PT1007566E

PT1007566E - Utilização terapêutica da proteína smrl e seus derivados activos

Info

Publication number: PT1007566E
Application number: PT98912339T
Authority: PT
Inventors: Catherine Rougeot; Francois Rougeon
Original assignee: Pasteur Institut
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1998-02-19
Publication date: 2007-01-31
Also published as: DK1007566T3; EP1007566B1; US20040047805A1; DE69835680T2; US20020019008A1; ES2271991T3; DE69835680D1; EP1702929A3; US20030195155A1; US20020198361A1; CA2281912A1; ATE337339T1; AU6721998A; EP1702929A2; US7429448B2; WO1998037100A2; US6589750B2; WO1998037100A3; US6818405B2; EP1007566A2

Description

DESCRIÇÃO

Utilização terapêutica da proteína SMR1 e seus derivados activos

Antecedentes da invenção (i) Campo da invenção A presente invenção diz respeito à utilização terapêutica de uma molécula peptídeo derivada dos produtos de maturação de SMR1 (proteína submandibular de rato 1). (ii) Descrição da técnica 0 desequilíbrio hidro-minerai intracelular ou sistemático do corpo de um mamífero, e mais especificamente do corpo humano, é a causa de patologias várias que afectam o metabolismo e o comportamento fisiológico de diversos órgãos e tecidos, tais como ossos, rins, paratiróide, pâncreas, intestino, mucosa glandular do estômago ou próstata assim como glândulas salivares.

No corpo de um mamífero, a manutenção dos índices potássio/sódio e magnésio da transmembrana, é perigosamente importante no controlo da excitação celular e a regulação de muitos aspectos do metabolismo intracelular. Os tecidos mais activos tais como os nervos, fígado e músculos têm um índice maior de potássio/sódio e magnésio/cálcio que os tecidos inactivos tais como a pele e eritrócitos. Adicionalmente, os tecidos mais activos têm um conteúdo fósforo maior que os tecidos inactivos, mantendo o papel de esters de fosfato no metabolismo de energia celular. Um humano adulto contém 1/85 aproxímadamente 1,000 g de cálcio (Krane et al., 1970). 99% deste cálcio está no esqueleto na forma de hidroxiapatite, e 1% está contido nos fluidos extracelulares e tecidos moles. Cerca de 1% do conteúdo de cálcio do esqueleto é livremente permutável com os fluídos extracelulares. Apesar de pequeno como percentagem do conteúdo do esqueleto, esta união permutável é aproxímadamente igual ao conteúdo total de cálcio nos fluídos extracelulares e tecidos moles, e serve como um importante depósito ou armazém de cálcio. Deste modo, desempenha dois papéis fisiológicos predominantes no organismo. No osso, os sais de cálcio fornecem a integridade estrutural do esqueleto. Nos fluídos extracelulares e no critosol, a concentração de iões de cálcio é perigosamente importante na manutenção e controlo de um número de processos bioquímicos, e as concentrações de Ca2+ em ambos os compartimentos são mantidos com grande uniformidade (Broadus, 1993). Outros iões minerais importantes tais como o sódio, magnésio ou fósforo estão profundamente envolvidos no balanço de ião mineral necessário para um bom metabolismo intra- e extracelular. O termo balanço de ião mineral refere-se ao estado da homeostase mineral no organismo face ao ambiente. No balanço zero, a entrada mineral e aumento, coincide exactamente com as perdas minerais; no balanço positivo, a entrada mineral e aumento, excede as perdas minerais, e no balanço negativo, as perdas minerais excedem a entrada mineral e aumento. Sob circunstâncias normais, a absorção do cálcio providencia um excedente de cálcio que excede consideravelmente os requerimentos sistémicos. A união extracelular de ortofosfato (cerca de 550 mg num humano) está em equilíbrio dinâmico com a entrada e saída de fósforo via intestino, osso, rim e tecidos moles. Em balanço zero, a absorção fraccionária de fósforo net é cerca de dois 2/85 terços de entrada de fósforo. Esta quantidade representa um vasto excesso sobre os requerimentos sistémicos e é quantitativamente excretada na urina. A união extracelular de magnésio (cerca de 250 mg num humano) está em equilíbrio bidireccional com os fluxos de magnésio através do intestino, osso, rim e tecidos moles. No balanço zero, o magnésio derivado da absorção intestinal net (cerca de 100 mg/dia num humano) representa um excedente sistémico e é quantitativamente excretado.

Dois órgãos estão principalmente envolvidos na absorção e excreção dos iões minerais diferentes do corpo: 1)hormonal e/ou mecanismos intrínsecos de absorção de ião mineral no intestino, fornecem o corpo com um fornecimento mineral que excede as necessidades minerais sistémicas através de uma medida considerável? 2) o túbulo renal desempenha o papel quantitativo dominante ao manter normal a homeostase mineral.

Poucos metabolitos endógenos foram já mostrados para participar activamente na manutenção do balanço ião mineral dentro do corpo. A vitamina D 1,25-dihidroxi (também denominada calcitriol) é o único estímulo hormonal reconhecido da absorção de cálcio intestinal activo que ocorre principalmente no duodeno e jejuno (Lemann Jr J., 1993). Como consequência, ocorre a absorção de cálcio intestinal net reduzido quando a entrada de cálcio alimentar é limitada, quando as concentrações do soro de vitamina D 1,25 díhidroxi são baixas ou quando o intestino não responde a esta hormona. Em contraste, a absorção de cálcio intestinal aumentada ocorre quando as concentrações de soro de vitamina D 1,25 são altas. Deste 3/85 modo, deficiências na regulação da concentração de vitamina D 1,25 dihidroxi no soro podem provocar distúrbios maiores reduzindo ou aumentando a absorção de cálcio intestinal e levar a um estado patológico. A vitamina D 1,25 dihidroxi também influencia a entrada corporal do fosfato.

Um segundo factor endógeno envolvido no balanço de ião mineral é a hormona paratiróide (PTH). A hormona paratiróide regula o nível de cálcio e fosfato no sangue ao modular a actividade de células específicas no osso e rim. Essas acções servem para: 1) estimular a reabsorção de cálcio e fosfato do osso; 2) estimular a reabsorção de cálcio e inibe a reabsorção de fosfato do filtrado glomerular; e 3) estimula a síntese renal de Vitamina D 1,25-díhidroxi aumentando assim a absorção intestinal de cálcio e fosfato.

Um terceiro factor endógeno interveniente no balanço de ião mineral é a calcitonina. A Calcitonina (CT) é um 32-aminoácido peptídeo que é segregado primeiramente peias células C tiroidais (Deftos, 1993). 0 seu efeito biológico principal é inibir a reabsorção do osso osteoclástico. Esta propriedade levou à utilização CT para distúrbios caracterizados por aumentar a reabsorção do osso, tal como a doença de Paget, osteoporose e para a hipercalcemía de malignidade. A secreção de CT é regulada com precisão pelo cálcio de sangue e cronicamente pelo género e talvez a idade. A Calcitonina é metalizada pelo rim e fígado. A sequência do aminoácido de CT é amplamente conservado através da evolução, desde o peixe aos mamíferos.

As deficiências no balanço de ião mineral são a causa de distúrbios vários que afectam tanto o osso, como o rim, o 4/85 intestino, o pâncreas, os tecidos dentais (esmalte e marfim), ou a mucosa do estômago.

Um desequilíbrio de ião mineral afecta a capacidade de remodelação do osso, provocando distúrbios tais como a osteoporose ou afecta a capacidade de reabsorção do osso tais como na doença do hiperparatíroidismo. 0 sistema de remodelação tem sido caracterizado em numerosas publicações num passado recente (Parfitt, 1986). A remodelação do osso ocorre em superfícies de osso trabecular e Haversian. 0 primeiro passo é a activação de precursores osteoclásticos para formar osteoctastos que depois começam a escavar uma cavidade numa superfície. Depois da remoção dos tecidos do osso (cerca de 0.05mm3), o sítio mantém-se quiescente durante um curto tempo, seguindo da activação de precursores osteoblásticos que ocorrem no sitio e a escavação é tornada a encher. Este processo serve para várias funções, entre elas a remoção de tecido de osso velho com danos mínimos e reorganização da arquitectura do osso para ir de encontro às necessidades para suporte mecânico. Com utilização diária normal do esqueleto, perda de osso, acumulação anormal de danos mínimos, ou erros em geometria, só podem acontecer através de deficiências neste sistema, por exemplo uma deficiência no balanço de ião mineral. A osteoporose é uma grande preocupação de saúde pública e existe consequentemente uma grande necessidade para novas moléculas terapêuticas que serão capazes de regular o balanço de ião mineral no corpo e se possível, ma is eficiente e mais selectiva (alvo específico) que as moléculas presentemente usadas na terapêutica, tal como o estrogénio e a calcitonina. Outras doenças de absorção ou reabsorção do osso podem ser causadas pelas deficiências no metabolismo de ião mineral renal ou 5/85 gastrointestinal, tal como a osteodistrofia renal ou mesmo causado por insuficiência pancreática. 0 hiperparatiroidismo primário é uma causa muito comum de hipercaicemia, o que estima uma incidência tão alta como 1 em 500 para 1 em 1000 (Bileziklan, 1990). O hiperparatiroismo é uma hipercaicemia que ocorre na associação com níveis elevados para a hormona paratiróide, muitas vezes causado por um adenoma benigno e solitário. A hipercaicemia pode ser o resultado de outros vários distúrbios tais como síndromas hiperparatiróides familiares (Szabo J. et ai.,1993), hipercaicemia hipocalciúrica familiar (Marx S.J., 1993), hipercaicemia devido aos estados de malignidade (Stewart A.F., 1993; Mundy G.R., 1993) ou devido a distúrbios que formam granuloma (Adams, J.S., 1993).

Por outro lado, as deficiências no balanço de ião mineral pode resultar em hipocalcemia a qual é encontrada em doenças associadas com uma baixa concentração de albumina de soro ou também com hipoparatiroidismo idiopático. A própria hipocalcemia é algumas vezes devida a hipomagnesemia ou hiperfosfatemía, ou para uma secreção debilitada da hormona da paratiróide (Shane E., 1993) ou também para os distúrbios da vitamina D (Insogna K.L., 1993).

Os tecidos dentais podem também ser afectados no caso de uma deficiência na mineralização e formação do marfim ou esmalte dental. 0 pâncreas é também um órgão muito sensível para uma deficiência no equilíbrio do ião mineral, o qual é capaz de provocar uma inflamação, nomeadamente a pancreatite. Mesmo a glândula submandibular pode ser afectada, levando ao estado patológico de litíase o qual é associado com depósitos de 6/85 cálcio. 0 rim pode ser afectado, resultando no desenvolvimento de nefrolitiase.

Da mesma maneira, a acumulação de alumínio em pacientes urémicos está associada à doença dos ossos, o que é caracterizada pela redução da formação do osso levando à osteodistrofia (Sherrard et ai., 1988).

Dois outros distúrbios de preocupação de saúde pública são respectivamente uma hipercalcemia resultante de medicações (Stewart, 1993) e os síndromas de resistência da hormona paratiróide (Levine, 1993).

Devido aos vários distúrbios causados pela diminuição ou aumento do metabolismo de ião mineral (principalmente iões de cálcio, magnésio, fósforo ou alumínio) e o número muito reduzido de moléculas que são, até à data, de valor terapêutico na prevenção ou no tratamento dos estados patológicos acima descritos, existe uma grande necessidade pública para novas moléculas activas que são capazes de regular as concentrações de ião mineral dentro do corpo.

Os inventores caracterizaram anteriormente uma nova proteína de glândula submandibular, nomeadamente SMR1 (proteína de rato submandibular 1), o qual tem a estrutura de uma pró-hormona e cuja síntese está sob controlo andrógeno (Rosinsky-Chupin et al., 1988 e Pedido de Patente PCT n° WO 90/03981). 0 gene que codifica o SMRl pertence a uma nova família de vários genes, a família VCS, a qual tem sido localizada ao cromossoma 14, bandas p21-p22 (Courty et al., 1996; Rosinsky-Chupin et al., 1995) e para o qual a contraparte do gene humano tem sido caracterizado. O gene tem uma organização similar para um número de genes precursores de hormonas 7/85 (Rosinsky-Chupin et al., 1990). O SMRl mRNA está expresso numa maneira altamente específica de tecido, idade e sexo nas células acinar da glândula submaxílar do rato macho (SMG) e na próstata (Rosinsky-Chupin et al., 1993).

Tem sido descrito que, in vivo, o SMRl é selectivamente processado em pares de sítios de aminoácidos básicos numa maneira especifica de tecido e sexo para fazer surgir produtos peptídeo maturos, numa maneira similar ao caminho da maturação de precursores de peptídeo-hormonas (Rougeot et al., 1994). Geralmente, esta fragmentação proteolítica selectiva tem mostrado ser crítica para a geração e regulação de peptídeos biologicamente activos (Lindberg et al., 1991; Steiner et al., 1992). A biossíntese dos peptídeos gerados do SMRl ou da sua contraparte humana através de separação em pares de resíduos de arginina, por exemplo, o undecapeptídeo: VRGPRRQHNPR; o hexapeptídeo: RQHNPR; e o pentapeptídeo: QHNPR, é sujeito a distinguir caminhos reguladores dependendo de 1) o órgão: SMG e próstata, 2) a fase de desenvolvimento: desde as 6 semanas pós-natal, 3) o sexo: predominantemente no macho, e 4) hormonas gonadas: os andrógenos. Além disso, in vivo, os peptídeos maturos os quais acumulam no rato macho SMG, são exportados em espaço extracelular em resposta a um estímulo externo especifico e, desta maneira são transportados dentro dos fluídos da saliva e sangue (Rougeot et al.,1993). Os factos que esses peptídeos são principalmente produzidos nos ratos machos pós-pubescentes e são secretados na saliva e sangue sob condições estimuladas, levando uma condição que têm um papel fisiológico local e sistemático mediando algumas características comportamentais específicas nos machos, mas este papel era totalmente desconhecido. 8/85

Sumário e objectos da invenção

Os inventores descobriram recentemente que os produtos de maturação da proteína SMR1, especificamente um peptídeo de fórmula estruturai XQHNPR, reconhece sítios alvo específicos em órgãos que estão profundamente envolvidos na concentração de ião mineral. Esta descoberta levou os inventores a marcar o pentapeptídeo, hexapeptídeo ou undecapeptídeo SMR1, um papel activo na regulação das concentrações de ião de metal nos fluídos e tecidos corporais, e deste modo um papel terapêutico desses peptídeos em todos os distúrbios metabólicos relacionados com o desequilíbrio de ião mineral.

Deste modo, a presente invenção diz respeito ao uso terapêutico do peptídeo de fórmula estrutural XQHNPR em que o X denota um átomo de hidrogénio ou ο X representa uma cadeia de aminoácido escolhida de entre o seguinte: X=V ou X=VR ou X=VRG ou X=VRGP ou X=VRGPR ou X=VRGPRR, para prevenir ou tratar doenças causadas pelo desequilíbrio de ião de metal num mamífero, especialmente num humano.

Mais particularmente, um objecto da presente invenção é o uso dos peptídeos terapêuticos acima descritos para tratar ossos, dentes, renal, rim, intestino, pâncreas, mucosa estomacal ou distúrbios paratiróides causados principalmente por um desequilíbrio de ião de metal nos fluídos e tecidos corporais.

Consequenternente, os peptídeos terapêuticos de acordo com a presente invenção são usados para prevenir ou tratar doenças tipo hiper- ou hipo- paratiroidismo, osteoporose, pancreatite, glândula de litíase submandibular, nefrolitíase ou osteodistrofia. 9/85 A descoberta da actividade terapêutica da proteína SMR1 e os seus peptídeos derivados assim como os seus alvos fisiológicos in vivo permitiram aos inventores designar novas moléculas que podem ser consideradas como derivados biologicamente activos dos peptídeos terapêuticos acima descritos.

Tais derivados biologicamente activos dos peptídeos terapêuticos de acordo com a invenção, são peptídeos que estão relacionados estruturalmente e quimicamente com XQHNPR, tais como peptídeos com a mesma sequência de aminoácído que os peptídeos iniciais mas que contém um ou vários aminoácidos modificados que são capazes de conferir uma melhor estabilidade in vivo à molécula terapeuticamente activa e a qual possui a mesma actividade biológica como o peptídeo endógeno ou a qual se comporta como uma molécula antagonista do peptideo endógeno.

Deste modo, o uso terapêutico dos peptídeos que são homólogos ao peptídeo XQHNPR também é parte da presente invenção. Por peptídeo homólogo de acordo com a presente invenção, quer-se dizer que um peptídeo que contém uma ou várias substituições de aminoácidos na sequência XQHNPR. A substituição de aminoácído consiste na substituição de um ou vários aminoácidos consecutivos ou não consecutivos por aminoácidos "equivalentes”. A expressão aminoácidos "equivalentes" é aqui usada para denominar qualquer aminoácído que possa ser substituído por um dos aminoácidos que pertencem à estrutura inicial do peptídeo sem modificar as propriedades de hidrofilicidade e o alvo biológico da estrutura inicial do peptideo. Preferencialmente, os peptídeos que contém um ou vários aminoácidos "equivalentes", retêm as suas propriedades de especificidade e afinidade para os alvos biológicos do 10/85 peptídeo XQHNPR. Noutras palavras, os aminoácidos "equivalentes" são aqueles que permitem a geração ou obtenção de um polipeptídeo ou peptídeo com uma sequência modificada no que diz respeito ao XQHNPR, o dito polipeptídeo ou peptídeo modificado sendo capaz de agir como uma molécula agonista ou antagonista do peptídeo XQHNPR.

