CN1283785C - 利用转基因动物乳腺生产人促红细胞生成素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了生产EPO的新方法，包括：利用牛(B.taurus)的乳球蛋白(BLG)5′侧翼序列、部分外显子内含子序列及3′侧翼序列为乳腺特异表达的调控序列，以人促红细胞生成素(EPO)全长基因组DNA为编码序列，构建融合基因BLG-EPO，该融合基因可以在催乳山羊乳腺中瞬时表达。以该融合基因显微注射山羊受精卵原核，获得了人促红细胞生成素乳腺特异高效表达的转基因山羊。

Description

利用转基因动物乳腺生产人促红细胞生成素的方法
技术领域
本发明涉及基因工程和转基因动物领域，具体地，本发明涉及一种调控外源基因(如人促红细胞生成素)在动物乳腺组织特异性表达的载体，以及在动物乳腺中特异性表达外源基因的方法。本发明还涉及生产人促红细胞生成素的新方法。
背景技术
促红细胞生成素(EPO)是一种多功能的糖蛋白，具有刺激红细胞增殖分化等作用，临床主要用于治疗肾性贫血，是一种有重要价值的医用蛋白。EPO的生产方法主要是通过微生物发酵，然而目前的生产工艺成本较高，设备投入需要较多的资金，且对环境的污染也较严重。
动物乳腺组织具有较强的合成蛋白的功能，如能利用转基因技术将外源基因特别是有重要医疗价值的基因如人促红细胞生成素基因，人生长激素基因等转入动物体内，就有可能生产出大量的药用蛋白。人体内的许多蛋白的生理活性与翻译后修饰有关，通过原核表达的蛋白通常因为缺少翻译后修饰而不具备生物活性。以真核细胞培养来表达这些蛋白需要较高的成本，以转基因动物来表达外源蛋白，其产物接近天然即具有较高的生物活性、表达量高而且成本底。
用显微注射的方法转入动物体内的基因，其在动物体内的基因组的整合及表达是随机的，如果外源基因产物具有较强的生物活性，外源基因的随机表达或异位表达就有可能造成转基因动物体的疾病甚至死亡。如促红细胞生成素的异位表达会引起高红细胞血症。迄今为止，本领域还没有通过乳腺反应器(转基因羊或牛的乳腺)来生产EPO的报道。
因此，本领域迫切需要开发新的成本低、污染小的生产EPO的新方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种成本低、污染小的生产促红细胞生成素的方法，即利用转基因动物乳腺生产人促红细胞生成素，从而在动物乳腺中大量表达人促红细胞生成素。
本发明的另一目的是提供具有乳腺组织特异性的有关的表达融合基因、高效表达外源基因的载体、乳腺特异性表达EPO的转基因动物。
在本发明的第一方面，提供了一种乳腺特异性表达融合基因，该融合基因从5′至3′依次包含以下元件：牛乳球蛋白的5′侧翼序列、人促红细胞生成素基因组DNA序列、和牛乳球蛋白3′侧翼序列。
在一优选例中，该融合基因从5′至3′依次包含以下元件：牛乳球蛋白的5′侧翼序列、外显子1非编码序列、人促红细胞生成素基因组DNA序列、牛乳球蛋白外显子1编码序列、牛乳球蛋白内含子1、牛乳球蛋白外显子2、牛乳球蛋白内含子2、牛乳球蛋白外显子3、牛乳球蛋白外显子6、牛乳球蛋白内含子6、牛乳球蛋白外显子7及牛乳球蛋白3′侧翼序列。
在一优选例中，所述的融合基因在牛乳球蛋白的5′侧翼序列及外显子1非编码序列与人促红细胞生成素基因组DNA序列之间还有接头序列；和/或在人促红细胞生成素基因组DNA序列与牛乳球蛋白外显子1编码序列之间还有接头序列。
在另一优选例中，所述的融合基因中的牛乳球蛋白的5′侧翼序列、外显子1非编码序列具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
人促红细胞生成素基因组DNA序列具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
牛乳球蛋白外显子1、牛乳球蛋白内含子1、牛乳球蛋白外显子2、牛乳球蛋白内含子2、牛乳球蛋白外显子3具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
牛乳球蛋白外显子6、牛乳球蛋白内含子6、牛乳球蛋白外显子7及牛乳球蛋白3′侧翼序列具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
在第二方面，本发明提供了一种产生转基因动物的方法，它包括步骤：
(a)将本发明上述的乳腺特异性表达融合基因，显微注射动物受精卵原核，制得基因组中整合有融合基因的受精卵；
(b)将步骤(a)中的基因组中整合有融合基因的受精卵发育成转基因动物，该动物在其乳腺中有人促红细胞生成素的特异表达。
较佳地，该动物选自下组：羊、牛。
在第三方面，本发明提供了一种生产人促红细胞生成素的方法，它包括步骤：
(3)培养用本发明上述方法制得的转基因动物，从动物乳腺分泌的乳汁中分离纯化出表达的人促红细胞生成素。
在第四方面，本发明提供了一种调控外源基因在动物乳腺中特异性表达的载体，该载体含有权利要求1所述的融合基因。
在第五方面，本发明提供了一种乳汁，它含有浓度10-100,000ug/ml的人促红细胞生成素。更佳地，所述的乳汁含有浓度50-50,000ug/ml的人促红细胞生成素。
附图说明
图1是BLG-EPO融合基因元件构成示意图。
图2是BLG-EPO融合基因构建流程图。
图3是BLG-EPO融合基因酶切图谱。其中各酶切位点下方的数字为各位点的相对位置。
图4是融合基因BLG-EPO羊基因组的整合检测。其中，P为阳性对照，N为阴性对照，73、132、134、138为整合检测阳性的羊编号。
图5显示了转基因羊促红细胞生成素乳腺表达的检测结果。其中图5A为蛋白质转移到硝酸纤维素膜后的全蛋白丽春红染色；图5B为对醋酸纤维素膜进行抗体杂交后显色结果。各泳道如下：泳道1为分子量标记；泳道2为EPO标准品(沈阳三生)，分子量为34KD，上样量为30IU；泳道3、4、5分别为134号羊催乳后第3、2、1天羊奶样品，上样量为0.5ul；泳道6、7、8分别为138号羊催乳后第3、2、1天羊奶样品，上样量为0.5ul。
