DE19920514A1 - Methoden zur Auffindung von Proteasen, die spezifisch membrangebundene Substrate spalten - Google Patents
Methoden zur Auffindung von Proteasen, die spezifisch membrangebundene Substrate spaltenInfo
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Abstract
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Auffindung von Proteasen, die membranassoziierte Substrate spalten sowie die dafür notwendigen rekombinanten Fusionsproteine.
Description
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Auffindung von Proteasen, die
membranassoziierte Substrate spalten sowie die dafür notwendigen rekombinanten
Fusionsproteine.
Proteasen spielen eine wichtige Rolle für viele physiologische Prozesse wie
beispielsweise die Transkription, Apoptose, Entwicklung und Signaltransduktion.
(Whiteside, S. T. et al. J. Biol. Chem., 269, 1994: 27059). Auch ist bekannt, daß
Proteasen eine Schlüsselrolle in einer ganzen Reihe von Erkrankungen einnehmen, wie
beispielsweise bei den neurodegenerativen Krankheiten, die zum Beispiel auch die
Alzheimersche Krankheit beim Menschen umfassen. Die in solchen Krankheitsbildern
involvierten bekannten und noch unbekannten Proteasen stellen einen wichtigen
Ansatzpunkt zur Entwicklung neuer therapeutischer Verfahren dar.
Das Auffinden von Proteasen und der Nachweis ihrer proteolytischen Aktivität und
Spezifität basiert auf dem Nachweis und der Charakterisierung eines Spaltprodukts. Es
sei hier auf die Verfahren von Smith und Kohorn (Smith, T. A. und Kohorn, B. D. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88, 1991: 5159) und Dasmahapatra et al. (Dasmahapatra, B. et al.
PNAS 89(9), 1992: 4159-4162) verwiesen.
Smith und Kohorn beschreiben ein Verfahren zur Auffindung der cDNA's
eukaryontischer Proteasen, die eine vorgegebene Aminosäuresequenz spalten. Zum
Nachweis einer spezifischen proteolytischen Aktivität wurde hier ein Fusionsprotein aus
einer bekannten Proteasespaltsequenz und dem Transkriptionsfaktor GAL4 sowie die
dafür spezifische Protease selbst rekombinant in Hefe exprimiert. Die Spaltung der
Proteasespaltsequenz durch die spezifische Protease trennt die transkriptions
aktivierende Domäne von der DNA-bindenden Domäne, die in diesem Fusionsprotein
durch die Spaltsequenz funktional verbunden waren. Der Nachweis der spezifischen
Proteasereaktion erfolgt durch die Inaktivierung der Gal4-Aktivität.
Auch Dasmahapatra et al. verwenden das GAL4-Reportersystem in identischer Weise
durch Insertion einer autolytisch spaltendenden Protease zwischen den funktionellen
Anteilen des GAL4-Reportersystems. Der Verlust der Gal4-Aktivität dient auch hier zum
Nachweis der autoproteolytischen Aktivität der Insertionssequenz.
Beide Verfahren sind beschränkt auf das Auffinden cytosolisch lokalisierter bzw.
cytosolisch spaltender Proteasen, da die beschriebenen rekombinanten Substrate bzw.
Fusionsproteine cytosolisch lokalisiert sind.
Manche physiologischen Vorgänge, aber auch einige pathologische Prozesse wie die
oben bereits erwähnten neurologischen Erkrankungen basieren auf der proteolytischen
Spaltung membrangebundener Substrate. Die Pathologie der Alzheimerschen
Erkrankung, der am häufigsten vorkommenden neurodegenerativen Erkrankung am
Menschen, ist mit der proteolytischen Aktivierung des neurotoxischen Amyloid β-peptids
(Aß) assoziiert und involviert mindestens zwei proteolytische Aktivitäten, die beide ein
membrangebundenes Substrat voraussetzen (Haass, C. and Selkoe, D. J. Cell, 75,
1993: 1039; Selkoe, D. J. J. Biol. Chem., 271, 18295; Citron M. et al. Neuron, 14,
1995: 661; Tischer, E. and Cordell, B. J. Biol. Chem., 271, 1996: 21914). Während die
β-Sekretase im Lumen von Membrankompartimenten den N-Terminus generiert, spaltet
die γ-Sekretase den C-Terminus der Amyloiddomäne (Haass, C. et al. Nature, 359,
1992: 325; M. Shoji et al. Science, 258, 1992: 126; Busciglio, J. et al. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 90, 1993: 2092). Auch die zwei in die Alzheimersche Pathologie involvierten
homologen Presenilinproteine (PS), die wahrscheinlich die γ-Sekretase aktivieren
(DeStrooper, B. et al. Nature, 391, 1998: 391), sind membrangebunden und werden
durch noch unbekannte Presenilinasen und Caspasen proteolytisch prozessiert
(Thinakaran, G. et al. Neuron, 17,1996: 181; Podlisny, M. et al. Neurobiology of
Disease, 3, 1997: 325; Mercken, M. et al. FEBS Letters, 389, 1996: 297; Tomita, T. et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1997: 2025; Capell, A. et al. J. Biol. Chem., 273,
1998: 32050; Thinakaran, G. et ab Neurobiol. Disease, 4, 1998: 438; Yu, G. et al. J. Biol.
Chem. 273: 1998: 16740; Kim, T.-W. et al. Science, 277, 1997: 373; Loetscher, H. et al.