Esses aminoácidos equivalentes podem ser determinados pela sua homologia estrutural com os aminoácidos iniciais para serem substituídos e pela sua actividade biológica nas células alvo do peptídeo XQHNPR.

Como exemplo ilustrativo, deve ser mencionada a possibilidade de realizar substituições tipo por exemplo, leucina por valina ou isoleucina, ácido aspártico por ácido glutâmico, glutamina por asparagina, arginina por lisina etc., sendo entendido que as substituições invertidas são permitidas nas mesmas condições.

Por aminoácido modificado de acordo com a presente invenção também se quer dizer a substituição de um resíduo na forma em L por um resíduo na forma em D ou a substituição do resíduo de glutamina (Q) por um componente de ácido glutâmico Pyro. A síntese de peptídeos que contém pelo menos um resíduo em forma de D é por exemplo descrita por Koch et al., em 1977.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1- autoradiografias de corpo inteiro representativos de ratos machos de cinco semanas, 60 minutos depois da injecção de SMRl-derívado^H-pentapeptídeo (2qg ou 3 nmoles/lOOg de peso corporal). A: secção sagital lateral e B: secção sagital mediana. 11/85

As secções 20pm foram expostas durante 15 dias com hiperpelícula 3H. As áreas em preto correspondem a um alto levantamento de radioactividade. Ά maior concentração de grãos prata é visto na medular renal externa, mucosa glandular, lobos pancreáticos e submandibulares assim como tecidos de osso visíveis (base do crânio, costela, vértebra e membros) e tecido dental.

Figura 2- mapa representativo de órgãos alvo para SMR1-derivado3H-pentapeptídeo usando o gerador de imagens radio β de alta resolução. A: Secção sagital mediana e B: secção sagital lateral do corpo inteiro do rato, 60 minutos após a injecção de 3nmoles ou 2gg de peptídeo tritlado.

As secções 20pm são expostas durante 8 horas. As áreas a vermelho correspondem ao alto levantamento de radioactividade. A maior concentração de radioactividade é vista na medular renal externa, mucosa glandular gástrica, lobos pancreáticos e submandibulares assim como tecidos de osso visíveis (base de crânio, costela, vértebra e membros) e tecido dental.

Figura 3- perfil quantitativo da radioactividade em vários tecidos seguindo a administração de 2gg ou 3nmoles 3H-pentapeptídeo (QHNPR), 60 minutos após a dose. Quantificação directa foi taxada usando o gerador de imagens radio β dentro das secções de corpo inteiro sagital. O número de partículas β emitidas por área, foi contado durante 8 horas, e expressas como counts/mm2. A taxação de diferenças regionais quantitativas foi desempenhada com análise de imagem assistida por computador usando o programa de visão β. A 12/85 barras representam meios +SD de determinações triplicadas da mesma estrutura e duas secções de corpo inteiro.

Figura 4- perfil quantitativo de radioactividade em vários tecidos seguido da administração de 100 pmoles 3H-hexapeptídeo, 60 minutos após dose ou mais nmoles de peptídeo não classificado para ligação não específica.

Quantificação foi taxada usando um espectómetro e calculado como proteína cpm/mg dos extractos completos de tecido.

Figura 5- perfil quantitativo de radioactividade em vários tecidos seguido da administração de 5pmoles 125 ] -undecapeptídeo (VRGPRRQHNPR), 10 minutos após a dose ou mais 100 nmoles de peptídeo não classificado para ligação não específica.

Quantificação foi taxada usando um espectómetro gama e calculado como tecido cpm/g.

Figura 6- perfil representativo do tempo de percurso de SMR1-níveis de plasma derivado de pentapeptídeo, em ratos machos após uma única injecçâo intravenosa de 110 ng de pentapeptídeo tritiado.

Fracção de peptídeo livre de plasma foi medido após a purificação Q porapak RP (valores significam ±SD de 2 ratos) e fracção de pentapeptídeo livre após a cromatografia RP HPLC, como descrito em "materiais e métodos”.

Figura 7- fotomicrografia de campo claro de autoradiografia de levantamento celular 3H-pentapeptídeo in vivo em secções de vários órgãos, incluindo Ά: medula externa do rim, B: mucosa gástrica glandular, C: lobos pancreáticos, D: raiz do incisor superior, E: osso vertebral, F: osso longo da tíbia proximal. 13/85

As imagens do campo claro representara in vivo, classificação via radio de secções 5gm. 60 minutos após a injecção de concentrações fisiológicas de peptídeo tritiado (160 ng). As secções foram coloridas com hematoxilina e toluidina azul para verificar detalhes microanatómicos e foi fotografado para uma magnificação de impressão final de 400X (A,B,'D,E,F) e 600X (C).

Figura 8- A: mapa da distribuição renal de 3H-pentapeptídeo usando o gerador de imagens radio β de alta resolução. A classificação via radio in vivo, 60 minutos após a injecção de concentrações fisiológicas de peptídeo tritiado (160 ng) (A-l}, ou mais 100- excesso incluído de peptídeo não classificado para ligação nào especifica (A— 2). As secções 5gm foram expostas durante 50 horas. A área a branco corresponde à maior concentração de radioactividade. B: quantificação da radioactividade dentro do rim seguido dos 60 minutos após a administração de concentrações fisiológicas de 3H-pentapeptídeo in vivo ou maior 100- excesso de peptídeo não classificado correspondente. O conteúdo da radioactividade foi medido directamente com um espectómetro μβ e calculado como proteína cpm/mg das secções 20gm de tecido completo (B-2) ou dos extractos de tecido completo (B—1) ou com um gerador de imagens radio β e calculado como verificado X100/mm2 de secções 5pm (B-3-1). A taxação de diferenças regionais quantitativas foi desempenhada com análise assistida por computador da imagem usando o programa de visão β. (B-3-2 e B-3-3).

Figura 9- perfil quantitativo de radioactividade de diferentes fracções de preparações de membrana da medula externa do rím. 14/85

Figura 10- isoelectrofocagem (IEF) das proteínas das membranas da medula externa do rim solubílizado com SB14 1% e SB201 1 M.

Figura 11- coador molecular (Superdex 200) das fracções que resultam de isoelectrofocagem das preparações da membrana solubilizada da medula externa do rim.

Figura 12- perfil da cromatografia correspondente à figura 10 com uma densidade óptica a 27 4 nm, e resultando de fraccionamento a 0.75 ml/minuto.

Fracções de isoelectrofocagem das preparações da membrana solubilizada da medula externa do rim.

Figura 13- calibração do Superdex 200.

Figura 14- cromatografia da fase liquida inversa FPLC Ci8 (Rep RFC, Pharmacia).

Fracções IEF de preparações da membrana da medula externa do rim.

Figura 15- perfis cromatográficos FPLC RP-18 de radioactividade, densidade óptica a 280 nm, concentração de acetonitrilo e fraccionamento a 0.75 ml/minuto).

Cromatografia representativa de fracções IEF de preparações de membrana solubilizada da medula externa do rim.

Figura 16- perfil de isoelectrofocagem preparativo das preparações da membrana solubilizada em SB14/SB201 da medula externa do rim.

Figura 17- preparações de membrana de lobos pancreáticos solubilizados em SB14/SB201. 15/85

Figura 18- iEF de preparações de membrana de mucosa gástrica glandular solubilizada em SB14/SB201.

Figura 19- IEF de preparações de membrana de matriz do osso trabecular solubilizado em SB14/SB201.

Figura 20- IEF de proteínas de membrana de matrix dentinal solubilizado em SB14/SB201.

Figura 21- Coador molecular (Superdex 200) de fracções cítosólicas e membrana da medula externa do rim solubilizado em detergente.

Figura 22- perfis de cromatografia correspondentes à figura 21 de OD a 274 nm e fraccionando a 0.75 ml/min. A: fracção de membrana solubilizada B: fracção citosólica da medula externa do rim.

Figura 23- perfil do coador molecular (Superdex 200) de fracções de membrana pancreática solubilizada em SB14/SB201.

Figura 24- perfil do coador molecular (Superdex 200) das proteínas da membrana da mucosa gástrica glandular solubilizada em SB14/SB201.

Descrição detalhada das realizações preferidas

Os peptídeos usados de acordo com a presente invenção podem ser preparados numa maneira convencional pela síntese do peptideo na fase liquida ou solida através de uniões sucessivas dos diferentes resíduos de aminoácidos para serem 16/85 incorporados (da extremidade N-terminal à extremidade exterminai na fase líquida, ou da extremidade C-terminal até à extremidade N-terminal na fase sólida) em que as extremidades N-terminal e as correntes laterais reactivas são previamente bloqueadas por grupos convencionais.

Para a síntese da fase sólida, a técnica descrita por Merrifield pode ser usada em particular. Alternativamente, a técnica descrita por Houbenweyl em 1974 pode também ser usada.

Para produzir uma corrente de peptídeo usando o processo Merrifiel, é usado um polímero de resina altamente poroso, no qual o primeiro amínoãcido da corrente é fixo. Este aminoácido é fixo à resina através dos seus grupos carboxil e da sua função amino, é protegida por exemplo pelo grupo t-butiloxicarbonilo.

Quando o primeiro aminoácido C-terminal é assim fixo à resina, o grupo protector é removido da função amino ao lavar a resina com um ácido. Se o grupo protector para a função amino é o grupo t-butiloxicarbonilo, pode ser eliminado ao tratar a resina com ácido trifluoroacético. 0 segundo aminoácido o que fornece o segundo resíduo da sequência desejada é então unido à função amino desprotegida do primeiro aminoácido C-terminal fixo para a corrente.

Preferivelmente, a função carboxil deste segundo aminoácido é activado por exemplo, usando diciclohexilcarbodiimida, e a função amino é protegida, por exemplo, usando t-butiloxicarbonilo. 17/85

Desta maneira, a primeira parte a corrente do peptideo desejaac é obtida, o que compreende dois aminoácidos, a função ctmino terminal do qual é protegido. Como antes a função amino é desprotegida e o terceiro resíduo pode então ser fixo, sob condições similares, para aqueles usados na adição do segundo axninoãcido C-terminal.

Deste modo, os aminoácidos os quais são para formar a corrente do peptideo, são fixos, um após o outro, para o grupo amino, o que é previamente desprotegido de cada vez, para a parte da corrente do peptideo já formada, o que é anexo à resina.

Quando toda a corrente de peptideo desejada é formada, os grupos protectores são eliminados dos vários aminoácidos o que constitui a corrente do peptideo e o peptideo é solto da resina, por exemplo usando ácido hidrofluórico.

Os peptídeos deste modo sintetizados podem ser um polímero do peptideo XQHNPR, que contém 2 a 20 unidades monoméro da sequência do aminoácido XQHNPR, preferivelmente 4 a 15 unidades monoméro e mais preferivelmente 5 a 10 unidades monoméro. Os polímeros podem ser obtidos pela técnica de Merrifield ou a outro qualquer método de síntese de peptideo convencional bem conhecido por um especialista.

Os peptídeos deste modo obtidos podem ser purificados, por exemplo através de cromatografia líquida de alta performance, tal como a fase inversa e/ou mudança catiónica HPLC, como descrito por Rougeot et al. Em 194.

Os peptídeos usados no método terapêutico de acordo com a presente invenção também podem ser obtido usando métodos de 18/85 engenharia genética. A sequência de ácido nucleíco do cADN que codifica a proteína SMR1 do aminoácido 146 completo foi descrita no Pedido de Patente PCT n° WO 90/03891 (Rougeot et al.,). Para os derivados de peptideo biologicamente activos do XWHNPR, um especialista da técnica vai referir-se à literatura geral para determinar quais os códons adequados podem ser usados para sintetizar o peptideo desejado.

Para a expressão genética do peptideo XQHNPR, a sequência nucleótida seguinte pode ser usada, baseado no uso de códon geral em mamíferos:

Peptideo VRGPRRQHNP

RDNAGTC AGA GGC CCA AGA AGA CAA CAT AAT CCT AGA

Ou uma sequência nucleótida que hibridiza com a sequência acima sob condições severas e as quais codificam um peptideo com qualitativamente a mesma aetividade de regulação do ião mineral que o peptideo QHNPR.

Por condições severas de hibridização, de acordo com a presente invenção, entendem-se as seguintes condições: 0 passo de hibridização é executado a 65°C na presença de 6xSSC, 5x solução Denhardt, 0.5% SDS e IQOpg/ml ADN de esperma de salmão. Os passos de lavagem consiste em: - lavar duas vezes durante 5 minutos a 65°C num espaço de 2x SSC e 0.1% SDS; - lavar uma vez durante 30 minutos a 65°C num espaço de 2x SSC e 0.1%; - lavar uma vez durante 10 minutos a 65°C em O.ix SSC e 0.1% SDS. 19/85 A expressão do polinucleótido que codifica o XQHNPR pode ser optimizado, de acordo com o organismo no qual a sequência tem de ser expressa e o uso especifico do códon deste organismo (mamíferos, planta, bactéria, etc.). Para bactérias e plantas, respectivamente as utilizações gerais do códon podem ser encontradas no Pedido de Patente Europeia n°. EP-0359472 (Mycogen). É agora fácil produzir proteínas em grandes quantidades através de técnicas de engenharia genética usando, como expressão vectores, plasmidas, fagos ou fagomidas. Os polinucleótidos que codificam para os polipeptídeos da presente invenção, são inseridos num vector de expressão adequada para produzir o polipeptídeo de interesse ín vitro. Consequentemente, a presente invenção também abrange a produção através de técnicas de engenharia genética da proteína SMR1 ou um dos seus produtos de maturação. A proteína SMRl (a qual pode ser considerada como percursora dos produtos de maturação diferentes) é processado por furina. A Furina é uma convertase tipo subtilisina envolvida num processo endoproteolítico de pós-tradução de várias pró-hormonas. Deste modo, a furina pode ser vantajosamente usada em combinação com um percursor do peptideo XQHNRR para obter o produto de maturação correspondente.

Deste modo, um método para produzir a proteína SMRl ou um dos seus produtos de maturação tais como o peptideo XQHNPR da invenção, ou também um peptideo que contenha aminoácidos "equivalentes" como acima descrito, compreende os seguintes passos de: a) amplificar opcionalmente o código do ácido nucleíco para o polipeptídeo desejado usando um par de escorvadores 20/85 específicos para o genómico SMR1 ou sequência cADN (por DAS, TAS, 3SR, NASBA, TMA, LCR, RCR, CPR, replicase Q-beta ou PCR); b) inserir o código do ácido nucleíco para o interesse da proteína SMR1 num vector adequado; c) inserir o código do ácido nucleíco para a furina num vector adequado, o dito vector sendo o vector do passo b) ou o dito vector sendo uma forma de vector diferente, o vector do passo b) . d) cultivar, num desprovido de soro de cultura média adequada, uma célula hospedeira anteríormente transformada ou transfectada com um vector recombinante do passo b) e c); e) colher a cultura média assim condicionada e a célula hospedeira, por exemplo ao dissolver a célula hospedeira através de sonicação ou através de um choque osmótico; f) separar ou purificar, a cultura média, ou o comprimido do llsato da célula hospedeira resultante, o polipeptideo de interesse deste modo produzido. g) caracterizar o peptídeo de interesse obtido. h) opcionalmente experimentar para o reconhecimento específico do peptídeo através de um anticorpo policlonal ou monoclonal dirigido contra o peptídeo XQHNPR, especificamente contra o peptídeo QHNPR.

Um vector adequado para a expressão da proteína SMR1 e a proteína convertase acima definida é o vector baculovírus que pode ser propagado em células de insecto e em linhas de células de insecto. Um sistema de vector hospedeiro especifico adequado é o vector de transferência baculovírus (Phamingen) pVL1392/1393 que é usado para transferir a linha de células SF9 (ATCC N°CRL 1711) o qual é derivado da Spodoptera frugiperda. 21/85

Outro vector adequado para executar o processo acima descrito é o vector virus vaccinia. Nesta realização especifica, o BSC-40 ou LóVo são usados para passos de transfecção e cultura. A purificação da proteína recombinante pode ser realizada pela passagem numa coluna cromatografia de afinidade Nickel ou Copper. A coluna cromatograf ia Nickel pode conter a resina Ni-NTA (Poratoh et al., 1975). A reacção de amplificação PCR foi descrita por Saiki et al., em 1985; a técnica DAS foi descrita por Walker et al. Em 1992 e foi melhorada por Spargo et al, em 1996; a reacção de amplificação TAS foi descrita por Kwoh et al. Em 1989; a técnica 3SR foi descrita por Guatelli et al. Em 1990; a técnica NASBA foi descrita por Kievitis et al. Em 1991; a reacção LCR foi descrita por Landergen em 1991 e melhorada por Barany et al em 1991; a técnica RCR foi descrita por Sêgev em 1992; a técnica CPR foi descrita por Duck et al. Em 1990.

Ref Co-transfecção com convertase. XXX

Os peptídeos produzidos através de métodos de engenharia genética para a invenção podem ser caracterizados por ligação numa coluna cromatografia de imuno-afinidade na qual os anticorpos policlonal ou monoclonal dirigidos a XQHNPR foram previamente imobilizados.

Mais preferivelmente, o peptídeo de valor terapêutico contido nas composições terapêuticas de acordo com a presente invenção é purificado por HPLC como descrito por Rougeot et al. Em 1994. A razão para preferir este tipo de purificação 22/85 de peptídeo ou proteína é a falta de produtos laterais encontrados nas amostras de extracção.

