【発明の詳細な説明】
新規化合物
発明の分野
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドにより
コードされるポリペプチド、前記のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用
、並びにその生産方法に関する。より詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドはKvカリウムチャンネルファミリーに関係しており、以後hKv4.3
と記す。本発明はまた、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作用
を阻害または活性化することに関する。
発明の背景
一過性外向きカリウムチャンネル(Ito)はカリウムチャンネルKvファミリーの
メンバーであり、心房性活動電位の再分極に関与する主なイオン電流の一つであ
る。心室においては、該チャンネルは活動電位の初期再分極に関与している。そ
の電気生理学的特性はヒトの心細胞内で実証されており、それによりその活性化
および不活性化キネティクスの変更は、再流入(re-entry)の発生において主要な
役割を担っていることが示唆される。
この電流に関与するヒトのチャンネルをコードする遺伝子はまだ同定されてい
ない。種々の候補物の中で、どうもKv4.3がイヌおよびラットにおいてItoに関与
しているらしい(Circ Res,1996,79:659-668)。さらに最近になって、ラットKv4.
3イソ型の部分断片が同定された(Takimotoら、CircRes,1997,81:533-539;Ohya
Ｓら、FEBS Letters,1997,420:47-53)。該部分断片は、１９個の追加のアミノ酸
からなる挿入部を含んでいた。ヒトの心臓においては、Itoをコードする遺伝子
はまだ同定されていない。心不整脈およびアルツハイマー病を含むがこれらに限
らない、機能障害または疾病を予防し、改善し、治療する上で何らかの役割を果
たすKvカリウムチャンネルファミリーのさらなるメンバーを同定して特性付ける
必要性が存在している。
発明の要約
本発明は、一つの態様において、hKv4.3ポリペプチドおよび組換え物質、並び
にその生産方法に関する。本発明のもう一つの態様はhKv4.3ポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドの使用方法に関する。こうした使用には、とりわけ、心不整脈
およびアルツハイマー病の治療が含まれる。他の態様では、本発明は、本発明に
より提供される物質を用いてアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法、
並びに同定された化合物を用いてhKv4.3の平衡異常と関連した状態を治療するこ
とに関する。本発明のさらに他の態様は、不適当なhKv4.3活性またはhKv4.3レベ
ルと関連した疾病を検出するための診断アッセイに関する。
発明の詳細な説明定義
下記の定義は、本明細書中で頻繁に使用される用語を理解しやすくするための
ものである。
「hKv4.3」とは、特に、一般的には配列番号２または４で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドまたはそのアレル変異体を意味する。
「hKv4.3活性もしくはhKv4.3ポリペプチド活性」または「hKv4.3もしくはhKv4
.3ポリペプチドの生物学的活性」とは、類似の活性、向上した活性、または望ま
しくない副作用が低下したこれらの活性を含めて、hKv4.3の代謝的または生理的
機能を意味する。さらに、前記hKv4.3の抗原的および免疫原的活性も含まれる。
「hKv4.3遺伝子」とは、配列番号１または３で表されるヌクレオチド配列を有
するポリヌクレオチドまたはそのアレリック変異体および／またはそれらの相補
体を意昧する。
本明細書中で用いる「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロブリ
ン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントが含まれる。
「単離された」とは、天然の状態から「人間の手によって」改変されたことを
意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在するのであれば、それは
そのもとの環境から変化しているか移動しており、またはその両方である。例え
ば、生存している動物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポリペ
プチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から分離され
たポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書中で用いられるように、「
単離された」ものである。
「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデ
オキシリボヌクレオチドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ
、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」には
、制限するものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域
が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖でも、
またはより典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合った
ものでもよい）が含まれる。加えて、「ポリヌクレオチド」はＲＮＡまたはＤＮＡ
またはＲＮＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領域を意味する。「ポリヌクレオチ
ド」という用語はまた、１個以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、お
よび安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡ
も含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンの
ような特殊な塩基がある。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざまな修飾が行われ
てきた。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界に一般的に存在するポリヌク
レオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、並びにウイルスおよ
び細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。また、「ポリヌ
クレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレ
オチドも包含する。
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合（すなわ
ち、ペプチドアイソスター）により連結された２個以上のアミノ酸を含む任意の
ペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプチド」は短鎖(通常はペプチ
ド、オリゴペプチドまたはオリゴマーという)と長鎖（一般的にはタンパク質と
いう）の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コード化アミノ酸以外の
アミノ
酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプロ
セスで、または当技術分野で公知の化学的修飾法のいずれかで修飾されたアミノ
酸配列を含む。このような修飾は基本的な教科書、より詳細な学術論文および研
究文献に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノまたはカ
ルボキシル末端を含めてポリペプチドのどこでも行うことができる。同じタイプ
の修飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさまざまに異な
る程度で存在してもよい。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの修飾を含
んでいてもよい。ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、分枝の
ある又はない環状であってもよい。環状の、分枝した、または分枝した環状のポ
リペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じることがあり、また、合成法によっ
て製造することもできる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボ
シル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドま
たはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスフ
ァチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メ
チル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル
化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化
、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化
、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパ
ク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化などがある。例えば、
PROTEINS‐STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,2nd Ed.,T.E.Creighton,WH.Fr
eeman and Company,New York,1993;
POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,B.C.Johnson編,Academ
ic Press,New York,1983中のWold,F.,Posttranslational Protein Modification
s:Perspectives and Prospects,pgs.1-12;Seifterら,
“Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors”,Meth Enz