图6是MTT法检测EPO活性标准曲线。
图7显示了乳腺表达的促红细胞生成素氨基酸序列。斜体表示信号肽序列，黑体表示成熟肽序列。
具体实施方式
本发明首先发现，利用牛乳球蛋白的5′侧翼序列和牛乳球蛋白3′侧翼序列，可以有效地使外源基因在转基因动物的乳腺中特异性表达。在此基础上完成了本发明。
在本发明的优选例中，所使用的牛乳球蛋白的序列包括：从5′至3′依次包含以下元件：牛乳球蛋白的5′侧翼序列、外显子1非编码序列、牛乳球蛋白外显子1编码序列、牛乳球蛋白内含子1、牛乳球蛋白外显子2、牛乳球蛋白内含子2、牛乳球蛋白外显子3、牛乳球蛋白外显子6、牛乳球蛋白内含子6、牛乳球蛋白外显子7及牛乳球蛋白3′侧翼序列。其中，一种更优选的方式是在外显子1非编码序列和牛乳球蛋白外显子1编码序列之间插入外源基因。
当然，在外源基因(如EPO基因)与牛乳球蛋白基因之间还可含有接头序列，例如在牛乳球蛋白的5′侧翼序列及外显子1非编码序列与人促红细胞生成素基因组DNA序列之间还有接头序列A；和/或在人促红细胞生成素基因组DNA序列与牛乳球蛋白外显子1编码序列之间还有接头序列B。接头序列的作用主要是便于克隆操作。设计和选用各种接头序列在本领域的技术人员技能之内。在本发明的一个优选例中，所示的接头序列是：接头序列A是5′-ctcgagtcacc-3′(SEQ ID NO：15)；该接头序列B是5′-ccatgtcgagt-3′(SEQ ID NO：16)。
本发明还提供了一种调控外源基因在动物乳腺组织特异性表达的载体。为了使外源基因(人促红细胞生成素)在动物乳腺中特异表达，本发明利用牛乳蛋白基因的乳腺特异表达调控元件构建了乳腺特异表达的载体。一种优选的载体包括牛乳球蛋白基因的5′侧翼序列，部分外显子和内含子序列，3′侧翼序列。位于5′侧翼序列下游的供外源基因插入的多克隆位点，以及供载体连同插入其上的外源基因在大肠杆菌中复制的pGEM-Teasy序列。
在本发明的一个实施例中，所构建的载体的具有如下序列元件：
一、包括了牛乳球蛋白基因(BLG)的5′调控序列(-1216～+45bp)；
二、包含了牛乳球蛋白基因外显子1至外显子3(+48～+1878bp)、外显子6至外显子7(+4109～+4723)及3′侧翼序列(734bp)。
在本发明另一实施例中，还以该特异性表达载体为基础，构建了表达人促红细胞生成素的融合基因BLG-EPO，该融合基因的特点为：EPO全长编码序列基因组DNA 5′端以BstEII补平连于BLG的5′调控序列及外显子1非编码序列的下游，3′端以NcoI补平连于BLG外显子1编码序列至3′侧翼序列的上游。该融合基因的EPO基因组DNA位于转录起始位点的下游，紧邻BLG的5′-UTR，因而EPO能在BLG启动子作用下而转录，转录体为融合mRNA，其编码序列为EPO基因组DNA，而5′-UTR及3′-UTR来源于BLG和EPO。因EPO基因组DNA提供了终止密码，因而只有EPO蛋白被编码，而BLG不被翻译。
本发明的载体/融合基因所包含的调控序列含有乳腺特异表达的元件，能保证外源基因在乳腺特异表达。
在本发明的另一实施例中，将以此载体构建能在乳腺特异表达人促红细胞生成素的融合基因BLG-EPO转入动物时，从而在动物乳腺中大量表达人促红细胞生成素。
可用于本发明的转基因动物没有特别限制，可以是任何哺乳动物，较佳地，该动物选自下组：羊、牛、兔，更佳地选自下组：羊、牛。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1  EPO乳腺表达载体的构建
该实施例的基因构建过程如图2所示，该基因构建物即为BLG-EPO融合基因，其中调控序列来源于牛BLG和EPO，编码序列来源于EPO。
pBLG-EPO的制备
1.各部分元件的来源
1)牛BLG5′侧翼序列和外显子1非编码序列部分
根据GENBANK X14710报道的序列设计并合成如下引物：5′-cggccgggggtctgctcc-3′(SEQ ID NO：5)和5′-ctcgagggctgcagctggggtcac-3′(SEQ IDNO：6)，以牛基因组DNA为模板，用PCR法(94℃，5min；94℃，1min；60℃45s；72℃90s，30个循环)扩增BLG5′侧翼序列及外显子1非编码部分序列(SEQ ID NO：1)。PCR产物并克隆于pGEM-Teasy载体(Promega公司)，得质粒pBLG5′。
2)牛BLG外显子1-3及外显子6-7和3′侧翼序列
根据GENBANK X14710报道的序列设计并合成如下引物：5′-ctcgagtagtgcctcctgcttgccctg-3′(SEQ ID NO：7)和5′-atcgatcttgaacaccgcagg-3′(SEQ ID NO：8)，以牛基因组DNA为模板，通过PCR(94℃，5min；94℃，1min；58℃45s；72℃90s，30个循环)扩增出外显子1-3序列(SEQ ID NO：3)并将PCR扩增产物克隆于pGEM-Teasy载体得质粒pBLG 1-3。
根据GENBANK X14710报道的序列设计并合成如下引物：5′-atcgatgtgagcccctgccggcgc-3′(SEQ ID NO：9)和5′-gcatgccaggcctttctgtc-3′(SEQ IDNO：10)，以牛基因组DNA为模板，通过PCR通过PCR(94℃，5min；94℃，60s；56℃60s；72℃90s，35个循环)扩增出BLG外显子6～7及3′侧翼序列(SEQ ID NO：4)，并将PCR扩增产物克隆于pGEM-Teasy载体得质粒pBLG 6-3′。