Os anticorpos podem ser preparados a partir de híbridomas de acordo com a técnica descrita por Kohler e Mílstein em 1975. Os anticorpos policlonal podem ser preparados através de imunização de um mamífero, especialmente um rato ou um coelho, com um peptídeo de acordo com a invenção que é combinada com um adjuvante de imunidade e depois por purificar os anticorpos específicos contidos no soro do animal imunizado na coluna de cromatografia de afinidade a qual foi previamente imobilizada o peptídeo que foi usado como antigénio. A técnica para preparar e usar uma coluna de cromatografia de imuno-afinídade foi descrita, por exemplo por Bird et al. Em 1984.

Uma realização preferida para preparar anticorpos salientes contra a proteína SMR1 ou os seus produtos de maturação é descrito daqui para a frente, usando o pentapeptídeo QHTSFPR como um exemplo. Resumidamente, o peptídeo QHNPR é conjugado para óvulo de albumina (Calbiochem) usando o procedimento de benzídína-bis-diazotada descrito por Gregory et al. Em 1967, o índice de resíduos peptídeo para uma molécula de ovalbumina sendo 5:1. Os coelhos são ínjectados no momento 0 com 1 mg do peptídeo conjugado. Dois meses após a primeira Injecção, os animais são ínjectados com 0.5 mg do peptídeo conjugado e uma terceira injecção de 0.5 mg do mesmo peptídeo é desempenhado entre dois e quatro meses apôs a segunda injecção. O anti-soro é colhido entre duas a quatro semanas a seguir à terceira injecção de peptídeo conjugado e opcionalmente purificado na coluna de cromatografia de afinidade como anteriormente descrito. Preferencialmente a injecção é uma 23/85 injecção intradermalmente multi-pontos; geralmente são executados dez pontos de injecção.

Outros derivados biologicamente activos dos peptídeos terapêuticos da invenção consistem em moléculas que são tanto (ou ambas) estruturalmente ou quimicamente não relacionadas com os peptídeos endógenos mas ligam os mesmos alvos específicos e têm uma actividade agonista ou antagonista. Preferivelmente, os derivados biologicamente activos dos peptídeos terapêuticos usados no método terapêutico de acordo com a presente invenção são favorecidos com uma meia-vida in vivo mais duradoura que as suas contrapartes endógenas natural.

Os métodos que permitem o especialista da técnica a seleccionar e purificar os derivados biologicamente activos que ligam os mesmos alvos e têm uma actividade biológica agonista e antagonista do peptídeo XQHNPR da invenção, são descritos de acordo com este documento. 0 derivado biologicamente activo do peptídeo XQHNPR pode ser uma proteína, uma hormona, um anticorpo ou um componente sintético o qual é uma molécula peptídeo ou nâo peptídico, tal como qualquer componente que pode ser sintetizado por métodos convencionais de química orgânica.

Selecção dos derivados biologicamente activos do peptídeo XQHNPR da invenção é executado ao taxar a ligação de uma molécula ligante candidata para as células ou órgãos alvo conhecidos do peptídeo XQHNPR, especialmente o pentapeptídeo QHNPR e ao determinar as mudanças metabólicas induzidas por esta molécula candidata no seu alvo, tal como a síntese dos metabolitos primário e secundário como resultado de um sinal 24/85 de transducção via as quinases de proteína ou ciclase adenilato e a activação de uma proteína da família G. A ligação da molécula candidata para as células de cultura primária, linhas de células ou amostras de tecido frescas estabelecidas (criosecções ou fatias) é executado como descrito daqui para a frente.

As experiências da ligação da molécula candidata são geralmente executados a uma temperatura fria (4°C). Contudo são úteis as variações do procedimento Standard abaixo descrito envolvendo incubação a 37°C, para taxar a internaiização e destruição do pentapeptídeo e uma molécula ligante candidata derivada biologicamente actíva sobre a ligação na superfície da célula (Wakefield, 1987). Para facilitar a leitura do protocolo descrito mais para a frente, o pentapeptídeo QHNPR é usado em vez de uma molécula candidata derivada biologicamente activa. * Consequentemente, um objecto da presente invenção é um processo de filtração de moléculas ligantes que ligam especifícamente ao receptor alvo para o pentapeptídeo XQHNPR, compreendendo os passos de : a) preparar uma mono-camada de cultura de células alvo confluentes ou preparar um espécimen de órgão alvo ou uma amostra de tecido; b) adição da molécula candidata a ser testada em competição com concentração meio saturada do pentapeptídeo classificado; c) incubação da cultura da célula, espécimen ou amostra de tecido do órgão do passo a) na presença da molécula candidata classificada durante tempo suficiente para ligação específica para ocorrer; 25/85 d)quantificar a ligação especificamente classificada para a cultura de célula alvo, espécimen ou amostra de tecido de órgão. *Gutro objecto da presente invenção é um processo para determinar a afinidade de moléculas ligantes que ligam especificamente ao receptor alvo para o pentapeptídeo XQHNPR, compreendendo os passos de: a) preparar uma mono-camada de cultura de células alvo confluente ou preparar um espécimen alvo ou uma amostra de tecido do órgão; b) adição da molécula candidata para a qual foi previamente classificada com uma classificação radioactiva ou não radioactiva; c) incubação da cultura da célula, espécimen ou amostra de tecido do órgão do passo a) na presença da molécula candidata classificada durante tempo suficiente para ocorrer uma ligação específica; e d) quantificar a ligação especificamente classificada para a cultura de célula alvo, espécimen ou amostra de tecido de órgão. A molécula ligante candidata pode ser classificada radiactivamente (32P, 35S, 3H, x251 etc»..) ou classificada não radiactivamente (biotlna, digoxigenina, fluorescina, etc.).

Especificamente, os materiais usados para desempenhar o processo ligação acima referido são: - ligação divisória | : 128 mM NaC | , 5MM KC | , SmM MgS04, 1.2 mM HEPES, pH 7.5, BSA (entre 0.1 e 2 mg/ml). 26/85 - ligação divisória | j: Dulbecco modificou meio Eagle {Gibco Brl) supplementada com 25 mM HEPES, pH 7.5, e 2 mg/ml de BSA (entre o.l e 2 mg/ml). H-classifiçada ou 1251 -classificada QHNPR: uma diluição adequada é preparada no meio de ligação imediatamente antes de cada experiência. Esta diluição deve ser feita num tubo de plástico Minisorb™ (Nunc). 0 3H-classificada QHNPR tem uma radioactividade específica de 60 Ci/mmole (CEA, Saclay, França). A técnica de classificação 1231 é descrita mais à frente. ~ QHNPR; adequadamente diluído usando a mesma divisão e condições que 3H-classifiçada ou i2ii| QHNPR. ~ divisão de solubilização de célula: 1% (v/v) Triton X-100, 10% (v/v) glícerol, 25mM HEPES, pH 7.5, Img/ml BSA. - Células: são usadas 2 ou 10-cm2 mono-camadas confluente

preferivelmente disseminadas em placas com vários espaços, experiências envolvendo tipos de células que se descolam facilmente do substractum, devem ser executadas com suspensões de células. As suspensões de uma só célula podem ser obtidas através de descolagem mecânica (através de pipetas) ou breve exposição a 37°C para dividir a descolagem com 1 mM EDTA, 128 mM NaC | , 5 mM glucose, 25 mM HEPES, pH 7.4,2 mg/ml BSA. A classificação radio-iodinada de QHNPR é realizada da seguinte maneira: 0 peptídeo QHNPR é classificado de acordo com o método de Greenwood et ai., 1963, usando ImCi Na 1251 (Amersham), 0.8pg (1 nmoU pentapeptideo e 15pg cloramina T (Fluka) em 50pg sódio borato, pH8. Depois de uma reacção de 2 minutos, a mistura é cromatografada por filtração a gel GF05 (Pharmacia - LKB) para isolar o pentapeptideo 1231-classificado e é 27/85 subsequentemente cromatografado em porapak de fase inversa Q™ (Waters-Millipore) para eluir o pentapeptídeo mono-ioinado-classifiçado. A radioactívidade especifica, correspondente a um átomo de molécula radioiodo/peptideo, é estimado como 1500 Ci/rrunol. A própria experiência compreende os seguintes passos: a) mono-camadas de células lavadas com emulsão de ligação. As emulsões de ligação I e II podem ser usadas impermutavelmente em experiências executadas a 4°C, mas a emulsão de ligação II deve ser usado em experiências que envolvem um passo de incubação a 37°C. Após lavar uma vez, as mono-camadas são deixadas a equilibrar com a emulsão de ligação durante 30 minutos a 4°C. b) aspiração da emulsão e adicionar a emulsão de ligação gelada às placas em gelo. 0 volume da emulsão é cerca de 1 ml/2-cm2 de espaço. c) adicionar 3H-classifiçado ou 1251 classificado QHNPR diluído aproximadamente num pequeno volume de emulsão de ligação. Concentrações de 3H-classifiçado ou 1251-classificado QHNPR na extensão pH, são definidas por uma curva de saturação (perto da dissociação constante Kd). Se desejado, o 3H-classifiçado ou 1251-classificado QHNPR pode ser incorporado na emulsão usado no passo b) antes da adição aos espaços. Imediatamente antes ou depois da adição de 1251 -classificado QHNPR, e QHNPR não classificado para aqueles espaços que o requerem. QHNPR é usado para dois propósitos. Concentrações de aumento de QHNPR são usados para suplementar a concentração traçadora de 3H-classificado ou 125 j -classificado QHNPR em experiências designadas para estabelecer a curva de saturação de QHNPR da ligação às células. As concentrações de aumento de QHNPR ou da molécula 28/85 ligante candidata são também usadas no método receptor de ligação competitivo. Adicionalmente, um invólucro 50 ou maior de excesso de QHNPR é usado em todas as experiências para determinar a quantidade de 1251-classificado QHNPR o qual é ligado não especificamente. Esta determinação é baseada na suposição que o 3H-classificado ou 1251 -classificado QHNPR compete para ligação para sítios relevantes de alta afinidade, mas não para sítios não específicos nas superfícies de células ou pratos.

d) as experiências incubaram durante cerca de 1 hora a 4°C numa plataforma que oscila a 120 cpm. e) aspiração do meio. Lavar culturas cinco vezes com emulsão de ligação | gelada. f) adicionar emulsão de solubilização (0.5 ou 1.5 ml para 2-ou 10- cm2 de espaços, respectivamente). Incubar 40 minutos a 4°C. g) radioactividade verificada nos extractos solúveis. Para determinar a ligação específica, subtrair as verificações por minuto obtido em espaços incubados com 3H-classificado ou 125I-classificado QHNPR na presença de QHNPR em excesso a partir das verificações por minuto em espaços incubados só com 3H-classifiçado ou 1251-classificado QHNPR. verificação de uma alíquota de cada diluição de 3H-classifieado ou 1251 -classificado QHNPR usado na experiência para determinar valores de radioactividade específica. Verificação do número de células por espaço para determinar a quantidade de QHNPR ligado por célula. A cerca de uma hora de incubação de acordo com o passo a) acima mencionado, é suposto um período de tempo de incubação que é suficiente para o QHNPR ou QHNPR classificado para ligar aos seus sítios alvo específicos na célula, tendo em conta que a experiências é executada a uma temperatura de 29/85 4 ° C, deste modo a uma temperatura para a qual a fluidez da membrana é lenta. Consequentemente, o período de tempo de incubação adequado está compreendido entre i e 12 horas (durante a noite).

Outros métodos de ligação receptores podem também ser usados para seleccionar derivados biologicamente activos de peptídeo XQHNPR da invenção tais como aqueles descritos por Whitcomb et al. em 1993, Epelbaum et al. em 1993, Ricci et al. em 1993, Loring et al. em 1993, Walsh et al. em 1995, Roberts et al. em 1995 ou também Wu et al. em 1996, as experiências de ligação descritos nos artigos acima mencionados sendo aqui incorporados através de referência.

Para taxar a actividade biológica de uma molécula ligante candidata de interesse para o propósito da presente invenção que tem sido positivamente seleccionada de acordo com a experiência de ligação previamente descrita e para determinar se esta molécula ligante competitiva é seleccionada. Age como uma molécula agonista ou antagonista do peptídeo XQHNPR da invenção, experiências metabólicas diferentes podem ser executadas. Daqui mais para a frente, é descrita uma experiência ciclase adenilato que é executada tanto nas culturas primárias de células alvo como também nas linhas de células ou homogenatos de tecido alvo.

Resumidamente, os homogenatos de tecido ou células cultivados (proteína l-10Qpg) são incubados em 50 mM de emulsão Tris/HEPES, pH 7.5, contendo lmM Mg SQ4, 1 mM EGTA, 1 mM 3-Isobutí 1-1-metIlxantina, 0.1% (wt/vol) BSA, 1 mM ATP, 25 mM fosfato creatína, 260 U/ml quinase creatina (E.C.2.7.3.2), e 6.5 U/ml mioquinase (E.C.2.7.4.3) num vol final de ΙΟΟμΙ durante 10 minutos a 37°C. A reacção é parada ao adicionar ΙΟΟμΙ 0.5% (wt/vol) SDS e fervendo durante 2 minutos. CAMP é 30/85 extraído com Dowex 50WX-8 e analisada por RIA (Stangi e al. 1993). a. quantidade de cAMP produzido em resposta a presença da molécula ligante candidata (1 θ“10~ 10“5 M. de extensão) é taxada corno acima descrito. Uma estimulação de actividade ciclase adenrlato o qual é equivalente, quando usado sozinho, ou maior, quando associado com concentração sub—optimal de QHNPR, que a estimulação da actividade ciclase adenilato induzida só por XQHNPR, e mais especificamente só QHNPR, é considerado como positivo e a molécula ligante candidata é deste modo classificada como agonista do peptídeo XQHNPR da invenção.

Noutra realização do método de filtração de acordo com a presente invenção, a quantidade de cAMP produzida na presença de XQHNPR, especialmente QHNPR, e a molécula ligante candidata é taxada. Se a presença da molécula ligante candidata é capaz de suprimir ou bloquear o estímulo de actividade ciclase adenilato induzido por XQHNPR, especificamente QHNPR, depois a molécula ligante candidata é classificada entre os componentes antagonistas do peptídeo de acordo com a invenção.

De facto, a quantificação da actividade ciclase adenilato representa só uma realização dos métodos de filtração de acordo com a presente invenção. Um especialista terá compreendido que as mudanças metabólicas diversas da fisiologia da célula podem ser visualizadas para taxar a actividade agonista ou antagonista da célula ligante candidata a ser experimentada. Outras experiências de quantificação da mudança metabólica são também incluídas pela presente invenção, tais como mudanças na actividade de 31/85 quinases, nos actividade dependente das proteínas GTP-G, na produção de metabolitos específicos de célula- o tecido- tais como colagenase por tipos de células ostegénicas.

Deste modo, a presente invenção também diz respeito a um processo para moléculas ligante de filtração que possuem uma actividade biológica agonista no receptor alvo do pentapeptídeo XQHNPR, compreendendo os seguintes passos de: a) preparar uma mono-camada de cultura de célula alvo confluente ou preparar um espécimen ou uma amostra de tecido de órgão alvo (criosecções ou fatias); b) incubar a cultura de célula, espécimen ou amostra de tecido de órgão do passo a) na presença da molécula candidata (1(Γ10-1(Γ5 MJ e de uma concentração sub-maxíirtal de QHNPR (70 para 80% saturação de receptor) durante um tempo suficiente para a activação de ciclase adenilato ocorrer; c) Quantificar a actividade ciclase adenilato presente no material biológico do passo a) , respectivamente na presença ou na ausência da molécula ligante candidata e na presença ou na ausência de uma concentração sub-maximal de XQHNPR.

Outro objecto da presente invenção compreende um processo para moléculas ligantes de filtração que possui urna actividade biológica antagonista no receptor alvo do pentapeptídeo XQHNPR, compreendendo os passos de: a) preparar uma mono-camada de cultura de célula alvo confluente ou preparando um espécimen ou amostra de tecido de um órgão alvo; b) incubar a cultura de células, exemplar ou amostra de tecido do órgão do passo a) na presença do peptídeo XQHNPR, especificamente o peptídeo QHNPR, na presença ou na ausência 32/85 da molécula candidata durante tempo suficiente para a activação da ciclase adenilato para ocorrer, mais particularmente durante 2-20 minutos, preferivelmente 5-15 minutos, e ainda mais preferivelmente 10 minutos; c) quantificar a actividade ciclase adenilato presente no material biológico do passo a) , respectivamente na presença ou na ausência da molécula ligante candidata.

Como acima mencionado, outra experiência metabólica para taxar a actividade agonista ou antagonista da molécula ligante candidata compreende a incubação da candidata ligante na presença de uma cultura de célula primária ou linha de célula determinando, tanto quantitativamente como qualitativamente, o colagénio produzido em resposta ao estimulo in ví tro (com extensão de 1(Γ10-1(Γ5 M de concentração da molécula a ser testada).

Como já anteriormente mencionado, a experiência de ligação e a experiência metabólica, tal como a experiência ciclase adenilato, pode ser executada em culturas de célula primária, estabelecendo linhas de células ou em fatias de tecido frescas, criosecções de tecido ou homogenatos de tecido.

Uma linha de célula preferida que é usada nos métodos filtração de acordo com a presente invenção é uma linha de célula mesodermal clonal osteogénica do rato, nomeadamente o Cl, o qual deriva do teratocarcinoma. Isso expressa os oncogenes SV4Q sob o controlo do promotor Ela adenovírus (Chentoufi et al., 1993; Kellermann et al., 1990; Poliard et al., 1993; Poliard et al., 1995).

Outras linhas de células preferidas consistem em várias linhas de células clonal derivadas do mesmo esforço do rato a 33/85 partir do qual a linha Cl de células clonal acima mencionado, foi inicialmente derivada, ma is especificamente, linhas de células clonal derivadas da célula epitelàal dos túbulos proximal renal.

