ES2200558T3 - Peptidos de rho-conotoxina que tienen actividad selectiva sobre el receptor alfa-1. - Google Patents

Peptidos de rho-conotoxina que tienen actividad selectiva sobre el receptor alfa-1.

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ES2200558T3 ES99950405T ES99950405T ES2200558T3 ES 2200558 T3 ES2200558 T3 ES 2200558T3 ES 99950405 T ES99950405 T ES 99950405T ES 99950405 T ES99950405 T ES 99950405T ES 2200558 T3 ES2200558 T3 ES 2200558T3
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Abstract

Un péptido del grupo de las -conotoxinas aislado, sintético o recombinante, o un derivado del mismo que tiene actividad antagonista selectiva del adrenoceptor 1.

Description

Péptidos de \rho-conotoxina que tienen actividad selectiva sobre el receptor \alpha-1.
La presente invención se refiere a nuevos péptidos y a derivados de los mismos útiles como antagonistas selectivos del adrenoceptor \alpha_{1}. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden estos péptidos, a sondas de ácido nucleico útiles para encontrar análogos activos de estos péptidos, a ensayos para encontrar compuestos que tengan actividad antagonista selectiva del adrenoceptor \alpha_{1} y al uso de estos péptidos en la profilaxis o tratamiento de afecciones tales como, pero sin limitación, afecciones urinarias o cardiovasculares.
Los caracoles marinos del género Conus (conos) usan una estrategia bioquímica sofisticada para capturar a sus presas. Como depredadores de cualquier pez, gusano o de otros moluscos, los conos inyectan a su presa un veneno que contiene un cóctel de péptidos bioactivos pequeños. Estas moléculas de toxina, que se denominan conotoxinas, interfieren con la neurotransmisión al dirigirse a una diversidad de receptores y canales de iones. El veneno de cualquier especie individual del género Conus puede contener más de 100 péptidos diferentes. Las conotoxinas se dividen en clases basándose en sus dianas fisiológicas. Hasta la fecha, se han descrito diez clases. La clase de péptidos perteneciente al grupo de las \omega-conotoxinas se dirige y bloquea canales de Ca^{2+} sensibles al voltaje inhibiendo la liberación de neurotransmisores. Las \alpha-conotoxinas y las \Psi-conotoxinas se dirigen y bloquean los receptores nicotínicos ACh, produciendo un bloqueo ganglionar y neuromuscular. Los péptidos de la clase de las \mu-conotoxinas actúan bloqueando canales de Na^{+} sensibles al voltaje, inhibiendo potenciales de acción muscular y nerviosa. Las \delta-conotoxinas se dirigen y retrasan la inactivación de canales de Na^{+} sensibles al voltaje, potenciando la excitabilidad neuronal. La clase de péptidos pertenecientes al grupo de las \kappa-conotoxinas se dirige y bloquea canales de K^{+} sensibles al voltaje, y también puede aumentar la excitabilidad neuronal. Las conopresinas son antagonistas del receptor de vasopresina y las conantoquinas son antagonistas del receptor NMDA. Más recientemente, se ha descrito el prototipo de una nueva clase de \gamma-conotoxina, que se dirige a un canal de cationes no específico sensible al voltaje, y de una nueva clase de \sigma-conotoxina, que antagoniza el receptor 5HT_{3}.
Ahora se ha descubierto que existe una nueva clase de conotoxinas, denominadas en lo sucesivo la clase de
\rho-conotoxinas, que se caracterizan por tener actividad antagonista del adrenoceptor \alpha_{1}. Los adrenoceptores \alpha_{1} juegan papeles importantes en muchos procesos fisiológicos y patofisiológicos de los sistemas cardiovascular y urogenital, incluyendo inotropia y cronotropia del miocardio, hipertrofia cardíaca y arritmias, vasoconstricción, contracción del músculo liso y enfermedad prostática. Los fármacos antagonistas del adrenoceptor \alpha_{1} son útiles como herramientas para la investigación básica y como agentes terapéuticos.
La Patente de Estados Unidos 5.620.993 (Patane et al) describe algunas de las funciones conocidas de los receptores adrenérgicos del subtipo \alpha_{1}, así como algunos agentes farmacológicos conocidos que se unen a dichos receptores. Los péptidos de la presente invención son los primeros péptidos presentados que tienen actividad antagonista del adrenoceptor \alpha_{1}. Además, los péptidos del grupo de las \rho-conotoxinas actúan de forma no competitiva en la inhibición de la acción de la noradrenalina. De esta manera, parece ser que las \rho-conotoxinas actúan en un sitio distinto del sitio de activación de la noradrenalina y distinto del sitio de acción de antagonistas de \alpha-adrenorreceptores tradicionales tales como el prazosín.
Por consiguiente, en un aspecto de la presente invención se proporciona un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas aislado, sintético o recombinante, que tiene actividad antagonista selectiva del adrenoceptor \alpha_{1}.
El péptido del grupo de las \rho-conotoxinas puede ser un péptido natural aislado a partir de un cono, o un derivado del mismo.
Preferiblemente, el péptido del grupo de las \rho-conotoxinas es \rho-TIA o un derivado del mismo. \rho-TIA puede aislarse a partir del conducto del veneno del cono cazador de peces Conus tulipa. Es un péptido que consta de 19 aminoácidos y contiene 2 enlaces disulfuro. La secuencia de aminoácidos de \rho-TIA es la siguiente:
SEC ID Nº. 1FNWRCCLIPACRRNHKKFC
El extremo C puede ser un ácido libre o puede estar amidado.
Como se usa en este documento, el término "selectivo", a menos que el contexto requiera otra cosa, significa que la capacidad del péptido de actuar como antagonista de un adrenoceptor \alpha_{1} es considerablemente mayor que su capacidad de actuar como antagonista de otros adrenoceptores \alpha. Preferiblemente, la actividad en otros adrenoceptores \alpha es insignificante.
El término "derivado", como se usa en este documento en relación con péptidos del grupo de las \rho-conotoxinas naturales, tales como \rho-TIA, se refiere a un péptido que difiere de los péptidos naturales en una o más deleciones, adiciones o substituciones de aminoácidos, o en una o más modificaciones de cadenas laterales. Los derivados que no tienen actividad antagonista selectiva del adrenoceptor \alpha_{1} no se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Uno de tales derivados inactivos es el péptido \rho-TIA truncado mostrado a continuación:
SEC ID Nº. 2CCLIPACRRNHKKFC
Los estudios de la truncación C-terminal de \rho-TIA han indicado que el resto en la posición 4 puede ser importante para la unión. Por consiguiente, se prefieren los péptidos en los que se retiene el resto de arginina en la posición 4 o se ha substituido con otro aminoácido con una carga positiva.
También se ha descubierto que los restos en las posiciones 1, 2 y 3 pueden substituirse para modificar la potencia y la selectividad de \rho-TIA. Tales modificaciones incluyen la adición o substitución de uno o más restos de tirosina, lo cual facilitaría el marcaje de derivados de \rho-TIA para el desarrollo de ensayos.
Las substituciones incluyen alteraciones de aminoácidos en las que un aminoácido se reemplaza por un resto aminoacídico diferente natural o no convencional. Tales substituciones pueden clasificarse como "conservativas", en cuyo caso un resto aminoacídico contenido en un polipéptido se reemplaza por otro aminoácido natural de carácter similar en relación con la polaridad, la funcionalidad de la cadena lateral o el tamaño, por ejemplo, Ser\cdot Thr\cdot Pro\cdot Hyp\cdot Gly\cdot Ala, Val\cdot Ile\cdot Leu, His\cdot Lys\cdot Arg, Asn\cdot Gln\cdot Asp\cdot Glu o Phe\cdot Trp\cdot Tyr. Debe entenderse que también pueden ser substitutos adecuados de los aminoácidos naturales algunos aminoácidos no convencionales. Por ejemplo, la ornitina, la homoarginina y la dimetil-lisina están relacionadas con His, Arg y Lys.
Las substituciones incluidas por la presente invención también pueden ser "no conservativas", en las que un resto aminoacídico que está presente en un polipéptido se substituye por un aminoácido que tiene propiedades diferentes, tal como un aminoácido natural de un grupo diferente (por ejemplo, la substitución de un aminoácido cargado o hidrófobo por alanina) o, como alternativa, en las que un aminoácido natural se substituye por un aminoácido no convencional.
Las substituciones de aminoácidos típicamente son de restos individuales, pero pueden ser de múltiples restos, agrupados o dispersos.
