EP1805215A2 - Chemisch modifizierte iapp-peptidanaloga - Google Patents

Chemisch modifizierte iapp-peptidanaloga

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Publication number
EP1805215A2
EP1805215A2 EP05806441A EP05806441A EP1805215A2 EP 1805215 A2 EP1805215 A2 EP 1805215A2 EP 05806441 A EP05806441 A EP 05806441A EP 05806441 A EP05806441 A EP 05806441A EP 1805215 A2 EP1805215 A2 EP 1805215A2
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EP
European Patent Office
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iapp
peptide
natural
peptide analogue
antibody
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05806441A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen Bernhagen
Afroditi Kapurniotu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV, Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Publication of EP1805215A2 publication Critical patent/EP1805215A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
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    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein

Definitions

  • the present invention relates to peptide analogs of the islet amyloid polypeptide (IAPP), methods for finding IAPP or its aggregates, pharmaceutical compositions for the prophylaxis and therapy of protein aggregation diseases, in particular diabetes and Alzheimer's disease and diagnostic Zu ⁇ compositions for the detection of Proteinaggregationskrankhei ⁇ th, in particular diabetes and Alzheimer's disease as well as uses of said peptide analogues for purposes of diagnosis and therapy of diseases or for basic research.
  • IAPP islet amyloid polypeptide
  • Diabetes is a disease for which there are currently no satisfactory therapeutic approaches. Usually, a distinction is made between Type I and Type II diabetes. 90% of diabetics suffer from type II diabetes or adult-onset diabetes. Today, there are more than 150 million Type II diabetics worldwide. Diabetes is caused by the lack of insulin or by the disturbed course of insulin-dependent biological processes. Since, on the one hand, the central role of insulin in the carbohydrate metabolism can not be replaced by other molecules, and on the other hand, the action of insulin alone does not eliminate the pathological consequences of the disease in the case of type I diabetes or the disease itself in the case of type II diabetes can, new therapeutic approaches are necessary.
  • Such concepts should on the one hand support the secretion, uptake and unfolding of the biological function of the insulin molecule and on the other hand against unwanted side effects of insulin such as weight gain or hypoglycemia. to protect against kaemia.
  • New molecules, which contribute in particular together with insulin for the regulation of carbohydrate metabolism, are thus of great biomedical interest.
  • IAPP islet amyloid polypeptide
  • amylin is a peptide hormone consisting of 37 amino acids, which is synthesized in the pancreatic ⁇ -cells and, together with insulin and glucagon, is involved in the regulation of sugar metabolism. IAPP is an antagonist of insulin.
  • amyloid plaques are found in the pancreas of more than 95% of the type II diabetics. Amyloid plaques are deposits consisting of insoluble aggregates of the polypeptide IAPP.
  • Parkinson's, prion diseases or Huntington's disease diabetes can therefore also be regarded as protein aggregation disease (Ross and Poirier, Nature Medicine, July 2004, Vol.
  • IAPP amyloid plaques, soluble oligomers and multirnere forms of the lAPP molecule are cytotoxic. It is assumed that the damage to the ⁇ -cells caused by lAPP amyloid formation makes a considerable contribution to the cascade of the pathogenesis of type II diabetes. Therefore, the development of therapeutically effective inhibitors of the lAPP amyloid formation process is of great biomedical interest.
  • the IAPP molecule in its biological function as an insulin antagonist and as a regulator of postprandial hypoglycaemia associated with insulin secretion or administration, is per se an important polypeptide hormone which has potential therapeutic applications in the treatment of type I (for example in combination with insulin) and Type II could have diabetes.
  • the medical application of IAPP is considerably limited due to its poor solubility and its strong aggregation tendency.
  • the soluble lAPP analog pramlintide is known.
  • Pramlintide (Sym5lin®) was produced by the replacement of 3 amino acid residues at positions 25, 28, and 29 in the sequence of the human IAPP molecule by proline. These proline substituents occur in the rat ILPP sequence, which itself has no aggregation tendency. Structurally, the diminished aggregation tendency of pro-olin-containing sequences can be explained by the fact that proline residues are incapable of accepting ⁇ -sheet conformations (prolines are ⁇ -sheet "breaking" residues). In fact, the lAPP analog pramlintide has a greatly reduced tendency to aggregate and thus a better solubility profile than human IAPP.
  • the present invention is therefore based on the technical problem of providing means and methods by means of which improved prophylaxis, therapy and diagnosis of protein aggregation diseases, in particular of diabetes and / or Alzheimer's disease, are made possible.
  • the invention solves this technical problem by providing peptide analogs of the islet amyloid polypeptide (IAPP) with the ability to bind to natural lAPP receptor, the peptide analog a) having at most 38 amino acids, preferably at most 37 amino acids 37 amino acids of which have the natural amino acid sequence of the natural IAPP, b) at least amino acids 19 to 37 of the natural IAPP in their natural sequence, c) at least one of its amide bonds is N-methylated, d) and optionally in the amino acid sequence of the natural IAPP Lys (lysine) at position 1 may be replaced by Om (ornithine) and / or Cys (cysteine) at position 2 and 7 by Dap (2,3-diaminopropionic acid) at position 2 and Asp (aspartic acid) at position 7 or Asp at position 2 and Dap at position 7, and e), wherein the N-methylated peptide analogs are excluded with the SEQ ID Nos.
  • IAPP islet amyloid polypeptid
  • the present invention solves the underlying technical problem by providing a peptide analogue of the islet amyloid polypeptide (IAPP) as a diagnostic or therapeutic agent having the ability to bind to the natural receptor of the IAPP, the peptide analogue a) at most 38 amino acids, preferably at most 37 amino acids, of which 37 amino acids thereof have the amino acid sequence of the natural IAPP in their natural sequence, b) at least the amino acids 19 to 37 of the natural IAPP in their natural sequence, c) at least one of its amide bonds is N-methylated, and, optionally, d) where in the amino acid sequence of the natural IAPP Lys (lysine) can be substituted at position 1 by Orn (ornithine) and / or Cys at position 2 and 7 may be replaced by Dap at position 2 and Asp at position 7 or Asp at position 2 and Dap at position 7.
  • IAPP Lys lysine
  • the invention provides these peptide analogues, ie the modified N-methylated lAPP derivatives, preferably in isolated, preferably in partially or completely purified form.
  • the abovementioned peptide analogs are therefore characterized by the required characteristics a), b) and c), where they may optionally have the feature d), that is to say that in this optional embodiment of the present invention Peptidanaloga characterized by one of the natural sequence of the IAPP, in particular of the human IAPP, deviating amino acid sequence, insofar as that in the natural hu ⁇ manen IAPP sequence at position 1 having lysine by the amino acid ornithine and / or the two cysteines Position 2 and 7 of the natural in particular human IAPP by Dap (2,3-diaminopropionic acid) at position 2 and Asp at position 7 or Asp at position 2 and Dap at position 7 are replaced or is.
  • inventive peptide analogue which is carried out according to feature d), that is, in deviation from the natural lAPP sequence, in particular the human IAPP sequence, ornithine at position 1 (instead of lysine) and / or Asp or Dap at position 2 and Dap or Asp at position 7 (in each case instead of cysteine), designated as a derivative of the peptide analog according to the invention.
  • the peptide analogs according to the invention which have Cys at positions 2 and 7 are preferably oxidized, ie the disulfide bridge between the thiol residues of Cys 2 and Cys 7 is closed.
  • the peptide analogs according to the invention which have Dap and Asp or Asp and Dap at position 2 and 7 are preferably bridged, ie the side chains of Asp and Dap are covalently linked to one another via a lactam bridge.
  • the C-terminus is in the form of an amide.
  • the term natural IAPP is understood to mean the IAPP which has the wild-type amino acid sequence of the IAPP, that is to say the amino acid sequence. has seque ⁇ z, as it is naturally found in vivo in the organism in question, that is preferably in humans.
  • Various natural IAPP sequences, in particular of humans, are published in Kapumiotu (Biopolymers (Peptide Science) 60 (2001) 438-459).
  • SEQ ID NO: 18 of the present teachings shows the wild-type sequence of human IAPP.
  • the peptide analogues according to the invention have exactly the same primary structure as the natural, human IAPP and, in another embodiment, essentially the same primary structure as, in particular, human IAPP, but have certain specific N-methyl groups according to the invention Amide bonds have a conformation other than IAPP and thus altered biological, in particular biochemical and biophysical properties, compared with native human IAPP.
  • the peptide analogues according to the invention are characterized in that they are capable of interacting with native IAPP, in particular native human IAvPP, and of reducing or inhibiting its aggregation into amyloid fibrils, the subsequent amyloid plaque formation and the associated cytotoxicity.
  • the peptide analogues according to the invention have no relationship or greatly reduced fribrillability. At a physiological pH of about 7, they show a particularly greatly reduced tendency to fibrillate and can accordingly be formulated and administered in a particularly advantageous manner, in contrast to native IAPP or pramintide, together with insulin.
  • the peptide analogues according to the invention are at least one hundred times more soluble than IAPP, in particular at a physiological pH of about pH 7 to 7.4, which enables their above-described formulation capacity with insulin.
  • the peptide analogues according to the invention are more stable compared to IAPP against degradation by proteases, which could also allow administration of the peptide analogues of the present invention in tablet form.
  • the peptide analogues according to the invention interact with the ⁇ -amyloid peptide, which plays a role in the development of Alzheimer's disease.
  • the peptide analogues according to the invention in particular reduce the cytotoxicity of the ⁇ -amyloid peptide and are therefore also suitable for the diagnosis, therapy and prophylaxis of Alzheimer's diseases.
  • the peptide analogues according to the invention are particularly suitable for the prophylaxis, therapy and diagnosis of protein aggregation diseases, in particular diabetes, particularly preferably of type I diabetes and / or of type II diabetes (diabetes mellitus). overall If appropriate, it is provided in a preferred embodiment to use the peptide analogues according to the invention together with insulin and / or IAPP and / or pramlintide for the prophylaxis and therapy of diabetes, in particular type I and / or type II diabetes.
  • conformation-stabilized peptide analogues provided according to the invention can be used as antigens, for example alone or in admixture with lAPP monomers or lAPP oligomers of defined size, in order to obtain conformation-specific antibodies for, for example, an ELISA / RIA antibody.
  • lAPP monomers or lAPP oligomers of defined size in order to obtain conformation-specific antibodies for, for example, an ELISA / RIA antibody.
  • the peptide analogues according to the invention for example for ELISA, RIA, etc. together with a marker, for example a spin label, fluorescence or luminescence marker, in particular in N-terminally labeled, in particular N-terminal biotinilierter form, or N-terminal fluorescein mar ⁇ kierter form or provided with other fluorescent markers use.
  • a marker for example a spin label, fluorescence or luminescence marker, in particular in N-terminally labeled, in particular N-terminal biotinilierter form, or N-terminal fluorescein mar ⁇ kierter form or provided with other fluorescent markers use.
  • the invention provides that the peptide analogue according to the invention has the complete amino acid sequence 1 to 37 of the natural IAPP, in particular of the natural human IAPP, or the amino acids 1 to 37 of the above-mentioned derivative thereof or only these 37 Amino acids, ie consists of these.
  • the invention provides an abovementioned peptide analog consisting of the 37 amino acids of the natural, in particular human, IAPP or the amino acids of the aforementioned derivatives, which are in the order of the natural one and wherein at least one of the ⁇ -amino bonds of the ⁇ -amino groups of the amino acids of this peptide analogue is N-methylated.
  • the invention provides the teaching that the peptide analog of the invention IAvPP, the full amino acid sequence of the natural, in particular human IAPP, namely the amino acid sequence 1 to 3T in full length or the amino acid sequence of the aforementioned Deri ⁇ vats thereof or consists of this, acts as a receptor agonist of natural lAPP receptor.
  • the peptide analog activates the lAPP receptor.
  • these peptide analogs act as inhibitors of the formation of amyloid fibrils and / or amyloid plaques, that is to say as inhibitors of the formation of insoluble cell-damaging lAPP aggregates and, at the same time, reduce or inhibit thereby the cytotoxicity caused thereby.
  • the invention provides that the peptide analog according to the invention is shorter than the wild-type sequence, in particular shortened at its N-Terrm nus, and at least the amino acids 19 to 37, preferably 8 to 37 of the natural IAPP or the amino acids of the aforementioned derivative thereof or consists solely of these in their natural order.
  • the truncated peptide analog at least the amino acids 19 to 37, preferably 8 to 37 and at most the amino acids 2 to 37 of the natural, in particular human wild-type IAPP or the amino acids of the aforementioned derivative thereof or consists thereof and at least one of the Amidbin fertilize the peptide analog N-methyiiert is.
  • the invention also provides the teaching that the abridged peptide analogs according to the invention, which thus do not have the complete amino acid sequence of the natural, in particular human, IAPP or not the complete amino acid sequence of the aforementioned derivative, ie the peptide analogs containing the amino acids from positions 2 to 37 to positions 19 to 37 or the amino acid sequence of the abovementioned derivatives thereof, or which consist of these, likewise bind to a wild-type receptor of the natural IAPP, but act there as receptor antagonists and are therefore likewise suitable are to act as regulators of the sugar metabolism.
  • the peptide analog inhibits the lAPP receptor.
  • These particularly preferred peptide analogues also act as inhibitors of the formation of amyloid fibrils and / or of amyloid plaques and therefore reduce or inhibit the associated cytotoxicity.
  • the invention also encompasses embodiments, that is to say peptide analogs of the wild-type IAPP, these being, for example, the amino acids 7 to 37, 6 to 37, 5 to 37, 4 to 37, 3 to 37 and 2 to 37 of the natural , in particular human natural IAPP or the amino acids of the abovementioned derivative thereof have or consist solely of these and in each of these embodiments at least one of the amide bonds of the peptide analogue is N-methylated.
  • the peptide analogues according to the invention have one, two, three or four amide bonds which are N-methylated, ie in which a hydrogen atom of the ⁇ -amino group of an amino acid of the peptide is replaced by a methyl group.
  • the amide bonds of the inventive peptide analogues are N-methylated, which are the ⁇ -amino groups of the amino acids at positions 22 and / or r 23 and / or 24 and / or 25 and / or 26 and / or 27 and / or 28 and / or 29.
  • the N-methylated amide bonds in a region of the peptide analog comprising 4 to 8 amino acids are arranged in an uninterrupted order in the amino acid sequence.
  • the IN methyl groups can be present in a region of the peptide analog comprising 4 to 8 amino acids on every second amide bond of the peptide analog, in particular the abovementioned amino acid positions.
  • the present invention relates to peptide analogs selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 1 to 17, with the exception of the peptide analogs, which have the natural amino acid sequence of the human wild type IAPP and at the same time the N Having methylation according to SEQ ID Nos. 1 to 5.
  • the present invention relates to peptide analogues for therapeutic or diagnostic purposes, selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 1 to 17.
  • the invention provides for the peptide analogues according to the invention, in particular SEQ ID Nos. ⁇ to 17 , therefore the first application in a method for therapeutic treatment of the human or animal body and in a Diagnostic method, which is performed on the human or animal body, ready.
  • the invention therefore also relates to pharmaceutical and diagnostic agents containing the abovementioned peptide analogs of the invention, in particular the peptide analogues selected from the group consisting of SEQ ID Nos. 1 to 17.
  • the present invention relates to peptide analogues, these being selected from the group of the peptide analogs according to the invention with the amino acids 1 to 37 of the human wild type IAPP or a derivative thereof, the amide bonds of the ⁇ -amino groups of Amino acids at positions (24 and 26), (25 and 27), (23 and 25), (26 and 27), (25 and 26 and 27), (24 and 25), (25 and 26), (22 and 24), (23 and 24), (24 and 26), (23), (24), (25), (26), (27), (28 and 29), (25 and 28 and 29) ,
  • These peptide analogs are also referred to in the following order as IAPP-GI, IAPP-AL, IAPP-FA, IAPP-IL, IAPP-AIL, IAPP-GA, IAPP-AI, IAPP-NG, IAPP-FG, IAPP-GAIL , IAPP-F, IAPP-G, IAPP-A 1 IAPP-I, IAPP-L, IAPP-
  • the invention also relates to the abovementioned peptide analogs of the wild type IAPP or its derivatives in a mixture, such as, for example, a 1: 1 mixture, with natural, unmodified IAPP and / or ⁇ -amyloid peptide or other known peptide analogues of the IAPP or the ⁇ -peptide.
