KR20010103576A - 종양 치료용 조성물 및 치료 방법 - Google Patents

종양 치료용 조성물 및 치료 방법 Download PDF

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케네스 제이. 힐란
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윌리암 아이. 우드
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 인간을 비롯한 포유동물에서 신생물 세포의 성장 및 증식의 진단 및 치료용 조성물, 및 진단 및 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종양 세포의게놈에서 증폭된 유전자의 확인을 기초로 한다. 그러한 유전자 증식은 동일 조직 타입의 정상 세포에 비해 유전자 생성물의 과발현된 것과 관련되어 있으며, 종양발생의 원인이 되는 것으로 여겨진다. 따라서, 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 특정 암의 진단 및(또는) 치료(예방을 비롯하여)에 유용한 표적이며, 종양 치료의 예후의 예시자로서 작용할 수 있는 것으로 여겨진다.

Description

종양 치료용 조성물 및 치료 방법{Compositions and Methods for The Treatment of Tumor}
악성 종양(암)은 심장 질환에 이어 두 번째로 높은 사망 원인이다(Boring et al., CA Cancer J. Clin., 43:7 [1993]).
암은 정상 조직으로부터 유래된 비정상적이거나 신생물성인 세포(증식하여 종양 덩어리를 형성함) 수의 증가, 이 신생물성 종양 세포에 의한 인접 조직으로의 침입 및 결국 혈액 또는 림프계를 통해 국부적 림프절 및 원격 부위로 퍼지는 (전이) 악성 세포의 발생을 특징으로 한다. 암 상태에서, 세포는 정상 세포가 성장하지 않는 상태에서 증식한다. 암은 침입성 및 침습성의 상이한 정도를 특징으로 하는 각종 형태로 그 자체로 확장된다.
유전자 발현의 이상은 모든 암의 통상적인 특징인 조절되지 않은 세포 성장 및 탈분화와 밀접하게 관련되어 있다. 잘 연구되어 있는 특정 종양의 게놈에서는 통상 종양 억제유전자로 불리며 정상적으로는 악성 세포 성장을 억제하는 기능을 하는 열성유전자의 발현이 감소되어 있고(거나), 악성 성장을 촉진시키는 기능을 하는 특정 우성유전자, 예를 들어, 종양유전자가 과발현되어 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 각 유전적 변화는 총체적으로 완전한 신생물성 표현형을 나타내는 몇가지 중요한 형질의 원인이 되는 것으로 여겨진다(Hunter, Cell, 64:1129 [1991] and Bishop, Cell, 64:235-248 [1991]).
암 세포에서의 유전자(예를 들어, 종양유전자) 과발현의 잘 공지된 기전은 유전자 증폭이다. 이는 조상 세포의 염색체에서 특정 유전자의 조상 세포 다수 복제본이 생성되는 과정이다. 이 과정은 유전자를 포함하는 염색체 영역의 예정되지 않은 복제에 이어 복제된 세그먼트가 재조합되어 통합되는 과정을 포함한다(Alitalo et al., Adv. Cancer Res., 47-235-281 [1986]). 유전자의 과발현이 유전자 증폭과 평행 관계가 되는, 즉 생성되는 복제본 수에 비례하는 것으로 여겨진다.
성장 인자 및 성장 인자 수용체를 코딩하는 원시 종양유전자(proto-oncogene)는 유방암을 비롯한 각종 인간 악성 질환의 병인에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 예를 들어, 상피 성장 인자 수용체 EGFR과 관련된 185 kd 막횡단 당단백질 수용체(p185HER2; HER2)를 코딩하는 인간 ErbB2 유전자(또한 her2 또는 c-erbB-2로도 공지된 erbB2)는 인간 유방암의 약 20% 내지 약 30%에서 과발현된 것으로 밝혀졌다(Slamon et al., Science, 235:177-182[1987]; Slamon et al., Science, 244:707-712[1989]).
원시 종양유전자의 유전자 증폭은 전형적으로 보다 악성인 형태의 암과 관련된 사건이며, 임상 결과의 예시자로서 작용할 수 있는 것으로 보고되었다(Schwabet al., Genes Chromosomes Cancer, 1:181-193[1990]; 상술한 문헌, 즉 Alitalo et al.,). 따라서, erbB2 과발현은 특히 엽액 림프절과 관련된 1차 질환의 환자에서 통상 불량한 예후의 예시자로 여겨지며(상술한 문헌 Slamon et al.,[1987] 및 [1989]; Ravdin and Chamness, Gene, 159:19-27[1995]; 및 Hynes and Stern, Biochim. Biophys. Acta. 1198:165-184[1994]), 호르몬 치료 및 CMF(시클로포스파미드, 메토트렉세이트 및 플루오르우라실) 및 안트라실린을 비롯한 화학요법 섭생에 대한 감수성 및(또는) 내성과 결부되어 있는 것으로 여겨진다(Baselge et al., Oncology, 11(3 Suppl 1):43-48[1997]). 그러나, 불량한 예후르 보이는 erbB2 과발현과 관련되어 있지만, 탁산을 사용한 치료에 임상적으로 반응하는 HER2-양성 환자의 이상 증상은 HER2-음성 환자보다 3 배 더 높다. 재조합 인간화 항-ErB2(항-HER2), 모노클로날 항체(쥐 항-ErbB2 항체 4D5의 인간화 버젼은 rhuMAb Her2 또는 상표명 헤르셉틴으로 언급됨)는 항암 치료전에 광범위하게 수용된 ErbB2 과발현 전이 유방암 환자에서 임상적으로 활성적이었다(Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14:737-744 [1996]).
상술한 바에 비추어, 명백하게도 유전자 증폭과 관련되어 있는 종양의 신규 진단 및 치료용 조성물과 진단 및 치료 방법을 확인하는데 흥미가 있게 되었다.
<발명의 요약>
본 발명은 인간을 포함하는 포유동물에서 신생물성 세포의 성장 및 증식의 진단 및 치료용 조성물 및 진단 및 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종양 세포의 게놈에서 증폭되는 유전자를 확인하는 것을 기초로 한다. 그러한 유전자 증폭은 유전자 생성물의 과발현과 관련되어 있으며, 종양형성의 원인이 되는 것으로 생각된다. 따라서, 증폭된 유전자에 의해 코딩된 단백질은 특정 암의 진단 및(또는) 치료(예방을 포함하여)에 있어 유용한 표적인 것으로 여겨지며, 종양 치료의 예후의 예시자로 작용할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드로 지칭되는 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체에 관한 것이다, 다른 측면에서, 항체는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 발현하는 세포의 사멸을 유도한다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 과발현하는 세포는 때로는 동일한 조직 타입의 정상 세포에 비해 폴리펩티드를 과발현하는 종양 세포이다. 또다른 측면에서, 항체는 바람직하기로는 비-인간 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR) 잔기 및 인간 프레임워크(framework) 영역(FR) 잔기를 갖는 모노클로날 항체이다. 항체는 표지화할 수 있고, 고체 지지체상에 고정화 할 수 있다. 또다른 측면에서, 항체는 바람직하기로는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 단편, 단일쇄 항체 또는 인간화 항체이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 바람직하기로는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체와 제약상 허용가능한 담체가 혼합된 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명의 조성물은 치료 유효량의 항체를 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명의 조성물은 예를 들어, 추가의 항체 또는 세포독성제 또는 화학치료제일 수 있는 추가의 활성 성분을 포함한다. 조겅물은 멸균된 것이 바람직하다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 및 그러한 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317항체를 코딩하는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포를 항체를 발현시키기에 충분한 조건하에 배양시키고, 세포 배양액으로부터 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 및(또는)면역학적 기능 또는 활성을 억제하는, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 길항제에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 그의 상보체에 혼성화되는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 단리된 핵산분자는 DNA가바람직하고, 혼성화는 엄격한 혼성화 및 세척 조건에서 일어나는 것이 바람직하다. 상기 핵산 분자는 본원에서 확인된 증폭된 유전자의 안티센스 분자로 작용할 수 있으며, 이는 또한 각 증폭된 유전자의 전사 및(또는) 번역에서, 또는 증폭 반응의 안티센스 프라이머로서 유용할 수 있다. 또한, 그러한 서열은 리보자임 및(또는) 삼중 나선 서열의 일부로 사용할 수 있고, 또한 증폭된 유전자의 조절에 사용할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체에 노출시키고, 상기 샘플에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체가 결합하는 것을 결정하는 것을 포함하는, 상기 샘플에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 존재를 결정하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 세포를 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체에 노출시키고, 항체가 세포 결합하는 것을 결정하는 것을 포함하는, 세포에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 존재를 결정하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험샘플 및 (b) 공지된 동일한 조직 타입의 정상 조직 세포의 대조용 샘플에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 종양의 진단 방법에 관한 것이며, 이 방법에서 대조용 샘플에 비해 시험 샘플의 발현 수준이 보다 높다면, 이는 시험 조직 세포를 얻은 포유동물에 종양이 존재함을 지시하는 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 시험 샘플을 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체를 포유동물로부터 얻은 조직 세포와 접촉시키고, 시험 샘플에서 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체와 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드와의 결합체의 형성을 결정하는 것을 포함하는 것을 포함하는, 포유동물에서 종양의 진단 방법에 관한 것이며, 이 방법에서 결합체의 형성은 상기 포유동물에 종양이 존재함을 지시하는 것이다. 검출은 정성 또는 정량적일 수 있으며, 공지된 동일한 세포 타입의 정상 조직 세포의 대조용 샘플에서의 결합체 형성을 모니터링한 결과를 비교하여 수행할 수 있다. 시험 샘플에 보다 다량의 결합체가 형성되었다는 것은 시험 조직 세포를 얻은 포유동뭉에 종양이 존재함을 지시하는 것이다. 항체는 검출가능한 포지를 포함하는 것이 바람직하다. 결합체 형성은 예를 들어, 광학현미경, 유동 세포계측법(flow cytometry), 형광측정법 또는 당업계에 공지된 다른 기술로 모니터링할 수 있다.
시험 샘플은 통상 신생물성 세포 성장 또는 증식으로 의심되는 환자의 세포(예를 들어, 암 세포)로부터 얻는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 적합한 용기내에 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체 및 담체(예를 들어, 완충제)를 포함하는 암 진단용 키트에 관한 것이다, 키트는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플에서 상기 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위해 항체를 사용하는 설명서를 포함하는 것이 바람직하다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역적 활성 및(또는) 발현을 억제하는 물질의 유효량에 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포를 노출시켜 종양 세포의 성장을 억제시키는 것을 포함하는, 종양 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 물질은 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체, 작은 유기 및 무기 분자, 펩티드, 포스포펩티드, 안티센스 또는 리보자임 분자 또는 삼중 나선 분자가 바람직하다. 특정 측면에서, 상기 물질, 예를 들어, 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체는 세포 사멸을 유도한다. 추가의 측면에서, 종양 세포는 방사선 치료 및(또는) 세포독성제 또는 화학치료제에 더 노출시킬 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 용기; 용기상의 라벨; 및 상기 용기중에 함유된 활성제를 포함하는 조성물을 포함하며, 상기 조성물은 종양 세포의 성장을 억제하는데 효과적이며, 상기 용기상의 라벨은 상기 상기 조성물이 동일한 조직 타입의 정상 세포에 비해 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드가 과발현되는 것을 특징으로 하는 증상을 치료하는데 사용할 수 있음을 가리키는 것인 제품에 관한 것이다. 특정 측면에서, 상기 조성물중의 활성제는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 활성 및(또는) 발현을 억제하는 물질이다. 바람직한 측면에서, 활성제는 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명은 또한 후보 화합물을 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드와 이들 두 성분이 상호작용할 수 있는 충분한 시간 및 조건하에 접촉시키고, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역적 활성이 억제되는지의 여부를 결정하는 포함하는, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이다. 다른 측면에서, 비-고정화 성분은 검출가능한 표지를 갖는다. 바람직한 측면에서, 본 발명은 (a) 세포와 스크리닝될 후보 화합물을 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246또는 PRO317 폴리펩티드 존재하에 상기 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응을 유도하기에 적절한 조건하에 접촉시켜 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 존재를 스크리닝하는 단계, 및 (b) 시험 화합물이 효과적인 길항제인지의 여부를 결정하기 위해 상기 세포 반응이 유도되는 것을 결정하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 세포를 후보 화합물과 접촉시키고, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 발현이 억제되는지의 여부를 결정하는 것을 포함하는, 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포에서 상기 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 바람직한 측면에서, 본 발명은 (a) 세포와 후보 화합물을 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 발현시키기에 적절한 조건하에 접촉시키는 단계, (b) 상기 폴리펩티드의 발현이 억제되는 것을 결정하는 단계를 포함한다.
<도면의 간단한 설명>
도 1은 본원에서 DNA27864-1155로 지칭된 클론인, 천연 서열 PRO187을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열 1)을 보여준다.
도2 는 서열 1의 코딩 서열로부터 유래된 것으로서 천연 서열 PRO187 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열 2)을 보여준다.
도 3은 본원에서 DNA49435-1219로 지칭된 클론인, 천연 서열 PRO533을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열 6)을 보여준다. 또한, 굵은 활자 및 밑줄친 활자는 각각의 개시 및 종료 코돈이 위치하는 서열이다.
도 4는 서열 6의 코딩 서열로부터 유래된 것으로서 천연 서열 PRO533 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열 7)을 보여준다.
도 5는 본원에서 DNA32286-1191로 지칭된 클론인, 천연 서열 PRO214를 코딩하는 핵산 서열을 갖는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열 11)을 보여준다. 또한, 굵은 활자 및 밑줄친 활자는 각각의 개시 및 종료 코돈이 위치하는 서열이다.
도 6은 서열 11의 코딩 서열로부터 유래된 것으로서 천연 서열 PRO214 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열 16)을 보여준다.
도 7은 본원에서 DNA34387-1138로 지칭된 클론인, 천연 서열 PRO240을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열 16)을 보여준다. 또한, 굵은 활자 및 밑줄친 활자는 각각의 개시 및 종료 코돈이 위치하는 서열이다.
도 8은 서열 11의 코딩 서열로부터 유래된 것으로서 천연 서열 PRO240 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열 17)을 보여준다.
도 9는 본원에서 DNA32292-1131로 지칭된 클론인, 천연 서열 PRO240을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열 21)을 보여준다. 또한, 굵은 활자 및 밑줄친 활자는 각각의 개시 및 종료 코돈이 위치하는 서열이다.
도 10은 서열 21의 코딩 서열로부터 유래된 것으로서 천연 서열 PRO240 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열 22)을 보여준다.
도 11은 본원에서 DNA33223-1136으로 지칭된 클론인, 천연 서열 PRO230을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열 26)을 보여준다. 또한,굵은 활자 및 밑줄친 활자는 각각의 개시 및 종료 코돈이 위치하는 서열이다.
도 12는 서열 26의 코딩 서열로부터 유래된 것으로서 천연 서열 PRO230 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열 27)을 보여준다.
도 13은 본원에서 DNA33473-1176으로 지칭된 클론인, 천연 서열 PRO261을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열 31)을 보여준다. 또한, 굵은 활자 및 밑줄친 활자는 각각의 개시 및 종료 코돈이 위치하는 서열이다.
도 14은 서열 31의 코딩 서열로부터 유래된 것으로서 천연 서열 PRO240 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열 32)을 보여준다.
도 15은 본원에서 DNA35639-1172로 지칭된 클론인, 천연 서열 PRO246을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열 36)을 보여준다. 또한, 굵은 활자 및 밑줄친 활자는 각각의 개시 및 종료 코돈이 위치하는 서열이다.
도 16은 서열 36의 코딩 서열로부터 유래된 것으로서 천연 서열 PRO240 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열 37)을 보여준다.
도 17은 본원에서 DNA33461-1199로 지칭된 클론인, 천연 서열 PRO317을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 cDNA의 뉴클레오티드 서열(서열 41)을 보여준다. 또한, 굵은 활자 및 밑줄친 활자는 각각의 개시 및 종료 코돈이 위치하는 서열이다.
도 18은 서열 41의 코딩 서열로부터 유래된 것으로서 천연 서열 PRO240 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열 42)을 보여준다.
도 19A 내지 9D는 ALIGN02 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 % 아미노산 서열 동일성(도 19 A 및 19 B)및 % 핵산 서열 동일성(도 19C 및 19D)을 측정하기 위해 하기에 설명된 방법을 이용하기 위한 이론예를 보여준다. 여기서, "PRO"는 관심있는 이론적 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가리키고, "비교 펩티드"는 관심있는 "PRO" 폴리펩티드와 비교할 펩티드의 아미노산 서열을 가리키고, "PRO-DNA"는 관심있는 이론적 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 코딩 핵산 서열을 가리키고, "비교 DNA"는 관심있는 "PRO-DNA" 핵산 분자와 비교할 핵산 분자의 핵산 서열을 가리키고, "X"."Y" 및 "Z" 각각은 상이한 이론적 아미노산 잔기를 나타내고, "N", "L" 및 "V" 각각은 상이한 이론적 뉴클레오티드를 가리킨다.
도 20A 내지 20Q는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 위한 완전한 원천 코드를 제공한다. 이 원시 코드는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램에 제공하기 위해 통상 UNIX 운용 시스템상에서 사용하기 위한 다른 부호로 번역될 수 있다.
도 21은 DNA27864-1155의 지도화 영역을 보여주는 염색체 1의 지도이다.
도 22는 DNA34387-1138의 지도화 영역을 보여주는 염색체 2의 지도이다.
도 23은 DNA33223-1136의 지도화 영역을 보여주는 염색체 8의 지도이다.
본 발명은 종양의 진단 및 치료용 조성물 및 그 방법에 관한 것이다.
1. 정의
"유전자 증폭" 및 "유전자 복제"는 서로 바꿔 사용할 수 있고, 특정 세포 또는 세포주에서 유전자 또는 유전자 단편의 다수 복제본이 형성되는 과정을 말한다. 복제된 영역(증폭된 DNA 스트레치)는 종종 "앰플리콘(amplicon)"으로 불린다. 통상, 생성되는 mRNA의 양, 즉 유전자 발현량은 발현되는 특정 유전자의 복제본의 개수에 비례한다.
본원에 사용된 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 예비암성 및 암성 세포 및 조직을 말한다.
"암" 및 "암성"이란 비조절된 세포 증식이라는 전형적 특징을 갖는 포유동물의 생리 상태를 의미하거나 규정한다. 암의 예로는 비제한적으로, 암종, 임파종, 아세포종, 육종 및 백혈병이 있다. 상기 암의 보다 구체적인 예로는 유방암, 전립선암, 결장암, 판상 세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위장암, 췌장암, 신경교아종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 결장직장암, 자궁내막암, 타액선암종, 신장암, 외음부암, 갑상선암, 간암종 및 여러 종류의 두부 및 경부암이 있다.
"치료"란 질병의 병리 상태의 발병 또는 변화를 예방하기 위해 수행하는 대책을 의미한다. 따라서, "치료"는 치료제를 사용한 치료 및 억제 또는 예방 조치둘 다를 가리킨다. 치료를 요하는 인간이란 이미 질병에 걸린 인간 뿐만 아니라 질병을 예방해야하는 인간을 포함한다. 종양(예를 들어, 암) 치료에서, 치료제는 암 세포의 병리를 직접 감소시킬 수 있거나, 종양 세포를 다른 치료제, 예를 들어, 방사선 및(또는) 화학요법제에 의한 처리에 보다 감응성이도록 할 수 있다.
암의 "병리"란 환자의 건강에 손상을 주는 모든 현상이 포함된다. 이러한 것으로는 비제한적으로, 비정상 또는 조절될 수 없는 세포 성장, 전이, 인접 세포의 정상적인 기능 방해, 시토킨 또는 다른 분비물의 비정상적 수준에서의 분비, 염증 또는 면역 반응의 억제 또는 악화 등이 있다.
치료 목적의 "포유동물"은 인간, 가축 및 사육 동물, 및 동물원용, 경기용 또는 애완용 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 비롯하여 포유동물로 분류되는 모든 동물을 말한다. 바람직한 포유동물은 인간이다.
본원에서 사용된 "담체"라 함은 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 제약상 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제가 있다. 생리학상 허용되는 담체는 종종 pH 완충 수용액이다. 생리상 허용가능한 담체의 예로는 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 비롯한 산화방지제; 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈(TWEEN, 상표명), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS, 상표명)이 있다.
하나 이상의 다른 치료제와 "조합하여" 투여한다는 것은 동시에 (동시다발적으로) 투여하거나 어떤 순서로든 연속하여 투여하는 것이 포함된다.
본원에 사용된 "세포독성제"라 함은 세포의 기능을 저해하거나 억제하고(하거나) 세포를 파괴시키는 물질을 말한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어I131, I125, Y90및 Re186), 화학요법제 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성을 갖는 독소 또는 그의 단편을 포함하는 것을 말한다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 그의 예는 아드리아마이신, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (상표명 탁솔(Taxol), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재 브리스톨마이어스 스켑 오콜로지사 제품) 및 독세탁셀 (상표명 탁소테레(Taxotere), 프랑스 안토니 소재 롱플랑 로레아사 제품), 톡소테레, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련 질소 머스타드가 있다. 또한, 타목시펜 및 오나프리스톤과 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 호르몬 제제도 상기 화학요법제의 정의에 포함된다.
본원에 사용된 "성장 억제제"라 함은 특히 본원에서 확인된 어떠한 유전자이든지 그를 과발현하는 암세포의 ㅅ애체외 또는 생체내 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 말한다. 따라서, 성장 억제제는 그러한 유전자를 과발현하는 세포의 S기 비율을 크게 감소시키는 물질이다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 시기에서)차단하는 물질, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질을 포함한다. 전형적인 M기 차단제로는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔, 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 있다. 또한, G1을 정지시키는 물질, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메톡트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지에도 작용한다. 추가 정보는 문헌(Murakami et al., The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995), Chapter 1, 특히 13면)에 기재되어 있다.
"독소루비신"은 안트라사이클린 항생제이다. 독소루비신의 완전한 화학명은 (8S-시스-)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9.10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-8-(히드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온이다.
"시토킨"이란 하나의 세포 군집에 의해 방출되는, 세포간 매개제로서 다른 세포에 대해 작용하는 단백질의 일반명이다. 이러한 시토킨의 예로는 임포킨, 모노킨 및 전형적인 폴리펩티드 호르몬이다. 시토킨에는 성장 호르몬, 예를 들어, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 소낭 자극 호르몬(FSH), 티로이드 자극 호르몬(TSH) 및 황체 형성화 호르몬(LH) 등의 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토젠; 인간 암 괴사 인자-α및 -β; 뮬러리안 억제 물질; 생쥐 성선자극세포 관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 맥관 내피 성장 인자; 인테그린; 혈소판형성소(TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어, NGF-β; 혈소판 성장 인자; 형질전환 세포 성장 인자(TGF), 예를 들어, TGF-α및 -β; 인슐린 유사 성장 인자-1 및 -Π; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자(osteoinductive); 인터페론, 예를 들어, 인터페론-α, -β및 -γ;콜로니 자극 인자(CSF), 예를 들어, 대식세포-CSF(M-CSF); 과립세포-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립세포-CSF(G-CSF); 인터루킨(IL), 예를 들어, IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들어, TNF-α또는 TNF-β; 및 LIF-및 키트 리간드(KL)를 비롯한 다른 폴리펩티드 인자. 본원에서 사용되는 바와 같이, 시토킨이란 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 시토킨의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
본원에서 사용된 "전구약물"이란 모약물에 비해 암 세포에 대한 세포독성이 덜하며 효소적으로 활성이거나 보다 활성인 모형태로 전환될 수 있는 제약상 활성 물질의 전구체 또는 유도체형을 말한다(문헌[Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14:375-382, 615th Meeting Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 147-276, Humana Press (1985)] 참조). 본 발명의 전구약물로는 비제한적으로, 보다 활성인 무세포독성 약물로 전환될 수 있는 포스페이트 함유 전구약물, 티오포스페이트 함유 전구약물, 술페이트 함유 전구약물, 펩티드 함유 전구약물, D-아미노산 개질 전구약물, 글리코실레이트 전구약물, β-락탐 함유 프로드러그, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드 함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른5-플루오로유리딘 프로드러그가 있다. 본 발명에 사용하기 위한 전구약물로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물로는 비제한적으로 상기된 화학요법제가 있다.
신생물 세포 성장, 종양 성장 또는 암 세포과 관련하여 본원에 개시된 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 "유효량"은 표적 세포의 성장을 어느 정도까지 억제시킬 수 있는 양을 의미한다. 이 용어에는 표적 세포의 성장 억제, 세포 증식 억제성 및(또는) 세포 독성 효과 및 또는 아팝토시스가 포함된다. 신생물 세포 성장, 종양 성장 또는 암 세포 성장을 억제하기 위한 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 길항제의 "유효량"은 경험적으로 통상의 방식으로 결정할 수 있다.
종양의 치료와 관련하여 "치료상 유효량"이란 하나 이상의 다음 효과, 즉 (1) 종양 성장의 지연 및 완전한 성장 정지를 비롯하여 종양 성장의 어느 정도까지의 억제, (2) 종양 세포수의 감소; (3) 종양 크기의 감소; (4) 주위 기관으로의 종양 세포 침윤의 억제(즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지); (5) 전이의 억제(즉, 감소, 지연 또는 완전한 정지); (6) 종양의 퇴행 또는 거부를 일으킬 수 있거나 일으키지 않는 항종양 면역 반응의 증진; 및(또는) (7) 질환과 관련된 하나 이상의 증후군의 어느 정도까지의 경감을 일으킬 수 있는 양을 가리킨다. 종양 치료를 위한 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 길항제의 "치료상 유효량"은 경험적으로 통상의 방식으로 결정할 수 있다.
PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는PRO317 길항제의 "성장 억제량"은 세포, 특히 종양 세포, 예를 들어, 암세포의 성장을 생체외 또는 생체내에서 억제할 수 있는 양이다. 신생물 세포 성장을 억제하기 위한 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 길항제의 "성장 억제량"은 경험적으로 통상의 방식으로 결정할 수 있다.
PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 길항제의 "세포독성량"은 세포, 특히 종양, 예를 들어, 암세포의 파괴를 생체외 또는 생체내에서 일으킬 수 있는 양이다. 신생물 세포 성장을 억제하기 위한 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 길항제의 "세포독성량"은 경험적으로 통상의 방식으로 결정할 수 있다.
본원에 사용된 "PRO187", "PRO533", "PRO214", "PRO240", "PRO211", "PRO230", "PRO261", "PRO246" 또는 "PRO317", "PRO187 폴리펩티드", "PRO533 폴리펩티드", "PRO214 폴리펩티드", "PRO240 폴리펩티드", "PRO211 폴리펩티드", "PRO230 폴리펩티드", "PRO261 폴리펩티드", "PRO246 폴리펩티드" 또는 "PRO317 폴리펩티드"라 함은 천연 서열 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 및 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 변이체 폴리펩티드(본원에 추가로 정의된 바와 같음)를 포함한다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드는 인간 조직 타입 등의 각종 공급원 또는 또다른 공급원으로부터 단리할 수 있거나, 또는 재조합 및(또는) 합성 방법으로 제조할 수 있다.
"천연 서열" PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드는 천연으로부터 유래된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 그러한 천연 서열 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드는 쳔연으로부터 단리할 수 있거나, 재조합 및(또는) 합성 수단으로 제조할 수 있다. "천연 서열" PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드라 함은 구체적으로 천연 발생 말단 절단형 또는 분비형(예를 들어, 세포외 도메인 서열), 천연 발생 변이체형(예를 들어, 선택적 접합형) 및 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및 PRO317 폴리펩티드의 천연 발생 대립유전자적 변이체를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 천연 서열 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드는 도 2(서열 2), 도 4(서열 7), 도 6(서열 12), 도 8(서열 17), 도 10(서열 22), 도 12(서열 27), 도 14(서열 32), 도 16(서열 37) 또는 도 18(서열 42)의 아미노산 서열 각각을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드이다. 본 발명에서의 각 서열 폴리펩티드의 단편으로는 비제한적으로, 말단 절단(분비)형이 천연에서 발생하는지의 여부에 관계없이, 천연 N-말단 신호 서열이 완전 또는 부분적으로 결실되었거나 또는 다른 서열로 치환된 폴리펩티드 및 각 천연 서열의 세포외 도메인이 있다. 단편은 상응하는 천연 "PRO" 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 제조를 위해 그 길이가 충분한 것이 바람직하다.
"PRO187 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 2(서열 2)에 나타난 PRO187 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 23 내지 205, (b) 도 2(서열 2)에 나타난 PRO187 폴리펩티드의 잔기 X 내지 205(X는 도 2(서열 2)의 18 내지 27의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 2(서열 2)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편의 아미노산 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상인 하기 정의된 바와 같은 활성 폴리펩티드를 의미한다.
"PRO533 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 4(서열 7)에 나타난 PRO533 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 23 내지 216, (b) 도 4(서열 7)에 나타난 PRO533 폴리펩티드의 잔기 X 내지 216(X는 도 4(서열 7)의 18 내지 27의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 4(서열 7)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편의 아미노산 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상인 하기 정의된 바와 같은 활성 폴리펩티드를 의미한다.
"PRO214 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 6(서열 12)에 나타난 PRO214 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 30 내지 420, (b) 도 6(서열 12)에 나타난 PRO214 폴리펩티드의 잔기 X 내지 420(X는 도 6(서열 12)의 25 내지 34의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 6(서열 12)의 잔기 1 또는 약 30 내지 X(X는 도 6(서열 12)의 아미노산 367 내지 376의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 도 6(서열 12)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편의 아미노산 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상인 하기 정의된 바와 같은 활성 폴리펩티드를 의미한다.
"PRO240 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 8(서열 17)에 나타난 PRO240 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 31 내지 229, (b) 도 8(서열 17)에 나타난 PRO240 폴리펩티드의 잔기 X 내지 229(X는 도 8(서열 17)의 26 내지 35의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 8(서열 17)의 잔기 1 또는 약 31 내지 X(X는 아미노산 193 내지 202 의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 도 8(서열 17)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편의 아미노산 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상인 하기 정의된 바와 같은 활성 폴리펩티드를 의미한다.
"PRO211 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 10(서열 22)에 나타난 PRO211 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 25 내지 353, (b) 도 10(서열 22)에 나타난 PRO211 폴리펩티드의 잔기 X 내지 353(X는 도 10(서열 22)의 20 내지 29의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 10(서열 22)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편의 아미노산 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상인 하기 정의된 바와 같은 활성 폴리펩티드를 의미한다.
"PRO230 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 12(서열 27)에 나타난 PRO230 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 164, (b) 도 12(서열 27)에 나타난 PRO230 폴리펩티드의 잔기 X 내지 164(X는 도 12(서열 27)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 12(서열 27)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편의 아미노산 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상인 하기 정의된 바와 같은 활성 폴리펩티드를 의미한다.
"PRO261 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 14(서열 32)에 나타난 PRO261 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 24 내지 250, (b) 도 14(서열 32)에 나타난 PRO261 폴리펩티드의 잔기 X 내지 250(X는 도 14(서열 32)의 19 내지 28의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 14(서열 32)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편의 아미노산 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상인 하기 정의된 바와 같은 활성 폴리펩티드를 의미한다.
"PRO246 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 16(서열 37)에 나타난 PRO246 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 30 내지 390, (b) 도 16(서열 37)에 나타난 PRO246 폴리펩티드의 잔기 X 내지 390(X는 도 16(서열 37)의 25 내지 34의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 16(서열 37)의 잔기 1 또는 약 30 내지 X(X는 도 16(서열 37)의 아미노산 242 내지 251의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 도 16(서열 37)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편의 아미노산 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상인 하기 정의된 바와 같은 활성 폴리펩티드를 의미한다.
"PRO317 변이체 폴리펩티드"는 (a) 도 18(서열 42)에 나타난 PRO317 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 19 내지 366, (b) 도 18(서열 42)에 나타난 PRO317 폴리펩티드의 잔기 X 내지 366(X는 도 18(서열 42)의 14 내지 23의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 18(서열 42)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편의 아미노산 서열과 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상인 하기 정의된 바와 같은 활성 폴리펩티드를 의미한다.
그러한 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및 PRO317 변이체 폴리펩티드로는, 예를 들어, 도 2(서열 2), 도 4(서열 7), 도 6(서열 12), 도 8(서열 17), 도 10(서열 22), 도 12(서열 27), 도 14(서열 32), 도 16(서열 37) 또는 도 18(서열 42)의 서열 각각의 N- 및(또는) C-말단은 물론 하나 이상의 내부 도메인에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및 PRO317 변이체 폴리펩티드가 있다.
통상, PRO187 변이체 폴리펩티드는 도 2(서열 2)에 나타난 PRO187 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 23 내지 205, (b) 도 2(서열 2)에 나타난 PRO187 폴리펩티드의 잔기 X 내지 205(X는 도 2(서열 2)의 18 내지 27의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 2(서열 2)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하기로는 약 81% 이상, 더 바람직하기로는 약 82% 이상, 더 바람직하기로는 약 83% 이상, 더 바람직하기로는 약 84% 이상, 더 바람직하기로는 약 85% 이상, 더 바람직하기로는 약 86% 이상, 더 바람직하기로는 약 87% 이상, 더 바람직하기로는 약 88% 이상, 더 바람직하기로는 약 89% 이상, 더 바람직하기로는 약 90% 이상, 더 바람직하기로는 약 91% 이상, 더 바람직하기로는 92% 이상, 더 바람직하기로는 약 93% 이상, 더 바람직하기로는 약 94% 이상, 더 바람직하기로는 약 95% 이상, 더 바람직하기로는 약 96% 이상, 더 바람직하기로는 약 97% 이상, 더 바람직하기로는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하기로는 약 99% 이상이다.
통상, PRO533 변이체 폴리펩티드는 도 4(서열 7)에 나타난 PRO533 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 23 내지 216, (b) 도 4(서열 7)에 나타난 PRO533 폴리펩티드의 잔기 X 내지 216(X는 도 4(서열 7)의 18 내지 27의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 4(서열 7)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하기로는 약 81% 이상, 더 바람직하기로는 약 82% 이상, 더 바람직하기로는 약 83% 이상, 더 바람직하기로는 약 84% 이상, 더 바람직하기로는 약 85% 이상, 더 바람직하기로는 약 86% 이상, 더 바람직하기로는 약 87% 이상, 더 바람직하기로는 약 88% 이상, 더 바람직하기로는 약 89% 이상, 더 바람직하기로는 약 90% 이상, 더 바람직하기로는 약 91% 이상, 더 바람직하기로는 92% 이상, 더 바람직하기로는 약 93% 이상, 더 바람직하기로는 약 94% 이상, 더 바람직하기로는 약 95% 이상, 더 바람직하기로는 약 96% 이상, 더 바람직하기로는 약 97% 이상, 더 바람직하기로는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하기로는 약 99% 이상이다.
통상, PRO214 변이체 폴리펩티드는 도 6(서열 12)에 나타난 PRO214 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 30 내지 420, (b) 도 6(서열 12)에 나타난 PRO214 폴리펩티드의 잔기 X 내지 420(X는 도 6(서열 12)의 25 내지 34의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 6(서열 12)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하기로는 약 81% 이상, 더 바람직하기로는 약 82% 이상, 더 바람직하기로는 약 83% 이상, 더 바람직하기로는 약 84% 이상, 더 바람직하기로는 약 85% 이상, 더 바람직하기로는 약 86% 이상, 더 바람직하기로는 약 87% 이상, 더 바람직하기로는 약 88% 이상, 더 바람직하기로는 약 89% 이상, 더 바람직하기로는 약 90% 이상, 더 바람직하기로는 약 91% 이상, 더 바람직하기로는 92% 이상, 더 바람직하기로는 약 93% 이상, 더 바람직하기로는 약 94% 이상, 더 바람직하기로는 약 95% 이상, 더 바람직하기로는 약 96% 이상, 더 바람직하기로는 약 97% 이상, 더 바람직하기로는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하기로는 약 99% 이상이다.
통상, PRO240 변이체 폴리펩티드는 도 8(서열 17)에 나타난 PRO240 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 31 내지 229, (b) 도 8(서열 17)에 나타난 PRO240 폴리펩티드의 잔기 X 내지 229(X는 도 8(서열 17)의 193 내지 202의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 8(서열 17)에 나타난 잔기 1 또는 약 31 내지 X(X는 아미노산 193 내지 202의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 도 8(서열 17)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하기로는 더 약 81% 이상, 더 바람직하기로는 약 82% 이상, 더 바람직하기로는 약 83% 이상, 더 바람직하기로는 약 84% 이상, 더 바람직하기로는 약 85% 이상, 더 바람직하기로는 약 86% 이상, 더 바람직하기로는 약 87% 이상, 더 바람직하기로는 약 88% 이상, 더 바람직하기로는 약 89% 이상, 더 바람직하기로는 약 90% 이상, 더 바람직하기로는 약 91% 이상, 더 바람직하기로는 92% 이상, 더 바람직하기로는 약 93% 이상, 더 바람직하기로는 약 94% 이상, 더 바람직하기로는 약 95% 이상, 더 바람직하기로는 약 96% 이상, 더 바람직하기로는 약 97% 이상, 더 바람직하기로는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하기로는 약 99% 이상이다.
