ES2248458T3 - Polipeptido secretado y acidos nucleicos que lo codifican. - Google Patents

Abstract

Ácido nucleico aislado, el cual codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de residuos aminoácidos 1 ó 17 a 1029, inclusive, de la Figura 2 (SEC. Nº ID.: 2) y/o el polipéptido de longitud completa o maduro codificado por el inserto de ADNc (DNA77631-2537) del Depósito de laATCC Nº 203651, o que es complementario de la misma, en donde dicha identidad de secuencia se determina usando

Description

Polipéptido secretado y ácidos nucleicos que lo codifican.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general a la identificación y aislamiento de ADN original y a la producción recombinante de nuevos polipéptidos.

Antecedentes de la invención

Las proteínas extracelulares tienen papeles importantes en, entre otras cosas, la formación, diferenciación y mantenimiento de los organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, la proliferación, migración, diferenciación, o interacción con otras células, está típicamente gobernado por información recibida de otras células y/o del entorno inmediato. Esta información se transmite a menudo mediante polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos, y hormonas), los cuales, a su vez, son recibidos e interpretados por diversos receptores o proteínas unidas a membranas celulares. Estos polipéptidos secretados o moléculas señalizadoras normalmente pasan a través de la vía secretora celular para alcanzar su sitio de acción en el entorno extracelular.

Las proteínas secretadas tienen diversas aplicaciones industriales, incluyendo como fármacos, agentes diagnósticos, biosensores y bioreactores. La mayoría de los fármacos proteicos disponibles en la actualidad, tales como los agentes trombolíticos, interferones, interleukinas, eritropoyetinas, factores estimuladores de colonias, y otras varias citoquinas, son proteínas secretoras. Sus receptores, que son proteínas de membrana, también tienen potencial como agentes terapéuticos o de diagnóstico. Tanto la industria como el mundo académico están realizando esfuerzos para identificar nuevas proteínas nativas secretadas. Muchos esfuerzos se centran en el examen de bibliotecas de ADN recombinante de mamíferos para identificar las secuencias codificantes de nuevas proteínas secretadas. Los ejemplos de procedimientos y técnicas de examen se describen en la literatura [ver, por ejemplo, Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:7108-7113 (1996); Patente estadounidense nº 5.536.637)].

Las proteínas unidas a membrana y los receptores pueden jugar papeles importantes en, entre otras cosas, la formación, diferenciación y mantenimiento de los organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, la proliferación, migración, diferenciación, o interacción con otras células, está típicamente gobernado por información recibida de otras células y/o del entorno inmediato. Esta información se transmite a menudo mediante polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos, y hormonas), los cuales, a su vez, son recibidos e interpretados por diversos receptores o proteínas unidas a membranas celulares. Tales proteínas unidas a membrana y receptores celulares incluyen, pero no se limitan a, los receptores de citoquinas, las quinasas de receptores, las fosfatasas de receptores, los receptores implicados en las interacciones célula-célula, y las moléculas adhesinas celulares, tales como las selectinas e integrinas. Por ejemplo, la transducción de señales que regula el crecimiento y diferenciación celular está regulada, en parte, por la fosforilación de varias proteínas celulares. Las quinasas de tirosina de proteínas, enzimas que catalizan ese proceso, pueden actuar también como receptores del factor de crecimiento. Los ejemplos incluyen el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y el receptor del factor de crecimiento del nervio.

Las proteínas unidas a membrana y las moléculas de receptor tienen varias aplicaciones industriales, incluyendo como agentes farmacéuticos y de diagnóstico. Por ejemplo, las inmunoadhesinas del receptor pueden emplearse como agentes terapéuticos para bloquear interacciones receptor-ligando. Las proteínas unidas a membrana pueden usarse también en la búsqueda de péptidos o moléculas pequeñas inhibidores potenciales de la interacción receptor/ligando relevante.

Tanto la industria como el mundo académico están realizando esfuerzos para identificar nuevas proteínas receptoras o unidas a membrana. Muchos esfuerzos se centran en el examen de bibliotecas de ADN recombinante de mamíferos para identificar las secuencias codificantes de nuevas proteínas receptoras o unidas a membrana.

PRO3434

Tanto la industria como el mundo académico están realizando esfuerzos para identificar nuevas proteínas secretadas nativas. Muchos esfuerzos se centran en el examen de bibliotecas de ADN recombinante de mamíferos para identificar las secuencias codificantes de nuevas proteínas secretadas. En ésta nosotros describimos la identificación y caracterización de nuevos polipéptidos secretados, denominados en ésta como polipéptidos PRO3434.

Resumen de la invención PRO3434

Se ha identificado un clon de ADNc (DNA77631-2537) que codifica un nuevo polipéptido designado en la presente solicitud como "PRO3434".

En una realización, tal como se define en las reivindicaciones, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende ADN que codifica un polipéptido PRO3434.

En un aspecto, tal como se define en las reivindicaciones, la invención concierne a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende (a) ADN que codifica un polipéptido que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos aproximadamente el 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia, lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de residuos aminoácidos desde el 1 o aproximadamente 17 hasta aproximadamente el 1029, inclusive, de la Figura 2 (SEC. ID. Nº: 2), o el complementario del ADN de (a).

En un aspecto específico, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende el ADN que codifica un polipéptido PRO3434, con o sin la secuencia señal N-terminal y/o la metionina iniciadora, o es complementario a tal molécula de ácido nucleico codificante. De forma tentativa, se ha identificado que el péptido señal se extiende desde la posición de aminoácido 1 hasta aproximadamente la posición de aminoácido 16 en la secuencia de la Figura 16 (SEC. ID. Nº: 2).

En otra realización, tal como se define en las reivindicaciones, la invención proporciona el polipéptido PRO3434 aislado codificado por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aisladas definidas en ésta más arriba.

En un aspecto específico, tal como se define en las reivindicaciones, la invención proporciona el polipéptido PRO3434 de la secuencia nativa aislado, el cual, en una realización incluye la secuencia de aminoácidos que comprende los residuos desde 1 o aproximadamente 17 hasta 1029 de la Figura 2 (SEC. ID. Nº: 2).

En otro aspecto, la invención concierne a un polipéptido PRO3434 aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos aproximadamente el 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia, los más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos desde el residuo 1 o aproximadamente 17 hasta aproximadamente el 1029, inclusive, de la Figura 2 (SEC. ID. Nº: 2).

Realizaciones adicionales

En otras realizaciones de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden el ADN que codifica cualquiera de los polipéptido descritos en ésta. También se proporcionan células huésped que comprenden cualquiera de tales vectores. A modo de ejemplo, las células huésped podrían ser células CHO, E. coli, o levadura. Se proporciona además un proceso para producir cualquiera de los polipéptidos descritos en ésta, y comprende: cultivar células huésped en condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido deseado, y recuperar el polipéptido deseado del cultivo celular.

En otras realizaciones, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los polipéptidos descritos en ésta fusionado con un polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogos. Los ejemplos de tales moléculas quiméricas comprenden cualquier de los polipéptidos descrito en ésta fusionado con una secuencia etiqueta de epítopo o una región Fc de una inmunoglobulina.

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo, el cual específicamente se une a cualquiera de los polipéptidos descritos más arriba o más abajo. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo humanizado, fragmento de anticuerpo o anticuerpo de cadena sencilla.

En otras realizaciones, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PRO.

En un aspecto, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos aproximadamente el 81% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos aproximadamente el 82% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 83% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 84% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 85% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 86% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 87% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 88% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 89% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 91% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 92% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 93% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 94% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 96% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 97% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 98% de identidad de secuencia, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia respecto (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa tal como se describe en ésta, una secuencia de aminoácidos que carece del péptido señal tal como se describe en ésta, un dominio extracelular de una proteína transmembrana, con o sin el péptido señal, tal como se describe en ésta, o cualquier otro fragmento definido específicamente de la secuencia de aminoácidos de longitud completa, tal como de descubre en ésta, o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a).

En otra realización, la invención proporciona polipéptido PRO aislado codificado por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aisladas identificadas en ésta más arriba.

En un cierto aspecto, la invención concierne a un polipéptido PRO aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos aproximadamente el 81% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos aproximadamente el 82% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 83% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 84% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 85% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 86% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 87% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 88% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 89% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 91% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 92% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 93% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 94% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 96% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 97% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 98% de identidad de secuencia, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia respecto un polipéptido PRO que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud completa tal como se describe en ésta, una secuencia de aminoácidos que carece de péptido señal tal como se describe en ésta, un dominio extracelular de una proteína transmembrana, con o sin el péptido señal, tal como se describe en esta, o cualquier otro fragmento específicamente definido de la secuencia de aminoácidos de longitud completa, tal como se descubre
en ésta.

En un aspecto adicional, la invención concierne a un polipéptido PRO aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos aproximadamente el 81% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos aproximadamente el 82% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 83% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 84% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 85% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 86% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 87% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 88% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 89% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 91% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 92% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 93% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 94% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 96% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 97% de identidad de secuencia, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 98% de identidad de secuencia, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia respecto de una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los ADNc de proteína humana depositados con la ATCC tal como se describe en ésta.

En un aspecto específico, la invención proporciona un polipéptido PRO aislado sin la secuencia señal N-terminal y/o la metionina de iniciación, y está codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica tal secuencia de aminoácidos tal como se describe en ésta más arriba. También se describen en ésta los procesos para producir los mismos, en donde esos procesos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector, el cual comprende la molécula de ácido nucleico codificante apropiada en condiciones apropiadas para la expresión del polipéptido PRO, y recuperar el polipéptido PRO del cultivo de células.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una secuencia de nucleótido (SEC. ID. Nº: 1) de una secuencia nativa de cADN de PRO3434, en donde la SEC. ID. Nº 1 es un clon denominado en ésta "DNA77631-2537)".

La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC. ID. Nº: 2) derivada de la secuencia codificante de la SEC. ID. Nº: 1 y mostrada en la Figura 1.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Los términos "polipéptido PRO" y "PRO" tal como se usan en ésta, y cuando están seguidos inmediatamente por una designación numérica, se refieren a varios polipéptidos, en donde la designación completa (es decir, PRO/número) se refiere a secuencias de polipéptido específicas, tal como se describe en ésta. Los términos "polipéptido PRO/número" y "PRO/número", en donde el término "numero" se proporciona como una designación numérica, tal como se usa en ésta, abarca los polipéptidos de secuencia nativa y las variantes del polipéptido (las cuales se definen adicionalmente en ésta). Los polipéptidos PRO descritos en ésta podrían aislarse a partir de una variedad de fuentes, tal como tipos de tejido humano o a partir de otras fuentes, o prepararse mediante procedimientos recombinantes o sintéticos.

Un "polipéptido PRO de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el correspondiente polipéptido PRO derivado de la naturaleza. Tales polipéptidos PRO de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido PRO de secuencia nativa" abarca específicamente las formas truncadas o secretadas del polipéptido PRO específico (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular) que existen de forma natural, formas variantes que ocurren de forma natural (por ejemplo, formas cortadas y empalmadas de forma alternativa) y variantes alélicas del polipéptido que ocurren naturalmente. En varias realizaciones de la invención, los polipéptidos PRO de secuencia nativa descubiertos en ésta son polipéptidos maduros o de secuencia nativa de longitud completa que comprenden las secuencias de aminoácido de longitud completa mostradas en las figuras anexas. Los codones de inicio y detención se muestran en letra negrita y subrayados en las figuras. No obstante, aunque el polipéptido PRO descrito en las figuras anexas se muestra que empieza con residuos metionina, designados en ésta como la posición 1 de aminoácido en las figuras, es concebible y posible que otros residuos metionina, ubicados cadena arriba o cadena abajo respecto del aminoácido en la posición 1 en las figuras, pudieran emplearse como el residuo aminoácido inicial de los polipéptidos PRO.

El "dominio extracelular" o "ECD" del polipéptido PRO se refiere a una forma del polipéptido PRO que carece esencialmente de los dominios transmembrana y citoplasmático. Ordinariamente, el ECD del polipéptido PRO tendrá menos del 1% de tales dominios transmembrana y/o citoplasmático, y preferiblemente tendrá menos del 0,5% de tales dominios. Se entenderá que cualesquier dominios transmembrana identificados para los polipéptidos PRO de la presente invención se identifican de acuerdo con los criterios empleados rutinariamente en la técnica para identificar ese tipo de dominios hidrofóbicos. Los límites exactos de un dominio transmembrana podrían variar, pero lo más probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio tal como se ha identificado inicialmente en ésta. Por tanto, opcionalmente, un dominio extracelular de un polipéptido PRO podría contener desde aproximadamente 5 o menos residuos aminoácidos en cualquier extremo del límite del dominio transmembrana/dominio extracelular tal como se identifica en los ejemplos o en la especificación, y tales polipéptidos, con o sin el péptido señal asociado, y el ácido nucleico que lo codifica, se contemplan en las presente invención.

La ubicación específica de los "péptidos señal" de los varios polipéptidos PRO descubiertos en ésta se muestran en la presente especificación y/o en las figuras adjuntas. Debe destacarse, sin embargo, que el límite C-terminal de un péptido señal podría variar, aunque lo más probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del límite C-terminal del péptido señal tal como se ha identificado inicialmente en ésta, en donde el límite C-terminal del péptido señal podría identificarse de acuerdo con los criterios empleados rutinariamente en la técnica para identificar ese tipo de elemento de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6 (1997) y von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Más aún, se reconoce también que, en ciertos casos, el corte de una secuencia señal de un polipéptido secretado no es completamente uniforme, resultando en más de una especie secretada. Estos polipéptidos, cuando el péptido señal se corta dentro de no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del límite C-terminal del péptido señal tal como se ha identificado en ésta, y los polinucleótidos que los codifican, son contemplados por la presente invención.

"Variante de polipéptido PRO" significa un polipéptido PRO activo, tal como se define más arriba o más abajo, que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa tal como se descubre en ésta, una secuencia de polipéptido PRO que carece de péptido señal tal como se descubre en ésta, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el péptido señal, tal como se descubre en ésta, o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido PRO de longitud completa tal como se descubre en ésta. Tales variantes de polipéptido PRO incluyen, por ejemplo, los polipéptidos PRO en los que se añaden, o suprimen, uno o más residuos aminoácidos en los extremos N- o C-terminal de la secuencia de aminoácidos nativa de longitud completa. Ordinariamente, una variante de polipéptido PRO tendrá al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, preferiblemente al menos aproximadamente el 81% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 82% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 83% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 84% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 85% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 86% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 87% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 88% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 89% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 91% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 92% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 93% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 94% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 96% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 97% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente el 98% de identidad de secuencia de aminoácidos, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa y longitud completa tal como se descubre en ésta, una secuencia de polipéptido PRO que carece de péptido señal tal como se descubre en ésta, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el péptido señal, tal como se descubre en ésta, o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de polipéptido PRO de longitud completa tal como se descubre en ésta. Ordinariamente, las variantes de polipéptido PRO son de al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, a menudo de al menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 90 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, más a menudo de al menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, o más.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto las secuencias de polipéptido PRO identificadas en ésta se definen como el porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos en la secuencia de polipéptido PRO específica, después de alinear las secuencias e introducir discontinuidades, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y no considerando cualesquiera sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede conseguirse de varias formas que se hallan dentro de los conocimientos de la técnica, por ejemplo, usando programas de ordenador disponibles públicamente tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Aquéllos formados en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualesquier algoritmos necesarios para conseguir el alineamiento máximo a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se están comparando. Sin embargo, para los propósitos en ésta, los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos se generaron usando el programa de comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código fuente completo del programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa de ordenador para comparación de secuencias ALIGN-2 fue escrito por Genentech, Inc., y el código fuente mostrado en la Tabla 1 ha sido registrado con la documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, en donde está registrado con el número de registro estadounidense de derechos de autor TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o podría compilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1 siguiente. El programa ALIGN-2 debería compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencia son ajustados por el programa ALIGN-2 y no varían.

En las situaciones en que se emplea ALIGN-2 para la comparación de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia de aminoácidos A respecto, con, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B (la cual puede alternativamente describirse como una determinada secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto, con, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

en donde X es el número de residuos aminoácidos valorados como emparejamientos idénticos por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en ese alineamiento del programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A respecto B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto A. Como ejemplos de cálculos del % de identidad de secuencia de aminoácidos que usan este procedimiento, las Tablas 2 y 3 demuestran cómo calcular el % de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos denominada "Proteína de Comparación" respecto la secuencia de aminoácidos denominada "PRO", en donde "PRO" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido PRO hipotético, y la "Proteína de Comparación" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido con el que se compara el polipéptido "PRO" de interés, y "X", "Y" y "Z" representan cada uno diferentes residuos aminoácidos hipotéticos.

A menos que específicamente se afirme lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en ésta se obtienen como se ha descrito en el parágrafo inmediatamente precedente usando el programa de ordenador ALIGN-2. Sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos podrían obtenerse también tal como se describe más abajo usando el programa de ordenador WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST2 se ajustan a los valores por defecto. Aquéllos no ajustados a valores por defecto, es decir, los parámetros ajustables, se ajustan con los valores siguientes: "extensión de solapamiento" = 1, fracción de solapamiento = 0,125, nivel de palabra (T) = 11, y matriz de puntuación = BLOSUM62. Cuando se emplea WU-BLAST2, un valor de % de identidad de secuencia de aminoácidos se determina dividiendo (a) el número de residuos aminoácidos idénticos emparejados entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés, que tiene una secuencia derivada del polipéptido PRO nativo, y la secuencia de aminoácidos de comparación de interés (es decir, la secuencia con la que se está comparando el polipéptido PRO de interés, el cual podría ser una variante PRO del polipéptido) tal como es determinada por WU-BLAST2, por (b) el número total de residuos aminoácidos del polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la afirmación "un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos A que tiene o teniendo al menos el 80% de identidad de secuencia de aminoácidos respecto la secuencia de aminoácidos B", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia de aminoácidos a comparar de interés, y la secuencia de aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés.

El porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos podría determinarse también usando el programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencias podría descargarse de http://www.ncbi.nlm.nih.gov. NCBI-BLAST2 usa varios parámetros de búsqueda, en donde la totalidad de esos parámetros de búsqueda se ajustan a valores por defecto, incluyendo, por ejemplo, desenmascarar = sí, hebra = todas, ocurrencias esperadas = 10, mínima longitud de complejidad baja minimum = 15/5, valor e de múltiples pasadas = 0.01, constante para múltiples pasadas = 25, descarte para el alineamiento discontinuo final = 25 y matriz de puntuación = BLOSUM62.

En las situaciones en que se emplea NCBI-BLAST2 para la comparación de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia de aminoácidos A respecto, con, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B (la cual puede alternativamente describirse como una determinada secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos respecto, con, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

en donde X es el número de residuos aminoácidos valorados como emparejamientos idénticos por el programa de alineamiento de secuencias NCBI-BLAST2 en ese alineamiento del programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A respecto B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B respecto A.

"Polinucleótido variante de PRO" o "secuencia de ácido nucleico variante de PRO" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO activo tal como se define más abajo, y la cual tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa y longitud completa tal como se descubre en ésta, una secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa y longitud completa que carece del péptido señal tal como se descubre en ésta, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el péptido señal, tal como se descubre en ésta, o cualquier fragmento de una secuencia de polipéptido PRO de longitud completa tal como se descubre en ésta. Ordinariamente, un polinucleótido variante de PRO tendrá al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 81% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 82% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 83% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 84% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 85% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 86% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 87% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 88% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 89% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 91% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 92% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 93% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 94% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 96% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 97% de identidad de secuencia de ácido nucleico, más preferiblemente al menos aproximadamente el 98% de identidad de secuencia de ácido nucleico y aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa y longitud completa tal como se descubre en ésta, una secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa y longitud completa que carece del péptido señal tal como se descubre en ésta, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el péptido señal, tal como se descubre en ésta, o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido PRO de longitud completa tal como se descubre en ésta. Las variantes no abarcan la secuencia de nucleótidos nativa.

Ordinariamente, los polinucleótidos variantes de PRO son al menos de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, a menudo al menos de aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos de aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos de aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos de aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos de aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos de aproximadamente 210 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos de aproximadamente 240 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos de aproximadamente 270 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos de aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos de aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos de aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos de aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, o más.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" con respecto las secuencias de ácido nucleico que codifican PRO identificadas en ésta se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en la secuencia de secuencia de ácido nucleico PRO de interés, después de alinear las secuencias e introducir discontinuidades, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia. El alineamiento para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico puede conseguirse de varias formas que se hallan dentro de los conocimientos de la técnica, por ejemplo, usando programas de ordenador disponibles públicamente tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Sin embargo, para los propósitos en ésta, los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos se generaron usando el programa de comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código fuente completo del programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa de ordenador para comparación de secuencias ALIGN-2 fue escrito por Genentech, Inc., y el código fuente mostrado en la Tabla 1 ha sido registrado con la documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, en donde está registrado con el número de registro estadounidense de derechos de autor TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o podría compilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1 siguiente. El programa ALIGN-2 debería compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencia son ajustados por el programa ALIGN-2 y no varían.

En las situaciones en que se emplea ALIGN-2 para la comparación de secuencias de ácido nucleico, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia de ácido nucleico C respecto, con, o contra una determinada secuencia de ácido nucleico D (la cual puede alternativamente describirse como una determinada secuencia de ácido nucleico C que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de ácido nucleico respecto, con, o contra una determinada secuencia de ácido nucleico D) se calcula como sigue:

100 veces la fracción W/Z

en donde W es el número de nucleótidos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en ese alineamiento del programa de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la secuencia de ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de C respecto D no igualará el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de D respecto C. Como ejemplos de cálculos del % de identidad de secuencia de ácido nucleico que usan este procedimiento, las Tablas 4 y 5 demuestran cómo calcular el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico denominada "ADN de Comparación" respecto la secuencia de ácido nucleico denominada "ADN-PRO", en donde "ADN-PRO" representa una secuencia de ácido nucleico hipotética que codifica PRO, y "ADN de Comparación" representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico con la que se compara la molécula de ácido nucleico "ADN-PRO" de interés, y "N", "L" y "V" representan cada uno diferentes nucleótidos hipotéticos.

