MXPA04010092A - Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores. - Google Patents

Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores.

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Abstract

La presente invencion se dirige a las composiciones en cuestion utiles para el diagnostico y tratamiento de tumores en mamiferos y a metodos para utilizar esas composiciones en cuestion para los mismos.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE TUMORES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a composiciones de la materia útil para el diagnóstico y tratamiento de tumores en mamíferos y a métodos para utilizar esas composiciones de la materia para las mismas . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los tumores malignos (cánceres) son la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, después de las enfermedades cardiacas (Boring et al., CA Cancel ¿T. Clin. 43:7 (1993)). El cáncer se caracteriza por el incremento en el número de células anormales o neoplásicas derivadas de un tejido normal que prolifera para formar una masa tumoral, la invasión de tejidos adyacentes por estas células neoplásicas tumorales y la generación de células malignas que eventualmente se propagan a través de la sangre o el sistema linfático hacia los nodos linfáticos regionales y hacia sitios distantes a través de un proceso llamado metástasis . En un estado canceroso, una célula prolifera bajo condiciones en las cuales las células normales no crecerían. El cáncer se manifiesta por sí mismo en una extensa variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de invasividad y agresividad. En intentos por descubrir objetivos celulares - - efectivos para el diagnóstico y la terapia del cáncer, los investigadores han buscado identificar polipéptidos asociados a la transmembrana o asociados de otra manera a una membrana que se expresan específicamente en la superficie de uno o más tipos particulares de célula cancerosa en comparación a una o más células normales no cancerosas. Frecuentemente, tales polipéptidos asociados a la membrana se expresan más abundantemente en la superficie de las células cancerosas en comparación a la superficie de las células no cancerosas. La identificación de tales polipéptidos de antígeno de superficie celular asociados al tumor ha dado origen a la capacidad para enfocar específicamente las células cancerosas para su destrucción a través de terapias a base de anticuerpos. A este respecto, se hace notar que la terapia a base de anticuerpos ha probado ser muy efectiva en el tratamiento de ciertos cánceres. Por ejemplo, HERCEPTIN® y RITUXAN® (ambos de Genentech Inc., South San Francisco, California) son anticuerpos que se han utilizado con éxito para tratar el cáncer de mama y el linfoma no-de Hodgkin, respectivamente. Más específicamente, el HERCEPTIN® es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se enlaza selectivamente al dominio extracelular del protooncogén del receptor 2 del factor humano de crecimiento epidérmico (HER2) . La sobreexpresión de la proteína HER2 se observa en el 25-30% de los cánceres de mama primarios. El - - RITUXA ® es un anticuerpo quimérico monoclonal murino/humano genéticamente diseñado dirigido contra el antígeno CD20 encontrado en la superficie de los linfocitos B normales y malignos. Ambos anticuerpos se producen recombinantemente en las células CHO. En otros intentos por descubrir objetivos celulares efectivos para el diagnóstico y la terapia del cáncer, los investigadores han buscado identificar (1) polipéptidos no asociados a la membrana que se producen específicamente por uno o más tipo(s) particular (es) de célula (s) cancerosa (s) en comparación a uno o más tipo(s) particular (es) de célula (s) normal (es) no cancerosa (s) , (2) polipéptidos que se producen por células cancerosas en un nivel de expresión que es significativamente más alto que el de una o más células normales no cancerosas o (3) polipéptidos cuya expresión está específicamente limitada a solo un único (o un número muy limitado de diferentes) tipo(s) de tejido(s) tanto en estado canceroso como en no canceroso (e.g., en tejido de próstata normal y de tumor de próstata) . Tales polipéptidos pueden permanecer intracelularmente localizados o pueden secretarse por la célula cancerosa. Además, tales polipéptidos pueden expresarse no por la célula cancerosa en sí, sino por células que producen y/o secretan polipéptidos que tienen un efecto de aumento de potencia o de crecimiento en las células cancerosas . Tales polipéptidos secretados frecuentemente son - - proteínas que proveen a las células cancerosas con una ventaja en crecimiento sobre las células normales e incluyen cosas como, por ejemplo, factores angiogénicos, factores de adhesión celular, factores de crecimiento y lo similar. Se esperaría que la identificación de los antagonistas de tales polipéptidos no asociados a la membrana sirviera como agentes terapéuticos efectivos para el tratamiento de tales cánceres. Además, la identificación del patrón de expresión de tales polipéptidos sería útil para el diagnóstico de cánceres particulares en mamíferos . ? pesar de los avances anteriormente identificados en la terapia del cáncer en mamíferos, existe una gran necesidad de agentes diagnósticos y terapéuticos adicionales capaces de detectar la presencia de tumor en un mamífero y para inhibir efectivamente el crecimiento de células neoplásicas, respectivamente. De acuerdo a esto, es un objetivo de la presente invención identificar: (1) polipéptidos asociados a la membrana celular que se expresen más abundantemente en uno o más tipo(s) de célula (s) cancerosa (s) en comparación con las células normales o en otras células cancerosas diferentes, (2) polipéptidos no asociados a la membrana que se produzcan específicamente por medio de uno o más tipos particulares de células cancerosas (o por otras células que producen polipéptidos que tienen un efecto de aumento de potencia en el crecimiento de las - - células cancerosas) en comparación con uno o más tipo(s) particular (es) de célula (s) normal(es) no cancerosa(s () , 3) polipéptidos no asociados a la membrana que se produzcan por células cancerosas en un nivel de expresión que sea significativamente más alto que el de una o más célula (s) normal (es) no cancerosa (s) o (4) polipéptidos cuya expresión se limite específicamente a únicamente un solo (o a un número muy limitado de diferentes) tipo(s) de tejido (s) tanto en estado canceroso como no canceroso (e.g., tejido prostático normal y de tumor prostático) y utilizar esos polipéptidos y sus ácidos nucleicos codificadores, para producir composiciones de la materia útil en el tratamiento terapéutico y en la detección diagnóstica del cáncer en mamíferos. También es un objetivo de la presente invención identificar polipéptidos, asociados a la membrana celular, secretados o intracelulares cuya expresión se limite a un único o a un número muy limitado de tejidos y utilizar esos polipéptidos y sus ácidos nucleicos codificadores, para producir composiciones de la materia útil en el tratamiento terapéutico y en la detección diagnóstica del cáncer en mamíferos . SUMARIO DE LA INVENCIÓN 1 Modalidades En la presente especificación, los Solicitantes describen por primera vez la identificación de varios - - polipéptidos celulares (y sus ácidos nucleicos codificadores o sus fragmentos) que se encuentran expresados a un mayor grado en la superficie o por uno o más tipos de célula (s) cancerosa (s) en comparación a la superficie o por uno o más tipos de células normales no cancerosas. Alternativamente, tales polipéptidos se encuentran expresados por células que producen y/o secretan polipéptidos que tienen un efecto de aumento de potencia o de crecimiento en las células cancerosas. De nuevo alternativamente, tales polipéptidos pueden no encontrarse sobreexpresados por las células tumorales en comparación con las células normales del mismo tipo de tejido, sino que pueden encontrarse específicamente expresados por las células tumorales y las células normales de solo uno o un número muy limitado de tipos de tejido (de preferencia tejidos que no son esenciales para la vida, e.g., prostáticos, etc.). Todos los polipéptidos anteriores se refieren en la presente como polipéptidos de Objetivo Antigénico Asociado al tumor (polipéptidos WTAT") y se espera que sirvan como objetivos efectivos para la terapia y el diagnóstico del cáncer en mamíferos. De acuerdo a esto, en una modalidad de la presente invención, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de objetivo antigénico asociado al tumor o un fragmento del mismo (un polipéptido ¾TAT") .
- - En ciertos aspectos, la molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente un 80% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, para (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido TAT de longitud total que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en la presente, una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAT de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de aminoácidos del polipéptido TAT de longitud total como se describe en la presente o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) . En otros aspectos, la molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, para (a) una molécula de ADN que comprende la secuencia de codificación de un ADNc del - - polipéptido TAT de longitud total como se describe en la presente, la secuencia de codificación de un polipéptido TAT que carece del péptido de señal como se describe en la presente, la secuencia de codificación de un dominio extracelular de un polipéptido TAT de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o la secuencia de codificación de cualquier otro fragmento específicamente definido de la secuencia de aminoácidos del polipéptido TAT de longitud total como se describe en la presente o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) . En aspectos adicionales, la invención se refiere a una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, para (a) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por la región de codificación de longitud total de cualquiera de los ADNcs de la proteína humana depositados con la ATCC como se describe en la presente o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) . Otro aspecto de la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido TAT que - - es ya sea de dominio de transmembrana suprimido o de dominio de transmembrana inactivado o es complementario a tal secuencia de nucleótidos de codificación, en donde el (los) dominio (s) de transmembrana de tal (es) polipéptido (s) se describe (n) en la presente. Por lo tanto, se contemplan los dominios extracelulares solubles de los polipéptidos TAT descritos en la presente. En otros aspectos, la presente invención se dirige a moléculas aisladas de ácido nucleico que se hibridizan a (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido TAT que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud total como se describe en la presente, una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAT de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT de longitud total como se describe en la presente o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) . A este respecto, una modalidad de la presente invención se dirige a fragmentos de una secuencia de codificación del polipéptido TAT de longitud total o su complemento, como se describe en la presente, que puede encontrar su uso como, por ejemplo, sondas de hibridación útiles como, por ejemplo, sondas de diagnóstico, sondas de - - oligonucleótido de antisentido o para fragmentos de codificación de un polipeptido TAT de longitud total que opcionalmente pueden codificar un polipeptido que comprende un sitio de enlace para un anticuerpo de polipéptido anti-TAT, un oligopéptido de enlace TAT u otra molécula orgánica pequeña que se enlaza a un polipéptido TAT. Tales fragmentos de ácido nucleico son comúnmente de al menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, i 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, - 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760 , 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000 nucleótidos de longitud, en donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de referencia de la secuencia de nucleótidos más o menos 10% de esa longitud de referencia. Se hace notar que pueden determinarse nuevos fragmentos de una secuencia de nucleótidos de codificación del polipéptido TAT de manera - - rutinaria alineando la secuencia de nucleótidos de codificación del polipéptido TAT con otras secuencias de nucleótidos conocidas utilizando cualquiera de una variedad de programas de alineación de secuencia bien conocidos y determinando cual (es) fragmento (s) de secuencia de nucleótidos de codificación del polipéptido TAT son nuevos. Todos tales nuevos fragmentos de las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido TAT se contemplan en la presente. También se encuentran contemplados los fragmentos de polipéptido TAT codificados por estos fragmentos de molécula de nucleótido, preferentemente aquellos fragmentos de polipéptido TAT que comprenden un sitio de unión para un anticuerpo anti-TAT, un oligopéptido de enlace TAT u otra molécula orgánica pequeña que se enlaza a un polipéptido TAT. En otra modalidad, la invención proporciona polipéptidos TAT aislados codificados por cualquiera de las secuencias aisladas de ácido nucleico identificadas anteriormente en la presente. En un cierto aspecto, la invención se refiere a un polipéptido TAT aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de la secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% - - de identidad de la secuencia de aminoácidos, para un polipeptido TAT que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud total como se describe en la presente, una secuencia de aminoácidos de polipéptido TAT que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de una proteína del polipéptido TAT de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente, una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de aminoácidos del polipéptido TAT de longitud total como se describe en la presente . En un aspecto adicional, la invención se refiere a un polipéptido TAT aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de "la secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de la secuencia de aminoácidos, para una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los ADNcs de proteína humana depositados con la ATCC como se describe en la presente. En un aspecto específico, la invención proporciona un polipéptido TAT aislado sin la secuencia de señal N- - - terminal y/o sin la metionina de inicio ? se encuentra codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica tal secuencia de aminoácidos como se describió anteriormente en la presente. También se encuentran descritos en la presente procesos para producir el mismo en donde aquellos procesos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de codificación de ácido nucleico apropiada bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido TAT y la recuperación del polipéptido TAT del cultivo celular. Otro aspecto de la invención proporciona un polipéptido TAT aislado que es ya sea suprimido del dominio de transmembrana o inactivado del dominio de transmembrana. También se encuentran descritos en la presente procesos para producir el mismo en donde aquellos procesos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector que comprende la molécula de codificación de ácido nucleico apropiada bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido TAT y la recuperación del polipéptido TAT del cultivo celular. En otras modalidades de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden el ADN que codifica cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente . También se proporcionan las células huésped que comprenden cualquiera de tales vectores. A modo de ejemplo, - - las células huésped pueden ser células CEO, células de E. coli o células de levadura. Se proporciona además un proceso para producir cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente y comprende cultivar las células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado y recuperar el polipéptido deseado del cultivo celular. En otras modalidades, la invención proporciona polipéptidos quiméricos aislados que comprenden cualquiera de los polipéptidos TAT descritos en la presente fusionados a un polipéptido heterólogo (no-TAT) . Ejemplos de tales moléculas quiméricas comprenden cualquiera de los polipéptidos TAT descritos en la presente fusionados a un polipéptido heterólogo tal como, por ejemplo, una secuencia marcadora de epítope o una región Fe de una inmunoglobulina. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo que se enlaza, preferentemente de manera especifica, a cualquiera de los polipéptidos descritos anterior o posteriormente. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo de cadena única o un anticuerpo que inhibe competitivamente el enlace de un anticuerpo de polipéptido anti-TAT a su epítope antigénico respectivo. Los anticuerpos de la presente invención opcionalmente pueden conjugarse a un agente inhibidor del - - crecimiento o a un agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo un maytansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o lo similar. Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o en células bacteriales y preferentemente inducir la muerte de la célula a la cual se enlazan. Para propósitos de diagnóstico, los anticuerpos de la presente invención pueden marcarse de manera detectable, unidos a un soporte sólido o lo similar. En otras modalidades de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden el ADN que codifica cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente. También se proporciona la célula huésped que comprende cualquiera de tales vectores. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células de E. coli o células de levadura. Se proporciona además un proceso para producir cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente y comprende cultivar las células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo deseado y recuperar el anticuerpo deseado a partir del cultivo celular. En otra modalidad, la invención proporciona oligopéptidos ("oligopéptidos de enlace TAT") que se enlazan, preferentemente de manera específica, a cualquiera de los polipéptidos TAT descritos anterior o posteriormente.
- - Opcionalmente, los oligopéptidos de enlace TAT de la presente invención pueden conjugarse a un agente inhibidor del crecimiento o a un agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo un maytansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o lo similar. Los oligopéptidos de enlace TAT de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o en células bacteriales y preferentemente inducir la muerte de la célula a la cual se enlazan. Para propósitos de diagnóstico, los oligopéptidos de enlace TAT de la presente invención pueden marcarse de manera detectable, unidos a un soporte sólido o lo similar. En otras modalidades de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden el ADN que codifica cualquiera de los oligopéptidos de enlace TAT descritos en la presente. También se proporciona la célula huésped que comprende cualquiera de tales vectores. A modo de ejemplo, las células huésped pueden ser células CHO, células de E. coli o células de levadura. Se proporciona además un proceso para producir cualquiera de los oligopéptidos de enlace TAT descritos en la presente y comprende cultivar las células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del oligopéptido deseado y recuperar el oligopéptido deseado a partir del cultivo celular.
- - En otra modalidad, la invención proporciona moléculas orgánicas pequeñas ("moléculas orgánicas de enlace TAT") que se enlazan, preferentemente de manera especifica, a cualquiera de los polipéptidos TAT descritos anterior o posteriormente. Opcionalmente, las moléculas orgánicas de enlace TAT de la presente invención pueden conjugarse a un agente inhibidor del crecimiento o a un agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo un maytansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o lo similar. Las moléculas orgánicas de enlace TAT de la presente invención preferentemente inducen la muerte de la célula a la cual se enlazan. Para propósitos de diagnóstico, las moléculas orgánicas de enlace TAT de la presente invención pueden marcarse de manera detectable, unidas a un soporte sólido o lo similar. Aún en una modalidad adicional, la invención se refiere a una composición de materia que comprende un polipéptido TAT como se describe en la presente, un polipéptido quimérico TAT como se describe en la presente, un anticuerpo anti-TAT como se describe en la presente, un oligopéptido de enlace TAT como se describe en la presente o una molécula orgánica de enlace TAT como se describe en la presente, en combinación con un vehículo. Opcionalmente, el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable. Aún en otra modalidad, la invención se refiere a un - - artículo de manufactura que comprende un contenedor y una composición de materia contenida dentro del contenedor, en donde la composición de materia puede comprender un polipéptido TAT como se describe en la presente, un polipéptido quimérico TAT como se describe en la presente, un anticuerpo anti-TAT como se describe en la presente, un oligopéptido de enlace TAT como se describe en la presente o una molécula orgánica de enlace TAT como se describe en la presente. El artículo opcionalmente puede comprender además una etiqueta fija al contenedor o un inserto de empaque incluido con el contenedor, que se refiere al uso de la composición de materia para el tratamiento terapéutico o la detección diagnóstica de un tumor. Otra modalidad de la presente invención se dirige al uso de un polipéptido TAT como se describe en la presente, un polipéptido quimérico TAT como se describe en la presente, un anticuerpo anti-TAT como se describe en la presente, un oligopéptido de enlace TAT como se describe en la presente o una molécula orgánica de enlace TAT como se describe en la presente, para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una condición que responde al polipéptido TAT, al polipéptido quimérico TAT, al anticuerpo de polipéptido anti-TAT, al oligopéptido de enlace TAT o a la molécula orgánica de enlace TAT. 2 Modalidades Adicionales - - Otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa un polipéptido TAT, en donde el método comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo, un oligopéptido o una molécula orgánica pequeña que se enlaza al polipéptido TAT y en donde el enlace del anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica al polipéptido TAT ocasiona la inhibición del crecimiento de la célula que expresa el polipéptido TAT. En modalidades preferidas, la célula es una célula cancerosa y el enlace del anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica al polipéptido TAT ocasiona la muerte de la célula que expresa el polipéptido TAT. Opcionalmente el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o un anticuerpo de cadena única. Los anticuerpos oligopéptidos de enlace TAT y las moléculas orgánicas de enlace TAT empleados en los métodos de la presente invención opcionalmente pueden conjugarse a un agente de inhibición del crecimiento o a un agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maytansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o lo similar. Los anticuerpos y los oligopéptidos de enlace TAT empleados en los métodos de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o células bacteriales. Aún otra modalidad de la presente invención se - - dirige a un método para tratar terapéuticamente a un mamífero que tiene un tumor canceroso que comprende células que expresan un polipéptido TAT, en donde el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo, un oligopéptido o una molécula orgánica pequeña que se enlaza al polipéptido TAT, dando como resultado por tanto el tratamiento terapéutico efectivo del tumor. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo de cadena única. Los anticuerpos oligopéptidos de enlace TAT y las moléculas orgánicas de enlace TAT empleados en los métodos de la presente invención pueden conjugarse opcionalmente a un agente de inhibición del crecimiento o a un agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maytansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o lo similar. Los anticuerpos y oligopéptidos empleados en los métodos de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o en células bacteriales. Aún otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para determinar la presencia de un polipéptido TAT en una muestra sospechosa de contener el polipéptido TAT, en donde el método comprende exponer la muestra a un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica - - pequeña que se enlaza al polipéptido TAT y determinar el enlace del anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica al polipéptido TAT en la muestra, en donde la presencia de tal enlace es indicativa de la presencia del polipéptido TAT en la muestra. Opcionalmente, la muestra puede contener células (las cuales pueden ser células cancerosas) sospechosas de expresar el polipéptido TAT. El anticuerpo, el oligopéptido de enlace TAT o la molécula orgánica de enlace TAT empleados en el método opcionalmente pueden estar marcados detectablemente, unidos a un soporte sólido o lo similar. Una modalidad adicional de la presente invención se dirige a un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, en donde el método comprende detectar el nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido TAT (a) en una muestra de prueba de células de tejido obtenidas de dicho mamífero y (b) en una muestra de control de células normales no cancerosas conocidas del mismo origen o tipo de tejido, en donde un más alto nivel de expresión del polipéptido TAT en la muestra de prueba, en comparación con la muestra de control, es indicativo de la presencia de tumor en el mamífero del cual se obtuvo la muestra de prueba. Otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, en donde el método comprende (a) poner en contacto una muestra de prueba que comprende células de tej ido - - obtenidas del mamífero con un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica pequeña que se enlaza a un polipeptido TAT y (b) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo, el oligopéptido o la molécula orgánica pequeña y el polipeptido TAT en la muestra de prueba, en donde la formación de un complejo es indicativa de la presencia de un tumor en el mamífero. Opcionalmente, el anticuerpo, el oligopéptido de enlace TAT o la molécula orgánica de enlace TAT empleado se marca de manera detectable, unido a un soporte sólido o lo similar y/o la muestra de prueba de las células de tejido se obtiene de un individuo sospechoso de tener un tumor canceroso . Aún otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para tratar o prevenir un trastorno celular proliferativo asociado con la expresión o actividad alterada, preferentemente incrementada de un polipéptido TAT, el método comprende administrar a un sujeto que necesita tal tratamiento una cantidad efectiva de un antagonista de un polipéptido TAT. Pref rentemente, el trastorno celular proliferativo es cáncer y el antagonista del polipéptido TAT es un anticuerpo de polipéptido anti-???, un oligopéptido de enlace TAT, una molécula orgánica de enlace TAT o un oligonucleótido de antisentido. El tratamiento o prevención efectiva del trastorno celular proliferativo puede ser el resultado de la destrucción directa o la inhibición del - - crecimiento de las células que expresan un polipeptido TAT o mediante la antagonización de la actividad potenciadora del crecimiento celular de un polipeptido TAT. Aún otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para enlazar un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica pequeña a una célula que expresa un polipéptido TAT, en donde el método comprende poner en contacto una célula que expresa un polipéptido TAT con dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica pequeña bajo condiciones que son adecuadas para enlazar el anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica pequeña a dicho polipéptido TAT y permitir el enlace entre los mismos. Otras modalidades de la presente invención se dirigen al uso de (a) un polipéptido TAT, (fc>) un ácido nucleico que codifica un polipéptido TAT o un vector o célula huésped que comprende ese ácido nucleico, (c) un anticuerpo de polipéptido anti-TAT, (d) un oligopéptido de enlace TAT o (e) una molécula orgánica pequeña de enlace TAT en la preparación de un medicamento útil para (i) el tratamiento terapéutico o la detección diagnóstica de un cáncer o tumor o (ii) el tratamiento terapéutico o la prevención de un trastorno celular proliferativo . Otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa, en donde el crecimiento de dicha célula cancerosa - - al menos en parte depende de el (los) efecto (s) de aumentar la potencia del crecimiento de un polipéptido TAT (en donde el polipéptido TAT puede expresarse ya sea por la célula cancerosa en si o una célula que produce polipéptido (s) que tiene (n) un efecto de aumento de potencia del crecimiento en las células cancerosas) , en donde el método comprende poner en contacto el polipéptido TAT con un anticuerpo, un oligopéptido o una molécula orgánica pequeña que se enlaza al polipéptido TAT, antagonizando en consecuencia la actividad de aumento de potencia del crecimiento del polipéptido TAT y, a la vez, inhibir el crecimiento de la célula cancerosa. Prefe entemente el crecimiento de la célula cancerosa se inhibe completamente. Incluso más preferentemente, el enlace del anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica pequeña al polipéptido TAT induce la destrucción de la célula cancerosa. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo de cadena única. Los anticuerpos oligopéptidos de enlace TAT y moléculas orgánicas de enlace TAT empleadas en los métodos de la presente invención opcionalmente pueden conjugarse a un agente de inhibición del crecimiento o agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maytansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o lo similar. Los anticuerpos y los - - oligopéptidos de enlace TAT empleados en los métodos de la presente invención pueden producirse opcionalmente en células CHO o en células bacteriales . Aún otra modalidad de la presente invención se dirige a un método para tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento de dicho tumor al menos en parte depende de el (los) efecto (s) de aumento de potencia del crecimiento de un polipéptido TAT, en donde el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo, un oligopéptido o una molécula orgánica pequeña que se enlaza al polipéptido TAT, con lo cual antagoniza la actividad de aumento de potencia del crecimiento de dicho polipéptido TAT y da como resultado el tratamiento terapéutico efectivo del tumor. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo de cadena única. Los anticuerpos oligopéptidos de enlace TAT y las moléculas orgánicas de enlace TAT empleadas en los métodos de la presente invención pueden conjugarse opcionalmente a un agente de inhibición del crecimiento o un agente citotóxico tal como una toxina, incluyendo, por ejemplo, un maytansinoide o calicheamicina, un antibiótico, un isótopo radioactivo, una enzima nucleolítica o lo similar. Los anticuerpos y oligopéptidos empleados en los métodos de la presente invención pueden - - producirse opcionalmente en células CHO o en células bacteriales . 3 Modalidades Adicionales En aún modalidades adicionales, la invención se dirige al siguiente conjunto de reivindicaciones potenciales para esta solicitud: 1. El ácido nucleico aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de la identidad de secuencia de ácido nucleico para: (a) una molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) ; (b) una molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) que carece de su péptido de señal asociado; (c) una molécula que ADN que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), con su péptido de señal asociado; (d) una molécula de ADN que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS : 17-32), que carece de su péptido de señal asociado; (e) la secuencia de nucleótidos mostrada en - - cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16); (f) la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS : 1-3); o (g) el complemento de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) o (f) - 2. El ácido nucleico aislado que tiene: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS : 17-32) que carece de su péptido de señal asociado; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), con su péptido de señal asociado; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su péptido de señal asociado; (e) la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16); (f) la región de codificación de longitud total de - - la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16); o (g) el complemento de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) o (f) ¦ 3. El ácido nucleico aislado que hibridiza a: (a) un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS : 17-32) ; (b) un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , que carece de su péptido de señal asociado; (c) un ácido nucleico que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), con su péptido de señal asociado; (d) un ácido nucleico que codifica un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su péptido de señal asociado ; (e) la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16); (f) la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16); o (g) el complemento de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) o - - (f) · 4. El ácido nucleico de la Reivindicación 3, en donde la hibridación ocurre bajo condiciones rigurosas. 5. El ácido nucleico de la Reivindicación 3 , que es de al menos aproximadamente 5 nucleotidos de longitud. 6. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la Reivindicación 1, 2 o 3. 7. El vector de expresión de la Reivindicación 6, en donde dicho ácido nucleico se enlaza operablemente a las secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector. 8. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la Reivindicación 7. 9. La célula huésped de la Reivindicación 8 que es una célula CHO, una célula de E. coli o una célula de levadura . 10. Un proceso para producir un polipéptido que comprende cultivar la célula huésped de la Reivindicación 8 bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido y recuperar dicho polipéptido a partir del cultivo celular. 11. Un polipéptido aislado que tiene al menos 80% de la identidad de secuencia de aminoácidos para: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); - - (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17- 32) , con su péptido de señal asociado; (d) un domino extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS : 1-16) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1- 16) . 12. Un polipéptido aislado que tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) que carece de su secuencia de péptidos de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), con su secuencia de - - péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS : 1-16); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) . 13. Un polipéptido quimérico que comprende el polipéptido de la Reivindicación 11 o 12 fusionado a un polipéptido heterólogo. 14. El polipéptido quimérico de la Reivindicación 13 , en donde dicho polipéptido heterólogo es una secuencia de marcador de epitope o una región Fe de una inmunoglobulina. 15. Un anticuerpo aislado que se enlaza a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos para: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS : 17-32); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS : 17-32), que carece de su péptido - - de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , con su peptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , que carece de su peptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) . 16. Un anticuerpo aislado que se enlaza a un polipéptido que tiene : (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), con su secuencia de péptido de señal asociada; - - (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NO: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) . 17. El anticuerpo de la Reivindicación 15 o 16 que es un anticuerpo monoclonal . 18. El anticuerpo de la Reivindicación 15 o 16 que es un fragmento de anticuerpo. 19. El anticuerpo de la Reivindicación 15 o 16 que es un anticuerpo quimérico o humanizado. 20. El anticuerpo de la Reivindicación 15 o 16 que se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento. 21. El anticuerpo de la Reivindicación 15 o 16 que se conjuga a un agente citotóxico. 22. El anticuerpo de la Reivindicación 21, en donde el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolxticas . - - 23. El anticuerpo de la Reivindicación 21, en donde el agente citotóxico es una toxina. 