Outras linhas de célula preferidas de origem diferente são as seguintes, que estão em geral disponíveis a partir da recolha de cultura de célula ATCC: 1) Linhas de células do pâncreas: - AsPC-1 (ATCC N° CRL1682), origem humana; - Bx PC-3 (ATCC N° CRL1687), origem humana; - Capan-1 (ATCC Na HTB79), origem humana; - Capan-1 (ATCC N° HTB80), origem humana; - PANC-1 (ATCC N° CRL1469), origem humana; - AR42J (ATCC N° CRL1492), origem do rato; - ARIP (ATCC N° CRL1674), origem do rato; 2) Linhas das células da próstata: - DU145 (ATCC N° HTB81), origem humana; - LNCaP. FGC (ATCC N° CRL1740), origem humana; - PC-3 (ATCC N° CRL1435), origem humana; 3) Linha de célula do rim: - RAG (ATCC N° CCL142), origem do rato; 4) Linha de célula da glândula submandibular: - SCA-9 Clone 15 (ATCC N° CRL1734), origem do rato; 5) Linha de célula do intestino: 34/85 ΙΑ-XsSBR (ATCC N° CRL1677), origem do rato; 6) Linhas de células de osteogénio: - FC25T (ATCC N° CRL6090), origem do gato; - D-17 (ATCC N° CCL183), origem do cão; - 143B (ATCC N° CRL8303), origem humana; - HOS (ATCC N° CRL 1543), origem humana; - Saos-2 (ATCC N° HTB 85), origem humana; - SK-ES-1 (ATCC 11° HTB 86), origem humana; - UMR-106 (ATCC N° CRL 1661) , origem do rato; - UMR-108 (ATCC n° CRL 1663), origem do rato;

Para o propósito de uma realização especifica da experiência metabólico de acordo com a presente invenção, nomeadamente a análise de colagénio, a experiência é executada como descrita abaixo: Células osteogénicas confluentes, especificamente a linha de células Cl descrita acima, são classificadas durante 24 horas com 50 pCi/ml de 4.5 [3H]prolina (32 Ci/nmole; Commissariat à 1'Energie Atomique, Saclay, França) em DME suplementadas com 1% FBS, 100pg/ml de ácido ascórbico, e õOpg/ml de fumarato b-aminopropionitrilo [Sigma Chemical Co., Saint Louis, Missouri, USA). As células são recolhidas em 50 mH Tris-HC| (pH 7.4) com 150 mM NaC|, 25 mM EDTA, 10 mM N-etilmaleimida e 2 mM PMSF, e juntas com o meio de cultura. Após a sonicação e adição do tricloroaeetato (TCA) (10%), o resíduo insolúvel é recoxhido por centrifugação· A quantidade de [3H1prolina incorporada para a proteína coiagenase-diqestível e a proteína não colagenase é determinada como descrita polo Peterkofsky et al., em j.971. 35/85

Os tipos de colagénio são determinados por PAGE: comprimidos re-suspensos em 0.5 M de ácido acético são digeridos com 100 pg/ml de fumarato pepsina (Sigma Chemical Co., Saint-Louis, Missouri, USA), pH 2.0 para 4 h a 4°C. A pepsina digestiva trouxe um pH 8.0 e é dialisado e liofilizado. As amostras são então analisadas por SDS-PAGE. A redução atrasou com 2-mercaptoetanol e é usado em algumas amostras. As proteínas classificadas são visualizadas por fluorografia ou autoradiografla e quantificadas por um dispositivo radiogerador de imagens beta.

Outros eventos metabólicos são seguidos ao determinar as mudanças metabólicas induzidas pelas moléculas terapêuticas usadas de acordo com a presente invenção, tal como os depósitos de componentes minerais na matriz do colagénio. Para este propósito, é usado a experiência descrito de acordo com este documento: - culturas de células: é usada a linha de célula mesodermal clonal Cl. As células Cl são laminadas em células 3X1Q5 em pratos de plástico não tratados com diâmetro de 100 mm e são cultivadas num meio Eagle modificado Dulbecco (DMEM, Gobco, Grand Island, N. Y., USA) com 10% de soro fetal de bezerro (FCS). Após 8-10 dias de cultura, são formados grupos tridimensionais. Nessa axtura (dia 0) , as células são cultivadas em DMEM com 1% FCS em presença de 10 mM glicerofosfato - beta (Sigma) e 50pg/ml de ácido ascórbico (Sigma). Em alguns espaços, 50 pg/ml de tetraciclína são adicionados ao media para visualizar, através de classificação fluorescente, o mineral Incorporado dentro da matriz. 0 meio é mudado cada três dias e as culturas são levadas a cabo até 30 dias. 36/85 - determinações bioquímicas. Nos dias 0,2,7,11,16,22 e 30, são recolhidas as culturas, lavadas três vezes em PBS livre de cálcio, e dividido em três partes iguais para avaliação de cálcio, actividade fosfatase alcalina e síntese de DNA. Para determinação de cálcio, as culturas são dissolvidas em 1 ml 6N MCI para lha 100°C. O cálcio é experimentado em alíquotas por espectrometria de absorção atómica após diluição em cloreto de lantânio. Para determinação de actividade fosfatase alcalina, 1 ml de água distilada fria é adicionada às culturas. Após a sonicação durante 10 segundos, o material insolúvel é removido por centrifugação. Algumas amostras são aquecidas a 56°C durante 1 hora para medir a actividade fosfatase alcalina {calor variável) do tipo de osso. A actividade do enzima é determinada ao medir a quantidade de p-nitrofenol formado a 37°C após 30 minutos. O conteúdo de células com proteínas é medido por um método descrito por Lowry et al. em 1951. O glicerofosfato-beta não radioactivo pode ser substituído por uma molécula radioactiva. O componente fósforo convencionalmente usado como agente localizador de osso é um fosfato ou pirofosfato inorgânico. Uma molécula radioactiva que pode ser usada na experiência acima é tetrasódio “P pirofosfato (NEX 019, New Englana Nuclear) ou "tecnétio que liga ao componente fósforo.

Deste modo, outro objecto da presente invenção compreende um método para filtração moléculas ligand que possui uma actividade biológica agonista ou antagonista no receptor alvo do pentapeptídeo XQHNPR, compreendendo os passos de: a) cultivar uma célula eucariótíca capaz de sintetizar o colagénio; 37/85 b) incubar a célula eucariótica do passo a) em giicerofosfato-beta na presença da molécula candidato (1CT10-1CT5M) e uma concentração sub-maximal de peptídeo QHNPR; c) quantificar a produção de um metabolito específico, tal como cálcio, fosfatase alcalina ou síntese ADN, respectivamente na presença ou na ausência da molécula ligante candidata e na presença ou na ausência de uma concentração sub-maximal de QHNPR. A célula eucariótica do método acima mencionado pode ser tanto uma célula que foi transfectada ou transformada com um código de ácido nucleico para colagénio, ou uma célula eucariótica que é capaz de sintetizar o colagénio numa maneira constitutiva ou induzível. Uma célula preferida é uma célula mamífera que é capaz de sintetizar naturalmente o colagénio, tal como a linha da célula Cl.

Outras mudanças metabólicas induzidas pelas moléculas terapêuticas usadas de acordo com a presente invenção, também podem ser taxadas, tais como outras experiências de enzima, experiências de transporte de iões ou experiências de transducção de sinal. Experiências de enzima que podem ser executadas, compreendem acetilcolínesterase (Ellman G.L. et al., 1961, Biochem. Pharmacol., 7:88), catepsina (Barret A.J. et al., 1981, Methods Enzymol,. 80: 535), ATPase, cicloxigenase (Mítchell J.A. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei., 90:11693), guanilato ciclase (Wolin M.S. et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 13312), lipoxigenase (Shimízu T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 1984, 81:689), oxidase monoamino (Weyler W. et al., 1985, J. Biol. Chem., 260:13199), mieloperoxidase (Desser R.K. et al., 1972, Arch. Biochem. Biophys., 148,452), fosfodiesterase (Nicholson C.D. et al., 1989, Br. J. Pharmacol., 97:889), quinase proteína (Hannun 38/85 Y.A. et al., 1985, J. Biol. Chem., 260:10039), tirosina hidroxilase (Nagatsu et al., 1964, Analyt. Biochem., 9:122) ou experiências xantina oxidase ('McCord J.K. et al., 1969, J. Biol.Chem., 244:6049). Os experiências de transporte de iões compreendem Ca bomba (Jean T. et al., 1986, J. Biol. Chem., 261: 16414), Ca canal (Galizzi J.P. et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:6947), Na canal (Jacques Y. et al., 1978, J. Biol. Chem., 253:7383), Na-K bomba (Chassande O. et al., 1988, Eur. J. Biochem., 171:425), Na-Ca antíport (Barle A.B. et al., 1990, Am. J. Physiol., 259:19), Na-H antíport (Jean T. et al., 1986, Eur. J. Biochem., 160:211), Na/K/C| cotransport (Chassande O. et al., 1988, Eur. J. Biochem., 171:425) experiências. Os experiências de transducção de sinal que podem ser também usados compreendem libertação Ca (Grynkievicz G. et al., 1985, J. Biol. Chem., 260:3440) ou PI rotação (White T.E. et al., 1993, Br. J. Pharmacol., 108:196). O conteúdo técnico dos artigos acima referenciados relativos às experiências metabólicas, é aqui incorporado por referência.

Um objecto da presente invenção é também um método para filtração de moléculas ligantes que possui uma actividade biológica agonísta ou antagonista no receptor alvo do pentapeptídeo XQHNPR, que compreende os passos de: a) preparar uma cultura mono-camada de células alvo confluente ou preparar um órgão espécimen alvo ou uma amostra de tecido fcríosecçoes ou fatias); b) incubar a cultura de célula do passo a) na presença da molécula candidata (1(Γ10-1(Γ5Μ) e uma concentração sub-maxímal de QHNPR durante um tempo suficiente para a mudança metabólica para ocorrer; 39/85 c) quantificar a produção de um metabolito correspondente, respectivamente na presença ou na ausência da molécula ligante candidata e na presença ou na ausência de uma concentração sub-maximal de QHNPR. A mudança metabólica referida no método de filtração acima descrito é impermutavelmente uma mudança na produção de qualquer um dos metabolitos que são experimentados de acordo como os métodos acima referidos. Consequentemente, o tempo que é suficiente para a mudança metabólica para ocorrer, vai depender do metabolito experimentado e é indicado, para um metabolito particular, em cada artigo referência que foi dado de acordo com este documento.

Fatias de tecido, criosecções de tecido ou homogenatos de tecido são usados na execução de ligação ou experiências metabólicas para seleccionar as moléculas ligantes de interesse que representam os derivados biologicamente activos de XQHNPR, especificamente QHNPR, peptídeo de acordo com a presente invenção. As amostras de tecido preferidas são o rim, pâncreas, osso, dental, mucosa glandular do estômago, de origem da próstata e intestino assim como glândulas salivares.

Os homogenatos de tecido são preparados pelas primeiras biópsias emergindo em nitrogénio líquido. As amostras congeladas são então homogeneizadas em 20 vol de uma emulsão gelada 50 mM Tris/HEPES, pH 7,5, com 1 mM EGTA, 0.3% (wt/vol) bacitracina, 20 mM 4-amídinofenílmetanesuifonilo fluorída, e 10 mM de leupeptina com um homogenizador dirigido com motor de vidro Teflon. Os homogenatos são centrifugados a 24,000 x g durante 20 minutos a 4°C e os comprimidos lavados uma vez com 50 mM Tris/HEPES, pH 7.5, com 1 mM EGTA. Os comprimidos 40/85 finais são suspensos em 50 mM TrisHEPES pH 7.5 com 1 mM EGTA e 0.3% (wt/vol) bacitracina, e armazenado a -20°C. Mais detalhes do procedimento são descritos por Stangi et al em 1993, dependendo da origem do tecido para homogeneizar, os procedimentos usados por Stangi são aqui incorporados como referência.

Para obter amostras de tecido intactas, por exemplo do rim, o seguinte procedimento é usado:

Antes de colher um órgão ou tecido, por exemplo no rato, o animal é anestesiado com hidrato de cloral (35%, 0.14 ml/100 g peso corporal) ou com pentobarbital (45 mg/kg de peso corporal). Depois, é feita uma perfuração intracardíaca com 100 mi 4°C desucrose isotónica (Loring et al., 1993).

Podem ser obtidos rins após biópsias de humanos ou de ratos Wistar machos imediatamente após a morte por deslocação cervical, ou anestesia como acima descrito. As amostras de tecido são imediatamente embebidas em Tissue-Tek (Miles, Elkhart, IN) e congelados para reter verificações em isopentano derretido (em -70°C) sem fixação anterior. Os espécimens são armazenados a -70°C até ao uso. São cortadas secções espessas de 10-30-μπι num crióstato (a uma temperatura média de -20°C a -30°C) e são verificadas que derretem em laminas de vidro de baixo ião não revestidos. São então usadas imediatamente ou secas por vácuo e armazenadas a -20°C com gel de sílica durante 5 dias até ao uso. Tal técnica foi descrita por Walsh et al., em 1995, os detalhes dos quais são aqui incorporados por referência.

Alternatívamente, as secções de tecido são congeladas em gelo seco na presença de isopentano e verificadas que derretem nos 41/85 slides microscópicos, e armazenadas a ~80°C até ao uso (Whitcomb et al., 1993).

Como outro método alternativo para obter as amostras de tecido frescas, espécimens de córtex renal humano e medula Sâo obtidos de sujeitos que se submetem à nefrectomia. As partes do rim recolhidas são colocadas numa solução gelada 0.9% NaC| para remover sangue e restos de célula. Blocos que incluem córtex renal e medula ou amostras separadas do córtex ou da medula são embebidas num meio crioprotector (OCT, Ames, IA) e congeladas em isopentano arrefecido com nitrogénio liquido ou gelo seco. Os blocos OCT sâo armazenados a -80°C até ao uso. São obtidas partes espessas serial δ-μπι, usando um crióstato microtomo -20°C, verificado em laminas microscópicas revestidas com tipo de gelatina e ar seco. Tal técnica é descrita por Ricci et al em 1993.

Derivados biologicamente activos preferidos do peptídeo XQHNPR da composição terapêutica de acordo com a presente invenção, têm farmacocinéticos melhores que o peptídeo XQHNPR endógeno natural ou sintético e desse modo possui uma vida média mais longa in vivo quando comparada com as suas contrapartes naturais.

Um método para taxar os farmacocinéticos das moléculas ligantes seleccionadas de acordo com a experiência de ligação e a experiência metabólica acima descrita é exemplificada no Exemplo 3. Alternativamente ou adicionalmente, a libertação de plasma das moléculas ligantes seleccionadas é determinada de acordo com a técnica descrita por Wu et al., e 1996 ou a técnica descrita por Ezan et al., em 1986, ou por Ezan et ai., 1996, cujas técnicas são aqui incorporadas como referência. 42/85

Os derivados biologicamente activos acima descritos, que não puderam ser identificados antes da descoberta dos inventores, são também um objecto da presente invenção.

Deste modo, a invenção também diz respeito aos derivados biologicamente activos do peptídeo XQHNPR que foram seleccionados de acordo com os processos de filtração de descritos de acordo com este documento, provê que eles não têm a seguinte estrutura: Y-HNP-Z, em que Y denota uma glutamina (Q) ou um resíduo de ácido piroglutãmico e Y representa um grupo OH ou um aminoácido básico, sendo o aminoácido básico uma Lisina (K) ou uma Arginina (R) . De facto, também excluído como um membro dos derivados biologicamente activos do peptídeo XQHNPR, é a proteína de aminoácido 146 que constitui o próprio peptídeo SMR1 (PCT Pedido de Aplicação n° WO 90/03981). Contudo, o uso terapêutico dessas moléculas que são excluídas por elas próprias da presente invenção, é o objectivo principal da invenção em causa.

Os derivados biologicamente activos do peptídeo XQHNPR usados nas composições terapêuticas de acordo com a presente invenção, têm sido numa realização preferida, seleccionados em primeiro lugar, de acordo com a sua capacidade de ligar aos mesmos alvos como o peptídeo XQHNPR, especialmente QHNPR e em segundo lugar a sua capacidade de induzir as mudanças metabólicas (estimulação de actividade ciclase adenilase), produção de colagénio, etc.) dentro do alvo ou para suprimir, bloquear ou prevenir as ditas mudanças metabólicas do alvo que são induzidas peio peptídeo XQHNPR, especialmente QHNPR. A presente invenção também lida com o uso das composições terapêuticas que compreendem uma quantidade eficaz do 43/85 peptídeo XQHNPR ou um dos seus derivados biologicamente activos.

Como anteriormente detalhado, o uso de composições terapêuticas de acordo com a presente invenção é indicado no caso de desequilíbrio hidro-mineral do corpo. Esse uso das composições é também indicado no caso onde uma deficiência no nivel normal endógeno do pentapeptídeo QHNPR é diagnosticada através de uma amostra biológica do paciente, particularmente dos fluídos do paciente tais como soro ou plasma, saliva e urina. 0 nível da concentração pentapeptídeo na amostra biológica é considerada deficiente quando é pelo menos um múltiplo de cinco menos importante que a concentração não patológica normalmente encontrada, assim como quando é peio menos um múltiplo de cinco mais importante que a concentração não patológica normalmente encontrada nesta amostra biológica particular.

Um método diagnóstico que permite a determinação da concentração do pentapeptídeo QHNPR numa amostra biológica, especialmente do soro ou plasma, é uma experiência radio-imuno competitiva (RIA), como descrito por Rougeot et al., em 1994.

