DE69907239T2 - Rho-conotoxin Peptide mit selektiver antagonistischer Aktivität auf den alpha-1-adrenozeptor - Google Patents
Rho-conotoxin Peptide mit selektiver antagonistischer Aktivität auf den alpha-1-adrenozeptor Download PDFInfo
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft neue Peptide und deren Derivate, die nützlich sind als selektive α1-Adrenozeptor-Antagonisten. Die Erfindung betrifft ferner diese Peptide enthaltende pharmazeutische Zubereitungen, zum Auffinden von wirksamen Analoga dieser Peptide nützliche Nukleinsäuresonden, Tests zum Auffinden von Verbindungen mit einer selektiven α1-Adrenozeptor-Antagonistenwirkung und die Verwendung dieser Peptide von Zuständen wie solchen des Harntrakts oder kadiovaskulären Systems, ohne darauf beschränkt zu sein.
- Die Meeresschnecken der Gattung Konus (Kesselschnecken) nutzen eine trickreiche biochemische Strategie zum Fangen ihrer Beute. Als Räuber von Fischen, Würmern oder anderen Weichtieren injizieren die Kesselschnecken in ihre Beute ein Gift, das einen Cocktail kleiner aktiver Peptide enthält. Diese Toxinmoleküle, die als Conotoxine bezeichnet werden, interagieren mit der Neurotransmission durch Zielen auf eine Reihe von Rezeptoren und Ionenkanälen. Das Gift einer einzigen Konus-Art kann mehr als 100 verschiedene Peptide enthalten. Die Conotoxine werden in Klassen auf der Grundlage ihrer physiologischen Ziele unterteilt. Bisher sind zehn Klassen beschrieben worden. Die ω-Conotoxinklasse von Peptiden zielt auf und blockiert spannungsempfindliche CA2+-Kanäle, die die Neurotransmitterfreisetzung inhibieren. Die α-Conotoxine und ψ-Conotoxine zielen auf und blockieren nikotinerge ACh-Rezeptoren, die eine ganglionäre und neuromuskuläre Blockade verursachen. Peptide der μ-Conotoxinklasse blockieren spannungsempfindliche Na+-Kanäle, die Muskel- und Nervenaktionspotentiale inhibieren. Die δ-Conotoxine zielen auf und verzögern die Inaktivierung der spannungsempfindlichen Na+-Kanäle, die die neuronale Erregbarkeit vergrößern. Die κ-Conotoxinklasse der Peptide zielt auf und blockiert spannungsempfindliche K+-Kanäle und diese können ebenfalls eine verstärkte neuronale Erregbarkeit verursachen. Die Conopressine sind Vasopressinrezeptor-Antagonisten und Conotoxine sind NMDA-Rezeptor-Antagonisten. Kürzlich wurde der Prototyp einer neuen γ-Conotoxinklasse beschrieben, die auf spannungsempfindliche nonspezifische Kationkanäle zielen und eine neue σ-Conotoxinklasse, die den 5HT3-Rezeptor blockieren.
- Es wurde nun festgestellt, dass eine neue Klasse von Conotoxinen existiert, die nachfolgend als ρ-Conotoxinklasse bezeichnet wird und die durch eine Wirkung als α1-Adrenozeptor-Antagonist gekennzeichnet ist.
- α1-Adrenozeptoren spielen wichtige Rollen in vielen physiologischen und pathophysiologischen Vorgängen des kadiovaskulären und des Urogenitalsytems einschließlich einer myokardialen Inotropie und Chronotopie, einer cardialen Hypertrophie und Arrhythmien, Vasokonstriktion, der Kontraktion glatter Muskeln und Prostatakrankheiten. α1-adrenozeptor-antagonistische Arzneimittel sind deshalb sowohl Werkzeuge der Grundlagenforschung als auch therapeutische Mittel.
- Die
US 5 620 993 (Patane et al) beschreibt einige bekannte Funktionen von adrenergen Rezeptoren des α1-Subtyps als auch einige der bekannten pharmakologischen Mittel, die an diese binden. Die Peptide dieser Erfindung sind die ersten Peptide, von denen eine Wirkung als α1-Adrenozeptor-Antagonist berichtet wird. Ferner wirken ρ-Conotoxin-Peptide nicht kompetetiv zur Hemmung der Noradrenalin-Wirkung. Folglich hat es den Anschein, dass ρ-Conotoxine an einer Stelle wirken, die unterschiedlich von der Stelle der Noradrenalinaktivierung und unterschiedlich von der Stelle der Wirkung traditioneller α-Adrenorezeptor-Antagonisten wie Prazosin ist. - Folglich wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein isoliertes, synthetisches oder rekombinantes ρ-Conotoxin-Peptid mit einer selektiven Wirkung als α1-Adrenorezeptor-Antagonist bereitgestellt.
- Das ρ-Conotoxin-Peptid kann ein natürlich auftretendes Peptid sein, das aus der Kesselschnecke oder einem Abkömmling derselben isoliert ist.
- Vorzugsweise ist das ρ-Conotoxin-Peptid ein ρ-TIA oder ein Derivat davon. ρ-TIA kann isoliert werden aus dem Giftgang des Fischs, der Kesselschnecken jagd, Conus tulipa. Es ist ein Peptid, das 19 Aminosäuren umfasst und 2 Disulfidbindungen enthält. Die Aminosäuresequenz von ρ-TIA ist die folgende.
- Der C-Terminus kann eine freie Säure sein oder als Amid vorliegen.
- Der hier verwendete Begriff „selektiv" bedeutet, sofern der Zusammenhang nichts anderes verlangt, dass die Fähigkeit des Peptids als Antagonist eines α1-Adrenozeptors zu wirken beträchtlich größer ist, als seine Fähigkeit als Antagonist für andere α-Adrenozeptoren zu wirken. Vorzugsweise ist die Wirkung an anderen α-Adrenozeptoren vernachlässigbar.
- Der hier im Zusammenhang mit natürlich auftretenden ρ-Conotoxin-Peptiden wie ρ-TIA verwendete Begriff „Derivat" bezieht sich auf Peptide, die sich von den natürlich auftretenden Peptiden durch das Fehlen, das Hinzufügen oder den Ersatz oder Seitenketten-Veränderungen durch eine oder mehrere Aminosäuren unterscheiden. Solche Derivate, die keine selektive Wirkung als α1-Adrenozeptor-Antagonist aufweisen, fallen nicht in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Ein solches inaktives Derivat ist das verkürzte ρ-TIA, das nachfolgend gezeigt ist.
- Untersuchungen der C-terminalen Verkürzung von ρ-TIA haben gezeigt, dass der Rest in Position 4 wichtig für das Binden sein kann. Folglich werden Peptide, deren Argininrest in Position 4 erhalten bleibt oder mit einer anderen Aminosäure, die eine positive Ladung aufweist substituiert ist, bevorzugt.
- Es ist auch festgestellt worden, dass die Reste in den Positionen 1, 2 und 3 substituiert werden können, um die Potenz und die Selektivität des ρ-TIA zu modifizieren. Solche Modifizierungen schließen das Hinzufügen oder den Ersatz von einem oder mehrerer Tyrosinresten ein, die ein leichtes Markieren von ρ-TIA Derivaten zur Entwicklung von Tests erlauben.
- Substitutionen schließen Aminosäuren-Veränderungen ein, in denen eine Aminosäure durch einen verschiedenen natürlich auftretenden oder einen nicht herkömmlichen Aminosäurerest ersetzt ist. Solche Substitutionen können als „konservativ" klassifiziert werden, in welchem Fall ein Aminosäurerest, der in einem Polypeptid enthalten ist, mit einer anderen natürlich auftretenden Aminosäure ähnlichen Charakters sowohl in Bezug auf die Polarität, die Seiten, die Seitenkettenfunktionalität oder die Größe ersetzt ist, beispielsweise Ser↔Thr↔Pro↔Hyp↔Gly↔Ala, Val↔Ile↔Leu, His↔Lys↔Arg, Asn↔Gln↔Asp↔Glu oder Phe↔Trp↔Tyr. Selbstverständlich können einige nicht herkömmliche Aminosäuren geeignet zum Ersatz von natürlich auftretenden Aminosäuren sein. Beispielsweise Ornithin, Homoarginin, und Dimethyllysin, die verwandt sind mit His, Arg und Lys.
- Erfindungsgemäß eingeschlossene Substitutionen können auch „nicht konservativ" sein, in denen ein Aminosäurerest, der in einem Polypeptid vorliegt, ersetzt wird durch eine Aminosäure mit verschiedenen Eigenschaften wie einer natürlich auftretenden Aminosäure, einer unterschiedlichen Gruppe (beispielsweise dem Ersatz einer geladenen oder hydrophoben Aminosäure durch Alanin) oder alternativ, in denen eine natürlich auftretende Aminosäure ersetzt ist durch eine nicht übliche Aminosäure.
- Aminosäure-Substitutionen betreffen typischerweise einzelne Reste, können aber auch mehrere Reste betreffen, sowohl in Klusterform oder verteilt.
- Vorzugsweise sind die Aminosäure-Substitutionen konservativ.