24. El anticuerpo de la Reivindicación 23 , en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maytansinoide y calicheamicina. 25. El anticuerpo de la Reivindicación 23, en donde la toxina es un maytansinoide. 26. El anticuerpo de la Reivindicación 15 o 16 que se produce en bacterias . 27. El anticuerpo de la Reivindicación 15 o 16 que se produce en células CHO. 28. El anticuerpo de la Reivindicación 15 o 16 que induce la muerte de la célula a la cual se enlaza. 29. El anticuerpo de la Reivindicación 15 o 16 que se marca de manera detectable. 30. Un ácido nucleico aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de la Reivindicación 15 o 16. 31. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la Reivindicación 30 enlazado operablemente a las secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector. 32. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la Reivindicación 31. 33. La célula huésped de la Reivindicación 32 que - - es una célula CHO, una célula E. coli o una célula de levadura . 34. Un proceso para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la Reivindicación 32 bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho anticuerpo y recuperar dicho anticuerpo a partir del cultivo celular. 35. Un oligopéptido aislado que se enlaza a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos para: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS : 1-16) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de - - codificación, de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) . 36. Un oligopéptido aislado que se enlaza a un polipéptido que tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS : 17-32); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS : 1-16) . - - 37. El oligopéptido de la Reivindicación 35 o 36 el cual se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento. 38. El oligopéptido de la Reivindicación 35 o 36 que se conjuga a un agente citotoxico. 39. El oligopéptido de la Reivindicación 38, en donde el agente citotoxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleoliticas . 40. El oligopéptido de la Reivindicación 38, en donde el agente citotoxico es una toxina. 41. El oligopéptido de la Reivindicación 40, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maytansinoide y calicheamicina. 42. El oligopéptido de la Reivindicación 40, en donde la toxina es un maytansinoide . 43. El oligopéptido de la Reivindicación 35 o 36 que induce la muerte de la célula a la cual se enlaza. 44. El oligopéptido de la Reivindicación 35 o 36 que se marca de manera detectable. 45. Una molécula orgánica de enlace TAT que se enlaza a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos para : (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las - - Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su péptido de señal asociado,- (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS : 17-32) , con su péptido de señal asociado; (d) un domino extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleotidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleotidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS : 1-16) . 46. La molécula orgánica de la Reivindicación 45 que se enlaza a un polipéptido que tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), con su secuencia de - - péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NO: 17-32) , que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) . 47. La molécula orgánica de la Reivindicación 45 o 46 que se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento. 48. La molécula orgánica de la Reivindicación 45 o 46 que se conjuga a un agente citotóxico. 49. La molécula orgánica de la Reivindicación 48, en donde el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 50. La molécula orgánica de la Reivindicación 48, en donde el agente citotóxico es una toxina. 51. La molécula orgánica de la Reivindicación 50, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maytansinoide y calicheamicina. - - 52. La molécula orgánica de la Reivindicación 50, en donde la toxina es un maytansinoide . 53. La molécula orgánica de la Reivindicación 45 o 46 que induce la muerte de la célula a la cual se enlaza. 5 . La molécula orgánica de la Reivindicación 45 o 46 que se marca de manera detectable. 55. Una composición de materia que comprende: (a) el polipéptido de la Reivindicación 11; (b) el polipéptido de la Reivindicación 12; (c) el polipéptido quimérico de la Reivindicación 13; (d) el anticuerpo de la Reivindicación 15; (e) el anticuerpo de la Reivindicación 16; (f) el oligopéptido de la Reivindicación 35, (g) el oligopéptido de la Reivindicación 36; (h) la molécula orgánica de enlace TAT de la Reivindicación 45; o (i) la molécula orgánica de enlace TAT de la Reivindicación 46; en combinación con un vehículo. 56. La composición de materia de la Reivindicación 55, en donde dicho vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable . 57. Un artículo de manufactura que comprende: (a) un contenedor; y - - (b) la composición de materia de la Reivindicación 55 contenida dentro de dicho contenedor. 58. El artículo de manufactura de la Reivindicación 57 que comprende además un marcador unido a dicho contenedor o un inserto de paquete incluido con dicho contenedor, que se refiere al uso de dicha composición de materia para el tratamiento terapéutico o la detección diagnóstica de un cáncer. 59. Un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos para: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , con su péptido de señal asociado; (d) un domino extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS : 1-16) ; o - - (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) , comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica que se enlaza a dicha proteína, al enlace de dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica a dicha protexna causando por lo tanto una inhibición del crecimiento de dicha célula. 60. El método de la Reivindicación 59 en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 61. El método de la Reivindicación 59 en donde dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 62. El método de la Reivindicación 59 en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 63. El método de la Reivindicación 59, en donde dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento. 64. El método de la Reivindicación 59, en donde dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente citotóxico. 65. El método de la Reivindicación 64, en donde dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 66. El método de la Reivindicación 64, en donde el - - agente citotóxico es una toxina. 67. El método de la Reivindicación 66, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maytansanoide y calicheamicina . 68. El método de la Reivindicación 66, en donde la toxina es un maytansinoide . 69. El método de la Reivindicación 59, en donde dicho anticuerpo se produce en bacterias. 70. El método de la Reivindicación 59, en donde dicho anticuerpo se produce en células CHO. 71. El método de la Reivindicación 59, en donde dicha célula es una célula cancerosa. 72. El método de la Reivindicación 71, en donde dicha célula cancerosa se expone además al tratamiento por radiación o a un agente quimioterapéutico . 73. El método de la Reivindicación 71, en donde dicha célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste de una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer colorrectal, una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer del sistema nervioso central, una célula de cáncer del hígado, una célula de cáncer de vejiga, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer cervical, una célula de melanoma y una célula de leucemia. 74. El método de la Reivindicación 71, en donde - - dicha proteina se expresa más abundantemente por dicha célula cancerosa en comparación a una célula normal del mismo origen de tejido. 75. El método de la Reivindicación 59 que causa la muerte de dicha célula. 76. El método de la Reivindicación 59, en donde dicha proteína tiene : (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud total de la secuencia de - - nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) . 77. Un método para tratar terapéuticamente a un mamífero que tiene un tumor canceroso que comprende células que expresan una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos para: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , con su péptido de señal asociado; (d) un domino extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) , comprendiendo dicho método administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo - - oligopéptido o molécula orgánica que se enlaza a dicha proteína, tratando por lo tanto de manera efectiva a dicho mamífero . 78. El método de la Reivindicación 77, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 79. El método de la Reivindicación 77 en donde dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 80. El método de la Reivindicación 77 en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 81. El método de la Reivindicación 77 en donde dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento. 82. El método de la Reivindicación 77 en donde dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente citotóxico. 83. El método de la Reivindicación 82, en donde dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 84. El método de la Reivindicación 82, en donde el agente citotóxico es una toxina. 85. El método de la Reivindicación 84, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maytansinoide y calicheamicina . 86. El método de la Reivindicación 84, en donde la - - toxina es un maytansinoide . 87. El método de la Reivindicación 77 en donde dicho anticuerpo se produce en bacterias . 88. El método de la Reivindicación 77 en donde dicho anticuerpo se produce en células CHO. 89. El método de la Reivindicación 77, en donde dicho tumor se expone además al tratamiento por radiación o a un agente quimioterapéutico . 90. El método de la Reivindicación 77, en donde dicho tumor es un tumor de mama, un tumor colorrectal, un tumor de pulmón, un tumor de ovario, un tumor del sistema nervioso central, un tumor del hígado, un tumor de vejiga, un tumor pancreático o un tumor cervical . 91. El método de la Reivindicación 77, en donde dicha proteína se expresa más abundantemente por las células cancerosas de dicho tumor en comparación con una célula normal del mismo origen de tejido. 92 El método de la Reivindicación 77, en donde dicha proteína tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio - - extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) . 93. Un método para determinar la presencia de una proteína en una muestra sospechosa de contener dicha proteína, en donde dicha proteína tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos para: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17- - - 32) , con su péptido de señal asociado; (d) un domino extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) ; O (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) , comprendiendo dicho método exponer dicha muestra a un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica que se enlaza a dicha proteina y determinar el enlace de dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica a dicha proteina en dicha muestra, en donde el enlace del anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica a dicha proteína es indicativo de la presencia de dicha proteina en dicha muestra. 94. El método de la Reivindicación 93, en donde dicha muestra comprende una célula sospechosa de expresar dicha proteína. 95. El método de la Reivindicación 94, en donde dicha célula es una célula cancerosa. 96. El método de la Reivindicación 93, en donde dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se marca de manera detectable . - - 97. El método de la reivinidicación 93, en donde dicha proteina tiene : (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), con su secuencia de péptido de señal asociada,- (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) . 98. Un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, comprendiendo dicho método determinar el nivel de expresión de un gen que codifica una proteína que - - tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos para : (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , con su péptido de señal asociado; (d) un domino extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS : 17-32) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) ; O (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16), en una muestra de prueba de las células del tejido obtenidas a partir de dicho mamífero y en una muestra de control de células normales conocidas del mismo origen de tejido, en donde un mayor nivel de expresión de dicha proteína en la muestra de prueba, en comparación a la muestra de control, es indicativo de la presencia del tumor en el - - mamífero a partir del cual se obtuvo la muestra de prueba. 99. El método de la Reivindicación 98, en donde la etapa de determinar el nivel de expresión de un gen que codifica dicha proteína comprende emplear un oligonucleótido en una hibridación in situ o análisis RT-PCR. 100. El método de la Reivindicación 98, en donde la etapa de determinar el nivel de expresión de un gen que codifica dicha proteína comprende emplear un anticuerpo en un análisis inmunohistoquímico o de inmunotransferencia Western. 101. El método de la Reivindicación 98, en donde dicha proteína tiene : (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la - - secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud total de la secuencia' de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) . 102. Un método para diagnosticar la presencia de un tumor en un mamífero, comprendiendo dicho método poner en contacto una muestra de prueba de las células de tejido obtenidas a partir de dicho mamífero con un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica que se enlaza a una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos para: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17- 32) , con su péptido de señal asociado; (d) un domino extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de - - nucleotidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS : 1-16) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleotidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS : 1-16) y detectar la formación de un complejo entre dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica y dicha proteína en la muestra de prueba, en donde la formación de un complejo es indicativa de la presencia de un tumor en dicho mamífero. 103. El método de la Reivindicación 102, en donde dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se marca de manera detectable. 104. El método de la Reivindicación 102 en donde dicha muestra de prueba de las células de tejido se obtiene de un individuo que se sospecha de tener un tumor canceroso. 105. El método de la Reivindicación 102, en donde dicha proteína tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), con su secuencia de - - péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS : 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS : 1-16); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) . 106. Un método para tratar o evitar un trastorno proliferativo celular asociado con la expresión o actividad incrementada de una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos para: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , con su péptido de señal asociado; (d) un domino extracelular del polipéptido - - mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS : 1-16) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) , comprendiendo dicho método administrar a un sujeto con la necesidad de dicho tratamiento una cantidad efectiva de un antagonista de dicha proteína, tratando o evitando por lo tanto de manera efectiva dicho trastorno proliferativo celula . 107. El método de la Reivindicación 106 en donde dicho trastorno proliferativo celular es cáncer. 108. El método de la Reivindicación 106, en donde dicho antagonista es un anticuerpo del polipéptido anti-TAT oligopéptido de enlace TAT, molécula orgánica de enlace TAT u oligonucleótido de anti-sentido . 109. Un método para enlazar un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica a una célula que expresa una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos para : (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); - - (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17- 32) , con su péptido de señal asociado; (d) un domino extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) ; O (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) , comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica que se enlaza a dicha proteína y que permite que ocurra el enlace del anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica a dicha proteína, enlazando así dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica a dicha célula. 110. El método de la Reivindicación 109, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 111. El método de la Reivindicación 109 en donde dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. - - 112. El método de la Reivindicación 109, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 113. El método de la Reivindicación 109 en donde dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento. 114. El método de la Reivindicación 109 en donde dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente citotoxico. 115. El método de la Reivindicación 114, en donde dicho agente citotoxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolxticas . 116. El método de la Reivindicación 114, en donde el agente citotoxico es una toxina. 117. El método de la Reivindicación 116, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maytansinoide y calicheamicina. 118. El método de la Reivindicación 116, en donde la toxina es un maytansinoide. 119. El método de la Reivindicación 109 en donde dicho anticuerpo se produce en bacterias. 120. El método de la Reivindicación 109 en donde dicho anticuerpo se produce en células CHO. 121. El método de la Reivindicación 109, en donde dicha célula es una célula cancerosa. - - 122. El método de la Reivindicación 121, en donde dicha célula cancerosa se expone además al tratamiento por radiación o a un agente guimioterapéutico . 123. El método de la Reivindicación 121, en donde dicha célula cancerosa se selecciona del grupo que consiste de una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer colorrectal, una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer del sistema nervioso central, una célula de cáncer del hígado, una célula de cáncer de vejiga, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer cervical, una célula de melanoma y una célula de leucemia. 124. El método de la Reivindicación 123, en donde dicha proteína se expresa más abundantemente por dicha célula cancerosa en comparación a una célula normal del mismo origen de tej ido . 125. El método de la Reivindicación 109 que provoca la muerte de dicha célula. 126. El uso de un ácido nucleico como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 30 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección diagnóstica de un cáncer. 127. El uso de un ácido nucleico como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 30 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. - - 128. El uso de un ácido nucleico como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o 30 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular. 129. El uso de un vector de expresión como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 o 31 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección diagnóstica de un cáncer. 130. El uso de un vector de expresión como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 o 31 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 131. El uso de un vector de expresión como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 o 31 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular. 132. El uso de una célula huésped como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 32 o 33 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección diagnóstica de un cáncer. 133. El uso de una célula huésped como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 32 o 33 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 134. El uso de una célula huésped como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 32 o 33 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o - - prevención de un trastorno proliferativo celular. 135. El uso de un polipéptido como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección diagnóstica de un cáncer. 136. El uso de un polipéptido como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 137. El uso de un polipéptido como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular. 138. El uso de un anticuerpo como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 29 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección diagnóstica de un cáncer. 139. El uso de un anticuerpo como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 29 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 140. El uso de un anticuerpo como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 29 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular. 141. El uso de un oligopéptido como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 35 a 44 en la - - preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección diagnóstica de un cáncer. 142. El uso de un oligopéptido como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 35 a 44 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 143. El uso de un oligopéptido como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 35 a 44 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular. 14 . El uso de una molécula orgánica de enlace TAT como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 45 a 54 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección diagnóstica de un cáncer. 145. El uso de una molécula orgánica de enlace TAT como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 45 a 54 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 146. El uso de una molécula orgánica de enlace ??? como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 45 a 54 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular. 147. El uso de una composición de materia como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 55 o 56 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección diagnóstica de un cáncer. 148. El uso de una composición de materia como se - - reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 55 o 56 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 149. El uso de una composición de materia como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 55 o 56 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular. 150. El uso de un artículo de manufactura como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 57 o 58 en la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o detección diagnóstica de un cáncer. 151. El uso de un articulo de manufactura como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 57 o 58 en la preparación de un medicamento para tratar un tumor. 152. El uso de un artículo de manufactura como se reivindicó en cualquiera de las reivindicaciones 57 o 58 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno proliferativo celular. 153. Un método para inhibir el crecimiento de una célula, en donde el crecimiento de dicha célula es al menos en parte dependiente de un efecto de aumento de potencia del crecimiento de una proteína que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos para : (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las - - Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , con su péptido de señal asociado; (d) un domino extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleotidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS : 1-16) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleotidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) , comprendiendo dicho método poner en contacto dicha proteína con un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica que se enlaza a dicha proteína, inhibiendo por lo tanto el crecimiento de dicha célula. 154. El método de la Reivindicación 153, en donde dicha célula es una célula cancerosa. 155. El método de la Reivindicación 153 en donde dicha protelna se expresa por dicha célula. 156. El método de la Reivindicación 153 en donde el enlace de dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica a dicha protelna antagoniza una actividad de aumento de - - potencia del crecimiento celular de dicha protexna. 157. El método de la Reivindicación 153 en donde el enlace de dicho anticuerpo oligopeptido o molécula orgánica a dicha proteína induce la muerte de dicha célula. 158. El método de la Reivindicación 153 en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 159. El método de la Reivindicación 153 en donde dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 160. El método de la Reivindicación 153 en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 161. El método de la Reivindicación 153 en donde dicho anticuerpo oligopeptido o molécula orgánica se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento . 162. El método de la Reivindicación 153 en donde dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente citotóxico. 163. El método de la Reivindicación 162, en donde dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 164. El método de la Reivindicación 162, en donde el agente citotóxico es una toxina. 165. El método de la Reivindicación 164, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maytansinoide y calicheamicina. - - 166. El método de la Reivindicación 164, en donde la toxina es un maytansi oide . 167. El método de la Reivindicación 153 en donde dicho anticuerpo se produce en bacterias . 168. El método de la Reivindicación 153 en donde dicho anticuerpo se produce en células CHO. 169. El método de la Reivindicación 153, en donde dicha proteina tiene : (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de peptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), con su secuencia de peptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de peptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la - - región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleotxdos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS : 1-16) . 170. Un método para tratar terapéuticamente un tumor en un mamífero, en donde el crecimiento de dicho tumor es de al menos en parte dependiente de un efecto de aumento de potencia del crecimiento de una proteina que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos para: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17- 32) , con su péptido de señal asociado; (d) un domino extracelular del polipéptido mostrado en- cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) , que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) ; o (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) - - comprendiendo dicho método poner en contacto dicha proteína con un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica que se enlaza a dicha proteína tratando por lo tanto de manera efectiva dicho tumor. 171. El método de la Reivindicación 170, en donde dicha proteína se expresa por las células de dicho tumor. 172. El método de la Reivindicación 170, en donde el enlace de dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica a dicha proteína antagoniza una actividad de aumento de potencia del crecimiento celular de dicha proteína. 173. El método de la Reivindicación 170, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . 17 . El método de la Reivindicación 170 en donde dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 175. El método de la Reivindicación 170 en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico o humanizado. 176. El método de la Reivindicación 170 en donde dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento. 177. El método de la Reivindicación 170 en donde dicho anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se conjuga a un agente citotóxico. 178. El método de la Reivindicación 177, en donde dicho agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 179. El método de la Reivindicación 177, en donde el agente citotóxico es una toxina. 180. El método de la Reivindicación 179, en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maytansinoide y calicheamicina. 181. El método de la Reivindicación 179, en donde la toxina es un maytansinoide. 182. El método de la Reivindicación 170 en donde dicho anticuerpo se produce en bacterias. 183. El método de la Reivindicación 170 en donde dicho anticuerpo se produce en células CHO. 184. El método de la Reivindicación 170, en donde dicha proteína tiene : (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), con su secuencia de péptido de señal asociada; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las - - Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32), que carece de su secuencia de péptido de señal asociada; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) . Aún las modalidades adicionales de la presente invención serán evidentes para el técnico experto al leer la presente especificación. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:l) de un ADNc TAT293, en donde la SEQ ID N0:1 es un clon designado en la presente como "DNA293550" . La Figura 2 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 2) de un ADNc TAT294 , en donde la SEQ ID NO: 2 es un clon designado en la presente como "DNA150813" . La Figura 3 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) de un ADNc TAT295, en donde la SEQ ID NO: 3 es un clon designado en la presente como "DNA225785" . La Figura 4 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: ) de un ADNc TAT296, en donde la SEQ ID NO: 4 es un clon designado en la presente como nDNA226313" .
- - La Figura 5 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 5) de un ADNc TAT297, en donde la SEQ ID NO : 5 es un clon designado en la presente como "DNA103365" . La Figura 6 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 6) de un ADNc TAT298, en donde la SEQ ID NO: 6 es un clon designado en la presente como "DNA88158". La Figura 7 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 7) de un ADNc TAT347, en donde la SEQ ID NO: 7 es un clon designado en la presente como "DNA225800" . La Figura 8 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 8) de un ADNc TAT299, en donde la SEQ ID NO: 9 es un clon designado en la presente como "DNA103386". La Figura 9 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 9) de un ADNc TAT351, en donde la SEQ ID NO: 9 es un clon designado en la presente como "DNA273438". La Figura 10 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:10) de un ADNc TAT300, en donde la SEQ ID NO:10 es un clon designado en la presente como "DNA225865" . La Figura 11 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 11) de un ADNc TAT301, en donde la SEQ ID NO: 11 es un clon designado en la presente como "DNA196665" . La Figura 12 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 12) de un ADNc TAT352, en donde la SEQ ID NO : 12 es un clon designado en la presente como "DNA287183". Las Figuras 13A-B muestran una secuencia de - - nucleótidos (SEQ ID NO: 13) de un ADNc TAT302, en donde la SEQ ID NO: 13 es un clon designado en la presente como "DNA226403" . La Figura 14 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 14) de un ADNc TAT303, en donde la SEQ ID NO: 14 es un clon designado en la presente como "DNA73736". La Figura 15 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 15) de un ADNc TAT304, en donde la SEQ ID NO: 15 es un clon designado en la presente como "DNA299884" . La Figura 16 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 16) de un ADNc TAT305, en donde la SEQ ID NO: 16 es un clon designado en la presente como "DNA299885" . La Figura 17 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17) derivada de la secuencia de codificación de la SEQ ID NO:l mostrada en la Figura 1. La Figura 18 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 18) derivada de la secuencia de codificación de la SEQ ID NO : 2 mostrada en la Figura 2. La Figura 19 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 19) derivada de la secuencia de codificación de la SEQ ID NO:3 mostrada en la Figura 3. La Figura 20 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 20) derivada de la secuencia de codificación de la SEQ ID NO : 4 mostrada en la Figura 4. La Figura 21 muestra la secuencia de aminoácidos - - (SEQ ID NO:21) derivada de la secuencia de codificación de la SEQ ID NO:5 mostrada en la Figura 5. La Figura 22 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 22) derivada de la secuencia de codificación de la SEQ ID NO: 6 mostrada en la Figura 6. La Figura 23 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 23) derivada de la secuencia de codificación de la SEQ ID NO: mostrada en la Figura 7. La Figura 24 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 24) derivada de la secuencia de codificación de la SEQ ID NO: 8 mostrada en la Figura 8. La Figura 25 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 25) derivada de la secuencia de codificación de la SEQ ID NO : 9 mostrada en la Figura 9. La Figura 26 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 26) derivada de la secuencia de codificación de la SEQ ID NO: 10 mostrada en la Figura 10. La Figura 27 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 27) derivada de la secuencia de codificación de la SEQ ID NO: 11 mostrada en la Figura 11. La Figura 28 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 28) derivada de la secuencia de codificación de la SEQ ID NO: 12 mostrada en la Figura 12. La Figura 29 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 29) derivada de la secuencia de codificación de la - SEQ ID NO: 13 mostrada en las Figuras 13A-B. La Figura 30 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 30) derivada de la secuencia de codificación de la SEQ ID NO: 14 mostrada en la Figura 14. La Figura 31 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:31) derivada de la secuencia de codificación de la SEQ ID NO: 15 mostrada en la Figura 15. La Figura 32 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 32) derivada de la secuencia de codificación de la SEQ ID NO: 16 mostrada en la Figura 16. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS I. Definiciones Los términos "polipéptido TAT" y "TAT" como se utilizan en la presente y cuando se siguen inmediatamente por una designación numérica, se referieren a varios polipéptidos , en donde la designación completa (i.e., TAT/número) se refiere a las secuencias de polipéptido específicas como se describe en la presente. Los términos "polipéptido TAT/número" y "TAT/número" en donde el término "número" se proporciona como una designación numérica actual como se utiliza en la presente incluye polipéptidos de secuencia natural, variantes de polipéptido y fragmentos de polipéptidos de secuencia natural y variantes de polipéptido (que se definen adicionalmente en la presente) . Los polipéptidos TAT descritos en la presente pueden aislarse a ¦÷ - partir de una variedad de fuentes, tales como a partir de tipos de tejido humano o a partir de otras fuentes o preparados mediante métodos recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido TAT" se refiere a cada polipéptido individual TAT/número descrito en la presente. Todas las exposiciones en esta especificación que se refieren al "polipéptido TAT" se refieren a cada uno de los polipéptidos individualmente así como en conjunto. Por ejemplo, las descripciones de preparación, purificación, derivación, formación de anticuerpos para o contra, formación de oligopéptidos de enlace TAT para o contra, formación de moléculas orgánicas de enlace TAT para o contra, administración, composiciones que contienen, el tratamiento de una enfermedad con, etc., pertenecen individualmente a cada polipéptido de la invención. El término "polipéptido TAT" también incluye las variantes de los polipéptidos TAT/número descritos en la presente. Un "polipéptido TAT de secuencia natural" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido TAT corresponidente derivado a partir de la naturaleza. Tales polipéptidos TAT de secuencia natural pueden aislarse a partir de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos . El término "polipéptido TAT de secuencia natural" incluye específicamente formas truncadas o secretadas que ocurren de manera natural del polipéptido TAT especifico (e.g., una secuencia de domino extracelular) , formas de variante que ocurren de manera natural (e.g., formas alternativamente empalmadas) y variantes alélicas que ocurren de manera natural del polipéptido. En ciertas modalidades de la invención, los polipéptidos TAT de secuencia natural descritos en la presente son polipéptidos de secuencia natural maduros o de longitud total que comprenden las secuencias de aminoácidos de longitud total mostradas en las figuras acompañantes . Los codones de inicio y de terminación (si se indican) se muestran en negritas y subrayadas en las figuras . Los residuos de ácido nucleico indicados como nN" en las figuras acompañantes son cualquier residuo de ácido nucleico. Sin embargo, aunque los polipéptidos TAT descritos en las figuras acompañantes se muestran que inician con residuos de metionina designados en la presente como posición 1 de aminoácido en las figuras, es concebible y posible que puedan emplearse otros residuos de metionina ubicados ya sea corriente arriba o corriente abajo a partir de la posición 1 de aminoácidos en las figuras como el residuo de aminoácido de inicio para los polipéptidos TAT. El "dominio extracelular" o "ECD" del polipéptido TAT se refiere a una forma del polipéptido TAT que se encuentra esencialmente libre de los dominios de transmembrana y citoplásmico . Comúnmente, un ECD de - - polipéptido AT tendrá menos de 1% de tales dominios de transmembrana y/o citoplásmico y preferentemente, tendrá menos del 0.5% de tales dominios. Deberá entenderse que cualquier dominio de transmembrana identificado para los polipéptidos TAT de la presente invención se identifican acuerdo a los criterios rutinariamente empleados en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio de transmembrana pueden variar pero más probablemente por no mas de aproximadamente 5 aminoácidos en ya sea el extremo del dominio como se identificó inicialmente en la presente. Por lo tanto opcionalmente un dominio extracelular de un polipéptido TAT puede contener desde aproximadamente 5 o menos aminoácidos en cualquier lado del límite del dominio de transmembrana/ dominio extracelular como se identifica en los Ejemplos o la especificación y tales polipéptidos se contemplan por la presente invención con o sin el polipéptido de señal asociado y el ácido nucleico que los codifican. La ubicación aproximada de los "péptidos de señal" de los diversos polipéptidos TAT descritos en la presente puede mostrarse en la presente especificación y/o las figuras acompañantes. Sin embargo, se observa, que el límite C-terminal de un péptido de señal puede variar, pero más probablemente por no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier lado del límite C-terminal del péptido de señal - - como se identificó inicialmente en la presente, en donde el límite C-terminal del péptido de señal puede identi icarse de acuerdo a los criterios rutinarios empleados en la técnica para identificar ese tipo de elemento de secuencia de aminoácidos (e.g., Nielsen et al., Prot . Eng . 