DE60020087T2

DE60020087T2 - Nachweis mtoc verrenkenden substanzen

Info

Publication number: DE60020087T2
Application number: DE60020087T
Authority: DE
Inventors: Moore David Sandy GLOVER; Maria Do Carmo Avides
Original assignee: Cyclacel Ltd
Current assignee: Cyclacel Ltd
Priority date: 1999-03-04
Filing date: 2000-03-03
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2020-03-04
Also published as: WO2000052478A1; AU2927100A; ATE295543T1; EP1159620A1; EP1159620B8; EP1159620B1; DE60020087D1; GB9905007D0

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des Asp-Proteins oder Homologer davon in einem Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die in der Lage sind, Zellen durch Stören der Bildung und/oder Aufrechterhaltung des Mikrotubuli organisierenden Zentrums in der Mitose zu arretieren. Solche Substanzen können in therapeutischen Verfahren zur Hemmung des Zellwachstums verwendet werden.
Hintergrund der Erfindung
Das Ziel vieler Antikrebstherapien besteht darin, die Zellteilung, d.h. die Mitose, in Tumorzellen zu hemmen. Die Zusammenfügung des Spindelapparats ist ein Schlüsselereignis in der Zellmitose, da der Spindelapparat für die Chromosomensegregation zwischen Tochterzellen erforderlich ist. Die Zusammenfügung des Spindelapparats ist somit ein potentielles Ziel für die Hemmung von Mitose und die Tumortherapie.
Der Spindelapparat umfaßt Mikrotubuli, welche an ihren Polen von einem Mikrotubuli organisierenden Zentrum (MTOC), das in den meisten Tierzellen als das Zentrosom bezeichnet wird, organisiert werden. Das Zentrosom selbst umfaßt ein Paar von Zentriolen, die mit einer Trübung von schlecht definiertem perizentriolaren Material (PCM) assoziiert sind. Während der Interphase entwickelt das PCM eine zytoplasmatische Anordnung von Mikrotubuli, die nach außen in Richtung des Zellperimeters hervorstehen. Eine Verdopplung des Zentrosoms findet während der Interphase statt. Die zwei Zentrosome bleiben vor der Mitose als ein einzelner Komplex zusammen, aber sobald die Mitose beginnt, teilt sich dieser Komplex in zwei auf. Jedes Zentrosom dient dann als ein separates MTOC, das eine radiale Anordnung von Mikrotubuli entwickelt, die als ein Aster bezeichnet wird. Die zwei Aster bewegen sich zu entgegengesetzten Seiten des Kerns unter Ausbildung der zwei Pole der mitotischen Spindel.
Es wurden mehrere Mutationen in einer Vielzahl experimenteller Organismen identifiziert, die zu Defekten bei der Spindelbildung führen. Eine dieser Mutationen, die asp-Mutation, wurde ursprünglich in Drosophila von Ripoll et al., 1975, identifiziert. Das asp-Gen wurde in Drosophila kloniert und von ihm wurde gezeigt, daß es ein hochgradig basisches Protein mit einem Molekulargewicht von 220 kDa codiert, welches mutmaßliche Actin- und Calmodulin-Bindungsdomänen enthält (Saunders et al., 1997).
Die abnormalen Spindelmikrotubuli, die man in der Meiose und in der Mitose einer Vielzahl von Zelltypen beobachtet, führten Saunders et al., 1997, dazu zu spekulieren, daß das asp-Genprodukt in einige Aspekte der Spindelmikrotubulidynamik involviert sei. Die Verbindung von Asp mit Mikrotubuli wurde durch den Befund, daß es mit taxolstabilisierten Mikrotubuli gemeinsam aufgereinigt wurde und nach Waschen mit 0,4 M NaCl assoziiert blieb, gezeigt. Immunlokalisation des Asp-Proteins in Syncytiumembryonen stand mit diesem Befund in Einklang. Das Asp-Protein war während der Interphase in dem Cytoplasma vorhanden und auf Mikrotubuli in den polaren Bereichen der Spindel in der Mitose bis zur Telophase, wenn es mit dem zentralen Bereich der Spindel assoziiert wurde (Saunders et al., 1997).
Zusammenfassung der Erfindung
Wir haben nun gezeigt, daß, im Gegensatz zu früheren Befunden, die darauf hindeuten, daß Asp ein mit Mikrotubuli assoziiertes Protein ist, das an den Zentrosomen der mitotischen Spindeln lokalisiert ist, Asp tatsächlich während der Mitose mit dem Zentrosom assoziiert und nach dessen Isolierung in vitro an dem Zentrosom vorhanden ist. Darüber hinaus haben wir gezeigt, daß eine Abreicherung von Asp aus Drosophila-Embryoextrakten zu dem Verlust der Fähigkeit der Extrakte führte, die Aktivität des Mikrotubuli organisierenden Zentrums (MTOC) auf salzgestrippte Zentrosomenpräparationen wiederherzustellen. Wir haben auch gezeigt, daß Antikörper, die gegen das Asp-Protein gerichtet sind, die Mikrotubuliausbildung aus den Zentrosomen in einer dosisabhängigen Art und Weise blockieren.
Daher können Substanzen, die an Asp binden und die Wechselwirkung von Asp mit dem Zentrosom stören, dazu verwendet werden, die MTOC-Integrität und folglich die normale Spindelausbildung stören, was zu einer Arretierung in der Mitose führt. Diese Substanzen können daher auch dafür verwendet werden, Mitose und Zellproliferation zu hemmen.
Dementsprechend liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Substanz, die in der Lage ist, die Integrität des Mikrotubuli organisierenden Zentrums (MTOC) zu stören, wobei das Verfahren umfaßt, daß man ein Asp-Polypeptid, wie es in SEQ ID NO:1 gezeigt ist, oder ein Fragment davon, welches in der Lage ist, in der Abwesenheit der Substanz MTOCs auszubilden und/oder zu erhalten, mit einer Kandidatensubstanz in der Gegenwart von Bestandteilen, die für MTOC-Bildung und Mikrotubulusbildung daraus erforderlich sind, in Kontakt bringt und bestimmt, ob die Substanz die MTOC-Integrität stört.
Der Begriff "Stören der MTOC-Integrität" bedeutet eine Verminderung oder Verhinderung der Bildung und/oder Aufrechterhaltung von MTOCs, insbesondere Zentrosomen, die in der Lage sind, den Mikrotubulusaufbau aus einem organisierten Zentrum unter Herstellung von asterartigen, polymerisierten Mikrotubulusstrukturen, wie beispielsweise Astern selbst, einzuleiten.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Bestandteile mit KI extrahierte Zentrosomen und einen von Asp abgereicherten Zellextrakt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Bestandteile eine teilweise gereinigte Zentrosomenpräparation und Tubulin.
Kandidatensubstanzen, die nach dem Testverfahren der Erfindung identifiziert wurden, können weiter in Mitoseinhibitionstests getestet werden, welche umfassen, daß man eine Substanz, von welcher durch das oben beschriebene Testverfahren bestimmt wurde, daß sie die MTOC-Integrität stört, an eine Zelle verabreicht und bestimmt, ob die Substanz die Mitose in der Zelle hemmt.
Die vorliegende Erfindung liefert auch die Verwendung eines Asp-Polypeptids, wie es in SEQ ID NO:1 gezeigt ist, oder eines Fragments davon, welches in der Lage ist, die Bildung von MTOCs zu stimulieren und/oder MTOCs zu erhalten, in einem Test zur Identifizierung einer Substanz, die in der Lage ist, die MTOC-Integrität zu stören.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Obwohl die hierin erwähnten Techniken im allgemeinen auf dem Gebiet gut bekannt sind, wird insbesondere auf Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995) und John Wiley & Sons, Inc. Bezug genommen.
A. Asp-Polypeptide
Asp-Polypeptide für die Verwendung in den Testverfahren der vorliegenden Erfindung umfassen das Drosophila-Asp-Polypeptid, welches bei Saunders et al., 1997, J. Cell Biol., Band 137, 4, S. 881-890, beschrieben ist, und Homologe, Varianten, Derivate und Fragmente davon. Die Aminosäure- und Nukleotidsequenz von Drosophila-Asp, welches bei Saunders et al., 1997, beschrieben ist, ist als SEQ ID NO:1 gezeigt.
Somit umfaßt die vorliegende Erfindung Varianten, Homologe oder Derivate der Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung sowie Varianten, Homologe oder Derivate der Nukleotidsequenz, welche die Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung codiert. In Bezug auf Fragmente können verkürzte Versionen der oben genannten in den Tests der vorliegenden Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Fragmente in der Lage sind, die MTOC-Bildung und/oder -Erhaltung zu stimulieren, was durch die Fähigkeit der MTOCs, Aster zu bilden, bestimmt wird.