Resumidamente, a fase liquida RIA é executada em 0.2 M Tris/HCI pH 8.5 contendo 0.25% de albumina de soro bovino (Fr5, Miles), 0.1% X-1G0 (Sigma), 1000 KIU (kallikreín unidade internacional)/ml Trasiloi (um inibidor de Tripsina e kallikreín ; Bayer) , EDTA (1 mM) e 0.1 g/1 NaN3_ Standard ou amostra (0.1 ml), 0.1 ml soro anti-pentapeptídeo diluído (Rougeot et al., 1994) e 1251 -pentapeptídeo classificado (15xlOJ dpm, 0.1 ml) são incubados durante a noite a 4°C. Fracções que ligam e livres são separadas por precipitação de 44/85 propanol {10 μΐ de soro de coelho normal e 1 ml de propanol-1 gelado) e a radioactividade do precipitado é determinado usando um contador de gama. As amostras de plasma, saliva ou urina serão recolhidas nos tubos previamente arrefecidos com uma mistura de inibidores de peptidase (1 mM EDTA. 1000 U/ml Aprotinlna, 130 μΜ bestatina, 1 μΜ leupeptina, 0.4 mM pefabloc, 1 μΜ pepstatina). O método diagnóstico acima mencionado é agora usado como ferramenta do uso médico para determinar o tipo de deficiência que pode ser associada com um sintoma de desequilíbrio de ião mineral. No seu uso médico, este teste diagnóstico é também um objecto da presente invenção. Os passos sucessivos deste teste diagnóstico são os seguintes: a) incubar um peptídeo XQHNPR, especificamente QHNPR com um anticorpo policlonal ou monoclonal dirigido contra o mesmo peptídeo; b) pôr em contacto os complexos imunes formados com uma amostra biológica de um paciente a ser testado suspeito de conter um peptídeo XQHNPR endógeno não-classifícado, especialmente o peptídeo QHNPR; c) detectar os peptídeos classificados ligados com anticorpo monoclonal ou policlonal, que não foram deslocados pelo XQHNPR endógeno não classificado, especialmente QHNPR, o peptídeo contido na amostra biológica para determinar a concentração deste peptídeo endógeno que é contido na amostra biológica; d) comparar a concentração do peptídeo XQHNPR, especialmente QHNPR encontrado no passo c) com a concentração do peptídeo XQHNPR, especialmente QHNPR normalmente encontrado num indivíduo saudável. 45/85 e) calcular a quantidade de uma composição terapêutica que é necessária para fornecer a deficiência do peptídeo XQHNPR nos fluídos corporais e tecidos. A quantidade da molécula terapêutica a ser administrada é calculada, tendo em conta os farmacocinéticos específicos in vivo da dita molécula terapêutica, sendo os farmacocinéticos in vivo taxados como descritos no Exemplo 3 e claro, a quantidade normal de peptídeo XQHNPR, especialmente QHNPR normalmente encontrada nos fluídos corporais (plasma, saliva, urina) ou órgãos. 0 peptídeo XQHNPR classificado usado no teste diagnóstico é radiactivamente classificado ou não-radíactivamente. 0 anticorpo políclonal usado neste método diagnóstico pode ser opcionalmente sob a forma de um soro imune. 0 sistema de imuno-deteeção quantitativa particular designada pelos inventores, é extremamente específico e sensitivo: 50% de deslocação do pentapeptídeo classificado 1251 QHNPR é obtido com não rtiais que 57 0 fmole pentapeptídeo Standard ([Glp1] pentapeptídeo ou [Gin1] pentapeptídeo. 0 limite de detecção (80% ligação) é 106 fmole peptídeo Standard. 0 coeficiente da variação inter-experiência é de 12%, n=24. A teactividade-transversal do anti-soro com sequência de tetrapeptídeo (QHNP) e hormona de libertação-tirotropina (Glp-His-Pro) é menor que 0.01%.

Numa realização específica da presente invenção, as concentrações de peptídeo XQHNPR quantificadas de acordo com o método de diagnóstico acima descrito são usadas para determinar a quantidade de peptídeo XQHNPR ou de um dos seus 46/85 derivados biologicamente activos a ser administrado ao Paciente para fornecer a deficiência diagnosticada, em caso de um baixo nível no peptídeo endógeno e para determinar os seus parâmetros farmacocinéticos em sujeitos patológicos e nâo patológicos.

As composições terapêuticas que contêm os produtos de maturação SMR1 ou a proteína SMR1 ou os seus derivados usados de acordo com a presente invenção, podem ser sob a forma de uma solução líquida, sob a forma de um gel ou sob a forma de um pó seco.

Os peptídeos terapêuticos de acordo com a presente invenção são vantajosamente complexados com iões de sal metal tais como Ca++, Cu++, Ni++, Mg++ ou Al++ tanto directamente ou indirectamente com as proteínas de iões veículos ou também fosfato de cálcio como descrito nas Patentes Francesas N°s FR-2,543,439 e FR-2,181,426 (Reliveld et al) , ou também com ATP.

Os peptídeos terapêuticos de acordo com a presente invenção pode também ser complexos para Dextran ou derivados de Dextran.

Uma realização específica do uso de sistemas de distribuição controlada com moléculas Dextran é representada por forma "Acção longa (AL)" e forma "Acção Longa Renovável (ALR)". A forma AL consiste em microesferas de ácido poliláctico que contém bromocriptina incluída no Dextran. Na forma ALR, a bromocriptina está contida em microesferas de D, L-polilactida-coglicolida-glucose, a degradação a qual está quase completa num período de tempo menor que três meses e a qual permite repetir a administração várias vezes durante um 47/85 longo período de tempo (Montini et al., 1986; Kato et al., 1988).

Preferencíalmente, as composições terapêuticas de acordo com a presente invenção são administradas localmente, perto do sítio, órgão ou tecido a ser tratado. Como uma realização alternativa, as composições terapêuticas da invenção são administradas por via oral para actuar sistematicamente ou no nível da mucosa bucal ou estomacal ou ao nível do tracto gastrointestinal. Tais composições terapêuticas podem ser na forma de uma solução salina ou um comprimido, preferivelmente um comprimido de distribuição controlada. Um comprimido de distribuição controlada típica é descrita no Pedido de Aplicação PCT n° WO 9622768, o que contém cerca de 30 a 70 porcento por peso de um ou mais éteres de celulose tal como metilcelulose hidroxipropil, e cerca de 30 a 70 porcento por peso de uma substância inerte tal como amido de milho.

Noutra realização das composições terapêuticas da presente invenção, o peptídeo XQHNPR ou os seus derivados biologicamente activos são incluídos num dispositivo de libertação controlada a ser colocado localmente no corpo, para obter uma distribuição mantida nas moléculas activas ao redor do sítio a ser tratado.

Preferivelmente, os dispositivos de distribuição controlada que são usados com o propósito da presente invenção, são microparticuias de lipídeos ou polímeros que dissolvem ou são hidrolizados lentamente dentro do corpo, especificamente no estômago ou no tracto gastrointestinal.

Numa realização preferida dos dispositivos de libertação controlada da presente invenção, este último pode ser 48/85 implantado localmente para assegurar a difusão de uma área limitada da molécula activa, que rodeia o órgão ou tecido a ser tratado.

Dispositivos de distribuição mantidos preferidos de acordo com a presente invenção, contém polímeros biodegradáveis tais como descrito no Pedido de Aplicação PCT n° WO 97 01331. 0 polímero pode ser um polissacarídeo como no Pedido de Aplicação PCT n° WO 9613253, tal como o alginato de sódio. Uma preparação mantida biodegradável é preferencíalmente composta de um polissacarídeo o qual é revestido com moléculas catiónicas tais como chitosan, o veículo sendo lentamente e enzimaticamente íiidrolizado, por exemplo por lisozima, ín vivo depois da distribuição da molécula activa. O polímero usado nos dispositivos de distribuição controlado de acordo com a presente invenção pode também ser um polímero do tipo polívinilpirrolidona, tal como descrito no Pedido de Aplicação PCT n° WO 8804 922 ou um amido de hidrolisato, tal como descrito no Pedido de Aplicação PCT n° WO 94176/6.

Na realização específica, o polímero é um polímero bioadesivo tal como carboxímetilcelulose, Carbopol™, Polyca^ophiP” ou alginato sódio, que liga com uma eficiência excelente para a mucína presente na superfície do epitélio (Robinson e~ al * > 1998), esses polímeros sendo especialmente usados no caso de uma distribuição do medicamento oral.

Outros dispositivos de distribuição mantidos preferidos de acordo com a presente invenção estão sob a forma dos polímeros micro-contas, por exemplo micro-contas polimencos porosos ligados transversalmente, tal como descritos no Pedido de Patente PCT n° WO 9533553. 49/85

Outra realização dos dispositivos de distribuição controlada de acordo com a presente invenção sâo liposomas tanto numa forma hydratada como no Pedido de Aplicação PCT n° WO 8601102 ou no Pedido de Aplicação PCT n° WO 9522 961 (Capron et al.) ou numa forma desidratada, tal como no Pedido de Aplicação PCT n° 'WO 8601103. Outras emulsões lípídas usadas como sistemas de distribuição de medicamento que podem ser usadas para o propósito da presente invenção são descritas por Davis et al., em 1988, que podem ser administradas por via oral, parenteral ou intravenosa. Os liposomas podem conter determinados sacarideos que ligam a componentes de células membranas especificas para facilitar a distribuição da molécula activa na direcção de uma célula alvo seleccionada, em particular determinantes sacarideos que liga a lectinas especificas da célula membrana (Shen, 1988).

Outra realização das fórmulas de distribuição mantidas usadas de acordo com a presente invenção consiste de um vector partícula que compreende, da camada interior para a camada exterior: um núcleo hidrofílico não líquido, por exemplo um polissacarídeo de ligação transversal ou matriz oligossacarídeo, o dito núcleo sendo opcionalmente enxertado com ligantes iónicos com pelo menos um grupo seleccionado do fosfato, sulfato, ácido carboxílico, amónio quaternário, amino secundário ou amino terciário. uma camada externa de componentes lípidos que são enxertados no núcleo por ligações covalentes.

Tal vector particular é descrito no Pedido de Aplicação PCT n° WO 94/23701 (Perrin et al). 50/85

Excepcionalmente, o peptídeo XQHNPR da invenção pode ser administrado na pele através de um sistema de distribuição iontoforético percutânea, tal como descrito por Chien et al em 1988.

As composições terapêuticas usadas de acordo com a presente invenção contêm uma quantidade farmaceuticamente eficaz do peptídeo XQHNPR ou de um dos seus derivados biologicamente activos. A quantidade de princípio activo contido numa dosagem terapêutica do peptídeo XQHNPR ou derivado peptídeo biologicamente activo é contido na extensão entre 10 pg/kg e 10 mg/kg de peso corporal, preferivelmente entre 50 pg/kg e 5 mg/kg do peso corporal e mais preferível ainda entre 200 pg/kg e 1 mg/kg de peso corporal.

Um objecto da presente invenção é também uma composição terapêutica que compreende uma quantidade farmaceuticamente activa da proteína SMR1, os seus produtos de maturação, especialmente o peptídeo XQHNPR, mais especialmente ainda o pentapeptídeo QHNPR, assim como os derivados biologicamente activos do último, usado em combinação com uma quantidade farmaceuticamente eficaz de outra molécula envolvida em regulação do equilíbrio ião mineral. As moléculas preferidas para serem associadas com a proteína SMRl ou derivados são as hormonas paratíróide (PTH), calcitonina (CT) e 1,25-dihidroxi vitamina D. O facto de que os inventores determinaram, no rato macho, a distribuição topográfica precisa dos órgãos alvo para os o peptídeos XQHNPR, permitiu aos presentes inventores 51/85 compreender e especificar o papel desses peptídeos nos sistemas locais e periféricos.

Mais especificamente, os inventores mapearam os alvos periféricos para o produto de maturação secretória final de SMR1, o pentapeptídeo, ao examinar ín vivo a distribuição de tecido grosso do peptídeo radio classificado com a autoradiografia corporal total (WBA) (Ullberg et al, 1981). Este método fornece uma imagem visual de todo o animal, tornando assim possível para examinar simultaneamente o levantamento do pentapeptídeo num grande número de tecidos e compartimentos. Além disso, esta abordagem é consideravelmente mais atractiva que um método in vítro, visto que o tecido vivo minimiza a possibilidade de engano devido à distribuição não específica, para a degradação do sítio receptor e para o peptídeo unido ao sítio não receptor eliminado através da corrente sanguínea (Lindberg et al., 1991). Por essas razões, o tecido relacionado com o tempo do levantamento para o pentapeptídeo tem sido taxado in vivo. Para eliminar a possibilidade de competição para os sítios de ligação disponíveis do peptídeo endógeno, a classificação tem sido alcançada através de pentapeptídeo tritiado por infusão intravenosa em ratos pubescentes com 5 semanas. Adicionalmente à película da autoradiografia, o traçado e o tempo do percurso do levantamento do peptídeo tritiado através de órgãos vivos, tem sido registado pelo gerador de imagens radio β recentemente desenvolvido, o qual oferece a capacidade única para detectar e quantificar as partículas β emitidas da união ligante tritiado para superfícies lisas tais como as partes corporais totais {Charpak et al., 1989;

Tríbollet et al., 1991). Os inventores também analisaram as características cromatográficas do componentes classificada associado com o órgão alvo. 52/85

Os sítios de recepção biológicos têm duas características essenciais que permitem a ligação específica a serem identificadas, in vivo; têm uma alta afinidade para o ligante e o ligação é saturável (Whitcomb et al., 1993). Assim, têm sido executadas experiências de deslocação, usando administração sistemática paralela de um excesso do peptídeo não classificado correspondente. Além disso, a localização celular específica do pentapeptídeo classificado para tecidos alvos, tem sido identificada através da parte de autoradiografia microscópica.

Finalmente, para perceber a relevância do levantamento dc peptídeo sob condições fisiológicas, os inventores determinaram o padrão de secreção na corrente sanguínea endógena dos peptídeos relacionados com SMR1 em ratos machos adultos conscientes. É importante stress que todos os estudos de distribuição dos sítios farmacocínéticos e celulares foram realizados usando concentrações fisiológicas de pentapeptídeo classificada. A presente invenção vai ser ilustrada com detalhes nos seguintes exemplos sem ser de uma maneira limitada no objectivo dessas realizações específicas.

Materiais e métodos A. Químicos - Os peptídeos correspondentes às sequências (Glpi)-His-Asn-Pro-Arg, (Glni) -His-Asn-Pro-Arg e (ΘΙηχ)-His-Asn-(D3,4-Pro)-

Arg foram sintetizados pelo Laboratório de Química Orgânica, Institut Pasteur, Paris, França. 53/85 - Componente classificado: (Glpi/Glnx) -His-Asn- (3, 43H) Pro-Arg foi sintetizado pelo Dr. R. Genet, Departamento de engenharia e do estudo das proteínas, CEA/Yvette, França. 0 produto purificado RP-C18 HPLC (h98% de pureza) com uma radioactivídade específica estimada em 2.22TBq/irtmole foi armazenada a -80°C em 10% de metanol/0.1% ácido trifluoroacético (1.11 GBq/ml). A pureza do peptídeo tritiado foi sistematicamente taxada antes do uso, por fase inversa Cl 8 e cromatografias de trocas de catião FPLC de acordo com os métodos previamente descritos (Rougeot et al., 1994). B. Animais

Ratos machos wistar (com 4 semanas de idade), adquiridos a Iffa-Credo), foram mantidos numa jaula de 2-4 animais sob luz e temperatura controlada com livre acesso a comida e água, até ao uso 5-7 dias mais tarde para o estudo da distribuição do sítio receptor do pentapeptídeo e 5-6 semanas mais tarde para o estudo de secreção de pentapeptídeo endógeno. Foram cuidadosamente manuseados diariamente pelo operador durante este período. Todas as experiências foram executadas entre as 10.00 e as 14.0Oh. C. Administração do componente classificada O componente classificado (isto é, 6,66 MBq, 3nmoles ou 2 mg para a autoradiografia corporal completa (WBA) e 370-555 KBq, 170-250 pmoles ou 110-160 ng para os estudos de distribuição do sítio celular foi diluído em 100-200 ml de emulsão fosfato-salina (PBS Dulbecco's, Bio Media, França) e administrada intravenosamente na veia jugular de ratos anestesiados (halotano para WBA ou pentobarbital para todas as outras experiências). 54/85 D. Visualização autoradiográfica da macro corporal completa

Os tecidos alvo para ao produto de maturação secretóría final de SMR1, o pentapeptídeo, foram examinados, in vivo, pelo procedimento de autoradiografia corporal completa de acordo com o método de Ullberg (Ullberg et al., 1981).