3)以人基因组DNA为模板，采用如下引物：5′-atgagggcccccggtgtg-3′(SEQ IDNO：11)和5′-agtgtccatgggacaggctg-3′(SEQ ID NO：12)，通过PCR法获得EPO全长编码序列基因组DNA及部分5′-UTR和3′-UTR序列(SEQ ID NO：2)，并将其克隆入pGEM-Teasy载体，得质粒pEPO。
2.pBLG-EPO的构建
以ClaI和SalI双酶切pBLG6-3′回收外显子6-3′片段(约1350bp)将该片段连于pBLG1-3的ClaI和SalI位点得pBLG1-3′；以XhoI和SalI双酶切pBLG1-3′回收BLG1-3′片段(约3.1Kb)将该片段连于pBLG5′的XhoI和SalI位点得pBLG；以BstEII和NcoI双酶切pEPO回收EPO片段(约2.3KB)将该片段平端连于pBLG的XhoI位点得pBLG-EPO。(构建过程详见图2)。
pBLG-EPO乳腺特异表达融合基因的酶切图谱，参见图3。
在pBLG-EPO中，EPO与BLG5′接头及其邻近序列如下：
转录起始位点BLG5′-UTR接头序列EPO5′-UTRCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGTGACCCCAGCTGCAGCC CTCGAGTCACCCGGCGCGCCCCAGGTCGCTGAGGGACCCCGGCCAGGCGCGGAG ATG(SEQ ID NO：13)
起始密码子
EPO与BLG 3′接头及邻近序列如下：
EPO3′-UTR接头序列BLG3′-UTRTCGAGGGGCTCTCAGCTCAGCGCCAGCCTGTC CCATGTCGAGTAGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGCCCTCACTTGTGGCGC
参见图1，在人促红细胞生成素乳腺特异性表达载体pBLG-EPO或融合基因BLG-EPO中，各元件的功能如下：
阴影框部分为BLG的5′侧翼序列，该部分是BLG启动子，负责驱动外源基因的表达，保证外源基因表达是乳腺特异性的。→表示BLG5′非翻译区(5′-UTR)，5′-UTR为外源基因翻译编码形成蛋白提供核糖体结合位点。其详细序列参见附图4和SEQ ID NO：1。
空心框部分为外源基因EPO全长编码序列。包括翻译起始密码及终止密码子。序列详见SEQ ID NO：2。
实心框部分为牛BLG外显子1至外显子3，外显子6～7和3′侧翼序列，其作用是提供转录终止信号及加Poly A信号。外显子部分向外源基因提供3′非翻译区，内含子部分及3′侧翼序列与乳腺特异性高效表达的调控有关，序列详见SEQID NO：3，以及SEQ ID NO：4。
人EPO的氨基酸序列如图7和SEQ ID NO：17所示。
实施例2  融合基因pBLG-EPO转基因山羊的制备
1.转基因用质粒DNA的制备
1)质粒pBLG-EPO转化大肠杆菌DH52，液体培养含pBLG-EPO质粒的DH52菌株，培养量根据需要可为100ml-1000ml，然后收集细菌，用快速抽提法或大规模抽提法制备pBLG-EPO(详细操作参考曼尼安蒂斯主编的分子克隆手册)。
提取的pBLG-EPO质粒用NotI酶切，琼脂糖凝胶电泳，用SephaglassBabndprep(pharmacia biotech)试剂盒回收纯化6.82Kb的片段备用。
2)用显微注射DNA稀释液将纯化后DNA稀释至2ug/ml，离心(12000rpm，30min)，分装，即可作显微注射用。
2.制备转基因动物
将融合基因BLG-EPO通过显微注射的方法导入到奶山羊受精卵雄原核内，然后再移植到同步发情的受体山羊输卵管内，待其妊娠产仔。
实施例3.融合基因pBLG-EPO转基因山羊基因组整合的检测
1.样品处理
未转基因山羊和待测转基因山羊，按常规操作取羊耳(长度小于1厘米)，-20℃保存备用。
2.检测方法
1)基因组DNA的快速抽提：，将羊耳置于1.5ml离心管中，加0.5ml的LysisBuffer(4M Urea power，10mM EDTA(pH8.0)，0.5％Sarkosyl(Sigma L5125)，0.1MTris-Cl(pH 8.0)，0.2M NaCl)，50μl的蛋白酶K(10mg/ml)置于55℃的杂交炉中振摇过夜。离心(14000rpm)5min，转移上清至一个干净的离心管中，加入1ml无水乙醇轻轻混合后强烈振摇，用Tip头轻轻挑起絮状DNA沉淀，用250-300μl的0.1×TE或双蒸水重悬DNA，吹打混匀，4℃保存。
2)酶切及电泳：取基因组DNA约10微克采用限制性内切酶EcoRI在37℃酶切12小时以上。酶切产物以1％琼脂糖凝胶电泳，1-2V/cm电压，电泳12小时以上。
变性及中和：加入变性液(1.5M NaCl 0.5M NaOH)使胶变性45分钟(轻摇)，加入中和液(1.5M NaCl 0.5M Tris-Hcl(PH 8.0)轻摇中和45分钟(轻摇)
3)转膜：将尼龙膜均匀铺在胶上，上面铺3MM Waterman吸水纸3张，再铺纸塔(5-10厘米)，压上重物，转膜18小时；用5×SSC冲洗膜以去除膜表面的凝胶碎片；在室温下晾干，80℃固定2小时。
4)探针制备：以EcoR I和Xho I双酶切质粒pBLG-EPO，回收3.5kb条带，产量应在500ng-1000ng间，采用随机引物标记试剂盒标记探针。
5)预杂交及杂交：转印膜在预杂交液(5×SSPE，5×Denhardt′s  Solution，0.1％SDS，100μg/ml nonhomologous Salmon sperm blocking DNA，50％Formamide)中42℃预杂交4小时。将探针加入到预杂交液中，42℃杂交16小时。
6)洗膜压片洗片：采用Wash Solution(1×SSC，0.1％SDS)65℃洗涤1小时，重复此步骤，直到本底降到10以下。把洗后的膜用保险膜固定，暗室中放入X光片，-70℃保存两天。暗室中取出X光片，显影5分钟，定影15分钟，检查光片上所显示的结果，