Der Begriff "Mikrotubulusbildungszentrum" bedeutet ein Zentrosom, das in der Lage ist, als ein Zentrum für Mikrotubulusbildung zu wirken. Vorzugsweise ist das Zentrosom in der Lage, als ein Zentrum für die Mikrotubulusbildung während der Mitose zu wirken. Somit bezieht sich der Begriff "Mi krotubulusbildungszentrum" auf ein intaktes MTOC (Zentrosom), das in der Lage ist, Aster von Mikrotubuli zu bilden.
Der Begriff "Integrität des Mikrotubuli organisierenden Zentrums", welcher durchgängig verwendet wird, umfaßt sowohl die Bildung von MTOCs als auch deren Aufrechterhaltung in einem Zustand, der in der Lage ist, Aster zu bilden.
Asp-Polypeptide für eine Verwendung in der Erfindung können mit rekombinanten Mitteln, z.B. solchen, wie sie nachfolgend beschrieben werden, hergestellt werden. Sie können jedoch auch mit synthetischen Mitteln hergestellt werden, bei denen Techniken angewendet werden, die den Fachleuten gut bekannt sind, wie beispielsweise Festphasensynthese. Peptide für eine Verwendung in der Erfindung können auch als Fusionsproteine hergestellt werden, z.B. zur Unterstützung bei der Extraktion und Reinigung. Beispiele für Fusionsproteinpartner umfassen Glutathion-S-Transferase (GST), 6xHis, Gal4 (DNA-bindende und/oder Transkriptionsaktivierungsdomänen) und β-Galaktosidase. Es kann auch zweckmäßig sein, zwischen den Fusionsproteinpartner und die interessierende Proteinsequenz eine Stelle für proteolytische Spaltung aufzunehmen, um ein Entfernen von Fusionsproteinsequenzen zu ermöglichen. Vorzugsweise wird das Fusionsprotein die Aktivität des interessierenden Proteins bei der Aufrechterhaltung der Integrität des Mikrotubuli organisierenden Zentrums nicht behindern.
Alternativ können Asp-Polypeptide aus Vertebratenzellen, wie Insekten- oder Säugerzellen, gereinigt werden. Ein ausführliches Protokoll ist in Abschnitt E beschrieben.
Proteine für eine Verwendung in der Erfindung können in einer im wesentlichen isolierten Form vorliegen. Es ist klar, daß das Protein mit Trägern oder Verdünnungsmitteln, welche den beabsichtigten Zweck des Proteins nicht stören, gemischt sein kann und dennoch als im wesentlichen isoliert angesehen wird. Ein Protein der Erfindung kann auch in einer im wesentlichen gereinigten Form vorliegen, wobei diese dann im allgemeinen das Protein in einer Zubereitung enthalten wird, in welcher mehr als 90%, z.B. 95%, 98% oder 99%, des Proteins in der Zubereitung ein Asp-Polypeptid ist.
B. Polynukleotide
Polynukleotide für eine Verwendung gemäß der Erfindung umfassen Nukleinsäuresequenzen, welche die Aminosäuresequenzen der Erfindung codieren. Sie umfassen auch die als SEQ ID NO:2 gezeigte Drosophila-Asp-cDNA-Sequenz und Fragmente. Dem Fachmann wird klar sein, daß viele verschiedene Polynukleotide infolge der Degeneration des genetischen Codes das gleiche Polypeptid codieren können. Darüber hinaus sollte klar sein, daß Fachleute unter Anwendung von Routinetechniken unter Berücksichtigung der Codonverwendung eines bestimmten Wirtsorganismus, in welchem die Polypeptide der Erfindung exprimiert werden sollen, Nukleotidsubstitutionen durchfüh ren können, welche die von den Polynukleotiden codierte Polypeptidsequenz für eine Verwendung gemäß der Erfindung nicht beeinflussen.
Polynukleotide für eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können DNA oder RNA umfassen. Sie können einzelstrangig oder doppelstrangig sein. Sie können auch Polynukleotide sein, welche darin synthetische oder modifizierte Nukleotide enthalten. Es ist eine Vielzahl verschiedener Arten der Modifikation an Oligonukleotiden auf dem Gebiet bekannt. Diese umfassen Methylphosphonat- und Phosphorothionatgrundgerüste, Hinzufügung von Acridin- oder Polylysinketten an den 3'- und/oder 5'-Enden des Moleküls. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sollte klar sein, daß die hierin beschriebenen Polynukleotide nach jedem auf dem Gebiet verfügbaren Verfahren modifiziert werden können. Solche Modifikationen können durchgeführt werden, um die in vivo-Aktivität oder die Lebensdauer von Polynukleotiden der Erfindung zu erhöhen.
Polynukleotide für eine Verwendung gemäß der Erfindung können zur Herstellung eines Primers, z.B. eines PCR-Primers, eines Primers für eine alternative Vervielfältigungsreaktion, eine Sonde, die z.B. mit einer durch herkömmliche Mittel unter Verwendung von radioaktiven oder nicht radioaktiven Markierungen erkennbaren Markierung markiert ist, verwendet werden, oder die Polynukleotide können in Vektoren kloniert werden. Solche Primer, Sonden und andere Fragmente werden wenigstens 15, vorzugsweise wenigstens 20, z.B. wenigstens 25, 30 oder 40, Nukleotide lang sein und werden, wie es hierin benutzt wird, für eine Verwendung in der Erfindung auch mit dem Begriff Polynukleotide bezeichnet.
Polynukleotide, wie DNA-Polynukleotide und -Sonden, für eine Verwendung gemäß der Erfindung können rekombinant, synthetisch oder mit jedem Mittel, das den Fachleuten auf dem Gebiet zur Verfügung steht, hergestellt werden. Sie können auch durch Standardtechniken kloniert werden.
Im allgemeinen werden Primer mit synthetischen Mitteln hergestellt werden, die eine schrittweise Herstellung der gewünschten Nukleinsäuresequenz ein Nukleotid nach dem anderen umfassen. Techniken zu deren Durchführung unter Verwendung automatisierter Techniken stehen auf dem Gebiet fertig zur Verfügung.
Längere Polynukleotide werden im allgemeinen unter Anwendung von rekombinanten Mitteln hergestellt, z.B. unter Verwendung von PCR- (Polymerasekettenreaktion-) Klonierungstechniken. Dies wird die Herstellung eines Primerpaares (mit z.B. etwa 15 bis 30 Nukleotiden) umfassen, die einen Bereich der Asp-Sequenz, welche kloniert werden soll, flankieren, Inkontaktbringen der Primer mit mRNA oder cDNA, die aus einer tierischen oder menschlichen Zelle erhalten wurde, Durchführen einer Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen, welche eine Vervielfältigung des gewünschten Bereichs bewirken, Isolieren des vervielfältigten Fragments (z.B. durch Reinigen des Reaktionsgemischs auf einem Agarosegel) und Gewinnen der vervielfältigten DNA. Die Primer können so ent worfen sein, daß sie geeignete Restriktionsenzymerkennungsstellen enthalten, so daß die vervielfältigte DNA in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden kann.
C. Nukleotidvektoren
Polynukleotide für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung können in einen rekombinanten, replizierbaren Vektor aufgenommen sein. Der Vektor kann dafür verwendet werden, die Nukleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle zu replizieren. Somit liefert die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung von Polynukleotiden für eine Verwendung in der Erfindung, indem man ein Polynukleotid der Erfindung in einen replizierbaren Vektor einbringt, den Vektor in eine kompatible Wirtszelle einbringt und die Wirtszelle unter Bedingungen, welche eine Replikation des Vektors erlauben, züchtet. Der Vektor kann aus der Wirtszelle gewonnen werden. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, wie E. coli, Hefe, Säugerzellinien und andere eukaryontische Zellinien, z.B. Sf9-Insektenzellen.
Vorzugsweise ist ein Polynukleotid für eine Verwendung gemäß der Erfindung in einem Vektor funktionsfähig mit einer Kontrollsequenz verknüpft, welche die Expression der codierenden Sequenz durch die Wirtszelle ermöglichen kann, d.h. der Vektor ist ein Expressionsvektor. Der Begriff "funktionsfähig verknüpft" bedeutet, daß die beschriebenen Bestandteile in einem Verhältnis zueinander stehen, welches ihnen erlaubt, in ihrer vorgesehenen Art und Weise zu funktionieren. Eine regulatorische Sequenz, die mit einer codierenden Sequenz "funktionsfähig verknüpft" ist, wird in solch einer Art und Weise ligiert, daß unter Bedingungen, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind, eine Expression der codierenden Sequenz erreicht wird.
