ES2242597T3 - Composiciones y procedimientos para el diagnostico y tratamiento de un tumor. - Google Patents
Composiciones y procedimientos para el diagnostico y tratamiento de un tumor.Info
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Abstract
Procedimiento de diagnóstico de un tumor en un mamífero, que comprende la detección de la amplificación de y/o el nivel de la expresión de un gen que codifica un polipéptido de cardiotrofina-1 (CT-1), (a) en una muestra a analizar de células del tejido obtenido de un mamífero, y (b) en una muestra control de células de un tejido normal del mismo tipo celular, en el que la amplificación génica y/o un nivel de expresión superior en la muestra a analizar indica la presencia del tumor en el mamífero de donde se obtuvieron las células del tejido a analizar.
Description
Composiciones y procedimientos para el
diagnóstico y tratamiento de un tumor.
La presente invención hace referencia a las
composiciones y procedimientos para el diagnóstico y tratamiento de
tumores.
Los tumores malignos (cánceres) son la segunda
causa de muerte en los Estados Unidos, después de las enfermedades
del corazón (Boeing y col., CA Cancel J. Clin. 43, 7, [1993]).
El cáncer se caracteriza por el incremento de
células anormales o neoplásicas derivadas de un tejido normal que
proliferan hasta formar una masa tumoral, la invasión de los tejidos
adyacentes de estas células tumorales neoplásicas y la generación de
células malignas que eventualmente se propagan por la sangre o el
sistema linfático a los nódulos linfáticos regionales y a sitios más
lejanos (metástasis). En un estado canceroso una célula prolifera en
condiciones en las que células normales no crecerían. El cáncer se
manifiesta de muchas maneras y se caracteriza por sus distintos
grados de invasión y agresividad.
La alteración de la expresión génica está
relacionada íntimamente con el crecimiento celular incontrolado y la
desdiferenciación que es un hecho común de todos los cánceres. Se ha
demostrado que los genomas de ciertos tumores bien estudiados
presentan una expresión disminuida de genes recesivos, generalmente
denominados genes supresores de tumores, que normalmente funcionan
para prevenir el crecimiento de células malignas y/o la
sobreexpresión de ciertos genes dominantes, como los oncogenes, que
actúan para promover el crecimiento maligno. Cada uno de estos
cambios confieren algunas de las nuevas características que en su
conjunto representan el fenotipo neoplásico (Hunter y col., Cell,
64, 1129 (1991); Bidhop, Cell, 64, 235-248
(1991)).
Un mecanismo bien conocido de la sobreexpresión
génica en las células cancerosas es la amplificación génica. Este es
un proceso que ocurre en la célula ancestral, donde se producen
múltiples copias de un gen particular en un determinado cromosoma.
El proceso implica la replicación desprogramada de la región del
cromosoma que contiene el gen, seguido de la recombinación de los
segmentos replicados en el cromosoma (Alitalo y col., Adv. Cancer
Res. 47, 235-281 (1986)). Se cree que la
sobreexpresión del gen es paralela a la amplificación génica, es
decir proporcional al número de copias.
Se han identificado
proto-oncogenes que codifican factores de
crecimiento y receptores de factores de crecimiento que desempeñan
funciones importantes en la patogénesis de diversos procesos
malignos, incluyendo el cáncer de mama. Por ejemplo, se ha hallado
que el gen ErbB2 (erbB2, también denominado her2, o
c-erbB-2), que codifica un receptor
glicoproteico transmembrana de 185-Kd
(p-185HER2; HER2) relacionado con el receptor del
factor de crecimiento epitelial (EGFR), se sobreexpresa en
aproximadamente el 25%-30% en el cáncer de mama humano (Salmón y
col., Science 235:177-182 (1987); Salmón y col.,
Science 244:707-712, (1989)).
Se ha publicado que la amplificación génica de un
proto-oncogen es un suceso típicamente implicado en
la mayoría de las formas malignas del cáncer y podría utilizar como
un factor de predicción de diagnóstico clínico (Schwab y col.,
Genes, Chromosomes and Cancer 1, 181-193 (1990);
Alitalo y col., supra). Por ello, la sobreexpresión de erbB2
se considera un factor de predicción de pronóstico malo,
especialmente en pacientes con enfermedad primaria que implica los
nódulos linfáticos axilares (Salmón y col., (1987) y (1988),
supra; Ravdin y Chamness, Gene 159:19-27
(1995); y Hynes y Stem, Biochim Biophys Acta
1198:165-184 (1994) y se ha asociado a la
sensibilidad y/o resistencia a la terapia hormonal y a los regimenes
quimioterapéuticos, incluyendo el CMF (ciclofosfamida, metotrexato y
fluoruracil) y las antraciclinas (Baselga y col., Oncology 11 (3
Suppl 1):43-48 (1997)). Sin embargo, a pesar de la
asociación de la sobreexpresión de erbB2 con un diagnóstico pobre,
la proporción de pacientes HER2-positivos que
responden clínicamente al tratamiento con taxanos fue tres veces
superior a los pacientes HER2-negativos
(ibid). Un anticuerpo monoclonal anta-ErbB2
humanizado recombinante (anta-HER2) (una versión
humanizada del anticuerpo anta-ErbB2 murino 4D5,
denominado como rhuMAb HER2 o Herceptin® ha demostrado ser activo
clínicamente en pacientes con cánceres de mama metastático que
sobreexpresan ErbB2 que habían recibido primero extensa terapia
anticáncer.(Baselga y col., J. Clin. Oncol.
14:737-744 (1996).
La presente invención hace referencia a las
composiciones y procedimientos para el diagnóstico y tratamiento del
crecimiento y proliferación de células neoplásicas en mamíferos,
incluyendo el hombre. La presente invención se basa en la
identificación de un gen que se amplifica en el genoma de células
tumorales. Dicha amplificación génica se espera que se asocie con la
sobreexpresión del producto génico y contribuya a la tumorigénesis.
Según ello, se considera que la proteína codificada por el gen
amplificado es una diana útil para el diagnóstico y/o tratamiento
(incluyendo la prevención) de ciertos cánceres y puede actuar como
un factor de predicción del pronóstico del tratamiento tumoral.
\newpage
Un producto génico, GT-1 de
utilidad en el tratamiento de fallo cardíaco y/o trastornos
neurológicos como la neuropatía periférica, se describe en la
patente americana 5.571.675 y también en las patentes WO 97/30146;
US 5.627.073; US 5.679.545; US 5.571.893 y Penca col., (1996)
Cytokine 8(3): 183-189. en la presente
invención, se describe El descubrimiento sorprendente de que
CT-1 se amplifica en las células tumorales, como las
células tumorales de pulmón y de colon. El descubrimiento de los
solicitantes de que CT-1 se amplifica en las células
tumorales conduce a los descubrimientos adicionales de composiciones
para el tratamiento de células tumorales y procedimientos para
llevar a cabo dicho tratamiento.
En una realización, la presente invención hace
referencia a un procedimiento para diagnosticar un tumor en un
mamífero, que comprende la detección de la amplificación y/o el
nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido
CT-1 (a) en una muestra a analizar de células
tumorales obtenidas del mamífero y (b) en una muestra control de
células de tejido normal conocido del mismo tipo celular, en donde
la amplificación génica y/o una mayor nivel de expresión en la
muestra a analizar indica la presencia de tumor en el mamífero de
quien se obtuvieron las células del tejido a analizar.
En otra realización, la presente invención hace
referencia a un procedimiento para diagnosticar un tumor en un
mamífero, que comprende (a) el contacto de un anticuerpo
anta-CT-1 con una muestra a analizar
de las células del tejido obtenidas del mamífero y (b) la detección
de la formación de un complejo entre el anticuerpo
anta-CT-1 y el polipéptido
CT-1 en la muestra a analizar. La detección puede
ser cualitativa o cuantitativa y puede realizarse en comparación con
la monitorización de la formación del complejo en una muestra
control de células de tejido conocido del mismo tipo celular. Una
gran cantidad de complejos formados en la muestra a analizar es
indicativo de la presencia de tumor en el mamífero de quién se
obtuvieron las muestras. El anticuerpo porta preferentemente un
marcaje detectable. La formación del complejo puede controlarse, por
ejemplo, mediante microscopía óptica, citometría de flujo,
fluorímetro u otras técnicas conocidas en la materia.
La muestra a analizar se obtiene generalmente de
un individuo sospechoso de presentar crecimiento o proliferación de
células neoplásicas (p.ej., células cancerosas).
En otra realización, la utilización de un agente
que inhibe la expresión y/o la actividad del polipéptido
CT-1 en la preparación de un medicamento para el
tratamiento del tumor. El agente es preferentemente un anticuerpo
anta-CT-1, una molécula pequeña
orgánica e inorgánica, péptido, fosfopéptido, molécula antisentido o
ribozima, o una molécula de triple hélice. En un aspecto específico,
el agente, por ejemplo el anticuerpo
anta-CT-1 induce la muerte celular.
En otro aspecto, las células tumorales se exponen además a un
tratamiento por radiación y o un agente citotóxico o
quimioterapéutico.
La figura 14 (SEC ID Nº: 1 y 2) muestra la
secuencia nucleotídica de DNA58125 que es un cDNA que codifica una
cardiotrofina-1 (CT-1) de secuencia
nativa. La SEC ID Nº: 1 es la cadena codificante del DNA58125 y la
SEC ID Nº: 2 es la cadena complementaria del DNA58125. La SEC ID Nº:
3 es la secuencia aminoacídica derivada de una
cardiotrofina-1 (CT-1) de secuencia
nativa.
La figura 2 es un diagrama del cromosoma humano
16 que indica que las regiones del cromosoma en donde hibridan el
DNA58125 y diversas sondas marcadoras. Las sondas marcadoras (P7,
P55, P99, P154 y P208) se localizan aproximadamente cada 20
megabases a lo largo del cromosoma 16 y se utilizan como controles
para cuantificar la amplificación genética. El DNA58125 híbrida con
una región del brazo largo del cromosoma entre el centrómero y la
sonda marcadora P99.
La figura 3 es una representación
tri-dimensional de los resultados de un análisis de
DNA58125 (cardiotrofina-1) en el Panel 1 de cáncer
pulmonar. Los tumores primarios de pulmón analizados se muestran en
el eje de las X; las sondas marcadoras y el DNA58125 se muestran en
el eje de las Y; y la amplificación genética relativa en el área de
cada una de las sondas marcadoras se representa con ayuda de
histogramas en el eje de las Y. Los histogramas se proyectan por
encima del plano cero para las regiones genéticas amplificadas
relativas al DNA58125 en tejidos sanos, o por debajo del plano cero
indicando una cuantificación genética reducida en dicha región.
La figura 4 es una representación tridimensional
de los resultados de un análisis de tipo marco de trabajo
("framework" en inglés) del DNA58125
(cardiotrofina-1) sobre el panel-2
de tumores de pulmón. El gráfico de histogramas de barras se ha
ordenado según se describe en la figura 3.
La figura 5 es un resumen de los gráficos de
histogramas bi-dimensionales de los resultados para
el DNA58125 de las Figuras 3 y 4. Se muestran los valores de la
media de \DeltaCt determinados para cada una de las líneas de
tumores de pulmón analizadas.
La figura 6 es una representación
tri-dimensional de los resultados de un análisis de
tipo marco trabajo del DNA58125 (cardiotrofina-1)
sobre el Panel-1 de tumores de colon. Los tumores de
colon primarios analizados se muestran en el eje de las X; las
sondas marcadoras y el DNA58125 se muestran en el eje de las Z; y la
amplificación genética relativa en el área de cada uno de las sondas
marcadoras se muestra en el eje de las Y. Los histogramas se
proyectan por encima del plano cero para las regiones genéticas
amplificadas relativas al DNA58125 en el tejido sano, o por debajo
del plano cero indicando una cuantificación genética reducida en
dicha región.
La figura 7 es una representación tridimensional
de los resultados de un análisis del DNA58125
(cardiotrofina-1) en el Panel-2 de
tumores de colon. El gráfico de histogramas de barras se ordena tal
como se indicó en la figura 6.
La figura 8 es un gráfico de histogramas de
barrar bidimensional de los resultados para el DNA58125 de las
figuras 6 y 7. Se muestran los valores medios del \DeltaCt
determinados para cada uno de los tumores de colon analizados.
La figura 9 es una representación tridimensional
de los resultados de un análisis epicéntrico del DNA58125
(cardiotrofina-1) sobre el Panel-1
de tumores de pulmón. El gráfico de histogramas barras se ordena tal
como se indicó en la figura 3.
La figura 10 es una representación tridimensional
de los resultados de un análisis epicéntrico del DNA58125
(CT-1) sobre el Panel-2 de tumores
de pulmón. El gráfico de histogramas barras se ordena tal como se
indicó en la figura 3.
La figura 11 es una representación tridimensional
de los resultados de un análisis epicéntrico del DNA58125
(CT-1) sobre el Panel-1 de tumores
de colon. El gráfico de histogramas barras se ordena tal como se
indicó en la figura 6.
La figura 12 es una representación tridimensional
de los resultados de un análisis epicéntrico del DNA58125
(CT-1) sobre el Panel-2 de tumores
de colon. El gráfico de histogramas barras se ordena tal como se
indicó en la figura 3.
Los términos "amplificación génica" y
"duplicación génica" se utilizan de forma intercambiable y
hacen referencia a un proceso mediante el cual se forman múltiples
copias de un gen o fragmento de un gen en una célula o línea celular
determinada. La región duplicada (un fragmento de DNA) es denominada
a menudo como "amplicón". Generalmente, la cantidad del RNA
mensajero (mRNA) producido, es decir, el nivel de expresión génica,
también incrementa en proporción del número de copias generadas del
gen expresado en particular.
El término "tumor" tal como se utiliza aquí,
hace referencia al crecimiento y proliferación de células
neoplásicas, malignas o benignas y a todos las células y todos los
tejidos pre-cancerosos y cancerosos.
Los términos "cáncer" y "canceroso"
hace referencia a o describe la condición fisiológica en los
mamíferos que se caracteriza típicamente por el crecimiento celular
no regulado. Ejemplos de cánceres incluyen pero no se limitan a,
carcinomas, linfomas, blastomas, sarcomas y leucemias. Ejemplos
determinados de dichos cánceres incluyen el cáncer de mama, el
cáncer de próstata, el cáncer de colon, el cáncer de células
escamosas, el cáncer de pulmón de células pequeñas, el cáncer de
pulmón de células no pequeñas, el cáncer gastrointestinal, el cáncer
pancreático, el glioblastoma, el cáncer cervical, el cáncer de
hígado, el cáncer de vejiga, el hepatoma, el cáncer colorectal, el
cáncer de endometrio, el carcinoma de glándulas salivares, el cáncer
de riñón, el cáncer de vulva, el cáncer de tiroides, el carcinoma
hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello.
El "tratamiento" es una intervención
realizada con la intención de prevenir el desarrollo o de alterar la
patología de un trastorno. Según ello, el término "tratamiento"
hace referencia tanto al tratamiento terapéutico y como a las
medidas profilácticas o preventivas. Los pacientes que necesitan un
tratamiento incluyen los que ya presentan la enfermedad y aquellos
en los que se intenta prevenir dicha enfermedad. En el tratamiento
tumoral (p.ej., el cáncer), un agente terapéutico puede disminuir
directamente la patología de las células tumorales, o volver las
células tumorales más susceptibles al tratamiento mediante agentes
terapéuticos, p.ej., radiación y/o quimioterapia.
La "patología" del cáncer incluye todos los
fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Ello incluye,
sin limitación, el crecimiento celular anormal o incontrolado, la
metástasis, la interferencia con el funcionamiento normal de las
células vecinas, la liberación de citoquinas u otros productos de
secreción a niveles anormales, la supresión o el agravamiento de la
respuesta inflamatoria o inmunológica, etc.
El término "mamífero" con propósitos de
tratamiento hace referencia a cualquier animal clasificado como un
mamífero, incluyendo el hombre, los animales domésticos y de granja,
los animales del zoo, los de competición o los animales de compañía
como el perro, gato, caballo, ganado vacuno, etc. Preferentemente,
el mamífero es el hombre.
El término "vehículo" tal como se utiliza
aquí incluye los vehículos aceptables farmacéuticamente, los
excipientes o los estabilizantes que no son tóxicos para la célula o
para el mamífero expuesto a ellos a las dosis y concentraciones
utilizadas. A menudo, el vehículo aceptable fisiológicamente es una
solución acuosa tamponada. Ejemplos de vehículos aceptables
fisiológicamente incluyen los tampones como el fosfato, el citrato y
otros ácidos orgánicos; los antioxidantes incluyendo el ácido
ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10
residuos); proteínas, como la seroalbúmina, la gelatina, o las
inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos como la
polivinilpirrolidona; los aminoácidos como la glicina, la glutamina,
la asparraguina, la arginina o la lisina; los monosacáridos, los
disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa o
las dextrinas; los agentes quelantes como el EDTA; los alcoholes de
azúcar como el manitol o el sorbitol; las parejas de iones
formadores de sales como el sodio; y/o los tensoactivos no iónicos
como el TWEEN^{TM}, el polietilén glicol (PEG) y el
PLURONICS^{TM}.
La administración "en combinación con" uno o
más de un agente terapéutico incluye la administración simultánea
(concurrente) y la administración consecutiva en cualquier
orden.
El término "agente citotóxico" tal como se
utiliza aquí, hace referencia a una sustancia que inhibe o previene
la función de las células y/o causa su destrucción. El término
abarca los isótopos radioactivos (p.ej., I^{131}, I^{125},
Y^{90} y Re^{186}), los agentes quimioterapéuticos y las toxinas
como las toxinas activas enzimáticamente de origen bacteriano,
fúngico, vegetal o animal, o de fragmentos de lo mismo.
Un "agente quimioterapéutico" es un
compuesto químico de utilidad en el tratamiento del cáncer. Ejemplos
de agentes quimioterapéuticos incluyen la adriamicina, la
doxorubicina, la epiubicina, el 5-fluorouracil, la
citosina arabinósido ("Ara-C"), la
ciclofosfamida, la tiotepa, el busulfán, la citosina, los taxoides,
p.ej., paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb
Oncology, Princeton, NJ) y el doxetaxel (Taxotere,
Rhône-Poulenc Rorer, Anthony, Rnace), el toxotere,
el metotrexato, las cisplatina, el melfalán, la vinblastina, la
bleomicina, el etoposido, la ifosfamida, la mitomicina C, el
mitoxantron, la vincristina, el vinorelbin, la carboplatin, el
tenipósido, la daunomicina, la carminomicina, la aminopterina, la
dactinomicina, las mitomicinas, las esperamicinas (véase la patente
americana U.S. 4.675.187), el melfalán y otras mostazas nitrogenadas
relacionadas. También se incluyen en esta definición los agentes
hormonales que actúan para regular o inhibir la acción de las
horomonas sobre los tumores como el tamoxifeno y el onapriston.
Un agente "inhibidor del crecimiento" cuando
se utiliza aquí hace referencia a un compuesto o composición que
inhibe el crecimiento de una célula, especialmente las células
cancerosas que sobre-expresan cualquiera de los
genes identificados aquí, in vitro o in vivo. Por
ello, el agente inhibidor del crecimiento es uno que reduce el
porcentaje de células que sobre-expresan dichos
genes en la fase S del ciclo celular. Ejemplos de agentes
inhibidores incluyen los que bloquean la progresión del ciclo
celular (en un sitio distinto de la fase S), como los agentes que
inducen el paro en G1 y en fase M. Los bloqueadores clásicos de fase
M incluyen el vincas (la vincristina y la vinblastina), el taxol y
los inhibidores de la topo II como la doxorubicina, la epirubicina,
la daunorubicina, el etopósido y la bleomicina. Aquellos agentes que
generan un paro en G1 también y abarcan el paro en la fase S, por
ejemplo, los agentes alquilantes del DNA como el tamoxifeno, la
prednisona, la dacarbazina, la meclorotamina, la cisplatina, el
metotrexato, el 5-fluorouracil y el
ara-C. Se puede hallar información adicional en The
Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., capítulo 1,
titulado ``Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs
por Murakami y col., (WB Saunders: Philadelphia, 1995),
especialmente la pág. 13.
La "doxorubicina" es un antibiótico de la
atraciclina. El nombre químico completo de la doxorubicina es
(8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-\alpha-L-lixo-hexapiransil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11
trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-5,12-naftacenediona.
El término "citosina" es un término genérico
para las proteínas liberadas por una población celular que actúa
sobre otra célula como mediadoras intercelulares. Ejemplos de
citocinas son las linfocinas, monocinas y las hormonas
polipeptídicas tradicionales, incluídas entre las citocinas se
hallan la hormona de crecimiento como la hormona de crecimiento
humana, la hormona de crecimiento N-emtionil y la
hormona de crecimiento bovina; la hormona paratifoidea, la tiroxina,
la insulina, la proinsulina, la relaxina, la prorelaxina, las
hormonas glicoproteicas como la hormona estimulante del folículo
(FSH), la hormona estimulante del tiroides (TSH) y la hormona
luteinizante (LH), el factor de crecimiento hepático, el factor de
crecimiento de fibroblastos, la prolactina, el lactógeno placental,
el factor de necrosis tumoral-\alpha y -\beta,
las sustancia inhibidora mulleriana, el péptido asociado a
gonadotropina de ratón, la inhibina, la activita, el factor de
crecimiento endotelial vascular, la trombopoyetina (TPO), los
factores de crecimiento nerviosos como el
NGF-\beta, el factor de crecimiento plaquetario,
los factores osteoinductores (TGFs) como el
TGF-\alpha y el TGF-\beta, el
factor-I y II de crecimiento similar a la insulina,
la eritropoyetina (EPO), los factores osteoinductores, los
interferones-\alpha, -\beta y \gamma, los
factores estimulantes de colonias (CSFs) como el
CSF-macrófago (M-CSF),
granulocito-macrófago-CSF
(GM-CSF) y el granulocito-CSF
(G-CSF), las interleuquinas (ILs) como
IL-1, IL-1\alpha,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-11,
IL-12; un factor de necrosis tumoral como el
TNF-\alpha o el TNF-\beta y
otros factores polipeptídicos incluyendo el equipo de ligando (KL).
Tal como se utiliza aquí, el término citocinas incluye las proteínas
de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y los
equivalentes activos biológicamente de las citocinas de secuencia
nativa.
Tal como se utiliza aquí, los términos un
polipéptido "CT-1" hace referencia a un
polipéptido que comprende un polipéptido de secuencia nativa que
tiene la misma secuencia aminoacídica como un polipéptido
CT-1 correspondiente derivado de la naturaleza, de
fragmentos de dichos polipéptidos de secuencia nativa. Dichos
polipéptidos CT-1 de secuencia nativa pueden
aislarse de la naturaleza o, junto con los fragmentos respectivos,
pueden producirse mediante métodos recombinantes y/o sintéticos. El
término abarca específicamente formas truncadas o secretadas de
forma natural (p.ej., una secuencia de dominio extracelular), las
formas variantes que ocurren de forma natural (p.ej., las formas de
ayuste alternativo) y las variantes alélicas que tienen lugar de
forma natural del polipéptido CT-1. En una
realización de la invención, la secuencia nativa
CT-1 es una presecuencia de tamaño completo o una
forma madura de un polipéptido CT-1 que se muestra
en la Figura 1 (SEC ID Nº 3). Los fragmentos de los respectivos
polipéptidos nativos incluyen, pero no se limitan a, variantes
polipeptídicas en las que se ha delecionado o reemplazado la
secuencia señal N-terminal nativa por otra secuencia
y los dominios extracelulares de las secuencias nativas respectivas,
a pesar de que dichas formas truncadas (secretadas) ocurran en la
naturaleza.