  • Amyloidpeptids (A- ß) or other derivatives of IAPP or A- in particular for the production of drugs or diagnostic agents and for research and experimental purposes.
  • inventive peptide analogues are labeled, in particular on their N-terminal ⁇ -amino group, in particular with an acetyl group, a radioactive marker, an enzyme marker, a fluorescence marker, a luminescence marker or a spin label preferably in a manner such that said markers are linked to the peptide analog via a spacer, which spacer may be an amino acid.
  • the peptide analogs according to the invention are derivatized with at least one functional group selected from the group consisting of an acyl group, functionalized acyl group, aromatic group, an amino acid, a glycato group and a ligand. pidelle.
  • the functional group is connected to the peptide analog via a spacer, for example an amino acid, if the functional group is not itself an amino acid group.
  • the peptide analogues according to the invention are supported on a support, for example a matrix or on the surface of a well, a microtiter plate, a membrane, etc., is immobilized.
  • the peptide analogues according to the invention can usually be chemically synthesized and / or modified.
  • the invention also relates to processes for the preparation of antibodies specifically directed against a) IAPP or b) a peptide analogue / IAPP complex or c) specifically against a peptide analogue of the present invention, wherein at least one peptide analogue according to the invention as antigen, optionally together with monomeric IAPP or an oligomer thereof, is contacted with a system capable of forming antibodies, for example, injected into an animal organism, and the formed antibodies are obtained.
  • the invention also relates to methods for the production of specific antibodies directed against IAPP or a lAPP / peptide analogue complex or specifically against a peptide analogue of the present invention, wherein the antibodies can be not only polyclonal but also monoclonal antibodies .
  • the invention therefore also relates to monoclonal or polyclonal antibodies and also fragments thereof which can be prepared by an abovementioned method, the antibody or the fragment thereof being specifically directed against a peptide analog of the present invention or specifically against IAPP or against a peptide analogue / IAPP. Complex is directed, that is, these can know and bind specifically er ⁇ .
  • the antibodies may be modified in a conventional manner, for example labeled.
  • polyclonal or monoclonal antibodies according to the invention can be used, for example, to analyze the course of the disease of patients treated with, for example, peptide analogues according to the invention or for the isolation and identification of further therapeutically active peptides.
  • the peptides according to the invention prove to be particularly advantageous in the context of their use as immunogen for the production of antibodies for diagnostic and therapeutical purposes due to their considerably improved handling compared to the natively occurring poorly soluble peptides.
  • the antibodies produced in this way can specifically recognize the peptides according to the invention and, in another embodiment, the native WiId-type IAPP, if appropriate in aggregated form, so that the antibodies according to the invention can be used, for example, to diagnose Alzheimer's disease or can be used by diabetes NEN.
  • the invention also relates to methods for the immunization of human or animal organisms, wherein the erfindungsge ⁇ MAESSEN peptide analogues applied to human or animal organisms and an immunization against IAPP or its derivative is achieved.
  • the invention therefore relates to methods of producing antibodies specifically directed against a peptide analogue of the present invention wherein at least one peptide analogue of the present invention is contacted as an antigen with a system capable of generating antibodies and the antibodies produced are recovered.
  • the invention also relates to a process for the preparation of antibodies specifically directed against IAPP and a peptide analogue of the present invention, wherein at least one peptide analog of the present invention is brought into contact with a system capable of generating antibodies and the antibodies formed are obtained.
  • the invention also relates to methods for producing specifically against mixtures of IAPP with a peptide-analogue-directed antibody, mixtures of monomeric IAPP and a peptide analog of the present invention as An ⁇ term, where appropriate, the IAPP can also be used as an oligomer, with a capable of antibody formation system brought into contact and the antibodies formed are recovered.
  • the invention also relates to a process for the preparation of specific antibodies against mixtures of ⁇ -amyloid peptide with a peptide analog of the present invention directed antibodies, wherein mixtures of monomeric or oligomeric ß-amyloid peptide with at least one peptide analogue of the present invention as antigen with a system capable of generating antibodies, and the antibodies formed are obtained.
  • the invention also relates to the specific antibodies or specific fragments thereof produced by the abovementioned methods which specifically recognize and bind their antigen, in particular also for the diagnosis, prophylaxis or therapy of diseases, in particular protein aggregation diseases, in particular diabetes and / or Alzheimer's disease. Illness.
  • the invention therefore also relates to the use of the abovementioned antibodies or specific fragments thereof for the production of a diagnostic agent or medicament, in particular for the diagnosis, prophylaxis or therapy of diabetes and / or Alzheimer's disease.
  • the present invention relates to a medicament containing as active ingredient at least one peptide analogue and / or an antibody of the present invention, preferably in prophylactic form or therapeutically effective amount, preferably together with at least one pharmaceutically acceptable carrier.
  • this medicament additionally contains, if necessary, release agents, lubricants, solvents, dispersants, coatings, antibacterial or antifungicidal agents, preservatives, dyes, emulsifiers, flavorings or other customary formulation auxiliaries , It may be envisaged to use further substances in the pharmaceutical composition which serve, for example, for transport in the target organism, for example through the blood-brain barrier.
  • the drug is designed as a depot drug, that is, a slow release of the drug, that allows the present peptide analog, for example, contains a so-called “slow release” matrix or wherein the drug with a in the patient slowly dissolving dragee cover is shrouded.
  • the medicament of the aforementioned type is carried out as a combination medicament, that is, in the same formulation or in the same medicament pack, additionally contains insulin and / or IAPP and / or pramlintide.
  • the invention therefore also relates to a pharmaceutical kit comprising a) a pharmaceutical formulation comprising at least one of the abovementioned peptide analogues and / or an antibody on the other hand and b) a pharmaceutical formulation comprising insulin and / or IAPP and / or pramlintide, in each case optionally together with pharmaceutically acceptable carriers and other Formulation aids, wherein the active ingredients peptide analog and insulin and / or pramlintides and / or IAPP are present in a prophylactically or therapeutically effective amount.
  • the invention provides that the medicament is in tablet form, as an aerosol or as a solution, in particular an injection solution.
  • the invention relates to the use of a peptide analogue according to the invention or an abovementioned antibody for the production of a medicament for the prophylaxis or therapy of protein aggregation diseases, in particular diabetes, preferably type I diabetes or type II diabetes.
  • the invention also relates to the use of a peptide analogue according to the invention or an abovementioned antibody together with insulin and / or IAPP and / or pramlintide for the preparation of a combination drug kit, for example a common formulation or a drug kit for simultaneous or staggered administration with two separate formulations of the active ingredients peptide analog and / or insulin and / or IAPP and / or pramlintide for the prophylaxis or thereafter of diabetes, for example of type 1 or type 2.
  • a combination drug kit for example a common formulation or a drug kit for simultaneous or staggered administration with two separate formulations of the active ingredients peptide analog and / or insulin and / or IAPP and / or pramlintide for the prophylaxis or thereafter of diabetes, for example of type 1 or type 2.
  • the present invention relates to a use of a peptide analog according to the invention, optionally together with insulin and / or IAPP and / or pramlintide, for the production of a medicament for the prophylaxis or therapy of diabetes, for example of type 1 or type 2, wherein the peptide analog according to the invention, in particular the Peptide analogue having 1 to 37 amino acids of the natural IAPP or the amino acid sequence of the derivative thereof, as a receptor agonist for the lAPP receptor-driven treatment of diabetes, in particular for the activation of the natural IAPP receptor, is used.
  • the use according to the invention therefore provides that in the context of this use, the peptide analog of the aforementioned type binds to a natural lAPP receptor in vivo and activates it, so that the sugar metabolism can be regulated in this way.
  • a use according to the invention is provided, accordingly a peptide analogue of the present invention, in particular a truncated, in particular N-terminally truncated, peptide analogue, preferably a peptide analogue having at least 8 to 37 or at least 19 to 37 and at most 2 to 37 amino acids of the natural human nen IAPP or an aforementioned derivative thereof, for the production of a drug, optionally together with insulin, and / or IAPP and / or pramlintide, for the treatment of diabetes vor ⁇ seen in which the peptide analogue is used as a receptor antagonist for the lAPP receptor-controlled treatment of diabetes, that is, binds to natural lAPP receptor in vivo and inhibits it, so that in this way the sugar metabolism and the other physiological functions of IAPP are regulated came ⁇ can.
  • all peptide analogues or antibodies according to the invention are used as inhibitors of the lAPP aggregation, in particular as inhibitors of the lAPP amyloid plaque formation.
  • the invention sees on the other hand, that the peptide analogues or antibodies according to the invention are used for the reduction or inhibition of the cytotoxicity of IAPP, in particular for the production of a corresponding medicament.
  • the peptide analogues of the present invention or an antibody of the present invention for the production of a medicament for the simultaneous a) Re ⁇ reduction or inhibition of lAPP aggregation or the formation of amyloid plaques and b ) to regulate the metabolism be it as a receptor agonist or as a receptor agonist.
  • a use of a peptide analogue according to the invention or of an antibody according to the invention for the preparation of a medicament is provided, wherein the peptide analogue or the antibody is used for the simultaneous a) reduction or inhibition of the cytotoxicity of IAPP or its aggregates and b) for regulation of the sugar metabolism, be it as a receptor agonist or as a receptor antagonist.
  • the invention relates to a peptide analogue of the aforementioned type and / or an antibody on the other hand, this or this for the production of a medicament for the prophylaxis or therapy of Alzheimer's disease or other protein aggregation diseases such as Parkinson's or Huntington's disease or prion disease and wherein the peptide analogue and / or the antibody is used in a therapeutically or prophylactically effective amount, in particular wherein the peptide analogue or the antibody, however, the aggregate formation or amyloid plaque formation of the ⁇ -amyloid peptide is reduced or inhibited, or its cytotoxicity is reduced or inhibited.
  • the present invention relates to a peptide analogue of the present type or of an antibody on the other hand for the production of a medicament for the simultaneous prophylaxis or therapy a) of Alzheimer's disease or other protein aggregation diseases such as prion disease, Parkinson's disease or Huntington's disease; and b) diabetes, in particular Type I diabetes or Type II diabetes.
  • the medicament is intended for the prophylaxis or treatment of Alzheimer's disease or other protein aggregation diseases such as Parkinson's disease, prion disease or Huntington's disease, in particular for the simultaneous treatment of a) Alzheimer's disease or other protein aggregation diseases such as Prio ⁇ NEN'S disease, Parkinson's disease or Huntington's disease and b) of diabetes, as a combination medicine with insulin, pramintint or IAPP.
  • Alzheimer's disease or other protein aggregation diseases such as Parkinson's disease, prion disease or Huntington's disease
  • simultaneous treatment of a) Alzheimer's disease or other protein aggregation diseases such as Prio ⁇ NEN'S disease, Parkinson's disease or Huntington's disease and b) of diabetes, as a combination medicine with insulin, pramintint or IAPP.
  • this relates to a peptide analogue or an antibody of the present invention for the preparation of a diagnostic agent for the diagnosis of Alzheimer's disease or other protein aggregation diseases, for example prion disease, Parkinson's disease and / or Huntington's disease.
  • this relates to a peptide analogue of the present invention or an antibody of the present invention for the production of development of a diagnostic agent for the diagnosis of protein aggregation diseases, in particular diabetes.
  • the invention also relates to the use of the present peptide analogs for research purposes.
  • the present invention relates to a peptide analog of the present invention as an improved handling immunogen for the production of antibodies, in particular monoclonal or polyclonal antibodies for diagnostic, therapeutic and research purposes.
  • the present invention relates to a method of qualitatively and / or quantitatively detecting IAPP or its aggregates, wherein a detection peptide-containing peptide analogue of the present invention or a detection-labeled antibody of the present invention is used as a probe having a examining sample in vivo, that is in a human or animal organism, or brought into contact in vitro and a binding of the peptide analog or the antibody with optionally present IAPP or its oligomers or aggregates is detected.
  • the invention also relates to methods for monitoring and to aggravating the aggregation, in particular for the qualitative or quantitative detection of amyloidogenic peptides, oligomers or aggregates thereof, in particular lAPP peptides, lAPP oligomers or IAPP aggregates or for inhibiting the Cytotoxicity of lAPP peptides, oligomers or aggregates thereof, wherein the peptide analogues of the present invention or antibodies thereof are contacted in vivo or in vitro with the amyloidogenic peptides, oligomers or aggregates thereof and the aggregation behavior of the amyloidogenic peptides, oligomers or aggregates is changed, in particular the aggregation is reduced or inhibited and / or can be traced (diagnosis).
  • the invention also relates to methods for monitoring and modifying the aggregation, in particular for the qualitative or quantitative detection of amyloidogenic peptides, oligomers or aggregates thereof, in particular ⁇ -amyloid peptide, prion protein, ⁇ -synuclein or polyglutamine, oligomers thereof, or aggregates thereof, or for the inhibition of cytotoxicity of ß-amyloid peptide, prion Protei ⁇ s, ⁇ -synuclein or polyglutamine, or oligomers or aggregates because of r, wherein the peptide analogs of the present invention or Ant ⁇ - on the other hand, the in vivo or in vitro with the amyloidogenic Pepti ⁇ the, oligomers or aggregates thereof was ⁇ brought the was ⁇ and the aggregation behavior of the amyloidogenic peptides, oligomers or aggregates thereof is changed, in particular the aggregation is reduced or inhibited and / or pursued can be (diagnos
  • the present invention relates to a process for modifying, in particular preventing, the aggregate formation of IAPP present in a liquid, polyglutamine, ⁇ -synuclein, prion protein or ⁇ -amyloid peptide, a peptide analogue of the present invention ⁇ tion is brought into contact with the liquid, incubated and the aggregation behavior of the IAPP 1 prion protein, a -Synucleins, polyglutamine or ß-amyloid peptide is modified.
  • the SEQ ID numbers show:
  • SEQ ID Nos. 1 to 17 represent preferred embodiments of the present peptide analogues.
  • Each of the SEQ ID Nos. Represents several different peptide analogues of the present invention, which differ in their primary structure with the same N-methylation pattern.
  • Each individual SECi ID number therefore represents a particular N-methylation pattern, this one in the case of different primary structures, that is to say in the case of different amino acid acid sequences, for example the natural amino acid sequence of the human IAPP or a previously defined derivative thereof, ie a derivative according to which the lysine at position 1 and / or the two cysteines - residues at positions 2 and 7 by ornithine (as a replacement for lysine) at position 1 and / or aspartic acid and Dap (as a substitute for the two cysteine residues) can be used.
  • amino acid acid sequences for example the natural amino acid sequence of the human IAPP or a previously defined derivative thereof, ie a derivative according to which the lysine at position 1 and / or the two cysteines - residues at positions 2 and 7 by ornithine (as a replacement for lysine) at position 1 and / or aspartic acid and Dap (as a substitute for the two cyste
  • Each individual SEQ ID number therefore represents, on the one hand, the primary structure of the wild-type natural IAPP from the human with a specific N-methylation pattern and, in addition, for the abovementioned derivatives having the same N-methylation pattern thereof.
  • the peptide analogs according to the invention which have Cys at positions 2 and 7 are preferably oxidized, ie the disulphide bridge between the thiol residues of Cys 2 and Cys 7 is closed.
  • the peptide analogs according to the invention which have Dap and Asp or Asp and Dap at position 2 and 7 are preferably bridged, ie the side chains of Asp and Dap are covalently linked to one another via a lactam bridge.
  • the C-terminus is in the form of an amide.
  • Example 8 shows an assignment of the SEQ ID numbers to the abbreviations of the preferred peptide analogues used in the following examples.
  • SEQ ID NO: 18 represents the amino acid sequence of the human, natural IAPP.