통상, PRO211 변이체 폴리펩티드는 도 10(서열 22)에 나타난 PRO211 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 25 내지 253, (b) 도 10(서열 22)에 나타난 PRO211 폴리펩티드의 잔기 X 내지 353(X는 도 10(서열 22)의 20 내지 29의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 10(서열 22)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하기로는 약 81% 이상, 더 바람직하기로는 약 82% 이상, 더 바람직하기로는 약 83% 이상, 더 바람직하기로는 약 84% 이상, 더 바람직하기로는 약 85% 이상, 더 바람직하기로는 약 86% 이상, 더 바람직하기로는 약 87% 이상, 더 바람직하기로는 약 88% 이상, 더 바람직하기로는 약 89% 이상, 더 바람직하기로는 약 90% 이상, 더 바람직하기로는 약 91% 이상, 더 바람직하기로는 92% 이상, 더 바람직하기로는 약 93% 이상, 더 바람직하기로는 약 94% 이상, 더 바람직하기로는 약 95% 이상, 더 바람직하기로는 약 96% 이상, 더 바람직하기로는 약 97% 이상, 더 바람직하기로는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하기로는 약 99% 이상이다.
통상, PRO230 변이체 폴리펩티드는 도 12(서열 27)에 나타난 PRO230 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 164, (b) 도 12(서열 27)에 나타난 PRO230 폴리펩티드의 잔기 X 내지 164(X는 도 12(서열 27)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 12(서열 27)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하기로는 약 81% 이상, 더 바람직하기로는 약 82% 이상, 더 바람직하기로는 약 83% 이상, 더 바람직하기로는 약 84% 이상, 더 바람직하기로는 약 85% 이상, 더 바람직하기로는 약 86% 이상, 더 바람직하기로는 약 87% 이상, 더 바람직하기로는 약 88% 이상, 더 바람직하기로는 약 89% 이상, 더 바람직하기로는 약 90% 이상, 더 바람직하기로는 약 91% 이상,더 바람직하기로는 92% 이상, 더 바람직하기로는 약 93% 이상, 더 바람직하기로는 약 94% 이상, 더 바람직하기로는 약 95% 이상, 더 바람직하기로는 약 96% 이상, 더 바람직하기로는 약 97% 이상, 더 바람직하기로는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하기로는 약 99% 이상이다.
통상, PRO261 변이체 폴리펩티드는 도 14(서열 32)에 나타난 PRO261 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 24 내지 250, (b) 도 14(서열 32)에 나타난 PRO261 폴리펩티드의 잔기 X 내지 250(X는 도 14(서열 32)의 19 내지 28의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 14(서열 32)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하기로는 약 81% 이상, 더 바람직하기로는 약 82% 이상, 더 바람직하기로는 약 83% 이상, 더 바람직하기로는 약 84% 이상, 더 바람직하기로는 약 85% 이상, 더 바람직하기로는 약 86% 이상, 더 바람직하기로는 약 87% 이상, 더 바람직하기로는 약 88% 이상, 더 바람직하기로는 약 89% 이상, 더 바람직하기로는 약 90% 이상, 더 바람직하기로는 약 91% 이상, 더 바람직하기로는 92% 이상, 더 바람직하기로는 약 93% 이상, 더 바람직하기로는 약 94% 이상, 더 바람직하기로는 약 95% 이상, 더 바람직하기로는 약 96% 이상, 더 바람직하기로는 약 97% 이상, 더 바람직하기로는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하기로는 약 99% 이상이다.
통상, PRO246 변이체 폴리펩티드는 도 16(서열 37)에 나타난 PRO246 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 30 내지 390, (b) 도 16(서열 37)에 나타난 PRO246 폴리펩티드의 잔기 X 내지 390(X는 도 16(서열 37)의 25 내지 34의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 16(서열 37)의 잔기 1 또는 약 30 내지 X(X는 도 16(서열 37)의 아미노산 242 내지 251의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 도 16(서열 37)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하기로는 약 81% 이상, 더 바람직하기로는 약 82% 이상, 더 바람직하기로는 약 83% 이상, 더 바람직하기로는 약 84% 이상, 더 바람직하기로는 약 85% 이상, 더 바람직하기로는 약 86% 이상, 더 바람직하기로는 약 87% 이상, 더 바람직하기로는 약 88% 이상, 더 바람직하기로는 약 89% 이상, 더 바람직하기로는 약 90% 이상, 더 바람직하기로는 약 91% 이상, 더 바람직하기로는 92% 이상, 더 바람직하기로는 약 93% 이상, 더 바람직하기로는 약 94% 이상, 더 바람직하기로는 약 95% 이상, 더 바람직하기로는 약 96% 이상, 더 바람직하기로는 약 97% 이상, 더 바람직하기로는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하기로는 약 99% 이상이다.
통상, PRO317 변이체 폴리펩티드는 도 18(서열 42)에 나타난 PRO317 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 19 내지 366, (b) 도 18(서열 42)에 나타난 PRO317 폴리펩티드의 잔기 X 내지 366(X는 도 14(서열 32)의 14 내지 12의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 18(서열 42)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하기로는 약 81% 이상, 더 바람직하기로는 약 82% 이상, 더 바람직하기로는 약 83% 이상, 더 바람직하기로는 약 84% 이상, 더 바람직하기로는 약 85% 이상, 더 바람직하기로는 약 86% 이상, 더 바람직하기로는 약 87% 이상, 더 바람직하기로는 약 88% 이상, 더 바람직하기로는 약 89% 이상, 더 바람직하기로는 약 90% 이상, 더 바람직하기로는 약 91% 이상,더 바람직하기로는 92% 이상, 더 바람직하기로는 약 93% 이상, 더 바람직하기로는 약 94% 이상, 더 바람직하기로는 약 95% 이상, 더 바람직하기로는 약 96% 이상, 더 바람직하기로는 약 97% 이상, 더 바람직하기로는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하기로는 약 99% 이상이다.
PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및 PRO317 변이체 폴리펩티드는 천연 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 서열을 포괄하지 않는다. 통상, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 변이체 폴리펩티드는 그 길이가 약 10개 이상의 아미노산, 흔히 약 20개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 30개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 40개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 50개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 60개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 70 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 80 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 90 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 100 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 150 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 200 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 300 개 이상의 아미노산 또는 그 이상이다.
본원에서 확인된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 (%)"은 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우 서열 동일성 퍼센트의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬법은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적상 아미노산 서열 동일성 값(%)은 하기에 기재된 바와 같이 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 도 20A 내지 20Q에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사가 개발하였으며, 도 20A 내지 20Q에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱톤 D.C.에 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨텍, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 쉽게 구할 수 있거나, 도 20A 내지 20Q에 기재된 원시 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운용계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정하고 다양하지 않다.
본 발명에 이용하기 위해, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성(%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성(%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 이 방법을 이용한 아미노산 서열 동일성 계산의 예로서, 도 19A 내지 19B는 "PRO"로 지칭되는 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 지칭되는 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성(%)을 계산하는 방법을 나타낸다.
달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 값(%)은 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻었다. 그러나, 아미노산 서열 동일성(%)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 이용하여 계산할 수도 있다 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997)). NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.
NCBI-BLAST2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성(%)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성(%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 NCBI-BLAST2 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성(%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성(%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
또한, 본원에 사용된 동일성 값(%)은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램(Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996))을 이용하여 얻었다. WU-BLAST-2 연구 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정했다. 디폴트 값으로 설정하지 않은 것들, 즉 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정하였다. 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 점수 매트릭스 = BLOSUM62. 본 발명의 목적상, 아미노산 서열 동일성 값(%)은 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 갖는 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교되는 관심있는 아미노산 서열(즉, 관심있는 PRO 폴리펩티드와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리펩티드일 수있음)과의 사이에 매치되는 동일한 아미노산 잔기의 수를 WU-BLAST-2로 결정하여 얻고, 이를 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 총 잔기수로 나누어 결정한다. 예를 들어, 아미노산 서열 B와 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 A를 포함하는 폴리펩티드"라는 말에서, 아미노산 서열 A는 비교하는 관심있는 아미노산 서열이고, 아미노산 서열 B는 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
"PRO187 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO187 변이체 핵산 서열"은 하기된 바와 같은 활성 PRO187 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, (a) 도 2(서열 2)에 나타난 PRO187 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 23 내지 205, (b) 도 2(서열 2)에 나타난 PRO187 폴리펩티드의 아미노산 X 내지 205(X는 도 2(서열 2)의 18 내지 27의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 2(서열 2)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 서열 동일성이 약 80 % 이상인 핵산 분자이다. 통상, PRO187 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 2(서열 2)에 나타난 PRO187 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 23 내지 205, (b) 도 2(서열 2)에 나타난 PRO187 폴리펩티드의 잔기 X 내지 205(X는 도 2(서열 2)의 18 내지 27의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 2(서열 2)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 81% 이상, 더 바람직하게는 약 82% 이상, 더 바람직하게는 약 83% 이상, 더 바람직하게는 약 84% 이상, 더 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 86% 이상, 더 바람직하게는 약 87% 이상, 더 바람직하게는 약 88% 이상,더 바람직하게는 약 89% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91% 이상, 더 바람직하게는 약 92% 이상, 더 바람직하게는 약 93% 이상, 더 바람직하게는 약 94% 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상, 더 바람직하게는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 99% 이상일 것이다. PRO187 변이체 폴리뉴클레오티드는 천연 PRO187 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
"PRO533 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO533 변이체 핵산 서열"은 하기된 바와 같은 활성 PRO533 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, (a) 도 4(서열 7)에 나타난 PRO533 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 23 내지 216, (b) 도 4(서열 7)에 나타난 PRO533 폴리펩티드의 잔기 X 내지 216(X는 도 4(서열 7)의 18 내지 27의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 4(서열 7)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 서열 동일성이 약 80 % 이상인 핵산 분자이다. 통상, PRO533 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 4(서열 7)에 나타난 PRO533 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 23 내지 205, (b) 도 4(서열 7)에 나타난 PRO533 폴리펩티드의 잔기 X 내지 216(X는 도 4(서열 7)의 18 내지 27의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 4(서열 7)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 81% 이상, 더 바람직하게는 약 82% 이상, 더 바람직하게는 약 83% 이상, 더 바람직하게는 약 84% 이상, 더 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 86% 이상, 더 바람직하게는 약 87% 이상, 더 바람직하게는 약 88% 이상, 더바람직하게는 약 89% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91% 이상, 더 바람직하게는 약 92% 이상, 더 바람직하게는 약 93% 이상, 더 바람직하게는 약 94% 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상, 더 바람직하게는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 99% 이상일 것이다. PRO533 변이체 폴리뉴클레오티드는 천연 PRO533 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
"PRO214 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO214 변이체 핵산 서열"은 하기된 바와 같은 활성 PRO214 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, (a) 도 6(서열 12)에 나타난 PRO214 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 30 내지 420, (b) 도 6(서열 12)에 나타난 PRO214 폴리펩티드의 잔기 X 내지 420(X는 도 6(서열 12)의 25 내지 34의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 6(서열 12)의 잔기 1 또는 약 30 내지 X(X는 도 6(서열 12)의 아미노산 367 내지 376의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 도 6(서열 12)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 서열 동일성이 약 80 % 이상인 핵산 분자이다. 통상, PRO214 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 6(서열 12)에 나타난 PRO214 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 30 내지 420, (b) 도 6(서열 12)에 나타난 PRO187 폴리펩티드의 잔기 X 내지 420(X는 도 6(서열 12)의 25 내지 34의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 6(서열 12)의 잔기 1 또는 약 30 내지 X(X는 아미노산 367 내지 376의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 도 6(서열 12)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81% 이상, 더 바람직하게는 약 82% 이상, 더 바람직하게는 약 83% 이상, 더 바람직하게는 약 84% 이상, 더 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 86% 이상, 더 바람직하게는 약 87% 이상, 더 바람직하게는 약 88% 이상, 더 바람직하게는 약 89% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91% 이상, 더 바람직하게는 약 92% 이상, 더 바람직하게는 약 93% 이상, 더 바람직하게는 약 94% 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상, 더 바람직하게는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 99% 이상일 것이다. PRO214 변이체 뉴클레오티드는 천연 PRO214 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
"PRO240 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO240 변이체 핵산 서열"은 하기된 바와 같은 활성 PRO240 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, (a) 도 8(서열 17)에 나타난 PRO240 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 31 내지 299, (b) 도 8(서열 17)에 나타난 PRO240 폴리펩티드의 잔기 X 내지 299(X는 도 8(서열 17)의 26 내지 35의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 8(서열 17)의 잔기 1 또는 약 31 내지 X(X는 도 8(서열 17)의 아미노산 193 내지 202의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 도 8(서열 17)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 서열 동일성이 약 80 % 이상인 핵산 분자이다. 통상, PRO240 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 8(서열 17)에 나타난 PRO240 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 31 내지 299, (b) 도 8(서열 17)에 나타난 PRO240 폴리펩티드의 잔기 X 내지 299(X는 도 8(서열 17)의 26 내지 35의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 8(서열17)의 잔기 1 또는 약 31 내지 X(X는 도 8(서열 17)의 아미노산 193 내지 202의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 도 8(서열 17)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 81% 이상, 더 바람직하게는 약 82% 이상, 더 바람직하게는 약 83% 이상, 더 바람직하게는 약 84% 이상, 더 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 86% 이상, 더 바람직하게는 약 87% 이상, 더 바람직하게는 약 88% 이상, 더 바람직하게는 약 89% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91% 이상, 더 바람직하게는 약 92% 이상, 더 바람직하게는 약 93% 이상, 더 바람직하게는 약 94% 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상, 더 바람직하게는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 99% 이상일 것이다. PRO240 변이체 폴리뉴클레오티드는 천연 PRO240 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
"PRO211 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO211 변이체 핵산 서열"은 하기된 바와 같은 활성 PRO211 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, (a) 도 10(서열 22)에 나타난 PRO211 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 25 내지 353, (b) 도 10(서열 22)에 나타난 PRO211 폴리펩티드의 잔기 X 내지 353(X는 도 10(서열 22)의 20 내지 29의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 10(서열 22)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 서열 동일성이 약 80 % 이상인 핵산 분자이다. 통상, PRO533 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 10(서열 22)에 나타난 PRO211 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 25 내지 353, (b) 도 10(서열22)에 나타난 PRO211 폴리펩티드의 잔기 X 내지 353(X는 도 10(서열 22)의 20 내지 29의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 10(서열 22)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 81% 이상, 더 바람직하게는 약 82% 이상, 더 바람직하게는 약 83% 이상, 더 바람직하게는 약 84% 이상, 더 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 86% 이상, 더 바람직하게는 약 87% 이상, 더 바람직하게는 약 88% 이상, 더 바람직하게는 약 89% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91% 이상, 더 바람직하게는 약 92% 이상, 더 바람직하게는 약 93% 이상, 더 바람직하게는 약 94% 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상, 더 바람직하게는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 99% 이상일 것이다. PRO211 변이체 폴리뉴클레오티드는 천연 PRO211 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
"PRO230 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO230 변이체 핵산 서열"은 하기된 바와 같은 활성 PRO230 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, (a) 도 12(서열 27)에 나타난 PRO230 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 164, (b) 도 12(서열 27)에 나타난 PRO230 폴리펩티드의 잔기 X 내지 164(X는 도 12(서열 27)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 12(서열 27)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 서열 동일성이 약 80 % 이상인 핵산 분자이다. 통상, PRO230 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 12(서열 27)에 나타난 PRO230 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 22 내지 164, (b) 도 12(서열27)에 나타난 PRO230 폴리펩티드의 잔기 X 내지 164(X는 도 12(서열 27)의 17 내지 26의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 12(서열 27)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 81% 이상, 더 바람직하게는 약 82% 이상, 더 바람직하게는 약 83% 이상, 더 바람직하게는 약 84% 이상, 더 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 86% 이상, 더 바람직하게는 약 87% 이상, 더 바람직하게는 약 88% 이상, 더 바람직하게는 약 89% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91% 이상, 더 바람직하게는 약 92% 이상, 더 바람직하게는 약 93% 이상, 더 바람직하게는 약 94% 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상, 더 바람직하게는 약 98% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상일 것이다. PRO230 변이체 폴리뉴클레오티드는 천연 PRO230 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
"PRO261 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO261 변이체 핵산 서열"은 하기된 바와 같은 활성 PRO261 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, (a) 도 14(서열 32)에 나타난 PRO261 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 24 내지 250, (b) 도 14(서열 32)에 나타난 PRO261 폴리펩티드의 잔기 X 내지 250(X는 도 14(서열 32)의 19 내지 28의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 14(서열 32)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 서열 동일성이 약 80 % 이상인 핵산 분자이다. 통상, PRO261 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 14(서열 32)에 나타난 PRO261 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 24 내지 250, (b) 도 14(서열32)에 나타난 PRO261 폴리펩티드의 잔기 X 내지 250을 코딩하는 핵산 서열(X는 도 14(서열 32)의 19 내지 28의 임의의 아미노산 잔기임) 또는 (c) 도 14(서열 32)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 81% 이상, 더 바람직하게는 약 82% 이상, 더 바람직하게는 약 83% 이상, 더 바람직하게는 약 84% 이상, 더 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 86% 이상, 더 바람직하게는 약 87% 이상, 더 바람직하게는 약 88% 이상, 더 바람직하게는 약 89% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91% 이상, 더 바람직하게는 약 92% 이상, 더 바람직하게는 약 93% 이상, 더 바람직하게는 약 94% 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상, 더 바람직하게는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 99% 이상일 것이다. PRO261 변이체 폴리뉴클레오티드는 천연 PRO261 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
"PRO246 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO246 변이체 핵산 서열"은 하기된 바와 같은 활성 PRO246 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, (a) 도 16(서열 37)에 나타난 PRO246 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 30 내지 390, (b) 도 16(서열 37)에 나타난 PRO246 폴리펩티드의 잔기 X 내지 390(X는 도 16(서열 37)의 25 내지 34의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 16(서열 37)의 잔기 1 또는 약 30 내지 X(X는 도 16(서열 37)의 아미노산 242 내지 251의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 도 16(서열 37)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 서열 동일성이 약 80 % 이상인 핵산 분자이다. 통상, PRO246 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 16(서열 37)에 나타난 PRO246 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 30 내지 390, (b) 도 16(서열 37)에 나타난 PRO246 폴리펩티드의 잔기 X 내지 390을 코딩하는 핵산 서열(X는 도 16(서열 37)의 아미노산 242 내지 251의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 16(서열 37)의 잔기 1 또는 약 30 내지 X(X는 아미노산 242 내지 251의 임의의 아미노산임) 또는 (d) 도 16(서열 37)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 81% 이상, 더 바람직하게는 약 82% 이상, 더 바람직하게는 약 83% 이상, 더 바람직하게는 약 84% 이상, 더 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 86% 이상, 더 바람직하게는 약 87% 이상, 더 바람직하게는 약 88% 이상, 더 바람직하게는 약 89% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91% 이상, 더 바람직하게는 약 92% 이상, 더 바람직하게는 약 93% 이상, 더 바람직하게는 약 94% 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상, 더 바람직하게는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 99% 이상일 것이다. PRO246 변이체 폴리뉴클레오티드는 천연 PRO246 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
"PRO317 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO317 변이체 핵산 서열"은 하기된 바와 같은 활성 PRO317 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, (a) 도 18(서열 42)에 나타난 PRO317 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 19 내지 366, (b) 도 18(서열 42)에 나타난 PRO317 폴리펩티드의 잔기 X 내지 366을 코딩하는 핵산 서열(X는 도 18(서열 42)의 14 내지 23의 임의의 아미노산 잔기임)또는 (c) 도 18(서열 42)에나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 서열 동일성이 약 80 % 이상인 핵산 분자이다. 통상, PRO317 변이체 폴리뉴클레오티드는 (a) 도 18(서열 42)에 나타난 PRO317 폴리펩티드의 잔기 1 또는 약 19 내지 366, (b) 도 18(서열 42)에 나타난 PRO366 폴리펩티드의 잔기 X 내지 366(X는 도 18(서열 42)의 14 내지 23의 임의의 아미노산 잔기임), (c) 도 18(서열 42)에 나타난 아미노산 서열의 특이적으로 유래된 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 81% 이상, 더 바람직하게는 약 82% 이상, 더 바람직하게는 약 83% 이상, 더 바람직하게는 약 84% 이상, 더 바람직하게는 약 85% 이상, 더 바람직하게는 약 86% 이상, 더 바람직하게는 약 87% 이상, 더 바람직하게는 약 88% 이상, 더 바람직하게는 약 89% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91% 이상, 더 바람직하게는 약 92% 이상, 더 바람직하게는 약 93% 이상, 더 바람직하게는 약 94% 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96% 이상, 더 바람직하게는 약 97% 이상, 더 바람직하게는 약 98% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 99% 이상일 것이다. PRO317 변이체 폴리뉴클레오티드는 천연 PRO317 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
통상, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및 PRO317 변이체 폴리펩티드는 그 길이가 약 30 개 이상, 흔히 약 60 개 이상, 더 흔히는 약 120개 이상, 더 흔히는 약 150 개 이상, 더 흔히는 약 180 개 이상, 더 흔히는 약 240 개 이상, 더 흔히는 270 개 이상, 더 흔히는 300 개 이상, 더 흔히는 약 450 개 이상, 더 흔히는 약 600 개 이상, 더 흔히는 약 900 개 이상인 뉴클레오티드이다.
본원에서 확인된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및 PRO317 폴리펩티드 코딩 핵산 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 (%)"은 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 코딩 핵산 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우 서열 동일성 퍼센트의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 코딩 핵산 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬법은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 아미노산 서열 동일성 값(%)은 하기에 기재된 바와 같이 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 도 20A 내지 20Q에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사가 개발하였으며, 도 20A 내지 20Q에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱톤 D.C.에 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은제넨텍, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 쉽게 구할 수 있거나, 도 20A 내지 20Q에 기재된 원시 코드로부터 편집할 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운용계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집하여 이용할 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정하고 다양하지 않다.
본 발명의 목적상, 주어진 아미노산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 아미노산 서열 C의 아미노산 서열 동일성 (%)(주어진 아미노산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
W/Z ×100
여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Z는 D에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 C의 길이가 아미노산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 아미노산 서열 동일성(%)은 C에 대한 D의 아미노산 서열 동일성(%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 이 방법을 이용한 아미노산 서열 동일성 계산의 예로서, 도 19C 내지 19D는 "PRO-DNA"로 지칭하는 아미노산 서열에 대한 "비교 DNA"로 지칭하는 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성(%)을 계산하는 방법을 나타낸다.
달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 값(%)은 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻었다. 그러나, 아미노산 서열 동일성(%)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 이용하여 계산할 수도 있다(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.
NCBI-BLAST2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 아미노산 서열 C의 아미노산 서열 동일성(%)(주어진 아미노산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성(%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
W/Z ×100
여기서, W는 C 및 D의 프로그램 정렬에서 서열 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Z는 D에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 C의 길이가 아미노산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 아미노산 서열 동일성(%)은 C에 대한 D의 아미노산 서열 동일성(%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
또한, 본원에 사용된 동일성 값(%)은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))을 이용하여 얻었다. WU-BLAST-2 연구 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정했다. 디폴트값으로 설정되지 않은, 즉 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정하였다. 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 점수 매트릭스 = BLOSUM62. 본 발명의 목적상, 아미노산 서열 동일성 값(%)은 (a) 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 갖는 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교되는 관심있는 아미노산 서열 (즉, 관심있는 PRO 폴리펩티드와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리펩티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 아미노산 잔기의 수를 WU-BLAST-2로 결정하여 얻고, (b) 이를 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 총 잔기수로 나누어 결정한다. 예를 들어, 핵산 서열 B와 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 A를 포함하는 단리된 핵산 분자"라는 말에서, 핵산 서열 A는 비교하는 관심있는 아미노산 서열이고 핵산 서열 B는 관심있는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
다른 실시양태에서, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및 PRO317 폴리펩티드는 바람직하기로는 엄격한 혼성화 및 세척 조건하에서 도 2(서열 2), 도 4(서열 7), 도 6(서열 12), 도 8(서열 17), 도 10(서열 22), 도 12(서열 27), 도 14(서열 32), 도 16(서열 37) 또는 도 18(서열 42)에 나타난 전장의 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 각각을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 활성 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 변이체 폴리펩티드는 PRO187, PRO533,PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 것들일 수 있다.
상기한 바와 같이 수행되는 서열 비교와 관련하여 "양성"이란 동일하지는 않으나 성질이 유사한 비교되는 서열의 잔기를 의미한다. 관심있는 아미노산 잔기에 대해 양성값을 기록하는 아미노산 잔기는 관심있는 아미노산 잔기와 동일한 것이거나 관심있는 아미노산 잔기의 바람직한 치환 (하기 표 1에 기재되어 있음)이다.
본 발명의 목적상, 양성 값(%)은 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 양성값 (%)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 양성값 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 상기에서 정의된 양성값을 기록하는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 양성값 (%)은 A에 대한 B의 양성값 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된 "단리된"은 폴리펩티드가 확인되고, 그 자연 환경 성분으로부터 분리 및(또는) 회수되었음을 의미한다. 바람직하기로는, 단리된 폴리펩티드는 자연적으로 결합되는 모든 성분과 결합되어 있지 않다. 폴리펩티드의 자연 환경의 오염 성분은 이 폴리펩티드의 진단또는 치료적 사용을 일반적으로 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질 등이 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝컵 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제될 수 있다. 단리된 폴리펩티드는 1 종 이상의 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 천연 환경 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내에 존재하는 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 얻어질 것이다.
PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 코딩하는 "단리된" 핵산 분자 또는 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체를 코딩하는 "단리된" 핵산은 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 코딩 핵산 또는 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 코딩 핵산의 천연 공급원에서 통상적으로 결합되어 있는 1 종 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자라는 의미이다. 바람직하기로는, 단리된 핵산은 천연적으로 결합되는 모든 성분과 결합되어 있지 않아야 한다. 단리된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317코딩 핵산 분자 또는 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 코딩 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와 다르게 존재한다. 따라서, 단리된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 코딩 핵산 분자 또는 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 코딩 핵산 분자는 PRO 폴리펩티드 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 코딩 핵산 분자 또는 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 예를 들어, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 또는 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자는 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하며 통상적으로 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 또는 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체를 발현하는 세포에 함유된, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 코딩 핵산 분자 또는 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체 코딩 핵산 분자를 포함된다.
"조절 서열"이란 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열이다. 원핵생물에 적절한 조절 서열로는 예컨데 프로모터, 경우에 따라 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 들 수 있다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는 해당 폴리펩티드가 분비되기 전의 형태인 전단백질로서 발현되는 경우 그 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩티드 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"다는 것은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 위치할 뿐만 아니라 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.
"항체"라 함은 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 하나의 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 모노클로날 항체 (아고니스트, 길항제 및 중화 항체 등), 폴리에피토프 특이성이 있는 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체 조성물, 단일쇄 항-PRO187,항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체 및 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체의 단편 (하기 참조) 등을 통칭한다. 본원에서 사용된 "모노클로날 항체"라 함은 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외한, 한 집단을 이루는 동일한 개별 항체를 의미한다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도, 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로 보다 긴 프로브일수록 적절한 어닐링에 보다 높은 온도를 필요로하며, 보다 짧은 프로브일수록 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 용융 온도보다 낮은 환경에 존재할 때 재어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 목적하는 상동성의 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 높아진다. 따라서, 상대적 온도보다 높아질수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 반면, 상대적 온도가 낮을수록 반응조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 더 자세한 정보 및 설명은 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995))을 참조한다.
본원에서 정의된 "엄격 조건" 또는 "엄격도가 높은 조건"이란 (1) 세척시 이온 세기가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들어 50 ℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산 나트륨/0.1 % 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 조건, 또는 (2) 혼성화시에 포름아미드, 예를 들어 42 ℃, 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)/0.1 % 소혈청 알부민/0.1 % 피콜/0.1 % 폴리비닐피롤리돈으로 제조한 50 % (부피/부피) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, (3) 50 % 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1 % 피로인산 나트륨, 5 x 덴하르트(Denhardt) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1 % SDS, 및 10 % 덱스트란 술페이트를 42 ℃에서 사용하고, 42 ℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 그리고 55 ℃에서 50 % 포름아미드로 세척하며, 55 ℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC를 이용한 고도로 엄격한 세척을 수행하는 것이다.
"중간정도의 엄격 조건"이란 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press 1989)에 기재된 바와 같고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 혼성화 조건 (예를 들어 온도, 이온 세기 및 %SDS)의 이용을 말한다. 중간정도의 엄격 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 잘린 연어 정액 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃로 밤새 인큐베이션한 후 필터를 약 37 내지 50℃에서 1 x SSC로 세척하는 조건이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞추기 위해 필요한 온도, 이온 세기 등을 조절하는 방법을 잘 알 것이다.
본원에 사용된 "에피토프 태그를 붙인"이란 "태그 폴리펩티드"에 융합된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. "태그 폴리펩티드"가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 융합되는 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 태그 폴리펩티드는 매우 독특해서 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 가교반응하지 않는 것이 바람직하다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기를 갖는다(약 10 내지 20개의 잔기가 바람직함).
본원에서 사용된 "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 천연 발생 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역적 활성을 보유하는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 형태(들)을 말하는데, 여기서 "생물학적" 활성이란 천연 또는 천연 발생 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 있는 항원성 에피토프에 대한 항체 생성을 유도하는 능력이 아니라, 천연 또는 천연 발생 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 의한 생물학적 기능 (억제 또는 촉진능)을 말하며, "면역학적" 활성이란 천연 또는 천연 발생 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 있는 항원성 에피토프에 대한 항체 생성을 유도하는 능력을 말한다.
본원에 개시된 스크리닝 분석에 의해 확인될 수 있는 항체 또는 다른 항체(예를 들어, 유기 또는 무기 소분자,펩티드 등)와 관련된 "생물학적 활성"은 상기 분자가 본원에서 확인된 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 결합하거나 결합체를 이루는 능력을 말하는데 이용하거나, 다르게는 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포 단백질과의 상호작용을 방해하거나 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 전자 또는 번역을 방해하는 능력을 말하는데 이용한다. 바람직한 생물학적 활성은 표적 종양 세포의 성장을 억제한다. 생물학적 활성으로서 다른 바람직한 것은 표적 종양 세포의 사멸을 일으키는 세포독성 활성이다.
본원에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드와 관련하여 "생물학적 활성"이란 신생물 세포 성장 또는 비조절된 세포 성장을 일으키는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 능력을 의미한다.
"면역적 활성"이란 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프와의 면역학적 교차 반응성을 의미한다.
본원에서 "면역학적 교차 반응성"은 후보 폴리펩티드가 공지된 활성 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 대해 생성된 모노클로날 항혈청과 활성을 갖는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 정성의 생물학적 활성을 경쟁적으로 억제할 수 있음을 의미하는데 이용된다. 그러한 항혈청은염소 또는 토끼에, 예를 들어 완전 프레운드 보조제 중의 공지된 활성 동족체로 피하 주사한 후 불완전 프레운드 보조제 중의 것을 복강내 또는 피하 주사하여 재면역시킴으로써 통상적인 방식으로 제조할 수 있다. 면역적 교차 반응성은 특이적인것이 바람직한데, 이는 확인된 면역적 교차 반응성 분자 (예를 들어 항체)의 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 대한 결합 친화성이 다른 어떠한 공지된 천연 폴리펩티드의 결합 친화성 보다도 훨씬 (바람직하게는 약 2 배 이상, 더 바람직하게는 약 4 배 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 8 배 이상, 가장 바람직하게는 약 10 배 이상) 크다는 것을 의미한다.
"길항제"라 함은 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 생물학적 활성 또는 그의 전사 또는 번역을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 통칭한다. 적절한 길항제 분자로는 구체적으로 길항제 항체 또는 항체의 단편, 펩티드, 작은 유기 분자, 안티센스 핵산 등이 있다. 후보 길항제를 확인하는 방법은 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 길항제를 후보 길항제 분자와 접촉시키고, RO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드와 정상적으로 관련된 하나 이상의 생물학적 활성에서의 검출가능한 변화를 측정하는 방법을 포함한다.
"소분자 (작은 분자)"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 이하인 것으로 정의된다.
"항체(Ab) 및 이뮤노글로불린(Ig)"은 동일한 구조 특성을 갖는 당단백질이다. 항체는 특이 항원에 특이적으로 결합하는 반면, 이뮤노글로불린은 항체 및 항원 특이성이 없는 다른 항체 유사 분자 둘 다를 포함한다. 이뮤노글로불린 등의 폴리펩티드는 예를 들어, 림프계에 의해 낮은 농도로 생성되며 골수종에 의해 농도가 증가한다. "항체"라 함은 넓은 의미로, 구체적으로는 비제한적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 2개 이상의 온전한 항체에 의해 형성되는 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 가지다면 항체 단편까지 망라하여 이용된다.
"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성되는 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머의 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 결합의 개수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄 사이에서 변한다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적 간격으로 쇄 내부의 디술피드 결합을 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(VH) 및 이 도메인에 후속하는 많은 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인(VL) 및 다른 말단에 불변 도메인을 갖고, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 한줄로 위치하고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 한줄로 위치한다. 특정 아미노산 잔기들이 경쇄 와 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다.
"가변"이란 항체들 간에 가변 도메인의 특정 부분의 서열이 크게 상이하고 그 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 말한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인에서 보존도가 보다 높은 부분은 프레임워크 영역(FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결을 형성하며 어떤 경우에는 β-시트 구조의 일부를 이루는 3개의 CDR에 의해, 주로 β-시트의 입체형태인 프레임워크 영역 4개가 연결되어 이루어진다. 각 쇄 내의 CDR은 FR 영역에 의해 서로 매우 근접하게 유지되고, 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 (1991) 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합시에 직접 관여하지 않지만, 항체 의존적 세포의 세포독성에서 항체의 참가와 같은 상이한 이펙터 기능을 보인다.
본원에 사용된 "고도 가변 영역"이란 항원 결합의 원인이 되는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 고도 가변 영역은 경쇄 가변 영역에서의 "상보성 결정 영역 내지 "CDR"의 잔기(즉, 잔기 24 내지, 34(L1), 50 내지 56(L2) 및 89 내지 97(L3)) 및 중쇄 가변 영역에서의 잔기 31 내지 35(H1), 50 내지 65(H2) 및 95 내지 102(H3)의 아미노산 잔기(Kabar et al., Sequences of Proteins of Immunological Interests, 5th Ed. Public Health Services, National Institute of Health, Bethesda, MD. [1990]) 및(또는) 경쇄 가변 영역에서의 고도 가변 루프(즉, 잔기26 내지 32(L1), 50 내지 52(L2) 및 91 내지 96(L3)) 및 중쇄 가변 영역에서의 잔기 26 내지 32(H1), 53 내지 55(H2) 및 96 내지 101(H3)의 아미노산 잔기(Clothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917[1987])를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 가변 영역 잔기 및 상기 정의된 고도 가변 영역 잔기이외의 다른 잔기이다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10):1057-1062 (1995); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 있다.
항체를 파파인 (Papain) 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 이름 붙여진 나머지 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')2단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성된다. 이 구조에서는 각 가변 도메인의 CDR 3개가 상호작용하여 VH-VL이량체의 표면에 항원 결합 부위를 형성한다. 결론적으로 보면, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합하는 능력을 갖는다.
또한, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab 단편은 항체 힌지 (Hinge) 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab 단편은 Fab' 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 지칭한다. F(ab')2항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인이 있는 몇쌍의 Fab' 단편으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되었다.
임의의 척추동물종으로부터 유래한 항체(이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 명백하게 상이한 타입 중의 하나로 분류될 수 있다.
이뮤노글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 이뮤노글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개 주요 클래스가 있고, 이들 중 몇 개는 서브클래스(이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분류될 수 있다.