- Hinzufügungen schließen die Zugabe einer oder mehrerer natürlich auftretender oder nicht üblicher Aminosäurereste ein. Deletionen schließen das Fehlen von einer oder mehreren Aminosäuren ein.
- Wie zuvor bereits festgestellt, schließt die vorliegende Erfindung Peptide ein, in denen ein oder mehrere Aminosäuren Seitenketten-Modifikationen erfahren haben. Beispiele solcher Seitenketten-Veränderungen, die erfindungsgemäß zu berücksichtigen sind, schließen Veränderungen von Aminogruppen wie durch reduktive Alkylierung, durch Reaktion mit einem Aldehyd, gefolgt von einer Reduktion mit NaBH4, die Amidierung mit Methylacetimidat, die Acylierung mit Essigsäureanhydrid, die Carbamoylierung mit Aminogruppen mit Cyanat, die Trinitrobenzylierung von Aminogruppen mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS), die Acylierung von Aminogruppen mit Bernsteinsäureanhydrid und Tetrahydrophthalsäureanhydrid und die Pyridoxylierung von Lysin mit Pyridoxal-5-phosphat, gefolgt durch Reduktion mit NaBH4, ein.
- Die Guanidingruppen oder Argininreste können unter Bildung heterocyclischer Kondensationsprodukte mit Reaktionsmitteln wie 2,3-Butandion, Phenylglyoxal und Glyoxal modifiziert werden.
- Die Carboxylgruppe kann modifiziert sein durch Carbodiimidaktivierung mittels O-Acylisoharnstoff-Bildung gefolgt von einer Derivatisierung, beispielsweise zu dem entsprechenden Amid.
- Sulfhydrylgruppen können modifiziert werden durch Carboxymethylierung mit Jodessigsäure oder Jodacetamid, Perameisensäureoxidation zu Cysteinsäure, Bildung von gemischten Disulfiden mit anderen Thiolverbindungen, Reaktion mit Maleinimid, Maleinsäureanhydrid oder anderem substituierten Maleinhydrid, Bildung von Quecksilberderivaten unter Verwendung von 4-Chlormercuribenzoat, 4-Chlormercuriphenylsulphonsäure, Phenylmercurichlorid, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol und anderen Mercuriverbindungen, Carbamoylierung mit Cyanat bei alkalischem pH-Wert. Jegliche Modifikation von Cysteinresten darf nicht die Fähigkeit des Peptids zur Bildung der erforderlichen Disulfidbindungen beeinträchtigen. Es ist auch möglich, die Sulfhydrylgruppen des Cysteins durch Selenäquivalente derart zu ersetzen, dass das Peptid eine Diselenbindung anstatt einer oder mehrerer Disulfidbindungen bildet.
- Tryptophanreste können beispielsweise modifiziert werden durch Oxidation mit N-Bromosuccinimid oder Acylierung des Indolrings mit 2-Hydroxy-5-nitrobenzylbromid oder Sulfinylhalogenen. Tyrosinreste können andererseits verändert werden durch Nitrierung mit Tetranitromethan unter Bildung eines 3-Nitrotyrosin-Derivats.
- Die Modifikation des Imidazolrings, eines Histidinrests, kann verwirklicht werden durch Alkylierung mit Jodessigsäure-Derivaten oder N-Carbethoxylierung mit Diethylpyrocarbonat.
- Der Prolinrest kann beispielsweise modifiziert werden durch Hydroxylierung in Position 4.
- Eine Liste einiger Aminosäuren mit modifizierten Seitenketten und anderen nichtnatürlichen Aminosäuren ist in der Tabelle 1 gezeigt.
- Diese Arten von Modifikationen können wichtig sein, um das Peptid zu stabilisieren, wenn es einem einzelnen als diagnostisches Mittel appliziert wird.
- Andere durch die Erfindung zu berücksichtigende Derivate schließen eine Reihe von Glycosylierungsvarianten vom vollständig nicht glycosylierten Molekül bis zu einem modifiziert glycosylierten Molekül ein, veränderte Glycosylierungsmuster können aus der Exprimierung rekombinanter Moleküle verschiedenen Wirtszellen resultieren.
- Die erfindungsgemäßen ρ-Conotoxine sind typischerweise am C-Terminal amidiert, jedoch werden Verbindungen mit einem freien Carboxylende und anderen Modifikationen am C-Terminal als unter den Schutz der vorliegenden Erfindung fallend angesehen. Vorzugsweise sind die Peptide am C-Terminal amidiert oder haben eine freie Carboxylgruppe.
- Vorzugsweise werden die natürlich auftretenden Derivate der ρ-Conotoxin-Peptide die Cys-Reste und das charakteristische Disulfidbindungsmuster erhalten. Derivate können zusätzlich Cys-Reste enthalten, vorausgesetzt, dass sie während der Bildung der Sulfidbindungen geschützt sind.
- Bei der Modifizierung zur Bildung von Derivaten von natürlich auftretenden ρ-Conotoxin-Peptiden ist es nützlich, die Aminosäuresequenz der natürlich auftretenden Peptide zu vergleichen, um zu bestimmen, welche Reste, wenn überhaupt, zwischen den wirksamen Arten konserviert werden. Der Ersatz dieser konservierten Reste ist, wenn auch nicht verboten, so jedoch weniger favorisiert als Substitutionen nicht-konservierterer Reste.
- Derivate, bei denen Ala einen oder mehrere Reste ersetzt, können zur Identifizierung des Pharmacophors verwendet werden. Vorzugsweise werden eine oder zwei Aminosäuren durch Ala gleichzeitig ersetzt. Zusätzlich können neue Peptide erzeugt werden, wo geladene, polare oder hydrophobe Reste jeweils ersetzt werden, um präziser die Wechselwirkungen zu definieren, die das Binden dieser pharmakologischen Peptidklasse an seinem Rezeptor einschließt. Nicht-konservative Ersetzungen, wo die Ladung umgekehrt ist oder polare Reste ersetzt sind durch hydrophobe Reste, können weitere Reste identifizieren, die in das Binden involviert sind. Alle diese Peptide haben das Potential eine verbesserte Wirksamkeit oder eine größere Selektivität für den α1-Adrenozeptorssubtyp bereitzustellen. Nicht-native Aminosäure-Auswechslungen können ebenfalls vorgesehen sein, um die Wirksamkeit, die Selektivität und/oder Stabilität zu verbessern.
- Exponierte Reste sind höchstwahrscheinlich involviert in das Binden am Rezeptor und können systematisch ersetzt werden. Besondere Bedeutung ist dem Wechseln von Resten zuzuordnen, die in das Binden involviert sind, und Resten an der Peripherie des Pharmacophors, die längere Seitenkettenformen oder nicht-konservierte Wechsel nutzen, um zusätzliche Bindungsinteraktionen zur Verbesserung der Wirksamkeit und/oder Selektivität aufzunehmen. Die Verringerung oder das Vergrößern von Loops und des Schwanzes von ρ-TIA modifiziert darüber hinaus die Wirksamkeit.
- Es ist festzustellen, dass ρ-TIA aufgebaut ist aus einem Schwanz (Reste 1–4) und zwei Schleifen (Reste 7–10 und 12–18), wobei die erfindungsgemäßen ρ-Conotoxin-Peptide und deren erfindungsgemäßen Abkömmlinge nicht auf solche mit dieser besonderen Anordnung der Aminosäuren und Disulfidbindungen beschränkt sind. Andere Anordnungen sind auch möglich und vorausgesetzt das daraus folgende Peptid hat eine selektive Wirkung als α1-Adrenozeptor-Antagonist, wird ein solches Peptid in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen. Vorzugsweise haben die Peptide wenigstens zwei Cystein-Reste und wenigstens eine Sulfidbindung oder gemäß einer bevorzugteren Ausführungsform vier Cystein-Reste und zwei Disulfidbindungen.
- Der Zusammenhang von Disulfidbindungen in diesen Peptiden kann sein A-C/B-D, A-D/B-C oder A-B/C-D, wobei die erstere für ρ-TIA bevorzugt ist. A, B, C und D beziehen sich auf die ersten, zweiten, dritten und vierten Cys-Reste, die jeweils in die Bildung von Disulfidbindung involviert sind.
- Diese Peptide können auch markiert sein und zur Errichtung eines Bindungsversuches zur Identifizierung neuer Moleküle, die an der gleichen Stelle wirken, verwendet werden. Beispielsweise kann ein markierter Ligand von ρ-TIA ein Tritium aufweisen oder kann ein radioaktiv markiertes Jod oder ähnliches, gebunden an Tyr, oder andere geeignete Reste, aufweisen. Ein Tyr-Scan durch jedes Peptid wird eine geeignete Stelle zum Einfügen von Tyr ergeben. Die Hemmung der Bindung eines solchen markierten Peptids an Gewebehomogenaten oder exprimierten Adrenozeptoren durch Verbindungen oder Gemische würde die Identifizierung neuer Peptide, die an dieser Stelle wirksam sind, erlauben, einschließlich von Peptiden, die eben Serum und Nerven und Muskelgewebe von Säugern, einschließlich von menschlichen Geweben, vorhanden sind. Dieser Test wird auch die Identifizierung von Nichtpeptid-Molekülen erlauben, die an derselben Stelle wie ρ-TIA wirken und die nützlich sein könnten als oral wirksame Formen dieser Peptide. Markierte Peptide werden zusätzlich Autoradiographieuntersuchungen zur Identifizierung der Stelle des Bindens des Peptids an verschiedenen Geweben erlauben.
