CN1261589C - Aβ－肽的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及γ-分泌酶活性的测定方法，该方法的各成分及其应用。本发明提供了一种测定γ-分泌酶活性及检测γ-分泌酶的新颖方法；该方法的具体实施方案涉及γ-分泌酶或编码γ-分泌酶的cDNA的鉴定方法和对可抑制γ-分泌酶活性的有效物质的鉴定方法。此类物质具有特殊的意义，因为它们可作为药物活性物质，比如用于阿尔茨海默病的治疗。

Description

Aβ-肽的筛选方法
本发明涉及测定γ-分泌酶活性的方法，本方法的各成分及其应用。
阿尔茨海默(Alzheimer)病是一种脑部的神经变性疾病，在细胞水平，其伴随着外周神经系统和中枢大脑皮层内大量神经元的丢失。在受累的大脑部位，从分子水平来讲，蛋白的沉积-通称为“老年斑”-可在分子水平被检测到，这是阿尔茨海默病的基本特征。在这些斑块内的主要蛋白为由40-42个氨基酸组成的多肽，其被称为Aβ-肽。这种肽是由695-770个氨基酸组成的大分子蛋白即β-淀粉样前体蛋白(APP)的裂解产物。
APP是一个完整的跨膜蛋白，其首先横跨脂质双层。该蛋白分子的大部分暴露在细胞外，只有小部分C-末端区域存在于胞浆内(图1)。Aβ-肽在图1被示为暗灰色。大约2/3的Aβ-肽分子来自APP的细胞外区域，而余下的1/3来自其跨膜区。
除了与膜结合的APP外，可检测到一种分泌型淀粉样前体蛋白，其由APP大的细胞外区域组成，被称为APPsec(“分泌型APP”)。APPsec是由APP被蛋白水解断裂而成，此过程由α-分泌酶完成。这一发生在APP氨基酸序列内部的蛋白水解的断裂位点处于Aβ-肽氨基酸序列内(Aβ-肽第16位氨基酸残基后)。因此，由α-分泌酶对APP的蛋白水解不能形成Aβ-肽。
那么，Aβ-肽只能由APP其它的加工途径产生。有一种假说提出，另外两种蛋白酶参与了这一加工途径。其中之一为β-分泌酶，在APP分子内的Aβ-肽的N-末端断裂；第二个蛋白酶被称为γ-分泌酶，可释放Aβ-肽的C-末端(Kang，J.等，Nature，325，733)(图1)。
到目前为止，尚无法鉴别三种分泌酶或蛋白酶(α-分泌酶，β-分泌酶，γ-分泌酶)中的任何一种。然而，对于这些分泌酶的了解和认识是一项很有意义的课题，尤其是对阿尔茨海默病的探讨及鉴别参与其中的蛋白质，从而作为进一步研究的靶蛋白。从一方面讲，通过抑制β-分泌酶，尤其是γ-分泌酶可导致Aβ-肽合成减少；另一方面，激活α-分泌酶可增加APP的加工合成APPsec，从而同时降低Aβ-肽的合成。正是根据这样的研究方案，人们发现了转基因秀丽新小杆线虫(C.elegans)，这一发现报道在未公开的德国专利申请19849 073.9号中。
大量的实验证据表明，Aβ-肽是阿尔茨海默病发病的关键因素。其中，Aβ-原纤维的神经毒性在细胞培养中得到了证实(Yankner，B.A等，(1990)，Proc Natl Acad Sci USA，87,9020)。对于患有唐氏综合征的病人，即此种病人具有一份额外的APP基因拷贝，甚至在30岁的年龄脑内就有阿尔茨海默病的神经病理学特征。在这里，有人认为是由于APP的过多表达，从而导致转换合成Aβ-肽增加(Rumble，B等，(1989)，N.Engl.J.Med.，320，1446)。
关于Aβ-肽重要作用的最强证据可能要属家族性阿尔茨海默病了。这里，在APP基因内围绕β-和γ-分泌酶的裂解位点或在另外两个阿尔茨海默病相关基因(presenilins)内发现了多个突变，从而导致培养细胞内的Aβ-肽的产量明显增加(Scheuner，D.等，(1996)，Nature Medicine，2，864)。
已有大量的实验证据表明，在加工过程中，APP首先被β-分泌酶裂解为Aβ-多肽，然后，后者作为γ-分泌酶的反应底物(Maruyama，K.Y.等，(1994)Biochem.Biophys Res Commun，202，1517；Estus，S.等，(1992)，Science，255，726)。因此，γ-分泌酶在Aβ-肽的形成中具有重要作用。为了检测γ-分泌酶的活性，通常是通过测定Aβ-肽，然而，这通常是很困难的。
这种困难的重要原因是只有小部分的APP被转化成Aβ-肽(SimonsM等，Neurosci(1996)1；16(3)：899-908)。此外，Aβ-肽是唯一很小的裂解片段，大约4kDa，同时，由于它具有疏水性，很易自聚，因此在生理状态下很易沉淀(Hilbich，C.等，(1991)J.Mol.Biol.，218，149)。
检测真核细胞内的Aβ-肽是通过免疫生物学的方法进行的，比如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀和蛋白杂交(Suzuki，N.等，Science 1994，27，264(5163)1336；Haass，C.等，(1992)Nature，359，322)。这些检测方法的工作量相对较大，因为它们牵扯到要与合适的抗体温育和必需破坏所用细胞，这些细胞可能来源于培养细胞或生物体模型(如秀丽新小杆秀丽新小杆线虫秀丽新小杆线虫)。
本发明涉及一种测定γ-分泌酶活性和检测γ-分泌酶的新方法；本方法的特定实施方案一方面涉及对γ-分泌酶或编码γ-分泌酶的cDNA的鉴定方法；另一方面涉及对可抑制γ-分泌酶活性的有效物质的鉴定方法。这些物质具有特别重要的意义，例如，因为它们可被当作药理学活性化合物，比如，可用于治疗阿尔茨海默病。
本发明涉及一种检测γ-分泌酶的方法，其中
1.制备和应用一种转基因，其编码一个融合蛋白和包含下列组成成分：
a)第一核苷酸序列，其编码的蛋白包含氨基酸序列：
GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)，
b)在第一核苷酸序列的5’末端的编码一个信号肽的第二核苷酸序列，
c)一个启动子，和
d)如果必要，额外的编码和/或非编码性核苷酸序列；
2.将该转基因导入细胞内，并表达融合蛋白；
3.该融合蛋白被细胞内的γ-分泌酶在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列内裂解，因此形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白，和包含氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白，及
4.检测第一片段蛋白和/或第二片段蛋白。
本发明还涉及一种γ-分泌酶活性的测定方法，其中
1.制备和应用一种转基因，其编码一个融合蛋白和包含下列组成成分：
a)第一核苷酸序列，其编码包含氨基酸
GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白，
b)在第一核苷酸序列的5’末端的编码一个信号肽的第二核苷酸序列。
c)一个启动子，和，
d)如果必要，额外的编码和/或非编码性核苷酸序列；
2.将该转基因导入细胞内，并表达融合蛋白；
3.该融合蛋白被细胞内的γ-分泌酶在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列内裂解，因此形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白，和包含氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白；
4.测定第二片段蛋白的含量，且由第二片段蛋白的形成量确定γ-分泌酶活性。
这些方法(“Aβ-肽筛选方法”，“γ-分泌酶测定方法”)适合于在体测定γ-分泌酶或γ-分泌酶活性，并有可能被广泛应用，例如，其甚至可用于高通量筛选技术(“HTS”)。本系列方法避免了上述常规检测方法的弊端，尤其是不需要费力的分离和检测布骤。这一方案的根据是，APP的C-末端片段被γ-分泌酶裂解成两个片段，第一个片段蛋白包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)，第二个片段蛋白包含氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)，包含氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白可扩散到细胞的胞浆中(图2)。在胞浆内的该第二个片段蛋白很容易被检测到，比如，借助于一个报告基因；从而用于检测γ-分泌酶或γ-分泌酶的活性。γ-分泌酶的裂解位点位于APP的跨膜区域(Kang，J.等，(1987)Nature，325，733)。APP跨膜区域的氨基酸序列为：GAIIGLMVGGVV40IA42TVIVIILVML。γ-分泌酶在V40、A42或T43之后的氨基酸位点断裂。与此相比，培养的真核细胞产生的Aβ-肽被分泌到上清培养液内。
借助于适当的报告系统，释放的第二片断蛋白可激活报告蛋白的表达，这一蛋白在真核细胞内可被检测到。通过对报告蛋白的检测，可以证明在APP分子中发生了γ-分泌酶裂解作用。结果，γ-分泌酶或γ-分泌酶的活性可被定性或定量地测定。
这一测量方法的组成可更为详细地描述如下：
第一核苷酸序列编码淀粉样前体蛋白(APP)或其部分。优选地，第一核苷酸序列编码的蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO.4；SEQ IDNO.4包含SEQ ID NO.1。
第二核苷酸序列编码一个信号肽，优选APP的信号肽(此后缩写为“SP”)。例如，这个信号肽(SP)包含氨基酸序列SEQ IDNO.5。
作为启动子，最可能使用可调节的或组成型启动子。比如，可为适合在哺乳细胞、秀丽新小杆线虫、酵母或果蝇细胞内表达蛋白的启动子。比如适合于哺乳细胞的启动子有：CMV(如，Clontech，Heidelberg，德国)、HSV TK(如，Clontech)、RSV(如，Invitrogen，NV Leek，荷兰)、SV40(如，Clontech)和LTR(如，Clontech)。再如，用于秀丽新小杆线虫的启动子有：unc119，unc54，hsp16-2，GOA1和sel-12。对于酵母表达，启动子ADH1(组成型)(Vlckova等(1994)Gene，25(5)，472-4)，Gal1(条件性可诱导的)(Selleck等(1987)Nature 325，173-7)，MET3(条件性)(Cherest等，(1987)Mol Gen Genet 210，307-13)和Met25更为合适。对于果蝇，举例说明，可能用启动子MT(金属硫蛋白)(如，Invitrogen)，Ac5(Invitrogen)或Ds47(Invitrogen)。
优选地，真核细胞被用于本检测方法，如人类细胞或非人类的细胞，如猴、仓鼠、小鼠、果蝇、斑马鱼或酵母。比如，使用HeLa，293，H4，SH-SY5Y，H9，Cos，CHO，N2A，SL-2或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。本发明的一个具体实施方案中使用了秀丽新小杆线虫细胞。这个细胞可以是一个转基因的非人动物的组成部分。在一个具体实施方案中，转基因细胞可以是转基因秀丽新小杆线虫的组成部分。本发明特别涉及使用酵母细胞的检测方法，如来自MAV203菌株(Life Technologies公司，Rockville镇，马里兰州，美国)或EGY48(OriGene Technologies，Inc.，Rockville镇，马里兰州，美国)的细胞。
所述转基因编码一个融合蛋白；这个融合蛋白由第一和第二核苷酸序列和必要时的额外的核苷酸序列编码的部分蛋白组成。因此，这个融合蛋白包含了第一片段蛋白和第二片段蛋白及适当时的其它片段蛋白。这个融合蛋白的氨基酸序列例如为SEQ ID NO.6。
详细地讲，具有核苷酸序列SEQ ID NO.8的转基因可用于本测定方法。在本发明方法的一个特别优选的实施方案中，这个转基因存在于一个表达载体上。该重组表达载体上有核苷酸序列SEQ ID NO.9。本发明的该具体方案也被称为SP-C100-Gal 4-VP16系统。此时，一个由APP信号肽、APP的C100片段、Gal4和VP16组成的融合蛋白被表达。这个蛋白位于跨膜区域，在C100片段和第二片段蛋白-即包含部分C100片段、Gal4和VP16的融合蛋白部分-内被裂解，在报告质粒的协助下可被检测。