Una molécula de ácido nucleico "aislada" que
codifica un polipéptido CT-1 es una molécula de
ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula
de ácido nucleico con la que está asociada en la fuente natural del
ácido nucleico que codifica CT-1. Una molécula de
ácido nucleico que codifica CT-1 es distinta en la
forma o ajuste en que se halla en la naturaleza. Las moléculas de
ácido nucleico aisladas se diferencian en consecuencia de las
moléculas de ácido nucleico que codifican CT-1 tal
como existen en las células naturales. Sin embargo, una molécula de
ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido
CT-1 incluye moléculas de ácido nucleico contenidas
en las células que generalmente expresan CT-1, si,
por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se halla en una
localización cromosómica distinta a la de las células naturales.
El término "secuencia control" hace
referencia a las secuencias de DNA necesarias para la expresión de
una secuencia unida operativamente en un organismo huésped
particular. Las secuencias control que son adecuadas para los
protagonistas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una
secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que
las células eucariotas utilizan promotores, señales de
poliadenilación e intensificadores.
El ácido nucleico está "unido
operativamente" si está colocado en una relación funcional con
otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el DNA para una
presecuencia o líder secretor está unido operativamente a un DNA por
un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en
la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está
unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la
transcripción de la secuencia, o un sitio de unión está unido
operativamente a una secuencia codificante si está en una posición
que facilita la traducción. En general, "unido operativamente"
significa que las secuencias de DNA que están unidas son contiguas,
y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en la mima pauta de
lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen porque ser
contiguos. La unión se logra mediante ligación en dianas de
restricción adecuadas. Si dichas dianas no existen, se utilizan
adaptadores oligonucleotídicos sintéticos o engarces de acuerdo con
la práctica convencional.
La "estringencia" de las reacciones de
hibridación se determina fácilmente por un artesano en la materia y
generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la
sonda, la temperatura del lavado y las concentraciones de sal. En
general, sondas mayores requieren temperaturas más elevadas para una
hibridación adecuada, mientras que sondas más cortas necesitan
temperaturas menores. La hibridación depende generalmente de la
capacidad del DNA desnaturalizado para rehibridar cuando las cadenas
complementarias están presentes en un entorno por debajo de su
temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseada
entre la sonda y la secuencia a hibridar, mayor es la temperatura
relativa que puede utilizarse. Como resultado, una mayor temperatura
relativa hará que las condiciones de la reacción sean más
astringentes, mientras que temperaturas inferiores producirán un
efecto contrario. Para detalles adicionales y una explicación de la
estringencia de las reacciones de hibridación, véase Ausubel y col.,
Current Protocols en Molecular Biology. Wiley Interscience
Publishers, (1995).
Las "condiciones astringentes" o
"condiciones de elevada estringencia", tal como se definen
aquí, pueden identificarse por los que: (1) utilizan baja fuerza
iónica y temperaturas elevadas para el lavado, por ejemplo cloruro
sódico 0,015M/citrato sódico 0,0015M/sodio dodecil sulfato a 50ºC;
(2) utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante, como
la formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina
sérica bovina al 0,1%/Ficoll al 0,1%/ polivinilpirrolidona al
1%/tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM,
citrato sódico 75 mM a 42ºC, o (3) utilizan formamida al 50%, 5xSSC
(NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8),
pirofosfato sódico al 0,1%, solución de Denhardts, DNA de esperma de
salmón sonicado (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y dextran sulfato al
0,1% a 42ºC con lavados a 42ºC en 0,2XSSC (cloruro sódico/citrato
sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido por una lavado a alta
astringencia que consiste en 0,1XSSC con EDTA a 55ºC.
Las "condiciones de astringencia moderada"
pueden identificarse tal como se describe por Sambrook y col.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New Cork: Cold Spring Harbor
Press, 1989, e incluye la utilización de la solución de lavado y las
condiciones de hibridación (p.ej., temperatura, fuerza iónica y % de
SDS) menos astringente que las descritas anteriormente. Un ejemplo
de condiciones astringentes moderadas es la incubación a 37ºC
durante toda la noche en una solución que comprende: formamida al
20%, 5XSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50
mM (pH 7,6), solución de 5XDenhardts, dextran sulfato al 10% y DNA
de esperma de salmón troceado y desnaturalizado, seguido por lavados
de los filtros en 1XSSC a aproximadamente 37-50ºC.
El artesano en la materia reconocerá cómo ajustar la temperatura, la
fuerza iónica, etc., tanto como sea necesario para adaptar los
factores como la longitud de la sonda y similares.
El término "epitopo con etiqueta" cuando se
utiliza aquí hace referencia a un polipéptido quimérico que
comprende un polipéptido CT-1 fusionado a un
"polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene
suficientes residuos para proporcionar un epitopo contra el que
pueda generarse un anticuerpo, es suficientemente corto para que no
interfiera con la actividad del polipéptido con el que se fusiona.
El polipéptido etiqueta preferentemente también es bastante único de
modo que el anticuerpo no reacciona de forma cruzada con otros
epitopos. Polipéptidos etiqueta adecuados tienen al menos 6 residuos
aminoacídicos y entre unos 8 y 50 aminoácidos (preferentemente,
entre 10 y 20 residuos aminoacídicos).
El término "activo" o "actividad" en el
contexto de moléculas identificadas según los polipéptidos
CT-1 (o sus secuencias codificantes) hacen
referencia a polipéptidos (p.ej., anticuerpos) o moléculas pequeñas
orgánicas o inorgánicas, péptidos, etc., que retienen las
propiedades biológicas y/o inmunológicas de un CT-1
nativo o que tiene lugar de forma natural.
La "actividad biológica" en el contexto de
un anticuerpo u otra molécula que pueda identificarse mediante
ensayos de rastreo se describe aquí (p.ej., una molécula pequeña
orgánica o inorgánica, péptido, etc.) se utiliza para referirse a la
capacidad de dichas moléculas para unirse o formar un complejo con
los polipéptidos que codifican los genes amplificados aquí
identificados, o dicho de otro modo que interfieren con la
interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas. Una
actividad biológica preferida es la inhibición del crecimiento de
una célula tumoral diana. Otra actividad biológica preferida es la
actividad citotóxica que resulta en la muerte de la célula tumoral
diana.
El término "propiedad inmunológica"
significa la reactividad cruzada inmunológica con al menos un
epitopo de un polipéptido CT-1.
La "reactividad cruzada inmunológica" tal
como se utiliza aquí hace referencia a que el polipéptido candidato
es capaz de inhibir competitivamente la actividad biológica
cualitativa de un polipéptido CT-1 que tiene esta
actividad con el antisuero policlonal generado contra el polipéptido
CT-1 activo y conocido. Dicho antisuero se prepara
de manera convencional inyectando en cabras o conejos, por ejemplo,
de forma subcutánea con el análogo activo conocido en adyuvante
completo de Freund, seguido de una segunda inyección estimuladora
intraperitoneal o subcutánea en Freund completo. La reactividad
cruzada inmunológica es preferentemente "específica", lo que
significa que la afinidad de unión de la molécula de reactividad
cruzada inmunológica (p.ej., anticuerpo) identificada, con el
polipéptido CT-1 correspondiente es
significativamente más elevada (preferentemente al menos 2 veces,
más preferentemente al menos 4 veces, aún más preferentemente al
menos 6 veces, más preferentemente al menos 8 veces superior) que la
afinidad de unión de dicha molécula con cualquier otro polipéptido
nativo conocido.
El término "antagonista" se utiliza en el
sentido amplio e incluye cualquier molécula que bloquea completa o
parcialmente, inhibe, o neutraliza la actividad biológica de un
polipéptido CT-1 nativo, aquí descrito. De forma
similar, el término "agonista" se utiliza aquí en sentido
amplio e incluye cualquier molécula que mimetice una actividad
bilógica de un polipéptido CT-1 nativo descrito
aquí. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen
específicamente anticuerpos agonistas o antagonistas o fragmentos de
anticuerpo, los fragmentos o variantes de secuencia aminoacídica de
polipéptidos nativos, péptidos, moléculas orgánicas pequeñas,
etc.
Una "molécula pequeña" se define aquí como
una molécula que tiene un peso molecular por debajo de 500
daltons.
Los "anticuerpos" (Abs) y las
"inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las
mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos
presentan especificidad de unión con un antígeno específico, las
inmunoglobulinas incluyen tanto los anticuerpos como otras moléculas
similares a anticuerpos que carecen de la especificidad antigénica.
Los polipéptidos del último tipo son, por ejemplo, producidos a
niveles bajos por el sistema linfático y a niveles aumentados por
los mielomas. El término "anticuerpo" se utiliza en sentido
amplio y abarca específicamente, sin limitación, los anticuerpos
monoclonales intactos, los anticuerpos policlonales, los anticuerpos
multiespecíficos (p.ej., los anticuerpos biespecíficos) formados a
partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de
anticuerpo siempre y cuando presentan la actividad biológica
deseada.
Los "anticuerpos nativos" y las
"inmunoglobulinas nativas" son glicoproteínas
heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de
dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas
(H). Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace
disulfuro, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre
las cadenas pesadas de isótopos de inmunoglobulina distintos. Cada
una de las cadenas ligeras y pesadas también tiene puentes disulfuro
intracatenarios espaciados de forma regular. Cada cadena pesada
tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número
de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable
en uno de los extremos (VL) y un dominio constante en el otro; el
dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer
dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de
cadena ligera se alinea con el dominio variable de cadena pesada.
Los residuos aminoacídicos determinados se cree que forman una
interfície entre los dominios variables de cadena pesada.
El término "variable" hace referencia al
hecho de que ciertas proteínas de los dominios variables difieren
extensamente en su secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en
la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su
antígeno determinado. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye
uniformemente en los dominios variables de anticuerpos. Se concentra
en tres segmentos denominados regiones determinantes de la
complementariedad (CDRs) o regiones hipervariables tanto en los
dominios de cadena ligera como en los de cadena pesada. Las
porciones altamente conservadas de los dominios variables se
denominan región de entramado (FR). Los dominios variables de las
cadenas ligera y pesada comprenden cada uno 4 regiones FR, que
adoptan de forma amplia una configuración de
hoja-\beta, conectadas por las CDRs, que forman
bucles de conexión y en algunos casos forman parte de, la estructura
en hoja-\beta. En cada cadena, las CDRs se
mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con
las CDRs de otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de
unión antigénico de los anticuerpos (véase Kabat y col., NIH Publ.
91-3242, vol. I, págs. 647-669
(1991). Los dominios constantes no están implicados indirectamente
en la unión de un anticuerpo con un antígeno, pero presentan
diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo
en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.
\newpage
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden
una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la unión al
antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de
fragmentos de anticuerpo incluyen el Fab, Fab',
F(ab')2 y fragmentos Fv; los diacuerpos, los anticuerpos lineales (Zapata y col., Protein Eng. 8(10):1057-1062 [1995]; las moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, y los anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpo.
F(ab')2 y fragmentos Fv; los diacuerpos, los anticuerpos lineales (Zapata y col., Protein Eng. 8(10):1057-1062 [1995]; las moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, y los anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpo.
La digestión con papaína de los anticuerpos
produce dos fragmentos de unión al antígeno, denominados fragmentos
"Fab", cada uno con un sitio de unión al antígeno y un
fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para
cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un
fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación
antigénicos y todavía es capaz de unirse de forma cruzada al
antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo
que contiene un sitio completo de reconocimiento antigénico y de
unión. Esta región consiste en un dímero de un dominio de cadena
variable ligera y un dominio de cadena variable pesada en estrecha
asociación no-covalente. Es en esta configuración
que las tres CDRs de cada dominio variable interactúan para definir
un sitio de unión antigénico en la superficie del dímero
VH-VL. En conjunto, las seis CDRs confieren
especificidad de unión antigénica al anticuerpo. Sin embargo,
incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende
sólo tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad de
reconocer y unir el antígeno, aunque a una afinidad inferior que el
sitio de unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de
cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab por
la adición de unos pocos residuos en el extremo
carboxi-terminal del dominio CH1 de cadena pesada
incluyendo una o más cisternas de la región bisagra del anticuerpo.
Fab'-SH es la denominación para Fab' en la que el
residuo(s) cisterna de los dominios constantes contiene un
grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se
produjeron originalmente como parejas de fragmentos Fab' que tienen
cisternas bisagra entre ellos. También se conocen otros
acoplamientos de fragmentos de anti-
cuerpo.
cuerpo.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados puede
asignarse a uno de los dos tipos claramente distintos, denominados
Kappa (\kappa) y lambda (\lambda), basados en la secuencia
aminoacídica de los dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia aminoacídica del
dominio constante de las cadenas pesadas, las inmunoglobulinas
pueden asignarse en diferentes clases. Existen 5 clases principales
de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y algunas de estas
pueden dividirse en subclases (isotipos), p.ej., IgG1, IgG2, IgG3,
IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que
corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se
denominan \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu,
respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las
configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de
inmunoglobulinas son bien conocidas en la materia.
El término "anticuerpo monoclonal" tal como
se utiliza aquí hace referencia a un anticuerpo obtenido de una
población de anticuerpos homogénea, es decir, los anticuerpos
individuales que comprenden la población son idénticos excepto para
posibles mutaciones que ocurren de forma natural y que pueden estar
poco representadas. Los anticuerpos monoclonales son altamente
específicos, siendo dirigidos contra un sitio antigénico único.
Además, al contrario que las preparaciones de anticuerpo
convencionales (policlonales) que incluyen típicamente anticuerpos
distintos dirigidos contra determinantes distintos (epitopos), cada
anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante del
antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales
presentan la ventaja que se sintetizan en cultivo de hibridomas, sin
contaminarse por otras inmunoglobulinas. El anticuerpo
"monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de
una población homogénea de anticuerpos, y sin que se deba considerar
que ello requiera la producción del anticuerpo por un procedimiento
determinado. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de
acuerdo con la presente invención pueden generarse por el
procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y
col., Nature, 256:495 [1975], o puede generarse por procedimientos
de tecnología del DNA recombinante (véase, p.ej., la patente
americana U.S. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales"
también pueden aislarse a partir de librerías de anticuerpos de
fagos utilizando las técnicas descritas en Clackson y col., Nature,
352:624-628 [1991] y Marks y col., J. Mol. Biol.,
222:581-597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales que se incluyen aquí
específicamente incluyen los antiucuerpos "quiméricos"
(inmunoglobulinas) en las que una porción de la cadena ligera y/o
pesada es idéntica con o homóloga a las secuencias correspondientes
en los anticuerpos derivados de especies particulares o
pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo determinado,
mientras que la cadena(s) restante es idéntica a u homóloga a
las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de
otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de
anticuerpos, así como los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre
que presenten la actividad biológica deseada (véase la patente
americana U.S. Nº 4.816.567; Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 81:56851-6855 [1984]).
Las formas "humanizadas" de los anticuerpos
no-humanos (p.ej., murinos) son inmunoglobulinas
quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de lo mismo
(como Fv, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión
antigénica) que contienen una secuencia mínima derivada de la
inmunoglobulina no-humana. Para la mayoría, los
anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpos
receptores) en los que se han reemplazado residuos de un CDR por
residuos de un CDR de especies no humanas como el ratón, la rata o
el conejo con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En
algunos casos, los residuos FvFR de la inmunoglobulina humana se
reemplazan por los residuos no-humanos
correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden
comprender residuos que no se hallan en el anticuerpo receptor ni en
las secuencias de entramado o CDR. Estas modificaciones se realizan
para perfeccionar y maximizar la realización del anticuerpo. En
general, el anticuerpo humanizado comprenderá por lo menos uno y
típicamente dos dominios variables, en los que todas o esencialmente
todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina
no-humana y todas o casi todas las regiones FR son
las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo
humanizado también comprenderá de forma óptima al menos una porción
de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de
una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones y
col., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann y col.,
Nature, 332.323-329 [1988]; y Presta, Curr. Op.
Struct. Biol., 2:593-596 (1992). El anticuerpo
humanizado incluye un anticuerpo PRIMATIZED^{TM} en donde la
región de unión antigénica del anticuerpo deriva de un anticuerpo
producido mediante inmunización de monos macacos con el antígeno de
interés.
Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena
sencilla" o "sFv" que comprende los dominios VH y VL del
anticuerpo, en donde estos dominios están presente en una única
cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende
además un engarce polipeptídico entre los dominios VH y VL que
permite que sFV forme la estructura deseada para la unión
antigénica. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en The
Pharmacology of Monoclonals Antibodies, vol. 113, Rosenber y Moore
eds., Springer-Verlag, Nueva Cork, pág.
269-315 (1994).
El término "diacuerpos" hace referencia a
fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión
antigénica, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de
cadena pesada (VH) conectado a un dominio de cadena ligera (VL) en
la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante la
utilización de un engarce que es demasiado corto para permitir el
apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios
son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra
cadena y crear dos sitios de unión antigénica. Los diacuerpos se
describen más completamente en, por ejemplo, las patentes EP
404.097, WO 93/11161 y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:6444-6448 (1993).
Un "anticuerpo aislado" es uno que se ha
identificado y separado y/o recuperado de un componente de su
entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural
son materiales que pueden interferir con las utilizaciones
diagnósticas o terapéuticas del anticuerpo y pueden incluir enzimas,
hormonas y otros solutos proteicos o no. En realizaciones
preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a una pureza superior al
95% en peso del anticuerpo según se determina por el procedimiento
de Lowry, y más preferentemente superior al 99% en peso, (2) a un
grado suficiente como para obtener al menos 15 residuos de la
secuencia aminoacídica N-terminal o la interna
utilizando un secuenciador spinning cup, o (3) a homogeneidad
mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no
reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente tinción
de plata, el anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ
dentro de las células recombinantes ya que al menos un componente
del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Generalmente,
sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos
una etapa de purificación.
El término "marcaje" cuando se utiliza aquí
hace referencia a un compuesto o composición detectable que se
conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo de modo que se
genera un anticuerpo "marcado". El marcaje puede ser detectable
por él mismo (p.ej., marcajes radioisotópicos o marcajes
fluorescentes) o, en el caso de un marcaje enzimático, puede
catalizar la alteración química de un compuesto sustrato o
composición que sea detectable.
Por "fase sólida" se hace referencia a una
matriz no acuosa con la que el anticuerpo de la presente invención
puede adherirse. Ejemplos de fases sólida abarcados aquí incluyen
los formados parcial o completamente de vidrio (p.ej., vidrio de
poro controlado), polisacáridos (p.ej., azarosa), poliacrilamidas,
poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En ciertas
realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede
comprender el pocillo de la placa de ensayo; en otras es una columna
de purificación (p.ej., una columna de cromatografía). Este término
también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas,
como las descritas en la patente americana U.S. 4.275.149.
Un "liposoma" es una vesícula pequeña
compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o
tensoactivos que es útil para la liberación de un fármaco (como un
polipéptido CT-1 o un anticuerpo de lo mismo y,
opcionalmente, un agente quimioterapéutico) en un mamífero. Los
componentes del liposoma están normalmente distribuidos en una
formación en bicapa, similar a al de las membranas biológicas.
Tal como se utilizó aquí, el término
"inmunoadhesinas" denomina las moléculas similares al
anticuerpo que combinan la especificidad de unión de una proteína
heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los
dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las
inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia aminoacídica
con la especificidad de unión deseada que es distinta a la de
reconocimiento antigénico y al sitio de unión de un anticuerpo (es
decir, es "heteróloga") y una secuencia de dominio constante de
inmunoglobulina. La parte de la adhesina de una molécula de
inmunoadhesina es una secuencia de dominio constante típicamente es
una secuencia aminoacídica que comprende al menos un sitio de unión
de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constante de
inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de una
inmunoglobulina, como los subtipos IgG-1,
IgG-2, IgG-3 o
IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1,
IgA-2), IgE, IgD o IgM.
Se describen los procedimientos para la
utilización del DNA58125 que codifican CT-1 para la
producción de compuestos que inhiben el crecimiento neoplásico así
como la preparación de procedimientos para la identificación de
compuestos inhibidores del crecimiento (p.ej., de los compuestos
tumorales). En particular, los cDNAs que codifican ciertos
polipéptidos CT-1. Para simplificar, en la presente
invención, las proteínas codificadas por el ácido nucleico
denominado DNA58125, así como todas las homólogas nativas y
variantes incluidas en la definición anterior de polipéptido
CT-1, serán referidas como polipéptido
"CT-1", independientemente de su origen o modo
de expresión.
La descripción de más adelante hace referencia
principalmente a la producción de polipéptidos CT-1
mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas con un
vector que contiene el ácido nucleico CT-1. Desde
luego, se contempla que los procedimientos alternativos, que son
bien conocidos en la materia, puedan ser utilizados para preparar
los polipéptidos CT-1. Por ejemplo, la secuencia del
polipéptido CT-1, o las porciones de lo mismo,
pueden producirse mediante síntesis peptídico directa utilizando
técnicas de fase sólida [véase, p.ej., Stewart y col.,
Solid-Phase Peptide Síntesis, W.H., Freeman co., San
Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,
85:2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in
Vitro puede realizarse utilizando técnicas manuales o mediante
automatización. Las síntesis automática puede lograrse, por ejemplo,
utilizando el sintetizador Applied Biosystems Peptide Synthesizer
(Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Diversas
porciones del polipéptido CT-1 pueden sintetizarse
químicamente por separado o combinadas utilizando procedimientos
químicos o enzimáticos para producir el CT-1 de
tamaño completo.
El DNA que codifica CT-1,
homólogos, variantes o porciones de lo mismo, puede producirse
mediante síntesis de DNA directa por técnicas de síntesis de ácido
nucleico estándares [véase, p.ej., Gait, M.J. Oligonucleotide
Síntesis, IRL Press Oxford, 1984]. La síntesis de DNA in
Vitro puede realizarse utilizando técnicas manuales o
automatizadas. La síntesis de oligonucleótidos automatizada puede
lograrse, por ejemplo, utilizando técnicas estándares. Diversas
porciones del CT-1 que codifican la secuencia de
ácido nucleico pueden sintetizarse químicamente por separado y
combinarse mediante procedimientos químicos o enzimáticos para
producir la secuencia codificante CT-1 de tamaño
completo.
Alternativamente, el DNA codificante
CT-1 puede obtenerse a partir de una librería de
cDNA preparada a partir de tejido que probablemente presenta el mRNA
de CT-1 y expresarlo a un nivel detectable. Según
ello, el DNA de CT-1 humano puede obtenerse de forma
adecuada a partir de una librería de cDNA preparada de tejido
humano, tal como se describe en los ejemplos. El gen codificante de
CT-1 también puede obtenerse de una librería
genómica o mediante síntesis oligonucleotídica.
Las librerías pueden rastrearse con sondas (como
los anticuerpos contra el polipéptido CT-1, o los
oligonucleótidos de al menos 20-80 bases) diseñadas
para identificar el gen de interés o la proteína codificada por
éste. El rastreo del cDNA o la librería genómica con la sonda
seleccionada puede realizarse utilizando procedimientos estándares
como los descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (New Cork: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989). Un procedimiento alternativo para aislar el gen que codifica
CT-1 consiste en utilizar metodología de la PCR
[Sambrook y col., supra; Dieffenbach y col., PCR Primer; A
Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Los ejemplos de más adelante describen técnicas
para el rastreo de una librería de cDNA. Las secuencias
nucleotídicas seleccionadas como sondas deberían ser de tamaño
suficiente y lo suficientemente no ambiguas como para minimizar los
falsos positivos. El oligonucleótido está marcado preferentemente de
modo que puede detectarse tras hibridación con el DNA en la librería
que se rastrea. Los procedimientos de marcaje son bien conocidos en
la materia e incluyen la utilización de radiomarcajes como el ATP
con P^{32}, la biotinilación o el marcaje enzimático. Las
condiciones de hibridación, incluyendo la astringencia moderada y
elevada se proporcionan en Sambrook y col., supra.
