DE69835680T2

DE69835680T2 - Therapeutische verwendung von smr1 protein und seinen aktiven derivaten

Info

Publication number: DE69835680T2
Application number: DE69835680T
Authority: DE
Inventors: Catherine Rougeot; Francois Rougeon
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1998-02-19
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2018-02-20
Also published as: DK1007566T3; EP1007566B1; EP1702929A2; DE69835680D1; US20040047805A1; ES2271991T3; US20020019008A1; WO1998037100A3; US20030195155A1; EP1007566A2; CA2281912A1; WO1998037100A2; US7429448B2; PT1007566E; ATE337339T1; US6589750B2; AU6721998A; US20020198361A1; US6818405B2; EP1702929A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(i) Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die therapeutische Verwendung eines Peptidmoleküls, das von Reifungsprodukten des SMR1 (Submandibulares Rattenprotein 1) abstammt.
(ii) Beschreibung des Stands der Technik
Das intrazelluläre oder systemische hydro-mineralische Ungleichgewicht des Körpers eines Säugers und insbesondere des menschlichen Körpers ist die Ursache von zahlreichen Krankheiten, die den Stoffwechsel und den physiologischen Zustand von verschiedenen Organen und Geweben, wie Knochen, Niere, Nebenschilddrüse, Pankreas, Darm, glandulärer Magenschleimhaut oder Prostata ebenso wie Speicheldrüse beeinflussen.
Im Körper eines Säugers ist das Aufrechterhalten des transmembranen Kalium/Natrium- und Magnesium/Calcium-Verhältnisses außerordentlich wichtig bei der Kontrolle der Zellanregung und der Regulierung von vielen Bereichen des intrazellulären Stoffwechsels. Die stark aktiven Gewebe wie Nerven, Leber und Muskeln besitzen ein höheres Verhältnis an Kalium/Natrium und Magnesium/Calcium als inaktive Gewebe wie Haut und Erythrozyten. Darüber hinaus besitzen die meisten aktiven Gewebe einen höheren Phosphorgehalt als inaktive Gewebe in Übereinstimmung mit der Rolle von Phosphatestern im zellulären Energiestoffwechsel.
Ein erwachsener Mensch enthält ungefähr 1.000 g Calcium (Krane et al., 1970). Etwa 99% dieses Calciums befindet sich in dem Knochengerüst in der Form von Hydroxyapatit und 1% ist in den extrazellulären Flüssigkeiten und den Weichteilen enthalten. In etwa 1% des skelettären Gehalts an Calcium ist frei austauschbar mit den extrazellulären Flüssigkeiten. Obwohl dieses aus tauschbare Reservoir prozentual im Hinblick auf den skelettären Gehalt gering ist, entspricht es in etwa dem Gesamtgehalt an Calcium in den extrazellulären Flüssigkeiten und Weichteilen und dient als wichtiger Puffer oder Speicher für Calcium. Aus diesem Grunde spielt Calcium zwei vorherrschende Rollen im Organismus. Im Knochen sorgen Calciumsalze für die strukturelle Integrität des Knochengerüsts. In den extrazellulären Flüssigkeiten und im Zytosol ist die Konzentration der Calciumionen überaus wichtig für das Aufrechterhalten und die Kontrolle einer Vielzahl biochemischer Prozesse und die Konzentrationen von Ca²⁺ in beiden Bereichen werden mit großer Konstanz aufrecht erhalten (Broadus, 1993). Andere wichtige Mineralionen wie Natrium, Magnesium oder Phosphor sind stark in den Mineralionenhaushalt, der für einen guten intra- und extrazellulären Stoffwechsel nötig ist, involviert. Der Begriff Mineralionenhaushalt bezieht sich auf den Zustand der Mineralhomeostase im Organismus gegenüber der Umwelt. Im „Null-Ausgleich" gleichen Mineralienaufnahme und Einlagerung genau den Mineralienverlust aus; im „positiven Ausgleich" übersteigen Mineralienaufnahme und Einlagerung die Mineralienverluste, und im „negativen Ausgleich" übersteigen die Mineralienverluste die Mineralienaufnahme und Einlagerung. Unter normalen Umständen sorgt die Netto-Calciumabsorption für einen Überschuss an Calcium, der die systemischen Anforderungen bei weitem übersteigt.
Das extrazelluläre Reservoir an Orthophosphat (etwa 550 mg im Menschen) steht im dynamischen Gleichgewicht mit der Phosphoraufnahme und -abgabe über Darm, Knochen, Niere und Weichteile. Beim „Null-Ausgleich" beträgt die fraktionierte Netto-Phosphorabsorption etwa 2/3 der Phosphoraufnahme. Diese Menge stellt einen deutlichen Überschuss in Bezug auf die systemischen Bedürfnisse dar und wird quantitativ mit dem Urin ausgeschieden.
Das extrazelluläre Reservoir an Magnesium (etwa 250 mg im Menschen) steht im bidirektionalen Gleichgewicht mit den Magnesi umfluxen durch Darm, Knochen, Niere und Weichteile. Beim Null-Ausgleich stellt das Magnesium, das von der netto-intestinalen Absorption stammt (etwa 100 mg pro Tag im Menschen), einen systemischen Überschuss dar und wird quantitativ ausgeschieden.
Zwei Organe sind hauptsächlich an der Absorption und Ausscheidung von verschiedenen Mineralionen im Körper beteiligt: 1) Der hormonale und/oder intrinsische Mechanismus von Mineralionenabsorption im Darm stellt für den Körper einen Mineralienüberschuss bereit, der die systemischen Mineralienbedürfnisse um einiges übersteigt; 2) der Nierentubulus spielt die dominante quantitative Rolle beim Aufrechterhalten der normalen Mineralienhomeostase.
Nur von wenigen endogen hergestellten Metaboliten wurde bereits gezeigt, dass sie aktiv an der Aufrechterhaltung des Mineralionenhaushalts innerhalb des Körpers teilnehmen.
Das 1,25-Dihydroxyvitamin D (auch Calcitriol genannt) ist der einzige bekannte hormonale Stimulus der wirksamen intestinalen Calciumabsorption, der hauptsächlich in dem Duodenum und dem Jejenum vorkommt (Lehmann Jr. J., 1993). Als Folge hiervon tritt eine verringerte netto-intestinale Calciumabsorption auf, wenn entweder die Calciumaufnahme über die Nahrung reduziert wird, wenn die Konzentration an Serum 1,25-Dihydroxyvitamin D gering ist oder wenn der Darm unempfindlich für dieses Hormon ist. Im Unterschied dazu tritt erhöhte intestinale Calciumabsorption auf, wenn die Serum 1,25-Dihydroxyvitamin D-Konzentration hoch ist. Demnach können Defekte bei der Regulation der 1,25-Dihydroxyvitamin D-Konzentration im Serum, größere Funktionsstörungen, die die intestinale Calciumabsorption verringern oder erhöhen und zu einem krankhaften Zustand führen, verursachen. Das 1,25-Dihydroxyvitamin D beeinflusst auch die Aufnahme von Phosphat vom Körper.
Ein zweiter endogener Faktor, der beim Mineralionenhaushalt beteiligt ist, ist das Parathyroidhormon (PTH). Das Parathyroidhormon reguliert den Calcium- und Phosphatpegel im Blut, indem es die Wirkung spezifischer Zellen in Knochen und Niere abstimmt. Diese Handlungen dienen 1) der Stimulierung der Reabsorption von Calcium und Phosphat vom Knochen; 2) der Stimulierung der Reabsorption von Calcium und der Inhibierung der Reabsorption von Phosphat von glomerulärem Filtrat; und 3) der Stimulierung der renalen Synthese von 1,25-Dihydroxvitamin D, wobei die intestinale Absorption von Calcium und Phosphat erhöht wird.
Ein dritter endogener Faktor, der in den Mineralionenhaushalt eingreift, ist Calcitonin. Calcitonin (CT) ist ein Peptid mit 32 Aminosäuren, das hauptsächlich über thyroidale C-Cellen ausgeschieden wird (Deftos, 1993). Sein biologischer Haupteffekt besteht darin, die osteoklastische Knochenresorption zu verhindern. Diese Eigenschaft führte zur Verwendung von CT's für Krankheiten, die durch erhöhte Knochenresorption gekennzeichnet sind wie die Paget'sche Krankheit, Osteoporose und für die bösartige Hyperkalzämie. Die Sekretion von CT wird im akuten Stadium von dem Blutcalciumgehalt und im chronischen Zustand von Geschlecht und vielleicht auch Alter gesteuert. Calcitonin wird über die Niere und die Leber metabolisiert. Die Aminosäurensequenz von CT ist im Laufe der Evolution (vom Fisch zu den Säugetieren) weitestgehend erhalten geblieben.
Störungen im Mineralionenhaushalt sind die Ursache von zahlreichen Krankheiten, die entweder die Knochen, die Niere, den Darm, den Pankreas, das Zahngewebe (Zahnschmelz und Zahnbein) oder die Magenschleimhaut beeinflussen.
Ein Missverhältnis im Mineralionenhaushalt beeinflusst die Fähigkeit der Knochen zur Umbildung, was Krankheiten wie Osteoporose verursacht, oder beeinträchtigt die Fähigkeit der Knochen zur Resorption wie bei der Hyperparathyroidismus-Krankheit. Das Knochenumbildungssystem wurde in jüngster Vergangenheit in zahlreichen Publikationen dargestellt (Parfitt, 1986). Knochenumbildung tritt auf bei trabekulären und Haversian'schen Knochenoberflächen. Der erste Schritt ist die Aktivierung von osteoklastischen Vorläuferverbindungen zur Bildung von Osteoklasten, welche anschließend damit beginnen, eine Aushöhlung in die Oberfläche einzugraben. Nach dem Entfernen von Knochengewebe (etwa 0,05 mm³) verbleibt der Bereich eine kurze Zeit lang ruhig, woraufhin die Aktivierung der osteoblastischen Vorläufermoleküle stattfindet und der Bereich und die Aushöhlung wieder gefüllt werden. Dieser Vorgang dient verschiedenen Zwecken, unter ihnen das Entfernen von gealtertem im mikroskopischen Bereich beschädigten Knochengewebe und der Umgestaltung des Knochenaufbaus, um die Anforderungen, die an eine mechanische Stütze gestellt werden, zu erfüllen. Beim normalen täglichen Gebrauch des Knochengerüsts können Knochenabbau, eine abnorme Häufung an Schädigungen auf mikroskopischer Ebene oder Fehler in der Geometrie lediglich durch Defekte innerhalb dieses Systems auftreten, beispielsweise über einen Defekt im Mineralionenhaushalt. Osteoporose ist eine Krankheit, die von großer Wichtigkeit für die öffentliche Gesundheit ist und aus diesem Grund gibt es ein großes Bedürfnis für neue therapeutische Moleküle, die in der Lage sind, den Mineralionenhaushalt im Körper zu regulieren und dies, wenn möglich, effizienter und selektiver (Ziel-spezifisch) als die bisher therapeutisch eingesetzten Moleküle wie Östrogen und Calcitonin. Andere Knochenabsorptions- oder Resorptionskrankheiten können durch Defekte beim renalen oder gastrointestinalen Mineralionenhaushalt, wie renaler Osteodystrophie, oder sogar durch Pankreasinsuffizienz verursacht werden.
Primärer Hyperparathyreoidismus ist sehr häufig die Ursache für Hyperkalzämie mit einer geschätzten Häufigkeit von 1 auf 500 bis 1 auf 1.000 (Bilezikian, 1990). Hyperparathyreodismus ist eine Hyperkalzämie, die gemeinsam mit erhöhten Pegeln an Pa rathyroidhormon auftritt, oftmals verursacht von solitärem Drüsengeschwulst.
Hyperkalzämie kann die Folge verschiedener anderer Krankheiten wie der familiären hyperparathyroiden Syndrome (Szabo J. et al., 1993), der gemeinen hypokalzären Hyperkalzämie (Marx S.J. 1993), der Hyperkalzämie, die durch maligne Zustände verursacht wird (Stewart A.F., 1993; Mundy G.R., 1993) oder einer Hyperkalzämie, die durch granulombildende Krankheiten verursucht wird (Adams, J.S., 1993), sein.
Auf der anderen Seite können Defekte im Mineralionenhaushalt zu Hypokalzämie führen, die bei Krankheiten gefunden werden, die mit einer niedrigen Serumalbuminkonzentration oder auch mit ideophatischem Hypoparathyroidismus verbunden sind. Hypokalzämie selbst wird gelegentlich von Hypomagnäsemie oder Hyperphosphatämie oder verminderter Sekretion des Parathyroidhormons (Shane E., 1993) oder auch Vitamin D Krankheiten (Insogna K.L., 1993) verursacht.
Die Dentalgewebe können auch bei einem Defekt bei der Mineralisierung und Bildung von Zahnbein oder Zahnschmelz beeinträchtigt werden. Pankreas ist ebenfalls ein Organ, das sehr empfindlich auf einen Defekt im Mineralionenhaushalt reagiert und das eine Entzündung, genannt Pankreatitis, verursachen kann. Sogar die Submandibulardrüse kann beeinträchtigt werden, was zur Bildung eines krankhaften Lithiasezustands führt, der mit Calciumablagerungen verknüpft ist. Die Niere kann ebenfalls betroffen sein, was zur Bildung von Nephrolithiase führt.
Auf die gleiche Weise ist die Aluminiumakkumulierung in urämischen Patienten mit Knochenkrankheiten verknüpft, die durch reduzierte Knochenbildung gekennzeichnet sind, was zu Osteodystrophie führt (Sherrard et al, 1988).
Zwei andere Krankheiten, die von Bedeutung für die Volksgesundheit sind, sind jeweils Hyperkalzämie, die von medikamentöser Behandlung herrührt (Stewart, 1993) und Parathyroidhormon-Resistenzsydrom (Levine, 1993).
Aufgrund der zahlreichen Krankheiten, die von einer Abnahme oder einem Anstieg des Mineralionenstoffwechsels verursacht werden (im wesentlichen Calcium-, Magnesium-, Phosphor- oder Aluminiumionen) und aufgrund der sehr geringen Anzahl an Molekülen, die bis dato bei der Vorbeugung oder Behandlung der oben beschriebenen pathologischen Zustände von therapeutischem Wert sind, gibt es ein großes öffentliches Bedürfnis für neue wirksame Moleküle, die auch dazu fähig sind, die Mineralionenkonzentrationen innerhalb des Körpers zu regulieren.
Die Erfinder haben bereits ein neues Submandibulardrüsen-Rattenprotein, genannt SMR1 (submandibulares Ratten 1 Protein) charakterisiert, das die Struktur eines Prähormons besitzt und dessen Synthese unter Androgenkontrolle stattfindet (Rosinsky-Chupin et al., 1988 und WO 90/03981). Das Gen, das SMR1 kodiert, gehört zu einer neuen Multigenfamilie, der VCS-Familie, die im Chromosom 14, Banden p21–p22 (Courty et al., 1996; Rosinsky-Chupin et al., 1995), lokalisiert wurde und für welches der menschliche Gen-Gegenpart charakterisiert wurde. Das Gen weist eine ähnliche Organisation wie eine Vielzahl von Hormonvorgängergenen auf (Rosinsky-Chupin et al, 1990). SMR1 mRNA wird in einer stark gewebe-, alters- und geschlechtsspezifischen Weise in den azinären Zellen der Submaxillardrüse männlicher Raten (SMG) und in der Prostata exprimiert (Rosinsky-Chupin et al., 1993).
Es wurde beschrieben, dass in vivo SMR1 selektiv bei Paaren basischer Aminosäurebereiche auf eine gewebe- und geschlechtsspezifische Art und Weise prozessiert wird, was zu reifen Peptidprodukten führt in einer Weise, die der Reifung von Peptid-Hormon-Vorgängermolekülen ähnelt (Rougeot et al., 1994). Im allgemeinen wurde von dieser selektiven proteolytischen Fragmentation gezeigt, dass sie kritisch für die Bildung und Regulierung von biologisch wirksamen Peptiden ist (Lindberg et al., 1991; Steiner et al., 1992). Die Biosynthese von den Peptiden, die von SMR1 oder von seinem menschlichen Gegenpart über Spaltung bei Paaren von Argininresten, z.B. dem Undekapeptid: VRGPRRQHNPR; dem Hexapeptid: RQHNPR; und dem Pentapeptid: QHNPR stammen, unterliegt bestimmten regulatorischen Bahnen in Abhängigkeit von 1) dem Organ: SMG und Prostata, 2) dem Entwicklungsstadium: ab 6 Wochen postnatal, 3) dem Geschlecht: hauptsächlich im Männchen, und 4) Keimdrüsenhormonen: den Androgenen. Darüber hinaus werden in vivo die reifen Peptide, die in der männlichen Ratten-SMG akkumulieren, in den extrazellulären Raum exportiert als Antwort auf einen spezifischen externen Stimulus und auf diese Weise in den Speichel und die Blutflüssigkeiten transportiert (Rougeot et al., 1993). Die Tatsache, dass diese Peptide hauptsächlich in postpubertären männlichen Ratten produziert werden und in den Speichel und in das Blut unter stimulierten Bedingungen sekretiert werden, führt zu der Postulation, dass sie eine lokale und systemische physiologische Rolle bei der Mediation einiger männlich spezifischer Verhaltenscharakteristiken spielen – diese Rolle war aber vollständig unbekannt.
ZUSAMMENFASSUNG UND ZIELE DER ERFINDUNG:
Die Erfinder haben nun entdeckt, dass die Reifungsprodukte des SMR1 Proteins, insbesondere ein Peptid der strukturellen Formel XQHNPR spezifische Zielbereiche in Organen erkennen, die stark mit der Mineralionenkonzentration verknüpft sind. Diese Entdeckung führte die Erfinder dazu, dem SMR1 Pentapeptid, Hexapeptid oder Undekapeptid eine aktive Rolle bei der Regulierung der Metallionenkonzentrationen in den Körperflüssigkeiten und Geweben zuzuschreiben und somit eine therapeutische Rolle dieser Peptide in allen metabolischen Krankheiten, die mit einem Metallionenungleichgewicht verknüpft sind.
Demnach betrifft die vorliegende Erfindung die therapeutische Verwendung des Peptids der strukturellen Formel XQHNPR, worin X ein Wasserstoffatom bezeichnet oder X eine Aminosäurenkette bezeichnet, ausgewählt aus: X = V oder X = VR oder X = VRG oder X = VRGP oder X = VRGPR oder X = VRGPRR zur Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten, die von einem Mineralionenungleichgewicht in einem Säuger, insbesondere im Menschen, verursacht werden.
Insbesondere ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung die Verwendung der oben beschriebenen therapeutischen Peptide zur Behandlung von Knochen-, Zahn-, renalen, Nieren-, Darm-, Pankreas-, Magenschleimhaut- oder parathyroiden Krankheiten, die hauptsächlich von einem Mineralionenungleichgewicht in den Körperflüssigkeiten oder -geweben verursacht wurden.
Dementsprechend werden die therapeutischen Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung zur Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten wie Hyper- oder Hypoparathyroidismus, Osteoporose, Pankreatitis, submandiularer Drüsenlithiase, Nephrolithiase oder Osteodystrophie eingesetzt.
Die Entdeckung der therapeutischen Wirkung des SMR1 Proteins und der von ihm abgeleiteten Peptide ebenso wie deren physiologischer in vivo Ziels hat es den Erfindern ermöglicht, neue Moleküle aufzubauen, die als biologisch aktive Derivate der oben beschriebenen therapeutischen Peptide betrachtet werden können.
Solche biologisch wirksamen Derivate der erfindungsgemäßen therapeutischen Peptide sind Peptide, die strukturell und chemisch verwandt mit dem XQHNPR sind, wie Peptide, die die gleiche Aminosäurensequenz wie die Ausgangspeptide haben, aber eine oder mehrere modifizierte Amminosäuren aufweisen, die den therapeutisch wirksamen Molekülen eine bessere in vivo Stabilität ver leihen können, und die die gleiche biologische Wirkung wie das endogene Peptid aufweisen oder die sich wie ein Antagonistenmolekül des endogenen Peptids verhalten.
Demnach ist die therapeutische Verwendung von Peptiden, die homolog zu dem XQHNPR-Peptid sind, ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung. Mit dem Ausdruck homologes Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Peptid gemeint, das eine oder mehrere Aminosäurensubstitutionen in der XQHNPR Sequenz aufweist. Die Aminosäurensubstitution besteht in dem Ersatz von einer oder mehreren konsekutiven oder nicht-konsekutiven Aminosäuren durch „äquivalente" Aminosäuren. Der Ausdruck „äquivalente" Aminosäure wird hier verwendet, um jede Aminosäure zu bezeichnen, die eine der Aminosäuren substituieren kann, die zu der ursprünglichen Peptidstruktur gehören, ohne dass die hydrophilen Eigenschaften und das biologische Ziel der ursprünglichen Peptidstruktur modifiziert werden. Vorzugsweise behalten die Peptide, die eine oder mehrere „äquivalente" Aminosäuren enthalten, ihre Spezifitäts- und Affinitätseigenschaften zu den biologischen Ziels des XQHNPR-Peptids. In anderen Worten, sind die „äquivalenten" Aminosäuren solche, die die Generierung oder den Erhalt eines Polypeptids oder Peptids mit einer modifizierten Sequenz betreffend XQHNPR ermöglichen, wobei die modifizierten Polypeptide oder Peptide dazu fähig sind, als ein Agonisten- oder ein Antagonistenmolekül des XQHNPR-Peptids zu agieren.
Diese äquivalenten Aminosäuren können über ihre strukturelle Homologie zu den Ausgangsaminosäuren, die ersetzt werden sollen, bestimmt werden und über deren biologische Wirkung auf die Zielzellen des XQHNPR-Peptids.
Als ein erläuterndes Beispiel soll die Möglichkeit erwähnt werden, Substitutionen wie Leucin durch Valin oder Isoleucin, Asparaginsäure durch Glutaminsäure, Glutamin durch Asparagin, Arginin durch Lysin etc. durchzuführen, wobei zu verstehen ist, dass die umgekehrten Substitutionen unter den gleichen Bedingungen erlaubt sind.
Unter modifizierter Aminosäure gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch der Ersatz eines Restes in der L-Form durch einen Rest in der D-Form oder der Ersatz des Glutamin (Q) – Rests durch eine Pyroglutaminsäurenverbindung gemeint. Die Synthese von Peptiden, die mindestens einen Rest in der D-Form aufweisen, ist beispielsweise von Koch et al. im Jahre 1977 beschrieben worden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:
1 Repräsentative Ganzkörperautoradiographien einer fünf Wochen alten männlichen Ratte, 60 Min. nach i.v. Injektion von SMR1-stämmigem ³H-Pentapeptid (2 μg oder 3 nMol/100 g Körpergewicht). A: Lateraler sagittaler Schnitt, und B: Mittsagittaler Schnitt.
Die 20 μm Schnitte wurden 15 Tage lang mit 3H/Hyperfilm exponiert. Schwarze Bereiche korrespondieren mit einer großen Aufnahme an Radioaktivität. Die höchste Konzentration an Silberkörnern wird in der renalen äußeren medullären, glandulären Magenschleimhaut, dem pankreatischen und submandibularen Lobulus sowie als sichtbares Knochengewebe (Schädelbasis, Rippe, Rückenwirbelsäule und Extremität) und Zahngewebe beobachtet.
2 Repräsentative Abbildung von Zielorganen für SMR1-stämmige ³H-Pentapeptide unter Verwendung des hoch auflösenden (3-Radiobilderzeugers.
A: Mittsagittaler Schnitt, und B: Lateraler sagittaler Schnitt des gesamten Rattenkörpers, 60 Min. nach Injektionen von 3 nMol oder 2 μg tritiiertem Peptid.
Die 20 μm Schnitte wurden 8 Stunden lang exponiert. Rote Bereiche korrespondieren mit einer hohen Aufnahme von Radioaktivität. Die höchste Konzentration an Radioaktivität wird in der renalen äußeren medullären glandulären Magenschleimhaut, dem pankreatischen und submandibularen Lobulus sowie im sichtbaren Knochengewebe (Schädelbasis, Rippe, Rückenwirbel und Extremität) und Dentalgewebe beobachtet.
3 Quantitatives Profil von Radioaktivität in verschiedenen Geweben im Anschluss an die Verabreichung von 2 μg oder 3 nMol ³H-Pentapeptid (QHNPR), 60 Min. postdosal. Eine direkte Quantifizierung wurde durchgeführt unter Verwendung des β-Radiobildererzeugers in den gesamten sagittalen Körperschnitten. Die Zahl der β-Partikel, die pro Gebiet emittiert wurde, wurde 8 Stunden lang gezählt und als Counts pro mm² ausgedrückt. Die Bestimmung der quantitativen regionalen Unterschiede wurde mit computerunterstützter Bildanalyse unter Verwendung des β-Visionsprogramms durchgeführt. Die Balken stellen Mittelwerte ± SD der dreifachen Bestimmungen der gleichen Struktur sowie zwei Gesamtkörperschnitte dar.
4 Quantitatives Radioaktivitätsprofil in verschiedenen Geweben im Anschluss an die Verabreichung von 100 pMol ³H-Hexapeptid, 60 Min. postdosal oder zuzüglich 100 nMol unmarkiertem Peptid zur nicht spezifischen Bindung.
Die Quantifizierung wurde unter Verwendung eines Spektrometers durchgeführt und berechnet als cpm/mg Protein von den Gesamtgewebeextrakten.
5 Quantitatives Radioaktivitätsprofil in verschiedenen Geweben im Anschluss an die Verabreichung von 5 pMol ¹²⁵I-Undekapeptid (VRGPRRQHNPR), 10 Min. postdosal oder zuzüglich 100 nMol unmarkiertes Peptid für die nicht spezifische Bindung.
Die Quantifizierung wurde unter Verwendung eines gamma-Spektrometers durchgeführt und berechnet als cpm/g Gewebe.
6 Repräsentatives Profil des Zeitverlaufs des SMR1-stämmigen Pentapepidplasmapegels in männlichen Ratten nach einer einzigen intravenösen Injektion von 110 ng tritiiertem Pentapeptid.
Die plasmafreie Peptidfraktion wurde nach RP Porapak Q Reinigung (Werte sind Mittelwerte ± SD von 2 Ratten) und die freie Pentapeptidfraktion nach RPHPLC Chromatographie wie in „materials and methods" beschrieben gemessen.
7 Hellfeldphotomikrographie der Autoradiographie von in vivo ³H-pentapeptidzellulärer Aufnahme in Schnitten von verschiedenen Organen, einschließlich A: äußere Medulla der Niere, B: glanduläre Magenschleimhaut, C: pankreatische Lobules, D: Wurzel des oberen Schneidezahns, E: Vertebralknochen, F: proximales Langknochenschienbein.
Hellfeldbilder zeigen in vivo Radiomarkierungen von 5 μm Schnitten 60 Minuten nach Injektion von physiologischen Konzentrationen des trithiierten Peptids (160 ng). Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Toluidinblau gefärbt, um mikroanatomische Details zu verifizieren und wurden fotografiert mit einer finalen Druckvergrößerung von 400X (A, B, D, E, F) und 600X (C).
8 A: Mapping der renalen³H-Pentapeptidverteilung unter Verwendung des hochauflösenden β-Radiobilderzeugers. In vivo Radiomarkierung, 60 Min. nach Injektion von physiologischen Konzentrationen des tritiierten Peptids (160 mg) (A-1), oder zuzüglich eines 100fachen Überschusses an unmarkiertem Peptid für nicht spezifische Bindung (A-2). Die 5 μm Schnitte wurden 50 Stunden lang exponiert. Die weißen Bereiche korrespondieren mit der höchsten Konzentration an Radioaktivität.
B: Quantifizierung der Radioaktivität innerhalb der Niere im Anschluss an eine 60-minütige Verabreichung von physiologischen Konzentrationen von ³H-Pentapeptid in vivo oder zuzüglich eines 100fachen Überschusses an unmarkiertem korrespondierenden Peptid.
Der Radioaktivitätsgehalt wurde direkt mit einem β-Spektrometer gemessen und als cpm/mg Protein der 20 μm Gesamtgewebeschnitte (B-2) berechnet oder der Gesamtgewebeextrakte (B-1) oder mit einem R-Radiobildgeber gemessen und als counts × 100/mm² der 5 μm Schnitte (B-3-1) berechnet. Die Bestimmung der quantitativen regionalen Unterschiede wurde mit computerunterstützter Bildanalyse unter Verwendung des β-Visionsprogramms durchgeführt (B-3-2 und B-3-3).
9 Quantitatives Profil der Radioaktivität verschiedener Fraktionen der Membranpräparationen der äußeren Medulla der Niere.
10 Isoelektrofokussierung (IEF) von Membranproteinen der äußeren Medulla der Niere, aufgelöst mit SB14 1% und SB201 1 M.
11 Molekularsieb (Superdex 200) der Fraktionen, die vom Isoelektrofokussieren aufgelöster Membranpräparationen der äußeren Medulla der Niere stammen.
12 Chromatografisches Profil korrespondierend zu 10 mit einer optischen Dichte bei 274 nm und stammend vom Fraktionieren bei 0,75 ml/Min..
Isoelektrofokussierungsfraktionen der aufgelösten Membranpräparationen der äußeren Medulla der Niere.
13 Kalibrierung von Superdex 200.
14 FPLC c₁₈ Phasenumkehrflüssigkeitschromatografie (Rep RPC, Pharmacia).
IEF Fraktionen von Membranpräparationen der äußeren Medulla der Niere.
15 FPLC RP-18 chromatografische Profile der Radioaktivität, optische Dichte bei 280 nm, Acetonitrilkonzentration und Fraktionierung bei 0,75 ml/Min.
Repräsentatives Chromatogramm der IEF Fraktionen der aufgelösten Membranpräparationen der äußeren Medulla der Niere.
16 Profile des präparativen Isoelektrofokussierens von Membranpräparationen aufgelöst in SB14/SB201 der äußeren Medulla der Niere.
17 Membranpräparationen des pankreatischen Lobulus aufgelöst in SB14/SB201.
18 IEF von Membranpräparationen der glandulären Magenschleimhaut aufgelöst in SB 14/SB 201.
19 IEF von Membranpräparationen der trabekulären Knochenmatrix aufgelöst in SB 14/SB 201.
20 IEF von Membranproteinen der Dentinalmatrix aufgelöst in SB 14/SB 201.
21 Molekularsieb (Superdex 200) von zytosolischen und Membranfraktionen der äußeren Medulla der Niere aufgelöst in Detergens.
22 Chromatografische Profile entsprechend 21 von OD bei 274 nm und Fraktionieren bei 0,75 ml/Min.
A: Aufgelöste Membranfraktion
B: Zytosolische Fraktion der äußeren Medulla der Niere.
23 Profil des Molekularsiebs (Superdex 200) der pankreatischen Membranfraktionen aufgelöst in SB14/SB201.
24 Profil des Molekularsiebs (Superdex 200) von Membranproteinen der glandulären Magenschleimhaut aufgelöst in SB 14/SB201.
DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Peptide, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können auf übliche Weise über Peptidsynthese in der flüssigen oder festen Phase hergestellt werden über sukzessives Kuppeln der verschiedenen Aminosäurereste, die eingebaut werden sollen (vom N-terminalen Ende zum C-terminalen Ende in flüssiger Phase oder vom C-terminalen Ende zum N-terminalen Ende in der Festphase), wobei die N-terminalen Enden und die reaktiven Seitenketten vorher über konventionelle Gruppen blockiert werden.
Für die Festphasensynthese kann insbesondere die von Merrifield beschriebene Technik eingesetzt werden. Alternativ kann auch die von Houbenweyl im Jahre 1974 beschriebene Technik eingesetzt werden.
Um eine Peptidkette unter Verwendung des Merrifield-Verfahrens herzustellen, wird ein hochporöses Harzpolymer verwendet, an welches die erste C-terminale Aminosäure der Kette befestigt wird. Diese Aminosäure wird an das Harz über seine Carboxylgruppen befestigt und seine Aminfunktion wird geschützt, beispielsweise mit der t-Butyloxycarbonylgruppe.
Wenn die erste C-terminale Aminosäure demnach an das Harz befestigt wird, wird die Schutzgruppe von der Aminfunktion über Waschen des Harzes mit einer Säure entfernt. Wenn die Schutzgruppe für die Aminfunktion die t-Butyloxycarbonylgruppe ist, kann sie über Behandeln des Harzes mit Trifluoressigsäure entfernt werden.
Die zweite Aminosäure, die den zweiten Rest der erwünschten Sequenz liefert, wird anschließend mit der entschützten Aminfunktion der ersten C-terminalen Aminosäure, die an der Kette befestigt ist, gekoppelt. Vorzugsweise wird die Carboxylfunktion dieser zweiten Aminosäure aktiviert, beispielsweise unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid und die Aminfunktion wird geschützt, beispielsweise unter Verwendung von t-Butyloxycarbonyl.
Auf diese Weise wird der erste Teil der erwünschten Peptidkette erhalten, die zwei Aminosäuren umfasst, deren terminale Aminfunktion geschützt ist. Wie vorhin beschrieben wird die Aminfunktion entschützt und der dritte Rest kann anschließend unter ähnlichen Bedingungen wie denjenigen, die bei der Zugabe der zweiten C-terminalen Aminosäure verwendet wurden, befestigt werden.
Demnach werden die Aminosäuren, die die Peptidkette bilden sollen, nacheinander an der Aminogruppe befestigt, die vorher jedes Mal entschützt wird, an dem Teil der Peptidkette, der bereits gebildet worden und der mit dem Harz verknüpft ist.
Wenn die gesamte erwünschte Peptidkette gebildet worden ist, werden die Schutzgruppen von den verschiedenen Aminosäuren, die die Peptidkette bilden, entfernt und das Peptid wird von dem Harz entfernt, beispielsweise unter Verwendung von Fluorwasserstoffsäure.
Die auf diese Weise synthetisierten Peptide können auch ein Polymer des XQHNPR Peptids sein, das 2 oder 20 Monomereinheiten der Aminosäuensequenz XQHNPR, vorzugsweise 4 bis 15 Monomereinheiten und insbesondere bevorzugt 5 bis 10 Monomereinheiten, enthält. Die Polymere können mittels der Merrifield-Technik oder über jede andere konventionelle Peptidpolymersynthese, die dem Fachmann bekannt ist, hergestellt werden.
Die auf diese Weise erhaltenen Peptide können gereinigt werden, beispielsweise über Hochdruckflüssigkeitschromatographie, wie der Umkehrphasen und/oder kationischen Austausch HPLC wie von Rougeot et al. im Jahre 1994 beschrieben.
Die Peptide, die in dem therapeutischen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können auch unter Verwendung von Gentechnikverfahren erhalten werden. Die Nukleinsäuresequenz der cDNA, die das komplette 146 Aminosäuren SMR1 Protein kodiert, wurde in der WO 90/03891 (Rougeot et al.) beschrieben. Was die biologisch wirksamen Peptidderivate des XQHNPR betrifft, wird der Fachmann, um zu bestimmen, welche geeigneten Kodons zur Synthese des erwünschten Peptids verwendet werden können, die übliche Literatur heranziehen.
Für die genetische Exprimierung des XQHNPR Peptids kann die folgende Nukleotidsequenz verwendet werden auf der Basis der üblichen Kodonverwendung in Säugetieren:
Peptid V R G P R R Q H N P R
DNA GTC AGA GGC CCA AGA AGA CAA CAT AAT CCT AGA
oder eine Nukleotidsequenz, die mit der oben genannten Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert und welche ein Peptid, das im wesentlichen die gleiche Mineralionenregulierungswirkung wie das QHNPR Peptid aufweist, kodiert.
Mit stringenten Hybridisierungsbedingungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind folgende Bedingungen gemeint:
Der Hybridisierungsschritt wird bei 65°C in Gegenwart von 6 × SSC, 5 × Denhardt-Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml Lachssamen DNA ausgeführt. Die Waschschritte bestehen aus:

– zweimaligem Waschen innerhalb von 5 Min. bei 65°C in einem 2 × SSC und 0,1% SDS Puffer;
– einmaligem Waschen 30 Min. lang bei 65°C in einem 2 × SSC und 0,1% SDS Puffer;
– einmaligem Waschen für einen Zeitraum von 10 Min. bei 65°C in einem 0,1 × SSC und 0,1% SDS.

Die Exprimierung des Polynukleotids, welches das XQHNPR kodiert, kann in Abhängigkeit von dem Organismus, in dem die Sequenz exprimiert werden soll und in Abhängigkeit von der spezifischen Codonverwendung dieses Organismus (Säugetier, Pflanze, Bakterium etc.) optimiert werden. Für Bakterien und Pflanzen können die allgemeinen Codonverwendungen in der EP 0 359 472 (Mycogen) gefunden werden.
Inzwischen ist es leicht, Proteine in großen Mengen über Gentechnikverfahren herzustellen unter Verwendung von Plasmiden, Phagen oder Phagemiden als Exprimierungsvektoren. Die Polynukleotide, die für die Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung kodieren, werden in einen geeigneten Exprimierungsvektor insertiert, um das interessierende Polypeptid in vitro herzustellen. Folglich umfasst die vorliegende Erfindung auch die Herstellung des SMR1 Proteins oder die Herstellung eines seiner Reifungsprodukte über Gentechnikverfahren. Das SMR1 Protein (das als Vorgänger verschiedener Reifungsprodukte angesehen werden kann) wird über Furin prozessiert. Furin ist eine Subtilisin-artige Konvertase, die bei der Posttranslation des endoproteolytischen Prozessierens verschiedener Prähormone beteiligt ist. Demnach kann Furin vorteilhafterweise in Kombination mit einem Vorgängermolekül des XQHNPR Peptids eingesetzt werden, um das entsprechende Reifungsprodukt zu erhalten.
Demnach umfasst ein Verfahren zum Herstellen des SMR1 Proteins oder eines seiner Reifungsprodukte wie dem XQHRNPR Peptid gemäß der Erfindung oder auch von einem Peptid, das „äquivalente" Aminosäuren wie oben beschrieben enthält, die folgenden Schritte.

a) Gegebenenfalls Amplifizieren der Nukleinsäure, die für das erwünschte Polypeptid kodiert, unter Verwendung eines Primer-Paares, das spezifisch für die SMR1 genomische oder cDNA Sequenz ist (über SDA, TAS, 3SR NASBA, TMA, LCR, RCR, CPR, Q-Beta-Replikase oder PCR;)
b) Insertieren der Nukleinsäure, die für das interessierende SMR1 Protein kodiert, in einen geeigneten Vektor;
c) Insertieren der Nukleinsäure, die für Furin kodiert, in einen geeigneten Vektor, wobei dieser Vektor der Vektor von Schritt b) oder ein anderer Vektor als der Vektor aus Schritt b) sein kann;
d) Kultivieren – in einem geeigneten Kulturmedium frei von Serum – einer Wirtszelle, die vorher mit dem rekombinanten Vektor aus Schritt b) und c) transformiert oder transfektiert worden ist;
e) Ernten des Kulturmediums, das auf diese Weise konditioniert wurde und der Wirtszelle beispielsweise über Lysieren der Wirtszelle über Sonikation oder über einen osmotischen Schock;
f) Separieren oder Purifizieren des auf diese Weise hergestellten interessierenden Polypeptids aus dem Kulturmedium oder aus dem Pellet des resultierenden Wirtszellenlysats;
g) Charakterisieren des interessierenden Peptidprodukts;
h) Gegebenenfalls Prüfung auf die spezifische Erkennung des Peptids eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers, der gegen das XQHNPR Peptid gerichtet ist, insbesondere gegen das QHNPR Peptid.

