ES2317967T3 - Proteina gas-6 (growth arrest-specific gene 6) humana y acidos nucleicos que la codifican. - Google Patents
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Abstract
Ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de los residuos 20 a 273 mostrada en las figuras 2 y 4, o el complemento de la misma, en el que dicha identidad de secuencia se determina sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan, y en el que dicho ácido nucleico es amplificado en tumores de pulmón y/o colon humanos.
Description
Proteína gas-6 (growth
arrest-specific gene 6) humana y ácidos nucleicos
que la codifican.
La presente invención hace referencia en general
a la identificación y aislamiento de un nuevo DNA y a la producción
recombinante de polipéptidos nuevos codificados por dicho DNA.
Las proteínas extracelulares juegan un papel
importante en la formación, diferenciación y mantenimiento de
organismos multicelulares. El destino de muchas células
individuales, por ejemplo, su proliferación, migración,
diferenciación o interacción con otras células está gobernado
generalmente por la información recibida de otras células y/o el
entorno inmediato. Esta información, a menudo se transmite por
polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos,
factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de
diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que, a su vez, son
recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o
proteínas unidas a membrana. Estos polipéptidos secretados o
moléculas de señalización tras su secreción por la célula de forma
específica alcanzan su sitio de acción en el entorno
extracelular.
Las proteínas secretadas tienen diversas
aplicaciones industriales, incluyendo las farmacéuticas,
diagnósticas, los biosensores y los bioreactores. La mayoría de
fármacos proteicos disponibles en la actualidad, como los agentes
trombolíticos, los interferones, las interleucinas, las
eritropoyetinas, los factores estimulantes de la formación de
colonias y diversas otras citocinas, son proteínas de secreción. Sus
receptores, que son proteínas de membrana, también tienen un
potencial como agentes terapéuticos o diagnósticos. Se han realizado
numerosos esfuerzos, tanto en la industria como en el ámbito
académico para identificar nuevas proteínas de secreción. Muchos de
los esfuerzos se han concentrado en el rastreo de librerías de DNA
recombinante de mamífero para identificar secuencias codificantes
de nuevas proteínas secretadas. En la literatura se describen
diversos ejemplos de procedimientos y técnicas de rastreo [véase
por ejemplo, Klein y col., Proc. Natl. Acad. Sci.,
93:7108-7113 (1996); patente americana U.S.
5.536.637)].
Las proteínas unidas a membrana y los receptores
pueden desempeñar una importante función en la formación,
diferenciación y mantenimiento de los organismos multicelulares. El
destino de muchas células individuales, por ejemplo, su
proliferación, migración, o interacción con otras células está
gobernado en general por la información recibida de otras células
y/o el entorno inmediato. Esta información, a menudo se transmite
por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos,
factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de
diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que, a su vez, son
recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o
proteínas unidas a membrana. Dichas proteínas unidas a membrana y
receptores celulares incluyen, pero no se limitan a, los receptores
de citocinas, los receptores quinasas, los receptores fosfatasas,
los receptores implicados en las interacciones
célula-célula y las moléculas de adhesión como las
selectinas e integrinas. Por ejemplo, la transducción de señales
que regulan el crecimiento y la diferenciación celular está
regulada en parte por la fosforilación de diversas proteínas
celulares. Las proteína tirosina quinasas, enzimas que catalizan
dicho proceso, también pueden actuar como receptores de factores de
crecimiento. Se incluyen como ejemplos el receptor del factor de
crecimiento de fibroblastos y el factor de crecimiento nervioso.
Las proteínas unidas a membrana y las moléculas
de receptor tienen diversas aplicaciones industriales, por ejemplo,
como agentes farmacéuticos y diagnósticos. Los receptores
inmunoadhesinas, por ejemplo, pueden utilizarse como agentes
terapéuticos para bloquear la interacción con el
receptor-ligando. Las proteínas unidas a membrana
también pueden utilizarse para el rastreo de inhibidores potenciales
de moléculas pequeñas o de péptidos de la interacción relevante
receptor/ligando. Se han realizado esfuerzos tanto en la
investigación industrial como académica para identificar nuevas
proteínas receptoras nativas. Muchos esfuerzos se han centrado en
el rastreo de librerías de DNA recombinantes para identificar las
secuencias codificantes de nuevas proteínas receptoras.
En la presente invención se describe la
identificación y la caracterización de nuevos polipéptidos de
secreción y transmembrana, así como los nuevos ácidos nucleicos que
los codifican.
El cáncer se caracteriza por el incremento en el
número de células anormales, o neoplásicas, derivadas de un tejido
normal que proliferan para formar una masa tumoral, la invasión de
tejidos adyacentes por estas células tumorales neoplásicas, y la
generación de células malignas que finalmente se extienden a través
de la sangre o el sistema linfático hasta los nódulos linfáticos
regionales y hasta sitios distantes (metástasis). En un estado
canceroso, una célula prolifera bajo condiciones en las que células
normales no crecerían. El cáncer se manifiesta por sí mismo en una
gran variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de
invasión y agresividad.
La alteración de la expresión génica está
íntimamente relacionada con el crecimiento incontrolado de células
y la desdiferenciación, las cuales son una característica común a
todos los cánceres. Se ha observado que los genomas de ciertos
tumores bien estudiados muestran una menor expresión de genes
recesivos, a los que habitualmente se hace referencia como genes
supresores de tumores, que funcionarían normalmente para evitar el
crecimiento de células malignas, y/o la sobreexpresión de ciertos
genes de dominio, tales como oncogenes, que actúan para inducir el
crecimiento maligno. Cada uno de estos cambios genéticos parece ser
responsable de la importación de algunos de los rasgos que,
agregados, representan el fenotipo neoplásico completo (Hunter.
Cell 64, 1129 [1991]; Bishop, Cell 64,
235-248 [1991]).
Un mecanismo bien conocido de la sobreexpresión
de genes (por ejemplo, oncogén) en células cancerígenas es la
amplificación génica. Este es un procedimiento en el que en el
cromosoma de la célula ancestral se producen múltiples copias de un
gen particular. El procedimiento implica la replicación no
programada de la región del cromosoma que comprende el gen, seguido
por la recombinación de los segmentos replicados de nuevo en el
cromosoma (Alitalo et al., Adv. Cancer Res. 47.
235-281 [1986]). Se cree que la sobreexpresión del
gen va en paralelo con la ampliación génica, es decir, es
proporcional al número de copias realizadas.
Se ha identificado que los
proto-oncogenes que codifican factores de
crecimiento y receptores de factores de crecimiento juegan papeles
importantes en la patogénesis de varios tumores humanos, incluyendo
cáncer de mama. Por ejemplo, se ha observado que el gen de ErbB2
humano (erbB2, también conocido como her2 o
c-erbB-2), que codifica un
receptor de glicoproteína transmembrana de 185 kD (p185HER2, HER2)
relacionado con el receptor del factor de crecimiento epidérmico
(EGFR), se sobreexpresa en aproximadamente de un 25% a un 30% del
cáncer de mama humano (Slamon et al., Science 235:
177-182 [1987]; Slamon et al., Science 244:
707-712 [1989]).
Se ha descrito que la amplificación génica de un
protooncogén en un suceso implicado habitualmente en las formas más
malignas de cáncer, y podría actuar como un factor de pronóstico del
resultado clínico (Schwab et al., Genes Chromosomes Cancer
1, 181-193 [1990]; Alitalo et al.,
supra). De este modo, la sobreexpresión de erbB2 se considera
habitualmente como un factor de pronóstico de una mala prognosis,
especialmente en pacientes con enfermedad primaria que implica
nódulos linfáticos auxiliares (Slamon et al., [1987] y
[1989], supra; Ravdin y Chamness, Gene 159:
19-27 [1995]; y Hynes y Stem, Biochim. Biophys.
Hacia 1198: 165-184 [1994]) y se ha
relacionado con la sensibilidad y/o resistencia a la terapia con
hormonas y pautas quimioterapéuticas, incluyendo CMF
(ciclofosfamida, metotrexato y fluorouracilo) y antraciclinas
(Baselga et al., Oncology 11 (3 Suppl 1):
43-48 [1997]). Sin embargo, a pesar de la asociación
de la sobreexpresión de erbB2 con una mal prognosis, las
probabilidades de pacientes con respuesta positiva a HER2 que
respondían clínicamente al tratamiento con taxanos eran superiores
a tres veces aquellos pacientes con respuesta negativa a HER2
(Ibid). Un anticuerpo monoclonal recombinante
anti-ErbB2 humanizado (anti-HER2)
(una versión humanizada del anticuerpo anti-ErbB2
4D5, al que se hace referencia como rhuMAb HER2 o
Herceptin7\delta) ha sido clínicamente activo en pacientes con
cánceres de mama metastáticos que sobreexpresan ErbB2 que habían
recibido terapia anticancerígena previa a la extensión. (Baselga
et al., J. Clin. Oncol. 14: 737-744
[1996]).
La proteína Notch y sus homólogos son receptores
reguladores claves en la determinación del destino celular en
diversos procesos de desarrollo. La proteína
Notch-4, también conocida como oncogén
int-3, se identificó originalmente como una diana
frecuente en el virus de tumor mamario de ratón (MMVS). Se cree que
la Notch-4 es un transgén que afecta a la capacidad
de diferenciación de células madre y conduce a la proliferación
neoplásica en células epiteliales. Shirayoshi et al., Genes
Cells 2(3): 213-224 (1997). Durante la
embriogénesis, la expresión de Notch-4 se detectó
en células endoteliales de vasos sanguíneos que forman tejidos,
tales como la aorta dorsal, los vasos intersegmentales, vasos del
saco vitelino, vasos cefálicos, corazón, vasos en arcos
branquiales, y plexos capilares. La expresión de
Notch-4 en estos tejidos también estaba asociada con
flk-1, el gen regulador principal de la
vasculogénesis y la angiogénesis. La Notch-4 también
se regula por incremento in vitro durante la diferenciación
de la célula madre endotelial. El patrón de expresión específico
para células endoteliales de Notch-4, así como su
similitud estructural con Notch, sugieren que
Notch-4 es un homólogo específico para células
endoteliales de Notch y que puede jugar un papel en la
vasculogénesis y angiogénesis.
La presente invención se refiere a composiciones
y métodos para el diagnóstico y el tratamiento del crecimiento y
proliferación de células neoplásicas en mamíferos, incluyendo
humanos. La presente invención se basa en la identificación de
genes que se amplifican en el genoma de células tumorales. Se espera
que dicha amplificación génica esté asociada con la sobreexpresión
del producto génico y contribuya a la tumorigénesis. Por
consiguiente, se cree que las proteínas codificadas por los genes
amplificados son dianas útiles para el diagnóstico y/o el
tratamiento (incluyendo prevención) de ciertos cánceres, y pueden
actuar como factores de pronóstico del tratamiento de tumores.
La presente invención proporciona una molécula
de ácido nucleico aislada tal como se define en las
reivindicaciones, que comprende ADN que codifica un polipéptido
PRO213-1, PRO1330 y/o PRO1449. En un aspecto, el
ácido nucleico aislado comprende ADN que codifica el polipéptido
PRO213-1, PRO1330 y/o PRO1449 que tiene los
residuos de aminoácidos 1 a 273 de la figura 2, 20 a 273 de la
figura 4 y 20 a 273 de la figura 6, respectivamente, o es
complementario a dicha secuencia de ácido nucleico codificante, y
permanece unido de manera estable al mismo bajo condiciones de
astringencia por lo menos moderada y, opcionalmente, condiciones de
astringencia elevada. La secuencia de ácido nucleico aislada puede
comprender el inserto de ADNc del vector designado como
DNA30943-1-1163-1
(ATCC 209791) depositado el 21 de abril de 1998;
DNA64907-1163-1 (ATCC 203243)
depositado el 9 de septiembre de 1998 y/o
DNA64908-1163-1 (ATCC 203242)
depositado el 9 de septiembre de 1998.
La presente invención también proporciona un
polipéptido PRO213-1, PRO1330 y/o PRO1449 aislado
tal como se define en las reivindicaciones. En particular, la
presente invención proporciona un polipéptido
PRO213-1, PRO1330 y/o PRO1449 de secuencia nativa
aislado, que en una realización, incluye una secuencia de
aminoácidos que comprende los residuos 1 a 273 de la figura 2, 20 a
273 de la figura 4 ó 20 a 273 de la figura 6, respectivamente.
Opcionalmente, el polipéptido PRO213-1, PRO1330 y/o
PRO1449 se obtiene o es obtenible mediante la expresión del
polipéptido codificado por el inserto de ADNc del
DNA30943-1-1163-1
(ATCC 209791), DNA64907-1163-1 (ATCC
203243) o DNA64908-1163-1 (ATCC
203242).
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un polipéptido PRO213-1, PRO1330 y/o
PRO1449 aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que
tiene por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la
secuencia, preferiblemente por los menos aproximadamente un 85% de
identidad en la secuencia, más preferiblemente por lo menos
aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia con los residuos
de aminoácidos 1 a 273 de la figura 2, 20 a 273 de la figura 4 ó 20
a 273 de la figura 6, inclusive.
En otra realización, la presente invención
proporciona un polipéptido PRO213-1, PRO1330 y/o
PRO1449 aislado, que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 273
de la figura 2, 20 a 273 de la figura 4 ó 20 a 273 de la figura
6.
Tal como se define en las reivindicaciones, la
presente invención también se refiere a un anticuerpo aislado que
se une a un polipéptido PRO213-1, PRO1330 y/o
PRO1449 aislado. En un aspecto, el anticuerpo induce la muerte de
una célula que sobreexpresa un polipéptido PRO213-1,
PRO1330 y/o PRO1449. En otro aspecto, el anticuerpo es un
anticuerpo monoclonal, que preferiblemente tiene residuos de la
región determinante de complementariedad (CDR) no humana y residuos
de la región estructural ("framework") (FR) humana. El
anticuerpo se puede marcar y se puede inmovilizar en un soporte
sólido. En un aspecto adicional, el anticuerpo es un fragmento de
anticuerpo, un anticuerpo de cadena única o un anticuerpo
anti-idiotípico.
En otra realización, la presente invención se
refiere a una composición que comprende un anticuerpo que se une a
un polipéptido PRO213-1, PRO1330 y/o PRO1449 en una
mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto,
la composición comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del
anticuerpo. En otro aspecto, la composición comprende un principio
activo adicional que puede ser, por ejemplo, un anticuerpo
adicional o un agente citotóxico o quimioterapéutico.
Preferiblemente, la composición es estéril.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo
anti-PRO213-1,
anti-PRO1330 y/o anti-PRO1449, y
vectores y células huésped recombinantes que comprenden dicho ácido
nucleico.
En otra realización, tal como se define en las
reivindicaciones, la presente invención se refiere a un método para
determinar la presencia de un polipéptido PRO213-1,
PRO1330 y/o PRO1449 que comprende exponer una célula sospechosa de
contener el polipéptido PRO213-1, PRO1330 y/o
PRO1449 a un anticuerpo
anti-PRO213-1,
anti-PRO1330 y/o anti-PRO1449 y
determinar la unión del anticuerpo a la célula.
En otra realización, tal como se define en las
reivindicaciones, la presente invención se refiere a un método de
diagnóstico de tumores en un mamífero, que comprende detectar el
nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido
PRO213-1, PRO1330 y/o PRO1449 (a) en una muestra de
prueba de células de tejido obtenidas del mamífero, y (b) en una
muestra de control de células de tejido normales conocidas del mismo
tipo de células, donde un nivel de expresión más elevado en la
muestra de prueba indica la presencia de un tumor en el mamífero
del que se obtuvieron las células de tejido de prueba.
En otra realización, tal como se define en las
reivindicaciones, la presente invención se refiere a un método de
diagnóstico de tumores en un mamífero, que comprende (a) poner en
contacto un anticuerpo
anti-PRO213-1,
anti-PRO1330 y/o anti-PRO1449 con
una muestra de prueba de células de tejido obtenidas del mamífero, y
(b) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo
anti-PRO213-1,
anti-PRO1330 y/o anti-PRO1449 y el
polipéptido PRO213-1, PRO1330 y/o PRO1449 en la
muestra de prueba. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa
y se puede realizar en comparación con la monitorización de la
formación de complejo en una muestra de control de células de
tejido normales conocidas del mismo tipo de célula. Una mayor
cantidad de complejos formador en la muestra de prueba indica la
presencia de un tumor en el mamífero del que se obtuvieron las
células de tejido de prueba. El anticuerpo preferiblemente
transporta un marcador detectable. La formación del complejo se
puede monitorizar, por ejemplo, mediante microscopía de luz,
citometría de flujo, fluorimetría u otras técnicas conocidas en el
sector. La muestra de prueba se obtiene habitualmente de un
individuo sospechoso de sufrir un crecimiento o proliferación de
células neoplásicas (por ejemplo, células cancerosas).
En otra realización, tal como se define en las
reivindicaciones, la presente invención se refiere a un kit de
diagnóstico del cáncer, que comprende un anticuerpo
anti-PRO213-1,
anti-PRO1330 y/o anti-PRO1449 y un
portador (por ejemplo, un tampón) en un envase adecuado. El kit
contiene preferiblemente las instrucciones para el uso del
anticuerpo para detectar el polipéptido PRO213-1,
PRO1330 y/o PRO1449.
\newpage
En otras realizaciones de la presente invención,
l invención proporciona vectores que comprende ADN que codifica
cualquiera de los polipéptidos descritos anterior o posteriormente.
También se proporciona una célula huésped que comprende cualquiera
de dichos vectores. A modo de ejemplo, las células huésped pueden
ser células CHO, E. coli o levadura. También se proporciona
un proceso para la producción de cualquiera de los polipéptidos
descritos anterior o posteriormente y comprende cultivar células
huésped en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido
deseado y recuperar el polipéptido deseado del cultivo celular.
En otras realizaciones, la presente invención
proporciona moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los
polipéptidos descritos anterior o posteriormente fusionados a un
polipéptido o secuencia de aminoácidos heterólogos. Un ejemplo de
dicha molécula quimérica comprende cualquiera de los polipéptidos
descritos anterior o posteriormente fusionados a una secuencia de
epítopo etiqueta o una región Fc de una inmunoglobulina.
En otra realización, la presente invención
proporciona un anticuerpo que se une específicamente a cualquiera
de los polipéptidos descritos anterior o posteriormente.
Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
La figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos
de un ADNc de PRO213-1 de secuencia nativa, que es
un clon designado en la presente invención como
"DNA30943-1-1163-1".
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
derivada de la secuencia codificante mostrada en la figura 1.
La figura 3 muestra una secuencia de nucleótidos
de un ADNc de PRO1330 de secuencia nativa, que es un clon designado
en la presente invención como
"DNA64907-1163-1".
La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos
derivada de la secuencia codificante mostrada en la figura 3.
La figura 5 muestra una secuencia de nucleótidos
de un ADNc de PRO1449 de secuencia nativa, que es un clon designado
en la presente invención como
"DNA64908-1163-1".
La figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos
derivada de la secuencia codificante mostrada en la figura 5.
Los términos "polipéptido PRO" y
"PRO", tal como se usan aquí, y cuando van seguidos
inmediatamente por una designación numérica se refieren a varios
polipéptidos, en donde la designación completa (es decir,
PRO/número) se refiere a secuencias polipeptídicas específicas como
se describe aquí. Los términos "PRO/número polipéptido" y
"PRO número" tal como se usan aquí comprenden secuencias
polipeptídicas nativas y variantes polipeptídicas (que se definen
con más en profundidad más adelante). Los polipéptidos PRO descritos
aquí pueden aislarse de una variedad de fuentes, tales como tejidos
humanos o de otra fuente o preparados mediante métodos de
recombinación o sintéticos.
Una "polipéptido PRO de secuencia nativa"
comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de
aminoácidos que el correspondiente polipéptido PRO natural. Dichos
polipéptidos PRO de secuencia nativa pueden aislarse de la
naturaleza o pueden producirse mediante métodos recombinantes o
sintéticos. El término "polipéptido PRO de secuencia nativa"
comprende específicamente las formas truncadas o secretadas
naturales del polipéptido PRO específico (por ejemplo, una
secuencia de un dominio extracelular), formas variantes naturales
(por ejemplo, formas procedentes de ayuste ("splice")
alternativo) y variantes alélicas del polipéptido naturales.
El "dominio extracelular" del polipéptido
PRO o "ECD" se refiere a una forma del polipéptido PRO que
esencialmente está libre de los dominios transmembrana y
citoplasmático. Ordinariamente, un ECD de un polipéptido PRO tendrá
menos de un 1% de dichos dominios transmembrana y/o citoplasmáticos
y preferentemente, tendrá menos de un 0,5% de dichos dominios.
Deberá entenderse que cualquier dominio transmembrana identificado
para los polipéptidos PRO de la presente invención se identifican
según lo acordado con el criterio rutinariamente empleado en la
materia para identificar ese tipo de dominio hidrofóbico. Los
límites exactos de un dominio transmembrana pueden variar pero no
más de alrededor de 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio
como inicialmente se identificó. Opcionalmente, por tanto, un
dominio extracelular de un polipéptido PRO puede contener alrededor
de 5 o menos aminoácidos en cada uno de los extremos del dominio
transmembrana como inicialmente se identificó.
"Variante de un polipéptido PRO" significa
un polipéptido PRO activo como se definió anteriormente o más
adelante que tiene al menos un 80% de identidad en la secuencia
aminoacídica con la secuencia nativa completa del polipéptido PRO,
tal como se describe aquí. Dichas variantes de polipéptido PRO
incluyen, por ejemplo, polipéptidos PRO en donde uno o más residuos
aminoacídicos se añaden o eliminan, en el extremo N- o C- terminal
de la secuencia aminoacídica nativa completa. Ordinariamente, una
variante de un polipéptido PRO tendrá al menos un 80% de identidad
de secuencia aminoacídica, preferentemente al menos un 85% de
identidad de secuencia aminoacídica, e incluso más preferiblemente
al menos alrededor de un 90% de identidad de secuencia
aminoacídica, incluso más preferentemente al menos un 91% de
identidad de secuencia aminoacídica, incluso más preferentemente al
menos alrededor de un 93% de identidad de secuencia de aminoácidos,
incluso más preferentemente al menos alrededor de un 94% de
identidad de secuencia de aminoácidos, incluso más preferentemente
al menos alrededor de un 95% de identidad de secuencia de
aminoácidos, todavía más preferentemente al menos alrededor de un
96% de identidad de secuencia de aminoácidos, todavía más
preferentemente al menos alrededor de un 97% de identidad de
secuencia de aminoácidos, todavía más preferentemente al menos
alrededor de un 98% de identidad de la secuencia de aminoácidos, y
más preferentemente al menos alrededor de un 99% de identidad de
secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la
secuencia aminoacídica nativa completa tal y como se describe
aquí.
