MXPA01002545A - Composiciones y metodos para el tratamiento de tumores. - Google Patents

Composiciones y metodos para el tratamiento de tumores.

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Abstract

La invencion concierne a composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento del crecimiento y proliferacion de celulas neoplasticas en mamiferos, incluyendo el humano. La invencion esta basada en la identificacion de genes que son amplificados en el genoma de celulas tumorales. Tal amplificacion genetica se espera que este asociada con la sobre-expresion del producto genetico en comparacion a celulas normales del mismo tipo de tejido y contribuya a la tumorigenesis. Por consiguiente, las proteinas codificadas por los genes amplificados se cree que son objetivos utiles para el diagnostico y/o tratamiento (que incluye prevencion) de ciertos canceres, y puede actuar prediciendo el pronostico de tratamiento tumoral.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA EL TRATAMIENTO DE TDMORBS Campo de la Invención La presente Invención concierne a composiciones y métodos para el diagnóstico y tratamiento de tumores. &n1-f-nprit-nl-es de la T wnr'i fin Los tumores malignos (cánceres) son la segunda causal de muerte en los Estados Unidos, después de las enfermedades del corazón (Boring y colaboradores, CA Cancel J. Clin. 43; 7
[1993]) .
El cáncer se caracteriza por un incremento en el número de células anormales, neoplásticas derivadas de un tejido normal que prolifera para formar una masa tumoral, la invasión de tejidos adyacentes por estas células tumorales neoplásticas, y la generación de células malignas que eventualmente se propagan vía la sangre ó el sistema linfático a nodulos linfáticos regionales y hasta sitios distantes (metástasis) .
En un estado canceroso, una célula prolifera en condiciones en las cuales células normales no podrían REF i 127506 crecer. El cáncer se manifiesta por sí mismo en una amplia variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de invasión y agresividad.
S La alteración de la expresión genética está íntimamente relacionada a un crecimiento y de desdiferenciación celular sin control las cuales son un aspecto común de todos los cánceres. Se ha encontrado que los genomas de ciertas tumores bien estudiados muestran 0 expresión disminuida de los genes recesivos, usualmente mencionados como genes de supresión de tumores, los cuales podrían normalmente funcionar para prevenir el crecimiento de células malignas, y/ó la sobre expresión de ciertos genes dominantes, tales como encógenos, que actúan para S promover el crecimiento maligno. Cada uno de estos cambios genéticos parece ser responsable de alguna manera importante de las características que, en totalidad, representan el fenotipo neoplástico completo (Hunter, Cell 64:1129
[1991] y Bishop, Cell 64:235-248
[1991]).
Un mecanismo bien conocido de sobre-expresión genética en células cancerosas es el de amplificación genética. Este es un proceso en el que se produce, en el cromosoma de células ancestrales, copias múltiples de un gen particular. 5 Este proceso involucra réplicaciones no programadas de la región del cromosoma que comprende el gen, seguido por la recombinación de los segmentos replicados que regresan al interior del cromosoma (Alitab y colaboradores, Adv. Cáncer Res., 47:235-281
[1986]). Se cree que la sobre-expresión de los genes paralelos por amplificación genética, por ejemplo, proporciona el número de copias hechas .
Se han identificado que los proto-encógenos que codifican al factor de crecimiento y a los receptores del factor de crecimiento desempéñan papeles importantes en la patogénesis de varias malignidades humanas, que incluyen cáncer de seno. Por ejemplo, se ha encontrado que el gen ErbB2 humano (erbB2, también conocido como her2, ó c-erbB-2) , codifica al receptor de la glicoproteína transmembrana de 185-kd (pl85HBR:2; HER2) relacionado con el receptor del factor de crecimiento epidérmico EGFR) , es sobre-expresado en aproximadamente 35 % hasta 30 % de los cánceres de seno humanos (Salmón y colaboradores, Science. 235: 177-182
[1987]; Salmón y colaboradores, Science 244: 707-712
[1989]) .
Se ha publicado que la amplificación genética de un proto-oncógeno es un evento típicamente involucrado en las formas más malignas de cáncer, y podría actuar como un predictor de resultados clínicos (Schwab y colaboradores, Genes Chromosomes Cáncer, 1: 181-193
[1990]; Alitalo y colaboradores supra) . Así, la sobre-expresión de erbB2 es comúnmente considerada como una información previa de un pronóstico pobre, especialmente en pacientes con enfermedad primaria que involucra nodos linfáticos axilares (Salmón y colaboradores,
[1987] y
[1989], supra; Ravdinand Channess, Gene, 159; 19-27
[1995]; y Inés y Stern, Biochim, Biophys.Acta, 1198: 165-184
[1994]), y se ha relacionado con la sensibilidad y/ó resistencia a terapia hormonal y regímenes quimioterapéuticos, que incluyen C F (ciclofosfamida, metotrexate, y fluoracil) y antraciclinas (Baselga y colaboradores, Oncology 11 (3 suppl 1) : 43-48
[1997]. Sin embargo, a pesar de la asociación de la sobre-expresión de erbB2 con pronósticos pobres, los irregularidades de pacientes HER2-positivos que responden clínicamente a tratamiento con taxanos fueron superiores a tres veces aquellos de pacientes HER2-negativos (lbid) . Un anticuerpo monoclonal anti-ErbB2 (anti-HER2) humanizado recombinante (una versión humanizada del anticuerpo 4D5 anti-ErbB2 de murina, mencionado como un rhu Ab KER2 ó Herceptin™) ha sido activo clínicamente en pacientes con cánceres de seno metastáticc que sobre-expresa a ErbB2, que habían recibido terapia anticáncer extensiva previa. (Baselga y colaboradores, J. Clin. Oncol . , 14:737-744
[1996].
A la luz de lo anterior, hay interés obvio en identificar nuevos métodos y composiciones que sean útiles para diagnosticar y tratar tumores que están asociados con amplificación genética.
Breve Descripción de la Invención La presente invención concierne a composiciones y métodos para el diagnóstico y tratamiento de crecimiento y proliferación celular neoplástica en mamíferos, incluyendo a los humanos. La presente invención se basa en la identificación de genes que son amplificados en el genoma de células tumorales. Se espera que tal amplificación genética esté asociada con la sobre-expresión del producto genético y contribuya a la tumorigénesis . Por consiguiente, se cree que las proteínas codificadas por los genes amplificados, son objetivos útiles para el diagnóstico y/ó tratamiento (incluyendo prevención) de ciertos cánceres, y pueden actuar como predictores del pronóstico de tratamiento de tumores.
En una modalidad, la presente invención concierne a un anticuerpo aislado que enlaza a un polipéptido designado en la presente como polipéptido P 0187, PR0533, PR0214, P O240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317. En otro aspecto, el anticuerpo induce a la muerte de una célula que ^ expresa al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246, ó PR0317. A menudo, la 5 célula que expresa al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 es una célula tumcral que sobre-expresa al polipéptido en comparación con una célula normal del mismo tipo de tejido. En aún otro aspecto, el anticuerpo es una anticuerpo ^-^ 10 monoclonal, que preferiblemente tiene residuos de regiones determinantes de complementaridad (CDR) no-humanos y residuos de regiones de estructura humanos (FR) . El anticuerpo puede ser marcado y puede ser inmovilizado en un soporte sólido. En otro aspecto, el anticuerpo es un 15 fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de una sola cadena, ó un anticuerpo humanizado que enlaza, preferiblemente ^ específicamente, al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246, ó PR0317. 20 En otra modalidad, la invención concierne a una composición de materias que comprenden un anticuerpo que enlaza, preferiblemente específicamente a un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317, en una mezcla con un vehículo 25 farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la composición de materiales comprende una cantidad efectiva terapéuticamente del anticuerpo. En otro aspecto, la composición comprende un ingrediente activo adicional, que puede, por ejemplo, ser un anticuerpo adicional, ó un agente citotóxico ó quimioterapéutico. Preferiblemente, la composición es estéril.
En una modalidad adicional, la invención concierne a moléculas de ácido nucleico aislados codificadoras de los anticuerpos anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246, ó anti-PR0317, y vectores y células huéspedes recombinantes que comprenden tales moléculas de ácido nucleico.
En aún una modalidad adicional, la invención concierne a un método para producir un anticuerpo anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246, ó anti-PR0317, en la presente el método comprende cultivar una célula huésped transformada con una molécula de ácido nucleico que codifica al anticuerpo en condiciones suficientes para permitir la expresión del anticuerpo, y recuperar el anticuerpo del cultivo celular.
La invención concierne adicionalmente antagonistas de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230# PR0261, PR0246, ó PR031 que inhiba una ó más de las funciones ó actividades biológicas del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317.
En una modalidad adicional, la invención concierne a una molécula de ácido nucleico aislado que hibridiza a una molécula de ácido nucleico codificador de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 ó al complemento del mismo. La molécula de ácido nucleico aislado es preferiblemente DNA y la hibridización preferiblemente tiene lugar en condiciones de hibridización severas y condiciones de lavado. Tales moléculas de ácido nucleico pueden actuar como moléculas antisentido de los genes amplificados identificados en la presente, las cuales, a su vez, pueden encontrar uso en la modulación de la transcripción y/ó translación de los genes amplificados respectivos,, ó como cebadores antisentido en reacciones de amplificación. Además, tales secuencias pueden usarse como parte de un ribosoma y/ó una secuencia helicoidal triple la cual, a su vez, puede usarse en la regulación de los genes amplificados.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para determinar la presencia de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en una muestra sospechosa de contener al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317, en la presente el método comprende exponer la muestra a un anticuerpo anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246, ó anti-PR0317 y determinar el enlace del anticuerpo a un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en la muestra. En otra modalidad, la invención proporciona un método para determinar la presencia de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en una célula, en la presente el método comprende exponer la célula a un anticuerpo anti-PROi87, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246, ó anti-PR0317 y determinar el enlace del anticuerpo a la célula.
En aún otra modalidad, la presente invención concierne a un método de diagnóstico de tumor en mamífero, que comprende detectar el nivel de expresión de un gen codificador de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 (a) en una muestra de prueba de células de tejido obtenidas del mamífero, y (b) en una muestra control de células de tejido normal conocidas del mismo tipo de tejido, en donde un alto nivel de expresión en la muestra de prueba en comparación a la muestra control, es indicador de la presencia de tumor en el mamífero del cual se obtuvo las células de tejido de prueba.
En otra modalidad, la presente invención concierne a un método de diagnóstico de tumor en un mamífero, que comprende, (a) poner en contacto un anticuerpo anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246, ó anti-PR0317 con una muestra de prueba de células de tejido obtenido del mamífero, y (b) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246, ó anti-PR0317 y un polipéptido PR0187, PR0533, PR02I4, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en la muestra de prueba, en donde la formación de un complejo es indicador de la presencia de un tumor en dicho mamífero. La detección puede ser cualitativa ó cuantitativa, y puede efectuarse comparando con el monitoreo de la formación del complejo en una muestra control de células de tejido normal conocido del mismo tipo de células. Una mayor cantidad de complejos formados en la muestra de prueba indican la presencia de tumor en el mamífero del cual se obtuvo las células del tejido de prueba. El anticuerpo preferiblemente lleva un marcador detectable. La formación de complejos 5 puede monitorearse, por ejemplo, por microscopía luminosa, citometría de flujo, fluorometría, u otras técnicas conocidas en la materia.
La muestra de prueba se obtiene usualmente de un individuo sospechoso de tener crecimiento ó proliferación de células neoplásticas (por ejemplo, células cancerosas) .En otra modalidad, la presente invención concierne a un equipo para diagnóstico de cáncer que comprende un anticuerpo anti-PR0187, anti-PR0533, anti- PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PRQ246, ó anti-PR0317 y un vehículo (por ejemplo un regulador) en empaque adecuado. El equipo preferiblemente — contiene instrucciones para usar el anticuerpo para detectar la presencia de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en una muestra sospechosa de contenerlo.
En aún otra modalidad, la invención concierne a un método para inhibir el crecimiento de células tumorales que 25 comprende exponer células tumorales que expresan a' un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 a una cantidad efectiva de un agente que inhibe una actividad biológica y/ó inir.unológica y/ó la expresión de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, FR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317, con las que se inhibe el crecimiento de células tumorales. El agente preferiblemente es un anticuerpo anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240 anti-PR0211, anti-PR0230, anti-PR0261, anti-PR0246, ó anti-PR0317, una molécula orgánica ó inorgánica pequeña, péptido, fosfopéptido, molécula antisentido ó ribozima, ó una molécula helicoidal triple. En un aspecto especifico, el agente, por ejemplo, el anticuerpo PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 induce muerte celular. En un aspecto adicional, las células tumorales se exponen adicionalmente a tratamiento por radiación y/ó a un agente citotóxico ó quimioterapoéutico.
En una modalidad adicional, la invención concierne a un articulo de manufactura, que comprende: un contenedor, una etiqueta sobre el contenedor; y una composición que comprenda un agente activo contenida en el contenedor; en donde la composición es efectiva para inhibir el crecimiento de células tumoraies y la etiqueta sobre el contenedor indica que la composición puede usarse para tratar condiciones caracterizadas por sobre-expresión de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en comparación a una célula normal de del mismo tipo de tejido. En aspectos particulares, el agente activo en la composición es un agente que inhibe una actividad y/ó la expresión de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246, ó PR0317. en aspectos preferidos, el agente activo es un anticuerpo PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 ó un oligonucleótido antisentido.
La invención también proporciona un método para identificar un compuesto que inhibe una actividad de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317, que comprende poner en contacto un compuesto candidato con un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en condiciones y por un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interactúen y determinar si se ha inhibido una actividad biológica ó inmunológica del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317. En un aspecto especifico, ya sea el compuesto candidato ó el polipéptido PR01S7, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 es inmovilizado sobre un soporte sólido. En otro aspecto, el componente no inmovilizado lleva un marcador detectable. En un aspecto preferido, este método comprende las etapas de (a) poner en contacto células y un compuesto candidato para ser cribado en presencia del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en condiciones adecuadas para la inducción de una respuesta celular normalmente inducida por un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246, ó PR0317 y (b) determinar la inducción de dicha respuesta celular para determinar si el compuesto de prueba es un antagonista efectivo.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que inhibe la expresión de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en células que expresan al polipéptido, en la presente el método comprende poner en contacto a las células con un compuesto candidato y determinar si se ha inhibido la expresión del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317. En un aspecto preferido, este método comprende las etapas de (a) poner en contacto células y un compuesto candidato para ser cribado en condiciones adecuadas para permitir la expresión del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 y (b) determinar la inhibición de la expresión de dicho polipéptido.
Breve Descripción de las figuras La figura 1 presenta la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 1) de un cDNA que contiene una secuencia de nucleótidos ccodificadora de una secuencia nativa de PR0187, en donde la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 1) es un clon designado en la presente como DNA27864-1155. También presentadas en caracteres en negrilla y subrayadas están las posiciones de los codones de inicio y de detención respectivos.
La figura 2 presenta a la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 2) de una secuencia nativa del polipéptido PR0187, como derivada de la secuencia codificadora de SEC t? Mr» · i La figura 3 presenta la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 6) de un cDNA que contiene una secuencia de nucleótidos codificadora de la secuencia nativa de PR0533, en la que la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 6 es unción designado en la presente como DNA49435-1219. También presentadas en caracteres en negrilla y subrayadas están las posiciones de los codones de inicio y de terminación respectivos .
La figura 4 presenta a la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 7) de un polipéptido PR0533 de secuencia nativa como derivada de la secuencia codificadora de la SEC ID NO: 6.
La figura 5 presenta a la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 11 de un cDNA que contiene una secuencia de nucleótidos codificadora de PR021 de secuencia nativa, en donde la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 11) es un clon designado en la presente como DNA32286-1191. También presentadas en caracteres en negrillas y subrayadas están las posiciones de los codones de inicio y de terminación respectivos .
La figura 6 presenta a la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 12) de un polipéptido PR0214 de secuencia nativa como derivada de la secuencia codificadora de la SEC ID NO: 11.
La figura 7 presenta a la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 16) de un cDNA que contiene una secuencia de nucleótidos codificadora de PR0240 de secuencia nativa, en donde la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 16) es un clon designado en la presente como DNA34387-1138. También presentadas en caracteres en negrilla y subrayadas están las posiciones de los codones de inicio y de terminación respectivos .
La figura 8 presenta a la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 17) de un polipéptido PRO240 de secuencia nativa como derivada de la secuencia codificadora de la SEC ID NO: 16) .
La figura 9 presenta a la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 21) de un cDNA que contiene una secuencia de nucleótidos codificadora de PR021I de secuencia nativa, en donde la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 21) es un clon designado en la presente como DNA32292-1131. También presentadas en caracteres en negrillas y subryadas están las posiciones de los codones de inicio y de terminación respectivos .
La figura 10 presenta a la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 22) de un polipéptido PR0211 de secuencia nativa como derivado de la secuencia codificadora de la SEC ID NO: 21.
La figura 11 presenta a la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 26) de un cDNA que contiene una secuencia de nucleótidos codificadora de PRO230 de secuencia nativa, en donde la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 26) es un clon designado en la presente como DNA33223-1136. También presentadas en caracteres en negrillas y subrayadas están las posiciones de los codones de inicio y de terminación respectivos .
La figura 12 presenta a la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 27) de un polipéptido PRO230 de secuencia nativa como derivada de la secuencia codificadora de la SEC ID NO: 26.
La figura 13 presenta a la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 31) de un cDNA que contiene a una secuencia de nucleótidos codificadora de PR0261 de secuencia nativa, en donde la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 31) es un clon designado en la presente como DNA33475-1176. También presentadas en caracteres en negrillas y subrayadas están las posiciones de los codones de inicio y de terminación respectivos .
La figura 14 presenta a la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 32) de un polipéptido PR0261 de secuencia nativa como derivado de la secuencia codificadora de la 5EC ID NO: 31) .
La figura 15 presenta a la secuencia de nculeótidos (SEC ID NO: 36) de un cDNA que contiene a una secuencia de nucleótidos codificadora de PR02 6 de secuencia nativa, en donde la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 36) es un clon designado en la presente como DNA35636-1172. También presentadas en caracteres en negrillas y subrayadas están las posiciones de los codones de inicio y de terminación respectivos .
La figura 16 presenta a la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 37) de un polipéptido PR0246 de secuencia nativa como derivada de la secuencia codificadora de la SEC ID NO: 36) .
La figura 17 presenta a la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 41) de un cDNA que contiene una secuencia de nucleótidos codificadora de PR0317 de secuencia nativa, en donde la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 41) es un clon designado en la presente como DNA33461-1199. también presentadas en caracteres en negrillas y subrayadas están las posiciones de los codones de inicio y de terminación correspondientes .
La figura 18 presenta a la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 42) de un polipéptido PR031 de secuencia nativa derivada de la secuencia codificadora de la SEC ID NO: 41.
Las figuras 19 hasta 19D presentan ejemplos hipotéticos para usar los métodos descritos posteriormente para determinar el ¾ de identidad de una secuencia de aminoácidos (figuras 19A-E) y el % de identidad de una secuencia de ácidos nucleicos (Figuras 19C-D) utilizando el programa de cómputo para comparación de secuencias ALIGN-2, en donde "PRO" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 hipotético de interés, "Proteína de comparación" representa a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido contra la cual el polipéptido "PRO" de interés está siendo comparado. "PRO-DNA" representa a una secuencia de ácido nucleico codificadora de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 hipotético de interés, "DNA para comparación" representa a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico contra la cual la molécula de ácido nucleico "P O- DNA" de interés está siendo comparada, "X", WY", y "Z", representan cada una diferentes residuos de aminoácidos ^ hipotéticos y "N", "L" y "V" representan cada una a 5 diferentes nucleótidos hipotéticos.
La figura 20A hasta 20Q proporcionan el código fuente completo para el programa de cómputo para comparación de secuencias ALIGN-2. Este código fuente puede ser ^ 10 rutinariamente compilado para uso enun sistema operativo UNÍS para alimentar al programa de cómputo para alineación de secuencias ALIGN-2.
La figura 21 es un mapa del Cromosoma 8 que presenta 15 la región de mapeo de DNA27864-1115.
La figura 22 es un mapa del Cromosoma 2 que presenta _ la región de mapeo de DNA34387-1138. 20 La figura 23 es un mapa del Cromosoma 1 que presenta la región de mapeo de DNA33223-1136.
Descripción Detallada de la Invención I . Definiciones Las frases "amplificación genética" y duplicación genética se usan indistintamente y se refieren a un proceso por el cual se forman copias múltiples de un gen ó fragmento de gen en una célula ó linea celular particular. La región duplicada (una extensión de DNA amplificada) es a menudo mencionada como un "amplicon". Usualmente, la cantidad del RNA mensajero (mRNA) producido, por ejemplo, el nivel de expresión genética, también aumenta en la proporción del número de copias hechas del gen particular expresado.
"Tumor", como se usa en la presente, se refiere a todo crecimiento y proliferación celular neoplásticos, ya sea maligno ó benigno, y a toda célula ó tejido pre-cancerosos ó cancerosos .
Los términos "cáncer" y "cancerosos" se refiere a ó describe la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cánceres incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de seno, cáncer de la próstata, cáncer de colon, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no-pequeñas, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer colon-rectal, carcinoma endo étrico, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer vúlvico, cáncer de la tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cuello y cabeza.
"Tratamiento" es una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo ó alterar la patología de un transtorno. Por consiguiente, "tratamiento" se refiere a ambos tratamiento terapéutico y medidas profilácticas ó preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen a aquellos ya con el transtorno así como también a aquellos en los cuales se pretende prevenir el trasntorno. En tratamiento de tumor (por ejemplo, cáncer) , un agente terapéutico puede directamente disminuir la patología de las células tu orales, ó volver las células tumorales más susceptibles a tratamiento por otros agentes terapéuticos, por ejemplo, radiación y/ó quimioterapia.
La "patología" del cáncer incluye todo fenómeno que compromete el bienestar del paciente. Esto incluye, sin limitar, crecimiento celular incontrolable, metástasis, interferencia con el funcionamiento normal de células vecinas, liberación de citocinas ó de otros productos de secreción a niveles anormales, supresión ó agravación de respuesta inflamatoria ó inmunológica, etx.
"Mamífero", para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y animales de granja, y de zoológico, deportivos, ó mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, cerdos, ovejas, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano.
"Vehículos" como se usa en la presente incluye vehículos, excipientes, ó estabilizantes, farmacéuticamente aceptables, los cuales son no tóxicos a la célula ó mamífero que es expuesto al mismo en las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el vehículo farmacéuticamente aceptable es una solución acuosa a pK regulado. Ejemplos de vehículos aceptables fisiológicamente incluyen reguladores tales como fosfatos, citratos, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico, ; polipéptidos de bajo peso molecular ( menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, ó inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, aspargina, arginina ó lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, ó dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA alcoholes de azúcar tales como manitol ó sorbitol; iones contrarios formadores de sales tales como sodio; y/ó surfactantes no-iónicos tales como TWEEN™, poletilen glicol (PEG), y PLURONICS™.
La administración "en combinación con" uno ó más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
El término "agente citotóxico" como se usa en la presente se refiere a una substancia que inhibe ó previene la función de las células y/ó causa la destrucción de las células. El término es extensivo a isótopos radioactivos (por ejemplo, I1"", I"5, Y3" y Reíf6), agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas activas enzimáticamente de origen bacteriano, fúngico, de plantas ó-de animales, ó fragmentos de las mismas.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto quimico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen adriamicina, doxorubicina, epirubicina, 5-fluoroacil, ciosina arabinosida ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfan, citoxin, taxoides, por ejemplo, paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncciogy, princeton, NJ) , y doxetaxel (Taxotere, Rhóne-Pculenc Rorer, Anthony, Rnace) , toxotere, metotrexate, cisplatina, melfalan, vinblastina, bleomicina, etoposida, ifosfamida, mitomicin C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatina, teniposida, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomici as, esperamicinas (ver Patente USA No. 4,675,187), 5-FU, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina, actinomicina D, VP-16, clorambucii, melfalan, y otros relacionados con las mostazas nitrogenadas. También incluidos en esta definición están los agentes hormonales que actúan para regular ó inhibir la acción hormonal en tumores tales como tamoxifeno y onapristona.
Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto ó composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente células cancerosas que sobre-expresan a cualquiera de los genes identificados en la presente, ya sea in vitro ó in vivo. Asi, el agente inhibidor del crecimiento es uno que reduce significativamente el porcentaje de células que sobre-expresan a tales genes en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean el progreso del ciclo celular < en un lugar diferente de la fase S) , aquellos agentes que inducen la detención de la fase Gl y la fase M. Bloqueadores de la fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxol, e inhibidores de topo II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposida, y bleomicina. Aquellos agentes que detienen Gl también repercuten en la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de DNA tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexate, 5-fluorouraciio, y ara-C. se puede encontrar información adicional en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn e Israel, eds. Capitulo I, intitulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastics drugs" por Murakami y colaboradores, (WB Saunders; Philadelphia, 1995), especialmente p.13.
"Doxorubicina", es un antibiótico antraciclcina. El nombre químico completo de la doxorubicina es (85-cis) -10[ {3-amino-2, 3, 6-tridesoxi-a-L-Iixo-hexapiranosil) oxi]-7,8,9, 10-tetrahidro-6, 8, ll-trihidroxi-8- (hidroxiacetil) -1-metoxi-5, 12-naftacendiona.
El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa sobre otra célula como mediadores intracelulares . Ejemplos de tales citocinas son las linfocinas, monocinas, y las hormonas polipéptidincas tradicionales. Incluidas entre las citocinas está la hormona del crecimiento tal como la hormona del crecimiento humano, la hormona del crecimiento humano N-metionil, y la hormona del crecimiento bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glicoproteinicas tales como la hormona estimuladora del folículo (FSH) , hormona estimuladora de la tiroides (TSH) , y al hormona luteizante (LK) ; el factor de crecimiento hepático; el factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placéntico; factores a y ß de necrosis de tumor; substancia inhibidora mulleriana; péptido asociado con la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial; integrina; ¦ trombopoietina (TPO) ; factores de crecimiento de nervios tales como NGF-ß; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformante (TGFs) tales como TGF-a y TGF-ß; factor-I y II de crecimiento similar a la insulina; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductivos; interferones tales como interferon -a, -ß, y -?; factores estimulantes de las colonias (CSFs) tales como CSF-macrófago (M-CSF) ; CSF-granulocito-macrofagc (GM-CSF) ; y CSF-granulocito (G-CSF) ; interleucinas (lis) tales como IL-I, IL-Ia, IL-2, IL-3, IL-<3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis de tumor tales como TNF-a ó TNF-ß; y otros factores polipeptidicos que incluyen LIF y ligando en equipo (KL) . Como se usa en la presente, el término citosina incluye proteínas de fuentes naturales ó de cultivos celulares recombinantes y equivalentes activos biológicamente de las citocinas de secuencia nativa.
El término "pro-fármaco", como se usa en esta solicitud se refiere a un precursor ó forma derivada de una substancia activa farmacéuticamente que es menos citotóxica en célula tumorales en comparación con el fármaco genitor y es capaz de ser activada enzimáticamente ó convertida en la forma genitora más activa. Ver por ejemplo, Wil an, "Prodrugs in cáncer Chemotheraphy", Biochemical Society Transaction, 14:375-382, 615 th Meeting, belfast (1986), y Stella y colaboradores, "Prodrugs: A Chemical Approach to targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt y colaboradores, (ed.) pp. 147-267, Humana Press (1985). Los pro-fármacos de esta invención incluyen pero no s elimitan a, pro-fármacos que contienen fosfatos, profármacos que contienen tiofosfatos, pro-fármacos que contienen sulfates, prc-fármacos que contienen péptidos, pro-fármacos modificados con aminoñácidos, pro-fármacos glicosilados, pro-fármacos que contienen ß-lactamas, profármacos que contienen fenoxiacetaminas opcional ente substituidas, ó pro-fármacos que contienen fenilacetamidas opcionalmente substituidas, pro-fármacos que contienen 5-fluorocitocinas y otras 5-fluorouridinas que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivarse de una forma de pro-fármaco para uso en esta invención incluyen pero no se limitan a, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.
Una "cantidad efectiva" de un polipéptido descrito en la presente ó un antagonista del mismo, en referencia a inhibición del crecimiento celular neoplástico, crecimiento de tumor, ó crecimiento de células cancerosas, es una cantidad capaz de inhibir, en alguna extensión, el crecimiento de células objetivo. El término incluye una cantidad capaz de invocar a un efecto citotóxico y/ó citostático, inhibidor de crecimiento, y /ó apoptosis de la células objetivo. Una "cantidad efectiva" de un antagonista del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 para propósitos de inhibir el crecimiento celular neoplástico, crecimiento de tumor ó crecimiento de células cancerosas, puede determinarse empíricamente y de una manera rutinaria.
Una "cantidad efectiva terapéuticamente", en referencia al tratamiento de tumor, se refiere a una cantidad capaz de invocar uno ó más de los siguientes efectos: (1) inhibición, en alguna extensión, de crecimiento de tumor, que incluye disminución gradual y detención del crecimiento completo; (2) reducción del número de células tumorales, (3) reducción del tamaño del tumor; (4) inhibición (por ejemplo, reducción, disminución gradual ó detención completa) de la infiltración de células tumorales en los órganos periféricos; (5) inhibición (por ejemplo, reducción, disminución gradual ó detención completa) de la metástasis; (6) mejoramiento de la respuesta inmune anti-tumor; y/ó (7) puesta en evidencia, en alguna medida, de uno ó más síntomas relacionados con el transtorno. Una "cantidad efectiva terapéuticamente" de un antagonista de polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 para propósitos de tratamiento de tumor puede determinarse empíricamente y de una manera rutinaria.
Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un antagonista de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de una célula especialmente tumor, por ejemplo, célula cancerosa, ya sea n vitro ó in vivo. Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un antagonista de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 para propósitos de inhibir crecimiento celular neoplástico puede determinarse empíricamente y de una manera rutinaria.
Una "cantidad citotóxica" de una antagonista de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 es una cantidad capaz de causar la destrucción de una célula, especialmente de tumor, por ejemplo, célula cancerosa, ya sea in vitro ó in vivo. Una "cantidad citotóxica" de un antagonista de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 para propósitos de inhibir el crecimiento celular neoplástico puede determinarse empíricamente de una manera rutinaria.
Los términos "PR0187", WPR0533", "PR0214", "PRO240", "PR0211", "PRO230", "PR0261", "PR0246", ó "PR0317", "polipéptido PR0187", "polipéptido PR0533", "polipéptido PR0214", "polipéptido PRO240", "polipéptido PR0211", "polipéptido PRO230", "polipéptido PR0261", "polipéptido PR0246", ó "polipéptido PR0317", cuando se usa en la presente abarca a los polipéptidos PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 de secuencia nativa y a las variantes del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 (que son definidos adicionalmente en la presente) . El polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PRQ246, ó PR'0317 puede ser asilado de una variedad de Fuentes, tales como de tipos de tejido humanos ó de otra fuente, ó preparase por métodos sintéticos y/ó recombinantes .
Un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR024.6, ó PR0317 de "secuencia nativa", comprende a un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 derivado de la naturaleza. Tales polipéptidos PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza ó pueden producirse por medios sintéticos ó recombinantes. El término polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 de "secuencia nativa" abarca específicamente a las formas secretadas truncadas como se encuentran naturalmente (por ejemplo, secuencia de región extracelular) , formas variantes como se encuentran naturalmente (por ejemplo, formas unidas alternativamente) y variantes alélicas como se encuentran naturalmente del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317. en ciertas modalidades de la invención, el polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 de secuencia nativa es un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 de secuencia nativa maduro ó de extensión total que comprende a la secuencia de aminoácidos de la figura 2 (SEC ID NO: 2) . Figura 4 {SEC ID NO: 7), figura 6 (SEC ID NO: 12), figura 8 (SEC ID NO: 17), figura 10 (SEC ID NO: 22), figura 12 (SEC ID NO: 27), figura 14 (SEC ID NO: 32), figura 16 (SEC ID NO: 37), ó la figura 18 (SEC ID NO: 42), respectivamente. Los fragmentos de los polipéptidos nativos respectivos en la presente incluyen, pero no se limitan a, variantes del polipéptido de los cuales la secuencia indicadora N-teritiinal ha sido total ó parcialmente eliminada ó reemplazada por otra secuencia, y regiones extracelulares de las secuencias nativas respectivas, a pesar de que tales formas truncadas (secretadas) se encuentren en la naturaleza. Los fragmentos son preferiblemente suficientes en extensión para la producción de un anticuerpo que enlaza específicamente al polipéptido "PRO" nativo correspondiente .
El "polipéptido variante de PR0187" significa un lipéptido activo como se define posteriormente que tiene menos aproximadamente 80 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de (a) residuos 1 ó aproximadamente 23 a 205 del polipéptido PR0187 presentado en la figura 2 (SEC ID NO: 2), (b) X hasta 205 del polipéptido PR0187 presentado en la figura 2 (SEC ID NO: 2), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos de 18 hasta 27 de la figura 2 (SEC ID NO: 2) ó (c)otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 2 (SEC ID NO: 2) .
"Polipéptido variante de PR0533" significa un polipéptido activo como se define posteriormente que tiene al menos 80 ¾, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de (a) residuos 1 ó aproximadamente 23 hasta 216 del polipéptido PR0533, presentado en la figura 4 {SEC ID NO: 7), (b)X a 216 del polipéptido PR0533 presentado en la figura 4 (SEC ID NO: 7), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos de 18 a 27 de la figura 4 (SEC ID NO: 7) ó (c)otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 4 (SEC ID NO: 7) .
"Polipéptido variante de PR0214" significa un polipéptido activo como se define posteriormente que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de (a) residuos 1" ó aproximadamente 30 hasta 420 del polipéptido PR0214 presentado en la figura 6 (SEC ID NO: 12), (b)X hasta 420 del polipéptido PR0214 presentado en la figura 6 (SEC ID NO: 12), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos desde 25 hasta 34 de la figura 6 (SEC ID NO: 12), (c) 1 ó aproximadamente 30 hasta X de la figura 6 (SEC ID NO: 12), en donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido 367 hasta el aminoácido 376 de la figura 6 (SEC ID NO: 12) ó (d)otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 6 (SEC ID NO: 12) .
"Polipéptido variante de PRO240" significa un polipéptido activo como se define posteriormente que tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de (a) residuos 1 ó aproximadamente 31 hasta 229 del polipéptido PRO240 presentado en la figura 8 (SEC ID NO: 17), (b) X a 229 del polipéptido PRO240 presentado en la figura 3 (SEC ID NO: 17), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 26 a 35 de la figura 8 (SEC ID NO: 17), (c) 1 ó aproximadamente 31 hasta X de la figura 8 (SEC ID NO: 17), en donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido 193 hasta el aminoácido 202 de la figura 8 (SEC ID NO: 17) ó (d) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 8 (SEC ID NO: 17) .
"Polipéptido variante de PR0211" significa un polipéptido activo como se define posteriormente que tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de amioácidos con la secuencia de aminoácidos de (a) residuos 1 6 aproximadamente 25 hasta 353 del polipéptido PR0211 presentado en la figura 10 (SEC ID NO: 22), (b)X a 353 del polipéptido PR0211 presentado en la figura 10 {SEC ID NO:22), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 20 a 29 de la figura 10 (SEC ID NO: 22), (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 10 {SEC ID NO: 22) .
"Polipéptido variante de PRO230" significa un polipéptido activo como se define posteriormente que tiene al menos aproximadamente 80 de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de (a) esiduos 1 ó aproximadamente 22 hasta 164 del polipéptido PRO230 presentado en la figura 12 {SEC ID NO: 27), (b)X a 164 del polipéptido PRO230 presentado en la figura 12 (SEC ID NO:27), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 17 a 26 de la figura 12 (SEC ID NO: 27), ó (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 12 (SEC ID NO: 27) .
"Polipéptido variante de PR0261" significa un polipéptido activo como se define posteriormente que tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de (a) residuos 1 ó aproximadamente 24 hasta 250 del polipéptido PR0261 presentado en la figura 14 (SEC ID NO: 32), (b)X a 250 del polipéptido PR0261 presentado en la figura 14 (SEC ID NO: 32), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 19 a 28 de la figura 14 {SEC ID NO: 32), ó (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 14 (SEC ID NO: 32) .
"Polipéptido variante de PR0246" significa un polipéptido activo como se define posteriormente que tiene al menos aproximadamente 80 t de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de (a) residuos 1 ó aproximadamente 30 hasta 390 del polipéptido PR0246 presentado en la figura 16 (SEC ID NO: 37), (b)X a 390 del polipéptido PR0246 presentado en la figura 16 (SEC ID NO: 37), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 25 a 34 de la figura 16 (SEC ID NO: 37), ó (c) 1 ó aproximadamente 30 hasta X de la figura 16 (SEC ID NO: 37), en donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido 242 hasta el aminoácido 251 de la figura 16 (SEC ID NO: 37) ó (d) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 16 (SEC ID NO: 37) .
"Polipéptido variante de PR0317" significa un polipéptido activo como se define posteriormente que tiene al menos aproximadamente 80 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de (a) residuos 1 ó aproximadamente 19 hasta 366 del polipéptido PR0317 presentado en la figura 18 (SEC ID NO: 42), (b)X a 366 del polipéptido PR0317 presentado en la figura 18 (SEC ID NO: 2), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 14 a 23 de la figura 18 (SEC ID NO: 42), ó (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 18 (SEC ID NO: 42) .
Tales polipéptidos variantes de PR0187, PR0533, PR0214, PP.O240, PP.0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 incluyen por ejemplo, polipéptidos PR0187, PR0533, PR0214, PR02 0, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en donde uno ó m'ñas rsíduos de aminoácidos son añadidos, ó eliminados/ en el M— y/ó C— terminus, así como también en una ó más regiones internas, de la secuencia de la figura 2 (SEC ID NO: 2), figura 4 (SEC ID NO: 17), figura 6 (SEC ID NO: 12), figura 8 (SEC ID NO: 17), figura 10 (SEC ID NO: 22), figura 12 (SEC ID NO: 27), figura 14 (SEC ID NO: 32), figura 16 (SEC ID NO: 37), ó figura 18 (SEC ID NO: 42), respectivamente .
Ordinariamente, un polipéptido variante de PR0187 tendrá al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, con (a) residuos 1 ó aproximadamente 23 hasta 205 del polipéptido PR0187 presentado en la figura 2 (SEC ID NO: 2), (b)X hasta 205 del polipéptido PR0187 presentado en la figura 2 (SEC ID NO: 2), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos desde 18 hasta 27 de la figura 2 (SEC ID NO: 2) ó (c)otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 2 (SEC ID NO: 2) .
Ordinariamente, un polipéptido variante de PR0533 tendré al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 * de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 » de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 . de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, con (a) residuos 1 ó aproximadamente 23 hasta 216 del polipéptido PR0533 presentado en la figura 4 (SEC ID NO: 7), (b)X hasta 216 del polipéptido PR0533 presentado en la figura 4 (SEC ID NO: 7), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos desde 18 hasta 27 de la figura 4 (SEC ID NO: 7) ó (c)otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 4 (SEC ID NO: 7) .
Ordinariamente, un polipéptido variante de PR0214 tendrá al menos aproximadamente 80 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 % de identidad de secuencia de aminoácidos/ más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 * de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 V. de identidad de secuencia de aminoácidos, con (a) residuos 1 ó aproximadamente 30 hasta 420 del polipéptidc PR0214 presentado en la figura 6 (SEC ID NO: 12), (b)X hasta 420 del polipéptido PR0214 presentado en la figura 6 (SEC ID NO: 12), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos desde 25 hasta 34 de la figura 6 (SEC ID NO: 12) ó (c) 1 ó aproximadamente 30 hasta X de la figura 6 (SEC ID NO: 12), en donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido 367 hasta el aminoácido 376 de la figura 6 (SEC ID NO: 12) ó (d) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 6 (SEC ID NO: 12) .
Ordinariamente, un polipéptido variante de PRO240 tendrá al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 * de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 * de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 £ de identidad de secuencia de aminoácidos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, con (a) residuos 1 6 31 hasta aproximadamente 229 del polipéptido PRO240 presentado en la figura 8 (SEC ID NO: 17), (b)X hasta 229 del polipéptido P O240 presentado en la figura 8 (SEC ID NO: 17), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos desde 26 hasta 35 de la figura 8 (SEC ID NO: 17) ó (c) 1 ó aproximadamente 31 hasta X de la figura 8 (SEC ID NO: 17), en donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido 193 hasta el aminoácido 202 de la figura 8 (SEC ID NO: 17) ó (d)otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 8 (SEC ID NO: 17) .
Ordinariamente, un polipéptido variante de PR0211 tendrá al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 ?· de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88' ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuenci de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente ai menos aproximadamente 93 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 r- de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 *: de identidad de secuencia de aminoácidos, con (a) residuos 1 ó aproximadamente 25 hasta 353 del polipéptido PR0211 presentado en la figura 10 (SEC ID NO: 22), (b)X hasta 353 del polipéptido PR0211 presentado en la figura 10 (SEC ID NO: 22), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos desde 20 hasta 29 de la figura 10 (SEC ID NO: 22) ó (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 10 (SEC ID NO: 22) .
Ordinariamente, un polipéptido variante de PRO230 tendrá al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 ¦¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 t de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 fc de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 * de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 £ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 ¾ de identidad ^—, de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 de identidad de secuencia de 5 aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 ? de identidad de secuencia de .^ 10 aminoácidos, con (a) residuos 1 ó aproximadamente 22 hasta 164 del polipéptido PRO230 presentado en la figura 12 {SEC ID NO: 27), (b)X hasta 164 del polipéptido PRO230 presentado en la figura 12 (SEC ID NO: 27), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos desde 17 hasta 26 de la 15 figura 12 (SEC ID NO: 27) ó (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada ^ en la figura 12 (SEC ID NO: 27) . V. ^ Ordinariamente, un polipéptido variante de PR0261 20 tendrá al menos aproximadamente 80 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más 25 preferiblemente al menos aproximadamente 83 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 S de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos, con (a) residuos 1 ó aproximadamente 24 hasta 250 del polipéptido PR0261 presentado en la figura 14 (SEC ID NO: 32), (b) X hasta 250 del polipéptido PR0261 presentado en la figura 14 (SEC ID NO: 32), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos desde 19 hasta 28 de la figura 14 (SEC ID NO: 32) ó (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 14 (SEC ID NO: 32) .
Ordinariamente, un polipéptido variante de PR0246 tendrá al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 % de identidad de secuencia de aminoácidos/ más preferiblemente al menos aproximadamente 83 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos/ más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 % de identidad de secuencia de aminoácidos/ más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos, con (a) residuos 1 ó aproximadamente 30 hasta 390 del polipéptido PR0246 presentado en la figura 16 (SEC ID NO: 37), (b)X hasta 390 del polipéptido PR0246 presentado en la figura 16 (SEC ID NO: 37) , en donde X es cualquier residuo de aminoácidos desde 25 hasta 34 de la figura 16 (SEC ID NO: 37) ó (c) 1 ó aproximadamente 30 a X de la figura 16 (SEC ID NO: 37), en donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido 242 nata el aminoácido 251 de la figura 16 (SEC ID NO: 37) ó (d) otro fragmento derivado especificamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 16 (SEC ID NO: 37) .
Ordinariamente, un polipéptido variante de PR0317 tendrá al menos aproximadamente 80 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 ¾ de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos, con (a) residuos 1 ó aproximadamente 19 hasta v ^ 366 del polipéptido PR0317 presentado en la figura 18 (SEC ID NO: 42), (b)X hasta 366 del polipéptido PR0317 presentado en la figura 18 (SEC ID NO: 42), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos desde 14 hasta 23 de la figura 18 (SEC ID NO: 42) ó (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 18 (SEC ID NO: 42) . 25 El polipéptido variante de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 no abarcan a la secuencia nativa del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR03I7. ordinariamente, los polipéptidos variantes de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246, ó PR0317, tienen al menos 10 aminoácidos de extensión, a menudo al menos aproximadamente 20 aminoácidos de extensión, más a menudo al menos aproximadamente 30 aminoácidos de extensión, más a menudo al menos aproximadamente 40 aminoácidos de extensión, más a manudo al menos aproximadamente 50 aminoácidos de extensión, más a a menudo al menos aproximadamente 60 aminoácidos de extensión, más a menudo al menos aproximadamente 70 aminoácidos de extensión, más a a menudo al menos aproximadamente 80 aminoácidos de extensión, más a a menudo al menos aproximadamente 90 aminoácidos de extensión, más a a menudo al menos aproximadamente 100 aminoácidos de extensión, más a menudo al menos aproximadamente 150 aminoácidos de extensión, más a a menudo al menos aproximadamente 200 aminoácidos de extensión, más a a menudo al menos 300 aminoácidos de extensión, ó más.
"Por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoácidos 11 , con respecto a las secuencias del pOlipéptidO PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317 identificadas en la presente se define como el por ciento de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticas a los residuos de aminoácidos en una secuencia de PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 6 PR0317, después de alinear las secuencias y de introducir espacios, si es necesario, para lograr el máximo de por ciento de identidad de secuencias, y sin considerar cualquier substitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación para propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia puede lograrse de varias maneras que están en la experiencia en la materia., por ejemplo, utilizar programas de cómputo disponibles al público tales como los programas BLAST, BLAST-2 , ALIGN, ALIGN-2 ó Megalign (DNASTA ) . Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre las secuencias de extensión total que son comparadas. Para propósitos de la presente, no obstante, los valores del % de identidad de secuencias de aminoácidos se obtienen como se describe posteriormente por utilización de el programa de cómputo para comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el código de la fuente completa para el programa ALIGN-2 se proporciona en las figuras 20'-Q. Genentech, Inc tiene los derechos de autor del programa de cómputo para comparación de secuencias ALIGN-2, y el código fuente presentado en las figuras 20A-Q se registró con documentación de usuario en 5 la Oficina de Derechos de Autor de los USA, en Washington, D.C., 20559 en donde se registró bajo el No. de Registro de Derechos de Autor TXU10087. El programa ALIGN-2 está disponible al público a través de Genentecch, Inc., South San Francisco, California ó puede compilarse del código ^ 10 fuente proporcionado en las figuras 20A-Q. El programa ALIGN-2 podría compilarse para uso en un sistema operativo UNÍS, preferiblemente UNÍS V4.0D. digital. Todos los parámetros para comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían. 15 Para propósitos de la presente, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A a, con, ó contra una secuencia de amxnoáidos dada B (que puede alternativamente parafraseadaa como una 20 secuencia de aminoácidos A que tiene ó comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos a , con ó contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue: 25 100 veces la fracción X/Y en donde X es el numero de residuos de aminoácidos registrados como parejas idénticas por el programa ALIGN-2 para alineación de secuencias en esa alineación de A y B del programa, y en donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se notará que cuando la extensión de la secuencia de aminoácidos ? no es igual a la extensión de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencias de A a B no será igual al por ciento de identidad de secuencia de B a A. Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencias de aminoácidos, las figuras 19a-B demuestran como calcular el % de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos designada ""Proteína de comparación" a la secuencia de aminoácidos designada PRO" ' .
A menos que específicamente se establezca de otra manera, todos los valores de % de identidad de secuencias usados en la presente se obtienen utilizando el programa de cómputo para comparación de secuencias ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad de secuencias de aminoácidos puede determinarse también utilizando el programa para comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Alschul y colaboradores, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)). El programa para comparación de secuencias NCBI-BLAST2 puede bajarse desde http: //WWW. ncbi .nlm.nih.gov. NCBI-BLAST2 usa varios parámetros de búsqueda, en donde, todos los parámetros de búsqueda son fijados para los valores faltantes que incluyen, por ejemplo, despeje=si, 5 filamento=todo, ocurrencias esperadas=10, extensión de baja complejidad minima=15/5, valor-e de paso mültiple=0.01, contante para paso-múltiple=25, eliminación de los espacios en la alineación final=25 y matriz de registro=BLOSUM62. 10 En situaciones en las que NCBI-BLAST2 se emplea para comparación de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencias de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada a, con ó contra una secuencia de amionoácidos B dada (que pueden alternativamente ser 15 parafraseadas como una secuencia de aminoácidos ? dada que tiene ó comprende un cierto % de identidad de secuencia a, con ó contra una secuencia de aminoácidos B dada) se r ^ ^ calcula como sigue: 20 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácidos registrados como parejas idénticas por el programa para alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en la alineación de A y B del programa, y en donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se notará que cuando la extensión de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la extensión de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A.
Además, la identidad de secuencia de aminoácidos puede también determinarse utilizando el programa de cómpuro WU-BLAST-2 (Altscchul y colaboradores, Methods in Enzymology, 266: 60-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST-2 son puestos en los valores faltantes, los valores faltantes que no son puestos, por ejemplo, parámetros ajustables, son colocados con los siguientes valores: abertura en exceso = 1, fracción excedente = 0.125, señal crítica (T) = 11, y matriz de registro = BLOSUM62. para propósito de la presente, un valor de % de identidad de secuencia de aminoácidos se determina por división de (a) el número de residuos de aminoácidos idénticos emparejados entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés que tiene una secuencia derivada del polipéptido PRO nativo y la secuencia de aminoácidos de comparación de interés (por ejemplo, la secuencia contra la cual el polipéptido PRO de interés está siendo comparado la cual puede ser un polipéptido variante de PRO) como se determinó por ü- BLAST-2 entre (b)el número total de residuos de r aminoácidos del polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en ... la declaración "un polipéptido que comprende una secuencia 5 de aminoácidos A la cual tuvo ó que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos B", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia de aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del 10 polipéptido PRO de interés.
"Polinucleótido variante de PR0187" ó "secuencia de ácido nucleico variante de PR0187", significa una molécula de ácido nucleico codificador de un polipéptido PR0187 15 activo como se define posteriormente y la cual tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con ya sea (a) una secuencia de ácidos ^ nucleicos que codifica a los residuos 1 ó aproximadamente 23 hasta 205 del polipéptido PR0187 presentado en la figura 20 2 (SEC ID N0:2), (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica a los aminoácidos X hasta 205 del polipéptido PRO 187 presentado en la figura 2 (SEC ID NO: 2) , en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 18 hasta 27 de la figura 2 (SEC ID NO: 2) ó (c) una secuencia de ácidos 25 nucleicos codificadora de otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 2 (SEC ID NO: 2) . Ordinariamente, un polinucleótido variante de PR0187 tendrá al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferibleme te al menos aproximadamente 83 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 ¾ de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, con ya sea (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica a los residuos 1 ó aproximadamente 23 hasta 205 del polipéptido PR0187 presentado en la figura 2 (SEC ID NO: 2), (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica a los aminoácidos X hasta 205 del polipéptido PR0187 presentado en la figura 2 (SEC ID NO: 2), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 18 hasta 27 de la figura 2 (SEC ID NO: 2) , ó (c) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica a otro fragmento específicamente derivado de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 2 (SEC ID NO: 2) . Las variantes del polinucleótido PR0187 no abarcan a la secuencia de nucleótidos PR0187 nativa.