본원에서 사용된 "모노클로날 항체"라 함은 실질적으로 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를제외한, 한 집단을 이루는 동일한 개별 항체를 의미한다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 관한 것이므로 메우 특이적이다. 또한, 전형적으로 상이한 결정군(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와 달리, 각 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정군에 대한 것이다. 모노클로날 항체는 그 특이성외에 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양액으로 합성할 수 있다는 잠점이 있다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동정인 항체 집단으로부터 얻었다는 항체 특성을 가리키는 것이며, 임의의 특별한 방법으로 항체를 제조하는데 요구되는 것으로 여겨지지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 먼저 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495[1975])에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어, 문헌(Clackson et al., Nature, 352:624-628[1991] 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597(1991))에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본원에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분은 특별한 종으로부터 유래된 항체 또는 특별한 항체군 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 유사하지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체군 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 유사한 "키메라" 항체(이뮤노글로불린)를 포함한다(미국 특허 제4, 816, 567호; Morrison et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 81:6851-6855[1984]).
비-인간(예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 인간화 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2또는 항체의 다른 항원 결합 작은 서열)이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 치환시킨 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체에서도 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 이뮤노글로불린 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 [Jones et al.,Nature,321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,Nature,332: 323-329 (1988); 및 Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)].
"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의VH및 VL도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 필요한 구조를 형성하도록 하는 VH및 VL도메인 사이에 폴리펩티드 링커도 포함한다(sFv에 관해서는 문헌 (Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)) 참조).
"디아바디(diabody)"라 함은 동일한 폴리펩티드 쇄 (VH-VL) 내에 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 말한다. 동일한 쇄에 있는 2개의 도메인을 페어링시키기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 페어링시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어, 유럽 특허 제404,097호, 국제 공개 제93/11611호 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"단리된" 항체는 자신의 천연 환경 성분으로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 천연 환경 성분은 항체의 진단 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질이 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정시 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 항체로, 또는 (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산의 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드로 정제될 것이다. 단리된 항체는 그 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 원위치에서의 항체를 포함한다. 그러나, 단리된 항체는 일반적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 정제될 것이다.
"표지(label)"는 이 명세서에 사용될 때, 항체에 직간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체로 (방사성동위원소 표지 또는 형광 표지) 검출될 수 있거나, 효소 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다. 검출가능한 표지로 작용할 수 있는 방사성핵종으로는 예를 들어, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-186, At-211, C4-67, Bi-212 및 Pd-109가 있다.
"고상(solid phase)"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고상의 예는 부분적으로 또는 완전하게 형성된 유리 (예를 들어 세공 조절된 유리), 폴리사카라이드 (예를 들어 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘 등이 있다. 특정 실시양태에서, 내용에 따라 고상은 분석 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 실시양태에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들어 친화 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상도 포함한다.
"리포좀"은 약물 (예를 들어, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 또는 이에 대한 항체)을 포유동물에게 전달하는 데 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 작은 비히클이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생체막의 지질 정렬과 유사하게 이중층 형태로 정렬된다.
본원에 사용된 "이뮤노어드헤신"이란 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 이종 단백질(어드헤신)의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로 보면 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위가 아닌, 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신 중 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 서브타입, IgA(IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM등 어떠한 이뮤노글로불린으로부터든지 얻을 수 있다.
II. 본 발명의 조성물 및 방법
A. 전장 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및 PRO317 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및 PRO317로 언급된 폴리펩티드를 코딩하는 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 특히, 하기 실시예에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 각종 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및 PRO317 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. 별도의 발현 주기에서 생성된 단백질의 PRO 숫자는 다를 수 있지만 UNQ 수는 임의 주어진DNA 및 코딩된 단백질이든지 그의 특유의 것이며, 변하지 않을 것이다. 그러나, 본원에서는 간단하게, 본원에 개시된 전장의 천연 핵산 분자에 의해 코딩된 단백질, 및 상기 정의에 포함된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및 PRO317의 다른 천연 상동체 및 변이체를 이들의 출처 및 제조 방식과 상관없이 "PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317"로 언급할 것이다.
하기 실시예에 기재된 바와 같이, 여러가지 cDNA 클론을 ATCC에 기탁하였다. 당업자라면 당업계의 일반적인 방법을 이용하여 기탁된 클론의 서열을 분석함으로써 상기 클론의 실제 뉴클레오티드 서열을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적인 기술을 사용하여 뉴클레오티드 서열로부터 예상된 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산의 경우, 본 발명자들은 당시 이용할 수 있었던 서열 정보를 사용하여 가장 잘 확인할 수 있는 리딩 프레임으로 여겨지는 것을 확인하였다.
B. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 변이체
본원에서 설명되는 전장 천연 서열 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 외에, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 변이체를 제조할 수 있는 것으로 생각된다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및 PRO317 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 PRO187, PRO533,PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 DNA에 도입하고(하거나) 목적 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 합성하여 제조할 수 있다. 당업자라면 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경 또는 멤브레인 앵커링 특성의 변화와 같은 아미노산 변화가 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 번역후 프로세싱을 변경시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 설명된 전장 천연 서열 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 또는 각종 도메인에서의 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 변이는 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이 기술 및 지침을 사용하여 제조할 수 있다. 변이는 천연 서열 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317와 비교되는 것으로 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 아미노산 서열이 변화된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 하나 이상의 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 도메인에서 하나 이상의 아미노산을 임의 다른 아미노산으로 치환함으로써 생성된다. 목적 활성에 유해한 효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 서열을 공지의 상동 단백질 분자의 서열과 비교하고 상동성이 높은 영역에서 생성된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환, 예를 들어 루이신의 세린으로의 치환, 즉 아미노산의 보존적 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시키고, 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타나는 생성된 변이체의 활성을 시험함으로써 정할 수 있다.
본원은 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 단편들을 제공한다. 예를 들어 전장 천연 단백질과 비교하는 경우, 이 단편들은 N-말단 또는 C-말단이 잘릴 수 있으며 내부 잔기가 결손될 수 있다. 몇몇 단편은 본 발명의 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 목적 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결손되어 있다.
PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 단편은 많은 통상의 기술 중 임의 기술에 의해 제조할 수 있다. 목적 펩티드 단편은 화학적으로 합성할 수 있다. 다른 방법은 효소적 분해 방법, 예를 들어 이 단백질을 특정 아미노산 잔기에 의해 정해진 부위에서 단백질을 자르는 것으로 알려진 효소로 처리하거나 또는 이 DNA를 적합한 제한 효소로 잘라냄으로써 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 단편을 생성하고 이 목적 단편을 단리하는 것을 포함한다. 그러나, 또다른 적합한기술은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 목적 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 증폭하는 것을 포함한다. DNA 단편의 목적 말단부를 정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머로 사용된다. 바람직하게는, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 단편은 본원에서 개시된 천연 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드와 한가지 이상의 생물학적 및(또는) 면역적 활성을 공유한다.
구체적인 실시태양에서, 목적물의 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 1에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 1에서 치환예로서 명명되거나 아미노산 종류에 대해서 하기에서 보다 상세하게 설명된 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.
폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 백본의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서의 분자의 하전 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 그의 효과를 상당히 변경시키는 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족; trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 상기 한 종류의 구성 성분을 다른 종류의 것으로 교환시킬 것이다. 또한, 이렇게 치환되는 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나 또는 보다 바람직하게는 나머지(비보존) 부위에 도입될 수 있다.
변이는 올리고뉴클레오티드 매개(위치 지정) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝법 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수있다. 위치 지정 돌연변이 유발법(Carter et al., Nucl. Acids Res.,13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res.,10:6487 (1987)), 카세트 돌연변이 유발법(Wells et al., Gene,34:315 (1985)), 제한 선택 돌연변이 유발법(Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA,317:415 (1986)) 또는 다른 공지 기술을 클로닝된 DNA에 실시하여 본 발명의 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 변이체 DNA를 제조할 수 있다.
또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 사용하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 통상, 알라닌은 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 배열을 변경시킬 가능성이 적기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다[Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. 또한, 알라닌은 통상 가장 흔한 아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 빈번하게 발견된다(Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체(isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
C. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및 PRO317의 변형
PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및PRO317의 공유결합 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 변형의 한 형태는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N 말단 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는 예를 들어 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 가교결합시키거나 그 반대로 가교결합시키는데 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제는 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질을 포함한다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기의 메틸화(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)), N-말단 아민의 아세틸화및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 공유결합 변형의 다른 유형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. 본원에서 "천연 글리코실화 패턴의 변화"는 천연 서열 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실(잠재성 있는 글리코실화 부위를 제거하거나 화학적 및(또는) 효소적 방법에 의해 글리코실화를 결실시킴으로써) 및(또는) 천연 서열 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 또한, 이 용어는 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 특성 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어 질적 변화를 포함한다.
PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열의 변화에 의해 달성될 수 있다. 변화는 예를 들어 천연 서열 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우). PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 아미노산 서열은 특히 목적 아미노산으로 번역되는 코돈을 생성시키도록 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이시킴으로써 DNA수준에서의 변화를 통하여 임의로 변화시킬 수 있다.
PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 국제 공개 제87/05330호 및 문헌(Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981))에 기재되어 있다.
PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 또는 글리코실화 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌(Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52(1987) 및 Edge et al., Anal. Biochem., 118:131(1981))에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 효소에 의한 절단은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다(Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350(1987)).
PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 공유결합 변형의 다른 종류는 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 기재된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 PRO187,PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 연결시키는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317은 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 PRO를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 아미노 또는 카르복실 말단에 위치한다. 상기 에피토프 태그를 갖는 형태의 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 종류의 친화성 매트릭스를 사용한 친화성 정제에 의해 PRO를 용이하게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘(poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)], c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3636 (1985)], 및 단순포진 바이러스 당단백질 D (gD)태그 및 그의 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]를 들 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)], KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)], 알파-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)] 및 T7 유전자 10 단백질 태그 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]를 포함한다.
다른 한 실시태양에서, 키메라 분자는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317과 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정 영역의 융합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태("면역어드헤신"으로 언급하기도 함)의 경우, 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역일 수 있다. 이 Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자내 1개 이상의 가변성 영역의 부위를 PRO 폴리펩티드의 가용성(결실 또는 활성화된 막횡단 도메인) 형태로 치환한 것을 포함한다. 특히 바람직한 한 실시태양에서, 이뮤노글로불린 융합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 융합체를 생산하는 방법으로는, 1995년 6월 27일 간행된 미국 특허 제5,428,130호를 참조한다.
D. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및 PRO317의 폴리펩티드의 제조
이하에 설명되는 내용은 주로 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211,PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 제조하는 방법에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 제조할 수 있다. 예를 들어, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 서열 또는 그의 단편은 고상 기술을 사용하는 직접 펩티드 합성법에 의해 제조할 수 있다(Stewart et al., Solid -Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963). 생체외 단백질 합성은 수동 방법 또는 자동 방법에 의해 수행될 수 있다. 자동 합성법은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 펩티드 합성기(Applied Biosystems Peptide Synthesizer)(미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. PRO의 상이한 단편을 별도로 화학적으로 합성하고 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합함으로써 전장 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 제조할 수 있다.
a. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317를 코딩하는 DNA의 단리
PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 코딩하는 DNA는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 mRNA를 보유하여 그를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 생각되는 조직으로부터 제조한 cDNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 따라서, 인간 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 DNA는 실시예에서 설명되는 바와 같이 인체 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득할 수 있다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 수득하거나 또는 공지된 합성 방법(예를 들어, 자동 핵산 합성 방법)에 의해 수득할 수 있다.
라이브러리는 목적 유전자 또는 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 고안된 프로브 (예를 들어, 목적하는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317에 대한 항체 또는 약 20 내지 80개 이상의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 코딩하는 유전자를 단리하는 다른 수단은 PCR 방법을 사용하는 것이다 [Sambrook et al., 상기 문헌; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)].
하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성 결과를 최소화하기 위해서 충분한 길이를 갖고 충분히 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA에 혼성화시에 검출될 수 있도록 표지되는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고,32P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간정도 엄격성 및 높은 엄격성을 포함하는 혼성화 조건은 문헌(Sambrook et al., 상기 문헌)에서 제공된다.
상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 GenBank와 같은 공용 데이타베이스 또는 다른 독점 서열 데이타베이스에 기탁되고 입수될 수 있는 다른 공지의 서열과 비교하여 정렬시킬 수 있다. 분자의 한정된 영역 내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 선행 기술 공지된 방법 및 본원에서 설명된 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 먼저 본원에서 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하고 필요하다면 전구체를 검출하기 위해 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 기재된 통상의 프라이머 신장 방법을 사용하여, 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사되지 않은 mRNA의 중간체를 프로세싱함으로써 수득할 수 있다.
b. 숙주 세포의 선택 및 형질전환
숙주 세포는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 생성을 위해 본원에서 설명한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환되고 프로모터 유도, 형질전환체 선택 또는 목적 서열을 코딩하는유전자 증폭에 적합하게끔 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양된다. 당업자라면 불필요한 실험을 수행하지 않고서도 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시되는 기술은 문헌[Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al., 상기 문헌]에서 찾을 수 있다.
진핵세포 형질감염 방법 및 원핵세포 형질전환 방법, 예를 들어 CaCl2, CaPO4, 리포솜-매개 방법 및 일렉트로포레이션은 당업자에게 공지되어 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 문헌(상기 Sambrook et al.,)에 기재된 염화칼슘법을 이용하는 칼슘 처리, 또는 일렉트로포레이션은 일반적으로 원핵세포에 대해 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 문헌(Shaw et al.,Gene,23:315(1983) 및 1989년 6월 29일 공개된 국제 공개 제89/05859)에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 상기 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌(Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978))의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 특징은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌(Van Solingen et al., J. Bact., 130:949(1977) 및 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76:3829(1979))의 방법에 따라 수행된다. 그러나,세포 내로 DNA를 도입하는 다른 방법, 예를 들어 핵내 미세주입, 일렉트로포레이션, 원형 세포와 세균 원형질체 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어 폴리브렌, 폴리오르니틴도 사용할 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환을 위한 여러 기술에 대해서는 문헌(Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 및 Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988))을 참조한다.
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포에는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포가 포함된다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae), 예를 들어 이. 콜라이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예를 들어 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 X1776(ATCC 31,537), 이. 콜라이 균주 W3110(ATCC 27,325) 및 K5 772(ATCC 53,635)는 용이하게 입수할 수 있다. 다른 적합한 원핵생물 숙주 세포는 에셔리키아(Eshcerichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(marcescans) 및 시겔라(Shigella) 등의 장내세균과(Enterobacteriaceae), 및 바실러스(Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (subtilis) 및 비. 리체니포르미스(licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공고된 DD 266,710호에 기재된 비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사(aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예는 단지 예시적인 것으로서 이에 제한되는 것은 아니다. 균주 W3110은 재조합 DNA 산물 발효에 공통적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주의 내생 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 초래하도록 변형될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2, 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4, 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT kanr를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7(ATCC 55,244), 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4 및 1990년 8월 7일 공포된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 페리플라즘 프로테아제 변이체를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응이 적합하다.
원핵세포 외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 PRO-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 일반적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) (Beach andNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985년 5월 2일 공고된 EP 139,383); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주(미국 특허 제4,943,529호; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어 케이. 락티스(lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]), 케이. 프라길리스 (fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135(1990)), 케이. 테르모톨레란스 (thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (marxianus); 야로위아 (yarrowia)(유럽 특허 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (유럽 특허 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia)(유럽 특허 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa; Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); 시와니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis)(1990년 10월 31일 공고된 유럽 특허 394,538); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공고된 국제 공개 제91/00357호) 및 아스퍼길러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (nidulans)(Ballance et al,, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) 및 에이. 니게르 (niger) (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])가 포함된다. 메틸 영양 요구성 효모가 적합하고, 한세눌라(Hansenula), 칸디다(Candida), 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아, 사카로마이세스, 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라(Rhodotorula)로 이루어지는 속으로부터 선택된, 메탄올 상에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들 종류의 효모의 예인 구체적인 종의 목록은 문헌(C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982))에 기재되어 있다.
글리코실화 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예에는 드로소필라 S2 및 스포도프테라 Sf9와 같은 곤충 세포 및 식물 세포가 포함된다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 COS 세포가 포함된다. 보다 구체적인 예에는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인(COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 라인 (293 세포 또는 현탁 배양액 중의 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59(1997)), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)), 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251(1980)), 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포(Hep G2, HB 8065) 및 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51)이 포함된다. 당업자라면 적합한 숙주 세포를 선택할 수 있다.
c. 복제가능 벡터의 선택 및 사용
PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 코딩하는 핵산(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입할 수 있다. 다양한 벡터를 용이하게 구할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 사용하여 DNA를 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 성분을 하나 이상 포함하는 적합한 벡터의 제조는 당업자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 사용한다.
PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317은 직접 재조합 방법에 의해 생산될 수 있을 뿐만 아니라 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 또는 벡터 내로 삽입된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 코딩 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더(사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더(미국 특허 제5,010,182호)를 포함함) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더(1990년 4월 4일 공고된 유럽 특허 362,179) 또는 1990년 11월 15일 공개된 국제 공개 제90/13646호에 기재된 신호 서열일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열, 예를 들어 동일하거나 관련된 종의 분비 폴리펩티드로부터의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더를 사용하여 단백질의 분비를 지시할 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 선택된 1 종 이상의 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 만드는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 선택가능한 마커로도 불리우는 선택 유전자를 함유할 것이다. 대표적인 선택 유전자, 예를 들어 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라싸이클린에 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능한 마커의 예는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 코딩 핵산을 수용할 수 있는 세포의 동정을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 이용될 경우, 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이고, 문헌(Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980))에 기재된 바와 같이 제조 및 증식된다. 효모에 사용하는데 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다(Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979); Kingsman et al., Gene, 7:141(1979); Tschemper et al., Gene, 10:157(1980)). trp1 유전자는 트립토판으로의 성장능이 결여된 효모의 변이주(예를 들어, ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선택 마커를 제공한다(Jones, Genetics, 85: 12 (1977)).
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 mRNA 합성을 지시하는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재성 있는 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터에는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템(Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)), 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템(Goeddel, Nucleic acid Res., 8:4057 (1980); 유럽 특허 36,776), 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터(deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983))를 포함한다. 또한, 세균계에서 사용되는 프로모터는 PRO를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(S.D.) 서열을 함유할 것이다.
효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트키나제(Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) 또는 다른 당분해 효소(Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149(1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 디히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 EP 제73,657호에 기재되어 있다.
포유동물 숙주 세포내의 벡터로부터의 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 전사는 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989년 7월 5일 공고된 UK 2,211,504호), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 얻어진 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터 및 열-충격 프로모터로부터 얻어진, 숙주세포계에 적합성인 프로모터에 의해 조절된다.
고등 진핵세포에 의한 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 일반적으로 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 대해 작용하는, 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-액팅 성분이다. 많은 인핸서 서열은 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 유래하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 뒷부분 상의 SV40 인핸서(bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 뒷부분 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 코딩 서열에 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
또한, 진핵생물 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래한 다핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 수 있을 것이다. 그러한 서열은 통상적으로 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역 영역으로부터 확보된다. 이들 영역은 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 단편을 포함한다.
재조합 척추동물 세포 배양에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 합성에 적용하는데 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌(Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); 유럽 특허 제117,060호 및 동제117,058호)에 기재되어 있다.
d. 유전자 증폭/발현의 검출
유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어 통상의 서던 블로팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블로팅(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), 도트 블로팅(DNA 분석) 또는 본원에서 제공된 서열을 기초로 하여 적절하게 표지된 프로브를 사용한 동일 반응계 혼성화에 의해 시료에서 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중쇄, RNA 이중쇄 및 DNA-RNA 혼성 이중쇄 또는 DNA-단백질 이중쇄를 비롯한 특정 이중쇄를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 바꾸어 말하면, 항체를 표지하고, 상기 이중쇄를 표면에 결합시켜, 표면 상에 이중쇄가 형성될 때 이중쇄에 결합한 항체의 존재를 검출할 수 있는 분석을 수행할 수 있다.
별법으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 생성물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양액 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 임의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 또는 본원에서 제공되는DNA 서열을 기초로 한 합성 펩티드 또는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 DNA에 융합되고 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.
e. 폴리펩티드의 정제
PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 형태는 배양 배지 또는 숙주 세포 용균액으로부터 회수될 수 있다. 멤브레인에 결합하는 경우, 적합한 세제 용액 (예를 들어 Triton-X 100)을 사용하거나 효소의 절단에 의해 멤브레인으로부터 방출될 수 있다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 싸이클, 초음파 처리, 기계적 분쇄 또는 세포 용균제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 분쇄시킬 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 정제 방법의 예는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지, 예를 들어 DEAE 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 예를 들어 Sephadex G-75를 사용한 겔 여과, IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼 및 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 에피토프 태그 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이팅 컬럼이다. 다양한 단백질 정제 방법을 사용할 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌(Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982))에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어 사용되는 생산 방법 및 생산되는 특정 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 특성에 따라 결정될 것이다.
E. 종양 조직 및 세포주에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 증폭
본 발명은 특정 암 세포에서 증폭된 유전자의 확인 및 특성 분류를 기로로 한 것이다.
원핵생물 및 진핵생물의 게놈은 표면상 모순되는 두 요구조건하에 놓인다. 하나는 여러 세대를 거치면서 안정한 유전성이 보존되도록 유전 정보인 DNA를 원형대로 보존 및 증식시켜야 한다. 다른 하나는 세포 또는 유기체는 환경 변화를 견딜 수 있어야 한다. 적용가능한 기전으로는 유전 물질의 정성 또는 정량적 변화가 있다. 정성적 변화로는 코딩 서열이 변형되어 구조적 및(또는) 기능적으로 상이한 단백질을 생성시키는 DNA 돌연변이가 있다. 유전자 증폭은 완전한 토딩 서열, 예를 들어, 유전자의 실질적인 수가 증가하여 전사에 이용될 수 있는 주형의 수가 증가하고, 변역가능한 전사물 수의 증가 및 결국에는 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 풍부해진다.
유전자 증폭의 현상 및 그의 주요 기전은 다수 원핵생물 및 진핵생물 배양 시스템에서 생체내 연구하였다. 유전자의 증폭의 가장 전형적인 예는 세포독성 약물인 메토트렉세이트(MTX)의 농도를 달리하여 함유하는 배지중 진핵세포의 배양액을 포함한다, MTX는 폴산 동족체이며, 효소 디히드로 폴레이트(DHFR)를 블록킹하여 DNA 합성을 방해한다. 낮은 농도의 MTX에 초기 노출되는 동안, 대부분의 세포(99.9%를 넘음)가 사멸된다. 소수의 세포만이 살아남고, 다량의 DFHR-RNA 및 단백질을 생성하여 증가되는 MTX 농도에서 성장할 수 있다. 이러한 과생성은 단일 DHFR 유전자의 증폭을 기초로 한다. 추가의 유전자 복제본은 작은 형태의 세포외염색체 복제본, 과잉 염색체(이중) 또는 통합된 염색체 복제본으로 발견된다.
유전자 증폭은 거의 대부분 세포독성 약물(세균의 경우에는 항생제이고, 원핵세포의 경우에는 화학요법제)에 대한 내성을 발현 및 신생물 형질변환중에 일어난다. 자발적인 사건으로서 또는 바이러스 또는 화학/환경적 손상으로 인한 원핵세포의 형질전환은 전형적으로 그 세포의 유전 물질의 변화와 관련되어 있다. 인간 악성질환에서 관찰되는 가장 통상적인 유전적 변화중 하나는 p53 단백질의 돌연변이이다. p53은 세포가 정지기(G1)에서 복제기(S)로 전이되는 것을 조절하며, DNA가 손상된 상태에서는 이러한 전이가 저해된다. 즉, p53 돌연변이를 무력하게한 결과로 주요한 것은 DNA 손상이 축적 및 증가, 즉 유전적으로 변화된다. 점 돌연변이외에, 신생물 세포에서 유전적 변화의 통상적인 유형은 증폭 및 확장, 구조적 변형, 예를 들어, 전좌이다.
DNA 서열의 증폭은 DHFR계에서 예시된 바와 같이 특정 기능적 요구조건을 가리킬 수 있다. 따라서, 악성에서의 특정 종양유전자의 증폭은 악성 혈질전화 및 형질전호될 표현형의 유지 과정에서 원인이 되는 상기 유전자의 역할에 대한 것이다.이 이론은 최근 연구에 의해 지지되고 있다. 예를 들어, bcl-2 단백질은 특정 유형의 비-호드킨 림프종에서 증폭되는 것으로 밝혀졌다. 이 단잭질은 아팝토시스를 억제하고, 신생물 세포를 점차적으로 축적시킨다. 성장 인자 수용체의 오전자 패밀리에 속하는 부류는 각종 유형의 암에서 증폭되는 것을 밝혀졌는데, 이는 상기 수용체의 과발현이 이용가능한 성장 인자의 양을 제한하는데에 신생물 세포를 덜 민감게 하는 것임을 시사하는 것이다. 예로 들 수 있는 것으로는 안드로겐 제거 요법 도중 재발된 전립선암에서 안드로겐의 증폭 및 유방암에서 ERB2와 유사한 성장 인자 수용체의 증폭이 있다. 최근, 세포 주기 진행의 세포내 신호 및 조절에 관련된 유전자가 악성 형질전환 도중 증폭될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 것은 각종 상피 및 임파 신생물에서의 bcl-1 및 ras 유전자에 의해 예시된다.
초기 연구에서는 그러한 연구를 통해 악성 형질전화에 중요한 유전자를 확인할 수 있기 때문에 신생물에서 증폭된 DNA 서열의 확인 가능성을 예시하였다. ERB2의 경우에는 형질전환 단백질이 신규하며 종양 치료 요법에 대한 특이적 표적이기 때문에 치료요법 견지에서의 실행가능성도 보여준다.
증폭된 게놈 서열을 증명하는데 다수의 상이한 기술을 이용할 수 있다. 암 세포로부터 제조된 염색체 스프레드의 전형적인 세포유전적 분석은 전체 구조적 변형, 예를 들어, 전좌, 결실 및 전위를 확인하는데 적합한다. 증폭된 게놈 영역은 많은 복제본 수를 가지거나 염색체외 물질로 존재하는 경우에만 가시화할 수 있다. 세포유전학은 특정 신생물과 특이적 염색체 변화가 일정한 관계에 있ㅇ㎕을 보여준 최초의 기술이지만, 취급이 용이한 DNA 서열의 확인 및 분리에 부적합한다. 비교게놈 혼성화(GGH)의 보다 근래 개발된 기술은 신생물에서 게놈 증폭의 만연된 현상을 예시하고 있다. 종양 및 정상 DNA는 분열 중기의 정상 세포에 동시에 혼성화되고, 전체 게놈은 종양에 높은 빈도수로 존재하는 DNA 서열을 영상 분석하여 스크리닝할 수 있다(국제 공개 93/1,186호; Gray et al., Radiation Res., 137:275-289[1994]). 스크리닝 방법으로서, 이러한 유형의 분석은 각종 인간 신생물에 존재하는 많은 수의 재발생 앰플리콘(복제된 DNA 스트레치)을 밝혀낸다. CGH는 증폭된 DNA 스트레치를 확인하는데 있어 전형적인 세포유전적 분석보다 더 민감하지만, 표준 분자 유전적 분석으로 앰플리콘내의 코딩 서열을 신속하게 확인 및 단리할 수없다.
유전자 앰플리콘을 검출하는 가장 민감한 방법은 폴리머라제 쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR) 분석이다. 이 분석법은 매우 소량의 종양 DNA를 출발 물질로 사용하며, 매우 민감하며, 서열분석 등 추가로 분석할 수 있는 DNA를 제공하며, 분석동안 내내 많은 부피를 유지하는데 적합하다.
상술한 분석법은 상호 배타적이지만, 종종 신생물내 증폭을 확인하는데 조합하여 사용한다. 세포유전적 분석 및 CGH는 증폭된 영역을 위해 전체 게놈을 조사하는 방법을 가리키지만, PCR을 기초한 분석이 증폭되 영역내 코딩 서열, 예를 들어, 유전자의 최종 확인을 위해서는 가장 적합한다.
본 발명에 따라, 상기 유전자는 유방암, 폐암, 결장암, 전립선암, 뇌암, 간암, 신장암, 췌장암, 비장암, 흉선암, 고환암, 난소암, 자궁암 등을 비롯한 원발성 암, 종양 또는 종양 세포주로부터의 DNA와 건강한 공여자로부터의 급원된 DNA를 비교하여 정량적 PCR(S. Gelmini et al., Clin. Chem., 43:752[1997])로 확인하였다. 정량적 PCR은 TaqMan 장치(ABI)를 이용하여 수행하였다. 유전자 특이적 프라이머 및 형광성 유전자 프로브는 DNA의 코딩 서열을 기초로 설계하였다.
인간 폐 암종 세포주로는 모두 ARCC로 부어 입수할 수 있는 A549(SRCC768), Calu-1(SRCC769), Calu-6(SRCC770), H157(SRCC771), H441(SRCC772), H460(SRCC773), H522(SRCC832), H810(SRCC833), SKMES-1(SRC774) 및 SW900(SRCC775)가 있다. 원발성 인간 폐 종양 세포는 통상 선암종, 평편상피암종, 대세포 암종, 비세포 암종, 소세포 암종 및 기관지 폐포 암종으로부터 유래되며, 그의 예로는 SRCC724(선암종, 약어 "AdenoCa"), SRCC725(평편상피암종, 약어 "SqCCa)(LT1a), SRCC726(선암종)(LT2), SRCC727(선암종)(LT3), SRCC728(선암종)(LT4), SRCC729(평편상피암종)(LT6), SRCC730(산암종/평편세포 암종)(LT7), SRCC825(선암종)(LT8), SRCC731(선암종)(LT9), SRCC732(평편상피암종(LT10), SRCC733(평편상피암종)(LT11), SRCC734(선암종)(LT12), SRCC735(선암종/평편상피암종)(LT13), SRCC736(평편상피암종)(LT15), SRCC737(평편상피암종)(LT16), SRCC738(평편상피암종)(LT17), SRCC739(평편상피암종)(LT-18), SRCC740(평편상피암종)(LT19), SRCC741(폐세포 암종, 약어 "LCCa")(LT21), SRCC811(선암종)(LT22), SRCC887(평편상피암종)(LT26), SRCC888(선-BAC 암종)(LT27), SRCC889(평편상피암종)(LT28), SRCC890(평편상피암종)(LT29), SRCC891(선암종)(LT30), SRCC892(평편상피암종((LT31), SRCC894(선암종)(LT33)이 있다. 또한, SRCC1125[HF-000631], SRCC1129[HF-000643],SRCC1133[HF-000840] 및 SRCC1135[HF-000842]로 표시되는 인간 폐 종양도 있다.
결장 암 세포주로는 예를 들어, ATCC 세포주 SW480(선암종, SRCC776), SW620(결장 선암종의 림프절 전이, SRCC777), Colo320(암종, SRCC778). Colo205(선암종, SRCC828), HCC2998(선암종, SRCC830), HT29(선암종, SRCC779), HM7(선암종, SRCC780), KM12(선암종, SRCC831), CaWiDr(선암종, SRCC781), HCT(선암종, SRCC829), HCT116(선암종, SRCC782), SKCO1(선암종, SRCC783), SW403(선암종, SRCC 784), LS174T(선암종, SRCC785) 및 HM7(UCSF 로버트 워렌으로부터 얻은 ATCC 결장 선암종 세포주 LS 174T의 뮤신 다생성 변이체, SRCC780)이 있다. 원발성 결장 종양으로는 CT1(SRCC751), CR2(SRCC742), CT3(SRCC743), CT4(SRCC752), CT5(SRCC753), CT6(SRCC754), CT7(SRCC755), CT8(SRCC744), CT9(SRCC756), CT10(SRCC745), CT11(SRCC757), CT12(SRCC746), CT14(SRCC747), CT15(SRCC748), CT16(SRCC749), CT17(SRCC750), CT18(SRCC758), CT25(선암종, SRCC912), CT28(선암종, SRCC915), CT35(선암종, SRCC921)로 표시되는 결장 선암종이 있다. 또한, SRCC1051[HF-OOO756], SRCC1144[HF-000789] 및 SRCC1148[HF-00081]로 표시되는 인간 결장암 중심부 및 SRCC1059[HF-000755]로 표시되는 인간 결장 종양 주변부가 있다.
인간 유방암 암종 세포주로는 예를 들어, HBL100(SRCC759), MB435s(SRCC760), T47D(SRC761), MB468(SRCC763), MB(SRCC764), BT20(SRCC765), MCF7(SRCC766) 및 SKBR3(SRCC767) 및 SRCC1057[HF-000545]로 표시되는 인간 유방암 종양 중심부도 있다. 또한, SRCC1094, SRCC1095, SRCC1096, SRCC1097, SRCC1098,SRCC1099, SRCC1100 및 SRCC1101이 있다.
인간 신장 종양 중심부로는 SRCC989[HF-000611] 및 SRCC1014[HF-000613]이 있다. 림프절 종양으로는 SRCC1004[HF-000854]가 있다. 직장 종양 주변부로는 SRCC82[HF-000551]이 있다. 고환 종양 중심부로는 SRCC1001[HF-000733], 고환 종양 주변부로는 SRCC999[HF-000716]이 있다.
F. 조직 분포
본원의 유전자 증폭 분석 결과는 추가의 연구, 예를 들어, 각종 인간 조직에서의 mRNA 발현을 측정하여 입증할 수 있다.
상기한 바와 같이, 각종 조직에서의 유전자 증폭 및(또는) 유전자 발현은 본원에 제공된 서열을 기초로 하여 적절히 표지된 프로브를 사용하여 통상의 서던 블롯팅, 노던 블롯팅(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77:5201-5205[1980]), 도트 블롯팅(DNA 분석), 또는 동일 반응계 혼성화로 측정하여 mRNA의 전사를 정량적으로 측정할 수 있다. 또한, DNA 이중 나선, RNA 이중 나선 및 DNA-RNA 하이브리드 이중 나선 또는 DNA-단백질 이중 나선을 비롯한 특이적 이중 나선을 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다.
또한, 각종 조직에서의 유전자 발현은 유전자 생성물의 발현을 직접 정량화하기 위해 면역학적 방법, 예를 들어, 조직 부분의 면역조직화학적 염색 및 세포 배양액 또는 체액의 배양액으로 측정할 수 있다. 샘플액의 면역조직화학적 염색 및(또는) 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있으며, 어떠한 포유동물에서든지 제조할 수 있다. 통상, 항체는 천연 서열 PRO187, PRO533,PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 또는 본원에 제공된 DNA 서열에 기초한 합성 펩티드 또는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 DNA와 융합되었으며 특이적 항체 에피토프를 코딩하는 외생 서열에 대하여 제조할 수 있다. 항체를 제조하는 일반 기술 및 노던 블롯팅 및 동일 반응계 혼성화에 대한 특정 프로토콜은 하기에 제시하였다.
G. 염색체 지도화
소정의 유전자의 증폭이 기능적으로 관련되어 있는 경우, 그 유전자는 종양 생존에 중요하지 않은 인접 게놈 영역보다 더 증폭된다. 이를 시험하기 위해, 유전자는 예를 들어, 방사선-하이브리드 분석으로 특정 염색체에 지도화할 수 있다. 이어서, 증폭 정도는 확인된 지역 및 인접 게놈 영역에서 측정한다. 유전자가 지도화된 게놈 영역에서의 선택적 또는 우선적 증폭은 관찰된 유전자 증폭이 종양 성장 또는 생존을 촉진시킬 수 있다. 염색체 지도화로는 프레임워크 및 에피센터 지도화가 있다. 추가의 상세한 설명은 예를 들어, 문헌(Stewart et al., Genome Research, 7:422-433 (1997))을 참조한다.
H. 항체 결합 연구
유전자 증폭 연구 결과는 종양(암) 세포상의 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체 항체 및 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체가 결합하는 능력을 시험하는 항체 결합 연구로 더 입증할 수 있다. 항체의 예로는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 ㅎ테로콘쥬게이트 항체이며, 그 제조 방법은 하기하였다.
항체 결합 연구는 임의의 공지된 분석 방법, 예를 들어, 경쟁 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석 및 면역침전 분석으로 수행할 수 있다(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.. 147-158(CRS Press, Inc., 1987)).
경쟁 결합 분석은 제한된 양의 항체와 결합하는데 있어 시험 샘플 분석물과과 경쟁하는 표지된 표준 물질의 능력에 좌우된다. 시험 샘플중 표적 단백질(종양 세포에서 증폭된 유전자에 의해 코딩됨)의 양은 항체에 결합하게 되는 표준 물질의 양에 역비례한다. 결합하게 되는 표준 물질의 양의 측정을 촉진시키기 위해, 항체는 결쟁전 또는후에 불용화시켜, 항체에 결합하는 표준 물질 및 분석물이 결합되지 않은 채로 남아있는 표준 물질 및 분석물로부터 쉽게 분리될 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
샌드위치 분석은 각각 검출할 단백질의 상이한 면역원 부분 또는 에피토프에 결합할 수 있는 두 항체를 사용하는 방법을 포함한다. 샌드위치 분석에서, 시험 샘플 분석물은 고상 지지체상에 고정화되는 제1 항체에 의해 결합되고, 그후 분속물에 제2 항체가 결합됨에 따라, 불용성 3부 결합체를 형성한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,376,110호 참조한다. 제2 항체는 그 자체 검출가능한 잔기로 표지(직접 샌드위치 분석)할 수 있거나, 또는 검출가능한 부분에 의해 표지된 항-이뮤노글로불린 항체를 사용하여 (간접 샌드위치 분석)측정할 수 있다. 예를 들어, 샌드위치 분석의 한 유형은 ELISA 분석이며, 이 경우 검출가능한 부분은 효소이다.