Preferiblemente, las substituciones de aminoácidos son conservativas.
Las adiciones incluyen la adición de uno o más restos aminoacídicos naturales o no convencionales. Las deleciones incluyen la deleción de uno o más restos aminoacídicos.
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención incluye péptidos en los que uno o más de los aminoácidos ha experimentado modificaciones en la cadena lateral. Los ejemplos de modificaciones de cadena lateral contemplados por la presente invención incluyen modificaciones de grupos amino tales como por medio de alquilación reductora por reacción con un aldehído seguida de reducción con NaBH_{4}; amidinación con metilacetimidato; acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido
2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS); acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con piridoxal-5-fosfato seguida de reducción con NaBH_{4}.
El grupo guanidina de los restos de arginina puede modificarse por la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos tales como 2,3-butanodiona, fenilglioxal y glioxal.
El grupo carboxilo puede modificarse por activación de carbodiimida por medio de la formación de O-acilisourea, seguida de una modificación posterior, por ejemplo, para dar una amida correspondiente.
Los grupos sulfhidrilo pueden modificarse por métodos tales como carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; oxidación de ácido perfórmico a ácido cisteico; formación de disulfuros mixtos con otros compuestos tiólicos; reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida substituida; formación de derivados mercuriales usando 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de fenilmercurio, 2-cloromercuri-4-nitrofenol y otros mercuriales; o carbamoilación con cianato a pH alcalino. Ninguna modificación de restos de cisteína debe afectar a la capacidad del péptido de formar los enlaces disulfuro necesarios. También es posible reemplazar los grupos sulfhidrilo de la cisteína con equivalentes de selenio, de tal forma que el péptido forme un enlace de diselenio en lugar de uno o más de los enlaces disulfuro.
Los restos de triptófano pueden modificarse, por ejemplo, por oxidación con N-bromosuccinimida o alquilación del anillo de indol con bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros de sulfenilo. Por otra parte, los restos de tirosina pueden alterarse por nitración con tetranitrometano para formar un derivado de 3-nitrotirosina.
La modificación del anillo de imidazol de un resto de histidina puede realizarse por alquilación con derivados de ácido yodoacético o N-carbetoxilación con dietilpirocarbonato.
Los restos de prolina pueden modificarse, por ejemplo, por hidroxilación en la posición 4.
En la tabla 1 se muestra una lista de algunos aminoácidos que tienen cadenas laterales modificadas y otros aminoácidos no naturales.
TABLA 1
Aminoácido no convencional Código Aminoácido no convencional Código
ácido \alpha-aminobutírico Abu L-N-metilalanina Nmala
\alpha-amino-\alpha-metilbutirato Mgabu L-N-metilarginina Nmarg
aminociclopropano-carboxilato Cpro L-N-metilasparagina Nmasn
ácido L-N-metilaspártico Nmasp
ácido aminoisobutírico Aib L-N-metilcisteína Nmcys
aminonorbonil-carboxilato Norb L-N-metilglutamina Nmgln
ácido L-N-metilglutámico Nmglu
ciclohexilalanina Chexa L-N-metilhistidina Nmhis
ciclopentilalanina Cpen L-N-metilisoleucina Nmile
D-alanina Dal L-N-metil-leucina Nmleu
D-arginina Darg L-N-metil-lisina Nmlys
ácido D-aspártico Dasp L-N-metilmetionina Nmmet
D-cisteína Dcys L-N-metilnorleucina Nmnle
D-glutamina Dgln L-N-metilnorvalina Nmnva
ácido D-glutámico Dglu L-N-metilornitina Nmorn
D-histidina Dhis L-N-metilfenilalanina Nmphe
D-isoleucina Dile L-N-metilprolina Nmpro
D-leucina Dleu L-N-metilserina Nmser
D-lisina Dlys L-N-metiltreonina Nmthr
D-metionina Dmet L-N-metiltriptófano Nmtrp
D-ornitina Dorn L-N-metiltirosina Nmtyr
D-fenilalanina Dphe L-N-metilvalina Nmval
D-prolina Dpro L-N-metiletilglicina Nmetg
D-serina Dser L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug
D-treonina Dthr L-norleucina Nle
D-triptófano Dtrp L-norvalina Nva
D-tirosina Dtyr \alpha-metil-aminoisobutirato Maib
D-valina Dval \alpha-metil-\gamma-aminobutirato Mgabu
D-\alpha-metilalanina Dmala \alpha-metilciclohexilalanina Mchexa
D-\alpha-metilarginina Dmarg \alpha-metilciclopentilalanina Mcpen
D-\alpha-metilasparagina Dmasn \alpha-metil-\alpha-naftilalanina Manap
D-\alpha-metilaspartato Dmasp \alpha-metilpenicilamina Mpen
D-\alpha-metilcisteína Dmcys N-(4-aminobutil)glicina Nglu
D-\alpha-metilglutamina Dmgln N-(2-aminoetil)glicina Naeg
D-\alpha-metilhistidina Dmhis N-(3-aminopropil)glicina Norn
D-\alpha-metilisoleucina Dmile N-amino-\alpha-metilbutirato Nmaabu
D-\alpha-metil-leucina Dmleu \alpha-naftilalanina Anap
D-\alpha-metil-lisina Dmlys N-bencilglicina Nphe
D-\alpha-metilmetionina Dmmet N-(2-carbamiletil)glicina Ngln
D-\alpha-metilornitina Dmorn N-(carbamilmetil)glicina Nasn
D-\alpha-metilfenilalanina Dmphe N-(2-carboxietil)glicina Nglu
D-\alpha-metilprolina Dmpro N-(carboximetil)glicina Nasp
D-\alpha-metilserina Dmser N-ciclobutilglicina Ncbut
D-\alpha-metiltreonina Dmthr N-cicloheptilglicina Nchep
D-\alpha-metiltriptófano Dmtrp N-ciclohexilglicina Nchex
D-\alpha-metiltirosina Dmty N-ciclodecilglicina Ncdec
D-\alpha-metilvalina Dmval N-ciclododecilglicina Ncdod
D-N-metilalanina Dnmala N-ciclooctilglicina Ncoct
D-N-metilarginina Dnmarg N-ciclopropilglicina Ncpro
D-N-metilasparagina Dnmasn N-cicloundecilglicina Ncund
D-N-metilaspartato Dnmasp N-(2,2-difeniletil)glicina Nbhm
D-N-metilcisteína Dnmcys N-(3,3-difenilpropil)glicina Nbhe 
\newpage
TABLA 1 (continuación)
Aminoácido no convencional Código Aminoácido no convencional Código
D-N-metilglutamina Dnmgln N-(3-guanidinopropil)glicina Narg
D-N-metilglutamato Dnmglu N-(1-hidroxietil)glicina Nthr
D-N-metilhistidina Dnmhis N-(hidroxietil)glicina Nser
D-N-metilisoleucina Dnmile N-(imidazoliletil)glicina Nhis
D-N-metil-leucina Dnmleu N-(3-indoliletil)glicina Nhtrp
D-N-metil-lisina Dnmlys N-metil-\gamma-aminobutirato Nmgabu
N-metilciclohexilalanina Nmchexa D-N-metilmetionina Dnmmet
D-N-metilornitina Dnmorn N-metilciclopentilalanina Nmcpen
N-metilglicina Nala D-N-metilfenilalanina Dnmphe
N-metilaminoisobutirato Nmaib D-N-metilprolina Dnmpro
N-(1-metilpropil)glicina Nile D-N-metilserina Dnmser
N-(2-metilpropil)glicina Nleu D-N-metiltreonina Dnmthr
D-N-metiltriptófano Dnmtrp N-(1-metiletil)glicina Nval
D-N-metiltirosina Dnmtyr N-metil-naftilalanina Nmanap
D-N-metilvalina Dnmval N-metilpenicilamina Nmpen
ácido \gamma-aminobutírico Gabu N-(p-hidroxifenil)glicina Nhtyr
L-t-butilglicina Tbug N-(tiometil)glicina Ncys
L-etilglicina Etg penicilamina Pen
L-homofenilalanina Hphe L-\alpha-metilalanina Mala
L-\alpha-metilarginina Marg L-\alpha-metilasparagina Masn
L-\alpha-metilaspartato Masp L-\alpha-metil-t-butilglicina Mtbug
L-\alpha-metilcisteína Mcys L-metiletilglicina Metg
L-\alpha-metilglutamina Mgln L-\alpha-metilglutamato Mglu
L-\alpha-metilhistidina Mhis L-\alpha-metilhomofenilalanina Mhphe
L-\alpha-metilisoleucina Mile N-(2-metiltioetil)glicina Nmet
L-\alpha-metil-leucina Mleu L-\alpha-metil-lisina Mlys
L-\alpha-metilmetionina Mmet L-\alpha-metilnorleucina Mnle
L-\alpha-metilnorvalina Mnva L-\alpha-metilornitina Morn
L-\alpha-metilfenilalanina Mphe L-\alpha-metilprolina Mpro
L-\alpha-metilserina Mser L-\alpha-metiltreonina Mthr
L-\alpha-metiltriptófano Mtrp L-\alpha-metiltirosina Mtyr
L-\alpha-metilvalina Mval L-N-metilhomofenilalanina Nmhphe
N-(N-(2,2-difeniletil) Nnbhm N-(N-(3,3-difenilpropil) Nnbhe
carbamilmetilglicina carbamilmetilglicina
1-carboxi-1-(2,2-difeniletilamino) Nmbc O-metil-L-serina Omser
ciclopropano
O-metil-L-homoserina Omhser
Estos tipos de modificaciones pueden ser importantes para estabilizar al péptido si se administra a un individuo o para uso como un reactivo de diagnóstico.
