ES2323220T3 - Polipeptidos humanos stra6. - Google Patents
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Abstract
Anticuerpo contra un polipéptido Stra6, consistiendo el polipéptido Stra6 en: (a) una secuencia de aminoácidos de residuos de aminoácidos de 1 a 667 de la figura 2; o (b) una secuencia de aminoácidos de residuos de aminoácidos de 532 a 667 de la figura 2; en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado.
Description
Polipéptidos humanos Stra6.
La presente invención se refiere, en general, a
la identificación y aislamiento de ADN nuevo y a la producción
recombinante de nuevos polipéptidos que tiene una similitud en la
secuencia con Stra6 murino, una proteína sensible al ácido
retinoico. Algunas de estas moléculas se denominaron anteriormente
como "PR010282" pero más adelante también se referirán como
polipéptidos "Stra6".
Las proteínas unidas a membrana y receptores
pueden jugar roles importantes, entre otras cosas, en la formación,
diferenciación y mantenimiento de los organismos pluricelulares. El
destino de muchas células individuales, por ejemplo, proliferación,
migración, diferenciación o interacción con otras células está
gobernado habitualmente por la información recibida de otras
células y/o el entorno inmediato. Esta información a menudo se
transmite por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores
mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos,
factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que son, a su
vez, recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o
proteínas unidas a membranas. Dichas proteínas unidas a membranas y
receptores celulares incluyen, pero no están limitados a receptores
de citoquina, receptores quinasas, receptores fosfatasas,
receptores involucrados en interacciones de
célula-célula y moléculas de adhesión celular como
selectinas e integrinas. Por ejemplo, la transducción de señales
que regulan el crecimiento y la diferenciación celular está
regulada en parte por la fosforilación de varias proteínas
celulares. Las proteínaa tirosina quinasas, enzimas que catalizan
ese proceso, también pueden actuar como receptores de factores de
crecimiento. Algunos ejemplos incluyen el receptor del factor de
crecimiento del fibroblasto y el receptor del factor de crecimiento
del nervio.
Las proteínas unidas a las membranas y las
moléculas receptoras tienen varias aplicaciones industriales,
incluyendo como agentes farmacéuticos y de diagnóstico. Las
imunoadhesinas receptoras, por ejemplo, pueden ser empleadas como
agentes terapéuticos para bloquear las interacciones de
receptor-ligando. Las proteínas unidas a membranas
también pueden ser empleadas para el cribado del péptido potencial o
los inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción
receptor/ligando pertinente.
Se están realizadon esfuerzos tanto en la
industria como en las escuelas para identificar nuevas proteínas
receptoras nativas o unidas a membrana. Muchos esfuerzos se centran
en el cribado de bibliotecas de ADN recombinante de mamíferos para
identificar las secuencias codificantes para proteínas receptoras
nuevas o proteínas unidas a membrana.
Los polipéptidos Stra6 descritos aquí comparten
la homología de secuencia (73% de identidad y 81% de similitud) con
la proteína murina Stra6, cuya expresión es inducida por ácido
retinoico (Bouillet et al., Dev. Biol.
170:420-433[1995]; Bouillet et al.,
Mech. Dev.63: 173-186 [1997]; Chazaud et al.,
Dev. Genet.19: 66-73 [1996]). Dado que el ácido
retinoico es una importante molécula de señalización durante el
desarrollo vertebral, se cree que los genes inducidos en la
respuesta al ácido retinoico, juegan un papel vital en el
crecimiento y la difirenciación durante el desarrollo embrionario.
El ADNc de Stra6 murino se aisló de las células de carcinoma
embrionario murino P19 empleando una estrategia de hibridación
substractiva diseñada para identificar y aislar los genes
inducibles por ácido retinoico, y no muestra similitud con las
proteínas previamente caracterizadas. Contiene los tramos de
residuos de aminoácidos altamente hidrofóbicos que corresponden a
los dominios trans-membrana múltiples, una
característica de una proteína integral de membrana. Basándose en
su patrón de expresión, se cree que Stra6 juega un papel importante
en el modelo del miembro dorsoventral inicial durante el desarrollo
embrionario y más adelante en el control de la osificación
endocondrial (Chazaud et al., Dev. Genet. 19:
66-73 [1996]).
Los polipéptidos Stra6 descritos aquí contienen
múltiples regiones altamente hidrofóbicas que probablemente
constituyen dominios transmembrana que indican que los polipéptidos
Stra6 son proteínas integrales de membrana. Pueden funcionar como
receptores para un ligando desconocido y pueden ser parte del
mecanismo de transducción de señales con un impacto en el
crecimiento, desarrollo y diferenciación celular.
Los tumores malignos (cánceres) son la segunda
causa principal de muerte en los Estados Unidos después de la
enfermedad cardiaca (Boring et al., CA Cancel J.Clin., 43:7
[1993]).
El cáncer está caracterizado por un incremento
en el número de células anormales o neoplásicas obtenidas del
tejido normal que proliferan para formar una masa tumoral, la
invasión de tejidos contiguos por estas células neoplásicas
tumorales y la generación de células malignas que finalmente se
extienden por la sangre o el sistema linfático hacia los nódulos
limfáticos regionales y sitios distantes (metástasis). En un estado
canceroso, la célula prolifera bajo condiciones en las que las
células normales no crecerían. El cáncer se manifiesta por sí mismo
en una gran variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados
de invasión y agresividad.
La alteración de la expresión génica está
íntimamente relacionada con el crecimiento celular incontrolado y
la desdiferenciación, que son una caracteristica habitual de todos
los cáncers. Se ha observado que los genomas de ciertos tumores
estudiados muestran una expresión reducida de genes recesivos, a los
que se hace referencia habitualmente como genes de supresión de
tumores, que actuarían normalmente para evitar el crecimiento de
células tumorales y/o la sobreexpresión de ciertos genes dominantes,
tales como oncogenes, que actúan para inducir el crecimiento
tumoral. Parece ser que cada uno de estos cambios genéticos es
responsable de la importación de algunas de las características
que, en combinación, representan el fenotipo neoplasico completo
(Hunter, Cell, 64:1129 [1991] y Bishop, Cell,
64:235-248 [1991]).
Un mecanismo conocido de la sobreexpresión de
genes (por ejemplo, el oncogen) en células cancerigenas es la
amplificación génica. Este es un proceso en el que se producen
múltiples copias de un gen particular en el cromosoma de la célula
ancestral. El proceso implica la replicación no programada de la
región de cromosoma que comprende el gen, seguido de la
recombinación de los segmentos replicados de nuevo en cromosoma
(Alitalo et al., Adv. Cancer Res.,
47:235-281 [1986]). Se cree que la sobreexpresión
del gen es paralela a la amplificación génica, es decir, es
proporcional al número de copias realizadas.
Se han identificado que los protooncogenes que
codifican factores de crecimiento y receptores de factores de
crecimiento juegan un papel importante en la patogénesis de diversos
tumores malignos, incluyendo el cáncer de mama. Por ejemplo, se ha
observado que el gen ErbB2 (erbB2, también conocido como her2 o
c-erbB-2), que codifica un receptor
de glicoproteína transmembrana de 185 kd (p185^{HER2}; HER2)
relacionado con el receptor del factor de crecimiento epidérmico
EGFR, se sobreexpresa en aproximadamente de un 25% a un 30% del
cáncer de mama humano (Slamon et al., Science,
235:177-182 [1987]; Slamon et al., Science,
224:707-712 [1989]).
Se ha escrito que la amplificación génica de un
protooncogen es un suceso implicado habitualmente en las formas de
cáncer más malignas y podría actuar como un factor predictivo del
resultado clínico (Schwab et al., Genes Chromosomes cancer,
1:181-193 [1990]; Alitalo et al.,
supra). De este modo, la sobreexpresión de erbB2 se
considera habitualmente como un factor predictivo de un pronostico
pobre, especialmente en pacientes con enfermedad primaria que
implica nódulos linfáticos auxiliares (Slamon et al., [1987]
y [1989], supra; Ravdin y Chamness, Gene,
159:19-27 [1995]; y Hynes y Stern, Biochim. Biophys.
Acta, 1198:165-184 [1994]), y se ha relacionado con
la sensibilidad y/o resistencia a la terapia hormonal y pautas
quimioterapéuticas, incluyendo CMF (ciclofosfamida, metotrexato, y
fluorouracilo) y antraciclinas (Baselga et al., Oncology, 11
(3 Suppl I):43-48 [1998]). Sin embargo, a pesar de
la asociación de la sobreexpresión de erbB2 con un pronostico
pobre, las probabilidades de pacientes positivos a HER2 que
responden clínicamente al tratamiento con taxanos fue más de 3
veces que las de pacientes negativos a HER2 (Ibid). El
anticuerpo monoclonal anti-ErbB2
(anti-HER2) humanizado recombinante (una versión
humanizada del anticuerpo anti-ErbB2 murino 405,
referido como rhuMAb HER2 o Herceptin^{TM}) era clínicamente
activo en pacientes con cáncer de mama metastatico que sobreexpresan
ErbB2 que habían recibido una larga terapia anticancerigena
anteriormente (Baselga et al., J. CLin. Oncol.
14:737-744 [1996]).
En vista de lo anterior, existe un interés obvio
por identificar nuevas moleculas, procedimientos y composiciones
que sean útiles para el diagnostico y tratamiento de tumores que
estén asociados con la amplificación génica.
Se ha identificado un clon de ADNc humano
(denominado aquí como DNA 148380-2827) que tiene
homología con un ácido nucleico que codifica una proteína Stra6
murina sensible a ácido retinoico y que codifica un nuevo
polipéptido de 667 aminoácidos designado en la presente solicitud
como "PRO010282" humano de secuencia nativa de longutd
completa. Se ha identificado un clon de ADNc humano adicional
(denominado aquí como
DNA148389-2827-1) que codifica un
nuevo polipéptido de 658 aminoácidos (PR019578), que muestra una
homología de secuencia significativa con tanto Stra6 murino como
PR010282 humano de secuencia nativa, que se cree que es un variante
por "splice" alternativo de PR010282 humano de secuencia
nativa. Tal como se indica posteriormente aquí, en vista de su
homología con Stra6 murino, los polipéptidos PR010282 de la presente
invención que incluyen la secuencia nativa y moléculas variantes
también se les referirá como polipéptidos "Stra6".
La presente invención proporciona un anticuerpo
tal como se define a continuación que se une específicamente a un
polipéptido Stra6. El anticuerpo es un anticuerpo contra un
polipéptido Stra6, el polipéptido Stra6 consistiendo en
a) una secuencia de aminoácidos de los residuos
de aminoácidos de 1 a 667 de la Figura 2; o
b) una secuencia de aminoácidos de los residuos
de aminoácidos 532 a 667 de la Figura 2; donde el anticuerpo es un
anticuerpo humano o humanizado. Opcionalmente, el anticuerpo es un
anticuerpo monoclonal, un fragmento del anticuerpo o un anticuerpo
de cadena única.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende
el anticuerpo en combinación con un portador farmacéuticamente
aceptable.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una molécula de ácido nucleico aislado que codifica el
anticuerpo, un vector que comprende dicho ácido nucleico y una
célula huésped que comprende dicho vector. La presente invención
también se refiere a un procedimiento de producción de los
anticuerpos.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un anticuerpo tal como se ha descrito anteriormente
para su uso en un método de tratamiento que comprende la inhibición
del crecimiento de las células tumorales que tienen un defecto
genético en el mecanismo Wnt-1.
La presente invención también se refiere al uso
de un anticuerpo anti-Stra6 en la preparación de un
medicamiento para la inhibición del crecimiento de las células
tumorales, donde dichas células tumorales sobreexpresan el
polipéptido Stra6 que comprende una secuencia de aminoácidos que
tiene al menos un 95% de identidad en la secuencia de residuos de
aminoácidos de 1 a 667 de la Figura 2 en comparación con las células
normales del mismo tipo de tejido y donde dicho anticuerpo
anti-Stra6 se une a dicha secuencia de aminoácidos
que tiene por lo menos un 95% de identidad con la secuencia de
residuos de aminoácidos de 1 a 667 de la Figura 2.
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos
(SEC ID NO:1) de un ADNc que contiene una secuencia de nucleótidos
(nucleótidos 1-2732) que codifica PR010282 de
secuencia nativa, donde la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO:1)
es un clon designado aquí como
"DNA148380-2827". Las posiciones de los codones
del comienzo y de parada respectivos también están presentes en
negrita y subrayados.
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
(SEO ID NO:2) de un polipéptido PR010282 de secuencia nativa
derivada de la secuencia codificante de SEC ID NO:1. También se
muestran las posiciones aproximadas de otros dominios de
polipéptidos importantes.
Las Figuras 3A-D muestran
ejemplos hipotéticos para el uso del método descrito posteriormente
para determinar el % de identidad de la secuencia de aminoácidos
(Figuras 3A-B) y el % de identidad de la secuencia
de ácidos nucleicos (Figuras 3C-D) usando el
programa informático de comparición de secuencias
ALIGN-2, donde "PRO" representa la secuencia
de aminoácidos de polipéptido PR010282 hipotético de interés,
"Proteínas de Comparición" representa la secuencia de
aminoácidos de un polipéptido con el que el polipéptido "PRO"
de interés se compara, "PRO-DNA" representa
una secuencia de ácidos nucleicos de interés hipotética que codifica
PR010282, "ADN de Comparición" representa la secuencia de
nucleótidos de una molécula de ácido nucleico con la que se compara
la molécula de ácido nucleico "PRO-ADN" de
interés, "X", "Y" y "Z" cada una de ellas representa
los diferentes residuos de aminoácidos hipotéticos y "N",
"L" y "V" cada una de ellas representa los diferentes
nucleótidos hipotéticos.
Las Figuras 4A-Q proporcionan el
código fuente completo para el programa informático de comparición
de secuencias ALIGN-2. Este código fuente puede
compilarse de forma rutinaria para el uso en un sistema operativo
UNIX para proporcionar el programa informático de comparición de
secuencias ALIGN-2.
La Figura 5 muestra una secuencia de nucleótidos
designada aquí como DNA 100038 (SEC ID NO:3).
La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos
(SEC ID NO:4) de un ADNc que contiene una secuencia de nucleótidos
(nucleótidos 1-2778) que codifica una variante del
polipéptido Stra6 humano de secuencia nativa, donde la secuencia de
nucleótidos (SEC ID NO:4) es un clon designado aquí como
"DNA148389-2827-1". También se
presentan en negrita y subrayados las posiciones de los respectivos
codones de inicio y parada.
La Figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos
(SEC ID NO:5) de una variante de del polipéptido Stra6 humano de
secuencia nativa derivada de la secuencia codificante de SEC ID
NO:4. También se muestran las posiciones aproximadas de otros
dominios de polipéptidos importantes.
La Figura 8 es una representación esquemática de
la proteína Stra6 de ratón y la proteína Stra6 humana codificada
por DNA 148380-2827 (PR010282 nativa humana).
La Figura 9 muestra la representación
hidrofóbica de la proteína Stra6 humana de secuencia nativa
codificada por el DNA 148380-2827 (PR010282 nativa
humana).
La Figura 10 muestra el perfil de expresión de
ARN relativo para la la proteína Stra6 humana de secuencia nativa
codificada por DNA 148380-2827 en varios tejidos
humanos normales.
La figura 11 muestra el número de expresión de
ARN para la proteína Stra6 humana de secuencia nativa codificada
por DNA 148380-2827 en tejido de tumor de colon
humano en relación con la expresión de ARN en mucosa normal del
mismo paciente analizado mediante PCR cuantitativo. Los datos son de
un experimento realizado por triplicado. Se repitió el experimento
como mínimo dos veces con un juego diferente de cebadores de
PCR.
La Figura 12A muestra la expresión de ARN de la
proteína Stra6 humana de secuencia nativa codificada por DNA
148380-2827 en tejido de colon humano en relación a
la expresión de ARN en mucosa normal del mismo paciente usando el
gen doméstico GAPDH como control.
La Figura 12B muestra la localización de Stra6
en las células epiteliales tumorales en un adenocarcinoma de colon
mediante la hibridación in situ.
La Figura 13 muestra la expresión de ARN para la
proteína Stra6 humana de secuencia nativa codificada por DNA
148380-2827 en líneas de células tumorales de mama,
riñón, colon y pulmón humano, en relación con las líneas celulares
normales correspondientes.
La figura 14 muestra la expresión de los
fragmentos de los péptidos derivados de la proteína Stra6 humana de
secuencia nativa codificada por DNA 148380-2827 en
E. coli.
La Figura 15 muestra la expresión de ARN de
Stra6 en células de carcinoma de colon humano en presencia y
ausencia de ácido retinoico todo en trans (ATRA) y ácido
9-cis-retinoico (9cRA),
respectivamente.
La Figura 16. Hibridación in situ para
Stra6 en secciones de tumores. Se muestran imágenes de campo oscuro
que muestran granos plateados (A,C,E,G) con las correspondientes
imágenes de campo brillante tenidas de hematoxilina/eosina
(B,D,F,H). Las densidades moderadas de los granos plateados recubren
células tumorales pero no un vaso sanguíneo en un melanoma maligno
(A,B). El epitelio neoplásico en un adenocarcenoma endometrial está
marcado de manera moderada, mientras que el estroma tumoral es
negativo (C,D). Las regiones blastemales en un tumor de Wilm
muestran niveles de expresión elevados, mientras que el estroma
tumoral es negativo (E,F). Un feo cromocitoma muestra una expresión
de ARNm de Stra6 muy elevada, mientras que el córtex adrenal normal
adyacente es negativo (G,H). Escala de la barra = 100 micras.
La Figura 17. (A) Inducción de la expresión de
ARNm de Stra6 en respuesta a
9-cis-RA o ATRA en células
C57MG/parental y C57MG/Wnt-1. (B) Inducción de ARNm
de Stra6 en células C57MG/parental en respuesta al medio
acondicionado Wnt-3A y
9-cis-RA. (C) Inducción de la
expresión de ARNm de Stra6 después del tratamiento con ácido
retinoico en células de adenocarcinoma de colon HCT116 y WiDr. (D)
Imágenes de campo oscuro que muestran la expresión de Stra6
mediante la hibridación in situ en células HCT116 antes
(parte superior) y después (parte inferior) del tratamiento con
ácido retinoico. (E) Expresión de la proteína Stra6 en células WiDr
antes (-RA) y después (+RA) del tratamiento con ácido retinoico tal
como se visualiza mediante transferencia Western con un anticuerpo
monoclonal dirigido contra el péptido B de Stra6 humano. (F)
Localización de la membrana de Stra6 en las células WiDr no
tratadas (parte izquierda) o tratadas (parte derecha) con ácido
retinoico. La immunohistoquímica se realizó con un sobrenadante del
cultivo de hibridoma monoclonal de péptido B de Stra6
anti-humano (clon 12F4.2H9.1D5). Para los
experimentos mostrados en A-F, las células se
trataron con ácido retinoico durante 48 horas. Los productos Stra6
obtenidos después de la finalización de las reacciones de PCR
cuantitativa (40 ciclos cada uno) se muestran debajo de cada
gráfico A-C.
La Figura 18 (A) Wnt-1 induce la
expresión de RAR\gamma-1. Las cantidades
equivalentes de proteína de todo el lisado celular de células
C57MG/Wnt-1 reprimidas con tetraciclina en ausencia
de tetraciclina durante 0, 24, 48, ó 72 horas, se sometieron a
SDS-PAGE e immunotransferencia para
RAR\gamma-1 y ERK2. (B) La expresión de ARNm de
RAR\gamma-1 en glándulas mamarias híperplásicas y
tumores de las glándulas mamarias de ratones transgénicos
Wnt-1. La expresión de ARNm se determinó mediante
RT-PCR cuantitativa y los datos se expresan como el
número de veces la expresión en relación con la expresión de ARNm en
las glándulas mamarias de tipo salvaje.
Los términos "polipéptido PRO10282",
"proteína PRT010282", "PRO10282", "polipéptido
Stra6", "proteína Stra6" y "Stra6" se utilizan
indistintamente y comprenden PRO10282 (Stra6) de secuencia nativa y
variantes del polipéptido PRO10282 (Stra6) (que se definen en
detalle en la presente invención). El polipéptido PRO10282 (Stra6)
se puede aislar de una serie de fuentes, tales como de diferentes
tipos de tejido humano o de otras fuentes, o se puede preparar
mediante métodos recombinantes y/o sintéticos.
Un "polipéptido PRO10282 de secuencia
nativa" o "Stra6 de secuencia nativa" comprende un
polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un
PRO10282 derivado de la naturaleza. Dicho PRO10282 (stra6) de
secuencia nativa se puede aislar de la naturaleza o puede producirse
mediante medios recombinantes y/o sintéticos. El término
"PRT010282 de secuencia nativa" o "Stra6 de secuencia
nativa" comprende específicamente formas secretadas o truncadas
naturales (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular),
formas variantes naturales (por ejemplo, formas de corte y empalme
("spliced") alternativas) y variantes alélicas naturales del
PRO10282. El PRO10282 de secuencia nativa puede ser un PRO10282 de
secuencia nativa maduro o de longitud completa que comprende los
aminoácidos 1 a 667 de la figura 2 (SEC ID No. 2). El polipéptido
PRO10282 de secuencia nativa puede ser un polipéptido PRO19578
maduro o de longitud completa que comprende los aminoácidos 1 a 658
de la SEC ID No. 5, que se cree que es una forma de corte y empalme
alternativo del polipéptido PRO10282 de secuencia nativa de la SEC
ID No. 2. Además, aunque se observa que los polipéptidos PRO10282
descritos en la figura 2 (SEC ID No. 2) y en la figura 7, SEC ID
No. 5, empieza con el residuo de metionina designado en la presente
invención como posición 1 de aminoácido, es concebible y posible que
se pueda utilizar otro residuo de metionina situado "upstream"
o "downstream" desde la posición 1 de los aminoácidos en la
figura 2 (SEC ID No. 2) o en la figura 7 (SEC ID No. 5) como el
residuo de aminoácido de partida del polipéptido PRO10282.
El "dominio extracelular" o "ECD" del
polipéptido PRO10282 (Stra6) o se refiere a una forma del
polipéptido PRO10282 (Stra6), que está esencialmente libre de los
dominios transmembrana y citoplasmáticos. Normalmente, un ECD del
polipéptido PRO10282 tendrá menos de aproximadamente un 1% de dichos
dominios transmembranma y/o citoplasmáticos y, preferiblemente,
tendrá menos de aproximadamente un 0,5% de dichos dominios. Se
entenderá que cualquier dominio transmembrana identificado para los
polipéptidos PRO10282 se identifica según los criterios utilizados
habitualmente en la técnica para identificar ese tipo de dominio
hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio transmembrana pueden
variar, pero probablemente en más de aproximadamente 5 aminoácidos
en cualquiera de los extremos del dominio identificado
inicialmente. Por consiguiente, el dominio extracelular del
polipéptido PRO10282 puede comprender los aminoácidos 1 a X, en la
que X es cualquier aminoácido 49 a 59 de la figura 2 (SEC ID No. 2)
o de la figura 7 (SEC ID No. 5).
La "variante de polipéptido PRO10282" o
"variante del polipéptido Stra6", cuyos términos se utilizan
indistintamente, significa un polipéptido PRO10282 (Stra6) activo
tal y como se define posteriormente que tiene por lo menos
aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos
con la secuencia de aminoácidos de (a) residuos 1 a 667 del
polipéptido PRO10282 mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2), o
residuos 1 a 658 de la figura 7 (SEC ID No. 5), (b) 1 a X de la
figura 2 (SEC ID No. 2) o la figura 7 (SEC ID No. 5), donde X es
cualquier aminoácido desde el aminoácido 49 hasta el aminoácido 59
de la figura 2 (SEC ID No. 2) o de la figura 7 (SEC ID No. 5), o
(c) otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID No. 2) o la figura 7
(SEC ID No. 5). Entre dichas variantes de polipéptidos PRO10282
(Stra6) se incluyen, por ejemplo, polipéptidos PRO10282 (Stra6) en
los que uno o más residuos de aminoácidos se añaden, o se eliminan,
en el extremo N- y/o C-terminal, así como en uno o
más dominios internos de la figura 2 (SEC ID No. 2) o la figura 7
(SEC ID No. 5). Habitualmente, una variante de polipéptido PRO10282
tendrá por lo menos aproximadamente un 80% de identidad en la
secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos
aproximadamente un 81% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 82% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo
menos aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un
84% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente
por lo menos aproximadamente un 85% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 86%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente
por lo menos aproximadamente un 87% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 88%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente
por lo menos aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un
90% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente
por lo menos aproximadamente un 91% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un
92% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente
por lo menos aproximadamente un 93% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un
94% de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente
por lo menos aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 96%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente
por lo menos aproximadamente un 97% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 98%
de identidad en la secuencia de aminoácidos, y aún más
preferiblemente por lo menos aproximadamente un 99% de identidad en
la secuencia de aminoácidos con (a) residuos 1 a 667 del
polipéptido PRO10282 mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2), o
residuos 1 a 658 del polipéptido PRO19578 mostrado en la figura 7
(SEC ID No. 5), (b) 1 a X de la figura 2 (SEC ID No. 2) o la figura
7 (SEC ID No. 5), donde X es cualquier aminoácido desde el
aminoácido 49 hasta el aminoácido 59 de la figura 2 (SEC ID No. 2)
o de la figura 7 (SEC ID No. 5), o (c) otro fragmento
específicamente derivado de la secuencia de aminoácidos mostrada en
la figura 2 (SEC ID No. 2) o la figura 7 (SEC ID No. 5). Las
variantes de los polipéptidos PRO10282 no comprenden el polipéptido
PRO10282 de secuencia nativa. Habitualmente, los variantes de los
polipéptidos PRO10282 tienen por los menos aproximadamente 10
aminoácidos de longitud, frecuentemente por lo menos
aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por
lo menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, más
frecuentemente por lo menos aproximadamente 40 aminoácidos de
longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 50
aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos
aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por
lo menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, más
frecuentemente por lo menos aproximadamente 80 aminoácidos de
longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 90
aminoácidos de longitud, más frecuentemente por lo menos
aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, más frecuentemente por
lo menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, más
frecuentemente por lo menos aproximadamente 200 aminoácidos de
longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 300
aminoácidos de longitud, o más, y son diferentes de los fragmentos
de la secuencia de Stra6 murina, tal como se describe en Bouillet
et al., Mechanisms of Development 63,
173-186 (1997).
El "porcentaje (%) de identidad en la
secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias del
polipéptido PRO10282 (Stra6) identificadas en la presente invención
se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una
secuencia candidata que son idénticos con los residuos de
aminoácidos en una secuencia de PRO10282, después de la alineación
de las secuencias y la introducción de espacios, si es necesario,
para conseguir el máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y
sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la
identidad de la secuencia. La alineación con el objetivo de
determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de
aminoácidos se puede conseguir de varias maneras que están dentro de
la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible
públicamente, tal como software BLAST, BLAST-2,
ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden
determinar parámetros apropiados para medir la alineación,
incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo
de alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se
comparan. Para los objetivos de la presente invención, sin embargo,
los valores en % de la identidad en la secuencia de aminoácidos se
obtienen tal como se describe a continuación utilizando el programa
informático de comparación de secuencias ALIGN-2,
en el que el código fuente completo para el programa
ALIGN-2 se proporciona en las figuras
4A-Q. El programa informático de comparación de
secuencias ALIGN-2 era de Genentech, Inc. y el
código fuente mostrado en las figuras 4A-Q se ha
presentado con la documentación del usuario en la U.S. Copyright
Office, Washington D.C. 20559, donde está registrado bajo el U.S.
Copyright Registration No. TXU510087. El programa
ALIGN-2 está disponible públicamente mediante
Genentech Inc., South San Francisco, California o se puede compilar
a partir del código fuente proporcionado en las figuras
4A-Q. El programa ALIGN-2 debería
compilarse para su utilización en un sistema operativo UNIX,
preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de
comparación de las secuencias son fijados por el programa
ALIGN-2 y no varían.
Para los objetivos de la presente invención, el
% de identidad en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de
aminoácidos determinada A a, con, o contra una secuencia de
aminoácidos determinada B (que se puede escribir alternativamente
como una secuencia de aminoácidos determinada A que tiene o
comprende un cierto % de identidad en la secuencia de aminoácidos
a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B) se
calcula tal y como se indica a continuación:
100 veces la fracción
X/Y
donde X es el número de residuos de
aminoácidos identificados como emparejamientos idénticos por el
programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en
dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total
de residuos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la
longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud
de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia
de aminoácidos de A con B no es igual al % de identidad en la
secuencia de aminoácidos de B con A. Como ejemplos de los cálculos
del % de identidad en la secuencia de aminoácidos, las figuras
3A-B demuestran cómo calcular el % de identidad en
la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos
denominada "Proteína de comparación" con la secuencia de
aminoácidos denominada como
"PRO".
A menos que se afirme específicamente lo
contrario, todos los valores en % de identidad en la secuencia de
aminoácidos utilizados en la presente invención se obtienen tal y
como se describe anteriormente utilizando el programa informático
de comparación de secuencias ALIGN-2. Sin embargo,
el % de identidad en la secuencia de aminoácidos también se puede
determinar mediante la utilización del programa de comparación de
secuencias NCI-BLAST-2 (Altschul
et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402
(1997)). El programa de comparación de secuencias
NCBI-BLAST2 se puede descargar de
http://www.ncbi.nim.nih.gov. NCBI-BLAST2
utiliza diversos parámetros de búsqueda, donde todos estos
parámetros de búsqueda se fijan en los valores por defecto
incluyendo, por ejemplo, desenmascarado = sí, hebras = todas,
sucesos esperados = 10, longitud de baja complejidad mínima = 15/5,
e-valor multi-paso = 0,01, contante
para multi-paso = 25, disminución para la alineación
final con espacios = 25 y matriz de puntuación ("scoring
matrix") = BLOSUM 62.
En las situaciones en las que se utiliza
NCBI-BLAST2 para comparaciones de secuencias de
aminoácidos, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de
una secuencia de aminoácidos determinada A a, con, o contra una
secuencia de aminoácidos determinada B (que se puede escribir
alternativamente como una secuencia de aminoácidos determinada A
que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de
aminoácidos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos
determinada B) se calcula tal y como se indica a continuación:
100 veces la fracción
X/Y
donde X es el número de residuos de
aminoácidos identificados como emparejamientos idénticos por el
programa de alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en
dicha alineación del programa de A y B, y donde Y es el número
total de residuos de aminoácidos en B. Se comprenderá que cuando la
longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud
de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia
de aminoácidos de A con B no será igual al % de identidad en la
secuencia de aminoácidos de B a
A.
La "variante del polipéptido PRO10282
(Stra6)" o "variante de la secuencia de ácidos nucleicos de
PRO10282 (Stra6)" significa una molécula de ácido nucleico que
codifica un polipéptido PRO10282 activo tal y como se define a
continuación y que tiene por lo menos aproximadamente un 80% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con (a) una secuencia
de ácidos nucleicos que codifica los residuos 1 a 667 del
polipéptido PRO10282 mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2), o los
residuos 1 a 658 de la figura 7 (SEC ID No. 5), (b) una secuencia
de ácidos nucleicos que codifica los aminoácidos 1 a X de la figura
2 (SEC ID No. 2) o la figura 7 (SEC ID No. 5), donde X es cualquier
aminoácido desde el aminoácido 49 hasta el aminoácido 59 de la
figura 2 (SEC ID No. 2) o de la figura 7 (SEC ID No. 5), o (c) una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica otro fragmento
específicamente derivado de la secuencia de aminoácidos mostrada en
la figura 2 (SEC ID No. 2) o la figura 7 (SEC ID No. 5).
Habitualmente, una variante de polipéptido PRO10282 tendrá por lo
menos aproximadamente un 80% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 81%
de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más
preferiblemente por lo menos aproximadamente un 82% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos
aproximadamente un 83% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 84%
de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más
preferiblemente por lo menos aproximadamente un 85% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos
aproximadamente un 86% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 87%
de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más
preferiblemente por lo menos aproximadamente un 88% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos
aproximadamente un 89% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90%
de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más
preferiblemente por lo menos aproximadamente un 91% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos
aproximadamente un 92% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 93%
de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más
preferiblemente por lo menos aproximadamente un 94% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos
aproximadamente un 95% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 96%
de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, más
preferiblemente por lo menos aproximadamente un 97% de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente por lo menos
aproximadamente un 98% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente
un 99% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con (a) una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica los residuos 1 a 667 del
polipéptido PRO10282 mostrado en la figura 2 (SEC ID No. 2), o los
residuos 1 a 658 del polipéptido PRO19578 mostrado en la figura 7
(SEC ID No. 5), (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica
los aminoácidos 1 a X de la figura 2 (SEC ID No. 2) o la figura 7
(SEC ID No. 5), donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido
49 hasta el aminoácido 59 de la figura 2 (SEC ID No. 2) o de la
figura 7 (SEC ID No. 5), o (c) una secuencia de ácidos nucleicos
que codifica otro fragmento específicamente derivado de la
secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 (SEC ID No. 2) o en
la figura 7 (SEC ID No. 5). Las variantes del polipéptido PRO10282
no comprenden la secuencia de nucleótidos de PRO10282 nativa o la
secuencia de nucleótidos de PRO19578 nativa.
Normalmente, las variantes de polinucleótidos
PRO10282 (Stra6) tienen por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos
de longitud, frecuentemente por lo menos aproximadamente 60
nucleótidos de longitud, más frecuentemente por lo menos
aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, más frecuentemente por
lo menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, más
frecuentemente por lo menos aproximadamente 150 nucleótidos de
longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 180
nucleótidos de longitud, más frecuentemente por lo menos
aproximadamente 210 nucleótidos de longitud, más frecuentemente por
lo menos aproximadamente 240 nucleótidos de longitud, más
frecuentemente por lo menos aproximadamente 270 nucleótidos de
longitud, más frecuentemente por lo menos aproximadamente 300
nucleótidos de longitud, más frecuentemente por lo menos
aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, más frecuentemente por
lo menos aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, más
frecuentemente por lo menos aproximadamente 900 nucleótidos de
longitud, o más, y se excluyen específicamente los polinucleótidos
que están incluidos en la secuencia de nucleótidos de Stra6 murina,
tal como se describe en Bouillet et al., Mechanisms of
Development 63, 173-186 (1997).
El "porcentaje (%) de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a las secuencias de
ácidos nucleicos que codifican el polipéptido PRO10282 (Stra6)
identificadas en la presente invención se define como el porcentaje
de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con los
nucleótidos en la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el
polipéptido PRO10282, después de la alineación de las secuencias y
la introducción de espacios, si es necesario, para conseguir el
máximo porcentaje de identidad en la secuencia. La alineación con
el objetivo de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia
de ácidos nucleicos se puede conseguir de varias maneras que están
dentro de la técnica, por ejemplo, utilizando software informático
disponible públicamente, tal como software BLAST,
BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos
en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la
alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir
la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias
que se comparan. Para los objetivos de la presente invención, sin
embargo, los valores en % de la identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos se obtienen tal como se describe a continuación utilizando
el programa informático de comparación de secuencias
ALIGN-2, en el que el código fuente completo para el
programa ALIGN-2 se proporciona en las figuras
4A-Q. El programa informático de comparación de
secuencias ALIGN-2 era de Genentech, Inc. y el
código fuente mostrado en las figuras 4A-Q se ha
presentado con la documentación del usuario en la U.S. Copyright
Office, Washington D.C. 20559, donde está registrado bajo el U.S.
Copyright Registration No. TXU510087. El programa
ALIGN-2 está disponible públicamente mediante
Genentech Inc., South San Francisco, California o se puede compilar
a partir del código fuente proporcionado en las figuras
4A-Q. El programa ALIGN-2 debería
compilarse para su utilización en un sistema operativo UNIX,
preferiblemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de
comparación de las secuencias son fijados por el programa
ALIGN-2 y no varían.
Para los objetivos de la presente invención, el
% de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia
de ácidos nucleicos determinada C a, con, o contra una secuencia de
ácidos nucleicos determinada D (que se puede escribir
alternativamente como una secuencia de ácidos nucleicos determinada
C que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos a, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos
determinada D) se calcula tal y como se indica a continuación:
100 veces la fracción
W/Z
donde W es el número de nucleótidos
identificados como emparejamientos idénticos por el programa de
alineación de secuencias ALIGN-2 en dicha
alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de
nucleótidos en D. Se comprenderá que cuando la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad en la secuencia
de ácidos nucleicos de C con D no será igual al % de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos de D con C. Como ejemplos de los
cálculos del % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos,
las figuras 3C-D demuestran cómo calcular el % de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de
ácidos nucleicos denominada como "ADN de comparación" con la
secuencia de ácidos nucleicos denominada
"PRO-ADN".
A menos que se afirme específicamente lo
contrario, todos los valores en % de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos utilizados en la presente invención se obtienen tal
y como se describe anteriormente utilizando el programa informático
de comparación de secuencias ALIGN-2. Sin embargo,
el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos también se
puede determinar mediante la utilización del programa de comparación
de secuencias NCBI-BLAST-2
(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:
3389-3402 (1997)). El programa de comparación de
secuencias NCBI-BLAST2 se puede descargar de
http://www.ncbi.nim.nih.gov. NCBI-BLAST2
utiliza diversos parámetros de búsqueda, donde todos estos
parámetros de búsqueda se fijan en los valores por defecto
incluyendo, por ejemplo, desenmascarado = sí, hebras = todas,
sucesos esperados = 10, longitud de baja complejidad mínima = 1515,
e-valor multi-paso = 0,01, contante
para multi-paso = 25, disminución para la alineación
final con espacios = 25 y matriz de puntuación ("scoring
matrix") = BLOSUM 6.