  • 570 nm corresponds to the amount of the protein (in the pellet or in the supernatant).
  • FIG. 2 Results of a fibril formation test: The fibril formation potential of 52.5 ⁇ M IAPP versus 62.5 ⁇ M IAPP-GI, IAPP-AL, and IAPP-IL is determined by the
  • FIG. 3 Results of an EM Study of the Amyloidogenic Potentials of IAwPP and the Analogs IAPP-
  • FIG. 4 Results of MTT reduction assays for the determination of the potential cytotoxic effects of the analogues IAPP-GI, IAPP-AL, IAPP-FA in comparison to IAPP.
  • FIG. 5 Results of a fibril binding test: The effect of IAPP-GI, IAPP-AL and IAPP-FA (1/1 mixtures) on the fibril formation potential of IAPP (6.25 ⁇ M) is quantitated by the ThT binding assay.
  • IAPP-GI 1 IAPP-AL and IAPP-FA (1/1 mixtures) for the fibril formation potential of IAPP (5 ⁇ M) is examined by an EM-based aggregation assay. From left to right, aliquots of the following incubations are shown (20h): IAPP alone, IAPP mixed with IAPP-GI, IAPP mixed with IAPP-FA, and IAPP mixed with IAPP-AL.
  • FIG. 7A Results of MTT reduction assays for determining the effect of the analogs IAPP-GI, IAPP-AL and IAPP-FA on the pancreatic cytotoxicity of IAPP (RIN5fm cell line).
  • FIG. 7B The determination of the lAPP-induced adoptosis
  • FIG. 8A shows results of (human) lAPP receptor
  • IAPP and the analogs IAPP-GI, IAPP-AL, and
  • Adenylate cyclase activation (% of maximum) is achieved by quantification of cAMP using cAMP Biotrak
  • FIG. 9 Results of an ELISA: The time-dependence of the receptor activation potential on MGF-7 cells of a 25 .mu.M IAPP solution (in 10 mM sodium phosphate, pH 7.4), which remains at RT (room temperature) for 4 days, becomes that analogs IAPP-GI and IAPP-LA and mixtures of the analogs compared with IAPP.
  • the adenylate cyclase activation (% of maximum) is determined by quantification of cAMP using the cAMP Biotrak ELISA (Amersham). As maximum AC activation, that achieved by 1 ⁇ M IAPP was assumed.
  • FIG. 10 Results of an MTT reduction test for determining the effect of the analog IAPP-GI on the cytotoxicity of A ⁇ . (PC.12 cell line). The results are mean values ( ⁇ SEM) from a representative assay (triplicate determination). example 1
  • IAPP agglomeration of IAPP begins at a concentration of 10 ⁇ M immediately after the preparation of the solution. After 20 h, IAPP has completely failed; In contrast, the N-methylated analogs IAPP-LA, IAPP-GI, and IAPP-AF remain soluble over 14 days even at a concentration of 100 ⁇ M. IAPP has completely failed after only 2 h under the latter conditions (100 ⁇ M).
  • Amyloid fibrils of various protein species bind the dye ThT and lead to an increase in its fluorescence emission maximum.
  • the ThT bond is therefore a specific shear test, which is widely used for the quantification of amyloid fibrils.
  • This assay was used to determine the amyloid-forming potentials of the analogs compared to IAPP. For this assay, the analogs and IAPP were incubated at a concentration of 62.5 ⁇ m in assay buffer (2% HFIP, 10 mM Tris, pH 7.4).
  • IAPP forms fibrils even at a concentration of 625 nM.
  • the analogues do not fibrillate at a concentration of 62.5 ⁇ M (FIG. 2).
  • LAPP amyloid aggregates are cytotoxic to pancreatic ⁇ cells and to a number of other cells. It is believed that the cytotoxic effect of IAPP and other amyloid polypeptides is associated with their aggregation to amyloid. From this follows the assumption that, since the analogs are not amyloidogenic, they should not be cytotoxic either. To investigate this assumption, the MTT cytotoxicity test was used, which is based on the reduction of the dye 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) by "healthy" cells with intact redox potential (Shearman et al., J. Neurochem.
  • MTT dye 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide
  • Th-T binding assay mixture incubations were carried out containing 6.25 ⁇ M IAPP in assay buffer (10 mM Tris, pH 7.4 and 2% HFIP) alone or in a 1/1 mixture with one of the analogs. At certain points in time, aliquots of the solutions were mixed with ThT as described above and their fluorescence emission checked. As can be seen from FIG. 5, the analogues have a strong inhibitory effect on the amyloid formation potential of IAPP.
  • IAPP In a typical EM-followed aggregation assay, IAPP (5 ⁇ M) was incubated alone or in the presence of one of the analogs (in a 1/1 ratio (in 10 ml / l sodium phosphate buffer, pH 7.4, containing 1% HFIP)). After 20 h, 10 .mu.l of the solution was applied to an EM platelet and, after staining with 1% uranyl acetate as described (Kayed, J. Mol. Biol.
  • IAPP-GI IAPP alone and in the presence of IAPP-GI (1/1) (5 ⁇ M in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4) and incubated with the plated cells at a final concentration of 500 ⁇ l for 20 h. Thereafter, apoptosis was by means of a commercial Apoptosis ELISAs (Cell Death Detection Kit from Roche) quantified. This ELISA assay quantifies the cytosolic nucleosomes, which are an early and specific evidence of apoptotic cell death. This test also shows (FIG. 7B) that IAPP-GI is able to protect pancreatic ⁇ cells from IAPP-induced apoptotic cell death.
  • the receptor binding assay was analogous to that described by Zimmermann, et al. J. Endocrinology (1997) 155, 423-31.
  • the binding of the 125 I-labeled rat IAPP (rlAP P) sequence which is the strongest receptor ligand known to date, was quantitative in the presence of IAPP or the peptide analogs IAPP-GI, IAPP-AL or IAPP-FA ⁇ true.
  • Mixtures of the radioactively labeled ligand rIAPP (-80 pM) with the corresponding peptides in different final concentrations (FIG. 8A) were incubated for 1 h with MCF-7 cells at RT. cubed.
  • test buffer consisted of a 1/1 mixture of Dulbecco's MOD Eagle and F12 nutrient mixture (HAM) containing 0.1% BSA
  • NaOH 0.5 M
  • the scintillation fluid was then washed with test buffer (the test buffer consisted of a 1/1 mixture of Dulbecco's MOD Eagle and F12 nutrient mixture (HAM) containing 0.1% BSA), admixed with NaOH (0.5 M) and then with the scintillation fluid, and the Membrane-bound radioactivity was determined by means of a scintillation counter.
  • HAM Dulbecco's MOD Eagle and F12 nutrient mixture
  • NaOH 0.5 M
  • FIG. 8A all three analogs tested here are able to bind the lAPP receptor.
  • IAPP-AL proves to be the agonist with the highest receptor affinity, with IAPP-GI being the weakest (FIG. 8A).
  • AC activation adenylate cyclase activation potential
  • IAPP-GI full-length LAPP agonists.
  • IAPP-AL proves to be the most potent agonist and is a better AC activating ligand than IAPP.
  • IAPP-AF has the same AC activation potential as IAPP and IAPP-GI is a weaker agonist than IAPP.
  • AD Alzheimer's Disease
  • IAPP-GI mixed 1/1
  • A- ⁇ 100 ⁇ M
  • IAPP-GI was incubated for 4 days in 10 mM Tris buffer, pH 7.4, containing 150 mM NaCl and 2.2% HFIP at RT.
  • the solutions were then added after dilution to PC-12 and HTB-14 cells. Both cell lines are often used to study the inhibitory effect of potential A- ⁇ cytotoxicity inhibitors. It was found on both cell lines that IAPP-GI can indeed greatly reduce the cytotoxicity of the A- ⁇ peptide (FIG. 10).
  • the interaction of A-ß with IAPP-GI was confirmed by further binding assays.
  • IAPP-GI and other N-methylated lAPP analogs are particularly suitable for the treatment of Alzheimer's disease (AD).
  • SEQ IDENTIFICATION SEQ ID NO. ⁇ i only KCNTATCATQRI-ANFLVHSSNNF (N-Me) GA (N-Me) ILSSTNVGSNTY [(N-Me) G ⁇ 1 (N-Me) IH-IAPP g KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFG (N-Me ) AI (N-Me) LSSTNVGSNTY [(N-Me) AH (N-Me) LH-IAPP
  • the peptide analogues according to the invention were prepared by simple chemosynthesis in high purity and good yield by conventional methods of solid-phase peptide synthesis on RINK amide MBHA resin using the Fmoc / tBu strategy (Kazantzis et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269, 780-791).
  • Fmoc / tBu strategy Kazantzis et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269, 780-791.
  • N ⁇ -Fmoc-protected amino acids side-chain protection as follows: Lys (Boc), Cys (Tet), Arg (Pmc), Asn (Tet), His (Tet), Ser (t Bu), Tyr (t Bu), Thr (tBu)).
  • N-methylated Fmoc amino acids are also used in this form (for example, Fmoc- (N-Me) Ne, Fmoc- (N-Me) Gly, etc.).
  • Amino acids are carried out with TBTU and DIEA (4-fold molar excess of AS, 4-fold excess of TBTU, 6-fold excess of DIEA with respect to the molar amount of C-terminal AS) in DMF and / or NMP ,
  • DIEA 4-fold molar excess of AS, 4-fold excess of TBTU, 6-fold excess of DIEA with respect to the molar amount of C-terminal AS
  • NMP amino acids

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Mittel und Verfahren zur Behandlung von Diabetes und Alzheimer-Krankheit unter Ver­wendung von IAPP-Peptidderivaten.

Description

Chemisch modifizierte Peptidanaloga Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Peptidanaloga des Islet Amyloid Polypeptids (IAPP), Verfahren zum Auffinden von IAPP oder dessen Aggregaten, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Prophylaxe und Therapie von Proteinaggregationskrankheiten, insbesondere Diabetes und Alzheimer'sche Krankheit sowie diagnostische Zu¬ sammensetzungen zum Nachweis von Proteinaggregationskrankhei¬ ten, insbesondere Diabetes und Alzheimer'sche Krankheit ebenso wie Verwendungen der genannten Peptidanaloga zu Zwecken der Diagnose und Therapie von Krankheiten oder für die Grundlagenfor¬ schung.
Diabetes ist eine Krankheit, für welche es gegenwärtig noch keine befriedigenden Therapieansätze gibt. Üblicherweise wird unterschie¬ den zwischen der Typ I- und der Typ Il-Diabetes. 90 % der Diabeti- ker leiden an Typ Il Diabetes oder Alterdiabetes. Heutzutage gibt es weltweit mehr als 150 Millionen Typ Il Diabetiker. Diabetes entsteht durch den Mangel an Insulin beziehungsweise durch den gestörten Verlauf Insulin-abhängiger biologischer Prozesse. Da einerseits die zentrale Rolle des Insulins beim Kohlenhydratstoffwechsel durch andere Moleküle nicht ersetzt werden kann und andererseits die Ga¬ be von Insulin allein die pathologischen Konsequenzen der Krank¬ heiten im Fall von Typ I Diabetes oder die Krankheit selbst im Fall von Typ Il Diabetes nicht eliminieren kann, sind neue therapeutische Ansätze notwendig. Derartige Konzepte sollen einerseits die Sekreti- on, Aufnahme und die Entfaltung der biologischen Funktion des In¬ sulin-Moleküls unterstützen und andererseits vor unerwünschten Nebenwirkungen des Insulins wie Gewichtszunahme oder Hypogly- kämie schützen. Neue Moleküle, welche insbesondere zusammen mit Insulin zur Regulation des Kohlenhydratstoffwechsels beitragen, sind somit von großem biomedizinischem Interesse.
Eines dieser neuen Moleküle ist das Islet Amyloid Polypeptid (IAPP oder Amylin). IAPP ist ein aus 37 Aminosäure resten bestehendes Peptidhormon, welches in den ß -Zellen des Pankreas synthetisiert wird und zusammen mit Insulin und Glukagon an der Regulation des Zuckermetabolismus beteiligt ist. IAPP ist ein Gegenspieler von Insu¬ lin. In den Bauchspeicheldrüsen von mehr als 95 % der Typ Il Diabe- tikern findet man die sogenannten Amyloidplaques. Amyloidplaques sind Ablagerungen, die aus unlöslichen Aggregaten des Polypeptids IAPP bestehen. Ähnlich wie die Alzheimer'sche Krankheit, Parkin¬ son, Prionen-Erkrankungen oder Huntington's Krankheit kann auch Diabetes daher als Proteinaggregationskrankheit (Ross und Poirier, Nature medicine, Juli 2004, Vol. 10 Suppl., Seiten 10-17) angesehen werden. Die Bioaktivität von IAPP wird durch seine lösliche, mono¬ mere Form über cAMP-gekoppelte Rezeptoren vermittelt. IAPP^ Amyloidplaques, lösliche Oligomere und multirnere Formen des lAPP-Moleküls sind jedoch zytotoxisch. Man geht davon aus, dass die durch lAPP-Amyloidbildung hervorgerufene Schädigung der ß - Zellen zur Kaskade der Pathogenese des Typ Il Diabetes einen er¬ heblichen Beitrag leistet. Daher ist die Entwicklung von therapeutisch wirksamen Inhibitoren des lAPP-Amyloidbildungsprozesses von gro¬ ßem biomedizinischem Interesse. Darüber hinaus ist das IAPP- Molekül in seiner biologischen Funktion als Insulin-Gegenspieler und als Regulator der mit der Insulinsekretion oder -gäbe assoziierten postprandialen Hypoglykämie per se ein wichtiges Polypeptidhor- mon, welches potentielle therapeutische Anwend ungen bei der Be¬ handlung von Typ I (zum Beispiel in Kombination mit Insulin) und Typ Il Diabetes haben könnte. Die medizinische Applikation von IAPP ist jedoch aufgrund seiner Schwerlöslichkeit und seiner starken Aggregationstendenz erheblich eingeschränkt.
Bekannt ist das lösliche lAPP-Analog Pramlintide. Pramlintide (Sym- 5 lin®) entstand durch den Ersatz von 3 Aminosäureresten an den Po¬ sitionen 25, 28, und 29 in der Sequenz des humanen IAPP -Moleküls durch Prolin. Diese Prolin-Substituenten kommen in der Ratten- lAPP-Sequenz vor, welche selbst keine Aggregationstendenz hat. Strukturell lässt sich die verminderte Aggregationstendenz von Pro- O lin-enthaltenden Sequenzen dadurch erklären, dass Prolinreste nicht in der Lage sind, ß -Faltblattkonformationen anzunehmen (Proline sind ß -Faltblatt-"brechende" Reste). In der Tat weist das lAPP- Analog Pramlintide eine stark reduzierte Aggregationsneigung und somit ein besseres Löslichkeitsprofil als humanes IAPP auf. Klini- 5 sehe Studien, welche noch nicht komplett abgeschlossen sind, wei¬ sen darauf hin, dass dieses Analogon zusammen mit Insulin in der Behandlung von Diabetes Anwendung finden könnte. Dennoch ver¬ hindert die Aggregationsneigung von Pramlintide bei pH-Werten ü- ber 5 eine Formulierung und Applikation zusammen mit Insulin. Das O Analogon wird daher getrennt von Insulin per s.c. Injektion verab¬ reicht, was seine Applikation erheblich erschwert (Nyholm -B. et al., Expert Opinion, Investig. Drug (2001) 10(9) 1641-1652).