10:1-6 (1997) y von Heinje et al., Nucí. Acid. Res. 14:4683-4690 (1986)). Además, también debe reconocerse que, en algunos casos, el desdoblamiento de una secuencia de señal a partir de un polipéptido secretado no es totalmente uniforme, dando como resultado más de una especie secretada. Estos polipéptidos maduros, se contemplan por la presente invención en donde el péptido de señal se desdobla dentro de no mas de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier lado del límite C-terminal del péptido de señal como se identificó en la presente y los polinucleotidos que lo codifican. La "variante del polipéptido TAT" significa un polipéptido TAT, preferentemente un polipéptido TAT activo, como se define en la presente que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de polipéptido TAT de secuencia natural de longitud total como se describe en la presente, una secuencia de polipéptido TAT que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento de una - - secuencia de polipeptido TAT de longitud total como se describe en la presente (tal como la codificada por un ácido nucleico que representa solamente una porción de la secuencia de codificación completa para un polipeptido TAT de longitud total) . Tales variantes del polipeptido TAT incluyen, por ejemplo, los polipeptidos TAT en donde se agregan o suprimen uno o más residuos de aminoácidos, en la N- o C- terminal de la secuencia de aminoácidos natural de longitud total . Comúnmente, una variante del polipeptido TAT tendrá al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos para una secuencia de polipeptido TAT de secuencia natural de longitud total como se describe en la presente, una secuencia de polipeptido TAT que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipeptido TAT, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de polipéptido TAT de longitud total como se describe en la presente. Comúnmente, los polipeptidos de variante TAT son de al menos aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, - - 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos de longitud o más. Opcionalmente, los polipéptidos de variante TAT no tendrán más de una sustitución de aminoácidos conservadora en comparación a la secuencia de polipéptido TAT natural, alternativamente no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácido conservadoras en comparación a la secuencia de polipéptido TAT natural . El "porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de polipéptido TAT identificadas en la presente se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidato que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la secuencia de polipéptido TAT especifica, después de alinear las secuencias e introducir los espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar cualquiera de las sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para los propósitos de determinar el porcentaje de la identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse en varias formas que se encuentran dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, utilizando software de computadora públicamente disponible tal como software BLAST, BLAST-2 , ALIGN o Megalign - - (DNASTAR) . Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr el máximo alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para propósitos de la presente, los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2, en donde el código de la fuente completa para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 de abajo. El programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2 se autorizó por de Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 1 de abajo se registró con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los E.U., Washington D.C., 20559, en donde se registró bajo el Registro de Derechos de Autor de E.U. No. TXU510087. El programa ALIGN-2 se encuentra públicamente disponible a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede recopilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1 de abajo. El programa ALIGN-2 debe recopilarse para utilizarse en un sistema de operación UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones en donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencia de aminoácidos, el % de identidad - - de secuencia de aminoácidos de una secuencia A de aminoácidos dada para, con o contra una secuencia B de aminoácidos dada (que puede expresarse alternativamente como una secuencia A de aminoácidos dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos para, con o contra una secuencia B de aminoácidos dada) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácido marcados como equivalencias idénticas mediante el programa ALIGN-2 de alineamiento de secuencia en ese alineamiento del programa de A y B y en donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. Gomo ejemplos de los cálculos de % de identidad de secuencia de aminoácidos utilizando este método, las Tablas 2 y 3 demuestran cómo calcular el % de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos designada "Proteina de Comparación" para la secuencia de aminoácidos designada "TAT" , en donde "TAT" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido TAT hipotético de interés, la "Proteína de Comparación" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido contra el cual el polipéptido TAT de interés se - - compara y UX" , "Y" y "Z" cada uno representa diferentes residuos de aminoácido hipotéticos. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los % de los valores de identidad de secuencia de aminoácidos utilizados en la presente se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2. El "polinucleotido de variante TAT" o la "secuencia de ácido nucleico de variante TAT" se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido TAT, preferentemente un polipéptido TAT activo, como se define en la presente y que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia nucleótida que codifica una secuencia de polipéptido TAT de secuencia natural de longitud total como se describe en la presente, una secuencia de polipéptido TAT de secuencia natural de longitud total que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin el péptido de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido TAT de longitud total como se describe en la presente (tal como la codificada por un ácido nucleico que representa solamente una porción de la secuencia de codificación completa para un polipéptido TAT de longitud total) . Comúnmente, un polinucleotido de variante TAT tendrá - - al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptido TAT de secuencia natural de longitud total como se describe en la presente, una secuencia de polipéptido TAT de secuencia natural de longitud total que carece del péptido de señal como se describe en la presente, un dominio extracelular de un polipéptido TAT, con o sin la secuencia de señal, como se describe en la presente o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido TAT de longitud total como se describe en la presente. Las variantes no abarcan la secuencia de nucleótidos naturales . Comúnmente, los polipeptidos de variante TAT son de al menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, - - 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000 nucleótidos de longitud, en donde en este contexto el término "aproximadamente" se refiere a la longitud de la secuencia de nucleótidos referida más o menos el 10% de esa longitud referida. El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" con respecto a las secuencias de ácido nucleico de codificación TAT identificadas en la presente se define como el porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidato que son idénticos con los nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico TAT de interés, después de alinear las secuencias e introducir los espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. El alineamiento para los propósitos de determinar el porcentaje de la identidad de secuencia de ácido nucleico puede lograrse en varias formas que se encuentran dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, utilizando software de computadora públicamente disponible tal como software BLAST, BLAST-2 , ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Sin embargo, para propósitos de la presente, el % de los valores de identidad de secuencia de ácido nucleico se genera utilizando el programa ALIGN-2 de computadora de comparación de secuencia, en donde el código fuente completo para el - - programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 de abajo. El programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2 se autorizó por Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 1 de abajo se registró con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los E.U., Washington D.C., 20559, en donde se registró bajo el Registro de Derechos de Autor de E.U. No. TXU510087. El programa ALIGN-2 se encuentra públicamente disponible a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede recopilarse a partir del código fuente proporcionado en la Tabla 1 de abajo. El programa ALIGN-2 debe recopilarse para el uso en un sistema de operación UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones en donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencia de ácido nucleico, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia C de ácido nucleico dada para, con o contra una secuencia D de ácido nucleico dada (que puede expresarse alternativamente como una secuencia C de ácido nucleico dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de ácido nucleico para, con o contra una secuencia D de ácido nucleico dada) se calcula como sigue : 100 veces la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótidos marcados como - - equivalencias idénticas por el programa ALIGN-2 de alineamiento de secuencia en ese alineamiento del programa de C y D y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de C a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácido nucleico de D a C. Como ejemplos de los cálculos de % de identidad de secuencia de ácido nucleico, las Tablas 4 y 5 demuestran cómo calcular el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico designada "DNA de Comparación" para la secuencia de ácido nucleico designada "TAT-ADN" , en donde "TAT-ADN" representa una secuencia de interés hipotética del ácido nucleico que codifica TAT, el "DNA de Comparación" representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico contra el cual la molécula de ácido nucleico "TAT-ADN" de interés se compara y "N" , "L" y "V" cada uno representa diferentes nucleótidos hipotéticos. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los % de los valores de identidad de secuencia de ácido nucleico utilizados en la presente se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2. En otras modalidades, los polinucleótidos de la - - variante AT son moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido TAT y que son capaces de hibridizar, preferentemente bajo hibridación y condiciones de lavado rigurosas, a las secuencias nucleótidas que codifican un polipéptido TAT de longitud total como se describe en la presente. Los polipéptidos de variante TAT pueden ser aquellos que se codifican por un polinucleótido de variante TAT. El término "región de codificación de longitud total" cuando se utiliza con referencia a un ácido nucleico que codifica un polipéptido TAT se refiere a la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido TAT de longitud total de la invención (que con frecuencia se muestra entre los codones de inicio y de terminación, inclusive de los mismos, en las figuras acompañantes) . El término "región de codificación de longitud total" cuando se utiliza en referencia a un ácido nucleico depositado ATCC se refiere a la porción que codifica al polipéptido TAT del ADNc que se inserta en el vector depositado con el ATCC (que con frecuencia se muestra entre los codones de inicio y de terminación, inclusive en los mismos, en las figuras acompañantes) . "Aislado" cuando se utiliza para describir los diversos polipéptidos TAT descritos en la presente, se refiere al polipéptido que se ha identificado y separado y/o - - recuperado de un componente de su ambiente natural . Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que pueden interferir típicamente con el diagnóstico o usos terapéuticos para el polipeptido y puede incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En las modalidades preferidas, el polipeptido se purificará (1) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratorio o (2) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones sin reducción o de reducción utilizando azul de Coomassie o preferentemente, tintura de plata. El polipeptido aislado incluye el polipeptido in situ dentro de las células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del polipéptido TAT no estará presente. Sin embargo, comúnmente, el polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. Un ácido nucleico que codifica al polipéptido TAT "aislado" u otro ácido nucleico que codifica al polipéptido es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa a partir de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con al cual se asocia comúnmente en la fuente natural del ácido nucleico que codifica al polipéptido. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica al polipéptido es diferente en la forma o colocación en la cual - - se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican al polipeptido se distinguen de la molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido específico ya que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido aislado incluye moléculas de ácido nucleico que codifican al polipéptido contenidas en las células que comúnmente expresan el polipéptido en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una ubicación cromosomal diferente al de las células naturales. El término "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operablemente enlazada en un organismo huésped particular. Por ejemplo, las secuencias de control que son adecuadas para los procariotos, incluyen un promotor opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosoma. Las células eucarióticas se conocen para utilizar promotores, señales de poliadenilación y mej oradores. El ácido nucleico se "enlaza operablemente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o guía secretora se enlaza operablemente al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o me orador se - - enlaza operablemente a una secuencia de codificación si este afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma se enlaza operablemente a una secuencia de codificación si este se coloca a fin de facilitar la traducción. Generalmente, "enlazado operablemente" significa que las secuencias de ADN que se enlazan son contiguas y en el caso de una guía secretora, contiguas y en la fase de lectura. Sin embargo, los mej oradores no tienen que ser contiguos . El enlace se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción convenientes . Si tales sitios no existen, se utilizan los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional . La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación se determina fácilmente por alguien de experiencia ordinaria en la técnica y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas mayores para hibridarse adecuadamente, mientras que se necesitan sondas mas cortas a temperaturas inferiores. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para re-hibridarse cuando los filamentos complementarios se encuentran presentes en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Tanto más alto sea el grado de la homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridable, más alta será la temperatura relativa que pueda utilizarse. Como resultado, las temperaturas relativas mayores tenderían a hacer mas rigurosas las condiciones de reacción, mientras que las temperaturas inferiores las hacen menores . Para detalles adicionales y explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, (Protocolos Actuales en Biología Molecular) , Wiley Interscience Publishers, (1995) . Las "condiciones de rigurosidad" o "condiciones de alta rigurosidad" como se define en la presente pueden identificarse por aquellos que: (1) emplean baja rigurosidad iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo de coluro de sodio 0.015 M/ citrato de sodio 0.0015 M/ dodecil sulfato de sodio 0.1% a 50°C; (2) emplean durante la hibridación un agente de desnaturalización, tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con 0.1% de albúmina de suero bovino/Ficoll al 0.1%/polivinilpirrolidona al 0.1%/amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) la hibridación durante la noche en una solución que emplea 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml) , SDS al 0.1% y sulfato de dextran - - al 10% a 42 °C, con un lavado de 10 minutos a 42 °C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) seguido por un lavado de alta rigurosidad de 10 minutos consistiendo de 0.1 x SSC que contiene EDTA a 55 °C. Las "condiciones moderadamente rigurosas" pueden identificarse como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Clonación Molecular: un Manual de Laboratorio) , New York: Cold Spring Harbor Press, 1989 e incluye el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (e.g., temperatura, resistencia iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextran al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cortado desnaturalizado, seguido por el lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50 °C. El técnico experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, la resistencia iónica, etc., a medida que sea necesario para ajustar los factores tal como la longitud de la sonda y lo similar. El término "epítope marcado" cuando se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido TAT o anticuerpo anti-TAT fusionado - - a un "polipéptido marcador" . El polipéptido marcador tiene suficientes residuos para proporcionar un epítope contra el cual puede elaborarse un anticuerpo, encontrándose aún suficientemente corto de tal forma que no interfiere con la actividad del polipéptido al cual se fusiona. El polipéptido marcador preferentemente también es claramente único de manera que el anticuerpo no reacciona sustancialmente de manera cruzada con otros epítopes . Los polipéptidos marcadores adecuados generalmente tienen al menos seis residuos de aminoácido y usualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácido (preferentemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácido) . "Activo" o "actividad" para los propósitos de la presente se refiere a la(s) forma (s) de un polipéptido TAT el cual retiene una actividad biológica y/o inmunológica de un TAT nativo o que ocurre de manera natural, en donde la actividad "biológica" se refiere a una función biológica (ya sea inhibidora o estimulatoria) causada por un TAT natural o que ocurre de manera natural diferente a la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico poseído por un TAT natural o que ocurre de manera natural y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico poseído por un TAT natural o que ocurre de manera natural .
El término "antagonista" se utiliza en el amplio sentido e incluye cualquier molécula que bloquea, inhibe o neutraliza parcial o completamente una actividad biológica de un polipéptido TAT natural descrito en la presente. En una forma similar, el término "agonista" se utiliza en el más amplio sentido e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica de un polipéptido TAT natural descrito en la presente. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas especí icamente incluyen anticuerpos o fragmentos de anticuerpos agonistas o antagonistas, fragmentos o variantes de secuencia de aminoácidos de polipéptidos TAT naturales, péptidos oligonucleótidos de antisentido, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Los métodos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido TAT pueden comprender poner en contacto un polipéptido TAT con una molécula agonista o antagonista candidato y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido TAT. "Tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en donde el objeto es evitar o retrasar (disminuir) la condición o trastorno patológico enfocado . Los que necesitan del tratamiento incluyen aquellos que aún se encuentran con el trastorno así como aquellos propensos de tener el trastorno o aquellos en - - quienes el trastorno se puede evitar. Un sujeto o mamífero se "trata" exitosamente para un cáncer que expresa el polipéptido TAT si, después de recibir una cantidad terapéutica de un anticuerpo anti-TAT oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT de acuerdo con los métodos de la presente invención, el paciente muestra la reducción observable y/o medible en o la ausencia de uno o más de los siguientes : la reducción en el número de células cancerosas o la ausencia de las células cancerosas; la reducción en el tamaño del tumor; la inhibición (i.e., disminución hasta cierto grado y preferentemente la detención) de la infiltración de células cancerosas hacia los órganos periféricos incluyendo la difusión del cáncer en el tejido blando y hueso; la inhibición (i.e., disminución hasta cierto grado y preferentemente la detención) de la metástasis de tumor; la inhibición, hasta cierto grado, del crecimiento del tumor; y/o el alivio, hasta cierto grado de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; morbilidad y mortalidad reducida y mejoramiento en la calidad de vida. Hasta el grado en que el anticuerpo anti-TAT o el oligopéptido de enlace TAT puede evitar el crecimiento y/o la eliminación · de las células cancerosas existentes, pueden ser citostáticos y/o citotóxicos . La reducción de estos signos o síntomas puede también sentirse por el paciente. Los parámetros anteriores para valorar el - 9 - tratamiento exitoso y mejoramiento en la enfermedad son fácilmente medibles mediante procedimientos de rutina familiares para un médico. Para la terapia del cáncer, puede medirse la eficacia, por ejemplo, al valorar el tiempo de la progresión de la enfermedad (TTP) y/o determinar la tasa de respuesta (RR) . La metástasis puede determinarse mediante pruebas de estadificación y mediante escaneo del hueso y pruebas para el nivel de calcio y otras enzimas para determinar la difusión hacia el hueso. Los escaneos CT también pueden hacerse para buscar la difusión hacia la pelvis y nodos linfáticos en el área. Los rayos X de tórax y mediciones de los niveles de enzima del hígado por métodos conocidos se utilizan para buscar la metástasis hacia los pulmones e hígado respectivamente . Otros métodos de rutina para monitorear la enfermedad incluyen ultrasonografla transrectal (TRUS) y biopsia por inyección transrectal (TR B) . Para el cáncer de vejiga, que es un cáncer más localizado, los métodos para determinar el progreso de la enfermedad incluyen la evaluación citológica urinaria mediante cistoscopia, el monitoreo de la presencia de sangre en la orina, visualización del tracto urotelial mediante sonografía o un pielograma intravenoso, tomografía computarizada (CT) e imagen de resonancia magnética (MRI) . La presencia de metástasis distante puede valorarse por el CT - - del abdomen, los rayos X de tórax o imagen de radionúclido del esqueleto. La administración "crónica" se refiere a la administración del (de los) agente (s) en un modo continuo como opuesto a un modo agudo, a fin de mantener el efecto terapéutico inicial (actividad) por un periodo extendido. La administración "intermitente" es el tratamiento que no se hace consecutivamente sin interrupción, sino más bien es de naturaleza cíclica. "Mamífero" para propósitos del tratamiento de, aliviar los síntomas de o el diagnóstico de un cáncer se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, de entretenimiento o mascotas, tales como perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferentemente, el mamífero es humano. La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden. Los "vehículos" como se utiliza en la presente incluyen vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o el mamífero que se está exponiendo a estos en las dosis y concentraciones empleadas. Con frecuencia el vehículo fisiológicamente aceptable es una solución acuosa amortiguada del pH. Ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; los antioxidantes incluyen ácido ascórbico; el polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; las proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona,- los aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; los monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones que forman sales tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN®, polietilen glicol (PEG) y PLURONICS®. Por "fase sólida" o "soporte sólido" se refiere a una matriz no acuosa a la cual un anticuerpo oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT de la presente invención puede adherirse o unirse. Ejemplos de fases sólidas abarcados en la presente incluyen aquellas parcial o totalmente formadas de cristales (e.g., cristal poroso controlado), polisacáridos {e.g., agarosa) , poliacrilamidas , poliestireno, polivinil alcohol y siliconas. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender la cavidad de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación {e.g., una columna de cromatografía de afinidad) . Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas separadas, tal como aquella descrita en la Patente de E.U. No. 4,275,149. Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactantes que es útil para el suministro de una droga (tal como un polipéptido TAT, un anticuerpo del mismo o un oligopéptido de enlace TAT) a un mamífero. Los componentes del liposoma se ordenan comúnmente en una formación de bicapa similar al ordenamiento de lípidos de las membranas biológicas. Una molécula "pequeña" o molécula orgánica "pequeña" se define en la presente para tener un peso molecular por debajo de aproximadamente 500 Daltones. Una "cantidad efectiva" de un polipéptido, anticuerpo oligopéptido de enlace TAT, molécula orgánica de enlace TAT o un agonista o antagonista del mismo como se describe en la presente es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito específicamente establecido. Una "cantidad efectiva" puede determinarse empíricamente y en una forma rutinaria, en relación con el propósito establecido. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipéptido oligopéptido de enlace TAT, molécula orgánica de enlace TAT u otra droga efectiva para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva de la droga puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (i.e., disminución hasta cierto grado y preferentemente la detención) de la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (i.e., disminución hasta cierto grado y preferentemente la detención) de la metástasis de tumor; inhibir, hasta cierto grado, el crecimiento del tumor; y/o el alivio hasta cierto grado, de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Ver, la definición en la presente de "tratamiento" . Hasta el grado en que la droga pueda evitar el crecimiento y/o eliminar las células cancerosas existentes, puede ser citostática y/o citotóxica. Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT es una cantidad capaz de inhibir el crecimiento de una célula, especialmente tumor, e.g. , célula cancerosa ya sea in vitro o ín vivo. Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT para propósitos de inhibir el crecimiento de la célula neoplásica puede determinarse empíricamente y en una forma rutinaria. Una "cantidad citotóxica" de un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT es una cantidad capaz de provocar la - - destrucción de una célula, especialmente tumor, e.g. , célula cancerosa ya sea in vitro o in vivo. Una "cantidad citotóxica" de un anticuerpo anti-TAT, polipéptido TAT oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT para propósitos de inhibir el crecimiento de la célula neoplásica puede determinarse empíricamente y en una forma rutinaria. El término "anticuerpo" se utiliza en el más amplio sentido y específicamente cubre, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-TAT únicos (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes) , composiciones de anticuerpo anti-TAT con especificidad poliepitópica, anticuerpos policlonales, anticuerpos anti-TAT de cadena única y fragmentos de anticuerpos anti-TAT (ver abajo) mientras que exhiban la actividad biológica o inmunológica deseada. El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa intercambiablemente con anticuerpo en la presente. Un "anticuerpo aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural . Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que pueden interferir con el diagnóstico o usos terapéuticos para el anticuerpo y puede incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no porteináceos . En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más de 95% por - - peso de anticuerpo como se determinó por el método Lowry y más preferentemente más de 99% por peso (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratorio o (3) hasta la homogenidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o de no reducción utilizando azul de Coomassie o preferentemente, tintura de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, comúnmente, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificació . La unidad básica de anticuerpo de 4 cadenas es una glicoproteína heterotetramétrica compuesta de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un anticuerpo IgM consiste de 5 de las unidades básicas de heterotetrámero junto con un polipéptido adicional llamado cadena J y por lo tanto contiene 10 sitios de unión a antigeno, mientras que los anticuerpos IgA secretados pueden polimerizarse para formar ensamblajes polivalentes que comprenden 2-5 de las unidades básicas de 4 cadenas junto con la cadena J) . En el caso de IgGs, la unidad de 4 cadenas es generalmente de aproximadamente 150,000 daltones. Cada cadena L se enlaza a una cadena H mediante una unión covalente de disulfuro, mientras que las dos cadenas H se enlazan entre sí mediante una o más uniones de disulfuro dependiendo del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L también tienen puentes de disulfuro de intracadena espaciados de forma regular. Cada cadena H tiene en la N-terminal, un dominio variable (VH) seguido por tres dominios constantes (CH) para cada una de las cadenas ? ? ? cuatro dominios CH para los isotipos µ y e. Cada cadena L tiene en la N-terminal, un dominio variable (VL) seguido por un dominio constante (CL) en su otro extremo. La VL se alinea con la VH Y la CL se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1) . Los residuos de aminoácidos particulares se cree que forman una interferencia entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El par de una VH y una VL juntas forman un sitio de unión a antigeno único. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, ver e.g., Basic and Clinical Immunology (Inmunología Básica y Clínica) , 8a edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y Capitulo 6. La cadena L de cualquier especie de vertebrado puede asignarse a uno o dos tipos claramente distintos, llamados kappa y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes . Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH) , las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases de isotipos. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas pesadas designadas a, d, e, ? y µ respectivamente. Las clases ? y ce se dividen además en subclases en la base de diferencias relativamente pequeñas en la secuencia y función CH, e.g., los humanos expresan las siguientes subclases: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 , IgAl e IgA2. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren extensamente en la secuencia entre los anticuerpos. El dominio V media el enlace a antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular para su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de la extensión de 110 aminoácidos de los dominios variables. En su lugar, las regiones V consisten de extensiones relativamente invariantes llamadas regiones de estructura (FRs) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de extrema variabilidad llamadas "regiones hipervariables" que son cada una de 9-12 aminoácidos de largo. Los dominios variables de las cadenas naturales pesada y ligera cada uno comprende cuatro FRs, adoptando grandemente una configuración de lámina ß, conectada por tres regiones hipervariables, que forman circuitos de conexión y en algunos casos forman parte de la estructura de lámina ß. Las regiones hipervariables en cada cadena se sostienen juntas en proximidad cercana mediante las FRs y con las regiones hipervariables de la otra cadena contribuyen a la formación de los sitios de unión a antigeno de los anticuerpos (ver Kabat et al . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, (Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico) , 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no se involucran directamente en el enlace a anticuerpo hacia un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en el anticuerpo dependiente de la citotoxicidad celular (ADCC) . El término "región hipervariable" cuando se utiliza en la presente se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que es responsable del enlace antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos de aminoácido provenientes de una "región determinante de complementaridad" o "CDR" (e.g., alrededor de aproximadamente los residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL y alrededor de aproximadamente de 1-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la VH; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico) , 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos a partir de un circuito hipervariable" (e.g., residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en la VL y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en la VH; Chothia y Lesk J. Mol. Biol ¦ , 196:901-917 (1987) ) . El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, i.e., los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para mutaciones que ocurren posiblemente de manera natural que pueden presentarse en cantidades menores . Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, en contraste a las preparaciones del anticuerpo policlonal que incluye diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en el antígeno. En adición a su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que pueden sintetizarse sin contaminarse por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" no tiene que considerarse como requiriendo la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención pueden prepararse mediante la metodología de hibridoma descrita primero por Kohler et al . , Nature, 256:495 (1975) o puede hacerse utilizando métodos de ADN recombinantes en células bacteriales, animal eucariótico o planta (ver, e.g., la Patente de E.U. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden aislarse también a partir de bibliotecas de anticuerpos de fago utilizando las técnicas descritas por ejemplo en Clackson et al., Nature , 352:6217-3228 (1991) y Marks et al., J . Mol . Biol . , 222:581-597 (1991) . Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados a partir de especies particulares o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados a partir de otras especies o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo, así como los fragmentos de tales anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (ver la Patente de E.U. No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc . Nati . Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antigeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (e.g., Mono del Viejo Mundo, Simio, etc.) y secuencias de región constante humana. Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende un sitio de unión a antígeno asi como una CL y al menos dominios constante de cadena pesada, CH1, GH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constante de secuencia natural (e.g., dominios constantes de secuencia natural humana) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras . Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente el enlace a antigeno o la región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab' , F(ab')2 Y Fv; diabodies; anticuerpos lineales (ver la Patente de E.U. No. 5,641,870, Ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062