En las situaciones en las que se utiliza
NCBI-BLAST2 para comparaciones de secuencias, el %
de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia
de ácidos nucleicos determinada C a, con, o contra una secuencia de
ácidos nucleicos determinada D (que se puede escribir
alternativamente como una secuencia de ácidos nucleicos determinada
C que tiene o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos a, con, o contra una secuencia de aminoácidos
determinada D) se calcula tal y como se indica a continuación:
100 veces la fracción
W/Z
donde W es el número de nucleótidos
identificados como emparejamientos idénticos por el programa de
alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en dicha
alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de
nucleótidos en D. Se comprenderá que cuando la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la
secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad en la secuencia
de ácidos nucleicos de C con D no será igual al % de identidad en
la secuencia de ácidos nucleicos de D con
C.
En otras realizaciones, las variantes de
polinucleótidos PRO10282 (Stra6) son moléculas de ácido nucleico
que codifican un polipéptido PRO10282 activo y que son capaces de
hibridarse, preferiblemente bajo condiciones de hibridación y
lavado rigurosos, a secuencias de nucleótidos que codifican los
polipéptido PRO10282 mostrados en la figura 2 (SEC ID No. 2) o la
figura 7 (SEC ID No. 5). Las variantes de polipéptidos PRO10282
pueden ser aquellas que son codificadas por una variante de
polinucleótidos de PRO10282.
El término "positivos", en el contexto de
comparaciones de identidad en la secuencia de aminoácidos
realizadas tal y como se describe anteriormente, incluye residuos de
aminoácidos en las secuencias comparadas que no solamente son
idénticos, sino también los que además tienen propiedades similares.
Los residuos de aminoácidos que presentan un valor positivo
respecto a un residuo de aminoácido de interés son aquellos que son
idénticos al residuo de aminoácido de interés o son una sustitución
preferida (tal como se define en la Tabla 1 de más adelante) del
residuo de aminoácido de interés.
Para los objetivos de la presente invención, el
% de valores positivos de una secuencia de aminoácidos determinada
A a, con, o contra una secuencia de aminoácidos determinada B (que
se puede escribir alternativamente como una secuencia de
aminoácidos determinada A que tiene o comprende un cierto % de
identidad en la secuencia de aminoácidos a, con, o contra una
secuencia de aminoácidos determinada B) se calcula tal y como se
indica a continuación:
100 veces la fracción
X/Y
donde X es el número de residuos de
aminoácidos que presentan un valor positivo tal como se ha definido
anteriormente mediante el programa de alineación de secuencias
ALIGN-2 en dicha alineación del programa de A y B, y
donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se
comprenderá que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A
no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de
positivos de A con B no será igual al % de positivos de B con
A.
El término "aislado" cuando se utiliza para
describir los diversos polipéptidos descritos en la presente
invención, significa un polipéptido que se ha identificado y
separado y/o recuperado a partir de un componente de su medio
natural. Preferiblemente, el polipéptido aislado está libre de la
asociación con todos los componentes con los que está asociado de
manera natural. Los componentes contaminantes de su medio natural
son materiales que habitualmente interferirían con usos diagnóstico
o terapéutico para el polipéptido, y pueden incluir enzimas,
hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En
realizaciones preferidas, se purificará el polipéptido (1) hasta un
grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una
secuencia de aminoácidos N-terminal o interna
mediante la utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (2)
hasta una homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones
no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o,
preferiblemente, tinción con plata. El polipéptido aislado incluye
el polipéptido in situ en el interior de células
recombinantes, ya que por lo menos un componente del medio natural
del polipéptido PRO10282 (Stra6) no estará presente. Normalmente,
sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante por lo
menos una etapa de purificación.
\newpage
Una molécula de ácido nucleico "aislada"
que codifica un polipéptido PRO10282 (Stra6) es una molécula de
ácido nucleico que se identifica y se separa de por lo menos una
molécula de ácido nucleico contaminante con la que está asociada
normalmente en el medio natural del ácido nucleico que codifica el
polipéptido PRO10282. Preferiblemente, el ácido nucleico aislado
está libre de la asociación con todos los componentes con los que
está asociado de manera natural. Una molécula de ácido nucleico
aislada que codifica el polipéptido PRO10282 está en una forma o
composición diferente de la que se encuentra en la naturaleza. Por
lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de
la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PRO10282
tal y como existen en células naturales. Sin embargo, una molécula
de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido PRO10282
(Stra6) incluye moléculas de ácido nucleico que codifican
polipéptidos PRO10282 (Stra6) contenidas en células que normalmente
expresan el polipéptido PRO10282, cuando, por ejemplo, la molécula
de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de
la de las células naturales.
El término "secuencias de control" se
refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped
particular. Las secuencias de control que son adecuadas para
procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una
secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que
las células eucariotas utilizan promotores, señales de
poliadenilación y potenciadores.
Un ácido nucleico está "unido
operativamente" cuando está situado en una relación funcional con
otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una
presecuencia o secuencia líder secretora está unido operativamente
a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que
participa en la secreción del polipéptido; un promotor o
potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si
afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a
ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si
está situado para facilitar la traducción. Generalmente, "unido
operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen
están contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora,
contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no
tienen que estar contiguos. La unión se realiza mediante la unión
en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no
existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos
sintéticos se utilizan según la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se utiliza en el
sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos
monoclonales anti-PRO10282 individuales (incluyendo
anticuerpos agonistas, antagonistas, y neutralizantes),
composiciones de anticuerpos anti-PRO10282 con
especificidad poliepitópica, anticuerpos
anti-PRO10282 de cadena única, y fragmentos de
anticuerpos anti-PRO10282 (ver a continuación). El
término "anticuerpo monoclonal", tal y como se utiliza en la
presente invención, se refiere a un anticuerpo obtenido de una
población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los
anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos
a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar
presentes en pequeñas cantidades.
La "fidelidad" de las reacciones de
hibridación se puede determinar fácilmente por un experto habitual
en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de
la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la
concentración de sal. En general, sondas más largas requieren
temperaturas más elevadas para una hibridación más correcta,
mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La
hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN
desnaturalizado para rehibridarse cuando las cadenas complementarias
están presentes en un medio por debajo de su temperatura de fusión.
Cuanto mayor es el grado de homología deseado entre la sonda y la
secuencia de hibridación, mayor es la temperatura relativa que se
puede utilizar. Como resultado, se deduce que temperaturas
relativas superiores tenderían a hacer las condiciones de reacción
con más fidelidad, mientras que temperaturas inferiores no tanto.
Para detalles adicionales y explicaciones de la fidelidad de las
reacciones de hibridación, ver Ausubel y et al., Current
Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers,
(1995).
"Condiciones de fidelidad" o "condiciones
de fidelidad elevada", tal como se definen en la presente
invención, se pueden identificar por aquéllas que: (1) utilizan una
fuerza iónica baja y una temperatura elevada para el lavado, por
ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil
sulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) utilizan durante la hibridación
un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo,
formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficol
al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM
a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o
(3) utilizan formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico
0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%,
5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50
\mug/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con
lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro sódico/citrato sódico) y
formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado de fidelidad elevada
que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.
Las "condiciones de fidelidad moderada" se
pueden identificar tal y como se describen en Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York:
Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la utilización de una
solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo,
temperatura, fuerza iónica y % de SDS) con menos fidelidad que las
descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones con fidelidad
moderada es la incubación durante toda la noche a 37ºC en una
solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM,
citrato sódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución
de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón
fragmentado desnaturalizado 20 mg/ml, seguido del lavado de los
filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El
experto en la materia sabrá como ajustar la temperatura, la fuerza
iónica, etc., según sea necesario para acomodar factores, tales
como la longitud de la sonda y similares.
\newpage
El término "epítopo etiquetado", cuando se
utiliza en la presente invención, se refiere a un polipéptido
quimérico que comprende un polipéptido PRO10282 fusionado a un
"polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene residuos
suficientes para proporcionar un epítopo frente al que se puede
fabricar un anticuerpo, aunque es suficientemente corto, de manera
que no interfiere en la actividad del polipéptido al que se fusiona.
El polipéptido etiqueta es también preferiblemente bastante único,
de manera que el anticuerpo no reacciona de forma cruzada
sustancialmente con otros epítopos. Los polipéptidos etiqueta
adecuados tienen generalmente por lo menos seis residuos de
aminoácidos y habitualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de
aminoácidos (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 20
residuos de aminoácidos).
El término "anticuerpo" se utiliza en el
sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos
monoclonales anti-PRO10282
(anti-Stra6) individuales (incluyendo anticuerpos
agonistas, antagonistas, y neutralizantes), composiciones de
anticuerpos anti-PRO10282 con especificidad
poliepitópica, anticuerpos anti-PRO10282 de cadena
única, y fragmentos de anticuerpos anti-PRO10282
(ver a continuación).
El término "anticuerpo monoclonal", tal y
como se utiliza en la presente invención, se refiere a un
anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente
homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden
la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones
naturales que pueden estar presentes en pequeñas cantidades.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden
una parte de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región
variable o de unión a antígeno del anticuerpo intacto. Entre los
ejemplos de fragmentos de anticuerpos se incluyen Fab, Fab',
F(ab')_{2} y fragmentos Fv; "diabodies"; anticuerpos
lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10):
1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpos de
cadena única; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos
de anticuerpos.
La digestión con papaína de anticuerpos produce
dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos
"Fab", cada uno con un sitio único de unión a antígeno y un
fragmento "Fc" residual, una nomenclatura que refleja la
capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina
produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de
combinación a antígeno y aún es capaz de reticular el antígeno.
"Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo
que contiene un sitio completo de unión y reconocimiento de
antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable
de cadena pesada y cadena ligera en asociación estrecha no
covalente. Es en esta configuración que las tres CDRs de cada
dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a
antígeno en la superficie del dímero V_{H-}V_{L}.
Colectivamente, las seis CDRs confieren al anticuerpo una
especificidad de unión a antígeno. Sin embargo, incluso un único
dominio variable (o la mitad de una Fv que comprende sólo tres CDRs
específicas del antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse
a antígeno, aunque con una menor afinidad que el sitio de unión
completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1)
de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos
Fab' por la adición de una serie de residuos en el extremo carboxi
terminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más
cisteínas de la región bisagra del anticuerpo.
Fab'-SH es la denominación en la presente invención
para Fab' en el que el residuo o residuos de cisteína de los
dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de
anticuerpos F(ab')_{2} se produjeron originalmente como
parejas de fragmentos de Fab' que tienen cisteínas bisagras entre
ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos
de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie de invertebrado se puede
asignar a uno de dos tipos claramente diferentes, llamados kappa y
lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios
constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del
dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se
pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases principales
de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varios de éstas se
pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena
pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas
se denominan... y, respectivamente. Las estructuras de las
subunidades y las configuraciones tridimensionales de las
diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
El término "diabodies" se refiere a
pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a
antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena
pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera
(V_{L}) en la misma cadena del polipéptido (V_{H} - V_{L}).
Utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el
emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los
dominios son forzados a emparejarse con los dominios
complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a
antígeno. Los diabodies se describen más detalladamente en, por
ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y otros, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).
Un anticuerpo "aislado" es el que se ha
identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de
su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural
son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico y
terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y
otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones
preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más de un 95% en
peso de anticuerpo según se determina por el método de Lowry, y más
preferiblemente más de un 99% en peso, (2) hasta un grado
suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de
aminoácidos N-terminal o interna mediante la
utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta la
homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones
reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o,
preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye
el anticuerpo in situ en el interior de las células
recombinantes ya que por lo menos un componente del medio natural
del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el
anticuerpo aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de
purificación.
El término "variable" se refiere al hecho
de que ciertas partes de los dominios variables difieren
ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la
unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su
antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está
distribuida uniformemente a lo largo de los dominios variables de
los anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos denominados
regiones determinantes de complementariedad (CDRs) o regiones
hipervariables en los dominios variables tanto de la cadena ligera
como de la cadena pesada. Las partes más altamente conservadas de
dominios variables se denominan regiones estructurales
("framework") (FR). Los dominios variables de cadenas ligeras y
pesadas nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan
ampliamente una configuración de lámina beta, conectadas mediante
tres CDRs, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman
parte de, la estructura de lámina beta. Las CDRs en cada cadena se
mantienen juntas de manera próxima mediante las regiones FR y, con
las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de
unión a antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al.,
NIH Publ. No. 91-3142, Vol. 1, páginas
647-669 (1991)). Los dominios constantes no están
implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno,
pero muestran varias funciones efectoras, tales como la
participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de
anticuerpo.
El término "región hipervariable" cuando se
utiliza en la presente invención hace referencia a los residuos de
aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al
antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos
de una "región determinante de la complementariedad" o
"CDR" (es decir, residuos 24-34 (L1),
50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el
dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1),
50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el
dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of
Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., Public Health Service,
National Institute of Health, Bethesda, MD. [1991]) y/o los residuos
de un "bucle hipervariable" (es decir, residuos
26-32 (L1), 50-52 (L2) y
91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera
y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y
96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada;
Clothia y Lesk, J. Mole. Biol. 196:901-917 [1987]).
Los residuos de "estructura" o "FR" son aquellos residuos
de dominio variable distintos a los residuos de la región
hipervariable tal como se define aquí.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas,
cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como
Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de
anticuerpos de unión a antígeno) que contienen una secuencia mínima
derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los
anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo
receptor) en que los residuos de una CDR del receptor se sustituyen
por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo
dador), tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad,
afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de FR
de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los
correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos
humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el
anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o estructurales
importadas. Estas modificaciones se realizan para refinar
adicionalmente y optimizar la acción del anticuerpo. En general, el
anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de, como
mínimo, uno, y habitualmente dos, dominios variables, en que todas o
sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de las de
una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las
regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El
anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente, como mínimo,
una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina,
habitualmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles,
véase Jones et al., Nature, 321:
522-525 (1986), Reichmann et al.,
Nature 332: 323-329 (1988); y Presta,
Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596
(1992). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo
PRIMATIZED^{TM} en el que la región de unión a antígeno del
anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido mediante la
inmunización de monos macaco con el antígeno de interés.
Tal y como se utiliza en la presente invención,
el término "inmunoadhesina" designa moléculas de tipo
anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína
heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de
dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las
inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de
aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es diferente
del reconocimiento y sitio de unión a antígeno de un anticuerpo (es
decir, es "heterólogo"), y una secuencia de dominio constante
de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de
inmunoadhesina habitualmente es una secuencia de aminoácidos
contigua que comprende por lo menos el sitio de unión de un receptor
o un ligando. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina
en la inmunoadhesina se puede obtener a partir de cualquier
inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1,
IgG-2, IgG-3 o
IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e
IgA-2), IgE, IgD o IgM.
"Activo" o "actividad" para los
objetivos de la presente invención se refiere a una forma o formas
de un polipéptido PRO10282 que conservan una actividad biológica y/o
inmunológica del PRO10282 nativo o natural, donde actividad
"biológica" se refiere a una función biológica (inhibidora o
estimuladora) provocada por un PRO10282 nativo o natural diferente
de la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un
epítopo antigénico que se encuentra en un PRO10282 nativo o natural
y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de
inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico
que se encuentra en un PRO10282 nativo o natural. Una actividad
biológica preferida incluye, por ejemplo, una función en el
crecimiento, desarrollo o diferenciación en respuesta a ácido
retinoico. En base a la estrecha similitud con Stra6, una proteína
murina inducida en respuesta al ácido retinoico, el polipéptido
PRO10282 descrito en la presente invención puede jugar un papel
importante, por ejemplo, en el reconocimiento inicial del miembro
dorsoventral y posteriormente en el control de la osificación
endocondrial. Otra actividad biológica es la implicación en el
desarrollo y crecimiento de tumores.
La "actividad inmunológica" es
preferiblemente la "reactividad cruzada inmunológica" que se
utiliza para dar a entender que el polipéptido candidato es capaz
de inhibir de manera competitiva la actividad biológica cualitativa
de un polipéptido PRO10282 (Stra6) que presenta esta actividad con
antisueros policlonales desarrollado contra el polipéptido PRO10282
(Stra6) activo conocido. Dichos antisueros se preparan de manera
convencional inyectando a cabras o conejos, por ejemplo, de forma
subcutánea, el análogo activo conocido en adyuvante completo de
Freund, seguido de una inyección de refuerzo intraperitoneal o
subcutánea en adyuvante incompleto de Freund. La reactividad
cruzada inmunológica es preferiblemente "específica", lo cual
significa que la afinidad de unión de la molécula identificada que
inmunológicamente reacciona de manera cruzada (por ejemplo, un
anticuerpo), con el correspondiente polipéptido Stra6 es
significativamente mayor (preferiblemente por lo menos
aproximadamente 2 veces, más preferiblemente por lo menos
aproximadamente 4 veces, incluso más preferiblemente por lo menos
aproximadamente 8 veces, lo más preferible por lo menos
aproximadamente 10 veces superior) que la afinidad de unión de esa
molécula con cualquier otro polipéptido nativo conocido.
El término "antagonista" se utiliza en el
sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que parcial o
totalmente bloquea, inhibe o neutraliza una actividad biológica de
un polipéptido PRO10282 nativo descrito en la presente invención.
De forma similar, el término "agonista" se utiliza en el
sentido más amplio e incluye cualquier molécula que mimetiza una
actividad biológica de un polipéptido PRO10282 nativo descrito en la
presente invención. Entre las moléculas agonistas o antagonistas
adecuadas se incluyen específicamente anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos, fragmentos o variantes de secuencias de aminoácidos de
polipéptidos PRO-10282 nativo, péptidos, pequeñas
moléculas orgánicas, agonistas o antagonistas, etc. Los
procedimientos para identificar agonistas o antagonistas de un
polipéptido PRO10282 pueden comprender poner en contacto un
polipéptido PRO10282 con una molécula agonista o antagonista
candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades
biológicas asociadas normalmente con el polipéptido PRO10282.
"Tumor", tal y como se utiliza en la
presente invención, se refiere a todo crecimiento y proliferación
de células neoplásicas, ya sean malignas o benignas, y a todos los
tejidos y células pre-cancerosas y cancerosas.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se
refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos que se
caracteriza habitualmente por un crecimiento celular no regulado.
Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, pero sin limitación, el
carcinoma, el linfoma, el blastoma, el sarcoma y la leucemia. Entre
los ejemplos más particulares de dichos cánceres se incluyen el
cáncer de mama, el cáncer de próstata, el cáncer de colon, el
cáncer de células escamosas, el cáncer de pulmón de células
pequeñas, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer
gastrointestinal, el cáncer pancreático, el glioblastoma, el cáncer
cervical, el cáncer de ovario, el cáncer de hígado, el cáncer de
vejiga, el hepatoma, el cáncer colorrectal, el carcinoma
endométrico, el carcinoma de glándulas salivares, el cáncer de
riñón, el cáncer de hígado, el cáncer de vulva, el cáncer tiroidal,
el carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y
cuello.
"Tratamiento" se refiere tanto al
tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o
preventivas, en el que el objetivo es evitar o ralentizar
(disminuir) la afección o trastorno patológico diana. Entre los
individuos que necesitan un tratamiento se incluyen individuos que
ya padecen el trastorno, así como individuos propensos a padecer el
trastorno o individuos en los cuales va a evitarse el trastorno. En
el tratamiento de tumores (por ejemplo, cáncer), un agente
terapéutico puede disminuir directamente la patología de las células
tumorales o hacer que las células tumorales sean más susceptibles
de tratamiento por otros agentes terapéuticos, por ejemplo,
radiación y/o quimioterapia.
La "patología" del cáncer incluye todos los
fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto incluye,
sin limitación, el crecimiento celular anormal o incontrolado, la
metástasis, la interferencia con el funcionamiento normal de las
células vecinas, la liberación de citoquinas u otros productos
secretores a niveles anómalos, la supresión o la agravación de la
respuesta inflamatoria o inmunológica, etc.
La administración "crónica" se refiere a la
administración del agente o agentes en un modo continuo en
oposición a un modo puntual, para mantener el efecto (actividad)
terapéutico inicial durante un periodo largo de tiempo. La
administración "intermitente" es el tratamiento que no se
realiza de forma consecutiva sin interrupción, sino que es bastante
cíclico en su naturaleza.
El término "mamífero" con el propósito de
tratamiento hace referencia a cualquier animal clasificado como un
mamífero, incluyendo el hombre, los animales domésticos y de
granja, del zoo, los animales deportivos o los animales de
compañía, como los perros, gatos, ternera, caballos, ovejas, cerdos,
cabras, conejos, etc. Preferentemente, el mamífero es el
hombre.
La administración "combinada con" uno o más
agentes terapéuticos adicionales incluye la administración
simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
Los "portadores", tal y como se utilizan en
la presente invención, incluyen portadores, excipientes o
estabilizantes farmacéuticamente aceptables que son no tóxicos para
la célula o al mamífero expuestos a los mismos en las dosis y
concentraciones utilizadas. Frecuentemente, el portador
fisiológicamente aceptable es una solución acuosa tamponada de pH.
Entre los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables se
incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos
orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos
de peso molecular bajo (inferior a aproximadamente 10 residuos);
proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o
inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros
carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes
quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales como
manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como
sodio; y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN^{TM},
polietilenglicol (PEG) y PLURONICS^{TM}.
La palabra "marcador" cuando se utiliza en
la presente invención se refiere a un compuesto o composición
detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo
para generar un anticuerpo "marcado". El "marcador" puede
ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos o
marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático,
puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición
sustrato que es detectable.
Por "fase sólida" se entiende una matriz no
acuosa a la que se puede adherir el anticuerpo de la presente
invención. Entre los ejemplos de fases sólidas que se engloban en la
presente invención se incluyen las formadas parcial o totalmente de
vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por
ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, polivinilalcohol
y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la
fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en
otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de
cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase
sólida discontinua de partículas discretas, tales como las
descritas en la Patente de Estados Unidos No. 4.275.149.
Un "liposoma" es una vesícula pequeña
compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensoactivos
que es útil para la liberación de un fármaco (tal como un
polipéptido PRO10282 o un anticuerpo para el mismo) a un mamífero.
Los componentes del liposoma se disponen habitualmente en una
formación de bicapa, similar a la disposición lipídica de las
membranas biológicas.
Una "molécula pequeña" se define en la
presente invención que tiene un peso molecular por debajo de
aproximadamente 500 Daltons.
Las expresiones "amplificación génica" y
"duplicación génica" se utilizan indistintamente y se refieren
a un proceso mediante el cual se forman múltiples copias de un gen
o fragmento de gen en una célula o línea celular particular. A la
región duplicada (un tramo de ADN amplificado) se hacer referencia a
menudo como "amplicón". Normalmente, la cantidad de ARN
mensajero (ARNm) producido, es decir, el nivel de expresión de
genes también aumenta en la proporción de número de copias
realizadas del gen particular expresado.
El término "agente citotóxico" tal y como
se utiliza en la presente invención se refiere a una sustancia que
inhibe o impide la función de las células y/o provoca la destrucción
de las células. El término pretende incluir isótopos radioactivos
(por ejemplo I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), agentes
quimioterapéuticos, y toxinas tales como las toxinas
enzimáticamente activas de origen bacteriano, micótico, vegetal o
animal o fragmentos de las mismas.
Un "agente quimioterapéutico" es un
compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Entre los
ejemplos de agentes quimioterapéuticos se incluyen adriamicina,
doxorrubicina, epirrubicina, 5-fluorouracilo,
citosina arabinósido ("Ara-C"), ciclofosfamida,
tiotepa, busulfano, citosina, taxoides, por ejemplo paclitaxel
(Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton,
NJ) y doxetaxel (Taxótero, Rh%\hat{o}ne-Poulenc
Rorer, Antony, Francia), toxótero, metotrexato, cisplatino,
melfalán, vinblastina, bleomicina, etopósido, ifosfamida, mitomicina
C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatino,
tenipósido, daunomicina, carminomicina, aminopterina,
dactinomicina, mitomicina, espiromicina (véase la Patente de Estados
Unidos No. 4.675.187), 5-FU,
6-tioguanina, 6-mercaptopurina,
actinomicina D, VP-16, clorambucilo, melfalán y
otras mostazas de nitrógeno relacionadas. También se incluyen en
esta definición agentes hormonales que actúan para regular o inhibir
la acción hormonal sobre tumores, tales como tamoxifeno y
onapristona.
Un "agente inhibidor del crecimiento"
cuando se utiliza en la presente invención se refiere a un compuesto
o una composición que inhibe el crecimiento de una célula,
especialmente una célula cancerosa que sobreexpresa cualquiera de
los genes identificados en la presente invención, ya sea in
vitro o in vivo. De este modo, el agente inhibidor del
crecimiento es aquel que reduce significativamente el porcentaje de
células que sobreexpresan dichos genes en la fase S. Algunos
ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes
que bloquean la progresión del ciclo celular (en un punto diferente
de la fase S), tales como agentes que inducen la interrupción de G1
y la interrupción de la fase M. Algunos bloqueadores clásicos de la
fase M incluyen los vincas (vincristina y vinblastina), taxol e
inhibidores topo II, tales como doxorrubicina, epirrubicina,
daunorrubicina, etopósido, y bleomicina. Los agentes que interrumpen
G1 también afectan a la interrupción de la fase S, por ejemplo,
agentes alquilantes de ADN, tales como por ejemplo tamoxifeno,
prednisona, dacarbazina, mecloroetamina, cisplatino, metotrexato,
5-fluorouracilo, y ara-C. Puede
encontrarse más información en The Molecular Basis of Cancer,
Mendelsohn y Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell cycle
regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" por Murakami
et al., (WB Saunders: filadelfia, 1995), especialmente la
página 13.
"Doxorrubicina" es un antibiótico de
antraciclina. El nombre químico completo de la doxorrubicina es
(8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-\alpha-L-lixo-hexapiranosil)
oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-5,12-naftacenodiona.
El término "citoquina" es un término
genérico para proteínas liberadas por una población de células que
actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Algunos
ejemplos de dichas citoquinas son linfoquinas, monoquinas, y
hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citoquinas se
incluyen hormonas del crecimiento, tales como hormona del
crecimiento humano, hormona del crecimiento humano
N-metionilo, y hormona de crecimiento bovino;
hormona paratiroidal; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina;
prorelaxina; hormonas de glicoproteínas, tales como hormona
estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante de la tiroides
(TSH), y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático;
factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno
placentario; factor \alpha y \beta de necrosis tumoral;
sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina
de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial
vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento
nervioso, tales como NGF-\beta; factor de
crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformante
(TGFs), tales como TGF-\alpha y
TGF-\beta, factor de crecimiento I y II de tipo
insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos;
interferones, tales como interferón-\alpha,
\beta, y \gamma; factores estimulantes de colonias (CSFs),
tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de
granulocito-macrófago (GM-CSF); y
CSF de granulocito (G-CSF); interleuquinas (ILs),
tales como IL-1, IL-1\alpha,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5 IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-11,
IL-12; un factor de necrosis tumoral, tal como
TNF-\alpha o TNF-\beta, y otros
factores de polipéptidos que incluyen LIF y ligando kit (LK). Tal y
como se utiliza en la presente invención, el término citoquina
incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivos de células
recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las
citoquinas de secuencia nativa.
El término "profármaco", tal como se
utiliza en esta solicitud, hace referencia a un precursor o forma
derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos
citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco
parental y es capaz de ser activado enzimáticamente o convertido en
la forma parental más activa. Véase, por ejemplo, Willman, Prodrugs
in Cancer Chemotherapy, Biochemical Society Transactions,
14:375-382, 615th Meeting, Belfast (1986), y Stella
et al., Prodrugs: A Chemical approach to targeted drug
delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.)
pág. 147-267, Humana Press (1985). Los profármacos
de la presente invención incluyen, pero no se limitan a,
profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen
tiosfosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que
contienen péptidos, profármacos modificados por
D-aminoácidos, profármacos glicosilados,
profármacos que contienen \beta-lactama,
profármacos que contienen fenoxiacetamidas opcionalmente
sustituidas o profármacos que contienen fenilacetamidas
opcionalmente sustituidas, profármacos de
5-fluorocitosina y otros profármacos de
5-fluorouridina que pueden convertirse en un fármaco
libre citotóxico más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que
pueden derivarse en profármacos para su utilización en la presente
invención incluyen, pero sin limitación, los agentes
quimioterapéuticos descritos anteriormente.
Una "cantidad efectiva" de un polipéptido
descrito en la presente invención o un antagonista del mismo,
respecto a la inhibición del crecimiento de células neoplásicas, el
crecimiento tumoral o el crecimiento de células cancerosas, es una
cantidad capaz de inhibir, en cierta magnitud, el crecimiento de
células diana. El término incluye una cantidad capaz de provocar un
efecto inhibidor, citostático y/o citotóxico del crecimiento y/o la
apoptosis del crecimiento de las células diana. Una "cantidad
efectiva" de un polipéptido PRO10282 (incluyendo PRO19578) o un
antagonista del mismo para los objetivos de inhibir el crecimiento
de células neoplásicas, crecimiento de células tumorales o
cancerosas se puede determinar empíricamente y de una manera
rutinaria.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva",
en referencia al tratamiento del tumor, se refiere a una cantidad
capaz de provocar uno o más de los efectos siguientes: (1)
inhibición, en cierta magnitud, del crecimiento tumoral,
incluyendo, la ralentización y la completa interrupción del
crecimiento; (2) la reducción en el número de células tumorales;
(3) la reducción en el tamaño del tumor; (4) la inhibición (es
decir, la reducción, la ralentización o la completo interrupción)
de la infiltración de células tumorales en los órganos periféricos;
(5) la inhibición (es decir, la reducción, la ralentización o la
completo interrupción) de metástasis; (6) aumento de la respuesta
inmune antitumoral, lo cual puede, aunque no es requisito, dar como
resultado la regresión o el rechazo del tumor; y/o (7) alivio, en
cierta magnitud, de uno o más síntomas asociados con el trastorno.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de un antagonista del
polipéptido PRO10282 para propósitos de tratamiento del tumor puede
determinarse empíricamente y de una manera rutinaria.
Una "cantidad inhibidora del crecimiento"
de un antagonista de PRO10282 es una cantidad capaz de inhibir el
crecimiento celular, especialmente tumoral, por ejemplo, las células
cancerosas, ya sea in vivo o in vitro. Una
"cantidad citotóxica" de un antagonista de PRO10282 con el
propósito de inhibir el crecimiento de células neoplásicas puede
determinarse empíricamente y de una manera rutinaria.
Una "cantidad citotóxica" de un antagonista
de PRO10282 es una cantidad capaz de causar la destrucción de una
célula, especialmente tumoral, por ejemplo las células cancerosas,
ya sea in vitro o in vivo. Una "cantidad
citotóxica" de un antagonista de PRO10282 con el propósito de
inhibir el crecimiento de células neoplásicas puede determinarse
empíricamente y de una manera rutinaria.
"Oligodesoxinucleótidos antisentido" u
"oligonucleótidos antisentido" (cuyos términos se utilizan
indistintamente) se definen como moléculas de ácido nucleico que
pueden inhibir la transcripción y/o traducción de genes diana de
una manera específica de la secuencia. El término "antisentido"
se refiere al hecho de que el ácido nucleico es complementario a la
secuencia genética codificante (sentido) del gen diana. Los
oligonucleótidos antisentido se hibridan en una orientación
antiparalela al ARNm naciente a través del emparejamiento de bases
de Watson-Crich. Mediante la unión al molde de ARNm
diana, los oligonucleótidos antisentido bloquean la traducción
satisfactoria de la proteína codificada. El término incluye
específicamente agentes antisentido denominados "ribozomas"
que se han designado para inducir la división catalítica de un ARN
diana mediante la adición de una secuencia que tiene actividad
auto-"splicing" natural (Warzocha y Wotowiec, "Antisense
strategy biological utility and prospects in the treatment of
hematological malignancies." Leuk. Lymphoma 24:
267-281 [1997]).
La presente solicitud proporciona secuencias de
nucleótidos recientemente identificadas y aisladas que codifican
los polipéptidos a los que se refiere la presente solicitud como
PRO10282 (o también UN03126) y PRO19578 humanos de secuencia
nativa, respectivamente. En particular, se ha identificado y aislado
el ADNc que codifica los polipéptidos PRO10282 y PRO19578 humanos
nativos tal y como se detalla en los Ejemplos siguientes. Cabe
indicar que las proteínas producidas en rondas separadas de
expresión pueden dar diferentes números de PRO, pero el número UNQ
es único para cualquier ADN determinado y la proteína codificada y
no cambiará. Sin embargo, para simplificar, en la presente memoria
la proteína codificada por
DNA148380-2827-1, así como todas
las homólogas nativas y variantes incluidas en la anterior
definición de PRO10282, serán referidas como "PRO10282" con
independencia de su origen y forma de preparación. El polipéptido
codificado por DNA148380-2827-1, que
es una variante nativa de "PRO10282", se le hará referencia
específicamente como "PRO19578".
Tal y como se describe en los Ejemplos
posteriores, se han depositado varias clones de ADNc denominados en
la presente invención como
DNA-148380-2827 y
DNA143389-2827-1 con el ATCC. La
secuencia de nucleótidos real del clon se puede determinar
fácilmente por un experto en la materia mediante la secuenciación
del clon depositado utilizando procedimientos rutinarios en la
técnica. La secuencia de aminoácidos prevista se puede determinar a
partir de la secuencia de nucleótidos utilizando medios rutinarios.
Para los polipéptidos PRO10282 y PRO19578 humanos nativos de
longitud completa y los ácidos nucleicos codificantes descritos en
la presente invención, los solicitantes han identificado lo que se
cree que es el mejor marco de lectura identificable con la
información de la secuencia disponible en el momento.
Utilizando el programa informático de alineación
de secuencias ALIGN-2 al que se hace referencia
anteriormente, se ha observado que el PRO10282 de secuencia nativa
y longitud completa (mostrado en la figuras 2 y de SEC ID No. 2)
tiene cierta identidad en la secuencia de aminoácidos con Stra6, una
proteína murina inducida en la respuesta a ácido retinoico
(AF062476). Por consiguiente, actualmente se cree que el polipéptido
PRO10282 descrito en la presente solicitud es un miembro
recientemente identificado de la familia de proteínas Stra6 y puede
poseer una o más actividades biológicas y/o inmunológicas o
propiedades habituales de esta familia de proteínas. Se cree que el
PRO19578 es una variante "spliced" de manera alternativa del
PRO10282 nativo humano de longitud completa que tiene 9 aminoácidos
(SPVDFLAGD) eliminado en las posiciones 89-97 de la
secuencia de aminoácidos de PRO10282 nativa humana y contiene Ile
(I) en lugar de Met (M) en la posición 518 que corresponde a la
posición 527 de PRO10282. Esto indica que Stra6 puede ser
polimórfico.
En la presente invención se describen dos
polipéptidos Stra6 específicos humanos de secuencia nativa. Tal
como se ha indicado anteriormente, se cree que PRO19578 es una
variante nativa "spliced" de manera alternativa del PRO10282
humano de secuencia nativa y es, por tanto, una "variante de
PRO10282". Además de los polipéptidos PRO10282 y PRO19578 de
secuencia nativa de longitud completa descritos en la presente
invención, se contempla que se pueden preparar variantes de
PRO10282 y PRO19578. Las variantes de PRO10282 y PRO19578 se pueden
preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN
de PRO10282 o PRO19578, y/o mediante la síntesis de la variante del
polipéptido PRO10282 deseado. Los expertos en la materia entenderán
que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos
post-traduccionales de PRO10282 o PRO19578, tales
como el cambio del número o la posición de los sitios de
glicosilación o la alteración de las características de anclaje a
la
membrana.
membrana.
Las variaciones en PRO10282 O PRO19578 de
secuencia nativa de longitud completa o en varios dominios del
PRO10282 o PRO19578 descritos en la presente invención, se pueden
realizar, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y
directrices para mutaciones conservativas y no conservativas
establecidas, por ejemplo, en la Patente USA 5.364.934. Las
variaciones pueden ser una sustitución, una eliminación o una
inserción de uno o más codones que codifican el PRO10282 o PRO19578
que dan lugar a un cambio en la secuencia de aminoácidos del
PRO10282 o PRO19578 en comparación con el PRO10282 o PRO19578 de
secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es por sustitución de
por lo menos un aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o
más de los dominios del PRO10282 o PRO19578. Al determinar qué
residuo de aminoácido se puede insertar, sustituir o eliminar sin
afectar de forma adversa la actividad deseada, se puede encontrar
una guía mediante la comparación de la secuencia del PRO10282 o
PRO19578 con la de las moléculas de proteínas conocidas homólogas y
minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos
realizados en regiones con elevada homología. Las sustituciones de
aminoácidos pueden ser el resultado de la sustitución de un
aminoácido por otro aminoácido que tiene una estructura y/o
propiedades químicas similares, tales como la sustitución de una
leucina por una serina, es decir, sustituciones de aminoácidos
conservativos. Las inserciones o eliminaciones pueden estar
opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos.
La variación permitida se puede determinar realizando
sistemáticamente inserciones, eliminaciones o sustituciones de
aminoácidos en la secuencia y probando en las variantes resultantes
la actividad mostrada por la secuencia nativa de longitud completa o
madura.
En la presente invención se proporcionan
fragmentos de polipéptido PRO10282. Dichos fragmentos se pueden
truncar en el extremo N-terminal o
C-terminal, o pueden carecer de residuos internos,
por ejemplo, cuando se compara con una proteína nativa de longitud
completa. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que
no son esenciales para una actividad biológica deseada del
polipéptido PRO10282 o PRO19578.
Los fragmentos de PRO10282 o PRO19578 se pueden
preparar mediante cualquiera de un grupo de técnicas
convencionales. Los fragmentos de péptidos deseados se pueden
sintetizar químicamente. Un enfoque alternativo implica la
generación de fragmentos de PRO10282 o PRO19578 mediante digestión
enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con una enzima
conocida para dividir proteínas en los sitios definidos por residuos
de aminoácidos particulares o mediante la digestión del ADN con
enzimas de restricción adecuadas y el aislamiento del fragmento
deseado. Otra técnica adecuada implica el aislamiento y la
amplificación de un fragmento de ADN que codifica un fragmento de
polipéptido deseado, mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Los oligonucleótidos que definen los extremos deseados del
fragmento de ADN se utilizan en los cebadores del extremo 5' y 3' en
la PCR. Preferiblemente, los fragmentos de polipéptido PRO10282 o
PRO19578 comparten por lo menos una actividad biológica y/o
inmunológica con el polipéptido PRO10282 o PRO19578 nativo mostrado
en la figura 2 (SEC ID No. 2).