Otros derivados contemplados por la presente invención incluyen una serie de variantes de glicosilación de una molécula completamente desglicosilada hasta una molécula glicosilada modificada. Los modelos de glicosilación alterados pueden deberse a la expresión de moléculas recombinantes en diferentes células hospedadoras.
Las \rho-conotoxinas de la presente invención típicamente se amidan en el extremo C, sin embargo, se consideran dentro del alcance de la presente invención compuestos con un extremo carboxilo libre u otras modificaciones en el extremo C. Preferiblemente, los péptidos se amidan o tienen un carboxilo libre en el extremo C.
Preferiblemente, los derivados de péptidos del grupo de las \rho-conotoxinas naturales retendrán los restos Cys y un modelo de enlaces disulfuro característico. Los derivados pueden incluir restos de Cys adicionales siempre que estén protegidos durante la formación de los enlaces disulfuro.
\newpage
En la modificación para formar derivados de péptidos del grupo de las \rho-conotoxinas naturales, es útil comparar las secuencias de aminoácidos de los péptidos naturales activos para determinar cuáles de los restos se conservan, si se conserva alguno, entre las especies activas. La substitución de estos restos conservados, aunque no está prohibida, es menos preferida que las substituciones de restos no conservados.
Pueden usarse derivados en los que una Ala reemplaza a uno o más restos para identificar el farmacóforo. Preferiblemente, sólo uno o dos aminoácidos se remplazan por Ala al mismo tiempo. Pueden obtenerse nuevos péptidos adicionales en los que se reemplacen restos cargados, polares o hidrófobos, respectivamente, para ayudar a definir de forma más precisa el tipo de interacciones implicadas en la unión de esta clase de péptidos farmacológicos a su receptor. Los reemplazos no conservativos, en los que se invierte la carga o restos polares reemplazan a restos hidrófobos, pueden identificar adicionalmente los restos implicados en la unión. Todos estos péptidos pueden mostrar una mayor potencia, o una mayor selectividad por un subtipo de adrenoceptor \alpha_{1}. También podrían incluirse cambios de aminoácidos no nativos para mejorar la potencia, la selectividad y/o la estabilidad.
Lo más probable es que los retos expuestos estén implicados en la unión al receptor y pueden reemplazarse sistemáticamente. Se da una importancia particular al cambio de los restos implicados en la unión y de los restos situados en la periferia del farmacóforo, usando formas de cadena lateral más larga, o a cambios no conservados para seleccionar interacciones de unión adicionales para conseguir una mayor potencia y/o selectividad. La reducción o el aumento de los tamaños de los bucles y de la cola de TIA modifica adicionalmente la actividad.
Debe tenerse en cuenta que \rho-TIA consta de una cola (restos 1-4) y dos bucles (restos 7-10 y 12-18), sin embargo, los péptidos del grupo de las \rho-conotoxinas y los derivados de la presente invención no se restringen a los que tienen esta disposición particular de aminoácidos y enlaces disulfuro. También son posibles otras disposiciones, y siempre que el péptido resultante tenga actividad antagonista selectiva del adrenoceptor \alpha_{1}, dicho péptido se incluirá dentro del alcance de la presente invención. Preferiblemente, los péptidos tendrán al menos dos restos de cisteína y al menos un enlace disulfuro o, más preferiblemente, cuatro restos de cisteína y dos enlaces disulfuro.
La conectividad de los enlaces disulfuro en estos péptidos puede ser A-C/B-D, A-D/B-C o A-B/C-D, siendo preferida la primera en el caso de \rho-TIA. A, B, C y D se refieren al primer, segundo, tercer y cuarto restos de Cys implicados en la formación de enlaces disulfuro, respectivamente.
Estos péptidos también pueden marcarse y usarse para establecer ensayos de unión para identificar nuevas moléculas que actúan en el mismo sitio. Por ejemplo, el ligando marcado de \rho-TIA puede incluir tritio o puede tener yodo radiactivo o estar unido de forma similar a través de una Tyr u otro resto apropiado. Una exploración de las Tyr a lo largo de cada péptido establecerá una localización adecuada par la incorporación de la Tyr. La inhibición de la unión de tales péptidos marcados a homogeneizados de tejido o a adrenoceptores expresados por ciertos compuestos o mezclas permitiría la identificación de nuevos péptidos activos en este sitio, incluyendo péptidos presentes en suero y en tejido nervioso y muscular de mamíferos, incluyendo tejidos humanos. El ensayo también permitirá la identificación de moléculas no peptídicas que también actúan en el mismo sitio que \rho-TIA, y que pueden tener utilidad como formas de estos péptidos activas por vía oral. Los péptidos marcados también permitirán realizar estudios autorradiográficos para identificar la localización de la unión de los péptidos a lo largo de diversos tejidos.
Pueden usarse porciones de estas secuencias para examinar bases de datos ESTR para identificar en mamíferos péptidos o proteínas que contengan una información de secuencia relacionada que pueda usarse para identificar ligandos endógenos que actúen de una manera similar en mamíferos.
Las \rho-conotoxinas de la presente invención pueden prepararse usando métodos de síntesis de péptidos convencionales seguidas de la formación oxidativa de enlaces disulfuro. Por ejemplo, los péptidos lineales pueden sintetizarse por la metodología en fase sólida usando la química BOC, como se describe por Schnoltzer et al (1992). Después de la desprotección y escisión del soporte sólido, los péptidos reducidos se purifican usando cromatografía preparativa. Los péptidos reducidos purificados se oxidan en sistemas tamponados, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 2. Los péptidos oxidados se purifican usando cromatografía preparativa.
Las referencias que describen la síntesis de conotoxinas incluyen Sato et al., Lew et al y el documento
WO 91/07980.
Las \rho-conotoxinas también pueden prepararse usando la tecnología de ADN recombinante. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia peptídica deseada puede insertarse en un vector adecuado y la proteína puede expresarse en un sistema de expresión apropiado. En algunos casos, puede ser apropiada una modificación química adicional del péptido expresado, por ejemplo, una amidación C-terminal. En algunas circunstancias, puede ser deseable realizar la formación de enlaces oxidativos del péptido expresado como una etapa química posterior a la expresión del péptido. Esto puede estar precedido por una etapa de reducción para proporcionar el péptido no plegado. Los especialistas en la técnica pueden determinar fácilmente las condiciones apropiadas para la reducción y oxidación del péptido.
La invención proporciona además una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria o a la secuencia que codifica un péptido de \rho-conotoxina descrita anteriormente.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una sonda de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica todo o parte de un péptido de
\rho-conotoxina.
En una realización particularmente preferida, la sonda de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica la secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 1.
Como se usa en este documento, una referencia a una "sonda" incluye la referencia a un cebador usado en una amplificación o una sonada para uso en una hibridación directa.
Otro aspecto más de la presente invención se refiere a anticuerpos contra los péptidos del grupo de las \rho-conotoxinas de acuerdo con la invención. Tales anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden seleccionarse entre anticuerpos naturales contra los péptidos o pueden inducirse específicamente contra los péptidos usando técnicas convencionales. En este último caso, puede ser necesario asociar primero los péptidos con una molécula de soporte. Los anticuerpos de la presente invención son particularmente útiles como agentes terapéuticos o de diagnóstico.