Las secuencias identificadas en dichos
procedimientos de rastreo de librerías pueden compararse y alinearse
con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en las
bases de datos públicas como el GenBank u otras bases de datos de
secuencias privadas. La identidad de secuencias (a nivel
aminoacídico o nucleotídico) dentro de las regiones definidas de las
molécula o a lo largo de toda la secuencia pueden determinarse
mediante alineamiento de secuencias utilizando programas de
informáticos como ALIGN, Enastar e INHERIT que utilizan diversos
algoritmos para cuantificar la homología.
El ácido nucleico de secuencia codificante para
proteína se puede obtener mediante cribado seleccionado de librerías
de cDNA o genómicas utilizando la secuencia aminoacídica descrita
aquí por primera vez, y, si es necesario, utilizando procedimientos
de extensión de cebador tal como se describe en Sambrook y col.,
supra, para detectar precursores y productos intermedios de
procesamiento de mRNA que puede que no se hayan
retro-transcrito a cDNA.
Las células huésped se transfectan o transforman
con los vectores de expresión o clonaje descritos aquí para la
producción de CT-1 y se cultivan en medio nutritivo
convencional adecuado para la inducción de promotores, la selección
de transformantes o la amplificación de genes que codifican las
secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, como el medio, la
temperatura, el pH y otros, pueden seleccionarse por el artesano en
la materia sin demasiada experimentación. En general, los
principios, protocolos y técnicas prácticas para la maximización de
la productividad de los cultivos celulares puede hallarse en
Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed.
(IRL Press, 1991) y Sambrook y col., supra.
Los procedimientos de transfección son conocidos
por los expertos en la materia, por ejemplo, el procedimiento del
CaPO_{4} y la electroporación. Dependiendo de la célula huésped
utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas
estándares adecuadas para dichas células. El tratamiento con calcio
que utiliza cloruro cálcico, tal como se describe en Sambrook y
col., supra, o la electroporación se utiliza generalmente
para procariotas u otras células que contengan barreras importantes
de pared celular. La infección con Agrabacterium tumefaciens
se utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, tal
como se describe por Shaw y col., Gene, 23:315 (1983) y la patente
internacional WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para
células de mamífero sin dicha pared celular, puede utilizarse la
precipitación con fosfato cálcico de Gram. y van der Eb, Virology,
52:456-457(1978). Los aspectos generales de
las transformaciones del sistema de células huésped se han descrito
en la patente americana U.S. 4.399.216. Las transformaciones en
levaduras se llevan a cabo típicamente de acuerdo con el
procedimiento de Van Solingen y col., J. Bact. 130:946 (1977) y
Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 76:3829 (1979). Sin
embargo, también pueden utilizarse otros procedimientos como la
microinyección nuclear, la electroporación, la fusión de
protoplastos bacterianos con células intactas, o los policationes,
p.ej., el polibreno, la poliornitina. Para diversas técnicas de
transformación de células de mamífero, véase Keown y col., Methods
in Enzymology, 185:527-537 (1980) y Mansour y col.,
Nature, 336:348-352 (1988).
Las células huésped adecuadas para el clonaje o
la expresión del DNA en los vectores aquí incluidos incluyen las
procariotas, levaduras o las eucariotas. Las procariotas adecuadas
incluyen, pero no se limitan a, eubacterias, como los organismos
Gram-negativos o Gram-positivos, por
ejemplo. Las Enterobacterias como E. coli, de quien existen
diversas cepas disponibles públicamente como la cepa E. coli
K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537), E,
coli W3110 (ATCC 27.325) y K2772 (ATCC 53.635).
Además de las células procariotas, también son
adecuados como huéspedes de clonaje o expresión los microbios
eucariotas como los hongos o levaduras para vectores codificantes de
CT-1. Saccharomyces cerevisiae es un
microorganismo huésped eucariota inferior utilizado comúnmente.
Las células huésped adecuadas para la expresión
de CT-1 glicosilado derivan de organismos
multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen
células de insectos como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como
células vegetales. Ejemplos de líneas de células huésped de mamífero
de utilidad incluyen las células de ovario de hámster Chino (CHO) y
las células COS. Ejemplos más específicos incluyen la línea CV1 de
riñón de mono transformada por SV40 (CO-7, ATCC CRL
1651); la línea de riñón embrional humano (células 293 o 293
subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Gram. y
col., J. Gen. Virol., 36:59 (1977)); TM4, células de ovario de
hámster/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol.
Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmón
humano (W138, ATCC, CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB
8065); y tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La
selección de la célula huésped adecuada dependerá del experto en la
materia.
El ácido nucleico (p.ej., cDNA o DNA genómico)
que codifica CT-1 puede insertarse en un vector
replicable para el clonaje (amplificación del DNA) o para la
expresión. Diversos vectores están disponibles públicamente. El
vector puede, por ejemplo, hallarse en forma de un plásmido,
cósmico, partícula vírica o fago. La secuencia de ácido nucleico
puede insertarse en el vector mediante diversos procedimientos. En
general, el DNA se inserta en una diana(s)
de endonucleasa de restricción adecuada utilizando técnicas conocidas en la materia. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, una o más de una secuencia de finalización de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más componentes utiliza técnicas de ligación estándar que son conocidas por el experto en la materia.
de endonucleasa de restricción adecuada utilizando técnicas conocidas en la materia. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, una o más de una secuencia de finalización de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más componentes utiliza técnicas de ligación estándar que son conocidas por el experto en la materia.
El polipéptido CT-1 puede
producirse de forma recombinante no sólo directa, sino también como
un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede
tener una secuencia señal u otro polipéptidos con una diana de corte
específica en el extremo N-terminal de la proteína
madura o polipéptido. En general, la secuencia señal puede ser un
componente del vector, o puede ser una parte del DNA que codifica
CT-1 que se inserta en el vector. Las secuencia
señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por
ejemplo, de entre el grupo de la fosfatasa alcalina, la
penicilinasa, 1pp, o los líderes de la enterotoxina II estable al
calor. Para la secreción en levaduras, las secuencia señal puede
ser, p.ej., el líder de la invertasa de levaduras, el líder del
factor alfa (incluyendo los líderes del
factor-\alpha de Saccharomyces y
Kluyveromyces, que se describieron posteriormente en la
patente americana U.S. 5.010.182), o el líder de la fosfatasa, el
líder de la glucoamilasa de C. albicans (patente europea EP
362.179, publicada el 4 de Abril de 1990), o la secuencia señal
descrita en la patente internacional WO 90/13646 publicada el 15 de
noviembre de 1990. En la expresión células de mamífero, las
secuencias señal de mamífero puede utilizarse para la secreción
directa de la proteína, como las secuencias señal de los
polipéptidos secretados de la misma especie o relacionadas, así como
los líderes secretores virales.
Tanto los vectores de expresión como los de
clonaje contienen una secuencia de ácido nucleico que permite la
replicación del vector en una o más células huésped seleccionadas.
Dichas secuencias son bien conocidas para diversas bacterias,
levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es
adecuado para las bacterias Gram-negativo, el origen
del plásmido 2\mu es adecuado para levaduras y diversos origenes
virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son de utilidad para
los vectores de clonaje en células de mamífero.
Los vectores de expresión y clonaje contendrán
típicamente un gen de selección, también denominado un marcador
seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas
que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p.ej.,
ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) deficiencias
autotróficas del complemento, o (c) suministrar nutrientes críticos
procedentes del medio complejo, p.ej., el gen que codifica la
racemasa D-alanina de Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccinables adecuados
para células de mamífero son los que permiten la identificación de
células competentes para incorporar el ácido nucleico que codifica
CT-1, como las células DHFR o la timidita quinasa.
Una célula huésped adecuada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje
es la línea de células CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y
propagada tal como se describió por Urlaub y col., Proc. Nat. Acad.
Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para utilizar
en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levaduras
YRp7 [Stinchcomb y col., Nature, 282:39 (1979); Kingsman y col.,
Gene, 7:141 (1979); Tschemper y col., Gene, 10:157 (1980)]. El gen
trp1 proporciona un marcador seleccionable para una cepa mutante de
levaduras carentes de la capacidad para crecer con triptófano, por
ejemplo, ATCC 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12
(1977)].
Los vectores de expresión y clonaje contienen
generalmente un promotor unido operativamente a la secuencia de
ácido nucleico que codifica CT-1 para dirigir la
síntesis de mRNA. Los promotores reconocidos por diversas células
huésped potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados
para su utilización con huéspedes procariotas incluyen los sistemas
de promotores de la \beta-lactamasa y de la
lactosa [Chang y col., Nature 275:615 (1978); Goeddel y col.,
Nature, 281:544 (1979)], la fosfatasa alcalina, un sistema de
promotor del triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057
(1980); patente europea EP 36.776] y promotores híbridos como el
promotor tac [deBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
80:21-25 (1983)]. Los promotores para utilizar en
sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de
Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al DNA
que codifica CT-1.
Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para
la utilización con huésped de levaduras incluyen los promotores para
la 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman y col., J.
Biol. Chem., 255:2073 (1980)], u otras enzimas glicolíticas [Hess y
col., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry,
17:4900 (1978)], como la enolasa, la
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenada, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la
fosfofructoquinasa, la
glucosa-6-fosfato isomerasa, la
3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la
triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la
glucoquinasa.
Otros promotores que son inducibles presentan la
ventaja adicional de una transcripción controlada por las
condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la
alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas
de degradación asociadas con el metabolismo del nitrógeno, la
metalotioneína, la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de la
maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para
utilizar en la expresión en levaduras se describen además en la
patente europea EP 73.657.
La transcripción de CT-1 de
vectores en células huésped de mamífero se controla, por ejemplo,
por los promotores obtenidos de genomas de virus como el virus del
polioma, el virus de la viruela aviar (patente inglesa UK 2.211.504,
publicada el 5 de julio 1989), adenovirus (como el adenovirus 2), el
virus del papiloma aviar, el virus del sarcoma aviar, el
citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el
Virus Simian 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos,
p.ej., el promotor de la actina o de una inmunoglobulina, y por
promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean
compatibles con los sistemas de células huésped.
La transcripción de un DNA que codifica un
polipéptido CT-1 por eucariotas superiores puede
incrementarse insertando una secuencia intensificadora en el vector.
Los intensificadores son elementos que actúan en cis del DNA,
generalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un
promotor para aumentar su transcripción. Actualmente, se conocen
muchas secuencias intensificadoras de mamíferos (globina, elastasa,
albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina).
Generalmente, sin embargo, se utilizará un intensificador de un
virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el intensificador
de SV40 en el sitio tardío del origen de replicación (pb de
100-270), el intensificador del promotor temprano de
citomegalovirus, el intensificador del polioma en el sitio tardío
del origen de replicación y los intensificadores de adenovirus. El
intensificador puede ayustarse en el vector en una posición 5' o 3'
de la secuencia codificante de CT-1, pero
preferentemente se localiza en 5' del promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células
huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales y
humanos, o células nucleadas de otros organismos mulicelulares)
también contendrán secuencias necesarias para la finalización de la
transcripción y para la estabilización del mRNA. Dichas secuencias
se localizan normalmente en las regiones no transcritas en el
extremo 5' y, ocasionalmente del extremo 3', de los DNAs o cDNAs
eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos
nucleotídicos transcritos como fragmentos de poliadenilación en la
porción no traducida del mRNA que codifica CT-1.
Otros procedimientos, vectores y células huésped
adecuados para la adaptación a la síntesis de CT-1
en el cultivo de células recombinantes de vertebrados se describen
en Gething y col., Nature, 293:620-625 (1981);
Mantei y col., Nature, 281:40-46 (1979); patentes
europeas EP 117.060 y EP 117.058.
La amplificación y/o la expresión puede
cuantificarse directamente en una muestra, por ejemplo, mediante
transferencia convencional de Southern, transferencia de Northern
para cuantificar la transcripción del mRNA [Thomas, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)], transferencia
de mancha (análisis de DNA), o hibridación in situ,
utilizando una sonda de marcada adecuadamente, basada en las
secuencias que aquí se proporcionan. Alternativamente, se pueden
utilizar anticuerpos que pueden reconocer dúplexs de
DNA-proteína. Los anticuerpos a su vez, pueden
marcarse y el ensayo puede llevarse a cabo si el dúplex se une a una
superficie, de modo que tras la formación del dúplex en la
superficie, se puede detectar la presencia del anticuerpo unido al
dúplex.
La expresión génica, alternativamente, se puede
cuantificar por procedimientos inmunológicos, como la tinción
inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y realizar el
ensayo del cultivo celular o de fluidos corporales, para cuantificar
directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos de
utilidad para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de
muestras de fluido pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden
prepararse en cualquier mamífero. De forma conveniente, los
anticuerpos pueden prepararse contra una secuencia nativa del
polipéptido CT-1 o contra un péptido sintético
basado en las secuencias de DNA proporcionadas aquí o contra una
secuencia exógena fusionada al DNA de CT-1 y que
codifica un etpitopo de anticuerpo específico.
Las formas de polipéptidos CT-1
pueden recuperarse del medio de cultivo o de lisados de células
huésped. Si las formas unidas a membrana pueden liberarse con una
solución de detergente (p.ej., Triton X-100) o
mediante corte enzimático. Las células utilizadas en la expresión de
CT-1 pueden romperse mediante medios físicos o
mecánicos, como ciclos repetidos de
congelación-descongelación, rotura mecánica o
agentes de lisis.
Puede ser deseable purificar CT-1
de proteínas de células o polipéptidos recombinantes. Los siguientes
procedimientos son un ejemplo de los procedimientos de purificación
adecuados: por fraccionamiento en una columna de intercambio iónico,
precipitación por etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en
sílice o en una resina de intercambio catiónico como el DEAE;
cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con sulfato
amónico, filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex
G-75, columnas de proteína
A-Sepharose para eliminar los contaminantes como la
IgG, y columnas quelantes de metal para unir las formas etiquetadas
del epitopo de los polipéptidos CT-1. Diversos
procedimientos de purificación de proteína pueden utilizarse y
dichos procedimientos son conocidos en la materia y se describen en
el ejemplo de Deuscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes,
Protein Purification, Principles and Practice,
Springe-Verlag, New York (1982). Las etapas de
purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, en la naturaleza
del proceso de producción utilizado y en particular del polipéptido
CT-1 producido.
La presente invención se basa en la
identificación y caracterización de genes que están amplificados en
ciertas células cancerosas.
El genoma de organismos procariotas y eucariotas
está sometido a dos requerimientos aparentemente conflictivos. Uno
es la conservación y propagación de la información genética en su
forma original, para garantizar la herencia estable a lo largo de
múltiples generaciones. Por otra parte, las células o los organismos
deben ser capaces de adaptarse a cambios ambientales de larga
duración. Los mecanismos adaptativos pueden incluir modificaciones
cualitativas o cuantitativas del material genético. Las
modificaciones cualitativas incluyen las mutaciones del DNA, en
donde dichas secuencias codificantes están alteradas dando como
resultado una proteína distinta estructural y/o funcionalmente. La
amplificación génica es una modificación cuantitativa, por lo que el
número actual de secuencia codificante completa, es decir un gen,
aumenta, conduciendo a un número aumentado de moldes disponiblees
para la transcripción, un número aumentado de transcritos
traducibles y, últimamente, a una gran abundancia de la proteína
codificada por el gen amplificado.
El fenómeno de la amplificación génica y sus
mecanismos subyacentes se han investigado in vitro en varios
sistemas de células eucariotas y procariotas en cultivo. El ejemplo
mejor caracterizado de la amplificación génica implica el cultivo de
células eucariotas en medio que contiene concentraciones variables
del fármaco citotóxico metrotexato (MTX). Durante la exposición
inicial a concentraciones bajas de MTX, muchas células (>99,9%)
morirán. Un pequeño número de células sobrevive, y son capaces de
crecer en concentraciones aumentadas de MTX al producir grandes
cantidades de DHFR-RNA y proteína. La base de esta
sobre-producción es la amplificación el gen único
DHFR. Las copias adicionales de este gen se hallan como copias
extracromosómicas en la forma de pequeños cromosomas supernumerarios
(doble minutos) o como copias de cromosomas integrados.
La amplificación génica se halla más
frecuentemente en el desarrollo de resistencia a fármacos
citotóxicos (antibióticos para bacterias y agentes
quimioterapéuticos para células eucariotas) y transformación
neoplásica. La transformación de una célula eucariota como un suceso
espontáneo o debido a una agresión viral o química/ambiental se
asocia típicamente con los cambios en el material genético de la
célula. Uno de los cambios más comunes observados en los procesos
malignos son las mutaciones de la proteína p53. La proteína p53
controla la transición de las células desde la fase estacionaria
(G1) a la replicativa (S) del ciclo celular y previene esta
transición en presencia de lesiones del DNA. En otras palabras, una
de las principales consecuencias de las mutaciones invalidantes de
p53 es la acumulación y propagación de lesiones del DNA, es decir,
cambios genéticos. Los tipos comunes de los cambios genéticos en las
células neoplásicas son, además de las mutaciones puntuales, la
amplificación y grandes alteraciones estructurales, como las
translocaciones.
La amplificación de las secuencias de DNA puede
ser una indicación de la necesidad de requerimientos funcionales
específicos tal como se demuestra en el sistema experimental DHFR.
En consecuencia, la amplificación de ciertos oncogenes en los
procesos malignos apunta hacia un papel causal de estos genes en el
proceso de la transformación maligna y el mantenimiento del fenotipo
transformado. Esta hipótesis ha ganado adeptos en estudios
recientes. Por ejemplo, la proteína bcl-2 se halló
amplificada en ciertos tipos de linfomas de
no-Hogdkin. Esta proteína inhibe la apoptosis y
conduce a la acumulación progresiva de células neoplásicas. Los
miembros de la familia de genes de los receptores del factor de
crecimiento se amplifican en diversos tipos de cánceres, lo que
sugiere que la sobre-expresión de estos receptores
puede generar células neoplásicas con menor susceptibilidad a
cantidades limitantes del factor de crecimiento disponible. Ejemplos
incluyen la amplificación del receptor del andrógeno en el cáncer de
próstata recurrente durante la terapia de deprivación y la
amplificación de ERB2 homólogo del receptor del factor de
crecimiento en el cáncer de mama. Por último, los genes implicados
en la señalización intracelular y el control de la progresión del
ciclo celular puede experimentar amplificación durante la
transformación maligna. Ello se ilustra por la amplificación de los
genes blc-I y ras en diversos neoplasmas epiteliales
y linfoides.
Estos estudios previos muestran la viabilidad de
identificación de las secuencias de DNA amplificadas en los
neoplasmas, ya que esta aproximación puede identificar genes
importantes para la transformación maligna. El caso de ERB2 también
demuestra la viabilidad desde un punto de vista terapéutico, ya que
las proteínas transformantes pueden representar dianas nuevas y
específicas para la terapia tumoral.
Se pueden utilizar diferentes técnicas para
demostrar la amplificación de secuencias genómicas. Las regiones
genómicas amplificadas pueden visualizarse, si implican grandes
regiones con elevado número de copias o están presentes como
material extracromosómico. Mientras que la citogenética fue la
primera técnica para demostrar la asociación consistente de cambios
cromosómicos específicos con neoplasmas particulares, es inadecuada
para la identificación y aislamiento de las secuencias de DNA
manejables. La técnica desarrollada más recientemente de la
hibridación genómica comparativa (CGH) demuestra la generalización
de este fenómeno de amplificación genómica en neoplasmas. El DNA
tumoral y el DNA normal se hibridan simultáneamente en las metafases
de células normales y a continuación se rastrea el genoma completo
mediante análisis de imagen para las secuencias de DNA que están
presentes en el tumor a una frecuencia aumentada (WO 93/18, 186;
Gray y col., Radiation Res. 137, 275-289 [1994]).
Como procedimiento de rastreo, este tipo de análisis ha demostrado
un gran número de amplicones recurrentes (como fragmento de DNA
amplificado) en diversos neoplasmas humanos. Aunque, CGH es más
sensible que el análisis de citogenética clásica para identificar
regiones de DNA, no permite una identificación rápida y aislamiento
de secuencias codificantes dentro del amplicón mediante técnicas
genéticas moleculares estándares.
Los procedimientos más sensibles para detectar la
amplificación génica son los ensayos basados en la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Estos ensayos utilizan una pequeña
cantidad de DNA tumoral como material de partida, son sensibles,
proporcionan DNA que se puede utilizar para posteriores análisis,
como la secuenciación y son adecuados para el análisis de
rendimiento de gran volumen.
Los ensayos mencionados anteriormente no son
mutuamente exclusivos, pero se utilizan frecuentemente en
combinación para identificar las amplificaciones en neoplasmas.
Mientras que el análisis citogenético y el CGH representan
procedimientos de cribado para inspeccionar el genoma completo y
detectar regiones amplificadas, los ensayos basados en la PCR son
más adecuados para la identificación de secuencias codificantes, es
decir genes en regiones amplificadas.
De acuerdo con la presente invención, dichos
genes se han identificado mediante PCR cuantitativa (S. Gelmini y
col., Clin. Chem., 43, 752 (1997)), comparando el DNA de diversos
tumores, incluyendo mama, pulmón, colon, próstata, cerebro, hígado,
riñón, páncreas, bazo, timo, testículos, ovario, útero, etc, tumores
o líneas de células tumorales, con DNA agrupado de donantes sanos.
La PCR cuantitativa se realizó utilizando instrumental Taqman (ABI).
Los cebadores específicos de los genes y las sondas fluorogénicas se
diseñaron según las secuencias codificantes de los DNAs.
Las líneas de carcinoma de pulmón incluyen A549
(SRCC768), Calu-1 (SRCC769), Calu-6
(SRCC770), H157 (SRCC771), H441 (SRCC772), H460 (SRCC774) y SW900
(SRCC775), disponibles de ATCC. Las células tumorales de pulmón
humano primario generalmente derivan de adenocarcinomas, carcinomas
de células escamosas, carcinomas de células grandes, carcinomas de
células no pequeñas, carcinomas de células pequeñas y carcinomas
bronco-alveolares, por ejemplo, SRCC725 (carcinoma
de células escamosas abreviado como "SqCCa"), SRCC725
(carcinoma de células no pequeñas, abreviado como "NSCCa"),
SRCC726 (adenocarcinoma abreviado como "AdenoCa"), SRCC727
(adenocarcinoma), SRCC731 (adenocarcinoma), SRCC732 (carcinoma de
células escamosas), SRCC733 (adenocarcinoma), SRCC734
(adenocarcinoma); SERCC735 (carcinoma
bronco-alveolar, abreviado como "BAC"), SRCC736
(carcinoma de células escamosas), SRCC738 (carcinoma de células
escamosas), SRCC739 (carcinoma de células escamosas), SRCC740
(carcinoma de células escamosas), SRCC740 (carcinoma de células de
pulmón, abreviado como "LCCa").
Las líneas celulares de cáncer de colon incluyen,
por ejemplo, las líneas celulares del ATCC Sw480 (adenocarcinoma
SRCC776), SW620 (metástasis de nódulo linfático de adenocarcinoma de
colon, SRCC777), COLO320 (adenocarcinoma, SRCC778); SHT29
(adenocarcinoma, SRCC779), HM7 (carcinoma, SRCC780), CaWiDr
(adenocarcinoma, srcc781), HCT116 (carcinoma, SRCC782), SKCOI
(adenocarcinoma, SRCC783), SW403 (adenocarcinoma, SRCC784), LS174T
(carcinoma, SRCC785), y HM7 (un variante altamente mucinosa de
adenocarcinoma de la línea de adenocarcinoma de colon ATCC LS 174T,
obtenida del Dr. Robert Warren, UCSF). Los tumores primarios de
colon incluyen los adenocarcinomas de colon denominados ColT2
(SRCC742), ColT3 (SRCC743), ColT8 (SRCC744), ColT10 (SRCC745),
ColT12 (SRCC746), ColT14 (SRCC747), ColT15 (SRCC748), ColT17
(SRCC750), ColT1 (SRCC751), ColT4 (SRCC753), ColT5 (SRCC753), ColT6
(SRCC754), ColT7 (SRCC755), ColT9 (SRCC756), ColT1 (SRCC757), ColT8
(SRCC758), y DcR3, BACrev, BACfwd, T160, y T159. Las líneas
celulares de adenocarcinoma de mama humano incluyen, por ejemplo,
HBL100 (SRCC759), MB435s (SRCC760), T47D (SRCC761), MB468 (SRCC762),
MB175(SRCC763), MB361 (SRCC764), BT20 (SRCC765), MCF7
(SRCC766), SKBR3 (SRCC767).