- Teile dieser Sequenzen können verwendet werden zur Durchforschung von ESTR-Datenbanken, zum Identifizieren von Peptiden oder Proteinen in Säuren, die eine verwandte Sequenzinformation enthalten, welche zum Identifizieren von endogenen Liganden verwendet werden können, die in gleicher Weise in Säugern wirken.
- Die erfindungsgemäßen ρ-Conotoxine können unter Verwendung von Standardsyntheseverfahren für Peptide, gefolgt durch die oxidative Bildung von Disulfidbindungen, hergestellt werden, beispielsweise können lineare Peptide synthetisiert werden durch ein Festphasenverfahren unter Verwendung der BOC-Chemie, wie beschrieben von Schnoltzer et al (1992). Im Anschluss an die Entfernung der Schutzgruppen und das Abspalten vom festen Träger können die reduzierten Peptide unter Verwendung präparativer Chromatographie gereinigt werden. Die gereinigten reduzierten Peptide werden in gepufferten Systemen oxidiert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die oxidierten Peptide wurden unter Verwendung der präparativen Chromatographie gereinigt.
- Referenzen, die die Synthese von Conotoxinen beschreiben, schließen Sato et al, Lew et al und die WO 91/07980 ein.
- Die ρ-Conotoxine können auch unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie erzeugt werden. Eine Nukleotidsequenz, die die erwünschte Peptidsequenz codiert, kann in einen geeigneten Vektor insertiert und das Protein in diesem geeigneten Expressionssystem exprimiert werden. In einigen Fällen kann eine weitere chemische Modifizierung des exprimierten Peptids, beispielsweise eine C-terminale Amidierung, geeignet sein. Unter einigen Umständen kann es wünschenswert sein, eine oxidative Bildung einer Bindung des exprimierten Peptids als chemische Stufe, die der Peptidexprimierung folgt, vorzunehmen. Dieser kann eine Reduktionsstufe des ungefalteten Peptids vorgeschaltet sein. Der einschlägige Fachmann wird leicht die geeigneten Bedingungen für die Reduktion und die Oxidation des Peptids bestimmen können.
- Die Erfindung liefert ferner ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz von Nukleotiden aufweist, die für eine Sequenz des oben beschriebenen ρ-Conotoxin-Peptids codiert oder komplementär zu einer solchen Sequenz ist.
- Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Nukleisäuresonde bereitgestellt, die eine Sequenz von Nukleotiden umfasst, die komplementär sind zu einer Sequenz, die für das gesamte oder einen Teil des ρ-Conotoxinpeptins komplementär ist oder für einen Teil oder das gesamte ρ-Conotoxin-Peptid codiert.
- Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Nukleinsäuresonde umfasst diese eine Sequenz von Nukleotiden, die die Sequenz von SEQ ID NO: 1 codiert oder komplementär zu dieser ist.
- Der Bezug auf eine „Sonde" wie er vorliegend verwendet wird, schließt den Bezug auf einen Primer, der zur Verstärkung verwendet wird, oder eine Sonde zur Verwendung in einer direkten Hybridisierung ein.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist gerichtet auf Antikörper gegen die erfindungsgemäßen ρ-Conotoxin-Peptide. Solche Antikörper können monoclonal oder polyclonal sein und können ausgewählt sein aus natürlich auftretenden Antikörpern gegen diese Peptide oder können in spezifischer Weise gegen diese Peptide unter Verwendung von üblichen Techniken erzeugt sein. Im letzteren Fall können die Peptide möglicherweise zunächst mit einem Träger molekular verbunden werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper sind insbesondere nützlich als therapeutische oder diagnostische Mittel.
- In dieser Hinsicht können spezifische Antikörper zum Suchen nach erfindungsgemäßen Peptiden verwendet werden. Techniken für solche Assays sind gut bekannt und schließen beispielsweise Sandwich-Assays und ELISA ein. Die Kenntnis über Peptidspiegel kann wichtig zur Überwachung von therapeutischen Protokollen sein.
- Es kann auch möglich sein, antiidiotypische Antikörper unter Verwendung bekannter Techniken zu erzeugen. Diese antiidiotypischen Antikörper und deren Verwendung als therapeutische Mittel bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung.
- Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können DNA oder RNA sein. Ist das Nukleinsäuremolekül in DNA-Form, kann es genomische DNA oder cDNA sein. RNA-Formen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle sind im Allgemeinen mRNA.
- Obwohl die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen in isolierter Form vorliegen, können sie integriert sein oder in anderer Weise verbunden oder assoziiert mit anderen genetischen Molekülen sein, wie Vektor-Molekülen und insbesondere Expressionsvektor-Molekülen. Vektoren und Expressionsvektoren sind im Allgemeinen zur Replikation fähig und, sofern anwendbar, zur Expression in einer prokaryontischen Zelle oder einer eukaryontischen Zelle oder zur Expression in beiden. Vorzugsweise schließen prokaryontische Zellen E. coli, Bacillus sp und Pseudomonas sp. ein. Bevorzugte eukaryontische Zellen schließen Hefe, Pilz, Säuger- und Insektenzellen ein.
- Folglich gehört gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung auch ein genetisches Konstrukt, dass einen Vektoranteil und ein zur Codierung eines erfindungsgemäßen Peptids fähiges Gen ein.
- Vorzugsweise ist der Genanteil des genetischen Konstrukts in verwendungsfähiger Weise verbunden mit einem Promoter im Vektor, so dass der Promoter in der Lage ist die Exprimierung des Genteils in einer geeigneten Zelle zu steuern.
- Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf genetische Konstrukte und auf prokaryontische oder eukaryontische Zellen, die dieselben enthalten.
- Chimäre von ρ-Conotoxinen wie ρ-TIA mit anderen Conotoxinen oder zusätzlich mit anderen Peptiden oder Proteinen können erzeugt werden, um die Aktivität in andere Moleküle zu überführen, in einigen Fällen zur Erzeugung neuer Moleküle mit einer zusätzlichen Funktionalität. Dies wird vorzugsweise erfolgen unter Verwendung des Segments oder der Segmente einer Sequenz dieser Peptide, welches das Pharmacophor enthält. Ist das Pharmacophor diskontinuierlich, sollten die Segmente die das Pharmacophor bilden derart in dem neuen Konstrukt positioniert werden, dass sie ein Binden am Rezeptor ermöglichen. Chimäre mit anderen Conotoxinen können zusätzliche Cys-Reste und zusätzliche Disulfidbindungen einschließen.
- Für Conotoxin-Peptide innerhalb einer Aktivitätsklasse ist es üblich, dass sie ein ähnliches Muster an Disulfidbindungen aufweisen mit Peptidschleifen zwischen den jeweiligen Cystein-Resten. Bei ρ-TIA-Sulfidbindungen sind der erste und dritte und der zweite und vierte Cystein-Rest verbunden. Dieses Muster ist ähnlich bei Bindungsmustern, die für α-Conotoxin-Peptide festgestellt wurden. Folglich können Chimäre-Derivate hergestellt werden durch Ersetzen der Schleife eines ρ-Conotoxin-Peptids mit der Schleife, die die Sequenz eines anderen Peptids, einschließlich α-Conotoxine, enthält.
- Die Erfindung schließt auch Dimere, Trimere, etc. von ρ-Conotoxin-Peptiden, als auch ρ-Conotoxin-Peptide, gebunden an andere Peptide, ein.
- Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen ρ-Conotoxin-Peptide 10 bis 30 Aminosäuren, besonders bevorzugt 15 bis 25.
- Die vollständige Gensequenz für die natürlich auftretenden ρ-Conotoxin-Peptide können durch Verwendung einer kombinierten 5'RACE und 3'RACE gekoppelt mit Klonieren und Sequenzieren der DNA, erhalten werden.
- Obwohl ρ-TIA eine gewisse Sequenzhomologie mit den α-Conotoxinen zeigt, die nikotinerge ACh-Rezeptorenblocker sind, konnte nicht festgestellt werden, dass ρ-TIA (10 μM) den neuronalen oder muskulären Subtyp des nikotinergen ACh-Rezeptors in Tests, die isolierte Präparationen des Ileums vom Meerschweinchen und des Nervus Phrenicus-Hemidiaphragmas der Maus benutzen, besetzt.
- Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das ρ-Conotoxin-Peptid ferner gekennzeichnet durch die fehlende Wirkung an dem neuronalen oder muskulären Subtyp des nikotinergen Ach-Rezeptors.
- Es wurde auch in Bindungsstudien festgestellt, dass eine Variation in der Affinität von ρ-TIA zu α1A, α1B und α1D-Adrenozeptor-Subtypen vorliegt. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein isoliertes, synthetisches oder rekombinantes ρ-Conotoxin-Peptid mit einer selektiven α1-Antagonistenaktivität bereitgestellt, dass Selektivität für einen α1-Subtyp gegenüber den anderen Subtypen aufweist.