2.检测结果
结果见附图4，泳道P为阳性对照：转基因构件BLG-EPO以EcoR I酶切；泳道N为阴性对照：未转基因山羊基因组DNA；其余泳道为待测转基因山羊基因组DNA。结果显示：转基因山羊(73、132、134、138)的基因组DNA中有BLG-EPO的整合。
实施例4.Western blot检测转基因山羊乳汁中人促红细胞生成素
1.样品处理
1)转基因奶山羊的人工诱乳：
选取奶山羊，每天肌肉注射苯甲酸雌二醇及黄体酮二次，每次剂量分别为2mg及20mg，共七天。然后分别于第8，10，12，14天肌肉注射利血平0.5mg。于第12天收集乳汁供EPO表达检测用
收集羊奶，脱脂处理(4000rpm，4℃，20min)，加入等体积的TBS缓冲液(0.1mol/L Tris-碱，0.3mol/L NaCl，0.2mol/L EDTA，PH6.5)，过0.22um滤膜除菌，样品中加入1×SDS凝胶加样缓冲液，于100℃煮沸3分钟，使蛋白变性。
2.检测方法
蛋白电泳：经处理样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，积层胶：4％胶浓度，50V；分离胶：7.5％胶浓度，100V。
蛋白转印：电泳后在80mA电流下进行蛋白转印2小时，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，以丽春红染色检测转印效果。转印膜用Tris-NaCl溶液(0.05mol/L Tris-碱，0.15mol/L NaCl，pH7.5)洗去结合在蛋白上的丽春红染料后用于杂交抗体。
抗体杂交：将转印膜放入平皿，加入适量封闭液(10％脱脂奶粉)，以1∶3000的浓度加入第一抗体(鼠抗人促红细胞生成素抗体)，于平缓摇动的摇床上室温杂交四小时；杂交结束，用Tris-NaCl溶液漂洗滤膜3次，每次10分钟；以1∶2000的浓度加入酶联二级抗体，室温杂交二小时；杂交结束，用Tris-NaCl溶液漂洗膜3次，每次10分钟，然后进行显色反应。
显色：在膜上加入适量底物(碱性磷酸酶用BCIP/NBT)，暗反应约20分钟，就能看到蛋白条带。
3.检测结果
结果见附图5，图中泳道1为分子量标准物；泳道2为阳性对照EPO标准品(沈阳三生)：；泳道3，4，5，6，7，8为待测转基因山羊乳蛋白。
结果显示：转基因山羊134、138(泳道3，4，5，6，7，8)的乳汁中有人促红细胞生成素的特异性条带显示。
实施例5.转基因山羊乳汁中人促红细胞生成素(EPO)体外生物活性测定(MTT法)
活细胞特别是增殖的细胞中能量代谢旺盛，利用线粒体能量代谢过程中产生的琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原为蓝紫色结晶沉积在细胞核周围，形成的结晶与增值的细胞数成正比。利用32D细胞对EPO的生长依赖特性，可检测培养液中的EPO活性。
1.实验材料：
1640培养液：按说明书配制，4度保存。
基础培养液：1640培养液添加10％的小牛血清，1*P/S，4度保存。
完全培养液：基础培养液添加EPO至终浓度1-2U/ml，4度保存。
PBS：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4、KH2PO40.24g加蒸馏水配成1000ml。121度15分钟灭菌。
噻唑蓝MTT溶液：用PBS配成5.0mg/ml的溶液，经0.22um滤器过滤除菌，4度避光保存。
裂解液：10％的SDS、0.01mol/mlHCl。
32D细胞培养物：32D细胞在完全培养液中培养24-48个小时用于EPO活性测定。
EPO标准品：沈阳三生益比奥3000U/ml，4℃保存。
2.实验步骤：
空白羊奶制备：
空白羊奶用针头滤器除菌过滤。用基础培养液稀释成10％的溶液。
样品溶液制备：
除菌过滤，羊奶样品用针头滤器过滤除菌，用基础培养液稀释成10％的溶液，按样品的含量用10％的空白羊奶稀释成不同浓度梯度的样品。
制备标准品样品稀释：
取益比奥用10％的空白羊奶配成12.8U/ml的溶液，然后用空白羊奶倍比稀释成12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05U/ml。
制备细胞悬液：
取足量的32D细胞培养物离心收集32D细胞，用基础培养液洗涤三次，重悬于基础培养液中计数配成40万细胞每毫升备用。在96孔板中按下表加入标准系列100ul，及样品100ul，每个3-4复孔
加入细胞悬液及培养：
每孔加入100ul细胞悬液，置37℃，5％CO2培养44小时(至2A-D存活细胞不足11A-D的10％)
加入MTT并培养：
酶孔加入10ulMTT溶液，37℃，5％CO2培养4小时
加入裂解液并保温：
酶孔加入100ul裂解液，37℃保温18-24小时
测定光密度值：
在酶标仪上比色，测定波长590nm(570-600，可选用参比波长630nm)，记录测定结果。
3.结果
MTT法检测EPO活性标准曲线如图6所示。以标准系列浓度u/ml的对数对OD590作直线回归，计算样品EPO浓度，结果表明BLG-EPO整合羊132、134、138乳腺表达EPO分别达117U/ml、28000U/ml、19038U/ml乳汁。
                 MTT法检测EPO活性标准曲线的制定
  EPOu/ml   OD590   OD590   OD590   OD590   log(EPO u/ml)   OD590平均值
  0.098   0.093   0.092   0.091   0.0935
  0   0.553   0.579   0.584   0.587   0.57575
  0   0.554   0.569   0.59   0.59   0.57575