El "Porcentaje (%) de identidad de secuencia
aminoacídica" con respecto a las secuencias del polipéptido PRO
identificadas aquí, se define como el porcentaje de residuos
aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos a los
residuos de aminoácidos en la secuencia específica del polipéptido
PRO, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si
fuera necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad
de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como
parte de la identidad de secuencia. Se pueden realizar
alineamientos con el objetivo de determinar el porcentaje de
identidad en la secuencia aminoacídica de maneras diversas que
están dentro del ámbito de la materia, por ejemplo, usando programas
disponibles públicamente tales como los programas BLAST,
BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). El programa de
alineamiento preferido es el BLAST. Los expertos en la materia
pueden determinar los parámetros adecuados para medir el
alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para
conseguir el máximo alineamiento a lo largo de la totalidad de las
secuencias que están comparándose. Los valores de % de identidad
usados aquí se han generado con el programa de ordenador
WU-BLAST-2 (Altschul y col., Methods
in Enzymology 266:460-480
(1996);http://blast.wustl/edu/blast/README.html). La mayoría de los
parámetros de búsqueda del
WU-BLAST-2 se ajustan a los valores
por defecto. Los parámetros ajustables se ajustan con los valores
siguientes: tramo de solapamiento=1, fracción de solapamiento=0,125
valor umbral(T)=11 y puntuación de matriz = BLOSUM62. Los
parámetros HSP S y HSP S2, que son valores dinámicos usados por el
BLAST-2, los establece el propio programa
dependiendo de la composición de la secuencia de interés y de la
composición del banco de datos con el que se está comparando la
secuencia. Sin embargo, los valores pueden ajustarse para aumentar
la sensibilidad. Un valor en % de identidad de secuencia se
determina por la fracción de residuos idénticos dividido por el
número total de residuos en la región alineada.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia
nucleotídica" con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos
que codifican PRO e identificadas aquí se define como el porcentaje
de nucleótidos que en una secuencia candidata son idénticos a los
nucleótidos en las secuencia de ácidos nucleicos del PRO de interés,
después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es
necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de
secuencia. Pueden realizarse alineamientos con el propósito de
determinar el porcentaje de identidad de una secuencia nucleica de
diversas maneras, que se hallan dentro del ámbito de la materia, por
ejemplo, usando programas disponibles públicamente como los
programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign
(DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los
parámetros adecuados para medir el alineamiento, incluyendo
cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo alineamiento
a lo largo de la totalidad de las secuencias que están comparándose.
Los valores de identidad usados aquí se generan mediante el módulo
BLASTN del WU-BLAST-2 fijado a los
parámetros por defecto, con tramo de solapamiento y fracción de
solapamiento fijados a 1 y 0,125 respectivamente.
El término "positivos", en el contexto de
la comparación de secuencias realizado tal y como se describe
arriba, incluye residuos en las secuencias comparadas que no son
idénticos pero tienen propiedades similares (por ejemplo, como
resultado de sustituciones conservadoras). El valor de % de
positivos se determina a través de la fracción de residuos que
puntúan un valor positivo en la matriz BLOSUM 62 dividido por el
número total de residuos en la región alineada, tal como se define
anteriormente.
El término epitopo etiquetado se refiere aquí a
un polipéptido quimérico que comprende el polipéptido PRO, o un
dominio de su secuencia, fusionado con un "polipéptido
etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos
para proporcionar un epitopo contra el que se puede generar un
anticuerpo, o que puede ser identificado por algún otro agente,
pero es suficientemente corto como para no interferir en la
actividad del polipéptido PRO de interés. El polipéptido etiqueta
preferentemente es bastante único de forma que el anticuerpo no
reacciona substancialmente de forma cruzada con otros epitopos. Los
polipéptidos etiqueta apropiados generalmente tienen al menos seis
residuos de aminoácidos y usualmente alrededor de entre 8 y 50
residuos aminoacídicos (preferentemente entre 10 y 20
residuos).
"Aislado", cuando se usa para describir
varios polipéptidos usados aquí, significa aquél polipéptido que ha
sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su
entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno
natural son materiales que típicamente interferirían con los usos
diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir
enzimas, hormonas, y otros solutos de naturaleza proteica o no
proteica. En las realizaciones preferidas, el polipéptido será
purificado (1) en un grado suficiente para obtener al menos 15
residuos de la secuencia aminoacídica N-terminal o
interna mediante el uso de un secuenciador de spinning cup,
o(2) a homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo
condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Comassie o,
preferentemente, tinción con plata. El aislamiento del polipéptido
incluye el polipéptido aislado en células recombinantes, en los que
al menos un componente del entorno natural del polipéptido PRO no
estará presente. Habitualmente, sin embargo, el polipéptido aislado
se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
\newpage
Un ácido nucleico que codifica para un
polipéptido PRO "aislado" es una molécula de ácido nucleico
que se identifica y separa de al menos una molécula contaminante de
ácido nucleico con la cual está asociado habitualmente en la fuente
natural del ácido nucleico del polipéptido PRO. Una molécula de
ácido nucleico de un polipéptido PRO aislado es aquella cuya forma
es distinta de la que se encuentra en la naturaleza. Las moléculas
de ácido nucleico para un polipéptido PRO aislado se distinguen, por
tanto, de la molécula de ácido nucleico del polipéptido PRO
específico ya que existe en células naturales. Sin embargo, una
molécula de ácido nucleico para un polipéptido PRO incluye
moléculas de ácido nucleico para el polipéptido PRO contenidas en
las células que ordinariamente expresan el polipéptido PRO en donde,
por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una
localización cromosómica diferente de la de las células
naturales.
El término "secuencias control" hace
referencia a secuencias de DNA necesarias para la expresión de una
secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped
particular. Las secuencias control que son adecuadas para
procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una
secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Las células
eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación e
intensificadores.
El ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando está situado en una relación funcional
con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el DNA para una
presecuencia o un líder secretor está unido operativamente al DNA
correspondiente a un polipéptido si se expresa como una preproteína
que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un
intensificador está unido operativamente a una secuencia codificante
si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión
al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante
si está situado de manera que facilite la traducción. Generalmente
"unido operativamente" significa que las secuencias de DNA que
están unidas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor,
contiguo y en la misma pauta de lectura. Sin embargo, los
intensificadores no tienen porqué ser contiguos. La unión se
consigue mediante ligación en dianas de restricción adecuadas. Si
tales dianas no existen, se usan adaptadores o engarces de
oligonucleótidos sintéticos según prácticas convencionales.
El término "anticuerpo" se usa en el
sentido más amplio de la palabra y abarca específicamente
anticuerpos monoclonales contra un solo polipéptido PRO (incluyendo
agonistas, antagonistas y anticuerpos de neutralización) y
composiciones de anticuerpos anti-polipéptido PRO
con especificidad poliepitópica. El término "anticuerpo
monoclonal" tal y como se usa aquí se refiere a un anticuerpo
obtenido de una población de anticuerpos substancialmente
homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la
población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales
que puedan estar presentes en cantidades inferiores.
"Activo" o "actividad" para los
objetivos de esta invención se refiere a forma(s) del
polipéptido PRO que retienen la actividad biológica y/o
inmunológica del polipéptido PRO nativo o natural.
"Tratamiento" se refiere tanto al
tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o
preventivas. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen los que
ya presentan el trastorno, como los propensos a padecerlo.
"Mamífero" para los propósitos de
tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero,
incluyendo humanos, animales domésticos, de granja y del zoo, de
competición deportiva o mascotas tales como ovejas, perros,
caballos, gatos, vacas, y similar. Preferentemente, el mamífero aquí
es un humano.
"Vehículos", tal y como se usa aquí,
incluye los vehículos, excipientes o estabilizantes
farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o el
mamífero que se está exponiendo al mismo a las dosis y
concentraciones empleadas. A menudo, el vehículo fisiológicamente
aceptable es una solución acuosa tamponada. Entre los ejemplos de
vehículos fisiológicamente aceptables se incluyen tampones como el
fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo
ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10
residuos); proteínas, como albúmina sérica, gelatina o
inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como la
polivinilpirrolidona; aminoácidos como la glicina, la glutamina, la
asparraguina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y
otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas;
agentes quelantes como el EDTA; alcoholes de azúcares como el
manitol o el sorbitol; iones que forman sales como el sodio; y /o
tensoactivos no iónicos como el TWEEN,^{TM} el polietilénglicol
(PEG) y el PLURONICS^{TM}.
El término "agonista" se usa para referirse
a análogos peptídicos y no peptídicos de los polipéptidos PRO
nativos (en donde polipéptido PRO nativo se refiere a un
pro-polipéptido PRO, un
pre-polipéptido PRO, un
prepro-polipéptido PRO o un polipéptido PRO maduro)
de la presente invención y a los anticuerpos que específicamente se
unen a dichos polipéptidos PRO nativos; debido a que retienen al
menos una actividad biológica de un polipéptido PRO nativo.
Preferentemente, los agonistas de la presente invención retienen las
propiedades cualitativas de reconocimiento de unión y las
propiedades de activación del receptor del polipéptido PRO
nativo.
El término "antagonista" se usa aquí para
referirse a una molécula que inhibe una actividad biológica de un
polipéptido PRO nativo de la presente invención en donde el
polipéptido PRO nativo se refiere a un
pro-polipéptido PRO, un
pre-polipéptido PRO, un
prepro-polipéptido PRO o un polipéptido PRO maduro.
Preferentemente, los antagonistas aquí inhiben la unión de un
polipéptido PRO nativo de la presente invención a una pareja de
unión. Un "antagonista" del polipéptido PRO es una molécula
que previene, o interfiere con, una función efectora antagonista PRO
(por ejemplo, una molécula que previene o interfiere con la unión
y/o activación del polipéptido PRO a un receptor del polipéptido
PRO.). Dichas moléculas pueden ser cribadas por su capacidad para
inhibir competitivamente la activación del receptor del polipéptido
PRO mediante la monitorización de la unión de un polipéptido PRO
nativo en presencia y ausencia de la molécula antagonista a
analizar. Un antagonista de la invención incluye también un
polinucleótido antisentido contra el gen del polipéptido PRO,
polinucleótido antisentido que bloquea la transcripción o
traducción del gen del polipéptido PRO, de ese modo inhibe su
expresión y su actividad biológica.
La "astringencia" de las reacciones de
hibridación se determina fácilmente por los expertos en la materia
y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de
la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sales. En
general las sondas más largas requieren temperaturas más altas para
que la hibridación sea adecuada, mientras que las sondas más cortas
necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente
depende de la capacidad del DNA desnaturalizado para rehibridarse
cuando las cadenas complementarias están presentes en un entorno
por debajo de sus temperaturas de fusión. Cuanto mayor es el grado
de homología deseado entre la sonda y la secuencia a hibridar,
mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado,
se deriva que temperaturas relativas más altas tenderían a hacer las
condiciones de reacción más astringentes, mientras que temperaturas
más bajas lo serían menos. Para detalles y explicaciones sobre la
astringencia de las reacciones de hibridacion véase Ausubel y col.,
Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience
Publishers, (1995).
"Condiciones de astringencia" significa (1)
emplear fuerzas iónicas bajas y temperaturas altas para el lavado,
por ejemplo cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/ dodecil
sulfato sódico 0,1% a 50ºC, o (2) emplear un agente
desnaturalizante durante la hibridación, como por ejemplo formamida
al 50% (vol/vol) con albúmina sérica bovina al 0,1%/Ficoll al
0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/ tampón de fosfato sódico 50 nM a
pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC. Otro
ejemplo es usar formamida al 50%, 5X de SSC (NaCl 0,75 M, citrato
sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6/8), pirofosfato sódico
al 0,1%, solución Denhart 5X, DNA de esperma de salmón sonicado (50
\mug/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC en SSC
2X y SDS al 0,1%. Otro ejemplo más de hibridación usa un tampón de
sulfato de dextrano al 10%, SSC 2X (cloruro sódico/citrato sódico)
y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado a alta astringencia
que consiste en SSC 0,1X conteniendo EDTA a 55ºC.
"Condiciones moderadamente astringentes" se
describen en Sambrook y col., supra, e incluye el uso de una
solución de lavado y de condiciones de hibridación (por ejemplo,
temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos astringentes que las
descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente
astringentes es una incubación durante la noche a 37ºC en una
solución compuesta por: formamida al 20%, SSC 5X (150 mM de NaCl,
15 mM de citrato trisódico), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución
Denhart 5X, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/ml de DNA de esperma
de salmón fragmentado y desnaturalizado, seguido de un lavado de los
filtros en SSC 1X a aproximadamente 37-50ºC. El
personal capacitado reconocerá como ajustar la temperatura, la
fuerza iónica, etc., como sea necesario para adaptarse a factores
como la longitud de la sonda y similares.
El "análisis de Southern" o la
"transferencia de Southern" es un método por el cual la
presencia de secuencias de DNA en un DNA digerido con enzimas de
restricción o una composición que contenga DNA se confirma por
hibridación a un oligonucleótido marcado o a un fragmento de DNA
conocidos. El análisis de Southern implica habitualmente la
separación electroforética del DNA digerido en geles de agarosa, la
desnaturalización del DNA después de la separación electroforética
y la transferencia del DNA a un soporte de membrana de
nitrocelulosa, nylon o cualquier otro soporte adecuado para el
análisis con una sonda marcada radioactivamente, biotinilada o
marcada enzimáticamente como se describe en las secciones
9.37-9.52 de Sambrook y col., Molecular Cloning: A
laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989).
El "análisis de Northern" o la
"transferencia de Northern" es un método usado para identificar
secuencias de RNA que hibridan a una sonda conocida como un
oligonucleótido, un fragmento de DNA, un fragmento de su cDNA o un
fragmento de RNA. La sonda se marca con un radioisótopo como
P^{32}, o por biotinilización o enzimáticamente. El RNA que va a
analizarse habitualmente se separa electroforéticamente en gel de
agarosa o poliacrilamida, transferido a una membrana de
nitrocelulosa, nylon, o cualquier otra membrana adecuada, e
hibridada con la sonda, usando técnicas estándar bien conocidas en
el área como las descritas en las secciones
7.39-7.52 de Sambrook y col., supra.
Tal y como se usa aquí, el término
"inmunoadhesina" designa moléculas tipo anticuerpo que combinan
la unión específica a una proteína heteróloga (una "adhesina")
con las funciones efectoras de los dominios constantes de una
inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden
una fusión entre una secuencia aminoacídica con la especificidad de
unión deseada que no es otra que los sitios de reconocimiento del
antígeno y el sitio de unión de un anticuerpo (es decir, es
"heteróloga"), y la secuencia de un dominio constante de
inmunoglobulina. La región adhesina de una molécula de
inmunoadhesina típicamente es una secuencia aminoacídica contigua
que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un
ligando. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en
la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier
inmunoglobulina como los subtipos IgG-1,
IgG-2, IgG-3, o
IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e
IgA-2), IgE, IgD o IgM.
El término administración "crónica" se
refiere a la administración del agente(s) de modo continuo
contrariamente a un modo agudo, para mantener el efecto terapéutico
inicial (actividad) durante un periodo de tiempo prolongado.
Administración "intermitente" es aquel tratamiento que no se
realiza consecutivamente sin interrupción, sino que tiene una
naturaleza cíclica.
\newpage
La administración "en combinación con" uno
o más agentes terapéuticos incluye la administración simultánea
(concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
El término "vector de expresión" se usa
para definir un vector, en el cual un ácido nucleico que codifica
para el polipéptido PRO está unido operativamente a secuencias
control capaces de afectar su expresión en una célula huésped
adecuada. Los vectores habitualmente llevan un sitio de replicación
(aunque éste no es necesario si se produce integración
cromosómica). Los vectores de expresión también incluyen secuencias
marcadoras que son capaces de proporcionar una selección fenotípica
en las células transformadas. Por ejemplo E. coli
típicamente se transforma con PBR322, un plásmido derivado de una
especie de E. coli (Bolivar, y col., Gene
2:95[1977]). El PBR322 contiene genes que codifican para
resistencia a ampicilina y tetraciclina y por tanto proporciona un
método sencillo para identificar las células transformadas para
objetivos de clonaje o expresión. Los vectores de expresión
óptimamente también contendrán secuencias útiles para el control de
la transcripción y la traducción, por ejemplo, promotores y
secuencias Shine-Dalgarno (para procariotas) o
promotores e intensificadores (para células mamíferas). Los
promotores pueden ser, pero no necesariamente, inducibles; incluso
promotores fuertes constitutivos como el promotor del CMV para
huéspedes mamíferos se ha observado que produce el LHR sin
toxicidad para la célula huésped. Aunque es posible que los vectores
de expresión no necesiten contener ningún control de expresión,
secuencias replicativas o genes de selección, su ausencia puede
dificultar la identificación de transformantes híbridos y el logro
de niveles de expresión elevados de la inmunoglobulina híbrida.
El término "lipopolisacárido" o "LPS"
se usa aquí como sinónimo de endotoxina. Los lipopolisacáridos
(LPS) son componentes característicos de la membrana externa de
bacterias Gram-negativas,por ejemplo, Escherichia
coli. Consisten en una parte de polisacárido y una lipídica
denominada lípido A. El polisacárido, que varía de una especie
bacteriana a otra, está compuesto por una cadena específica O
(constituida a base de unidades repetidas de tres a ocho azúcares)
y el núcleo de dos partes. El lípido A virtualmente siempre incluye
dos azúcares de glucosamina modificados por un fosfato y un número
variable de ácidos grasos. Para más información véase, por ejemplo,
Rietschel and Brade, Scientific American Agosto
1992,54-61.
El término "choque séptico" se usa aquí en
el sentido más amplio, incluyendo algunas definiciones descritas en
Bone, Ann. Intern. Med. 114, 332-333 (1991).
Específicamente, el choque séptico comienza con una respuesta
sistémica a la infección, un síndrome llamado sepsis. Cuando este
síndrome resulta en hipotensión y disfunción orgánica, se denomina
choque séptico. El choque séptico puede ser iniciado por organismos
Gram-positivos y hongos, así como por organismos
Gram-negativos que contengan endotoxina. Por
consiguiente, la definición indicada no se limita al "choque por
endotoxina".
Las frases "amplificación génica" y
"duplicación génica" son intercambiables y se refieren a un
proceso por el cual en una célula o línea celular particular se
forman múltiples copias de un gen o de fragmentos de un gen. La
región duplicada (un tramo de DNA amplificado) se denomina
frecuentemente como "amplicón". Habitualmente la cantidad de
RNA mensajero (mRNA) producido, es decir, el nivel de expresión
génica, también aumenta en proporción con el número de copias
hechas del gen particular expresado.
"Tumor" tal y como se usa aquí, se refiere
a todo crecimiento y proliferación celular neoplásico, tanto
maligno o benigno, y a todas las células y tejidos
pre-cancerosos y cancerosos. Los términos
"cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la
condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente
por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer
incluyen, aunque no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma,
sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de dichos cánceres
incluyen el cáncer de mama, de próstata, de colon, el carcinoma de
las células espinales, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el
cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer
gastrointestinal, el cáncer de páncreas, el glioblastoma, el cáncer
de cérvix, el cáncer de ovarios, el cáncer hepático, el cáncer de
vejiga, el hepatoma, el cáncer colorectal, el carcinoma de
endometrio, el carcinoma de glándulas salivares, el cáncer de riñón,
el cáncer de vulva, el cáncer de tiroides, el carcinoma hepático, y
varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.
El término "agente citotóxico" tal y como
se usa aquí se refiere a una substancia que inhibe o previene la
función de las células y/o que causa destrucción celular. El término
incluye isótopos radioactivos (por ejemplo, I^{131}, I^{125},
Y^{90}, y Re^{186}), agentes quimioterapéuticos, y toxinas como
toxinas activas enzimáticamente de origen bacteriano, fúngico, de
plantas o animales, o sus fragmentos.
Un "agente quimioterapéutico" es un
compuesto químico útil para el tratamiento del cáncer. Entre los
ejemplos de agentes quimioterapéuticos se incluyen adriamicina,
doxorrubicina, epirrubicina, 5-fluorouracil,
arabinósido de citosina ("Ara-C"),
ciclofosfamida, tiotepa, busulfan, taxoides, por ejemplo, paclitaxel
(Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton,
NJ) y doxetaxel (Taxotere®, Rhone-Poulenc Rorer,
Antony, France), taxotere, metotrexato, cisplatino, melfalan,
vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosmamida, mitomicina C,
mitoxantrone, vincristina, vinorelbina, carboplatino, tenipósido,
daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina,
mitomicinas, esperamicinas (véase patente americana US 4.675.187),
melfalan y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. También se
incluyen en esta definición agentes hormonales que regulan o inhiben
la acción de hormonas sobre tumores como tamoxifeno y
onapristona.
Un "agente inhibidor del crecimiento"
cuando se usa aquí se refiere a un compuesto o composición que
inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula
cancerosa que sobreexprese cualquiera de los genes identificados
aquí, tanto in vitro como in vivo. Por tanto, el
agente inhibidor del crecimiento es aquel que reduce
significativamente el porcentaje de células que sobreexpresan dichos
genes en fase S. Entre los ejemplos de inhibidores del crecimiento
se incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo (en otra
fase distinta de la fase S), como aquellos agentes que inducen la
quiescencia celular en fase G1 y M. Entre los agentes que
clásicamente bloquean la fase M se incluyen las vincas (vincristina
y vinblastina), el taxol, e inhibidores de la topo II como la
doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido, y
bleomicina. Aquellos agentes que producen quiescéncia en G1 también
producen quiescencia en fase S, por ejemplo agentes alquilantes del
DNA como tamoxifeno,prednisona, dacarbazida, mecloretamina,
cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y
ara-C. Puede encontrarse información adicional en
The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo
1, titulado "Cell cycle regulation, oncogens and antineoplastic
drugs " por Murakami y col. (WB Saunders: Philadelphia, 1995),
especialmente pag 13.
La "doxorrubicina" es un antibiótico
antraciclina.
El término "citoquina" es un término
genérico para proteínas liberadas por una población celular que
actúa sobre otras células como mediadores intercelulares. Entre los
ejemplos de citoquinas están las linfoquinas, las monoquinas, y las
hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citoquinas se
incluyen hormonas de crecimiento como la hormona del crecimiento
humana, la hormona del crecimiento humana
N-metionil, la hormona del crecimiento bovina, la
hormona paratiroidea, la tiroxina, la insulina, la proinsulina, la
relaxina, la prorelaxina y similares. Tal y como se usa aquí el
término citoquina incluye proteínas de origen natural u obtenidas a
partir de cultivos celulares recombinantes con una actividad
biológica equivalente a las de las citoquinas nativas.
La "reactividad cruzada inmunológica", tal
como se utiliza en la presente invención, significa que el
polipéptido candidato es capaz de inhibir de manera competitiva la
actividad biológica cuantitativa de un polipéptido
PRO213-1, PRO1330 o PRO1449 que poseen esta
actividad con antisueros policlonales desarrollados contra el
polipéptido PRO213-1, PRO1330 o PRO1449 activo
conocido. Dichos antisueros se pueden preparar de manera
convencional mediante la inyección a cabras o conejos, por ejemplo,
de manera simultánea con el análogo activo conocido en adyuvante de
Freund completo, seguido a continuación de inyección intraperitoneal
o subcutánea de refuerzo en adyuvante de Freund incompleto. La
reactividad cruzada inmunológica es preferiblemente
"específica", lo que significa que la afinidad de unión de la
molécula de la reacción cruzada inmunológica (por ejemplo,
anticuerpo) identificada al correspondiente polipéptido
PRO213-1, PRO1330 o PRO1449 es significativamente
superior (preferiblemente por lo menos aproximadamente 2 veces, más
preferiblemente por lo menos aproximadamente 4 veces, incluso más
preferiblemente por lo menos aproximadamente 6 veces, aún más
preferiblemente por lo menos aproximadamente 8 veces superior) que
la afinidad de unión de esa molécula con cualquier otro polipéptido
nativo conocido.
"Anticuerpos nativos" e "inmunoglobulinas
nativas" son glicoproteínas heterotetraméricas de alrededor de
150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y
dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a
una cadena pesada mediante un enlace covalente disulfuro, mientras
el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de
diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y
ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados
regularmente. Cada cadena pesada tiene en su extremo un dominio
variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada
cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un
dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la
cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena
pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con
dominio variable de la cadena pesada. Se considera que los residuos
aminoacídicos particulares forman una superficie entre los dominios
variables de las cadenas ligera y pesada.
El término "variable" se refiere al hecho
de que ciertas porciones de los dominios variables difieren
extensamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y
en la especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno.