Die Kontrollsequenzen können z.B. durch die Hinzufügung weiterer Transkriptionsregulationselemente modifiziert werden, um das Niveau der Transkription, die durch die Kontrollsequenzen gesteuert wird, auf Transkriptionsmodulatoren stärker ansprechend macht.
Vektoren für eine Verwendung gemäß der Erfindung können in eine geeignete Wirtszelle transformiert oder transfiziert werden, wie es unten beschrieben wird, um eine Expression eines Proteins der Erfindung zu liefern. Dieses Verfahren kann das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, wie es oben beschrieben ist, unter Bedingungen, die eine Expression einer codierenden Sequenz, die das Protein codiert, durch den Vektor liefern, und wahlweise die Gewinnung des exprimierten Proteins umfassen.
Die Vektoren können z.B. Plasmid- oder Virusvektoren sein, die mit einem Replikationsursprung, wahlweise einem Promotor für die Expression des Polynukleotids und wahlweise einem Regulator des Promotors ausgestattet sind. Die Vektoren können ein oder mehrere selektierbare Markergene enthalten, z.B. ein Ampicillinresistenzgen im Falle eines bakteriellen Plasmids oder ein Neomycinre sistenzgen für einen Säugervektor. Vektoren können beispielsweise dafür verwendet werden, eine Wirtszelle zu transfizieren oder zu transformieren.
Kontrollsequenzen, die funktionsfähig mit Sequenzen, die Asp-Polypeptide codieren, verknüpft sind, umfassen Promotoren/Verstärker und andere Expressionsregulationssignale. Diese Kontrollsequenzen können so ausgewählt sein, daß sie mit der Wirtszelle, für welche der Expressionsvektor für eine Verwendung darin ausgestaltet ist, kompatibel sind. Der Begriff Promotor ist auf dem Gebiet gut bekannt und bezeichnet Nukleinsäurebereiche, die hinsichtlich Größe und Komplexität von Minimalpromotoren bis zu Promotoren, die aufstromig liegende Elemente und Verstärker umfassen, reichen.
Der Promotor wird typischerweise unter Promotoren ausgewählt, die in Säugerzellen funktionieren, obwohl auch prokaryontische Promotoren und Promotoren, die in anderen eukaryontischen Zellen, insbesondere Insektenzellen, funktionieren, verwendet werden können. Der Promotor ist typischerweise von Promotorsequenzen von viralen oder eukaryontischen Genen abgeleitet. Zum Beispiel kann er ein Promotor sein, der von dem Genom einer Zelle, in welchem Expression stattfinden soll, abgeleitet ist. In Bezug auf eukaryontische Promotoren können diese Promotoren sein, die in einer ubiquitären Art und Weise funktionieren (wie Promotoren von α-Actin, β-Actin, Tubulin) oder alternativ in einer gewebespezifischen Art und Weise (wie Promotoren der Gene für Pyruvatkinase). Sie können auch Promotoren sein, die auf spezifische Stimuli ansprechen, z.B. Promotoren, die Steroidhormonrezeptoren binden. Virale Promotoren können ebenfalls verwendet werden, z.B. der Promotor für die lange terminale Sequenzwiederholung des Moloney-Mausleukämievirus (MMLV LTR), der Promotor des Rous-Sarkomvirus- (RSV-) LTR oder der Promotor des humanen Cytomegalovirus- (CMV-) IE.
Es kann auch vorteilhaft sein, daß die Promotoren induzierbar sind, so daß die Niveaus der Expression des heterologen Gens während der Lebensdauer der Zelle reguliert werden können. Induzierbar bedeutet, daß die Niveaus der Expression, die man unter Verwendung des Promotors erhält, reguliert werden können.
Darüber hinaus kann jeder dieser Promotoren durch die Hinzufügung weiterer regulatorischer Sequenzen, z.B. Verstärkersequenzen, modifiziert werden. Es können auch chimäre Promotoren verwendet werden, die Sequenzelemente von zwei oder mehr verschiedenen der oben beschriebenen Promotoren enthalten.
D. Wirtszellen
Vektoren und Polynukleotide für eine Verwendung gemäß der Erfindung können zum Zwecke der Replikation der Vektoren/Polynukleotide und/oder der Expression von Asp-Polypeptiden in Wirtszellen eingebracht werden. Obwohl die Asp-Polypeptide unter Verwendung von prokaryontischen Zel len als Wirtszellen produziert werden können, ist es bevorzugt, eukaryontische Zellen zu verwenden, z.B. Hefe-, Insekten- oder Säugerzellen, insbesondere Säugerzellen.
Vektoren/Polynukleotide für eine Verwendung in der Erfindung können unter Verwendung einer Vielzahl von auf dem Gebiet bekannten Techniken, wie Transfektion, Transformation und Elektroporation, in geeignete Wirtszellen eingebracht werden. Wo Vektoren/Polynukleotide der Erfindung an Tiere verabreicht werden sollen, sind mehrere Techniken auf dem Gebiet bekannt, z.B. Infektion mit rekombinanten viralen Vektoren, wie Retroviren, Herpes simplex-Viren und Adenoviren, direkte Injektion von Nukleinsäuren und biolistische Transformation.
E. Proteinexpression und -reinigung
Wirtszellen, welche Polynukleotide für eine Verwendung gemäß der Erfindung enthalten, können zur Expression von Proteinen für eine Verwendung gemäß der Erfindung benutzt werden. Wirtszellen können unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden, welche eine Expression der Asp-Polypeptide erlauben. Die Expression der Asp-Polypeptide kann konstitutiv sein, so daß sie kontinuierlich produziert werden, oder induzierbar, wobei ein Stimulus zur Initiierung der Expression benötigt wird. Im Falle einer induzierbaren Expression kann die Proteinproduktion, wenn sie benötigt wird, z.B. durch Zugabe einer Induktorsubstanz zu dem Kulturmedium, z.B. Dexamethason oder IPTG, initiiert werden.
Proteine für eine Verwendung gemäß der Erfindung können aus Wirtszellen mittels einer Vielzahl von auf dem Gebiet bekannten Techniken extrahiert werden, einschließlich enzymatischer, chemischer und/oder osmotischer Lyse und physikalischer Zerstörung.
Polypeptide für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung können auch aus Extrakten von Zellen, in welchen sie natürlich vorkommen, gereinigt werden. Zum Beispiel kann Drosophila-Asp aus Drosophila-Embryonen gereinigt werden. Ausgangszellen können z.B. von ganzen Organismen oder von Zellen in Gewebekultur erhalten werden. Ein bestimmtes Reinigungsprotokoll für Drosophila-Asp aus Embryonen ist das folgende.
Drosophila-Embryonen werden über einen Zeitraum von drei Stunden gesammelt und durch Inkubation in 50% Natriumhypochlorid für 3 min von der Zottenhaut befreit. Das Bleichmittel wird dann durch ausgiebiges Waschen mit Wasser entfernt. Die Embryonen werden dann in Lysepuffer gewaschen (0,1 M Pipes/NaOH, pH 6,6, 5 mM EGTA, 1 mM MgSO₄, 0,9 M Glycerol, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1 mg/ml Aprotinin, 1 mg/ml Leupeptin und 1 mg/ml Pepstatin). Etwa 3 ml Embryonen werden in 2 Volumen von eiskaltem Lysepuffer mit einem Dounce-Homogenisierer oder einem Pistill und einem Mörser homogenisiert. Die Mikrotubuli werden durch Inkubation auf Eis für 15 min depolymerisiert, und der Extrakt wird bei 16.000 × g für 30 min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird bei 135.000 × g für 90 min bei 4°C erneut zentrifugiert. Mikrotubuli in dem resultierenden Überstand werden durch Zugabe von GTP auf eine Endkonzentration von 1 mM, Zugabe von Taxol auf eine Endkonzentration von 20 μM und Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min polymerisiert. Aliquote Teile des Extrakts von 3 ml werden auf 3 ml 15%-ige Sucrosekissen aufgeschichtet, die in Lysepuffer, der mit 20 μM Taxol und 1 mM GTP versetzt war, hergestellt worden waren. Nach Zentrifugieren bei 54.000 × g für 30 min bei 20°C unter Verwendung eines Schwingbecherrotors wird das Pellet in Lysepuffer, der Taxol und GTP enthält, suspendiert. Dies liefert auch einen geeigneten Zellextrakt für die Verwendung in den unten beschriebenen Mikrotubulusbildungstests.
Zum Extrahieren der mit Mikrotubuli assoziierten Proteine wird das Pellet mit 400–500 mM NaCl extrahiert. Nach Zentrifugation wird das Pellet dann mit 1 M NaCl extrahiert, zentrifugiert und abschließend mit 1–2 M KI extrahiert. Gereinigtes Asp-Protein ist in der löslichen KI-Fraktion vorhanden, welche dann typischerweise mittels Ultrafiltration unter Verwendung des Millipore Ultrafree-Systems konzentriert wird. Die Fraktionen können auch vor der Lagerung und Verwendung gegen einen geeigneten Puffer dialysiert werden.
