【発明の詳細な説明】
新規化合物 発明の利用分野
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、前記のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用
、並びにその生産方法に関する。より詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドは脱共役タンパク質(uncoupling protein)ファミリーに関係して
おり、以後これをHNFCW60と記す。本発明はまた、このようなポリヌクレオチド
およびポリペプチドの作用を阻害または活性化することに関する。発明の背景
脱共役タンパク質は哺乳動物の褐色脂肪組織（ＢＡＴ）のミトコンドリア中に
存在していると考えられるペプチドで、最近では、マウス筋肉(ＭＵＣＰ２，Ric
quierら，Genbank受託番号:U69135)のような他の組織でも見いだされている。こ
れはげっ歯類の脂肪沈着物中に豊富に存在しており(Saverioら，The Endocrinol
ogy Journal，138(2)，1997)、ミトコンドリアの内膜を横切るタンパク質勾配を
消失させる。これは続いて酸化的リン酸化鎖の脱共役を起こし、この過程を「脱
調節」(decontrol)する。脱共役タンパク質（ＵＣＰ）が果たす役割は、組織の
熱発生における重要な因子の役割と、全体としてのエネルギー消費の役割である
。したがって、これはＢＡＴ酸化を高めることにより肥満や体重関連障害を解消
するのに使用できるだろう。
ヒトＵＣＰは主に褐色脂肪細胞中に見いだされる(Cassardら，Journal of Cel
l Biochemistry，43，1990)。ＵＣＰ ｍＲＮＡは、β-3アドレナリン受容体が例
えばBRL 37344により作動されるとき、より高い割合で発現され(Chengjunら，Th
e Endocrinology Journal，138(2)，1997)、このことはインスリン依存性糖尿病
をコントロールするに際しての該タンパク質の使用を示唆する。特許出願番号WO
96/05861は、ＭＵＣＰ２に対して高い相同性を示す遺伝子配列を開示している。
ヒトＵＣＰ２はFleuryら，Nature Genetics，1997，15，269に記
載されている。比較的最近になって、このファミリーの別のメンバーである脱共
役タンパク質-3が開示された(Boss Oら，FEBS Lett，1997，12 May，408(1)，39
-42;Vidal-Puig Aら，Biochem Biophys Rs Commun，1997，9 June，235(1)，79-
82)。しかし、これらの論文は本出願の二つの優先権主張日（1997年３月５日お
よび1997年３月18日）の後で発表されたものである。
肥満、糖尿病、高脂血症および体重障害を含むがこれらに限らない、機能障害
または疾病を予防し、改善し、治療する上で何らかの役割を果たす脱共役タンパ
ク質ファミリーの新たなメンバーを同定して特徴づける必要性が存在している。発明の要旨
本発明は、一つの態様において、HNFCW60ポリペプチドおよび組換え物質、並
びにその生産方法に関する。本発明のもう一つの態様はHNFCW60ポリペプチドお
よびポリヌクレオチドの使用方法に関する。こうした使用には、とりわけ、肥満
、糖尿病、高脂血症および体重障害の治療が含まれる。他の態様では、本発明は
、本発明により提供される物質を用いてアゴニストおよびアンタゴニストを同定
する方法、並びに同定された化合物を用いてHNFCW60の平衡異常と関連した状態
を治療することに関する。本発明のさらに他の態様は、不適当なHNFCW60活性ま
たはHNFCW60レベルと関連した疾病を検出するための診断アッセイに関する。図面の簡単な説明
図１は、HNFCW60からのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列（配列番号
１および２）を示す。
図２は、HNFCW60からのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列（配列番号
３および４）を示す。
図３は、HNFCW60からのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列（配列番号
５および６）を示す。発明の説明 本発明のポリペプチド
本発明はHNFCW60ポリペプチドおよびその使用に関する。新規なポリペプチド
として、配列番号２のポリペプチド、および配列番号１に含まれるヌクレオチド
配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチドが挙げ
られる。使用に関する別の態様では、HNFCW60ポリペプチドは配列番号２のポリ
ペプチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９７〜９９％または１００％同
一であるポリペプチドを含む。
HNFCW60ポリペプチドは「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク質
のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加のアミ
ノ酸配列を含めることが有利であり、このようなアミノ酸配列としては、分泌す
なわちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列
、または組換え体生産の間の安定性を確保する付加的配列などがある。
また、HNFCW60ポリペプチドの生物学的に活性な断片も本発明に含まれる。こ
うした断片は全体的に前記HNFCW60ポリペプチドのアミノ酸配列の一部と同一で
あるが、全部とは同一でないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
HNFCW60ポリペプチドと同様に、断片は「フリースタンディング」（それ自体で
独立）していても、より大きいポリペプチド内に含まれていてもよく、つまりそ
の大きいポリペプチドの一部または一領域、最も好ましくは一つの連続領域、を
断片が構成していてもよい。本発明のポリペプチド断片の代表的な例として、お
よその見当でアミノ酸番号１−２０、２１−４０、４１−６０、６１−８０、８
１−１００、および１０１からHNFCW60ポリペプチドの末端までの断片が挙げら
れる。ここで、「およそ」とは、上記の範囲の一端または両端で数個、５個、４
個、３個、２個または１個のアミノ酸が増えたり減ったりした範囲を含むもので
ある。
好適な断片としては、例えば、アミノ末端を含む一連の残基もしくはカルボキ
シル末端を含む一連の残基の欠失、またはアミノ末端を含むものとカルボキシル
末端を含むものとの二連の残基の欠失を除外すれば、HNFCW60ポリペプチドと同
じアミノ酸配列を有する末端切断型(truncation)ポリペプチドが含まれる。また
、αヘリックスとαヘリックス形成領域、βシートとβシート形成領域、ターン
とターン形成領域、コイルとコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親
媒
性領域、β両親媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高
抗原指数領域を含む断片のような、構造的または機能的特性により特徴づけられ
る断片も好適である。その他の好適な断片は生物学的に活性な断片である。生物
学的に活性な断片は、同様の活性をもつ断片、その活性が向上した断片、または
望ましくない活性が減少した断片を含めて、HNFCW60活性を媒介するものである
。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性がある断片も含まれる
。
これらのポリペプチド断片はどれも、抗原活性を含めたHNFCW60の生物学的活
性を保持することが好ましい。特定された配列および断片の変異型も本発明の一
部を構成する。好適な変異型は同類アミノ酸置換により対象物と異なるもの、す
なわち、ある残基が同様の性質の他の残基で置換されているものである。典型的
なこうした置換は、Ala，Val，LeuとIleの間；SerとThrの間；酸性残基AspとGlu
の間；AsnとGlnの間；塩基性残基LysとArgの間；または芳香族残基PheとTyrの間
で起こる。特に、数個、５〜１０個、１〜５個または１〜２個のアミノ酸が任意
の組合せで置換、欠失または付加されている変異型が好ましいものである。
本発明のHNFCW60ポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができる。
このようなポリペプチドには、単離された天然のポリペプチド、組換え的に生産
されたポリペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法の
組合せにより製造されたポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチドを製
造する手段は当業界でよく理解されている。
本発明のポリヌクレオチド
本発明はまた、HNFCW60ポリヌクレオチドおよびその使用に関する。新規なポ
リヌクレオチドとしては、配列番号２のポリペプチドをコードする配列番号１中
に含まれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号１のポリ
ヌクレオチドがある。使用に関する他の態様では、配列番号１のポリヌクレオチ