[1995]); moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo . La digestión de la papaina de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, llamados fragmentos "Fab" y un fragmento residual uFc" , una designación que refleja la capacidad para cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste de una cadena L completa junto con el dominio de región variable de la cadena H (VH) y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH1) - Cada fragmento Fab es monovalente con respecto al enlace a antígeno, i.e., tiene un solo sitio de unión a antígeno. El tratamiento de la pepsina de un anticuerpo produce un solo fragmento grande F(ab' )2 corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab de enlace de disulfuro que tienen actividad divalente de unión a antígeno y todavía es capáz del enlace cruzado al antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en que tienen unos cuantos residuos adicionales en la terminación carboxi del dominio CH1 incluyendo una o más cisteínas provenientes de la región de articulación del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab' en la cual el (los) residuo (s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo de tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se producían como pares de los fragmentos Fab' que tienen cisteínas de articulación entre ellos . También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo. El fragmento Fe comprende las porciones de la terminal carboxi de ambas cadenas H sostenidas juntas por disulfuros. Las funciones efectoras de los anticuerpos se determinan por las secuencias en la región Fe, cuya región es también la parte reconocida por los receptores Fe (FcR) encontrada en ciertos tipos de células. "Fv" es el fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y de unión a antígeno completo. Este fragmento consiste de un dímero de un dominio de región variable de una cadena pesada y/o una ligera en asociación estrecha no covalente. A partir de la dualidad funcional de estos dos dominios emanan seis circuitos hipervariables (3 circuitos cada uno a partir de la cadena H y L) que contribuyen a los residuos de aminoácidos para el enlace a antxgeno y confieren el enlace a antigeno específicamente al anticuerpo. Sin embargo, aún un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres CDRs específicos para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad inferior que el sitio de unión completo. El "Fv de cadena sencilla" también abreviado como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados en una cadena de polipéptido sencilla. Preferentemente, el polipéptido sFv además comprende un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite al sFv formar la estructura deseada para el enlace a antígeno. Para una revisión del sFv ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies (La Farmacología de Anticuerpos Monoclonales) vol . 113, Rosenburg and Moore eds . , Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) ; Borrebaeck 1995, infra. El término "diabodies" se refiere a los fragmentos pequeños de anticuerpo preparados mediante la construcción de fragmentos sFv (ver párrafo anterior) con enlazadores cortos (aproximadamente de 5-10 residuos) entre los dominios VH y VL de tal manera que se logran los pares de la inter-cadena pero no de la intra-cadena de los dominios V, dando como resultado un fragmento bivalente, i.e., un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diabodies biespecífieos son heterodimeros de dos fragmentos sFv de "cruzamiento" en los cuales los dominios VH y VL de los dos anticuerpos se encuentran presentes en diferentes cadenas de polipéptido. Los diabodies se describen más completamente en, por ejemplo, la EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos {&.g., roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada a partir del anticuerpo no humano. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) cuyos residuos provenientes de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos provenientes de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad del anticuerpo deseado. En algunos casos, los residuos de región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los circuitos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos de los FRs son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechman et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Un "anticuerpo dependiente de la especie" e.g., un anticuerpo IgE anti-humano de mamífero es un anticuerpo que tiene una afinidad de unión mas fuerte para un antígeno proveniente de una primera especie de mamífero que la que tiene para un homólogo de ese antígeno proveniente de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de la especie "enlazado específicamente" a un antígeno humano (i.e., tiene un valor de afinidad de unión (Kd) de no más de aproximadamente 1 x 10"7 , preferentemente no más de aproximadamente 1 x 10"8 y más preferentemente no más de aproximadamente 1 x 10"9 M) pero tiene una afinidad de unión para un homólogo del antígeno proveniente de una segunda especie de mamífero no humano que es de al menos aproximadamente 50 veces o al menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1000 veces, más débil que su afinidad de unión para el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de la especie puede ser de cualquiera de los diversos tipos de anticuerpos como se definió anteriormente, pero preferentemente es un anticuerpo humanizado o humano. Un "oligopeptido de enlace TAT" es un oligopeptido que se enlaza, preferentemente de manera específica, a un polipéptido TAT como se describe en la presente. Los oligopéptidos de enlace TAT pueden sintetizarse químicamente utilizando metodología de síntesis de oligopeptido conocida o pueden prepararse y purificarse utilizando tecnología recombinante . Los oligopéptidos de enlace TAT son usualmente de al menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 aminoácidos de longitud o más, en donde tales oligopéptidos como se describe en la presente son capaces de unirse, preferentemente de manera específica, a un polipéptido TAT. Los oligopéptidos de enlace TAT pueden identificarse sin experimentación excesiva utilizando técnicas bien conocidas. A este respecto, debe notarse que las técnicas para clasificar bibliotecas de oligopeptido para oligopéptidos que son capaces de unirse específicamente a un objetivo de polipéptido se conocen bien en la técnica (ver e.g., las Patentes de E.U. Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Las Publicaciones del PCT Nos. WO 84/03506 y la WO84/03564; Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:178-182 (1985); Geysen et al., en Synthetic Peptides as Antigens (Péptidos Sintéticos como Antígenos) , 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth. , 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol, 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al., (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B., et al., (1991) Biochemistry 30:10832; Claxon, T. et al., (1991) Nature, 352:624; Marks, J. D. et al., (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al., (1991) Proc. Na i. Acad. Sci. USA 88:8363 y Smith G. P. (1991) Current . Opin. Biotechnol . , 2:668). Una "molécula orgánica de enlace TAT" es una molécula orgánica diferente a un oligopéptido o anticuerpo como se define en la presente que se enlaza, preferentemente de manera específica, a un polipéptido TAT como se describe en la presente. Las moléculas orgánicas de enlace TAT pueden identificarse y sintetizarse químicamente utilizando metodología conocida (ver e.g., las Publicaciones del PCT Nos. WO00/00823 y la O00/39585) . Las moléculas orgánicas de enlace TAT usualmente son menores a aproximadamente 2000 daltones de tamaño, alternativamente menores a aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 daltones de tamaño, en donde tales moléculas orgánicas que son capaces de enlazarse, preferentemente de manera específica, a un polipéptido TAT como se describe en la presente pueden identificarse sin experimentación excesiva utilizando técnicas bien conocidas. A este respecto, debe notarse que las técnicas para clasificar bibliotecas de moléculas orgánicas para moléculas que son capaces de enlazarse a un objetivo de polipéptido se conocen bien en la técnica (ver e.g., las Publicaciones del PCT Nos. WO00/00823 y la WO00/39585) . Un anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica "que enlaza" un antígeno de interés, e.g., un objetivo de antígeno de polipéptido asociado a un tumor, es uno que se enlaza al antígeno con afinidad suficiente de tal forma que el anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica es útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico para enfocar una célula o tejido que expresa el antígeno y no reacciona significativamente de manera cruzada con otras protexnas . En tales modalidades, el grado de enlace del anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica a una proteína "no enfocada" será menor de aproximadamente 10% del enlace del anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica a su proteína objetivo particular como se determina por el análisis de selección de la célula activada por fluorescencia (FACS) o mediante radioinmunoprecipitación (RIA) . Con respecto al enlace de un anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica a una molécula objetivo, el término "enlace específico" o "específicamente enlazado a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítope en un objetivo de polipéptido particular se refiere al enlace que es mediblemente diferente de una interacción no específica. El enlace específico puede medirse, por ejemplo, al determinar el enlace de una molécula comparada con el enlace de una molécula control, que generalmente es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, el enlace específico puede determinarse mediante la competencia con una molécula control que es similar al objetivo, por ejemplo, un exceso de objetivo no etiquetado. En este caso, el enlace específico se indica si el enlace del objetivo etiquetado a una sonda se inhibe competitivamente mediante el exceso del objetivo no etiquetado. El término "unión específica" o "se enlaza específicamente a" o es "específico para" un polipeptido particular o un epítope en un objetivo de polipéptido particular como se utiliza en la presente puede exhibirse, por ejemplo, mediante una molécula que tiene un Kd para el objetivo de al menos aproximadamente 10"4 M, alternativamente al menos aproximadamente 10"5 M, alternativamente al menos aproximadamente 10"e M, alternativamente al menos aproximadamente 10"7 M, alternativamente al menos aproximadamente 10"8 M, alternativamente al menos aproximadamente 10"9 , alternativamente al menos aproximadamente 10-io M, al ernativamente al menos ap oximadamente lO"11 M, alternativamente al menos aproximadamente 10"12 o mayor . En una modalidad, el término "enlace especifico" se refiere al enlace en donde una molécula se enlaza a un polipéptido o epítope particular en un polipéptido particular sin enlazarse sustancialmente a cualquier otro polipéptido o epítope de polipéptido . Un anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica que "inhibe el crecimiento de las células de tumor que expresan un polipéptido TAT" o un anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica "inhibidora del crecimiento" es uno que da como resultado la inhibición del crecimiento medible de las células cancerosas que expresan o sobreexpresan al polipéptido TAT apropiado. El polipéptido TAT puede ser un polipéptido de transmembrana expresado en la superficie de una célula cancerosa o puede ser un polipéptido que se produce y secreta por una célula cancerosa. Los anticuerpos oligopéptidos u otras moléculas orgánicas anti-TAT inhibidores del crecimiento preferidos inhiben el crecimiento de las células de tumor que expresan TAT por más de 20%, preferentemente desde aproximadamente 20% hasta aproximadamente 50% y aún más preferentemente, por más de 50% {o.g., desde aproximadamente 50% hasta aproximadamente 100%) en comparación con el control apropiado, siendo el control típicamente células de tumor no tratadas con el anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica que se prueba. En una modalidad, la inhibición del crecimiento puede medirse a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.1 hasta 30 µg/ml o aproximadamente 0.5 nM hasta 200 nM en un cultivo celular, en donde la inhibición del crecimiento se determina de 1-10 dias después de la exposición de las células de tumor al anticuerpo. La inhibición del crecimiento de las células de tumor in vivo puede determinarse en varias formas tal como se describe en los Ejemplos Experimentales de la sección de abajo. El anticuerpo es inhibidor del crecimiento in vivo si la administración del anticuerpo anti-TAT a aproximadamente 1 |jg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal da como resultado la reducción en el tamaño del tumor o la proliferación celular del tumor dentro de aproximadamente 5 dias a 3 meses a partir de la primer administración del anticuerpo, preferentemente dentro de aproximadamente 5 hasta 30 días. Un anticuerpo oligiopétido u otra molécula orgánica que "induce la apoptosis" es el que induce la muerte celular programada como se determinó por el enlace de la anexina V, la fragmentación de ADN, disminución celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículos de membrana (llamados cuerpos apoptoticos) . La célula usualmente es la que sobreexpresa un polipéptido TAT. Preferentemente la célula es una célula tumoral, e.g., una célula de próstata, de mama ovario, estómago, endometrial, pulmón, riñon, colon, vejiga. Diversos métodos se encuentran disponibles para evaluar los eventos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, la transubicación de la fosfatidil serina (PS) puede medirse por el enlace de la anexina; la fragmentación del ADN puede evaluarse a través del escalonamiento de ADN; y la condensación nuclear/cromatina junto con la fragmentación de ADN puede evaluarse mediante cualquier incremento en las células hipodiploides . Preferentemente, el anticuerpo oligiopétido u otra molécula orgánica que incluye apoptosis es la que da como resultado aproximadamente 2 hasta 50 veces, preferentemente de aproximadamente 5 hasta 50 veces y más preferentemente de aproximadamente 10 hasta 50 veces, la inducción del enlace de la anexina relacionada con la célula - - no tratada en un ensayo de enlace de anexina. Las "funciones efectoras" del anticuerpo se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia natural o una región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo y varía con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras del anticuerpo incluyen: el enlace Clq y citotoxicidad dependiente del complemento; enlace del receptor Fe; citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; subregulación de los receptores de la superficie celular (e.g., receptor de la célula B) ; y la activación de las células B. La "citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual la Ig secretada enlazada en los receptores Fe (FcRs) presentes en ciertas células citotóxicas {e.g., células Eliminadoras Naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) permiten a estas células efectoras citotóxicas enlazarse específicamente a una célula objetivo que porta el antígeno y subsecuentemente eliminar la célula objetivo con las citotoxinas . Los anticuerpos "arman" las células citotóxicas y se requieren absolutamente para tal eliminación. Las células primarias para mediar las células ADCC, NK expresan solamente FcyRIII, mientras que los monocitos expresen FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión FcR en las células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetech y Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9:457-92 (1991) . Para valorar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede llevarse a cabo un ensayo ADCC in vit.ro, tal como aquel descrito en la Patente de E.U. No. 5,500,362 o la 5,821,337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células Eliminadoras Naturales (NK) . Alternativa o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede valorarse in vivo, e.g., en un modelo animal tal como el descrito por Clynes et al., (EUA) 95:652-656 (1998). El "receptor Fe" o "FcR" describe un receptor que se enlaza a la región Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es una secuencia natural FcR humana. Además, un FcR preferido es uno que se enlaza a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y alternativamente formas empalmadas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tiene secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos del mismo. El receptor de activación FcyRIIA contiene un motivo inmunoreceptor de activación en base a la tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición FcyRIIB contiene un motivo inmunoreceptor de inhibición en base a la tirosina (ITI ) en su dominio citoplásmico . (Ver revisión de M. in Daéron, Annu. Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)) . Los FcRs se resumieron en Ravetch y Kinet, Annu . Re . Immunol . 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) . Otros FcRs incluyendo aquellos a identificarse en el futuro, se encuentran incluidos por el término wFcR" en la presente. El término también incluye al receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternas a los fetos (Guyer et al., J . Immunol . 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) . Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y llevan a cabo funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan al menos FcyRIII y llevan a cabo la función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células eliminadoras naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; siendo preferidas las células PBMCs y NK. Las células efectoras pueden aislarse a partir de una fuente natural, e.gr. , a partir de la sangre. La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lísis de una célula objetivo en la presencia del complemento. La activación de la trayectoria - - clásica del complemento se inicia por el enlace del pirmer componente del sistema del complemento (Clq) hacia los anticuerpos (de la subclase apropiada) que se enlazan a su antígeno cognado. Para valorar la activación del complemento, puede llevarse a cabo un ensayo CDC, e.cr., como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202 :163 (1996) . Los términos "cáncer" y "canceroso" se refiere a o describe la condición fisiológica en los mamíferos que se caracteriza típicamente por el crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o malignidades linfoides . Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas (e.g., cáncer de células escamosas epiteliales) , cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso de pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de la glándula salival, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, - - cáncer de la tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma penial, melanoma, mieloma múltiple y cáncer de linfoma de la célula B, cerebro, así como cabeza y cuello y metástasis asociadas. Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a los trastornos que se asocian con algunos grados de proliferación celular anormal. En una modalidad, el trastorno proliferativo celular es cáncer. El "tumor" como se utiliza en la presente, se refiere a todos los crecimientos y proliferaciones celulares neoplásicos ya sea malignos o benignos y todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos. Un anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica que "induce la muerte celular" es uno que ocasiona que una célula viable se vuelva no viable. La célula es la que expresa un polipéptido TAT, preferentemente una célula que sobreexpresa un polipéptido TAT en comparación con una célula normal del mismo tipo de tejido. El polipéptido TAT puede ser un polipéptido de transmembrana expresado en la superficie de una célula cancerosa o puede ser un polipéptido que se produce y secreta por una célula cancerosa. Preferentemente, la célula es una célula cancerosa, e.g., una célula de mama ovario, estómago, endometrial, glándula salival, pulmón, riñon, colon, tiroide, pancreática o vejiga.
- - La muerte celular in vitro puede determinarse en la ausencia del complemento y las células efectoras inmunes para distinguir la muerte celular inducida por la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Así, el ensayo para la muerte celular puede llevarse a cabo utilizando suero inactivado por calor (i.e., en la ausencia del complemento) y en la ausencia de las células efectoras inmunes. Para determinar si el anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica es capaz de inducir la muerte celular, la pérdida de la integridad de la membrana como se evaluó por la absorción del yoduro de propidio (PI) , azul de tripano (ver Moore et al., Cytotechnology 17:1-11 (1995)) o 7AAD puede valorarse en relación a las células no tratadas. Los anticuerpos oligopéptidos u otras moléculas orgánicas preferidos que inducen la muerte celular son aquellos que inducen la absorción de PI en el ensayo de absorción PI en células BT474. Una "célula que expresa TAT" es una célula que expresa un polipéptido TAT endógeno o transfectado ya sea en la superficie celular o en una forma secretada. Un "cáncer que expresa TAT" es un cáncer que comprende células que tienen un polipéptido TAT presente en la superficie celular o que produce y secreta un polipéptido TAT. Un "cáncer que expresa TAT" opcionalmente produce suficientes niveles de - - polipéptidos TAT en la superficie de las células del mismo, de tal manera que el anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica anti-TAT puede enlazarse al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. En otra modalidad, un "cáncer que expresa TAT" opcionalmente produce y secreta suficientes niveles de polipeptido TAT, de tal manera que un anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica antagonista anti-TAT puede enlzarse al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer . Con respecto a lo anterior, el antagonista puede ser un oligonucleótido de antisentido que reduce, inhibe o evita la producción y secreción del polipéptido TAT secretado por las células de tumor. Un cáncer que "sobreexpresa" un polipéptido TAT es el que tiene niveles significativamente mayores del polipéptido TAT en la superficie celular del mismo o produce y secreta en comparación a una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Tal sobreexpresión puede causarse mediante la amplificación del gen o mediante la transcripción o traducción incrementada. La sobreexpresión del polipéptido TAT puede determinarse en un ensayo de diagnóstico o pronóstico al evaluar niveles incrementados de la proteína TAT presente en la superficie de una célula o secretarse por la célula {e.g., a través de un ensayo inmunohistoquímico utilizando anticuerpos anti-TAT preparados contra un polipéptido TAT aislado que puede prepararse utilizando tecnología de ADN recombinante a partir de un ácido nucleico aislado que codifica al polipeptido TAT; análisis FACS, etc.) . Alternativa o adicionalmente, se pueden medir los niveles de ácido nucleico que codifican al polipeptido TAT o ARNm en la célula, e.g., a través de la hibridación fluorescente in situ utilizando un ácido nucleico en base a la sonda correspondiente para un ácido nucleico que codifica TAT o el complemento del mismo; (FISH; ver W098/45479 publicada en Octubre, 1998) , las técnicas de inmunotransferencia Southern, Northern o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , tales como PCR cuantitativo de tiempo real (RT-PCR) . También se puede estudiar la sobreexpresión del polipeptido TAT al medir el antígeno vertido en un fluido biológico tal como suero, e.g., utilizando ensayos en base al anticuerpo (ver también e.g., la Patente de E.U. No. 4,933,294 expedida en Junio 12, 1990; WO91/05264 publicada en Abril 18, 1991; la Patente de E.U. 5,401,638 expedida en Marzo 28, 1995; y Sias et al., J. Immunol . Methods 132:73-80 (1990)). Aparte de los ensayos anteriores, varios ensayos in vivo se encuentran disponibles para el practicante experto. Por ejemplo, se pueden exponer células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo que se marca opcionalmente con un marcador detectable, e.g., un isótopo radioactivo y puede evaluarse el enlace del anticuerpo a las células en el paciente, e.g., mediante exploración externa para la radioactividad o mediante analizar una biopsia tomada del paciente previamente expuesto al anticuerpo. Como se utiliza en la presente, el término "inmunoadhesina" designa a las moléculas similares al anticuerpo que combinan la especificidad de enlace de una proteína heteróloga (una wadhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de enlace deseada que es diferente al reconocimiento del antigeno y al sitio de enlace de un anticuerpo (i.e., es "heterólogo" ) y una secuencia de dominio de constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de enlace de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse a partir de cualquier inmunoglobulina, tales como los subtipos IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA (incluyendo IgAl e lgA2) , IgE, IgD o IgM. La palabra "marcador" cuando se utiliza en la presente se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente al anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica a fin de generar un anticuerpo oligopéptido u otra molécula orgánica "marcado" . El marcador puede ser detectable por si mismo {e.g.r marcadores de radioisótopo o marcadores fluorescentes) o en el caso de un marcador enzimáticao puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que sea detectable . El término "agente citotóxico" como se utiliza en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o causa la destrucción de las células . El término se propone para incluir isótopos _ra ,dji-oactivos (e.gr. , At_ 211, 1-131, 1-125 ,y,.90 , -R,e_ 186, -R,e_ 188, S s—m,153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos , e.g. , metotrexato, adriamicina, alcaloides vinca (vincristina, vinblastina, etopósido) doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes de intercalación, enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacterial, fungal, de planta o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos y los diversos agentes anti-tumor o anti-cancerígenos descritos abajo. Se describen abajo otros agentes citotóxicos . Un agente tumoricidal causa la destrucción de las células de tumor. Un "agente inhibidor del crecimiento" cuando se utiliza en la presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula de cáncer que expresa TAT ya sea in vitro o in vivo. Asi, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de las células que expresan TAT en la fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar diferente a la fase S) , tales como agentes que inducen la retención Gl y la retención de la fase M. Los bloqueadores clásicos de la fase M incluyen las vincapervincas (vincristina y vinblastina) , taxanos e inhibidores de la topoisomerasa II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina. Estos agentes que retienen Gl también se vierten en la retención de la fase S, por ejemplo, los agentes de alquilación de ADN tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Información adicional puede encontrarse en The Molecular Basis of Cáncer (Las Bases Moleculares del Cáncer) Mendelsohn e Israel, eds . , Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation oncogenes, and antineoplastic drugs" (Regulación del ciclo celular oncógenos y drogas antineoplásicas) por Murakami et al., (WB Saunders : Philadelphia, 1995), especialmente la pág. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son drogas anticáncer ambas derivadas del árbol de tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del te o Europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblaje de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos al evitar la despolimerización, que da como resultado la inhibición de la mitósis en células . La oxorubicina" es un antibiótico de antraciclina . El nombre químico completo de la doxorubicina es (8S-cis) -10- [ (3-amino-2 , 3 , 6-trideoxi-oc-L-lixo-hexapiranosil) oxi] -7,8,9, 10-tetrahidro-6, 8 , ll-trihidroxi-8- (hidroxiacetil) -l-metoxi-5 , 12-naftacenediona . El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas tradicionales de polipéptido. Incluidas entre las citocinas se encuentran la hormona del crecimiento tal como la hormona del crecimiento humano, la hormona del crecimiento humano de N-metionil y la hormona del crecimiento bovino; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de la glicoproteína tales como hormona de estimulación folicular (FSH) , hormona de estimulación tiroidea (TSH) y hormona luteinizante (LH) ; factor del crecimiento hepático; factor del crecimiento de fibroblastos; - - prolactina, lactógeno placental; factor-a y -ß de necrosis de tumor; sustancia que inhibe el mullerian; péptido asociado con la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor del crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores del crecimiento del nervio tales como NGF-ß; factor del crecimiento de plaquetas; factores del crecimiento de transformación (TGFs) tales como TGF-a y TGF-ß; factor I y II del crecimiento similar a la insulina; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductivos; interferones tales como interferón-a, -ß y -?,- factores de estimulación de colonias (CSRs) tales como macrófagos-CSF (M-CSF) ; granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF) ; y granulocito-CSF (G-CSF) ; interleucinas (ILs) tales como IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 ; un factor de necrosis de tumor tal como TNF-oc o TNF-ß; y otros factores polipéptidos que incluyen LIF y ligando de conjunto (KL) . Como se utiliza en la presente, el término citocina incluye proteínas provenientes de fuentes naturales o provenientes de cultivos de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia natural . El término "inserto de paquete" se utiliza para referirse a las instrucciones que se acostumbran incluir en paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen la información acerca de las indicaciones, usos, dosis, administración, contraindicaciones y/o precauciones - - concernientes al uso de tales productos terapéuticos.
- - Tabla 1 * C-C incrementado de 12 a 15 * Z es promedio de EQ * B es promedio de ND * comparación con paro es _M; paro-paro = 0; J (sujeto) comparación = 0 */ definir# _M -8 /* valor de una comparación con un paro*/ int _día[26] [26] = { /* A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z*/ /*A*/ 2, 0, -2, 0, 0, -4, 1, -1, -1, 0, -1, -2, -1, 0,_M, 1, 0, -2, 1, 1, 0, 0, -6, 0, -3, 0}, /*B*/ 0, 3, -4, 3, 2, -5, 0, 1, -2, 0, 0, -3, -2, 2, _M, -1, 1, 0, 0, 0, 0, -2, -5, 0, -3, 1}, l*C*l -2,-4, 15, -5, -5, -4, -3,-3, -2, 0,-5, -6, -5, -4, _M, -3,-5, -4, 0,-2, 0,-2,-8, 0, 0, -5}, /*D*/ 0, 3, -5, 4, 3, -6, 1, 1, -2, 0, 0, -4, -3, 2, _M, -1, 2, -1, 0, 0, 0, -2, -7, 0, -4, 2}, /*E*/ 0.2, -5, 3, 4, -5, 0, 1, -2, 0, 0, -3, -2, 1, _M, -1, 2, -1, 0, 0, 0, -2, -7, 0, -4, 3}, /* p*/ -4,-5,-4, -6, -5, 9, -5, -2, 1, 0, -5, 2, 0, -4,_M,-5,-5, -4, -3, -3, 0, -1, 0, 0, 7,-5}, /*G*/ 1, 0, -3, 1, 0, -5, 5, -2,-3, 0, -2, -4, -3, 0, _M, -1, -1,-3, 1, 0, 0, -1,-7, 0, -5, 0}, /*H*/ -1, 1, -3, 1, 1, -2, -2, 6,-2, 0, 0, -2, -2, 2, _M, 0, 3, 2,-1,-1, 0, -2,-3, 0, 0, 2}, 1*1*1 -1, -2, -2, -2, -2, 1, -3, -2, 5, 0, -2, 2, 2,-2, _M, -2,-2,-2,-1, 0, 0, 4,-5, 0, -1,-2}, /* J*/ 0, 0, 0,0, 0,0, 0, 0,0,0,0, 0,0,0,_M, 0, 0,0,0, 0,0,0, 0, 0, 0,0}, /*K*/ -1, 0, -5, 0, 0, -5, -2, 0, -2, 0, 5, -3, 0, 1, _M, -1, 1, 3, 0, 0, 0, -2, -3, 0, -4, 0}, f*L*f -2, -3, -6, -4, -3, 2, -4, -2, 2, 0, -3, 6, 4, -3, _M,-3,-2,-3,-3,-l, 0, 2,-2, 0, -1,-2}, /*M*/ -1,-2, -5, -3, -2, 0, -3,-2, 2, 0, 0, 4, 6, -2,_M, -2, -1, 0, -2, -1, 0, 2,-4, 0, -2,-1}, /*N*/ t 0, 2, -4, 2, 1, -4, 0, 2, -2, 0, 1, -3, -2, 2, _M, -1, 1, 0, 1, 0, 0, -2, -4, 0, -2, 1}, /* O*/ {_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,^ /# p*/ ' 1,-1,-3, -1, -1, -5,-1, 0, -2, 0, -1, -3, -2,-l,_M, 6, 0, 0, 1, 0, 0, -1,-6, 0, -5, 0,}, /*Q*/ 0.1, -5, 2, 2, -5, -1, 3, -2, 0, 1, -2, -1, 1, _M, 0, 4, 1,-1, -1, 0, -2, -5, 0, -4, 3}, /* R*/ -2, 0, -4, -1,-1, -4, -3, 2,-2, 0, 3, -3, 0, 0, _M, 0, 1, 6, 0, -1, 0, -2, 2, 0, -4, 0}, /*S*/ 1, 0, 0, 0, 0, -3, 1, -1,-1, 0, 0, -3, -2, 1, _M, 1, -1, 0, 2, 1, 0, -1, -2, 0, -3, 0}, /* ·?*/ 1, 0, -2, 0, 0, -3, 0, -1, 0, 0, 0, -1, -1, 0, _M, 0, -1,-1, 1, 3, 0, 0, -5, 0, -3, 0}, /*U*/ 0, 0, 0,0, 0,0, 0, 0,0,0,0, 0,0, 0, _M, 0, 0,0,0, 0,0,0, 0, 0, 0,0}, /* y*/ 0, -2, -2, -2, -2, -1, -1, -2, 4, 0,-2, 2, 2,-2,_M,-l, -2, -2, -1, 0, 0, 4,-6, 0, -2,-2}, /*w*/ -6, -5, -8, -7, -7, 0, -7, -3,-5, 0, -3 -2,-4,-4,_M,-6,-5, 2,-2,-5, 0, -6,17, 0, 0, -6}, /*x*/ 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, _M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0}, /* y*/ -3,-3, 0, -4,-4, 7,-5, 0, -1, 0, -4,-l,-2,-2,_M,-5, -4, -4,-3, -3, 0, -2, 0, 0, 10, -4}, /*Z*/ 0, 1, -5, 2, 3, -5, 0, 2, -2, 0, 0, -2, -1, 1,_M, 0, 3, 0, 0, 0, 0, -2, -6, 0, -4, 4} }; - - /* */ incluye# < stdio.h > incluye# < ctype. h > define# MAXJMP 16 /* salto max en un diag*/ define# MAXGAP 24 /* no continuar para penalizar espacios mayores que este*/ define# JMPS 1024 / * salto max en una ruta*/ define# MX 4 /* salvar si existe al menos bases MX-1 desde el último salto*/ defme# DMAT 3 /* valor de bases de comparación */ define# DMIS 0 /* pena para bases desacopladas*/ define# DINSO 8 /* pena para un espacio*/ define# DINS1 1 /* pena por base*/ deline# PINSO 8 /* pena para un espacio*/ define# PINS1 4 /* pena por residuo*/ salto de estruct { corto n[MAXJMP]; /* tamaño de salto (neg para dely) */ corto sin señal xfMAXJMP]; /* sin base, del salto en la sec x*/ /* limita la sec a 2?6 - 1 */ }; diag de estruct { int score; /* puntuación en el último salto*/ largo offset; /* fuera del bloque prev*/ corto ijmp; /* índice de salto actual*/ salto de estruct jp; /* lista de saltos*/ }; ruta de estruc { int spc /* número de espacios guía*/ corto n[JMPS]; /* sizeofl salto (espacio) */ int x[JMPS]; /* loe del salto (último elemento antes del espacio) */ }; car cter *ofile; /* nombre de archivo de salida */ carácter *namex[2]; /* nombres de sec: conseguir secs 0* carácter *prog; /* prog nombre para mensajes de error*/ carácter *seqx[2]; /* secs: conseguir secs 0*/ int dmax; /* diag mejor: nw 0* int dmaxO; /* diag final */ int dna; /* fijar si adn: principalO*/ int endgaps; /* fijar si espacios finalesde penalización*/ int gapx, gapy; /* total de espacios en secs */ int lenO, lenl; /* sec lens */ int ngapx, ngapy; /* tamaño total de espacios*/ int smax; /* puntuación max: nw 0*/ int *xbm; /* mapa de bits para comparación*/ largo offset; /* salida actual en archivo de salto*/ estruct diag *dx; /* conserva diagonales */ estruct path PP[2]; /* conserva ruta para secs*/ carácter *calloc(), *malloc(), *indexO, *strcpyO; carácter *getseqO, *g-callocO; /* programa de alineamiento Needleman-Wunsch * * uso: progs archivo 1 archivo2 * en donde archivol y archivo2 son dos adn o dos secuencias de proteínas. * Las secuencias pueden ser en caso superior o inferior pueden contener ambigüedad * Cualquier línea que inicia con '>' o '<' se ignora * La longitud max del archivo es 65535 (limitado por x corto sin señal en la estruct de salto) * Una secuencia con 1/3 o más de sus elementos ACGTU se suponen ser ADN * La salida esta en el archivo "align.out" * * El programa puede crear un archivo tmp en /tmp para mantener info a cerca de la cola de traza.