"Polinucleótido variante de PR0533" ó "secuencia de ácido nucleico variante de PR0533", significa una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido PR0533 activo como se define posteriormente y la cual tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con ya sea (a) residuos 1 ó aproximadamente 23 hasta 216 del polipéptido PR0533 presentado en la figura 4 (SEC ID NO: 7), (b) X hasta 216 del polipéptido PR0533 presentado en la figura 4 (SEC ID NO: 7), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 18 hasta 24 de la figura 4 (SEC ID NO: 7) ó (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 4 (SEC ID NO: 7) . Ordinariamente, un polinucleótido variante de PR0533 tendrá al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 S de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, con ya sea (a) residuos 1 ó aproximadamente 23 hasta 216 del polipéptido PR0533 presentado en la figura 4 (SEC ID NO: 7), (b) X hasta 216 del polipéptido PR0533 presentado en la figura 4 (SEC ID NO: 7),· en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 18 hasta 27 de la figura 4 (SEC ID NO: 7), ó (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 4 (SEC ID NO: 7) . Las variantes del polinucleótido PR0533 no abarcan a la secuencia de nucleótidos PR0533 nativa.
"Polinucleótido variante de PR0214" ó "secuencia de ácido nucleico variante de PR0214", significa una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido PR0214 activo como se define posteriormente y la cual tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con ya sea (a) residuos 1 ó aproximadamente 30 hasta 420 del polipéptido PR0214 presentado en la figura 6 (SEC ID NO: 12), (b) X hasta 420 del polipéptido PR0214 presentado en la figura 6 (SEC ID NO: 12), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 25 hasta 34 de la figura 6 (SEC ID NO: 12) ó (c) 1 ó aproximadamente 30 hasta X de la figura 6 (SEC ID NO: 12), en donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido 367 hasta el aminoácido 376 de la figura 6 (SEC ID NO: 12), ó (d) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 6 (SEC ID NO: 12) . Ordinariamente, un polinucleótido variante de PR0214 tendré al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, con ya sea (a) residuos 1 ó aproximadamente 30 hasta 420 del polipéptido PR0214 presentado en la figura 6 (SEC ID NO: 12), (b) X hasta 420 del polipéptido PR0214 presentado en la figura 6 (SEC ID NO: 12), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 25 hasta 34 de la figura 6 (SEC ID NO: 12), (c) 1 ó aproximadamente 30 hasta X de la figura 6 (SEC ID NO: 12) , en donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido 367 hasta el aminoácido 376 de la figura 6 (SEC ID NO: 12) ó (d) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 6 (SEC ID NO: 12) . Las variantes del polinucleótido PR0214 no abarcan a la secuencia de nucleótidos PR0214 nativa.
"Polinucleótido variante de PRO240" ó "secuencia de ácido nucleico variante de PRO240", significa una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido PRO240 activo como se define posteriormente y la cual tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con ya sea (a) residuos 1 ó aproximadamente 31 hasta 229 del polipéptido PRO240 presentado en la figura 8 (SEC ID NO: 17), (b) X hasta 229 del polipéptido PRO240 presentado en la figura 8 (SEC ID NO: 17), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 26 hasta 35 de la figura 8 (SEC ID NO: 17) ó (c) 1 ó aproximadamente 31 hasta X de la figura 8 (SEC ID NO: 17), en donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido 193 hasta el aminoácido 202 de la figura 8 (SEC ID NO: 17), ó (d) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 8 (SEC ID NO: 17) . Ordinariamente, un polinucleótido variante de PRO240 tendrá al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 ¾ de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, con ya sea (a) residuos 1 f N 6 aproximadamente 31 hasta 229 del polipéptido PRO240 presentado en la figura 8 (SEC ID NO: 17), (b) X hasta 229 5 del polipéptido PRO240 presentado en la figura 8 (SEC ID NO: 17) , en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 26 hasta 35 de la figura 8 {SEC ID NO: 17), (c) 1 ó aproximadamente 31 hasta X de la figura 8 (SEC ID NO: 17), en donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido 193 ^ 10 hasta el aminoácido 202 de la figura 8 (SEC ID NO: 17) ó (d) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 8 (SEC ID NO: 17) . Las variantes del polinucleótido PRO240 no abarcan a la secuencia de nucleótidos PRO240 nativa . 15 "Polinucleótido variante de PR0211" ó "secuencia de ^ ácido nucleico variante de PR0211", significa una molécula ^ de ácido nucleico que codifica a un polipéptido PR0211 activo como se define posteriormente y la cual tiene al 20 menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con ya sea (a) residuos 1 ó aproximadamente 25 hasta 353 del polipéptido PR0211 presentado en la figura 10 (SEC ID NO:22), (b) X hasta 353 del polipéptido PR0211 presentado eh la figura 10 (SEC ID 25 NO: 22), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 20 hasta 29 de la figura 10 (SEC ID NO: 22) ó (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 10 (SEC ID NO: 22) . Ordinariamente, un polinucleótido variante de PR0211 tendrá al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 ¾ de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 ¾ de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, con ya sea (a) residuos 1 6 aproximadamente 25 hasta 353 del polipéptido PR0211 presentado en la figura 10 (SEC ID NO: 22), (b) X hasta 353 del polipéptido PR0211 presentado en la figura 10 (SEC ID NO: 22), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 20 hasta 29 de la figura 10 (SEC ID NO: 22), ó (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 10 (SEC ID NO: 22) . Las variantes del polinucleótido PR0211 no abarcan a la secuencia de nucleótidos PR0211 nativa.
"Polinucleótido variante de PRO230" ó "secuencia de ácido nucleico variante de PRO230", significa una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido PRO230 activo como se define posteriormente y la cual tiene al menos aproximadamente 80 ¾ de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con ya sea (a) residuos 1 ó aproximadamente 22 hasta 164 del polipéptido PRO230 presentado en la figura 12 (SEC ID NO:27), (b) X hasta 164 del polipéptido PRO230 presentado en la figura 12 (SEC ID NO: 27) , en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 17 hasta 26 de la figura 12 (SEC ID NO: 27) ó (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 12 (SEC ID NO: 27) . Ordinariamente, un polinucleótido variante de PRO230 tendrá al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, con ya sea (a) residuos 1 ó aproximadamente 22 hasta 164 del polipéptido PRO230 presentado en la figura 12 (SEC ID NO: 27), (b) X hasta 164 del polipéptido PRO230 presentado en la figura 12 (SEC ID NO: 27), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 17 hasta 26 de la figura 12 (SEC ID NO: 27), ó (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 12 (SEC ID NO: 27) . Las variantes del polinucleótido PRO230 no abarcan a la secuencia de nucleótidos PRO230 nativa.
"Polinucleótido variante de PR0261" ó "secuencia de ácido nucleico variante de PR0261", significa una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido PR0261 activo como se define posteriormente y la cual tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con ya sea (a) residuos 1 ó aproximadamente 24 hasta 250 del polipéptido PR0261 presentado en la figura 14 (SEC ID NO: 32), (b) X hasta 250 del polipéptido PR0261 presentado en la figura 14 (SEC ID NO: 32), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 19 hasta 28 de la figura 14 (SEC ID NO: 32) ó (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 14 (SEC ID NO: 32) . Ordinariamente, un polinucleótido variante de PR0261 tendrá al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83 S de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 ¾ de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente ai menos aproximadamente 96 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 ¾ de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 ¾ de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, con ya sea (a) residuos 1 ó aproximadamente 24 hasta 250 del polipéptido PR0261 presentado en la figura 14 (SEC ID NO: 32), (b) X hasta 250 del polipéptido PR0261 presentado en la figura 14 (SEC ID NO: 32), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 19 hasta 28 de la figura 14 (SEC ID NO: 32), (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 14 (SEC ID NO: 32) . Las variantes del polinucleótido PR0261 no abarcan a la secuencia de nucleótidos PR0261 nativa.
"Polinucleótido variante de PR0246" ó "secuencia de ácido nucleico variante de PR0246", significa una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido PR0246 activo como se define posteriormente y la cual tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con ya sea (a) residuos 1 ó aproximadamente 30 hasta 390 del polipéptido PR0246 presentado en la figura 16 (SEC ID NO:37), (b) X hasta 390 del polipéptido PR0246 presentado en la figura 16 (SEC ID NO: 37), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 25 hasta 34 de la figura 16 (SEC ID NO: 37} 6 (c) 1 ó aproximadamente 30 hasta X de la figura 16 (SEC ID NO: 37), en donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido 242 hasta el aminoácido 251 de la figura 16 (SEC ID NO: 37), ó (d) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 16 (SEC ID NO: 37) . Ordinariamente, un polinucleótido variante de PR0246 tendrá al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, con ya sea (a) residuos 1 ó aproximadamente 30 hasta 390 del polipéptido PR0246 presentado en la figura 16 (SEC ID NO: 37), (b) X hasta 390 del polipéptido PR0246 presentado en la figura 16 (SEC ID NO: 37), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 25 hasta 34 de la figura 16 (SEC ID NO: 37), (c) 1 ó aproximadamente 30 hasta X de la figura 16 (SEC ID NO: 37), en donde X es cualquier aminoácido desde el aminoácido 242 hasta el aminoácido 251 de la figura 16 (SEC ID NO: 37) ó (d) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 16 (SEC ID NO: 37) . Las variantes del polinucleótido PR02 6 no abarcan a la secuencia de nucleótidos PR0246 nativa.
"Polinucleótido variante de PR0317" 6 "secuencia de ácido nucleico variante de PR0317", significa una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido PR0317 activo como se define posteriormente y la cual tiene al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con ya sea (a) residuos 1 ó aproximadamente 19 hasta 366 del polipéptido PR0317 presentado en la figura 18 (SEC ID NO:42), (b) X hasta 366 del polipéptido PR0317 presentado en la figura 18 (SEC ID NO: 42), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 14 hasta 23 de la figura 18 (SEC ID NO: 42) ó (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 18 (SEC ID NO: 42) . Ordinariamente, un polinucleótido variante de PR0317 tendrá al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 81 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 82 ¾ de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 83 ¾ de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 84 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 86 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 87 S de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 88 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 89 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 91 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 93 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 94 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 96 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 97 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, con ya sea (a) residuos 1 ó aproximadamente 19 hasta 366 del polipéptido PR0317 presentado en la figura 18 (SEC ID NO: 42), (b) X hasta 366 del polipéptido PR0317 presentado en la figura 18 (SEC ID NO: 42), en donde X es cualquier residuo de aminoácido desde 14 hasta 23 de la figura 18 [SEC ID NO: 42), (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 18 (SEC ID NO: 42) . Las variantes del polinucleótido PR0317 no abarcan a la secuencia de nucleótidos PR0317 nativa.
Ordinariamente, los polinucleótidos variantes de PR0187, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, y PR0317 son de aproximadamente 30 nucleótidos de extensión, a menudo al menos de aproximadamente 60 nucleótidos de extensión, más a menudo al menos de aproximadamente 90 nucleótidos de extensión, más a menudo al menos de aproximadamente 120 nucleótidos de extensión, más a menudo al menos de aproximadamente 150 nucleótidos de extensión, más a menudo al menos de aproximadamente 180 nucleótidos de extensión, más a menudo al menos de aproximadamente 210 nucleótidos de extensión, más a menudo al menos de aproximadamente 240 nucleótidos de extensión, más a menudo al menos de aproximadamente 270 nucleótidos de extensión, más a menudo al menos de aproximadamente 300 nucleótidos de extensión, más a menudo al menos de aproximadamente 450 nucleótidos de extensión, más a menudo al menos de aproximadamente 600 nucleótidos de extensión, más a menudo al menos de aproximadamente 900 nucleótidos de extensión, ó más.
""Por ciento (%) de identidad de secuencias de ácidos nucleicos 11 , con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 identificadas en la presente se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos en una secuencia de ácidos nucleicos que codifica al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317, después de alinear las secuencias y de introducir espacios, si es necesario, para lograr el máximo de por ciento de identidad de secuencias. La alineación para propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia de ácidos nucleicos puede lograrse de varias maneras que están en la experiencia en la materia., por ejemplo, utilizar programas de computo disponibles al público tales como los programas BLAST, BLAST-2 , ALIGN, ALIGN-2 6 Megalign (DNASTAR) . Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre las secuencias de extensión total que son comparadas. Para propósitos de la presente, no obstante, los valores del % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos se obtienen como se describe posteriormente por utilización del programa de cómputo para comparación de secuencias ALIGN-2, en el que el código de la fuente completa para el programa ALIGN-2 se proporciona en las figuras 20A-Q. El programa de cómputo para comparación de secuencias ALIGN-2 fue autoreado por Genentech, Inc., y el código fuente presentado en las figuras 20A-Q se registró con documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los USA, en Washington, D.C., 20559 en donde se registró bajo el No. de Registro de Derechos de Autor TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público a través de Genentecch, Inc., South San Francisco, California ó puede compilarse del código fuente proporcionado en las figuras 20a -Q. El programa ALIGN-2 podría compilarse para uso en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX V4.0D. digital. Todos los parámetros para comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.
Para propósitos de la presente, el % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos dada C a, con, ó contra una secuencia de ácidos nucleicos dada D (que puede alternativamente parafraseadaa como una secuencia de ácidos nucleicos C que tiene ó comprende un cierto % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos a , con ó contra una secuencia de ácidos nucleicos dada D) se calcula como sigue: 100 veces la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótidos registrados como parejas idénticas por el programa ALIGN-2 para alineación de secuencias en esa alineación de C y O del programa, y en donde Z es el número total de residuos de aminoácidos en D. Se notará que cuando la extensión de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la extensión de la secuencia de ácidos nucleicos O, el % de identidad de secuencias de C a D no será igual al por ciento de identidad de secuencia de D a C. Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos, las figuras 19C-D demuestran como calcular el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos designada ""DNA de comparación" a la secuencia de ácidos nucleicos designada "PRO-DNA".
A menos que específicamente se establezca de otra manera, todos los valores de % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos usados en la presente se obtienen utilizando el programa de cómputo para comparación de secuencias ALIGN-2/ anteriormente descrito. Sin embargo, el % de identidad de secuencias de ácidos nucleicos puede determinarse también utilizando el programa para comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Alschul y colaboradores, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)). El programa para comparación de secuencias NCBI-BLAST2 puede bajarse desde http: //WWW .ncbi .nlm.nih. gov. NCBI-BLAST2 usa varios parámetros de búsqueda, en donde, todos los parámetros de búsqueda son fijados para los valores faltantes que incluyen, por ejemplo, despeje=si, filamento=todo, ocurrencias esperadas=10, extensión de baja complejidad mínima=15/5, valor-e de paso múltiple=0.01, contante para paso-múltiple=25, eliminación de los espacios en la alineación final=25 y matriz de registro=BLOSUM62.
En situaciones en las que NCBI-BLAST2 se emplea para comparación de secuencias de ácidos nucleicos, el ¾ de identidad de secuencias de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos C dada a, con ó contra una secuencia de ácidos nucleicos D dada (que pueden alternativamente ser parafraseadas como una secuencia de ácidos nucleicos C dada que tiene ó comprende un cierto ¾ de identidad de secuencia a, con ó contra una secuencia de ácidos nucleicos D dada) se calcula como sigue: 100 veces la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótidos registrados como parejas idénticas por el programa para alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en la alineación de C y d del programa, y en donde Z es el número total de nucleótidos en O. Se notará que cuando la extensión de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la extensión de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de C a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de D a C.
Además, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos puede también determinarse utilizando el programa de cómputo WU-BLAST-2 (Altschul y colaboradores, Methods in Enzymology,, 266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST-2 son puestos en los valores faltantes. Los valores faltantes que no son puestos, por ejemplo, parámetros ajustables, son colocados con los siguientes valores: abertura en exceso = 1, fracción excedente = 0.125, señal critica (T) = 11, y matriz de registro = BL0SUM62. Para propósito de la presente, un valor de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos se determina por división de (a) el número de nucleótidos idénticos emparejados entre la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de ácidos nucleicos que codifica al polipéptido PRO de interés que tiene una secuencia derivada del ácido nucleico que codifica al polipéptido PRO de secuencia nativa y la molécula de ácido nucleico de comparación de interés (por ejemplo, la secuencia contra la cual la molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido PRO de interés que es comparada la cual puede ser un polinucleótido PRO variante) como se determinó por WU-BLAST-2 entre (b)el número total de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido PRO de interés. Por ejemplo, en la declaración "una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos A la cual tuvo ó que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la secuencia de ácidos nucleicos B", la secuencia de ácidos nucleicos A es la molécula de ácido nucleico de comparación de interés y la secuencia de ácidos nucleicos B es la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido PRO de interés.
En otra modalidad los polinucleótidos variantes de PR0187,. PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 o PR0317 son moléculas de ácido nucleico que codifican a un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 o PR0317 activo y que son capaces de hibridizar preferiblemente en condiciones de hirbridización y condiciones de lavado severas, a secuencias de nucleótidos que codifican al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317 de extensión total presentado en la figura 2 (SEC ID NO: 2), figura 4 (SEC ID NO: 7), figura 6 (SEC ID NO: 12) , figura 8 (SEC ID NO: 17), figura 10 (SEC ID NO: 22), figura 12 (SEC ID NO: 27), figura 14 (SEC ID NO: 32), figura 16 (SEC ID NO: 37), ó figura 18 (SEC ID NO: 42), respectivamente. Los polipéptidos variantes de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317, pueden ser aquellos que son codificados por un polinucleótido variante de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317.
El término "positivas", en el contexto de comparaciones de identidad de secuencias de aminoácidos efectuadas como se describió anteriormente, incluye residuos de aminoácidos en las secuencias comparadas que no son solamente idénticas, sino aquellas que tienen propiedades similares.» Los residuos de aminoácidos que calificaron un valor positivo con un residuos de aminoácidos de interés son aquellos que son ya sea idénticos al residuo de aminoácido de interés ó son una substitución preferida (como se define en la Tabla 1 posterior), del residuo de aminoácido de interés.
Para propósito de la presente, el ¾ de valores positivos de una secuencia de aminoácidas dada A a, con ó contra una secuencia -de aminoácidos dada B (que puede alternativamente ser parafraseada como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene ó comprende un cierto S de positivos a, con, ó contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácidos que calificaron un valor positivo, como se definió anteriormente por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2, en esa alineación de A y B del programa, y en donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se notará que cuando la extensión de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la extensión de la secuencia de aminoácidos B, el % de positivos de A a B no será igual al % de positivos de E a A.
"Aislado", cuando se usa para describir varios polipéptidos descritos en la presente, significa el polipéptido que ha sido identificado y separado y/ó recuperado desde un componente de su ambiente natural . Preferiblemente, el polipéptido asilado está libre de asociaciones con todos los componentes con los cuales está asociado naturalmente. Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían típicamente con los usos para diagnóstico ó terapéuticos del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos ó no-protei'náceos. En modalidades preferidas, el polipéptido será purificado (Da un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencias de aminoácidos internas ó N-terminales por uso de un secuenciador de platillo giratorio, ó (2) homogeneizar por SDS-PAGE en condiciones reductores ó no-reductoras utilizando Azul de Coomassie ó, preferiblemente coloración con plateado. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ en células recombinantes, puesto que al menos un componente del ambiente natural de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317 no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el polipéptido asilado se preparará por al menos una etapa de purificación.
Una molécula de ácido nucleico "aislado" que codifica a un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 ó un ácido nucleico "aislado" que codifica a un anticuerpo anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240# anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246 ó anti-PR0317, es una molécula que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual esta ordinariamente asociada en la fuente natural del ácido nucleico que codifica a PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 6 al ácido nucleico que codifica a anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR02 6 ó anti-PR0317. Preferiblemente, el ácido nucleico aislado está libre de asociación con todos los componentes con los cuales está naturalmente asociados. Una molécula de ácido nucleico que codifica a PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 ó PR0317 aislado ó una molécula de ácido nucleico que codifica a anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246 ó anti-PR0317 es diferente en la forma 6 colocación en la cual se encuentra en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas por consiguiente son distintas a las moléculas de ácido nucleico que codifican a PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 ó a las moléculas de ácido nucleico que codifican a anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246 ó anti-PR0317 como existen en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 ó a un anticuerpo anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211 anti-PRO230, anti-PR0261# anti-PR0246 6 anti-PR0317 incluye moléculas de ácido nucleico-PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 y moléculas de ácido nucleico que codifican a anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246 ó anti-PR0317 contenidas en células que ordinariamente expresan a los polipéptidos PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó que expresan a anticuerpos anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211# anti-PRO230, anti-PR0261# anti-PR0246 ó anti-PR0317 en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico esté en una localización cromosómica diferente de la de las células naturales.
El término "secuencias control" se refiere a secuencias de DNA necesarias para la expresión de una secuencia codificadora operablemente fijada e un organismo huésped particular. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de enlace de ribosoma. Las células eucarióticas son conocidas para utilizar promotores, indicadores de poliadenilación, y mejoradores.
El ácido nucleico está "operablemente unido" cuando es colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, DNA para una presecuencia ó líder secretora es operablemente unido a DNA para un polipéptido si es expresado como una preproteina que participa en la secreción del polipéptido: un promotor ó me orador está operablemente unido a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia; ó un sitio de enlace de ribosoma está operablemente unido a una secuencia codificadora si está colocado de modo que facilite la translación. Generalmente, "operablemente unido", significa que la secuencia de DNA que esta unida es contigua, y, en el caso de una líder secretora, contigua y en fase de lectura. Sin embargo, las mejoradoras no tienen que ser contiguas. La unión se logra por ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan los adaptadores ó unidores de oligonucleótidos sintéticos de conformidad con la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre, por ejemplo, a anticuerpos monoclonales anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246 ó anti-PR0317 solos (incluyendo agonistas antagonistas y anticuerpos neutralizantes), las composiciones de anticuerpos anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246 ó anti-PR0317 con especificidad poliepitópica, los anticuerpos anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246 ó anti-PR0317 de un solo filamento y los fragmentos de los anticuerpos anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246 ó anti-PR0317 (ver a continuación) . El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que tienen lugar naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores .
La "Severidad" de reacciones de hibridización es fácilmente determinable por un experto en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la extensión de la sonda, temperatura de lavado, y concentración de sales. En general, sondas más largas requieren temperaturas más altas para fortalecimiento apropiado, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridización generalmente depende de la capacidad del DNA desnaturalizado para re-fortalecer cuando están presentes filamentos complementarios en un ambiente inferior a su temperatura de fusión. El grado más alto de homología deseado entre la sonda y la secuencia hibridizable, la temperatura relativa más alta que puede usarse. Como un resultado, se concluye que temperaturas relativas más altas tenderían a hacer las condiciones de reacción más severas, mientras que temperaturas más bajas las hacen menos. Para detalles y explicaciones adicionales de severidad de las reacciones de hibridización, ver, Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) .
Las "condiciones severas" ó "condiciones de lata severidad", como se definen en la presente, pueden ser identificadas como aquellas que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura de lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M/ citrato de sodio 0.0015 M / dodecil sulfato de sodio al 0.1 % a 50 °C; (2) emplean durante la hibridización un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50 % v/v con 0.1 % de albúmina de suero bovino / Ficoll al 0.1 %/ polivinilpirrolidona al 0.1 %/ 50 mM de regulador de fosfato de sodio a pH 6.5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM de citrato de sodio a 42 °C; ó (3) emplean formamida al 50 %, 5 X SSC (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M) , 50 mM de fosfato de sodio (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1 %, 5 X solución de Denhardt, DNA de esperma de salmón sonicado (50 g ml), SDS al 0.1 %, y sulfato de dextrano al 10 % a 42 °C, con lavados a 42 °C eri =.2 X SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50 % a 55 °C, seguido por un lavado de alta severidad que consiste de 0.1 X SSC que contiene EDTA a 55 °C.
"Condiciones moderadamente severas", pueden ser identificadas como describe Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual/ New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluye el uso de solución de lavar y condiciones de hibridización (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y * de SDS) menos severas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente severas es incubación toda la noche a 37 °C en una solución que comprende formamida al 20 , 5 x SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10 %, y 20 mg/ml de DNA esperma de salmón desnaturalizada sonicada, seguido por lavar los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 35-50 °C. El experto en la materia reconocerá como ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. Como sea necesario para acomodar los factores tales como longitud de sonda y los similares.
El término "epitope tagueado" cuando se usa en la presente se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR02 6 ó PR0317 fusionado a un "polipéptido tag". El "polipéptido tag" tiene suficientes residuos para proporcionar un epitope contra el cual se pueda elaborar un anticuerpo, aún si es suficientemente corto de modo que no interfiera con la actividad del polipéptido al cual está fusionado. El polipéptido tag preferiblemente también es bastante único de modo que el anticuerpo no reacciona cruzadamente con otros epitopes . Los polipéptidos tag adecuados tienen al menos seis residuos de aminoácidos y usualmente entre aproximadamente ocho y 50 residuos de aminoácidos (preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácidos) .
"Activo" ó "actividad", para ios propósitos de la presente se refiere a formas de los polipéptidos PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 que retienen una actividad/propiedad biológica y/ó inmunológica de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 nativo ó como se encuentra naturalmente, en donde actividad "biológica", se refiere a una función (ya sea inhibidora ó estimuladora) causada por un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 nativo ó como se encuentra naturalmente, de otra manera que la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epitope antigénico poseída por un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 ó PR0317 nativo ó como se encuentra naturalmente, y una actividad "inmunológica se refiere a la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epitope antigénico poseído por un polipéptido PR0187, PR0533, ^ PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 ^ nativo ó como se encuentra naturalmente. 5 "Actividad biológica", en el contexto de un anticuerpo u otra molécula antagonista puede identificarse por medio de los ensayos de cribado descritas en la presente (por ejemplo, una molécula pequeña inorgánica u orgánica, ^ 10 péptido, etc.) se usa para referirse a la capacidad de tales moléculas para enlazar ó formar complejos con el polipéptido codificado por los genes amplificados identificados en la presente, ó que de otro modo, interfieren con la transcripción ó translación de un 15 polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317. Una actividad biológica preferida es inhibir el crecimiento de una célula tumoral objetivo. Otra actividad biológica preferida es la actividad citotóxica que dá como resultado la muerte de la célula 20 tumoral objetivo.
El término "actividad biológica", en el contexto de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317, significa la. capacidad de un 25 polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR02 6 ó PR0317 para inducir el crecimiento de crecimiento celular neoplástico ó crecimiento celular sin control .
La frase "actividad inmunológica", significa reactividad inmunológica cruzada con al menos un epitope de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR031 .
"Reactividad inmunológica cruzada", como se usa en la presente significa que el polipéptido candidato es capaz de inhibir comparativamente la actividad biológica cualitativa de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 que tiene esta actividad con antisuero policlonal aumentado contra el polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 activo conocido. Tales antisueros se preparan al estilo convencional inyectando cabras ó conejos, por ejemplo, subcutáneamente con el análogo activo conocido en adyuvante de Freunds completo, seguido por inyección de refuerzo intraperitoneal ó subcutánea en adyuvante de Freunds incompleto. La reactividad inmunológica cruzada preferiblemente es "específica", lo cual significa que la afinidad de enlace de la molécula reactiva cruzadamente inmunológicamente )por ejemplo, anticuerpo) identificada, al polipéptido PR01S7, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 correspondiente es significativamente superior (preferiblemente al menos aproximadamente dos veces, más preferiblemente al menos aproximadamente cuatro veces, igualmente más preferiblemente al menos aproximadamente ocho veces, más preferiblemente al menos diez veces superior) que la afinidad de enlace de esa molécula aq cualquier otro polipéptido nativo conocido.
El término "antagonista" se usa, en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que parcial ó totalmente bloquea, inhibe, ó neutraliza una actividad biológica de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 nativo descrito en la presente ó la transcripción ó translación del mimso. Moléculas antagonistas adecuadas específicamente incluyen anticuerpos ó fragmentos de anticuerpos, fragmentos, péptidos, moléculas orgánicas pequeñas, ácidos nucleicos anti-sentido, etc. Antagonistas. Se incluyen los métodos para idenificar antagonistas de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, . PR0230, PR0261, PR0246 ó PR0317 con una molécula antagonista candidata y medir un cambio detectable en una ó más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido PR01B7, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317.
Una "molécula pequeña" se define en la presente por tener un peso molecular inferior a aproximadamente 500 daltones. wA ticuerpos", (Abs) e "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteinas que tienen las mismas características estructurales . Mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de enlace a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen ambos anticuerpos y otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de actividad antigénica. Los polipéptidos de la clase posterior son por ejemplo, producidos en niveles bajos por el sistema linfático y en niveles incrementados por mielomas. El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre, sin limitación, a anticuerpos monoclonales intactos,, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos bi-específieos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos tan largos que exhiben la actividad biológica deseada.
"Anticuerpos nativos" e "inmunoglobulinas nativas", son usualmente glicoproteinas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltones, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas, y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada por una unión ó puente disulfuro covalente, mientras que el número de uniones disulfuro varia entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas . Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro entre cadenas espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo una región variable (VH) seguida por un número de regiones constantes. Cada cadena ligera tiene una región variable en un extremo (VL) y una región constante en cu otro extremo; la región constante de la cadena ligera está alineada con la primera región constante de la cadena pesada, y la región variable de la cadena ligera está alineada con la región variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interface entre las regiones variables de cadena ligera y pesada .
El término ^variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de las regiones variables difieren extensivamente en secuencia entre los anticuerpos y se usan en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular para su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida equitativamente a través de las regiones variables de los anticuerpos. Esta concentrada en tres segmentos llamados regiones determinantes de complementaridad (CDRs) ó regiones hipervariables ambas en las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de las regiones variables de llaman la estructura (FR) . Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera nativas cada una comprende cuatro regiones FR, que adoptan ampliamente una configuración ß-laminar, conectada por tres CDRs, que forman bucles de conexión, y en algunos casos que forman parte de, la estructura ß-laminar. La CDRs en cada cadena están retenidas juntas en proximidad estrecha por las regiones FR y, con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace antigénico de los anticuerpos (ver Kabat y colaboradores, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. 1, páginas 647-669 (1991)}. Las regiones constantes no están involucradas directamente en el enlace de un anticuerpo a un antigeno, pero exhibe varias funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo.
El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables del enlace antigénico. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos desde una "región determinante de complementaridad" hasta CDR" (por ejemplo, los residuos 24-34 (LI), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la región variable de cadena ligera y 31-35 (HI), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la región variable de cadena pesada; Kabat y colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th. Ed. Public Health Service, national Institute of Health, Bethesda, MD, [(1991)] y/ó aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, residuos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en la región variable de cadena ligera y 26-32 (HI) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en la región variable de cadena pesada; Clothia y Lesk, J. Mol. Biol.., 196-901-917 [(1987)]. Residuos de "estructura" ó "FR", son aquellos residuos de región variable diferentes a los residuos de región hipervariable que se definen en la presente.
"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacta, preferiblemente el enlace antigénico ó región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab' , F(ab'), y Fv; dianticuerpos, anticuerpos lineales (Zapata y colaboradores, protein Eng. 8 (10): 1057-1062
[1995]); moléculas de anticuerpo de una sola cadena y anticuerpos multiespecificos formados de fragmentos de anticuerpos.
La digestión de la papaina de los anticuerpos produce dos fragmentos con enlace antigénico idéntico, llamados fragmentos wFab", cada uno con un sitio de enlace antigénico único, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab' )- que tiene dos sitios de combinación antigénica y es aún capaz de enlace antigénico cruzado.
MFv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de enlace y de reconocimiento antigénico completo. Esta región consiste de un dímero ó de una región de cadena pesada y un de cadena ligera en firme, asociación no-covalente. En esta configuración en la que las tres CDRs de cada región variable interactúan para definir un sitio de enlace antigénico sobre la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis CDRs confieren especificidad de enlace antigénico al anticuerpo. .Sin embargo, igualmente una región variable única (ó la mitad de un Fv que comprende solamente tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocimiento y enlace antigénico. aunque con una afinidad inferior que el sitio de enlace completo .
El fragmento Fab también contiene la región constante de la cadena ligera y la primera región constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de unos cuantos residuos en el terminus carboxi de la región de cadena pesada CK1 que incluye una ó más cisteinas de la región eje del anticuerpo. Fab'-SH es la designada en la presente por Fab' en la cual los residuos de cisteina de las regiones constantes sostienen a un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')¿ originalmente se produjeron como pares de los fragmentos Fab' que tienen cisteinas ejes entre ellos. También se conocen, otros acoplantes químicos de los fragmentos de anticuerpo.
Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden ser asignadas a uno ó dos tipos claramente distinguidos, llamados kappa (k) y lambda (?) , basados en las secuencias de aminoácidos de sus regiones constantes.
Dependiendo, en la secuencia de aminoácidos de la región constante de su cadena pesada, las inmunoglobulinas pueden ser asignadas a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e Ig , y varias de éstas pueden ser adicionaime te divididas en sub-clases (isotipos), por ejemplo, IgGl/ IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, d, e, ?, y µ respectivamente. Las estructuras de las subunidades y configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, por ejemplo anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que tienen lugar naturalmente que pueden estar presentes en menores cantidades. Los anicuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpor convencionales (policlonales) que típicamente incluyen anticuepos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son convenientes porque son sintetizados por el cultivo del hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. El"monoclonal" modificador indica el carácter del anticuerpo que es obtenido desde una población substancialmente homogénea de anticuerpos, y no se construye como lo requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para usarse de conformidad con la presente invención pueden elaborarse por el método del hibridoma primeramente descrito por Kohler y colaboradores, Nature, 256:495
[1975], ó pueden elaborarse por métodos de D A recombinante (ver, por ejemplo, Patente USA No. 4,816567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden también aislarse de acervos de anticuerpos de fagos utilizando las técnicas descritas en Claxon y colaboradores, Nature 352 : 624-628
[1991] y Marks y colaboradores, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales de la presente incluyen anticuerpos ""quiméricos" (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de las cadenas pesada y/ó ligera es idéntica con u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie en particular ó que pertenecen a un clase ó subclase de anticuerpo particular, mientras que el remanente de las cadenas es idéntica con u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies 6 que pertenecen a otra clase ó subclase de anticuerpo, así como también a fragmentos de tales anticuerpos, mientras que exhiben la actividad biológica deseada {Patente USA No. 4,816,567; Morrison y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855
[1984]) .
Las formas ""humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murina) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas ó fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab1, F(ab'}a u otras subsecuencias de anticuerpos con enlace antigénico ) que contiene la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no-humana. En s anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en las cuales residuos de una CDR del recipiente son reemplazados por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tales como ratón, rata ó conejo que tenga la especificidad, afinidad, y capacidad deseada. En algunos casos, residuos FR Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los residuos no-humanos correspondientes. Además, losa nticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo recipiente ni en la secuencia de FR ó CDR importadas. Estas modificaciones se hacen para refinar y maximizar adicionalmente el comportamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todas de al menos una, y típicamente dos, regiones variables, en las cuales toda ó substancialmente todas de las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no-humana y toda ó substancialmente todas de las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver, Jones y colaboradores. Nature. 321: 522-525 (1986) ; Reichmann y colaboradores, Nature, 332-323-329
[1986]; y Presta, Curr . Op . Struct . Biol ... 2:593-596 (1992). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo PRI ATIZED™ en el cual la región de enlace antigénico del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido por inmunización de monos macaco con el antígeno de interés.
Fragmentos de anticuerpo ""sFv' ' ó "*Fv de cadena única" comprenden las regiones VH y VL del anticuerpo, en el que estas regiones están presentes ena cadena de polipéptido única. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende adicionalmente un polipéptido de unión entre las regiones V„ y vt que facilita la sFV para formar la estructiura deseada para enlace antigénico. Para una revisión de sFv ver Plubcktun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer El término ^dianticuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de enlace antigénico, dichos fragmentos comprenden una región variable de caena pesada (VH) conectada a una región variable de cadena ligera (Vb) en la misma cadena polipeptídica (?,,- ^) . Por utilización de una unión que es tan corta para permitir en emparejamiento entre las dos regiones sobre la misma cadena, las regiones son forzadas a emparejaar con las regiones complementarias de otra cadena y crear dos sitios de enlace antigénico. Los dianticuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404,097; wo 93/11161; y Hollinger y colaboradores, Proc . Nati . Acad . Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).
Un anticuerpo ""aislado" en uno que se ha identificado y separado y/ó recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con los usos en diagnóstico y terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos ó no-proteináceos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más de 95 % en peso - „ del anticuerpo como se determinó por ell método de Lowry, y ^ más preferiblemente más de 99 % en peso,, (2)hasta un grado 5 suficiente poara obtener al menos 15 residuos de secuencias de aminoácidos internas ó N-terminales por uso del secuenciador de platillo giratorio, ó (3)hasta homogeneidad por SDS- Coomassie ó, preferiblemente manchado con plata. El ^ 10 anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en células recombinantes puesto que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación. 15 La palabra "marcador" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto ó composición detectable que está conjugada directa ó indirectamente al anticuerpo de manera de generar un anticuerpo ""marcado" . El marcador 20 puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos ó marcadores fluorescentes) ó, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar alteraciones químicas de un compuesto ó composición substrato que es detectable. Los adionucluros que pueden servir como 25 marcadores detectables incluyen por ejemplo, 1-131, 1-123, 1-125, Y-90, Re-188, R2-186, At-211, Cu-67, Bi-212, y Pd- 109.
Por "fase sólida", se quiere decir una matriz no- S acuosa en la cual el anticuerpo de la presente invención puede adherirse. Ejemplos de fases sólidas abarcadas en la presente incluyen aquellas formadas parcial ó totalmente de vidrio (por ejemplo, vidrio poroso controlado) , polisacáridos, (por ejemplo, afarosa) , poliarilamidas, 10 poliestireno, alcohol polivinílicco y siliconas. En ciertas modalidades, que dependen del contexto, la fase sólida puede comprender el pocilio de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, columna de cromatografía por afinidad) . Este término también 1S incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como las descritas en la Patente USA No. 4,275,149. ^ Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de 20 varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/ó surfactantes los cuales son útiles para la liberación de un fármaco (tal como un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 ó anticuerpo del mismo y, opcional ente, un agente quimioterapéutico) en un mamífero. 25 Los componentes del liposoma están comúnmente dispuestos en una formación bicapa, similar a la disposición lipídica de las membranas biológicas.
Como se usa en la presente, el término ""inmunoadhesina11 designa moléculas similares a anticuerpo que combinan la especificidad de enlace de una proteína heteróloga (una ""adhesina11 ) con la función efectora de las regiones constantes de inmunoglobulina . Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de enlace deseada la cual es diferente del sitio de enlace y de reconocimiento antigénico de un anticuerpo (por ejemplo, es ""heteróloga"), y una secuencia de región constante de inmunoglobulina.. La parte adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de enlace de un receptor ó un ligando. La secuencia de región constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obetenrse de cualquier inmunoglobulina tales como, los subtipos IfG-1, IgG-2, IgG-3, ó IgG-4, IgA (que incluye IgA-1 e IgA-2) , IgE, IgD ó IgM.
II.Composiciones v Métodos de la Invención A. olipéptidos PR0187. PR0533. PR0214. PRO240. PR0211. PRO230. PR0261. PR0246 v PR0317 de extensión total La presente invención proporciona secuencias de 5 nucíeótidos aisladas e identificadas que codifican a polipéptidos mencionados en la presente solicitud como polipéptidos PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 y PR0317. en particular el cDNA que codifica a los polipéptidos PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, 0 PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317 se ha identificado y asilado, como se describe en detalles adicionales en los Ejemplos siguientes. Se observa que las proteínas producidas enrondas de expresión separadas pueden dar diferentes números de PRO pero el número ONQ es único para S cualquier DNA dado y la proteína codificada, y no se cambiará.
Sin embargo, para efectos de simplicidad, en la presente especificación las proteína codificadas por las 0 secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente así como también todos las homólogas y variantes nativas incluidas en la definición precedente de PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 se mencionarán como "PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, P O230, PR0261, PR0246 6 PR0317 " , a pesar de su origen 6 modo de preparación.
Como se describe en los ejemplos siguentes, clones de cD A se han depositado con el ATCC. La secuencia de nucleótidos de los clones actual puede determinarse fácilmente por los expertos en la materia por secuenciacion de los clones depositados utilizando métodos de rutina en la especialidad. Las secuencias de aminoácidos predichas pueden determinarse desde las secuencias de nucleótidos utilizando lo conocido de rutina. Para los polipéptidos PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 y los ácidos nucleicos codificadores descritos en la presente, los solicitantes han identificado que se cree que es la mejor estructuras de lectura identi icable con la información de la secuencia disponible actualmente .
B. Variantes de PR0187. PR0533. PR0214. PRO240. PR0211. PRQ230. PR0261. PR0246 y PR0317 Además de los polipéptidos PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 y PR0317 de secuencia nativa de extensión total descritos en la presente, se contempla que se pueden preparar variantes de PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 y PR0317. Las variantes de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR023D, PR0261, PR0246 y PR0317 pueden prepararse por introducción de cambios en los nucleótidos apropiados en el DNA de PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317, y/Ó por síntesis del polpéptido PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 deseado. Los expertos en la materia notarán que los cambios en los aminoácidos puede alterar el proceso post-translacional de PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317, tal como cambiar el número ó posición de los sitios de glicosilación ó alterar las características de anclaje de la membrana.
Las variaciones en PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317 de secuencia nativa de extensión total ó en varias regiones del PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 descrito en la presente, pueden hacerse, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y guías para mutaciones conservadoras y no-conservadoras expuestas, por ejemplo en la Patente USA No. 5,364,934. las variaciones pueden se por substitución, eliminación ó inserción de uno ó más codones que codifican al PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 que dan como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos del PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 en comparación con el PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317 de secuencia nativa. Opcionalmente la variación e spor substitución de al menos un aminoácido con otro aminoácido en una ó más regiones del PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317. Las guías en determinar cual residuo de aminoácido puede insertarse, substituirse ó eliminarse sin afectar adversamente la actividad deseada pueden encontrarse por comparación de la secuencia del PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 con las de moléculas de el número de cambios en secuencias de aminoácidos hechos en regiones de alta homología. Las substituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/ó químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina con una serina, por ejemplo, reemplazo conservador de aminoácidos. Las inserciones ó eliminaciones pueden opcionalmente estar en el rango de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse por inserciones, eliminaciones ó substituciones de aminoácidos hechas sintéticamente en la secuencia y verificando las variantes resultantes por actividad exhibida por la secuencia nativa madura 6 de extensión total .
Los fragmentos del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317 son proporcionados en la presente. Tales fragmentos pueden estar truncados en el N-terminus ó C-terminus, ó pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, en comparación con una proteína antiva de extensióntotal . Ciertos fragmentos carecec de residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 Ó PR0317.
LOS fragmentos de PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 pueden prepararse por alguna de numerosas técnicas convencionales. Los fragmentos péptidos deseados pueden ser químicamente sintetizados. Un procedimiento alternativo involucra generar fragmentos de PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 por digestión enzimática, por ejemplo, por tratamiento de la proteína con una enzima conocida para división de proteínas en sitios definidos por residuos de aminoácidos particulares, ó por digerir el DNA con enzimas de restricción adecuadas y aislamiento del fragmento deseado. Aún otra técnica involucra técnicas de aislamiento y amplificación de un fragmento de DNA que codifica a un fragmento de polipéptido deseado, por reacción en caena de la polimerasa ) PCR) . Los oligonucleótidos que definen el termini deseado de fragmento de DNA son empleados en los cebadores en 51 y 31 en la PCR. Preferiblemente, los fragmentos del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 con acción de al menos una ctividad biológica y/ó inmunológica con el polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 ó PR0317 nativo.
En modalidades particulares, substituciones conservadoras de interés se presentan en la Tabla l bajo el encabezado de substituciones preferidas. Si tales substituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces más cambios substanciales, denominados substituciones ejemplares en la Tabla, ó como se describe adicionalmente a continuación en referencia a clases de aminoácidos, son introducidas y los productos cribado.
Tabla 1 Residuo Substituciones Substituciones Original Ejemplares Preferidas Ala (A) val; leu;ile val Arg (R) lys;gln;asn lys Asn (N) gln;his; lys; arg gln Asp (D) glu glu Cys © ser ser Gln (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg lie (I) leu; al;met;ala;phe; Norleucina leu Leu (L) norleucina;ile;val Met; ala;phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu;phe;ile leu Phe (F) leu;val; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr;phe tyr Tabla 1 (continuación) Residuo Substituciones Substituciones Original Ejemplares Preferidas Tyr (Y) trp; he; thr; ser phe Val (V) le; leu; met; phe; Ala;norleucina leu Se logran modificaciones substanciales en función de identidad inmunológica del polipéptido, por selección de las substituciones que difieren significativamente en su efecto sobre mantener (a) la estructura del polipéptido principal en el área de la substitución, por ejemplo, como una conformación laminar ó helicoidal, (b) la carga ó hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, ó (c)la densidad de la cadena lateral. Residuos que se encuentran naturalmente se dividen en grupos en base a propiedades comunes de la cadena lateral; (1) hidrofóbicos :norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofilicos neutrales; cys, ser, thr; (3) ácidos :asp, glu; (4) básicosrasn, gln# his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la caden :gly# pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Substituciones no-conservadoras ocasionaran intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Tales residuos substituidos también pueden introducirse en los sitios de substitución conservadores ó, más preferiblemente, en los sitios restantes (no conserados) .
Pueden hacerse variaciones utilizando métodos conocidos en la amteria tales como mutagénesis mediada (en sitio dirigido) por oligonucleótido, exploración de alanina, y mutagénesis por PCR. La mutagénesis en sitio dirigiddo [Cárter y colaboradores, Nucí. Acids. Res. 13: 4331 (1986); Zoller y colaboradores. Nucí. Acids. Res., 10:6487 (1987)], mutagénesis en cartucho [Wells y colaboradores, Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis por técnicas conocidas pueden efectuarse sobre los DNA clonados para producir el DNA de las variantes de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317.
Se puede también emplear el análisis de aminoácidos por exploración para identificar uno ó más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de exploración preferidos están los aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina, y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de exploración preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más lejos del carbón beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. La alanina es también típicamente preferida porque es el aminoácido más común. Adicinalmente, se encuentra frecuentemente en ambas posiciones enmascarado y expuesto [Creighton, The Proteins . (W. H. Freeman & Co. N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol.. 150: 1 (1976)). Si la substitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variantes, puede usarse un aminoácido isotérico.
C. Modificaciones de PR0187. PR0533. PR0214. PRO240. PR0211. PR0230. PR0261. PR0246 v PR0317 Se incluyen en el alcance de esta invención, modificaciones covalentes de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 y PR0317. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos de aminoácidos objetivos de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 Ó PR0317 con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas ó con los residuos N- ó C-terminales de PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317. La derivación con agentes funcionales es útil, por ejemplo, para reticular PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 en una matriz ó superficie de soporte insoluole en agua por uso del método para purificar anticuerpos anti-PROi87, anti-PR0533, anti-PR02i4, anti-PR0240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246 6 anti-PR03i7, y vice-versa. Agentes reticulantes comúnmente usados incluyen, por ejemplo, lrl-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, que incluyen ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) , maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-l, 8-ocatno y agentes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen desamidación de los residuos glutaminilo y asparaginilo a los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos serilo y treonilo, metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina, y histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, w. H. Freeman & Co., San Francisco, pp 79-86 81983)], acetilación de la amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal .
Otro tipo de modificación covalente del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 incluida en el alcance de esta invención comprende alterar los patrones e glicosilación nativos del polipéptido. "Alterar los patrones de glicosilación nativos", es utilizado para propósitos de la presente para significar eliminar uno ó más porciones carbohidratos encontradas en PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 de secuencia nativa (ya sea por remoción de los sitios de glicosilación subrayados ó por supresión de la glicosilación por medios químicos y/ó enzimáticos) , y/ó adición de uno ó más sitios de glicosilación que no están presentes en PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 Ó PR0317 de secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, que involucran un cambio en la naturaleza y proporciones de las varias porciones de carbohidratos presentes.
La adición de sitios de glicosilación al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 puede lograrse por alteración de la secuencia de aminoácidos. La alteración puede hacerse, por la adición de, ó substitución por, una ó mas residuos de serina ó treonina al PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 ó PR0317 de secuencia nativa (por sitios de glicosilación O-unidos) . La secuencia de aminoácidos de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 puede opcionalmente ser alterada a través de cambios en el nivel de OSA, particularmente por mutación del DNA que codifica al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 en bases preseleccionadas de modo que se generan los codones que transformaran en los aminoácidos deseados.
Otro medio de incrementar el número de porciones carbohidratos en el polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317 es por acoplamiento químico 6 enzimático de glicosidos al polipéptido. Tales métodos se describen en la especialidad, por ejemplo, en WO 87/05330 publicada el 11 de Septiembre de 1987, y en Aplin y Wrinston, CRC Crit. Rev. Biochem. pp. 259-306 (1981) .
La remoción de las porciones carbohidratos presentes en el polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 puede lograrse química 6 enzimáticamente ó por substitución mutacional de codones que codifican para residuos de aminoácidos que sirven como objetivos para glicosilación. Son conocidas en la especialidad, técnicas de desglicosilación y se describen, por ejemplo, en Hakimuddin, y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys .. 259: 52 (1987) y por Edge y colaboradores, Anal. Biochem., 118:131(1981). La fragmentación enzirañatica de las porciones carbohidratos en polipéptidos puede lograrse por el uso de una variedad de endo- y exo- glicosidasas como describe Thotakura y colaboradores, Meth. Enzymol .. 118:350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente de PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317 comprende enlazar al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 ó PR0317 a alguno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo polietilen glicol (PEG) , polipropilen glicol, 6 polialquilenos, en la manera expuesta en la Patente USA No. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 6 4,179,337.
El PR0187, PR0533. PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 6 PR0317 de la presente invención puede también modificarse de una manera para formar una molécula quimérica que comprenda a PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 fusionado a otro, polipéptido ó secuencia de aminoácido heterólogos.
En una modalidad, una molécula quimérica tal comprende una fusión del PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 con un polipéptido marcado que proporciona un epitope al cual un anticuerpo an i-marcador puede enlazar selectivamente. El epitope marcado es generalmente colocado en el amino- ó carboxil- terminus del PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317. La presencia de tales formas epítopes marcadas de PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 ó PR0317 puede ser detectada utilizando un anticuerpo contra el polipéptido marcado. También, la previsión del epítope marcado facilita al PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317 para ser purificado fácilmente por purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-marcador u otro tipo de matiz de afinidad que enlace al epítope marcado. Varios polipéptidos marcados y sus respectivos anticuerpos son bien conocidos en la materia. Los ejemplos incluyen marcas de poli-histidina (poli-his) ó poli-histidina-glicina (poli-his-gli) el polipéptido marcado flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Field y colaboradores. Mol . Cell . Biol .. 8: 2159-2165 (1988)]; el c-myc marcado y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 de los mismos [Evans y colaboradores, Molecular and Cellular Biology. 5; 3610-3616 .]. - -Herpes Simplex (gD) y su anticuerpo [Paborsky y colaboradores, Protein Engineerinqr. 3(6) : 547-553 (1990)].