ドに対して少なくとも７０、８０、９０、９５、９７〜９９％または１００％の
同一性を有するポリヌクレオチドもHNFCW60ポリヌクレオチドに含まれる。
本発明はまた、このようなHNFCW60ポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオ
チドを提供する。
本発明のHNFCW60は、ヒトHNFCW60をコードするｃＤＮＡの配列決定の結果によ
り示されるように、脱共役タンパク質ファミリーの他のタンパク質と構造的に関
連している。このｃＤＮＡ配列は３１２個のアミノ酸からなるポリペプチドをコ
ードするオープンリーディングフレーム（１９９−１１３５）を含んでいる。配
列番号１のヌクレオチド配列は、４９５位のＣがBossおよびVidal-Puig（下記参
照）により発表された配列ではそれぞれ４８０／４５０位でＴであり、１個の保
存塩基において相違している。配列番号２のポリペプチド配列はBossおよびVida
l-Puigの配列と同一である。
本発明はまた、配列番号１および配列番号２の対応する全長配列の決定に先立
って最初に同定された部分的なまたは他のポリヌクレオチドおよびポリペプチド
配列に関する。
したがって、更なる態様において、本発明のポリヌクレオチドは次のヌクレオ
チド配列：
（a）配列番号３または配列番号５に対して、それぞれ配列番号３または配列
番号５の全長にわたり、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０
％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらに好ましくは少な
くとも９５％の同一性、さらに一層好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性
を有するヌクレオチド配列、
（b）配列番号３または配列番号５に対して、それぞれ配列番号３または配列
番号５の全長にわたり、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０
％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらに好ましくは少な
くとも９５％の同一性、さらに一層好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性
を有するヌクレオチド配列、
（c）配列番号３または配列番号５のポリヌクレオチド、または
（d）配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列に対して、それぞれ配列番
号４または配列番号６の全長にわたり、少なくとも７０％の同一性、好ましくは
少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらに
好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに一層好ましくは少なくとも９７〜
９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
を含んでなる単離されたポリヌクレオチド、ならびに配列番号３または配列番号
５のポリヌクレオチドを包含する。
本発明のポリペプチドはさらに、
（a）配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列に対して、それぞれ配列番
号４または配列番号６の全長にわたり、少なくとも７０％の同一性、好ましくは
少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらに
好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％
の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
（b）配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列に対して、それぞれ配列番
号４または配列番号６の全長にわたり、少なくとも７０％の同一性、好ましくは
少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらに
好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％
の同一性であるアミノ酸配列を有する、
（c）配列番号４または配列番号６のアミノ酸を含む、および
（d）配列番号４または配列番号６のポリペプチドである、
ポリペプチド、ならびに配列番号３または配列番号５中に含まれる配列を含んで
なるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを包含する。
配列番号３または配列番号５のヌクレオチド配列およびそれによりコードされ
るペプチド配列はＥＳＴ（Expressed Sequence Tag）配列から誘導されたもので
ある。当業者であれば、ＥＳＴ配列中に必然的に若干のヌクレオチド配列解読エ
ラーが存在することを理解できよう(Adams，M.D.ら，Nature 377(supp)3，1995
を参照のこと)。それゆえ、配列番号３または配列番号５のヌクレオチド配列お
よびそれによりコードされるペプチド配列は、配列の精度においてＥＳＴ固有の
同様の制限を受ける。さらに、配列番号３または配列番号５によりコードされる
ペプチド配列は、最も近縁な相同タンパク質または構造的に類似したタンパク質
と同一の領域または近似した相同領域および／または近似した構造類似領域（例
えば、同類アミノ酸の相違）を含む。
図２のｃＤＮＡ配列（配列番号３）は７４個のアミノ酸からなるポリペプチド
をコードするオープンリーディングフレームを含んでいる。図２のアミノ酸配列
（配列番号４）は、マウスＵＣＰ２(Ricquier，D.ら，Ceremod，CNRS，1996，Ge
nbank受託番号U69135)に対して１４アミノ酸残基において約６２％の同一性（tf
asta使用）を有する。図１のヌクレオチド配列（配列番号1）は、ＭＵＣＰ２
ｍＲＮＡの完全なコード配列(Ricquier,D.ら，Ceremod，CNRS，1996，Genbank受
託番号U69135)に対して１６ヌクレオチド残基において約６８％の同一性（bestf
it使用）を有する。
図３のｃＤＮＡ配列（配列番号５）は９５個のアミノ酸からなるポリペプチド
をコードするオープンリーディングフレームを含んでいる。図３のアミノ酸配列
（配列番号６）は、ヒトＵＣＰ２(Fleury，C.ら，Nature Genetics(15)，March
1997，Genbank受託番号U76367)に対して１４アミノ酸残基において約５８％の同
一性（Tfasta使用）を有する。図２のヌクレオチド配列（配列番号４）は、ヒト
ＵＣＰ２ ｍＲＮＡの完全なコード配列(Fleury，C.ら，Nature Genetics(15)，
March 1997，Genbank受託番号U76367)に対して１６ヌクレオチド残基において約
６４％の同一性（BlastN使用）を有する。
HNFCW60をコードする本発明の一つのポリヌクレオチドは、標準的なクローニ
ングおよびスクリーニングを用いて、ヒト脳前頭皮質、横紋筋肉腫、胎児心臓お
よび骨格筋の細胞中のｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡライブラリーからＥＳＴ
分析（Adams，M.D.ら，Science（1991）252:1651-1656;Adams，M.D.ら，Nature
（1992）355:632-634;Adams，M.D.ら，Nature（1995）377 Supp:3-174）により
得ることができる。２つのＥＳＴ（GenBank受託番号:aa192136およびz28895）が
HNFCW60の一部を表していることに注目されたい。本発明のポリヌクレオチドは
また、ゲノムＤＮＡライブラリーのような天然源から得ることができ、市販され
ている公知の技術を用いて合成することもできる。
配列番号２のHNFCW60ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、図１に
示したコード配列（配列番号１）と、その全長にわたり、同一であっても、配列
番号２のポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列の縮重形態であっても
、配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と高度に同一であっ
てもよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、HNFCW60ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列と高度に同一、少なくとも８０％同一であるヌクレ
オ
チド配列、またはHNFCW60ポリペプチドをコードする図１（配列番号１）中に含
まれる配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列、または配列番号２
のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるヌ
クレオチド配列を含む。
本発明のポリヌクレオチドをHNFCW60ポリペプチドの組換え生産のために用い
る場合、そのポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列またはその