면역조직화학에서, 종양 샘플은 신선한 상태이거나 또는 냉동시킬 수 있거나, 또는 파라핀에 포함시키거나, 방부제, 예를 들어, 포르말린이다.
I. 세포에 기초한 종양 분석
세포 기재 분석및 동물 모델은 유전자 증폭 분석에서 발견된 사항을 입증하며, 본원에서 확인된 유전자와 신생물 세포 성장의 발달 및 병인사이의 관계를 더 이해하는데 이용할 수 있다. 종양 세포 또는 암의 발생 및 병인에 있어 본원에서 확인된 유전자 생성물의 역할은 본원에서 유전자를 증폭하기 위해 확인된 원발성 종양 세포 또는 세포를 사용하여 시험할 수 있다. 그러한 세포로는 예를 들어, 유방, 결장 및 폐 암세포 세포주 및 상기 열거된 세포주가 있다.
또다른 한 연구에서, 원발성 종양에 관련된 것으로 공지된 세포 타입의 세포는 본원에서의 cDNA로 형질감염시키고, cDNA가 과도한 성장을 유도해내는 능력을 분석한다. 적합한 세포로는 예를 들어, B104-1 세포주(neu 원시 종양유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주) 및 ras로 형질감염된 NIH-3T3 세포가 있으며, 이들은 목적하는 유전자로 형질감염될 수 있으며, 종양원성 성장을 모니터링할 수 있다. 이어서, 상기 형질감염된 세포주는 형질전환되 세포의 성장에 세포정지 또는 세포독성 활성을 발휘하거나, 또는 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)을 발휘하는 폴리- 또는 모노클로날 항체 또는 항체 조성물의 능력을 시험하는데 사용할 수 있다. 본원에서 확인된 코딩 서열로 형질감염된 세포는 추가로 암 치료를 위한 후보 약물을 확인하는데 사용할 수 있다.
또한, 형질전환 동물(하기됨)의 종양으로부터 유래된 원발성 배양액이 세포를 기초로 한 분석에서 사용될 수 있지만, 안정한 세포주가 바람직하다. 형질전환 동물로부터 연속성 세포주를 유도해내는 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 (Small et al., Mol. Cell. Biol., 5:642-648 (1985)] 참조).
J. 동물 모델
잘 공지되어 있는 각종 동물 모델은 종양의 발생 및 변인에 있어서 본원에서 확인된 유전자의 역할을 더 이해하고, 항체를 비롯한 후보 치료제 및 소분자 길항제를 비롯한 천연 폴리펩티드의 다른 길항제의 효능을 시험하는데 사용할 수 있다. 상기 분자의 생체내 특성으로 인해 특히 인간 환자에서의 반응을 예측할 수 있다. 종양 및 암(예를 들어, 유방암, 결장암, 전립선, 폐암 등)의 동물 모델로는 비-재조합 및 재조합 (형질전환) 동물이 있다. 비-재조합 동물로는 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 쥐 모델이 있다. 상기 모델은 표준 기술, 예를 들어, 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신장 캡슐상태중의 이식, 또는 직생이식, 예를 들어, 결장 조직에 이식된 결장 암 세포를 사용하여 종양 세포를 동질유전자적 생쥐에 도입하여 제조한다(예를 들어, 1997년 9월 18일에 공개된 PCT 국제 출원 국제 공개 제97/33551호 참조).
종양유전자 연구에 가장 흔하게 연구되는 동물은 면역결핍된 생쥐, 특히 무모 생쥐(nude mouse)일 것이다. 인간 종양 이종이식에 대한 숙주로 성공적으로 작용하는 과다/결여증이 있는 무모 생쥐를 관찰한 결과 본 발명의 목적을 위해 광범위하게 사용할 수 있다. 상염색체 열성 nu 유전자는 많은 수의 무모 생쥐의 각 친화종(예를 들어, ASW, A/He, AKB, BALB/c, B10, LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA,DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NAC, NZW, P, RIII 및 SJL)으로 도입하였다. 또한, 무모 생쥐이외의 유전적으로 면역적 결합이 있는 광범한 범위의 다른 동물을 번식시켜 이종 이식의 수용체로 사용하였다. 더 상세한 사항은 예를 들어,문헌(The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven and B. Winograd, eds., CRC Press, Inc. 1991) 참조한다.
상기 동물로 도입된 세포는 공지된 종양/암 세포, 예를 들어, 상기 열거된 종양 세포주라면 어떠한 것이든지, 예를 들어, B104-1 세포주(neu 원시 종양유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주); ras로 형질감염된 NIH-3T3 세포; Caco-2(ATCC HTB-37); 중간 정도로 잘 분화된 등급 II 인간 결장 선암종 세포주, HT-29(ATCCHTB-38), 또는 종양 및 암으로부터 유래될 수 있다 . 종양 또는 암 세포의 샘플은 수술중인 환자로부터 냉동시키고, 액체 질소중에 저장하는 방법을 포함하는 표준 조건으로 얻을 수 있다(Karmali et al, Br. J. Cancer, 48:689-696[1983]).
종양 세포는 각종 방법을 이용하여 동물, 예를 들어, 무모 생쥐로 도입할 수 있다. 생쥐에서의 피하 공간은 종양 이식에 매우 적합한다. 종양은 고상 블록으로서, 투관침을 사용한 침상 생체검사로, 세포 현탁액으로서 이식할 수 있다. 고상 블록 또는 투관침 이식의 경우, 적합한 크기의 종양 조직 단편을 피하 공간으로 도입한다. 세포 현탁액은 원발성 종양 또는 안정한 종양 세포주로부터 새로 제조하고, 피하 주사한다. 종양 세포는 또한 경피하 이식체로서 주사할 수 있다. 이 영역에서, 접종물은 경피 연결 조직과 피하 조직의 하부 사이에 침착된다. 상술한 문헌(Boven and Winograd(1991)) 참조한다.
유방암의 동물 모델은 근복적으로는 문헌(Drebin et al., PNAS USA, 83:9129-9133 (1986))에 기재된 바와 같이, 예를 들어, (neu 종양유전자가 최초로 단리된) 쥐 신경모세포종 세포 또는 neu로 형질전환된 NIH-3T3 세포를 무모 생쥐로 이식하여 제조할 수 있다.
이와 유사하게, 결장 암의 동물 모델은 결장 암 세포를 동물, 예를 들어, 무모 생쥐로 통과시켜 동물에 종양 형상을 일으킨다. 무모 생쥐내 사람 결장암의 직생이식 이식체 모델은 예를 들어, 문헌(Wang et al., Cancer Research, 54:4726-4728(1994) 및 Too et al., Cabcer Research, 55:681-684(1995))에 기재되어 있다. 이 모델은 AntiCancer Inc.(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재) 제품의 소위 메타마우스(METAMOUSE)를 기초로 하였다.
동물 모델에서 유도된 종양은 제거할 수 있으며 생체외 배양할 수 있다. 이어서, 생체외 배양액으로부터의 세포는 동물로 유입시킨다. 상기 종양은 추가의 시험 또는 약물 스크리닝을 위한 표적으로 이용될 수 있다. 또한, 그와 같은 유입으로부터 유도된 종양은 단리할 수 있고, 예비 유입 세포로부터의 RNA 및 1 주기 이상의 유입 전후에 단리된 세포는 관심있는 유전자의 차등적 발현을 분석한다. 상기 유입 기술은 공지된 어떠한 종양 또는 암 세포에서든지 수행할 수 있다.
예를 들어, Meth A. CMS4, CMS5, CMS21 및 WEHI-164는 BALB/c 암컷 생쥐(DeLeo et al., J. Exp. Med., 146:720[1997])의 화학적으로 유도된 섬유육종이며, 이는 각종 물질의 항-종양 활성을 연구하는데 고도로 조절가능한 모델 시스템을 제공한다(Palladino et al., J. Immunol., 138L4023-4032 [1987]). 간단히,종양 세포는 세포 배양액에서 생체외 증식한다. 동물로 주사하기전에 세포주를 세척하고, 완충액에 약 10x107세포/㎖의 세포 밀도로 현탁시킨다. 이어서, 동물 모델은 세포 현탁액 10 내지 100 ㎕로 피하 주사하여 종양이 1 내지 3 주후에 나타나도록 한다.
또한, 가장 완전한 수준으로 연구된 것중 하나인 생쥐의 루이스 페(3 LL) 암종은 연구용 종양 모델로 사용할 수 있다. 종양 모델에서의 효능은 폐의 소세포 암종(SCCL)인 것으로 진단된 인간 환자의 치료에 있어서의 유익한 효과와 상관관계가 있다. 이 종양은 병에 걸린 생쥐로부터의 종양 단편 또는 배양액중에 유지된 세포를 주사할 때 정상 생쥐에 도입(Zupi et al., Br. J. Cancer, 41:suppl. 4:309 [1980])할 수 있고, 그와 같은 사실은 종양이 단일 세포를 주사하는 것으로부터도 시작할 수 있으며, 상당한 높은 비율의 감염 종양 세포가 생존할 수 있음을 입증하는 것이다.
종양이 이식된 동물 모델에서 시험 화합물의 효능을 평가하는 한 방식은 처치전 및 후의 종양의 크기를 측정하는 것이다. 전형적으로, 이식된 종양의 크기는 슬라이드 캘리퍼스를 사용하여 2 내지 3 차원으로 측정하였다. 2 차원으로 제한된 측정값은 종양의 크기를 정확히 반영하기 때문에, 통상 수학식을 이용하여 상응하는 체적으로 환산한다. 그러나, 종양 크기의 측정값은 매우 부정확하다. 후보 약물의 치료 효과는 처치로 유도된 성장의 지연 및 특이적 성장의 지연으로 더 양호하게 설명할 수 있다. 종양 성장의 설명에 있어서의 중요한 다른 변수는 종양이 2배 체적으로 되기까지 소요되는 시간이다. 종양 성장의 계산 및 설명을 위해 문헌(Rygaard and Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds., Basel, 1989, 301)에 보고된 바와 같이 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 그러나, 처치후의 괴사 및 염증 반응은 적어도 초기에 실제적으로 종양 크기를 증가시킬 수 있음을 주의해야 한다. 따라서, 이러한 변화는 형태측정법 및 유동 세포계수법으로 조심스럽게 모니터링할 필요가 있다.
재조합(형질전화) 동물 모델은 형질전환 동물을 제조하기 위한 표준 기술을 이용하여 본원에서 확인된 유전자의 코딩부를 관심있는 동물의게놈으로 유전공학적으로 도입할 수 있다. 형질전화 조작을 위한 표적으로 이용될 수 있는 동물로는 비제한적으로, 생쥐, 쥐, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 인간을 제외한 영장류, 예를 들어, 비비, 침팬지, 원숭이가 있다. 형질전환 도입 유전자(transge)를 상기와 같은 동물로 도입하는 당업계에 공지된 기술로는 전-핵산 미량주입(microinjection)(Hoppe 및 Wanger, 미국 특허 제4,873,191호); 생식선으로의 레트로바이러스 매개된 유전자 전달(예를 들어, Van Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6148-615[1985]); 배간세포(hompson et al., Cell, 56:313-321[1989]); 배의 전기천공(Lo, Mol. Cell Biol., 3:1803-1814[1983]); 정자 매개된 유전자 전달(Lavitrano et al., Cell, 57:717-73[1989])이 있다. 검토를 하기 위해 예를 들어, 미국 특허 제4,736,866호 참조한다
본 발명의 목적상, 형질전화 동물은 형질전환 도입 유전자를 그 세포에만 갖는 동물(모자이크 동물)이 포함된다. 형질전환 도입 유전자는 단일 형질전환 도입유전자로서 또는 연쇄체로, 예를 들어, 헤드 앤드 헤드 또는 헤드 앤드 테일 텐덤으로 통합될 수 있다. 특정 세포 타입으로의 형질전환 도입 유전자의 선택적 도입은 또한 예를 들어, 문헌(Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6232-6236[1992])의 기술로 수행할 수 있다.
형질전환 동물에서의 형질전화 도입 유전자의 발현은 표준 기술로 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 서던 블롯 분석 또는 PCR 증폭은 형질전환 도입 유전자를 입증하는데 사용할 수 있다. 이어서, mRNA 발현 정도는 동일 반응계 혼성화, 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학등의 기술을 이용하여 분석할 수 있다. 동물을 종양 또는 암 발생의 신호에 대해 더 조사할 수 있다.
또한, 본원에서 확인된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 동물의 배세포로 도입된 상기 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA사이의 동종 재조합 결과 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 결함이 있거나 변형된 "넉 아웃" 동물을 구축할 수 있다. 예를 들어, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA는 확립된 기술에 따라 상기 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝하는데 사용할 수 있다. 특정 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 코딩하는 게놈 DNA의 일부를 결실시키거나 다른 유전자, 예를 들어, 통합을 모니터링하는데 사용될 수 있는 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자로 치환할 수 있다. 전형적으로, 수 킬로베이스(kb)의 비변형된 플랭킹(flanking) DNA(5' 및 3' 말단 모두에서)가 벡터에 포함되어 있다(동종 재조합 벡터의 설명의 경우, 예를 들어, 문헌[Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)] 참조). 벡터를 배세포 세포주로(예를 들어, 전기천공) 도입하고, 도입된 DNA가 내인성 DNA와 함께 동종 재조합된 세포를 선별한다(예를 들어, 문헌[Li et al., Cell, 69:915(1992)]. 이어서, 선별된 세포는 동물(예를 들어, 생쥐 또는 쥐)의 포배로 주사하여 집합체 키메라를 형성한다(예를 들어, 문헌[Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed.(IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]). 이어서, 키메라 배는 적합한 유사임신 암컷 양모 동물 및 배로 이식하여 "넉 아웃" 동물을 유도하였다. 생식 세포에 동종 재조합 DNA를 함유하는 자손은 표준 기술로 확인할 수 있고, 동물의 모든 세포가 동종 재조합 DNA를 함유하는 동물을 번식시키는데 사용할 수 있다. 넉 아웃 동물은 예를 들어, 특정 병인적 증상을 방어하는 능력 및 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 부재로 인한 변인적 증상의 발생을 특징으로 한다.
본워에서 확인된 폴리펩티드 및 다른 후보 약물에 특이적으로 결합하는 항체의 효능은 특발성 동물 종양의 치료에서도 시험할 수 있다. 그러한 연구에 적한한 표적은 고양이과 경구 평편상피 세포 암종(SCC)이다. 고양이과 경구 SCC는 고양이종에서 보고된 경구 종양의 60% 이상을 차지하는 것으로서 가장 흔한 고양이 경구 악성인 매우 침입성이 강한 악성 종양이다. 원발 부위로 거의 전이되지 않지만, 이러한 전이의 낮은 발생률은 상기 종양이 있는 고양이의 생존 시간이 짧다는 것을반영한다. 이 종양은 통상 수술받지 못하는데, 그 주된 이유는 고양이과 구강의 해부학적 구조 때문이다. 현재 이 종양에 대한 효과적인 치료는 없다. 연구에 들어가지 전에 각 고양이를 완전히 임상 조사(생체검사)하고, 컴퓨터 X선 단층 촬영(computed tomography, CT)으로 주사한다. 설하 경구 평판상피 세포 종양이 있는 것으로 진단된 고양이는 이 연구에서 제외한다. 이러한 종양의 결과 혀가 마비될 수 있고, 치료를 하여 종양을 사멸시킬지라도, 동물은 음식을 섭치할 수 없다. 각 고양이를 장시간에 걸쳐 반복 처치한다. 처리 기간 동안 종양을 촬영하고, 각 수반 현상을 다시 점검한다. 처치후, 8 주 마다 각 고양이는 추가로 CT 주사를 한다. CT 주사 및 흉부 방사선 투과 사진으로 평가한다. 그 데이타는 대조군과 비교한 생존율, 반응 및 독성의 차이를 평가한 것이다. 양성 반응은 종양 퇴행과, 바람직하기로는 삶의 질이 개선 및(또는) 수명의 연장을 요한다.
또한, 다른 자발적인 동물 종양, 예를 들어, 개, 고양이 및 비비의 섬유육종, 선암종, 림프종, 결잘종, 평판육종도 시험할 수 있다. 이들 포유류중 개 및 고양이의 선암종은 그 외양 및 행동이 인간과 매우 유사하기 때문에 연구 모델로 바람직하다. 그러나, 동물에서 상기 유형의 종양이 드물게 발생하기 때문에 그 모델을 사용하는 것이 제한을 받는다.
K. 후보 약물의 스크리닝 분석
후보 약물에 대한 스크리닝 분석은 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 결하하거나 그와 결합체를 이루거나, 또는 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포 단백질의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하도록 고안되었다. 그러한 스크리닝 분석은 키메라 라이브러의 스크리닝을 고도로 처리하여 특히 소분자 후보 약물을 확인하는데 적합할 수 있는 분석을 포함한다. 예상되는 소분자로는 펩티드, 바람직하기로는 가용성 펩티드, (폴리)펩티드-이뮤노글로불린 융합체와, 특히 폴리- 및 모노클로날 항체를 비롯한 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-유전형 항체 및 상기 항체 또는 항체 단편의 키메라 또는 인간화 버젼과 또한 인간 항체 및 항체 단편을 비롯한 항체를 비롯한 합성 유기 또는 무기 화합물이 있다. 분석은 당업계에 잘 득성화되어 있는 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역 분석 및 세포를 기초로한 분석을 비롯한 각종 형식으로 수행할 수 있다.
모든 분석법은 본원에서 확인된 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 후보 약물이 이들 두 성분이 상호작용할 수 있는 충분한 시간 및 조건하에 접촉시키는 것을 필요로한다는 점에서 통상적이다.
결합 분석에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 형성된 결합체는 반응 혼합물에서 단리 또는 검출할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 확인된 류전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 후보 약물은 고상 지지체, 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트상에 비공유결합적 부착으로 고정화한다. 비공유결합적 부착은 일반적으로 고상 표면을 폴리펩티드의 용액으로 코딩하고 건조시켜 달성한다. 또한, 고정화될 폴리펩티드에 특이적인 고정화 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체는 고상 표면에 폴리펩티드를 고정시키는데 사용할 수 있다. 이 분석은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 비고정화 성분을 고정화 성분, 예를 들어, 고정화된 성분을 갖는 코팅 표면에 가하여 수행한다. 반응이 완료되면, 비반응성 성분은 예를 들어, 세척하여 제거하고, 고상 지지체상에 고정된 결합체는 검출한다. 원래의 비고정화 성분은 검출가능한 표지를 갖기 때문에, 표면상에 고정화된 표지가 검출되면 이는 결합체가 형성되었음을 가리키는 것이다. 원래의 비고정화 성분은 표지를 갖지 않기 때문에, 예를 들어, 고정화 결합체에 특이적으로 결합하는 고정화 항체를 사용하여 결합체 형성을 검출할 수는 없다.
후보 화합물이 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 특정 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드와 상호작용하거나 그에 결합하는 경우, 그 폴리펩티드와의 결합은 단백질-단백질 상호작용을 검출하는데 있어 잘 공지된 방법으로 분석할 수 있다. 그러한 분석법으로는, 전통적인 연구법, 예를 들어, 가교결합, 동시-면역침전 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시 정제법이 있다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌(Chevary and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-95828(1991))에 개시된 바와 같은 필드(Field)와 그의 공동 연구자 문헌(Fields and Song, Nature, 340:245-246(1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:9578-9582(1991))에 기재된 효모를 기초로한 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 많은 전사 활성화 인자, 예를 들어, 효모 GAL4는 하나는 DNA 결합 도메인으로 작용하고, 다른 하나는 전사 활성 도메인으로 작용하는 두 개의 물질적으로 독특한 조절 도메인으로 이루어져 있다. 상기 문헌에 기재된 효모 발현 시스템(일반적으로, "투-하이브리드 시스템"(two-hybrid system)으로 불림)은 그러한 특성을 이용하며, 2 종의 하비브리드 단백질, 즉 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA 결합도메인에 융합되어 있는 단백질, 다른 하나는 후보 활성화 단백질이 활성 도메인에 융합되어 있는 단백질을 사용한다. GAL4-활성화 프로모터에 의한 조절하에 있는 GAL1-lacZ 수용체 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 좌우된다. 상호작용하는 폴리펩티드를 함유하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 색소원 기질로 검출할 수 있다. 투 하이브리드 기술을 이용하여 두 특이적 단백질사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완전 키트(매치마커(MATCHMAKER), 상표명)는 Clontech로부터 구입할 수 있다. 이 시스템은 또한 특이적 단백질 상호작용에 관련된 단백질 도메인을 지도화하는 것은 물론 그러한 상호작용에 결정적으로 중요한 아미노산 잔기를 정확하게 나타내는데까지 확장하여 사용할 수 있다. 본원에서 확인된 PRO187-, PRO533-, PRO214-, PRO240-, PRO211-, PRO230-, PRO261-, PRO246- 또는 PRO317-코딩 유전자와 다른 세포내- 및 세포외 성분사이의 상호작용을 방해하는 화합물은 다음과 같이 시험할 수 있다. 통상, 반응 혼합물은 증폭된 유전자의 생성물 및 세포간- 또는 세포외 성분을 이들 생성물이 상호작용하고 결합할 수 있는 충분한 시간 및 조건하에 접촉시켜 제조한다. 결합을 억제하는 시험 화합물의 능력을 시험하기 위해, 반응을 시험 화합물의 존재 및 부재하에 실행한다. 또한, 제3 반응 혼합물에 위약을 가하여 양성 대조용으로 이용한다. 혼합물중에 존재하는 시험 화합물과 세포간- 또는 세포외 성분 사이의 결합(결합체 형성)은 상기한 바와 같이 모니터링한다. 시험 화합물을 함유하지 않는 반응 혼합물이 아닌 대조 반응물(들)에서 결합체가 형성되면, 이는 시험 화합물이 그와 그의 반응 상대물사이의 상호작용을 방해하는 것을 가리키는것이다.
길항제를 시험하기 위해, 특정 활성 및 화합물이 PRO187-, PRO533-, PRO214-, PRO240-, PRO211-, PRO230-, PRO261-, PRO246- 또는 PRO317 폴리펩티드에 대한 길항제임을 가리키는 PRO187-, PRO533-, PRO214-, PRO240-, PRO211-, PRO230-, PRO261-, PRO246- 또는 PRO317 폴리펩티드 존재하에 관심있는 활성을 억제하는 화합물의 능력에 대해 스크리닝할 화합물과 함께 세포에 가할 수 있다. 또한, 길항제는 PRO187-, PRO533-, PRO214-, PRO240-, PRO211-, PRO230-, PRO261-, PRO246- 또는 PRO317 폴리펩티드 및 잠재성 있는 길항제를 막 결합된 PRO187-, PRO533-, PRO214-, PRO240-, PRO211-, PRO230-, PRO261-, PRO246- 또는 PRO317 폴리펩티드 수용체와 경쟁적 억제 분석 조건하에 조합하여 검출할 수 있다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드는 방사능 등으로 표지하여 수용체에 결합된 상기 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 분자의 수로 잠재성 있는 길항제의 유효성을 결정하는데 사용할 수 있다. 수용체를 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 많은 방법, 예를 들어, 리간드 패닝 및 FACS 소팅(Coligan et al., Current Protocols in Immune., 1(2); Chapter 5(1991))으로 입증할 수 있다. 바람직하기로는, 발현 클로닝은 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드로부터 폴리아데닐화 RNA가 제조되고, 이 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리가 풀로 분배되고, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 반응하지 않은COS 세포 또는 다른 세포를 형질감염시키는데 사용하는 경우에 이용한다. 유리 슬라이드상에서 성장한 형질감염된 세포는 표지된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 노출시킨다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드는 요오드화 또는 부위 특이적 프로테인 키나제에 대한 인식 부위를 포함시키는 등 각종 수단으로 표지시킬 수 있다. 고정화 및 인큐베이션을 수행한 후, 슬라이드는 방사능자동사진 분석을 한다. 양성 풀을 확인하고, 서브풀을 제조하고, 상호작용성 서브풀 및 재스크리닝 방법을 이용하여 재형질감염하여 결국에는 추정 수용체를 코딩하는 딘일 클론을 제조한다.
수용체 확인을 위한 또다른 연구법으로서, 표지된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드는 세포막 또는 수용체 분자를 발현하는 추출물 제제와 결합된 광친화성일 수 있다. 가교결합된 물질은 PAGE로 해상하고, X-선 필름에 노출시킨다. 수용체를 함유하는 표지된 결합체는 절단하여 펩티드 단편으로 분해할 수 있고, 단백질 미량 서열분석(micro-sequencing)을 할 수 있다. 미량 서열분석으로부터 얻은 아미노산 서열은 추정의 수용체를 코딩하는 유전자를 입증하기 위해 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위해 동의성 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 설계하는데 사용할 수 있다.
길항제에 대한 다른 분석법에서, 수용체를 발현하는 포유류 세포 또는 막 제제를 표지된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드와 후보 화합물 존재하에 인큐베이션시킨다. 이이서, 이러한상호작용을 증진시키거나 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있다.
잠재성 있는 길항제의 보다 특이적인 예로는 이뮤노글로불린과 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드와의 융합체에 결합하는 올리고뉴클레오티드와, 구체적으로는 비제한적으로 폴리- 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-유전형 항체를 비롯한 항체, 또는 키메라 버젼 또는 그러한 항체의 인간화 버젼 또는 단편은 물론 인간 항체 및 항체 단편이 있다. 또한, 잠재성 있는 길항제는 단백질, 예를 들어, 수용체를 인식하지만 효과를 부여하지 않아 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제하는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 돌연변이형과 밀접하게 관련되어 있다.
잠재성 있는 다른 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드는 안티센스 기술을 이용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구축물이며, 여기서, 안티센스 RNA 또는 DNA는 표적화된 mRNA에 혼성화됨으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하고, 단백질 번역을 억제한다. 안티센스 기술은 삼중 나선 형성 또는 안티센스 RNA 또는 DNA를 통한 유전자 발현을 억제하는데 사용할 수 있으며, 이들 두 방법은 폴리뉴크렐오티드의 DNA 또는 RNA에 대한 결합을 기초로 한다. 예를 들어, 본원에서의 성숙 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리뉴클레오티드를 코딩하는폴리뉴클레오티드 서욜의 5' 코딩부는 길이가 약 10 내지 40 bp인 안티센스 RNA올리고뉴클레오티드를 설계하는데 사용한다. DNA 뉴클레오티드는 전사에 관련된 유전자 영역에 상보적이도록 설계(삼중 나선에 대해서는 문헌[Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073(1979); Cooney et al., Science, 241:456(1988); Dervan et al., Science, 251:1360(1991))하여 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리뉴클레오티드의 전사 및 제조를 억제시킨다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA에 혼성화되고, mRNA 분자가 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리뉴클레오티드로 번역되는 것을 억제한다(안티센에 대해서는 문헌[Ojano, Neuochem., 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)] 참조).상기된 올리고뉴클레오티드는 또한 세포로 전달되어 안티센스 RNA 또는 DNA가 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리뉴클레오티드의 생성을 억제하도록 생체내 발현될 수 있게 된다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 번역 개시 부위, 예를 들어, 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10에서 +10 위치사이가 바람직하다.
안티센스 DNA 또는 RNA 분자는 일반적으로 길이가 약 5 base 이상, 약 10 base 이상, 약 15 base 이상, 약 20 base 이상, 약 25 base 이상, 약 30 base 이상, 약 35 base 이상, 약 40 base 이상, 약 45 base 이상, 약 50 base 이상, 약 55 base 이상, 약 60 base 이상, 약 65 base 이상, 약 70 base 이상, 약 75 base 이상, 약 80 base 이상, 약 85 base 이상, 약 90 base 이상, 약 95 base 이상, 약100 base 이상이다.
잠재성 있는 길항제로는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리뉴클레오티드의 활성 부위, 수용체 결합 부위, 또는 성장 인자 또는 관련 결합 부위에 결합하여 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리뉴클레오티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 소분자가 있다. 소분자의 예로는 비제한적으로, 작은 펩티드 또는 펩티드 유사 분자, 바람직하기로는 가용성 펩티드 및 합성 비-펩티딜 유기 또는 무기 화합물이 있다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매화할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 그와 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적 혼성화한 다음, 엔도누클레아제에 의해 절단됨으로써 작용한다. 공지된 기술로 잠재성 있는 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있었다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌 (Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) 및 1997년 9월에 공개된 국제 공개 제97/33551호)을 참조한다.
전사를 억제하는데 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일쇄가어야하며, 데옥시뉴클레오티드로 이루어져야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 그가 호그스틴(Hoogsteen) 염기쌍 규칙을 통해 삼중나선 형성을 촉진하게끔 설계되어 있는데, 삼중나선 형성에는 일반적으로 이중쇄 중 한 쇄에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 있어야 한다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌(상기 국제 공개 제97/33551호)을 참조한다.
상기 작은 분자들은 상기 기재된 임의 한가지 이상의 스크리닝 분석법 및(또는) 당업자에게 잘 알려진 임의 다른 스크리닝 기술에 의해 확인할 수 있다.
L. 종양의 치료용 조성물 및 치료 방법
본원에서 확인된 유전자의 증폭과 관련된 종양의 치료에 유용한 조성물로는 비제한적으로, 표적 유전자 생성물의 발현 및(또는) 활성을 억제하는 항체, 작은 유기 및 무기 분자, 펩티드, 포스포펩티드 안티센스 및 리보자임 분자, 삼중 나선 등이 있다.
예를 들어, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적 mRNA에 혼성화되어 mRNA의 번역을 직접 차단하고, 단백질로의 번역을 저해한다. 안티센스 DNA가 사용되는 경우, 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 번역 개시 부위, 예를 들어, 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10에서 +10 위치 사이로부터 유래된다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매화할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 그와 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적 혼성화한 다음, 엔도누클레아제에 의해 절단됨으로써 작용한다. 공지된 기술로 잠재성 있는 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있었다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌 (Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) 및 1997년 9월 18일에 공개된 국제 공개 제97/33551호)을 참조한다.
전사를 억제하는데 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일쇄가어야하며, 데옥시뉴클레오티드로 이루어져야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 그가 호그스틴 염기쌍 규칙을 통해 삼중나선 형성을 촉진하게끔 설계되어있는데, 삼중나선 형성에는 일반적으로 이중쇄 중 한 쇄에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 있어야 한다. 보다 자세한 사항은 예를 들어 문헌(상기 국제 공개 제97/33551호)을 참조한다.
M. 항체
본 발명에 따라 몇가지 후보 약물로 가장 유망한 것은 본원에서 확인된 증폭된 유전자의 생성물 또는 유전자 생성물의 생성을 억제하고(하거나) 유전자 생성물의 활성을 감소시키는 항체 또는 항체 단편이다.
1.폴리클로날 항체
폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업계 숙련자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 포유동물에 1회 이상 면역화제를 주입, 필요한 경우 면역보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및(또는) 면역보강제는 포유동물에 피하 주사 또는 복강내 주사로 수회 주입될 것이다. 면역화제는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성이 있는 것으로 공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 효과적일 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예에는 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소의 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 사용할 수 있는 면역보강제에는 프로인트 완전 면역보강제 (Freund's complete adjuvant) 및 MPL-TDM 면역보강제(모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl Lipid A), 합성 트레할로오스 디코리노미콜레이트)가 포함된다. 면역화 방법은 불필요한 실험없이 당업계 숙련자가 선택할 수 있다.
2.모노클로날 항체
다른 방법으로, 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975))에 기재된 바와 같은 하이브리도마(hybridoma) 방법을 사용하여 제조한다. 하이브리도마 방법에서, 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 만들거나 만들 수 있는 림프구를 유도하기 위해, 상기 면역화제로 생쥐, 햄스터 또는 다른 적합한 숙주 동물을 면역화시킨다. 다른 방법으로, 림프구는 생체외에서 면역화될 수 있다.
면역화제는 통상 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드, 이들의 단편, 또는 이러한 단백질들이나 이들 단편의 융합 단백질을 포함한다. 통상, 인간에서 유래한 세포가 요구되는 경우에는 말초 혈관 림프구(peripheral blood lymphocyte: "PBL")를 사용하고, 인간이 아닌 포유류에서 유래한 세포가 요구되는 경우에는 비장 세포 또는 림프절 세포를 이용한다. 이어서, 상기 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 무한증식 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). 무한증식 세포주는 통상 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간에서 유래한 골수종 세포이다. 통상, 쥐 또는 생쥐의 골수종 세포를 사용한다. 하이브리도마 세포는 융합되지 않은 무한증식 세포의 생장 또는 생존을 억제하는 1 종 이상의 물질을 포함하는 적합한 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모세포에 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)라는 효소가 결핍되어 있으면, 하이브리도마의 배지는 통상 HGPRT-결핍 세포의 생장을 방해하는 물질인 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함("HAT 배지")할 것이다.
바람직한 무한증식 세포주는 효과적으로 융합되고, 선택된 항체-생성 세포에 의해 높은 수준의 항체를 안정하게 만들어내며, HAT 배지와 같은 배지에 감응성이 높은 것이다. 더욱 바람직한 무한증식 세포주는 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center) 및 버지니아주 마나사스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수가능한 쥐과 골수종 세포이다. 또한, 인간의 골수종 세포 및 생쥐-인간 이종골수종 세포도 인간 모노클로날 항체 생성에 사용되었다 (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)) 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63).
하이브리도마 세포가 배양된 배지를 사용하여 원하는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 의해 유도된 모노클로날 항체의 존재 여부를 분석할 수 있다. 바람직하게는 하이브리도마 세포에서 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성이 면역 침강이나, 방사성면역분석(radioimmunoassay: RIA)이나 효소-결합 면역흡수 분석(enzyme-linked immunoabsorbent assay: ELISA)과 같은 생체외 결합 분석으로 측정할 수 있다. 상기 기술 및 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 문헌 (Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107:220 (1980))에 기재된 스캐쳐드(Scatchard) 분석법에 의해 측정할 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포를 찾아낸 후, 그 클론을 한계 희석 방법으로 서브클로닝하여 표준 방법(Goding, 상기 문헌)으로 배양한다. 이러한 목적에 적합한 배지에는 둘벨코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지가 포함된다. 다른 방법으로, 하이브리도마 세포는 포유동물의 복수종양으로서 생체내에서 배양할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 종래의 면역글로불린 정제 방법(예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피)에 의해 배지나 복수액으로부터 단리 또는 정제할 수 있다.
모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법으로 만들어질 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 종래의 방법(쥐과 동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 사용)을 사용하여 쉽게 단리하고 서열 분석할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 출처로 사용된다. 일단 분리된 DNA를 발현 벡터로 클로닝하고, 이를 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포(평상시에는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않음)에 형질감염시킨 후, 재조합 세포에서 합성된 모노클로날 항체를 수득할 수 있다. 쥐과 동물의 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인을 이와 상동성 있는 인간의 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열로 치환(미국 특허 제4,816,567호 및 모리슨(Morrison) 등의 상기 문헌 참조)하거나, 또는 비-면역글로불린 코딩 서열의 전체 또는 일부분을 면역글로불린 코딩 서열과 공유결합시키는 등의 방법에 의해 상기 DNA를 변화시킬 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명 항체의 불변 도메인으로 치환하거나, 또는 2가 키메라 항체의 생성을 위해 본 발명 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인으로 치환할 수 있다.
상기 항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 한 가지 방법은 면역글로불린의 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄의 가교결합을 방지하기 위해 통상 Fc 영역의 임의의 지점에서 중쇄의 말단이 절단된다. 다른 방법으로, 관련 시스테인 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하거나 제거하여 가교결합을 방지한다.
또한, 생체외 방법도 1가 항체의 제조에 적합하다. 항체를 분해하여 그 단편, 특히 Fab 단편을 제조하는 것은 당업계에 공지된 흔한 기술을 이용하여 수행할 수 있다.