A este respecto, pueden usarse anticuerpos específicos para seleccionar los polipéptidos de acuerdo con la invención. Las técnicas para tales ensayos son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayos de sándwich y ELISA. El conocimiento de los niveles de péptido puede ser importante para controlar ciertos protocolos terapéuticos.
También es posible preparar anticuerpos antiidiotípicos usando técnicas conocidas en la técnica. Estos anticuerpos antiidiotípicos y su uso como agentes terapéuticos representan un aspecto adicional de la invención.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser ADN o ARN. Cuando la molécula de ácido nucleico está en forma de ADN, puede ser ADN genómico o ADNc. Las formas de ARN de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención son generalmente ARNm.
Aunque las moléculas de ácido nucleico de la presente invención generalmente están en forma aislada, pueden integrarse, unirse, fusionarse de otra manera o asociarse con otras moléculas genéticas tales como moléculas de vectores y, en particular, moléculas de vectores de expresión. Los vectores y los vectores de expresión generalmente son capaces de replicarse y, si es pertinente, de expresarse en una célula procariota, en una célula eucariota o en ambos tipos celulares. Preferiblemente, las células procariotas incluyen E. coli, Bacillus sp y Pseudomonas sp. Las células eucariotas preferidas incluyen levaduras, hongos, células de mamífero y células de insecto.
Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención contempla una construcción genética que comprende una porción de vector y un gen capaz de codificar un péptido de acuerdo con la invención.
Preferiblemente, la porción génica de la construcción genética está unida operativamente a un promotor presente en el vector de tal forma que dicho promotor sea capaz de dirigir la expresión de la porción génica en una célula apropiada.
La presente invención incluye tales construcciones genéticas y células procariotas o eucariotas que las comprenden.
Pueden obtenerse quimeras de \rho-conotoxinas tales como \rho-TIA, con otras conotoxinas o adicionalmente con otros péptidos o proteínas, para introducir la actividad en otras moléculas por medio de ingeniería genética, en algunos casos para producir una nueva molécula con funcionalidad extra. Preferiblemente, esto se realizaría usando el segmento o segmentos de la secuencia de estos péptidos que contienen el farmacóforo. Cuando el farmacóforo es discontinuo, los segmentos que constituyen el farmacóforo deben colocarse en la nueva construcción para permitir la unión al receptor. Las quimeras con otras conotoxinas pueden incluir restos de Cys adicionales y restos disulfuro adicionales.
Es común que los péptidos del grupo de las conotoxinas dentro de una clase de actividad tengan un modelo similar de formación de enlaces disulfuro, con bucles de péptidos entre los restos de cisteína respectivos. En el caso de
\rho-TIA, los enlaces disulfuro unen el primer y el tercer, y el segundo y el cuarto restos de cisteína. Este modelo es similar al modelo de unión observado para los péptidos del grupo de las \alpha-conotoxinas. Por consiguiente, pueden prepararse derivados quiméricos substituyendo un bucle de un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas por el bucle que comprende una secuencia de otro péptido, incluyendo \alpha-conotoxinas.
La invención también incluye dímeros, trímeros, etc. de péptidos del grupo de las \rho-conotoxinas, así como péptidos del grupo de las \rho-conotoxinas unidos a otros péptidos.
Preferiblemente, los péptidos del grupo de las \rho-conotoxinas de acuerdo con la invención tienen de 10 a 30 aminoácidos, más preferiblemente de 15 a 25.
La secuencia génica completa para los péptidos del grupo de las \rho- conotoxinas naturales puede obtenerse usando una estrategia 5' RACE y 3' RACE combinada junto con clonación y secuenciación del ADN.
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Aunque \rho-TIA presenta alguna homología de secuencia con las \alpha-conotoxinas, que son bloqueantes del receptor nicotínico ACh, no se descubrió que \rho-TIA (10 \muM) se dirigiera al subtipo neuronal o muscular del receptor nicotínico ACh en ensayos que usaban preparaciones aisladas de íleon de cobaya y de hemidiafragma de nervio frénico de ratón.
Por consiguiente, en un aspecto preferido de la presente invención, el péptido del grupo de las \rho-conotoxinas se caracteriza adicionalmente porque carece de actividad en el subtipo neuronal o muscular del receptor nicotínico ACh.
En estudios de unión, también se descubrió que existe una variación en la afinidad de \rho-TIA por los subtipos de receptores adrenérgicos \alpha_{1a}, \alpha_{1b} y \alpha_{1d}. Por consiguiente, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas aislado, sintético o recombinante, que tiene actividad antagonista selectiva de \alpha_{1}, y que tiene selectividad por un subtipo de \alpha_{1} con respecto a los demás subtipos.
Los péptidos del grupo de las \rho-conotoxinas de acuerdo con la presente invención son antagonistas selectivos del adrenoceptor \alpha_{1}. Por consiguiente, la invención proporciona el uso de una \rho-conotoxina de acuerdo con la invención como un antagonista selectivo del adrenoceptor \alpha_{1}, y en el tratamiento o profilaxis de enfermedades o afecciones en las que una actividad antagonista en los adrenoceptores \alpha_{1} está asociada con un tratamiento eficaz. Tal actividad en agentes farmacológicos está asociada con la eficacia en la profilaxis o tratamiento de enfermedades o afecciones de los sistemas urinario o cardiovascular, o de trastornos del estado de ánimo, o en el tratamiento o control del dolor o la inflamación.
Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para el tratamiento o profilaxis de afecciones o enfermedades urinarias o cardiovasculares o de trastornos del estado de ánimo, o para el tratamiento o control del dolor o la inflamación, que incluye la etapa de administrar a un mamífero una cantidad eficaz de un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas aislado, sintético o recombinante, que tiene actividad antagonista selectiva del adrenoceptor \alpha_{1}.
Los ejemplos de enfermedades o afecciones del sistema urinario incluyen hiperplasia prostática benigna y trastornos relacionados. Los ejemplos de enfermedades o afecciones cardiovasculares incluyen arritmia de diversas regiones, hipertensión e insuficiencia cardíaca coronaria. Los ejemplos de trastornos del estado de ánimo incluyen adicciones tales como el hábito de fumar. Los ejemplos de dolor incluyen dolor crónico, dolor neuropático y dolor inflamatorio.
Preferiblemente, el mamífero necesita tal tratamiento, aunque el péptido puede administrarse en un sentido profiláctico.
La invención también proporciona una composición que comprende un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas aislado, sintético o recombinante, que tiene actividad antagonista selectiva del adrenoceptor \alpha_{1}, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Preferiblemente, la composición está en forma de una composición farmacéutica.
También se proporciona el uso de un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas aislado, sintético o recombinante, que tiene actividad antagonista selectiva del adrenoceptor \alpha_{1}, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de afecciones o enfermedades urinarias o cardiovasculares, o trastornos del estado de ánimo, o para el tratamiento o control del dolor o la inflamación.
Como se apreciará fácilmente por los especialistas en la técnica, la vía de administración y la naturaleza del vehículo farmacéuticamente aceptable dependerá de la naturaleza de la afección y del mamífero a tratar. Se cree que la elección de un vehículo o sistema de liberación particular, y la vía de administración, pueden determinarse fácilmente por una persona especialista en la técnica. En la preparación de cualquier formulación que contenga los péptidos activos, debe tenerse cuidado de garantizar que la actividad del péptido no se destruye en el proceso y que el péptido es capaz de alcanzar su sitio de acción sin destruirse. En algunas circunstancias, puede ser necesario proteger al péptido por medios conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, microencapsulación. De forma similar, la vía de administración elegida debe ser tal que el péptido alcance su sitio de acción.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones inyectables estériles, y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles. Deben ser estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento y pueden protegerse contra la oxidación y la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias u hongos.
Los especialistas en la técnica pueden determinar fácilmente las formulaciones apropiadas para los péptidos o péptidos modificados de la presente invención usando estrategias convencionales. La identificación de intervalos de pH preferidos y excipientes adecuados, por ejemplo, antioxidantes, es rutinaria en la técnica (véase, por ejemplo, Cleland et al, 1993). Rutinariamente se usan sistemas tampón para proporcionar valores de pH de un intervalo deseado e incluyen tampones de ácido carboxílico, por ejemplo, acetato, citrato, lactato y succinato. Se dispone de una diversidad de antioxidantes para tales formulaciones, incluyendo compuestos fenólicos tales como BHT o vitamina E, agentes reductores tales como metionina o sulfito, y quelantes de metales tales como EDTA.