断片単独、他のコード配列（例えば、リーダーもしくは分泌配列、プレー、プロ
ーもしくはプレプロータンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードす
るもの）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプチドのコード配列ま
たはその断片が含まれる。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカ
ー配列がコードされ得る。本発明のこの態様の好ましい具体例として、マーカー
配列は、ｐＱＥベクター(Qiagen，Inc.)により提供されかつGentzら，Proc．Nat
l．Acad．Sci．USA（1989）86:821-824に記載されるようなヘキサーヒスチジン
ペプチド、またはＨＡタグである。また、このポリヌクレオチドは5'および3'非
コード配列、例えば、転写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポ
リアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、およびｍＲＮＡ安定化配列を含ん
でいてもよい。
さらに好適な具体例は、数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、
または１個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されている、
図１のHNFCW60ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）を含むHNFCW60変異型
をコードするポリヌクレオチドである。
本発明はさらに、前記の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する
。これに関して、本発明は特にストリンジェントな条件下で前記のポリヌクレオ
チドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いる「ス
トリンジェントな条件」とは、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくと
も９７％の同一性が存在するときだけハイブリダイゼーションが起こる条件を指
す。
配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列と同一であるか十分に同一である本
発明のポリヌクレオチドは、HNFCW60ポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡお
よびゲノムクローンを単離するために、また、HNFCW60遺伝子との配列類似性が
高い他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡお
よびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる
。このようなハイブリダイゼーション技法は当業者には公知である。一般的に、
これらのヌクレオチド配列は対象物のヌクレオチド配列と７０％、好ましくは８
０％、より好ましくは９０％同一である。プローブはたいてい１５個以上のヌク
レオチドを含み、好ましくは３０個以上を含み、５０個以上のヌクレオチドを有
していてもよい。特に好ましいプローブは３０〜５０個の範囲のヌクレオチドを
有するものである。
一実施態様において、HNFCW60ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
得ることは、配列番号１のヌクレオチド配列またはその断片を有する標識プロー
ブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で適当なライブ
ラリーをスクリーニングし、前記のポリヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮＡお
よびゲノムクローンを単離する各工程を含んでなる。このようなハイブリダイゼ
ーション技法は当業者に公知である。ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件は上で定義したとおりであるか、または、50%ホルムアミド、５×SSC（15
0mM NaCl，15mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、５×D
enhardt溶液、10%デキストラン硫酸および20μｇ/mlの変性し剪断したサケ精子
ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃で一夜インキュベートし、次いでフィルターを
0.1×SSC中約６５℃で洗浄する条件である。
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、動物およびヒトの疾病に対
する治療薬および診断薬を探索するための研究用の試薬および材料として利用す
ることができる。
ベクター、宿主細胞、発現
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター、このベクター
により遺伝子操作された宿主細胞、および組換え法による本発明のポリペプチド
の生産に関する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いてこの種の
タンパク質を生産するための無細胞翻訳系も使用することができる。
組換え体生産に関しては、本発明のポリヌクレオチドの発現系またはその一部
を組み入れるために、宿主細胞が遺伝子操作される。宿主細胞へのポリヌクレオ
チドの導入は、Davisら，BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY（1986）およびS
ambrookら，MOLECULAR CLONING:A LAB0RATORY MANUAL，2nd Ed.，Cold Spring H
arbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y．（1989）などの多くの標
準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランス
フェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベ
クション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トラ
ンスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディン
グ(scrape loading)、射出導入(ballistic introduction)または感染により行う
ことができる。
適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフ
ィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、ア
スペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９）、動
物細胞（例：ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ 127、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ293
、Bowesメラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられる。
多種多様な発現系を使用することができる。こうした発現系として、特に、染
色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由来、バク
テリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメン
ト由来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ４
０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイル
ス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組
合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミド
とバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものがある。この発現系は発現を
起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。一般的に、
宿主内でのポリペプチドの産生のためにポリヌクレオチドを維持し、増やし、発
現するのに適した系またはベクターはどれも使用することができる。Sambrookら
，MOLECULAR CLONING:A LAB0RATORY MANUAL（前掲）に記載されるような、公知
の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発現系に挿入することがで
きる。
翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境
に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、