- Die erfindungsgemäßen ρ-Conotoxin-Peptide sind selektive α1-Adrenozeptor-Antagonisten. Folglich ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen ρ-Conotoxins als selektiver α1-Adrenozeptor-Antagonist Gegenstand der Erfindung, vor allem bei der Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten oder Zuständen, in denen die Antagonismuswirkung am α1-Adrenorezeptoren mit einer wirksamen Behandlung verbunden ist. Solche Aktivität pharmakologischer Mittel ist verbunden mit einer wirksamen Prophylaxe oder Behandlung von Krankheiten oder Zuständen des Harntrakts oder des kardiovaskulären Systems oder Stimmungsstörungen oder bei der Behandlung oder Kontrolle von Schmerz oder Entzündung.
- Folglich liefert die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe von Harntrakt- oder kardiovaskulären Zuständen oder Krankheiten oder Stimmungsstörungen oder zur Behandlung oder zur Kontrolle von Schmerz oder Entzündung einschließlich der Stufe der Verabreichung einer wirksamen Menge eines isolierten, synthetischen oder rekombinanten ρ-Conotoxin-Peptids mit einer selektiven α1-Adrenozeptor-Antagonisten-Wirkung an Säuger.
- Beispiele solcher Krankheiten oder Zustände des Harnsystems schließen eine gutartige Prostatahyperplasie und damit verbundene Störungen ein. Beispiele von kardiovaskulären Krankheiten oder Zuständen schließen Arrhythmie verschiedener Regionen, Hypertension und coronares Herzversagen ein. Beispiele von Stimmungsstörungen schließen Suchtzustände wie das Rauchen ein. Beispiele von Schmerz schließen den chronischen Schmerz, neuropathischen Schmerz und Entzündungsschmerz ein.
- Vorzugsweise benötigt der Säuger eine solche Behandlung, obwohl das Peptid auch im prophylaktischen Sinne verabreicht werden kann.
- Die Erfindung liefert auch eine Zusammensetzung, die ein isoliertes, synthetisches oder rekombinantes ρ-Conotoxin-Peptid mit einer selektiven α1-Adrenozeptor-Antagonisten-Wirkung umfasst und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
- Vorzugsweise ist die Zubereitung in der Form einer pharmazeutischen Zubereitung.
- Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines isolierten, synthetischen oder rekombinanten ρ-Conotoxin-Peptids mit einer selektiven α1-Adrenozeptor-Antagonisten-Wirkung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von Zuständen oder Krankheiten des Harntrakts oder des kardiovaskulären Systems oder Stimmungsstörungen oder zur Behandlung oder Kontrolle von Schmerz oder Entzündung.
- Wie vom Fachmann einfach erkannt werden wird, ist der Verabreichungsweg und die Natur des pharmazeutisch verträglichen Trägers abhängig von der Natur oder dem Zustand des zu behandelnden Säugers. Es wird angenommen, dass die Wahl eines speziellen Trägers oder Freisetzungssystems und der Verabreichungsweg einfach durch den Fachmann bestimmt werden kann. In der Zubereitung einer Formulierung, die das aktive Mittel enthält, muss Sorgfalt dafür getragen werden, dass die Aktivität des Peptids in dem Verfahren nicht zerstört wird und dass das Peptid in der Lage ist, seinen Wirkplatz ungestört zu erreichen. Unter einigen Umständen kann es erforderlich sein, das Peptid durch bekannte Mittel, wie Mikroverkapselung, zu schützen, gleichfalls soll der Verabreichungsweg derart sein, dass das Peptid seinen Wirkort erreicht.
- Die pharmazeutischen Formulierungen, die zum Injizieren verwendet werden, schließen sterile injizierbare Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver zur extemporierten Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen ein. Sie sollten stabil unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen sein und gegen Oxidation und Kontaminierung von Mikroorganismen wie Bakterien oder Pilzen geschützt sein. Der einschlägige Fachmann kann geeignete Formulierungen für die erfindungsgemäßen Peptide oder modifizierten Peptide unter Verwendung üblicher Verfahrensweisen bestimmen. Die Identifizierung der bevorzugten pH-Bereiche und geeignete Additive, wie Antioxidantien, ist für den Fachmann eine Routinetätigkeit (beispielsweise Cleland et al, 1993). Puffersyteme werden routinemäßig verwendet um pH-Werte in einem gewünschten Bereich einzustellen und schließen Carbonsäurepuffer, beispielsweise Acetat, Citrat, Lactat und Succinat ein. Eine Reihe von Antioxidantien sind verfügbar für solche Formulierungen einschließlich phenolischer Verbindungen wie BHT oder Vitamin E, Reduktionsmittel wie Methionin oder Sulfit und Metalchelatoren wie EDTA.
- Das Lösungs- oder Dispersionsmedium für die injizierbare Lösung oder Dispersion kann ein übliches Lösungsmittel oder Trägersysytem für wirksame Peptide sein und kann, beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (beispielsweise Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und ähnliches) umfassen, geeignete Mischungen derselben und pflanzliche Öle. Die geeignete Fließfähigkeit kann erhalten werden, beispielsweise, durch Verwendung von Beschichtungen wie Lecitin, durch Aufrechterhalten der erforderlichen Teilchengröße im Falle einer Dispersion und durch die Verwendung von Tensiden. Das Vorbeugen vor Einwirkungen von Mikroorganismen kann dort, wo erforderlich, vorgenommen werden durch Zugabe verschiedener antibakterieller und fungizider Mittel, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thiomersal und ähnlichem. In vielen Fällen wird es bevorzugt sein, die Osmolalität einzustellen, beispielsweise durch Zucker oder Natriumchlorid. Vorzugsweise ist eine Formulierung zur Injektion isotonisch mit Blut. Eine verlängerte Absorption von injizierbaren Zubereitungen kann eingestellt werden durch die Verwendung von Absorptionsverzögerern in den Zubereitungen, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine. Pharmazeutische zur Injektion geeignete Formen können über jeden geeigneten Weg injiziert werden, einschließlich intravenöser, intramuskulärer, intracerebraler, intrathecaler, epiduraler Injektion oder Infusion.
- Sterile injizierbare Lösungen werden hergestellt durch Einbringen der aktiven Verbindungen in der erforderlichen Menge in das geeignete Lösungsmittel mit verschiedenen anderen Inhaltsstoffen, wie denjenigen, die zuvor aufgelistet worden sind – soweit erforderlich – und anschließender Sterilfiltration. Im allgemeinen werden Dispersionen hergestellt durch Einbringen der verschiedenen sterilisierten wirksamen Bestandteile in ein steriles Vehikel, das ein Basisdispersionsmedium und die erforderlichen anderen zuvor aufgelisteten Bestandteile enthält. In dem Fall eines sterilen Pulvers zur Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen sind bevorzugte Verfahren der Zubereitung das Vakuumtrocknen oder Gefriertrocknen einer zuvor steril filtrierten Lösung des aktiven Bestandteils plus allen zusätzlich gewünschten Inhaltsstoffen.
- Sind die aktiven Bestandteile in geeigneter Weise geschützt, können sie oral verabreicht werden, beispielsweise mit einem inerten Verdünnungsmittel oder mit einem stoffwechselfähigen verzehrbaren Träger, oder sie können eingeschlossen sein in einer harten oder weichen Gelatinekapsel oder können zu Tabletten verpresst sein, oder können direkt in ein Nahrungsmittel eingebracht sein. Zur oralen therapeutischen Verabreichung kann die wirksame Verbindung eingebracht werden mit Hilfstoffen und verwendet in der Form von verzehrbaren Tabletten, Bukaltabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspension, Sirupen, Oblaten und ähnlichem. Solche Zusammensetzungen und Zubereitungen enthalten vorzugsweise wenigstens 1 Gewichtsprozent der aktiven Verbindung. Der prozentuale Anteil der Zusammensetzungen und Zubereitungen kann selbstverständlich variiert werden und kann üblicherweise zwischen etwa 5 und etwa 80% des Gewichts einer Applikationseinheit betragen. Die Menge der aktiven Verbindungen in solch therapeutisch nützlichen Zusammensetzungen ist derart, dass eine geeignete Dosierung erhalten wird.
- Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und ähnliche können ferner die nachfolgend aufgeführten Bestandteile enthalten: Ein Bindungsmittel wie Akaziengummi, Maisstärke oder Gelatine; Hilfsstoffe wie Dicalciumphosphat; ein Zersetzungsmittel wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und ähnliches; ein Schmiermittel wie Magnesiumstearat, und ein Süssungsmittel wie Saccharose, Lactose oder Saccharin können hinzugefügt werden oder ein Geschmacksstoff, wie Pfefferminz, Wintergrünöl oder Kirschgeschmack. Die Verabreichungseinzeldosis einer Kapsel kann zusätzlich zu den oben genannten Mitteln einen flüssigen Träger enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Beschichtungen vorliegen oder in anderer Weise die physikalische Form der Einzeldosis modifizieren. Beispielsweise können Tabletten, Pillen oder Kapseln beschichtet sein mit Shellack, Zucker oder beidem. Ein Sirup oder Elixier kann den wirksamen Bestandteil, Saccharose als Süssungsmittel, Methyl- und Propylparabene als Konservierungsmittel, einen Farbstoff und einen Geschmacksstoff, wie Kirsch- oder Orangenaroma enthalten. Selbstverständlich sollte jedes Material, das zur Herstellung einer Einzeldosisform verwendet wird, pharmazeutisch rein und im wesentlichen in Bezug auf die eingesetzten Mengen nicht toxisch sein. Zusätzlich kann/können der/die wirksame/en Bestandteil/e die Freisetzung verzögernde Zubereitungen und Formulierungen eingebracht werden.
- Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf jede andere geeignete Verabreichungsform, beispielsweise topische Applikation wie Cremes, Lotionen und Gele oder zur Inhalation oder intranasalen Verabreichung geeignete Zusammensetzungen, wie Lösungen oder trockene Pulver.
- Parenterale Verabreichungen, einschließlich denjenigen zur intravenösen, intrathecalen, intracerebralen oder epiduralen Verabreichung sind bevorzugt.
- Pharmazeutisch verträgliche Träger und/oder Verdünnungsmittel schließen jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmittel, Beschichtungen, antibakterielle und fungizide Mittel, isotonische und die Absorption verzögernde Mittel und ähnliche ein. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch wirksame Substanzen ist gut bekannt: Mit der Ausnahme, dass ein herkömmliches Medium oder Mittel inkompatibel mit dem aktiven Bestandteil ist, ist die Verwendung solcher therapeutischen Zusammensetzungen zu berücksichtigen. Ergänzende wirksame Bestandteile können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingebracht sein.
- Es ist insbesonders vorteilhaft, parenterale Zubereitungen in Einzeldosisform zur einfachen Verabreichung und Homogenität der Dosis zu formulieren. Eine Einzeldosisform, wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Einzeldosierungen für zu behandelnde Säuger geeignet sind; jede Einheit enthält eine vorbestimmte Menge eines aktiven Bestandteils, der berechnet wurde, um die gewünschte therapeutische Wirkung gemeinsam mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger zu erbringen. Die Spezifizierung für die neue Einzeldosisform der Erfindung wird vorgegeben und ist direkt abhängig von (a) den einzigartigen Eigenschaften des aktiven Materials und der besonderen therapeutischen Wirkung, die erreicht werden soll, und (b) den Beschränkungen, die gemäß der Technik des Vermischens solch eines aktiven Materials zur Behandlung einer Krankheit in lebenden Subjekten in einem krankhaften Zustand, in dem die Körpergesundheit wie hier detailliert offenbart beeinträchtigt ist, vorhanden ist.
- Der Hauptwirkbestanddteil ist für eine übliche und wirksame Verabreichung in wirksamen Mengen mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger in Einzeldosisform vermischt. Eine Einzeldosisform kann beispielsweise den Hauptwirkbestandteil in Mengen zwischen 0,25 μg bis etwa 2000 mg enthalten. Ausgedrückt in Anteilen liegt die wirksame Verbindung im Allgemeinen in einer Menge von 0,25 μg bis etwa 200 mg/ml des Trägers vor. Im Falle von Zusammensetzungen, die weitere ergänzende wirksame Bestandteile enthalten, werden die Dosen bestimmt unter Bezugnahme auf die übliche Dosis und die Art der Verabreichung dieser Inhaltsstoffe.
- Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen und Beispiele beschrieben, es ist jedoch zu berücksichtigen, dass die Genauigkeit der folgenden Beschreibung keinen Vorrang vor der allgemeinen zuvor erfolgten Beschreibung der Erfindung besitzt.
- Bezugnahme auf die Figuren:
-
1 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung von ρ-TIA während der Zeit einer isometrischen Kontraktion einer representativen Zubereitung eines halbierten Vas deferens der Rattenprostata, das einer Feldstimmulierung mit einem einzigen supramaximalen Puls (55 V, 1 ms) unterzogen wird. -TIA (100 nM–3 μM) wurde kumulativ dem Organbad unter Verwendung einer halblogarithmischen Steigerung der Einzeldosis hinzugefügt. -
2 ist eine graphische Darstellung, die die Log-Konzentration-Antwort-Kurven für Noradrenalin in halbiertem Vas deferens des Rattennebenhodens in Abwesenheit (0) und in Gegenwart von 1 μM (∆), 3 μM (?) oder 10 μM (♢) ρ-TIA. Die angegebenen Daten sind Mittelwerte ±SEM der Antworten von 5 getrennten Experimenten. Einige Fehlerbalken werden verdeckt durch die Symbole. -
3 ist eine graphische Darstellung des Effekts von ρ-TIA auf die α2-Adrenozeptor mediierte Hemmung der Zuckantwort des halbierten Vas deferens der Rattenprostata auf die Feldstimulierung mit einem einzigen supramaximalen Puls (55 V, 1 ms). Log-Konzentrations-Antwort-Kurven für Noradrenalin in Abwesenheit (0) und in Gegenwart (♢) von 10 μM ρ-TIA. Jeder Punkt ist der Mittelwert von 5 Experimenten und die vertikalen Balken geben die SEM an. -
4 ist eine graphische Darstellung der Wirkung von ρ-TIA auf das Binden des radioaktiv markierten α1-Adrenozeptor-Antagonist [125I]-HEAT an Membranzubereitungen von COS-1-Zellen, die transfiziert sind mit cDNA Klonen, für die drei α1-Adrenorezeptor-Subtypen, α1A, α1B und α1D. Jeder Punkt gibt den Mittelwert von drei Experimenten ±SEM an. Einige Fehlerbalken sind durch die Symbole verdeckt. -
5 ist eine graphische Wiedergabe, die die Herkunft der Kegelschnecke-Giftpeptid-Sequenzen zeigt. 5'RACE PCR unter Verwendung des Primers AP1 + RHO-1B erzeugt das 5'UTR und die Leader Peptid-Sequenz, die dann zur Erzeugung des für ρ-Conotoxine spezifischen PCR-Primers verwendet wird. Das 3'UTR vervollständigt den Abkömmling der verbleibenden reifen Peptidsequenz und der 3'UTR-Sequenz unter Verwendung des Primers RHO-1A + ANCHOR. - BEISPIELE
- Statistik und Analyse der Daten
- Die Daten der folgenden Beispiele werden ausgedrückt als Mittelwert ± Standardabweichung (SR) des Mittelwerts aus den Ergebnissen von n = 3–6 Experimenten. „Student's two-tailed t-Test" oder ANOVA wurden zur statistischen Bewertung verwendet und Werte mit p < 0,05 wurden als signifikant betrachtet. Die sigmoidale Kurvenbildung der Konzentrations-Antwort-Kurven zur Berechnung von EC10-Werten erfolgte mittels nichtlinearer Regression unter Verwendung des Programmpakets Igor Pro (WaveMetrics). Die Radioliganden-Bindungsdaten analysiert unter Verwendung des iterativen nichtlinearen Kurvenanpassungsprogramm Prism (GraphPad). IC50-Werte wurden in Ki-Werte unter Verwendung der Cheng-Prusoff-Gleichung konvertiert und ein KD[125I]-HEAT von 66 pM.
- Arzneistoffe
- Die folgenden Arzneistoffe wurden von Sigma erhalten: Indomethacin, Nikotinhydrogentartrat, (–)-Noradrenalinbitartrat, Prazosinhydrochlorid, Suramin, Tetrodotoxin und Yohimbin-Hydrochlorid. [125I]-HEAT (spezifische Aktivität 2200 Ci/mmol) wurde von New England Nuclear erhalten.
- Beispiel 1
- Das Vas deferens der Ratte
- Männliche Wistarratten (250–350 g) wurden durch einen Schlag auf den Kopf getötet und entblutet. Die Vasa deferentia wurden entfernt und vom Bindegewebe getrennt. Jedes Vas deferens wurde in halbierte epididymale und prostatische Segmente unterteilt. Die Gewebeanteile wurden unter einer Spannung von 0,5 g in 5 ml Organbad gebracht, das eine physiologische Salzlösung bei 37°C enthält und durchblasen wird mit 5% v/v CO2 in O2. Die Zusammensetzung der Badlösung war (mM): NaCl, 119; KCl, 4,7; MgSO4, 1,17; KH2PO4, 1,18; NaHCO3, 25,0; Glucose, 5,5; CaCl2, 2,5; EDTA, 0,026. Den Gewebepräparationen wurde ermöglicht, sich über einen Zeitraum von 45 Minuten vor dem Experiment zu äquilibrieren. Isometrische Kontraktionen wurden aufgezeichnet unter Verwendung eines Kraftüberträgers (Narco-Bio-System F-60) und wurden digital mit einem Power Macintosh Computer mit Chart, Version 3.5.4/s Software und einem MacLab/8s data auf Datenempfangssystem (ADInstruments) bei einer Samplingfrequenz von entweder 10 oder 200 Hz aufgezeichnet.