Sin embargo, la variabilidad no está distribuida regularmente por
todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en 3
segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad
(CDRs) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de
la cadena ligera y la cadena pesada. Las regiones de los dominios
variables más altamente conservadas se denominan regiones de
entramado (FR). Cada uno de los dominios variables de las cadenas
ligera y pesada nativas comprende cuatro regiones FR, que adoptan
una configuración de hoja beta, conectadas por 3 CDRs, los cuales
forman bucles de conexión, y en algunos casos forman parte de la
estructura hoja beta. Los 3 CDRs en cada cadena están unidos en
proximidad con las regiones FR y, con los CDRs de la otra cadena,
contribuyen a la formación del sitio de unión del antígeno de los
anticuerpos (véase Kabat y col, NIH Publ. Nº91-3242,
Vol I páginas 647-669 (1991)). Los dominios
constantes no están implicados directamente en la unión del
anticuerpo al antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras,
como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular
dependiente del anticuerpo.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden
fracciones de un anticuerpo intacto, preferentemente las regiones
de unión al antígeno o las región variables del anticuerpo intacto.
Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen los
fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; anticuerpos
biespecíficos, anticuerpos lineales (Zapata y col., Protein Eng.
8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de
anticuerpos de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos
formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
La digestión con papaína de los anticuerpos
produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, llamados
fragmentos "Fab", cada uno con un sitio simple de unión a
antígeno, y un fragmento residual "Fc", una designación que
refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con
pepsina da lugar a un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios
de combinación de antígeno y que todavía es capaz de unirse al
antígeno.
El fragmento "Fv" es el fragmento mínimo
que contiene un sitio de reconocimiento del antígeno y de unión
completa. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable
de cadena pesada y otro de cadena ligera en estrecha asociación no
covalente. Es en esta configuración que las tres CDRs de cada
dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión
antígeno-anticuerpo en la superficie del dímero
VH-VL. Colectivamente, las seis CDRs confieren la
especificidad de unión del anticuerpo al antígeno. Sin embargo,
incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende
solo tres CDRs específicas para un antígeno) tienen la capacidad de
reconocer y unirse al antígeno, aunque con menor afinidad que el
sitio de unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1)
de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos
Fab' por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo
del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas
de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la
designación usada aquí para Fab' en el cual el/los residuo(s)
de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre.
Los fragmentos F(ab')2 de un anticuerpo originalmente se
produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas
bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos
químicos de fragmentos de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden
asignarse a uno de los dos tipos claramente diferenciados, llamados
kappa y lambda, basados en las secuencias aminoacídicas de sus
dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia aminoacídica del
dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas
pueden asignarse a diferentes clases. Hay 5 clases fundamentales de
inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de ellas
pueden ser divididas en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena
simple" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del
anticuerpo, en donde dichos dominios se presentan en una cadena
polipeptídica simple. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende
además un engarce polipeptídico entre los dominios VH y VL que
permite al sFv formar la estructura deseada para la unión del
antígeno. Para una revisión sobre sFv, véase Pluckthun en The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore
eds., Springer-Verlag, New York, pp
269-315 (1994).
El término "anticuerpos biespecíficos" se
refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión
del antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de
cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera
(VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL).
Mediante el uso de un engarce demasiado corto para permitir la
unión entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios están
forzados a unirse con los dominios complementarios de otras cadenas
y crear dos sitios de unión de antígeno. Los anticuerpos
biespecíficos se describen en mayor profundidad en, por ejemplo, la
patente europea 404.097; la patente mundial WO93/11161; y Hollinger
y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448
(1993).
Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha
sido identificado y separado o recuperado a partir de un componente
de su entorno natural. Son componentes contaminantes de su entorno
natural materiales que interferirían en el uso diagnóstico o
terapéutico del anticuerpo, y puede incluir enzimas, hormonas, y
otros solutos de naturaleza proteica o no proteica. En
realizaciones preferentes, el anticuerpo podrá ser purificado (1) a
más de un 95% en peso de anticuerpo determinado por el método de
Lowry, y más preferentemente a más del 99% en peso, (2) a un grado
suficiente para obtener al menos 15 residuos del extremo
N-terminal o de la secuencia aminoacídica interna
mediante el uso de un secuenciador de spinning cup o, (3) a
homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones
reductoras o no reductoras usando azul de Comassie o,
preferentemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye
el anticuerpo localizado dentro de las células recombinantes en el
que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no
estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado
se preparará mediante una etapa de purificación
La palabra "marca" cuando se usa aquí se
refiere a un compuesto o composición detectable que está conjugado
directa o indirectamente con el anticuerpo para generar un
anticuerpo "marcado". El marcaje puede detectarse por sí mismo
(por ejemplo, marcajes radioactivos o fluorescentes) o, en el caso
del marcaje enzimático, puede catalizar una alteración química de
un compuesto o composición substrato que es detectable.
Como "fase sólida" se entiende una matriz
no acuosa a la cual puede adherirse el anticuerpo de la presente
invención. Los ejemplos de fases sólidas incluyen aquellos formados
parcialmente o en su totalidad por vidrio (por ejemplo, vidrio de
poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa),
poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En
ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida
puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una
purificación por columna (por ejemplo, una columna de cromatografía
de afinidad). Este término incluye también una fase sólida
discontinua de partículas discretas, como las descritas en la
patente americana U.S. 4.275.149.
Un "liposoma" es una pequeña vesícula
compuesta por varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos
que es útil para la liberación de un fármaco a un mamífero. Los
componentes del liposoma se disponen comúnmente en formación de
bicapa, similar a la disposición de las membranas biológicas.
La presente invención proporciona secuencias de
nucleótidos recientemente identificadas y aisladas que codifican
para polipéptidos denominados en la presente solicitud como
PRO213-1, PRO1330 y/o PRO1449. En particular, se
han identificado y aislado el cDNA que codifica para un polipéptido
PRO213-1, PRO1330 y/o PRO1449, tal como se describe
en mayor detalle en los ejemplos mostrados más adelante. Cabe
indicar que a las proteínas producidas en rondas de expresión
separadas se les puede otorgar diferentes números PRO, pero el
número UNQ es único para cualquier ADN dado y la proteína
codificada y no cambiará. Sin embargo, por simplicidad, en la
presente memoria, las proteínas codificadas por
DNA30943-1-1163-1,
DNA64907-1163-1 y
DNA64908-11-1, así como homólogos y
variantes nativos adicionales incluidos en la definición anterior de
PRO213-1, PRO1330 y/o PRO1449 se referirán como
"PRO213-1, PRO1330 y/o PRO1449",
independientemente de su origen o modo de preparación.
Además del la secuencia nativa completa de los
polipéptidos PRO descritos aquí, se contempla que pueden prepararse
variantes del polipéptido PRO. Las variantes del polipéptido PRO
pueden prepararse mediante la introducción de cambios adecuados en
el DNA del polipéptido PRO, o mediante síntesis del polipéptido PRO
deseado. Los expertos en la materia apreciarán que los cambios
aminoacídicos pueden alterar procesos
post-traduccionales de los polipéptidos PRO, tales
como la modificación del número o la posición de sitios de
glicosilación o la alteración de las características de anclaje a
la membrana.
Las variaciones en la secuencia completa de los
polipéptidos PRO o en varios dominios de los polipéptidos PRO
descritas aquí, pueden realizarse, por ejemplo, usando cualquiera de
las técnicas y pautas sobre mutaciones conservativas y no
conservativas marcadas, por ejemplo, en la patente americana U.S.
5.364.934. Las variaciones pueden ser sustituciones, deleciones, o
inserciones de un o más codones que codifican para el polipéptido
PRO que resulten en un cambio de secuencia aminoacídica del
polipéptido PRO comparado con la secuencia nativa del polipéptido
PRO. Opcionalmente, la variación es por sustitución de al menos un
aminoácido por otro aminoácido en un o más dominios del polipéptido
PRO. La pauta para determinar qué residuo aminoacídico puede ser
insertado, sustituido, o delecionado sin afectar adversamente la
actividad deseada puede encontrarse comparando la secuencia del
polipéptido PRO con la de moléculas proteicas homólogas conocidas y
minimizando el número de cambios en la secuencia aminoacídica en
regiones con alta homología. Las sustituciones aminoacídicas pueden
ser el resultado de reemplazar un aminoácido por otro que muestre
similitud estructural y/o de propiedades químicas, como la
sustitución de una leucina por una serina, es decir, sustituciones
conservativas. Las inserciones o deleciones opcionalmente pueden
estar en el rango de 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede
determinarse haciendo inserciones, deleciones o sustituciones de
aminoácidos en la secuencia sistemáticamente, y analizando las
variaciones de actividad resultantes en el ensayo in
vitro descrito más adelante en los Ejemplos.
En realizaciones particulares, las sustituciones
conservativas de interés se muestran en la Tabla 1 bajo el título
de sustituciones preferentes. Si tales sustituciones resultan en un
cambio en la actividad biológica, entonces se introducen cambios
más substanciales, denominados en la Tabla 1 sustituciones
ejemplares, o como se describe más abajo en referencia a clase de
aminoácidos, y se analizarán los productos.
Se llevan a cabo modificaciones substanciales en
la función o en la identidad inmunológica del polipéptido PRO
mediante la selección de sustituciones que difieren
significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura del
esqueleto del polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo,
con una conformación de hélice u hoja, (b) la carga de
hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de
la cadena lateral. Los residuos que se producen de forma natural se
dividen en grupos basados en propiedades comunes de la cadena
lateral:
(1) hidrofóbico: norleucina, met, ala,
val,leu,ile;
(2) hidrofílico neutro: cys,ser,thr:
(3) acídico: asp,glu;
(4) básico: asn,gln,his,lys,arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de
la cadena: gly,pro; y
(6) aromáticos: trp,tyr,phe.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sustituciones no conservativas implicarán el
cambio de un miembro de estas clases por otro de otra clase. Tales
residuos sustituidos pueden introducirse en los sitios de
sustitución conservativos, o más preferentemente, en los sitios
remanentes (no conservativos).
Las variaciones pueden realizarse usando métodos
conocidos en el área tales como la mutagénesis mediada por
oligonucleótidos (dirigida), el rastreo de alanina y la mutagénesis
por PCR. La mutagénesis dirigida [Carter y col., Nucl. Acids Res.,
13:4331 (1986); Zoller y col., Nucl. Acids Res.,10:6487 (1987)], la
mutagénesis de casete [Wells y col., Gene, 34: 315(1985)],
la mutagénesis de selección por restricción [Wells y col., Philos.
Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas
conocidas pueden ser utilizadas sobre el DNA clonado para producir
la variante de DNA del polipéptido PRO deseado.
El análisis de rastreo de aminoácidos puede
emplearse también para identificar un o más aminoácidos a lo largo
de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos preferidos para el
rastreo están los aminoácidos neutros, relativamente pequeños.
Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La
alanina es uno de los aminoácido de rastreo preferidos entre este
grupo ya que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y
es menos probable que altere la conformación de la cadena principal
en la variante. También se prefiere habitualmente la alanina porque
es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente
tanto en posiciones escondidas como en las expuestas [Creghton, The
Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol.,
150: 1 (1976)]. Si la sustitución por alanina no rinde suficiente
cantidad de variante, se puede utilizar un aminoácido
isotérico.
Dentro del ámbito de esta invención se incluyen
modificaciones covalentes de los polipéptidos PRO. Un tipo de
modificación covalente incluye la reacción de los residuos de
aminoácidos diana del polipéptido PRO con un agente orgánico
derivatizante que es capaz de reaccionar con cadenas laterales
seleccionadas o con los residuos N- o C- terminales del polipéptido
PRO. La modificación con agentes bifuncionales es útil, por
ejemplo, para la unión del polipéptido PRO a una matriz de soporte
insoluble en agua o a una superficie para purificar anticuerpos
anti-polipéptido PRO y viceversa. Los agentes de
unión comúnmente más usados incluyen, por ejemplo,
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por
ejemplo, ésteres con el ácido 4-azidosalicílico,
imidoésteres homobifuncionales, incluidos disuccinimidil ésteres
tales como el
3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato),
maleimidas bifuncionales como
bis-N-maleimido-1,8-octano
y agentes tales como el
metil-3-[p-azidobenil)-ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la desamidación de
residuos glutaminil y asparaginil a los correspondientes residuos
glutamil y aspartil, respectivamente, la hidroxilación de prolina y
lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos seril o
treonil, la metilación de los grupos \alpha-amino
de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E.
Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.
Freeman & Co., San Francisco, pp 79-86
(1983)],la acetilación de la amina N-terminal y la
amidación de cualquier grupo carboxilo
C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente de los
polipéptidos PRO incluida dentro del ámbito de esta invención
comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del
polipéptido. "La alteración del patrón de glicosilación"
significa aquí, de cara a los objetivos previstos, la eliminación de
un o más grupos carbohidrato que se encuentran en una secuencia
nativa del polipéptido PRO, y/o la adición de un o más sitios de
glicosilación que están presentes en la secuencia del polipéptido
PRO nativa, y/o la alteración del ratio y/o composición de los
residuos de azúcar unidos al sitio(s) de glicosilación.
La adición de sitios de glicosilación al
polipéptido PRO puede conseguirse alterando la secuencia
aminoacídica. Esta alteración puede lograrse, por ejemplo, mediante
la adición de, o la sustitución por, un o más residuos de serinas o
treoninas a la secuencia nativa del polipéptido PRO (para lugares de
O-glicosilación). La secuencia aminoacídica del
polipéptido PRO puede ser alterada opcionalmente a través de cambios
a nivel de DNA, particularmente mutando el DNA que codifica el
polipéptido PRO en bases preseleccionadas de tal modo que los
codones que se generen se traduzcan en los aminoácidos
deseados.
El acoplamiento químico o enzimático de
glicósidos al polipéptido constituye otro mecanismo para incrementar
el número de grupos carbohidrato en el polipéptido del polipéptido
PRO. Estos métodos están descritos en la materia, por ejemplo, en
la patente internacional WO87/05330 publicada el 11 de Septiembre de
1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp 259- 306
(1981).
La eliminación de grupos carbohidrato presentes
en el polipéptido PRO puede conseguirse químicamente o
enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que
codifican para residuos aminoacídicos que sirven como dianas de
glicosilación. Las técnicas de deglicosilación química se conocen
en el área y se describen, por ejemplo, por Hakimuddin y col.,
Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987) y por Edge y col., Anal.
Biochem., 118: 131 (1981). La ruptura enzimática de los grupos
carbohidrato en los polipéptidos puede lograrse usando distintas
endo- y exo-glicosidasas como describe Thotakura y
col., Meth. Enzymol., 138: 350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente de los
polipéptidos PRO de la invención comprende la unión del polipéptido
PRO a uno de los diversos polímeros no proteicos, e.j.
polietilénglicol, polipropilénglicol o
poli-oxialquilenos, tal y como se indica en las
patentes americanas U.S. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144;
4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
Los polipéptidos PRO de la presente invención
pueden ser modificados también para formar una molécula quimérica
que comprenda el polipéptido PRO unido a otro polipéptido heterólogo
o a una secuencia aminoacídica. En una realización tal molécula
quimérica comprende una fusión del polipéptido PRO con un
polipéptido etiqueta que proporciona un epitopo al cual un
anticuerpo anti-etiqueta puede unirse de forma
selectiva. El epitopo etiqueta generalmente se sitúa en el extremo
amino o carboxil del polipéptido PRO. La presencia de dichas formas
epitopo-etiqueta del polipéptido PRO pueden
detectarse usando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta.
También la provisión del epitopo etiqueta permite al polipéptido PRO
estar listo para ser purificado fácilmente por afinidad usando un
anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de
afinidad que se una al epitopo etiqueta. Alternativamente, la
molécula quimera puede comprender una fusión del polipéptido PRO
con una inmunoglobulina o una región particular de una
inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica,
dicha fusión podría ser a la región Fc o a una molécula IgG.
Son bien conocidos en la materia varios
polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Los ejemplos
incluyen etiquetas de poli-histidina
(poli-his) o
poli-histidina-glicina; el
polipéptido etiqueta flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Fleid y col.,
Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la etiqueta
c-myc y sus anticuerpos, el 8F9, el 3C7, el 6E10,el
G4, el B7 y el 9E10 [Evan y col., Molecular and Cellular
Biology,5:3610-3616 (1985)] y la etiqueta de la
glicoproteína D del virus del herpes simple (gD) y su anticuerpo
[Paborsky y col., Protein Engineering, 3(6):
547-553 (1990)]. Otros polipéptidos etiqueta
incluyen el péptido Flag [Hoop y col., Biotechnology, 6:
1204-1210 (1988)]; el péptido del epitopo KT3
[Martin y col., Science, 225:192-194 (1992)]; el
péptido de un epitopo de \alpha-tubulina [Skinner
y col., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)] y el
péptido etiqueta de la proteína 10 del gen T7.
[Lutz-Freyermuth y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87: 6393-9397 (1990).
La descripción indicada más abajo se refiere
principalmente a la producción de polipéptidos PRO mediante el
cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que
contiene el ácido nucleico correspondiente al polipéptido PRO
deseado. Por supuesto, se contempla que se puedan utilizar métodos
alternativos para preparar el polipéptido PRO, bien conocidos en la
materia. Por ejemplo, la secuencia del polipéptido PRO o fracciones
del mismo, pueden producirse mediante síntesis peptídica directa
usando técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo Stewart y col.,
Solid-Phas Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San
Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,
85:2149-2154 (1963)]. La síntesis proteica in
vitro puede realizarse usando técnicas manuales o mediante
automatización. La síntesis automática puede conseguirse, por
ejemplo, usando un Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems
(Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se
pueden sintetizar químicamente varias porciones del polipéptido PRO
deseado separadamente y combinarlas usando métodos químicos o
enzimáticos para producir el polipéptido PRO completo.
El DNA que codifica para el polipéptido PRO
puede obtenerse de una librería de cDNA preparada a partir de un
tejido que se considera que posee el mRNA del polipéptido PRO y que
lo expresa en un nivel detectable. Por consiguiente, el DNA del
polipéptido PRO humano puede ser obtenido adecuadamente a partir de
una librería de cDNA preparada de un tejido humano, tal y como se
describe en los Ejemplos. El gen que codifica para el polipéptido
PRO puede obtenerse también a partir de una librería genómica o
mediante síntesis con oligonucleótidos.
Las librerías pueden ser cribadas con sondas
(como anticuerpos contra el polipéptido PRO deseado u
oligonucleótidos de alrededor de 20-80 bases)
diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína
codificada por el mismo. El cribaje de una librería de cDNA o
genómica con la sonda seleccionada puede realizarse utilizando
procedimientos estándar, como los descritos en Sambrook y col.,
Molecular Cloning: A laboratory Manual (New York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989). Otro medio alternativo para aislar
el gen que codifica para el polipéptido PRO deseado consiste en
usar la metodología del PCR [Sambrook y col., supra:
Dieffenbach y col., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1995)].
Los Ejemplos mostrados más abajo describen
técnicas para el cribaje de librerías de cDNA. Las secuencias de
oligonucleótidos seleccionadas como sondas deben ser de longitud
suficiente y suficientemente específicas como para minimizar falsos
positivos. Preferentemente el oligonucleótido se marca de tal forma
que tras la hibridación al DNA puede ser detectado en la librería
que se está cribando. Los métodos de marcaje son bien conocidos en
el área, e incluye el uso de marcadores radioactivos como ATP
marcado con P^{32}, biotinilización o marcaje enzimático.
Sambrook y col., supra proporciona las condiciones de
hibridación, incluyendo una moderada y alta astringencia.
Las secuencias identificadas mediante dichos
métodos de cribaje de librerías pueden compararse y alinearse con
otras secuencias conocidas depositadas en bancos de datos públicos
disponibles como el GenBank u otros bancos de datos de secuencias
privadas. La identidad de la secuencia (tanto a nivel de aminoácidos
como de nucleótidos) dentro de regiones definidas o a lo largo de
la totalidad de la secuencia puede determinarse mediante el
alineamiento de secuencia usando programas de ordenador como BLAST,
ALIGN, DNAstar e INHERIT que emplean diversos algoritmos para medir
la homología.
El cribaje de librerías seleccionadas de cDNA o
genómicas permite la obtención de ácidos nucleicos que tienen una
secuencia codificante para la proteína usando la secuencia
aminoacídica deducida descrita aquí por primera vez, y si es
necesario, usando procedimientos convencionales de extensión de
cebador como se describe en Sambrook y col., supra, para
detectar precursores e intermediarios en el procesamiento del mRNA
que no han sido inversamente transcritos en cDNA.
Las células huésped se transfectan o transforman
con vectores de expresión o clonaje descritos aquí para la
producción del polipéptido PRO y se cultivan en medio de cultivo
convencional modificado para que sea más apropiado para la
inducción de promotores, la selección de transformantes, o la
amplificación de los genes que codifican para las secuencias
deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medio, temperatura,
pH y demás, pueden ser seleccionados por el experto en la materia.
En general, los principios, protocolos, y técnicas prácticas, para
maximizar la productividad de las células pueden encontrarse en
Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Aproach, M Butler, ed
(IRL Press, 1991) y Sambrook y col., supra.
Los métodos de transfección son conocidos por el
experto en la materia, por ejemplo, el método del CaPO_{4} y la
electroporación. La transformación se realiza usando técnicas
estándar apropiadas para las células dependiendo de la célula
huésped utilizada. El tratamiento con calcio empleando cloruro
cálcico, como se describe en Sambrook y col., supra, o la
electroporación, generalmente se usan en procariotas u otras
células que contienen barreras importantes como las paredes
celulares. La infección con Agrobacterium tumefaciens se
utiliza para la transformación de ciertas células de plantas, como
se describe por Shaw y col., Gene,23:315 (1983) y la patente
internacional WO 89/05859 publicada el 29 de Junio de 1989. Para
células mamíferas sin tales paredes celulares, puede emplearse el
método de la precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der
Eb, Virology,52:456-457 (1978). Se han descrito
aspectos generales de las transformaciones de sistemas de célula
huésped de mamífero en la patente americana U.S. 4.399.216. Las
transformaciones en levaduras se llevan a cabo típicamente según el
método de Van Solingen y col., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo,
pueden usarse también otros métodos para introducir DNA en las
células, tales como la microinyección nuclear, la electroporación,
la fusión de protoplastos bacterianos con células intactas o
policationes, por ejemplo, polibrene o poliornitina. Para diversas
técnicas de transformación de células de mamífero, véase Keown y
col., Methods in Enzymology,185:527-537 (1990) y
Mansour y col., Nature,336:348-352 (1988).
Entre las células huésped adecuadas para clonar
o expresar el DNA en vectores se incluyen procariotas, levaduras o
células eucariotas superiores. Entre los procariotas apropiados se
incluyen, aunque no están limitados a ellos, eubacterias, tales
como organismos Gram-negativos o
Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriáceas
como E. coli. Se encuentran disponibles públicamente varias
cepas de E. coli tales como la cepa E. coliK12 MM294
(ATCC 31, 446); E. coliX1776 (ATCC 31, 537); la cepa E.
coli W3110 (ATCC 27,325) y K5 772(ATCC 53,635). Otras
células huésped procariotas adecuadas incluyen Enterobacteriáceas
como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter,
Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo
Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo Serratia
marcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como
B. subtilis y B. Licheniformis (por ejemplo, B.
Licheniformis41P descrito en DD 266,710 publicado el 12 de
Abril de 1989), Pseudomonas tales como P. Aeruginosa,
y Streptomyces. Se encuentran públicamente disponibles
varias cepas de E. coli tales como la cepa E. coliK12
MM294 (ATCC 31, 446); E. coliX1776 (ATCC 31, 537); la cepa
E. coli W3110 (ATCC 27,325) y K5 772(ATCC 53,635).
Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. La cepa W3110
es un huésped particularmente preferido o un huésped parental porque
es una cepa común para la generación de productos de DNA
recombinante. Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades
mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 puede
modificarse para causar una mutación genética en los genes que
codifican para proteínas endógenas del huésped; los ejemplos de
tales huéspedes incluyen la cepa E. coli W3110 1A2, la cual
tiene el genotipo completo tonA; la cepa E. coli
W3110 9E4, que presenta el genotipo completo tonA ptr3; la
cepa E. coli W3110 27C7 (ATCC 55,244) que tiene el genotipo
completo tonA ptr3 ptr3phoA E15
(argF-lac)169 degP ompT kan^{1}; la
cepa E. coli W3110 37D6 que tiene el genotipo completo
tonA ptr3phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT
rbs7 ilvG kan^{1}; la cepa E. coli W3110 40B4 que es
la cepa 37D6 con una mutación por deleción degP no resistente
a kanamicina; y una cepa E. coli que presenta una proteasa
periplásmica mutada descrita en la patente americana U.S. 4.946.783
publicada el 7 de Agosto de 1990. Alternativamente, están
disponibles métodos de clonaje in vitro, por ejemplo, PCR u
otras reacciones de las polimerasas de ácidos nucleicos.