異種シグナルであってもよい。
スクリーニングアッセイで使用するためHNFCW60ポリペプチドを発現させよう
とする場合、そのポリペプチドを細胞の表面に産生させることが好適である。こ
の場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先立って細胞を回収する。HNFCW6
0ポリペプチドが培地に分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製する
ために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、そ
の後にポリペプチドを回収する必要がある。
組換え細胞培養物からHNFCW60ポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマト
グラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いるこ
とができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる
。ポリペプチドが単離および／または精製中に変性されるときは、タンパク質を
再生させるための公知の技法を用いて、活性のあるコンフォメーションを復元す
ることが可能である。
診断アッセイ
本発明はまた、診断薬としてのHNFCW60ポリヌクレオチドの使用に関する。機
能障害と関連したHNFCW60遺伝子の変異型の検出は、HNFCW60の過少発現、過剰発
現または変化した発現により生ずる疾病またはその疾病への罹りやすさの診断に
追加しうる、またはその診断を下しうる診断用ツールを提供するだろう。HNFCW6
0遺伝子に変異がある個体を、さまざまな技法によりＤＮＡレベルで見つけ出す
ことができる。
診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織の生検または剖
検材料から得ることができる。検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用しても、分
析前にＰＣＲまたは他の増幅法を使って酵素的に増幅してもよい。同様の方法で
ＲＮＡまたはｃＤＮＡを使用することもできる。欠失および挿入変異は、正常な
遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により検出できる。点突然変
異は増幅ＤＮＡを標識HNFCW60ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることで
同定できる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖とはＲＮアーゼ消化に
より、または融解温度の差異により区別できる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変
性剤を用いるまたは用いないゲルでのＤＮＡ断片の電気泳動の移動度の変化によ
り、または直接ＤＮＡ配列決定によっても検出できる（例えば、Myersら，Scien
ce（1985）230:1242を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌクレアーゼプロ
テクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよびＳ１プロテクション）または化
学的開裂法によっても確認できる（Cottonら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA（19
85）85:4397-4401を参照のこと）。別の実施態様では、例えば、遺伝子変異の効
率のよいスクリーニングを行うため、HNFCW60ヌクレオチド配列またはその断片
を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。アレイ技
法は公知で、一般的な適用可能性を有し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的
変異性を含めた分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすために用いられている
（例えば、M．Cheeら，Science，Vol.274，pp.610-613（1996）を参照のこと）
。
診断アッセイは、前記の方法によりHNFCW60遺伝子の変異を検出することで、
肥満、糖尿病、および体重障害への罹りやすさを診断または判定する方法を提供
する。
さらに、被験者から得られたサンプルからHNFCW60ポリペプチドまたはHNFCW60
ｍＲＮＡのレベルの異常な低下または増加を測定する方法により、肥満、糖尿病
、および体重障害の診断を下すことができる。発現の低下または増加は、当技術
分野で公知のポリヌクレオチド定量法のいずれか、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ
、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザンブロット、その他のハイブリダイゼーシ
ョン法によりＲＮＡレベルで測定することができる。宿主から得られたサンプル
中のHNFCW60ポリペプチドのようなタンパク質のレベルを測定するためのアッセ
イ法は当業者によく知られている。こうしたアッセイ法として、ラジオイムノア
ッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイなど
がある。染色体アッセイ
本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体の同定にも有用である。この配列は
個々のヒト染色体上の特定の位置を標的指向し、その特定位置とハイブリダイズ
することができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作成することは、こ
れらの配列と遺伝子関連疾患とを相関させる上で重要な第一段階である。ひとた
び配列が正確な染色体位置にマッピングされたら、その染色体上のその配列の物
理的位置を遺伝地図データと相関させることができる。この種のデータは、例え
ば、V．McKusick，Mendelian Inheritance in Man（Johns Hopkins University
Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能）中に見いだせる。その後、
同一の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係を連鎖分析（物理的
に隣接した遺伝子の共遺伝）により同定する。
罹患個体と非罹患個体とのｃＤＮＡまたはゲノム配列の差異も調べることがで
きる。罹患個体の一部または全部に変異が観察されて、どの正常個体にも観察さ
れない場合は、その変異が疾病の原因である可能性がある。
抗体
本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、またはそれらを発現す
る細胞は、HNFCW60ポリペプチドに免疫特異的な抗体を産生するための免疫原と
しても使用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が従来技術におけ
る他の関連ポリペプチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチドに対し
て実質的に高い親和性を有することを意味する。
HNFCW60ポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（
好ましくはヒト以外）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類似体も
しくは細胞を投与することにより得られる。モノクローナル抗体の調製には、連
続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす任意の技法を用いることがで
きる。例を挙げると、ハイブリドーマ技法(Kohler，G.およびMilstein，C.，Nat
ure（1975）256:495-497)、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（K
ozborら，Immunology Today（1983）4:72）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法
（Coleら，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，pp.77-96，Alan R．Li
ss，Inc.，1985）などがある。
本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製
法（米国特許第4,946,778号）を適応させることができる。また、ヒト化抗体を
発現させるために、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含む他の生
物を利用することができる。
前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現するクローンを単離・同定した
り、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもで
きる。