* Versión original desarrollada bajo BSD 4.3 en un vax 8650 */ incluyei "nw.h" incluye# "day.h" estático dbval [26] = { 1, 14, 2, 13, 0, 0, 4, 11, 0, 0, 12, 0, 3, 15, 0, 0, 0, 5, 6, S, 8, 7, 9, 0, 10, 0 }; estático _pbval [26] = { 1, 2 I (1 « (?'-?' )) | (1 < < (??-?' )), 4, 8, 16, 32, 64, - - 128, 256, OxFFFFFFF, 1 < < 10, 1 < < 11, 1< < 12, 1< < 13, 1< < 14, 1«15, 1<<16, 1<<17, 1<<18, 1<<19, 1 <<20, 1 <<21, 1<<22, 1< <23, 1< < 24, 1< < 25 I (1< < (?'-?' )) | (1< < ('Q'-'A' )) }; principal(ac, av) principal int ac ; carácter *av[]; { prog = av[0]; si (ac ! = 3) { fprintf(stderr,"uso: %s archivol archivo2\n", prog); fprintf(stderr, "en donde archivol y archivo2 son dos adn o dos secuencias de proteínas.W); fprintf(stderr, "Las secuencias pueden estar en el caso superior o inferior\n"); rprintf(stderr, "Cualquier línea que incia co ';' o ' < 1 se ignora\n"); fprintf(stderr,"La salida esta en el archivo\"align.out\"\n"); salida(l); } namex[0] = av[l]; namex[l] = av[2]; seqx[0] = getseq(namex[0], &len0); seqxfl] = getseq(namex[l], &lenl); xbm = (dna)? _dbval : jpbval; endgaps = 0; /* 1 para penalizar espacios finales */ ofile= "align.out"; /* archivo de salida */ nwO; /* llenar en la matriz, conseguir los saltos posibles*/ readjmpsO; /* consigue los saltos actuales */ printQ; /* imprime estados, alineamiento*/ cleanup(0); /* desenlaza cualquier archivo tmp /* hace el alineamiento, regresa a la mejor puntuación: principalO * adn: valores en Fitch y Smith, PNAS, 80, 1382-1386, 1983 * pro: valores PAM 250 * Cuando las puntuaciones son iguales, preferimos desacoplar cualquier espacio, prefer * un nuevo espacio para extender un espacio en curso y prefer un espacio en seqx * ' para un espacio en seq y. */ nw() nw { carácter *px, *py; /* secs y ptrs*/ int *ndely, *dely; /* mantiene pista dely*/ int delx, delx; /* mantiene pista delx*/ int *tmp; /* para transferencia hileraO, hilera 1*/ int mis; /* puntuación para cada tipo*/ int insO, insl; /* penas de inserción*/ registro id; /* índice de diagonal */ registro /* índice de salto*/ registro *colO, *coll; /* puntuación para hilera actual, última*/ registro xx yy; /* índice en secs */ dx - (struct diag *)g_calloc("to get diags", lenO+Ienl + 1, sizeof(struct diag)); ndely (int *)g_calloc("to get ndely", lenl + 1, sizeof(int)); dely = (int *)g_calloc("to get dely", lenl + 1, sizeof(int)); colO = (int *)g_calloc("to get colO", lenl + 1, sizeof(int)); coll = (int *)g_calloc("to get coll", lenl + 1, sizeof(int)); insO = (dna)? DINSO : PINSO; insl = (dna)? DINS1 : PINS1; smax = -10000; si (espaciosfinales){ para (col0[0] = dely[0] = -insO yy = 1 ; yy < = lenl ; yy+ +) { col0[yy] = dely[yy] = col0[yy-l] - insl; ndely[yy] = yy; } col0[0] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84*/ } además para (yy= 1; yy < = lenl; yy+ +) dely[yy] = -insO; /* llenar la matriz de comparación */ para (px seqx[0], xx = 1 ; xx < = lenO; px+ +, xx+ +) { /* inicia primera entrada en col */ si (espaciosfínales) { si (xx = = 1) coll[0] = delx = -(insO+insl); además coll[0] = delx = colO[0] - insl; ndelx = xx; } además { coll [0] = 0; delx = -insO; ndelx= 0; } ...nw para (py = seqx[l] yy = 1; yy < = lenl; py+ + yy+ +) { mis = colO[yy-l]; si (dna) mis + = (xbm[*px-'A']&xbm[*py-,Al) ? DMAT : DMIS; además mis + = _day[*px-'A'] [*py-'A'j; /* actualiza pena para del en sec x; * favor de nuevo del sobre del en curso * ignore MAXGAP si se ponderan endgaps */ si (endgaps 1 1 ndely[y ] < MAXGAP) { si (colOjyy] - insO > = delyfyy]) { dely[yy] = colO[yy] - (insO+insl); ndely[yy] = 1; } además { delyfyy] -= insl; ndely[yy] + +; } } además { si (colOjyy] - (insO+insl) > = dely[yy]) { delyfyy] = colO[yy] - (insO+insl); ndely[yy] = 1; } además ndely[yy] + +; } /* actualiza pena para del en sec y; * favor de nuevo del sobre del en curso*/ */ si (endgaps ) | ndelx < MAXGAP) { si (coll[yy-l] - insO > = delx) { delx = coll[yy-l] - (insO+insl); ndelx = 1; } además { delx - ins 1; ndelx + +; } } además { si (coll[yy-l] - (insO+insl) > = delx) { delx = coll[yy-l] - (insO+insl); ndelx = 1; } además ndelx+ +; } /* recoge la puntuación máxima; fiaimos favorecidos *mis sobre cualquier del y delx sobre dely */ nw id=xx - yy + lenl - 1; si (mis > = delx && mis > = dely[yy]) coll[yy] = mis; además si (delx > = dely[yy]) { coll[yy] = delx; ij = dx[id].ijmp; si (dx[id].jp.n[0] && (!dna 1 1 (ndel > = MAXJMP && XX > dx[id].jp. x[ij] + MX) 1 1 mis > dx[id]. score + DINSO)) { dx[id]. ijmp + +; si (+ + ij > = MAXJMP) { writejmps(id); ij = dx[id].ijmp = 0; dx[id] .offset = offset; offset + = sizeof(struct jmp) + sizeof(offset); } } dx[id].jp.n[ij] = ndelx; dx[id].jp.x[ij] = xx; dx[id]. score = delx; } además { coll[yy] = dely[ y]; ij = dx[id].ijmp; & (!dna 1 1 (ndely[yy] > = MAXJMP && xx > dx[id].jp. x[ij] + MX) 11 mis > dx[id]. score + DINSO)) { dx[id]. ijmp + +; si (+ + ij > = MAXJMP) { writejmps(íd); ij = dx[id].ijmp = 0; dx[id].offset = offset; offset + = sizeof(struct jmp) + sizeof (offset); } } dx[id] jp.n[ij] = -ndely[ y]; dx[id].jp.x[ij] = xx; dx[id].score = dely[yy]; } si (xx = = lenO && yy < lenl) { /* last col */ si(endgaps) coll[yy] - = insO+insl*(Ienl-yy); si (coll[yy] > smax) { smax = coll [yy]; dmax = id; } } } si (endgaps && xx < lenO) coll[yy-l] - = insO+insl*(IenO-xx); si (coll[yy-l] > smax) { smax = coll [yy-1]; dmax = id; } tmp = colO; colO = coll; coll = tmp; } (vacío) libre((caracter *)ndely); (vacío) libre((caracter *)dely); (vacío) libre((caracter *)col0) (vacío) libre((caracter *)coll): } /* * printO — solo rutina visible fuera de este módulo * * estático: * getmatO — mejor ruta de cola de traza, compara cuenta: printO * pr alignO — imprime alineamiento de lo descrito en ordenamiento p[]: printO * dumpblockO ~ descarga un bloque de líneas con números, asteriscos: pr_alignO * numsO — pone una línea de números: dumpblockO * putlineO — pone una línea (nombre, [núm], sec, [núm]): dumpblockO * starsO —pone una línea de asteriscos: dumpblockO * stripnameO — quitar cualquier ruta y prefijo de un nombre de secuencia */ include # "nw.h" define# SPC 3 define# P_LINE 256 /* línea de salida máxima*/ define# P SPC 3 /* espacio entre nombre o núm y sec*/ externo _day[26][26]; int olen; /* establece longitud de línea de salida */ ARCHIVO *fx; /* archivo de salida*/ printO print int lx, ly, primer espacio, último espacio; /* sobreposición*/ si ((fie = fopen(ofíle, "w")) = = 0) { fprintf(stderr, " %s: no puede escribir % s\n", prog ofile); elirninar(l); } fprintf(fx, " < primera secuencia: % s (longitud = % d)\n", namex[0], lenO); fprintf(fx, " < segunda secuencia: % s (longitud = % d)\n", namex[l], lenl); olen = 60; lx = lenO; ly = lenl; primer espacio = último espacio = 0; si (dmax < lenl - 1) { /* guiando espacio en x */ pp[0].spc = primer espacio = lenl - dmax - 1; ly -= pp[0].spc; } además si (dmax > lenl - 1) { /* guiando espacio en y*/ pp[l].spc = primer espacio = dmax - (lenl - 1); lx -= pp[l].spc; } si (dmaxO < lenO - 1){ /* arrastrando espacio en x */ último espacio = lenO - dmaxO -1; lx-= último espacio; } además si (dmaxO > lenO - 1) { /* arrastrando espacio en y*/ último espacio = dmaxO - (lenO - 1); ly -= último espacio; } getmat(lx, ly, primer espacio, último espacio); pr_alignO; } /* * cola de traza la mejor ruta, cuenta comparaciones */ estático getmat(lx, ly, primer espacio, último espacio) getmat int lx, ly; /* "núcleo" (menos espacios finales)*/ int primer espacio, último espacio; /*guiando arrastrando sobreponer*/ { int nm, iO, il, sizO, sizl; caract outx[32]; doble pct; registro O, ni; caract registro *p0, *pl; /* consigue comparaciones totales, puntuación */ iO = il = sizO = sizl = 0; pO = seqx[0] 4- pp[l]. spc; pl = seqx[l] + pp[0]. spc; n0 = pp[l].spc + 1; ni =pp[0].spc + 1; nm= 0; mientras (*p0 && *pl) { si (sizO) { pl + +; ni + +; sizO— ; } además si (sizl) { pO + +; nO + +; sizl—; } además { si (xbm[*pO-A']&xbm[*pl-A']) nm++; si(nO+ + = = pp [0].x[iO]) sizO = pp[0].n[iO++]; si (nl+ + = = pp[l].x[il]) sizl =pp[l].n[il + +] pO + +; pl++; } } /* homología pct: * si se penalizan espacios finales, la base es la sec más corta * además, elimina inclinaciones y toma el núcleo más corto */ si (espacios finales) lx = (lenO < leal)? lenO : lenl; además lx = (lx < ly)? lx : ly; pct = 100 *(doble)nm/(doble)lx; fprintf(fx, "\n"); fprintf(fx, " < %d compara %s en una sobreposición de %d: %.2f similitud de porcentaje \n", nm, (nm = = 1)? " " : "es", lx, pct); p???(??, " < espacios en primera secuencia: % d ", gapx); ... getmat si (gapx) { (vacío) sprintf(outx, " (%d %s%s)", ngapx, (dna)? £¾ase" : "residuo", (ngapx = = 1)? " " : "s"); fi rintf(&,"%s" outx); fp???(G?, ", espacios en segunda secuencia: %d", gapy); si (gapy) { (vacío) sprintf(outx, " (%d %s %s)", ngapy, (dna)? "base" : "residuo", (ngapy = = 1)? " ": "s"); } si (dna) fyrintf(fx, "Vn < puntuación: %d (comparación = %d, desacoplo = %d, pena de espacio = %d + %d por base) n", smax, DMAT, DMIS, DINSO, DINS 1); además "\n < puntuación: %d (matriz Dayhoff PAM 250, pena de espacio = %d + %d por residuo)\n", smax, PINSO, PINS1); si (espacios finales) fprintf(fx, "< espacios finales penalizados, espacio final izquierdo: %d %s %s, espacio final derecho: %d %s primer espacio, (dna)? "base" : "residuo", (primer espacio = = 1)? " " : "s", último espacio, (dna)? "base" : "residuo", (último espacio = = 1)? " " : "s") además fprintf(fx, " < espacios finales no penalizadosV); } estático nm; /* compara en el núcleo — para verificación*/ estático lmax; /* longitudes de nombres de archivo quitados*/ estático ¾ P]; /* índice jmp para una ruta */ estático nc[2]; /* número en asterisco de línea actual*/ estático ni[2]; /* número de elemento actual — para espaciar*/ estático siz[2]; caract éstático *ps[2]; /* ptr para elemento actual*/ caract estático *po[2]; /* ptr para siguiente ranura de caract de salida*/ caract estático out[2] [P_LINE]; /* línea de salida */ caract éstático star[P_LINE]; /* establece por asteriscosO*/ /* * alineamiento impreso de lo descrito en ruta de estruct pp[] */ estático pr_align() pr_align { int nn; /* cuenta de caract */ int más; registro i; para (i = 0, lmax = 0; i < 2; i + +) { nn = stripname(namex[i]); si (nn > lmax) lmax = nn; nc[i] = 1; ni[i] = 1; siz[i] = ij[i] = 0; ps[i] = seqx[i]; po[i] = out[i]; } para (nn = nm = 0, más = 1; más; ) { ...pr_align para (i = más = 0; i < 2; i + +) { /* * ¿tenemos más de esta secuencia? */ si (!*ps[i]) continua; más + +; si (pp[i].spc) { /* guiando espacio*/ *po[i] + + = " ; pp[i].spc~; } además si (siz[i]) { /* en un espacio*/ *po[i] + + =' - '; siz[i] -; } además { /* ponemos un elemento de sec */ *po[i] = *ps[i]; si (islower(*ps[i])) *ps[i] = toupper(*ps[i]); po[i] + +; ps[i] + +; /* * ¿estamos en el siguiente espacio para esta sec? */ - - si (ni[i] = =pp[i].x[ij[i]]) { /* *necesitamos fundir todos los espacios *en esta ubicación */ siz[i] = pp[i].n[ij[i] + + ]; mientras (ni[i] = = pp[i].x[ij[i]]) siz[i] + = pp[i].n[ij[i]+ +]; } ni[i] ++; } } si (+ + nn = = olen 1 1 !más && nn) { descarga bloqueQ; para (i = 0; i < 2; i + +) po[i] = out[i]; } } } /* * descarga un bloque de líneas, incluyendo números, asteriscos: pr_align() */ estático descarga bloqueQ dumpblock registro i; para(i = 0;i<2;i + +) *po[i]~='\0'; .dumpblock (vacío) putc(V, fe); para(i = 0;i<2;i + +) { si (*out[i] && (*out[i] ! = " 11 *(po[i]) ! = ")){ si(i = = 0) nums(i); si (i = = 0 && *out[i]) asteriscosO; poner línea(i); si (i = = 0 && *out[i]) fprintf(f , asterisco); si(i = =l) nums(i); } } } /* * elimina línea de números: descarga bloqueQ */ estático nums(ix) nums int ix; /* índice en out[] conservar línea de sec caract nline[P_LINE]; registro caract registro *pn, *px, *py; para (pn = nline, i = 0; i < lmax + P_SPC; i + +, pn + +) *pn="; para (i = nc[ix], py = out[ix]; *py; py + +, pn + +) { si(*py=="í!*py==£-') *pn="; además { si (i% 10 = = 011 (i = = 1 &&nc [ix] ! = 1)) { j= (i<0)?-i : i; para (px = pn; j; j / = 10, px-) *px=j % 10 + '0'; si (i < 0) *px='-'; } además *pn = ' } } *pn='VT; nc[ix] = i; para (pn = nline; *pn; pn+ +) (vacío) putc(*pn, fe); (vacío) putcC\n'5 fe); } /* * elimina una línea (nombre, [núm], sec, [núm]): dumpblockO */ estático poner línea(ix) putline int ix; ...putline int i; caract registro *px; para (px = namex[ix], i = 0; *px && (vacío) putc(*px, fe); para (; i < lmax + P_SPC; i + +) (vacío) putc(' ', fe); /* este cuenta desde 1 : * ni[] es elemento actual (desde 1) * nc[] es númeo en asterisco de línea actual */ para (px = out[ix]; *px; px + +) (vacío) putc(*px&0x7F, fe); (vacío) putcC\n', fx); } /* * pone una línea de asteriscos (secs siempre en out [0] out[l]): dumpblockO */ estático asteriscosO stars { int i; caract registro *p0, *pl, ex, *px; si (!*out[0] 1 1 (*out[0] = = " && *(po[0] !*out[l] 1 1 (*out[l] = = " && *(po[l] ¦ ¦ regreso; px = asterisco; para (i = lmax+P_SPC; i; i-) *px++ = ' '; out[0], pl = out[l]; *p0 && *pl; pO ++, pl+ +) { (isalpha(*pO) && isalpha(*pl)) { si (xbm[*p0- 'A'J&xbm^pl-'A']) { ex. = nm+ +; - leo - } . además si (!dna && _day[*pO-'A,][*pl-,A'] > 0) cx = '.' ; además cx="; } además cx="; *px + + = ex; } *px+ + = 1 \n'; *px = '\0'; } /* * quitar ruta o prefijo de pn, regresar a len: pr_align 0 */ estático quitar nombre(pn) stripname caract *pn; /* nombre de archivo (puede ser ruta)*/ { caract registro *px, *py pn; *px; x+ +) (*px = = '/') py = px + 1; si (py) (vacío) strcpy(pn, py); regreso (strlen(pn)); /* * clanup O — elimina cualquier archivo tmp * getseq 0 — lee en sec, establece adn, len, maxlen * g_calloc 0 callocO con verificación de error * readjmps 0 consigue buenos saltos, desde archivo tmp si es necesario * writejmps 0 escribe un ordenamiento lleno de saltos a un archivo tmp: nw 0 */ incluyc# "nw.h" incluye# <sys/archivo.h> caract *jname = "/tmp/homgXXXXXX"; /* archivo tmp para saltos*/ ARCHIVO *fj; int cleanup 0; /* elimina archivo tmp */ largo lseek 0; /* * retira cualquier archivo tmp si soplamos */ eliminar(i) cleanup int i; { si (fj) (vacío) sin enlaceQname); salida(i); } /* * lee, regresa ptr a sec, establece dna, len, maxlen * salta líneas que inician con '; ', ' <' o ' >' * sec en caso superior o inferior */ caract * getseq(archivo, len) getseq caract *archivo;/* nombre de archivo */ int *len; /* sec len*/ caract línea
[1024], *pseq; caract registro *px, *py; int natgc, tlen; ARCHIVO * fp; si ((fp = fopen(archivo, " r ")) = = 0) { ri tf(stderr, " %s: no puede leer % s n", prog, archivo); salida(l); } tlen = natgc = 0; mientras (fgets(línea, 1024, fp)) { si (*línea= = ' 1 1 *Hnea = = '<' | 1 *Hnea = = '>' ) continua; para (px = línea; *px ! = '\?'; px + + ) si (isupper(*px) 1 1 islower(*px)) tlen+ +; } si (fpseq = malloc((sin señal)(tlen + 6))) = = 0) { fprintf(stderr, " %s: mallocO archivado para conseguir %d bytes para %s\n", prog, tlen+6, archivo); salida(l); } pseq[0] = pseqfl] = pseq[2] = pseq[3] = '\0'; ...getseq py = pseq + 4; *len = tlen; rebobinar(f ); mientras (fgets(línea, 1024, fp)) { si (*línea = = '; ' 1 1 *línea = = '<'| | *línea continua; para px = línea; *px ! =' \n '; px + +) { si (isupper(*px)) *py + + = *px; además si (islower(*px)) *?? + + = toupper(*px); si (índice("ATGCU",*(py-l))) natgc + +; } } *py + + = '\0' ; *py= '0' ; (vacío) fclose(fp); dna = natgc > (tlen/3); regreso(pseq + 4); } caract * g_caIloc(msg, nx, sz) g_calIoc caract *msg; /* programa, rutina de llamada*/ int nx, sz; /* número y tamaño de elementos */ { caract *px, *calloc(); si ((px = calloc((sin señal)nx, (sin señal)sz)) = = 0) { si (*msg) { rprintf(stderr, " %s: g-callocO falló %s (n= %d, sz = %d)\n", prog, msg, nx, sz); salida(l); } } regreso(px); } /* * consigue saltos finales desde dx[] o archivo tmp, establece pp[], restablece dmax: mainO */ readjmpsO readjmps int fd = -l; int siz, iO, il; registro i, j, xx; (vacío) fclose(fj); si ((fd = open(jname o RDO LY, 0)) < 0 ) { fprintf(stderr, " % s: no puede abrir() % s\n", prog, jname); elimitiar(l); } } para (i = iO = il = 0, dmaxO = dmax, xx = lenO; ; i + +) { mientras (1) { para Q = dx[dmax].ijmp; j > = 0 && dx[dmax].jp.x[j] > = xx;j~ ) ... readjmps si (j < 0 && dx[dmax] .fuera && íj) { (vacío) lseek(fd, dx[dmax] .fuera, 0); (vacío) leer(fd, (caract*)&dx[dmax].jp, sizeof(estract jmp)); (vacío) leer(fd, (caract*)&dx[dmax].fuera, sizeof(dx[dmax]. fuera)); dx[dmax].ijmp = MAXJMP-1; } además interrupción; } si (i > = JMPS { fprintf(stderr, " % s: demasiados espacios en alíneamientoVa", prog); elirninar(l); } si (j > = 0) { siz = dx[dmax].jp.n[j]; xx = dx[dmax].jp.x[j]; dmax + = siz; si (siz < 0) { /* espacio en segunda sec */ pp[l].n[il] = -siz; xx + = siz; /* id = X - y + lenl — 1 */ pp[l].x[il] = xx - dmax + lenl - 1; gapy + +; ngapy — siz; P cuando hacen espacios finales */ siz = (-siz < MAXGAP 1 1 espaciosf finales)? siz : MAXGAP; il + +; } además si (siz > 0) { /* espacio en primera sec */ pp[0].n[i0] = siz; pp[0].x[i0] = xx; gapx + +; ngapx + = siz; ignore MAXGAP cuando hacen espacios finales */ siz = (siz < MAXGAP | ] espacios finales)? siz : MAXGAP; i0++; } } además interrupción; } /* invierte el orden de los saltos */ para (j = 0, Í0-; j < Í0; j + +, i0~) { i = PP[0].nD];pp[0].n¡j] = pp[0].n[i0]; pp[0].n[i0] = i; i = PP[0].xD];PP[0j.x[j] = Pp[0].x[i0]; pp[0].x[iO] = i; } para(j = 0,il-;j<il;j++,il-){ i = pp[l].nD'];pp[l].n|j] = pp[l].n[il]; pp[l].n[il] = i; i = pp[l].xD];pp[l].xtj] = pp[l].x[il]; pp[l].x[il] = i; } si(fd> = 0) (vacío) cierra(fd); si(fj)í (vacío) sin enlace(jname); fuera = 0; } } /* * escribe una estruct jmp llena fuera del prev (si hay): nw() */ writejmps(ix) writejmps int ix; { caract *mktemp(); si (!fj) { si (mkternp(jname) < 0) { fprintf(stderr, "% s: no puede mktempO % s^11"» Pr°g= jname); elirninar(l); } si ((fj = fopen(jname, "w" )) = = 0) { fprintf(stderr, " % s: no puede escribir % s\n", prog, jname); salida(l); } } (vacío) fwrite((caract *)&dx[ix].jp, sizeof(estruct jmp), 1, fj); (vacío) fwrite((caract *)&dx[ix] .fuera, sizeof(dx[ix] .fuera), 1, fj ); Tabla 2 TAT xxxxxxxxxxxxxxx (Longitud = 15 aminoácidos) Proteína de Comparación XXXXXYYYYYYY (Longitud = 12 aminoácidos) % de identidad de secuencia de aminoácidos = (el número de residuos de aminoácidos idénticamente acoplados entre las dos secuencias de polipéptidos como se determina por ALIGN-2) dividido entre (el número total de residuos de aminoácido del polipéptido TAT) = 5 dividido entre 15 = 33.3 % Tabla 3 TAT xxxxxxxxxx (Longitud = 10 aminoácidos) Proteína de Comparación XXXXXYYYYYYZZYZ (Longitud = 15 aminoácidos) % de identidad de secuencia de aminoácidos = (el número de residuos de aminoácidos idénticamente acoplados entre las dos secuencias de polipéptidos como se determina por ALIGN-2) dividido entre (el número total de residuos de aminoácido del polipéptido TAT) = 5 dividido entre 10 = 50% Tabla 4 TAT-ADN NNNHNISuNIN^ (Longitud = 14 nucleótidos) ADN de Comparison NNNNNNLLLLLLLLLL (Longitud = 16 nucleótidos) % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos = (el número de nucleótidos idénticamente acoplados entre las dos secuencias de ácidos nucleicos como se determina por ALIGN-2) dividido entre (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos TAT-ADN) = 6 dividido entre 14 = 42.9% Tabla 5 TAT-ADN NNNNNMSINNN N (Longitud = 12 nucleótidos) ADN de Comparación NNNNLLLW (Longitud = 9 nucleótidos) % de identidad de secuencia de ácido nucleico = (el número de nucleótidos que corresponden idénticamente entre las dos secuencias de ácido nucleico como se determina por ALIGN-2) dividido entre (el número total de nucleótidos de la secuencia TAT-ADN de ácido nucleico)= 4 dividido entre 12 = 33.3%* II . Composiciones y Métodos de la Invención A. Anticuerpos Anti-TAT En una modalidad, la presente invención proporciona anticuerpos anti-TAT que pueden encontrar su uso en la presente como agentes terapéuticos y/o de diagnóstico. Los anticuerpos ejemplificativos incluyen anticuerpos policlonales , monoclonales , humanizados, biespecíficos y heteroconjugados . 1. Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos policlonales se cultivan preferentemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante (especialmente cuando se utilizan péptidos sintéticos) a una proteina que es inmunogénica en las especies a inmunizar. Por ejemplo, el antígeno puede conjugarse a hemocianxna de lapa californiana (KLH) , albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de semilla de soya, utilizando un agente bifuncional o de derivación, e.g. , éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12 o R1N=C=NR, en donde R y R1 son diferentes grupos alquilo. Se inmuniza a los animales contra el antxgeno, conjugados inmunogénicos o derivados, combinando, e.g-, 100 jixg o 5 /xg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes después, los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en sitios múltiples. De siete a 14 días después, los animales se sangran y el suero se analiza para la titulación del anticuerpo. Los animales se refuerzan hasta que el título se establece. Los conjugados también pueden elaborarse en un cultivo celular xecombinante como fusiones de proteina. También, se utilizan adecuadamente agentes de agregación tales como alumbre para mejorar la respuesta inmune. 2. Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos monoclonales pueden elaborarse utilizando el método de hibridoma descrito primeramente por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) o pueden elaborarse mediante métodos de ADN recombinante (Patente de E.U. No. 4, 816,567) . En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, se inmuniza como se describió anteriormente para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se enlazarán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.
Después de la inmunización, los linfocitos se aislan y después se fusionan con una linea celular de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilen glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, (Goding, Anticuerpos Monoclonales : Principios y Práctica) pag. 59-103 (Academic Press, 1986)). Las células de hibridoma asi preparadas se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado cuyo medio contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas (también referidas como socio de fusión) . Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo selectivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Las células de mieloma de socio de fusión preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción estable a alto nivel del anticuerpo por medio de las células que producen un anticuerpo seleccionado y son sensibles a un medio selectivo que se selecciona contra las células originales no fusionadas. Las lineas celulares de mieloma preferidas son las lineas de mieloma murinas, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EUA y SP-2 y derivados e.g. , células XS3-Ag8-653 disponibles del American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, EUA. También se han descrito las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Técnicas de Producción y Aplicaciones de Anticuerpos Monoclonales) pag. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma se analiza para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un análisis de enlace in vitro, tal como un radioinmunoanálisis (RIA) o un análisis inmunoabsorbente enlazado a la enzima (ELISA) . La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard descrito en Munson et al., Anal . Biochem. , 107:220 (1980) .
