ES2240310T3 - Polipeptidos y acidos nucleicos que codifican los mismos. - Google Patents

Polipeptidos y acidos nucleicos que codifican los mismos.

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Abstract

Ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO:2), o su complemento, en el que dicha identidad de secuencia está determinada sobre toda la longitud de las secuencias que se comparan, y en el que el polipéptido tiene la capacidad de inhibir la producción de proteínas mediante células del conducto pancreático PDB12.

Description

Polipéptidos y ácidos nucleicos que codifican los mismos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a la identificación y al aislamiento de nuevo ADN y a la producción recombinante de nuevos polipéptidos codificados mediante ese ADN.
Antecedentes de la invención
Las proteínas extracelulares y unidas con membrana juegan un papel importante en la formación, diferenciación y mantenimiento de organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, la proliferación, migración, diferenciación, o interacción con otras células, está típicamente gobernado por la información recibida desde otras células y/o el ambiente inmediato. Esta información a menudo se transmite mediante polipéptidos segregados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos, y hormonas) que, a su vez, son recibidos e interpretados por diversas proteínas receptores de células o unidas a la membrana. Estos polipéptidos segregados o moléculas de señalización normalmente pasan a través de la trayectoria de secreción celular para alcanzar su sitio de acción en el ambiente extracelular, usualmente en una proteína receptora unida a la membrana.
Las proteínas segregadas tienen varias aplicaciones industriales, incluyendo el uso como productos farmacéuticos, productos de diagnosis, biosensores y bioreactores. De hecho, la mayoría de medicamentos de proteínas disponibles en la actualidad, tales como agentes trombolíticos, interferonas, interleucinas, eritropoietinas, factores de estimulación de colonia, y diferentes citoquinas, son proteínas secretorias. Sus receptores, que son proteínas unidas a la membrana, también tienen potencial como agentes terapéuticos o de diagnóstico. Por ejemplo, se puede utilizar inmunoadhesinas receptoras como agentes terapéuticos para bloquear la interacción receptor-ligando. Las proteínas unidas a la membrana también se pueden utilizar para el tamizado de péptidos potenciales o inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción receptor/ligando relevante. Estas proteínas unidas a la membrana y receptores de células incluyen, pero no están limitadas a las mismas, receptores de citoquina, quinasas receptoras, fosfatasas receptoras, receptores implicados en interacciones célula-célula, y moléculas de adhesina como selectinas e integrinas. La transducción de las señales que regulan el crecimiento de la célula y la diferenciación está regulada en parte mediante fosforilación de varias proteínas celulares. Quinasas de proteína tirosina, encimas que catalizan ese proceso, también pueden actuar como receptores de factores de crecimiento. Los ejemplos incluyen receptor de factor de crecimiento de fibroblastos y receptor de factor de crecimiento de nervios.
Se han acometido esfuerzos por parte de la industria y de la academia para identificar nuevas proteínas receptoras nativas segregadas y unidas a la membrana. Muchos de los esfuerzos están focalizados en el tamizado de bancos de DNA recombinantes de mamíferos para identificar las secuencias de codificación para las nuevas proteínas receptoras segregadas y unidas a la membrana. Ejemplos de procedimientos y técnicas de tamizado se describen en la literatura [ver, por ejemplo, Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:7108-7113 (1996); Patente US-5.536.637)].
Describimos aquí la identificación y la caracterización de nuevos polipéptidos segregados y transmembrana y nuevos ácidos nucleicos que codifican esos polipéptidos.
PRO211
El factor de crecimiento epidérmico (FCE) es un factor mitógeno convencional que estimula la proliferación de varios tipos de células, incluyendo las células epiteliales y fibroblastos. El FCE se une y activa el receptor FCE (RFCE), que inicia la señal intracelular y los efectos posteriores. El RFCE se expresa en neuronas del córtex cerebral, cerebelo e hipocampo además de otras zonas en el sistema nervioso central (SNC). Además, el FCE también se expresa en varias zonas del SNC. Por lo tanto, el FCE actúa no solamente sobre células mitóticas, sino también sobre neuronas postmitóticas. De hecho, muchos estudios han indicado que el FCE tiene efectos neurotróficos o neuromodulatorios sobre varios tipos de neuronas en el SNC. Por ejemplo, el FCE actúa directamente sobre neuronas corticales cerebrales cultivadas y neuronas cerebelosas, mejorando la producción y supervivencia de las neuritas. Por otro lado, el FCE también actúa sobre otros tipos de células, que incluyen neuronas colinérgicas septales y dopaminérgicas mesencefálicas, indirectamente a través de células gliales. La evidencia de los efectos del FCE sobre las neuronas en el SNC es acumulativo, pero los mecanismos de acción permanecen esencialmente desconocidos. La señalización inducida con FCE en células mitóticas se entiende mejor que en las neuronas postmitóticas. Los estudios de células feocromocitoma PC12 y neuronas corticales cerebrales cultivadas han sugerido que las acciones neurotróficas inducidas con FCE están mediadas mediante la activación sostenida del RFCE y la quinasa de proteína activada con mitógeno (MAPK) en respuesta al FCE. La señalización intracelular sostenida está correlacionada con el índice disminuido de la regulación inferior del RFCE, que podría determinar la respuesta de las células neuronales al FCE. Es probable que el FCE sea un factor de crecimiento de múltiples potencias que actúa baja varios tipos de células, incluye las células mitóticas y las neuronas postmitóticas.
El FCE se produce mediante las glándulas salivares y de Brunner del sistema gastrointestinal, el riñón, el páncreas, la glándula tiroides, la glándula pituitaria, y el sistema nervioso, y se encuentra en fluidos corporales tales como la saliva, la sangre, el fluido cerebroespinal (FCE), la orina, el fluido amniótico, el jugo pancreático, y la leche materna, Plata-Salaman, Peptides 12: 653-663 (1991).
El FCE está mediado por su receptor específico de membrana, que contiene una quinasa de tirosina intrínseca. Stoscheck et al., J. Cell Biochem. 31: 135-152 (1986). Se cree que el FCE funciona mediante unión a la porción extracelular de su receptor, que incluye una señal de transmembrana que activa la quinasa de tirosina intrínseca.
La purificación y el análisis de secuencia del dominio de FCE similar ha revelado la presencia de seis residuos de cisteína conservados que se unen para crear tres bucles de péptido, Savage et al., J. Biol. Chem. 248: 7669-7672 (1979). Ahora se conoce generalmente que varios péptidos diferentes pueden reaccionar con el receptor de FCE que comparte el mimo motivo generalizado X_{n}CX_{7}CX_{4/5}CX_{10}CXCX_{5}GX_{2}CX_{n}, donde X representa cualquier aminoácido no cisteína, y n es un número de repetición variable. Los péptidos no aislados que tienen este motivo incluye TGF-\alpha, amfiregulina, factor de crecimiento derivado de schwannoma (FCDS), factores de crecimiento de FCE similares ligados a la heparina y ciertos péptidos codificados de manera viral (por ejemplo, virus Vaccinia, Reisner, Nature 313: 801-803 (1985), virus fibroma Shope, Chang et al., Mol Cell Biol. 7: 535-540 (1987), Molluscum contagiosum, Porter y Archard, J. Gen. Virol. 68: 673-682 (1987), y virus Myxoma, Upton et al., J. Virol. 61: 1271-1275 (1987), Prigent y Lemoine, Prog. Growth Factor Res. 4: 1-24 (1992).
Los dominios de FCE similares no están confinados a factores de crecimiento, pero se han observado en una variedad de proteínas de la superficie de la célula y extracelulares, que tienen propiedades interesantes en la adhesión de la célula, interacción y desarrollo proteína-proteína, Laurence y Gusterson, Tumor Biol. 11: 229-261 (1990). Estas proteínas incluyen factores de coagulación de sangre (factores VI, IX, X, XII, proteína C, proteína S, proteína Z, activador plasminógeno de tejido, uroquinasa), componentes de matriz extracelular (laminina, citotactina, entactina), receptores de superficie de la célula (receptor LDL, receptor trombomodulina) y proteínas relacionadas con la inmunidad (complemento Clr, uromodulina).
Incluso más interesante, el diseño de la estructura general de los precursores de FCE similares se preserva a través de organismos inferiores, así como en células de mamíferos. Se han identificado una serie de genes con significancia de desarrollo en invertebrados con repeticiones de FCE similares. Por ejemplo, el gen notch de la Drosophila codifica 36 colocadas en tándem 40 repeticiones de aminoácido que muestran homología con el FCE, Wharton et al., Cell 43: 557-581 (1985). Las parcelas de muestreo de la hidropatía indican un dominio de expansión de membrana putativa, con las secuencias relacionadas con el FCE situadas en el lado extracelular de la membrana. Otros genes homeóticos con repeticiones de FCE similares incluyen Delta, 95F y 5ZD, que se identificaron usando sondas basadas en Notch, y el gen nematodo Lin-12 que codifica un receptor putativo para una señal de desarrollo transmitida entre dos células especificadas.
Específicamente, el FCE ha mostrado que tiene potencial en la preservación y el mantenimiento de la mucosa gastrointestinal y la reparación de lesiones mucosas agudas y crónicas, Konturek et al., Eur. J. Gastroenterol Hepatol. 7 (10), 933-37 (1995), incluyendo el tratamiento de enterocolitis necrótica, el síndrome Zollinger-Ellison, ulceraciones gastrointestinales y atrofia de micropilo congénita, Guglietta y Sullivan, Eur. J. Gastroenterol Hepatol, 7 (10), 945-50 (1995). Además, el FCE se ha implicado en la diferenciación de folículos capilares; du Cros, J. Invest. Dermatol. 101 (1 Supl.) 106S-113S (1993), Hillier, Clin. Endocrinol. 33 (4), 427-28 (1990); función del riñón, Hamm et al., Semin. Nephrol. 13 (1): 109-15, Harris, Am. J. Kidney Dis. 17 (6): 627-30 (1991); fluido lagrimal, van Setten et al., Int. Ophthalmol 15 (6); 359-62 (1991); coagulación de la sangre con mediación de vitamina K, Stenflo et al., Blood 78 (7): 1637-51 (1991). El FCE está también implicado en varias enfermedades de la piel caracterizadas por diferenciación anormal del queratinocito, por ejemplo, soriasis, cánceres epiteliales tales como carcinomas de células escamosas del pulmón, carcinoma epidermoide de la vulva y gliomas. King et al., Am. J. Med. Sci. 296: 154-158 (1988).
De gran interés es la evidencia de soporte que las alteraciones genéticas en las trayectorias de señalización de los factores de crecimiento están muy vinculadas con anormalidades de desarrollo y con enfermedades crónicas que incluyen el cáncer. Aaronson, Science 254; 1146-1153 (1991). Por ejemplo, el c-erb-2 (también conocido como HER-2), un proto-oncogen con una estructura muy similar a la proteína del receptor FCE, se expresa en el cáncer de mama humano. King et al., Science 229: 974-976 (1985); Gullick, Hormones and their actions, Cooke et al., eds, Amsterdam, Elsevier, pp 349-360 (1986).
Aquí describimos la identificación y la caracterización de un nuevo polipéptido que tiene homología al FCE, en el que ese polipéptido se designa aquí como PRO211.
Descripción de la invención PRO211
Los solicitantes han identificado un clon ADNc que codifica un nuevo polipéptido que tiene homología al FCE, designado en la presente solicitud como polipéptido "PRO211".
En una realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada tal como se define en las reivindicaciones que comprende ADN que codifica un polipéptido PRO211. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende ADN que codifica el polipéptido PRO211 homólogo de FCE similar de la figura 2 (SEC ID NO: 2) indicado en la figura 1 (SEC ID NO: 1), o es complementario a esta secuencia de ácido nucleico de codificación, y permanece unido de manera estable al mismo bajo condiciones por lo menos moderadas, y opcionalmente, bajo condiciones de alta escasez.
En otra realización, la realización proporciona un polipéptido PRO211 homólogo de FCE similar PRO211 tal como se define en las reivindicaciones. En particular, la invención proporciona polipéptidos homólogos de FCE similares PRO211 de secuencia nativa aislada, que en una realización, incluye una secuencia de aminoácido que comprende residuos: 1 a 353 de la figura 2 (SEC ID NO: 2).
Realizaciones Adicionales
En otras realizaciones de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos descritos anterior o posteriormente. También se proporciona una célula hospedadora que comprende cualquiera de estos vectores. A modo de ejemplo, las células hospedadoras pueden ser células CHO, E. coli, o levadura. También se proporciona un procedimiento para producir polipéptidos PRO211, tal como se define en las reivindicaciones y comprende células hospedadoras de cultivo bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y la recuperación del polipéptido deseado a partir del cultivo de la célula.
En otras realizaciones, la invención proporciona moléculas quiméricas tal como se define en las reivindicaciones que comprende polipéptido PRO211 fundido con un polipéptido heterólogo o una secuencia de aminoácido. Un ejemplo de esta molécula quimérica comprende un polipéptido PRO211 fundido con una secuencia de referencia epítopo o una región Fc de una inmunoglobulina.
En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo tal como se define en las reivindicaciones, que se une específicamente a un polipéptido PRO211. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 1) de una secuencia nativa PRO211 ADNc, en donde la SEC ID NO: 1 es un clon designado aquí como "UNQ185" y/o "ADN32292-1131".
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácido (SEC ID NO: 2) derivada de la secuencia de codificación de la SEC ID NO: 1 mostrada en la figura 1.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones
Los términos "polipéptido PRO" y "PRO" tal como se usan aquí y cuando están seguidos inmediatamente por una designación numérica se refiere a varios polipéptidos, en los que la designación completa (es decir, PRO/número) se refiere a secuencias de polipéptido específicas tal como se describen aquí. Los términos "PRO/número polipéptido" y "PRO/número" tal como se usan aquí abarcan los polipéptidos de secuencia nativa y las variantes de polipéptidos (que también se definen aquí). Los polipéptidos PRO aquí descritos se pueden aislar a partir de una pluralidad de fuentes, tales como a partir de tipos de tejido humano o a partir de otra fuente, o prepararse mediante procedimientos recombinantes o sintéticos.