Die frühe Erkennung von Diabetes zusammen mit einem frühen Ein¬ satz therapeutischer Maßnahmen könnte den KrankheitsverJauf stark 5 verzögern und somit positiv beeinflussen. Die Rolle von IAPP beim Typ Il Diabetes ist jedoch noch nicht geklärt. Da seine Aggregation von seiner Konzentration abhängig ist, könnte es durcha us einen Zusammenhang der Konzentration von löslichem IAPP beziiehungs- weise der löslichen lAPP-Aggregate im Blut mit dem Auftreten der Krankheit geben. Die gängigen IAPP-RIAs können nur die vom lAPP-Antikörper erkannten lAPP-Moleküle bestimmen. Es ist jedoch bekannt, dass Proteinregionen (Antigenregionen), die für die Anti- gen-Antikörperwechselwirkung zuständig sind, durch die Proteinas¬ soziation nicht mehr ohne weiteres erkannt werden können. Deswe¬ gen ist es von Bedeutung, eine laborchemische lAPP-Messmethode zu entwickeln, welche spezifisch verschiedene Assoziationsformen des IAPP-Mo leküls erkennen kann. Notwendig erscheint dazu die Entwicklung eines konformationsspezifischen Antikörpers, also eines Antikörpers, der gegen ein monomeres beziehungsweise oligomeres IAPP-Molekül erzeugt wurde. Der herkömmliche lAPP-Antikörper ist nämlich nicht konformationsspezifisch.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde, Mittel und Verfahren bereitzustellen, mit deren Hilfe eine verbesserte Prophylaxe, Therapie und Diagnose von Proteinaggre- gationskrankheiten, insbesondere von Diabetes und/oder Alzhei- mer'sche Krankheit ermöglicht wird.
Die Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstel- lung von Peptidanaloga des Islet Amyloid Polypeptids (IAPP) mit der Fähigkeit, an natürlichen lAPP-Rezeptor zu binden, wobei das Pep- tidanalogon a) höchstens 38 Aminosäuren, vorzugsweise höchstens 37 Aminosäuren aufweist, von denen 37 Aminosäuren davon die Aminosäuresequenz des natürlichen IAPP in ihrer natürlichen Abfol- ge aufweisen, b) mindestens die Aminosäuren 19 bis 37 des natürli¬ chen IAPP in ihrer natürlichen Abfolge aufweist, c) mindestens eine seiner Amidbindungen N-methyliert ist, d) und wobei optional in der Aminosäuresequenz des natürlichen IAPP Lys (Lysin) an Position 1 ersetzt sein kann durch Om (Ornithin) und/oder Cys (Cystein) an Position 2 und 7 ersetzt sein kann durch Dap (2,3- Diaminopropionsäure) an Position 2 und Asp (Asparaginsäure) an Position 7 oder Asp an Position 2 und Dap an Position 7, und e) wo- bei die N-methylierten Peptidanaloga mit den SEQ ID Nr. 1 bis 5 ausgenommen sind, welche die Wildtyp-Aminosäuresequenz des humanen IAPP aufweisen. Insbesondere löst die vorliegende Erfin¬ dung das ihr zugrundeliegende technische Problem durch die Bereit¬ stellung eines Peptidanalogon des Islet Amyloid Polypeptids (IAPP) als diagnostisches oder therapeutisches Mittel mit der Fähigkeit, an natürlichen Rezeptor des IAPP zu binden, wobei das Peptidanalo¬ gon a) höchstens 38 Aminosäuren, vorzugsweise höchstens 37 A- minosäuren, aufweist, von denen 37 Aminosäuren davon die Amino¬ säuresequenz des natürlichen IAPP in ihrer natürlichen Abfolge auf- weisen, b) mindestens die Aminosäuren 19 bis 37 des natürlichen IAPP in ihrer natürlichen Abfolge aufweist, c) mindestens eine seiner Amidbindungen N-rnethyliert ist, und, optional, d) wobei in der Ami¬ nosäuresequenz des natürlichen IAPP Lys (Lysin) an Position 1 er¬ setzt sein kann durch Orn (Ornithin) und/oder Cys an Position 2 und 7 ersetzt sein kann durch Dap an Position 2 und Asp an Position 7 oder Asp an Position 2 und Dap an Position 7.
Die Erfindung stellt diese Peptidanaloga, also die modifizierten N- methylierten lAPP-Derivate vorzugsweise in isolierter, vorzugsweise in partiell oder vollständig gereinigter Form bereit.
Die vorstehend genannten Peptidanaloga sind daher durch die zwin¬ gend erforderlichen Merkmale a), b) und c) charakterisiert, wobei sie das Merkmal d) gegebenenfalls aufweisen können, das heißt in die¬ ser optionalen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Peptidanaloga durch eine von der natürlichen Sequenz des IAPP, insbesondere des humanen IAPP, abweichende Aminosäurese¬ quenz gekennzeichnet, insofern, als dass das in der natürlichen hu¬ manen IAPP Sequenz an Position 1 aufweisende Lysin durch die Aminosäure Ornithin und/oder die beiden Cysteine an Position 2 und 7 des natürlichen insbesondere humanen IAPP durch Dap (2,3- Diaminopropionsäure) an Position 2 und Asp an Position 7 bezie¬ hungsweise Asp an Position 2 und Dap an Position 7 ersetzt sind beziehungsweise ist. Im Folgenden wird ein erfindungsgemäßes Peptidanalogon, welches gemäß Merkmal d) ausgeführt ist, das heißt das in Abweichung von der natürlichen lAPP-Sequenz, insbe¬ sondere der humanen IAPP Sequenz, Ornithin an Position 1 (anstel¬ le von Lysin) und/oder Asp oder Dap an Position 2 und Dap oder Asp an Position 7 (jeweils anstelle von Cystein) aufweist, als Derivat des erfindungsgemäßen Peptidanalogons bezeichnet.
Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga, die Cys an Position 2 und 7 aufweisen, sind vorzugsweise oxidiert, dass heisst die Disulfidbrücke zwischen den Thiolresten von Cys 2 und Cys 7 ist geschlossen.
Ebenso sind die erfindungsgemäßen Peptidanaloga, die an Position 2 und 7 Dap und Asp beziehungsweise Asp und Dap aufweisen, vorzugsweise verbrückt, dass heisst die Seitenketten von Asp und Dap sind kovalent miteinander über eine Lactambrücke verbunden.
Bei allen Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung liegt der C- Terminus in einer bevorzugten Ausführungsform als Amid vor.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff natürliches IAPP das IAPP verstanden, welches die Wildtyp- Aminosäuresequenz des IAPP aufweist, das heißt die Aminosäure- sequeπz aufweist, wie sie natürlicherweise in vivo im betreffenden Organismus, das heißt vorzugsweise im Menschen, anzutreffen ist. Verschiedene natürliche IAPP Sequenzen, insbesondere des Men¬ schen, sind in Kapumiotu (Biopolymers (Peptide Science) 60 (2001) 438-459) veröffentlicht. SEQ ID Nr. 18 der vorliegenden Lehre zeigt die Wildtyp-Sequenz von IAPP aus dem Menschen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Positionsangaben von Aminosäuren oder Amidbindungen daher, soweit nicht anders angegeben, immer Positionsangaben, die sich auf die Aminosäuresequenz des natürli- chen humanen IAPP, dargestellt in Schema 1 von Kapumiotu (vor¬ stehend) oder in SEQ ID Nr. 18 beziehen. Ebenso wird unter dem Begriff natürlicher lAPP-Rezeptor natürlicherweise vorhandener Wildtyp-Rezeptor für IAPP, insbesondere humaner Wildtyp-Rezeptor verstanden.
Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga weisen in einer Ausführungs¬ form also exakt die gleiche Primärstruktur wie das natürliche, huma¬ ne IAPP und in einer anderen Ausführungsform im Wesentlichen die gleiche Primärstruktur wie insbesondere humanes IAPP auf, weisen aber aufgrund der erfindungsgemäß selektiv eingeführten N- Methylgruppierungen an bestimmten Amidbindungen eine andere Konformation als IAPP und somit veränderte biologische, insbeson¬ dere biochemische und biophysikalische Eigenschaften auf, vergli¬ chen mit nativem humanem IAPP. Insbesondere zeich nen sich die erfindungsgemäßen Peptidanaloga dadurch aus, dass s ie fähig sind, mit nativem IAPP, insbesondere nativem humanem IAvPP zu inter- agieren und seine Aggregation in Amyloidfibrillen, die anschließende Amyloidplaquebildung und die damit assoziierte Zytotoxizität zu re¬ duzieren oder zu inhibieren. Gleichzeitig weisen sie die vorteilhafte Eigenschaft auf, an natürlichen, also Wildtyp-Rezeptor, also vor- zugsweise humanen lAPP-Rezeptor spezifisch binden zu können. Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga weisen keine beziehungs¬ weise eine stark reduzierte Fribrillbildungsfähigkeit auf. Bei einem physiologischen pH von etwa 7 zeigen sie eine besonders stark ver- minderte Fibrillbildungsneigung und können demgemäß in beson¬ ders vorteilhafter Weise im Gegensatz zu nativem IAPP oder Pram- lintide zusammen mit Insulin formuliert und verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga sind insbesondere bei einem physiologischen pH-Wert von etwa pH 7 bis 7.4 mindestens einhun- dert Mal löslicher als IAPP, was ihre vorstehend erläuterte Formulie¬ rungsfähigkeit mit Insulin ermöglicht. Ihre hohe Löslichkeit im Ver¬ gleich zu IAPP führt dazu, dass ihre biologische Aktivität während ihrer Lagerung als Lösung (1 mg/ml) nicht reduziert wird (das ist der Fall mit IAPP). Auch können sie als Zusatz zu lAPP-haltigen Lösun- gen dazu beitragen, dass das IAPP in löslicher und somit biologisch aktiver Form bleibt. Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga sind im Vergleich zu IAPP gegen den Abbau durch Proteasen stabiler, was auch eine Verabreichung der Peptidanaloga der vorliegenden Erfin¬ dung in Tablettenform ermöglichen könnte. Darüber hinaus inter- agieren die erfindungsgemäßen Peptidanaloga mit dem ß- Amyloidpeptid, das bei der Entstehung der Alzheimer-Erkrankung eine Rolle spielt. Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga reduzieren insbesondere die Cytotoxizität des ß -Amyloidpeptides und eignen sich daher auch zur Diagnose, Therapie und Prophylaxe von AIz- heimer-Erkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga eignen sich insbesondere zur Prophylaxe, Therapie und Diagnose von Proteinaggregati- onskrankheiten, insbesondere Diabetes, besonders bevorzugt von Typ I Diabetes und/oder von Typ Il Diabetes (Diabetes mellitus). Ge- gebenenfalls ist in bevorzugter Ausfuhrungsform vorgesehen, die erfindungsgemäßen Peptidanaloga zusammen mit Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide zur Prophylaxe und Therapie von Diabe¬ tes, insbesondere Typ I und/oder Typ 11 Diabetes einzusetzen. Dar- über hinaus können die erfindungsgemäß bereitgestellten konforma- tionsstabilisierten Peptidanaloga als Antigene, zum Beispiel allein oder in Mischung mit lAPP-Monomeren oder lAPP-Oligomeren defi¬ nierter Größe, eingesetzt werden, um konformationsspezifische Anti¬ körper für zum Beispiel eine ELISA/RIA-basierte Detektion von IAPP in Körperflüssigkeiten bereitzustellen und einzusetzen und so ver¬ besserte Diagnose- und Analyse-Verfahren bereitzustellen.
Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, die erfindungsgemäßen Peptidanaloga zum Beispiel für ELISA, RIA etc. zusammen mit ei¬ nem Marker, zum Beispiel einem Spin-Label, Fluoreszens- oder Lu- mineszensmarker, insbesondere in N-terminal markierter, insbeson¬ dere N-terminal biotinilierter Form, oder N-terminal Fluorescein mar¬ kierter Form oder mit anderen fluoreszierenden Markern versehen einzusetzen.
Die Erfindung sieht in einer bevorzugten Ausführungsform vor, dass das erfindungsgemäße Peptidanalogon die vollständige Aminosäu¬ resequenz 1 bis 37 des natürlichen IAPP, insbesondere des natürli¬ chen humanen IAPP, oder die Aminosäuren 1 bis 37 des vorgenann¬ ten Derivats davon aufweist beziehungsweise allein diese 37 Amino¬ säuren aufweist, d.h. aus diesen besteht. Die Erfindung sieht in be- sonders bevorzugter Ausführungsform also ein vorgenanntes Pep¬ tidanalogon vor, welches aus den 37 Aminosäuren des natürlichen, insbesondere humanen, IAPP oder den Aminosäuren der vorge¬ nannten Derivate besteht, die in der Reihenfolge des natürlichen humanen IAPP angeordnet sind und wobei wenigstens eine d&r A- midbindungen der α -Aminogruppen der Aminosäuren dieses Pep- tidanalogons N-methyliert ist.
Die Erfindung stellt in besonders bevorzugter Ausführungsform die Lehre bereit, dass das erfindungsgemäße Peptidanalogon des IAvPP, das die vollständige Aminosäuresequenz des natürlichen, insbeson¬ dere humanen IAPP, nämlich die Aminosäuresequenz 1 bis 3T in voller Länge oder die Aminosäuresequenz des vorgenannten Deri¬ vats davon aufweist beziehungsweise aus dieser besteht, als Rezep- toragonist von natürlichem lAPP-Rezeptor fungiert. In dieser Aus -füh- rungsform aktiviert das Peptidanalogon den lAPP-Rezeptor. Diese Lehre macht diese erfindungsgemäßen Peptidanaloga besonders geeignet zur Regulation des Zuckerstoffwechsels und anderer bϊ olo- gischer Wirkungen des nativen IAPP Moleküls. Gleichzeitig wirken diese Peptidanaloga als Inhibitoren der Bildung von Amyloidfibrillen und/oder Amyloidplaques, das heißt als Inhibitoren der Bildung un¬ löslicher zellschädigender lAPP-Aggregate und reduzieren oder \ nhi- bieren damit gleichzeitig die dadurch verursachte Zytotoxizität.
Die Erfindung sieht in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor, dass das erfindungsgemäße Peptidanalogon gegenüber der Wildtyp-Sequenz verkürzt ist, insbesondere an seinem N-Terrm nus verkürzt ist, und mindestens die Aminosäuren 19 bis 37, vorzugs¬ weise 8 bis 37 des natürlichen IAPP oder die Aminosäuren des 'vor¬ genannten Derivats davon aufweist beziehungsweise allein aus die- sen in ihrer natürlichen Reihenfolge besteht. In dieser Ausführungs¬ form ist also vorgesehen, dass das verkürzte Peptidanalogon min¬ destens die Aminosäuren 19 bis 37, vorzugsweise 8 bis 37 und höchstens die Aminosäuren 2 bis 37 des natürlichen, insbesondere humanen Wildtyp IAPP oder die Aminosäuren des vorgenannten Derivats davon aufweist beziehungsweise aus diesen besteht und mindestens eine der Amidbin düngen des Peptidanalogons N- methyiiert ist.
Die Erfindung stellt auch die Lehre bereit, dass die erfindungsgemä¬ ßen verkürzten Peptidanaloga, die also nicht die vollständige Amino¬ säuresequenz des natürlichen, insbesondere humanen IAPP oder nicht die vollständige Aminosäuresequenz des vorgenannten Deri¬ vats aufweisen, das heißt die Peptidanaloga, die die Aminosäuren von den Positionen 2 bis 37 bis Positionen 19 bis 37 oder die Ami¬ nosäuresequenz der vorgenannten Derivate davon aufweisen bezie¬ hungsweise aus diesen bestehen, ebenfalls an einen Wildtyp- Rezeptor des natürlichen IAPP binden, dort aber als Rezeptoranta- gonisten wirken und dadurch ebenfalls geeignet sind, als Regulato- ren des Zuckerstoffwechsels zu fungieren. In dieser Ausführungs¬ form hemmt das Peptidanalogon den lAPP-Rezeptor. Auch diese besonders bevorzugten Peptidanaloga wirken gleichzeitig als Inhibi¬ toren der Bildung von Amyloidfibrillen und/oder von Amyloidplaques und reduzieren oder inhibieren daher die damit verbundene Zytotoxi- zität.