En realizaciones particulares, las sustituciones
conservativas de interés se muestran en la Tabla 1 bajo el
encabezamiento de sustituciones preferidas. Si dichas sustituciones
dan lugar a un cambio en la actividad biológica, entonces se
introducen más cambios sustanciales, denominados sustituciones de
ejemplo en la Tabla 1, o tal y como se describen posteriormente en
referencia a las clases de aminoácidos, y se criban los
productos.
Las modificaciones sustanciales en la identidad
funcional o inmunológica del polipéptido PRO10282 se llevan a cabo
mediante la selección de las sustituciones que difieren
significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura del
esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo,
como conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad
de la molécula en el sitio diana, o (c) el conjunto de la cadena
lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos en base a las
propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrofóbica: norleucina, met, ala, val, leu,
ile;
(2) hidrofílica neutra: cys, ser, thr;
(3) ácida: asp, glu;
(4) básica: asn, gln, his, lys, arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de
la cadena: gly, pro; y
(6) aromática: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas comprenderán
el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Dichos residuos sustituidos también se pueden introducir en sitios
de sustitución conservativa o, más preferiblemente, en los sitios
restantes (no conservados).
Las variaciones se pueden realizar utilizando
procedimientos conocidos en la técnica tales como la mutagénesis
mediada por oligonucleótidos (dirigida de sitio), el rastreo de
alanina, y mutágenesis por PCR. Para producir el ADN variante de
PRO10282 se puede llevar a cabo sobre el ADN clonado una mutagénesis
dirigida de sitio [Carter et al., Nucl. Acids. Res., 13:
4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids. Res., 10: 6487
(1987)], mutagénesis de cassette [Wells et al., Gene, 34 315
(1985)], mutagénesis de selección de restricción [Wells et
al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras
técnicas conocidas.
El análisis de aminoácido por rastreo también se
puede utilizar para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de
una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de rastreo preferidos
están los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Entre dichos
aminoácidos se incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. En este
grupo la alanina es habitualmente un aminoácido de rastreo
preferido ya que elimina la cadena lateral más allá del carbono
beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena
principal de la variante [Cunninghan y Wells, Science,
244:1081-1085 (1989)]. La alanina es también
habitualmente preferida ya que es el aminoácido más habitual.
Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones escondidas
como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman and Co.,
N.Y.), Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de
alanina no produce cantidades adecuadas de variante, se puede
utilizar un aminoácido isotérico.
Son posibles modificaciones covalentes de
PRO10282 y variantes de PRO10282, incluyendo PRO19578. Un tipo de
modificación covalente incluye la reacción de residuos de
aminoácidos marcados de un polipéptido PRO10282 con un agente
derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas
laterales seleccionadas o los residuos N- o
C-terminales del PRO10282. La derivatización con
agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular PRO10282
con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su
utilización en el procedimiento para purificar anticuerpos
anti-PRO10282, y viceversa. Entre los agentes de
entrecruzamiento utilizados habitualmente se incluyen, por ejemplo,
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida,
por ejemplo, ésteres con ácido 4-azido salicílico,
imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres
disuccinimidílicos, tales como
3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato),
maleimidas bifuncionales, tales como
bis-N-maleimido-1,8-octano
y agentes, tales como
metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen la desamidación de
residuos glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos
glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina
y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o
treonilo, metilación de los grupos \alpha-amino de
las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina [T.E.
Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.
Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86
(1983)], acetilación de la amina N-terminal, y la
amidación de cualquier grupo carboxilo
C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente de los
polipéptidos PRO10282 comprende la alteración del patrón de
glicosilación nativo del polipéptido. Los polipéptidos PRO10282 y
PRO10578 de secuencia nativa contienen un sitio de glicosilación de
unión a N en las posiciones 8-12 de su secuencia de
aminoácidos. Por "alteración del patrón de glicosilación
nativo" para los objetivos de la presente invención se pretende
indicar la eliminación de uno o más grupos carbohidratos hallados
en PRO10282 o PRO19578 de secuencia nativa (mediante la eliminación
del sitio de glicosilación subyacente o mediante la eliminación de
la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o la
adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes
en el PRO10282 o PRO19578 de secuencia nativa. Además, la expresión
incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas
nativas, implicando un cambio en la naturaleza y proporciones de los
diversos grupos de carbohidrato presentes.
La adición de sitios de glicosilación a un
polipéptido PRO10282 nativo o variante se puede realizar alterando
la secuencia de aminoácidos. La alteración se puede realizar, por
ejemplo, mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más
residuos de serina o treonina al PRO10282 de secuencia nativa (para
sitios de glicosilación unidos a O). La secuencia de aminoácidos de
PRO10282 puede alterarse opcionalmente a través de los cambios a
nivel de ADN, particularmente mediante la mutación del ADN que
codifica el polipéptido PRO10282 en bases preseleccionadas, de
manera que los codones que se generan se traducirán en los
aminoácidos deseados.
Otros medios para aumentar el número de grupos
carbohidrato en el polipéptido PRO10282 es mediante acoplamiento
químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Dichos
procedimientos están descritos en la técnica, por ejemplo, en WO
87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y
Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306
(1981).
La eliminación de grupos carbohidrato presentes
en el polipéptido PRO10282 se puede realizar química o
enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que
codifican los residuos de aminoácidos que actúan como dianas para
la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación químicas son
conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por
Hakimuddin, et. al. Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y
por Edge, et al. Anal. Biochem., 118:131 (1981). La división
enzimática de grupos carbohidrato del polipéptido se puede
conseguir mediante la utilización de un conjunto de endoglicosidasas
y exoglicosidasas tal y como se describe en Thotakura et al.
Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente de PRO10282
comprende la unión del polipéptido PRO10282 a uno de un conjunto de
polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG),
polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la forma establecida en
las Patentes de Estados Unidos Nos: 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144;
4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
Los polipéptidos PRO10282 también se puede
modificar de manera que forma una molécula quimérica que comprende
PRO10282 fusionado a otro polipéptido o secuencia de aminoácidos
heteróloga.
En una realización, dicha molécula quimérica
puede comprender una fusión del PRO10282 con un polipéptido
etiqueta que proporciona un epítopo al que se puede unir
selectivamente un anticuerpo anti-etiqueta. El
epítopo-etiqueta se sitúa generalmente en el
extremo terminal amino o carboxilo del PRO10282. La presencia de
dichas formas epítopo etiquetadas del PRO10282 se pueden detectar
utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la
disposición del epítopo etiqueta permite que el PRO10282 se
purifique fácilmente mediante purificación por afinidad utilizando
un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de
afinidad que se une al epítopo etiqueta. En la técnica se conocen
varios polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos. Entre
los ejemplos se incluyen etiquetas de
poli-histidina (poli-his) o
poli-histidina-glicina
(poli-his-gly); el polipéptido
etiqueta de gripe HA y su anticuerpo 12C45 [Field et al.,
Mol. Cell. Biol., 8: 2159-2165 (1988)]; la etiqueta
c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y
9E10 de la misma [Evan et al., Molecular and Cellular
Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de
gliproteína D (gD) del virus del Herpes Simplex y su anticuerpo
[Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6):
547-553 (1990)]. Entre otros polipéptidos etiqueta
se incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology,6:
1204-1210 (1988)]; el péptido epítopo KT3 [Martin
et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; un
péptido epítopo de \alpha-tubulina [Skinner et
al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)];
y el péptido etiqueta de la proteína T7 del gen 10
[Lutz-Freyemuth et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)].
En una realización alternativa, la molécula
quimérica puede comprender una fusión del PRO10282 con una
inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para
una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como
"inmunoadhesina"), dicha fusión podría ser a la región Fc de
una molécula de IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferiblemente la
sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana eliminado o
inactivado) de un polipéptido PRO10282 en lugar de por lo menos una
región variable de una molécula de Ig. De manera particularmente
preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye la bisagra, CH2 y
CH3, o la bisagra, regiones CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1.
Para la producción de fusiones de inmunoglobulinas, véase también
la Patente de USA No. 5.428.130 concedida el 27 de junio de
1995.
La siguiente descripción se refiere
principalmente a la producción de polipéptidos PRO10282 (Stra6) de
secuencia nativa y variantes, incluyendo específicamente PRO19578,
mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un
vector que contiene ácido nucleico de PRO10282. Naturalmente, se
prevé que se puedan utilizar procedimientos alternativos, que se
conocen bien en la técnica, para preparar PRO10282. Por ejemplo, la
secuencia de PRO10282, o partes de la misma, se pueden producir
mediante síntesis directa de péptidos utilizando técnicas de fase
sólida [véase, por ejemplo, Stewan et al.,
Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman
Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem.
Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. La síntesis
de proteínas in vitro se puede realizar utilizando técnicas
manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada se
puede realizar, por ejemplo, utilizando un Applied Biosystems
Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando las instrucciones
del fabricante. Se pueden sintetizar químicamente varias partes del
PRO10282 por separado y combinarse utilizando procedimientos
químicos o enzimáticos para producir PRO10282 de longitud
completa.
El ADN que codifica PRO10282 se puede obtener a
partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que
se cree que posee el ARNm de PRO10282 y expresarlo a un nivel
detectable. Por consiguiente, el ADN de PRO10282 humano se puede
obtener convenientemente a partir de una biblioteca de ADNc
preparada a partir de tejido humano, tal como se describe en los
Ejemplos. El gen que codifica PRO10282 también se puede obtener a
partir de una biblioteca genómica o mediante procedimientos
sintéticos conocidos (por ejemplo, síntesis de ácidos nucleicos
automatizada).
Las bibliotecas se pueden cribar con sondas
(tales como anticuerpos para PRO10282 u oligonucleótidos de por lo
menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para
identificar el gen de interés o la proteína codificada por el
mismo. El cribado del ADNc o biblioteca genómica con la sonda
seleccionada se puede realizar utilizando procedimientos estándar,
tal como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica PRO10282
es utilizar la metodología de PCR [Sambrook et al.,
supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Los siguientes Ejemplos describen técnicas para
cribar una biblitoeca de ADNc. Las secuencias de oligonucleótidos
seleccionadas como sondas deberían ser de longitud suficiente y
suficientemente inequívocas para minimizar los falsos positivos. El
oligonucleótido está preferiblemente marcado de manera que se puede
detectar tras la hibridación a ADN en la biblioteca que se criba.
Los procedimientos de marcado son bien conocidos en la técnica, e
incluyen la utilización de radiomarcadores como ATP marcado con
^{32}P, biotinilación o marcaje enzimático. Las condiciones de
hibridación, incluyendo la rigurosidad moderada y la rigurosidad
elevada, se proporcionan en Sambrook et al.,
supra.
Las secuencias identificadas en dichos
procedimientos de cribado de bibliotecas se pueden comparar y
alinear con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en
los bancos de datos públicos, tales como el Banco de Genes u otros
bancos de datos de secuencias. La identidad en la secuencia (a nivel
de aminoácido o nucleótido) en las regiones definidas de la
molécula o a lo largo de la secuencia de longitud completa se puede
determinar utilizando procedimientos conocidos en la técnica y tal y
como se describen en la presente invención.
El ácido nucleico que tiene la secuencia de
codificación de la proteína se puede obtener mediante el cribado
del ADNc seleccionado o las bibliotecas genómicas utilizando la
secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente invención
por primera vez, y, si es necesario, utilizando procedimientos
convencionales de extensión con cebadores tal y como se describe en
Sambrook et al., supra, para detectar precursores e
intermedios de procesamiento de ARNm que no se han transcrito de
forma inversa en ADNc.
Las células huésped se transfectan o transforman
con vectores de expresión o clonación descritos en la presente para
la producción de PRO10282 y se cultivan en medios nutrientes
convencionales modificados para que sean adecuados para inducir
promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que
codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo,
tales como el medio, la temperatura, el pH y similares, se pueden
seleccionar por un técnico en la materia sin una experimentación
excesiva. En general, los principios, protocolos y técnicas
prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares se
pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical
Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al.,
supra.
Los procedimientos de transfección de células
eucariotas y transformación de células procariotas son conocidos
por el técnico en la materia, por ejemplo, CaCl_{2}, CaPO_{4},
mediados por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula
huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas
estándar adecuadas para dichas células. El tratamiento con calcio
que utiliza cloruro cálcico, tal y como se describe en Sambrook
et al., supra, o la electroporación se utilizan
generalmente para procariotas. La infección con Agrobacterium
tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células
vegetales, tal como se describe en Shaw et al., Gene, 23:315
(1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las
células de mamíferos sin dichas paredes celulares, se puede
utilizar el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de
Graham y van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978).
En la Patente de Estados Unidos No. 4.399.216 se han descrito
aspectos generales de transfecciones de sistemas de células huésped
de mamíferos. Las transformaciones en la levadura se llevan a cabo
habitualmente según el procedimiento de Van Solingen et al.,
J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también se pueden utilizar
otros procedimientos para introducir ADN en células, tales como
mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de
protoplasto bacteriano con células intactas, o policationes, por
ejemplo, polibreno, poliornitina. Para varias técnicas para
transformar células de mamífero, ver Keown et al., Methods in
enzymology, 185:527-537 (1990) y Manssur et
al., Nature, 336. 348-352 (1988).
Entre las células huésped adecuadas para la
clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente
invención se incluyen células procariotas, de levadura, o eucariotas
superiores. Entre las procariotas adecuadas se incluyen, pero no se
limitan a, eubacterias, tales como organismos
Gram-negativo o Gram-positivo, por
ejemplo, Enterobacteriaceae, tal como E. coli. Varias cepas
de E. coli están disponibles públicamente, tales como la
cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776
(ATCC 31.537); cepa de E. coli W3110 (ATCC 27.325) y K5772
(ATCC 53.635). Entre otras células huésped procariotas adecuadas se
incluyen Enterobacteriaceae, tales como Escherichia, por
ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus,
Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium,
Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y
Shigella, así como Bacilli, tal como B.
subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B.
licheniformis 41P descrito en DD 266.710 publicada el 12 de
abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa, y
Streptomyces. Estos ejemplos son más ilustrativos que
limitantes. La cepa W3110 es un huésped o huésped parental
particularmente preferible ya que es una cepa huésped para
fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente,
la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas
proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 se puede modificar para
realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas
endógenas al huésped, con ejemplos de dichos huéspedes incluyendo
la cepa de E. coli W3110 1A2, que tiene el genotipo completo
tonA; la cepa de E. coli W3110 9E4, que tiene el
genotipo completo tonA ptr3; la cepa de E. coli
W3110 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo
tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP
ompT kan'; la cepa de E. coli W3110 37D6, que tiene el
genotipo completo tonA ptr3 phoA E15
(argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan'; la
cepa de E. coli W3110 40B4, que es una cepa 37D6 con una
mutación por eliminación degP no resistente a kanamicina; y
una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante
descrita en la Patente de Estados Unidos No. 4.946.783 concedida el
7 de agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados procedimientos
de clonación in vitro, por ejemplo, PCR u otras reacciones de
ácido nucleico polimerasa.
Además de los procariotas, los microbios
eucariotas, tales como hongos o levaduras filamentosos, son
huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que
codifican PRO10282. El Saccharomyces cerevisiae es un
microorganismo huésped eucariótico inferior utilizado habitualmente.
Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse,
Nature, 290: 140 [1981]; EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985);
huéspedes Kluyveromyces (Patente de Estados Unidos No.
4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology,
9:968-975 (1991)) tal como, por ejemplo, K.
lactis (MW98-8C, CBS683, CBS574; Louvencourt
et al. J. Bacterial., 154(2):737-742
[1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus
(ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii
(ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg
et al., Bio/Technology, 8:135(1990)), K.
thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226);
Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J.
Basic. Microbiol. 28:265-278 [1988]);
Candida; Trichoderma recia (EP 244.234); Neurospora
crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces, tales
como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538, publicada el
31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos, tales como, por
ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357
publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus,
tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilbum
et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:
1470-1474 [1984]) y A. Niger (Nelly y Hynes,
EMBO J., 4:475-479 [1985]). Las levaduras
metiltrópicas son adecuadas en la presente invención e incluyen,
pero no se limitan a, levadura capaz del crecimiento en metanol
seleccionado del género que consiste en Hansenula, Candida,
Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y
Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son
ejemplos de esta clase de levaduras se puede encontrar en C.
Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
Las células huésped adecuadas para la expresión
de PRO10282 glicosilado se derivan de organismos multicelulares.
Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células
de insectos, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como
células vegetales. Entre los ejemplos de líneas de células huésped
de mamíferos útiles se incluyen células de ovario de hámster chino
(CHO) y células COS. Algunos ejemplos más específicos incluyen la
línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40
(COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón de embrión
humano (células 293 o células 293 subclonadas para el crecimiento
en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol.,
36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub
y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de
sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod.,
23:243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138,
ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y tumor
mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCl51). La selección de la
célula huésped apropiada se estima que está dentro de la
técnica.
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN
genómico), que codifica un PRO10282 se puede insertar en un vector
replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la
expresión. Existen varios vectores disponibles públicamente. El
vector puede estar, por ejemplo, en forma de plásmido, cósmido,
partícula viral, o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada
se puede insertar en el vector mediante una serie de procedimientos.
En general, el ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa
de restricción apropiados utilizando técnicas conocidas en el
sector. Los componentes de los vectores incluyen generalmente, pero
no se limitan a, una o más secuencias señal, un origen de
replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un
promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. La
construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos
componentes utiliza técnicas de unión estándar que son conocidas por
un técnico en la materia.
El PRO10282 se puede producir recombinantemente
no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión
con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u
otro polipéptido que tiene un sitio de división específico en el
extremo N-terminal de la proteína o polipéptido
maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del
vector, o puede ser una parte del ADN que codifica el PRO10282 que
se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia
señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de las
secuencias líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1pp o
enterotoxina II estable térmicamente. Para la secreción en
levaduras, la secuencia señal puede ser, por ejemplo, la secuencia
líder de invertasa de levadura, la secuencia líder del factor alfa
(incluyendo las secuencias líderes del factor \alpha de
Saccharomyces y Kluyveromyces, el último descrito en
la Patente de Estados Unidos No. 5.010.182), o la secuencia líder
de fosfatasa ácida, la secuencia líder de C. Albicans
glucoamilasa (EP 362.179 publicada el 4 de abril de 1990) o la
señal descrita en WO 90/13646, publicada el 15 de noviembre de
1990. En la expresión de células de mamíferos, las secuencias señal
de mamíferos se pueden utilizar para dirigir la secreción de la
proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de
la misma especie o especies relacionadas, así como secuencias
líderes virales secretoras.
Ambos vectores de expresión y clonación
contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite la
replicación del vector en una o más células huésped seleccionadas.
Dichas secuencias son conocidas para un conjunto de bacterias,
levaduras, y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322
es adecuado para la mayoría de bacterias
gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es
adecuado para la levadura, y orígenes virales varios (SV40,
polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de
clonación en células de mamíferos.
Los vectores de clonación y expresión contendrán
habitualmente un gen de selección, también denominado como marcador
seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas
que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por
ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b)
complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran
nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo,
el gen que codifica D-alanina racemasa para
Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para células de mamíferos son aquéllos que permiten la
identificación de células competentes para captar el ácido nucleico
que codifica PRO10282, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula
huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea
de células CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y
propagada tal y como se describe por Urlaub et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección
adecuado para su utilización en la levadura es el gen trp1
presente en el plásmido de la levadura YRp7 [Stinchcomb et
al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al.,
Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene,
10:157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de
selección para una cepa mutante de levadura que carece de la
capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o
PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Los vectores de clonación y expresión contienen
habitualmente un promotor unido operativamente a la secuencia de
ácido nucleico que codifica PRO10282 para dirigir la síntesis de
ARNm. Se conocen promotores reconocidos por un conjunto de células
huésped potenciales. Entre los promotores adecuados para utilizar
con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas de promotores de
\beta-lactamasa y lactosa [Chang et al.,
Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544
(1979)], fosfatasa alcalina, un sistema de promotores de triptófano
(trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776], y
promotores híbridos, tales como el promotor tac [deBoer et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25
(1983)]. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos
también contendrán una secuencia de Shine-Dalgamo
(S.D.) unida operativamente al ADN que codifica PRO10282.
Entre los ejemplos de secuencias promotoras
adecuadas para su utilización con huéspedes de levadura se incluyen
promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman
et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otros enzimas
glicolíticos [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);
Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levaduras, que son
promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una
transcripción controlada mediante condiciones de crecimiento, son
las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo
C, fosfatasa ácida, enzimas degradativos asociados con el
metabolismo del nitrógeno, metalotioneina,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa
y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para la
utilización en la expresión en levaduras se describen adicionalmente
en EP 73.657.
La transcripción de PRO10282 desde vectores en
células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, mediante
promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como virus del
polioma, virus de la viruela aviar (Patente del Reino Unido
2.211.504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el
Adenovirus 2), el virus de papiloma bovino, virus del sarcoma
aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la
hepatitis-B y virus de simio 40 (SV40), de
promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de
actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque
térmico, siempre y cuando dichos promotores sean compatibles con
los sistemas de células huésped.
Se puede incrementar la transcripción de un ADN
que codifica el PRO10282 por eucariotas superiores mediante la
inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los
potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN, habitualmente
aproximadamente de 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para
aumentar su transcripción. Actualmente, se conocen muchas
secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa,
albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina).
Habitualmente, sin embargo, se utilizará un potenciador de un virus
de célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador
de SV40 en la cara tardía del origen de replicación (pb
100-270), el potenciador de promotor temprano de
citomegalovirus, el potenciador de polioma en la cara tardía del
origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El potenciador
se puede cortar y empalmar ("splice") en el vector en una
posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia codificante de
PRO10282, pero se sitúa preferiblemente en un sitio 5' con respecto
al promotor.
\newpage
Los vectores de expresión utilizados en células
huéspedes eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas,
animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos
multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la
terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm.
Dichas secuencias están disponibles habitualmente de las regiones
no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADNs o ADNcs eucariotas o
virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos
transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida
del ARNm que codifica PRO10282.
En Gething et al., Nature,
293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature,
281:40-46 (1979); EP 117.060 y EP 117.058 se
describen adicionalmente otros procedimientos, vectores, y células
huésped adecuados para la adaptación a la síntesis de PRO10282 en
cultivos de células de vertebrados recombinantes.
La amplificación y/o expresión génica se puede
medir en una muestra directamente, por ejemplo, mediante
transferencia Southern convencional, transferencia Northern
convencional para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205
(1980)], transferencia de manchas ("blots") (análisis de ADN),
o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada
apropiadamente, basada en las secuencias proporcionadas en la
presente invención. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos
que pueden reconocer cadenas dobles específicas, incluyendo cadenas
dobles de ADN, cadenas dobles de ARN, cadenas dobles híbridas de
ADN-ARN o cadena doble de
ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden
marcar y el ensayo se puede llevar a cabo cuando la cadena doble
está unida a una superficie, de manera que tras la formación de la
cadena doble en la superficie, se puede detectar la presencia de
anticuerpo unido a la cadena doble.
Alternativamente, la expresión génica se puede
medir mediante procedimientos inmunológicos, tales como tinción
inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo de
cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar
directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos
útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de fluidos de
muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden preparar
en cualquier mamífero. De manera conveniente, los anticuerpos se
pueden preparar contra un polipéptido PRO10282 de secuencia nativa
o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN
proporcionadas en la presente invención o contra una secuencia
exógena fusionada a ADN de PRO10282 y que codifica un epítopo de
anticuerpo específico.
Las formas de PRO10282 se pueden recuperar del
medio de cultivo o de los lisatos de células huésped. Si está unido
a membrana, se puede liberar de la membrana utilizando una solución
de detergente adecuada (por ejemplo, Triton X-100)
o mediante división enzimática. Las células utilizadas en la
expresión de PRO10282 se pueden destruir mediante diversos medios
físicos o químicos, tales como ciclos de
congelación-descongelación, sonicación, destrucción
mecánica, o agentes para lisar células.
Se puede desear purificar PRO10282 a partir de
proteínas o polipéptidos de células recombinantes. Los siguientes
procedimientos son ejemplos de procedimientos de purificación
adecuados: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio
iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa;
cromatografía sobre sílice o una resina de intercambio catiónico,
tal como DEAE; "cromatofocusing"; SDS-PAGE;
precipitación con sulfato amónico; filtración en gel utilizando,
por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A
sefarosa para eliminar contaminantes, tales como IgG, y columnas
quelantes de metales para unir formas etiquetadas con epítopo del
PRO10282. Se pueden utilizar varios métodos de purificación de
proteínas y dichos métodos son conocidos en la técnica y se
describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology,
182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and
Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). La
etapa o etapas de purificación seleccionadas dependerán, por
ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y el
PRO10282 concreto producido.
La presente invención se basa en la
identificación y caracterización de genes que se amplifican en
ciertas células cancerosas.
El genoma de organismos procariotas y eucariotas
está sometido aparentemente a dos requisitos en conflicto. El
primero es la conservación y propagación del ADN como información
genética en su forma original, para garantizar la herencia estable
a través de múltiples generaciones. Por otro lado, las células u
organismos han de ser capaces de adaptarse a cambios ambientales
constantes. Los mecanismos adaptativos pueden incluir modificaciones
cualitativas o cuantitativas del material genético. Las
modificaciones cualitativas incluyen las mutaciones de ADN, en las
que las secuencias codificantes son alteradas dando lugar a una
proteína estructural y/o funcionalmente diferente. La amplificación
génica es una modificación cuantitativa, por la cual la cantidad
real de secuencia codificante completa, es decir un gen, aumenta,
llevando a un aumento en el número de moldes disponibles para la
transcripción, un número aumentado de transcritos traducibles y,
finalmente, a un aumento en la abundancia de la proteína codificada
por el gen amplificado.
El fenómeno de la amplificación génica y sus
mecanismos subyacentes han sido investigados in vitro en
varios sistemas de cultivo de procariotas y ecuariotas. El ejemplo
mejor caracterizado de amplificación génica se refiere al cultivo
de células eucariotas en medio que contienen concentraciones
variables del fármaco citotóxico, metotrexato (MTX). El MTX es un
análogo del ácido fólico e interfiere en la síntesis de ADN al
bloquear la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR). Durante la
exposición inicial a bajas concentraciones de MTX, la mayoría de
las células (>99,9%) morirán. Un pequeño número de células
sobreviven y son capaces de crecer en concentraciones crecientes de
MTX al producir cantidades mayores de DHFR-ARN y
proteína. La base de esta sobreproducción es la amplificación del
gen único de DHFR. Las copias adicionales del gen se encuentran en
copias extracromosómicas en forma de pequeños cromosomas
supernumerarios (dobles minutos) o como copias cromosómicas
integradas.
La amplificación génica se observa generalmente
el desarrollo de la resistencia a compuestos citotóxicos
(antibióticos para bacterias y agentes quimioterapéuticos para
células eucariotas) y la transformación neoplásica. La
transformación de células eucariotas como un acontecimiento
espontáneo o debido a una agresión viral o químico/ambiental está
asociada habitualmente a cambios en el material genético de esas
células. Uno de los cambios genéticos observados más habitualmente
en tumores malignos en humanos son las mutaciones de la proteína
p53. La proteína p53 controla la transición de células de la fase
estacionaria (G1) a la fase replicativa (S) y evita esta transición
en presencia de daño en el ADN. En otras palabras, una de las
consecuencias principales de la inutilización de mutaciones de p53
es la acumulación y propagación del daño en el ADN, por ejemplo,
cambios genéticos. Los tipos de cambios genéticos más comunes en
células neoplásicas son, además de las mutaciones puntuales, las
amplificaciones y las alteraciones estructurales mayores, como son
las translocaciones.
La amplificación de las secuencias de ADN puede
indicar un requisito funcional específico tal como se ilustra en el
sistema experimental de DHFR. Por tanto, la amplificación de ciertos
oncogenes en los tumores indicaría un papel causal de estos genes
en el proceso de transformación de tumores y el mantenimiento del
fenotipo transformado. Esta hipótesis ha conseguido apoyo en
estudios recientes. Por ejemplo, se observó que la proteína
bcl-2 se amplificaba en ciertos tipos de linfoma de
no Hodgkin. Esta proteína inhibe la apoptosis y lleva a la
acumulación progresiva de células neoplásicas. Se ha observado que
los miembros de esta familia génica de receptores de factores de
crecimiento están amplificados en varios tipos de cánceres
sugiriendo que la sobreexpresión de estos receptores puede
convertir las células neoplásicas en menos susceptibles a
cantidades limitantes de factores de crecimiento disponibles. Los
ejemplos incluyen la amplificación del receptor de andrógenos en el
cáncer de próstata recurrente durante la terapia de privación de
andrógenos y la amplificación del receptor de factor de crecimiento
homólogo, ERB2, en cáncer de mama. Últimamente, los genes implicados
en la señalización intracelular y el control de la progresión del
ciclo celular pueden experimentar amplificación durante la
transformación de tumores. Esto queda ilustrado por la amplificación
de los genes bcl-I y ras en varios neoplasias
epiteliales y linfoides.
Estos estudios iniciales ilustran la posibilidad
de identificar las secuencias de ADN amplificadas en neoplasias, ya
que este enfoque puede identificar genes importantes para la
transformación de tumores. El caso de ERB2 también demuestra la
posibilidad desde un punto de partida terapéutico, ya que las
proteínas transformantes pueden representar dianas novedosas y
específicas para la terapia tumoral.
Se pueden utilizar diferentes técnicas para
demostrar la amplificación de secuencias genómicas. El análisis
clásico citogenético de preparaciones cromosómicas obtenidas a
partir de células cancerosas es adecuado para la identificación de
alteraciones estructurales mayores, como translocaciones,
eliminaciones e inversiones. Las regiones genómicas amplificadas
pueden visualizarse sólo si están implicadas regiones amplias con un
número alto de copias o si están presentes como material
extracromosómico. Aunque la citogenética fue la primera técnica
para demostrar la asociación consistente en cambios cromosómicos
específicos con neoplasias particulares, no es adecuada para la
identificación y el aislamiento de secuencias manejables de ADN. La
técnica desarrollada más recientemente de la hibridación genómica
comparativa (CGH) ha ilustrado el fenómeno ampliamente extendido de
la amplificación genómica en las neoplasias. El ADN tumoral y normal
se hibridan simultáneamente en las metafases de células normales y
todo el genoma puede ser cribado mediante análisis de imagen para
detectar las secuencias de ADN que están presentes en el tumor con
una frecuencia aumentada. (Patente internacional WO93/18.186); Gray
et al., Radiation Res., 137:275-289 [1994].
Como procedimiento de cribado, este tipo de análisis ha revelado un
gran número de amplicones recurrentes (un tramo de ADN amplificado)
en una variedad de neoplasmas humanos. Aunque la CGH es más
sensible que el análisis citogenético clásico en la identificación
de tramos de ADN amplificados, no permite una identificación rápida
y aislamiento de secuencias codificantes en el amplicón mediante
las técnicas estándares de genética molecular.
Los procedimientos más sensibles para detectar
la amplificación génica son los ensayos basados en la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Estos ensayos utilizan una cantidad
muy pequeña de ADN tumoral como material de partida, son
exquisitamente sensibles, proporcionan ADN que es susceptible de un
análisis posterior, por ejemplo por secuenciación, y son adecuados
para el análisis de volúmenes con gran rendimiento.
Los ensayos mencionados anteriormente no son
mutuamente excluyentes y frecuentemente se usan en combinación para
identificar amplificaciones en neoplasmas. Aunque el análisis
citogenético y la CGH representan procedimientos de cribado para
estudiar regiones amplificadas en el genoma completo, los ensayos
basados en la PCR son los más adecuados para la identificación
final de las secuencias codificantes, es decir los genes en las
regiones amplificadas.
Según la presente invención, se han identificado
dichos genes mediante PCR cuantitativa (S. Gelmini et al.,
Clin. Chem., 43:752 [1997]), mediante comparación del ARN de una
variedad de tumores primarios, incluyendo mama, pulmón, colon,
próstata, cerebro, hígado, riñón, páncreas, bazo, timo, testículo,
ovario, útero, etc., tumor o líneas celulares tumorales, con el ADN
combinado de donantes sanos. La PCR cuantitativa se llevó a cabo
utilizando un instrumento TaqMan (ABI). Los cebadores específicos de
los genes y las sondas fluorogénicas se diseñaron en base a las
secuencias codificantes de los ADNs.
Las líneas celulares de carcinoma de pulmón
humano incluyen A549 (SRCC768), Calu-1 (SRCC769),
Calu-6 (SRCC770), H157 (SRCC771), H441 (SRCC772),
H460(SRCC773), SKMES-1(SRCC774),
SW900(SRCC775), H522(SRCC832) y
H8100(SRCC833), todas disponibles en el ATCC. Las células
primarias de tumores humanos de pulmón normalmente derivan de
adenocarcionamas, carcinomas de célula escamosa, carcinomas de
célula grande, carcinomas de célula no pequeña, carcinomas de
célula pequeña, y carcinomas bronco alveolares, e incluyen, por
ejemplo, SRCC724 (adenocarcinoma, abreviado como
"AdenoCa")(LT1), SECC725 (carcinoma de célula escamosa,
abreviado como "SqCCA"(LT1A), SRCC726 (adenocarcinoma)(LT2),
SECC727 (adenocarcinoma)(LT3), SRCC728 (adenocarcinoma)(LT4),
SRCC729 (carcinoma de célula escamosa)(LT6), SECC730 (carcinoma de
célula adeno/escamosa)(LT7), SRCC731 (adenocarcinoma)(LT9), SRCC732
(carcinoma de célula escamosa)(LT10), SRCC733 (carcinoma de célula
escamosa)(LT11), SRCC734 (adenocarcinoma)(LT12), SRCC735 (carcinoma
de célula adeno/escamosa) (LT13), SRCC736 (carcinoma de célula
escamosa) (LT15), SRCC737 (carcinoma de célula escamosa) (LT16),
SRCC738 (carcinoma de célula escamosa)(LT17), SRCC739 (carcinoma de
célula escamosa)(LT18), SRCC740 (carcinoma de célula
escamosa)(LT19), SRCC741 (carcinoma de célula de pulmón, abreviado
como "LCCa")(LT21), SRCC811 (adenocarcinoma)(LT22), SRCC825
(adenocarcinoma)(LT8), SRCC886 (adenocarcinoma)(LT25), SRCC887
(carcinoma de célula escamosa) (LT26), SRCC888 (carcinoma
adeno-BAC) (LT27), SRCC889 (carcinoma de célula
escamosa)(LT28), SRCC890 (carcinoma de célula escamosa)(LT29),
SRCC891 (adenocarcinoma)(LT30), SRCC892 (carcinoma de célula
escamosa)(LT31), SRCC894 (adenocarcinoma) (LT33). También se
incluyen tumores de pulmón humano denominados como SRCC1125
[HF-000631], SRCC1127 [HF-000641],
SRCC1129[HF-000643],
SRCC1133[HF-000840],
SRCC1135[HF-000842],
SRCC1227[HF-001291], SRCC1229
[HF-001293], SRCC11230[HF-001294], SRCC1231[HF-001295], SRCC1232[HF-001296], SRCC1233[HF-001297],
SRCC1235[HF-001299] y SRCC1236[HF-001300].
[HF-001293], SRCC11230[HF-001294], SRCC1231[HF-001295], SRCC1232[HF-001296], SRCC1233[HF-001297],
SRCC1235[HF-001299] y SRCC1236[HF-001300].
Las líneas celulares de cáncer de colon
incluyen, por ejemplo, las líneas celulares de la ATCC SW480
(adenocarcinoma, SRCC776), SW620 (metástasis de nódulos linfáticos
de adenocarcinoma de colon, SRCC777), Colo320 (carcinoma, SRCC778),
HT29 (adenocarcinoma, SRCC779), HM7 (una variante de la línea
celular de adenocarcinoma de colon del ATCC altamente productora de
mucina, SRCC780, obtenida del Dr. Robert Warren, UCSF),
CaWiDr(adenocarcinoma, SRCC781), HCT116 (carcinoma,
SRCC782), SKC01 (adenocarcinoma, SRCC783), SW403 (adenocarcinoma,
SRCC784), LS174T (carcinoma, SRCC785), Colo2115 (carcinoma,
SRCC828), HCT15 (carcinoma, SRCC829), HCC2998 (carcinoma, SECC830),
y KM12 (carcinoma, SRCC831). Los tumores de colon primarios incluyen
los adenocarcinomas de colon denominados como CT2 (SRCC742), CT3
(SRCC743), CT8 (SRCC744), CT10 (SRCC754), CT12 (SRCC746), CT14
(SRCC747), CT15 (SRCC748), CT16 (SRCC749), CT17 (SRCC750), CT1
(SRCC751), CT4 (SRCC752), CT5 (SRCC753), CT6 (SRCC754), CT7
(SRCC755), CT9 (SRCC756), CT11 (SRCC757), CT18 (SRCC758), CT19
(adenocarcinoma, SRCC906), CT20 (adenocarcinoma, SRCC907), CT21
(adenocarcinoma, SRCC908), CT22 (adenocarcinoma, SRCC909), CT23
(adenocarcinoma, SRCC910), CT24 (adenocarcinoma, SRCC911), CT25
(adenocarcinoma, SRCC912), CT26 (adenocarcinoma, SRCC913), CT27
(adenocarcinoma, SRCC914), CT28 (adenocarecinoma, SRCC915), CT29
(adenocarcinoma, SRCC916), CT30 (adenocarcinoma, SRCC917), CT31
(adenocarcinoma, SRCC918), CT32 (adenocarcinoma, SRCC919), CT33
(adenocarcinoma, SRCC920), CT35 (adenocarcinoma, SRCC921), y CT36
(adenocarcinoma, SRCC922). También se incluyen los tumores de colon
humanos denominados como SRCC 1051 [HF-000499],
SRCC1052 [HF-000539], SRCC1053
[HF-000575], SRCC1054 [HF-000698],
SRCC 1142 [HF-000762], SRCC1144
[HF-000789], SRCC1146 [HF-000795] y
SRCC1148 [HF-000811].