Wir haben gezeigt, daß das Protein bei Verwendung dieser Reinigungstechnik biologische Aktivität behält, und wenn es zu einem bezüglich Asp mutierten Embryonenextrakt hinzugefügt wird, kann es den Defekt hinsichtlich der Organisation der Mikrotubuli bildenden Aktivität von Zentrosomen korrigieren. Auf andere Arten von Organismen werden modifizierte Protokolle anwendbar sein. Zum Beispiel sind dem Fachmann für die Reinigung von Säugermikrotubuli und deren assoziierte Proteine (MAPs) Protokolle bekannt. Wenn die MAPs erst einmal gemäß diesen Protokollen unter Verwendung von NaCl extrahiert wurden, kann das Asp-Protein typischerweise noch immer in dem Pellet vorhanden sein. Das Asp-Protein kann dann mit 1–2 M KI extrahiert werden. Die Extraktbedingungen können variieren, aber sie können von einer Person, die in der Fraktionierung von Zellextrakten bewandert ist, einfach bestimmt werden.
F. Tests
Die Tests der vorliegenden Erfindung sind geeignet zur Identifizierung von Substanzen, welche die organisierende Aktivität des Mikrotubulusbildungszentrums, welche durch ein Asp-Polypeptid vermittelt wird (wobei eine Bezugnahme darauf Homologe, Varianten, Derivate und Fragmente umfaßt, wie sie oben beschrieben sind), hemmt. Solche Tests werden typischerweise in vitro durchgeführt. Es werden auch Tests bereitgestellt, welche die Wirkungen von Kandidatensubstanzen testen, die in vorläufigen in vitro-Tests an intakten Zellen in Gesamtzelltests identifiziert wurden.
Kandidatensubstanzen
Eine Substanz, welche die organisierende Aktivität des Mikrotubulusbildungszentrums (d.h. die Aufrechterhaltung der MTOC-Integrität), vermittelt durch ein Asp-Polypeptid, hemmt, kann dies auf mehrere Weisen. Sie kann direkt die Bindung von Asp an einen Bestandteil des Zentrosoms der zwei Bestandteile stören, indem sie beispielsweise an Asp bindet und die Stelle der Wechselwirkung mit dem anderen Bestandteil maskiert oder verändert. Kandidatensubstanzen dieser Art können bequem durch in vitro-Bindungstests, wie sie beispielsweise unten beschrieben sind, vorläufig durchmustert und dann in einem Mikrotubulusbildungstest, wie er unten beschrieben wird, getestet werden. Beispiele für Kandidatensubstanzen umfassen Antikörper, welche Asp erkennen.
Eine Substanz, die direkt an Asp binden kann, kann auch dessen organisierende Aktivität des Mikrotubulusbildungszentrums hemmen, indem sie dessen subzelluläre Lokalisation verändert und dadurch verhindert, daß Asp und Bestandteile des Zentrosoms innerhalb der Zelle in Kontakt kommen. Dies kann getestet werden, indem man z.B. die unten beschriebenen Gesamtzelltests verwendet. Nicht funktionale Homologe von Asp können ebenfalls hinsichtlich Hemmung der organisierenden Aktivität des Mikrotubulusbildungszentrums getestet werden, da sie mit Asp bezüglich einer Bindung an Bestandteile des Zentrosoms konkurrieren können, während sie nicht in der Lage sind, die Bildungsaktivität des Mikrotubuli organisierenden Zentrums zu stimulieren, oder die Funktion des an das Zentrosom gebundenen Asp blockieren. Solche nicht funktionalen Homologen können natürlich vorkommende Asp-Mutanten und modifizierte Asp-Sequenzen oder Fragmente davon umfassen.
Alternativ kann die Substanz, statt daß sie die Assoziation der Komponenten direkt verhindert, die biologisch verfügbare Menge an Asp unterdrücken. Dies kann durch Hemmen der Expression des Bestandteils, z.B. auf der Stufe der Transkription, der Transkriptstabilität, der Translation oder der posttranslationalen Stabilität, erfolgen. Ein Beispiel für solch eine Substanz wäre Antisense-RNA oder doppelstrangige störende RNA-Sequenzen, welche das Ausmaß an Asp-mRNA-Biosynthese unterdrücken.
Geeignete Kandidatensubstanzen umfassen Peptide, insbesondere solche mit einer Größe von etwa 5 bis 30 oder 10 bis 25 Aminosäuren, auf der Grundlage der Sequenz der verschiedenen Domänen von Drosophila-Asp, was in Abschnitt A beschrieben ist, oder Varianten solcher Peptide, in welchen ein oder mehrere Reste substituiert wurden. Peptide aus Ansammlungen von Peptiden umfassen zufällige Sequenzen oder Sequenzen, welche konsistent verändert wurden, um sicherzustellen, daß ein maximal diversifizierter Bereich von Peptiden verwendet werden kann.
Besonders bevorzugte Peptide umfassen Peptide, die z.B. eine oder mehrere p34^cdc2-Konsensusphosphorylierungsstellen (wie beispielsweise die Reste 267–271, 272–276, 291–295, 387-391, 421–425 oder 473–477 von SEQ ID NO:1), eine oder mehrere MAP-Kinase-Konsensusphosphorylierungsstellen (wie beispielsweise die Reste 140144, 237–241, 269–273 oder 471–475 von SEQ ID NO:1), eine oder mehrere Epitopphosphorylierungsstellen des monoklonalen Antikörpers MPM2 (wie beispielsweise die Reste 155–160 oder 237–243 von SEQ ID NO:1), eine mutmaßliche Actinbindungsstelle (wie beispielsweise die Reste 743–875 von SEQ ID NO:1) oder ein oder mehrere IQ-Motive (Stellen der Wechselwirkung mit Mitgliedern der Calmodulin-Proteinfamilie (Cheny und Mooseker, 1992)) (wie beispielsweise die Reste 911–940, 1293–1322, 1374–1403, 1563-1591 oder 1597–1624 von SEQ ID NO:1) enthalten. Diese Peptide können durch Insertion, Deletion oder Substitution modifiziert werden (einschließlich durch Verwendung von nicht natürlich vorkommenden Aminosäuren und Analogen).
Bevorzugte Peptide umfassen somit Peptide, die im wesentlichen aus 5 bis 35 Aminosäuren bestehen, die eine unter den Resten x bis y von SEQ ID NO:1 ausgewählte Aminosäuresequenz umfassen, wobei x bis y 267–271, 272–276, 291–295, 387–391, 421–425, 473–477, 140–144, 237241, 269-273, 471–475, 155–160, 237–243, 743–875, 911–940, 1293–1322, 1374–1403, 1563-1591 und 1597-1624 ist.
Geeignete Kandidatensubstanzen umfassen auch Antikörperprodukte (z.B. monoklonale und polyklonale Antikörper, Einzelkettenantikörper, chimäre Antikörper und CDR-gepfropfte Antikörper), die für Asp spezifisch sind. Darüber hinaus können auch Kombinationsbibliotheken, Peptide und Peptidmimetika, definierte chemische Gruppen, Oligonukleotide und Bibliotheken von natürlichen Produkten hinsichtlich Aktivität als Inhibitoren der organisierenden Aktivität des Mikrotubulusbildungszentrums in Tests, wie solchen, die unten beschrieben werden, durchmustert werden. Die Kandidatensubstanzen können in einer ersten Durchmusterung in Ansätzen von z.B. zehn Substanzen pro Reaktion eingesetzt werden, und die Substanzen derjenigen Ansätze, welche eine Inhibition zeigen, können einzeln getestet werden. Kandidatensubstanzen, welche in in vitro-Durchmusterungen Aktivität zeigen, wie diejenigen, die unten beschrieben werden, können dann in Gesamtzellsystemen getestet werden, wie in Säugerzellen, welche dem Inhibitor ausgesetzt und hinsichtlich Inhibition der Mitose getestet werden.
Asp-Bindungstests
Eine Art von vorläufigem Test zur Identifizierung von Substanzen, die Asp binden, umfaßt das Inkontaktbringen eines Asp-Polypeptids, welches an einem festen Träger immobilisiert ist, mit einer nicht immobilisierten Kandidatensubstanz und Bestimmen ob und/oder in welchem Ausmaß das Asp-Polypeptid und die Kandidatensubstanz aneinander binden. Alternativ kann die Kandidatensubstanz immobilisiert und das Asp-Polypeptid nicht immobilisiert sein.