Ein geeigneter Vektor für die Exprimierung des SMR1 Proteins und des oben definierten Konvertaseproteins ist der Baculovirusvektor, der in Insektenzellen und Insektenzelllinien vermehrt werden kann. Ein geeignetes Wirtsvektorsystem ist der pVL1392/1993 Baculovirustransfervektor (Pharmingen), der dazu verwendet wird, die SF9 Zelllinie (ATCC Nr. CRL 1711), welche von Spodoptera frugiperda abstammt, zu transfizieren.
Ein weiterer geeigneter Vektor zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens ist ein Vaccinia Virusvektor. In dieser spezifischen Ausführungsform wird BSC-40 oder LoVo für die Transfektions- und Kultivierungsschritte eingesetzt.
Die Reinigung des rekombinanten Proteins kann über den Durchlauf durch eine Nickel- oder Kupferaffinitätschromatographiesäule durchgeführt werden. Die Nickelchromatographiesäule kann das Ni-NTA Harz enthalten (Porath et al., 1975).
Die PCR-Amplifizierungsreaktion wurde von Saiki et al. im Jahre 1985 beschrieben; die SDA Technik wurde von Walker et al. im Jahre 1992 beschrieben und von Spargo et al. im Jahre 1996 verbessert; die TAS Amplifizierungsreaktion wurde von Kwoh et al. im Jahre 1989 beschrieben; die 3SR Technik wurde von Guatelli et al. im Jahre 1990 beschrieben; die NASBA Technik wurde von Kievitis et al, im Jahre 1991 beschrieben; die LCR Reaktion wurde von Landergen im Jahre 1991 beschrieben und von Barany et al. im Jahre 1991 verbessert; die RCR Technik wurde von Segev im Jahre 1992 beschrieben; die CPR Technik wurde von Duck et al. im Jahre 1990 beschrieben.
Ref Co-Transfektion mit Konvertase XXX
Die Peptide, die mittels Gentechnikverfahren gemäß der Erfindung hergestellt wurden, können über ihr Binden an eine Immunoaffinitätschromatografiekolonne charakterisiert werden, auf der polyklonale oder monoklonale Antikörper, die auf XQHNPR gerichtet sind, zuvor immobilisiert wurden.
Vorzugsweise wird das Peptid, das einen therapeutischen Wert aufweist, und das in den therapeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten ist, über HPLC, wie beschrieben von Rougeot et al. im Jahre 1994, gereinigt. Der Grund, diese Art der Reinigung des Peptids oder Proteins zu bevorzugen, liegt darin, dass in den Eluierungsproben keine Nebenprodukte gefunden werden.
Die Antikörper können ausgehend von Hybridomen gemäß der Technik, die von Kohler und Milstein im Jahre 1975 beschrieben wurde, hergestellt werden. Die polyklonalen Antikörper können über Immunisierung eines Säugetiers, insbesondere einer Maus oder eines Hasen, mit einem erfindungsgemäßen Peptid hergestellt werden, das mit einem Immunitätsadjuvanz kombiniert wird und über anschließendes Reinigen der spezifischen Antikörper, die im Serum des immunisierten Tieres enthalten sind, auf einer Affinitätschromatografiekolonne, auf welcher vorher das Peptid, das als Antigen eingesetzt wurde, immobilisiert worden war. Eine Technik zum Herstellen und Verwenden einer Immunoaffinitätschromatographiesäule wurde beispielsweise im Jahr 1984 von Bird et al. beschrieben.
Eine bevorzugte Ausführungsform zum Herstellen von Antikörpern, die gegen das SMR1 Protein oder seine Reifungsprodukte gerichtet sind, wird im folgenden beschrieben unter Verwendung des QHNPR Pentapeptids als ein Beispiel. Kurz gesagt wird das QHNPR Peptid zu Eialbumin (Calbiochem) unter Verwendung des Benzidinbis-diazotierungsverfahrens, das im Jahre 1967 von Gregory et al. beschrieben wurde, konjugiert, wobei das Verhältnis der Peptidreste zu einem Molekül Ovalbumin 5:1 beträgt. Ratten wurde zur Zeit 0 1 mg des konjugierten Peptids injiziert. Zwei Monate nach der erstmaligen Injektion wurde den Tieren 0,5 mg des konjugierten Peptids injiziert und eine dritte Injektion von 0,5 mg des gleichen Peptids wurde zwischen 2 und 4 Monaten nach der zweiten Injektion durchgeführt. Das Antiserum wurde zwischen 2 und 4 Wochen im Anschluss an die dritte konjugierte Peptidinjektion geerntet und dieses wurde gegebenenfalls auf einer Affinitätschromatographiesäule, wie vorangehend beschrieben, gereinigt. Vorzugsweise ist die Injektion eine intraderma le Multi-Point-Injektion; üblicherweise werden zehn Injektionspunkte durchgeführt.
Weitere biologisch aktive Derivate der erfindungsgemäßen Peptide sind Moleküle, die strukturell und/oder chemisch zu den endogenen Peptiden in keiner Beziehung stehen, aber an die gleichen spezifischen Ziels binden und eine Agonisten- oder eine Antagonistenwirkung aufweisen. Vorzugsweise werden die biologisch wirksamen Derivate der therapeutischen Peptide, die in dem therapeutischen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, mit einer längeren in vivo-Halbwertzeit ausgestattet als ihre natürlichen endogenen Gegenstücke.
Die Verfahren, die es einem Fachmann ermöglichen, die biologisch wirksamen Derivate, die an die gleichen Zielmoleküle binden, zu selektieren und zu reinigen und die eine biologische Agonisten- oder Antagonisten-Wirkung des XQHNPR Peptids gemäß der Erfindung aufweisen, werden im Folgenden beschrieben.
Das biologisch aktive Derivat des XQHNPR Peptids kann ein Protein, ein Peptid, ein Hormon, ein Antikörper oder eine synthetische Verbindung sein, die entweder ein peptidisches oder ein nicht-peptidisches Molekül ist, wie jede Verbindung, die über die konventionellen Verfahren der organischen Chemie synthetisiert werden kann.
Die Selektion der biologisch wirksamen Derivate des XQHNPR-Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung wird durchgeführt durch sowohl das Bewerten der Bindung eines Kandidatenmolekül-Liganden an die bekannten Zielzellen oder Organe des XQHNPR Peptids, insbesondere des QHNPR-Pentapeptids als auch durch Bestimmen der metabolischen Veränderungen, die durch dieses Kandidatenmolekül an seinem Zielmolekül induziert worden sind wie die Synthese der primären oder sekundären Messenger-Metaboliten als Ergebnis eines Transduktionssignals über die Proteinkinasen oder Adenylatcyclase und die Aktivierung eines Proteins der G-Familie.
Die Bindung des Kandidatenmoleküls an primäre Kulturzellen, bestehende Zelllinien oder frische Gewebeproben (Kryoschnitte oder Teile) wird wie im Folgenden beschrieben durchgeführt.
Bindungsuntersuchungen des Kandidatenmoleküls werden üblicherweise bei einer tiefen Temperatur (4°C) durchgeführt. Jedoch sind Variationen des Standardverfahrens wie unten beschrieben, die eine Inkubation bei 37°C umfassen, nützlich, um die Internalisierung und das Schicksal des Pentapeptids oder eines biologisch wirksamen derivativen Kandidatenmolekül-Ligandens nach Bindung an der Zelloberfläche zu beurteilen (Wakefield, 1987). Um das Lesen des nachfolgend beschriebenen Protokolls zu vereinfachen, wird QHNPR-Pentapeptid anstelle eines biologisch wirksamen derivativen Kandidatenmoleküls verwendet.
Dementsprechend ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Screenen von Ligandenmolekülen bereitzustellen, die spezifisch an einen Zielrezeptor für das XQHNPR-Pentapeptid binden, umfassend die folgenden Schritte:

a) Herstellen einer konfluenten Zielzellen Kulturmonoschicht oder Herstellen einer Zielorganprobe oder einer Gewebeprobe;
b) Zugabe des zu untersuchenden Kandidatenmoleküls in Konkurrenz mit einer halb gesättigten Konzentration an markiertem Pentapeptid;
c) Inkubieren der Zellkultur, der Organprobe oder der Gewebeprobe aus Schritt a) in Gegenwart des markierten Kandidatenmoleküls für eine Zeit, die dazu ausreicht, dass die spezifische Bindung stattfinden kann;
d) Quantifizieren der Markierung, die sich spezifisch an die Zielzellkultur, an die Organprobe oder die Gewebeprobe gebunden hat.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Bestimmen der Affinität von Ligandenmolekülen, die spezifisch an den Zielrezeptor für das XQHNPR-Pentapeptid binden, bereitzustellen, umfassend die folgenden Schritte:

a) Herstellen einer konfluenten Zielzellkulturmonoschicht oder Herstellen einer Zielorganprobe oder einer Gewebeprobe;
b) Zugabe des Kandidatenmoleküls zu derjenigen, die vorher mit einer radiowirksamen oder nicht radiowirksamen Markierung markiert worden war;
c) Inkubieren der Zellkultur, der Organprobe oder der Gewebeprobe aus Schritt a) in Gegenwart des markierten Kandidatenmoleküls für eine Zeit, die dazu ausreicht, dass die spezifische Bindung stattfinden kann; und
d) Quantifizieren der Markierung, die sich spezifisch an die Zielzellkultur, die Organprobe oder Gewebeprobe gebunden hat.

Der Kandidatenmolekül-Ligand kann radioaktiv markiert (³²P, ³⁵S, ³H, ¹²⁵I etc.) oder nicht radioaktiv markiert (Biotin, Digoxigenin, Fluorescein etc.) sein.
Insbesondere sind die Materialien, die für die oben genannten Bindungsprozesse eingesetzt werden, folgende:

– Bindungspuffer I: 128 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgSO₄, 1,2 mM CaCl, 50 mM HEPES, pH 7,5, BSA (zwischen 0,1 und 2 mg/ml).
– Bindungspuffer II: Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (Gibco Brl) mit 25 mM HEPES versehen, pH 7,5 und 2 mg/ml BSA (zwischen 0,1 und 2 mg/ml).
– ³H-markiertes oder ¹²⁵I-markiertes QHNPR: Eine geeignete Verdünnung wird im Bindungsmedium unmittelbar vor jedem Experiment durchgeführt. Diese Verdünnung sollte in einem Minisorb^® Plastikröhrchen (Nunc) durchgeführt werden. Das ³H-markierte QHNPR besitzt eine spezifische Radioaktivität von 60 Ci/mMol (CEA, Saclay, Frankreich). Die ¹²⁵I-Markierungstechnik wird im folgenden beschrieben.
– QHNPR: Angemessen verdünnt unter Verwendung des gleichen Puffers und den Bedingungen wie für ³H-markiertes oder ¹²⁵I-markiertes QHNPR.
– Zelllöslichkeitspuffer: 1% (V/V) Triton X-100, 10% (V/V) Glycerol, 25 mM HEPES, pH 7,5, 1 mg/ml BSA.
– Zellen: 2 oder 10 cm² konfluente Monoschichten, die vorzugsweise in Multivertiefungsplättchen gesät worden waren, wurden verwendet. Untersuchungen, die Zellarten umfassen, die sich leicht von dem Substrat lösen, sollten mit Zellsuspensionen durchgeführt werden. Einzelne Zellsuspensionen können über mechanische Trennung (über Pipettieren) oder kurzes Behandeln mit einem Trennungspuffer enthaltend 1 mM EDTA, 128 mM NaCl, 5 mM Glucose, 25 mM HEPES, pH 7,4, 2 mg/ml BSA bei 37°C erhalten werden.

Die radiojodierte Markierung von QHNPR wird wie folgt durchgeführt:
Das Peptid QHNPR wird gemäß dem Verfahren von Greenwood et al., 1963, unter Verwendung von 1 mCi Na¹²⁵I (Amersham), 0,8 μg (1 nMol) Pentapeptid und 15 μg Chloramin T (Fluka) in 50 μl Natri umborat bei einem pH-Wert von 8 markiert. Nach einer zweiminütigen Reaktion wird das Gemisch über GF05 Gelfiltration (Pharmacia-LKB) chromatografiert, um das ¹²⁵I-markierte Pentapeptid zu isolieren und anschließend auf Umkehrphasen-Porapak Q^® (Waters-Millipore) chromatografiert, um das monojodierte markierte Pentapeptid zu eluieren. Die spezifische Radioaktivität, die einem Atom des Radioiod/Peptidmoleküls entspricht, wird auf 1500 Ci/mMol geschätzt.
Der Versuch selbst umfasst die folgenden Schritte:

a) Waschzellmonoschichten mit dem Bindungspuffer. Bindungspuffer I und II können abwechselnd in Versuchen eingesetzt werden, die bei 4°C durchgeführt werden, aber Bindungspuffer II sollte in Versuchen eingesetzt werden, die einen Inkubationsschritt bei 37°C umfassen. Wenn einmal gewaschen worden ist, lässt man die Monoschichten mit dem Bindungspuffer 30 Minuten lang bei 4°C äquilibrieren.
b) Der Puffer wird abgesaugt und eiskalter Bindungspuffer wird zu den Platten auf Eis gegeben. Das Volumen des Puffers beträgt etwa 1 ml/2 cm² Vertiefung.
c) ³H-markiertes oder ¹²⁵I-markiertes QHNPR, das in einem kleinen Volumen Bindungspuffer in etwa aufgelöst wurde, wird zugegeben. Die Konzentrationen von ³H-markiertem oder ¹²⁵I-markiertem QHNPR befinden sich in dem pH-Bereich, der von der Sättigungskurve (in der Nähe der Dissoziationskonstante Kd) definiert ist. Wenn erwünscht, kann das ³H-markierte oder ¹²⁵I-markierte QHNPR vor der Zugabe zu den Vertiefungen in den Puffer eingebracht werden, der in Schritt b) verwendet wird. Unmittelbar vor oder nach der Zugabe von ¹²⁵I-markiertem QHNPR wird unmarkiertes QHNPR zu denjenigen Vertiefungen gegeben, die es benötigen. QHNPR wird für zwei Zwecke verwendet. Steigende Konzentrationen an QHNPR werden verwendet, um die Indikatorkonzentrationen von ³H-markiertem oder ¹²⁵I- markiertem QHNPR in Experimenten zu vervollständigen, mit denen die Sättigungskurve der Bindung von QHNPR an die Zellen erstellt werden soll. Steigende Konzentrationen an QHNPR oder des Kandidatenmoleküls-Liganden werden auch beim konkurrierenden Rezeptorbindungsverfahren verwendet. Zusätzlich wird ein 50facher oder noch größerer Überschuss an unmarkiertem QHNPR in allen Experimenten verwendet, um die Menge an ¹²⁵I-markiertem QHNPR, das nicht spezifisch gebunden ist, zu bestimmen. Diese Bestimmung basiert auf der Annahme, dass ³H-markiertes oder ¹²⁵I-markiertes QHNPR und QHNPR miteinander im Hinblick auf die Bindung an relevante Bereiche hoher Affinität konkurrieren, aber nicht in Bezug auf nicht spezifische Bereiche auf der Oberfläche von Zellen oder Gefäßen.
d) Die versuche werden etwa 1 Stunde lang bei 4°C auf einer Plattform inkubiert, die bei 120 cpm oszilliert.
e) Das Medium wird abgesaugt. Die Kulturen werden fünfmal mit eiskaltem Bindungspuffer I gewaschen.
f) Löslichkeitspuffer (0,5 oder 1,5 ml für jeweils 2- oder 10-cm² Vertiefungen) wird zugegeben. Es wird 40 Min. lang bei 4°C inkubiert.
g) Die Radioaktivität in den löslichen Extrakten wird gemessen. Um die spezifische Bindung zu bestimmen, werden die Counts pro Minute, die in Plättchen erhalten wurden, die mit ³H-markiertem oder mit ¹²⁵I-markiertem QHNPR in Gegenwart eines Überschusses an QHNPR inkubiert worden waren, abgezogen von den Zählungen pro Minute in Vertiefungen, die mit ³H-markiertem oder ¹²⁵I-markiertem QHNPR allein erhalten wurden. Ein Aliquot jeder ³H-markierten oder ¹²⁵I-markierten QHNPR-Lösung, die in dem Experiment verwendet wurde, um die spezifischen Radioaktivitätswerte zu bestimmen, werden gezählt. Die Anzahl der Zellen pro Vertiefung wird gezählt, um die Menge an QHNPR, das pro Zelle gebunden ist, zu bestimmen.

Mit in etwa einstündiger Inkubation gemäß Schritt a) oben ist ein Inkubationszeitraum gemeint, der dafür ausreicht, dass QHNPR oder markiertes QHNPR an seine spezifischen Zielbereiche in der Zelle binden kann unter der Berücksichtigung, dass der Versuch bei einer Temperatur von 4°C durchgeführt wird, also bei einer Temperatur, bei der die Membranfluidität gering ist. Demnach beträgt eine angemessene Inkubationszeit zwischen 1 und 12 Stunden (über Nacht).
Andere Rezeptorbindungsverfahren können ebenfalls eingesetzt werden, um biologisch aktive Derivate des XQHNPR Peptids der Erfindung auszuwählen, wie von Whitcomb et al., im Jahre 1993, Epelbaum et al., im Jahre 1993, Ricci et al, im Jahre 1993, Loring et al, im Jahre 1993, Walsh et al, im Jahre 1995, Roberts et al., im Jahre 1995 oder auch Wu et al., im Jahre 1996, beschrieben. Die Bindungsversuche, die in den vorangehend genannten Artikeln beschrieben wurden, sind hier durch Inbezugnahme mit umfasst.
Um die biologische Wirkung eines interessierenden Kandidatenmolekül-Ligandens, der gemäß der im vorangehenden beschriebenen Bindungsversuche für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ausgewählt wurde, zu bestimmen und um herauszufinden, ob dieses selektive kompetitive Ligandenmolekül als ein Agonisten- oder als ein Antagonistenmolekül des XQHNPR Peptids gemäß der Erfindung fungiert, können verschiedene metabolische Versuche durchgeführt werden. Nachfolgend ist ein Adenylatcyclaseversuch beschrieben, der durchgeführt wird entweder auf primären Kulturen von Zielzellen oder auf Zelllinien oder auf Zielgewebehomogenisaten.
Kurz gesagt, Gewebehomogenisate oder kultivierte Zellen (1–100 μg Protein) werden inkubiert in 50 mM Tris/HEPES Pufer, pH 7,5, enthaltend 1 mM MgSO₄, 1 mM EGTA, 1 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin, 0,1% (Gew./Vol.) BSA, 1 mM ATP, 25 mM Krea tinphosphat, 260 U/ml Kreatinkinase (E.C. 2.7.3.2), und 6,5 U/ml Myokinase (E.C. 2.7.4.3) in einem Endvolumen von 100 μl 10 Min. lang bei 37°C. Die Reaktion wird durch Zugabe von 100 μl 0,5% (Gew./Vol.) SDS und 2 minütiges Kochen gestoppt. CAMP wird mit Dowex 50WX-8 extrahiert und über RIA (Stangi et al, 1993) analysiert.
Die Menge an cAMP, die als Antwort auf die Gegenwart des Kandidatenmoleküls-Liganden (10^-10–10^-5 M Bereich) produziert wurde, wird wie oben beschrieben bestimmt. Eine Stimulierung der Adenylatcyclasewirkung, welche äquivalent – wenn allein verwendet – oder größer – wenn verknüpft mit der suboptimalen Konzentration an QHNPR – als die Stimulierung der Adenylatcyclasewirkung ist, die von XQHNPR allein induziert wurde und insbesondere von QHNPR allein, wird als positiv bewertet und der Kandidatenmolekül-Ligand wird demnach als ein Agonist des XQHNPR Peptids gemäß der Erfindung klassifiziert.
In einer anderen Ausführungsform des Screeningverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Menge an cAMP, das in Gegenwart von sowohl XQHNPR, insbesondere QHNPR als auch dem Kandidatenmolekül-Liganden produziert wird, bestimmt. wenn die Gegenwart des Kandidatenmoleküls-Liganden es vermag, die Stimulierung der Adenylatcyclasewirkung, die von XQHNPR, insbesondere QHNPR induziert wurde, abzubauen oder zu blockieren, dann wird der Kandidatenmolekül-Ligand als Antagonistenverbindung des Peptids gemäß der Erfindung klassifiziert.
Tatsächlich verkörpert die Quantifizierung der Adenylatcyclasewirkung lediglich eine Ausführungsform der Screenverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Ein Fachmann weiss, dass diverse metabolische Veränderungen der Zellphysiologie sichtbar gemacht werden können, um die Agonisten- oder Antagonistenwirkung des Kandidatenmolekül-Ligandens, der untersucht werden soll, zu bestimmen. Andere metabolische Veränderungsquantifikationsversuche sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst, wie Veränderungen in der Kinasewirkung, in der GTP-G Protein abhängigen Wirkung, in der Herstellung von zell- oder gewebespezifischen Metaboliten, wie der Kollagenase über osteogene Zelltypen.
Deshalb erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zum Screenen von Ligandenmolekülen, die eine biologische Agonistenwirkung auf den Zielrezeptor des XQHNPR-Pentapeptids haben, umfassend die folgenden Schritte:

a) Herstellen einer konfluenten Zielzellkulturmonoschicht oder Herstellen einer Zielorganprobe oder einer Gewebeprobe (Kryoschnitte oder Teile);
b) Inkubieren der Zelkultur, Organprobe oder Gewebeprobe aus Schritt a) in Gegenwart des Kandidatenmoleküls (10^-10–10^-5 M) und einer submaximalen Konzentration an QHNPR (70 bis 80% Rezeptorsättigung) für eine Zeit, die dazu ausreicht, dass die Adenylatcyclaseaktivierung stattfinden kann;
c) Quantifizieren der Adenylatcyclasenwirkung, die in dem biologischen Material von Schritt a) vorliegt, jeweils in Gegenwart oder in Abwesenheit des Kandidatenmoleküls-Liganden und in Gegenwart oder in Abwesenheit einer submaximalen Konzentration an QHNPR.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zum Screenen von Ligandenmolekülen, die eine biologische Antagonistenwirkung auf den Zielrezeptor des RQHNPR Pentapeptids ausüben, umfassend die folgenden Schritte:

a) Herstellen einer konfluenten Zielzellkulturmonoschicht oder Herstellen einer Zielorganprobe oder einer Gewebeprobe.
b) Inkubieren der Zellkultur, Organprobe oder Gewebeprobe aus Schritt a) in Gegenwart des XQHNPR Peptids, insbesondere des QHNPR Peptids in Gegenwart oder in Abwesenheit des Kandidatenmoleküls für eine Zeit, die dazu ausreicht, dass die Adenylatcyclaseaktivierung stattfinden kann, insbesondere für 2 bis 20 Min., vorzugsweise 5 bis 15 Min., und besonders bevorzugt 10 Min.;
c) Quantifizieren der Adenylatcyclasewirkung, die in dem biologischen Material aus Schritt a) vorliegt, jeweils in Gegenwart oder in Abwesenheit des Kandidatenmolekül-Ligandens.