Otros polipéptidos marcados incluyen el péptido-Flag [Hopp y colaboradores, BioTechnology. 6:1204-1210 (1988)],- el péptido epítope de KT3 [Martin y colaboradores, Science. 255:192-194 (1992)]; un péptido epítope de a-tubulina [Skinner y colaboradores, J. Biol.. Chem.. 266:15163- 151*66 (1991)]; y el marcador del péptido de la proteína 10 del gen T7 [Lutz-Freyermuth y colaboradores, Proc . Nati Acad. Sci USA, 87: 6393-6397 (1990)].
En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprende una fusión del PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317 con una irimunoglobulina ó una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de una molécula quimérica (también mencionada como una inmunoadhesina" ) , una fusión tal podría ser en la región Fe de una molécula de IgG. Lasa fusiones de Ig preferiblemente incluyen la substitución de una forma soluble (región trasmembrana eliminada ó inactivada) de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 ó PR0317 en lugar de al menos una región variable en una molécula de ig. En una modalidad preferida particular, la fusión de la inmunoglobulina incluye el eje, regiones CH2 y CH3, ó el eje, regiones CH1, CH2, y CH3 de una molécula de igGi. Para la producción de fusiones de inmunoglobulinas ver también Patente USA No. 5,428,130, registrada el 27 de Junio de 1995.
D. Preparación de los polipéptidos PR0187. PR0533. PR0214. PR0240. PR0211. PRO230. PR0261. PR0246 y PR0317 La descripción siguiente concierne primeramente a la producción de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317 por cultivo de células transformadas ó transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico de PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317. se contempla, por supuesto, que métodos alternativos que son bien conocidos en la materia, puedan emplearse para preparar PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317. Por ejemplo, la secuencia de PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317, ó porciones de ésta, pueden producirse por síntesis peptídica directa utilizando técnicas en fase sólida [ver, por ejemplo, Stewart y colaboradores, Solid-Phase peptide Synthesis . W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85-2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteínas in vitro puede efectuarse utilizando técnicas manuales 6 automatización. La síntesis automática puede lograse, por ejemplo, utilizando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Varias porciones del PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 pueden sintetizarse químicamente separadamente ó combinadas utilizando métodos químicos ó enzimáticos para producir el PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 Ó PR0317 de extensión total . a.Aislamiento del DNA que codifica a un polipéptido PR0187. PR0533. PR0214. PRO240. PR0211. PRQ230. PR0261.
PR0246 6 PRQ317 El DNA que codifica a PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 6 PR0317 puede obtenerse de una cervo de cDNA preparado de tejido que se cree que posee al mRNA de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 y expresarlo a un nivel detectable. Por consiguiente, DNA de PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317 humano puede obtenerse convenientemente de una biblioteca de cDNA preparada de tejido humano, tal como se describe en los ejemplos. PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 6 PR0317 que codifica al gen puede también obtenerse de una biblioteca genómica ó por síntesis de oligonucleótidos.
Las bibliotecas pueden ser cribadas por sondas (tales como anticuerpos en el polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317, u oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) designadas para identificar el gen de interés ó la proteina codificada por él. El cribado de la biblioteca genómica ó f ^ de cDNA con la sonda seleccionada puede conducirse utilizando los procedimientos estándares descritos en 5 Sambrook y colaboradores. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un medio alternativo de aislar el gen que codifica a PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR02 6 ó PR0317 es usar la metodología de la PCR [Sambrook ^ ^ 10 y colaboradores supra; Dieffenbach y colaboradores, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Los ejemplos siguientes describen técnicas para cribar 15 una biblioteca de cDNA. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberán ser suficientemente extensas y suficientemente sin ambigüedad para minimizar '^—' los falsos positivos. El oligonucleótido es preferiblemente marcado de modo que pueda ser detectado después de 20 hibridización del DNA en la biblioteca que está siendo cribada. Los métodos de marcado son bien conocidos en la materia, e incluyen el uso de radiomarcadores similares a ATP 32P-marcado, marcado enzimático ó por biotinilación. Las condiciones de hibridización, que incluyen moderada severidad y alta severidad, se proporcionan en Sambrook y colaboradores, supra.
Las secuencias identificadas en tales métodos de cribado de bibliotecas pueden compararse y alinearse con otras secuencias depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como GeneBank u otras bases de datos de secuencias privadas. La identidad de las secuencias ( ya sea al nivel de aminoácidos ó de nucleótidos) en regiones definidas de la molécula ó a través de la secuencia de extensión total puede determinarse utilizando métodos conocidos en la materia como se describe en la presente.
Las secuencias codificadoras de proteínas que tienen ácidos nucleicos pueden obtenerse por cribado de bibliotecas genómicos ó de cDNA seleccionados utilizando la secuencia de aminoácidos deducida descrita en la presente para la primera vez, y, si es necesario utilizar los procedimientos de extensión de cebadores convencionales como se describe en Sambrook y colaboradores, supra, para detectar precursores e intermediarios del proceso de mR A que no puedan ser transcritos inversamente en el cD A. b. Selección y Transformación de Células Huéspedes Las células huéspedes son transfectadas ó transformadas con los vectores de expresión ó de clonación descritos en la presente para la producción de PR01S7, PR0533, PR021 , PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 y cultivados en medios nutrientes convencionales modificados apropiadamente para inducir promotores, seleccionar transformantes, ó amplificar los genes que codifican a las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medio, temperatura, pH y los similares, pueden ser seleccionadas por los expertos en la materia sin experimentación indebida. En general, los principios, protocolos, y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Buttler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook y colaboradores, supra.
Los métodos de transformación celular eucariótica y de transformación celular procariótica son conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, CaCl2, CaP04, por medio de liposoma y electroporación. Dependiendo de las células huéspedes usadas, la transformación se efectúa utilizando técnicas estándares apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en Sambrook y colaboradores, ó electroporación son generalmente usados para procariotas. La infección con Agrobacterivaa tumefaciens es usada para la transformación /'^ de ciertas células de plantas, como se describe en Shaw y colaboradores. Gene, 23: 315 (1983) y WO 89/05859 publicada 5 el 29 de Junio de 1989. Para células de mamíferos sin tales paredes celulares, el método de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456- 457(1978) puede emplearse. Los aspectos generales de trasnfecciones en sistemas de huéspedes de células de 10 mamífero se ha descrito en la Patente USA No. 4,399,216. La transformación en levaduras es típicamente llevada a cabo conforme al método de Van Solingen y colaboradores, J. Bact. 130:946 (1977) y Hsiao y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, pueden 15 usarse otros métodos para introducir el DNA en las células, tales como por microinyección nuclear, electroporación, fusión del protoplasto bacteriano con células intactas, ó policaciones, por ejemplo, polibreno, poliomitina. Para varias técnicas para transformar células de mamíferos, ver, 20 keown y colaboradores, Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) y Mansour y colaboradores, Nature 336:348-352 (1988) .
Células huéspedes adecuadas para clonar ó expresar el 25 DNA en los vectores de la presente incluyen células procariotas, levaduras, ó eucariotas superiores. Las eucariotas adecuadas incluyen pero no se limitan a eubacteras tales como organismos Gram-negativos ó Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacter tal como E. cali. Varias cepas de E. coli están públicamente disponibles, tales como la cepa MM294 de la cepa de E coli, K12 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); cepa W3110 de E. coli (ATCC 27,325) y cepa K5 772 de E. coli (ATCC 53,635). Otras células huéspedes procariotas incluyen enterobacterias tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwina, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella thyphimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, asi como también bacilli tal como B. Subtilis y B. Licheniformis (por ejemplo B. Licheniformis 41 P descrita en DD266,710 publicada el 12 de Abril de 1989) , Pseudomonas, tales como P. aeruginosa, y Strptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos sin limitar. La cepa W3110 es una huésped particularmente preferida ó huésped genitora porque es una cepa huésped común para fermentación de productos de DNA recombinante . Preferiblemente las células huéspedes secretan cantidades mínimas de enzimas proteolíticas . Por ejemplo, la cepa W3110 puede ser modificada para efectuar una mutación genética en los genes que codifican a las proteínas endógenas en el huésped, con ejemplos de tales huéspedes que incluyen la cepa 1A2 de E. coli W3110, la cual tiene el genotipo completo tonA; la cepa 9E4 de E. coli W3110, la cual tiene el genotipo completo tonA ptr3; cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55244), la cual tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ampTkarf; cepa 37D6 de E. coli W3110, la cual tiene el genotipo completo tonAptr3phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG karf; cepa 40B4 de E.coli W3110, que es la cepa 37D6 con una mutación por eliminación de degP no resistente a la kanamicina; y una cepa E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente USA No. 4,946,783 registrada el 7 de Agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados los métodos in vitro de clonación, por ejemplo, la PCR u otras reacciones de la polimerasa del ácido nucleico.
Además de los procariotas, microbios eucariotas tales como hongos filamentosos ó levaduras son huéspedes adecuados para clonación ó expresión de los vectores que codifican a PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317. Sacharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior comúnmente usado. Otros incluen Schizosacc aromyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140
[1981]; EP 139,383 publicado el 2 de Mayo de 1985) ; huéspedes Kluyveromyces (Patentee USA No. 4,943,529; Fleer y colaboradores, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)) tales como K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt y colaboradores J. Bacteriol., 737
[1983]) , K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waitii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Vanden Berg y colaboradores, Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, y K.marxianus; yarrowia (EP 402,226); Picchua pastoris (EP 183,070; Srekrishna y colaboradores, J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988J) ; Candida: Trichoderma recia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263
[1979]); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicado el 31 de Octubre de 1990) ; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, neurospora, Penicilliu , Tolypocladium (WO 91/00357 publicado el 10 de enero de 1991), y el huésped Aspergillus tal como A. Nidulans (Ballance y colaboradores, Biochem Biophys. Res. Común., 112:284-289
[1983]; Tilburn y colaboradores, Gene 26: 205-221
[1983]; Yelton y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474
[1984] y A. Niger (Kelly y Hynes, EMBO J. 4:475-479
[1985]). Levaduras metilotrópicas son adecuadas en la presente e incluyen, pero no se limitan a, levaduras capaces de crecer en metanol seleccionadas del género consistente de hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccaromyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una lista de especies especificas que son ejemplares de esta clase de levaduras puede encontrarse en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982) .
Células huéspdes adecuadas para la expresión de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR02 6 ó PR0317 glicosilados se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, asi como también células de plantas. Ejemplos de lineas celulares huéspedes de mamíferos, útiles incluyen las células de Ovario de Hámster Chino (CHO) y COS. Ejemplos más específicos incluyen la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embrionario humano (células 293 ó 293 subclonada por crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y colaboradores, J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)); células de ovario de hámster chino/ -DHFR (CHO) , Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); células de sertolli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75) ;células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) . La selección de la célula huésped apropiada es a juicio de los expertos en la materia. c. Selección y Uso de un vector Replicable El ácido nucleico (por ejemplo, cDNA ó DNA gene-mico) codificador de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 puede ser insertado en un vetor replicable para clonación (amplificación del DNA) ó para expresión. Varios vectores están disponibles al público. El vector puede, por ejemplo, estár en la forma de un plásmido, cósmido, partícula viral ó fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede ser insertada en el vector por una variedad de procedimientos. En general, el DNA es insertado en un sitio de endonucleasa de restricción utilizando técnicas conocidas en la materia. Los componentes de los vectores generalmente incluyen, pero no se limitan a una secuencia indicadora, un origen de replicación, uno ó más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuados que contengan uno ó más de estos componentes emplea técnicas de ligación estándares las cuales son conocidas por los expertos en la materia.
El PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 puede producirse recombinantemente no solamente directamente, sino también, como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual puede ser una secuencia indicadora u otro polipéptido que tenga un sitio de fragmentación específico en el N-terminus de la proteína ó polipéptido maduro. En general, la secuencia indicadora puede ser un componente del vector, ó puede ser una parte del DNA que codifica a PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 que es insertado en el vector. La secuencia indicadora puede ser una secuencia indicadora procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp, ó enterotoxina II líder termo-estables. Para la secreción de levaduras la secuencia indicadora puede ser, por ejemplo, líder de la invertasa de la levadura, líder del factor-alfa (que incluye líderes del factor alfa de Saccharomyces y Kluyveromyces, la posteriormente descrita en la Patente USA NO. 5,010,182), ó líder de la fosfatasa ácida, y líder de la glucoamilasa de C. albicans (EP 362,179 publicada el 4 de abril de 1990) , ó la indicadora descrita en WO 90/13646 publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión celular en mamíferos, pueden usarse las secuencias indicadoras de mamíferos para dirigir la secreción de las proteínas, tales secuencias indicadoras de polipéptidos secretados de igual ó de especies relativas, asi como también líderes secretores virales .
Ambos vectores, de expresión y de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que facilita al vector replicar en una ó más células huéspedes seleccionadas . Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras, y virus. El origen de replicacion del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2µ es adecuado para levaduras y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV ó BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamíferos.
Los vectores de clonación y de expresión contendrán típicamente un gen de selección también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típica codifican a las proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexate, ó tetraciclina, (b) complementan las deficiencias, ó (c) proveen nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen codificador de D-alanina racemasa en bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionarles adecuados para células de mamíferos son aquellos que facilitan la identificación de células competentes para admitir al ácido nucleico codificador de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317, tales como DHFR ó timidina cinasa. Una célula huésped apropiada cuando el DHFR tipo silvestre es empleada es la linea celular de CKO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada como describe Urlaub y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para uso en levaduras es el gen trpl presente en el plásmido YRp7 de la levadura [Stinchcomb y colaboradores, Nature, 282:39 (1979); Kingsman y colaboradores, Gene, 7:141 (1979); Tschemper y colaboradores, Gene, 10: 157 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levaduras que carece de la capacidad para crecer en triptof no, por ejemplo, ATCC No. 44076 ó PEP4-1 [Jones, genetics, 85:12 (1977)].
Los vectores de expresión y de clonación usualmente contienen un promotor operablemente unido a la secuencia de ácidos nucleicos codificadora de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317, para dirigir la síntesis de mRNA. Los promotores reconocidos por una variedad de células huéspedes potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados para uso con células huéspedes procarióticas incluyen los sistemas promotores de ß-lactamasa y de lactosa [Chang y colaoradores, Nature, 275:615 (1978); Goeddel y colaboradores, Nature, 281:544 (1979) ], la fosfatase alcalina, un sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids. Res. 8: 4057 (1980) ; EP 36,776]. Y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80:21-25(1983)]. Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contienen una secuencia Shine-Dalgamo (S.D.) operablemente unida al DNA codificador de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317.
Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para uso con huéspedes levaduras incluyen a los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa [Hitzeman y colaboradores, J. Biol.. Chem., 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicoliticas [Hess y colaboradores, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como la enolasa, gliceraldehido-3-fosfato .deshidrogenase, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-e-fosfato isomerasa, 3- fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.
Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradadoras asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3- fosfato deshidrogenasa, y enzimas respobnsables de la utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores adecuados para uso en expresión en levaduras se describen adicionalmente en EP 73,657.
La transcripción de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317, de vectores en células huéspedes de mamíferos es controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus pustular aviar (UK 2,211,504 publicada el 5 de Julio de 1989) , adenovirus (tales como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y el Virus Simiano 40 (SV40) , de los promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo el promotor de actina, ó un promotor de inmunoglobulina, y de los promotores de choque térmico, a condición de que tales promotores sean compatiples con los sistemas de las células huéspedes .
La transcripción de un DNA codificador de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 ó PR0317 en eucariotas superiores puede aumentarse por inserción de una secuencia mejoradora en el vector. Los mej oradores son elementos de DNA que actúan en cis, usualmente aproximadamente desde 10 hasta 300 bp, ese acto sobre un promotor incrementa su transcripción. Muchas secuencias mejoradoras son actualmente conocidas desde genes de mamíferos (glonina, elastasa, albúmina, a-feto-proteína, e insulina) . Típicamente, sin embargo, uno usará un mejorador de un virus de célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el mejorador de SV40 sobre la cadena lateral del origen de replicación (bp 100-270), el mejorador del promotor del citomegalovirus precoz, el mejorador del polioma sobre la cadena lateral del origen de replicación, y los mejoradores de adenovirus. El mejorador puede ser unido al vector en una posición 5' ó 3' en la secuencia codificadora de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317, pero está preferiblemente localizado en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión usados en células huéspedes sucarióticas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, ó células anucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el mRNA. Tales secuencias son comúnmente disponibles desde las regiones no transformadas 5' y, ocasionalmente 3', de cDNAs ó DNAs eucariótico, ó viral. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no trasnformada del mRNA que codifica a PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR02 6 ó PR0317.
Aún otros métodos, vectores, y células huéspedes adecuadas para adapatación a la síntesis de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 en cultivos celulares de vertebrados recombinantes se describen en getting y colaboradores, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei y colaboradores, Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117,060; y EP 117,058. d. Detección de la Amplificación/Expresión Genética La amplificación y/ó expresión genética puede medirse en una muestra directamente, por manchado Southern convencional, manchado Northern para cuantificar la transcripción de mRNA [Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 77:5201-5205 (1980)], manchado punteado (análisis de DNA) , ó hibridización in situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente basada en las secuencias proporcionadas en la presente. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer dupletos específicos, que incluyen dupletos de DNA, ddupletos de RNA, y dupletos híbridos DNA-RNA ó dupletos DNA-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden ser marcados y el ensayo puede llevarse a acabo cuando el dupleto es enlazado a una superficie, de modo que desde la formación del dupleto sobre la superficie, puede detectarse la presencia del enlace del anticuerpo al dupleto.
La expresión genética, alternativamente, puede medirse por métodos inmunológicos, tales como manchado inmunohistoquímico de células ó secciones de tejidos y ensayo del cultivo celular ó fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto genético. Los anticuerpos útiles para manchado inmunohistoquímico y/ó ensayo de muestras fluidas puede ser ya sea monoclonal ó policlonal, y puede prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido PR0187, PR0533, P 0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 de secuencia nativa 6 contra un péptido sintético basado en la secuencia de DNA proporcionada en la presente ó contra una secuencia exógena fusionada al DNA. de PR0187, PR0533, 5 PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 y codificadora de un epitope de anticuerpo especifico. e. Purificación del péptido r ^ Las formas de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 pueden recuperarse del medio de cultivo ó desde Usados de células huéspedes. Si hay enlace de membrana, pueden ser liberados de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo, 15 Triton-X 100= ó por fragmentación enzimática. Las células empleadas en la expresión de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 ó PR0317 pueden ser ^ destruidas ó disruptadas por varios medios físicos ó químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, 20 sonicación, disrupción mecánica ó por agentes para lisado celular.
Puede desearse purificar a PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 desde 25 proteínas ó polipéptidos celulares recombinantes . Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación: por fraccionamiento sobre columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC en fase inversa; cromatografía sobre sílice sobre una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque : SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración de gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sepharose para retirar los contaminantes tales como IgG; y columnas de quelación metálica para enlazar a las formas epítope-marcadas de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317. varios métodos de purificación de proteínas pueden emplearse y tales métodos son conocidos en la materia y descritos por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). La(s) etapa(s) de purificación seleccionada (s) dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y del PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 particular producido.
E.Amplificación de Genes que Codifican a los Polipéptidos PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 en Líneas Celulares y Tejidos Tumorales La presente invención está basada en la identificación y caracterización de genes que son amplificados en ciertas células cancerosas.
El genoma de organismos procarióticos y eucarióticos es sometido a dos requerimientos aparentemente contradictorios. Uno es la preservación y propagación de DNA como la información genética en su forma original, para garantizar herencia estable a través de múltiples generaciones. Por otro lado, las células u organismos deben se capaces de adpatarse a cambios ambientales permanentes. Los mecanismos de adaptación pueden incluir modificaciones cualitativas ó cuantitativas del material genético. Las modificaciones cualitativas incluyen mutaciones de DNA, en las cuales las secuencias codificadoras son alteradas dando como resultado proteínas diferentes estructural y/ó funcionalmente . La amplificacióngenética es una modificación cuantitativa, con la cual el número de secuencias codificadoras completas, por ejemplo, un gen, aumenta, conduciendo a un incremento en el número de moldes disponibles para transcripción, un número incremntado de trasncritos transformables, y, finalmente a una abundancia creciente de la proteina codificada por el gen amplificado.
El fenómeno de amplificación genética y sus mecanismos subordinados se ha investigado in vitro en varios sistemas de cultivos procarióticos y eucarióticos. El ejemplo mejor caracterizado de amplificación genética involucra el cultivo de células eucarióticas en medio que contiene concentraciones variables del fármaco citotóxico metotrexate (MTX) . El MTX es un análogo del ácido fólico e interfieree con la síntesis de DNA por bloqueo de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) . Durante la exposición inicial a bajas concentraciones de MTX la mayoría de las células (> 99 ) morirán. Un pequeño número de células sobreviven, y son capaces de crecer en concentraciones crecientes de MTX para produciendo grandes cantidades de DHFR-RNA y proteína. La base de esta sobre-producción es la amplificación del gen de DHFR solo. Las copias adicionales del gen se encuentran como copias extracromosómicas en forma de pequeños, cromosomas supernumerarios (dobles diminutos) ó como copias cromosómicas integradas. La amplificación genética se encuentra más comúnmente en el desarrollo de la resistencia a fármacos citotóxicos (antibióticos para bacterias y agentes quimioterapéuticos para células eucarióticas) y transformación neoplástica. La transformación de una célula eucariótica como un evento espontáneo ó debido a una agresión viral ó quimica/ambiental se asocia típicamente con cambios en el material genético de esa célula. Uno de los cambios genéticos más comunes observados en las malignidades humanas son las mutaciones de la proteína p53. p53 controla la transición de las células desde la fase estacionaria (Gl) hasta la fase de replicación (S) y previene esta transición en presencia de DNA dañado. En otras ppalabras, una de las principales consecuencias de mutaciones de p53 inhabilitadoras es la acumulación y propagación de DNA dañado, por ejemplo, cambios genéticos. Tipos comunes de cambios genéticos en cálulas neoplásticas son, además de las mutaciones puntuales, alteraciones estructurales totales y amplificaciones, tales como translocaciones.
La amplificación de las secuencias de DNA puede indicar requerimientos funcionales específicos como se ilustra en el sistema experimental DHFR. Por consiguiente, la amplificación de ciertos oncógenos en puntos de malignidad hacia un papel causal de estos genes en el proceso de transformación maligna y mantenimiento del fenotipo transformado. Esta hipótesis ha ganado apoyo en estudios recientes. Por ejemplo, la proteína bcl-2 se encontró que es amplificada por ciertos tipos de linfomas no de Hodgkin. Esta proteína inhibe la apoptosis y provoca la acumulación progresiva de células neoplásticas. Se ha encontrado que los miembros de la familia genética de receptores del factor de crecimiento están amplificados en varios tipos de cánceres lo que sugiere que la sobre-expresión de estos receptores puede hacer a las células neoplásticas menos susceptibles a limitar las cantidades de factor de crecimiento disponible. Los ejemplos incluyen la amplificación del receptor del andrógeno en cáncer de próstata recurrente durante la terapia de privación de andrógeno y la amplificación del receptor del factor de crecimiento homólogo ERB2 en cáncer de seno. Permanentemente, los genes involucrados en indicación y control intracelular de la progresión del ciclo celular pueden sufrir amplificación durante la transformación maligna. Esto es ilustrado por la amplificación de los genes bcl-I y ras en varios neoplasmas epitelial y linfoide.
Estos estudios precoces ilustran la factibilidad de identificar secuencias de DNA amplificadas en neoplasmas, porque este procedimiento puede identificar genes importantes para la transformación maligna. El caso de ERB2 también demuestra la factibilidad de un punto de vista terapéutico, puesto que la transformación de proteínas puede representar objetivos nuevos y específicos para la terapia tumoral .
Varias técnicas diferentes pueden usarse para demostrar secuencias genómicas amplificadas. Es adecuado el análisis citogenético clásico de propagación cromosómica preparado desde células cancerosas, para identificar alteraciones estructurales totales, tales como translocaciones, eliminaciones e inversiones. Regiones genómicas amplificadas pueden solamente ser visualizadas, si involucran regiones grandes con alta cantidad de copias ó si están presentes como un material extracromosómico. Mientrs quelas citogenéticas fueron las primeras técnicas para demostrar la asociación consistente de cambios cromosómicos especificos con neoplasmas particulares, es inadecuada para la identificación y aislamiento de secuencias de DNA manejable. La técnica más recientemente desarrollada de hibridización genómica comparativa (CGH)ha ilstrado el fenómeno ampliamente propagado deampli icación genómica en neoplasmas. DNA normal y de tumor se hibiridizaron simultáneamente en metaf ses de células normales y el genoma completo puede ser cribado por análisis de imágenes para secuencias de DNA que están presentes en el tumor a una frecuencia creciente. (WO 93/18,186; Gray y colaboradores, radiation Res. 137:275-289
[1994]) . Como un método de cribado, este análisis reveló un gran número de amplicones recurrentes (una extensión de DNA amplificado) en una variedad de neoplasmas humanos. Aunque CGH es más sensible que el análisis citogenético clásico en r la identificación de extensiones amplificadas de DNA, , no v... permite una identificación y aislamiento rápidos de 5 secuencias codificadoras en el amplicon por técnicas genéticas moleculares estándares.
Los métodos más sensibles para detectar amplificación genética son los ensayos basados en la reacción en cadena 10 de la polimerasa. Estos ensayos utilizan muy pequeñas cantidades de DNA de tumor como material de partida, son exquisitamente sensibles, proporciona DNA que es adaptable para análisis adicionales, tal como secuenciación y son adecuados para análisis en grandes volúmenes. 15 Los ensayos anteriormente mencionados no son exclusivos mutuamente, pero son usados frecuentemente en combinación para identificar amplificaciones en neoplasmas. Mientras que el análisis citogenético y CGH representan 20 métodos de cribado para estudiar el genoma entero para regiones amplificadas, los ensayos basados en PCR son más adecuados para la identificación final de secuencias codificadoras., por ejemplo, genes en regiones amplificadas . 25 Conforme a la presente invención, tales genes se han identificado por PCR cuantitativa (S. Gelmini y colaboradores, Clin. Chem. 43: 752
[1997], por comparación de DNA de una variedad de tumores primarios, que incluyen tumores de seno, pulmón, colon, próstata, cerebro, hígado, riñon, páncreas, bazo, timo, testículos, ovario, útero, ó líneas celulares con DNA agrupado de donantes saludables. Se efectuó la PCR cuantitativa utilizando un instrumento TaqMan (ABI) . Se designaron los cebadores específicos del gen y las ondas fluorogénicas en base a las secuencias codificadoras de los DNAs.
Las líneas celulares de carcinoma pulmonar humano A549 (SRCC768), Calu-I (SRCC769) , Calu-6 (SRCC770) , H157 (SRCC771), H441 (SRCC772) , H460 (SRCC773) , H522 (SRCC832) , H810 (SRCC833) , SKMES-I (SRCC774) y SW900 (SRCC775) , todas disponibles de ATCC. Las células tumorales de pulmón humano primario usualmente se derivan de adenocarcinomas, carcinomas de células escamosas, carcinomas de células grandes, carcinomas de células pequeñas, y carcinomas bronco alverolares, por ejemplo, SRCC724 (adenocarcinoma, abreviado como ""AdenoCa") (LT1) , SRCC725 (carcinoma de células escamosas, abreviado como "SqCCa) (LTla) , SRCC726 (adenocarcinoma) (LT2) , SRCC727 (adenocarcinoma) (LT3) , SRCC728 (adenocarcinoma) (LT4) , SRCC729 (carcinoma de células escamosas) (LT6), SRCC730 (adeno/carcinoma de células escamosas) (LT7) , SRCC825 (adenocarcinom) (LT8), SRCC731 (adenocarcinoma) (LT9) , SRCC732 (carcinoma de células escamosas) (LT10) , SRCC733 (carcinoma de células escamosas) (LT11) , SRCC734 (adenocarcinoma) (LT12) , SRCC735 (adeno/carcinoma de células escamosas) (LT13) , SRCC736 (carcinoma de células escamosas) (LT15) , SRCC737 (carcinoma de células escamosas= (LT16) , SRCC738 (carcinma de células escamosas) (LT17) , SRCC739 (carcinoma de células escamosas) (LT18) , SRCC740 (carcinoma de células escamosas) (LT19) , SRCC741 (carcinoma de células pulmonares, abreviado como "LCCa") (LT21, SRCC811 (adenocarcinoma) (LT22) , SRCC887 (carcinoma de células escamosas) (LT26) , SRCC888 (carcinoma adeno-BAC) (LT27), SRCC889 (carcinoma de células escamosas) (LT28) , SRCC890 (carcinoma de células escamosas) (LT29) , SRCC891 (adenocarcinoma) (LT30) , SRCC892 (carcinoma de células escamosas) (LT31) , SRCC894 (adenocarcinoma) (LT33) . También se incluyen tumores pulmonares humanos designados SRCC1125[HF-000631], SRCC1129[HF-000643J, SRCC1133[HF-000840] y SRCC1135[HF-000842].
Las lineas celulares de cáncer de colon incluye, por ejemplo, lineas celulares de ATCC SW480 (adenocarcinoma, SRCC776), SW620 (metástasis de nodulo linfático de adenocarcinoma de colon, SRCC777), Colo320 (carcinoma, SRCC778), Colo205 (carcinoma, SRCC828), HCC2998 (carcinoma, SRCC830), HT29 (adenocarcinoma, SRCC779) , HM7 (carcinoma, SRCC780), KM12 (carcinoma, SRCC831), CaWiDr (adenocarcinoma, SRCC781), HCT15 (carcinoma, SRCC829) , HCT116 (carcinoma, SRCC782), SKC01 (adenocarcinoma, SRCC783) , SW 03 (adenocarcinoma, SRCC784), LS17 T (carcinoma, SRC785) , y H 7 (una mucina superior que produce una variante de la ATCC de la linea celular de adenocarcinoma de colon, LS 174T, SRCC780, obtenida del Dr. Robert Warren, UCSF) . Los tumores primarios de colon incluyen adenocarcinomas de colon designados CT1 (SRCC751), CT2 (SRCC742), CT3 (SRCC743), CT4 (SRCC752) , CT5 (SRCC753) , CT6 (SRCC754) , CT7 (SRCC755), CT8 (SRCC744) , CT9 (SRCC756) , CT10 (SRCC745) , CT11 (SRCC757), CT12 (SRCC746) , CT1 (SRCC747) , CT15 (SRCC748) , CT16(SRCC749) , CT17 (SRCC750) , CT18 (SRCC758) , CT25 (adenocarcinoma, SRCC912), CT28 (adenocarcinoma, SRCC915) CT35 (adenocarcinoma, SRCC921) . También están incluidos los centros tumorales de colon humanos designados SRCC1051 [HF-000499], SRCC1052 [HF-000539], SRCC1053 [HF-000575], SRCC11054 [HF-000698], SRCC1060 [KF-000756], SRCC1144 [HF-000789], y SRCC1148[HF-0008114, y el tumor marginal de colon humano designado SRCC1059[HF-000755].
Las lineas celulares de carcinoma de seno humano incluyen, por ejemplo, HBL100 (SRCC759), MB435s (SRCC760) , T47D(SRCC761) , MB468 (SRCC762) , MB175 (SRCC763) , MB361 (SRCC764) , BT20 (SRCC765) , MCF7 (SRCC766) , y SKBR3 (SRCC767) , y el centro tumoral de seno humano designado SRCC1057[HF-000545]. También están incluidos los tumores de seno humano designados SRCC1094, SRCC1095, SRCC1096, SRCC1097, SRCC1098, SRCC1099, SRCC1100 y SRCC1101.
Los centros tumorales de riñón humano incluyen SRCC989 [HF-000611] y SRCC1014[HF-000613] . El tumor de nodulo linfático incluye SRCC1004 [HF-000854]. El tumor marginal rectal incluye SRCC82 [HF-000551]. El centro tumoral de testículo incluye SRCC1001 [HF-000733] y el tumor marginal de testículo SRCC999 [HF-000716], F. Distribución de Tejido Los resultados de los ensayos de amplificación genética de la presente pueden verificarse por medio de studios adicionales, tales como, por determinación de la expresión de mRNA en varios tejidos humanos.
Como se hizo notar anteriormente, la amplificación genética y/ó la expresión genética en varios tejidos puede medirse por medio de manchado Southern convencional, manchado Northern para cuantificar la transcripción de mRNA (Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205
[1980]), manchado punteado análisis de DNA, ó por hibridización i.n s tu, utilizando una sonda marcada apropiadamente, basada en las secuencias cproporcionadas en la presente. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que puedan reconocer dupletos específicos, que incluyen dupletos de DNA, dupletos de RNA, y ddupletos híbridos de DNA-RNA ó dupletos de DNA-proteína.
La expresión genética en varios tejidos, alternativamente, puede medirse por métodos inmunológicos, tales como manchado inmunohistoquímico de secciones de tejido y ensayos de cultivo celular ó de fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto genético. Los anticuerpos útiles para manchado inmunohistoquímico y/ó ensayos de muestras de fluidos pueden se ya sea monoclonales ó policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 de secuencia nativa ó contra un péptido sintético basado en las secuencias de DNA proporcionadas en la presente ó contra la secuencia exógena fusionada al DNA de la secuencia PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 y que codifica a un epitope de anticuerpo especifico. Las técnicas generales para generar anticuerpos, y lo los protocolos especiales para manchado Northern e hibridización in situ se proporcionan a continuación.
G. Mapeo Cromosomico Si la amplificación de un gen dado es funcionalmente relevante, entonces ese gen sería amplificado más que las regiones genómicas vecinas, las cuales no son importantes para la sobrevivencia del tumor. Para probar esto, el gen puede ser mapeado en un cromosoma particular, por ejemplo, por análisis híbrido por radiación. El nivel de amplificación es entonces determinado en la localización identificada, y en las regiones genómicas vecinas. La amplificación preferencial selectiva en la región genómica en la cual el gen ha sido mapeado es consistente con la posibilidad de que la amplificación del gen observada promueve el crecimiento ó sobrevivencia de tumor. El mapeo cromosómico incluye ambos mapeo de epicentro y de estructura. Para detalles adicionales ver por ejemplo, Stewart y colaboradores, Genome Research. 7:422-433(1997).
H.Estudios de Enlace de Anticuerpo 5 Los resultados de los estudios de amplificación genética pueden ser adicionalmente verificados por estudios de enlace de anticuerpo, en los cuales se verificó la capacidad de los anticuerpos anti-PR0187, anti-PR0533, ClO anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti- PR0261, anti-PR0246 ó anti-PR0317, para inhibir la expresión de los polipéptidos PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 en célula stumorales (cáncer) . Anticuerpos ejemplares incluyen 15 anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecificos, y hetroconjugados, la preparación de los cuales se describirá a posteriormente.
Los estudios de enlace de anticuerpo pueden llevarse a 20 cabo por cualquier método de ensayo conocido, tales como ensayos de enlace comparativo, ensayos emparedado directos ó indirectos, y ensayos por inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal antibodies: a Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987). 25 Los ensayos, de enlace comparativo se basan en la capacidad de un estándar marcado para comparar con el analito de la muestra de prueba por enlace con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de proteína objetivo (codificada por un gen amplificado en una célula tumoral) en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se traduce enlace de los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que se traduce en enlace, los anticuerpos preferiblemente son insolubilizados antes ó después de la comparación, de modo que el estándar y el analito que son enlazados a los anticuerpos pueden convenientemente ser separados del estándar y el analito que permanece sin enlace.
Los ensayos emparedado involucran el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de enlazar a una diferente porción inmunogénica, ó epítope, de la proteína a ser detectada. En un ensayo sándwich, el analito de la muestra de prueba es enlazado a un primer anticuerpo el cual es inmovilizado sobre un soporte sólido, y en después un segundo anticuerpo enlaza al analito, formando así un complejo de tres parte insoluble. Ver, por ejemplo, Patente USA No. 4,376,110. el segundo anticuerpo puede él mismo ser marcado con una porción detectable (ensayos emparedado directos) 6 puede ser medido utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con una porción detectable (ensayo emparedado indirecto) . Por ejemplo, un tipo de ensayo emparedado en un ensayo ELISA, en cuyo caso la porción detectable es una enzima.
Por inmunohistoquímica, la muestra de tumor puede ser recientemente obtenida ó congelada ó puede ser embebida en parafina y fijada con un preservativo tal como formalina, por ejemplo.
I . Ensayos Tumorales basados en Células.
Los ensayos basados en células y modelos animales para tumores (por ejemplo, cánceres) pueden usarse para verificar los resultados del ensayo de amplificación genética, y comprender adicionalmente la relación entre los genes identificados en la presente y la patogénesis del crecimiento celular neoplástico. El papel de los productos genéticos identificados en la presente en el desarrollo y patología de tumor ó cáncer puede ser verificado por utilización de células ó líneas celulares de tumor primario que han sido identificadas para amplificar los genes de la presente. Tales células incluyen, por ejemplo, células de cáncer de seno, colon y pulmón y las lineas celulares enlistadas anteriormente.
En un procedimiento diferente, las células de un tipo celular que se sabe que están involucradas en un tumor particular son transfectadas con los cDNAs de la presente, y se analizó la capacidad de estos cDNAs para inducir crecimiento excesivo. Células adecuadas incluyen, por ejemplo, lineas celulares de tumor estable como, la línea celular B104-1-1 (línea celular NIH-3T3 estable transíectada con el nuevo protooncógeno) y células NIH-3T3 transfectadas en ras, las cuales son transfectadas con el gen deseado, y monitoreadas para crecimiento tumorigénico. Tales líneas celulares transfectadas pueden entonces usarse para probar la capacidad de anticuerpos ó composiciones de anticuerpos poli- ó monoclonales, para inhibir el crecimiento celular tumorigénico por ejercicio de actividad citotóxica ó citostática sobre el crecimiento de las células transformadas, ó por mediación de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (DAC) . Las células transfectadas con las secuencias codificantes de los genes identificados en la presente pueden adicionalmente ser usadas para identificar fármacos candidatos para el tratamiento de cáncer.
Además, pueden usarse cultivos primarios derivados de tumores en animales transgénicos (como se describe posteriormente), en los ensayos basados en células de la presente, aunque se prefieren las lineas celulares estables. Son bien conocidas en la materia las técnicas para derivar lineas celulares continuas de animales transgénicos. (ver por ejemplo, Small y colaboradores, Mol . Cell. Biol., 5:642-648
[1985]).
J. Modelos Animales Pueden usarse una variedad de modelos animales bien conocidos para comprender adicionalmente el papel de los genes identificados en la presente en el desarrollo de la patogénesis de tumores, y las pruebas de eficiencia de agentes terapéuticos candidatos, que incluyen anticuerpos, y otros antagonistas de los polipéptidos nativos, que incluyen antagonistas de moléculas pequeñas. La naturaleza in vivo de tales modelos los hace particularmente predictivos de respuestas en pacientes humanos. Los modelos animales de tumores y cánceres (por ejemplo, cáncer de seno, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, etc.) incluyen ambos animales, no recombinantes y recombinantes (transgénicos) . Los modelos animales no-recombinantes incluyen, por ejemplo, roedores, por ejemplo modelos de murinas. Tales modelos pueden ser generados por introducción de células tumorales en ratones singeneicos, utilizando técnicas estándares, por ejemplo, inyección subcutánea, inyección en la vena de la cola, implantación en bazo, implantación intraperitoneal, implantación debajo de la cápsula renal, ó implantación ortofina, por ejemplo, células de cáncer de colon implantadas en tejido colónico. (Ver, por ejemplo, la Publicación de PCT No. O 97/33551, publicada en Septiembre 18, de 1997) .
Probablemente las especies animales usadas más a a menudo en estudios oncológicos son ratones inmunodeficientes y, en particular el ratón desnudo. La observación de que el ratón desnudo con hipo/aplasia podría actuar exitosamente como un huésped para xenoinjertos de tumor humano ha provocado que se propague su uso para este propósito. Se ha introducido el gen nu resecivo autosomático en un gran número de cepas congénicas distintas de ratón desnudo, incluyendo, por ejemplo, ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, 1/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RUI y SJL. Además, una amplia variedad de otros animales con defectos inmunológicos hereditarios diferentes del ratón desnudo han sido reproducidos y usados como recipientes de xenoinjertos de tumor. Para detalles adicionales ver, por ejemplo, The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven y B. Winograd, eds. CRC Pres, Inc. 1991.
^ Las células introducidas en tales animales pueden 5 derivarse de lineas celulares de tumor/cáncer, tales como, cualquiera de las lineas celulares tumorales enlistadas anteriormente, y, por ejemplo, la linea celular B104-1-1 (linea celular NIH-ST3 estable transfectada con el protooncógeno neu) ; células NIH-3T3 transfectadas en ras; 10 Caco-2 (ATCC HTB-37); una linea celular de adenocarcinoma de colon humano grado II moderadamente bien diferenciada, HT-29(ATCC HTB-38), ó de tumores y cánceres. Las muestras de células de tumor ó de cánceres pueden obtenerse de pacientes que han sido sometidos a cirugía, utilizando 15 condiciones estándares, que involucran congelar y almacenar en nitrógeno líquido (Karmali y colaboradores, Br. J. Cáncer, 48 : 689-696
[1983]) .
Las células tumorales pueden introducirse en animales, 20 tales como ratones desnudos, por medio de una variedad de procedimientos. El espacio subcutáneo (s.c.) en ratones es muy adecuado para implantación de tumores. Los tumores pueden ser trasplantados s.c. como un bloque sólido, como biopsias con aguja por uso de un trocar, ó como 25 suspensiones celulares. Por bloque sólido ó implantación con trocar, los .fragmentos de tejido de tumor de tamaño adecuado se introducen en el espacio s.c. Las suspensiones celulares son recientemente preparadas de tumores primarios ó de lineas celulares tumorales estables, e inyectadas subcutáneamente. Las células tumorales pueden también ser inyectadas como implantes sub-dérmicos . En esta localización, el inoculum se deposita entre la parte inferior del tejido conectivo dérmico y el tejido s.c. Boven y Winograd (1991), supra.
Se pueden generar modelos animales de cáncer de seno, por ejemplo, por implantación de células de neuroblastoma de ratas (de las cuales se aisló inicialmente el oncógeno neu) , ó células NIH-3T3 neu-transformadas en ratones desnudos, esencialmente como se describe por Drebin y colaboradores, PNAS USA, 83:9129-9133 (1986).
Similarmente, se pueden generar modelos animales por el paso de células de cáncer de colon en animales , por ejemplo, ratones desnudos, que provocan la apariencia de tumores en estos animales. Un modelo de trasplante ortotópico de cáncer de colon humano en ratones desnudos ha sido descrito, por ejemplo, por Wang y colaboradores, Cáncer Research 54:4726-4728 (1994) y Too y colaboradores, C ncer Research, 55: 681-684 (1995) . Este modelo está basado en el denominado "METAMOUSE" vendido por AntiCancer, Inc. (San Diego, California) .
Los tumores que se reproducen en animales pueden retirarse y cultivarse in vitro. Las células de los cultivos in vitro pueden entonces pasarse a animales. Tales tumores pueden servir como objetivos para pruebas adicionales ó selección de fármacos. Alternativamente, los tumores que resultan del paso pueden aislarse y el RNA de las células pre-pasadas y células aisladas después de una ó más rondas de paso, analizadas para expresión diferencial de genes de interés. Tales técnicas de pasaje pueden ser efectuadas con cualesquier lineas celulares de tumor ó de cáncer.
Por ejemplo, Meth A, CMS4, CMSS, CMS21, y WEHI-164 son fibrosarcomas de ratones hembras BALB/c químicamente inducidos (DeLeo y colaboradores, J. Exp. Med. 146:720
[1977]) , lo cual proporciona un sistema modelo altamente controlable para estudiar las actividades anti-tumor de varios agentes (Palladino y colaboradores, J. Inmuno1. , 138; 4023-4032
[1987]). Brevemente, las células tumorales son propagadas in vitro en cultivos celulares. Antes de la inyección en los anímale, las líneas celulares se lavan y suspenden en regulador, a una densidad celular de aproximadamente 10 x 106 hasta 10 x 107 células/mi. Los animales son entonces infectados subcutáneamente con 10 hasta 100 µ? de la suspensión celular, esperando de 1 a 3 semanas para que aparezca un tumor.
Además, el carcinoma de pulmón de ratón de Lewis (3LL) , el cual es uno de los tumores experimentales más extensamente estudiados, puede usarse como un modelo de tumor experimental. La eficiencia en este modelo de tumor se ha correlacionado con los efectos benéficos en el tratamiento de pacientes diagnosticados con carcinoma de células pequeñas del pulmón (SCCL) . Este tumor puede introducirse en ratones normales por inyección de fragmentos de tumor de un ratón afectado ó de células conservadas en cultivo (Zupi y colaboradores, Br. J. Cáncer, 41:suppl. 4:309
[1980], y la evidencia indica que los tumores pueden ser iniciados desde la inyección de igualmente una sola célula y que una muy alta proporción de células tumorales infectadas sobrevive. Para información adicional acerca de este modelo de tumor ver, Zacharski, Haemostasis, 16:300-320
[1986]).
Una manera de evaluar la eficiencia de un compuesto de prueba en un modelo animal es el tumor implantado midiendo el tamaño del tumor antes y después del tratamiento.
Tradicionalmente, el tamaño de los tumores implantados se ha medido con vernier en dos ó tres dimensiones. La medida limitada a dos dimensiones no refleja precisamente el tamaño del tumor, por consiguiente es usualmente convertida 5 al volumen correspondiente por utilización de una fórmula matemática. Sin embrago, la medida del tamaño del tumor es muy imprecisa. Los efectos terapéuticos de un fármaco candidato puede describirse mejor como retardo en el crecimiento inducido por el tratamiento y retardo en el \^__, 10 crecimiento especifico. Otra variable importante en la descripción del crecimiento de tumor es el tiempo en el que se duplica el volumen del tumor. Programas de cómputo para el cálculo y descripción del crecimiento de tumor están también disponibles, tales como el programa reportado por 15 Rygard y Spang-Thomsen, Proc. 6 th Int. Workshop on Immune- Deficient Animáis, Wu y Sheng eds., Basel, 1989, 301. Se hace notar, sin embargo, que las respuestas inflamatorias y de necrosis después del tratamiento pueden actualmente dar como resultado un aumento en el tamaño del tumor, al menos 20 inicialmente. Por consiguiente, estos cambios necesitan ser cuidadosamente monitoreados, por una combinación de un método morfométrico y análisis citométrico de flujo.
Modelos de animales recombinantes (transgénicos) 25 pueden ser diseñados por introducción de la porción codificadora de los genes identificados en la presente en el genoma de animales de interés, utilizando técnicas estándares para producir animales transgénicos . Los animales que pueden servir como un objetivo para las manipulaciones transgénicas incluyen, sin limitación, ratones, ratas, conejos, cobayos, ovejas, cabras, cerdos, y primates no humanos, por ejemplo, baboons, chimpancés, y monos. Las técnicas conocidas en la materia para introducir un transgen en tales animales incluyen microinyección pronucleica (Hoppe y Wanger, patente USA No. 4,873,191); transferencia genética mediada por retrovirus en lineas genéticas (por ejemplo, Van der Putten y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:6148-615
[1985]); selección de objetivos genéticos en células germinales embrionarias (Thompson y colaboradores, Cell, 56:313-321
[1989]); electroporación de embriones (Lo, Mol. Cell. Biol. 3:1803-1814
[1983]) ; transferencia genética mediada por esperma (Lavirano y colaboradores, Cell, 57:717-73
[1989]). Para revisión, ver, por ejemplo, la Patente USA No. 4,736,866.
Para el propósito de la presente invención, los animales transgénicos incluyen aquellos que llevan el transgen solamente en parte de sus células ("animales mosaico") .El transgen puede estar integrado ya sea como un solo transgen, ó en concatámeros, por ejemplo, tándems de cabeza-a-cabeza ó cabeza-a-cola. La introducción selectiva de un transgen en un tipo celular particular es también posible siguiendo/ por ejemplo/ la técnica de LasJo y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:6232-636 (1992) .
La expression del transgen en animales transgénicos puede monitorearse por técnicas estándares. Por ejemplo, pueden usarse el análisis por manchado Southern ó por amplicifación por PCR para verificar la integración del transgen. El nivel de expresión de mRNA puede entonces ser analizado utilizando técnicas tales como hibridización in situ, análisis por manchado Northern, PCR, ó inmunocitoquimica. Los animales se examinan adicionalmente para signos de desarrollo de tumor ó de cáncer.
Alternativamente, pueden construirse animales "agotados" , los cuales tienen un gen defectuoso ó alterado que codifica al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 ó PR0317 identificado en la presente, como un resultado de recombinación homologa entre el gen endógeno que codifica al polipéptido y el DNA genómico alterado que codifica al mismo polipéptido introducido en un célula embrionaria del animal. Por ejemplo, cDNA que codifica al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 puede usarse para clonar al DNA genómlco que codifica a ese polipéptido de conformidad con técnicas establecidas. Una porción del DNA genómico que codifica a un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 particular puede ser eliminado ó reemplazado con otro gen, tal como un gen que codifica a un marcador seleccionable que se puede usar para monitorear la integración. Típicamente, varios kilobases de DNA laterales no alterados (ambos en los extremos 5' y 3' ) se incluyen en le vector [ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homologa]. Se introduce el vector en una línea celular germinal embrionaria (por ejemplo, por electroporación) y se seleccionan las células en las cuales el DNA introducido se ha recombinado homólogamente con el DNA endógeno [ver por ejemplo, Li y colaboradores, Cell, 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan entonces en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón ó rata) para formar quimeras de agragación [ver por ejemplo, Bradley, en Tetracarcinomas and Embryonic Stem Cell: a Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Puede implantarse entonces un embrión quimérico en un animal criado por una hembra pseudopreñada adecuada y el embrión llevado a término para criar un animal agotado. La progenie que alberga el DNA recombinado homólogamente en sus células germinales puede identificarse por técnicas estándares y usarse para animales de cria en las cuales todas las células del animal contienen el DNA recombinado homólogamente. Los animales agotados pueden caracterizarse por ejemplo, por su capacidad para protegerse de ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debido a ausencia del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317.