Los resultados de los ensayos de amplificación
pueden verificarse mediante estudios posteriores, como, por ejemplo,
determinación de la expresión de mRNA en diversos tejidos
humanos.
Tal como se indicó anteriormente, la expresión de
la amplificación génica y/o la expresión en diversos tejidos puede
cuantificarse mediante transferencia de Southern, transferencia de
Northern para cuantificar la transcripción del mRNA (Thomas, Proc.
Natl. Acad. Sci, USA, 77:5201-5205 (1980), la
transferencia de mancha (análisis de DNA), o la hibridación in
situ, utilizando una sonda marcada de forma adecuada, basada en
las secuencias que aquí se proporcionan. Alternativamente, los
anticuerpos pueden utilizarse para reconocer dúplex específicos,
incluyendo los dúplex de DNA, de RNA y los dúplex híbridos
DNA-RNA o DNA-proteína.
La expresión en diversos tejidos, puede
cuantificarse alternativamente mediante procedimientos
inmunológicos, como la tinción inmunohistoquímica de ls secciones de
tejido y el ensayo de cultivos celulares o de fluidos corporales,
para cuantificar directamente el producto de expresión génica. Los
anticuerpos de utilidad para la tinción de inmunohistoquímica y/o el
ensayo de muestras de fluido pueden ser mono o policlonales, y
pueden prepararse en cualquier mamífero. Los anticuerpos se pueden
preparar contra una secuencia nativa del polipéptido
CT-1 o contra un péptido sintético basado en las
secuencias de DNA que se proporcionan aquí o contra la secuencia
exógena fusionada con el DNA de CT-1 y que codifica
un epitopo de anticuerpo específico. Las técnicas generales para la
generación de anticuerpos, y en especial los protocoles para la
transferencia de Northern y la hibridación in situ se
proporcionan más adelante.
Si la amplificación de un gen dado es relevante
funcionalmente, entonces el gen debería amplificarse más allá de las
regiones genómicas vecinas que no son importantes para la
supervivencia del tumor. Para ello, el gen se puede mapear en un
cromosoma particular, p.ej., mediante análisis de híbridos de
radiación. El nivel de amplificación se determina entonces en la
localización determinada y en la región genómica vecina. La
amplificación selectiva o preferencial en la región genómica en la
que el gen se ha mapeado es consistente con la posibilidad de que la
amplificación génica observada promueva el crecimiento tumoral o la
supervivencia. El mapeo cromosómico incluye el mapeo de la región
enmarcada y el epicentro. Para detalles adicionales, véase por
ejemplo, Stewart y col., Genome Research, 7, 422-433
(1997).
Los resultados del estudio de amplificación
génica pueden verificarse posteriormente mediante estudios de unión
de anticuerpos, en los que se analizó la capacidad de los
anticuerpos anti-CT-1 para inhibir
el efecto de los polipéptidos CT-1 sobre las células
tumorales (cáncer). Ejemplos de anticuerpos incluyen los anticuerpos
policlonales, monoclonales, los biespecíficos humanizados y los
anticuerpos heteroconjugados, cuya preparación se describirá más
adelante.
Los estudios de unión pueden llevarse a cabo
mediante cualquier procedimiento de ensayo conocido, como los
ensayos de unión competitivos, ensayos sánwich directos e indirectos
y los ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A
Manual of Techniques, pág. 147-158 (CRC Press, Inc.
1987).
Los ensayos de unión competitiva se basan en la
capacidad de un estándar marcado para competir con el analito de la
muestra a analizar su unión con una cantidad limitada de anticuerpo.
La cantidad de la proteína diana (codificada por un gen amplificado
en una célula tumoral) en la muestra a analizar es inversamente
proporcional a la cantidad de estándar que se une a los anticuerpos.
Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se
une, los anticuerpos están preferentemente insolubilizados antes o
después de la competición, de modo que el estándar y el analito
unidos al anticuerpo pueden separarse del estándar y analito que
permanecen sin unir.
Los ensayos sándwich implican la utilización de
dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción
inmunogénica, o epitopo, distinta de la proteína a detectar. En un
ensayo sándwich, el analito de la muestra a analizar se une por un
primer anticuerpo que se inmoviliza en un soporte sólido y a
continuación, se une un segundo anticuerpo al analito, formándose un
complejo insoluble de tres partes. Véase, p.ej., la patente
americana U.S. 4.376.110. El segundo anticuerpo puede marcarse con
una porción detectable (ensayos de sándwich directos) o puede
cuantificarse utilizando un anticuerpo
anti-inmunoglobulina que se marca con una porción
detectable (ensayo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de
ensayo sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso la porción
detectable es una enzima.
Para la inmunohistoquímica, la muestra de tumor
puede ser fresca o congelada o puede estar embebida en parafina y
fijada con un conservante como la formalina, por ejemplo.
Los ensayos con células y modelos animales
(p.ej., cánceres) pueden utilizarse para verificar los hallazgos de
la amplificación génica, y comprender posteriormente la relación
entre los genes identificados aquí y el desarrollo y patogénesis del
crecimiento de las células neoplásicas. El papel de los productos
génicos identificados aquí en el desarrollo y patología del tumor o
del cáncer pueden analizarse utilizando células tumorales primarias
o líneas celulares en donde se ha identificado la amplificación de
dichos genes. Dichas células incluyen, por ejemplo, las células y
las líneas celulares de mama, colon y pulmón citadas
anteriormente.
En una aproximación distinta, las células de un
tipo celular conocido por estar implicado en un tumor particular se
transfectan con los cDNAs de la presente invención, y se analiza la
capacidad de estos cDNAs para inducir el crecimiento excesivo. Las
células adecuadas incluyen, por ejemplo, líneas celulares tumorales
estables como la línea celular
B104-1-1 (línea celular
NIH-3T3 transfectada con el
proto-oncogen neu) y las células
NIH-3T3 transfectadas con ras, que pueden
transfectarse con el gen deseado y controlarse su crecimiento
tumorigénico. Dichas líneas celulares transfectadas que pueden
utilizarse para analizar la capacidad de los anticuerpos poli- o
monoclonales o las composiciones de anticuerpos para inhibir el
crecimiento de células tumorigénicas al aplicar una actividad
citostática o citotóxica sobre el crecimiento de las células
transformadas, o mediante la citotoxicidad celular dependiente de
anticuerpo (ADCC). Las células transfectadas con las secuencias
codificantes de los genes identificados aquí pueden utilizarse
posteriormente para identificar los fármacos candidatos para el
tratamiento del cáncer.
Además, los cultivos primarios derivados de
tumores en animales transgénicos (tal como se describe más adelante)
pueden utilizarse en ensayos celulares, aunque las líneas celulares
estables son las preferidas. Las técnicas para derivar líneas
celulares continuas de animales transgénicos son bien conocidas en
la materia (véase, p.ej., Small y col., Mol. Cell. Biol. 5, 642:648
(1985).
Se pueden utilizar diversos modelos animales para
comprender mejor el papel de estos genes identificados aquí en el
desarrollo y patogénesis del tumor y para analizar la eficacia de
los agentes terapéuticos, incluyendo los anticuerpos, y otros
antagonistas de los polipéptidos nativos, incluyendo antagonistas de
moléculas pequeñas. La naturaleza in vivo de dichos
modelos facilita la predicción de las respuestas en pacientes
humanos. Los modelos animales de tumores y cánceres (p.ej., cáncer
de mama, de colon, de próstata, de pulmón, etc.) incluyen animales
no-recombinantes y recombinantes (transgénicos). Los
modelos animales no-recombinantes incluyen, por
ejemplo, los roedores, p.ej. modelos murinos. Dichos modelos pueden
generarse introduciendo células tumorales en los ratones singénicos
utilizando técnicas estándares, p.ej., inyección subcutánea,
inyección de la vena de la cola, implantación del bazo, implantación
intraperitoneal, implantación bajo la cápsula renal o la
implantación orthopin, p.ej., las células de cáncer de colon
implantadas en el tejido colónico (véase, p.ej., la patente
internacional WO 97/33551, publicada el 18 de setiembre de
1997).
Probablemente, las especies animales más
utilizadas en estudios oncológicos son los ratones inmunodeficientes
y, en particular, los ratones nude. La observación de que los
ratones nude con hipo/aplasia podrían actuar
satisfactoriamente como un huésped para tumores humanos xenógrafos
ha conducido a su amplia utilización para estos propósitos. El gen
nu autosómico recesivo se ha introducido en un gran número de cepas
congénitas de ratones nude, incluyendo, por ejemplo, ASW, A/He, AKR,
BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR,
NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII y SJL. Además, se han criado una
gran variedad de otros animales con defectos inmunológicos
hereditarios distintos a los ratones nude y se han utilizado como
receptores de xenógrafos tumorales. Para más detalles, véase, p.ej.,
The Nude Mouse in Oncology Research, E. Bowen y B. Winograd, eds.,
CRC Press, Inc., 1991.
Las células introducidas en dichos animales
pueden derivarse de líneas celulares de tumor/cáncer, como por
ejemplo, cualquiera de las líneas de células tumorales aquí citadas,
y, por ejemplo, la línea celular
B104-1-1 (línea celular
NIH-3T3 estable transfectada con el
proto-oncogen neu); las células
NIH-3T3 transfectadas con ras;
Caco-2 (ATCC HTB-37); una línea
celular de adenocarcinoma de colon humano de grado II moderadamente
bien diferenciada, HT-29 (ATCC
HTB-38), o de tumores o cánceres. Las muestras de
tumores o células cancerosas pueden obtenerse de pacientes sometidos
a cirugía, utilizando condiciones estándares, implicando congelación
y almacenamiento en nitrógeno líquido (karmali y col., Br. J. Cancer
48, 689-696 (1983)).
Las células tumorales se pueden introducir en
animales, como los ratones nude, mediante diversos procedimientos.
El espacio subcutáneo (s.c.) en los ratones e muy adecuado para la
implantación animal. Los tumores pueden transplantarse s.c. como
bloques sólidos, como biopsias inyectables con jeringas utilizando
una troca, o una suspensión celular. Para la implantación de un
bloque sólido o troca, los fragmentos de tejido tumoral del tamaño
adecuado pueden introducirse en el espacio s.c. Las suspensiones
celulares se preparan al momento de los tumores primarios o de
líneas celulares de tumor y se inyectan subcutáneamente. Las células
tumorales también pueden inyectarse como implantes subdérmicos. En
esta localización, el inóculo se deposita entre la parte más
inferior del tejido conectivo y el tejido s.c. Boven y Winegrad
(1991), supra.
Los modelos animales de cáncer de mama pueden
generarse, por ejemplo, mediante implantación de células de
neuroblastoma de rata (de quienes se aisló incialmente el oncogen
neu), o células NIH-3T3 transformadas con neu en
ratones nude, esencialmente tal como se describió por Drebin y col.,
PNAS USA 83, 9129-9133 (1986).
De forma similar, los modelos animales de cáncer
de colon pueden generarse mediante pasaje de células de cáncer de
colon en animales, p.ej., ratones nude, conduciendo a la aparición
de tumores de estos animales. Un modelo de trasplante orthópico de
cáncer de colon humano en ratones nude se ha descrito, por ejemplo,
por Wang y col., Cancer Research 54, 4726-4728
(1994) y Too y col., Cancer Research 55, 681-684
(1995). Este modelo se basa en el denominado "METAMOUSE^{TM}"
comercializado por AntiCancer, Inc., (San Diego, California).
Los tumores que se producen en animales pueden
eliminarse y cultivarse in vitro. Las células de los cultivos
in vitro pueden traspasarse a animales. Dichos tumores pueden
servir como dianas para análisis posteriores de cribado de fármacos.
Alternativamente, los tumores resultantes del pasaje pueden aislarse
porcederse a la extracción del RNA de las células del
pre-pasaje y de las células aisladas al cabo de una
o más tandas de pasajes. Dicho RNA puede utilizarse para expresión
diferencial de genes de interés. Estas técnicas de pasaje pueden
realizarse con cualquier línea de células tumorales o
cancerosas.
Por ejemplo, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 y
WENI-164 son fibrosarcomas inducidos químicamente de
ratones BALB/c hembras (DeLeo yc ol., J. Exp. Med. 146, 720 (1977),
que proporciona un sistema de modelo controlado para el estudio de
las actividades anti-tumorales de diversos agentes
(Palladino y col., J. Immunol. 138, 4023-4032
(1987). En resumen, las células tumorales se propagan in
vitro en el cultivo celular. Antes de la inyección en los
animales, las líneas celulares se lavan y resuspenden en tampón, a
una densidad celular de aproximadamente 10x10^{6} a 10x10^{7}
células/ml. A continuación, los animales se inyectan subcutáneamente
con 10 a 100 \mul de suspensión celular, esperando que el tumor
aparezca al cabo de una a tres semanas.
Además, el carcinoma de pulmón de Lewis (3LL) de
ratón, uno de los tumores experimentales más ampliamente estudiados,
puede utilizarse como un modelo tumoral. La eficacia en este modelo
tumoral se ha correlacionado con los efectos beneficiosos en los
ratones normales tras inyección de fragmentos de tumor de un ratón
afecto, o de células mantenidas en cultivo (Zupi y col., Br. J.
Cancer 41, suppl., 4, 309 (1980), una evidencia que indica que los
tumores pueden iniciarse a partir de una inyección de incluso una
sola célula y que una gran proporción de células tumorales
infectadas sobrevive. Para mayor información sobre este modelo
tumoral, véase Zacharski, Haemostasis 16, 300-320
(1986)).
Una manera de evaluar la eficacia de un compuesto
en un modelo animal del tumor implantado consiste en medir el tamaño
del tumor antes y después del tratamiento. Tradicionalmente, el
tamaño de los tumores implantados puede medirse con un portaobjetos
calibrador en dos o tres dimensiones. La medida limitada a dos
dimensiones no refleja de forma exacta el tamaño del tumor, en
consecuencia, es convertido generalmente en el volumen
correspondiente utilizando una fórmula matemática. Sin embargo, la
medida del tamaño del tumor es muy inexacta. Los efectos
terapéuticos de un fármaco candidato pueden describirse mejor como
un retraso del crecimiento inducido por el tratamiento y un retraso
del crecimiento específico. Otra variable importante en la
descripción del crecimiento tumoral es el tiempo de necesario para
doblar el volumen tumoral. Los programas informáticos para el
cálculo y descripción del crecimiento tumoral también están
disponibles, como el programa publicado por Rygaard y
Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Inmune
Deficient Animals, Wu y Sheng eds., Basel, 1989, 301. Se ha de
remarcar que la necrosis y las respuestas inflamatorias después del
tratamiento pueden dar como resultado un incremento del tamaño del
tumor, al menos inicialmente. Sin embargo, estos cambios necesitan
controlarse cuidadosamente, mediante una combinación de un
procedimiento morfométrico y el análisis por citometría de
flujo.
Los modelos animales recombinantes (transgénicos)
pueden diseñarse introduciendo la porción codificante de los genes
identificados en la presente invención en el genoma de los animales
de interés, mediante técnicas estándares para producir animales
transgénicos. Los animales que pueden servir como dianas para la
manipulación transgénica incluyen, sin limitación, los ratones,
ratas, conejos, cobayas, ovejas, cabras, cerdos y primates
no-humanso, p.ej., baboones, chimpancés y monos. Las
técnicas conocidas en la materia para introducir un transgén en
dichos animales incluyen la microinyección de pronúcleos (Hoppe y
Wanger, patente americana U.S. 4.873.191); la transferencia de genes
mediada por retrovirus en las líneas germinales (p.ej., Van der
Putten y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:
6148-6151 (1985)); el direccinamiento de genes en
células madre embrionales (Thompson y col., Cell 56,
313-321 [1989]); la electroporación de embriones
(Lo, Mol Cell Biol. 3, 1803-1814 [1983]);
transferencia mediada por esperma (Lavitrano y col., Cell57,
717-73 [1989]). Para una revisión, véase por
ejemplo, la patente americana U.S. 4.736.866.
Para los propósitos de la presente invención, los
animales transgénicos incluyen aquellos que únicamente el transgen
en parte de sus células ("animales mosaico"). El transgen puede
integrarse como un transgen simple, o en concatámeros, p.ej.,
tándems de cabeza con cabeza o cabeza con cola. También es posible
la introducción selectiva de un transgen en un tipo de célula
particular, por ejemplo, la técnica de Lasko y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992).
La expresión del transgen en animales
transgénicos puede controlarse mediante técnicas estándares. Por
ejemplo, análisis de transferencia de southern o amplificación por
PCR para verificar la integración del transgen. El nivel de
expresión del mRNA puede analizarse a continuación mediante técnicas
como la hibridación in situ, transferencia de Northen, PCR, o
inmunocitoquímica. Posteriormente, se examinan los animales para
reconocer los signos del desarrollo del tumor o cáncer.
Alternativamente, pueden generarse animales
"knock-out" con un gen defectuoso o alterado
que codifique un polipéptido-CT-1
identificado aquí, como resultado de la recombinación homóloga entre
el gen endógeno que codifica el polipéptido y el DNA genómico que
codifica el mismo polipéptidos introducido en una célula embrional
del animal. Por ejemplo, puede utilizarse el cDNA que codifica un
polipéptido CT-1 para clonar el DNA genómico que
codifica el polipéptido de acuerdo con las técnicas establecidas.
Una porción del DNA genómico que codifica un polipéptido
CT-1 determinado puede delecionarse o reemplazarse
por otro gen, como un gen que codifica un marcador seleccionable que
puede utilizarse para controlar la integración. De forma típica, se
incluyen en el vector diversas kilobases de DNA flanqueante (en
ambos extremos 3' y 5') [véase p.ej., Thomas y Capecchi, Cell,
51:503 (1987) para una descripción de los vectores de recombinación
homóloga]. El vector se introduce en una línea de células madre
embrionales (p.ej., mediante electroporación) y se seleccionan las
células en donde el DNA introducido se ha recombinado de forma
homóloga con el DNA endógeno [véase p.ej., Li y col., Cell, 69:915
(1992)]. Las células seleccionadas se inyectan a continuación en un
blastocisto de un animal (p.ej., un ratón o una rata) para formar
quimeras por agregación [véase p.ej., Bradley, en Teratocarcinomas
and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson,
eds., (IRL, Oxford, 1987), pág. 113-152]. Un embrión
quimérico puede implantarse en un animal de acogida, una hembra
pseudopreñada adecuada donde crecerá hasta finalizar el período de
crecimiento y se obtendrá un animal "knock out". La progenie
que porta el DNA recombinado de forma homóloga en sus células
germinales puede identificarse mediante técnicas estándares y
utilizarse para la reproducción de animales cuyas células contendrán
el DNA recombinado de forma homóloga. Los animales knock out pueden
caracterizarse por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra
ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de las
condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido
CT-1.
La eficacia de los anticuerpos de unión
específica con los polipéptidos identificados aquí y otros fármacos
candidatos, puede analizarse también en el tratamiento de tumores
espontáneos de animales. Un tumor adecuado para dichos estudios es
el carcinoma bucal de células escamosas (SCC) felino. El SCC bucal
felino es un tumor maligno, altamente invasivo que es el cáncer
bucal más común de los gatos, representando más del 60% de los
tumores bucales descritos en estas especies. Este tumor metastatiza
raramente a sitios distantes, aunque esta incidencia baja de
metástasis puede ser simplemente un reflejo de los tiempos de
supervivencia cortos de los gatos con dicho tumor. La cirugía en
estos casos no es practicable, en primer lugar debido a la anatomía
de la cavidad oral del felino. En la actualidad, no existe un
tratamiento eficaz para este tumor. Antes de entrar en el estudio,
se procedió a practicar un examen clínico completo a cada gato, una
biopsia y un escáner por tomografía computerizada. Los gatos
diagnosticados con células tumorales escamosas, de la cavidad oral
sublingual se excluyeron del estudio. La lengua puede paralizarse
como resultado de dicho tumor, e incluso si el tratamiento destruye
el tumor, los animales no pueden alimentarse por sí solos. Cada gato
se trata de forma repetida, durante un periodo de tiempo prolongado.
Se toman fotografías de los tumores diariamente durante el
tratamiento, y en cada control. Después del tratamiento, se realiza
otro escáner por tomografía computerizada. Estos escáneres y
radiografías torácicas se evalúan cada 8. Los resultados se evalúan
para analizar las diferencias en la supervivencia, respuesta y
toxicidad en comparación con los grupos control. Una respuesta
positiva requiere pruebas evidentes de la regresión del tumor,
preferentemente con implicación de la calidad de vida y/o un
incremento de la duración de vida.
Además, otros tumores espontáneos en animales,
como el fibrosarcoma, el adenocarcinoma, el linfoma, el condromioma,
el leiomiosarcoma de perros, gatos y baboones también puede
analizarse. Los adenocarcinomas de mamíferos en perros y gatos, son
un modelo preferido para ya que su apariencia y comportamiento son
muy similares en humanos. Sin embargo, la utilización de este modelo
está limitada por la ocurrencia rara de este tipo de tumores en los
animales.
Los ensayos de rastreo para fármacos candidatos
se diseñaron para identificar compuestos que se unen o forman un
complejo con los polipéptidos que codifican los genes identificados
aquí, o interfieren con la interacción de estos polipéptidos
codificados con otras proteínas celulares. Dichos ensayos de rastreo
incluyen los ensayos ampliables a rastreo de alto rendimiento de
librerías químicas, haciéndolos especialmente adecuados para la
identificación de moléculas pequeñas como fármacos candidatos. Las
moléculas pequeñas que se contemplan incluyen los compuestos
orgánicos o inórganicos sintéticos, incluyendo los polipéptidos,
preferentemente los péptidos solubles, fusiones (poli)
péptido-inmunogloblulina, y, en particular, los
anticuerpos incluyen, sin limitación, anticuerpos poli- y
monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena
sencilla, anticuerpos anti-idiopáticos, y versiones
quimerizadas o humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, así
como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. Los ensayos
pueden realizarse de muy diversas formas, incluyendo ensayos de
proteína-proteína, ensayos de rastreo bioquímico,
inmunoensayos y ensayos celulares, bien caracterizados en la
materia.
Todos los ensayos tiene en común que exigen el
contacto del fármaco candidato con un polipéptido codificado por un
ácido nucleico identificado aquí en condiciones y tiempo suficientes
para permitir que los dos componentes interactúen.
En los ensayos de unión, la interacción se
realiza mediante la unión y así el complejo formado puede aislarse o
detectarse en la mezcla de reacción. En una realización particular,
el polipéptido codificado por el gen identificado aquí o el fármaco
candidato se inmoviliza en una fase sólida, p.ej., en una placa de
microtitulación, mediante enlaces covalentes o no covalentes. Las
uniones no covalentes se logran generalmente recubriendo la
superficie sólida con una solución del polipéptido y el secado
posterior. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, p.ej., un
anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido a inmovilizar
puede utilizarse para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se
realiza mediante adición del componente
no-inmovilizado, que puede marcarse mediante un
marcaje detectable, para componentes inmovilizados, p.ej., la
superficie recubierta que contenga el componente unido. Cuando la
reacción se ha completado, se eliminan los componentes que no han
reaccionado, p.ej., mediante lavado y se detectan los complejos
anclados en fase sólida. Cuando el componente
no-inmovilizado originalmente porta un marcaje
detectable, la detección del marcaje inmovilizado en la superficie
indica que el complejo se ha formado. Si el componente
no-inmovilizado originalmente no lleva un marcaje,
el complejo se puede detectar, por ejemplo, utilizando un anticuerpo
marcado de unión específica con el complejo inmovilizado.
