ES2239089T3 - Polipeptidos y acidos nucleicos que codifican los mismos. - Google Patents

Abstract

Ácido nucleico aislado que es o bien: (a) ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEC ID Nº: 2) o la complementaria del mismo, en donde dicha identidad de secuencia se determina respecto a la longitud completa de las secuencias que son comparadas y en donde la expresión del polipéptido de entre los siguientes tejidos humanos: Tejidos fetales (E12-E16 semanas): placenta, cordón umbilical, hígado, riñón, adrenales, tiroides, pulmones, corazón, vasos mayores, esófago, estómago, intestino delgado, bazo, timo, páncreas, cerebro, ojo, cordón espinal, paredes corporales, pelvis y extremidades inferiores; y Tejidos humanos: riñón (normal y en estado final), adrenal, miocardio, aorta, bazo, nódulo linfoide, páncreas, pulmón, piel, ojo (inc. retina), vejiga, hígado (normal, cirrótico y con fallo agudo); está limitada a endotelio vascular de bazo fetal, bazo adulto, hígado fetal y tiroides adultas y el desarrollo de ganglios espinales en un humano; o bien (b) ácido nucleico que comprende la secuencia codificante de longitud completa del inserto de ácido nucleico (ADN 33221-1133) contenido en el número de acceso ATCC 209263.

Description

Polipéptidos y ácidos nucleicos que codifican los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de modo general a la identificación y aislamiento de ADN novedoso y a la producción recombinante de polipéptidos novedosos codificados por ese ADN.

Antecedentes de la invención

Las proteínas extracelulares y transmembrana juegan importantes papeles en la información, diferenciación y mantenimiento de los organismos pluricelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, proliferación, migración, diferenciación o interacción con otras células, normalmente está dirigido por la información recibida desde otras células y/o en el entorno inmediato. Esta información a menudo la transmiten polipéptidos de secreción (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos u hormonas) que son, a su vez, recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o proteínas transmembrana. Estos polipéptidos de secreción o moléculas de señalización pasan a través de la ruta de secreción celular para alcanzar su lugar de acción en el entorno extracelular, normalmente en una proteína receptora transmembrana.

Las proteínas de secreción tienen varias aplicaciones industriales, incluyendo su uso como productos farmacéuticos, de diagnóstico, biosensores y bioreactores. De hecho, la mayoría de fármacos proteicos disponibles en el presente, como agentes trombolíticos, interferones, interleucinas, eritropoyetinas, factores de estimulación de colonias y otras varias citoquininas, son proteínas de secreción. Sus receptores, que son proteínas transmembrana, tienen además un potencial como agentes terapéuticos o de diagnóstico. Los receptores inmunoadhesinas, por ejemplo, se pueden emplear como agentes terapéuticos para bloquear la interacción receptor/ligando. Las proteínas transmembrana se pueden también emplear para la selección de péptidos potenciales o pequeñas moléculas inhibidoras de la interacción receptor/ligando pertinente. Tales proteínas transmembrana y receptores celulares, incluyen, pero no se limitan a, citoquininas, receptores, receptor quinasas, receptor fosfatasas, receptores implicados en las interacciones célula-célula y moléculas de adhesión celular como selectinas e integrinas. La transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación celular está regulada en parte por la fosforilación de varias proteínas celulares. Las proteína tirosina quinasas, enzimas que catalizan ese proceso, pueden actuar además como receptores de factores de crecimiento. Algunos Ejemplos incluyen el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y el receptor del factor de crecimiento nervioso.

Se están realizando esfuerzos tanto a nivel industrial como académico para identificar proteínas de secreción receptoras transmembrana nativas, nuevas. Muchos de los esfuerzos se están centrando en la selección de genotecas de ADN recombinante de mamíferos para identificar las secuencias codificadoras de proteínas de secreción y transmembrana novedosas. Algunos Ejemplos de procedimientos y técnicas de selección están descritos en la bibliografía [ver por ejemplo, Klein y col., Proc. Nati. Acad. Sci., 93: 7108-7113 (1996)]; Patente de EE.UU. Nº 5.536.637].

En la presente memoria descriptiva nosotros describimos la identificación y caracterización de polipéptidos de secreción y transmembrana novedosos y ácidos nucleicos novedosos que codifican esos polipéptidos.

PRO224

La ingesta de colesterol puede tener serias implicaciones en la salud. La ingesta de colesterol proporciona células con más colesterol del que requieren para la síntesis de membrana. Si se bloquea la ingesta, el colesterol se acumula en la sangre y puede contribuir a la formación de placas de ateroesclerosis en las paredes de los vasos sanguíneos. La mayoría del colesterol se transporta en sangre unido a una proteína en forma de complejos conocidos como lipoproteínas de baja densidad (LDL). Las LDL se endocitan dentro de las células mediante proteínas receptoras de LDL. Por lo tanto, las proteínas receptoras de LDL y las proteínas que tengan la homología, son de interés para las comunidades científica y médica. Las proteínas unidas a membrana y los receptores pueden jugar un papel importante en la formación, diferenciación y mantenimiento de organismos multicelulares. Los receptores de LDL son un ejemplo de proteínas unidas a membrana que están implicadas en la síntesis y formación de las membranas celulares en donde la salud de un individuo se encuentra afectada de manera directa e indirecta por su función. Muchas proteínas unidas a membrana actúan como receptores, tales como el receptor de LDL. Estos receptores pueden funcionar para endocitar sustratos o pueden funcionar como receptor de un canal. Otras proteínas unidas a membrana funcionan como señales o antígenos.

Las proteínas unidas a membrana y las moléculas receptoras tienen diversas aplicaciones industriales, que incluyen como agentes farmacéuticos y de diagnóstico. Las proteínas unidas a membrana también se pueden utilizar para el cribaje de un péptido potencial o de reguladores de pequeñas moléculas de la interacción relevante receptor/ligando. En el caso del receptor de LDL, es deseable encontrar moléculas con una endocitosis intensificada con el fin de disminuir los niveles de colesterol en sangre y la formación de placas. También es deseable identificar moléculas que inhiban la endocitosis de manera que puedan ser evitadas o reguladas estas moléculas por individuos que tengan colesterol alto en sangre. Los polipéptidos que son homólogos a receptores de liopoproteína pero que no funcionan como receptores de lipoproteína son también de interés en la determinación de la función de los fragmentos que muestran homología.

Los siguientes estudios realizados sobre receptores de lipoproteínas de baja densidad conocidas y proteínas relacionadas que incluyen apolipoproteínas: Sawamura et al., Nipón Chemiphar Co, Solicitud de patente japonesa J09098787; Novak, S., et al., J. Biol. Chem., 271:(20)11372-6 (1996); Blaas, D., J. Virol., 69(11)7244-7 (Nov. 1995); Scott, J., J. Inherit. Metab. Dis. (UK), 9/Supp. 1(3-16) (1986); Yamamoto, et al., Cell, 39:27-38 (1984); Rebece, et al., Neurobiol. Aging, 15:5117 (1994); Novak, S., et al, J. Biol. Chemistry, 271:11732-11736 (1996); y Sestavel y Fruchart, Cell Mol. Biol., 40(4):461-81 (Junio 1994). Estas publicaciones y otras publicadas antes de la presentación de esta solicitud proporcionan más antecedentes de péptidos ya conocidos en la técnica.

Se están realizando esfuerzos tanto en la industria como en el académico para identificar nuevas proteínas receptoras nativas unidas a membrana, en particular aquellas que tengan homología con receptores de lipoproteínas. Nosotros describimos en el presente documento la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos que tienen homología con los receptores de lipoproteínas, designadas en el presente documento como polipéptidos PRO 224.

Descripción resumida de la invención PRO224

Los solicitantes han identificado un clon de cDNA que codifica un polipéptido nuevo, en donde el polipéptido se designa en la presente invención como "PRO224".

En una realización, la invención propociona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un ADN codificante de un polipéptido PRO224 según se define en las reivindicaciones. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende ADN codificante del polipéptido PRO224 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 282 de la Figura 2 (SEC ID Nº: 2) o es complementaria a dicha secuencia codificante de ácido nucleico y permanece estable unida a esta bajo condiciones al menos moderadas y, opcionalmente, bajo condiciones de astringencia elevadas.

En otra realización, la invención proporciona un polipéptido PRO224 aislado según se define en las reivindicaciones. En particular, la invención proporciona el polipéptido PRO224 se secuencia nativa aislada, el cual en una realización, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 1 a 282 de la Figura 2 (SEC ID Nº: 2).

Realizaciones adicionales

En otras realizaciones de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden el ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente o a continuación. También se proporciona una célula hospedadora que comprende cualquiera de tales vectores. A modo de ejemplo, las células hospedadoras puedes ser células CHO, E. coli o levaduras. Se proporciona además un procedimiento para producir cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente o a continuación, y comprenden el cultivo de las células hospedadoras en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y la recuperación del polipéptido deseado a partir del cultivo celular.

En otras realizaciones, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente o a continuación fusionados a un polipéptido o secuencia aminoacídica heteróloga. Un ejemplo de tal molécula quimérica comprende cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente o a continuación fusionado a un secuencia etiqueta epítopo o una región Fc de una inmunoglobulina.

En otras realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo como se define en las reivindicaciones. Opcionalmente, el anticuerpo en un anticuerpo monoclonal.

En aún otras realizaciones, la invención proporciona sondas oligonucleotídicas útiles para aislar secuencias nucleotídicas de ADNc y genómicas, en las que estas sondas pueden derivar de cualquiera de las secuencias nucleotídicas descritas anteriormente o a continuación.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 1) de un cDNA de PRO224 de secuencia nativa, en donde la SEC ID Nº: 1 es un clon designado en el presente documento como "UNQ198" y/o "DNA33221-1133".

La Figura 2 muestra la secuencia aminoacídica (ID de SEC. Nº 2) derivada de la secuencia codificadora de la ID de SEC. Nº 1 mostrada en la Figura 1.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas 1. Definiciones

Los términos "polipéptido PRO" y "PRO" se usan en la presente memoria descriptiva y cuando están inmediatamente seguidos de una denominación numérica se refiere a varios polipéptidos, en el que la denominación completa (es decir, PRO/número) se refiere a secuencias polipeptídicas específicas como se describe en la presente memoria descriptiva. Los términos "polipéptido PRO/número" y "PRO/número" como se usan en la presente memoria descriptiva engloban polipéptidos de secuencia nativa y variantes polipeptídicas (que se definen con más detalle en la presente memoria descriptiva). Los polipéptidos PRO descritos en la presente memoria descriptiva se pueden aislar de varias fuentes, como a partir de tipos de tejidos humanos o de otra fuente, o preparados con procedimientos sintéticos recombinantes.

Un "polipéptido PRO de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia aminoacídica que el polipéptido PRO correspondiente natural. Tales polipéptidos PRO de secuencia nativa se pueden aislar a partir de la naturaleza o se pueden producir por medios sintéticos recombinantes. El término "polipéptido PRO de secuencia nativa" engloba específicamente formas truncadas naturales o de secreción del polipéptido PRO específico (por ejemplo, formas de ayuste alternativas) y variantes alélicas naturales del polipéptido. En una realización de la invención, la secuencia nativa del polipéptido PRO224 es un polipéptido PRO224 con la secuencia madura o nativa de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 282 de la Figura 2 (SEC ID Nº: 2).

"Variante del polipéptido PRO" quiere decir un polipéptido PRO activo como se define anteriormente o a continuación que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia del polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa como se describe en la presente memoria descriptiva. Tales variantes del polipéptido PRO incluyen, por ejemplo, polipéptidos PRO en los que se añaden, o eliminan uno o más residuos aminoacídicos, en el extremo amino (N) o carboxilo (C) terminal de la secuencia aminoacídica nativa de longitud completa. Habitualmente, una variante de polipéptido PRO tendrá al menos aproximadamente un 80% por ciento de identidad de secuencia aminoacídica, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia aminoacídica e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia aminoacídica de la secuencia aminoacídica nativa de longitud completa como se describe en la presente memoria descriptiva.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia aminoacídica" respecto a las secuencias polipeptídicas PRO identificadas en la presente memoria descriptiva se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos de la secuencia polipeptídica PRO específica, después de alinear las secuencias e introducir espacios de disparidad, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para propósitos de determinación del porcentaje de identidad de secuencia aminoacídica se puede lograr de varios modos accesibles para los expertos en la materia, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles públicamente como los programas BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El programa de alineamiento preferido es BLAST. Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para la medida del alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo que se necesite para lograr un alineamiento máximo en toda la longitud de las secuencias que se están comparando.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia nucleotídica" respecto a las secuencias nucleotídicas que codifican los PRO identificadas en la presente memoria descriptiva se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos de la secuencia aminoacídica PRO de interés, después de alinear las secuencias e introducir espacios de disparidad, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para propósitos de determinación del porcentaje de identidad de secuencia nucleotídica se puede lograr de varios modos accesibles a los expertos en la materia, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles públicamente como los programas BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El programa de alineamiento preferido es BLAST. Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para la medida del alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo que se necesite para lograr un alineamiento máximo en toda la longitud de las secuencias que se están comparando.

"Aislado", cuando se usa para describir los varios polipéptidos descritos en la presente memoria descriptiva, quiere decir que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que típicamente puede interferir con el diagnóstico o usos terapéuticos del polipéptido, y que pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En las realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia aminoacídica N-terminal o interna usando un secuenciador spinning cup (de taza giratoria), o (2) para homogenizar con SDS-PAGE (gel de poliacrilamida con SDS) en condiciones no reductoras o reductoras usando Azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El polipéptido aislado incluye polipéptido in situ en las células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del polipéptido PRO no estará presente. Habitualmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará al menos con una etapa de purificación.

Un ácido nucleico polipeptídico PRO "aislado" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula nucleotídica contaminante con la que está normalmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico polipeptídico PRO. Una molécula de ácido nucleico polipeptídico PRO aislado es distinta de la forma o entorno en el que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico polipeptídico PRO aislado se distinguen, por lo tanto, de la molécula de ácido nucleico polipeptídico PRO específica que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico polipeptídico PRO aislado incluye moléculas de ácido nucleico polipeptídico PRO contenidas en células que normalmente expresan el polipéptido PRO donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.

El "análisis Southern" o "transferencia Southern" es un procedimiento por el que se confirma la presencia de secuencias de ADN en una digestión con endonucleasas de restricción de ADN o una composición que contiene ADN mediante la hibridación con un oligonucleótido o un fragmento de ADN etiquetado conocido. Los análisis Southern típicamente implican una separación electroforética de las digestiones de ADN en geles de agarosa, la desnaturalización del ADN tras la separación electroforética, y la transferencia del ADN a una membrana soporte de nitrocelulosa, nailon o de otro material adecuado para analizarla con una sonda etiquetada con un enzima, biotinizada o etiquetada radiactivamente como se describe en las secciones 9.37-9.52 de Sambrook y col., "Molecular cloning: A Laboratory Manual" (Clonación molecular: Manual de laboratorio) (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

El "análisis Northern" o "transferencia Northern" es un procedimiento usado para identificar secuencias de ARN que hibridan con una sonda conocida como un oligonucleótido, un fragmento de ADN, ADNc o sus fragmentos, o un fragmento de ARN. La sonda está etiquetada con un isótopo radiactivo como P^{32}, o por biotinización, o con un enzima. El ARN que se va a analizar normalmente se separa electroforéticamente en un gel de agarosa o poliacrilamida, se transfiere a una membrana de nitrocelulosa, nailon o de otro material adecuado y se hibrida con una sonda, usando técnicas habituales muy conocidas como las que se describen en las secciones 7.39-7.52 de Sambrook y col., supra.