Wie oben erwähnt, umfasst ein weiterer metabolischer Versuch, der die Agonisten- oder Antagonistenwirkung des Kandidatenmoleküls-Liganden bestimmen soll, das Inkubieren des Ligandenkandidaten in Gegenwart einer osteogenen primären Zellkultur oder Zelllinie und entweder quantitatives und/oder qualitatives Bestimmen des Kollagens, das als Antwort auf die in vitro Stimulierung (mit 10^-10–10^-5 M Bereichskonzentration des zu testenden Moleküls) gebildet wird.
Wie bereits erwähnt, kann der Bindungsversuch und der metabolische Versuch wie der Adenylatcyclaseversuch auf primären Zellkulturen durchgeführt werden, auf bestehenden Zelllinien oder frischen Gewebeteilen, Gewebekryoschnitte oder Gewebehomogenisaten.
Eine bevorzugte Zelllinie, die bei den Screeningverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist eine osteogene klonale mesodermale Zelllinie von der Maus, genannt C1, die vom Teratocarcinom der Maus stammt. Sie exprimiert die SV40 Onkogene unter der Kontrolle des Adenovirus E1a Promotors (Chentoufi et al., 1993; Kellermann et al., 1990; Poliard et al., 1993; Poliard et al., 1995).
Andere bevorzugte Zelllinien bestehen aus verschiedenen klonalen Zelllinien, die vom gleichen Mausstamm abstammen, von welchem die oben genannte klonale Zelllinie C1 ursprünglich ab stammte, insbesondere klonalen Zelllinien, die von der epithelialen Zelle renaler proximaler Tubuli abstammen.
Andere bevorzugte Zelllinien verschiedenen Ursprungs sind die folgenden, die öffentlich von der ATCC Zellkultursammlung erhältlich sind.

1) Pankreaszelllinien: AsPC-1 (ATCC Nr. CRL1682), menschlichen Ursprungs BxPC-3 (ATCC Nr. CRL1687), menschlichen Ursprungs Capan-1 (ATCC Nr. HTB79), menschlichen Ursprungs Capan-2 (ATCC Nr. HTB80), menschlichen Ursprungs PANC-1 (ATCC Nr. CRL1469), menschlichen Ursprungs AR42J (ATCC Nr. CRL1492), Ratten-Ursprung ARIP (ATCC Nr. CRL1674), Ratten-Ursprung
2) 2)Prostatazelllinien: DU145 (ATCC Nr. HTB81), menschlichen Ursprungs LNCaP.FGC(ATCC Nr. CRL1740), menschlichen Ursprungs PC-3 (ATCC Nr. CRL1435), menschlichen Ursprungs
3) Nierenzelllinie: RAG (ATCC Nr. CCL142), Maus-Ursprung
4) Submandibulare Drüsenzelllinie: SCA-9 Clone 15(ATCC Nr. CRL 1734), Maus-Ursprung
5) Darmzelllinie: IA-XsSBR (ATCC Nr. CRL1677), Ratten-Ursprung
6) Osteogene Zelllinien: FC25T/ATCC Nr. CRL 6090), Katzen-Ursprung D 17 (ATCC Nr. CCL183), Hunde-Ursprung 143B (ATCC Nr. CRL8303), menschlichen Ursprungs HOS (ATCC Nr. CRL1543), menschlichen Ursprungs Saos-2 (ATCC Nr. HTB85), menschlichen Ursprungs SK-ES-1 (ATCC Nr. HTB86), menschlichen Ursprungs UMR-106 (ATCC Nr. CRL1661), Ratten-Ursprung UMR-108 (ATCC Nr. CRL1663, Ratten-Ursprung

Für den Zweck einer spezifischen Ausführungsform des metabolischen Versuchs gemäß der vorliegenden Erfindung, nämlich der Kollagenanalyse, wird der Versuch wie unten beschrieben ausgeführt.
Konfluente osteogene Zellen, insbesondere die C1 Zelllinie, die oben beschrieben ist, werden 24 Stunden lang mit 50 μCi/ml 4,5 [³H]Prolin (32 Ci/mMol; Commissariat à l'Energie Atomique, Saclay, Frankreich) in DME, versetzt mit 1% FBS, 100 μg/ml Ascorbinsäure und 50 μg/ml b-Aminopropionitrilfumarat (Sigma Chemical Co., Saint Louis, Missouri, USA) markiert. Die Zellen werden in 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) enthaltend 150 mM NaCl, 25 mM EDTA, 10 mM N-Ethylmaleimid und 2 mM PMSF gesammelt und mit dem Kulturmedium vereinigt. Nach Sonikation und Zugabe von Trichloracetat (TCA) (10%) wird der unlösliche Rückstand über Zentrifugation gesammelt.
Die Menge an [³H]Prolin, das in ein durch Kollagenase verdaubares Protein und nicht-Kollagenase-Protein eingebracht wurde, wird wie von Peterkofsky et al. im Jahre 1971 beschrieben, bestimmt.
Kollagentypen werden über PAGE bestimmt: In 0,5 M Essigsäure resuspendierte Pellets werden mit 100 μg/ml Pepsinfumarat (Sigma Chemical Co., Saint Louis, Missouri, USA), pH 2,0, 4 Stunden lang bei 4°C digeriert. Der Pepsinextrakt, der auf einen pH-Wert von 8,0 gebracht worden ist, wird dialysiert und lyophylisiert. Die Proben werden anschließend über SDS-PAGE analysiert. Verzögerte Reduktion mit 2-Mercaptoethanol wird in einigen Proben verwendet. Die markierten Proteine werden über Fluorographie oder Autoradiografie visualisiert und über eine beta-radiobildgebende Vorrichtung quantifiziert.
Andere metabolische Ereignisse wie die Deponierung der mineralischen Komponenten auf der Kollagenmatrix folgen beim Bestimmen der metabolischen Veränderungen, die von den gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten therapeutischen Molekülen induziert wurden. Für diesen Zweck wird der im folgenden beschriebene versuch verwendet:
Zellkulturen: Die klonale mesodermale Zelllinie C1 wird verwendet. Die C1 Zellen werden auf 3 × 10⁵ Zellen in 100 mm-Durchmesser unbehandelten Plastikschüsseln plattiert und in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM, Gobco, Grand Island, N.Y., USA) mit 10 %igem fötalem Kalbserum (FCS) kultiviert. Nach 8 bis 10 Tagen Kultivierung bildeten sich dreidimensionale Kluster. Zu dieser Zeit (Tag 0) werden die Zellen in DMEM mit 1 %igem FCS in Gegenwart von 10 mM beta-Glycerophosphatase (Sigma) und 50 μg/ml Ascorbinsäure (Sigma) kultiviert. In einigen Vertiefungen wird 50 μg/ml Tetracylin zu dem Medium gegeben, um über Fluoreszenz-Markierung das Mineral, das in der Matrix enthalten ist, sichtbar zu machen. Das Medium wird alle drei Tage ausgetauscht und die Kultivierungen werden für einen Zeitraum von bis zu 30 Tagen durchgeführt.
Biochemische Bestimmungen: Nach 0, 2, 7, 11, 16, 22 und 30 Tagen werden die Kulturen gesammelt, dreimal in calciumfreien PBS gespült und in drei gleiche Teile für die Bestimmung von Calcium, alkalischer Phosphatasewirkung und DNA Synthese getrennt. Für die Bestimmung von Calcium werden die Kulturen in 1 ml 6N HCl 1 Stunde lang bei 100°C aufgelöst. Calcium wird in Aliquoten über Atomabsorptionsspektrometrie nach Auflösen in Lanthanchlorid bestimmt. Zur Bestimmung der alkalischen Phosphatasewirkung wird 1 ml kaltes destilliertes Wasser zu den Kulturen gegeben. Nach 10sekündiger Ultraschallbehandlung wird das unlösliche Material durch Zentrifugieren entfernt. Einige Proben werden 1 Stunde lang auf 56°C erwärmt, um die knochenartige (hitzelabile) alkalische Phosphatasewirkung zu messen. Die Wir kung des Enzyms wird durch Messen der Menge an p-Nitrophenol, das bei 37°C nach 30 Min. gebildet wurde, bestimmt. Der Zellproteingehalt wird über das Verfahren, das bei Lowry et al. 1951 beschrieben wurde, gemessen.
Das nicht-radioaktive beta-Glycerophosphat kann ersetzt werden durch ein radioaktives Molekül. Die Phosphorverbindung, die üblicherweise als Knochenlokalisierungsmittel verwendet wird, ist ein anorganisches Phopsphat oder Pyrophosphat. Ein radioaktives Molekül, das in dem obigen Versuch eingesetzt werden kann, ist Tetranatrium ³²P Pyrophosphat (NEX 019, New England Nuclear) oder ⁹⁹Technetium, das an die Phosphorverbindung bindet.
Demnach ist es ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Screenen von Ligandenmolekülen bereitzustellen, die eine Agonisten- oder eine Antagonisten-biologische Wirkung bezüglich des Zielrezeptors des XQHNPR Pentapeptids besitzen, bereitzustellen, das folgende Schritte umfasst:

a) Kultivieren einer eukaryotischen Zelle, die Kollagen synthetisieren kann;
b) Inkubieren der eukaryotischen Zelle von Schritt a) in beta-Glycerophosphat in Gegenwart des Kandidatenmoleküls (10^-10–10⁵ M) und einer submaximalen Konzentration an QHNPR-Peptid;
c) Quantifizieren der Produktion eines spezifischen Metaboliten wie Calcium, alkalische Phosphatase oder DNA-Synthese, jeweils in Gegenwart oder in Abwesenheit des Kandidatenmolekül-Ligandens und in Gegenwart oder in Abwesenheit einer submaximalen Konzentration an QHNPR.

Die eukaryotische Zelle des oben beschriebenen Verfahrens kann entweder eine Zelle sein, die transfiziert oder transformiert wurde mit einer Nukleinsäure, die für Kollagen kodiert oder eine eukaryotische Zelle, die dazu fähig ist, Kollagen zu synthetisieren auf eine konstitutive oder induzible Weise. Eine bevorzugte Zelle ist eine Säugerzelle, die auf natürliche Weise Kollagen synthetisieren kann, wie die C1-Zelllinie.
Andere metabolische Veränderungen, die durch die therapeutischen Moleküle induziert wurden, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt worden sind, können ebenfalls untersucht werden wie andere Enzymversuche, Ionentransportversuche oder Signaltransduktionsversuche. Enzymversuche, die durchgeführt werden können, umfassen Acetylcholinesterase (Ellmn G.L. et al., 1961, Biochem. Pharmacol., 7:88), Cathepsin (Barret A.J. et al., 1981, Methods Enzymol., 80:535), ATPase, Cyclooxygenase (Mitchell J.A. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:11693), Guanylatcyclase (Wolin M.S. et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 13312), Lipoxygenase (Shimizu T. et al., Proc., Natl. Acad. Sci., 1984, 81:689), Monoaminoxidase (Weyler W. et al., 1985, J. Biol. Chem., 260:13199), Myeloperoxidase (Desser R.K. et al., 1972, Arch. Biochem. Biophys., 148:452), Phosphodiesterase (Nicholson C.D. et al., 1989, Br. J. Pharmacol., 97:889), Proteinkinase (Hannun Y.A., et a., 1985, J. Biol. Chem., 260:10039), Tyrosinhydroxylase (Nagatsu et al., 1964, Analyt. Biochem., 9:122) oder Xanthinoxidase (McCord J.K. et al., 1969, J. Biol. Chem., 244:6049)-versuche. Ionentransportversuche umfassen Ca Pumpen (Jean T. et al., 1986, J. Biol. Chem., 261:16414), Ca Kanal (Galizzi J.P. et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:6947, Na Kanal (Jacques Y. et al., 1978, J. Biol. Chem., 253:7383), NaK Pumpen (Chassande O. et al., 1988, Eur. J. Biochem., 171:425), Na-Ca Antiport (Barle A.B. et al., 1990, Am. J. Physiol., 259:19), Na-H Antiport (Jean T. et al., 1986, Eur. J. Biochem., 160:211), Na/K/Ct Cotransport (Chassande O. et al., 1988, Eur. J. Biochem., 171:425)-versuche. Signaltransduktionsversuche, die ebenfalls verwendet werden können, umfassen Ca Freisetzung (Grynkievicz G. et al., 1985, J. Biol. Chem., 260:3440) oder PI Umsatz (White T.E. et al., 1993, Br. J. Pharmacol., 108:196). Der technische Inhalt der oben genannten Artikel in Bezug auf die metabolischen Versuche ist hier durch Inbezugnahme mitumfasst.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zum Screenen von Ligandenmolekülen, die eine Agonisten- oder eine biologische Antagonistenwirkung auf den Zielrezeptor des XQHNPR-Pentapeptids haben, umfassend die folgenden Schritte:

a) Herstellen der konfluenten Zielzellkulturmonoschicht oder Herstellen einer Zielorganprobe oder einer Gewebeprobe (Kryoschnitte oder Teile);
b) Inkubieren der Zellkultur, der Organprobe oder Gewebeprobe nach Schritt a) in Gegenwart des Kandidatenmoleküls (10^-10–10^-5 M) und einer submaximalen Konzentration an QHNPR für eine Zeit, die dazu ausreicht, dass der metabolische Austausch stattfindet;
c) Quantifizieren der Produktion des korrespondierenden Metaboliten, jeweils in Gegenwart oder in Abwesenheit des Kandidatenmolekül-Ligandens und in Gegenwart oder in Abwesenheit einer submaximalen Konzentration an QHNPR.

Der metabolische Austausch, auf den im oben beschriebenen Screeningverfahren Bezug genommen wurde, ist abwechselnd ein Austausch bei der Herstellung jeder der Metaboliten, die nach den oben beschriebenen Verfahren untersucht wurden. Deshalb hängt die Zeit, die dafür ausreicht, dass der metabolische Austausch stattfinden kann, von dem untersuchten Metaboliten ab und ist in jeder Artikelreferenz, die vorangehend angegeben wurde, angegeben.
Gewebeteile, Gewebekryoschnitte oder Gewebehomogenisate werden bei der Durchführung der Bindung oder der metabolischen Versuche eingesetzt, um die interessierenden Ligandenmoleküle, die die biologisch wirksamen Derivate von XQHNPR, insbesondere QHNPR, Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung, darstellen, auszuwählen. Bevorzugte Gewebeproben stammen von Niere, Pankreas, Knochen, Dentalgewebe, glandulärer Magenschleimhaut, Prostata und Darm sowie von Speicheldrüsen.
Gewebehomogenisate werden hergestellt, indem zunächst die Biopsien in flüssigen Stickstoff eingetaucht werden. Die gefrorenen Proben werden anschließend homogenisiert in 20 Vol. eiskaltem 50 mM Tris/HEPES Puffer, pH 7,5, enthaltend 1 mM EGTA, 0,3% (Gew./Vol.) Bazitrazin, 20 mM 4-Amidinophenylmethansulfonylfluorid und 10 mM Leupeptin mit einem motorbetriebenen Teflonglashomogenisator. Die Homogenisate werden bei 24000 G 20 Min. lang bei 4°C zentrifugiert und die Pellets einmal mit 50 mM Tris/HEPES, pH 7,5, enthaltend 1 mM EGTA gewaschen. Die so erhaltenen Pellets werden in 50 mM Tris/HEPES, pH 7,5, enthaltend 1 mM EGTA und 0,3% (Gew./Vol.) Bacitracin suspendiert und bei –20°C suspendiert. Weitere Details des Verfahrens wurden im Jahre 1993 von Stangi et al. beschrieben. Je nach Ursprung des zu homogenisierenden Gewebes sind die Verfahrensweisen, die von Stangi verwendet werden, durch Inbezugnahme hier umfasst.
Um intakte Gewebeproben beispielsweise von der Niere zu erhalten, wird das folgende Verfahren angewendet: Bevor das Organ oder Gewebe gewonnen wird, beispielsweise aus einer Ratte, wird das Tier mit Chloralhydrat (35%, 0,14 ml/100 g Körpergewicht) oder mit Pentobarbital (45 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert. Im Anschluss daran wird eine intrakardiale Perfusion mit 100 ml 4°C isotonischer Saccharose durchgeführt (Loring et al., 1993).
Nieren können im Anschluss an eine menschliche Biopsie oder von männlichen Wistar-Ratten unmittelbar nach deren Tod über zervikale Dislokation oder Anästhesie, wie sie oben beschrieben wurde, erhalten werden. Gewebeproben werden sofort in Tissue-Tek (Miles, Elkhart, IN) eingebettet und in schmelzendem Isopentan (bei –70°C) zu Korkbergen ohne vorherige Fixierung gefroren. Die Proben werden bei –70°C bis zur Verwendung gelagert. 10 bis 30 μm dicke Schnitte werden in einem Kryostat geschnitten (bei einem Temperaturbereich von –20°C bis –30°C) und werden auf unbeschichteten Glasstücken von niedrigem Eisengehalt schmelzbar befestigt. Diese werden dann sofort eingesetzt oder vakuumgetrocknet und bei –20°C mit Silikagel für einen Zeitraum von bis zu 5 Tagen bis zur Verwendung gelagert. Eine solche Technik wurde von Walsh et al. im Jahre 1995 beschrieben. Die Einzelheiten dieser Technik sind durch Inbezugnahme hier mit umfasst.
Alternativ werden die Gewebeschnitte in Trockeneis in Gegenwart von Isopentan gefroren und auf Glasträgern schmelzbar befestigt und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert (Whitcomb et al., 1993).
In einem alternativen Verfahren zum Erhalten von frischen Gewebeproben werden Proben der menschlichen Nierenrinde und der Medulla von Subjekten erhalten, die eine Nephrektomie durchlaufen. Die gesammelten Nierenteile werden in eine eiskalte 0,9%ige NaCl Lösung gegeben, um Blut und Zellablagerungen zu entfernen. Blöcke, die Nierenrinde und Medulla enthalten oder getrennte Proben von Cortex oder Medulla, werden in einem kryoprotektierenden Medium (OCT, Ames, IA) eingebettet und in gekühltem Isopentan mit flüssigem Stickstoff oder Trockeneis eingefroren. OCT-Blöcke werden bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Serielle 8 μm dicke Schnitte werden unter Verwendung eines –20°C Mikrotomkryostat erhalten, auf Gelatine beschichteten Objektträgern befestigt und luftgetrocknet. Eine solche Technik wurde von Ricci et al. im Jahre 1993 beschrieben.
Bevorzugte biologisch aktive Derivate des XQHNPR-Peptids der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung weisen bessere pharmakokinetische Eigenschaften auf als das endogene natürliche oder synthetische XQHNPR-Peptid und besitzen demnach eine längere in vivo-Halbwertszeit verglichen mit ihren natürlichen Vertretern.
Ein verfahren zum Bestimmen der pharmakokinetischen Eigenschaften der Ligandenmoleküle, die durch den oben beschrieben Bindungsversuch und den metabolischen versuch, ermittelt wurden, wird in Beispiel 3 dargestellt. Alternativ oder auch zusätzlich wird die Plasmaclearance der ausgewählten Ligandenmoleküle gemäß der Technik untersucht, die von Wu et al. im Jahre 1996 beschrieben wurde oder gemäß der Technik, die von Ezan et al. im Jahre 1986 beschrieben wurde oder von Ezan et al. im Jahre 1996; diese Techniken sind hier durch Inbezugnahme umfasst.
Die oben beschriebenen biologisch wirksamen Derivate, die vor der Entdeckung durch die Erfinder nicht identifiziert werden konnten, sind ebenfalls ein Ziel der vorliegenden Erfindung.
Demnach betrifft die Erfindung auch biologisch aktive Derivate des XQHNPR Peptids, die ausgewählt wurden gemäß dem zuvor beschriebenen Screenverfahren unter der Voraussetzung, dass sie nicht die folgende Struktur haben:
Y-HNP-Z, worin Y ein Glutamin (Q) oder einen Pyroglutaminsäurerest beschreibt und Y eine OH-Gruppe oder eine basische Aminosäure darstellt, wobei die basische Aminosäure ein Lysin (K) oder ein Arginin ist. Tatsächlich ist das 146 Aminosäurenprotein, das das SMR1 Peptid selbst darstellt (WO 90/03981) ebenfalls ausgeschlossen als Teil der biologisch wirksamen Derivate des XQHNPR-Peptids. Jedoch ist die therapeutische Verwendung dieser Moleküle, die selbst von der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen sind, ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung.
Die biologisch wirksamen Derivate des XQHNPR-Peptids, die in den erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden, wurden in einer bevorzugten Ausführungsform in erster Linie über ihre Fähigkeit, sich mit den gleichen Zielmo lekülen wie dem XQHNPR, insbesondere QHNPR-Peptid zu verbinden, ausgewählt und in zweiter Linie über ihre Fähigkeit metabolische Veränderungen (Adenylatcyclase-Wirkungsstimulierung, Kollagenproduktion etc.) in dem Zielmolekül zu induzieren oder diese metabolischen Veränderungen des Zielmoleküls, die von dem XQHNPR, insbesondere QHNPR-Peptid induziert werden, abzubauen, zu blockieren oder zu verhindern.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von therapeutischen Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge des XQHNPR-Peptids oder eines seiner biologisch wirksamen Derivate enthalten.
Wie vorangehend ausgeführt, ist die Verwendung der therapeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung indiziert im Falle eines hydromineralischen Ungleichgewichts des Körpers. Diese Verwendung der Zusammensetzung ist auch dann indiziert, wenn ein Defekt im normalen endogenen Pegel des QHNPR Pentapeptids bei einer biologischen Probe des Patienten diagnostiziert wurde, insbesondere bei Patientenflüssigkeiten wie Serum oder Plasma, Speichel und Urin. Die Pentapeptidkonzentration in der biologischen Probe wird als gestört angesehen, wenn sie wenigstens fünfmal geringer als die nicht pathologische Konzentration ist, die üblicherweise gefunden wird, und ebenso, wenn sie mindestens fünffach so hoch ist wie die nicht-pathologische Konzentration, die üblicherweise in dieser besonderen biologischen Probe gefunden wird.
Ein Diagnoseverfahren, das die Bestimmung der Konzentration des QHNPR-Pentapeptids in einer biologischen Probe, insbesondere in Serum oder Plasma ermöglicht, ist ein kompetitiver Radioimmunoassay (RIA), wie er von Rougeot et al. im Jahre 1994 beschrieben wurde.
Kurz gesagt, wird die Flüssigphasen RIA in 0,2 M Tris/HCl, pH 8,5, durchgeführt enthaltend 0,25% Rinderserumalbumin (Fr 5, Miles), 0,1% Triton X-100 (Sigma), 1000 KIU (Kallikrein International Unit)/ml Trasylol (einen Trypsin- und Kallikrein-Inhibitor; Bayer), EDTA (1 mM) und 0,1 g/l NaN₃. Handelsübliches oder als Probe (0,1 ml), 0,1 ml verdünntes Antipentapeptidserum (Rougeot et al., 1994) und ¹²⁵I-markiertes Pentapeptid (15 × 10³ dpm, 0,1 ml) werden über Nacht bei 4°C inkubiert. Die gebundenen und die freien Fraktionen werden durch Fällen mit Propanol getrennt (10 μl normales Hasenserum und 1 ml eiskaltes 1-Propanol) und die Radioaktivität des Niederschlags wird unter Verwendung eines Gamma-Zählers bestimmt. Die Plasma-, Speichel- oder Urinproben werden üblicherweise in vorgekühlten Reagenzröhrchen gesammelt, die ein Gemisch an Peptidaseinhibitoren (1 mM EDTA, 1000 U/ml Aprotinin, 130 μm Bestatin, 1 μm Leupeptin, 0,4 mM Pefabloc, 1 μM Pepstatin) enthalten.
Das oben beschriebene diagnostische Verfahren wird nun als medizinischen Werkzeug angewendet, um die Art des Defekts festzustellen, der mit einem Mineralionenungleichgewichts-Symptom in Verbindung gebracht werden kann. In seiner medizinischen Anwendung ist dieser Diagnosetest ebenfalls ein Ziel der vorliegenden Erfindung. Die weiteren Schritte dieses Diagnosetests sind die Folgenden:

a) Inkubieren eines markierten XQHNPR, insbesondere QHNPR-Peptids mit einem polyklonalen oder monoklonalen Antikörper, der gegen das gleiche Peptid gerichtet ist;
b) Inkontaktbringen der Immunkomplexe, die mit einer biologischen Probe gebildet wurden, die von einem zu testenden Patienten stammt, von dem vermutet wird, dass er ein endogenes nicht markiertes XQHNPR-Peptid, insbesondere das QHNPR-Peptid enthält;
c) Detektieren der monoklonalen oder polyklonalen Antikörper gebundenen markierten Peptide, die von dem endogenen nicht markierten XQHNPR, insbesondere QHNPR-Peptid, das in der biologischen Probe enthalten ist, nicht ersetzt worden sind, um die Konzentrationen dieses endogenen Peptids, das in der biologischen Probe enthalten ist, zu bestimmen;
d) Vergleichen der Konzentration des XQHNPR, insbesondere QHNPR-Peptids, das unter Schritt c) gefunden wurde mit der Konzentration an XQHNPR, insbesondere QHNPR-Peptid, die üblicherweise in einem gesunden Individium gefunden wird;
e) Berechnen der Menge der therapeutischen Zusammensetzung, die dafür notwendig ist, den Mangel an XQHNPR-Peptid in den Körperflüssigkeiten und Geweben auszugleichen.

Die Menge an therapeutischem Molekül, die verabreicht werden soll, wird unter Berücksichtigung der spezifischen in vivo Pharmakokinetika dieses therapeutischen Moleküls, der in vivo Pharmakokinetika, die, wie in Beispiel 3 beschrieben, bestimmt wurden und selbstverständlich der üblichen Menge an XQHNPR insbesondere QHNPR-Peptid, die üblicherweise in den Körperflüssigkeiten (Plasma, Speichel, Urin) oder Organen gefunden wird, berechnet.
Das markierte XQHNPR-Peptid, das in dem diagnostischen Test verwendet wurde, wird radioaktiv oder nicht-radioaktiv markiert.
Der polyklonale Antikörper, der in diesem diagnostischen Verfahren verwendet wurde, kann gegebenenfalls in Form eines Immunserums verwendet werden.
Das besondere quantitative Immunodetektionssystem, das von den Erfindern entwickelt wurde, ist sowohl sehr spezifisch als auch empfindlich: 50% Verdrängung des ¹²⁵I-markierten Pentapeptids QHNPR wird mit nicht mehr als 570 fMol Pentapeptidstandard ([Glp¹] Pentapeptid oder [Gln¹] Pentapeptid erhalten. Das De tektionslimit (80% Bindung) ist 106 fMol Standardpeptid. Der Inter-Assay Variationskoeffizient beträgt 12%, n = 24. Die Cross-Reaktion des Antiserums mit der Tetrapeptidsequenz (QHNP) und dem Thyrotropin freisetzenden Hormon (Glp-His-Pro) beträgt weniger als 0,01%.
Gemäß einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die XQHNPR Peptidkonzentrationen, die gemäß dem oben beschriebenen Diagnostikverfahren bestimmt wurden, dazu verwendet, die Menge des XQHNPR-Peptids oder eines seiner biologisch wirksamen Derivate, die dem Patienten verabreicht werden soll, um dem diagnostischen Mangel entgegenzuwirken, im Falle eines niedrigen Pegels an endogenem Peptid und um deren pharmakokinetische Parameter in pathologischen und nichtpathologischen Subjekten zu bestimmen.
Die therapeutischen Zusammensetzungen, die das SMR1 Protein oder SMR 1 Reigungsprodukte enthalten oder deren Derivate und die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können entweder in Form einer flüssigen Lösung, in Gelform oder in Form eines trockenen Pulvers eingesetzt werden.
Die therapeutischen Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise komplexiert mit Metallsalzionen wie Ca⁺⁺, Cu⁺⁺, Ni⁺⁺, Mg⁺⁺ oder Al⁺⁺ entweder direkt oder indirekt mit den Trägerionenproteinen oder auch Calciumphosphat wie beschrieben in FR 2 543 439 und FR 2 181 426 (Reliveld et al.) oder auch mit ATP.
Die therapeutischen Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung können auch mit Dextran oder Dextranderivaten komplexiert werden.
Eine spezifische Ausführungsform der Verwendung kontrollierter Zuliefersysteme, die Dextranmoleküle enthalten, wird von der „long Action (LA)" Form und „Renewable Long Action (RLA)" Form dargestellt. Die LA Form besteht aus Mikrosphären aus Polyaktischer Säure, die Bromocriptin in Dextran enthält. In der RLA Form ist Bromocriptin in Mikrosphären aus D, L-Polyaktischer-Coglycolidglucose enthalten, die sich in einem Zeitraum von weniger als drei Monaten nahezu vollständig abbaut und die es ermöglicht die Verabreichung über einen großen Zeitraum hinweg zahlreiche Male zu wiederholen (Montini et al., 1986, Kato et al., 1988).
Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen lokal verabreicht, in der Nähe des Bereichs, Organs oder Gewebes, das behandelt werden soll. Gemäß einer alternativen Ausführungsform werden die therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung auf oralem Weg verabreicht, um systemisch oder über die bukale Schleimhaut oder die Magenschleimhaut oder über den Gastro-Intestinaltakt zu wirken. Solche therapeutischen Zusammensetzungen können in Form einer Salzlösung oder einer Tablette, vorzugsweise einer Tablette zum kontrollierten Freisetzen, vorliegen. Eine typische Tablette zum kontrollierten Freisetzen wird in der WO 96/22768 beschrieben, die etwa 30 bis etwa 70 Gew.% eines oder mehrerer Celluloseether wie Hydroxypropylmethylcellulose enthält und etwa 30 bis etwa 70 Gew.% einer inerten Substanz wie Maisstärke.
In einer anderen Ausführungsform der erfrindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen sind das XQHNPR-Peptid oder seine biologisch wirksamen Derivate in einer Vorrichtung zur kontrollierten Freisetzung enthalten, die im Körper lokal angeordnet wird, um eine verzögerte Abgabe der wirksamen Moleküle in die Umgebung des Bereichs, der behandelt werden soll, zu erhalten.
Vorzugsweise sind die Vorrichtungen zum kontrollierten Freisetzen, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, Lipid- oder Polymermikropartikel, die sich im Körper langsam auflösen oder hydrolysiert werden, insbesondere im Magen oder im Gastrointestinaltrakt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtungen zum kontrollierten Freisetzen gemäß der vorliegenden Erfindung können letztere lokal implantiert werden, um einen begrenzten Diffusionsbereich des wirksamen Moleküls in der Umgebung des Organs oder Gewebes, das behandelt werden soll, sicherzustellen.
Bevorzugte Vorrichtungen zum nachhaltigen Freisetzen gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten bioabbaubare Polymere wie sie in der WO 97/01331 beschrieben wurden. Das Polymer kann ein Polysaccharid sein wie Natriumalginat gemäß der WO 96/13253. Eine nachhaltige Zubereitung, die biologisch abbaubar ist, ist vorzugsweise zusammengesetzt aus einem Polysaccharid, das mit kationischen Molekülen wie Chitosan beschichtet ist, wobei der Träger langsam enzymatisch hydrolysiert wird, beispielsweise über Lysozym, in vivo nach der Freisetzung des wirksamen Moleküls.
Das Polymer, das in den Vorrichtungen zum kontrollierten Freisetzen gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, kann auch ein Polyvinylpyrrolidon-artiges Polymer sein, wie es in der WO 88/04922 beschrieben ist oder ein Stärkehydrolysat wie in der WO 94/17676 beschrieben.
Gemäß einer spezifischen Ausführungsform ist das Polymer ein bioadhäsives Polymer wie Carboxymethylcellulose, Carbopol^®, Polycarbophil^® oder Natriumalginat, das sich mit einer hervorragenden Wirksamkeit an das Mucin bindet, das auf der Oberfläche des Epitheliums vorliegt (Robinson et al., 1998). Diese Polymere werden insbesondere bei einer oralen Verabreichung des Medikaments eingesetzt.
Andere bevorzugte Vorrichtungen zum nachhaltigen Freisetzen gemäß der vorliegenden Erfindung fallen unter polymere Mikrobeads, beispielsweise poröse vernetzte polymere Mikrobeads, wie sie in der WO 95/33553 beschrieben sind.
Eine andere Ausführungsform für Vorrichtungen zum kontrollierten Freisetzen gemäß der vorliegenden Erfindung sind Liposome, entweder in hydratisierter Form wie gemäß der WO 86/01102 oder der WO 95/22961 (Capron et al.) oder in dehydratisierter Form wie gemäß der WO 86/01103. von anderen Lipidemulsionen, die als Arzneistofffreisetzungssysteme verwendet wurden und die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wurde von Davis et al. im Jahre 1988 dargelegt, dass sie oral, parenteral oder auf intravenösem Wege verabreicht werden können. Die Liposome können Sacchariddeterminanten enthalten, die sich mit spezifischen Zellmembrankomponenten verbinden, um die Lieferung des wirksamen Moleküls hin zu einer ausgewählten Zielzelle zu erleichtern, insbesondere Sacchariddeterminanten, die sich mit spezifischen Lektinen der Zellmembran (Shen, 1988) verbinden.
Eine weitere Ausführungsform von Formulierungen zum nachhaltigen Freisetzen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden, besteht in einem Partikelvektor, der von der inneren Schicht bis zur äußeren Schicht aufweist:

– Einen nicht flüssigen hydrophilen Kern, beispielsweise eine vernetzte Polysaccharid- oder Oligosaccharidmatrix, wobei auf diesen Kern gegebenenfalls ionische Liganden aufgepropft wurden, die mindestens eine Gruppe tragen, ausgewählt aus Phosphat, Sulfat, Carboxylsäure, quartärem Ammonium, sekundärem Amin oder tertiärem Amin.
– Eine externe Schicht, die aus Lipidverbindungen besteht, die auf den Kern über kovalente Bindungen gepfropft wurden.