除了转基因构建体SPC100-Gal4-VP16外，其它报告基因构建体也是很可行的，例如，转录激活域可被插到SPC100跨膜区和胞浆区之间，或一个标签(Tag，如MYC，FLAG)插在N-和C-末端及在SPC100跨膜区和胞浆区之间。
所述额外的编码核苷酸序列可编码例如一种蛋白，且这个蛋白可用于第二片段蛋白的检测。优选该额外的编码核苷酸序列位于第一核苷酸序列的3’末端。该额外的编码核苷酸序列例如编码一种嵌合蛋白或另一蛋白，这一蛋白由数个不同功能域构成，如包含DNA-结合域和转录激活域的蛋白。在本发明的一个具体实施方案中，该额外的编码核苷酸序列编码一个由Gal4-结合域和VP16的转录激活域(Gal4-VP16)组成的蛋白，该另外的片段蛋白优选具有氨基酸序列SEQ IDNO.7。对于酵母细胞，这个额外蛋白还有LexA-结合域(即，LexA-VP16)。这个额外蛋白特别适合于应用酵母细胞株EGY48的本检测方法。
特别是，本发明涉及其中所用细胞共转染了报告质粒的检测方法。报告质粒包含的报告基因是在可调控启动子控制之下的。举例说明，这个报告基因可编码绿色荧光蛋白(GFP)和它的衍生物，如增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)、EBFP、EYFP、d2EGFP、GFPuv或荧光素酶(如，Promega，Mannheim，德国)、CAT(如，Promega)、SEAP(如Clontech)、βGal(如Clontech)或细胞凋亡诱导因子，如Fas、TNF-R1、死亡域和类似物(Tartaglia等(1993)Cell 74，845-53)、ced3、ced4、ced9。对于可调启动子，报告质粒可包含例如HIV的最小启动子、CD4启动子或mec7启动子。对于最适合的可调启动子的选择主要取决于所用的转录-激活域。
本发明的一个具体实施方案涉及测定方法的具体执行，所用细胞为酵母细胞。作为酵母表达载体pDBTRP(Life Technologies Inc.)(SEQ ID NO.11)-其中在一具体方案中使用MET-25启动子(见SEQ IDNO.12)-的替代，可以选择带有不同启动子(如诱导型Gal1启动子和MET-25启动子或组成性活性ADH1启动子)和不同选择标记(ADE，LEU，TRP，HIS，LYS，PHE)的其它大量表达载体。
一个具体实施方案中，使用酵母细胞，其包含稳定地整合在基因组或存在于染色体外的Gal4或Lex可诱导性报告基因。
对于这些实施方案，优选使用酵母细胞株MaV203(LifeTechnologies，Rockville，MD，U.S.A.)或EGY48(OrigeneTechnologies，Inc.Rockyille，MD，U.S.A.)。
本发明方法的的一个具体实施方案涉及使用被额外的重组载体转染了的细胞。优选，这些实施方案中所用细胞正常情况下没有或几乎没有内源性γ-分泌酶或用上述提到的测定方法不能检测到内源性γ-分泌酶的活性。这类细胞可被额外的表达载体转化，这个表达载体含有编码γ-分泌酶的核苷酸序列-优选cDNA。例如，可以使用cDNA文库。此外，本发明方法的该实施方案可特别用于鉴定γ-分泌酶或编码γ-分泌酶的cDNA。用于搜索γ-分泌酶的cDNA文库可从细胞或组织制备，如，B淋巴细胞、神经元、神经胶质细胞、脑海马细胞、全脑、胎盘、肾脏。优选，由人类细胞或人类组织制备cDNA，但也可由其动物生物体(如，豚鼠、大鼠、小鼠、狗、猴)制备。
如果在细胞未被转染的情况下不表现γ-分泌酶的活性，而转染cDNA文库后可表现γ-分泌酶活性，则存在于细胞内的cDNA可编码γ-分泌酶。通过已知的方法可从表现上述行为的细胞内分离和鉴别cDNA。
本发明还涉及一种编码一个融合蛋白并包含如下组成成分的转基因：
a)第一编码包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQID NO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，
b)在第一核苷酸序列的5’末端的编码信号肽的第二核苷酸序列，
c)启动子，和
d)在第一核苷酸序列的3’-末端、编码一个DNA-结合域和一个转录激活域的至少一个额外的核苷酸序列。
优选第一核苷酸序列编码APP或部分APP。举例说明，这个转基因拥有的核苷酸序列SEQ ID NO.8。这个转基可构建到一个表达载体上。例如，这个表达载体的核苷酸序列为：SEQ ID NO.9。
本发明方法涉及转基因和/或表达载体用于生产转基因细胞的应用。这类细胞可以是非人生物体的组成部分。例如，该转基因和/或表达载体可用于产生转基因秀丽新小杆线虫。在另一个具体实施方案中，该转基因和/或表达载体可用于产生转基因酵母细胞，如酿酒酵母细胞。
本发明还涉及一种产生非人类生物如转基因秀丽新小杆线虫的方法，其中转基因和/或包含一个转基因的表达载体被微注射到生物体的性细胞内，例如秀丽新小杆线虫的性细胞。本发明还涉及含有本发明的转基因的细胞和含有本发明转基因的转基因秀丽新小杆线虫。本发明还涉及含有本发明转基因(优选存在于适当的载体中)的细胞，尤其是酵母细胞。本发明尤其涉及含有本发明转基因还有cDNA文库的细胞，优选酵母细胞。
本发明涉及转基因或重组细胞、优选酵母细胞或转基因秀丽新小杆线虫在测定γ-分泌酶或γ-分泌酶活性方法中的应用；这些细胞或转基因秀丽新小杆线虫在鉴定γ-分泌酶活性抑制剂中的应用和该测定方法本身。
尤其是，本发明涉及鉴定γ-分泌酶活性抑制剂的方法，该方法包含如下步骤：
1.产生非人类转基因生物如转基因秀丽新小杆线虫或酿酒酵母或产生转基因细胞，该非人类转基因生物或转基因细胞包含一个具有如下组成成分的转基因：
a)第一编码包含氨基酸序列
GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，
b)在第一核苷酸序列5’-末端的第二编码信号肽的第二核苷酸序列，和
c)启动子，及
非人类转基因生物体或转基因细胞还含有一个报告质粒，该报告质粒载有一个蛋白结合位点、一个最小启动子和一个报告基因，及，
如果适宜，一个编码γ-分泌酶的cDNA，其中该非人类转基因生物体或转基因细胞表达该转基因及适当时所述cDNA编码的γ-分泌酶；
2.将该非人类转基因生物体或转基因细胞与被研究的物质一起保温，及
3.检测第二片段蛋白的含量。本发明还涉及一种鉴别γ-分泌酶活性抑制物的方法，其中
1.制备包含如下成分的转基因：
a)第一编码包含氨基酸序列
GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)之蛋白的第一核苷酸序列，
b)在第一核苷酸序列的5’-末端的编码信号肽的第二核苷酸序列，和
c)启动子，及，
d)适当时额外的编码和/或非编码性核苷酸序列；
2.将该转基因和一个报告质粒及适当时一个编码γ-分泌酶的cDNA引入到细胞内，且在被研究物质存在的情况下表达由转基因编码的融合蛋白和适当时cDNA编码的γ-分泌酶，
3.该融合蛋白被，
A)裂解或
B)不被细胞内的γ-分泌酶在氨基酸序列SEQ ID NO.1内裂解，这是由于下列原因之一，
a)形成了含有氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白，或
b)没有形成可检测的第一和/或第二片段蛋白。
4.确定第二片段蛋白是否形成。
本发明还涉及可抑制γ-分泌酶活性的物质的鉴别方法，其中编码含有一个信号肽和氨基酸序列SEQ ID NO.1的蛋白质的转基因在被研究物质和报告质粒存在下表达，确定研究物质对第二片段蛋白形成量的影响，第二片段蛋白包含氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)。
本发明还涉及由本发明方法鉴别的γ-分泌酶抑制剂。
本发明还涉及一种药物生产方法，将利用上述方法鉴定出的药物活性化合物通过配制和/或与药学上可接受的载体混合进一步加工。
本发明还涉及一个用于实施上述方法的检验试剂盒。
本发明方法尤其可与例如C100-Gal4-VP16系统(即一个由C100，Gal4和VP16组成的融合蛋白或用编码此融合蛋白的核苷酸序列)联合使用，用于：
1.γ-分泌酶活性的鉴定和测定(定性和/或定量)。
2.在不同组织、细胞和生物体或物种中对γ-分泌酶的鉴定。编码γ-分泌酶的有关cDNA的鉴定和分离，及这一cDNA的进一步应用。
3.对例如酵母细胞(酿酒酵母)或秀丽新小杆线虫的在体筛选，且可能在不用免疫生物学方法的情况下测定γ-分泌酶活性。
4.本发明方法可用于鉴定和分离一些物质，如药理活性化合物，这类化合物可调节γ-分泌酶的活性，如γ-分泌酶的抑制剂。尤其是，本发明方法可用于高通量筛选(HTS，High ThroughputScreening)。比如，可鉴定一些物质，这类物质可用于阿尔茨海默病的治疗和/或预防性治疗。
5.对于阿尔茨海默病发病机理的探讨，如，利用APP的突变体或C100。
6.所描述的融合蛋白/转基因如SP-C100-Gal4-VP16内的C100可被完整的APP和γ-分泌酶所替代，可利用本方法类似地研究其活性和调节。
图1：图1所示为淀粉样前体蛋白(同形体APP695和同形体APP770或APP751)和分泌酶的裂解产物。
图2：图解显示本发明方法所基于的原理：β-分泌酶的裂解位点在N-末端；γ-分泌酶的裂解位点在跨膜区域内；C100＝APP的C100片段；Gal4-V16＝DNA-结合域、转录激活域(由DNA-结合域和转录激活子组成)，其可与报告质粒DNA上的蛋白-结合域结合。
图3：表达质粒SP-C100-Gal4-VP16的构建：aa＝氨基酸；SacI，HindIII和KpnI限制性内切酶位点所示为质粒上断裂位点的位置。
图4：表达质粒pDBTRP-MET25-SP-C100-Gal4-VP16：在酵母细胞内进行转基因表达的表达质粒的构建。
实施例：
实施例1：表达质粒SP-C100-Gal4-VP16的构建：
这个质粒编码APP的信号肽，即融入了APP C-末端的100个氨基酸残基(C100)。C100开始于Aβ-肽的N-末端，结束于APP的C-末端。它必须被γ-分泌酶进一步裂解才可释放出Aβ-肽。将Gal4-VP16融入了SP-C100的C-末端。Gal4-VP16是由酵母细胞转录激活因子Gal4的头147个氨基酸残基和单纯疱疹病毒的转录激活因子VP16的C-末端78个氨基酸残基组成。作为一个融合蛋白，Gal4蛋白片段接管与DNA结合的功能，而VP16蛋白片段激活转录(Sadowski等，(1988)Sciences 335，563)。pcDNA3.1+购自荷兰Invitrogen，作为一个载体质粒。
实施例2：报告质粒pGL2 MRG5 EGFP的构建：
报告质粒pGL2 MRG5在HIV-TATA盒前有5个Gal4结合位点。为了便于在细胞培养物内检测，pGL2 MRG5上的荧光素酶基因与购自Clontech，Heidelberg的pEGFP N1载体上的EGFP(增强型绿色荧光蛋白)基因进行了互换。
实施例3：
人成神经细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)用上述两种质粒共转染，然后，在波长480nm的光照射下，通过其所激发的EGFP在显微镜下进行了分析。在某些情况下，可以检测到细胞所发射出的强绿色光。
因为在没有特异激活的情况下，这种效应也可能基于报告质粒对EGFP的表达，所以还只用该报告质粒转染了SH-SY5Y细胞。在这些细胞内，检测不到绿色荧光。因此，EGFP的表达必须被Gal4-VP16激活，它预示APP C-末端被蛋白水解后释放。到目前为止，除了γ-分泌酶，未提到其它的蛋白水解活性能在跨膜区域或在胞质内部分进行蛋白水解加工APP。因此，我们认为与Gal4-VP16融合的APP C-末端的释放系基于γ-分泌酶的活性。
实施例4：
应用C100-Gal4-VP16系统在cDNA文库中检测编码γ-分泌酶的cDNA：