Os ratos com cinco semanas de idade foram sacrificados sob halotano, e 90 segundos, 60 e 240 minutos após injecção de 3 nmoles (6.66 MBq ou 2pg) de tritiado pentapeptídeo. No tempo seleccionado, o animal dominado foi imediatamente imerso numa mistura a -80°C de gelo seco e isopentano, para evitar a redistribuição rastreadora artefactual. Após 48 horas armazenado em plástico auto-isolador em -30°C, o animal foi então preso num meio verificado. As secções sagitai corporais completas (20 mm)do rato congelado foram feitas a -30°C com um crióstato (fatiagem micro-átomo corporal completa Leitz 400 com um congelador tipo arca móvel Leitz OM, Leica, França). As secções que aderem à tape Scotch foram deixadas no congelador, temperatura -30°C, durante 4 dias para assegurar a secagem completa. As tapes são colocadas numa película de cassete 3H Hiper-película (Amersham, França) a -20°C. depois de 2 semanas. As películas foram reveladas num revelador Kodak D19 e fixo num fixador Kodak. E. Preparação de tecido para seccionar e visualização micro-autoradiogrãfica clara A localização do sítio celular para concentrações fisiológicas do peptídeo classificado foi investigada pelo procedimento de autoradiografía microscópica de secção de parafina ou resina. 55/85

Sessenta minutos após a administração de 3H-pentapeptídeo (555KBq, 160 ng ou 250 pmoles), os ratos machos anestesiados foram perfurados via veias jugulares com emulsão Krebs ringer Bicarbonate Glucosed gelado e depois 0.5% de paraformaldehido/O.5% de emulsão PBS fixa glutaraldehida (mais glucose 1.6%, CaCl2 0.002% e DMSO 1%) (50 ml/5 minutos para cada). Os tecidos foram removidos rapidamente e colhidos para seccionamento de parafina (Paraplast plus-Sherwood medicai, OSI, França) ou para o seccionamento de resina (hísto-resína, Lei ca, França).

Todas as secções foram cortadas a 5 mícrons (Reichter Jung para a secção de parafina e RM2155 Leica para a secção de resina) e verificadas em laminas de vidro Superfrost/Plus (revestimento não gelatinoso). Ά parafina foi removida com xileno, e secções foram realizadas através de uma serie decrescente e depois ascendente de etanol (de 100 a 50%, VN e inverso). As secções secas foram então processadas para a autoradiografia microscópica clara ao anexar um revestimento emulsão nuclear (Kodak, ΝΤΘ2, diluído 1:1 com água distilada) capas de revestimento para eles. Depois de secar o ar durante 2 horas à temperatura ambiente, as autoradiografias foram expostas durante 6 a 10 semanas em caixas apertadas claras a 4 ° C. Foram desenvolvidas capas de revestimento radiosensitivas no revelador Kodak Dl9 (3 minutos) e fixo no fixador Kodak (3 minutos). As secções foram coloridas com a hematoxilina Harri.s (Prol abo, França) e Toluidina azul (Sigma, França), desidratado e verificado num meio Eukitt. 0 tecido e grãos prata foram vistos e fotografados com um fotomicroscópio Leica equipado com ópticas de campo brilhante (DmRD Leitz, Leica). 56/85 F. Mapeamento e quantificação do levantamento 3H-pentapeptídeo por tecidos vivos A determinação quantitativa da radioactividade de várias secções de órgãos, foi realizada ao usar um detector gasoso de partículas B, as quais foram recentemente desenvolvidas (Charpak et al., 1989; Tribollet et al., 1991). A informação das secções corporais completas ou secções de órgãos individuais colocadas no detector da câmara de gás, foram recolhidas durante 8 horas ou 50 horas, respectivamente. O numero de cálculos por pixel foi registado no gerador de imagens β 2200 (Biospace, França) com um detector de superfície de 20x20cm2, seguido de uma análise de imagem assistida por computador com o programa Vision β usando um computador HP Vectra. A actividade trítio foi determinada como cálculos/mm2. A linearidade deste método de detecção permite a medida do ligação não especifica de pentapeptídeo JH, medido em várias estruturas ou compartimentos dentro da secção com sítios de não ligação aparentes para o peptídeo (tecidos antecedentes, por exemplo, músculo e sangue cardíaco excepto cérebro e coluna) ou na mesma estrutura classificada, em experiências de deslocação.

No caso de quantificação radioactiva de secções de órgãos ou extractos ácidos, usar um contador de brilho liquido (MR300 Kontron), a actividade trítio foi determinada como proteína cpm/mg. A concentração de proteína foi determinada pelo método Bradford (Bradford et al., 1976). G. Caracterização cromatográfíca do levantamento peptideo radioactivo através de tecidos 57/85

As características cromatográficas do componente classificado associado, m vivo, para órgãos alvo, foram taxadas através de HPLC.

Em pontos de tempo (2 e 18 0 min) após administração do pentapeptídeo tritiado, os ratos anestesiados foram sacrificados (punção de sangue do coração) e tecidos rapidamente removidos em gelo. Os tecidos foram imediatamente homogeneizados a 4°C em 5-10 volumes de 0.1 M ácido clorídrico usando um homogenizador indolente (desmineralização de tecido do osso foi realizada após 24-48 horas a 4°C em hidrocloreto guanidio e pré-tratamento EDTA, concentração final 4 M e 0.25 M respectivamente). Os homogenatos foram centrifugados durante 30 minutos a 4°C e 15,000 g. para determinar a radioactividade total, alíquotas da solução flutuantes foram adicionados a 50 volumes de Biofluor (NEN, Dupont de Nemours, Fança) e contados num contador de brilho liquido.

Para determinar a radioactividade na fracção do pentapeptídeo, as alíquotas dos extractos de tecido foram submetidas a um procedimento de extracção de metanol ('Rougeot et al., 1994) apôs a neutralização com Tris/HC| pH 8.5 com 16 mM DTPA (DietíienoTriamina Penta-ácido acético, Sigma, França). A fase do metanol foi removida do flutuante através de evaporação parcial, depois a liofilização e a fase aquosa reconstituída 16 mM DTPA foi aplicada à coluna ODS AQ (cromatografia 'HPLC RP Cl8) (Ά|T, França). Ά elução com um gradiente linear de 0.1% do acético trifluoro (TFA) em água/0.1% TFA em acetonitrilo (Merck, França) de 100/0 (vol/vol) para 50/50 (vol/vol) foi executada durante 30 minutos a uma taxa de fluxo de Irru/min. As fracções foram 58/85 recolhidas cada 60 segundos e analisados para a radioactividade usando um contador de brilho liquido. H. Secreção e farmacocinético da corrente sanguínea do pentapeptídeo, in vivo a) Secreção sistémica do pentapeptídeo sob basal ou stress -e agente adrenérgico - induzido na secreção da glândula submandibular dos ratos macbxos conscientes A secreção da corrente sanguínea endógena in vivo de peptídeos relacionados com o precursor SMR1, em particular o pentapeptídeo, foi investigado nos ratos machos conscientes.

Os ratos de 9-10 semanas de idade foram colocados num jarro durante uma exposição de 2 minutos a éter gumos, ou foram colocados durante 20-40 minutos em jaulas metabólicas individuais após a administração intraperitoneal de agentes secretagogos adrenérgicos (fenilefrina, 4mg/kg ma is isoprotereronol, 1 mg/Tcg') ou veiculo (PBS Dulbecco's). Em tempos seleccionados, os ratos foram anestesiados com pentobarbital (45 mg/kg). Foram tiradas amostras de sangue através de punção cardíaca e recolhidas nos tubos prevíamente arrefecidos contendo uma mistura de inibidores de peptidase {EDTA 1 mM, Aprotinina 1000 U/ml, bestatina 130 μΜ, leupeptina 1 μΜ, pefabloc 0.4 mM, pepstatina 1 μΜ) . Foram imediatamente centrifugadas durante 15 minutos a 4000 g e 4 ° C. Fracções de plasma foram depois submetidas a um procedimento de extracção da coluna Porapak Q (Fougeot et al., 1988) e testadas para o conteúdo pentapeptídeo antes e depois das separações HPLC. 59/85

Resumidamente, as amostras de plasma acidificado (concentração final HC | 0.1 N) , foram aplicadas aos beads

Porapak Q (Waters, França), colocados numa coluna 0.5x2cm. depois, lavando com 0.1% de TFA em água, os peptideos foram eluídos com 0.1% de TFA em 50% de metanol (recuperação do marcador pentapeptídeo adicionado foi de 93+ 6, n=5). Cada uma das amostras extraídas foi então analisada usando um sistema HPLC (espectrafísico SP8000) ligada a uma coluna de carboximetil HEMA-IEC BIO-lOOO (Alltech, França). A cromatografia de mudança de catião foi executada com um passo de 30 minutos gradiente de acetato de amónio 1-100 inM pH 4.6 a uma taxa de fluxo de 1 ml/minuto. Fraeções de 1 ml foram recolhidas e testadas após a iiofilização para o seu conteúdo do seu conteúdo pentapeptídeo. 0 procedimento RIA e características para as medidas de pentapeptídeo, foram previamente descritas (Rougeot et al., 1994). b) Estudos metabólicos e farmacocinéticos de pentapeptídeo

No decorrer do tempo in vivo da distribuição, metabolismo e eliminação do pentapeptídeo foram investigados em ratos machos adultos anestesiados usando concentrações fisiológicas de pentapeptídeo tritiado de circulação.

Foram dados aos ratos machos anestesiados uma injecção intravenosa bolus de 170 pmoles ou 110 ng de pentapeptídeo tritiado diluído em 100μ1 PBS Dulbecco. 0 sangue foi recolhido em tubos com uma mistura de inibidores de peptidase acima descrita, via um catéter implantado na veia jugular externa. O sangue foi retirado mesmo antes 2,4,6,8,10,20,30,45,60,90 e 120 minutos depois da administração do peptídeo. Foram tirados no total dois 60/85 mililitros de sangue por rato e foi recolhido todo o conteúdo urinário da bexiga num ponto seleccionado.

As amostras biológicas foram submetidas à centrifugação e condições de extracção Parapak Q, como acima descrito. A cromatografia que usa o procedimento HPLC acima descrito e na referência (Rougeot et al., 1994), foi então aplicado a cada uma das amostras extraídas. 0 ODS AQ RP-C1B foi usado para identificação de metabolitos amino terminais e Pep RPC HR C18 (Pharmacia, França) para identificaçâo de metabolitos carboxil terminais. 0 conteúdo de radioactividade das amostras antes e depois das separações cromatográficas foi determinado usando um contador beta (Kontron, MR300).

Exemplos

Exemplo 1; Distribuição dos órgãos alvo para pentapeptídeo derivado 3H-classíficado SMR1, hexapeptídeo ou undecapeptídeo em ratos machos examinados através de uma autoradiografia corporal completa (WBA). A WBA tem uma aplicação considerável nos estudos de ligação receptor e as análises do destino biológico de proteínas e peptídeos. Aplica-se esta abordagem ao exame de potenciais tecidos alvo do pentapeptídeo SMG derivado SMR1. 0 mapeamento e tempo de percurso da distribuição do tecido do pentapeptídeo radioactivo foi investigado em 90 segundos, 3 minutos, 60 minutos e 240 minutos depois 3 nmoles ou 2pg de 3H- pentapeptídeo foram sistematicamente injectados em 5 ratos machos com 5 semanas de idade. Para gerar imagens autoradiográficas de densidade suficiente num tempo de exposição razoável, e para compreender o levantamento especifico comparado para a classificação não específica, uma 61/85 quantidade de 6.66 MBq de isótopo foi empregue nessas experiências. Apesar disso, foi usado peptídeo tritiado de actividade altamente especifica (2.22 TBq/mmole), a dose do peptídeo infixada na circulação resulta em quantidades de pentapeptideo de sangue cerca de múltiplo de 10 o seu nível fisiológico [ver o capitulo seguinte). Além disso, para eliminar a possibilidade dos sítios de ligação do peptídeo previamente ocupado pelo peptídeo endógeno, ratos macho pubescentes com 5 semanas de idade foram usados, visto que previamente se mostrou que os peptídeos derivados do SMR1 foram detectados no rato macho SMG, só com uma idade pós-natal de seis semanas (Rougeot et al., 1294). A distribuição grossa anatómica do levantamento do pentapeptideo 3H a 60 minutos, pós dose, em secções completas sagital do corpo do rato, são mostradas nas figuras 1 e 2. Como ilustrado nos autoradiogramas representativos (Figuras 1-A, 1-B), sessenta minutos depois de uma injecção intravenosa bolus de pentapeptideo radioactivo, uma acumulação densa e distinta dos grãos prata, foi aparente no rim e em todo o tecido do osso assim como tecido dentai, mucosa glandular do estômago, lóbulos pancreãticos e glândula subrnandibular. Neste tempo seleccionado, os níveis moderados de classificação foram vistos no fígado, baço, timo e parede intestinal. Nem o cérebro, nem a medula espinal acumulam o pentapeptideo radioactivo, demonstrando que uma barreira sangue/cérebro severo limita o levantamento do peptídeo ín vi vo. A taxação do tecido de peptídeo alvo, foi conseguida por uma quantificação de gerador de imagens radio (¾ (Figura 2). 0 numero das partículas β emitidas por unidade de área, foi recolhido directamente das secções corporais completas, 62/85 durante 8 horas. A linearidade e selectividade deste método de detecção, permite uma medida relevante de estruturas classificada comparadas com o escurecimento definido com a área anatómica seleccionada da mesma secção (aqui, sangue no espaço cardíaco) Tríbollet et al., 1991).

No rim, pâncreas, osso, incisor, glândula submandibular e mucosa gástrica glandular, a concentração de radioactividade em 60 minutos pós dose, cálculo/mm2 por 8 horas, foi acentuadamente maior, 4 a 10 vezes, que o sangue no coração. Esteve presente muito mais radioactividade nesses espaços de tecido do que previsto pelo mesmo espaço de sangue anatómico (Figura 3). Esta sobrestimativa do plasma anatómico e espaços intersticial, podem reflectir a presença de sítios de ligação receptores de peptídeo dentro desses tecidos (Whitcomb et al., 1993). No figado, timo, parede intestinal e baço, a acumulação de tecido relativo foi igual ou menor que os 2 excesso do escurecimento. E, nos outros tecidos visualizados (músculo, gonada, cartilagem, mucosa gástrica não glandular, cérebro), o nível de radioactividade foi igual, ou menor que o da área de sangue, restrição reflectora do peptídeo somente para o plasma anatómico e espaços intersticial desses órgãos (Figura 3).

Os resultados do hexapeptídeo 3H (Figura 4) e de levantamento do undecapept ídeo 3H (Figura 5) indica claramente que os órgãos alvo desses produtos de maturação da proteína SMR1 são quase os mesmos que os órgãos alvo do pentapeptídeo. Especificamente, o rim e o pâncreas são os órgãos alvo apesar do hexapeptídeo também ser efícientemente retido pela mucosa glandular do estômago. 63/85 0 perfil dinâmico do levantamento do pentapeptideo revelou que a radioactividade é rapidamente distribuída e diferencialmente acumulada mais cedo como 90 segundos e 3 minutos, no rim, pâncreas, tecido dental e parede glandular gástrica, com um tecido para o índice de sangue para perto de 2. A classificação persistiu dentro desses tecidos por mais de 240 minutos. Mais precisamente, dentro do rim, a classificação este predominantemente na área medular externa, sobre o tempo do percurso estudado de 90 segundos. Para 240 minutos pós injecção (Figura 1-A, 60 minutos pós a injecção). Dentro do osso, a classificação foi predominantemente visualizada cedo, como 09 segundos e 3 minutos, nas superfícies do osso periosteal (periosteum). Dentro do dente, a classificação foi também acumulada rapidamente e ficou durante um tempo na massa interna da raiz do incisor assim como o osso alveolar. Por contraste, no sangue e órgãos ricos em sangue, tais como os pulmões e músculos, a radioactividade foi amplamente distribuída em 90 segundos e 3 minutos mas daí, foi completamente excluída a 60 minutos. Não foi encontrada radioactividade no conteúdo intestinal como tarde como 240 minutos após a injecção, enquanto a bexiga tinha radioactividade, indicando que alguns dos pentapeptídeos e/ou metabolitos já foram excretados na urina. Isto é consistente com a alta classificação encontrada na pélvis renal e nenhuma classificação no fígado 90 segundos e 3 minutos após injecção sistémica. Este resultado pode ser explicado através de uma explicação mais eficiente do pentapeptideo da corrente sanguínea, através de filtração glomerular que a libertação hepática e excreção biliar.

Para determinar se os exemplares radioactivos detectados são actualmente o componente administrado, homogenatos do ácido dos órgãos alvo, foram analisados depois da extracção do 64/85 metanol e cromatografia da fase inversa, 2-20 minutos, e 180-200 minutos, após injecção sistémica de 2 qg ou 3nmoles do pentapeptídeo 3'R. Uma boa correlação foi obtida entre o gerador de imagens radio β e brilho liquido contando valores para cada órgão, cálculo/mm2 e cpm/g de peso de tecido, respectivamente. Após 5-20 minutos de tempos de sobrevivência, quase todo o levantamento de radioactividade através de tecidos, foi extraído dos homogenatos do ácido através do solvente orgânico usado: 72+4%. Enquanto 180 minutos após a injecção de pentapeptídeo 3H, a fracção do peptídeo radioactivo foi levantada só quando a extracçâo do metanol foi executada dos homogenatos do tecido para o qual DTPA (16 mM) , um agente quelatante de metal forte, foi adicionado: 53+9%. Além disso, só sob esta condição de extracçâo fez a cromatografia RP-HPLC, revelando que a radioactividade foi predominantemente recuperada no pico correspondente para libertar o pentapeptídeo: 52+8%. O resto do extracto radioactivo representa metabolitos, ou um complexo peptídeo não associado: 8±6% e 29+14%.

Tomados em conjunto, estes dados fornecem uma forte evidência de levantamento selectívo, rápido e estável do pentapeptídeo pela medula exterior do rim, lóbulos pancreáticos, mucosa glandular do estômago e para os tecidos ósseos e dentais.