Biol. Chem. 272, 1997: 20655; Vito, P. et al. J. Biol. Chem. 272, 1997: 28315; Grünberg,
J. et al. Biochemistry, 37, 1998: 2263).
Derzeit ist es mit den Methoden des Standes der Technik nicht möglich, Proteine selbst
bekannter proteolytischer Aktivität von membrangebundenen Substraten zu
identifizieren und isolieren. Die Identifizierung solcher Proteasen, wie beispielsweise der
oben genannten γ-Sekretase, der Presenilinasen und Caspasen würde erheblich zum
molekularen Verständnis pathologischer Erkrankungen beitragen und die Entwicklung
hochspezifischer Proteaseinhibitoren zur Therapie entscheidend voranbringen. Die
Reinigung dieser bekannten proteolytischen Aktivitäten durch konventionelle Methoden
unter Verwendung löslicher Substrate ist sehr schwierig, wenn nicht sogar unmöglich,
da diese Proteasen membrangebundene Substrate zur Erkennung ihrer Zielsequenz
(Citron M. et al. Neuron, 14, 1995: 661; Tischer, E. and Cordell, B. J. Biol. Chem., 271,
1996: 219145).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher das Bereitstellen eines Verfahrens zum
Auffinden von Proteasen, die membranassoziierte Substrate spalten.
Die der Anmeldung zugrundeliegende Aufgabe konnte mit der vorliegenden Erfindung
im Rahmen der Beschreibung und der Patentansprüche gelöst werden, indem ein
Verfahren zum Auffinden von Proteasen, die membranassoziierte Substrate spalten, zur
Verfügung gestellt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
- A) ein rekombinantes Fusionsprotein, bestehend aus mindestens einem Reporteranteil und einer Proteasespaltsequenz in einem geeigneten Zeilsystem exprimiert wird, das mit einer Membran assoziiert und
- B) ein weiteres Protein in dem gleichen Zellsystem exprimiert wird, und
- C) das Vorhandensein des abgespaltenen Reporteranteils nachgewiesen wird.
Eine Protease im Sinne der Erfindung ist jedes Protein oder Makromolekül mit einem
Peptidanteil, das in der Lage ist, Peptidbindungen zu spalten.
Unter einem Fusionsprotein soll der Fachmann ein Protein verstehen, das rekombinant
in einem geeigneten Zellsystem exprimiert wird und mindestens zwei funktionelle
Anteile aufweist, einen Reporteranteil und eine Proteasespaltsequenz.
Unter membranassoziierten Fusionsproteinen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind
Proteine zu verstehen, die in räumlicher Nähe mit einer beliebigen Membran innerhalb
der Zelle oder der Zellmembran stehen. Die Membranen der Zelle und Zellorganellen
bzw. Zellkompartimente sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Zellbiologie bestens
bekannt und werden hier nicht im einzelnen aufgezählt.
Unter einem weiteren Protein, das neben dem erfindungsgemäßen rekombinanten
Fusionsprotein im gleichen Zellsystem exprimiert wird, ist im Sinne der Erfindung
sowohl ein endogen vorhandenenes Protein als auch ein rekombinantes Protein oder
das Fragment eines solchen endogenen oder rekombinanten Proteins zu verstehen,
von dem vermutet wird, das dieses eine proteolytische Aktivität aufweist.
Bei der Proteasespaltsequenz handelt es sich um eine Peptidsequenz, die als durch
Proteasen spaltbare Sequenz bekannt ist oder als solche vermutet wird.
Für die Lokalisation des rekombinanten Fusionsproteins ergeben sich drei
Möglichkeiten. Zum einen kann die membranassoziierte Spaltsequenz vollständig oder
teilweise innnerhalb der Membran lokalisiert sein. In einer bevorzugten
Ausführungsform umfasst die Erfindung daher Verfahren, die dadurch gekennzeichnet
sind, daß die Proteasespaltsequenz ganz oder teilweise innerhalb der Zellmembran
lokalisiert ist.
Neben der seltenen jedoch nicht auszuschließenden Möglichkeit, daß die membran
assoziierte Spaltsequenz außerhalb der Zellmembran in das extrazelluläre Medium ragt,
besteht auch die Möglichkeit, daß die membranassoziierte Proteasespaltsequenz
teilweise oder ganz im Zytosol lokalisiert ist. Selbst ein solches membranassoziiertes
Proteasesubstrat, das vollständig im Zytosol lokalisiert ist, kann bedingt durch die
unmittelbare räumliche Nähe von Membranen nicht als zytosolisch, sondern muß als
membranassoziiert angesehen werden, da die Zugänglichkeit dieses Substrats für eine
rein zytosolisch spaltende Protease räumlich in erheblichem Maße eingeschränkt ist. In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung daher Verfahren,
die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Proteasespaltsequenz ganz oder teilweise
innerhalb des Zytosols lokalisiert ist.
Wenn weder die Proteasespaltsequenz noch der Reporteranteil, noch ein anderer Teil
des Fusionproteins eine Membranassoziation ermöglichen, so kann das Fusionsprotein
mit einem zusätzlichen funktionellen Ankeranteil versehen werden. Daher umfasst die
Erfindung in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform auch Verfahren, die dadurch
gekennzeichnet sind, daß das Fusionsprotein durch einen zusätzlichen Ankeranteil in
der Membran verankert ist.
Es ist auch möglich, das Fusionsprotein durch eine entsprechende geeignete
Spaltsequenz in der Membran zu verankern. Bei membranständigen natürlichen
Proteasesubstraten ist eine solche Eigenschaft zu erwarten. Beispielsweise sei hier die
Spaltsequenz genannt, die durch die γ-Sekretase gespalten wird. Daher umfasst die
Erfindung in einer besonders bevorzugten Ausführungsform auch Verfahren, die
dadurch gekennzeichnet sind, daß das Fusionsprotein durch die Proteasespaltsequenz
selbst in der Membran verankert ist.