将SPC100-Gal4-VP16克隆到由MET25启动子控制的酵母表达载体pDBTRP(Life Technologies，Rockyille，MD，U.S.A.)中，并用这一表达载体转化了酵母细胞株MaY203(Life Technologies)。酵母细胞株MaY203已在基因水平上被修饰，且包含三个稳定地整合到基因组内的GAL4-诱导性报告基因(URA3，HIS3，LacZ)。在MaY203内，SPC100-Gal4-VP16 cDNA的表达只提供低水平的报告蛋白的活性，因此本系统适合于在cDNA文库内搜寻γ-分泌酶。
实施例5：
由实施例4构建的重组MaY203细胞可应用于例如鉴定γ-分泌酶或筛选人类B淋巴细胞cDNA文库(American Type Culture Collection，Manassas，VA，U.S.A.)。类似地，整合到酵母表达载体p415-MET25(ATCC，Nucleic Acid Research，1994，Vol.22，No.25，5767)或p415-ADH1(ATCC，GENE，1995，158：119-122)中的人类海马细胞cDNA文库也可用于筛选编码γ-分泌酶的cDNA或具有γ-分泌酶活性的蛋白。
(SEQ ID NO.：1)
GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML
第一片段蛋白(SEQ ID NO.：2)
GAIIGLMVGGVV
第二片段蛋白(SEQ ID NO.：3)
VIVITLVML
C100片段的氨基酸序列(SEQ ID NO.：4)
LDAEFRHDSG YEVHHQKLVF FAEDVGSNKG AIIGLMVGGV VIATVIVITL
VMLKKKQYTS IHHGVVEVDA AVTPEERHLS KMQQNGYENP TYKFFEQMQN
APP信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO.：5)
MLPGLALFLL AAWTARA
SP-C100片段的氨基酸序列(SEQ ID NO.：6)
MLPGLALFLL AAWTARALDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAII
GLMVGGVVIA TVIVITLVML KKKQYTSIHH GVVEVDAAVT PEERHLSKMQ
QNGYENPTYK FFEQMQN
转录-激活域VP16和Gal4结合域(Gal4-VP16)(SEQ ID NO.：7)
MKLLSSIEQA CDICRLKKLK CSKEKPKCAK CLKNNWECRY SPKTKRSPLT
RAHLTEVESR LERLEQLFLL IFPREDLDMI LKMDSLQDIK ALLTGLFVQD
NVNKDAVTDR LASVETDMPL TLRQHRISAT SSSEESSNKG QRQLTVSPEF
PGIWAPPTDV SLGDELHLDG EDVAMAHADA LDDFDLDMLG DGDSPGPGFT
PHDSAPYGAL DMADFEFEQM FTDALGIDEY GG
编码SP-C100-Gal4-VP16的转基因核苷酸序列
(SEQ ID NO.：8)
GGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTAC
GGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTC
ATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACC
CCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAAT
GGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTA
TTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTT
GGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTG
GATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACC
GCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGA
AATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCACAGCTAGCGCA
CTCGGTGCCCCGCGCAGGGTCGCGATGCTGCCCGGTTTGGCACTGTTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCG
CTGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTG
GGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTG
GTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTTGACGCCGCTGTCACCCCAGAG
GAGCGCCACCTGTCCAAGATGCAGCAGAACGGCTACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAAC
GCGCGGGGTACCCCGGCG ATGAAGC TACTGTCTTC TATCGAACAA GCATGCGATA TTTGCCGACT
TAAAAAGCTC AAGTGCTCCA AAGAAAAACC GAAGTGCGCC AAGTGTCTGA AGAACAACTG
GGAGTGTCGC TACTCTCCCA AAACCAAAAG GTCTCCGCTG ACTAGGGCAC ATCTGACAGA
AGTGGAATCA AGGCTAGAAA GACTGGAACA GCTATTTCTA CTGATTTTTC CTCGAGAAGA
CCTTGACATG ATTTTGAAAA TGGATTCTTT ACAGGATATA AAAGCATTGT TAACAGGATT
ATTTGTACAA GATAATGTGA ATAAAGATGC CGTCACAGAT AGATTGGCTT CAGTGGAGAC
TGATATGCCT CTAACATTGA GACAGCATAG AATAAGTGCG ACATCATCAT CGGAAGAGAG
TAGTAACAAA GGTCAAAGAC AGTTGACTGT ATCG CCGGAATTCCCGGGGATCTGGGC CCCCCCGAC
CGATGTCAGC CTGGGGGACG AGCTCCACTT AGACGGCGAG GACGTGGCGA TGGCGCATGC
CGACGCGCTA GACGATTTCG ATCTGGACAT GTTGGGGGAC GGGGATTCCC CGGGGCCGGG
ATTTACCCCC CACGACTCCG CCCCCTACGG CGCTCTGGAT ATGGCCGACT TCGAGTTTGA
GCAGATGTTT ACCGATGCCC TTGGAATTGA CGAGTACGGT GGGTAG
哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1+(荷兰Invitrogen公司)的核苷酸序列(SEQ ID NO.：9)
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAA
GCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAA
GGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTAC
GGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTC
ATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACC
CCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAAT
GGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTA
TTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTT
GGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTG
GATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACC
AAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTAC
GGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTA
ATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCAC
TAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAA
ACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCC
TTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGT
AGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGG
CATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCC
CACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCC
AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAA
GCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGAT
TAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACG
TTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTA
TAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAA
TTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGC
ATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGC
ATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGT
TCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCT
GAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGT
ATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCAC
GCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCT
GATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCC
CTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTG
CTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCA
TCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCG
GCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTT
GTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCG
CGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAAT
GGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCT
ACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCT
CCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAA
TGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGG
GCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCG
CCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATA
AAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATAC
CGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCA
CAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCA
CATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCG
GCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCT
CGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGG
ATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGG
CGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACC
CGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGC
CGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGT
ATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCT
GCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCA
CTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACG
GCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTA
GCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCA
GAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCAC
GTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTT
TTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTA
TCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGG
AGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAG
CAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTA
TTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTA
CAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAG
TTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGT
TGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGAT
GCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTT
GCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTT
CTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCA
ACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAA
AAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTT
ATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGC
GCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
APP的核苷酸序列(SEQ ID NO.：10)
AGTTTCCTCG GCAGCGGTAG GCGAGAGCAC GCGGAGGAGC GTGCGCGGGG GCCCCGGGAG
ACGGCGGCGG TGGCGGCGCG GGCAGAGCAA GGACGCGGCG GATCCCACTC GCACAGCAGC
GCACTCGGTG CCCCGCGCAG GGTCGCGATG CTGCCCGGTT TGGCACTGCT CCTGCTGGCC
GCCTGGACGG CTCGGGCGCT GGAGGTACCC ACTGATGGTA ATGCTGGCCT GCTGGCTGAA
CCCCAGATTG CCATGTTCTG TGGCAGACTG AACATGCACA TGAATGTCCA GAATGGGAAG
TGGGATTCAG ATCCATCAGG GACCAAAACC TGCATTGATA CCAAGGAAGG CATCCTGCAG
TATTGCCAAG AAGTCTACCC TGAACTGCAG ATCACCAATG TGGTAGAAGC CAACCAACCA
GTGACCATCC AGAACTGGTG CAAGCGGGGC CGCAAGCAGT GCAAGACCCA TCCCCACTTT
GTGATTCCCT ACCGCTGCTT AGTTGGTGAG TTTGTAAGTG ATGCCCTTCT CGTTCCTGAC
AAGTGCAAAT TCTTACACCA GGAGAGGATG GATGTTTGCG AAACTCATCT TCACTGGCAC
ACCGTCGCCA AAGAGACATG CAGTGAGAAG AGTACCAACT TGCATGACTA CGGCATGTTG
CTGCCCTGCG GAATTGACAA GTTCCGAGGG GTAGAGTTTG TGTGTTGCCC ACTGGCTGAA
GAAAGTGACA ATGTGGATTC TGCTGATGCG GAGGAGGATG ACTCGGATGT CTGGTGGGGC
GGAGCAGACA CAGACTATGC AGATGGGAGT GAAGACAAAG TAGTAGAAGT AGCAGAGGAG
GAAGAAGTGG CTGAGGTGGA AGAAGAAGAA GCCGATGATG ACGAGGACGA TGAGGATGGT
GATGAGGTAG AGGAAGAGGC TGAGGAACCC TACGAAGAAG CCACAGAGAG AACCACCAGC
ATTGCCACCA CCACCACCAC CACCACAGAG TCTGTGGAAG AGGTGGTTCG AGTTCCTACA
ACAGCAGCCA GTACCCCTGA TGCCGTTGAC AAGTATCTCG AGACACCTGG GGATGAGAAT
GAACATGCCC ATTTCCAGAA AGCCAAAGAG AGGCTTGAGG CCAAGCACCG AGAGAGAATG
TCCCAGGTCA TGAGAGAATG GGAAGAGGCA GAACGTCAAG CAAAGAACTT GCCTAAAGCT
GATAAGAAGG CAGTTATCCA GCATTTCCAG GAGAAAGTGG AATCTTTGGA ACAGGAAGCA
GCCAACGAGA GACAGCAGCT GGTGGAGACA CACATGGCCA GAGTGGAAGC CATGCTCAAT
GACCGCCGCC GCCTGGCCCT GGAGAACTAC ATCACCGCTC TGCAGGCTGT TCCTCCTCGG
CCTCGTCACG TGTTCAATAT GCTAAAGAAG TATGTCCGCG CAGAACAGAA GGACAGACAG
CACACCCTAA AGCATTTCGA GCATGTGCGC ATGGTGGATC CCAAGAAAGC CGCTCAGATC
CGGTCCCAGG TTATGACACA CCTCCGTGTG ATTTATGAGC GCATGAATCA GTCTCTCTCC
CTGCTCTACA ACGTGCCTGC AGTGGCCGAG GAGATTCAGG ATGAAGTTGA TGAGCTGCTT
CAGAAAGAGC AAAACTATTC AGATGACGTC TTGGCCAACA TGATTAGTGA ACCAAGGATC
AGTTACGGAA ACGATGCTCT CATGCCATCT TTGACCGAAA CGAAAACCAC CGTGGAGCTC
CTTCCCGTGA ATGGAGAGTT CAGCCTGGAC GATCTCCAGC CGTGGCATTC TTTTGGGGCT
GACTCTGTGC CAGCCAACAC AGAAAACGAA GTTGAGCCTG TTGATGCCCG CCCTGCTGCC
GACCGAGGAC TGACCACTCG ACCAGGTTCT GGGTTGACAA ATATCAAGAC GGAGGAGATC
TCTGAAGTGA AGATGGATGC AGAATTCCGA CATGACTCAG GATATGAAGT TCATCATCAA
AAATTGGTGT TCTTTGCAGA AGATGTGGGT TCAAACAAAG GTGCAATCAT TGGACTCATG
GTGGGCGGTG TTGTCATAGC GACAGTGATC GTCATCACCT TGGTGATGCT GAAGAAGAAA
CAGTACACAT CCATTCATCA TGGTGTGGTG GAGGTTGACG CCGCTGTCAC CCCAGAGGAG
CGCCACCTGT CCAAGATGCA GCAGAACGGC TACGAAAATC CAACCTACAA GTTCTTTGAG
CAGATGCAGA ACTAGACCCC CGCCACAGCA GCCTCTGAAG TTGGACAGCA AAACCATTGC
TTCACTACCC ATCGGTGTCC ATTTATAGAA TAATGTGGGA AGAAACAAAC CCGTTTTATG
ATTTACTCAT TATCGCCTTT TGACAGCTGT GCTGTAACAC AAGTAGATGC CTGAACTTGA
ATTAATCCAC ACATCAGTAA TGTATTCTAT CTCTCTTTAC ATTTTGGTCT CTATACTACA