Solch ein besonderer Vektor wird in der WO 94/23701 (Perrin et al.) beschrieben.
Ausnahmsweise kann das XQHNPR-Peptid gemäß der Erfindung über ein transdermales iontophoretisches Zuliefersystem wie es von Chien et al. im Jahre 1988 beschrieben wurde der Haut zugeführt werden.
Die therapeutischen Zusammensetzungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, enthalten eine pharmazeutisch wirksame Menge des XQHNPR-Peptids oder eines seiner biologisch wirksamen Derivate.
Die Menge des wirksamen Grundbestandteils, der in einer therapeutischen Dosierung des XQHNPR-Peptids oder biologisch wirksamen Peptidderivats enthalten ist, liegt im Bereich zwischen 10 μg/kg und 10 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise zwischen 50 μg/kg und 5 mg/kg Körpergewicht und noch bevorzugter Weise zwischen 200 μg/kg und 1 mg/kg Körpergewicht.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine therapeutische Zusammensetzung bereitzustellen, enthaltend eine pharmazeutisch wirksame Menge des SMR1-Proteins, seiner Reifungsprodukte, vorzugsweise des XQHNPR-Peptids, vorzugsweise des QHNPR-Pentapeptids sowie der biologisch wirksamen Derivate des letzteren, die gemeinsam mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge eines anderen Moleküls, das bei der Regulierung des Mineralionenhaushalts involviert ist, verwendet werden. Die bevorzugten Moleküle, die mit dem SMR1-Protein oder dessen Derivaten verbunden werden sollen, sind das Parathyroidhormon (PTH), Calcitonin (CT) und 1,25-Dihydroxyvitamin D.
Die Tatsache, dass die Erfinder in der männlichen Ratte die genaue topografische Verteilung der Zielorgane für XQHNPR-Peptide bestimmt haben, ermöglichte es den Erfindern, die Rolle dieser Peptide in lokalen und peripheren Systemen zu verstehen und zu spezifizieren.
Insbesondere haben die Erfinder die peripheren Ziele für das sekretorische Reifungsendprodukt von SMR1, das Pentapeptid über in vivo Untersuchung der Rohgewebeverteilung des radiomarkierten Peptids über Gesamtkörperautoradiographie (WBA) (Ullberg et al., 1981) ausgearbeitet. Dieses verfahren stellt ein visuelles Bild des gesamten Tiers bereit, wodurch es möglich gemacht wird, gleichzeitig die Aufnahme des Pentapeptids in einer großen Anzahl von Geweben und Bereichen zu untersuchen. Ferner ist dieser Ansatz deutlich aktraktiver als ein in vitro Verfahren, da das Markieren in lebendem Gewebe die Möglichkeit einer Fehlinterpretation aufgrund der nicht spezifischen Verteilung aufgrund rezeptorseitigem Abbau und aufgrund der Eliminierung von Peptid, das nicht rezeptorseitig gebunden vorliegt, über den Blutkreislauf (Lindberg et al., 1991) ausschließt. Aus diesen Gründen wurde die zeitabhängige Gewebeaufnahme von Pentapeptid in vivo bestimmt. Um die Möglichkeit zu eliminieren, dass die verfügbaren Bindungsbereiche des endogenen Peptids miteinander konkurrieren, wurde das Markieren über intravenöse Infusion von trithiiertem Pentapeptid in 5 Wochen alten geschlechtsreifen Ratten bewirkt. Zusätzlich zu der Filmautoradiografie wurde die Ausarbeitung und der Zeitverlauf der Aufnahme des trithiierten Peptids über die lebenden Organe von dem kürzlich entwickelten R-Radiobildgeber aufgenommen, welcher die einzigartige Möglichkeit bietet, die β-Partikel, die von tritiiertem Liganden, der an flachen Oberflächen wie den Ganzkörperschnitten gebunden vorliegt, zu detektieren und zu quantifizieren (Charpak et al., 1989; Tribollet et al., 1991). Die Erfinder haben außerdem die chromatographischen Charakteristika der markierten Verbindung, die mit dem Zielorgan verbunden ist, analysiert.
Biologische Rezeptorbereiche besitzen zwei essentielle Charakteristika, die es ermöglichen, das spezifische Bindungsverhalten in vivo zu identifizieren; sie weisen eine hohe Affinität zum Liganden auf und die Bindung ist sättigbar (Whitcomb et al., 1993). Aus diesem Grunde wurden Verdrängungsexperimente und Verwendung paralleler systemischer Verabreichung eines Ü berschusses an korrespondierendem unmarkiertem Peptid durchgeführt. Zusätzlich wurde die spezifische zelluläre Lokalisierung des markierten Pentapeptids in den Zielgeweben über schnittmikroskopische Autoradiographie identifiziert.
Schließlich haben die Erfinder, um die Relevanz der Pentapeptid-Aufnahme unter physiologischen Bedingungen einzuschätzen, das endogene Blutkreislauf-Sekretionsmuster der Pentapeptide, die mit dem SMR1 in erwachsenen männlichen Ratten bei Bewußtsein verknüpft sind, bestimmt. Es ist wichtig herauszuheben, dass alle pharmakokinetischen und zellulärseitigen Verteilungsstudien unter Verwendung von physiologischen Konzentrationen des markierten Pentapeptids durchgeführt wurden.
Die vorliegende Erfindung wird im Detail in den folgenden Beispielen dargestellt, ohne damit auf irgendeine Weise den Schutzbereich auf diese spezifischen Ausführungsformen zu beschränken.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
A. Chemikalien
Die Peptide, die mit den Sequenzen (Glp₁)-His-Asn-Pro-Arg, (Gln₁)-His-Asn-Pro-Arg und (Gln₁)-His-Asn-(D3,4-Pro)-Arg korrespondieren, wurden von Laboratoire de Chimie Organique, Institut Pasteur, Paris, Frankreich hergestellt.
Die markierte Verbindung (Glp₁/Gln₁)-His-Asn-(3,4³H)Pro-Arg wurde von Dr. R. Genet, Departement d'ingénierie et d'étude des protéines, CEA/Saclay, Gif/Yvette, Frankreich hergestellt. Das RP-C18 HPLC gereinigte Produkt (≥ 98% Reinheit) mit einer spezifischen Radioaktivität, die auf 2,22 TBq/mMol geschätzt wurde, wurde bei –80°C in 10 %igem Methanol/0,1% Trifluoressigsäure (1,11 GBq/ml) gelagert. Die Reinheit des tritiierten Pen tapeptids wurde systematisch vor der Verwendung über Umkehrphasen-C18 und Kationenaustausch-FPLC Chromatographien gemäß den vorangehend beschriebenen Verfahren untersucht (Rougeot et al., 1994).
B. Tiere
Männliche Wistar-Ratten (4 Wochen alt), bezogen von Iffa-Credo (Frankreich) wurden in Käfigen mit 2 bis 4 Tieren unter kontrollierter Beleuchtung und Temperatur mit freiem Zugang zu Essen und Wasser bis zur 5 bis 7 Tage späteren Verwendung für die Studie der Pentapeptid Rezeptor-seitigen Verteilung und bis zur 5 bis 6 Wochen späteren Verwendung für die Studie der endogenen Pentapeptidsekretion gehalten. Sie wurden in dieser Zeitspanne täglich von dem ausführenden Arbeiter behutsam angefasst. Alle Experimente wurden zwischen 10 und 14 Uhr durchgeführt.
C. Verabreichung der markierten Verbindung
Die markierte Verbindung, d.h. 6,66 MBq, 3 nMol oder 2 mg für die Ganzkörperautoradiografie (WBA) und 370–555 KBq, 170 bis 250 pMol oder 110–160 ng für die pharmakokinetischen und zellulärseitigen Verteilungsstudien wurden in 100 bis 200 ml Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS Dulbecco's, Bio Media, Frankreich) aufgelöst und intravenös in die Jugularis-Vene von betäubten Ratten (Halothan für WBA oder Pentobarbital für alle anderen Experimente) verabreicht.
D. Ganzkörper-autoradiographische Makrovisualisierung
Die Zielgewebe für das sekretorische Reifungsendprodukt von SMR1, das Pentapeptid, wurde in vivo über das Ganzkörperautoradiografie-Verfahren gemäß dem Verfahren von Ullberg (Ullberg et al., 1981) untersucht.
Die fünf Wochen alten Ratten wurden zu folgenden Zeitpunkten nach intravenöser Injektion von 3 nMol (6,66 MBq oder 2 μg) trithiiertem Pentapeptid unter Halothan geopfert: 90 Sek., 3, 60 und 240 Min. Zu der ausgewählten Zeit wurde das gebändigte Tier sofort in ein –80°C Gemisch aus Trockeneis und Isopentan getaucht, um künstliche Tracerredistribution zu verhindern. Nach 48 Stunden in selbstschließendem Plastik gelagert bei –30°C wurde das Tier in ein Haltevorrichtung gesperrt. Sagittale Ganzkörperschnitte (20 mm) der gefrorenen Ratte wurden bei –30°C mit einem Kryostaten gemacht (Ganzkörper-Schnittmikrotom Leitz 400 mit einer mobilen Kühltruhe Leitz OM, Leica, Frankreich). Schnitte, die an dem Scotch-Tape hafteten, wurden 4 Tage lang in einer Kühltruhe gelassen, Temperatur –30°C, um vollständiges Trocknen zu gewährleisten. Die Tapes wurden in eine Filmkassette mit ³H-Hyperfilm (Amersham, Frankreich) bei –20°C eingebracht. Nach zwei Wochen wurden die Filme in einem Kodak D19 Entwickler entwickelt und in Kodak Fixiermittel fixiert.
E. Gewebezubereitung zur Schneidung und mikroautoradiografischen Lichtvisualisierung
Die zellulärseitige Lokalisierung der physiologischen Konzentrationen des markierten Pentapeptids wurde über ein Paraffin- oder Harzschnitt-mikroskopisches Autoradiographieverfahren untersucht.
60 Minuten nach Verabreichung von ³H-Pentapeptid (555 KBq, 160 ng oder 250 pMol) i.v. wurden die anästhesierten männlichen Ratten über die Jugularvenen mit eiskaltem Krebs-Ringer Bicarbonat glukosiertem Puffer künstlich durchblutet und anschließend mit 0,5 %igem Paraformaldehyd/0,5% Glutaraldehyd fixativem PBS Puffer (plus Glukose 1,6%, CaCl₂, 0,002% und DMSO 1%) (50 ml/5 Min. jeweils). Die Gewebe wurden schnell entfernt und für Paraffinschneidung (Paraplast plus-Sherwood Medical, OSI, Frankreich) oder für Harzschneidung (Histo-Resin Leica, Frankreich) rasch geerntet.
Alle Schnitte wurden bei 5 Mikrometern geschnitten (Reichert Jung für Paraffin und RM2155 Leica für Harzschnitte) und auf Superfrost/Plus Glasobjektträger (nicht Gelatine-beschichtet) befestigt. Paraffin wurde mit Xylol entfernt und die Schnitte wurden durch abnehmende und anschließend zunehmende Ethanolbäderserien (von 100 bis 50%, V/V und umgekehrt) befördert. Die getrockneten Schnitte wurden anschließend für die lichtmikroskopische Autoradiographie aufgearbeitet, indem kernmulsionsbeschichtete Deckgläser (Kodak, NTB2, verdünnt 1:1 mit destilliertem Wasser) auf ihnen befestigt wurden. Nach zweistündigem Lufttrocknen bei Raumtemperatur wurden die Autoradiographen 6 bis 10 Wochen lang in lichtundurchlässigen Behältern bei 4°C belichtet. Radiosensitive Deckgläser wurden in einem Kodak D19 (3 Min.) Entwickler entwickelt und in Kodak Fixierlösung (3 Min.) fixiert. Die Schnitte wurden mit Harris' Hematoxylin (Prolabo, Frankreich) und Toluidinblau (Sigma, Frankreich) kontrastgefärbt, dehydratisiert und in Eukittmedium befestigt. Das Gewebe und aufliegende Silberkörner wurden geprüft und mit einem Leica Fotomikroskop ausgestattet mit Hellfeld-Optiken (DMRD Leitz, Leica) fotografiert.
F. Mapping und Quantifizierung der 3H-Pentapeptid-Aufnahme von lebenden Geweben
Die quantitative Bestimmung der Radioaktivität in verschiedenen Körperschnitten wurde durchgeführt unter Verwendung eines gasförmigen Detektors von β-Partikeln, welcher kürzlich entwickelt wurde (Charpak et al., 1989; Tribollet et al., 1991). Daten von Ganzkörperschnitten oder individuellen Organschnitten, die in den Gaskammerdetektor eingebracht worden waren, wurden jeweils 8 Stunden lang oder 50 Stunden lang gesammelt. Die Anzahl an Counts pro Pixel wurde in dem β-Bildgeber 2200 (Biospace, Frankreich) mit einem Oberflächendetektor von 20 × 20 cm², ge folgt von Computer-unterstützter Bildanalyse mit dem (3-Visionsprogramm unter Verwendung eines HP Vectra-Computers aufgenommen. Die Tritiumwirkung wurde als Counts pro mm² bestimmt. Die Linearität dieses Detektionsverfahrens ermöglichte die Messung der nicht spezifischen Bindung von ³H-Pentapeptid, gemessen in verschiedenen Strukturen oder Bereichen innerhalb des Schnitts mit offensichtlichen Nicht-Bindungsbereichen für das Peptid (Hintergrundgewebe, z.B. Muskel und Herzblut mit Ausnahme des Gehirns und dem Rückenmark) oder in der gleichen markierten Struktur in Verdrängungsexperimenten.
Im Falle der radiowirksamen Quantifizierung von Organschnitten oder Säureextrakten unter Verwendung eines flüssigen Szintillationzählers (MR300 Kontron) wurde die Tritiumwirkung als cpm/mg Protein bestimmt. Die Proteinkonzentration wurde über das Bradford-Verfahren (Bradford et al., 1976) bestimmt.
G. Chromatografische Charakterisierung der Aufnahme des radiowirksamen Peptids von Geweben
Die chromatografischen Charakteristika der markierten Verbindung, die in vivo mit Zielorganen assoziiert war, wurde über HPLC bestimmt.
Zu bestimmten Zeitpunkten (2 und 180 Min.) nach Verabreichung von trithiiertem Pentapeptid wurden die anästhesierten Ratten geopfert (Herz-Blut Punktion) und die Gewebe wurden schnell auf Eis entfernt. Die Gewebe wurden sofort bei 4°C in 5 bis 10 Volumen 0,1 M Chlorwasserstoffsäure unter Verwendung eines Potter-Homogenisators (Demineralisierung von Knochengewebe wurde jeweils nach 24 bis 48 Stunden bei 4°C in Guanidiumhydrochlorid und EDTA Vorbehandlung, 4 M und 0,25 M Endkonzentration durchgeführt) homogenisiert. Die Homogenisate wurden 30 Min. lang bei 4°C und 15.000 g zentrifuriert. Um die Gesamtradiowirkung zu bestimmen, wurden Aliquote der überstehenden Lösung zu 50 Volumen Biofluor (NEN, Dupont de Nemours, Frankreich) gegeben und in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler gezählt.
Um die Radioaktivität in der Pentapeptidfraktion zu bestimmen, wurden Aliquote der Gewebeextrakte einem Methanol-Extraktionsverfahren unterworfen (Rougeot et al, 1994) nach Neutralisierung mit Tris/HCl, pH 8,5 enthaltend 16 mM DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure, Sigma, Frankreich). Die Methanolphase wurde von dem Überstand durch teilweises Verdampfen entfernt, anschließend wurde lyophilisiert und die wiedergewonnene wässrige Phase enthaltend 16 mM DTPA wurde auf eine ODS AQ Kolonne (HPLC RP C18 Chromatografie) (AIT, Frankreich) aufgebracht. Eluieren mit einem linearen Gradienten von 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser/0,1% TFA in Acetonitril (Merck, Frankreich) von 100/0 (Vol./Vol.) bis 50/50 (Vol/Vol) wurde 30 Min. lang durchgeführt bei einer Flussrate von 1 ml/Min. Alle 60 Sekunden wurden Fraktionen gesammelt und auf Radioaktivität untersucht unter Verwendung eines Flüssigkeits-Szintillationszählers.
H. Pentapeptidblutkreislaufsekretion und Pharmakokinetik, in vivo.
a) Systemische Pentapeptidsekretion unter basaler oder Etherstress- und adrenergisches Mittel-induzierter submandibularer Drüsensekretion von männlichen Ratten bei Bewußtsein.
Die endogene in vivo-Blutkreislaufsekretion von Peptiden, die mit dem SMR1-Vorgängermolekül, insbesondere dem Pentapeptid, in Beziehung stehen, wurde in erwachsenen männlichen Ratten bei Bewußtsein untersucht.
9 bis 10 Wochen alte Ratten wurden in einem Gefäß 2 Min. lang Etherdämpfen ausgesetzt oder wurden 20–30 Min. lang nach intraperitonealer Verabreichung adrenergischer sekretagoger Mittel (Phenylephrin, 4 mg/kg plus Isoproteronol, 1 mg/kg) oder Träger (PBS Dulbecco's) in individuelle metabolische Käfige gegeben. Zu bestimmten Zeiten wurden die Ratten mit Pentobarbital (45 mg/kg) anästhesiert. Blutproben wurden über Herzpunktion genommen und in vorher gekühlten Reagenzgläsern gesammelt, die ein Gemisch aus Peptidaseinhibitoren (EDTA 1mM, Aprotinin 1000 U/ml, Bestatin 130 μM, Leupeptin 1 μM Pefabloc 0,4 mM, Pepstatin 1 μM) enthielten. Diese wurden sofort 15 Min. lang bei 4000 G und 4°C zentrifiguriert. Plasmafraktionen wurden anschließend einem Porapak Q Kolonnenextraktionsverfahren (Rougeot et al., 1988) unterworfen und vor und nach HPLC-Trennung auf ihren Pentapeptidgehalt hin untersucht.
Kurz gesagt, wurden die angesäuerten Plasmaproben (HCl 0,1 N Endkonzentration) auf Porapak Q-beads (Waters, Frankreich) gegeben, die in einer 0,5 × 2 cm Kolonne gepackt waren. Nach Waschen mit TFA 0,1% in Wasser mit TFA 0,1% wurden die Peptide in 50% Methanol eluiert (die Wiedergewinnung des zugegebenen Pentapeptid-Markers betrug 93 ± 6%, n = 5). Jede der extrahierten Proben wurde anschließend unter Verwendung eines HPLC Systems (Spectraphysik SP8000) analysiert, das mit einer HEMA-IEC BIO-1000 Carboxymethylsäule (Alltech, Frankreich) verbunden war. Kationenaustauschchromatographie wurde mit einem einstufigen 30minütigen linearen Gradienten von 1–1000 mM Ammoniumacetat pH 4,6 bei einer 1 ml/Min. Flussrate durchgeführt. 1 ml Fraktionen wurden gesammelt und nach Lyophilisierung auf ihren Pentapeptidgehalt hin untersucht. Das RIA Verfahren und die Chrakteristika für Pentapeptid-Messungen wurden bereits beschrieben (Rougeot et al., 1994).
b) Metabolische und pharmakokinetische Pentapeptid-Studien
Der in vivo-Verteilungszeitverlauf, der Metabolismus und die Eliminierung des Pentapeptids wurde untersucht in anästhesierten erwachsenen männlichen Ratten unter Verwendung physiologischer Konzentrationen an zirkulierendem tritiiertem Pentapeptid.
Anästhesierten männlichen Ratten wurde eine intravenöse Bolusinjektion von 170 pMol oder 110 ng tritiiertem Pentapeptid, verdünnt in 100 μl PBS Dulbecco's gegeben. Das Blut wurde in Reagenzröhrchen enthaltend ein Gemisch von Peptidaseinhibitoren wie oben beschrieben gesammelt und über einen Silastikkatheder in die externale Jugularvene implantiert. Blut wurde kurz vorher und 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 45, 60, 90 und 120 Min. nach der Peptidverabreichung entnommen. 2 ml Blut pro Ratte wurden insgesamt entnommen und der gesamte Harnblaseninhalt wurde zu mindestens einem bestimmten Zeitpunkt gesammelt.
Die biologischen Proben wurden wie oben beschrieben unter Porapak Q Bedingungen zentrifugiert und extrahiert. Jede extrahierte Probe wurde anschließend mit dem oben und in der Referenz (Rougeot et al., 1994) beschriebenen HPLC-Verfahren chromatografiert. Das ODS AQ RP-C18 wurde für die Identifizierung der aminoterminalen Metaboliten und Pep RPC HR C18 (Pharmacia, Frankreich) für die Identifizierung der carboxylterminalen Metaboliten verwendet. Der Radioaktivitätsgehalt der Proben vor und nach den chromatografischen Trennungen wurde unter Verwendung eines Beta-Zählers (Kontron, MR300) bestimmt.
BEISPIELE
Beispiel 1:
Verteilung von Zielorganen für 3H-markiertes von SMR1 stammendes Pentapeptid, Hexapeptid oder Undecapeptid in männlichen Ratten, untersucht über Ganzkörperautoradiographie (WBA).
WBA findet besondere Anwendung in Studien für die Rezeptorbindung und die Analyse des biologischen Schicksals von Proteinen und Peptiden. Wir wendeten diesen Ansatz an, um die möglichen Zielgewebe des vom SMG abstammenden SMR1 Pentapeptids zu untersuchen. Das Mapping und der Zeitverlauf der Gewebeverteilung von radioaktivem Pentapeptid wurde zu den Zeitpunkten 90 Sek., 3 Min., 60 Min. und 240 Min. nach der systemischen Injektion von 3 nMol oder 2 μg ³H-Pentapeptid in 5 Wochen alten männlichen Ratten untersucht. Um autoradiographische Bilder genügender Dichte in einer vernünftigen Expositionszeit zu bilden und um die spezifische Aufnahme verglichen mit nicht spezifischem Markieren einzuschätzen, wurde eine Menge von 6,66 MBq Isotop bei diesen Untersuchungen verwendet. Obwohl wir tritiiertes Peptid hoher spezifischer Wirkung (2,22 TBq/mMol) verwendet haben, führte die Dosis von Pentapeptid, das in den Blutkreislauf eingebracht worden war, zu Mengen an Blutpentapeptid von etwa dem 10fachen des physiologischen Pegels (siehe folgendes Kapitel). Ferner, um die Möglichkeit auszuschließen, dass die peptidischen Bindungsbereiche vorher von endogenem Peptid belegt werden, wurden geschlechtsreife männliche Ratten im Alter von 5 Wochen verwendet, da wir bereits zeigen konnten, dass die Peptide, die vom SMR1 stammen, in männliche SMG-Ratten erst ab 6 Wochen nach der Geburt nachzuweisen sind (Rougeot et al., 1994).
Die anatomische Rohverteilung der ³H-Pentapeptidaufnahme 60 Min. nach Dosierung auf den sagittalen Schnitten des gesamten Rattenkörpers wird in den 1 und 2 gezeigt. Wie in den charakteristischen Autoradiogrammen (1-A, 1-B) gezeigt, trat eine dichte und deutliche Anhäufung an Silberkörnern in der Niere und im gesamten Knochengewebe sowie in dem Dentalgewebe, der glandulären Magenschleimhaut, dem pankreatischen Lobulus und der Submandibulardrüse 60 Min. nach der intravenösen Bolusinjektion von radioaktivem Pentapeptid auf. Zu dieser bestimmten Zeit waren mäßige Pegel der Markierung in Leber, Milz, Thymus und Darmwand zu beobachten. weder das Gehirn noch das Rückenmark akkummulierten radioaktives Pentapeptid und zeigten so, dass eine stringente Bluthirnschranke die in vivo-Peptidaufnahme limitierte.
Die Bestimmung der Gewebepeptidziele wurde mit einer quantitativen β-Radiobilderzeugung (2) durchgeführt. Die Anzahl an β-Partikeln, die pro Einheitsbereich emittiert wurden, wurde direkt von den Gesamtkörperschnitten 8 Stunden lang gesammelt. Die Linearität und Selektivität dieses Detektionsverfahrens ermöglichte eine entsprechende Messung markierter Strukturen verglichen mit der Schwarzfärbung, die mit einem ausgewählten anatomischen Bereich des gleichen Schnitts (hier Blut in der Herzregion) definiert wurde (Tribollet et al., 1991).
In der Niere, Pankreas, Knochen, Schneidezahn, submandibularer Drüse und glandulärer Magenschleimhaut war die Konzentration an Radioaktivität zu einem Zeitpunkt von 60 Min. nach Dosierung als Counts/mm² pro 8 Stunden deutlich höher, 4 bis 10 mal so hoch, wie die des Bluts im Herzen. Viel mehr Radioaktivität war in diesen Gewebeberäumen vorhanden als es von dem gleichen anatomischen Blutraum erwartet wird (3). Diese Überschätzung des anatomischen Plasma und der interstitiellen Räume kann die Gegenwart von Peptidrezeptorbereichen, die mit diesen Geweben eine Bindung eingegangen sind, widerspiegeln (Whitcomb et al., 1993). In der Leber, Thymus, Darmwand und Milz war die relative Gewebeanhäufung gleich oder kleiner als das 2fache der Schwärzung. Und in allen anderen visualisierten Geweben (Muskeln, Gonad, Knorpel, nicht glandulärer Magenschleimhaut, Gehirn) war der Radioaktivitätspegel gleich oder kleiner als im Blut, was die Beschränkung des Peptids auf das anatomische Plasma und die interstitiellen Räume dieser Organe (3) widerspiegelt.
Die Ergebnisse der ³H-Hexapeptid- (4) und ³H-Undecapeptid-Aufnahme (5) zeigen deutlich, dass die Zielorgane für diese anderen Reifungsprodukte des SMR1 Proteins nahezu die gleichen wie die Zielorgane des Pentapeptids sind. Insbesondere sind Niere und Pankreas die bevorzugten Zielorgane, obwohl das Hexapeptid ebenfalls sehr effizient von der glandulären Magenschleimhaut zurückgehalten wird.
Das dynamische Profil der ³H-Pentapeptid-Aufnahme zeigte, dass die Radioaktivität schnell verteilt wird und unterschiedlich akkumuliert wird, bereits nach 90 Sek. und 3 Min. in der Niere, Pankreas, Zahngewebe und glandulärer Magenwand mit einem Gewebe zu Blut-Verhältnis von etwa 2. Die Markierung dauerte in diesen Geweben mehr als 240 Min. an. Genauer gesagt, fand das Markieren hauptsächlich in dem äußeren medullären Gebiet statt, über den untersuchten Zeitraum hinweg von 90 Sek. bis 240 Min. nach Injektion (1-A, 60 Min. postinjektion). In dem Knochen wurde das Markieren vorwiegend bereits nach 90 Sek. und 3 Min. auf den periostalen Knochenoberflächen (Periosteum) sichtbar gemacht. In den Zähnen wurde die Markierung ebenso schnell und dauerhaft in dem inneren Teil der Schneidezahnwurzel sowie in dem Alveolarknochen akkumuliert. Im Unterschied dazu war die Radioaktivität im Blut und in blutreichen Organen wie in der Lunge und den Muskeln weit verbreitet zum Zeitpunkt von 90 Sek. und 3 Min., aber war von dort nach 60 Min. vollständig verschwunden. Keine Radioaktivität wurde 240 Min. postinjektion im Darminhalt gefunden, während die Harnblase Radioaktivität aufwies, was anzeigte, dass Teile des Pentapeptids und/oder Metaboliten bereits in den Urin ausgeschieden worden waren. Dies stimmt mit der hohen Markierung überein, die in dem Nierenbecken gefunden wurde und dass keine Markierung in der Leber 90 Sek. und 3 Min. nach der systemischen Injektion gefunden wurde. Dieses Ergebnis kann darüber erklärt werden, dass glomeruläre Filtration des Blutstrompentapeptids eine effizientere Eliminierung darstellt als hepatische und biliäre Ausscheidung.
Um zu bestimmen, ob die detektierte radioaktive Verbindung tatsächlich die verabreichte Verbindung ist, wurden Säurehomogenisate von Zielorganen nach Methanolextraktion analysiert und Umkehrphasenchromatografie, 2–20 Min. und 180–200 Min. nach systemischer Injektion von 2 μg oder 3 nMol ³H-Pentapeptid durchgeführt. Eine gute Übereinstimmung wurde zwischen dem β-Radiobildgeber und Flüssigszintillation erhalten durch Zählen der Werte für jedes Organ, jeweils Counts/mm² und cpm/g Gewebe gewicht. Nach 5–20 Min. Überlebenszeit war fast die gesamte Radioaktivitätsaufnahme der Gewebe von den Säurehomogenisaten über das eingesetzte organische Lösungsmittel, extrahiert worden: 72 ± 4%. Während 180 Min. nach Injektion von ³H-Pentapeptid wurde die radioaktive Peptidfraktion nur aufgenommen, wenn die Methanolextraktion von Gewebehomogenisaten durchgeführt wurde zu denen DTPA (16 mM), ein starkes Metallchelatisierungsmittel, zugegeben wurde: 53 ± 9%. Darüber hinaus zeigte lediglich unter dieser Extraktionsbedingung die RP-HPLC Chromatographie, dass die Radioaktivität vorzugsweise in dem Peak, der dem freien Pentapeptid entspricht, entdeckt wurde: 52 ± 8%. Der Rest des radioaktiven Extrakts repräsentierte Metaboliten oder undissoziierten Peptidkomplex: 8 ± 6% und 29 ± 14%.
Zusammen genommen beweisen diese Daten deutlich die selektive, schnelle und stabile Aufnahme des Pentapeptids von der äußeren Medulla der Niere, von den pankreatischen Lobules, von der glandulären Magenschleimhaut und von sowohl Knochen als auch Zahngeweben.
Beispiel 2:
Pentapeptid-Blutstromsekretionsmuster abgeleitet von SMR1 in der erwachsenen männlichen Ratte
Um die Bedeutung der Pentapeptidaufnahme unter physiologischen Bedingungen einzuschätzen, wurde die endogene Blutstromkonzentration an Peptiden, die mit dem SMR1 Vorläuferprotein in Verbindung stehen, insbesondere des Pentapeptids in erwachsenen männlichen Ratten bei Bewußtsein als Antwort auf pharmakologische und akute Stressstimuli untersucht. Die Entnahme und Extraktion von Blutproben beschrieben unter „Verfahren" wurde durchgeführt in Gegenwart eines Gemischs von Peptidaseinhibitoren plus EDTA und unter diesen Bedingungen betrug der basale Plasmapentapeptidimmunoreaktivpegel der 10 Wochen alten männlichen Ratten 1,9 ± 0,2 ng/ml, n = 5. In anästhesierten Ratten zeigte die zeitabhängige Antwort auf adrenergische sekretagoge Mittel der vom SMR1 abstammenden Peptidblutsekretion kürzlich, dass die Peptide maximale Zirkulierungspegel innerhalb 10–30 Min. im Anschluss an die peritoneale Verabreichung von Epinephrin zeigten (Rougeot et al., 1994). In männlichen Ratten bei Bewußtsein 20–40 Min. nach Injektion von Phenylephrin und Isoproterenol wurde herausgefunden, dass die Plasmapeptidimmunoreaktivantwort bei 12,5 ± 5,4 ng/ml, n = 4 lag.
Es ist weit verbreitet, Ratten gesättigtem Ätherdampf 2 Min. lang auszusetzen, um Stress zu verursachen und dessen Effekt auf die endogene Adrenalin- und Adrenocorticotropinsekretion, zwei der Hauptmediatoren für die Stressantwort (Rougeot et al, 1991; Van Herck et al., 1991). Die endogene adrenergische sekretorische Antwort auf akuten Ätherstress in Ratten bei Bewußtsein führt zu einem immunoreaktiven Pentapeptidzirkulierung von 7,0 ± 4,1 ng/ml, n = 4. Extraktion und Fraktionierung über Kationenaustausch-HPLC von Plasmaproben, die unter pharmakologischen oder akuten stressinduzierten Bedingungen erhalten wurden, zeigten, dass 56 ± 21%, n = 6 der immunoreaktiven Peptidfraktion dem freien Pentapeptid entspricht; der Rest entspricht hauptsächlich SMR1 stämmigen Hexapeptid und Undecapeptid. Die Immunoquantifizierung der Pentapeptidplasmafraktion konnte lediglich durchgeführt werden, wenn Probenentnahme und die anschließenden Extraktionsschritte in Gegenwart von EDTA oder DTPA durchgeführt wurden.
Der physiologische Bereich des zirkulierenden Pentapeptids in männlichen Ratten bei Bewußtsein wurde demnach auf 1 bis 7 ng/ml festgelegt.
Beispiel 3:
Zeitverlauf von SMR1-stämmiger Pentapeptidverteilung und Eliminierung im Plasma
Das in vivo-Schicksal von infundiertem Pentapeptid im Kreislauf wurde untersucht. Plasmapentapeptid und seine Metaboliten wurden nach einer einzigen Injektion einer physiologischen Menge von 110 ng tritiiertem Pentapeptid in den Blutkreislauf von zwei männlichen Ratten gemessen. Die Bestimmung der radiowirksamen Plasmapentapeptidfraktion wurde durchgeführt über RP Porapak Q Purifikation und die des radiowirksamen Pentapeptids zu Metaboliten über RP-HPLC Chromatographie. Nachdem ein maximaler Pegel innerhalb von 2 Min. erreicht worden war, nahm die Plasmapeptidkonzentration schnell ab und kehrte fast bis zu einem basalen Pegel innerhalb von 30 Min. zurück (6).
Die HPLC-Fraktionierungen der Plasmapeptidextrakte zeigten, dass in dem Blutstrom 35% der infundierten Pentapeptide innerhalb von 4 Min. metabolisiert waren und dass Proteolyse ausgehend von dem aminoterminalen Teil des Peptids stattfand. Andererseits dissoziierte saure Plasma pH Behandlung vor der Porapak Q-Extraktion teilweise einen Pentapeptid bindenden Substanzkomplex, der etwa 45% der zirkulierenden Peptidfraktion darstellte.
Die Eliminierung wurde über Messen der Radioaktivität untersucht, die im Verlauf des Experiments ausgeschieden wurde und wurde in anästhesierten Ratten auf 6 pMol geschätzt, eliminiert durch glomerulare Filtration über einen Zeitraum von 60 Min. Etwa 80% der Urinradioaktivität schienen Pentapeptidmetaboliten zu sein.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Verteilung des zirkulierenden Pentapeptids in den Geweben 30 Min. nach Injektion fast vollständig war. Nach diesem Zeitraum, um die vollständige Verteilung des Peptids zu ermöglichen, untersuchten wir die zelluläre Aufnahme des Peptids zu einem Zeitpunkt von 60 Min. nach Injektion mit physiologischen Konzentrationen an ³H-Peptid.
Beispiel 4:
Zelluläre Lokalisierung von ³H-Pentapeptidbindungsbereichen durch lichtmikroskopische Autoradiografie: in vivo Radiomarkierung 60 Min. nach Injektion von physiologischen zirkulierenden Konzentrationen an ³H-Peptid
Das Verstehen der Funktion des SMR1 bezogenen Peptids benötigt die Information über die Identität der zellulären Lage von dessen Bindungsbereichen innerhalb der oben bezeichneten Zielgewebe. Ein solches Auflösungspegel kann lediglich über direktes Beschichten der in vivo radiomarkierten Organschnitte bewirkt werden mit radiosensitiver flüssiger Kernemulsion unter der Voraussetzung, dass das gebundene radioaktive Peptid sicher mit den Bindungsbereichen vernetzt ist über divalente Aldehyde. Ferner, da die Aufnahme von Medikamenten oder Hormonen über die Dosis beeinflusst werden kann, wurde die Bedeutung der selektiven zellulären Aufnahme des Pentapeptids unter Verwendung physiologischer zirkulierender Konzentrationen des tritiierten Moleküls bestimmt. Das Verteilungsvolumen des Pentapeptids in der männlichen Ratte wurde zu 35–40 ml/100 g Körpergewicht berechnet, was vergleichbar dem extrazellulären Flüssigkeitsvolumen ist. Um eine Pentapeptidplasmaendkonzentration von 1–7 ng/ml zu erhalten, benötigt eine fünf Wochen alte männliche Ratte von 100 g eine systemische Injektion von 40–280 ng markiertem Peptid. Deshalb erhielten fünf Wochen alte Ratten zwischen 110–160 ng ³H-Pentapeptid, um physiologische Peptidplasmakonzentrationen von 10 Wochen alten männlichen Ratten für die folgenden Experimente zu reproduzieren: 1. zelluläre Lokalisierung von Peptidbindungsbereichen und 2. regionale und zelluläre Sättigung von Peptidbindungsbereichen nach Koinjektion von einem Überschuss an unmarktiertem Peptid.
Lichtmikroskopische Autoradiographien der Niere zeigten die Gegenwart von Silberkörnern, vorzugsweise im Gebiet der tieferen inneren Hirnrinde und des äußeren Streifens der äußeren Medulla über den epithelialen Zellen des S3 Segments des gera den Teils der proximalen Tubulus. Dichte Silberkörner wurden auch innerhalb der S1 und S2-Segmente des anfänglichen gewundenen Teils dieser Tubulus gefunden (7-A). Keine spezifische zelluläre Markierung wurde innerhalb der Glomeruli beobachtet oder im Ephithel der distalen und auffangenden Tubuli.
In der glandulären Magenschleimhaut wurden 60 Min. nach ³H-Pentapeptidinjektion Silberkörner ausschließlich auf der basalen Hälfte der Magendrüsen verteilt über die „Chief" oder peptischen Zellen (7-B). In dem Pankreasgewebe wurden Silberkörner selektiv und homogen in den Zellen der Acini (7-C) konzentriert. Keine Markierung wurde innerhalb der verschiedenen Ducti und Langerhans'schen Inseln beobachtet. Im Unterschied zu der Erwartung war in dem submandibularen Zielgewebe keine selektive Zellassoziation der Markierung zu identifizieren.
7-E und 7-F zeigen jeweils einen Schnitt eines Teils der Brustwirbel und das proximale Ende der Tibia, wobei beide den trabekulären Knochen zeigen. In dem Knochengewebe trat die höchste Anhäufung an Silberkörnern ausschließlich auf der inneren Oberfläche des Knochens auf, in den Räumen innerhalb des Knochenmarkgewebes, der trabekulären Knochenräume. Die intratrabekulären Räume umgeben Knochenzellen, hauptsächlich die Osteozyten und deren langwierige zytoplasmische Prozesse beschäftigen jeweils die lacunae und canaliculi. Innerhalb dieser Knochennadeln waren die Silberkörner dichter über der canalicularen Schicht verteilt als über der lacunaren Schicht. Eine spezifische Akkumulierung an Silberkörnern war nicht zu beobachten, weder in der Knorpelwachstumsplatte noch in dem hämatoporischen Knochenmark (7-E, 7-F). 7-D zeigt ein Schnitt in die Radix des oberen Rattenschneidezahns. In diesem Zahngewebe waren die Silberkörner selektiv auf der gesamten Dentinschicht über die Länge der dentinalen Tubules des canaliculären Systems konzentriert.
In Austauschexperimenten wurde die zelluläre und Gesamtgewebeverteilung des ³H-Pentapeptids untersucht 60 Min. postinjektion eines 100fachen Überschusses an unmarkiertem Peptid. Der große Überschuss an Kaltligandenkonzentration führte zu einer fast vollständigen Displazierung der ³H-Pentapeptidaufnahme innerhalb der renalen äußeren medullären Dukti und zu einer Diffusion der Markierung hin zu den inneren medullären Sammeldukti (8-A). Ein Überschuss an unmarkiertem Peptid verringerte die Bindung in verschiedenen Ausmaßen innerhalb der glandulären Magenschleimhaut, der pankreatischen und submandibularen Lobules und der Röhrenknochen mit einem spezifischen Markierungsprozentsatz von jeweils 38 bis 61%, 37 bis 55%, 51 bis 91% und 29 bis 38%. Die schwach detektierbare Reduktion des radiomarkierten Peptids könnte bedingt sein durch die niedrige Häufigkeit der Rezeptorbereiche oder die Gegenwart von stark radioaktiven Abbauprodukten verteilt zwischen dem Plasma und den Knochenzwischenräumen und kann in vivo die gesättigte Bindung verdecken (Whitcomb et al., 1985). In unserem Experiment scheint es, dass die Wirksamkeit der Detektion der saturierenden Bindung in vivo von der Verteilung der Peptidbindungsbereiche innerhalb der spezifischen Organe abhängt, entweder breite Verteilung (pankreatische und submandibulare Lobules) oder enge Verteilung (Knochen, Magen, Niere) und von der Selektivität der verwendeten-Analysemethoden, d.h. jeweils Gesamtgewebezählung oder regionale Differenzanalyse (8-B, Niere, spezifischer Markierungsprozentsatz von 12 bis 92%).
In der vorliegenden Studie unter Verwendung eines in vivo Markierungsverfahrens gekoppelt mit quantitativer β-Radiobildanalyse der Gesamtkörperschnitte der Ratten zeigen die Erfinder, dass Pentapeptid, das von zirkulierendem SMR1 abstammt, Zugang zu selektiven Regionen in der Niere, Pankreas, Submandibulardrüse, Knochen, Zähne und Magen gewinnt. Die Gewebeaufnahmeprofile weisen wichtige Charakteristika auf, die es ermöglichen, die spezifischen Bindungsbereiche zu identifizieren in vivo, – die Bindung ist schnell (90 Sek. nach Verabreichung spätestens), stabil (240 Min.), selektiv und sättigbar. Es wurde ferner gezeigt, dass dieses hormonartige Peptid sich bei physiologischen zirkulierenden Konzentrationen in erwachsenen männlichen Ratten mit diesen Geweberezeptorbereichen verbinden kann.
Wie von der Analyse des quantitativen β-Radiobilderzeugung und von der Kinetik der Verteilung und Eliminierung von Pentapeptid im Rattenblutstrom bei 90 Sek. und 3 Min. (Distributionsphase des zirkulierenden Peptids) bestätigt, spiegelt die Menge die an Pentapeptid in einem bestimmten Gewebe die Summe der Mengen in dem Plasma und den interstitiellen Räumen zuzüglich der Rezeptorbindungsstellen wieder. Bei 60 Min. (Eliminierungsphase des zirkulierenden Peptids) und später spiegelt die Menge die Peptidbindungsstellen vermittelte Sequestrierung wieder. Demnach spiegelt die Messung der Selektivität und Sättigbabarkeit des Gewebes und die zelluläre Aufnahme, die 60 Min. nach Verabreichung des Peptids durchgeführt wurde, tatsächlich die spezifischen Bindungsstellen für das Peptapeptid wieder. Eine schnelle und stabile Verteilung und Akkumulierung des Peptids wurde in der äußeren Medulla der Niere, den Pankreaslappen, der glandulären Magenschleimhaut und den periostalen und alveolaren Knochengeweben sowie in der Dentinstruktur des Schneidezahns demonstriert. Das Fehlen einer frühen Pentapeptidaufnahme von der inneren Knochenmatrix konnte mit einer wesentlich langsameren Austauschrate zwischen dem Blut und den extrazellulären Knochengeweben, verglichen mit dem Austausch zwischen Blut und den extrazellulären Nichtknochen-Flüssigkeiten, in Verbindung gebracht werden (Billinghurst et al, 1982).
Die Erfinder weiteten diese Studie aus, indem sie dne zellulären Ort, an welchem das Pentapeptid in jedem Gewebe in vivo bindet, identifizierten. Dieser Ansatz liefert den Wirkungsort, was einen wichtigen Schritt bei der Bestimmung der Rolle von SMR1-stämmigen Peptiden in männlichen Ratten darstellt.
Die vorliegenden Ergebnisse bezeugen direkt, dass Pentapeptidbindungsstellen innerhalb spezifischer Bereiche des männlichen Rattennephrons mit einer Verteilungsdichte in dem Gebiet des tiefen inneren Cortex und dem äußeren Streifen der äußeren Medulla und insbesondere über die epithelialen Zellen der S3-, S2- und S1-Segmenten der proximalen Tubuli vorliegen. Demnach, von einem historischen Standpunkt aus betrachtet, bezeugen die Ergebnisse, dass das zirkulierende Peptapeptid bei der Regulierung der Nierenfunktion in erwachsenen männlichen Ratten eine Rolle spielt. Der proximale Tubulus convolutus spielt eine wichtige Rolle bei der Reabsorption von Na⁺, HCO₃ ^-, Cl^-, Ca²⁺, PO₄ ^-, Wasser und organischen gelösten Verbindungen wie Glukose und Aminosäuren. Die Aktivität der meisten wenn nicht aller renaler epithelialer Transportsysteme ist hormonreguliert von Steroiden (gonadale und glukocortico-adrenale Steroide) und Peptidhormonen (pankreatische, hypophysäre und parathyroide Hormone). Die meisten der Hormone, die die Tubulusreabsorption und die Ausscheidungsvorgänge regeln, wirken auf die Membranrezeptoren und können Zugang zu den Zellen über den Blutstrom gewinnen (Tisher et al., 1996).
Die Visualisierung der Pentapeptidbindungsbereiche in dem inneren Bereich vom Knochen, dem trabekulären Knochengewebe und in der periostealen Knochenoberfläche, dem Periosteum, bezeugt in situ eine Rolle des Pentapeptids bei der Regulierung der Knochenumbildung. Obwohl die Knochenumbildung ein kaum verstandener Vorgang ist, bezeugen zahlreiche Daten, dass diese Aktivität von zahlreichen Hormonen sichergestellt wird einschließlich Steroiden (Androgene, Östrogene und Glukocorticoide) und peptidischen Hormonen (Parathyroidhormon, Wachstumshormon, Insulinwachstumsfaktor-1, Thyroxin, Glukagon) stammend von der Zufuhr von Blut zu dem Knochen. Ferner akkumuliert das Pentapeptid in der trabekulären Knochenumbildungseinheit, die die höchste Knochenumsatzrate und Hormonempfindlichkeit aufweist, über die langsamen zytoplasmischen Prozesse der Osteocyten, die Canaliculi. Diese tubulären Tunnelprozesse sind benachbart zu Osteo cytenlakunen und offen für extrazelluläre Flüssigkeiten auf der Knochenoberfläche. Sie sind in die Ablagerung oder Resorption von Calcium und Phosphationen involviert, die in den extrazellulären Knochenflüssigkeiten vorliegen und in die Ablagerung von Hydroxyapatitkristallen. Ferner wird das Periosteum bei der Knochenregeneration benötigt während der Bruchreparatur (Jee et al., 1988). Dieses Ergebnis legt nahe, dass SMR1-stämmige Peptide zu der Regulierung der Knochendynamiken und Erneuerung in erwachsenen männlichen Ratten als hormonale Modulatoren beitragen können.
Ferner könnte SMG-stämmiges Pentapeptid auch als Mineraltransportmittel fungieren, jedoch spricht seine Aufnahme, die ausschließlich von der skelettären Knochenmatrix (nicht von der kartilagenen Matrix) und von den renalen proximalen Tubulus (nicht von den distalen Tubulus) bewirkt wird, gegen eine solche Hypothese. Es könnte auch als Steuerungsmittel der Membranenzymaktivität fungieren, die bei der skelettären Mineralisierung und der renalen Mineralreabsorption beteiligt sind. Jedoch könnte die Peptid-Enzyminteraktion hochaffine Bindungscharakteristika haben, um seine selektive Lokalisierung in vivo, wie sie gerade in der vorliegenden Studie beobachtet wurde, zu identifizieren.
Die Existenz von Pentapeptidbindungsbereichen lokalisiert innerhalb der Tubules des dentinalen Rattenschneidezahns konnte bewiesen werden. Von der Schicht an reifem Dentin wurde vermutet, dass sie in die Iniziierung des Mineralisierungsvorgangs der Zähne involviert ist (Bernard, 1972). Überraschenderweise wurde berichtet, dass hormonale Stimulierung der Flüssigkeitsbewegung durch diese dentinalen Tubules teilweise von parotiden Faktoren abhängen kann, die vom Blutkreislauf auf die Zähnen übertragen werden (Leonora et al., 1987; Tieche et al, 1994).
Die Pentapeptidaufnahme von Dentinalgewebe und alveolarem Knochen der Schneidezähne, die in der Ratte jeweils kontinuierli chem Wachstum und schneller Umbildung unterliegen, beweisen zusätzlich, dass das submandibulare drüsenstämmige Pentapeptid in die Regulierung des Mineralhaushalts zwischen skelettären, dentalem und renalem Mineraltransport und demnach auch der Mineralhomeostase beteiligt sind. Ferner legen diese Daten nahe, dass verglichen mit den Verhaltenscharakteristika, die spezifisch für männliche Ratten sind, das androgenregulierende SMR1-stämmige Pentapeptid eine Komponente eines Rückführkreises sein kann, die unter Stressbedingungen wirksam wird, welche zu dessen-systemischer Sekretion führen, um die stufenförmigen Nebenwirkungen auf den Mineralhaushalt zu regulieren, wobei der homeostatische Mineralbedarf gestillt wird.
Auf der anderen Seite sind Darm und Leber sowie Speicheldrüsen immer noch die potentiellen Hauptbereiche für die Ionenverarbeitung und Regulierung. Die moderate und verzögerte Pentapeptidaufnahme von Darm und Leber kann mit einer schwachen Verteilung von wirksamem Peptid in diesen Geweben in Verbindung gebracht werden. Außerdem kann die verzögerte und umfassende zelluläre Verteilung von Peptidanhäufung in der Submandibulardrüse bedingt sein durch entweder eine ausreichende endogene Produktion von SMR1-stämmigen Peptiden bei Konzentrationen, die verfügbare Bindungsbereiche besetzen und/oder unvollständige funktionale Differenzierung von 5 Wochen alten SMG-Rattenzellen, die möglicherweise bei der Peptidaufnahme beteiligt sind. Tatsächlich sind die duktalen Zellen, wenn die SMR1 sekretierende azinäre Zelldifferenzierung während der ersten 6 wochen vorkommt, vollständig differenziert bereits in einem Entwicklungszustand von 10 Wochen nach der Geburt (Leeson et al., 1959). Nichtsdestotrotz unterstützt die spezifische Akkumulierung des Pentapeptids in den submandibularen Lobules die Hypothese, dass endogen produzierte Peptide lokale Wirksamkeit aufweisen. Zusätzlich, da die lokale Konzentration an SMR1-stämmigen Peptiden größer sein kann als der mikromolare Bereich in SMG von erwachsenen männlichen Ratten, greift das zirkulierende Peptid in die Drüsenfunktion nur schwach wenn überhaupt ein.
Die gastrischen Hauptzellen und die pankreatischen azinären Zellen sind ebenfalls Ziele für das Pentapeptid, was die Schlussfolgerung zulässt, dass die SMR1-stämmigen Peptide eine funktionale Rolle bei der Modulierung der Synthese und/oder Sekretion in sowohl den zymogen sekretierenden Zellen und/oder der Sekretion von Flüssigkeit und Elektrolyten in den azinären Zellen haben. Die Sekretion von gastrischen und pankreatischen Verdauungsenzymen wird stark reguliert und bemerkenswerte Mengen an Enzymen werden bereits bei Stimulierung der zymogenen Zellen, wie sie während der Fütterung vorkommt, freigesetzt (überprüft in Hersey, 1994 und Jensen, 1994). Zusätzlich wird von dem Hauptmechanismus für die Regulierung der Enzymsekretion allgemein angenommen, dass er durch Sekretagoge stimuliert wird. Sekretagoge Rezeptoren für eine große Anzahl an Peptidhormonen wurden bei diesen Zellen beschrieben, einschließlich dem Sekretin/vasoaktiven Darmpeptid und der Cholecystokinfamilie (zuzüglich Gastrin freisetzenden Peptiden, Tachykininen für azinäre Zellen). Die Demonstration von Pentapeptidbindungsbereichen in diesen exokrinen Zellen unterstützt die Hypothese einer regulierenden Rolle von SMR1-stämmigen Peptiden bei der systemischen Kontrolle von frühen Verdauungsprozessen. Chromatografische Charakteristika von zirkulierendem und gewebegebundenem Pentapeptid zeigte, dass der Transport und die Aufnahme des Pentapeptids eine komplexe molekulare Spezies involviert einschließlich eines kationischen mineralischen Elements. Nach allgemeinem Verständnis kann SMG-stämmiges Pentapeptid wie alle Haupthormone an Plasma bindende Moleküle verankert werden als zirkulierendes Reservoir, um Abbau vorzubeugen und/oder Transport zu erleichtern und dann die Verbindung zu Zellrezeptorbereichen.
Zusammenfassend führten die Daten, die in der vorliegenden Beschreibung dargestellt werden, die Erfinder zu der Entdeckung, dass zirkulierendes SMR1-stämmiges Pentapeptid primär in die hormonale Kontrolle des Mineralionenhaushalts zwischen mindes tens vier Systemen involviert ist: Den Knochen, der Niere, den Zähnen und dem Blutkreislauf. Mineralionenungleichgewicht kann als Antwort auf akuten oder chronischen Stress einschließlich Intraspecies Kampf und Schmerzgefühl, Durst, Hunger und schädlichen Temperaturen auftreten. Das zirkulierende androgenabhängige Pentapeptid kann eine Komponente eines Rückführungskreises sein, das in erwachsenen männlichen Ratten die stufenweise Antwort auf Umgebungsstress sein kann, innerhalb welcher die Mineralaufnahme oder -ausscheidung verändert wird, wobei die Mineralhomeostase kontrolliert wird.
Beispiel 5:
Der zelluläre Rezeptorkomplex, der das SMR1 Pentapeptid in vivo bindet, wurde isoliert und. biochemisch charakterisiert.
Experimentelles Verfahren: Zunächst Reinigungsschritte des Rezeptorbereichs der äußeren Medulla der Niere.
Das Verfahren, das im folgenden dargestellt wird, zeigt das Endergebnis der Studien bezüglich der Optimierung der Bedingungen, die für die spezifische Isolierung des molekularen SMR1 Rezeptorpentapeptidkomplexes geeignet sind, dessen subzelluläre Lokalisierung und molekulare Charakteristika, die bis dato unbekannt waren.
Die Selektion der gesuchten molekularen Population wird über systemisches Detektieren der Radioaktivität (3 H), die vom Liganden (SMR1 Pentapeptid) übertragen wurde, welcher selbst kovalent verknüpft zu seinem zellulären Rezeptorbereich vorliegt, durchgeführt.
Da Bindung und Vernetzung in vivo stattfinden, ist die physiologische Relevanz dieser Interaktion gewährleistet.
Die Zielgeweberezeptorbereiche werden in vivo mittels tritiiertem SMR1-Pentapeptid radiomarkiert (Verfahren verwendet für zelluläre Lokalisierungen, Rougeot et al, Am. J. of Physiol., 1997).