In einem bevorzugten Testverfahren wird das Asp-Polypeptid an Kügelchen, wie beispielsweise Agarosekügelchen, immobilisiert. Typischerweise wird dies erreicht, indem man den Bestandteil als ein GST-Fusionsprotein in Bakterien, Hefe oder höheren eukaryontischen Zellinien exprimiert und das GST-Fusionsprotein aus rohen Zellextrakten unter Verwendung von Glutathion- Agarosekügelchen reinigt (Smith und Johnson, 1988). Als eine Kontrolle wird die Bindung der Kandidatensubstanz, welche nicht als ein GST-Fusionsprotein vorliegt, an das immobilisierte Asp-Polypeptid in der Abwesenheit des Asp-Polypeptids bestimmt. Die Bindung der Kandidatensubstanz an das immobilisierte Asp-Polypeptid wird dann bestimmt. Diese Art von Test ist auf dem Gebiet als ein GST-Pulldown-Test bekannt. Wiederum kann die Kandidatensubstanz immobilisiert und das Asp-Polypeptid nicht immobilisiert sein.
Es ist auch möglich, diese Art von Test unter Verwendung verschiedener Affinitätsreinigungssysteme zur Immobilisierung eines der Bestandteile durchzuführen, z.B. Ni-NTA-Agarose und mit Histidin markierte Bestandteile.
Eine Bindung des Asp-Polypeptids an die Kandidatensubstanz kann durch eine Vielzahl von auf dem Gebiet gut bekannten Verfahren bestimmt werden. Zum Beispiel kann der nicht immobilisierte Bestandteil markiert sein (z.B. mit einer radioaktiven Markierung, einer Epitopmarkierung oder einem Enzym-Antikörper-Konjugat). Alternativ kann eine Bindung durch immunologische Nachweistechniken bestimmt werden. Zum Beispiel kann das Reaktionsgemisch Western-Blot unterzogen und der Blot mit einem Antikörper, der den nicht immobilisierten Bestandteil detektiert, sondiert werden. Es können auch ELISA-Techniken verwendet werden.
Tests auf die Bildungsaktivität des Mikrotubuli organisierenden Zentrums
Kandidatensubstanzen, z.B. solche, die unter Anwendung der oben beschriebenen Asp-Bindungstests identifiziert wurden, können unter Verwendung eines Tests auf die Bildungsaktivität des Mikrotubuli organisierenden Zentrums durchmustert werden, um zu bestimmen, ob sie in der Lage sind, MTOCs zu stören, was z.B. durch Asterbildung gemessen wird. Dieser Test umfaßt in seiner einfachsten Form die Zugabe der Kandidatensubstanz zu einem Zellextrakt, welcher bei Abwesenheit der Kandidatensubstanz eine Bildungsaktivität des Mikrotubuli organisierenden Zentrums aufweist, die zur Bildung von Astern führt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Testsystem (i) ein Asp-Polypeptid oder ein Homologes, eine Variante, ein Derivat oder ein Fragment davon und (ii) Bestandteile, die für die Bildungsaktivität des Mikrotubuli organisierenden Zentrums erforderlich sind, ausgenommen funktionales Asp, welches typischerweise durch Immunabreicherung (oder durch die Verwendung von Extrakten von Asp-Mutanten) entfernt wird. Die Bestandteile bestehen typischerweise selbst aus zwei Teilen, so daß Mikrotubulusbildung nicht stattfindet, bis die zwei Teile gemischt werden (Mikrotubulusbildung kann in der Abwesenheit von Asp stattfinden, aber das Ergebnis ist eher eine Menge unorganisierter Mikrotubuli als normaler Aster – siehe 4A vs. 4C). Das Asp kann von Anfang an in einem der zwei Teile vorhanden sein oder anschließend vor dem Mischen der zwei Teile hinzugefügt werden.
Anschließend werden das Asp-Polypeptid und die Kandidatensubstanz zu dem Komponentengemisch hinzugefügt und die Mikrotubulusbildung von Zentrosomen gemessen, beispielsweise durch Immunfärbung hinsichtlich Asp und Visualisierung der Asterbildung durch Immunfluoreszenzmikroskopie. Das Asp-Polypeptid kann vor der Zugabe zu dem Komponentengemisch mit der Kandidatensubstanz vorinkubiert werden. Alternativ können sowohl das Asp-Polypeptid als auch die Kandidatensubstanz gleichzeitig oder nacheinander in beliebiger Reihenfolge direkt zu dem Komponentengemisch hinzugefügt werden.
Die für die Bildung des Mikrotubuli organisierenden Zentrums erforderlichen Bestandteile umfassen typischerweise salzgestrippte Zentrosome, die hergestellt wurden, wie es bei Moritz et al., 1998, beschrieben ist. Das Strippen von Zentrosompräparationen mit 2 M KI entfernt die Zentrosomproteine CP60, CP190, CNN und γ-Tubulin. Unter diesen scheinen weder CP60 noch CP190 für die Mikrotubulusbildung erforderlich zu sein. Die anderen minimalen Bestandteile werden typischerweise als ein von Asp abgereicherter Zellextrakt oder zweckmäßigerweise als ein Zellextrakt von Zellen mit nicht-funktionalem Asp, z.B. Drosophila-Embryonenextrakten von bezüglich Asp mutierten Embryonen, bereitgestellt. Typischerweise wird auch markiertes Tubulin (üblicherweise β-Tubulin) hinzugefügt, um die Visualisierung der Asterbildung zu unterstützen.
Alternativ können teilweise gereinigte Zentrosome, die nicht salzgestrippt wurden, als Teil der Bestandteile verwendet werden. In diesem Fall ist nur Tubulin, vorzugsweise markiertes Tubulin, zur Vervollständigung des Komponentengemischs erforderlich.
Kandidatensubstanzen werden typischerweise zu einer Endkonzentration von 1–1000 nmol/ml, besonders bevorzugt von 1–100 nmol/ml, zugegeben. Im Falle von Antikörpern beträgt die Endkonzentration typischerweise von 100–500 μg/ml, besonders bevorzugt von 200–300 μg/ml.
Das Ausmaß der Hemmung der Asterbildung durch die Kandidatensubstanz kann durch Messen der Anzahl normaler Aster pro Einheitsfläche für eine unbehandelte Kontrollzellpräparation und durch Messen der Anzahl normaler Aster pro Einheitsfläche für Zellen, die mit der Kandidatensubstanz behandelt wurden, und Vergleichen der Ergebnisse bestimmt werden. Typischerweise wird eine Kandidatensubstanz als zur Störung der MTOC-Integrität fähig angesehen, wenn die behandelten Zellpräparationen weniger als 50%, vorzugsweise weniger als 40, 30, 20 oder 10% der Anzahl an Astern aufweisen, die man in unbehandelten Zellpräparationen findet. Es kann auch erwünscht sein, Zellen hinsichtlich γ-Tubulin zu färben, um die maximale Anzahl möglicher vorhandener MTOCs zu bestimmen, um eine Normalisierung zwischen Proben zu ermöglichen.
Gesamtzelltests
Kandidatensubstanzen können auch an Gesamtzellen hinsichtlich ihres Einflusses auf die Integrität des Mikrotubuli organisierenden Zentrums und nachfolgender Einflüsse auf die Mitose getestet werden. Vorzugsweise wurden die Kandidatensubstanzen durch die oben beschriebenen in vitro-Verfahren identifiziert. Alternativ können schnelle Gesamtdurchmusterungen auf Substanzen, die in der Lage sind, die Mitose zu hemmen, als eine vorläufige Durchmusterung verwendet und anschließend in dem oben beschriebenen in vitro-Test zur Bestätigung, daß der Einfluß auf die MTOC-Integrität besteht, verwendet werden.
Die Kandidatensubstanz, d.h. die Testverbindung, kann der Zelle auf verschiedenen Wegen verabreicht werden. Zum Beispiel kann sie direkt zu dem Zellkulturmedium hinzugefügt oder in die Zelle injiziert werden. Alternativ kann die Zelle im Falle von Polypeptidkandidatensubstanzen mit einem Nukleinsäurekonstrukt, welches die Expression des Polypeptids in der Zelle steuert, transfiziert werden. Vorzugsweise ist die Expression des Polypeptids unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors.
Typischerweise umfaßt ein Test zur Bestimmung der Wirkung einer Kandidatensubstanz, die durch das Verfahren der Erfindung identifiziert wurde, auf die Zellmitose das Verabreichen der Kandidatensubstanz an eine Zelle und Bestimmen, ob die Substanz die Mitose hemmt. Techniken zum Messen der Mitose in einer Zellpopulation sind auf dem Gebiet gut bekannt. Das Ausmaß von Mitose in behandelten Zellen wird mit dem Ausmaß von Mitose in einer unbehandelten Kontrollzellpopulation verglichen, um den Grad der Hemmung, soweit eine vorhanden ist, zu bestimmen. Zellen können auch durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung geeigneter Antikörper gegen Mikrotubulus/Asterbestandteile untersucht werden, um irgendwelche Wirkungen auf die Mikrotubulusbildung in behandelten Zellen zu bestimmen.