Un "polipéptido PRO de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácido que el correspondiente polipéptido PRO derivado de la naturaleza. Estos polipéptidos PRO de secuencia nativos se pueden aislar a partir de la naturaleza o se pueden producir mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido PRO de secuencia nativa" abarca específicamente formas truncadas o segregadas que se producen de manera natural del polipéptido PRO específico (por ejemplo una secuencia de dominio extracelular), formas variantes que se producen de manera natural (por ejemplo formas unidas de manera alternativa) y variantes alélicas que se producen de manera natural del polipéptido. En una realización de la invención, la secuencia nativa PRO211 es un polipéptido PRO211 de secuencia nativa acabada o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 353 de la figura 2 (SEC ID NO: 2).
"Variante de polipéptido PRO" significa un polipéptido PRO activo tal como se define anterior o posteriormente que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia de aminoácido con la secuencia de polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa tal como se describe aquí. Estas variantes de polipéptido PRO incluyen, por ejemplo, polipéptidos PRO en los que se añaden uno o más residuos de aminoácido, o se retiran, en el terminal N- o C- de la secuencia nativa de animoácido de longitud completa. Ordinariamente, una variante de polipéptido PRO tendrá por lo menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia de aminoácido, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia de aminoácido, e incluso más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia de aminoácido con la secuencia de aminoácido de la secuencia nativa de aminoácido de longitud completa tal como se describe aquí.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácido" respecto a las secuencias de polipéptido PRO aquí identificadas se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácido en la secuencia de polipéptido PRO específica, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna substitución conservativa como parte de la identidad de la secuencia. La alineación por propósitos de determinación del porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácido se puede conseguir de varias maneras que están dentro de la práctica en la materia, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente tal como software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El programa de software de alineación preferido es BLAST. Los técnicos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima sobre toda la longitud de las secuencias que se comparan.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" respecto a las secuencias de ácido nucleico que codifican PRO aquí identificadas se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con los nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico PRO de interés, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia. La alineación por propósitos de determinación del porcentaje de identidad de la secuencia de ácido nucleico se puede conseguir de varias maneras que están dentro de la práctica en la materia, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente tal como software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los técnicos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima sobre toda la longitud de las secuencias que se comparan.
"Aislado", cuando se usa para describir los diferentes polipéptidos aquí descritos, significa un polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podría interferir típicamente con uso de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de N-terminal o secuencia de aminoácido interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) a una homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o no reducción usando Coomasie azul o, preferiblemente, tinte de plata. El polipéptido aislado incluye polipéptido in situ en células recombinantes, ya que por lo menos un componente del ambiente natural del polipéptido PRO no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.
Un ácido nucleico de polipéptido PRO "aislado" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante que está ordinariamente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del polipéptido PRO. Una molécula de ácido nucleico de polipéptido PRO aislada es diferente que en la forma o manera en la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico de polipéptido PRO aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico de polipéptido PRO específico en que existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico de polipéptido PRO aislada incluye moléculas de ácido nucleico de polipéptido PRO contenidas en células que expresan ordinariamente el polipéptido PRO donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una posición cromosómica diferente que la de las células natura-
les.
"Análisis de Southern" o "transferencia de Southern" es un procedimiento mediante el cual se confirma la presencia de secuencias de ADN en un compendio de endonucleasa de restricción de ADN o una composición que contiene ADN mediante hibridación a un oligonucleótido o fragmento de ADN marcado. El análisis de Southern típicamente implica la separación electroforética de compendios de ADN en geles de agarosa, la desnaturalización del ADN después de la separación electroforética, y la transferencia del ADN a nitrocelulosa, nylon, u otro soporte de membrana adecuado para su análisis con una sonda radiomarcada, biotinilada o marcada con enzimas tal como se describe en las secciones 9.37-9.52 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
"Análisis de Northern" o "transferencia de Northern" es un procedimiento usado para identificar secuencias de ARN que hibridizan a una sonda conocida tal como un oligonucleótido, fragmento de ADN, ADNc o fragmento del mismo, o fragmento de ARN. La sonda se marca con un radioisótopo tal como ^{32}P, o mediante biotinilación, o con una enzima. El ARN que se ha de analizar usualmente se separa electroforéticamente sobre un gel de agarosa o poliacrilamida, transferido a nitrocelulosa, nylon u otra membrana adecuada, e hibridizado son la sonda, usando técnicas estándar bien conocidas en la técnica tal como las descritas en las secciones 7.39-7.52 de Sambrook et al., supra.
El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada de manera operativa en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotes, por ejemplo, incluye un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión de ribosoma. Se conocen células eucarióticas para utilizar promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.
El ácido nucleico está "enlazado de manera operativa" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una presecuencia o líder de secreción está enlazado de manera operativa a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está enlazado de manera operativa a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de ribosoma está enlazado de manera operativa a una secuencia de código si está colocada para facilitar la traducción. En general, "enlazado de manera operativa" significa que las secuencias de ADN que están enlazadas son contiguas, y, en el caso de un líder de segregación, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no han de ser contiguos. El enlace se cumple mediante el ligado en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se usan según la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales de polipéptido anti-PRO simples (incluyendo agonista, antagonista, y anticuerpos de neutralización) y composiciones de anticuerpo de polipéptido anti-PRO con especificidad poliepitópica. El término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa aquí se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se producen de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores.
"Activo" o "actividad" para los propósitos de aquí se refiere a forma(s) de polipéptido PRO que retienen las actividades biológicas y/o inmunológicas del polipéptido PRO nativo o que se produce de manera natural específico.
"Tratamiento" o "tratando" se refiere al tratamiento terapéutico y a las medidas profilácticas o preventivas. Las que necesitan tratamiento incluyen las que ya tienen el trastorno, así como las propensas a tener el trastorno de aquellas en las que se debe evitar el trastorno.
"Mamífero" para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo los humanos, los animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deporte o de compañía, tal como ovejas, perros, caballos, gatos, vacas y similar. Preferiblemente, el mamífero aquí es un humano.
"Portadores" tal como se usa aquí incluyen los portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o el mamífero que se exponen a los mismos en las dosis y concentraciones empleadas. A menudo el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa con amortiguación de pH. Ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menor de 10 residuos aproximadamente); proteínas, tales como albúmina de la sangre, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelatantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones de formación de sal tales como sodio; y/o sulfactantes no iónicos tales como TWEEN^{TM}, polietileno glicol (PEG), y PLURONICS^{TM}.
El término "agonista" se usa para indicar análogos péptidos o no péptidos de los polipéptidos PRO nativos (donde el polipéptido PRO nativo se refiere a polipéptido pro-PRO, polipéptido pre-PRO, polipéptido prepro-PRO, o polipéptido PRO maduro) de la presente invención y a anticuerpos que unen estos polipéptidos PRO nativos, estando previsto que retengan por lo menos una actividad biológica de un polipéptido PRO nativo. Preferiblemente, los agonistas de la presente invención retiene las propiedades de reconocimiento de unión cualitativas y las propiedades de activación del receptor del polipéptido PRO nativo.
El término "antagonista" se usa para indicar una molécula que inhibe una actividad biológica de un polipéptido PRO nativo de la presente invención, en el que el polipéptido PRO nativo se refiere a un polipéptido pro-PRO, polipéptido pre-PRO, polipéptido pre-pro-PRO, o polipéptido PRO maduro. Preferiblemente, los antagonistas aquí inhiben la unión de un polipéptido PRO nativo de la presente invención.
Un "antagonista" de polipéptido PRO es una molécula que evita, o interfiere con, una función de efector antagonista PRO (por ejemplo, una molécula que evita o interfiere con la unión y/o activación de un receptor de polipéptido PRO mediante polipéptido PRO). Estas moléculas se pueden tamizar para su capacidad para inhibir de manera competitiva la activación de receptor del polipéptido PRO mediante la monitorización de la unión del polipéptido PRO nativo en presencia y ausencia de la molécula antagonista de prueba, por ejemplo.
Un antagonista de la invención también abarca un polinucleótido antisentido contra el gen polipéptido PRO, cuyo polinucleótido antisentido bloquea la transcripción o traducción del gen polipéptido PRO, inhibiendo así su expresión y su actividad biológica.
"Condiciones estringentes" significa (1) utilizar una baja resistencia iónica y una alta temperatura para lavar, por ejemplo, 0,015 cloruro de sodio/0,0015 M citrato de sodio/0,1% sulfato de docecilo de sodio a 50ºC, o (2) utilizar durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, 50% (vol/vol) formamida con 0,1% albúmina de suero bovino/0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/50 nM de amortiguador de fosfato de sodio a pH 6,5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM de citrato de sodio a 42ºC. Se usa otro ejemplo de 50% formamida, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M citrato de sodio), 50 mM fosfato de sodio (pH 6/8), 0,1% pirofosfato de sodio, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 \mug/ml), 0,1% SDS, y 10% sulfato de dextrano a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC y 0,1% SDS. Otro ejemplo es la hibridación usando un amortiguador de 10% sulfato de dextrano, 2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% formamida a 55ºC, seguido por un lavado de alta estringencia que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.
"Condiciones moderadamente estringentes" se describen en Sambrook et al., supra, e incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, resistencia iónica, y %SDS) menos estringentes que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente estringentes es una condición tal como una incubación de un día a 37ºC en una solución que comprende: 20% formamida, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM citrato de sodio), 50 mM fosfato de sodio (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, 10% sulfato de dextrano, y 20 mg/mL ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido por el lavado de los filtros en 1 x SSC a unos 37-50ºC. El técnico en la material reconocerá cómo ajustar la temperatura, la resistencia iónica, etc., como sea necesario para ajustar factores tales como la longitud de la sonda y similares.
II. Composiciones y procedimientos de la invención Polipéptido PRO211 de longitud completa
La presente invención proporciona nuevas secuencias de nucleótidos identificadas y aisladas que codifican polipéptidos indicados en la presente solicitud como PRO211. En particular, los solicitantes han identifica y aislado ADNc que codifica polipéptidos PRO211, tal como se describe con mayor detalle en los ejemplos adjuntos. Usando programas informáticos de alineación de secuencia BLAST (formato FastA), los solicitantes encontraron que una secuencia de ADNc que codifica la secuencia nativa de longitud completa PRO211 tiene homología para conocer las proteínas que tienen dominios de FCE similares. Específicamente la secuencia de ADNc ADN32292-1131 (figura 1, SEC ID NO: 1) tiene un 36% de identidad y una marca Blast de 209 con PAC6_RAT y un 31% de identicidad y una marca Blast de 206 con Fibulina-1, precuros c isoformo.
En consecuencia, se cree actualmente que el polipéptido PRO211 descrito en la presente solicitud es un nuevo elemento identificado de la familia de FCE similar y posee las propiedades típicas de la familia de las proteínas de FCE similares.
Variantes del polipéptido PRO
Además de los polipéptidos PRO de secuencia nativa de longitud completa aquí descritos, se contempla que se puedan preparar variantes de polipéptido PRO. Las variantes de polipéptido PRO se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótido apropiados en el ADN del polipéptido PRO, o mediante síntesis del polipéptido PRO deseado. Los técnicos en la materia apreciarán que los cambios del aminoácido pueden alterar los procesos post-traductores de los polipéptidos PRO, tal como el cambio del número u oposición de los sitios de glicosilación o la alteración de las características de anclaje de la membrana.
Las variaciones en los polipéptidos PRO de secuencia de longitud completa nativos o en varios dominios de los polipéptidos PRO aquí descritos pueden hacerse, por ejemplo usando cualquiera de las técnicas y directrices para las mutaciones conservativas y no conservativas indicadas, por ejemplo, en la patente US-5.364.934. Las variaciones pueden ser una substitución, eliminación o inserción de uno o más codones que codifican el polipéptido PRO que produce un cambio en la secuencia de aminoácido del polipéptido PRO comparado con el polipéptido PRO de secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es mediante la substitución de por lo menos un aminoácido con otro aminoácido en uno o más de los dominios del polipéptido PRO. La guía en la determinación de qué residuo de aminoácido se puede insertar, sustituir o eliminar sin afectar de manera adversa la actividad deseada se puede encontrar comparando la secuencia del polipéptido PRO con el de las moléculas de proteína homólogas conocidas y minimizar el número de cambios en la secuencia del aminoácido hechos en la zona de alta homología. Las sustituciones de aminoácido pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina con una serina, es decir, reemplazos de aminoácido conservativos. Las inserciones o eliminaciones pueden estar opcionalmente en el rango de 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar realizando sistemáticamente inserciones, eliminaciones o substituciones de aminoácidos en la secuencia y probando las variantes resultantes para su actividad en el ensayo in vitro descrito en los Ejemplos adjuntos.
Las variaciones se pueden realizar usando procedimientos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis con mediación de oligonucleótidos (dirigida), exploración de alanina, y mutagénesis PCR. Se puede realizar mutagénesis dirigida [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagénesis de casete [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis de restricción de selección [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas en el ADN clonado para producir la variante de ADN polipéptido PRO deseada.
También se puede utilizar análisis de exploración de aminoácido para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de exploración preferidos están los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Estos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina, y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de exploración preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del beta-carbono y es menos propenso a alterar la conformación de la cadena principal de la variante. La alanina también se prefiere típicamente porque es el aminoácido más común. Además, se encuentra de manera frecuente en posiciones ocultas y expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la substitución de la alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede usar un aminoácido isotérico.
Modificaciones de los Polipéptidos PRO
Las modificaciones covalentes de los polipéptidos PRO están incluidas dentro del ámbito de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye la reacción de residuos de aminoácidos dirigidos del polipéptido PRO con un agente de derivación orgánico que sea capaz de reacción con cadenas laterales seleccionadas de los residuos terminales N- o C- del polipéptido PRO. La derivación con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular un polipéptido PRO a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su uso en el procedimiento para purificar anticuerpos de polipéptido anti-PRO, y viceversa. Los agentes de reticulación usados comúnmente incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehido, ésteres N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidil, tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano y agentes tales como metil-3-[p-azidofenil)ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la deamidación de residuos de glutaminil y asparaginil a los correspondientes residuos de glutamil y aspartil, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxil de residuos de seril o treonil, metilación de los grupos \alpha-amino de cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetilación de la amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxil C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente de los polipéptidos PRO incluido dentro del ámbito de esta invención comprende la alteración del diseño de glicosilación nativo del polipéptido. "Alteración del diseño de glicosilación nativo" está pensado aquí para el propósito de que signifique la retirada de una o más porciones de carbohidrato encontradas en un polipéptido PRO de secuencia nativa, y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el polipéptido PRO de secuencia nativa.