A menos que específicamente se afirme lo contrario, todos los valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico usados en ésta se obtienen como se ha descrito en el parágrafo inmediatamente precedente usando el programa de ordenador ALIGN-2. Sin embargo, los valores de % de identidad de secuencia de ácido nucleico podrían obtenerse también tal como se describe más abajo usando el programa de ordenador WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST2 se ajustan a los valores por defecto. Aquéllos no ajustados a valores por defecto, es decir, los parámetros ajustables, se ajustan con los valores siguientes: "extensión de solapamiento" = 1, fracción de solapamiento = 0,125, nivel de palabra (T) = 11, y matriz de puntuación = BLOSUM62. Cuando se emplea WU-BLAST2, un valor de % de identidad de secuencia de ácido nucleico se determina dividiendo (a) el número de nucleótidos idénticos emparejados entre la secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de interés, que tiene una secuencia derivada de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de secuencia nativa, y la molécula de ácido nucleico de comparación de interés (es decir, la secuencia con la que se está comparando la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de interés, la cual podría ser una variante del polinucleótido de PRO) tal como es determinada por WU-BLAST2, por (b) el número total de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la afirmación "una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico A que tiene o teniendo al menos el 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico respecto la secuencia de ácido nucleico B", la secuencia de ácido nucleico A es la molécula de ácido nucleico de interés a comparar, y la secuencia de ácido nucleico B es la secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO de interés.

El porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico podría determinarse también usando el programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencias podría descargarse de http://www.ncbi.nlm.nih.gov. NCBI-BLAST2 usa varios parámetros de búsqueda, en donde la totalidad de esos parámetros de búsqueda se ajustan a valores por defecto, incluyendo, por ejemplo, desenmascarar = sí, hebra = todas, ocurrencias esperadas = 10, mínima longitud de complejidad baja minimum = 15/5, valor e de múltiples pasadas = 0.01, constante para múltiples pasadas = 25, descarte para el alineamiento discontinuo final = 25 y matriz de puntuación = BLOSUM62.

En las situaciones en que se emplea NCBI-BLAST2 para la comparación de secuencias de ácido nucleico, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia de ácido nucleico C respecto, con, o contra una determinada secuencia de ácido nucleico D (la cual puede alternativamente describirse como una determinada secuencia de ácido nucleico C que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de ácido nucleico respecto, con, o contra una determinada secuencia de ácido nucleico D) se calcula como sigue:

100 veces la fracción W/Z

en donde W es el número de nucleótidos puntuados como emparejamientos idénticos por el programa de alineamiento de secuencias NCBI-BLAST2 en ese alineamiento del programa de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la secuencia de ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de C respecto D no igualará el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de D respecto C.

En otras realizaciones, los polinucleótido de variantes de PRO son moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido PRO activo, y que son capaces de hibridarse, preferiblemente en condiciones de hibridación y lavado rigurosas, con secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido PRO de longitud completa tal como se descubre en ésta. Los polipéptidos variantes de PRO podrían ser aquéllos que están codificados por un polinucleótido variante de PRO.

El término "positivos", en el contexto de comparación de secuencia realizada tal como se ha descrito más arriba, incluye los residuos en las secuencias comparadas que no son idénticos pero que tienen propiedades similares (por ejemplo, de resulta de sustituciones conservadoras, consultar la Tabla 6 más adelante). Para los propósitos en ésta, el valor del % de positivos se determina dividiendo (a) el número de residuos aminoácidos que puntúan un valor positivo entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés, que tiene una secuencia derivada de la secuencia del polipéptido PRO nativo, y la secuencia de aminoácidos de interés de la comparación (es decir, la secuencia de aminoácidos con la que se está comparando la secuencia del polipéptido PRO), tal como se determina en la matriz BLOSUM62 de WU-BLAST-2, por (b) el número total de residuos aminoácidos del polipéptido PRO de interés.

A menos que se afirme específicamente lo contrario, el valor del % de positivos se calcula como se describió en el parágrafo inmediatamente precedente. Sin embargo, en el contexto de las comparaciones de identidad de secuencia de aminoácidos realizadas tal como se ha descrito más arriba para ALIGN-2 y NCBI-BLAST-2, incluye los residuos aminoácidos en las secuencias comparadas que no sólo son idénticos, sino que también tienen propiedades similares. Los residuos aminoácidos que puntúan un valor positivo respecto un residuo aminoácido de interés, son aquéllos que, o son idénticos al residuo aminoácido de interés, o son una sustitución preferida (tal como se definen en la Tabla 6 más abajo) del residuo aminoácido de interés.

Para las comparaciones de secuencias de aminoácidos que usan ALIGN-2 o NCBI-BLAST2, el % de positivos de una determinada secuencia de aminoácidos A respecto, con, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B (la cual puede alternativamente describirse como una determinada secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un cierto % de positivos respecto, con, o contra una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

en donde X es el número de residuos aminoácidos que puntúan un valor positivo, tal como se ha definido más arriba por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 o NCBI-BLAST2 en ese alineamiento del programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la secuencia de aminoácidos B, el % de positivos de A respecto B no igualará el % de positivos de B respecto A.

"Aislado", cuando se usa para describir los varios polipéptidos descubiertos en ésta, significa un polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que típicamente interferirían con los usos terapéuticos y diagnósticos del polipéptido, y podrían incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos y no proteicos. En las realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará hasta (1) un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un "sequenator" de copa rotatoria, o (2) hasta su homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. No obstante, ordinariamente, el polipéptido aislado se preparará al menos mediante un paso de purificación.

Un ácido nucleico que codifica un polipéptido PREO "aislado", u otro ácido nucleico que codifica un polipéptido, es una molécula de ácido nucleico que está identificada y separada de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que está ordinariamente asociada en la fuente natural del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido es distinta que la forma o disposición en la cual se halla en la naturaleza. Por tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido se distinguen de la molécula de ácido nucleico específica que codifica el polipéptido tal como ésta existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido incluye las moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido incluidas en células que normalmente el polipéptido cuando, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de la de las células naturales.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia operativamente unida en un determinado organismo huésped. Las secuencias de control que son apropiadas para los procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión de ribosomas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.

El ácido nucleico está "operativamente unido" cuando se coloca en relación funcional con otro secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una pre-secuencia o líder secretor está unida operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si está ubicado de forma que facilita la traducción. Generalmente, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas en la fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen porque se contiguos. La unión se consigue mediante ligación en los sitios de restricción convenientes. Si no existen tales sitios, se usan adaptadores o conectores de oligonucleótido de acuerdo con la práctica convencional.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-PRO sencillos (incluyendo los anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes), las composiciones de anticuerpo anti-PRO con especificidad poliepitópica, los anticuerpos anti-PRO de cadena sencilla, y los fragmentos de anticuerpos anti-PRO (ver más abajo). El término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en ésta se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que constituyen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren de forma natural, las cuales podrían estar presentes en cantidades menores.

La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación es fácilmente determinable por alguien con formación ordinaria en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, de la temperatura de lavado, y de la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más elevadas para una hibridación apropiada, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para hibridarse de nuevo cuando hay hebras complementarias presentes en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, mayor será la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se concluye que temperaturas relativas más elevadas tenderán a hacer más rigurosas las condiciones de reacción, mientras que temperaturas más bajas las harán menos. Para detalles adicionales y explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, consultar Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

Las "condiciones de rigurosidad" o "condiciones de rigurosidad elevadas", tal como se definen en ésta, podrían identificarse como aquéllas que: (1) emplean una fuerza iónica baja y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/0,1% de dodecilsulfato sódico a 50ºC; (2) emplean un agente desnaturalizante durante la hibridación, tal como la formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con 0,1% de albúmina de suero bovino/0,1% de Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, 5\times SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato sódico, 5\times solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), 0,1% de SDS, y 10% de sulfato de dextrano 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2\times SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y 50% de formamida a 55ºC, seguidos por un lavado con elevada rigurosidad consistente en 0,1\times SSC que contiene EDTA a 55ºC.

Las "condiciones de rigurosidad moderada" podrían identificarse como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas más arriba. Un ejemplo de condiciones de rigurosidad moderada es la incubación durante la noche a 37ºC en una solución que comprende: 20% de formamida, 5\times SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5\times solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, seguida por el lavado de los filtros en 1\times SSC a aproximadamente 37-50ºC. El especialista capacitado reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc, según sea necesario para acomodar factores tales como la longitud de la sonda y similares.

El término "marcado con epítopo", cuando se usa en ésta, se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido PRO fusionado a un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene bastantes residuos como para proporcionar un epítopo contra el que puede prepararse un anticuerpo, aunque es lo bastante corto como para no interferir con la actividad del polipéptido al que se fusiona. El polipéptido etiqueta preferiblemente también es bastante único, de forma que el anticuerpo sustancialmente no reaccione de forma cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos etiqueta apropiados generalmente tiene al menos seis residuos aminoácidos y usualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos aminoácidos (preferiblemente entre aproximadamente 10 y 20 residuos aminoácidos).

Tal como se usa en ésta, el término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras del dominio constante de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada, la cual es distinta del sitio de reconocimiento y unión de antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácido contigua que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina podría obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, o IgG-4, la IgA (incluyendo la IgA-1 y la IgA-2), la IgE, la IgD o la IgM.

"Activo" o "actividad" para los propósitos en ésta se refiere a la(s) forma(s) de un polipéptido PRO que retienen una actividad biológica y/o inmunológica de PRO nativo o que ocurre naturalmente, en donde actividad "biológica" se refiere a una función biológica (bien inhibidora o estimuladora) causada por un PRO nativo o que ocurre naturalmente, y distinta de la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico poseído por un PRO nativo o que ocurre naturalmente, y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico poseído por un PRO nativo o que ocurre naturalmente.

El término "antagonista" se usa en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que parcial o completamente bloquea, inhibe, o neutraliza una actividad biológica de un polipéptido PRO nativo tal como se descubre en ésta. De forma similar, el término "agonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica de un polipéptido PRO nativo tal como se descubre en ésta. Las moléculas agonistas o antagonistas apropiadas incluyen específicamente los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, fragmentos o variantes de la secuencia de aminoácidos de polipéptidos PRO nativos, péptidos, oligonucleótidos antisentido, pequeñas moléculas orgánicas, etc, agonistas o antagonistas. Los procedimientos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido PRO podrían comprender poner en contacto un polipéptido PRO con una molécula agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el
polipéptido PRO.

"Tratamiento" se refiere a ambos, tratamiento terapéutico y a medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o retardar (aliviar) la condición patológica o trastorno tratado. Los que necesitan el tratamiento incluyen los que ya padecen el trastorno así como aquéllos proclives a padecer el trastorno o aquéllos en los que debe prevenirse el trastorno.

Administración "crónica" se refiere a la administración de los agentes de modo continuo en oposición a un modo agudo, con objeto de mantener el efecto (actividad) terapéutica inicial durante un período de tiempo prolongado. La administración "intermitente" es un tratamiento que no se aplica consecutivamente sin interrupción, sino que, en cambio, es de naturaleza cíclica.

"Mamífero", para los propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo los humanos, los animales domésticos y de granja, y los animales de zoo, deportes o mascotas, tales como los perros, gatos, terneras, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferiblemente, el mamífero es un humano.

La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y la consecutiva en cualquier orden.

"Portadores", tal como se usa en ésta incluye los portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o mamífero que se está exponiendo a los mismos, en las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen los tampones tales como el fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; los antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; los polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); las proteínas, tales como la albúmina de suero bovino, la gelatina, o las inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como la glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares alcohol tales como el manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como el sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como el TWEEN, el polietilenglicol (PEG), y el PLURONICS™.

"Fragmentos de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región variable o unidora de antígeno del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv; los diacuerpos; los anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062[1995]); las moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y los anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos unidores de antígeno idénticos, denominados fragmentos "Facb", cada uno con un único sitio de unión de antígeno, y un fragmento "Fc" residual, una denominación que refleja la capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de combinación de antígeno y es todavía capaz de entrecruzar el antígeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión de antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación no covalente. Es en esta configuración que los tres CDR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión de antígeno sobre la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. Colectivamente, los seis CDR confieren especificidad de unión de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable sencillo (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicos para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir antígeno, aunque con una afinidad inferior a la del sitio de unión entero.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas procedentes de la región bisagra del anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. Se conocen también otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas podrían dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IGG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena única" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende además un eslabón polipeptídico entre los dominios V_{H} y V_{L}, el cual permite al sFv formar la estructura deseada para la unión de antígeno. Para una revisión sobre los sFv, consultar Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Eds. Rosenburg y Moore, Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión de antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica (V_{H}-V_{L}). Mediante el uso de un eslabón que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, los dominios están forzados a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión de antígeno. Los diacuerpos se describen más detalladamente en, por ejemplo, EP-404.097; WO93/11.161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separada y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos y terapéuticos del anticuerpo, y podrían incluir los enzimas, las hormonas, y otros solutos proteicos y no proteicos. En las realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más del 95% en peso de anticuerpo según se determina mediante el procedimiento de Lowry, y más preferiblemente más del 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un "sequenator" de copa rotatoria, o (3) hasta su homogeneidad mediante SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras, usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, puesto que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, ordinariamente, el anticuerpo aislado se preparará al menos mediante un paso de purificación.

La palabra "marca" cuando se usa en ésta se refiere a un compuesto o composición detectable, el cual está conjugado directa o indirectamente al anticuerpo con objeto de generar un anticuerpo "marcado". La marca podría ser detectable por sí misma (por ejemplo, marcas con radioisótopo o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, podría catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable.

Por "fase sólida" se quiere indicar una matriz no acuosa a la que puede adherirse el anticuerpo de la presente invención. Los ejemplos de fases sólidas abarcadas en ésta incluyen aquéllas formadas parcial o enteramente por vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico, y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía por afinidad). Este término incluye también una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como las descritas en la patente estadounidense nº 4.275.149.

Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta por varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos, la cual es útil para suministrar un fármaco (tal como un polipéptido PRO o un anticuerpo contra el mismo) a un mamífero. Los componentes del liposoma están comúnmente dispuestos en una formación de bicapa, similar a la disposición de los lípidos de las membranas biológicas.

Una "molécula pequeña" se define aquí como que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 500 dalton.

TABLA 1

1

TABLA 1 (continuación)

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17

TABLA 2

PRO	XXXXXXXXXXXXXXX	(Longitud = 15 aminoácidos)
Proteína de comparación	XXXXXYYYYYYY	(Longitud = 12 aminoácidos)
% de identidad de secuencia de aminoácidos =
\begin{minipage}[t]{160mm} (el número de residuos aminoácidos idénticamente concordantes entre las dos secuencias de polipéptidos tal como se determinó mediante ALIGN-2) dividida por (el número total de residuos aminoácidos del polipéptido PRO) = \end{minipage}
5 dividido por 15 = 33,3%

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3

PRO	XXXXXXXXXX	(Longitud = 10 aminoácidos)
Proteína de comparación	XXXXXYYYYYYZZYZ	(Longitud = 15 aminoácidos)
% de identidad de secuencia de aminoácidos =
\begin{minipage}[t]{160mm}(el número de residuos aminoácidos idénticamente concordantes entre las dos secuencias de polipéptidos tal como se determinó mediante ALIGN-2) dividida por (el número total de residuos aminoácidos del polipéptido PRO) = \end{minipage}
5 dividido por 10 = 50%

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4

ADN-PRO	NNNNNNNNNNNNNN	(Longitud = 14 nucleótidos)
ADN de comparación	NNNNNNLLLLLLLLLL	(Longitud = 16 nucleótidos)
% de identidad de secuencia de ácido nucleico =
\begin{minipage}[t]{160mm} (el número de nucleótidos idénticamente concordantes entre las dos secuencias de ácido nucleico tal como se determinó mediante ALIGN-2) dividido por (el número total de nucleótidos de la secuencia del ácido nucleico ADN-PRO) = \end{minipage}
6 dividido por 14 = 42,9%

TABLA 5

ADN-PRO	NNNNNNNNNNNN	(Longitud = 12 nucleótidos)
ADN de comparación	NNNNLLLVV	(Longitud = 9 nucleótidos)
% de identidad de secuencia de ácido nucleico =
\begin{minipage}[t]{160mm} (el número de nucleótidos idénticamente concordantes entre las dos secuencias de ácido nucleico tal como se determinó mediante ALIGN-2) dividido por (el número total de nucleótidos de la secuencia del ácido nucleico ADN-PRO) = \end{minipage}
4 dividido por 12 = 33,3%

II. Composiciones y procedimientos de la invención A. Polipéptidos PRO de Longitud Completa

La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos recién identificadas y aisladas que codifican polipéptidos denominados en la presente solicitud como polipéptidos PRO. En particular, se han identificado y aislado ADNc que codifican varios polipéptidos PRO, tal como se descubre con más detalle en los Ejemplos siguientes. Se destaca que a las proteínas producidas en rondas de expresión distintas se les podría asignar números PRO diferentes, pero el número UNQ es único para cualquier ADN dado y la proteína codificada, y no cambiará. Sin embargo, por motivo de simplicidad, en la presente especificación la proteína codificada por las moléculas de ácido nucleico nativas de longitud completa descubiertas en ésta, así como todos los homólogos nativos adicionales y variantes incluidas en la anterior definición de PRO, se denominarán como "PRO/número", con independencia de su origen o modo de preparación.

Tal como se descubre en los Ejemplos siguientes, se han depositado varios clones de ADNc en la ATCC. Las secuencias de nucleótidos reales de esos clones pueden ser fácilmente determinadas por el especialista capacitado mediante la secuenciación del clon depositado usando procedimientos rutinarios en la técnica. La secuencia de aminoácidos predicha puede determinarse a partir de la secuencia de nucleótidos usando conocimientos rutinarios. Para los polipéptidos PRO y los ácidos nucleicos codificantes descritos en ésta, los solicitantes han identificado la que se cree que es la pauta de lectura que mejor puede identificarse con la información de secuencia disponible en ese momento.

8. Polipéptidos PRO3434 de Longitud Completa

El clon DNA77631-2537 se aisló a partir de una biblioteca de tejido aórtico humano usando una técnica de caza que selecciona secuencias de nucleótidos que codifican proteínas secretadas. Hasta donde se sabe, la secuencia DNA77631-2537 codifica un factor nuevo denominado en ésta como PRO3434; usando el programa de ordenador para alineamiento de secuencias WU-BLAST2, no se revelaron identidades de secuencia con ninguna proteína conocida.

B. Variantes del Polipéptido PRO

Además de los polipéptidos PRO de secuencia nativa y longitud completa descritos en ésta, se contempla que pueden prepararse variantes de PRO. Las variantes de PRO pueden prepararse introduciendo los cambios de nucleótido apropiados en el ADN de PRO, y/o mediante la síntesis del polipéptido PRO deseado. Los especialistas en la técnica apreciarán que los cambios de aminoácido podrían alterar los procesos post-traducción del PRO, tales como cambiar el número o posición de los sitios de glicosilación o alterar las características de anclaje a membrana.

Las variaciones en el PRO de secuencia de longitud completa y nativo, o en varios dominios del PRO descrito en ésta, pueden hacerse, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas e instrucciones para mutaciones conservadoras y no conservadoras detalladas, por ejemplo, en la patente estadounidense nº 5.364.934. Las variaciones podrían ser una sustitución, supresión o inserción de uno o más codones que codifican el PRO, la cual resulta en un cambio en la secuencia de aminoácidos del PRO en comparación con el PRO de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es por sustitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del PRO. La guía para determinar qué residuo aminoácido podría insertarse, sustituirse o suprimirse sin afectar negativamente la actividad deseada podría hallarse comparando la secuencia del PRO con la de moléculas de proteína conocidas homólogas, y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos hechos en regiones de elevada homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de remplazar un aminoácido con otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como la sustitución de una leucina con una serina, es decir, sustituciones de aminoácidos conservadoras. Las inserciones y supresiones podrían opcionalmente estar en el rango de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida podría determinarse haciendo sistemáticamente inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia, y ensayando las variantes resultantes según la actividad exhibida por la secuencia nativa madura o de longitud
completa.

En ésta se proporcionan fragmentos de polipéptido PRO. Tales fragmentos podrían estar truncados en el extremo N-terminal o C-terminal, o podrían carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con la proteína nativa de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del polipéptido PRO.

Los fragmentos de PRO podrían prepararse mediante cualquiera de un cierto número de técnicas convencionales. Los fragmentos de péptido deseados podrían sintetizarse químicamente. Una estrategia alternativa implica generar fragmentos de PRO mediante digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con un enzima que se sabe corta las proteínas en sitios definidos por determinados residuos aminoácidos, o digiriendo el ADN con enzimas de restricción apropiados y aislando el fragmento deseado. Aún otra técnica apropiada implica aislar y amplificar un fragmento de ADN, que codifica un fragmento de polipéptido deseado, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En la PCR, en los cebadores de 5' y 3' se emplean oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN. Preferiblemente, los fragmentos de polipéptido PRO comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido PRO nativo descubierto en ésta.

En realizaciones concretas, las sustituciones conservadoras de interés se muestran en la Tabla 6 bajo el encabezamiento de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, entonces, en los productos examinados se introducen cambios más sustanciales, denominados "sustituciones de ejemplo" en la Tabla 6, o como se describe con más detalle más abajo en referencia a las clases de aminoácidos.

TABLA 6

Residuo original	Sustituciones de ejemplo	Sustituciones preferidas
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; lys; arg	gln
Asp (D)	glu	glu
Cys (C)	ser	ser
Gln (Q)	asn	asn
Glu (E)	asp	asp
Gly (G)	pro; ala	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; norleucina	leu
Leu (L)	norleucina; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	leu
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr (T)	ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; norleucina	leu

Se consiguen modificaciones sustanciales en la función o identidad inmunológica del polipéptido PRO seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que ocurren de forma natural se dividen en grupos en base a compartir propiedades de la cadena lateral:

(1)

hidrofóbica: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2)

hidrofílica neutra: cys, ser, thr;

(3)

ácida: asp, glu;

(4)

básica: asn, gln, his, lys, arg;

(5)

residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6)

aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Tales residuos sustituidos podrían introducirse también en los sitios de sustitución conservadora o, más preferiblemente, en los sitios restantes (no conservados).