  0.025   0.578   0.621   0.635   0.627   -1.602059991   0.61525
  0.05   0.654   0.683   0.71   0.668   -1.301029996   0.67875
  0.1   0.722   0.812   0.837   0.854   -1   0.80625
  0.2   0.905   1.047   1.043   1.088   -0.698970004   1.02075
  0.4   1.022   1.197   1.198   1.2   -0.397940009   1.15425
  0.8   1.423   1.455   1.377   1.507   -0.096910013   1.4405
  1.6   1.639   1.231   1.555   1.529   0.204119983   1.4885
  3.2   1.31   1.553   1.505   1.657   0.505149978   1.50625
                     整合羊132、134、138乳腺表达EPO活性的测定
  山羊132
  日期/稀释度   OD590   OD590   OD590   OD590   平均值   EPO u/ml   EPOu/ml羊奶
  20/3  500   0.995   1.022   1.056   1.069   1.0355   0.211777906   105.888953
  21/3  500   1.003   1.093   1.041   1.041   1.0445   0.218956118   109.4780592
  22/3  500   1.088   1.107   1.045   1.013   1.06325   0.234701749   117.3508746
  山羊134
  20/3  125000   1.113   1.013   1.092   0.995   1.05325   0.226168125   28271.01564
  21/3  125000   0.999   1   1.015   1.01   1.006   0.189858529   23732.31609
  22/3  125000   0.965   0.998   0.985   0.963   0.97775   0.170997668   21374.70852
  山羊138
  20/3   25000   1.053   1.029   1.054   0.976   1.028   0.205976158   5149.403954
  21/31  25000   1.025   0.973   0.895   0.838   0.93275   0.14474648   18093.30996
  22/31  25000   1.127   0.925   0.819   0.915   0.9465   0.152308727   19038.59081
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
                          序列表
<110>上海杰隆生物工程股份有限公司
<120>利用转基因动物乳腺生产人促红细胞生成素的方法
<130>022856
<160>17
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1264
<212>DNA
<213>牛(B.taurus)
<400>1
cggccggggg tctgctcccg tgggtgggct ctttctggta cagtcaccaa cagtctctcc   60
gggaaggaaa ccagaggcca gagagcaagc cagagctagt ctaggagatc cctgagcctc   120
cacccaagat gccgaccagg ccagcgggcc ccctggaaag accctacagt ctaggggggg   180
aacaggagcc gacccgccag gcccccgcta tcaggagaca ccccaacctt gctcctgttc   240
ccctacccca gtacgcccac ccgacccctg agatgagtgg tttacttgct tagaatgtca   300
attgaaggct tttgtacccc ctttgccagt ggcacagggc acccacagcc cgttgggtac   360
tgatgcccat gtggactcag ccaggaggac tgtcctgcgc cctccctgct cgggccccct   420
ccatactcag cgacacaccc agcaccagca ttcccaccac tcctgaggtc tgaaggcagc   480
tcgctgtggt ctgagcggtg cggagggaag tgccctggga gatttaaaat gtgagaggtg   540
ggaggtggga ggttgggtcc tgtaggcctt cccatcccac gtgcctgcac ggagccctag   600
tgctactcag tcatgccccc gcagcagggg tcaggtcact ttcccatcct gggggttatt   660
atgactgttg tcattgttgt tgccattttt gctaccctaa ctgggtagcg ggtgcttgca   720
gagccctcga tactgaccag gttcccccct cggagctcga cctgaacccc atgtcaccct   780