HNFCW60ポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、肥満、糖尿病、および体重
障害の治療に使用できる可能性がある。
ワクチン
本発明の別の態様は、哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法に関し、
この方法は、特に肥満、糖尿病、および体重障害から前記動物を防御するための
抗体および／またはＴ細胞免疫応答を引き出すのに十分なHNFCW60ポリペプチド
またはその断片を哺乳動物に接種することを含んでなる。本発明のさらに別の態
様は、哺乳動物を疾病から防御する抗体を産生させるような免疫学的応答を引き
出すために、in vivoでHNFCW60ポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介
してHNFCW60ポリペプチドを供給することを含んでなる、哺乳動物において免疫
学的応答を引き出す方法に関する。
本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導入したとき、その哺乳動物において
HNFCW60ポリペプチドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン製剤
（組成物）に関し、この組成物はHNFCW60ポリペプチドまたはHNFCW60遺伝子を含
有する。ワクチン製剤は適当な担体をさらに含んでいてもよい。HNFCW60ポリペ
プチドは胃の中で分解されうるので、非経口的（皮下、筋肉内、静脈内、皮内等
への注射を含む）に投与することが好ましい。非経口投与に適した製剤としては
、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液と等張にする溶質
を含みうる水性および非水性の無菌注射液、並びに懸濁化剤または増粘剤を含み
うる水性および非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は１回量容器または数
回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で提供することができ、また
、使用直前に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で保管するこ
ともできる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増強するためのアジュバント
系、例えば水中油型のアジュバント系や当技術分野で公知の他のアジュバント系
を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性に依存し、ルーチンな実験操作
により簡単に決定できる。
スクリーニングアッセイ
本発明のHNFCW60ポリペプチドは、このポリペプチドを活性化する化合物（ア
ゴニスト）またはその活性を阻害する化合物（アンタゴニスト、または阻害剤と
もいう）のスクリーニング法において使用することができる。こうして、本発明
のポリペプチドは、例えば、細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリーおよび
天然産物の混合物からアゴニストまたはアンタゴニストを評価し同定するために
も用いられる。これらのアゴニストまたはアンタゴニストは、本発明のポリペプ
チドの、場合によって、天然の基質、リガンド、受容体などであってよく、また
、本発明のポリペプチドの構造的または機能的なミメティックであってもよい（
Coliganら，Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5(1991)を参照の
こと）。
HNFCW60ポリペプチドは哺乳動物宿主の様々な部位に存在し、多くの病理を含
めて多数の生物学的機能に関与している。したがって、一方ではHNFCW60ポリペ
プチドを刺激し、他方ではHNFCW60ポリペプチドの機能を阻害し得る化合物およ
び薬物を見つけ出すことが望まれる。一般的に、アゴニストは肥満、糖尿病およ
び体重障害のような症状の治療および予防目的で用いられる。アンタゴニストは
肥満、糖尿病および体重障害のような症状のさまざまな治療および予防目的で使
用しうる。
一般に、こうしたスクリーニング法は本発明のHNFCW60ポリペプチドを発現す
るまたはHNFCW60ポリペプチドに応答する適当な細胞を用いるものである。この
種の細胞には、HNFCW60ポリペプチドを発現するまたはHNFCW60ポリペプチドに応
答する、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエまたは大腸菌由来の細胞が含まれ、
次に、かかる細胞（もしくは発現されたポリペプチドを含む細胞膜）を試験化合
物と接触させて、その結合または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察する。候
補化合物と接触させた細胞の能力を、接触させなかった同一細胞とHNFCW60活性
に関して比較する。
これらのアッセイでは候補化合物の結合を簡単に試験することができ、そこで
は候補化合物と直接または間接に結合された標識により、または標識した競合物
質との競合を用いるアッセイにより、HNFCW60ポリペプチドを担持する細胞への
付着が検出される。さらに、これらのアッセイでは、HNFCW60ポリペプチドを担
持する細胞に適した検出系を用いて、候補化合物がHNFCW60ポリペプチドの活性
化により生ずるシグナルを結果的にもたらすか否かを試験することができる。一
般的に、活性化の阻害剤は既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、そして候
補化合物の存在がアゴニストによる活性化に与える影響が調べられる。このよう
なスクリーニングアッセイを行うための標準的な方法は当業界で十分に理解され
ている。
HNFCW60ポリペプチドの潜在的なアンタゴニストの例としては、抗体、または
ある場合には、HNFCW60ポリペプチドの、場合により、リガンド、基質、受容体
などと密接な関係があるオリゴヌクレオチドもしくはタンパク質（例えば、リガ
ンド、基質、受容体の断片）、または本発明のポリペプチドと結合するが応答を
誘導しない（それゆえポリペプチドの活性を妨げる）小分子などがある。
予防法および治療法
本発明は、HNFCW60ポリペプチド活性の過剰量と不足量のどちらにも関係した
異常な状態の治療法を提供する。
HNFCW60ポリペプチドの活性が過剰である場合は、いくつかのアプローチが利
用可能である。一つのアプローチは、リガンドのHNFCW60への結合をブロックす
ることにより、または第二シグナルを抑制することで異常な状態を軽減すること
により活性化を阻害するのに有効な量で、前記の阻害剤化合物（アンタゴニスト
）を製剤学上許容される担体とともに患者に投与することを含んでなる。
もう一つのアプローチでは、リガンドと結合する能力がまだある可溶性形態の
HNFCW60ポリペプチドを、内因性のHNFCW60ポリペプチドとの競合状態で投与する
ことができる。このような競合剤の典型的な例はHNFCW60ポリペプチドの断片で
ある。
さらに別のアプローチでは、発現阻止法を使って内因性HNFCW60ポリペプチド
をコードする遺伝子の発現を抑制することができる。こうした公知技術は、体内
で生成されるか別個に投与されるアンチセンス配列の使用を必要とする。例えば
、Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC
Press，Boca Raton，FL(1988)中のO'Connor，J Neurochem（1991）56:560を参
照のこと。あるいはまた、この遺伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌクレ
オチドを供給することもできる。例えば、Leeら，Nucleic Acids Res（1979）6:
3073;Cooneyら，Science（1988）241:456;Dervanら，Science（1991）251:1360
を参照のこと。これらのオリゴマーはそれ自体を投与することもできるし、関連
オリゴマーをin vivoで発現させることもできる。
HNFCW60およびその活性の過少発現に関係した異常な状態を治療する場合も、
いくつかのアプローチを取ることができる。一つのアプローチは、治療上有効な
量のHNFCW60ポリペプチドを活性化する化合物（すなわち、前記のアゴニスト）
を製剤学上許容される担体とともに患者に投与して、異常な状態を緩和すること
を含んでなる。別法として、患者の関連細胞においてHNFCW60を内因的に産生さ
せるために遺伝子治療を用いることができる。例えば、上で述べたような複製欠
損レトロウイルスベクターによる発現のために本発明のポリヌクレオチドを遺伝
子操作する。次にレトロウイルス発現構築物を単離し、本発明のポリペプチドを
コードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入され
たパッケージング細胞に導入する。その結果、パッケージング細胞は対象の遺伝
子を含有する感染性のウイルス粒子を産生するようになる。in vivoでの細胞操
作およびin vivoでのポリペプチド発現のために、これらの産生細胞を患者に投
与する。遺伝子治療の概論に関しては、Human Molecular Genetics，TStrachana