Las variaciones pueden hacerse usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida a un sitio), el barrido con alanina, y la mutagénesis mediante PCR. La mutagénesis dirigida a un sitio [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], la mutagénesis mediante casete [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], la mutagénesis mediante selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London Ser A, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden emplearse con el ADN clonado para producir ADN variante de PRO.

También puede emplearse el análisis con aminoácido de barrido para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido preferidos están los aminoácidos neutros y relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen la alanina, la glicina, la serina, y la cisteína. La alanina es típicamente el aminoácido de barrido preferido de entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. La alanina es también típicamente preferida porque es el aminoácido más común. Además, frecuentemente se halla tanto enterrada como expuesta [Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución con alanina no rinde cantidades adecuadas de variante, puede usarse un aminoácido isotérico.

C. Modificaciones de PRO

Las modificaciones covalentes de PRO se incluyen dentro del ámbito de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos aminoácidos apuntados de un polipéptido PRO con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales del PRO. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para entrecruzar PRO con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su uso en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-PRO y viceversa. Los agentes entrecruzadores comúnmente usados incluyen, por ejemplo, el 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con el ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo los ésteres de disuccinimidilo tales como el 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales tales como el bis-N-maleimido-1,8-octano, y agentes tales como el metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos glutaminilo y asparaginilo respectivamente a los correspondientes residuos glutamilo y aspartilo, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido PRO, incluida dentro del ámbito de esta invención, comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del polipéptido. "Alterar el patrón de glicosilación nativo" se pretende, para los propósitos en ésta, que signifique suprimir uno o más grupos carbohidratos hallados en el PRO de secuencia nativa (bien suprimiendo el sitio de glicosilación subyacente o suprimiendo la glicosilación mediante medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el PRO de secuencia nativa. Además, la frase incluye los cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, que implican un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos grupos carbohidrato presentes.

La adición de sitios de glicosilación al polipéptido PRO podría conseguirse alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración podría hacerse, por ejemplo, mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos serina o treonina en el PRO de secuencia nativa(para sitios de glicosilación unidos a O). La secuencia de aminoácidos de PRO podría alterarse opcionalmente a través de cambios a nivel del ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido PRO en bases preseleccionadas de tal forma que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Otros medios para incrementar el número de grupos carbohidrato sobre los polipéptidos PRO es mediante acoplamiento químico o enzimático de los glicósidos al polipéptido. Tales procedimientos se describen en la técnica, por ejemplo, en WO87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).

La supresión de grupos carbohidratos presentes sobre el polipéptido PRO podría conseguirse química o enzimáticamente, o mediante sustitución por mutación de codones que codifican residuos aminoácidos que sirven como dianas para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química son conocidas en la técnica y son descritas, por ejemplo, por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). El corte enzimático de grupos carbohidratos sobre polipéptidos puede conseguirse mediante el uso de una variedad de endo- y exoglucosidasas, tal como describen Thotakura et al., Meth. Enzyvol., 138:350 (1987).

Otro tipo de modificación covalente de PRO comprende unir el polipéptido PRO a una de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, o polioxialquilenos, en la forma establecida en las patentes estadounidenses nº 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

El PRO de la presente invención podría también modificarse de manera que forme una molécula quimérica que comprenda el PRO fusionado a otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos.

En una realización, una molécula quimérica tal comprende una fusión del PRO con un polipéptido marca que proporciona un epítopo al cual puede unirse selectivamente un anticuerpo anti-marca. La marca del epítopo se coloca generalmente en el extremo amino o carboxilo-terminal del PRO. La presencia de tales formas del PRO marcadas con epítopo puede detectarse usando un anticuerpo contra el polipéptido marca. También, la provisión de la marca del epítopo permite que el PRO sea fácilmente purificado mediante purificación por afinidad usando un anticuerpo anti-marca u otro tipo de matriz de afinidad que se une a la marca del epítopo. Varios polipéptidos marca y sus anticuerpos respectivos son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen las marcas poli-histidina (poli-hys) o poli-histidina-glicina (poli-hys-gly); el polipéptido marca HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la marca c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 contra los mismos [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y la glicoproteína D (gD) del virus Herpes Simplex y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, (6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos marca incluyen el péptido-Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido del epítopo KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido del epítopo de la \alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y la marca del péptido de la proteína del gen 10 del T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].

En una realización alternativa, la molécula quimérica podría comprender una fusión del PRO con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también denominada como "inmunoadhesina"), una fusión tal podría ser con la región Fc de una molécula IgG. Las fusiones de Ig preferiblemente incluyen la sustitución de una forma soluble (con el dominio transmembrana suprimido o inactivado) de un polipéptido PRO en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En una realización particularmente preferida, la fusión con inmunoglobulina incluye las regiones bisagra, CH2 y CH3, o bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción de fusiones con inmunoglobulina consultar también la patente estadounidense nº 5.428.130 concedida el 27 de junio de 1995.

D. Preparación del PRO

La descripción a continuación se refiere principalmente a la producción de PRO mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico de PRO. Se contempla, por supuesto, que pudieran emplearse procedimientos alternativos para preparar el PRO, los cuales son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de PRO, o porciones de la misma, podrían producirse mediante síntesis de péptido directa usando técnicas en fase sólida [consultar, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteína in vitro podría realizarse usando técnicas manuales o de forma automatizada. La síntesis automatizada podría realizarse, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems (Foster City, California) siguiendo las instrucciones del fabricante. Varias porciones del PRO podrían sintetizarse químicamente por separado y combinarse usando procedimientos químicos o enzimáticos para producir el PRO de longitud completa.

1. Aislamiento del ADN que codifica el PRO

El ADN que codifica el PRO podría obtenerse a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree posee el ARNm de PRO, y expresándolo hasta un nivel detectable. En consecuencia, el ADN de PRO humano puede obtenerse convenientemente de una biblioteca de ADNc preparada a partir tejido humano, tal como se describe en los ejemplos. El gen que codifica el PRO podría obtenerse también de una biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo, la síntesis automatizada de ácido nucleico).

Las bibliotecas pueden examinarse con sondas (tales como anticuerpos contra el PRO u oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) diseñados para codificarlo. El examen de la biblioteca genómica o de ADNc con la sonda seleccionada podría realizarse usando procedimientos estándares, tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un procedimiento alternativo para aislar el gen que codifica el PRO es usar la metodología de la PCR [Sambrook et al., ver más arriba; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1995)].

Los ejemplos siguientes describen técnicas para examinar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótido seleccionadas como sondas deberían tener la longitud suficiente y ser suficientemente inequívocas como para que los falsos positivos estén minimizados. El oligonucleótido está preferiblemente marcado, de forma que pueda detectarse a partir de su hibridación con ADN en la biblioteca que se está examinando. Los procedimientos de marcado son bien conocidos en la técnica, e incluyen el uso de marcas radiactivas como el ATP marcado con ^{32}P, la biotinilación o el marcado con enzima. Las condiciones de hibridación, incluyendo las de rigurosidad moderada y elevada rigurosidad, se proporcionan en Sambrook et al., ver más arriba.

Las secuencias identificadas en tales procedimientos de verificación de biblioteca pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas, depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de la secuencia (a nivel de aminoácido o de nucleótido) dentro de regiones definidas de la molécula o a lo largo de la longitud completa de la secuencia pueden determinarse usando procedimientos conocidos en la técnica y tal como se describe en ésta.

El ácido nucleico que tenga la secuencia que codifica la proteína podría obtenerse examinando bibliotecas seleccionadas de ADNc o genómicas usando, para la primera vez, la secuencia de aminoácidos deducida descubierta en ésta, y, si es necesario, usando procedimientos de extensión convencionales, tal como se describe en Sambrook et al., ver más arriba, para detectar precursores e intermedios de procesamiento del ARNm que podrían no haberse transcrito de forma inversa en el ADNc.

2. Selección y transformación de células huésped

Las células huéspedes se transfectan o transforman con vectores de expresión o clonación descritos en ésta para la producción de PRO, y se cultivan en medio nutritivo convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como el medio, temperatura, pH y similares, pueden ser seleccionadas por el especialista capacitado sin experimentación innecesaria. En general, los principios, protocolos, y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos de células pueden hallarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, ed. M. Butler (IRL Press, 1991) y en Sambrook et al., ver más arriba.

Los procedimientos para la transfección de células eucariotas y la transformación de células procariotas son conocidos por el especialista con formación ordinaria, por ejemplo, el del CaCl_{2}, el del CaPO_{4}, el mediado por liposomas y la electroporación. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza usando técnicas estándares apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro cálcico, según se describe en Sambrook et al., ver más arriba, o la electroporación se usan generalmente para los procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens es usa para la transformación de ciertas células de plantas, según se describe en Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y en WO89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero sin tales paredes celulares, pueden emplearse el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Los aspectos general de los sistemas de transfección de células huéspedes de mamífero han sido descritos en la patente estadounidense nº 4.399.216. Las transformaciones en levaduras típicamente se realizan de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, también podrían usarse otros procedimientos para introducir ADN en las células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para varias técnicas para transformar células de mamífero, consultar Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

Las células huéspedes apropiadas para clonar o expresar el ADN en los vectores de ésta incluyen las procariotas, levaduras, o las células eucariotas superiores. Las procariotas apropiadas incluyen, pero no se limitan a, las eubacterias, tales como los organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, enterobacteriaceas tales como E. coli. Hay varias cepas de E. coli disponibles públicamente, tales como la cepa MM294 de E. coli K12 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); la cepa W3110 de E. coli (ATCC 27.325) y la K5 772 (ATCC 53.635). Otras células huéspedes procariotas apropiadas incluyen las enterobacteriaceas tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descubierta en DD-266.710, publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes. La cepa W3 110 es un huésped o huésped progenitor particularmente preferido porque es una cepa huésped común para las fermentaciones de producto de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, podría modificarse la cepa W31 10 para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas del huésped, incluyendo los ejemplos de tales huéspedes la cepa 1A2 de E. coli W3110, la cual tiene el genotipo completo tont; la cepa 9E4 de E. coli W3110, la cual tiene el genotipo completo tonA ptr3; la cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55.244), la cual tiene el genotipo completo ton4 ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^{r}; la cepa 37D6 de E. coli W3110, la cual tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^{r}; la cepa 40B4 de E. coli W3110, la cual es la cepa 37D6 con una mutación por supresión de degP y no resistente a la kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene una proteasa periplásmica mutante, descubierta en la patente estadounidense nº 4.946.783 concedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son apropiados los procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo, la PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido nucleico.

Además de las procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o las levaduras, son vectores de clonación o expresión apropiados para vectores que codifican el PRO. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariotas inferior comúnmente usado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140[1981]; EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes de Kluyveromyces (patente estadounidense nº 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154(2):737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wvickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 [1990]), K. thennotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tales como Schwarniiomyces occidentalis (EP 394.538 publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO91/00357 publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Las levaduras metilotróficas son apropiadas en ésta e incluyen, pero no se limitan a, levaduras capaces de crecer en metanol, seleccionadas de entre los géneros consistentes en Hatuenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ilustrativas de esta clase de levaduras puede hallarse en C. Anthony, The Biochemistiy of Methylotrophs, 269 (1982).

Las células huéspedes apropiadas para la expresión de PRO glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de insectos tales como la S2 de Drosophila S2 y la Sf9 de Spodoptera, así como células de plantas. Los ejemplos de células huéspedes de mamífero útiles incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) y las COS. Más específicamente, los ejemplos incluyen la CVI de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea renal embrionaria humana (células 293 ó 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); las células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasmn, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); las células sertoli de ratón (TM4, Mather, Bio. Reprod., 23:243-251 (1980)); las células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); las células hepáticas humanas (Hep02, HB 8065); y las del tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La selección de la célula huésped apropiada se considera que se halla dentro de las capacidades de la técnica.

3. Selección y uso de un vector replicable

El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica el PRO podría insertarse en un vector replicable para su clonación (amplificación del ADN) o para su expresión. Hay varios vectores disponibles públicamente. El vector podría, por ejemplo, estar en forma de plásmido, cósmido, partícula viral, o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada podría insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio de endonucleasa de restricción apropiado usando técnicas bien conocidas en la técnica. Los componentes del vector generalmente incluyen, pro no están limitados a, una o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores apropiados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligación estándares que son conocidas por el especialista capacitado.

El PRO podría producirse de forma recombinante no sólo directamente sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual podría ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte específico en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduros. En general, la secuencia señal podría ser un componente del vector, o éste podría ser parte del ADN que codifica el PRO que se inserta en el vector. La secuencia señal podría ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, de entre el grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o líderes de la enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal podría ser, por ejemplo, la líder de la invertasa de levadura, la líder del factor alfa (incluyendo las líderes del factor \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, descrita ésta última en la patente estadounidense nº 5.010.182), o la líder de la fosfatasa ácida, la líder de la glucoamilasa de C. albicans (EP 362.179, publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en WO90/13646 publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión en células de mamífero, las secuencias señal de mamífero podrían usarse para dirigir la secreción de la proteína, tales como las secuencias señal procedentes de polipéptidos secretados de la misma especie o de especies relacionadas, así como las líderes secretoras virales.

Ambos, los vectores de expresión y de clonación, contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huéspedes seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es apropiado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2\mu es apropiado para levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero.

Los vectores de expresión y clonación típicamente contienen un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia frente a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, la ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles en el medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la racemasa de D-alanina para Bacilli.

Un ejemplo de marcadores seleccionables apropiados para las células de mamífero, son aquéllos que permiten la identificación de las células competentes para captar el ácido nucleico que codifica el PRO, tales como el de la DHFR o la quinasa de timidina. Una célula huésped apropiada cunado se emplea la DHFR del tipo salvaje es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como describen Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección apropiado para su uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido YRp7 de levadura [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador seleccionable para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, las ATCC nº 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

Los vectores de clonación y expresión usualmente contienen un promotor operativamente unido a la secuencia de ácido nucleico que codifica el PRO para dirigir la síntesis del ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de células huéspedes son bien conocidos. Los promotores apropiados para su uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotor de la \beta-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor del triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776], y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para uso en sistemas bacterianos incluyen también una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el PRO.

Los ejemplos de secuencias promotoras apropiadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para la quinasa de 3-fosfoglicerato [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas glicolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como la enolasa, la deshidrogenasa del gliceraldehído-3-fosfato, la hexoquinasa, la piruvatodescarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la isomerasa de la glucosa-6-fosfato, la mutasa del 3-fosfoglicerato, la quinasa de piruvato, la triosafosfatoisomerasa, la isomerasa de la fosfoglucosa, y la glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, los cuales son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de que su transcripción está controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, del isocitocromo C, de la fosfatasa C, de los enzimas degradantes asociados con el metabolismo del nitrógeno, de la metalotioneína, de la deshidrogenasa del gliceraldehído-3-fosfato, y de los enzimas responsables de la utilización de la maltosa y galactosa. Los vectores y promotores apropiados para su uso en la expresión en levadura se describen adicionalmente en EP 73.657.

La transcripción del PRO a partir de vectores en células huéspedes de mamífero se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, del virus de la viruela aviar (UK-2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis-B y el virus 40 de los simios (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, a condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huéspedes.

La transcripción de un ADN que codifica el PRO por parte de eucariotas superiores podría incrementarse insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos del ADN que actúan en cis, usualmente de aproximadamente 10 a 300 p.b., que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Actualmente se conocen muchas secuencias potenciadoras procedentes de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína, e insulina). No obstante, típicamente, se usará un potenciador procedente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación (p.b. 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación, y los potenciadores de adenovirus. El potenciador se podría ayustar dentro del vector en una posición 5' ó 3' respecto la secuencia codificante del PRO, pero preferiblemente está ubicado en un sitio 5' respecto el promotor.

Los vectores de expresión usados en células de levadura eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están disponibles comúnmente a partir de las regiones 5', y, ocasionalmente, 3' no traducidas de los ADN virales o ADNc eucariotas. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el PRO.

Aún otros procedimientos, vectores y células huéspedes apropiados para la adaptación a la síntesis del PRO en cultivo de células recombinantes de vertebrados se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP-117.060; y EP-117.058.

4. Detectando la amplificación/expresión de los genes

La amplificación y/o expresión del gen podría medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia en punto (análisis de ADN), o hibridación in situ, usando una sonda convenientemente marcada, en base a las secuencias proporcionadas en ésta. Alternativamente, podrían emplearse anticuerpos que reconocen duplexes específicos, incluyendo los duplexes de ADN, los duplexes de ARN, y los duplexes híbridos ADN-ARN o los duplexes ADN-proteína. A su vez, los anticuerpos podrían marcarse y podría llevarse a cabo el ensayo en el que el duplex está unido a una superficie, de forma que, a partir de la formación del duplex sobre la superficie, pueda detectarse la presencia del anticuerpo unido al duplex.

La expresión del gen, podría medirse alternativamente mediante procedimientos inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de células o de secciones de tejido, y el ensayo del cultivo de células o de los fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión de un producto del gen. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de fluidos de muestra podrían ser monoclonales o policlonales, y podrían prepararse en cualquier mamífero. De forma conveniente, los anticuerpos podrían prepararse contra una secuencia nativa del polipéptido PRO o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en ésta, o contra una secuencia exógena fusionada al ADN del PRO y que codifica un epítopo de anticuerpo específico.

5. Purificación del polipéptido

La formas del PRO podrían recuperarse a partir del medio de cultivo o a partir de lisados de células huéspedes. Si están unidas a membrana, pueden liberarse de la membrana usando una solución de detergente apropiada (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante corte enzimático. Las células empleadas en la expresión del PRO pueden romperse mediante varios medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica, o agentes para lisar células.

Podría desearse purificar el PRO de proteínas o polipéptidos de la célula recombinante. Los siguientes procedimientos son ilustrativos de procedimientos de purificación apropiados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC en fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio catiónico tal como la DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración con gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de Proteína-A y Sepharose para retirar contaminantes tales como la IgG; y columnas quelantes de metales para unir formas marcadas con epítopo del PRO. Podrían emplearse varios procedimientos de purificación de proteínas, y tales procedimientos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). El(los) paso(s) de purificación seleccionados dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y del PRO concreto producido.

E. Usos del PRO

Las secuencias de nucleótidos (o sus complementos) que codifican el PRO tienen varias aplicaciones en el campos de la biología molecular, incluyendo los usos como sondas de hibridación, en el mapeado de genes y cromosomas, y en la generación de ARN y ADN antisentido. El ácido nucleico del PRO será útil también para la preparación de polipéptidos PRO mediante las técnicas recombinantes descritas en ésta.

El gen del PRO de secuencia nativa y longitud completa, o porciones del mismo, podrían usarse como sondas de hibridación con una biblioteca de ADNc para aislar el ADNc del PRO de longitud completa o para aislar aún otros ADNc (por ejemplo, los que codifican variantes del PRO que ocurren de forma natural, o PRO procedentes de otras especies) que tienen una deseada identidad de secuencia con la secuencia del PRO nativo descubierta en ésta. Opcionalmente, la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridación podrían derivarse de al menos una región parcialmente novedosa de la secuencia de nucleótidos nativa de longitud completa, en donde esas regiones podrían determinarse sin experimentación improcedente, o a partir de secuencias genómicas que incluyeran promotores, elementos potenciadores e intrones del PRO de secuencia nativa. A modo de ejemplo, un procedimiento de examen comprenderá aislar la región codificante del gen PRO usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación podrían marcarse con una diversidad de marcas, incluyendo los radionúcleos tales como el ^{32}P o ^{35}S, o con marcas enzimáticas tales como una fosfatasa alcalina acoplada con la sonda a través de sistemas de acoplamiento de avidina-biotina. Las sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria a la del gen PRO de la presente invención pueden usarse para examinar bibliotecas de ADNc, ADN genómico, o ARNm humano con miembros de tales bibliotecas con los que se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen con más detalles en los Ejemplos siguientes.

Cualesquiera secuencias EST descubiertas en la presente solicitud podrían emplearse de forma similar como sondas, usando los procedimientos descubiertos en ésta.

Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos de PRO incluyen los oligonucleótidos antisentido o con sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico de hebra sencilla (bien ARN o ADN) capaz de unirse a secuencias diana de ARNm (con sentido) de PRO o ADN (antisentido) de PRO. Los oligonucleótidos antisentido o con sentido acordes con la presente invención, comprenden un fragmento de la región codificante del ADN de PRO. Un fragmento tal generalmente comprende al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente desde aproximadamente 14 hasta 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido antisentido o con sentido, basado en una secuencia de ADNc que codifica una proteína determinada se describen en, por ejemplos, Stein y Cohen (Cancer Res., 48:2659, 1988) y van der Krol et al. (BioTechniques, 6:958, 1988).

La unión de oligonucleótidos antisentido o con sentido a secuencias de ácido nucleico dianas resulta en la formación de duplexes que bloquean la transcripción o traducción de la secuencia diana por uno de varios medios, incluyendo la degradación potenciada de los duplexes, la terminación prematura de la transcripción o traducción, o mediante otros medios. Por tanto, los oligonucleótidos antisentido podrían usarse para bloquear la expresión de proteínas PRO. Los oligonucleótidos antisentido o con sentido comprenden además oligonucleótidos que tienen esqueletos azúcar-fosfodiéster modificados (u otros enlaces azúcar, tales como los descritos en WO91/06629) y en donde tales enlaces azúcar son resistentes a las nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, son capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia para ser capaces de unir secuencias de nucleótidos diana.

Otros ejemplos de oligonucleótidos con sentido o antisentido incluyen aquéllos oligonucleótidos que están unidos covalentemente a grupos orgánicos, tales como los descritos en WO-90/110.048, y otros grupos que incrementan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia diana de ácido nucleico, tal como la poli-(L-lisina). Más aún, podrían unirse agentes intercaladores, tales como la elipticina, y agentes alquilantes o complejos de metal, a los oligonucleótidos con sentido o antisentido para modifican la especificidades de unión del oligonucleótido con sentido o antisentido por la secuencia nucleotídica diana.