yniol(1990)182:626-646;およびRattanら,“Protein Synthesis:Posttranslatio
nal Modifications and Aging”,Ann NY Acad Sci(1992)663:48-62を参照のこと
。
本明細書中で用いる「変異体」とは、基準のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドと異なるが、不可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドのことである。典型的なポリヌクレオチドの変異体は基準ポリヌクレオチド
とヌクレオチド配列の点で相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、
基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更
しても、しなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下で述べるように、基準配
列によりコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付加、欠失、融合
および末端切断（トランケーション）を生じさせることができる。典型的なポリ
ペプチドの変異体は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。一般的に
は、基準ポリペプチドの配列と変異体の配列が全般的によく類似しており、多く
の領域で同一となるような相違に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任意に
組み合わせた１以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列が相違していてよい
。置換または挿入されるアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるもので
あっても、なくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体はアレ
ル変異体のように天然に存在するものでも、天然に存在することが知られていな
い変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在し
ない変異体は、突然変異誘発法または直接合成により調製することができる。
当分野で公知である「同一性」とは、２以上のポリペプチド配列または２以上
のポリヌクレオチド配列間の関係をいい、配列同士を比較して決定する。当分野
では、「同一性」はポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列相関性の
程度も意味しており、場合によってはそうした配列の鎖間のマッチ(一致)により
決定する。「同一性」と「類似性」は公知の技法を使って容易に計算することがで
き、COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk，A.M．編，Oxford University Pr
ess,New York,1988:BIOCOMPUTING:INFORMATICS AND GENOME PROJECTS，Smith，D
.W．編，Academic Press，New York，1993;COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DAT
A，PART I，Griffin，A.M．and Griffin，H.G．編，Humana Press,New Jersey，
1994;SEQUENCE ANALYSIS INMOLECULAR BIOLOGY,von Heinje，G.,Academic Press
，1987;およびSEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribskov，M．and Devereux，J.編，
MStockton Press，New York,1991;およびCarillo，H．and Lipton，D.,SIAM J A
pplied Math(1988)48:1073に記載される方法があるが、これらに限らない。
同一性を決定する好ましい方法は、試験する配列間で最大級のマッチ（一致）が
得られるように設計する。同一性および類似性の決定方法は市販のコンピュータ
プログラムに集成されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するた
めの好適なコンピュータプログラム法としては、GCGプログラムパッケージ(Deve
reux,J.ら，Nucleic Acids Research(1984)12(1):387)、BLASTP、BLASTN、FASTA
(Atschul,S.F.ら,J Molec Biol(1990)215:403-410)があるが、これらに限らない
。BLAST XプログラムはNCBIおよび他のソースから一般に入手可能である(BLAST
Manual,Altschul,S.ら，NCBI NLM NIH Bethesda,MD20894;Altschul,S.ら，J.Mol
.Biol.215:403-410(1990))。公知のSmith Watermanアルゴリズムも同一性の決定
に使用することができる。
ポリペプチド配列を比較するための好ましいパラメーターは次のものを含む：
１）アルゴリズム：Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)
比較マトリックス：Hentikoff and Hentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10
915-10919(1992)からのBLOSSUM62
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルテイー：４
これらのパラメーターと共に有用なプログラムはGenetics Computer Group(Ma
dison WI)から「gap」プログラムとして一般に入手可能である。前記のパラメー
ターはポリペブチド比較のためのデフォルトパラメーター（default parameter)
である(末端ギャップのペナルティーは無し）。
ポリヌクレオチド配列を比較するための好適なパラメーターは次のものを含む
：
１）アルゴリズム：Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)
比較マトリックス：マッチ＝＋1０、ミスマッチ＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
これらのパラメーターと共に有用なプログラムはGenetics Computer Group
(Madison WI)から「gap」プログラムとして一般に入手可能である。前記のパラ
メーターはポリヌクレオチド比較のためのデフォルトパラメーターである。
具体例として、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の基準配列と同一、
すなわち１００％同一であっても、または該基準配列と比較して、ある整数個ま
でのヌクレオチド変異を含んでいてもよい。前記変異は少なくとも１個のヌクレ
オチドの欠失、置換（トランジションおよびトランスバージョンを含む）または
付加よりなる群から選択され、こうした変異は基準ヌクレオチド配列の5'もしく
は3'末端位置、またはこれらの末端位置の間のどこに存在してもよく、基準配列
中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループ
として点在することができる。ヌクレオチド変異の前記の数は、配列番号１のヌ
クレオチドの総数に、それぞれの同一性％の％数(100で割った値)を掛け、その
積を配列番号１のヌクレオチドの総数から差し引くことにより、すなわち、次式
：
ｎn ≦ ｘn −（Ｘn・ｙ）
により求めることができる。式中、ｎnはヌクレオチド変異の数であり、ｘnは配
列番号１のヌクレオチドの総数であり、ｙは、例えば、70％については0.70、80
％については0.80、85％については0.85、90％については0.90、95％については
0.95等であり、ここでｘnとｙの非整数の積は、その積をｘnから引く前に、最も
近似する整数に切り下げる。配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド配列を改変すると、そのコード配列にナンセンス、ミスセンスまたはフレ
ームシフト突然変異が生じ、こうした変異後に該ポリヌクレオチドによりコード
されたポリペプチドを改変させることもできる。
同様に、本発明のポリペプチド配列は、配列番号２のポリペプチド基準配列と
同一、すなわち１００％同一であっても、該基準配列と比較して、ある整数個ま
でのアミノ酸変異を含んでいてもよい。前記変異は少なくとも１個のアミノ酸の
欠失、置換（同類および非同類アミノ酸置換を含む）または付加よりなる群から
選択され、こうした変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末
端位置、またはこれらの末端位置の間のいずれに存在してもよく、基準配列中の
アミノ酸の間に個々に、または基準配列内に１以上の連続するグループとして点
在することができる。アミノ酸変異の前記の数は、配列番号２のアミノ酸の総数
に、それぞれの同一性％の％数値(100で割った値)を掛け、その積を配列番号２
のアミノ酸の総数から差し引くことにより、すなわち、次式：
ｎa ≦ｘa −（ｘa・ｙ）
により求めることができる。式中、ｎaはアミノ酸変異の数であり、ｘaは配列番
号２中のアミノ酸の総数であり、ｙは、例えば、70％については0.70、80％につ
いては0.80、85％については0.85等であり、ここでｘaとｙの非整数の積は、そ
の積をｘaから引く前に、最も近似する整数に切り下げる。
本発明のポリペプチド
一つの態様において、本発明はhKv4.3ポリペプチド（またはhKv4.3タンパク質
）に関する。このhKv4.3ポリペプチドには、配列番号２および４のポリペプチド
だけでなく、配列番号２または４のアミノ酸配列を含むポリペプチドも含まれる
。配列番号４のポリペプチドは配列番号２のポリペプチドのイソ型であり、アミ
ノ酸番号487と488の間に追加の19個のアミノ酸（GLSYLVDDPLLSVERTSTIK）が挿入
されている。
hKv4.3ポリペプチドはさらにその全長において配列番号２のアミノ酸配列を有
するポリペプチドと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポ
リペプチドも含む。配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して、