El disolvente o medio de dispersión para la solución o dispersión inyectable puede contener cualquiera de los sistemas disolventes o excipientes convencionales para péptidos activos, y puede contener, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por medio del uso de un recubrimiento tal como lecitina, por medio del mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión y por medio del uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse cuando sea necesario por medio de la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes para ajustar la osmolalidad, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. Preferiblemente, la formulación para inyección será isotónica con la sangre. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse por medio del uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las formas farmacéuticas para uso inyectable pueden administrarse por cualquier vía apropiada, incluyendo inyección intravenosa, intramuscular, intracerebral, intratecal, epidural o infusión.
Las soluciones inyectables estériles se preparan por medio de la incorporación de los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos ingredientes distintos tales como los indicados anteriormente, cuando se requiera, seguido de una esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y otros ingredientes requeridos seleccionados entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, son métodos de preparación preferidos el secado al vacío o la liofilización de una solución filtrada previamente de forma estéril del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional.
Cuando los ingredientes activos están protegidos convenientemente, pueden administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden encerrarse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente en los alimentos de la dieta. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Tales composiciones y preparaciones preferiblemente contienen al menos un 1% en peso de compuesto activo. Por supuesto, el porcentaje de las composiciones y preparaciones puede variar y, convenientemente, puede estar comprendido entre aproximadamente un 5 y aproximadamente un 80% del peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en tales composiciones terapéuticamente útiles será tal que se obtenga una dosificación adecuada.
Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener los componentes indicados más adelante: Puede añadirse un aglutinante tal como goma arábiga, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente disgregante tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina, o un agente aromatizante tal como menta, aceite de pirola o aroma de cerezas. Cuando la forma de dosificación es una cápsula, puede contener, además de materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Pueden estar presentes otros diversos materiales como recubrimientos o para modificar de otra manera la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con goma laca, azúcar o ambas substancias. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y un aromatizante tal como aroma de cerezas o de naranja. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente puro y substancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto o los compuestos activos pueden incorporarse en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida.
La presente invención también incluye cualquier otra forma adecuada para la administración, por ejemplo, para la aplicación tópica tal como cremas, lociones y geles, o composiciones adecuadas para la inhalación o la administración intranasal, por ejemplo, soluciones o polvos secos.
Se prefieren las formas de dosificación parenterales, incluyendo las adecuadas para la administración intravenosa, intratecal, intracerebral o epidural.
Los vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen todos y cada uno de los siguientes: disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares. El uso de tales medios y agentes para substancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto en el caso de que algún medio o agente convencional no sea compatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. En las composiciones también pueden incorporarse ingredientes activos adicionales.
Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y para permitir una uniformidad en la dosificación. La forma de dosificación unitaria, como se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las nuevas formas de dosificación unitaria de la invención está gobernada y depende directamente de (a) las características particulares del material activo y el efecto terapéutico particular que se desee conseguir, y (b) las limitaciones intrínsecas de la técnica de la formación de composiciones de un material activo para el tratamiento de enfermedades en sujetos vivos que tienen un estado de enfermedad en el que se ve perjudicada la salud corporal como se describe en este documento con detalle.
Para una administración conveniente y eficaz, el ingrediente activo principal se mezcla, en cantidades eficaces, con un vehículo farmacéuticamente aceptable en una forma de dosificación unitaria. Una forma de dosificación unitaria puede contener, por ejemplo, el compuesto activo principal en cantidades que varían de 0,25 \mug a aproximadamente 2000 mg. Expresado en proporciones, el compuesto activo generalmente está presente en una cantidad de aproximadamente 0,25 \mug a aproximadamente 200 mg/ml de vehículo. En el caso de composiciones que contienen ingredientes activos adicionales, las dosificaciones se determinan por referencia a la dosis habitual y la forma de administración de dichos ingredientes.
La invención se describirá a continuación haciendo referencia a los dibujos adjuntos y ejemplos, sin embargo, debe entenderse que la particularidad de la siguiente descripción no substituye a la generalidad de la descripción anterior de la invención.
Haciendo referencia a las figuras:
La figura 1 es una representación gráfica que muestra el efecto de \rho-TIA a lo largo del tiempo de la contracción isométrica de una preparación representativa de conducto deferente de próstata de rata biseccionado sometida a estimulación de campo con un solo pulso supramáximo (55 V, 1 ms). \rho-TIA (100 nM-3 \mul) se añadió al baño de órganos acumulativamente, usando una progresión de unidades de dosificación semilogarítmica.
La figura 2 es una representación gráfica que muestra las curvas de logaritmo de la concentración-respuesta para la noradrenalina en el conducto deferente de epidídimo de rata biseccionado en ausencia (O) y presencia de \rho-TIA 1 \muM (\Delta), 3 \muM ( ) o 10 \muM (\diamondsuit). Los puntos de datos son medias \pm SEM de respuestas de 5 experimentos distintos. Algunas barras de error están oscurecidas por los símbolos.
La figura 3 es una representación gráfica del efecto de \rho-TIA sobre la inhibición mediada por el adrenoceptor \alpha_{2} de la respuesta de espasmo del conducto deferente de próstata de rata biseccionado a la estimulación de campo con un solo pulso supramáximo (55 V, 1 ms). Curvas de logaritmo de la concentración-respuesta para noradrenalina en ausencia (O) y presencia (\Delta) de \rho-TIA 10 \muM. Cada punto en la media de 5 experimentos y las barras verticales indican la SEM.
La figura 4 es una representación gráfica del efecto de \rho-TIA sobre la unión por el antagonista del adrenoceptor \alpha_{1} radiomarcado [^{125}I]-HEAT a preparaciones de membrana de células COS-1 transfectadas de forma transitoria con clones de ADNc para los tres subtipos de adrenoceptor \alpha_{1}, \alpha_{1a}, \alpha_{1b} y \alpha_{1d}. Cada punto representa la media de tres experimentos \pm SEM. Algunas barras de error están obscurecidas por los símbolos.
La figura 5 es una representación esquemática que muestra la derivación de secuencias peptídicas de veneno de conos. La PCR 5'RACE usando los cebadores AP1 + RHO-1B produce 5'UTR y la secuencia peptídica líder que después se usa para generar cebadores de PCR específicos para \rho-conotoxinas. La 3'UTR, usando los cebadores RHO-1A + ANCHOR, completó la derivación de la secuencia peptídica madura restante y la secuencia de 3'UTR.
Ejemplos Estudios estadísticos y análisis de datos
Los datos para los siguientes ejemplos se expresaron como media \pm s.e. de la media a partir de los resultados obtenidos con n = 3-6 experimentos. Para la evaluación estadística se usaron ensayos t de Student de dos colas o ANOVA y los valores de p<0,05 se consideraron significativos. El ajuste de la curva sigmoidea de las curvas de concentración-respuesta para el cálculo de los valores de EC_{50} se realizó por regresión no lineal usando el paquete de software Igor Pro (WaveMetrics). Los datos de unión del radioligando se analizaron usando el programa de ajuste de curvas no lineal iterativo Prism (GraphPad). Los valores de IC_{50} se convirtieron en valores de K_{i} usando la ecuación de Cheng-Prusoff y una K_{D} para [^{125}I]-HEAT de 66 pM.
Fármacos
Los siguientes fármacos se obtuvieron en Sigma: indometacina, hidrogenotartrato de nicotina, bitartrato de
(-)-noradrenalina, clorhidrato de prazosín, suramina, tetrodotoxina y clorhidrato de yohimbina. [^{125}I]-HEAT (actividad específica 2200 Ci/mmol) se obtuvo en New England Nuclear.
Ejemplo 1 Conducto deferente de rata
Se sacrificaron ratas Wistar macho (250-350 g) por un golpe en la cabeza y se desangraron. Se retiraron los conductos deferentes y se liberaron de tejido conjuntivo. Cada conducto deferente se cortó en segmentos de epidídimo y de próstata biseccionados. Las porciones de tejido se montaron bajo una tensión de 0,5 g en baños de órganos de 5 ml que contenían solución fisiológica salina a 37ºC y se burbujearon con CO_{2} al 5% v/v en O_{2}. La composición de la solución del baño era (mM): NaCl, 119; KCl, 4,7; MgSO_{4}, 1,17; KH_{2}PO_{4}, 1,18; NaHCO_{3}, 25,0; glucosa, 5,5; CaCl_{2}, 2,5; EDTA, 0,026. Las preparaciones de tejido se dejaron equilibrar durante al menos 45 minutos antes de la experimentación. Se registraron contracciones isométricas usando un transductor de fuerza (Narco Bio-System F-60) y se registraron digitalmente en un ordenador Power Macintosh con el software Chart versión 3.5.4/s y un sistema de adquisición de datos MacLab/8s (ADInstruments) a una frecuencia de muestreo de 10 o 200 Hz.