Los oligonucleótidos antisentido o con sentido podrían introducirse dentro de una célula que contuviera la secuencia de ácido nucleico diana mediante cualquier procedimiento de transferencia de genes, incluyendo, por ejemplo, la transfección de ADN mediada por CaPO_{4}^{-}, la electroporación, o usando vectores de transferencia de genes tales como el virus de Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un oligonucleótido antisentido o con sentido se inserta en un vector retroviral apropiado. Una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico diana se pone en contacto con el vector retroviral recombinante, bien in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales apropiados incluyen, pero no se limitan a, aquéllos derivados del retrovirus M-MuLV de ratón, el N2 (un retrovirus derivado del M-MuLV), o los vectores de copia doble denominados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver WO 90/13.641).

Los oligonucleótidos con sentido o antisentido podrían introducirse también en una célula que contuviera la secuencia nucleotídica diana mediante la formación de un conjugado con una molécula unidora de ligando, tal como se describe en WO91/04.753. Las moléculas unidoras de ligando apropiadas incluyen, pero no se limitan a, los receptores de superficie celular, los factores de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a los receptores de la superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula unidora de ligando no interfiere sustancialmente con la capacidad de la molécula unidora de ligando para unirse a su correspondiente molécula o receptor, o para bloquear la entrada del oligonucleótido con sentido o antisentido, o su versión conjugada, dentro de la célula.

Alternativamente, un oligonucleótido con sentido o antisentido podría introducirse dentro de una célula que contuviera la secuencia de ácido nucleico diana mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, tal como se describe en WO-90/10.448. El complejo lípido-oligonucleótido con sentido o antisentido preferiblemente es disociado dentro de la célula por una lipasa endógena.

Las moléculas de ARN o ADN con sentido o antisentido tienen generalmente al menos 5 bases de longitud, aproximadamente 10 bases de longitud, aproximadamente 15 bases de longitud, aproximadamente 20 bases de longitud, aproximadamente 25 bases de longitud, aproximadamente 30 bases de longitud, aproximadamente 35 bases de longitud, aproximadamente 40 bases de longitud, aproximadamente 45 bases de longitud, aproximadamente 50 bases de longitud, aproximadamente 55 bases de longitud, aproximadamente 60 bases de longitud, aproximadamente 65 bases de longitud, aproximadamente 70 bases de longitud, aproximadamente 75 bases de longitud, aproximadamente 80 bases de longitud, aproximadamente 85 bases de longitud, aproximadamente 90 bases de longitud, aproximadamente 95 bases de longitud, aproximadamente 100 bases de longitud, o más.

Las sondas podrían emplearse también en técnicas de la PCR para generar un conjunto de secuencias para la identificación de secuencias codificantes del PRO estrechamente relacionadas.

Las secuencias de nucleótido que codifican un PRO podrían usarse también para construir sondas de hibridación para mapear el gen que codifican ése PRO y para el análisis genético de individuos con trastornos genéticos. Las secuencias de nucleótidos proporcionadas en ésta podrían mapearse sobre un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma usando técnicas conocidas, tales como la hibridación in situ, el análisis de conexión genética respecto marcadores cromosómicos conocidos, y el examen mediante hibridación con bibliotecas.

Cuando las secuencias codificantes para el PRO codifican un proteína que se une a otra proteína (por ejemplo, cuando el PRO es un receptor), el PRO puede usarse en ensayos para identificar las otras proteínas o moléculas implicadas en la interacción de unión. Mediante tales procedimientos, pueden identificarse inhibidores de la interacción de unión receptor/ligando. Las proteínas implicadas en tales interacciones de unión pueden usarse también para examinar en busca de péptidos o moléculas pequeñas inhibidores o agonistas de la interacción de unión. También, el receptor PRO puede usarse para aislar ligandos correlativos. Los ensayos de cribado pueden diseñarse para hallar compuestos líderes que imiten la actividad biológica de un PRO nativo o de un receptor para PRO. Tales ensayos de cribado incluirán ensayos capaces de cribado con elevado rendimiento de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente apropiados para identificar moléculas pequeñas candidatas a fármaco. Las moléculas pequeñas contempladas incluyen los compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, incluyendo los ensayos de unión proteína-proteína, los ensayos de cribado bioquímico, los inmunoensayos y los ensayos basados en células, los cuales están bien caracterizados en la técnica.

Los ácidos nucleicos que codifican el PRO o su formas modificadas pueden usarse también para generar animales transgénicos o animales "noqueados" ("knock out") los cuales, a su vez, sin útiles en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticos útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgén, transgén que fue introducido en el animal o en un ancestro del animal en un estadio prenatal, por ejemplo, un estado embrionario. Un transgén es un ADN que está integrado en el genoma de una célula a partir de la que se desarrolla el animal transgénico. En una realización, el ADNc que codifica el PRO puede usarse para clonar el ADN genómico que codifica el PRO de acuerdo con técnicas establecidas, y las secuencias genómicas pueden usarse para generar animales transgénicos que contienen células que expresan el ADN que codifica el PRO. Los procedimientos para genera animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, han pasado a ser convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses nº 4.736.866 y 4.870.009. Típicamente, para la incorporación del transgén de PRO se apuntaría a células concretas con potenciadores específicos de tejidos. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica el PRO introducido en la línea germinal del animal en un estadio embrionario pueden usarse para examinar el efecto de la expresión incrementada del ADN que codifica el PRO. Tales animales pueden usarse como animales de ensayo para reactivos que se cree confieren protección frente a, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. De acuerdo con este aspecto de la invención, un animal se trata con el reactivo, y una incidencia reducida de la condición patológica, en comparación con los animales sin tratar portadores del transgén, indicaría una potencial intervención terapéutica para la condición patológica.

Alternativamente, pueden usarse homólogos no humanos del PRO para construir un animal "noqueado" de PRO que tiene un gen codificante de PRO defectuoso o alterado a consecuencia de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica el PRO y el ADN genómico alterado que codifica el PRO introducido en una célula madre embrionaria del animal. Por ejemplo, podría usarse el ADNc que codifica el PRO para clonar el ADN genómico que codifica el PRO de acuerdo con técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que codifica el PRO puede suprimirse o reemplazarse con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable, el cual puede usarse para monitorizar la integración. Típicamente, se incluyen varios kilobases de ADN flanqueante inalterado (en ambos, los extremos 5' y 3') [ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de los vectores de recombinación homólogos]. El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación), y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno [ver, por ejemplo, Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan a continuación en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar quimeras de agregación [consultar, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, ed. E.J. Robertson, (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-1521. Un embrión quimérico puede entonces implantarse en un animal criador hembra pseudoembarazada, y el embrión puede llevarse a término para crear un animal "noqueado". La progenie que alberga el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas estándares y usarse para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado homólogamente. Los animales noqueados pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad para defenderse de ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido PRO.

EL ácido nucleico que codifica los polipéptidos de PRO podría usarse también en terapia génica. En las aplicaciones de terapia génica, los genes se introducen en las células con objeto de conseguir la síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente efectivo, por ejemplo, mediante la sustitución de un gen defectuoso. La "terapia génica" incluye tanto la terapia génica convencional, en la que se consigue un efecto duradero mediante un único tratamiento, y la administración de agentes terapéuticos de genes, lo que implica la administración una única vez o repetida de un ADN o ARNm terapéuticamente efectivo. Los ARN y los ADN antisentido pueden usarse para bloquear la expresión in vivo de ciertos genes. Ya se ha observado que los oligonucleótidos cortos antisentido pueden ser importados dentro de las células en donde actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares causadas por su captación reducida a causa de la membrana celular. (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:4143-4146 [1986]). Los oligonucleótidos pueden modificarse para potenciar su captación, por ejemplo, sustituyendo sus grupos fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados.

Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos dentro de células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere dentro de células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped previsto. Las técnicas apropiadas para la transferencia in vitro del ácido nucleico dentro de células de mamífero incluyen el uso de liposomas, la electroporación, la microinyección, la fusión de células, el DEAE-dextrano, el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico, etc. Las técnicas de transferencia de genes in vivo actualmente preferidas incluyen la transfección con vectores virales (típicamente retrovirales) y la transfección mediada por liposoma-proteína de cubierta viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology, 11:205-210 [1993]). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que apunta a las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie de una célula o para la célula diana, un ligando para un receptor sobre la célula diana, etc. Cuando se emplean liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de membrana de superficie de una célula asociada con la endocitosis podrían usarse para apuntar y/o facilitar la captación, por ejemplo, proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas trópicas para un determinado tipo de célula, los anticuerpos para proteínas que experimentan internalización al ciclarse, proteínas que apuntan a la localización intracelular y potencian la vida media intracelular. Las técnica de la endocitosis mediada por receptor es descrita, por ejemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414 (1990). Para una revisión de los protocolos de marcado de genes y de terapia génica consultar Anderson et al., Science, 256:808-813 (1992).

Los polipéptidos PRO descritos en ésta podrían emplearse también como marcadores de peso molecular para propósitos de electroforesis de proteínas, y las secuencias de ácido nucleico aisladas podrían usarse para expresar recombinantemente esos marcadores.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos PRO, o fragmentos de los mismos, descritas en ésta son útiles para la identificación del cromosoma. En este sentido existe una continua necesidad de identificar nuevos marcadores de cromosomas, puesto que actualmente hay relativamente pocos reactivos marcadores de cromosoma basados en datos de secuencia. Cada molécula de ácido nucleico de PRO de la presente invención puede usarse como marcador cromosómico.

Los polipéptidos PRO y las moléculas de ácido nucleico de la presente invención podrían usarse también para tipado de tejidos, en donde los polipéptidos PRO de la presente invención podrían expresarse de forma diferencial en un tejido en comparación con otro. Las moléculas de ácido nucleico hallarán un uso para generar sondas para PCR, análisis Northern, análisis Souther, y análisis Western.

Los polipéptidos PRO descritos en ésta podrían emplearse también como agentes terapéuticos. Los polipéptidos PRO de la presente invención pueden formularse de acuerdo con procedimientos conocidos para preparar composiciones útiles farmacéuticamente, en donde el producto PRO de ésta se combina en mezcla con un vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones terapéuticas se preparan para su almacenamiento mezclando el ingrediente activo, que tiene el grado de pureza deseado, con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales y fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, ed. A. Osol, (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como el fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina de suero, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como la glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; los monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares alcohol tales como el manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como el sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como el Tween™, Pluronics™ o PEG.

Las formulaciones a usarse para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o a continuación de la liofilización y reconstitución.

Las composiciones terapéuticas en ésta generalmente se colocan en un contenedor que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica.

La ruta de administración es de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión mediante ruta intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional, administración tópica, o mediante sistemas de liberación continua.

Las dosis y concentraciones de fármacos deseadas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención podrían variar dependiendo del uso concreto previsto. La determinación de la dosis apropiada o de la ruta de administración se halla perfectamente dentro de la capacitación del médico ordinario. Los experimentos con animales proporcionan una guía fiable para la determinación de dosis efectivas para la terapia humana. El escalado entre especies de dosis efectivas puede realizarse siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en Toxicokinetics and New Drug Development, eds. Yacobi et al., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96.

Cuando se emplea la administración in vivo de un polipéptido PRO, o de un agonista o antagonista del mismo, las cantidades de dosis normal podrían variar desde aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal del mamífero o más por día, preferiblemente aproximadamente de 1 \mug/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de administración. En la literatura se proporciona guía sobre dosis particulares y procedimientos de administración; ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses nº 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Se anticipa que formulaciones diferentes serán efectivas para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos, que la administración dirigida a un órgano o tejido podría necesitar, por ejemplo, su suministro en un forma diferente a la de otro órgano o tejido.

Cuando se desea la administración de liberación continua de un polipéptido PRO en una formulación con características de liberación apropiadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno que requiera la administración del polipéptido PRO, se contempla la microencapsulación del polipéptido PRO. La microencapsulación de proteínas recombinantes para su liberación continua se ha realizado de forma exitosa con la hormona del crecimiento humana (rhGH), el interferón- (rhIFN-), la interleukina-2, y la MN rgp120. Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, eds. Powell y Newman, (Plenum Press: Nueva York, 1995), pp. 439-462; WO-97/03.692, WO-96/40.072, WO-96/07.399; y la patente estadounidense nº 5.654.010.

Las formulaciones de liberación continua de estas proteínas se desarrollaron usando polímero de ácido poli-láctico-glicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplio rango de propiedades biodegradables. Los productos de degradación del PLGA, los ácidos láctico y glicólico, pueden eliminarse rápidamente dentro del cuerpo humano. Más aún, la degradabilidad de este polímero puede ajustarse desde meses hasta años dependiendo de su peso molecular y composición. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," en: M. Chasin y R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: Nueva York, 1990), pp. 1-41.

Esta invención abarca procedimientos para examinar compuestos para identificar aquéllos que imitan el polipéptido PRO (agonistas) o impiden el efecto del polipéptido PRO (antagonistas). Los ensayos de examen para candidatos a fármacos antagonista se diseñan para identificar compuestos que se unen o complejan con los polipéptidos PRO codificados por los genes identificados en ésta, o interfieren de otro modo con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Tales ensayos de examen incluirán ensayos capaces de cribar bibliotecas químicas con elevado rendimiento, haciéndolos especialmente apropiados para identificar moléculas pequeñas candidatas a fármaco.

Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, incluyendo los ensayos de unión proteína-proteína, los ensayos de examen bioquímicos, los inmunoensayos, y los ensayos basados en células, los cuales están bien caracterizados en la técnica.

Todos los ensayos para antagonistas son comunes en que requieren el contacto del candidato a fármaco con un polipéptido PRO codificado por un ácido nucleico identificado en ésta, en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interacciones.

En los ensayos de unión, la interacción es la unión y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una realización determinada, el polipéptido PRO codificado por el gen identificado en ésta, o el fármaco candidato, se inmoviliza sobre una fase sólida, por ejemplo, sobre una placa de microvaloración, mediante enlaces covalentes o no covalentes. La unión no covalente se consigue generalmente recubriendo la superficie sólida con una solución del polipéptido PRO y secándola. Alternativamente, puede usarse un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido PRO a inmovilizar para anclarlo sobre una superficie sólida. El ensayo se realiza añadiendo el componente no inmovilizado, el cual podría marcarse mediante una marca detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el compuesto anclado. Cuando se ha completado la reacción, los componentes sin reaccionar se retiran, por ejemplo, mediante lavado, y se detectan los complejos anclados sobre la superficie sólida. Cuando el componente originalmente no inmovilizado lleva una marca detectable, la detección de la marca inmovilizada sobre la superficie indica que ha ocurrido la complejación. Cuando el componente originalmente no unido no lleva una marca, la complejación puede detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo marcado que se una específicamente al complejo inmovilizado.

Si el compuesto candidato interacciona pero no se une a un determinado polipéptido PRO codificado por un gen identificado en ésta, su interacción con el polipéptido puede ensayarse mediante procedimientos bien conocidos para detectar interacciones proteína-proteína. Tales ensayos incluyen las estrategias tradicionales, tales como, por ejemplo, el entrecruzamiento, la co-inmunoprecipitación, y la co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas. Además, las interacciones proteína-proteína pueden monitorizarse usando un sistema genético basado en levaduras descrito por Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) tal como es descrito por Chevray y Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991). Muchos activadores de la transcripción, tales como el GAL4 de levadura, consisten en dos dominios moleculares físicamente discretos, uno actúa como dominio unidor de ADN, y el otro funciona como dominio de activación de la transcripción. El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones precedentes (generalmente denominado como el "sistema de dos híbridos") saca provecho de esta propiedad, y emplea dos proteínas híbridas, una en la que la proteína diana está fusionada con el dominio unidor de ADN del GAL4, y la otra en la que las proteínas activadoras candidatas están fusionadas con el dominio de activación. La expresión de un gen informador GAL1-lacZ bajo control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad GAL4 vía la interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen polipéptidos que interactúan se detectan con un sustrato cromogénico para la \beta-galactosidasa. Hay un equipo completo (MATCHMAKER™) para identificar interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas usando la técnica de dos híbridos, disponible comercialmente de Clontech. Este sistema puede extenderse también para mapear dominios proteicos implicados en interacciones de proteínas específicas, así como para determinar con precisión los residuos aminoácidos que son cruciales para estas interacciones.

Los compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica un polipéptido PRO identificado en ésta y otros componentes intra- o extracelulares pueden ensayarse como sigue: usualmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intra- o extracelular en condiciones y durante un período que permite la interacción y la unión de los dos productos. Para ensayar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se realiza en ausencia y en presencia del compuesto de ensayo. Además, podría añadirse un placebo a una tercera mezcla de reacción para servir como control positivo. La unión (formación de complejo) entre el compuesto de ensayo y el componente intra- o extracelular presente en la mezcla se monitoriza tal como se describió en ésta más arriba. La formación de un complejo en la(s) reacción(es) de control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de ensayo indica que el compuesto de ensayo interfiere con la interacción del compuesto de ensayo y su pareja de reacción.

Para ensayar en busca de antagonistas, el polipéptido PRO podría añadirse a una célula junto con el compuesto a examinar, y la capacidad de inhibir la actividad de interés en presencia del polipéptido PRO indica que el compuesto es un antagonista del polipéptido PRO. Alternativamente, los antagonistas podrían detectarse combinando el polipéptido PRO y un antagonista potencial con receptores del polipéptido PRO, o receptores recombinantes, unidos a membrana, en condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido PRO puede marcarse, tal como mediante radiactividad, de tal forma que el número de moléculas de polipéptido PRO unidas al receptor pueden usarse para determinar la efectividad del antagonista potencial. El gen que codifica el receptor puede identificarse mediante numerosos procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, cribado del ligando y clasificación mediante FACS. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2):capítulo 5 (1991). Preferiblemente, se emplea la clonación y expresión, en donde se prepara ARN poliadenilado a partir de células que responden al polipéptido PRO, y una biblioteca de ADNc, creada a partir de este ARN, se divide en grupos y se usa para transfectar células COS u otras células que no responden al polipéptido PRO. Las células transfectadas, que se hacen crecer sobre portaobjetos de vidrio, se exponen a polipéptido PRO marcado. El polipéptido PRO puede marcarse mediante una variedad de medios, incluyendo la yodación o la inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica para el sitio. A continuación de la fijación e incubación, los portaobjetos se someten a análisis autorradiográfico. Se identifican los grupos positivos, y se preparan subgrupos y se transfectan de nuevo usando un proceso interactivo de submuestreo y re-examen, que eventualmente proporcionará un único clon que codifica el receptor
putativo.

Como una estrategia alternativa para la identificación del receptor, el polipéptido PRO marcado puede unirse mediante fotoafinidad con una membrana de célula o preparaciones de extractos que expresan la molécula del receptor. El material entrecruzado se separa mediante PAGE y se expone con película para rayos-X. El complejo marcado que contiene el receptor puede cortarse, separarse en fragmentos de péptido, y someterse a microsecuenciación de proteínas. La secuencia de aminoácidos obtenida a partir de la microsecuenciación se usaría para diseñar un conjunto de sondas oligonucleotídicas degeneradas para examinar una biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica el receptor putativo.

En otro ensayo para antagonistas, las células de mamífero, o una preparación de membrana, que expresan el receptor se incubarían con polipéptido PRO marcado en presencia del compuesto candidato. La capacidad del compuesto para potenciar o bloquear esta interacción podría medirse a continuación.

Los ejemplos más específicos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones de inmunoglobulina con el polipéptido PRO, y, en concreto, anticuerpos, incluyendo, sin limitación, anticuerpos poli- y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos anti-idiopáticos, y versiones quiméricas o humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. Alternativamente, un antagonista potencial podría ser una proteína estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido PRO que reconoce el receptor pero no causa efecto alguno, inhibiendo competitivamente, por tanto, la acción del polipéptido PRO.

Otro antagonista potencial del polipéptido PRO es una construcción de ARN o ADN antisentido preparada usando la tecnología del antisentido, en donde, por ejemplo, una molécula de ARN o ADN antisentido actúa para bloquear directamente la traducción del ARNm hibridizando el ARNm apuntado, e impidiendo la traducción en proteína. La tecnología antisentido puede usarse para controlar la expresión del gen a través de la formación de hélice triple o mediante ADN o ARN antisentido, basándose ambos procedimientos en la unión de un polinucleótido al ADN o ARN. Por ejemplo, la porción codificante 5' de la secuencia del polipéptido, la cual codifica los polipéptidos PRO maduro en ésta, se usa para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente desde 10 hasta 40 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN para que sea complementario de una región del gen implicado en la transcripción (triple hélice, ver Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), impidiendo de ese modo la transcripción y la producción del polipéptido PRO. El oligonucleótido de ARN antisentido se hibrida con el ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido PRO (antisentido, Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press, Boca Raton, Fla., 1988). Los oligonucleótidos descrito más arriba pueden suministrarse también a células, de tal forma que el ARN o ADN antisentido pudieran expresarse in vivo para inhibir la producción del polipéptido PRO. Cuando se usa ADN antisentido, se prefieren los oligonucleótidos derivados del sitio de inicio de la traducción, por ejemplo, entre aproximadamente -10 y +10 posiciones de la secuencia nucleotídica del gen diana.

Los antagonistas potenciales incluyen las moléculas pequeñas que se unen al sitio activo, el sitio de unión del receptor, o de factores de crecimiento u otro sitio de unión relevante del polipéptido PRO, bloqueando de ese modo la actividad biológica normal del polipéptido PRO. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, los péptidos o moléculas parecidas a péptidos pequeños, preferiblemente los péptidos solubles, y los compuestos orgánicos o inorgánicos no peptídicos sintéticos.

Los ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar el corte específico del ARN. Los ribozimas actúan mediante hibridación específica para la secuencia con el ARN diana complementario, seguida por corte endonucloelítico. Los sitios de corte del ribozima dentro de un potencial ARN diana pueden identificarse mediante técnicas conocidas. Para detalles adicionales ver, por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), y la publicación del PCT Nº WO97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997).