Das rekombinante Fusionsprotein im Sinne der Erfindung kann neben den funktionellen
Anteilen wie der Spaltsequenz, der Reportersequenz und optional einer zusätzlichen
Ankersequenz auch reine Abstandshalter beinhalten. Bei Abstandshaltern im Sinne des
Patents handelt es sich um Peptide, die funktionelle Anteile voneinander trennen
beziehungsweise verbinden. Ihr Nutzen besteht in der räumlichen Trennung der
funktionellen Anteile, die in manchen Fällen erst das unbeeinträchtigte Ausüben deren
Funktion ermöglicht. Daher umfasst die Anmeldung in einer weiteren besonders
bevorzugten Ausführungsform Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die
Proteasespaltsequenz und/oder der Reporteranteil und/oder der Ankeranteil des
Fusionsproteins durch einen Abstandshalter verbunden sind.
Auch ist es möglich, Signalsequenzen direkt bzw. über einen Abstandshalter mit dem
Fusionsprotein zu verbinden. Ein Beispiel für eine Signalsequenz ist für Hefezellen die
Hefe Invertase Signalsequenz (Moir and Dumais, Gene 56, 1987: 209). Eine
Signalsequenz bzw. Signalanteil im Sinne der vorliegenden Erfindung dirigiert in den
entsprechenden Expressionssystemen den Transport des Fusionproteins zur Membran.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher in einer besonders bevorzugten
Ausführungsform Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das
erfindungsgemäße rekombinante Fusionsprotein einen Signalanteil enthält, der das
erfindungsgemäße Fusionsprotein zur gewünschten Membran eines dafür geeigneten
Zellsystems dirigiert.
Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Zellsysteme besonders
geeignet, die keine endogenen Proteasen exprimieren, die die Proteasespaltsequenz
des erfindungsgemäßen Fusionsprotein spalten, und die ein Exprimieren des
Fusionproteins und eines weiteren Proteins oder Fragments desselben sowie die
Assoziation des Fusionproteins mit Membranen ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Auffindung von Proteasen jeglichen
Ursprungs, die membranassoziierte Substrate spalten. Die Proteasen können
prokaryontischen, eukaryontischen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein. Für die
Auffindung von therapierelevanten Proteasen in Säugern eignen sich eukaryontischen
Expressionssysteme besonders gut. Daher umfasst die vorliegende Erfindung in einer
besonders bevorzugten Ausführungsform Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind,
daß das geeignete Expressionsystem ein eukaryontisches Expressionssystem ist.
Ganz besonders bevorzugt sind Hefeexpressionssysteme, da diese einfach
handhabbar und oftmals frei von endogenen Säugetierproteasen sind. Zudem stehen
eine Vielzahl rekombinanter Werkzeuge für Hefe zur Verfügung. In einer weiteren ganz
besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung daher Verfahren, die
dadurch gekennzeichnet sind, daß das geeignete Expressionsystem ein Hefe
expressionssystem ist.
Zur Realisierung der Erfindung sind auch Expressionsysteme aus Säugetierzellen oder
transgenen Tieren möglich. Hierbei ist jedoch besonders auf das Vorhandensein und
nach Möglichkeit Inaktivieren endogener Proteasen zu achten, die das Verfahren
beeinflussen können. Die Erfindung umfasst daher auch Verfahren, die dadurch
gekennzeichnet sind, daß das geeignete Expressionsystem ein Säuger
expressionssystem ist.
Der Reporteranteil eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins kann jedes beliebige
rekombinant exprimierbare Protein oder Peptid sein, dessen Freisetzung vom
Fusionsprotein durch proteolytische Spaltung ein nachweisbares Signal auslöst. Zum
einen kann der Reporteranteil dann als Protein bzw. Peptid im Zytosol nachgewiesen
werden, beispielsweise durch reporteranteilspezifische Antikörperbindung im Zytosol
nach Abtrennung der Membranfraktion. In Frage kommen aber auch alle Arten löslicher
Transkriptionsfaktoren. Die Freisetzung löslicher Transkriptionsfaktoren kann dann
nachgeschaltete Signale auslösen. Geeignete transkriptionsregulierende Elemente sind
dem Fachmann aus dem Stand der Technik geläufig und beinhalten Signalmoleküle wie
Gal4 (Laughan, A and Gesteland, R Molec. Cell Biol., 4, 1984: 260-267), VP16 (Goff,
Stephen P. et al. Current Opinion in Biotechnology, 6, 1995: 59-64) und LexA (siehe
Goff et al.). Der Transkriptionsaktivator Gal4 eignet sich besonders gut für
Hefeexpressionssysteme. Auch verkürzte aktive Formen von Gal4, wie beispielsweise
Gal4-1147/768-881 und Gal4-1-238/768-881 (Jun Ma und Mark Ptashne, Cell 48,
1998: 847-853) sind geeignet. Daher umfasst die Erfindung in einer besonders
bevorzugten Ausführungsform auch Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß
der Reporteranteil des Fusionsproteins der Hefetranskriptionsaktivator Gal4 ist.
Typische Reportergene, die Transkriptionsaktivatoren nachgeschaltet sind, sind CAT
(Alton and Vapnek, Nature 282, 1979: 864-869), Luziferase (deWet et al. Mol. Cell.
Biol., 7, 1987: 725-737; Engebrecht and Silverman, PNAS 1, 1984: 4154-4158), β-
Galctosidase (siehe oben, Goff et al.) und alkalische Phosphatase (Toh et al. Eur. J.
Biochem. 182, 1989, 231-238).