Además de los sitios de glicosilación el polipéptido PRO se puede realizar alterando la secuencia de aminoácido. La alteración puede ser, por ejemplo, mediante la adición, o substitución, de uno o más residuos de serina o treonina al polipéptido PRO de secuencia nativa (para sitios de glicosilación O-enlazados). La secuencia de aminoácido del polipéptido PRO puede alterarse opcionalmente a través de cambios en el nivel de ADN, particularmente mediante la mutación del ADN que codifica el polipéptido PRO en bases preseleccionadas, de manera que se generan codones que traducirán en los aminoácidos deseados.
Otros medios para aumentar el número de porciones de carbohidrato en el polipéptido PRO es mediante acoplamiento químico o enzimático de glicosidas al polipéptido. Estos procedimientos se describen en la técnica, por ejemplo, en la patente WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).
La retirada de porciones de carbohidrato presentes en el polipéptido PRO se puede realizar química o enzimáticamente o mediante substitución mutacional de codones que codifican residuos de aminoácido que sirven como blancos para glicosilación. Las técnicas de deglicosilación química son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, por parte de Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por parte de Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). El despegamiento enzimático de las porciones de carbohidrato en los polipéptidos se puede conseguir mediante el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas, tal como se describe por parte de Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente de polipéptidos PRO de la invención comprende el enlace del polipéptido PRO a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, o polioxialquilenos, de la manera descrita en las patentes US 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
Los polipéptidos PRO de la presente invención también se puede modificar de una manera para formar una molécula quimérica que comprende polipéptido PRO fundido con otro, polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácido. En una realización, una molécula quimérica de este tipo comprende una fusión del polipéptido PRO con un polipéptido de marca que proporciona un epítope al que se puede unir de manera selectiva un cuerpo anti-marca. La marca epítope se coloca generalmente en la terminal amino- o carboxil- del polipéptido PRO. La presencia de estas formas marcadas con epítope del polipéptido PRO se pueden detectar usando un anticuerpo contra el polipéptido de marca. Además, la previsión de la marca de epítope permite que el polipéptido PRO se purifique fácilmente mediante purificación de afinidad usando un anticuerpo anti-marca u otro tipo de matriz de afinidad que se una a la marca de epítope. En una realización alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido PRO con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica, esta fusión podría ser en la región Fc de una molécula IgG.
Varios polipéptidos de marca y sus respectivos anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen marcas de polihistidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gli); el polipéptido de marca flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la marca c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 al mismo [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y la marca de glicoproteína D del virus Herpes Simples (gD) y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos de marca incluyen el Flag-péptido [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido epítope KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido epítope \alpha-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y la marca de péptido de proteína 10 del gen T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].
Preparación de los Polipéptidos PRO
La descripción adjunta se refiere principalmente a la producción de polipéptidos PRO mediante células de cultivo transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico de polipéptido PRO deseado. Por supuesto, se contempla que se puedan utilizar procedimientos alternativos, que son bien conocidos en la técnica, para preparar el polipéptido PRO. Por ejemplo, la secuencia de polipéptido PRO, o porciones de la misma, se pueden producir mediante síntesis de péptido directa usando técnicas de fase sólida [ver, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Síntesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteína in vitro se puede realizar usando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se puede realizar, por ejemplo, usando un "Applied Biosystems Peptide Synthesizer" (Foster City, CA) usando las instrucciones del fabricante. Varias porciones del polipéptido PRO deseado se pueden sintetizar químicamente de manera separada y combinar usando procedimientos químicos o enzimáticos para producir el polipéptido PRO de longitud completa.
A. Aislamiento del ADN que codifica Polipéptidos PRO
El ADN que codifica polipéptidos PRO se puede obtener a partir de una librería de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el ARNm de polipéptido PRO deseado y para expresarlo en un nivel detectable. En consecuencia, el ADN de polipéptido PRO humano se puede obtener convenientemente a partir de una librería de ADNc preparada a partir de tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El gen de codificación del polipéptido PRO también se puede obtener a partir de una librería genómica o mediante síntesis de oligonucleótido.
Las librerías se pueden tamizar con sondas (tales como anticuerpos al polipéptido PRO u oligonucleótidos deseados de por lo menos 20 a 80 bases aproximadamente) diseñadas para identifica el gen de interés o la proteína codificada mediante el mismo. El tamizado del ADNc o la librería genómica con la sonda seleccionada se puede realizar usando procedimientos estándar, tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Unos medios alternativos para aislar el gen que codifica el polipéptido PRO deseado es usar la metodología PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Los ejemplos adjuntos describen técnicas para tamizar una librería de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas han de ser de suficiente longitud y suficientemente no ambiguas para minimizar los falsos positivos. El oligonucleótido está preferiblemente marcado de manera que se pueda detectar bajo hibridación a ADN en la librería que se tamiza. Los procedimientos de marcado son bien conocidos en la técnica, e incluyen el uso de marcas de radio como ATP marcado ^{32}P, biotinilación o marcado con enzimas. Las condiciones de hibridación, incluyendo estringencia moderada y alta estringencia, se proporcionan en Sambrook et al., supra.
Las secuencias identificadas en estos procedimientos de tamizado se pueden comparar y alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de la secuencia (al nivel de aminoácido o nucleótido) dentro de las regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia de longitud completa se puede determinar a través de la alineación de la secuencia usando programas de software informáticos tales como BLAST, ALIGN, DNAstar, y INHERIT, que utilizar varios algoritmos para medir la homología.
Se puede obtener ácido nucleico que tiene secuencia de codificación de proteínas tamizando ADNc seleccionado o librerías genómicas usando la secuencia de aminoácido deducida descrita aquí por primera vez, y, si es necesario, usando procedimientos de extensión de manual convencionales, tal como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar precursores y procesar intermedios de ARNm que puede que no se hayan transcrito de manera inversa en ADNc.
B. Selección y Transformación de las Células hospedadoras
Las células hospedadoras se transfectan o transforman con vectores de expresión o clonación aquí descritos para la producción de polipéptido PRO y cultivados en un medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para inducir a la promotores, seleccionando transformantes, o amplificando los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, se pueden seleccionar por parte del técnico en la materia sin experimentación indebida. En general, los principios, protocolos, y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos de células se puede encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra.
El técnico en la materia conoce procedimientos de transfección, por ejemplo, CaPO_{4} y electroporación. Dependiendo de la célula hospedadora usada, la transformación se realiza usando técnicas estándar apropiadas para estas células. El tratamiento de calcio utilizando cloruro de calcio, tal como se describe en Sambrook et al., supra, o la electroporación se usa generalmente para procariotes u otras células que contienen barreras substanciales de pared celulares. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células de plantas, tal como se describe Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y la patente WO 89/05859 publicado el 29 de Junio de 1989. Para células de mamíferos son estas paredes celulares, se puede utilizar el procedimiento de precipitación de fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Aspectos generales de las transformaciones del sistema de células hospedadoras de mamíferos se han descrito en la patente US-4.399.216. Las transformaciones en levadura se realizan típicamente según el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, también se pueden usar otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplasto bacterial con células intactas, o policationes, por ejemplo polibreno, poliomitina. Para varias técnicas para transformar células de mamíferos, ver Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).
Las células hospedadoras adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores incluyen aquí procariota, levadura, o células de eucariota mayor. Las procariotas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a eubacteria, tal como organismos Gram-negativo o Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como E. coli. Varias variedades de E. coli están disponibles públicamente, tales como la variedad E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); la variedad E. coli W3110 (ATCC 27.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Otras células hospedadoras procarióticas adecuadas incluyen Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enteobacter, Envinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tal como B. Subtilis y B. Lucheniformis (por ejemplo, B. Licheniformis 41P descrito en 266,719 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tal como P. Aeruginosa, y Streptomyces. Varias variedades de E. coli están disponibles públicamente, tal como la variedad E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); la variedad E. coli W3110 (ATCC 27.325); y K5 772 (ATCC 53.635). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitativos. La variedad W3110 es un huésped o huésped madre que se prefiere particularmente porque es una variedad huésped común para fermentaciones de producto de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula hospedadora segrega cantidades mínimas de enzimas protelíticas. Por ejemplo, la variedad W3110 se puede modificar para realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenos al huésped, con ejemplos de estos huéspedes que incluyen la variedad E. coli W3110 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; la variedad E. coli W3110 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; la variedad E. coli W3110 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-Iac) 169 degP ompT kan'; la variedad E. coli W3110 37D6, que tiene en genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-Iac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan'; la variedad E. coli W3110 40B4, que es la variedad 37D6 con una mutación por deleción degP resistente no kanamicina; y una variedad E. coli que tiene una proteasa periplásmica mutante descrita en la patente US-4.946.783 publicada el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados procedimientos in vitro de clonación, por ejemplo, PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido nucleico.
Además de procariotas, microbios eurocarióticos tales como hongos filamentosos o levadura son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican polipéptido PRO. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior usado comúnmente. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290:140 [1981]; EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes Kluyveromyces (Patente US-4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tal como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135 (1990)), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538 publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos tal como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus tal como A. Nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly y Inés, EMBO J., 4: 475-479 [1985]). Aquí son adecuadas levaduras metilotrópicas e incluyen, pero no está limitadas a las mismas, levadura capaz de crecimiento en metanol seleccionada entre los géneros que consisten en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ejemplos en esta clases de levaduras se puede encontrar en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de polipéptidos PRO glicosilados se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células invertebradas incluyen células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células de plantas. Ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamíferos útiles incluye células de ovario de hámster chino (CHO) y COS. Ejemplos más específicos incluyen línea de riñón de mono CV1 transformada mediante SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651): línea de riñón embrionario humano (293 ó 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y tumor de mama de ratón (MMT 0605622, ATCC CCL51). La selección de la célula hospedadora adecuada se estima que está dentro de los conocimientos del técnico en la materia.
C. Selección y Uso de un Vector Replicable
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica un polipéptido PRO deseado se puede insertar en un vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Varios vectores están disponibles públicamente. El vector puede, por ejemplo, ser en forma de un plásmido, cósmico, partícula viral, o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada se puede insertar en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio(s) de restricción de endonucleasa apropiados usando técnicas bien conocidas en la técnica. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no están limitados a los mismos, una o más secuencias de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes utiliza técnicas de ligación estándar que son bien conocidas por los técnicos en la materia.
El polipéptido PRO de interés se puede producir de manera recombinante no solamente de manera directa, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de despegamiento específico en el terminal N de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN del polipéptido PRO que se inserta en el vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, a partir del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, o líderes de enterotoxina II termoestable. Para la secreción de levadura, la secuencia de señal puede ser, por ejemplo, líder de invertasa de levadura, líder de factor alfa (incluyendo líderes de factor \alpha Saccharomyces y Kluyveromyces, este último descrito en la patente US-5.010.182), o líder de fosfatasa ácida, el líder glucoamilasa C. albicans (EP 362.179 publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en la patente WO 90/13646 publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamíferos, se pueden usar secuencias de señal de mamíferos para dirigir la secreción de la proteína, tal como secuencias de señal para polipéptidos segregados de la misma especie o relacionadas, así como líderes secretores virales.
Los vectores de expresión y clonación contiene una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células hospedadoras seleccionadas. Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras, y virus. El origen de la replicación a partir del plásmido pBR322 es adecuado la mayoría de bacterias Gram-negativa, el origen plásmido 2\mu es adecuado para levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamíferos.
Los vectores de expresión y clonación contendrán típicamente un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotrópicas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son las que permiten la identificación de células competentes para aceptar el ácido nucleico de polipéptido PRO, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula hospedadora apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea de célula CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como se describe mediante Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para su uso en levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una variedad mutante de levadura que no dispone de la capacidad de crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC Nº. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Los vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor enlazado de manera operativa a la secuencia de ácido nucleico del polipéptido PRO para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de células hospedadoras potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procarióticos incluyen los sistemas promotores \beta-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776], y promotores híbridos tal como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para su uso en sistemas bacteriales también contendrán una secuencia Shine-Dalgamo (S.D.) enlazada de manera operativa con el ADN que codifica el polipéptido PRO deseado.
Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada mediante condiciones de crecimiento, son las regiones de promotor para alcohol dehidrogenasa 2, isocitocromo C, ácido fosfatasa, enzimas degradativas asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, y enzimas que responden a la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y los promotores adecuados para su uso en expresión de levadura también se describen en la patente EP 73.657.
La transcripción del polipéptido PRO a partir de vectores en células hospedadoras de mamíferos se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de genomas de virus tales como virus del polioma, virus fowlpox (UK 2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B y Virus Simian 40 (SV40), a partir de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor actin o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de shock térmico, previendo que estos promotores sean compatibles con los sistemas de célula hospedadora.
La transcripción de un ADN que codifica el polipéptido PRO deseado mediante eurocariotes mayores se puede aumentar insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN, usualmente aproximadamente entre 10 y 300 bp, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Ahora se conocen muchas secuencias potenciadoras a partir de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína, e insulina). Sin embargo, típicamente uno usará un potenciador a partir de un virus de célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el último lado del origen de replicación (bp 100-270), el potenciador del promotor precoz del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el último lado del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El potenciador se puede empalmar en el vector en una posición 5' ó 3' del prolipéptido PRO que codifica la secuencia, pero está situado preferiblemente en un sitio 5' desde el promotor.
Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucarióticas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias están comúnmente disponibles desde el 5' y, ocasionalmente 3', las regiones no traducidas de ADNs o ADNcs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica los polipéptidos PRO.
Otros procedimientos, vectores y células hospedadoras adecuadas para su adaptación a la síntesis de polipéptidos PRO en el cultivo de células de vertebrados recombinantes se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117.060 y EP 117.058.
D. Detección Amplificación/Expresión Gen
La amplificación y/o expresión del gen se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia de puntos (análisis de ADN), o hibridación in situ, usando una sonda marcada de manera apropiada, basada en las secuencias aquí previstas. Alternativamente, se puede utilizar anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex ADN, dúplex ARN, y dúplex híbridos ADN-ARN o dúplex ADN-proteína. Los anticuerpos, a su vez, se pueden marcar y el ensayo se puede realizar donde el dúplex se une a una superficie, de manera que al formarse el dúplex sobre la superficie, se puede detectar la presencia de anticuerpo unido al dúplex.
La expresión del gen, alternativamente, se puede medir mediante procedimientos inmunológicos, tal como coloración inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo de cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto del gen. Los anticuerpos útiles para la coloración inmunohistoquímica y/o ensaye de fluidos de muestra puede ser monoclonal o policlonal, y se puede preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se puede preparar contra un polipéptido PRO de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN aquí previstas o contra una secuencia exógena fundida con un ADN de polipéptido PRO y que codifica un epítope de un anticuerpo específico.