Junto a procariotas, microbios eucariotas tales
como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes adecuados para
clonaje o expresión de vectores que codifican para el polipéptido
PRO. El Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo
huésped eucariota inferior que se usa comúnmente. Otros incluyen
Schizosaccharomyce pombe (Beach y Nurse, Nature, 290:
140[1981]; patente europea EP 139,383 publicado el 2 de Mayo
de 1985); huéspedes Kluyveromyces (patente americana U.S.
4.943.529; Fleer y col., Bio/Technology, 9:968-975
(1991)) tales como, por ejemplo, K lactis
(MW98-8C,CBC683, CBS4574; Louvencort y col., J
Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424) K.
bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178),
K. waltii,(ATCC 56,500), K. drosophilarium (ATCC
36,906; Van den Berg y col., bio/Technology, 8: 135 (1990)), K.
thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (patente europea
EP 402.226); Pichia pastoris (patente europea EP 183.070;
Sreekrishna y col., J. Basic Microbiol.,28: 265-278
[1988]); Candida; Tricoderma reesia (patente europea EP
244.234); Neurospora crassa (Case y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 76:5259-5263[1979]);
Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis
(patente europea EP 394.538 publicado el 31 de Octubre de 1990); y
hongos filamentosos tales como por ejemplo, Neurospora,
Penicillium, Totypocladium (patente internacional WO 91/00357
publicada el 10 de Enero de 1991), y huéspedes Aspergillus
tales como A. nidulans (Ballance y col., Biochem. Biophys.
Res. Commn., 112:284-289 [1983]; Tilburn y col.,
Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton y col., Proc. Natl.
Acad. USA, 81: 1470-1474 [1984] y A. niger
(Kelly y Hynes EMBO J., 4: 475-479 [1985]). Son
adecuadas aquí levaduras metilotroficas e incluyen aunque no se
limitan a ellas, levaduras capaces de crecer en metanol
seleccionadas de los géneros Hansenula, candida, Kloeckera,
Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Puede
encontrarse una lista de especies específicas que son ejemplos de
esta clase de levaduras en C. Anthony, The Biochemistry of
Methylotrophs, 269 (1982).
Las células huésped adecuadas para la expresión
de polipéptidos PRO glicosilados se derivan de organismos
multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen
células de insectos como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como
células de plantas. Entre los ejemplos de líneas celulares huésped
de mamífero se incluyen las células de ovario de hámster chino
(CHO) y las células COS. Ejemplos más específicos incluyen la línea
de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC
CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (293 o células 293
subclonadas para crecer en cultivo en suspensión, Graham y col., J.
Gen. Virol., 36:59 (1977); células de ovario de hámster chino
deficientes en DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather,
Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células humanas
de pulmón (W138,ATCC CCL 75); células humanas de hígado (Hep G2, HB
8065); y células de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC
CCL51). La selección de la célula huésped adecuada se tomar según
el criterio del experto en la materia.
El ácido nucleico (por ejemplo, cDNA o DNA
genómico) que codifica un polipéptido PRO deseado puede ser
insertado en un vector replicable para clonaje (amplificación del
DNA) o para expresión. Varios vectores están disponibles
públicamente. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un
plásmido, un cósmido, una partícula viral, o un fago. La secuencia
del ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante
diversos procedimientos. En general, el DNA se inserta en un
sitio(s) apropiado reconocido por un enzima de restricción
usando técnicas conocidas en la materia. Los componentes de los
vectores generalmente incluyen, aunque no están limitados a ello,
una o más secuencias señal, un origen de replicación, uno o más
genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor, y una
secuencia de finalización de la transcripción. La construcción de
vectores adecuados que contengan uno o más de estos componentes
requiere técnicas de ligación estándar conocidas por el experto en
la materia.
El polipéptido PRO de interés puede producirse
mediante recombinación no sólo directamente, sino también como un
polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual puede
ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un lugar
específico de corte en el extremo N-terminal de la
proteína madura o el polipéptido. En general, la secuencia señal
puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del DNA
del polipéptido PRO que se inserta en el vector. La secuencia señal
puede ser una secuencia señal procariota, por ejemplo, del grupo de
la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, lpp, o líderes de endotoxina
II termoestables. Para la secreción en levaduras la secuencia señal
puede ser por ejemplo, la del líder de invertasa de levadura, el
líder factor alfa (incluidos los líderes de los factores \alpha de
Saccharomyces y Kluyveromyces,este último descrito en la
patente americana U.S. 5.010.182), el líder ácido fosfatasa, la
secuencia líder de la glucoamilasa de C. Albicans (patente
europea EP 362.176 publicada el 4 de Abril de 1990) o la señal
descrita en la patente internacional WO 90/13646 publicada el 15 de
Noviembre de 1990. En la expresión en células de mamífero, pueden
usarse secuencias señal de mamíferos para dirigir la secreción de la
proteína, tales como las secuencias señal de polipéptidos
secretados de la misma especie o de especies relacionadas, así como
líderes secretores virales.
Tanto los vectores de expresión como los de
clonaje contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite al
vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Tales
secuencias son bien conocidas para diversas bacterias, levaduras y
virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para
muchas bacterias Gram-negativas, el origen del
plásmido \mu es adecuado para levaduras, y varios orígenes
virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para
vectores de clonaje en células de mamíferos.
Los vectores de clonaje y expresión contienen
típicamente un gen de selección, también llamado marcador de
selección. Los genes de selección típicos codifican para proteínas
que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, ej.,
ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina (b) complementan
deficiencias auxotróficas, o (c) suplementan nutrientes críticos no
disponibles en un medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica
por la D-alanina racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para células mamíferas son aquellos que permiten la
identificación de células competentes que llevan el ácido nucleico
del polipéptido PRO, como la DHFR o la timidina quinasa. Una célula
huésped apropiada cuando se emplea la DHFR salvaje es la línea
celular CHO deficiente en DHFR, preparada y propagada como se
describe por Urlaub y col., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 77:4216
(1980). El gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7
es un gen de selección adecuado para ser usado en levadura
[Stinchcomb y col., Nature, 282:39 (1979); Kingsman y col., Gene,
7:141 (1979); Tschemper y col., Gene,10:157 (1980)]. El gen
trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa
mutante de levadura a la que le falta la habilidad de crecer en
triptófano, por ejemplo, ATCC Nº 44076 o PEP4-1
[Jones Genetics,85:12 (1977)].
Los vectores de expresión y clonaje
habitualmente contienen un promotor unido operativamente a la
secuencia de ácido nucleico del polipéptido PRO para dirigir la
síntesis del mRNA. Se conocen promotores reconocidos por una
variedad de potenciales células huésped. Los promotores adecuados
para ser usados en huéspedes procariotas incluyen los sistemas de
promotores de la \beta-lactamasa y la lactosa
[Chang y col., Nature, 275:615 (1978); Goeddel y col., Nature,
281:544 (1979)], la fosfatasa alcalina, un sistema de promotor del
triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980);
patente europea EP 36.776], y promotores híbridos como el promotor
tac [deBoer u col., Proc Natl. Acad. Sci. USA,
80:21-25 (1983)]. Los promotores para uso en
sistemas bacterianos también contendrán una secuencia
Shine-Dalgarno (S. D.) unida operativamente al DNA
que codifica por el polipéptido PRO deseado.
Entre los ejemplos de secuencias promotoras
adecuadas para ser usadas en huéspedes de levadura se incluyen los
promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa
[Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas
glicolíticos [Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968);
Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como la enolasa, la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato decarboxilasa, la
fosfofructoquinasa, la
glucosa-6-fosfato isomerasa, la
3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la
triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la
glucoquinasa.
Otros promotores de levaduras, promotores
inducibles con la ventaja adicional de tener la transcripción
controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones
promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la
fosfatasa ácida, las enzimas degradadoras asociadas con el
metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa
y galactosa. En la patente europea EP 73.657 se describen vectores
adecuados y promotores para ser usados en la expresión en
levaduras.
La transcripción del polipéptido PRO a partir de
vectores en células huésped mamíferas se controla, por ejemplo,
mediante promotores obtenidos a partir de genomas de virus como el
virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente inglesa UK
2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), el adenovirus (como el
adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma
aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis
B, y el virus del simio 40 (SV40), a partir de promotores
heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de la actina o
un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque
térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con el
sistema de célula huésped.
La transcripción de un DNA que codifica para el
polipéptido PRO deseado en eucariotas superiores puede
incrementarse insertando una secuencia intensificadora en el vector.
Los intensificadores son elementos del DNA que actúan en cis,
habitualmente de alrededor de 10 a 300 pb, que actúan sobre un
promotor para aumentar su transcripción. Actualmente se conocen
muchas secuencias intensificadoras de genes mamíferos (globina,
elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e
insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un intensificador de
un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el
intensificador SV40 en el sitio tardío del origen de replicación
(pb 100-270), el intensificador del promotor
temprano del citomegalovirus, el intensificador del polioma en el
sitio tardío del origen de replicación, e intensificadores de
adenovirus. El intensificador puede empalmarse en el vector en la
posición 5' o 3' de la secuencia codificante del polipéptido PRO,
pero es preferible que esté localizado en el sitio 5' del
promotor.
Los vectores de expresión usados en células
huésped eucariotas (de levaduras, hongos, insectos, plantas,
animales, humanos o células nucleadas de otros organismos
multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la
terminación de la transcripción y para la estabilización del mRNA.
Dichas secuencias están disponibles comúnmente en las regiones no
traducidas en 5' y ocasionalmente en 3' de DNAs o cDNAs eucarióticos
o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos
transcritos como fragmentos poliadenilados en la región no
traducida del mRNA que codifica para los polipéptidos PRO.
Aún se describen otros métodos, vectores y
células huésped adecuadas para ser adaptadas a la síntesis de
polipéptidos PRO en cultivo de células de vertebrados recombinantes
en Gething y col., Nature,293:620-625 (1981);
Mantei y col., Nature, 281:40-46 (1979); patente
europea EP 117.060; y patente europea EP117.058.
La amplificación génica y/o la expresión pueden
medirse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante
transferencia de Southern convencional o transferencia de Northern
para cuantificar la transcripción del mRNA [Thomas, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia
de puntos (análisis de DNA), o hibridación in situ, usando
una sonda adecuada marcada, basada en las secuencias proporcionadas
aquí. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos que pueden
reconocer cadenas dobles específicas, incluidas cadena doble de
DNA, de RNA y cadena doble híbridas de DNA-RNA o
DNA-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden estar
marcados y el ensayo puede llevarse a cabo en donde la cadena doble
esté unida a una superficie, por lo que una vez se ha formado la
cadena doble en la superficie, puede detectarse la presencia del
anticuerpo unido a la cadena doble.
La expresión génica puede medirse de forma
alternativa mediante métodos inmunológicos, tales como tinción
inmunohistoquímica de las células o secciones de tejido y ensayos
del cultivo celular o de los fluidos corporales, para cuantificar
directamente la expresión del producto del gen. Los anticuerpos
útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayos sobre fluidos
de la muestra pueden ser tanto monoclonales como policlonales y
pueden prepararse en cualquier animal. Es conveniente que los
anticuerpos puedan preparase contra la secuencia nativa del
polipéptido PRO o contra un péptido sintético basado en las
secuencias de DNA proporcionadas aquí o contra una secuencia
exógena fusionada al DNA del polipéptido PRO y que codifique por un
epitopo del anticuerpo específico.
Las formas del polipéptido PRO pueden ser
recuperadas del medio de cultivo o de los lisados de las células
huésped. Si están unidos a membrana, pueden liberarse de la membrana
mediante una solución de detergente adecuada (por ejemplo,
Tritón-X 100) o por ruptura enzimática. Las células
empleadas en la expresión del polipéptido PRO pueden romperse a
través de diversos mecanismos físicos o químicos como ciclos de
congelación y descongelación, sonicación, ruptura mecánica o
agentes que lisan las células.
Puede desearse purificar los polipéptido PROs a
partir de proteínas celulares recombinantes o polipéptidos. Los
siguientes métodos son ejemplos de procedimientos de purificación
adecuados: por fraccionamiento o por columna de intercambio iónico;
precipitación con etanol; HPLC de fase reversa; cromatografía sobre
sílice o sobre una resina de intercambio catiónico como DEAE;
cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con
persulfato amónico; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex
G-75; columnas de proteína A Sepharose para eliminar
contaminantes como IgG; y columnas quelantes de metales para unirse
a las formas epitopo-etiqueta del polipéptido PRO.
Pueden usarse diversos métodos de purificación de proteínas, métodos
conocidos en el área y descritos por ejemplo en Deutscher, Methods
in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles
and Practice, Springer-Verlag, New York (1982).
El/Los paso(s) de purificación dependerán, por ejemplo, de la
naturaleza del proceso de producción usado y en particular del
polipéptido PRO sintetizado.
Las secuencias nucleotídicas (o sus
complementarias) que codifican para los polipéptidos PRO de la
presente invención tienen diversas aplicaciones en el área de la
biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridación, en
mapeo cromosómico y génico y en la generación de RNA antisentido y
DNA. El ácido nucleico que codifica para el polipéptido PRO puede
también ser útil para la preparación de polipéptidos PRO mediante
las técnicas recombinantes descritas aquí.
La secuencia nativa completa del ácido nucleico
que codifica para el polipéptido PRO o porciones de la misma,
pueden usarse como sondas sobre una librería de cDNA para aislar el
gen del polipéptido PRO completo o para aislar incluso otros genes
(por ejemplo, aquellos que codifican para variantes naturales del
polipéptido PRO o polipéptidos PRO de otras especies) que tienen
una identidad de secuencia con las secuencias nucleicas del
polipéptido PRO. Opcionalmente, la longitud de las sondas podrá ser
de alrededor de 20 a 50 bases. Las sondas de hibridación pueden
derivarse de la secuencia nucleotídica de cualquiera de las
moléculas de DNA descritas aquí o a partir de secuencias genómicas
incluyendo promotores, elementos intensificadores e intrones de la
secuencia de DNA nativa que codifica para el polipéptido PRO. A modo
de ejemplo, un método de cribaje comprenderá el aislamiento de la
región codificante del gen del polipéptido PRO usando la secuencia
de DNA conocida para sintetizar una sonda seleccionada de unas 40
bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse con diversos
marcadores, incluyendo radionucleótidos como P^{32} o S^{35}, o
marcadores enzimáticos tales como fosfatasa alcalina acoplada con
la sonda vía sistemas de acoplamiento avidina/biotina. Las sondas
marcadas que tienen una secuencia complementaria a la del gen del
polipéptido PRO específico de la presente invención pueden usarse
para analizar librerías de cDNA humano, DNA genómico o mRNA para
determinar a qué miembros de dichas librerías hibrida la sonda. Las
técnicas de hibridación se describen en más detalle más adelante en
la sección de Ejemplos.
Los ESTs descritos en la aplicación presente
pueden ser usados de forma similar como sondas, utilizando los
métodos descritos aquí.
Las sondas pueden usarse también en técnicas de
PCR para generar un banco de secuencias para la identificación de
secuencias íntimamente relacionadas con el polipéptido PRO.
Las secuencias que codifican para el polipéptido
PRO pueden usarse también para construir sondas de hibridación que
permitan mapear el gen que codifica para ese polipéptido PRO y para
el análisis genético de individuos con desórdenes genéticos. Las
secuencias nucleotídicas proporcionadas aquí pueden ser mapeadas en
un cromosoma y a regiones específicas de un cromosoma usando
técnicas conocidas como la hibridación in situ, el análisis
de ligamiento contra marcadores cromosómicos conocidos, y el
análisis de hibridación con librerías.
Cuando la secuencia codificante para el
polipéptido PRO codifica una proteína que se une a otra proteína,
el polipéptido PRO puede usarse en ensayos para identificar sus
ligandos. De forma similar, se pueden identificar inhibidores de la
unión receptor/ligando. Las proteínas implicadas en dichas
interacciones de unión pueden usarse también para la búsqueda de
péptidos o pequeñas moléculas inhibidoras o agonistas de la
interacción de unión. Los ensayos de cribaje pueden usarse para
encontrar compuestos líderes que imitan la actividad biológica del
polipéptido PRO nativo o de un ligando del polipéptido PRO. Dichos
ensayos de cribaje incluirán ensayos susceptibles de analizar
librerías químicas a gran escala, haciéndolos particularmente
adecuados para la identificación de pequeñas moléculas candidatas a
fármacos. Las pequeñas moléculas contempladas incluyen compuestos
sintéticos orgánicos o inorgánicos. Los ensayos pueden realizarse
en diversos formatos, incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína, ensayos de análisis bioquímico,
inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien
caracterizados en el área.
Los ácidos nucleicos que codifican para el
polipéptido PRO o sus formas modificadas pueden usarse también para
generar tanto animales transgénicos como animales "knock out",
los cuales, a su vez, son útiles en el desarrollo y análisis de
reactivos útiles terapéuticamente. Un animal transgénico (por
ejemplo, un ratón o una rata) es un animal que presenta células que
contienen un transgen, el cual se introdujo en el animal o en un
ancestro del animal en un estadio prenatal, por ejemplo, estadio
embrional. Un transgen es un DNA que se ha integrado en el genoma
de una célula a partir de la cual se desarrolla el animal
transgénico. En una realización, el cDNA que codifica para el
polipéptido PRO de interés puede usarse para clonar el DNA genómico
que codifica para el polipéptido PRO según técnicas establecidas y
las secuencias genómicas serán usadas para generar los animales
transgénicos que contienen células que expresan el DNA que codifica
para el polipéptido PRO. Los métodos para generar animales
transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas,
han llegado a ser convencionales dentro del área, por ejemplo en las
patentes americanas U.S. 4.736.866 y 4.870.009. Determinadas
células podrían ser diana para la incorporación del transgen que
codifica para el polipéptido PRO mediante intensificadores
específicos de tejido. Los animales transgénicos que incluyen una
copia del transgén que codifica para el polipéptido PRO, introducido
en la línea germinal del animal en un estadio embrional, pueden
usarse para examinar el efecto del aumento de la expresión del DNA
que codifica para el polipéptido PRO. Dichos animales pueden usarse
como animales de análisis para reactivos que confieran protección
frente, a por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su
sobreexpresión. En concordancia con esta faceta de la invención, un
animal es tratado con el reactivo de forma que una reducción de la
incidencia de la condición patológica, comparado con animales no
tratados que llevan el transgen, indicaría un potencial terapéutico
de la intervención para la condición patológica.
Alternativamente, pueden usarse homólogos
no-humanos de los polipéptidos PRO para construir un
animal "knock out" para el polipéptido PRO el cual presenta un
gen, que codifica para el polipéptido PRO de interés, defectivo o
alterado como resultado de la recombinación homóloga entre el gen
endógeno que codifica para el polipéptido PRO y el DNA genómico
alterado que codifica para el polipéptido PRO introducido en una
célula embrional del animal. Por ejemplo, el cDNA que codifica para
el polipéptido PRO puede usarse para clonar el DNA genómico que
codifica para el polipéptido PRO según técnicas establecidas. Una
porción del DNA genómico que codifica para el polipéptido PRO puede
ser eliminada o reemplazada por otro gen, como por un gen que
codifique para un marcador seleccionable que puede utilizarse para
monitorizar la integración. Típicamente se incluyen en el vector
varias kilobases de secuencia de DNA flanqueante no modificada
(tanto en el extremo 5' como en el 3') [véase ej., Thomas and
Capecchi, Cell,51:503 (1987) para la descripción de vectores de
recombinación homóloga]. El vector se introduce en una línea de
célula madre embrional (ej., por electroporación) y se seleccionan
aquellas células en las que el DNA introducido se ha recombinado
homologamente con el DNA endógeno [véase ej., Li y col.,Cell,69:915
(1992)]. Las células seleccionadas se inyectan en un blastocito del
animal (ej., un ratón o una rata) para formar quimeras de
agregacion [véase ej., Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic
Stem Cells: A practical Approach, E.J. Robertson,ed (IRL, Oxford,
1987), pp. 113-152]. Un embrión quimérico puede
entonces implantarse en un animal adoptivo que sea una hembra
pseudopreñada adecuada y el embrión se llevará a término para
generar el animal "knock out". La progenie que porta el DNA
recombinado homólogamente en sus células germinales puede
identificarse mediante técnicas estándar y puede usarse para
cruzarse con animales en los que todas las células del animal
contienen el DNA recombinado homólogamente. Los animales knockout
pueden ser caracterizados por ejemplo, para su capacidad para
defenderse de ciertas condiciones patológicas y para el desarrollo
de condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido
PRO.
Cuando se emplea la administración in
vivo de un polipéptido PRO, las dosis normales pueden variar
entre 10 ng/kg y 100 mg/kg de peso corporal de un mamífero o más por
día, preferentemente de 1 \mug/kg/día a 10 mg/kg/día, dependiendo
de la vía de administración. En la literatura se provee de una guía
sobre dosis particulares y métodos de administración; véase, por
ejemplo, las patentes americanas U.S. 4.657.760; 5.206.344; ó
5.225.212. Es de esperar, que diferentes formulaciones serán
efectivas para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes
desórdenes, que la administración que tiene como objetivo un órgano
o tejido, por ejemplo, puede necesitar ser administrada de manera
diferente a la de otro órgano o tejido.
Cuando se desee la administración sostenida de
un polipéptido PRO en una formulación con características de
liberación adecuadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o
trastorno que requiere la administración del polipéptido PRO, se
puede contemplar la microencapsulación del polipéptido PRO. La
microencapsulación de proteínas recombinantes para liberación
sostenida se ha realizado con éxito con la hormona del crecimiento
humana (rhGH, el interferón-(rhIFN-), la
interleucina-2 y MN rgp120. Johnson y col., Nat.
Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:
1221-1223(1993); Hora y col., Bio/Technology,
8:755-758 (1990); Cleland, "Desing and Production
of single Inmunization Vaccines Using Polylactide Plyglycolide
Microsphere Systems." en Vaccine Design: The Subunit and
Adjuvant Approach, Powell y Newman, eds, (Plenum Press: New York,
1995), pp. 439-462; las patentes internacionales WO
97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399, y patente americana U.S.
5,654.010.
Las formulaciones de liberación sostenida de
estas proteínas se desarrollaron usando el polímero de ácido
poli-láctico-coglicólico (PLGA)
debido a su biocompatibilidad y al rango amplio de propiedades
biodegradables. Los productos de degradación del PLGA, los ácidos
láctico y glicólico, pueden ser rápidamente aclarados del cuerpo
humano. Además la degradabilidad de este polímero puede ajustarse
desde meses hasta años dependiendo de su peso molecular y su
composición. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from
lactide/glycolide polymer", en: M. Chasin y R. Langer (Eds.),
Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New
York, 1990, pp. 1-41.