その全長にわたり、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポ
リペプチドもhKV4.3ポリペプチドに含まれる。
hKv4.3ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列に対して、その全長にわた
り、少なくとも９７％、好ましくは９８％、より好ましくは少なくとも９９％の
同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをさらに含む。配列番号４の
アミノ酸配列を有するポリペプチドに対して、その全長にわたり、少なくとも９
７％、好ましくは９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するア
ミノ酸配列を有するポリペプチドもまたhKv4.3ポリペプチドに含まれる。
hKv4.3ポリペプチドはhKv4.3の少なくとも１つの生物学的活性を示すことが好
ましい。
hKv4.3ポリペプチドは「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク質の
ような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加のアミノ
酸配列を含めることが有利であり、このようなアミノ酸配列としては、分泌すな
わちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、
または組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列などがある。
また、hKv4.3ポリペプチドの断片も本発明に含まれる。こうした断片は全体的
に前記hKv4.3ポリペプチドのアミノ酸配列の一部と同一であるが、全部とは同一
でないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。hKv4.3ポリペプチドと同様に
、断片は「フリースタンディング」（それ自体で独立）していても、より大きい
ポリペプチド内に含まれていてもよく、つまりその大きいポリペプチドの一部ま
たは一領域、最も好ましくは一つの連続領域、を断片が構成していてもよい。本
発明のポリペプチド断片の代表的な例として、およその見当でアミノ酸番号１−
２０、２１−４０、４１−６０、６１−８０、８１−１００、および１０１から
hKv4.3ポリペプチドの末端までの断片が挙げられる。ここで、「およそ」とは、上
記の範囲の一端または両端で数個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ
酸が増えたり減ったりした範囲を含むものである。
好適な断片としては、例えば、アミノ末端を含む一連の残基もしくはカルボキ
シル末端を含む一連の残基の欠失、またはアミノ末端を含むものとカルボキシル
末端を含むものとの二連の残基の欠失を除いた、hKv4.3ポリペプチドのアミノ酸
配列を有するトランケーション(truncation)ポリペプチドが含まれる。また、α
ヘリックスとαヘリックス形成領域、βシートとβシート形成領域、ターンとタ
ーン形成領域、コイルとコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性
領域、β両親媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗
原指数領域を含む断片のような、構造的または機能的特性により特徴づけられる
断片も好適である。その他の好適な断片は生物学的に活性な断片である。生物学
的に活性な断片は、同様の活性をもつ断片、その活性が向上した断片、または望
ましくない活性が減少した断片を含めて、hKv4.3活性を媒介するものである。さ
らに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性がある断片も含まれる。
これらのポリペプチド断片はどれも、抗原活性を含めたhKv4.3の生物学的活
性を保持することが好ましい。特定された配列および断片の変異型も本発明の一
部を構成する。好適な変異型は同類アミノ酸置換により対象物と異なるもの、す
なわち、ある残基が同様の性質の他の残基で置換されているものである。典型的
なこうした置換は、Ala,Val,LeuとIleの間；SerとThrの間；酸性残基AspとGluの
間；AsnとGlnの間；塩基性残基LysとArgの間；または芳香族残基PheとTyrの間で
起こる。特に、数個、５〜１０個、１〜５個または１〜２個のアミノ酸が任意の
組合せで置換、欠失または付加されている変異型が好適である。
本発明のhKv4.3ポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができる。こ
のようなポリペプチドには、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え的
に生産されたポリペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの
方法の組合せにより製造されたポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチ
ドの製造のための手段は当業界でよく理解されている。
本発明のポリヌクレオチド
本発明のもう一つの態様はhKv4.3ポリヌクレオチドに関する。hKv4.3ポリヌク
レオチドには、hKv4.3ポリペプチドおよび断片をコードする単離されたポリヌク
レオチド、並びにこれらと密接に関連したポリヌクレオチドが含まれる。
さらに特定すると、本発明のhKv4.3ポリヌクレオチドとしては、配列番号２の
hKv4.3ポリペプチドをコードする配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列を含
むポリヌクレオチド、および配列番号１の特定配列を有するポリヌクレオチドが
ある。さらに、hKv4.3ポリヌクレオチドには、配列番号２のhKv4.3ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列とその全長において少なくとも９３％同一である
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号１のヌクレオチド配
列とその全長において少なくとも９３％、好ましくは９５％同一であるヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。さらに、少なくとも９７％同一で
あるものがより好ましく、少なくとも９８〜９９％同一であるものがより一層好
ましく、少なくとも９９％同一であるものが最も好ましい。
さらに、本発明のhKV4.3ポリヌクレオチドは配列番号４のhKv4.3ポリペプ
チドをコードする配列番号３に含まれるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チドまたは配列番号３の特定配列を有するポリヌクレオチドを含む。hKv4.3ポリ
ヌクレオチドはさらに、配列番号４のhKv4.3ポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列とその全長において少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９５％同
一であるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号３の
ヌクレオチド配列とその全長において少なくとも９２％、好ましくは少なくとも
９５％同一であるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを含む。さら
に、少なくとも９７％同一であるものがより好ましく、少なくとも９８〜９９％
同一であるものがより一層好ましく、少なくとも９９％同一であるものが最も好
ましい。
また、増幅反応に使用できる条件下、またはプローブやマーカーとして使用で
きる条件下でハイブリダイズするのに十分な、配列番号１または３中に含まれる
ヌクレオチド配列との同一性を有するヌクレオチド配列もhKv4.3ポリヌクレオチ
ドに含まれる。本発明はまた、このようなhKv4.3ポリヌクレオチドと相補的なポ
リヌクレオチドを提供する。
本発明のhKv4.3は、ヒトhKv4.3をコードするｃＤＮＡの配列決定の結果により
示されるように、Kvカリウムチャンネルファミリーの他のタンパク質と構造的に
関連している。配列番号１のｃＤＮＡ配列は配列番号２の636個のアミノ酸から
なるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド番
号1−1908）を含んでいる。配列番号２のアミノ酸配列は636個のアミノ酸残基に
おいてラットKv4.3(Dixonら、Circulation Research、79:659-668,1996)と約99％
同一である(Bestfit使用)。さらに、配列番号２のポリペプチドは630個のアミノ
酸残基においてラットKv4.2(Baldwin,T.J.ら、Neuron7:471-483
1991)と77％同一である。さらに、配列番号２のポリペプチドは、636個のアミノ
酸残基においてラットKv4.3(Serodioら、J.Neurophysiology、75:2174-
2179,1996)と99％同一である。配列番号１のヌクレオチド配列は1913個のヌクレ
オチド残基においてラットKv4.3(Dixonら、Circulation Research、79:659-668,1
996)と約92％同一である(Bestfit使用)。さらに、配列番号１のポリヌクレオチ
ドは1843個のヌクレオチド残基においてラットKv4.2(Baldwin,T.J.ら、
Neuron7:471-483 1991)と73％同一である。さらに、配列番号１のポリヌクレオ
チドは、1913個のヌクレオチド残基においてラットKv4.3(Serodioら、
J.Neurophysiology、75:2174-2179,1996)と91％同一である。
配列番号３のｃＤＮＡ配列は配列番号２の655個のアミノ酸からなるポリペプ
チドをコードするオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド番号1−1965）
を含んでいる。配列番号４のアミノ酸配列は655個のアミノ酸残基においてラッ
トKv4.3(Dixonら、Circulation Research、79:659-668,1996)と約97％同一であ
る(GCGパイルアップ使用)。さらに、hKv4.3(配列番号４)は655個のアミノ酸残基
においてラットKv4.2(Baldwin,T.J.ら、Neuron7:471-4831991)と71％同一である
。さらに、配列番号４のポリペプチドは、655個のアミノ酸残基においてラットK
v4.3(Serodioら、J.Neurophysiology、75:2174-2179,1996)と96％同一である。
配列番号３のヌクレオチド配列は1932個のヌクレオチド残基においてラットKv4.