El término "secuencias control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora unidas operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias control adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia nucleotídica. Por ejemplo, ADN para una presecuencia o una secuencia guía de secreción se une operativamente al ADN que codifica un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador se une operativamente a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas se une operativamente a una secuencia codificadora si se sitúa de modo que facilite la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se están uniendo son contiguas, y en el caso de las secuencias guías de secreción, contiguas y en pauta de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se realiza mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan adaptadores oligonucleotídicos sintéticos o ADN de enlace según la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales anti-polipéptido PRO únicos (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes) y composiciones de anticuerpos anti-polipéptido PRO con especifidad poliepitópica. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por posibles mutaciones naturales que puedan estar en cantidades minoritarias.

"Activo" o "actividad" para los propósitos de la presente memoria descriptiva se refieren a formas del polipéptido PRO que mantienen las actividades biológicas y/o inmunológicas del polipéptido nativo específico o natural.

"Tratamiento" o "el tratamiento" se refiere tanto al tratamiento médico como a las medidas preventivas o profilácticas. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen a los que ya tienen el trastorno, como a los propensos a tenerlo, en los que hay que prevenir el desorden.

"Mamífero" para los propósitos del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo a los humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoo, de deportes o de compañía, como ovejas, perros, caballos, gatos, vacas y similares. Preferiblemente, el mamífero de la presente memoria descriptiva en un humano.

"Vehículos" como se usa en la presente memoria descriptiva incluyen vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes, o estabilizantes que no sean tóxicos para la célula o mamífero expuesto a las dosis y concentraciones empleadas. A menudo el vehículo fisiológicamente aceptable, es una solución acuosa tamponada. Algunos Ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen tampones como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como seroalbúmina, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilo como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparragina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextranos; agentes quelantes como EDTA; polioles como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal como sodio; y/o tensioactivos no iónicos como TWEEN^{TM}, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS^{TM}.

El término "agonista" se usa para hacer referencia a análogos peptídicos y no peptídicos de los polipéptidos PRO nativos (donde polipéptido PRO nativo se refiere a propolipéptido PRO, prepolipéptido PRO, prepropolipéptido PRO o polipéptido PRO maduro) de la presente invención y a anticuerpos que se unen específicamente a tales polipéptidos PRO nativos, con la condición de que mantengan al menos una actividad biológica del polipéptido PRO maduro. Preferiblemente, los agonistas de la presente invención mantienen las propiedades de reconocimiento de unión cualitativas y las propiedades de activación del receptor del polipéptido PRO maduro.

El término "antagonista" se usa para hacer referencia a una molécula que inhibe una actividad biológica del polipéptido PRO maduro de la presente invención en la que polipéptido PRO maduro se refiere a propolipéptido PRO, prepolipéptido PRO, prepropolipéptido PRO o polipéptido PRO maduro. Preferiblemente, los antagonistas en la presente memoria descriptiva inhiben la unión de un polipéptido PRO maduro de la presente invención.

Un polipéptido PRO "antagonista" es una molécula que evita o interfiere con una función efectora antagonista PRO (por ejemplo, una molécula que evita o interfiere con la unión y/o la activación de un receptor del polipéptido PRO por un polipéptido PRO). Tales moléculas se pueden seleccionar por su capacidad de inhibir completamente la activación del receptor del polipéptido PRO controlando la unión de un polipéptido PRO en presencia y ausencia de la molécula antagonista de prueba, por ejemplo.

Un antagonista de la invención además engloba un polinucleótido antisentido contra el gen del polipéptido PRO, tal polinucleótido antisentido bloquea la transcripción o traducción del gen del polipéptido PRO, inhibiendo por lo tanto su expresión y actividad biológica.

"Condiciones restrictivas" quiere decir (1) el empleo de soluciones de baja concentración iónica y alta temperatura para los lavados, por ejemplo, cloruro de sodio 0,015 M; citrato de sodio 0,0015 M; 0,1% de dodecilsulfato de sodio a 50ºC, o (2) el empleo durante la hibridación de un agente desnaturalizante, como formamida, por ejemplo, 50% de formamida (v/v) con 0,1% de seroalbúmina bovina; 0,1% de Ficol; 1% de polivinilpirrolidona; tampón de pirofosfato de sodio 50 nM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42ºC. Otro ejemplo es usar 50% de formamida, SSC 5X (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH6/8), 0,1% de pirofosfato de sodio, solución de Denhardt 5X, ADN de esperma de salmón sometido a sonicación (50 \mug/ml), 0,1% de SDS y 10% de sulfato de dextrano a 42ºC, con lavados a 42ºC en SSC 0,2X y 0,1% de SDS. Aún otro ejemplo es la hibridación usando un tampón con 10% de sulfato de dextrano, SSC 2X (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% de formamida a 55ºC, seguido de un lavado altamente restrictivo constituido por SSC 0,1X que contenga EDTA a 55ºC.

Las "condiciones moderadamente restrictivas" se describen en Sambrook y col., supra e incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, concentración iónica y % de SDS) menos restrictivas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente restrictivas es una condición como la incubación durante toda la noche a 37ºC en una solución que comprenda: 20% de formamida, SSC 5X (NaCl 0,75 M, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5X, 10% de sulfato de dextrano, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, seguida con un lavado del filtro en SSC 1X a 37-50ºC. Los expertos en la materia sabrán cómo ajustar la temperatura, concentración iónica, etc., como sea necesario para acomodar factores tales como longitud de la sonda y similares.

II. Composiciones y procedimientos de la invención Polipéptidos PRO224 de longitud completa

La presente invención proporciona nuevas secuencias nucleotídicas identificadas y aisladas que codifican polipéptidos a los que en la presente solicitud nos referimos como PRO224. En particular, los solicitantes han identificado y aislado un ADNc que codifica un polipéptido PRO224, como se describe con más detalle en los Ejemplos de más abajo. Usando programas conocidos tales como los programas de alineación de nucleótidos por ordenador BLAST y FastA, los Solicitantes descubrieron que la PRO224 nativa de longitud completa (Figura 2, SEC ID Nº: 2) tiene una identidad de aminoácidos con el receptor 2906 de la apolipoproteína E procedente de homo sapiens. Las alineaciones de las diferentes porciones de estos dos polipéptidos muestran identidades de aminoácidos del 37%, 36%, 30%, 44%, 44% y 28% respectivamente. La PRO224 nativa de longitud completa (Figura 2, SEC ID Nº: 2) tiene también una identidad de secuencia con el precursor del receptor de lipoproteína de muy baja densidad procedente de bilis. Las alineaciones de las diferentes porciones de estos dos polipéptidos muestran identidades de aminoácidos del 38%, 37%, 42%, 33% y 37% respectivamente. Adicionalmente, la PRO224 nativa de longitud completa (Figura 2, SEC ID Nº: 2) tiene una identidad de aminoácidos con el receptor de oocito de pollo P95 1procedente de Gallus gallus. Las alineaciones de las diferentes proporciones de estos dos polipéptidos muestran identidades aminoacídicas del 38%, 37%, 42%, 33% y 37%, respectivamente. Además, la PRO224 nativa de longitud completa (Figura 2, SEC ID Nº: 2) tiene una identidad aminoacídica con la forma corta del precursor del receptor de lipoproteína de baja densidad procedente de humanos. Las alineaciones de las diferentes porciones de estos dos polipéptidos muestran identidades aminoacídicas del 32%, 38%, 34%, 45% y 31%, respectivamente. De acuerdo con esto, se cree actualmente que el polipéptido PRO224 descrito en la presente solicitud es un nuevo miembro identificado de la familia de receptores de lipoproteínas de baja densidad y posee las características estructurales requeridas para tener la capacidad funcional de reconocer y endocitar lipoproteínas de baja densidad típicas de la familia de receptores de lipoproteínas de baja densidad. (Las alineaciones descritas más arriba utilizaron los siguientes parámetros de puntuación: T = 7, S + 65, S2 =
36, Matriz: BLOSUM62).

Variantes del polipéptido PRO

Además de los polipéptidos PRO de secuencia nativa de longitud completa descritos en la presente memoria descriptiva, se contempla que se puedan preparar variantes del polipéptido PRO. Se pueden preparar variantes del polipéptido PRO introduciendo los cambios nucleotídicos apropiados en el ADN del polipéptido PRO, o sintetizando el polipéptido PRO deseado. Los expertos en la materia apreciarán que los cambios aminoacídicos pueden alterar los procesos postraduccionales de los polipéptidos PRO, como cambios del número o posición de sitios de glicosilación o alteraciones las características de anclaje a la membrana.

Las variaciones de los polipéptidos PRO de secuencia nativa de longitud completa o en varios dominios de los polipéptidos PRO, descritos en la presente memoria descriptiva, se pueden realizar, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y orientaciones para mutaciones conservativas y no conservativas expuestas, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 5.364.934. Las variaciones pueden ser sustitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican el polipéptido PRO que tengan como resultado el cambio de la secuencia aminoacídica del polipéptido PRO en comparación con el polipéptido PRO de secuencia nativa. Opcionalmente la variación es por la sustitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más dominios del polipéptido PRO. La orientación para determinar que aminoácido se puede introducir, sustituir o delecionar sin afectar adversamente la actividad deseada se puede encontrar comparando la secuencia del polipéptido PRO con la de moléculas proteicas conocidas homólogas y minimizando el número de cambios en la secuencia aminoacídica hechos en regiones de alta homología. Las sustituciones aminoacídicas pueden resultar de remplazar un aminoácido con otro que tenga características estructurales y químicas similares, como el reemplazo de una leucina con una serina, es decir, reemplazos aminoacídicos conservativos. Las inserciones y deleciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se pude determinar realizando inserciones, deleciones o sustituciones sistemáticas de aminoácidos en la secuencia y probando la actividad de las variantes resultantes en el ensayo in vitro descritos en los siguientes Ejemplos.

Las variaciones se pueden realizar usando procedimientos conocidos en la técnica como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida), sustitución sistemática de alaninas y mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida [Carter y col., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller y col., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)], mutagénesis con caete [Wells y col., Gene, 34: 315 (1985)], mutagénesis por selección de restricción [Wells y col., Philos. Trans R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)] u otras técnicas conocidas se pueden realizar sobre el ADN clonado para producir el ADN variante del polipéptido PRO.

El análisis de aminoácidos de sustitución sistemática se puede también emplear para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de sustitución sistemática preferidos están los aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de sustitución sistemática preferido entre este grupo ya que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina se prefiere además típicamente porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones protegidas y expuestas [Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman y Cía., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede usar un aminoácido isostérico.

Modificaciones de polipéptidos PRO

Las modificaciones covalentes de los polipéptidos PRO están incluidas en el alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar los residuos aminoacídicos diana del polipéptido PRO con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos N-terminal o C-terminal del polipéptido PRO. La Es útil la derivatización con agentes bifuncionales, por ejemplo para reticular (crosslinking) un polipéptido PRO a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para usar en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-polipéptido PRO, y viceversa. Los agentes de reticulación comúnmente utilizados incluyen por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano; glutaraldehído; ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-acidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo como 3,3'-ditiobis(succinidimilpropionato), maleimidas bifuncionales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes como metil-3-[(p-acidofenil)ditio]propioimidato.

Otras modificaciones incluyen la desaminación de residuos glutaminilo y asparraginilo hasta los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T. E. Creighton, "Proteins: Structure and Molecular Properties" (Proteínas: Estructura y Propiedades Moleculares) Freeman y Cía., San Francisco, págs 79-86 (1983)].

Otro tipo de modificación covalente de los polipéptidos PRO incluidos en el alcance de esta invención comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del polipéptido. "La alteración del patrón de glicosilación nativo" está diseñada para los propósitos de la presente memoria descriptiva para significar eliminar uno o más residuos glucídicos encontrados en la secuencia nativa del polipéptido PRO, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no estén presentes en el polipéptido PRO de secuencia nativa.

La adición de sitios de glicosilación al polipéptido PRO se puede lograr alterando la secuencia aminoacídica. La alteración se puede realizar, por ejemplo, añadiendo o sustituyendo uno o más residuos de serinas o treoninas al polipéptido PRO de secuencia nativa (para sitios de enlace O-glucosídico). La secuencia aminoacídica del polipéptido PRO se puede alterar opcionalmente a través de cambios a nivel del ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido PRO en bases preseleccionadas ya que esos codones generados se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otros medios de aumentar el número de residuos glucosídicos en el polipéptido PRO es por unión química o enzimática de glucósidos al polipéptido. Tales procedimientos se describen en la técnica, por ejemplo, en el documento WO87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., págs 259-306 (1981).

La eliminación de residuos glucosídicos presentes en el polipéptido PRO se puede conseguir químicamente o enzimáticamente o por sustitución mutacional de codones que codifiquen residuos aminoacídicos que sirvan de diana de glicosilación. Las técnicas de desgliosilación química se conocen en la técnica y se describen por ejemplo, en Hakimuddin y col., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) y en Edge y col., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). El corte enzimático de los residuos glucídicos de polipéptidos se puede lograr usando una variedad de endoglicosidasas y exoglicosidasas como se describe en Thotakura y col., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente de los polipéptidos PRO de la invención comprende la unión del polipéptido PRO a una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, en la manera expuesta en las Patentes de EE.UU. Nº 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192, o 4.179.337.

Los polipéptidos PRO de la presente invención se pueden modificar además de modo que formen una molécula quimérica que comprenda un polipéptido PRO fusionado a otra secuencia polipeptídica o aminoacídica heteróloga. En una realización, tal molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido PRO con un polipéptido etiqueta que proporciona un epítopo al que un anticuerpo antietiqueta se puede unir selectivamente. La etiqueta epítopo se coloca generalmente en los extremos amino terminal o carboxilo terminal del polipéptido PRO. La presencia de tales formas etiquetadas con epítopo posibilita que el polipéptido PRO sea fácilmente purificado mediante purificación por afinidad usando un anticuerpo antietiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se una a la etiqueta epítopo. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido PRO con una inmunoglobina o una región particular de una inmunoglobina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica, tal fusión puede ser con la región Fc de una molécula de IgG.

Varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos son muy conocidos en la técnica. Algunos Ejemplos incluyen polihistinida (poli-His) o polihistidinglicina (Poli-His-Gly); el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field y col., Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; la etiqueta Myc-c y sus anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 [Evan y col., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)].; y la etiqueta glicoproteína D del virus Herpes Simple (gD) y su anticuerpo [Paborsky y col., Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)] Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido Flag [Hopp y col., Biotechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; el péptido epítopo KT3 [Martin y col., Science, 225: 192-194 (1992)]; un péptido epítopo de \alpha-tubulina [Skinner y col., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)] y la etiqueta peptídica del la proteína de gen 1o del T7 [Lutz-Freyermuth y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 87: 6393-6397 (1990)].

Preparación de polipéptidos PRO

La siguiente descripción describe principalmente la producción de polipéptidos PRO cultivando células transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico del polipéptido PRO deseado. Se contempla, por supuesto, que se puedan emplear procedimientos alternativos, muy conocidos en la técnica, para preparar el polipéptido PRO. Por ejemplo, la secuencia del polipéptido PRO, o sus porciones, se pueden producir por síntesis peptídica directa usando técnicas en fase sólida [ver por ejemplo, Stewart y col., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman y Cía., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in vitro se puede realizar usando técnicas manuales o automáticas. La síntesis automática se puede lograr, por ejemplo, usando un sintetizador peptídico de Applied Biosystems (Foster City, CA) usando las instrucciones del fabricante. Varias porciones del polipéptido PRO deseado e pueden sintetizar químicamente por separado y combinar usando procedimientos químicos o enzimáticos para producir el polipéptido PRO de longitud completa.