La eficiencia de los anticuerpos para enlazar específicamente a los polipéptidos identificados en la presente y a otros fármacos candidatos, puede probarse también en el tratamiento de tumores animales espontáneos . Un objetivo adecuado para tales estudios es el carcinoma de células escamosas oral del felino (SCC) . El SCC oral del felino es un tumor maligno altamente invasor que es la malignidad oral más común en los gatos, representando hasta 60 % de los tumores orales reportados en estas especies. Raramente se metastasiza en sitios distantes, aunque esta baja incidencia de metástasis puede meramente ser un reflejo del corto tiempo de sobrevivencia para gatos con este tumor. Estos tumores no son usualmente manejables por cirugía, primeramente a causa de la anatomía de la cavidad oral del felino. Actualmente, no hay tratamiento efectivo para este tumor. Previo a entrar en estudio, cada gato se somete a exámenes clínicos completos, biopsia, y es explorado por tomografia computarizada (CT) . Los gatos diagnosticados con tumores de células escamosas oral sublingual se excluyen del estudio. La lengua puede paralizarse como resultado de tal tumor, e igualmente si el tumor se elimina en el tratamiento, los animales no son capaces de alimentarse por si mismos. Cada gato es tratado repetidamente, durante un largo periodo de tiempo. Se tomarán fotografías de los tumores diariamente durante el periodo de tratamiento, y en cada verificación posterior. Después de tratamiento, cada gato se somete a otra exploración de CT. Las exploraciones por CT y radiogramas déla caja torácica se evalúan cada 8 semanas en los sucesivo. Los datos se evalúan para diferencias en sobrevivencia, respuesta y toxicidad en comparación con los grupos control. La respuesta positiva puede requerir evidencia de regresión de tumor, preferiblemente con mejoramiento de la calidad de vida y/ó incremento la esperanza de vida.
Además, otros tumores animales espontáneos, tales como fibrosarcoma, adenocarcinoma, linfoma, crondroma, leiomiosarcoma de perros, gatos, y baboons pueden examinarse también. De éstos el adenocarcinoma mamario en gatos es un modelo preferido cuya apariencia y comportamiento son muy similares a los de los humanos. Sin embargo, el uso de este modelo está limitado por la rara ocurrencia de este tipo de tumor en animales.
K. Ensayos de Selección para Fármacos Candidatos Los ensayos de selección para fármacos candidatos se diseñan para identificar compuestos que enlazan ó forman complejos con los polipéptidos codificados por los genes identificados en la presente, ó de otra manera interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Tales ensayos de selección incluirán ensayos manejables para cribado de alta eficiencia de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar candidatos fármacos de molécula pequeñas candidatos. Las moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos orgánicos e inorgánicos sintéticos, incluyen péptidos, preferiblemente péptidos solubles, fusiones de (poli) péptido-inmunoglobulina, y, en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos poli- y monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos-anti-idiotípicos, y versiones humanizadas ó quiméricas de tales anticuerpos 6 fragmentos, así como también anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanos. Los ensayos pueden efectuarse en una variedad de formatos, que incluyen ensayos de enlace proteína-proteína, ensayos de cribado bioquímico, inmunoensayos y ensayos basados en células, los cuales están bien caracterizados en la materia.
Todos los ensayos son comunes en que atraen para contactar al fármaco candidato con un polipéptido codificado por un ácido nucleico identificado en la presente en condiciones y por un tiempo suficiente para permitir a estos dos componentes interactuar.
En ensayos de enlace, la interacción es enlazar y el complejo formado puede aislarse ó detectarse en la mezcla de reacción. En una modalidad particular, el polipéptido codificado por el gen identificado en la presente ó el fármaco candidato se inmoviliza sobre una fase sólida, por ejemplo, una placa de microtítulo, por uniones covalentes 6 no-covalentes . Las uniones no-covalentes generalmente se logran por recubrimiento de la superficie sólida con una solución del polipéptido y secado. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido a ser inmovilizado puede usarse para anclarlo a la superficie sólida. El ensayo se efectúa por adición del componente no-inmovilizado, el cual puede ser marcado con un marcador detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene al componente anclado. Cuando la reacción es completa se retiran los componentes que no reaccionaron, por ejemplo, por lavado, y se detectan los complejos anclados sobre la superficie sólida. Cuando los componentes no-inmóvilizados originalmente llevan un marcador detectable, la detección del marcador inmovilizado sobre la superficie indica que la formación del complejo ha tenido lugar. Cuando el componente no-inmovilizado originalmente no lleva un marcador, la formación del complejo puede detectarse, por ejemplo, por utilización de un anticuerpo marcado que enlaza específicamente ai complejo inmovilizado.
Si el compuesto candidato interactúa con pero no enlaza a un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 particular codificado por un gen identificado en la presente, su interacción con ese polipéptido puede ser verificada por métodos bien conocidos para detectar las interacciones proteína-proteína. Tales ensayos incluyen procedimientos tradicionales, tales como reticulado, co- inmunoprecipitación, y co-purificación a través de gradientes ó columnas cromatográficas. Además, la interacción proteina-proteina puede ser monitoreada utilizando sistemas genéticos basados en levaduras descritos por Fields y colaboradores [Fields y Song, Nature, 340:245-246 (1989); Chien y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582 (1991)] como describió Chevray y Nathans, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89-5789-5793 (1991)]. Muchos activadores transcripcionales, tales como la levadura GAL4, consiste de dos regiones modulares discretas físicamente, una que actúa como región de enlace de DNA, mientras que la otra funciona como una región de activación de la transcripción. El sistema de expresión de levaduras descrito en las publicaciones anteriores (generalmente mencionados como el "sistema de dos híbrido") tiene la ventaja de esta propiedad, y emplea dos proteínas híbridas, una en la cual la proteína objetivo se fusiona con la región de enlace de DNA de GAL , y la otra, en la cual el candidato que activa a las proteínas se fusiona a la región de activación. La expresión de un gen informador GALl-lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL vía interacción proteina-proteina. Las colonias que contienen polipéptidos interactuantes se detectan con un substrato cromogénico por ß-galactosidasa. Un equipo completo (MATCHMAKER™) para determinar las interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas utilizando la técnica dedos-híbridos está comercialmente disponible de Clontech. Este sistema puede también hacerse extensivo para mapeo de regiones de proteínas involucradas en interacciones de proteínas específicas así como también para detectar residuos de aminoácidos que son cruciales para estas interacciones.
Compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica a PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 identificado en la presentee y otros componentes intra- ó extracelulares pueden verificarse como sigue: usualmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen amplificado y el componente intra- ó extracelular bajo las condiciones y por un tiempo que permita la interacción y el enlace de los dos productos. Par verificar la capacidad de un compuesto de prueba para inhibir el enlace, la reacción se corre en ausencia y en presencia del compuesto de prueba, . Además, puede añadirse un placebo a una tercera mezcla de reacción, para servir como control positivo. El enlace (formación del complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intra- ó extracelular presente en la mezcla se monitorea como se describió anteriormente. La formación de un complejo en la reacción control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba ^ indica que el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de prueba y es compañero de 5 reacción.
Para ensayo para antagonistas, puede añadirse el polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 a una célula paralelamente con el 10 compuesto a ser seleccionado por una actividad particular y la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en presencia del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 indica que el compuesto es un antagonista del polipéptido 15 PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317. Alternativamente, pueden detectarse los antagonistas por combinación del polipéptido PR0187, ^ PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 y un antagonista potencial con receptores del 20 polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 con enlace de membrana ó reeptores recombinantes bajo condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición comparativo. El polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 25 puede estar marcado, tal como por radioactividad, de modo que el número de moléculas del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 que enlazadas al receptor pueden usarse para determinar la efectividad del antagonista potencial. El gen que codifica al receptor puede identificarse por numerosos métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo/ panorámica de ligando y salida de FACS. Coligan y colaboradores, Current Protocols in Immun./ 1(2): Capitulo 5 (1991) . Preferiblemente, se emplea la clonación por expresión que se emplea en RNA poliadenilado se prepara desde una célula responsable en el polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 y una biblioteca de cDNA creada desde este RNA se divide em grupos y se usa para transfectar células COS u otras células que no son responsables en el polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317. las células transíectadas que no crecieron sobre placas de vidrio se exponen al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 marcado. El polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 puede ser marcado por una variedad de medios que incluyen iodación ó inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa en sitio-específico. Continuando con la fijación y la incubación, las placas se cometen a análisis autoradiográfico . Se identifican los grupos positivos y se preparan los sub-grupos y se transfectan utilizando un sub-agrupamiento interactivo y proceso de re-selección, eventualmente se produce un solo clon que codifica al receptor putativo.
Como un procedimiento alternativo para identificación de receptores, el polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 puede ser enlazado por fotoafinidad con la membrana celular ó preparaciones de extractos que expresan a la molécula receptora. El material reticulado se resuelve por PAGE y se expone a película de rayos-X. El complejo marcado que contiene el receptor puede ser excisado, resuelto en fragmentos de péptido, y sometido a micro-secuenciación de proteina. La secuencia de aminoácido obtenida de la micro-secuenciación se utilizará para diseñar un grupo de sondas de oligonucleótidos degeneradas para cribar una biblioteca de cDNA para identificar al gen que codifica al receptor putativo.
En otro ensayo para antagonistas, células de mamíferos ó preparaciones de membrana que expresan al receptor se incubarían con el polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 marcado en presencia del compuesto candidato. La capacidad del compuesto para mejorar ó bloquear esta interacción podría entonces ser medida.
Ejemplos más específicos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que enlaza a la fusión de inmunoglobulinas con el polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317, y en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos poli- y monoclonales , anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos anti-idiotípicos, y versiones quiméricas y humanizadas de tales anticuerpos ó fragmentos, así como también anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanos. Alternativamente, un antagonista potencial puede esta próximamante relacionado con la proteína, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 que reconoce el receptor pero que no imparte efecto, con lo que inhibe comparativamente la acción del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317.
Otro antagonista potencial del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 es un RNA antisentido ó construcción de DNA preparada utilizando tecnología antisentido, en donde, por ejemplo un RNA antisentido ó molécula de DNA actúan para bloquear directamente la translación de mRNA por hibridización del RNA seleccionado y prevención de la translación de la proteína. La tecnología antisentido puede usarse para control de la expresión genética por medio de la formación de triple-hélice ó DNA ó RNA antisentido, ambos de dichos métodos están basados en enlace de un polinucleótido a DNA ó RNA. Por ejemplo, la porción codificadora de 5' de la secuencia de polinucleótidos, que codifica a los polipéptidos PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 ó PR0317 maduros de la presente, es usado para designar un oligonucleótido de RNA antisentido de desde aproximadamente 10 hasta 40 pares de bases de extensión. Un oligonucleótido de DNA se designa par ser complementario de una región del gen involucrada en la transcripción (triple-hélice- ver Lee y colaboradores, Nucí. Acids. Res. 6:3073 (1979); Cooney y colaboradores, Science, 241: 456 (1988); Dervan y colaboradores, Science, 251: 1360 (1991)), previniendo de ese modo la transcripción y la producción del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317. El oligonucleótido de RNA antisentido hibridiza al mRNA in vivo y bloquea la translación de la molécula de mRNA en el polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246 ó PR0317 (antisentido - Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expresión (CRC Press: Boca Ratón, FL, 1988) . Los oligonucleótidos descritos anteriormente pueden también ser liberados en células de modo que el RNA ó DNA antisentido pueda ser expresado in vivo para inhibir la producción del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317. Cuando se usa el DNA antisentido, oligonucleótidos se prefiere derivados del sitio de iniciación de translación, por ejemplo, entre aproximadamente las posiciones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del gen objetivo.
Las moléculas de RNA ó DNA son generalmente al menos aproximadamente 5 bases de extensión, aproximadamente 10 bases de extensión, aproximadamente 15 bases de extensión, aproximadamente 25 bases de extensión, aproximadamente 30 bases de extensión, aproximadamente 35 bases de extensión, aproximadamente 40 bases de extensión, aproximadamente 45 bases de extensión, aproximadamente 50 bases de extensión, aproximadamente 55 bases de extensión, aproximadamente 60 bases de extensión, aproximadamente 65 bases de extensión, aproximadamente 70 bases de extensión, aproximadamente 75 bases de extensión, aproximadamente 80 bases de extensión, aproximadamente 85 bases de extensión, aproximadamente 90 bases de extensión, aproximadamente 100 bases de extensión, ó más.
Antagonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas que enlazan al sitio activo, el sitio de enlace receptor, ó factor de crecimiento u otro sitio de enlace relevante del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317, bloqueando así la actividad biológica normal del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, péptidos pequeños ó moléculas similares a péptidos, preferiblemente péptidos solubles, y compuestos orgánicos ó inorgánicos no-peptídilos sintéticos.
Los ribozimas son moléculas de RNA enzimáticas capaces de catalizar la fragmentación especifica de RNA. Las ribozimas actúan por hibridización específica de secuencia en el RNA objetivo complementario, seguido por la fragmentación endonucleolítica. Los sitios de fragmentación de ribozima específicos en un RNA objetivo potencial pueden identificarse por técnicas conocidas. Para detalles adicionales ver, por ejemplo, Rossi, Current Biology, : 469-471 (1994), y publicación de PCT No. WO 97/33551 (publicada en Septiembre 18 de 1997) .
Las moléculas de ácido nucleico en formación de triple hélice usadas para inhibir la transcripción serian de un solo filamento y compuestas de desoxinucleótidos . La composición base de estos oligonucleótidos se designa de manera que promueva la formación de triple-hélice vía las reglas de emparejamiento de bases de Hoogsteen, la cual generalmente requiere extensiones clasificables por tamaño de purinas ó pirimidinas sobre una sola cadena de un dúplex. Para detalles adicionales, ver, por ejemplo, la publicación de PCT No. WO 97/33551, supra.
Estas moléculas pequeñas pueden identificarse por alguna ó más de los ensayos de cribado discutidos anteriormente y/ó por cualquier otra técnica bien conocida por los expertos en la materia.
L. Composiciones y Métodos para el Tratamiento de Tumores Las composiciones útiles en el tratamiento de tumores asociado con la amplificación de los genes identificados en la presente incluyen, sin limitación, anticuerpos, moléculas orgánicas e inorgánicas pequeñas, péptidos, fosfopéptidos, moléculas de ribozima y antisentido, moléculas de triple-hélice, etc. Que inhiben la expresión y/ó actividad del producto genético objetivo.
Por ejemplo, la molécula de NA y RNA antisentido actúa para bloquear directamente la translación de mRNA por hibridización del mRNA objetivo y previene la translación de la proteína. Cuando se usa el DNA antisentido, los oligodesoxiribonucleótidos derivados del sitio de iniciación de trasnlación, por ejemplo, se prefieren entre aproximadamente las posiciones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del gen objetivo.
Las ribozimas son moléculas de RNA enzimáticas capaces de catalizar la división especifica de RNA. Las ribozimas actúan para hibridización específica de la secuencia en el RNA objetivo complementario, seguido por división endonucleolítica. Los sitios de división de ribozima específicos en un RNA objetivo potencial pueden identificarse por técnicas conocidas. Para etalles adicionales ver, por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4 : 469-471 (1994), y publicación de PCT No. WO 97/33551 (publicado el 18 de Septiembre de 1997) .
Las moléculas de ácido nucleico en formación de triple-hélice usadas para inhibir la transcripción serian de un solo filamento y estarían compuestas de desoxinucleótidos. La composición de bases de este oligonucleótido se designa de modo que promueva la formación en triple-hélice vía las reglas de empare amiento de bases de Hoogsteen, la cual generalmente requiere selección por tamaños de las extensiones de purinas ó pirimidinas sobre una cadena de un dupletc. Para detalles adicionales ye, por ejemplo, publicación de PCT No. WO 97/33551, supra.
Estas moléculas pueden identificarse por cualquier ensayo ó combinación de ensayos de cribado discutidos anteriormente y/ó por cualquier otra técnica bien conocida por los expertos en la materia.
M. Anticuerpos Alguno de los candidatos a fármaco más prometedores conforme a la presente invención son los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos los cuales pueden inhibir la producción ó el producto genético de los genes amplificados identificados en la presente y/ó reducir la actividad de los productos genéticos. 1. Anticuerpos Policlonales Los métodos para preparar anticuerpos policlonales son bien conocidos por los expertos. Los anticuerpos policlonales pueden ser aumentados en mamíferos/ por ejemplo, por una ó más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/ó adyuvante será inyectado en el mamífero por inyecciones subcutáneas 6 intraperitoneales múltiples. El agente inmunizante puede incluir el polipéptidp PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 ó una proteína de fusión de éste. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante con una proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero que está siendo inmunizado. Ejemplos de tal proteína inmunogénica incluyen pero no se limitan a hemocianina de insecto, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, e tripsina de soya inhibidora. Ejemplos de adyuvantes que pueden ser empleados incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante PL-TD (Lípido A monofosforilo , dicorinomicolato de trealosa sintético ) . El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por un experto en la materia sin experimentación indebida. 2. Anticuerpos onoclonales Los anticuerpos anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211# anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246 ó anti-PR0317 pueden, alternativamente, ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kholer y Milstein, Nature, 256:495 (1975) . En un método de hibridoma, un ratón, hámster, ú otro animal huésped apropiado, es inmunizado típicamente con un agente inmunizante para fomentar los linfocitos que producen ó son capaces de producir anticuerpos que enlazaran específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro.
Los agentes inmunizantes incluirán típicamente al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317, que incluye fragmentos ó una proteína de fusión de tales proteínas ó un fragmento de los mismos. Generalmente, son usados ya sea linfocitos de sangre periférica (vPBLs") si se desean células dé origen humano, ó bien células de bazo ó se usan células de nodulo linfático si se desean fuentes de mamífero no humano. Los linfocitos son entonces fusionados con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión, tal como el polietilen glicol, para formar una célula hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. Las lineas celulares inmortalizadas son usualmente transformadas en células de mamíferos, particularmente células mieloma de orígen roedor, bovino y humano. Usualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de ratón. Las células hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que contenga preferiblemente una ó más substancias que inhiban el crecimiento ó sobrevivencia de células inmortalizadas, no fusionadas. Por ejemplo, si las células genitoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforil transferasa (HGPRT ó PRET=, el medio de cultivo para hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopetrina, y ti idina ("medio HAT"), dichas substancias previenen el crecimiento de células HGPRT-deficientes .
Líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que fusionan eficientemente, apoyan de manera estable el alto nivel de expresión del anticuerpo, por las células prductoras del anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Líneas celulares inmortalizadas preferidas son líneas de mieloma de murina, las cuales pueden obtenerse, por ejemplo, de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la american Type Culture Colection (ATCC) , Mannassas, Virginia.Lineas celulares de mieloma humano y de heteromieloma humano-ratón han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984); Brodeur y colaboradores Monoclonal Antibody Production Techniques and Application, Marcel Dekker, Inc., New York (1987) pp. 51-63]. el medio de cultivo en el se cultivan las células hibridoma pueden entonces ensayarse para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317. Preferiblemente, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonale sproducidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación ó por un ensayo de enlace in vitro, tal como radioinmunoensayos (RIA) ó ensayos inmunoabsorbentes unido a enzimáticos (ELISA) . Tales técnicas y ensayos son conocidos en la materia. La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse por el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem, 107:220 (1980) .
Después de que se identifican las células de hibridoma, los clones pueden ser subclonados por procedimientos de dilución limitante y crecimiento por métodos estándares [Goding, supra]. El medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, Dulbecco's Modified Eagle's Médium y medio RPMI-1640. alternativamente, las células hibridoma pueden crecer in vivo como ascitas en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse ó purificarse desde el medio de cultivo ó fluido de ascitas por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteina A-Sepharose, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis sobre gel, diálisis, ó cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales pueden elaborarse por métodos de DNA recombinante, tales como los descritos en la Patente USA No. 4,816,567. El DNA que codifica a los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse fácilmente y ser secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, por utilización de sondas de oligonucleótidos que son capaces de enlazar específicamente a los genes que codifican a las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de murina) . Las células de hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de tal DNA. Una vez aislado, el DNA puede colocarse en vectores de expresión, los cuales son entonces transfectados en células huéspedes tales como células COS simianas, células de hámster chino (CHO) , ó células de mieloma que no producen de otra manera proteina inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células huéspedes recombinantes . El DNA también puede ser modificado, por ejemplo, por substitución de la secuencia codificante por las regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias homologas de murina [Patente USA No. 4,816,567; Morrison y colaboradores, supra] ó por unir covalentemente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina toda ó parte de la secuencia que codifica para un polipéptido no-inmunoglobulina. Un polipéptido no-inmunoglobulina puede ser substituido por las regiones constantes de un anticuerpo de la invención, ó puede ser substituido por las regiones variables de un sitio combinante de antigeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los métodos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, un método involucra la expresión recombinante de la cadena pesada modificada y cadena ligera de inmunoglobulina. La cadena pesada es truncada generalmente en cualquier punto en la refión Fe de modo de prevenir el entrecruzamiento de la cadena pesada. Alternativamente, se substituyen residuos cisteina relevantes con otros residuos de aminoácidos ó son eliminados de modo de prevenir las ligaduras transversales.
Son también adecuados los métodos in vivo para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, puede lograrse utilizando técnicas de rutina conocidas en la materia. 3. Anticuerpos Humanizados y Humanos Los anticuerpos anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246 ó anti-PR0317 pueden comprender adicionalmente anticuerpos humanizados ó anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no-humanos (por ejemplo, de murina) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas ó fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos con enlace antigénico) los cuales contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no-humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulina humana (anticuerpo receeptor) en el cual los residuos de una CDR de unas especies no-humanas (anticuerpo donante) tal como ratón, rata ó conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, residuos de estructura Fv de la inmunoglobuli a humana son reemplazados por los residuos no-humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden también comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en la CDR ó secuencias de estructura importadas. En general el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todas de al menos una, y típicamente dos, regiones variables, en las cuales todas ó substancialmente todas de las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no-humana y todas ó substancialmente todas de las regiones FR son las de una secuencia consensus de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones y colaboradores, Nature, 321:522-525 (1986); Riechman y colaboradores, Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol . , 2:593-596 (1992)].
Métodos para humanizar anticuerpos no-humanos son bien conocidos en la materia. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno ó más residuos de aminoácidos introducidos en él desde una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no-humanos son a menudo mencionados como residuos "importados", los cuales son típicamente tomados de una región variable "importada". La humanización puede efectuarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones y colaboradores, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann y colaboradores, Nature, 332:323-327 81988); verhoeyen y colaboradores, Science, 239:1534-1536 81988)], por substitución las secuencias de CDR ó CDRs de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos {Patente USA No. 4,816,567), en donde substancialmente menos de una región variable humana intacta ha sido substituida por la secuencia correspondiente de unas especies no-humanas. En práctica, los anticuerpos humanizados, son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR son substituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos pueden también producirse utilizando varias técnicas conocidas en la materia, que incluyen bibliotecas de exposición de fago [Ogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991) Marks y colaboradores, J. Mol. 3iol. 222:581 (1991)]. Las técnicas de Colé y colaboradore, y Boerner y colaboradores, están también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé y colaboradores, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner y colaboradores, J, Immunol . , 147(1): 86-95 (1991)]. Similarmente, anticuerpos humanos pueden elaborarse por introducción de inmunoglobulina loci humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes de la inmunoglobulina endógena han sido parcial ó completamente inactivados. Por desafio, se observa la producción de anticuerpos humanos, la cual se asemeja muy estrechamente a la vista en humanos con respecto a todo, incluyendo re-disposición genética, montaje, y repertorio del anticuerpo. Este procedimiento se describe, por ejemplo, en las Patentes USA Nos. 5,545, 807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,661,016; y las siguientes publicaciones científicas: Marks y colaboradores, Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Lonberg y colaboradores, Nature, 368:856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-13 (1994); Fish ild y colaboradores, Nature Biotechnology, 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Re . Immunol., 13:65-93 (1995). 4. Terapia con Pro-fármaco Mediada por Enzima dependiente de anticuerpo (ADEPT) Los anticuerpos de la presente invención pueden 5 también usarse en ADEPT por conjugación del anticuerpo a una enzima activadora de un pro-fármaco la cual convierte un pro-fármaco (por ejemplo agentes quimioterapéuticos peptidilos, ver WO 81/01145) en un fármaco anti-cáncer activo. Ver, por ejemplo, WO ( ^10 88/07378 y la Patente USA No. 4,975,278.
El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADPT incluye una enzima capaz de actuar sobre un pro-fármaco de tal manera para convertirlo en una forma 15 citotóxica, más activa.
Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no se limitan a, glicosidasa, glucosa oxidasa, lisozima human, glucuronidasa humana, 20 fosfatasa alcalina útil para convertir pro-fármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir pro-fármacos que contienen sulfato en fármacos libres; proteasas, tales como proteasa serratia, termolisina, ssubtilsina, carboxipeptidasa 25 (por ejemplo, carboxipeptidasa G2 y carboxipeptidasa A) y catepsinas (tales como catepsina B y L) , que son útiles para convertir pro-fármacos que contienen ^ péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir pro-fármacos que contienen 5 substituyentes D-aminoácidos; enzimas fragmentadoras de carbohidratos tales como ß-galactosidasa y neuramidasa útil para convertir pro-fármacos glicosiladcs en fármacos libres; ß-lactamasa útil para convertir fármacos derivados con ß-lactamas en los fármacos ^lO libres; y penicilina amidasas, tales como la penicilina Vamidasa ó Penicilina G amidasa, útil para convertir derivados de fármacos en sus nitrógenos aminados con grupos fenoxiacetilo ó fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, anticuerpos con 15 actividad enzimática, también conocidos en la materia como "abzimas" pueden usarse para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (ver, por ejemplo, Massey, Nature, 328:457-458 (1987)). Conjugados anticuerpo-abzima pueden prepararse como se 20 describe en la presente por liberación de la abisma en una población de células tumorales.
Las enzimas de esta invención pueden ser enlazadas covalentemente a los anticuerpos aanti-PR0187, anti- 25 PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246 ó anti-PR0317 por técnicas bien conocidas en la materia tales como el uso de agentes con ligadura transversal heterobifuncionales discutidos anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de enlace antigénico del anticuerpo de la invención unida a al menos una porción activa funcionalmente de una enzima de la invención pueden ser construidas utilizando técnicas de DNA recombinante bien conocidas en la materia (ver, por ejemplo, Neuberger y colaboradores, Nature, 312:604-608 (1984)). 5. Anticuerpos bi-especifieos Los anticuerpos bi-específicos son monoclonales, preferiblemente humanos ó humanizados, anticuerpos que tienen especificidades de enlace por al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de enlace es para el PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 la otra es para cualquier antigeno, y preferiblemente para una proteína ó receptor ó sub-unidad receptora de superficie celular.
Métodos para elaborar anticuerpos bi-especificos son conocidos en la materia. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos bi-especifieos está basada en la co-expresión de dos pares de cadena-ligera/cadena-pesada de inmunoglobulinas, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539
[1983]. A causa de la selección aleatoria de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez diferentes moléculas de anticuerpos, de los cuales solamente uno tiene la estructura bi-especifica correcta. La purificación de la molécula correcta es usualmente lograda por etapas de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares son descritos en WO 93/08829, publicada el 13 de Mayo de 1993, y en Traunecker y colaboradores, EMBO J. 10:3655-3659 (1991).
Las regiones variables de los anticuerpos con las especificidades de enlace (sitios que combinan antígeno-anticuerpo) pueden ser fusionadas a las secuencias de la región constante de inmunoglobulina. La fusión preferiblemente es con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones CH2 y CH3 principales. Se prefieree tener la primera región constante de cadena pesada (CK1) que contenga el sitio necesario para enlace de la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los DNAs que codifican a las fusiones de cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, a la cadena ligera de inmunoglobulina, son insertados en vectores de expresión separados, y son co-transfectados en un organismo huésped adecuado. Para detalles adicionales de generación de anticuerpos bi-especificos ver, por ejemplo, Suresh y colaboradores, Methods in Enzymology, 121:210 (1986) .
De conformidad con otro procedimiento descrito en WO 96/27011, la interface entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser diseñada para maximizar el porcentaje de heterodimeros los cuales son recuperados del cultivo celular recombinante. La interface preferida comprende al menos una parte de la región CH3 de una región constante del anticuerpo. En este método, una ó más cadenas laterales de aminoácidos pequeños desde la interface de la primera molécula del anticuerpo son reemplazadas con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina ó triptofano) . "Cavidades" compensadoras de tamaño idéntico ó similar en las cadenas laterales grandes son creadas sobre la interface de la segunda molécula del anticuerpo por reemplazo de cadenas laterales de aminoácidos grandes con unas pequeñas (por ejemplo, alanina ó treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar la producción del heterodimero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros .
Los anticuerpos bi-especificos pueden prepararse como anticuerpos de extensión total ó fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos bi-especificos F(ab')2). Se han descrito en la literatura, técnicas para generar anticuerpos bi-especificos desde fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, anticuerpos bi-especificos pueden prepararse utilizando unión química. Brennan y colaboradores, Science, 229:81 (1985) describe un procedimiento en el que anticuerpos intactos son fragmentados proteoliticamente para generar fragmentos F(ab')2. estos fragmentos son reducidos en la presencia de agente para la formación de complejos ditiol, arsenito de sodio para estabilizar ditioles vecinales y prevenir la formación de disulfuro molecular. Los fragmentos ab' generados son entonces convertidos a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fabf -TNB es entonces reconvertido en el Fab' -tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo bi-especifico. Los anticuerpos bi-especificos producidos pueden ser usados como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Los fragmentos Fab' pueden ser recuperados directamente de E. coli y químicamente acoplados para formar anticuerpos bi-específicos . Shalaby y colaboradores, J. Exp. ed. 175:217-225 (1992) describe la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo bi-especifico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' fue secretado separadamente de E. coli y sometido a acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo bi-especifico. El anticuerpo bi-específico así formado fue capaz de enlazar a células que sobre-expresan al receptor de ErbB2 y a células T humanas, así como también activar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de seno humano.
Varias técnicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpos bi-específicos directamente de cultivos celulares recombinantes se han descrito también. Por ejemplo, se han producido anticuerpos bi-específicos utilizando cierres leucina. Kostelny y colaboradores, I munol., 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptido con cierre leucina de las proteínas Fos y Jun fueron unidos a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión genética. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región principal para formar monómeros y entonces se re-oxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este método puede también utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología "di-anticuerpo" descrita por Hollinger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para elaborar fragmentos de anticuerpo bi-específicos . Los fragmentos comprenden una región variable de cadena pesada (VH) conectada a una región variable de cadena ligera (VL) por un eslabón el cual es suficientemente corto para permitir en emparejamiento entre las dos regiones sobre la misma cadena. Por consiguiente, las regiones VH y VL de un fragmento son forzadas emparejar con las regiones VL y VH complementarias de otro fragmento, con lo cual se forman dos sitios de enlace antigénico. Se ha publicado, otra estrategia para elaborar fragmentos anticuerpo bi-específicos por el uso de dimeros Fv(sF„) de una sola cadena. Ver, Gruber y colaboradores, J. Immunol. 152:5368 81994).
Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, anticuerpos bi-específicos pueden .N preparase. Tutt y colaboradores, J. Immunol., 147-60 ^ (1991). 5 Anticuerpos bi-especificos ejemplares pueden enlazar a dos epítopes diferentes sobre un polipéptido dado de la presente. Alternativamente, un brazo anti- pilpéptido puede ser combinada con un brazo que enlaza a ^ 10 una molécula activadora sobre un leucocito tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28 ó B7), ó receptores de Fe para IgG (FcXR), tal como Fetal (CD64), Fc RII (CD32) y FcXRIII (CD16) asimismo en cuanto al enfoque de los mecanismos de 15 defensa celular de la célula que expresa al polipéptido particular los anticuerpos bi-específicos pueden también usarse para localizar agentes citotóxicos para células ^ que expresan a un polipéptido particular. Estos anticuerpos poseen un brazo que enlaza al polipéptido y 20 un brazo que enlaza a un agente citotóxico ó a un radionucluro quelador, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, ó TETA. Otro anticuerpo bi-específico de interés enlaza al polipéptido y adicionalmente enlaza al factor de tejido (TF) . 25 6. Anticuerpos Heteroconjugados Los anticuerpos heteroco jugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente . Tales anticuerpos han sido , por ejemplo, propuestos para objetivo de células del sistema inmune de células indeseables [WO 91/00360; O 92/200373; EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos puedan prepararse in vitro utilizando métodos conocidos en química de proteínas sintéticas, que incluyen aquellos que involucran agentes con ligadura trasnversal. Por ejemplo se pueden construir inmunotoxinas utilizando una reacción de intercambio de disulfuro ó por formación de un enlace tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4- mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la Patente USA No. 4,676,980. 7. Diseño de Funciones Efectoras Puede desearse modificar el anticuerpo de la invención con respecto a funciones efectoras, de modo de mejorar la efectividad del anticuerpo en el tratamiento del cáncer, por ejemplo. Por ejemplo, pueden introducirse residuos de cisteína en la región Fe, permitiendo asi la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado asi puede tener capacidad de internalización mejorada y/ó muerte celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) incrementada. Ver, Carón y colaboradores, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Im unol., 148:2918-2922(1992) . Pueden también prepararse anticuerpos homodiméricos con capacidad anti-tumoral mejorada, utilizando ligaduras transversales heterobifuncionales como se describe en Wolf y colaboradores, Cáncer Research, 53:2560-2565 (1993) . Alternativamente, un anticuerpo puede ser diseñado de manera que tenga regiones Fe duales y puede asi tener lisis de complemento y capacidades ADCC mejoradas. Ver, Stevenson y colaboradores, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). 8. Inmunocon ugados La invención también pertenece a inmunoco ugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal como un agente guimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina activa enzimáticamente de origen bacteriano, fúngico, planta ó animal, ó fragmentos de estas, ó una toxina de molécula pequeña) , ó un isótopo radioactivo (por e emplo, un radiocon ugado) .
Se han descrito anteriormente agentes 5 quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoco jugados. Toxinas proteinicas activas enzimáticame te y fragmentos de las mismas que pueden usarse incluyen cadena de la difteria A, fragmentos activos no enlazantes de la toxina de difteria, toxina del cólera, ^10 tóxina botulinus, cadena de la exotoxina A (de Pseudomona aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa sarcina, proteínas de aleurites fordii, proteínas diantinas, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de caranda mo crdica, , 15 inhibidor de saponaria officinalis, gelonina, saporina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, eno icina y las tricotecenos . Las toxinas de molécula pequeña incluyen, por ^ ejemplo, caliceamicinas, mantaisinoides, palitoxinas y CC1065. Una variedad de radionucleótidos están disponibles 20 para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186 e.
Los conjugados de los anticuerpos y agentes citotóxicos se hacen utilizando una variedad de agentes de 25 acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridiltiol) (5PDP) , iminotiolato (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL) ) , ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehido) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina) , derivados de bis-diazonium (tales como bis- (p-diazoniumbenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como 2, 6-diisocianato de tolieno) , y compuestos de flúor bis activo (tales como 1, 5-difluoro-2, 4—dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta y colaboradores, Science, 238:1098 (1987) .Carbón-14-marcado ácido 1- isotiocianato bencil- 3- metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Ver, WO 94/11026.
En otra modalidad, el anticuerpo puede estar conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilización en tumor preseleccionado en el que el conjugado receptor-anticuerpo se administra al paciente, seguido por el retiro de conjugado no enlazado de la circulación utilizando un agente limpiador y entonces administración de un "ligando (por ejemplo, avidina) la cual está conjugada a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido) . 9. Inmunoliposomas Los anticuerpos descritos en la presente, pueden también estar formulados como liposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la materia, tal como describe Epstein y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 82:3688 (1985); Hwang y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); y Patentes USA Nos. 4,485,045 y4, 544, 545. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se exponen en la Patente USA No. 5,013,556.
Liposomas particularmente útiles pueden generarse por el método de evaporación en fase inversa con una composición lipidica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE) . Los liposomas son extrudados a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden estar conjugados a los liposomas como se describió en Martin y colaboradores, J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) via una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como Doxorubicina) está contenido óptimamente en el liposoma.
Ver, Gabizon y colaboradores, J. National Cáncer Inst. 81 (19): 1484 (1989).
N. Composiciones Farmacéuticas Anticuerpos que enlazan específicamente el producto de un gen amplificado identificado en la presente, así como también otras moléculas identificadas por ensayos de cribado descritas anteriormente, pueden administrarse para el tratamiento de tumores, incluyendo cánceres, en la forma de composiciones farmacéuticas.
Si la proteína codificada por el gen amplificado es intracelular y se usaron anticuerpos completos como inhibidores, se prefiere los anticuerpos que se interiorizan. Sin embargo, lipofecciones ó liposomas pueden también usarse para liberar el anticuerpo. Ó fragmentos de un anticuerpo, en células. En donde se usan los fragmentos del anticuerpo, se prefieren los fragmentos inhibidores más pequeños, los cuales específicamente enlazan a la región de enlace de la proteína seleccionada. Por ejemplo con base en las secuencias de región variable de un anticuerpo, moléculas peptídicas pueden diseñarse, las que retienen la habilidad para enlazar a la secuencia proteínica objetivo. Tales péptidos pueden sintetizarse químicamente y/ó producidas por tecnología de DNA recombinantes (ver, por ejemplo, arasco y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893
[1993]).
Se preparan para almacenar las formulaciones terapéuticas del anticuerpo, por mezcla del anticuerpo que tiene el grado de pureza con vehículos, excipientes ó estabilizantes farmacéuticos aceptables opcionales, (Remington' s Pharmaceutical Sciences , 16th. Edición, Osol, A. Ed.
[1980]) , en la forma de formulaciones liofiiizadas ó soluciones acuosas. Vehículos, excipientes, ó estabilizantes aceptables son no tóxicos en recipientes a las dosis y concentraciones empleadas, e incluye reguladores tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen, ácido ascórbico y metionina; preservativos (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butílico ó bencílico; alquil parabenos tales como metil ó propil parabenos; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol; polipéptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina; ó inmunoglobulinas; polímeros hidrofilicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, aspargina, histidina, arginina, ó lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluye glucosa, ma osa, ó dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manito, trehalosa ó sorbitol; contra-iones formadoras de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos proteina-Zn) ; y/ó surfactantes no-iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ ó polietilen glicol (PEG) .
Compuestos no-anticuerpos identificados por ensayos de cribado de la presente invención pueden formularse de manera análoga, utizando técnicas estándares conocidas en la materia.
La presente formulación puede contener también más de un compuesto activo cuando sea necesario para la indicación particular que es tratada, preferiblemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre si. Alternativamente, ó además, la composición puede comprender un agente citotóxico, citosina ó agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito que se pretende.
Los ingredientes activos pueden también estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por ^ técnicas de coacervación ó por polimerización ínte facial, ^ por ejemplo, microcápsulas de gelatina ó de 5 hidroximetilcelulosa y microcápsulas de poii- (metilmetacilato) , respectivamente, sistemas coloidales de liberación de fármacos (por ejemplo, liposomas microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nano- cápsulas) ó en macroemulsiones. Tales técnicas se describen ^ 10 en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol. A. Ed. (1980) .
Las formulaciones para ser usadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por 15 filtración a través de membranas de filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones para liberación prolongada. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semi-permeables de 20 polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, dichas matrices están en la forma de los artículos conformados, por ejemplo, películas ó microcápsulas. Ejemplos de matrices para liberación prolongada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil- 25 metacrilato) , ó poli (vinilalcohol) ) , poliacturos (patente USA No. 3,773,919, copolimeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, acetato de etilen vinilo no degradable, copolimeros ácido-láctico-ácido glicólico degradable tales como el LUPRON DEPOT ™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero del ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico . Mientras que polímeros tales como acetato de etilen-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico facilitan la liberación de moléculas por durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por períodos de tiempo más cortos. Cuando anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo por largo tiempo, pueden desanturalizarse ó agregarse como un resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad. Se pueden visualizar estrategias racionales para estabilización, dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces -S-S-intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro# se puede lograr la estabilización por modificación de los residuos sulfhidrilo, liofilización de las soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos adecuados, y desarrollo de composiciones con matriz de polímero especifico.
O. Métodos de tratamiento Se contempla que los anticuerpos y otros compuestos antitumorales de la presente invención pueden usarse para tratar varias condiciones, que incluyen aquellas caracterizadas por la sobre-expresión y/ó activación de los genes amplificados identificados en la presente. Condiciones ó transtornos ejemplares a ser tratados con tales anticuerpos y otros compuestos, que incluyen, ambos, no se limitan a, moléculas orgánicas ó inorgánicas pequeñas, péptidos, moléculas antisentido, etc., incluyen tumores benignos y malignos (por ejemplo, carcinomas renal, de hígado, de riñon, de vejiga, de seno, gástrico, de ovario, colon rectal, de próstata, pancreático, de pulmón, vúlvar, de tiroides, hepático; sarcomas; glioblastomas; y varios tumores de cuello y cabeza) ; isquemias y malignidades linfoides; otros transtornos tales como neuronal, glial, astrosita, hipotaláamico y otros trasntornos glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocíticos; y otros transtornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos .
Los agentes anti-tumorales de la presente invención, por ejemplo, anticuerpos, son administrados a un mamífero, preferiblemente a un humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa como un bolus ó por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vías intramuscular, intraperitoneal, intra-cerebroespinal, subcutánea, inter-articular, intrasinovial, intra-raquidea, oral, tópica ó por inhalación. Se prefiere la administración intravenosa. Se pueden combinar otros regímenes terapéuticos con la administración de tales agentes anticáncer, por ejemplo, anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, el paciente a ser tratado con tales agentes anticáncer puede también recibir terapia de radiación. Alternativamente, ó además, puede administrarse al paciente un agente quimioterapéutico. Se pueden usar las preparaciones y dosificaciones programadas para agentes quimioterapéuticos conforme a las instrucciones del fabricante ó como se determine empíricamente por los expertos. Las preparaciones y dosificaciones programadas para la quimioterapia tal se describen también en Chemotherapy Service Ed. . C. Perry, Willaimas & Wilkins, Baltimore, MD (1992) . El agente quimioterapéutico puede preceder, ó seguir a la administración del agente antitumor, por ejemplo, anticuerpo, ó puede se dado simultáneamente con éste. El anticuerpo puede combinarse con un compuesto anti-estrógeno tal como tamoxifeno ó un antiprogesterona como la onapristona (ver, EP 616812) en dosificaciones conocidas de tales moléculas.
Puede ser conveniente también administrar anticuerpos contra otros antigenos asociados a tumor, tales como anticuerpos que enlazan al ErbB2, EGFR, ErbE3, ErbB , ó ai factor endotelial vascular (VEGF) . Alternat amente, ó además, dos ó más anticuerpos que enlazan al mismo ó dos ó más diferentes antigenos descritos en la presente pueden ser co-administrados al paciente. Algunas veces, puede ser benéfico también administrar una ó más citocinas al paciente. En una modalidad preferida, los anticuerpos de la presente son co-administrados con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor del crecimiento puede administrarse primero, seguido por un anticuerpo de la presente invención. Sin embargo, la administración simultánea ó administración del anticuerpo de la presente invención primero se contempla también. Dosis adecuadas del agente inhibidor del crecimiento son aquellos utilizados en la presentee y pueden ser abatidas debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y el anticuerpo de la presente.
Para la prevención ó tratamiento de enfermedades, la dosis apropiada de un agente antitumoral, por ejemplo, un anticuerpo de la presente dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, como se definió anteriormente, la severidad y curso de la enfermedad/ si el agente se administra para propósitos preventivos ó terapéuticos, terapia previa, historia clínica del paciente y respuesta al agente, y la discreción del médico que lo atiende. El agente es administrado adecuadamente al paciente en una sola administración ó durante una serie de tratamientos.
Por ejemplo, dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 ug/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0.1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosis candidata inicial para administración al paciente, si, por ejemplo, por una ó más administraciones separadas, ó por infusión continua. Una dosis diaria típica puede variar desde aproximadamente 1 µg kg ó más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días ó más tiempo, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que una supresión conveniente de los síntomas de la enfermedad tenga lugar. Sin embargo, otros regímenes de dosis pueden ser útiles. El progreso de esta terapia es fácilmente monitoreada por técnicas y ensayos convencionales.
P. Artículos de Fabricación En otra modalidad de la invención, se proporciona un articulo de manufactura que contiene materiales útiles para ^ el diagnóstico ó tratamiento de los transtornos descrieos ^ anteriormente. El articulo de manufactura comprende un 5 contenedor y una etiqueta. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frasquitos, jeringas, y tubos de ensayo. El contendor puede estar formado de una variedad de materiales tales como vidrio ó plástico. El contendor girada una composición que es efectiva para * 10 diagnosticar ó tratar la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el contendor puede ser un saco con solución intravenosa ó un frasquito que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . El agente activo en la composición es usualmente un agente 15 anti-tumor capaz de interferir con la actividad de un producto genético identificado en la presente, por ejemplo, un anticuerpo. La etiqueta sobre ó asociada con, el ^ contenedor indica que la composición es usada para diagnosticar ó tratar la condición de elección. El articulo 20 de fabricación puede adicionalmente contener un segundo contenedor que comprenda un regulados farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina regulada con fosfato, solución de Ringer' s y solución de dextrosa. Puede adicionalmente incluirse otros materiales deseables desde 25 un punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros reguladores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos de empaque con instrucciones para el uso.
Q. Diagnóstico y Pronóstico de Tumores Mientras que las proteínas de superficie celular, tales como receptores de crecimiento sobre-expresados en ciertos tumores son excelentes objetivos para candidatos a fármacos ó tratamiento de tumor (por ejemplo, cáncer}, la misma proteina, junto con proteínas secretadas codificada por los genes amplificados en células tumorales encuentra uso adicional en el diagnóstico y pronóstico de tumores. Por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra los productos proteínicos de genes amplificados en células tumorales pueden usarse como diagnóstico ó pronóstico del tumor.
Por ejemplo, anticuerpos, que incluyen fragmentos de anticuerpos, pueden usarse para detectar cuanlitativa y cuantitativamente la expresión de proteínas codificadas por los genes amplificados ("productos genéticos marcadores") . El anticuerpo preferiblemente está equipado con un marcador detectable, por ejemplo, marcador fluorescente, y el enlace ouede ser monitoreado por microscopía luminosa, citometria de flujo, fluorimetría, u otras técnicas conocidas en la materia. Estas técnicas son particularmente adecuadas, si el gen amplificado codifica a una proteina de superficie celular., por ejemplo, un factor de crecimiento. Tale ^-s ensayos de enlace se efectúan esencialmente como se describe en la sección 5 anterior. 5 La detección in situ del enlace del anticuerpo a los productos genéticos marcadores puede efectuarse, por ejemplo, por inmunofluorescencia ó microscopía inmunoelectrónica. Para este propósito, un espécimen 10 histológico es retirado del paciente y se le aplica un anticuerpo marcado, preferiblemente por sobreposición del anticuerpo sobre una muestra biológica. Este procedimiento también permite determinar la distribución del producto genético marcador en el tejido examinado. Es obvio para el 15 experto en la materia que una amplia variedad de métodos histológicos están fácilmente disponibles para detección in situ.
Se ofrece los siguientes ejemplos solamente con 20 propósito ilustrativo, y no se pretende limitar el alcance de la presente invención en manera alguna.
Todas las referencias a patentes y literatura citadas en la presente especificación se incorporan totalmente a la 25 presente como referencia.
EJEMPLOS Los reactivos comercialmente disponibles mencionados en los ejemplos se utilizaron conforme a las instrucciones del fabricante a menos que se indique de otra manera. La fuente de aquellas células identificadas en los siguientes ejemplos y a lo largo de las espec ficaciones, por números de Acceso a ATCC es la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., anassas, VA 20110-2209. Todos los depósitos originales mencionados en la presente solicitud se hicieron bajo las condiciones del tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito de Procedimientos de Patente y las Reglamentaciones concernientes (Tratado de Budapest) . Esto asegura el mantenimiento de un cultivo factible del depósito por 30 años desde la fecha de depósito. El depósito estará disponible bajo los términos de ATCC del Tratado de Budapest, y sometido a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, el cual asegura disponibilidad permanente e sin restricción de la progenie del cultivo del depósito al público después de la expedición de la Patente USA pertinente ó por exposición al público de cualquier solicitud de patente USA ó extranjera, cualquiera que courra primero, y asegura la disponibilidad de la progenie a alguien determinado por el Comisionado Patentes y Marcas de U.S.A. para ser titular de la misma conforme a 35 UCC § 122 y a las reglas del Comisionado que dan seguimiento a la misma (incluyendo 37 CFR § 1.14 con referencia particular a 886 OG 638) .
A menos que se haga notar de otra manera, la presente invención utiliza procedimientos estándares de tecnología de DNA recombinante, tales como los descritos anteriormente y en los siguientes libros de texto: Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning; a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associated and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innis- y colaboradores, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y., 1990; harlow y colaboradores, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, Qligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R. L. I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan y colaboradores, Current Protocols in Immunology, 1991.
EJEMPLO 1 Aislamiento de Clones de cDNA Codificadores de un PR0187 Humano Se investigó por base de datos de DNA (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceutical/ Palo Alto, CA) una secuencia tag expresada (EST) , y se identificó que exhibe homología con el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF-8) también conocido como factor de crecimiento inducido por andrógeno.
El RNA para la construcción de bibliotecas de cDNA se aisló entonces del tejido de pulmón fetal humano. Las bibliotecas de cDNA usadas para aislar los clones de cDNA Codificadores de Tabla 1 Residuo Substituciones Substituciones Original Ejemplares Preferidas PR0187 humano se construyeron por métodos estándares utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como los de Invitrogen, San Diego, CA. El cDNA fue iniciado con oligo dT que contenia un sitio Notl, unido en el extremo plano a adaptadores hemicinaseados Salí, fragmentado con NotlI, dimensionado apropiadamente por electroforesis sobre gel, y clonado en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pR B ó pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil; ver, Holmes y colaboradores, Science, 253:1278-1280 (1991)) f - en Xhol impar y Notl. 5 Se sintetizaron sondas de oligonucleótidos basadas en la secuencia EST anteriormente descrita: 1) para identificar por PCR una biblioteca de cDNA que contenga la secuencia de interés, y 2) para usar como sondas para aislar un clon de la secuencia codificante de extensión r " ^- 10 total para PR0187. Los cebadores de PCR delantero e inverso generalmente varían en el rango de 20 a 30 nucleótidos y son a menudo diseñados para dar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 bp de extensión. Las secuencias sondas son típicamente de 40-55 bp de extensión. A fin de 15 cribar varias bibliotecas para un clon de extensión total, el DNA de las bibliotecas se cribaron por amplificación por PCR, como por Ausubel y colaboradores, Current Protocols in ^ Molecular Biology, supra, con el par de cebadores de PCR. Una biblioteca positiva se usó entonces para aislar clones 20 codificadores del gen de interés utilizando la sonda oligonucleótida y uno de los pares de cebadores.
Las sondas de oligonucleótidos empleadas fueron las siguientes: 25 cebador de PCR delantero: 5' -CAGTACGTGAGGGACCAGGGCGCCATGA-3' (SEC ID NO: 3) 5 cebador de PCR inverso: 5' -CCGGTGACCTGCACGTGCTTGCCA-3' (SEC ID NO: 4) sonda de hibridización: 5' -GCGGATCTGCCGCCTGCTCANCTGGTCGGTCATGGCGCCCT-3' (sec id no: 5) Se identificó que un clon de extensión total contenia 1S una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación traduccional aparente en las posiciones de los nucleótidos 641-643 (Figura 1, SEC ID NO: 1) . El precursor ^ del polipéptido predicho es de 205 aminoácidos de largo y se presenta en la figura 2 (SEC ID NO: 2) . El Análisis de 20 la secuencia de PR0187 de extensión total presenta en la figura 2 (SEC ID NO: 2} evidencias de la presencia de una región polipeptídica importante como se exhibe en la figura 2 en donde la localización dada para esa región polipeptídica importante es aproximadamente como se 25 describió anteriormente. El análisis de la secuencia de PR0187 de extensión total evidenció un péptido indicador desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 22. El clon DNA27864-1155 se depositó en ATCC el 16 de octubre de 1997 y se le asignó el No. de depósito en ATCC 209375.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión 35.45 SwissProt35) , utilizando el análisis de alineación de secuencias ALIGN-2 de la secuencia de extensión total expuesta en la figura 2 (SEC ID NO: 2), evidenció 74 % de identidad de secuencia entre la secuencia de aminoácidos de PR0187 y el factor-8 de crecimiento de fibroblastos (factor de crecimiento inducido por andrógeno) .