3.인간 및 인간화 항체
본 발명의 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체는 추가로 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 인간이외의 생물(예를 들어, 쥐과 동물)에서 제조한 항체의 인간화 형태는 상기 생물의 면역글로불린으로부터 유래한 최소 서열을 포함하는, 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편(Fv, Fab, Fab', F(ab')2또는 항체의 다른 항원-결합 서열)이다. 인간화 항체는 수용체의 상보성 결정 영역(complementary determining region: CDR)의 잔기가, 원하는 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간이 아닌 종(공여 항체)의 CDR 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용 항체)를 포함한다. 어떤 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 잔기가 상응하는 인간이 아닌 종의 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체 및 수용된 CDR 또는 골격 서열 어디에도 나타나지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 인간이 아닌 종의 면역글로불린과 일치하거나, 또는 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 서열인, 하나 이상(통상, 두 개)의 가변 도메인을 실질적으로 포함한다. 또한, 최적의 인간화 항체는 인간의 면역글로불린 불변부(Fc)를 일부분 이상 포함한다(Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)).
인간이 아닌 생물에서 제조한 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 통상, 인간화 항체는 인간이 아닌 생물에서 제조한 항체에서 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가지고 있다. 이들 아미노산 잔기는 통상 "임포트(import)" 잔기라 불리우며, "임포트" 가변 도메인에서 유래된 것이다. 인간화 과정은 윈터(Winter) 및 그 동료들의 방법(Jones et al, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332:323-327 (1988); 및 Verhoeyen et al, Science 239:1534-1536 (1988))에 따라 설치류의 CDR 또는 인간 항체에서 이에 상응하는 CDR 서열을 치환하여 수행한다. 따라서, "인간화" 항체는 인간 항체의 가변 도메인이 인간이 아닌 종에서 유래한 상응하는 서열에 의해 실질적으로 치환된 키메라 항체(미국 특허 제4,816,567호)이다. 사실상, 인간화 항체는 특정 CDR 잔기 및 어쩌면 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위에서 유래한 잔기로 치환된 인간 항체이다.
또한, 인간 항체는 파아지 디스플레이(phage display) 라이브러리(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381(1991); 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:581(1991))를 포함하는, 당업계에 공지된 여러 가지 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 콜(Cole) 등의 기술 및 뵈르너(Boerner) 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 유용하다(Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); 및 Boerner et al, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)). 마찬가지로, 내생성 면역글로불린 유전자 전체 또는 그 일부가 불활성화된 생쥐와 같은 유전자도입 동물에 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 인간 항체를 제조할 수 있다. 항원투여 후에, 인간 항체 생산이 관찰되었는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 목록을 비롯한 모든 점에서 인간에서 관찰되는 항체와 매우 유사하였다. 이러한 접근법은 예를 들어 문헌 (미국 특허 제5,545,807호, 동 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 5,661,016호) 및 과학 간행물 (Marks etal., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994), Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))에 기재되어 있다.
4.항체 의존성 효소 매개 전구약 치료법 (ADEPT)
또한, 전구약(예들 들면, 펩티딜 화학 요법 치료제, WO 제81/01145호 참조)을 활성 항암제로 전환시키는 전구약-활성화 효소에 이 항체를 접합시킴으로써 본 발명의 항체를 ADEPT에 사용할 수 있다 (WO 제88/07378호 및 미국 특허 제4,975,278호 참조).
ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분에는 전구약을 더 활성적이고 세포독성인 형태로 전환시킬 수 있는 임의의 효소가 포함된다.
본 발명의 방법에 유용한 효소에는 글리코시다제, 글루코스 옥시다제, 인간 리소자임, 인간 글루쿠로니다제, 포스페이트-함유 전구약을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리 포스파타제; 술페이트-함유 전구약을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 무독성 5-플루오로시토신을 항암제 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 전구약을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 세라티아 프로테아제, 써모리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제(예를 들어, 카르복시펩티다제 G2 및 카르복시펩티다제 A) 및 카텝신(예를 들어, 카텝신 B 및 L)과 같은 프로테아제; D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약의 전환에유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제와 같은 탄수화물-절단 효소; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소 위치에서 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 방법으로, 당업계에 "아브자임(abzyme)"이라 공지된, 효소 활성이 있는 항체는 본 발명의 전구약을 유리 활성 약물로 전환시키는데 사용될 수 있다 (Massey, Nature, 328:457-458 (1987)). 항체-아브자임 접합체는 종양 세포 군집으로 아브자임의 전달을 위해 본원에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
본 발명의 효소는 상기 논의된 헤테로-이관능성 가교결합의 이용과 같이 당업계에 공지된 기술에 의해 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317에 공유결합 될 수 있다. 다른 방법으로, 본 발명 효소의 적어도 기능적 활성 부분에 결합된, 본 발명 항체의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은 당업계에 잘 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다 (Neuberger et al., Nature, 312:604-608(1984)).
5.이중특이적 항체
이중특이적 항체는 상이한 두 가지 이상의 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 이 경우에, 결합 특이성 중 하나는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는 세포-표면 단백질, 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중 특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄/경쇄-중쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기에서, 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 일반적으로 친화 크로마토그래피 단계로 수행된다. 유사한 절차가 WO 제93/08829호(1993년 5월 13일에 공개됨) 및 문헌(Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991))에 기재되어 있다.
원하는 결합 특이성을 갖는 항체의 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 이 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 내에서 이루어진다. 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 및 원한다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 유기체로 동시 형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은 예를 들어, 문헌(Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121:210(1986))을 참조한다.
WO 제96/27011호에 개시된 다른 방법에 따르면, 한쌍의 항체 분자사이의 인터페이스를 조작하여 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 헤테로다이머의 비율을 최대화할 수 있다. 바람직한 인터페이스는 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 인터페이스로부터 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체하였다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보충 "공동(cavity)"를 제2 항체 분자의 인터페이스에 생성시켰다. 이는 헤테로다이머의 수율을 호모다이머와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물보다 높게 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')2이중특이적 항체)으로 제조할 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학 결합을 사용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 (Brennan et al., Science 229:81 (1985))에는 온전한 항체를 단백질 가수분해로 잘라서 F(ab')2단편을 생성하는 방법이 기재되어 있다. 이러한 단편은 디티올 복합 물질인 소듐 아르세니트의 존재하에 환원되어 근처 디티올을 안정화하고 분자간 디술피드 결합의 형성을 방지한다. 그 후에, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환시켰다. 그 후에, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민을 사용하여 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시켰다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로 사용할 수 있다.
대장균(E. coli)으로부터 Fab' 단편을 직접 회수하여 화학적으로 연결시킴으로써 이중특이적 항체를 형성시켰다. 문헌 (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992))에는 완전한 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2분자가 기재되어 있다. 각각의 Fab' 단편은 대장균(E. coli)으로부터 별도로 분비되었으며 시험관내에서 지시된 화학적 방법으로 연결하여 이중특이적 항체를 형성시켰다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현시키는 세포 및 정상적인 인간 T 세포와 결합할 수 있을뿐 아니라, 인간 유방암 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용균 활성을 개시할 수 있었다.
또한, 재조합 세포 배양으로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하는 여러 기술이 기재되어 있다. 예를 들어, 루이신 지퍼를 사용하여 이중 특이적 항체를 제조하였다(Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)). 유전자 융합에 의해, Fos 및 Jun 단백질로부터의 루이신 지퍼 펩티드를 2종의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결하였다. 항체 호모다이머의 힌지 영역을 환원시켜 모노머를 형성한 다음, 재산화시켜 항체 헤테로다이머를 형성시켰다. 또한, 이 방법은 항체 호모다이머를 생산하기 위한 방법으로 이용할 수 있다. 문헌 (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993))에 기재된 "디아바디(diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편을 만드는 다른 메카니즘을 제공한다. 이 단편은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는데, 이 링커는 너무 짧아서 상기 두 도메인을 동일 쇄로 짝지을 수 없다. 따라서, 한 단편의 VH및 VL도메인은 다른 단편의 상보적인 VL및 VH도메인과 쌍을 이루게 되며, 그 결과 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv(sFv) 다이머를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 만드는 또다른 전략이 보고되었다(문헌 (Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)) 참조).
2가 이상의 결합가를 갖는 항체도 고려 대상이다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 만들 수 있다(Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)).
전형적인 이중특이적 항체는 본원에 기재된 폴리펩티드의 두 가지 상이한 에피토프와 결합할 수 있다. 또는, 특정 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 대한 세포내 방어 메카니즘에 초점을 맞추기 위해, 항-폴리펩티드 팔 영역(arm)을 백혈구 상 개시 분자, 예를 들어 T-세포 수용체 분자(예를 들어, CD2, CD3, CD28 또는 B7), 또는 IgG의 Fc 수용체(FcγR), 예를 들어 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)와 결합하는 팔 영역과 연결할 수 있다. 또한, 이중특이적 항체를 사용하여 특정 폴리펩티드를 발현시키는 세포에 세포독성 물질을 국소화할 수 있다. 이러한 항체는 폴리펩티드-결합 팔 영역과 세포독성 물질 또는 방사성핵종 킬레이트제, 예를 들어 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA와 결합하는 팔 영역을 가지고 있다. 목적하는 또다른 이중특이적 항체는 폴리펩티드와 결합하며 추가로 조직 인자(TF)와 결합한다.
6.이종접합 항체
이종접합 항체는 2개의 공유결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염을 치료(WO 제91/00360호, 동 제92/200373호, 및 EP 제03089호)하기 위해 제안되었다. 이종접합 항체는 가교결합제를 사용하는 방법을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응에 의해 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약에는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트 및 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 시약이 포함된다.
7.효과기 기능 조작
효과기 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형하여, 예를 들어 암치료에 있어 항체의 효과를 증대하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 Fc 영역에 도입하여 이 영역내 쇄간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 생성된 호모다이머 항체는 내부화 능력이 향상되고(되거나) 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포내 세포독성(ADCC)이 증대된다 (문헌 (Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)) 참조). 또한, 문헌 (Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993))에 기재된 헤테로이관능성 가교결합제를 사용하여 증대된 항암 활성을 지닌 호모다이머 항체를 제조할 수 있다. 또는, 이중의 Fc 영역을 갖는 항체를 조작하여 보체 용균성 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있다(문헌 (Stevenson et al.,Anti-Cancer DrugDesign, 3:219-230 (1989)) 참조).
8.면역결합체
또한, 본 발명은 세포독성 물질, 예를 들어 화학치료제, 독소(예를 들어, 효소적으로 활성인 박테리아, 진균, 식물 또는 동물성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사활성 동위원소(즉, 방사성결합체)와 결합된 항체를 포함하는 면역결합체에 관한 것이다.
상기 면역결합체의 생성에 유용한 화학치료제는 상기에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 콜레라 독소, 보툴리누스 독소, 외독소 A 쇄(슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 사포린, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테세네스가 포함된다. 여러 방사성핵종을 방사결합체 항체의 제조에 이용할 수 있다. 예에는212Bi,131I,131In,90Y 및186Re가 포함된다.
다양한 이관능성 단백질 결합 물질, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이관능성유도체(예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성 물질의 결합체를 만들 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987))에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14로 표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오디드를 항체에 결합시키는 전형적인 킬레이트제이다(WO 제94/11026호 참조).
또다른 실시양태로, 항체를 종양 예비표적화에 이용되는 "수용체"(예를 들어, 스트렙타비딘)에 결합시킬 수 있는데, 여기서 항체-수용체 결합체를 환자에게 투여한 다음, 킬레이트제를 사용하여 순환계로부터 결합하지 않은 결합체를 제거하고 세포독성 물질(예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드"(예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
9.면역리포좀
본원에서 개시된 항체를 면역리포좀으로 제형화할 수도 있다. 이 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 (Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호)에 기재된방법으로 제조할 수 있다. 순환 시간이 증대된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 함유하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 정해진 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 밀어내어 소정의 직경을 갖는 리포좀을 수득하였다. 문헌 (Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982))에 기재된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 접합시킬 수 있다. 화학 요법 치료제(예를 들어, 독소루비신 (Doxorubicin))은 임의로 리포좀내에 포함된다(문헌 (Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989)) 참조).
N.제약 조성물
암을 포함하는 각종 질환을 치료하기 위해, 본원에서 확인되어 증폭된 유전자에 특이적으로 결합하는 항체 및 상기 기재된 스크리닝 분석에 의해 확인된 다른 분자를 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.
증폭된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 세포내에 있고 항체 전부가 억제제로 사용되는 경우, 내부화 항체가 바람직하다. 그러나, 또한 리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 항체 또는 항체 단편을 세포내에 전달할 수 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 억제성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 기초로 하여, 표적 단백질 서열과 결합하는 능력을 지닌 펩티드 분자를 설계할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성하고(하거나) 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다(예를 들어, 문헌 (Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993)) 참조).
항체의 치료 제형은 저장을 위해, 소정의 순도를 갖는 항체를 임의의 제약상 허용가능한 담체, 부형체 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980))와 혼합하여 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조하였다. 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 투여된 투여량 및 농도가 환자에 무독성이어야하며, 인산, 시트르산 및 기타 유기산의 완충액과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 방부제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸), 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 소수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 일당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터 이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및(또는) TWEEN(상표명), PLURONICS(상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제가 포함된다.
본 발명의 스크리닝 분석에 의해 확인된 비항체 화합물도 당업계에 공지된표준 기술을 이용하여 유사한 방법으로 제형화될 수 있다.
또한, 본원의 제형은 치료할 특정 증상에 있어 필요에 따라 1 종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물을 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 이 조성물은 세포독성 물질, 싸이토카인 또는 생장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 배합된다.
활성 성분은 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에, 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980))에 개시되어 있다.
체내 투여에 사용되는 제형은 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
서방성 제형도 제조될 수 있다. 서방성 제형의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이 매트릭스는 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 성형품 형태이다. 서방성 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT(상표명)(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출시키지만, 어떤 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 오랫 동안 체내에 남아있는 경우, 그는 37 ℃에서 습기에 노출된 결과, 변성 또는 응집되어 생물 활성을 감소시키고 면역원성을 변화시킬 수 있다. 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자내 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화시킬 수 있다.
O.치료 방법
본 발명의 항체 및 기타 항암 화합물을, 본원에서 확인되어 증폭된 유전자의 과다 발현 및(또는) 활성화에 의해 특성화된 증상을 포함하는 다양한 증상의 치료에 사용할 수 있음을 고려할 수 있다. 이러한 항체 및 기타 화합물(작은 유기 및 무기 분자, 펩티드, 안티센스 분자 등을 포함하나 이에 제한되지 않음)로 치료되는 대표적인 증상 또는 질환에는 양성 또는 악성 종양(예를 들어, 신세포암, 간암, 신장암, 방광암, 유방암, 위암, 난소암, 결직장암, 전립선암, 췌장암, 폐암, 자궁암, 갑상선암, 간암; 육종; 교모세포종; 및 다양한 머리 및 목 종양); 백혈병 및 림프전이; 신경 질환, 신경교 질환, 성상세포 질환, 시상하부 질환, 및 기타 분비선 질환, 대식세포성 질환, 상피성 질환, 간질성(stromal) 질환 및 포배강성 질환; 및 면역성 질환, 혈관성 질환 및 면역성 질환이 포함된다.
본 발명의 항암제(예를 들어, 항체)는 볼루스로서의 정맥내 투여, 또는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하내, 관절내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의한 장기간의 연속 관주와 같은 공지된 방법 의해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 항체의 정맥내 투여가 바람직하다.
다른 치료법이 본 발명의 항체와 같은 항암제의 투여와 병행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항암제로 치료되는 환자는 또한 방사선 치료를 받을 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 환자에게 화학 요법 치료제를 투여할 수 있다. 이러한 화학 요법 치료제의 제조 및 투여 일정은 제조자의 지시를 따르거나 당업계 전문 숙련인에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 이러한 화학 요법 치료제의 제조 및 투여 일정은 문헌 (Chemotherapy Service Ed., M.C.Perry, Williams&Wilkins, Baltimore, MD(1992))에 기재되어 있다. 화학 요법 치료제는 항체와 같은 항암제의 투여 전 또는 후에 투여되거나, 동시에 투여될 수 있다. 타목시펜과 같은 항-에스트로겐 화합물 또는 오나프리스톤과 같은 항-프로게스테론 화합물(EP 제616812호 참조)에 대해 공지된 투여량의 상기 분자와 항체를 배합하여 투여할 수 있다.
또한, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 혈관 내피 인자(VEGF)에 결합하는 항체와 같은 기타 종양 관련 항체를 투여하는 것도 바람직하다. 별법으로, 또는 추가로, 본원에 개시된 동일하거나 2종 이상의 상이한 항원에 결합하는 2종 이상의항체를 환자에 동시 투여할 수 있다. 때로는, 환자에 1 종 이상의 싸이토카인을 투여하는 것도 유익할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원의 항체를 생장 억제제와 동시에 투여할 수 있다. 예를 들어, 우선 생장 억제제를 투여한 후에 본 발명의 항체를 투여할 수 있다. 그러나, 동시 투여나 본 발명의 항체를 먼저 투여하는 것도 고려할 수 있다. 생장 억제제의 적합한 투여량은 현재 사용되는 투여량이며, 생장 억제제와 본원 항체의 복합 작용(상승)으로 인하여 투여량을 저하시킬 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원의 항체와 같은 항암제의 적합한 투여량은 상기 정의한 바와 같이 치료되는 질환의 유형, 심각성 및 질환의 진행 과정, 투여되는 항암제가 예방 목적인지 치료 목적인지, 이전의 치료법, 환자의 임상 병력 및 약제에 대한 반응, 및 재량 및 주치의에 따라 달라질 것이다. 이 약제는 일시에 또는 일련의 치료를 통해 환자에 적합하게 투여된다.
예를 들어, 질환의 유형 및 심각성에 따라, 약 1㎍/kg 내지 15mg/kg(예를 들어, 0.1 내지 20mg/kg)의 항체가 1회 이상의 분리된 투여 또는 연속 관주에 의한 환자에의 투여에 대한 초기 후보 투여량이다. 통상적인 일일 투여량은 상기 언급한 인자에 의존하여 약 1㎍/kg 내지 100mg/kg 이상이다. 증상에 따라 며칠 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 원하는 질환 징후가 억제될 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투여량이 효과적일 수도 있다. 이 치료법의 진행은 종래의 기술 및 분석에 의해 쉽게 모니터될 수 있다.
P.제품
본 발명의 또다른 실시양태에서, 질환의 진단 또는 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 이 제품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 이 용기에는 증상의 진단 또는 치료에 효과적인 조성물이 들어 있으며, 멸균 채취구(access port) (예를 들어, 이 용기는 정맥 주사용액 백(bag)이거나, 피하 주사기 바늘이 뚫을 수 있는 마개가 달린 바이알일 수 있음)가 있을 수 있다. 상기 조성물의 활성 성분은 통상 본원에서 확인된 유전자 생성물의 활성을 방해할 수 있는 항암제, 예를 들어 항체이다. 용기 위에 있거나 용기에 부착되어 있는 라벨은 조성물이 선택된 증상의 진단 또는 치료에 사용된다는 것을 알려준다. 이 제품은 또한 인산염-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 제2의 용기를 더 포함할 수 있다. 이 제품은 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지침이 들어있는 패키지 삽입물을 포함하는, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 재료를 추가로 포함할 수 있다.
Q.종양의 진단 및 예후
특정 종양에서 과다 발현되는 생장 수용체와 같은 세포 표면 단백질이 약물 후보 또는 종양(예를 들어, 암) 치료에 대한 훌륭한 표적인 반면, 상기 단백질은 종양 세포에서 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 분비 단백질과 함께 종양의 진단 및 예후에 부가적인 용도를 나타낸다. 예를 들어, 종양 세포에서 증폭된 유전자의 단백질 생성물에 대해 유도된 항체는 종양 진단제 또는 예후제로서 사용할 수 있다.
예를 들어, 항체 단편을 포함하는 항체는 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 단백질("마커 유전자 생성물")의 발현을 정성 또는 정량 검출하는데 사용할 수 있다. 항체는 형광 표지와 같이 검출 가능한 표지물이 부착되어 있는 것이 바람직하며, 항체의 결합은 광학현미경법, 유세포 분석법, 형광법, 또는 당업계에 공지된 다른 기술에 의해 모니터될 수 있다. 이 기술은, 증폭된 유전자가 생장 인자와 같은 세포 표면 단백질을 코딩하는 경우에 특히 적합하다. 이러한 결합 분석법은 상기 5단락에 기재된 바와 같이 수행된다.
원래 위치에서(in situ) 마커 유전자 생성물에 대한 항체 결합의 검출은, 예를 들어 면역형광현미경법 또는 면역전자현미경법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 환자로부터 조직학적 시료를 분리하여, 바람직하게는 상기 생물학적 샘플에 항체를 올려놓음으로써 표지된 항체를 반응시킨다. 또한, 이 절차는 조사된 조직에서 마커 유전자 생성물이 어떻게 분포하는지 결정하게 해준다. 원래 위치에서의 검출에 다양한 조직학적 방법을 쉽게 사용할 수 있음이 당업계 숙련자들에게 명백할 것이다.
하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다.
본 실시예에 언급되는 상업적 시판 시약은 다른 지시가 없는 한 제조자의 지시에 따라 사용하였다. ATCC(American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209)의 수탁번호에 의해 하기 실시예 및 본 명세서 중의 세포의 출처를 확인하였다. 본 출원에 대한 모든 원기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙(부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시(이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 라벨청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 라벨청장의 규칙(37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.
달리 언급이 없는 한, 본 발명은 상기 및 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., Y.Y., 1990; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R. I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; 및 Coligan et al., Current Protocols inImmunology, 1991)에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 기술의 표준 절차를 이용한다.
<실시예 1>인간 PRO187을 코딩하는 cDNA의 단리
발현 서열 태그(EST) DNA 데이타베이스(LIFESEQ(상표명), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하여, 안드로겐-유도 생장 인자로서도 알려진 섬유아세포 생장 인자(FGF-8)에 상동성을 나타내는 EST[#843193]를 찾아내었다.
이후에, cDNA 라이브러리 제조용 RNA를 인간 태아 폐 조직으로부터 단리하였다. 인간 PRO187을 코딩하는 cDNA 클론을 단리하는데 사용된 cDNA 라이브러리는, 인비트로젠(Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, 블런트(blunt) 말단화하여 SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터를 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
이어서, 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO187에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 상기 기재된 EST 서열 기재의 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
사용된 올리고뉴클레오티드 프로브는 하기와 같다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-CAGTACGTGAGGGACCAGGGCGCCATGA-3' (서열 3)
역방향 PCR 프라이머:
5'-CCGGTGACCTGCACGTGCTTGCCA-3' (서열 4)
혼성화 프로브:
5'-GCGGATCTGCCGCCTGCTCANCTGGTCGGTCATGGCGCCCT-3' (서열 5)
전장의 클론은 뉴클레오티드 위치 26 내지 28의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 641 내지 643의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함함을 확인하였다(도 1, 서열 1). 도 2(서열 2)에 나타낸 예상된 폴리펩티드 전구체는 205개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다. 도 2(서열 2)에 나타낸 전장 PRO187 서열의 분석은 그 위치가 상기 기재된 바와 같이 근접한, 도 2에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 전장 PRO187 서열의 분석을 통하여 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 22에 신호 펩티드가 있음을 알 수 있었다. 클론 DNA27864-1155를 1997년 10월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209375를 배정받았다.
도 2(서열 2)에 나타낸 전장 서열의 ALIGN-2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프(Dayhoff) 데이타베이스(버전 35.45 SwissProt 35)의 분석을 통하여 PRO187 아미노산 서열과 인간 섬유아세포 생장 인자-8(안드로겐-유도 생장 인자) 사이에 74%의 서열 동일성이 있음을 알 수 있었다.
<실시예 2>인간 PRO533을 코딩하는 cDNA의 단리
쥐 섬유아세포 생장 인자(FGF-15)의 서열인 EST 서열 허가번호 AF007268을 사용하여 다양한 공용 EST 데이타베이스(예를 들어, 젠뱅크, 데이호프 등)를 검색하였다. 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996))를 사용하여, EST 서열의 6 프레임 번역물에 대해 ECD 단백질 서열의 비교물로서 상동성 검색을 수행하였다. 검색 결과 젠뱅크 EST AA220994가 적중했고, 이는 스트라타진(stratagene) NT2 신경 전구체 937230임이 확인되었다.
이어서, cDNA 라이브러리 제조용 RNA를 인간 태아 망막으로부터 단리하였다. 인간 PRO533을 코딩하는 cDNA를 단리하는데 사용된 cDNA 라이브러리는, 인비트로젠(San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, 블런트 말단화하여 SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터를 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임;Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
이어서, 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO533에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해, 상기 기재된 EST 서열 기재의 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
사용된 올리고뉴클레오티드 프로브는 하기와 같다:
FGF15.f(전방향 PCR 프라이머):
5'-ATCCGCCCAGATGGCTACAATGTGTA-3' (서열 8)
FGF15.r(역방향 PCR 프라이머):
5'-CCAGTCCGGTGACAAGCCCAAA-3' (서열 9)
FGF15.p(혼성화 프로브):
5'-GCCTCCCGGTCTCCCTGAGCAGTGCCAAACAGCGGCAGTGTA-3' (서열 10)
전장의 클론은 뉴클레오티드 위치 464 내지 466의 분명한 번역 개시 부위 및뉴클레오티드 위치 1112 내지 1114의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함함을 확인하였다(도 3, 서열 6). 도 4(서열 7)에 나타낸 예상된 폴리펩티드 전구체는 216개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다. 도 4(서열 7)에 나타낸 전장 PRO533 서열의 분석은 그 위치가 상기 기재된 바와 같이 근접한, 도 4에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 전장 PRO533 서열의 분석을 통하여 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 22에 신호 펩티드가 있음을 알 수 있었다. 클론 DNA49435-1219를 1997년 11월 21일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209480을 배정받았다.
도 4(서열 7)에 나타낸 전장 서열의 ALIGN-2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스(버전 35.45 SwissProt 35)의 분석을 통하여 PRO533 아미노산 서열과 섬유아세포 생장 인자 사이에 53%의 서열 동일성이 있음을 알 수 있었다.
<실시예 3>인간 PRO214를 코딩하는 cDNA의 단리
스위스-프로트(Swiss-Prot) 공용 데이타베이스의 약 950 가지 공지된 분비 단백질로부터의 세포외 도메인(ECD) 서열(분비 신호 서열이 존재하는 경우, 이를 포함)을 이용하여 EST 데이타베이스를 검색하였다. 이 EST 데이타베이스에는 공용 EST 데이타베이스(예를 들어, 젠뱅크) 및 독점 EST 데이타베이스(LIFESEQ(상표명), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)가 포함된다. 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996))를 사용하여 EST 서열의 6 프레임 번역물에 대해 ECD 단백질 서열의 비교물로서 상동성 검색을 수행하였다. 공지의 단백질을 코딩하지 않는, BLAST 스코어가 70 (일부 경우에90) 이상인 비교물을 수집한 후, 프로그램 "프랩(phrap)" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)으로 정리하여 컨센서스 DNA 서열을 수득하였다.
상기 기재한 바와 같은 프랩을 이용하여, 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 정리하였다. 이 컨센서스 서열을 본원에서 DNA28744라 지칭하였다. 어떤 경우에는 BLAST 및 프랩을 반복 사용하여 상기 논의된 EST 서열 공급원을 이용해 가능한 긴 길이로 확장되는 중간체 컨센서스 서열로부터 상기 컨센서스 서열이 유도되었다.
DNA28744 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO214에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp를 초과하는 경우에는 부가의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-ATTCTGCGTGAACACTGAGGGC-3' (서열 13)
역방향 PCR 프라이머:
5'-ATCTGCTTGTAGCCCTCGGCAC-3' (서열 14)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA28744 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-CCTGGCTATCAGCAGGTGGGCTCCAAGTGTCTCGATGTGGATGAGTGTGA-3' (서열 15)
cDNA 라이브러리 제조용 RNA를 인간 태아 폐 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하는데 사용된 cDNA 라이브러리는 인비트로젠(Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, 블런트(blunt) 말단화하여 SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터를 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기한 바와 같이 단리한 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 전장 PRO214 폴리펩티드의 전장 DNA 서열(본원에서 DNA32286-1191[도 5, 서열 11]이라 지칭함) 및이로부터 유도된 PRO214의 단백질 서열을 수득하였다.
상기 확인된 전장의 클론은 뉴클레오티드 위치 103 내지 105의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1363 내지 1365의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 5, 서열 11). 도 6(서열 12)에 나타낸 예상된 폴리펩티드 전구체는 420개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다. 도 6(서열 12)에 나타낸 전장 PRO214 서열의 분석은 그 위치가 상기 기재된 바와 같이 근접한, 도 6에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 전장 PRO214 서열의 분석을 통하여 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 29의 신호 펩티드 및 약 아미노산 372 내지 약 아미노산 392의 막횡단 도메인의 존재를 입증하였다. 클론 DNA32286-1191을 1997년 10월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209385을 배정받았다.
도 6(서열 12)에 나타낸 전장 서열의 ALIGN-2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스(버전 35.45 SwissProt 35)의 분석을 통하여 PRO214 아미노산 서열과 HT 단백질 및(또는) 피불린(각각 49% 및 38%) 사이에 서열 동일성이 있음을 알 수 있었다.
<실시예 4>인간 PRO240을 코딩하는 cDNA의 단리
스위스-프로트(Swiss-Prot) 공용 데이타베이스의 약 950 가지 공지된 분비 단백질로부터의 세포외 도메인(ECD) 서열(분비 신호 서열이 존재하는 경우, 이를 포함)을 이용하여 EST 데이타베이스를 검색하였다. 이 EST 데이타베이스에는 공용 EST 데이타베이스(예를 들어, 젠뱅크) 및 독점 EST 데이타베이스(LIFESEQ(상표명), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)가 포함된다. 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996))를 사용하여 EST 서열의 6 프레임 번역물에 대해 ECD 단백질 서열의 비교물로서 상동성 검색을 수행하였다. 공지의 단백질을 코딩하지 않는, BLAST 스코어가 70 (일부 경우에 90) 이상인 비교물을 수집한 후, 프로그램 "프랩" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)으로 정리하여 컨센서스 DNA 서열을 수득하였다.
상기 기재한 바와 같은 프랩을 이용하여, 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 정리하였다. 이 컨센서스 서열을 본원에서 DNA30873이라 지칭하였다. 어떤 경우에는 BLAST 및 프랩을 반복 사용하여 상기 논의된 EST 서열 공급원을 이용해 가능한 긴 길이로 확장되는 중간체 컨센서스 서열로부터 상기 컨센서스 서열이 유도되었다.
DNA30873 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO240에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp를 초과하는 경우에는 부가의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-TCAGCTCCAGACTCTGATACTGCC-3' (서열 18)
역방향 PCR 프라이머:
5'-TGCCTTTCTAGGAGGCAGAGCTCC-3' (서열 19)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA30873 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-GGACCCAGAAATGTGTCCTGAGAATGGATCTTGTGTACCTGATGGTCCAG-3' (서열 20)
cDNA 라이브러리 제조용 RNA를 인간 태아 간 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하는데 사용된 cDNA 라이브러리는 인비트로젠(Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, 블런트(blunt) 말단화하여 SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터를 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기한 바와 같이 단리한 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 전장 PRO240 폴리펩티드의 전장 DNA 서열(본원에서 DNA34387-1138[도 7, 서열 16]이라 지칭함) 및 이로부터 유도된 PRO240의 단백질 서열을 수득하였다.
상기 확인된 전장의 클론은 뉴클레오티드 위치 12 내지 14의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 699 내지 701의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 7, 서열 16). 도 8(서열 17)에 나타낸 예상된 폴리펩티드 전구체는 229개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다. 도 8(서열 17)에 나타낸 전장 PRO240 서열의 분석은 그 위치가 상기 기재된 바와 같이 근접한, 도 8에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 전장 PRO240 서열의 분석을 통하여 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 30의 신호 펩티드 및 약 아미노산 198 내지 약 아미노산 212의 막횡단 도메인의 존재를 입증하였다. 클론 DNA34387-1138을 1997년 9월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209260을 배정받았다.
도 8(서열 17)에 나타낸 전장 서열의 ALIGN-2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스(버전 35.45 스위스프로트 35)의 분석을 통하여 PRO240 아미노산 서열과 초파리(Drosophilia melanogaster)의 세레이트 전구체 단백질 및 닭(Gallus gallus)의 C-세레이트-1 단백질(각각 30% 및 35%) 사이에 서열 동일성이 있음을 알 수 있었다.
<실시예 5>인간 PRO211을 코딩하는 cDNA의 단리
스위스-프로트(Swiss-Prot) 공용 데이타베이스의 약 950 가지 공지된 분비 단백질로부터의 세포외 도메인(ECD) 서열(분비 신호 서열이 존재하는 경우, 이를포함)을 이용하여 EST 데이타베이스를 검색하였다. 이 EST 데이타베이스에는 공용 EST 데이타베이스(예를 들어, 데이호프, 젠뱅크) 및 독점 EST 데이타베이스(LIFESEQ(상표명), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)가 포함된다. 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996))를 사용하여 EST 서열의 6 프레임 번역물에 대해 ECD 단백질 서열의 비교물로서 상동성 검색을 수행하였다. 공지의 단백질을 코딩하지 않는, BLAST 스코어가 70 (일부 경우에 90) 이상인 비교물을 수집한 후, 프로그램 "프랩" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)으로 정리하여 컨센서스 DNA 서열을 수득하였다.
상기 기재한 바와 같은 프랩을 이용하여, 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 정리하였다. 이 컨센서스 서열을 본원에서 DNA28730이라 지칭하였다. 어떤 경우에는 BLAST 및 프랩을 반복 사용하여 상기 논의된 EST 서열 공급원을 이용해 가능한 긴 길이로 확장되는 중간체 컨센서스 서열로부터 상기 컨센서스 서열이 유도되었다.
DNA28730 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO211에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp를 초과하는 경우에는 부가의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-AGAGTGTATCTCTGGCTACGC-3' (서열 23)
역방향 PCR 프라이머:
5'-TAAGTCCGGCACATTACAGGTC-3' (서열 24)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA28730 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-AGGGAGCACGGACAGTGTGCAGATGTGGACGAGTGCTCACTAGCA-3' (서열 25)
cDNA 라이브러리 제조용 RNA를 인간 태아 폐 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하는데 사용된 cDNA 라이브러리는 인비트로젠(Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, 블런트(blunt) 말단화하여 SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터를 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기한 바와 같이 단리한 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 전장 PRO211 폴리펩티드의 전장 DNA 서열(본원에서 DNA32292-1131[도 9, 서열 21]이라 지칭함) 및 이로부터 유도된 PRO211의 단백질 서열을 수득하였다.
상기 확인된 전장의 클론은 뉴클레오티드 위치 65 내지 67의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1124 내지 1126의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 9, 서열 21). 예상된 폴리펩티드 전구체는 353개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖으며, 분자량은 약 38,129 달톤이다(도 10, 서열 22). 도 10(서열 22)에 나타낸 전장 PRO211 서열의 분석은 그 위치가 상기 기재된 바와 같이 근접한, 도 10에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 전장 PRO211 서열의 분석을 통하여 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 24의 신호 펩티드의 존재를 입증하였다. 클론 DNA32292-1131을 1997년 9월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209258을 배정받았다.
도 10(서열 22)에 나타낸 전장 서열의 ALIGN-2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스(버전 35.45 스위스프로트 35)의 분석을 통하여 PRO211 아미노산 서열과 EGF 사이에 서열 동일성이 있음을 알 수 있었다.
<실시예 6>인간 PRO230을 코딩하는 cDNA의 단리
스위스-프로트(Swiss-Prot) 공용 데이타베이스의 약 950 가지 공지된 분비 단백질로부터의 세포외 도메인(ECD) 서열(분비 신호 서열이 존재하는 경우, 이를 포함)을 이용하여 EST 데이타베이스를 검색하였다. 이 EST 데이타베이스에는 공용 EST 데이타베이스(예를 들어, 데이호프, 젠뱅크) 및 독점 EST 데이타베이스(LIFESEQ(상표명), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)가 포함된다. 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996))를 사용하여 EST 서열의 6 프레임 번역물에 대해 ECD 단백질 서열의 비교물로서 상동성 검색을 수행하였다. 공지의 단백질을 코딩하지 않는, BLAST 스코어가 70 (일부 경우에 90) 이상인 비교물을 수집한 후, 프로그램 "프랩" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)으로 정리하여 컨센서스 DNA 서열을 수득하였다.
상기 기재한 바와 같은 프랩을 이용하여, 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 정리하였다. 이 컨센서스 서열을 본원에서 DNA30857이라 지칭하였다. 제넨테크에서 독점하는 EST를 컨센서스 서열 정리에 사용하였고, 이 EST는 본원에서 DNA20088이라 지칭하였다. 어떤 경우에는 BLAST 및 프랩을 반복 사용하여 상기 논의된 EST 서열 공급원을 이용해 가능한 긴 길이로 확장되는 중간체 컨센서스 서열로부터 상기 컨센서스 서열이 유도되었다.