Los segmentos prostáticos biseccionados se pusieron entre dos electrodos estimuladores de platino. Para examinar el efecto de \rho-TIA sobre la contracción inducida eléctricamente del músculo liso mediada por la neurotransmisión simpática, se añadieron concentraciones crecientes del péptido acumulativamente al baño de órganos cuando el tejido se estaba sometiendo a la estimulación de campo eléctrico. Se generaron pulsos eléctricos individuales con una amplitud de 55 V y una duración de 1 ms por un estimulador Grass S44 a intervalos de 3 minutos. Las contracciones resultantes podían anularse por tetrodotoxina (0,1 mM), lo que indica que eran de origen neurogénico. Además, la fase inicial de la contracción era sensible a suramina (0,3 mM) y la segunda fase podía inhibirse por prazosín (0,5 \muM).
Efecto de \rho-TIA sobre la neurotransmisión simpática en el conducto deferente de rata
La respuesta del conducto deferente de próstata de rata biseccionado a la estimulación de campo fue bifásica. La primera fase de la contracción fue la mayor de las dos, y tuvo un máximo aproximadamente 200 ms después de la estimulación. La segunda fase alcanzó un máximo aproximadamente 500-600 ms después del estímulo. \rho-TIA actuó reduciendo la segunda fase de la contracción de una manera dependiente de la concentración (figura 1). El pico monofásico generado restando la señal obtenida en presencia de la mayor concentración de \rho-TIA usada (10 \muM) de las otras, ilustra que el efecto de la conotoxina era específico sólo para el segundo componente de la contracción. Se descubrió que la concentración de conotoxina que inhibe la segunda fase de la concentración en un 50%, el valor de IC_{50}, era de aproximadamente 300 nM (figura 1).
El modelo de inhibición producido por \rho-TIA se parece al observado usando prazosín u otros antagonistas del adrenoceptor \alpha_{1} (McGrath, 1978, J Physiol Lond, 283, 23-39). Sin embargo, se ha observado que cuando se usan altas concentraciones de prazosín (0,5 \muM), se pierde la especificidad de la acción, siendo también sensible a la inhibición el primer componente de la contracción. El primer componente está mediado por la acción del co-transmisor simpático ATP en los purinoceptores P_{2x}, y puede anularse por antagonistas del purinoceptor P_{2x} tales como suramina. Por lo tanto, se considera probable que la inhibición no específica de la primera fase de la contracción se deba al bloqueo de los canales neuronales de Na^{+}, un efecto anestésico local que se ha notificado previamente para el prazosín y algunos otros antagonistas del adrenoceptor \alpha_{1} (Bralet et al., 1985, Br J Pharmacol, 84, 47-55; Northover, 1983, Br J Pharmacol, 80, 85-93; Perez et al., 1994, Mol Pharmacol, 46, 823-31). \rho-TIA actuó como un antagonista no competitivo funcional, lo que sugiere que actuaba alostéricamente en un nuevo sitio para modular la unión de noradrenalina al adrenoceptor \alpha_{1}.
Ejemplo 2 Efectos de métodos de respuestas post-funcionales
Estos experimentos fueron similares a los descritos en el ejemplo 1, con la excepción de que los segmentos de epidídimo biseccionados no se estimularon eléctricamente. Estas preparaciones de tejido se usaron para examinar el efecto de \rho-TIA sobre la respuesta contráctil después de la unión a la noradrenalina. Se establecieron curvas de concentración acumulativa-respuesta en ausencia y en presencia de \rho-TIA. La conotoxina, a una concentración de 1 \muM, 3 \muM o 10 \muM, se añadió al baño de órganos y se equilibró con el tejido durante 20 min antes de la aplicación de dosis de noradrenalina. Se generó una sola curva de concentración-respuesta por preparación, sirviendo como controles segmentos de tejido contralaterales que no se habían expuesto a \rho-TIA.
Efecto de \rho-TIA sobre la respuesta a noradrenalina en el conducto deferente de rata
Para confirmar que el efecto de \rho-TIA sobre la respuesta a la estimulación de campo se debía a la acción del péptido corriente abajo de la liberación del neurotransmisor, se examinó su efecto sobre la respuesta a noradrenalina aplicada exógenamente.
Se generaron curvas de logaritmo de la concentración-respuesta a noradrenalina en segmentos biseccionados del conducto deferente de epidídimo de rata en ausencia y presencia de \rho-TIA (figura 2). El efecto de \rho-TIA a una concentración de 1 \muM fue una reducción de 3 veces en la sensibilidad del tejido a la noradrenalina, observada como un desplazamiento de la curva de concentración-respuesta a la derecha. A las concentraciones superiores (3 \muM y 10 \muM), \rho-TIA actuó reduciendo la sensibilidad del tejido adicionalmente, aumentando la EC_{50} de la noradrenalina en un factor de 5,2 y 16,7. Las dos concentraciones máximas de \rho-TIA también actuaron reduciendo el nivel de la respuesta máxima al 82 y 42% de la respuesta de control, respectivamente.
La reducción de la respuesta máxima del conducto deferente a la noradrenalina producida por \rho-TIA es coherente con el hecho de que la conotoxina actúe como un antagonista no competitivo del adrenoceptor \alpha_{1}. Inicialmente, la curva de concentración de noradrenalina-respuesta se desplaza a la derecha sin ningún cambio en la tensión máxima desarrollada. Según aumenta la concentración de \rho-TIA, un desplazamiento adicional de la curva a la derecha acompaña a la reducción progresiva en la respuesta máxima. Este resultado indica la existencia de un conjunto de adrenoceptores \alpha_{1} "sobrantes" en este tejido, y confirma los hallazgos de Diaz-Toledo y Marti 1988 Eur Pharmacol, 156, 315-24 y Minnerman & Abel 1984, Mol Pharmacol, 25, 53-63, que demostraron una reserva funcional de
\alpha-adrenoceptores en el conducto deferente de rata. Aunque actúa de una manera no competitiva, \rho-TIA no es un antagonista irreversible, ya que hay una lenta recuperación de la inhibición de la respuesta inducida eléctricamente del conducto deferente producida por la conotoxina tras el lavado de la preparación con solución sin fármaco.
Ejemplo 3 Experimentos para examinar el efecto de \rho-TIA sobre adrenoceptores \alpha_{2}
Se siguió un protocolo experimental similar al del ejemplo 1, con la excepción de que la estimulación del campo eléctrico se realizó con pulsos individuales de la misma duración y amplitud, pero a intervalos de 20 s. En presencia de prazosín (0,5 \muM), se estableció una curva de concentración acumulativa-respuesta para noradrenalina que producía la inhibición de la respuesta de espasmo. Tras el lavado y la recuperación, se reemplazó el prazosín y se aplicó
\rho-TIA (10 \muM) al baño de órganos. Después de un período de equilibro de 20 min, se generó una segunda curva de concentración-respuesta a la noradrenalina.
Efecto de \rho-TIA sobre la inhibición presináptica de la liberación de neurotransmisores en el conducto deferente de rata
La liberación de los co-transmisores simpáticos ATP y noradrenalina desde reservas neuronales está modulada por la activación de adrenoceptores \alpha2 presinápticos (Amobi & Smith, 1988, J Auton Pharmacol, 8, 141-52; McCulloch et al., 1985 Br J Pharmacol, 86, 455-64). Para determinar si \rho-TIA actúa bloqueando los adrenoceptores \alpha_{2}, se examinó su efecto sobre la inhibición por noradrenalina de la contracción purinérgica de segmentos del conducto deferente de rata. Ciertos fármacos antagonistas del adrenoceptor \alpha_{2}, tales como la yohimbina, antagonizan el efecto inhibidor de la noradrenalina en este ensayo (Warming et al., 1982 Arch Int Phannacodyn Ter, 259, 14-30).
La respuesta del conducto deferente a la estimulación eléctrica en presencia de prazosín se inhibió por la noradrenalina con un valor de -log de IC_{50} de 5,96 \pm 0,052 (figura 3). Este valor no fue significativamente diferente del valor del -log de IC_{50} determinado en presencia de \rho-TIA 10 \muM (5,90 \pm 0,031, p > 0,3, n = 5).
Se descubrió que \rho-TIA no antagonizaba la acción de la noradrenalina en los adrenoceptores \alpha_{2}. Por lo tanto,
\rho-TIA es capaz de distinguir entre los adrenoceptores \alpha_{1} y \alpha_{2}.