3(Dixonら、Circulation Research、79:659-668,1996)と約91％同一である(Best
fit使用)。さらに、配列番号３のヌクレオチド配列は1843個のヌクレオチド残基
においてラットKv4.2(Baldwin,T.J.ら、Neuron 7:471-
4831991)と72％同一である。さらに、配列番号３のヌクレオチド配列は、1913個
のヌクレオチド残基においてラットKv4.3(Serodioら、J.Neurophysiology、75:2
174-2179,1996)と90％同一である。
本発明のhKv4.3ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけ、それらの
相同ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／特性をもつこ
とが予測される。
配列番号２または４のhKv4.3ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、
配列番号１中に含まれるポリペプチドコード配列（配列番号１のヌクレオチド番
号1−1908）または配列番号３と同一であっても、遺伝子コードの重複性（縮重
）のため、それぞれが配列番号２または４のポリペプチドをコードする配列であ
ってもよい。
また、本発明は、配列番号１／３および配列番号２／４の対応する全長配列の
決定に先立って最初に同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列に関
する。
したがって、更なる態様において、本発明は、
（a）配列番号５の全長にわたり、配列番号５のヌクレオチド配列に対して少
なくとも９２％の同一性、好ましくは少なくとも９３％の同一性、より好ましく
は少なくとも９４％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性、さ
らに一層好ましくは９７〜９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（b）配列番号５の全長にわたり、配列番号５のヌクレオチド配列に対して少
なくとも９２％の同一性、好ましくは少なくとも９３％の同一性、より好ましく
は少なくとも９４％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性、さ
らに一層好ましくは９７〜９９％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（c）配列番号５のポリヌクレオチド、または
（d）配列番号６の全長にわたる配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくと
も９２％の同一性、好ましくは少なくとも９３％の同一性、より好ましくは少な
くとも９４％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらに一
層好ましくは９７〜９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列、
を含んでなる単離されたポリヌクレオチドならびに配列番号５のポリヌクレオチ
ドを提供する。
さらに、本発明は、
（a）配列番号６の全長にわたり、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なく
とも９８％の同一性、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配
列を含んでなるポリペプチド、
（b）配列番号６の全長にわたり、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なく
とも９８％の同一性、好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配
列を有するポリペプチド、
（c）配列番号６のアミノ酸を含んでなるポリペプチド、および
（d）配列番号６のポリペプチドであるポリペプチド、
を提供する。
配列番号５のヌクレオチド配列およびそれによりコードされるペプチド配列は
エクスプレスド・シーケンス・タグ（Expressed Sequence Tag：ＥＳＴ）配列か
ら誘導される。当業者であれば、ＥＳＴ配列中に若干のヌクレオチド配列読み取
り誤差が必然的に存在することを理解するであろう(Adams，M.D.ら，Nature 377
(supp)3，1995を参照のこと)。したがって、配列番号３のヌクレオチド配列およ
びそれによりコードされるペプチド配列は配列精度において同一の固有限界を受
ける。さらに、配列番号５によりコードされるペプチド配列は、相同性または構
造類似性が最も高いタンパク質と同一の領域、または相同性および／または構造
類似性（例えば、同類アミノ酸の差異）が高い領域を含んでいる。配列番号２お
よび６は次のミスマッチを有する：アミノ酸20，M/V；アミノ酸106，P/T；アミ
ノ酸298，FIS；アミノ酸413，N/K。
配列番号５のｃＤＮＡ配列は636個のアミノ酸からなるポリペプチドをコード
するオープンリーディングフレームを含んでいる。配列番号６のアミノ酸配列は
636個のアミノ酸残基においてラットKv4.3カリウムチャンネル(Circulation Res
earch 1996,79,659)と約98％同一である(LASAGENE biocomputing software for
Windows使用)。配列番号５のヌクレオチド配列は1914個のヌクレオチド残基にお
いてラットKv4.3カリウムチャンネル(Circulation Research 1996,79,659)と約9
1％同一である(LASAGENE biocomputing software for Windows使用)。
hKv4.3をコードする本発明の一つのポリヌクレオチドは、標準的なクローニン
グおよびスクリーニングにより、ヒト心臓および脳の細胞中のｍＲＮＡから誘導
されたｃＤＮＡライブラリーから、ＥＳＴ分析（Adams,M.D.ら,Science
(1991)252:1651-1656:Adams,M.D.ら，Nature(1992)355:632-634;Adams,
M.D.ら，Nature(1995)377Supp:3-174)を用いて得ることができる。また、本発明
のポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡライブラリーのような天然源から得ることが
でき、商業的に入手可能な公知の技法を用いて合成することもできる。
本発明のポリヌクレオチドをhKv4.3ポリペプチドの組換え生産のために用いる
場合、そのポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列またはその断
片単独、他のコード配列（例えば、リーダーもしくは分泌配列、プレ−、プロ−
もしくはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードする
もの）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプチドのコード配列ま
たはその断片が含まれる。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカ
ー配列がコードされ得る。本発明のこの態様の好ましい具体例として、マーカー
配列は、ｐＱＥベクター(Qiagen,Inc.)により提供されかつGentzら,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA(1989)86:821-824に記載されるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド
、またはＨＡタグである。また、このポリヌクレオチドは5'および3'非コード配
列、例えば、転写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニ
ル化シグナル、リボソーム結合部位、およびｍＲＮＡ安定化配列を含んでいても
よい。
さらに好適な具体例は、数個、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、
または１個のアミノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されている、
配列番号２のhKv4.3ポリペプチドのアミノ酸配列を含むhKv4.3変異型をコードす
るポリヌクレオチドである。
本発明はさらに、前記の配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する
。これに関して、本発明は特にストリンジェントな条件下で前記のポリヌクレオ
チドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いる「ス
トリンジェントな条件」とは、配列間に少なくとも８０％、好ましくは少なくと
も９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好ましくは少なくとも９
７〜９９％の同一性があるときだけハイブリダイゼーションが起こる条件を指す
。
配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列またはその断片(配列番号３のもの
を含む)と同一であるか実質的に同一である本発明のポリヌクレオチドは、
hKv4.3ポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する
ために、また、hKv4.3遺伝子との配列類似性が高い他の遺伝子（ヒト以外の種に
由来する相同体およびオーソログ体(ortholog)をコードする遺伝子を含む)のｃ
ＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの
ハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。このようなハイブ
リダイゼーション技法は当業者には公知である。一般的に、これらのヌクレオチ
ド配列は対象物のヌクレオチド配列と８０％、好ましくは９０％、より好ましく
は９５％同一である。プローブはたいてい１５個以上のヌクレオチドを含み、好
ましくは３０個以上を含み、５０個以上のヌクレオチドを有していてもよい。
特に好ましいプローブは３０〜５０個の範囲のヌクレオチドを有するものである
。
一実施態様において、hKv4.3ポリペプチド（ヒト以外の種に由来する相同体お
よびオーソログ体を含む）をコードするポリヌクレオチドを得ることは、配列番
号１のヌクレオチド配列またはその断片（配列番号３の断片を含む）を有する標
識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で適当