Una vez identificadas las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones pueden subclonarse limitando los procedimientos de dilución y cultivarse mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, (Goding, Anticuerpos Monoclonales: Principios y Práctica) pag. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores de ascitis en un animal e.g-., mediante inyección i.p. de las células en ratones . Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, del fluido de la ascitis o del suero mediante procedimientos convencionales de purificación de anticuerpos tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad {e.g. , utilizando proteína A o proteína G-Sepharose) o cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, etc. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla y se secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (e.g., utilizando sondas de oligonucleótido que son capaces de enlazarse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse dentro de vectores de expresión, que se transfectan entonces dentro de células huésped tales como las células de E. coli, células COS de simio, células Ováricas de Hámster Chino (CHO) o células de mieloma que de otra manera no producen proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes . Los artículos de revisión acerca de la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et al., Cur . Opinión in Immunol . , 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol . Revs . 130:151-188 (1992) . En una modalidad adicional, los anticuerpos monoclonales o los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse a partir de bibliotecas de bacteriófagos de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en cCafferty et al., Nature , 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol . , 222:581-597 (1991) que describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de bacteriófagos. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) mediante redistribución de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas muy grandes de bacteriófagos (Waterhouse et al., Nuc . Acids Res ¦ , 21:2265-2266 (1993)). De este modo, estas técnicas son alternativas viables para las técnicas tradicionales del hibridoma de anticuerpo monoclonal para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. El ADN que codifica el anticuerpo puede modificarse para producir polipéptidos de anticuerpos quiméricos o de fusión, por ejemplo, sustituyendo las secuencias humanas de dominio constante de cadena pesada y de cadena ligera (CH y CL) para las secuencias murinas homologas (Patente de E.U. No. 4,816,567; y Morrison, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 81:6851 (1984)) o fusionando la secuencia de codificación de inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no de inmunoglobulina (polipéptido heterólogo) . Las secuencias de polipéptidos no de inmunoglobulina pueden sustituirse para los dominios constantes de un anticuerpo o se sustituyen para los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo quimérico bivalente que comprende un sitio de combinación de antigeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. 3. Anticuerpos Humanos y Humanizados Los anticuerpos anti-TAT de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de los anticuerpos no-humanos (e.gr., murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulxna o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab' , F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de enlace de antxgeno) que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulxna no-humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en cuyos residuos desde una región de determinación de complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos provenientes de una CDR de una especie no-humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, la afinidad y la capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la estructura Fv de la inmunoglobulxna humana se reemplazan por los residuos no-humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o las secuencias de estructura. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulxna no-humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia humana de consenso de inmunoglobul na. El anticuerpo humanizado de manera óptima comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature , 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332 :323-329 (1988); y Presta, Curr . O . Struct . Biol . , 2:593-596 (1992)] . Los métodos para humanizar anticuerpos no-humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en él provenientes de una fuente que es no-humana. Estos residuos de aminoácido no-humanos se refieren frecuentemente como residuos de "importación", que se toman típicamente de un dominio variable de "importación" . La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo el método de inter y colaboradores [Jones et al., Nature , 321:522-525 (1986); Riechman et al., Nature, 332.-323-327 (1988) ; Verhoeyen et al., Science, 23_9: 1534-1536 (1988)], sustituyendo las secuencias de roedor CDRs o CDR para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de E.U. No. 4,816,567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no-humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a utilizar para preparar los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad y la respuesta ???? (anticuerpo humano antiratón) cuando se propone el anticuerpo para uso terapéutico humano. De acuerdo al así llamado método de "adaptación óptima", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se clasifica contra la biblioteca completa de las secuencias de dominio variable humano conocidas. Se identifica la secuencia del dominio V humano que es la más cercana a la del roedor y la región de estructura humana (FR) dentro de ésta aceptada para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol , 151:2296 (1993); Chothia et al., J.Mol . Biol . 196:901 (1987)) . Otro método utiliza una región particular de estructura derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de las cadenas ligera o pesada. La misma estructura puede utilizarse para varios diferentes anticuerpos humanizados (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol . 151:2623 (1993)). Además es importante que los anticuerpos se humanicen con retención de la alta afinidad de enlace para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables . Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias nativas y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias humanizadas y nativas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se encuentran comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Se encuentran disponibles programas de computadora que ilustran y despliegan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias candidato de inmunoglobulina seleccionadas. La inspección de estas imágenes permite el análisis del probable rol de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, i.e., el análisis de los residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidato para enlazar su antígeno. De esta manera, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias de receptor e importación de modo que se logra la característica del anticuerpo deseada, tal como la afinidad aumentada para el (los) antígeno (s) objetivo. En general, los residuos de región hipervariable se encuentran directamente y más sustancialmente implicados en influenciar el enlace del antígeno . Se contemplan varias formas de un anticuerpo humanizado anti-TAT. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, que se encuentra opcionalmente conjugado con uno o más agentes citotóxicos a fin de generar un inmunoconjugado . Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo intacto de IgGl. Pueden generarse anticuerpos humanos como una alternativa para la humanización. Por ejemplo, es posible ahora producir animales transgénicos {e.g., ratones) que son capaces, al inmunizarse, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción endógena de inmunoglobulina . Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y mutantes de linea germinal da como resultado la completa inhibición de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia del ordenamiento del gen de inmunoglobulina humano de línea germinal a tales ratones mutantes de linea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos al probar al antigeno. Ver, e.g., Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90:2551 (1993); Jacobovits et al., ature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al. Year in Immuno, 7:33 (1993); Patentes de los E.U. Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (todas de GenPharm) ; 5,545,807; y WO 97/17852.
Alternativamente, la tecnología de imagen de fago (McCafferty et al., Nature, 348:552-553
[1990]) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de los repertorios del gen de inmunoglobulina de dominio variable (V) de donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de anticuerpo de dominio V se clonan en bloque dentro de un gen de protelna ya sea de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como MI3 o fd y se muestran como fragmentos de anticuerpo funcional en la superficie de la partícula de bacteriófagos . Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma de bacteriófagos, las selecciones en base a las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica para el anticuerpo que exhibe aquellas propiedades. De este modo, el bacteriófago imita algunas de las propiedades de la célula B. La imagen de bacteriófago puede llevarse a cabo en una variedad de formatos, revisados en, e.g., Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology, 3:564-571 (1993). Pueden utilizarse varias fuentes de segmentos del gen V para la imagen de bacteriófago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aisló un ordenamiento diverso de anticuerpos anti-oxazolona de una pequeña biblioteca aleatoria combinatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos para un diverso ordenamiento de antígenos (incluyendo auto-antígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol . Biol .. 222:581-597 (1991) o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver, también, Patentes de los E.U. Nos 5,565,332 y 5,573,905. Como se trató anteriormente, los anticuerpos humanos también pueden generarse mediante células B activadas in vitro (ver Patentes de los E.U. 5,567,610 y 5,229,275). 4. Fragmentos de anticuerpo En ciertas circunstancias existen ventajas en el uso de fragmentos de anticuerpo, en lugar de anticuerpos completos . El menor tamaño de los fragmentos permite una rápida limpieza y puede conducir al acceso mejorado hacia tumores sólidos . Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, e.g., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, ahora estos fragmentos pueden producirse directamente por medio de células huésped recombinantes .
Todos los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv pueden expresarse en y secretarse de E coli, permitiendo así la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Pueden aislarse los fragmentos de anticuerpo de las bibliotecas de bacteriófagos de anticuerpo anteriormente tratadas. Alternativamente, los fragmentos Fab' -SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro procedimiento, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente del cultivo de la célula huésped recombinante . Los fragmentos Fab y F(ab' )2 con una vida media ín vivo incrementada que comprenden residuos de recuperación de epítope de enlace al receptor se describen en la Patente de E.U. No. 5,869,046. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes para el practicante experto. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena única (scFv) . Ver, W093/16185; Patente de E.U. No. 5,571,894; y la Patente de E.U. No. 5,587,458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que se encuentran libres de las regiones constantes; por lo tanto, son adecuadas para el enlace reducido no-específico durante su uso in vivo. Las proteínas de fusión sFv pueden construirse para producir la fusión de una proteína efectora ya sea en la terminal amino o la carboxi de un sFv. Ver, Antibody Engineering, edic. Borrebaeck, supra. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", e.g., como se describe por ejemplo en la Patente de E.U. 5,641,870. Tales fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser raonoespecífieos o biespecificos . 5. Anticuerpos Biespecificos Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para al menos dos epítopes diferentes. Los anticuerpos biespeci icos ej emplificativos pueden enlazarse a dos diferentes epitopes de una proteina TAT como se describe en la presente. Otros de tales anticuerpos pueden combinar un sitio de enlace TAT con un sitio de enlace para otra proteína. Alternativamente, una rama de anti-TAT puede combinarse con una rama que se enlaza a una molécula activadora en un leucocito tal como una molécula receptora de célula T, {e.g., CD3) o receptores Fe para IgG(FcyR), tales como FcyRI (CD64) , FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) , a fin de enfocar y localizar los mecanismos celulares de defensa para la célula que expresa TAT. Los anticuerpos biespecificos pueden utilizarse también para localizar agentes citotóxicos para células que expresan TAT. Estos anticuerpos poseen una rama de enlace TAT y una rama que enlaza el agente citotóxico (e.g., saporina, anti-interferon-a, alcaloide de vincapervinca, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno de isótopo radioactivo) . Los anticuerpos biespecxficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud total o fragmentos de anticuerpo (e.g. , anticuerpos F(ab')2 biespecxficos) . La WO 96/16673 describe un anticuerpo anti-ErbB2/anti-FcYRIII biespecxfico y la Patente de E.U. ?. 5,837,234 describe un anticuerpo anti-ErbB2/anti-FcyRI biespecxfico . Un anticuerpo anti-ErbB2/Fca biespecxfico se muestra en la WO98/02463. La Patente de E.U. No. 5,821,337 muestra un anticuerpo anti-ErbB2/anti-CD3 biespecxfico . Se conocen en la técnica los métodos para preparar anticuerpos biespecxficos . La producción tradicional de anticuerpos biespecxficos de longitud total se basa en la coexpresión de dos pares de inmunoglobulinas de cadena pesada-cadena ligera, en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein efc al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la selección aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales solo una tiene la estructura biespecxfica correcta. La purificación de la molécula correcta, que comúnmente se hace mediante etapas de cromatografía de afinidad, es más bien complicada y el rendimiento del producto es bajo. Procedimientos similares se describen en la WO 93/08829 y en Traunecker et al., E BO J. 10:3655-3659 (1991).
De acuerdo con un procedimiento diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios que combinan anticuerpo-antígeno) se encuentran fusionados a secuencias de inmunoglobulina de dominio constante. Preferentemente, la fusión es con un dominio constante de Ig de cadena pesada, que comprende al menos parte de las regiones articuladas CH2 y CH3. Se prefiere tener presente la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para el enlace de cadena ligera, en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de inmunoglobulina de cadena pesada y, si se desea, las de inmunoglobulina de cadena ligera, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transfectan dentro de una célula huésped adecuada. Esto proporciona mayor flexibilidad al ajusfar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipeptido en modalidades en donde las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipeptido utilizadas en la construcción proporcionan el rendimiento óptimo del anticuerpo biespecifico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas de polipeptido dentro de un solo vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no afectan significativamente el rendimiento de la combinación de cadena deseada. En una modalidad preferida de este procedimiento, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada híbrida de inmunoglobulina con una primera especificidad de enlace en una rama y un par híbrido de inmunoglobulina de cadena pesada-cadena ligera (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en la otra rama. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona un fácil modo de separación. Este procedimiento se describe en la O 94/04690. Para detalles adicionales para generar anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986). De acuerdo con otro procedimiento descrito en la Patente de E.U. No. 5,731,168, puede diseñarse la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante . La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3. En este método, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácido de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes {e.g. , tirosina o triptofano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena (s) lateral (es) grande (s) se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales grandes de aminoácido con más pequeñas {e.g.f alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como los homodímeros . Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir las células del sistema inmune hacia las células no deseadas (Patente de E.U. No. 4,676,980) y para el tratamiento de la infección VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados pueden elaborarse utilizando cualquier método conveniente de entrecruzamiento . Los agentes de entrecruzamiento adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen en la Patente de E.U. No. 4,676,980, junto con una variedad de técnicas de reticulación. Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando enlace químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se desdoblan proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente de acomplej amiento de ditiol, arsenita de sodio, para estabilizar los ditioles vecinos y prevenir la formación intermolecular de disulfuro. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte entonces a Fab' -tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecifico . Los anticuerpos biespecífieos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmunización selectiva de enzimas . El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli que pueden acoplarse químicamente para formar anticuerpos biespecificos . Shalaby et al., J . Exp . Med. 175:217-225 (1992) describe la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespeci ico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó por separado a partir de E. coli y se sometió a acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo biespecifico . El anticuerpo biespecifico así formado fue capaz de enlazarse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y las células T humanas normales, así como activar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de mama humano . También se han descrito varias técnicas para elaborar y aislar fragmentos biespecíficos de anticuerpo directamente a partir del cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se produjern anticuerpos biespecíficos utilizando zippers de leucina. Kostelny et al., J. Immunol . 148 (5) .-1547-1553 (1992). Los péptidos de zipper de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante la fusión del gen. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región articulada para formar monómeros y después se re-oxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología iabody" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecíficos . Los fragmentos comprenden un VH conectado a un VL mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el acoplamiento entre los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con esto, los dominios VH y L de un fragmento se fuerzan para hacer par con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, por lo cual forman dos sitios de enlace de antígeno. También se ha reportado otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de los dímeros Fv (sFv) de cadena única. Ver, Gruber et al., J. Immunol . , 152 :5368 (1994) . Se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos . Tutt et al., J. Immunol . 147 : SO (1991). 6. Anticuerpos Heteroconjugados Los anticuerpos heteroco jugados también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos covalentemente unidos. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir las células del sistema inmune a células no deseadas [Patente de E.U. No. 4,676,980] y para el tratamiento de la infección VIH [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089] . Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vitro utilizando métodos conocidos en la química de la proteína sintética, incluyendo aquellos que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace de tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos descritos, por ejemplo, en la Patente de E.U. No. 4,676,980. 7. Anticuerpos Muítivalentes Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más rápido que un anticuerpo bivalente mediante una célula que expresa un antígeno al cual se enlazan los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son diferentes de los de clase IgM). con tres o más sitios de enlace de antígeno (e.g., anticuerpos tetravalentes), que pueden producirse fácilmente mediante la expresión recombinante del ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multxvalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de enlace de antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste de) una región Fe o una región articulada. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de enlace de antígeno amino-terminal a la región Fe. El anticuerpo multxvalente preferido en la presente comprende (o consiste de) tres hasta aproximadamente ocho, pero de preferencia cuatro, sitios de enlace de antígeno. El anticuerpo multxvalente comprende al menos una cadena de polipéptido (y de preferencia dos cadenas de polipéptido) en donde la (las) cadena (s) de polipéptido comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la (las) cadena (s) de polipéptido puede (n) comprender VD1- (XI) n-VD2- (X2) n-Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena de polipéptido de una región Fe, XI y X2 representan un aminoácido o polipéptido y n es 0 o 1. Por ejemplo, la(s) cadena (s) de polipéptido puede (n) comprender: VH-CH1-enlazador flexible-VH-CHl-cadena de región Fe; o VH-CH1-VH-CHl-cadena de región Fe. El anticuerpo multivalente en la presente comprende además preferentemente al menos dos (y preferentemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente en la presente puede comprender, por ejemplo, desde aproximadamente dos hasta aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en la presente comprenden un dominio variable de cadena ligera y opcionalmente, comprenden además un dominio CL. 8. Diseño de la Función Efectora Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, e.g., a fin de mejorar la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del antigeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse introduciendo una o más sustituciones de aminoácido en una región Fe del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, el (los) residuo (s) de cisteína puede (n) introducirse en la región Fe, por lo cual se permite la formación del enlace de intercadenas de disulfuro en esta región. El anticuerpo homodimérico asi generado puede tener una capacidad de internalización incrementada y/o incrementada muerte celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Ver, Carón et al., J. Exp . ed. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J . Immunol . 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con actividad anti-tumor mejorada también pueden prepararse utilizando reticuladores heterobifuncionales como se describió en olf et al., Cáncer Research 53:2560-2565 (1993) . Alternativamente, puede diseñarse un anticuerpo que tenga regiones Fe duales y por lo cual puede tener lisis de complemento mejorada y capacidades ADCC. Ver, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989) . Para aumentar la vida media del suero del anticuerpo, se debe incorporar un epxtope de enlace del receptor de recuperación dentro del anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) por ejemplo como se describió en la Patente de E.U. 5,739,277,. Como se utiliza en la presente, el término "epxtope de enlace de receptor de recuperación" se refiere a un epxtope de la región Fe de una molécula IgG (e.g., IgGi, IgG2, IgG3 o IgG) que es responsable del incremento en la vida media del suero in vivo de la molécula IgG. 9. Inmunoconjugados La invención se refiere también a los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina {e.g., una toxina enzimáticamente activa de origen bacterial, fungal, vegetal o animal o sus fragmentos) o un isótopo radioactivo (i.e., un radioconjugado) . Se han descrito arriba los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados . Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden utilizarse incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos sin enlace de la toxina de difteria, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordxi, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Se encuentra disponible una variedad de radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 186 e. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se elaboran utilizando una variedad de agentes bifuncionales de acoplamiento de proteína tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) (SPDP) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL) , esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) exanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como tolieno 2 , 6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science, 238 : 1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3 -metildietilen triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente de quelación ej emplificativo para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Ver, WO94/11026. También se contemplan en la presente los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como una calicheamicina, maytansinoides , un tricoteno y CC1065 y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina. Maytansina y maytansinoides En una modalidad preferida, un anticuerpo anti-TAT (de longitud total o fragmentos) de la invención se conjuga a una o más moléculas maytansinoides. Los maytansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan inhbiendo la polimerización de tubulina. La maytansina se aisló primeramente del arbusto Africano del este Maytenus serrata (Patente de E.U. No. 3,896,111). Subsecuentemente se descubrió que ciertos microbios también - - producen maytansinoides tales como maytansinol y esteres de maytansinol C-3 (Patente de E.U. No. 4,151,042). Se describen el maytansinol sintético y sus derivados y análogos, por ejemplo, en las Patentes de E.U. Nos. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; y 4,371,533, cuyas descripciones se incorporan en la presente expresamente mediante la referencia. Conjugados de maytansinoide-anticuerpo En un intento para mejorar su índice terapéutico, la maytansina y maytansinoides se han conjugado a anticuerpos que se enlazan específicamente a antígenos de célula tumoral . Los inmunoconjugados que contienen maytansinoides y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en las Patentes de E.U. Nos. 5,208,020, 5,416,064 y en la Patente Europea EP 0 425 235 Bl, cuyas descripciones se incorporan en la presente expresamente mediante la referencia. Liu et al., Proc. Nati . Acad. Sel . USA 93:8618-8623 (1996) describió inmunoconjugados que comprenden un maytansinoide designado DM1 ligado al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se encontró que el conjugado es altamente citotóxico hacia células cultivadas de cáncer de colon y mostró actividad antitumoral en un análisis de crecimiento tumoral in vivo. Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992) describe inmunoconjligados en los cuales un maytansinoide se conjugó a través de un enlazador de disulfuro al anticuerpo murino A7 que enlaza un antígeno en líneas celulares humanas de cáncer de colon o a otro anticuerpo murino monoclonal TA.l que enlaza el oncógeno HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA.1-maytansinoide se probó in vitro en la línea celular humana de cáncer de mama SK-BR-3, que expresa 3 x 105 antígenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de droga logró un grado de citotoxicidad similar a la droga de maytansinoide libre, el cual pudo aumentarse incrementando el número de moléculas maytansinoides por molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maytansinoide mostró baja citotoxicidad sistemica en ratones. Conjugados de anticuerpo del polipéptido anti-TAT-maytansinoide (inmunoconjugados) Los conjugados de anticuerpo anti-TAT-maytansinoide se preparan enlazando químicamente un anticuerpo anti-TAT a una molécula maytansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica ya sea de la molécula de anticuerpo o del maytansinoide. Un promedio de 3-4 moléculas de maytansinoide conjugadas por molécula de anticuerpo ha mostrado eficacia para mejorar la citotoxicidad de las células objetivo sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque incluso se esperaría que una molécula de toxina/anticuerpo mejorara la citotoxicidad sobre el uso del anticuerpo desnudo. Los maytansinoides se conocen bien en la técnica y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Los maytansinoides adecuados se describen, por ejemplo, en la Patente de E.U. No. 5,208,020 y en otras publicaciones de patentes y no de patentes referidas anteriormente en la presente . Los maytansinoides preferidos son maytansinol y análogos de maytansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maytansinol, tal como varios esteres de maytansinol. Existen muchos grupos de enlace conocidos en la técnica para elaborar conjugados de anticuerpo-maytansinoide, incluyendo, por ejemplo, aquellos descritos en la Patente de E.U. No. 5,208,020 o Patente EP 0 425 235 Bl y Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992). Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles al ácido, grupos fotolábiles, grupos lábiles a peptidasa o grupos lábiles a estearasa, como se describe en las patentes anteriormente identificadas, siendo preferidos los grupos disulfuro y tioéter. Los conjugados de anticuerpo y maytansinoide pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como propionato de N-succinimidil-3- (2 -piridilditio) (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL) , esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina, diisocianatos (tales como tolueno 2 , 6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Los agentes de acoplamiento particularmente preferidos incluyen propionato de N-succinimidil-3 - (2-piridilditio) (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737
[1978]) y N-succinimidil-4- (2-piridiltio) pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace de disulfuro. El enlazador puede encontrarse unido a la molécula de maytansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace de éster puede formarse mediante la reacción con un grupo hidroxilo utilizando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción puede ocurrir en la posición C-3 teniendo un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En una modalidad preferida, el enlace se forma en la posición C-3 del maytansinol o un análogo de maytansinol .
Calicheamicina Otro inmunoconjugado de interés comprende un anticuerpo anti-TAT conjugado a una o más moléculas de calicheamicina. La familia de calicheamicina de antibióticos es capaz de producir rompimientos de ADN bicatenarios a concentraciones sub-picomolares . Para la preparación de los conjugados de la familia calicheamicina, ver Patentes de E.U. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas de American Cyanamid Company) . Los análogos estructurales de calicheamicina que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, ?±t , a2t · 3t , N-acetil-??1, PSAG y ?t? (Hinman et al., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes de E.U. anteriormente mencionadas de American Cyanamid) . Otra droga anti-tumoral a la cual puede conjugarse el anticuerpo es QFA que es un antifolato. Tanto la calicheamicina como la QFA tienen sitios intracelulares de acción y no cruzan fácilmente la membrana del plasma. En consecuencia, la absorción celular de estos agentes a través de la internal zac ón mediada por el anticuerpo mejora grandemente sus efectos citotóxicos. Otros agentes citotóxicos Otros agentes antitumorales que pueden conjugarse a los anticuerpos anti-TAT de la invención incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos colectivamente como complejo LL-E33288 descrito en las patentes de E.U. 5,053,394, 5,770,710, así como las esperamiciñas (patente de E.U. 5,877,296) . Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden utilizarse incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos sin enlace de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Ver, por ejemplo, O 93/21232 publicada en Octubre 28, 1993. La presente invención contempla además un i munoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica {e.g., una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN tal como desoxirribonucleasa; DNasa) . Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Se encuentra disponible una variedad de isótopos radioactivos para la producción de anticuerpos anti-TAT radioconj gados . Los ejemplos incluyen At211, I131, I125 Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el conjugado se utiliza para el diagnóstico, puede comprender un átomo radioactivo para estudios centellográficos, por ejemplo tc9Sm o I123 o una marca de rotación para la representación de imágenes por resonancia magnética nuclear (N R) (también conocida como representación de imágenes por resonancia magnética, mri) , tal como de nuevo yodo-123 yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15 ox£geno-17, gadolinio, manganeso o hierro. El radio u otras marcas pueden incorporarse en el conjugado de maneras conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse mediante la síntesis química de aminoácido utilizando precursores adecuados de aminoácido que involucran, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Las marcas tales como tc99m o I123, Re186, Re188 e In111 pueden unirse a través de un residuo de cisteína en el péptido. El itrio-90 puede unirse a través de un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al., (1978) Biochem. Biophys . Res. Commun. 80:49-57 puede utilizarse para incorporar el yodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" ("Anticuerpos onoclonales en la Inmunocentellográf£a" ) (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditio) (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL) , esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) -hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina, diisocianatos (tales como tolueno 2 , 6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describió en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminopentaacético ( X-DTPA) marcado con carbono-14 es un agente de quelación ej emplificativo para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Ver, O94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador desdoblable" que facilita la liberación de la droga citotóxica en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazador lábil al ácido, enlazador sensible a la peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador de dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992); Patente de E.U. No. 5,208,020). Alternativamente, puede elaborarse una proteína de fusión que comprende el anticuerpo anti-TAT y el agente citotóxico, e.g., mediante técnicas recombinantes o síntesis del péptido. La longitud del ADN puede comprender las regiones respectivas que codifican para las dos porciones del conjugado ya sea adyacentes entre si o separadas por una región que codifica para un péptido de enlace que no destruye las propiedades deseadas del conjugado. Aún en otra modalidad, el anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para su utilización en el pre-objetivo tumoral en donde el conjugado del receptor de anticuerpo se administra al paciente, seguido por el retiro en la circulación del conjugado no enlazado utilizando un agente de limpieza y después la administración de un "ligando" {e.g., avidina) que se conjuga a un agente citotóxico {e.g., un radionucleótido) . 10. In unoliposomas Los anticuerpos anti-TAT descritos en la presente también pueden formularse como inmunoliposomas. Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta de varios tipos de lipidos, fosfolipidos y/o surfactante que es útil para el suministro de una droga a un mamífero. Los componentes del liposoma comúnmente se encuentran dispuestos en una formación bicapa, similar a la disposición del lípido de las membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al . , Proc. Nati. Acad. Sci . USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 77:4030 (1980); las Pats . de E.U. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y W097/38731 publicada en Octubre 23, 1997. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente de E.U. No. 5,013,556. Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación en fase inversa con una composición de lípido que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros de un tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse a los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol.Chem. 257:286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro. Opcionalmente se encuentra contenido un agente quimioterapeutico dentro del liposoma. Ver, Gabizon et al., J. National Cáncer Inst . 81 (19) :1484 (1989) . B. Oligopéptidos de Enlace TAT Los oligopéptidos de enlace TAT de la presente invención son oligopéptidos que se enlazan, preferentemente de manera especifica a un polipéptido TAT como se describe en la presente. Los oligopéptidos de enlace TAT pueden sintetizarse químicamente utilizando metodología conocida para la síntesis de oligopéptidos o pueden prepararse y purificarse utilizando tecnología recombinante . Los oligopéptidos de enlace TAT son comúnmente de al menos aproximdamente 5 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82. 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 aminoácidos de longitud o más, en donde tales oligopéptidos son capaces de enlazarse, preferentemente de manera específica, a un polipéptido TAT como se describe en la presente. Los oligopéptidos de enlace TAT pueden identificarse sin experimentación indebida utilizando técnicas bien conocidas. A este respecto, se anota que las técnicas para la selección de bibliotecas de oligopéptidos para oligopéptidos que son capaces de enlazarse específicamente a un objetivo polipéptido son muy conocidas en la técnica (ver, e.g., Patentes de E.U. Nos. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Publicaciones PCT Nos. WO 84/03506 y WO 84/03564; Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 82:178-182 (1985); Geysen et al., en Synthetic Peptides as Antigens, (Péptidos Sintéticos como Antígenos) 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth. , 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988); Cwirla S.E. et al., (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA ., 87:6378; Lo man H.B. et al., (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson T. et al., (1991) Nature, 352:624; Marks J.D., et al., (1991), J. Mol. Biol . 222:581; ang A.S. et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 88:8363 y Smith G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2:668) . A este respecto, la imagen de bacteriófago (fago) es una técnica muy conocida que permite seleccionar grandes bibliotecas de oligopéptido para identificar al (a los) miembro (s) de aquellas bibliotecas que son capaces de enlazarse específicamente a un objetivo de polipéptido. La imagen fago es una técnica mediante la cual se despliegan polipéptidos variantes como proteínas de fusión para la proteína de recubrimiento en la superficie de las partículas del bacteriófago (Scott, J.K. y Smith, G.P. (1990) Science 249:386) . La utilidad de la imagen fago reside en el hecho de que las grandes bibliotecas de variantes de proteina selectivamente aleatorizadas (o ADNcs clonados aleatoriamente) pueden clasificarse rápida y eficientemente para aquellas secuencias que se enlazan a una molécula objetivo con alta afinidad. La imagen de las bibliotecas de péptido (Cwirla S.E. et al. (1990), Proc. Nati. Acad. Sci.