– 45 Minuten nach Injektion des radiomarkierten Liganden (300 ng) wird das Subjekt (Ratte) infundiert (KREBS; + 4°C), um das freie Peptid und das Peptid, das von den Zielorganen in einer geringen Menge aufgenommen wird (nicht spezifisch), zu entfernen.
– Die kovalente Verknüpfung des radiomarkierten Liganden mit den Zielbereichen wird erhalten nach einer Infusion mit Konjugierungsmitteln für primäre Amine, Epsilonlysin oder Guanidium Arginin (Paraformaldehyd + Glutaraldehyd: 0,5% in Gegenwart von Glukose: 2,5%, Calciumchlorid: 1,2 mM und DMSO: 0,5%).
– Nieren, Pankreas, Oberschenkelknochen, Schneidezähne und glanduläre Magenschleimhaut werden schnell entfernt, gesäubert und bei 4°C in Gegenart von Formaldehyd 0,25% + Glukose 2,5% 3 bis 17 Stunden inkubiert.
– Die Organe werden mit PBS 25 mM pH 7,4 gewaschen und inkubiert in Gegenwart von Glycin 0,2 M bei +4°C, um die Sättigung der verbleibenden freien Aldehydgruppen zu gewährleisten.
– Organe werden seziert: Die äußere Medulla der Niere, mineralische und organische Anteile von Schneidezähnen und Oberschenkelknochen.
– In Stücke geschnittene Gewebe werden gewaschen bei +4°C mit 20 Vol. PBS (in zwei Schritten von jeweils 10 vol.) in Gegenwart von Proteaseinhibitoren (siehe Cocktails in Am. J. Physiol., Rougeot et al., 1994).
– Die Gewebe werden bei +4°C gemahlen (Potter-Homogenisator) in 2 × 10 Vol. Ammoniumacetat (AcNH₄) 5 mM pH 8,8 in Gegenwart von Inhibitoren. Das Homogenisat wird bei +4°C beschallt und anschließend zentrifugiert bei 1000 g bei +4°C 15 Minuten lang.