EJEMPLO 2 Aislamiento de Clones de cDNA Codificadores de PR0533 Humano El número de acceso de secuencia EST AF007268, un factor de crecimiento de fibroblastos de murina (FGF-15J se utilizaron para investigar en varias bases de datos públicas EST (por ejemplo, Dayoff, etc.) La investigación se efectuó utilizando el programa de cómputo BLAST ó BLAST2 [Alschul y colaboradores, Methods in Enzymology, 266:460- 480 (1996)] como una comparación de las secuencias de proteínas ECD con una translación de estructura 6 de las secuencias EST. La investigación dio como resultado un acierto con GenBank EST AA220994, que se identificó como el 5 precursor neuronal de N 2 Stratagen, 937230.
El RNA para construcción de bibliotecas de DNA se aisló entonces de la retina fetal humana. Las bibliotecas de cDNA usadas para aislar los clones de cDNA codificadores v^^lO PR0533 humano se construyeron por métodos estándares utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como los de Invitrogen, San Diego, CA. El cDNA se inició con oligo dT que contenia un sitio Notl, unido en el extremo plano a los adaptadores hemicinaseados Salí, fragmentado 15 con Notl, calibrado apropiadamente por electroforesis sobre gel, y clonado en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB ó pRKD pRK5B es un ^ precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil; ver Holmes y colaboradores, Science, 253: 1278-1280 (1991)) en 20 el Xhol impar y Notl.
Las sondas de oligonucleótidos basadas en la secuencia EST anteriormente descrita fueron entonces sintetizadas: l)para identificar por PCR una biblioteca de cDNA que contenga la secuencia de interés, y 2) para usar como sondas para asilar un clon de la secuencia codificadora de extensión total para PR0533. Los cebadores de PCR delantero e inverso generalmente varían desde 20 hasta 30 nucleótidos y son a menudo diseñados para dar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 bp de extensión. Las secuencias sondas son típicamente de 40-55 bp de extensión. A fin de cribar varias bibliotecas para un clon de extensión total, el DNA de las bibliotecas se cribaron por amplificación, conforme a Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, supra, con el par de cebadores de PCR. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para asilar clones codificadores del gen de interés utilizando el oligonucleótido sonda y uno de los pares de cebadores.
Las sondas de oligonucleótidos empleadas fueron las siguientes: FGF15. f (cebador de PCR delantero): 5' -ATCCGCCCAGATGGCTACAATGTGTA-3' (SEC ID NO: 8) FGF15.r (cebador de PCR inverso) : 5' -CCAGTCCGGTGACAAGCCCAAA-3' (SEC ID NO: 9) FGF15.p (sonda de hibridización) : ^ 5' -GCCTCCCGGTCTCCCTGAGCAGTGCCAAACAGCGGCCAGTGTA-3' (SEC ID NO: 10) 5 Se identificó un clon de extensión total que contenia una sola estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación traduccional aparente en las posiciones de los nucleótidos 464-466 y una indicación de detención en las 10 posiciones de los nucleótidos 1112-114 (figura 3, SEC ID NO: 6). El precursor del polipéptido predicho es de 216 aminoácidos de largo y se presenta en la figura 4 (SEC ID NO: 7) . El análisis de la secuencia de PR0533 de extensión total expuesta en la figura 4 (SEC ID NO: 7) evidencia la 15 presencia de una región polipeptidica importante como se demuestra en la figura 4 en donde la localización dad par esa región polpeptidica importante es aproximadamente como se describe anteriormente. El análisis de la secuencia de PR0533 de extensión total evidencia un péptido indicador 20 desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 22. El clon DNA49435-1219 se ha depositado con ATCC el 21 de Noviembre de 1997 y se le asignó el no. de depósito en ATCC 209480.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión 35.45 25 SwissProt35) , que utiliza al análisis de alineación de secuencias ALIGN-2 de la secuencia de extensión total presentada en la figura 4 (SEC ID NO: 7), puso en evidencia r 53 % de identidad entre la secuencia de aminoácidos de v. PR0533 y el factor de crecimiento de fibroblastos.
EJEMPLO 3 Aislamiento de Clones de cDNA Codificadores de PR0214 Humano ^ io Las secuencias de región extracelular (ECD) (que incluyen la secuencia indicadora de secreción, si la hay) de aproximadamente 950 proteinas secretadas conocidas desde la base de datos Swiss-Prot se utilizaron para investigar 15 en las bases de datos EST. La base de datos EST incluye las bases de datos EST pública (por ejemplo, GenBank) y una base de datos EST propietaria (LIFESEQ®, Incyte ^ Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) . La búsqueda se efectuó utilizando el programa de cómputo BLAST ó BLAST2 [Alschul y 20 colaboradores, Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)] como una comparación de las secuencias proteinicas ECD con una translación de estructura 6 de las secuencias EST. Las comparaciones dieron como resultado un registro BLAST de 70 (ó en algunos casos 90) ó superior, las que no codificaron 25 a las proteinas conocidas fueron aglomeradas y conjuntadas en secuencias de DNA consensus con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) .
Una secuencia de DNA consensus se conjuntó con otras secuencias EST utilizando prap como se describió anteriormente. Esta secuencia consensus es designada en la presente DNA28744. En algunos casos, la secuencia consensus se deriva de una secuencia de DNA consensus intermediaria que se extendió utilizando ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender esa secuencia consensus intermediaria tanto como sea posible utilizando las fuentes de secuencias EST discutidas anteriormente.
Con base en la secuencia consensus DNA28744, se sintetizaron oligonucleótidos: Dpara identificar por PCR una biblioteca de cDNA que contenia la secuencia de interés, y 2) para usar como sondas para aislar un clon de la secuencia codificadora de extensión total para PR0214. Los cebadores delantero e inverso generalmente varían desde 20 hasta 30 nucleótidos y se diseñan a menudo para dar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 bp de extensión. Las secuencias sonda son típicamente de 40-55 bp de extensión. En algunos casos, se sintetizaron adicionalmente oligonucleótidos cuando la secuencia consensúe es mayor de aproximadamente 1-1.5 kbp. A fin de cribar varias bibliotecas para un clon de extensión total, el DNA de las bibliotecas se cribaron por amplificación de PCR, como por Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, supxa, con el par de cebadores de PCR. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar clones codificadores del gen de interés utilizando el oligonucleótido sonda y uno de los pares de cebadores. sintetizaron los cebadores de PCR (delantero inverso) cebador de PCR delantero: 5'ATTCTGCGTGAACACTGAGGGG-3' (SEC ID NO: 13) cebador de PCR inverso: 5' -ATCTGCTTGTAGCCCTCGGCAC-3' (SEC ID NO: 14) adicionalmente, se construyó una sonda de ibridización de oligonucleótido sintética desde la secuencia DNA28744 consensus la cual tuvo la siguiente secuencia de nucleótidos: Sonda de hibridización: 5' - CCTGGCTATCAGCAGGTGGGCTCCAAGTGTCTCGATGTGGATGAGTG-3' (SEC ID NO: 15) Se aisló el RNA para la construcción de las bibliotecas de cDNA de tejido de pulmón fetal humano. Las bibliotecas de cDNA usados para aislar los clones de cDNA se construyeron por métodos estándares utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como los de Invitrogen, san Diego, CA. El cDNA se inició con oligo dT que contiene un sitio Notl, unido con el extremo plano de adaptadores hemicinaseados Salí, fragmentados con Notl, calibrado apropiadamente por electroforesis de gel, y clonado en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB: pRK5B es un precursor de pRK5D que no contenga el sitio Sfil: ver, Holmes y colaboradores, Science, 253:1278-1280 (1991) en los sitios disparejos Xhol y Notl.
La secuenciación del DNA de los clones aislados como se describió anteriormente dio la secuencia de DNA de extensión total para un polipéptido PR0214 de extensión total (designado en la presente DNA32286-1191 [figura 5, SEC ID NO: 11]) y la secuencia proteínica derivada para ese polipéptido PR0214.
El clon de extensión total identificado anteriormente contiene una estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación traduccional en las posiciones de los nucleótidos 103-105 y un indicador de detención en la posición de los nucleótidos 1363-1365 (figura 5, SEC ID NO: 11) . El precursor del polipéptido predicho es de 420 aminoácidos de longitud y se presenta en la figura 6 {SEC ID NO: 12) . El análisis de la secuencia PR0214 de extensión total expuesta en la figura 6 (SEC ID NO: 12) pone en evidencia la presencia de una variedad de regiones polipeptídicas importantes como se demuestra en la figura 6, en donde la localización dada para aquellas regiones polipeptídicas importantes es aproximadamente como se describió anteriormente. El análisis de la secuencia de PR0214 de extensión total pone en evidencia la presencia de lo siguiente: un péptido indicador desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 29 y una región transmembrana desde aproximadamente el aminoácido 372 hasta aproximadamente el aminoácido 392. El clon DNA32286-1191 se ha depositado con en ATCC el 16 de octubre de 1997 y se le asignó el no. de depósito 209385.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión 35.45 SwissProt35) , puso en evidencia la identidad de secuencia entre la secuencia de aminoácidos de PR021 y la proteína HT y/ó Fibulina (49 % y 38 %, respectivamente) .
EJEMPLO 4 Aislamiento de Clones de cD A Codificadores del Polipéptido PRO240 Humano Las secuencias de región extracelular (ECD) (que incluyen la secuencia indicadora de secreción, si la hay) de aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas desde la base de datos Swiss-Prot se utilizaron para investigar en las bases de datos EST. La base de datos EST incluye las bases de datos EST pública (por ejemplo, GenBank) y una base de datos EST propietaria (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) . La búsqueda se efectuó utilizando el programa de cómputo BLAST ó BLAST2 [Alschul y colaboradores, Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)] como una comparación de las secuencias de proteínicas ECD con una translación de estructura 6 de las secuencias EST. Las comparaciones dieron como resultado un registro BLAST ¦ de 70 (ó en algunos casos 90) ó superior, las que no codificaron a las proteínas conocidas fueron aglomeradas y conjuntadas en secuencias de DNA consensus con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) .
Una secuencia de DNA consensus se conjuntó en relación a otras secuencias EST utilizando phrap como se describió anteriormente. Esta secuencia consensus es designada en la presente DNA30873. en algunos casos, la secuencia consensus se deriva de de una secuencia de DNA consensus intermediaria que se extendió utilizando ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender esa secuencia consensus intermediaria tanto como sea posible utilizando las fuentes de secuencias EST discutidas anteriormente.
Con base en la secuencia consensus DNA30873, se sintetizaron oligonucleótidos : 1] para identificar por PCR una biblioteca de cDNA que contenía la secuencia de interés, y 2) para usar como sondas para aislar un clon de la secuencia codificadora de extensión total para PR0240. Los cebadores delantero e inverso generalmente varían desde 20 hasta 30 nucleótidos y se diseñan a menudo para dar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 bp de extensión. Las secuencias sonda son típicamente de 40-55 bp de extensión. En algunos casos, se sintetizaron adicionalmente oligonucleótidos cuando la secuencia consensus es mayor de aproximadamente 1-1.5 kbp. A fin de cribar varias bibliotecas para un clon de extensión total, los D As de las bibliotecas se cribaron por amplificación de PCR, como por Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, supra, con el par de cebadores de PCR. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar clones codificadores del gen de interés utilizando el oligonucleótido sonda y uno de los pares de cebadores.
Se sintetizaron los cebadores de PCR (delantero e inverso) : cebador de PCR delantero: 5' -TCAGCTCCAGACTCTGATACTGCC-3' (SEC ID NO: 18) cebador de PCR inverso: 5'-TGCCTTTCTAGGAGGCAGAGCTCC-3' (SEC ID NO: 19) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización de oligonucleótido sintética desde la secuencia DNA30873 consensus la cual tuvo la siguiente secuencia de nucleótidos: sonda de hibridización: 5' -GGACCCAGAAATGTGTCCTGAGAATGGATCTTGTGTACCTGATGGTCCAG-3' (SEC ID NO: 20) Se aisló el RNA para la construcción de las bibliotecas de cDNA de tejido de hígado fetal humano. Las bibliotecas de cDNA usadas para aislar los clones de cDNA se construyeron por métodos estándares utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como los de Invitrogen, san Diego, CA. El cDNA se inició con oligo dT que contiene un sitio Notl, unido con el extremo plano de adaptadores hemicinaseados Salí, fragmentados con Notl, calibrado apropiadamente por electroforesis de gel, y clonado en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB 'p pRKD: pR 5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil: ver, Holmes y colaboradores, Science, 253:1278-1280 (1991) en los sitios disparejos Xhol y Notl.
La secuenciación del DNA de los clones aislados como se describió anteriormente dio la secuencia de DNA de extensión total para un polipéptido PRO240 de extensión total (designado en la presente DNA34387-1138 [figura 7, SEC ID NO: 16]) y la secuencia proteinica derivada para ese polipóptido PRO240.
El clon de extensión total identificado anteriormente contiene una estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación traduccional en las posiciones de los nucleótidos 12-14 y un indicador de detención en la posición de los nucleótidos 699-701 (figura 1, SEC ID NO: 17) . El precursor del polipéptido predicho es de 229 aminoácidos de longitud y se presenta en la figura 8 (SEC ID NO: 17) . El análisis de las secuencia PRO240 de extensión total expuesta en la figura 8 (SEC ID NO: 17) pone en evidencia la presencia de una variedad de regiones polipeptidicas importantes como se demuestra en la figura 8, en donde la localización dada para aquellas regiones polipeptidicas importantes es aproximadamente como se describió anteriormente. El análisis de la secuencia de PRO240 de extensión total pone en evidencia la presencia de lo siguiente: un péptido indicador desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 30 y una región transmembrana desde aproximadamente el aminoácido 198 hasta aproximadamente el aminoácido 212. El clon DNA34387-1138 se ha depositado con en ATCC el 16 de septiembre de 1997 y se le asignó el no. de depósito 209260.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión 35.45 SwissProt35) , utilizando el análisis de alineación de secuencias ALIGN-2 de la secuencia de extensión total expuesta en la figura 8 (SEC ID NO: 17), puso en evidencia la identidad de secuencia entre la secuencia de aminoácidos de PRO240 y la proteina precursora de serrata de Drosophila melanogaster y el la proteina C-serrate-l de Gal1us gallus (30 % y 35 % respectivamente) .
EJEMPLO 5 Aislamiento de Clones de cDNA Codificadores de PR0211 Humano Las secuencias de región extracelular (ECD) (que incluyen la secuencia indicadora de secreción, si la hay) de aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas desde la base de datos pública Swiss-Prot se utilizaron para investigar en las bases de datos EST. La base de datos EST incluye las bases de datos EST pública (por ejemplo, GenBank) y una base de datos EST propietaria (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) . La búsqueda se efectuó utilizando el programa de cómputo BLAST ó BLAST2 [Alschul y colaboradores, Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)] como una comparación de las secuencias de proteinicas ECD con una translación de estructura 6 de las secuencias EST. Las comparaciones dieron como resultado un registro BLAST de 70 (ó en algunos casos 90) ó superior, las que no codificaron a las proteínas conocidas fueron aglomeradas y conjuntadas en secuencias de DNA consensus con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) .
Una secuencia de DNA consensus se conjuntó en relación a otras secuencias EST utilizando phrap como se describió anteriormente. Esta secuencia consensus es designada en la presente DNA28730. En algunos casos, la secuencia consensus se deriva de una secuencia de DNA consensus intermediaria que se extendió utilizando ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender esa secuencia consensus intermediaria tanto como sea posible utilizando las fuentes de secuencias EST discutidas anteriormente.
Con base en la secuencia consensus DNA28730, se sintetizaron oligonucleótidos: Upara identificar por PCR una biblioteca de cDNA que contenia la secuencia de interés, y 2) para usar como sondas para aislar un clon de la secuencia codificadora de extensión total para P 0211. Los cebadores delantero e inverso generalmente varían desde 20 hasta 30 nucleótidos y se diseñan a menudo para dar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 bp de extensión. Las secuencias sonda son típicamente de 40-55 bp de extensión. En algunos casos, se sintetizaron adicionalmente oligonucleótidos cuando la secuencia consensúe es mayor de aproximadamente 1-1.5 kbp. A fin de cribar varias bibliotecas para un clon de extensión total, el DNA de las bibliotecas se cribaron por amplificación de PCR, como por Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, supra, con el par de cebadores de PCR. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar clones codificadores del gen de interés utilizando el oligonucleótido sonda y uno de los pares de cebadores.
Se sintetizaron los cebadores de PCR (delantero e inverso) : cebador de PCR delantero: 5' -AGAGTGTATCTCTGGCTACGC-3' (SEC ID NO: 23) cebador de PCR inverso: 5' -TAAGTCCGGCACATTACAGGTC-3' (SEC ID NO: 24) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización de oligonucleótido sintética desde la secuencia DNA28730 consensus la cual tuvo la siguiente secuencia de nucleótidos: sonda de hibridización: 5' -AGGGAGCACGGACAGTGTGCAGATGTGGACGAGTGCTCACTAGCA-3' (SEC ID NO: 25) Se aisló el RNA para la construcción de las bibliotecas de cDNA de tejido de pulmón fetal humano. Las bibliotecas de cDNA usadas para aislar los clones de cDNA se construyeron por métodos estándares utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como los de Invitrogen, san Diego, CA. £1 cDNA se inició con oligo dT que contiene un sitio Notl, unido con el extremo plano de adaptadores hemicinaseados Salí, fragmentados con Notl, calibrado apropiadamente por electroforesis de gel, y clonado en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB 'p pR D: p K5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil: ver, Holmes y colaboradores, Science, 253:1278-1280 (1991) en los sitios disparejos Xhol y Notl.
La secuenciación del DNA de los clones aislados como se describió anteriormente dió la secuencia de DNA de extensión total para un polipéptido PR0211 de extensión total (designado en la presente DNA34292-1131 [figura 9, SEC ID NO: 21]) y la secuencia proteinica derivada para ese polipéptido PR0211.
El clon de extensión total identificado anteriormente contiene una estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación traduccional aparente en las posiciones de los nucleótidos 65-67 y un indicador de detención en la posición de los nucleótidos 1124-1126 (figura 9, SEC ID NO: 21) . El precursor del polipéptido predicho es de 353 aminoácidos de longitud, con un peso molecular de aproximadamente 38,190 daltones (figura 10 (SEC ID NO: 22). El análisis de las secuencia PR0211 de extensión total expuesta en la figura 10 (SEC ID NO: 22) pone en evidencia la presencia de una región polipeptidica importante como se demuestra en la figura 10, en donde la localización dada para aquellas regiones polipeptidicas importantes es aproximadamente como se describió anteriormente. El análisis de la secuencia de PR0211 de extensión total pone en evidencia la presencia de un péptido indicador desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 24. El clon DNA32292-1131 se ha depositado con en ATCC el 16 de Septiembre de 1997 y se le asignó el no. de depósito 209258.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión 35.45 SwissProt35) , utilizando el análisis de alineación de secuencias ALIGN-2 de la secuencia de extensión total expuesta en la figura 10 (SEC ID NO: 22) , puso en evidencia la identidad de secuencia entre la secuencia de aminoácidos de PR0211 y EGF.
EJEMPLO 6 Aislamiento de Clones de cDNA Codificadores de PRO230 Humano Las secuencias de región extracelular (ECD) (que incluyen la secuencia indicadora de secreción, si la hay) de aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas desde la base de datos pública Swiss-Prot se utilizaron para investigar en las bases de datos EST. La base de datos EST incluye las bases de datos EST pública (por ejemplo, GenBank) y una base de datos EST propietaria (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) . La búsqueda se efectuó utilizando el programa de cómputo BLAST ó BLAST2 [Alschul y colaboradores, Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)] como una comparación de las secuencias proteinicas ECD con una translación de estructura 6 de las secuencias EST. Las comparaciones dieron como resultado un registro BLAST de 70 (ó en algunos casos 90) ó superior, las que no codificaron a las proteínas conocidas fueron aglomeradas y conjuntadas en secuencias de DNA consensus con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) .
Una secuencia de DNA consensus se conjuntó en relación a otras secuencias EST utilizando phrap como se describió anteriormente. Esta secuencia consensus es designada en la presente DNA30857.Se empleo una EST propietaria de Genentech en el conjunto consensus y se designa en la presente DNA20088. en algunos esos, la secuencia consensus se deriva de una secuencia de DNA consensus intermediaria que se extendió utilizando ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender esa secuencia consensus intermedia tanto como sea posible utilizando las fuentes de secuencias EST discutidas anteriormente.
Con base en la secuencia consensus DNA30857, se sintetizaron oligonucleótidos: Dpara identificar por PCR una biblioteca de cDNA que contenia la secuencia de interés, y 2) para usar como sondas para aislar un clon de la secuencia codificadores de extensión total para PRO230. Los cebadores delantero e inverso generalmente varían desde ^ 20 hasta 30 nucleótidos y se diseñan a menudo para dar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 bp de 5 extensión. Las secuencias sonda son típicamente de 40-55 bp de extensión. En algunos casos, se sintetizaron adicionalmente oligonucleótidos cuando la secuencia consensus es mayor de aproximadamente 1-1.5 kbp. A fin de cribar varias bibliotecas para un clon de extensión total, 10 el DNA de las bibliotecas se cribaron por amplificación de PCR, como por Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, supra, con el par de cebadores de PCR. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar clones codificadores del gen de interés utilizando el 15 oligonucleótido sonda y uno de los pares de cebadores.
Se sintetizaron los cebadores de PCR (delantero e inverso) : 20 cebador de PCR delantero: 5' -TTCGAGGCCTCTGAGAAGTGGCCC-3' (SEC ID NO: 28) cebador de PCR inverso: 25 5' GGCGGTATCTCTCTGGCCTCCC-3' (SEC ID NO: 29) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización de oligonucleótido sintética desde la secuencia DNA30857 consensus la cual tuvo la siguiente secuencia de nucleótidos: sonda de hibridización: 5' -TTCTCCACAGCAGCTGTGGCATCCGATCGTGTCTCAATCCATTCTCTGGG- 3' (SEC ID NO: 30) Se aisló el RNA para la construcción de las bibliotecas de cDNA de tejido de pulmón fetal humano. Las bibliotecas de cDNA usadas para aislar los clones de cDNA se construyeron por métodos estándares utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como los de Invitrogen, san Diego, CA. El cDNA se inició con oligo dT que contiene un sitio Notl, unido con el extremo plano de adaptadores hemicinaseados Salí, fragmentados con Notl, calibrado apropiadamente por electroforesis de gel, y clonado en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB ó pRKD: pR 5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil: ver, Holmes y colaboradores, Science, 253:1278-1280 (1991) en los sitios disparejos Xhol y Notl. ^ La secuenciación del D A de los clones aislados como 5 se describió anteriormente dió la secuencia de DNA de extensión total para un polipéptido PRO230 de extensión total (designado en la presente DNA33223-1136 [figura 11, SEC ID NO: 26]) y la secuencia proteinica derivada para ese polipéptido PR0230. 10 El clon de extensión total identificado anteriormente contiene una estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación traduccional aparente en las posiciones de los nucleótidos 100-102 y un indicador de detención en la 15 posición de los nucleótidos 592-594 (figura 11, SEC ID NO: 26) . El precursor del polipéptido predicho es de 164 aminoácidos de longitud, (figura 12 (SEC ID NO: 27). El " análisis de las secuencia de PR0230 de extensión total expuesta en la figura 12 (SEC ID NO: 27) pone en evidencia 20 la presencia de una región polipeptidica importante como se demuestra en la figura 12, en donde la localización dada para esas regiones polipeptidicas importantes es aproximadamente como se describió anteriormente. El análisis de la secuencia de PRO230 de extensión total pone 25 en evidencia la presencia de un péptido indicador desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 21. El clon DNA33223-1136 se ha depositado con en ATCC el 16 de Septiembre de 1997 y se le asignó el no. de depósito 209264.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión 35.45 S issProt35) , utilizando el análisis de alineación de secuencias ALIGN-2 de la secuencia de extensión total expuesta en la figura 12 (SEC ID NO: 27), puso en evidencia la identidad de secuencia entre la secuencia de aminoácidos de PRO230 y un precursor antigénico de nefritis túbulointersticial de conejo.
EJEMPLO 7 Aislamiento de Clones de cDNA Codificadores de PR0261 Humano Las secuencias de región extracelular (ECD) (que incluyen la secuencia indicadora de secreción, si la hay) de aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas desde la base de datos pública Swiss-Prot se utilizaron para investigar en las bases de datos EST. La base de datos EST incluye las bases de datos EST pública (por ejemplo, GenBank) y una base de datos EST propietaria (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) . La búsqueda se efectuó utilizando el programa de cómputo BLAST ó BLAST2 [Alschul y colaboradores, Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)] como una comparación de las secuencias proteinicas ECD con una translación de estructura 6 de las secuencias EST. Las comparaciones dieron como resultado un registro BLAST de 70 (ó en algunos casos 90) ó superior, las que no codificaron a las proteínas conocidas fueron aglomeradas y conjuntadas en secuencias de DNA consensus con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) .
Una secuencia de DNA consensus se conjuntó en relación a otras secuencias EST utilizando phrap como se describió anteriormente. Esta secuencia consensus es designada en la presente DNA30843. En algunos casos, la secuencia consensus se deriva de una secuencia de DNA consensus intermediaria que se extendió tan lejos como fue posible, utilizando las fuentes de secuencias EST discutidas anteriormente.
Con base en la secuencia consensus DNA30843, se sintetizaron oligonucleótidos: Dpara identificar por PCR una biblioteca de cDNA que contenía la secuencia de interés, y 2) para usar como sondas para aislar un clon de la secuencia codificadora de extensión total para PR0261.
Los cebadores delantero e inverso generalmente varían desde 20 hasta 30 nucleótidos y se diseñan a menudo para dar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 bp de extensión. Las secuencias sonda son típicamente de 40-55 bp de extensión. En algunos casos, se sintetizaron adicionalmente oligonucleótidos cuando la secuencia consensus es mayor de aproximadamente 1-1.5 kbp. A fin de cribar varias bibliotecas para un clon de extensión total, el DNA de las bibliotecas se cribaron por amplificación de PCR, como por Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, supra, con el par de cebadores de PCR. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar clones codificadores del gen de interés utilizando el oligonucleótido sonda y uno de los pares de cebadores.
Se sintetizaron los cebadores de PCR (delantero e inverso) : cebador de PCR delantero: 5' -AAAGGTGCGTACCCAGCTGTGCC-3' (SEC ID NO: 33) cebador de PCR inverso: 5' -TCCAGTCGGCAGAAGCGGTTCTGG-3' (SEC ID NO: 34) Adicionalmente se construyó una sonda de hibridización de oligonucleótido sintética desde la secuencia DNA30843 consensus la cual tuvo la siguiente secuencia de nucleótidos: sonda de hibridización: 5' -CCTGGTGCTGGATGGCTGTGGCTGCTGCCGGGTTATGTGCACGGCGGCT GGG-3' (SEC ID NO: 35) Se aisló el RNA para la construcción de las bibliotecas de cDNA de tejido de pulmón fetal humano. Las bibliotecas de cDNA usados para aislar los clones de cDNA se construyeron por métodos estándares utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como los de Invitrogen, san Diego, CA. El cDNA se inició con oligo dT que contiene un sitio Notl, unido con el extremo plano de adaptadores hemicinaseados Salí, fragmentados con Notl, calibrado apropiadamente por electroforesis de gel, y clonado en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB ó pRKD: pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil: ver, Holmes y colaboradores, Science, 253:1278-1280 (1991) en los sitios disparejos Xhol y Notl.
La secuenciación del DNA de los clones aislados como se describió anteriormente dió la secuencia de DNA de V extensión total, para un polipéptido PR0261 de extensión 5 total (designado en la presente DNA33473-1176 [figura 13, SEC ID NO: 31]) y la secuencia proteínica derivada, para ese polipéptido PR0261.
El clon de extensión total identificado anteriormente 10 contiene una estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación traduccional aparente en las posiciones de los nucleótidos 10-12 y un indicador de detención en la posición de los nucleótidos 760-762-1126 (figura 13 SEC ID NO: 31) . El precursor del polipéptido predicho es de 250 15 aminoácidos de longitud, figura 14 (SEC ID NO: 32) . El análisis de las secuencia PR0261 de extensión total expuesta en la figura 14 (SEC ID NO: 32) pone en evidencia la presencia de una región polipeptidica importante como se demuestra en la figura 14, en donde la localización dada 20 para aquellas regiones polipeptidicas importantes es aproximadamente como se describió anteriormente. El análisis de la secuencia de PR0261 de extensión total pone en evidencia la presencia de un péptido indicador desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el 25 aminoácido 23. El clon DNA33473-1176 se ha depositado con en ATCC el 17 de Octubre de 1997 y se le asignó el no. de depósito 209391.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión 35.45 SwissProt35) , utilizando el análisis de alineación de secuencias ALIGN-2 de la secuencia dé extensión total expuesta en la figura 14 (SEC ID NO: 32), puso en evidencia la identidad de secuencia entre la secuencia de aminoácidos de PR0211 y CTCF, con lo que se indica que PR0261 es un nuevo factor de crecimiento.
EJEMPLO 8 Aislamiento de Clones de cDNA Codificadores dePRQ246 Humano Las secuencias de región extracelular (ECD) (que incluyen la secuencia indicadora de secreción, si la hay) de aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas desde la base de datos pública Swiss-Prot se utilizaron para investigar en las bases de datos EST. La base de datos EST incluye las bases de datos EST pública (por ejemplo, GenBank) y una base de datos EST propietaria (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA) . La búsqueda se efectuó utilizando el programa de cómputo BLAST ó BLAST2 [Alschul y colaboradores, Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)] como una comparación de las secuencias proteinicas ECD con una traslación de estructura 6 de las secuencias EST. Las comparaciones dieron como resultado un registro BLAST de 70 (ó en algunos casos 90) ó superior, las que no codificaron a las proteínas conocidas fueron aglomeradas y conjuntadas en secuencias de DNA consensus con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) .
Una secuencia de DNA consensus se conjuntó en relación a otras secuencias EST utilizando phrap como se describió anteriormente. Esta secuencia consensus es designada en la presente DNA30955. En algunos casos, la secuencia consensus se deriva de una secuencia de DNA consensus intermediaria que se extendió, utilizando ciclos repetidos de BLAST y phrap hasta extender esa secuencia intermediaria consensus tal tan lejos como sea posible, utilizando las fuentes de secuencias EST discutidas anteriormente.
Con base en la secuencia consensus DNA30955, se sintetizaron oligonucleótidos: 1) para identificar por PCR un biblioteca de cDNA que contenía la secuencia de interés, y 2) para usar como sondas para aislar un clon de la secuencia codificadora de extensión total para PR0246. Los cebadores delantero e inverso generalmente varían desde 20 hasta 30 nucleótidos y se diseñan a menudo para dar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 bp de extensión. Las secuencias sonda son típicamente de 40-55 bp de extensión. En algunos casos, se sintetizaron adicionalmente oligonucleótidos cuando la secuencia consensus es mayor de aproximadamente 1-1.5 kbp. A fin de cribar varias bibliotecas para un clon de extensión total, el DNA de las bibliotecas se cribó por amplificación de PCR, como por Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, supra, con el par de cebadores de PCR. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar clones codificadores del gen de interés utilizando el oligonucleótido sonda y uno de los pares de cebadores.
Se sintetizaron los cebadores de PCR (delantero e inverso) : cebador de PCR delantero: 5' -AGGGTCTCCAGGAGAAAGACTC-3' (SEC ID NO: 38) cebador de PCR inverso; 5' -ATTGTGGGCCTTGCAGACATAGAC-3' (SEC ID NO: 39) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización de oligonucleótido sintética desde la secuencia DNA30355 consensus la cual tuvo la siguiente S secuencia de nucleótidos: sonda de hibridización: 5-GGCCACAGCATCAAAACCTTAGAACTCAATGTACTGGTTCCTCCAGC 0 TCC-3' (SEC ID NO: 40) Se aisló el RNA para la construcción de los bibliotecas de cDNA de tejido de HÍGADO fetal humano. Los bibliotecas de cDNA usados para aislar los clones de cDNA 5 se construyeron por métodos estándares utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como los de Invitrogen, san Diego, CA. El cDNA se inició con oligo dT que contiene un sitio Notl, unido con el extremo plano de adaptadores hemicinaseados Salí, fragmentados con Notl, calibrado 0 apropiadamente por electroforesis de gel, y clonado en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB ó pRKD: pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil: ver, Holmes y colaboradores, Science, 253:1278-1280 (1991) en los sitios disparejos Xhol 5 y Notl.
La secuenciación del DNA de los clones aislados como se describió anteriormente dió la secuencia de DNA de extensión total, para un polipéptido PR0246 de extensión total (designado en la presente DNA35639-1172 [figura 15, SEC ID NO: 36¾) y la secuencia proteinica derivada, para ese polipéptido PR0246.
El clon de extensión total identificado anteriormente contiene una estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación traduccional aparente en las posiciones de los nucleótidos 126-128 y una señal de detención en la posición de los nucleótidos 1296-1298 (figura 15, SEC ID NO: 36) . El precursor del polipéptido predicho es de 290 aminoácidos de longitud, figura 16 (SEC ID NO: 37) . El análisis de las secuencia PR0246 de extensión total expuesta en la figura 16 (SEC ID NO: 37) pone en evidencia la presencia de una región polipeptidica importante como se demuestra en la figura 16, en donde la localización dada para aquellas regiones polipeptidicas importantes es aproximadamente como se describió anteriormente. El análisis de la secuencia de PR02 6 de extensión total pone en evidencia la presencia de lo siguiente: un péptido señal desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 29 y una región transmembrana desde aproximadamente el aminoácido 247 hasta aproximadamente el aminoácido 266. El clon DNA35639-1176 se ha depositado con en ATCC el 17 de Octubre de 1997 y se le asignó el no. de depósito 209396.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión 35.45 SwissProt35) , utilizando el análisis de alineación de secuencias ALIGN-2 de la secuencia de extensión total expuesta en la figura 16 (SEC ID NO: 37), puso en evidencia la identidad de secuencia entre la secuencia de aminoácidos de PR0246 y la proteina de superficie celular HCAR, con lo que se indica que PR0246 es un nuevo receptor viral de superficie celular.
EJEMPLO 9 Aislamiento de Clones de cDNA Codificadores de un PR0317 Humano Las secuencias de región extracelular (ECD) (que incluyen la secuencia indicadora de secreción, si la hay) de aproximadamente 950 proteinas secretadas conocidas desde la base de datos pública Swiss-Prot se utilizaron para investigar en las bases de datos EST. La base de datos EST incluye las bases de datos EST pública (por ejemplo, GenBank) y una base de datos EST propietaria (LIFESEQ®, Incyte PharmaceuticalS Palo Alto, CA) . La búsqueda se efectuó utilizando el programa de cómputo BLAST ó BLAST2 [Alschul y colaboradores, Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)] como una comparación de las secuencias proteinicas de ECD con una translación de estructura 6 de las secuencias EST. Las comparaciones dieron como resultado un registro BLAST de 70 (ó en algunos casos 90) ó superior, las que no codificaron a las proteínas conocidas fueron aglomeradas y conjuntadas en secuencias de DNA consensus con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) .
Una secuencia de DNA consensus se conjuntó en relación a otras secuencias EST utilizando phrap como se describió anteriormente. Esta secuencia consensus es designada en la presente DNA28722. En algunos casos, la secuencia consensus se deriva de una secuencia de DNA consensus intermediaria que se extendió utilizando ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender esta secuencia consensus intermediaria tan lejos como fue posible, utilizando las fuentes de secuencias EST discutidas anteriormente.
Con base en la secuencia consensus DNA28722, se sintetizaron oligonucleótidos: 1) para identificar por PCR un biblioteca de cDNA que contenia la secuencia de interés, y 2) para usar como sondas para aislar un clon de la secuencia codificadora de extensión total para PR0317. Los cebadores de PCR delantero e inverso generalmente varian desde 20 hasta 30 nucleótidos y se diseñan a menudo para dar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 bp de extensión. Las secuencias sonda son típicamente de 40-55 bp de extensión. En algunos casos, se sintetizaron adicionalmente oligonucleótidos cuando la secuencia consensus es mayor de aproximadamente 1-1.5 kbp. A fin de cribar varias bibliotecas para un clon de extensión total, el DNA de las bibliotecas se cribaron por amplificación de PCR, como en Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, supra, con el par de cebadores de PCR. Una biblioteca positiva se utilizó entonces para aislar clones codificadores del gen de interés utilizando el oligonucleótido sonda y uno de los pares de cebadores.
Se sintetizaron los cebadores de PCR (delantero e inverso) : cebador de PCR delantero: 5' -AGGACTGCCATAACTTGCCTG-3' (SEC ID NO: 43) cebador de PCR inverso: 5'-ATAGGAGTTGAAGCAGCGCTGC-3' (SEC ID NO: 44) Adicionalmente, se construyó una sonda de hibridización de oligonucleótido sintético desde la secuencia DNA28722 consensus la cual tuvo la siguiente secuencia de nucleótidos: sonda de hibridización: 5' -TGTGTGGACATAGACGAGTGCCGCTACCGCTACTGCCAGCACCGC-3' (SEC ID NO: 45) Se aisló el RNA para la construcción de las bibliotecas de cDNA de tejido de riñón fetal humano. Las bibliotecas de cDNA usados para aislar los clones de cDNA se construyeron por métodos estándares utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como los de Invitrogen, san Diego, CA. El cDNA se inició con oligo dT que contiene un sitio Notl, unido con el extremo plano de adaptadores hemicinaseados Salí, fragmentado con Notl, calibrado apropiadamente por electroforesis de gel, y clonado en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB ó pRKD: pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil: ver, Holmes y colaboradores, Science, 253:1278-1280 (1991) en los sitios disparejos Xhol y Notl.
La secuenciación del DNA de los clones aislados como se describió anteriormente dio la secuencia de DNA de extensión total, para un polipéptido PR0317 de extensión total (designado en la presente DNA33461-1199 [figura 17, SEC ID NO: 41]) y la secuencia proteinica derivada, para ese polipéptido PR0317.
El clon de extensión total identificado anteriormente contiene una estructura de lectura abierta con un sitio de iniciación traduccional aparente en las posiciones de los nucleótidos 68-70 y un indicador de detención en la posición de los nucleótidos 1166-1168 (figura 17, SEC ID NO: 41) . El precursor del polipéptido predicho es de 366 aminoácidos de longitud, figura 18 (SEC ID NO: 42) . El análisis de las secuencia PR0317 de extensión total expuesta en la figura 18 (SEC ID NO: 42) pone en evidencia la presencia de una región polipeptidica importante como se demuestra en la figura 18, en donde la localización dada para aquellas regiones polipeptidicas importantes es aproximadamente como se describió anteriormente. El análisis de la secuencia de PR0317 de extensión total (figura 18, SEC ID NO: 42) pone en evidencia lo siguiente: un péptido indicador desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 18 y un sitio de N-glicosilación en el aminoácido 160. El clon DNA33461-1199 se ha depositado con en ATCC el 15 de Octubre de 1997 y se le asignó el no. de depósito 209367.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión 35.45 SwissProt35) , utilizando el análisis de alineación de secuencias ALIGN-2 de la secuencia de extensión total expuesta en la figura 18 (SEC ID NO: 42), puso en evidencia 92% de identidad de secuencia entre la secuencia de aminoácidos de PR0317 y EBAF-1, Una homología significativa existe también entre la secuencia de aminoácidos de PR0317 y EBAF-2 y la proteína LEFTY de ratón. PR0317 muestra alineación de secuencia e aminoácidos con otros miembros de la superfamilia TGF-ß. El extremo C-terminal de la proteína contiene muchas secuencias conservadas y el patrón esperado de la superfamilia TGF-ß.
EJEMPLO 10 Amplificación Genética Este ejemplo demuestra que los genes codificadores de PR0187-, PR0533-, PR0214-, PRO240-, PR0211-, PRO230-, PR0261-. PR0246-, ó PR0317- son amplificados en el genoma de ciertas lineas celulares y/ó cánceres de pulmón, colon, y/ó seno. La amplificación esté asociada con la sobre-expresión del producto genético, indicando que los polipéptidos son objetivos útiles para la intervención terapéutica en ciertos cánceres tales como de colon, pulmón, seno y otros cánceres. Los agentes terapéuticos pueden tomar la forma de antagonistas del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261. PR02 6, ó PR0317.
El material inicial para el cribado fue DNA genómico aislado de una variedad de cánceres. El DNA es precisamente cuantificado, por ejemplo, fluorométricamente. Como control negativo, el DNA fue aislado de las células de diez individuos saludables normales que se agruparon y usaron como controles de ensayo para la copia genética en individuos saludables (no expuestos). El ensayo 5' nucleasa (por ejemplo, TaqMan™ (perkin elmer, applied Biosystems División, Foster City, CA) ) , se usó para encontrar los genes potencialmente amplificados en ciertos cánceres. Los resultados se usaron para determinar si el DNA que codifica a PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261.
PR0246, 6 PR0317 está sobre-representado en cualquiera de las lineas celulares ó cánceres de colon ó de pulmón ó lineas celulares de seno que fueron cribadas. Los cánceres de pulmón primario se obtuvieron de individuos con tumores del tipo y en la etapa que se indica en la Tabla 2. Se ha dado precedentemente una explicación de las abreviaciones usadas para la designación de los tumores primarios enlistados en la tabla 2 y los tumores primarios y lineas celulares mencionadas a lo largo de este ejemplo se han dado precedentemente.
Los resultados del TaqMan™ se reportan en unidades (A)Ct. Una unidad corresponde a un ciclo de PCR ó aproximadamente a amplificación de dos veces en relación al normal, dos unidades corresponden a amplificación de 4 veces, 3 unidades a amplificación de 8 veces y asi sucesivamente. La cuantificación se obtuvo utilizando cebadores y una sonda fluorescente de TaqMan™ derivada del gen codificadora de PR0187-, PR0533-, PR0214-, PRO240-, PR0211-, PRO230-, PR0261-. PR0246-, ó PR0317-. Las regiones de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261. PR02 6, ó PR0317 que son las que más probablemente contienen secuencias de ácidos nucleicos únicas y que son las que menos probablemente están unidas a intrones externos se prefieren para el cebador y derivación de la sonda, por ejemplo, regiones sin traducción en 3' . Las secuencias para los cebadores y sondas (delantera, inversa y sonda) usada para el análisis de amplificación genética de P 0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261. PR0246, ó PR0317. son como sigue : 27864.un .p: Íi'-C A ;?TTI ÜAGCACAGCCACCTCCA-J¦ (SEC ID NO: 46) f N 27864.un.f: ^ 10 5 -GGCCTTGCAGACAACCGT-3' (SEC ID NO: 47) 27864.un.r. 5¦-CAÜA Tü?C?GG?GATCCG?GA- , (SEC ID NO: 48) 27864.im.p2: (SEC ID NO: 49) S'-CAGCTGCCC TTCCCCAACCA ' 27864.im.i-l: Í'-CATCAACCGCCTCTACCA-J' (SEC ID NO: 50) 15 27864. im r2: S'-CACAAACTCGA ACl ?0?????-3· (SEC ID NO: 51) , P O«¾ fDNA4 435- 2t9 4943S.tm.f: S'-GGGACGTGCTTCTACAAGAACAG-r ( SEC ID N0 : 52 1 4943S.un.r: 20 5'-CAGGC7TACAATGTTATGATCAGACA-3' ( SEC ID N?: 53 > 4943S.tm.p. 5'-TAlTCAGAGTTTrCCATTGGCAGTGCCAGTT-3' (SEC ID NO: 54) 25 PR02l4 fDNA32286-H9I V 32286.3utr-5: S'-OGOCCATCACAGCTCCCT-y (SEC ID NO: 32286.3uir-3b: 5'-GGGATGTGGTGAACACAGAACA-3' {SEC ID NO 32286.3utr . sonda : s tsa:??<:t?€???€t? :??t-t-3· (SEC ID NO PRO240 (DNA34387-1 138>. 34387.tm.pl: (SEC ID NO: 58) 5'-CAGCGCCGAAAAGCCAAGACTTCAT-3' 34387.im.rl : y-AGCTCC TGACTGGGCTAAGATA (SEC ID NO: 60) 34387.3uit.5-. 5 -GTCAGGGAGCTCTGCTTCCTAG-3¦ (SEC ID NO: 61) 34387.3utr-3: .V-AATGGCGGCCTCAACCTT-3' (SEC ID NO: 62) 34387.3utr-sonda-rc: 5'-C:GAATCCACTGGCGAAAGATGCCTT-3' (SEC ID NO: 63) PRQ21 I (???32292·1 )3?: 32292.3uir-3: sxKXXKnxmxAcrccAG'? <SEC ID N0 : 32292.3utr-sonda. re : 5'-GACGGCATCCTCAGGGCCACA.3- (SEC ID NO: 66) ppfl)?n f >NA33223.| 1361: 33223.tm.p3: 5"-ATGTCCTCCATGCCCACGCG-3' (SEC ID NO: 67) 33223.tm.O: (SEC ID NO: 68) 5'-CAGTGCGACATCGAGAGCTT-3" 33223.im.r3. (SEC ID NO: 69) 5'.CCGCAGCC1 AGTGATGA-3' 33223.3uir-5: 5'-GAAGAGCACAGCTGCAGATCC-3" (SEC ID NO: 70) 33223.3utr-3: S'-GAGGTGTCCTGGCTTTGGTAnT. v (SEC ID NO: 71) 33223.3utr-sonda: .V-CCT TGGCGCCCCCACTCAA-3" (SEC ID NO: 72) PR026I f!¾NA334?3-» l76 33473.3ulr-5: (SEC ID NO: 73) .S -TCTAGCCCACTCCCTCCCl -3-33473.3utr-3: S'-GAAGTCGGAGAGAAAGCTCGC-3' (SEC ID NO: 74) 33473.3utr-sonda S'-CACACACAGCCTATATCAAACATGCACACG-S- (SEC ID NO: 75) >'R()246 (DNA35639- 1 172): .V-GGCAGAGACrrCCAGTCACTGA-S' (SEC ID NO: 76) 3S639.3«iir-3: S'-GCCAAGGGTGGTGTTACiATAGG (SEC ID NO: 77) 35639.3utr-sonda: -V-CAGGCCCCCri GATCTGTACCCCA-3- (SEC ID NO: 78) P OJ ! ? ÍDNA3346M l '<9): 3346!.im.i: .V-CCAGGACAGCTGGCGAl G-3 (SEC ID NO: 79) 3346l.tni.r: f ^ 5 -GCAAATTCAGGGCTCAC AGAGA-3 (SEC ID NO: SO) 3346 Um. : (SEC ID ??· Rl) 5'-CACAGAGCATTTGTCCATCAGCAGT]" ACi--;" ^ ' - L > La reacción del ensayo de 5'nucleasa es una técnica basada en PCR fluorescente que utiliza la actividad 5' exonucleasa de la enzima Taq DNA polimerasa para monitorear la amplificación en el tiempo real. Dos 10 cebadores oligonucleótidos se usan para generar un amplicón tipico de una reacción de PCR. Un tercer oligonucleótido ó sonda se designa para detectar la secuencia de nucleótidos localizada entre los dos cebadores de PCR. La sonda es no- extensible por la enzima Taq DNA polimerasa, y es marcada 15 con un informador teñido de fluorescente y un extinguidor teñido de fluorescente. Cualquier emisión inducida por láser de la tintura del informador es extinguida por la tintura extinguidora cuando las dos tinturas se localizan tan cerca una de la otra que están en la sonda. Durante la 20 reacción de amplificación la enzima Taq DNA polimerasa fragmenta la sonda de una manera dependiente del molde. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en la solución, y la señal de la tintura del informador liberada está libre del efecto extinguidor del segundo fluoróforo. Una 25 molécula de la tintura del informador es liberada por cada nueva molécula sintetizada, y la detección de la tintura del informador no extinguida proporciona la base para interpretación cuantitativa de los datos..
El procedimiento de la 5'nucleasa se corre sobre un equipo para PCR cuantitativa en tiempo real tal como el ABI prism 7700TM Séquense Detection. El sistema consiste de un termociclador, láser, cámara del equipo acoplado a la carga (CCD) y computadora, El sistema amplifica las muestras en formato de 96 pocilios en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser se colecta en tiempo real a través de cales de fibra óptica para todos los 96 pocilios, y se detecta en el CCD. El sistema incluye programas de cómputo para correr el instrumento y para analizar los datos. Los datos del ensayo 5'nucleasa se expresan inicialíñente como Ct, ó el ciclo umbral . Este es definido como el ciclo en el que la señal del informador acumulada sobre el nivel de fondo de fluorescencia. Los valores de ACt se utilizan como medida cuantitativa del número relativo de copias cebadoras de una secuencia objetivo particular en una muestra de ácido nucleico en comparación de los resultados DNA de cáncer con los resultados de DNA humano normal.
La Tabla 2 describe la etapa, etapa T y Etapa N de varios tumores primarios que se usaron para cribar los compuestos de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, 6 PR0317 de la invención.