Exemplo 2: SMR1- padrão de secreção da corrente sanguínea de derivado de pentapeptídeo num rato macho adulto

Para compreender a relevância do levantamento do pentapeptídeo sob condições fisiológicas, a concentração da corrente sanguínea endógena dos peptídeos, refere-se à proteína precursora SMR1, em particular do pentapeptídeo, foi investigado em ratos machos adultos conscientes em resposta 65/85 ao estímulo de stress farmacológico. A amostra e extracção de sangue descritas no "método", foram realizadas na presença de uma mistura de inibidores de peptidase mais EDTA e sob estas condições, o pentapeptídeo plasma basal- nível imunoreactivo de ratos machos de 10 semanas de idade foi de: 1.910.2 ng/ml, n=5. Em ratos anestesiados, o tempo do percurso responde aos agentes secretagogos adrenérgicos de SMR1- a secreção de sangue do derivado de peptídeo revelou previamente que os peptídeos mostraram níveis de circulação máximos dentro de 10-30 minutos seguido de administração perioneal de epinefrina (Rcugeot et al., 1994). Em ratos machos conscientes, 20-40 minutos pós injecção de fenilefrina e isoproterenol, o peptídeo plasma-resposta imunoreactivo foi descoberto ser 12.5+5.4 ng/ml, n=4. A exposição dos ratos ao vapor de éter saturado durante 2 minutos, é amplamente usado para provocar o stress, e os seus efeitos na adrenalina endógeno e secreção adrenocorticotropina, dois dos maiores mediadores de resposta de stress, é bera conhecido (Rcugeot et al., 1991; Van Herck et al., 1991). A resposta secretória adrenérgica endógena para despontar tanto o stress em ratos conscientes, resultou num nível de circulação imunocreativo de 7.014.1 ng/ml, n=4. Ά extracção e fraccionamento por troca de catiâo HRLC de amostras de plasma obtidas sob condições farmacológicas ou despontadas induzidoras de stress, mostraram que 56121%, n=6 da fracção do peptídeo imunoreactivo corresponde ao pentapeptídeo livre; o resto corresponde primeiramente ao SMRl-derivado de hexapeptídeo e undecapeptídeo. A imuno-quantificação da fracção de plasma de pentapeptídeo, pode ser taxada só se as amestras e passos sucessivos de extracção forem realizados na presença de EDTA ou DTPA. 66/85 A extensão fisiológica de pentapeptídeo de circulação, em ratos machos adultos conscientes, foi então estabelecido para 1-7 ng/rni.

Exemplo 3: tempo de percurso de plasma SMR1- distribuição e eliminação de derivado de pentapeptídeo 0 destino in vivo do pentapeptídeo na circulação foi investigado. 0 pentapeptídeo plasma e os seus metabolitos foram medidos com tempo após uma única injecção de uma quantidade fisiológica de 110 ng pentapeptídeo tritiado na circulação de dois ratos machos. A determinação da fracçâo do peptídeo radioactivo de plasma foi executado por purificação RP Porapak Q, e do pentapeptídeo radioactivo para metabolitos através de cromatografia RP-HPLC. Após alcançar um nível máximo em 2 minutos, a concentração do pentapeptídeo plasma diminui rapidamente, voltando para o nível basal de 30 minutos (Figura 6).

As fracções HPLC de extractos de peptídeo plasma revelaram que na corrente sanguínea 35% dos pentapeptideos infundidos foram metabolízados em 4 minutos, e essa proteolises ocorrem na parte amino-terminal do peptídeo. Por outro lado, o tratamento pH acídico plasma antes que a extracção porapak Q dissocie parcialmente um complexo de substância pentapeptídeo-ligação, representando aproximadamente 45% da fracção do peptídeo de circulação. A eliminação foi investigada pela medida de radioactividade excretada sobre o tempo de percurso da experiência e foi estimada em ratos anestesiados, em 6 pmoles, eliminados através de filtração glomerular, durante um período de 60 67/85 minutos. Aproximadamente 80% da radioactividade de urina pareceu ser metabolitos pentapeptídeos.

Estes resultados sugerem que a distribuição de pentapeptídeo de circulação para os tecidos foi quase completa 30 minutos após a injecção. Depois deste período para permitir uma distribuição total do peptídeo, examina-se o seu levantamento celular, 60 minutos após a injecção com concentrações fisiológicas de "H-peptídeo.

Exemplo 4: localização celular de sítios ligação pentapeptídeo 3K através de autoradiografia microscópica clara: radio classíficação in vivo de 60 minutos pós a injecção de concentrações de circulação fisiológicas de peptídeo 3H. A compreensão da função de SMR1- de derivado de peptídeo requer informação acerca da identidade da localização celular dos seus sítios de ligação nos tecidos alvos acima identificados. Tal nível de resolução só pode ser alcançado através de revestimento directo das secções de órgão radio classificada in vivo com emulsão nuclear liquida radiosensitiva, provido que o peptídeo radioactivo é ligado transversalmente com segurança aos sítios de ligação com aldeídos divalentes. Além disso, visto que o levantamento de medicamentos ou hormonas pode ser influenciado pela dosagem, o significado do levantamento celular selectivo do pentapeptídeo foi determinado usando as concentrações de circulação fisiológicas da molécula tritiada. O volume de distribuição para o pentapeptídeo no rato macho foi calculado que seja 35-40 ml/lOOg de peso corporal, 0 qual é similar ao volume do fluído extracelular. Para atingir uma concentração de pentapeptídeo plasma final de 1-7 ng/ml, os rato machos de 68/85 100 gramas de cinco semanas de vida, vão requerer uma miecção sistémica de 40-280 ng de peptideo classificada. Beste modo, os ratos de cinco semanas de vida receberam entre 110-160 ng 3H-pentapeptídeo, para reproduzir concentrações de peptideo plasma fisiológico de ratos machos de 10 semanas de idade para as seguintes experiências: 1-iocalização celular de sítios de ligação peptideo, e - saturação regional e celular dos sítios de ligação do peptideo após a co-injecção de excesso de peptideo não classificado.

Autoradiografias microscópicas claras do rim revelaram a presença de grãos prata confinados preferencialmente numa profundidade de córtex e barra externa da medula exterior sob as células epitelial do segmento S3 da porção directa dos tubulos proximal. Os grãos prata densos foram também vistos nos segmentos SI e S2 da parte convoluta inicial desses túbulos (Figura 7-A) . Não foi notável nenhuma classificação celular específica dentro do glomérulo, ou no epitelial de túbulos distai e de recolha.

Dentro da mucosa gástrica glandular, 60 minutos após a injecção de pentapeptídeo 3H, os grãos prata foram exclusivamente distribuídos para a metade basal das glândulas gástricas sobre as células chefe ou pépticas (Figura 7-C) . Não foi observada nenhuma classificação dentro dos vários canais e "ilhéus" de Langerhans. Contrariamente à expectativa, dentro do tecido alvo submandibular, não foi identificável qualquer associação de célula selectiva da classificação.

As figuras 7-E e 7-F ilustram a secção de parte das vértebras toráxicas e a extremidade proximal da tíbia respectivamente, mostrando ambos o osso trabecular. Dentro do tecido do osso, 69/85 a maior acumulação de grãos prata ocorreu exclusivamente na superfície interna do osso, nos espaços dentro do tecido da medula óssea, os espaços de osso de trabéculos. As células de osso enredam nos espaços intrabeculares, primeiramente os osteócitos e os seus longos processos citoplasmáticos que ocupam a lacunas de canalículos, respectivamente. Dentro desses corpos em forma de agulhas do osso, os grãos prata foram mais densos sobre a camada canalicuiar que sobre a camada lacunar. Ά acumulação especifica dos grãos prata não foi notável tanto no prato de crescimento cartilaginoso ou na medula óssea (Figuras 7-E, 7-F). A figura 7-D ilustra uma secção na raiz do incisor superior do rato. Neste tecido dental, os grãos prata foram selectivamente concentrados sobre toda a camada dentina, ao longo do comprimento dos túbulos dentinal do sistema canalicuiar.

Em experiências de deslocação, a distribuição de tecido celular e total de pentapeptídeo 3H foram examinadas após 60 minutos de pós co-injecção de 100- excesso de peptideo não classificado. 0 grande excesso de concentração frio-ligante resultou num deslocamento quase completo do levantamento do pentapeptídeo dH dentro do medular externo renal e difusão da classificação na direcção dos canais de recolha do medular interior (Figura 8-A). 0 peptideo não classificado em excesso reduz a ligação para várias extensões dentro da mucosa glandular dos lóbulos do estômago, pancreática e submandibular e osso longo, com uma percentagem específica de classificação de 38-61%, 37-55%, 51-91% e 29-38% respectivamente. A fraca redução detectável do peptideo radio classificada pode ser calculada para a baixa abundância dos sítios receptores, ou a presença de produtos de degradação radioactivos significativos distribuídos entre o plasma e o espaço intersticial e pode ter ligação saturável obscura, in 70/85 vivo (Whitcomb et al., 1985). Nesta experiência, parece que a eficácia na detecção de ligação saturável in vivo depende na distribuição dos sítios de ligação do peptídeo dentro dos órgãos específicos, tanto a distribuição ampla (lóbulos pancreáticos e submandibular), ou distribuição estreita (ossos, estômago, rim) e na selectividade dos métodos de análise usados, isto é, o cálculo de tecido total de análise de diferença regional, respectivamente (Figura 8-B, rim, percentagem de classificação específica de 12 a 92%).

No presente estudo, usando um método de classificação in vivo acoplada à análise do gerador de imagens radio β das secções corporais do rato totais, os inventores demonstram que o derivado do pentapeptídeo SMRl ganha acesso as regiões selectivas dentro do rim, pâncreas, glândula submandibular, osso, dentes e estômago. Os perfis do levantamento do tecido têm características essenciais que permitem sítios de ligação específicos a serem identificados in vivo, a ligação é rápida (90 segundos após a administração, no mínimo), estável (240 minutos), selectiva e saturada. Também foi demonstrado que este peptídeo tipo hormona pode ligar a esses sítios receptores de tecido em concentrações de circulação fisiológicas de um rato macho adulto.

Como apoiado pela análise de gerador de imagens radio β quantitativa e quinéticos da distribuição e eliminação do pentapeptídeo na corrente sanguínea do rato, em 90 segundos e 3 minutos (fase de distribuição do peptídeo de circulação), a quantidade de pentapeptídeo num tecido distinto reflecte a soma de quantidades no plasma e espaço intersticial mais sítios receptores de ligação. Aos 60 minutos, (fase de eliminação do peptídeo de circulação) e mais recente, a quantidade reflecte os sítios de ligação do peptídeo 71/85 sequestrados mediados. Deste modo, a medida da selectividade e saturabilidade do tecido e levantamento celular, realizado em 60 minutos após a administração do peptídeo, actualmente reflecte os sítios de ligação específicos para o pentapeptídeo. Uma rápida e estável distribuição e acumulação do peptídeo. Foi demonstrada na medula externa do rim, lóbulos pancreáticos, mucosa glandular do estômago e tecidos do osso periosteal e alveolar assim como a estrutura dentinal do incisor. A falta de levantamento pentapeptídeo mais cedo através da matriz do osso interno, pode ser relatado para uma taxa substancialmente mais lenta de mudança entre o sangue e o fluido extracelular do osso comparado com a mudança entre o sangue e os fluidos extracelular não-osso (Billinghurst et al., 1982).

Os inventores estendem este estudo ao identificar a localização celular para o qual o pentapeptídeo liga em cada tecido ín vivo. Esta abordagem fornece um sítio de acção, um passo essencial na determinação do papel do derivado de peptídeo SMRl nos ratos machos.

O presente resulta no fornecimento de prova directa que os sítios de ligação do pentapeptídeo estão localizados nas porções especificas do nefron do rato macho, com uma densidade de distribuição na área do córtex interno profundo e a barra externa da medula externa e em particular sobre as células epitelial dos segmentos S3, S2 e SI dos túbulos proximal. Deste modo, de um ponto de vista histológico, as provas dadas foram encontradas para um papel do pentapeptídeo de circulação na regulação da função renal nos ratos machos adultos. 0 túfaulo convoluto proximal desempenha um papel principal na reabsorção de Na+, HC03", Cl", Ca2+, P04; solutos de água e orgânicos tais como a glucose e aminoácidos. A 72/85 actividade da maior parte, senão de todos, os sistemas de transporte epitelial renal, são regulados hormonalmente por esteróides (esteróides gonadal e glucocortico-adrenal) e hormonas de peptídeo (hormonas pancreáticas, pituitárias e paratiróides). A maior parte das hormonas que modulam os processos de reabsorção e secreção, agem nos receptores da membrana e podem ganhar acesso às células do fluxo sanguíneo (Tisher et al., 1996). A visualização dos sítios de ligação do pentapeptídeo dentro da área interna do osso, o tecido do osso trabéculo e na superfície do osso periosteal, o periosteum, fornece no sitio a prova para um papel para o pentapeptídeo na regulação das actividades de remodelação do osso. Apesar da remodelação do osso ser um processo muito pouco compreendido, vários dados indicam que esta actividade é assegurada por várias hormonas, incluindo esteróides (androgénios, estrogénios e glucocorticóides) hormonas de peptídeo (normona paratiróide, hormona de crescimento factor de crescimento de insulina-1, tiroxina, glucagon), derivado do fornecimento do sangue para o osso. Além disso, na unidade de remodelação do osso trabecular a qual tem a maior taxa de volta do osso e capacidade de resposta do osso, o pentapeptídeo acumula durante os longos processos citoplãsmícos dos osteócltos, o canalículo. Esses processos de canal tubular estendem-se adjacentes às lacunas de osteócito e abre para o fluido extracelular na superfície do osso. Eles estão envolvidos no depósito, ou reabsorção do cálcio e iões de fosfato os quais estão presentes no fluido extracelular do osso, e com o estendimento dos cristais hidroxiapatite. Em adição, o periosteum é necessário na regeneração do osso durante a reparação da fractura (Jee et al., 1988). Esta descoberta sugere que os derivados de peptídeo SMR1 podem contribuir 73/85 para a regulação da dinâmica do osso e volta no rato macho adulto, como moduladores hormonais.

Além disso, o derivado de pentapeptideo SMG pode também agir como agente de transporte mineral, contudo, o seu levantamento exclusivo através da matriz do osso skeletal (não através de matriz cartilaginosa) e túbulos proximal renal (não através de túbulos distai) vai contra tal hipótese. Pode também interagir como agente eficaz da actividade da enzima da membrana a qual está envolvida na mineralização do esqueleto e reabsorção renal mineral. Contudo, a interacção peptídeo-enzima pode ter características de ligação de alta afinidade para identificar a sua localização selectiva in vi vo como é observado no presente estudo. A prova para a existência de sítios de ligação de pentapeptideo localizados nos túbulos do incisor do rato dentinal, foi obtida. A camada de natureza dentina é postulada para ser envolvida no inicio de um processo de mineralização do dente (Bernard, 1972). Visivelmente, foi reportado que a estimulação hormonal do movimento do fluido através desses túbulos dentinal pode ser dependente em parte de factores parótidos os quais são realizados pela circulação do dentes (Leonora et al., 1987; Tieche et al., 1994). 0 levantamento do pentapeptideo peio tecido dentinal e osso alveolar dos incisores, os quais são sujeitos ao rato para o crescimento continuo e rápida remodelação respectivamente, dá a prova adicional que a glândula submandibular- derivado de peptídeo está envolvido na regulação do balanço mineral entre transporte mineral do esqueleto, dental e renal e assim homeostase mineral. Além disso, em relação às características 74/85 comportamentais do rato macho, esses dados sugerem que o derivado de pentapeptídeo SMR1 regulado- androgénio pode ser um componente, operação sob circunstâncias stressantes as quais levam à sua secreção sistémica, de uma abertura de reacção para regular os efeitos laterais em cascata no balanço mineral, satisfazendo deste modo os requerimentos homeostáticos minerais.

Por outro lado, o intestino e fígado assim como as glândulas salivares, sâo ainda os sítios de maior potencial de manuseamento e regulação de iões. 0 levantamento do pentapeptídeo moderado e atrasado pelo intestino e fígado, pode ser relatado para uma fraca distribuição de peptídeo activo nesses tecidos. Além disso, a distribuição celular atrasada e expandido na acumulação do peptídeo na glândula submandibular, pode ser devido à produção endógena suficiente de derivados de peptídeos SMRl em concentrações que ocupam sítios de ligação disponíveis, e/ou diferenciação funcionai incompleta de células SMG de rato com cinco semanas de vida que estão potencíalmente envolvidas no levantamento do peptídeo. De facto, se ocorre a diferenciação de SMRl célula acinal de secreção durante as primeiras seis semanas, as células ductal são cuidadosamente diferenciada para a fase de desenvolvimento pós-natal de 10 semanas (Leeson et al., 1959). Todavia, a acumulação específica do pentapeptídeo para os lóbulos submandibulares suporta a hipótese que os peptídeos endogenamente produzidos agem localmente. Adicionalmente, visto que a concentração local de derivados de peptídeos SMRl pode ser maior que a extensão mícromolar no rato macho adulto SMG, o peptídeo de circulação pode fracamente, se mesmo todo, intervir na função da glandular. 75/85

As células chefe gástricas e as células acinar pancreáticas, são também alvos para os pentapeptídeos, que suportam a conclusão de que os derivados de peptídeos SMRl têm um papel fundamental na modulação da síntese e/ou secreção em ambas as células secretora de zimogénio e/ou secreção do fluido e electrólitos nas células acinar. A secreção de enzimas digestivas gástricas e pancreáticas é altamente regulada e são libertadas quantidades significativas de enzimas sob estimulação das células zimogénicas, como ocorre durante o fornecimento (revisto em Hersey 1994 e em Jensen, 1994). Adicionalmente, o mecanismo principal para a regulação da secreção de enzima é geralmente mantida para ter estimulação através dos secretagogos. Os receptores secretagogos têm sido descritos nestas células para um número de hormonas de peptídeo, incluindo o peptídeo intestinal secretina/vasoactiva e as famílias cholecistoquina (mais peptídeos libertadores de Gastrin, tachíquínínas para células acinar). A demonstração dos sítios de ligação pentapeptídeo nessas células exocrina, suporta a hipótese de um papel regulador dos derivados de peptídeos SMRl num sistema de controlo de processos digestivos mais cedo. As características cromatográficas de pentapeptídeo tecido de ligação e de circulação, revelou que o transporte e o levantamento do peptídeo envolve espécies moleculares complexas incluindo um elemento mineral catião. Para um acordo geral, o derivado de pentapeptídeo SMG, assim como as hormonas principais, pode ser ancoradas para moléculas ligação de plasma como reservatório de circulação para prevenir a degradação e/ou para facilitar o transporte e depois a associação para os sítios receptores de células.