Si el compuesto candidato interactúa pero no se
une con un polipéptido CT-1 determinado mediante una
secuencia de ácido nucleico, descrita aquí, su interacción con el
polipéptido puede analizarse mediante procedimientos bien conocidos
para la detección de las interacciones
proteína-proteína. Dichos ensayos incluyen
aproximaciones tradicionales, como, la unión, la
co-inmunoprecipitación y la
co-purificación con gradientes o columnas
cromatográficas. Además, las interacciones
proteína-proteína pueden controlarse utlizando un
sistema genético de levaduras descrito por Fields y colaboradores
[Fields y song, Nature (London) 340, 245-246 (1989);
Chien y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
9578-9582 (1991)] tal como se describió por Chevray
y Nathans [Proc Natl Acad. Sci. USA 89, 5789-5793
(1991)]. Muchos activadores transcrpcionales, como la levadura GAL4,
consisten en dos dominios modulares discretos físicamente, uno actúa
como un dominio de unión a DNA, mientras que el otro funciona como
un dominio de activación de la transcripción. El sistema de
expresión en levaduras que se describe en las publicaciones (es
referido generalmente como "sistema del doble híbrido de
levaduras") presenta ventajas, y utiliza dos proteínas híbridas,
en donde está fusionada la proteína diana en el dominio de unión a
DNA de GAL-4 y la otra, en donde se fusionan las
proteínas de activación de candidatos para la activación del
dominio. La expresión del gen reportero GAL1-lacZ
bajo el control del promotor activado GAL4 depende de la
reconstitución de la actividad de GAL4 mediante la interacción
proteína-proteína. Las colonias que contienen
polipéptidos que interaccionan se detectan con un sustrato
cromogénico para la \beta-galactosidasa. Un equipo
completo (MATCH-MAKER^{TM}) para la identificación
de interacciones proteína-proteína entre dos
proteínas específicas utilizando la técnica del doble híbrido está
disponible comercialmente por Clontech. Este sistema puede también
extenderse para mapear dominios proteicos implicados en
interacciones proteicas específicas así como para señalar residuos
aminoacídicos que son cruciales para dichas interacciones.
Los compuestos que interfieren con la interacción
de un gen codificante de CT-1 aquí y otros
componentes intra- o extracelulares puede analizarse de la manera
siguiente: generalmente una mezcla de reacción se prepara
conteniendo el producto del gen amplificado y el componente intra- o
extracelular en condiciones y durante un tiempo que permita la
interacción y la unión de los dos productos. Para analizar la
capacidad de un compuesto para inhibir la unión, la reacción se
realiza en ausencia y en presencia de dicho compuesto. Además, puede
añadirse un placebo a una tercera mezcla de reacción, para servir
como control positivo. La unión (formación del complejo) entre el
compuesto a analizar y el componente intra- o extracelular presente
en la mezcla se controla tal como se indicó anteriormente. La
formación de un complejo en la reacción control, pero no en la
mezcla de reacción que contiene el producto a analizar indica que el
compuesto a analizar interfiere con la interacción del
componente.
Las composiciones de utilidad en el tratamiento
de tumores asociados con la amplificación de los genes identificados
aquí, incluyen, sin limitación, anticuerpos, moléculas pequeñas
orgánicas e inorgánicas, péptidos, fosfopéptidos, moléculas
antisentido y de ribozimas, moléculas de triple hélix, etc., que
inhiben la expresión y/o la actividad del producto del gen
diana.
Por ejemplo, las moléculas de RNA antisentido, y
moléculas de RNA actúan para bloquear directamente la traducción del
mRNA mediante hibridación con el mRNA diana y prevención de la
traducción a proteína. Cuando se utiliza el DNA antisentido, son
preferibles los oligodesoxiribonucleótidos derivados del sitio de
inicio de la traducción, p.ej., entre aproximadamente -10 y +10
posiciones de las secuencias nucleotídicas del gen diana.
Las ribozimas son moléculas enzimáticas de RNA
capaces de catalizar el corte específico de RNA. Las ribozimas
actúan mediante hibridación específica de secuencia con el RNA diana
complementario, y luego por el corte endonucleotídico. Los sitios de
corte específico de la ribozima entre la diana potencial de RNA
pueden identificarse por técnicas conocidas. Para más detalles,
véase Rossi, Current Biology, 4, 469-471 (1994) y la
patente internacional WO 97/33551 (publicada el 18 de setiembre,
1997).
Las moléculas de ácido nucleico en triple hélix
utilizadas para inhibir la transcripción deberían ser de cadena
sencilla y estar compuestas de desoxinucleótidos. La composición
base de estos oligonucleótidos se diseña de modo que promuevan la
formación de triple hélice mediante las reglas de apareamiento de
bases de Hoogsteen, que requieren generalmente secuencias cortas de
purina o pirimidinas en una cadena del dúplex. Para más detalles,
véase p.ej., la patente internacional WO 97/33551, supra.
Estas moléculas pueden identificarse mediante
cualquiera de los ensayos de rastreo discutidos anteriormente, o una
combinación de ellos, y/o mediante otras técnicas de rastreo bien
conocidas por los expertos en la materia.
Algunos de los fármacos candidatos más
prometedores de acuerdo con la presente invención son anticuerpos y
fragmentos de anticuerpos, que pueden inhibir la producción o el
producto del gen de los genes amplificados identificados aquí y/o
reducir la actividad de los productos génicos.
Los procedimientos de preparación de anticuerpos
policlonales son conocidos por los expertos en la materia. Los
anticuerpos policlonales pueden generarse en un mamífero, por
ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y,
si se desea, un adyuvante. De forma característica, el agente
inmunizante y/o adyuvante será inyectado en el mamífero mediante
inyecciones múltiples subcutáneas o intraperitoneales. El agente
inmunizante puede incluir el polipéptido CT-1 o una
proteína de fusión. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante
con una proteína inmunogénica en el mamífero a inmunizar. Ejemplos
de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no se limitan, a la
hemocianina de la lapa, la seroalbúmina, la tiroglobulina bovina y
el inhibidor de la tripsina de soja. Ejemplos de adyuvante que
pueden utilizarse incluyen el adyuvante completo de Freund y el
adyuvante MPL-TDM (Lípido A monofosforil,
dicorinomicolato de trehalosa sintético). El protocolo de
inmunización puede seleccionarse por el experto en la materia sin
demasiada experimentación.
Los anticuerpos
anti-CT-1 pueden ser,
alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos
monoclonales pueden prepararse utilizando procedimientos de
hibridomas, como los descritos por Kohler y Milstein, Nature,
256:495 (1975). En un procedimiento de hibridomas, se inmuniza un
ratón, hámster, u otro animal huésped adecuado con un agente
inmunizante para estimular los linfocitos que produzcan o sean
capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al
agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden
inmunizarse in vitro.
El agente inmunizante incluirá generalmente, el
polipéptido CT-1, incluyendo fragmentos, o una
proteína de fusión de dicha proteína o un fragmento de lo mismo. Por
lo general, se utilizan linfocitos de sangre periférica
("PBLs") si se desean células de origen humano, o células del
bazo o de los nódulos linfáticos para otras fuentes de células de
mamíferos no humanos. Los linfocitos se fusionan con una línea
celular inmortalizada utilizando un agente de fusión, como el
polietilén glicol, para formar una célula de hibridoma [Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,
(1986) pág. 59-103]. Las líneas celulares
inmortalizadas son generalmente células de mamífero transformadas,
en particular células de mieloma de roedor, bovino, y de origen
humano. Generalmente, se utilizan líneas celulares de mieloma de
ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de
cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias
que inhiben el crecimiento o la supervivencia de células
inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales
carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa
(HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá
típicamene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"),
cuyas sustancias impiden el crecimiento de células deficientes en
HPGRT.
Las líneas celulares inmortalizadas son aquellas
que se fusionan eficazmente, soportan un alto nivel de expresión
estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos
seleccionadas, y son sensibles a un medio como el HAT. Las líneas
celulares inmortalizadas más preferidas son las líneas de mieloma
murino, las cuales pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute
Cell Distribution Center, San Diego, California y del American Type
Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia. Las líneas celulares
de mmieloma murino y de heteromieloma murino-humano
también se han descrito para la producción de anticuerpos
monoclonales [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y col.,
Monoclonal Antibocy Production Techniquees and Applications, Marcel
Dekker, Inc., NEw York, (1987) págs. 51-63].
El medio de cultivo de las células del hibridoma
puede analizarse para la presencia de anticuerpos monoclonales
dirigidos contra CT-1. Preferentemente, la
especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos
por las células del hibridoma mediante inmunoprecipitación o
mediante ensayo de unión in vitro, como el radioinmunoensayo
(RIA) o ensayo de unión ligado a enzima (ELISA). Dichas técnicas y
ensayos son conocidos en la materia. La afinidad de unión del
anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante
análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220
(1980).
Después de identificar las células de hibridoma
deseadas, se pueden subclonar los clones deseados mediante dilución
limitante y crecimiento por procedimientos estándares (Goding,
supra). El medio de cultivo adecuado para este propósito
incluye, por ejemplo, Medio de Eagle Modificado por Dulbecco y el
RPMI-1640. Alternativamente, las células de
hibridoma pueden crecerse in vivo como ascitas en un
mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones pueden aislarse o purificarse del medio de cultivo o del
fluido de ascitas mediante procedimientos de purificación de
inmunoglobulinas, como por ejemplo, la proteína
A-Sepharose, la cromatografía de hidroxiapatita, la
electroforesis en gel, la diálisis, o la cromatografía por
afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también pueden
generarse mediante procedimientos de DNA recombinantes, como los
descritos en la patente americana U.S. 4.815.567. El DNA que
codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse
fácilmente y secuenciarse utilizando procedimientos convencionales
(p.ej., utilizando sondas oligonucleotídicas que sean capaces de
unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligera y
pesada de anticuerpos murinos). Las células de hibridomas de la
invención sirven como una fuente preferida de dicho DNA. Una vez
aislado, el DNA puede colocarse en vectores de expresión, que luego
se transfectan en células huésped como las células COS. Las células
de ovario de hámster chino (CHO), o las células de mieloma que de
otra manera no producirían proteína inmunoglobulina, para obtener la
síntesis de anticuerpos monoclonales en células huésped
recombinante. El DNA también puede modificarse, por ejemplo,
sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de
cadena ligera y pesada en lugar de las secuencias murinas homólogas
(patente americana U.S. 4.816.567; Morrison y col., supra) o
mediante unión covalente con la secuencia codificante de
inmunoglobulinas, toda o parte de la secuencia codificante para un
polipéptido no-inmunoglobulínico. Un polipéptido
no-inmunoglobulínico puede sustituirse por los
dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede
sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación
antigénica de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo
bivalente quimérico.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los procedimientos para la preparación de anticuerpos
monovalentes son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, un
procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera
y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena
pesada está generalmente truncada en cualquier punto en la región
Fc, para prevenir la unión de la cadena pesada. Alternativamente,
los residuos de cisteína relevantes se sustituyen con otro residuo
aminoacídico o se delecionan para evitar la unión.
Los procedimientos in vitro son también
adecuados para la preparación de anticuerpos monovalentes. La
digestión de anticuerpos para producir fragmentos de éstos, en
particular, fragmentos Fab, puede lograrse utilizando técnicas de
rutina conocidas en la materia.
Los anticuerpos
anti-CT-1 pueden comprender
anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas
humanizadas de anticuerpos no-humanos (p.ej.,
murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de
inmunoglobulinas o fragmentos de lo mismo (como Fv, Fab, Fab',
F(ab')2 u otras subsecuencias de unión al antígeno) que
contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina
no-humana. Los anticuerpos humanizados incluyen las
inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que residuos
de una región determinante de la complementariedad (CDR) del
receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no
humana (anticuerpo donador) como el ratón, rata o conejo con la
especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los
residuos de la región de entramado Fv de la inmunoglobulina humana
se reemplazan por residuos no-humanos
correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden
comprender residuos que no se hallen ni en el anticuerpo receptor ni
por las secuencias CDR o de entramado. En general, el anticuerpo
humanizado comprenderá esencialmente todos o al menos uno, y
típicamente dos, dominios variables, en los que todos o
esencialmente todas las regiones CDR corresponde con las de una
inmunoglobulina no-humana y todas o esencialmente
todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de
inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá
de forma óptima al menos una región constante de una inmunoglobulina
(Fc), típicamente de una inmunoglobulina humana [Jones y col.,
Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col.,
Nature, 332:323-329 81988); y Presta, Curr. Op.
Struct. Biol., 2:593-596 (19912)].
Los procedimientos para la humanización de
anticuerpos no-humanos son bien conocidos en la
materia. Por lo general, un anticuerpo humanizado, tiene uno o más
de un residuo aminoacídico introducido a partir de una fuente que no
es humana. Estos residuos aminoacídicos no-humanos
son referidos a menudo como residuos de "importación", los
cuales se toman típicamente de un dominio variable de
"importación". La humanización puede realizarse esencialmente
después del procedimiento de Winter y colaboradores [Jones y col.,
Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col.,
Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col.,
Science, 239:1534-1536 (1988)] mediante
sustitutición de las secuencias CDR de un anticuerpo humano por las
secuencias CDR de roedor. Según ello, dichos anticuerpos
"humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente americana
U.S. 4.816.567), en donde esencialmente menos de un dominio variable
humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de
una especie no-humana. En la práctica, los
anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los
que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se
sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de
roedor.
Los anticuerpos humanizados también pueden
producirse utilizando diversas técnicas conocidas en la materia,
incluyendo las librerías de expresión de fagos [Hoogenboom y Winter,
J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581
(1991)]. Las técnicas de Cole y Boemer y col., también están
disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos
(Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.
Liss, pág. 77 (1985) y Boemer y col., J. Immunol.,
147(1):86-95 (1991)]. De modo similar, los
anticuerpos humanos pueden generarse introduciendo loci de
inmunoglobulina humana en animales transgénicos, p.ej., ratones en
los que genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado total o
parcialmente. Después del estímulo, se observa producción de
anticuerpo humano, que se parece estrechamente al humano en todos
los aspectos, incluyendo las reordenaciones génicas, ensamblaje y
repertorio de anticuerpos. Esta aproximación se describe, por
ejemplo, en la patente americana U.S. 5.545.806, 5.545.807,
5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016 y las siguientes
publicaciones científicas: Marks y col., Bio/Technology 10,
779-783 (1992); Lonberg y col., Nature
368:856-859 (1994); Morrison, Nature
368:812-13 (1994); Fishwild y col., Nature
Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature
Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev.
Immunol. 13:65-93 (1995).
Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales,
preferentemente humanos o anticuerpos humanizados, que tienen
especificidades de unión para al menos dos antígenos distintos. En
el caso presente, una de las especificidades de unión es para un
polipéptido CT-1, el otro para cualquier antígeno, y
preferentemente pra una proteína de superficie celular o receptor o
subunidad de receptor.
Los procedimientos para la generación de
anticuerpos biespecíficos son conocidos en la materia.
Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos
biespecíficos se basa en la co-epxresión de dos
pares de cadenas ligeras/pesadas de inmunoglobulina, y las cadenas
pesadas tienen especificidades distintas (Milstein y Cuello, Nature,
305:537-539 [1983]). Debido a la reorganización
aleatoria de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina, estos
hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez
moléculas de anticuerpo distintas, de las cuales una tiene la
estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula
correcta se logra generalmente mediante etapas de cromatografía de
afinidad. En la patente internacional WO 93/08829, publicada el 13
de mayo de 1993 y en Traunecker y col., EMBO J.,
10:3655-3659 (1991), se describen procedimientos
similares.
Los dominios variables del anticuerpo con las
especificidades de unión deseadas (sitios de combinacion
anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse con las
secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión se
realiza preferentemente con un dominio constante de cadena
pesada/ligera de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la
bisagra, las regiones CH2 y CH3. Es preferible que la primera región
constante de cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la
unión de cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los
DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina
y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en
vectores de expresión separados y se co-transfectan
en un organismo huésped adecuado. Para otros detalles sobre la
generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh y
col., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos
de dos anticuerpos unidos covalentemente. Se ha propuesto, por
ejemplo, que dichos anticuerpos dirigen las células del sistema
inmune contra las células no deseadas [patente americana U.S.
4.676.980], y para el tratamiento de la infección por VIH [patente
internacional WO 91/00360; WO 92/200373; patente europea EP 03089].
Se contempla que los anticuerpos puedan prepararse in vitro
utilizando procedimientos conocidos en la química de proteínas
sintéticas, incluyendo los que implican agentes de unión. Por
ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse utilizando una
reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéster.
Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen el
iminotiolato y el
metil-4-mercaptobutirimidato y los
descritos, por ejemplo en la patente americana U.S. 4.676.980.
Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la
invención respecto a la función efectora, por ejemplo, para aumentar
la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por
ejemplo, pueden introducirse residuos de cisteína en la región Fc,
permitiendo en consecuencia la formación de enlaces disulfuro
intercatenarios en esta región. El anticuepro homodimérico así
generado puede mejorar la capacidad de internalización y/o aumentar
la capacidad de eliminación de células mediada por el complemento y
la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Véase
Caron y col., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) y
Shopes, B.J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Los
anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumoral
aumentada también pueden prepararse utilizando agentes de unión
heterobifuncionales tal como se describe en Wolff y col., Cancer
Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, un
anticuerpo puede diseñarse con regiones Fc duales y en consecuencia
puede tener capacidades aumentadas de lisis por complemento y ADCC.
Véase Stevenson y col., Anti-Cancer Drug Design
3:219-230 (1989).
La invención también abarca los inmunoconjugados
que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico como
un agente quimioterapéutico, toxina (p.ej., una toxina activa
enzimáticamente de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o
fragmentos de lo mismo), o un isótopo radioactivo (es decir, un
radioconjugado).
\newpage
Los agentes quimioterapéuticos de utilidad en la
generación de dichos inmunoconjugados se han descrito más arriba.
Las toxinas activas enzimáticamente y los fragmentos de lo mismo que
pueden utilizarse incluyen la cadena A de la difteria, los
fragmentos activos de no-unión de la toxina de la
difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas
aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina,
la cadena A de la modecina, la alfa sarcina, las proteínas de
Aleurites fordii, las proteínas de diantina, las
proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y
PAP-S), el inhibidor de la charantia
momordica, la curcina, el crotin, el inhibidor de la
Sapaonaria officinalis, la gelonina, la mitogelina, la
restrictocina, la fenomicina, la enomicina y los tricotecenos. Están
disponibles diversos radionúclidos para la producción de anticuerpos
radioconjugados. En los ejemplos se incluyen Bi^{212}, I^{131},
Y^{90}
y Re^{186}.
y Re^{186}.
Los conjugados del anticuerpo y de agente
citotóxico se generan utilizando diversos agentes bifuncionales de
acoplamiento de proteínas como el
N-succinimidil-3-(2-piriditiol)
propionato (SPDP), el iminotiolano (IT), los derivados bifuncionales
de los imidoésteres (como dimetil adipimidato HCL), los ésteres
activos (como el disuccinimidil suberato), los aldehidos (como el
glutaraldehido), los compuestos bis-azido (como el
bis(p-azidobenzoil)hexanediamina), los
derivados del bis-diazonium (como el
bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamina),
los diisocianatos (como el tolieno
2,6-diisocianato), y los compuestos de flúor
bis-activo (como el
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse tal como se
describe en Vitetta y col., Science 238:1098 (1987). El ácido
isotiocianatobencil-3-metildietileno
triaminopentacético marcado con carbono-14
(MX-DPTA) es un ejemplo de agente quelante para la
conjugación de radionucleótidos para le anticuerpo, véase la patente
internacional
WO 94/11026.
WO 94/11026.
En otra realización, el anticuerpo puede
conjugarse con un "receptor" (como la estreptavidina) para la
utilización en el predireccionamiento del tumor, en donde el
conjugado anticuerpo-receptor se administra al
paciente, seguido por la eliminación de conjugado no unido de la
circulación utilizando un agente clarificante y luego la
administración de un "ligando" (p.ej., la avidina) que se
conjuga con un agente citotóxico (p.ej., radionúclido).
Los anticuerpos descritos pueden formularse como
inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se
preparan mediante procedimientos conocidos en la materia, tal como
se describe en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688
(1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); y
las patentes americanas U.S. 4.485.045 y 4.544.545. En la patente
americana U.S. 5.013.556 se describen liposomas con un tiempo de
circulación aumentado.
En particular, los liposomas de utilidad se
pueden generar mediante evaporación en fase reversa con una
composición lipídica que contiene fosfatidilcolina, colesterol y
fosfatidiletanolamina derivada por PEG (PEG-PE). Los
liposomas se hacen pasar por filtros de tamaño de poro definido para
rendir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del
anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los
liposomas tal como se describe en Martin y col., J. Biol. Chem. 257:
286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio
de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (como la Doxorubicina)
está contenido dentro del liposoma. Véase Gabizon y col., J.
National Cancer Inst. 81 (19):1484 (1989).
Los anticuerpos de unión específica al producto
de un gen amplificado e identificado aquí, así como otras moléculas
identificadas por los ensayos de rastreo y descritas aquí, pueden
administrarse para el tratamiento de tumores, incluyendo cánceres en
la forma de composiciones farmacéuticas.
Si la proteína codificada por el gen amplificado
es intracelular y los anticuerpos completos se utilizan como
inhibidores, son preferibles los anticuerpos de internalización. Sin
embargo, también pueden utilizarse las lipofectinas o liposomas para
liberar el anticuerpo o un fragmento de anticuerpo en las células.
Si se utilizan fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento
inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión
de la proteína diana. Por ejemplo, según las secuencias de las
regiones variables de un anticuerpo, las moléculas peptídicas pueden
diseñarse para que retengan la capacidad de unirse a la secuencia de
la proteína diana. Dichos péptidos pueden sintetizarse químicamente
y/o producirse por teconología del DNA recombinante (véase, p.ej.,
Marasco y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,
7889-7893 [1993]).
Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo se
preparan para el almacenamiento mezclando el anticuerpo con el grado
deseado de pureza con los vehículos aceptables farmacéuticamente,
excipientes o estabilizantes (Remington Pharmaceutical Sciences 16ª
edición, Osol, A. Ed. [1980]), en la forma de formulaciones
liofilizadas o soluciones acuosas. Vehículos aceptables,
excipientes, o estabilizantes son no tóxicos para los receptores a
las dosificaciones y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones
como el fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos, antioxidantes
como el ácido ascórbico y la metionina, conservantes (como el
cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametenio;
cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol; butil o bencil
alcohol; parabenos alquil como el metil o el propil paraben;
catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y el
m-cresol; polipéptidos de bajo peso molecular
(inferior a 10 residuos); proteínas como la seroalbúmina, la
gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como la
polivinilpirrolidona; los ácidos amina como la glicina, la
glutamina, la asparraguina, la histidina, la arginina o la lisina;
monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo la
glucosa, la manosa o las dextrinas, los agentes quelantes como el
EDTA; los azúcares como la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el
sorbitol; los iones formadores de sales como el sodio; los complejos
de metales (p.ej., complejos proteicos de Zn); y/o los tensoactivos
no iónicos como el Tween^{TM}, PLURONICS^{TM}, o el polietilén
glicol (PEG).
Los compuestos que no son anticuerpos
identificados por los ensayos de rastreo de la presente invención
pueden formularse de manera análoga, utilizando técnicas estándares
bien conocidas en la materia.