Tabla 2 Perfiles de Tumor Primario en Colon y Pulmón Tumor Primario Etapa .. Otra .. Etapa ..Etapa Etapa Etapa Dukes T AdenoCa de tumor de pulmón humano (SRCC724) fLTl] HA TI NI SqCCa de tumor de pulmón humano (SRCC725) [LTla] IIB T3 NO AdenoCa de tumor de pulmón humano (SRCC726) [LT2] IB T2 NO AdenoCa de tumor de pulmón humano (SRCC727) [LT3] IIIA TI N2 Tabla 2 (continuación) /¦ ^ Perfiles de Tumor Primario en Colon y Pulmón 5 Tumor Primario Etapa..Otra..Etapa..Etapa Etapa Etapa Dukes T N AdenoCa de tumor de pulmón humano (SRCC728) [LT4] IB T2 NO 10 SqCCa de tumor de pulmón humano (SRCC729)[LT6] IB T2 NO Aden/SqCCa de tumor de pulmón 15 humano (SRCC730) [LT7] IA TI NO AdenoCa de tumor de pulmón humano {SRCC731 )[LT9] IB T2 NO 20 SqCCa de tumor de pulmón humano (SRCC732 )[LT10] IIB T2 NI SqCCa de tumor de pulmón humano (SRCC733 ) [LT11] IIB TI NI 25 Tabla 2 (continuación) Perfiles de Tumor Primario en Colon y Pulmón Tumor Primario Etapa..Otra..Etapa..Etapa Etapa Etapa Dukes T AdenoCa de tumor de pulmón humano (SRCC734) [LT12] IV T2 NO AdenoSqCCa de tumor de pulmón humano(SRCC735)[LT13] IB T2 NO SqCCa de tumor de pulmón humano {SRCC 36) [LT15] IB T2 NO SqCCa de tumor de pulmón humano {SRCC737 ) [LT16] IB T2 NO SqCCa de tumor de pulmón humano (SRCC738 ) [LT17] III T2 NI SqCCa de tumor de pu humano (SRCC739) [LT18] IB T2 NO Tabla 2 (continuación) Perfiles de Tumor Primario en Colon y Pulmón Tumor Primario Etapa..Otra..Etapa..Etapa Etapa Etapa Dukes T N SqCCa de tumor de pulmón humano (SRCC740) ÍLT19] IB T2 NO LCCa de tumor de pulmón humano (SRCC741 ) [LT21] IIB T3 NI AdenoCa de tumor de pulmón humano (SRCC811) [LT22] IA TI NO AdenoCa de tumor de colon humano (SRCC 42) [CT2] MI D pT4 NO AdenoCa de tumor de colon humano (SRCC743) [CT3] MI D pT3 NO AdenoCa de tumor de colon humano (SRCC744) [CT8] B T3 NO Tabla 2 (continuación) Perfiles de Tumor Primario en Colon v Pulmón Tumor Primario Etapa..Otra..Etapa .. Etapa Etapa Etapa Dukes T N AdenoCa de tumor de colon humano (SRCC745) [CT10] A pT2 NO AdenoCa de tumor de colon humano (SRCC746) [LT12] MO,Rl B T3 NO AdenoCa de tumor de < humano (SRCC747 ) [CT14] pMO,RO B pT3 NO AdenoCa de tumor de colon humano (SRCC748) [CT15] M1,R2 D T4 N2 AdenoCa de tumor de col humano (SRCC749) [CT16] p O B pT3 pNO AdenoCa de tumor de colon humano (SRCC750) [CT17] Cl pT3 pNl Tabla 2 (continuación) Perfiles de Tumor Primario en Colon y Pulmón V. 5 Tumor Primario Etapa .. Otra ..Etapa ..Etapa Etapa Etapa Dukes T N AdenoCa de tumor de colon humano (SRCC751) [CT1] MO, Rl B pT3 NO 10 AdenoCa de tumor de colon humano (SRCC752) [CT4] B pT3 MO AdenoCa de tumor de colon 15 humano ¡SRCC753) [CT5] G2 Cl pT3 pNO AdenoCa de tumor de colon humano (SRCC754 ) [CT6] pMO,RO B pT3 pNO AdenoCa de tumor de colon pulmón humano (SRCC755) [CT7] AdenoCa de tumor de colon humano (SRCC756) [CT9] Tabla 2 (continuación) Perfiles de Tumor Primario en Colon v Pulmón Tumor Primario Etapa..Otra..Etapa..Etapa Etapa Etapa Dukes T N AdenoCa de tumor de colon humano (SRCC757) [C 11] B T3 NO AdenoCa de tumor de colon humano (SRCC758) [CT18] MO, O B pT3 pNO Preparación de DNA: El DNA se preparó de lineas celulares, tumores primarios, sangre humana normal cultivadas. El aislamiento se efectuó utilizando equipo de purificación, proteasa y grupo de reguladores y todo de Qiagen, conforme a las instrucciones del fabricante y la descripción siguiente: Lisis de cultivo celular: Las células se lavaron y triptinizaron a una concentración de 7.5 x 10ti por dosificador y se compactó por centrifugación a 1000 RPM por 5 minutos a 4 °C, seguido por lavado otra vez con 4 volumen de recentrifugación de PBS. Los compactados se lavaron una tercera vez, las células suspendidas se colectaron y lavaron 2 x con PBS. Las células se suspendieron en 10 mi de PBS. El regulador Cl se equilibró a 4 °C. La proteasa no. 19155 de Quiagen se diluyó en 6.25 mi de ddH?0 frío hasta una concentración final de 20 mg/ml y se equilibró a 4 °C. Se prepararon 10 mi de G2 por dilución de solución madre de RNAsa de Quiagen (100 mg/ml) hasta una concentración final de 200 g ml .
Se añadieron entonces el regulador Cl (10 mi, 4°C) y ddH:0 (40 mi, 4 °C) a 10 mi de la suspensión celular, se mezclaron por inversión y se incubaron sobre hielo por 10 minutos. El núcleo celular se compacto por centrifugación en un rotor de celda oscilante Beckman a 2500 rpm a 4°C por 15 minutos. El sobrenadante de descargó y el núcleo se suspendió con vórtice en 2 mi de solución reguladora Cl ( a 4 °C) y 6 mi de ddK-O, seguido por una segunda centrifugación a 4 °C a 2500 rpm por 15 minutos. El núcleo se resuspendió entonces en la solución reguladora residual utilizando 200 µ? por extremo. Se añadió el regulador G2 (10 mi) al núcleo resuspendido mientras que se aplicó vórtice suave. Desde el plazo de la adición de la solución reguladora se aplicó vórtice vigoroso por 30 segundos. Se añadió la proteasa de Qiagen (200 µ?, preparada como se indicó anteriormente) e incubó a 50 °C por 60 minutos. La incubación y la centrifugación se repitieron hasta que el lisado estuvo claro (por ejemplo incubación adicional de 30-60 minutos, compactación a 3000 x g por 10 minutos, 4 °C) .
' Preparación de muestras y lisis del tumor humano sólido Se pesaron las muestras de tumor y se colocaron en tubos cónicos de 50 mi y se retuvieron sobre hielo. El proceso se limitó a no más de 250 mg de tejido por preparación (1 dosificación/preparación) . La solución de proteasa se preparó recientemente por dilución de 6.25 mi de ddK^O fría hasta una concentración final de 20 mg/ml y se almacenó a 4 °C. El regulador G2 (20 mi) se preparó por dilución de DNAsa A hasta una concentración final de 200 mg/ml (desde solución madre de 100 mg/ml). El tejido de tumor se homogeneizó en 19 mi de regulador G2 por 60 segundos utilizando el dosificador más ancho del politrón en una campana de extracción de aire TC de flujo laminar, a fin de evitar la inhalación de aerosoles, y mantener a la temperatura ambiente. Entre muestras, el politron se lavó por rotación a 2 x 30 segundos cada una en 2 L de ddH20, seguido por regulador Q2 (50 mi) . Si el tejido estaba aún presente sobre el dosificador del generador, el aparato se desmontó y limpió.
Se añadió la proteasa de Qiagen (preparada como se indicó anteriormente, 1.0 mi), seguida por vórtice e incubación a 50 °C poe 3 horas. La incubación y centrifugación se repitió hasta que los lisados fueron claros (por ejemplo, incubación adicional 30-60 minutos, compactación a 3000 x g por 10 minutos, 4 °C) .
Preparación de sangre humana y lisis La sangre se extrajo de voluntarios saludables utilizando protocolos para agentes infecciosos estándares y se citrataron en 10 mi de muestras por dosificador. La proteasa de Qiagen se preparó recientemente por dilución en 6.25 mi de ddH.O fría hasta una concentración final de 20 mg/ml y se almacenó a 4 °C. El regulador G2 se preparó por dilución de RNAsa A hasta una concentración final de 200 g/ l desde solución madre de 100 mg/ml) . La sangre (10 mi) se colocó en un tubo cónico y se añadieron 10 mi de regulador Cl 5 30 mi de ddK;0 (ambas previamente equilibradas a 4 °C) , y los componentes se mezclaron por inversión y se mantuvieron sobre hielo por 10 minutos. El núcleo se compactó con un rotor de celda oscilante Beckman a 2500 rpm, 4 °C por 15 minutos y se descargó el sobrenadante. Aplicando vórtice, se suspendió el núcleo en 2 mi de regulador Cl (4 °C) y 6 mi de ddH0 (4 °C) . Se repitió el vórtice hasta que el compactado fue blanco. El núcleo se suspendió entonces en el regulador residual utilizando una cantidad de 200 µ?. Se añadió regulador G2 (10 mi) al núcleo suspendido mientras se sometió a vórtice lentamente., seguido por vórtice vigoroso por 30 segundos. Se añadió la proteasa de Qiagen [200 µ?) y se incubó a 50 °C por 60 minutos. Se repitieron la incubación y centrifugación hasta que el lisado fue claro (por ejemplo, incubar 30-60 minutos adicionales, compactar a 3000 x g por 10 minutos, 4 °C) .
Purificación de lisados clarificados (1 ) Aislamiento de DNA genómico Se equilibró el DNA genómico (1 muestra por preparaciones en caídas de muestra maxi) con 10 mi de regulado QBT. El regulador de elusión QF se equilibró a 50 °C. las muestras se sometieron a vórtice por 30 segundos, luego se cargaron en dosificadores equilibrados y se drenaron por gravedad Los dosificadores se lavaron con 2 x 15 mi de regulador QC. El DNA se eluyó en 30 mi se silanizó y autoclaveó en tubos Corex de 30 mi con 15 mi de regulador QF (50 °C) . Se añadió isopropanol (10.5) a cada muestra, se cubrieron los tubos con parafina y se mezclaron por inversiones repetidas hasta que el DNA precipitó. Las muestras se compactaron por centrifugación en el rotor SS-34 a 15,000 rpm por 10 minutos a 4 °C. la localización del compactado se marcó, se descargó el sobrenadante, y se añadieron 10 mi de etanol al 70 % (4 °C) . Las muestras se compactaron otra vez por centrifugación en el rotor 55-34 a 10, 000 rpm por 10 minutos a 4 °C. la localización del compactado se marcó y el sobrenadante se descargó. Los tubos se colocaron entonces sobre su lado en un soporte de secado y se secó 10 minutos a 37 °c, teniendo cuidado de no sobre-secar las muestras.
Después de secado, los compactados de disolvieron en 1.0 mi de TE (pH 8.5) y se colocaron a 50 °C por 1-2 horas. Las muestras se mantuvieron toda la noche a 4 °C de modo que continúe la disolución. La solución de DNA se transfirió entonces a tubos de 1.5 mi con una aguja de presión 26 sobre una jeringa de tuberculina. La transferencia se repitió 5 x a fin de cortar el DNA. Las muestras se colocaron entonces a 50 eC por 1-2 horas. (2) Cuantificación de DNA Genómico y Preparación para Ensayo de Amplifiación Genética Los niveles de DNA en cada uno de los tubos se cuantifico por espectrometría estándar ATÓO# sobre unas diluciones 1:20 (5 µ? de DNA + 95 µ? de ddH20) utilizando celdillas de cuarzo de 0.1 mi en el espectrofotómetro Beckman DU640. La proporción de ^so/ ^o estuvo en el rango de 1.8 - 1.9. Cada una de las muestras de DNA se diluyeron entonces adicionalmente hasta aproximadamente 200 ng/ml en TE (pH 8.5). Si el material original estuvo altamente concentrado (aproximadamente 700 ng/µ?) , el material se colocó a 50 °C por varias horas hasta que se resuspendió.
La cuantificación fluorométrica del DNA se efectuó entonces sobre el material diluido (20-600 ng/ml) utilizando la guía del fabricante como se modifican a continuación. Esto se logró calentando un fluorométro Hoeffer DyNA Quant 200 por aproximadamente 15 minutos. La solución de trabajo con tintura de Hoeschst (#K33258, 10 µ?, preparada 12 horas antes de uso) se diluyó en 100 mi 1 x regulador TNE. Una celdilla de 2 mi se llenó con la solución del flucrómetro, se colocó en la máquina, y la máquina se ajustó a cero. Se añadió pGEM 3Zf(+) {2 µ?, lote 360651026) a 2 mi de solución de fluorómetro y se calibró a 200 unidades. Una cantidad adicional de 2 µ? de pGEM3Zf (+) DNA se examinó entonces y la se confirmó la lectura a 400 +/- 10 unidades. Se leyó cada una de las muestras al menos por triplicado. Cuando se encontró que 3 muestras estaban en 10 % cada una de la otra, se tomó su promedio y este valor se utilizó como el valor cuantificado .
La concentración determinada fluorométricamente se usó entonces para diluir cada una de las muestras hasta 10 ng/µ? en dH:0. Esto se hizo simultáneamente sobre todas muestras moldes para un ensayo en placa TaqMan única, y con suficiente material para correr 500-1000 muestras. Las muestras se examinaron por triplicado con cebadores TaqMan™ y sondas ambas B-actina y GAPDH sobre una sola placa con DNA humano y controles sin moldes. Las muestras diluidas se usaron a condición de que el valor de Ct de DNA humano normal sustraído de DNA de prueba fue +/- 1 Ct.El DNA genómico de 1 lote calificado, diluido se almacenó en alícuotas de 1.0 mi a -80 °C. Las alícuotas 2 que fueron posteriormente usadas en ensayos de amplificación genética se almacenaron a 4 aC. Cada alícuota de 1 mi es suficiente para 8-9 placas ó 64 pruebas.
Ensayo de amplificación genética: Los compuestos de PR0187, PR0533, PR0214, PRC240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246 ó PR0317 de la invención se cribaron en los siguientes tumores primarios y los valores de ACt resultantes se reportan en la Tabla 3. v J r t O Tabla 3 Valores de ACt en modelos de lineas celulares y Tumores tumores primarios de pulmón y colon Primarios ó Lincas PROI87 l'R(>533 I'R02I4 l'RO.40 l'ROJII IM«12J(I l'K026l l*R()246 I'R03I7 celulares ?.?7 -I 09 087 089 051 073 0.03 0.10 1.32 ¦ I 34 ¦o 2A 0 II -022 -009 -0.33 -0.08 0.48 -I 19 -027 -070 -II 76 1.127 -I 10 007 -063 1.16 -039 -I 09 •I Ift s ?.??3 274 I 85 201 188 342 I 02 1 1 1.90 298 091 I 83 237 226 322 I 13 1.68 2.24 244 026 213 0.73 284 1.01 -0.01 0.87 246 215 0.29 293 238 275 -0.23 205 2.53 1.16 1.74 1.82 II •1.53 014 002 040 -024 0.41 031 052 •I 58 •0.05 013 •014 -0 8 -039 0.44 0.85 •046 ¦212 -028 •028 -n 3 -036 ¦2on -048 LT2 ¦I 75 -009 0.52 056 •024 0.27 -0.13 0.69 •0.37 -0.17 •0.02 0.01 0.18 -001 0.06 010 0.52 •0.72 •0 9 -021 ¦0.28 v / M O Tabla 3 (Continuación) Valores de ACt on modelos de lincas mini a y tumores primarios de pulmón y colon Primary I umors P OIR7 PR0533 I'RD2I4 PRU240 PR02I1 ???230 PR026I PR0246 P 0JI7 or Cell lines I.TJ 032 I 57 122 1 7 016 091 1.06 I.M -O0S 078 034 0.20 056 0.63 0.16 0.61 0.6) -029 0.49 0.14 0 ID 1.14 • I «0 021 013 I 17 -044 0.32 0.64 I II -I 43 0 •019 0.4) 037 -0.40 -023 012 0.31 -I 92 •026 0.19 -073 I.T9 -042 019 OIR I 42 054 OIS 027 1.04 -I 17 010 -014 051 0 IS •0.11 -0.24 •0.10 -0.11 -0.71 •0.19 -0.1 -1.1) LTI2 270 1.38 2.32 I 51 286 0.10 •0S7 2.54 290 0.76 I 49 2S4 1.27 2 6 1.73 247 1.74 2.27 ¦0.19 242 0.27 292 1.08 I 54 0.74 3.02 I2S 2.23 3.07 261 0 S 209 228 1.13 134 LT22 -I.S8 OIS 0 IS •0.48 ¦08) •0.IS -0.93 ¦065 \ ) o Tabla 3 (Continuación) Valores de ACt en modelos de lineas celulares tumores primarios de pulmón y colon Tumores Primarios ó Lineas I»ROI«7 PROSS) PKOIM PRIMO G?02?? I IO230 PR026I PRU246 PR03I7 celulares mo I 67 199 213 085 071 017 I 36 O un I.T33 ¦07J 032 •044 0.21 -033 039 •055 1.121 ¦04) 097 -004 I 26 I 09 0.04 1.50 0.01 -072 092 094 I 22 098 003 114 060 0.4S 10 044 048 0 SO -M8 340 1152 049 088 ?.?-* .017 oes I 36 118 045 1.08 089 129 -0)2 I 02 ¦007 0)4 038 -0.08 -0.33 055 046 -091 -1354 .005 -066 I.T6 •012 066 I 12 075 08) 045 (160 193 -105 -002 ¦041 028 ¦004 -01) 014 -012 -017 • I 24 ¦030 .037 ¦076 \ J (SI Tabla 3 (Continuación) Valores de Act en modelos de lineas celulares y tumores primarios de pulmón y colon Tumores Prima ios ó Líneas PROI87 PR0533 PR02I4 PRO240 PRO. II PRO230 PR026I PR0246 PR03I7 celulares LTIO 031 096 1.24 196 0.31 I 16 107 2.57 -091 0.79 -019 0.41 030 0.32 0.21 -031 •0.35 001 -0.15 0.36 025 l ili 054 I 67 1 1 205 1 2 0 7 343 2.20 O 022 i no I so 231 I 19 I 14 I 59 141 2.31 ¦ JO n ii 27g 059 083 063 -1)07 1.02 I 99 028 019 1 0 154 0.48 I 67 080 1.24 0 9 ?.??5 375 I 77 2.44 244 12 0.97 211 206 392 050 I se 2.77 2.16 17 2.64 156 2.76 3.49 -001 2.79 0.77 >4 056 002 163 3.25 14 2.38 0.16 330 ¡6 •0.06 3.06 12 0.32 -0.50 >8 1.116 •023 0.91 0.95 125 1.15 080 0.92 1.55 •028 166 0.(2 I II 086 097 075 0.18 1.08 2.10 •0.14 105 0.11 0.29 0.82 -0.32 0.76 1.37 2.04 205 1.33 120 0.72 •042 217 0.54 0.43 1.37 183 10 O Tabla 3 (Continuación) Valores de Act en modelos de lineas celulares y tumores primarios de pulmón y colon Tumores Primarios ó Lineas PR0533 I'R«)2I l*Rt>240 PR02II l'IU)23U l'R026l PRÜ246 PR03I7 celulares ?.?7 071 I 93 124 185 I 26 1.67 2.68 229 047 I 32 I 17 247 230 I 39 201 I 69 203 -010 203 014 I 30 1.43 0.21 1.10 1.95 047 0.93 I 79 133 0.22 098 1.30 I 35 033 1.118 • I 29 ¦011 ¦044 048 062 I 22 0.36 •066 O ¦ I 58 031 -027 040 053 -021 0.46 -021 -0.31 -035 021 007 075 •050 OIS 0.23 0.64 033 -I 19 -017 030 007 -0.11 092 -044 019 0.69 I.TI 4 OS 209 307 242 0! 0.71 1.91 231 399 I 67 I 98 335 2SS 9; I 31 1.68 2.03 364 9! 1.39 1.16 307 71 2.33 3.44 7( 1.04 ?.G26 003 110 061 0.16 002 026 0.42 I.T28 •043 I II -046 0.64 o Tabla 3 (Continuación) Valores de ACt en modelos do lincas celulares y tumores primarios de pulmón y colon Tumores rrimarios ó Lincas l'ROS33 PR02I4 PRO240 l>R()2l l l'KI 123(1 PR026I PR0246 PR03I7 celulares LT29 -I 51 -D IO -0.9 ¦1.07 •I I I •0.70 ¦0.95 LTJI -006 092 0 73 •0.20 -044 O H 0.26 O oo ??G-?0?63? -0.19 066 0.S0 063 IIF-000643 •I 60 0.25 ¦0 10 0.34 HF-000140 -0.12 1.81 t .58 1.66 ???'·????42 •069 0.54 -031 052 A549 -030 • 1.30 •0 71 •I 67 0.92 \ J r \ t J O Tumores Trimarios Ó Lincas PROI87 PROS» PRCHI4 PRO240 PR02I I PRO230 PR026I PR0246 PR03I7 celulares Calu-I -2 53 0 10 -0 40 1 08 · -0.79 035 0 70 l'alu-6 -I 50 -0 62 -0 78 0 01 -0.80 -094 0 33 111 )7 -0 63 0 10 •0 70 090 · -0 08 -1.55 n 6 II M I -0 44 -0 43 -0 44 O I J ¦ -0 13 -(I I I 0 12 11460 -1.48 -0 SI •0.61 0 71 -048 036 -0.22 SKMESI -1.78 -009 0 31 0 21 0.85 021 •0.21 SW900 · -0.05 1.86 · ¦ -0 32 11322 •1.91 0 52 0.20 V / \ J o Tabla 3 (Continuación) Valores de Act en modelos de lineas celulares y tumores primarios de pulmón y colon Tumores Primarios Ó Lí eas PROI87 PROJ33 PR02I4 PRO240 PR02II PR"23ll PROMI PR024* PR03I7 celulares nsio -i OÍ o IÍ 04Í · -20* O CÍ2 3Sfi 24» 119 I 42 0.82 I 66 0.13 2.7S Olí 297 I 12 0.11 2.36 CTJ 0.« ?06 165 0» 134 214 0.05 0.77 053 096 0.14 0.2} 0.16 CT« 1.01 i« I 21 0.65 O.ftO 055 0.10 0.10 (M6 113 -001 0.34 0.72 CTIO I »· 114 til 030 I*» 1.00 -051 t.ll OÍ47 2.38 0.ÍI 0.13 I.» \ J o Tabla 3 (Continuación) Valores de ACt en modelos de lineas celulares y tumores primarios de pulmón y colon Tumores Primarios ó Lineas celulares PR0187 PR0533 PR0214 PRO240 PR0211 PRO230 PR0261 PR02 6 PR0317 I II I 37 047 I 13 014 •0.19 0.91 CU 2 -032 066 I 33 003 0.SI 0.97 241 220 049 079 103 02S 136 CTH i 12 0.73 0.72 1.24 095 I 95 I 63 I 85 071 096 067 041 133 CTI5 0X6 040 1.28 0.12 0.13 1.04 020 I9S IIJ 0 0 I 40 0.87 005 OIS CT16 039 070 I 26 0.01 051 0.21 •032 0.49 CII7 061 204 I 76 0.62 1.74 -019 009 071 1.27 0.23 OS» •0.06 -047 1.27 I 25 -0.06 076 •0.07 CTI I 24 015 I 22 I 50 2 021 •12.77 I 34 146 1.4? 1.14 0.9 0.14 CT4 012 066 1.36 116 1.33 1.32 100 0 6 0.63 0 1.42 194 1.02 0.95 1.10 I 17 -0.01 \ J tJ I J o Tabla 3 (Continuación) Valores de ACt en modelos de lineas celulares y tumores primarios de pulmón y colon Tumores Primarios ó Lineas P OI87 PR0533 PR02 I PRO240 IMUJ2 I I PR023II PR026I PR0246 PRO] 17 celulares C T5 2 96 0 19 I 56 2.41 I 76 2.27 I 07 I 33 0.07 2 99 2.76 2 04 I 64 I 03 2.39 0.10 CT6 I 10 0 S6 I 33 I 38 1 01 0.97 -0.01 0.IS 0.04 0 88 0 86 1.74 1.14 0.56 0.68 -0.62 CT7 I 40 0 42 064 1.09 0 70 1.39 0.IS 0.42 0.47 -1.13 •0 9) 1.48 0 38 0.34 -1.14 0 53 CT9 -0 86 0 21 0 38 -0.05 021 -0.18 0.68 0.17 0.01 1.39 1 16 0.12 0.86 0.38 1.09 1.24 0 31 CTI I 2.22 091 2 05 3.08 201 1.75 0.59 1.48 -033 2.26 1 85 2.81 1.83 1.00 1.12 0.39 CTII 0.31 0 55 0.63 0.26 0.76 0.75 0 73 0.38 -0.7J -0.07 0.38 0.59 0.57 0.33 0.23 0.22 o Tabla 3 (Continuación) Valores de ACt en modelos do lineas celulares y tumores primarios de pulmón y colon Tumores Primarios ó Líneas PROS» PR02I4 PRO240 PR02I I PKO230 PR026I PR0246 PR03I celulares CT2S -0 77 0 S4 -0 39 -OIS -066 073 -030 CT28 0 IR 0.40 001 CTJ5 -I 23 0 33 -061 •0 3 -l ni -006 -0 15 iironow 0.91 -0.23 0.22 ??G( )0539 2.21 I S7 1.16 ??G?00575 I I I -006 n.41 \ J o Tabla 3 (Continuación) Valores de ACt en modelos de lineas celulares y tumores primarios de pulmón y colon Tumores Primarios celulares ™°'»7 rRO"3 PR02M PR°240 ,,R02n PW>3° PR06' PR846 ??G000691 1 07 0 16 l IIF0IJO756 0 17 IIF00O789 -I 71 IIF0008I I -0 25 ??G?00755 X-3 O Tabla 3 (Continuación) Valores do Act en modelos de lincas celulares y ' tumores primarios de pulmón y colon Tumores Primarios Ó LileáS PROI R7 PR053J PRCJ2 M CROi-ÍO PRO.1 1 PRO230 PR026I PR0246 PR03I 7 celulares 0.62 1.90 1.20 1.57 1.68 I 36 I 59 1 S6 1 91 2.36 1.61 I.S3 2 50 SW620 ¦0 47 0 I I 1.14 061 -0.37 o Tabla 3 (Continuación) Valores de ACt en modelos de lineas célula tumores primarios de pulmón y colon Tumores Primarios ó Lineas celulares l'ROI 87 PR0533 PR02I l'R()2J0 l'K02l l l'K( )23U PR026I CCIO320 0 72 0 31 -0 5» 0 99 -033 0.41 091 072 033 249 0.99 1.06 1.24 1.04 0.46 0.27 IIT29 •0 92 -061 O IS 0.46 1.95 1.61 2.38 1.49 I 38 1.40 200 2.59 2.59 1.39 1.32 10 o Tabla 3 (Continuación) Valores do ACt en modelos de lineas celulares y tumores primarios de pulmón y colon Tumores Primarios Ó LinCaS |. OI87 PROS33 PK02I PRO240 PR02I I PRO230 PR026I PR0246 PROJI7 celulares -0.29 0 6 0.27 0.01 0.54 067 0.64 0.34 009 0.29 0.21 0.19 1.64 1.00 I 71 1.44 0 74 1.44 1.37 093 I.S4 1 58 0.91 017 Tabla 3 (Continuación) Valores de ACt en modelos de lineas celulares y tumores primarios de pulmón y colon PROI87 PR0533 PR02I4 PRO240 PR02II PRU2JU PR026I P 0246 PR03I7 llClllft - - -0*0 - 0.25 1.29 1.04 201 1.29 1.07 I 01 I.S6 10} 1.09 0.96 S COI 132 -035 · 021 0.7J 0.36 1.99 I 33 1.00 I 33 1.26 119 210 1.30 213 1.33 1.29 \ 1 o Tabla 3 (Continuación) Valores de Act en modelos de lineas celulares y tumores primarios de pulmón y colon Tumores Primarios PR024U l'RO. I I l'RO230 PR026I PR0246 PRO] 17 ó Líneas PR0533 PR02H celulares ¦049 026 •0.24 SW403 -I 44 ¦0 54 1.98 1 42 2.20 2 40 I 50 I .4J 2.15 I 52 1.67 2.19 1.40 vO 1.29 I.SI 7IT ¦099 -0 31 0 45 1.48 0.11 Cli.205 -0 72 -0 «3 0.27 0.07 IICTI J •0.49 -0.33 0 53 ¦090 IICC299» ¦0.7) ¦0.47 •0.36 •O H V / O Tabla 3 (Continuación) Valores de ACt en modelos de lineas celulares y tumores primarios de pulmón y colon Tumores Primarios ó Lineas celulares PR0533 PR02I PRO240 PR02I I l'K()2)U PR026I PK0246 PROJI7 KMI2 ¦ I 20 ¦047 ¦ 1.20 •0.80 SRCCI094 •3 26 •04S -I 61 ¦2 4 N O SRCCI09S ¦I 04 0)3 -O JO •0 0 SRCCI096 • I 66 029 -0.63 040 SRCCI097 -011 0.67 (1 24 1.07 SRCCI098 •0 J 056 •0.09 I.S7 /' ? 1-J O Tabla 3 (Continuación) Valores de ACt en modelos de lineas celulares y tumores primarios de pulmón y colon Tumores Primarios SRCCI099 -I 04 026 -018 100 SRLTIKIO -0 II 0 0 010 I 04 SKCCIIOI -0 J4 037 019 1.01 5 1.62 15 MF-005I 0.69 1.40 IIDI.I00 1.43 MB43SS o Tabla 3 (Continuación) Valores de ACt en modelos de lineas celulares y tumores primarios de pulmón y colon Tumores Primarios ó Lineas PK0IR7 PROS33 PR02I riH)24(l PRU2I I PRO230 PR026I PR0246 PRO} 17 celulares ?471? 0.11 ???68 -0.08 > 0.21 Mil 175 MDJ6I 0.J7 I .M DT20 MCI:7 0.S3 G Tabla 3 (Continuación) Valores de ACt en modelos de lineas celulares y Tumores tumores primarios de pulmón y colon Primarios ó Lincas celulares l'KU2M l'KO.40 I'RIM 11 l'K()23ll l*R026l l'RU24b I'R03I7 SKDR3 I 73 ??G0006?? 2h1 4?4 i n onos u o»4 -0 II] 025 024 l IIF-0008 1.22 •0.34 058 IIF-OW I 097 1111100733 214 1.21 233 1.36 IIFD007I6 255 1.61 1.18 2*2 I 54 PR0187: Se re-examinó PR0187 (DNA27864-1155) junto con tumores selccionados del cribado inicial anterior con mapeo de estructura. La Tabla 4 describe los marcadores de estructura que se emplearon en asociación con PR0187 (DNA27864-1155) . Los marcadores de estructura se localizaron aproximadamente cada 20 megabases a lo largo del cromosoma 8 (figura 21), y se usaron para controlar la aneuploidia. Los valores de ACt para los marcadores de structura descritos a lo largo del cromosoma 8 en relación a PR0187 (DNA27864) se indicaron para tumores seleccionados en la Tabla 6.
Se re-examinó también PR0187 (DNA27864-1155) junto con tumores seleccionados del cribado inicial anterior con mapeo epicéntrico. La Tabla 5 describe a los marcadores epicéntricos que se emplearon en asociación con PR0187 (DNA27864-1155) . Estos marcadores se localizaron en estrecha proximidad de DNA27864 y se usaron para evaluar el status de amplificación de la región del cromosoma 8 en la cual está localizado DNA27864. La distancia entre marcadores se mide en centirayos (cR) , que es una unidad de rompimiento de radiación aproximadamente igual a 1 % de oprtunidad de rompimiento entre dos marcadores. Un cR es muy aproximadamente equivalente a 20 kilobases. El marcador SHGC-9963 es el marcador encontró ser el más próximo a la localización del cromosoma 8 en el mapeo cuidadoso de DNA27864-1155.
La Tabla 7 indica los valores de ACt que resultaron del mapeo epicéntrico en relación a DNA27864, que indica la amplificación relativa en la región más inmediata a la localización actual de DNA27864 a lo largo del cromosoma 8 (firura 21) .
Tabla 4 Marcadores de estructura utilizados para DNA27864 Posición del mapa Nombre del Marcador de en el Cromosoma 8 Stanford Genome Center H9 EST00040 H59 WI-961 H121 SHGC-11323 H200 SHGC-7433 H256 AFMal83zfl Tabla 5 Marcadores epicéntricos a lo largo del Cromo5oiría 8 utilizados para DNA27864 Posición del Nombre del Marcador Distancia Mapa en el del Stanford Human al siguienCromosoma 8 Genome Center te marcador (CR5 H60 SHGC-32556 H61 SHGC-15994 H62 SHG-9963 H63 SHG-33989 10 K64 UT5371 33 H6! Tabla 6 Amplificación de marcadores de estructura en relación a DNA27864 (ACt) Tumor H9 DNA27864 HS9 H121 H200 H256 CT1 0.00 0.50 0.07 -0.07 -0.13 0.S8 CT4 •0.42 0.20 -0.18 •0.49 •0.08 0.27 CT5 -0.07 2.03 -0.54 -0.34 0.14 0.43 CT6 -0.08 0.13 0.04 •0.02 -0.09 •0.13 CT7 0.03 0.86 0.02 •0.06 -0.10 0.07 CT9 -0.39 -1.3 -0.14 •0.24 -0.29 0.08 CTI 1 -0.08 1.90 0.04 -0.05 -0.12 0.12 CTJÍ 0.12 0.1 1 0.02 -0.06 0.09 0.09 CT2 -0.25 2 92 0.23 0.16 0.14 0.34 CT3 -1.47 •0.05 0.09 0.07 -0.22 -0.01 T8 •0.80 0.84 0.04 0.08 •0.11 0.29 cno -0.41 ! .5 I -0.48 0.03 0.05 0.25 CT12 • 1.69 -0.57 -0 60 -0.07 0.43 0.83 CT14 - 1.17 1.62 0.24 0.14 0.21 1.14 CT13 - 1.05 0.30 -0.65 0.32 0.02 •15.63 CTI6 • 1.24 •0.00 0.13 0.16 0.07 0.1 ) CTI7 -0.12 0.26 -0.03 0.15 0.19 0.16 LT1 I . I -0.1 1 -0.3U -0.17 0.10 -0.1 1 0.06 LT12. I 0.26 2.26 0.59 -0.37 0.40 0.48 1-TI3. I 0.24 2.5S 0.45 0.14 0.08 0.28 I.TI5. I 0.21 3-5-? 0.39 -0.16 -0.09 0.30 LTI6.2 0.03 2.07 -0.14 -0.66 •0.34 0.99 LTI7.2 0.64 -0.10 0.39 0.03 -0.01 0.38 LTI S.2 0.82 •0 73 0.27 0.09 •0.10 0.19 LT22.1 0.07 ¦ 1.57 -0.2? -0.22 0.43 0.45 LTI . I 0.05 - 1 94 -0.62 -0.12 0.25 0.25 I.Tla.1 •0.15 -0.7 ! -0.65 0.00 0.29 0.56 1.T2.? 0.13 -0.5(> 0.22 0.21 0.25 0.43 LT3 1 -0.19 0.26 -0.10 ?.??' 1 0.20 0.13 Tabla 6 (continuación) Amplificación de marcadores de estructura en relación a DNA2 864 (ACt) Tumor H9 DNA27S6 H59 HI21 H200 H256 LT4.2 0.17 -1.35 -0.19 0.36 0.81 0.58 LT6.I ¦0.38 -0.81 -0.82 0.2S 0.15 036 LT7.1 -0.94 •1.12 -0.89 •0.50 0.35 0.73 LT9. I 0.11 -0.27 -0.10 -0.01 026 -0.01 LTIO.l 0.10 0.2S 0.00 0.10 -0.10 -0.04 Tabla 7 Amplificadión de los marcadores epicéntricos en relación a DNA27864 (ACt) Tumor H60 H6I H62 DNA H63 H64 H6S 27864 LTl. l -0.32 -0.56 0.00 •2.38 -0.77 •3.07 •0.22 LTIa. ! -0.09 -Ü.32 0.00 -0.66 -0.29 -1.14 -0.09 LT2.2 0.16 -0.31 0.00 -0.55 -0.52 1.14 -0.09 I.T3.1 -0.47 -0.63 0.00 -0.45 -0.75 0.29 -0.13 LT4.2 -0.32 -0.29 0.00 -1.61 •0.09 -3.46 -0.05 LT6. I -0.52 -0.69 0.00 -0.99 -0.20 •0.6S -0.30 ?/p. ? -1.16 - 1.5» 0.00 -1.54 • 1.19 -2.79 -1.18 LT9.I 0.16 -0.15 0.00 - 1.13 -0.61 -0.88 -0.05 LTIO. I -0.27 -0.46 0.00 -0.41 -0.66 -1.25 -0.28 LTl l . l 1.87 0.20 0.00 -0.53 0.55 0.92 0.51 LT I2.1 0.48 0.02 0.00 1.96 •0.21 •0.54 0.1 1 1.??3.? 0.23 -0.19 O.Of.» 2.32 0.1 1.74 0.10 LTI5. I 0.23 -0.27 0.00 3.43 -0.41 1.61 -0.03 LTI6.2 -0.16 -0.72 0.0Ü 1.88 -0.59 1.05 -0.32 LT17.2 2 44 0.20 0.00 D. I4 0.71 0.63 0.01 LT18.2 0.17 -0.29 0.00 -0.60 -0.27 0.01 -0.05 1.T22. I 0.38 -U.4Ú 000 ¦ 1.42 -0.35 -9.53 -0.20 CT2 0.19 -0.10 0.00 3.25 0.13 3.15 0.05 CT3 0. IS -0.18 0.00 -0.02 0.15 2.34 0.09 CTK 0.33 0.18 000 1 05 •8.10 0.34 0.05 CT10 0.34 0.02 0.00 1.81 0.32 3.52 0.05 Tabla 7 (continuación) Amplificadión de los marcadores epicéntricos en relación a DNA27864 (ACt) Tumor H60 H61 H62 DNA H63 H64 H6S 27864 CTI2 •0.14 -0.27 0.00 -0.44 -0.46 0.71 0.29 CTH 0.90 0.24 0.00 1.86 0.45 0.34 0.02 CTI 6 0.2S 0.09 0.00 0.27 0.33 1.88 -0.07 CT17 0.13 -0.22 0.00 0.32 0.40 0.29 -0.15 CTi •0.05 -0.08 0.00 0.76 -0.25 -0.66 0.16 CT4 -0.47 -0.24 0.00 0.28 -0.47 •0.15 •0.36 CT5 -0.35 -0.15 0.00 2.19 -0.47 0.00 0.06 CT6 -0 17 0.1 1 u.oo 0. 1 -0.06 -1.50 0.31 CT7 •0.29 -0.22 0.0Ü 0.98 -0.25 0.81 0.07 CT ¦0.33 -0.36 .oo •1.89 0.06 -1.74 0.09 CTI 1 -0.23 -0.30 000 1.89 0.33 0.36 0.38 CT1 S -0 15 -0.12 0 00 -0.05 0.16 -1.36 0.31 PRO2 0: Se re-examinó PRO240 (DNA34387-1138) junto con tumores seleccionados del cribado inicial anterior con mapeo de estructura. La Tabla 8 describe los marcadores de estructura que se emplearon en asociación con PRO240 (DNA34387-1138) . Los marcadores de estructura se localizaron aproximadamente cada 20 megabases a lo largo del cromosoma 2 (figura 22), y se usaron para controlar la aneuploidia. Los valores de ACt para los marcadores de estructura descritos a lo largo del cromosoma 2 en relación a PRO240 (DNA34387) se indicaron para tumores seleccionados en la Tabla 10.
Se re-examinó también PRO240 (DNA34387-1138) junto con tumores seleccionados del cribado inicial anterior con mapeo epicéntrico. La Tabla 9 describe a los marcadores epicéntricos que se emplearon en asociación con PRO240 (DNA34387-1138) . Estos marcadores se localizaron en estrecha proximidad de DNA34387 y se usaron para evaluar el status de amplificación de la región del cromosoma 2 (figura 22) en la cual está localizado DNA34387. La distancia entre marcadores se mide en centirayos (cR) , que es una unidad de rompimiento de radiación aproximadamente igual a 1 % de oportunidad de rompimiento entre dos marcadores. Un cR es muy aproximadamente equivalente a 20 kilobases. El marcador SHGC-14626 es el marcador a lo largo del cromosoma 2 que más cuidadosamente mapea al DNA 34387; Sin embargo, los cebadores de TaqMan™ y sondas para SHGC-14626 fallaron en nuestro ensayo, debido a dificultades técnicas relacionadas con PCR.E1 DNA3 387, se encontró que también estaba contenido en un BAC (Cromosoma Artificial bacteriano) . El BAC completo fue de aproximadamente 100 Kb. Se identificó por cribado de una biblioteca de BAC con los cebadores de TaqMan™ y la sonda para DAN34387 un BAC que contiene DAN34387. Los extremos de un clon pcsitivo-DNA34387 se secuenciaron, y dos grupos de cebadores de TaqMan™ y sondas se elaboraron para la secuencia final de BAC (Tablas 9 y 11) .Esto confirma la validez los resultados de nuestro mapeo epicéntrico original. La Tabla 11 indica los valores de Act para los resultados del mapeo epicéntrico relativos a D A34387, que indican la amplificación relativa en la región cromosómica inmediata a lo largo del cromosoma 2 (figura 22) .
Tabla 8 Marcadores de Estructura Usados Para DNA34387 Posición del mapa Nombre del Marcador de en el Cromosoma 2 Stanford Genome Center B3 SHGC-30098 E45 SKGC-33615 DQfl I-7936 B125 WI-469 B169 SKGC-31624 B213 SHGC-10074 SHGC-30970 B290 3HGC-9794 B331 AEM210xb2 Tabla 8 (continuación) Marcadores de Estructura Usados Para DNA34387 Posición del mapa Nombre del Marcador de en el Cromosoma 2 Stanford Genome Center B386 SHGC-13676 B441 AFM199yf2 B494 SHGC-33448 Tabla 9 Marcadores epicéntricos a lo largo del Cromosema 2 Usados para DNA34387 Posición del Nombre del Marcador Distancia Mapa en el del Stanford Human al sicfuisn- Cromosoma 2 Genome Center te marcador (c ) 360 AFMal36wh9 65 (espacio) B63 AFM254 c9 B64 r /- r> -i B66 SHGC-11736 B67 SHGC-35430 17 B6 AFM234YA9 32 B71 CHLC . GATASF07. 40 Tabla 9 (continuación) G Marcadores epicéntricos a lo largo del Cromosoma 2 Usados para DNA34387 Posición del Nombre del Marcador Distancia Mapa en el del Stanford Human al siguienCromosoma 2 Genome Center te marcador (cR) V. 10 189D13FOR1 Marcador del extremo delantero de la secuencia BAC 15 189D13REV1 Marcador del extremo delantero de la secuencia 20 25 J LA Tabla 10 Amplificación de marcadores de estructura en relación a DNA34387-Marcadores de Estructura (Act) r ¦ w \ J o Tabla 11 Amplificación de marcadores epicéntricos y de BAC en relación a DNA34387 Tumor de B 0 B63 B64 B65 B66 B67 B68 B7I BAC BAC DNA DNA Pulmón (for.) (rev.) 34387.3utr 34387.lm.2 LTI 0. J7 0 22; 0.34; 0.00 0.10; 0.65; 0.64; -0.01 0 1 1 0.91 0.65; 0.81 0.76 0.14 0.04 0.32 0.38 0.83 LT Ia 0 06 -0 04; 0.03; 0.00 -0 21 ; -0.03; 0.22; 0.86 1.29 0.61 1.63; 1.50 1.54 0.06 0.66 0.06 0.14 0.83 LT2 0.28 0 15; ¦001 ; 0.00 0.14; 0.43; 0.49; 0.69 0.08 0.68 0.54; 0.88 1.19 0.26 0.79 0.07 0.21 1.01 LT3 0.16 004; 0.07; 0.00 -0.30; 0.16; 0.29; 0.27 0.98 0.89 1.97; 1.38 1.44 0.12 0.86 0.01 0.13 0.96 LT4 0.29 -0.13; ¦0.09; 0.00 0.01 ; 0.49; 0.45; -0.62 -0.26 0.82 0.70: 0.84 1.05 -0 05 0.82 0.23 -0.34 1.06 LT6 0.13 -0.41; 0.07; 0.00 -0.71 ; 0.06; 0.35; 0.34 0.81 0.69 1.26: 1 19 1.01 -0.41 0.72 0.09 ¦0.53 0.61 LT7 0.18 -0.29; 0.22: 0.00 ¦0.32; 0.29; 0.32; -0.37 0.74 0.42 1.06; 1.07 1.07 -0.I S I OS 0.24 ¦0.04 0.96 Lung Tumor 1)60 U63 064 B65 B66 B67 B68 B7I BAC BAC DNA DNA (Ibr.) (rev.) 34387.3ulr 34387.???.2 I.T 0, 18 -0.21 ; 0.66; 0.00 -0.15; 0.38; 0.32; -0.23 0.62 0.48 1.58: 1.01 1.03 -0.02 1.01 0.16 -0.33 1.04 LTIO 0.03 -0.32; 0.18; 0.00 -0.28; 0.76; 0.28; 1.02 0.99 0.38 1.41; 1.24 I .SS -0.03 0.95 0.32 1.06 0.80 tabla 11 (Continuación) Amplificación de marcadores epicéntricos y de BAC en relación a DNA34387 Tumor de B60 B63 B64 B65 B66 B67 B68 B7 I BAC BAC DNA DNA Pulmón (G?G.) (rev.) 34387.3ulr 34387.im.2 LTI I 0.3 1 0.08; 0.76; 0.00 0.24; 0.05; 0.88; 0.95 2.13 0.72 2.25 1.50 0.15 1.59 0.15 0.14 0 97 LT12 0.19 -0.1 1 ; 0.J8; 0.00 0.18; 0.27; 0.70; 1 .39 2.86 0.42 3.1 1 2.41 •0. 1 1 0.81 0.22 0.05 0.73 I.TI3 0.1 1 0.0.1; 0.46 0.00 -0.02; 0 00 0.68; 1.3 1 2.84 0.53 2.85 1.76 0. 12 0.71 ¦0.22 •0.19 0.71 I.TI5 0.16 -0.03; 0.35; 0.00 0.00; •0.08; 0.52; 0.98 3.73 0.71 3.78 2.92 0.1 1 0.94 -0.44 -0.37 0, 1 LTI6 0.27 -0.03; 0.00; 0.00 0.02; 0.23; 0.63; 1.46 0.91 0.47 1.33 0.67 0.10 0.64 0 00 0.44 0.63 LTI 7 0.17 0.20; 0.45; 0.00 0.19; 0.S8; 0.86; 1.59 1.99 0.80 2.20 1.29 0.24 1.19 0.19 0.13 0.96 LTI8 0.00 -0.09; -0.45; 0.00 0.1 1 ; 0.46; 0.32; 1.47 -0.39 0.57 0.18 -0.46 -0.04 -0.01 0.18 1.36 0.33 LTI9 0.31 ¦0.18; 0.32; 0.00 •0.10; 0.30; 0.66; 1.09 3.91 0.58 3.93 2.86 -0.26 0.79 ¦0.40 0. 1 0.61 LT2 I 0.20 -0.02; 0.40; 0.00 -0.06; 0.45; 0.77; 1.92 0.66 0.71 1.10 0.34 0.24 1.03 -0.01 0.98 0.75 PRO230: Se re-examinó PRO230 (DNA33223-1136) junto con tumores selccionados del cribado inicial anterior con mapeo de estructura. La Tabla 12 describe los marcadores de estructura que se emplearon en asociación con PRO230 (DNA33223-1136) . Los marcadores de estructura se localizaron aproximadamente cada 20 megabases a lo largo del cromosoma 1 (figura 23), y se usaron para controlar la aneuploidia. Los valores de ACt para los marcadores de estructura descritos a lo largo del cromosoma 1 en relación a PRO230 (DNA33223-1136) se indicaron para tumores seleccionados en la Tabla 14.
Se re-examinó también PRO230 (DNA33223-1136) con mapeo epicéntrico. Se identificó cromosoma artificial bacteriano (un BAC) que contiene DNA33223 por cribado de un biblioteca de BAC. Los extremos de un clon positivo-DNA33223 se secuenciaron, y dos grupos de cebadores de TaqMan™ y sondas se elaboraron para la secuencia final de BAC. Los cebadores TaqMan™ y sondas para el extremo de BAC fueron asi usados como marcadores para evaluar el status de amplificación de la región del cromosoma 1 en la cual se localiza DNA33323. Los clones de BAC son aproximadamente de 100 a 150 Kb. DNA40625 (un nuevo gen) se localiza también en el BAC que contiene a DNA33223) . Estos marcadores se localizan en estrecha proximidad a DNA33223 y se usan para evaluar el ^ status de amplificación de la región del Cromosoma I en la que se localiza DNA33223. La distancia entre marcadores se 5 mide en centirayos (cR) , la cual es una unidad de rompimiento de radiación aproximadamente igual a 1 ¾ de probabilidad de un rompimiento entre dos marcadores, Un cR es muy aproximadamente equivalente a 20 kilobases. El marcador SHGC-35321 es el marcador que se encontró que es 10 el más próximo a la localización en el Cromosoma 1 en el mapa de DNA-1136 (figura 23) .
La Tabla 15 indica los valores de ACt para los resulados del mapeo epicéntrico de DNA33223, que indican la 15 amplificación relativa en la región cromosómica más inmediata a la localización actual de DNA33223 a lo largo del cromosoma 1 (figura 23). 20 25 Tabla 12 Marcadores de Estructura Usados Para DNA.33223 Posición del mapa Nombre del Marcador de Stanford Human Genome Center Al SHGC-33169 A40 SHGC-3901 A84 AFM234tb6 A129 ACT1B03 Al 80 SKGC-34001 A220 AFM338wb5 A263 EST00691 A312 SHGC7599 Tabla 12 (continuación) Marcadores de Estructura Usados Para DNA33223 Posición del mapa Nombre del Marcador de Stanford Human Genome Center A398 SHGC-37552 A443 SHGC-11921 A485 SHGC-9327 A520 SHGC-30345 A553 SHGC-3055 Tabla 13 Marcadores epicéntricos a lo largo del cromosoma 1 usados para DNA33223 Posición del Nombre del Marcador Distancia Mapa en el del Stanford Human al siguienCromosoma 1 Genome Center te marcador (cR) A83 SHGC-37693 97 (espacio) A8 AFM234tb6 A85 AFM2 0za9 46 A86 AEM199zd2 10 A87 SHGC-35321 11 A88 SHGC-3252 12 A89 SHGC-11204 173 A102 SHGC-11219 Tabla 13 (continuación) Marcadores epicéntricos a lo largo del cromosoma 1 usados para DNA33223 Posición del Nombre del Marcador Distancia Mapa en el del Stanford Human al siguienCromosoma 1 Genome Center te marcador (cR) 10 189D13FOR1 Marcador del extremo delantero de la secuencia BAC 15 189D13FOR2 Marcador del extremo delantero de la secuencia BAC V ..