- Die unterteilten Segmente wurden zwischen zwei stimulierenden Platinelektroden angeordnet. Zur Untersuchung der Wirkung von ρ-TIA auf die elektrisch hervorgerufene Kontraktion des glatten Muskels, übertragen durch sympathische Neurotransmission, wurden ansteigende Konzentrationen des Peptids kumulativ dem Organ zugesetzt, wenn das Gewebe einer elektrischen Feldstimulierung unterzogen wurde. Einzelne elektrische Pulse einer Amplitude von 55 V und einer Länge von 1 ms wurden erzeugt durch einen Grass S44-Stimulator in 3-Minuten-Intervallen. Die sich ergebenden Kontraktionen konnten durch Tetrodotoxin (0,1 μM) verhindert werden, was anzeigt, dass diese neurogener Herkunft sind. Ferner war die anfängliche Phase der Konzentration empfindlich gegenüber Suramin (0,3 mM), und die zweite Phase konnte durch Prazosin (0,5 μM) gehemmt werden.
- Die Wirkung von ρ-TIA auf die sympathische Neurotransmission in dem Vas deferens der Ratte
- Die Antwort des unterteilten prostatischen Vas deferens der Ratte auf Feldstimulierungen war zweiphasig. Die erste Phase der Kontraktion war die größere der beiden und hatte einen Peak bei etwa 200 ms nach der Stimulierung. Die zweite Phase erreichte ihr Maximum nach etwa 500–600 ms nach dem Stimulus. ρ-TIA wirkte durch Verringerung der zweiten Phase der Kontraktion in konzentrationsabhängiger Weise (
1 ). Der monophasische Peak, erzeugt durch Abziehen des Verlaufs der in Anwesenheit der höchsten Konzentration von ρ-TIA (10 μM) erhalten wurde, von den anderen zeigt das die Wirkung des Conotoxin spezifisch nur für die zweite Komponente der Kontraktion ist. Die Konzentration von Conotoxin, die die zweite Phase der Kontraktion um 50 hemmt, der IC50-Wert, wurde mit etwa 30 nM (1 ) ermittelt. - Das durch ρ-TIA veranlasste Inhibierungmuster ähnelte demjenigen, das unter Verwendung von Prazosin oder anderen α1-Adrenozeptor-Antagonisten beobachtet wird (McGrath, 1978, J Physiol Lond, 283, 23–39). Es wurde jedoch festgestellt, dass bei der Verwendung von hohen Konzentrationen von Prazosin (0,5 μM) die Spezifität der Wirkung mit dem ersten Bestandteil der Kontraktion, der gegenüber einer Hemmung auch empfindlich ist, verloren geht. Die erste Komponente wird vermittelt durch die Wirkung des sympathischen Co-Transmitters ATP an P2x-Purinozeptoren und kann verhindert werden durch P2x-Purinozeptor-Antagonisten wie Suramin. Es ist deshalb wahrscheinlich, dass die nichtspezifische Hemmung der ersten Phase der Kontraktion wegen der Blockade neuronaler Na+-Kanäle erfolgt, ein lokalanästhetischer Effekt, der zuvor für Prazosin und einige andere α1-Andrenozeptor-Antagonisten beschrieben wurde (Bralet et al., 1985, Br J Pharmacol 84, 47–55; Northover, 1983, Br J Pharmacol, 80, 85–93; Perez et al., 1994, Mol Pharmacol, 46, 823–31). ρ-TIA wirkte als funktionaler nicht kompetetiver Antagonist, was eine alosterische Wirkung an einer neuen Stelle zur Modulierung der Bindung von Noradrenalin am α1-Adrenozeptor vorschlägt.
- Beispiel 2
- Wirkungen in Methoden von post-junktionalen Antworten
- Diese Experimente waren ähnlich denjenigen, die in Beispiel 1 beschrieben worden sind, mit der Ausnahme, dass die unterteilten Epididymal-Segmente nicht elektrisch stimuliert wurden. Diese Gewebepräparationen wurden zur Untersuchung der Wirkung von ρ-TIA auf die Post-junktionale kontraktile Antwort auf Noradrenalin verwendet. Kumulative Konzentrations-Antwort-Kurven wurden aufgezeichnet in der Abwesenheit und in Gegenwart von ρ-TIA. Das Conotoxin bei einer Konzentration von entweder 1 μM, 3 μM oder 10 μM wurde dem Organbad zugesetzt und das Gewebe 20 Minuten vor dem Einsatz von Noradrenalin-Dosen äquilibriert. Eine einzige Konzentration-Antwort-Kurve wurde je Präparation erzeugt, mit kontralateralen Gewebesegmenten, die nicht ñ-TIA ausgesetzt wurden und als Kontrollen dienten.
- Wirkung von ρ-TIA auf die Antwort auf Noradrenalin in dem Vas deferens der Ratte
- Zur Bestätigung, dass die Wirkung von ρ-TIO auf die Antwort einer Feldstimulierung wegen der Wirkung des Peptid-Downstreams der Neurotransmitterfreisetzung erfolgte, wurde seine Wirkung auf die Antwort von exogen verabreichtem Noradrenalin untersucht.
- Logkonzentrations-Antwort-Kurven auf Noradrenalin in unterteilten Segmenten des epididymalen Vas deferens der Ratte wurden erzeugt in Abwesenheit und in Gegenwart von ρ-TIA (
2 ). Die Wirkung von ρ-TIA bei einer Konzentration von 1 μM war eine dreifache Verringerung in der Empfindlichkeit des Gewebes gegenüber Noradrenalin, beobachtet als Verschieben der Konzentrations-Antwort-Kurve zur rechten Seite. Bei höheren Konzentrationen (3 μM und 10 μM) wirkte ρ-TIA unter weiterer Verringerung des Gewebes, Erhöhung der EC50 auf Noradrenalin um einen Faktor 5,2 und 16,7. Die zwei höchsten Konzentrationen von ρ-TIA wirkten auch unter Verringerung des Grads der maximalen Antwort auf 82 und 42% der Kontrollantwort. - Die Verringerung der maximalen Antwort des Vas deferens auf Noradrenalin, verursacht durch ρ-TIA, steht in Übereinstimmung mit der Wirkung des Conotoxins als ein nicht kompetetiver α1-Adrenozeptor-Antagonist. Zunächst wird die Noradrenalinkonzentrations-Antwort-Kurve nach rechts verschoben, ohne dass sich irgendwelche Änderungen der maximalen Spannung entwickelt. Wenn die Konzentration von ρ-TIA erhöht wird, begleitet ein weiteres sich Verschieben der Kurve zur rechten Seite das fortschreitende Verringern der maximalen Antwort. Diese Ergebnisse deuten auf die Existenz eines Pools von einer Reserve an α1-Adrenozeptoren in diesem Gewebe und unterstützen die Befunde von Diaz-Toledo & Marti 1988 Eur J Pharmacol, 156, 315–24 und Minneman & Abel 184, Mol Pharmacol, 25, 56–63, die eine funktionale Reserve von α-Adrenozeptoren in dem Vas deferens der Ratte zeigten. Obwohl es in nichtkompetetiver Weise wirkt, ist ρ-TIA kein irreversibler Antagonist, weil es eine langsame Erholung der Hemmung auf die elektrisch hervorgebrachte Antwort des Vas deferens, verursacht durch Conotoxin, nach dem Waschen der Präparation mit einer arzneimittelfreien Lösung verursacht.
- Beispiel 3
- Experimente zur Untersuchung der Wirkung von ρ-TIA auf α2-Adrenozeptoren
- Ein ähnliches experimentelles Protokoll wie in Beispiel 1 wurde durchgeführt mit der Ausnahme, dass die elektrische Feldstimulierung mit einzelnen Pulsen derselben Dauer und Amplitude, aber mit 20 s-Intervallen vorgenommen wurde. In Gegenwart von Prazosin (0,5 μM) wurde eine kumulative Konzentrations-Antwort-Kurve für Noradrenalin unter Hemmung der Zupf-Antworten etabliert. Nach dem Auswaschen und dem Erholen wurde das Prazosin ersetzt und ρ-TIA (10 μM) wurde in das Organbad gegeben. Nach einer Äquilibrierungszeit von 20 Minuten wurde eine zweite Konzenrations-Antwort-Kurve auf Noradrenalin erzeugt.
- Wirkung von ρ-TIA auf die präsynaptische Hemmung der Neurotransmitterfreisetzung in dem Vas deferens der Ratte Die Freisetzung der sympathischen Cotransmitter ATP und Noradrenalin aus neuronalen Lagern ist Gegenstand der Modulierung durch die Aktivierung von präsynaptischen α2-Adrenozeptoren (Amobi & Smih, 1988, J Auton Pharmacol, 8, 141–52, McCulloch et al., 1985 Br J Pharmacol, 86, 455–64). Zur Bestimmung, ob ρ-TIA unter Blockierung von α2-Adrenozeptoren wirkt, wurde seine Wirkung auf die Hemmung der purinergen Kontraktion der Segmente des Vas deferens der Ratte durch Noradrenalin untersucht. α2-Adrenozeptor-antagonistische Arzneimittel wie Yohimbin, antagonisieren den hemmenden Effekt des Noradrenalin in diesem Versuch (Warming et al., 1982 Arch Int Pharmacodyn Ter, 259, 14–30).