DNA30857 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO230에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp를 초과하는 경우에는 부가의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-TTCGAGGCCTCTGAGAAGTGGCCC-3' (서열 28)
역방향 PCR 프라이머:
5'-GGCGGTATCTCTCTGGCCTCCC-3' (서열 29)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA30857 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-TTCTCCACAGCAGCTGTGGCATCCGATCGTGTCTCAATCCATTCTCTGGG-3' (서열 30)
cDNA 라이브러리 제조용 RNA를 인간 태아 폐 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하는데 사용된 cDNA 라이브러리는 인비트로젠(Invitrogen, SanDiego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, 블런트(blunt) 말단화하여 SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터를 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기한 바와 같이 단리한 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 전장 PRO230 폴리펩티드의 전장 DNA 서열(본원에서 DNA33223-1136[도 11, 서열 26]이라 지칭함) 및 이로부터 유도된 PRO230 폴리펩티드의 단백질 서열을 수득하였다.
상기 확인된 전장의 클론은 뉴클레오티드 위치 100 내지 102의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 592 내지 594의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 11, 서열 26). 예상된 폴리펩티드 전구체는 164개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다(도 12, 서열 27). 도 12(서열 27)에 나타낸 전장 PRO230 서열의 분석은 그 위치가 상기 기재된 바와 같이 근접한, 도 12에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 전장 PRO230 서열의 분석을 통하여 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 21의 신호 펩티드의 존재를 입증하였다. 클론 DNA33223-1136을 1997년 9월 16일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209264를 배정받았다.
도 12(서열 27)에 나타낸 전장 서열의 ALIGN-2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스(버전 35.45 스위스프로트 35)의 분석을 통하여 PRO230 아미노산 서열과 토끼의 세뇨관 간질 신염 항원 전구체 사이에 서열 동일성이 있음을 알 수 있었다.
<실시예 7>인간 PRO261을 코딩하는 cDNA의 단리
스위스-프로트(Swiss-Prot) 공용 데이타베이스의 약 950 가지 공지된 분비 단백질로부터의 세포외 도메인(ECD) 서열(분비 신호 서열이 존재하는 경우, 이를 포함)을 이용하여 EST 데이타베이스를 검색하였다. 이 EST 데이타베이스에는 공용 EST 데이타베이스(예를 들어, 데이호프, 젠뱅크) 및 독점 EST 데이타베이스(LIFESEQ(상표명), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)가 포함된다. 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996))를 사용하여 EST 서열의 6 프레임 번역물에 대해 ECD 단백질 서열의 비교물로서 상동성 검색을 수행하였다. 공지의 단백질을 코딩하지 않는, BLAST 스코어가 70 (일부 경우에 90) 이상인 비교물을 수집한 후, 프로그램 "프랩" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)으로 정리하여 컨센서스 DNA 서열을 수득하였다.
상기 기재한 바와 같은 프랩을 이용하여, 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 정리하였다. 이 컨센서스 서열을 본원에서 DNA30843이라 지칭하였다. 어떤 경우에는 BLAST 및 프랩을 반복 사용하여 상기 논의된 EST 서열 공급원을 이용해 가능한 긴 길이로 확장되는 중간체 컨센서스 서열로부터 상기 컨센서스 서열이 유도되었다.
DNA30843 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO261에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp를 초과하는 경우에는 부가의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-AAAGGTGCGTACCCAGCTGTGCC-3' (서열 33)
역방향 PCR 프라이머:
5'-TCCAGTCGGCAGAAGCGGTTCTGG-3' (서열 34)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA30843 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-CCTGGTGCTGGATGGCTGTGGCTGCTGCCGGGTATGTGCACGGCGGCTGGG-3' (서열 35)
cDNA 라이브러리 제조용 RNA를 인간 태아 폐 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하는데 사용된 cDNA 라이브러리는 인비트로젠(Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, 블런트(blunt) 말단화하여 SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터를 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기한 바와 같이 단리한 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 전장 PRO261 폴리펩티드의 전장 DNA 서열(본원에서 DNA33473-1176[도 13, 서열 31]이라 지칭함) 및 이로부터 유도된 PRO261 폴리펩티드의 단백질 서열을 수득하였다.
상기 확인된 전장의 클론은 뉴클레오티드 위치 10 내지 12의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 760 내지 762의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 13, 서열 31). 예상된 폴리펩티드 전구체는 250개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다(도 14, 서열 32). 도 14(서열 32)에 나타낸 전장 PRO261 서열의 분석은 그 위치가 상기 기재된 바와 같이 근접한, 도 14에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 전장 PRO261 서열의 분석을 통하여 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 23의 신호 펩티드의 존재를 입증하였다. 클론 DNA33473-1176을 1997년 10월 17일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209391을 배정받았다.
도 14(서열 32)에 나타낸 전장 서열의 ALIGN-2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스(버전 35.45 스위스프로트 35)의 분석을 통하여 PRO261 아미노산 서열과 CTCF 사이에 서열 동일성이 있음을 알 수 있었으며, 따라서 PRO261은 신규 생장 인자이다.
<실시예 8>인간 PRO246을 코딩하는 cDNA의 단리
스위스-프로트(Swiss-Prot) 공용 데이타베이스의 약 950 가지 공지된 분비 단백질로부터의 세포외 도메인(ECD) 서열(분비 신호 서열이 존재하는 경우, 이를 포함)을 이용하여 EST 데이타베이스를 검색하였다. 이 EST 데이타베이스에는 공용 EST 데이타베이스(예를 들어, 데이호프, 젠뱅크) 및 독점 EST 데이타베이스(LIFESEQ(상표명), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)가 포함된다. 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996))를 사용하여 EST 서열의 6 프레임 번역물에 대해 ECD 단백질 서열의 비교물로서 상동성 검색을 수행하였다. 공지의 단백질을 코딩하지 않는, BLAST 스코어가 70 (일부 경우에 90) 이상인 비교물을 수집한 후, 프로그램 "프랩" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)으로 정리하여 컨센서스 DNA 서열을 수득하였다.
상기 기재한 바와 같은 프랩을 이용하여, 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 정리하였다. 이 컨센서스 서열을 본원에서 DNA30995라 지칭하였다.어떤 경우에는 BLAST 및 프랩을 반복 사용하여 상기 논의된 EST 서열 공급원을 이용해 가능한 긴 길이로 확장되는 중간체 컨센서스 서열로부터 상기 컨센서스 서열이 유도되었다.
DNA30995 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO246에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp를 초과하는 경우에는 부가의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-AGGGTCTCCAGGAGAAAGACTC-3' (서열 38)
역방향 PCR 프라이머:
5'-ATTGTGGGCCTTGCAGACATAGAC-3' (서열 39)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA30995 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-GGCCACAGCATCAAAACCTTAGAACTCAATGTACTGGTTCCTCCAGCTCC-3' (서열 40)
cDNA 라이브러리 제조용 RNA를 인간 태아 간 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하는데 사용된 cDNA 라이브러리는 인비트로젠(Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, 블런트(blunt) 말단화하여 SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터를 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기한 바와 같이 단리한 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 전장 PRO246 폴리펩티드의 전장 DNA 서열(본원에서 DNA35639-1172[도 15, 서열 36]이라 지칭함) 및 이로부터 유도된 PRO246 폴리펩티드의 단백질 서열을 수득하였다.
상기 확인된 전장의 클론은 뉴클레오티드 위치 126 내지 128의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1296 내지 1298의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 15, 서열 36). 예상된 폴리펩티드 전구체는 390개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다(도 16, 서열 37). 도 16(서열 37)에 나타낸전장 PRO246 서열의 분석은 그 위치가 상기 기재된 바와 같이 근접한, 도 16에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 전장 PRO246 서열의 분석을 통하여 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 29의 신호 펩티드 및 약 아미노산 247 내지 약 아미노산 266의 막횡단 도메인의 존재를 입증하였다. 클론 DNA35639-1172를 1997년 10월 17일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209396을 배정받았다.
도 16(서열 37)에 나타낸 전장 서열의 ALIGN-2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스(버전 35.45 스위스프로트 35)의 분석을 통하여 PRO246 아미노산 서열과 인간 세포 표면 단백질 HCAR 사이에 서열 동일성이 있음을 알 수 있었으며, 따라서 PRO246은 신규 세포 표면 바이러스 수용체이다.
<실시예 9>인간 PRO317을 코딩하는 cDNA의 단리
스위스-프로트(Swiss-Prot) 공용 데이타베이스의 약 950 가지 공지된 분비 단백질로부터의 세포외 도메인(ECD) 서열(분비 신호 서열이 존재하는 경우, 이를 포함)을 이용하여 EST 데이타베이스를 검색하였다. 이 EST 데이타베이스에는 공용 EST 데이타베이스(예를 들어, 데이호프, 젠뱅크) 및 독점 EST 데이타베이스(LIFESEQ(상표명), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)가 포함된다. 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2(Altshul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996))를 사용하여 EST 서열의 6 프레임 번역물에 대해 ECD 단백질 서열의 비교물로서 상동성 검색을 수행하였다. 공지의 단백질을 코딩하지 않는, BLAST 스코어가 70 (일부 경우에 90) 이상인 비교물을 수집한 후, 프로그램 "프랩" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)으로 정리하여 컨센서스 DNA 서열을 수득하였다.
상기 기재한 바와 같은 프랩을 이용하여, 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 정리하였다. 이 컨센서스 서열을 본원에서 DNA28722라 지칭하였다. 어떤 경우에는 BLAST 및 프랩을 반복 사용하여 상기 논의된 EST 서열 공급원을 이용해 가능한 긴 길이로 확장되는 중간체 컨센서스 서열로부터 상기 컨센서스 서열이 유도되었다.
DNA28722 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 목적 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR에 의해 확인하고 2) PRO317에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하는데 프로브로서 사용하기 위해 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 통상 뉴클레오티드 20 내지 30개 범위이며, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 산출하도록 설계한다. 프로브 서열은 통상 40 내지 55 bp 길이이다. 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp를 초과하는 경우에는 부가의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 전장 클론의 여러 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 상기 문헌(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 라이브러리로부터 DNA를 스크리닝하였다. 그 후에, 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 목적 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는데 양성 라이브러리를 이용하였다.
PCR 프라이머(전방향 및 역방향)를 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머:
5'-AGGACTGCCATAACTTGCCTG-3' (서열 43)
역방향 PCR 프라이머:
5'-ATAGGAGTTGAAGCAGCGCTGC-3' (서열 44)
추가로, 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA28722 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브:
5'-TGTGTGGACATAGACGAGTGCCGCTACCGCTACTGCCAGCACCGC-3' (서열 45)
cDNA 라이브러리 제조용 RNA를 인간 태아 신장 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하는데 사용된 cDNA 라이브러리는 인비트로젠(Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 상업적으로 시판하는 시약을 이용하여 표준 방법에 의해 제조하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, 블런트(blunt) 말단화하여 SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터를 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 대략의 크기를 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들어, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기한 바와 같이 단리한 클론의 DNA 서열 분석을 통하여 전장 PRO317 폴리펩티드의 전장 DNA 서열(본원에서 DNA33461-1199[도 17, 서열 41]이라 지칭함) 및 이로부터 유도된 PRO317 폴리펩티드의 단백질 서열을 수득하였다.
상기 확인된 전장의 클론은 뉴클레오티드 위치 68 내지 70의 분명한 번역 개시 부위 및 뉴클레오티드 위치 1166 내지 1168의 정지 신호를 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다(도 17, 서열 41). 예상된 폴리펩티드 전구체는 366개의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다(도 18, 서열 42). 도 18(서열 42)에 나타낸 전장 PRO317 서열의 분석은 그 위치가 상기 기재된 바와 같이 근접한, 도 18에 나타낸 중요한 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증한다. 전장 PRO317 서열의 분석을 통하여 약 아미노산 1 내지 약 아미노산 18의 신호 펩티드 및 약 아미노산 160의 n-결합 글리코실화 부위의 존재를 입증하였다. 클론 DNA33461-1199를 1997년 10월 15일에 ATCC에 기탁하여 ATCC 기탁번호 209367을 배정받았다.
도 18(서열 42)에 나타낸 전장 서열의 ALIGN-2 서열 정렬 분석을 이용한 데이호프 데이타베이스(버전 35.45 스위스프로트 35)의 분석을 통하여 PRO317 아미노산 서열과 인간 EBAF-1 사이에 92%의 서열 동일성이 있음을 알 수 있었다. 또한, PRO317 아미노산 서열과 인간 EBAF-2 및 생쥐 LEFTY 단백질 사이에 상당한 상동성이 나타난다. PRO317은 TGF-β 거대족의 다른 구성원에 대해서도 서열 정렬성이 나타났다. 이 단백질의 C-말단에는 TGF-β 거대족에서 기대되는 보존 서열 및 패턴이 많이 존재한다.
<실시예 10>유전자 증폭
본 실시예는 특정 인간의 폐암, 결장암 및(또는) 유방암의 게놈, 및(또는) 세포주에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 코딩하는 유전자가 증폭된다는 것을 보여준다. 이 유전자의 증폭은 유전자 생성물의 과다 발현과 관련되어 있으며, 이로써 상기 폴리펩티드들이 결장암, 폐암, 유방암 및 기타 암과 같은 특정 암의 치료에 있어서 유용한 표적임을 알 수 있다. 치료제는, 예를 들어 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 대한 쥐-인간 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체와 같은, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 대한 길항제의 형태로 얻을 수 있다.
스크린을 위한 출발 물질은 다양한 암으로부터 단리된 게놈 DNA였다. DNA는 형광법과 같은 방법으로 정확하게 정량하였다. 음성 대조용으로서, 10명의 건강한 정상 개체로부터 DNA를 단리하여 이를 모은 후, 건강한 개체의 유전자 복제본에 대한 분석 대조용으로 사용하였다(나타내지 않음). 5' 뉴클레아제 분석(예를 들어, TaqMan™) 및 실시간 정량 PCR(예를 들어, ABI 프리즘(Prizm) 7700 서열 검출 시스템(상표명, Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA))을 이용하여 특정 암에서 잠재적으로 증폭되는 유전자를 찾아냈다. 이 결과를 이용하여, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 코딩하는 DNA가 스크린된 원발성 폐암 또는 결장암이나 암세포주 또는 유방암 세포주에서 과다 발현되는지 여부를 결정하였다.
표 2에 그 유형 및 단계가 기재된 종양이 있는 개체로부터 원발성 폐암을 수득하였다. 표 2에 기재된 원발성 종양을 지칭하기 위해 사용되는 약어, 및 본 실시예 전체에 걸쳐 언급되는 원발성 종양 및 세포주에 대한 설명은 본원의 상기에 기재되었다.
택맨(TaqMan)(상표명)의 결과는 델타(Δ)Ct 단위로 기록된다. 1 단위는 1PCR 싸이클 또는 정상에 비해 2배 증폭된 것에 상응하며, 2 단위는 4배, 3단위는 8배가 증폭된 것에 상응한다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 코딩하는 유전자로부터 유도된 프라이머 및 택맨(상표명) 형광 프로브를 사용하여 정량화하였다. 독특한 핵산 서열을 가지며 스플라이싱으로 제거되는 인트론이 아닐 것 같은 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 영역(예를 들어, 3'-비번역 영역)이 프라이머 및 프로브를 유도하는데 바람직하다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 유전자 증폭 분석에 사용된 프라이머 및 프로브(전방향, 역방향 및 프로브)는 하기와 같다:
5' 뉴클레아제 분석 반응은 실시간으로 증폭을 모니터하기 위해 Taq DNA 중합효소의 5' 엑소뉴클레아제 활성을 이용하는, 형광 PCR-기재의 기술이다. PCR 반응을 대표하는 앰플리콘을 생성하기 위해 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한다. 3번째 올리고뉴클레오티드, 즉 프로브는 상기 2개의 PCR 프라이머 사이에 위치한 뉴클레오티드 서열을 검출하도록 고안된다. 이 프로브는 Taq DNA 중합효소에 의해 확장될 수 없으며, 리포터 형광 염료 및 켄처(quencher) 형광 염료로 표지되어 있다. 리포터 염료로부터의 어떤 레이저-유도 방출은, 이 리포터 염료와 켄칭 염료가 매우 가깝게 위치할 경우에 프로브에 있는 켄칭 염료에 의해 형광 신호가 약해진다. 증폭 반응시, Taq DNA 중합효소는 주형에 의존적인 방식으로 프로브를 절단한다. 결과의 프로브 단편은 용액 중에서 해리되어, 방출된 리포터 염료로부터의 신호에는 제2 형광체(fluorophore)의 켄칭 효과가 나타나지 않는다. 리포터 염료 1 분자는 합성된 새로운 분자 각각에 대해 유리되고, 켄칭되지 않은 염료의 검출은 데이타의 정량적 조절에 대한 기초를 제공한다.
5' 뉴클레아제 분석의 절차는 ABI 프리즘 7700TM 서열 검출기와 같은 실시간 정량 PCR 장치에서 수행된다. 이 시스템은 열순환기(thermocycler), 레이저, 전하 결합 소자(CCD) 카메라 및 컴퓨터로 이루어져 있다. 이 시스템은 열순환기 상의 96-웰 포맷에서 샘플을 증폭시킨다. 증폭시 레이저-유도 형광 신호는 모든 96 웰에 대해 섬유 광학 케이블을 통해 실시간으로 수집되어 CCD에서 검출된다. 이 시스템에는 장치 구동 및 데이타 분석을 위한 소프트웨어가 포함되어 있다.
5' 뉴클레아제 분석 데이타는 최초에 Ct, 즉 역치 싸이클(threshold cycle)로 표현된다. 이는 리포터 신호가 배경 수준의 형광을 초과하여 측정되는 경우의 싸이클로서 정의된다. ΔCt 값은, 암 DNA의 결과를 정상 인간 DNA의 결과와 비교할 때, 핵산 샘플에서 특정 표적 서열의 출발 복제본 수에 대한 상대적인 정량 측정값으로 사용된다.
표 2에는 본 발명의 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 화합물을 스크리닝하는데 사용된 다양한 원발성 종양의 단계, T 단계 및 N 단계가 기재되어 있다.
원발성 폐암 및 결장암 프로파일
원발성 종양 단계 기타 단계 듀크 단계 T 단계 N 단계
인간 폐 종양 AdenoCa(SRCC724)[LT1]인간 폐 종양 SqCCa(SRCC724)[LT1a]인간 폐 종양 AdenoCa(SRCC726)[LT2]인간 폐 종양 AdenoCa(SRCC727)[LT3]인간 폐 종양 AdenoCa(SRCC728)[LT4]인간 폐 종양 AdenoCa(SRCC729)[LT6]인간 폐 종양 Aden/SqCCa(SRCC730)[LT7]인간 폐 종양 AdenoCa(SRCC731)[LT9]인간 폐 종양 SqCCa(SRCC732)[LT10]인간 폐 종양 SqCCa(SRCC733)[LT11]인간 폐 종양 AdenoCa(SRCC734)[LT12]인간 폐 종양 AdenoSqCCa(SRCC735)[LT13]인간 폐 종양 SqCCa(SRCC736)[LT15]인간 폐 종양 SqCCa(SRCC737)[LT16]인간 폐 종양 SqCCa(SRCC738)[LT17]인간 폐 종양 SqCCa(SRCC739)[LT18]인간 폐 종양 SqCCa(SRCC740)[LT19]인간 폐 종양 LCCa(SRCC741)[LT21]인간 폐 AdenoCa(SRCC811)[LT22]인간 결장 AdenoCa(SRCC742)[CT2]인간 결장 AdenoCa(SRCC743)[CT3]인간 결장 AdenoCa(SRCC744)[CT8]인간 결장 AdenoCa(SRCC745)[CT10]인간 결장 AdenoCa(SRCC746)[CT12]인간 결장 AdenoCa(SRCC747)[CT14]인간 결장 AdenoCa(SRCC748)[CT15]인간 결장 AdenoCa(SRCC749)[CT16]인간 결장 AdenoCa(SRCC750)[CT17]인간 결장 AdenoCa(SRCC751)[CT1]인간 결장 AdenoCa(SRCC752)[CT4]인간 결장 AdenoCa(SRCC753)[CT5]인간 결장 AdenoCa(SRCC754)[CT6]인간 결장 AdenoCa(SRCC755)[CT7]인간 결장 AdenoCa(SRCC756)[CT9]인간 결장 AdenoCa(SRCC757)[CT11]인간 결장 AdenoCa(SRCC758)[CT18] ⅡAⅡBⅠBⅢAⅠBⅠBⅠAⅠBⅡBⅡAⅠVⅠBⅠBⅠBⅡBⅠBⅠBⅡB1A M1MO, R1pMO, ROM1, R2pMOMO, R1G2pMO, ROG1G3MO, RO DBBABBDBC1BBC1BADBB T1T3T2T1T2T2T1T2T2T1T2T2T2T2T2T2T2T3T1pT4pT3T3pT2T3pT3T4pT3pT3pT3pT3pT3pT3pT2pT4T3pT3 N1N0N0N2N0N0N0N0N1N1N0N0N0N0N1N0N0N1N0N0N0N0N0N0pN0N2pN0pN1N0M0pN0pN0pN0pN2N0pN0
DNA 제제:
배양된 세포주, 원발성 종양, 정상 인간 혈액으로부터 DNA를 제조하였다. 퀴아젠(Qiagen)사의 정제 키트, 완충액 세트 및 프로테아제를 이용하여, 제조자의 지시 및 하기 기재된 내용에 따라 DNA를 정제하였다.
세포 배양물의 용해:
세포를 세척하고 각 팁(tip)당 7.5×108의 농도로 트립신을 처리한 후, 4℃에서 1000rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 1/2 부피의 PBS로 세척한 다음 다시 원심분리하였다. 펠릿을 세번째로 세척하고, 현탁된 세포를 수집하여 PBS로 2회 세척하였다. 이후에 세포를 PBS 10ml에 현탁하였다. 4℃에서 C1 완충액을 평형화시켰다. 퀴아젠 프로테아제 #19155를 차가운 ddH2O 6.25ml로 희석하여 최종 농도를 20mg/ml로 맞춘 후, 4℃에서 평형화시켰다. 퀴아젠 RNase A 원액(100mg/ml)을 최종 농도 200㎍/ml로 희석하여 G2 완충액 10ml을 제조하였다.
세포 현탁액 10ml에 C1 완충액(10ml, 4℃) 및 ddH2O(40ml, 4℃)를 가하고, 거꾸로 세워 이들을 혼합한 후, 얼음상에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 4℃에서 베크만 스윙 버킷(Beckman swing bucket) 로터 중 2500rpm으로 15분 동안 원심분리하여 세포 핵을 펠릿화시켰다. 상층액을 버리고, C1 완충액(4℃) 2ml 및 ddH2O 6ml 중에서 볼텍싱하여 핵을 현탁한 후, 4℃에서 2500rpm으로 15분 동안 두번째로 원심분리하였다. 이후에 200㎕ 팁을 이용하여 잔류 완충액에 핵을 재현탁하였다. 부드럽게 볼텍싱하면서 현탁된 핵에 G2 완충액(10ml)을 가하였다. 완충액을 모두 가한 후에 30초 동안 철저히 볼텍싱하였다. 퀴아젠 프로테아제(200㎕, 상기와 같이 제조함)를 가하고, 50℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해물이 투명해질 때까지 인큐베이션 및 원심분리를 반복하였다(예를 들어, 추가의 30 내지 60분 동안 인큐베이션 후, 4℃에서 3000xg로 10분동안 펠릿화시킴).
인간 충실성 종양 샘플 제제 및 용해:
종양 샘플을 계량하고, 50ml 코니컬 튜브에 넣어 얼음에 보관하였다. 공정은 각 제조당 조직 250mg으로 제한되었다(1 팁/제조). 차가운 ddH2O 6.25ml에 희석하여 최종 농도를 20mg/ml로 함으로써 프로테아제 용액을 새로이 제조하여, 이를 4℃에 보관하였다. DNase A를 최종 농도 200㎍/ml(100mg/ml 원액)로 희석하여 G2 완충액(20ml)을 제조하였다. 에어로졸을 흡입하지 않기 위해 라미나-플로우 (laminar-flow) TC 후드에서 폴리트론의 큰 팁을 이용하여, G2 완충액 19ml 중에서 종양 조직을 균질화시켜 상온에서 보관하였다. 샘플들 사이에서, ddH2O 2L 중에서 30초씩 2회 가라앉히고, G2 완충액(50ml) 중에서 가라앉혀 폴리트론을 깨끗하게 하였다. 팁에 조직이 여전히 존재하는 경우에는 장치를 분해하여 깨끗하게 하였다.
퀴아젠 프로테아제(상기와 같이 제조함, 1.0ml)를 가한 후, 볼텍싱하고 50℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해물이 투명해질 때까지 인큐베이션 및 원심분리를 반복하였다(예를 들어, 추가의 30 내지 60분 동안 인큐베이션 후, 4℃에서 3000xg로 10분동안 펠릿화시킴).
인간 혈액 제제 및 용해:
표준 감염제 프로토콜을 이용하여 건강한 지원자로부터 혈액을 채취하여 시트르산염 용액 10ml에 넣었다. 차가운 ddH2O 6.25ml에 희석하여 최종 농도를 20mg/ml로 함으로써 프로테아제 용액을 새로이 제조하여, 이를 4℃에 보관하였다. DNase A를 100mg/ml 원액으로부터 최종 농도 200㎍/ml로 희석하여 G2 완충액을 제조하였다. 혈액(10ml)을 50ml 코니컬 튜브에 넣고, C1 완충액 10ml 및 ddH2O 30ml(모두 4℃로 미리 평형화시킴)을 가한 후, 거꾸로 세워 성분을 혼합하여 얼음상에서 10분 동안 방치하였다. 4℃에서 베크만 스윙 버킷 로터 중 2500rpm으로 15분 동안 원심분리하여 핵을 펠릿화시킨 후, 상층액을 버렸다. C1 완충액(4℃) 2ml 및 ddH2O 6ml(4℃) 중에서 볼텍싱하여 핵을 현탁하였다. 펠릿이 하얗게 될 때까지 볼텍싱을 반복하였다. 이후에 200㎕ 팁을 이용하여 잔류 완충액에 핵을 재현탁하였다. 부드럽게 볼텍싱하면서 현탁된 핵에 G2 완충액(10ml)을 가한 후, 30초 동안 철저히 볼텍싱하였다. 퀴아젠 프로테아제(200㎕)를 가하고, 50℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 세포 용해물이 투명해질 때까지 인큐베이션 및 원심분리를 반복하였다(예를 들어, 추가의 30 내지 60분 동안 인큐베이션 후, 4℃에서 3000xg로 10분동안 펠릿화시킴).
투명한 용해물의 정제:
(1)게놈 DNA의 단리:
게놈 DNA를 QBT 완충액 10ml에 평형화시켰다(맥시 팁(maxi tip) 당 샘플 1개). QF 용출 완충액을 50℃에서 평형화시켰다. 샘플을 30초 동안 볼텍스한 후, 평형화된 팁에 로딩하여 중력의 힘으로 흐르게 하였다. 팁을 QC 완충액 15ml로 2회 세척하였다. QF 완충액 15ml을 이용하여(50℃), 실란화 및 살균된 30ml 코렉스(Corex) 튜브에 DNA를 용출시켰다. 이소프로판올(10.5ml)을 각 샘플에 가하고, 튜브를 파라핀으로 덮은 후, DNA가 침전될 때까지 거꾸로 세우는 과정을 계속반복하여 혼합하였다. 4℃에서 SS-34 로터 중 15,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 샘플을 펠릿화시켰다. 펠릿 위치를 표시하고, 상층액을 버린 후, 70% 에탄올 10ml(4℃)을 가하였다. 4℃에서 SS-34 로터 중 10,000rpm으로 10분 동안 다시 원심분리하여 샘플을 펠릿화시켰다. 펠릿의 위치를 표시하고, 상층액을 버렸다. 이후에 샘플이 과도하게 건조되지 않도록 주의하면서 튜브를 건조대에 넣고 37℃에서 10분 동안 건조시켰다.
건조 후, 펠릿을 TE(pH 8.5) 1.0ml 에 용해시키고, 50℃에 1 내지 2시간 동안 방치하였다. 계속 용해되도록 샘플을 4℃에 밤새 방치하였다. 이후에, 투베르쿨린(tuberculin) 주사기의 26 게이지 바늘을 이용하여 DNA 용액을 1.5ml 튜브에 옮겼다. DNA를 절단하기 위해 상기와 같이 옮기는 과정을 5회 반복하였다. 이후에 샘플을 50℃에 1 내지 2시간 동안 방치하였다.
(2)게놈 DNA의 정량 분석 및 유전자 증폭 분석용 제제:
베크만 DU640 분광기에서 0.1ml 석영 큐벳을 이용하여, 1:20 희석(5㎕ DNA + 95㎕ ddH2O) 샘플의 표준 A260, A280분광법에 의해 각 튜브의 DNA 양을 정량하였다. A260/A280의 비율은 1.8 내지 1.9 사이였다. 이후에 각 DNA 샘플을 TE(pH 8.5)중에 추가로 희석하여 약 200ng/ml이 되게하였다. 원래의 재료가 매우 고농도(약 700ng/㎕)인 경우에는 DNA가 현탁될 때까지 50℃에 몇 시간 동안 방치하였다.
하기와 같이 변형된 제조자의 안내서를 이용하여, 희석된 재료(20 내지 600ng/ml)의 형광 DNA 정량법을 수행하였다. 이는 호퍼(Hoeffer) DyNA퀀트(Quant) 200 형광계를 약 15분 동안 예열한 후 수행하였다. 획스트(Hoechst) 염료 활성 용액(#H33258, 10㎕, 사용 12시간 내에 제조)을 1x TNE 완충액 100ml로 희석하였다. 2ml 큐벳을 형광계 용액으로 채우고 기계에 넣은 후, 기계의 영점을 잡았다. pGEM2Zf(+)(2㎕, 로트번호 360851026)을 형광계 용액 2ml에 가하여 200 단위로 조정하였다. 추가의 pGEM2Zf(+) DNA 2㎕를 시험하여 값이 400±10 단위인지 확인하였다. 이후에 각 샘플의 값을 3회 이상 측정하였다. 3회의 샘플 측정값이 서로 10% 이내의 범위일 때, 이들의 평균을 취하여 정량치로 사용하였다.
형광계에 의해 측정된 농도를 이용하여 각 샘플의 농도가 10ng/㎕가 되도록 ddH2O로 희석하였다. 단일 택맨 플레이트 분석용 주형의 모든 샘플에 대해 동시에 이를 수행하였으며, 500 내지 1000회 분석할 수 있는 충분한 재료로 수행하였다. 단일 플레이트상에서 택맨(상표명) 프라이머 및 B-액틴과 GAPDH 프로브를 이용하여, 정상 인간 DNA 및 주형이 없는 대조용과 함께 시험을 3회 수행하였다.
시험 DNA로부터 감해진 정상 인간 DNA의 Ct 값이 ±1Ct인 경우에 희석된 샘플을 사용하였다. 희석된 고품질의 게놈 DNA를 1.0ml씩 분취하여 -80℃에 보관하였다. 이후에 유전자 증폭 분석에 사용될 분취액은 4℃에 보관하였다. 각 1ml의 분취액은 8 내지 9 플레이트 또는 64회 시험에 충분하였다.
유전자 증폭 분석:
하기의 원발성 종양에 대해 본 발명의 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 화합물을 스크린하여, 결과의 ΔCt값을 표 3에 기록하였다.
PRO187:
프레임워크 지도화(framework mapping)를 이용한 상기 최초 스크린으로부터 선택된 종양으로 PRO187(DNA27864-1155)를 다시 조사하였다. 표 4에는 PRO187(DNA27864-1155)과 함께 사용된 프레임워크 마커(framework marker)가 기재되어 있다. 프레임워크 마커는 8번 염색체를 따라 매 20 메가염기마다 위치해 있으며(도 21), 염색체의 이수성(異數性)을 제어하기 위해 사용된다. PRO187(DNA27864)에 대해 8번 염색체를 따라 기재된 프레임워크 마커의 선택된 종양에 대한 ΔCt 값은 표 6에 기재되어 있다.
에피센터 지도화(epicenter mapping)를 이용한 상기 최초 스크린으로부터 선택된 종양으로 PRO187(DNA27864-1155)를 다시 조사하였다. 표 5에는 PRO187(DNA27864-1155)과 함께 사용된 에피센터 마커(epicenter marker)가 기재되어 있다. 이 마커들은 DNA27864의 부근에 가깝게 위치해 있으며, DNA27864가 위치하는 8번 염색체 영역의 증폭 상태를 평가하기 위해 사용하였다. 마커들 사이의 거리는 두 마커 사이에 나타나는 방사선 붕괴의 약 1% 변화에 상응하는 붕괴 단위인 센티레이(cR)로 측정하였다. 1 cR은 대략 20 킬로염기에 해당한다. SHGC-9963 마커는 DNA27864-1155가 가깝게 위치하는 8번 염색체에서 가장 가깝게 위치하는 마커이다.
표 7은 DNA27864에 대한 에피센터 지도화의 결과로 나타난 ΔCt 값을 나타내는 것으로, 이는 8번 염색체를 따라 DNA27864의 실제 위치에 인접한 영역의 상대적인 증폭을 나타낸다 (도 21).
DNA27864에 사용된 프레임워크 마커
8번 염색체상의 맵 위치 스탠포드 게놈 센터 마커 명칭
H9 EST00040
H59 WI-961
H121 SHGC-11323
H200 SHGC-7433
H256 AFMa183zf1
DNA27864에 사용된 8번 염색체의 에피센터 마커
8번 염색체상의 맵 위치 스탠포드 인간 게놈 센터 마커 명칭 다음 마커까지의 거리 (cR)
H60 SHGC-32556 9
H61 SHGC-15994 5
H62 SHGC-9963 5
H63 SHGC-33989 10
H64 UT5371 33
H65 SHGC-9507 -
PRO240:
프레임워크 지도화를 이용한 상기 최초 스크린으로부터 선택된 종양으로 PRO240(DNA34387-1138)을 다시 조사하였다. 표 8에는 PRO240(DNA34387-1138)과 함께 사용된 프레임워크 마커가 기재되어 있다. 프레임워크 마커는 2번 염색체를 따라 매 20 메가염기마다 위치해 있으며(도 22), 염색체의 이수성을 제어하기 위해 사용된다. PRO240(DNA34387)에 대해 2번 염색체를 따라 기재된 프레임워크 마커의 선택된 종양에 대한 ΔCt 값은 표 10에 기재되어 있다.
에피센터 지도화를 이용한 상기 최초 스크린으로부터 선택된 종양으로 PRO240(DNA34387-1138)을 다시 조사하였다. 표 9에는 PRO240(DNA34387-1138)과 함께 사용된 에피센터 마커가 기재되어 있다. 이 마커들은 DNA34387의 부근에 가깝게 위치해 있으며, DNA34387이 위치하는 2번 염색체 영역의 증폭 상태를 평가하기 위해 사용하였다(도 22). 마커들 사이의 거리는 두 마커 사이에 나타나는 방사선 붕괴의 약 1% 변화에 상응하는 붕괴 단위인 센티레이로 측정하였다. 1 cR은 대략 20 킬로염기에 해당한다. SHGC-14626 마커는 DNA34387에 가장 가깝게 위치하는 2번 염색체의 마커이다. 그러나, 택맨(상표명) 프라이머와 SHGC-14626에 대한 프로브를 통한 분석은 PCR에 대한 기술적인 어려움으로 인해 본 분석법에서 실패하였다. 또한, DNA34387은 BAC(세균 인공 염색체) 내에도 함유되어 있는 것으로 밝혀졌다. 전장의 BAC은 약 100kb였다. 택맨(상표명) 프라이머와 DNA34387에 대한 프로브로 BAC 라이브러리를 스크린하여 DNA34387을 함유하는 BAC을 찾아내었다. DNA34387에 양성인 클론의 말단을 서열 분석하여, BAC 말단 서열에 대한 2 세트의 택맨(상표명) 프라이머 및 프로브를 만들었다(표 9 및 11). 이는 우리의 원래 에피센터 지도화의 결과에 대한 타당성을 확인해 주었다. 표 11은 DNA34387에 대한 에피센터 지도화의 결과로 나타난 ΔCt 값을 나타내는 것으로, 이는 2번 염색체를 따라 DNA34387의 실제 위치에 인접한 영역의 상대적인 증폭을 나타낸다 (도 22).