Als Ankeranteil im Sinne der Erfindung kommen alle Peptidsequenzen in Frage, die mit
Membranen assoziieren. Hier sei besonders auf die Transmembranregionen membran
ständiger Proteine verwiesen. Insbesondere eignen sich Transmembranregionen von
Typ1 Transmembranregionen. Presenilin (Sherrington et al., Nature 325, 754), z. B. die
TM1-Domäne von Presenilin 1, und ßAPP (Kang et al., Nature 325 : 733) enthalten
bevorzugte Transmembranregionen. Die Erfindung umfasst daher auch Verfahren, die
dadurch gekennzeichnet sind, daß der Ankeranteil des Fusionsproteins die TM1-
Domäne von Presenilin 1 ist.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die vorliegende
Erfindung ein Fusionsprotein, das neben der zu untersuchenden Spaltsequenz als
Ankeranteil über die TM1-Domäne von Presinilin 1 verfügt, dessen Reporteranteil der
Hefetranskriptionsfaktor Gal4 ist, und das mit einem geeigneten Membransignalanteil
verbunden ist.
Dem Fachmann sind eine ganze Reihe von Techniken geläufig, die Expression
endogener Proteine in Zellsystemen zu inhibieren. Bei Bedarf ist der Fachmann somit in
der Lage, systemeigene unerwünschte Proteasen aus geeigneten Expressionssytemen
zu entfernen oder zu inaktivieren. Besonders bevorzugt sind Verfahren, die dadurch
gekennzeichnet sind, daß das geeignete Expressionsystem keine systemeigenen
Proteasen enthält, die membranassoziierte Substrate spalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für alle Proteasespaltsequenzen. Ganz
besonders bevorzugt sind Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei
der Proteasespaltsequenz um eine Aminosäuresequenzen handelt, die von mindestens
einer der folgenden Proteasen gespalten wird:
γ-Sekretase (Selkoe, J. BioLChem 271, 1996: 18259), NOTCH Protease (Schroeter et al. Nature 393, 1998: 382), Presenilin Protease (Thinakaran et al. Neuron 17, 1998: 181), Caspasen (Nicholson, D. W. and Thornberry, N. A. Trends Biochem. Sci., 22, 1997: 299).
γ-Sekretase (Selkoe, J. BioLChem 271, 1996: 18259), NOTCH Protease (Schroeter et al. Nature 393, 1998: 382), Presenilin Protease (Thinakaran et al. Neuron 17, 1998: 181), Caspasen (Nicholson, D. W. and Thornberry, N. A. Trends Biochem. Sci., 22, 1997: 299).
In einer weiteren ganz besonders bevorzugten Ausführungsform offenbart die
vorliegende Erfindung Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die
Proteasespaltsequenz das humane β amyloid precursor protein (ßAPP) oder ein Teil
davon ist.
In einer weiteren ganz besonders bevorzugten Ausführungsform offenbart die
vorliegende Erfindung Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die
Proteasespaltsequenz einer der in den Fig. 5 oder 6 dargestellten Teilsequenzen
des humanen β amyloid precursor protein's (ßAPP) entspricht.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet, Proteasen und deren Gene
aus Genbibliotheken zu identifizieren. Sobald ein geeignetes Zellsystem mit einem
geeigneten rekombinanten Fusionsprotein mit einer festgelegten Proteasespaltsequenz
vorliegt, muß nur noch das weitere Gen aus einer zu untersuchenden Genbibliothek im
gleichen Expressionssystem exprimiert werden.
Sobald der Fachmann ein geeignetes Zellsystem mit einem erfindungsgemäßen
rekombinanten Fusionsprotein etabliert hat, das eine Spaltsequenz von Interesse
enthält, muß er nur noch ein weiteres Protein oder Fragment davon aus einer zu
untersuchenden Genbibliothek im gleichen Expressionssystem exprimieren, um
Proteine oder Teile davon mit entsprechender spezifischer proteolytischer Aktivität in der
zu untersuchenden Genbibliothek aufzufinden.
Ganz besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Verfahren zur Auffindung der γ-
Sekretase, oder der Presinilinase, oder der NOTCH-Protease, oder der Presinilin
spaltenden Caspasen aus Genbibliotheken.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die rekombinanten
Fusionsproteine, die zur Ausübung der oben beschriebenen Verfahren notwendig sind.
Solche Fusionsproteine können mit einer zellulären Membran assoziieren und bestehen
mindestens aus einem Reporteranteil und einer Proteasespaltsequenz.
Sollte ein solches rekombinantes Fusionsprotein bestehend aus einem Reporteranteil
und einer Proteasespaltsequenz nicht von selbst mit den Membranen des
Expressionssystems assoziieren können, so muß ein solches Fusionsprotein einen
zusätzlichen Membranankeranteil enthalten.
Auch kann es vorteilhaft sein, die oben genannten funktionellen Anteile des
erfindungsgemäßen Fusionsproteins durch zusätzliche Abstandshalter zu trennen und
so den sterischen Freiraum einzelner funktioneller Anteile zu erhöhen oder deren
Lokalisation in oder an der Membran zu verändern.
Desweiteren kann es vorteilhaft sein, dem rekombinanten erfindungsgemäßen
Fusionsprotein einen zusätzlichen Signalanteil zum Zweck des zielgerichteten
Transports zur Membran eines Expressionssystems hinzuzufügen.
Als besonders vorteilhafte Ausführungsform hat sich für Hefeexpressionssysteme das
Reportermolekül Hefetranskriptionsaktivator Gal4 bewährt.
Eine weitere besonders vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Fusionsproteins enthält als Ankeranteil die TM1-Domäne von Presenilin 1.
Als Signalanteil in Hefeexpressionssystemen enthält eine besondere Ausführungsform
der Erfindung Fusionsproteine deren Signalanteil der Hefe Invertase (siehe oben)
entnommen ist.