なライブラリーをスクリーニングし、前記のポリヌクレオチド配列を含む全長ｃ
ＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する各工程を含んでなる。このようなハイブ
リダイゼーション技法は当業者に公知である。したがって、他の一態様において
、本発明のhKv4.3ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で配列番号１
を有するヌクレオチド配列またはその断片(配列番号３のものを含む)にハイブリ
ダイズするヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列をさらに含む。hKv4
.3ポリペプチドは、上記ハイブリダーゼーション条件下で得られるヌクレオチド
配列によりコードされるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをさらに含む。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は上で定義したとおりであるか
、または、50％ホルムアミド、５×SSC(150mM NaCl，15mMクエン酸三ナトリウム
）、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、５×Denhardt溶液、10％デキストラン硫酸
および20μg/mlの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で４２℃で一
夜インキュベートし、次いでフィルターを0.1×SSC中約６５℃で洗浄する条件で
ある。
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、動物およびヒトの疾病に対
する治療薬および診断薬を探索するための研究用の試薬および材料として利用す
ることができる。
ベクター、宿主細胞、発現
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター、このベクター
により遺伝子操作された宿主細胞、および組換え法による本発明のポリペプチド
の生産に関する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いてこの種の
タンパク質を生産するための無細胞翻訳系も使用することができる。
組換え体生産に関しては、本発明のポリヌクレオチドの発現系またはその一部
を組み入れるために、宿主細胞が遺伝子操作される。宿主細胞へのポリヌクレオ
チドの導入は、Davisら,BASIC METHODS INMOLECULAR BIOLOGY
(1986)およびSambrookら,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY
MANUAL,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring
Harbor,N.Y(1989)などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例
えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介ト
ランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェク
ション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、
形質導入、スクレープローディング(scrape loading)、弾丸導入(ballistic
introduction)または感染により行うことができる。
適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞(例：ストレプトコッカス、スタフ
ィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌)、真菌細胞(例：酵母、アス
ペルギルス)、昆虫細胞(例：ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９)、動物細
胞（例：ＣＨＯ，ＣＯＳ、ＨｅＬａ，Ｃ127、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ293、Bowe
sメラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられる。
多種多様な発現系を使用することができる。こうした発現系として、特に、染
色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由来、バク
テリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメン
ト由来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ４
０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイル
ス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組
合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミド
とバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものがある。この発現系は発現を
起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。一般的に、
宿主内でのポリペプチドの産生のためにポリヌクレオチドを維持し、増やし、発
現するのに適した系またはベクターはどれも使用することができる。Sambrookら
,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL(前掲)に記載されるような、日常的に
用いられる公知の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発現系に挿
入することができる。
翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境
に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むこと
ができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、
異種シグナルであってもよい。
スクリーニングアッセイで使用するためhKv4.3ポリペプチドを発現させようと
する場合、そのポリペプチドを細胞の表面に産生させることが好適である。この
場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先立って細胞を回収する。hKv4.3ポ
リペプチドが培地に分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製するため
に培地を回収する。細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後
にポリペプチドを回収する必要がある。
組換え細胞培養物からhKv4.3ポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモ
ニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグ
ラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマト
グラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いること
ができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。
ポリペプチドが単離および／または精製中に変性されるときは、タンパク質を再
生させるための公知の技法を用いて、活性のあるコンフォメーションを復元する
ことが可能である。
診断アッセイ
本発明はまた、診断薬としてのhKv4.3ポリヌクレオチドの使用に関する。機能
障害と関連したhKv4.3遺伝子の変異型の検出は、hKv4.3の過少発現、過剰発現ま
たは変化した発現により生ずる疾病またはその罹病性の診断に追加しうる、また
はその診断を下しうる診断用ツールを提供するだろう。hKv4.3遺伝子に変異があ
る個体を、さまざまな技法によりＤＮＡレベルで見つけ出すことができる。
診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織の生検または剖
検材料から得ることができる。検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用しても、分
析前にＰＣＲまたは他の増幅法を使って酵素的に増幅してもよい。同様の方法で
ＲＮＡまたはｃＤＮＡを使用することもできる。欠失および挿入変異は、正常な
遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化により検出できる。点突然変
異は増幅ＤＮＡを標識hKv4.3ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることで同
定できる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖とはＲＮアーゼ消化によ
り、または融解温度の差異により区別できる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性
剤を用いるもしくは用いないゲルでのＤＮＡ断片の電気泳動の移動度の変化によ
り、または直接ＤＮＡ配列決定によっても検出できる(例えば、Myersら，
Science(1985)230:1242を参照のこと)。特定位置での配列変化はヌクレアーゼプ
ロテクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよびＳ１プロテクション）または
化学的開裂法によっても確認できる(Cottonら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)85
:4397-4401を参照のこと)。別の実施態様では、例えば、遺伝子変異の効率のよ
いスクリーニングを行うため、hKv4.3ヌクレオチド配列またはその断片を含むオ
リゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。アレイ技法は公知
で、一般的な適用可能性を有し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を