Las líneas celulares de carcinoma de mama humano
incluyen, por ejemplo, HBL100 (SRCC759), MB435s
(SRCC760), T47D (SRCC761), MB468 (SRCC762), MB175 (SRCC763), MB361 (SRCC764), BT20 (SRCC765), MCF7 (SRCC760) y SKBR3 (SRCC767), y centros de tumores de mama humano designados como SRCC1057 [HF-000545]. También se incluyen los tumores de mama humanos designados como SRCC1094, SRCC 1095, SRCC1096, SRCC1097, SRCC10980, SRCC1099, SRCC1100, SRCC1101, y tumor de mama-met-pulmón-NS humano designado como SRCC893 [LT32].
(SRCC760), T47D (SRCC761), MB468 (SRCC762), MB175 (SRCC763), MB361 (SRCC764), BT20 (SRCC765), MCF7 (SRCC760) y SKBR3 (SRCC767), y centros de tumores de mama humano designados como SRCC1057 [HF-000545]. También se incluyen los tumores de mama humanos designados como SRCC1094, SRCC 1095, SRCC1096, SRCC1097, SRCC10980, SRCC1099, SRCC1100, SRCC1101, y tumor de mama-met-pulmón-NS humano designado como SRCC893 [LT32].
Los centros de tumores de riñón humano incluyen
SRCC989 [HF-000611] y SRCC1014
[HF-000613].
El centro de tumor de testículo humano incluye
SRCC1001 [HF-000733] y el margen del tumor de
testículo humano SRCC999 [HF-000716].
El tumor de paratiroides humano incluye SRCC1002
[HF-000831] y SRC1003 [000832].
Los resultados de los ensayos de amplificación
génica de la presente invención pueden ser verificados mediante
estudios adicionales, tales como la determinación de la expresión de
ARNm en varios tejidos humanos.
Como se ha indicado anteriormente, la
amplificación génica y/o la expresión génica en varios tejidos
puede cuantificarse mediante transferencia Southern, transferencia
Northern para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 [1980]), la
transferencia de "manchas" (análisis del ADN), o la
hibridación in situ, utilizando una sonda marcada
apropiadamente, basada en las secuencias proporcionadas en la
presente invención. Alternativamente, los anticuerpos pueden
emplearse para el reconocimiento de cadenas dobles específicas,
incluyendo las cadenas dobles de ADN, las cadenas dobles de ARN, las
cadenas dobles híbridas de ADN-ARN o las cadenas
dobles de ADN-proteína.
La expresión génica en varios tejidos también
puede cuantificarse, alternativamente, mediante procedimientos
inmunológicos, tales como la tinción inmunohistoquímica de secciones
de tejido y el ensayo del cultivo celular o fluidos corporales,
para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los
anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo
de fluidos de muestras pueden ser tanto monoclonales como
policlonales, y pueden preparase en cualquier mamífero.
Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra el
polipéptido PRO10282 (Stra6) de secuencia nativa o contra el péptido
sintético basado en el ADN y que codifica un epítopo de anticuerpo
específico. A continuación, se proporcionan técnicas generales para
generar anticuerpos y protocolos especiales y protocolos especiales
para transferencia Northern e hibridación in situ.
Si la amplificación de un gen dado es
funcionalmente relevante, el gen debería entonces amplificarse más
que las regiones genómicas vecinas que no son importantes para la
supervivencia del tumor. Para su comprobación, el gen se puede
mapear en un cromosoma determinado, por ejemplo, mediante el
análisis de híbridos por radiación. El nivel de amplificación se
determina entonces en la localización identificada y en las regiones
genómicas vecinas. La amplificación selectiva o preferente en la
región genómica en la que el gen se ha mapeado concuerda con la
posibilidad de que la amplificación génica observada promueva el
crecimiento o supervivencia tumoral. El mapeo cromosómico incluye
el mapeo tanto de la estructura como el epicentro. Para más detalles
véase, por ejemplo, Stewart et al., Genome Research,
7:422-433 (1997).
Los resultados del estudio de amplificación
génica pueden además verificarse mediante estudios de unión a
anticuerpos, en los que se analiza la capacidad de los anticuerpos
anti-PRO10282 (anti-Stra6) para
inhibir la expresión de los polipéptidos Stra6 en las células del
tumor (cáncer). Entre los ejemplos de anticuerpos se incluyen
anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos,
y heteroconjugados, la preparación de los cuales se describe más
adelante.
Los estudios de unión a anticuerpo pueden
llevarse a cabo con cualquier procedimiento de ensayo conocido,
tales como los ensayos de unión competitiva, ensayos en sánwich
directo o indirecto, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola,
Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.
147-158 (CRC Press, Inc., 1987).
Los ensayos de unión competitiva se basan en la
capacidad de un patrón marcado para competir con el analito de la
muestra a analizar para unirse con una cantidad limitada de
anticuerpo. La cantidad de proteína diana (codificada por un gen
amplificado en una célula tumoral) en la muestra a analizar es
inversamente proporcional a la cantidad de patrón que se une a los
anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de
patrón que resulta unido, los anticuerpos preferentemente se
insolubilizan antes o después de la competición, de manera que el
patrón y el analito que se unen a los anticuerpos pueden separarse
de forma adecuada del patrón y del analito que permanecen sin
unir.
Los ensayos sándwich implican el uso de dos
anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una parte inmunogénica
diferente, o epítopo, de la proteína a detectar. En un ensayo de
sándwich, el analito de la muestra a analizar está unido mediante
un primer anticuerpo que está inmovilizado sobre un soporte sólido,
y a continuación un segundo anticuerpo se une al analito, formando
así un complejo de tres partes insoluble. Véase, por ejemplo, la
patente americana U.S. 4.376.110. El segundo anticuerpo puede estar
él mismo marcado con un grupo detectable (ensayos sándwich
directos) o puede medirse usando un anticuerpo
anti-inmunoglobulina que esté marcado con un grupo
detectable (ensayos sándwich indirectos). Por ejemplo, un tipo de
ensayo de sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso el grupo
detectable es una enzima.
Para inmunohistoquímica, la muestra tumoral
puede ser fresca o congelada o puede estar embebida en parafina y
fijada con un conservante como formalina, por ejemplo.
Se pueden usar ensayos basados en células y
modelos animales para tumores (por ejemplo, cánceres) para
verificar los hallazgos del ensayo de amplificación génica, y
comprender mejor la relación entre los genes identificados en la
presente invención y el desarrollo y la patogénesis del crecimiento
celular neoplásico. El papel de los productos génicos identificados
en la presente invención en el desarrollo y la patología de un
tumor o cáncer puede analizarse usando células o líneas celulares
tumorales primarias en las que se observado que amplifican los
genes de la presente invención. Dichas células incluyen, por
ejemplo, células de cáncer de mama, colon y pulmón y las líneas
celulares indicadas anteriormente.
En un enfoque diferente, se transfectan células
de un tipo de célula conocida por estar implciada en un tumor
particular con los ADNcs de la presente invención y se analiza la
capacidad de estos ADNcs para inducir un crecimiento desmedido.
Entre las células adecuadas se incluyen, por ejemplo, líneas
celulares tumorales estables tales como la línea celular
B104-1-1 (línea celular
NIH-3T3 transfectada de forma estable con el
protooncogen neu) y células NIH-3T3
transfectadas con ras, que pueden ser transfectadas con el gen
deseado y controladas respecto a su crecimiento tumorigénico.
Dichas líneas celulares transfectadas pueden ser usadas para
analizar la capacidad de anticuerpos policlonales o monoclonales o
de mezclas de anticuerpos para inhibir el crecimiento celular
tumorigénico al ejercer una acción citostática o citotóxica sobre el
crecimiento de las células transformadas, o mediante la
citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Las células
transfectadas con las secuencias codificantes de los genes
identificados en la presente invención pueden usarse además para la
identificación de fármacos candidatos para el tratamiento del
cáncer.
Además, pueden usarse los cultivos primarios
derivados de tumores en animales transgénicos (tal como se describe
más adelante) en los ensayos basados en células aquí descritos,
aunque se prefieren las líneas celulares estables. Son bien
conocidas en el sector las técnicas para obtener líneas celulares
continuas a partir de animales transgénicos (véase, por ejemplo,
Small et al., Mol. Cell. Biol. 5:642-618
[1985]).
Se pueden utilizar una serie de modelos animales
bien conocidos para entender en mayor profundidad el papel de los
genes identificados en la presente invención en el desarrollo y la
patogénesis tumoral, y para analizar la eficacia de los agentes
terapéuticos candidatos, incluyendo anticuerpos y otros antagonistas
de los polipéptidos nativos, incluyendo moléculas pequeñas
antagonistas. La naturaleza in vivo de dichos modelos los
hace particularmente útiles para predecir respuestas en pacientes
humanos. Entre los modelos animales de tumores y cánceres (por
ejemplo, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer
de pulmón, etc.) se incluyen tanto animales no recombinantes como
recombinantes (transgénicos). Entre los modelos animales no
recombinantes se incluyen, por ejemplo, roedores, por ejemplo,
modelos murinos. Dichos modelos pueden generarse introduciendo
células tumorales en ratones singeneicos usando técnicas habituales,
por ejemplo, inyección subcutánea, inyección en la vena de la cola,
implantación en el bazo, implantación intraperitoneal, implantación
bajo la cápsula renal, o implantación ortotópica, por ejemplo,
células de cáncer de colon implantadas en un tejido colónico.
(Véase, por ejemplo, la publicación PCT No. WO97/33551, publicada
el 18 de Septiembre de 1997).
Probablemente, la especie animal más
frecuentemente utilizada en estudios oncológicos son ratones
inmunodeficientes y, en particular, ratones desnudos
("nude"). La observación de que los ratones desnudos con
hipo/aplasia podrían actuar con éxito como un huésped para
xenoinjertos de tumores humanos ha llevado a su uso generalizado
para este propósito. El gen autosómico recesivo nu se ha
introducido en un gran número de distintas cepas congénitas de
ratones desnudos, incluyendo, por ejemplo, ASW, A/He, AKR, BALB/c,
B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, l/st, NC, NFR, NFS,
NFS/N, NZB, NZC, NZW.P, RIII, y SJL. Además, se han criado y usado
como receptores de xenoinjertos tumorales una amplia variedad de
otros animales con defectos inmunológicos heredados diferentes del
ratón desnudo. Para más detalles véase, por ejemplo, The Nude Mouse
in Oncology Research, E. Boven and B. Winograd, eds., (CRC Press,
Inc., 1991).
Las células introducidas en dichos animales
pueden derivarse de líneas celulares conocidas de un tumor/cáncer,
tales como, cualquiera de las líneas celulares tumorales indicadas
anteriormente, y, por ejemplo, la línea celular
B104-1-1 (la línea celular
NIH-3T3 estable transfectada con el protooncogén
neu); células NIH-3T3 transfectadas con
ras; Caco-2 (ATCC HTB-37); o
una línea celular de adenocarcinoma de colon humano de grado II
moderadamente bien diferenciada, HT-29 (ATCC
HTB-38); o de tumores y cánceres. Las muestras de
células tumorales o cancerosas pueden obtenerse de pacientes que
van a someterse a una cirugía, usando condiciones estándar, que
implican congelación y almacenamiento en nitrógeno líquido. Karmali
et al., Br. J. Cancer, 48:689-696
(1983).
Las células tumorales pueden introducirse en
animales, tales como ratones desnudos, mediante una serie de
procedimientos. El espacio subcutáneo (s.c.) en ratones es muy
apropiado para la implantación de tumores. Los tumores pueden
transplantarse s.c. como bloques sólidos, como biopsias con aguja
usando un trócar o como suspensiones celulares. Para bloques
sólidos o implantaciones por trócar, se introducen fragmentos de
tejido tumoral de un tamaño adecuado en el espacio s.c. Las
suspensiones celulares se preparan de manera reciente a partir de
tumores primarios o de líneas celulares tumorales estables, y se
inyectan subcutáneamente. Las células tumorales también pueden
inyectarse como implantes subdérmicos. En esta localización, el
inóculo se deposita entre la parte inferior del tejido conectivo
dérmico y el tejido s.c. Boven y Wiograd (1991), supra.
Se pueden generar modelos animales de cáncer de
mama, por ejemplo, mediante la implantación de células de
neuroblastoma de rata (de las cuales se aisló inicialmente el
oncogén neu) o de células NIH-3T3
transformadas con neu en ratones desnudos, esencialmente tal
como describe en Drebin et al., PNAS USA,
83:9129-9133 (1986).
De forma similar, se pueden generar modelos
animales de cáncer de colon transfiriendo células de cáncer de
colon a animales, por ejemplo, ratones desnudos, lo que conduce a la
aparición de tumores en estos animales. Se ha descrito un modelo de
transplante ortotópico de cáncer de colon humano en ratones
desnudos, por ejemplo por Wang et al., Cancer Research,
54:4726-4728 (1994) y Too et al., Cancer
Research, 55:681-684 (1995). Este modelo se basa en
el llamado "METAMOUSE" vendido por AntiCancer, Inc., (San
Diego, California).
Los tumores que aparecen en animales pueden
extraerse y cultivarse in vitro. Las células procedentes de
los cultivos in vitro pueden transferirse entonces a
animales. Dichos tumores pueden servir como dianas para análisis
adicionales o para el cribado de fármacos. Alternativamente, los
tumores resultantes de la transferencia pueden aislarse y se puede
analizar el ARN procedente de las células antes de la transferencia
y de las células aisladas después de una o más rondas de
transferencia para determinar la expresión diferencial de los genes
de interés. Dichas técnicas de transferencia pueden realizase con
cualquier línea celular tumoral o cancerosa conocida.
Por ejemplo, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21, y
WEHI-164 son fibrosarcomas inducidos químicamente en
ratones hembra BALB/c (DeLeo et al., J. Exp. Med., 146:720
[1977]), que proporcionan un sistema modelo altamente controlable
para el estudio de las actividades antitumorales de diversos agentes
(Palladino et al., J. Immuno.,
138:4023-4032). Brevemente, se propagan células
tumorales in vitro en cultivo celular. Antes de la inyección
en los animales, las líneas celulares se lavan y se suspenden en
tampón a una densidad celular de aproximadamente de 10x10^{6} a
10x10^{7} células/ml. A continuación, los animales se infectan
subcutáneamente con de 10 a 100 \mul de la suspensión celular,
permitiendo la aparición de un tumor al cabo de una a tres
semanas.
Además, el carcinoma de pulmón de Lewis (3LL) de
ratones, que es uno de los tumores experimentales más ampliamente
estudiados, puede utilizarse como modelo de tumor de investigación.
La eficacia de este modelo tumoral se ha correlacionado con los
efectos beneficiosos en el tratamiento de pacientes humanos
diagnosticados con carcinoma de célula pequeña de pulmón (SCCL).
Este tumor puede introducirse en ratones normales mediante
inyección de fragmentos de tumores de un ratón afectado o de células
mantenidas en cultivo (Zupi et al., Br. J. Cancer, 41:
suppl.4:309 [1980]), y existen evidencias que indican que los
tumores pueden iniciarse a partir de la inyección de incluso una
única célula y que una proporción muy alta de células tumorales
infectadas sobreviven. Para más información sobre este modelo
tumoral véase, Zacharski, Haemostasis, 16:300-320
[1986].
Una manera de evaluar la eficacia de un
compuesto de prueba en un modelo animal sobre un tumor implantado
es medir el tamaño del tumor antes y después del tratamiento.
Tradicionalmente, se ha medido el tamaño de los tumores implantados
con un portaobjetos calibrador en dos o tres dimensiones. La
medición limitada a dos dimensiones no refleja de forma precisa el
tamaño del tumor, por tanto, habitualmente se convierte en el
volumen correspondiente usando una fórmula matemática. Sin embargo,
la medición del tamaño del tumor es muy poco precisa. Los efectos
terapéuticos de un fármaco candidato pueden describirse mejor como
el retraso en el crecimiento inducido por el tratamiento y el
retraso específico del crecimiento. Otra variable importante en la
descripción del crecimiento del tumor es el tiempo de duplicación
del volumen del tumor. Están disponibles también programas
informáticos para el cálculo y la descripción del crecimiento
tumoral, tales como el programa descrito por Rygaard y
Spang-Thomsen, Proc. 6th Int Workshop on
Immune-Deficient Animals. Wu y Sheng eds., Basel,
1989, pág. 301. Cabe destacar, sin embargo, que por lo menos
inicialmente, la necrosis y respuestas inflamatorias pueden
realmente dar lugar a un aumento del tamaño del tumor tras el
tratamiento. Por tanto, estos cambios deber ser controlados
cuidadosamente, mediante una combinación de un procedimiento
morfométrico y análisis por citometría de flujo.
Se pueden generar modelos animales recombinantes
(transgénicos) introduciendo la región codificante de los genes
identificados en la presente invención en el genoma de los animales
de interés, usando técnicas estándar para la producción de animales
transgénicos. Entre los animales que pueden ser objeto de
manipulación transgénica se incluyen, sin limitaciones, ratones,
ratas, conejos, cobayas, ovejas, cabras, cerdos y primates no
humanos, por ejemplo, babuinos, chimpancés y monos. Entre las
técnicas conocidas en el sector para introducir un transgén en
dichos animales se incluyen la microinyección pronuclear (Hoppe y
Wanger, Patente de Estados Unidos 4.873.191); la transferencia
génica en líneas germinales mediada por retrovirus (por ejemplo, Van
der Putten et al., Proc Natl. Aca. Sci. USA,
82:6148-615[1985]; reconocimiento génico en
células madre embrionarias (Thompson et al., Cell,
56:313-321 [1989]); la electroporación de embriones
(Lo, Mol. Cell Biol., 3:1803-1814 ); la
transferencia génica mediada por esperma. Lavitrano et al.,
Cell, 57:717-73 [1989]. Véase, por ejemplo, la
Patente de Estados Unidos 4.736.866 para una revisión.
Para el objetivo de la presente invención, en
los animales transgénicos se incluyen también aquellos que portan
el transgén sólo en una parte de sus células ("animales
mosaico"). El transgén puede integrarse como un único transgén,
o en concatámeros, por ejemplo, tándem
cabeza-cabeza, cabeza-cola. La
introducción selectiva de un transgén en un tipo de célula en
particular también es posible siguiendo, por ejemplo, la técnica de
Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89:6232-636 (1992).
La expresión del transgén en los animales
transgénicos puede controlarse mediante técnicas estándar. Por
ejemplo, puede utilizarse el análisis de transferencia Southern o la
amplificación por PCR para verificar la integración del transgén.
El nivel de expresión de ARNm puede analizarse entonces usando
técnicas, tales como la hibridación in situ, el análisis por
transferencia Northern, PCR, o inmunocitoquímica. Los animales se
examinan adicionalmente para determinar signos de desarrollo
canceroso o tumoral.
Alternativamente, se pueden construir animales
"knock out" que tienen un gen defectuoso o alterado que
codifica un polipéptido PRO10282 (Stra6) identificado en la presente
invención, como resultado de la recombinación homóloga entre el gen
endógeno que codifica el polipéptido y el ADN genómico alterado que
codifica el mismo polipéptido introducido en una célula embrionaria
del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica un polipéptido
PRO10282 se puede utilizar para clonar ADN genómico que codifica
este polipéptido según las técnicas establecidas. Una parte del ADN
genómico que codifica un polipéptido PRO10282 particular se puede
eliminar o sustituir por otro gen, tal como un gen que codifica un
marcador seleccionable que se puede utilizar para monitorizar la
integración. Habitualmente, se incluyen en el vector varias
kilobases de ADN flanqueante inalterado (en los extremos 5' y 3')
(véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987)
para una descripción de vectores de recombinación homólogos). El
vector se introduce en una línea de células madres embrionarias (por
ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan las células en
las que el ADN introducido se ha recombinado de manera homóloga con
el ADN endógeno (véase, por ejemplo, Li et al., Cell,
69: 915 (1992)). A continuación, las células seleccionadas
se inyectan en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o
una rata) para formar quimeras de agregación (véase, por ejemplo,
Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A
Practical Approach, E. J. Robertson ed. (IRL. Oxford, 1987),
páginas 113-152). A continuación, un embrión
quimérico se puede implantar en un animal criado hembra
pseudopreñada adecuado y se produce un embrión para crear un animal
"knock out". La progenie que alberga el ADN recombinado
homólogamente en sus células germinales se puede identificar
mediante técnicas estándar y utilizarse para criar animales en los
que todas las células del animal contienen el ADN recombinado
homólogamente. Los animales knock out se pueden caracterizar, por
ejemplo, por su capacidad de defenderse contra ciertas condiciones
patológicas y por su desarrollo de afecciones patológicas debido a
la ausencia del polipéptido PRO10282.
La eficacia de los anticuerpos que se unen
específicamente a los polipéptidos identificados en la presente
invención, y a otros fármacos candidatos, se puede analizar también
en el tratamiento de tumores espontáneos en animales. Una diana
adecuada para dichos estudios es el carcinoma de célula escamosa
(SCC) oral felina. La SCC oral felina es un tumor maligno altamente
invasivo que es el tumor maligno oral más habitual de los gatos,
representando sobre un 60% de los tumores orales descritos en esta
especie. Raramente produce metástasis en sitios distantes, aunque
esta baja incidencia de metástasis puede ser simplemente un reflejo
de los periodos cortos de supervivencia para los gatos con este
tumor. Estos tumores no son susceptibles habitualmente de cirugía,
principalmente debido a la anatomía de la cavidad oral del felino.
En la actualidad, no existe un tratamiento eficaz para este tumor.
Antes de entrar en este estudio, a cada gato se le realiza un examen
clínico completo y una biopsia y se escanea por tomografía
computerizada (CT). Los gatos diagnosticados con tumores de célula
escamosa oral sublingual se excluyen del estudio. La lengua empieza
a paralizarse como resultado de dicho tumor e incluso si el
tratamiento mata al tumor, los animales no son capaces de
alimentarse por sí mismos. Cada gato se trata repetidamente durante
un periodo de tiempo más largo. Las fotografías de los tumores se
tomarán diariamente durante el periodo del tratamiento y en cada
chequeo posterior. Después del tratamiento, a cada gato se le
realiza otro rastreo CT. Los rastreos CT y los radiogramas torácicos
se evalúan cada 8 semanas a partir de entonces. Los datos se
evalúan por las diferencias en la supervivencia, la respuesta y la
toxicidad en comparación con los grupos de control. La respuesta
positiva puede requerir la evidencia de la regresión del tumor,
preferiblemente con mejora de la calidad de vida y/o un aumento de
la esperanza de vida.
Además, también se pueden analizar otros tumores
espontáneos de animal, tales como fibrosarcoma, adenocarcinoma,
linfoma, condroma o leiomiosarcoma de perros, gatos y babuínos.
Entre éstos, el adenocarcinoma mamario en perros y gatos es un
modelo preferido ya que su apariencia y comportamiento es muy
similar al de los humanos. Sin embargo, el uso de este modelo está
limitado por la rara aparición de este tipo de tumores en
animales.
Los ensayos de cribado para fármacos candidatos
se diseñan para identificar compuestos que se unen o forman
complejos con los polipéptidos codificados por los genes
identificados en la presente invención, o en cualquier caso
interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados con
otras proteínas celulares. Dichos ensayos de cribado incluirán
ensayos susceptibles de cribado de alto rendimiento de quimiotecas,
siendo particularmente adecuados para identificar fármacos
candidatos de molécula pequeña. Entre las moléculas pequeñas
contempladas se incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos
sintéticos, incluyendo péptidos, preferiblemente péptidos solubles,
fusiones (poli)péptido-inmunoglobulina y, en
particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos
policlonales y monoclonales y fragmentos de anticuerpo, anticuerpos
de cadena única, anticuerpos anti-idiotípicos, y
formas quiméricas o humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos,
así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. Los
ensayos se pueden realizar en una serie de formatos, incluyendo
ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de
cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, que
están bien caracterizados en la técnica.
Todos los ensayos tienen en común que exigen el
contacto del fármaco candidato con un polipéptido codificado por un
ácido nucleico identificado en la presente invención en condiciones
y durante un tiempo suficiente para permitir que estos dos
compuestos interaccionen.
En ensayos de unión, la interacción es la unión
y el complejo formado se puede aislar o detectar en la mezcla de
reacción. En una realización particular, el polipéptido codificado
por el gen identificado en la presente invención o el fármaco
candidato se inmovilizan sobre una fase sólida, por ejemplo, una
placa de microtítulos, mediante enlaces covalentes o no covalentes.
La unión no covalente se realiza generalmente mediante el
recubrimiento de la superficie sólida con una solución del
polipéptido y secado. Alternativamente, se puede utilizar un
anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal,
específico para el polipéptido a inmovilizar, para anclarlo a la
superficie sólida. El ensayo se realiza mediante la adición del
componente no inmovilizado, que puede estar marcado mediante un
marcador detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la
superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando se
completa la reacción, se extraen los componentes no reaccionados,
por ejemplo, mediante lavado, y se detectan los complejos anclados a
la superficie sólida. Cuando el componente originalmente no
inmovilizado transporta un marcador detectable, la detección del
marcador inmovilizado en la superficie indica que tuvo lugar la
formación del complejo. Cuando el componente originalmente no
inmovilizado no transporta un marcador, se puede detectar la
formación de complejo, por ejemplo, utilizando un anticuerpo
marcado que se une específicamente al complejo inmovilizado.
Si el compuesto candidato interacciona con, pero
no sin unirse, a una proteína concreta PRO10282 codificada por un
gen identificado en la presente invención, su interacción con ese
polipéptido se puede ensayar mediante procedimientos conocidos para
detectar interacciones proteína-proteína. Dichos
ensayos incluyen enfoques tradicionales, tales como, por ejemplo,
entrecruzamiento, coinmunoprecipitación y copurificación a través de
gradientes o columnas cromatográficas. Además, las interacciones
proteína-proteína se pueden monitorizar mediante la
utilización de sistemas genéticos basados en levaduras descritos
por Fields y colaboradores [Fields y Song, Nature (London),
340:245-246 (1989); Chien et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582 (1991)] tal
como se describe por Chevray y Nathans [Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 89: 5789-5793 (1991)]. Muchos activadores
transcripcionales, tales como GAL4 de levadura, consisten en dos
dominios modulares físicamente discretos, uno que actúa como el
dominio de unión a ADN, mientras que el otro actúa como el dominio
de activación de la transcripción. El sistema de expresión en las
levaduras descrito en las publicaciones anteriores (referido
generalmente como "el sistema de dos híbridos") aprovecha esta
propiedad y utiliza dos proteínas híbridas, una en la que la
proteína diana se fusiona al dominio de unión a ADN de GAL4, y otra,
en la que las proteínas activadoras candidatas se fusionan al
dominio de activación. La expresión de un gen informador
GAL1-lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4
depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 a través de la
interacción de proteína-proteína. Las colonias que
contienen polipéptidos que interaccionan se detectan con un sustrato
cromatogénico para \beta-galactosidasa. En
Clontech se encuentra disponible comercialmente un equipo completo
(MATCHMAKER^{TM}) para identificar interacciones
proteína-proteína entre dos proteínas específicas
utilizando la técnica de dos híbridos. Este sistema también se
puede extender para mapear dominios de proteínas implicados en las
interacciones de proteínas específicas así como para precisar los
residuos de aminoácidos que son cruciales para estas
interacciones.
Los compuestos que interfieren con la
interacción de un gen que codifica un polipéptido PRO10282
identificado en la presente invención y otros componentes intra o
extracelulares se pueden analizar de la siguiente manera: se
prepara habitualmente una mezcla de reacción que contiene el
producto del gen amplificado y el componente intra o extracelular
en condiciones y durante un tiempo que permite la interacción y
unión de los dos productos. Para ensayar la capacidad de un
compuesto de prueba para inhibir la unión, la reacción se realiza en
ausencia y presencia del compuesto de prueba. Además, se puede
añadir un placebo a una tercera mezcla de reacción, para utilizar
como control positivo. La unión (formación de complejo) entre el
compuesto de prueba y el componente intra o extracelular presente
en la mezcla se controla tal y como se ha descrito anteriormente. La
formación de un complejo en la reacción o reacciones de control,
pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de
prueba, indica que el compuesto de prueba interfiere con la
interacción del compuesto de prueba y su compañero de reacción.
Para analizar antagonistas, se puede añadir el
polipéptido PRO10282 a una célula junto con el compuesto a cribar
según una actividad particular y la capacidad del compuesto para
inhibir la actividad de interés en presencia del polipéptido
PRO10282 indica que el compuesto es un antagonista para el
polipéptido PRO10282. Alternativamente, se pueden detectar
antagonistas mediante la combinación del polipéptido PRO10282 y un
potencial antagonista con receptores del polipéptido PRO10282
unidos a membrana o receptores recombinantes bajo condiciones
adecuadas para un ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido
PRO10282 puede marcarse, mediante por ejemplo radioactividad, de
manera que el número de moléculas del polipéptido PRO10282 unidas al
receptor pueden usarse para determinar la eficacia del potencial
antagonista. El gen que codifica el receptor puede identificarse
mediante numerosos procedimientos conocidos por los expertos en la
materia, por ejemplo, utilizando un "panning" de ligandos y la
separación por FACS. Coligan et al., Current Protocolos in
Immun., 1(2): capítulo 5 (1991). Preferiblemente, se emplea
la clonación de expresión en donde se prepara ARN poliadenilado a
partir de una célula sensible al polipéptido PRO10282 y una
biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN se divide en grupos
y se usa para transfectar células COS u otras células que no son
sensibles al polipéptido PRO10282. Las células transfectadas que
han crecido en portaobjetos de cristal se exponen al polipéptido
PRO10282 marcado. El polipéptido PRO10282 puede marcarse mediante
distintos sistemas incluyendo la yodación o la inclusión de un
sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica de
sitio. Tras la fijación e incubación, los portaobjetos se someten a
un análisis autorradiográfico. Los grupos positivos se identifican y
se preparan subgrupos y se retransfectan usando un subagrupamiento
interactivo y un nuevo proceso de cribado dando lugar finalmente a
un único clon que codifica el receptor potencial.
Como estrategia alternativa para la
identificación de un receptor, el polipéptido PRO10282 marcado
puede unirse por fotoafinidad con preparaciones de membranas
celulares o extractos que expresan la molécula del receptor. El
material reticulado se resuelve mediante PAGE y se expone a una
película de rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor
puede cortarse, separarse en fragmentos de péptidos y someterse a
microsecuenciación de proteínas. La secuencia de aminoácidos
obtenida por microsecuenciación se utilizaría para diseñar un
conjunto de sondas de oligonucleótidos degenerados para cribar una
biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica el receptor
potencial.
En otro ensayo para antagonistas, se incubarían
células de mamífero o una preparación de membranas que expresen el
receptor con el polipéptido PRO10282 marcado en presencia del
compuesto candidato. A continuación, puede medirse la capacidad del
compuesto de aumentar o bloquear esta interacción.
Ejemplos más específicos de potenciales
antagonistas incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones
de inmunoglobulina con el polipéptido PRO10282 y, en particular,
anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos policlonales
y monoclonales y fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena
única, anticuerpos antiidiotípicos, y formas quiméricas o
humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos, así
como anticuerpos humanos y fragmentos de estos anticuerpos.
Alternativamente, un potencial antagonista puede ser una proteína
estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del
polipéptido PRO10282 que reconozca el receptor pero que no ejerza
ningún efecto, por tanto, inhibiendo competitivamente la acción del
polipéptido PRO10282.
Otro antagonista potencial del polipéptido
PRO10282 es una construcción de ARN o ADN antisentido preparada
usando la tecnología antisentido, en donde, por ejemplo, una
molécula de ADN o ARN antisentido actúa bloqueando directamente la
traducción de ARNm mediante la hibridación al ARNm diana y evitando
la traducción de la proteína. La tecnología antisentido puede
usarse para controlar la expresión génica a través de la formación
de una triple hélice o de ADN o ARN antisentido, ambos
procedimientos basados en la unión de un polinucleótido al ADN o al
ARN. Por ejemplo, la región codificante 5' de la secuencia de
polinucleótidos, que codifica el polipéptido PRO10282 maduro de la
presente invención se usa para diseñar un oligonucleótido de ARN
antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud.
Se diseña un oligonucleótido de ADN que sea complementario a una
región del gen implicado en la transcripción (triple hélice- véase,
Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et
al., Science, 241:456 (1988): Dervan et al., Science,
251:1360 (1991)], evitando así la transcripción y la producción del
polipéptido PRO10282. El oligonucleótido de ARN antisentido se
hibrida al ARNm in vivo y bloquea la traducción de la
molécula de ARNm en el polipéptido PRO10282
(antisentido-Okano, Neurochem., 56:560 (1991);
Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expresión (CRC
Press: Boca Raton, FL, 1988). Los oligonucleótidos descritos
anteriormente pueden también liberarse a células de forma que el ARN
o ADN antisentido puede ser expresado in vivo para inhibir
la producción del polipéptido PRO10282. Cuando se usa un ADN
antisentido, se prefieren oligodesoxirribonucleótidos derivados del
sitio de inicio de la traducción, por ejemplo, entre las posiciones
de aproximadamente -10 a +10 de la secuencia de nucleótidos del gen
diana.
Las moléculas de ADN o ARN antisentido tienen
generalmente una longitud de por lo menos aproximadamente 5 bases,
de aproximadamente 10 bases, de aproximadamente 15 bases, de
aproximadamente 20 bases, de aproximadamente 25 bases, de
aproximadamente 30 bases, de aproximadamente 35 bases, de
aproximadamente 40 bases, de aproximadamente 45 bases, de
aproximadamente 50 bases, de aproximadamente 55 bases, de
aproximadamente 60 bases, de aproximadamente 65 bases, de
aproximadamente 70 bases, de aproximadamente 75 bases, de
aproximadamente 80 bases, de aproximadamente 85 bases, de
aproximadamente 90 bases, de aproximadamente 95 bases, de
aproximadamente 100 bases, o más.
Entre los antagonistas potenciales se incluyen
moléculas pequeñas que se unen al sitio activo, el sitio de unión a
receptor o el factor de crecimiento u otro sitio de unión relevante
del polipéptido PRO10282, bloqueando de este modo la actividad
biológica normal del polipéptido PRO10282. Entre los ejemplos de
moléculas pequeñas se incluyen, pero no se limitan a, péptidos
pequeños o moléculas de tipo péptido, preferiblemente péptidos
solubles, y compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos no
peptídicos.
Las ribocimas son moléculas de ARN enzimáticas
capaces de catalizar la división específica del ARN. Las ribocimas
actúan mediante la hibridación específica de secuencia con el ARN
diana complementario seguido de la división endonucleolítica. Los
sitios de división específicos de las ribocimas en un ARN diana
potencial se pueden identificar mediante técnicas conocidas. Para
más detalles, véase, por ejemplo, Rossi. Current Biology
4, 469-471 (1994) y la publicación de PCT No.
WO 97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997).
Las moléculas de ácido nucleico en la formación
de triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deberían
ser de cadena única y compuestas de desoxinucleótidos. La
composición base de estos oligonucleótidos se diseña de manera que
activan la formación de la triple hélice a través de las reglas de
emparejamiento de bases de Hoogsteen, que generalmente requieren de
tramos considerables de purinas o pirimidinas en una de las cadenas
de la doble cadena. Para más detalles, ver, por ejemplo, publicación
de PCT No. WO 97/33551, supra.
Estas moléculas pequeñas se pueden identificar
mediante uno o más de los ensayos de cribado descritos
anteriormente y/o mediante cualquier otra técnica conocida por los
expertos en la materia.
Las secuencias de nucleótidos (o sus
complementarias) que codifican polipéptidos PRO10282 (stra6) tienen
varias aplicaciones en la disciplina de la biología molecular,
incluyendo usos como sondas de hibridación, en el mapeo de
cromosomas y genes y en la generación de ARN y ADN antisentido. El
ácido nucleico de PRO10282 también será útil para la preparación de
polipéptidos PRO10282 mediante las técnicas recombinantes descritas
en la presente invención.
El gen de PRO10282 de secuencia nativa de
longitud completa (SEC ID No. 1), o gen de PRO19578 (SEC ID No. 4),
o partes del mismo, se puede utilizar como sondas de hibridación
para una biblioteca de ADNc para aislar el ADNc de PRO10282 o
PRO19578 de longitud completa o para aislar incluso otros ADNcs (por
ejemplo, aquéllos que codifican variantes naturales adicionales de
PRO10282 o PRO10282 de otras especies) que tienen una identidad en
la secuencia deseada con la secuencia codificante de PRO10282
descrita en la figura 1 (SEC ID No. 1) o la secuencia codificante
de RPO19578 descrita en la figura 6 (SEC ID No. 4). Opcionalmente,
la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 a
aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridación se pueden
derivar de regiones por lo menos parcialmente nuevas de la secuencia
de nucleótidos de SEC ID No. 1 en la que dichas regiones se pueden
determinar sin una experimentación excesiva o de secuencias
genómicas que incluyen promotores, elementos potenciadores e
intrones del gen de PRO10282 o PRO19578 de secuencia nativa. A modo
de ejemplo, un procedimiento de cribado comprenderá el aislamiento
de la región codificante del gen de PRO10282 o PRO19578 utilizando
la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada
de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación se pueden
marcar con una serie de marcadores, incluyendo radionucleótidos,
tales como ^{32}P o ^{35}S, o marcadores enzimáticos, tales como
fosfatasa alcalina acoplada a la sonda a través de los sistemas de
acoplamiento avidina/biotina. Las sondas marcadas que tienen una
secuencia complementaria a la del gen de PRO10282 o PRO19578 de la
presente invención se pueden utilizar para cribar bibliotecas de
ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar a qué miembros de
dichas bibliotecas se hibrida la sonda. Las técnicas de hibridación
se describen con mayor detalle en los siguientes Ejemplos.