Em conclusão, os dados apresentados na especificação em questão leva os inventores à descoberta de que o derivado de 76/85 pentapeptídeo SMR1 está envolvido primeiramente num controlo hormonal de balanço mineral entre pelo menos quatro sistemas: o osso, rim, dente e a circulação. 0 desequilíbrio mineral pode ocorrer como resposta para acentuar ou circunstâncias de stress crónicas incluindo luta de intra-amostras e sensações de dor, sede, fome e temperaturas prejudiciais. 0 androgénio de circulação-peptídeo dependente pode ser um componente de uma abertura de reacção que regula, nos ratos machos adultos, a resposta em cascata para o stress ambiental na qual a entrada mineral ou excreção são modificados, controlando deste modo a homeostase mineral.

Exemplo 5: o receptor complexo celular que liga in vivo o pentapeptídeo SMR1 que foi isolado e caracterizado bíoquimicamente

Procedimento da experiência: primeiros passos de purificação do sítio receptor da medula externa do rim 0 procedimento aqui apresentado representa o resultado final dos estudos relativos à optimização das condições adequadas para o isolamento específico do receptor molecular complexo do pentapeptídeo SMR1, cuja localização subcelular e características moleculares eram anteriormente desconhecidas. A selecção da população molecular que é procurada, é realizada ao detectar sistemicamente a radioactividade (3H) nascida pelo lígante (pentapeptídeo SMRl) o qual é ele próprio covalentemente ligado transversalmente para o seu sítio receptor celular.

Visto que a ligação e a ligação transversal são executadas in vivo, a relevância fisiológica dessa interacção é assegurada. 77/85

Os sítios receptores alvo-tissular são radio classificados in vivo através de meios de pentapeptídeo SMR1 tritiado (método usado para as localizações celulares, Rougeot et al., Am. J. of Physiol,m 1997). - 45 minutos após a injecção do ligante radio classificado (300ng), o sujeito (rato) é infundido (KREBS; +4 °C) para remover o peptídeo livre e o peptídeo com um levantamento baixo pelos órgãos alvo (não especifico). o covalente de ligação transversal do ligante radio classificado e os sítios alvo são obtidos após uma infusão com agentes de conjunção para aminos primários, lisina épsilon, ou arginina guanidium (paraformaldehida + glutaraldehida: 0,5% em presença de glucose: 2,5% cloreto de cálcio: 1,2 mM e DMSO: 0,5%. - rins, pâncreas, osso do fémur, incisores e mucosa gástrica glandular são rapidamente removidos, limpos e incubados a + 4°C na presença de formaldehida 0,25% + glucose durante 3 a 17 horas. - os órgãos são lavados com PBS 25 mM pH7,4 e incubados na presença de glicina 0.2 M a +4°C para assegurar a saturação dos grupos aldehida livres - os órgãos são dissecados: medula externa do rim, conteúdos minerais e orgânicos de incisores e ossos do fémur - os tecidos cortados em pedaços são lavados a +4°C com 20 vol de PBS Sem dois passos de 10 vol cada) na presença de 78/85 inibidores de protease (ver cocktails em Am. J. Physiol., Rougeot et al., 1994) - os tecidos são baseados a +4°C (homogenizador Potter) em 2x 10 vol. De acetato de amónio (AcNH4) 5 mM pH 8.8 na presença de inibidores. O homogenato é sonicado a +4°C e depois centrifugado a 1000 g em +4°C durante 15 minutos.

Os Flutuantes (= total de extractos) contém geralmente 60-85% da radioactividade inicial contida do extracto em bruto.

a fracção solúvel (proteínas citosol) é separada dos componentes insolúveis (membranoso) após a centrifugação a 100 000 g durante 30-60 minutos a +4°C - dependendo dos tecidos, os flutuantes de critosol reúnem 60-50% da radioactividade contida no extracto em bruto. A radioactividade do citosol é suposto representar a internalizaçâo e/ou os componentes de degradação intracelular do ligante de radioactividade/complexo receptor.

Os seus maiores pontos isoeléctricos são de .23-5.85 e os seus pesos moleculares aparentes são >6 kDa (Figuras 21-24). - os comprimidos 100 000 g são extraídos ao solubilizar os componentes de membrana (Rabillard et al., Biofutur 126:1-12, 1993; Bretscher Sei. Amer. 253:100-109, 1985)

As diferentes experiências conduzidas com as preparações de membrana da medula externa do rim e vários tipos de detergentes: - um detergente anfotérico ou zuiterióníco, tal como Chaps® - um detergente não iónico tal como NP40 ou Hecarmeg®

- um detergente anionico tal como 3DS 79/85 todos usados em concentrações micelares críticas (CMC) revelaram que só o SDS fornece uma soiubilizaçâo quase completa do complexo de radioaetlvidade começando das preparações de membrana (tabela 1, figura 9). Apesar da SDS ter uma excelente potência de soiubilizaçâo, as interacções com proteínas são de tal modo que por um lado, são desnaturadas e por outro é difícil de remover e deste modo interfere com os sistemas de separação cromatográfica, tornando assim impossível fazer qualquer separação resolutiva de várias populações moleculares. Deste modo, os inventores foram levados a usar um agente de soiubilizaçâo do tipo anfotéríco, os sulfobetainos SB14 e SB201 com um efeito de baixa desnaturação mas notavelmente eficiente em relação às proteínas associadas com a membrana lipídica muiti-camadas através de vários domínios transmembrana (Vuillard et al., Biochem. J. 305,337-343, 1995).

Além disso, o SBs torna possível o uso subsequente de vários sistemas de separação tais como o isoelectrofocagem de fluxo liquido (IEF) permitindo a separação da população molecular baseada no seu ponto isoeléctrico (pHl).

Dependendo das preparações de membrana tíssular, 40 a 90% do complexo de membrana radioactiva é solubilizada, na presença desse agente de soiubilizaçâo.

Os passos subsequentes consistem no isolamento do complexo radioactivo que começa das preparações de membrana solubilizada da medula externa do rim através de meios de vários sistemas de separação, e concorrentemente de delimitação de algumas das suas caracteristicas moleculares as quais são comuns ou diferentes para vários tecidos alvos. Aqui outra vez o método proposto é o tal que é o resultado 80/85 final de vários testes para optimizar as condições adequadas para o isolamento especifico do receptor molecular receptor-pentapeptídeo SMRl. - o preparativo de isoelectrofocagem de fluxo líquido (IEF) (anfolito gradiente em Rotofor, Biorad) foi seleccionado como o primeiro passo para purificar as proteínas de membrana solubilizadas que contém o sítio receptor/complexo pentapeptídeo SMRl (Marchase et al., Arch. Biochem e Biophys 280:122-129, 1990; Rich et al., Technique 1:196-203, 1989; Veser anal. Biochem. 182:-217-221, 1989 e Petrash et al. electroforese 12:84-90, 1991). Os extractos solubilizados em SB14/SB2Q são aplicados directamente e submetidos a um campo eléctrico contínuo (500-1000 volts) durante 3 horas através de um gradiente linear de extensão do ponto isoeléctrico de 3 a 11.

Como representado na figura 10, para as proteínas de membrana solubilizadas da medula externa do rim, este procedimento de separação baseado no ponto isoeléctrico é altamente resolutivo. 0 pico radioactivo coincide com uma baixa quantidade de proteínas (actividade específica máxima/cpm/mg da proteína).

As proteínas com um pH alcalino que são predominantes, são então removidas.

No que diz respeito à medula externa do rim, a (s) população(ôes) molecular(es) radioactiva(s) tem(têm) um pH de 5.89. 81/85

Apesar de uma produção de purificação relativamente baixa (20-40%), o procedimento de purificação tem sido usado para isolar o complexo do sítio receptor ligante -renal.

Deste modo, um passo analítico de cromatografia de exclusão de tamanho permite a separação de amostras com uma extensão de peso molecular d e6 a '500 kDa {©Superdex 200, Pharmacia) mostra que as fracções que resultam do ísoelectrofocagem das preparações de membrana da medula externa do rim, representa uma população radioactlva predominante com um peso molecular de 130 kDa (Figura 13) verificado através de uma calibraçao representativa (logPM* VeNm Figura 13). - uma cromatografia liquida /FPLC) usando uma fase inversa estacionária Cie (Rep RFC Pharmacia) representa o segundo passo de purificação. Visto que os domínios da transmembrana das proteínas da membrana são domínios altamente hidrofóbicos, foi razoável assumir que o sitio receptor para o pentapeptídeo SMR1 possui igualmente essa característica.

Após a diálise e liofilização das fracções IEF radioactivas, o liofilisato é dissolvido em acetato de amónio 5 mM pH 8.8 aplicado à coluna na cabeça e submetido a um gradiente linear de acetonitrilo (ACN) de 1-100% durante 30 minutos a uma taxa de fluxo de 0.75 mi/min (Figuras 14 e 15). Como representado na figura 15, este passo é também altamente resolutivo. Ambas as populações radioactivas coincidem com uma baixa quantidade de proteínas que são detectadas a 280 nra.

Nesta fase, é necessário um passo analítico para controlar a pureza das fracções radioactivas isoladas, nomeadamente aquelas eluldas por 40% de acetonitrilo. 82/85

Este passo analítico é desempenhado após um passo de migração electroforético em géis de acrilamida em condições de desnaturação (SDS-PAGE) das fracções que resultam do procedimento cromatográfico, seguido de um passo de revelação das fracções ao colorir com nitrato de prata. Resultados preliminares indicam que a população molecular representada por pico-1 de radioactividade (tempo de retenção de 6 minutos) resultando de Ci8-PR (tempo de retenção de 6 minutos) corresponde a duas bandas com um peso molecular (PM) entre 100 e 200 kDa. 0 pico -2 de radioactividade (tempo de retenção de 20-22 minutos em FPLC Cis-RP) corresponde a uma banda detectável (com um PM entre 100 e 200 k'Da) .

Características bioquímicas de sítios receptores tissular diferentes

No decorrer dos vários procedimentos realizados para o ajuste dos passos de purificação do sítio receptor da medula do rim (tecido que recebe predominantemente o pentapeptídeo SMR1 ao longo do pâncreas) também se determinou algumas características bioquímicas que são comuns ou distintas para os vários tecidos alvo.

Os sucessivos procedimentos de isoelectrofocagem revelaram que as populações receptoras- ligante molecular radioactivo têm um ponto isoeléctrico de: - 5.64±Q.30, n=10 determinações para a medula externa do rim (figura 16); - 5.58+0.30, n=3 determinações para os lóbulos pancreáticos (figura 11); 6.62+0.35, n=3 determinações para a mucosa gástrica glandular(figura 18); 83/85 - entre 4.2 e 4.9 para a população predominante e 5.6 para a segunda população da matriz do osso trabecular (figura 19, n=l); e - 5.74-6.08, n=l para a matriz dentinal (figura 20).

Ocorridos em conjunto, esses resultados sugerem que pelo menos 2 populações moleculares de sítios receptores para o pentapeptídeo SMR1 estão presentes: um com um pHi de 5.85/5.6410.30, representado basicamente na medula do rim, pâncreas e numa extensão menor na matriz do osso trabecular e dentinal, e o outro com um pHi de 6.6210.35, representado basicamente na mucosa gástrica glandular. A terceira população com um pHi de 4.510.4 que está presente na matriz do osso trabecular precisa de mais confirmação, para a presença de altas quantidades de componentes minerais em que a matriz pode introduzir algumas modificações nos parâmetros da separação IEF.

As sucessivas cromatografias de exclusão de tamanho têm sido usadas como passos analíticos em vez do preparativo (método resolutivo pobre) ou como passo de remoção dos agentes de solubilização (o que não ocorre actualmente).

As cromatografias (figuras 21-24) representativas de cada tecido, revelam que as populações moleculares radioactivas têm um peso molecular aparente entre 200 e 400 kDa. Essas populações com um alto peso molecular encontradas em todos os tecidos alvo, correspondem actualmente a micelas "proteína-detergente" sob circunstâncias analíticas, o peso molecular da proteína receptora sendo deste modo, de maneira que sobrestimado. 84/85

Tabela 1

Rim: medula externa Cpm(Pentapeptídeo de ligação SMR1) Produção Actividade específica Homogenato em bruto 130000 :“!:“T32 0 tf^pmfmg' de proteínas Extracto total (lOOOg) 105600 81% Eracção de citosol solúvel lOOOOOg 26000 27% 21533 cpm/mg de proteínas Membrana de fracção insolúvel lOOOOOg 40560 61% Fracções de membrana solubilizada: chaps 0.5% 2520 6% Fracções de membrana solubilizada: NP40 1% 3200 8% Fracções d,e. membrana solubilizada: hecameg 0.35% 1520 A 9- dt O Fracções de membrana solubilizada: SDS 0.2% 35140 87% 139900 cpm/mg de proteínas Fracções de membrana s o1ubi1i z ada: SB 14 1%+SB201 IM 28040 69% 46733 cpm/mg de proteínas

Como aparece nas descrições da especificação, a invenção não é limitada no ou vários objectivos das realizações acima detalhadas, a presente invenção também abrange todas as alternativas que podem ser executadas por um especialista da técnica no mesmo campo técnico, sem fugir do assunto ou do objectivo da invenção em questão.

Lisboa, 17 de Novembro de 2006 85/85

Claims

Re ivindicações 1. Um método para determinar a quantidade de XQHNPR ou um dos seus derivados biologicamente activos a serem administrados a um paciente que sofre de um desequilíbrio de ião mineral, que compreende os seguintes passos: a) incubar um peptídeo XQHNPR classificada com um anticorpo policionai ou monoclonal dirigido contra o mesmo peptídeo; b) pôr em contacto os complexos imunes formados com uma amostra biológica de um paciente a ser testada, suspeita de conter um peptídeo XQHNPR endógeno não-classifiçado; c) detectar os peptídeos classificados de ligação a anticorpo monoclonal ou policionai, que não foram deslocados pelo peptídeo XQHNPR endógeno não classificado, contido na amostra biológica para determinar a concentração do dito peptídeo endógeno que é contido na amostra biológica; d) comparar a concentração do peptídeo XQHNPR, encontrado no passo c) com a concentração do peptídeo XQHNPR, especialmente QHNPR normalmente encontrado num indivíduo saudável; e e} calcular a quantidade de uma composição terapêutica, compreendendo uma quantidade farmaceuticamente activa de uma proteína SMR1, ou um produto de maturação da proteína SMR1 ou dos seus derivados biologicamente activos, necessários para o fornecimento da deficiência do peptídeo XQHNPR nos fluidos corporais e tecidos. 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito peptídeo XQHNPR é QHNPR. 1/4
3. Uma composição que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz de: - uma proteína SMR1; - um produto de maturação SMR1; ou - um derivado biologicamente activo do acima mencionado; em combinação com uma quantidade farmaceuticamente eficaz de outra molécula envolvida em regulação do equilíbrio ião mineral, a qual ê seleccionada do grupo que consiste em hormonas paratiróide (PTH), calcitonina (CT) e 1,25-dihidroxi vitamina (D).
4. A composição de acordo com a reivindicação 3, em que o dito produto de maturação SMR1 é um peptídeo XQHNPR.
5. A composição de acordo com a reivindicação 4, em que o dito peptídeo XQHNPR é um pentapeptídeo QHNPR ou um polímero. 6. 0 uso de uma proteína SMR1, ou um produto de maturação da proteína SMR1 ou de um dos seus derivados biologicamente actívos para a concentração de um medicamento para prevenir ou tratar um desequilíbrio de ião mineral num mamífero. 7. 0 uso de acordo com a reivindicação 6, para tratamento de um distúrbio que afecta o osso, dentes, renal, rim, intestino, pâncreas, mucosa do estômago, ou paratiróide, provocado principalmente por um desequilíbrio de ião mineral. 8. 0 uso de acordo com a reivindicação 7 ou 8, para prevenir ou tratar um distúrbio que afecta o osso provocado principalmente por um desequilíbrio de ião mineral. 2/4 9. 0 uso de acordo com a reivindicação 8, para prevenir ou tratar a osteoporose. 10. 0 uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, em que o dito mamífero é humano. 11. 0 uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, em. que ο X é um átomo de hidrogénio, um aminoácido V ou R, o um polipeptídeo VR, VRG, VRGP, VRGPR ou VRGPRR, ou um dos seus derivados biologicamente activos. 12. 0 uso de acordo com a reivindicação 11, em que o peptídeo XQHNPR ou um dos seus derivados biologicamente activos compreende um ou mais aminoácidos na forma D. 13. 0 uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, em que o medicamento é uma solução liquida. 14. 0 uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, em que o medicamento é um gel. 15. 0 uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, em que o medicamento é um pó seco. 16. 0 uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, em que o medicamento é um dispositivo de administração de medicamento controlado.
17. O uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 12, em que o medicamento deve ser localmente administrado perto do sitio a ser tratado. 3/4 18. 0 uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, em que o medicamento deve ser administrado através por via oral. Lisboa, 17 de Novembro de 2006 4/4