cgccccagcc tgcagaggga gaggtgactg cagagatccc tttacccaag gccacagtca   840
catggtttgg aggagatggt gcccaaggca gaagccaccc tccaggacac acctgccccc   900
agtgctggct ctgacctgtc cttgtctaag aggctgaccc cagaagtgtt cctggcgctg   960
gcagccagcc tggacccaga gcctggacaa ccccctgcgc ccccacttct ggggcgtacc  1020
aggaaccgtc caggcccaga gggggccttc ccgcttggcc tcgaatggaa gaaggcctcc  1080
tattgtcctc gtagaggaag caaccccagg gcccaaggaa aggccagggg ggattcgggg  1140
aaccgcgtgg ctgggggccc ggcccgggct ggctggctgg ccctcctcct gtataaggcc  1200
ccgagcccgc tgtctcagcc ctccactccc tgcagagctc agaagcgtga ccccagctgc  1260
agcc                                                               1264
<210>2
<211>2309
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
cggcgcgccc caggtcgctg agggaccccg gccaggcgcg gagatggggg tgcacggtga    60
gtactcgcgg gctgggcgct cccgcccgcc cgggtccctg tttgagcggg gatttagcgc    120
cccggctatt ggccaggagg tggctgggtt caaggaccgg cgacttgtca aggaccccgg    180
aagggggagg ggggtggggc agcctccacg tgccagcggg gacttggggg agtccttggg    240
gatggcaaaa acctgacctg tgaaggggac acagtttggg ggttgagggg aagaaggttt    300
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caccacttat ctgccagagg ggaagcctct gtcacaccag gattgaagtt tggccggaga    420
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cgtggggatg aaggaagctg tccttccaca gccacccttc tccctccccg cctgactctc    600
agcctggcta tctgttctag aatgtcctgc ctggctgtgg cttctcctgt ccctgctgtc    660
gctccctctg ggcctcccag tcctgggcgc cccaccacgc ctcatctgtg acagccgagt    720
cctggagagg tacctcttgg aggccaagga ggccgagaat atcacggtga gaccccttcc    780
ccagcacatt ccacagaact cacgctcagg gcttcaggga actcctccca gatccaggaa    840
cctggcactt ggtttggggt ggagttggga agctagacac tgccccccta cataagaata    900
agtctggtgg ccccaaacca tacctggaaa ctaggcaagg agcaaagcca gcagatccta    960
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tcagacgggc tgtgctgaac actgcagctt gaatgagaat atcactgtcc cagacaccaa    1080
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ttgcatacct tctgtttgct cagcttggtg cttggggctg ctgaggggca ggagggagag    1680
ggtgacatgg gtcagctgac tcccagagtc cactccctgt aggtcgggca gcaggccgta    1740
gaagtctggc agggcctggc cctgctgtcg gaagctgtcc tgcggggcca ggccctgttg    1800
gtcaactctt cccagccgtg ggagcccctg cagctgcatg tggataaagc cgtcagtggc    1860
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ttctgcttgc cctttctgta agaaggggag aagggtcttg ctaaggagta caggaactgt    1980
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caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat gaccaggtgt gtccacctgg gcatatccac    2220