Cualquier secuencia EST descrita en la presente
solicitud se puede utilizar de forma similar como sondas,
utilizando los procedimientos descritos en la presente
invención.
Entre otros fragmentos útiles de los ácidos
nucleicos de PRO10282 (Stra6) se incluyen oligonucleótidos
antisentido o sentido que comprenden una secuencia de ácidos
nucleicos de cadena única (ARN o ADN) capaz de unirse a secuencias
de ARNm de PRO10282 (Stra6) diana (sentido) o ADN de PRO10282
(Stra6) diana (antisentido). Los oligonucleótidos antisentido o
sentido, según la presente invención, comprenden un fragmento de la
región codificante de ADN de PRO10282 (Stra6). Dicho fragmento
comprende generalmente por lo menos aproximadamente 14 nucleótidos,
preferiblemente de aproximadamente 14 a 30 nucleótidos. La capacidad
de derivar un oligonucleótido antisentido o sentido, basado en una
secuencia de ADNc que codifica una proteína determinada se describe
en, por ejemplo, Stein y Cohen (Cancer Res., 48:2659, 1988) y van
der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988).
La unión de oligonucleótidos sentido y
antisentido a secuencias de ácidos nucleico diana da lugar a la
formación de cadenas dobles que bloquean la transcripción o la
traducción de la secuencia diana mediante uno de los diferentes
medios, que incluyen una mayor degradación de las cadenas dobles, la
terminación prematura de la transcripción o la traducción, o
mediante cualquier otro medio. De este modo, los oligonucleótidos
antisentido se puede utilizar para bloquear la expresión de
proteínas PRO10282 (Stra6). Los oligonucleótidos antisentido o
sentido comprenden además oligonucleótidos que tienen esqueletos de
azúcar-fosfodiéster modificados (u otras uniones a
azúcares, tales como las descritas en WO 91/06629) y en los que
dichas uniones a azúcares son resistentes a nucleasas endógenas.
Dichos oligonucleótidos con uniones a azúcares resistentes son
estables in vivo (es decir, capaces de resistir la
degradación enzimá-
tica) pero mantienen la especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a las secuencias de nucleótidos diana.
tica) pero mantienen la especificidad de secuencia para ser capaces de unirse a las secuencias de nucleótidos diana.
Entre otros ejemplos de oligonucleótidos sentido
o antisentido se incluyen aquellos oligonucleótidos que están
unidos covalentemente a grupos orgánicos, tales como los descritos
en WO 90/10048, y otros grupos que aumentan la afinidad del
oligonucleótido por una secuencia de ácidos nucleicos diana, tal
como poli-(L-lisina). Además, los agentes
intercalantes, tales como elipticina, y agentes alquilantes o
complejos metálicos se pueden unir a oligonucleótidos sentido o
antisentido para modificar las especificidades de unión del
oligonucleótido antisentido o sentido para la secuencia de
nucleótidos diana.
Los oligonucleótidos sentido o antisentido se
pueden introducir en una célula que contiene la secuencia de ácidos
nucleicos diana mediante cualquier procedimiento de transferencia de
genes, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN mediada por
CaPO_{4}, electroporación, o mediante la utilización de vectores
de transferencia de genes, tales como el virus
Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un
oligonucleótido antisentido o sentido se inserta en un vector
retroviral adecuado. Una célula que contiene la secuencia de ácidos
nucleicos diana se pone en contacto con el vector retroviral
recombinante, in vivo o ex vivo. Entre los vectores
retrovirales adecuados se incluyen, pero no se limitan a, los
derivados de retrovirus murinos M-MuLV, N2 (un
retrovirus derivado de M-MuLV) o los vectores de
copia doble designados como DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase WO
90/13641).
Los oligonucleótidos sentido o antisentido
también se pueden introducir en una célula que contiene la
secuencia de nucleótidos diana mediante la formación de un conjugado
con una molécula de unión ligando, tal y como se describe en WO
91/04753. Entre las moléculas de unión ligandos se incluyen, pero no
se limitan a, receptores de la superficie de las células, factores
de crecimiento, otras citoquinas, u otros ligandos que se unen a
receptores de la superficie de las células. Preferiblemente, la
conjugación de la molécula de unión ligando no interfiere
sustancialmente con la capacidad de la molécula de unión ligando
para unirse a su correspondiente molécula o receptor, ni bloquea la
entrada del oligonucleótido sentido o antisentido o su forma
conjugada en la célula.
Alternativamente, se puede introducir un
oligonucleótido sentido o antisentido en una célula que contiene la
secuencia de ácidos nucleicos diana mediante la formación de un
complejo oligonucleótido-lípido, tal y como se
describe en WO 90/10448. El complejo oligonucleótido sentido o
antisentido-lípido se disocia preferiblemente en el
interior de la célula por una lipasa endógena.
Las sondas también se pueden utilizar en
técnicas de PCR para generar un grupo de secuencias para la
identificación de secuencias de codificación de PRO10282
estrechamente relacionadas.
Las secuencias de nucleótidos que codifican un
polipéptido PRO10282 (Stra6) de secuencia nativa también se pueden
utilizar para construir sondas de hibridación para mapear el gen que
codifica el PRO10282 (Stra6) de secuencia nativa y para el análisis
genético de individuos con trastornos genéticos. Las secuencias de
nucleótidos proporcionadas en la presente invención se pueden mapear
en un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma utilizando
técnicas conocidas, tales como la hibridación in situ, el
análisis de unión contra marcadores cromosómicos conocidos, y el
cribado de hibridación con bibliotecas.
Cuando las secuencias codificantes de PRO10282
codifican una proteína que se une a otra proteína (por ejemplo,
cuando PRO10282 es un receptor), el PRO10282 se puede utilizar en
ensayos para identificar las otras proteínas o moléculas implicadas
en la interacción de unión. Mediante dichos procedimientos, se
pueden identificar los inhibidores de la interacción de unión
receptor/ligando. Las proteínas implicadas en dichas interacciones
de unión también se pueden utilizar para cribar inhibidores o
agonistas de péptidos o moléculas pequeñas de la interacción de
unión. Además, el receptor PRO10282 (Stra6) se puede utilizar para
aislar el ligando o ligandos correlativos. Se pueden diseñar
ensayos de cribado ("screening") para encontrar compuestos
candidatos que mimeticen la actividad biológica de un PRO10282
(Stra6) nativo o un polipéptido que se une a PRO10282 ("proteína
de unión a PRO10282"). Dichos ensayos de cribado incluirán
ensayos susceptibles de cribar con un alto rendimiento
quiomiotecas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar
pequeñas moléculas como fármacos candidatos. Entre las pequeñas
moléculas contempladas se incluyen compuestos orgánicos o
inorgánicos sintéticos. Los ensayos se pueden realizar en una
variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico,
inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien
caracterizados en la técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican PRO10282 o
sus formas modificadas también se pueden utilizar para generar
animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son
útiles en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente
útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o una rata) es
un animal que tiene células que contienen un transgén, el cual se
introdujo en el animal o en un antecesor del animal en estado
prenatal, por ejemplo, una etapa embrionaria. Un transgén es un ADN
que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual
se desarrolla un animal transgénico. En una realización, el ADNc que
codifica PRO10282 se puede utilizar para clonar ADN genómico que
codifica PRO10282 según las técnicas establecidas y las secuencias
genómicas utilizadas para generar animales transgénicos que
contienen células que expresan ADN que codifica PRO10282. Los
procedimientos para generar animales transgénicos, particularmente
animales tales como ratones o ratas, se han convertido en
habituales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las
Patentes de Estados Unidos Nos. 4.736.866 y 4.870.009.
Habitualmente, se marcarían células concretas para la incorporación
del transgén de PRO10282 con potenciadores específicos de tejido. Se
pueden utilizar animales transgénicos que incluyen una copia de un
transgén que codifica PRO10282 introducido en la línea germinal del
animal en una etapa embrionaria para examinar el efecto de la mayor
expresión de ADN que codifica PRO10282. Dichos animales se pueden
utilizar como animales de prueba para reactivos pensados para
conferir protección frente a, por ejemplo, afecciones patológicas
asociadas con su sobreexpresión. Según este aspecto de la presente
invención, el tratamiento de un animal con el reactivo y la
reducción de la incidencia de la afección patológica en comparación
con animales no tratados que llevan el transgén, indicaría una
potencial intervención terapéutica en la afección patológica.
Alternativamente, se pueden utilizar homólogos
no humanos de PRO10282 para construir un animal "knock out"
con PRO10282 que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica
PRO10282 como resultado de la recombinación homóloga entre el gen
endógeno que codifica PRO10282 y el ADN genómico alterado que
codifica PRO10282 introducido en una célula madre embrionaria del
animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica PRO10282 se puede utilizar
para clonar ADN genómico que codifica PRO10282 según las técnicas
establecidas. Una parte del ADN genómico que codifica PRO10282 se
puede eliminar o sustituir por otro gen, tal como un gen que
codifica un marcador seleccionable que se puede utilizar para
monitorizar la integración. Habitualmente, se incluyen en el vector
varias kilobases de ADN flanqueante inalterado (en los extremos 5'
y 3') [véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503
(1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos].
El vector se introduce en una línea de células madres embrionarias
(por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan las células
en que el ADN introducido se ha recombinado de manera homóloga con
el ADN endógeno [véase, por ejemplo, Li et al., Cell, 69:
915 (1992)]. A continuación, las células seleccionadas se inyectan
en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón o una rata)
para formar quimeras de agregación [véase, por ejemplo, Bradley, en
Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical
Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), páginas
113-152]. A continuación, un embrión quimérico se
puede implantar en un animal criado hembra pseudoembarazada adecuado
y el embrión nacido para crear un animal "knock out". La
progenie que alberga el ADN recombinado de manera homóloga en sus
células germinales se puede identificar mediante técnicas estándar y
utilizar para criar animales donde todas las células del animal
contienen el ADN recombinado de manera homóloga. Los animales knock
out se pueden caracterizar, por ejemplo, por su capacidad de
defenderse contra ciertas afecciones patológicas y por su
desarrollo de afecciones patológicas debido a la ausencia del
polipéptido PRO10282.
El ácido nucleico que codifica los polipéptidos
PRO10282 también se pueden utilizar en terapia génica. En
aplicaciones de terapia génica, los genes se introducen en células
para conseguir una síntesis in vivo de un producto genético
terapéuticamente eficaz, por ejemplo, para la sustitución de un gen
defectuoso. La "terapia génica" incluye tanto la terapia
génica convencional en la que se consigue un efecto duradero
mediante un único tratamiento, como la administración de agentes
terapéuticos génicos, que implica la administración de una vez o
repetitiva de un ADN o ARN terapéuticamente eficaz. Se pueden
utilizar ADNs y ARNs antisentido como agentes terapéuticos para
bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. También se ha
observado que se pueden importar oligonucleótidos antisentido
cortos en células en las que actúan como inhibidores, a pesar de
sus bajas concentraciones intracelulares causadas por su captación
limitada por la membrana celular. (Zamecnik et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]). Los
oligonucleótidos se pueden modificar para aumentar su captación,
por ejemplo, mediante la sustitución de sus grupos fosfodiéster
cargados negativamente por grupos no cargados.
Existe una variedad de técnicas disponibles para
introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían
dependiendo si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas
in vitro o in vivo en las células del huésped
deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido
nucleico en células de mamíferos in vitro incluyen la
utilización de liposomas, electroporación, microinyección, fusión
celular, DEAE-dextrano, el procedimiento de
precipitación con fosfato cálcico, etc. Entre las técnicas de
transferencia génica in vivo actuales preferidas se incluyen
la transfección con vectores virales (habitualmente retrovirales) y
la transfección mediada por liposoma-proteínas de
cubierta viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11,
205-210 [1993]). En algunas situaciones, es deseable
proporcionar la fuente de ácidos nucleicos con un agente que
reconoce las células diana, tales como un anticuerpo específico para
una proteína de membrana de la superficie de la célula o la célula
diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando
se utilizan liposomas, se pueden utilizar proteínas que se unen a
una proteína de membrana de la superficie de la célula asociada con
endocitosis para dirigir y/o facilitar la captación, por ejemplo, de
proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas trópicas para un
tipo de célula concreta, anticuerpos para proteínas que experimentan
internalización en el ciclado, proteínas que reconocen la
localización intracelular y aumentan la vida media intracelular. La
técnica de la endocitosis mediada por receptor se describe en, por
ejemplo, Wu et al., J. Biol. Chem. 262,
4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990). Para una
revisión de los protocolos de marcaje génico y terapia génica,
véase Anderson et al., Science 256, 808-813
(1992).
Los polipéptidos PRO10282 descritos en la
presente invención se pueden utilizar también como marcadores del
peso molecular para fines de electroforesis de proteínas.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican
los polipéptido PRO10282 o fragmentos de los mismos descritos en la
presente invención son útiles para la identificación de cromosomas.
En este aspecto, existe una necesidad actual para identificar
nuevos marcadores de cromosomas, ya que actualmente hay disponibles
relativamente pocos reactivos marcadores de cromosomas basados en
datos de secuencias reales. Cada molécula de ácido nucleico de
PRO10282 de la presente invención se puede utilizar como marcador de
cromosomas.
Los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico
de la presente invención se pueden utilizar también para el
agrupamiento tisular, donde los polipéptidos PRO10282 de la presente
invención se pueden expresar de manera diferencial en un tejido en
comparación con otro. Las moléculas de ácido nucleico de PRO10282
serán útiles para generar sondas para PCR, análisis Northern,
análisis Southern y análisis Western.
Los polipéptido PRO10282 descritos en la
presente invención se pueden utilizar también como agentes
terapéuticos. Los polipéptidos PRO10282 de la presente invención se
pueden formular según métodos conocidos para preparar composiciones
farmacéuticamente útiles, donde el producto PRO10282 de las mismas
se combina mezclado con un vehículo portador farmacéuticamente
aceptable. Las formulaciones terapéuticas se preparan para el
almacenamiento mediante la mezcla del principio activo que tiene el
grado deseado de pureza con portadores, excipientes o
estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's
Pharmaceutical Sciences 16ª Edición, Osol, A. Ed. (1980)) en forma
de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores,
excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los
receptores en las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen
tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos;
antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de peso
molecular bajo (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas,
tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros
hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos, tales
como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina;
monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen
glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA;
alcoholes de azúcares, tales como manitol o sorbitol; contraiones
formadores de sales, tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos,
tales como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o PEG.
Las formulaciones a utilizar para la
administración in vitro deben ser estériles. Esto se realiza
fácilmente mediante la filtración a través de membranas de
filtración estériles, previamente o posteriormente a la
liofilización y reconstitución.
Las composiciones terapéuticas de la presente
invención generalmente se colocan en un recipiente que tiene un
puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución
intravenosa que tiene un tapón penetrable por una aguja de
inyección hipodérmica.
La ruta de administración está en concordancia
con procedimientos conocidos, por ejemplo, la inyección o la
infusión mediante las rutas intravenosa, intraperitoneal,
intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o
intralesional, administración tópica, o mediante sistemas de
liberación controlada.
Las dosis y concentraciones del fármaco deseadas
de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden
variar dependiendo de la utilización particular prevista. La
determinación de la dosis o la ruta de administración apropiadas
están dentro del conocimiento de un médico habitual. Los
experimentos con animales proporcionan una guía fiable para la
determinación de las dosis eficaces para la terapia humana. El
escalado entre especies de dosis eficaces se puede llevar a cabo
siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell,
W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en
Toxicokinetics y New Drug Development, Yacobi et al., Eds.,
Pergamon Press, Nueva York, 1989, páginas 42-96.
Cuando se utiliza la administración in
vivo de un polipéptido PRO10282 o agonista o antagonista del
mismo, las cantidades de dosificación normales pueden variar desde
aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de masa corporal de
mamífero o más por día, preferiblemente aproximadamente 1
\mug/kg/día hasta 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de
administración. Las guías de las dosis concretas y los
procedimientos de liberación se proporcionan en la literatura;
véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nos. 4.657.760;
5.206.344; o 5.225.212. Se anticipa que diferentes formulaciones
serán eficaces para diferentes compuestos de tratamiento y
diferentes trastornos, que la administración que se dirige a un
órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar la liberación de una
manera diferente a la de otro órgano o tejido.
Cuando se desea la administración por liberación
controlada de un polipéptido PRO10282 en una formulación con
características de liberación adecuadas para el tratamiento de
cualquier enfermedad o trastorno que requiere la administración del
polipéptido PRO10282, se contempla la microencapsulación del
polipéptido PRO10282. La microencapsulación de proteínas
recombinantes para la liberación controlada se ha realizado
satisfactoriamente con hormona del crecimiento humano (rhGH),
interferón- (rhIFN-), interleuquina-2 y MN rgp 120.
Johnson et al., Nat. Med., 2: 795-799
(1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993);
Hora et al., Bio/Technology, 8:_755-758
(1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization
Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems,"
en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and
Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp.
439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; y
Patente de Estados Unidos No. 5.654.010.
Las formulaciones de liberación controlada de
estas proteínas se desarrollaron utilizando polímero de ácido
poli-láctico-glicólico (PLGA) debido
a su biocompatibilidad y amplio rango de propiedades biodegradables.
Los productos de degradación de PLGA, ácidos láctico y glicólico,
se pueden depurar rápidamente del cuerpo humano. Además, la
degradabilidad de este polímero se puede ajustar desde meses hasta
años dependiendo de su peso molecular y composición. Lewis,
"Controlled release of bioactive agents from lactide/_glycolide
polymer," en: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable
Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990),
pp. 1-41.
Esta solicitud describe procedimientos de
cribado de compuestos para identificar aquéllos que mimetizan el
polipéptido PRO10282 (agonistas) o evitan el efecto del polipéptido
PRO10282 (antagonistas). Los ensayos de cribado para candidatos de
fármacos antagonistas se diseñan para identificar compuestos que se
unen o forman complejos con los polipéptidos PRO10282 codificados
por los genes identificados en la presente invención, o en
cualquier caso, interfieren con la interacción de los polipéptidos
codificados con otras proteínas celulares. Dichos ensayos de
cribado incluirán ensayos susceptibles de cribar con un alto
rendimiento bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente
adecuados para identificar pequeñas moléculas como fármacos
candidatos.
Los ensayos se pueden realizar en una variedad
de formatos incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico,
inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien
caracterizados en la técnica.
Todos los ensayos para antagonistas son comunes
en que requieren el contacto del fármaco candidato con un
polipéptido PRO10282 codificado por un ácido nucleico identificado
en la presente invención bajo condiciones y durante un tiempo
suficiente para permitir que estos dos componentes
interaccionen.
En ensayos de unión, la interacción es la unión
y el complejo formado se puede aislar o detectar en la mezcla de
reacción. En una realización particular, el polipéptido PRO10282
codificado por el gen identificado en la presente invención o el
fármaco candidato se inmobilizan sobre una fase sólida, por ejemplo,
en una placa de microtítulos, mediante enlaces covalentes o no
covalentes. La unión covalente se realiza generalmente mediante el
recubrimiento de la superficie sólida con una solución del
polipéptido PRO10282 y el secado. Alternativamente, se puede
utilizar un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo
monoclonal, específico para el polipéptido PRO10282 a inmovilizar,
para anclarlo a la superficie sólida. El ensayo se realiza mediante
la adición del componente no inmovilizado, que se puede marcar
mediante un marcador detectable al componente inmovilizado, por
ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente
anclado. Cuando se completa la reacción, se extraen los componentes
no reaccionados, por ejemplo, mediante lavado, y se detectan los
complejos anclados a la superficie sólida. Cuando el componente
originalmente no inmovilizado transporta un marcador detectable, la
detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que tuvo
lugar la complejación. Cuando el componente originalmente no
inmovilizado no transporta un marcador, se puede detectar la
complejación, por ejemplo, utilizando un anticuerpo marcado que se
une específicamente al complejo inmovilizado.
Si el compuesto candidato interacciona, pero no
se une a un polipéptido PRO10282 particular codificado por un gen
identificado en la presente invención, su interacción con este
polipéptido se puede ensayar mediante procedimientos conocidos para
detectar interacciones proteína-proteína. Dichos
ensayos incluyen estrategias tradicionales, tales como, por
ejemplo, entrecruzamiento, coinmunoprecipitación y copurificación a
través de gradientes o columnas cromatográficas. Además, las
interacciones proteína-proteína se pueden
monitorizar mediante la utilización de sistemas genéticos basados
en levaduras descritos por Fields y colaboradores (Fields y Song,
Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582
(1991)), tal como se describe por Chevray y Nathans, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991)). Muchos
activadores transcripcionales, tales como GAL4 de levadura,
consisten en dos dominios modulares físicamente discretos, uno
actuando como el dominio de unión a ADN, el otro actuando como el
dominio de activación de la transcripción. El sistema de expresión
en las levaduras descrito en las publicaciones anteriores (referido
generalmente como "el sistema de dos híbridos") aprovecha esta
propiedad y utiliza dos proteínas híbridas, una en la que se
fusiona la proteína diana al dominio de unión a ADN de GAL4, y otra,
en la que las proteínas activadoras candidatas se fusionan al
dominio de activación. La expresión de un gen informador
GAL1-lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4
depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 a través de la
interacción de proteína-proteína. Las colonias que
contienen polipéptidos que interaccionan se detectan con un sustrato
cromatogénico para \beta-galactosidasa. En
Clontech se encuentra disponible comercialmente un kit completo
(MATCHMAKER^{TM}) para identificar interacciones
proteína-proteína entre dos proteínas específicas
utilizando la técnica de dos híbridos. Este sistema también se
puede extender para mapear dominios de proteínas implicados en las
interacciones de proteínas específicas así como para precisar los
residuos de aminoácidos que son cruciales para estas
interacciones.
Los compuestos que interfieren con la
interacción de un gen que codifica un polipéptido PRO10282
identificado en la presente invención y otros componentes
intracelulares o extracelulares se puede ensayar tal y como se
indica a continuación: habitualmente se prepara una mezcla de
reacción que contiene el producto del gen y el componente
intracelular o extracelular bajo condiciones y durante un tiempo que
permite la interacción y unión de los dos productos. Para ensayar
la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la
reacción se desarrolla en ausencia y en presencia del compuesto de
prueba. Además, se puede añadir un placebo a una tercera mezcla de
reacción para usar como control positivo. La unión (formación de
complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intracelular
o extracelular presente en la mezcla se monitoriza tal y como se
describe anteriormente en la presente invención. La formación del
complejo en la reacción o reacciones de control, pero no en la
mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba indica que el
compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de
prueba y su compañero de reacción.
Para ensayar antagonistas, el polipéptido
PRO10282 se puede añadir a una célula junto con el compuesto a
cribar para una actividad concreta y la capacidad del compuesto para
inhibir la actividad de interés en presencia del polipéptido
PRO10282 indica que el compuesto es un antagonista del polipéptido
PRO10282. Alternativamente, los antagonistas se pueden detectar
mediante la combinación del polipéptido PRO10282 y un antagonista
potencial con los receptores o receptores recombinantes de
polipéptido PRO10282 unidos a membrana bajo condiciones apropiadas
para un ensayo de inhibición competitiva. El polipéptido PRO10282 se
puede marcar, por ejemplo, mediante radiactividad, de manera que el
número de moléculas de polipéptidos PRO10282 unidas al receptor se
pueden utilizar para determinar la eficacia del potencial
antagonista. El gen que codifica el receptor se puede identificar
mediante numerosos procedimientos conocidos por los expertos en la
materia, por ejemplo, "panning" de ligando y clasificación por
FACS. Coligan et al. Current Protocols in Immun.,
1(2): Capítulo 5 (1991). Preferiblemente, se utiliza la
clonación de la expresión en la que el ARN poliadenilado se prepara
a partir de una célula sensible al polipéptido PRO10282 y una
biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN se divide en grupos y
se utiliza para transfectar células COS u otras células que no son
sensibles al polipéptido PRO10282. Las células transfectadas que se
desarrollan sobre portamuestras de vidrio se exponen a polipéptido
PRO10282 marcado. El polipéptido PRO10282 se puede marcar mediante
una variedad de medios que incluyen la yodación o inclusión de un
sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica de
sitio. Tras la fijación e incubación, los portamuestras se someten
a un análisis autorradiográfico. Los grupos positivos se identifican
y los subgrupos se preparan y se retransfectan utilizando un
proceso de subagrupación y recribado interactivos, obteniendo
finalmente un único clon que codifica el posible receptor.
Como estrategia alternativa para la
identificación de receptores, el polipéptido PRO10282 marcado se
puede unir por fotoafinidad con preparaciones de membranas o
extractos celulares que expresan la molécula receptora. El material
reticulado se resuelve mediante PAGE y se exponen a una película de
rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor se puede
escindir, separar en fragmentos de péptidos y someterse a
microsecuenciación de proteínas. La secuencia de aminoácidos
obtenida a partir de la microsecuenciación se utilizaría para
diseñar un grupo de sondas de oligonucleótidos degenerados para
cribar una biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica
el posible receptor.
En otro ensayo para antagonistas, las células de
mamíferos o una preparación de membrana que expresa el receptor se
incubarían con polipéptido PRO10282 marcado en presencia del
compuesto candidato. A continuación, se podría medir la capacidad
del compuesto para aumentar o bloquear esta interacción.
Más ejemplos específicos de antagonistas
potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones
de inmunoglobulina con polipéptido PRO10282, y, en particular,
anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos policlonales
y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena
única, anticuerpos anti-idiotípicos y las versiones
quiméricas o humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, así
como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos.
Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína
estrechamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del
polipéptido PRO10282 que reconoce el receptor pero no transmite el
efecto, inhibiendo así competitivamente la acción del polipéptido
PRO10282.
Otro potencial antagonista del polipéptido
PRO10282 es una construcción de ADN o ARN antisentido preparada
utilizando tecnología antisentido, cuando, por ejemplo, una molécula
de ADN o ARN antisentido actúa para bloquear directamente la
traducción del ARNm mediante la hibridación a ARNm marcado y
evitando la traducción de la proteína. La tecnología antisentido se
puede utilizar para controlar la expresión génica a través de la
formación de una triple hélice o ADN o ARN antisentido, ambos
procedimientos basados en la unión de un polinucleótido a ADN o
ARN. Por ejemplo, la parte codificante 5' de la secuencia del
polinucleótido, que codifica los polipéptidos PRO10282 maduros de
la presente invención, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de
ARN antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de
longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN para que sea
complementario a una región del gen implicado en la transcripción
(triple hélice - véase Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073
(1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et
al., Science, 251: 1360 (1991)), evitando así la transcripción
y la producción del polipéptido PRO10282. El oligonucleótido de ARN
antisentido se hibrida al ARNm in vivo y bloquea la
traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido PRO10282
(antisentido - Okano, Neurochem., 56:560 (1991);
Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression
(CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Los oligonucleótidos descritos
anteriormente también se pueden liberar a las células, de manera
que el ARN o ADN antisentido se pueden expresar in vivo para
inhibir la producción del polipéptido PRO10282. Cuando se utiliza
ADN antisentido, se prefieren oligodesoxinucleótidos derivados del
sitio de iniciación de la traducción, por ejemplo, entre
aproximadamente las posiciones -10 y +10 de la secuencia de
nucleótidos del gen diana.
Entre los antagonistas potenciales se incluyen
pequeñas moléculas que se unen al sitio activo, el sitio de unión
al receptor, o el factor de crecimiento u otro sitio de unión
relevante del polipéptido PRO10282, bloqueando de esta manera la
actividad biológica normal del polipéptido PRO10282. Entre los
ejemplos de moléculas pequeñas se incluyen, pero no se limitan a,
péptidos pequeños o moléculas similares a péptidos, preferiblemente
péptidos solubles y compuestos orgánicos o inorgánicos no peptídicos
sintéticos.
Las ribozimas son moléculas de ARN enzimático
capaces de catalizar la división específica de ARN. Las ribozimas
actúan mediante la hibridación específica de secuencia al ARN diana
complementario, seguido de la división endonucleolítica. Los sitios
de división específica de la ribozima en un ARN potencial diana se
pueden identificar mediante técnicas conocidas. Para más detalles,
véase, por ejemplo, Rossi, Current Biology,
4:469-471 (1994) y publicación de PCT No. WO
97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997).
Las moléculas de ácido nucleico en la formación
de triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deberían
ser de cadena única y compuestas de desoxinucleótidos. La
composición de las bases de estos oligonucleótidos se diseña de
manera que induce la formación de la triple hélice a través de las
reglas de emparejamiento de bases de Hoogsteen, que generalmente
requiere tramos considerables de purinas o pirimidinas en una hebra
de una doble cadena. Para más detalles, véase, por ejemplo, la
publicación de PCT No. WO 97/33551, supra.
Estas pequeñas moléculas se pueden identificar
mediante uno o más de los ensayos de cribado descritos
anteriormente en la presente invención y/o mediante cualquier otra
técnica de cribado conocida para un experto en la materia.
Stra6, un gen murino inducible por ácido
retinoico, presenta una expresión dependiente del ciclo
espermatogénico en células de Sertoli en testículos. En base a la
homología de secuencia con Stra6, los polipéptidos PRO10282
descritos en la presente invención pueden tener un importante papel
en la espermatogénesis y, por tanto, tiene un uso potencial en el
tratamiento de la fertilidad. Actualmente se cree que la expresión
del polipéptido PRO10282, tal como la del homólogo murino Stra6, es
inducida en respuesta al ácido retinoico. Por lo tanto, la
expresión de PRO10282 a nivel de ARNm, mediante hibridación, o
proteína, mediante ensayos inmunológicos, se puede utilizar para
determinar si un compuesto de prueba tiene un potencial para el
tratamiento de una amplia variedad de enfermedades sensibles a
retinoides. Entre los tipos de enfermedades contempladas como
dianas terapéuticas se incluyen la psoriasis, acné, displasias,
cánceres y enfermedades autoinmunes. La categoría de displasias
contempladas incluye lesiones precancerosas de los tejidos
epiteliales, tales como leucoplaquias orales, displasia del cérvix,
laringe y bronquios. La categoría de cánceres contemplados incluye
carcinomas de colon (adenocarcinoma), pulmón (carcinoma y
adenocarcinoma), piel, cabeza y cuello, cérvix, útero, mama y
próstata. La categoría de enfermedades autoinmunes contempladas
incluye artritis reumatoide, osteoartritis, lupus eritematoso
sistémico, pemphigus vulgaris y pemphigus foliaceous. Los agentes
terapéuticos para tratar dichas enfermedades y afecciones son
anticuerpos y antagonistas (incluyendo moléculas pequeñas) de
PRO10282.
Las composiciones útiles en el tratamiento de
tumores asociados con la amplificación de los genes identificados
en la presente invención incluyen, sin limitación, anticuerpos,
moléculas orgánicas e inorgánicas pequeñas, péptidos,
fosfopéptidos, moléculas antisentido y ribozimas, moléculas de
triple hélice, etc. que inhiben la expresión y/o actividad del
producto génico diana.
Por ejemplo, las moléculas de ADN y ARN
antisentido actúan para bloquear directamente la traducción de ARNm
hibridándose a ARNm marcado y evitando la traducción de proteínas.
Cuando se utiliza ADN antisentido, se prefieren
oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de iniciación de la
traducción, por ejemplo, entre aproximadamente las posiciones -10 y
+10 de la secuencia de nucleótidos del gen diana.
Los ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas
capaces de catalizar la división específica del ARN. Los ribozimas
actúan mediante la hibridación específica de secuencia con el ARN
diana complementario seguido por la división endonucleolítica. Los
sitios de división específicos de las ribozimas en un ARN diana
potencial se pueden identificar mediante técnicas conocidas. Para
más detalles, ver, por ejemplo, Rossi. Current Biology 4,
469-471 (1994) y la publicación de PCT No. WO
97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997).
Las moléculas de ácido nucleico en la formación
de triples hélices utilizadas para inhibir la transcripción
deberían ser de cadena única y compuestas de desoxinucleótidos. La
composición base de estos oligonucleótidos se diseñan de manera que
inducen la formación de la triple hélice a través de las reglas de
emparejamiento de bases de Hoogsteen, que generalmente requieren de
tramos considerables de purinas o pirimidinas en una de las cadenas
de la doble cadena. Para más detalles, ver, por ejemplo, publicación
de PCT No. WO 97/33551, supra.
\newpage
Estas moléculas se pueden identificar mediante
cualquier combinación de los ensayos de cribado descritos
anteriormente y/o mediante cualquier otra técnica conocida por los
expertos en la materia.
La presente invención proporciona anticuerpos
anti-PRO10282 (anti-Stra6) tal como
se ha descrito anteriormente. Entre los anticuerpos de ejemplo se
incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados,
biespecíficos y heteroconjugados.
Los anticuerpos anti-PRO10282
puede comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos para
la preparación de anticuerpos policlonales son conocidos por los
expertos. Los anticuerpos policlonales pueden generarse en un
mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente
inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Habitualmente, el agente
inmunizante y/o el adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante
múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente
inmunizante puede incluir el polipéptido PRO10282 o una proteína de
fusión del mismo. Puede ser útil para conjugar el agente inmunizante
a una proteína de la que se conoce su poder inmunogénico en el
mamífero que va a ser inmunizado. Entre los ejemplos de dichas
proteínas inmunogénicas se incluyen, pero sin limitación, la
hemocianina de lapa californiana, la albúmina sérica, la
tiroglobulina bovina, y el inhibidor de la tripsina de soja. Entre
los ejemplos de adyuvantes que se pueden utilizar se incluyen el
adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM
(monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético).
El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por un experto
en la materia sin una gran experimentación.
Los anticuerpos anti-PRO10282
pueden ser, alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los
anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando
procedimientos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y
Milstein, Nature, 256: 495 (1975). En un procedimiento
de hibridoma, se inmuniza habitualmente un ratón, un hámster u otro
animal huésped apropiado con un agente inmunizante para obtener
linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que
se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente,
los linfocitos se pueden inmunizar in vitro.
El agente inmunizante incluirá habitualmente el
polipéptido PRO10282 o una proteína de fusión del mismo.
Generalmente, se utilizan linfocitos de sangre periférica
("PLBs") si se desean células de origen humano, o se utilizan
células de bazo o células de nódulos linfáticos si se desean fuentes
de mamíferos no humanos. A continuación, los linfocitos se fusionan
con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión
adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de
hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice, Academia Press, (1986), páginas
59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas son
habitualmente células de mamífero transformadas, particularmente
células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Habitualmente,
se utilizan líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las
células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo
adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que
inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células
inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales
carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa
(HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá
habitualmente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio
HAT"), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células
deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas
son aquéllas que se fusionan de manera eficaz, permiten un nivel de
expresión elevado estable del anticuerpo por las células productoras
de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como
un medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son
líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del
Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la
American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. También se han
descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de
ratón-humano para la producción de anticuerpos
monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur
et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) páginas,
51-63].
A continuación, en el medio de cultivo en el que
se cultivan las células de hibridoma se puede analizar la presencia
de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el PRO10282.
Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos
monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina
mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in
vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo
inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). Dichas técnicas y ensayos
se conocen en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo
monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis
Scatchard de Munson y Poliard, Anal. Biochem., 107: 220
(1980).
(1980).
Después de identificar las células de hibridoma
deseadas, los clones se pueden subclonar limitando los
procedimientos de dilución y se pueden desarrollar mediante
procedimientos estándar [Goding, supra]. Entre los medios de
cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio
de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640.
Alternativamente, las células de hibridoma se pueden desarrollar
in vivo como ascites en un mamífero.
\newpage
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o
fluido ascítico mediante procedimientos de purificación de
inmunoglobulinas convencionales, tales como, por ejemplo, proteína
A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatita,
eletroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también se pueden
fabricar mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como
los descritos en la Patente de Estados Unidos No. 4.816.567. El ADN
que codifica los anticuerpos monoclonales de la presente invención
se pueden aislar fácilmente y secuenciar utilizando procedimientos
convencionales (por ejemplo, mediante la utilización de sondas de
oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes
que codifican las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos murinos).
Las células de hibridoma de la presente invención sirven como una
fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede
situar en vectores de expresión, que a continuación se transfectan
en células huésped, tales como células COS de simio, células de
ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen
de ningún modo proteína de inmunoglobulina, para obtener la
síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped
recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo,
sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes
de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias
homólogas murinas [Patente de Estados Unidos No. 4.816.567;
Morrison et al., supra] o uniendo covalentemente a la
secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la
secuencia codificante para un polipéptido que no es inmunoglobulina.
Dicho polipéptido que no es inmunoglobulina se puede sustituir por
los dominios constantes de un anticuerpo de la presente invención,
o se pueden sustituir por los dominios variables de un sitio de
combinación a antígeno de un anticuerpo de la presente invención
para crear un anticuerpo quimérico bivalente.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos
monovalentes son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un
procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera
y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena
pesada se trunca generalmente en cualquier punto en la región Fc
para evitar la entrecruzamiento de la cadena pesada.
Alternativamente, los residuos de cisteína pertinentes se
sustituyen por otro residuo de aminoácido o se eliminan para evitar
la entrecruzamiento.
Los procedimientos in vitro también son
adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de
anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente,
fragmentos Fab, se puede realizar utilizando técnicas rutinarias
conocidas en el sector.