Als Proteasespaltsequenzen enthalten die erfindungsgemäßen Fusionsproteine in einer
ganz besonderen Ausführungsform mindestens eine der Aminosäuresequenzen, die
spezifisch von der γ-Sekretase, oder der Presenilinase, oder der NOTCH-Protease,
oder den Presenilin-spaltenden Caspasen gespalten werden.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße
Fusionsprotein als Reporteranteil den Hefetranskriptionsaktivator Gal4, als Ankeranteil
die TM1-Domäne von Presinilin 1 und eine vermutete Proteasespaltsequenz.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße
Fusionsprotein als Reporteranteil den Hefetranskriptionsaktivator Gal4, die TM1-
Domäne von Presinilin 1 als Ankeranteil, die Signalsequenz der Hefe Invertase als
Signalanteil und eine vermutete Proteasespaltsequenz.
Bevorzugt sind rekombinante erfindungsgemäße Fusionsproteine, die dadurch
gekennzeichnet sind, daß die Proteasespaltsequenz das humane β amyloid precursor
protein (ßAPP) oder ein Teil davon ist.
Besonders bevorzugt sind rekombinante erfindungsgemäße Fusionsproteine, die
dadurch gekennzeichnet sind, daß die Proteasespaltsequenz einer der in den Fig. 5
oder 6 dargestellten Teilsequenzen des humanen β amyloid precursor protein's (ßAPP)
entspricht.
Ganz besonders bevorzugt sind rekombinante erfindungsgemäße Fusionsproteine, die
dadurch gekennzeichnet sind, daß es eine Signalsequenz gemäß Fig. 3, eine
Proteasespaltsequenz mit Abstandshalter gemäß Fig. 5 und einen Reporteranteil
gemäß Fig. 8 enthält.
Ganz besonders bevorzugt sind rekombinante erfindungsgemäße Fusionsproteine, die
dadurch gekennzeichnet sind, daß es eine Signalsequenz gemäß Fig. 3, eine
Proteasespaltsequenz mit Abstandshalter gemäß Fig. 6 und einen Reporteranteil
gemäß Fig. 8 enthält.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines der
oben beschriebenen erfindungsgemäßen Fusionsproteine in einem der oben
beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren.
Die Erfindung wurde beispielhaft an einem rekombinanten Fusionsprotein (ssTM1Gal4;
ss steht für Signalsequenz gemäß Fig. 3, jedoch ohne Methionin am Ende, TM1 steht
für die Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4, Gal4 steht für die Aminosäuresequenz
gemäß Fig. 8; zwischen TM1 und Gal4 befindet sich der Abstandshalter bzw. die
Klonierungsstelle gemäß Fig. 7) gezeigt, bei dem der Transkriptionsaktivator Gal4 C
terminal mit der TM1 Domäne des PS1 Gens verbunden wurde (alle hier verwendeten
Gal4-Konstrukte wurden aus pCl1 (Fields. S. and Song, O. Nature, 340, 1989: 245)
abgeleitet und beinhalten eine Expressionskassette des Gal4-Gens, die unter der
Kontrolle der ADH1 Promoter- und Terminatorsequenzen steht. Diese Kassette wurde
in YCplac22 (Gietz, R. D. und Sugino, A. Gene, 74, 1988: 527) einkloniert zur Darstellung
des parentalen Plasmids für ssTMIGal4 und dessen Derivativen. Das Fusionsprotein
ssTMIGal4 besteht aus der Signalsequenz der Hefe Invertase (aa1-aa19, Moir, D. T.
und Dumais, D. R. Gene, 56, 1987: 209), die an den N-Terminus des humanen PS1
fusioniert wurde, der bis hin zur ersten Transmembrandomäne (aa3-aa101) reicht und
an den sich eine 3aa (RPH) Spacerregion, die über die Stul- und Ndel-Restrictionstellen
verfügt, sowie Hefe-Gal4 (aa1-aa881) anschließt. SsTMIGal4 wurde durch PCR-
Amplifikation der korrespondierenden cDNA-kodierenden Regionen unter Verwendung
von Standardklonierungstechniken hergestellt (Ausubel, F. M. et al. Current Protokols in
Molec. Biol. (Greene, New York, 1992). Die Fusionsproteine ssTM1-DEVDG-Gal4 und
ssTM1-DEVNG-Gal4 wurden durch Insertion hybridisierter Oligonukleotide, die für
DEVDG oder DEVNG kodieren, in Stul und Ndel geschnittene ssTMIGal4-Konstrukte
hergestellt.) Zum Zweck des Dirigierens an Membranen in Hefezellen wurde eine
Zielsequenz, nämlich die Signalsequenz der Hefe-Invertase (Dumais und Noir, siehe
oben) mit dem N-Terminus der TM1-Domane verbunden. Nach Expression in SFY526
(es wurden Standardmethoden (Ausubel et al., siehe oben) zur Einführung der
Plasmide in den Hefestamm SFY526 verwendet (MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101,
lys2-801, trp1-901, leu2-3, 112, can®, gal4-542, ga180-538, URA3 : Gall-lacZ) (Bartel,
P. L. et al. BioTechniques, 14, 1993: 920) sowie zur Herstellung von Proteinextrakten
und β-gal Assays) war keine β-Galaktosidaseaktivität detektierbar. Die Expression des
gleichen, jedoch löslichen Gal4-Anteils für sich allein führte zu einer starken β-
Galaktosidaseaktivität. Nach Fraktionierung der Hefezellen war ssTM1-Gal4 in der
Membranfraktion nachweisbar. Die Membranassoziation von ssTM1-Gal4 wurde ferner
durch Karbonatextraktion erbracht. Die Karbonatextraktion der Membranfraktion führte
nicht zur Freisetzung des Fusionsproteins. SsTM1-Gal4 verhält sich somit wie ein
integrales Membranprotein.