cacctccctc accaacattg cttgtgccac accctccccc gccactcctg aaccccgtcg    2280
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<210>3
<211>1832
<212>DNA
<213>牛(B.taurus)
<400>3
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<213>牛(B.taurus)
<400>4
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ctcgctcttg tggggtgacc tgtgtcctgg cctcactcac acgctgatct cctccacctc    240
cttcctggca gacctaaggg ccaaggtgga ggctcaggaa gtggacacct aagggggagg    300
ctaggggggt ccttctccca aggaggggcc gtcctgaatc cccagccacg gacaggctgg    360
caagggtctg gcaggtaccc caggaatcac aggggagccc catgtccatt tcagagcccg    420
ggagccttgg cccctctggg gacagacgat gtcatccccg cctgccccat caggggacca    480
ggaggaaccg ggaccacatt cacccctcct gggacccagg cccctccagg cccctcctgg    540
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<223>引物
<400>7
ctcgagtagt gcctcctgct tgccctg                                          27
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>8
atcgatcttg aacaccgcag g                                                21
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>9
atcgatgtga gcccctgccg gcgc                                             24
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>10
gcatgccagg cctttctgtc                                                  20
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>11
atgagggccc ccggtgtg                                                    18
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>12
agtgtccatg ggacaggctg                                                  20
<210>13
<211>102
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>EPO与BLG5’接头及其邻近序列
<400>13
cctccactcc ctgcagagct cagaagcgtg accccagctg cagccctcga gtcacccggc   60
gcgccccagg tcgctgaggg accccggcca ggcgcggaga tg                      102
<210>14
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>EPO与BLG 3’接头及邻近序列
<400>14
tcgaggggct ctcagctcag cgccagcctg tcccatgtcg agtagtgcct cctgcttgcc    60
ctggccctca cttgtggcgc                                                80
<210>15
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>接头序列
<400>15
ctcgagtcac c                                                           11
<210>16
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>接头序列
<400>16
ccatgtcgag t                                                           11
<210>17
<211>193
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(27)
<223>信号肽
<400>17
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
            20                  25                  30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