Las moléculas de ácido nucleico en formación de triple hélice usadas para inhibir la transcripción deberían ser de hebra única y estar compuestas por desoxinucleótidos. La composición de bases de estos oligonucleótidos se diseña de tal forma que promueve la formación de la triple hélice a través de reglas de emparejamiento de Hoogsteen, las cuales requieren generalmente tramos bastante grandes de purinas o pirimidinas en una hebra del dúplex. Para más detalles, ver, por ejemplo, la publicación del PCT Nº WO 97/33551, ver más arriba.

Estas moléculas pequeñas pueden identificarse mediante uno o más de los ensayos de verificación descritos en ésta más arriba y/o mediante cualquiera otra técnica de verificación bien conocida por los especialistas en la técnica.

F. Anticuerpos anti-PRO

La presente invención proporciona además anticuerpos anti-PRO. Los anticuerpos de ejemplo incluyen los anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos anti-PRO podrían comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos por el especialista capacitado. Los anticuerpos policlonales pueden generarse en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizador y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizador y/o el adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizador podría incluir el polipéptido PRO o una proteína de fusión del mismo. Podría ser útil conjugar el agente inmunizador a una proteína que se sabe es inmunogénica en el mamífero que se está inmunizando. Los ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a la hemocianina de lapa con forma de ojo de cerradura, la albúmina de suero, la tiroglobulina bovina, y el inhibidor de la tripsina de soja. Los ejemplos de adyuvantes que podrían emplearse incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MLD-TDM (monofosforil lípido A, trehalosa dicorinomicolato sintética). El protocolo de inmunización podría ser seleccionado por alguien formado en la técnica sin experimentación innecesaria.

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos anti-PRO podría, alternativamente, ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales podrían prepararse usando procedimientos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un procedimiento de hibridoma, un ratón, hámster, u otro animal huésped apropiado, se inmuniza típicamente con un agente inmunizador para elicitar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizador. Alternativamente, los linfocitos podrían inmunizarse in vitro.

El agente inmunizador típicamente incluye el polipéptido PRO o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, o se usan linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean células de origen humano, o se usan células del bazo o de nódulo linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Los linfocitos se fusionan a continuación con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión apropiado, tal como el polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas son usualmente células de mamífero transformadas, particularmente, células de mieloma de origen de roedor, bovino y humano. Usualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma podrían cultivarse en un medio de cultivo apropiado que inhibe el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células progenitoras carecen del enzima fosforibosiltransferasa de hipoxantina guanina (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que impiden el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquéllas que se fusionan eficientemente, soportan una expresión de nivel elevado estable, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son las líneas de mieloma de ratón, las cuales pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Ca, y de la American Type Culture Collection, Manassas, Va. También se han descrito líneas celulares de mieloma humanas y de heteromielomas de ratón-humanos para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) pp. 51-631.

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma puede entonces ensayarse para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el PRO. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo inmunoabsorbente unida a enzima (ELISA). Tales técnicas y ensayos son conocidos en el campo. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de identificar las células de hibridoma deseadas, los clones podrían subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante procedimientos estándar [Goding, ver más arriba]. Los medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco y el medio RPMI-1640. Alternativamente, las células del hibridoma podrían cultivarse in vivo como ascites en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones podrían aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o del fluido de ascites mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, la Proteína A-Sepharose, la cromatografía con hidroxilapatito, la electroforesis en gel, la diálisis, o la cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales podrían prepararse también mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente estadounidense nº 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse y secuenciarse fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de ratón). Las células de hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN podría colocarse en vectores de expresión, los cuales se transfectan entonces dentro de células tales como las células COS de simio, las células del ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma, que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN podría modificarse también, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de la cadena ligera y pesada humana en lugar de las secuencias de ratón homólogas [patente estadounidense nº 4.816.567; Morrison et al., ver más arriba], o uniendo covalentemente a la secuencia que codifica la inmunoglobulina la totalidad o parte de la secuencia que codifica un polipéptido que no es de inmunoglobulina. Tal polipéptido que no es de inmunoglobulina puede sustituirse con los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede sustituirse con los dominios variables de un sitio de combinación con antígeno de un anticuerpo de la invención, para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Los anticuerpos podrían ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera y cadena pesada modificada de inmunoglobulina. La cadena pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc con objeto de impedir que la cadena cruzada se entrecruce. Alternativamente, los residuos cisteína relevantes se sustituyen con otro residuo aminoácido o se suprimen con objeto de impedir el entrecruzado.

Los procedimientos in vitro son también apropiados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, puede realizarse usando técnicas de rutina conocidas en el campo.

3. Anticuerpos humanos y humanizados

Los anticuerpos anti-PRO de la invención podrían comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de ratón) son inmunoglobulinas o cadenas de inmunoglobulina quiméricas, o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos unidoras de antígeno), las cuales contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen las inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos procedentes de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo, que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos estructurales de Fv de la inmunoglobulina human son sustituidos por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados podrían comprender también residuos que no se hallan ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o en las secuencias estructurales. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, de los dominios variables, en el cual la todas o sustancialmente todas de las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también contendrá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típica la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoácidos no humanos se denominan a menudo como residuos "importados", los cuales se tomas típicamente de un dominio variable "importado". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], mediante la sustitución de CDR o secuencias de CDR de roedores en lugar de las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente estadounidense nº 4.816.567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de la CDR, y posiblemente algunos residuos de la FR, son sustituidos por residuos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

Los anticuerpos humanos pueden producirse también usando varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo las bibliotecas de exhibición sobre fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Las técnicas de Cole et al. y Boemer et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. De forma similar, los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante la introducción de loci de inmunoglobulina human en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que se han desactivado parcial o completamente los genes de inmunoglobulina endógenos. A partir del desafío, se observa la producción de anticuerpos humanos, los cuales se parecen estrechamente en todos los aspectos a los observados en humanos, incluyendo la reordenación y ensamblado de genes, y el repertorio de anticuerpos. Esta estrategia se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses nº 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368:856-859(1994); Morrison, Nature, 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995).

4. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el caso presente, una de las especificidades de unión es por el PRO, la otras es por cualquier otro antígeno, y preferiblemente por una proteína o receptor, o subunidad del receptor, de la superficie celular.

Los procedimientos para construir anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en donde la dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes [Milsteinand Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Debido al surtido aleatorio de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (quadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se consigue usualmente mediante pasos de cromatografía de afinidad. Se describen procedimientos similares en WO93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse a secuencias del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferiblemente lo es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, comprendiendo al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión distintos, y se co-transfectan en un organismo huésped apropiado. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos consultar, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acuerdo con otra estrategia descrita en WO96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos puede manipulares para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfaz preferida comprende al menos un parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se remplazan con cadenas laterales mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). En la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo se crean "cavidades" de tamaño idéntico o similar al de la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) sustituyendo cadenas laterales de aminoácido grandes con unas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero respecto otros productos finales no deseados, tales como los homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}). Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse usando enlaces químicos. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde se cortan proteolíticamente anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente arsenito sódico, complejador de ditioles, para estabilizar los ditioles vicinales e impedir la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten a continuación en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Entonces, uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte al Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Los fragmentos Fab' podrían recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')_{2} de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secreto de E. coli por separado y se sometió in vitro a acoplamiento químico directo para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpos biespecífico así formado fue capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y a células T humanos normales, así como de disparar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano.

También se han descrito varias técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente a partir del cultivo de células recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Se unieron péptidos de cremallera de leucinas, procedentes de las proteínas Fos y Jun, a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante la fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros, y a continuación se re-oxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento puede utilizarse también para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) mediante un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena. En consecuencia, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento están forzados a emparejarse con los dominios V_{L} y V_{H} complementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos sitios unidores de antígeno. También se ha descrito otra estrategia para construir fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de dímeros de Fv de cadena sencilla (sFv). Ver, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994). Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991).

Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo podrían unirse a dos epítopos diferentes sobre un determinado polipéptido PRO en ésta. Alternativamente, un brazo de polipéptido anti-PRO podrían combinarse con un brazo que se une a una molécula disparadora sobre un leucocito, tal como una molécula de receptor de célula T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28, o B7), o a receptores de Fc para la IgG (Fc\gammaR), tales como los Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) con objeto de concentrar los mecanismos de defensa celular sobre la célula que expresa el polipéptido PRO concreto. Los anticuerpos biespecíficos podrían usarse también para localizar agentes citotóxicos sobre células que expresan un determinado polipéptido PRO. Estos anticuerpos poseen un brazo unidor de PRO y un brazo que se une a un agente citotóxico o a un quelante de radionúcleo, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés une el polipéptido PRO y además une el factor de tejido (TF).

5. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados se hallan también dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune contra células no deseadas [patente estadounidense nº 4.676.980], y para el tratamiento de la infección por VIH [WO91/00360; WO92/200373; EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos podrían prepararse in vitro usando procedimientos conocidos en la química sintética de proteína, incluyendo aquéllos que implican agentes entrecruzadores. Por ejemplo, podrían construirse inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de agentes apropiados para este propósito incluyen el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato y aquéllos descubiertos, por ejemplo, en la patente estadounidense nº 4.676.980.

6. Diseñando la función efectora

Podría ser deseable modificar el anticuerpo de la invención en relación a la función efectora, con objeto de potenciar, por ejemplo, la efectividad del anticuerpo para tratar el cáncer. Por ejemplo, podrían introducirse residuo(s) cisteína en la región Fc, permitiendo de ese modo la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo podría tener una capacidad de internalización mejorada, y/o una capacidad de matar células mediada por el complemento y una citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC) incrementadas. Ver Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992). También podrían prepararse anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor potenciada usando entrecruzadores heterobifuncionales tal como se describe en Wolff et al., Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alternativamente, puede diseñarse un anticuerpo que tiene regiones Fc duales y podría de ese modo tener capacidades de lisis por complemento y ADCC potenciadas. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989).

7. Inmunoconjugados

La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprende un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radioactivo (por ejemplo, un radioconjugado).

Más arriba se han descrito agentes quimioterapéuticos útiles para la generación de tales inmunoconjugados. Las toxinas activas enzimáticamente y los fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen la cadena A de la difteria, fragmentos activos no unidores de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, la alfa-sarcina, las proteínas de Aleurites fordii, la proteína diantina, las proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), el inhibidor de Momordica charantia, la curcina, la crotina, el inhibidor de Saponaria officinalis, la gelonina, la mitogelina, la restrictocina, la fenomicina, la enomicina, y la tricotecenes. Hay disponibles una variedad de radionúcleos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen el ^{212}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y, y ^{186}Re. Los conjugados del anticuerpo y del agente citotóxico se preparan usando una variedad de agentes bifuncionales acopladores de proteína, tales como el N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), el iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como el dimetiladipimidato HCl), ésteres activos (tales como el disuccinimidilsuberato), aldehídos (tales como el glutaraldehído), y compuestos biz-azido (tales como la bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tales como la bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como el toluen-2,6-diisocianato), y compuestos de fluor bis-activos (tales como el 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen-triamino-pentaacético(MX-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente quelante de ejemplo para la conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026.

En otra realización, el anticuerpo podría estar conjugado a un "receptor" (tal como al estreptoavidina) para su utilización en el pre-apuntamiento a tumor, en donde la conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por la retirada del conjugado no unido de la circulación usando un agente de eliminación, y la administración a continuación de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que está conjugado con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido).

8. Inmunoliposomas

Los anticuerpos descubiertos en ésta podrían formularse también como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); y en las patentes estadounidenses nº 4.485.045 y 4.544.545. En la patente estadounidense nº 5.013.556 se descubren liposomas con tiempo de circulación mejorado.

Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase inversa, con una composición que comprende fosfatidilcolina, colesterol, y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros con tamaño de poro definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar con los liposomas tal como se describe en Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Opcionalmente, un agente quimioterapéutico (tal como la doxorubicina) está contenido dentro del liposoma. Ver Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 1(19):1484 (1989).

9. Composiciones farmacéuticas de anticuerpos

Los anticuerpos que específicamente se unen a un polipéptido PRO identificado en ésta, así como otras moléculas identificadas por los ensayos de verificación descritos en ésta más arriba, pueden administrarse para el tratamiento de varios trastornos en forma de composiciones farmacéuticas.

Si el polipéptido PRO es intracelular y se usan anticuerpos completos como inhibidores, se prefieren los anticuerpos que se internalizan. Sin embargo, también pueden usarse lipofecciones o liposomas para suministrar el anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, dentro de las células. Cuando se usan fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio unidor de la proteína diana. Por ejemplo, basándose en las secuencias de la región variable de un anticuerpo, pueden diseñarse moléculas peptídicas que retienen la capacidad de unirse a la secuencia proteica diana. Tales péptidos pueden sintetizarse química y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante. Ver, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993). La formulación en ésta podrían contener también más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación concreta que se esté tratando, preferiblemente aquéllos con actividades complementarias que no se afecten negativamente entre ellas. Alternativamente, o además, la composición podría comprender un agente que potencia su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, una citoquina, un agente quimioterapéutico, o un agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están convenientemente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos podrían atraparse también en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, respectivamente, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de suministro de drogas coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, ver más arriba.

Las formulaciones a usarse para la administración in vivo deben ser estériles. Esto puede conseguirse fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estéril.

Podrían prepararse preparaciones de liberación continua. Los ejemplos de preparaciones de liberación continua apropiadas incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contiene el anticuerpo, matrices que se hallan en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación continua incluyen los poliésteres, los hidrogeles (por ejemplo, el poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), los poliláctidos (patente estadounidense nº 3.773.919), los copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, el etilenvinilacetato no degradable, los copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y el ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que polímeros tales como el etilenvinilacetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más breves. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un período prolongado, podrían desnaturalizarse o agregarse a resultas de la exposición a humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de actividad biológica y en posibles cambios en su inmunogenicidad. Pueden idearse estrategias racionales para la estabilización que dependen del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, podría conseguirse la estabilización mediante la modificación de los residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones específicas de matriz de polímero.

G. Usos para los anticuerpos anti-PRO

Los anticuerpos anti-PRO de la invención tienen varias utilidades. Por ejemplo, podrían usarse anticuerpos anti-PRO en ensayos de diagnóstico para el PRO, por ejemplo, detectando su expresión en células específicas, tejidos, o suero. Podrían usarse varias técnicas de ensayo diagnóstico conocidas en el campo, tales como los ensayos de unión competitiva, ensayos en sandwich directos o indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases homogéneas o heterogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. Los anticuerpos usados en los ensayos de diagnóstico pueden marcarse con un grupo detectable. El grupo detectable debería ser capaz de producir, bien directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el grupo detectable podría ser un radioisótopo, tal como el ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, o la luciferina, o un enzima, tal como la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa o la peroxidasa de rábano silvestre. Para la conjugación del anticuerpo al grupo detectable podría emplearse cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo aquéllos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).

Los anticuerpos anti-PRo son útiles también para la purificación mediante afinidad del PRO a partir del cultivo de células recombinantes o de fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra el PRO se inmovilizan sobre un soporte apropiado, tal como la resina Sephadex o el papel de filtro, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto entonces con una muestra que contiene el PRO a purificar, y luego se lava el soporte con un solvente apropiado que retirará sustancialmente todo el material en la muestra excepto el PRO, el cual está unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente apropiado que liberará el PRO del anticuerpo.

Los ejemplos siguientes se ofrecen sólo con propósitos ilustrativos, y no se pretende que limiten el ámbito de la presente invención en modo alguno.

Ejemplos

Los reactivos disponibles comercialmente mencionados en los ejemplos se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario. La fuente de aquellas células identificadas en los ejemplos siguientes, y a través de la especificación, mediante números de acceso de la ATCC, es la American Type Culture Collection, Manassas, Va.

Ejemplo 1 Examen de la homología del dominio extracelular para identificar polipéptidos nuevos y el ADNc que los codifica

Las secuencias del dominio extracelular (ECD) (incluyendo la secuencia de señal de secreción, si había alguna) de aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas de la base de datos pública Swiss-Prot se usaron para buscar las bases de datos de EST. Las bases de datos de EST incluyen bases de datos públicas (por ejemplo, Dayhoff, GenBank) y bases de datos de propiedad (por ejemplo, LIFESEQ™, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Ca). La búsqueda se realizó usando el programa de ordenador BLAST o BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)) como una comparación de las secuencia de proteína de ECD con una traducción en 6 pautas de las secuencias de la EST. Aquéllas comparaciones con una puntuación de 70 (o en algunos casos de 90) o superior que no codifican proteínas conocidas se agruparon y ensamblaron en secuencias de ADN consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Wa).

Usando esta pantalla de homología de dominio extracelular, se ensamblaron secuencias de ADN consenso en relación a las otras secuencias de la EST identificadas usando phrap. Además, las secuencias de ADN consenso obtenidas a menudo (pero no siempre) se extendieron usando ciclos repetidos de BLAST o BLAST-2 y phrap para extender la secuencia consenso tan lejos como fuera posible usando las fuentes de secuencias de EST discutidas más arriba.

En base a las secuencias consenso obtenidas tal como se ha descrito más arriba, se sintetizaron a continuación oligonucleótidos y se usaron para identificar mediante PCR una biblioteca de ADNc que contenía la secuencia de interés, y para su uso como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante de longitud completa para un polipéptido PRO. Los cebadores hacia adelante y hacia atrás generalmente oscilan desde 20 hasta 30 nucleótidos, y a menudo se diseñan para proporcionar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 p.b. de longitud. Las secuencias sonda típicamente son de 40-50 p.b. de longitud. En algunos casos, se sintetizaron oligonucleótidos adicionales cuando la secuencia consenso es mayor de aproximadamente 1-1,5 k.p.b. Con objeto de examinar varias bibliotecas en busca de un clon de longitud completa, el ADN de las bibliotecas se examinó mediante amplificación con PCR, siguiendo el consejo de Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, con el par de cebadores de PCR. A continuación se usó una biblioteca positiva para aislar clones que codifican el gen de interés usando el oligonucleótido sonda y uno de los pares de cebadores.

Las bibliotecas de ADNc usadas para aislar los clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos estándares usando reactivos disponibles comercialmente, tales como los de Invitrogen, San Diego, Ca. El ADNc se cebó con oligo-dT que contenía un sitio NotI, unido con extremos romos a adaptadores "hemiquinasados" de SalI, cortados con NotI, calibrados apropiadamente mediante electroforesis en gel, y clonados en una orientación definida dentro de un vector de clonación apropiado (tal como el pRKB o pRKD; el pRK5B es un precursor del pRKSD que no contiene el sitio SfiI; ver, Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)) en los únicos sitios XhoI y NotI.

Ejemplo 2

Aislamiento de clones de ADNc mediante examen con amilasa 1. Preparación de una biblioteca de ADNc cebada con oligo dT

Se aisló ARNm a partir de un tejido humano de interés usando reactivos y protocolos de Invitrogen, San Diego, Ca. (Fast Track 2). Este ARN se usó para generar una biblioteca de ADNc cebada con oligo-dT en el vector pRK5D usando reactivos y protocolos de Life Technologies, Gaithersburg, Md. (Super Script Plasmid System). En este procedimiento, el ADNc de doble hebra se ajustó en tamaño a más de 1000 p.b. y el ADNc enlazado con SalI/NotI se clonó en el vector cortado con XhoI/NotI. El pRK5D es un vector de clonación que tiene un sitio de inicio de la transcripción sp6 seguido por un sitio de enzima de restricción SfiI que precede los sitios de clonación XhoI/NotI del ADNc.

2. Preparación de una biblioteca de ADNc cebada aleatoriamente

Se generó una segunda biblioteca de ADNc con objeto de representar preferentemente los extremos 5' de los clones primarios de ADNc. El ARN de sp6 se generó a partir de la biblioteca primaria (descrita más arriba), y este ARN se usó para generar una biblioteca de ADNc cebada aleatoriamente en el vector pSST-AMY.0 usando reactivos y protocolos de Life Technologies (Super Script Plasmid System, mencionado más arriba). En este procedimiento el ADNc de doble hebra se ajustó en tamaño a 500-1000 p.b., se enlazó con adaptadores de romo a NotI, se cortó con SfiI, y se clonó en el vector cortado con Sfil/NotI. El pSST-AMY.0 es un vector de clonación que tiene un promotor de la deshidrogenasa de alcohol precediendo los sitios de clonación del ADNc y la secuencia de la amilasa de ratón (la secuencia madura sin la señal de secreción), seguido por el terminador de la deshidrogenasa de alcohol de levadura, después de los sitios de clonación. Por tanto, los ADNc clonados en este vector que están fusionados en pauta con la secuencia de la amilasa conducirán a la secreción de la amilasa desde colonias de levadura apropiadamente transfectadas.

3. Transformación y detección

El ADN de la biblioteca descrita en el parágrafo 2 anterior se congeló sobre hielo al cual se le añadió la bacteria DHIOB electrocompetente (Life Technologies, 20 ml). La mezcla de bacteria y vector se electroporó entonces según recomienda el fabricante. De forma subsiguiente, se añadió medio SOC (Life Technologies, 1 ml) y se incubó la mezcla a 37ºC durante 30 minutos. Los transformantes se sembraron entonces sobre 20 placas LB estándares de 150 mm que contenían ampicilina, y se incubaron durante 16 horas (37ºC). Las colonias positivas se rascaron de las placas y se aisló el ADN del precipitado bacteriano usando protocolos estándares, por ejemplo, el gradiente en CsCl. El ADN purificado se usó entonces en los protocolos de levaduras siguientes.

Los procedimientos de levaduras se dividieron en tres categorías: (1) transformación de levadura con el vector de plásmido/ADNc combinado; (2) detección y aislamiento de clones de levadura que secretan amilasa; y (3) amplificación mediante PCR del inserto directamente de la colonia de levaduras y purificación del ADN para su secuenciación y análisis ulterior.

La cepa de levadura usada fue la HD56-5A (ATCC-90785). Esta cepa tiene el siguiente genotipo: MAT alfa, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL^{+}, SUC^{+}, GAL^{+}. Preferiblemente, pueden emplearse mutantes de levadura que tienen vías post-traducción deficientes. Tales mutantes podrían tener alelos de translocación deficientes en sec71, sec72, sec62, siendo el sec7l truncado el más preferido. Alternativamente, también podrían emplearse preferiblemente antagonistas (incluyendo nucleótidos antisentido y/o ligandos) que interfieren con la operación normal de estos genes, otras proteínas implicadas en esta vía post-traducción (por ejemplo, SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p o SSA1p-4p), o la formación de complejo de estas proteínas, en combinación con la levadura que expresa
amilasa.