USA, 87:6378) o de protelna (Lowman, H.B. et al., (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson T. et al., (1991) Nature 352:624; Marks J.D. et al., (1991), J. Mol. Biol . , 222 : 581 ; anf A.S. et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363) en fago se han utilizado para seleccionar millones de polipéptidos u oligopéptidos para unos con propiedades de enlace específicas (Smith G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2:668) . La clasificación de las bibliotecas fago de imitantes aleatorios requiere una estrategia para construir y propagar un gran número de variantes, un procedimiento para la purificación de afinidad utilizando el receptor objetivo y un medio para evaluar los resultados de enriquecimientos del enlace. Patentes de E.U. Nos. 5,223,409, 5,403,484, 5 , 571 , 689 y 5 , 663 , 143. Aunque la mayoría de los métodos de imagen fago han utilizado un fago filamentoso, también se conocen sistemas lambdoides de imagen fago (WO 95/34683; U.S. 5,627,024), sistemas T4 de imagen fago ( en, Z-J. et al., (1998) Gene 215:439; Zhu Z. (1997) CAN 33:534; Jiang J. et al., (1997) can 128:44380; Ren Z-J. et al., (1997) CAN 127:215644; Ren Z-J. (1996) Protein Sci. 5:1833; Efimov, V.P. et al., (1995) Virus Genes 10:173) y sistemas T7 de imagen fago (Smith G.P. y Scott, J. . (1993) Methods in Enzymology, 217, 228_257; E.U. 5,766,905) . Se han desarrollado ahora muchas otras mejoras y variantes del concepto básico de imagen fago. Estas mejoras aumentan la capacidad de los sistemas de imagen para seleccionar bibliotecas de péptidos para enlazarse a moléculas objetivo seleccionadas y para desplegar proteínas funcionales con el potencial de seleccionar estas proteínas para las propiedades deseadas . Se han desarrollado dispositivos de reacción combinatoria para las reacciones de imagen fago (WO 98/14277) y se han utilizado bibliotecas de imagen fago para analizar y controlar las interacciones bimoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) y las propiedades de péptidos helicoidales forzados (WO 98/20036) . La WO 97/35196 describe un método para aislar un ligando de afinidad en el cual una biblioteca de imagen fago se encuentra en contacto con una solución en la cual el ligando se enlazará a una molécula objetivo y una segunda solución en la cual el ligando de afinidad no se enlazará a la molécula objetivo, para aislar selectivamente los ligandos de enlace. La WO 97/46251 describe un método para la bio-panoramización de una biblioteca aleatoria de imagen fago con un anticuerpo de afinidad purificado y después el aislamiento del fago de enlace, seguido por un proceso de micro-panoramización utilizando pozos de micro-placas para aislar el fago de alta afinidad de enlace. También se ha reportado el uso de la proteína A de Staphylococcus aureus como una etiqueta de afinidad (Li et al., (1998) Mol. Biotech. , 9:187). La WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de sustracción de sustrato para distinguir las especificidades de la enzima utilizando una biblioteca combinatoria que puede ser una biblioteca de imagen fago. Un método para seleccionar las enzimas adecuadas para su uso en detergentes utilizando imagen fago se describe en la WO 97/09446. Los métodos adicionales para seleccionar proteínas de enlace especificas se describen en las Patentes de E.U. Nos. 5,498,538, 5,432,018 y WO 98/15833. Los métodos para generar bibliotecas de péptidos y seleccionar estas bibliotecas también se encuentran descritos en las Patentes de E.U. Nos. 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192 y 5,723,323. C. Moléculas Orgánicas de Enlace TAT Las moléculas orgánicas de enlace TAT son moléculas orgánicas diferentes de los oligopéptidos o anticuerpos como se definen en la presente que se enlazan, preferentemente de manera especifica, a un polipéptido TAT como se describe en la presente. Las moléculas orgánicas de enlace TAT pueden identificarse y sintetizarse químicamente utilizando metodología conocida (ver, e.g., Publicaciones PCT Nos. WO00/00823 y WO00/39585) . Las moléculas orgánicas de enlace TAT son comúnmente menores a aproximadamente 2000 daltones en tamaño, alternativamente menores a aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 daltones de tamaño, en donde tales moléculas orgánicas que son capaces de enlazarse, preferentemente de manera específica, a un polipéptido TAT como se describió en la presente pueden identificarse sin experimentación indebida utilizando técnicas muy conocidas. A este respecto, se anota que las técnicas para seleccionar biblioecas de moléculas orgánicas para moléculas capaces de enlazarse a un objetivo polipéptido son muy conocidas en la técnica (ver e.g.. Publicaciones PCT Nos. WO00/00823 y WOOO/39585. Las moléculas orgánicas de enlace TAT pueden ser por ejemplo, aldehidos, cetonas oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas N-sustitu£das , hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílicos, esteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acétales, tioacetales, haluros de arilo, sulfonatos de arilo, haluros de alquilo, sulfonatos de alquilo, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alquinos, dioles, aminoalcoholes oxazolidinas oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazo, cloruros de ácido o lo similar. D. Selección de Anticuerpos Anti-TAT oligopeptidos de enlace TAT y Moléculas Orgánicas de Enlace TAT con las Propiedades Deseadas Las técnicas para generar anticuerpos oligopeptidos y moléculas orgánicas que se enlazan a polipéptidos TAT se han descrito anteriormente. Además se pueden seleccionar anticuerpos oligopeptidos u otras moléculas orgánicas con ciertas características biológicas, según se desee. Los efectos inhibidores del crecimiento de un anticuerpo anti-TAT oligopéptido u otra molécula orgánica de la invención pueden valorarse mediante métodos conocidos en la técnica, e.g., utilizando células que expresan un polipéptido TAT ya sea endógenamente o seguido de la transfección con el gen TAT. Por ejemplo, pueden tratarse líneas celulares tumorales apropiadas y células TAT-transfectadas con un anticuerpo monoclonal anti-TAT oligopéptido, u otra molécula orgánica de la invención en varias concetraciones durante unos cuantos días (e.g., 2-7 días) y colorearse con violeta de cristal o MTT o analizarse mediante algún otro análisis colorimétrico . Otro método para medir la proliferación sería comparar la absorción de timidina 3H por las células tratadas en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-TAT, un oligopéptido de enlace TAT o la molécula orgánica de enlace TAT de la invención. Después del tratamiento las células se cosechan y la cantidad de radiactividad incorporada dentro del ADN se cuantifica en un contador de escintilación. Los controles positivos apropiados incluyen el tratamiento de una línea celular seleccionada con un anticuerpo inhbidor de crecimiento conocido por inhibir el crecimiento de esa línea celular. La inhibición del crecimiento de las células tumorales in vivo puede determinarse en varias formas conocidas en la técnica. Preferentemente, la célula tumoral es la que sobreexpresa un polipéptido TAT. Preferentemente, el anticuerpo anti-TAT, el oligopéptido de enlace TAT o la molécula orgánica de enlace TAT inhibirán la proliferación celular de una célula tumoral que expresa TAT in vitro o in vivo por aproximadamente 25-100% en comparación con la célula tumoral no tratada, más preferentemente, por aproximadamente 30-100% y aún más preferentemente por aproximadamente 50-100% o 70-100%, en una modalidad, a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µg/ml. La inhibición del crecimiento puede medirse a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 µ9/p?1 o aproximadamente 0.5 nM a 200 nM en el cultivo celular, en donde la inhibición del crecimiento se determina de 1-10 días después de la exposición de las células tumorales al anticuerpo. El anticuerpo es inhibidor del crecimiento in vivo si la administración del anticuerpo anti-TAT en aproximadamente 1 ucj/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal da como resultado la reducción en el tamaño del tumor o la reducción de la proliferación de la célula tumoral dentro de aproximadamente 5 días hasta 3 meses desde la primera - - administración del anticuerpo, preferentemente dentro de aproximadamente 5 a 30 días. Para seleccionar un anticuerpo anti-TAT, un oligopéptido de enlace TAT o una molécula orgánica de enlace TAT que induce la muerte celular, puede valorarse la pérdida de la integridad de la membrana como se indica e.g., por la absorción de yoduro de propidio (PI) azul de tripano o absorción de 7AAD en relación al control . Un análisis de absorción de PI puede llevarse a cabo en ausencia de células del complemento y efectoras inmunes. Las células tumorales que expresan el polipéptido TAT se incuban con un medio solo o con un medio que contiene el anticuerpo anti-TAT apropiado (e.g., en aproximadamente 10 µg/ml) , el oligopéptido de enlace TAT o la molécula orgánica de enlace TAT. Las células se incuban durante un periodo de 3 días . Después de cada tratamiento, las células se lavan y se hacen alícuotas en tubos de 12 x 75 cubiertos con un filtro de 35 mm (1 mi por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para el retiro de aglutinaciones de células. Los tubos reciben entonces PI (10 g/ml) . Las muestras pueden analizarse utilizando un citómetro de flujo FACSCAN® y el software CellQuest FACSCONVERT® (Becton Díckinson) . Aquellos anticuerpos anti-TAT oligopéptidos de enlace TAT o moléculas orgánicas de enlace TAT que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular determinado por la absorción de PI pueden seleccionarse como anticuerpos anti-TAT oligopéptidos de enlace TAT o moléculas orgánicas de enlace TAT que inducen la muerte celular. Para seleccionar anticuerpos oligopéptidos u otras moléculas orgánicas que se enlazan a un epitope en un polxpeptido TAT enlazado por un anticuerpo de interés, puede llevarse a cabo un análisis de rutina de bloqueo cruzado tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988) . Este análisis puede utilizarse para determinar si un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica de prueba se enlaza al mismo sitio o epitope como un anticuerpo anti-TAT conocido. Alternativamente o de manera adicional, puede llevarse a cabo una representación del epitope mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia del anticuerpo puede mutagenizarse tal como mediante exploración de alanxna para identificar residuos de contacto. El anticuerpo mutante se prueba inicialmente para enlazarse con el anticuerpo policlonal para asegurar el plegamiento apropiado. En un método diferente, los péptidos que corresponden a diferentes regiones de un polipéptido TAT pueden utilizarse en análisis de competencia con los anticuerpos de prueba o con un anticuerpo de prueba y un anticuerpo con un epitope caracterizado o conocido. E. Terapia de Prodroga Mediada por la Enzima Dependiente del Anticuerpo (ADEPT) Los anticuerpos de la presente invención también pueden utilizarse en ADEPT conjugando el anticuerpo a una enzima de activación de prodrogas que convierte una prodroga (e.g., un agente quimioterapéutico de peptidilo, ver WO81/01145) en una droga activa anti-cáncer. Ver por ejemplo, O 88/07378 y la Patente de E.U. No. 4,975,278. El componente de enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en una prodroga de tal modo que la convierte a su forma citotóxica más activa. Las enzimas que son útiles en el método de esta inveción incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir prodrogas que contienen fosfato en drogas libres; arilsulfatasa útil para convertir prodrogas que contienen sulfatos en drogas libres; citosina deaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no-tóxica en la droga anticáncer, 5-fluoruracilo; proteasas, tales como la proteasa serratia, termolisina subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como las catepsinas B y L) , que son útiles para convertir prodrogas que contienen péptido en drogas libres; D-alanilcarboxipeptidasas , útiles para convertir prodrogas que contienen sustituyentes D-aminoácido ,- enzimas de desdoblamiento de carboxidrato tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir prodrogas glicosiladas en drogas libres; ß-lactamasa útil para convertir drogas derivadas con ß-lactanos en drogas libres; y amidasas de penicilina, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir drogas derivadas en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en drogas libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como uabzimas" , pueden utilizarse para convertir las prodrogas de la invención en drogas activas libres (ver, e.g., Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Los conjugados de anticuerpo-abzima pueden prepararse como se describe en la presente para suminisrar la abzima a una población de células tumorales . Las enzimas de esta invención pueden enlazarse covalentemente a los anticuerpos anti-TAT mediante técnicas muy conocidas en la técnica tales como el uso de los reactivos eterobifuncionales de reticulación tratados anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de enlace de antigeno de un anticuerpo de la invención enlazadas a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención pueden construirse utilizando técnicas recombinantes de ADN muy conocidas en la técnica (ver, e.g., Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984) . F. Polipéptidos TAT de Longitud Total La presente invención proporciona también secuencias de nucleótido recientemente identificadas y aisladas que codifican los polipéptidos referidos en la presente solicitud como polipéptidos TAT. En particular, los ADNcs (de longitud parcial y total) que codifican varios polipéptidos TAT se han identificado y aislado, como se describe en mayor detalle abajo en los Ejemplos. Como se describe en los Ejemplos abajo, se han depositado varios clones de ADNc en la ATCC. Las secuencias de nucleótido actuales de aquellos clones pueden determinarse fácilmente por el técnico experto mediante el secuenciado del clon depositado utilizando métodos de rutina en la técnica. La secuencia de aminoácidos predicada puede determinarse a partir de la secuencia de nucleótidos utilizando experiencia de rutina. Para los polipéptidos TAT y los ácidos nucleicos de codificación descritos en la presente, en algunos casos, los Solicitantes han identificado lo que se considera ser el marco de lectura mejor identificable con la información de secuencia disponible por el momento. G. Variantes de Anticuerpo Anti-TAT y Polipéptido TAT Adicionalmente a los anticuerpos anti-TAT y los polipéptidos TAT de longitud total de la secuencia nativa descritos en la presente, se contempla que pueden prepararse variantes del anticuerpo anti-TAT y del polipéptido TAT. Las variantes del anticuerpo anti-TAT y del polipéptido TAT pueden prepararse introduciendo los cambios apropiados del nucleótido en el ADN de codificación y/o mediante la síntesis del anticuerpo o polipéptido deseado. Los expertos en la técnica apreciarán que los cambios del aminoácido pueden alterar los procesos port-translacionales del anticuerpo anti-TAT o del polipéptido TAT, tales como el cambio del número o posición de los sitios de glicosilación o alterar las características de anclaje de la membrana. Las variaciones en los anticuerpos anti-TAT y los polipéptidos TAT descritos en la presente, pueden elaborarse, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y lineamientos para mutaciones conservadoras y no conservadoras publicadas, por ejemplo, en la Patente de E.U. No. 5,364,934. Las variaciones pueden ser una sustitución, eliminación o inserción de uno o más codones que codifican el anticuerpo o polipéptido que dan como resultado un cambio en la secuencia de aminoácidos en comparación con el anticuerpo o polipéptido de la secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es por sustitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. La guía para determinar cuál residuo de aminoácido puede insertarse, sustituirse o suprimirse sin afectar de manera adversa la actividad deseada puede encontrarse comparando la secuencia del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT con la de moléculas de proteína homologas conocidas y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácido hechos en regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácido pueden ser el resultado del reemplazo de un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina con una serina, i.e., reemplazos conservadores de aminoácido. Las inserciones o eliminaciones pueden encontrarse opcionalmente en el rango de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse haciendo sistemáticamente inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y analizando las variaciones resultantes para la actividad exhibida por la secuencia nativa de longitud total o madura. Se proporcionan en la presente los fragmentos del anticuerpo anti-TAT y del polipéptido TAT. Tales fragmentos pueden encontrarse truncados en las N-terminal o C-terminal o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, al compararse con un anticuerpo o proteína nativa de longitud total . Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácido que no son esenciales para una actividad biológica deseada del anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT. Los fragmentos del anticuerpo anti-TAT y del polipéptido TAT pueden prepararse mediante cualquiera de una variedad de técnicas convencionales. Los fragmentos de péptido deseados pueden sintetizarse químicamente. Un procedimiento alternativo implica generar fragmentos de anticuerpo o polipéptido mediante digestión enzimática, e.g., tratando la proteína con una enzima conocida para desdoblar las proteínas en sitios definidos por medio de residuos de aminoácido particulares o por digerir el ADN con enzimas de restricción adecuadas y aislar el fragmento deseado. Aún otra técnica adecuada implica aislar y amplificar un fragmento de ADN que codifica un fragmento de anticuerpo o polipéptido deseado mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Los oligonucleó idos que definen los términos deseados del fragmento de ADN se emplean en los iniciadores 5' y 3' en la PCR. Preferentemente, los fragmentos de anticuerpo anti-TAT y de polipéptido TAT comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT nativo descritos en la presente . En modalidades particulares, las sustituciones conservadoras de interés se muestran en la Tabla 6 bajo el encabezado de las sustituciones preferidas. Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se introducen más cambios sustanciales, denominados sustituciones ejemplificativas en la Tabla 6 o como se describe adicionalmente más adelante con referencia a las clases de aminoácidos se introducen y se seleccionan los productos . Tabla 6 Residuo Sustituciones Sustituciones Original Ej emplificativas Preferidas val ; leu,- le lys;gln;asn gln;his ;lys ; arg glu ser asn asp pro; ala asn;gln,-lys ; arg 1eu;val ;met ; ala;phe; norleucina norleucina; ile; val; met ; ala; phe arg; gln; asn leu; phe; ile leu; val; ile; ala; tyr ala thr ser tyr; phe trp; phe; thr; ser Val (V) ile ; leu; met ; phe; ala; norleucina leu Se logran modificaciones sustanciales en función o la identidad inmunológica del anticuerpo anti-TAT o del polipeptido TAT seleccionando las sustituciones que difieren significati amente en su efecto para mantener (a) la estructura de la estructura del polipeptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que se presentan naturalmente se dividen en grupos en base a las propiedades de la cadena lateral común: (1) hidrofóbicos : norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrof licos neutrales: cys, ser, thr; (3) acídicos : asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influencian la orientación de la cadena: gly,pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe. Las sustituciones no conservadoras ocasionarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Tales residuos sustituidos pueden introducirse en los sitios de sustitución conservadora o, más preferentemente, en los sitios restantes (no-conservados) .
Las variaciones pueden efectuarse utilizando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis mediada por oligonucleótido (dirigida al sitio) , exploración de alanina y mutagénesis de PCR. La mutagénesis dirigida al sitio [Cárter et al., ucí. Acids Res. 13:4331 (1986), Zoller et al., Nucí . Acids Res . 10:6487 (1987)], la mutagénesis de cásete [Wells et al., Gene, 3_4:315 (1985)], la mutagénesis de selección de restricción [Wells et al . , Philos. Trans . R. Soc . London Ser. 317 : 415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden llevarse a cabo en el ADN clonado para producir el ADN variante del anticuerpo anti-TAT o del polipéptido TAT. También puede emplearse el análisis de exploración de aminoácido para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia continua. Entre los aminoácidos de exploración preferidos se encuentran los aminoácidos relativamente pequeños, neutros. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. Alanina es típicamente un aminoácido de exploración preferido entre este grupo debido a que elimina la cadena lateral más allá del beta-carbono y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. También se prefiere típicamente la alanina debido a que es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en ambas posiciones oculta y expuesta [Creighton, The Proteins, (W.H.
- - Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol.Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce las cantidades adecuadas de variantes, puede utilizarse un aminoácido isotérico . Cualquier residuo de cisteina no involucrado en mantener la apropiada conformación del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación aberrante. De manera inversa, puede (n) agregarse enlace (s) de cisteina al anticuerpo anti-TAT o al polipéptido TAT para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) . Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional implica la sustitución de uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo nativo (e.g., un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante (s) resultante (s) seleccionada (s) para el desarrollo posterior tendrá (n) propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo nativo a partir del cual se genera (n) . Un modo conveniente para generar tales variantes sustitucionales implica maduraciones de afinidad utilizando imagen fago. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (e.g., sitios 6-7) se encuentran mutados para generar todas las sustituciones de aminoácido posibles en cada sitio. Las variantes del anticuerpo asi generadas se despliegan de una manera monovalente a partir de partículas fago filamentosas como fusiones para el producto del gen III de 13 encapsulado dentro de cada partícula. Las variantes fago-desplegadas se seleccionan entonces por su actividad biológica (e.g., afinidad de enlace) como se describe en la presente. A fin de identificar sitios candidato de región hipervariable para la modificación, puede llevarse a cabo la mutagénesis de exploración de alanina para identificar los residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente al enlace del antígeno . Alternativamente o adicionalmente, puede ser benéfico analizar una estructura de cristal del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el polipéptido TAT humano. Tales residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo a las técnicas elaboradas en la presente. Una vez generadas tales variantes, el panel de variantes se somete a selección como se describe en la presente y pueden seleccionarse los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más análisis relevantes para desarrollo posterior. Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de secuencia de aminoácido del anticuerpo anti-TAT se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de las variantes de secuencia de aminoácido que se presentan de manera natural) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida al sitio) , mutagénesis PCR y mutagénesis de cásete de una variante preparada con mayor anterioridad o una versión no-variante del anticuerpo anti-TAT. H. Modificaciones de Anticuerpos Anti-TAT y Polipéptidos TAT Las modificaciones covalentes de los anticuerpos anti-TAT y los polipéptidos TAT se incluyen dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos de aminoácido objetivo de un anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT con un agente orgánico de derivación que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminal del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. La derivación con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para la reticulación del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su uso en el método para purificar anticuerpos anti-TAT y viceversa. Los agentes de reticulación comúnmente utilizados incluyen, e.g. , 1, 1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehído, esteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalic£lico, imidoésteres homobifuncionales, - 2 - incluyendo esteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) , maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1, 8-octano y agentes tales como metil-3- [ (p-azidofenil) ditio] propioimidato . Otras modificaciones incluyen la deamidación de los residuos de glutaminilo y asparaginilo a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de los residuos de serilo o treonilo, la metilación de los grupos oc-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina [T.E. Creighton, Proteins : Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT incluido dentro del alcance de esta invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del anticuerpo o polipéptido. La "alteración del patrón de glicosilación nativo" pretende significar para los propósitos en la presente, suprimir uno o más residuos de carbohidrato encontrados en el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT de secuencia nativa (ya sea retirando el sitio de glicosilación subyacente o suprimiendo la glicosilación mediante medios químicos y/o enzim ticos) y/o agregando uno o más sitios de glicosilación que no se encuentran presentes en el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT de secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, implicando un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos residuos de carbohidrato presentes . La glicosilación de anticuerpos y otros polipéptidos es típicamente ya sea Enlazada a N o enlazada a O. Enlazada a N se refiere a la unión del residuo de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del residuo de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De este modo, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial . Glicosilación Enlazada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares de N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque puede utilizarse también 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácido de modo tal que contenga una o más de las secuencias de tripéptido arriba descritas (para sitios de glicosilación Enlazados a N) . La alteración también puede efectuarse mediante la adición o la sustitución de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT original (para sitios de glicosilación Enlazados a O) . La secuencia de aminoácido del anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT puede alterarse opcionalmente a través de cambios en el nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT en bases preseleccionadas de modo tal que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados . Otro medio para incrementar el número de residuos de carbohidrato en el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT es mediante acoplamiento químico o enzimático de glicosidos al polipéptido. Tales métodos se describen en la técnica, e.g. , en la WO 87/05330 publicada el 11 de Septiembre de 1987 y en Aplin y Wriston, CRC Crit . Rev. Biochem. , p . 259-306 (1981) . El retiro de los residuos de carbohidrato presentes en el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT puede lograrse química o enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de los codones que codifican para residuos de aminoácido que sirven como objetivo para la glicosilación. Las técnicas químicas de desglicosilación se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, por Hakimuddin et al., Arch. Biochem.
Biophys . , 259 : 52 (1987) y por Edge et al., Anal. Biochem. , 118 : 131 (1981) . El desdoblamiento enzimático de los residuos de carbohidrato en los polipéptidos puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo-y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al., Meth . Enzymol , 138 :350 (1987). Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT comprende enlazar el anticuerpo o polipéptido a uno de una variedad de polímeros no-proteináceos, e.g., polietilen glicol (PEG) , polipropilen glicol o polioxialquilenos, en la manera indicada en las Patentes de E.U. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; o 4,179,337. El anticuerpo o polipéptido también puede atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, cápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente) , en sistemas coloidales de suministro de drogas (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición Oslo, A. , Ed. , (1980) . El anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT de la presente invención también pueden modificarse en una manera para formar moléculas quiméricas que comprenden un anticuerpo - - anti-TAT o polipéptido TAT fusionado a otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácido. En una modalidad, tal molécula quimérica comprende una fusión del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT con un polipéptido marcador que proporciona un epítope al cual puede enlazarse selectivamente un anticuerpo anti-marcador. El marcador de epítope se coloca generalmente en el terminus de amino- o carboxilo- del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT. La presencia del tales formas epítope-marcadas del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT pueden detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido marcador. También, la provisión del marcador de epítope permite que el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT se purifique fácilmente por purificación de afinidad utilizando un anticuerpo anti-marcador u otro tipo de matriz de afinidad que se enlace al marcador de epítope . Varios polipéptidos marcador y otros anticuerpos respectivos son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen marcadores de poli-histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly) ; el polipéptido marcador flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Pield et al., Mol . Cell. Biol., :2159-2165 (1988)]; el marcador c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4 y 9E10 para el mismo [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985); y el marcador de glicoproteína D (gD) del virus de Herpes Simples y su anticuerpo [Paborsky et al . , Protein Engineering, 3(6) :547-553 (1990)]. Otros polipéptidos de marcador incluyen el péptido Marcados [Hoop et al., EioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido KT3 de epítope [Martín et al., Science, 255 : 192-194 (1992)]; un péptido de epítope de a-tubulina [Skinner et al., J. Biol . Chem. , 266: 15163-15166 (1991) ] ; y el marcador de péptido del gen T7 de la proteína 10 [Lutz-Freyermuth et al. , Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 87:6393-6397 (1990)]. En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como una "inmunoadhesina" ) , tal fusión podría ser para la región Fe de una molécula IgG. Las fusiones Ig incluyen de preferencia la sustitución de una forma soluble (dominio transmembrana suprimido o inactivado) de un anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula Ig. En una modalidad particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye la articulación, CH2 y CH3 o la articulación CHa, CH2 y las regiones CH3 de una molécula IgGl . Para la producción de fusiones de inmunoglobulina ver también la Patente de E.U. No. 5,428,130 expedida en Junio 27, 1995. I . Preparación de Anticuerpos Anti-TAT y Polipéptidos TAT La siguiente descripción se refiere principalmente a la producción de anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT cultivando células transformadas o transfectadas con un vector que contiene un anticuerpo anti-TAT y un polipéptido TAT que codifica ácido nucleico. Por supuesto, se contempla que pueden emplearse métodos alternativos, que son bien conocidos en la técnica, para preparar anticuerpos anti-TAT y polipéptidos TAT. Por ejemplo, la secuencia de aminoácido apropiada o sus porciones, puede producirse mediante síntesis directa del peptido utilizando técnicas de fase sólida [ver, e.g., Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 8_5: 2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteína in vitro puede llevarse a cabo utilizando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada puede lograrse, por ejemplo, utilizando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Varias porciones del anticuerpo anti-TAT o del polipéptido TAT pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse utilizando métodos químicos o enzimáticos para producir el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT deseado. 1. Aislamiento del Anticuerpo Anti-TAT o Polipéptido TAT que codifica ADN El anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT que codifica ADN puede obtenerse a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el mARN del anticuerpo anti-TAT o del polipéptido TAT y que lo expresa en un nivel detectable. De acuerdo con esto, el anticuerpo anti-TAT humano o el ADN del polipéptido TAT pueden obtenerse convenientemente de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido humano. El gen que codifica el anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT también puede obtenerse de una biblioteca genómica o mediante procedimientos sintéticos conocidos (e.gr. , síntesis automatizada de ácido nucleico) . Las bibliotecas pueden seleccionarse con sondas (tales como oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés de la proteína codificada por el. La selección del ADNc o biblioteca genómica con la sonda seleccionada pueden llevarse a cabo utilizando procedimientos estándar, tales como los descritos en Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT es utilizar metodología PCR [Sambrook et al., supra : Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
- - Las técnicas para seleccionar una biblioteca de ADNc son bien conocidas en la técnica. Las secuencias de oligonucleótido seleccionadas como sondas deben ser de longitud suficiente y suficientemente inambiguas que los falsos positivos se minimicen. El oligonucleótido se marca de preferencia de tal modo que puede detectarse a la hibridación al ADN en la biblioteca que se selecciona. Los métodos de marcado son bien conocidas en la técnica, e incluyen el uso de radiomarcas como ATP 32P-marcado, biotinilación o marcado con enzimas . Las condiciones de hibridización, incluyendo rigidez moderada y alta rigidez, se proporcionan en Sambrook et al., supra. Las secuencias identificadas en tales métodos de selección de biblioteca pueden compararse y alinearse a otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases públicas de datos tales como GenBank u otras bases privadas de datos . La identidad de secuencia (ya sea en el nivel aminoácido o nucleótido) dentro de regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia de longitud total pueden determinarse utilizando métodos conocidos en la técnica y como aquí se describe. El ácido nucleico que tiene secuencia que codifica proteína puede obtenerse seleccionando el ADNc o las bibliotecas genómicas utilizando la secuencia de aminoácido deducida descrita en la presente por primera vez y, si es - - necesario, utilizando procedimientos de primera extensión convencionales como se describe en Sambrook et al . , supra, para detectar precursores y procesar intermediarios de mARN que pueden no haber sido reversa-transcritos dentro del ADNc. 2. Selección y Transformación de Células Huésped Las células huésped se transfectan o se transforman con vectores de expresión o de clonación descritos en la presente para la producción del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT y se cultivan en un medio nutritivo convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformadores o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones del cultivo, tales como el medio, temperatura, pH y lo similar, pueden seleccionarse por el técnico experto sin experimentación indebida. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, .Butler, ed. (I L Press, 1991) y Sambrook et al., supra. Los métodos de transfección de célula eucariótica y transformación de célula procariótica son conocidos para el técnico de experiencia ordinaria, por ejemplo, CaCl2, CaP0 , liposoma-mediada y electroporacion. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se lleva a cabo utilizando técnicas estándar apropiadas para tales células.