Por ejemplo, para una formulación que pueda
proveer una dosis de aproximadamente 80 g/kg/día en mamíferos con
un peso corporal máximo de 85 kg, la mayor dosis sería
aproximadamente de 6,8 mg del polipéptido PRO por día. Para
conseguir este nivel de dosis, se necesita una formulación de
liberación sostenida que contenga un máximo posible de carga de
proteína (15-20% peso/peso de polipéptido PRO) con
la menor liberación inicial posible (<20%). También es deseable
una liberación continuada (orden cero) del polipéptido PRO a partir
de micropartículas durante 1-2 semanas. Además la
proteína encapsulada que va a ser liberada debe mantener su
integridad y estabilidad durante todo el período de liberación
deseado.
Los compuestos de la presente invención pueden
ser formulados de acuerdo con métodos conocidos para preparar
composiciones farmacéuticamente útiles, a través de las cuales el
polipéptido PRO de la presente invención se combina en adición con
un vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Se describen
portadores vehículos adecuados y sus formulaciones, incluídas otras
proteínas humanas, por ejemplo, albúmina sérica humana en, por
ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980 Mack
Publishing Co., editada por Oslo y col.
Las dosis y concentraciones deseadas de fármaco
de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden
variar dependiendo del uso particular pensado. Por ejemplo, en el
tratamiento de la trombosis venosa profunda o de la enfermedad
vascular periférica, se prefieren típicamente dosis en bolo con
administraciones subsecuentes con el objetivo de mantener un nivel
sanguíneo aproximadamente constante, preferentemente en el orden de
unos 3 \mug/ml.
Sin embargo, para usarse en conexión con las
instalaciones de asistencia médica de emergencia en donde la
capacidad de infusión generalmente no está disponible y debido a la
naturaleza generalmente crítica de la enfermedad subyacente (por
ejemplo, embolismo, infarto), generalmente será deseable
proporcionar unas dosis iniciales mayores, tales como un bolo
intravenoso.
La presente invención proporciona además
anticuerpos anti-polipéptido PRO. Se incluyen
ejemplos de anticuerpos que incluyen anticuerpos policlonales,
monoclonales, humanizados, bioespecíficos, y heteroconjugados.
Los anticuerpos contra el polipéptido PRO puede
comprender anticuerpos policlonales. El personal experto en la
materia conoce métodos para la preparación de anticuerpos
policlonales. Los anticuerpos policlonales pueden desarrollarse en
un mamífero, por ejemplo, mediante la administración de una o más
inyecciones de un agente inmunizante, y si se desea un adyuvante.
Típicamente, el agente inmunizante y/o el adyuvante se inyectarán
en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o
intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir al
polipéptido PRO o a una proteína suya de fusión. Puede ser útil
conjugar el agente inmunizante con una proteína que se conozca como
inmunogénica en el mamífero que va a ser inmunizado. Entre los
ejemplos de dichas proteínas inmunogénicas se incluyen, aunque no
están limitados a ellos, la hemocianina de lapa, la albúmina
sérica, la tiroglobulina bovina y el inhibidor de la tripsina de
soja. Entre los ejemplos de adyuvantes que pueden ser utilizados se
incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante
MPL-TDM (monofosforil lípido A, trehalosa sintética
dicorinomicolato). El protocolo de inmunización puede ser
seleccionado por los expertos en la materia.
Los anticuerpos contra el polipéptido PRO pueden
ser alternativamente anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos
monoclonales pueden prepararse usando los métodos de hibridoma,
tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein, Nature,256:495
(1975). En un método de hibridoma, un ratón, un hámster u otro
animal huésped adecuado, se inmuniza típicamente con un agente
inmunizante para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de
producir anticuerpos que se unan específicamente al agente
inmunizante. De manera alternativa, los linfocitos pueden ser
inmunizados in vitro.
Típicamente, el agente inmunizante incluirá el
polipéptido PRO de interés o una proteína de fusión del mismo.
Generalmente, se usan o bien linfocitos de sangre periférica
("PBLs") si se desean células de origen humano, o células de
bazo o células de nódulos linfáticos si se desean fuentes de
mamíferos no humanos. Los linfocitos entonces se fusionan con una
línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado,
como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,
(1986) pp. 59-103]. Habitualmente las líneas
celulares inmortalizadas son células de mamífero transformadas,
particularmente células de mieloma de roedores, de origen bovino y
de origen humano. Habitualmente se usan líneas celulares de mieloma
de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en
medios de cultivo adecuados que preferentemente contienen una o más
sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las
células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si a las células
parentales les falta el enzima hipoxantina guanina fosforibosil
transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo de los hibridomas
incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidina
("medio HAT"), substancias que impiden el crecimiento de
células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas
son aquellas que se fusionan eficientemente, que sostienen niveles
estables elevados de expresión del anticuerpo por las células
seleccionadas productoras de anticuerpo, y que son sensibles a
medios tales como el medio HAT. Las líneas de mieloma murino se
encuentran entre las células inmortalizadas más preferidas, las
cuales pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell
Distribution Center, San Diego, California y de la American Type
Culture Collection, Rockville, Maryland. También se han descrito
para la producción de anticuerpos monoclonales humanos las líneas
celulares de mieloma humano y de heteromieloma
ratón-humano [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984);
Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications, Marcel Dekker, Inc, New York, (1987) pp.
51-63].
El medio de cultivo en el que se cultivan las
células de hibridoma puede ser analizado para determinar la
presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el
polipéptido PRO de interés. Preferentemente, la especificidad de
unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células de
hibridoma se determina por inmunoprecipitación o mediante un ensayo
de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un
ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA). Dichas técnicas y
ensayos son conocidas en el área. La afinidad de unión del
anticuerpo monoclonal puede ser determinada, por ejemplo, mediante
el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem.,
107:220 (1980).
Después de que las células de hibridoma deseadas
hayan sido identificadas, los clones pueden subclonarse mediante
procedimientos de dilución limitante y crecimiento según métodos
estándar [Goding, supra]. El medio adecuado para este
propósito incluye, por ejemplo, medios como el Dulbecco's Modified
Eagle's Medium y el RPMI-1640. Alternativamente,
las células de hibridoma pueden crecer in vivo como ascitas
en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones pueden ser aislados o purificados a partir del medio de
cultivo o del fluido de los ascitas mediante procedimientos
convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como,
proteína-A-Sepharose, cromatografía
en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía
de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse
también mediante métodos de DNA recombinante, tales como los
descritos en la patente americana U.S. 4.816.567. El DNA que
codifica para los anticuerpos monoclonales de la invención puede
aislarse fácilmente y secuenciarse usando procedimientos
convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que
son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican para
las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos). Las
células de hibridoma de la invención sirven como fuente preferente
de dicho DNA. Una vez aislado, el DNA puede incorporarse en vectores
de expresión, los cuales son entonces transfectados en células
huésped como las células de simio COS, las células de ovario de
hámster chino (CHO), o células de mieloma que de lo contrario no
producirían la proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis
de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El
DNA puede modificarse también, por ejemplo, sustituyendo la
secuencia codificante para los dominios constantes humanos de las
cadenas pesada y ligera en lugar de las secuencias murinas
homólogas [patente americana U.S. 4.816.567; Morrison y col.,
supra] o por la unión covalente de toda o parte de la
secuencia codificante para un polipéptido no inmunoglobulina a la
secuencia codificante para la inmunoglobulina. Dicho polipéptido no
inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un
anticuerpo de la invención, o puede ser sustituido por los dominios
variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo
de la invención para crear un anticuerpo quimérico bivalente.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los métodos para preparar anticuerpos monovalentes
son bien conocidos en el área. Por ejemplo, un método implica la
expresión recombinante de una cadena ligera de la inmunoglobulina y
una cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca
generalmente en cualquier punto de la región Fc para prevenir la
unión de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de
cisteína relevantes se sustituyen por otro residuo aminoacídico o
se eliminan para evitar la unión.
También son adecuados métodos in vitro
para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de los
anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente
fragmentos Fab, puede conseguirse usando técnicas de rutina
conocidas en el área.
Los anticuerpos anti-polipéptido
PRO de la invención pueden además comprender anticuerpos humanizados
o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos
no-humanos (por ejemplo, murinos) son
inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o sus
fragmentos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab)_{2} u
otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que
contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no
humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas
humanas (anticuerpo receptor) en las cuales se sustituyen residuos
de una región determinante complementaria (CDR) del receptor por
residuos de un CDR de especies no humanas (anticuerpo donador) como
ratón, rata o conejo que tengan la especificidad, afinidad y
capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan residuos de la
región estructural Fv de la inmunoglobulina humana por los residuos
no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden
comprender también residuos que no se encuentran ni en el
anticuerpo receptor ni en el CDR importado o en secuencias de la
región estructural. En general el anticuerpo humanizado comprenderá
substancialmente todos o al menos un, y típicamente dos, dominios
variables, en el cual todas o substancialmente todas las regiones
CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o
substancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de
consenso de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado,
óptimamente también comprenderá al menos una porción de una región
constante de una inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de una
inmunoglobulina humana [Jones y col., Nature,321:
522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:
323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol.,
2:
593-596 (1992)].
593-596 (1992)].
Se conocen bien en el área métodos para
humanizar anticuerpos no humanos. Generalmente, un anticuerpo
humanizado tiene un o más residuos aminoacídicos introducidos en él
a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos
aminoacídicos no-humanos se denominan con frecuencia
como residuos "de importación", los cuales típicamente son
tomados de un dominio variable "de importación". La
humanización puede ser realizada esencialmente siguiendo el método
de Winter y colaboradores [Jones y col., Nature,
321:522-525 (1986); Riechmann y col.,
Nature,332:323-327 (1988); Verhoeyen y col.,
Science, 239: 1534-1536 (1988)], sustituyendo CDRs
de roedor o secuencias CDR por las secuencias correspondientes a un
anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos
"humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente americana
U.S. 4.816.567), en donde substancialmente menos de un dominio
variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia
correspondiente de una especie no-humana. En la
práctica los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos
humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos
residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en
anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos pueden producirse
también usando diversas técnicas conocidas en el área, incluyendo
librerías de expresión en fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol.,
227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Las
técnicas de Cole y col. y Boerner y col. están también disponibles
para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y
col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77
(1985) y Boerner y col., J Inmunol.,
147(1):86-95 (1991)].
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos
monoclonales, preferentemente humanos o humanizados que tienen
especificidad de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el
caso presente, una de las especificidades de unión es por el
polipéptido PRO, y la otra es por cualquier otro antígeno,
preferentemente por una proteína de superficie celular o un
receptor o una subunidad de receptor.
Los métodos para fabricar anticuerpos
biespecíficos son conocidos en el área. Tradicionalmente, la
producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la
co-expresión de 2 parejas de inmunoglobulina de
cadena pesada/cadena ligera, en donde las dos cadenas pesadas tienen
especificidades diferentes [Milstein y Cuello, Nature,
305:537-539 (1983)]. Debido a la aleatoria variedad
de cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, estos
hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez
moléculas de anticuerpo diferentes, de los cuales sólo una tiene la
estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula
correcta habitualmente se consigue mediante etapas de cromatografía
de afinidad. Se describen procedimientos similares en la patente
internacional WO 93/08829 publicada el 13 de Mayo de 1993 y en
Traunecker y col., EMBO J., 10:3655-3659
(1991).
Se pueden fusionar dominios variables de
anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de
combinación antígeno-anticuerpo) con secuencias de
dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión preferentemente
se produce con un dominio constante de cadena pesada de
inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, y las
regiones CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante de
cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión de
la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los DNAs
que codifican para las fusiones de cadena pesada de la
inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la
inmunoglobulina se insertan en vectores de expresión separados, y
son co-transfectados en un organismo huésped
adecuado. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos
biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh y col., Methods in
Enzymology, 121: 210 (1986).
Los anticuerpos heteroconjugados están también
dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos
heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos
covalentemente. Tales anticuerpos, por ejemplo, han sido propuestos
para dirigir células del sistema inmune hacia células no deseadas
[patente americana U.S. 4.676.980], y para el tratamiento de la
infección por VIH [patentes internacionales WO 91/00360; WO
92/2000373; patente europea EP 03089]. Se contempla que los
anticuerpos puedan prepararse in vitro usando métodos
conocidos en la química sintética de proteínas, incluyendo aquellos
que implican agentes de unión. Por ejemplo, las inmunotoxinas
pueden construirse usando una reacción de intercambio de disulfuro o
formando un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos
adecuados para este propósito se incluyen el iminotiolato y el
metil-4-mercaptobutirimidato y
aquellos descritos, por ejemplo en la patente americana U.S.
4.676.980.
Los anticuerpos anti-polipéptido
PRO de la invención tienen diversas utilidades. Por ejemplo, los
anticuerpos anti-polipéptido PRO pueden usarse en
ensayos de diagnóstico para un polipéptido PRO, por ejemplo,
detectando su expresión en células, tejidos o sueros específicos.
Pueden usarse diversas técnicas de diagnóstico conocidas en el
área, tales como los ensayos de unión competitiva, ensayos de
sándwich directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación
realizados tanto en fases heterogéneas como homogéneas [Zola,
Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc.
(1987) pp. 147-158]. Los anticuerpos usados en los
ensayos de diagnóstico pueden marcarse con una fracción detectable.
La fracción detectable debería ser capaz de producir, directa o
indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la fracción
detectable puede ser un radioisótopo, como H^{3}, C^{14},
P^{32}, S^{35}, o I^{125}, un compuesto fluorescente o
quimioluminiscente, como el isotiocianato de fluoresceína, la
rodamina o la luciferina, o bien un enzima como la fosfatasa
alcalina, la beta-galactosidasa o la peroxidasa de
rábano. Puede emplearse cualquier método conocido en el área para
conjugar el anticuerpo con la fracción detectable, incluyendo
aquellos métodos descritos por Hunter y col., Nature, 144: 945
(1962); David y col., Biochemistry,13: 1014 (1974); Pain y col., J.
Immunol. Meth., 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and
Cytochem., 30:407 (1982).
Los anticuerpos anti-polipéptido
PRO pueden ser útiles también para la purificación por afinidad del
polipéptido PRO a partir de cultivos celulares recombinantes o
fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra el
polipéptido PRO están inmovilizados sobre un soporte adecuado, como
Sephadex o papel de filtro, usando métodos bien conocidos en el
área. El anticuerpo inmovilizado se pone entonces en contacto con
una muestra que contenga el polipéptido PRO a purificar, y a partir
de entonces se lava el soporte con un solvente adecuado que
eliminará substancialmente todo el material en la muestra excepto el
polipéptido PRO, el cuál está unido al anticuerpo inmovilizado.
Finalmente, el soporte se lava con otro solvente apropiado que
liberará el polipéptido PRO del anticuerpo.
Se ofrecen los siguientes ejemplos con
propósitos únicamente ilustrativos, y no se pretende de ningún modo
limitar el ámbito de la presente invención.
Los reactivos disponibles comercialmente
normbrados en los ejemplos se usan según las instrucciones del
fabricante a menos que se indique lo contrario. La fuente de las
células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo de
toda la especificación, por número de acceso ATCC es la American
Type Culture Collection, Rockville, Maryland.
Las secuencias del dominio extracelular (ECD)
(incluidas las secuencias correspondientes al péptido señal de
secreción, si existía) de alrededor de 950 proteínas conocidas
secretadas procedentes del banco de datos público
Swiss-Prot se utilizaron para la búsqueda de bancos
de datos EST. Los bancos de datos EST, incluyeron los bancos de
datos públicos (por ejemplo, Dayhoff, GenBank), y bancos de datos en
propiedad (por ejemplo, LIFESEC^{TM}, Incyte Pharmaceuticals,
Palo Alto, CA). La búsqueda se realizó mediante el programa
informático BLAST o BLAST2 (Altxchul y Gish, Methods in Enzymology
266: 460-480 (1996)) comparando las secuencias de
proteína ECD con secuencias EST en 6 pautas de traducción. Estas
comparaciones con una puntuación en el Blast de 70 (o en algunos
casos 90) o mayor, que no codificaban para proteínas conocidas, se
agruparon y combinaron en secuencias de DNA consenso con el
programa "phrap" (Phil Gree, University of Washington, Seattle,
WA; (http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.
html).
Mediante esta búsqueda por homología del dominio
extracelular, se ensamblaron secuencias consenso de DNA en relación
a otras secuencias EST identificadas mediante Phrap. Además, las
secuencias de DNA consenso obtenidas, fueron a menudo (pero no
siempre) ampliadas con ciclos repetidos de BLAST y phrap para
aumentar la secuencia consenso tanto como era posible en las
fuentes de secuencias EST descritas más arriba.
En base a las secuencias consenso obtenidas tal
como se ha descrito, se sintetizaron oligonucleótidos y se
utilizaron por PCR para la identificación de una librería de cDNA
que contenía la secuencia de interés y como sondas para el
aislamiento de un clon con la secuencia codificante completa de un
polipéptido PRO. Los cebadores para la PCR, sentido de la
traducción (.f) y antisentido (.r), por lo general de 20 a 30
nucleótidos, se diseñaron frecuentemente para generar un producto
de PCR con un tamaño de 100-1000 bp. La secuencia
consenso es mayor que 1-1.5 kbp. Con el fin de
cribar algunas librerías para un clon de secuencia completa, el DNA
de las librerías se sometió a amplificación por PCR, tal como
Ausubel et al., en Current Protocols in Molecular Biology,
con el par de cebadores de PCR. Una librería positiva se utilizó a
continuación para el aislamiento de clones codificantes para el gen
de interés mediante un oligonucleótido sonda y uno de los pares de
cebadores.
Las librerías de cDNA utilizadas para el
aislamiento de clones de cDNA se contruyeron mediante métodos
estándares con reactivos disponibles comercialmente como los que
facilita la firma Invitrogen, San Diego, CA. El cDNA se cebó con un
oligo dT que contenía una diana NotI, unida con adaptadores romos
SalI tratados con quinasas, se digirió con NotI, se separó por
tamaño en electroforesis en gel y se clonó en una orientación
determinada en un vector de clonado adecuado (como por ejemplo pRKB
o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene lugares
Sfil; Holmes et al., Science, 253: 1278-1280
(1991))en las dianas únicas XhoI y NotI.
El mRNA se aislaba de un tejido humano de
interés mediante los reactivos y protocolos de Invitrogen, San
Diego, CA (Fast Track 2). Este RNA se utilizó para generar una
librería de cDNA oligodT en el vector pRK5D con los reactivos y
protocolos de Life Technologies, Gathersburg, MD (Super Script
Plasmid System). En este procedimineto, el cDNA de doble cadena
mayor de 1000 bp, se separó por tamaño y el que estaba unido a
SalI/NotI se clonó en un vector digerido con XhoI/NotI. pRK5D es un
vector de clonaje que tienen un lugar de inicio de la transcripción
sp6 seguido por una diana de restricción SfiI precedido de las
dianas de clonaje XhoI/NotI.
Una librería de cDNA secundaria se generó para
representar de manera preferencial los extremos 5' de los clones de
cDNA. El RNA Sp6 se generó de una librería primaria (descrita más
arriba) y ese RNA se utilizó para generar una librería de cDNA
cebada aleatoriamente en el vector pSST-AMY.0 con
los reactivos y protocolos de Life Technologies (Super Script
Plasmid System, a los que se ha hecho referencia más arriba). En
este procedimiento, el cDNA de doble cadena se separó por tamaño de
500-1000 bp., se unió a adaptadores romos NotI, con
SfiI y se clonó en un vector digerido por SfiI/NotI.
pSST-AMY.0 es un vector de clonaje que tienen el
promotor de la alcohol deshidrogenasa de levadura precedido por
dianas de clonaje de cDNA y la secuencia de la amilasa de ratón (la
secuencia madura sin la señal de secreción) seguida por el
terminador de la alcohol deshidrogenasa de levadura después de las
dianas de clonaje. Por tanto los cDNAs clonados en ese vector,
fusionados en la misma pauta de lectura con la secuencia de la
amilasa, permitirán la secreción de la amilasa de las colonias de
levaduras convenientemente transfectadas.
El DNA de la librería descrito en el párrafo 2
más arriba, se enfrió en hielo y se añadieron bacterias
electrocompetentes DH10B (Life Technologies, 20 ml). La bacteria y
la mezcla del vector se electroporaron según recomendaciones del
fabricante). A continuación, se añadió medio SOC (Life Technologies,
1 ml) y la mezcla se incubó a 37ºC durante 30 min. Los
transformantes se plaquearon en 20 placas de LB estándares de 150
mm, que contenían ampicilina y se incubaron durante 16 horas (37ºC).
Se aislaron las colonias positivas y se aisló el DNA de los clones
del bacteriano con protocolos estándares, por ejemplo, gradiente de
CsCl. Con el DNA purificado se procedió según los protocolos de
levadura que siguen.
Los métodos de levadura se separaron en tres
categorías: (1) Transformación de levadura con el plásmido
combinado con el vector de cDNA, (2) Detección y aislamiento de
clones de levadura que secretaban amilasa; (3) amplificación por
PCR del inserto directamente de la colonia de levadura y
purificación del DNA para secuenciación y análisis posteriores.
La cepa de levadura utilizada fue
HD56-5ª (ATCC-90785). Esta cepa
tiene el fenotipo siguiente: MAT alfa, ura3-52,
leu2-3, leu2-112,
his3-11, his3-15, MAL^{+},
SUC^{+}, GAL^{+}. Se suelen emplear de manera preferente,
mutantes de levadura que tienen mecanismos
post-traduccionales deficientes. Estos mutantes
pueden tener alelos deficientes translocados sec71, sec72, sec62,
siendo el sec71 truncado el más preferente. De forma alternativa,
los antagonistas (incluyendo nucleótidos antisentido y/o ligandos)
que interfieren con la acción normal de estos genes, otras
proteínas implicadas en el mecanismo
post-traduccional (por ejemplo, SEC61p, SEC72p,
SEC62p, SEC63p, TDJ1p o SSA1p-4p) o la formación de
complejos de esas proteínas pueden emplearse en combinación con la
levadura que expresa la amilasa.
La transformación se realizó en base al
protocolo descrito por Gietz et al., Nucl. Acid. Res.,
20:1425 (1992). Las células transformadas se inocularon del
agar a un medio complejo de caldo YEPD (100 ml) y se crecieron toda
la noche a 30ºC. El caldo de YEPD se preparó tal como está descrito
en Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring
Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994). El cultivo de
toda la noche se diluyó hasta 2 x 10^{6} células/ml
(aproximadamente OD_{600}=0,1) en caldo de YEPD (500 ml) y se
dejó crecer hasta 1 X 10^{7} células/ml (aproximadamente
OD_{600}=0,4-0,5).
Las células se recogieron y prepararon para la
transformación transfiriéndolas a botellas para el rotor GS3 y se
centrifugaron en el rotor GS3 durante 5 min a 5000 rpm, el
sobrenadante se descartó y a continuación el precipitado se
resuspendió en agua estéril, y se centrifugó otra vez en tubos
falcon de 50 ml a 3500 rpm en una centrífuga Beckman
GS-6KR. El sobrenadante se descartó y las células se
lavaron subsiguientemente con LiAc/TE (10 ml, 10 mM
Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5, 100 mM
Li_{2}OOCCH_{3}), y se resuspendieron en LiAc/TE (2,5 ml).
La transformación se realizó por la mezcla en
tubos de microcentrífuga de las células preparadas (100 \mul),
con DNA de esperma de salmón de cadena sencilla desnaturalizado
recientemente (Lofstrand Labs, Gaithersburg, MD) y el DNA
transformante (1 \mug, vol < 10 \mul). Las mezcla se mezcló
brevemente en el vórtex y se añadió a continuación, PEG/TE al 40%
(600 ml, 40% polietilen-glicol-4000,
10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM
Li_{2}OOCCH_{3}, pH 7,5). La mezcla se agitó cuidadosamente en
un vaso de reacción centrifugado en una microfuga a 12000 rpm
durante 5-10 segundos, se decantó y resuspendió en
TE (500 \mul, 10 mM Tris-ClH, 1 mM EDTA, pH 7,5)
seguido por centrifugación. Las células se diluyeron en TE (1 ml) y
las alícuotas (200 \mul) se propagaron en un medio selectivo
previamente preparado en placas de 150 mm (VWR).