Ejemplo 4 Íleon de cobaya
Se dejaron en ayunas durante una noche cobayas macho (285-425 g) y después se sacrificaron por un golpe en la cabeza y se desangraron. Se tomaron segmentos con una longitud de aproximadamente 1,5 cm del íleon, y el contenido luminal se retiró por un lavado suave con una solución de baño. Las preparaciones se montaron bajo una tensión de reposo de 1,0 g en baños de órganos de 5 ml. La solución de baño contenía (mM): NaCl, 136,9; KCl, 2,68; CaCl_{2}, 1,84; MgCl_{2}, 1,03; glucosa, 5,55; NaHCO_{3}, 11,9; y KH_{2}PO_{4}, 0,45; se calentó a 37ºC y se burbujeó con CO_{2} al 5% v/v en O_{2}. En la solución de baño se incluyó indometacina (10 \muM) para mantener un valor basal estable. Después de un período de equilibro de al menos 40 min, se añadieron dosis de nicotina (4 \muM) a intervalos de 15 minutos. Cuando se descubrió que la respuesta contráctil a la nicotina era reproducible, el tejido se expuso a \rho-TIA durante 25 min. Después de este tiempo, se aplicó otra dosis de nicotina. Las respuestas a la nicotina se midieron isométricamente y se digitalizaron a una velocidad de muestreo de 10 Hz.
Efecto de \rho-TIA sobre respuestas a la nicotina en el íleon de cobaya
Las respuestas a la nicotina de los segmentos de íleon no se vieron afectadas significativamente por \rho-TIA (10 \muM). En ausencia de \rho-TIA, la respuesta media fue de 3,29 \pm 0,67 g, y en presencia de \rho-TIA fue de 4,13 \pm 0,70 g
(p > 0,25; ensayo t de dos colas; n = 4).
El presente descubrimiento de que la repuesta de segmentos de íleon de cobaya a la nicotina y la respuesta del hemidiafragma de nervio frénico de ratón a la estimulación eléctrica no se ven afectadas por \rho-TIA indica que, a diferencia de las \alpha-conotoxinas, esta nueva conotoxina no se dirige al subtipo neuronal ni al subtipo muscular del receptor nicotínico ACh.
Ejemplo 5 Hemidiafragma de nervio frénico de ratón
Se retiraron los hemidiafragmas izquierdo y derecho, con los nervios frénicos unidos, de ratones Quackenbush macho (20-30 g) sacrificados por dislocación cervical. La base de cada hemidiafragma se puso entre dos electrodos estimuladores de platino paralelos y el nervio frénico se puso a lo largo de dos bucles de platino pequeños para la estimulación de campo. Las preparaciones se montaron en baños de órganos de 5 ml bajo una tensión de 1,0 g, y se bañaron en una solución de la siguiente composición (mM): NaCl, 135,0; KCl, 5,0; CaCl_{2}, 2,0; MgCl_{2}, 1,0; glucosa, 11,0; NaHCO_{3}, 15,0; y KH_{2}PO_{4}, 1,0. La solución de baño se calentó a 37ºC y se burbujeó continuamente con CO_{2} al 5% v/v en O_{2}. Después de un período de equilibrio de al menos 30 min, se realizaron estimulaciones directas e indirectas alternas a intervalos de 10 s. La estimulación directa se realizó usando un pulso de 30 V con una duración de 2 ms suministrado a los electrodos puestos frente a cualquier lado del músculo, y la estimulación indirecta se realizó con un pulso de 3 V con una duración de 0,2 ms suministrado a los electrodos que rodeaban al nervio frénico. Se examinó el efecto de una sola dosis de \rho-TIA a una concentración de 10 \muM sobre estas respuestas inducidas directa e indirectamente. Las concentraciones se registraron de la misma manera que se ha descrito para las preparaciones del conducto deferente.
Efecto de \rho-TIA sobre respuestas a la estimulación eléctrica del hemidiafragma de nervio frénico de ratón.
\rho-TIA (10 \muM) no afectó a las contracciones del hemidiafragma de ratón inducidas por estimulación de campo del nervio frénico o por estimulación muscular directa (n = 4; datos no mostrados), lo que indica que \rho-TIA no se dirige al receptor nicotínico ACh del músculo.
Ejemplo 6 Estudios de unión de radioligandos
Las construcciones de adrenoceptor \alpha usadas fueron el ADNc de \alpha_{1A}-AR de rata, el ADNc de \alpha_{18}-AR de hámster y el ADNc de \alpha_{1D} de rata clonados en el vector de expresión eucariota modificado pMT2', como se ha descrito previamente (Hwa et al., 1995, J Biol Chem, 270, 23189-95; Perez et al., 1991, Mol Pharmacol, 40, 876-83; Perez et al., 1994, Mol Pharmacol, 46, 823-31). Se cultivaron células COS-1 (American Type Culture Collection) y se transfectaron de forma transitoria con las construcciones usando el método de DEAE-dextrano (Cullen, 1987, Methods Enzymol, 152, 684-704). La eficacia de transfección para este método varía de un 30 a un 40%. Las células se recogieron 72 h después de la transfección. Se prepararon membranas a partir de las células COS-1 transfectadas, como se ha descrito previamente (Perez et al., 1991, Mol Pharmacol, 40, 876-83). Las membranas se resuspendieron en tampón HEM (HEPES 20 mM, pH 7,5, EGTA 1,5 mM, MgCl_{2} 12,5 mM) que contenía glicerol al 10% (v/v) y se almacenaron a -70ºC. Las características de unión a ligandos de los receptores expresados se determinaron en una serie de estudios de unión a radioligandos que usaban [^{125}I]-HEAT, un antagonista específico del adrenoceptor \alpha_{1}. El procedimiento incluía tubos duplicados que contenían membranas de células COS-1, [^{125}I]-HEAT 70 pM, tampón HEM y \rho-TIA (a 9 concentraciones diferentes) en un volumen de reacción total de 250 \mul. Se determinó la unión no específica en presencia de fentolamina (100 \muM). Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente, las reacciones se interrumpieron por la adición de tampón HEM enfriado con hielo y se filtraron en filtros de vidrio Whatman GF/C con un recolector de células Brandel. Los filtros se lavaron 5 veces con el tampón HEM enfriado con hielo. La cantidad de radiactividad unida se analizó usando un Contador Packard Auto-gamma 500.
Efecto de \rho-TIA en estudios de unión de radioligandos
Los adrenoceptores \alpha_{1} son una familia heterogénea, y se han clonado tres subtipos distintos, \alpha_{1A}, \alpha_{1B} y \alpha_{1D}. La acción de \rho-TIA en los estudios de unión de radioligandos fue inhibir la unión de [[^{125}I]-HEAT a los tres subtipos de adrenoceptores \alpha_{1} expresados, confirmando que el adrenoceptor \alpha_{1} es la diana de la conotoxina (figura 4). Se determinó que los valores de -log de K_{i} eran de 7,29 \pm 0,141 para el subtipo \alpha_{1A}; 7,70 \pm 0,179 para el subtipo \alpha_{1B}; y 7,09 \pm 0,057 para el subtipo \alpha_{1D}. Se descubrió que la diferencia en la potencia de \rho-TIA en los adrenoceptores \alpha_{1B} y \alpha_{1D} era significativa (p < 0,05), lo que indica que \rho-TIA y sus análogos tienen la capacidad de distinguir entre los subtipos de adrenoceptores \alpha_{1}.
\rho-TIA era el más potente en el subtipo de adrenoceptor \alpha_{1B}. El valor de K_{i} de 20 nM indicó que \rho-TIA es aproximadamente 2 órdenes de magnitud menos potente que el antagonista clásico del adrenoceptor \alpha_{1} prazosín en este subtipo, basándose en los datos presentados en la bibliografía. El descubrimiento de antagonistas específicos de subtipo es de interés por su utilidad potencial como herramientas de investigación para investigar la estructura y el funcionamiento de los adrenoceptores \alpha_{1}, y como agentes terapéuticos potenciales para el tratamiento de afecciones tales como la hiperplasia prostática benigna (Chapple, 1995, Br J Urol, 1, 47-55). Los estudios de unión de radioligandos también indicaron que \rho-TIA actuaba de forma no competitiva para inhibir la unión de [^{125}I]-HEAT, lo cual es indicativo de un modulador alostérico que actúa en un sitio separado del sitio de unión de noradrenalina en el adrenoceptor \alpha_{1}.