Los anticuerpos anti-PRO10282 de
la presente invención pueden comprender además anticuerpos
humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de
anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas
quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas
(tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras
subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen
una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Entre
los anticuerpos humanizados se incluyen inmunoglobulinas humanas
(anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región
determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen
por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador),
tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad
y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la
estructura ("framework") Fv de la inmunoglobulina humana se
sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Los
anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no
se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de
la CDR o la estructura importados. En general, el anticuerpo
humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y
habitualmente dos, dominios variables, en los que todas o
sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una
inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las
regiones de FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina
humana. El anticuerpo humanizado de forma óptima también
comprenderá por lo menos una parte de una región constante de
inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una inmunoglobulina
humana [Jones et al., Nature, 321: 522-525
(1986); Riechmann et al., Nature, 332:
323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol.,
2: 593-596 (1992)].
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no
humanos son conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo
humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en
el mismo de un origen no humano. Estos residuos de aminoácidos no
humanos se indican frecuentemente como residuos "importados",
que se adquieren habitualmente de un dominio variable
"importado". La humanización se puede realizar esencialmente
siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et
al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann
et al., Nature, 332: 323-327 (1988);
Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536
(1988)], mediante la sustitución de CDRs o secuencias de CDR de
roedor por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano.
Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son
anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos No. 4.816.567), en
los que sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano
ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie
no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son
habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de
CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos
de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos también se pueden
producir utilizando varias técnicas conocidas en el sector,
incluyendo las bibliotecas de expresión de fagos [Hoogenboom y
Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J.
Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Las técnicas de Cole et al. y
Boerner et al. están también disponibles para la preparación
de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985) y
Boerner et al., J. Inmunol., 147(1):
86-95 (1991)]. De forma similar, los anticuerpos
humanos se pueden fabricar mediante la introducción de loci de
inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo,
ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena han sido
parcial o completamente inactivados. Tras la estimulación, se
observa la producción de anticuerpos humanos, que se parece
estrechamente a la observada en humanos en todos los aspectos,
incluyendo el reajuste de genes, el ensamblaje, y el repertorio de
anticuerpos. Esta estrategia se describe, por ejemplo, en las
Patentes de Estados Unidos Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825;
5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones
científicas: Marks et al., Bio/Technology 10,
779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368,
856-859 (1994); Morrison, Nature 368,
812-13 (1994); Fishwild et al., Nature
Biotechnology 14, 845-51, (1996); Neuberger, Nature
Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev.
Immunol. 13 65-93 (1995).
Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales,
preferiblemente humanos o humanizados, anticuerpos que tienen
especificidades de unión con por lo menos dos antígenos diferentes.
En el presente caso, una de las especificidades de unión es por el
PRO10282, el otro es por cualquier otro antígeno, y preferiblemente
por una proteína o receptor o subunidad del receptor de la
superficie celular.
Los procedimientos para fabricar anticuerpos
biespecíficos son conocidos en la técnica. Habitualmente, la
producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la
coexpresión de dos parejas de cadena pesada/cadena ligera de
inmunoglobulina, en las que las dos cadenas pesadas tienen
especificidades diferentes [Millstein y Cuello, Nature, 305:
537-539 (1983)]. Debido a la variedad aleatoria de
cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas
(cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas
diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la
estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula
correcta se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía
de afinidad. En WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en
Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659
(1991) se describen procedimientos similares.
Los dominios variables de anticuerpo con las
especificidades de unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar a secuencias
de dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión
preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de
inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra,
CH2, y regiones CH3. Se prefiere tener la primera región constante
de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la
unión a cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones.
Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de
inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de
inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y
se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para más
detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase,
por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzimology, 121: 210
(1986).
Según otra estrategia descrita en WO 96/27011,
la interfase entre una pareja de moléculas de anticuerpos se puede
diseñar para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se
recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase
preferida comprende por lo menos una parte de la región de CH3 de un
dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más
cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfase de la
primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales
mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean
"cavidades" compensatorias de tamaño similar o idéntico a la
cadena o cadenas laterales grandes en la interfase de la segunda
molécula de anticuerpo mediante la sustitución de cadenas laterales
grandes de aminoácidos por más pequeñas (por ejemplo, alanina o
treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el
rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no
deseados, tales como homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar
como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos
(por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}). Las
técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de
fragmentos de anticuerpos se han descrito en la literatura. Por
ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar
utilizando uniones químicas. Brennan et al., Science 229:81
(1985) describen un procedimiento en el que los anticuerpos
intactos se dividen proteolíticamente para generar fragmentos
F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en presencia del
agente complejante de ditiol, arsenito sódico, para estabilizar los
ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuro
intermolecular. A continuación, los fragmentos Fab' generados se
convierten en derivados de nitrobenzoato (TNB). A continuación, uno
de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte a
Fab'-tiol mediante la reducción con
mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro
derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo
biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden
utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de
enzimas.
Los fragmentos Fab' se pueden recuperar
directamente de E. coli y acoplar químicamente para formar
anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:
217-225 (1992) describen la producción de una
molécula de anticuerpo biespecífico totalmente humanizado
F(ab')_{2}. Cada fragmento de Fab' se secretó por separado
de E. coli y se sometió a un acoplamiento químico dirigido
in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El
anticuerpo biespecífico formado de esta manera era capaz de unirse a
células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y células T humanas
normales, así como de desencadenar la actividad lítica de linfocitos
citotóxicos humanos contra tumores de mama humanos dianas.
Se han descrito también varias técnicas para
fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos
directamente de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se
han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de
leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):
1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de
leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes de Fab'
de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los
homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para
formar monómeros y, a continuación, se reoxidaron para formar los
heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento también se puede
utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La
tecnología de "diabody" descrita por Hollinger et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha
proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de
anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio
variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable
de cadena ligera (V_{L}) mediante un enlazador que es demasiado
corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la
misma cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de
un fragmento son forzados a emparejarse con los dominios V_{L} y
V_{H} complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios
de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para
fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante la
utilización de dímeros de Fv de cadena única (sFv). Véase, Gruber
et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Se consideran
anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden
preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol.
147:60 (1991).
Los anticuerpos biespecíficos de ejemplo se
pueden unir a dos epítopos diferentes en un polipéptido PRO10282
determinado de la presente invención. Alternativamente, un brazo
anti-polipéptido PRO10282 se puede combinar con un
brazo que se une a una molécula desencadenante en un leucocito, tal
como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2, CD3,
CD28, o B7), o receptores Fc para IgG (Fc\gammaR), tales como
Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y Fc\gammaRIII (CD16)
para centrar los mecanismos de defensa celular en la célula que
expresa el polipéptido PRO10282 particular. Los anticuerpos
biespecíficos también se pueden utilizar para confinar agentes
citotóxicos a células que expresan un polipéptido PRO10282
particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a PRO10282 y
un brazo que se une a un agente citotóxico o un radionúcleo
quelante, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo
biespecífico de interés se une al polipéptido PRO10282 y además se
une al factor tisular (TF).
Los anticuerpos heteroconjugados se encuentran
también dentro del alcance de la presente invención. Los
anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos
unidos covalentemente. Dichos anticuerpos se han propuesto, por
ejemplo, para dirigir células del sistema inmune a células no
deseadas [Patente de Estados Unidos No. 4.676.980] y para el
tratamiento de la infección por VIH [WO 91/00360: WO 92/300373; EP
03089]. Se considera que los anticuerpos se pueden preparar in
vitro utilizando procedimientos conocidos en la química
sintética de proteínas, incluyendo los que implican agentes de
entrecruzamiento. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas
utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o mediante la
formación de un enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos
adecuados para este objetivo se incluyen el iminotiolato y
metil-4-mercaptobutirimidato y los
descritos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No.
4.676.980.
Se puede desear modificar el anticuerpo con
respecto a la función efectora con el fin de aumentar, por ejemplo,
la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por
ejemplo, el residuo o residuos de cisteínas se pueden introducir en
la región Fc, permitiendo de esta manera la formación de enlaces
disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico
generado de esta manera puede mejorar la capacidad de
internalización y/o incrementar la citólisis mediada por el
complemento y la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
(ADCC). Véase Caron et al., J. Exp. Med., 176:
1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148:
2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con
una actividad anti-tumoral aumentada también se
pueden preparar utilizando reticuladores heterobifuncionales tal y
como se describe en Wolf et al. Cancer Research, 53:
2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede diseñar
un anticuerpo para que tenga regiones Fc duales y, de esta manera,
pueda aumentar la lisis complementaria y las capacidades de ADCC.
Véase, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug
Design, 3:219-230 (1989).
La presente invención también puede utilizar
inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente
citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por
ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano,
fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo
radioactivo (es decir, un radioconjugado).
Los agentes quimioterapéuticos útiles para la
generación de dichos inmunoconjugados se han descrito
anteriormente. Entre las toxinas enzimáticamente activas y
fragmentos de las mismas que se pueden utilizar se incluyen la
cadena A de difteria, fragmentos activos no enlazantes de toxina de
difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa),
cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina,
alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii,
proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana
(PAPI, PAPII, y PAPS), inhibidor de momordica charantia, curcina,
crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina,
restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Existe un
conjunto de radionúcleos disponibles para la producción de
anticuerpos radioconjugados. Algunos ejemplos incluyen ^{212}Bi,
^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.
Los conjugados del anticuerpo y el agente
citotóxico se fabrican utilizando una serie de agentes bifuncionales
acopladores de proteínas, tales como
N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato
(SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres
(tales como dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (tales como
disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como glutaraldehído),
compuestos bis-azido (tales como
bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina),
derivados de bis-diazonio (tales como
bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina),
diisocianatos (tales como toluen 2,6-diisocianato)
y compuestos de flúor bis-activos (tales como
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina tal y
como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098
(1987). El ácido
1-isotiocianatobencil-3-metildietilen
triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono
14 es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de
radionúcleos al anticuerpo. Ver WO94/11026.
En otra realización, el anticuerpo se puede
conjugar a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la
utilización en el premarcado de tumores en los que el conjugado
anticuerpo-receptor se administra al paciente,
seguido de la eliminación de conjugado no enlazado de la circulación
utilizando un agente purificador y, a continuación, la
administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se
conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionúcleo).
Los anticuerpos descritos en la presente
invención también se pueden formular como inmunoliposomas. Los
liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante
procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en
Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985);
Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77: 4030 (1980); y
las Patentes U.S. Nos. 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con un
mayor tiempo de circulación se describen en la Patente U.S. No.
5.013.556.
Se pueden generar liposomas particularmente
útiles mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con
una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol,
y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE).
Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro
definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los
fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden
conjugar a los liposomas tal y como se describen en Martin et
al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)
mediante la reacción de intercambio de enlaces disulfuro.
Opcionalmente, el liposoma contiene un agente quimioterapéutico (tal
como Doxorubicina). Véase Gabizon et al., J. Nacional Cancer
Inst., 81(19): 1484 (1989).
Los anticuerpos de la presente invención pueden
usarse en ADEPT mediante la conjugación del anticuerpo a una enzima
activadora de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo,
un agente quimioterapéutico de tipo peptidilo, véase WO 81/01145)
en un fármaco anticanceroso activo. Véase, por ejemplo, WO 88/07378
y la patente de Estados Unidos 4.975.278.
El componente enzimático del inmunoconjugado
útil para la ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre
un profármaco de manera que lo convierta en su forma más activa y
citotóxica.
Entre las enzimas que son útiles en el
procedimiento de esta invención se incluyen, pero no está limitado
a, la glicosidasa, la glucosa oxidasa, la lisozima humana, la
glucuronidasa humana, la fosfatasa alcalina útil por convertir
profármacos que contienen fosfato en los fármacos libres; la
arilsulfatasa útil por convertir profármacos que contienen sulfato
en los fármacos libres; citosina deaminasa útil por convertir la
5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco
anticanceroso 5-fluorouracilo; proteasas, tales como
la proteasa de Serratia, la termolisina, la subtilisina,
carboxipeptidasas (por ejemplo, carboxipeptidasa G2 y
carboxipeptidasa A) y las catepsinas (tales como las catepsinas B y
L), que son útiles por convertir profármacos que contienen péptidos
en los fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas,
útiles por convertir profármacos que contienen sustituyentes de
tipo D-aminoácido; las enzimas que hidrolizan
carbohidratos como la \beta-galactosidasa y la
neuraminidasa útiles por convertir profámacos glicosilados en
fármacos libres; la \beta-lactamasa útil por
convertir fármacos derivatizados con
\beta-lactamas en los fármacos libres; y las
penicilin amidasas; tales como la penicilin vamidasa o la penicilin
G amidasa, útiles por convertir fármacos derivatizados en sus
nitrógenos de aminas con grupos fenoxiacetil o fenilacetil,
respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, pueden
usarse anticuerpos con actividad enzimática también conocidos en la
técnica como "abzimas" para convertir los profármacos de la
invención en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey,
Nature, 328:457-458 (1987)). Los conjugados
anticuerpo-abzima pueden prepararse como se describe
aquí para la liberación del abzima de una población de células
tumorales.
Las enzimas de esta invención pueden unirse
covalentemente a los anticuerpos anti-PRO10282
(anti-Stra6) mediante técnicas bien conocidas en la
materia, tales como el uso de agentes de entrecruzamiento
heterobifuncionales descritos anteriormente. Alternativamente,
pueden generarse proteínas de fusión que comprendan al menos la
región de unión al antígeno del anticuerpo de la invención unido a
al menos una parte funcionalmente activa de una enzima de la
invención usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la
técnica (véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature,
312:604-608 (1984)).
Los anticuerpos que se unen específicamente a un
polipéptido PRO10282 identificados en la presente invención, así
como otras moléculas identificadas por los ensayos de cribado
descritos anteriormente en la presente invención, se pueden
administrar para el tratamiento de varios trastornos en forma de
composiciones farmacéuticas.
Si el polipéptido PRO10282 es intracelular y los
anticuerpos completos se utilizan como inhibidores, se prefieren
anticuerpos de internalización. Sin embargo, se pueden utilizar
también las lipofecciones o liposomas para liberar el anticuerpo, o
un fragmento de anticuerpo, en las células. Cuando se utilizan
fragmentos de anticuerpos, se prefiere el fragmento inhibidor más
pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la
proteína diana. Por ejemplo, en base a las secuencias de región
variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas peptídicas
que mantienen la capacidad de unirse a la secuencia de la proteína
diana. Dichos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o
producirse mediante tecnología de ADN recombinante. Véase, por
ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:
7889-7893 (1993). La formulación de la presente
invención también puede contener más de un compuesto activo según
sea necesario para la enfermedad particular en tratamiento,
preferiblemente aquéllos con actividades complementarias que no
afectan de forma adversa entre sí. Alternativamente o
adicionalmente, la composición puede comprender un agente que
potencia su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico,
una citoquina, un agente quimioterapéutico o un agente inhibidor del
crecimiento. Dichas moléculas están presentes de forma adecuada
combinadas en cantidades que son eficaces para el objetivo
deseado.
Los principios activos también se pueden
introducir en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante
técnicas de coacervación o mediante polimerización por interfase,
por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y
microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en
sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo,
liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas
y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen
en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.
Las formulaciones a utilizar en la
administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza
fácilmente mediante la filtración a través de membranas de
filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación
controlada. Entre algunos ejemplos de preparaciones de liberación
controlada adecuadas se incluyen matrices semipermeables de
polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas
matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo,
películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de
liberación controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por
ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato)
o poli(vinilalcohol), poliláctidos (Patente de Estados Unidos
No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y
\gamma-etil-L-glutamato,
etileno-acetato de vinilo no degradable,
copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico no degradables, tales
como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de
copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de
leuprolida), y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras que polímeros, tales como etileno-acetato
de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de
moléculas durante aproximadamente 100 días, ciertos hidrogeles
liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los
anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un periodo
largo de tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado
de la exposición a humedad a 37ºC, dando lugar a una pérdida de
actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se
pueden idear estrategias razonables para la estabilización
dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre
que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces
S-S intermoleculares a través del intercambio
tio-disulfuro, la estabilización se puede conseguir
mediante la modificación de residuos sulfhidrilo, la liofilización
de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, la
utilización apropiada de aditivos, y el desarrollo de composiciones
de matrices de polímero específicas.
Los anticuerpos anti-PRO10282 de
la presente invención tienen varias utilidades. Por ejemplo, los
anticuerpos anti-PRO10282 se pueden utilizar en
ensayos de diagnóstico para PRO10282, por ejemplo, detectando su
expresión en células específicas, tejidos o suero. Se pueden
utilizar varias técnicas de ensayo de diagnóstico conocidas en el
sector, tales como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich
directo o indirecto y ensayos de inmunoprecipitación realizados en
fases heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A
Manual of Techniques, CRC PRess, Inc. (1987) páginas
147-158]. Los anticuerpos utilizados en los ensayos
de diagnóstico se pueden marcar con un grupo detectable. El grupo
detectable debería ser capaz de producir, directa o indirectamente,
una señal detectable. Por ejemplo, el grupo detectable puede ser un
radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o
^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como
isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferina, o una
enzima, tal como alcalina fosfatasa,
beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante.
Se puede utilizar cualquier procedimiento conocido en la técnica
para conjugar el anticuerpo al grupo detectable, incluyendo
aquellos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature,
144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014
(1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219 (1981); y
Nygren, J. Histochem. y Cytochem., 30: 407 (1982).
Los anticuerpos anti-PRO10282
también son útiles para la purificación por afinidad de PRO10282 a
partir de un cultivo de células recombinantes o de origen natural.
En este proceso, los anticuerpos contra PRO10282 se inmovilizan
sobre un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex o papel de
filtro, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. A
continuación, el anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una
muestra que contiene el PRO10282 a purificar, y posteriormente se
lava el soporte con un disolvente adecuado que extraerá
sustancialmente todo el material en la muestra a excepción del
PRO10282, que está unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el
soporte se lava con otro disolvente adecuado que liberará el
PRO10282 del anticuerpo.
Los anticuerpos anti-PRO10282 se
pueden utilizar para monitorizar la expresión del polipéptido
PRO10282 que tiene un uso potencial como procedimiento sensible
para cribar compuestos terapéuticamente útiles contra una amplia
variedad de enfermedades sensibles a retinoide. Entre los tipos de
enfermedades contempladas como dianas terapéuticas se incluyen la
psoriasis, acné, displasias, cánceres y enfermedades autoinmunes. La
categoría de displasias contempladas incluye lesiones precancerosas
de los tejidos epiteliales, tales como leucoplaquias orales,
displasia del cérvix, laringe y bronquios. La categoría de cánceres
contemplados incluye carcinomas de colon (adenocarcinoma), pulmón
(carcinoma y adenocarcinoma), piel, cabeza y cuello, cérvix, útero,
mama y próstata. La categoría de enfermedades autoinmunes
contempladas incluye artritis reumatoide, osteoartritis, lupus
eritematoso sistémico, pemphigus vulgaris y pemphigus foliaceous.
Los anticuerpos anti-PRO10282 tienen un uso
terapéutico potencial en el tratamiento de dichas enfermedades y
afecciones.
Se contempla que los anticuerpos y otros
compuestos anti-tumorales de la presente invención
se puedan utilizar para tratar varias enfermedades, incluyendo
aquellas caracterizadas por la sobreexpresión y/o activación de los
genes amplificados identificados en la presente invención. Algunos
ejemplos de enfermedades o trastornos a tratar con dichos
anticuerpos y otros compuestos incluyendo, pero sin limitación,
moléculas orgánicas e inorgánicas pequeñas, péptidos, moléculas
antisentido, etc., se incluyen tumores benignos o malignos (por
ejemplo, carcinomas renal, hígado, riñón, vejiga, mama, gástrico,
ovárico, colorrectal, próstata, pancreático, pulmón, vulva,
tiroides, hepático; sarcomas; glioblastomas; y varios tumores de
cabeza y cuello); leucemias y tumores de linfoides; otros
trastornos, tales como trastornos neuronal, glial, astroglial,
hipotalámico y otros trastornos glandulares, de macrófagos,
epiteliales, estromales y blastocoélicos; y trastornos
inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos. Las dianas
particularmente preferidas para el tratamiento con anticuerpos
anti-Stra6 y otros antagonistas de la presente
invención son tumores que albergan defectos genéticos en el
mecanismo de Wnt-1 (por ejemplo, que conducen a la
activación anormal de la señalización de
\beta-catenina) y/o sobreexpresan Stra6. Se ha
observado que los cánceres humanos que albergan defectos genéticos
en el mecanismo de Wnt-1 habitualmente también
muestran la sobreexpresión de Stra, pero no todos los tumores que
sobreexpresan Stra6 se sabe que están asociados con mutaciones en
el mecanismo de Wnt-1. Los antagonistas de Estra6 de
la presente invención presentan un gran potencial en el tratamiento
de tumores que sobreexpresan Stra6. Un grupo preferido de dichos
tumores incluye tumores colorrectales, tumores de ovario, endometrio
y riñón de Wilm, melanoma y feocromocitoma (un tumor derivado de la
médula adrenal).
Los agentes anti-tumorales de la
presente invención, por ejemplo, anticuerpos, se administran a un
mamífero, preferiblemente un humano, según métodos conocidos, tales
como administración intravenosa como un bolo o mediante infusión
continua durante un periodo de tiempo, mediante las rutas
intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea,
intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o
inhalación. Se prefiere la administración intravenosa del
anticuerpo.
Se pueden combinar otras pautas terapéuticas con
la administración de los agentes anticancerígenos, por ejemplo,
anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, el paciente a
tratar con dichos agentes anticancerosos también pueden recibir
terapia por radiación. Alternativamente, o adicionalmente, se puede
administrar un agente quimioterpéutico al paciente. La preparación
y los programas de dosificación para dichos agentes
quimitoerapéuticos se pueden utilizar según las instrucciones del
fabricante o según se determina empíricamente por un profesional
experto. La preparación y los programas de dosificación para dicha
quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service
Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). El
agente quimioterapéutico puede preceder o seguir a la
administración del agente anti-tumoral, por ejemplo,
un anticuerpo, o se puede administrar simultáneamente con el mismo.
El anticuerpo se puede combinar con un compuesto
anti-oestrógeno, tal como tamoxifeno, o una
anti-progesterona, tal como onapristona (ver, EP
616812) en dosis conocidas para dichas moléculas.
Se puede desear tamibén administrar anticuerpos
contra otros antígenos asociados a un tumor, tales como anticuerpos
que se unen a ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 o factor endotelial vascular
(VEGF). Alternativamente, o además, se pueden coadministrar al
paciente dos o más anticuerpos que se unen al mismo o dos o más
antígenos diferentes descritos en la presente invención. Algunas
veces, puede ser beneficioso administrar también una o más
citoquinas al paciente. En una realización preferida, los
anticuerpos de la presente invención se coadministran con un agente
inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del
crecimiento se puede administrar en primer lugar, seguido de un
anticuerpo de la presente invención. Sin embargo, también se
contempla la administración simultánea o la administración en
primer lugar del anticuerpo de la presente invención. Las dosis
adecuadas para el agente inhibidor del crecimiento son aquellas que
se utilizan actualmente y pueden disminuirse debido a la acción
combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y el
anticuerpo de la presente invención.
Para la prevención o el tratamiento de la
enfermedad, la dosis apropiada de un agente
anti-tumoral, por ejemplo, un anticuerpo de la
presente invención, dependerá del tipo de enfermedad a tratar, tal
como se ha definido anteriormente, la gravedad y la evolución de la
enfermedad, si el agente se administra con objetivos de prevención
o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y
la respuesta al agente, y la discreción del profesional que atiende
al paciente. El agente se administra adecuadamente al paciente en
una vez o durante una serie de tratamientos.
Por ejemplo, dependiendo del tipo y la gravedad
de la enfermedad, aproximadamente de 1 \mug/kg a 15 mg/kg (por
ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosis
candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por
ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante
infusión continua. Una dosis diaria habitual podría variar entre
aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los
factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas
durante varios días o a más tiempo, dependiendo de la enfermedad,
el tratamiento se mantiene hasta que tenga lugar la supresión
deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser
útiles otras pautas de dosificación. El progreso de esta terapia se
monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos
convencionales.
En la presente invención también se describe un
artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el
diagnóstico o tratamiento de los trastornos descritos anteriormente.
El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta.
Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas,
viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar
formados de una variedad de materiales, tales como vidrio o
plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para
el diagnóstico o tratamiento de la enfermedad y puede tener un
puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una
bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón penetrable
por una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente
activo en la composición es un agente anti-tumoral
capaz de interferir con la actividad de un producto génico
identificado de la presente invención, por ejemplo, un anticuerpo.
La etiqueta en el recipiente o asociado con el mismo indica que la
composición se utiliza para el diagnóstico o el tratamiento de la
enfermedad de elección. El artículo de fabricación puede comprender
además un segundo recipiente que comprende un tampón
farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina tamponada
con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede
incluir también otros materiales deseables desde un punto de vista
comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes,
filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para su
uso.
Mientras que las proteínas de la superficie
celular, tales como receptores de crecimiento que se sobreexpresan
en ciertos tumores, son excelentes dianas para los fármacos
candidatos o el tratamiento del tumor (por ejemplo, cáncer), las
mismas proteínas junto con proteínas secretadas codificadas por los
genes amplificados en células tumorales son útiles adicionalmente
en el diagnóstico y pronóstico de tumores. Por ejemplo, los
anticuerpos dirigidos contra los productos proteicos de los genes
amplificados en células tumorales se pueden utilizar como
diagnóstico o pronóstico de tumores.
Por ejemplo, los anticuerpos, incluyendo
fragmentos de anticuerpos, se pueden utilizar para detectar
cualitativamente o cuantitativamente la expresión de proteínas
codificadas por los genes amplificados ("productos génicos
marcadores"). El anticuerpo está preferiblemente equipado con un
marcador detectable, por ejemplo fluorescente, y la unión se puede
monitorizar mediante microscopía de luz, citometría de flujo,
fluorimetría, u otras técnicas conocidas en el sector. Estas
técnicas son particularmente adecuadas, si el gen amplificado
codifica una proteína de la superficie celular. Dichos ensayos de
unión se realizan esencialmente tal y como se ha descrito en la
sección 5 anteriormente.
La detección in situ de la unión del
anticuerpo a los productos génicos marcadores se puede realizar,
por ejemplo, mediante inmunofluorescencia o microscopía
inmunoelectrónica. Con este objetivo, se extrae una muestra
histológica del paciente, y se aplica un anticuerpo marcado a la
misma, preferiblemente mediante el recubrimiento del anticuerpo
sobre la muestra biológica. Este procedimiento también permite la
determinación de la distribución del producto génico marcador en el
tejido examinado. Será evidente para los expertos en la materia que
existen una gran variedad de procedimientos histológicos fácilmente
disponibles para la detección in situ.
Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con
objetivos ilustrativos, y no pretenden limitar de ningún modo el
alcance de la presente invención.
Los reactivos disponibles comercialmente a los
que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con
las instrucciones del fabricante a menos de que se indique lo
contrario. El origen de las células identificadas en los siguientes
ejemplos, y a lo largo del documento, por los números de acceso de
la ATCC pertenecen a la American Type Culture Collection, Manassas,
VA. En los siguientes ejemplos, a menos que se especifique lo
contrario, "Stra6" hará referencia al polipéptido PRO10282 de
secuencia nativa.
Los clones de ADNc
(DNA148380-2827 y
DNA148389-2827-1) que codifican los
polipéptidos PRO10282 y PRO19578 humanos nativos se identificaron
utilizando un cribado de levadura, en una biblioteca de ADNc de
cerebro fetal humano que representa preferencialmente los extremos
5' de los clones de ADNc primarios.
El clon DNA 148380-2827 contiene
un marco de lectura abierto único con un sitio de iniciación
traduccional aparente en las posiciones de nucleótidos
49-51 y finalización en el codón de parada en las
posiciones de nucleótidos 21150-2052 (figura 1). El
precursor del polipéptido previsto tiene 667 aminoácidos de longitud
(figura 2). La proteína PRO10282 de longitud completa mostrada en
la figura 2 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente
73.502 daltons y un pI de aproximadamente 9,26. El análisis de la
secuencia de PRO10282 de longitud completa que se muestra en la
Figura 2 (SEC ID No: 2) pone en evidencia la presencia de una
variedad de dominios de polipéptido importantes, tal como se
muestra en la figura 2, en los que las localizaciones
proporcionadas para estos dominios de polipéptido importantes son
aproximadamente tal como se ha descrito anteriormente. El clon DNA
148380-2827 se ha depositado con ATCC el 11 de enero
de 2000 y se asigna el depósito ATCC no.
PTA-1181.
El clon DNA
148389-2827-1 contiene un marco de
lectura abierto único con un sitio de iniciación traduccional
aparente en las posiciones de nucleótidos 186-188 y
finalización en el codón de parada en las posiciones de nucleótidos
2160-2162 (figura 6, SEC ID No. 4). El precursor del
polipéptido previsto tiene 658 aminoácidos de longitud (figura 7,
SEC ID No. 5). La proteína PRO19578 de longitud completa mostrada en
la figura 7 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente
72.583 daltons y un pI de aproximadamente 9,36. El análisis de la
secuencia de PRO19578 de longitud completa que se muestra en la
Figura 7 (SEC ID No: 5) pone en evidencia la presencia de una
variedad de dominios de polipéptido importantes, tal como se muestra
en la figura 7, en los que las localizaciones proporcionadas para
estos dominios de polipéptido importantes son aproximadamente tal
como se ha descrito anteriormente. Cabe mencionar la presencia de
nueve dominios transmembrana potenciales y catorce residuos de
cisteína conservados entre la secuencia humana y la correspondiente
secuencia de ratón. Mientras que Stra6 de ratón tiene tres sitios
potenciales de glicosilación unidos a N, el polipéptido PRO19578
humano (Stra6 humano nativo) tiene uno. El clon DNA
148389-2827-1 se ha depositado con
ATCC el 23 de febrero de 2000 y se asigna el depósito ATCC no.
PTA-1405.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión
35.45 SwissProt 35) utilizando el análisis de alineación de
secuencia ALIGN-2 de la secuencia de longitud
completa mostrada en la figura 2 (SEC ID No. 2) y de la secuencia
de longitud completa mostrada en la figura 7 (SEC ID No. 6) puso de
manifiesto la identidad entre la secuencia de aminoácidos de
PRO10282 y las siguientes secuencias de Dayhoff: AF062476, P_W88559
y HGS_RE259.
Tal como se muestra en la figura 8, la
comparación de los polipéptidos PRO10282 y PRO19578 humanos de
longitud completa muestra que el PRO19578 contiene una eliminación
de nueve aminoácidos (SPVDFLAGD; SEC ID No. 13) en las posiciones
89-97 de la secuencia de aminoácidos PRT010282.
Además, el PRO19578 contiene una isoleucina (I) en la posición de
aminoácido 528 en lugar de metionina (M) en la correspondiente
posición (posición 527) de PRO10282, que resulta de un polimorfismo
G/A en esta posición. Se cree que tanto los polipéptidos PRO10282
como PRO19578 de secuencia nativa son los homólogos humanos del
polipéptido Stra6 de ratón, y se les hace referencia por tanto como
"Stra6". Stra6 de ratón y el polipéptido PRO10282 de longitud
completa humano de secuencia nativa codificado por
DNA148340-2827 muestran aproximadamente una
identidad de la secuencia de aminoácidos de aproximadamente el
74%.
La figura 9 muestra la representación de
hidrofobicidad del polipéptido PRO10282 de longitud completa humano
de secuencia nativa codificado por DNA148340-2827,
al que se hace referencia brevemente como "Stra6 humano". Tal
como se muestra en la figura 9, aproximadamente el 50% de los
residuos de aminoácidos en este polipéptido de 667 de aminoácidos
de largo son hidrofóbicos.
El gen de Stra6 humano se localizó en el
cromosoma 15q23 determinado por UNIGENE. El mapeo fino preliminar
indica que Stra6 se localiza en el intervalo STS
D15S124-D15S160 y la posición 98 del GeneMap
corresponde a 244,52 en el mapa G3.
El siguiente procedimiento describe el uso de
una secuencia de nucleótidos que codifica PRO10282 como sonda de
hibridación.
El ADN que comprende la secuencia codificante de
PRO10282 o PRO19578 de longitud completa o madura se utiliza como
sonda para cribar los ADNs homólogos (tales como aquéllos que
codifican variantes naturales de PRO10282 o PRO19578) en
bibliotecas de ADNc de tejido humano o bibliotecas genómicas de
tejido humano.
La hibridación y el lavado de filtros que
contienen cualquier ADN de biblioteca se realizan según las
siguientes condiciones de astringencia elevada. La hibridación de la
sonda radiomarcada derivada de PRO10282 a los filtros se realiza en
una solución al 50% de formamida, 5x SSC, SDS al 0,1%, pirofosfato
de sodio al 0,1%, 50 mM de fosfato de sodio, pH 6,8, 2x de solución
de Denhardt, y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas.
El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1x
SSC y SDS al 0,1% a 42ºC.
A continuación, se pueden identificar los ADNs
que tienen una identidad en la secuencia deseada con el ADN que
codifica el PRO10282 o PRO19578 de secuencia nativa de longitud
completa utilizando las técnicas estándar conocidas en la
literatura.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
no glicosilada de PRO10282 o PRO19578 mediante la expresión
recombinante en E. coli.
La secuencia de ADN que codifica PRO10282 o
PRO19578 se amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR
seleccionados. Los cebadores deberían contener sitios para enzimas
de restricción que se correspondan con los sitios para enzimas de
restricción en el vector de expresión seleccionado. Se puede
utilizar un conjunto de vectores de expresión. Un ejemplo de un
vector adecuado es el pBR322 (derivado del E. coli, véase
Bolivar et. al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para
la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. El vector se
digiere con una enzima de restricción y se defosforila. A
continuación, las secuencias amplificadas por PCR se unen en el
vector. El vector preferiblemente incluirá secuencias que codifican
un gen resistente a un antibiótico, un promotor trp, una secuencia
líder de polihis (incluyendo los primeros seis codones STII,
secuencia polihis, y sitio de división para la enteroquinasa), la
región codificante de PRO10282 o PRO19578, el finalizador
transcripcional lambda, y un gen argU.
A continuación, la mezcla de unión se utiliza
para transformar una cepa seleccionada de E. coli utilizando
los procedimientos descritos en Sambrook et. al.,
supra. Los transformantes se identifican por su capacidad
para crecer en placas de LB y, a continuación, se seleccionan las
colonias resistentes a los antibióticos. El ADN plasmídico se puede
aislar y confirmar mediante el análisis de restricción y la
secuenciación del ADN.
Los clones seleccionados se pueden desarrollar
durante toda la noche en un medio de cultivo líquido, tal como
caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche
se puede utilizar posteriormente para inocular un cultivo a mayor
escala. A continuación, las células se desarrollan hasta una
densidad óptica deseada, durante la cual se activa el promotor de
la expresión.
Después de cultivar las células durante más
horas, las células se pueden recoger mediante centrifugación. El
residuo celular obtenido mediante la centrifugación se puede
solubilizar utilizando diversos agentes conocidos en la técnica y,
a continuación, la proteína PRO10282 solubilizada se puede purificar
utilizando una columna quelante metálica en condiciones que
permiten la unión fuerte de la proteína.
El PRO10282 o PRO19578 puede expresarse en E.
coli en forma de etiqueta de poli-His,
utilizando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica PRO10282
o PRO19578 se amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR
seleccionados. Los cebadores contendrán sitios para enzimas de
restricción que se corresponden con los sitios para enzimas de
restricción en el vector de expresión seleccionado, y otras
secuencias útiles que proporcionan una iniciación de la traducción
eficaz y fiable, una purificación rápida en una columna quelante
metálica, y la extracción proteolítica con enteroquinasa. Las
secuencias etiquetadas con poli-His amplificadas
por PCR se unen a continuación en un vector de expresión que se
utiliza para transformar un E. coli huésped basado en la
cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts)
clpP(laclq). Los transformantes se cultivan en primer lugar
en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC con agitación
hasta alcanzar una D.O. 600 de 3-5. Los cultivos se
diluyen a continuación 50-100 veces en un medio CRAP
(preparado mezclando 3,57 g de (NH_{4})_{2}SO_{4},
0,71 g de citrato de sodio\cdot2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de
extracto de levadura Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF en 500 ml
de agua, además de 110 mM de MPOS, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y
7 mM de MgSO_{4}) y se cultivan durante aproximadamente
20-30 horas a 30ºC con agitación. Las muestras se
extraen para verificar la expresión mediante un análisis
SDS-PAGE, y el volumen del cultivo se centrifuga
hasta que las células son residuos de centrifugación. Los residuos
celulares se congelan hasta la purificación y el repliegue.
La masa de E. coli de fermentaciones de
0,5 a 1 L (6-10 g de residuos celulares) se
resuspende en 10 volúmenes (p/v) de 7 M de guanidina, 20 mM de
Tris, tampón de pH 8. Se añade sulfito sódico sólido y tetrationato
de sodio para que las concentraciones finales sean de 0,1 M y 0,02
M, respectivamente, y la solución se agita durante toda la noche a
4ºC. Esta etapa da lugar a una proteína desnaturalizada con todos
los residuos de cisteína bloqueados por sulfitolización. La
solución se centrifuga a 40.000 rpm durante 30 minutos en una
ultracentrífuga Beckman. El sobrenadante se diluye con
3-5 volúmenes de tampón de columna quelante metálica
(6 M de guanidina, 20 mM de Tris, pH 7,4) y se filtra a través de
filtros de 0,22 micras para aclarar. El extracto purificado se
carga en una columna quelante metálica Qiagen Ni-NTA
de 5 ml equilibrada con el tampón de columna quelante metálica. La
columna se lava con un tampón adicional que contiene 50 mM de
imidazol (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluye
con un tampón que contiene 250 mM de imidazol. Las fracciones que
contienen la proteína de interés se agrupan y se guardan a 4ºC. La
concentración de la proteína se estima según su absorbancia a 280
nm utilizando el coeficiente de extinción calculado en base a su
secuencia de aminoácidos.