TTATTAATGG GTTTTGTGTA CTGTAAAGAA TTTAGCTGTA TCAAACTAGT GCATGAATAG
ATTCTCTCCT GATTATTTAT CACATAGCCC CTTAGCCAGT TGTATATTAT TCTTGTGGTT
TGTGACCCAA TTAAGTCCTA CTTTACATAT GCTTTAAGAA TCGATGGGGG ATGCTTCATG
TGAACGTGGG AGTTCAGCTG CTTCTCTTGC CTAAGTATTC CTTTCCTGAT CACTATGCAT
TTTAAAGTTA AACATTTTTA AGTATTTCAG ATGCTTTAGA GAGATTTTTT TTCCATGACT
GCATTTTACT GTACAGATTG CTGCTTCTGC TATATTTGTG ATATAGGAAT TAAGAGGATA
CACACGTTTG TTTCTTCGTG CCTGTTTTAT GTGCACACAT TAGGCATTGA GACTTCAAGC
TTTTCTTTTT TTGTCCACGT ATCTTTGGGT CTTTGATAAA GAAAAGAATC CCTGTTCATT
GTAAGCACTT TTACGGGGCG GGTGGGGAGG GGTGCTCTGC TGGTCTTCAA TTACCAAGAA
TTCTCCAAAA CAATTTTCTG CAGGATGATT GTACAGAATC ATTGCTTATG ACATGATCGC
TTTCTACACT GTATTACATA AATAAATTAA ATAAAATAAC CCCGGGCAAG ACTTTTCTTT
GAAGGATGAC TACAGACATT AAATAATCGA AGTAATTTTG GGTGGGGAGA AGAGGCAGAT
TCAATTTTCT TTAACCAGTC TGAAGTTTCA TTTATGATAC AAAAGAAGAT GAAAATGGAA
GTGGCAATAT AAGGGGATGA GGAAGGCATG CCTGGACAAA CCCTTCTTTT AAGATGTGTC
TTCAATTTGT ATAAAATGGT GTTTTCATGT AAATAAATAC ATTCTTGGAG GAGC
质粒pDBTRP的核苷酸序列(SEQ ID NO.11)：
GACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGGACGGATCGC
TTGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACTCTGTGTTTATTTATT
TTTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGTAGAAGAGTTACGGAATGAAGAAAAAAAAATAA
ACAAAGGTTTAAAAAATTTCAACAAAAAGCGTACTTTACATATATATTTATTAGACAAGAAAAGCAGATTAAATA
GATATACATTCGATTAACGATAAGTAAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGACAAGA
TGAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTAG
AGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATA
TATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGG
GGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAA
CCCTGATAAATGCTTCAATAATCTGCAGCTCTGGCCCGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAA
AAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCA
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ACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCC
TCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCGCGGGAAAAC
AGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCG
GTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACG
AATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAA
AGAAATGCATACGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTAT
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TCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTA
ACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCAC
TGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTG
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ACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAAC
TCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGT
CTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACA
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CCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCA
GGGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGC
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TTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGAT
ACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAA
CCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGT
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ATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGGA
ATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGTACCGATCCCGAGCTTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAA
AACCTTCTCAAGCAAGGTTTTCAGTATAATGTTACATGCGTACACGCGTCTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTTG
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CCTTAGAAGCAGATTTCAAGTATTGGTCTCTCTTGTCTTCTGGGATCAATGTCCACAATTTGTCCAAGTTCAAGA
CTGGCTTCCAGAAATGAGCTTGTTGCTTGTGGAAGTATCTCATACCAACCTTACCGAAATAACCTGGATGGTATT
TATCCATGTTAATTCTGTGGTGATGTTGACCACCGGCCATACCTCTACCACCGGGGTGCTTTCTGTGCTTACCGA
TACGACCTTTACCGGCTGAGACGTGACCTCTGTGCTTTCTAGTCTTAGTGAATCTGGAAGGCATTCTTGATTAGT
TGGATGATTGTTCTGGGATTTAATGCAAAAATCACTTAAGAAGGAAAATCAACGGAGAAAGCAAACGCCATCTTA
AATATACGGGATACAGATGAAAGGGTTTGAACCTATCTGGAAAATAGCATTAAACAAGCGAAAAACTGCGAGGAA
AATTGTTTGCGTCTCTGCGGGCTATTCACGCGCCAGAGGAAAATAGGAAAAATAACAGGGCATTAGAAAAATAAT
TTTGATTTTGGTAATGTGTGGGTCCTGGTGTACAGATGTTACATTGGTTACAGTACTCTTGTTTTTGCTGTGTTT
TTCGATGAATCTCCAAAATGGTTGTTAGCACATGGAAGAGTCACCGATGCTAAGTTATCTCTATGTAAGCTACGT
GGCGTGACTTTTGATGAAGCCGCACAAGAGATACAGGATTGGCAACTGCAAATAGAATCTGGGGATCCCCCCTCG
AGATCCGGGATCGAAGAAATGATGGTAAATGAAATAGGAAATCAAGGAGCATGAAGGCAAAAGACAAATATAAGG
GTCGAACGAAAAATAAAGTGAAAAGTGTTGATATGATGTATTTGGCTTTGCGGCGCCGAAAAAACGAGTTTACGC
AATTGCACAATCATGCTGACTCTGTGGCGGACCCGCGCTCTTGCCGGCCCGGCGATAACGCTGGGCGTGAGGCTG
TGCCCGGCGGAGTTTTTTGCGCCTGCATTTTCCAAGGTTTACCCTGCGCTAAGGGGCGAGATTGGAGAAGCAATA
AGAATGCCGGTTGGGGTTGCGATGATGACGACCACGACAACTGGTGTCATTATTTAAGTTGCCGAAAGAACCTGA
GTGCATTTGCAACATGAGTATACTAGAAGAATGAGCCAAGACTTGCGAGACGCGAGTTTGCCGGTGGTGCGAACA
ATAGAGCGACCATGACCTTGAAGGTGAGACGCGCATAACCGCTAGAGTACTTTGAAGAGGAAACAGCAATAGGGT
TGCTACCAGTATAAATAGACAGGTACATACAACACTGGAAATGGTTGTCTGTTTGAGTACGCTTTCAATTCATTT
GGGTGTGCACTTTATTATGTTACAATATGGAAGGGAACTTTACACTTCTCCTATGCACATATATTAATTAAAGTC
CAATGCTAGTAGAGAAGGGGGGTAACACCCCTCCGCGCTCTTTTCCGATTTTTTTCTAAACCGTGGAATATTTCG
GATATCCTTTTGTTGTTTCCGGGTGTACAATATGGACTTCCTCTTTTCTGGCAACCAAACCCATACATCGGGATT
CCTATAATACCTTCGTTGGTCTCCCTAACATGTAGGTGGCGGAGGGGAGATATACAATAGAACAGATACCAGACA
AGACATAATGGGCTAAACAAGACTACACCAATTACACTGCCTCATTGATGGTGGTACATAACGAACTAATACTGT