E. Purificación del Polipéptido
Las formas de polipéptidos PRO se pueden recuperar de un medio de cultivo o de lisatos de células hospedadoras. Si está unido a la membrana, se puede liberar de la membrana usando una solución detergente adecuada (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante despegamiento enzimático. Las células utilizadas en la expresión de polipéptidos PRO se pueden dividir mediante varios medios físicos o químicos, tal como ciclos congelación-descongelación, sonicación, división mecánica, o agentes de lisado de células.
Se puede desear purificar polipéptidos PRO de proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: mediante fraccionamiento de una columna de intercambio de iones; precipitación de etanol; fase inversa HPLC; cromatografía sobre sílice o una resina de intercambio de cationes tal como DEAE; cromatofocalización; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; filtración de gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sepharose para retirar contaminantes tale como IgG; y columnas de quelación de metal para unir formar marcadas con epítope del polipéptido PRO. Se pueden utilizar varios procedimientos de purificación de proteínas y estos procedimientos son conocidos en la técnica y se describe por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New Cork (1982). La(s) etapa(s) de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y el polipéptido PRO particular producido.
Usos de Polipéptidos PRO
Las secuencias de nucleótidos (o sus complementos) que codifican los polipéptidos PRO de la presente invención tienen varias aplicaciones en la técnica de la biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridación, en mapeo de cromosomas y genes y en la generación de ARN y ADN anti-sentido. El ácido nucleico que codifica polipéptido PRO también será útil para la preparación de polipéptidos PRO mediante las técnicas de recombinación aquí descritas.
El ácido nucleico o porciones del mismo que codifican polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa se puede usar como sonda de hibridación para una librería de ADNc para aislar el gen de polipéptido PRO de longitud completa o para aislar también otros genes (por ejemplo, los que codifican variantes que se producen de manera natural del polipéptido PRO o polipéptidos PRO de otras especies) que tiene una identidad de secuencia deseada con las secuencias de ácido nucleico de polipéptido PRO. Opcionalmente, la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridación se pueden derivar de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las moléculas de ADN aquí descritas o a partir de secuencias genómicas que incluyen promotores, elementos potenciadores e intrones de ADN que codifican polipéptido PRO de secuencia nativa. A modo de ejemplo, un procedimiento de tamizado comprenderá el aislamiento de la región de codificación del gen del polipéptido PRO usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de unas 40 bases. Las sondas de hibridación se pueden marcar mediante una pluralidad de marcas, que incluyen radionucleótidos tales como ^{32}P o ^{35}S, o marcas enzimáticas tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda a través de sistemas de acoplamiento avidina/biotina. Las sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria a la del gen del polipéptido PRO específico de la presente invención se pueden usar para tamizar librerías de ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar a qué elementos de estas librerías se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación se describen en mayor detalle a los Ejemplos adjuntos.
Los ESTs descritos en la presente solicitud se pueden utilizar de manera similar como sondas, usando los procedimientos aquí descritos.
Las sondas también se pueden utilizar en técnicas PCR para generar una fuente de secuencias para la identificación de secuencias de polipéptido PRO muy relacionadas.
Las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido PRO también se pueden usar para construir sondas de hibridación para trazar el gen que codifica ese polipéptido PRO y para el análisis genético de personas con desórdenes genéticos. Las secuencias de nucleótidos aquí previstas se pueden trazar en un cromosoma y en regiones específicas de un cromosoma usando técnicas conocidas, tal como hibridación in situ, análisis de enlace contra marcadores cromosómicos conocidos, y tamizado de hibridación con librerías.
El polipéptido PRO se puede usar en ensayos para identificar sus ligandos. De una manera similar, se pueden identificar inhibidores de la interacción de unión receptor/ligando. Las proteínas implicadas en estas interacciones de unión también se pueden usar para tamizar el péptido o pequeñas moléculas inhibidoras o agonistas de la interacción de unión. Los ensayos de tamizado se pueden diseñar para encontrar compuestos líderes que imitan la actividad biológica de un polipéptido PRO nativo o un ligando para el polipéptido PRO. Estos ensayos de tamizado incluirán ensayos en correspondencia con el tamizado de alta producción de librerías químicas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar pequeñas moléculas candidatas a medicamentos. Las pequeñas moléculas contempladas incluyen compuestos sintéticos orgánicos o inorgánicos. Los ensayos se pueden realizar en una variedad de formatos, que incluyen ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de tamizado bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido PRO o sus formas modificadas también se pueden usar para generar animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y tamizado de reagentes terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que tiene células que contiene un transgen, cuyo transgen se introdujo en el animal o un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, en una etapa embrionaria. Un transgen es un ADN que está integrado en el genoma de una célula desde la que se desarrolla un animal transgénico. En una realización, se puede usar ADNc que codifica un polipéptido PRO de interés para clonar ADN genómico que codifica el polipéptido PRO según técnicas establecidas y las secuencias genómicas usadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifican el polipéptido PRO. Los procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas, se han vuelto convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes US-4.736.866 y US-4.870.009. Típicamente, las células particulares se dirigirían para la incorporación del transgen de polipéptido PRO con potenciadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de transgen que codifica un polipéptido PRO introducidos en la línea del germen del animal en una etapa embrionaria se pueden usar para examinar un defecto de expresión aumentada de ADN que codifica el polipéptido PRO. Estos animales se pueden usar como animales de prueba para reagentes pensados para conferir protección de, por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. Según esta faceta de la invención, un animal se trata con el reagente y una incidencia reducida de la condición patológica, comparada con los animales no tratados que llevan el transgen, indicaría una intervención terapéutica potencial para la condición patológica.
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Alternativamente, se pueden usar homólogos no humanos de polipéptidos PRO para construir un animal "knock out" de polipéptido PRO que tenga un gen defectuoso o alterado que codifique el polipéptido PRO de interés como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica en polipéptido PRO y el ADN genómico alterado que codifica el polipéptido PRO introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, se puede usar ADNc que codifica un polipéptido PRO para clonar ADN genómico que codifica polipéptido PRO según técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que codifica un polipéptido PRO se puede eliminar o reemplazar con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que se puede usar para monitorizar la integración. Típicamente, varias kilobases de ADN flanqueador no alterado (ambas en los extremos 5' y 3') están incluidas en el vector [ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos]. El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan células en las que el ADN introducido se ha recombinado de manera homóloga con el ADN endógeno [ver por ejemplo, Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan a continuación en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata) para formas quimeras de agregación [ver, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Un embrión quimérico se puede implantar a continuación en un animal de acogida hembra pseudoembarazado adecuado y el embrión llevarse a término para crear un animal "knock out". El alojamiento de progenie del ADN recombinado de manera homóloga en sus células de germinación se puede identificar mediante técnicas estándar y usadas para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado de manera homóloga. Los animales knockout se puede caracterizar por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido PRO.
Respecto al polipéptido PRO211, las indicaciones terapéuticas incluyen desórdenes asociados con la preservación y el mantenimiento de la mucosa gastrointestinal y la reparación de lesiones mucosales agudas y crónicas (por ejemplo, enterocolitis, síndrome de Zollinger-Ellison, ulceración gastrointestinal y atrofia microvillus congénita), enfermedades de la piel asociadas con diferenciación de la keratonicita anormal (por ejemplo, psoriasis, cánceres epiteliales tales como carcinoma de células escamosas del pulmón, carcinoma epidermoide de la vulva y gliomas.
Anticuerpos de Polipéptido Anti-PRO
La presente invención también proporciona anticuerpos de polipéptido anti-PRO. Los anticuerpos de ejemplo incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, bispecíficos y heteroconjugados.
A. Anticuerpos Policlonales
Los anticuerpos de polipéptido anti-PRO pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos por los técnicos en la materia. Los anticuerpos policlonales se pueden producir en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente de inmunización y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente de inmunización y/o el adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente de inmunización puede incluir el polipéptido PRO o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente de inmunización en una proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Ejemplos de estas proteínas inmunogénicas incluyen, pero lo están limitadas a las mismas, hemocianina de lapa californiana, albúmina de la sangre, tiroglobulina bovina, e inhibidor de la tripsina del grano de soja. Los ejemplos de adyuvantes que se pueden utilizar incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil Lípido A, trehalosa dicorinomicolato sintético). El protocolo de inmunización se puede seleccionar por parte de un técnico en la materia sin experimentación indebida.
B. Anticuerpos Monoclonales
Los anticuerpos de polipéptido anti-PRO pueden, alternativamente, ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparan usando procedimientos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un procedimiento de hibridoma, un ratón, hámster, u otro animal huésped apropiado se inmuniza típicamente con un agente de inmunización con linfocitos causantes que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente de inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.
El agente de inmunización incluirá típicamente el polipéptido PRO de interés o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se usan linfocitos de sangre periféricos ("PBLs") si se desean células de origen humano, o se usan células del bazo o células del nódulo linfático si se desean fuentes de mamífero no humano. Los linfocitos se funden a continuación con una línea de células inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como un polietileno glicol, para forma una célula hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academia Press, (1986) pp. 59-103]. Las líneas de células inmortalizadas se transforman usualmente en células de mamíferos, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Usualmente, se utilizan líneas de células de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más substancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fundidas. Por ejemplo, las células parentales no tienen la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidita ("medio HAT"), cuyas substancias previenen el crecimiento de células de deficiencia de HGPRT.
Las líneas de células inmortalizadas preferidas son aquellas que se funden de manera eficiente, soportan una expresión estable de alto nivel de anticuerpo mediante las células que producen anticuerpos seleccionados, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Las líneas de células inmortalizadas más preferidas son línea de mieloma de murina, que se pueden obtener, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, y de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. También se han descrito las líneas de células de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Prodution Technicques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New Cork, (1987), pp. 51-63].
El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se puede ensayar a continuación para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido PRO de interés. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos mediante las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación, o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente enlazado con enzima (ELISA). Estas técnicas y ensayos son conocidos en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de limitación de dilución y crecer mediante procedimientos estándar [Goding, supra]. Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, el Medio de Eagle Modificado de Dubecco y el medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma puede crecer in vivo como ascites en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales segregados mediante los subclones se pueden aislar o purificar a partir del medio de cultivo o fluido de ascites mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencional tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también se pueden hacer mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente US-4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleótidas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de murina). Las células de hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de este ADN. Una vez aisladas, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que se transfectan a continuación en células hospedadoras tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otra manera proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, substituyendo la secuencia de codificación para dominios constantes de cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias de murina homólogas [Patente US-4.816.567; Morrison et al., supra] o uniendo de manera covalente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido de no inmunoglobulina. Este polipéptido de no inmunoglobulina se puede sustituir para los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o se puede sustituir para los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar los anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de cadena ligera de inmunoglobulina y cadena pesada modificada. La cadena pesada está truncada generalmente en cualquier punto de la región Fc para evitar el entrecruzado de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisterna relevantes se substituyen con otro residuo de aminoácido o se eliminar para evitar el entrecruzado.
Los procedimientos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, se puede realizar usando técnicas de rutina conocidas en la técnica.
C. Anticuerpos Humanizados
Los anticuerpos de polipéptido anti-PRO de la invención también pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murina) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de la misma (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen al antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en las que los residuos de una región de determinación complementaria (CDR) del recipiente se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos del armazón Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan mediante correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo recipiente ni en las secuencias de CDR o armazón. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todo de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en el que todas o substancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o substancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consensus de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado de manera óptima también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 232: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].
Los procedimientos para humanizar los anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo desde una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácido no humano se indican a menudo como residuos de "importación", que se toman típicamente de un dominio de "importación" variable. La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter et al. trabajadores [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)], mediante la substitución de secuencias CDRs o CDR de roedor para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente US-4.816.567), en el que substancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha substituido por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se substituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos también se producen usando varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo librerías de visualización de fago [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boermer et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)].
D. Anticuerpos Biespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para el polipéptido PRO, la otra es para cualquier otro antígeno, y preferiblemente para una proteína o receptor de la superficie de la célula o subunidad receptora.
Los procedimientos para hacer anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades [Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Debido al surtido aleatorio de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se realiza usualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares se describen en la patente WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
Dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se pueden fundir con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la articulación, CH2, y regiones CH3. Se prefiere que tenga la primera región contacte de cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para la unión de la cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en un organismo hospedador adecuado. Para más detalles de generación de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
E. Anticuerpos Heteroconjugados
Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos de manera covalente. Estos anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas [Patente US-4.676.980], y para tratamiento de infección VIH [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos se puedan preparar in vitro usando procedimientos conocidos en química de proteínas sintéticas, que incluyen aquellos agentes de entrecruzado. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la formación de una unión tioéter. Ejemplos de reagentes adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la patente US-4.676.980.
Usos para los Anticuerpos de Polipéptido Anti-Pro
Los anticuerpos de polipéptido anti-PRO de la invención tienen varias utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos de polipéptido anti-PRO se pueden usar en ensayos de diagnóstico para un polipéptido PRO, por ejemplo, detectando su expresión en células específicas, tejidos, o suero. Se pueden usar varias técnicas de ensayo diagnóstico conocidas en la técnica, tales como ensayos de unión competitiva, ensayos sándwich directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación conducidos en fases heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. Los anticuerpos usados en los ensayos de diagnóstico se pueden marcar con una fracción detectable. La fracción detectable ha de ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. La fracción detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimiliminiscente, tal como fluoresceína isotiocianato, rodamina, o luciferina, o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano. Se puede utilizar cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo a la fracción detectable, incluyendo los procedimientos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Inmmunol. Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).
Los anticuerpos de polipéptido anti-PRO también son útiles para la purificación de afinidad del polipéptido PRO a partir del cultivo de células recombinantes o fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra el polipéptido PRO se inmovilizan sobre un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex o papel de filtro, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se contacta a continuación con una muestra que contiene el polipéptido PRO que se ha de purificar, y a continuación el soporte se lava con un solvente adecuado que retirará substancialmente todo el material en la muestra excepto el polipéptido PRO, que está unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado que liberará el polipéptido PRO del anticuerpo.