Las proteínas se repliegan mediante la dilución
lenta de la muestra en tampón de repliegue preparado recientemente
consistente en: 20 mM de Tris, pH 8,6, 0,3 M de NaCl, 2,5 M de urea,
5 mM de cisteína, 20 mM de glicina y 1 mM de EDTA. Los volúmenes de
repliegue se escogen de manera que la concentración final de
proteína está entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de
repliegue se agita suavemente a 4ºC durante 12-36
horas. La reacción de repliegue se desactiva mediante la adición de
TFA hasta una concentración final del 0,4% (pH de aproximadamente
3). Antes de otra purificación de la proteína, la solución se filtra
a través de un filtro de 0,22 micras y se añade acetonitrilo hasta
una concentración final del 2-10%. La proteína
replegada se somete a una columna de cromatografía de fase inversa
Poros R1/H utilizando un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución
con un gradiente de acetonitrilo del 10 al 80%. Las alícuotas de
fracciones con una absorbancia A280 se analizan en geles de SDS
poliacrilamida y las fracciones que contienen proteína replegada
homogénea se agrupan. Generalmente, las muestras replegadas
correctamente de la mayoría de las proteínas se eluyen a las
concentraciones más bajas de acetronitrilo, ya que esas muestras
son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos de
la interacción con la resina de fase inversa. Las muestras agregadas
se eluyen normalmente a concentraciones de acetonitrilo superiores.
Además de separar las formas mal plegadas de proteínas de las de
manera deseada, la etapa de la fase inversa también elimina la
endotoxina de las muestras.
\newpage
Las fracciones que contienen el polipéptido
PRO10282 o PRO19578 plegado deseado se agrupan y se elimina el
acetonitrilo utilizando una corriente suave de nitrógeno dirigida a
la solución. Las proteínas se formulan en 20 mM Hepes, pH 6,8 con
0,14 M de cloruro sódico y manitol al 4% por diálisis o por
filtración en gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia)
equilibradas en el tampón de formulación y filtradas estériles.
Específicamente, se expresaron por separado dos
dominios extracelulares (ECD) de la proteína stra6 humana nativa
PRO10282, Pepetide A (aminoácidos 229-295) y
Pepetide B (aminoácidos 532-567) como péptidos en
el citoplasma de E. coli con una secuencia líder de
polihistidina N-terminal que tiene la secuencia de
aminoácidos MKHQHQHQHQHQHQMHQ (SEC ID No. 12). Esta secuencia líder
proporciona un inicio de traducción óptimo, una purificación en una
columna quelante de níquel y la extracción eficaz si se desea con el
sistema TAGZima (Unizyme Laboratories). La transcripción se
controló mediante el promotor de fosfatasa alcalina de E.
coli (kikuchi et al. Nucleic Acids Res.
9:5671-5678 [1981]) y el sitio de unión a ribosoma
del operón trp (Yanofsky et al. Nucleic Acids Res.
9:6647-6668 [1981] proporcionaba la traducción. En
posición "downstream" del codón de terminación de la
traducción está la \lambda con respecto al terminador
transcripcional (Scholtissek y Grosse, Nucleic Acids Res. 15:3185
[1987], seguido de los genes de ARNt de codón raro pro2, argU y glyT
(Komine et al., J. Mol. Biol. 212: 579-598
[1990], Fournier y Ozeki, Microbiol. Rev. 49:
379-397 [1985]).
Los dos fragmentos de ADN de la secuencia
codificante de ECD de Stra6 se prepararon mediante PCR a partir de
un clon de ADNc de longitud completa y se insertaron en el vector de
expresión descrito anteriormente, el cual se designó como pST239.
Después de la verificación de la secuencia de ADN, los nuevos
plásmidos de expresión de Stra6, designados como PE148380A y
PE14838B, se transformaron en la cepa de E. coli 58F3
((fhuA\Delta(ton\Delta) lon\Delta galE rpoHts (htpRts)
\DeltaclpP laclq \DeltaompTA (nmpc-fepE)
\DeltaslyD). Los caldos de cultivo Luria de estos transformantes
se desarrollaron en primer lugar durante toda la noche a 30ºC y a
continuación se diluyeron 100 veces en un medio limitante de
fosfato para inducir el promotor de fosfatasa alcalina. Después de
24 horas a 30ºC con agitación, los cultivos se centrifugaron y las
masas celulares se congelaron hasta el inicio de la purificación de
los péptidos.
Para la purificación, las masas de E.
coli (residuos celulares de 6-10 gm) se
resuspendieron en 10 volúmenes (p/v) de 7 M de guanidina HCl, 20 mM
tris, pH 8, tampón. Se añadieron sulfito sódico y tetrationato
sódico sólidos para que las concentraciones finales fueran de 0,1 M
y 0,02 M, respectivamente, y la solución se agitó durante tda la
noche a 4ºC. La solución se depuró mediante centrifugación y se
cargó sobre una columna de quelato metálico Ni-NTA
Qiagen equilibrada en 6 M de guanidina, HCl, 20 mM Tris, pH 7,4. La
columna se lavó con tampón adicional que contenía 50 mM de imidazol
(Calbiochem, grado Utrol). La proteína se eluyó con tampón que
contenía 250 mm de imidazol. Las fracciones que contenían la
proteína deseada se agruparon, se dializaron frente a 1 mM de HCl y
se guardaron a 4ºC.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
potencialmente glicosilada de PRO10282 y PRO19578 mediante la
expresión recombinante en células de mamíferos.
El vector pRK5 (véase EP 307.247, publicada el
15 de marzo de 1989) se utiliza como vector de expresión.
Opcionalmente, el ADN de PRO10282 o PRO19578 se une en el pRK5 con
enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del
ADN de PRO10282 utilizando procedimientos de unión tales como los
descritos en Sambrook et. al., supra. El vector
resultante se denomina pRK5-PRO10282 y
pRK5-PRO19578, respectivamente.
En una realización, las células huésped
seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC
CCL 1573) se desarrollan para unirse en placas de cultivo de tejidos
en un medio tal como DMEM suplementado con suero de ternera fetal y
opcionalmente, componentes nutricionales y/o antibióticos. Se
mezclan aproximadamente 10 \mug de ADN de
pRK5-PRO10282 o pRK5-PRO19578 con
aproximadamente 1 \mug de ADN que codifica el gen del ARN de VA
[Thimmappaya et. al., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelve en
500 \mul de 1 mM de Tris-HCl, 0,1 mM de EDTA,
0,227 M de CaCl_{2}. A esta mezcla se le añade, gota a gota, 500
\mul de 50 mM de HEPES (pH 7,35), 280 mM de NaCl, 1,5 mM de
NaPO_{4}, y se deja formar un precipitado durante 10 minutos a
25ºC. El precipitado se suspende y se añade a células 293 y se deja
reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de
cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante
30 segundos. A continuación, las células 293 se lavan con medio sin
suero, se añade medio nuevo y las células se incuban durante
aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las
transfecciones, el medio de cultivo se extrae y se reemplaza por
medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200
\muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de
^{35}S-metionina. Tras una incubación de 12 horas,
se recoge el medio acondicionado, se concentra en un filtro de giro
y se carga en un gel SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y
exponerse a una película durante un período de tiempo concreto para
revelar la presencia del polipéptido PRO10282. Los cultivos que
contienen células transfectadas pueden experimentar una incubación
adicional (en medio sin suero) y el medio se examina en bioensayos
concretos.
En una técnica alternativa, se puede introducir
PRO10282 o PRO19578 en células 293 transitoriamente utilizando el
procedimiento del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et.
al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981). Las
células 293 se desarrollan hasta la máxima densidad en un frasco
giratorio y se añaden 700 \mug de ADN de
pRK5-PRO10282 o pRK5-PRO19578. En
primer lugar, las células se concentran a partir del frasco
giratorio mediante centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado
de ADN-dextrano se incuba sobre el residuo celular
durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20%
durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejido, y se
reintroducen en el frasco giratorio que contiene el medio de cultivo
de tejido, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml de
transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el
medio acondicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las
células y los debris. La muestra que contiene el PRO10282 o
PRO19578 expresado se puede concentrar a continuación y purificar
mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como la diálisis
y/o cromatografía en columna.
En otra realización, el PRO10282 o PRO19578
puede expresarse en células CHO. El pRK5-PRO10282 o
pRK5-19578 puede transfectarse en células CHO
utilizando reactivos conocidos, tales como CaPO_{4} o
DEAE-dextrano. Tal y como se ha descrito
anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y el medio
puede reemplazarse por medio de cultivo (solo) o medio que contiene
un radiomarcador, tal como la ^{35}S-metionina.
Después de determinar la presencia del polipéptido PRO10282 o
PRO19578, el medio de cultivo puede reemplazarse por medio sin
suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante
aproximadamente 6 días y, a continuación, se recoge el medio
acondicionado. A continuación, el medio que contiene el PRO10282 o
PRO19578 expresado puede concentrarse y purificarse mediante
cualquier procedimiento seleccionado.
El PRO10282 o PRO19578 etiquetado con epítopo
puede expresarse también en células CHO huésped. El PRO
10282 o PRO19578 puede subclonarse fuera del vector pRK5. El inserto del subclon puede experimentar PCR para fusionarse en el marco con una etiqueta de epítopo seleccionada, tal como una etiqueta de poli-his en un vector de expresión de Baculovirus. El inserto de PRO10282 o PRO19578 etiquetado con poli-his puede subclonarse a continuación en un vector conductor SV40 que contiene un marcador de selección, tal como DHFR, para seleccionar clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (tal y como se describe anteriormente) con el vector conductor SV40. El marcaje puede realizarse, tal y como se ha descrito anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el PRO10282 o PRO19578 etiquetado con poli-His expresado puede a continuación concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante cromatografía de afinidad de quelante-Ni^{2+}.
10282 o PRO19578 puede subclonarse fuera del vector pRK5. El inserto del subclon puede experimentar PCR para fusionarse en el marco con una etiqueta de epítopo seleccionada, tal como una etiqueta de poli-his en un vector de expresión de Baculovirus. El inserto de PRO10282 o PRO19578 etiquetado con poli-his puede subclonarse a continuación en un vector conductor SV40 que contiene un marcador de selección, tal como DHFR, para seleccionar clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (tal y como se describe anteriormente) con el vector conductor SV40. El marcaje puede realizarse, tal y como se ha descrito anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el PRO10282 o PRO19578 etiquetado con poli-His expresado puede a continuación concentrarse y purificarse mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante cromatografía de afinidad de quelante-Ni^{2+}.
El PRO10282 o PRO19578 puede expresarse también
en células CHO y/o COS mediante un procedimiento de expresión
transitoria o en células CHO mediante otro procedimiento de
expresión estable.
La expresión estable en células CHO se realiza
utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan
como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias
codificantes de las formas solubles (por ejemplo, los dominios
extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una
secuencia de región constante de IgG1 que contiene la bisagra, CH2
y los dominios de CH2 y/o una forma etiquetada de
poli-his.
Tras la amplificación por PCR, los ADNs
respectivos se subclonan en un vector de expresión de CHO utilizando
técnicas estándar descritas en Ausubel et. al., Current
Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and Sons
(1997). Los vectores de expresión de CHO se construyen para tener
sitios de restricción 5' y 3' compatibles del ADN de interés para
permitir el trasporte adecuado de los ADNc. El vector utilizado en
la expresión en las células CHO es tal y como se describe en Lucas
et. al., Nucl. Acid Res. 24:9 (1774-1779
(1996), y utiliza el promotor/potenciador temprano de SV40 para
dirigir la expresión del ADNc de interés y la dihidrofolato
reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el
mantenimiento estable del plásmido tras la transfección.
Se introducen doce microgramos del ADN
plasmídico deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO
utilizando reactivos de transfección Superfect® (Quiagen), Dosper® o
Fugene® (Boehringer Mannheim) disponibles comercialmente. Las
células se desarollan tal y como se describe en Lucas et.
al., supra. Se congelan aproximadamente 3 x 10^{-7}
células en una ampolla para un crecimiento y producción posterior
tal y como se describe a continuación.
Las ampollas que contienen el ADN plasmídico se
descongelan colocándolas en un baño de agua y se mezclan mediante
centrifugación. El contenido se pipetea en un tubo de centrífuga que
contiene 10 mL de medio y se centrifuga a 1000 rpm durante 5
minutos. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en
10 ml de medio selectivo (PS20 filtrado a 0,2 \mum con un 5% de
suero bovino fetal dialfiltrado a 0,2 \mum). A continuación, las
células se fraccionan en un centrifugador de 100 mL que contiene 90
mL del medio selectivo. Después de 1-2 días, las
células se transfieren a un centrifugador de 250 mL lleno con 150 mL
de medio de crecimiento selectivo y se incuban a 37ºC. Después de
otros 2-3 días, se siembran centrifugadores de 250
mL, 500 mL y 2000 mL con 3 x 10^{5} células/mL. El medio celular
se cambia por medio nuevo mediante centrifugación y resuspensión en
el medio de producción. Aunque se puede utilizar cualquier medio de
CHO adecuado, en realidad se puede utilizar un medio de producción
descrito en la patente estadounidense No. 5.122.469, concedida el
16 de junio de 1992. Se siembra un centrifugador de 3 L de
producción a razón de 1,2 x 10^{6} células/ml. En el día 0, se
determina el pH del número de células. En el día 1, se toman
muestras en el centrifugador y se inicia el burbujeo con aire
filtrado. En el día 2, se toman muestras en el centrifugador, la
temperatura se cambia a 33ºC, y se toman 30 mL de glucosa a 500 g/L
y 0,6 mL de antiespuma al 10% (por ejemplo 35% de emulsión de
polidimetilsiloxano, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion).
Durante toda la producción, el pH se ajusta según la necesidad
manteniéndose en valores alrededor de 7,2. Después de 10 días, o
hasta que la viabilidad cae por debajo del 70%, el cultivo celular
se recoge mediante centrifugación y se filtra a través de un filtro
de 0,22 \mum. El filtrado se guarda a 4ºC o se carga
inmediatamente en columnas para la
purificación.
purificación.
Para las construcciones etiquetadas con
poli-his, las proteínas se purifican utilizando una
columna de Ni-NTA (Qiagen). Antes de la
purificación, se añade imidazol al medio acondicionado hasta una
concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombea en una
columna de 6 ml de Ni-NTA equilibrada en 20 mM
Hepes, pH 7,4, tampón que contiene 0,3 M de NaCl y 5 mM de imidazol
a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min. a 4ºC. Tras
cargarse, la columna se lava con un tampón de equilibrio adicional y
la proteína se eluye con el tampón de equilibrio que contiene 0,25
M de imidazol. La proteína altamente purificada se desala
posteriormente en un tampón de almacenamiento que contiene 10 mM
Hepes, 0,14 M de NaCl y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25
Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se guarda a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) se purifican a partir del medio acondicionado tal y
como se indica a continuación. El medio acondicionado se bombea a
una columna de Proteína A (Pharmacia) de 5 ml que ha sido
equilibrada en un tampón de 20 mM de fosfato sódico, pH 6,8. Después
de cargarse, la columna se lava ampliamente con tampón de
equilibrio antes de la elución con 100 mM de ácido cítrico, pH 3,5.
La proteína eluída se neutraliza inmediatamente recogiendo
fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 \muL de tampón de
Tris 1 M, pH 9. La proteína altamente purificada se desala
posteriormente en un tampón de almacenamiento, tal como el descrito
anteriormente para las proteínas etiquetadas con
poli-his. La homogeneidad se valora mediante geles
de poliacrilamida SDS y mediante la secuenciación de los aminoácidos
N-terminales mediante degradación Edman.
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante de PRO10282 o PRO19578 en levadura.
En primer lugar, los vectores de expresión de
levadura se construyen para la producción o secreción intracelular
de polipéptidos PRO10282 a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN
que codifica un polipéptido PRO10282 (incluyendo PRO19578) y el
promotor se insertan en los sitios para enzimas de restricción
adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión
intracelular de PRO10282. Para la secreción, el ADN que codifica
PRO10282 puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el
ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal de
PRO10282 nativo u otro péptido señal de mamífero, o, por ejemplo,
una secuencia señal/líder de factor alfa de levadura o la secuencia
señal/líder secretora de la invertasa, y secuencias enlazadoras (si
se necesitan) para la expresión de PRO10282.
Las células de levadura, tales como la cepa
AB110 de la levadura, pueden a continuación transformarse con los
plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivarse en medio
de fermentación seleccionado. Los sobrenadantes de levadura
transformados pueden analizarse mediante precipitación con ácido
tricloroacético al 10% y separación mediante
SDS-PAGE, seguido de la tinción de los geles con
azul de Coomassie.
El PRO10282 recombinante (incluyendo PRO19578)
puede aislarse posteriormente y purificarse mediante la extracción
de las células de levadura del medio de fermentación mediante la
centrifugación y, a continuación, la concentración del medio
utilizando filtros de cartucho específicos. El concentrado que
contiene PRO10282 (por ejemplo, PRO19578) puede purificarse
adicionalmente utilizando resinas de cromatografía en columna
concretas.
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante de PRO10282 y PRO19578 en células de insecto
infectadas de Baculovirus.
La secuencia que codifica PRO10282 o PRO19578 se
fusiona en dirección 5' a un epítopo etiqueta contenido en un
vector de expresión de baculovirus. Dichas epítopo etiquetas
incluyen etiquetas de poli-his y etiquetas de
inmunoglobulina (como las regiones Fc de IgG). Pueden utilizarse un
conjunto de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de los
plásmidos disponibles comercialmente, tales como pVL1393 (Novagen).
Brevemente, la secuencia que codifica PRO10282 o PRO19578 o la
parte deseada de la secuencia que codifica PRO10282 o PRO19578, tal
como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una
proteína transmembrana o la secuencia que codifica la proteína
madura si la proteína extracelular se amplifica mediante PCR con
cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5'
puede incorporar sitios para enzimas de restricción flanqueantes
(seleccionados). El producto se digiere a continuación con todas
esas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el
vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante
la cotransfección del plásmido anterior y el ADN del virus
BaculoGold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera
frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina
(disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Después de
4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados
se recogen y se utilizan para amplificaciones adicionales. La
infección viral y la expresión de la proteína se realizan tal y
como describe en O'Reilley et. al., Baculovirus expresion
vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press
(1994).
\newpage
A continuación, el PRO10282 o PRO19578
etiquetado con poli-His expresado puede purificarse,
por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad con
Ni^{2+}-quelato tal y como se indica a
continuación. Los extractos se preparan a partir de las células
recombinantes Sf9 infectadas del virus tal y como se ha descrito por
Rupert et. al., Nature, 362:
175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se
lavan, se resuspenden en el tampón de sonicación (25 ml Hepes, pH
7,9; 12,5 mM de MgCl_{2}; 0,1 mM de EDTA: glicerol al 10%;
NP-40 a 0,1%; 0,4 M de KCl), y se sonica dos veces
durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se purifican por
centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en el tampón
de carga (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH
7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara
una columna de agarosa Ni^{2+}-NTA
(comercialmente disponible de Qiagen) con un volumen de lecho de 5
ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml del tampón
de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5
mL por minuto. La columna se lava hasta la línea base a A_{280}
con el tampón de carga, en cuyo punto se inicia la recogida de la
fracción. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado
secundario (50 mM fosfato; 300 mM de NaCl, glicerol al 10%, pH
6,0), que eluye las proteínas unidas no específicamente. Después de
alcanzar de nuevo la línea base a A_{280}, la columna se
desarrolla con un gradiente de 0 a 500 mM de imidazol en el tampón
de lavado secundario. Se recogen fracciones de un mL y se analizan
mediante SDS-PAGE y tinción con plata o
transferencia Western con Ni^{2+}-NTA conjugado a
fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen PRO10282
o PRO19578 etiquetado con His_{10} eluído se agrupan y se dializan
contra el tampón de carga.
Alternativamente, la purificación del PRO10282 o
PRO19578 etiquetado con IgG (o con Fc) puede realizarse usando
técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo,
cromatografía en columna con Proteína A o proteína G.
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a
PRO10282 o PRO19578.
Las técnicas para producir los anticuerpos
monoclonales son conocidas en la técnica y están descritas, por
ejemplo, en Goding, supra. Entre los inmunógenos que se
pueden utilizar se incluyen PRO10282 y PRO19578 purificado,
proteínas de fusión que contienen PRO10282 o PRO19578, y células que
expresan PRO10282 o PRO19578 recombinante en la superficie celular.
La selección del inmunógeno puede realizarse según el técnico en la
materia sin una gran experimentación.
Los ratones, tales como Balb/c, se inmunizan con
el inmunógeno de PRO10282 o PRO19578 emulsionado en adyuvante
completo de Freund y se injecta subcutáneamente o
intraperitonealmente en una cantidad de 1-100
microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsiona en el
adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research,
Hamilton, MT) y se inyecta en las bases de las patas traseras del
animal. A continuación, los ratones inmunizados a continuación son
reforzados 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsionado
en el adyuvante seleccionado. A continuación, durante diversas
semanas, los ratones también se pueden reforzar con inyecciones de
inmunización adicionales. Las muestras de suero se pueden obtener
periódicamente de los ratones mediante muestras de sangre
retro-orbitales para ser analizadas en ensayos ELISA
para detectar anticuerpos anti-PRO10282 o
anticuerpos anti-PRO19578.
Después de detectar un título de anticuerpo
adecuado, a los animales "positivos" para anticuerpos se les
puede inyectar una inyección intravenosa final de PRO10282 o
PRO19578. De tres a cuatro días más tarde, los ratones se
sacrifican y se recogen las células del bazo. A continuación, las
células del bazo se fusionan (usando polietilenglicol al 35%) a una
línea celular de mieloma murino seleccionada, tal como la
P3X63AgU.1, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan
células de hibridoma que se pueden colocar a continuación en placas
de cultivo de tejido de 96 pocillos que contienen un medio HAT
(hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la
proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e
híbridos de células de bazo.
Las células de hibridomas se cribarán en un
ELISA por la reactividad contra PRO10282 o PRO19578. La
determinación de células de hibridomas "positivas" que secretan
los anticuerpos monoclonales deseados contra PRO10282 o PRO19578
está dentro de la técnica.
Las células de hibridomas positivas se pueden
inyectar intraperitonialmente en ratones singeneicos Balb/c para
producir ascites que contienen los anticuerpos monoclonales
anti-PRO10282 o anti-PRO19578.
Alternativamente, las células de hibridomas pueden desarrollarse en
matraces de cultivos de tejidos o en botellas en rodillo. La
purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en los
ascites se puede realizar usando precipitación con sulfato de
amonio, seguido por cromatografía de exclusión en gel.
Alternativamente, puede usarse la cromatografía por afinidad basada
en la unión del anticuerpo a la proteína A o la proteína G.
Específicamente, se hiperinmunizaron cinco
ratones Balb/c (Charles River Laboratories, Wilmington, DE) con un
péptido de aminoácidos conjugados a Unizyme purificado,
correspondiente a los aminoácidos 532-667 de Stra6
humana, en adyuvante Ribi (Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton,
MO). Las células B de nódulos linfáticos popliteales se fusionaron
con células de mieloma de ratón (X63.Ag8.653; American Type Culture
Collection, Rockville, MD) tal y como se ha descrito previamente
(Hongo et al., Hybridoma 14; 253-260 [1995].
Después de 10-14 días, se recogieron los
sobrenadantes y se cribaron según la producción de anticuerpos
mediante un ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA). Se
inyectaron ocho clones positivos, que mostraban la mayor
inmunounión por ELISA directo e inmunohistoquímica después de dos
rondas de subclonación por dilución limitante, en ratones cebados
con Pristina para una producción in vivo de mAb (Freud y
Blair, J. Immunol. 129: 2826-2830). Los fluidos
ascíticos se agruparon y se purificaron mediante cromatografía de
afinidad de Proteína A (cromatografía líquida de proteína rápida
Pharmacia (FPLC); Pharmacia, Uppsala, Suecia) tal como se ha
descrito previamente (Hongo et al., supra). Las
preparaciones de anticuerpos purificadas se filtraron de forma
estéril (tamaño de poro de 0,2 \mum; Nalgene, Rochester, NY) y se
guardaron a 4ºC en tampón fosfato salino(PBS).
Los polipéptidos PRO10282 y PRO19578 se pueden
purificar mediante una serie de técnicas estándar en el campo de la
purificación de proteínas. Por ejemplo, se purifica el polipéptido
pro-PRO10282 o pro-19578, el
polipéptido PRO10282 o PRO19578 maduro, o el polipéptido
pre-PRO10282 o pre-PRO19578 mediante
cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para
el polipéptido PRO10282 de interés. En general, se construye una
columna de inmunoafinidad mediante acoplamientos covalentes de
anticuerpos de anti-polipéptido PRO10282 o
anti-polipéptido PRO19578 a una resina de
cromatografía activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a
partir de sueros inmunes mediante precipitación con sulfato de
amonio o mediante purificación en la Proteína A inmovilizada
(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J). Asimismo, los
anticuerpos monoclonales se preparan a partir de los fluidos
ascíticos de ratón mediante la precipitación con sulfato de amonio
o cromatografía en Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina
parcialmente purificada se une covalentemente a una resina
cromatográfica, tal como la SEPHAROSE^{TM} activada con CnBr
(Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina,
la resina se bloquea y la resina derivada se lava de acuerdo con
las instrucciones del fabricante.
Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la
purificación del polipéptido PRO10282 o PRO19578 mediante la
preparación de una fracción a partir de células que contienen
polipéptido PRO10282 o PRO19578 en una forma soluble. Esta
preparación se deriva por solubilización de toda la célula o de una
fracción subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial
por adición de detergente o mediante otros procedimientos conocidos
en la técnica. Alternativamente, el polipéptido PRO10282 o PRO19578
soluble que contiene una secuencia señal podría secretarse en una
cantidad útil en el medio en el que las células crecen.
Una preparación que contiene polipéptido
PRO10282 o PRO19578 soluble se pasa por la columna de
inmunoafinidad, y la columna se lava en condiciones que permiten la
absorbancia preferencial del polipéptido PRO10282 o PRO19578 (por
ejemplo, tampones de fuerza iónica elevada en presencia de
detergente). A continuación, la columna se eluye en condiciones que
rompen la unión anticuerpo/polipéptido PRO10282 o PRO19578 (por
ejemplo, un tampón de pH bajo, tal como aproximadamente un pH de
2-3, o una alta concentración de caótropo, tal como
urea o ión tiocianato), y se recoge el polipéptido PRO10282 o
PRO19578.
La presente invención es particularmente útil
para cribar compuestos mediante la utilización de polipéptidos
PRO10282 (Stra6) (incluyendo PRO19578) o fragmentos de unión de los
mismos en cualquiera de un conjunto de técnicas de cribado de
fármacos. El polipéptido PRO10282 o el fragmento utilizado en dicha
prueba puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido,
adsorbido en una superficie celular o situado intracelularmente. Un
procedimiento de cribado de fármacos utiliza células huésped
eucariotas o procariotas, las cuales se transforman de forma
estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el
polipéptido PRO10282 o un fragmento. Los fármacos se criban contra
dichas células transformadas en ensayos de unión competitiva. Dichas
células, tanto en forma viable como fija, se pueden utilizar para
ensayos de unión estándar. Se puede medir, por ejemplo, la
formación de complejos entre el polipéptido PRO10282 o un fragmento
y el agente que se está probando. Alternativamente, se puede
examinar la disminución en la formación del complejo entre el
polipéptido PRO10282 y su célula diana o receptores diana causada
por el agente que se está probando.
De este modo, la presente invención proporciona
procedimientos de cribado para fármacos o cualquier otro agente que
puede afectar a una enfermedad o un trastorno asociados al
polipéptido PRO10282 (Stra6). Estos procedimientos comprenden el
contacto de dicho agente con un polipéptido Stra6 o fragmento del
mismo y el ensayo (I) de la presencia de un complejo entre el
agente y el polipéptido Stra6 o un fragmento, o (II) de la
presencia de un complejo entre el polipéptido Stra6 o un fragmento y
la célula, mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. En
dichos ensayos de unión competitiva, el polipéptido Stra6 o un
fragmento están normalmente marcados. Después de una incubación
adecuada, el polipéptido Stra6 libre o un fragmento se separan de
la forma unida, y la cantidad de marca libre o no complejada es una
medida de la capacidad del agente concreto para unirse al
polipéptido Stra6 o para interferir en el complejo polipéptido
Stra6/célula.
Otra técnica para el cribado de fármacos
proporciona un cribado de alto rendimiento de compuestos que tienen
una afinidad de unión adecuada a un polipéptido y se describe en
detalle en WO 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984.
Brevemente, una gran cantidad de compuestos de diferentes péptidos
pequeños de prueba se sintetizan en un sustrato sólido, tal como
agujas de plástico o alguna otra superficie. Tal y como se aplica a
un polipéptido PRO10282 (Stra6), los compuestos de péptidos de
prueba se hacen reaccionar con polipéptido Stra6 y se lavan. Se
detecta el polipéptido Stra6 unido mediante procedimientos bien
conocidos en la técnica. El polipéptido Stra6 purificado también
puede recubrirse directamente en placas para utilizar en las
técnicas de cribado de fármacos mencionadas anteriormente. Además,
se pueden utilizar anticuerpos no neutralizantes para capturar el
péptido e inmovilizarlo en el soporte sólido.
La presente invención también contempla la
utilización de ensayos de cribado de fármacos competitivos en los
cuales los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse a un
polipéptidos Stra6 compiten específicamente con un compuesto de
prueba para unirse a un polipéptido Stra6 o fragmentos del mismo. De
esta manera, pueden utilizarse anticuerpos para detectar la
presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes
antigénicos con el polipéptido Stra6.
El objetivo del diseño racional de fármacos es
producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente
activos de interés (es decir, un polipéptido PRO10282 (Stra6)) o de
pequeñas moléculas con las cuales interaccionan, por ejemplo,
agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos
se pueden utilizar para crear fármacos que son formas más activas o
estables del polipéptido PRO10282 o polipéptido PRO19578 de
secuencia nativa o que potencian o interfieren con la función del
polipéptido PRO10282 o polipéptido PRO19578 de secuencia nativa
in vivo (c.f. Hodgson, Bio/Technology, 9:
19-21 (1991)).
En una estrategia, se determina la estructura
tridimensional del polipéptido PRO10282 o PRO19578 de secuencia
nativa, o de un complejo polipéptido PRO10282 o
PRO19578-inhibidor, mediante cristalografía de rayos
X, mediante modelación por ordenador o, más habitualmente, mediante
una combinación de las dos estrategias. Deben comprobarse la forma
y las cargas del polipéptido PRO10282 o PRO19578 nativo para
elucidar la estructura y para determinar el sitio o sitios activos
de la molécula. Con menor frecuencia, podría obtenerse la
información útil con respecto a la estructura del polipéptido
PRO10282 o PRO19578 mediante la modelación basada en la estructura
de proteínas homólogas. En ambos casos, la información estructural
pertinente se utiliza para diseñar moléculas análogas de tipo
polipéptido PRO10282 o para identificar inhibidores eficaces. Entre
los ejemplos útiles de diseño racional de fármacos se pueden
incluir moléculas que han mejorado la actividad o la estabilidad,
tal como se muestra por Braxton y Wells, Biochemistry, 31:
7796-7801 (1992) o que actúan como inhibidores,
agonistas o antagonistas de péptidos nativos tal y como se muestra
por Athauda et. al.,J. Biochem., 113:
742-746 (1993).
También es posible aislar un anticuerpo
específico de diana, seleccionado mediante un ensayo funcional, tal
y como se ha descrito anteriormente y, a continuación resolver su
estructura cristalina. Esta estrategia, en principio, produce un
profármaco en el que puede basarse el diseño de fármacos posterior.
Es posible evitar una cristalografía de toda la proteína mediante
la generación de anticuerpos anti-idiotípicos
(anti-ids) a un anticuerpo funcional
farmacológicamente activo. Como imagen especular de una imagen
especular, se esperaría que el sitio de unión del
anti-ids fuera un análogo del receptor original. A
continuación, el anti-ids podría utilizarse para
identificar y aislar péptidos de bancos de péptidos producidos
química o biológicamente. Los péptidos aislados actuarían entonces
como el profármaco.
En virtud de la presente invención, se pueden
fabricar cantidades suficientes del polipéptido PRO10282
(incluyendo PRO19578) para realizar dichos estudios analíticos,
tales como la cristalografía de rayos-X. Además, el
conocimiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO10282
proporcionada en la presente invención proporcionará una guía para
los usuarios de técnicas de modelación por ordenador en lugar de o
adicionalmente a la cristalografía de rayos-X.
Se construyeron sondas de oligonucleótidos a
partir de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido
PR010282 mostrado en las figuras que acompañan para el uso en
reacciones de amplificación de PCR cuantitativa. Se eligieron las
sondas de oligonucleótidos de manera que den un fragmento
amplificado de aproximadamente 200-600 pares de
bases desde el extremo 3' de su plantilla asociada en una reacción
de PCR estándar. Las sondas de oligonucleótidos se emplearon en
reacciones de amplificación de PCR cuantitativa estándar con ARN de
Clontech aislado de diferentes fuentes de tejido humano adulto y se
analizaron mediante electroforesis de gel de agarosa de manera que
se obtiene una determinación cuantitativa del nivel de expresión del
ácido nucleico que codifica el polipéptido PR010282 en los diversos
tejidos evaluados. El conocimiento del patrón de expresión o la
expresión diferencial del ácido nucleico que codifica el
polipéptido PR010282 en diferentes tipos de tejido humano
proporciona un marcador diagnóstico útil para la clasificación del
tejido, con o sin otros marcadores específicos de tejido, para la
determinación del origen de tejido primario de un tumor metastático,
y similares. Los resultados de estos ensayos (mostrados en la
Figura 10) demostraron que la molécula de
DNA148380-2827 se expresa de manera elevada en el
riñón, los testículos y el útero adultos; se expresa
significativamente en la mama, la próstata y la tráquea; se expresa
débilmente en el cerebro, el corazón, el pulmón y el timo; y no se
expresa en el hígado, la médula ósea, el colon, el músculo
esquelético, el intestino delgado, el bazo y el estómago.
Se obtuvo el ARN total de Clontech (Palo Alto,
California) y se analizó utilizando el siguiente equipo
cebador/sonda para amplificación de PCR:
| h.Stra6.tmf3: | 5' CACACTCGAGAGCCAGATATTTT | (SEC ID Nº:6) |
| h.Stra5.tmr4: | 5' AACAAGTTTATTGCAGGGAACAC | (SEC ID Nº:7) |
| h.Stra6.tmp4: | 5' TGTAGTTTTTATGCCTTTGGCTATTATGAAAGAGGT | (SEC ID Nº:8) |
tmf = cebador directo
tmr = cebador inverso
tmp = sonda
\vskip1.000000\baselineskip
La hibridación in situ, realizada tal y
como se describe en el Ejemplo 12 más adelante, confirmó la
expresión de Stra6 en células epiteliales tubulares de riñón,
miometrio y estromales que rodean los conductos y lóbulos mamarios,
mientras que se detectó poca o ninguna expresión en secciones de
cerebro, hígado, bazo, páncreas, corazón, pulmón, estómago,
intestino delgado, colon, próstata, bazo, y córtex adrenal (datos no
mostrados). De los tejidos normales examinados mediante hibridación
in situ, se vieron los niveles de expresión más altos en
placenta y médula adrenal, que no se incluyeron en el análisis por
PCR.
Este ejemplo muestra que el gen que codifica
PR010282 (Stra6) de longitud completa humano nativo se sobreexpresa
significativamente en ciertos tumores de colon humanos y también en
líneas celulares derivadas de varios tumores humanos como colon,
pulmón, riñón y mama.
El material inicial para el cribado era ARN
total aislado de tumores de colon humanos, o varias líneas
celulares tumorales de colon, riñón, mama, o pulmón humanos. En
tejido tumoral de colon, se determinó la expresión de ARN de Stra6
en relación con ARN de tejido de colon normal (mucosa) del mismo
paciente. Se determinó la expresión de ARN de Stra6 en varias
líneas celulares tumorales en comparación con varias líneas
celulares normales (es decir, líneas celulares de colon, riñón y
pulmones normales).
Se utilizó PCR cuantitativa a tiempo real
(RT-PCR, por ejemplo, TAOMAN ABI PRIZM 7700^{TM}
Sequence Detection System^{TM} [Perkin Elmer, Applied Biosystems
Division, Foster City, California]), para monitorizar diferencias
cuantitativas en el nivel de expresión del gen que codifica PR010292
(Stra6) (correspondiente a DNA148380-2827) en
células normales y células derivadas de ciertos cánceres o líneas
celulares de cáncer, utilizando reactivos de ensayo Taqman. 50
\mul de las reacciones de RT-PCR consistían en 5
\mul de tampón A Taqman 10x, 300 \muM de cada dNTF, MgCl2 5 mM,
10 unidades de inhibidor de ARNasa, 12,5 unidades de transcriptasa
inversa de MuLV, 1,25 unidades de ADN polimerasa AmpliTaq Gold,
sonda en 200 nM, cebadores en 500 nM y 100 ng de ARN. Las
condiciones de reacción consistían en trascripción inversa a 48ºC
durante 30 minutos, desnaturalización a 95ºC durante 25 segundos y
65ºC durante un minuto. Se analizaron los productos de reacción en
geles de poliacrilamida al 4-20% (Novex).
Se utilizaron curvas estándar para determinar
niveles relativos de expresión para cada gen de interés además del
gen doméstico de la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) para cada muestra analizada. Se obtuvieron
unidades normalizadas relativas mediante la división del nivel de
ARNm del gen de interés por el nivel de ARNm de GAPDH. Se
compararon unidades normalizadas relativas entre muestra
experimental y control para determinar la inducción de pliegue.
Se utilizaron los resultados para determinar si
el ARNm que codifica PR010282 se sobreexpresa en cualquiera de los
cánceres de colon o en líneas celulares primarias de cáncer de
colon, riñón, mama, o pulmón que se cribaron. A continuación, se
muestra la histología de algunas muestras normales y tumorales de
colon humano emparejadas utilizadas para el análisis (ver Figuras
11 y 12).