DNA33223 20 DNA40625 189D13REV1 Marcador del extremo delantero de la 25 secuencia BAC Tabla 13 Marcadores epicéntricos a lo largo del cromosoma 1 usados para DNA33223 Posición del Nombre del Marcador Distancia Mapa en el del Stanford Human al siguienCromosoma 1 Genome Center te marcador 'V .,' 10 (cR) 189D13REV2 Marcador del extremo delantero de la secuencia BAC 15 20 25 \ l-J o Tabla 14 Amplificación de marcadores de estructura en relación a DNA33223-Marcadores de Estructura (Act) Marcadores de Estructura Tumor A l A40 A84 AI 29 A 180 A220 A263 ?3 ? 2 A355 A398 A443 A485 A520 A5S3 DNA 33223-utr LTI 0.64 0.1 1 0.03 -0.19 0.00 0.35 0.00 0.1 1 0.23 0.22 0.58 0.42 0. 1 0.20 -0.38 Li la 0.76 0.32 -0.18 •0.28 0.00 0.29 0.00 -0.54 -0.04 -4.27 -0.08 0.22 0.05 0.1 1 0.4S LT2 0.54 0.48 -0.03 -0.14 0.00 0.33 0.00 0.07 0.19 0.46 0.30 0.42 0.07 0.27 -0.32 LT3 1.14 0.51 •0 13 -0.21 0.00 0 65 0.00 •0.15 -0.05 -0.34 0.00 0.01 •0.05 0.02 0.87 LT4 0.73 0.21 •0.40 -0.10 0.00 0.45 0.00 -0.25 0.32 0.37 0.20 0.42 0.05 0.23 •0.63 LT6 0.55 0.44 -0.40 0.02 0.00 0.63 0.00 -0.56 0.43 0.83 -0.17 0.02 -0.16 -0.31 0.63 LT7 0.53 -0.04 •0.15 -0.25 0.00 0.63 0.00 -0.27 0.56 -0.58 0.87 0.96 0.70 0.54 0.86 LT9 0.55 -0.31 -0.08 •0.28 0.00 0.51 0.00 -0.63 -0.01 -0.12 ¦0.17 0.01 -0.30 -0.2S -0.07 V. J ? o Tabla 14 (Continuación) /Amplificación de marcadores de estructura en relación a DNA33223-Marcadores de Estructura (Act) Marcadores de Estructura LTIO 0.78 0.1 1 0.16 0.1 1 0.00 0.90 0.00 -0.18 -0.18 0.00 0.15 -0.15 -0.09 -0.22 0.77 LTI 1 0.63 0.32 -0.48 -0.16 0.00 0.07 0.00 •0.15 0.18 0.13 -0.1 1 0.35 0.35 0.00 1.30 LTI2 0.29 0.30 -0.32 -0.51 0.00 -0.18 0.00 -0.72 0.04 0.02 -0.21 -0.06 0.27 •0.10 2.76 LTI3 0.66 0.39 -0.04 -0.47 0.00 -0.65 0.00 -0.04 -0.12 -0.24 -0.20 0.01 0.02 -0.08 3.42 LTI5 0.53 0.29 0.00 -0.16 0.00 0.25 0.00 •0.38 -0.02 -0.03 •0.11 -0.1 1 0.65 0.18 4.64 LTI6 0.84 0.57 -0.22 0.00 0.00 0.64 0.00 -0.97 0.37 0.12 ¦0.04 -0.03 0.83 0.35 0.73 LTI 7 0.66 0.41 -0.51 0.04 0.00 0.69 0.00 -0.22 0.09 0.22 -0.01 -0.25 0.60 0.26 1.24 LTI8 ¦0.21 0.56 -0.1 1 -1.99 0.00 0.32 0.00 -0.83 0.02 -0.19 -0.04 •0.22 0.63 -0.01 -0.24 LTI9 0.26 • 13.38 -0.17 -0.31 0.00 0.02 0.00 ¦0.51 -0.10 0.28 -0.41 -0.29 0.41 0.04 4.74 LT2 I 0.37 0.23 ¦0.17 •0.09 0.00 0.69 0.00 •0.09 -0.10 -0.08 -0.04 •0.17 0.61 ¦0.07 0.28 r o Tabla 15 Amplificación de Marcadores Epicéntricos en Relación a DNA33223 (ACt) Tumor: A83 ?8 ? A85 ?86 ?87 A88 A89 A 102 DNA DNA I 89DI 3 I89DI3 DNA I89DI3 I89DI3 33223. 33223. FOR I FOR2 40625 REVI REV2 3'ulr Im3 LTI ¦0.22; -0.05; -0 15; -0.05; 1.14; -0.82; 0.12; -0 07 - 1.42; •0.58 • - - - - -0 09 -0.07 -0.09 -0.30 -0.30 -0.99 -0.08 -0.76 LTI a -0.35; - 1.23; •0.48; 0.02: 1.32: 0.90 -0.27; 0.69 2.1 1 ; 2.02 - - - - - 0.02 -0.37 -0.07 0 I I 0.39 -0.03 -0.1 1 -0.25 LT2 -0.23; - 1.70; -0 32; -0 05; 0 97; 0.72; -0.03; 0.32 - 1.35; -0.73 - - • - - 0.09 0.63 0 01 0.05 -0. 18 0.37 0.09 -0.09 LT3 0.09; -0.60; 0.00; -0.26; 1.53; 1. 17; 0.22; 1.01 1.51 ; 1.68 - - - - 0.00 -0.06 0 08 -0.41 0.24 0.27 -0.01 0.27 LT4 -0.05; -0.4-1; -0.15; -0.08; 0.90; 0.90; -0.02; 0.60 -1.70; -0.66 - - - - - -0.02 -0.18 -0.12 0.17 0.33 0.25 0.04 •0.46 LT6 ¦0.20; -0. 10; -0.19; -0.1 1 ; 1.67; 1.20; 0.27; 1.40 3.79; 3.52 - - - - - -0.20 -0.08 -0.06 ¦0.37 •0.59 ¦0.03 •0.05 0.04 LT7 -0.28; 0.22; -0.09; 0.26 1.59; 0.90; 0.09; -14.51 0.97; 0.73 - - - - -0.09 -0.44 ¦0.15 0.03 0.38 -0.07 -0.12 -0.01 LT? -0.22; 0.02; -0.23; 0.07; 1.90; 1.43: 0.04; 2.02 4.44; 4.26 - - • - - -0.07 -0.84 0.05 0.15 0.95 0.07 0.08 0.09 © Tabla 15 (Continuación) Amplificación de Marcadores Epiccntricos en Relación a DNA33223 (ACt) Tumor A83 A84 ?85 A86 A87 A88 A89 A 102 DNA DNA I 89DI3 I89DI 3 DNA I89DI3 I89DI3 33223. 33223. FO I FOR2 40625 REV I REV2 3'utr Im3 LTIO -0.29; - 1 07; -0.27; -0.09; 2.09; 1.19; 0.09; 1.85 4.41 ; 4.19 - - - - - -0.02 -0.55 0.02 -0.22 0.86 0.12 -0.02 0.05 LTM -0.15; -0 02; -0.09; 0.43; 0.65; 1.15; 0.10; 0.88 0.90; 0.91; 0.05 -0.15 -0.04 0.43 0.58 0.28 0 13 -0.18 -0.24 -0 18; 0.06; 0.05 0.31 1.14 0.14 1.34 LTI2 -0.03: 0.09; -0.20; 0.16; 0.59; 1.00; 0 »3; 0.36 2.39; 1.74; -0.1 1 -0.03 -0.09 0.07 0.29 0.19 -0.18 -0.18 0.03 0.40; 0.00; 0.07 1.46 2.59 - 1.57 0.65 LTI3 -0.01 ; -0.17; -0.25; 0.23; 0.68; 1.06; 0.06; 0.81 2.70; 2.15; 0.05 -0.13 0.04 0.53 0.60 0.34 -0.01 0.20 ¦0.14 0.28; 0.10: 0.04 2.15 3.21 0.47 1.14 LTI 5 -0.02; 0.14; •0.18; •0.02; 0.34; 0.96; 0.07; 1.28 3.89; 2.91 ; •0.20 •0.30 0.31 0.30 0.32 0.29 ¦0.13 •0.06 -0.30 ¦1.57; 0.27; 0.09 3.12 4.30 -0.93 1.07 LTI6 0.22; 0.49; 0.43; 0.47; 0.94; 1.12; 0.34; 1.37 0.18: 0.31 ; 0.16 0.02 0.16 0.95 0.38 -0. I S ¦0.45 -0 52 ¦0.78 ¦0.63; -0.21; •0.1 1 1.67 0.S8 0.74 1.23 V V J O Tabla 15 (Continuación) Amplificación dc Marcadores Epiccntricos en Relación a DNA33223 (ACt) Tumors A83 ?8? A8S ?86 ?87 ?88 ?89 A I02 DNA DNA I 89DI 3 I89DI 3 . DNA I89DI 3 I89DI3 33223. 33223. FORI FOR2 40625 REVI REV2 3'utr tm3 LTI 7 0.13; 0.83; 0.21 ; 0.04; 1.06; 0.39; 0.30; 0.98 0.63; 0.95; -0.1 1 -0.01 0.38 0.27 0.64 0.41 -0.10 0.31 0.19 0.21 ; 0.10; 0.21 0.56 1 18 -0.12 0.47 LTI 8 -0.07; 0.36; 0.14; -0.1 1 ; 0.47; -4.77; 0.27; 0.09 -0.82; -0.66; -0.05 -0.23 -0.07 0.25 0.60 0 22 0.08 0.05 -0.13 002; -0.93; 0.21 0.59 -0.55 -0.56 -0.33 LTI9 -0.29 -0,44 -0.35 -0.30 0.1 ; -0.13; 0.17 1.35 4.09 3.23; -0.23 -0.43 -0.21 0.27 0.73 -0.98 •0.03 4.67 LT2I -0.22 -0.59 -0.13 -0.16 0.88; 0.91 ; -0.05 0.44 -0.54 0.29; 0.04 -0.09 0.08 0.48 0.69 -0.39 1.27 -0.04 LT22 -0.95 -0.32 -0.18 -0.18 -0.25 •0.02 0.1 1 -0.75 CT2 0.43 -0.46 0.01 0.50 0.00 -0.52 0.29 0.84 CT4 -0.16 -0.72 -0.23 -0.86 0.00 ¦1.72 0.05 0.76 CTS ¦0.07 -0.42 -0.03 O IS 0.00 0.32 -0.50 2.1 1 CT6 -o.os -0.72 O.OS •0.17 0.00 0.41 ¦0.17 0.59 CT7 •0.20 •0.45 0.03 -0.49 0.00 0.19 ¦0.59 0.8S CT9 •0.02 0.22 -3.00 0.00 0.00 0.20 -0.66 -0.10 CTI I -0.34 -0.38 -0.15 • 1.24 0.00 0.22 -1.35 1.46 C/l o Tabla 15 (Continuación) Amplificación de Marcadores Epicéntricos en Relación a DNA33223 (ACt) Tuinors A83 A84 A85 A86 A87 A88 A89 A 102 DNA DNA I 89DI I89DI3 ONA I89DI3 I89DI3 33223. 33223. FOR I FOR2 40625 REV I REV2 3'utr Im3 CTI 8 ¦0.1 1 4.24 -0.05 0.22 0.00 -0.84 -0.79 0.47 CT2 -0.48 -0.18 -0.52 -0.91 0.00 -2.99 -0.47 2.01 CT3 -0.21 0.07 - 1.02 •0.27 0.00 0.21 -0.36 0.38 CT8 0.24 0.80 0.05 -0.07 0.00 0.25 -0.04 0.78 CTIO -0.39 0.1 1 -0.29 -0.31 0.00 0.10 -0.34 1.17 CTI2 -0.60 005 -1.01 -0.25 0.00 0.13 -0.90 0.53 CTI4 -0.39 0.49 -0.99 - I I I 0.00 -0.32 -0.61 0.79 ene 0.04 -0.37 -0.07 0.14 0.(10 0.19 •0.20 0.51 CTI 7 0.01 •0.06 0.13 0.59 0.00 0.34 0.07 0.36 - - DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES f x PR0187 (DNA27864-1155) : 5 Los valores de ACt para DNA27864-1155 en una variedad de tumores se reportaron en la Tabla 3. Un ACt de > 1 se utilizó típicamente como valor umbral para registro de amplificación, de modo que esto representa una reduplicación de la copia genética. La Tabla 3 indica que la ^ ' 10 amplificación significativa del ácido nucleico DNA 27864- 1155 codificadora de PR0187 tiene lugar (1) en tumores de pulmón primarios: LT12, LT13, LT15, LT16, LT19 y LT30; y (2) en tumores primarios de colon: CT2, CT8, CT10, CT14, CTl, CT5, CT6, CT7, CT9 y CT11. La amplificación se ha 15 confirmado por mapeo de estructura (Tabla 6) para DNA27864: en tumores de pulmón primario: LT12, LT13, LT15 y LT16 y en tumores de colon primario: CT2, CT5, CT10, CT11 y CT14. El análisis de los marcadores de estructura reporta la amplificación relativa de regiones particulares del 20 Cromosoma 8 en los tumores indicados, mientras que el análisis de los marcadores epicéntricos da una lectura más precisa de la amplificación relativa en la región inmediatamente en la vecindad del gen de interés. La amplificación de los marcadores de estructura mejor conocidos (Tabla .6) no tiene lugar en un mayor grado que la de DNA27864.
Se ha confirmado la amplificación por mapeo epicéntrico (Tabla 7) para DNA27864-1155 y dio como resultado amplificación significativa: en tumores de colon primario: CT2, CT5, CT8, CT10, CT11 y CT14; y en tumores de pulmón primario: LT12, LT13, LT15, y LT16. en contraste, la amplificación de los marcadores epicéntricos mejor conocidos (con excepción de H60 y H64) no tiene lugar en un mayor grado que la de DNA27864 (Tabla 7) . Esto sugiere fuertemente que DNA27864 es el gen responsable de la amplificación de la región particular del Cromosoma 8. Porque la amplificación de DNA27864 tiene lugar en varios tumores de colon y de pulmón, es altamente probable desempeñar un papel significativo en la formación ó crecimiento de tumor. Como un resultaddo, los antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la proteina codificada por DNA27864 (PR0187) se esperaría que tenga utilidad en terapia para el cáncer.
PR0533 (DNA4943-1219) : Los valores de ACt para DNA49435-1219 en una variedad de tumores de pulmón se reportan en la Tabla 3. Un ACt de > 1 fue usado típicamente como un valor umbral para registro de amplificación, de modo que esto representa una reduplicación de copia genética. La Tabla 3 indica que la amplificación significativa del ácido nucleico DNA49435-1219 codificadora de PR0533 tiene lugar en tumores primarios de pulmón: LTla, LT7, LT11, LT16, LT17, y LT19. Porque la amplificación de DNA49435-1219 tiene lugar en varios tumores de pulmón, está probablemente asociado con la formación y/ó crecimiento de tumores. Como un resultado, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la proteína codificada por DNA49435 (PR0533) se esperaría que sea de utilidad en terapia para el cáncer.
PR0214 (DNA32286-1191) : Los valores de ACt para DNA32286-1191 en una variedad de tumores de pulmón se reportan en la Tabla 3. Un ACt de > 1 fue usado típicamente como un valor umbral para registro de amplificación, de modo que esto representa una reduplicación de copia genética. La Tabla 3 indica que la amplificación significativa del ácido nucleico DNA32286-1191 codificadora de PR0214 tiene lugar: (1) en tumores primarios de pulmón: LT3, LT11, LT12, LT13, LT15, LT17 y LT19 y (2) en tumores de colon primarios: CT2, CT3, CT8, CT10, CT12, CT14, CT15, CT16, CT17, CT1, CT4, CT5, CT6, CT9 y CT11. Porque la amplificación de DNA32286-1191 tiene lugar en varios tumores de pulmón, está probablemente asociado con la formación y/ó crecimiento de tumores. Como un resultado, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la proteina codificada por DNA32286 (PR0214) se esperaría que sea de utilidad en terapia para el cáncer.
PRO240(DNA34387-1138) Los valores de ACt para DNA32286-1191 en una variedad de tumores de pulmón se reportan en la Tabla 3. Un ACt de > 1 fue usado típicamente como un valor umbral para registro de amplificación, de modo que esto representa una reduplicación de copia genética. La Tabla 3 indica que la amplificación significativa del ácido nucleico DNA34387-1138 codificadora de PRO240 tiene lugar: (1) en tumores primarios de pulmón: LTla, LT3, LT6, LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17, LT19, LT21,. LT26, LT28, LT30 y HF000840; y (2) en tumores de colon primarios: CT2, CT3, CT8, CT10, CT12, CT14, CT15, CT16, CT17, CT1, CT4, CT5, CT6, CT7, CT11 y en HF000539, HF000575 y HF000698 de centros tumorales de colon; (3) en SRCC1097, SRCC1098, SRCC1100, SRCC1101 de tumores de seno y en HF000575 del centro tumoral de seno; (4) en HF000611 del centro tumoral de riñon; (5) en HF000854 de nodulo linfático; y (6) en HF000733 de tumor de tsticulo yen HF00716 de tumor marginal de testículo.
Se confirmó la amplificación por mapeo de structura (Tabla 10) para DNA34387-1138: en tumores de pulmón primarios: LTla, LT3, LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17 y LT19. En contraste, la amplificación de los marcadores epicéntricos mejor conocidos (con excepción de B3 y B90) no tiene lugar en un mayor grado que la de DNA34387 (Tabla 10) . El análisis de los marcadores de estructura reportan la amplificación relativa de regiones particulares del Cromosoma 2 en los tumores indicados, mientras que el análisis de los marcadores epicéntricos dán una lectura más precisa de la amplificación relativa en la región inmediatamente vecina del gen de interés.
La amplificación se confirmó también por mapeo epicéntrico (Tabla 11) para DNA3 387-1138 y dio como resultado amplificación significativa: en tumores d epulmón primarios: LTla, LT2, LT3, LT4, LT6, LT7, LT9, LT10, LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17, LT19 y LT21. Parece que DNA34387 es muy próximo al marcador 208K21Forl fr BAC de modo que el marcador muestra amplificación con un patón similar de tumores como DNA34387, y el grado de amplificación es similar (Tabla 11) .
La amplificación demostrada por mapeo de estructura y epicéntrico sugiere fuertemente que DNA34387 es el gen responsable de la amplificación de la región particular del Cromosoma 2. porque la amplificación de DNA34387 tiene lugar en varios tumores, es altamente probable desempeñar un papel significativo en la formación ó crecimiento de tumores. Como un resultado, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la proteina codificada por DNA34387 (PRO240) se esperaría que tuvieran utilidad en terapia para cáncer.
PR0211 (DNA32292-1131) : Los valores de ACt para DNA32292-1131 en una variedad de tumores de pulmón se reportan en la Tabla 3. Un ACt de > 1 fue usado típicamente como un valor umbral para registro de amplificación, de modo que esto representa una reduplicación de copia genética. La Tabla 3 indica que la amplificación significativa del ácido nucleico DNA32292-1131 codificadora de PR0211 tiene lugar: (1) en tumores primarios de pulmón: LTla, LT3, LT4, LT9, LT10, LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17 LT19 y LT21; (2) en tumores de colon primarios: CT2, CT1, CT4, CT5, Ct6 y CT11; y (3) en la línea celular SW900 de tumor de pulmón. Porque la amplificación de DNA32292-1131 tiene lugar en varios tumores de pulmón, está probablemente asociado con la formación y/ó crecimiento de tumores. Como un resultado, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la proteina codificada por DNA32292 (PR0211) se esperaría que sea de utilidad en terapia para el cáncer.
PRO230 (DNA33223-1136) : Los valores de ACt para DNA33223-1136 en una variedad de tumores se reportaron en la Tabla 3. Un ACt de > 1 se utilizó típicamente como valor umbral para registro de amplificación, de modo que esto representa una reduplicación de la copia genética. La Tabla 3 indica que la amplificación significativa del ácido nucleico DNA 33223-1136 codificadora de PRO230 tiene lugar (1) en tumores de pulmón primarios: LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17, LT19 LT21, y LT30 y HF000840; y (2) en tumores primarios de colon: CT3, CT12, CT16, CT17, CT1, CT4, CT5, CT7, CT11 y HF000539 de centro tumoral de colon; (3) en línea celular Calu-1 de tumor de pulmón; (4) en la línea celular SW620 de tumor de colon; (5) en HF000611 de centro tumoral de riñon; y (6) en HF000733 y HF000716 de centro tumoral y de tumor margina de testículo respectivamente.
La amplificación se ha confirmado por mapeo de estructura (Tabla 14) para DNA33223: en tumores de pulmón primario: LT11, LT12, LT13, LT15, LT17 y LT19. El mapeo epicéntrico (Tabla 15) para DNA33223 dio como resultado amplificación significativa: en tumores primarios de pulmón: LTla, LT3, LT6, LT9, LT10, LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17 y LT19; y en tumores primarios de colon: CT2, CT5, CT10 y CT11. El análisis de los marcadores de estructura reporta la amplificación relativa de regiones particulares del Cromosoma 1 en los tumores indicados, mientras que el análisis de los marcadores epicéntricos da una lectura más precisa de la amplificación relativa en la región inmediatamente en la vecindad del gen de interés. La amplificación de los marcadores de estructura mejor conocidos (Tabla 14) no tiene lugar en un mayor grado que la de DNA33223. Esto sugiere fuertemente que DNA33223 es el gen responsable de la amplificación de la región particular del Cromosoma 1. Porque la amplificación de DNA33223 tiene lugar en varios tumores y lineas celulares (especialmente de pulmón) , es altamente probable desempeñar un papel significativo en la formación ó crecimiento de tumor. Como un resultado, los antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la proteina codificada por DNA33223 (PRO230) se esperaría que tenga utilidad en terapia para el cáncer.
PR0261 (DNA33474-1176 Los valores de ACt para DNA33474-1176 en una variedad 5 de tumores se reportan en la Tabla 3. Un ACt de > 1 fue usado típicamente como un valor umbral para registro de amplificación, de modo que esto representa una reduplicación de copia genética. La Tabla 3 indica que la amplificación significativa del ácido nucleico DNA33473- 10 1176 codificadora de PR0261 tiene lugar: (1) en tumores de pulmón primarios: LTla, LT10, LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17 LT18, LT19 y LT21; (2) en tumores primarios de colon: CT2, CT3, CT14 y CT5; y (3) en las líneas celulares HBL100, MB435s, BT20, y SKBR3 de seno. Porque la amplificación de 15 DNA33473-1176 tiene lugar en varios tumores, está probablemente asociado con la formación y/ó crecimiento de ^ tumores. Como un resultado, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la proteina codificada por DNA33473 (PR0261) se esperaría que sea de utilidad en 20 terapia para el cáncer.
PR0246 (DNA35639-1172) : Los valores de ACt para DNÁ35639-1172 en una variedad 25 de tumores se reportan en la Tabla 3. Un ACt de > 1 fue usado típicamente como un valor umbral para registro de amplificación, de modo que esto representa una ^ reduplicación de copia genética. La Tabla 3 indica que la amplificación significativa del ácido nucleico DNA35639- 5 1172 codificadora de P 0246 tiene lugar: (1) en tumores primarios de pulmón: LT3, LT10, LT11, LT12, LT13, LT15, LT17 LT19 y LT21; (2) en tumores primarios de colon: CT4, CT5, CT9 y CT11. Porque la amplificación de DNA35639-1172 tiene lugar en varios tumores, está probablemente asociado ^ 10 con la formación y/ó crecimiento de tumores. Como un resultado, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la proteína codificada por DNA35639 (PR02 6) se esperaría que sea de utilidad en terapia para el cáncer. 15 PR0317 (DNA33461-1199) Los valores de ACt para DNA33461-1199 en una variedad de tumores se reportan en la Tabla 3. Un ACt de > 1 fue 20 usado típicamente como un valor umbral para registro de amplificación, de modo que esto representa una reduplicación de copia genética. La Tabla 3 indica que la amplificación significativa del ácido nucleico DNA33461- 1199 codificadora de PR0317 tiene lugar: (1) en tumores 25 primarios de pulmón: LTla, LT3, LT4, LT6, LT7, LT9, LT10, LT11, LT12, LT13, LT15, LT16, LT17 y LT19; y (2) en tumores primarios de colon: CT2, CT10, CT14, CT15, CT4 y CT9. Porque la amplificación de DNA33461-1199 tiene lugar en varios tumores, está probablemente asociado con la formación y/ó crecimiento de tumores. Como un resultado, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la proteína codificada por DNA33461 (PR0317) se esperaría que sea de utilidad en terapia para el cáncer.
EJEMPLO 11 Hibridización in situ La hibridización in situ es una técnica poderosa y versátil para la detección y localización de secuencias de ácido nucleico en preparaciones celulares ó de tejidos. Puede ser útil, por ejemplo, para identificar sitios de expresión genética, analizar la distribución de la transcripción de tejido, identificar y localizar la infección viral, seguir cambios en la síntesis de mRA específicos y ayudar en el mapeo cromosómico.
La hibridización in situ se efectuó siguiendo una versión optimizada del protocolo por Lu y Guillett, Cell Vision, 1:169-176 (1994), utilizando ribosondas marcadas con "JP generadas por PCR. Brevemente, tejidos humanos fijados con formalina, embebidos con parafina se seccionaron, desparafinizaron, se desproteinaron en proteinaza K (20 g/ml) por 15 minutos a 37 °C, y se procesaron adicionalmente para hibridización in situ como describe Lu y Guillett, supra. Una ribosonda antisentido marcada con [~-P]UTP se generó desde un producto de PCR y se hibridizó a 55 °C toda la noche. Las placas se sumergieron en emulsión de la canal nuclear Kodak NTB2 y se expusieron por 4 semanas .
Síntesis de la Ribosonda-~°P Se secaron al vacío por giro 6.0 µ? (125 mCi) de "P-UTP (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/moles) . A cada tubo que contenía ""P-UTP, se ñadieron los siguientes ingredientes: 2.0 µ? 5x de regulador de transcripción 1.0 µ? de DTT (100 mM) 2.0 µ? de mezcla de NTP (2.5 mM: 10 µ?; cada uno de 10 mM de GTP, CTP y ATP + 10 µ? de H20) 1.0 µ? de UTP (50 µ?) 1.0 µ? de Rnasina 1.0 µ? de DNA molde (1 µ?) µ? de H20 1.0 µ? de RNA polimerasa (para los productos de PCR T3 =AS, T7-S, usualmente) Se incubaron los tubos a 37 °C por una hora. Se añadió 1.0 µ? de RQ1 DNasa, seguido por incubación a 37 °C por 15 minutos. Se añadieron 90 µ? de TE (10 mM de Tris pH 7.6/ 1 mM de EDTA pH 8.0), y la mezcla se pipeteó sobre papel DE81. La solución remanente se cargó en una unidad de ultrafiltración Microcon-50, y se rotó utilizando el programa 10 (6 minutos) . La unidad de filtración se invirtió sobre un segundo tubo y se rotó utilizando el programa 2 (3 minutos) . Después de la rotación de recuperación final, se añadieron 100 µ? de TE. 1 µ? del producto final se pipeteó sobre papel DE81 y se contó en 6 mi de Biofluor II.
La sonda se corrió sobre un gel TBE/urea. 1-3 µ? de la sonda ó 5 µ? de rk III de RNA se añadió a 3 µ? de regulador de carga. Después de calentamiento sobre una placa caliente a 37 °C por tres minutos, el gel se colocó ^ inmediatamente sobre hielo. Los pocilios de gel se lavaron abundantemente, la muestra se cargó, y corrió a 180-250 5 voltios por 45 minutos. El gel se envolvió en envoltura de vinbilo y se expuso a película de XAR con una pantalla intensificadoraa en congelador a -70 °C una hora toda la noche . ^ 10 Hibridización-"P Pretratamiento de las secciones congeladas: Las placas se retiraron del congelador, se colocaron sobre bandejas de aluminio y se descongelaron a la temperatura ambiente por 5 15 minutos. Las bandejas se colocaron en una incubadora a 55 °C por 5 minutos para reducir la condensación. Las placas se fijaron por 10 minutos en paraformaldehido al 4 % sobre hielo en campana de extracción, y se lavaron en 0.5 x SSC por 5 minutos, a la temperatura ambiente (25 mi 20 x SSC + 20 975 mi de SQ H20) . Después de desproteinación en 0.5 µg/ml de proteinaza K por 10 minutos a 37 °C (12.5 µ? de solución madre de 10 mg/ml en 250 mi de regulador de RNAsa libre de RNasa precalentada ), las secciones se lavaron en 0.5 x SSC por 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se dehidrataron en etanol al 70 , 95 %, 100 ¾, 2 minutos en cada uno.
Pretratamiento de las secciones embebidas con parafina: las placas se desparafinaron, se colocaron en SQ H:0, y se enjuagaron dos veces en 2 x SSC a la temperatura ambiente, por 5 minutos cada vez. Las secciones se desproteinaron en 20µg ml de proteinaza K (500 µ? de 10 mg/ml en 250 mi de regulador de RNasa libre de R asa; 37 °C, 15 minutos) - embrión humano, ó 8 x proteinaza K (100 µ? en 250 mi de regulador de RNasa, 37 °C, 30 minutos) -tejidos de formalina. Se efectuaron enjuagues subsecuentes en 0-5 x SSC y deshidratación como se describió anteriormente .
Pre-hibridización: Las placas se colocaron en cajas plásticas revestidas con regulador de Caja ( 4 x SSC, formamida al 50 ¾) - papel filtro saturado. El tejido se cubrió con 50 µ? de regulador de hibridización (3.75 g de Sulfato de Dextrano + 6 mi de SQ H-O) , se sometió a vórtice y calentó en el micro-ondas por 2 minutos con él tapón suelto. Después de enfriamiento sobre hielo, se añadieron 18.75 mi de formamida, 3.75 mi 20 x SSC y 9 mi de SQ H20, el tejido se sometió a vórtice bien, y se incubó a 42 °C por 1-4 horas.
Hibridización; 1.0 x 10* cpm de sonda y 1.0 µ? de tRNA (solución madre de 50 mg/ml) por placa se calentaron a 95 °C por 3 minutos. Las placas se enfriaron sobre hielo, y 48 5 µ? de regulador de hibridización se añadieron por placa. Después de que se sometió a vórtice se añadieron 50 µ? de mezcla de í3P a placas de prehibridización de 50µ1. Las placas se incubaron toda la noche a 55 °C. '^s 10 Lavados : Se dio el lavado 2 x 10 minutos con 2 x SSC, EDTA a la temperatura ambiente (400 mi 20 x SSC + 16 mi de EDTA 0.25 M, Vf=4L) , seguido por tratamiento con RNasa a 37 °C por 30 minutos (500 µ? de 10 mg/ml en 250 mi de regulador de RNasa = 20 µg ml) . las placas se lavaron 2 x 15 10 minutos con 2 x SSC, EDTA a la temperatura ambiente. Las condiciones de lavado de severidad fueron las siguientes: 2 ^ horas a 55 °C, 0.1 x SSC, EDTA (20 mi 20 x SSC + 16 mi de EDTA, Vf=4L) . 20 DNA49435-1219 (homólogo de FGF, ligando 3 del receptor de FGF) Oligo A-252G 46 mer 25 5' -GGATTCTAATACCGACTCACTATAGGGCGGATCCTGGCCGGCCTCGG-3' (SEC ID NO: 82) ^ Oligo A-251H 48 mer. 5' -CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGCCCGGGCATGGTCTCAGTTA-3' (SEC ID NO: 83) Se observó expresión moderada sobre la neurona cortical en el cerebro fetal. Se observó expresión sobre el 10 aspecto interior de la retina fetal, y posiblemente en el cristalino en desarrollo. Se vió expresión sobre la piel fetal, cartílago, intestino delgado, vellosidad placentaria y cordón umbilical. En tejidos adultos, hubo un nivel extremadamente alto de expresión sobre el epitelio de la 15 vesícula biliar. Expresión moderada se observó sobre el riñon adulto, epilelio colónico y gástrico. Estos datos son ^ consistentes con el papel potencial de esta molécula en el desarrollo de cartílago y hueso. 20 DNA32286-1191 (homólogo similar a EGF) : Oligo B-138U 47 mer: 5' -GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCCTCCTGCCTTCCCTGTCC-3' 25 (SEC ID NO: 84) Oligo A-134R 48 mer: 5' -CTATGAAATTAACCCTCATAAAGGGAGTGGTGGCCGCGATTATCTGC-3' (SEC ID NO: 85) En tejidos fetales, se observaron niveles de expresión bajos a lo largo del mesénquima . Se observó expresión moderada en las células estromales de la placenta en tejidos membranosos, y en tiroides. Niveles de expresión bajos se observaron en neuronas corticales .
DNA34387-1138 (homólogo de EGF/dentado) Oligo B-231 W 48 mer: 5' -GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCGAGATATGCACCCAATGTC-3' (SEC ID NO: 86) Oligo B-231-X 47 mer: 5' . C ATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGATCCCAGAATCCCGAAGAACA-3' (SEC ID NO: 87) Patrones de expresión en tejidos fetal y de adulto humanos Se observó señal elevada en los siguientes sitios: 5 Tejidos fetales: epitelio tiroideo, epitelio del intestino delgado, gónadas, epitelio pancreático, hepatocitos en higado y túbulos renales; se observó también expresión en tejido vascular en huesos en r ^ 10 desarrollo.
Tejidos adultos: señal moderada en citotrofoblasto placentario, epitelio tubular renal, epitelio de vesícula, tumores epiteliales y paratiroideos . 15 Expresión en adenocarcinoma y carcinoma escamoso pulmonar Se observó expresión en componentes in situ e 20 infiltrantes, Los niveles de expresión fueron de bajoa a moderados en los adenocarcinomas . En general, la expresión fue superior en los carcinomas escamosos y en dos la expresión fue fuerte. Ninguna expresión se observó en el estroma tumoral, epitelio respiratorio normal y de alveolos. Hubo posible bajo nivel de expresión en nodulos linfáticos .
DNA33223-1136 (homólogo antigénico de nefritis túbulointersticial) : DNA33223pl : 5' GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGGCGATGTCCACTGGGGCTAC-3' (SEC ID NO: 88) DNA33223p2: 5' CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACGAGGAAGATGGGCGGATGGT-3' (SEC ID NO: 89) Expresión en tejidos humano y fetal Las secciones de tejido mostraron una señal intensa asociada con los vasos venosos y arteriales en el fetus. En arterias, la señal pareció estar confinada a células periciticas /de músculo liso. La señal se vió también en vasos capilares y en glomeruli. La expresión se observó también en células epiteliales en el cristalino fetal. Se observó fuerte expresión en células en el villi trofoblástico placentario. Estas células colocadas entre el trofoblasto y las células similares del fibroblasto que v expresan a HGF, y tienen una histogénesis incierta. 5 En el adulto no hubo evidencia de expresión en la pared de la aorta y la mayoría de los vasos parecieron ser negativos. Sin embargo, se observó expresión sobre los canales vasculares en la próstata normal y en el epitelio que recubre la vesícula biliar. Se observó expresión en los ^-?? vasos del sarcoma de tejido blando y en carcinoma de células renales. En resumen, esta molécula mostró expresión vascular relativamente específica en el fetus así como también en algunos órganos adultos. Se observó también expresión en el cristalino fetal y en la vesícula biliar 15 adulta.
Expresión utilizando tejidos tumorales de pulmón y de v. seno 20 Uno de 16 tumores (1/16) mostraron una fuerte señal de hibridización, y 2 fuera de los 16 mostraron señales positivas de intensidad leve a moderada. Los tres tumores fueron clasificados como carcinomas de células escamosas pobremente diferenciados. Los 6 carcinomas escamosos 25 remanentes y los 7 adenocarcinomas fueron negativos. Como parece de estudios previos descritos anteriormente, la expresión estuvo presente en células de músculo liso y endoteliales de canales vasculares de tamaño medio y pequeño y un caso mostró leve, expresión focal en células glandulares benignas.
DNA33473-1176 (homólogo de CTGF) : Oligo D-170 45 mer 51 -GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCGCGAGGACGGC3GCTTCA-3 (SEC ID NO: 90) Oligo D-170V 48 mer: -CTATGAAAT AACCCTCACTAAAGGGAAGAGTCGCGGCCGCCCTTTTT-3 (SEC ID NO: 91) Se observó fuerte expresión en fibroblastos dérmicos en piel de adulto normal. También se observó fuerte expresión en dos hígados cirróticos, en sitios de fibrosis hepática activa. Se encontró expresión moderada sobre células fasciculata de la corteza adrenal. Esta localización apoya un papel para esta molécula en la formación ó inversión de la matriz extracelular.
DNA35639-1172 (homólogo de HCAR) : DNA35639pl: 5 ' -GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTTGCTC ' (SEC ID NO: 92) DNA35639p2: 51 -CTATCAAAI AACCCTCACTAAAGGGAGCTXSCCGATCCCACTGGTATT-3 ' (SEC ID NO: 93) Esta molécula se expresó fuertemente en endotelio vascular fetal, que incluye tejidos de CNS. Se observo nivel más bajo de expresión en vasculatura adulta, que incluye CNS. No se expresó obviamente a niveles superiores en endotelio vascular tumoral. Se observaron también señales sobre matriz ósea y bazo adulto, sin embargo, esta señal estuvo obviamente asociada a la célula.
EJEMPLO 12 Uso de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 como una sonda de hibridización El siguiente método describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317, como una sonda de hibridización.
El D A que comprende la secuencia codificadora de un polipéptido wPRO" maduro de extensión total como se describe en la presente y/ó fragmentos de éste puede emplearse como una sonda para cribar para DNAs homólogos (tales como aquellos que codifican a variantes de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 como se encuentran naturalmente, en bibliotecas de cDNA de tejido humano ó en bibliotecas genómicos de tejido humano .
La hibridización y el lavado de filtros que contienen ya sea bibliotecas de DNAs se efectúa bajo las siguientes condiciones de alta severidad. La hibridización de sondas derivadas de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR031 radiomarcados en los filtros se efectúa en una solución al 50 ¾ de formamida, 5x SSC, SDS al 0.1 %, pirofosfato de sodio al 0.1 , 50 mM de fosfato de sodio, pH 6.8, 2 x solución de Denhardt, y sulfato de dextrano al 10 ¾ a 42 °C por 20 horas. El lavado de los filtros se efectúa en una solución acuosa de 0.1 x SSC y SDS al 0.1 % a 42 °C. v. . El DNA que tiene una identidad de secuencia deseada con el DNA que codifica a PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, 6 PR0317 de secuencia nativa de extensión total puede entonces identificarse utilizando las técnicas estándares conocidas en la materia. ^ 10 EJEMPLO 13 Expresión de Polipéptidos "PRO" en E. coli Este Ejemplo ilustra la preparación de una forma no 15 glicosilada de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 por expresión recombinante ^ ·? en E. coli.
La secuencia de DNA que codifica al polipéptido PRO de 20 interés es amplificado utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contendrían sitios de enzimas de restricción que correspondan a los sitios de enzimas de restricción sobre el vector de expresión seleccionado. Pueden emplearse una variedad de vectores de expresión. Un 25 ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolívar, y colaboradores, Gene, 2: 95 (1977)) que contiene genes para resitencia a la ampicilina y a la tetraciclina. El vector es digerido con enzima de restricción y desfosforilado. Las secuencias amplificadas por PCR son entonces ligadas en el vector. El vector incluirá preferiblemente secuencias que codifiquen para un gen con resistencia antibiótica, una promotora de trp, una líder poli-His (que incluyan los seis primeros codones de STII, secuencia poli-His, y sitio de fragmentación de enterocinasa) , la región codificadora de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317, terminador transcripcional lambda, y un gen de argU.La mezcla de ligación se utiliza entonces para transformar una cepa de E. coli seleccionada utilizando los métodos descritos en Sambrook y colaboradores, supra. Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas de LB y se seleccionan las colonias resitentes a antibiótico. El plásmida DNA puede aislarse y ser confirmado por análisis de restricción y secuenciación de DNA.
Los clones seleccionados pueden crecer toda la noche en medio de cultivo líquido tal como caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche puede se usado subsecuentemente para inocular un cultivo a mayor escala. Las células son entonces desarrolladas hasta una densidad óptica deseada, durante la cual el promotor de expresión es admitido. Después de cultivar las células por varias horas más, las células pueden cosecharse por 5 centrifugación. El compactado celular obtenido por la centrifugación puede solubilizarse utilizando varios agentes conocidos en la materia, y la proteina de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 solubilizada puede entonces purificarse utilizando ^ ^ 10 una columna quelatante metálica bajo condiciones que permitan el enlace firme de la proteina.
PR0187, PR0533, PRO2 0 y PR0317 fueron exitosamente expresados en E. coli en una forma marcada con poli-His utilizando el siguiente procedimiento. El DNA que codifica a PR0187, PR0533, PRO2 0 ó PR0317 fueron amplificados inicialmente utilizando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contenían sitios de enzimas de restricción que correspondían a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles para proporcionar iniciación de traducción eficiente y confiable, purificación rápida sobre una columna de quelación metálica, y remoción proteolítica con enterocinasa . Las secuencias marcadas con poli-His , amplificada por PCR se ligaron entonces en un vector de expresión, que se usó para transformar un huésped de E. coli en la cepa 52 ( 3110 futhA(tonA) Ion galE rpoHts (htpRts) clpP(lacIq) . Los transformantes se desarrollaron primero en LB que contenia 50 mg/ml de carbenicilina a 30 °C con agitación hasta que se alcanzó un O.D.-ÓOO de 3-5. Los cultivos se diluyeron entonces 50-100 veces en medio de CRAP (preparado por mezcla de 3.57 g (NH4)2S04/ 0.71 g de citrato de sodio.2H20, 1.07 g de KCl, 5.36 g de extracto de levadura Difco, 5.36 g de SF Icaza de Sheffield en 500 mi de agua, asi como también 110 mM de MPOS, pH 7.3, glucosa al 0.55 % (peso/ olumen) y 7 mM de MgSO^) y crecimiento por aproximadamente 20-30 horas con agitación. Las muestras se retiraron para verificar la expresión por análisis por SDS-PAGE, y el cultivo a granel se centrifugo para compactar las células. El compactado celular se congeló hasta purificación y reconcentrado.
La pasta de E. coli de fermentaciones de 0.5 a 1 L (6-10 g de compactado) se resuspendió en 10 volúmenes (peso/volumen) en guanidina 7M, 20 mM de Tris, regulador de pH 8. Se añadió sulfito de sodio sólido y tetrationato sódico para hacer la concentración final de 0.1 M y 0.02 M respectivamente, y la solución se agitó toda la noche a 4 °C. Esta etapa dio como resultado una proteina desnaturalizada con todos los residuos de cisteina bloqueados por sulfitolización. La solución se centrifugo a 40,000 rpm en una ultracentrifuga Beckman por 30 minutos. El sobrenadante se diluyó con 3-5 volúmenes de regulador para columna de quelato metálico (guanidina 6M, 20 mM de Tris, pH 7.4) y se filtra a través de filtros de 0.22 micrones para clarificar. El extracto clarificado se cargó en una columna de quelato metálico Niz'T-NTA Qiagen de 5 mi equilibrada en el regulador de columna de quelato metálico. La columna se lavó con regulador adicional que contenia 50 mM de imidazol (Calbiochem, grado Utrol), pH 7.4. Se eluyó la proteina con regulador que contenia 250 mM de imidazol. Las fracciones que contenían la proteína deseada se conjuntaron y almacenaron a 4 °C. La concentración de la proteína se estimó por su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado en base a su secuencia de aminoácidos.
Las proteínas se reconcentraron por dilución de la muestra lentamente en regulador de reconcentración preparado recientemente que consistió de: 20 mM de Tris, pH. 8.6, NaCl 0.3 M, urea 2.5 M, 5 mM de cisteína, 20 mM de glicina y 1 mM de EDTA. Los volúmenes de reconcentración se seleccionaron de manera que la concentración final de la proteína fue entre 50 y 100 microgramos/ml . La solución reconcentrada se agitó suavemente a 4 °C por 12-36 horas.
La reacción de reconcentrado se extinguió por adición de TFA hasta una concentración final de 0.4 % (pH de aproximadamente 3) . Antes de purificación adicional de la proteína, la solución se filtró a través de filtros de 0.22 micrones y se añadió acetonitrilo hasta concentración final de 2 - 10 S. La proteína reconcentrada se cromatografió sobre una columna de fase inversa Poros Rl/H utilizando un regulador móvil de TFA al 0.1 % con elusión con un gradiente de acetonitrilo de 10 a 80 %. Alícuotas de fracciones con absorbancia Aneo se analizaron sobre geles de poliacrilamida SDS y las fracciones que contenían la proteína reconcentrada homogénea se conjuntaron. Generalmente, las especies reconcentradas apropiadamente de la mayor parte de las proteínas se eluyeron a concentraciones más bajas de acetonitrilo puesto que esas especies son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos de la interacción con la resina en fase inversa. Las especies agregadas se eluyen usualmente a concentraciones de acetonitrilo más altas. Además de la resolución de las formas mal concentradas de proteínas desde la forma deseada, , la fase inversa también elimina las endotoxinas de las muestras. Las fracciones que contienen las proteínas de PR0187, PR0533, PRO240 y PR0317 reconcentradas, respectivamente, se conjuntaron y el acetonitrilo se eliminó utilizando una corriente suave de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas se formularon en 20 mM de Hepes, pH de 6.8 con cloruro de sodio 0.14 M y manitol al 4 i por diálisis ó por filtración sobre gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibrada en regulador de formulación y filtrado estéril.
EJEMPLO 1 Expresión de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PRQ211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en células de mamíferos Estos ejemplos ilustran la preparación de una forma glicosilada potencialmente de PR01S7, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 por expresión recombinante en células de mamíferos.
El vector, pRK5 (ver EP307,247, publicada el 15 de marzo de 1989), se empleó como vector de expresión.
Opcionalmente, el DNA de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 es ligado en pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del DNA de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 utilizando métodos de ligación tales como los descritos en Sambrook y colaboradores, supra. El vector resultante se llamó p K5- PR0187, pRK5-PR0533, pRK5-PR0214, pRK5-PRO240, pRK5-PR021I, pRK5-PRO230, pR 5-PR0261, pRK5-PR0246, ó pRK5-PR0317. '?..
En una modalidad, las células huéspedes seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) son desarrolladas para confluencia en placas de cultivo de tejido en medio tal como DMEM suplementado cor- suero de ternera fetal y opcionalmente, componentes nutrientes y/ó antibióticos. Aproximadamente 10 µs de DNA de RK5-PR0187, pRK5-PR0533, pRK5-PR0214, pRK5-PRO240, pRK5-PR0211, PRK5-PRO230, pRK5-PR0261, pRK5-PR0246 ó pRK5- PR031 se mezclan con aproximadamente 1 µg de DNA codificador del gen de VA RNA [Thimmappaya y colaboradores, Cell, 31:543 (1982)] y se disuelven en 500 µ? de 1 mM de Tris-HCl, 0.1 mM de EDTA, CaCl 0.227 . A esta mezcla se añade, gota a gota, 500 µ? de 50 mM de HEPES (pH 7.35), 280 mM de NaCl, 1.5 mM de NaPO;, y se deja por 10 minutos a 25 °C para formar un precipitado. El precipitado se suspende y se añade a las células 293 y se deja sedimentar por aproximadamente cuatro horas a 37 °c. Se retira por aspiración el medio de cultivo y se añade 2 mi de glicerol al 20 en P3S por 30 segundos. Las células 293 se lavan entonces con medio libre de suero, se añade medio 38S recientemente preparado y las células se incuban por r -s aproximadamente 5 dias.
Aproximadamente 24 horas después de la transfección, 5 se retira el medio de cultivo que contiene 200 µ??/p?? de 35S-cisteina y 200 µ??/??? de 35S-metionina. Después de 12 horas de incubación, se colecta el medio condicionado, se concentra sobre un filtro giratorio y se carga sobre un gel ^ con 15 % de SDS. El gel procesado puede secarse y exponerse 10 para película por un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR031 . Los cultivos que contienen células transfectadas pueden someterse a incubación adicional (en medio Ubre de suero) 1S y el medio se examina en bioensayos seleccionados.
^ En una técnica alternativa, el DNA de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 puede introducirse en células 293 transitoriamente 20 utilizando el método de sulfato de dextrano descrito por Somparyac y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci., 12:7575 (1981) . Las células 293 son desarrolladas hasta una densidad máxima en un matraz giratorio y se añade 700 µg de DNA de pRK5-PR0187, pRK5-PR0533, pRK5-PR0214, pRK5-PRO240, 25 pRK5-PR0211, pRK5-PRO230, pRK5-PR0261, pRK5-PR0246 ó pRK5- PR0317. Las células se concentran primero del matraz ^ ¦¦, giratorio por centrifugación y se lavan con PBS. El i V ^ precipitado de DNA-dextrano se incuba sobre el compactado celular por cuatro horas. Las células se tratan con 5 glicerol al 20 % por 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejido, y se re-introducen en el matraz giratorio que contiene medio de cultivo de tejido, 5 g/ml de insulina y 0.1 g/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro dias, el medio acondicionaddo se 10 centrifuga y se filtra para retirar las células y desechos. La muestra que contiene a PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, 6 PR0317 expresado puede entonces concentrarse y purificarse por cualquier método seleccionado, tal como diálisis y/ó cromatografía de 15 columna.
En otra modalidad PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 puede ser expresado en células CHO. El vector pR 5-PR0187, pRK5- 20 PR0533, pRK5-PR0214, pRK5-PRO240, pRK5-PR0211, pRK5-PRO230, pRK5-PR0261, pRK5-PR02 6 6 pR 5-PR0317 puede ser transfectado en células CHO utilizando reactivos conocidos tales como CaP04 ó DEAE-dextrano . Como se describió anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse, y 25 el medio reemplazarse con medio de cultivo (solo) ó medio que contenga un radiomarcador tal como 35S-metionina. Después de determinar la presencia del polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317, el medio de cultivo puede reemplazarse con medio 5 libre de suero. El medio que contiene a PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 expresado puede entonces concentrarse y purificarse por cualquier método seleccionado. ,r ^ 10 El epitope de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 marcado puede ser expresado en células CHO huéspedes. El PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, 6 PR0317 puede subclonarse afuera del vector pRK5. El inserto del 1S subclon puede sufrir PCR para fusionarse en estructura con „ N un epitope marcado seleccionado tal como un poli-His en un vector de expresión de Baculovirus. El inserto de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 marcado con poli-His puede entonces subclonarse en 20 un vector conductor de SV40 que contiene un marcador de selección tal como DHFR para la selección de clones estables. Finalmente/ las células CHO pueden ser transfectadas (como se describe anteriormente) con el vector conductor de SV40. El marcado puede efectuarse, como 25 se describió anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene al PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246, ó PR0317 marcado con poli-His puede entonces concentrarse y purificarse por cualquier método seleccionado, tal como por cromatografía por afinidad de quelato-Ni2+' La expresión en CHO y/ó células COS puede también lograrse por un procedimiento de expresión transitoria.
PR0214, PRO240, PR0211, PRO230 y PR0261 se expresaron en células CHO por ambos procedimientos de expresión transitoria y de expresión estable. Además, PR0246 fue expresado transitoriamente en células CHO.
La expresión estable en células COS se efectuó utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresaron como una construcción IgG (inmunoadhesina) , en la cual, las secuencias codificadoras para las formas solubles (por ejemplo, regiones extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionaron a una secuencia de región constante de IgGI que contiene el eje, CH2 y regiones CH2 y/ó es una forma marcada con poli-His.