Die Erfindung erfasst also auch Ausführungsformen, das heißt Pep¬ tidanaloga des Wildtyp-IAPP, wobei diese zum Beispiel die Amino¬ säuren 7 bis 37, 6 bis 37, 5 bis 37, 4 bis 37, 3 bis 37 und 2 bis 37 des natürlichen, insbesondere humanen natürlichen IAPP oder die Aminosäuren des vorgenannten Derivats davon aufweisen bezie¬ hungsweise allein aus diesen bestehen und wobei in jeder dieser Ausfuhrungsformen mindestens eine der Amidbindungen des Pep¬ tidanalogons N-methyliert ist. Die erfiπdungsgemäßen Peptidanaloga weisen i n bevorzugter Aus¬ führungsform der vorliegenden Erfindung eins, zwei, drei oder vier Amidbindungen auf, die N-methyliert sind, das heißt bei denen ein Wasserstoffatom der α-Aminogruppe einer Amin osäure des Peptids durch eine Methylgruppe ersetzt ist. In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Amidbindungen der erfindungs¬ gemäßen Peptidanaloga N-methyliert, die den α -Aminogruppen der Aminosäuren an den Positionen 22 und/ode r 23 und/oder 24 und/oder 25 und/oder 26 und/oder 27 und/oder 28 und/oder 29 zu- geordnet sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die N-methylierten Amidbindungen in einem Bereich des Pep- tidanalogons, der 4 bis 8 Aminosäuren umfasst, i n ununterbrochener Reihenfolge in der Aminosäuresequenz angeordnet. In einer weite¬ ren bevorzugten Ausführungsform können die IN-Methylgruppen in einem Bereich des Peptidanalogons, der 4 bis 8 Aminosäuren um¬ fasst, an jeder zweiten Amidbindung des Peptidanalogons, insbe¬ sondere den vorgenannten Aminosäurepositionen, vorhanden sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorlie¬ gende Erfindung Peptidanaloga, ausgewählt aus der Gruppe beste- hend aus SEQ ID Nr. 1 bis 17 mit Ausnahme der Peptidanaloga, die die natürliche Aminosäuresequenz des humanen Wildtyp-IAPP auf¬ weisen und gleichzeitig die N-Methylierung gemäß der SEQ ID Nr. 1 bis 5 aufweisen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform be¬ trifft die vorliegende Erfindung Peptidanaloga für therapeutische oder diagnostische Zwecke, ausgewählt aus der Gru ppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 17. Die Erfindung stellt für die erfindungsgemäßen Peptidanaloga, insbesondere der SEQ ID Nr. Λ bis 17, daher die erstmalige Anwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Be¬ handlung des menschlichen oder tierischen Körpers und in einem Diagnostizierverfahren, das am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen wird, bereit. Die Erfindung betrifft daher auch Arznei- und Diagnostiziermittel, enthaltend die vorgenannten Peptidanaloga der Erfindung, insbesondere die Peptidanaloga ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 17.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorlie¬ gende Erfindung Peptidanaloga, wobei diese ausgewählt sind aus der Gruppe der erfindungsgemäßen Peptidanaloga mit den Amino¬ säuren 1 bis 37 des humanen Wildtyp-IAPP oder eines Derivats da- von, die Amidbindungen der α -Aminogruppen der Aminosäuren an den Positionen (24 und 26), (25 und 27), (23 und 25), (26 und 27), (25 und 26 und 27), (24 und 25), (25 und 26), (22 und 24), (23 und 24), (24 und 26), (23), (24), (25), (26), (27), (28 und 29), (25 und 28 und 29) aufweisen. Diese Peptidanaloga werden im Folgenden in der vorgenannten Reihenfolge auch als IAPP-GI, IAPP-AL, IAPP-FA, IAPP-IL, IAPP-AIL, IAPP-GA, IAPP-AI, IAPP-NG, IAPP-FG, IAPP- GAIL, IAPP-F, IAPP-G, IAPP-A1 IAPP-I, IAPP-L, IAPP-SS und IAPP- ASS bezeichnet, sofern sie die Aminosäuresequenz des humanen Wildtyp-IAPP aufweisen.
Selbstverständlich betrifft die Erfindung auch die vorgenannten Pep¬ tidanaloga des Wildtyp-IAPP oder dessen Derivate in Mischung, wie zum Beispiel 1 :1 -Mischung, mit natürlichem, unmodifiziertem IAPP und/oder ß -Amyloidpeptid oder anderen bekannten Peptidanaloga des IAPP oder des ß -Amyloidpeptids (A- ß ) oder anderen Derivaten von IAPP oder A- ß , insbesondere auch zur Herstellung von Arznei¬ oder Diagnosemitteln sowie zu Forschungs- und Versuchszwecken. Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die erfindungsgemäßen Peptidanaloga, die löslich sind, insbesonde¬ re mindestens einhundertmal löslicher sind als natürliches IAPP1 ins¬ besondere humanes natürliches IAPP, insbesondere in Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung, vorzugsweise bei einem physiologi¬ schen pH-Wert von etwa 7,0 bis 8,0, vorzugsweise pH = 7,4.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungs¬ gemäßen Peptidanaloga markiert, insbesondere an ihrer N- terminalen α -Aminogruppe, insbesondere mit einer Acetylgruppe, einem radioaktiven Marker, einem Enzymmarker, einem Fluores- zenzmarker, einem Lumineszenzmarker oder einem Spin-Label, vor¬ zugsweise in einer Art und Weise, dass die genannten Marker über einen Spacer mit dem Peptidanalogon verbunden sind, wobei der Spacer eine Aminosäure sein kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die erfindungsgernäßen Peptidanaloga mit mindestens einer funktio¬ nellen Gruppe derivatisiert sind, ausgewählt aus der Gruppe beste¬ hend aus einer Acylgruppe, funktionalisierte Acylgruppe, aromati¬ sche Gruppe, einer Aminosäure, einer Glycogruppe und einer Li- pidgruppe.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die funktionelle Gruppe über einen Spacer, zum Beispiel eine Ami¬ nosäure, sofern die funktionelle Gruppe nicht selbst eine Aminosäu¬ regruppe ist, mit dem Peptidanalogon verbunden ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die erfindungsgernäßen Peptidanaloga auf einem Träger, zum Bei- spiel einer Matrix oder an der Oberfläche eines Wells, einer Mikroti- terplatte, einer Membran, etc., immobilisiert ist.
Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga können üblicherweise che¬ misch synthetisiert und/oder modifiziert werden.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von spezifisch gegen a) IAPP oder b) einen Peptidanalogon/IAPP-Komplex oder c) spezifisch gegen ein Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung gerichteten Antikörpern, wobei mindestens ein erfindungsgemäßes Peptidanalogon als Antigen, gegebenenfalls zusammen mit mono- merem IAPP oder einem Oligomer davon, mit einem zur Antikörper- Bildung befähigten System in Kontakt gebracht wird, zum Beispiel in einen tierischen Organismus gespritzt wird, und die gebildeten Anti¬ körper gewonnen werden. Selbstverständlich betrifft die .Erfindung auch Verfahren zur Herstellung von spezifisch gegen IAPP oder ei- nem lAPP/Peptidanalogon-Kornplex oder spezifisch gegen ein Pep¬ tidanalogon der vorliegenden Erfindung gerichteten Antikörpern, wo¬ bei die Antikörper nicht nur polyclonale, sondern auch monoclonale Antikörper sein können. Die Erfindung betrifft daher auch monoclo¬ nale oder polyclonale Antikörper sowie Fragmente davon, herstellbar nach einem vorgenannten Verfahren, wobei der Antikörper oder das Fragment davon spezifisch gegen ein Peptidanalogon der vorliegen¬ den Erfindung oder spezifisch gegen IAPP oder gegen einen Peptid- analogon/IAPP-Komplex gerichtet ist, das heißt diese spezifisch er¬ kennen und binden können. Die Antikörper können in üblicher weise modifiziert, zum Beispiel markiert sein. Sie können auch in immobili¬ sierter Form auf einem Träger oder einem Kügelchen fixiert vorlie¬ gen. Die erfindungsgemäßen polyclonalen oder monoclonalen Anti¬ körper können beispielsweise zur Analyse des Krankheitsverlaufs von zum Beispiel mit erfindungsgemäßen Peptidanaloga behandel¬ ten Patienten oder zur Isolierung und Identifizierung von weiteren therapeutisch wirksamen Peptiden dienen. Die erfindungsgemäßen Peptide erweisen sich im Rahmen ihres Einsatzes als Immunogen für die Herstellung von Antikörpern für diagnostische und therapeuti¬ sche Zwecke aufgrund ihrer erheblich verbesserten Handhabbarkeit gegenüber den nativ-vorkommenden schwer löslichen Peptiden als besonders vorteilhaft. Die so hergestellten Antikörper können in ei¬ ner Ausführungsform spezifisch die erfindungsgemäken Peptide und in einer anderen Ausführungsform auch das nativ vorhandene WiId- typ-IAPP gegebenenfalls in aggregierter Form erkennen, sodass die erfindungsgemäßen Antikörper zum Beispiel zur Diagnose der AIz- heimer'schen Krankheit oder von Diabetes eingesetzt werden kön¬ nen. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Immunisierung von menschlichen oder tierischen Organismen, wobei die erfindungsge¬ mäßen Peptidanaloga menschlichen oder tierischen Organismen appliziert und eine Immunisierung gegen IAPP beziehungsweise dessen Derivat erreicht wird.
Die Erfindung betrifft daher Verfahren zur Herstellung von spezifisch gegen ein Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung gerichteten Antikörpern, wobei mindestens ein Peptidanalogon d er vorliegenden Erfindung als Antigen mit einem zur Antikörper-Bildung befähigten System in Kontakt gebracht und die gebildeten Antikörper gewonnen werden. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von spezifisch gegen IAPP und ein Peptidanalogon d er vorliegenden Erfindung gerichteten Antikörpern, wobei mindestens ein Peptidana¬ loga der vorliegenden Erfindung mit einem zur Antikörper-Bildung befähigten System in Kontakt gebracht und die gebildeten Antikörper gewonnen werden. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstel- lung spezifisch gegen Mischungen von IAPP mit einem Peptidanalo- gon- gerichteten Antikörper, wobei Mischungen von monomerem IAPP und einem Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung als An¬ tigen, wobei gegebenenfalls das IAPP auch als Oligomer eingesetzt werden kann, mit einem zu Antikörper-Bildung befähigtem System in Kontakt gebracht und die gebildeten Antikörper gewonnen werden. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von spezi¬ fisch gegen Mischungen von ß-Amyloidpeptid mit einem Peptidana¬ logon der vorliegenden Erfindung gerichteten Antikörpern, wobei Mi- schungen von monomerem oder oligomerem ß-Amyloidpeptid mit mindestens einem Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung als Antigen mit einem zu Antikörper-Bildung befähigten System in Kon¬ takt gebracht und die gebildeten Antikörper gewonnen werden.
Die Erfindung betrifft auch die mittels der vorgenannten Verfahren hergestellten spezifischen Antikörper beziehungsweise spezifischen Fragmente davon, welche ihr Antigen spezifisch erkennen und bin¬ den, insbesondere auch zur Diagnose, Prophylaxe oder Therapie von Krankheiten, insbesondere Proteinaggregationskrankheiten, ins¬ besondere Diabetes und/oder Alzheimer-Erkrankung. Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung der vorgenannten Antikörper o- der spezifischen Fragmente davon zur Herstellung eines Diagnose¬ mittels oder Arzneimittels, insbesondere zur Diagnose, Prophylaxe oder Therapie von Diabetes und/oder Alzheimer-Erkrankung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorlie- gende Erfindung, wie bereits erläutert, ein Arzneimittel, enthaltend als Wirkstoff mindestens ein Peptidanalogon und/oder einen Anti¬ körper der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise in prophylaktisch oder therapeutisch wirksamer Menge, vorzugsweise zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass dieses Arzneimittel zusätzlich gegebenenfalls, falls erforderlich, Trennmittel, Gleitmittel, Lösungsmittel, Dispersionsmittel, Beschich- tungen, antibakterielle oder antifungizide Agentien, Konservierungs¬ stoffe, Farbstoffe, Emulgatoren, Geschmacksstoffe oder weitere üb¬ liche Formulierungshilfsstoffe enthält. Es kan n vorgesehen sein, wei¬ tere Substanzen in der pharmazeutischen Zusammensetzung einzu- setzen, die zum Beispiel dem Transport im Zielorganismus, bei¬ spielsweise durch die Blut-Him-Schranke, dienen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Arzneimittel als Depot-Arzneimittel ausgeführt ist, das heißt eine langsame Freisetzung des Wirkstoffs, das heißt des vorliegenden Peptidanalogons ermöglicht, beispielsweise eine sogenannte "slow release'-Matrix enthält oder wobei das Arzneimittel mit einer sich im Patienten langsam auflösenden Drageedecke umhüllt ist.
In besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Arzneimittel der vorgenannten Art als Kombinationsarzneimittel aus- geführt ist, das heißt in der gleichen Formu lierung oder in der glei¬ chen Arzneimittelpackung zusätzlich Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide enthält. Die Erfindung betrifft daher auch einen Arznei¬ mittelkit, enthaltend a) eine Arzneimittelformulierung enthaltend we¬ nigstens eines der vorgenannten Peptidanaloga und/oder einen An- tikörper dagegen sowie b) eine Arzneimittelformulierung enthaltend Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide, jeweils gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Trägern und sonstigen Formulierungshilfsstoffen, wobei die Wirkstoffe Peptidanalogon und Insulin und/oder Pramlintide und/oder IAPP in einer prophylaktisch oder therapeutisch wirksamen Menge vorhanden sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sieht die Erfindung vor, dass das Arzneimittel in Tablettenform, als Aerosol oder als Lö¬ sung, insbesondere Injektionslösung, vorliegt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptidanalogons oder eines vorgenannten Antikörpers zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder Therapie von Proteinaggregationskrankheiten, insbesondere Diabetes, vorzugsweise Diabetes vom Typ I oder Dia¬ betes vom Typ II.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemä¬ ßen Peptidanalogons oder eines vorgenannten Antikörpers zusam- men mit Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide zur Herstellung eines Kombinationsarzneimittelkits, zum Beispiel einer gemef nsa- men Formulierung oder eines Arzneimittelkits zur gleichzeitigen oder zeitlich gestaffelten Verabreichung mit zwei voneinander getrennten Formulierungen der Wirkstoffe Peptidanalogon und/oder Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide zur Prophylaxe oder Thenapie von Diabetes, zum Beispiel von Typ 1 oder Typ 2.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Verwendung eines erfindungsgemäßen Pep¬ tidanalogons, gegebenenfalls zusammen mit Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophy¬ laxe oder Therapie von Diabetes, zum Beispiel von Typ 1 oder Typ 2, wobei das erfindungsgemäße Peptidanalogon, insbesondere das Peptidanalogon, welches 1 bis 37 Aminosäuren des natürlichen IAPP oder die Aminosäuresequenz des Derivats davon aufweist, als Rezeptoragonist zur lAPP-Rezeptor gesteuerten Behandlung von Diabetes, insbesondere zur Aktivierung des natürlichen IAPP- Rezeptors, dient. Die erfindungsgemäße Verwendung sieht daher vor, dass im Rahmen dieser Verwendung das Peptidanalogon der vorgenannten Art an einen natürlichen lAPP-Rezeptor in vivo bindet und diesen aktiviert, sodass auf diese Art und Weise der Zucker¬ stoffwechsel reguliert werden kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine erfindungs¬ gemäße Verwendung vorgesehen, wobei demgemäß ein Peptidana¬ logon der vorliegenden Erfindung, insbesondere ein verkürztes, ins¬ besondere N-terminal verkürztes, Peptidanalogon, vorzugsweise ein Peptidanalogon, welches mindestens 8 bis 37 oder mindestens 19 bis 37 und höchstens 2 bis 37 Aminosäuren des natürlichen huma¬ nen IAPP aufweist oder ein vorgenanntes Derivat davon ist, zur Her¬ stellung eines Arzneimittels, gegebenenfalls zusammen mit Insulin, und/oder IAPP und/oder Pramlintide, zur Therapie von Diabetes vor¬ gesehen ist, wobei das Peptidanalogon als Rezeptorantagonist zur lAPP-Rezeptor-gesteuerten Behandlung von Diabetes verwendet wird, das heißt an natürlichen lAPP-Rezeptor in vivo bindet und die¬ sen hemmt, sodass auf diese Art und Weise der Zuckerstoffwechsel und die anderen physiologischen Funktionen von IAPP reguliert wer¬ den können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass alle erfindungsgemäßen Peptidanaloga oder Antikörper dagegen als Inhibitoren der lAPP-Aggregation, insbesondere als Inhibitoren der lAPP-Amyloidplaquebildung verwendet werden. Die Erfindung sieht auch vor, dass die erfindungsgemäßen Peptidanaloga oder Antikör¬ per dagegen zur Reduktion oder Inhibition der Cytotoxizität von IAPP eingesetzt werden, insbesondere zur Herstellung eines entspre¬ chenden Arzneimittels. In einer weiteren bevorzugten Ausführungs- form ist vorgesehen, dass die erfindungsgemäßen Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung oder ein Antikörper der vorliegenden Er¬ findung zur Herstellung eines Arzneimittels zur gleichzeiti gen a) Re¬ duktion oder Inhibition der lAPP-Aggregation beziehungsweise der Bildung von Amyloidplaques und b) zur Regulation des Züuckerstoff- wechseis, sei es als Rezeptoragonist oder als Rezepto rantag onist verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptidanalogs oder eines erfϊndungsge- mäßen Antikörpers zur Herstellung eines Arzneimittels vorgesehen, wobei das Peptidanalogon oder der Antikörper zur gleichzeitigen a) Reduktion oder Inhibition der Zytotoxizität von IAPP beziehungswei¬ se dessen Aggregaten und b) zur Regulation des Zucke rstoffwech- sels, sei es als Rezeptoragonist oder als Rezeptorantagonist, dient.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Peptidanalogon der vorgenannten Art und/oder einen Antikörper dagegen, wobei dieses oder dieser zur Herstellung eines Arzneimit¬ tels zur Prophylaxe oder Therapie der Alzheimer-Erkrankung oder anderer Proteinaggregationskrankheiten wie Parkinson's- oder Hun- tington's-Krankheit oder Prionenkrankheit dient und wobei das Pep- tidanalogon und/oder der Antikörper in einer therapeutisch oder pro¬ phylaktisch wirksamen Menge eingesetzt wird, insbesondere wobei das Peptidanaloga oder der Antikörper dagegen die Aggregatbildung oder Amyloidplaquebildung des ß -Amyloidpeptids reduziert oder in¬ hibiert oder dessen Cytotoxizität reduziert oder inhibiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorlie¬ gende Erfindung ein Peptidanalogon der vorliegenden Art oder eines Antikörpers dagegen zur Herstellung eines Arzneimittels zur gleich¬ zeitigen Prophylaxe oder Therapie a) der Alzheimer-Erkrankung oder anderer Proteinaggregationskrankheiten wie Prionen-Krankheit, Par- kinson's-Krankheit oder Huntington's-Krankheit und b) von Diabetes, insbesondere Diabetes Typ I oder Diabetes Typ II.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Arzneimittel zur Prophylaxe oder Behandlung der Alzheimer- Erkrankung oder anderer Proteinaggregationskrankheiten wie Par- kinson's-Krankheit, Prionen-Krankheit oder Huntington's-Krankheit, insbesondere zur gleichzeitigen Behandlung a) der Alzheimer- Erkrankung oder anderer Proteinaggregationskrankheiten wie Prio¬ nen-Krankheit, Parkinson's-Krankheit oder Huntington's-Krankheit und b) von Diabetes, als Kombinationsarzneimittel mit Insulin, Pram- lintide oder IAPP ausgeführt ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft diese ein Peptidanalogon oder einen Antikörper der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Diagnosemittels zur Diagnose der Alzheimer-Erkrankung oder anderer Proteinaggregati¬ onskrankheiten, zum Beispiel Prionen-Krankheit, Parkinson's- und/oder Huntington's-Krankheit.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft diese ein Peptidanalogon der vorliegenden Erfin¬ dung oder einen Antikörper der vorliegenden Erfindung zur Herstel- lung eines Diagnosemittels zur Diagnose von Proteinaggregati- onskrankheiten, insbesondere Diabetes.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der vorliegenden Peptid- analoga für Forschungszwecke.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorlie¬ gende Erfindu ng ein Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung als verbessert handhabbares Immunogen für die Herstellung von Anti¬ körpern, insbesondere monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern für diagnostische, therapeutische und Forschungszwecke.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von IAPP oder dessen Aggregaten, wobei ein mit einem Detektionsmar- ker versehenes Peptidanalogon der vorliegenden Erfindung oder ein mit einem Detektionsmarker versehener Antikörper der vorliegenden Erfindung als Sonde mit einer zu untersuchenden Probe in vivo, das heißt in einem menschlichen oder tierischen Organismus, oder in vitro in Kontakt gebracht und eine Bindung des Peptidanalogons o- der Antikörpers mit gegebenenfalls vorhandenen IAPP oder dessen Oligomeren oder Aggregaten nachgewiesen wird.
Es gibt Hinweise, dass lösliche Oligomere aus verschiedenen amy- loidogenen Polypeptiden beziehungsweise Proteinen wie das ß- Amyloidpeptid , das Prion-Protein, Polyglutamin (Huntington), das α - Synuclein (Parkinson's-Krankheit) und andere eine ähnliche Raum¬ struktur aufweisen (Kayed et al., Science (2003) 300, 486-489). Kürzlich konnten Kayed et al. (a.a.O.) zeigen, dass ein Antikörper, welcher gegen ein Modell der löslichen oligomeren Struktur des ß - Amyloidpeptids (Alzheimer-Krankheit) erzeugt wurde, in der Lage ist, lösliche und toxische Oligomere aus verschiedenen anderen Protei ¬ nen, wie zum Beispiel IAPP, α -Synuclein, Prion-Protein-Fragmente zu erkennen und ihre Zytotoxizität in vitro zu neutralisieren. Die er¬ findungsgemäßen Analoga beziehungsweise die Antikörper dagegen eignen sich daher auch für verschiedene Verfahren zur Veränderung der Aggregation oder zur Detektion von anderen amyloidogenen Po¬ lypeptiden wie ß -Amyloidpeptid, Prion-Protein, Polyglutamin oder α - Synuclein.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Verfolgen und zur Verärt- derung der Aggregation, insbesondere zum qualitativen oder quanti¬ tativen Nachweis, amyloidogener Peptide, Oligomere oder Aggrega¬ te davon, insbesondere lAPP-Peptide, lAPP-Oligomere oder IAPP- Aggregate oder zur Inhibierung der Zytotoxizität von lAPP-Peptidem, Oligomeren oder Aggregaten davon, wobei die Peptidanaloga d&r vorliegenden Erfindung oder Antikörper dagegen in vivo oder in vitro mit den amyloidogenen Peptiden, Oligomeren oder Aggregaten da¬ von in Kontakt gebracht werden und das Aggregationsverhalten der amyloidogenen Peptide, Oligomere oder Aggregate davon geändert wird, insbesondere die Aggregation reduziert oder inhibiert wird und/oder dadurch verfolgt werden kann (Diagnose).
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Verfolgen und zur Verän¬ derung der Aggregation, insbesondere zum qualitativen oder quanti¬ tativen Nachweis, amyloidogener Peptide, Oligomere oder Aggrega¬ te davon, insbesondere ß -Amyloidpeptid, Prion-Protein, α -Synuclein oder Polyglutamin, Oligomere davon oder Aggregate davon, oder zur Inhibierung der Zytotoxizität von ß -Amyloidpeptid, Prion-Proteiπs , α -Synuclein oder Polyglutamin oder Oligomere oder Aggregate dar von, wobei die Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung oder Antϊ- körper dagegen in vivo oder in vitro mit den amyloidogenen Pepti¬ den, Oligomeren oder Aggregaten davon in Kontakt gebracht wer¬ den und das Aggregationsverhalten der amyloidogenen Peptide, Oligomere oder Aggregate davon geändert wird, insbesondere die Aggregation reduziert oder inhibiert wird und/oder dadurch verfolgt werden kann (Diagnose).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorlie¬ gende Erfindung ein Verfahren zur Modifizierung, insbesondere Ver¬ hinderung, der Aggregatbildung von in einer Flüssigkeit vorhande- nem IAPP, Polyglutamin, α-Synuclein, Prionprotein oder ß - Amyloidpeptid, wobei ein Peptidanalogon der vorliegenden Erfin¬ dung mit der Flüssigkeit in Kontakt gebracht, inkubiert wird und das Aggregationsverhalten des IAPP1 Prionproteins, a -Synucleins, PoIy- glutamins oder des ß -Amyloidpeptids modifiziert wird.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Sequenzprotokoll:
Die SEQ ID Nummern zeigen:
SEQ ID Nr. 1 bis 17 stellen bevorzugte Ausführungsformen der vor¬ liegenden Peptidanaloga dar. Jede einzelne der SEQ ID Nummern stellt mehrere verschiedene Peptidanaloga der vorliegenden Erfin¬ dung dar, die sich bei gleichem N-Methylierungsmuster hinsichtlich ihrer Primärstruktur unterscheiden. Jede einzelne SECi ID Nummer stellt daher ein bestimmtes N-Methylierungsmuster dar, wobei dieses bei verschiedenen Primärstrukturen, das heißt bei verschiedenen Aminosäuresäurensequenzen auftreten kann, zum Beispiel der na¬ türlichen Wildtyp-Aminosäuresequenz des humanen IAPP oder ei¬ nem vorstehend definierten Derivat davon, das heißt einem Derivat gemäß dem das Lysin an Position 1 und/oder die beiden Cystein- reste an Position 2 und 7 durch Ornithin (als Ersatz für Lysin) an Po¬ sition 1 und/oder Asparaginsäure und Dap (als Ersatz für die beiden Cysteinreste) verwendet werden. Jede einzelne SEQ ID Nummer steht daher für einerseits die Primärstruktur des natürlichen Wildtyp- IAPP aus dem Menschen mit einem bestimmten N- Methylierungsmuster und außerdem für die vorgenannten Derivate mit dem gleichen N-Methylierungsmuster davon. Die erfindungsge¬ mäßen Peptidanaloga, die Cys an Position 2 und 7 aufweisen, sind vorzugsweise oxidiert, dass heisst die Disulfidbrücke zwischen den Thiolresten von Cys 2 und Cys 7 ist geschlossen.
Ebenso sind die erfindungsgemäßen Peptidanaloga, die an Position 2 und 7 Dap und Asp beziehungsweise Asp und Dap aufweisen, vorzugsweise verbrückt, dass heisst die Seitenketten von Asp und Dap sind kovalent miteinander über eine Lactambrücke verbunden. Bei allen Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung liegt in einer Ausführungsform der Erfindung der C-Terminus in einer bevorzugten Ausführungsform als Amid vor.
Aus Beispiel 8 geht eine Zuordnung der SEQ ID Nummern zu den in den folgenden Beispielen verwendeten Abkürzungen der bevorzug- ten Peptidanaloga hervor.
SEQ ID Nr. 18 stellt die Aminosäuresequenz des humanen, natürli¬ chen IAPP dar. Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und der dazuge¬ hörigen Figuren näher erläutert. Die Figuren zeigen:
Figur 1 Absorptionen von Sedirnentationsassays von IAPP
(bei 10 und 100 μM) und der Analoga IAPP-GI, IAPP-AL, IAPP-FA, IAPP-IL. Die Absorption bei
570 nm entspricht der Menge des Proteins (im Pel¬ let beziehungsweise im Überstand).
Figur 2 Ergebnisse eines Fibrilibildungstests: Das Fibrillen- bildungspotential von 52.5 μM IAPP versus 62.5 μM IAPP-GI, IAPP-AL, und IAPP-IL wird durch den
ThT-Bindungsassay quantifiziert.
Figur 3 Ergebnisse einer EM-U ntersuchung der amyloido- genen Potentiale von IAwPP und der Analoga IAPP-
Gl, IAPP-AL und IAPP-FA. Die Inkubationen der Peptide (5 μM, 20 h) wurden durch einen EM- basierten-Aggregationstest untersucht. Von links nach rechts sind Aliquots der folgenden Inkubatio¬ nen gezeigt: IAPP allein, IAPP-GI, IAPP-FA, und IAPP-AL (Balken: 100 nrn) .
Figur 4 Ergebnisse von MTT-Reduktionsassays zur Ermitt¬ lung der potentiellen zytotoxischen Effekte der Ana¬ loga IAPP-GI, IAPP-AL, IAPP-FA im Vergleich zu IAPP.
Figur 5 Ergebnisse eines Fibril len-Bindungstests: Der Ef- fekt von IAPP-GI, IAPP-AL und IAPP-FA (1/1 Mi¬ schungen) auf das Fibrillenbildungspotential von IAPP (6.25 μM) wird durch den ThT-Bindungsassay quantifiziert.
Figur 6 Ergebnisse eines Aggregationstests: Der Effekt von
IAPP-GI1 IAPP-AL und IAPP-FA (1/1 Mischungen) auf das Fibrillenbildungspotential von IAPP (5 μM) wird durch einen EM-basierten Aggregationsassay untersucht. Von links nach rechts sind Aliquots der folgenden Inkubationen gezeigt (20h): IAPP allein, IAPP gemischt mit IAPP-GI, IAPP gemischt mit IAPP-FA, und IAPP gemischt mit IAPP-AL.
Figur 7A Ergebnisse von MTT-Reduktionsassays zur Ermitt¬ lung der Wirkung der Analoga IAPP-GI, IAPP-AL und IAPP-FA auf die pankreatische Zytotoxizität von IAPP (RIN5fm Zelllinie).
Figur 7B Die Ermittlung der lAPP-induzierten Adoptose auf
RINδfm Zellen allein und in der Anwesenheit von IAPP-GI (1/1). Auch IAPP-GI allein wurde unter den gleichen Bedingungen getestet und es wurde keine Zytotoxizität gefunden. Die entsprechenden Mittel- werte (±SEM) aus mindestens 2 unabhängigen As- says sind gezeigt.
Figur 8A Ergebnisse von (humanen) lAPP-Rezeptor-
Bindungsassays mit IAPP und den Analoga IAPP-
Gl, IAPP-AL und IAPP-FA an MCF-7 Zellen. Es wird die spezifische Bindung des Radioligaπds
[125l]-rlAPP versus Ligandenkonzentration geplot- tet. Figur 8B Ergebnisse von Rezeptoraktivierungsassays mit
IAPP und den Analoga IAPP-GI, IAPP-AL, und
IAPP-FA an MCF-7 Zellen. Die Adenylatcyclaseak- tivierung (% vom Maximum) wird durch die Quanti- fizierung von cAMP mittels des cAMP Biotrak
ELISA (Amersham) bestimmt. Als maximale AC- Aktivierung wurde diejenige, welche durch 1 μM IAPP erreicht wurde, angenommen.
Figur 9 Ergebnisse eines ELISAs: Die Zeitabhängigkeit des Rezeptoraktivierungspotentials an MGF-7 Zellen einer 25O μM IAPP Lösung (in 10 mM Natrium¬ phosphat, pH 7,4), welche 4 Tage bei RT (Raum¬ temperatur) stehen bleibt, wird mit demjenigen der Analoga IAPP-GI und IAPP-LA und Mischungen der Analoga mit IAPP verglichen. Die Adenylatcyc- laseaktivierung (% vom Maximum) wird durch die Quantifizierung von cAMP mittels des cAMP Biotrak ELISA (Amersham) bestimmt. Als maximale AC- Aktivierung wurde diejenige, welche durch 1 μM IAPP erreicht wurde, angenommen.