Die Konzentration verwendeter Kandidatensubstanzen wird typischerweise so sein, daß die Endkonzentration in den Zellen zu derjenigen, die oben für die in vitro-Tests beschrieben wurde, ähnlich ist.
Eine Kandidatensubstanz wird typischerweise als ein Inhibitor für Mitose angesehen, wenn die Mitose auf unterhalb vom 50%, vorzugsweise unterhalb von 40, 30, 20 oder 10% derjenigen, die man in unbehandelten Kontrollzellpopulationen beobachtet, reduziert wird.
G. Therapeutische Anwendungen
Da eine Hemmung der Mikrotubulusbildung die zelluläre Mitose im allgemeinen hemmt, können Substanzen, die in der Lage sind, die durch Asp vermittelte Aufrechterhaltung von MTOCs zu hemmen, welche typischerweise nach den Verfahren der Erfindung identifiziert werden, dazu verwendet werden, Mitose z.B. in sich schnell teilenden Zellen, wie solchen, die man in Tumorgewebe findet, zu hemmen. Somit können Substanzen, die in der Lage sind, durch Asp vermittelte Aufrechterhaltung von MTOCs zu hemmen, in einem Verfahren zur Hemmung der Mitose in einer Zelle, wie beispielsweise einer Säugerzelle, vorzugsweise einer menschlichen Zelle, eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine Tumorzelle.
H. Verabreichung
Substanzen, die nach den Testverfahren der Erfindung identifiziert wurden oder identifizierbar sind, können vorzugsweise mit verschiedenen Bestandteilen kombiniert werden, um Zusammensetzungen der Erfindung herzustellen. Vorzugsweise werden die Zusammensetzungen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel unter Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung kombiniert (welche für eine Anwendung am Menschen oder Tier vorgesehen sein kann). Geeignete Träger oder Verdünnungsmittel umfassen isotonische Salzlösungen, z.B. phosphatgepufferte Salzlösung. Die Zusammensetzung der Erfindung kann durch direkte Injektion verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann für eine parenterale, intramuskuläre, intravenöse, subkutane, intraokulare oder transdermale Verabreichung formuliert sein. Typischerweise kann jedes Protein in einer Dosis von 0,01–30 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise von 0,1–10 mg/kg, besonders bevorzugt von 0,1–1 mg/kg Körpergewicht, verabreicht werden.
Polynukleotide/Vektoren, welche Polypeptidbestandteile für eine Verwendung beim Hemmen der Mitose codieren, können direkt als ein nacktes Nukleinsäurekonstrukt, das vorzugsweise weiterhin flankierende Sequenzen, die zu dem Wirtszellgenom homolog sind, umfassen, verabreicht werden. Wenn die Polynukleotide/Vektoren als eine nackte Nukleinsäure verabreicht werden, kann die Menge an verabreichter Nukleinsäure typischerweise im Bereich von 1 μg bis 10 mg, vorzugsweise von 100 μg bis 1 mg, liegen. Es ist besonders bevorzugt, Polynukleotide/Vektoren zu verwenden, die spezifisch Tumorzellen ansteuern, z.B. aufgrund geeigneter regulatorischer Konstrukte oder durch die Verwendung von zielgerichteten viralen Vektoren.
Die Aufnahme von nackten Nukleinsäurekonstrukten durch Säugerzellen wird durch verschiedene bekannte Transfektionstechniken erhöht, z.B. durch solche, welche die Verwendung von Transfektionsmitteln umfassen. Beispiele für diese Mittel umfassen kationische Mittel (z.B. Calciumphosphat und DEAE-Dextran) und Lipofektanzien (z.B. Lipofectam^TM und Transfectam^TM). Typischerweise werden Nukleinsäurekonstrukte mit dem Transfektionsmittel unter Herstellung einer Zusammensetzung gemischt.
Vorzugsweise wird das Polynukleotid oder der Vektor gemäß der Erfindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel unter Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung vereinigt. Geeignete Träger und Verdünnungsmittel umfassen isotonische Salzlö sungen, z.B. phosphatgepufferte Salzlösung. Die Zusammensetzung kann für eine parenterale, intramuskuläre, intravenöse, subkutane, intraokulare oder transdermale Verabreichung formuliert sein.
Die beschriebenen Verabreichungswege und Dosierungen sind nur als eine Richtlinie vorgesehen, da ein ausgebildeter Praktiker in der Lage sein wird, auf einfache Weise den optimalen Verabreichungsweg und die optimale Dosierung für einen bestimmten Patienten und einen Zustand zu bestimmen.
Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen weiter beschrieben, welche dafür vorgesehen sind, den Fachmann auf dem Gebiet bei der Ausführung der Erfindung zu unterstützen, und den Umfang der Erfindung in keiner Weise beschränken sollen. Die Beispiele beziehen sich auf die Figuren. In den Figuren ist folgendes gezeigt:
1 Antikörper gegen Asp bedecken das Zentrosom und können die Mikrotubulusbildungsaktivität in vitro blockieren. [A bis C] zeigen die Immunlokalisation von Asp in Wildtyp-Neuroblasten von Drosophila-Larven im dritten Entwicklungsstadium. A: Immunlokalisation von γ-Tubulin (grün), Asp (rot) und DNA (blau) in der Metaphase. B: Es ist die gleiche Zelle wie in A gezeigt, aber nur mit einer Asp-Färbung. C: Eine Zelle in der frühen Anaphase, welche α-Tubulin (grün), Asp (rot) und DNA (blau) zeigt. [D bis F] zeigen Präparationen von Zentrosomen von Drosophila-Embryonen. D: γ-Tubulin (blau). E: Asp (grün). F: Eine Zusammenlegung der zwei vorherigen Abbildungen, welche auch die Aster von Mikrotubuli, die nach Inkubation mit rhodaminmarkiertem Tubulin erhalten wurden, zeigt. Das Feld G ist ein Immunoblot der Fraktionen von der abschließenden Sucrosegradientenzentrifugation in dem Zentrosomenreinigungsverfahren. Das 70%-ige Sucrosekissen wurde verworfen, und die angegebenen Fraktionen sind die ersten sechs von insgesamt 26 in dem verbleibenden Gradienten. Asp und γ-Tubulin sedimentieren gemeinsam in den Fraktionen 4 und 5, wie es angegeben ist. Fraktion 5 wurde in den Experimenten hier verwendet. Das Feld H zeigt Antikörperverdrängungstests, in welchen Zentrosome zuerst mit 0–0,3 μg/ml affinitätsgereinigtem Anti-Asp inkubiert wurden, bevor sie in Mikrotubulusbildungstests eingesetzt und schließlich zur Sichtbarmachung von γ-Tubulin immungefärbt wurden. Die Präparationen wurden hinsichtlich der Gesamtzahl an Astern von Mikrotubuli und der gesamten Zentrosomen, wie es durch Foci von γ-Tubulin angezeigt ist, ausgewertet. Maßstäbe: 10 μm.
2 Die Mitose in asp-Mutanten zeigt unfokussierte Spindelpole mit unorganisiertem γ-Tubulin. Die Felder A und B zeigen in der Metaphase arretierte Zellen in bezüglich asp^dd4 mutierten Gehirnen, in welchen α-Tubulin grün gefärbt ist und DNA blau gefärbt ist. Eine Wildtyp-Spindel ist in der Einfügung des Feldes A gezeigt. Die Felder C und D zeigen γ-Tubulin (rot) und DNA (blau) in asp^dd4-Gehirnen (vgl. mit der Wildtyp-Zelle in 1A). Maßstäbe: 10 μm.
3 Eine Wiederherstellung der MTOC-Aktivität auf salzgestrippte Zentrosome durch lösliche Embryonenextrakte wird durch Immunabreicherung von Asp verhindert. A: Bildung von rhodaminmarkierten Mikrotubuli von teilweise gereinigten Zentrosomen. Die Einfügung zeigt ein einzelnes Zentrosom in höherer Vergrößerung. B: Gleiches Feld wie unter A, immungefärbt zur Sichtbarmachung von γ-Tubulin. Routinemäßig wurde gesehen, daß 80% der hinsichtlich γ-Tubulin färbenden Körper Aster von Mikrotubuli bilden. C: Mikrotubulusbildung nach Extraktion der Zentrosome mit 1 M KI. D: Mit Kaliumiodid extrahierte Zentrosome, die vor dem Mikrotubulusbildungstest mit löslichem Extrakt von Wildtyp-Drosophila-Embryonen inkubiert wurden. E: Gleiches Feld wie unter D, immungefärbt zur Sichtbarmachung von γ-Tubulin. F: Gleiches Feld wie unter D, aber unter Verwendung eines bezüglich Asp immunabgereicherten Extrakts. Maßstäbe: 10 μm. G: Immunoblot von löslichem Embryonenextrakt vor (Spur 1) und nach Immunabreicherung von Asp (Spur 2). Der Blot wurde mit Antikörpern gegen Asp, CP190, KLP61 F, Polo und γ-Tubulin, wie es angegeben ist, sondiert.