La formulación puede también contener más de un
compuesto activo, tantos como sea necesario para la indicación en
particular a tratar, preferentemente los aquellos con actividades
complementarias y no interaccionen de forma adversa el uno con el
otro. Alternativamente, o en adición, la composición puede
comprender un agente citotóxico, citoquina o agente inhibidor del
crecimiento. Dichas moléculas están presentes de forma adecuada en
combinación en cantidades que son efectivas para el propósito que se
pretende.
Los ingredientes activos pueden también incluirse
en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de
coacervación o polimerización interfacial, por ejemplo,
microcápsulas de hidroximetil celulosa o de gelatina y
poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de liberación
coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina,
microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o
en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's
Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980).
Las formulaciones a utilizar para la
administración in vivo deben ser estériles. Ello se logra
mediante filtración a través de membranas de filtración
estériles.
Pueden prepararse preparaciones de liberación
prolongada. Ejemplos adecuados de dichas preparaciones incluyen las
matrices semipermeables de polímeros hidrofílicos sólidos que
contienen el anticuerpo. Las matrices presentan diversas formas,
p.ej., films, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación
prolongada incluyen los poliésteres, lod hidrogeles (por ejemplo,
poli(2-hidroximetil-metacrilato),
o poli(vinilalcohol), los poliláctidos (patente americana
U.S. 3.773.919), los copolímeros del ácido
L-glutámico y el
etil-L-glutamato, el acetato de
etilén-vinil no degradable, los copolímeros de ácido
láctico-ácido glicólico degradables como el LUPRON DEPOT^{TM}
(microsferas inyectables compuestas de copolímeros de ácido
láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolido), y el ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras que los polímeros como el etilén-vinil
acetato y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de
moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan
proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los
anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo
prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la
exposición a humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de actividad
biológica y cambios posibles en la inmunogenicidad. Pueden diseñarse
estrategias racionales para la estabilización dependiente de los
mecanismos implicados. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación es
la formación de enlaces S-S intermoleculares a
través del intercambio de tio-disulfuros, se puede
lograr una estabilización modificando residuos sulfidril,
liofilizando soluciones de acídicas, controlando el contenido de
humedadTM, utilizando aditivos adecuados y desarrollando
composiciones de matriz de polímeros específicos.
Se contempla que los anticuerpos y otros
compuestos anti-tumorales de la presente invención
puedan utilizarse para tratar diversas condiciones, incluyendo las
caracterizadas por la sobreexpresión y/o activación de los genes
amplificados e identidificados aquí. Ejemplos de condiciones o
trastornos susceptibles de ser tratados con dichos anticuerpos y
otros compuestos, incluyendo, pero sin limitarse a, moléculas
orgánicas e inorgánicas, péptidos, moléculas antisentido, etc. Se
incluyen los tumores benignos o malignos (p.ej., carcinomas renales,
hepáticos, del bazo, mama, gástricos, del ovario, colorectales,
próstata, pancreáticos, pulmonares, vulvales, del tiroides; los
sarcoma; los glioblastomas; y diversos tumores de cabeza y cuello);
cánceres linfoides y leucemias; otros trastornos de neuronas, glias,
astrocitos, hipotálamo y otras glándulas, trastornos de macrófagos,
estromales y blastocélicos; trastornos de inflamación, angiogénicos
e inmunológicos.
Los agentes anti-tumorales de la
presente invención, p.ej., los anticuerpos, se administran a un
mamífero, preferentemente a un humano, de acuerdo con procedimientos
conocidos, como la administración intravenosa como el bolo o la
infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía
intramuscular, intracerebrospinal, subcutánea,
intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral,
tópica, o por inhalación. Es preferible la administración
intravenosa del anticuerpo.
Otros regimenes terapéuticos pueden combinarse
con la administración de agentes anti-cáncer, p.ej.,
anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, el paciente a
tratar con dichos agentes anti-cancerosos puede
también recibir terapia de irradiación. Alternativamente, o en
adición, puede administrarse un agente quimioterapéutico al
paciente. Los esquemas de preparación y de dosificación para dichos
agentes quimioterapéuticos pueden utilizarse de acuerdo con las
instrucciones del fabricante o determinarse empíricamente por el
practicante. Los programas de preparación y dosificación para dicha
quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service, Ed.,
M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). El agente
quimioterapéutico puede ir antes o después de la administración del
agente anti-tumoral, p.ej., anticuerpo, o puede
proporcionarse simultáneamente. El anticuerpo puede combinarse con
un compuesto anti-estrógenos como el tamoxifen o uno
anti-progesterona como la onapristona (véase la
patente europea, EP 616812) en dosificaciones conocidas para dichas
moléculas.
\newpage
Puede ser deseable administrar también
anticuerpos contra otros antígenos tumorales, como los anticuerpos
contra ErbB2, EGFR, ErB3, ErbB4, o el factor endotelial (VEGF).
Alternativamente, o en adición, es posible
co-administrar al pacientes dos o más anticuerpos de
unión con el mismo antígeno, o con dos o más antígenos distintos
descritos aquí. A veces, puede ser beneficioso administrar también
una o más citoquinas al paciente. En una realización preferida, los
anticuerpos se co-administran con un agente
inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del
crecimiento puede administrarse en primer lugar, seguido por un
anticuerpo de la presente invención. Sin embargo, también se
contempla la administración simultánea o la administración del
anticuerpo de la presente invención en primer lugar. Las
dosificaciones adecuadas para el agente inhibidor del crecimiento
son las utilizadas actualmente y pueden disminuirse debido a la
acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y
del anticuerpo de la presente invención.
Para la prevención o el tratamiento de la
enfermedad, la dosificación adecuada de un agente
anti-tumoral, p.ej., un anticuerpo será dependiente
del tipo de enfermedad a tratar, tal como se definió anteriormente,
de la gravedad y el curso de la enfermedad dependiendo de si el
agente se administra para la prevención o con propósitos
terapéuticos, antes de la terapia; de la historia clínica del
paciente y de la respuesta al agente y discreción del clínico
responsable. El agente se administra de forma adecuada al paciente
de una vez o durante una serie de tratamientos.
Por ejemplo, dependiendo del tipo de gravedad de
la enfermedad, aproximadamente a 1 \mug/Kg a 15 mg/Kg (p.ej.,
0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosificación
inicial del candidato para la administración al paciente, mediante
por ejemplo, una o más administraciones, o mediante infusión
continua. Una dosificación diaria típica puede hallarse entre 1
\mug/Kg a 100 mg/Kg o más, dependiendo de los factores mencionados
anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o
más prolongadas dependiendo de la condición, el tratamiento se
mantiene hasta la supresión de los síntomas de la enfermedad. Sin
embargo, se pueden utilizar otros regímenes de dosificación. El
progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y
ensayos convencionales.
Puede proporcionarse un artículo de fabricación
que contenga materiales de utilidad para el diagnóstico o el
tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. El artículo
de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta. Los
recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales,
jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados
por diversos materiales como vidrio o plástico. El recipiente
contiene una composición que es efectiva para el diagnóstico o
tratamiento de la condición y puede tener un puerto de acceso
estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución
intravenosa o un vial con un tapón agujereable por una aguja de
inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es
generalmente un agente anti-tumoral capaz de
interferir con la actividad de un producto génico identificado aquí,
p.ej., un anticuerpo. La etiqueta en, o asociada con, el recipiente
indica que la composición se utiliza para el diagnóstico o
tratamiento de la condición de elección. El artículo de fabricación
puede comprender además un segundo recipiente que comprende un
tampón farmacéuticamente aceptable, como la solución salina
tamponada con fosfato, la solución de Ringer y la solución de
dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde el
punto de vista del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes,
filtros, agujas, jeringas e instrucciones insertadas en el paquete
para su utilización.
Mientras que las proteínas de superficie, como
los receptores que se sobreexpresan en ciertos tumores son dianas
excelentes para fármacos candidatos o el tratamiento tumoral (p.ej.,
el cáncer), estas mismas proteínas junto con las secretadas
codificadas por los genes amplificados en las células tumorales
encuentran un uso adicional en el diagnóstico y pronóstico de
tumores. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra los productos
proteicos de genes amplificados en células tumorales pueden
utilizarse en el diagnóstico o pronóstico del tumor.
Por ejemplo, los anticuerpos, incluyendo los
fragmentos de anticuerpo, pueden utilizarse para detectar
cualitativa o cuantitativamente la expresión de proteínas
codificadas por los genes amplificados ("productos de genes
marcadores"). Preferentemente, el anticuerpo se equipa con un
marcaje detectable, p.ej., un marcaje fluorescente, y de este modo
la unión se puede controlar mediante microscopía, citometría de
flujo, fluorimetría, u otras técnicas conocidas en la materia. Estas
técnicas son particularmente adecuadas, si el gen amplificado
codifica una proteína de superficie celular, p.ej., un factor de
crecimiento. Dichos ensayos de unión se realizan esencialmente tal
como se describió en la sección 5 anterior.
Se puede realizar la detección in situ de
la unión del anticuerpo a los productos del gen marcador, por
ejemplo, mediante inmunofluorescencia o microscopía
inmunoelectrónica. Para este propósito, se toma una muestra
histológica del paciente, y se aplica un anticuerpo marcado,
preferentemente mediante colocando el anticuerpo sobre una muestra
biológica. Este proceso también permite la determinación de la
distribución del producto del gen marcador en el tejido examinado.
Será evidente para los expertos en la materia que existen y están
disponibles diversos procedimientos histológicos para la detección
in situ.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a título
ilustrativo únicamente, y sin ánimo de limitar el ámbito de la
presente invención.
Se utilizaron reactivos disponibles
comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante,
salvo que se indique lo contrario. La fuente de células
identificadas en los ejemplos siguientes, y en la especificación,
por los números de acceso ATCC es el American Type Culture
Collection, Manassas, VA. Salvo que se indique lo contrario, la
presente invención utiliza procedimientos estándares de tecnología
del DNA recombinante, como los descritos aquí anteriormente y en los
libros de texto siguiente: Sambrook y col., Molecular Cloning: A
laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1989; Ausubel y
col., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing
Association and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innis y col., PCR
protocols: A guide to methods and applications, Academic Press,
Inc., N.Y., 1990; Harlow y col., Antibodies: A laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, M., J.
Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R.I. Freshney,
Animal Cell Culture, 1987; Coligan y col., Current Protocols in
Immunology, 1991.
Este ejemplo muestra que el gen que codifica
CT-1 se amplifica en el genoma de algunas líneas de
cáncer de pulmón y de colon. La amplificación se asocia con la
sobrexpresión del producto génico, lo que indica que las proteínas
CT-1 son dianas útiles para la intervención
terapéutica en algunos cánceres como el colon, pulmón, mama y otros.
El agente terapéutico puede tomar la forma de antagonistas de los
productos de genes que codifican CT-1, por ejemplo,
anticuerpos quiméricos murino-humanos, anticuerpos
humanizados o anticuerpos humanos dirigidos contra un polipéptido
CT-1.
El material de partida para el rastreo fue DNA
genómico aislado de diversos cánceres. El DNA se cuantificó, p.ej.,
mediante fluorometría. Como control negativo, se aisló el DNA de
células de 10 individuos sanos normales, que se agruparon y
utilizaron en ensayos controles para conocer el número de copias en
individuos sanos (resultados no mostrados). Se utilizaron, por
ejemplo el ensayo de la nucleasa 5' (por ejemplo, TaqMan^{TM}) y
la PCR cuantitativa a tiempo real (por ejemplo, ABI Prism 7700
Sequence Detection System^{TM} (Perkin Elmer, Applied Biosystems
Division, Foster City, CA)) para hallar genes potencialmente
amplificados en ciertos cánceres. Los resultados se utilizaron para
determinar si el DNA codificante de CT-1 estaba
sobre-representado en cualquiera de los cánceres
primarios de colon o de pulmón o de las líneas celulares de lo mismo
que se rastrearon. Los cánceres primarios de pulmón se obtuvieron de
individuos con tumores del tipo y estadio indicado en la Tabla 1.
Una explicación de las abreviaciones utilizadas para la denominación
de los tumores primarios se indica en la Tabla 1 y los tumores
primarios y líneas celulares referidas en estos ejemplos que se han
indicado aquí con anterioridad. Los resultados del Taqman^{TM} se
indican en unidades Ct (\Delta). Una unidad corresponde a un ciclo
de PCR o aproximadamente a una amplificación dos veces superior en
relación con el normal, dos unidades corresponden a una
amplificación 4 veces superior, 3 unidades a una de 8 veces superior
y así repetidamente. La cuantificación se obtuvo utilizando
cebadores y una sonda Taqman^{TM} derivada del gen codificante
GT-1. Las regiones de CT-1 que más
probablemente contienen secuencias únicas de ácido nucleico y que al
menos han ayustado intrones son las preferidas para generar
cebadores y la sonda, p.ej., la región 3' no traducida. Las
secuencias para los cebadores y sondas (el cebador de sentido de
transcripcion 5' y el de sentido 3' y la sonda) utilizados para la
amplificación del gen CT-1 fueron los siguientes:
CT-1 (DNA58125):
- 58125.tm.fl
- 5'-TTCCCAGCCTCTCTTTGCTTT-3' (SEC ID NO. 4)
\vskip1.000000\baselineskip
- 58125.tm.rl
- 5'-TCAGACGGAGTTACCATGCAGA-3' (SEC ID NO. 5)
\vskip1.000000\baselineskip
- 58125.tm.pl
- 5'-TGCCCCGTTCTCTTAACTCTTGGACCC-3' (SEC ID NO. 6)
La reacción del ensayo de la nucleasa 5' es una
técnica basada en la PCR fluorescentes que utiliza la actividad 5'
exonucleasa de la Taq DNA polimerasa para controlar la amplificación
en tiempo real. Los cebadores oligonucleotídicos se utilizan para
generar un amplicón típico de una reacción de PCR. Un tercer
oligonucleótido, o sonda, se diseña para detectar la secuencia
localizada entre los dos cebadores de PCR. La sonda no se extiende
por la enzima Taq DNA polimerasa y está marcada con un flurocromo
reportero y un fluorocromo secuestrador del primero. Cualquier
emisión inducida por el láser de fluorocromo reportero es
secuestrada por el secuestrador cuando ambos se hallan muy próximos,
tal como lo están en la sonda. Durante la reacción de amplificación,
la enzima Taq DNA polimerasa corta la sonda de forma dependiente del
molde. El fragmento de sonda resultante se disocia en solución, y la
señal del fluoróforo reportero se libera del secuestrador del
segundo fluoróforo. Una molécula de fluoróforo reportero se libera
por cada nueva molécula sintetizada y la detección del reportero
libre proporciona la base para la cuantificación de la
interpretación de los resultados.
El procedimiento de la nucleasa 5' se realiza en
un dispositivo de PCR cuantitativa a tiempo real como el de ABO
Prims 7700^{TM} Sequence Detection. El sistema consiste en un
termociclador, láser, cámara de dispositivo acoplado a carga (CCD) y
ordenador. El sistema amplifica las muestras en un formato de 96
pocillos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal
fluorescente inducida por el láser se recoge a tiempo real a través
de cables de fibra óptica para los 96 pocillos y se detecta en la
CCD. El sistema incluye el programa para el funcionamiento del
instrumento y para el análisis de los resultados.
Los resultados del ensayo de la nucleasa 5' se
expresan inicialmente como Ct, o el umbral del ciclo. Esto se define
como el ciclo en el que se acumula la señal del reportero por encima
del nivel de fondo de fluorescencia. Los valores de \DeltaCt se
utilizan como cuantificación cuantitativa del número relativo de
copias de inicio de una secuencia particular en una muestra de ácido
nucleico cuando se comparan los resultados del DNA del cáncer con
los del DNA de tejido humano sano.
La Tabla 1 describe el estadio, estadio T y
estadio N, de diversos tumores primarios que se utilizaron para
rastrear los compuestos CT-1 de la invención.
El DNA se preparó a partir de líneas celulares,
tumores primarios, sangre humana normal. El aislamiento se realizó
utilizando el equipo de purificación, tampón y proteasas y todo el
resto de Quiagen, de acuerdo con las instrucciones del proveedor y
de las descripciones siguientes.
Las células se lavaron y tripsinizaron a una
concentración de 7,5x10^{8} por tubo y se sedimentaron por
centrifugacion a 1000 rpm durante 5 min a 4ºC, seguido por el lavado
con ½ volumen de PBS y recentrifugación. Los sedimentos se lavaron
una tercera vez, se resuspendieron las células y se lavaron con 2X
PBS. Las células se resuspendieron en 10 ml de PBS. El tampón C1 se
equilibró a 4ºC. El reactivo proteasa #19155 de Quiagen se diluyó en
6,25 ml de agua destilada fría a una concentración final de 20 mg/ml
y se equilibró a 4ºC. Se preparó 10 ml del tampón G2 diluyendo la
solución madre de RNAsa de Quiagen (100 mg/ml) a una concentración
final de 200 \mug/ml.
A continuación, se añadieron el tampón C1 (10 ml
a 4ºC) y agua destilada (40 ml a 4ºC) a los 10 ml de suspensión
celular, se mezcló por inversión y se incubó en hielo durante 10
minutos. Los núcleos celulares se sedimentaron por centrifugación en
un rotor basculante Beckamn a 2500 rpm a 4ºC durante 15 min. Se
descartó el sobrenadante y los núcleos se resuspendieron con ayuda
del vórtex en 2 ml de tampón C1 (a 4ºC) y 6 ml de agua destilada,
seguido de una centrifugación a 4ºC a 2500 rpm durante 15 min. Los
núcleos se resuspendieron en el tampón residual de 200 \mul. Se
añadió el tampón G2 (10 ml) a los núcleos resuspendidos con ligero
vórtex y tras la adición del tampón, un vórtex vigoroso durante 30
segundos. Se añadió la proteasa de Quiagen (200 \mul, preparada
tal como se indicó anteriormente) y se incubó a 50ºC durante 60 min.
La incubación y la centrifugación se repitieron hasta conseguir un
lisado claro (p.ej., mediante incubación adicional de
30-60 minutos, sedimentación a 3000xg durante 10 min
a 4ºC).
Las muestras de tumores se pesaron y colocaron en
tubos cónicos d 50 ml y se mantuvieron en hielo. El procesamiento se
limitó a no más de 250 mg de tejido por preparación (1
tubo/preparación). La solución de proteasa se preparó al momento
diluyendo en 6,25 ml de agua destilada fría a una concentración de
20 mg/ml y se guardó a 4ºC. El tampón G2 (20 ml) se preparó
diluyendo la DNasa A a una concentración final de 200 mg/ml (de 100
mg/ml de la solución madre). Los tejidos tumorales se homogeneizaron
en 19 ml de tampón G2 durante 60 segundos utilizando la punta ancha
del politrón en una campana TC de flujo laminar con el fin de evitar
la inhalación de los aerosoles y se mantuvo a temperatura ambiente.
Entre muestra y muestra, se limpió el politrón haciendo pasar 2 l de
agua destilada 2x30 s, seguido de tampón G2 (50 ml). Si todavía
había tejido en la punta del politrón, el aparato se desmontó y se
limpió.
Se añadió proteasa de Quiagen (preparado tal como
se indicó anteriormente, 1,0 ml), seguido por vórtex e incubación a
50ºC durante 3 horas. La incubación y la centrifugación se
repitieron hasta conseguir un lisado claro (p.ej., mediante
incubación adicional de 30-60 minutos, sedimentación
a 3000xg durante 10 min a 4ºC).
Se obtuvo sangre de voluntarios sanos utilizando
protocolos estándares y se tituló en 10 ml para cada muestra. Se
añadió la proteasa de Quiagen preparada al momento mediante dilución
en 6,25 ml de agua destilada fría a una concentración final de 20
mg/ml y se guardó a 4ºC. Se preparó el tampón G2 diluyendo la RNasa
A a una concentración final de 200 \mug/ml a partir de la solución
madre de 100 mg/ml. Se colocó la sangre (10 ml) en un tubo cónico de
50 ml y se añadieron 10 ml de tampón C1 y 30 ml de agua destilada
(ambos previamente equilibrados a 4ºC), y se mezclaron los
componentes por inversión y se mantuvieron en hielo durante 10 min.
Los núcleos se sedimentaron centrifugando con un rotor basculante
Beckmann a 2500 rpm, 4ºC, 15 min y se descartó el sobrenadante. Los
núcleos se resuspendieron con ayuda del vórtex en 2 ml de tampón C1
(4ºC) y 6 ml de agua destilada (4ºC). Se repitió el vórtex hasta
conseguir un sedimento blanco. Los núcleos se resuspendieron en un
tampón residual utilizando 200 \mul. Se añadió la proteasa de
Quiagen (200 \mul) y se incubó a 50ºC durante 60 min. La
incubación y la centrifugación se repitieron hasta conseguir un
lisado claro (p.ej., incubación adicional 30-60 min,
sedimentación a 3000xg, 10 min, 4ºC).
El DNA genómico se equilibró (1 muestra por
preparación maxi) con 10 ml de tampón QBT. El tampón de elución QF
se equilibró a 50ºC. Las muestras se agitaron con vórtex 30 s, luego
se cargaron en columnas equilibradas y se dejaron drenar por
gravedad. Las columnas se lavaron con 2x15 ml de tampón QC. El DNA
se eluyó con 15 ml de tampón QF (50ºC) en tubos Corex de 30 ml
silanizados y autoclavados. Se añadió isopropanol (10,5 ml) a cada
muestra, los tubos se recubrieron con parafina y se mezclaron
mediante inversión repetida hasta precipitar el DNA. Las muestras se
sedimentaron mediante centrifugación en un rotor
SS-34 a 15.000 rpm 10 min, 4ºC. Se marcó la
localización del sedimento, se descartó el sobrenadante y se
añadieron 10 ml de etanol al 70% (4ºC). Se sedimentaron de nuevo las
muestras mediante centrifugación en el rotor SS-34 a
10.000 rpm, 10 min a 4ºC. Se marcó la localización del sedimento y
se descartó el sobrenadante. A continuación, los tubos se colocaron
en un secador 10 min a 37ºC, teniendo cuidado de no secar demasiado
la muestra.
Después del secado, los sedimentos se
resuspendieron en 1,0 ml de TE (pH 8,5) y se colocaron a 50ºC,
1-2 h. Las muestras se mantuvieron durante toda la
noche a 4ºC como una disolución continuada. La solución de DNA se
transfirió entonces a tubos de 1,5 ml con una aguja de calibre 26 en
una jeringa de tuberculina. La transferencia se repitió 5X con el
fin de romper el DNA. Las muestras se colocaron a continuación a
50ºC durante 1-2 h.
Se cuantificó el DNA de cada tubo mediante
espectrofotometría estándar A260, A280 en una dilución 1:20 (5
\mul de DNA + 95 \mul de H_{2}Odd) utilizando cubetas de
cuarzo de 0,1 ml en el espectrofotómetro Beckman DU640. Los
cocientes A260/A280 se hallaron en el intervalo de
1,8-1,9. Cada una de las muestras de DNA se diluyó
después a aproximadamente 200 ng/ml en TE (pH 8,5). Si el material
original estaba altamente concentrado (aproximadamente 700
ng/\mul), el material se colocó a 50ºC durante varias horas hasta
su resuspensión.
La cuantificación de DNA fluorimétrica se realizó
con el material diluido (20-600 ng/ml) utilizando
las indicaciones del fabricante. Ello se logró permitiendo que un
fluorímetro Hoeffer DyNA Quant 200 se precalentara unos 15 min. Se
diluyó el colorante de Hoechst (#H33258, 10 \mul, preparado
durante las 12 h de su uso) en 100 ml de tampón 1xTNE. Se llenó una
cubeta de 2 ml con la solución fluorimétrica, se colocó en el
aparato y se ajustó el cero. Se añadió el pGEM 3Zf(+) (2 \mul,
lote #360851026) a 2 ml de solución fluorimétrica y se calibró a 200
unidades. A continuación, se analizaron 2 \mul adicionales de pGEM
3Zf(+)DNA y la lectura confirmó 400\pm10 unidades. Cada muestra se
leyó por triplicado. Cuando las 3 muestras se hallaron entre el 10%
de cada una de las otras, se calculó el promedio de las tres y se
utilizó este valor como el valor de cuantificación.