En conclusión, hay muchas clases estructurales de compuestos que tienen la capacidad de actuar como antagonistas del adrenoceptor \alpha_{1}. Entre estas clases se encuentran los alcaloides, un grupo que comprende varios productos naturales. Éstos incluyen dicentrina (Teng et al., 1991, Br J Pharmacol, 104, 651-6) y deshidroevodiamina (Chiou et al., 1996, J Cardiovasc Pharmacol, 27, 845-53) aislada a partir de fuentes vegetales, e himenina, un alcaloide aislado a partir de una esponja marina (Kobayashi et al., 1986, Experientia, 42, 1064-5). Otro antagonista de adrenoceptor \alpha_{1} aislado a partir de una especie de esponja marina es la aaptamina. A diferencia de la himenina, la aaptamina no es un alcaloide, sino que más bien es un compuesto heteroaromático (Ohizumi et al., 1984, J Pharm Pharmacol, 36,
785-6). Estos alcaloides no actúan con un alto grado de especificidad y, se han observado acciones antitrombóticas y anestésicas locales además del bloqueo del adrenoceptor \alpha_{1}. \rho-TIA es estructuralmente distinto de todas estas moléculas orgánicas pequeñas existentes, tanto naturales como sintéticas, ya que es el único ejemplo hasta la fecha de un péptido antagonista del adrenoceptor \alpha_{1}. Además, \rho-TIA es la primera conotoxina encontrada que se dirige al adrenoceptor \alpha_{1}, y de esta manera representa el primer miembro de una nueva clase de péptidos que denominamos la familia de \rho-conotoxinas.
Ejemplo 7 Obtención de una secuencia génica para los péptidos del grupo de las \rho-conotoxinas
La secuencia génica completa para la \rho-conotoxina se aisló usando una estrategia 5'RACE (Random Amplification of cDNA Ends (Amplificación Aleatoria de Extremos de ADNc)) y una estrategia 3'RACE junto con clonación y secuenciación del ADN.
5'RACE
El cebador oligonucleotídico RHO-1B se diseñó a partir de la secuencia peptídica del péptido \rho-TIA maduro. La relación entre el oligonucleótido y el péptido es la siguiente, junto con la secuencia oligonucleotídica:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \rho -TIA \+ - \+ FNWRCCLIPACRRNHKKFC \+ SEC ID
Nº. 1\cr  RHO-1B  \+ 5'- \+
RCARAAYTTYTTRTGRTT-3' \+ SEC ID Nº. 3\cr  AP1  \+
5'- \+ CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' \+ SEC ID Nº.
4\cr}
(donde N=A/C/G/T, R=A/G, Y=C/T).
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se realizó usando el oligonucleótido RHO-1B en combinación con el oligonucleótido AP1 en plantillas de ADNc procedentes del ARNm aislado a partir de conductos de veneno de conos. Los productos de PCR, que representan la región 5' del gen de \rho-TIA se aislaron, se purificaron, se clonaron en vectores bacterianos y se secuenciaron. La secuencia génica para \rho-TIA se obtuvo a partir de C. tupila (figura 5).
3'RACE
La secuencia de ADN para las regiones 5' del gen de \rho-TIA se usó para diseñar oligonucleótidos que fueran capaces de detectar la secuencia de \rho-TIA, y la secuencia de otros péptidos muy relacionados. En la figura 5 se muestra la posición de los oligonucleótidos con respecto a la secuencia del gen. El oligonucleótido RHO-1A se usa en una PCR junto con el oligonucleótido ANCHOR para producir fragmentos de ADN correspondientes al péptido líder, el péptido maduro y las regiones 3' no traducidas (3'UTR) del gen. La PCR de plantillas de ADNc de conductos de veneno de C. tulipa produce fragmentos de ADN correspondientes a \rho-TIA.
La secuencia de ADN para ANCHOR es:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 ANCHOR \+
5'-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAAT-3'
\+ SEC ID Nº.
5\cr}
Secuencia completa para \rho-TIA
La secuencia génica para el péptido \rho-TIA producido usando 5'RACE y 3'RACE representa fragmentos solapantes del gen. Estos fragmentos se combinan para producir una secuencia consenso para cada gen. Las secuencias consenso son los ADNc completos para los genes, e incluyen 5'UTR, el péptido líder, el péptido maduro y la 3'UTR.
A lo largo de toda esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones que se presentan a continuación, a menos que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que el término "comprender" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión del número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas indicado, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.
Los especialistas en la técnica apreciarán que la invención descrita en este documento es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Se entenderá que la invención incluye todas estas variaciones y modificaciones. La invención también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos mencionados o indicados en esta memoria descriptiva, individual o colectivamente, y todas y cada una de las combinaciones de dos o más de dichas etapas o características.
\vskip0.333000\baselineskip
<141>
\vskip0.333000\baselineskip
<150> PP6273/98
\vskip0.333000\baselineskip
<151> 1998-10-02
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Natural
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<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Asn Trp Arg Cys Cys Leu Ile Pro Ala Cys Arg Arg Asn His Lys}
Lys Phe Cys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Natural
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<400> 2
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\sa{Cys Cys Leu Ile Pro Ala Cys Arg Arg Asn His Lys Lys Phe Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 3
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<211> 18
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 3
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\sa{Arg Cys Ala Arg Ala Ala Tyr Thr Thr Tyr Thr Thr Arg Thr Gly Arg}
\sac{Thr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética
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<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
ccatcctaat acgactcact atagggc 
\hfill
27 
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética
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<400> 5
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\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
aactggaaga attcgcggcc gcaggaat 
\hfill
28

Claims (22)

1. Un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas aislado, sintético o recombinante, o un derivado del mismo que tiene actividad antagonista selectiva del adrenoceptor \alpha_{1}.
2. Un péptido de \rho-conotoxina de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia:
SEC ID Nº. 1FNWRCCLIPACRRNHKKFC
o una secuencia que ha experimentado una o más deleciones, adiciones o substituciones de aminoácidos, o modificaciones de la cadena lateral.
3. Un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas de acuerdo con la reivindicación 2, que es \rho-TIA.
4. Un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene una actividad insignificante o nula en el subtipo neuronal o muscular del receptor nicotínico ACh.
5. Una \rho-conotoxina de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene selectividad por un subtipo \alpha_{1} con respecto a los demás subtipos.
6. Una \rho-conotoxina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene cuatro restos de cisteína y dos enlaces disulfuro.
7. Un péptido de \rho-conotoxina de acuerdo con la reivindicación 6, donde la conectividad del enlace disulfuro es
A-C/B-D, donde A, B, C y D se refieren al primer, segundo, tercer y cuarto restos de cisteína implicados en la formación de enlaces disulfuro, respectivamente.
8. Uso de un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en un ensayo de unión a receptores para ensayar la actividad de una molécula como antagonista de la actividad del adrenoceptor \alpha_{1}.
9. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o que es complementaria a una secuencia que codifica un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Una sonda de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o que es complementaria a una secuencia que codifica todo o parte de un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
11. Un anticuerpo monoclonal o policlonal contra un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
12. Una construcción genética que comprende una porción de vector y un ácido nucleico capaz de codificar un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
13. Un péptido quimérico que comprende un segmento o secuencia de un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas natural como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un segmento o secuencia de otro péptido o proteína biológicamente activa, de tal forma que el péptido quimérico resultante posea una actividad asociada con dicho otro péptido o proteína.
14. Un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para uso en el tratamiento o la profilaxis de afecciones o enfermedades urinarias o cardiovasculares, o de trastornos del estado de ánimo, o para el tratamiento o control del dolor o la inflamación.
15. Uso de un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades o afecciones en las que el antagonismo selectivo de adrenoceptores \alpha_{1} está asociado con un tratamiento o una profilaxis eficaz.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, donde el medicamento es para el tratamiento o la profilaxis de afecciones o enfermedades urinarias o cardiovasculares, o de trastornos del estado de ánimo, o para el tratamiento o control del dolor o la inflamación.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, donde la enfermedad o afección del sistema urinario es hiperplasia prostática o un trastorno relacionado.
\newpage
18. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, donde la enfermedad o afección cardiovascular es una arritmia, hipertensión o insuficiencia cardíaca coronaria.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, donde el trastorno del estado de ánimo es una adicción.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, donde el dolor es un dolor crónico, dolor neuropático o dolor inflamatorio.
21. Una composición que comprende un péptido del grupo de las \rho-conotoxinas aislado, sintético o recombinante, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
22. Una composición de acuerdo con la reivindicación 21, que es una composición farmacéutica.
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