4 Ein löslicher Extrakt aus von asp-abgeleiteten Embryonen versagte darin, die MTOC-Aktivität auf salzgestrippte Zentrosome wiederherzustellen, aber diese Fähigkeit kann durch gereinigtes Asp-Protein wiederhergestellt werden. A und C zeigen die Bildung von rhodaminmarkierten Mikrotubuli durch KI-extrahierte Zentrosome, die mit einem löslichen Extrakt von einer dreistündigen Sammlung von asp^dd1-abgeleiteten Embryonen in der Abwesenheit (A) oder Gegenwart (C) von gereinigtem Asp-Protein inkubiert wurden (geschätzte Konzentration von 5 × 10^–4 pmol/μl). Die Einfügung in C zeigt ein MTOC in höherer Vergrößerung. B ist das gleiche Feld wie das Feld C, immungefärbt zur Sichtbarmachung von γ-Tubulin. In diesem Experiment wurde gesehen, daß 70% der γ-Tubulin-färbenden Körper Aster von Mikrotubuli bilden. Maßstäbe: 10 μm. D und E: Reinigung von Asp. D: Silbergefärbtes SDS-PAGE-Gel, und E: entsprechender Immunoblot, der mit Antikörpern gegen Asp und β-Tubulin sondiert wurde. Spur 1: Gesamtextrakt; Spuren 2–4: lösliche Fraktionen nach aufeinanderfolgenden Waschschritten von mit GTP-Taxol pelletierten Mikrotubuli mit 500 mM NaCl, 750 mM NaCl und 1 M KI.
BEISPIELE
Materialien und Methoden
Immunfärbung von Drosophila-Gehirnen wurde durchgeführt, wie es zuvor beschrieben wurde (Gonzalez et al., 1990). DNA wurde mit TOTO3 (Molecular Probes) nach den Anleitungen des Herstellers gefärbt. Mitotische Spindeln wurden durch Inkubation mit monoklonalem Anti-α-Tubulin-Antikörper (Klon YL1/2 von Harlan Sera Labs), 1:10 verdünnt, sichtbar gemacht. Wir detektierten γ-Tubulin unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers von Klon GTU88 (Sigma) bei einer Verdünnung von 1:10. Anti-Asp war polyklonales Kaninchenserum Rb3133 (Saunders et al., 1997), 1:50 verdünnt. Sekundäre Antikörper wurden von Jackson Immunochemicals bezogen und nach den Anleitungen des Herstellers eingesetzt. Die Präparationen wurden in einem BioRad 1024-Konfokalabtastkopf in Verbindung mit einem Nikon Optiphot-Mikroskop visualisiert.
Zentrosome wurden von Drosophila-Embryonen nach publizierten Protokollen für die Präparation von Zentrosomen aus Eizellen des chinesischen Hamsters gereinigt (Barton et al., 1995). Die abschließende Zentrifugation erfolgte durch einen 20–62,5%-igen (w/w) Sucrosegradienten über einem 70%-igen Sucrosekissen in einem SW27-Rotor (Beckman) für 90 min bei 65.000 × g bei 4°C.
Mikrotubulusbildungstests, Extraktion mit 1 M KI und Verdrängungstests wurden durchgeführt, wie es zuvor beschrieben wurde (Moritz et al., 1998). Mikrotubuli wurden aus Drosophila-Embryonenextrakten durch Zugabe von Guanosintriphosphat (GTP) und Taxol polymerisiert (Saunders et al., 1997). Das Mikrotubuluspellet wurde aufeinanderfolgend mit 500 mM NaCl, 750 mM NaCl und 1 M KI extrahiert. Lösliche Fraktionen wurden durch Ultrafiltration unter Verwendung von Millipore Ultrafree-Systemen konzentriert. Tubulin und rhodaminmarkiertes Tubulin, die in den Zentrosomenbildungstests eingesetzt wurden, wurden von Molecular Probes bezogen.
Asp wurde aus 100 μl Drosophila-Embryonenextrakten durch Inkubation mit affinitätsgereinigtem Anti-Asp (20–50 μg), gekoppelt an Protein G-Sepharose-Kügelchen (Sigma), immunabgereichert.
Gele der SDS-Polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) wurden auf Polyvinylidendifluoridmembrane (Millipore) geblottet. Es wurden die folgenden Antikörper verwendet: Anti-Asp, Rb3133 (Saunders et al., 1997); Anti-KLP61 F (Barton et al., 1995); Anti-Polo, MA294; Anti-γ-Tubulin, GTU88 (Sigma); Anti-β-Tubulin, BX69. Alle primären Antikörper wurden 1:500 verdünnt mit der Ausnahme von MA294 und BX69, welche 1:4 verdünnt wurden. Mit Peroxidase konjugierte sekundäre Antikörper wurden von Jackson Immunochemicals bezogen und nach den Anleitungen des Herstellers eingesetzt. Gebundene Antikörper wurden mittels Chemilumineszenz unter Verwendung von Chemikalien von Amersham (ECL) oder Pierce (Supersignal) detektiert.
Ergebnisse
Asp ist ein 220 kDa großes, mit Mikrotubuli assoziiertes Protein (MAP), das man an den Polen von mitotischen Spindeln in den Syncytiumembryonen von Drosophila melanogaster findet. Es besitzt Konsensusphosphorylierungsstellen für p34^cdc2 und mitogenaktivierte Proteinkinasen und mutmaßliche Bindungsdomänen für Actin und Calmodulin. Mutationen in asp führen zu einer abnormalen Spindelmorphologie, was zu einer mitotischen Arretierung oder zu einer häufig nicht stattfindenden Chromosomenseparation in der Meiose führt. Weil die mitotischen Defekte von asp-Mutanten am besten in dem zentralen Nervensystem von Larven untersucht sind, wollten wir deren Verteilung in Zellen von vollständig montierten Präparationen dieses Gewebes sorgfältiger untersuchen. Wir fanden, daß Asp während der Mitose mit dem Zentrosom assoziiert wurde und blieb (1, A–C). In der Telophase wanderte es zu Mikrotubuli auf der Spindelseite beider Tochterkerne und war nicht mit dem Zentrosom in Zellen der Interphase assoziiert. Die Immunlokalisation von Asp an der Spindel der Telophase in Zellen des Larvengehirns ist nicht gezeigt. Asp findet man in dem Bereich zwischen den Kernen und der zentralen Spindel. In allen mitotischen Stadien von der Prophase bis zur Anaphase war das Asp-Protein asymmetrisch um das γ-Tubulin in dem PCM lokalisiert, wo es einen halbkugelförmigen Becher auszubilden schien, der die Spindelmikrotubuli berührt (1B).
In mehreren asp-Mutationen fand keine Immunfärbung von Asp an den Spindelpolen statt. Die mutierten Allelen, die wir untersucht haben, sind asp¹, asp^dd1, asp^dd4, asp^dd7 und asp^dd8 (White-Cooper et al., 1996). Der Hauptteil der mitotisch arretierten asp-Zellen hatte bipolare Spindeln mit breiten unfokussierten Polen von Mikrotubuli (2, A und B). In einem kleinen Anteil von Zellen konnte ein Pol ausreichend unorganisiert sein, so daß die Spindel monopolar erschien. Das γ-Tubulin war innerhalb eines gut organisierten Zentrosoms in diesen Zellen nicht vorhanden, aber man fand es in verteilten Klumpen an den Spindelpolen (2, C und D). Dies legte nahe, daß Asp erforderlich sein könnte, um die Struktur des zentrosomalen Mikrotubuli organisierenden Zentrums (MTOC) während der Mitose aufrechtzuerhalten.