AGCCCTAGACTTGATAGCCATCATCATATCGAAGTTTCACTACCCTTTTTCCATTTGCCATCTATTGAAGTAATA
ATAGGCGCATGCAACTTCTTTTCTTTTTTTTTCTTTTCTCTCTCCCCCGTTGTTGTCTCACCATATCCGCAATGA
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GCTGATGAGGGGTATCTTCGAACACACGAAACTTTTTCCTTCCTTCATTCACGCACACTACTCTCTAATGAGCAA
CGGTATACGGCCTTCCTTCCAGTTACTTGAATTTGAAATAAAAAAAGTTTGCCGCTTTGCTATCAAGTATAAATA
GACCTGCAATTATTAATCTTTTGTTTCCTCGTCATTGTTCTCGTTCCCTTTCTTCCTTGTTTCTTTTTCTGCACA
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CCGCCACCGCGGTGGAGCTTTGGACTTCTTCGCCAGAGGTTTGGTCAAGTCTCCAATCAAGGTTGTCGGCTTGTC
TACCTTGCCAGAAATTTACGAAAAGATGGAAAAGGGTCAAATCGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATA
AGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTAAATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAG
TGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTGTTCTTGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGT
ATAGCATGAGGTCGCTCTTATTGACCACACCTCTACCGGCATGCCGAGCAAATGCCTGCAAATCGCTCCCCATTT
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ATACCTGTTGTAATCGTTCTTCCACACGGATCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGT
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CAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAC
GCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCC
CTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAAT
CGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGT
TCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGA
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TCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACA
ATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCAGGCAAGTGCACAAACAATACT
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CTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAGCTTTCGGGGCTCTCTTGCCTTCCAACCCAGTCAGAAATCG
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AAGCTGCACTGAGTAGTATGTTGCAGTCTTTTGGAAATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTT
GGTATTCTTGCCACGACTCATCTCCATGCAGTTGGACGATATCAATGCCGTAATCATTGACCAGAGCCAAAACAT
CCTCCTTAGGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAGTATTTCGGAGTGCCTGAACTATTTTTATATGCTTTTACAA
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CAGCATCGGAATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCTGTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGGACCAGAAC
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GTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTTTTCTTTTTTCGACCGAATTAATTCTTAATCGGCAAAAAAAGA
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GGCGTCATAACTGCAAAGTACACATATATTACGATGCTGTCTATTAAATGCTTCCTATATTATATATATAGTAAT
GTCGTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACAC
CCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCT
GCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGA
重组质粒pDBTRP-MET25-SPC100-Gal4-VP16的核苷酸序列
(SEQ ID NO.12)：
ACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGGACGGATCGCT
TGCCTGTAACTTACACGCGCCTCGTATCTTTTAATGATGGAATAATTTGGGAATTTACTCTGTGTTTATTTATTT
TTATGTTTTGTATTTGGATTTTAGAAAGTAAATAAAGAAGGTAGAAGAGTTACGGAATGAAGAAAAAAAAATAAA
CAAAGGTTTAAAAAATTTCAACAAAAAGCGTACTTTACATATATATTTATTAGACAAGAAAAGCAGATTAAATAG
ATATACATTCGATTAACGATAAGTAAAATGTAAAATCACAGGATTTTCGTGTGTGGTCTTCTACACAGACAAGAT
GAAACAATTCGGCATTAATACCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTAGA
GTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATAT
ATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAAAGGACCCAGGTGGCACTTTTCGGG
GAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAAC
CCTGATAAATGCTTCAATAATCTGCAGCTCTGGCCCGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAA
AATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAA
CGGGAAACGTCTTGCTGGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGC
GATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTTTCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAA
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CTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCGCGGGAAAACA
GCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGG
TTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGA
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GAAATGCATACGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATT
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CTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACT
CTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTC
TTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACAC
AGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTC
CCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAG
GGGGGAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCT
CGTCAGGGGGGCCGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTT
TTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATA
CCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAAC
CGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTG
AGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCCTA
TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGGAA
TTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGTACCGATCCCGAGCTTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAAA
ACCTTCTCAAGCAAGGTTTTCAGTATAATGTTACATGCGTACACGCGTCTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTTGA
AATATAAATAACGTTCTTAATACTAACATAACTATAAAAAAATAAATAGGGACCTAGACTTCAGGTTGTCTAACT
CCTTCCTTTTCGGTTAGAGCGGATGTGGGGGGAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATATCG
ACAAAGGAAAAGGGGCCTGTTTACTCACAGGCTTTTTTCAAGTAGGTAATTAAGTCGTTTCTGTCTTTTTCCTTC
TTCAACCCACCAAAGGCCATCTTGGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATAGAAATAATACAGAAGTAGATGTTG
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CTTAGAAGCAGATTTCAAGTATTGGTCTCTCTTGTCTTCTGGGATCAATGTCCACAATTTGTCCAAGTTCAAGAC
TGGCTTCCAGAAATGAGCTTGTTGCTTGTGGAAGTATCTCATACCAACCTTACCGAAATAACCTGGATGGTATTT
ATCCATGTTAATTCTGTGGTGATGTTGACCACCGGCCATACCTCTACCACCGGGGTGCTTTCTGTGCTTACCGAT
ACGACCTTTACCGGCTGAGACGTGACCTCTGTGCTTTCTAGTCTTAGTGAATCTGGAAGGCATTCTTGATTAGTT
GGATGATTGTTCTGGGATTTAATGCAAAAATCACTTAAGAAGGAAAATCAACGGAGAAAGCAAACGCCATCTTAA
ATATACGGGATACAGATGAAAGGGTTTGAACCTATCTGGAAAATAGCATTAAACAAGCGAAAAACTGCGAGGAAA
ATTGTTTGCGTCTCTGCGGGCTATTCACGCGCCAGAGGAAAATAGGAAAAATAACAGGGCATTAGAAAAATAATT
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TCGATGAATCTCCAAAATGGTTGTTAGCACATGGAAGAGTCACCGATGCTAAGTTATCTCTATGTAAGCTACGTG
GCGTGACTTTTGATGAAGCCGCACAAGAGATACAGGATTGGCAACTGCAAATAGAATCTGGGGATCCCCCCTCGA
CGGATGCAAGGGTTCGAATCCCTTAGCTCTCATTATTTTTTGCTTTTTCTCTTGAG.GTSGTCACATGATCGCAA
AATGGCAAATGGCACGTGAAGCTGTCGATATTGGGGAACTGTGGTGGTTGGCAAATGACTAATTAAGTTAGTCAA
GGCGCCATCCTCATGAAAACTGTGTAACATAATAACCGAAGTGTCGAAAAGGTGGCACCTTGTCCAATTGAACAC
GCTCGATGAAAAAAATAAGATATATATAAGGTTAAGTAAAGCGTCTGTTAGAAAGGAAGTTTTTCCTTTTTCTTG
CTCTCTTGTCTTTTCATCTACTATTTCCTTCGTGTAATACAGGGTCGTCAGATACATAGATACAATTCTATTACC
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CGGTGCCCCGCGCAGGGTCGCGATGCTGCCCGGTTTGGCACTGTTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCT
GGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGG
TTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGT
GATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTTGACGCCGCTGTCACCCCAGAGGA
GCGCCACCTGTCCAAGATGCAGCAGAACGGCTACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAACGC
GCGGGGTACCCCGGCGATGAAGCTACTGTCTTCTATCGAACAAGCATGCGATATTTGCCGACTTAAAAAGCTCAA
GTGCTCCAAAGAAAAACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTGAAGAACAACTGGGAGTGTCGCTACTCTCCCAAAACCAA
AAGGTCTCCGCTGACTAGGGCACATCTGACAGAAGTGGAATCAAGGCTAGAAAGACTGGAACAGCTATTTCTACT
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AACATTGAGACAGCATAGAATAAGTGCGACATCATCATCGGAAGAGAGTAGTAACAAAGGTCAAAGACAGTTGAC
TGTATCGCCGGAATTCCCGGGGATCTGGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGG
CGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCC
GGGGCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGAT
GTTTACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACGGTGGGTAGGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGA
TATCCAGCACAGTGGCGGCCGctcgaCCCCGGGTGCTAGCAAGGCCTTGTGGCCAGCCATGGCAACTAGTGCGGC
CGCTAAGTAAGTAAGACGTCGAGCTCTAAGTAAGTAACGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTTTGGACTTCTTCGCCA
GAGGTTTGGTCAAGTCTCCAATCAAGGTTGTCGGCTTGTCTACCTTGCCAGAAATTTACGAAAAGATGGAAAAGG
GTCAAATCGTTGGTAGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAAGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATTATTA
AATAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATTTTAAAGTGACTCTTAGGTTTTAAAACGAAAATTCTTGTTCT
TGAGTAACTCTTTCCTGTAGGTCAGGTTGCTTTCTCAGGTATAGCATGAGGTCGCTCTTATTGACCACACCTCTA
CCGGCATGCCGAGCAAATGCCTGCAAATCGCTCCCCATTTCACCCAATTGTAGATATGCTAACTCCAGCAATGAG
TTGATGAATCTCGGTGTGTATTTTATGTCCTCAGAGGACAATACCTGTTGTAATCGTTCTTCCACACGGATCCCA
ATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCG
TTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATC
GCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGT
GGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTT
TCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTT
ACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTT
TCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTAT
CTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACA
AAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTG
TGCGGTATTTCACACCGCAGGCAAGTGCACAAACAATACTTAAATAAATACTACTCAGTAATAACCTATTTCTTA
GCATTTTTGACGAAATTTGCTATTTTGTTAGAGTCTTTTACACCATTTGTCTCCACACCTCCGCTTACATCAACA
CCAATAACGCCATTTAATCTAAGCGCATCACCAACATTTTCTGGCGTCAGTCCACCAGCTAACATAAAATGTAAG
CTTTCGGGGCTCTCTTGCCTTCCAACCCAGTCAGAAATCGAGTTCCAATCCAAAAGTTCACCTGTCCCACCTGCT
TCTGAATCAAACAAGGGAATAAACGAATGAGGTTTCTGTGAAGCTGCACTGAGTAGTATGTTGCAGTCTTTTGGA
AATACGAGTCTTTTAATAACTGGCAAACCGAGGAACTCTTGGTATTCTTGCCACGACTCATCTCCATGCAGTTGG
ACGATATCAATGCCGTAATCATTGACCAGAGCCAAAACATCCTCCTTAGGTTGATTACGAAACACGCCAACCAAG
TATTTCGGAGTGCCTGAACTATTTTTATATGCTTTTACAAGACTTGAAATTTTCCTTGCAATAACCGGGTCAATT
GTTCTCTTTCTATTGGGCACACATATAATACCCAGCAAGTCAGCATCGGAATCTAGAGCACATTCTGCGGCCTCT
GTGCTCTGCAAGCCGCAAACTTTCACCAATGGACCAGAACTACCTGTGAAATTAATAACAGACATACTCCAAGCT
GCCTTTGTGTGCTTAATCACGTATACTCACGTGCTCAATAGTCACCAATGCCCTCCCTCTTGGCCCTCTCCTTTT
CTTTTTTCGACCGAATTAATTCTTAATCGGCAAAAAAAGAAAAGCTCCGGATCAAGATTGTACGTAAGGTGACAA
GCTATTTTTCAATAAAGAATATCTTCCACTACTGCCATCTGGCGTCATAACTGCAAAGTACACATATATTACGAT
GCTGTCTATTAAATGCTTCCTATATTATATATATAGTAATGTCGTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCT
GATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCG
GCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAA
CGCGCGA
SP-C100-Gal4-VP16融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.13)：