La concentración fluorométrica determinada se
utilizó para diluir cada muestra a 10 ng/\mul en H_{2}O
destilada. Ello se realizó simultáneamente en todas las muestras
para un ensayo en placa TaqMan^{TM}, y con suficiente material
para realizar 500-1000 ensayos. Las muestras se
analizaron por triplicado con cebadores Taqman^{TM} para las
sondas de la B-actina y el GAPDH en una sola placa
con el DNA humano normal y sin muestras controles. Se utilizaron
muestras diluidas siempre que el valor Ct del DNA humano normal
sustraído del DNA a analizar fuer \pm1 Ct. El DNA genómico diluido
del lote se guardó en alícuotas de 1,0 ml a -80ºC. Las alícuotas que
se utilizaron de forma secuencial en los ensayos de amplificación
génica se guardaron a 4ºC. Cada alícuota de 1 ml fue suficiente para
8-9 placas o 64 ensayos.
Los compuestos CT-1
(cardiotrofina-1) de la invención se rastrearon en
los tumores primarios siguientes y el resultado de los valores de
\DeltaCt se resumen en la Tabla 2.
El CT-1
(cardiotrofina-1, DNA58125) se
re-examinó mediante mapeo del marco de trabajo y
mapeo epicéntrico utilizando tumores seleccionados del rastreo
inicial. Las figuras 3-8 y las Tablas
3-5 proporcionan los resultados del mapeo del
cromosoma 16 de los marcadores del marco de trabajo en tumores de
pulmón y colon. Los marcadores del marco de trabajo se localizaron
aproximadamente cada 20 megabases y se utilizaron como controles
para determinar la amplificación. Las Tablas 6-8 y
las Figuras 9-12 muestran los resultados del mapeo
del cromosoma 16 de los marcadores epicéntricos cercanos al
DNA58125.
| Marcadores del marco de trabajo | |
| Posición en el mapa | Nombre del marcador del centro de |
| genoma humano de Stanford | |
| P7 | SHGC-2835 |
| P55 | SHGC-9643 |
| P99 | GATA7B02 |
| P154 | SHGC-33727 |
| P208 | SHGC-13574 |
Los valores \DeltaCt de los marcadores del
marco de trabajo descritos anteriormente en el cromosoma 16 en
relación con CT-1 se indican para los tumores de
pulmón y colon seleccionados en las Tablas 4 y 5,
respectivamente.
Las figuras 3 y 4 proporcionan una representación
gráfica tridimensional de los resultados en la Tabla 4, paneles 1 y
2, respectivamente. Los tumores de pulmón están anotados en el eje
de las X, los marcadores y el DNA58125 en el eje de las Z y la
amplificación relativa del cromosoma 16 en la región del marcador se
indica en el eje de las y por la altura del histograma. La figura 5
es un gráfico bidimensional que resume los resultados de la Tabla 4
para DNA58125 y muestra que el DNA cromosómico que codifica
CT-1 se amplifica en algunos tumores de pulmón
(valores promedios de \DeltaCt de aproximadamente 1,0 se han
subrayado con una sola línea y en doble subrayado, los valores de
aproximadamente x2).
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras 6 y 7 proporcionan un gráfico
tridimensional de los resultados de la Tabla 5, paneles 1 y 2,
respectivamente. Los tumores de colon se representan en el eje de
las X, los marcadores y el DNA58125 en el eje de las Z y la
amplificación relativa del cromosoma 16 en la región del marcador se
indica en el eje de las y por la altura de la barra. La figura 8 es
una gráfica de barras bidimensional que resume los resultados de la
Tabla 5 para el DNA58125 y muestra que el DNA cromosómico que
codifica CT-1 se amplifica en algunos tumores de
colon (valores promedios de \DeltaCt de aproximadamente 1,0 se han
subrayado con una sola línea y en doble subrayado, los valores de
aproximadamente x2).
La Tabla 6 describe los marcadores del epicentro
que se utilizaron en asociación con CT-1 (DNA58125).
Estos marcadores se localizaron en estrecha proximidad con DNA58125
y se utilizaron para valorar el estado de amplificación de la región
del cromosoma 16 en donde se localiza el DNA58125. La distancia
entre los marcadores individuales se cuantifica en centiradios,
siendo un centiradio una unidad de rotura por radiación
aproximadamente igual al 1% de posibilidad de una rotura entre dos
marcadores. Un cR es casi equivalente a 20 Kb de distancia. El
marcador SHGC-36123 es el marcador hallado más
cercano a la localización en el cromosoma 16 donde mapea el
DNA58125. Sin embargo, los cebadores Taqman^{TM} y las sondas para
SHGC-2726 fallaron en nuestro ensayo debido a
dificultades técnicas relacionadas con la PCR.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
cR ^{1} = \begin{minipage}[t]{130mm} centiradio. La distancia
entre marcadores se cuantifica en cR, que equivalen a unidades de
rotura por radiación. Una unidad cR equivale al 1% de probabilidades
de una rotura entre dos marcadores. Un cR corresponde
aproximadamente a 20
Kb.\end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 7 indica los valores de \DeltaCt para
los resultados del mapeo epicéntrico respecto al DNA58125 en tumores
de pulmón, indicativo de la amplificación relativa en la región más
inmediata a la actual localización del DNA58125 en el cromosoma
16.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 8 indica los valores de \DeltaCt para
los resultados del mapeo epicéntrico respecto al DNA59125 en tumores
de pulmón, indicando la amplificación relativa en la región más
inmediata a la localización actual del DNA58125 en el cromosoma
16.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los valores de \DeltaCt para el DNA58125
(CT-1) en diversos tumores de pulmón y colon se
muestran en las Tablas 2 (rastreo inicial), 4 y 5 (mostrando la
amplificación mediante análisis del marco de trabajo respecto a los
marcadores en el cromosoma 16), 7 y 8 (muestran la amplificación del
análisis epicéntrico respecto a los marcadores en el área
cromosómica donde se localiza el DNA58125), así como en las Figuras
3-12. Un valor \DeltaCt >1 (valores con un
subrayado simple) se utilizaron típicamente como valor umbral para
la valoración de la amplificación, ya que representa doblar el
número de copias génicas. La Tabla 4 indica que esta amplificación
significativa del DNA58125 tuvo lugar en los tumores de pulmón
primarios LT3, LT12, LT15, LT17 y LT18. Los valores promedios de
\DeltaCt fueron 1,02; 1,00; 1,33; 1,83; 1,03; 1,08,
respectivamente para los tumores de pulmón. Esto representa
aproximadamente un incremento de 2,0; 2,0; 2,5; 3,6; 2,0 y 2,1
veces, respectivamente, en el número de copias génicas para los
tumores de pulmón respecto al tejido normal.
La Tabla 5 indica que ocurrió una amplificación
significativa del DNA58125 en los tumores de colon primarios ColT2,
ColT3, ColT8, ColT10, ColT10, ColT12, ColT14, ColT15, ColT1, ColT4,
ColT5, ColT6, ColT11 y ColT18. Los valores promedio de de \DeltaCt
fueron 2, 27; 1,34; 1,74; 1,13; 1,74; 1,30; 1,08; 1,13; 2,17; 1,41;
2,24 y 1,04, respectivamente para los tumores de colon. Esto
representa aproximadamente un incremento de 4,8; 2,5; 2,3; 3,3; 2,5;
2,1; 2,2; 4,5; 2,6; 4,7 y 2,0 veces en el número de copias génicas
para los tumores de colon respecto al tejido normal.
Por el contrario, la amplificación de los
marcadores conocidos más cercanos (Tablas 7 y 8) no se amplificaron
más que el DNA58125. La amplificación de los marcadores mas próxima
al DNA58125 no tuvo lugar a una magnitud mayor que el DNA58125. Ello
sugiere que el DNA58125 es el gen, causa de la amplificación de la
región particular del cromosoma 16.
Ya que la amplificación del DNA58215
(CT-1) tiene lugar en diversos tumores, seguramente
desempeña un papel importante en la formación o el crecimiento del
tumor. Como resultado, se espera que los antagonistas (p.ej.,
anti-
cuerpos) dirigidos contra la proteína codificada por el DNA58125 (CT-1) sean de utilidad en la terapia contra
cuerpos) dirigidos contra la proteína codificada por el DNA58125 (CT-1) sean de utilidad en la terapia contra
\hbox{el cáncer.}
La hibridación in situ es una técnica
potente y versátil para la detección y localización de las
secuencias de ácido nucleico dentro de la célula o las preparaciones
tisulares. Puede ser de utilidad, por ejemplo, para identificar
sitios de expresión génica, analizar la distribución y localización
de la infección viral, para seguir los cambios en la síntesis del
mRNA específico y de ayuda en el mapeo cromosómico.
En la solicitud de patente americana U.S.
5.571.893, publicada el 5 de noviembre de 1996, incorporada como
referencia, se valoran los estudios de distribución tisular de la
cardiotrofina-1 en el tejido humano. Dichos estudios
también se describen en Pennica, D. y col., en Cytokine
8(3):183-9 (1996), incorporados también como
referencia. Se rastrearon los RNA poli(a)+ de diversos
tejidos humanos adultos utilizando una sonda de los clones de cDNA
de CT-1 de ratón. La hibridación de la transferencia
con un sonda CT-1 de ratón de 180 pb (que abarcaba
desde la base 19 en extremo 5' del codón ATG al aminoácido 50) en
formamida al 20%, 5XSSC a 42ºC con un lavado final a 0,25xSSC a
52ºC. Un mRNA de CT-1 de 1,7 Kb mostró que se
expresaba en corazón, músculo esquelético, ovario, colon, próstata y
testículos de tejido humano adulto y en riñón y pulmón fetal.
La hibridación in situ también se puede
realizar siguiendo una versión optimizada del protocolo de Lu y
Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994), utilizando
ribosondas marcadas con P^{32} y generadas por PCR. En resumen, se
realizaron secciones de tejidos humanos fijados en formalina y
embebidos en parafina, se desparafinaron, desproteinizaron en
proteinasa K (20g/ml) durante 15 minutos a 37ºC y se procesaron para
una hibridación in situ tal como se describe por Lu y
Gillett, supra. Se generó una ribosonda antisentido marcada
con UTP-(P32) a partir de un producto de PCR y se hibridó a 55ºC
durante toda la noche. Las preparaciones se sumergieron en emulsión
NTB2 de Kodak y se expusieron durante 4 semanas.
Se secaron mediante centrifugado con vacío 6,0
\mul (125 mCi) de UTP-P^{32} (Amersham BF 1002,
SA < 2000 Ci/mmol). A cada tubo que contenía el
UTP-P^{32} seco se añadieron los siguientes
ingredientes:
2,0 \mul de tampón de transcripción
1,0 \mul de DTT (100 mM)
2,0 \mul de mezcla de NTP (2,5 mM: 10 \mul de
cada GTP, CTP y ATP a 10 mM + 10 \mul de H_{2}O)
1,0 \mul de UTP (50 \muM)
1,0 \mul de Rnasin
1,0 \mul del molde de DNA (1 \mug)
1,0 \mul de agua
1,0 \mul de RNA polimerasa (para productos de
PCR, T3=antisentido, T7=sentido, generalmente)
Los tubos se incubaron a 37ºC durante 1 h. Se
añadió 1 \mul de RQ1 DNasa y se incubó a 37ºC, 15 min. Se
añadieron 90 \mul de TE (Tris 10 mM, pH 7,6/EDTA 1 mM, pH 8,0) y
la mezcla se pipeteó sobre papel DE81. La solución restante se cargó
en una unidad de ultrafiltración Microcon-50, se
centrifugó con el programa 10 (6 minutos). La filtración se invirtió
en un segundo tubo y se centrifugó con el programa 2 (3 minutos).
Después de la última recuperación, se añadieron 100 \mul de TE, 1
\mul del producto final se pipeteró en DE81 y se contó en 6 ml de
Biofluor II.
La sonda se migró en un gel TBE/urea. Se
añadieron 1-3 \mul de la sonda o 5 \mul del
MrkIII de RNA a 3 \mul de tampón de carga. Después de calentar a
95ºC en un termobloque, 3 min, el gel se colocó inmediatamente en
hielo. Los pocillos del gel se limpiaron, se cargó la muestra y se
dejó migrar a 180-220 voltios durante 45 min. El gel
se envolvió con película plastificada y se expuso a una película XAR
con una pantalla intensificadora en un congelador a -70ºC, 1 h a
toda la noche.
Pretratamiento de las secciones congeladas. Las
preparaciones se extrajeron del congelador, se colocaron en bandejas
de aluminio y se descongelaron a temperatura ambiente durante 5
minutos. Las bandejas se colocaron en un incubador a 55ºC durante 5
minutos para reducir la condensación. Las preparaciones se fijaron
10 min en paraformaldehido al 4% en hielo en la campana de
extracción, se lavaron con 0,5xSSC 5 min, a temperatura ambiente (25
ml de 20xSSC + 975 ml de agua destilada). Después de la
desproteinización en 0,5 \mug/ml de proteinasa K durante 10 min a
37ºC (12,5 \mul de solución madre a 10 mg/ml en 250 ml de tampón
sin RNasa precalentado), las secciones se lavaron en 0,5xSSC durante
10 min a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en
series de alcoholes, 70%, 95%, 100% durante 2 min cada una.
Pretratamiento de las secciones embebidas en
parafina. Las preparaciones se desparafinaron, se colocaron en
H_{2}O MQ, se lavaron dos veces en 2xSSC a temperatura ambiente, 5
min cada vez. Las secciones se desproteinizaron en
20 \mug/ml de proteinasa K (500 \mul de 10 mg/ml en tampón sin RNasa, 37ºC, 15 min)- 8xproteinasa K humana embrional- tejidos formalinizados. Los siguientes lavados en 0,5xSSC y deshidrataciones se realizaron tal como se ha descrito antes.
20 \mug/ml de proteinasa K (500 \mul de 10 mg/ml en tampón sin RNasa, 37ºC, 15 min)- 8xproteinasa K humana embrional- tejidos formalinizados. Los siguientes lavados en 0,5xSSC y deshidrataciones se realizaron tal como se ha descrito antes.
Prehibridación. Las preparaciones se colocaron en
una caja de plástico con tampón (4XSSC, formamida al 50%) y saturada
con papel de filtro. El tejido se cubrió con 50 \mul de tampón de
hibridación (3,75 g de Sulfato de Dextrano + 6 ml de H_{2}O MQ,
agitado con vórtex y calentado en el microondas 2 min con el tapón
del tubo semi-abierto). Después de enfriar en el
hielo el tampón de hibridación, se añadió 18,75 ml de formamida,
3,75 ml de 20xSSC y 9 ml de H_{2}O MQ, se volvió a agitar con el
vórtex y la mezcla se incubó a 42ºC sobre las secciones durante
1-4h.
Hibridación. Se calentaron a 95ºC durante 3 min,
1,0x10^{6} cpm de sonda y 1,0 \mul de tRNA (50 mg/ml solución
madre) por preparación. Las preparaciones se enfriaron en hielo y se
añadió 48 \mul de tampón de hibridación a cada una. Se añadieron
50 \mul de la mezcla-P^{33} a 50 \mul de
prehibridación por preparación. Las preparaciones se incubaron
durante toda la noche a 55ºC.
Lavados. Se realizaron dos lavados de 10 min co
2xSSC, EDTA a temperatura ambiente (400 ml de 20xSSC + 16 ml de EDTA
0,25 M, Vf= 4l), seguido del tratamiento con RNasa A a 37ºC, 30 min
(500 \mul de 10 mg/ml en 250 ml de tampón sin RNasa = 20
\mug/ml). Las preparaciones se lavaron 2x10 min con 2xSSC, EDTA a
temperatura ambiente. Las condiciones de astringencia fueron: 2 h a
55ºC, 0,1 xSSC, EDTA (20 ml de 20xSSC + 16 ml de EDTA, Vf= 4l).
El siguiente procedimiento describe el uso de una
secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido
CT-1 como sonda de hibridización.
Se utiliza ADN que comprende la secuencia de
codificación CT-1 de longitud completa o cultivado
(tal como se muestra en la figura 1, SEQ ID NO: 1 y 2) como sonda
para tamizar para ADNs homólogos (tales como los que codifican
variantes que se producen de manera natural de CT-1)
en librerías de ADNc de tejido humano o librerías genómicas de
tejido humano.
La hibridación y el lavado de los filtros que
contienen ADNs de cualquier librería se realiza bajo las siguientes
condiciones de alta estringencia. Hidridación de la sonda derivada
de CT-1 radioetiquetado a los filtros se realiza en
una solución de formamida 50%, 5x SSC, SDS 0,1%, pirofosfato de
sodio 0,1%, fosfato de sodio 50 mM, pH 6,8, 2x solución de Denhardt,
y sulfato de dextrano 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los
filtros se realiza en una solución acuosa de 0,1xSSC y SDS 0,1% a
42ºC.
A continuación se pueden identificar ADNs que
tienen una identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica
CT-1 de secuencia nativa de longitud completa usando
técnicas conocidas en la técnica.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
no glicosilada de CT-1, mediante expresión
recombinante en E. coli.
La secuencia de DNA que codifica
CT-1 (SEC ID 1) se amplifica inicialmente utilizando
cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deberían contener las
dianas de restricción que corresponden con las dianas de restricción
en el vector de expresión seleccionado. Se pueden utilizar muy
diversos vectores. Un ejemplo de un vector adecuado es el pBR322
(derivado de E. coli; véase Bolivar y col., Gene, 2:95
(1977)) que contiene genes para la resistencia a ampicilina y
tetraciclina. El vector se digiere con la enzima de restricción y se
desfosforila.Las secuencias de PCR amplificadas se ligan a
continuación en el vector. Este incluirá preferentemente secuencias
que codifican para un gen de resistencia a un antibiótico, un
promotor trp, un líder polihis (incluyendo los seis primeros codones
STII, la secuencia polihis, y la diana de corte de la
enteroquinasa), la región codificante de CT-1, el
terminador transcripcional de lambda y un gen argU.
La mezcla de ligación se utiliza para transformar
una cepa de E. coli seleccionada utilizando procedimientos
descritos en Sambrook y col., supra. Los transformantes se
identifican por su capacidad para crecer en placas de LB y a
continuación se seleccionan las colonias resistentes al antibiótico.
El cDNA del plásmido se puede aislar y confirmar su secuencia
mediante análisis de restricción y secuenciación.
Los clones seleccionados pueden crecerse durante
toda la noche en medio de cultivo líquido como el LB suplementado
con antibióticos. El cultivo de la noche se puede utilizar para
inocular un cultivo a mayor escala. Las células se crecen entonces a
una densidad óptica deseada, durante la cual el promotor de
expresión se activa.
Después de cultivar las células durante unas
cuantas hora más, se cosechan mediante centrifugación. El sedimento
celular se obtiene por centrifugación y luego se solubiliza con
diversos agentes conocidos en la materia. La proteína
CT-1 solubilizada, a continuación se purifica con
una columna quelante de metales en condiciones que permiten la unión
estrecha de la proteína.
CT-1 se expresa en E. coli
en una forma etiquetada con un poli-His, utilizando
el procedimiento siguiente. El DNA que codifica CT-1
se amplifica inicialmente utilizando cebadores de PCR. Los cebadores
contienen dianas de enzimas de restricción que corresponden con las
dianas de las enzimas de restricción del vector de expresión
seleccionado, y otras secuencias de utilidad que proporcionan un
inicio de traducción eficiente y factible, una purificación rápida
en una columna quelante de metal, y la eliminación proteolítica con
enteroquinasa. La PCR amplificada, las secuencias etiquetadas con
poli-His se ligan entonces en un vector de
expresión, que se utiliza para transformar un huésped E. coli
de la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion gal
ErpoHts(htpRts)cipP(lacIq). Los transformantes
se crecen primero en LB con carbenicilina 50 mg/ml a 30ºC con ligera
agitación hasta alcanzar una D.O. 600 de 3-5. Los
cultivos se diluyen a continuación de 50-100 veces
en medio CRAP (preparado mezclando 3,57 g
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de citrato
sódico-2H_{2}O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto
de levadura Difco, 5,36 g de licasa de Sheffield SF en 500 ml de
agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y MgSO4 7
mM) y se crecen durante aproximadamente 20-30 horas
a 30ºC con agitación. Se recogen muestras para verificar la
expresión por análisis SDS-PAGE y el grueso del
cultivo se centrifuga para sedimentar las células. Los sedimentos
celulares se congelan hasta su purificación y
replegamiento.
replegamiento.
La pasta de E. coli de fermentaciones de
0,5 a 1 l (6-10 g) se resuspende en 10 volúmenes
(p/v) en guanidina 7M, Tris 20 mM, pH 8. Se añaden sulfito sódico
sólido y tetrationato sódico para concentraciones finales de 0,1 M y
0,02 M, respectivamente. La solución se mezcla durante toda la noche
a 4ºC. Esta etapa resulta en una proteína desnaturalizada con todos
los residuso cisteína bloqueados por sulfitolización. La solución se
centrifuga a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman durante 30
min. El sobrenadante se diluye con 3-5 volúmenes de
tampón de columna quelante de metal (guanidina 6M, Tris 20 mM, pH
7,4) y se filtra a través de filtros de 0,22 micras para
clarificación. El extracto clarificado se carga en una columna
Quiagen de 5 ml Ni-NTA quelante de metal y
equilibrada con tampón de columna. La columna se lava con tampón que
contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La
proteína se eluye con tampón que contiene imidazol 250 mM. Las
fracciones que contienen la proteína deseada se agrupan y almacenan
a 4ºC. La concentración de proteína se estima por su absorbancia a
280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado según su
secuencia aminoacídica.
Las proteínas se repliegan diluyendo la muestra
lentamente en tampón de replegamiento preparado al momento y que
consiste en: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína 5
mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de replegamiento se
eligen para que la concentración final de proteína se halle entre 50
a 100 \mug/ml. La solución de replegamiento se mezcla suavemente a
4ºC durante 12-36 h. La reacción de replegamiento se
secuestra por la adición de TFA a una concentración final de 0,4%
(pH aproximado de 3). Antes de purificar más la proteína, la
solución se filtra a través de un filtro de 0,22 \mum y se añade
acetonitrilo a una concentración final de 2-10%. La
proteína replegada se cromatografía en una columna de fase inversa
Poros R1/H con un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución con
gradiente de acetonitrilo del 10% al 80%. Se analizan alícuotas de
las fracciones con A280 en geles de SDS poliacrilamida y las
fracciones que contienen proteína replegada se agrupan. En general,
las especies replegadas adecuadamente de la mayoría de las proteínas
se eluyen a las concentraciones menores de acetonitrilo ya que estas
especies son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos, que
las protegen de la interacción con la resina de la fase inversa.
Especies agregadas se eluyen generalmente a concentraciones
superiores de acetonitrilo. Además, para resolver las formas mal
plegadas de las proteínas de la forma deseada, la etapa de fase
inversa también elimina la endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contienen las proteínas
CT-1 deseadas, se agrupan y se elimina el
acetonitrilo utilizando una corriente suave de nitrógeno dirigido a
la solución. Las proteínas se formulan en Hepes 20 mM, pH 6,8 con
cloruro sódico 0,14 M y manitol al 4% mediante diálisis o filtración
en gel utilizando resinas Superfine G25 (Pharmacia) equilibradas en
el tampón de formulación y el filtro estéril.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
glicosilada de CT-1 mediante expresión recombinante
en células de mamífero.
El vector, pRK5 (véase la patente europea EP
307.247, publicada el 15 de marzo, de 1989) se utilizó como el
vector de expresión. Opcionalmente, el DNA de CT-1
se ligó en pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para
permitir la inserción del DNA de CT-1 utilizando
procedimientos de ligación como los descritos en Sambrook y col.,
supra. El vector resultante se denominó
pRK5-CT-1.