- Die Antwort des Vas deferens auf elektrische Stimulierung in Gegenwart von Prazosin wurde durch Noradrenalin mit einem Log IC50-Wert von 5,96 ± 0,052 (
3 ) gehemmt. Dieser Wert war nicht signifikant unterschiedlich von dem Log IC50-Wert, der in Gegenwart von 10 μM ρ-TIA bestimmt worden ist (5,90 ± 0,031, p > 0,3, n = 5). - Es wurde gefunden, das ρ-TIA nicht die Wirkung des Noradrenalins an α2-Adrenozeptoren antagonisiert. ρ-TIA kann deshalb zwischen α1- und α2-Adrenozeptoren unterscheiden.
- Beispiel 4
- Das Ileum des Meerschweinchens
- Männliche Meerschweinchen (285–425 g) fasteten über nacht und wurden dann durch einen Schlag auf den Kopf getötet und ausgeblutet. Etwa 1,5 cm lange Segmente wurden aus dem Ileum entnommen und die Luminalinhalte durch leichtes waschen mit einer Badlösung entfernt. Die Präparationen wurden unter einer Restspannung von 1,0 g in 5 ml Organbädern angebracht. Die Badlösung enthielt (mM): NaCl, 136,9; KCl, 2,68; CaCl2, 1,84; MgCl2, 1,03; Glucose, 5,55; NaHCO3, 11,9 und KH2PO4, 0,45, wurde auf 37°C erwärmt und durchlüftet mit 5% v/v CO2 in O2. Indomethacin (10 μM) wurde der Badlösung zugesetzt, um eine stabile Grundlinie zu haben. Nach einer Äquilibrierungsdauer von wenigstens 40 Minuten wurde Nikotin (4 μM) in 15-Minuten-Intervallen zugesetzt. Wenn die kontraktile Antwort auf Nikotin als reproduzierbar befunden wurde, wurde das Gewebe 25 Minuten lang ρ-TIA ausgesetzt, nach dieser Zeit wurde eine weitere Dosis Nikotin hinzugefügt. Die Antworten auf Nikotin wurden isometrisch gemessen und bei einer Samplingrate von 10 Hz digitalisiert.
- Wirkung von ρ-TIA auf die Antworten auf Nikotin im Ileum des Meerschweinchens
- Die Antworten von Ileum-Segmenten auf Nikotin waren nicht signifikant beeinflusst durch ρ-TIA (10 μM). In Abwesenheit von ρ-TIA war die mittlere Antwort 3,29 ± 0,67 g und in Gegenwart von ρ-TIA betrug sie 4,13 ± 0,70 g (p > 0,25; Paar t-Test; n = 4).
- Dieser Befund, dass die Antwort von Ileum-Segmenten des Meerschweinchens auf Nikotin und die Antwort des Nervus phrenicus-Hemidiaphragmas der Maus auf elektrische Stimulierung nicht durch ñ-TIA beeinträchtigt ist, lässt vermuten, dass anders als die α-Conotoxine dieses neue Conotoxin weder auf den neuronalen, noch muskulären Subtyp des nikotinergen ACh-Rezeptors wirkt.
- Beispiel 5
- Nervus phrenicus-Hemidiaphragma der Maus
- Linke und rechte Hemidiaphragmen mit den noch vorhandenen phrenischen Nerven wurden aus einer männlichen Quackenbuschmaus (20–30 g), die durch cervicale Dislocation getötet worden war, entfernt. Die Basis jeden Hemidiaphragmas wurde zwischen zwei parallelen stimulierenden Platinelektroden zugeordnet und der Nervus frenicus wurde durch zwei kleine Platinschleifen zu Feldstimulierung geführt. Die Präparationen wurden in 5 ml Organbädern unter einer Spannung von 1,0 g angebracht und in einer Lösung der folgenden Zusammensetzung (mM) gebaded: NaCl, 135,0; KCl, 5,0; CaCl2, 2,0; MgCl2, 1,0; Glucose, 11,0; NaHCO3, 15,0 und KH2PO4, 1,0. Die Badelösung wurde auf 37°C erwärmt und konstant durchlüftet mit 5% v/v CO2 in O2. Nach einer Äquilibrierungsdauer von wenigstens 30 Minuten wurde eine alternierende direkte und indirekte Stimulierung in 10-Sekunden-Intervallen durchgeführt. Die direkte Stimulierung erfolgte unter Verwendung eines 30 V Pulses, einer Dauer von 2 ms, der von Elektroden freigesetzt wurde, die auf jeder Seite des Muskels angeordnet waren, und die indirekte Stimulierung erfolge mit einem 3 V Puls, einer Dauer von 0,2 ms, der von den Elektroden abgegeben wurde, die den Nervus phrenicus umgaben. Die Wirkung einer einzelnen Dosis von ρ-TIA bei einer Konzentration von 10 μM auf diese direkt und indirekt hervorgerufenen Antworten wurde untersucht. Die Kontraktionen wurden in derselben Weise, wie zuvor für Vas deferens-Präparationen beschrieben, aufgezeichnet.
- Wirkung von ρ-TIA auf die Antworten auf elektrische Stimulierung des Nervus phrenicus-hemidiaphragmas der Maus
- ρ-TIA (10 μM) beeinträchtige nicht die Kontraktion des Hemidiaphragmas der Maus, die durch Feldstimulierung des Nervus phrenicus oder durch direkte Muskelstimulierung (n = 4; Daten nicht gezeigt) hervorgerufen wird, was darauf hinweist, dass ρ-TIA nicht am nikotinergen Muskel ACh-Rezeptor wirkt.
- Beispiel 6
- Radioliganden-Bindungsstudien
- Die verwendeten α-Adrenozeptorkonstrukte waren die α1A-AR cDNA der Ratte, der die α1B-AR cDNA des Hamsters und die α1C-cDNA der Ratte kloniert in den modifizierten eukaryotischen Expressionsvektor pMT2', wie zuvor beschrieben (HWA et al., 1995, J Biol Chem, 270, 23189– 95; Perez et al., 1991, Mol Pharmacol, 40, 876–83; Perez et al., 1994, Mol Pharmacol, 46, 823–31). COS-1-Zellen (American Type Culture Collection) wurden kultiviert und mit den Konstrukten unter Verwendung des DEAE-Dextranverfahrens transfiziert (Cullen, 1987, Methods Enzymol, 152, 684–704). Die Transfectionseffizienz dieses Verfahrens liegt bei 30 bis 40%. Die Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfizierung geerntet. Die Membranen der transfizierten COS-1-Zellen wurden repariert wie zuvor beschrieben (Perez et al., 1991, Mol Pharmacol, 40, 876–83). Die Membranen wurden resuspendiert in HEM-Puffer (20 mM HEPES, pH 7,5, 1,5 mM EGTA, 12,5 mM MgCl2), enthalten 10% (v/v) Glycerol und gelagert bei –70°C. Die Liganden Bindungseigenschaften der exprimierten Rezeptoren wurden in einer Reihe von Radioliganden- Bindungsstudien unter Verwendung von [125I]-HEAT, einem spezifischen α1-Adrenozeptor-Antagonist, untersucht. Das durchgeführte Verfahren schließt zwei Röhrchen mit COS-1-Zellmembranen ein, 70 pM [125I]-HEAT, HEM-Puffer und ρ-TIA (bei 9 verschiedenen Konzentrationen) in einem gesamten Reaktionsvolumen von 250 μL. Nicht-spezifische Bindung wurde bestimmt in der Gegenwart von Phentolamin (100 μM) nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Reaktionen durch Zugaben von eiskaltem HEM-Puffer gestoppt und auf Whatman GF/C Glasfiltern mit einem Brandel-Zellernter filtriert. Die Filter wurden fünfmal mit eiskaltem HEM-Puffer gewaschen. Die Menge der gebundenen Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Packart Auto-gamma 500-Counters analysiert.
- Wirkung von ρ-TIA in Radioliganden-Bindungsstudien
- Die α1-Adrenozeptoren sind eine heterogene Familie und drei unterschiedliche Subtypen, α1A, α1B und α1D, wurden geklont. Die Wirkung von ρ-TIA in den Radioliganden-Bindungsstudien war die Hemmung der Bindung von [125I]-HEAT an den drei exprimierten α1-Adrenozeptor-Subtypen, wodurch bestätigt wird, dass der α1-Adrenozeptor das Ziel des Conotoxins ist (
4 ). Die Log Ki-Werte wurden bestimmt mit 7,29 ± 0,141 für den α1A-Subtyp; 7,70 ± 0,179 für den α1B-Subtyp und 7, 09 ± 0, 057 für den α1D-Subtyp. Der Unterschied in der Potenz des ρ-TIA bei α1B und α1D-Adrenozeptoren wurde als signifikant befunden (p < 0,05), was ein Hinweis dafür ist, dass ρ-TIA und dessen Analoga ein Potential zur Unterscheidung zwischen α1-Adrenozeptorsubtypen aufweisen. - ρ-TIA war am potentesten beim α1B-Adrenozeptorsubtyp. Der Ki-Wert von 20 nM zeigte, dass ρ-TIA etwa zwei Größenordnungen weniger potent als der klassische α1-Andrenozeptor-Antagonist Prazosin an diesem Subtyp ist, bezogen auf Daten, die in der Literatur berichtet wurden. Die Entdeckung von Subtypus spezifischen Antagonisten ist von Interesse für deren Nützlichkeitspotential als Forschungswerkzeug zur Untersuchung der Struktur und der Funktionsweise von α1-Adrenozeptoren als auch als potentielle therapeutische Mittel zur Behandlung solcher Zustände wie einer gutartigen Prostatahyperplasie (Chapple, 1995, Br J Urol, 1, 47–55). Die Radioliganden-Bindungsstudien gaben ferner einen Hinweis dazu, dass ρ-TIA nicht kompetetiv wirkte bei der Hemmung von [125I]-HEAT bei der Bindung, was ein Hinweis für einen allosterischen Modulator ist, der auf der anderen von der Noradrenalin-Bindungsstelle getrennten Seite am α-Adrenozeptor wirkt.