含めた分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすために用いられている(例えば
、M.Cheeら,Science,Vol.274,pp.610-613(1996)を参照のこと)。
診断アッセイは、前記の方法によりhKv4.3遺伝子の変異を検出することで、心
不整脈およびアルツハイマー病への罹りやすさを診断または判定する方法を提供
する。
さらに、被験者から得られたサンプルからhKv4.3ポリペプチドまたはhKv4.3ｍ
ＲＮＡのレベルの異常な低下または増加を測定する方法により、心不整脈および
アルツハイマー病の診断を下すことができる。発現の低下または増加は、当技術
分野で公知のポリヌクレオチド定量法のいずれか、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ
、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザンブロット、その他のハイブリダイゼーシ
ョン法によりＲＮＡレベルで測定することができる。宿主から得られたサンプル
中のhKv4.3ポリペプチドのようなタンパク質のレベルを測定するためのアッセイ
法は当業者によく知られている。こうしたアッセイ法として、ラジオイムノアッ
セイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイなどが
ある。
かくして、もう一つの態様において、本発明は、疾病特に、心不整脈およびア
ルツハイマー病またはこのような疾病への罹りやすさを診断するためのキットに
関し、このキットは、
(a)hKv4.3ポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列）
もしくはその断片、
(b)(a)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
(c)hKv4.3ポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）もしくは
その断片、または
(d)hKv4.3ポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）に対する
抗体、
を含んでなる。このようなキットにおいて、(a)、(b)、(c)または(d)が実質的な
構成成分であることが理解されよう。
染色体アッセイ
本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体の同定にも有用である。この配列は
個々のヒト染色体上の特定の位置を標的指向し、その特定位置とハイブリダイズ
することができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作成することは、こ
れらの配列と遺伝子関連疾患とを相関させる上で重要な第一段階である。ひとた
び配列が正確な染色体位置にマッピングされたら、その染色体上のその配列の物
理的位置を遺伝地図データと相関させることができる。この種のデータは、例え
ば、V.McKusick,Mendehan Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welc
h Medical Libraryからオンラインで入手可能）中に見いだせる。その後、同一
の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係を連鎖分析（物理的に隣
接した遺伝子の共遺伝）により同定する。患者と正常個体とのｃＤＮＡまたはゲ
ノム配列の差異も調べることができる。患者の一部または全部に変異が観察され
るが、どの正常個体にも観察されない場合は、その変異が疾病の原因である可能
性がある。
抗体
本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、またはそれらを発現す
る細胞は、hKv4.3ポリペプチドに免疫特異的な抗体を産生するための免疫原とし
ても使用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が従来技術における
他の関連ポリペプチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチドに対して
実質的に高い親和性を有することを意味する。
hKv4.3ポリペプチドに対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好
ましくはヒト以外）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類似体もし
くは細胞を投与することにより得られる。モノクローナル抗体の調製には、連続
細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす任意の技法を用いることができ
る。例を挙げると、ハイブリドーマ技法(Kohler,G.およびMilstein,C.,Nature(1
975)256:495-497)、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kozborら
,Immunology Today(1983)4:72)およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Coleら,MON
OCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,pp.77-96,Alan R.Liss,Inc.,1985）な
どがある。
本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製
法（米国特許第4,946,778号）を適応させることができる。また、ヒト化抗体を
発現させるために、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含む他の生
物を利用することができる。
前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現するクローンを単離・同定した
り、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもで
きる。
hKv4.3ポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、心不整脈およびアルツハイマ
ー病の治療に使用できる可能性がある。
ワクチン
本発明の別の態様は、哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法に関し、
この方法は、特に心不整脈およびアルツハイマー病から前記動物を防御するため
の抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生ずるのに十分なhKv4.3ポリペプチドま
たはその断片を哺乳動物に接種することを含んでなる。本発明のさらに別の態
様は、哺乳動物を疾病から防御する抗体を産生させるような免疫学的応答を引き
出すために、in vivoでhKv4.3ポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介
してhKv4.3ポリペプチドを供給することを含んでなる、哺乳動物において免疫学
的応答を引き出す方法に関する。
本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導入したとき、その哺乳動物において
hKv4.3ポリペプチドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン製剤（
組成物）に関し、この組成物はhKv4.3ポリペプチドまたはhKv4.3遺伝子を含有す
る。ワクチン製剤は適当な担体をさらに含んでいてもよい。hKv4.3ポリペプチド
は胃の中で分解されうるので、非経口的（皮下、筋肉内、静脈内、皮内等への注
射を含む）に投与することが好ましい。非経口投与に適した製剤としては、酸化
防止剤、緩衝液、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液と等張にする溶質を含み
うる水性および非水性の無菌注射液、並びに懸濁化剤または増粘剤を含みうる水
性および非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は１回量容器または数回量容
器（例えば、密閉アンプルおよびバイアル）で提供することができ、また、使用
直前に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で保管することもでき
る。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増強するためのアジュバント系、例え
ば水中油型のアジュバント系や当技術分野で公知の他のアジュバント系を含んで
いてもよい。投与量はワクチンの比活性で変化し、ルーチンな実験操作により簡
単に決定できる。
スクリーニングアッセイ
本発明のhKv4.3ポリペプチドは、このポリペプチドを活性化する化合物（アゴ
ニスト）またはその活性を阻害する化合物（アンタゴニスト、または阻害剤とも
いう）のスクリーニング法において使用することができる。こうして、本発明の
ポリペプチドは、例えば、細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリーおよび天
然産物の混合物中の小分子基質およびリガンドの結合を評価するためにも用いら
れる。これらの基質およびリガンドは天然の基質またはリガンドであっても、構
造的または機能的な模擬物であってもよい(Coliganら,Current Protocols in Im
munology 1(2):Chapter 5(1991)を参照のこと)。
hKv4.3ポリペプチドは多くの病理を含めて多数の生物学的機能に関与している
。したがって、一方ではhKv4.3ポリペプチドを刺激し、他方ではhKv4.3ポリペプ
チドの機能を阻害し得る化合物および薬物を見つけ出すことが望まれる。一般的
に、アゴニストは心不整脈およびアルツハイマー病のような症状の治療および予
防目的で用いられる。アンタゴニストは心不整脈およびアルツハイマー病のよう
な症状のさまざまな治療および予防目的で使用しうる。
一般に、こうしたスクリーニング法はhKv4.3ポリペプチドをその表面に発現す
るかまたは本発明のhKv4.3ポリペプチドに応答する適当な細胞を用いるものであ
る。この種の細胞には哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ由来の細胞または大腸
菌細胞が含まれる。次いで、hKv4.3ポリペプチドを発現する細胞（もしくは発現