En una realización, las células huésped
seleccionadas pueden ser las células 293. Las células 293 humanas
(ATCC CCL 1573) se crecen hasta la confluencia en placas de cultivo
de tejidos en medio como el DMEM suplementado con suero fetal de
ternera y opcionalmente, componentes nutrientes y/o antibióticos.
Aproximadamente, 10 \mug del DNA de
pRK5-CT-1 se mezcló con
aproximadamente 1 \mug de DNA codificante del gen VA RNA
[Thimmappaya y col., Cell, 31:543 (1982)] y se disolvió en 500
\mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2}
0,227 M. A esta mezcla se añadió gota a gota 500 \mul de HEPES (pH
7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM y se dejó formar un
precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se resuspendió
y añadió a las células 293 y se dejó sedimentar durante
aproximadamente 4 horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspiró y se
añadió 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 s. A continuación,
se lavaron las células con medio sin suero, se añadió medio fresco y
las células se incubaron durante 5 días.
Aproximadamente, 24 horas después de las
transfecciones, el medio de cultivo se eliminó y reemplazó por medio
nuevo (sólo) o con 200 \muCi/ml de
cisteína-S^{35} y 200 \muCi/ml de
metionina-S^{35}. Al cabo de 12 h de incubación,
el medio se recogió, se concentró en un filtro de centrifugado, se
cargó en un gel de SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y
exponerse a la película durante un período de tiempo seleccionado
para revelar la presencia del polipéptido CT-1. Los
cultivos que contenían las células transfectadas pueden incubarse
por más tiempo (en medio sin suero) y analizarse el medio en
bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, el DNA de
CT-1 puede introducirse en células 293
transitoriamente utilizando el procedimiento del sulfato de dextrán
descrito por Somparyrac y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575
(1981). Las células 293 se crecen hasta la densidad máxima en un
frasco de centrifugado y se añaden 700 \mug de DNA de
pRK-5 CT-1. Las células se
concentran una primera vez por centrifugación y se lavan con PBS. El
precipitado de sulfato dextran se incuba con el sedimento celular
durante 4 horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante
90 s, se lavan con medio de cultivo de tejidos, y se
re-introducen en el frasco de centrifugado que
contiene medio de cultivo de tejidos, 5 \mug/ml de insulina bovina
y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente 4
días, el medio condicionado se centrifuga y se filtra para eliminar
las células y los restos celulares. La muestra que contiene el
CT-1 expresado pueden concentrarse y purificarse
mediante cualquier procedimiento seleccionado, como la diálisis y/o
cromatografía en columna.
En otra realización, CT-1 se
puede expresar en células CHO. El vector
pRK-5-CT-1 puede
transfectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos como el
CaPO_{4} o el DEAE-dextran. Tal como se describió
anteriormente, pueden incubarse los cultivos celulares y
reemplazarse el medio por medio de cultivo (sólo) o con
metionina-S^{35}. Después de determinar la
presencia del polipéptido CT-1, el medio de cultivo
puede reemplazarse con medio sin suero. Preferentemente, los
cultivos se incuban durante 6 días y luego se cosecha el medio
condicionado. El medio que contiene el CT-1
expresado, puede concentrarse y purificarse mediante cualquier
procedimiento seleccionado.
CT-12 etiquetado con epitopo
puede también expresarse en células CHO huésped. El
CT-1 puede subclonarse fuera del vector pRK5. El
inserto del subclon se puede amplificar por PCR para fusionarse en
el mismo marco de lectura con una etiqueta epitópica como el
poli-His en un marcador de selección como el DHFR
para la selección de clones estables. Por último, las células CHO
pueden transfectarse (tal como se describió anteriormente) con el
vector conducido por SV40. El marcaje se puede realizar, tal como se
describió anteriormente, para verificar la expresión. El medio de
cultivo que contiene el CT-1 etiquetado con
poli-His puede concentrarse y purificarse mediante
cualquier procedimiento seleccionado, como la cromatografía de
afinidad quelante de Ni2+.
El CT-1 se expresó en las células
CHO mediante un procedimiento de expresión transitoria y otros
estable. La expresión estable en las células CHO se realizó
utilizando el procedimiento siguiente. Las proteínas se expresaron
como una construcción de IgG (inmunoadhesinas), en las que las
secuencias codificantes para las formas solubles (p.ej., dominios
extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionaron a una
región constante de IgG1 que contenía la bisagra, los dominios
CH_{2} y CH_{2} y/o una etiqueta poli-His.
Después de la amplificación por PCR, el DNA58125
se subclonó en un vector de expresión CHO, utilizando técnicas
estándares tal como se describe en Ausubel y col., Current Protocols
of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley y Sons (1997). Los
vectores de expresión en CHO se construyeron para tener dianas de
restricción compatibles 5' y 3' con el DNA de interés, para permitir
el reordenamiento de los cDNAs adecuado. El vector utiliza la
expresión en células CHO tal como se describe en Lucas y col., Nucl.
Acids. Res. 24:9 (1774-1779 (1996)), y utiliza el
promotor temprano/intensificador de SV40 para conducir la expresión
del cDNA de interés y la reductasa dihidrofolato (DHFR). La
expresión de DHFR permite la selección para mantenimiento estable
del plásmido tras la transfección.
Se introdujeron 12 \mug del DNA plasmídico
deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando
reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect®
(Quiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las células se
crecieron tal como se describe en Lucas y col., supra.
Aproximadamente 3x10^{7} células se congelaron en una ampolla para
su posterior crecimiento y producción tal como se describe más
adelante.
Las ampollas que contenían el DNA plasmídico se
descongelaron colocándolas en un baño maría y se mezclaron al
vórtex. Los contenidos se pipetearon en un tubo de centrífuga con 10
ml de medio y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min. El
sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 10 ml de
medio selectivo (filtrado con filtro 0,2 \mum de PS20 con 5% suero
bovino fetal filtrado con filtro de 0,2 \mum). Las células se
alicuotaron en un frasco de centrifugado de 100 ml que contenía 90
ml de medio selectivo. Al cabo de 1-2 días, las
células se transfirieron a un frasco de 250 ml con 150 ml de medio
de crecimiento selectivo y se incubaron a 37ºC. Al cabo de
2-3 días, se sembraron frascos de 250 ml, 500 ml y
2000 ml con 3x105 células/ml. El medio se cambió por nuevo mediante
centrifugación y resuspensión en el medio de producción. Aunque,
puede utilizarse cualquier medio adecuado para CHO, se utilizó un
medio de producción descrito en la patente americana U.S. 5.122.469,
publicado el 16 de junio de 1992. Se sembró un frasco de 3 l a
1,2x10^{6} células/ml. El día 0, se determinó el número de
células. El día 1, se inició la adición de aire filtrado. El día 2,
se recogió una muestra, la temperatura se bajó a 33ºC y se añadieron
30 ml de glucosa 500 g/l y 0,6 ml de antiespumante al 10% (p.ej.,
emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, Dow Corning 365 Medical
Grade Emulsion). Durante la producción, se ajustó el pH para
mantener un pH de aproximadamente 7,2. Al cabo de 10 días, o hasta
que la viabilidad descendió por debajo del 70%, el cultivo celular
se cosechó por centrifugación y se filtró a través de un filtro de
0,22 \mum. El filrado se almacenó a 4ºC o se cargó inmediatamente
en columnas para la purificación.
Para las construcciones etiquetadas con
poli-His, se purificaron las proteínas utilizando
una columna Ni-NTA (Quiagen). Antes de la
purificación, se añadió imidazol al medio condicionado a una
concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombeó en una
columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada con Hepes 20 mmM,
pH 7,4, que contenía NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de
flujo de 4-5 ml/min a 4ºC. Después de cargar la
columna, ésta se lavó con tampón de equilibrado adicional y se eluyó
la proteína con imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada se
desaló a continuación en tampón de almacenamiento con hepes 10 mM,
NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna G25 Superfine
de 25 ml (Pharmacia) y se guardó a -80ºC.
El CT-1 puede producirse mediante
expresión transitoria en células COS, así como, utilizando técnicas
estándares.
El procedimiento siguiente describe la expresión
recombinante de CT-1 en levaduras.
En primer lugar, los vectores de expresión se
construyeron para la producción intracelular o secreción de
CT-1 a partir del promotor ADH2/GAPDH. El DNA58125
que codifica CT-1 y el promotor se insertaron en
dianas de restricción adecuadas en el plásmido seleccionado para
dirigir la expresión intracelular de CT-1. Para la
secreción, el DNA que codifica CT-1 puede clonarse
en el plásmido seleccionado, junto con el DNA que codifica el
promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal nativo u otor péptido señal de
mamífero, o por ejempol, una secuencia señal secretora/secuencia
líder del factor alfa de levadura o de la invertasa, y secuencias de
engarce (si son necesarias) para la expresión de
CT-1.
Las células de levadura, como la cepa de levadura
AB110, puede transformarse con los plásmidos de expresión descritos
anteriormente y cultivados en medio de fermentación seleccionado.
Los sobrenadantes de levadura transformados pueden analizarse
mediante precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación
por SDS-PAGE, seguido por tinción de los geles con
Coomassie Blue.
El CT-1 recombinantes puede
aislarse y purificarse eliminando las células de levadura del medio
de fermentación mediante centrifugación y luego concentrar el medio
utilizando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que
contien CT-1 puede purificarse posteriormene con
resinas de cromatografía en columna.
El siguiente procedimiento describe la expresión
de CT-1 recombinante en células de insecto
infectadas con Baculovirus.
La secuencia codificante para
CT-1 se fusionó cadena arriba de una etiqueta
epitópica contenida en un vector de expresión de baculovirus. Dichas
etiquetas epitópicas incluyen etiquetas poli-His y
etiquetas de inmunoglobulina (regiones de tipo Fc de IgG). Se pueden
utilizar diversos plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de
plásmidos disponibles comercialmente como pVL1393 (Novagen). En
resumen, la secuencia codificante de CT-1 o la
porción deseada de la secuencia codificante de CT-1
(como la secuencia codificante del dominio extracelular de una
proteína de membrana o la secuencia que codifica la proteína madura
si la proteína es extracelular) se amplifica mediante PCR con
cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5'
puede incorporar dianas de restricción flanqueantes (seleccionadas).
El producto se digiere con las enzimas de restricción seleccionadas
y se subclona en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante
co-transfección del plásmido anterior y el DNA del
virus
BaculoGold^{TM} (Pharmigen) en las células Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Al cabo de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se cosechan y utilizan para posterior amplificación. La infección viral y la expresión de proteína se realizaron tal como se describe por O'Reilley y col., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press (1994).
BaculoGold^{TM} (Pharmigen) en las células Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL). Al cabo de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se cosechan y utilizan para posterior amplificación. La infección viral y la expresión de proteína se realizaron tal como se describe por O'Reilley y col., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press (1994).
El CT-1 etiquetado con
poli-His expresado puede purificarse, por ejemplo,
mediante cromatografía de afinidad quelante de Ni2+ como sigue. Los
extractos se prepararon a partir de células Sf9 infectadas con el
virus recombinante, tal como se describe por Rupert y col., Nature,
362:175-179 (1993). En resumen, las células Sf9 se
lavaron, se resuspendieron en tampón de sonicación (25 ml de Hepes,
pH 7,9, MgCl_{2} 12,5 mM, EDTA 0,1 mM, glicerol al 10%,
NP-40 al 0,1%, KCl 0,4 M) y se sonicaron dos veces
durante 20 s en hielo. Los sonicados se clarificaron mediante
centrifugación y el sobrenadante se diluyó 50 veces en tampón de
carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se
filtró a través de un filtro de 0,45 \mum. Una columna de agarosa
de Ni2+-NTA (disponible comercialmente de Quiagen) se preparó con un
volumen de lecho de 5 ml, se lavó con 25 ml de agua y se equilibró
con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se cargó
en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lavó en la línea
basal A280, con tampón de carga, en cuyo punto se inició la
recolección de fracciones. A continuación, la columna se lavó con un
tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al
10%, pH 6,0), que eluye las proteínas de unión inespecífica. Después
de alcanzar de nuevo la línea basal A280, la columna se reveló con
un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de lavado
secundario. Se recogieron fracciones de 1 ml y se analizaron por
SDS-PAGE y tinción de plata o transferencia de
Western ocn Ni2+-NTA-conjugado con fosfatasa
alcalina (Qiagen). Las fracciones que contenían el
CT-1 etiquetado con His_{10} eluído se agruparon y
dializaron contra tampón de carga. Alternativamente, la purificación
del CT-1 etiquetado con IgG (o con Fc) puede
realizarse con técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por
ejemplo, la cromatografía de columna de proteína A o proteína G.
Mientras que la expresión de CT-1
se realiza en una escala de 0,5-2 l, también puede
realizar a mayor escal (p.ej., 8 l). CT-1 se expresa
como una construcción de IgG (inmunoadhesina), en la que la región
extracelular de la proteína está fusionada con una secuencia de
región constante de IgG que contiene la bisagra, los dominios
CH_{2} y CH_{3} y/o las formas etiquetadas con
poli-His.
Después de la amplificación por PCR, la secuencia
codificante se subclona en un vector de baculovirus (pb.PH.IgG para
fusiones IgG y pb.PH.His.c para proteínas etiquetadas con
poli-His) y se cotransfectan el vector y el DNA de
baculovirus Baculgold^{TM} (Pharmigen) en células 105
Spodoptera frugiperda ("Sf9")(ATCC CRL 1711), utilizando
Lipofectin (GibcoBRL). pb.PH.IgG y pb.PH.His son modificaciones del
vector de expresión de baculovirus disponibles comercialmente
pVL1393 (Pharmigen), con regiones del poliengarce modificadas para
incluir las secuencias de etiquetas His o Fc. Las células se crecen
en medio Hink TNM-FH suplementado con FBS al 10%
(Hyclone). Las células se incuban durante 5 días a 28ºC. El
sobrenadante se cosecha y se utiliza a continuación para la primera
amplificación viral infectando células Sf9 en medio Hink
TNM-FH suplementado con FBS al 10% a una
multiplicidad de infección (MOI) de 10. Las células se incuban
durante 3 días a 28ºC. El sobrenadante se recoge y se determina la
expresión de las construcciones y del vector de expresión de
baculovirus mediante ensayo de unión de 1 ml del sobrenadante con 25
ml de bolas de nI-NTA (Qiagen) para las proteínas
etiquetadas con histidina o bolas CL-4B de proteína
A-Sepharose (Pharmacia) para proteínas etiquetadas
con IgG mediante análisis SDS-PAGE, comparando con
una concentración conocida de proteína estándar mediante tinción de
Coomassie Blue.
El sobrenadante de la primera amplificación
amplificación viral se utilizó para infectar un cultivo de 500 ml de
células Sf9 crecidas en medio ESF-921 (Expression
Systems LLC) a una MOI de aproximadamente 0,1. Las células se
incubaron durante 3 días a 28ºC. Los sobrenadantes se cosecharon y
filtraron. El ensayo de unión y el análisis de
SDS-PAGE se repitieron, tantas veces como fue
necesario, hasta confirmar la expresión del cultivo.
El medio condicionado de las células
transfectadas (0,5 a 3 l) se cosechó mediante centrifugación para
eliminar las células y se filtró con filtros de 0,22 \mum. Para
las construcciones etiquetadas con poli-His, se
purificaron las construcciones de proteína utilizando una columna
Ni-NTA (Qiagen). Antes de la purificación, se añadió
imidazol al medio condicionado a una concentración de 5 mM. El medio
condicionado se bombeó en una columna equilibrad de
Ni-NTA de 6 ml en Hepes 20 mM, pH 7,4 con NaCl 0,3 M
e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5
ml/min a 4ºC. Después de cargar la columna, ésta se lavó con tampón
de equilibrado adicional y se eluyó la proteína con imidazol 0,25 M.
La proteína altamente purificada se desaló a continuación en un
tampón de almacenamiento que contenía Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y
manitol al 4%, pH 6,8, con una columna de G25 Superfine de 25 ml
(Pharmacia) y se guardó a -80ºC.
Las construcciones proteicas de inmunoadhesina
(que contienen Fc) se purificaron a partir del medio condicionado de
la manera siguiente. El medio condicionado se bombeó en una columna
de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) equilibrada co tampón de elución
de fosfato sódico 20 mm, pH 6,8. Después de la carga, la columna se
lavó extensamente con tampón de equilibrio antes de la elución con
ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluida se neutralizó
inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contenían
275 de Tris 1M, pH 9. La proteína altamente purificada se desaló a
continuación en tampón de almacenamiento tal como se describió
anteriormente para las proteínas etiquetadas con
poli-His. La homogeneidad de las proteínas se
verificó mediante SDS-PAGE y secuenciación
N-terminal por degradación de Edman.
Este ejemplo muestra la que preparación de
anticuerpos monoclonales puede unirse específicamente a
CT-1.
Las técnicas para la producción de anticuerpos
monoclonales son conocidas en la materia y se describen, por
ejemplo, en Goding, supra. Los inmunógenos que pueden
utilizarse incluyen las proteínas de fusión CT-1,
que contienen CT-1 y las células que expresan
CT-1 recombinante en la superficie celular. La
selección del inmunógeno puede realizarse por el experto en la
materia si demasiada experimentación.
Los ratones, como los Balb/c, se inmunizan con el
inmunógeno CT-1 emulsificado en adyuvante completo
deFreund y se les inyecta subcutánea o itraperitonealmente una
cantidad de 1-100 \mug. Alternativamente, el
inmunógeno se emulsiona en adyuvante MPL-TDM (Ribi
Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyecta en las
almohadillas de las patas traseras de los conejos. Los ratones
inmunizados se refuerzan a los 10-12 días después
con inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado.
En consecuencia, durante varias semanas, los ratones tambióen se
estimulan con inyecciones de inmunización adicional. Las muestras de
suero pueden obtenerse periódicamente de los ratones por sangrado
retro-orbital para los ensayos de ELISA para
detectar anticuerpo anti-CT-1.
Después de detectar el título de un anticuerpo
adecuado, los animales "positivos" para los anticuerpos se
pueden inyectar con una inyección intravenosa de
CT-1. Tres a 4 días más tarde, se sacrifican los
ratones y se extraen las células del bazo. Estas se fusionan
(utilizando polietilén glicol al 35%) con una línea celular de
mieloma murino seleccionada, como por ejemplo P3X63AgU.1, disponible
de ATCC CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que
pueden plaquearse en placas de cultivo de 96 pocillos en medio HAT
(hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación
de células no fusionadas, mielomas híbridos, e híbridos de células
del bazo.
Las células de hibridoma se tamizan en un ELISA
para su reactividad contra CT-1. La determinación de
las células de hibridoma "positivas" que segregan los
anticuerpos monoclonales deseados contra CT-1 está
dentro de los conocimientos de un técnico en la materia.
Las células de hibridoma positivas pueden
inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c singénicos para
producir ascitas que contenga anticuerpos monoclonales
anti-CT-1. Alternativamente, las
células de hibridoma pueden crecerse en frascos de cultivos
celulares o botellas rotativas. La purificación de los anticuerpos
monoclonales producidos por ascitas puede lograrse utilizando la
precipitación con sulfato de amonio, seguido por cromatografía de
exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse la
cromatografía por afinidad basada en la unión del anticuerpo a la
proteína A o la proteína G.
El material siguiente, un plásmido que codifica
CT-1 (descrito en la patente americana U.S.
5.571.893, publicada el 5 de noviembre de 1996), se ha depositado en
en el American Type Culture Collection, 1081 University Blvd.
Manassas, VA, 20110-2209, USA (ATCC):
| Material | ATCC Dep. No. | Fecha del depósito |
| pBSSK+ huCT1.h5 | 75.841 | 26 de julio de 1994 |
El depósito se realizó según el Tratado de
Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de
Microorganismos para el propósito de Procedimientos de Patentes y su
Regulación (Tratado de Budapest). Ello asegura el mantenimiento de
un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha del
depósito. El depósito estará disponible por ATCC bajo los términos
del Tratado de Budapest y sometido a un acuerdo entre Genentech,
Inc. y ATCC, que asegure la disponibilidad permanente y no
restringida de la progenie del cultivo del depósito al público bajo
el seguro de la patente americana o abierta al público de cualquier
estado americano U.S. o patente extranjera, quien venga primero, y
asegura la disponibilidad de la progenie a uno determinado por el
Comisionado U.S. de Patentes y Marcas de acuerdo con el artículo 35
U.S.C. & 122 con arreglo a las normas del Comisionado
(incluyendo 37 CFR & 1.14 con particular referencia a886 OG
638).
El concesionario de la presente invención ha
acordado que si el cultivo de los materiales depositados mueren o se
pierden o se destruyen cuando se cultivaban en condiciones
adecuadas, los materiales se reemplazarán prontamente tras
notificación por otra muestra del mismo cultivo. La disponibilidad
del material depositado no debe interpretars como una licencia para
la práctica de la invención en contravención de los derechos
garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno, de acuerdo con
sus leyes vigentes.
Las especificaciones escritas se consideran
suficientes para permitir a un experto en la materia practicar la
invención. La presente invención no está limitada en el ámbito de la
invención por la construcción depositada, ya que la realización
depositada pretende ser una ilustración sencilla de ciertos aspectos
de la invención.
El depósito del material de la presente invención
no constituye la admisión de que la descripción escrita aquí
contenida sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier
aspecto de la invención, incluyendo el modo mejor, tampoco debe
considerarse como una limitación del ámbito de las reivindicaciones
respecto a los ejemplos específicos que se representan. Incluso,
diversas modificaciones además de las mostradas y las descritas aquí
serán evidentes a los expertos en la materia a partir de la
descripción que se facilita y se halla dentro del ámbito de las
reivindicaciones anexadas.
Claims (9)
1. Procedimiento de diagnóstico de un tumor en un
mamífero, que comprende la detección de la amplificación de y/o el
nivel de la expresión de un gen que codifica un polipéptido de
cardiotrofina-1 (CT-1), (a) en una
muestra a analizar de células del tejido obtenido de un mamífero, y
(b) en una muestra control de células de un tejido normal del mismo
tipo celular, en el que la amplificación génica y/o un nivel de
expresión superior en la muestra a analizar indica la presencia del
tumor en el mamífero de donde se obtuvieron las células del tejido a
analizar.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, la
amplificación y/o el nivel de expresión se detecta mediante la
utilización de una sonda de ácido nucleico marcada, derivada de la
secuencia de la Fig. 1.
3. Procedimiento de diagnóstico de un tumor en un
mamífero, que comprende (a) contactar un anticuerpo
anti-CT-1 con una muestra a analizar
de las células del tejido obtenido del mamífero, y (b) detectar la
formación de un complejo entre el anticuerpo
anti-CT-1 y un polipéptido
CT-1 en la muestra a analizar.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, que
se realiza en comparación con la monitorización de la formación del
complejo en una muestra control de células de tejido normal del
mismo tipo celular en comparación con el control, en donde una gran
cantidad de complejos formados en las muestra a analizar es
indicativo de la presencia del tumor en el mamífero, de quien se han
obtenido las células del tejido a analizar.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la muestra a analizar se
obtiene de un individuo sospechoso de presentar crecimiento o
proliferación de células neoplásicas.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el tumor es un tumor de
pulmón, colon o mama.
7. Utilización de un agente que inhibe la
expresión y/o la actividad de un polipéptido CT-1 en
la preparación de un medicamento para el tratamiento del tumor.
8. Utilización de acuerdo con la reivindicación
7, en el que el tratamiento está dirigido a un tumor de pulmón,
colon o mama.
9. Utilización de acuerdo con la reivindicación 7
o la reivindicación 8, en el que el agente es (i) un anticuerpo
anti-CT-1, o (ii) un ácido nucleico,
el cual es una molécula antisentido, una ribozima o una molécula de
triple hélice.
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