La transformación se realizó en base al protocolo esbozado por Gietz et al., Nucl. Acid. Res., 20:1425 (1992). Las células transformadas se inocularon a continuación desde agar en caldo del medio complejo YEPD (100 ml) y se cultivaron durante la noche a 30ºC. El caldo YEPD se preparó según se describe en Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994). El cultivo de la noche se diluyó entonces hasta aproximadamente 2 \times 10^{6} células/ml (aproximadamente OD_{600} = 0,1) en medio YEPD recién preparado (500 ml) y se dejaron crecer de nuevo hasta 1 \times 10^{7} células/ml (aproximadamente OD_{600} = 0,4-0,5).

Las células se recolectaron entonces y se prepararon para la transformación mediante transferencia al interior de botellas de rotor GS3 en un rotor GS3 de Sorval a 5.000 r.p.m. durante 5 minutos. Se descartó el sobrenadante, y a continuación se resuspendió en agua estéril, y se centrifugó de nuevo en tubos falcon de 50 ml a 3.500 r.p.m. en una centrífuga GS-6KR de Beckman. Se descartó el sobrenadante y las células se lavaron a continuación con LiAc/TE (10 ml, Tris-HCI 10 mM, EDTA 1 mM pH 7,5, Li_{2}OOCCH_{3} 100 mM), y se resuspendieron en LiAc/TE (2,5 ml).

La transformación tuvo lugar mezclando las células preparadas (100 \mul) con ADN fresco, desnaturalizado, de hebra única, de esperma de salmón (Lofstrand Labs, Gaithersburg, Md.) y ADN transformante (1 \mug, vol. < 10 \mul) en tubos de microfuga. Se agitó la mezcla brevemente con un rotor vórtex, a continuación se le añadió un 40% de PEG/TE (600 \mul, 40% polyethylene glycol-4000, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, Li_{2}OOCCH_{3} 100 mM , pH 7,5). Esta mezcla se agitó suavemente y se incubó a 30ºC con agitación durante 30 minutos. A continuación, se sometieron las células choque térmico de 42ºC durante 15 minutos, y el recipiente de reacción se centrifugó en una microfuga a 12.000 r.p.m. durante 5-10 segundos, se decantó y se resuspendió en TE (500 \mul, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5), seguida por re-centrifugación. Las células se diluyeron entonces en TE (1 ml) y se extendieron alícuotas (200 \mul) sobre el medio selectivo preparado previamente en placas de cultivo (VWR) de 150 mm.

Alternativamente, en vez de múltiples pequeñas reacciones, la transformación se realizó usando una única reacción a gran escala, en donde las cantidades de reactivo se escalaron de forma acorde.

El medio selectivo usado fue un agar de dextrosa completo que carecía de uracilo (SCD-Ura), preparado tal como se describe en Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994). Los transformantes se cultivaron a 30ºC durante 2-3 días.

La detección de colonias secretoras de amilasa se realizó incluyendo almidón rojo en el medio de cultivo selectivo. El almidón estaba acoplado al colorante rojo (Reactive Red-120, Sigma) de acuerdo con el procedimiento descrito por Biely et al., Anal. Biochem., 172:176-179 (1988). El almidón acoplado se incorporó en las placas de agar SCD-Ura en una concentración final del 0,15% (p/v), y se tamponó con fosfato potásico hasta un pH de 7,0 (50-100 mM de concentración final).

Las colonias positivas se recolectaron y se extendieron a lo largo de medio selectivo reciente (sobre placas de 150 mm) con objeto de obtener colonias únicas bien aisladas e identificables. Las colonias bien aisladas que eran positivas para la secreción de la amilasa se detectaron mediante la incorporación directa de almidón rojo en el agar de SCD-Ura tamponado. Las colonias positivas se determinaron por su capacidad para romper el almidón, lo que resultaba en un halo claro alrededor de la colonia positiva que podía visualizarse directamente.

4. Aislamiento del ADN mediante amplificación con PCR

Cuando se aislaba una colonia positiva, una porción de ésta se recogía mediante un palillo y se diluía en agua estéril (30 \mul) en una placa de 96 pocillos. En ese momento, las colonias positivas o se congelaban y almacenaban para su subsiguiente análisis, o se amplificaban inmediatamente. Una alícuota de células (5 \mul) se usó como plantilla para la reacción de la PCR en un volumen de 25 \mul que contenía: 0,5 \mul Klentaq (Clontech, Palo Alto, Calif.); 4,0 \mul dNTP 10 mM (Perkin Elmer-Cetus); 2,5 \mul de tampón Kentaq (Clontech); 0,25 \mul del oligo hacia adelante 1; 0,25 \mul del oligo hacia atrás 2; 12,5 \mul de agua destilada. La secuencia del oligonucleótido hacia adelante 1 fue:

5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCG-3'

(SEC. Nº ID.: 3)

La secuencia del oligonucleótido hacia atrás 2 fue:

5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3'

(SEC. Nº ID.: 4)

\vskip1.000000\baselineskip

La PCR se realizó entonces como sigue:
a.	Desnaturalización	92ºC	5 minutos
b. 3 ciclos de	desnaturalización	92ºC	30 segundos
	emparejamiento	59ºC	30 segundos
	extensión	72ºC	60 segundos
c. 3 ciclos de	desnaturalización	92ºC	30 segundos
	emparejamiento	57ºC	30 segundos
	extensión	72ºC	60 segundos
d. 25 ciclos de	desnaturalización	92ºC	30 segundos
	emparejamiento	55ºC	30 segundos
	extensión	72ºC	60 segundos
e.	pausa	4ºC

\newpage

Las regiones subrayadas de los oligonucleótidos se emparejaban respectivamente con la región promotora de la ADN y la región amilasa, y amplificaban una región de 307 p.b. del vector pSST-AMY.0 cuando no había inserto alguno presente. Típicamente, los primeros 18 nucleótidos del extremo 5' de estos oligonucleótidos contenían sitios de hibridación para los cebadores de secuenciación. Así pues, el producto total de la reacción de la PCR de un vector vacío tenía 343 p.b. Sin embargo, el ADNc fusionado con la secuencia señal resultó en secuencias de nucleótidos considerablemente más largas.

A continuación de la PCR, se examinó una alícuota de la reacción (5 \mul) mediante electroforesis en gel de agarosa, en un gel de agarosa al 1%, usando un sistema de tamponado Tris-Borato-EDTA (TBE) tal como se describe en Sambrook et al., ver más arriba. Los clones que resultaban en un producto de la PCR intenso y único, mayor de 400 p.b. se analizaron además mediante secuenciación del ADN después de su purificación con una columna 96 Qiaquick de limpieza de la PCR (Qiagen Inc., Chatsworth, Calif.).

Ejemplo 3 Aislamiento de clones de ADNc usando el análisis con algoritmo para señales

Se identificaron varias secuencias de ácido nucleico que codificaban polipéptidos mediante la aplicación de un algoritmo propietario de hallazgo de secuencias señal desarrollado por Genentech, Inc. (South San Francisco, Ca.) a partir de la EST así como a partir de fragmentos de la EST agrupados y ensamblados procedentes de bases de datos públicas (por ejemplo, GenBank) y/o de bases de datos privadas (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, Ca.). El algoritmo de secuencia de señal computa una puntuación de señal de secreción en base al carácter de los nucleótidos del ADN que rodean el primer, y opcionalmente el segundo, codón de metionina (ATG) en el extremo 5' de la secuencia o fragmento de secuencia considerado. Los nucleótidos que siguen la primer ATG deben codificar al menos 35 aminoácidos inequívocos sin ningún codón de detención. Si el primer ATG tiene los aminoácidos requeridos, no se examina el segundo. Si ninguno cumple los requisitos, la secuencia candidata no se puntúa. Con objeto de determinar si la secuencia de EST contiene una secuencia de señal auténtica, las secuencias de ADN y la correspondiente de aminoácidos que rodean el codón ATG se puntúan usando un conjunto de siete sensores (parámetros de evaluación) que se sabe están asociados con las señales de secreción. El uso de este algoritmo resultó en la identificación de numerosas secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos.

Ejemplo 4 Aislamiento de clones de ADNc que codifican el PRO3434 humano

El uso del algoritmo de secuencias señal descrito en el Ejemplo 3 anterior permitió la identificación de una secuencia grupo de la EST procedente de la base de datos Incyte. Esta secuencia de grupo de la EST se comparó entonces con una variedad de bases de datos de marcas de secuencias expresadas (EST), las cuales incluyen bases de datos de EST públicas (por ejemplo, GenBank) y una base de datos de ADN de EST propietaria (Lifeseq®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, Ca.) para identificar las homologías existentes. La búsqueda de homología se realizó usando el programa de ordenador BLAST o BLAST2 (Altshul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)). Aquellas comparaciones que resultaban en una puntuación de BLAST de 70 (o en algunos casos de 90) o superior que no codificaban proteínas conocidas se agruparon y ensamblaron en una secuencia ADN consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA). La secuencia consenso obtenida de las mismas se denomina en ésta DNA56009.

A la luz de la homología de secuencia entre la secuencia DNA56009 y una secuencia de EST contenida en el clon nº 3327089 de la EST de Incyte, se compró el clon nº 3327089 de la EST de Incyte, y se obtuvo y secuenció el inserto de ADNc. La secuencia de este inserto de ADNc se muestra en la Figura 1 y se denomina en ésta como DNA77631-2537.

El clon DNA77631-2537 contiene una única pauta de lectura abierta con un sitio aparente de inicio de la traducción en las posiciones de nucleótido 46-48 y finalizando en el codón de detención en las posiciones de nucleótido 3133-3135 (Figura 1). El precursor de polipéptido predicho tiene 1029 aminoácidos de longitud (Figura 2). La proteína PRO3434 de longitud completa mostrada en la Figura 2 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente 114.213 daltones y un pI de aproximadamente 6,42. El análisis de la secuencia PRO3434 de longitud completa mostrada en la Figura 16 (SEC. Nº ID.: 2) evidencia la presencia de dominios polipeptídicos muy importante tal como se muestra en la Figura 2. El clon DNA77631-2537 se ha depositado en la ATCC el 9 de febrero de 1999 y se le ha asignado el nº de depósito de ATCC 203651.

Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión 35.45 SwissProt 35), usando el análisis de alineamiento de secuencia WU-BLAST2 de la secuencia de longitud completa mostrada en la Figura 2 (SEC. Nº ID.: 2) evidenció la homología entre la secuencia de aminoácidos de la PRO3434 y las siguientes secuencias de Dayhoff: VATX_YEAST, P_R51171, POLS_IBDVP, IBDVORF_2. JC5043, IBDVPIV_1, VE7_HPV11, GEN14220, MUTS_THETH y
COAC_CHICK.

Ejemplo 5 Amplificación del gen

Este ejemplo muestra que los genes que codifican el PRO3434 están amplificados en el genoma de ciertos cánceres de pulmón, colon y/o mama humanos, y/o de líneas celulares. La amplificación está asociada con la sobreexpresión del producto del gen, indicando que los polipéptidos son diana útiles para la intervención terapéutica en ciertos cánceres tales como del colon, pulmón, mama y otros cánceres, y en la determinación diagnóstica de la presencia de esos cánceres. Los agentes terapéuticos podrían adoptar la forma de antagonistas del polipéptido PRO3434, por ejemplo, anticuerpos quiméricos de ratón-humanos, humanizados o humanos contra un polipéptido PRO3434.

El polipéptido PRO3434, por ejemplo, anticuerpos quiméricos murino-humano, humanizados o humanos contra un polipéptido PRO3434.

El material de partida para la verificación fue el ADN genómico aislado de una variedad de cánceres. El ADN se cuantifica con precisión, por ejemplo, fluorométricamente. Como control negativo, se aisló ADN de las células de diez individuos sanos y normales, el cual se juntó y usó como control de ensayo para la copia del gen en individuos sanos (no se muestra). El ensayo de la nucleasa 5' (por ejemplo, TaqMan™) y la PCR cuantitativa en tiempo real (por ejemplo, el ABI Prizm 7700 Sequence Detection System™ (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, Ca.)), se usaron para hallar genes potencialmente amplificados en ciertos cánceres. Los resultados se usaron para determinar si el ADN que codifica el PRO3434 está sobrerrepresentado en cualquiera de los cánceres primarios de pulmón o colon, o en las líneas celulares de cáncer o líneas celulares de cáncer de mama que se examinaron. Los cánceres de pulmón primarios se obtuvieron a partir de individuos con tumores del tipo y etapa indicados en la Tabla 6. Más abajo se proporciona una explicación de las abreviaturas usadas para la designación de los tumores primarios listados en la Tabla 6 y de los tumores primarios y líneas celulares mencionadas a lo largo de este ejemplo.

Los resultados del TaqMan™ se dan en unidades delta (\Delta) Ct. Una unidad corresponde a 1 ciclo de PCR o aproximadamente a una amplificación de 2 veces en relación a la normal, dos unidades corresponden a 4 veces, 3 unidades corresponden a una amplificación de 8 veces, etcétera. La cuantificación se obtuvo usando cebadores y una sonda fluorescente de TaqMan™ derivada del gen que codifica el PRO3434. Para derivar el cebador y la sonda se prefieren las regiones del PRO3434 que más probablemente contienen secuencias de ácido nucleico únicas y que es menos probable que tengan intrones eliminados por ayuste, por ejemplo, las regiones 3' no traducidas. Las secuencias de los cebadores y sondas (hacia adelante, hacia atrás y sonda) usadas para el análisis de la amplificación del gen del PRO3434 fueron como sigue:

PRO3434 (DNA77631-2537)

hacia adelante	5'-GTCCAGCAAGCCCTCATT-3'	(SEC. Nº ID.:5)
sonda	5'-CTTCTGGGCCACAGCCCTGC-3'	(SEC. Nº ID.:6)
hacia atrás	5'-CAGTTCAGGTCGTTTCATTCA-3'	(SEC. Nº ID.:7)

La reacción de ensayo de la nucleasa 5' es una técnica fluorescente basada en la PRC que hace uso de la actividad de la exonucleasa 5' del enzima polimerasa Taq del ADN para monitorizar la amplificación en tiempo real. Se usaron dos cebadores de oligonucleótido para generar un amplicón típico de una reacción de la PCR. Se diseña un tercer oligonucleótido, o sonda, para detectar la secuencia de nucleótidos ubicada entre los dos cebadores de la PCR. La sonda no es extensible por el enzima polimerasa Taq del ADN, y está marcada con un colorante fluorescente informador y un colorante fluorescente atenuador. Cualquier emisión inducida por láser procedente del colorante informador es atenuada por el colorante atenuador cuando los dos colorantes están ubicados juntos, como lo están sobre la sonda. Durante la reacción de amplificación, el enzima polimerasa Taq del ADN corta la sondadas de forma dependiente de la plantilla. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en solución, y la señal procedente del colorante informador está libre de cualquier efecto atenuador del segundo fluoróforo. Se libera una molécula de colorante informador por cada nueva molécula sintetizada, y la detección del colorante informador no atenuado proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.

El procedimiento de la nucleasa 5' se realiza en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real tal como el ABI Prism 7700TM Sequence Detection. El sistema consiste en un termociclador, un láser, una cámara con dispositivo de carga acoplada (CCD) y un ordenador. El sistema amplifica muestra en un formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal de fluorescencia inducida por el láser es recoge en tiempo real a través de cables de fibra óptica para la totalidad de los 96 pocillos, y se detecta en el CCD. El sistema incluye el programa para controlar el instrumento y para analizar los datos.

Los datos del ensayo con nucleasa 5' se expresan inicialmente como Ct, o como el ciclo umbral. Este se define como el ciclo en el que la señal del informador se acumula por encima del nivel de fondo de la fluorescencia. Los valores \DeltaCt se usaron como mediciones cuantitativas del número relativo de copias de partida de una determinada secuencia diana en una muestra de ácido nucleico cuando se compararon resultados de ADN con resultados de ADN humano normal.

La Tabla 6 describe la etapa, etapa T y etapa N de varios tumores primarios que se usaron para verificar los compuestos de PRO3434 de la invención.

TABLA 6

Perfiles de tumores primarios de pulmón y colon
Etapa del tumor primario	Etapa	Otra	Etapa de	Etapa	Etapa
		etapa	Dukes	T	N
Human lung tumor	IIA			T1	N1
AdenoCa (SRCC724) [LT1]
Human lung tumor	IIB			T3	N0
SqCCa (SRCC725) [LT1a]
Human lung tumor	IB			T2	N0
AdenoCa (SRCC726) [LT2]
Human lung tumor	IIIA			T1	N2
AdenoCa(SRCC727) [LT3]
Human lung tumor	IB			T2	N0
AdenoCa(SRCC728) [LT4]
Human lung tumor	IB			T2	N0
SqCCa (SRCC729) [LT6]
Human lung tumor	IA			T1	N0
Aden/SqCCa (SRCC730) [LT7]
Human lung tumor	IB			T2	N0
AdenoCa (SRCC731) [LT9]
Human lung tumor	IIB			T2	N1
SqCCa (SRCC732) [LT10]
Human lung tumor	IIA			T1	N1
SqCCa (SRCC733) [LT11]
Human lung tumor	IV			T2	N0
AdenoCa (SRCC734) [LT12]
Human lung tumor	IB			T2	N0
AdenoSqCCa (SRCC735) [LT13]
Human lung tumor	IB			T2	N0
SqCCa (SRCC736) [LT15]
Human lung tumor	IB			T2	N0
SqCCa (SRCC737) [LT16]
Human lung tumor	IIB			T2	N1
SqCCa (SRCC738) [LT17]
Human lung tumor	IB			T2	N0
SqCCa (SRCC739) [LT18]

TABLA 6 (continuación)

Etapa del tumor primario	Etapa	Otra	Etapa de	Etapa	Etapa
		etapa	Dukes	T	N
Human lung tumor	IB			T2	N0
SqCCa (SRCC740) [LT19]
Human lung tumor	IIB			T3	N1
LCCa (SRCC741) [LT21]
Human lung AdenoCa	1A			T1	N0
(SRCC811) [LT22]
Human colon AdenoCa	M1	D	pT4	N0
(SRCC742) [CT2]
Human colon AdenoCa		B	pT3	N0
(SRCC743) [CT3]
Human colon AdenoCa		B	T3	N0
(SRCC744) [CT8]
Human colon AdenoCa		A	pT2	N0
(SRCC745) [CT10]
Human colon AdenoCa	MO, R1	B	T3	N0
(SRCC746) [CT12]
Human colon AdenoCa	pMO,	B	pT3	pN0
(SRCC747) [CT14]	RO
Human colon AdenoCa	M1, R2	D	T4	N2
(SRCC748) [CT15]
Human colon AdenoCa	pMO	B	pT3	pN0
(SRCC749) [CT16]
Human colon AdenoCa		C1	pT3	pN1
(SRCC750) [CT17]
Human colon AdenoCa	MO, R1	B	pT3	N0
(SRCC751) [CT1]
Human colon AdenoCa		B	pT3	M0
(SRCC752) [CT4]
Human colon AdenoCa	G2	C1	pT3	pN0
(SRCC753) [CT5]
Human colon AdenoCa	pMO,	B	pT3	pN0
(SRCC754) [CT6]	RO
Human colon AdenoCa	G1	A	pT2	pN0
(SRCC75S) [CT7]

TABLA 6 (continuación)

Etapa del tumor primario	Etapa	Otra	Etapa de	Etapa	Etapa
		etapa	Dukes	T	N
Human colon AdenoCa	G3	D	pT4	pN2
(SRCC756) [CT9]
Human colon AdenoCa		B	T3	N0
(SRCC757) [CT11]
Human colon AdenoCa	MO, R1	B	pT3	pN0
(SRCC758) [CT18]

Preparación del ADN

El ADN se preparó a partir de líneas celulares cultivadas, tumores primarios, sangre humana normal. El aislamiento se realizó usando un equipo de purificación, conjunto de tampón y proteasa, y todos procedían de Qiagen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la descripción siguiente.

Lisis del cultivo celular

Las células se lavaron y tripsinizaron a una concentración de 7,5 \times 10^{8} por punta, y se apelotonaron mediante centrifugación a 1000 r.p.m. durante 5 minutos a 4ºC, seguida por lavado de nuevo mediante centrifugación de nuevo con 1/2 volumen de PBC. Los precipitados se lavaron una tercera vez, las células suspendidas se recolectaron y lavaron 2\times con PBS. A continuación se suspendieron las células en 10 ml de PBS. El tampón C1 se equilibró a 4ºC, la proteasa #19155 de Qiagen se diluyó en 6,25 ml de ddH_{2}O fría hasta una concentración final de 20 mg/ml y se equilibró a 4ºC. Se prepararon 10 ml de tampón G2 diluyendo ARNasa A de reserva (100 mg/ml) de Qiagen hasta una concentración final de 200 \mug/ml.

A continuación se añadieron el tampón C1 (10 ml, 4ºC) y la ddH_{2}O (40 ml, 4ºC) a los 10 ml de suspensión de células, se mezclaron mediante inversión, y se incubaron sobre hielo durante 10 minutos. Los núcleos de las células se apelotonaron mediante centrifugación en un rotor basculante de Beckman a 2500 r.p.m. a 4ºC durante 15 minutos. Se descartó el sobrenadante y los núcleos se suspendieron con un agitador vórtex en 2 ml de tampón C1 (a 4ºC) y 6 ml de ddH_{2}O, seguida por una segunda centrifugación a 4ºC a 2500 r.p.m. durante 15 minutos. Los núcleos se suspendieron a continuación en el tampón residual usando 200 \mul por punta. Se añadió tampón G2 (10 ml) a los núcleos suspendidos mientras se aplicaba agitación con vórtice suave. Una vez completada la adición de tampón, se aplicó agitación con vórtice enérgica durante 30 segundos. Se añadió proteasa de Qiagen (200 \mul, preparada como se indicó más arriba) y se incubó a 50ºC durante 60 minutos. La incubación y centrifugación se repitieron hasta que los lisados eran claros (por ejemplo, incubando unos 30-60 minutos adicionales, precipitando a 3000 \timesg durante 10 minutos, 4ºC).