nd and A P Read，BI0S Scientific Publishers Ltd（1996）中のChapter 20，G
ene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches(お
よびその中の引用文献)を参照のこと。
製剤および投与
可溶性形態のHNFCW60ポリペプチドのようなペプチド、アゴニストおよびアン
タゴニストペプチド、または小分子は適当な製剤学上の担体と組み合わせて製剤
化することができる。このような製剤は治療上有効な量のポリペプチドまたは化
合物と、製剤学上許容される担体または賦形剤を含有する。この種の担体として
は、食塩水、生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、お
よびこれらの組合せがあるが、これらに限らない。製剤は投与様式に適合させる
べきであり、これは当技術分野の技量の範囲内である。本発明はさらに、前記の
本発明組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含んでなる医薬用パック
およびキットに関する。
本発明のポリペプチドおよび他の化合物は単独で使用しても、他の化合物例え
ば治療用化合物と一緒に使用してもよい。
医薬組成物を全身投与するときの好ましい形態は、注入（注射）、典型的には
静注である。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用できる。全
身投与の別の手段は、胆汁酸塩、フシジン酸、その他の界面活性剤などの浸透剤
を用いた経粘膜および経皮投与である。さらに、腸溶剤またはカプセル剤として
適切に製剤化されているのであれば、経口投与も可能である。これらの化合物は
軟膏、ペースト、ゲルなどの剤形で局所に投与しても、かつ／または局在化させ
てもよい。
必要な投与量範囲はペプチドの選択、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そ
して医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１kgあたり0.
1〜100μｇの範囲である。利用可能な化合物が多種多様であり、それぞれの投与
経路の効率も異なるため、必要とされる投与量は広範に変動することを予想すべ
きである。例えば、経口投与は静注による投与よりも高い投与量を必要とするこ
とが予想される。こうした投与量レベルの変動は、当技術分野でよく理解されて
いるような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
治療に用いるポリペプチドは、上述したような「遺伝子治療」と称する治療法
において、患者の体内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞を、
ex vivoでポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのようなポリヌクレオ
チドにより、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いて、遺伝子工学的
に操作する。その後、この細胞を患者に導入する。
定義
下記の定義は、本明細書中で頻繁に使用される用語を理解しやすくするための
ものである。
「HNFCW60活性またはHNFCW60ポリペプチド活性」または「HNFCW60またはHNFCW
60ポリペプチドの生物学的活性」とは、類似の活性、向上した活性、または望ま
しくない副作用が低下したこれらの活性を含めて、HNFCW60の代謝的または生理
的機能を意味する。さらに、前記HNFCW60の抗原的および免疫原的活性も含まれ
る。
本明細書中で用いる「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロブリ
ン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントが含まれる。
「単離された」とは、天然の状態から「人間の手によって」改変されたことを
意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在するのであれば、それ
はそのもとの環境から変化しているか移動しており、またはその両方である。例
えば、生存している動物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離さ
れたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられるように、
「単離された」ものである。
「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ
、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」に
は、制限するものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖
領域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖でも
、またはより典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合っ
たものでもよい）が含まれる。加えて、「ポリヌクレオチド」はＲＮＡまたはＤ
ＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領域を意味する。「ポリヌクレ
オチド」という用語はまた、１個以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ
、および安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲ
ＮＡも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノ
シンのような特殊な塩基がある。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざまな修飾が
行わ
れてきた。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界に一般的に存在するポリ
ヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、並びにウイルス
および細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。また、「ポ
リヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌ
クレオチドも包含する。
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわ
ち、ペプチドアイソスター）により連結された２個以上のアミノ酸を含む任意の
ペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は短鎖（通常はペプチ
ド、オリゴペプチドまたはオリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質と
いう）の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コード化アミノ酸以外の
アミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天
然のプロセスで、または当技術分野で公知の化学的修飾法のいずれかで修飾され
たアミノ酸配列を含む。このような修飾は基本的な教科書、より詳細な学術論文
および研究文献に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノ
またはカルボキシル末端を含めてポリペプチドのどこでも行うことができる。同
じタイプの修飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさまざ
まに異なる程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの
修飾を含んでいてもよい。ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても
、分枝のある又はない環状であってもよい。環状の、分枝した、または分枝した
環状のポリペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じることがあり、また、合成
法によって製造することもできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤ
Ｐ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレ
オチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合
、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形
成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、
ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロ
キシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、
リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のよう
なタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化などがある。例
えば、
PROTEINS‐STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，2nd Ed.，T.E．Creighton，W
.H．Freeman and Company，New York，1993;POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIF
ICATI0N OF PROTEINS，B.C．Johnson編，Academic Press，New York，1983中のW
old，F.，Posttranslational Protein Modifications:Perspectives and Prospe
cts，pgs．1-12;Seifterら，“Analysis for protein modifications and nonpr
otein cofactors”，Meth Enzymol（1990）182:626-646;およびRattanら，“Pro
tein Synthesis:Posttranslational Modifications and Aging”，Ann NY Acad
Sci（1992）663:48-62を参照のこと。
本明細書中で用いる「変異体」とは、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドと異なるが、不可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドのことである。典型的なポリヌクレオチドの変異体は基準ポリヌクレオチド
とヌクレオチド配列の点で相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、
基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更
しても、しなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下で述べるように、基準配
列によりコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付加、欠失、融合
および末端切断（トランケーション）を生じさせることができる。典型的なポリ
ペプチドの変異体は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。一般的に
は、基準ポリペプチドの配列と変異体の配列が全般的によく類似しており、多く
の領域で同一となるような相違に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任意に
組み合わせた１以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列が相違していてよい
。置換または挿入されるアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるもので
あっても、なくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体はアレ
ル変異体のように天然に存在するものでも、天然に存在することが知られていな
い変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在し
ない変異体は、突然変異誘発法または直接合成により調製することができる。
当技術分野で知られた「同一性」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオ
チド配列の比較により決定された、２以上のかかる配列間の関係のことである。
当技術分野ではまた、「同一性」はポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配
列の鎖間のマッチ(match)により決定された、このような配列間の配列関係の程
度を意味する。「同一性」および「類似性」は公知の方法により難なく算出する
ことができ、こうした方法として、例えばComputational Molecular Biology，L
esk，A.M.編，Oxford University Press，New York，1988;Biocomputing:Inform
atics and Genome Projects，Smith，D.W．編，Academic Press，New York，199
3;Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M．and Griffin
，H.G．編，Humana Press，New Jersey，1994;Sequence Analysis in Molecular
Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987;Sequence Analysis Primer
，Gribskov，M．and Devereux，J．編，M Stockton Press，New York，199１;お
よびCarillo，H．and Lipman，D.，SIAM J．Applied Math.，48:1073（1988）に
記載された方法があるが、これらに限らない。同一性を決定するための好ましい
方法は、検討する配列間で最大級のマッチが得られるように設計される。さらに
、同一性および類似性を決定する方法は一般に入手可能なコンピュータプログラ
ムに編集されている。２配列間の同一性および類似性を決定する好適なコンピュ
ータプログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux，J.ら，Nuc
leic Acids Research 12(1):387(1984))、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦ
ＡＳＴＡ（Atschul，S.F.ら，J．Molec．Biol．215:403-410(1990)）があるが、
これらに限らない。ＢＬＡＳＴ ＸプログラムはＮＣＢＩおよび他のソースから
一般に入手可能である(BLAST Manual，Altschul，S.ら，NCBI NLM NIH Bethesda
，MD 20894;Altschul，S.ら，J．Mol．Biol．215:403-410(1990))。公知のSmith
Watermanアルゴリズムも同一性の決定に使用することができる。
ポリペプチド配列を比較するための好適なパラメーターは次のものを含む：
１）アルゴリズム：Needleman and Wunsch，J．Mol．Biol．48:443-453（1970）
；
比較マトリックス：BLOSSUM62、Hentikoff and Hentikoff，Proc．Natl．Acad
．Sci．USA，89:10915-10919（1992）
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
これらのパラメーターと共に役に立つプログラムはGenetics Computer Group(
Madison WI)から「ｇａｐ」プログラムとして一般に入手可能である。前記のパ
ラメーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーター(default parameter
)である（末端ギャップのペナルティーは無し）。
ポリヌクレオチド配列を比較するための好適なパラメーターは次のものを含む
：
１）アルゴリズム：Needleman and Wunsch，J．Mol．Biol．48:443-453（1970）
比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
これらのパラメーターと共に役に立つプログラムはGenetics Computer Group(
Madison WI)から「ｇａｐ」プログラムとして入手可能である。前記のパラメー
ターはポリヌクレオチド比較のためのデフォルトパラメーターである。
例として、本発明のポリヌクレオチド配列は配列番号１の基準配列と同一であ
っても、該基準配列に対して、ある整数個までのヌクレオチド変異を含んでいて
もよい。前記変異は少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、置換（トランジショ
ンおよびトランスバージョンを含む）または付加よりなる群から選択され、こう
した変異は基準ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端位置、またはこれらの末端
位置の間のどこに存在してもよく、基準配列中のヌクレオチドの間に個々に、ま
たは基準配列内に１以上の連続するグループとして介在することができる。ヌク
レオチド変異の数は、配列番号１のヌクレオチドの総数に、それぞれの（100で
割った）同一性％値を掛け、その積を配列番号１のヌクレオチドの総数から差し
引くことにより、すなわち、次式：
ｎn≦ｘn−（ｘn・ｙ）
により求めることができる。式中、ｎnはヌクレオチド変異の数であり、ｘnは配
列番号１のヌクレオチドの総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％に
ついては0.80、85％については0.85、90％については0.90、95％については0.