Respecto al PRO211 las indicaciones terapéuticas incluyen desórdenes asociados con la preservación y el mantenimiento de la mucosa gastrointestinal y la reparación de lesiones mucosales agudas y crónicas (por ejemplo, enterocolitis, síndrome Zollinger-Ellison, ulceración gastrointestinal y atrofia microvillus congénita), enfermedades de la piel asociadas con diferenciación de keratinocita anormal (por ejemplo, psoriasis, cánceres epiteliales tales como carcinoma de célula escamosa de pulmón, carcinoma epidermoide de la vulva y gliomas).
Los antígenos específicos o asociados con el cáncer permiten la creación de anticuerpos monoclonales específicos de tumores o cáncer (mAbs) que son específicos para estos antígenos tumorales. Estos mAbs, que pueden distinguir entre células normales y cancerosas son útiles en el diagnóstico, prognosis y tratamiento de la enfermedad.
Los anticuerpos monoclonales específicos del cáncer (mAbs) que son específicos a antígenos de tumores. Estos mAbs, que pueden distinguir entre células normales y cancerosas son útiles en el diagnóstico, prognosis y tratamiento de la enfermedad. Se conocen antígenos particulares que se asocian con enfermedades neoplásticas, tales como cáncer colorectal y de mama. Como el cáncer de colon es una enfermedad extendida, un diagnóstico y un tratamiento temprano es un objetivo médico importante. El diagnóstico y el tratamiento del cáncer se puede implementar usando anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos, teniendo de esta manera marcas fluorescentes, magnéticas nucleares o radiactivas. Se pueden usar genes radiactivos, toxinas y/o mAbs marcados con medicamentos para el tratamiento in situ con descripción mínima del paciente.
Se ofrecen los siguientes ejemplos solamente para propósitos ilustrativos, y no están pensados para limitar el ámbito de la presente invención de ninguna manera.
Todas las patentes y las referencias de literatura citadas en la presente memoria se incorporan aquí como referencia en su totalidad.
Ejemplos
Los reagentes disponibles comercialmente indicados en los ejemplos se usaron según las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. La fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo de la memoria, mediante números de acceso ATCC es la "American Type Culture Collection", Rockville, Maryland.
Ejemplo 1 Tamizado de Homología de Dominio Extracelular para Identificar Nuevos Polipéptidos y ADNc que los Codifica
Se usaron las secuencias de dominio extracelular (ECD) (que incluyen la secuencia de señal de secreción, si la hay) de entre 950 proteínas segregadas conocidas de la base de datos pública Swiss-Prot para buscar las bases de datos EST. Las bases de datos EST incluían bases de datos públicas (por ejemplo, Dayhoff, GenBank), y bases de datos privadas (por ejemplo, LIFESEQ^{TM}, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). La búsqueda se realizó usando el programa informático BLAST o BLAST2 (Altshul, y Gish, Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996); http://blast.wustl/ed/ blast/README.html) como comparación de las secuencias de proteína ECD a una traducción de armazón de las secuencias EST. Esas comparaciones con un puntuación BLAST de 70 (o en algunos casos 90) o mayor que no codificaban proteínas conocidas se agruparon y unieron en secuencias de ADN consensus con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; (http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html).
Usando este tamizado de homología de dominio extracelular, se unieron secuencias de ADN consensus respecto a las otras secuencias EST identificadas. Además, las secuencias de ADN consensus obtenidas a menudo (pero no siempre) se extendieron usando ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender la secuencia consensus lo posible usando las fuentes de secuencias EST citadas anteriormente.
Basados en las secuencias consensus obtenidas tal como se han descrito anteriormente, los oligonucleótidos se sintetizaron a continuación y se usaron para identificar mediante PCR una librería de ADNc que contenía la secuencia de interés y para su uso como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para un polipéptido PRO. Los iniciadores PCR delantero (.f) e inverso (.r) generalmente varían entre 20 y 30 nucleótidos y a menudo están diseñados para proporcionar un producto PCR de 100-1000 bp de longitud aproximadamente. Las secuencias de sonda (.p) tienen típicamente una longitud de 40-55 bp. En algunos casos, oligonucleótidos adicionales se sintetizan cuando la secuencia consensus es mayor de 1-1,5 kbp aproximadamente. Para tamizar varias librerías para un clon de longitud completa, se tamizó el ADN de las librerías mediante amplificación PCR, como por Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, con el par iniciador PCR. Se usó a continuación una librería positiva para aislar clones que codifican el gen de interés usando el oligonucleótido de sonda y uno de los pares iniciadores.
Las librerías de ADNc usadas para aislar los clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos estándar usando reagentes comercialmente disponibles tales como los de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se inició con oligo dT que contiene un sitio Notl, enlazado directo a adaptadores hemiquinasados Sall, partidos con Notl, dimensionado de manera adecuada mediante gel electroforesis, y clonado en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil; ver Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)) en los únicos sitios Xhol y Notl.
Ejemplo 2 Aislamiento de Clones de ADNc que Codifican PRO211
Se montaron secuencias de ADN consensus tal como se describe en el Ejemplo 1 anterior y se designaron como DNA28730 y DNA28760, respectivamente. Basados en estas secuencias consensus, los oligonucleótidos se sintetizaron y se usaron para identificar mediante PCR una librería de ADNc que contenía las secuencias de interés y para su uso como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para el polipéptido PRO211. La librería usada para aislar el DNA32292-1131 era una librería de pulmón fetal.
Los clones de ADNc se secuenciaron en su totalidad. Toda la secuencia de nucleótido de PRO211 (DNA32292-1131; UNQ185) se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1). El polipéptido predicho es un aminoácido 353 en longitud, con un peso molecular de 38.190 daltons aproximadamente.
Las secuencias de oligonucleótido usadas en los procedimientos anteriores fueron las siguientes:
100 
\vskip1.000000\baselineskip
101
Ejemplo 3 Uso de Ácido Nucleico que Codifica Polipéptido PRO como Sondas de Hibridación
El siguiente procedimiento describe el uso de una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido PRO como sonda de hibridación.
El ADN que comprende la secuencia de codificación de un polipéptido PRO de interés tal como se describe aquí se puede utilizar como sonda o usarse como base a partir de la cual se preparan las sondas para tamizar ADNs homólogos (tal como los que codifican variantes que se producen de manera natural del polipéptido PRO) en librerías de ADNc de tejido humano o en librerías genómicas de tejido humano.
La hibridación y el lavado de los filtros que contienen cualquier librería de ADN se realiza bajo las siguientes condiciones de alta estringencia. La hibridación de la sonda derivada de ácido nucleico que codifica polipéptido PRO radiomarcada a los filtros se realiza en una solución de 50% formamida, 5x SSC, 0,1% pirofosfato de sodio, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6,8, 2x solución de Denhardt, y 10% sulfato de dextrano a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1 x SCC y 0,1% SDS a 42ºC.
Los ADNs que tienen una identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica polipéptido PRO de secuencia nativa de longitud completa se pueden identificar usando técnicas estándar conocidas en la técnica.
Ejemplo 4 Expresión de Polipéptidos PRO en E. coli
Este ejemplo representa la preparación de una forma unglicosilatada de un polipéptido PRO deseado mediante la expresión recombinante en E. coli.
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido PRO deseado se amplifica inicialmente usando iniciadores PCR seleccionados. Los iniciadores han de contener sitios de enzimas de restricción que corresponden con los sitios de enzimas de restricción sobre el vector de expresión seleccionada. Se pueden utilizar una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para resistencia de amplicilina y tetraciclina. El vector se asimila con enzima de restricción y defosforilatada. Las secuencias amplificadas PCR se ligan al vector a continuación. El vector incluirá preferiblemente secuencias que codifican un gen resistente a antibióticos, un promotor trp, un líder polihis (que incluye los primeros seis codones STII, secuencia polihis, y sitio de división de enteroquinasa), la región de codificación de polipéptido PRO específica, terminador transcripcional lambda y un gen argU.
La mezcla de ligado se usa a continuación para transformar una variedad de E. coli seleccionada usando los procedimientos descritos en Sambrook et al., supra. Los transformantes se identifican mediante sus capacidad para crecer en placas LB y a continuación se seleccionan las colonias resistentes al antibiótico. El ADN plásmido se puede aislar y confirmar mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN.
Los clones seleccionados puede crecer de un día al otro en medio de cultivo líquido tal como caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de un día al otro se puede usar posteriormente para inocular un cultivo a mayor escala. Las células crecen a continuación a una densidad óptica deseada, durante la cual el promotor de expresión está activo.
Después del cultivo de las células durante varias horas más, las células se pueden cosechar mediante centrifugación. La píldora de células obtenida mediante la centrifugación se puede solubilizar usando varios agentes conocidos en la técnica, y el polipéptido PRO solubilizado se puede purificar a continuación usando una columna de quelación bajo condiciones que permitan la unión firme de la proteína.
En EP1027434 (98946090.2) PRO187, PRO317, PRO301, PRO224 y PRO238 se expresaron de manera exitosa en E. coli de una forma marcada poli-His, usando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica PRO187, PRO317, PRO301, PRO224 o PRO238 inicialmente se amplificó usando iniciadores PCR seleccionados. Los iniciadores contenían sitios de enzima de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción sobre el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan una iniciación de la traducción eficiente y fiable, una rápida purificación sobre una columna de quelación de metal, y la retirada proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias marcadas poli-His amplificadas con PCR se ligaron a continuación en un vector de expresión, que se usó para transformar un hospedador E. coli en la variedad 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts (htpRts) clpP(laclq). Los transformantes crecieron primero en LB que contenía 50 mg/ml de carbenicilina a 30º con agitación hasta que se consiguió un O.D.600 de 3-5. Los cultivos se diluyeron a continuación 50-100 pliegues en medio CRAP (preparado mezclando 3,57 g (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato de sodio\cdot2H2O, 1,07 g KCl, 5,36 g extracto de levadura Disco, 5,36 g hidrosilato de caseína Sheffield SF en 500 mL de agua, así como 100 mM MPOS, ph 7,3, 0,55% (W/v) glucosa y 7 mM MgSO_{4}) y crecimiento durante aproximadamente 20-30 horas a 30ºC son agitación. Las muestras se retiraron para verificar la expresión mediante análisis SDS-PAGE, y el cultivo en volumen se centrifugó para formar píldoras de las células. Las píldoras de células se congelaron hasta su purificación y repliegue.
La pasta E. coli de 0,5 a 1 L de fermentaciones (6-10 g de píldoras) se resuspendió en 10 volúmenes (w/v) en 7 M guanidina, 20 mM Tris, ph 8 buffer. Se añadieron sulfito de sodio y tetrahionato de sodio sólidos para hacer concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la solución se agitó de un día al otro a 4ºC. Esta etapa produce una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisterna bloqueados mediante sulfitolización. La solución se centrifugó a 40.000 rpm en un Beckman Ultracentrifuge para 30 mm. El sobrenadante se diluyó con 3-5 volúmenes de buffer de columna de quelato de metal (6 M guanidina, 20 mM tris, pH 7,4) y filtrado a través de filtros de 0,22 micrones para clarificar. Dependiendo del extracto clarificado, se cargó sobre una columna de quelato de metal Ni-NTA Qiagen de 5 ml equilibrada en un buffer de columna de quelato de metal. La columna se lavó con un buffer adicional que contiene 50 mM de imidazol (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluyó con un buffer que contenía 250 mM de imidazol. Las fracciones que contenían la proteína deseada se apartaron y se almacenaron a 4ºC. Se estimó la concentración de proteínas mediante su absorbancia en 280 nm usando el coeficiente de extinción calculado basado en su secuencia de aminoácido.
Las proteínas se replegaron diluyendo la muestra lentamente en un buffer de replegado preparado de nuevo que consistía en: 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M urea, 5 mM cisterna, 20 mM glicina y 1 mM EDTA. Los volúmenes de replegado se eligieron de manera que la concentración de proteína final era entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de replegado se agitó suavemente a 4ºC durante 12-36 horas. La reacción de replegado se apagó mediante la adición de TFA a una concentración final del 0,4% (pH de 3 aproximadamente). Antes de una purificación adicional de la proteína, la solución se filtró a través de un filtro de 0,22 micrones y se añadió acetonitrilo a una concentración final del 2-10%. La proteína replegada se cromatografió sobre una columna de fase inversa Poros R1/H usando un buffer móvil del 0,1% de TFA con elución con un gradiente de acetonitrilo del 10 al 80%. Se analizaron las partes alícuotas con una absorbancia A280 sobre geles de policrilamida SDS y se agruparon fracciones que contenían proteína replegada homogénea. Generalmente, las especies replegadas de manera adecuada de la mayoría de proteínas se eluyeron en las concentraciones más bajas de acetonitrilo, ya que esas especies son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos de la interacción con la resina de fase inversa. Las especies agregadas se eluyen usualmente en concentraciones de acetonitrilo más altas. Además de resolver las formas desplegadas de proteínas de la forma deseada, la etapa de fase inversa también retira la endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contienen las proteínas PRO187, PRO317, PRO301, PRO224 y PRO238 plegadas deseadas, respectivamente, se agruparon y se retiró el acetonitrilo usando una corriente suave de nitrógeno dirigida en la solución. Las proteínas se formularon en 20 mM Hepes, pH 6,8 con 0,14 M cloruro de sodio y 4% manitol mediante diálisis o mediante filtración de gel usando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el buffer de formulación y el estéril filtrado.
Ejemplo 5 Expresión de Polipéptidos PRO en Células de Mamíferos
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma glicosilada de un polipéptido PRO deseado mediante expresión recombinante en células de mamíferos.
El vector, pRK5 (ver la patente EP 307.247, publicada el 15 de marzo de 1989), se utiliza como vector de expresión. Opcionalmente, el ADN que codifica el polipéptido PRO está ligado en pRK5 con enzimas de restricción seleccionados para permitir la inserción del ADN del polipéptido PRO usando procedimientos de ligado tal como el descrito en Sambrook et al., supra. El vector resultante se llama polipéptido pRK5-PRO.
En una realización, las células hospedadoras seleccionadas pueden ser 293 células. 293 células humanas (ATCC CCL 1573) crecen en confluencia en placas de cultivo de tejido en medio tal como DMEM suplementado con suero de becerro fetal y opcionalmente, componentes nutrientes y/o antibióticos. Aproximadamente 10 \mug de ADN de polipéptido pRK5-PRO se mezclan con aproximadamente 1 \mug de ADN que codifica el gen VA ARN [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelven en 500 \mug de 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl_{2}. A esta mezcla se añaden, gota a gota, 500 \mug de 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO_{4}, y se permite que se forme un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se suspende y se añade a las 293 células y se permite que se asiente durante cuatro horas aproximadamente a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de 20% de glicerol durante 30 segundos. Las 293 células se lavan a continuación con medio libre de suero, se añade medio nuevo y las células se incuban durante 5 días aproximadamente.
Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se retira y se reemplaza con medio de cultivo (sólo) o un medio de cultivo que contiene 200 \muCi/ml ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml ^{35}S-metionina. Después de una incubación de 12 horas, se recoge el medio condicionado, concentrado en un filtro giratorio, y cargado sobre un 15% gel SDS. El gel procesado se puede secar y exponer a una película durante un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia del polipéptido PRO. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden sufrir una incubación adicional (en medio libre de suero) y el medio se prueba en bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, el polipéptido PRO se puede introducir en 293 células de manera efímera usando el procedimiento de sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). 293 células crecen a la densidad máxima en un frasco giratorio mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba en la píldora de células durante cuatro horas. Las células son tratadas con un 20% de glicerol durante 90 segundas, se lavan con medio de cultivo de tejido, y se vuelven a introducir en el frasco giratorio que contiene el medio de cultivo de tejido, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferina bovina. Después de cuatro días aproximadamente, el medio condicionado se centrífuga y se filtra para retirar las células y los restos. La muestra que contiene el polipéptido PRO expresado se puede concentrar y purificar a continuación mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía de columna.
En otra realización, los polipéptidos PRO se pueden expresar en células CHO. El polipéptido pRK5-PRO se puede transfectar en células CHO usando reagentes conocidos tales como CAPO_{4} o DEAE-dextrano. Tal como se ha descrito anteriormente, los cultivos de células se pueden incubar, y el medio reemplazarse con medio de cultivo (sólo) o medio que contiene una radiomarca tal como ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia del polipéptido PRO, el medio de cultivo se puede reemplazar con un medio libre de suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante 6 días aproximadamente, y a continuación el medio acondicionado se cultiva. El medio que contiene el polipéptido PRO expresado se puede concentrar y purificar a continuación mediante cualquier procedimiento seleccionado.
El polipéptido PRO marcado con epítope también se puede expresar en células CHO hospedadoras. El polipéptido PRO se puede subclonar fuera del vector pRK5. El inserto del subclon puede sufrir PCR para fundirse en estructura con una marca epítope seleccionada como una marca poli-his en un vector de expresión Baculovirus. El inserto de polipéptido PRO marcado poli-his se puede subclonar a continuación en un vector activo SV40 que contiene un marcador de selección tal como DHFR para la selección de clones estables. Finalmente, las células CHO se pueden transfectar (tal como se ha descrito anteriormente) con el vector activo SV40. El marcado se puede realizar, tal como se ha descrito anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene en polipéptido PRO marcado poli-His expresado se puede concentrar y purificar a continuación mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante cromatografía de afinidad Ni^{2}-quelato.
El PRO211 se expresó de manera satisfactoria en células CHO mediante un procedimiento de expresión efímero y estable.
La expresión estable en células CHO se realizó usando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresaron como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias de codificación para las formas solubles (por ejemplo dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fundieron en una secuencia de región constante IgG1 que contiene la articulación, dominios CH2 y CH2 y/o es una forma marcada poli-His.
Siguiendo a la amplificación PCR, los respectivos ADNs se subclonaron en un vector de expresión CHO usando técnicas estándar tal como se describe en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley y Sons (1997). Los vectores de expresión CHO están construidos para tener sitios de restricción compatibles 5' y 3' del ADN de interés para permitir el lanzamiento conveniente del ADNc. La expresión de vector usada en células CHO es como se describe en Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24: 9 (1774-1779) (1996) y usa el promotor/potenciador temprano SV40 para activar la expresión del ADNc de interés y el dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido que sigue a la transfección.
Se introdujeron doce microgramos de ADN plásmido deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO usando reagentes de transfección disponibles comercialmente Superfect* (Quiagen), Dossier* o Fugene* (Boehringer Mannheim). Las células crecieron y se describen en Lucas et al., supra. Aproximadamente 3 x 10^{-7} células se congelaron en una ampolla para crecimiento adicional y producción tal como se describe a continuación.
Las ampollas que contienen el ADN plásmido se descongelaron mediante colocación en un baño de agua y se mezclaron mediante vortexing. Los contenidos se pipetearon en un tubo centrífugo que contenía 10 mLs de medio y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. El supernadante se aspiró y las células se resuspendieron en 10 mL de medio selectivo (0,2 \mum filtrados PS20 con 5% 0,2 \mum diafiltrados de suero bovino fetal). Las células se alicuotaron a continuación en un centrifugador de 100 mL que contenía 90 mL de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfirieron a un centrifugador de 250 mL lleno con 150 mL de medio de crecimiento selectivo y se incubaron a 37ºC. Después de otros 2-3 días, se sembraron centrifugadores de 250 mL, 500 mL y 2000 mL con 3 x 10^{5} células/mL. El medio de células se cambió con nuevo medio mediante centrifugación y resuspensión en medio de producción. Aunque se puede utilizar cualquier medio CHO adecuado, se usó realmente un medio de producción descrito en la patente US-5.122.469, publicada el 16 de junio de 1992. El centrifugador de producción 3L se sembró con 1,2 x 10^{6} células/mL. En el día 0, se determinó en número de pH de las células. En el día 1, se tomó una muestra del centrifugador y se comenzó el lavado con aire filtrado. En el día 2, se tomó una muestra del centrifugador, se cambió la temperatura a 33ºC, y 30 mL de 500 g/L de glucosa y 0,6 mL de 10% antiespuma (por ejemplo, 35% de emulsión de polidimetilsiloxano, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). A lo largo de toda la producción, se ajustó el pH lo necesario para mantenerlo alrededor de 7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad cayó por debajo del 70%, el cultivo de las células se cosechó mediante centrifugación y se filtro a través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se almacenó a 4ºC o se cargó inmediatamente sobre columnas para su purificación.
Para las construcciones marcadas poli-His, las proteínas se purificaron usando una columna Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol en el medio condicionado en una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombeó sobre una columna Ni-NTA de 6 ml en 20 mM Hepes, pH 7,4, el buffer contenía 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol en un índice de flujo de 4-5 ml/mm, a 4ºC. Después de la carga, la columna se lavó con un buffer de equilibrado adicional y la proteína eluída con un buffer que contenía 0,25 M imidazol. La proteína muy purificada se desaló posteriormente en un buffer de almacenamiento que contenía 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl y 4% manitil, pH 6,8, con una columna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se almacenó a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que contiene Fc) se purificaron a partir de medio condicionado como sigue. El medio condicionado se bombeó sobre una columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que se había equilibrado en un buffer de 20 mM de fosfato de Na, pH 3,5. La proteína eluída se neutralizó inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contenían 275 \muL de un buffer de 1 M Tris, pH 9. La proteína muy purificada se desaló posteriormente en un buffer de almacenamiento tal como se ha descrito anteriormente para las proteínas marcadas poli-His. La homogeneidad se determinó mediante geles de poliacrilamida SDS y mediante secuenciación de aminoácido N-terminal mediante degradación Edman.
El PRO211 también se expresó con éxito de manera efímera en células COS.
Ejemplo 6 Expresión de Polipéptidos PRO en Levadura
El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de un polipéptido PRO deseado en levadura.
En primer lugar, los vectores de expresión de levadura se construyen para producción o secreción intracelular de polipéptidos PRO a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica el polipéptido PRO deseado, un péptido de señal seleccionado y el promotor se inserta en sitios de enzima de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular del polipéptido PRO. Para secreción, el ADN que codifica el polipéptido PRO se puede clonar en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, la secuencia señal/líder de secreción de factor alfa de levadura, y secuencias de enlace (si es necesario) para expresión del polipéptido PRO.
Las células de levadura, tales como levadura variedad AB110, se pueden transformar a continuación con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivados en medio de fermentación seleccionado. Los supernadantes de levadura transformados se pueden analizar mediante precipitación con 10% de ácido tricloroacético y separación mediante SDS-PAGE, seguido por el tintado de los geles con tinte Coomassie Blue.
El polipéptido PRO recombinante se puede aislar posteriormente y purificar retirando las células de levadura del medio de fermentación mediante centrifugación, y a continuación concentrando el medio usando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene el polipéptido PRO también puede purificarse usando resinas de cromatografía de columna seleccionadas.
Ejemplo 7 Expresión de Polipéptidos PRO en Células de Insectos Infectadas con Baculovirus
El siguiente procedimiento describe la expresión recombinante de polipéptidos PRO en células de insecto infectadas con Baculovirus.
El polipéptido PRO deseado se funde antes de una marca de epítope contenida con un vector de expresión de baculovirus. Estas marcas de epítope incluyen marcas poli-his y marcas de inmunoglobulina (como regiones Fc de IgG). Se pueden utilizar una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos comercialmente disponibles tales como pVL1393 (Novagen). Brevemente, el polipéptido PRO de la porción deseada del polipéptido PRO (tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana) se amplifica mediante PCR con iniciadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El iniciador 5' puede incorporar sitios de enzima de restricción de flancos (seleccionados). El producto se agrupa a continuación con las enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante co-transfección del plásmido anterior y ADN virus BaculoGlod^{TM} (Pharmigen) en células Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando lipofectina (comercialmente disponible por parte de GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se cultivan y se usan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de la proteína se realizan tal como se describe por parte de O'Reilley et al., Baculovirus expresión vectores: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
A continuación se puede purificar el polipéptido PRO marcado poli-his expresado, por ejemplo, mediante la cromatografía de afinidad Ni^{2+}-quelato como sigue. Los extractos se prepararon a partir de células Sf9 infectadas con virus recombinantes tal como se describe por parte de Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993). En breve, las células Sf9 se lavaron, resuspendieron en buffer de sonicación (25 mL Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl_{2}; 0,1 mM EDTA; 10% Glicerol; 0,1% NP-40; 0,4 M KCl), y se sonicaron dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicatos se aclararon mediante centrifugación, y el supernadante se diluyó en 50-pliegues en un buffer de carga (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, 10% Glicerol, pH 7,8) y se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum. Se preparó una columna de agarosa Ni^{2+}-NTA (comercialmente disponible por parte de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 mL, lavado con 25 mL de agua y equilibrado con 25 mL de buffer de carga. El extracto de célula filtrado se carga sobre la columna a 0,5 mL por minuto. La columna se lavó a la línea de base A_{280} con un buffer de carga, en cuyo punto se inició la recogida de las fracciones. A continuación, la columna se lavó con un buffer de lavado secundario (50 mM fosfato; 300 mM NaCl, 10% Glicerol, pH 6,0), que eluye la proteína no específicamente unida. Después de alcanzar la línea de base A_{280} otra vez, la columna se desarrolla con un gradiente de Imidazol de 0 a 500 mM en el buffer de lavado secundario. Se recogen y se analizan fracciones de un mL mediante tintado SDS-PAGE y plata o transferencia western con Ni^{2+}-NTA conjugado a fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el polipéptido PRO marcado con His_{10} eluído se agrupan y se dializan contra el buffer de carga.
Alternativamente, la purificación del polipéptido PRO marcado IgG (o marcado Fc) puede realizarse utilizando técnicas conocidas de cromatografía, incluyendo por ejemplo, cromatografía de columna de Proteína A o proteína G.
PRO211 se expresó en baculovirus infectados Sf9 o células high5 de insectos. Aunque la expresión fue de hecho realizada en una escala 0,5-2 L, la misma puede sin esfuerzo aumentarse para preparaciones más grandes (por ejemplo 8 L). Las proteínas se expresaron como una estructura IgG (inmunoadhesina), en la cual la región de proteína extracelular se fundió en una secuencia de región constante IgG1 que contenía la articulación, dominios CH2 y CH3 y/o formas marcadas poli-His.
Siguiendo la ampliación PCR, las respectivas secuencias de codificación fueron subclonadas en un vector de expresión de baculovirus (pb.Ph.IgG para fusiones IgG y pb.Ph.His.c para proteínas marcadas poli-His), y el vector y ADN Bacologold® baculovirus (Pharmingen) se cotransfecta en 105 células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711), utilizando Lipofectina (Gibco BRL). pb.PH.IgG y pb.PH.His son modificaciones del vector de expresión pVL 1393 (Pharmingen) del baculovirus comercialmente disponible, con regiones poliligadoras para incluir las secuencias marcadoras His o Fc. Las células se cultivaron en medio Hink TNM-FH suplementado con 10% FBS (Hyclone). Las células se incubaron durante 5 días a 28ºC. El sobrenadante se recolectó y subsecuentemente se empleó para la primera amplificación viral mediante la infección de células de Sf9 en medio Hink TNM-FH suplementado con 10% FBS a una multiplicidad aproximada de la infección (MOI) de 10. Las células se incubaron durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se recolectó y la expresión de las estructuras en el vector de expresión del baculovirus se determinó mediante enlace de lotes de 1 ml de sobrenadante a 25 mL de granos de Ni-NTA (QIAGEN) para proteínas marcadas de histidina o granos de Proteína-A Sepharose CL-4B (Pharmacia) para proteínas marcadas IgG seguido por un análisis SDS-PAGE comparando con una concentración conocida de proteína estándar mediante tinción azul Coomassie.
El sobrenadante de la primera amplificación viral se utilizó para infectar un cultivo centrifugado (500 ml) de células Sf9 cultivadas en medio ESF-921 (Expression Systems LLC) a un MOI de aproximadamente 0,1. Las células se incubaron durante 3 días a 28ºC. Se recolectó y se filtró el sobrenadante. Se repitieron los análisis de lote y SDS-PAGE, según necesidad, hasta que se confirmó la expresión del cultivo centrifugado.
El medio acondicionado de las células transfectadas (0,5 a 3 L) se recogió mediante centrifugación para retirar las células y se filtró a través de filtros de 0,22 micrones. Para las estructuras marcadas poli-His, la estructura de proteína se purificó utilizando una columna de ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol al medio acondicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombeó sobre una columna de 6ml de Ni-NTA equilibrada en 20 mM Hepes, pH 7,4, buffer conteniendo 0,3 M NaCl y 5mM de imidazol a una tasa de flujo de 4-5 ml/min, a 4ºC. Después de la carga, la columna se lavó con buffer de equilibrado adicional y se enjuagó la proteína con buffer de equilibrado conteniendo 0,25 M de imidazol. La proteína altamente purificada se desalinizó en un buffer de almacenamiento que contiene 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl y 4% manitol, pH 6,8, con una columna de 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) y almacenado a -80ºC.