A. Aislamiento de ADN que codifica polipéptidos PRO

El ADN que codifica los polipéptidos PRO se puede obtener de una genoteca de ADNc preparada a partir de un tejido que se crea que posee el ARNm del polipéptido PRO deseado a un nivel detectable. Por consiguiente, el ADN del polipéptido PRO humano se puede obtener convenientemente de una genoteca de ADNc preparada a partir de un tejido humano, como se describe en los Ejemplos. El gen que codifica el polipéptido PRO se puede obtener además a partir de genotecas genómicas o por síntesis de oligonucleótidos.

Las genotecas se pueden investigar con sondas (como los anticuerpos frente al polipéptido PRO deseado u oligonucleótidos de la menos aproximadamente 20-80 pares de bases) diseñados para identificar el gen de interés o la proteína que codifica. La investigación de la genoteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada se puede llevar a cabo usando procedimientos habituales, como se describe en Sambrook y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Clonación molecular: Manual de laboratorio) (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el polipéptido PRO deseado es usar la metodología de la PCR [Sambrook y col., supra; Dieffenbach y col., "PCR Primer: A Laboratory Manual" (Cebador de PCR: Manual de laboratorio; New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Los siguientes Ejemplos describen técnicas para investigar una genoteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben tener suficiente longitud y ser lo suficientemente precisas para minimizar los falsos positivos. El oligonucleótido se etiqueta preferiblemente de modo que se pueda detectar un vez hibridado al ADN en la genoteca que se está investigando. Los procedimientos de etiquetado son muy conocidos en la técnica, e incluyen el uso de etiquetas radiactivas como ATP etiquetado con P^{32}, biotinización o etiquetado enzimático. Las condiciones de hibridación, incluyendo condiciones moderadamente restrictivas y muy restrictivas, se proporcionan en Sambrook y col., supra.

Las secuencias identificadas en tales procedimientos de investigación de librerías se pueden comparar y alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identificación de la secuencia (a nivel aminoacídico o nucleotídico) dentro de las regiones definidas de la molécula o por toda la longitud de la secuencia se puede determinar a través de un alineamiento de secuencias usando un programa informático como BLAST, ALIGN, DNAstar e INHERIT que emplea varios algoritmos para medir la homología.

El ácido nucleico que tiene la secuencia que codifica la proteína se puede obtener investigando la genoteca de ADNc o genómica usando la secuencia aminoacídica deducida descrita en la presente memoria descriptiva por primera vez y, si fuera necesario, usando procedimientos de extensión con cebador convencionales que se describen en Sambrook y col., supra, para detectar precursores e intermediarios de procesamiento del ARNm que puedan no haber sido retrotranscritos a ADNc.

B. Selección y transformación de células hospedadoras

Las células hospedadoras se transfectan o transforman con los vectores de expresión o de clonación descritos en la presente memoria descriptiva para la producción de polipéptido PRO y se cultivan en medios nutricionales convencionales modificados como sea apropiado para inducir a los promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Los expertos en la materia pueden seleccionar las condiciones de cultivo, como medios, temperatura, pH y similares, sin excesiva experiencia. En general, en "Mammalian Cell Biotechnology a Practical Approach" (Biotecnología con células de mamífero: Enfoque práctico), M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y en Sambrook y col., supra, se pueden encontrar los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares.

Los expertos habituales en la materia conocen muy bien los procedimientos de transfección, por ejemplo, CaPO_{4} y electroporación. Dependiendo de la célula hospedadora que se use, la transformación se realiza usando técnicas habituales apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio, que emplea cloruro de calcio, como se describe en Sambrook y col., supra, o la electroporación se usa generalmente para procariotas u otras células que contienen paredes celulares barrera considerables. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células vegetales, como se escribe en Shaw y col., Gene, 23: 315 (1983) y en el documento WO89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero sin tales paredes celulares, se puede emplear el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb., Virology, 53: 456-457 (1978). Se han descrito los aspectos generales de las transformaciones de sistemas de células hospedadoras de mamífero en la Patente de EE.UU. Nº 4.339.216. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo típicamente según el procedimiento de Van Solingen y col., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Nati. Acad. Sci. (EE.UU), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también se pueden emplear otros procedimientos para introducir ADN en las células, como por microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para varias técnicas de transformación de células de mamífero, ver Keown y col., Methods in Enzimology, 185: 527-537 (1990) y Mansour y col., Nature, 336: 348-352 (1988).

Las células hospedadoras adecuadas para clonar o expresar el ADN de los vectores en la presente memoria descriptiva incluyen procariotas, levaduras o células eucariotas superiores. Los procariotas adecuados incluyen pero no se limitan a eubacterias, como organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo Enterobacterias como E. coli. Varias cepas de E. coli son disponibles públicamente, como la cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.357); cepa de E. coli W3110 (ATCC 53.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Otras células hospedadoras procariotas adecuadas incluyen enterobacterias como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Kleibsella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhymurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescens, y Sighella, así como Bacilos como, B. subtillis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas como P. aureginosa, y Streptomyces. Varias cepas de E. coli son disponibles públicamente, como la cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.357); cepa de E. coli W3110 (ATCC 53.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Estos Ejemplos son ilustrativos más que limitantes. La cepa W3110 es una célula hospedadora o célula parenteral preferida particularmente porque es una cepa hospedadora común para fermentaciones con productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula hospedadora secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo la cepa W3110 se puede modificar para realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas de la hospedadora., con Ejemplos de tales hospedadoras que incluyen E. coli W3110 cepa 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; E. coli W3110 cepa 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3, E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT karl; E. coli W3110 cepa 37D6 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan^{r}; E. coli LW3110 cepa 40B4 que es la cepa 37D6 con una mutación por deleción degP sin resistencia a kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene una proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente de EE.UU. Nº 4.946.783 publicada el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados otros procedimientos in vitro de clonación, por ejemplo PCR u otras reacciones con polimerasa de ácido nucleico.

Además de los procariotas, los microorganismos eucariotas como hongos filamentosos o las levaduras son adecuados como hospedadores de clonación o expresión de vectores que codifican el polipéptido PRO. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo hospedador eucariota inferior usado comúnmente. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; (documento EP139.383 publicado el 2 de mayo de 1985); Hospedadores de Kluiveromyces (Patente de EE.UU. Nº 4.943.529; Fleer y col., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt y col., J. Bacteriol., 737 [1993]), K. fragilis (ATCC 12.244), K. bulgaricus (ATCC16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophylarum (ATCC 36.906; Van dern Berg y col., Bio/Technollogy, 8: 135 (1990)); K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (documento EP402.226) Pichia pastoris (documento EP183.070; Sreekrishna y col., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (documento EP244.234); Neurospora crassa (Case y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., 76: 5259-5263 [1979]; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis (documento EP394.538 publicado el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos como, por ejemplo Neurospora, Penicillium, Tolyplocadium (WO91/00357 publicada el 10 de enero de 1991), y hospedadores aspergillus como A. nidulans (Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]); Tiburn y col., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton y col., Proc. Nati. Acad. Sci EE.UU, 81: 1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly ye Hynes, EMBO J. 4: 475-479 [1985]. Las levaduras metilotróficas son adecuadas en la presente memoria descriptiva pero no se limitan a, una levadura capaz de crecer en metanol seleccionada entre los géneros constituidos por Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Se puede encontrar una lista de especies específicas que son Ejemplos de esta clase de levaduras en C. Anthony, "The Biochemistry of Methylotrophs" (Bioquímica de los Metilótrofos), 269 (1982).

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de polipéptidos PRO glicosilados se derivan de organismos pluricelulares. Algunos Ejemplos de células de invertebrado incluyen células de insecto como Drosophyla S2 y Spodoptera Sf9, así como células vegetales. Algunos Ejemplos de células hospedadoras de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y células COS. Ejemplos más específicos incluyen línea de riñón de mono CV1 transformada con el SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 ó 293 subclonadas para un crecimiento en cultivos en suspensión, Graham y col., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); células de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (YM4, Mather Biol Reprod., 23: 243-251 (1980)); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas (Hep G2, HB 8065); y células de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). Se supone que la selección de la célula hospedadora apropiada depende de la experiencia en la materia.

C. Selección y uso de vectores replicativos

El ácido nucleico (por ejemplo ADNc o ADN genómico) que codifica un polipéptido PRO deseado se puede introducir en un vector replicativo para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Hay varios vectores públicamente disponibles. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia nucleotídica apropiada se puede introducir en el vector mediante varios procedimientos. En general, el ADN se introduce en un(os) sitio(s) de una endonucleasa de restricción apropiado usando las técnicas conocidas en la materia. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, una o más secuencias señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligación habituales que los expertos en la materia conocen.

El polipéptido PRO de interés se puede producir de modo recombinante no sólo directamente, sino además como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte específico en el extremo N terminal de la proteína madura o del polipéptido. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN del polipéptido PRO que se introduce en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la secuencias guía de la fosfatasa alcalina, la penicilasa, la 1pp, o la enterotoxina termoestable II. Para la secreción en levaduras la secuencia señal, por ejemplo, la secuencia guía de la invertasa de levadura, la secuencia guía del factor alfa (incluyendo los factores \alpha de Saccharomyces y Kluiveromyces, descrito el último en la Patente de EE.UU. Nº 5.010.182), o la secuencia guía de la fosfatasa ácida, la secuencia guía de la glucoamilasa de C. albicans (documento EP362.179 publicado el 4 de abril de 1990), o la secuencia señal descrita en el documento WO90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamífero, se pueden usar secuencias señal para dirigir la secreción de la proteína, como secuencias señal de polipéptidos de secreción de la misma especie o relacionadas, así como secuencias guía de secreción virales.

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia nucleotídica que hace que el vector se pueda replicar en una o más células hospedadoras seleccionadas. Tales secuencias son muy conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gram negativas, el origen del plásmido de 2 \mum es adecuado para levaduras y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero.

Los vectores de expresión y clonación contendrán típicamente un gen de selección, también denominado marcador de selección. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan diferencias auxotróficas, o (c) proporcionan nutrientes críticos no disponibles en los medios complejos, por ejemplo el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilos.

Un ejemplo de marcadores de selección adecuados para células de mamífero son aquellos que posibilitan la identificación de las células competentes para llevar el ácido nucleico del polipéptido PRO, como DHFR o timidina quinasa. Una célula hospedadora apropiada cuando se emplea un DHFR silvestre es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada como se describe en Urlaub y col., Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU., 77: 4216 (1980). Un gen de selección adecuado para usar en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levaduras YRp7 [Stinchcomb y col., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7: 141 (1979; Tschemper y col., Genes, 10: 157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carezca de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo ATCC Nº 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)].

Los vectores de expresión y clonación contienen normalmente un promotor unido operativamente a la secuencia nucleotídica del polipéptido PRO para dirigir la síntesis del ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de células hospedadoras potenciales son muy conocidos. Los promotores adecuados para usar con hospedadores procariotas incluyen los sistemas promotores de la \beta-lactamasa y de la lactosa [Chang y col., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel y col., Nature, 281: 544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor triptófano (trp), [Goedel, Nucleic Acid Res., 8: 4057 (1980); documento EP36.776], y promotores híbridos como el promotor tac [deBoer y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., 80: 21-25 (1983)]. Los promotores para usar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el polipéptido PRO deseado.

Algunos Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para usar con células hospedadoras de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)], u otros enzimas glucolíticos [Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968)]; Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978), como la enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de tener controlada la transcripción mediante condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas de degradación asociadas al metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para el uso en expresión en levaduras se describen con más detalle en el documento EP73.657.

La transcripción del polipéptido PRO a partir de vectores en células hospedadoras de mamífero está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus como el virus del polioma o el virus de la viruela aviar (documento UK2.211.504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus a, virus de la hepatitis B y virus del simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de una inmunoglobulina, y promotores de choque térmico, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de la célula hospedadora.

La transcripción de un ADN que codifique el polipéptido PRO deseado en eucariotas superiores se puede incrementar introduciendo una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en cis, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Muchas secuencias potenciadoras se conocen muy bien actualmente para genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus celular eucariota. Algunos Ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el extremo tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma o en el extremo tardío del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El potenciador se puede cortar y desplazar a la posición 5' o 3' de la secuencia que codifica el polipéptido PRO, pero se localiza preferiblemente en el sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanas o células nucleadas de otro organismo pluricelulares) contendrán además secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias son comúnmente disponibles en el extremo 5' y, ocasionalmente del 3', regiones no traducidas de ADNs o ADNcs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica los polipéptidos PRO.

Aún otros procedimientos, vectores y células hospedadoras adecuadas para la adaptación para la síntesis de polipéptidos PRO en cultivos celulares de vertebrado recombinantes se describen en Gething y col., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei y col., Nature, 281: 40-46 (1979); documentos EP117.060 y EP117.058.

D. Detección de la amplificación/expresión del gen

La amplificación y/o expresión génica se puede medir directamente en una muestra, por ejemplo, con una transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., 77: 5201-5205 (1980)], transferencia en mancha (análisis de ADN), o hibridación in situ, usando una sonda etiquetada apropiadamente, en base a las secuencias proporcionadas en la presente memoria descriptiva. Alternativamente, se pueden usar anticuerpos que reconozcan dúplex específicos incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN o dúplex ADSN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden etiquetar y el ensayo se lleva a cabo cuando el dúplex está unido a la superficie, de modo que tras la formación del dúplex en la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpos unidos al dúplex.

La expresión génica, alternativamente, se puede medir mediante procedimientos inmunológicos, como tinciones inmunohistoquímicas de células cortes de tejidos y análisis de cultivos celulares o fluidos sanguíneos, para cuantificar directamente la expresión del producto del gen. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o análisis de muestras de fluidos pueden ser monoclonales o policlonales y se pueden preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se pueden preparar contra un polipéptido PRO de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en la presente memoria descriptiva o contra secuencias exógenas fusionadas al ADN de un polipéptido PRO y que codifican un epítopo para un anticuerpo específico.

E. Purificación del polipéptido

Las formas de polipéptidos PRO se pueden recuperar del medio de cultivo o de los lisados de las células hospedadoras. Si están unidos a la membrana, se pueden liberar de la membrana usando una solución detergente adecuada (por ejemplo Triton-X 100) o por corte enzimático. Las células empleadas en la expresión de los polipéptidos PRO se pueden romper por varios procedimientos físicos o químicos, como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica, o agentes de lisis celular.

Puede desearse purificar los polipéptidos PRO a partir de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes. Los siguientes procedimientos son Ejemplos de procedimientos de purificación adecuados. Por fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en una resina de sílice o de intercambio catiónico como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE (gel de poliacrilamida con SDS); precipitación con sulfato de amonio; usando filtración por gel, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de Proteína A-Sepharose para eliminar los contaminantes como IgG; y columnas de quelantes metálicos para unir las formas etiquetadas con epítopos del polipéptido PRO. Se pueden varios procedimientos de purificación de proteínas como procedimientos muy conocidos en la técnica y descritos por ejemplo en Deutscher, "Methods in Enzimology" (Procedimientos en enzimología), 182 (1990); Alcances, "Protein Purification: Principles and Practice" (Purificación de proteínas: Principios y práctica), Springer-Verlag, New York (1982). Las etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y el polipéptido PRO particular producido.

Usos para los polipéptidos PRO

Las secuencias nucleotídicas (o sus complementarias) que codifican los polipéptidos PRO de la presente invención, tienen varias aplicaciones en la técnica de la biología molecular, incluyendo uso en sondas de hibridación, en mapeo cromosómico y génico y en la generación de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO será además útil para la preparación de polipéptidos PRO mediante las técnicas recombinantes descritas en la presente memoria descriptiva.

El ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa o sus porciones, se pueden usar como sondas de hibridación para genotecas de ADNc para aislar el gel del polipéptido PRO de longitud completa o para aislar aún otros genes (por ejemplo, los que codifican variantes naturales del polipéptido PRO o de los polipéptidos PRO de otras especies) que tengan una identidad de secuencia deseada con las secuencias nucleotídicas del polipéptido PRO. Opcionalmente, la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a 50 bases. Las sondas de hibridación se pueden derivar de secuencias nucleotídicas de cualquiera de las moléculas de ADN descritas en la presente memoria descriptiva o de secuencias genómicas incluyendo promotores, elementos potenciadores e intrones del ADN que codifica el polipéptido PRO de secuencia nativa. A modo de ejemplo, un procedimiento de selección comprenderá el aislamiento de la región codificadora del gen del polipéptido PRO usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación se pueden etiquetar con una variedad de etiquetas, incluyendo radionucleótidos como P^{32} o S^{35}, o etiquetas enzimáticas como la fosfatasa alcalina unida a la sonda vía sistemas de unión avidina/biotina. Se pueden usar sondas etiquetadas que tengan una secuencia complementaria a la del gen del polipéptido PRO específico de la presente invención para investigar genotecas de ADNc, ADN genómico o ARNm humanas para identificar con que miembros de tales genotecas hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen con más detalle en os siguientes Ejemplos.

Las TSE descritas en la presente solicitud se pueden emplear de modo similar como sondas, usando los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva.

Las sondas se pueden emplear en técnicas de PCR para generar un grupo de secuencias para identificar secuencias de polipéptido PRO estrechamente relacionadas.

Las secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido PRO se pueden usar además para construir sondas de hibridación para el mapeo del gen que codifica es polipéptido PRO y para el análisis genético de individuos con alteraciones genéticas. Las secuencias nucleotídicas proporcionadas en la presente memoria descriptiva se pueden usar para el mapeo de un cromosoma y regiones específicas del cromosoma usando técnicas conocidas como la hibridación in situ, análisis de unión frente marcadores cromosómicos conocidos e investigación de genotecas por hibridación.

Los polipéptidos PRO se pueden usar en análisis para identificar sus ligandos. De modo similar, se pueden identificar los inhibidores de la interacción de unión receptor/ligando. Las proteínas implicadas en tal interacción de unión se pueden usar además para investigar péptidos o pequeñas moléculas inhibidoras o agonistas de la interacción de unión. Los análisis de investigación se pueden diseñar para encontrar compuestos guía que mimeticen la actividad biológica del polipéptido PRO nativo o un ligando para el polipéptido PRO. Tales análisis de investigación incluirán análisis preparadas para investigaciones de alto rendimiento de genotecas químicas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar candidatos farmacológicos de molecularmente pequeños. Las moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los análisis se pueden realizar de varias formas, incluyendo análisis de unión proteína-proteína, análisis de investigación bioquímica, inmunoanálisis y análisis celulares, caracterizados en la técnica.

Los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido PRO o sus formas modificadas se pueden usar además para generar animales transgénicos o animales "knock out" (sin un determinado gen) que a su vez, son útiles en el desarrollo e investigación terapéutica de reactivos útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que tiene células que contienen un transgen, dicho transgen fue introducido en el animal o un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, en una etapa embrionaria. Un transgen es un ADN que se integra en el genoma de una célula a partir de la que se desarrolla un animal. En una realización, el ADNc que codifica un polipéptido PRO de interés se puede utilizar para clonar ADN genómico que codifique el polipéptido PRO según con las técnicas establecidas y las secuencias genómicas usadas para generar los animales transgénicos que contienen las células que expresan el ADN que codifica el polipéptido PRO. Los procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente animales como ratones o ratas, se han convertido en convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nº 4.736.866 y 4.870.009. Típicamente, las células individuales serán las dianas para la incorporación de un transgen del polipéptido PRO con potenciadores específicas de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgen que codifica un polipéptido PRO introducido en la línea germinal del animal en una etapa embrionaria se pueden usar para examinar el efecto de la expresión aumentada del ADN que codifica el polipéptido PRO. Tales animales se pueden usar como animales de prueba para reactivos que se crea que confieren protección frente, por ejemplo, a estados patológicos asociados con su sobreexpresión. Según esta faceta de la invención, un animal se trata con el reactivo y una incidencia reducida del estado patológico en comparación con los animales sin tratar que lleven el transgen, indicaría una intervención terapéutica potencial del estado patológico.

Alternativamente, se pueden usar homólogos no humanos de los polipéptidos PRO para construir un animal "knock out" para el polipéptido PRO que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica el polipéptidos PRO de interés como resultado de una recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica el polipéptidos PRO y un ADN genómico alterado que codifica el polipéptidos PRO introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, ADNc que codifique un polipéptidos PRO que se use para clonar ADN genómico que codifica el polipéptidos PRO según las técnicas establecidas. Se puede eliminar o reemplazar una porción del ADN genómico que codifica un polipéptido PRO con otro gen como un gen que codifique un marcador de selección que se usa para controlar la integración. Típicamente, se incluyen en el vector varias quilobases de ADN sin alterar flanqueante (tanto en el extremo 5' como en el 3') [ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homóloga]. El vector se introduce en una línea celular troncal embrionaria (por ejemplo por electroporación) y se seleccionan las células en las que se introdujo el ADN y ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno [ver por ejemplo, Li y col., Cell, 69: 915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan entonces en un blastocisto de un animal (por ejemplo, ratón o rata) para formar quimeras de agregación [ver por ejemplo, Bradley, en "Teratocarcinomas and Embrionyc Stem Cells: A Practical Approach", (Teratocarcinomas y células troncales embrionarias: Un enfoque práctico), E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), págs 113-125]. Un embrión quimérico se puede después implantar en un animal receptor hembra pseudoembarazada adecuada y el embrión llevado a término para crear un animal "knock out". La descendencia que porta el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales se puede identificar mediante técnicas habituales y se puede usar para criar animales que contengan en todas sus células el ADN recombinado homólogamente. Los animales "knock out" se pueden caracterizar por ejemplo, por su capacidad de defenderse frente ciertos estados patológicos y por su desarrollo de estados patológicos debido a la ausencia del polipéptido PRO.

Anticuerpos anti polipéptidos PRO

La presente invención proporciona adicionalmente anticuerpos anti polipéptido PRO. Alguno Ejemplos de anticuerpos incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos, y heteroconjugados.

A. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos anti polipéptido PRO pueden comprender anticuerpos policlonales. Los expertos en la materia conocen los procedimientos para preparar anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales se pueden producir en un mamífero, por ejemplo mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Típicamente el agente inmunizante y/o adyuvante se inyectará en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido PRO o una de sus proteínas de fusión. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante a una proteína que se sepa que es inmunogénica en el mamífero que se está inmunizando. Algunos Ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a, hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina, tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de semilla de soja. Algunos Ejemplos de adyuvantes que se pueden emplear incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM (Monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trealosa sintético). Un experto en la materia sin demasiada experiencia puede seleccionar el protocolo de inmunización.

B. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos anti polipéptido PRO pueden, alternativamente, ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando procedimientos de formación de hibridomas, como los que se describen en Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un procedimiento de formación de hibridomas, un ratón, hámster u otro animal hospedador apropiado, se inmuniza típicamente con un agente inmunizante para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan activamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.

El agente inmunizante incluirá típicamente el polipéptido PRO de interés o una de sus proteínas de fusión. Generalmente, se usan linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si se desean células de origen humano, o se usan células de bazo o células de ganglios linfoides si se desean fuentes mamíferas no humanas. Los linfocitos se fusionan entonces con una línea inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice" (Anticuerpos monoclonales: Principios y práctica), Academic Press, (1986) págs 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas son normalmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen murino, bovino o humano. Normalmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se cultivan en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de células inmortalizadas sin fusionar. Por ejemplo, si las células parenterales carecen del enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son las que se fusionan eficazmente, soportan los altos y estables niveles de expresión de anticuerpo de las células que producen el anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino, que se pueden obtener por ejemplo, del Salk Institue Cell Distribution Center (Centro de distribución celular del Instituo Salk), San Diego, California y del American Type Culture Collection (Colección de cultivos tipo estadounidense), Rockville, Maryland. Se ha descrito también a las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma murino-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur y col., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications" (Técnicas y aplicaciones de la producción de anticuerpos monoclonales), Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) págs 51-63].

Se puede analizar el medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma para ver la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido PRO de interés. Preferiblemente, la especificidad de unión los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante análisis de unión in vitro, como radioinmunoanálisis (RIA) o análisis de inmunoabsorción ligada a enzima (ELISA). Tales técnicas son análisis conocidos en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y se pueden crecer mediante procedimientos habituales [Goding, supra]. Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, Medio Eagle modificado de Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente las células de hibridoma se pueden crecer in vivo como una ascitis en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar a partir de medios de cultivo o del fluido de la ascitis mediante procedimientos de purificación con inmunoglobulinas convencionales, por ejemplo, Proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales se pueden realizar además por procedimientos de ADN recombinante, como los descritos en la Patente de EE.UU. Nº 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la infección se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo usando sondas oligonucleotídicas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que se transfectan en células hospedadoras como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras. El ADN también se puede modificar por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora de los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas [Patente de EE.UU. Nº 4.816.567; Morrison y col., supra] o mediante unión covalente a toda la secuencia codificadora de la inmunoglobulina o parte de la secuencia codificadora de un polipéptido no inmunoglobulina. Tal polipéptido no inmunoglobulina se puede sustituir por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o se pueden sustituir por los dominios variables de un sitio de combinación con el antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera de la inmunoglobulina y una cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto de la región Fc para evitar la reticulación (crosslinking) de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos pertinentes de cisteína se sustituyen con otro residuo aminoacídico o se eliminan para evitar la reticulación (crosslinking).

Los procedimientos in vitro son también adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir sus fragmentos, particularmente, fragmentos Fab, se puede lograr usando técnicas habituales conocidas en la técnica.

C. Anticuerpos humanizados

Los anticuerpos anti polipéptido PRO de la invención pueden comprender adicionalmente anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o sus fragmentos (como Fv, Fab, Fab', F(ab)_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígenos) que contienen secuencias mínimas derivadas de una inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en las que residuos de una región determinante complementaria (CDR) del receptor se reemplazan con residuos de una CDR de especies no humanas (anticuerpo del donante) como ratón, rata o conejo que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos Ejemplos, los residuos de la estructura Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan con los residuos correspondientes no humanos. Los anticuerpos humanizados pueden comprender además residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo del receptor ni en la CDR o secuencias estructurales importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos un, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de una inmunoglobulina humana consenso. El anticuerpo humanizado óptimamente comprenderá demás al menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones y col., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son muy conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoacídicos introducidos en el de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoacídicos no humanos se refieren a menudo a residuos de "importación", que se toman típicamente de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones y col., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239: 1534-1536 (1988)], sustituyendo CDR murinas o secuencias CDR para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de EE.UU. Nº 4.816.567), en los que sustancialmente, menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente residuos FR están sustituidos por residuos de sitios análogos de anticuerpos murinos.

Los anticuerpos humanos se pueden producir además usando varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo genotecas de exposición a fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Están además disponibles las técnicas de Cole y col., y Boerner y col., para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy" (Anticuerpos monoclonales y terapia del cáncer), Alan R. Liss, pág 77 (1985) y Boerner y col., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)].

D. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. En el caso que nos ocupa, una de las especificidades de unión es por el polipéptido PRO, la otra es por cualquier otro antígeno, y preferiblemente por una proteína de superficie celular o receptor o subunidad receptora.

Los procedimientos para hacer anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadenas pesada-ligera/ligera-pesada de inmunoglobulinas, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades [Milstein y Cuello, Nature, 305: 5 37-539 (1983)]. Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (quadromas), producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo distintas, de las que sólo una tiene la correcta estructura biespecífica. La purificación de la molécula correcta se logra normalmente por etapas de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares se describen en el documento WO93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker y col., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

Los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar a secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra CH2 y CH3. Se prefiere que tengan la primera región constante (CH1) de la cadena pesada que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina, si se desea, la cadena pesada de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo hospedador adecuado. Para detalles adicionales para generar anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh y col., "Methods in Enzymology" (Procedimientos en enzimología), 121: 210 (1986).

E. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados están además dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Se ha propuesto a tales anticuerpos, por ejemplo, para hacer diana en células del sistema inmune para células no deseadas [Patente de EE.UU. Nº 4.676.980], y para el tratamiento de la infección del VIH [documentos WO91/00360; WO92/200373; EP03089]. Se contempla que los anticuerpos se puedan preparar in vitro usando procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo las que implican agentes de reticulantes. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de sidulfuro o formando un enlace tioéter. Algunos Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 4.676.980.

Usos de los anticuerpos anti polipéptido PRO

Los anticuerpos anti polipéptido PRO de la invención tienen varias utilidades. Por ejemplo los anticuerpos anti polipéptido PRO se pueden usar en ensayos de diagnóstico para un polipéptido PRO, por ejemplo para detectar la expresión en células, tejidos específicos, o suero. Se pueden usar varias técnicas de ensayo de diagnóstico conocidas en la técnica, como ensayos de unión competitiva, ensayos bocadillo directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u homogéneas [Zola, "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques" (Anticuerpos monoclonales: Manual de técnicas), CRC Press. Inc. (1987) págs 147-158]. Los anticuerpos usados en los ensayos de diagnóstico se pueden etiquetar con un residuo detectable. El residuo detectable debería ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el residuo detectable puede ser un isótopo radiactivo, como H^{3}, C^{14}, P^{32}, S^{35} o I^{125}, un compuesto fluorescente o quimiofluorescente, como fluoresceína isotiocianato, rodamina, o luciferina, o un enzima, como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o peroxidasa de rábano picante. Se puede emplear cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo al residuo detectable, incluyendo los procedimientos descritos en Hunter y col., Nature, 144: 945 (1962); David y col., Biochemistry, 13: 1014 (1974); Pain y col., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem and Cytochem., 30: 407 (1982).

Los anticuerpos anti polipéptido PRO son además útiles para la purificación por afinidad de un polipéptido PRO a partir de un cultivo de células recombinantes o de fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra el polipéptido PRO se inmovilizan en un soporte adecuado, como resina Sephadex o papel de filtro, usando procedimientos muy conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto entonces con una muestra que contiene el polipéptido PRO que se va a purificar, una vez purificado, se lava con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra salvo el polipéptido PRO, que está unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado que liberará el polipéptido PRO del anticuerpo.

Los antígenos específicos o asociados a un cáncer permiten la creación de anticuerpos monoclonales específicos de tumores o cánceres (mAbs) que son específico para los antígenos de dicho tumor. Tales mAbs, que distinguen entre células normales u cancerosas son útiles en diagnosis, prognosis y tratamiento de la enfermedad.

Anticuerpos monoclonales específicos de un cáncer (mAbs) que son específicos frente los antígenos de un tumor. Tales mAbs, que pueden distinguir entre células normales y cancerosas son útiles en diagnosis, prognosis y tratamiento de la enfermedad. Se sabe que ciertos antígenos están asociados con enfermedades neoplásicas, como cáncer colorectal o de mama. Debido a que el cáncer de colon es una enfermedad muy extendida, una diagnosis y un tratamiento precoces son un importante objetivo médico. La diagnosis y el tratamiento del cáncer se pueden llevar a cabo usando anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos que tengan por tanto etiquetas fluorescentes, nucleares magnéticas o radiactivas. Se pueden usar genes radiactivos, toxinas y/o mAbs etiquetados con un fármaco para el tratamiento in situ con una mínima descripción del paciente.