されたポリペプチドを含む細胞膜）またはhKv4.3ポリペプチドに応答する細胞を
試験化合物と接触させて、その結合または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察
する。hKv4.3活性についての該候補化合物と接触させた細胞の能力を、候補化合
物と接触させていない細胞と比較する。
これらには、パッチクランプ(patch-clamp)法または標準電気生理学的技法お
よび標準結合法を用いてイオン電流を記録する方法が含まれる。
FLIPR(Fluorimetric Imaging Plate Reader)システムも考慮できる。
これらのアッセイでは候補化合物の結合を簡単に試験することができ、そこで
は候補化合物と直接または間接に結合された標識により、または標識した競合物
質との競合を用いるアッセイにより、該hKv4.3ポリペプチドを担持する細胞への
付着が検出される。さらに、これらのアッセイでは、該hKv4.3ポリペプチドをそ
の表面に担持する細胞に適した検出系を用いて、候補化合物が該hKv4.3ポリペプ
チドの活性化により生ずるシグナルを結果的にもたらすか否かを試験することが
できる。一般的に、活性化の阻害剤は既知のアゴニストの存在下でアッセイされ
、そして候補化合物の存在がアゴニストによる活性化に与える影響が調べられる
。
さらに、これらのアッセイは、候補化合物とhKv4.3ポリペプチドを含む溶液と
を混ぜ合わせて混合物をつくり、この混合物中のhKv4.3活性を測定し、そしてこ
の混合物のhKv4.3活性を標準と比較する各ステップを単に含むだけでよい。
また、hKv4.3のｃＤＮＡ、タンパク質またはこのタンパク質に対する抗体を用
いて、細胞内でのhKv4.3ｍＲＮＡまたはタンパク質の生産に及ぼす添加化合物の
作用を検出するためのアッセイを組み立てることができる。例えば、当技術分野
で公知の標準方法によりモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて、hK
v4.3タンパク質の分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するためのＥＬＩＳＡ
を構築することができ、これは適切に操作された細胞または組織からのhKv4.3の
生産を抑制または増強する物質（それぞれアンタゴニストまたはアゴニストとも
いう）の探索に用いることができる。
当業界で公知の標準的な受容体結合法を用いれば、hKv4.3タンパク質を膜結合
型または可溶性の受容体を同定するために使用できる。こうした受容体結合法に
は、限定するものではないが、リガンド結合アッセイおよび架橋アッセイがあり
、これらのアッセイでは、hKv4.3を放射性アイソトープ（例：125Ｉ）で標識す
るか、化学的に修飾（例：ビオチン化）するか、または検出や精製に適したペプ
チド配列に融合させ、そして推定上の受容体源（細胞、細胞膜、細胞上清、組織
抽出物、体液など）とインキュベートする。その他の方法としては、表面プラズ
モン共鳴および分光学のような生物物理的方法がある。さらに、該受容体の精製
およびクローニングのために使用することもでき、これらの結合アッセイは
hKv4.3の（存在するのであれば）その受容体への結合と競合するhKv4.3のアゴニ
ストまたはアンタゴニストを同定するために用いることもできる。スクリーニン
グアッセイを行うための標準的な方法は当技術分野でよく理解されている。
hKv4.3の潜在的なアンタゴニストの例としては、抗体、ある場合には、hKv4.3
のリガンド、基質、酵素、受容体等と密接な関係があるオリゴヌクレオチドもし
くはタンパク質（例えば、リガンド、基質、酵素、受容体等の断片）、または該
ポリペプチドと結合するが応答を誘導しない（それゆえ該ポリペプチドの活性を
妨げる）小分子などがある。
かくして、他の態様において、本発明は、hKv4.3ポリペプチドのアゴニスト、
アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など、またはhKv4.3ポリペプチ
ドの生産を低下または増加させる化合物を同定するためのスクリーニングキット
に関し、このキットは、
(a)hKv4.3ポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）
(b)hKv4.3ポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）を発現す
る組換え細胞、
(c)hKv4.3ポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）を発現す
る細胞膜、または
(d)hKv4.3ポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）に対する
抗体、
を含んでなる。このようなキットにおいて、(a)、(b)、(c)または(d)が実質的な
構成成分であることが理解されよう。
予防および治療法
本発明は、hKv4.3活性の過剰量と不足量のどちらにも関係した心不整脈および
アルツハイマー病などの異常な状態の治療法を提供する。
hKv4.3ポリペプチドの活性が過剰である場合は、いくつかのアプローチが利用可
能である。一つのアプローチは、例えばリガンド、基質、酵素、受容体等の結合
をブロックすることにより、または第２のシグナルを抑制することで異常な状態
を軽減することにより、hKv4.3ポリペプチド機能を阻害するのに有効な量で、前
記の阻害剤化合物（アンタゴニスト）を製剤学上許容される担体とともに患者に
投与することを含んでなる。もう一つのアプローチでは、内因性のhKv4.3ポリペ
プチドとの競合状態でリガンド、基質、酵素、受容体等と結合する能力がまだあ
る可溶性形態のhKv4.3ポリペプチドを投与することができる。このような競合物
質の典型的な例はhKv4.3ポリペブチドの断片である。
もう一つのアプローチでは、内因性のｈＫｖ４．３との競合状態でリガンドと
結合する能力がまだある可溶性形態のhKv4.3ポリペプチドを投与することができ
る。このような競合物質の典型的な例はhKv4.3ポリペプチドの断片である。
さらに別のアプローチでは、発現阻止法を使って内因性hKv4.3ポリペプチドを
コードする遺伝子の発現を抑制することができる。こうした公知技術は、体内で
生成されるか別個に投与されるアンチセンス配列の使用を必要とする。例えば、
Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Pre
ss,
Boca Raton,FL(1988)中のO'Connor,J Neurochem(1991)56:560を参照のこと。あ
るいはまた、この遺伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供給
することもできる。例えば、Leeら,Nucleic Acids Res(1979)6:3073;Cooneyら,S
cience(1988)241:456;Dervanら,Science(1991)251:1360を参照のこと。これらの
オリゴマーはそれ自体を投与することもできるし、関連オリゴマーをin vivoで
発現させることもできる。
hKv4.3およびその活性の過少発現に関係した異常な状態を治療する場合も、い
くつかのアプローチを取ることができる。一つのアプローチは、治療上有効な量
のhKv4.3を活性化する化合物（すなわち、前記のアゴニスト）を製剤学上許容さ
れる担体とともに患者に投与して、異常な状態を緩和することを含んでなる。別
法として、患者の関連細胞においてhKv4.3を内因的に産生させるために遺伝子治
療を用いることができる。例えば、上で述べたような複製欠損レトロウイルスベ
クターによる発現のために本発明のポリヌクレオチドを遺伝子操作する。次にレ
トロウイルス発現構築物を単離し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを
含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケージング細
胞に導入する。その結果、パッケージング細胞は対象の遺伝子を含有する感染性
のウイルス粒子を産生するようになる。in vivoでの細胞処理およびin vivoでの
ポリペプチド発現のために、これらの産生細胞を患者に投与する。遺伝子治療の
概論に関しては、Human Molecular Genetics,T Strachan and AP Read,
BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)中のChapter 20,Gene Therapy and
other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches(およびその中の引用
文献）を参照のこと。もう一つのアプローチは治療量のhKv4.3ポリペプチドを適
当な製剤学上の担体とともに投与することである。
製剤および投与
可溶性形態のhKv4.3ポリペプチドのようなペプチド、アゴニストおよびアンタ
ゴニストペプチド、または小分子は適当な製剤学上の担体と組み合わせて製剤化
することができる。このような製剤は治療上有効な量のポリペプチドまたは化合
物と、製剤学上許容される担体または賦形剤を含有する。この種の担体として
は、食塩水、生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、お
よびこれらの組合せがあるが、これらに限らない。製剤は投与様式に適合させる
べきであり、これは当技術分野の技量の範囲内である。本発明はさらに、前記の
本発明組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含んでなる医薬用パック
およびキットに関する。
本発明のポリペプチドおよび他の化合物は単独で使用しても、他の化合物、例
えば治療用化合物と一緒に使用してもよい。
医薬組成物を全身投与するときの好ましい形態は、注入(注射)、典型的には静
注である。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用できる。全身
投与の別の手段は、胆汁酸塩、フシジン酸、その他の界面活性剤などの浸透剤を
用いた経粘膜および経皮投与である。さらに、腸溶剤またはカプセル剤として適
切に製剤化されているのであれば、経口投与も可能である。これらの化合物は軟
膏、ペースト、ゲルなどの剤形で局所に投与しても、かつ／または局在化させて
もよい。
必要な投与量範囲はペプチドの選択、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そ
して医師の判断に左右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１kgあたり0.