Zum Nachweis der Spaltbarkeit von membranassoziierten Proteasespaltsequenzen als
Bestandteil von ssTM1-Gal4 wurde ssTM1-DEVDG-Gal4 hergestellt, ein Fusionsprotein,
dessen Bestandteile ssTM1 und Gal4 durch die Proteasespaltsequenz DEVDG
(Nicholson, D. W. and Thornberry, N. A., Trends Biochem. Sci., 22, 1997: 299)
verbunden sind. DEVDG stellt eine Erkennungsstelle für Caspase-3 dar (Lazebnik, Y. A.
et al., Nature 371, 1994: 346); Fernandes-Alnemri, T. et al., J. Biol. Chem. 269, 1994:
30761; Tewari, M. et al., Cell, 81, 1995: 801; Nicholson, D. W. et al., Nature 376, 1995:
37; Nicholson, D. W. and Thornberry, N. A., Trends Biochem. Sci., 22, 1997: 299). Die
Expression von ssTM1-DEVDG-Gal4 in SFY526 Hefezellen bewirkte keine β-
Galaktosidaseaktivität. Die Koexpression von humaner Caspase-3 zusammen mit
ssTM1-DEVDG-Gal4 in SFY526 Hefezellen bewirkte eine starke β-Galaktosidase
aktivität. Die Gesamt cDNA der humanen Caspase-3 (Fernandes-Alnemri, T. et al., J.
Biol. Chem., 269, 1994: 30761; Tewari, M. et al., Cell, 81, 1995: 801; Nicholson, D. W. et
al., Nature, 376, 1995: 37) wurde in ein pVT100-U-Derivat (Vernet, T. et al., Gene, 52,
1997: 225) einkloniert, in welchem das URA3-Gen durch das LEU2-Gen ersetzt worden
war. In diesem Konstrukt steht die Caspase-3-Expression unter der Kontrolle der ADH1
Promoter- und Terminatorsequenzen. Die Aktivität der Caspase-3-Expression wurde
durch Spaltung von in vitro-translatiertem 35S Methionin-radiomarkiertem PARPC (ein C
termina) trunkiertes PARP-Derivat) bestätigt mittels eines cytosolischen Extrakts aus
Caspase-3 transformierten Hefezellen. Immunoblotting mit anti-Gal4-Antikörpern zeigte,
daß ssTM1-DEVDG-Gal4 ohne Koexpression als Gesamtprotein membrangebunden
vorliegt. Die Koexpression mit Caspase-3 führte zu löslichen abgespaltenen Gal4-
Anteilen. Auch die 12 kDa Untereinheit der Caspase-3 war nachweisbar.
Zum Nachweis der Spezifität wurde das membranassoziierte Fusionsprotein ssTM1-
DEVNG-Gal4 in Hefezellen mit Caspase-3 koexprimiert. Der Austausch der Aminosäure
Aspartat in der ursprünglichen Spaltsequenz gegen Asparagin resultierte in keiner
Spaltung des Fusionsproteins und somit in keiner β-Galaktosidaseaktivität.
Die oben genannten Versuche demonstrieren deutlich, daß die Expression einer
Protease, in diesem Fall humane Caspase-3, effizient die Spaltung erfindungsgemäßer
membranassoziierter Fusionsproteine und die Freisetzung der membrangebunden
Signalanteile, in diesem Fall des Transkriptionsaktivators Gal4, bewirken kann. Ein
solches erfindungsgemäßes Verfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen
Konstrukte erweist sich somit als hochspezifisch und sensibel unter in-vivo
Bedingungen.
In zwei weiteren spezifischen Ausführungsbeispielen wurden erfindungsgemäße
Fusionsproteine ohne Ankeranteil in geeigneten Expresssionssystemen hergestellt. Das
eine Fusionsprotein, ssMC1-55-Gal4 enthält eine Signalsequenz (ss) gemäß Fig. 3,
ein Methionin (M), eine Aminosäuresequenz gemäß Fig. 4 (C1-55) und den
Reporteranteil (Gal4) gemäß Fig. 8. Das andere Fusionsprotein, ssMC1-99-Gal4
enthält eine Signalsequenz (ss) gemäß Fig. 3, ein Methionin (M), die
Aminosäuresequenz gemäß Fig. 5 (C1-99) und den Reporteranteil (Gal4) gemäß Fig.
8. Beide Fusionsproteine assoziieren ohne zusätzlichen Ankeranteil und eignen sich
speziell zum Auffinden der γ-Sekretase aus Genbibliotheken, die die
Proteasespaltsequenzen in Fig. 5 und 6 spezifisch spaltet.
Fig. 1 beschreibt schematisch die Funktionsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Identifikation von Proteasen, die membranassoziierte Proteasespaltsequenzen
erkennen am Beispiel eines erfindungsgemäßen rekombinanten Fusionsproteins (I + II
+ III), das ein Signalmolekül (III) und einen Membranankeranteil (I) enthält sowie eine
diese funktionellen Anteile verbindende Proteasespaltsequenz (II).
Im Falle der Expression einer vermuteten Protease (V) in einem geeigneten Zellsystem
ergeben sich die beiden möglichen Folgen a) oder b) für das Zellsystem.
- a) Die vermutete Protease (V) spaltet die vorgegebene Proteasespaltsequenz (II) nicht. Der Signalanteil des Fusionsproteins bleibt mit der Membran verbunden und kann weder direkt cytosolisch nachgewiesen werden noch indirekt durch ein im Zellkern vorhandenes Reportergen (VIA/B), das durch den Signalanteil (III) in seiner Transkription beeinflusst wird. Das Reportergen bleibt unbeeinflusst (VIIA).
- b) Die vermutete Protease (V) spaltet die vorgegebene Proteasespaltsequenz (II) und kann nun direkt im Cytosol (VI) nachgewiesen werden beziehungsweise indirekt durch die Beeinflussung der Transkription eines Reportergens (VIB) im Zellkern. Das Reportergen vermittelt nun eine detektierbare Veränderung der Zelle.