Um zu bestätigen, daß Asp ein zentrosomales Protein war, wurden Zentrosome aus Syncytium-Drosophila-Embryonen, die ihre schnellen Kernteilungszyklen durchliefen, teilweise gereinigt. Immunoblotexperimente zeigten, daß diese Präparation sowohl bezüglich Asp als auch γ-Tubulin angereichert war (1G). Darüber hinaus wurden diese zwei Proteine durch Immunfluoreszenz an in vitro-organisierenden Zentren für rhodaminmarkierte Mikrotubuli gemeinsam lokalisiert (1, D-F). Im Gegensatz zu unseren Beobachtungen in vivo wurde Asp in allen der in vitro-MTOCs gefunden und war symmetrisch verteilt. Zunächst legt dies nahe, daß sich der Extrakt wahrscheinlich aufgrund der dominanten Wirkung der aktiven mitotischen Proteinkinase p34^cdc2 in einem mitoseartigen Zustand befand. Zum zweiten impliziert dies, daß die asymmetrische Lokalisierung, die man in intakten Zellen sieht, erfordert, daß Mikrotubuli mit Chromosomen unter Ausbildung einer Spindel in Berührung kommen. Wenn Asp auf der "Außenseite" des Zentrosoms lokalisiert war, fragten wir uns, ob Antikörper gegen Asp die Mikrotubulusbildung in dem in vitro-Test sterisch behindern könnten. Die Zentrosomenpräparation wurde daher vor der Zugabe von rhodaminmarkiertem Tubulin entweder mit affinitätsgereinigtem Anti-Asp oder Kontroll-Kaninchenimmunglobulinen inkubiert. Es wurde eine Anzahl von Kontrollantikörpern verwendet, einschließlich eines gegen den zentrosomalen Bestandteil CP190. Keiner von diesen würde eine Mikrotubulusbildung durch die Zentrosomenpräparation verhindern. Die Anzahl von Astern von gebildeten Mikrotubuli nahm proportional zu der Konzentration an Antikörper ab (1H). Jedoch blieb die Anzahl der bezüglich γ-Tubulin positiven Körper konstant, was nahelegt, daß der Antikörper eher die Mikrotubulusbildung blockierte als die Zentrosome zu stören.
Eine Extraktion von Zentrosomen mit KI zerstörte wirkungsvoll deren Mikrotubulusbildungsaktivität, wobei ein zentrosomales Gerüst zurückgelassen wurde (3C) (Schnakenberg et al., 1998; Moritz et al., 1998). Die Fähigkeit, Mikrotubuli zu bilden, kann bei solchen mit KI extrahierten Zentrosomen durch Inkubation mit der löslichen Fraktion eines Drosophila-Embryonenextrakts wiederhergestellt werden (3, D und E) (Moritz et al., 1998). Obwohl γ-Tubulin und dessen Ringkomplex (γTuRC) erforderlich sind, um die Asterbildungsfähigkeit von mit KI extrahierten Zentrosomen wiederherzustellen, sind sie nicht ausreichend und müssen durch einen mikrotubulusassoziierten Faktor ergänzt werden, von dem gefordert wird, daß er perienterisch ist (Moritz et al., 1998). Um zu testen, ob Asp-Protein zur Rekonstituierung von MTOCs von mit KI extrahierten Zentrosomen erforderlich sein könnten, führten wir eine Immunabreicherung von Asp aus einem löslichen Embryonenextrakt unter Bedingungen durch, bei denen andere zentrosomal assoziierte Proteine, einschließlich γ-Tubulin, CP190, KLP61 F und Polo, nicht entfernt wurden (3G). Dieser immunabgereicherte Extrakt war nicht in der Lage, die Fähigkeit von mit KI extrahierten Zentrosomen zur Bildung von Mikrotubuli zu Astern wiederherzustellen. Jedoch wurden viele lineare Anordnungen von Mikrotubuli gesehen (3F), was nahelegt, daß der bezüglich Asp abgereicherte Extrakt Mikrotubulusbildungsfähigkeit bereitstellte, daß sie aber nicht zu diskreten Zentren organisiert war.
Im Gegensatz zu dem löslichen Extrakt von Wildtyp-Embryonen war die äquivalent lösliche Fraktion, die von asp-abgeleiteten Embryonen hergestellt worden war, nicht in der Lage, die Fähigkeit von mit KI extrahierten Zentrosomen zur Bildung von Astern von Mikrotubuli wiederherzustellen (4A). Wir untersuchten dann, ob eine Zugabe von gereinigtem Asp-Protein dem mutanten Embryonenextrakt diese Fähigkeit wieder verleihen könnte. Asp wird gemeinsam mit Mikrotubuli von Drosophila-Embryonen aufgereinigt, aber es wird nicht durch Konzentrationen an NaCl, von denen bekannt ist, daß sie die meisten MAPs entfernen, freigesetzt (Saunders et al., 1997). Es scheint daher, daß, wenn KI Asp von den Zentrosomen extrahiert, es dies wahrscheinlich auch von solchen gereinigten Mikrotubuli würde. Wir extrahierten mit NaCl gewaschene Mikrotubulipräparationen mit 2 M KI und fanden heraus, daß ein 220 kDa großes Protein, das von Antikörpern gegen Asp erkannt wird, der Hauptbestandteil der Fraktion des resultierenden Überstands war (4D und E). Diese gereinigte Asp-Fraktion wurde zu dem löslichen Extrakt, der aus asp-abgeleiteten Embryonen hergestellt worden war, hinzugefügt, und es wurde gefunden, daß er die Fähigkeit von mit KI extrahierten Zentrosomen zur Bildung von Astern von Mikrotubuli wiederherstellt (4, B und C).
Es scheint daher, daß sowohl Asp als auch γTuRC erforderlich sind, um Zentrosomengerüsten wieder Mikrotubulusbildungsaktivität zu verleihen. Weil Asp weder mit dem γTuRC gemeinsam aufgereinigt wird, noch mit γ-Tubulin gemeinsam immunpräzipitiert, ist es unwahrscheinlich, daß es eine unmittelbare Rolle in dem Bildungsprozeß spielt. Die Folgen eines Verlusts der Asp-Funktion auf Spindelpole in vivo und auf MTOCs in vitro legen vielmehr nahe, daß es dafür erforderlich ist, das γTuRC innerhalb des PCM zur Ausbildung eines Bildungszentrums für Mikrotubuli in der Mitose zu organisieren. In asp-Mutanten kann sich nach wie vor eine Spindel ausbilden, was höchstwahr scheinlich die bekannte Fähigkeit von mitotischem Chromatin und Motorproteinen widerspiegelt, eine bipolare Spindel in der Abwesenheit von Zentrosomen zu organisieren. Jedoch ist eine Konsequenz der unorganisierten Zentrosome und Spindelpole, daß die Zellen in einem metaphasenartigen Zustand arretiert werden, was nahelegt, daß der Kontrollpunkt der Spindelintegrität aktiviert wurde. Es ist wahrscheinlich, daß die Funktion des Asp-Proteins später in dem mitotischen Zyklus modifiziert wird, da beobachtet wurde, daß es mit den Mikrotubuli der Telophasenspindel assoziiert, eine Eigenschaft, die mit dessen Reinigung als eine MAP konsistent ist. Das Fehlen jeglicher offensichtlicher Assoziierung mit Mikrotubuli während der Interphase legt jedoch nahe, daß dessen Eigenschaften möglicherweise durch Phosphorylierung beim Eintritt in die Mitose moduliert werden müssen, um dessen wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Kohärenz des Zentrosoms an den Spindelpolen zu aktivieren.
Literatur

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Identifizierung einer Substanz, die in der Lage ist, die Integrität des Mikrotubuli organisierenden Zentrums (MTOC) zu stören, wobei das Verfahren umfaßt, daß man ein Asp-Polypeptid, wie es in SEQ ID NO:1 gezeigt ist, oder ein Fragment davon, welches in der Lage ist, in der Abwesenheit der Substanz MTOCs auszubilden und/oder zu erhalten, mit einer Kandidatensubstanz in der Gegenwart von Bestandteilen, die für MTOC-Bildung und Mikrotubuluskeimbildung daraus erforderlich sind, in Kontakt bringt und die Mikrotubuluskeimbildung aus Zentrosomen in der Gegenwart der Kandidatensubstanz im Vergleich zu der Abwesenheit der Kandidatensubstanz mißt, um zu bestimmen, ob die Substanz die MTOC-Integrität stört.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestandteile mit KI extrahierte Zentrosomen und einen von Asp abgereicherten Zellextrakt umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestandteile eine Zentrosomenpräparation und Tubulin umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches weiterhin umfaßt, daß man eine Substanz, von der festgestellt wurde, daß sie MTOC-Integrität stört, an eine Zelle verabreicht und bestimmt, ob diese Substanz die Mitose in der Zelle hemmt.
Verwendung eines Asp-Polypeptids, wie es in SEQ ID NO:1 gezeigt ist, oder eines Fragments davon, welches in der Lage ist, die Bildung von MTOCs zu stimulieren und/oder MTOCs zu erhalten, in einem Test zur Identifizierung einer Substanz, die in der Lage ist, die MTOC-Integrität zu stören, welcher umfaßt, daß man die Mikrotubuluskeimbildung von Zentrosomen in der Gegenwart einer Kandidatensubstanz im Vergleich zur Abwesenheit der Kandidatensubstanz mißt.