Figur 10 Ergebnisse eines MTT-Reduktionstests zur Ermitt¬ lung der Wirkung des Analogs IAPP-GI auf die Zy¬ totoxizität von Aß . (PC.12 Zelllinie). Die Ergebnisse sind Mittelwerte (± SEM) aus einem repräsentativen Assay (triplikate Bestimmung). Beispiel 1
Charakterisierung der Löslichkeitseigenschaften der erfin¬ dungsgemäßen Peptidanaloga und Vergleich zu IAPP
Die Löslichkeitseigenschaften der erfindungsgemäßen Peptϊdanalo- ga verglichen zu natürlichen IAPP wurden mittels Sedimentations- tests, elektronenmikroskopischen Untersuchungen und durch den Thioflavin-T Bindungstests untersucht.
a) Der Sedimentationstests wurde verwendet, um die Löslichkeit der Analoga im Vergleich zu IAPP zu überprüfen. Dabei wurde die Menge an präzipitiertem oder löslichem Peptid in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt. In einem typischen Experiment wird zunächst eine Peptidlösung einer bestimmten Konzentration (1 , 10 oder 1 00 μ M) in 10 mM Natriumphosphat Puffer, pH 7.4 hergestellt. Bei bestimm¬ ten Zeitpunkten werden Aliquots dieser Lösung abzentrifugiert (20200 g, 20 min) und ausgefallenes Protein wird im Pellet und im Überstand mittels des BCA-Proteinbestimmungsassays (BCA steht für Bicinchonic Acid) quantifiziert. In Figur 1 sind einige Ergebnisse aus diesem Test dargestellt. Daraus ist zu entnehmen, dass die Ag¬ gregation von IAPP bei einer Konzentration von 10 μM gleich nach der Herstellung der Lösung anfängt. Nach 20 h ist IAPP vollständig ausgefallen; dementgegen bleiben die N-methylierten Analoga IAPP- LA, IAPP-GI, und IAPP-AF löslich über 14 Tage sogar bei einer Kon¬ zentration von 100 μM. IAPP ist komplett ausgefallen nach nur 2 h unter letzteren Bedingungen (100 μM).
b) Amyloidfibrillen verschiedener Proteinspezies bind en den Farbstoff ThT und führen zu einer Zunahme seines Fluoreszenz- Emissionsmaximums. Die ThT-Bindung ist deswegen ein spezifi- scher Test, welcher in breiter Anwendung zur Quantifizierung der Amyloidfibrillen verwendet wird. Dieser Test wurde verwendet, um die Amyloidbildungspotentiale der Analoga im Vergleich zu IAPP zu bestimmen. Für diesen Test wurden die Analoga und IAPP in einer Konzentration von 62.5 μm in Assaypuffer inkubiert (2% HFIP, 10 mM Tris, pH 7.4). Zu bestimmten Zeitpunkten wurden 40 ml Aliquots aus diesen Inkubationen mit 160 ml einer 5 μM ThT-Lösung (in 0.1 M Glycin-NaOH Puffer, pH 8.5) versetzt, gemischt und nach Anre¬ gung bei 450 nm wurde die Emission der Lösung bei 485 nm be- stimmt.
Es zeigte sich dabei, dass IAPP schon bei einer Konzentration von 625 nM Fibrillen bildet. Dementgegen fibrillieren die Analoga auch noch nicht bei einer Konzentration von 62.5 μM (Figur 2).
c) Für EM-Untersuchungen wurden 5 μM Lösungen der Analoga versus IAPP (in 10 mM Natriumphosphat Puffer, pH 7.4, enthaltend \% HFIP) etwa 20 h bei RT inkubiert. Danach wurden 10 μ l der Lö¬ sungen auf EM-Plättchen aufgetragen und nach Färbung mit 1 % Uranylacetat wie beschrieben (Kayed, J. Mol. Biol. (1999) 287, 781 - 796) auf die Anwesenheit von Fibrillen mittels EM untersucht. Es stellte sich heraus, das im Gegensatz zu der IAPP Lösung, welche hauptsächlich aus IAPP Amyloidfibrillen besteht, die Lösungen der lAPP-Analoga keine Fibrillen enthalten (Figur 3).
Zusammen mit den ThT-Bindungsassays- und den Sedimentation- sassay-Ergebnissen zeigen diese Daten, dass die Analoga nicht arnyloidogen und mindestens 100-fach löslicher als IAPP sind. Beispiel 2
Untersuchung der Cytotoxizität der Analoga im Vergleich zum IAPP
lAPP-Amyloidaggregate sind zytotoxisch für pankreatische ß -Zellen und für eine Reihe anderer Zellen. Man geht davon aus, dass der zytotoxische Effekt von IAPP und anderen Amyloidpolypeptiden mit ihrer Aggregation zum Amyloid einhergeht. Daraus folgt die Annah¬ me, dass, da die Analoga nicht amyloidogen sind, sie auch nicht zy¬ totoxisch sein sollten. Um diese Annahme zu untersuchen, wurde der MTT-Zytotoxizitätstest verwendet, welcher auf der Reduktion des Farbstoffs 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT) durch „gesunde" Zellen mit intaktem Redoxpotential beruht (Shearman et al., J. Neurochem. (1995) 65, 218-227; Shearman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1994) 91 , 1470-74). Letzteres ist ein früher Indikator von Zellviabilität oder Schädigung. Es hat sich ge¬ zeigt, dass der zytotoxische Effekt von Amyloidaggregaten, inkl. IAPP, durch diesen Test quantifiziert werden kann. Die Zelltoxizität von IAPP und der Analoga wurde anhand der pankreatischen Zellli¬ nie RINδfm wie beschrieben untersucht (Kapurniotu et al., J. Mol. Biol. (2002) 315, 339-350) (Figur 4). In einem typischen MTT-Test, werden Inkubationen der Peptide angesetzt (5 μM in 10 mM Natri¬ umphosphat-Puffer mit oder ohne 1 % HFIP, pH 7.4, ) und nach 20 h bei RT auf die Zellen (welche 20 h vorher in einer Zelldichte von 5x105 Zellen/ml ausgesät wurden) gegeben. Nach etwa 20 h Inkuba- tion mit den Zellen wird MTT dazu gegeben, und nach 2-stündiger Wirkung wird das MTT-Reduktionspotential der Zellen spektropho- tometrisch bestimmt. Die Ergebnisse sind als % Zellvitalität, welches dem Prozent der Reduktion von MTT durch die Kontrollzellen (100% Reduktion von MTT entspricht 100% Vitalität) entspricht, wiederge¬ geben und entsprechen Mittelwerten (dt SEM) aus mindestens 2 un¬ abhängigen Tests.
Wie aus Figur 4 zu entnehmen ist, die Analoga IAPP-AL, IAPP-GI, und IAPP-FA im Gegensatz zum IAPP keine Zytotoxizität auf.
Beispiel 3
Wirkung der Analoga als Inhibitoren oder Modulatoren der Amy- loidbildungsfähigkeit von IAPP
Der Effekt der Analoga auf das Amyloidbildungspotential von IAPP wurde durch EM (Elektronenmikroskop) und den ThT-Bindungstest untersucht.
In einem typischen Th-T Bindungstest Ansatz wurden Inkubationen angesetzt, welche 6.25 μM IAPP in Assaypuffer (10 mM Tris, pH 7.4 und 2% HFIP) allein oder in einer 1/1 IVlischung mit einem der Ana¬ loga enthielten. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden Aliquots der Lö¬ sungen wie oben beschrieben mit ThT versetzt und auf ihre Fluores¬ zenzemission überprüft. Wie aus der Figur 5 zu entnehmen, weisen die Analoga einen stark inhibitorischen Effekt auf das Amyloidbil- dungpotential von IAPP auf.
In einem typischen durch EM verfolgten Aggregationstest, wurde IAPP (5 μM) allein oder in Anwesenheit eines der Analoga (in einem Verhältniss von 1/1 inkubiert (in 10 ml\/l Natriumphosphat-Puffer, pH 7.4, enthaltend 1 % HFIP)). Nach 20 h wurden 10 μl der Lösung auf ein EM-Plättchen aufgetragen und nach Färbung mit 1% Uranylace- tat wie beschrieben (Kayed, J. Mol. Biol. (1999) 287, 7S1-96) auf Anwesenheit von Fibrillen mittels EM untersucht. Es stellte sich her¬ aus, dass im Gegensatz zur lAPP-Lösung, welche hauptsächlich aus lAPP-Amyloidfibrillen bestand, in den lAPP-Analoga-Mischungen die Fibrillenbildung komplett unterdrückt war (Figur 6).
Beispiel 4
Wirkung der Analoga als Inhibitoren der Zelltoxizität von IAPP
Die Wirkung der Analoga IAPP-GI, IAPP-AL und IAPP-FA auf die ß - Zell-Toxizität von lAPP-Amyloidaggregaten wurde mittels zweier ver¬ schiedener Tests untersucht. Zunächst wurde der MTT- Zellviabilitätstest verwendet (s. oben). Der Test zeigte, dass alle Analoga in einem lAPP/Peptidanalogon-Mischverhältniss von 1/1 die Zelltoxizität von IAPP signifikant hemmen können (Figur 7A). Dabei erwies sich IAPP-GI als der potenteste Inhibitor der IAPP- Zytotoxizität.
Beim zweiten Test wurde der Effekt von IAPP-GI auf den durch lAPP-Amyloid hervorgerufenen apopotischen ß -Zelltod untersucht
(es ist bekannt, dass der lAPP-vermittelte Zelltod hauptsächlich durch Apoptose hervorgerufen wird). Dazu wurden Lös ungen von
IAPP allein und in der Anwesenheit von IAPP-GI (1/1) (5 μM in 10 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7.4) hergestellt und mit den auspla- tierten Zellen bei einer finalen Konzentration von 500 nlvi 20 h lang inkubiert. Danach wurde die Apoptose mittels eines kommerziellen Apoptose ELISAs (Cell Death Detectioπ Kit von Roche) quantifiziert. Durch diesen ELISA-Assay werden die zytosolischen Nucleosomen, welche ein früher und spezifischer Nachweis von apoptotischem Zelltod sind, quantifiziert. Auch dieser Test zeigt (Figur 7B), dass IAPP-GI in der Lage ist, pankreatische ß -Zellen vor dem IAPP- induzierten apoptotischen Zelltod zu schützen.
Beispiel 5
Wirkung der Analoga als IAPP Rezeptoragonisten
Um die Wirkung der Analoga als (humane) lAPP-Rezeptoragonisten zu testen, wurde zunächst ihre Rezeptorbindungsaffinität an Zellen, welche diesen Rezeptor exprimieren, getestet. Solche Zellen sind die MCF-7 Zelllinie (Zimmermann, et al. J. Endocrinology (1997), 155, 423-31) welche aus humanen Brustkrebszellen stammt. Spezi- fische lAPP-Rezeptoren werde n in der MCF-7 Zelllinie exprimiert und diese Zelllinie findet deswegen eine breite Anwendung für das Tes¬ ten von lAPP-Agonisten/Antagonisten.
Der Rezeptorbindungstest wurde analog zu demjenigen, welcher bei Zimmermann, et al. J. Endocrinology (1997) 155, 423-31 beschrie- ben ist, durchgeführt. Dabei wurde die Bindung der mit 125I- markierten Ratten-IAPP (rlAP P)-Sequenz-, welche der stärkste bis heute bekannte Rezeptorligand ist, in Anwesenheit von IAPP oder der Peptidanaloga IAPP-GI, IAPP-AL oder IAPP-FA quantitativ be¬ stimmt. Mischungen des radioaktiv markierten Liganden rIAPP (-80 pM) mit den entsprechenden Peptiden in verschiedenen Endkon¬ zentrationen (Figur 8A) wurden für 1 h mit MCF-7 Zellen bei RT in- kubiert. Danach wurden die Zellen mit Testpuffer (der Testpuffer be¬ stand aus einer 1/1 Mischung von Dulbeccos MOD Eagle und F12 Nutrient Mixture (HAM) enthaltend 0.1% BSA) gewaschen, mit NaOH (0.5 M) und anschließend mit der Szintillationsflüssigkeit versetzt und die membrangebundene Radiaktivität wurde mittels eines Szin- tillationszählers bestimmt. Wie aus Figur 8A zu entnehmen, sind alle drei hier getesteten Analoga in der Lage, den lAPP-Rezeptor zu bin¬ den. Dabei erweist sich IAPP-AL als der Agonist mit der höchsten Rezeptoraffinität wobei IAPP-GI der schwächste ist (Figur 8A).
Um das agonistische Potential der Analoga zu testen, wurde an- schliessend ihr Adenylatzyklaseaktivierungspotential (AC-Akti- vierung) getestet. Es hat sich gezeigt, dass einige der rezeptorver¬ mittelten biologischen Effekte von IAPP durch Adenylatzyklaseakti- vierung vermittelt werden. Die AC-Aktivierung wird durch durch die Quantifizierung von cAMP, welches nach Behandlung der Zellen (15 min, 37 0C) mit verschiedenen Konzentrationen von IAPP oder den Analoga produziert wird, mittels des cAMP Biotrak ELISA (Amers- ham) bestimmt. Der Test wird an MCF-7 Zellen durchgeführt in Ana¬ logie zu dem Protokoll von in Zimmermann, et al. J. Endocrinology (1997) (a.a.O.). Wie aus Figur 8B zu entnehmen, sind alle geteste¬ ten Analoga (IAPP-GI, IAPP-AL, IAPP-FA) volle lAPP-Agonisten. Dabei erweist sich IAPP-AL als der potenteste Agonist und ist ein besserer AC-Aktivierungsligand als IAPP. IAPP-AF hat das gleiche AC-Aktivierungspotential wie IAPP und IAPP-GI ist ein schwächerer Agonist als IAPP.
Die Ergebnisse des AC-Aktivierungstests sind somit im Einklang zu den Ergebnissen der Rezeptorbindungstests. Beispiel 6
Vergleich der Stabilität in Lösung (Konzentration 1 mg/ml bei pH 7.4) und des Erhalts ihrer Bioaktivität (hormonellen Wirkung) verglichen zum IAPP: Potentielle Verwendung als Ersatz für IAPP in der Therapie
Um die potentielle Anwendbarkeit der Analoga als lAPP-oder Pram- lintide-Ersatz in der Therapie von Diabetes und/oder anderen Krank¬ heiten wurde die Stabilität Ihrer Lösungen und somit Ihrer hormonel¬ ler Wirkung im Vergleich zum leicht aggregierendem IAPP unter- sucht. In einem typischen Ansatz werden wässrige Lösungen von IAPP, IAPP-AL, IAPP-GI, oder 1/1 Mischungen der Analoga mit IAPP ( 250 μM oder 1 mg/ml ) in 10 μm Natriumphosphat, pH 7.4, bei RT eingesetzt und 4 tagelang inkubiert. Das AC- Aktivierungspotential dieser Lösungen wird an verschiedenen Zeit- punkten z.B. Zeit 0, 48 h und 96 h mittels des AC- Aktivierungsassays ober beschrieben bestimmt (Endkonzentration auf Zellen 1 μM, entsprechend der max. Aktivierung) (Figur 9).
Diese Experimente zeigen, dass IAPP, wenn es unter obigen Bedin¬ gungen gelagert wird, mehr als die Hälfte seiner ursprünglichen hor- monellen Wirkung verlieren kann (wahrscheinlich wegen seiner Ag¬ gregation). Im Gegensatz dazu ist die hormonelle Wirkung der Ana¬ loga und der Mischungen (1/1) lAPP/Analoga Mischungen voll er¬ halten. Die gewählte Konzentration von 1 mg/ml entspricht der Kon¬ zentration einer Formulierung von Symlin (Pramlintide Acetate) wel- ches von der Fa. Amylin Pharmaceuticals für die Therapie von Dia¬ betes in klinischen Studien eingesetzt wird. Beispiel 7
Inhibitorischer Effekt der Analoga auf die Zytotoxizität des Alz¬ heimer Peptides ß -Amyloidpeptid (A-ß ): Potentielle Verwendung für die Therapie der Alzheimer Krankheit (AD)
Es wurde der Effekt vom IAPP-GI (Mischung 1/1) auf die Zytotoxizi¬ tät vom A-ß mittels des MTT-Tests untersucht. Dafür wurde A-ß (100 μM) allein oder zusammen mit IAPP-GI 4 Tage lang in 10 mM Tris Puffer, pH 7.4, enthaltend 150 mM NaCI und 2.2% HFIP bei RT inkubiert. Die Lösungen wurden danach nach Verdünnung auf PC-12 und HTB-14 Zellen zugegeben. Beide Zelllinien werden oft für die Untersuchung der inhibitorischen Wirkung von potentiellen A-ß Zyto- toxizitätsinhibitoren verwendet. Es ergab sich an beiden Zelllinien, dass IAPP-GI in der Tat die Zytotoxizität des A-ß -Peptides stark herabsetzen kann (Figur 10). Die Interaktion von A-ß mit IAPP-GI wurde durch weitere Bindungstests bestätigt. Somit sind IAPP-GI und andere N-methylierte lAPP-Analoga besonders geeignet für die Therapie der Alzheimer-Krankheit (AD).