Después de la amplificación por PCR, los DNAs respectivos se subclonaron en un vector de expresión de CHO utilizando técnicas estándares que se describen en ausubel y colaboradores, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión de CHO se construyeron para tener sitios de restricción 5' y 3' compatibles con el DNA de interés para permitir la conexión conveniente de los cDNAs. El vector usado para expresión en células CHO es como se describió en Lucas y colaboradores, Nucí. Acids. Res., 24:9 (1774-1779 (1996), y usa el promotor precoz/mejorador de SV40 para conducir la expresión del cDNA de interés y dihidrofolato reductasa (DHFR) . La expresión de DHF permite la selección para mantenimiento estable del plásmido después de la transfección.
Doce microgramos del DNA plásmido descrito se introdujeron en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos para transfección disponibles comercialmente Superfect® (Qiagen) , Dosper® ó Fugene® (Boehringer Mannheim) . Las células se desarrollaron como se describió en Lucas y colaboradores, supra. Aproximadamente 3 x 10-7 células se congelaron en una ampolleta para crecimiento y producción adicionales como se describe a continuación.
Las ampolletas que contienen el DNA plásmido se descongelaron por colocación en baño de agua y se mezclaron por vórtice. Los contenidos se pipetearon en un tubo de centrífuga que contenía 10 mi de medio y se centrifugaron a 1000 rpm por 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 10 mi de medio selectivo (0.2 um de PS20 filtrado con 0.2 µ?t? de suero fetal bovino al 5 % diafiltrado) . Las células se alicuotaron entonces en un extractor centrífugo de 100 mi que contenía 90 mi de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfirieron a extractores centrífugos llenos con 150 mi de medio de crecimiento selectivo y se incubó a 37 °C. Después de 2-3 días, , extractores centrífugos de 250 mi, 500 mi y 2000 mi se sembraron con 3 x 105 células/ml. El medio celular se intercambió con medio recientemente preparado por centrifugación por centrifugación y resuspensión en medio de producción. Aunque puede emplearse cualquier medio de CHO adecuado, un medio de producción descrito en la Patente USA No. 5,122,469, registrado el 16 de Junio de 1992 se utilizó actualmente. Un extractor centrífugo par producción de 3L se sembró a 1.2 x 106 células/ml. En el día 0, se determinaron el número de células y pH. En el día 1, el extractor rotatorio se muestreó y se comenzó el burbujeo con aire filtrado. En el día 2, el extractor centrífugo se muestreó, la temperatura se desplazó a 33 °C, y 30 mi de glucosa de 500 g/L y 0.6 mi de antiespumante al 10 % (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35 %f Dow Corning 365 Medical Grade emulsión) . En el transcurso de la producción, el pH se ajustó cuando fue necesario para conservarlo alrededor de 7.2. Después de 10 dias, ó hasta abatimiento de la factibilidad a menos de 70 %, el cultivo celular se cosechó por centrifugación y se filtró a través de un filtro de 0.22 um. El filtrado fue ya sea almacenado a 4 °C ó inmediatamente cargado en una columna para purificación.
Para la construcción marcada con poli-His, las proteínas se purificaron utilizando una columna Ni2+-NTA (Qiagen) . Antes de purificación, se añadió imidazol al medio acondicionado a una concentración de 5 mM. el medio acondicionado se bombeó a una columna Ni2+-NTA de 6 mi equilibrada en 20 mM de Hepes, pH 7.4, regulador que contiene NaCl 0.3 M y 5 mM de imidazol a un flujo de 4-5 ml/min, a 4 °C. Después de cargar, la columna se lavó con regulador de equilibrio adicional y la proteina se eluyó con regulador de equilibrio que contiene imidazol 0.25 M. La proteina altamente purificada se desaló subsecuentemente en un regulador de almacenamiento que contenia 10 mM de Hepes, NaCl 0.14 M y manitol al 4 %, pH 6.8, con una columna G25 Superfine de 25 mi (Pharmacia) y se almacenó a -80 °C.
La construcción de inmunoadhesina (que contiene Fe) se purificó desde el medio acondicionado como sigue. El medio acondicionado se bombeó sobre una columna Protein A de 5 mi (Pharmacia) que habla sido equilibrada en 20 mM de regulador de fosfato de sodio, pH 6.8. Después de cargar, la columna se lavó extensivamente con regulador de equilibrio antes de elusión con 100 mM de ácido cítrico, pH 3.5. La proteina eludía se neutralizó inmediatamente recolectando fracciones de 1 mi en tubos que contenían 275 µ? de regulador Tris 1M, pH 9. La proteina altamente purificada se desaló subsecuentemente en regulador de almacenamiento como se describió anteriormente para las proteínas marcadas con poli-His . La homogeneidad se evaluó por geles de poliacrilamida SDS y por secuenciación del aminoácido N-terminal por la degradación de Edman.
EJEMPLO 15 Expresión de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, 6 PRQ317 en Levadura Los siguientes métodos describen la expresión recombinante de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en levadura.
Primero, se produjeron vectores de expresión de levaduras para producción intracelular ó secreción de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 desde el promotor de ADH2/GAPDH. El DNA codificador de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 y el promotor se insertaron en un sitio de enzima de restricción en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317. Por secreción, el DNA codificador de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con el DNA codificador del promotor de ADH2/GAPDH, un péptido indicador de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 u otro péptido indicador de mamífero, ó, por ejemplo, un factor-alfa de levadura ó una secuencia lider/invertasa secretora indicadora, y las secuencias de unión (si es necesario) para expresión de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317.
Las células de levaduras, tales como la cepa ABllO de levadura, pueden entonces transformarse con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivados en el medio de fermentación seleccionado. Los sobrenadantes de la levadura transformada pueden analizarse por precipitación - con ácido tricloroacético al 10 % y separación por SDS-i —? PAGE, seguido por manchado de los geles con manchas de Azul de Coomassie. 5 PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261 PR0246, ó PR0317 recombinante puede ser subsecuentemente aislado y purificado por eliminación de v—" las células de levadura desde el medio de fermentación por 10 centrifugación y luego concentrar el medio utilizando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 puede adicionalmente purificarse utilizando resinas de cromatografía de columna 15 seleccionadas.
^ EJEMPLO 16 Expresión de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240 PRQ211, 20 PRO230/ PR0261, PR0246, ó PRQ317 en células de insectos infectadas con Baculovirus El siguiente método describe la expresión recombinante en células de insectos infectadas con Baculovirus. 25 La secuencia codificadora de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 se fusionó en el extremo 5' de un epitope marcado contenido en un vector de expresión de baculovirus. Tales epitopes marcados 5 incluyen marcas de poli-His y marcas de inmunoglobulinas (regiones similares a Fe de IgG) . Puede emplearse una variedad de plásmidos, que incluyen los plásmidos derivados de plásmidos comercialmente disponibles tales como pVL1393 ^ (Novagen) . Brevemente, la secuencia codificadora de PR0187, 10 PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 ó de la porción deseada de la secuencia codificadora de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR02 6, ó PR0317 [tal como la secuencia codificadora de la región extracelular de una proteina transmembrana ó la 15 secuencia codificadora de la proteina madura si la proteina „ es extracelular] es amplificada por PCR con cebadores ^ complementarios en las regiones 5r y 3' . El cebador en 5' puede incorporar sitios de enzimas de restricción laterales (seleccionados) . El producto se digiere entonces con 20 aquellas enzimas de restricción seleccionadas y subclonado en el vector de expresión.
El baculovirus recombinante es generado co- transfectando el plásmido anterior y el DNA del virus 25 BaculoGold™ (Pharmigen) en células (ATCC CRL 1711) de Spodoptera frugiperda (mSf9w) utilizando lipofectina (comercialmente disponible de GIBCO-BRL) . Después de 4 - 5 dias de incubación a 28 °C, los virus liberados se cosechan u se usan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de la proteina se efectúan como se describe en O'Reilley y colaboradores, Baculovirus Expresión Vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994) .
El PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 marcado con poli-His expresado puede entonces purificarse, por ejemplo, por cromatografía de afinidad de quelato-Ni2+ como sigue. Se preparan los extractos de células Sf9 infectadas con virus recombinante como describió Rupert y colaboradores, Nature, 362:175-179 (1993) . Brevemente, las células Sf9 se . lavan, se resuspenden en regulador de sonicación (25 mi de Hepes, pH 7.9; 12.5 mM de MgCl2; 0.1 mM de EDTA; glicerol al 10 %; NP-- 0 al 0.1 %; KC1 0.4 M) , y se sónico dos veces por 20 segundos sobre hielo. Los sonicados se clarificaron por centrifugación, y el sobrenadante se diluyó 50 veces en regulador de carga (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, glicerol al 10 %, pH 7.8) y se filtró a través de un filtro de 0.45 um. Una columna de agarosa Ni+-NTA ( comercialmente disponible de Qiagen) se preparó con un volumen de lecho de 5 mi, se lavó con 25 mi de agua y se equilibró con 25 mi de regulador de carga. El extracto celular filtrado se cargó l en la columna a 0.5 mi por minuto. La columna se lavó hasta una linea base de A2eo con regulador de carga, punto en el 5 cual se inicia la colección de las fracciones. Subsiguiente, la columna se lavó con un regulador de lavado secundario (50 M de fosfato; 300 mM de NaCl, glicerol al 10 %, pH 6.0), que eluye proteina enlazadas no- .- específicamente. Después de alcanzar A2eo la linea base otra 10 vez, la columna se desarrolla con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el regulador de lavado secundario. Se colectaron fracciones de 1 mi y se analizaron por SDS-PAGE y manchado con plata 6 manchado Western con NÍ2+-NTA- conjugado a fosfatasa alcalina (Qiagen) . Las fracciones que 15 contienen el P 0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 marcado con HiSio " respectivamente, se conjuntaron y dializaron contra regulador de carga. 20 Alternativamente, la purificación del PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 marcado con IgG (ó marcado con Fe) , puede ser efectuada utilizando técnicas de cromatografía conocidas, que incluyen por ejemplo, cromatografía de columna protein G ó 25 protein A.
PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0246, ó PR0317 se expresaron en células de insectos Sf9 infectadas con baculovirus. Mientras que la expresión se 5 efectúa actualmente a una escala de 0.5 - 2L, puede ser fácilmente aumentada de escala para preparaciones más grandes (por ejemplo, 8 L) . Las proteinas se expresaron como una construcción IgG (inmunoadhesina) , en la que la ^ región extracelular de la proteína estaba fusionada a una 10 secuencia de región constante de IgGl que contiene el eje, las regiones CH2 y CH3 y/ó en las formas marcadas con poli-His.
A continuación de la amplificación, las secuencias 15 codificadoras respectivas se subclonaron en un vector de ,. expresión de baculovirus (pb.PH.IgG por fusiones de IgG y pb.PH.His.c para proteínas marcadas con poli-His), y el vector y el DNA del baculovirus BaculoGold® (Pharmigen) se co-transfectaron en 105 células (ATCC CRL 1711) de 20 Spodoptera frugiperda (*Sf9"), utilizando Lipofectina (Gibco BRL) . Pb.PH.IgG y pb.PH.His son modificaciones del vector de expresión de baculovirus pVL1393 disponible comercialmente (Pharmigen) , con regiones poli-enlazadoras modificadas para incluir las secuencias marcadas de His ó 25 Fe. Las células se desarrollaron en medio TNM-FH de Hink suplementado con FBS al 10 % (Hyclone) . Las células se f. incubaron por 5 dias a 28 °C. el sobrenadante se cosechó y se usó subsecuentemente para la primera amplif cación viral por infección de células Sf9 en medio T M-FH de Hink S suplementado con FBS al 10 % a una multiplicidad aproximada de infección (MOI) de 10. Las células se incubaron por 3 dias a 28 °C. El sobrenadante se cosechó y la expresión de las construcciones en el vector de expresión de baculovirus ^ se determinó por enlace discontinuo de 1 mi de sobrenadante 10 a 25 mi de perlas de NÍ2+-NTA (QIAGEN) para proteínas marcadas con histidina ó perlas de Protein-A Sepharose CL- 4B (Pharmacia) para proteínas marcadas con IgG seguido por análisis de SDS-PAGE que compara a una concentración conocida de proteína estándar por manchado coa Azul de 1S Coomassie.
^ El sobrenadante de la primera amplificación viral se usó para infectar un cultivo rotatorio (500 mi) de células Sf9 en desarrollo en medio ESF-921 (Expresión Systems LLC) 20 a uña MOI aproximada de 0.1. Las células se incubaron por 3 días a 28 °C. El sobrenadante se cosechó y filtró. Se repitió el enlace discontinuo y el análisis SDS-PAGE se repitió, tanto como fue necesario, hasta que se confirmó la expresión del cultivo giratorio. 25 El medio acondicionado de las células transfectadas (0.5 a 3 L) se colectó por centrifugación para retirar las células y se filtró a través de filtros de 0.22 micrones. Para las construcciones marcadas con poli-His, la construcción proteinica se purificó utilizando una columna NÍ2+-NTA (Qiagen) . Antes de purificación, se añadió imidazol al medio acondicionado a una concentración de 5 mM. el medio acondicionado se bombeó sobre una columna NÍ2+-NTA de 6 mi equilibrada en 20 mM de Hepes, pH 7.4, regulador que contiene NaCl 0.3 M y 5 M de imidazol a un flujo de 4-5 ml/min a 4 °C. Después de cargar, la columna se lavó con regulador de equilibrio adicional y la proteina se eluyó con regulador de equilibrio que contenia imidazol 0.25 M. La proteina altamente purificada se desaló subsecuentemente en un regulador de almacenamiento que contenia 10 mM de Hepes, NaCl 0.14 M y manitol al 4 %, pH 6.8, con una columna G25 Superfine (pharmacia) de 25 mi y se almacenó a - 80 °C.
La construcción de inmunadhesina de las proteinmas se purificó del medio acondicionado como sigue. El medio acondicionado se bombeó sobre una columna Protein A (Pharmacia) la cual habia sido equilibrada en 20 mM de regulador de fosfato de sodio, pH 6.8. Después de carga, la columna se lavó extensivamente con regulador de equilibrio antes de elusión con 100 mM de ácido citrico, pH 3.5. La proteina eluida se neutralizó inmediatamente por colección de fracciones de 1 mi en tubos que contenian 275 mi de regulador Tris 1 M, pH 9. La proteina altamente, purificada se desaló subsecuentemente en regulador de almacenamiento como se describió anteriormente para las proteinas marcadas con poli-His. La homogeneidad de las proteinas se verificó por electroforesis sobre gel (PEG) de poliacrilamida y secuenciación del aminoácido N-terminal por la degradación de Edman.
Alternativamente, un procedimiento modificado para baculovirus puede usarse inorporanddo 5 células superiores. En este procedimiento el DNA codificador de la secuencia deseada se amplificó con sistemas adecuados, tal como Pfu (Stratagene) , ó se fusióno de 5' a 3' de un epitope marcado incluye marcado poli-His y con >inmunoglobulina (regiones de IgG similares a Fe) . Una variedad de plásmidos pueden emplearse, que incluyen plásmidos derivados de plásmidos comercialmente disponibles tales como los vectores pIEl-1 (Novagen. El vector de pIEl-1 y el pIEl-2 se designan para expresión constitutiva de proteinas recombinantes del promotor el del baculovirus en células de insectos transformadas establemente. Los plásmidos difieren solamente en la orientación de los sitios de clonación múltiple y contienen todas las secuencias promotoras que se s sabe que son importantes para la expresión genética mediada por el en células de insectos sin infectar asi como también rl elemento me orador hr5. pIEl-1 y pIEl-2 incluye el sitio 5 de iniciación de translación y puede usarse para producir proteínas de fusión. Brevemente, la secuencia deseada de la porción deseada de la secuencia (tal como la secuencia codificadora de la región extracelular de una proteína transmembrana) es amplificada por PCR con cebadores 10 complementarios en las regiones 5' y 3' . El cebador cebador en 5' puede incorporar sitios de enzimas de restricción laterales (seleccionados) . El producto se digirió entonces con las enzimas de restricción seleccionadas y se subclonó en el vector de expresión. Por ejemplo, derivados de pIEl-1 15 pueden incluir la región Fe de IgG humana )pb.PH.IgG) ó ^ marcador 8 histidina (pb.PH.His) de 3' a 5' de la secuencia deseada. Preferiblemente, la construcción del vector se secuencia para confirmación. 20 Se desarrollan células Superiores 5 a una confluencia de 50 % bajo las condiciones de 27 °C, no C02, NO penicilina/estreptomicina. Para cada una de las placas de 15 mm, 30 µg de pIE en base al vector que contiene la secuencia se mezcló con 1 mi de medio ExCell (Medio: ExCell 25 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences # 14401-78P (nota: este medio sensible a la luz)), y en un tubo separado, 100 µ? de CellFectin (CellFECTIN (GibcoBRL # 10362-010) (se somete a vórtice para mezcla)) se mezcló con 1 mi de medio Ex Cell. Las dos soluciones se combinaron y se dejaron incubar a la temperatura ambiente por 15 minutos. Se añadieron 8 mi de medio Ex -Cell a la mezcla de 2 mi de DNA/CellFECTIN y esta distribuyó en una capa sobre las células Superiores 5 que se han lavado una vez con Medio Ex -Cell. La placa se incuba entonces en la obscuridad por 1 hora a la temperatura ambiente. La mezcla DNA/CellFECTIN se aspira entonces, y las células se lavan una vez con Ex -Cell poara retirar el exceso de CellFECTIN, se añade 30 mi de medio Ex Cell recientemente preparado y las células se incuban por 3 dias a 28 °C. El sobrenadante se recolecta y la expresión de la secuencia en el vector de expresión de baculovirus se determinó por enlace discontinuo de 1 mi de sobrenadante a 25 mi de perlas de Ni2+-NTA (QIAGEN) por proteínas marcadas con histidina ó perlas de Protein-A Sepharose CL-4B (Pharmacia) por proteínas marcadas con IgG seguido por análisis SDS-PAGE comparando con una concentración conocida de proteina estándar por manchado con Azul de Coomassie.
El medio acondicionado de las células transfectadas (0.5 a 3L) se recolectó por centrifugación para retirar las células y filtrar a través de filtros de 0.22 micrones.
Para las construcciones marcadas con poli-HiS/ la proteina que comprende la secuencia se purifica utilizando una columna NÍ2+-NTA (Qiagen) . antes de purificación, se añadió imidazol al medio acondicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombeó sobre una columna Ni2+-NTA de 6 mi equilibrada en 20 mM de Hepes, pH 7.4, regulador que contiene NaCl 0.3 M y 5 mM de imidazol a un flujo de 4-5 ml/min, a 48 °C. Después de cargar, la columna se lavó con regulador equlibrante adicional y se eluyó la proteina con regulador equilibrante que contiene imidazol 0.25 M. La proteina altamente purificada se desaló posteriormente en un regulador de almacenamiento que contienee 10 mM de Hepes, NaCl 0.14 M y manitol al 4 %, pH 6.8, con una columna G25 Superfine de 25 mi de Pharaiacia) y se almacenó a -80 °C.
Se purificó la construcción inmunoadhesina [que contiene Fe) de proteínas desde el medio acondicionado como sigue. El medio acondicionado se bombeó sobre una columna de 5 mi Protein A (Pharmacia) la cual habla sido equilibrada en 20 mM de regulador de fosfato de sodio, pH 6.8. Después de cargar, la columna se lavó extensivamente con regulador de equilibrio antes de elusión con 100 mM ácido cítrico, pH 3.5. La proteína eludía se neutralizó inmediatamente colectando fracciones de 1 mi en tubos que contenían 275 mi de regulador Tris 1 M, pH 9. La proteina altamente purificada se desaló subsecuentemente en regulador de almacenamiento como se describió anteriormente pata las proteínas marcadas con poli-His. La homogeneidad S de la secuencia se evaluó por geles de po1iacrilamidas de SDS y por secuenciación del aminoácido N-terminal por la degradación de edman y otros procedimientos analíticos que se desee ó sea necesario. 0 PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211 y PR0246 se expresaron exitosamente por el procedimiento de baculovirus modificado anterior que incorpora 5 células superiores . 5 EJEMPLO 17 Demostración del enlace de PR0533 al Receptor 3 de FGF Se expresó PR0533 en baculovirus en una forma marcada 0 del epitope His8 C-termina como se describió en el Ejemplo 16, asi como una proteina epitope 8- His C-terminal control. Las regiones extracelulares de los receptores 1-4 de FGF y el receptor de TIEl se expresaron como proteínas de fusión Fe. Las proteínas se dejaron interactuar en 5 regulador de enlace (medio DMEM + 10 mM de HEPES pH 7.4 + albúmina al 0.1 % + 200 ng/ml de heparina) a la temperatura ambiente por 1 hora.Se añadió Protein A Sepharose (Pharmacia) (0.01 mi) y se continuó el enlace por 30 minutos. Se colectaron las perlas de Protein A Sepharose y se lavaron dos veces en regulador de enlace. Las muestras se resolvieron entonces por SDS-PAGE en condiciones reductoras. El análisis por manchado Western se condujo con el anticuerpo anti-His (Qiagen) conforme a las recomendaciones del fabricante. Los resultados demostraron una alta especificidad de enlace al Receptor 3 de FGF (FGFR3-Fc) .esto es muy significativo, puesto que la mayoría de los ligandos de FGF enlazan a más de un receptor de FGF.
EJEMPLO 18 Preparación de los anticuerpos que enlazan a PRQ187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden enlazar específicamente a PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317.
Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales son conocidas en la materia y se describen, por ejemplo, en Goding, supra. Los inmunógenos que pueden emplearse incluyen PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 purificados, proteínas de fusión que contienen PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 y células que expresan a PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 recombinante sobre la superficie celular. Los expertos en la materia pueden seleccionar el inmunogeno sin experimentaciones indebidas.
Ratones, tales como Balb/c, se inmunizaron con el inmunogeno de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 emulsificado en adyuvante de Freund completo y se inyectaron subcutáneamente ó intrape itonealmente en una cantidad desde 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunogeno se emulsificó en adyuvante de MPL-TDM (Ribi Inmunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyectó en las palma de las patas posteriores de los animales. Los ratones inmunizados se reforzaron entonces 10 a 12 dias después con inmunógeno emulsificado adicional en el adyuvante seleccionado. Después de eso, por varias semanas, los ratones pueden también ser reforzados con inyecciones de inmunización adicionales. Pueden obtenerse periódicamente muestras de suero de los ratones por sangrado retro-orbital para examinar por ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti- PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, 5 anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246, ó anti-PR0317.
Después de detectar el titulo adecuado de un anticuerpo, los animales "positivos" para anticuerpos pueden ser inyectados con una inyección intravenosa final 0 de PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR02 6, ó PR0317. De tres a cuatro dias después, los ratones se sacrificaron y las células de bazo se colectaron. Las células de bazo se fusionaron entonces (utilizando polietilen glicol al 35 %) a una linea celular S de miéloma de murina seleccionada tal como P3X63AgU.l, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células hibridoma que pueden ser plaqueadas en placas para cultivo de tejidos de 96 pocilios que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina, y timidina) para inhibir la 0 proliferación de células no-fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo.
Las células hibridoma se cribaron en un ELISA para reactividad contra PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, 5 PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317. Los expertos en la materia tienen el conocimiento para la determinación de células hibridoma ¾positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317.
Células hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c singeneicos para producir ascitas que contienen los anticuerpos monoclonales anti-PR0187f anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246 ó anti-PR0317. Alternativamente, las células hibridoma pueden desarrollarse en matraces para cultivo de tejido ó botellas rotatorias. La purificación de los anticuerpos monoclonales producida en las ascitas puede lograrse utilizando precipitación al sulfato de amonio, seguido por cromatografía de exclusión de gel. Alternativamente/ puede emplearse cromatografía de afinidad basada en el enlace del anticuerpo a Protein A ó Protein G.
Depósito de material: Los siguientes materiales se depositaron con American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC) : Material Depósito Fecha de ATCC No.¡ Depósito: DNA27864-1155 209375 10/16/97 DNA 9435-1219 209480 11/21/97 DNA32286-1191 209385 10/1697 DNA34387-1138 209260 9/16/97 D A32292-1131 209258 9/1697 DNA33223-1136 209264 9/16/97 DNA33473-1176 209391 10/17/97 DNA35639-1172 209396 10/17/97 DNA33461-1199 209367 10/15/97 Estos depósitos se hicieron bajo las condiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Micro-organismos para el Propósito de Procedimientos de Patente y la Reglamentación al respecto (Tratado de Budapest) . Este asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito por 30 años desde la fecha de depósito. El depósito estará disponible en el ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un acuerdo entre Genentech, Inc., y el ATCC, el cual asegura disponibilidad permanente y sin restricción de la progenie del cultivo del depósito al público después de que la Aprobación del Registro pertinente de la Patente USA ó después de la apertura al público de cualquier solicitud de patente extranjera ó USA, cualquier cosa que ocurra primero, y asegure la disponibilidad de la progenie a cualquiera determinado por el Comisionado de Patentes y Marcas USA para ser titular de la misma conforme a USC 35 § 122 y las Reglas de la comisión relativas a las mismas (que incluyen C.F.R. 37 § 1.14 con referencia particular a 886 OG638) .
El signatario de la presente solicitud ha aceptado que si un cultivo de los materiales en depósito muriera ó se perdiera ó destruyera cuando se cultive bajo condiciones adecuadas/ los materiales serán reemplazados a la brevedad de la · notificación con otro igual. La disponibilidad del material depositado no se interpreta como una licencia para la práctica de la invención en contravención de los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier ¦ gobierno de conformidad con sus leyes de patentes .
Las especificaciones escritas anteriores se 5 consideran suficientes para facilitar a un experto en la materia poner en práctica la invención. La presente invención no está limitada en el alcance por los elementos depositados, puesto que las modalidades depositadas se r ^— planearon solo como ilustración de ciertos aspectos de la 10 invención y cualquier elemento que sea funcionalmente equivalente está en el alcance de esta invención. El depósito de presente material no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en la presente es inadecuada para facilitar la práctica de cualquier aspecto 1S de la invención, que incluye la mejor modalidad de la misma, ni se ha construido como limitante del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones especificas que las representan. Verdaderamente, varias modi icaciones de la invención además de las expuestas y descritas en la 20 presente se harán obvias para los expertos en la materia de la descripción anterior y caen en el alcance de las reivindicaciones anexas. 25 Listado de Secuencias <110> GENENTECH, INC.. Goddard, Audrey Gurney, Austin L. Hillan, Kenneth J. Roy, argaret Ann Wood, William I. <120> Composiciones y Métodos para el Tratamiento de Tumores <130> P1625R2PCT <140> PCT/US99/20594 <141> 1999-09-08 <150> US 60/099,803 <151> 1998-09-10 <150> PCT/US98/18824 <151> 1998-09-10 <160> 93 <210> 1 <211> 1200 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 cecacgcgtc cgaacctctc cagcgatggg agccgcccgc ctgctgccca 50 acctcactct gtgcttacag ctgctgattc tctgctgtca aactcagtac 100 gtgagggacc agggcgccat gaccgaccag ctgagcaggc ggcagatccg 150 cgagtaccaa ctctacagca ggaccagtgg caagcacgtg caggtcaccg 200 ggcgtcgcat ctccgccacc gccgaggacg gcaacaagtt tgccaagctc 250 atagtggaga cggacacgtt tggcagccgg gttcgcatca aaggggctga 300 gagtgagaag tacatctgta tgaacaagag gggcaagctc atcgggaagc 350 ccagcgggaa gagcaaagac tgcgtgttca cggagatcgt gctggagaac 400 aactatacgg ccttccagaa cgcccggcac gagggctggt tcatggcctt 450 cacgcggcag gggcggcccc gccaggcttc ccgcagccgc cagaaccagc 500 gcgaggccca cttcatcaag cgcctctacc aaggccagct gcccttcccc 550 ^ aaccacgccg agaagcagaa gcagttcgag tttgtgggct ccgcccccac 600 5 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Ser Arg Thr Ser Gly Lys His Val Gln Val Thr Gly Arg 50 55 60 Arg lie Ser Ala Thr Ala Glu Asp Gly Asn Lys Phe Ala Lys Leu 65 70 75 lie Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Arg Val Arg lie Lys Gly 80 85 90 Ala Glu Ser Glu Lys Tyr lie Cys Met Asn Lys Arg Gly Lys Leu 95 100 105 lie Gly Lys Pro Ser Gly Lys Ser Lys Asp Cys Val Phe Thr Glu 110 115 120 lie Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Phe Gln Asn Ala Arg His 125 130 135 Glu Gly Trp Phe Met Ala Phe Thr Arg Gln Gly Arg Pro Arg Gln 140 145 150 Ala Ser Arg Ser Arg Gln Asn Gln Arg Glu Ala His Phe lie Lys Arg Leu Tyr Gln Gly Gln Leu Pro Phe Pro Asn His Ala Glu Lys 170 175 180 Gln Lys Gln Phe Glu Phe Val Gly Ser Ala Pro Thr Arg Arg Thr 185 190 195 Lys Arg Thr Arg Arg Pro Gln Pro Leu Thr 200 205 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-28 <223> Sonda sintética <400> 3 cagtacgtga gggaccaggg cgccatga 28 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artifical <222> 1-24 <223> Sonda Sintética <400> 4 ccggtgacct gcacgtgctt gcca 24 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Secuencia Articicial <220> <221> Secuencia Artififical <222> 1-41 <223> Sonda Sintética <220> <221> Desconocida <222> 21 <223> Base desconocida <400> 5 gcggatctgc cgcctgctca nctggtcggt catggcgccc t 41 <210> 6 <211> 2137 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 6 gctcccagcc aagaacctcg gggccgctgc gcggtgggga ggagttcccc 50 gaaacccggc cgctaagcga ggcctcctcc tcccgcagat ccgaacggcc 100 tgggcggggt caccccggct gggacaagaa gccgccgcct gcctgcccgg 150 gcccggggag ggggctgggg ctggggccgg aggcggggtg tgagtgggtg 200 tgtgcggggg gcggaggctt gatgcaatcc cgataagaaa tgctcgggtg 250 tcttgggcac ctacccgtgg ggcccgtaag gcgctactat ataaggctgc 300 cggcccggag ccgccgcgcc gtcagagcag gagcgctgcg tccaggatct 350 agggccacga ccatcccaac ccggcactca cagccccgca gcgcatcccg 400 gtcgccgccc agcctcccgc acccccatcg ccggagctgc gccgagagcc 450 ccagggaggt gccatgcgga gcgggtgtgt ggtggtccac gtatggatcc 500 tggccggcct ctggctggcc gtggccgggc gccccctcgc cttctcggac 550 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2050 ggctcaagcg gtccacctgc ctccgcctcc caaagtgctg ggattgcagg 2100 catgagccac tgcacccagc cctgtattct tattcttcag atatttattt 2150 ttcttttcac tgttttaaaa taaaaccaaa gtattgataa aaaaaaa 452 <210> 27 <211> 164 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 27 Met Trp Arg Cys Pro Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ala 1 5 10 15 Gly His Leu Ala Leu Gly Ala Gln Gln Gly Arg Gly Arg Arg Glu 20 25 30 Leu Ala Pro Gly Leu His Leu Arg Gly lie Arg Asp Ala Gly Gly 35 40 45 Arg Tyr Cys Gln Glu Gln Asp Leu Cys Cys Arg Gly Arg Ala Asp 50 55 60 Asp Cys Ala Leu Pro Tyr Leu Gly Ala lie Cys Tyr Cys Asp Leu 65 70 75 Phe Cys Asn Arg Thr Val Ser Asp Cys Cys Pro Asp Phe Trp Asp 80 85 90 453 Phe Cys Leu Gly Val Pro Pro Pro Phe Pro Pro lie Gln Gly Cys 95 100 105 Met His Gly Gly Arg lie Tyr Pro Val Leu Gly Thr Tyr Trp Asp 110 115 120 Asn Cys Asn Arg Cys Thr Cys Gln Glu Asn Arg Gln Trp His Gly 125 130 135 Gly Ser Arg His Asp Gln Ser His Gln Pro Gly Gln Leu Trp Leu 140 145 150 Ala Gly Trp Glu Pro Gln Arg Leu Leu Gly His Asp Pro Gly 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160 165 Arg Leu Val Ser Val His Glu Ser Gly Trp Lys Ala Phe Asp Val 170 175 180 Thr Glu Ala Val Asn Phe Trp Gln Gln Leu Ser Arg Pro Arg Gln 185 190 195 Pro Leu Leu Leu Gln Val Ser Val Gln Arg Glu His Leu Gly Pro 200 205 210 Leu Ala Ser Gly Ala His Lys Leu Val Arg Phe Ala Ser Gln Gly Ala Pro Ala Gly Leu Gly Glu Pro Gln Leu Glu Leu His Thr Leu 230 235 240 Asp Leu Gly Asp Tyr Gly Ala Gln Gly Asp Cys Asp Pro Glu Ala 245 250 255 Pro Met Thr Glu Gly Thr Arg Cys Cys Arg Gln Glu Met Tyr lie 260 265 270 475 Asp Leu Gln Gly Met Lys Trp Ala Glu Asn Trp Val Leu Glu Pro Pro Gly Phe Leu Ala Tyr Glu Cys Val Gly Thr Cys Arg Gln Pro 290 295 300 Pro Glu Ala Leu Ala Phe Lys Trp Pro Phe Leu Gly Pro Arg Gln 305 310 315 Cys lie Ala Ser Glu Thr Asp Ser Leu Pro Met lie Val Ser lie 320 325 330 Lys Glu Gly Gly Arg Thr Arg Pro Gln Val Val Ser Leu Pro Asn 335 340 345 Met Arg Val Gln Lys Cys Ser Cys Ala Ser Asp Gly Ala Leu Val 350 355 360 Pro Arg Arg Leu Gln Pro 365 366 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Secuencia Artificial 476 <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-21 <223> Sonda sintética <400> 43 aggactgcca taacttgcct g 21 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-22 <223> Sonda sintética <400> 44 ataggagttg aagcagcgct gc 22 <210> 45 <211> 45 <212> DNA 477 <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial 5 <222> 1-45 <223> Sonda Sintética <400> 45 ^ tgtgtggaca tagacgagtg ccgctaccgc tactgccagc accgc 45 10 <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Secuencia Artificial 15 ^ <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-26 <223> Sonda Sintética 20 <400> 46 gcagattttg aggacagcca cctcca 26 <210> 47 25 <211> 18 478 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-18 <223> Sonda Sintética <400> 47 ggccttgcag acaaccgt 18 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-21 <223> Sonda Sintética <400> 48 cagactgagg gagatccgag a 21 <210> 49 479 <211> 20 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-20 <223> Sonda Sintética <400> 49 cagctgccct tccccaacca 20 <210> 50 <211> 18 15 <212> DNA <213> Secuencia Artificial v. <220> <221> Secuencia Artificial 20 <222> 1-18 <223> Sonda Sintética <400> 50 catcaagcgc ctctacca 25 480 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-21 <223> Sonda Sintética <400> 51 cacaaactcg aactgcttct g 21 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-23 <223> Sonda Sintética <400> 52 gggacgtgct tctacaagaa cag 23 481 <210> 53 <211> 26 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-26 <223> Sonda Sintética <400> 53 caggcttaca atgttatgat cagaca <210> 54 <211> 31 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-31 <223> Sonda Sintética <400> 54 482 tattcagagt tttccattgg cagtgccagt <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-18 <223> Sonda Sintética <400> 55 gggccatcac agctccct 18 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-22 <223> Sonda Sintética 483 <400> 56 gggatgtggt gaacacagaa ca 22 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-22 <223> Sonda Sintética <400> 57 tgccagctgc atgctgccag tt 22 <210> 58 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-25 <223> Sonda Sintética 484 r <400> 58 . cagcgccgaa aagccaagac ttcat 25 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Secuencia Artificial 10 <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-23 <223> Sonda Sintética 15 <400> 59 gattctggga gccaccactc tat 23 <210> 60 <211> 23 20 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial 25 <222> 1-23 48S <223> Sonda Sintética <400> 60 agctccctga ctgggctaag ata 23 5 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Secuencia Artificial 10 <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-22 <223> Sonda Sintética 15 ^ <400> 61 ^ gtcagggagc tctgcttcct ag 22 <210> 62 20 <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> 25 <221> Secuencia Artificial 486 <222> 1-18 <223> Sonda Sintética <400> 62 aatggcggcc tcaacctt <210> 63 <211> 25 <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Sintética <222> 1-25 <223> Sonda Sintética <400> 63 cgaatccact ggcgaaagat gcctt 25 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> 487 <221> Secuencia Artificial <222> 1-20 <223> Sonda Sintética <400> 64 cagaaggatg tcccgtggaa <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial 15 <222> 1-17 ^ s <223> Sonda Sintética <400> 65 gccgctgtcc actgcag 17 20 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Secuencia Artificial 25 488 <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-21 <223> Sonda Sintética <400> 66 gacggcatcc tcagggccac a 21 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-20 <223> Sonda Sintética <400> 67 atgtcctcca tgcccacgcg 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Secuencia Artificial 489 <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-20 <223> Sonda Sintética <400> 68 gagtgcgaca tcgagagctt 20 <210> 69 <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-18 <223> Sonda Sintética <400> 69 ccgcagcctc agtgatga <210> 70 <211> 21 <212> DNA 490 <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-21 <223> Sonda Sintética <400> 70 gaagagcaca gctgcagatc c 21 <210> 71 <211> 22 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-22 <223> Sonda sintética <400> 71 gaggtgtcct ggctttggta gt 22 <210> 72 <211> 20 491 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-20 <223> Sonda Sintética <400> 72 cctctggcgc ccccactcaa 20 <210> 73 <211> 19 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-19 <223> Sonda sintética <400> 73 tctagcccac tccctgcct 19 <210> 74 492 <211> 21 <212> DNA <213> Secuencia Artificial 5 <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-21 <223> Sonda Sintética r 10 <400> 74 gaagtcggag agaaagctcg c 21 <210> 75 <211> 30 15 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial 20 <222> 1-30 <223> Sonda Sintética <400> 75 cacacacagc ctatatcaaa catgcacacg 25 493 <210> 76 <211> 22 <212> D A <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-22 <223> Sonda Sintética <400> 76 ggcagagact tccagtcact ga <210> 77 <211> 22 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-22 <223> Sonda Sintética <400> 77 gccaagggtg gtgttagata gg 22 494 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-24 <223> Sonda Sintética <400> 78 caggccccct tgatctgtac ccca <210> 79 <211> 18 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-18 <223> Sonda Sintética <400> 79 495 ccaggagagc tggcgatg 18 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-23 <223> Sonda Sintética <400> 80 gcaaattcag ggctcactag aga 23 <210> 81 <211> 29 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-29 <223> Sonda Sintética 496 <400> 81 cacagagcat ttgtccatca gcagttcag 29 <210> 82 <211> 46 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-46 <223> Sonda Sintética <400> 82 ggattctaat acgactcact atagggcgga tcctggccgg cctcgg 46 <210> 83 <211> 48 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-48 <223> Sonda Sintética 497 ctatgaaatt aaccctcact aaagggagcc cgggcatggt ctcagtta 48 <210> 84 <211> 47 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-47 <223> Sonda Sintética <400> 84 ggattctaat acgactcact atagggcccc tcctgccttc cctgtcc 47 <210> 85 <211> 48 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-48 498 <223> Sonda Sintética <400> 85 ctatgaaatt aaccctcact aaagggagtg gtggccgcga ttatctgc 48 5 <210> 86 <211> 48 <212> DNA ^ <213> Secuencia Artificial 10 <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-48 <223> Sonda Sintética 15 <400> 86 ^ ggattctaat acgactcact atagggcccg agatatgcac ccaatgtc 48 <210> 87 20 <211> 47 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> 25 <221> Secuencia Artificial 499 <222> 1-47 C <223> Sonda Sintética <400> 87 5 ctatgaaatt aaccctcact aaagggatcc cagaatcccg aagaaca 47 <210> 88 <211> 48 <212> DNA 10 <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-48 15 <223> Sonda Sintética " <400> 88 ggattctaat acgactcact atagggcggc gatgtccact ggggctac 48 20 <210> 89 <211> 48 <212> DNA <213> Secuencia Artificial 25 <220> 500 <221> Secuencia Artificial f ^ <222> 1-48 <223> Sonda Sintética 5 <400> 89 ctatgaaatt aaccctcact aaagggacga ggaagatggg cggatggt 48 <210> 90 <211> 45 10 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial 15 <222> 1-45 <223> Sonda Sintética <400> 90 ggattctaat acgactcact atagggcgcg aggacggcgg cttca 45 20 <210> 91 <211> 48 <212> DNA <213> Secuencia Artificial 25 501 <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-48 <223> Sonda Sintética <400> 91 ctatgaaatt aaccctcact aaagggaaga gtcgcggccg cccttttt 48 <210> 92 <211> 48 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-48 <223> Sonda Sintética <400> 92 ggattctaat acgactcact atagggcttg ctgcggtttt tgttcctg 48 <210> 93 <211> 48 <212> DNA <213> Secuencia Artificial S02 ^- <220> <221> Secuencia Artificial <222> 1-48 5 <223> Sonda Sintética <400> 93 ctatgaaatt aaccctcact aaagggagct gccgatccca ctggtatt 48 10 Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. 15 Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad en las siguientes: 20 25

Claims (48)

503 REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado que está caracterizado porque enlaza al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, 6 PR0317.
2. El anticuerpo de la Reivindicación 1 que está caracterizado porque enlaza específicamente a dicho polipéptido.
3. El anticuerpo de la Reivindicación 1 que está caracterizado porque induce la muerte de una célula que expresa a dicho polipéptido.
4. El anticuerpo de la Reivindicación 3, que está caracterizado porque dicha célula es una célula cancerosa que sobre-expresa a dicho polipéptido en comparación a una célula normal del mismo tipo de tejido.
5. El anticuerpo de la Reivindicación 1 que está caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal.
6. El anticuerpo de la Reivindicación 5 que está caracterizado porque comprende una región determinante de 504 complementaridad no-humana (CDR) 6 una región de estructura humana (FR) .
7. El anticuerpo de la Reivindicación 1 que está caracterizado porque está marcado.
8. El anticuerpo de la Reivindicación l que está caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo ó un anticuerpo de un solo filamento.
9. Una composición de materiales que está - caracterizada porque comprende un anticuerpo de la Reivindicación 1 en mezcla con un vehículo aceptable farmacéuticamente.
10. La composición de materiales de la Reivindicación 9 que está caracterizada porque comprende una cantidad efectiva terapéuticamente de dicho anticuerpo.
11. La composición de materiales de la Reivindicación 9 que está caracterizada porque comprende adicionalmente un agente citotóxico ó quimioterapéutico. 505
12. Una molécula de ácido nucleico aislado que está caracterizada porque codifica al anticuerpo de la reivindicación 1. 5
13. Un vector que está caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 12.
14. Una célula huésped que está caracterizada porque ^— . comprende el vector de la Reivindicación 13. 10 15. Un método para producir un anticuerpo que enlaza a un polipéptido P 0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317, dicho método está caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped
15 de la Reivindicación 14 bajo condiciones suficientes para , permitir la expresión de dicho anticuerpo y recuperar dicho anticuerpo del cultivo celular.
16. Un antagonista del polipéptido PR0187, PR0533, 20 PR0214, PRO240, PRO211, PR0230, PR0261, PR0246, ó PR0317.
17. El antagonista de la reivindicación 16 que está caracterizado porque dicho. antagonista inhibe el crecimiento de células tumorales. 25 S06
18. Una molécula de ácido nucleico aislado que está caracterizada porque hibridiza a una secuencia de ácido nucleico que codifica a un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246, .6 PR0317, 6 al complemento del mismo.
19. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 18 que está caracterizada porque dicha hibridización es bajo condiciones severas de hibridización y de lavado.
20. Un método para determinar la presencia de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en una muestra sospechosa de contener dicho polipéptido, dicho método que está caracterizado porque comprende exponer la muestra a un anticuerpo anti-PR0187, anti-PR0533, an i-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PU0246, ó anti-PR03l7 y determinar el enlace de dicho anticuerpo al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en dicha muestra.
21. El método de la Reivindicación 20, que está caracterizado porque dicha muestra comprende una célula 507 sospechosa de comprender un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246, 6 PR0317.
22. El método de la Reivindicación 21, que está caracterizado porque dicha célula es una célula cancerosa.
23. Un método de diagnosticar tumor en un mamífero, dicho método que está caracterizado porque comprende detectar el nivel de expresión de un gen codificador de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 (a) en una muestra de células de tejido obtenida del mamífero, y (b) en una muestra control de células de tejido normal conocido del mismo tipo celular, en la que un nivel de expresión superior en la muestra de prueba, n comparación a la muestra control, es indicador de la presencia de tumor en el mamífero del cual se obtuvo la muestra de células de tejido.
24. Un método de diagnosticar tumor en un mamífero, dicho método que está caracterizado porque comprende (a) poner en contacto un anticuerpo anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PR0240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246, ó anti-PR03l7 con una muestra de prueba de células de tejido obtenido del mamífero, y (b) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo 508 anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti- PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246, 6 anti- PR0317 y polipéptido PR0187, PR0533, PR0214. PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en la muestra de 5 prueba, en donde la formación de un complejo es indicador de la presencia de un tumor en dicho mamífero.
25. El método de la Reivindicación 24, que está ^ caracterizado porgue dicho anticuerpo está marcado 10 detectablemente.
26. El método de la Reivindicación 24, que está caracterizado porgue dicha muestra de prueba de células de tejido se obtiene de un individuo sospechoso de tener 15 desarrollo ó proliferación celular neoplástica.
27. Un equipo para diagnóstico de cáncer gue está caracterizado porque comprende un anticuerpo anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti- 20 PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246, ó anti-PR0317 y un vehículo en un empaque adecuado.
28. El equipo de la reivindicación 27 que está caracterizado porque adicionalmente comprende instrucciones 25 para usar dicho anticuerpo para detectar la presencia de un 509 polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en una muestra sospechosa de contenerlo .
29. Un método para inhibir el crecimiento de células tumorales, dicho método que está caracterizado porque comprende exponer a las células tumorales que expresan al polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 a una cantidad efectiva de un agente que inhibe una actividad biológica de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246, ó PR0317, en donde se inhibe de ese modo, el crecimiento de dichas células tumorales.
30. El método de la Reivindicación 29, que está caracterizado porque dichas células tumorales sobre-expresan a dicho polipéptido en comparación a las células normales del mismo tipo de tejido.
31. El método de la Reivindicación 29, que está caracterizado porque dicho agente es un anticuerpo anti-PR0187, anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, an i-PR0246, ó anti-PR0317. 510
32. El método de la Reivindicación 31, que está r caracterizado porque dicho anticuerpo anti-PR0187, anti- PR0533, anti-PR0214, anti-PR0240, an i-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246, ó anti-PR0317 induce la muerte celular.
33. El método de la Reivindicación 29, que está caracterizado porque dichas células tumorales se exponen C adicionalmente a tratamiento por radiación, a un agente 10 citotóxico ó a un agente quimioterapéutico.
34. Un método para inhibir el crecimiento de células tumorales, dicho método que está caracterizado porque comprende exponer las células tumorales que expresan a un 15 polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 a una cantidad efectiva de un agente que inhibe la expresión de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR02S1, PR0246, Ó PR0317, en donde se inhibe de ese modo el crecimiento de 20 dichas células tumorales.
35. El método de la Reivindicación 34, que está caracterizado porque dichas células tumorales sobre- expresan a dicho polipéptido en comparación a células 25 normales del mismo tipo de tejido. Sil
36. El método de la reivindicación 34, que está caracterizado porgue dicho agente es un oligonucleótido antisentido que hibridiza a un ácido nucleico el cual codifica al polipéptido P 0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, 6 PR0317, ó al complemento del mismo.
37. El método de la Reivindicación 36, que está caracterizado porque dichas células tumorales se exponen adicionalmente a tratamiento por radiación, a un agente citotóxico ó a un agente quimioterapéutico.
38. Un artículo de manufactura, que está caracterizado porque comprende: un contenedor; una etiqueta sobre el contenedor; y una composición que comprende un agente activo contenido en el contenedor, en donde la composición es efectiva para inhibir el crecimiento de células tumorales y en donde la etiqueta sobre el contenedor indica que la composición es efectiva para tratar condiciones caracterizadas por la sobre-expresión de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PR0230, PR0261, 512 PR0246, 6 PR0317 en dichas células tümorales del mismo tipo de tejido.
39. El artículo de manufactura de la reivindicación 38, que está caracterizado porgue dicho agente activo inhibe una actividad biológica de y/ó la expresión de dicho polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246, Ó PR0317.
40. El artículo de manufactura de la Reivindicación 39, que está caracterizado porque dicho agente activo es un anticuerpo anti-PROl87, anti-PR0533, anti-PR0214f anti-PR0240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246, ó anti-PR0317.
41. El artículo de manufactura de la Reivindicación 39, que está caracterizado porque dicho agente activo es un oligonucleótido antisentido.
42. Un método de identificar un compuesto que inhibe una actividad biológica ó inmunológica de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO2 0, PR0211, PR0230, PR0251, PR0246, ó PR0317, dicho método que está caracterizado porque comprende poner en contacto un compuesto candidato con un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, 513 PRO230, PR0261, PR0246, 6 PR0317 bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir a los dos componentes interactuar y determinar si se inhibió una actividad biológica ó inmunológica de dicho polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, Ó PR0317.
43. El método de la Reivindicación 42, que está caracterizado porque dicho compuesto candidato es un anticuerpo anti-PR0187f anti-PR0533, anti-PR0214, anti-PRO240, anti-PR0211, anti-PRO230, anti-PR0261, anti-PR0246, ó anti-PR03l7.
44. El método de la Reivindicación 42, que está caracterizado porque dicho compuesto candidato ó dicho polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 está inmovilizado sobre un soporte sólido.
45. El método de la Reivindicación 44, que está caracterizado porque el componente no-inmovilizado está marcado detectablemente.
46. Un método de identificar un compuesto que inhibe una actividad de un polipéptido PROIS7, PR0533, PR0214, 514 PR0240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246, ó PR0317, dicho método está caracterizado porque comprende las etapas de (a) poner en contacto células y un compuesto candidato para ser cribado en la presencia de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PR0240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en condiciones adecuadas para la inducción de una respuesta celular normalmente inducida por un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 y (b) determinar la inducción de dicha respuesta celular para determinar si el compuesto de prueba es un antagonista efectivo, en donde la falta de inducción de dicha respuesta celular es indicador de que dicho compuesto es un antagonista efectivo.
47. Un método para identificar un compuesto que inhibe la expresión de un polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PRO230, PR0261, PR0246, ó PR0317 en células que expresan a dicho polipéptido, que está caracterizado porque dicho método comprende poner en contacto a dichas células con un compuesto candidato y determinar si se inhibió la expresión de dicho polipéptido PR0187, PR0533, PR0214, PRO240, PR0211, PR0230, PR0261, PR0246, ó PR0317. 515
48. El método de la Reivindicación 47, que está caracterizado porgue dicho compuesto candidato es un olignonucleótido antisentido.
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