Los siguientes Ejemplos se ofrecen con propósitos sólo ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención en ningún modo.

Todas las patentes y referencias bibliográficas citadas en la presente memoria descriptiva están incorporadas por la presente como referencia en su totalidad.

Ejemplos

Los reactivos disponibles comercialmente mencionados en los Ejemplos se usaron según las instrucciones del fabricante a menos que se indique de otro modo. La fuente de las células identificadas en los siguientes Ejemplos, y en toda la memoria descriptiva, mediante números de registro de adquisiciones ATCC es la American Type Cultures Collection (Colección de cultivos tipo estadounidense), Rockville Maryland.

Ejemplo 1 Investigación de homología de dominios extracelulares para identificar polipéptidos novedosos y sus ADNc codificadores

Se usaron las secuencias de los dominios extracelulares (SCD) (incluyendo la secuencia señal de secreción, si existiera) de aproximadamente 950 proteínas de secreción conocidas de la base de datos pública Swiss-Prot para buscar bases de datos de EST. Las bases de datos de EST incluyeron bases de datos públicas (por ejemplo, Dayhoff, GenBank), y bases de datos privadas (por ejemplo, LIFESEQ^{TM}, Incyte Pharmaceutical, Palo Alto, CA). La búsqueda se realizó usando el programa informático BLAST o BLAST2 (Altschul. y Gish, Methods in Enzimology, 266: 460-80 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html) como comparación de las secuencias proteicas ECD hasta una traducción de 6 pautas de lectura de las secuencias EST. Aquellas comparaciones que con un Blast tuvieron un resultado de 70 (o 90 en algunos casos) o mayor y que no codificaban proteínas conocidas se agruparon y reunieron en secuencias de ADN consenso con el programa "phrap" (Phil Green, Universidad de Washington, Seattle, WA; (http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html).

Usando esta investigación de homología de dominios extracelulares, se reunieron secuencias de ADN consenso relacionadas con las otras secuencias EST identificadas. Además, las secuencias de ADN consenso obtenidas a menudo (pero no siempre) se extendieron usando ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender la secuencia consenso tanto como fuera posible usando las fuentes de secuencias EST descritas anteriormente.

En base a las secuencias consenso obtenidas como se describe anteriormente, se sintetizaron después oligonucleótidos y se usaron para identificar por PCR una genoteca de ADNc que contenía la secuencia de interés y para usar como sondas para aislar un clon de la secuencia codificadora de longitud completa de un polipéptido PRO. A menudo se diseñaron cebadores de PCR directos (.f) y reversos (.r) generalmente en el intervalo de 20 a 30 nucleótidos para producir un producto de PCR de aproximadamente 100 a 1000 pb de longitud. Las secuencias sonda (.p) típicamente tienen de 40 a 55 pb de longitud. En algunos casos se sintetizaron oligonucleótidos adicionales cuando la secuencia consenso era mayor de 1 a 1,5 kpb. Para investigar varias genotecas en busca de un clon de longitud completa, el ADN de las genotecas se investigó mediante amplificación con PCR, como en Ausbel y col., "Current Protocols in Molecular Biology" (Protocolos actuales en biología molecular), con el par de cebadores de PCR. Una genoteca positiva se usó entonces para aislar clones que codificaran el gen de interés usando el oligonucleótido sonda y uno del par de cebadores.

Las genotecas de ADNc que se usaron para aislar los clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos habituales usando reactivos disponibles comercialmente como los de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se cebó con un oligo dT que contenía un sitio NotI, se ligó en romo con adaptadores SalI semifosforilados, se cortó con NotI, y se determinó su tamaño aproximadamente en una electroforesis en gel, y se clonó en un sentido determinado en vector de clonación adecuado (como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio SfiI; ver Holmes y col., Science, 253: 1278-1280 (1991)) en los sitios únicos XhoI y NotI.

Ejemplo 2 Aislamiento de clones de ADNc que codifican el PRO224 humano

Se ensambló una secuencia consenso de ADN respecto a otras secuencias identificadas EST según se ha descrito en el Ejemplo 1, en donde la secuencia consenso se designa en el presente documento como ADN30845. Se sintetizaron los oligonucleótidos en base a la secuencia consenso para identificar por PCR una genoteca de ADNc que contenía la secuencia de interés y para utilizar como sondas para aislar un clon de la secuencia de longitud completa que codificaba la PRO224.

Se sintetizaron un par de cebadores de PCR (directo e inverso):

Cebador de PCR directo:

5'-AAGTTCCAGTGCCTGCCGCACCAGTGGC-3'

\hskip5,1cm

(SEC ID Nº: 3)

Cebador de PCR inverso:

5'-TTGGTTCCACAGCCGAGCTCGTCG-3'

\hskip6cm

(SEC ID Nº: 4)

De manera adicional, se construyó una sonda de oligonucleótidos sintéticos de hibridación a partir de la secuencia consenso ADN 30845 que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos:

Sonda de hibridación

5'-GAGGAGGAGTGCAGGATTGAGCCATGTACCCAGAAAGGGCAATGCCCACC-3' (SEC ID Nº: 5).

Con el fin de cribar diversas genotecas para una fuente de un clon de longitud completa, el ADN procedente de las genotecas se cribó mediante amplificación con el par de cebadores de PCR identificado más arriba. Se utilizó, a continuación, una librería positiva para aislar los clones que codificaban el gen de la PRO224 utilizando una sonda de oligonucleótidos y uno de los cebadores de PCR.

El ARN para la construcción de las genotecas de ADNc se aisló del tejido de hígado fetal humano. La secuenciación de ADN de los clones aislados según se ha descrito más arriba dio una secuencia de ADN de longitud completa para la PRO224 [designado en el presente documento como UNQ198 (ADN332221-1133)] y la secuencia de la proteína derivada para PRO224.

La secuencia de nucleótidos entera de UNQ198 (ADN 33221-1133) se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº: 1). El clon UNQ198 (DNA 33221-1133) contiene un único marco de lectura abierta con un punto de inicio de la traducción aparente en las posiciones nucleotídicas 96-98 y finaliza en el codon de parada en las posiciones nucleotídicas 942-944 (Figura 1, SEC ID Nº: 1). El inicio de la región transmembrana empieza en la posición nucleotídica 777. El precursor del polipéptido predecido es de 282 aminoácidos de longitud (Figura 2). El clon UNQ198 (ADN33221-1133) ha sido depositado con ATCC y se asigna el nº de depósito de ATCC 209263.

El análisis de la secuencia de aminoácidos del PRO224 de longitud completa sugiere que este tiene homología con los receptores de lipoproteínas de baja densidad, apolipoproteína del receptor E y receptores P95 de oocito de pollo. El PRO224, en base a los análisis de alineación de secuencia BLAST y FastA de la secuencia de longitud completa, tiene una identidad aminoacídica respecto a porciones de estas proteínas en el rango de 28% a 45% y una identidad global con estas proteínas en el rango del 33% al 39%.

Ejemplo 3 Uso del ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO como sondas de hibridación

El siguiente procedimiento describe el uso de una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido PRO como una sonda de hibridación.

El ADN que comprende la secuencia codificadora de un polipéptido PRO de interés como se describe en la presente memoria descriptiva se puede emplear como una sonda o usar como base a partir de la cual preparar sondas para buscar ADNs homólogos (como los que codifican variantes naturales del polipéptido PRO) en genotecas de ADNc de tejido humano o genotecas genómicas de tejido humano.

La hibridación y los lavados de los filtros que contienen el ADN de genotecas se realizan bajo las siguientes condiciones altamente restrictivas. La hibridación de la sonda derivada del ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO etiquetada radiactivamente con los filtros se realiza en una solución de 50% de formamida, SSS 5X, 0,1% de SDS, 0,1% de pirofosfato de sodio, fosfato de sodio 50 mM, una solución acuosa de SSC 0,1X y 0,1% de SDS a 42ºC.

Los ADNs que tienen una identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica el polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa se pueden identificar entonces usando técnicas habituales conocidas en la técnica.

Ejemplo 4 Expresión de polipéptido PRO en E. coli

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma sin glicosilar de un polipéptido PRO por expresión recombinante en E. coli.

La secuencia de ADN que codifica el polipéptido PRO deseado se amplifica inicialmente usando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener sitios de enzimas de restricción que correspondan a los sitios de enzimas de restricción del vector de expresión seleccionado. Se puede emplear una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector de expresión adecuado es el pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolivar y col., Gene, 2: 95 (1997)) que contiene genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina. Se digiere el vector con enzimas de restricción y se desfosforila. Las secuencias amplificadas por PCR se ligan entonces en el vector. El vector incluirá preferentemente secuencias que codifiquen un gen de resistencia a un antibiótico, un promotor trp, y una secuencia guía poliHis (incluyendo los primeros seis codones STII, secuencia poliHis, y un sitio de corte de enteroquinasa), la región que codifica el polipéptido PRO específico, el terminador transcripcional lambda y un gen argU.

La mezcla de ligación se usa entonces para transformar una cepa de E. coli seleccionada usando los procedimientos descritos en Sambrook y col., supra. Los transformantes se identifican por su capacidad de crecer en placas LB y se seleccionan las colonias resistentes al antibiótico. El ADN plasmídico se puede aislar y confirmar con análisis de restricción y secuenciación de ADN.

Los clones seleccionados se pueden crecer toda la noche en un medio de cultivo líquido como LB complementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche se puede usar después para inocular un cultivo a escala mayor. Se crecen las células entonces hasta alcanzar la densidad óptica deseada, durante la cual se induce el promotor de expresión.

Después de cultivar las células durante varias horas más, las células se recogen por centrifugación. El sedimento celular obtenido en la centrifugación se puede solubilizar usando varios agentes conocidos en la técnica, y el polipéptido PRO solubilizado se puede entonces purificar usando una columna con un quelante metálico en condiciones que permitan una fuerte unión de la proteína.

En el documento EP1027434A (98946090.2), se expresó exitosamente el polipéptido PRO224 en E. coli en una forma etiquetada con poliHis, usando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica el polipéptido PRO224 se amplificó inicialmente con cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contenían sitios de enzimas de restricción que corresponden con los sitios de enzimas de restricción del vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan un inicio de la traducción fiable y eficaz, una rápida purificación en una columna con un quelante metálico, y la eliminación proeolítica con enteroquinasa. Las secuencias etiquetadas con poliHis amplificadas por PCR se ligaron entonces en un vector de expresión y se usaron para transformar un hospedaddor E. coli basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts (htpRts) clpP(laclq)). Los transformantes se crecieron primero en LB con 50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC con agitación hasta que se alcanzó una DO_{600} de 3-5. Los cultivos se diluyeron 50-100 veces en medios CRAP (preparados mezclando 3,57 g de (NH_{4})SO_{4}, 0,71 g de citrato de sodio x 2H_{2}o, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levaduras de Difco, 5,36 g de Hycase (hidrolizado de caseína) SF de Sheffield en 500 ml de agua, MPOS 110 mM, pH 7,3, 0,55% (p/v) de glucosa y MgSOJ 7 mM y se crecieron durante aproximadamente 20-30 horas a 30ºC con agitación. Las muestras se retiraron para verificar la expresión por análisis SDS-PAGE (gel de poliacrilamida con SDS), y el cultivo se centrifugó para sedimentar las células. Los sedimentos celulares se congelaron hasta la purificación y replegamiento.

La masa de E. coli de 0,5 a 1 litro de fermentaciones (6-10 g de sedimentos) se resuspendió en 10 volúmenes (p/v) en un tampón de guanidina 7 M, Tris 20 mM, pH 8,0. Se añadieron sulfito de sodio sólido y tetrationato de sodio para hacer unas concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la solución se agitó toda la noche a 4ºC. Este paso tiene como resultado la desnaturalización de la proteína con todos los residuos de cisteína bloqueados por sulfitolización. La solución se centrifugó a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman durante 30 minutos. El sobrenadante se diluyó con 3-5 volúmenes de tampón de la columna de quelante metálico (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtró a través de filtros de 0,22 micrómetros para depurar. Dependiendo, el extracto depurado se cargó en una columna con quelante metálico Qiagen de 5 mL equilibrada con tampón de columna con quelante metálico. La columna se lavó con un tampón adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, Grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluyó con tampón que contiene imidazol 250 mM. Se combinaron las fracciones que contienen la proteína deseada y se almacenaron a 4ºC. La concentración proteica se estimó por su absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de extinción calculado en base a su secuencia aminoacídica.

Las proteínas se replegaron diluyendo la muestra lentamente en un tampón de replegamiento recién preparado compuesto por Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegamiento se eligieron de modo que la concentración final de proteína fuera de 50 a 100 microgramos/ml. La solución de replegamiento se agitó suavemente a 4ºC durante 12-36 horas. La reacción de replegamiento se detuvo añadiendo TFA a una concentración final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de una purificación adicional de la proteína, se filtró la solución través de un filtro de 0,22 micrómetros y se añadió acetonitrilo a una concentración final de 2-10%. La proteína replegada se cromatografió en una columna de fase inversa R1/H de Poros usando una fase móvil de 0,1% de TFA con elución con un gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%. Se analizaron alícuotas de fracciones con una absorbancia a 280 nm en geles de poliacrilamida con SDS y se combinaron las fracciones que contenían proteína replegada homogénea. Generalmente, las especies replegadas adecuadamente de la mayoría de las proteínas se eluyen a las menores concentraciones de acetonitrilo ya que esas especies son las más compactas con su interior hidrófobo protegido de la interacción con la resina de la fase inversa. Las especies agregadas se eluyen normalmente a mayores concentraciones de acetonitrilo. Además de resolver las formas mal plegadas de proteínas de la forma deseada, la etapa de la fase inversa elimina la endotoxina de las muestras.

Las fracciones que contienen la proteína PRO224 plegada deseada, respectivamente, se combinaron y se eliminó el acetonitrilo usando un suave vapor de nitrógeno dirigido hacia la solución. Las proteínas se formularon en Hepes 20 mM, pH 6,9 con cloruro de sodio 0,14 M y manitol 4% por diálisis o por filtración en gel usando resinas G25 Superfinde (Pharmacia) equilibradas con el tampón de formulación y filtradas para esterilizar.

Ejemplo 5 Expresión de polipéptidos PRO en células de mamífero

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma glicosilada de un polipéptido PRO deseado mediante expresión recombinante en células de mamífero.

El vector, pRK5 (ver el documento EP307.247, publicado en marzo de 1989), se emplea como el vector de expresión. Opcionalmente el ADN que codifica el polipéptido PRO se liga en el pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la introducción del ADN de polipéptido PRO usando procedimientos de ligación como los descritos en Sambrook y col., supra. El vector resultante se llama pRK5-polipéptido PRO.

En una realización, las células hospedadoras seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se crecen hasta que confluyen en placas de cultivos tisulares como DMEM complementado con suero de ternera fetal y opcionalmente, componentes nutricionales y/o antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5-polipéptido PRO con aproximadamente 1 \mug del ADN que codifica el gen VA ARN [Thimmappaya y col., Cell, 31: 543 (1982)] y se disuelven en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227. A esta mezcla se añaden gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM y se deja que se forme un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se resuspende y se añade a las células 293 y se deja que sedimenten durante aproximadamente cuatro horas a 37 C. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. Las células 293 se lavan entonces con medio sin suero, se añade medio recién preparado y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.

Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, se elimina el medio de cultivo y se reemplaza con medio de cultivo (sólo) o medio de cultivo con cisteína-S^{35} 200 \muCi/ml y metionina-S^{35} 200 \muCi/ml. Tras una incubación de 12 horas, se recoge el medio acondicionado, se concentra en un filtro de centrífuga, y se carga en un gel con 15% de SDS. El gel procesado se puede secar y exponer a una película durante un periodo tiempo para revelar la presencia de polipéptido PRO. Los cultivos que contienen las células transfectadas pueden continuar con la incubación (en medio sin suero) y el medio se prueba en bioensayos seleccionados.

En una técnica alternativa, el polipéptido PRO se puede introducir en células 293 temporalmente usando el procedimiento del sulfato de dextrano descrito en Somparyrarc y col., Proc. Nati. Acad. Sci., 12: 7575 (1981). Las células 293 se crecen hasta una densidad óptica máxima en un recipiente giratorio y se añaden 700 \mug de ADN de pRK5-polipéptido PRO. Las células primero se concentran en el recipiente giratorio por centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado ADN-dextrano se incuba sobre el sedimento celular durante cuatro horas. Las células se tratan con un 20% de glicerol durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo tisular y se reintroducen en el recipiente giratorio que contiene le medio de cultivo tisular, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado se puede concentrar y purificar por cualquier procedimiento seleccionado, como diálisis y/o columna cromatográfica.

En otra realización, los polipéptidos PRO se pueden expresar en células CHO. El pRK5-polipéptido PRO se puede transfectar en células CHO usando reactivos conocidos como CaPO_{4} o DEAE-dextrano. Como se describe anteriormente, los cultivos celulares se pueden incubar, y remplazar el medio con medio de cultivo (sólo) o medio con un isótopo radiactivo como metionina-S. Después de determinar la presencia del polipéptido PRO, se puede reemplazar el medio de cultivo con medio sin suero. Preferiblemente los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y entonces se concentran y purifican por cualquier procedimiento seleccionado.

El polipéptido PRO etiquetado con un epítopo se puede expresar además en células hospedadoras CHO. El polipéptido PRO se puede subclonar fuera del vector pRK5. El inserto de subclonación se puede someter a PCR para fusionar la pauta de lectura con una etiqueta epítopo seleccionada como etiqueta poliHis en un vector de expresión de Baculovirus. El inserto de polipéptido PRO etiquetado con poliHis se puede subclonar entonces en un vector dirigido SV40 que contiene un marcador de selección como DHFR para seleccionar clones estables. Finalmente, las células CHO se pueden transfectar (como se describe anteriormente) con el vector dirigido SV40. El etiquetado se puede realizar, como se describe anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el polipéptido PRO etiquetado con poliHis se puede concentrar y purificar por cualquier procedimiento seleccionado, como por cromatografía de afinidad con quelato Ni^{2+}.

Se expresó con éxito PRO224 en células CHO tanto por el procedimiento temporal como por el de expresión estable.

La expresión estable en células CHO se realizó usando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresaron como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias codificadoras de las formas solubles (por ejemplo, dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionaron a una secuencia de una región constante IgG1 que contiene la región bisagra, los dominios CH2 y CH2 y/o es una forma etiquetada con poliHis.

Después de la amplificación por PCR, se subclonaron los respectivos ADNs en un vector de expresión CHO usando técnicas habituales como se describe en Ausubel y col., "Current Protocols in Molecular Biology" (Protocolos actuales en biología molecular), Unidad 3.16, John Willey e hijos (1997). Los vectores de expresión CHO se construyen de modo que tengan sitios de restricción compatibles 5' y 3' del ADN de interés para permitir el transporte conveniente de los ADNcs. El vector de expresión usado en las células CHO es como se describe en Lucas y col., Nucl. Acids Res., 24: 9 (1774-1779 (1996)), y usa el promotor/potenciador temprano del SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para un mantenimiento estable del plásmido después de la transfección.

Se introdujeron doce microgramos del ADN plasmídico deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO usando reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect*(Quiangen), Dospei*, o Fugene* (Boehringer Mannheim). Las células se crecieron como se describe en Lucas y col., supra. Se congelaron aproximadamente 3 x 10^{-7} células en una ampolla para un crecimiento y producción adicional como se describe a continuación.

Las ampollas que contienen el ADN plasmídico se descongelaron colocándolas en una baño de agua y se mezclaron con un vórtex. Se tomo con una pipeta el contenido y se transfirió a un tubo de centrífuga que contenía 10 ml de medio y se centrifugó a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado con por un filtro de 0,2 \mum con 5% de suero fetal bovino dializado y filtrado con por un filtro de 0,2 \mum). Se alicuotaron entonces las células en un recipiente giratorio de 100 ml que contenía 90 ml de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfirieron a un recipiente giratorio de 250 ml con 150 ml de medio de crecimiento selectivo y se incubaron a 37ºC. Después de otros 2-3 días, se sembraron 3 x 10^{5}células/ml en recipientes giratorios de 250 ml, 500 ml y 2000 ml. El medio celular se cambió por medio recién preparado por centrifugación y resuspensión en el medio de producción. Aunque se puede emplear un medio CHO adecuado, se usó en realidad un medio descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.122.469, publicada el 16 de junio de 1992. Se sembraron 3 l del recipiente giratorio con 1,2 x 10^{6} células/ml. El día 0, se calculó el pH y el número de células. El día 1, se tomó una muestra del recipiente giratorio y se comenzó a burbujear con aire filtrado. El día 2, se tomó una muestra del recipiente giratorio, se cambió la temperatura a 33ºC, y se añadieron 30 ml de glucosa 500 g/l y 0,6 ml de antiespumante al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, emulsión de grado médico de Dow Corning 365). Durante toda la producción, se ajustó el pH como fuese necesario para mantenerlo aproximadamente a 7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad descendió por de bajo del 70%, se recogió el cultivo celular por centrifugación y se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado o se almacenó a 4ºC o se cargó en columnas para su purificación.

Para las construcciones etiquetadas con poliHis, se purificaron las proteínas usando una columna Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añadió el imidazol al medio acondicionado hasta una concentración de 5 mM. Los medios acondicionados se bombearon a una columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada con Hepes 20 mM, pH 7,4, conteniendo el tampón NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min a 4ºC. Después de cargar, se lavó la columna con tampón de equilibrado adicional y se eluyó la proteína con tampón de equilibrado que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfinde de 25 ml (Pharmacia) y se almacenó a -80ºC.

Las construcciones con inmunoadhesina (que contienen Fc) fueron purificadas del medio acondicionado como se describe a continuación. El medio acondicionado se bombeó sobre una columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que se había equilibrado con tampón fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8. Después de cargar, se lavó la columna abundantemente con tampón de equilibrado antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluída se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 \mul de tampón Tris 1 M, pH 9. Se eliminaron las sales de la solución con proteína altamente purificada en tampón de almacenamiento como se describe anteriormente para las proteínas poliHis. Se valoró la homogeneidad en geles de poliacrilamida con SDS y por secuenciación del extremo amino terminal mediante degradación de Edman.

El PRO224 también se expresó temporalmente con éxito en células COS.

Ejemplo 6 Expresión de polipéptido PRO en levaduras

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de un polipéptido deseado en levaduras.

Primero, se construyeron los vectores de expresión para la producción intracelular o secreción de los polipéptidos PRO con el promotor ADH2/GAPDH. Se introducen el ADN que codifica un polipéptido PRO deseado, un péptido señal seleccionado y el promotor en los sitios de enzima de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular del polipéptido PRO. Para la secreción, el ADN que codifica el polipéptido PRO se puede clonar en el plásmido seleccionado, junto con un ADN que codifique el promotor ADH2/GAPDH, la secuencia guía/señal de secreción del factor alfa, y secuencias adaptadoras, si fuera necesario, para la expresión del polipéptido PRO.

Las células de levadura, como la cepa de levadura AB110, se pueden transformar con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y se pueden cultivar en medios de fermentación seleccionados. Se puede analizar el sobrenadante de las células transformadas mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y por separación en un gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), seguida de la tinción de los geles con colorante azul de Coomassie.

El polipéptido PRO recombinante se puede aislar a continuación y purificar eliminando las células de levadura del medio de fermentación por centrifugación y después concentrando el medio usando filtros en cartucho. El concentrado que contiene el polipéptido PRO se puede purificar adicionalmente usando resinas de cromatografía en columna seleccionadas.

Ejemplo 7 Expresión de polipéptidos PRO en células de insecto infectadas con Baculovirus

El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de polipéptidos PRO en células de insecto infectadas con Baculovirus.

El polipéptido PRO deseado se fusiona en la dirección 5' de una etiqueta epítopo contenida con un vector de expresión de Baculovirus. Tal etiqueta epítopo incluye etiquetas poliHis y etiquetas de inmunoglobulina (como regiones Fc o IgG). Se pueden emplear una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente como el pVL1393 (Novagen). Brevemente, el polipéptido PRO o la porción deseada del polipéptido PRO (como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana) se amplifica por PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cenador 5' puede incorporar sitios de enzimas de restricción (seleccionados) flanqueantes. El producto se digiere entonces con esas enzimas de restricción y se subclona en el vector de expresión.

El baculovirus recombinante se genera cotrasfectando el anterior plásmido y el ADN del virus BaculoGold™ (Pharmigen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando lipofectina (comercialmente disponible en GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recogen y se usan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de proteínas se realiza como se describe en O'Reilley y col., "Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual" (Vectores de expresión de Baculovirus: Manual de laboratorio), Oxford, Oxford University Press (1994).

El polipéptido PRO etiquetado con poliHis expresado se puede entonces purificar, por ejemplo con cromatografía de afinidad con quelato Ni^{2+} como se describe a continuación. Se prepararan los extractos a partir de las células Sf9 infectadas con el virus recombinante como se describe en Rupert y col., Nature, 362: 175-179 (1993). Brevemente, se lavan las células Sf9, se resuspenden en un tampón de sonicación (25 ml de Hepes, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; 10% de glicerol; 0,1% de NP-40; KCl 0,4 M), y se someten a sonicación dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se aclaran por centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, 10% de glicerol, pH 7,8) y se filtran a través de un filtro de 0,45 \mum de diámetro. Se prepara una columna de agarosa con Ni^{2+}-NTA (disponible comercialmente en Qiagen) en un volumen de soporte de 5 ml, lavada con 25 ml de agua y equilibrada con.25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta una base de referencia a A_{280} con tampón de carga, punto en el cual comienza la recogida de fracciones. Después, se lava la columna con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM; 10% de glicerol, pH 6,0), que eluye las proteínas unidas no específicamente. Después de alcanzar la base de referencia a A_{280} de nuevo, se desarrolla la columna con un gradiente de imidazol desde 9 a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recogen y analizan fracciones de un ml mediante un gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) y tinción con plata o inmunotransferencia tipo Western con Ni^{2+}-NTA conjugado a fosfatasa alcalina (Qiagen).Se combinan las fracciones que contienen el polipéptido PRO etiquetado con His_{10} y se dializan frente tampón de carga.

Alternativamente la purificación del polipéptido PRO etiquetado con IgG se puede realizar usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatografía con columnas de proteína A o proteína G.

Se expresó con éxito el PRO224 en células de insecto Sf9 o high5. Mientras que la expresión se realizó en realidad en una escala 0,5-2 l, se puede aumentar fácilmente la escala para preparaciones mayores (por ejemplo 8 l). Se expresaron las proteínas como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que la región extracelular de la proteína se fusionó con una secuencia de región constante de IgG que contiene la región bisagra, los dominios CH1 y CH2 y/o formas etiquetadas poliHis.

Después de la amplificación por PCR, se subclonaron las secuencias codificadoras respectivas en un vector de expresión de Baculovirus (pb.PH.IgG para fusiones con IgG y pb.PH.His para proteínas etiquetadas con poliHis), y se cotransfectaron el vector y el ADN de baculovirus BaculoGold® (Pharmigen) en células 105 de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711), usando Lipofectina (Gibco BRL). pb.PH.IgG y pb.PH.His son modificaciones del vector de expresión de baculovirus pVL1393 (Pharmigen) disponible comercialmente, con regiones del poliligador modificadas para incluir secuencias etiqueta His o Fc. Se crecieron las células en medio TNM-FH de Hink complementado con 10% de FBS (Suero fetal bovino) (Hyclone). Se incubaron las células durante 5 días a 28ºC. Se recogió el sobrenadante y se usó posteriormente para la primera amplificación viral infectando células Sf9 en medio TNM-FH de Hink complementado con 10% de FBS (Suero fetal bovino) a una multiplicidad de infección aproximada (MDI o MOI por sus siglas en inglés) de 10. Se incubaron las células durante 3 días a 28ºC. Se recogió el sobrenadante y se determinó la expresión de las construcciones en el vector de expresión de baculovirus por unión en lote de 1 ml de sobrenadante a 25 ml de perlas de Ni-NTA (QIAGEN) para proteínas etiquetadas con histidina o perlas de Proteína A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) para proteínas etiquetadas con IgG, seguido de un análisis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) comparando con una concentración conocida de patrón de proteína por tinción con azul de
Coomassie.

Se usó el sobrenadante de la primera amplificación viral para infectar un cultivo giratorio (500 ml) de células Sf9 crecidas en medio ESF-921 (Expression Systems LLC) a una MDI de aproximada de 0,1. Se incubaron las células durante 3 días a 28ºC. Se recogió y se filtró el sobrenadante. Se repitió la unión en lote y el análisis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), como fuera necesario, hasta que se confirmó la expresión del cultivo giratorio.

Se recogió el medio acondicionado para las células transfectadas (0,5 a 3 l) por centrifugación para eliminar las células y se filtró a través de filtros de 0,22 micrómetros. Para las construcciones etiquetadas con poliHis, se purificó la construcción de la proteína con una columna Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol al medio acondicionado a una concentración de 5 mM. Los medios acondicionados se bombearon en una columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada con Hepes 20 mM, pH 7,4, tampón con NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/m a 4ºC. Después de cargar, se lavó la columna con tampón de equilibrado adicional y se eluyó la proteína con tampón de equilibrado con imidazol 0,25 M. Se eliminaron las sales de la proteína altamente purificada y se guardó en un tampón de equilibrado con Hepes 10 mM, NaCl y 4% de manitol, pH 6,8, con una columna G25 Superfinde (Pharmacia) de 25 ml y se almacenó a -80ºC.

Las construcciones con inmunoadhesina (que contienen Fc) se purificaron del medio acondicionado como se describe a continuación. Se bombeó el medio acondicionado en una columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que había sido equilibrada con tampón fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8. Después de cargar, la proteína se neutralizó abundantemente con tampón de equilibrado antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluída se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos con 275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. Posteriormente se eliminaron las sales de la proteína altamente purificada y se guardó en tampón de almacenamiento como se describe anteriormente para las proteínas etiquetadas con poliHis. La homogeneidad de las proteínas se verificó por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (EGP) y secuenciación del extremo amino terminal mediante degradación de Edman.

Ejemplo 8 Preparación de anticuerpos que se unan a los polipéptidos PRO

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que se pueden unir específicamente a un polipéptido PRO.

Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Los inmunógenos que se pueden emplear incluyen el polipéptido PRO purificado, proteínas de fusión que contienen el polipéptido y células que expresan el polipéptido PRO recombinante en la superficie celular. Los expertos en la materia pueden realizar la selección del inmunógeno si una excesiva experiencia.

Se inmunizan ratones, como Balb/c, con el polipéptido PRO inmunógeno emulsionado en adyuvante de Freund completo y se inyectan subcutáneamente o intraperiotonealmente en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en el animal en las almohadillas del pie trasero. Se estimula después a los ratones inmunizados 10 a 12 días después con un inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A partir de entonces, durante varias semanas, se pueden estimular además a los ratones con inyecciones inmunizantes adicionales. Se pueden obtener muestras de suero de los ratones periódicamente mediante tomas de sangre retroorbitales para realizar ensayos de ELISA para detectar anticuerpos anti polipéptido PRO.