De forma alternativa, a pesar de las múltiples
pequeñas reacciones, la transformación se realizó como una reacción
simple a gran escala en la que las cantidades de reactivos se
añadieron proporcionalmente.
El medio selectivo utilizado fue un agar de
dextrosa completamente sintético sin uracilo
(SCD-Ura) preparado como se ha descrito en Kaiser
et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994). Los
transformantes se crecieron a 30ºC durante 2-3
días.
La detección de las colonias que secretaban
amilasa se realizó por inclusión de almidón rojo en el medio
selectivo de crecimiento. El almidón se combinó con el colorante
rojo (Reactive Red-120, Sigma) como en el
procedimiento descrito por Biely et al., Anal. Biochem. 172:
176-179 (1988). El almidón combinado se incorporó a
las placas de agar SCD-Ura a una concentración final
de 0,15% (p/v) y se tamponó con fosfato de potasio hasta un pH de
7,0 (50-100 mM de concentración final).
Las colonias positivas se picaron y se sembraron
en un medio selectivo fresco (en placas de 150 mm) con el fin de
obtener colonias aisladas identificables. Las colonias sencillas
aisladas positivas para la secreción de la amilasa se detectaron
por incorporación directa de almidón rojo en el agar
SCD-Ura tamponado. Las colonias positivas se
determinaron mediante su capacidad para romper el almidón resultando
en un halo claro rodeando las colonias positivas, visualizable de
manera directa.
Cuando se aisló una colonia positiva, se recogío
una parte con un asa de siembra y se diluyó en agua estéril (30
\mul) en una placa de 96 pocillos. Las colonias positivas, en ese
punto, se congelaron y guardaron para un análisis posterior o se
amplificaron inmediatamente. Se utilizó una alícuota de células (5
\mul) como molde para la reacción de PCR en un volumen de 25
\mul que contenía 0,5 \mul Klentaq (Clontech, Palo Alto, CA);
4,0 \mul de dNTPs 10 mM (Perkin Elmer-Cetus); 2,5
\mul de tampón Kentaq (Clontech); 0,25 \mul oligo de sentido 5'
1; 0,25 \mul de oligo anti-sentido 2; 12,5 \mul
agua destilada. La secuencia del oligonucleótido 1 sentido fue:
La secuencia del oligonucleótido
anti-sentido 2 fue:
La PCR se realizó como sigue:
Las regiones subrayadas de los oligonucleótidos
anillaron con las regiones promotoras de ADH y de la amilasa,
respectivamente, y amplificaron una región de 307 bp del vector
pSST-AMY.0 cuando el inserto no estaba presente. De
forma frecuente, los primeros 18 nucleótidos del extremo 5'-
terminal de esos oligonucleótidos, contenía lugares de hibridación
para los cebadores de secuenciación. Por tanto, el producto de la
reacción de PCR de un vector vacío fue de 343 bp. Sin embargo, la
secuencia señal fusionada con el cDNA resultó en secuencias largas
de nucleótidos.
A continuación de la PCR, una alícuota de la
reacción (5 \mul) se examinó por electroforesis en gel de agarosa
al 1% en tampón Tris-Borato-EDTA
(TBE) tal como se describió en Sambrook et al., supra.
Los clones resultantes, en un único producto de PCR mayor que 400
bp, se analizaron por secuenciación después de la purificación con
un equipo de columnas 96 Qiaquick PCR (Qiagen Inc., Chtsworth.
CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensambló una secuencia de DNA de consenso en
relación a otras secuencias EST utilizando phrap tal como se ha
descrito en el Ejemplo 1 anterior. Esta secuencia consenso se
designa en la presente invención como DNA28735. En base a la
secuencia consenso DNA28735, se sintetizaron oligonucleótidos: 1)
para identificar por PCR una librería de cDNA que contenía la
secuencia de interés, y 2) para usar como sondas para el aislamiento
de un clon de la secuencia codificante completa para
PRO213-1, PRO1330 y/o PRO1449. Se sintetizaron una
pareja de cebadores de PCR (sentido y
anti-sentido):
De forma adicional, se construyó una sonda de
hibridación con oligonucleótidos sintéticos a partir de la secuencia
consenso DNA28735 que tenía la siguiente secuencia de
nucleótidos:
sonda de hibridación
Con el fin de cribar algunas librerías como
fuente de clones de secuencia completa, el DNA de librerías se
cribó mediante amplificación por PCR con la pareja de cebadores para
PCR descrita anteriormente. A continuación, se utilizó una librería
positiva para el aislamiento de clones que codificaban para el gen
de PRO213-1, PRO1330 y/o PRO1449 utilizando los
oligonucleótidos de la sonda y uno de los cebadores de PCR. El RNA
para la construcción de las librerías de cDNA se aisló de tejido
humano fetal de pulmón.
La secuenciación del DNA de los clones aislados
tal como se ha descrito anteriormente produjo la secuencia completa
de DNA que codificaba PRO213-1, PRO1330 y/o PRO1449
[DNA30943-1-1163-1,
DNA64907-1163-1 y
DNA64908-1163-1,
respectivamente].
Las secuencias de nucleótidos completas que
corresponden a
DNA30943-1-1163-1,
DNA64907-1163-1 y
DNA64908-1163-1, respectivamente. DNA30943-1-1163-1, DNA64907-1163-1 y DNA64908-1163-1 contienen un único marco de lectura abierto con un sitio de inicio de la traducción aparente en las posiciones de nucleótidos 399-401, 488-490 y 326-328, respectivamente, y que acaba en el codón de parada en las posiciones de nucleótidos 1218-1220, 1307-1309 y 1145-1147, respectivamente (figuras 1, 3 y 5). El precursor de los polipéptidos previstos tiene 273, 273 y 273 aminoácidos de largo, respectivamente (figuras 2, 4 y 6). DNA30943-1-1163-1, DNA64907-1163-1 y DNA64908-1163-1 se han depositado con ATCC y les asignó los no. de depósito ATCC 209791, 203243 y 203242, respectivamente.
DNA64908-1163-1, respectivamente. DNA30943-1-1163-1, DNA64907-1163-1 y DNA64908-1163-1 contienen un único marco de lectura abierto con un sitio de inicio de la traducción aparente en las posiciones de nucleótidos 399-401, 488-490 y 326-328, respectivamente, y que acaba en el codón de parada en las posiciones de nucleótidos 1218-1220, 1307-1309 y 1145-1147, respectivamente (figuras 1, 3 y 5). El precursor de los polipéptidos previstos tiene 273, 273 y 273 aminoácidos de largo, respectivamente (figuras 2, 4 y 6). DNA30943-1-1163-1, DNA64907-1163-1 y DNA64908-1163-1 se han depositado con ATCC y les asignó los no. de depósito ATCC 209791, 203243 y 203242, respectivamente.
El análisis de la secuencia de aminoácidos del
polipéptido PRO123-1 completo, sugiere que una parte
del mismo posee una homología significativa con la proteína del gen
6 específico de la detención del crecimiento humano. Más
específicamente, un análisis del banco de datos Dayhoff (versión
35.45 SwissProt 35) puso de manifiesto una homología significativa
entre la secuencia de aminoácidos de PRO213 y las siguientes
secuencias Dayhoff, HSMHC3W5A_6 y B48089.
El análisis adicional de la secuencia de
aminoácidos de los polipéptidos PRO1330 y PRO1449 completos indica
una identidad significativa con notch4. Más específicamente, un
análisis del banco de datos Dayhoff (versión 35.130 SwissProt 35)
puso de manifiesto una identidad significativa entre PRO1330 y las
siguientes secuencias Dayhoff, D86566_1 y NEL_HUMAN.
El procedimiento siguiente describe el uso de
secuencias de nucleótidos codificantes para polipéptidos PRO como
sondas de hibridación.
El DNA que comprende la secuencia codificante
para el polipéptido PRO de interés tal como se ha descrito, puede
emplearse como sonda o como material de base para la preparación de
sondas que permitan la búsqueda de DNAs homólogos (como los que
codifican para variantes del polipéptido PRO presentes en la
población natural) en librerías de cDNA de tejido humano o de
librerías genómicas de tejido humano.
La hibridación y el lavado de los filtros que
contienen la librería de DNAs se realizó bajo condiciones de alta
astringencia tal como se detalla a continuación. Una sonda marcada,
derivada del ácido nucleico codificante para el polipéptido PRO, se
hibrida con un filtro en formamida al 50%, SSX 5X, SDS 0,1%, 0,1%
pirofosfato sódico, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, solución de
Denhardts 2X, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas.
El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de SSC
0,1 X y SDS 0,1% a 42ºC.
Los DNAs que tienen una identidad de secuencia
deseada con la secuencia nativa codificante para el polipéptido
PRO, puede a continuación ser identificada con técnicas estándares
conocidas en este campo.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
no glicosilada de un polipéptido PRO deseado por expresión
recombinante en E. coli.
La secuencia de DNA codificante para el
polipéptido PRO deseado se amplifica inicialmente con los cebadores
de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener lugares de
restricción para enzimas que corresponden con los lugares de
restricción presentes en el vector de expresión seleccionado. Pueden
emplearse una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo es el
vector disponible pBR322 (derivado de E. coli; véase Bolivar
et al., Gene, 2:95 (1977)), que contiene genes
para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. Este vector,
se digiere con enzimas de restricción y se desfosforila. Las
secuencias de PCR amplificadas se ligan al vector. El vector
preferentemente incluye secuencias que codifican para un gen de
resistencia a los antibióticos, un promotor trp, un segmentos
poli-His (incluyendo los primeros seis codones STII,
secuencia poli-His, y lugares de digestión por
enteroquinasa), la región codificante para el polipéptido específico
PRO, un terminador transcripcional de lambda y un gen argU.
La mezcla de ligación se utiliza a continuación
para transformar una cepa de E.coli seleccionada con los
métodos descritos en Sambrook et al., supra. Los
transformantes se identifican por su habilidad para crecer en
placas de LB y se seleccionan las colonias resistentes a los
antibióticos. El DNA del plásmido puede aislarse y confirmarse por
análisis de restricción y secuenciación.
Los clones seleccionados pueden crecer toda la
noche en medio de cultivo líquido como caldo LB suplementado con
antibióticos. El cultivo de toda una noche puede subsecuentemente
utilizarse para el inóculo de un cultivo a gran escala. A
continuación, se crecen las células hasta la densidad óptica
deseada, tiempo durante el cual se activa el promotor.
Después del cultivo durante algunas horas, las
células se recogen por centrifugación. El precipitado celular
obtenido por centrifugación se solubiliza con varios agentes
conocidos en la materia, y el polipéptido PRO solubilizado puede a
continuación ser purificado con una columna de quelación de metales
en condiciones que permiten la unión fuerte de la proteína.
En la aplicación EP No. 99912321.9, el
polipéptido PRO se expresaba en E. coli en una forma unida a
un fragmento poli-His según el método que sigue a
continuación. El DNA codificante para los polipéptidos PRO se
amplificó primero los cebadores seleccionados para la PCR. Los
cebadores contenían lugares para enzimas de restricción que
corresponden a los lugares de restricción presentes en el vector de
expresión, y otras secuencias útiles que proporcionan un lugar
eficiente de inicio de la traducción, purificación rápida en una
columna de quelación de metales, y digestión proteolítica con
enteroquinasa. Las secuencias amplificadas por PCR y unidas a
secuencias poly-His se ligaron después con un vector
de expresión que se utilizó para transformar un huésped E.
coli derivado de la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE
rpoHts(htpRTS)clpP(lacip). Los transformantes
se crecieron primero en LB que contenía 50 mg/ml de carbenicilina a
30ºC con agitación hasta una O.D. de 600 desde 3-5.
Los cultivos se diluyeron entre 50-100 veces en
medio CRPA (preparado por mezcla de 3,57
g(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0.71 g de citrato sódico
2H_{2}O, 1.07 g KCl, extracto de levadura de Difco 5.36 g,
Sheffield Hycase SF 5,36 g en 500 ml de agua al mismo tiempo que
110 mM MPOS, PH 7,3, glucosa 0,55 % (p/v) y MgSO_{4} 7 mM) y se
crecieron durante 20-30 horas aproximadamente a 30ºC
en agitación. Se tomaron muestras para verificar su expresión por
análisis en SDS-PAGE, y el conjunto del cultivo se
centrifugó y se obtuvo un precipitado celular. El precipitado
celular se congeló hasta su purificación y replegado.
La pasta de E. coli procedente de
fermentaciones de 0,5 a 1 L. (6-10 g de
precipitado), se resuspendió en 10 volúmenes (w/v) de guanidina 7
M, tampón Tris 20 mM, PH 8. Se añadieron sulfito sódico sólido y
tetrationto sódico, para unas concentraciones finales de 0.1 M y
0.01, respectivamente y la solución se dejó en agitación magnética
durante toda la noche a 4ºC. Este paso resulta en desnaturalización
de la proteína, con los residuos cisteínas bloqueados por
sulfitolización. La solución se centrifugó a 40.000 rpm en una
Ultracentrífuga Beckman durante 30 min. El sobrenadante se diluyó
con 3-5 volúmenes de tampón de la columna quelante
de metales (guanidina 6 M, 20 ml Qiagen Ni-NTA
columna quelante de metales equilibrada en el tampón 53. La columna
se lavó con tampón adicional que contenía imidazol 50 mM. Las
fracciones que contenían la proteína deseada se precipitaron y
almacenaron a 4ºC. La concentración de proteína se estimó por su
absorbancia a 280 nm con el coeficiente de extinción calculado en
base a su secuencia de aminoácidos.
Las proteínas se replegaron por dilución de la
muestra lentamente en tampón de replegado preparado fresco que
consistía en: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5
mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegado se
escogieron de manera que la concentración final de la proteína
estuviera entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de replegado
se dejó en agitación magnética cuidadosa durante
12-36 horas a 4ºC. La reacción de replegado se
enfrió por la adición de TFA a una concentración final de 0,4% (pH
de aproximadamente 3). Antes de una purificación ulterior de la
proteína, la solución se filtró a través de un filtro de 0.22
micras y se añadió acetonitrilo hasta una concentración final de
2-10%. La proteína replegada se cromatografió en
una columna de fase reversa Poros R1/H con un tampón móvil de 0,1%
TFA con elución en un gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%.
Alícuotas de fracciones con una absorbancia A280 se analizaron en
geles de poliacrilamida SDS y las fracciones conteniendo proteína
replegada homogénea se precipitaron. En general, las especias
replegadas adecuadamente de la mayoría de las proteínas, se eluyeron
a concentraciones menores de acetonitrilo ya que esas especies son
las más compactas con su hidrofobicidad interior tapada por la
interacción con la resina de fase reversa. Las especies agregadas se
eluyeron habitualmente a altas concentraciones de acetonitrilo.
Además para resolver las formas de proteínas no plegadas
completamente de la forma plegada, el paso de la fase reversa
también extrae la endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contenían las proteínas PRO
replegadas deseadas se precipitaron y el acetonitrilo se extrajo
con evaporación de nitrógeno cuidadosamente directamente sobre la
solución. Las proteínas se fomularon en Hepes 20 mM, pH 6,8 cloruro
de sodio 0,14 M y manitol al 4% por diálisis o por filtración en gel
mediante resina Superfina G25 (Pharmacia) equilibrada en el tampón
formulado y filtrado de manera estéril.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
glicosilada de un polipéptido PRO deseado, mediante la expresión
recombinante en células de mamíferos.
El vector pRK5 (véase la EP 307, 247, publicada
el 15 de Marzo, 1989), se empleó como vector de expresión. De
manera opcional, el DNA codificante para el polipéptido PRO se ligó
a pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la
inserción del DNA del polipéptido PRO por los métodos de ligación
descritos en Sambrook et al., supra. El vector
resultante se denominó pRK5-polipéptido PRO.
En otra realización, las células huéspedes
seleccionadas pueden ser las células 293. Las células 293 humanas
(ATCC CCL 1573) se crecen en confluencia en placas de cultivo de
tejidos en un medio tal como DMEM suplementado con suero bovino
fetal y opcionalmente con componentes nutritivos y/o antibióticos.
Unos 10 \mug de DNA de pRK5-polipéptido PRO se
mezclan con 1 \mug de DNA codificante para el gen VA RNA
[Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelven en
500 \mul de Tris-HCl 1 mM, 0,1 mM EDTA, 0,227 M
CaCl_{2}. A esta mezcla se añaden, en gotas, 500 \mul de HEPES
50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, 1,5 mM NaPO_{4} y se deja progresar
un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se
resuspende y se añade a las células 293 dejándose durante cuatro
horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de
glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. Las células 293 se
lavan con medio de cultivo libre de suero, se añade medio fresco y
las células se incuban durante 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las
transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se sustituye por
medio de cultivo solo o por medio que contiene 200
\muCi/ml^{35}S-cisteína y 200
\muCi/ml^{35}S-metionina. Después de 12 horas
de incubación, el medio condicionante se recoge, concentra en un
filtro en centrifugación, y se carga en un gel de SDS 15%. El gel
procesado se seca y se expone por un período de tiempo que permita
revelar la presencia del polipéptido PRO. Los cultivos que contienen
las células transfectadas pueden someterse a una incubación
adicional (en medio libre de suero), analizándose el medio en
bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, el polipéptido PRO
puede introducirse en las células 293 de forma transitoria
utilizando el procedimiento del dextrano de sulfato descrito por
Somparyrac y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Las
células 293 se crecen a una densidad máxima en un frasco de cultivo
centrifugador y se añaden 700 \mug de DNA de
pRK5-polipéptido PRO. Las células se concentran en
el frasco centrifugador y se lavan con PBS. El precipitado de
DNA-dextrano se incuba con el sedimento celular
durante cuatro horas. Las células se tratan a continuación con
glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con el medio de
cultivo de tejidos y se re-introducen en el frasco
centrifugador que contiene medio de cultivo, 5 \mug/ml de insulina
bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Al cabo de cuatro
días, el medio condicionado se centrifuga y se filtra para eliminar
las células y los restos celulares. La muestra que contenía el
polipéptido PRO puede entonces concentrarse y purificarse mediante
cualquier procedimiento, como la diálisis y/o la cromatografía por
columna.
En otra realización, los polipéptidos PRO pueden
expresarse en células CHO. El DNA de
pRK5-polipéptido PRO puede transfectarse en células
CHO utilizando reactivos como el CaPO4 o el
dextrano-DEAE. Tal como se describió más arriba,
los cultivos celulares pueden incubarse y el medio reemplazarse con
medio de cultivo (solo) o con medio que contenga un marcador
radioactivo como la metionina-S35. Después de
determinar la presencia del polipéptido PRO, el medio de cultivo
puede reemplazarse con medio sin suero. Preferentemente, los
cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días y luego se
cosecha el medio condicionado. El medio que contenía el polipéptido
PRO expresado pueden a continuación concentrarse y purificarse
mediante cualquier procedimiento seleccionado.
El polipéptido PRO etiquetado epitópicamente
también puede expresarse en células huésped CHO. El polipéptido PRO
puede subclonarse en otro vector distinto al pRK5. El inserto del
subclón puede experimentar PCR para fusionarse en el marco de
lectura con una etiqueta epitópicamente seleccionada, tal como una
etiqueta poli-his en un vector de expresión en
Baculovirus. El inserto del polipéptido PRO etiquetado con
poli-His se puede subclonar a continuación en un
vector dirigido por SV40 que contiene un marcador de selección tal
como DHFR para la selección de clones estables. Por último, las
células CHO se pueden transfectar (tal como se describió
anteriormente) con el vector dirigido por SV40. El marcaje se puede
realizar, tal como se describió anteriormente, para verificar la
expresión. El medio de cultivo que contiene el polipéptido PRO
etiquetado con poli-His se puede concentrar a
continuación y purificarse mediante cualquier procedimiento
seleccionado, tal como mediante la cromatografía de afinidad con
Ni^{2+}-quelato. En EP99912321.9, la expresión
estable en células CHO se realizó utilizando el procedimiento
siguiente. Las proteínas se expresaron como una construcción de IgG
(inmunoadhesina), en las que las secuencias codificantes para las
formas solubles (por ejemplo, dominios extracelulares) de las
proteínas respectivas se fusionaron a una secuencia de la región
constante de IgG1 que contenía la bisagra, los dominios CH2 y CH3
y/o es una forma etiquetada
con poli-His.
con poli-His.
Después de la amplificación por PCR, los DNAs
respectivos se subclonan en un vector de expresión en CHO
utilizando técnicas estándares, tal como se describió en Ausubel y
col., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John
Wiley y Sons (1997). Se construyeron vectores de expresión en CHO
con dianas de restricción compatibles en 5' y 3' del DNA de interés
para permitir el barajamiento adecuado de los cDNAs. El vector
utilizado para la expresión en CHO se describe por Lucas y col.,
Nucl. Acids. Res. 24:9 (1774-1779, (1996)) y
utiliza el intensificador de la transcripción del promotor temprano
de SV40 para dirigir la expresión del cDNA de interés y la
dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la
selección para el mantenimiento estable del plásmido tras la
transfección.
Se introdujeron 12 \mug del DNA plasmídico
deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando
reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect®
(Quiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las células se
crecieron tal como se describe en Lucas y col., supra.
Aproximadamente, 3x10^{7} células se congelaron en una ampolla
para el posterior crecimiento producción tal como se describe más
adelante.
Las ampollas que contenían el DNA del plásmido
se descongelaron colocándolas en un baño y se mezclaron con el
vórtex. Los contenidos se pipetearon en un tubo de centrífuga que
contenía 10 ml de medio y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5
minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron
en 10 ml de medio selectivo (filtrado con un filtro PS20 de 0,2
\mum con suero bovino fetal al 5% filtrado con un filtro de 0,2
\mum). Las células se alicuotaron en tubos de centrifugación de
100 ml que contenían 90 ml de medio selectivo. Al cabo de
1-2 días, las células se transfirieron a un frasco
de 250 ml que se rellenó con 150 ml de medio selectivo y se incubó
a 37ºC. Al cabo de 2-3 días, se sembraron frascos de
cultivo centrifugadores de 250, 500 y 2000 ml con 3x10^{5}
células/ml. El medio celular se cambió por medio fresco mediante
centrifugación y resuspensión en medio de producción. Aunque puede
utilizarse cualquier tipo de medio para CHO, se utilizó un medio de
producción descrito en la patente americana U.S. 5.122.469,
publicada el 16 de junio de 1992. Un frasco de cultivo
centrifugador de 3 l se sembró con 1,2x106 células/ml. El día 0, se
determinó el número de células y el pH. El día 1, se obtuvo una
muestra del cultivo y se inició la introducción de aire filtrado.
El día 2, se obtuvo una muestra del cultivo, la temperatura se
desplazó a 33ºC, y se añadieron 30 ml de una solución de glucosa
500 g/l y 0,6 ml de antiespumante al 10% (por ejemplo, emulsión de
polidimetilsiloxano al 35%, Dow Corning 365 Medical Grade
Emulsion). Durante la producción, se ajustó el pH para mantenerlo a
aproximadamente 7,2. Al cabo de 10 días, o hasta que la viabilidad
descendiera por debajo del 70%, el cultivo celular se cosechó
mediante centrifugación y se filtró con un filtro de 0,22 \mum. El
filtrado se guardó a 4ºC o se cargó inmediatamente en columnas para
su purificación.