Preparación y lisis de una muestra de tumor humano sólido

Las muestras de tumor se pesaron y colocaron en tubos cónicos de 50 ml y se mantuvieron en hielo. El procesamiento se limitó a no más de 250 mg de tejido por preparación (1 punta/preparación). La solución de proteasa se preparó al momento diluyéndola en 6,25 ml de ddH_{2}O fría hasta una concentración final de 20 mg/ml y se almacenó a 4ºC. El tampón G2 (20 ml) se preparó diluyendo ADNasa A hasta una concentración final de 200 mg/ml (a partir de 100 mg/ml de reserva). El tejido tumoral se homogeneizó en 19 ml de tampón G2 durante 60 segundos usando la punta larga del Polytron en una campana TC de flujo laminar con objeto de evitar la inhalación de los aerosoles, y se mantuvo a temperatura ambiente. El Polytron se lavó entre muestras haciéndolo girar 2\times 30 segundos cada vez en 2L de ddH_{2}O, seguidos por tampón G2 (50 ml). Si todavía había tejido presente en la punta del generador, se desmontaba el aparato y se limpiaba.

Se añadió proteasa de Qiagen (preparada tal como se indicó más arriba, 1,0 ml), seguida por agitación con vórtice e incubación a 50ºC durante 3 horas. La incubación y centrifugación se repitieron hasta que los lisados fueron claros (por ejemplo, incubando unos 30-60 minutos adicionales, precipitando a 3000 \timesg durante 10 minutos, 4ºC).

Preparación y lisis de la sangre humana

Se extrajo sangre de voluntarios sanos usando protocolos estándares para agente infeccioso y se citró en muestras de 10 ml por punta. Se preparó la solución de proteasa al momento diluyéndola en 6,25 ml de ddH_{2}O fría hasta una concentración final de 20 mg/ml y se almacenó a 4ºC. El tampón G2 se preparó diluyendo ARNasa A hasta una concentración final de 200 \mug/ml partiendo de 100 mg/ml de reserva. La sangre (10 ml) se colocó en tubos cónicos de 50 ml y se añadieron 10 ml de tampón C1 y 30 ml de ddH_{2}O (ambos equilibrados previamente a 4ºC), y los componentes se mezclaron mediante inversión y se mantuvieron sobre hielo durante 10 minutos. Los núcleos se apelotonaron con un rotor basculante de Beckman a 2500 r.p.m., 4ºC, durante 15 minutos y se descartó el sobrenadante. Los núcleos se suspendieron con un agitador vórtex en 2 ml de tampón C1 (4ºC) y 6 ml de ddH_{2}O (4ºC). La agitación con vórtice se repitió hasta que el precipitado fue blanco. A continuación, se suspendieron los núcleos en el tampón residual usando 200 \mul por punta. Se añadió tampón G2 (10 ml) a los núcleos suspendidos mientras se aplicaba agitación con vórtice suave, seguida por agitación con vórtice enérgica durante 30 segundos. Se añadió proteasa de Qiagen (200 \mul) y se incubó a 50ºC durante 60 minutos. La incubación y centrifugación se repitieron hasta que los lisados eran claros (por ejemplo, incubando unos 30-60 minutos adicionales, precipitando a 3000 \timesg durante 10 minutos, 4ºC).

Purificación de los lisados clarificados (1) Aislamiento del ADN genómico

El ADN genómico se equilibró (1 muestra por preparación de maxi-punta) con 10 ml de tampón QBT. El tampón de elución QF se equilibró a 50ºC. Las muestras se agitaron con vórtice durante 30 segundos, a continuación se cargaron sobre puntas equilibradas y se escurrieron mediante gravedad. Las puntas se lavaron con 2\times 15 ml de tampón QC. El ADN se eluyó en tubos Corex de 30 ml, autoclavados y silanizados, con 15 ml de tampón QF (50ºC). Se añadió isopropanol (10,5 ml) a cada muestra, los tubos se recubrieron con parafina y se mezclaron mediante inversión repetida hasta que el ADN precipitó. Se precipitaron las muestras mediante centrifugación en el rotor SS-34 a 15.000 r.p.m. durante 10 minutos a 4ºC. Se marcó la ubicación del precipitado, se descartó el sobrenadante, y se añadieron 10 ml de etanol al 70% (4ºC). Las muestras se precipitaron en el rotor SS-34 a 10.000 r.p.m. durante 10 minutos a 4ºC. Se marcó la ubicación del precipitado, se descartó el sobrenadante. A continuación se colocaron los tubos sobre su lado en una estantería de secado y se secaron 10 minutos a 37ºC, teniendo cuidado de no secar excesivamente las muestras.

Después del secado, se disolvieron los precipitados en 1,0 ml de TE (pH 8,5) y se colocaron a 50ºC durante 1-2 horas. Las muestras se mantuvieron durante la noche a 4ºC a mediada que continuaba la disolución. La solución de ADN se transfirió entonces a tubos de 1,5 ml con una aguja de galga 26 montada en un jeringa de tuberculina. La transferencia se repitió 5\times con objeto de cortar el ADN. Las muestras se colocaron entonces a 50ºC durante 1-2 horas.

(2) Cuantificación del ADN genómico y preparación para el ensayo de amplificación del gen

Los niveles de ADN en cada tubo se cuantificaron mediante espectrofotometría estándar a A_{260}, A_{280}, en una dilución 1:20 (5 \mul de ADN + 95 \mul de ddH_{2}O) usando las cubetas de cuarzo de 0,1 ml en el espectrómetro DU640 de Beckman. Los cocientes A_{260}/A_{280} estaban en el rango de 1,8-1,9. A continuación, se diluyó cada muestra de ADN aún más hasta aproximadamente 200 ng/ml en TE (pH 8,5). Si el material original estaba altamente concentrado (aproximadamente 700 ng/ml), el material se colocaba a 50ºC durante varias horas hasta que se resuspendía.

A continuación se realizó la cuantificación fluorométrica del ADN en el material diluido (20-600 ng/ml) usando las instrucciones del fabricante modificadas según se indica más abajo. Esto se consiguió dejando que el fluorímetro Hoeffer DyNA Quant 200 se calentara durante 15 minutos. Se diluyó la solución de trabajo del colorante de Hoechst (#H33258, 10 \mul, preparada en las 12 horas previas a su uso) en 100 ml de tampón 1 \times TNE. Se llenó una cubeta de 2 ml de con la solución del fluorímetro, se colocó dentro de la máquina, y se ajustó el cero de la máquina. Se añadió pGEM 3Zf(+) (2 \mul, lote #360851026) a 2 ml de solución de fluorímetro y se calibró a 200 unidades. A continuación se ensayaron 2 \mul adicionales de pGEM 3Zf(+) ADN y se confirmó la lectura a 400 \pm 10 unidades. A continuación se leyó cada muestra al menos por triplicado. Cuando se halló que 3 muestras estaban dentro del 10% entre ellas, se tomó su promedio y este valor se usó como el valor de cuantificación.

La concentración determinada fluorométricamente se usó entonces para diluir cada muestra hasta 10 ng/\mul en ddH_{2}O. Esto se hizo simultáneamente en todas las muestras de plantilla para una única placa de ensayo TaqMan, y con material suficiente para realizar 500-1000 ensayos. Las muestras se ensayaron por triplicado con cebadores y sonda TaqMan™ y sonda para ambas la B-actina y la GAPDH en una única placa, con ADN humano normal y controles sin plantilla. Las muestras diluidas se usaron a condición de que el valor de CT del ADN humano normal restado del ADN de ensayo fuera \pm1 Ct. El ADN genómico, diluido, de lote cualificado, se almacenó en alícuotas de 1,0 ml a -80ºC. La alícuotas que se iban a usar de forma subsiguiente en el ensayo de amplificación del gen se almacenaron a 4ºC. Cada alícuota de 1 ml es suficiente para 8-9 placas o 64 ensayos.

Ensayo de amplificación del gen

Los compuestos del PRO3434 de la invención se examinaron en los siguientes tumores primarios y los valores de \DeltaCt superiores o iguales a 1,0 se mencionan en la Tabla 7 siguiente.

TABLA 7

(Valores de \DeltaCt en modelos de tumor primario en pulmón y colon)
Tumor Primario	PRO3434
LT13	5,24, 4,47
LT15	1,24
LT16	3,65, 3,19
CT15	1,19, 1,40
Colo-320 (colon tumor cell line)	1,78, 1,76, 1,74
HF-00084 (lung tumor cell line)	2,2
HCT-116 (colon tumor cell line)	2,15, 2,22
HF-00129 (lung tumor cell line)	1,00, 1,17, 2,31, 1,11
SW-620 (colon tumor cell line)	1,3
HT-29 (colon tumor cell line)	1,64
SW-403 (colon tumor cell line)	1,75
LS174T (colon tumor cell line)	1,42
HCC-2998 (colon tumor cell line)	1,15
A549 (lung tumor cell line)	1,51, 1,09
Calu-6 (lung tumor cell line)	1,60, 1,22
H157 (lung tumor cell line)	1,61
H441 (lung tumor cell line)	1,07, 1,15
H460 (lung tumor cell line)	1,01
SKMES1 (lung tumor cell line)	1,02
H810 (lung tumor cell line)	1,20, 1,54

Ejemplo 6 Uso del PRO como una sonda de hibridación

El procedimiento siguiente describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica el PRO como una sonda de hibridación.

El ADN que comprende la secuencia codificante del PRO de longitud completa o maduro, tal como se descubre en ésta, se emplea como una sonda para examinar en busca de ADN homólogos (tales como los que codifican las variantes del PRO que ocurren de forma natural) en bibliotecas de ADNc de tejido humano o bibliotecas genómicas de tejido humano.

La hibridación y lavado de filtros que contenían una de las bibliotecas de ADN se realizó en las siguientes condiciones de elevada rigurosidad. La hibridación con los filtros de sonda derivada del PRO marcada radiactivamente se realiza en una solución con 50% de formamida, 5\times SSC, 0,1% de SDS, 0,1% de pirofosfato sódico, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, 2\times solución de Denhardt, y 10% de sulfato de dextrano, a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1\times SSC y 0,1% de SDS a 42ºC.

El ADN que tiene una identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica el PRO de secuencia nativa de longitud completa puede identificarse a continuación usando técnicas estándares bien conocidas en el campo.

Ejemplo 7 Expresión del PRO en E. coli

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de PRO mediante expresión recombinante en E. coli.

La secuencia de ADN que codifica el PRO se amplifica inicialmente usando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deberían contener sitios para enzimas de restricción que se correspondan con los sitios para enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Podrían emplearse una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector apropiados es el pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)) el cual contiene genes para la resistencia a la ampicilina y tetraciclina. El vector se digiero con enzima de restricción y se desfosforila. La secuencias amplificadas mediante la CPR se ligan a continuación en el vector. El vector incluirá preferiblemente secuencias que codifican un gen de resistencia a antibiótico, un promotor de trp, un líder de polihis (incluyendo los primeros seis codones de la STII, la secuencia polihis, y el sitio de corte para la enteroquinasa), la región codificante del PRO, el terminador de la transcripción lambda, y un gen argU.

A continuación se usa la mezcla de ligación para transformar una cepa de E. coli seleccionada usando los procedimientos descritos en Sambrook et al., ver más arriba. Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer sobre placas LB y a continuación se seleccionan las colonias resistentes al antibiótico. El ADN del plásmido puede aislarse y confirmarse mediante análisis de restricción y secuenciación del ADN.

Los clones seleccionados pueden dejarse crecer durante la noche en medio de cultivo líquido, tal como caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo nocturno podría de forma subsiguiente usarse para inocular un cultivo a mayor escala. Las células se dejan crecer entonces hasta una densidad óptica deseada, durante lo cual la expresión del promotor está activada.

Después de cultivar las células durante varias horas más, las células pueden recolectarse mediante centrifugación. El precipitado de células obtenido mediante la centrifugación puede solubilizarse usando varios agentes conocidos en la técnica, y la proteína PRO solubilizada puede entonces purificarse usando una columna quelante de metales en condiciones que permiten la unión intensa de la proteína.

La PRO podría expresarse en E. coli en una forma marcada con poli-His, usando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica la PRO se amplifica inicialmente usando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contendrán sitios para enzimas de restricción que se corresponden con los sitios para enzimas de restricción sobre el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan un inicio de la traducción eficiente y fiable, la purificación rápida en una columna de quelación de metales, y la extracción proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias marcadas con poli-His, amplificadas mediante la PCR, se ligan a continuación en un vector de expresión, el cual se usa para transformar un huésped E. coli basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq). Los transformantes se cultivan primero en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina, a 30ºC, con agitación, hasta que se alcanza una O.D. 600 de 3-5. Entonces, los cultivos se diluyen 50-100 veces en medio CRAP (preparado mezclando 3,57 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato sódico\cdot2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura de Difco, 5,36 g de SF HyCase de Sheffield en 500 ml de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, 0,55% (p/v) de glucosa, y MgSO_{4} 7 mM)
y se hacen crecer durante aproximadamente 20-30 horas a 30ºC con agitación. Se retiran muestras para verificar la expresión mediante análisis con SDS-PAGE, y el volumen del cultivo se centrifuga para precipitar las células. Los precipitados de células se congelan hasta su purificación y plegado de nuevo.

La pasta de E. coli procedente de fermentaciones de 0,5 a 1 l (6-10 g de precipitados) se resuspende en 10 volúmenes (p/v) en tampón guanidina 7 M, Tris 20 mM, pH 8. Se añade sulfito sódico sólido y tetrationato sódico para conseguir respectivamente una concentración final de 0,1 M y 0,02 M, y la solución se agita durante la noche a 4ºC. Este paso resulta en una proteína desnaturalizada con todos los residuos cisteína bloqueados mediante sulfitolización. La solución se centrifuga a 40.000 r.p.m. en una ultracentrífuga Beckman durante 30 minutos. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de tampón de columna quelante de metal (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 micrómetros para clarificarlo. El extracto clarificado se carga sobre 5 ml de columna quelante de metal Qiagen Ni-NTA equilibrada en el tampón de columna quelante de metal. Se lava la columna con tampón adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluye con tampón que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones que contienen la proteína deseada se juntan y almacenan a 4ºC. La concentración de proteína se estima por su absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de extinción calculado en base a su secuencia de aminoácidos.

Las proteínas se pliegan de nuevo diluyendo la muestra lentamente en tampón de replegado recién preparado consistente en: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM, y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegado se escogen de forma que la concentración final de proteína esté entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de replegado se agita suavemente a 4ºC durante 12-36 horas. La reacción de replegado se detiene mediante la adición de TFA hasta una concentración final del 0,4% (aproximadamente pH 3). Antes de la purificación adicional de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0,22 micrómetros y se añade acetonitrilo hasta una concentración final del 2-10%. La proteína replegada se cromatografía en una columna de fase inversa Poros RI/H usando un tampón móvil de 0,1% de TFA, con elución con un gradiente de acetonitrilo desde el 10% hasta el 80%. Las alícuotas de fracciones con absorbancia A280 se analizan en geles de poliacrilamida y SDS, y las fracciones que contienen proteína replegada homogénea se juntan. Generalmente, las especies correctamente replegadas de la mayoría de las proteínas eluyen con las concentraciones más bajas de acetonitrilo, puesto que esas especies son las más compactas, con sus interiores hidrofóbicos apantallados de la interacción con la resina de fase reversa. Las especies agregadas usualmente se eluyen a concentraciones de acetonitrilo más elevadas. Además de distinguir las formas mal plegadas de proteínas de la forma deseada, el paso de fase inversa también retira la endotoxina de las muestras.

Las fracciones que contienen el polipéptido PRO plegado deseado se juntan, y el acetonitrilo se retira usando una débil corriente de nitrógeno dirigida hacia la solución. Las proteínas se formulan en Hepes 20 mM, pH 6,8, con cloruro sódico 0,14 M y 4% de manitol, mediante diálisis o filtración en gel usando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación y esterilizadas mediante filtración.

Muchos de los polipéptidos PRO descubiertos en EP-99962992.6 (WO-00/36.102), de la cual se divide esta solicitud, se expresaron exitosamente tal como se ha descrito más arriba.

Ejemplo 8 Expresión del PRO en células de mamífero

Este ejemplo ilustra la preparación de una forma de PRO, potencialmente glicosilada, mediante expresión en células de mamífero.

El vector pRK5 (ver EP 307.247, publicada el 15 de marzo de 1989), se emplea como vector de expresión. Opcionalmente, el ADN del PRO se liga en el pRK5 con enzimas de restricción seleccionados para permitir la inserción del ADN del PRO usando procedimientos de ligación tales como los descritos en Sambrook et al., ver más arriba. El vector resultante se denomina pRK5-PRO.

En una realización, las células huéspedes seleccionadas podrían ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se hacen crecer hasta confluencia en placas de cultivo de tejidos, en un medio tal como el DMEM suplementado con suero fetal bovino y, opcionalmente, con componentes nutrientes y/o antibióticos. Aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5-PRO DNA se mezclan con aproximadamente 1 \mug de ADN que codifica el gen VA RNA [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)], y se disuelven en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 M. A esta mezcla se le añaden, gota a gota, 500 \mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1.5 mM, y se deja que se forme un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y añade a las células 293, y se deja reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. A continuación se lavan las células 293 con medio libre de suero, se añade medio reciente, y se incuban las células durante aproximadamente 5 días.

Aproximadamente 24 horas después de la transfección, el medio de cultivo se retira y remplaza con medio de cultivo (solo) o con medio de cultivo que contiene 200 \muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de ^{35}S-metionina. Después de una incubación de 12 horas, se recolecta el medio acondicionado, se concentra sobre un filtro giratorio, y se carga sobre un gel con un 15% de SDS. El gel procesado podrían secarse y exponerse a una película durante un período de tiempo seleccionado para revelar la presencia polipéptido PRO. Los cultivos que contienen células transfectadas podrían experimentar una incubación adicional (en medio libre de suero) y el medio se ensaya en bioensayos seleccionados.

En una técnica alternativa, el PRO podría introducirse transitoriamente en células 293 usando el procedimiento del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Se cultivan células 293 hasta la máxima densidad en un frasco rotatorio y se añaden 700 \mug de ADN de pRK5-PRO. Las células se concentran primero a partir del frasco rotatorio mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba sobre el precipitado de células durante cuatro horas. Las células se tratan con 20% de glicerol durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de células, y se introducen de nuevo en el frasco rotatorio que contiene medio de cultivo de células, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado se centrifuga y filtra para retirar las células y los desechos. La muestra que contiene el PRO expresado puede entonces concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como la diálisis y/o cromatografía en columna.

En otra realización, el PRO puede expresarse en células CHO. El pRK5-PRO puede transferirse dentro de células CHO usando reactivos conocidos tales como el CaPI_{4} o el DEAE-dextrano. Tal como se ha descrito más arriba, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio sustituirse con medio de cultivo (solo) o con medio que contiene una marca radiactiva tal como la ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia de polipéptido PRO, el medio de cultivo podría reemplazarse con medio libre de suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y a continuación se recolecta el medio acondicionado. El medio que contiene el PRO expresado puede entonces concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado.

El PRO marcado con epítopo también podría expresarse en células CHO huéspedes. El PRO podría subclonarse fuera del vector pRK5. El inserto del subclon puede experimentar PCR para fusionarlo en pauta con una marca de epítopo seleccionada, tal como una marca poli-his en un vector de expresión Baculovirus. El inserto de PRO marcado con poli-his puede a continuación subclonarse en un vector dirigido por el SV40 que contiene un marcador de selección, tal como el DHFR, para la selección de clones estables. Finalmente, las células CHO se pueden transfectar (tal como se describió más arriba) con el vector dirigido por SV40. El marcado podría realizarse, tal como se ha descrito más arriba, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el PRO marcado con poli-His y expresado puede entonces concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante cromatografía de afinidad Ni^{2+}-quelado.

El PRO podría expresarse también en células CHO y/o COS mediante un procedimiento de expresión transitoria, o en células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable.

La expresión estable en células CHO se realiza usando el procedimiento siguiente. Las proteínas se expresan como una construcción de IgG (inmunoadhesina) en la que las secuencias codificantes de las formas solubles (por ejemplo, dominios extracelulares) de las proteínas respectivas están fusionadas a una secuencia de región constante de IgG1 que contiene la bisagra, los dominios CH2 y CH2, y/o es una forma marcada con poli-His.

A continuación de la amplificación mediante PCR, los ADN respectivos se subclonan en un vector de expresión de CHO usando técnicas estándares, tal como se describe en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión en CHO se construyen para tener sitios de restricción compatibles 5' y 3' respecto el ADN de interés para permitir la transferencia conveniente de ADNc. El vector usado para la expresión en células CHO es como se describe en Lucas et al., Nucl. Acids Res., 24:9 (1774-1779 (1996), y usa el promotor/potenciador temprano del SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y de la reductasa de dihidrofolato (DHFR). La expresión de la DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido a continuación de la transfección.

Doce microgramos del ADN de plásmido deseado se introducen en aproximadamente 10 millones de células CHO usando los reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfecto (Quiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las células se cultivan como se describe en Lucas et al., ver más arriba. Aproximadamente 3 \times 10^{7} células se congelan en una ampolla para cultivo y producción adicional tal como se describe más abajo.