        35                  40                  45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
    50                  55                  60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65                  70                  75                  80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
                85                  90                  95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
            100                 105                 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
        115                 120                 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
    130                 135                 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145                 150                 155                 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
                165                 170                 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
            180                 185                 190
Arg

Claims (11)

1.一种乳腺特异性表达融合基因，其特征在于，该融合基因从5′至3′依次包含以下元件：牛乳球蛋白的5′侧翼序列、人促红细胞生成素基因组DNA序列、和牛乳球蛋白3′侧翼序列。
2.如权利要求1所述的融合基因，其特征在于，该融合基因从5′至3′依次包含以下元件：牛乳球蛋白的5′侧翼序列、外显子1非编码序列、人促红细胞生成素基因组DNA序列、牛乳球蛋白外显子1编码序列、牛乳球蛋白内含子1、牛乳球蛋白外显子2、牛乳球蛋白内含子2、牛乳球蛋白外显子3、牛乳球蛋白外显子6、牛乳球蛋白内含子6、牛乳球蛋白外显子7及牛乳球蛋白3′侧翼序列。
3.如权利要求2所述的融合基因，其特征在于，在牛乳球蛋白的5′侧翼序列及外显子1非编码序列与人促红细胞生成素基因组DNA序列之间还有接头序列；和/或在人促红细胞生成素基因组DNA序列与牛乳球蛋白外显子1编码序列之间还有接头序列。
4.如权利要求3所述的融合基因，其特征在于，在牛乳球蛋白的5′侧翼序列及外显子1非编码序列与人促红细胞生成素基因组DNA序列之间的接头序列是CTCGAGTCACC；而在人促红细胞生成素基因组DNA序列与牛乳球蛋白外显子1编码序列之间的接头序列是CCATGTCGAGT。
5.如权利要求2所述的融合基因，其特征在于，牛乳球蛋白的5′侧翼序列、外显子1非编码序列具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
人促红细胞生成素基因组DNA序列具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
牛乳球蛋白外显子1编码序列、牛乳球蛋白内含子1、牛乳球蛋白外显子2、牛乳球蛋白内含子2、牛乳球蛋白外显子3具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
牛乳球蛋白外显子6、牛乳球蛋白内含子6、牛乳球蛋白外显子7及牛乳球蛋白3′侧翼序列具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
6.一种产生转基因动物的方法，其特征在于，它包括步骤：
(1)将权利要求1所述的乳腺特异性表达融合基因，显微注射动物受精卵原核，制得基因组中整合有融合基因的受精卵；
(2)将步骤(1)中的基因组中整合有融合基因的受精卵发育成转基因动物，该动物在其乳腺中有人促红细胞生成素的特异表达。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，该动物选自下组：羊、牛。
8.一种生产人促红细胞生成素的方法，其特征在于，它包括步骤：
(3)培养用权利要求6所述方法制得的转基因动物，从动物乳腺分泌的乳汁中分离纯化出表达的人促红细胞生成素。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的乳汁含有浓度10-5000ug/ml的人促红细胞生成素。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的乳汁含有浓度50-1000ug/ml的人促红细胞生成素。
11.一种调控外源基因在动物乳腺中特异性表达的载体，其特征在于，该载体含有权利要求1所述的融合基因。
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