Las estructuras inmunoadhesinas (que contienen Fc) de proteínas se purificaron del medio acondicionado como sigue. El medio acondicionado se bombeó sobre una columna de 5 ml de Proteína A (Pharmacia) que se había equilibrado en un buffer de 20 mM de fosfato Na, pH 6,8. Después de la carga, la columna se lavó extensivamente con buffer de equilibrado antes del enjuague con 100 mM de ácido cítrico, pH 3,5. La proteína enjuagada se neutralizó inmediatamente mediante la recogida de fracciones de 1 ml en tubos que contenían 275 mL de buffer 1 M Tris, pH 9. La proteína altamente purificada se desalinizó en buffer de almacenamiento como se describió con anterioridad para las proteínas marcadas poli-His. La homogeneidad de las proteínas se verificó mediante electroforesis de gel SDS poliacrilamida (PEG) y secuenciado N-terminal amino ácido mediante degradación Edman.
Ejemplo 8 Preparación de Anticuerpos que se Unen a Polipéptidos PRO
Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a un polipéptido PRO.
En la técnica se conocen técnicas para producir los anticuerpos monoclonales y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Los inmunogenes que pueden emplearse incluyen polipéptido PRO purificado, proteínas de fusión que contengan el polipéptido PRO, y células que expresen polipéptido PRO recombinante sobre la superficie de la célula. La selección del inmunogen puede realizarse por los entendidos en la técnica sin excesiva experimentación.
Se inmunizan ratones, tales como Balb/c, con el inmunogen polipéptido PRO emulsificado en adyuvante completo Freund e inyectado de forma subcutánea o intraperitoneal en una cantidad de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunogen se emulsifica en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las almohadillas de las patas traseras del animal. Los ratones inmunizados se estimulan 10 a 12 días más tarde con inmunogen emulsificado adicional en el adyuvante seleccionado. Después de esto, durante varias semanas, los ratones también pueden estimularse con inyecciones de inmunización adicionales. Pueden obtenerse muestras periódicas de suero de los ratones mediante sangrado retro-orbital para pruebas en ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti-polipéptido PRO.
Después que se han detectado un título de anticuerpos adecuado, los animales "positivos" para anticuerpos pueden inyectarse con una inyección intravenosa final de polipéptido PRO. Tres o cuatro días después, los ratones se sacrifican y se recolectan las células del bazo. Las células del bazo se funden entonces (utilizando 35% polietilen glicol) a una línea de células de mieloma murina tal como P3X63AgU.1, disponible de ATCC, Nº CRL 1597. Las fusiones generan células hibridomas que pueden entonces cultivarse en placa en 96 placas de pocillos de cultivo de tejido que contengan medio HAT (hipoxantina, aminopterin, y timidita) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma y células híbridas del bazo.
Las células hibridomas se protegerán en un ELISA para reactividad contra el polipéptido PRO. La determinación de células hibridomas "positivas" que secretan los cuerpos monoclonales deseados contra el polipéptido PRO está dentro de las habilidades en la técnica.
Las células hibridomas positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones singénicos Balb/c para producir ascites que contengan los anticuerpos monoclonales anti-polipéptido PRO. Alternativamente, las células hibridomas pueden cultivarse en frascos de cultivo de tejido o en frascos rotativos. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en las ascites puede completarse utilizando la precipitación con sulfato de amonio, seguida por una cromatografía de gel de exclusión. Alternativamente, puede emplearse la cromatografía por afinidad basada en unir el anticuerpo a Proteína A o proteína G.
Ejemplo 9 Polipéptidos PRO Quiméricos
Los polipéptidos PRO pueden expresarse como proteínas quiméricas con uno o más dominios polipéptidos adicionales añadidos para facilitar la purificación de la proteína. Dichos dominios para facilitar la purificación incluyen, pero no están limitados, péptidos metálicos quelantes tales como módulos histidina-triptofano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación extensión/afinidad FLAGS^{TM} (Immunex Corp., Seattle Wash.). La inclusión de una secuencia de unión separable tal como el Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego Calif.) entre el dominio de purificación y la secuencia de polipéptido PRO puede ser útil para facilitar la expresión del ADN que codifica el polipéptido PRO.
Ejemplo 10 Purificación de polipéptidos PRO Utilizando Anticuerpos específicos
Los polipéptidos PRO nativos o recombinantes pueden purificarse mediante una variedad de técnicas estándar de la técnica de purificación de proteínas. Por ejemplo, el pro-polipéptido PRO, polipéptido PRO maduro, o pre-polipéptido PRO se purifica mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido PRO de interés. En general, se construye una columna de inmunoafinidad mediante el acoplamiento de forma covalente del anticuerpo anti-polipéptido PRO a una resina cromatográfica activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de suero inmune ya sea mediante precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación sobre Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Asimismo, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de fluido de ascites de ratón mediante precipitación con sulfato de amonio o cromatografía sobre Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se acopla en forma covalente a una resina cromatográfica tal como CnBr-activada SEPHAROSE^{TM} (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea, y la resina derivada se lava según las instrucciones del fabricante.
Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación de polipéptido PRO mediante la preparación de una fracción de células que contengan polipéptido PRO en forma soluble. Esta preparación se deriva mediante solubilización de la totalidad de la célula o de una fracción subcelular obtenida a través de centrifugación diferencial mediante la adición de detergente o mediante otros procedimientos bien conocidos en la técnica. De forma alternativa, el polipéptido PRO soluble que contiene una secuencia de señal puede secretarse en cantidad útil en el medio en el cual se cultivan las células.
Una preparación que contiene polipéptido PRO soluble se pasa por la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava bajo condiciones que permitan la absorbancia preferencial de polipéptido PRO (es decir, buffer de fuerza iónica alta en presencia de detergentes). Luego, la columna se enjuaga bajo condiciones que rompen el enlace anticuerpo/polipéptido PRO (es decir, un buffer de bajo pH tal como aproximadamente pH 2-3, o una alta concentración de un caotropo tal como urea o ión de teocianato), y se recoge el polipéptido PRO.
Ejemplo 11 Tamizado de Medicamentos
Esta invención es particularmente útil para tamizar compuestos usando polipéptidos PRO o uniendo fragmentos de los mismos en cualquiera de una variedad de técnicas de tamizado de medicamentos. El polipéptido PRO o el fragmento utilizado en esta prueba puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido, llevado sobre una superficie de célula, o situado de manera intracelular. Un procedimiento de tamizado de medicamentos utiliza células hospedadoras eucarióticas o procarióticas que se transforman de manera estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido PRO o el fragmento. Los medicamentos se tamizan contra estas células transformadas en ensayos de unión competitivos. Estas células, en forma viable o fija, se pueden usar para ensayos de unión estándar. Uno puede medir, por ejemplo, la formación de complejos entre el polipéptido PRO o un fragmento y el agente que se prueba. Alternativamente, uno puede examinar la disminución en la formación del complejo entre el polipéptido PRO y su célula diana o los receptores diana provocada por el agente que se prueba.
De esta manera, la presente invención proporciona procedimientos de tamizado para medicamentos o cualquier otro agente que pueda afectar a una enfermedad o desorden asociado con el polipéptido PRO. Estos procedimientos comprenden el contacto de este agente con un polipéptido PRO o un fragmento del mismo y en ensayo (i) para la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido PRO o el fragmento, o (ii) para la presencia de un complejo entre el polipéptido PRO o el fragmento y la célula, mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. En estos ensayos de unión competitivos, el polipéptido PRO o el fragmento típicamente se marcan. Después de la incubación adecuada, el polipéptido PRO libre o el fragmento se separan del presente en forma unida, y la cantidad de marca libre o no compleja es una medida de la capacidad del agente particular para unirse al polipéptido PRO o para interferir con el complejo polipéptido PRO/célula.
Otra técnica de tamizado de medicamentos proporciona un tamizado de alto rendimiento para compuestos que tienen afinidad de unión adecuada con un polipéptido y se describe en detalle en la patente WO 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984. Indicándose en breve, grandes cantidades de compuestos de prueba de diferentes péptidos pequeños se sintetizan sobre un substrato sólido, tal como pasadores de plástico u otra superficie. Tal como se aplica a un polipéptido PRO, los compuestos péptidos de prueba reaccionan con el polipéptido PRO y se lavan. El polipéptido PRO de unión se detecta mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. El polipéptido PRO purificado también se puede recubrir directamente sobre placas para su uso en las técnicas de tamizado de medicamentos citadas anteriormente. Además, se pueden usar anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido.
Esta invención también contempla el uso de ensayos de tamizado de medicamentos competitivos en los que los anticuerpos de neutralización capaces de unir el polipéptido PRO específicamente compiten con un compuesto de prueba para unirse al polipéptido PRO o a fragmentos del mismo. De esta manera, los anticuerpos se pueden usar para detectar la presencia de cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos con polipéptido
PRO.
Ejemplo 12 Diseño de Medicamentos Racional
El objetivo del diseño racional de medicamentos es producir análogos estructurales de polipéptido de interés biológicamente activo (es decir, un polipéptido PRO) o de pequeñas moléculas con las que interactúa, por ejemplo, agonistas, antagonistas, o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos se pueden usar para diseñar medicamentos que son formas más activas o estables del polipéptido PRO o que mejoran o interfieren con la función del polipéptido PRO in vivo (cf. Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)).
En una aproximación, la estructura de tres dimensiones del polipéptido PRO, o de un complejo inhibidor de polipéptido PRO, se determina mediante cristalografía de rayos x, mediante modelado por ordenador o, más típicamente, mediante una combinación de las dos aproximaciones. La forma y las cargas del polipéptido PRO se han de determinar para elucidar la estructura y determinar el sitio o sitios activos de la molécula. Menos a menudo, se puede conseguir información útil referente a la estructura del polipéptido PRO mediante modelado basado en la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la información estructural se usa para diseñar moléculas análogas similares al polipéptido PRO o para identificar inhibidores eficientes. Ejemplos útiles de diseño de medicamentos racionales pueden incluir moléculas que han mejorado la actividad o la estabilidad tal como se muestra por parte de Braxton y Wells, Biochemistry, 31:7796-7801 (1992) o que actúan como inhibidores, agonistas, o antagonistas de péptidos nativos tal como muestra Athauda et al., J. Biochem., 113:742-746 (1993).
También es posible aislar un anticuerpo diana específico, seleccionado mediante ensayo funcional, tal como se ha descrito anteriormente, y a continuación resolver su estructura cristalina. Esta aproximación, en principio, produce un farmacor en el cual se puede basar el diseño posterior del medicamento. Es posible derivar la cristalografía de la proteína conjunta mediante la generación de anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) a un anticuerpo funcional farmacológicamente activo. Como imagen reflejada de una imagen reflejada, el sitio de unión de los anti-ids se podría esperar que fuera análogo al receptor original. El anti-id se podría usar entonces para identificar y aislar los péptidos de bancos de péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces como el farmacor.
Gracias a la presente invención, se pueden hacer disponibles cantidades suficientes de polipéptido PRO para realizar estos estudios analíticos como cristalografía de rayos x. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácido del polipéptido PRO aquí proporcionada proporcionará una guía a los que utilizan técnicas de modelaje informáticas en lugar o además de cristalografía de rayos x.
Ejemplo 12A
Capacidad de los Polipéptidos PRO de Inhibir el Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) Estimulado de Proliferación de Crecimiento de Células Endoteliales
Se probó la capacidad de varios polipéptidos PRO de inhibir el VEGF estimulado de proliferación de células endoteliales. Específicamente, se cultivaron en placa células endoteliales capilares corticales adrenales bovinas (ACE) (del cultivo primario, máximo 12-14 pasajes) en placas de microtítulo de 96-well (Amersham Life Science) a una densidad de 500 células/well por 100 \muL en DMEM de baja glucosa, 10% de suero de becerro, 2 mM de glutamina, 1x pen/strept y fungizona, suplementadas con 3 ng/mL VEGF. Los controles se cultivaron en placa de la misma manera pero algunos no incluían VEGF. Una muestra de prueba del polipéptido PRO de interés se añadió en un volumen de 100 \mul para un volumen final de 200 \mul. Las células se incubaron durante 6-7 días a 37ºC. El medio se aspiró y las células se lavaron 1x con PBS. Se añadió una mezcla de reacción de fosfatasa (100 \muL, 0,1 M de acetato de sodio, pH 5,5, 0,1% Triton-100, 10 mM p-nitrofenil fosfato). Después de incubación durante 2 horas a 37ºC, se detuvo la reacción mediante la adición de 10 \mul 1N NaOH. Se midió el OD en un lector de placas de microtítulo a 405 nm. Los controles fueron ninguna célula, células solamente, células + FGF (5 ng/mL), células + VEGF (3 ng/mL), células + VEGF (3 ng/ml) + TGF-\beta (1 ng/ml), y células + VEGF (3 ng/ml) + LIF (5 ng/mL). (Se conoce que el TGF-\beta en una concentración de 1 ng/ml bloquea un 70-90% de VEGF de proliferación de células estimulado.
Los resultados se determinaron calculando el porcentaje de inhibición de VEGF de proliferación de células estimulado, determinado mediante la medición de la actividad de la fosfatasa ácida a OD405 nm, (1) respecto a células sin estimulación, y (2) respecto a la referencia TGF-\beta de inhibición de la actividad de VEGF estimulada. Los resultados, tal como se muestra en la Tabla 2 adjunta, son indicativos de la utilidad de los polipéptidos PRO en la terapia contra el cáncer y específicamente en la inhibición de tumores angiogénesis. Los valores numéricos (inhibición relativa) mostrados en la Tabla 2 se determinan mediante el cálculo del porcentaje de inhibición de VEGF de proliferación estimulado mediante el polipéptido PRO respecto a células sin estimulación, y a continuación dividiendo ese porcentaje por el porcentaje de inhibición obtenido mediante el TGF-\beta a 1 ng/ml que se conoce que bloquea el 70-90% del VEGF de proliferación de células estimuladas.
TABLA 2
Nombre PRO Concentración PRO Inhibición relativa
PRO211 0,01% 99,0
PRO211 0,01% 1,09
PRO211 0,1% 0,95
PRO211 0,1% 67,0
PRO211 1,0% 0,27
PRO211 1,0% 20,0
Ejemplo 13 Inhibición de Célula PDB12
Este ejemplo demuestra que varios polipéptidos PRO son eficaces para inhibir la producción de proteína por parte de las células pancreáticas ductales PDB12.