Las ampollas que contienen el ADN del plásmido se descongelan colocándolas en un baño de agua y se mezcla mediante agitación con vórtice. Los contenidos se pipetean dentro de un tubo de centrífuga que contiene 10 ml de medio y se centrifugan a 1000 r.p.m. durante 5 minutos. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en 10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado a través de 0,2 \mum, con 5% de suero fetal bovino filtrado a través de 0,2 \mum). A continuación, las células se reparten en un frasco rotatorio de 100 ml que contiene 90 ml de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfieren a un frasco rotatorio de 250 ml lleno con 150 ml de medio de cultivo selectivo, y se incuban a 37ºC. Después de otros 2-3 días, se sembraron frascos rotatorios de 250 ml, 500 ml y 2000 ml con 3 \times 10^{5} células/ml. El medio de las células se cambia con medio fresco mediante centrifugación y resuspensión en medio de producción. Aunque podría emplearse cualquier medio para CHO apropiado, en realidad podría emplearse un medio de producción descrito en la patente estadounidense nº 5.122.469, concedida el 16 de junio de 1992. Un frasco rotatorio de producción de 3 l se siembra a 1,2 \times 10^{6} células/ml. El día 0, el número de células está determinado. El día 1 se muestrea el frasco rotatorio y se inicia la aspersión con aire filtrado. El día 2, se muestrea el frasco rotatorio, la temperatura se cambia hasta 33ºC, y se toman 30 mL de glucosa a 500 g/l y 0,6 mL de antiespumante al 10% (por ejemplo, una emulsión al 35% de polidimetilsiloxano, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). A lo largo de la producción, el pH se ajusta según sea necesario para mantenerlo alrededor de 7,2. Después de 10 días, o hasta que la visibilidad desciende por debajo del 70%, el cultivo de células se recolecta mediante centrifugación y filtración a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado, o se almacena a 4ºC o se carga inmediatamente sobre columnas para su purificación.

Para las construcciones marcadas con poli-His, las proteínas se purificaron usando una columna Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añade imidazol al medio acondicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombea sobre una columna de 6 ml de Ni-NTA equilibrada en Hepes 20 mM, pH 7,4, tampón que contiene NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/minutos a 4ºC. Después de cargarla, la columna se lava con tampón de equilibrio adicional y la proteína se eluye con tampón de equilibrio que contiene imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada se desala de forma subsiguiente en un tampón de almacenamiento que contiene Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y un 4% de manitol, pH 6,8, con una columna de 25 ml de G25 Superfine (Pharmacia) y se almacena a -80ºC.

Las construcciones de inmunoadhesina (que contienen Fc) se purifican a partir del medio condicionado como sigue. El medio condicionado se bombea sobre una columna de 5 ml de Proteína A (Pharmacia), la cual se ha equilibrado en tampón fosfato sódico 20 mM, pH 6,8. Después de cargarla, la columna se lava extensivamente con tampón de equilibrio antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutraliza inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 \muL de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se desala de forma subsiguiente en tampón de almacenamiento tal como se ha descrito más arriba para las proteínas marcadas con poli-His. La homogeneidad se verifica mediante geles de poliacrilamida-SDS y mediante secuenciación de aminoácidos N-terminal usando la degradación de Edman.

Muchos de los polipéptidos PRO descubiertos en EP-99962992.6 (WO-00/36.102), de la cual se divide esta solicitud, se expresaron exitosamente tal como se ha descrito más arriba.

Ejemplo 9 Expresión del PRO en levaduras

El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante de PRO en levaduras.

Primero, se construyen vectores de expresión en levadura para la producción intracelular o secreción del PRO a partir del promotor de ADH2/GAPDH. El ADN que codifica el PRO y el promotor se inserta en sitios de enzimas de restricción apropiados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular del PRO. Para la secreción, el ADN que codifica el PRO puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con ADN que codifica el promotor de ADH2/GAPDH, un péptido señal del PRO nativo u otro péptido señal de mamífero, o, por ejemplo, un factor alfa de levadura o una secuencia señal/líder secretora de invertasa, y secuencias de eslabones (si se precisan) para la expresión del PRO.

Las células de levadura, tales como la cepa AB110 de levadura, pueden entonces transformarse con los plásmidos de expresión descritos más arriba y cultivarse en medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación mediante SDS-PAGE, seguida por tinción de los geles con colorante azul de Coomassie.

El PRO recombinante puede a continuación aislarse y purificarse retirando las células de levadura del medio de fermentación mediante centrifugación, y concentrando entonces el medio usando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene el PRO podría purificarse adicionalmente usando resinas de cromatografía en columna seleccionadas.

Muchos de los polipéptidos PRO descubiertos en EP-99962992.6 (WO-00/36.102), de la cual se divide esta solicitud, se expresaron exitosamente tal como se ha descrito más arriba.

Ejemplo 10 Expresión del PRO en células de insecto infectadas con baculovirus

El procedimiento siguiente describe la expresión recombinante del PRO en células de insecto infectadas con baculovirus.

La secuencia que codifica el PRO se fusiona cadena arriba de una marca de epítopo contenida dentro de un vector de expresión en baculovirus. Tales marcas de epítopo incluyen las marcas poli-His y las marcas de inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Podrían emplearse una variedad de plásmidos, incluyendo los plásmidos derivados de plásmidos disponibles comercialmente, tales como el pVL1393 (Novagen). En resumen, la secuencia que codifica el PRO o la porción deseada de la secuencia codificante del PRO, tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular, se amplifica mediante la PCR con cebadores complementarios de las regiones 5' y 3'. El cebador 5' podría incorporar sitios de enzimas de restricción (seleccionados) flanqueadores. El producto se digiere a continuación con esos enzimas de restricción seleccionados y se subclona en el vector de expresión.

El baculovirus recombinante se genera co-transfectando el plásmido anterior y el ADN de virus BaculoGold™ (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se recolectan y usan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de la proteína se realizan como describieron O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual. Oxford: Oxford University Press (1994).

El PRO marcado con poli-His expresado puede entonces purificarse, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad Ni^{2+}-quelato como sigue. Los extractos se preparan a partir de células Sf9 infectadas con virus recombinante tal como describieron Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993). En resumen, se lavan las células Sf9, se resuspenden en tampón de sonicación (25 ml de Hepes, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; 10% de glicerol; 0,1% de NP-40; KCl 0,4 M), y se sonican dos veces durante 20 segundos sobre hielo. Los sonicados se clarifican mediante centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, 10% de glicerol, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una columna de agarosa Ni^{2+}-NTA (disponible comercialmente de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua, y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto de células filtrado se carga sobre la columna a 0,5 ml por minuto. Se lava la columna con tampón de carga hasta una A_{280} de línea base, momento en el que se inicia la recogida de fracciones. A continuación, se lava la columna con un segundo tampón de lavado (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM; 10% de glicerol, pH 6,0), el cual eluye la proteína unida no específicamente. Después de alcanzar de nuevo la línea base de A_{280}, se revela la columna con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el segundo tampón de lavado. Se recogen fracciones de un ml y se analizan mediante SDS-PAGE y tinción con plata, o transferencia Western con Ni^{2+}-NTA conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el PRO marcado con His_{10} eluido se juntan y dializan frente a tampón de carga.

Alternativamente, la purificación del PRO marcado con IgG (o marcado con Fc) puede realizarse usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo, la cromatografía en columna de Proteína A o Proteína G.

Muchos de los polipéptidos PRO descubiertos en EP-99962992.6 (WO-00/36.102), de la cual se divide esta solicitud, se expresaron exitosamente tal como se ha descrito más arriba.

Ejemplo 11 Preparación de anticuerpos que unen el PRO

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unir específicamente el PRO.

Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales son conocidas en la técnicas y se describen, por ejemplo, en Goding, ver más arriba. Los inmunogenes que podrían emplearse incluyen el PRO purificado, proteínas de fusión conteniendo el PRO, y células que expresan el PRO recombinante sobre la superficie celular. La selección del inmunogén puede realizarla el especialista capacitado sin experimentación innecesaria.

Los ratones, tales como los Balb/c, se inmunizan con el inmunogén del PRO emulsionado en adyuvante de Freund completo, y se inyectan subcutánea o intraperitonealmente en un cantidad desde 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunogén se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, Mo.) y se inyecta en las plantas de las patas posteriores de los animales. Los ratones inmunizados se estimulan a continuación de 10 a 12 días más tarde con inmunogén adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. A partir de entonces, durante varias semanas, los ratones podrían estimularse con inyecciones de inmunización adicionales. Podrían obtenerse periódicamente muestras de suero de los ratones mediante sangrado retro-orbital para ensayo en ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti-PRO.

Una vez se ha detectado un nivel de título de anticuerpos apropiado, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden inyectarse con una inyección intravenosa final de PRO. Tres o cuatro días más tarde, se sacrifican los animales y se recogen las células del bazo. Las células del bazo se fusionan a continuación (usando polietilenglicol al 35%) con una línea celular de mieloma de ratón seleccionada, tal como la P3X63AgU.1, disponible en la ATCC, Nº CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que pueden sembrarse en placas de cultivo de 96 pocillos que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, de los híbridos de mieloma, y de los híbridos de células del bazo.

Las células de hibridoma se examinan en un ELISA en busca de reactividad contra el PRO. La determinación de células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra el PRO se halla dentro de las capacidades de la técnica.

Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c singeneicos para producir ascites que contienen los anticuerpos monoclonales anti-PRO. Alternativamente, las células de hibridoma pueden cultivarse en frascos de cultivo de tejidos o botellas rotatorias. La purificación de los anticuerpos producidos en los ascites puede conseguirse usando la precipitación con sulfato amónico, seguida por cromatografía por exclusión en gel. Alternativamente, puede emplearse la cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a la Proteína A o Proteína G.

Ejemplo 12 Purificación de polipéptidos PRO usando anticuerpos específicos

Los polipéptidos PRO nativos o recombinantes podrían purificarse mediante una variedad de técnicas estándares en el campo de la purificación de proteínas. Por ejemplo, el polipéptido pro-PRO, el polipéptido PRO maduro, o el polipéptido pre-PRO se purifica mediante cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para el polipéptido PRO de interés. En general, se construye una columna de afinidad acoplando covalentemente el anticuerpo anti-polipéptido PRO a una resina cromatográfica activada.

Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de suero inmune, bien mediante precipitación con sulfato amónico o mediante purificación sobre Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ.). De igual modo, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de fluido de ascites en ratón mediante precipitación con sulfato amónico o mediante purificación sobre Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une covalentemente a una resina cromatográfica tal como la SEPHAROSE™ activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, se bloquea la resina, y la resina derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Una columna de inmunoafinidad de este tipo se utiliza en la purificación del polipéptido PRO mediante la preparación de una fracción a partir de células que contienen el polipéptido PRO en una forma soluble. Esta preparación se deriva mediante solubilización de la célula entera, o de una fracción subcelular obtenida vía centrifugación diferencial, mediante la adición de detergente o mediante otros procedimientos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido PRO soluble que contiene una secuencia señal podría secretarse en cantidad útil en el medio en el que se cultivan las células.

Una preparación que contiene polipéptido PRO soluble se introduce en una columna de inmunoafinidad, y se lava la columna en condiciones que permiten la absorbancia preferente del polipéptido PRO (por ejemplo, tampones de fuerza iónica elevada en presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye en condiciones que interrumpe la unión anticuerpo/polipéptido PRO (por ejemplo, un tampón con pH bajo, tal como aproximadamente pH 2-3, o una concentración elevada de un agente caotrópico tal como la urea o el ion tiocianato), y se recoge un polipéptido PRO.

Ejemplo 13 Examen de fármacos

Esta invención es particularmente útil para examinar compuestos usando polipéptidos PRO, o fragmentos unidores de los mismos, en cualquiera de una variedad de técnicas de examen de fármacos. El polipéptido PRO o fragmento empleado en un ensayo tal podría estar libre en solución, fijado sobre un soporte sólido, unido sobre una superficie celular, o ubicado intracelularmente. Un procedimiento de examen de fármacos utiliza células huéspedes eucariotas o procariotas son están transformadas establemente con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido PRO o fragmento. Los fármacos se examinan respecto tales células transformadas en ensayos de unión competitiva. Tales células, bien en forma viable o fijada, pueden usarse para ensayos de unión estándares. Se podría medir, por ejemplo, la formación de complejos entre el polipéptido PRO o un fragmento y el agente que se está ensayando. Alternativamente, se puede examinar la disminución en la formación de complejo entre el polipéptido PRO y su célula diana o receptores diana causada por el agente que se está ensayando.

Por tanto, la presente invención proporciona procedimientos para examinar en busca de fármacos o cualesquier otros agentes que pueden afectar una enfermedad o trastorno asociada con el polipéptido PRO. Estos procedimientos comprenden poner en contacto un agente tal con un polipéptido PRO o fragmento del mismo y ensayar (i) la presencia de un complejo entre el agente u el polipéptido PRO o fragmento, o (ii) la presencia de un complejo entre el polipéptido PRO o el fragmento y la célula, mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. En tales ensayos de unión competitiva, el polipéptido PRO o fragmento están típicamente marcados. Después de la incubación apropiada, el polipéptido PRO o fragmento libres se separan del presente en forma unida, y la cantidad de marca libre o no complejada es una medida de la capacidad del agente concreto para unir el polipéptido PRO o para interferir con el complejo polipéptido PRO/célula.

Otra técnica para examinar fármacos proporciona el examen con elevado rendimiento en busca de compuestos que tienen una afinidad de unión apropiada por un polipéptido, y se describe en detalle en WO84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984. Explicada resumidamente, se sintetizan sobre un sustrato sólido, tal como puntas de plástico o alguna otra superficie, un número elevado de diferentes compuestos de ensayo que son péptidos pequeños. Tal como se aplicó a un polipéptido PRO, los compuestos de ensayo peptídicos se hacen reaccionar con el polipéptido PRO y se lavan. El polipéptido PRO unido se detecta mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. El polipéptido PRO purificado puede depositarse también directamente sobre placas para su uso en las técnicas de examen de fármacos mencionadas más arriba. Además, pueden usarse anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido.

Esta invención también contempla el uso de ensayos de examen de fármacos competitivos, en los que anticuerpos neutralizantes capaces de unirse específicamente al polipéptido PRO, compiten con un compuesto de ensayo por la unión al polipéptido PRO o a fragmentos del mismo. De esta forma, los anticuerpos pueden usarse para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos con el polipéptido PRO.

Ejemplo 14 Diseño racional de fármacos

El objetivo del diseño racional de fármacos es producir análogos estructurales de polipéptido biológicamente activos de interés (es decir, un polipéptido PRO) o de moléculas pequeñas con las que interaccionan, por ejemplo, agonistas, antagonistas, o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos puede usarse para diseñar drogas que son formas más activas o estables del polipéptido PRO, o que potencian o interfieren con la función del polipéptido PRO in vivo (cf., Hodgson, Bio/Technology, 9:19-21 (1991)).

En una estrategia, la estructura tridimensional del polipéptido PRO, o de una complejo polipéptido PRO-inhibidor, se determina mediante cristalografía de rayos X, mediante modelado con ordenador o, más típicamente, mediante una combinación de las dos estrategias. Para elucidar la estructura y para determinar los sitios activos de la molécula deben determinarse tanto la forma como las cargas del polipéptido. Menos frecuentemente, podría conseguirse información útil en relación a la estructura del polipéptido PRO mediante modelado en base a la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la información estructural relevante se usa para diseñar moléculas análogas similares al polipéptido PRO o para identificar inhibidores eficientes. Los ejemplos útiles de diseño racional de fármacos podrían incluir moléculas que tienen una actividad o actividad mejorada, tal como muestran Braxton y Wells, Biochemistry, 31:7796-7801 (1992) o que actúan como inhibidores, agonistas o antagonistas de péptidos nativos, tal como muestran Athauda et al., J. Biochem., 113:742-746 (1993).

Es posible también aislar un anticuerpo específico para una diana, seleccionado mediante ensayo funcional, tal como se ha descrito más arriba, y a continuación resolver su estructura cristalina. Esta estrategia, en principio, proporciona un núcleo de fármaco (pharmacore) a partir del cual puede basarse el diseño subsiguiente de fármacos. Es posible prescindir del todo de la cristalografía de la proteína mediante la generación anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) contra un anticuerpo funcional, farmacológicamente activo. Al igual que la imagen especular de una imagen especular, el sitio de unión de los anti-ids se esperaría que fuera un análogo del receptor original. El anti-id podría entonces usarse para identificar y aislar péptidos a partir de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces como núcleo del fármaco.

Gracias a la presente invención, podría disponerse de cantidad suficiente del polipéptido PRO para realizar tales estudios analíticos como cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO proporcionado en ésta, proporcionará una guía a los que emplean técnicas de modelado con ordenador en lugar de, o además de la cristalografía de rayos X.

Depósito de material

Los materiales siguientes se han depositado en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EE.UU. (ATCC):

Material	Depósito ATCC Nº	Fecha del depósito
DNA77631-2537	203651	9 de febrero de 1999

Este depósito se realizó de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el "Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorgani1smos para el Propósito del Procedimiento de Patentes y las Regulaciones del mismo" (Tratado de Budapest). Este asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. La ATCC hará asequibles los depósitos en los términos del Tratado de Budapest, y estarán sometidos a un acuerdo entre Genentech, Inc. y la ATCC, el cual asegura la disponibilidad permanente y no restringida de la progenie de los cultivos al público a partir de la concesión de la pertinente patente estadounidense o a partir de hacerse pública cualquiera solicitud de patente estadounidense o extranjera, cualesquiera que suceda primero, y asegura la disponibilidad de la progenie a cualquiera que detente el derecho a la misma, según determine el Comisionado de Patentes y Marca Registradas de los Estados Unidos de acuerdo con el artículo 35 de la Constitución de los Estados Unidos, sección 122, y las reglamentaciones del Comisionado relativas a la misma (incluyendo la nº 37 de la CFR, sección 1.14, con particular referencia a la 886 OG 638).

El asignatario de la presente invención ha aceptado que si un cultivo de los materiales en depósito muere, o se pierde, o se destruye, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, será remplazado con prontitud, a partir de la notificación, con otro del mismo. La disponibilidad del material depositado no debe considerarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes sobre patentes.

La especificación escrita precedente se considera que es suficiente para permitir a alguien capacitado en la técnica practicar la invención. La presente invención no debe limitarse en su alcance por la construcción depositada, puesto que la realización depositada se pretende como una única ilustración de ciertos aspectos de la invención. El depósito de material en ésta no constituye la admisión de que la descripción escrita contenida en ésta es inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni debe considerarse como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa.

<110> Genentech, Inc.

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<120> Polipéptidos secretados y transmembrana y ácidos nucleicos que codifican los mismos

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<130> CMD/FP6063333

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<140> EP 02016080.0

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<141> 2002-07-19

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<150> EP 99962992.6

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<151> 1999-12-01

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<150> US 60/119.537

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<151> 1999-02-10

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<160> 7

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<210> 1

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<211> 3437

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

18

19

20

21

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<210> 2

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<211> 1029

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

22

23

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25

26

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27

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<210> 3

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sonda de oligonucleótidos sintética

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgtaaaacga cggccagtta aatagtcctg caattattaa tct

\hfill

43

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<210> 4

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<211> 41

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sonda de oligonucleótidos sintética

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

caggaaacat ctatgaccac ctgcacacct gcaaatccat t

\hfill

41

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Claims (23)

1. Ácido nucleico aislado, el cual codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de residuos aminoácidos 1 ó 17 a 1029, inclusive, de la Figura 2 (SEC. Nº ID.: 2) y/o el polipéptido de longitud completa o maduro codificado por el inserto de ADNc (DNA77631-2537) del Depósito de la ATCC Nº 203651, o que es complementario de la misma, en donde dicha identidad de secuencia se determina usando el programa de ordenador ALIGN-2.

2. Ácido nucleico de la Reivindicación 1, en donde el nivel de identidad es de al menos el 90%.

3. Ácido nucleico de la Reivindicación 2, en donde el nivel de identidad es de al menos el 95%.

4. Ácido nucleico de la Reivindicación 1, el cual codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos aminoácidos 1 ó 17 a 1029, inclusive, de la Figura 2 (SEC. Nº ID.: 2) y/o el polipéptido de longitud completa o maduro codificado por el inserto de ADNc (DNA77631-2537) del Depósito de la ATCC Nº 203651, o el cual es complementario al mismo.

5. Ácido nucleico de la Reivindicación 1, el cual comprende la secuencia codificante de longitud completa de la secuencia mostrada en la Figura 1 (SEC. Nº ID.: 1), o el complemento de la misma.

6. Ácido nucleico de la Reivindicación 1, el cual comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEC. Nº ID.: 1), o el complemento de la misma.

7. Ácido nucleico aislado, el cual tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia de nucleótidos 46 ó 94 a 3132, inclusive, de la Figura 1 (SEC. Nº ID.: 1), o el cual es complementario de la misma, en donde dicha identidad de secuencia se determina usando el programa de ordenador ALIGN-2.

8. Ácido nucleico de la Reivindicación 7, en donde el nivel de identidad es de al menos el 90%.

9. Ácido nucleico de la Reivindicación 8, en donde el nivel de identidad es de al menos el 95%.

10. Vector que comprende el ácido nucleico de cualquier reivindicación precedente.

11. Vector de la Reivindicación 10 unido operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula hospedadora transformada con el vector.

12. Célula hospedadora que comprende el vector de la Reivindicación 10 ó Reivindicación 11.

13. Célula hospedadora de la Reivindicación 12 en donde dicha célula es una célula CHO, una E. coli, o una célula de levadura.

14. Proceso para producir un polipéptido que comprende cultivar la célula hospedadora de la Reivindicación 12 ó Reivindicación 13 en condiciones apropiadas para la expresión de dicho polipéptido y recuperar dicho polipéptido del cultivo de células.

15. Polipéptido aislado que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de residuos aminoácidos 1 ó 17 a 1029, inclusive, de la Figura 2 (SEC. Nº ID.: 2) y/o el polipéptido de longitud completa o maduro codificado por el inserto de ADNc (DNA77631-2537) del Depósito de la ATCC Nº 203651, en donde dicha identidad de secuencia se determina usando el programa de ordenador ALIGN-2.

16. Polipéptido de la Reivindicación 15, el cual consiste en los residuos aminoácidos 1 ó 17 a 1029, inclusive, de la Figura 2 (SEC. Nº ID.: 2).

17. Polipéptido de la Reivindicación 15, en donde el nivel de identidad es de al menos el 90%.

18. Polipéptido de la Reivindicación 15, en donde el nivel de identidad es de al menos el 95%.

19. Molécula quimérica que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 15 a 18 fusionado con una secuencia de aminoácidos heteróloga.

20. Molécula quimérica de la Reivindicación 19, en donde dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una secuencia de marca de epítopo.

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21. Molécula quimérica de la Reivindicación 19, en donde dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una región Fc de una inmunoglobulina.

22. Anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de acuerdo con la Reivindicación 16.

23. Anticuerpo de la Reivindicación 22, el cual es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo de cadena sencilla.