Beispiel 8
Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung
SEQ Abkür- Primärstruktur Name ID Nr. zung ■ i nur KCNTATCATQRI-ANFLVHSSNNF(N-Me)GA(N-Me)ILSSTNVGSNTY [(N-Me)G^1(N-Me)IH-IAPP g KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFG(N-Me)AI(N-Me)LSSTNVGSNTY [(N-Me)AH(N-Me)LH-IAPP
KCNTATCATQRLANFLVHSSNN(N-Me)FG(N-Me)AILSSTNVGSNTY [(N-Me)F^1(N-Me)AH-IAPP
3 KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGA(N-Me)I(N-Me)LSSTNVGSNTY [(N-Me)l ,(N-Me)LH-IAPP
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFG(N-Me)A(N-Me)I(N-Me)LSSTNVGSNTY [(N-Me)AH (N-Me) i , (N- Me)L27-IAPP
IAPP-GA ' KCNTATCATQRLANFLVHSSNNF(N-Me)G(N-Me)AILSSTNVGSNTY [(N-Me)G ,(N-Me)AH-IAPP
IAPP-AI KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFG(N-Me)A(N-Me)ILSSTNVGSNTY [(N-Me)A ,(N-Me)IH-IAPP
IAPP-NG .KCNTATCATQRLANFLVHSSN(N-Me)NF(N-Me)GAlLSSTNVGSNTY [(N-Me)N ,(N-Me)GH-IAPP
IAPP-FG KCNTATCATQRLANFLVHSSNN(N-Me)F(N-Me)GAILSSTNVGSNTY [(N-Me)F^(N-Me)G" 1-1 AP P
10 IAPP- KCNTATCATQRLANFLVHSSNNF(N-Me)G(N-Me)A(N-Me)I(N-Me)LSSTNVGSNTY [(N-Me)GH(N-Me)A^1N- GAIL Me)I26JN-Me)L27I-IAPP
1 1 IAPP-F KCNTATCATQRLANFLVHSSNN(N-Me)FGAILSSTNVGSNTY [(N-Me)FH-IAPP
12 IAPP-G KCNTATCATQRLANFLVHSSNNF(N-Me)GAILSSTNVGSNTY [(N-Me)GH-IAPP
13 IAPP-A KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFG(N-Me)AILSSTNVGSNTY [(N-Me)AH-IAPP
14 IAPP-I KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGA(N-Me)ILSSTNVGSNTY [(N-Me)IH-IAPP
15 IAPP-L KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAI(N-Me)LSSTNVGSNTY [(N-Me)LH-IAPP
16 IAPP-SS KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAlL(N-Me)S(N-Me)STNVGSNTY [(N-Me)SH(N-Me)SH-IAPP
17 IAPP-ASS KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFG(N-Me)AIL(N-Me)S(N-Me)STNVGSNTY [(N-Me)A , (N-Me)SH (N- Me)S29I-IAPP
18 IAPP KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY natürliches humanes IAPP
Die erfindungsgemäßen Peptidanaloga wurden durch einfache Che- mosynthese in hoher Reinheit und guter Ausbeute nach gängigen Methoden der Festphasenpeptidsynthese auf RINK-Amid-MBHA- Harz unter Verwendung der Fmoc/tBu Strategie hergestellt (Kazant- zis et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269, 780-791). In einer typischen
Synthese werden Nα -Fmoc-geschützte Aminosäuren (Seitenketten- schutz wie folgt: Lys (Boc), Cys (Tet), Arg (Pmc), Asn (Tet), His (Tet), Ser (tBu), Tyr (tBu), Thr (tBu)) verwendet. N-methylierte Fmoc- Aminosäuren werden auch in dieser Form eingesetzt (zum Beispiel Fmoc-(N-Me) Ne; Fmoc-(N-Me) GIy etc.). Die Kupplungen der Fmoc-
Aminosäuren (AS) werden mit TBTU und DIEA (4-facher molarer Überschuss an AS; 4-facher Überschuss an TBTU; 6-facher Über- schuss an DIEA bezüglich der molaren Menge an C-terminalen AS) in DMF und/oder NMP durchgeführt. Für die Kupplungen der N- methylierten AS oder an N-methylierte AS werden höhere Über¬ schüsse, doppelte bis zu x-fache Kupplungen, Mischungen aus Lö¬ sungsmitteln und längere Kupplungszeiten eingesetzt. Die Abspal¬ tung der Fmoc-Gruppe wird mittels 25% Piperidin in DMF durchge¬ führt. Die Abspaltung der Peptide vom Harz wird durch eine Mi- schung aus TFA/Wasser/Thioanisol/Ethandithiol/Phenol
(83/4,5/4,5/2/6 (v/v/v/v/w)) durchgeführt (Kazantzis et al., Eur. J. Bio¬ chem. (2002) 269, 780-791). Das Harz wird durch Filtration von der Peptidlösung abgetrennt und das Rohprodukt wird nach Eindampfen des Lösungsmittels, Aufnehmen in 10% HAc, Extraktion mit Äther und Lyophilisieren der wässrigen Phase in reduzierter Form gewon¬ nen. Die Schließung der Disulfidbrücke von Cys2 / Cys7 erfolgt in ei- ner O.1 M NH4HC O3 Lösung (1 mg/ml Peptidkonzentration), welche 3M GdnHCI enth ält, und erfordert 2-4 Stunden. Das Rohprodukt wurde nach der Oxidation wieder über Umkehrphasen- Chromatographie auf einer C18-Säule und mittels ACN-haltigem Gradienten hochgereinigt (Kazantis et al., a.a.O.).

Claims

Patentansprüche
1. Peptidanalogon des Islet Amylo id Polypeptids (IAPP) mit der Fähigkeit, an natürlichen lAPP-Rezeptor zu binden, wobei das Pep¬ tidanalogon a) höchstens 38 Aminosäuren aufweist, von denen 37 Aminosäuren die Aminosäuresequenz des natürlichen IAPP in ihrer natürlichen Abfolge aufweisen, b) mindestens die Aminosäuren 19 bis 37 des natürlichen IAPP in ihrer natürlichen Abfolge aufweist, c) mindestens eine seiner Amidbindungen N-methyliert ist, d) wobei optional in der Aminosäuresequenz des natürlichen IAPP Lys (Lysin) an Position 1 ersetzt sein kann durch Orn (Ornithin) und/oder Cys (Cystein) an Position 2 und 7 ersetzt sein kann durch Dap (Diami- nopropionsäure) an Position 2 und Asp (Asparaginsäure) an Position 7 oder Asp an Position 2 und Dap an Position 7, und e) wobei die Peptidanaloga der SEQ ID Nr. 1 bis 5 mit der Aminosäuresequenz des natürlichen humanen IAPP ausgenommen sind.
2. Peptidanalogon des Islet Amyloid Polypeptids (IAPP) als dia¬ gnostisches oder therapeutisches Mittel mit der Fähigkeit, an natürli¬ chen lAPP-Rezeptor zu binden, wobei das Peptidanalogon a) höchstens 38 Aminosäuren aufweist, von denen 37 Aminosäuren die Aminosäuresequenz des natürlichen IAvPP in ihrer natürlichen Abfol¬ ge aufweisen, b) mindestens die Aminosäuren 19 bis 37 des natürli¬ chen IAPP in ihrer natürlichen Abfolge aufweist, c) mindestens eine seiner Amidbindungen N-methyliert ist, d) und wobei optional in der Aminosäuresequenz des natürlichen IA. PP Lys an Position 1 ersetzt sein kann durch Orn und/oder Cys an Position 2 und 7 ersetzt sein kann durch Dap an Position 2 und As p an Position 7 oder Asp an Position 2 und Dap an Position 7.
3. Peptidanalogoπ nach Anspruch 1 oder 2, wobei dieses die vollständige Aminosäuresequenz des natürlichen IAPP aufweist.
4. Peptidanalogen nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei dieses die Aminosäuren 8 bis 37 des natürlichen IAPP aufweist.
5. Peptidanalogon nach Anspruch 3, wobei dieses als Agonist des natürlichen Rezeptors des IAPP wirkt.
6. Peptidanalogon nach Anspruch 4, wobei dieses als Antagonist des natürlichen Rezeptors des IAPP wirkt.
7. Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine, zwei, drei oder vier Amidbindungen des IAPP N- methyliert sind.
8. Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine Amidbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Amidbindungen der α-Am inogruppen, der Aminosäuren an den Positionen 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.
9. Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peptidanalogon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 17.
10. Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peptidanalogon löslich ist.
11. Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peptidanalogon, insbesondere an seiner N-terminalen α- Aminogruppe markiert ist, insbesondere mit einer Acetyfgruppe, ei- nem radioaktiven Marker, einem Enzymmarker, einem Fluoreszenz- marker, einem Lumineszenzrnarker oder einem Spin-Label.
12. Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peptid mit mindestens einer funktionellen Gruppe deriva- tisiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acylgruppe, funktionalisierten Alcylgruppe, aromatische Gruppe, Aminosäure, Glycogruppe und Lipidgruppe.
13. Peptidanalogon nach Anspruch 11 oder 12, wobei der Marker und/oder die funktionelle Gruppe über einen Spacer, insbesondere eine Aminosäure, mit dem Peptidanalogon verbunden ist.
14. Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dieses auf einem Träger immobilisiert ist.
15. Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das IAPP human ist.
16. Verfahren zur Herstellung von spezifisch gegen IAPP oder spezifisch gegen ein Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 gerichteten Antikörpern, wobei mindestens ein Peptidanalo¬ gon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 als Antigen, gegebenenfalls zusammen mit monomerem IAPP oder einem Oligomer davon mit einem zur Antikörper-Bildung befähigten System in Kontakt gebracht und die gebildeten Antikörper gewonnen werden.
17. Verfahren zur Herstellung von spezifisch gegen Mischungen von IAPP oder ß -Amyloidpeptid mit einem Peptidanalogon nach ei¬ nem der Ansprüche 1 bis 15 gerichteten Antikörper, wobei Mischun- gen von IAPP oder ß -Amyloidpeptid, oder einem Oligomer davon jeweils mit einem Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 als Antigen mit einem zu Antikörper-Bildung befähigten System in Kontakt gebracht und die gebildeten Antikörper gewonnen werden.
18. Antikörper, herstellbar nach dem Verfahren nach Anspruch 17, der spezifisch gegen eine Mischung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und IAPP oder spezifisch gegen eine Mischung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und das ß -Amyloidpeptid gerichtet ist und diese spezifisch bindet.
19. Antikörper, herstellbar nach dem Verfahren nach Anspruch 16, der spezifisch gegen ein Peptidanalogon nach einem der An¬ sprüche 1 bis 15 oder spezifisch gegen IAPP oder spezifisch gegen einen lAPP/Peptidanalogonkomplex gerichtet ist und diese spezi¬ fisch bindet.
20. Arzneimittel, enthaltend mindestens ein Peptidanalogon nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 15 und Joder einen Anti¬ körper nach Anspruch 18 oder 19.
21. Kombinationsarzneimittel, enthaltend mindestens ein Peptid¬ analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und/oder einen Anti¬ körper nach einem der Ansprüche 18 oder 19 und Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide.
22. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 20 oder 21 , enthal¬ tend mindestens einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
23. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei das Arzneimittel als Depot-Arzneimittel ausgeführt ist.
24. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 20 bis 23 , wobei das Arzneimittels in Tablettenform, Aerosol oder als Lösung vorliegt.
25. Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder Therapie von Proteinaggregationskrankheiten, insbesondere Diabetes.
26. Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zu¬ sammen mit Insulin und/oder IAPP und/oder Pramlintide zur Herstel- lung eines Kombinationsarzneimittels zur Prophylaxe oder Therapie von Diabetes.
27. Verwendung nach Anspruch 25 oder 26, wobei das Peptid- analogon als Rezeptorantagonist zur lAPP-Rezeptor-gesteuerten Behandlung von Diabetes verwendet wird.
28. Verwendung nach Anspruch 25 oder 26, wobei das Peptid- analogon als Rezeptoragonist zur lAPP-Rezeptor-gesteuerten Be¬ handlung von Diabetes verwendet wird.
29. Verwendung nach Anspruch 25, 26, 27 oder 28, wobei das Peptidanalogon als Inhibitor der lAPP-Aggregation und der Bildung von lAPP-PIaques verwendet wird.
30. Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur gleichzeitigen a) Reduktion oder Inhibition der lAPP-Aggregation oder der Bildung von Amyloidpla- ques aus IAPP und b) zur Regulation des Zuckerstoffwechsels.
31. Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Arzneimitteis zur gleichzeitigen a) Reduktion oder Inhibition der Cytotoxizität von IAPP oder dessen Aggregaten und b) zur Regulation des Zuckerstoffwechsels.
32. Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Reduktion oder Inhibition der ß - Amyloidpeptid-Aggregation oder der Bildung von Amyloidplaques aus ß -Amyloidpeptiden.
33. Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Reduktion oder Inhibition der Cy¬ totoxizität von ß -Amyloidpeptiden oder dessen Aggregaten.
34. Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder Therapie der Alzheimer-Erkrankung oder anderer Proteinaggregationskrankheiten.
35. Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprü- he 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 zur
Herstellung eines Arzneimittels zur gleichzeitigen a) Prophylaxe oder Therapie der Alzheimer-Erkrankung oder anderer Proteinaggregati¬ onskrankheiten und b) Diabetes.
36. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 35, wobei das Arzneimittel als Kombinationsarzneimittel mit Insulin und/oder Pram- lintide und/oder IAPP ausgeführt ist.
37. Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 z:ur Herstellung eines Diagnosemittels zur Diagnose der Alzheimer- Erkrankung oder anderer Proteinaggregationskrankheiten.
38. Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 z:ur Herstellung eines Diagnosemittels zur Diagnose von Proteinaggrega¬ tionskrankheiten, insbesondere Diabetes.
39. Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprü- che 1 bis 15 als ein verbessert handhabbares Immunogen für die
Herstellung von Antikörpern für diagnostische, therapeutische u nd Forschungszwecke.
40. Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis von IAPP, ß -Amyloidpeptid, Prion-Protein, α-Synuclein oder Polyg Iu- tamin oder deren Aggregaten, wobei ein mit einem Detektionsmarker versehenes Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 o- der ein mit einem Detektionsmarker versehener Antikörper nach /Nn- spruch 18 oder 19 als Sonde mit einer zu untersuchenden Probe- in Kontakt gebracht und eine Bindung des Peptidanalogons oder Anti- körpers mit gegebenenfalls vorhandenen IAPP, ß -Amyloidpeptid, Prion-Protein, α-Synuclein oder Polyglutamin oder deren Aggrega¬ ten nachgewiesen wird.
41. Verfahren zur Modifizierung, insbesondere Verhinderung der Aggregatbildung von in einer Flüssigkeit enthaltendem IAPP, ß - Amyloidpeptid, Prion-Protein, α-Synuclein oder Polyglutamin, wobei ein Peptidanalogon nach einem der Ansprüche 1 bis 15 mit der FIOs- sigkeit in Kontakt gebracht, inkubiert und die Aggregatbildung modifi¬ ziert wird.
42. Verwendung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 15 oder eines Antikörpers nach Anspruch 18 oder 19 für Forschungszwecke.
43. Mischung eines Peptidanalogons nach einem der Ansprüche Λ bis 15 mit IAPP und/oder ß -Amyloidpeptid und/oder Pramlintide.
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