Fig. 2 beschreibt schematisch die Funktionsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Identifikation von Proteasen. In dieser speziellen Ausführungsform führt die
Transformation von CPP32 cDNA zu zwei möglichen Reaktionsfolgen a) oder b)
innerhalb des Zellsystems.
- a) Die vermutete Protease (V) CPP 32 spaltet die vorgegebene Proteasespaltsequenz (IIa) DEVN nicht (IV). Das rekombinante Fusionsprotein besteht aus dem Transkriptionsaktivator Gal4 (III), der über zwei Abstandshalter (Ia, (IIIa) und der Proteasespaltsequenz (IIa) mit einem Membranankeranteil (I) aus der TM1-Domäne von Presinilin1 verbunden ist, wobei I zusätzlich einen Signalanteil der Hefe-Invertase enthält. Der Signalanteil des Konstrukts bleibt mit der Membran verbunden und kann weder direkt cytosolisch nachgewiesen werden noch indirekt durch ein im Zellkern vorhandenes Reportergen (Gal1-lacZ). Das Reportergen bleibt unbeeinflusst. Eine Färbung der Kolonien durch β-Galaktosidaseaktivität ist nicht möglich.
- b) Die vermutete Protease (V) CPP 32 spaltet (VI) die vorgegebene Proteasespaltsequenz (DEVD, IIb) und gelangt nun durch das Cytosol in den Zellkern (VIB), wo es als Transkriptionsaktivator die Expression der β-Galaktosidase und somit die Blaufärbung der Kolonien ermöglicht (VIIB).
RPH
Alle Gal4-Fusionsproteine leiten sich von Plasmid pCL1 (S. Fields and O. Song, Nature,
340, 245 (1989)) ab, welches das GAL4 Gen in einer Expressionskassette enthält, die
aus dem ADH1 Promoter und dem ADH1 Terminator besteht. Diese
Expressionskassette wurde in den Hefeexpressionsvektor Ycplac22 (R. D. Gietz and A.
Sugino, Gene, 74, 527 (1988) kloniert. Das resultierende Konstrukt (Ycplac22::Gal4) ist
der Ausgangsvektor für ssTM1-Gal4 und seine Derivate. Das Fusionsprotein ssTM1-Gal4
besteht aus der Signalsequenz der Invertase aus Hefe (As1-As19 (D. T. Moir and
D. R. Dumais, Gene, 56, 209 (1987)) gefolgt vom N-Terminus von humanem PS1 (bis
zur ersten Transmembrandomäne (As3-As101)) gefolgt von einer drei Aminosäure
(RPH) langen Abstandsregion, welche Restriktionschnittstellen für Stul und Ndell
enthält, gefolgt von Hefe Gal4 (As1-As881). SsTMIGal4 wurde durch PCR Amplifikation
der entsprechenden cDNA Regionen mittels Standardklonierungstechniken (F. M.
Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene, New York, 1992))
hergestellt. Die Fusionsproteine ssTM1-DEVDG-Gal4 und ssTM1-DEVNG-Gal4 wurden
durch Insertion von doppelstängigen Oligonukleotiden, die für die Aminosäuresequenz
DEVDG oder DEVNG kodieren, in das mit Stul und Ndell geschnittenes ssTM1-Gal4
Konstrukt hergestellt.
Standardmethoden wurden zur Fraktionierung von Hefezellen verwendet (Guthrie, C. &
Fink, G. R. (1991) Guide to Yeast Gentics and Molecular Biology, Academic Press, San
Diego). SsTM1-Gal4 war in der Membranfraktion nachweisbar. Die Membranassoziation
von ssTM1-Gal4 wurde ferner durch Resistenz gegen alkalische Extraktion
nachgewiesen (Y. Fujiki et al., J. Cell Biol., 93, 97 (1982)).
Die cDNA der humanen Caspase-3 (T. Fernandes-Alnemri et al., J BioL Chem. 269,
30761 (1994); M. Tewari et al., Cell 81, 801 (1995); D. W. Nicholson et al., Nature 376,
37 (1995.)) wurde in eine Derivat des Hefeexpressionsvektors pVT100-U (2626. T.
Vernet et al., Gene 52, 225 (1997).) kloniert, in dem das URA3 Gen durch das LEU2
Gen ersetzt wurde. In diesem Konstrukt erfolgt die Expression der Caspase-3 unter der
Kontrolle der ADH1 Promoter- und Terminatorsequenzen. Die Caspase-3 wird in
Hefezellen in die charakteristischen Untereinheiten des proteolytisch aktiven Enzyms
gespalten. Der Mechanismus der Caspase-3-Aktivierung in Hefezellen, die weder
Apoptose zeigen noch Caspase-Homologe (The Yeast Genome Directory, A
supplement to Nature 387, No. 6632) enthalten, ist nicht bekannt, aber könnte durch
Autoaktivierung aufgrund der Überexpression erfolgen.
Standardmethoden (Guthrie, C. & Finkk, G. R. (1991) Guide to Yeast Genetics and
Molecular Biology, Academic Press, San Diego; F. M. Ausubel et al., Current Protocols
in Molecular Biology ((Greene, New York, 1992) wurden angewandt um die
Expressionsvektoren für Gal4, ssTM1-Gaf4, ssTM1-DEVDG-Gal4, ssTM1-DEVNG-Gal4
und Caspase-3 in den Hefestamm SFY526 (MATa, ura3-52, his3-200, ande2-901, lys2-
801, trpl-901, leu2-3, 112, can®, gal4-542 ga180-538, URA3::Gal1-lacZ) (P. L. Bartel et
al., BioTechniques 14, 920 (1993)) einzubringen. Die Preparation von Proteinextrakten
und β-gal assays folgte Standardmethoden (Gurthrie, C. & Fink, G. R. (1991) Guide to
Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press, San Diego; F. M. Ausubel et
al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene, New York, 1992).