DNA34387에 사용된 프레임워크 마커
2번 염색체상의 맵 위치 스탠포드 인간 게놈 센터 마커 명칭
B3 SHGC-30098
B45 SHGC-33615
B90 WI-7936
B125 WI-469
B169 SHGC-31624
B213 SHGC-10074
B251 SHGC-30979
B290 SHGC-9794
B331 AFM210xb2
B386 SHGC-13676
B441 AFM199yf2
B494 SHGC-33448
DNA34387에 사용된 2번 염색체의 에피센터 마커
2번 염색체상의 맵 위치 스탠포드 인간 게놈 센터마커 명칭 다음 마커까지의 거리(cR)
B60 AFMa136wh9 65 (갭)
B63 AFM254vc9 6
B64 SHGC-14574 28
B65 SHGC-14626 7
B66 SHGC-11736 7
B67 SHGC-35430 17
B68 AFM234YA9 32
B71 CHLC.GATA8F07.440 -
189D13FOR1 BAC 서열의 전방향 말단으로부터의 마커 -
189D13REV1 BAC 서열의 전방향 말단으로부터의 마커 -
PRO230:
프레임워크 지도화를 이용한 상기 최초 스크린으로부터 선택된 종양으로 PRO230(DNA33223-1136)을 다시 조사하였다. 표 12에는 PRO230(DNA33223-1136)과 함께 사용된 프레임워크 마커가 기재되어 있다. 프레임워크 마커는 1번 염색체를 따라 매 20 메가염기마다 위치해 있으며(도 23), 염색체의 이수성을 제어하기 위해 사용된다. PRO230(DNA33223)에 대해 1번 염색체를 따라 기재된 프레임워크 마커의 선택된 종양에 대한 ΔCt 값은 표 14에 기재되어 있다.
또한, 에피센터 지도화로 PRO230(DNA33223-1136)을 다시 조사하였다. BAC 라이브러리를 스크리닝하여 DNA33223을 함유하는 세균 인공 염색체(BAC)을 찾아내었다. DNA33223에 양성인 클론의 말단을 서열 분석하여, BAC 말단 서열에 대한 2 세트의 택맨(상표명) 프라이머 및 프로브를 만들었다. 택맨(상표명) 프라이머와 BAC 말단에 대한 프로브를 마커로 이용하여, DNA33223이 위치하는 1번 염색체 영역의 증폭 상태를 평가하였다. BAC 클론은 통상 100 내지 150kb였다. 또한, DNA40625(신규 유전자)가 DNA33223을 함유하는 BAC 클론에 위치해 있었다. 표 13에는 PRO230(DNA33223)과 함께 사용된 에피센터 마커가 기재되어 있다. 이 마커들은 DNA33223의 부근에 가깝게 위치해 있으며, DNA33223이 위치하는 1번 염색체 영역의 증폭 상태를 평가하기 위해 사용하였다. 마커들 사이의 거리는 두 마커 사이에 나타나는 방사선 붕괴의 약 1% 변화에 상응하는 붕괴 단위인 센티레이(cR)로 측정하였다. 1 cR은 대략 20 킬로염기에 해당한다. SHGC-35321 마커는 DNA33223-1136이 가깝게 위치하는 1번 염색체에서 가장 가깝게 위치하는 마커이다(도 23).
표 15는 DNA33223에 대한 에피센터 지도화의 결과로 나타난 ΔCt 값을 나타내는 것으로, 이는 1번 염색체를 따라 DNA33223의 실제 위치에 인접한 영역의 상대적인 증폭을 나타낸다 (도 23).
DNA33223에 사용된 프레임워크 마커
맵 위치 스탠포드 인간 게놈 센터 마커 명칭
A1 SHGC-33169
A40 SHGC-3901
A84 AFM234tb6
A129 ACT1B03
A180 SHGC-34001
A220 AFM338wb5
A263 EST00691
A312 SHGC-7599
A355 SHGC-32839
A398 SHGC-37552
A443 SHGC-11921
A485 SHGC-9327
A520 SHGC-30345
A553 SHGC-3055
DNA33223에 사용된 1번 염색체의 에피센터 마커
1번 염색체상의 맵 위치 스탠포드 인간 게놈 센터마커 명칭 다음 마커까지의 거리(cR)
A83 SHGC-37693 97 (갭)
A84 AFM234tb6 9
A85 AFM240za9 46
A86 AFM199zd2 10
A87 SHGC-35321 11
A88 SHGC-3252 12
A89 SHGC-11204 173
A102 SHGC-11219 -
189D13FOR1 BAC 서열의 전방향말단으로부터의 마커 -
189D13FOR2 BAC 서열의 전방향말단으로부터의 마커 -
DNA33223 - -
DNA40625 - -
189D13REV1 BAC 서열의 전방향말단으로부터의 마커 -
189D13REV2 BAC 서열의 전방향말단으로부터의 마커 -
PRO187(DNA27864-1155):
다양한 종양에서의 DNA27864-1155에 대한 ΔCt 값이 표 3에 기록되어 있다.통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 3에는 (1) 원발성 폐 종양인 LT12, LT13, LT15, LT16, LT19 및 LT30, 및 (2) 원발성 결장 종양인 CT2, CT8, CT10, CT14, CT1, CT5, CT6, CT7, CT9 및 CT11에서 나타나는, PRO187을 코딩하는 핵산 DNA27864-1155가 상당히 증폭되었음이 나타나 있다. 원발성 폐 종양인 LT12, LT13, LT15 및 LT16, 및 원발성 결장 종양인 CT2, CT5, CT10, CT11 및 CT14에서 DNA27864에 대한 프레임워크 지도화(표 6)에 의해 증폭이 확인되었다. 프레임워크 마커 분석은 지정된 종양에서 8번 염색체 특정 영역의 상대적인 증폭을 기록하는 반면, 에피센터 마커 분석은 목적 유전자에 근접한 영역에서의 상대적인 증폭에 대한 더 정확한 판독을 가능하게 한다. 공지된 마커(표 6)에 가장 가깝게 위치하는 영역의 증폭은 DNA27864의 증폭에 비해 더 적게 일어난다.
DNA27864-1155에 대한 에피센터 지도화(표 7)에 의해 증폭을 확인하였고, 그 결과 원발성 결장 종양인 CT2, CT5, CT8, CT10, CT11 및 CT14, 및 원발성 폐 종양인 LT12, LT13, LT15 및 LT16에서 상당한 증폭이 확인되었다. 반대로, 공지된 에피센터 마커(H60 및 H64 제외)에 가장 가깝게 위치하는 영역의 증폭은 DNA27864의 증폭에 비해 더 적게 일어난다 (표 7). 이는 DNA27864가 8번 염색체상에서 특정 영역을 증폭시키는 유전자임을 강력히 시사한다. DNA27864의 증폭은 다양한 폐 종양 및 직장 종양에서 나타나기 때문에, DNA27864는 종양의 형성 및 생장에 중요한 역할을 할 것이다. 결국, DNA27864에 의해 코딩되는 단백질(PRO187)에 대한 길항제(예를 들어, 항체)가 암의 치료에 이용될 것으로 기대된다.
PRO533(DNA49435-1219):
다양한 종양에서의 DNA49435-1219에 대한 ΔCt 값이 표 3에 기록되어 있다.통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 3에는 원발성 폐 종양인 LT1a, LT7, LT11, LT16, LT17 및 LT19에서 나타나는, PRO533을 코딩하는 핵산 DNA49435-1219가 상당히 증폭되었음이 나타나 있다. DNA49435-1219의 증폭은 다양한 폐 종양에서 나타나기 때문에, DNA49435-1219는 종양의 형성 및(또는) 생장관 관련되어 있을 것이다. 결국, DNA49435에 의해 코딩되는 단백질(PRO533)에 대한 길항제(예를 들어, 항체)가 암의 치료에 유용할 것으로 기대된다.
PRO214(DNA32286-1191):
다양한 종양에서의 DNA32286-1191에 대한 ΔCt 값이 표 3에 기록되어 있다.통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 3에는 (1) 원발성 폐 종양인 LT3, LT11, LT12, LT13, LT15, LT17 및 LT19, 및 (2) 원발성 결장 종양인 CT2, CT3, CT8, CT10, CT12, CT14, CT15, CT16, CT17, CT1, CT4, CT5, CT6, CT9 및 CT11에서 나타나는, PRO214를 코딩하는 핵산 DNA32286-1191가 상당히 증폭되었음이 나타나 있다. DNA32286-1191의 증폭은 다양한 종양에서 나타나기 때문에, DNA32286-1191은 종양의 형성 및(또는) 생장과 관련되어 있을 것이다. 결국, DNA32286에 의해 코딩되는 단백질(PRO214)에 대한 길항제(예를 들어, 항체)가 암의 치료에 이용될 것으로 기대된다.
PRO240(DNA34387-1138):
다양한 종양에서의 DNA34387-1138에 대한 ΔCt 값이 표 3에 기록되어 있다.통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 3에는 (1) 원발성 폐 종양인 LT1a, LT3, LT6, LT10, LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17, LT19, LT21, LT26, LT28, LT30 및 HF000840, (2) 원발성 결장 종양인 CT2, CT3, CT8, CT10, CT12, CT14, CT15, CT16, CT17, CT1, CT4, CT5, CT6, CT7, CT11과 결장 종양 중심인 HF000539, HF000575 및 HF000698, (3) 유방 종양인 SRCC1097, SRCC1098, SRCC1100, SRCC1101과 유방 종양 중심인 HF000575, (4) 신장 종양 중심인 HF000611, (5) 림프절 HF000854, 및 (6) 고환 종양 중심인 HF000733과 고환 종양 가장자리인 HF000716에서 나타나는, PRO240을 코딩하는 핵산 DNA34387-1138이 상당히 증폭되었음이 나타나 있다.
원발성 폐 종양인 LT1a, LT3, LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17 및 LT19에서 DNA34387에 대한 프레임워크 지도화(표 10)에 의해 증폭이 확인되었다. 공지된 에피센터 마커(B3 및 B90 마커 제외)에 가장 가깝게 위치하는 영역의 증폭은 DNA34387의 증폭에 비해 더 적게 일어난다(표 10). 프레임워크 마커 분석은 지정된 종양에서 2번 염색체 특정 영역의 상대적인 증폭을 기록하는 반면, 에피센터 마커 분석은 목적 유전자에 근접한 영역에서의 상대적인 증폭에 대한 더 정확한 판독을 가능하게 한다.
DNA34387-1138에 대한 에피센터 지도화(표 11)에 의해 증폭을 확인하였고, 그 결과 원발성 폐 종양인 LT1a, LT2, LT3, LT4, LT6, LT7, LT9, LT10, LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17, LT19 및 LT21에서 상당한 증폭이 확인되었다. BAC 마커인 208K21For1의 종양에 대한 패턴이 DNA34387의 패턴과 유사하고 그 증폭의 정도도 유사하기 때문에(표 11), DNA34387은 상기 BAC 마커에 매우 가까운 것 같다.
프레임워크 및 에피센터 지도화에 의해 나타나는 증폭은 DNA34387이 2번 염색체상에서 특정 영역을 증폭시키는 유전자임을 강력히 시사한다. DNA34387의 증폭은 다양한 종양에서 나타나기 때문에, DNA34387은 종양의 형성 및 생장에 중요한 역할을 할 것이다. 결국, DNA34387에 의해 코딩되는 단백질(PRO240)에 대한 길항제(예를 들어, 항체)가 암의 치료에 이용될 것으로 기대된다.
PRO211(DNA32292-1131):
다양한 종양에서의 DNA32292-1131에 대한 ΔCt 값이 표 3에 기록되어 있다.통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 3에는 (1) 원발성 폐 종양인 LT1a, LT3, LT4, LT9, LT10, LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17, LT19 및 LT21, (2) 원발성 결장 종양인 CT2, CT1, CT4, CT5, CT6 및 CT11, 및 (3) 폐 종양 세포주인 SW900에서 나타나는, PRO211을 코딩하는 핵산 DNA32292-1131이 상당히 증폭되었음이 나타나 있다. DNA32292-1131의 증폭은 다양한 종양에서 나타나기 때문에, DNA32292-1131은 종양의 형성 및(또는) 생장에 중요한 역할을 할 것이다. 결국, DNA32292에의해 코딩되는 단백질(PRO211)에 대한 길항제(예를 들어, 항체)가 암의 치료에 이용될 것으로 기대된다.
PRO230(DNA33223-1136):
다양한 종양에서의 DNA33223-1136에 대한 ΔCt 값이 표 3에 기록되어 있다.통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 3에는 (1) 원발성 폐 종양인 LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17, LT19, LT21, LT30 및 HF000840, (2) 원발성 결장 종양인 CT3, CT12, CT16, CT17, CT1, CT4, CT5, CT7, CT11과 결장 종양 중심인 HF000539, (3) 폐 종양 세포주인 Calu-1, (4) 결장 종양 세포주인 SW620, (5) 신장 종양 중심인 HF000611, 및 (6) 고환 종양 중심인 HF000733 및 HF000716에서 각각 나타나는, PRO230을 코딩하는 핵산 DNA33223-1136이 상당히 증폭되었음이 나타나 있다.
원발성 폐 종양인 LT11, LT12, LT13, LT15, LT17 및 LT19에서의 DNA33223에 대한 프레임워크 지도화(표 14)에 의해 증폭을 확인하였다. DNA33223에 대한 에피센터 지도화(표 15) 결과, 원발성 폐 종양인 LT1a, LT3, LT6, LT9, LT10, LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17 및 LT19, 및 원발성 결장 종양인 CT2, CT5, CT10 및 CT11에서 상당한 증폭이 확인되었다.
프레임워크 마커 분석은 지정된 종양에서 1번 염색체 특정 영역의 상대적인 증폭을 기록하는 반면, 에피센터 마커 분석은 목적 유전자에 근접한 영역에서의 상대적인 증폭에 대한 더 정확한 판독을 가능하게 한다. 공지된 마커(표 14)에 가장 가깝게 위치하는 영역의 증폭은 DNA33223의 증폭에 비해 더 적게 일어난다. 이는DNA33223이 1번 염색체상에서 특정 영역을 증폭시키는 유전자임을 강력히 시사한다. DNA33223의 증폭은 다양한 종양 및 세포주(특히, 폐)에서 나타나기 때문에, DNA33223은 종양의 형성 또는 생장에 중요한 역할을 할 것이다. 결국, DNA33223에 의해 코딩되는 단백질(PRO230)에 대한 길항제(예를 들어, 항체)가 암의 치료에 이용될 것으로 기대된다.
PRO261(DNA33473-1176):
다양한 종양에서의 DNA33473-1176에 대한 ΔCt 값이 표 3에 기록되어 있다.통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 3에는 (1) 원발성 폐 종양인 LT1a, LT10, LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17, LT18, LT19 및 LT21, (2) 원발성 결장 종양인 CT2, CT3, CT14 및 CT5, (3) 결장 종양 세포주인 SW480, SW620, Colo320, HT29, WiDr, HCT116, SKCO1, SW403 및 LS174T, 및 (4) 유방 종양 세로주인 HBL100, MB435s, BT20 및 SKBR3에서 나타나는, PRO261을 코딩하는 핵산 DNA33473-1176이 상당히 증폭되었음이 나타나 있다. DNA33473-1176의 증폭은 다양한 종양 및 세포주(특히, 폐)에서 나타나기 때문에, DNA33473-1176은 종양의 형성 및(또는) 생장과 관련되어 있을 것이다. 결국, DNA33473에 의해 코딩되는 단백질(PRO261)에 대한 길항제(예를 들어, 항체)가 암의 치료에 이용될 것으로 기대된다.
PRO246(DNA35639-1172):
다양한 종양에서의 DNA35639-1172에 대한 ΔCt 값이 표 3에 기록되어 있다.통상, 유전자 복제본 수가 2배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 3에는 (1) 원발성 폐 종양인 LT3, LT10, LT11, LT12, LT13, LT15, LT17, LT19 및 LT21, 및 (2) 원발성 결장 종양인 CT4, CT5, CT9 및 CT11에서 나타나는, PRO246을 코딩하는 핵산 DNA35639-1172가 상당히 증폭되었음이 나타나 있다. DNA35639-1172의 증폭은 다양한 종양에서 나타나기 때문에, DNA35639-1172는 종양의 형성 및(또는) 생장과 관련되어 있을 것이다. 결국, DNA35639에 의해 코딩되는 단백질(PRO246)에 대한 길항제(예를 들어, 항체)가 암의 치료에 이용될 것으로 기대된다.
PRO317(DNA33461-1199):
다양한 종양에서의 DNA33461-1199에 대한 ΔCt 값이 표 3에 기록되어 있다.통상, 유전자 복제본 수가 2 배가 되는 것을 의미하는 값인 1을 초과하는 ΔCt 값을 증폭 점수의 역치값으로 사용하였다. 표 3에는 (1) 원발성 폐 종양인 LT1a, LT3, LT4, LT6, LT7, LT9, LT10, LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17 및 LT19, 및 (2) 원발성 결장 종양인 CT2, CT10, CT14, CT15, CT4 및 CT9에서 나타나는, PRO317을 코딩하는 핵산 DNA33461-1199가 상당히 증폭되었음이 나타나 있다. DNA33461-1199의 증폭은 다양한 종양에서 나타나기 때문에, DNA33461-1199는 종양의 형성 및(또는) 생장과 관련되어 있을 것이다. 결국, DNA33461에 의해 코딩되는 단백질(PRO317)에 대한 길항제(예를 들어, 항체)가 암의 치료에 이용될 것으로 기대된다.
<실시예 11>원래 위치에서의 혼성화
원래 위치에서의 혼성화는 세포 및 조직 표본 내의 핵산 서열을 검출하고 위치를 파악하게 하는 강력한 다용도 기술이다. 예를 들어, 유전자 발현 부위의 확인, 전사되는 조직의 분포, 바이러스 감염 확인 및 그 위치 파악, 특정 mRNA 합성에 따른 변화, 및 염색체 지도화를 돕는데 유용할 수 있다.
PCR-생성33P-표지 리보프로브를 이용하여 문헌(Lu and Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994)]의 최적 버전 프로토콜로 원래 위치에서의 혼성화를 수행하였다. 요컨대, 포르말린으로 고정되어 파라핀에 묻힌 인간 조직을 절단하고, 탈파라핀화한 후, 37℃에서 15분 동안 단백질 분해효소 K로 탈단백질화하고, 상기 문헌(Lu and Gillett)에 기재된 바와 같이 원래 위치에서의 혼성화로 추가 처리하였다. PCR 생성물로부터 [33P]-UTP로 표지된 안티센스 리보프로브를 생성하고 55℃에서 밤새 혼성화하였다. 상기 슬라이드를 코닥(Kodak) NTB2 핵 트랙 에멀젼(nuclear track emulsion) 중에 담그고 4주 동안 노출시켰다.
33 P-리보프로브 합성
33P-UTP(Amersham BF 1002, SA < 2000Ci/mmol) 6.0㎕(125mCi)를 고속 진공기(speed vac)에서 건조시켰다. 건조된33P-UTP를 포함하는 각 튜브에 하기 성분을 가하였다.
2.0㎕ 5x 전사 완충액
1.0㎕ DTT (100mM)
2.0㎕ NTP 혼합물 (2.5mM: 각각 10mM인 GTP, CTP 및 ATP 10㎕ + 10㎕ H2O)
1.0㎕ UTP (50μM)
1.0㎕ Rnasin
1.0㎕ DNA 주형 (l㎍)
1.0㎕ H20
1.0㎕ RNA 중합효소 (PCR 생성물의 경우에 통상 T3 = AS, T7 = S)
37℃에서 1시간 동안 상기 튜브를 인큐베이션하였다. RQ1 DNase 1.0㎕를 가한 후에 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. TE(10mM Tris(pH 7.6) 및 lmM EDTA(pH 8.0)) 90㎕를 가하고, 피펫으로 상기 혼합물을 DE81 페이퍼에 가하였다. 마이크로콘(Microcon)-50 초미세여과 유닛에 잔류 용액을 로딩하고 프로그램 10을 이용하여 6분 동안 회전시켰다. 제2 튜브 위에 여과 유닛을 거꾸로 올려놓고 프로그램 2를 이용하여 3분 동안 회전시켰다. 최종 회수하기 전에, TE 100㎕를 가하였다. DE81 페이퍼 상에 최종 생성물 1㎕를 피펫으로 가하고 6ml의 바이오플라워(Bioflour) Ⅱ로 계수하였다.
TBE 및 요소 겔 상에 프로브를 전기영동하였다. 3㎕의 로딩 완충액에 1 내지 3㎕의 프로브 또는 5㎕의 RNA Mrk Ⅲ를 가하였다. 37℃ 가열 블록(heat block)에서 3분 동안 가열한 후에, 즉시 겔을 얼음에 놓았다. 겔의 웰을 세척한 후, 샘플을 로딩하고 180 내지 250볼트에서 45분 동안 전기영동하였다. 사란(saran) 랩으로 겔을 싸고, 이를 -70℃ 냉동고에서 1시간 내지 밤새의 시간 동안 신호 증강 스크린 상에서 XAR 필름에 노출시켰다.
33 P-혼성화
동결 단편의 예비처리: 냉동고로부터 슬라이드를 꺼내 알루미늄 트레이에 놓고 상온에서 5분 동안 해동시켰다. 응축 감소를 위해, 트레이를 55℃ 배양기에 5분 동안 놓아 두었다. 발연 후드(fume hood) 내의 얼음 상 4% 파라포름알데히드 중에서 10분 동안 슬라이드를 고정시키고, 상온에서 0.5x SSC(25ml 20x SSC + 975ml SQ H2O)로 5분 동안 세척하였다. 단백질 분해효소 K 0.5㎍/ml로 37℃에서 10분 동안 탈단백질화 후에(예열된, RNase가 없는 RNase 완충액 250ml 중의 10mg/ml 원액 12.5㎕), 상온에서 10분 동안 0.5x SSC로 단편을 세척하였다. 70%, 95%, 100% 에탄올 중에서 각각 2분 동안 단편을 탈수화하였다.
파라핀에 묻힌 절편의 예비처리: 슬라이드를 탈파라핀화하고 SQ H2O 중에 놓고 상온에서 2x SSC로 5분씩 2회 세척하였다. 인간 배(embryo)의 경우 단백질분해효소 K(RNase가 없는 RNase 완충액 250ml 중의 10mg/ml 용액 500㎕, 37℃, 15분) 20㎕/ml 중에서, 또는 포르말린 조직의 경우 8x 단백질분해효소 K(RNase 완충액 250ml 중의 100㎕, 37℃, 30분) 중에서 절편을 탈단백질화하였다. 그 후에, 상기 기재된 바와 같이 0.5x SSC로 세척하고 탈단백질화를 수행하였다.
예비혼성화: 박스(Box) 완충액(4x SSC, 50% 포름아미드)으로 포회된 여과지에 의해 구획이 나뉜 플라스틱 상자에 슬라이드를 놓았다. 50㎕ 혼성화 완충액(덱스트란 설페이트 3.75g + SQ H2O 6ml)을 조직 시료에 넣고 볼텍싱 후, 뚜껑을 느슨하게 한 상태로 2분 동안 극초단파로 가열하였다. 얼음에서 냉각한 후에, 포름아미드 18.75ml, 20x SSC 3.75ml 및 SQ H2O 9ml를 가하고 조직을 잘 볼텍싱한 후, 42℃에서 1내지 4시간 동안 인큐베이션하였다.
혼성화: 슬라이드 당 1.0 x 106cpm의 프로브 및 tRNA(50mg/ml 원액) 1.0㎕를 95℃에서 3분 동안 가열하였다. 얼음에서 상기 슬라이드를 냉각하고, 슬라이드 당 혼성화 완충액 48㎕를 가하였다. 볼텍싱한 후에, 슬라이드 상의 예비혼성화 시료 50㎕에33P 혼합물 50㎕를 가하였다. 55℃에서 밤새 이 슬라이드를 배양하였다.
세척: 상온에서 2x SSC, EDTA로 10분씩 2회 세척한 후에(20x SSC 400ml + 0.25M EDTA 16ml, 최종 부피=4L), 37℃에서 30분 동안 RNase A로 처리하였다(RNase 완충액 250ml 중 10mg/ml 농도의 RNase 500㎕ = 20㎍/ml). 상온에서 2x SSC, EDTA로 10분씩 2회 슬라이드를 세척하였다. 엄격한 세척 조건은 하기와 같다: 55℃, 0.1x SSC 및 EDTA에서 2시간(20x SSC 20ml + EDTA 16ml, 최종 부피 = 4L).
DNA49435-1219(FGF 동족체, FGF 수용체 3 리간드):
올리고 A-252G 46 머(mer):
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGGATCCTGGCCGGCCTCGG-3' (서열 82)
올리고 A-251H 48 머:
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGCCCGGGCATGGTCTCAGTTA-3' (서열 83)
태아 뇌의 피질성 뉴런에서 중간 수준의 발현이 관찰되었다. 태아 망막의 내면에서 발현이 관찰되었으며, 발생중인 수정체에서도 발현되는 것 같다. 또한, 태아의 피부, 연골, 소장, 태반 융모 및 탯줄 도관에서도 발현이 관찰되었다. 성인 조직에서는 쓸개 상피에서 과도하게 높은 수준으로 발현되었다. 성인 신장, 위 상피 및 결장 상피에서 중간 수준의 발현이 관찰되었다. 이들 데이타는 연골 및 뼈의 생장에 있어서 이 분자의 잠재적인 기능과 일치한다.
DNA32286-1191(EGF-유사 동족체):
올리고 B-138U 47 머:
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCCTCCTGCCTTCCCTGTCC-3' (서열 84)
올리고 A-134R 48 머:
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGTGGTGGCCGCGATTATCTGC-3' (서열 85)
태아 조직에서, 간충질 조직을 통한 낮은 수준의 발현이 관찰되었다. 막 조직의 태반 간질 세포 및 갑상선에서 중간 수준의 발현이 관찰되었다. 피질성 뉴런에서 낮은 수준의 발현이 관찰되었다.
DNA34387-1138(톱니형/EGF 동족체):
올리고 B-231W 48 머:
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCGAGATATGCACCCAATGTC-3' (서열 86)
올리고 B-231-X 47 머:
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGATCCCAGAATCCCGAAGAACA-3' (서열 87)
성인 및 태아 조직에서의 발현 패턴
태아 조직: 갑상선 상피, 소장 상피, 생식선, 췌장 상피, 간의 간세포 및 신세뇨관에서 상승된 신호가 관찰되었으며, 발생중인 뼈의 도관 조직에서도 발현이 관찰되었다.
성인 조직: 태반의 세포영양막, 신세뇨관 상피, 방광 상피, 부갑상선 및 상피 종양에서 중간 신호가 관찰되었다.
폐 선암종 및 편평상피암종에서의 발현
8가지 편평상피암종 모두와 8가지 선암종 중 6가지 선암종에서 발현이 관찰되었다. 발현은 원래 위치 및 침윤 성분에서 관찰되었다. 선암종에서의 발현 수준은 낮은 수준 내지 중간 수준이었다. 통상, 편평상피암종에서의 발현 수준이 더 높았으며, 2가지 모두에서의 발현이 강력했다. 종양 간질, 폐포 또는 정상 호흡 상피에서는 발현이 관찰되지 않았다. 림프즐에서는 낮은 수준으로 발현되는 것 같았다.
DNA33223-1136(세뇨관간질성 신염 항체 동족체):
DNA33223p1:
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGGCGATGTCCACTGGGGCTAC-3' (서열 88)
DNA33223p2:
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACGAGGAAGATGGGCGGATGGT-3' (서열 89)
성인 및 태아 조직에서의 발현 패턴
조직의 단편에서 태아의 동맥 및 정맥 혈관과 관련된 강한 신호가 나타났다. 동맥에서는 신호가 평활근 및 주위세포에 한정되어 나타났다. 또한, 모세혈관 및 사구체에서도 신호가 나타났다. 또한, 태아 수정체의 상피세포에서도 발현이 관찰되었다. 또한, 태반 세포영양막 융모 내의 세포에서도 강력한 발현이 관찰되었다. 이들 세포는 영양세포막과 HGF를 발현하는 섬유아세포-유사 세포 사이에 놓여있으며, 불활실한 조직발생 능력이 있다.
성인에서는 대동맥 혈관벽에서 발현의 증거가 나타나지 않았으며, 대부분의 혈관이 음성 반응을 나타냈다. 그러나, 쓸개를 연결하는 상피와 정상 전립선의 혈관 통로에서 발현이 관찰되었다. 연부조직 육종 및 신세포 암종의 혈관에서도 발현이 관찰되었다. 요약하자면, 이 분자는 성인의 일부 기관 및 태아의 혈관에 특이적으로 발현되었다. 또한, 태아 수정체 및 성인 쓸개에서도 발현이 관찰되었다.
유방 및 폐 종양 조직을 이용한 발현
상기 결과와 유사한 혈관성 발현이 태아 블록에서 나타났다. 상피보다는 혈관의 평활근에서 발현되었다. 또한, 발현은 발생중인 식도에서도 발견되었으며, 따라서 이 분자는 혈관에 특이적이지 않다. 4가지 폐 암종 및 4가지 유방 암종에서 발현이 관찰되었다. 실질적인 발현은 4가지 폐암 중 3가지 이상 및 4가지 유방암 중 2가지에서 관찰되었다. 게다가, 한 유방 암종(IF97-06551 3E)에서는 불확실한 조직발생 기능이 있는 종양 주변 간질세포에서 발현이 관찰되었다(근섬유아세포일 것 같음).
폐 선암종 및 편평상피암종에서의 발현
16가지 종양 중 1가지에서 강한 혼성화 신호가 나타났고, 16가지 종양 중 2가지에서 약한 강도 내지 중간 강도의 양성 신호가 나타났다. 3가지 모든 종양이 불충분하게 분화된 편평상피암종으로 분류되었다. 나머지 6가지 편평상피암종 및 모든 7가지 선암종에서는 음성 반응이 나타났다. 상기 선행 연구에서 나타나는 바와 같이, 발현은 작거나 중간 크기 혈관 통로의 내피세포 및 평활근세포에서 나타났으며, 어떤 경우에는 양성 선(腺)세포에서 약하고 집중적인 발현이 관찰되었다.
DNA33473-1176(CTGF 동족체):
올리고 D-170R 45 머:
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGCGAGGACGACGGCGGCTTCA-3' (서열 90)
올리고 D-170V 48 머:
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAAGAGTCGCGGCCGCCCTTTTT-3' (서열 91)
정상 성인 피부의 섬유아세포에서 강력한 발현이 관찰되었다. 또한, 2가지 경화성 간의 활성 간 섬유증 부위에서도 강력한 발현이 관찰되었다. 이 위치는 세포외 매트릭스 형성 또는 전환에 있어서 이 분자의 역할을 암시한다.
DNA35639-1172(HCAR 동족체):
DNA35639p1:
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTTGCTGCGGTTTTTGTTCCTG-3' (서열 92)
DNA35639p2:
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGCTGCCGATCCCACTGGTATT-3' (서열 93)
이 분자는 CNS의 조직을 포함하는 태아 혈관 내피에서 강력하게 발현되었다. CNS를 포함하는 성인 혈관에서는 낮은 수준의 발현이 관찰되었다. 종양 혈관성 내피에서 높은 수준으로 발현되는지는 명백하지 않았다. 또한, 뼈 매트릭스 및 성인 비장에서도 신호가 관찰되었지만, 이 신호는 명백하게 세포와 관련된 것이었다.
<실시예 12>혼성화 프로브로서 PRO 폴리펩티드-코딩 핵산의 용도
하기 방법은 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261,PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 혼성화 프로브로서의 용도를 기술한다.
본원에 기술한 바와 같이 전장 또는 성숙 "PRO" 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함하는 DNA 및(또는) 그의 단편을 인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 상동성 DNA (예를 들어, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 자연 발생 변이체를 코딩하는 것)를 스크리닝하는데 프로브로서 사용할 수 있다.
이들 라이브러리 DNA를 포함하는 필터의 혼성화 및 세척을 하기 고엄격 조건 하에 수행하였다. 방사선 표지된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 유도 프로브를 50% 포름아미드, 5×SSC, 0.1% SDS, 0.1% 피로인산나트륨, 50 mM 인산나트륨, pH 6.8, 2×덴하르트(Denhardt's) 용액 및 10% 덱스트란 술페이트 용액 중의 42℃에서 20시간 동안 혼성화시켰다. 필터를 0.1×SSC 및 0.1% SDS의 수용액 중의 42℃에서 세척하였다.
이어서, 전장 천연 서열 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 코딩하는 DNA와 원하는 서열 동일성을 갖는 DNA를 당업계에 공지된 표준 방법으로 찾아내었다.
<실시예 13>대장균(E. coli)에서 "PRO" 폴리펩티드의 발현
본 실시예는 대장균(E. coli) 내의 재조합 발현에 의해 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 비글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 예시한다.
처음에 원하는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한 효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위를 포함해야만 한다. 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예에는 앰피실린 및 테트라싸이클린 내성 유전자를 포함하는 pBR322 (대장균(E. coli)에서 유래; Bolivar et al., Gene 2:95(1977) 참조)가 있다. 벡터를 제한 효소로 절단하고 탈인산화시켰다. 이어서, PCR 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션하였다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리-His 리더(처음 6개의 STII 코돈, 폴리-His 서열 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함), PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 코딩 부위, 람다 전사 종결부 및 argU 유전자를 서열을 포함할 것이다.
이어서, 상기 문헌(Sambrook et al.)에 기재된 방법을 이용하여 선택된 대장균(E. coli) 균주를 형질전환시키는데 라이게이션 혼합물을 사용하였다. LB 평판 배지에서 생장할 수 있는 형질전환체를 확인하고 항생제 내성을 갖는 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 단리하여, 제한 분석법 및 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다.
항생제가 포함된 LB 브로쓰와 같은 액체 배양 배지에서 선택된 클론을 밤새 배양하였다. 이 배양액을 더 큰 규모의 배양 접종에 사용하였다. 이어서, 세포를 원하는 광학 밀도까지 배양한 후, 발현 프로모터를 작동시켰다.
수시간 이상 동안 세포를 더 배양한 후에 원심분리로 세포를 회수하였다. 원심분리로 얻어진 세포 펠릿을 당업계에 공지된 여러가지 시약을 이용하여 용해시키고, 단백질이 강하게 결합하는 조건 하에서 금속 킬레이팅 컬럼을 이용하여 용해된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 단백질을 정제하였다.
PRO187, PRO533, PRO240 및 PRO317은 하기 과정을 이용하여 대장균(E. coli)에서 폴리-His 태그가 부착된 형태로 성공적으로 발현되었다. 선택된 프라이머를 사용하여 PRO187, PRO533, PRO240 및 PRO317을 코딩하는 DNA를 처음에 증폭하였다. 프라이머는 선택된 발현 벡터 상의 제한효소 부위에 해당하는 제한 효소 부위와 효율적이고 신뢰할 만한 번역 개시, 금속 킬레이트 컬럼에서 빠른 정제, 및 엔테로키나아제를 사용한 단백질 분해 제거를 제공하는 다른 유용한 서열을 포함하였다. 이어서 PCR 증폭된, 폴리-His 태그가 부착된 서열을 발현 벡터에 라이게이션시킨 후, 균주 52(W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP (lacIq) 기재의 대장균(E. coli) 숙주를 형질전환 시키는데 사용하였다. 우선 형질전환체를 50 ㎎/㎖의 카르베니실린 (carbenicillin)을 포함하는 LB 배지에서 O.D.600이 3 내지 5에 도달할 때까지 30℃에서 진탕 배양하였다. 이어서, 배양액을 CRAP 배지(물 500 ㎖ 중에 3.57 g (NH4)2SO4, 0.71 g 시트르산나트륨·2H2O, 1.07 g KCl, 5.36 g 디프코(Difco) 효모 추출물, 5.36 g 쉐필드 히카아제(Sheffield hycase) SF, 및 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55% (w/v) 글루코스 및 7 mM MgSO4를 혼합하여 제조)에 50 내지 100배로 희석하고, 약 20 내지 30시간 동안 30℃에서 진탕 배양하였다. 샘플을 분리하여 SDS-PAGE 분석법으로 발현을 확인하고 대량 배양액을 원심분리하여 세포를 펠릿으로 만들었다. 세포 펠릿을 정제 및 리폴딩시킬 때까지 냉동보관하였다.
0.5 내지 1L의 대장균(E. coli) 페이스트 발효액(6 내지 10 g 펠릿)을 10배 부피(w/v)의 7 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 8 완충액에 재현탁시켰다. 고체 아황산나트륨 및 사티온산나트륨을 각각 최종 농도 0.1 M과 0.02 M이 되도록 가하고 용액을 4℃에서 밤새 교반하였다. 이 단계에서 아황산염화에 의해 모든 시스테인 잔기가 차단된 변성 단백질이 생성되었다. 이 용액을 베크만(Beckman) 초강력 원심분리기에서 40,000 rpm으로 30분간 원심분리하였다. 상층액을 3 내지 5 배 부피의 금속 킬레이트 컬럼 완충액(6 M 구아니딘, 20 mM Tris, pH 7.4)으로 희석하고 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 투명하게하였다. 투명한 추출물을 금속 킬레이트 컬럼 완충액으로 평형화된 퀴아젠(Qiagen) Ni-NTA 금속 킬레이트 컬럼 5 ㎖에 로딩하였다. 50 mM 이미다졸(Calbiochem, Utrol grade)을 함유하는 추가의 완충액(pH 7.4)으로 컬럼을 세척하였다. 250 mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 단백질을 용출시키고, 원하는 단백질을 포함하는 분획을 모아 4℃에 보관하였다. 아미노산 서열에 따라 계산된 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서의 흡광도로 단백질 농도를 측정하였다.