MLPGLALFLL AAWTARALDA EFRHDSGYEV HHQKLVFFAE DVGSNKGAII
GLMVGGVVIA TVIVITLVML KKKQYTSIHH GVVEVDAAVT PEERHLSKMQ
QNGYENPTYK FFEQMQNARG TPAMKLLSSI EQACDICRLK KLKCSKEKPK
CAKCLKNNWE CRYSPKTKRS PLTRAHLTEV ESRLERLEQL FLLIFPREDL
DMILKMDSLQ DIKALLTGLF VQDNVNKDAV TDRLASVETD MPLTLRQHRI
SATSSSEESS NKGQRQLTVS PEFPGIWAPP TDVSLGDELH LDGEDVAMAH
ADALDDFDLD MLGDGDSPGP GFTPHDSAPY GALDMADFEF EQMFTDALGI
DEY GG
                  参考文献
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Claims (49)

1.一种γ-分泌酶活性的体外检测方法，其中
1)应用转基因，其编码融合蛋白，并包含如下组成成分：
a)编码包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质的第一核苷酸序列，
b)在该第一核苷酸序列5’-末端的编码信号肽的第二核苷酸序列，
c)启动子，及
d)一个或多个额外的编码序列，所述编码序列编码可以用于检测第二片段蛋白的蛋白质；
2)将该转基因引入细胞，并表达所述融合蛋白；
3)该融合蛋白在氨基酸序列SEQ ID NO.1内被细胞内存在的γ-分泌酶裂解，从而形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白，及
4)检测第二片段蛋白。
2.一种γ-分泌酶活性的体外检测方法，其中
1)应用转基因，其编码融合蛋白，并包含如下组成成分：
a)编码包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白质的第一核苷酸序列，
b)在该第一核苷酸序列5’-末端的编码信号肽的第二核苷酸序列，
c)启动子，及
d)一个或多个额外的编码序列，所述编码序列编码可以用于检测第二片段蛋白的蛋白质；
2)将该转基因引入细胞，并表达所述融合蛋白；
3)该融合蛋白在氨基酸序列SEQ ID NO.1内被细胞内存在的γ-分泌酶裂解，从而形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白，及
4)测定第二片段蛋白的量，由第二片段蛋白的形成量确定γ-分泌酶的活性。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中第一核苷酸序列编码淀粉样前体蛋白或其部分。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中第一核苷酸序列编码具有氨基酸序列SEQ ID NO.4的蛋白。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中第二核苷酸序列编码APP的信号肽。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述信号肽具有氨基酸序列SEQ ID NO.5。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述启动子是用于在哺乳动物细胞、秀丽新小杆线虫、酵母或果蝇内表达的启动子。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中所述启动子为CMV、HSVTK、RSV、SV40、LTR、unc119、unc54、hsp16-2、GoA1、sel-12、ADH1、Ga11、MET3、MET25、MT、Ac5或Ds47启动子。
9.如权利要求1或2所述的方法，其中细胞为真核细胞。
10.如权利要求1或2所述的方法，其中细胞为人类细胞。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中细胞为非人类细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述细胞为：HeLa、293、H4、SH-SY5Y、H9、Cos、CHO、N2A、SL-2或酿酒酵母细胞。
13.如权利要求11所述的方法，其中细胞为秀丽新小杆线虫细胞。
14.如权利要求12所述的方法，其中细胞为转基因秀丽新小杆线虫细胞。
15.如权利要求11所述的方法，其中细胞为酵母细胞。
16.如权利要求1或2所述的方法，其中融合蛋白具有或包含氨基酸序列SEQ ID NO.6。
17.如权利要求1或2所述的方法，其中所述额外的编码序列位于第一核苷酸序列的3’-末端。
18.如权利要求1或2所述的方法，其中所述额外的编码序列编码蛋白，该蛋白与第一片段蛋白和第二片段蛋白一起作为融合蛋白表达。
19.如权利要求1或2所述的方法，其中所述额外的编码序列编码含有DNA-结合域和转录-激活域的蛋白。
20.如权利要求1或2所述的方法，其中所述额外的编码核苷酸序列编码由Ga14-结合域和VP16的转录-激活域组成的蛋白(Ga14-VP16)。
21.如权利要求1或2所述的方法，其中所述转基因与报告质粒一起共转染所述细胞，该报告质粒包含处于可调节启动子控制之下的报告基因。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述可调节启动子可被转录-激活域所激活。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述报告质粒编码增强型绿色荧光蛋白报告基因，并且所述可调节启动子含有Ga14结合位点和HIV的最小启动子。
24.如权利要求1或2所述的方法，其中所述转基因具有核苷酸序列SEQ ID NO.8。
25.如权利要求1或2所述的方法，其中转基因存在于载体上。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述载体具有核苷酸序列SEQID NO.9。
27.如权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞中没有可检测的内源性γ-分泌酶活性。
28.如权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞用cDNA文库共转染。
29.如权利要求28所述的方法，其中从人类或非人类组织或者人类或非人类细胞制备的cDNA存在于cDNA文库内。
30.权利要求27至29中任何一项所述的方法在鉴定编码γ-分泌酶的cDNA中的应用，其中
a)鉴定在其中可检测到γ-分泌酶活性的细胞，和
b)从该细胞分离编码γ-分泌酶的cDNA。
31.一种转基因，其含有
a)编码含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白的第一核苷酸序列，
b)在该第一核苷酸序列5’-末端的编码信号肽的第二核苷酸序列，
c)启动子，及
d)在该第一核苷酸序列3’-末端的编码DNA-结合域和转录-激活域的至少一个额外核苷酸序列，该额外核苷酸序列编码能够用于检测第二片段蛋白的蛋白质。
32.如权利要求31所述的转基因，其中所述第一核苷酸序列编码APP或APP的一部分。
33.如权利要求31或32所述的转基因，其中所述转基因具有核苷酸序列SEQ ID NO.8。
34.含有如权利要求31至33之一所述转基因的载体。
35.权利要求34所述的载体，其具有核苷酸序列SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.12。
36.一种转基因细胞的产生方法，其中用权利要求34和35之一所述的载体转染细胞。
37.一种转基因秀丽新小杆线虫的产生方法，其中将权利要求31至33之一所述的转基因微注射到秀丽新小杆线虫的性细胞中。
38.含有权利要求31至33之一所述转基因的细胞。
39.权利要求38的细胞，它是秀丽新小杆线虫细胞或酵母细胞。
40.含有权利要求31至33之一所述转基因的转基因秀丽新小杆线虫。
41.一种含有如下成分的细胞：
a)权利要求31至33之一所述的转基因
b)cDNA文库，和
c)报告质粒。
42.权利要求41的细胞在鉴定编码γ-分泌酶的cDNA中的应用。
43.一种鉴定γ-分泌酶cDNA的方法，其中
1)制备如权利要求41所述的细胞，及
2)测定是否有第二片段蛋白形成。
44.权利要求41中所述的细胞在用于鉴定γ-分泌酶活性的抑制剂的方法中的应用。
45.抑制γ-分泌酶活性的物质的鉴定方法，该方法包括下列步骤：
1)制备非人类转基因生物体或转基因细胞，该非人类转基因生物体或转基因细胞中包含具有下列成分的转基因：
a)编码包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ IDNO.1)的蛋白质的第一核苷酸序列，
b)在该第一核苷酸序列5’-末端的编码信号肽的第二核苷酸序列，
c)启动子，及
d)额外的非编码和/或编码性核苷酸序列，所述序列编码能够用于检测第二片段蛋白的蛋白质；
包含报告质粒，该报告质粒携带蛋白结合位点、最小启动子和报告基因，并且在不含有γ-分泌酶的生物体或细胞内时还含有编码γ-分泌酶的cDNA，
其中，该非人类转基因生物体或转基因细胞将该转基因表达为融合蛋白，并且在不含有γ-分泌酶的生物体或细胞内还表达由所述cDNA编码的γ-分泌酶；
2)将所述非人类转基因生物体或转基因细胞与被研究的物质温育，及
3)该融合蛋白被：
a)裂解，因此形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白，或
b)未被细胞内存在的γ-分泌酶在氨基酸序列SEQ ID NO.1内裂解，因此没有可检测量的第一和/或第二片段蛋白的形成，
4)测定第二片段蛋白的含量。
46.抑制γ-分泌酶活性的物质的鉴定方法，其中
1)使用转基因，其包括下列成分：
a)编码包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVVIATVIVITLVML(SEQ ID NO.1)的蛋白的第一核苷酸序列，
b)在该第一核苷酸序列5’-末端的编码信号肽的第二核苷酸序列，和
c)启动子，及
d)一个或多个额外的编码序列，其中所述编码序列编码可以用于检测第二片段蛋白的蛋白质；
2)将该转基因和报告质粒、并且在该细胞不含有γ-分泌酶时还将编码γ-分泌酶的cDNA引入到细胞中，在所研究的物质存在下表达由所述转基因编码的融合蛋白，在引入了编码γ-分泌酶的cDNA时还表达由所述cDNA编码的γ-分泌酶，
3)该融合蛋白被：
a)裂解，因此形成包含氨基酸序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO.2)的第一片段蛋白和含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQ ID NO.3)的第二片段蛋白，或
b)未被细胞内存在的γ-分泌酶在氨基酸序列SEQ ID NO.1内裂解，因此没有可检测量的第一和/或第二片段蛋白的形成，
4)测定第二片段蛋白的含量。
47.鉴定抑制γ-分泌酶活性的物质的方法，其中将编码含有信号肽和氨基酸序列SEQ ID NO.1的融合蛋白的转基因在所研究物质存在下进行表达，加入γ-分泌酶，并确定所述被研究物质对第二片段蛋白形成量的影响，其中所述第二片段蛋白含有氨基酸序列VIVITLVML(SEQID NO.3)。
48.药物的生产方法，其中包括如权利要求45至47之一所述的方法，并且最后将鉴定出的抑制剂与药学上可耐受的载体混合。
49.如权利要求45至47中任一项所述的方法，还包括将所鉴定出的抑制剂配制成制药学上可耐受的形式。
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