- Schlussfolgernd kann festgestellt werden, dass viele strukturelle Klassen von Verbindungen existieren, die die Fähigkeit haben, als α1-Adrenozeptor-Antagonisten zu wirken. Unter diesen Klassen sind die Alkaloide, eine Gruppe, die eine Anzahl von natürlichen Produkten umfasst. Diese schließe Dicentrin ein (Teng et al., 1991, Br J Pharmacol, 104, 651–6) und Dehydroevodiamin (Chiou et al., 1996, J Cardiovasc Pharmacol, 27, 845–53), isoliert aus pflanzlichen Zellen und Hymenin, ein Alkaloid, das aus dem Seeschwamm isoliert ist (Kobayashi et al., 1986, Experientia, 42, 1064–5). Ein anderer α1-Adrenozeptor-Antagonist, der aus einer Seeschwammart isoliert ist, ist Aaptamin. Anders als Hymenin ist Aaptamin kein Alkaloid sondern eher eine heteroaromatische Verbindung (Ohizumi et al., 1984, J Pharm Pharmacol, 36, 785–6). Diese Alkaloide wirken nicht mit einem hohen Grad an Spezifität und antithrombotische und lokalanästhetische Wirkungen wurden zusätzlich zu der α1-Andrenozeptor-Blockade beobachtet. ρ-TIA ist strukturell verschieden von all diesen existierenden kleinen organischen Molekülen, sowohl den natürlichen als auch den synthetischen, es ist bisher das einzige Beispiel eines Peptids, das als α1-Adrenozeptor-Antagonist wirkt. Zusätzlich ist ρ-TIA das erste gefundene Conotoxin, das am α1-Adrenorezeptor wirkt, es repräsentiert somit ein erstes Mitglied einer neuen Klasse von Peptiden, die wir als ρ-Conotoxin-Familie bezeichnen.
- Beispiel 7
- Herkunft der Gensequenz der ρ-Conotoxin-Peptide
- Die vollständige Gensequenz des ρ-Conotoxins wurde herausgefunden mit einem kombinierten 5'RACE (Random Amplification of cDNA Ends) und 3'RACE Strategie, verknüpft mit dem Klonieren und Sequenzieren der DNA.
- 5'RACE
-
- Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde durchgeführt unter Verwendung des Oligonukleotids RHO-1B in Kombination mit dem AP1-Oligonukleotid auf cDNA-Templaten, die von der mRNA abgeleitet sind, die aus dem Duktus des Kegelschneckengifts isoliert sind. Die PCR-Produkte, die die 5'-Region des ρ-TIA-Gens wiedergeben wurden isoliert, gereinigt, in bakterielle Vektoren kopiert und sequenziert. Die Gen-Sequenz von ρ-TIA wurde erhalten von C. tupila (
5 ). - 3'RACE
- Die DNA-Sequenz der 5'-Regionen des ρ-TIA-Gens wurde verwendet zum erstellen von Oligonukleotiden, die zum Nachweis der ρ-TIA-Sequenz in der Lage waren und der Sequenz von eng verwandten Peptiden. Die Positionierung der Oligonukleotide in Bezug auf die Gensequenz ist in der
5 gezeigt. Das Oligonukleotid RHO-1A wurde in der PCR in Verbindung mit dem ANCHOR Oligonukleotid verwendet zur Bildung von DNA-Fragmenten, die dem Leaderpeptid, dem reifen Peptid und dem 3' nichttranslatierten (3'UTR) Regionen des Gens entspricht. Die PCR der Giftgang cDNA-Muster von C. tulipa bildet DNA-Fragmente, die dem ρ-TIA entsprechen. -
- Vollständige Sequenz des ρ-TIA
- Die unter Verwendung von 5'RACE und 3'RACE erzeugte Gensequenz des ρ-TIA gibt überlappende Fragmente des Gens wieder. Diese Fragmente sind kombiniert, um eine Consensus-Sequenz für jedes Gen zu ergeben. Die Consensus-Sequenzen sind die vollständigen cDNA für die Gene und schließen 5'UTR das Leaderpeptid, das reife Peptid, das 3'UTR ein.
- Soweit der Zusammenhang nichts anderes verlangt ist in dieser Beschreibung und den sich anschließenden Patentansprüchen das Wort „enthalten" und Variationen wie „enthält" und „enthaltend" derart zu verstehen, dass es den Einschluss von festgestellten Ganzheiten oder Stufen oder Gruppen von Ganzheiten oder Stufen impliziert, nicht aber den Ausschluss irgendeiner anderen Ganzheit oder Stufe oder Gruppen von Ganzheiten oder Stufen.
- Die Fachleute werden zu würdigen wissen, dass die hier beschriebene Erfindung Veränderungen und Modifikationen unterliegen kann, die sich von den zuvor beschriebenen Unterscheiden. Diese Offenbarung ist deshalb derart zu verstehen, dass die Erfindung solche Veränderungen und Modifikationen einschließt. Die Erfindung schließt auch alle Stufen, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen ein, die in dieser Beschreibung angegeben oder auf die einzeln oder insgesamt Bezug genommen worden ist.
Claims (22)
- Isoliertes, synthetisches oder rekombinantes ρ-Conotoxin-Peptid oder Derivat davon mit selektiver, antagonistischer α1-Adrenozeptor-Aktivität.
- ρ-Conotoxin-Peptid nach Anspruch 2, nämlich ρ-TIA.
- ρ-Conotoxin-Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit keiner oder vernachlässigbarer Aktivität am neuronalen oder muskulären Subtyp des nikotinergen ACh-Rezeptors.
- ρ-Conotoxin-Peptid nach Anspruch 1 mit Selektivität für einen α1-Subtyp relativ zu den anderen Subtypen.
- ρ-Conotoxin-Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit vier Cystein-Resten und zwei Disulfid-Brücken.
- ρ-Conotoxin-Peptid nach Anspruch 6, worin die Konnektivität der Disulfid-Brücken A-C/B-D ist, wobei A, B, C und D sich auf den ersten, zweiten, dritten bzw. vierten, an der Disulfid-Brückenbildung beteiligten Cystein-Rest beziehen.
- Verwendung eines ρ-Conotoxin-Peptids nach einem der vorhergehenden Ansprüche in einem Rezeptorbindungsassay, um die Aktivität eines Moleküls als Antagonist der α1-Adrenozeptor-Aktivität zu testen.
- Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein ρ-Conotoxin-Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert oder zu der codierenden Sequenz komplementär ist.
- Nukleinsäuresonde, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche die Gesamtheit oder einen Teil eines ρ-Conotoxin-Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert oder zu der codierenden Sequenz komplementär ist.
- Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper gegen ein ρ-Conotoxin-Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
- Genetisches Konstrukt, umfassend einen Vektorabschnitt und eine Nukleinsäure, die ein ρ-Conotoxin-Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zu codieren vermag.
- Chimäres Peptid, umfassend ein Segment oder eine Sequenz eines in der Natur vorkommenden, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definierten ρ-Conotoxin-Peptids und ein Segment oder eine Sequenz eines weiteren biologisch aktiven Peptids oder Proteins, wobei das resultierende chimäre Peptid eine mit dem weiteren Peptid oder Protein zusammenhängende Aktivität besitzt.
- ρ-Conotoxin-Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung bei der Behandlung oder Prophylaxe von urinären oder kardiovaskulären Zuständen oder Erkrankungen, oder von Gemütsstörungen, oder zur Behandlung oder Kontrolle von Schmerz oder Entzündungen.
- Verwendung eines ρ-Conotoxin-Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen oder Zuständen, bei denen ein selektiver Antagonismus von α1-Adrenozeptoren mit einer effektiven Behandlung oder Prophylaxe zusammenhängt.
- Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Medikament für die Behandlung oder Prophylaxe von urinären oder kardiovaskulären Zuständen oder Erkrankungen, oder von Gemütsstörungen, oder zur Behandlung oder Kontrolle von Schmerz oder Entzündung ist.
- Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Erkrankung oder der Zustand des urinären Systems eine Prostatahyperplasie oder eine verwandte Störung ist.
- Verwendung nach Anspruch 16, wobei die kardiovaskuläre Erkrankung oder der kardiovaskuläre Zustand eine Arrythmie, Hypertonie oder ein Herzinfarkt ist.
- Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Gemütsstörung eine Entzugserscheinung ist.
- Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Schmerz chronischer Schmerz, neuropathischer Schmerz oder entzündlicher Schmerz ist.
- Zusammensetzung, umfassend ein isoliertes, synthetisches oder rekombinantes ρ-Conotoxin-Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
- Zusammensetzung nach Anspruch 21, nämlich eine pharmazeutische Zusammensetzung.
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