Claims (34)
1. Ein Verfahren zur Identifikation von Proteasen, die membranassoziierte Substrate
spalten, dadurch gekennzeichnet, daß
- A) ein rekombinantes Fusionsprotein, bestehend aus mindestens einem Reporteranteil und einer Proteasespaltsequenz in einem geeigneten Zeilsystem exprimiert wird, das mit einer Membran assoziiert und
- B) ein weiteres Protein in dem gleichen Zellsystem exprimiert wird, und
- C) das Vorhandensein des abgespaltenen Reporteranteils nachgewiesen wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Proteasespaltsequenz ganz oder teilweise innerhalb der Zellmembran lokalisiert ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Proteasespaltsequenz ganz oder teilweise innerhalb des Zytosols lokalisiert ist.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
Fusionsprotein durch einen zusätzlichen Ankeranteil in der Membran verankert ist.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
Fusionsprotein durch die membranassoziierte Proteasespaltsequenz in der
Membran verankert ist.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die
membranassoziierte Protease-Spaltsequenz und/oder der Reporteranteil und/oder
der Ankeranteil des Fusionsproteins durch einen Abstandshalter verbunden sind.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das
erfindungsgemäße Fusionsprotein einen Signalanteil enthält, der das Fusionsprotein
zur Membran eines dafür geeigneten Zellsystems dirigiert.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das
geeignete Expressionsystem ein eukaryontisches Expressionssystem ist.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das
geeignete Expressionsystem ein Hefeexpressionssystem ist.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das
geeignete Expressionsystem ein Säugerexpressionssystem ist.
11. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Reporteranteil des
Fusionsproteins der Hefetranskriptionsaktivator Gal4 ist.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 und 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet,
daß der Ankeranteil des Fusionsproteins die TM1-Domäne von Presenilin 1 ist.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die
zu untersuchende Spaltsequenz mit einem Ankeranteil gemäß Anspruch 12 und
einem Reporteranteil gemäß Anspruch 11 und einem geeigneten Signalanteil
verbunden ist.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das
geeignete Expressionsystem keine systemeigenen Proteasen enthält, die membran
assoziierte Substrate spalten.
15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es
sich bei der Proteasespaltsequenz um eine Aminosäuresequenz handelt, die von
der γ-Sekretase, oder von der NOTCH Protease, oder von der Presinilin Protease
oder von den Presenilin-spaltenden Caspasen gespalten wird.
16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die
Proteasespaltsequenz das humane β amyloid precursor protein (ßAPP) oder ein Teil
davon ist.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die
Proteasespaltsequenz einer der in den Fig. 5 oder 6 dargestellten
Teilsequenzen des humanen β amyloid precursor protein's (ßAPP) ist.
18. Verfahren gemäß einem der vorangegangen Ansprüche zur Auffindung von
Proteasen, die membranassoziierte Substrate spalten und deren Gene aus
Genbibliotheken.
19. Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche zur Auffindung der γ-
Sektretase, oder der Presinilinase, oder der NOTCH-Protease oder der Presenilin
spaltenden Caspasen aus Genbibliotheken.
20. Ein rekombinantes Fusionsprotein, das mit einer zellulären Membran assoziieren
kann und mindestens einen Reporteranteil und eine Proteasespaltsequenz enthält.
21. Ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet,
daß es einen zusätzlichen Membranankeranteil enthält.
22. Ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß Anspruch 20 oder 21, dadurch
gekennzeichnet, daß es zusätzlich mindestens einen Abstandshalter zwischen den
funktionellen Anteilen des Fusionsproteins enthält.
23. Ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch
gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Signalanteil zum Zweck des zielgerichteten
Transports zur Membran eines Expressionssystems enthält.
24. Ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch
gekennzeichnet, daß der Reporteranteil der Hefetranskriptionsaktivator Gal4 ist.
25. Ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch
gekennzeichnet, daß der Ankeranteil die TM1-Domäne von Presinilin1 ist.
26. Ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 25, dadurch
gekennzeichnet, daß der Signalanteil die Signalsequenz der Hefe Invertase ist.
27. Ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 26, dadurch
gekennzeichnet, daß es als Proteasespaltsequenz mindestens eine der
Aminosäuresequenzen enthält, die spezifisch von der γ-Sekretase, oder der NOTCH
Protease, oder der Presenilin Protease oder von den Presenilin-spaltenden
Caspasen gespalten werden.
28. Ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 27, dadurch
gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein als Reporteranteil den Hefetranskriptions
aktivator Gal4, die TM1-Domäne von Presinilin 1 als Ankeranteil, und eine vermutete
Proteasespaltsequenz enthält.
29. Ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet,
daß ein zusätzlicher Signalanteil der Signalanteil der Hefe Invertase ist.
30. Ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 29, dadurch
gekennzeichnet, daß die Proteasespaltsequenz das humane β amyloid precursor
protein (ßAPP) oder ein Teil davon ist.
31. Ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 30, dadurch
gekennzeichnet, daß die Proteasespaltsequenz einer der in den Fig. 5 oder 6
dargestellten Teilsequenzen des humanen β amyloid precursor protein's (ßAPP)
entspricht.
32. Ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 31, dadurch
gekennzeichnet, daß es eine Signalsequenz gemäß Fig. 3, eine
Proteasespaltsequenz mit Abstandshalter gemäß Fig. 5 und einen Reporteranteil
gemäß Fig. 8 enthält.
32. Ein rekombinantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 32, dadurch
gekennzeichnet, daß es eine Signalsequenz gemäß Fig. 3, eine
Proteasespaltsequenz mit Abstandshalter gemäß Fig. 6 und einen Reporteranteil
gemäß Fig. 8 enthält.
33. Verwendung eines Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 18 bis 27 in einem
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17.
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