Después de que se haya detectado una cantidad de anticuerpos adecuada, se puede inyectar a los animales "positivos" para los anticuerpos una inyección intravenosa final de polipéptido PRO. Tres o cuatro días después, se sacrifica a los ratones y se recogen células del bazo. Las células del bazo se fusionan entonces (usando un 35% de polietilenglicol) a una línea celular de mieloma murino como P3X63AgU.1, disponible en ATCC, Nº CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que pueden proliferar en placas de cultivo tisular con 96 pocillos con medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, híbridos de mieloma, e híbridos de células de bazo.

Las células de hibridoma se pueden analizar en una ELISA para determinar la reactividad frente al polipéptido PRO. La determinación de células de hibridoma "positivas" que secreten los anticuerpos monoclonales deseados contra el polipéptido PRO depende de la experiencia en la materia.

Las células de hibridoma positivas se pueden inyectar intraperitonealmente en ratones Blab/c singénicos para producir ascitis que contenga los anticuerpos monoclonales anti polipéptido PRO. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden crecer en matraces o frascos de rosca de cultivo tisular. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en la ascitis se puede lograr a cabo usando precipitación con sulfato de amonio, seguida de cromatografía de exclusión por gel. Alternativamente, se puede emplear cromatografía de afinidad basándose en la unión del anticuerpo a la proteína A o G.

Ejemplo 9 Polipéptidos PRO quiméricos

Los polipéptidos PRO se pueden expresar como proteínas quiméricas con uno o más dominios polipeptídicos adicionales añadidos para facilitar la purificación de la proteína. Tales dominios de facilitación de purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes metálicos como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación con metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación con inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación extensión/afinidad FLAGS™ (Immunex Corp., Seattle Wash.). La inclusión de una secuencia de unión que se pueda cortar como Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, Calif.) entre el dominio de purificación y la secuencia del polipéptido PRO puede ser útil para facilitar la expresión del ADN que codifica el polipéptido PRO.

Ejemplo 10 Purificación de polipéptidos PRO usando anticuerpos específicos

Los polipéptidos PRO recombinantes se pueden purificar mediante una variedad de técnicas habituales en la técnica de la purificación de proteínas. Por ejemplo, se purifica el propolipéptido PRO, polipéptido PRO maduro, o prepolipéptido PRO por cromatografía de afinidad usando anticuerpos específicos para el polipéptido PRO de interés. En general, una columna de inmunoafinidad se construye uniendo covalentemente el anticuerpo anti polipéptido PRO a una resina cromatográfica activada.

Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de precipitación sérica con sulfato de amonio o mediante purificación en Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Así mismo, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de líquido de ascitis de ratón mediante precipitación con sulfato de amonio o cromatografía sobre Proteína A inmovilizada. Una proteína parcialmente purificada está covalentemente unida a la resina cromatográfica como SEPHAROSE^{TM} CnBr-activada (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se une a la resina, se bloquea la resina y la resina derivada se lava según las instrucciones del fabricante.

Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación de polipéptido PRO preparando una fracción de células que contengan el polipéptido PRO en forma soluble. Esta preparación se obtiene solubilizando todas las células o una fracción subcelular obtenida vía centrifugación diferencial mediante la adición de un detergente o mediante otros procedimientos muy conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido PRO soluble que contiene una secuencia señal se puede secretar en una cantidad útil al medio en el que crecen las células.

Una preparación que contenga un polipéptido PRO soluble se pasa a través de la columna de inmunoafinidad, y se lava la columna en condiciones que permitan la absorción preferencial del polipéptido PRO (por ejemplo, tampones de alta concentración iónica en presencia de detergente). Entonces, se eluye la columna en condiciones que alteren la unión anticuerpo/polipéptido PRO (por ejemplo, un tampón de pH bajo de aproximadamente 2-3, o una mayor concentración de una agente caotrópico como urea o ión tiocianato), y se recoge el polipéptido PRO.

Ejemplo 11 Selección de fármacos

Esta invención es particularmente útil para seleccionar compuestos usando polipéptidos PRO o sus fragmentos de unión en cualquier variedad de técnicas de selección de fármacos. El polipéptido o fragmento PRO empleado en tal prueba puede estar libre en disolución, sin unir a un soporte sólido, suspendido en una superficie celular, o localizado intracelularmente. Un procedimiento de selección de fármacos utiliza células hospedadoras eucariotas o procariotas que se han transformado de modo estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido o un fragmento PRO. Los fármacos se seleccionan frente dichas células transformadas en ensayos de unión competitivos. Tales células, tanto en forma soluble como fija, se pueden usar para ensayos de unión habituales. Se puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre el polipéptido o un fragmento PRO y el agente que se está probando. Alternativamente, se puede examinar la disminución en la formación de complejos entre el polipéptido PRO y su célula diana o receptores diana provocada por el agente que se está probando.

Así, la presente invención proporciona procedimientos para seleccionar fármacos o cualquier otro agente que pueda afectar a enfermedades o desórdenes asociados al polipéptido PRO. Estos procedimientos comprenden el contacto de tal agente con un polipéptido PRO o uno de sus fragmentos y el ensayo de (I) la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido o un fragmento PRO, o (II) la presencia de un complejo entre el polipéptido o un fragmento PRO y la célula, por procedimientos muy conocidos en la técnica. En dichos ensayos de unión competitiva, el polipéptido o el fragmento PRO está típicamente etiquetado. Después de una incubación adecuada se separa la forma unida del polipéptido o el fragmento PRO, y la cantidad de etiqueta libre o no unida a complejo es una medida de la capacidad del agente particular de unirse al polipéptido PRO o para interferir con el complejo polipéptido PRO/célula.

Otra técnica para la selección de fármacos proporciona un alto rendimiento de selección de compuestos que tienen la adecuada afinidad de unión al polipéptido PRO y se describe con detalle en el documento WO84/03564, publicado el 13 de septiembre de 1984. Brevemente descrito, se sintetiza un gran número de diferentes compuestos de prueba peptídica pequeños sobre un sustrato sólido, como agujas de plástico u otra superficie. Como se ha solicitado para un polipéptido PRO, los compuestos de prueba peptídica se hacen reaccionar con polipéptidos PRO y se lavan. El polipéptido PRO unido se detecta por procedimientos muy conocidos en la técnica. El polipéptido PRO purificado se puede recubrir directamente sobre placas para el uso en las técnicas de selección de fármacos antes mencionado. Además, los anticuerpos no neutralizantes se pueden usar para capturar el péptido e inmovilizarlo en el soporte sólido.

Esta invención contempla, también, el uso de ensayos de selección de fármacos competitivos en los que los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse al polipéptido PRO específicamente compitan con un compuesto de prueba en la unión al polipéptido PRO o sus fragmentos. De este modo, los anticuerpos se pueden usar para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos con el polipéptido PRO.

Ejemplo 12 Diseño de fármacos racionales

El objetivo del diseño de fármacos racionales es producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos de interés (es decir, un polipéptido PRO) o de pequeñas moléculas con las que interactúan, por ejemplo, agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos Ejemplos se puede usar para modelar fármacos que sean más activos o formas estables del polipéptido PRO o que potencien o interfieran con la función del polipéptido PRO in vivo (c.f., Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)).

En un enfoque, la estructura tridimensional del polipéptido PRO o de un complejo inhibidor-polipéptido PRO, se determina por cristalografía de rayos X, por modelado informático, o más típicamente, mediante una combinación de los dos enfoques. Se deben averiguar tanto la forma como las cargas del polipéptido PRO para elucidar la estructura de la molécula y determinar su(s) sitio(s) activo(s). Menos frecuentemente, se puede lograr la información útil relacionada con la estructura del polipéptido por modelado basándose en la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la información de la estructura relevante se usa para diseñar moléculas análogas al polipéptido PRO o para identificar inhibidores eficaces. Algunos Ejemplos útiles del diseño de fármacos racionales pueden incluir moléculas que mejoren la actividad o la estabilidad como se muestra en Braxton y Wells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992) o que actúen como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos nativos como se muestra en Athauda y col., J. Biochem., 113: 742-746 (1993).

Es también posible aislar un anticuerpo con una diana específica, seleccionado por ensayo funcional, como se describe anteriormente, y resolver entonces su estructura cristalina. Este enfoque, en principio, produce un núcleo farmacológico a partir del cual se puede basar el diseño de un fármaco. Es posible englobar la cristalografía de proteínas generando anticuerpos anti idiotipo (anti ids) frente a un anticuerpo farmacológicamente activo, funcional. Como imagen especular de una imagen especular, se podría esperar que el sitio de unión de los anti ids fuera análogo del receptor original. El anti id se podría usar entonces para identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían así como núcleo farmacológico.

En virtud de la presente invención, puede haber disponibles suficientes cantidades del polipéptido PRO para realizar tales estudios analíticos como cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia aminoacídica del polipéptido PRO proporcionado en la presente memoria descriptiva proporcionará una guía a los que empleen técnicas de modelado informático en lugar de o junto con la cristalografía de rayos X.

Ejemplo 13 Utilización de PRO224 para el cribado de compuestos

Se expresó el PRO224 en una célula desecha de proteínas de membrana y capaz de expresar PRO224. Se añaden las lipoproteínas de baja densidad que tienen una marca detectable para las células y se incuban durante un tiempo suficiente para la endocitosis. Se lavaron las células. Las células se analizaron, a continuación, por el marcaje unido a la membrana y dentro de la célula después de la lisis celular. La detección de las lipoproteínas de baja densidad dentro de la célula determina que el PRO224 se encuentra dentro de la familia de proteínas receptoras de lipoproteínas de baja densidad. Los miembros encontrados dentro de esta familia se utilizan, de esta manera, para el cribado de compuestos que afectan a estos receptores y, en particular, en la ingesta de colesterol mediante estos receptores.

Ejemplo 14 Capacidad de los polipéptidos PRO para inhibir la proliferación estimulada por el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) del crecimiento de células endoteliales

Se probó la capacidad de diversos polipéptidos PRO para inhibir la proliferación estimulada por VEGF. Específicamente, las células endoteliales de manera capilar de la corteza adrenal bovina ("ACE" en inglés) (procedentes de un cultivo primario, máximo 12-14 vueltas) se plaquearon en placas de microtitulación de 96 pocillos (Amersham Life Science) a una densidad de 500 células/pocillo por 100 \muL en DMEM con glucosa baja, suero de ternero al 10%, glutamina 2 mM, 1 x pen/strept y fungizona, suplementado con 3 ng/mL de VEGF. Los controles se plaquearon de la misma manera pero algunos no incluyeron VEGF. Se añadió una muestra de ensayo del polipéptido PRO de interés en un volumen de 100 \muL para un volumen final de 200 \muL. Las células se incubaron durante 6-7 días a 37ºC. Los medios se aspiraron y se lavaron las células con 1 x PBS. Se añadió una mezcla de reacción de fosfatasa ácida (100 \muL, acetato de sodio 0,1M, pH 5,5, Tritón-100 0,1%, p-nitrofenil fosfato 10 mM). Después de la incubación durante 2 horas a 37ºC, se paró la reacción mediante la adición de 10 \muL de NaOH 1 N. Se midió la OD en un lector de placas de microtitulación a 405 nm. Los controles fueron sin células, células solas, células + FGF (5 ng/mL), células + VEGF (3ng/ml), células + VEGF (3ng/mL) + TGF-\beta (1 ng/mL) y células + VEGF (3ng/mL) + LIF (5 ng/mL). (Se conoce que la TGF-\beta a una concentración de 1 ng/mL bloquea del 70-90% de la proliferación celular estimulada por VEGF).

Los resultados se obtuvieron calculando el porcentaje de inhibición de la proliferación celular estimulada por VEGF (3 ng/mL), determinada midiendo la actividad de la fosfatasa ácida a OD405 nm, (1) respecto a células sin estimulación, y (2) respecto a la referencia de inhibición de la TGF-\beta de la actividad estimulada por VEGF. Los resultados, según se muestran en la Tabla 2 de más abajo, son indicativos de la utilidad de los polipéptidos PRO en la terapia del cáncer y, específicamente, en la inhibición de la angiogénesis tumoral. Los valores numéricos (inhibición relativa) mostrados en la Tabla 2 se determinan mediante el cálculo del porcentaje de inhibición de la proliferación estimulada por VEGF por el polipéptido PRO respecto a células sin estimulación y, a continuación, dividiendo el porcentaje por el porcentaje de inhibición obtenido por TGF-\beta a 1 ng/mL que es conocida por bloquear del 70-90% de la proliferación celular estimulada por VEGF.

TABLA 2

Nombre PRO	Concentración de PRO	Inhibición relativa
PRO224	0,01%	101,0
PRO224	0,1%	65,0
PRO224	1,0%	23,0

Ejemplo 15 Potenciación de la hipertrofia neonatal de corazón inducida por PRO224

Este ensayo se diseña para medir la capacidad de polipéptidos PRO224 para estimular la hipertrofia de corazón neonatal.

Los miocitos cardíacos se obtuvieron procedentes de ratas Harlan Sprague Dawley de 1 día de edad. Las células (180 \muL a 7,5 x 10^{4} mL, suero < 0,1%, aislado de manera fresca) se añadieron en el día 1 sobre placas de 96 pocillos previamente recubiertas con DMEM/F12 + 4% FCS. Las muestras de ensayo que contenían el polipéptido PRO224 de ensayo o únicamente el medio de crecimiento (control negativo) (20 \muL/pocillo) se añadieron directamente a los pocillos en el día 1. A continuación, se añade el PGF (20 \muL/pocillo) en el día 2, a una concentración final de 10-6 M. Las células se tiñen, a continuación, en el día 4 y se marcan de manera visual en el día 5, en donde las células muestran un aumento de tamaño cuando se compara con los controles negativos se cuenta 0,0, células que muestran un aumento de tamaño de pequeño a moderado cuando se comparan con los controles negativos se cuentan 1,0 y las células que muestran un gran aumento de tamaño cuando se compara con los controles negativos se cuenta 2,0. Los resultados se muestran en la Tabla 9 de más abajo.

TABLA 9

Nombre PRO	Concentración PRO	Puntuación Potenciación Crecimiento
PRO224	0,01%	0,0
PRO224	0,1%	0,0
PRO224	1,0%	1,0

Ejemplo 16 Hibridación in situ

La hibridación in situ es una técnica poderosa y versátil para la detección y localización de secuencias de ácido nucleico en preparaciones celulares o tisulares. Puede ser útil, por ejemplo, para identificar sitios de expresión génica, analizar la distribución tisular de la transcripción, identificar y localizar una infección vírica, seguir cambios en la síntesis de un ARN específico y como ayuda en el mapeo cromosómico.

Se realizó la hibridación in situ siguiendo una versión optimizada del protocolo de Lu y Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994), usando ribosondas etiquetadas con P^{32} generadas por PCR. Brevemente, se cortaron los tejidos humanos fijados con formalina, en parafina, se les eliminó la parafina, las proteínas con proteinasa K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37ºC, y se procesaron adicionalmente para la hibridación in situ como se describe en Lu y Gillett, supra. Se generó una ribosonda etiquetada con UTP [P^{33}] a partir de un producto de PCR y se hibridó a 55ºC toda la noche. Se bañaron los portaobjetos en emulsión de seguimiento nuclear NTB2 y se expusieron 4 semanas.