Para las construcciones etiquetadas con
poli-His, las proteínas se purificaron utilizando
una columna Ni-NTA (Quiagen). Después de la
purificación, se añadió imidazol al medio condicionado a una
concentración de 5 mM. El medio condicionado se pasó por una
columna de 6 ml N9-NTA equilibrada con Hepes 20 mM,
pH 7,4, tampón que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una
velocidad de flujo de 4-5 ml/min a 4ºC. Después del
cargado, la columna se lavó con tampón de equilibrado adicional y
la proteína se eluyó con tampón de equilibrado que contenía
imidazol 0,25 mM. La proteína altamente purificada se desaló a
continuación en un tampón de almacenamiento que contenía Hepes 10
mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25
Superfine de 25 ml de Pharmacia y se guardó a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) se purificaron del medio condicionado de la manera
siguiente. El medio condicionado se cargó en una columna de Proteína
A de 5 ml (Pharmacia) que se había equilibrado con tampón fosfato
Na 20 mM, pH 6,8. Después de cargarse, la columna se lavó
extensamente con tampón de equilibrio antes de la elución con ácido
cítrico, pH 3,5. La proteína eluída se neutralizó inmediatamente
recogiendo alícuotas de 1 ml en tubos que contenían 275 \mul de
tampón Tris 1 M, pH 9. A continuación, se desaló la proteína
altamente neutralizada en tampón de almacenamiento, tal como se
describió anteriormente para las proteínas etiquetadas
poli-His. La homogeneidad se valoró en geles de
acrilamida-SDS y por secuenciación
N-terminal mediante degradación de Edman.
El procedimiento siguiente describe la expresión
recombinante de un polipéptido PRO deseado en levaduras.
En primer lugar, los vectores de expresión en
levaduras se construyeron para la producción o la secreción
intracelular de polipéptidos PRO a partir de un promotor ADH2/GAPDH.
El DNA que codifica un polipéptido PRO deseado, una secuencia de
péptido señal y el promotor se insertaron en dianas de restricción
adecuadas en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión
intracelular del polipéptido PRO. El DNA que codifica el
polipéptido PRO puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto
con el DNA que codifica el promotor ADH2/GAPDH, la secuencia
líder/señal secretora del factor alfa de levaduras y las secuencias
engarces (si fuera necesario) para la expresión del polipéptido
PRO.
Las células de levaduras, como la cepa de
levaduras AB110, pueden transformarse a continuación con los
plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en
medios de fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de
levaduras transformadas pueden analizarse mediante precipitación con
ácido tricloroacético al 10% y separarse mediante
SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con
Coomassie azul.
El polipéptido PRO recombinantes puede aislarse
a continuación y purificarse eliminando las células de levadura del
medio de fermentación mediante centrifugación y luego concentrar el
medio utilizando cartuchos de filtros seleccionados. El concentrado
que contiene el polipéptido PRO puede purificarse posteriormente
utilizando columnas de resinas cromatográficas.
El procedimiento siguiente describe la expresión
recombinante de polipéptidos PRO en células de insecto infectadas
con Baculovirus.
\newpage
El polipéptido PRO deseado se fusiona cadena
arriba de una etiqueta epitópica en un vector de expresión de
baculovirus. Dicha etiqueta epitópica incluye las etiquetas
poli-his y las etiquetas de inmunoglobulinas (como
las regiones Fc de IgG). Se pueden utilizar diversos plásmidos,
incluyendo plásmidos derivados de los comercialmente disponibles
como el pVL1393 (Novagen). En resumen, el polipéptido PRO o la
porción deseada del polipéptido PRO (como la secuencia codificante
del dominio extracelular de una proteína transmembrana) se
amplifica mediante PCR con cebadores complementarios en las regiones
5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar dianas de restricción
enzimática. El producto se digiere a continuación con las enzimas de
restricción seleccionadas y se subclonan en el vector de
expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante
co-transfección del plásmido anterior y el DNA del
virus
BaculoGold^{TM} (Pharmigen) en células Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) con lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Al cabo de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se cosechan y utilizan para amplificaciones posteriores. La infección viral y la expresión de proteínas se realizan tal como se describe en O'Reilly y col., Baculovirus expression vectors: A laboratory manual, Oxford Universtiy Press (1994).
BaculoGold^{TM} (Pharmigen) en células Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) con lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Al cabo de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se cosechan y utilizan para amplificaciones posteriores. La infección viral y la expresión de proteínas se realizan tal como se describe en O'Reilly y col., Baculovirus expression vectors: A laboratory manual, Oxford Universtiy Press (1994).
A continuación, se purifica el polipéptido
PRO-etiquetado con poli-His
expresado, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad con
quelato-Ni-^{2+} de la manera
siguiente. Se preparan los extractos de las células Sf9 infectadas
con virus recombinantes, tal como se describe por Rupert y col.,
Nature, 362:175-179 (1993). En resumen, las células
Sf9 se lavan, se resuspenden en tampón de sonicación (25 ml de
Hepes, pH 79; MgCl2 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol al 10%, EDTA 0,1
mM; glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%; KCl 0,4 M) y se
sonican dos veces durante 20 s en hielo. Los sonicados se aclaran
mediante centrifugación y a continuación se diluye el sobrenadante
50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al
10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se
prepara una columna de agarosa Ni^{2+}-NTA
(disponible comercialmente de Quiagen) con un volumen de lecho de 5
ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampón de
carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a una
velocidad de flujo de 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta
alcanzar una A_{280} basal con tampón de carga, en dicho punto la
fracción se inicia la recolecta de fracciones. A continuación, la
columna se lava con un tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM,
NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye específicamente la
proteína unida. Después de alcanzar de nuevo la A_{280} basal, se
hace pasar por la columna un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en
el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de 1 ml y se
analizan por SDS-PAGE y tinción con plata o
transferencia de western con Ni2+-NTA conjugado con fosfatasa
alcalina (Qiagen). Las fracciones que contenían el polipéptido PRO
etiquetado con His-10 se recogen, agrupan y se
dializan contra tampón de carga.
Alternativamente, la purificación del
polipéptido PRO etiquetado con IgG (o con Fc) puede realizarse
utilizando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por
ejemplo, cromatografía en columnas de Proteína A o G.
En la solicitud de patente europea EP
999.12321.9, los polipéptidos PRO se expresaron satisfactoriamente
en células de insecto Sf9 infectadas con baculovirus. Aunque la
expresión se realizó actualmente a una escala de
0,5-2 l, puede realizarse fácilmente a mayores
escalas (por ejemplo, 8 l). Las proteínas se expresaron como una
construcción IgG (inmunoadhesina), en la que la región extracelular
de la proteína se fusionó a una región constante de una IgG1 que
contenía la bisagra, dominios CH2 y CH3 y/o las formas etiquetadas
con poli-His.
Para la expresión en células Sf9 en baculovirus,
después de la amplificación por PCR, las secuencias codificantes
respectivas en el vector de expresión de baculovirus (pb.PH.IgG para
fusiones proteicas con IgG y pb.PH.His.c para fusiones proteicas
etiquetadas con poli-His) y el vector y el DNA del
baculovirus Baculogold® (Pharmigen) se cotransfectaron en 10^{5}
células de Spodoptera frugiperda (Sf9) (ATCC CRL 1711), utilizando
Lipofectin (Gibco BRL). Los plásmidos pb.PH.His y pb.PH.IgG son
modificaciones del vector pVL1393, vector de expresión de
baculovirus ampliamente disponible comercialmente (Pharmigen), con
regiones poliengarce modificadas para incluir las secuencias
etiquetas His o Fc. Las células se crecieron en medio Hink
TNM-FH suplementado con FBS al 10% (Hyclone). Las
células se incubaron durante 5 días a 28ºC. El sobrenadante se
cosechó y se utilizó para la amplificación viral infectando células
Sf9 en medio Hink TNM-FH suplementado con FBS al 10%
a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las células se
incubaron durante 30 días a 28ºC. El sobrenadante se cosechó y la
expresión de las construcciones en el vector de expresión de
baculovirus se determinó mediante unión del lote de 1 ml de
sobrenadante con 25 ml de bolas de Ni-NTA (Qiagen)
para las proteínas etiquetadas con histidina o bolas de
Proteína-A Sepharose CL-4B
(Pharmacia) para proteínas etiquetadas con IgG seguido por el
análisis de SDS-PAGE, comparándolo con una
concentración conocida de una proteína estándar teñida con de azul
de Coomassie.
El sobrenadante de la primera amplificación
viral se utilizó para infectar un cultivo en frascos centrifugadores
(500 ml) de células Sf9 crecidas en medio ESF-921
(Sistemas de expresión LLC) a una MOI aproximada de 0,1. Las
células se incubaron durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se
cosechó y filtró. Se repitieron los análisis de unión de lote y de
SDS-PAGE, tantas veces como fue necesario, hasta
confirmar la expresión de cultivo.
El medio condicionado de las células
transfectadas (0,5 a 3 l) se cosechó mediante centrifugación para
eliminar las células y se filtró con un filtros de 0,22 \mum. Para
las construcciones etiquetadas con poli-His, la
proteína se purificó con una columna Ni-NTA
(Qiagen). Antes de la purificación, se añadió imidazol al medio
condicionado a una concentración de 5 mM. El medio condicionado se
bombeó en una columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada
con Hepes 20 mM, pH 7,4, y un tampón que contenía NaCl 0,3 M e
imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5
ml/min a 4ºC. Después de cargar, la columna se lavó con tampón de
equilibrio adicional y se eluyó la proteína con el tampón de
equilibrio que contenía imidazol 0,25 M. La proteína altamente
purificada se desaló a continuación en un tampón de almacenamiento
con Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una
columna G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) y se almacenó a
-80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contenían Fc) de proteínas se purificaron del medio condicionado de
la manera siguiente. El medio condicionado se hizo pasara por una
columna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que se había equilibrado
en tampón fosfato Na 20 mM, pH 6,8. Después de cargar, la columna se
lavó extensamente con el tampón de equilibrio antes de la elución
con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluída se neutralizó
inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en los tubos con 275 ml
de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se
desaló en tampón de almacenamiento tal como se describió para las
proteínas etiquetadas con poli-His. Se verificó la
homogeneidad de las proteínas mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida (PEG) y secuenciación aminoacídica
N-terminal mediante degradación de Edman.
En la solicitud de Patente Europea No.
99912321.9, los polipéptidos PRO se expresaron de forma
satisfactoria en células de insecto Hi5 infectadas con
baculovirus.
Para la expresión de células de insecto Hi5
infectadas con baculovirus, el DNA codificante del polipéptido PRO
se puede amplificar con sistemas adecuados, como la Pfu
(Stratagene), o fusionarse cadena arriba (5' de) de etiqueta
epitópica contenida en un vector de expresión de baculovirus. Dichas
etiquetas epitópicas incluyen las etiquetas
poli-his y las etiquetas de inmunoglobulina (como
las regiones Fc de IgG). Se pueden utilizar diversos plásmidos,
incluyendo los derivados de plásmidos disponibles comercialmente
como el pVL1393 (Novagen). En resumen, el polipéptido PRO o la
porción deseada del polipéptido PRO (como la secuencia codificante
del dominio extracelular de una proteína transmembrana) se
amplifica mediante PCR con los cebadores complementarios con las
regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar dianas de enzimas
de restricción flanqueantes (seleccionadas). A continuación, se
digiere el producto con las enzimas de restricción seleccionadas y
se subclona en el vector de expresión. Por ejemplo, los derivados
de pVL1393 pueden incluir la región Fc de la IgG humana (pb.PH.IgG)
o una etiqueta histidina (pb.PH.His) cadena abajo (3' de) de la
secuencia NOMBRE. Preferentemente, la construcción del vector se
secuencia para su verificación.
Las células Hi5 se crecen a una confluencia del
50% en condiciones de, 27ºC, sin CO2, sin
penicilina/estreptomi-
cina. Para cada placa de 150 mm, 30 \mug del vector derivado de pIE que contiene el polipéptido PRO se mezcla con 1 ml de medio Ex-Cell (Medio: Ex-Cell + 1/100 L-Glu JRH Biosciences # 14401-78P (nota: este medio es sensible a la luz), y en un tubo separado, 100 \mul de CellFectin (CellFECTIN (GibcoBRL #10362-010) (agitar con ayuda del vórtex hasta mezclado completo)), se mezclan con 1 ml de medio Ex-Cell. Las dos soluciones se combinan y se incuban durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añaden 8 ml de medio ExCell a 2 ml de la mezcla de DNA/CellFECTIN y todo ello se dispone sobre las células Hi5 previamente lavadas una vez con medio ExCell. La placa se incuba en la oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de DNA/CellFECTIN se aspira, y las células se lavan una vez con ExCell para eliminar el exceso de CellFECTIN. Se añaden 30 ml de medio ExCell fresco y las células se incuban durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se cosecha y la expresión del polipéptido PRO en el vector de expresión de baculovirus puede determinarse mediante ensayos de unión de lote de 1 ml de sobrenadante con 25 ml de bolas de Ni-NTA (Qiagen) para las proteínas etiquetadas con histidina o bolas Proteína A-Sepharose CL4B (Pharmacia) para proteínas etiquetadas con IgG, seguido del análisis de SDS-PAGE comparándolo con una concentración conocida de una proteína estándar por tinción de azul de Coomassie.
cina. Para cada placa de 150 mm, 30 \mug del vector derivado de pIE que contiene el polipéptido PRO se mezcla con 1 ml de medio Ex-Cell (Medio: Ex-Cell + 1/100 L-Glu JRH Biosciences # 14401-78P (nota: este medio es sensible a la luz), y en un tubo separado, 100 \mul de CellFectin (CellFECTIN (GibcoBRL #10362-010) (agitar con ayuda del vórtex hasta mezclado completo)), se mezclan con 1 ml de medio Ex-Cell. Las dos soluciones se combinan y se incuban durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añaden 8 ml de medio ExCell a 2 ml de la mezcla de DNA/CellFECTIN y todo ello se dispone sobre las células Hi5 previamente lavadas una vez con medio ExCell. La placa se incuba en la oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de DNA/CellFECTIN se aspira, y las células se lavan una vez con ExCell para eliminar el exceso de CellFECTIN. Se añaden 30 ml de medio ExCell fresco y las células se incuban durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se cosecha y la expresión del polipéptido PRO en el vector de expresión de baculovirus puede determinarse mediante ensayos de unión de lote de 1 ml de sobrenadante con 25 ml de bolas de Ni-NTA (Qiagen) para las proteínas etiquetadas con histidina o bolas Proteína A-Sepharose CL4B (Pharmacia) para proteínas etiquetadas con IgG, seguido del análisis de SDS-PAGE comparándolo con una concentración conocida de una proteína estándar por tinción de azul de Coomassie.
El medio condicionado de las células
transfectadas (0,5 a 3 l) se cosechó mediante centrifugación para
eliminar las células y se filtró a través de un filtro de 0,22
\mum. Para las construcciones etiquetadas con
poli-His, la proteína que comprende el polipéptido
PRO se purifica utilizando una columna de Ni-NTA
(Qiagen). Antes de la purificación, se añade imidazol al medio
condicionado a una concentración de 5 mM. El medio condicionado se
bombea a la columna de nI-NTA de 6 ml equilibrada
con Hepes 20 mM, pH 7,4, tampón que contiene NaCl 0,3 M e imidazol
5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min, a 4ºC.
Después de cargar, la columna se lava con tampón de equilibrio
adicional y se eluye la proteína con el mismo tampón que contiene
imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada se desala a
continuación en un tampón de almacenamiento que contiene Hepes 10
mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna de G25
Superfine de 25 ml (Pharmacia) y se almacena a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) de proteínas se purifican del medio condicionado de
la manera siguiente. El medio condicionado se bombea en una columna
de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que ha sido equilibrada con
tampón fosfato Na 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, la columna se
lava extensamente con tampón de equilibrio antes de la elución con
ácido cítrico 100 mM, pH 5,3. La proteína eluída se neutraliza
inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen
275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada
se desala a continuación en tampón de almacenamiento tal como se
describió anteriormente para las proteínas etiquetadas con
poli-His. La homogeneidad del polipéptido PRO se
puede valorar mediante geles de poliacrilamida-SDS
y secuenciación aminoacídica N-terminal por
degradación de Edman y otros procedimientos analíticos, según se
requiera.
Este ejemplo muestra la preparación de
anticuerpos monoclonales que se pueden unir específicamente a un
polipéptido PRO.
Las técnicas para la producción de anticuerpos
monoclonales son conocidas en la materia y se describen, por
ejemplo, en Goding, supra. Los inmunoagentes que pueden
utilizarse incluyen el polipéptido PRO purificado, las proteínas de
fusión que contienen el polipéptido PRO y las células que expresan
el polipéptido PRO recombinante en la superficie celular. La
selección del inmunógeno puede realizarse por el experto en la
materia sin excesiva experimentación.
Se inmunizaron ratones Balb/c con el inmunógeno
polipéptido PRO emulsionado en adyuvante completo de Freund y se
inyectaron subcutáneamente o intraperitonealmente en una cantidad de
1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno
se emulsionó en adyuvante MPL-TDM (Ribi
Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyectó en las
almohadillas de las patas traseras del animal. Los ratones
inmunizados se estimularon a continuación 10 a 12 días más tarde
con inmunógeno adicional emulsionado con adyuvante seleccionado.
Durante varias semanas después, también podían estimularse los
ratones con inyecciones de inmunización adicionales. Se obtuvieron
muestras de suero periódicamente de los ratones mediante sangrado
retro-orbital para analizar en ensayos ELISA para
detectar los anticuerpos anti-polipéptido PRO.
Después de haber detectado un anticuerpo
adecuado, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden
ser inyectados con una inyección intravenosa de polipéptido PRO. De
tres a cuatro días más tarde, los ratones se sacrifican y se
obtienen las células del bazo. Las células del bazo se fusionan
(utilizando polietilén glicol al 35%) a una línea celular de
mieloma murino seleccionada, como por ejemplo P3X63AgU.1, disponible
del ATCC, CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que
pueden sembrarse en placas de cultivo de 96 pocillos con medio HAT
(hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación
de células no-fusionadas, híbridos de mieloma e
híbridos de células del bazo.
Las células de hibridomas se rastrearán en un
ensayo ELISA por su reactividad contra el polipéptido PRO. La
determinación de células de hibridoma "positivas" secretoras de
anticuerpos monoclonales deseados contra el polipéptido PRO se
halla dentro del ámbito de la materia.
Las células de hibridoma positivas pueden
inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c para producir
ascitas que contengan anticuerpos anti-polipéptido
PRO. Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecerse en
frascos de cultivo o botellas de cultivo giratorias. La purificación
de los anticuerpos monoclonales producidos en las ascitas puede
lograrse utilizando la precipitación con sulfato amónico, seguido de
cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, se puede
utilizar la cromatografía de afinidad mediante la unión del
anticuerpo a la proteína A o la proteína G.
Los polipéptidos PRO pueden expresarse como
proteínas quiméricas con uno o más dominios polipeptídicos
adicionales añadidos para facilitar la purificación de la proteína.
Dichos dominios facilitadores de la purificación incluyen, pero no
se limitan a, péptidos queladores de metales como los módulos
histidina-triptófano que permiten la purificación
sobre metales inmovilizados, los dominios de proteína A que permiten
la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada y el dominio
utilizado en el sistema de purificación por extensión/ afinidad
FLAGS^{TM} (Immunex Corp., Seattle Wash.). La inclusión de una
secuencia de engarce escindible como el Factor Xa o la
enteroquinasa (Invitrogen, San Diego Calif) entre el dominio de
purificación y se secuencia del polipéptido PRO puede ser de
utilidad para facilitar la expresión del DNA codificante del
polipéptido PRO.
Los polipéptidos PRO nativos o recombinantes
pueden purificarse mediante diversas técnicas estándares en la
materia relativas a la purificación de proteínas. Por ejemplo, el
pro-polipéptido PRO, el polipéptido PRO o el
pre-polipéptido PRO se purifican mediante
cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos
para el polipéptido PRO de interés. En general, una columna de
inmunoafinidad se construye mediante acoplamiento covalente del
anticuerpo anti-polipéptido PRO con una resina
cromatográfica activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a
partir del suero bien mediante precipitación con sulfato amónico o
mediante purificación sobre Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB
Biotechnology, Piscataway, N.J.). Al igual que los anticuerpos
monoclonales se preparan de ascitas de ratones mediante
precipitación con persulfato amónico o cromatografía sobre Proteína
A inmovilizada. La inmunoglobulina parcialmente purificada se une
covalentemente a una resina cromatográfica como la SEPHAROSE^{TM}
activada por CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se
acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se
lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se utiliza una columna de inmunoafinidad de
dicho tipo en la purificación del polipéptido PRO mediante
preparación de una fracción de células que contienen el polipéptido
PRO en una forma soluble. Esta preparación se deriva por
solubilización de las células completas o de una fracción subcelular
obtenida mediante centrifugación diferencial con adición de
detergente o por otros procedimientos bien conocidos en la materia.
Alternativamente, el polipéptido PRO contiene una secuencia señal
que puede secretarse en cantidad útil en el medio donde crecen las
células.
Una preparación que contiene el polipéptido PRO
soluble se pasa por la columna de afinidad, a continuación se lava
la columna en condiciones que permiten la absorbancia preferencial
del polipéptido PRO (por ejemplo, tampones de alta fuerza iónica en
presencia de detergente). A continuación, la columna se eluye en
condiciones tales que se rompe la unión anticuerpo/polipéptido PRO
(por ejemplo, un tampón con pH bajo de aproximadamente pH
2-3, o una concentración elevada de un agente
caotrópico como la urea o el ión tiocianato) y por último se recoge
el polipéptido PRO.
La invención es particularmente útil para el
rastreo de compuestos utilizando polipéptidos PRO o mediante la
unión a un fragmento de éste con cualquiera de las técnicas de
búsqueda de fármacos. El polipéptido PRO o un fragmento de éste que
se utilice en dicho análisis puede hallarse en libre en solución,
fijado a un soporte sólido, adherido a la superficie celular o
localizado intracelularmente. Un procedimiento de rastreo de
fármacos utiliza células eucariotas o procariotas que se
transforman establemente con los ácidos nucleicos recombinantes y
expresan el polipéptido PRO o sus fragmentos. Los fármacos se
seleccionan frente a dichas células transformadas en ensayos de
unión competitiva. Dichas células, bien en la forma viable o fija,
pueden utilizarse para ensayos de unión estándar. Se puede
cuantificar por ejemplo, la formación de complejos entre el
polipéptido PRO o un fragmento y el agente que se analiza.
Alternativamente, se puede examinar la disminución de la formación
del complejo entre el polipéptido PRO y su célula diana o sus
receptores diana que está causada pro el agente que se analiza.
En consecuencia, la presente invención
proporciona procedimientos de rastreo de fármacos o cualquier otro
agente que pueda afectar a la enfermedad o trastorno asociado con el
polipéptido PRO. Estos procedimientos comprenden el contacto con
uno de dichos agentes que contengan el polipéptido PRO o un
fragmento de éste y el análisis de (i) la presencia de un complejo
entre el agente y el polipéptido PRO o su fragmento, o (ii) la
presencia de un complejo entre el polipéptido PRO o un fragmento de
éste y la célula, mediante procedimientos bien conocidos en la
materia. En dichos ensayos de unión competitiva, el polipéptido PRO
o un fragmento de éste se marca de modo característico. Después de
una incubación adecuada, el polipéptido PRO libre o un fragmento de
éste se separa de la forma unida y la cantidad de libre o de marcaje
no presente en el complejo es una medida de la capacidad del agente
determinado para unirse al polipéptido PRO o para interferir con el
complejo polipéptido PRO/célula.
Otra técnica para el rastreo de fármacos
proporciona una selección de alto rendimiento para compuestos con
afinidad de unión adecuada por un polipéptido y se describe con
detalle en la patente internacional WO 84/03564, publicada el 13 de
septiembre de 1984. En resumen, grandes cantidades de compuestos de
pequeños péptidos distintos a analizar se sintetizan sobre un
sustrato sólido, como puntas o cualquier otra superficie. Tal como
se aplica para un polipéptido PRO, los compuestos peptídicos a
analizar se hacen reaccionar con el polipéptido PRO y se lavan. El
polipéptido PRO unido se detecta mediante procedimientos bien
conocidos en la materia. El polipéptido PRO purificado también
puede servir como recubrimientos de placas para utilizar en las
técnicas de rastreo de fármacos mencionadas anteriormente. Además,
se pueden utilizar anticuerpos neutralizantes para capturar el
péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido.