20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M 우레아, 5 mM 시스테인, 20 mM 글리신 및 1 mM EDTA로 이루어진, 새로이 제조한 리폴딩 완충액에 샘플을 천천히 희석하여 단백질을 리폴딩시켰다. 리폴딩 부피는 최종 단백질 농도가 50 내지 100 ㎍/㎖가 되도록 정하였다. 리폴딩 용액을 4℃에서 12 내지 36시간 가량 서서히 교반하였다. 최종농도가 0.4% (약 pH 3)가 되도록 TFA를 가하여 리폴딩 반응을 정지시켰다. 추가로 단백질을 정제하기 전에, 용액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하고 아세토니트릴을 최종 농도 2 내지 10%가 되도록 가하였다. 10 내지 80%의 아세토니트릴 농도 구배로 용출시키코 0.1% TFA의 이동 완충액을 이용하는 포로스(Poros) R1/H 역상 컬럼 크로마토그래피에서 리폴딩된 단백질을 분석하였다. A280흡광도가 나타나는 분획의 분액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하여 균질하게 리폴딩된 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 통상, 적절하게 리폴딩된 단백질은 역상 수지와의 상호작용으로부터 보호되는 소수성의 내부 부분으로 가장 밀착되기 때문에, 대부분의 단백질에서 적절하게 리폴딩된 단백질 형태는 아세토니트릴의 가장 낮은 농도에서 용출된다. 응집된 단백질은 대개 높은 아세토니트릴 농도에서 용출된다. 역상 단계는 바람직한 형태의 단백질로부터 잘못 폴딩된 형태의 단백질을 분리할 뿐 아니라, 샘플로부터 내독소를 제거한다.
바람직하게 폴딩된 PRO187, PRO533, PRO240 및 PRO317 단백질을 포함하는 각각의 분획을 회수하여, 용액에 부드러운 질소 기류를 사용하여 아세토니트릴을 제거하였다. 투석법이나 제제화 완충액으로 평형화되고 멸균 여과된 G25 슈퍼파인 (Superfine, Pharmacia) 수지를 이용한 겔 여과법으로 0.14 M 염화나트륨 및 4% 만니톨이 함유된 20 mM Hepes, pH 6.8로 단백질을 제제화하였다.
<실시예 14>포유동물 세포에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 발현
본 실시예는 포유동물 세포에서 재조합 발현에 의해 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 가능한 글리코실화된 형태를 제조하는 방법을 예시한다.
pRK5 벡터(1989년 3월 15일 공개된 EP 제307,247호 참조)를 발현 벡터로 사용하였다. 임의로, 상기 문헌(Sambrook et al.)에 기재된 라이게이션 방법을 이용하여 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 DNA를 선택된 제한 효소로 pRK5에 라이게이션시켜, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 DNA를 삽입하였다. 결과의 벡터를 pRK5-PRO187, pRK5-PRO533, pRK5-PRO214, pRK5-PRO240, pRK5-PRO211, pRK5-PRO230, pRK5-PRO261, pRK5-PRO246 또는 pRK5-PRO317이라 명명하였다.
한 실시양태에서, 숙주 세포로서 293 세포를 선택할 수 있다. 인간 293 세포(ATCC CCL 1573)를 태 송아지 혈청 및 임의로 영양소 및(또는) 항생제가 포함된 DMEM와 같은 배지에서 조직 배양 플레이트에 가득 차도록(confluent) 배양하였다. pRK5-PRO187, pRK5-PRO533, pRK5-PRO214, pRK5-PRO240, pRK5-PRO211, pRK5-PRO230, pRK5-PRO261, pRK5-PRO246 또는 pRK5-PRO317 DNA 약 10 ㎍을 VA RNA 유전자를 코딩하는 DNA(Thimmappaya et al., Cell, 31: 543(1982)) 약 1 ㎍과 혼합하여, 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA 및 0.227 M CaCl2500 ㎕에 용해시켰다. 이 혼합물에 50 mM HEPES(pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO4500 ㎕를 적가하여 25℃에서 10분간 침전물을 형성시켰다. 침전물을 현탁시키고 293 세포에 가하여 37℃에서 4시간 가량을 정치시켰다. 배지를 흡입 제거하고 PBS 중의 20% 글리세롤 2 ㎖를 30초 동안가하였다. 이어서, 293세포를 무혈청 배지로 세척하고 새로운 배지를 가하여 5일간 세포를 배양하였다.
형질감염 약 24시간 후에 배지를 제거하고 배지(만으로) 또는 200 μCi/㎖35S-시스테인 및 200 μCi/㎖35S-메티오닌을 포함하는 배지로 교체하였다. 12시간 배양 후, 조건화된 배지를 수집하고 회전 필터에서 농축시켜 15% SDS 겔에 로딩하였다. 처리된 겔을 건조시키고 일정 기간동안 필름에 노출시켜 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 존재를 확인하였다. 형질감염된 세포를 포함하는 배양액을 추가로 배양시키고(무혈청 배지에서), 이를 선택된 생물분석법으로 시험하였다.
별법으로, 문헌(Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575(1981))에 기재된 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 DNA를 293 세포에 일시적으로 도입시킬 수 있었다. 293 세포를 회전 플라스크에서 최대 밀도가 되도록 배양하고 pRK5-PRO187, pRK5-PRO533, pRK5-PRO214, pRK5-PRO240, pRK5-PRO211, pRK5-PRO230, pRK5-PRO261, pRK5-PRO246 또는 pRK5-PRO317 DNA 700 ㎍을 가하였다. 세포를 우선 원심분리하여 회전 플라스크로부터 농축하고 PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 세포 펠릿 상에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 20% 글리세롤로 90초간 처리하고 조직 배양 배지로 세척한 후, 조직 배양 배지, 5 ㎍/㎖ 소의 인슐린 및 0.1 ㎍/㎖ 소의 트랜스페린을 포함하는 회전 플라스크에 다시넣었다. 약 4일 후에 조건화된 배지를 원심분리하고 여과시켜 세포와 파쇄물을 제거하였다. 발현된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 포함하는 샘플을 농축시키고, 투석 및(또는) 컬럼 크로마토그래피와 같은 선택된 방법으로 정제하였다.
다른 실시양태로, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 CHO 세포에 발현시킬 수 있다. pRK5-PRO187, pRK5-PRO533, pRK5-PRO214, pRK5-PRO240, pRK5-PRO211, pRK5-PRO230, pRK5-PRO261, pRK5-PRO246 또는 pRK5-PRO317 벡터를 공지된 시약, 예를 들어 CaPO4또는 DEAE 덱스트란을 이용하여 CHO 세포에 형질감염시킬 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 세포를 배양하고 배지(만으로) 또는35S-메티오닌과 같은 방사선 표지를 포함하는 배지로 배양액을 교체하였다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 존재를 확인한 후, 배양 배지를 무혈청 배지로 교체하였다. 바람직하게는 6일 가량 배양물을 배양한 후에 조건화된 배지를 회수한다. 발현된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 포함하는 배지를 농축시켜 선택된 방법으로 정제하였다.
또한, 에피토프 태그가 부착된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317은 CHO 숙주세포에서 발현될 수 있다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317은 pRK5 벡터로부터 서브클로닝될 수 있다. 서브클론의 삽입체는 PCR을 통해 폴리-His 태그와 같은 선택된 에피토프 태그를 갖는 형태로 번역 프레임에 맞게 배큘로바이러스 발현 벡터에 융합될 수 있다. 폴리-His 태그가 부착된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 삽입체는 안정한 클론의 선별을 위한 DHFR과 같은 선택 마커를 포함하는 SV40 유도 벡터로 서브클로닝될 수 있다. 최종적으로, CHO 세포는 (상기에서와 같이) SV40 유도 벡터로 형질감염될 수 있다. 발현을 확인하기 위해서 상기와 같은 방법으로 표지시킬 수 있다. 이어서, 폴리-His 태그가 부착되어 발현된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 포함하는 배양 배지를 농축시켜 Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피와 같이 선택된 방법으로 정제할 수 있다. 또한, CHO 및(또는) COS 세포에서도 일시적 발현 과정에 의해 발현시킬 수 있다.
PRO214, PRO240, PRO211, PRO230 및 PRO261을 일시적 및 안정한 발현 과정에 의해 CHO 세포에서 발현시켰다. 또한, PRO246을 CHO 세포에서 일시적으로 발현시켰다.
하기 실험 과정을 이용하여 CHO 세포 내에서 안정하게 발현시켰다. 각 단백질의 가용성 형태의 코딩 서열이 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 구조체 (이뮤노어드헤신)로서 발현 및(또는) 폴리-His 태그가 부착된 형태로 단백질이 발현되었다.
PCR 증폭에 이어 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, Johnn Wiley and Sons(1997))에 기재된 표준 방법을 이용하여각 DNA를 CHO 발현 벡터에 서브클로닝하였다. CHO 발현 벡터는 목적하는 DNA의 5' 및 3'에 적합한 제한 부위를 갖도록 제조되어 cDNA의 제한 부위가 편리하게 셔틀링될 수 있게 된다. CHO 세포에서의 발현에 사용되는 벡터는 문헌(Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9 1774-1779(1996))에 기재된 바와 같으며, 목적하는 cDNA와 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 발현시키기 위해 SV40 초기 프로모터/인핸서를 사용하였다. DHFR 발현으로 형질감염 후에 플라스미드의 안정하게 유지되는 세포를 선별할 수 있다.
시판되는 형질감염 시약인 슈퍼펙트(상표명)(Superfect, Qiagen), 도스퍼(상표명)(Dosper) 또는 퓨진(상표명)(Fugene, Boehringer Mannheim)을 이용하여, 원하는 플라스미드 DNA 12 ㎍을 약 1000만개의 CHO 세포에 도입하였다. 상기 문헌(Lucas et al.)에 기재된 방법에 따라 세포를 배양하였다. 추후에 세포를 배양 및 생산하기 위해 약 3 x 10-7세포를 하기 기재된 방법에 따라 앰플에 동결시켰다.
플라스미드 DNA를 포함하는 앰플을 수조에 넣어 녹인 후 볼텍싱하여 혼합하였다. 배지 10 ㎖를 포함하는 원심분리 튜브에 피펫으로 내용물을 넣고 1000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 흡입 제거하고 세포를 10 ㎖ 선택 배지(0.2 ㎛ 투석 여과된 5% 소의 태 혈청을 포함하는, 0.2 ㎛ 여과지를 통해 여과된 PS20)에 재현탁시켰다. 선택 배지 90 ㎖를 포함하는 100 ㎖ 회전 플라스크에 세포를 분주하였다. 1 내지 2일 후, 선택 배지 150 ㎖로 채워진 250 ㎖ 회전 플라스크로 세포를 옮겨 37℃에서 배양하였다. 2 내지 3일 후에 250 ㎖, 500 ㎖ 및 2000 ㎖ 회전 플라스크에 ㎖당 3 x 105개의 세포를 접종하였다. 세포 배양액을 원심 분리하여 신선한 배지로 교환하고 생산 배지에 재현탁하였다. 임의의 적합한 CHO 배지를 사용할 수 있으나, 미국 특허 제5,122,469호 (1992년 6월 16일)에 기재된 생산 배지를 실제로 사용하였다. 3 L 생산 회전 플라스크에 1.2 x 106세포/㎖가 되도록 접종하였다. 제0일에 세포 수와 pH를 측정하였다. 제1일에 회전 플라스크에서 샘플을 취해 여과된 공기의 살포를 개시하였다. 제2일에 회전 플라스크에서 샘플을 취해 온도를 33℃로 바꾸고 500 g/L-글루코스 30 ㎖ 및 10% 소포제 0.6 ㎖(예를 들어, 35% 폴리디메틸 실록산 유상액, Dow Corning 365 의약 등급 유상액)을 가하였다. 전체 생산기 동안, 필요에 따라 pH를 약 7.2가 유지되도록 조절하였다. 10일 후 또는 생존률이 70% 미만으로 떨어질 즈음 세포 배양액을 원심분리로 회수하고 0.22 ㎛ 필터에 여과시켰다. 여과액을 4℃에 보관하거나 정제용 컬럼에 즉시 로딩하였다.
폴리-His 태그된 구조물의 경우, Ni-NTA 컬럼(Qiagen)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 가하였다. 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes, pH 7.4 완충액으로 평형화된 Ni-NTA 컬럼 6 ㎖에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 조건화된 배지를 주입하였다. 로딩 후에 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을25 ㎖의 G25 슈퍼파인(Pharmacia) 컬럼을 통해 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액(pH 6.8)중으로 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.
조건화된 배지로부터 이뮤노어드헤신(Fc 포함) 구조물을 하기와 같이 정제하였다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.8)으로 평형화된 단백질 A 컬럼(Pharmacia) 5 ㎖에 주입하였다. 로딩 후, 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고 100 mM 시트르산(pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액(pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 폴리-His 태그된 단백질의 경우에 대해 상기 기재된 바와 같이 저장 완충액(pH6.8) 중으로 염을 제거하였다. SDS-PAGE와 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 단백질의 균일함을 확인하였다.
<실시예 15>효모에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 발현
다음 방법은 효모에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 재조합 발현을 기재하고 있다.
우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 세포내 생산 또는 분비를 위한 효모 발현 벡터를 제조하였다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 및 프로모터를 코딩하는 DNA를 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 세포내 발현을 위해 선택된 플라스미드의 적합한 제한 효소 부위에 삽입하였다. 분비의 경우에는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 발현을 위해, ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 신호 펩티드 및 다른 포유동물의 신호 펩티드(예를 들어, 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 신호/리더 서열), 및 링커 서열(필요한 경우)을 코딩하는 DNA와 함께 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 코딩하는 DNA를 선택된 플라스미드에 클로닝할 수 있다.
이어서, 효모 세포, 예를 들어 효모 균주 AB110을 상기 기재된 발현 플라스미드로 형질전환시키고 선택된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질전환된 효모 상층액을 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 분석할 수 있다.
계속해서, 원심분리에 의해 발효 배지로부터 효모 세포를 회수하고 선택된 카트리지 필터를 이용하여 배지를 농축시켜 재조합 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 단리하고 정제할 수 있다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 함유하는 농축액을 선택된 컬럼 크로마토그래피 수지를 이용하여 추가로 정제할 수 있다.
<실시예 16>배큘로바이러스 감염 곤충 세포에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 발현
다음 방법은 배큘로바이러스로 감염된 곤충 세포 내에서의 재조합 발현에 대하여 기재하고 있다.
PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 코딩하는 서열을 배큘로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 상류에 융합시켰다. 이러한 에피토프 태그에는 폴리-His 태그 및 면역글로블린 태그(IgG의 Fc 영역과 같이)가 포함된다. 시판되는 플라스미드, 예를 들어 pVL1393(Novagen)에서 유도된 플라스미드를 포함하는 다양한 플라스미드를 사용할 수 있다. 간략하게, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 코딩하는 서열이나 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 코딩하는 서열의 원하는 부분(예를 들어, 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 세포외 단백질의 경우에 성숙 단백질 코딩하는 서열)을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서, 생성물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다.
리포펙틴(GIBCO-BRL로부터 구입)을 이용하여, 상기 플라스미드 및 배큘로골드 (상표명) (BaculoGold™) 바이러스 DNA (Phamingen)를 스포도프테라 프루기페르다 ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)에 동시 형질감염시켜 재조합 배큘로바이러스를 생성하였다. 28℃에서 4 내지 5일 배양 후에, 방출된 바이러스를 회수하여 이후의 증폭에 사용한다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌(O'Reilley et al., Baculovirus Expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994))에 따라 수행하였다.
이어서, 폴리-His 태그가 부착되어 발현된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317은, 예를 들어 Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피로 하기와 같이 정제될 수 있다. 문헌(Rupert et al., Nature, 362: 175-179(1993))에 따라 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 추출액을 제조한다. 간략하게, Sf9 세포를 세척하여 초음파 처리 완충액 (25 ㎖ Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고 얼음에서 20초간 2회 초음파 처리하였다. 초음파 처리물을 원심분리로 투명하게하고, 상층액을 로딩 완충액(50 mM 인산, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8)에 50배 희석하여 0.45 ㎛ 필터로 여과시켰다. Ni2+-NTA 아가로즈 컬럼(Qiagen으로부터 구입)을 5 ㎖ 충진 부피로 제조하여 물 25 ㎖로 세척하고 로딩 완충액 25 ㎖로 평형화시켰다. 여과된 세포 추출물을 분당 0.5 ㎖로 컬럼에 로딩하였다. 로딩 완충액으로 A280기준선까지 컬럼을 세척하고, 이 시점에서 분획을 회수하기 시작하였다. 다음으로, 2차 세척 완충액(50 mM 인산; 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)으로 컬럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시켰다. A280이 기준선에 다시 도달하면, 컬럼을 2차 세척 완충액 중의 0 내지 500 mM 이미다졸 구배로 전개시켰다. 1 ㎖ 분획을 회수하여 SDS-PAGE 및 은 염색하거나 알카리 포스파타제에 결합된 Ni2+-NTA(Qiagen)로 웨스턴 블롯팅하여 분석하였다. 용출된 His10태그된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을포함하는 분획을 모아 로딩 완충액에 대해 투석하였다.
별법으로, IgG 태그된 (또는 Fc 태그된) PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있다.
배큘로바이러스에 감염된 Sf9 곤충 세포에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 및 PRO317을 발현시켰다. 발현은 실제로 0.5 내지 2 L 규모로 수행되기는 했지만, 더 큰 제조 규모(예를 들어, 8 L)로 용이하게 규모를 키울 수 있다. 이들 단백질은, 단백질의 세포외 영역이 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 구조체 (이뮤노어드헤신)로서 발현 및(또는) 폴리-His 태그가 부착된 형태로 발현되었다.
PCR 증폭 후에, 각각의 코딩 서열을 배큘로바이러스 발현 벡터(IgG 융합 단백질의 경우 pb.PH.IgG, 폴리-His 태그된 단백질의 경우 pb.PH.His.c)에 서브클로닝한 후, 리포펙틴(Gibco BRL)을 이용하여 이 벡터 및 배큘로골드(상표명) 배큘로바이러스 DNA(Pharmingen)를 105 스포도프테라 프루기페르다("Sf9") 세포(ATCC CRL 1711)에 동시 형질감염시켰다. pb.PH.IgG 및 pb.PH.His.c는 상업적으로 시판되는 pVL1393 배큘로바이러스 발현 벡터(Pharmingen)를 His 또는 Fc 태그 영역이 포함되도록 변형시킨 벡터이다. 10% FBS가 포함된 힝크(Hink's) TNM-FH 배지(Hyclone)에서 세포를 배양하였다. 세포를 28℃에서 5일 동안 배양하였다. 상층액을 회수하여, 감염 다중성(MOI)이 약 10이 되도록 10% FBS가 포함된 힝크 TNM-FH 배지에서Sf9 세포를 감염시킴으로써 수행되는 1차 바이러스 증폭에 이를 사용하였다. 세포를 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 상층액을 회수하고, 히스티딘 태그된 단백질의 경우 Ni2+-NTA 비드(QIAGEN) 또는 IgG 태그된 단백질의 경우 단백질-A 세파로스 CL-4B 비드(Pharmacia) 25 ㎖에 상층액 1 ㎖을 배치 결합시킨 후에 쿠마시 블루 염색에 의해 알려진 농도의 단백질 표준과 비교하는 SDS-PAGE 분석에 의해 배큘로바이러스 발현 벡터 내 구조물의 발현을 확인하였다.
1차 바이러스 증폭 상층액을 사용하여, ESF-921 배지(Expression Systems LLC)가 들어있는 회전 플라스크 중의 Sf9 세포 배양액(500 ㎖)을 MOI 약 0.1로 감염시켰다. 세포를 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 상층액을 회수하여 여과하였다. 필요한 경우, 회전 플라스크 배양액의 발현이 확인될 때까지 배치 결합 및 SDS-PAGE 분석을 반복하였다.
형질감염된 세포로부터의 조건화된 배지(0.5 내지 3 L)를 원심분리에 의해 회수하여 세포를 제거한 후, 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-His 태그된 구조물의 경우, Ni2+-NTA 컬럼(Qiagen)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 가하였다. 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes, pH 7.4 완충액으로 평형화된 Ni-NTA 컬럼 6 ㎖에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 조건화된 배지를 주입하였다. 로딩 후에 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25슈퍼파인(Pharmacia) 컬럼을 통해 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액(pH 6.8)중으로 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.
조건화된 배지로부터 이뮤노어드헤신(Fc 포함) 구조물을 하기와 같이 정제하였다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.8)으로 평형화된 단백질 A 컬럼(Pharmacia) 5 ㎖에 주입하였다. 로딩 후, 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고 100 mM 시트르산(pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액(pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 폴리-His 태그된 단백질의 경우에 대해 상기 기재된 바와 같이 저장 완충액(pH6.8) 중으로 염을 제거하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔(PAG) 전기영동과 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석으로 단백질의 균일함을 확인하였다.
별법으로, 하이 5(high 5) 세포에 혼입시키는 변형된 배큘로바이러스 방법을 이용할 수 있다. 이 방법에서는 원하는 서열을 코딩하는 DNA를 Pfu(Stratagene)과 같은 적합한 시스템으로 증폭시키거나, 배큘로바이러스 발현 벡터에 포함된 에피토프 태그의 (5') 상류에 융합시켰다. 이러한 에피토프 태그에는 폴리-His 태그 및 면역글로불린 태그(예를 들어, IgG의 Fc 영역)가 포함된다. pIE1-1(Novagen)과 같이 상업적으로 시판되는 플라스미드에서 유도된 것을 포함하는 다양한 벡터가 사용될 수 있다. pIE1-1및 pIE1-2 벡터는 안정하게 형질전환된 곤충 세포에서 배큘로바이러스 ie1 프로모터로부터 재조합 단백질이 구성적으로 발현되도록 고안된 것이다. 이 플라스미드는 단지 다중 클로닝 부위의 방향만 다르고, 비감염 곤충 세포에서 ie1-매개 유전자 발현에 중요한 것으로 알려진 모든 프로모터 서열 및 hr5 인핸서를 포함하고 있다. pIE1-1및 pIE1-2는 번역 개시 부위를 포함하기 때문에 융합 단백질의 제조에 사용될 수 있다. 간략하게, 원하는 서열 또는 원하는 서열의 부분(예를 들어, 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열)을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 이어서, 생성물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 예를 들어, pIE1-1의 유도체는 원하는 서열의 (3') 하류에 인간 IgG의 Fc 영역(pb.PH.IgG) 또는 8개의 히스티딘(pb.PH.His) 태그를 포함할 수 있다.
하이 5 세포를 CO2, 페니실린 및 스트렙토마이신이 없는 27℃의 조건하에서 50%가 채워지도록 배양하였다. 각각의 150 mm 플레이트에 사용하기 위해, 원하는 서열을 포함하는 pIE 기재의 벡터 30㎍을 Ex-세포 배지(배지: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu, JHR Biosciences #14401-78P, 주의: 이 배지는 빛에 민감함) 1 ㎖과 혼합하고, 별도의 튜브에 셀펙틴(CellFECTIN, Gibco BRL #10362-010) 100㎕를 Ex-세포 배지 1 ㎖과 혼합(볼텍싱으로 혼합)하였다. 상기 2가지 용액을 혼합하여 상온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. Ex-세포 배지 8 ㎖을 DNA와 셀펙틴의 혼합물 2 ㎖에 가하고, 이를 미리 Ex-세포 배지로 1회 세척된 하이 5 세포에 가하였다. 이어서, 플레이트를 어두운 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. DNA와 셀펙틴의 혼합물을 흡입 제거하고, 세포를 Ex-세포 배지로 1회 세척하여 과량의 셀펙틱을 제거한후, 신선한 Ex-세포 배지 30 ㎖을 가하고 세포를 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 상층액을 회수하고, 히스티딘 태그된 단백질의 경우 Ni2+-NTA 비드(QIAGEN) 또는 IgG 태그된 단백질의 경우 단백질-A 세파로스 CL-4B 비드(Pharmacia) 25 ㎖에 상층액 1 ㎖을 배치 결합시킨 후에 쿠마시 블루 염색에 의해 알려진 농도의 단백질 표준과 비교하는 SDS-PAGE 분석에 의해 배큘로바이러스 발현 벡터 내 서열의 발현을 측정하였다.
형질감염된 세포로부터의 조건화된 배지(0.5 내지 3 L)를 원심분리에 의해 회수하여 세포를 제거한 후, 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 폴리-His 태그된 구조물의 경우, Ni2+-NTA 컬럼(Qiagen)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화된 배지에 가하였다. 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes, pH 7.4 완충액으로 평형화된 Ni-NTA 컬럼 6 ㎖에 4℃에서 4 내지 5 ㎖/분의 유속으로 조건화된 배지를 주입하였다. 로딩 후에 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 25 ㎖의 G25 슈퍼파인(Pharmacia) 컬럼을 통해 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유하는 저장 완충액(pH 6.8)중으로 염을 제거하고 -80℃에서 보관하였다.
조건화된 배지로부터 이뮤노어드헤신(Fc 포함) 구조물을 하기와 같이 정제하였다. 조건화된 배지를 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.8)으로 평형화된 단백질 A 컬럼(Pharmacia) 5 ㎖에 주입하였다. 로딩 후, 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고100 mM 시트르산(pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질을 275 ㎕의 1 M Tris 완충액(pH 9)을 포함하는 튜브에 1 ㎖ 분획으로 회수하여 즉시 중화시켰다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 폴리-His 태그된 단백질의 경우에 대해 상기 기재된 바와 같이 저장 완충액 중으로 염을 제거하였다. SDS 폴리아크릴아미드 겔, 에드만 분해법으로 수행되는 N-말단 아미노산 서열 분석, 및 원하거나 필요한 경우 기타 분석 방법으로 단백질의 균일함을 확인하였다.
하이 5 세포를 포함하는 상기 변형된 배큘로바이러스 방법에 의해 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240 및 PRO246을 성공적으로 발현하였다.
<실시예 17>FGF 3에 대한 PRO533의 결합 검증
C-말단 His8 에피토프 단백질을 대조용으로 하여 실시예 16에 기재된 바와 같이, 배큘로바이러스에서 C-말단에 His8 에피토프가 태그된 형태의 PRO533을 발현되었다. FGF 수용체 1 내지 4 및 TIE1 수용체의 세포외 도메인을 Fc 융합 단백질로서 발현시켰다. 결합 완충액(DMEM 배지 + 10mM Hepes pH 7.4 + 0.1% 알부민 + 200 ng/ml 헤파린) 중의 상온에서 4시간 동안 단백질들이 상호작용하도록 방치하였다. 단백질 A 세파로스(Pharmacia)를 가하고(0.1 ㎖), 30분 동안 계속 결합시켰다. 단백질 A 세파로스 비드를 수집하고, 결합 완충액으로 2회 세척하였다. 이어서, 샘플을 환원조건하에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 제조자의 지시에 따라 항-His 항체(Qiagen)로 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다. 그 결과로 FGF 수용체 3(FGFR3-Fc)에 대한 고특이적 결합을 확인할 수 있었다. 대부분의 FGF 리간드가 1 종 이상의 FGF 수용체에 결합하기 때문에 이 결과는 매우 중요하다.
<실시예 18>PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317에 결합하는 항체의 제조
본 실시예는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 제조하는 방법을 예시한다.
모노클로날 항체를 제조하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 상기의 문헌(Goding)에 기재되어 있다. 이용될 수 있는 면역원에는 본 발명의 정제된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 포함하는 융합 단백질, 및 세포 표면에 재조합 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 발현하는 세포가 포함된다. 당업계 숙련자는 불필요한 실험없이도 면역원을 선택할 수 있다.
생쥐, 예를 들어 Balb/c를 프로인트 완전 면역보강제에 유화된 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 면역원 1 내지 100 ㎍을 피하 또는 복강내 주사하여 면역화시켰다. 별법으로, 면역원을 MPL-TDM 면역보강제(Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)에 유화시켜 동물의 뒷발바닥에 주사하여 면역화시켰다. 이어서, 면역화된 생쥐를 10 내지 12일 후에 선택된 면역보강제 내에 유화된 추가의 면역원으로 부스팅하였다. 그 이후, 수주 동안 생쥐를 추가 면역 주사로 부스팅할 수 있다. 역회전 출혈법(retro-orbital bleeding)으로 생쥐에서 혈청 샘플을 주기적으로 채취하여, ELISA 분석법을 시험하여 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체를 검출하였다.
적합한 항체 역가가 검출되면, 항체에 대해 "양성"인 동물에게 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317을 최종 정맥주사하였다. 3 내지 4일 후에 생쥐를 희생시켜 비장 세포를 회수하였다. 이어서, 비장 세포를 선택된 쥐의 골수종 세포주, 예를 들어 ATCC CRL 1597로부터 입수가능한 P3X63AgU.1과 융합시켰다(35% 폴리에틸렌 글리콜 이용). 융합체는 비 융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 포함하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅될 수 있는 하이브리도마 세포를 생성하였다.
하이브리도마 세포를 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317에 대한 반응성을 위한 ELISA로 스크리닝할 수 있다. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 대한 목적하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 결정하는 방법은 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
양성 하이브리도마 세포는 동계의 Balb/c 생쥐가 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 모노클로날 항체를 포함하는 복수를 생산하도록 복강 내에 주사될 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 조직 배양 플라스크 또는 롤러 병에서 배양될 수 있다. 복수 내에서 생성된 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전에 이은 겔 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 별법으로, 항체의 단백질 A 또는 단백질 G 결합을 기초로 하는 친화 크로마토그래피를 이용할 수도 있다.
물질의 기탁:
다음 물질들은 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되었다.
물질 ATCC 기탁번호 기탁일
DNA27864-1155 209375 1997년 10월 16일
DNA49435-1219 209480 1997년 11월 21일
DNA32286-1191 209385 1997년 10월 16일
DNA34387-1138 209260 1997년 9월 16일
DNA32292-1131 209258 1997년 9월 16일
DNA33223-1136 209264 1997년 9월 16일
DNA33473-1176 209391 1997년 10월 17일
DNA35639-1172 209396 1997년 10월 17일
DNA33461-1199 209367 1997년 10월 15일
기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙(부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시(이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 라벨청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙(37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.
본 출원의 양수인은 적합한 조건하에서 배양시 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 이를 통지하면 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
앞서 기술한 명세서는 당업계의 숙련인이 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 기탁된 실시양태가 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 본 발명은 기탁된 구조물의 범위에 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의 구조물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 당업계 숙련자에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.

Claims (48)

  1. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포의 사멸을 유도하는 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포가 동일 조직 타입의 정상 세포에 비해 상기 폴리펩티드를 과발현하는 암 세포인 것인 항체.
  5. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체인 것인 항체.
  6. 제5항에 있어서, 비-인간 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR) 또는 인간 프레임워크 영역(framework region, FR)을 포함하는 항체.
  7. 제1항에 있어서, 표지된 것인 항체.
  8. 제1항에 있어서, 항체 단편 또는 단일쇄 항체인 것인 항체
  9. 제1항의 항체와 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 치료 유효한 양의 상기 항체를 포함하는 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 세포독성제 또는 화학요법제를 더 포함하는 조성물.
  12. 제1항의 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  13. 제12항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  14. 제13항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  15. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 결합하는 항체를 발현시키기에 충분한 조건하에 제14항의 숙주 세포를 배양하고, 세포 배양액으로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 상기 항체의 제조 방법.
  16. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 길항제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 길항제가 종양 세포 성장을 억제하는 것인 길항제.
  18. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 또는 그의 상보체에 혼성화되는 단리된 핵산 분자.
  19. 제18항에 있어서, 상기 혼성화가 엄격한 혼성화 및 세척 조건하에 수행되는 것인 단리된 핵산 분자.
  20. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체에 노출시키고, 상기 샘플에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드에 상기 항체가 결합하는 것을 결정하는 단계를 포함하는, 상기 샘플에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 존재 결정 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 샘플이 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 포함하는 것으로 의심되는 세포를 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 세포가 암 세포인 방법.
  23. (a) 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플 및 (b) 동일한 세포 타입의 공지된 정상 조직 세포의 대조 샘플에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 정도를 검출하는 단계를 포함하며, 대조 샘플보다 상기 시험 샘플에서 발현 정도가 더 높은 것이 시험 조직 세포를 얻은 포유동물에 종양이 존재함을 지시하는 것인, 포유동물에서 종양의 진단 방법.
  24. (a) 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체를 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플과 접촉시키고, (b) 시험 샘플에서 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체와 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드사이의 결합체 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 결합체 형성이 상기 포유동물에서 종양의 존재를 지시하는 것인, 포유동물에서 종양의 진단 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 항체를 검출가능하게 표지하는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 조직 세포의 시험 샘플을 신생물 세포 성장 또는 증식이 있는 것으로 의심되는 환자로부터 얻는 방법.
  27. 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체 및 담체를 적절한 용기중에 포함하는 암 진단용 키트.
  28. 제27항에 있어서, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 샘플에서 상기 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위해 상기 항체의 사용 설명서를 더 포함하는 키트.
  29. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포를 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 물질 유효량에 노출시켜 상기 종양 세포의 성장을 억제하는 단계를 포함하는, 종양 세포의 성장 억제 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 종양 세포가 동일한 조직 타입의 정상 세포에 비해 상기 폴리펩티드를 과발현하는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 물질이 상기 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체가 세포 사멸을 유도하는 것인 방법.
  33. 제29항에 있어서, 상기 종양 세포가 방사선 치료, 세포독성제 또는 화학요법제에 더 노출되는 것인 방법.
  34. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포를 상기 폴리펩티드의 발현을 억제하는 물질 유효량에 노출시켜 상기 종양 세포의 성장을 억제하는 단계를 포함하는, 종양 세포의 성장 억제 방법,
  35. 제34항에 있어서, 상기 종양 세포가 동일한 조직 타입의 정상 세포에 비해 상기 폴리펩티드를 과발현하는 것인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 물질이 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 혼성화되는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보체인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 종양 세포를 방사선 치료, 세포독성제 또는 화학요법제에 더 노출시키는 방법,
  38. 용기;
    용기상의 라벨; 및
    용기내에 함유된 활성제를 포함하는 조성물
    을 포함하며, 상기 조성물은 종양 세포의 성장을 억제하기에 효과적이며, 상기 용기상의 라벨은 동일한 조직 타입의 정상 세포에 비해 상기 종양 세포에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드가 과발현됨을 특징으로 하는 증상의 치료에 효과적임을 지시하는 것인 제품.
  39. 제38항에 있어서, 상기 활성제가 상기 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 생물학적 활성 및(또는) 발현을 억제하는 것인 제품.
  40. 제39항에 있어서, 상기 활성제가 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체인 제품.
  41. 제39항에 있어서, 상기 활성제가 안티센스 올리고뉴클레오티드인 제품.
  42. 후보 화합물을 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드와 상기 두 성분이 상호작용하기에 충분한 조건에서 충분한 시간 동안 접촉시키고, 상기 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 생물학적 또는 면역적 활성이 억제되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 생물학적 또는 면역적 활성을 억제하는 화합물의 확인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 후보 화합물이 항-PRO187, 항-PRO533, 항-PRO214, 항-PRO240, 항-PRO211, 항-PRO230, 항-PRO261, 항-PRO246 또는 항-PRO317 항체인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 후보 화합물 또는 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 고상 지지체상에 고정화하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 비-고정화 성분을 검출가능하게 표지하는 방법.
  46. (a) 세포와 스크리닝할 후보 화합물을 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드 존재하에 상기 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응을 유도하기에 적절한 조건하에 접촉시키고, (b) 시험 화합물이 효과적인 길항제인지의 여부를 결정하기 위해 상기 세포 반응의 유도를 결정하는 단계를 포함하며, 상기 세포 반응이 유도되지 않는 것은 상기 화합물이 효과적인 길항제임을 지시하는 것인 방법.
  47. PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, PRO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드를 발현하는 세포와 후보 화합물을 접촉시키고, 상기 폴리펩티드의 발현이 억제되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 상기 세포에서 PRO187, PRO533, PRO214, PRO240, RO211, PRO230, PRO261, PRO246 또는 PRO317 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물의 확인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 후보 화합물이 안티센스 올리코뉴클레오티드인 방법.
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