Síntesis de ribosondas con P^{33}

Se secaron en una centrífuga de vacío 6,0 \mul (125 mCi) de UTP-P^{33} (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol). A cada tubo con UTP-P^{33}, se agregaron los siguientes ingredientes:

2,0 \mul de tampón de transcripción 5X

1,0 \mul de DTT (100 mM)

2,0 \mul de mezcla de NTP (2,5 mM:10 \mul de cada, GTP, CTP y ATP 10 mM + 10 \mul de H_{2}O)

1,0 \mul de UTP (50 \muM)

1,0 \mul de ARNsina

1,0 \mul de molde de ADN (1 \mug)

1,0 \mul de H_{2}O

1,0 \mul de ARN polimerasa (para productos de PCR T3 = AS, T7 = S, normalmente).

Se incubaron los tubos a 37ºC durante una hora. Se añadió 1,0 \mul de DNasa RQ1, seguido de una incubación a 37ºC durante 15 minutos. Se añadieron 90 \mul de TE (Tris 10 mM pH 7,6; EDTA 1 mM pH 8,0), y se transfirió la mezcla con una pipeta a un papel DE81. La solución restante se cargó en una unidad de ultracentrifugación Microcon-50, y se centrifugó usando el programa 10 (6 minutos). La unidad de filtración se invirtió en un segundo tubo y se centrifugó usando el programa 2 (3 minutos). Después del pulso de recuperación final, se añadieron 100 \mul de TE, se transfirió con una pipeta 1 \mul de producto final a un papel DE81 y se realizó un recuento en 6 ml de Biofluor II.

Se corrió la sonda en un gel de TBE/urea. Se añadieron 1-3 \mul de la sonda o 5 \mul de RNA Mrk III a 3 \mul del tampón de carga. Tras calentar a 95ºC calentar el bloque durante tres minutos, el gel se colocó inmediatamente en hielo. Se nivelaron los pocillos, se cargó la muestra, y se corrió a 180-250 voltios durante 45 minutos. Se envolvió el gel con revestimiento de saran y se expuso a una película XAR con una pantalla de intensificación al congelador a -70ºC de una hora a toda la noche.

Hibridación-P^{33} A. Pretratamiento de los cortes congelados

Los portaobjetos se sacaron del congelador, se colocaron en bandejas de aluminio y se descongelaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocaron en un incubador a 55ºC durante cinco minutos para reducir la condensación. Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en 4% de paraformaldehído en hielo en la campana extractora de gases, y se lavaron en SSS 0,5X durante 5 minutos, a temperatura ambiente (25 ml de SSC 20X + 975 ml de H_{2}O SQ). Después de eliminar las proteínas con 0,5 \mug/ml de proteinasa K durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de 10 mg/ml de solución madre en 250 ml de tampón de ARNasa sin ARNasa precalentado), los cortes se lavaron con SSC 0,5X durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los cortes se deshidrataron en etanol al 70%, 95%, 100%, 2 minutos en cada uno.

B. Pretratamiento de los cortes en parafina

Se eliminó la parafina de los portaobjetos, se colocaron en H_{2}O SQ, y se aclararon dos veces en SSC 2X a temperatura ambiente, durante 5 minutos cada vez. Se eliminaron las proteínas de los cortes con 20 \mug/ml de proteinasa K (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón de ARNasa sin ARNasa, 37ºC, 15 minutos) para embrión humano, o proteinasa K 8X (100 \mul en 250 ml de tampón de ARNasa, 37ºC, 30 minutos) para tejidos con formalina. Los aclarados posteriores en SSC 0,5X y la deshidratación se realizaron como se describe anteriormente.

C. Prehibridación

Se prepararon los portaobjetos en una caja de plástico recubierta con tampón Box (SSC 4X, 50% de formamida) para papel de filtro saturado. Se cubrió el tejido con 50 \mul de tampón de hibridación (3,75 g de sulfato de dextrano + 6 ml de H_{2}O SQ), se agitaron con un vórtex y se calentaron en el microondas durante 2 minutos con la tapa aflojada. Tras enfriar en hielo, se añadieron 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de SSS 20X y 9 ml de H_{2}O SQ, el tejido se agitó en el vórtex bien y se incubó a 42ºC durante 1-4 horas.

D. Hibridación

Se calentaron 1,0 x 10^{6} cpm de sonda y 1,0 de ARNt (50 mg/ml de solución madre) por portaobjetos a 95ºC durante 3 minutos. Los portaobjetos se enfriaron en hielo, y se añadieron 48 \mul de tampón de hibridación por portaobjetos. Después de agitar con el vórtex, se añadieron 50 \mul de mezcla de P^{33} a 50 \mul de prehibridación en el portaobjetos. Los portaobjetos se incubaron toda la noche a 55ºC.

E. Lavados

Se realizaron 2 lavados de 10 minutos con SSS 2X, EDTA a temperatura ambiente (400 ml de SSC 20X + 16 ml de EDTA 0,25 M, V_{f} = 4 l), seguidos de un tratamiento con ARNasa A a 37ºC durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón de ARNasa = 20 \mug/ml), se lavaron los portaobjetos 2 veces durante 10 minutos con SSC 2X, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones restrictivas de lavado fueron 2 horas a 55ºC, SSC 0,1X, EDTA (20 ml de SSC 20X + 16 ml de EDTA, V_{f} = 4 l).

F. Oligonucleótidos

El análisis in situ se llevó a cabo sobre una serie de secuencias de ADN descritas aquí. Los oligonucleótidos utilizados para estos análisis son los que siguen:

DNA33221-1133(PRO224)

p1 5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGCAGCGATGGCAGCGATGAGG-3' SEC ID Nº: 6

P2 5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACAGACGGGGCAGAGGGAGTG-3' SEC ID Nº: 7

G. Resultados

El análisis in situ se llevó a cabo con una diversidad de secuencias de ADN descritas en el presente documento. Los resultados de estos análisis son como sigue.

DNA33221-1133 (PRO224)

La expresión limitada en endotelio vascular en bazo fetal, bazo adulto, hígado fetal, tiroides adulta y nódulos linfoides adultos (chimpancé). Sitios adicionales para la expresión es el desarrollo en ganglios espinales. Los demás tejidos negativos.

Tejidos fetales humanos examinados (E12-E16 semanas) incluyen: placenta, cordón umbilical, hígado, riñón, adrenales, tiroides, pulmones, corazón, vasos mayores, esófago, estómago, intestino delgado, bazo, timo, páncreas, cerebro, ojo, cordón espinal, paredes corporales, pelvis y extremidades inferiores.

Tejidos humanos de adultos examinados: riñón (normal y en estado final), adrenal, miocardio, aorta, bazo, nódulo linfoide, páncreas, pulmón, piel, ojo (inc. retina), vejiga, hígado (normal, cirrótico y con fallo agudo).

Tejidos de primate no humanos

Tejidos de chimpancé: glándulas salivares, estómago, tiroides, paratiroides, piel, timo, ovario, nódulo linfoide;

Tejidos de Monos Rhesus: corteza cerebral, hippocampo, cerebelo, pene.

Depósito de material

Los siguientes materiales se han depositado con la American Type Culture Collection (Colección de cultivos tipo estadounidense), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EE.UU. (ATCC):

Material	Nº de Dep. ATCC	Fecha del Depósito
DNA33221-1133	ATCC 209363	16 de Septiembre de 1997

Estos depósitos se realizaron bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para el propósito del procedimiento de patente y las normativas conforme al mismo (Tratado de Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito. La ATCC dispondrá de los depósitos bajo los términos del Tratado de Budapest, y estarán sujetos a un acuerdo entre Genentech, Inc. y la ATCC, que garantiza la disponibilidad permanente y sin restricciones de la descendencia del cultivo del depósito al público bajo la emisión de la patente de EE.UU. pertinente o bajo la puesta pública de cualquiera de las solicitudes de patente de EE.UU. o extranjeras, lo que primero ocurra, y garantiza la disponibilidad de la descendencia a uno determinado por los EE.UU. Se autoriza al Comisario de patentes y marcas comerciales por la misma con arreglo a la 35 USC \NAK 122 y las normas del Comisario según la misma (incluyendo la 37 CFR \NAK 1.14 con una referencia particular a la 886 OG 638).

El apoderado de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en depósito muriera o se perdiese o destruyera cuando se cultive bajo las condiciones adecuadas, se reemplazara rápidamente los materiales bajo notificación con otro igual. La disponibilidad del material depositado no está construida como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos concedidos por la autoridad o por cualquier gobierno con arreglo a estas leyes sobre patentes.

La memoria descriptiva anteriormente escrita se considera suficiente para capacitar a cualquier experto en la materia a practicar la invención. La presente invención no está limitada en alcance por la construcción depositada, ya que la realización depositada está diseñada como una simple ilustración de ciertos aspectos de la invención y cualquiera de las construcciones que sean funcionalmente equivalentes entran dentro del alcance de esta invención. El depósito de material en la presente memoria descriptiva no constituye una admisión de que la descripción escrita en la presente memoria descriptiva contenida sea inadecuada para capacitar la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni está construida como limitación del alcance de las reivindicaciones de las ilustraciones específicas que representa. Es más, varias modificaciones de la invención además de las mostradas en la presente memoria descriptiva serán aparentes para los expertos en la materia a partir de la anterior descripción y entrarán dentro del alcance de las reivindicaciones añadidas.

<110> Genentech, Inc.

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<120> Polipéptidos secretados y de transmembrana y ácidos nucleicos que codifican los mismos.

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<130> CMD/FP5963038

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<140> EP 01127794.4

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<141> 2001-11-22

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<150> US 60/059.115

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<151> 1997-09-17

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<160> 7

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1210

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

1

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<210> 2

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<211> 282

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

3

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<210> 3

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<221> fuente

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<223> /nota = "Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética"

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<400> 3

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aagttccagt gccgcaccag tggc

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24

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<210> 4

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<221> fuente

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<223> /nota = "Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética"

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<400> 4

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ttggttccac agccgagctc gtcg

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24

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<210> 5

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<221> fuente

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<223> /nota = "Descripción de la Secuencia Artificial: Sintética"

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<400> 5

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gaggaggagt gcaggattga gccatgtacc cagaaagggc aatgccacc

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50

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<210> 6

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<211> 48

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<221> fuente

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<223> /nota = "Descripción de la Secuencia Artificial: Sonda para la hibridación in situ"

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<400> 6

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ggattctaat acgactcact atagggcgca gcgatggcag cgatgagg

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48

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<210> 7

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<211> 47

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<221> fuente

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<223> /nota = "Descripción de la Secuencia Artificial: Sonda para la hibridación in situ"

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<400> 7

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ctatgaaatt aaccctcact aaagggacag acggggcaga gggagtg

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47

Claims (24)

1. Ácido nucleico aislado que es o bien:

(a) ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEC ID Nº: 2) o la complementaria del mismo, en donde dicha identidad de secuencia se determina respecto a la longitud completa de las secuencias que son comparadas y en donde la expresión del polipéptido de entre los siguientes tejidos humanos:

Tejidos fetales (E12-E16 semanas): placenta, cordón umbilical, hígado, riñón, adrenales, tiroides, pulmones, corazón, vasos mayores, esófago, estómago, intestino delgado, bazo, timo, páncreas, cerebro, ojo, cordón espinal, paredes corporales, pelvis y extremidades inferiores; y

Tejidos humanos: riñón (normal y en estado final), adrenal, miocardio, aorta, bazo, nódulo linfoide, páncreas, pulmón, piel, ojo (inc. retina), vejiga, hígado (normal, cirrótico y con fallo agudo);

está limitada a endotelio vascular de bazo fetal, bazo adulto, hígado fetal y tiroides adultas y el desarrollo de ganglios espinales en un humano; o bien

(b) ácido nucleico que comprende la secuencia codificante de longitud completa del inserto de ácido nucleico (ADN 33221-1133) contenido en el número de acceso ATCC 209263.

2. Ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia nucleotídica mostrada en la Figura 1 (SEC ID Nº: 1) o la complementaria de la misma.

3. Ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende la secuencia codificante de longitud completa de la secuencia mostrada en la Figura 1 (SEC ID Nº: 1) o la complementaria de la misma.

4. Ácido nucleico de la reivindicación 1, el cual codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEC ID Nº: 2).

5. Ácido nucleico de la reivindicación 1, parte (a), en donde el nivel de identidad es de al menos el 90%.

6. Ácido nucleico de la reivindicación 5, en donde el nivel de identidad es de al menos el 95%.

7. Vector que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. Vector de la reivindicación 7 unido operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula hospedadora transformada con el vector.

9. Célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 7 o reivindicación 8.

10. Célula hospedadora de la reivindicación 9 en donde dicha célula es una célula CHO.

11. Célula hospedadora de la reivindicación 9 en donde dicha célula es una E. coli.

12. Célula hospedadora de la reivindicación 9 en donde dicha célula es una célula de levadura.

13. Procedimiento para la producción de un polipéptido que comprende cultivar la célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 9-12 bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido y recuperar dicho polipéptido del cultivo celular.

14. Polipéptido aislado que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mistrada en la Figura 2 (SEC ID Nº: 2), en donde la expresión del polipéptido de entre los siguientes tejidos humanos:

Tejidos fetales (E12-E16 semanas): placenta, cordón umbilical, hígado, riñón, adrenales, tiroides, pulmones, corazón, vasos mayores, esófago, estómago, intestino delgado, bazo, timo, páncreas, cerebro, ojo, cordón espinal, paredes corporales, pelvis y extremidades inferiores; y

Tejidos humanos: riñón (normal y en estado final), adrenal, miocardio, aorta, bazo, nódulo linfoide, páncreas, pulmón, piel, ojo (inc. retina), vejiga, hígado (normal, cirrótico y con fallo agudo);

está limitada a endotelio vascular de bazo fetal, bazo adulto, hígado fetal y tiroides adultas y el desarrollo de ganglios espinales.

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15. Polipéptido aislado de la reivindicación 14 que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEC ID Nº: 2).

16. Polipéptido aislado que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia codificante de longitud completa del inserto de ácido nucleico (ADN 33221-1133) contenido en el número de acceso ATCC209263, en donde la expresión del polipéptido de entre los siguientes tejidos humanos:

Tejidos fetales (E12-E16 semanas): placenta, cordón umbilical, hígado, riñón, adrenales, tiroides, pulmones, corazón, vasos mayores, esófago, estómago, intestino delgado, bazo, timo, páncreas, cerebro, ojo, cordón espinal, paredes corporales, pelvis y extremidades inferiores; y

Tejidos humanos: riñón (normal y en estado final), adrenal, miocardio, aorta, bazo, nódulo linfoide, páncreas, pulmón, piel, ojo (inc. retina), vejiga, hígado (normal, cirrótico y con fallo agudo);

está limitada a endotelio vascular de bazo fetal, bazo adulto, hígado fetal y tiroides adultas y el desarrollo de ganglios espinales.

17. Polipéptido aislado de la reivindicación 16 que consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia codificante de longitud completa del inserto de ácido nucleico (ADN 33221-1133) contenido en el número de acceso ATCC 209263.

18. Polipéptido de la reivindicación 14 o reivindicación 16, en donde el nivel de identidad es al menos del 90%.

19. Polipéptido de la reivindicación 18, en donde el nivel de identidad de secuencia es al menos del 95%.

20. Molécula quimérica que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19 fusionado con una secuencia aminoacídica heteróloga.

21. Molécula quimérica de la reivindicación 20 en donde dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una secuencia epítope tag.

22. Molécula quimérica de la reivindicación 20 en donde dicha secuencia aminoacídica heteróloga es una región Fc de una inmunoglobulina.

23. Anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de acuerdo con la reivindicación 15 o reivindicación 17.

24. Anticuerpo de la reivindicación 23, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.