1〜100μgの範囲である。利用可能な化合物が多種多様であり、それぞれの投与
経路の効率も異なるため、必要とされる投与量は広範に変動することを予想すべ
きである。例えば、経口投与は静注による投与よりも高い投与量を必要とするこ
とが予想される。こうした投与量レベルの変動は、当技術分野でよく理解されて
いるような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整することができる。
治療に用いるポリペプチドは、上述したような「遺伝子治療」と称する治療法
において、患者の体内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞を、
ex vivoでポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのようなポリヌクレオ
チドにより、例えばレトロウイルスプラスミドベクターを用いて、遺伝子工学的
に操作する。その後、この細胞を患者に導入する。
実施例１：ヒトKV4.3cＤＮＡクローニング：
ヒトゲノムデータベースのランダム検索により部分クローン(ATG975,HGS
Est939345)をまず同定した。この部分クローン(406bp)はラットKV4.3遺伝子の3'
末端(最後の45アミノ酸)に対して有意な相同性を示した。部分ｃＤＮＡ断片およ
び全長ｃＤＮＡを得るために、ヒト心臓Marathon readyｃＤＮＡ
(Clontech,Palo Alto,CA)を増幅鋳型として使用した。
１．ヒトKV4.3全長ｃＤＮＡに対応する1914bpの断片：
リバースプライマー(5'CAC CCA CCA ACA TGC CA3')およびフォワードプライマ
ー(5'GCC CAA AAG CTG GAG TCA C3')を使用して最初のPCR実験を行なった。次に
、PCR産物を精製した後、リバース遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(5'GTT TTA
CAA GGC GGA GAC CTT GAC AAC 3'：ATG975クローン由来の部分ヒトKV4.3配列を
ベースとする)およびフォワード遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(5'ATG GCG GC
A GGA GTT GCA GCC T3')を用いて２回目のPCR実験を行なった。約2.0Kbの１つの
断片が得られ、この断片をpfuＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene,La Jolla,CA)を
使用して平滑末端となし、EcoRV消化済みpBluescript KSベクター(Stratagene,L
a JoUa,CA)中にサブクローン化した。自動化シーケンサーにより、挿入物の配列
を決定した。全部で1914bpが配列決定され、この中には636個のアミノ酸からな
るペプチドをコードするオープンリーディングフレームが含まれる。Fasta分析
により、このペプチドがラットKV4.3タンパク質に対して高度の相同性を有する
ことが示された。さらに、Lasergene Proteanプログラムを使用したこのペプチ
ドの疎水性プロットにより、KVファミリー関連タンパク質全てに典型的である６
回膜貫通架橋疎水性ドメインが示された。
２．フォワードプライマー(5'ATG GCG GCA GGA GTT GCA GCC T3')およびリバー
スプライマー(5'GTC TTG CCC ATG TGC TCC TCT TCT GGG G3')と共に前記と同様
の方法を使用して約1.6Kbの１つの断片を得た。
３．フォワードプライマー(5'CCG CAC TGG GAA GCT GCA CTA CCC ACG C3')およ
びリバースプライマー(5'GTC TTG CCC ATG TGC TCC TCT TCT GGG G3')と共に前
記と同様の方法を使用して約1.1Kbの１つの断片を得た。
４．フォワードプライマー(5'CCC CAG AAG AGG AGC ACA TGG GCA AGA C3')およ
びリバースプライマー(5'GTG TTG GGA CCT GGA CTG GCA GGG GGT
G3')と共に前記と同様の方法を使用して約0.55Kbの１つの断片を得た。
実施例２：HEK293細胞において発現された場合のhKv4.3チャンネルの電気生理学
的特性付け
HEK293トランスフェクト細胞中のhKv4.3チャンネルを通って流れる巨視的カリ
ウム電流。
−80mVの電位を保持する膜から10mV漸増的脱分極により電流を生じさせる−図
１参照。
HEK293トランスフェクト細胞中のhKv4.3チャンネルを通って流れる電流の、電
流−電圧関係−図２参照。
HEK293トランスフェクト細胞中のhKv4.3チャンネルを通って流れる電流の定常
状態電圧依存性不活性化曲線−図３参照。
HEK293トランスフェクト細胞中のhKv4.3チャンネルを通って流れる電流の再活
性化特性−図４参照。
本明細書中に引用された、特許および特許出願明細書を含めた全ての刊行物は
、あたかも各刊行物が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体を参
考としてここに組み入れるものとする。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00
Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705
16/18 16/18
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
(31)優先権主張番号 ９７４０３００７．４
(32)優先日 平成９年12月11日(1997．12．11)
(33)優先権主張国 ヨーロッパ特許庁（ＥＰ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ
(72)発明者 カルメルス，ティエリー，ポール，ジェラ
ルド
フランス国 エフ―35762 サン グレゴ
ワール，ボワト ポスタル 58，ル ドゥ
チェスネイ ボウルガルド ４，スミス
クライン ビーチャム ラボラトワール
ファーマシューティック
(72)発明者 フェブル，ジャン−フランソワ，シモン,
ピエール
フランス国 エフ―35762 サン グレゴ
ワール，ボワト ポスタル 58，ル ドゥ
チェスネイ ボウルガルド ４，スミス
クライン ビーチャム ラボラトワール
ファーマシューティック
(72)発明者 ジャブル，ジャン−ルク
フランス国 エフ―35762 サン グレゴ
ワール，ボワト ポスタル 58，ル ドゥ
チェスネイ ボウルガルド ４，スミス
クライン ビーチャム ラボラトワール
ファーマシューティック
(72)発明者 ロウアネット，サビヌ
フランス国 エフ―35762 サン グレゴ
ワール，ボワト ポスタル 58，ル ドゥ
チェスネイ ボウルガルド ４，スミス
クライン ビーチャム ラボラトワール
ファーマシューティック