Die überstehenden Flüssigkeiten (= Gesamtextrakte) enthalten üblicherweise 60 bis 85% der ursprünglichen Radioaktivität, die in dem Rohextrakt enthalten ist.

– Die lösliche Fraktion (Zytosolproteine) wird getrennt von den unlöslichen Komponenten (membranische) nach Zentrifugierung bei 100 000 g 30 bis 60 Minuten lang bei +4°C.
– In Abhängigkeit von den Geweben nehmen die zytosolischen überstehenden Flüssigkeiten 30 bis 50% der Radioaktivität auf, die in dem Rohextrakt enthalten ist. Von der zytosolischen Radioaktivität wird angenommen, dass sie die Internalisierung und/oder die intrazellulären Abbaukomponenten des radioaktiven Liganden/Rezeptor-Komplexes darstellt.

Deren hauptisoelektrische Punkte sind von 5,23–5,85 und deren scheinbare Molekulargewichte sind ≥ 6 kDa (21–24).

– Die 100 000 g Pellets werden extrahiert durch Auflösen der Membrankomponenten (Rabillard et al., Biofutur 126: 1–12, 1993; Bretscher Sci. Amer. 253: 100–109, 1985).

Die verschiedenen Versuche, die mit den Membranzubereitungen der äußeren Medulla der Niere durchgeführt wurden, und die verschiedenen Arten von Detergenzien:

– ein amphoteres oder zwitterionisches Detergens wie Chaps^®
– ein nicht ionisches Detergens wie NP40 oder Hecameg^®
– ein anionisches Detergens wie SDS alle verwendet unter kritischen micellären Konzentrationen (CMC) zeigen, dass lediglich mit SDS eine nahezu vollständige Lösung des radioaktiven Komplexes ausgehend von den Membranzubereitungen (Tabelle 1, 9) erhalten werden kann. Obwohl SDS eine hervorragende Lösungskraft aufweist, sind die Interaktionen mit den Proteinen derart, dass es einerseits denaturiert wird und dass es andererseits schwierig zu entfernen ist und ferner mit den chromatographischen Trennsystemen interferiert, so dass jede resolutive Trennung der verschiedenen molekularen Populationen unmöglich gemacht wird. Aus diesem Grunde wurden die Erfinder dahin geführt, ein Lösemittel des amphoteren Typs einzusetzen, nämlich die Sulfobetaine SB14 und SB201, die eine langsame denaturierende Wirkung aufweisen, aber hocheffizient sind bezüglich Proteinen, die mit der Lipiddoppelschicht der Membran über verschiedene transmembrane Domänen verknüpft sind (Vuillard et al., Biochem. J. 305, 337–343, 1995).

Ferner ermöglichen SBs die anschließende Verwendung verschiedener Trennungssysteme wie die präparative Flüssigkeitsstromisoelektrofokussierung (IEF), die die Trennung der molekularen Population auf Basis ihres isoelektrischen Punkts (pHi) ermöglicht.
In Abhängigkeit von den Membrangewebepräparationen werden 40 bis 90% des radioaktiven Membrankomplexes gelöst in Gegenwart dieses Lösungsmittels.
Die folgenden Schritte bestehen in der Isolierung des radioaktiven Komplexes ausgehend von den gelösten Membranpräparationen der äußeren Medulla der Niere über verschiedene Trennungssysteme und gleichzeitiges Delimitieren von einigen von dessen molekularen Charakteristika, die gleich oder verschieden für die verschiedenen Zielgewebe sind. Auch hier ist wieder das vorgeschlagene Verfahren dasjenige, dass das Endergebnis vieler Tests zur Optimierung der geeigneten Bedingungen für die spezi fische Isolierung des SMR1-Rezeptor pentapeptidmolekularen Rezeptors ist.

– Das präparative Flüssigkeitsstrom-Isoelektrofokussieren (IEF) (Ampholytengradient in Rotofor, Biorad) wurde als erster Schritt zum Reinigen der gelösten Membranproteine, die den Rezeptorbereich/SMR1-Pentapeptidkomplex enthalten, ausgewählt (Marchase et al., Arch. Biochem. und Biophys. 280: 122–129, 1990; Rich et al. Technique 1: 196–203, 1989; Veser anal. Biochem. 182: 217–221, 1989 und Petrash et al. Electrophoresis 12: 84–90, 1991). Die in SB14/SB20 gelösten Extrakte werden direkt angewendet und einem kontinuierlichen elektrischen Feld (500-1000 Volt) 3 Stunden lang über einen linearen Gradienten des isoelektrischen Punkts im Bereich von 3 bis 11 unterworfen.

Wie in 10 dargestellt, ist dieses Trennungsverfahren auf Basis des isoelektrischen Punkts für die von der äußeren Medulla der Niere gelösten Membranproteine hochauflösend. Der radioaktive Peak fällt zusammen mit einer niedrigen Menge an Proteinen (maximale spezifische Aktivität/cpm/mg Protein).
Proteine mit einem alkalischen pH-Wert, die vorherrschen, werden demnach entfernt.
Was die äußere Medulla der Niere betrifft, hat (haben) die radioaktive(n) molekulare(n) Population(en) einen pH-Wert von 5,89.
Trotz einer vergleichsweise niedrigen Reinigungsausbeute (20–40%) wurde das Reinigungsverfahren zum Isolieren des renalen rezeptorseitigen Ligandenkomplexes verwendet.
Ferner zeigt ein analytischer Schritt von Größenausschlusschromatografie, der die Trennung von Verbindungen mit einem Molekulargewicht im Bereich von 6 bis 500 kDa ermöglicht (Superdex^® 200, Pharmacia), dass die Fraktionen, die aus der Isoelektrofo kussierung der Membranzubereitungen der äußeren Medulla der Niere stammen, eine vorherrschende radioaktive Population mit einem Molekulargewicht von 130 kDa (13) darstellen, ermittelt über eine repräsentative Kalibrierung (logPM* Ve/Vm 13).

– Eine Flüssigkeitschromatografie (FPLC) unter Verwendung einer stationären Umkehr-C₁₈-Phase (Rep RPC Pharmacia) zeigt den zweiten Reinigungsschritt. Da die Transmembrandomäne der Membranproteine hoch hydrophobe Domänen sind, war es vernünftig anzunehmen, dass der Rezeptorbereich für das SMR1-Pentapeptid ebenfalls dieses Charakteristikum besaß.

Nach Dialyse und Lyophilisierung der radioaktiven IEF-Fraktionen wird das Lyophilisat in Ammoniumacetat aufgelöst, 5 mM pH 8,8, auf den Kopf der Kolonne aufgebracht und einem linearen Gradienten von Acetonitril (ANC) von 1–100% 30 Minuten lang bei einer Strömungsrate von 0,75 ml/Min. (14 und 15) unterworfen. Wie in 15 dargestellt, ist dieser Schritt ebenfalls hoch auflösend. Beide radioaktive Populationen fallen mit einer niedrigen Menge an Proteinen zusammen, die bei 280 nm detektiert werden.
In diesem Stadium ist ein analytischer Schritt notwendig zur Kontrolle der Reinheit der isolierten radioaktiven Fraktionen, nämlich derer, die bei 40% Acetonitril eluiert wurden.
Dieser analytische Schritt wird nach einem elektrophoretischen Wanderungsschritt auf Acrylamidgelen unter Denaturierungsbedingungen (SDS-PAGE) der Fraktionen durchgeführt, die aus dem chromatografischen Verfahren stammen, gefolgt von einem Schritt, der die Fraktionen durch Anfärben mit Silbernitrat sichtbar macht. Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass die molekulare Popoulation, die von Radioaktivitätspeak-1 dargestellt werden (Retentionszeit 6 Minuten), die von C₁₈-RP (Retentionszeit 6 Minuten) stammen, mit zwei Banden mit einem Molekularge wicht (MW) zwischen 100 und 200 kDa korrespondieren. Radioaktivitätspeak-2 (Retentionszeit 20–22 Minuten in FPLC C₁₈-RP) entspricht einer detektierbaren Bande (mit einem MW zwischen 100 und 200 kDa).
BIOCHEMISCHE CHARAKTERISTIKA DER VERSCHIEDENEN GEWEBEREZEPTOR-BEREICHE
Im Verlaufe der verschiedenen Verfahren, die zum Adaptieren der Reinigungsschritte des Rezeptorbereichs der Medulla der Niere durchgeführt wurden (Gewebe, das vorzugsweise das SMR1-Pentapeptid zusammen mit Pankreas aufnimmt), haben wir auch einige biochemische Charakteristika bestimmt, die gleich oder verschieden für die verschiedenen Zielgewebe sind.
Die aufeinander folgenden isoelektrofokussierenden Verfahren zeigen, dass die radioaktiven molekularen Rezeptorpopulationsliganden einen isoelektrischen Punkt haben von:

– 5,64 ± 0,30, n = 10 Determinierungen für die äußere Medulla der Niere (16);
– 5,58 ± 0,30, n = 3 Determinierungen für die Pankreaslappen (17);
– 6,62 ± 0,35, n = 3 Determinierungen für die glanduläre Magenschleimhaut (18);
– zwischen 4,2 und 4,9 für die predominante Population und von 5,6 für die zweite Population der trabekulären Knochenmatrix (19, n = 1); und
– 5,74 – 6,08, n = 1 für die Dentinmatrix (20).

Zusammen genommen lassen diese Ergebnisse vermuten, dass mindestens zwei molekulare Populationen von Rezeptorbereichen für das SMR1-Pentapeptid vorliegen: Eine mit einem pHi von 5,85/5,64 ± 0,30, hauptsächlich in der Medulla der Niere, Pankreas und in einem geringeren Ausmaß im Trabekularknochen und der Dentinmatrix, und der andere mit einem pHi von 6,62 ± 0,35, hauptsächlich in der glandulären Magenschleimhaut vorliegend. Die dritte Population mit einem pHi von 4,5 ± 0,4, die in der trabekulären Knochenmatrix vorliegt, benötigt eine weitere Bestätigung, da das Vorliegen von großen Mengen an mineralischen Komponenten in dieser Matrix einige Modifikationen in die Parameter der IEF-Separation einbringen kann.
Aufeinander folgende Größenausschlusschromatografen wurden eher als analytische Schritte als als präparative (schwach auflösendes Verfahren) oder als Schritt zum Entfernen der Lösungsmittel (was tatsächlich nicht vorkam) verwendet.
Chromatogramme (21–24) repräsentativ für jedes Gewebe zeigen, dass die radioaktiven molekularen Populationen ein scheinbares Molekulargewicht zwischen 200 und 400 kDa haben. Diese Populationen mit einem größeren Molekulargewicht, die in allen Zielgeweben gefunden wurden, korrespondieren tatsächlich mit den „proteindetergenten" Micellen unter analytischen Bedingungen, wobei das Molekulargewicht des Rezeptorproteins demnach etwas überschätzt wurde.
Tabelle 1
Wie es aus den Lehren der Beschreibung deutlich wird, ist die Erfindung nicht im Schutzbereich beschränkt auf eine oder mehrere der oben beschriebenen Ausführungsformen; die vorliegende Erfindung umfasst auch alle Alternativen, die von dem Fachmann auf dem gleichen Fachgebiet durchgeführt werden können, ohne vom Gegenstand oder Schutzbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen.

Claims

Ein Verfahren zur Bestimmung der Menge von XQHNPR oder eines seiner biologisch wirksamen Derivate, die an einen an einem Mineralion-Ungleichgewicht leidenden Patienten zu verabreichen sind, umfassend die Stufen a) Inkubieren eines markierten XQHNPR Peptids mit einem polyklonalen oder monoklonalen gegen dasselbe Peptid gerichteten Antikörper; b) das in Kontakt bringen von gebildeten Immunkomplexen mit einer biologischen Probe eines zu testenden Patienten, von dem angenommen wird, dass er ein endogenes nicht markiertes XQHNPR Peptid enthält; c) Nachweis von an monoklonale oder polyklonale Antikörper gebundenen markierten Peptiden, die nicht durch das endogene nicht markierte XQHNPR Peptid der biologischen Probe verdrängt wurden, zur Bestimmung der Konzentration dieses endogenen Peptids, das in der biologischen Probe enthalten ist; d) Vergleich der in Stufe c) ermittelten Konzentration des XQHNPR Peptids mit der üblicherweise in einem gesunden Individium ermittelten Konzentration des XQHNPR Peptids und e) Berechnen der Menge einer therapeutischen Zusammensetzung, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge eines SMR1-Proteins oder eines gereiften Produkts des SMR1-Proteins oder eines seiner biologisch wirksamen Derivate, das erforderlich ist, den Mangel an XQHNPR Peptid in Körperflüssigkeiten und Geweben auszugleichen.
Das Verfahren nach Anspruch 1, worin das XQHNPR Peptid XQHNPR ist.
Eine Zubereitung, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge von – einem SMR1-Protein, – einem SMR-Reifungsprodukt oder – einem biologisch wirksamen Derivat der beiden oben genannten Mittel in Kombination mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge eines Moleküls, das in die Regulation des Mineralion-Gleichgewichts involviert ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Parathyrin (PTH), Calcitonin (CT) und 1,25-Dihydroxyvitamin (D).
Die Zubereitung nach Anspruch 3, worin das SMR1-Reifungsprodukt ein XQHNPR Peptid ist.
Die Zubereitung nach Anspruch 4, worin das XQHNPR Peptid ein XQHNPR Pentapeptid oder eines seiner Polymere ist.
Die Verwendung eines SMR1-Proteins, eines Reifungsprodukts des SMR1-Proteins oder eines seiner biologisch wirksamen Derivate für die Herstellung eines Arneimittels zur Vorbeugung oder Behandlung eines Mineralion-Ungleichgewichts in einem Säuger.
Die Verwendung nach Anspruch 6 zur Behandlung einer den Knochen, die Zähne, den Renaltrakt, die Niere, den Darm, den Pankreas, die Magenschleimhaut oder die Nebenschilddrüse beeinträchtigende Störung, die im wesentlichen durch ein Mineralion-Ungleichgewicht verursacht ist.
Die Verwendung nach Anspruch 6 oder 7 zur Vorbeugung oder Behandlung einer den Knochen beeinträchtigenden Störung, die hauptsächlich durch ein Mineralion-Ungleichgewicht verursacht ist.
Die Verwendung nach Anspruch 8 zur Vorbeugung und Behandlung von Osteoporose.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, worin der Säuger ein Mensch ist.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, worin das Arzneimittel ein Peptid der Formel XQHNPR umfasst, worin X ein Wasserstoffatom, eine Aminosäure V oder R oder ein Polypeptid VR, VRG, VRGP, VRGPR oder VRGPRR oder eines seiner biologisch wirksamen Derivate ist.
Die Verwendung nach Anspruch 11, worin das Peptid XQHNPR oder eines seiner biologisch wirksamen Derivatpeptide ein oder mehrere Aminosäuren in der D-Form enthält.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 12, worin das Arzneimittel eine flüssige Lösung ist.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 12, worin das Arzneimittel ein Gel ist.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 12, worin das Arzneimittel ein trockenes Pulver ist.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 12, worin das Arzneimittel ein geregeltes Arzneimittel-Freisetzungssystem ist.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 12, worin das Arzneimittel lokal nahe bei der zu behandelnden Stelle verabreicht wird.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 12, worin das Arzneimittel oral zu verabreichen ist.