Las líneas celulares de pulmón humano incluyen
las líneas celulares de fibroblasto de pulmón humano normal MRC5
(CCL-171) e IMR90 (CCL-186), la
línea celular epitelial de carcinoma de pulmón humano A549 (SRCC768,
CCL-185), la línea celular de carcinoma de pulmón
epidermoide humano Calu-1 (SRCC769;
HTB-54), la línea celular de carcinoma anaplásico
humano Calu-6 (SRCC770, HTB-56 -
probablemente pulmón), la línea celular epitelial humana
NCI-H441 (SRCC772; HTB-174) que se
derivó de fluido pericárdico de un paciente con adenocarcinoma
papilar del pulmón, y la línea celular de carcinoma de célula
escamosa de pulmón humano SW900 (SRCC775; HTB-59),
todos disponibles en ATCC.
Las líneas celulares de colon incluyen, por
ejemplo, la línea celular de fibroblasto de colon normal CCD112Co
(CRL-1541), la línea celular de adenocarcinoma
colorrectal humano CaCo-2 (HTB-37),
la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano WiDr
(CCL-218), la línea celular de carcinoma colorrectal
humano HCT116(CCL-247), la línea celular de
adenocarcinoma colorrectal humano SK-Co1
(HTB-39), la línea celular de adenocarcinoma
colorrectal humano COL0320 (SRCC778; CCL-220), la
línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano HT29 (SRCC779;
HTB-38), la línea celular de adenocarcinoma
colorrectal humano SW403 (CCL-230), la línea celular
de cáncer de colon humano NCI/HCC2998, y la línea celular de
adenocarcinoma colorrectal humano Colo320DM
(CCL-220), todos disponibles en ATCC u otras
fuentes públicas.
\newpage
Las líneas celulares de carcinoma de mama humano
incluyen la línea celular de adenocarcinoma de mama humano MCF7
(SRCC766; HTB-22), y la línea celular de cáncer de
mama humano NCI/ADR-RES, ambos están disponibles
públicamente.
Las líneas de riñón incluyen la línea celular
293 (CRL-1573) que se transforma con ADN de
adenovirus 5. También se incluyeron en los análisis dos líneas
celulares tumorales de Wilm's, G401 (CRL-1441) y
SK-NEP-1
(CRL-1573).
Se preparó ARN a partir de líneas celulares
cultivadas anteriormente. Se realizó el aislamiento utilizando
purificación un kit de purificación, un grupo de tampones y proteasa
de Qiagen, según las instrucciones del fabricante y la descripción
de más adelante. Más específicamente, se aisló el ARN total de
células en el cultivo utilizando columnas midi RNeasy de Qiagen. Se
aisló el ARN total de muestras de tejido utilizando RNA
Stat-60 (Tel-Test). Se aisló el ARN
preparado a partir del tumor mediante centrifugación con gradiente
de densidad de cloruro de cesio.
Se pesaron las muestras de tumor y se colocaron
en tubos cónicos de 50 ml y se mantuvieron en hielo. El
procesamiento se limitó a no más de 250 mg de tejido por preparación
(1 punta/preparación). Se preparó al instante la solución de
proteasa mediante la dilución en 6,25 ml de ddH_{2}O fría a una
concentración final de 20 \mug/ml y se guardó a 4ºC. Se preparó
tampón G2 (20 ml) mediante dilución de DNAsa A hasta una
concentración final de 200 \mug/ml (de 100 mg/ml de solución de
madre). Se homogenizó el tejido tumoral en 10 ml de tampón G2
durante 60 segundos utilizando la punta amplia del polytron en un TC
de flujo laminar con el objetivo de evitar la inhalación de
aerosoles, y se mantuvo a temperatura ambiente. Entre muestras, se
limpió el polytron mediante rotación a 2 x 30 segundos cada uno en
2L, ddH_{2}O, seguido de tampón G2 (50 ml). Si el tejido aún
estuviera presente en la punta generadora, se desmontó y se limpió
el aparato.
Se añadió la proteasa de Qiagen (preparada tal y
como se indica anteriormente, 1,0 ml), seguido de la mezcla con
agitación e incubación a 50ºC durante 3 horas. Se prepararon la
incubación y la centrifugación hasta que los lisatos eran claros
(por ejemplo, incubación adicional de 30-60 minutos,
agrupando a 3000 x g durante 10 minutos, 4ºC).
Los resultados obtenidos a partir del análisis
por PCR a tiempo real de ARN se expresaron inicialmente como
unidades delta CT. Una unidad corresponde a un ciclo de PCR o
aproximadamente una amplificación de 2 veces relativa al normal,
dos unidades corresponden a 4 veces, 3 unidades a amplificación de 8
vrces y así en adelante. Se convierten los datos a la diferencia de
veces y se presentan como tales. Inicialmente, se utilizó la
transcriptasa inversa para sintetizar ADNc a partir de 100 ng de ARN
total o ARN polyA+ utilizando oligo(dT) como cebador. A
continuación se utilizó el ADNc resultante como plantilla para PCR.
Se obtuvo la cuantificación utilizando cebadores derivados de
regiones no traducidas 3' de la secuencia que codifica PR010282 y
una sonda fluorescente de TAQMAN^{TM} correspondiente a las
secuencias respectivas que intervienen. La utilización de la región
3' tiende a evitar el cruce de límites intrón-exón
en el ADN genómico, un requisito esencial para el cálculo preciso
de expresión de ARN utilizando este procedimiento. Las secuencias
para los cebadores y las sondas (directo, inverso, y sonda)
utilizando para la amplificación de gen que codifica la PR010282
fueron las siguientes:
Un grupo incluyó los cebadores directo e inverso
y sonda descritos en el Ejemplo 11 anterior como SEC ID Nºs: 6, 7 y
8, respectivamente.
Otro grupo incluyó:
| hStra6.tmfl1: | 5' AGACCAGGTCCCACACTGA | (SEC ID Nº: 9) |
| hStra6.tmr1: | 5' TTCATAATAGCCAAAGGCATAAAA | (SEC ID Nº: 10), y |
| h.Stra6.tmp1: | 5' CTGCCCACACTCGAGAGCCAGAT 3' | (SEC ID Nº: 11) |
\vskip1.000000\baselineskip
GAPDH humano:
| cebador directo: | 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' | (SEC ID Nº: 14) |
| cebador inverso; | 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3' | (SEC ID Nº: 15) |
| sonda: | 5'-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3' | (SEC ID Nº: 16) |
La reacción de ensayo de 5' nucleasa es una
técnica fluorescente basada en PCR que hace uso de la actividad de
5' exonucleasa de enzima de Taq ADN polimerasa para monitorizar la
amplificación a tiempo real. Se utilizan dos cebadores de
oligonucleótidos para generar un amplicón típico de una reacción
PCR. Se diseña un tercer oligonucleótido, o sonda, para detectar
una secuencia de oligonucleótidos localizada entre los dos cebadores
de PCR. La sonda es no-extendible mediante enzima
Taq ADN polimerasa, y se marca con un colorante fluorescente
informador y un colorante fluorescente neutralizante. Se neutraliza
cualquier emisión inducida con láser del colorante informador
mediante el colorante neutralizante cuando los dos colorantes están
localizados muy juntos tal y como están en la sonda. Durante la
reacción de amplificación, la enzima de Taq ADN polimerasa divide
la sonda de una manera dependiente de plantilla. Los fragmentos de
sonda resultantes se disocian en solución, y la señal del colorante
informador liberado está libre del efecto neutralizante del segundo
fluoróforo. Se libera una molécula de colorante informador por cada
nueva molécula sintetizada, y la detección del colorante informador
no neutralizado proporciona la base para la interpretación
cuantitativa de los datos.
Tal y como se ha indicado anteriormente, el
procedimiento de la 5' nucleasa se desarrolla en un dispositivo de
PCR cuantitativo a tiempo real como por ejemplo el ABI PRIZM
7700^{TM} Sequence Detection System^{TM}. El sistema consiste
en un termociclador, láser, dispositivo de cargas interconectadas
(CCD), cámara y ordenador. El sistema amplifica muestras en un
formato de 96 pocillos en un termociclador. Durante la
amplificación, se recoge la señal fluorescente inducida por láser a
tiempo real a través de cables de fibra óptica para los 96
pocillos, y se detecta en el CCD. El sistema incluye software para
el funcionamiento del instrumento y para analizar los datos.
Los datos de ensayo de
5'-nucleasa se expresan inicialmente como Ct, o el
ciclo umbral. Éste se define como el ciclo en el cual la señal
informadora se acumula por encima del nivel de base de
fluorescencia. Se utilizan los valores de Ct como medición
cuantitativa del número relativo de copias iniciales de una
secuencia diana particular en una muestra de ácido nucleico cuando
se compara la expresión de ARN en una célula cancerosa con la de
una célula normal.
El ARN de Stra6 humano (correspondiente a
DNA148380-2827) muestra una fuerte sobreexpresión en
tejidos tumorales de colon humano, cuando se compara con los
tejidos de colon humano normal correspondientes. Tal y como se
muestra en la Figura 11, se descubrió que el ARN de Stra6 humano
(correspondiente a DNA148380-2827) se
sobreexpresaba en los 14 tejidos de colon tumorales humanos
examinados, enrelación al ARN de mucosa colorrectal normal
emparejada del mismo paciente. La sobreexpresión varió entre dos y
170 veces, y en 7 de las 14 muestras de tejido tumoral fue por lo
menos aproximadamente 10 veces. Los valores de ciclo umbral
obtenidos mediante PCR cuantitativa indicaron que los niveles de
ARNm de Stra6 eran extremadamente bajos o posiblemente ausentes en
muchas de las muestras de mucosa normal.
Como segundo procedimiento de detección, los
productos obtenidos tras la finalización de las reacciones de PCR
cuantitativas (40 ciclos cada una) fueron sometidos a electroforesis
en geles de poliacrilamida y se visualizaron mediante tinción de
bromuro de etidio. Tal y como se muestra en la Figura 12A,
utilizando la expresión de un gen doméstico, gliceraldehído
3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como patrón, se
generaron cantidades sustancialmente mayores de productos de PCR a
partir de ARNm de Stra6 en muestras tumorales comparadas con sus
equivalentes normales. En cambio, se generó un nivel comparable de
producto a partir de ARNm de GAPDH de control interno a partir de
todas las muestras.
La expresión de Stra6 en adenocarcinomas de
colon se localizó en las células tumorales epiteliales mediante
hibridación in situ (ISH) realizada tal y como se indica a
continuación. Se transcribieron ribosondas sentido y antisentido
marcadas con ^{32}P a partir del producto de PCR de 874 pb
correspondiente a los nucleótidos 432-1247 de la
secuencia que codifica el polipéptido de Stra6 humano codificado por
DNA148380-2827. Las secciones de tejido embebido en
parafina y fijados a parafina se procesaron tal y como se ha
descrito previamente (Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci
USA 95:14717-22 [1998]). Los resultados se muestran
en la Figura 12B.
Tal y como se muestra en la Figura 13, el ARN de
Stra6 humano (correspondiente a DNA148380-2827)
también se sobreexpresa significativamente en varias líneas
celulares de tumor de mama, riñón, colon y pulmón. "Expresión de
ARN Relativa" significa que la expresión de ARN en tejidos
tumorales y normales se muestra en relación a la expresión en una
línea celular estándar elegida arbitrariamente SW480.
Los resultados de la hibridación in situ
obtenidos en varias secciones de tumores también se muestran en la
Figura 16. Diversos tipos de tumor diferentes de los adenocarcinomas
de colon también mostraron altos niveles de expresión de Stra6.
Éstos incluyeron 3 de 3 melanomas (Figuras 16A y B), 3 de 4
adenocarcinomas endometriales (Figuras 16C y D), 2 de 3
adenocarcinomas ováricos, y un tumor de Wilm del riñón (Figuras 16E
y F). La señal de hibridación in situ de Stra6 en estos
diversos tumores fue considerablemente mayor que en adenocarcinomas
de colon consistentes con los datos que muestran niveles de
expresión relativamente altos en riñones y úteros normales y
niveles bajos en colon normal. Dado que se detectó Stra6 en médula
adrenal normal, también examinamos dos feocromocitomas, que son
tumores derivados de este tejido. En estos tumores, la expresión de
Stra6 superó a la de cualquier otro tumor o tejido examinado en este
estudio (Figuras 16G y H). Aunque se detectó Stra6 en riñón normal
y se expresó fuertemente en tumor de Wilm, no se detectó en
carcinomas celulares renales. En carcinomas celulares transitorios
de riñón, las células estromales asociadas a tumor expresaron más
Str6 que las células epiteliales tumorales (datos no mostrados).
Debido a que el ARNm
DNA148380-2827 que codifica PR010282 se sobreexpresa
en varios tumores así como en un número de líneas celulares
derivadas de tumores, se asocia probablemente con la formación y/o
el crecimiento de tumores. Como resultado, se espera que los
antagonistas (por ejemplo, anticuerpos, moléculas pequeñas orgánicas
e inorgánicas, péptidos y polipéptidos, tales como variantes de
Stra6, oligonucleótidos antisentido) dirigidos contra la proteína
codificada por DNA148380-2827 (PR010282) u otras
variantes naturales de esta proteína, tales como PR019578
codificada por DNA148389-2827-1,
sean útiles en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento del
cáncer particularmente, sin limitación, cáncer de color, pulmón,
mama y/o riñón.
La eficacia de los antagonistas, tales como los
anticuerpos terapéuticos dirigidos contra la proteína codificada
por DNA148380-2827 (PR010282) podría mejorarse
mediante agentes que estimulen la expresión del gen que codifica
PR010282. Por ejemplo, el tratamiento de líneas celulares de cáncer
colorrectal humano con ácido
9-cis-retinoico o ácido retinoico
todo-trans dio lugar a un aumento espectacular de la
expresión del ARNm de Stra6 (Figura 15). De este modo, se espera
que el tratamiento de pacientes de cáncer con anticuerpos
terapéuticos dirigidos contra PR010282 en combinación con los
retinoides apropiados mejore la eliminación del tumor por parte de
los anticuerpos. Lo mismo será cierto para anticuerpos dirigidos
contra otros para anticuerpos dirigidos contra otros polipéptidos
de Stra6 nativos sobreexpresados en varios tumores, tales como la
variante de corte y empalme humana codificada por
DNA148389-2827-1.
Se desarrollaron células C57MG y
C57MG/Wnt-1 en medio Eagle modificado por Dulbecco
complementado con suero bovino fetal al 10%,
L-glutamina 2 mM, y puromicina 2,5 \mug/ml (Edge
Biosystems). Se desarrollaron células C57MG con la expresión de
Wnt-1 supresora de tetraciclina en medio completo
sin puromicina, complementado con G418 400 \mug/ml (Gibco BRL),
higromicina B 100 \mug/ml (Gibco BRL), y tetraciclina 50 ng/ml
(Korinek et al., Mol. Cell Biol. 18:1248-56
[1998]). Para los estudios de inducción de Wnt-1, se
lavaron las células con solución salian tamponada con fosfato, se
cultivaron en medios sin tetraciclina durante 10, 24, 48, 72, y 96
horas y a continuación se recogieron. Se mantuvo en su totalidad una
placa de control a 0 horas en medios que contenían tetraciclina. Se
recogieron simultáneamente todos las placas y se extrajo el ARN
total para cada punto de tiempo. Se llevó a cabo el RTPCR con
Wnt-1, Stra6, y cebadores y sondas específicos de
GAPDH en 100 ng de ARN total de cada muestra.
Se obtuvieron líneas celulares de adenocarcinoma
de colon humano HCT116 y células de WiDr de la American Type
Culture Collection. Se mantuvieron las células HCT116 en medios de
McCoy 5A complementados con suero bovino fetal (FBS) al 10%. Se
mantuvieron las células WiDr en medios esenciales mínimos de
Dulbecco (DMEM) complementado con FBS al 10%. Para estudios de
inducción de ácido retinoico, se pusieron las células en placas a
10^{5} células/placa de 60 mm que contenía 2,5 ml de medio y se
permitió que crecieran durante 24 horas. Se trataron las células
con Vitamina D3, ácido retinoico trodo-trans
(Spectrum Laboratory Products), o ácido
9-cis-retinoico (Toronto Research
Chemicals Inc.) (concentración final de 1 \muM en DMSO) para los
tiempos indicados. Se trataron las células de control con un mismo
volumen de DMSO.
Para el tratamiento de células C57MG/parentales
con medios acondicionados con Wnt-3a, se incubaron
las células en medios regulares o medios acondicionados de
células-L o células L-W3A en
presencia o ausencia de ácido
9-cis-retinoico 1 \muM. Los medios
acondicionados se prepararon tal y como se describe previamente
(Willert et al.,Genes Dev. 13:1768-73
[1999]). A las 48 horas, se recogieron las células mediante rascado
en PBS que contenía fluoruro y vanadato sódico y se congeló
rápidamente en nitrógeno líquido. Se preparó ARN utilizando el
equipo RNAeasy (Qiagen), incluyendo el tratamiento de DNasel
adicional en las columnas según las instrucciones del
fabricante.
Para la línea celular
C57MG/Wnt-1 TET, se indujo la expresión de
Wnt-1 mediante el cultivo de células en ausencia de
tetraciclinas durante 0, 24, 48, ó 72 horas. Se lisaron las células
en tampón de lisis Triton X-100
[tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 137 mM, Triton
X-100 al 1%, EGTA 1 mM, glycerol al 10%, MgCl_{2}
1,5 mM, ditiotreitol 1 mM, vanadato sódico 1 mM, fluoruro sódico 50
mM, y cóctel inhibidor de proteasas completo (Boehringer Mannheim)
y los equivalentes de proteínas se sometieron a
SDS-PAGE e inmunotransferencia. Se incubaron los
"blots" con anticuerpo policlonal de conejo purificado por
afinidad contra \beta-catenina 0,2 \mug/ml
(Rubinfeld et al., Science 262:1731-1734
[1993]), anticuerpo monoclonal anti-ERK2 0,1
\mug/ml (Transduction Laboratories), o antisueros policlonales de
conejo contra RARy-1 a 1:2000 (Affinity
Bioreagents). Para la línea celular WiDr, se trataron las células
con ácido retinoico todo-trans 1 \muM durante 48
horas y a continuación se lisaron en tampón de lisis Triton
X-100 y se procesaron tal y como se indica
anteriormente. Se incubaron los "blots" con sobrenadante de
cultivo de hibridoma monoclonal de péptido B
anti-stra6 al 1:50 (clon 12F4.2H9.1D5).
Se trataron las células WiDr con ácido
9-cis-retinoico o DMSO, a
continuación se separaron y se agruparon mediante centrifugación a
baja velocidad. Se fijaron los residuos celulares durante toda la
noche en formalina tamponada neutra al 10%, se deshidrataron, y se
embebieron en parafina. Se realizó la inmunohistoquímica utilizando
sobrenadante de cultivo de hibridoma monoclonal de péptido B
anti-Stra6 (clon 12F4.2H9.1D5) o IgG2A de isótopo
de ratón no específico como anticuerpos primarios, seguido de
detección utilizando el procedimiento de complejo de avidinbiotina
con diaminobenzidina como cromógeno (Vectastain Elite Kit, Vector
Laboratories) tal y como se describe previamente (Eberhard et
al., Am. J. Pathol. 145:640-9 [1994]). Se
contratiñeron las secciones con hematoxilina.
Los ratones transgénicos que expresan el
proto-oncogén Wnt-1 en la glándula
mamaria habitualmente muestra lesiones hiperplásicas y desarrolla
neoplasmas en este tejido (Tsukamoto et al., Cell
55:619-625 [1988]). Dichos ratones se utilizaron en
los siguientes experimentos.
Easwaran et al. previamente describieron
la activación aumentada de un gen informador sensible a ácido
retinoico sintético cuando se co-transfectaron las
células MCF-7 con \beta-catenina
mutante y se trataron con retinoides (Easwaran et al., Curr.
Biol. 9: 1415-1418 [1999]). Considerando esto, junto
con la identificación original de Stra6 como un gen inducible por
ácido retinoico (Bouillet et al., Mech Dev.
63:173-186 [1997]), nos preguntamos si el ácido
retinoico podría sinergizar con Wnt-1 para
incrementar el nivel de Stra6 en la línea celular C57MG. El
tratamiento de células C57MG parentales con ácido
9-cis-retinoico o ácido retinoico
todo-trans (ATRA) durante 48 horas incrementó
significativamente el nivel de ARNm de Stra6 mientras el DMSO y la
vitamina D3 no tenían efecto (Figura 17A). Tal y como se esperaba,
las células C57MG/Wnt-1 tratadas con DMSO o
vitamina D3 mostraron niveles aumentados de ARNm de Stra6 en
relación a la línea celular parental. El nivel de inducción de
Stra6 mediante Wnt-1 era comparable al observado en
la estimulación de las células C57MG parentales con ácido
9-cis retinoico. No obstante, el tratamiento con
ácido 9-cis-retinoico de la línea
celular C57MG/Wnt-1 indujo un incremento adicional
de 10 veces en el ARNm de Stra6 en relación con células parentales
C57MG/Wnt-1 no tratadas o C57MG tratadas con ácido
9-cis-retinoico. Se obtuvieron
resultados smilares con ácido retinoico
todo-trans.
Existía la posibilidad de que las variaciones
clonales potenciales en la línea celular
C57MG/Wnt-1, que no estaban relacionadas con la
expresión de Wnt-1, representaran su respuesta
diferencial ante ácido retinoico en relación con las células de
control parentales. Para abordar esto, probamos la respuesta de las
células C57MG parentales ante estimulación mediante
Wnt-3a soluble en presencia o absencia de ácido
9-cis-retinoico.
Wnt-3a es un homólogo de Wnt-1 que
muestra propiedades de transformación similares a las de
Wnt-1 y puede producirse como un ligando soluble en
células L de ratón. Los medios acondicionados de células L
cultivadas que expresan Wnt-3a, pero no de células
L de control, indujeron la expresión de Stra-6 en
las células C57MG (Figura 17B). Se observó un nivel de innducción
ligeramente mayor en el tratamiento de células C57MG con ácido
9-cis-retinoico. No obstante, la
combinación de ácido 9-cis-retinoico
y Wnt-3a dio lugar a niveles de transcritos de
Stra6 que superaban ampliamente los observado con el agente
solo.
Si se potenciaba la inducción de Stra6 en las
células C57MG /Wnt-1 tratadas con ácido retinoico
mediante niveles aumentados de \beta-catenina, se
puede esperar entonces una inducción similar de Stra6 en respuesta
al ácido retinoico en células de carcinoma de cólon humano que
contienen mutaciones en \beta-catenina o APC.
Para determinar si esto ocurre, se midieron los niveles de ARNm de
Stra6 antes y después del tratamiento con ácido retinoico en
células HCT116, que llevan una mutación activante en
\beta-catenina, y en células WiDr, que han
perdido ambas copias de APC de tipo natural. En ambas líneas
celulares, se observó un incremento significativo en los niveles de
ARNm de Stra6 después del tratamiento con ATRA o ácido
9-cis-retinoico en comparación con
DMSO o vitamina D3 (Figura 17C). Se confirmó la activación del gen
de Stra6 por parte de ATRA en la línea celular HCT116 se confirmó
mediante hibridación in situ (Figura 17D). Se detectó la
inducción de la banda de proteína de Stra6 de 73 kDa en células
WiDr mediante análisis transferencia Western con un anticuerpo
monoclonal específico de Stra6 (Figura 17E). El análisis
inmunohistoquímico de las células WiDr reveló que el incremento en
la proteína de Stra6 en respuesta al ácido retinoico se localizó en
la membrana plasmática (Fig. 17F).
Se ha propuesto el gen RARy como una diana para
la señalización de Wnt en embriones de Xenopus, y la inducción de
Stra6 mediante retinoides se demostró que era dependiente de la
presencia de este subtipo de receptor de ácido retinoico (McGrew
et al., Mech. Dev. 87:21-32 [1999]; Taneja
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7854-8
[1995]). Juntas, estas observaciones sugieren que la activación
sinérgica de Stra6 mediante Wnt y retinoides podría deberse a la
activación de la expresión de RAR\gamma mediante señalización de
Wnt. Para determinar si la señalización de Wnt tuvo alguna
influencia sobre los niveles de RAR\gamma en células mamarias,
realizamos transferencias Western para el receptor en lisatos
preparados a partir de células C57MG que expresan condicionalmente
Wnt-1. Tras la expresión de Wnt-1,
una proteína que reacciona con anticuerpo específico a
RARy-1, y que migra con una masa molecular aparente
de 64 kDa, se indujo a las 24 horas y se incrementó su expresión a
las 48 horas (Figura 18A). También analizamos glándulas mamarias
hiperplásicas y tumores de glándula mamaria de ratones transgénicos
Wnt-1 y detectamos niveles elevados de ARNm de
RAR\gamma en estos tejidos en relación con la glándula mamaria
normal (Figura 18B). El nivel de transcrito de RAR\gamma presente
en cantidades iguales de ARN aislado de 19 adenocarcinomas se evaluó
mediante PCR cuantitativa. De manera destacada, se incrementó la
expresión de ARNm de RAR\gamma aproximadamente 2-4
veces en 14 de los 19 (74%) tumores de colon humano examinados en
comparación con el tejido de colon humano normal (Figura 18C).
Estos resultados demuestran que la señalización de
Wnt-1 promueve la expresión de RAR\gamma, que los
receptores están elevados en tumores de ratón y de humano, que son
dirigidos por el mecanismo Wnt-1.
Las estrategias de determinación del perfil de
expresión de genes se basan en la detección objetiva de transcritos
de ARNm y por lo tanto puede llevar a interpretaciones inesperados
de los mecanismos mediante los cuales se produce la activación
génica. En la presente invención se ha observado que
Wnt-1 provocaba la inducción del gen Stra6 sensible
a ácido retinoico, sugiriendo una conexión entre los mecanismos de
señalización obtenidos por Wnt y el ácido retinoico. Esta conexión
fue adicionalmente apoyada mediante la demostración de una
inducción sinérgica de Stra6 mediante una combinación de Wnt y ácido
retinoico. Existen por lo menos tres explicaciones alternativas que
podrían valer para esta sinergia: i) factores de transcripción
directamente sensibles a Wnt, tales como TCF/LEFs, podrían unirse y
activar elementos promotores en el gen de Stra6; ii) componentes de
señalización en el mecanismo Wnt podrían interaccionar directamente
con el receptor de ácido retinoico (RAR) adecuado y potenciar la
activación génica mediada por el RAR; o iii) la señalización
mediante Wnt-1 podría activar la expresión del RAR
adecuado, el cual a continuación podría sensibilizar células al
ácido retinoico. Aunque este propósito final está favorecido ya que
los datos presentados en la presente invención muestran que la
señalización de Wnt-1 rápidamente induce la
expresión del receptor de RAR\gamma, la presente invención no
está limitada por cualquier teoría o mecanismo de acción
concretos.
concretos.
El trabajo previo ha mostrado que la
interrupción específica del gen de RAR\gamma redujo enormemente
la inducción del gen de Stra6 mediante retinoides, que se rescató a
continuación en la re-expresión de este receptor
(Taneja et al., supra). No obstante, parece posible
que haya mecanismos además de la expresión de Wnt-1
inducida por RAR\gamma puedan también contribuir en la sinergia
observada. La propuesta de que la \beta-catenina
se une a receptores de ácido retinoico es atractiva, pero no hemos
observado ninguna asociación específica de RAR\gamma endógeno con
\beta-catenina en nuestras líneas celulares. No
obstante, la unión de \beta-catenina a
RAR\gamma, tal y como se mostró in vitro (Easwaran et
al., 1999, supra), podría relacionarse con la activación
de Stra6 mediante Wnt-1. El patrón de expresión de
Stra6 en animales transgénicos inactivo para RAR\gamma fue más
extenso que el observado en los vástagos naturales, y la inducción
de Stra6 mediante ácido retinoico se aumentó en células de los
animales inactivos en comparación con los controles (Bouillet et
al., 1997, supra; Taneja et al., 1995,
supra). De este modo RAR\gamma podría ser inhibidor para la
expresión de Stra6, y la activación de
\beta-catenina mediante Wnt-1
podría mitigar potencialmente esta inhibición si
\beta-catenina inhibía la función de
RAR\gamma.
La inducción sinérgica de un gen sensible a
ácido retinoico mediante la señalización de Wnt-1
implica que los cánceres humanos que abergan defectos genéticos en
el mecanismo de Wnt-1 mostrarían sobreexpresión de
Stra6. La amplia mayoría de tumores colorrectales contienen
mutaciones en los genes que codifican para el supresor de tumor de
APC o \beta-catenina (Polakis, Curr. Opin. Genet.
Dev. 9:15-21 [1999]) y, por consiguiente, hemos
detectado la sobreexpresión del transcrito de Stra6 en 14 de los 14
tumores colorrectales en relación con los tejidos normales
emparejados (ver Ejemplo 12). También se han identificado mutaciones
activantes en \beta-catenina en cánceres de
ovario y de endometrio, tumores de riñón de Wilms y melanomas,
demostranndo que los defectos en la señalización de
Wnt-1 contribuyen a la progresión de estos cánceres
(Kobayashi et al. Jpn. J. Cancer Res.
90:55-9 [1999]; Koesters et al., Cencer Res.
59:3880-2 [1999]; Palacios y Hamallo, Cancer Res.
58:1344-7 [1998]; Rimm et al. Am. J.
Pathol.154:325-9 [1999]; Rubinfeld et al.
Science 262:1731-1734 ; Wright et al. Int.
J. Cancer 82:625-9 [1999]). Estos cuatro cánceres
humanos mostraron sobreexpresión de ARNm de Stra6 tal y como se
determina mediante hibridación in situ (ver Ejemplo 12). El
feocromocitoma, un tumor derivado de médula adrenal, mostró niveles
extremadamente altos de ARNm de Stra6, no obstante, no se ha
descrito el estado de estos tumores respecto a las mutaciones en el
mecanismo de señalización de Wnt-1. Es interesante
que los tipos de célula que dan lugar a melanomas y feocromocitomas
tienen en común una derivación embriológica de la cresta neural. De
manera destacada, el tumor de riñón de Wilms, el feocromocitoma, y
los carcinomas endometriales todos surgen en órganos en los cuales
Stra6 se expresa de forma normal. Esto sugiere que la señalización
tumorigénica, como la impulsada por el mecanismo de
Wnt-1, puede interaccionar con señales responsables
de la diferenciación, hiper-activando de ese modo la
expresión de
Stra6.
Stra6.
La proteína Stra6 humana reside en la superficie
celular, tal y como se determina mediante la tinción de células
cancerosas colorrectales con anticuerpos monoclonales específicos
para proteína Stra6 humana. Además, se incrementó la intensidad de
tinción observada en la membrana celular después del tratamiento de
las células con ácido retinoico. De este modo, stra6 probablemente
codifica una proteína transmembranna multi-paso que
se localiza en la superficie celular.
\newpage
Se han depositado los siguientes materiales con
la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd.,
Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):
Estos depósitos se realizaron según lo
estipulado en el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del
Procedimiento en Materia de Patentes y el Reglamento bajo el mismo
(Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo
viable del depósito durante 30 años a partir de la fecha de
ldepósito. Los depósitos estarán disponibles mediante la ATCC según
los términos del Tratado de Budapest, y están sujetos a un acuerdo
entre Genentech, Inc. y ATCC, que asegura la disponibilidad
permanente y sin restricción de la progenie del cultivo del depósito
al uso público tras la publicación de la respectiva patente
estadounidense o tras ponerse abierta a la inspección pública de
cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, la que
sea primera, y asegura la disponibilidad de la progenie para
alquien determinado por la U.S. Commissioner of Patents and
Trademarks para tener el derecho a la misma de acuerdo con 35 USC
\NAK 122 y las normas de la Commissioner según las mismas
(incluyendo 37 CFER \NAK 1.14 con referencia concreta a 886 OG
638).
El cesionario de la presente solicitud ha
acordado que si un cultivo de los materiales en el depósito
mueriera o se perdiera o se destruyera cuando se cultiva en las
condiciones adecuadas, los materiales serán inmediatamente
reemplazados en una notificación por otros iguales. La
disponibilidad del material depositado no se interpreta como una
licencia para realizar la invención contraviniendo los derechos
concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con
sus leyes de patente.
La memoria escrita anterior se considera que es
suficiente para permitir a un experto en la materia realizar la
invención. La presente invención no se limita en su alcance por la
construcción depositada. El depósito del material de la presente
invención no constituye una admisión de que la descripción escrita
contenida en la presente invención sea inadecuada para permitir la
práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el modo
óptimo de la misma, ni se interpreta como limitante del alcance de
las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que
representa.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
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\bullet US 4275149 A [0073]
\bullet US 4675187 A [0078]
\bullet US 5364934 A [0092]
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\bullet US 4640835 A [0106]
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<160> 5
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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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<210> 1
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<211> 2732
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<212> ADN
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<213> Homo Sapiens
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<220>
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<221> CDS
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<222> (49)..._(2052)
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<400> 1
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\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
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<210> 2
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<211> 667
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens
\newpage
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<400> 2
\hskip1cm
\hskip1cm
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<210> 3
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<211> 676
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<212> ADN
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<213> Homo Sapiens
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<220>
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<221> caracteríticas varias
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)...(26)
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<223> n = A, T, C o G
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<400> 3
\hskip1cm
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<210> 4
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<211> 2777
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<212> ADN
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<213> Homo Sapiens
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<220>
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<221> CDS
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<222> (186)...(2160)
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<400> 4
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
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<210> 5
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<211> 658
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens
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<400> 5
\hskip1cm
\hskip1cm
Claims (26)
1. Anticuerpo contra un polipéptido Stra6,
consistiendo el polipéptido Stra6 en:
(a) una secuencia de aminoácidos de residuos de
aminoácidos de 1 a 667 de la figura 2; o
(b) una secuencia de aminoácidos de residuos de
aminoácidos de 532 a 667 de la figura 2;
en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano
o humanizado.
2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el
que dicho anticuerpo está conjugado a un agente citotóxico o un
agente activante de profármacos.
3. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el
que dicho anticuerpo es un anticuerpo heteroconjugado.
4. Composición farmacéutica que comprende un
anticuerpo en una mezcla con un portador farmacéuticamente
aceptable, en la que el anticuerpo es un anticuerpo según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Composición farmacéutica según la
reivindicación 4, en la que la composición comprende además un
retinoide.
6. Molécula de ácido nucleico aislada que
codifica el anticuerpo según la reivindicación 1.
7. Vector que comprende la molécula de ácido
nucleico según la reivindicación 6.
8. Célula huésped que comprende el vector de la
reivindicación 7.
9. Procedimiento para producir un anticuerpo que
se une a un polipéptido Stra6, comprendiendo dicho procedimiento el
cultivo de la célula huésped según la reivindicación 8 en
condiciones suficientes para permitir la expresión de dicho
anticuerpo y la recuperación de dicho anticuerpo del cultivo
celular.
10. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, para su uso en un método de tratamiento que
comprende la inhibición del crecimiento de células tumorales que
tienen un defecto genético en el mecanismo de
WnNt-1.
11. Anticuerpo para su uso según la
reivindicación 10, en el que el tratamiento comprende además la
administración de un retinoide a un sujeto.
12. Anticuerpo para su uso según cualquiera de
las reivindicaciones 10 u 11, en el que el tratamiento comprende
además un tratamiento por radiación, o un tratamiento con un agente
citotóxico o un agente quimioiterapéutico.
13. Uso de un anticuerpo
anti-Stra6 en la preparación de un medicamento para
la inhibición del crecimiento de células tumorales, en el que
dichas células tumorales sobreexpresan un polipéptido Stra6 que
comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un
95% de identidad con la secuencia de residuos de aminoácidos de 1 a
667 de la figura 2 en comparación con células normales del mismo
tipo de tejido y en el que dicho anticuerpo
anti-Stra6 se une a dicha secuencia de aminoácidos
que tiene por lo menos un 95 de identidad con la secuencia de
residuos de aminoácidos de 1 a 667 de la figura 2.
14. Uso según la reivindicación 13, para la
fabricación de un medicamento para la inhibición del crecimiento de
células tumorales en combinación con un retinoide.
15. Uso según la reivindicación 13, en el que el
medicamento comprende un retinoide.
16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
13 a 15, en el que dicho retinoide estimula o aumenta la
sobreexpresión de Stra6 en dichas células tumorales.
17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
13 a 16, en el que el polipéptido Stra6 es un polipéptido que
comprende los residuos de aminoácidos 1 a 667 de a figura 2.
18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
13 a 17, en el que dicho anticuerpo está conjugado a un agente
citotóxico o un agente activador de profármaco.
19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
13 a 17, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
heteroconjugado.
20. Anticuerpo para su uso según cualquiera de
las reivindicaciones 10 a 12 o el uso según cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 19, en los que el anticuerpo antiStra6 induce
la muerte celular.
21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
13 a 19, en el que dicho medicamento es para el tratamiento en
combinación adicional con tratamiento por radiación, un agente
citotóxico o un agente quimioiterapéutico.
22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
13 a 19, en el que las células tumorales presentan un defecto
genético en el mecanismo de Wnt-1.
23. Anticuerpo para su uso según cualquiera de
las reivindicaciones 10 a 12, o el uso según la reivindicaciones
12, en los que dicho defecto conduce a la activación anormal de la
señalización de B-catenina.
24. Anticuerpo para su uso o uso según la
reivindicación 22, en el que las células tumorales contienen una
mutación de supresor de tumor APC de B-catenina.
25. Anticuerpo para su uso o uso segúnm
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 24, en el que las células
tumorales son células tumorales de mama, pulmón, colorrectal,
ovario, endometrio, riñón, melanoma o feocromocitoma.
26. Anticuerpo para su uso o uso según la
reivindicación 25, en el que el tumor de riñón es un tumor de riñón
de Wilm.
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