Las células pancreáticas ductales PDB12 se cultivan en 96 placas de pocillos revestidas con fibronectina a razón de 1,5 x 10^{3} células por pocillo en 100\muL/180\muL de medio de cultivo. Se añaden luego 100 \muL de medio de cultivo con la muestra de prueba del polipéptido PRO o controles negativos que carecen del polipéptido PRO al pocillo, para un volumen final de 200 \muL. Los controles que contienen medio de cultivo que contiene una proteína que muestra ser inactiva en este ensayo. Las células se incuban durante 4 días a 37ºC. Se añaden entonces 20 \muL de Tinte Azul Alamar (AB) a cada pocillo y se lee luego la lectura fluorescente a las 4 horas posteriores a la adición de AB, sobre un lector de placa de microtitulación a 530 nm de exitación y 590 nm de emisión. El estándar empleado son células sin Extracto Pituitario Bovino (BPE) y con varias concentraciones de BPE. Controles buffer o CM de desconocidos se ejecutan 2 veces en cada placa de 96 pocillos.
Los resultados de estos ensayos se muestran en la Tabla 6 a continuación donde la disminución de porcentaje en la producción de proteína se calcula mediante comparación de la concentración de proteína calculada con el Tinte de Azul Alamar producida mediante las células de polipéptido PRO con la concentración de proteína calculada con el Tinte de Azul Alamar producida mediante las células de control negativo. Una disminución del porcentaje en la producción de proteína mayor o igual al 25% comparado con las células de control negativo se considera positivo.
TABLA 6
Nombre PRO Concentración PRO Porcentaje de disminución en la producción de proteína
PRO211 0,1% 0,0%
PRO211 0,01% 0,6%
PRO211 1,0% 59,7%
Ejemplo 14 Hibridación in situ
La hibridación in situ es una técnica poderosa y versátil para la detección y localización de secuencias de ácido nucleico dentro de preparaciones de células o de tejidos. Puede ser útil por ejemplo, para identificar lugares de expresión de genes, analizar la distribución de tejido de transcripción, identificar y localizar infección viral, seguir cambios en síntesis específicas de ARNm y ayuda en el mapeado de cromosomas.
En la patente EP 1027434 A (98946090) la hibridación in situ se ha realizado siguiendo una versión optimizada del protocolo de Lu y Gillet, Cell Vision 1:169-176 (1994), utilizando ribosondas marcadas ^{33}P generadas por PCR. En breve, se seccionaron tejidos humanos incrustados en parafina y fijados en formalina, se desparafinizaron y se desproteinaron en proteinasa K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37ºC, y también se procesaron para hibridación in situ tal como se describe por parte de Lu Y Gillet, supra. Se generó una ribosonda antisentido marcada UTP A [^{33}-P] a partir de un producto PCR y se hibridizó a 55ºC de un día para el otro. Los portaobjetos se sumergieron en una emulsión de pista nuclear NTB2 Kodak y se expusieron durante 4 semanas.
Síntesis Ribosonda ^{33}P
Se secaron a velocidad vac 6,0 \mul (125 mCi) de ^{33}P-UTP (Amersham BF 1002, SA <2000 Ci/mmmol). Se añadieron a cada tubo que contenía el ^{33}P-UTP seco los siguientes ingredientes:
2,0 \mul 5x buffer de transcripción
1,0 \mul DIT (100 mM)
2,0 \mul mezcla NTP (2,5 mM; 10 \mu; cada uno de 10 mM GTP, CTP y ATP + 10 \mul H_{2}O)
1,0 \mul UTP (50 \muM)
1,0 \mul Rnasina
1,0 \mul cadena ADN (1 \mug)
1,0 \mul H_{2}O
1,0 \mul polimerasa ARN (para productos PCR T3 = AS, T7 = S, usualmente)
Los tubos se incubaron a 37ºC durante una hora. Se añadió 1,0 \mul RQ1 DNase, seguido por incubación a 37ºC durante 15 minutos. Se añadieron 90 \mul TE (10 mM Tris pH 7,6/1 mM EDTA pH 8,0), y mezcla se pipetó sobre papel DE81. La solución restante se cargó en una unidad de ultrafiltración Microcon-50, y se hizo girar usando el programa 10 (6 minutos). La unidad de filtración se invirtió en un segundo tubo y se hizo girar usando el programa 2 (3 minutos). Después del giro de recuperación final, se añadieron 100 \mul TE. Se pipetó 1 \mul del producto final sobre papel DE81 y se contó en 6 ml de Biofluor II.
La sonda se extendió sobre un gel TBE/urea. Se añadieron 1 a 3 \mul de la sonda o 5 \mul de ARN Mrk II a 3 \mul de buffer de carga. Después de su calentamiento sobre un bloque de calentamiento a 95ºC durante tres minutos, el gel se colocó inmediatamente sobre hielo. Las perforaciones del gel se purgaron, la muestra se cargó, y se extendió a 180-250 voltios durante 45 minutos. El gel se envolvió en envoltura de saran y se expuso a película XAR con una pantalla de intensificación en un congelador a -70ºC una hora a un día para el otro.
Hibridación ^{33}P A. Tratamiento previo de las secciones congeladas
Los portaobjetos se retiraron del congelador, se colocaron en bandejas de aluminio y se descongelaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocaron en una incubadora a 55ºC durante cinco minutos para reducir la condensación. Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en un 4% de formaldehído sobre hielo en la campana de humos, y se lavó en 0,5 x SSC durante 5 minutos, a temperatura ambiente (25 ml 20 x SSC + 975 ml SQ H_{2}O). Después de la desproteinización en 0,5 \mug/ml de proteinasa K durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de 10 mg/ml de stock en 250 ml de buffer ARNse libre de RNase precalentado), las secciones se lavaron en 0,5 x SSC durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en 70%, 95%, 100% de etanol, 2 minutos cada una.
B. Tratamiento previo de las secciones incrustadas en parafina
Los portaobjetos se desparafinaron, se colocaron en SQ H_{2}O, y se sumergieron dos veces en 2 x SSC a temperatura ambiente, durante 5 minutos cada vez. Las secciones se desproteinizaron en 20 \mug/ml de proteinasa K (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de buffer RNase libre de RNase; 37ºC, 15 minutos) - embrión humano, u 8 x proteinasa K (100 \mul en 250 ml de buffer Rnase, 37ºC, 30 minutos) - tejidos de formalina. La inmersión posterior en 0,5 x SSC y la deshidratación se realizaron tal como se ha descrito anteriormente.
C. Hibridación Previa
Los portaobjetos se colocaron en una caja de plástico recubierta con buffer Box (4 x SSC, 50% formamida) - papel de filtro saturado. El tejido se cubrió con 50 \mul de buffer de hibridación (3,75 g Sulfato de Dextrano + 6 ml SQ H_{2}O), vorteado y calentado en el microondas durante 2 minutos con el tapón aflojado. Después de enfriarse sobre hielo, se añadieron 18,75 ml de formamida, 3,75 ml 20 x SSC y 9 ml SQ H_{2}O, el tejido se vorteó bien y se incubó a 42ºC durante 1-4 horas.
D. Hibridación
Se calentaron una sonda 1,0 x 10^{6} cpm y 1,0 \mul tARN (50 mg/ml stock) por portaobjetos a 95ºC durante 3 minutos. Los portaobjetos se enfriaron sobre hielo, y se añadieron 48 \mul de buffer de hibridación por portaobjetos. Después del vorteado, se añadió una mezcla de 50 \mul ^{33}P a 50 \mul de hibridación previa sobre el portaobjetos. Los portaobjetos se incubaron de un día para el otro a 55ºC.
E. Lavados
El lavado se realizó 2 x 10 minutos con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente (400 ml 20 x SSC + 16 ml 0,25M EDTA, V_{f} = 4L), seguido por tratamiento con RNaseA a 37ºC durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/ml en 200 ml de buffer Rnase = 20 \mug/ml). Los portaobjetos se lavaron 2 x 10 minutos con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente. Las condiciones del lavado de estringencia fueron las siguientes: 2 horas a 55ºC, 0,1 x SSC, EDTA (20 ml 20 x SSC + 16 ml EDTA, V_{f} = 4L).
Depósito de Material
Se han depositado los siguientes materiales en la "American Type Culture Collection", 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC):
Material Dep. Nº. ATCC Fecha Depósito
ADN 32292-1131 ATCC 209258 16 Septiembre 1997
Este depósito se realizó bajo las provisiones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito de Patente y las Regulaciones bajo el mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha de depósito. Los depósitos se harán disponibles por parte de la ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo del depósito al público bajo la publicación de la pertinente patente US o bajo la publicación de cualquier solicitud de patente US o extranjera, la que sea primera y asegura la disponibilidad de la progenie a uno determinado por el Comisionado US de Patentes y Marcas a tener derecho al mismo según 35 USC \NAK 122 y la reglas del comisionado según las mismas (incluyendo 37 CFR \NAK 1.14 con particular referencia a 886 OG 638).
El titular de la presente solicitud ha estado de acuerdo que si un cultivo de materiales en depósito ha de morir o se ha de perder o destruir cuando está condiciones adecuadas, los materiales se reemplazarán en seguida bajo notificación con otros iguales. La disponibilidad del material depositado no se ha de considerar una licencia para poner el práctica la invención en contra de los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno según sus leyes de patentes.
La memoria escrita anterior se considera que es suficiente para permitir que un técnico en la materia ponga en práctica la invención. La presente invención no está limitada en ámbito a la construcción depositada, ya que la realización depositada está pensada como una única representación de ciertos aspectos de la invención, y cualquier construcción que sea funcionalmente equivalente está incluida en el ámbito de esta invención. El depósito de material no constituye una admisión de que la descripción escrita aquí contenida es inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni se han de considerar como limitativas del ámbito de las reivindicaciones las ilustraciones específicas que representa. Incluso, varias modificaciones de la invención además de las aquí mostradas y descritas se harán evidentes para los técnicos en la materia a partir de la descripción anterior y que están dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.
<110> Genentech, Inc.
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<120> Polipéptidos secretados y transmembrana y ácidos nucleicos que codifican los mismos.
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<130> CMD/FP5963004
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<140> EP 01127793.6
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<141> 2001-11-22
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/059,263
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1997-09-18
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US98/18824
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<151> 1998-09-10
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 1364
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
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1 
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<210> 2
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<211> 353
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
3
4 
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<210> 3
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<211> 45
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> fuente
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<223> /nota= "Descripción de la Secuencia Artificial: Sonda"
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
agggagcacg gacagtgtgc agatgtggac gagtgctcac tagca 
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45 
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<210> 4
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> fuente
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<223> /nota= "Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de PCR Forward"
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskip
agagtgtatc tctggctacg c 
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21 
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<210> 5
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> fuente
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<223> /nota= "Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador inverso de PCR"
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
taagtccggc acattacagg tc 
\hfill
22 
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<210> 6
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<211> 49
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> fuente
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskip
cccacgatgt atgaatggtg gactttgtgt gactcctggt ttctgcatc 
\hfill
49 
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<210> 7
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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aaagacgcat ctgcgagtgt cc 
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22 
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<210> 8
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<211> 23
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> fuente
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<223> /nota= "Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador inverso de PCR"
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<400> 8
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tgctgatttc acactgctct ccc 
\hfill
23 
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Claims (25)

1. Ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO:2), o su complemento, en el que dicha identidad de secuencia está determinada sobre toda la longitud de las secuencias que se comparan, y en el que el polipéptido tiene la capacidad de inhibir la producción de proteínas mediante células del conducto pancreático PDB12.
2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que el nivel de identidad es del 90% por lo menos.
3. Ácido nucleico según la reivindicación 2, en el que el nivel de identidad es del 95% por lo menos.
4. Ácido nucleico según la reivindicación 1, que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO:2).
5. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de nucleótido comprende la secuencia de codificación de longitud completa de la secuencia mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO:1), o su complemento.
6. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de nucleótido comprende la secuencia de nucleótido mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO:1), o su complemento.
7. Ácido nucleico aislado, que comprende la secuencia de codificación de longitud completa del inserto de ácido nucleico (ADN 32292-1131) contenido en el número de aceptación ATCC 209258, y que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de inhibir la producción de proteínas mediante células del conducto pancreático PDB12.
8. Vector que comprende el ácido nucleico según cualquier reivindicación anterior.
9. Vector según la reivindicación 8, enlazado de manera operativa con secuencias de control reconocidas por una célula hospedadora transformada con el vector.
10. Célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 8 o la reivindicación 9.
11. Célula hospedadora según la reivindicación 10, en la que dicha célula es una célula CHO.
12. Célula hospedadora según la reivindicación 10, en la que dicha célula es un E. coli.
13. Célula hospedadora según la reivindicación 10, en la que dicha célula es una célula de levadura.
14. Procedimiento para producir un polipéptido que comprende el cultivo de la célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido y la recuperación de dicho polipéptido a partir del cultivo de la célula.
15. Polipéptido aislado que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO:2), en el que el polipéptido tiene la capacidad de inhibir la producción de proteínas mediante células del conducto pancreático PDB12.
16. Polipéptido según la reivindicación 15, que consiste en la secuencia de aminoácido mostrada en la figura 2 (SEQ ID NO:2).
17. Polipéptido aislado que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácido codificada mediante la secuencia de codificación de longitud total del inserto de ácido nucleico (ADN 32292-1131) contenido en el número de admisión ATCC 209258, en el que el polipéptido tiene la capacidad de inhibir la producción de proteínas mediante células del conducto pancreático PDB12.
18. Polipéptido aislado según la reivindicación 17, que consiste en la secuencia de aminoácido codificada mediante la secuencia de codificación de longitud total del inserto de ácido nucleico (ADN 32292-1131) contenido en el número de admisión ATCC 209258.
19. Polipéptido según la reivindicación 15 o la reivindicación 17, en el que el nivel de identidad es por lo menos del 90%.
20. Polipéptido según la reivindicación 19, en el que el nivel de identidad es por lo menos del 95%.
21. Molécula quimérica que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20 fundida en una secuencia de aminoácido heterólogo.
22. Molécula quimérica según la reivindicación 21, en el que dicha secuencia de aminoácido heterólogo es una secuencia de marca epítope.
23. Molécula quimérica según la reivindicación 21, en el que dicha secuencia de aminoácido heterólogo es una región Fc de una inmunoglobulina.
24. Anticuerpo que se une específicamente al polipéptido según la reivindicación 16 o la reivindicación 18.
25. Anticuerpo según la reivindicación 24, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
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