La presente invención también contempla la
utilización de ensayos de rastreo competitivo de fármacos en los
que los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse al polipéptido
PRO compiten específicamente con un compuesto test por la unión con
el polipéptido PRO o con fragmentos del mismo. De esta manera,
pueden utilizarse anticuerpos para detectar la presencia de
cualquier péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos
con el polipéptido PRO.
El objetivo del diseño racional de fármacos es
producir análogos estructurales del polipéptido activo
biológicamente de interés (es decir, un polipéptido PRO) o de
moléculas pequeñas con las que interaccionan, por ejemplo, los
agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos
puede utilizarse para generar fármacos que sean formas más activas
o estables del polipéptido PRO o que intensifiquen o interfieran
con la función del polipéptido PRO in vivo (Hodgson,
Bio/Technology, 9:19-21 (1991)).
En una aproximación, la estructura
tridimensional del polipéptido PRO, o de un complejo inhibidor del
polipéptido PRO, se determina mediante cristalografía de rayos X,
mediante modelado informático o, de forma más característica,
mediante una combinación de dos aproximaciones. Es necesario conocer
tanto la forma como las cargas del polipéptido PRO para comprender
la estructura y determinar los sitios activos de la molécula.
Aunque a veces, pero no muy frecuentemente, se puede obtener
información útil sobre la estructura del polipéptido PRO mediante
modelado basado en la estructura de proteínas homólogas. En ambos
casos, la información estructural relevante se utiliza para diseñar
moléculas de tipo polipéptido-PRO análogas o para
identificar inhibidores eficientes. Ejemplos útiles del diseño
racional de fármacos puede incluir moléculas con una actividad
mejorada o estabilidad, tal como se muestra por Braxton y Wells,
Biochemistry, 31:7796-7801 (1992) o que actúan como
inhibidores, o antagonistas de péptidos nativos tal como se muestra
por Athauda y col., J. Biochem., 113:742-746
(1993).
\newpage
También es posible aislar un anticuerpo
específico de una diana, seleccionado mediante ensayo funcional,
tal como se describió anteriormente y a continuación resolver su
estructura cristalina. Esta aproximación, en principio, produce un
núcleo del fármaco, o farmacore, sobre el cual se pueden diseñar
otros fármacos. Es posible evitar la cristalografía de proteínas
generando anticuerpos anti-idiotipos
(anti-ids) contra una anticuerpo funcional, activo
farmacológicamente. Como una imagen en espejo de una imagen en el
espejo, el sitio de unión de los anti-ids se
esperaría que fuera un análogo del receptor original. El
anti-id podría utilizarse para identificar y aislar
péptidos a partir de bancos de péptidos producidos química o
biológicamente. Los péptidos aislados actuarían a continuación como
el farmacore.
En virtud de la presente invención, se pueden
obtener cantidades suficientes del polipéptido PRO para realizar
dichos estudios analíticos como la cristalografía por rayos X.
Además, el conocimiento de la secuencia aminoacídica del
polipéptido PRO que se proporciona aquí facilitará una guía par los
que utilicen técnicas de modelado informático en lugar de o además
de la cristalografía por rayos X.
Este ejemplo muestra que los genes que codifican
varios polipéptidos PRO se amplifican en el genoma de ciertos
cánceres humanos. La amplificación se asocia con la sobreexpresión
del producto génico, lo que indica que el polipéptido PRO es una
diana útil para la intervención terapéutica en algunos cánceres,
tales como colon, pulmón, y otros cánceres. Los agentes
terapéuticos pueden tomar la forma de antagonistas de genes que
codifican polipéptidos PRO, por ejemplo, anticuerpos quiméricos
murinos-humanos, humanizados o humanos contra el
polipéptido PRO.
El material de partida para el cribado fue el
ADN genómico aislado a partir de diversos cánceres. El ADN se
cuantifica de forma precisa, por ejemplo, fluorimétricamente. Como
control negativo, se aisló ADN de las células de 10 individuos
sanos normales que se agrupó y utilizó como controles del ensayo
para la copia génica en individuos sanos (NorHu).
Se utilizaron el ensayo de la nucleasa 5' (por
ejemplo TaqMan^{TM}) y la PCR cuantitativa a tiempo real (por
ejemplo, ABI Prizm 7700 Sequence Detection System^{TM} (Perkin
Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA)) para hallar
genes potencialmente amplificados en algunos cánceres. Los
resultados se utilizaron para determinar si el ADN que codifica el
polipéptido PRO está sobreexpresado en cualquiera de los cánceres
de pulmón o colon que se cribaron. El resultado se indicó en
unidades Delta CT. Una unidad corresponde a 1 ciclo de PCR o a
aproximadamente una amplificación de 2 veces con respecto a la
normal, dos unidades corresponden a 4 veces, 3 unidades a 8 veces y
así sucesivamente. La cuantificación se obtuvo utilizando cebadores
y una sonda fluorescente TaqMan^{TM} derivada del gen codificante
del polipéptido PRO. Las regiones del polipéptido PRO que
seguramente contienen secuencias de ácido nucleico único y que son
las menos probables de tener intrones ayustados ("spliced
out") son las preferidas para la derivación con cebador, por
ejemplo, la región 3' no traducida.
La reacción del ensayo de la nucleasa 5' es una
técnica basada en la PCR fluorescente que utiliza la actividad
5'-exonucleasa de la enzima Taq ADN polimerasa para
monitorizar la amplificación a tiempo real. Se utilizan dos
cebadores de oligonucleótidos para generar un amplicón típico de una
reacción de PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, se diseña para
detectar una secuencia de nucleótidos localizada entre los dos
cebadores de la PCR. La sonda no es extensible por la enzima Taq
ADN polimerasa, y se marca con un colorante fluorescente informador
y un colorante fluorescente desactivante. Cualquier emisión inducida
por láser del colorante informador es desactivado por el colorante
desactivante cuando los dos colorantes se localizan estrechamente
próximos, ya que están en la sonda. Durante la reacción de
amplificación, la enzima Taq ADN polimerasa corta la sonda de forma
dependiente del molde. Los fragmentos de la sonda resultantes se
disocian en solución, y la señal del colorante informador liberado
se libera del efecto desactivante del segundo fluoróforo. Una
molécula del colorante informador se libera para cada nueva
molécula sintetizada, y la detección del colorante informador no
desactivante proporciona la base para la interpretación cuantitativa
de los resultados.
El procedimiento de la nucleasa 5' se realiza en
un dispositivo de PCR cuantitativa a tiempo real, tal como el de
ABI Prism 7700TM Sequence Detection. El sistema consiste en un
termociclador, un láser, una cámara de dispositivo acoplado a la
carga (CCD) y un ordenador. El sistema amplifica muestras en un
formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la
amplificación, la señal fluorescente inducida por el láser se
recoge a tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 96
pocillos, y se detecta en la CCD. El sistema incluye el programa
para poner en marcha el instrumento y para analizar los
resultados.
Los resultados del ensayo con nucleasa 5' se
expresan inicialmente como Ct, o el umbral del ciclo. Esto se
define como el ciclo en el que se acumula la señal del informador
sobre el nivel de fondo de fluorescencia. Los valores de Ct se
utilizan como medición cuantitativa del número relativo de copias
iniciales de una secuencia diana particular en una muestra de ácido
nucleico.
Se observó que los genes que codifican los
siguientes polipéptidos PRO se amplificaban en el ensayo anterior:
PRO213-1.
La hibridación in situ es una técnica potente y
versátil para la detección y localización de secuencias de ácido
nucleico en las preparaciones celulares o de tejidos. Puede ser
útil, por ejemplo, para identificar sitios de expresión génica,
analizar la distribución en el tejido, identificar y localizar la
infección viral, seguir los cambios en la síntesis de mRNA
específico y con la ayuda del mapeo cromosómico.
La hibridación in situ se realizó según
la versión optimizada del protocolo de Lu y Gillet, Cell Vision
1:169-176 (1994), utilizando las ribosondas marcadas
con P^{32} generadas por PCR. En resumen, los tejidos humanos
incluidos en parafina, fijados en formalina se seccionaron,
desparafinaron, desproteinizaron en proteinasa K (20 g/ml) durante
15 minutos a 37ºC y se procesaron posteriormente para la hibridación
in situ tal como se describió por Lu y Gillet, supra. Una
ribosonda antisentido marcada con UTP-P^{32} se
generó de un producto de PCR y se hibridó a 55ºC durante la noche.
A continuación los portaobjetos con las hibridaciones se
sumergieron en la emulsión fotográfica Kodak NTB2 y se expusieron
durante 4 semanas.
6,0 \mul de UTP-P^{32} (125
mCi) (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol) se secaron al vacío. Y
a cada tubo que contenía el UTP-P^{32} secado se
añadieron los siguientes ingredientes:
2,0 \mul de tampón de transcripción 5X
1,0 \mul de DTT (100 mM)
2,0 \mul de mezcla de NTP (2,5 mM: 10 \mul
de cada GTP, CTP, TTP y ATP a 10 mM + 10 \mul de H_{2}O)
1,0 \mul de UTP (50 \muM)
1,0 de Rnasin
1,0 \mul de DNA molde (1 \mug)
1,0 \mul de H_{2}O
1,0 \mul de RNA polimerasa (para productos de
PCR T3= antisentido, T7= sentido 5', generalmente).
\vskip1.000000\baselineskip
Los tubos se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Se
añadió 1,0 \mul de DNasa RQ1, seguido de una incubación a 37ºC
durante 15 minutos. Se añadieron 90 \mul de TE (10 mM de Tris pH
7,6/EDTA 1 mM, pH 8,0) y la mezcla se pipeteó en papel DE81. La
solución restante se cargó en una unidad de ultrafiltración
Microcon-50 y se centrifugó utilizando el programa
10 (6 minutos). La unidad de filtración se invirtió sobre un segundo
tubo y se centrifugó con el programa 2 (3 minutos). En la última
recuperación, se añadieron 100 \mul de TE. Se pipeteó 1 \mul de
producto final sobre papel DE81 y se contaron en 6 ml de Biofluor
II.
La sonda se migró en un gel de TBE/urea. Se
añadieron 1-3 \mul de la sonda o 5 \mul de RNA
Mrk II a 3 \mul de tampón de carga. Se calentó la mezcla a 95ºC
en termobloque durante 3 min e inmediatamente después se colocó en
hielo. Se nivelaron los pocillos, se cargó la muestra y se migró a
180-250 voltios durante 45 minutos. El gel se
envolvió en saran-wrap y se expuso a una
película XAR con una pantalla intensificadora a -70ºC durante 1 h a
toda la
noche.
noche.
Los portaobjetos se sacaron del congelador, se
colocaron en bandejas de aluminio y se descongelaron a temperatura
ambiente durante 5 minutos. Las bandejas se colocaron en el
incubador a 55ºC durante 5 minutos para reducir la condensación.
Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído
al 4% en hielo en la campana de gases y se lavaron en 0,5XSSC
durante 5 minutos, a temperatura ambiente (25 ml de 20XSSC + 975 ml
de H_{2}O SQ). Después de desproteinizar con proteinasa K a 0,5
\mug/ml durante 10 minutos a 37ºC (12,5 \mul de solución madre
de proteinasa K en 250 ml de tampón sin RNasa precalentado), las
secciones se lavaron en 0,5XSSC durante 10 minutos a temperatura
ambiente. Las secciones se deshidrataron en etanol al 70%, 95%,
100%, durante 2 min en cada
baño.
baño.
\newpage
Los portaobjetos se desparafinaron, se colocaron
en H_{2}O SQ y se lavaron dos veces con 2XSSC a temperatura
ambiente, durante 5 minutos cada vez. Las secciones de embriones
humanos se desproteinizaron con proteinasa K 20 \mug/ml (500
\mul de una solución madre de 10 mg/ml en 250 ml de tampón sin
RNAsa; 37ºC, 15 minutos), o 8X proteinasa K (100 \mul en 250 ml
de tampón sin RNasa, 37ºC, 30 minutos) para tejidos en formalina. A
continuación, se realizaron lavados en 0,5XSSC y se deshidrataron
tal como se describió anteriormente.
Las preparaciones de los portaobjetos se
colocaron en una cajita de plástico con tampón Box (4XSSC,
formamida al 50%) - saturada con papel de filtro. El tejido se
recubrió con 50 \mul de tampón de hibridación (3,75 g de Dextrano
de sulfato + 6 ml de H_{2}O SQ), se mezcló con ayuda del vórtex y
se calentó en el microondas durante 2 minutos con la tapa
aflojada. Después de enfriar las cajas con los tejidos en hielo, se
añadieron 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de 20XSSC y 9 ml de
H_{2}O SQ, se volvió a mezclar bien con el vórtex y se incubó a
42ºC durante 1-4 horas.
Un sonda de 1,0x10^{6} cpm y 1,0 \mul de
tRNA (50 mg/ml de solución madre) por porta se calentaron a 95ºC
durante 3 minutos. Los portas se enfriaron en hielo, y se añadieron
48 \mul de tampón de hibridación por porta. Después de mezclar
con el vórtex, se añadieron 50 \mul de P3 a 50 \mul de solución
de prehibridacicón sobre el porta. Y se incubaron durante toda la
noche a 55ºC.
Se realizaron dos lavados durante 10 minutos con
2XSSC, EDTA a temperatura ambiente (400 ml de 20XSSC + 16 ml de
EDTA 0,25 M, Vf = 4L), seguido de un tratamiento con RNasa a 37ºC
durante 30 minutos (500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón
RNasa = 20 mg/ml). Los portas se lavaron 2x10 min con 2XSSC, EDTA a
temperatura ambiente. Las condiciones de astringencia del lavado
fueron las siguientes: 2 horas a 55ºC, 0,1 SSC, EDTA (20 ml de
20XSSC + 16 ml de EDTA, V_{f} = 4 l).
El análisis in situ se realizó con
diversas secuencias de DNA descritas en la patente europea EP
99912321.9. Los oligonucleótidos utilizados para estos análisis se
derivaron de secuencias nucleotídicas descritas en la patente
europea 99912321.9 y por lo general tuvieron una longitud de 40 a 55
nucleótidos.
Se realizó un análisis in situ en una
serie de secuencias de ADN descritas en la presente invención. Los
resultados de estos análisis son los siguientes.
En tejidos fetales humanos hubo una fuerte
expresión específica sobre el endotelio arterial, venoso, capilar y
sinusoidal en todos los tejidos examinados, a excepción del cerebro
fetal. En tejidos adultos normales, la expresión fue de baja a
ausente, pero cuando estaba presente, la expresión aparecida se
limitaba a la vasculatura. La mayor expresión en tejidos adultos se
observó de manera regional en vasos sanguíneos que recorrían la
materia blanca del cerebro de rhesus - la importancia de este
patrón no está clara. Se observó una expresión elevada en la
vasculatura de muchos tejidos inflamados y enfermos, incluyendo la
vasculatura tumoral. En algunos de estos tejidos, no estaba claro
si la expresión estaba solamente limitada al endotelio vascular. En
los 15 tumores de pulmón examinados no se observó expresión sobre
el epitelio maligno, aunque sin embargo, se observó expresión
vascular en muchos de los tumores y tejido pulmonar adyacente. Se
observó con esta sonda un fondo moderado aparentemente no
específico sobre colágeno hialinizado y puntos de necrosis tisular.
Sin embargo, en ausencia de un control del sentido, no es posible
estar completamente seguros de que toda esta señal es no
específica. Se observó parte de señal, aunque se creía que no
específica, sobre la mucosa gástrica de chimpancé, epitelio de
células transicionales de vejiga adulta humana y retina fetal.
\newpage
Los siguientes materiales se han depositado en
el American Type Culture Collection, 12301.
Este depósito se realizó de acuerdo con la
normativa del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de
Procedimientos de Patentes y de la Regulación que se contempla
(Tratado de Budapest). Ello asegura el mantenimiento de un cultivo
viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito.
Los depósitos estarán disponibles por el ATCC bajo los términos del
tratado de Budapest y sometidos a un acuerdo entre Genentech, Inc.
Y ATCC, que asegure la disponibilidad permanente y no restringida
de la progenie del cultivo del depósito para el público tras la
emisión de la patente americana pertinente o tras que sea accesible
al público cualquier patente americana o europea, que la preceda, y
asegure la disponibilidad de la progenie a uno determinado por el
de acuerdo con el 35\NAK122 y las normas del Comisionado de
Patentes y Marcas (incluyendo 37 CFR\NAK1,14 con la referencia
especial a 886 OG 638).
El beneficiario de la presente solicitud está de
acuerdo que si el cultivo de los materiales en depósito perece, se
pierde o se destruye cuando se cultiva en las condiciones adecuadas,
los materiales se reemplazarán en la mayor prontitud posible con
otro similar. La disponibilidad del material depositado no debe
considerarse como una licencia para practicar la invención en
contravención de los derechos garantizados bajo la autoridad de
cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes.
La especificación escrita en la presente
invención se considera suficiente para que un experto en la materia
ponga en práctica la invención. La presente invención no limita su
ámbito por la construcción depositada, ya que la realización
depositada se considera una ilustración de ciertos aspectos de la
invención y cualquier construcción que sea equivalente
funcionalmente se halla dentro del ámbito de la presente invención.
El depósito de materiales no constituye una admisión de que la
descripción aquí descrita sea inadecuada para permitir la práctica
de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de
realización, tampoco debe considerarse como limitante del ámbito de
las reivindicaciones con las ilustraciones específicas que se
representan. Incluso, diversas modificaciones de la invención,
además de las aquí mostradas y descritas, serán evidentes a los
expertos en la materia a partir de la descripción presente y se
hallan por tanto dentro del ámbito de las reivindicaciones
anexadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
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\bullet US 4675187 A [0067]
\bullet EP 404097 A [0081]
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\bullet EP 139383 A [0113]
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Claims (37)
1. Ácido nucleico aislado que codifica un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo
menos un 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos de los residuos
20 a 273 mostrada en las figuras 2 y 4, o el complemento de la
misma, en el que dicha identidad de secuencia se determina sobre la
longitud completa de las secuencias que se comparan, y en el que
dicho ácido nucleico es amplificado en tumores de pulmón y/o colon
humanos.
2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en
el que el nivel de identidad es por lo menos del 85%.
3. Ácido nucleico según la reivindicación 2, en
el que el nivel de identidad es por lo menos del 95%.
4. Ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que codifica un polipéptido que
comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 20 a 273
mostrada en cualquiera de las figuras 2, 4 y 6.
5. Ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha secuencia de
nucleótidos comprende la secuencia codificante completa de
cualquiera de las secuencias mostradas en las figuras 1, 3 y 5, o
el complemento de las mismas.
6. Ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha secuencia de
nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en
cualquiera de las figuras 1, 3 y 5, o el complemento de las
mismas.
7. Ácido nucleico que comprende la secuencia
codificante completa del inserto de ADN
(DNA30943-1-1163-1,
DNA64907-1163-1 o
DNA64908-1163-1) depositado bajo el
número de acceso ATCC 209791, ATCC 203243 o ATCC 203242, o el
complemento del mismo.
8. Vector que comprende el ácido nucleico según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Vector según la reivindicación 8, en el que
dicho ácido nucleico está unido operativamente a secuencias de
control reconocidas por una célula huésped transformada con el
vector.
10. Célula huésped que comprende el vector según
la reivindicación 8 o la reivindicación 9.
11. Célula huésped según la reivindicación 10,
en la que dicha célula es una célula CHO, un E. coli o una
célula de levadura.
12. Procedimiento para la producción de un
polipéptido que comprende cultivar la célula huésped según la
reivindicación 10 o la reivindicación 11 en condiciones adecuadas
para la expresión de dicho polipéptido y recuperar dicho
polipéptido del cultivo celular.
13. Polipéptido aislado que es por lo menos un
80% idéntico a la secuencia de aminoácidos de residuos 20 a 273
mostrada en las figuras 2 y 4, en el que dicha identidad de
secuencia se determina sobre la longitud completa de las secuencias
que se comparan, y en el que dicho polipéptido es codificado por un
ácido nucleico que es amplificado en tumores de pulmón y/o colon
humanos.
14. Polipéptido según la reivindicación 13, en
el que el nivel de identidad es por lo menos del 85%.
15. Polipéptido según la reivindicación 14, en
el que el nivel de identidad es por lo menos del 95%.
16. Polipéptido aislado según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, que incluye la secuencia de aminoácidos
de residuos 20 a 273 mostrada en las figuras 2 y 4.
17. Polipéptido aislado según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, que incluye la secuencia de aminoácidos
de residuos 20 a 273 mostrada en las figura 6.
18. Polipéptido aislado según la reivindicación
16, que consiste en la secuencia de aminoácidos de residuos 20 a
273 mostrada en las figuras 2 y 4.
19. Polipéptido aislado según la reivindicación
18, que consiste en la secuencia de aminoácidos de residuos 20 a
273 mostrada en la figura 6.
20. Polipéptido aislado, que es obtenible
mediante la expresión del inserto de ADN
(DNA30943-1-1163-1,
DNA64907-1163-1 o DNA64908-1163-1) depositado bajo el número de acceso ATCC 209791, ATCC 203243 o ATCC 203242.
DNA64907-1163-1 o DNA64908-1163-1) depositado bajo el número de acceso ATCC 209791, ATCC 203243 o ATCC 203242.
\newpage
21. Molécula quimérica que comprende un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20,
fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga.
22. Molécula quimérica según la reivindicación
21, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una
secuencia epítopo etiqueta.
23. Molécula quimérica según la reivindicación
21, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una
región Fc de una inmunoglobulina.
24. Anticuerpo que se une específicamente a un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20.
25. Anticuerpo según la reivindicación 24, en el
que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
26. Anticuerpo según la reivindicación 24, en el
que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
27. Anticuerpo según la reivindicación 26, en el
que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico.
28. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 27, para su uso en un método de tratamiento
médico.
29. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 27, para su uso en el tratamiento del
crecimiento de células neoplásicas.
30. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 27, en la preparación de un medicamento para
el tratamiento del crecimiento de células neoplásicas.
31. Composición que comprende un anticuerpo
según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27 en mezcla con un
portador farmacéuticamente aceptable.
32. Método para determinar la presencia de un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, que
comprende exponer una célula sospechosa de contener dicho
polipéptido a un anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 27, y determinar la unión del anticuerpo a la
célula.
33. Método de diagnóstico de un tumor en un
mamífero, que comprende detectar el nivel de expresión del ácido
nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 (a) en una
muestra de prueba de células de tejido del mamífero y (b) en una
muestra de control de células de tejido normales conocidas del mismo
tipo de células, donde un nivel de expresión más elevado en la
muestra de prueba indica la presencia de un tumor en el mamífero
del que se obtuvieron las células de tejido de prueba.
34. Método de diagnóstico de un tumor en un
mamífero, que comprende (a) poner en contacto un anticuerpo según
cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27 con una muestra de prueba
de células de tejido obtenidas del mamífero, y (b) detectar la
formación en la muestra de prueba de un complejo entre el anticuerpo
y un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 16 a
20.
35. Método según la reivindicación 34, en el que
la detección se realiza en comparación con la monitorización de la
formación del complejo en una muestra de control de células de
tejido normales conocidas del mismo tipo de células, indicando una
mayor cantidad de complejos formados en la muestra de prueba la
presencia de un tumor en el mamífero del que se obtuvieron las
células de tejido de prueba.
36. Método según la reivindicación 34 o la
reivindicación 35, en el que el anticuerpo transporta una marca
detectable.
37. Kit de diagnóstico del cáncer, que comprende
un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27 y un
portador en un envase adecuado, junto con instrucciones para el uso
del anticuerpo para detectar un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 20.
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