95などであり、ｘnとｙの非整数の積は、その積をｘnから引く前に、最も近似す
る整数に切り下げる。配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
配列の改変は、そのコード配列にナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト
突然変異を生じさせ、それにより、こうした変異後に該ポリヌクレオチドにより
コードされたポリペプチドを改変させることができる。
同様に、本発明のポリペプチド配列は配列番号２の基準配列と同一、すなわち
100％の同一性であっても、該基準配列に対して、ある整数個までのアミノ酸変
異を含んでいてもよい。前記変異は少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（同
類および非同類アミノ酸置換を含む）または付加よりなる群から選択され、こう
した変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、または
これらの末端位置の間のいずれに存在してもよく、基準配列中のアミノ酸の間に
個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループとして介在することがで
きる。所定の同一性％についてのアミノ酸変異の数は、配列番号２のアミノ酸の
総数に、それぞれの（100で割った）同一性％値を掛け、その積を配列番号２の
アミノ酸の総数から差し引くことにより、すなわち、次式：
ｎa≦ｘa−（ｘa・ｙ）
により求めることができる。式中、ｎaはアミノ酸変異の数であり、ｘaは配列番
号２中のアミノ酸の総数であり、ｙは例えば70％については0.70、80％について
は0.80、85％については0.85などであり、ｘaとｙの非整数の積は、その積をｘa
から引く前に、最も近似する整数に切り下げる。実施例 １．配列
脱共役タンパク質3'（ＵＣＰ３）配列は、Marathon-ReadyTM骨格筋ｃＤＮＡ(C
lontech Laboratories Inc.)を製造業者の推奨するプロトコールにより用いて、
重複する3'ＥＳＴから設計したnestedプライマーを用いて、5'ＲＡＣＥ（ｃＤＮ
Ａ末端の高速増幅）技術により決定した。1000bpの5'ＲＡＣＥ断片をプラスミド
ｐＧＥＭＴ(Promega)にサブクローニングし、二本鎖配列決定を行った。この配
列はこの遺伝子の5'末端から5'側にさらに198bp延びていることがわかった。
5'ＲＡＣＥ断片から生成された配列とNCBI EST aa192136からの配列とのアラ
イメント（並列化）を行い、エレクトロニック全長ＵＣＰ３配列を生成させた。
このエレクトロニック配列の5'および3'ＵＴＲ領域においてプライマーを設計
し、これらを用いて、プルーフリーディング(proof reading)酵素(pfuポリメラ
ーゼ-Stratagene)を製造業者の推奨するプロトコールにより用いて、Marathon-R
eadyTM骨格筋ｃＤＮＡからの全長ＵＣＰ３遺伝子をＰＣＲにかけた。
最終産物をベクターｐＴＡＲＧＥＴ(Promega)にサブクローニングし、配列オ
ーバーラップを生成する多数のプライマーを用いて二本鎖配列決定により全長配
列を確認した。
２．組織分布
ｉ）ノーザン分析
ジゴキシゲニン(DIG)-標識ｃＤＮＡプローブを、HHFCW603を用いて設計したプ
ライマー：
UCP3F
5'-GGT GGT GAC CTA CGA CAT CCT CAA GG-3'
UCP3R
5'-GGC CTG CAG GTG AGT TCA TAT ACC G-3'
を用いて、DIG-dUTP(Boehringer Mannheim)のＰＣＲ組込みにより合成した。
Wizard PCR prepTMキット(Promega)を用いて標識ＰＣＲ産物を精製し、次の組
織、すなわち、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、
前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、末梢血白血球、胃、甲状腺、脊髄、リンパ節
、気管、副腎および骨髄のポリＡ+ｍＲＮＡを２μｇ含有する市販のヒト多組織
ノーザンブロット(MTN-I，-IIおよび-III;Clontech)とハイブリダイズさせた。
ハイブリダイゼーションはEasyHybTM(Boehringer Mannheim)溶液を用いて50℃
で一夜行った。Claphamら，1997，Int．J．Obesity，21:179-183に記載されるよ
うに化学発光検出を行った。この方法で検査した全ての組織のうち、2.0kbの転
写物サイズを示す強いシグナルが骨格筋で明らかになり、さらに若干の存在が骨
髄において検出可能であった。
ii）サザン分析
DIG-UCP3ｃＤＮＡプローブのゲノム分析は、市販のZooblotTM(Clontech)およ
びEasyHybTM中40℃での一夜ハイブリダイゼーションを用いて行った。前述のよ
うに化学発光検出を行った。ＵＣＰ３は検査した全ての哺乳動物（ヒト、サル、
ラット、マウス、イヌ、ウシおよびウサギ）のゲノムＤＮＡ中に存在したが、ニ
ワトリと酵母のゲノムＤＮＡ中には存在しなかった。
iii）ＲＴ−ＰＣＲ
プライマーUCP3FおよびUCP3Rを用いて、白色脂肪組織、肝臓、骨格筋、膵臓、
心臓、骨髄、腎臓、肺、前立腺、全脳および精巣由来のヒトｃＤＮＡに対してＰ
ＣＲ分析を行った。
ＵＣＰ３の存在が骨格筋と骨髄に確認されたが、更なるかすかなシグナルが膵
臓、腎臓および脳ｃＤＮＡにおいて検出された。ＵＣＰ２(Fleury，C.ら，Natur
e Genetics(15)，March 1997，GenBank受託番号=U76367)と違って、ＵＣＰ３は
肝臓および白色脂肪組織には存在しなかった。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566
33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＰ
(31)優先権主張番号 ９７３０５３０５．１
(32)優先日 平成９年７月16日(1997．7．16)
(33)優先権主張国 ヨーロッパ特許庁（ＥＰ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ
(72)発明者 ペイン，ケリー
イギリス国 シーエム19 ５エーダブル
エセックス，ハーロー，サード アベニュ
ー，ニュー フロンティアーズ サイエン
ス パーク サウス，スミスクライン ビ
ーチャム ファーマシューティカルズ
(72)発明者 ゴッデン，ロバート，ジェームズ
イギリス国 シーエム19 ５エーダブル
エセックス，ハーロー，サード アベニュ
ー，ニュー フロンティアーズ サイエン
ス パーク サウス，スミスクライン ビ
ーチャム ファーマシューティカルズ