El tratamiento de calcio empleando cloruro de calcio, como se describe en Sambrook et a . , supra o la electroporación se utilizan generalmente para procariotos . La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células vegetales como se describe por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/95859 publicada el 29 de Junio de 1989. Para células de mamífero sin tales paredes celulares, puede emplearse el método de precipitación de fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52 :456-457 (1978) . Los aspectos generales de las transfecciones de sistema huésped de célula de mamífero se han descrito en la Patente de E.U. No. 4,399,216. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo típicamente de acuerdo al método de Van Solingen et al., J. Bact . , 130 : 946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Nati. Acad. Sel. (USA) , 76:3829 (1979) . Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos para introducir el ADN en las células tales como microinyección nuclear, electroporación, fusión bacterial de protoplasto con células intactas o policationes , e.g., polibreno, poliornitina . Para varias técnicas para transformar células de mamífero, ver Keo n et al., Methods in Enzimology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature , 336:348-352 (1988). Las células huésped adecuadas para clonar o expresar el ADN en los vectores en la presente incluyen procarioto, levadura o mayores células eucarioto. Los - - procariotos incluyen pero no se limitan a eubacteria, tal como organismos Gramo-negativo o Gr mo-positivo, por ejemplo, Enterobacteriáceas tal como E. coli . Varias especies de E. coli se encuentran disponibles públicamente, tales como la especie E. coli K12 MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); la especie E. coli W3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células procarioticas huésped adecuadas incluyen Enterobacteriáceas tales como Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klehsiella, Proteus, Salmonella, e.g. , Salmonella typhimurium, Serratia, e.g. , Serratia marcescans y Shigella, asi como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (e.g., B. licheniformis 41P descrita en DD 266,710 publicada el 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. La especie W3110 es un huésped o huésped nativo particularmente preferido debido a que es una especie huésped común para las fermentaciones de producto del ADN recombinante . Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas . Por ejemplo, la especie W3110 puede modificarse para efectuar una mutación genética en los genes que codifican las proteínas endógenas al huésped, con ejemplos de tales huéspedes incluyendo la especie E. coli W3110 1A2 , que tiene el genotipo tonA completo; especie E. coli 3110 9?4, que tiene el genotipo tonA ptr3 completo; especie E. coli 3110 27C7 (ATCC 55,244), que tiene el genotipo tonA ptr3 phoA E15 completo (argF-lac) 169 degP ompT kanr¡ especie E. coli 3110 37D6, que tiene el genotipo tonA ptr3 phoA E15 completo {argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; especie E. coli W3110 40B4, que es una especie 37D6 con mutación de supresión degP no resistente a la kanamicina y la especie E. coli que tiene la proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente de E.U. No. 4,946,783 expedida el 7 de Agosto de 1990. Alternativamente, son adecuados los métodos de clonación in vitro, e.g., PCR u otras reacciones polimerasa de ácido nucleico. El anticuerpo de longitud total, los fragmentos de anticuerpo y las proteínas de fusión de anticuerpo pueden producirse en bacterias, en particular cuando no se necesita glicosilación y efector Fe, tal como cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga a un agente citotóxico (e.g., una toxina) y el inmunoconj ugado por sí mismo muestra efectividad en la eliminación de la célula tumoral . Los anticuerpos de longitud total tienen mayor vida media en circulación. La producción de E. coli es más rápida y más eficiente en costo. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, ver, e.g., la U.S. 5,648,237 (Cárter et al.), U.S. 5,789,199 (Joly et al.) y U.S. 5,840,523 (Simmons et al . ) que describen la región de inicio de translación (TIR) y las secuencias de señal para optimizar la expresión y la secreción, estas patentes se incorporan en la presente por referencia. Después de la expresión, el anticuerpo se aisla a partir de pasta celular de E. coli en una fracción soluble y puede purificarse mediante, e.g., una columna A o G de proteína dependiendo del isotipo. La purificación final puede llevarse a cabo similar al proceso para purificar el anticuerpo expresado e.g., en células CHO. Además de los procariotos, los microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levadura son huéspedes de clonación o de expresión adecuados para los vectores que codifican el anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico menor comúnmente utilizado. Otros incluyen, Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290:140
[1981]; EP 139, 383 publicada el 2 de Mayo de 1985) ; huéspedes Kluyveromyces (Patente de E.U. No. 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technolog , 9:968-975 (1991) tales como e.g., K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al.,.J. Bacteriol . , 154 (2) : 737-742
[1983]); K.fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045); K. wickeramii (ATCC 24,178); K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van der Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol ., 28 : 265-278 - -
[1988]; Candida; Trichoder a recia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 76:5259-5253
[1979] ) ; Schwarmiomyces tales como Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicada en Octubre 31 de 1990); y hongos filamentosos tales como e.g., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de Enero de 1991) y huéspedes Aspergilius tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys . Res. Commmon, 112:284-289
[1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221
[1983]; Yelton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474
[1984]; y A Níger (Kelly and Hynes, EMBO J. , 4:475-479
[1985]. Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en la presente e incluyen, pero no se limitan a, levadura capaz de crecimiento en metanol seleccionada del género que consiste de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotorula. Una lista de las especies especificas que son ej emplificativos de esta clase de levaduras puede encontrarse en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982) . Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpo anti-??? o del polipéptido TAT se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células invertebradas incluyen las células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, asi como células vegetales, tales como los cultivos celulares de algodón, maíz, semilla de soya, petunia, tomate y tabaco. Se han identificado numerosas - - especies y variantes bacilovirales y las células huésped de insecto permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera. frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la f uta) y Bombix morí . Una variedad de especies virales para transfeccion se encuentran disponibles públicamente, e.g. , la variante L-l de Autographa californica NPV y la especie Bm-5 de Bombix mori NPV y tales virus pueden utilizarse como el virus presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfeccion de células de Spodoptera frugiperda. Sin embargo, el interés ha sido mayor en las células vertebradas y la propagación de las células vertebradas en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; línea de riñon embriónico humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol . 36:59 (1977)); células renales de bebe hámster (BHK, ATCC CCL 10) ; células ováricas de hámster Chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 77:4216 (1980); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. , 23:243-251 (1980)); células renales de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34) ; células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células pulmonares humanas ( 138, ATCC CCL 75) ; células hepáticas humanas (Hep G2 , HB 8065) ; tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL 51); células TRI (Mather et al., Annals ?.?. Acad. Sci. 383:417-328 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2) . Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o de clonación anteriormente descritos para la producción del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT y se cultivan en un medio nutritivo convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. 3. Selección y uso de un Vector Replicable El ácido nucleico (e.g., ADNc o ADN genómico) que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT pueden insertarse en un vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Varios vectores se encuentran públicamente disponibles. El vector, por ejemplo, puede encontrarse en forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta dentro de - - el (los) sitio (s) de restricción de endonucleasa apropiado (s) utilizando técnicas conocidas en la técnica. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento de aumento, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de enlace estándar que son conocidas para el técnico experto. El TAT puede producirse de manera recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterologo, que puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de segmentación específico en el N-terminus de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector o puede ser parte del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT que codifica el ADN que se encuentra insertado en el vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia procariótica de señal seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicillinasa, Ipp o derivaciones termo-estables de enterotoxina II. Para la secreción de la levadura la señal de secuencia puede ser e.g.r la derivación de levadura invertasa, la derivación del factor alfa (incluyendo Saccharomyces y derivaciones de Kluyveromyces factor , las últimas descritas en la Patente - - de E.U. No. 5,010,182); o derivación de fosfatasa de ácido, la derivación glucoamilasa de C. albicans (EP 362,179 publicada el 4 de Abril de 1990) o la señal descrita en O 90/13646 publicada el 15 de Noviembre de 1990. En la expresión de la célula de mamífero, las secuencias de señal de mamífero pueden utilizarse para la secreción directa de la proteína, tal como las secuencias de señal de polipéptidos secretados de la misma especie o relacionada, así como derivaciones secretorias virales . Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se repita en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levadura y virus. El origen de la replicación a partir del plásmido pBR322 es adecuado para la mayor parte de las bacterias Gramo-negativas, el origen de plásmido 2m es adecuado para la levadura y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para la clonación de vectores en células de mamífero. Los vectores de expresión y clonación contendrán típicamente un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable . Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, e.g. , ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotrópicas - - o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio compuesto, e.g., la racemasa D-alanina que codifica el gen para Bacilli. Un ejemplo de marcadores selecciónateles adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para recibir el ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-TAT o el polipéptido ???, tales como DHFR o quinasa timidina. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR del tipo silvestre es la linea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada como se describe por Urlaub et al. , Proc. Nati. Acad. Sci . USA 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para su uso en la levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:57 (1980)] . El gen trpl proporciona un marcador de selección para una especie mutante de levadura que carece de la habilidad para crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. Los vectores de expresión y de clonación comúnmente contienen un promotor operablemente enlazado a la secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT para dirigir la síntesis directa de mARN. Los promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales son bien conocidos . Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procarióticos incluyen los sistemas promotores de 3-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptofano (trp) [Goeddel, KTucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776] y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para uso en sistemas bacteriales contendrán también una secuencia Shine-Dalgrano (S.D.) operablemente enlazada al anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT que codifica el ADN. Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para la 3 -fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol . Chem. , 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. , 7:149 (1968); Holanda, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfo fructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, tiosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa . Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, - 2 3 - son las regiones promotoras para alcohol dehidrogenasa 2 , isocitocromo C, ácido fosfatasa, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneina, gliceraldeh£do-3-fosfato dehidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levadura se describen adicionalmente en la EP 73,657. Una transcripción del anticuerpo anti-TAT o del polipeptido TAT a partir de los vectores en células huésped de mamífero se controla, por ejemplo, mediante los promotores obtenidos de los genomas o virus tales como virus de polioma, virus de viruela (UK 2,211,504 publicada el 5 de Julio de 1989) , adenovirus (tal como un Adenovirus 2) , virus de papiloma bovino, virus de sarcoma avícola, citomegalovirus , un retrovirus, virus de hepatitis B y Virus de Simio 40 (SV40) , de promotores heterólogos de mamífero, e.g., el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina y de los promotores de choque térmico, a condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de célula huésped. La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT mediante eucariotos mayores puede incrementarse insertando una secuencia de aumento en el vector. Los aumentadores son elementos cis-activos del ADN, comúnmente de aproximadamente 10 a 300 bp. que actúan en un promotor para incrementar su transcripción. Muchas secuencias de aumento se conocen ahora para los genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína, e insulina) . Típicamente, sin embargo, se utilizará un aumentador de un virus de célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el aumentador SV40 en el lado posterior del origen de replicacion (bp 100-270) , el aumentador promotor citomegalovirus , el aumentador polioma en el lado posterior del origen de replicacion y los aumentadores de adenovirus. El aumentador puede unirse dentro del vector en la posición 5' o 3' a la secuencia de codificación del anticuerpo anti-TAT o el polipéptido TAT, pero se localiza preferentemente en un sitio 5' desde el promotor. Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas (células de levadura, de hongo, de insecto, vegetales, animales, humanas o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el mARU. Tales secuencias se encuentran comúnmente disponibles de las regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' de los ADNs o ADNcs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótido transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mARN que codifica el anticuerpo anti- AT o el polipéptido TAT.
- - Aún otros métodos, vectores y células huésped adecuados para su adaptación a la síntesis de un anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT en un cultivo celular recombinante vertebrado se describen en Gething et al., Nature , 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; y EP 117,058. 4. Cultivo de las Células Huésped Las células huésped utilizadas para producir el anticuerpo anti-TAT y el polipéptido TAT de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medios . Los medios comercialmente disponibles tales como el de Ham FIO (Sigma) , Minimal Essential Médium (MEM) , (Sigma), RPM1.-1640 (Sigma) y el Modified Eagle's Médium de Dulbecco (DMEM) , (Sigma) son adecuados para el cultivo de las células huésped. En adición, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth . Enz . 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Pats . de E.U. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o Pat de E.U. Re. 30,985 pueden utilizarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , amortiguadores (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como - - adenosina y timidina) , antibióticos (tales como la droga GENTAMYCIN®) , elementos de rastreo (definidos como compuestos inorgánicos comúnmente presentes en las concentraciones finales en el rango micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario puede incluirse también a las concentraciones adecuadas que serán conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones del cultivo, tales como temperatura, pH y lo similar, son aquellas previamente utilizadas con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán aparentes para el técnico de experiencia ordinaria . 5. Detección de Amplificación/Expresión del Gen La amplificación y/o expresión del gen puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante inmunotransferencia convencional, inmunotransferencia para cuantificar la transcripción de mARN [Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], coloración por puntos (análisis de ADN) o hibridación in situ, utilizando una sonda apropiadamente marcada, en base a las secuencias proporcionadas en la presente. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que puedan reconocer duplos específicos, incluyendo duplos de ADN, duplos de ARN y duplos híbridos de ADN-ARN o duplos de ADN-proteína . Los anticuerpos a su vez pueden marcarse y puede llevarse a cabo el análisis cuando los duplos se encuentran unidos a una superficie, de modo que al formarse los duplos en la superficie, puede detectarse la presencia de anticuerpo unido al duplo . La expresión del gen, alternativamente, puede medirse mediante métodos inmunológicos , tales como la coloración inmuno istoquímica de las células o secciones de tejido y análisis del cultivo celular o los fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto del gen. Los anticuerpos útiles para la coloración inmunohistoquímica y/o el análisis de los fluidos muestra pueden ser ya sea monoclonales o policlonales y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, pueden prepararse anticuerpos contra un polipéptido TAT de secuencia nativa o contra un péptido sintético en base a las secuencias de ADN provistas en la presente o contra una secuencia exógena fusionada a ADN TAT y que codifica un epítope de anticuerpo específico. 6. Purificación del Anticuerpo Anti-TAT y el Polipéptido TAT Las formas del anticuerpo anti-TAT y el polipéptido TAT pueden recuperarse del medio de cultivo o de lisatos de células huésped. Si se encuentra unido a la membrana, puede liberarse de la membrana utilizando una solución detergente adecuada {e.g., Triton-X 100) o mediante segmentación enzimática. Las células empleadas en la expresión del anticuerpo anti-TAT y el polipéptido TAT pueden romperse mediante varios medios físicos o químicos, tales como ciclaje de congelación-deshielo, sonicación, rompimiento mecánico o agentes de lisado celular. Puede desearse purificar el anticuerpo anti-TAT y el polipéptido TAT a partir de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes . Los siguientes procedimientos son ej emplificativos de procedimientos de purificación adecuados: mediante el fraccionamiento en una columna de intercambio de ion; precipitación de etanol; HPLC en fase de reversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio de catión tal como DEAE; cromatoenfoque ; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; filtración de gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sepharosa para retirar contaminantes tales como IgG; y columnas de quelación de metal para enlazar formas marcadas con epítope del anticuerpo anti-TAT y el polipéptido TAT. Varios métodos de purificación de proteína pueden emplearse y tales métodos se conocen en la técnica y se describen por ejemplo en Deutscher, ethods in Enzymology, 182 (1990) ; Scopes Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). La(s) etapa (s) de purificación seleccionada (s) dependerá (n) , por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y del anticuerpo anti-TAT o polipéptido TAT producido.
Al utilizar técnicas recombinantes , el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico o secretarse directamente dentro del medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, el desecho particulado ya sean células huésped o fragmentos lisados, se retira, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio-Technology, 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan hacia el espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se derrite en presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. El desecho celular puede retirarse mediante centrif gación. Cuando el anticuerpo se secreta dentro del medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión en general se concentran primero utilizando un filtro de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore. Puede incluirse un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes accidentales. La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, - 25 - diálisis y cromatografía de afinidad, con la cromatografía de afinidad siendo la técnica de purificación preferida. La adecuabilidad de la proteína A como enlazando de afinidad depende de las especies y el isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que se encuentre presente en el anticuerpo. La proteína A puede utilizarse para purificar anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas de ??, ?2 o ?4 humano (Lindmark et al., J . Immunol . Meth . 62:1-13 (1983)) . La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para el y3 humano (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual se encuentra unido el ligando de afinidad es más frecuentemente agarosa, pero se encuentran disponibles otras matrices . Las matrices mecánicamente estables tales como de vidrio de poro controlado o de poli (estirenodivinil) enceno permiten proporciones de flujo más rápidas u pequeñas tiempos de procesamiento de los que pueden lograrse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3 , la resina Bakerbond ABXÓresin (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteína tales como fraccionamiento en una columna de intercambio de ión, precipitación de etanol, HPLC en Fase de Reversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSEÓ, cromatografía en una resina de intercambio de anión o catión (tal como una columna de ácido poliaspártico) , - - cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación de sulfato de amonio se encuentran disponibles dependiendo del anticuerpo que va a recuperarse . Siguiendo cualquier etapa preliminar de purificación, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes pueden someterse a cromatografía hidrofóbica de interacción de bajo pH utilizando un amortiguador de elusión a un pH entre aproximadamente 2.5-4.5, de preferencia efectuada a bajas concentraciones de sal {e.g., desde aproximadamente 0-0.25M de sal) . J. Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti-TAT, los oligopéptidos de enlace AT, las moléculas orgánicas de enlace TAT y/o los polipéptidos TAT utilizados de acuerdo con la presente invención se preparan para almacenamiento mezclando el anticuerpo, polipéptido oligopéptido o molécula orgánica que tiene el grado deseado de pureza con vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales, excipientes o estabilizadores (Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16a. edición Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables son no-tóxicos para los receptors en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como acetato, Tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; - - antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; preservativos (tales como cloruro de octadecildimetilbenzil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalkonio, cloruro de benzetonio; alcohol de fenol, butilo o bencilo; parabenos de alquilo tales como parabeno de metilo o propilo; catecol; resorcitol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menor que aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinil irrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asaparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mannosa o dextrinas; agentes de quelación tales como EDTA; tonicificadores tales como trehalosa y cloruro de sodio; azúcares tales como sucrosa, mannitol, trehalosa o sorbitol; surfactantes tales como polisorbato; contra iones de formación de sal tales como sodio; compuestos de metal (e.gr., compuestos de Zn-proteína) ; y/o surfactantes no-iónicos tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilen glicol (PEG) . El anticuerpo comprende de preferencia el anticuerpo en una concentración de entre 5-200 mg/ml, de preferencia entre 10-100 mg/ml. Las formulaciones en la presente también pueden contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular a tratar, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre si. Por ejemplo, en adición a un anticuerpo anti-TAT oligopéptido de enlace TAT o molécula orgánica de enlace TAT, puede ser deseable incluir en la formulación, un anticuerpo adicional, e.g., un segundo anticuerpo anti-TAT que enlaza a un epítope diferente en el polipéptido TAT o un anticuerpo para algún otro objetivo tal como un factor de crecimiento que afecta el crecimiento del cáncer particular. Alternativamente o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citosina, agente inhibidor del crecimiento, agente anti-hormonal y/o cardioprotector. Tales moléculas se encuentran adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido. Los ingredientes activos también pueden encerrarse en microcápsulas preparadas, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas coloidales de suministro de drogas (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 16a. edición Osol, A. Ed. (1980) . Pueden prepararse preparaciones de liberación - - sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semi-permeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices se encuentran en forma de artículos conformados, e.g., películas o microcápsulas . Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (vinilalcohol) ) , poliláctidos (Pat. de E.U: No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicolico tales como LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicolico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D- ( -) -3-hidroxibutírico . Las formulaciones que van a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. K. Diagnóstico y Tratamiento con Anticuerpos Anti-TAT oligopéptidos de Enlace TAT y Moléculas Orgánicas de Enlace TAT Para determinar la expresión TAT en el cáncer, se encuentran disponibles varios análisis. En una modalidad, la sobreexpresión del polipéptido TAT puede analizarse mediante inmunohistoquímica (IHC) . Secciones de tejido inmersos en - - parafina de una biopsia del tumor pueden someterse al análisis IHC y adecuarse a un criterio de intensidad de coloración de la proteína TAT como sigue: Puntuación 0 - no se observa coloración o se observa coloración en membrana en menos del 10% de las células tumorales . Puntuación 1 + - se detecta una coloración tenue/apenas perceptible en membrana en más del 10% de las células tumorales. Las células solo están coloreadas en parte de su membrana. Puntuación 2 + - se observa una coloración débil a moderada en la membrana completa en más del 10% de las células tumorales . Puntuación 3 + - se observa una coloración moderada a fuerte en la membrana completa en más del 10% de las células tumorales . Aquellos tumores con puntuación de 0 o 1+ para la expresión del polipéptido TAT pueden caracterizarse como que no sobreexpresan TAT, mientras que aquellos tumores con puntuaciones de 2+ o 3+ pueden caracterizarse como que sobreexpresan TAT. Alternativamente o adicionalmente, los análisis FISH tales como el INFORM® (vendido por Ventana, Arizona) o PATHVISION® (Vysis, Illinois) pueden llevarse a cabo en tejido tumoral fijo en formalina, inmerso en parafina para determinar el grado (si existe) de sobreexpresión TAT en el tumor . La sobreexpresión o amplificación TAT puede evaluarse utilizando un análisis de diagnóstico in vivo, e.g., administrando una molécula (tal como un anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica) que enlaza la molécula a detectar y se marca con una marca detectable {e.g., un isótopo radioactivo o una marca fluorescente) y explorando externamente al paciente para la localización de la marca. Gomo se describió anteriormente, los anticuerpos anti-TAt oligopeptidos y moléculas orgánicas de la invención tienen varias aplicaciones no-terapéuticas . Los anticuerpos anti-TAT oligopéptidos y moléculas orgánicas de la presente invención pueden ser útiles para el diagnóstico y estadificación de cánceres que expresan el polipéptido TAT {e.g., en radiovisualizac ón) . Los anticuerpos oligopéptidos y moléculas orgánicas son también útiles para la purificación o inmunoprecipitación del polipéptido TAT de las células, para la detección y cuantificación del polipéptido TAT in vitro, e.g., en un ELISA o una inmunotransferencia, para destruir y eliminar las células que expresan TAT de una población de células mezcladas como una etapa en la purificación de otras células. Actualmente, dependiendo de la etapa del cáncer, el tratamiento del cáncer implica una o una combinación de las - - siguientes terapias: cirugía para retirar el tejido canceroso, terapia de radiación y quimioterapia. La terapia con anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica puede ser especialmente deseable en pacientes ancianos que no toleran bien la toxicidad y los efectos laterales de la quimioterapia y en enfermedad metastatica donde la terapia de radiación tiene una utilidad limitada. Los anticuerpos anti-TAT oligopéptidos y moléculas orgánicas que se dirigen al tumor de la invención son útiles para aliviar cánceres que expresan TAT al diagnóstico inicial de la enfermedad o durante la recaída. Para aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica puede utilizarse solo o en terapia de combinación con, e.g. , hormonas, an iangiogenes o compuestos radiomarcados o con cirugía, crioterapia y/o radioterapia. El tratamiento con anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica puede administrarse en conjunción con otras formas de terapia convencionales, consecuentemente ya sea con la terapia pre- o post-convencional . Las drogas quimioterapéuticas tales como TAXOTERE® (docetaxel) , TAXOL® (palictaxel) , estramustina y mitoxantrona se utilizan en el tratamiento del cáncer, en particular, en pacientes de alto riesgo. En el presente método de la invención para el tratamiento o alivio del cáncer, puede administrarse al paciente con cáncer el anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica en - - conjunción con el tratamiento con uno o más de los agentes quimioterapé ticos precedentes. En particular, se contempla la terapia de combinación con palictaxel y derivados modificados (ver, e.g., EP0600517) . El anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica se administrará con una dosis terapéuticamente efectiva del agente quimioterapéutico. En otra modalidad, el anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica se administra en conjunción con quimioterapia para mejorar la actividad y eficacia del agente quimioterapéutico, e.g. , paclitaxel . El Physicians' Desk Reference (PDR) describe dosificaciones de estos agentes que se han utilizado en el tratamiento de varios cánceres. El régimen de dosificación y las dosificaciones de estas drogas quimioterapéuticas antes mencionadas que son terapéuticamente efectivos dependerán del cáncer particular a tratar, la extensión de la enfermedad y otros factores familiares para el médico experto en la técnica y pueden determinarse por el médico . En una modalidad particular, se administra al paciente un conjugado que comprende un anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica conjugado con un agente citotóxico. Preferentemente, el inmunoconjugado unido a la proteína TAT se internaliza por medio de la célula, dando como resultado una eficacia terapéutica incrementada del inmunoconjugado en la eliminación de la célula cancerosa a la - - cual se enlaza. En una modalidad preferida, el agente citotóxico se dirige o interfiere con el ácido nucleico en la célula cancerosa. Los ejemplos de tales agentes citotóxicos se describen en lo anterior e incluyen maytansinoides, calicheamicinas, ribonucleasas y endonucleasas de ADN. Los anticuerpos anti-TAT oligopéptidos, moléculas orgánicas o conjugados de toxina de los mismos se administran a un paciente humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como la administración intravenosa, e.g., como un bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo, mediante vias intramuscular, intraperitoneal , intracerebroespinal , subcutánea, intra-articular, intrasinovial , intratecal oral, tópica o inhalación. Se prefiere la administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica. Otros regímenes terapéuticos pueden combinarse con la administración del anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica. La administración combinada incluye la co-administración utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica y la administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferentemente existe un período de tiempo mientras que ambos (o todos los) agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Preferentemente, tal terapia combinada da como resultado un efecto terapéutico sinergístico .
También puede ser deseable combinar la administración del anticuerpo o anticuerpos anti-TAT oligopéptidos o moléculas orgánicas con la administración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno tumoral asociado con el cáncer particular. En otra modalidad, los métodos de tratamiento terapéutico de la presente invención implican la administración combinada de un anticuerpo (o anticuerpos) anti-TAT oligopéptidos o moléculas orgánicas y uno o más agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores del crecimiento, incluyendo la co-administración de cócteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. Los agentes quimioterapéuticos incluyen fosfato de estramustina, prednimus ina, cisplatina, 5-fluorouracilo, melfalan, ciclofosfamida, hidroxiurea e hidroxiureataxanos (tales como paclitaxel y doxetaxel) y/o antibióticos de antraciclina. Los programas de preparación y dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden utilizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determine empíricamente por el practicante experto. Los programas de preparación y dosificación para tal quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed. , .C. Perry, Williams & Williams, Baltimore, MD (1992) . El anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica pueden combinarse con un compuesto anti-hormonal ; e.g., un - 1 - compuesto anti-estrógeno tal como tamoxiferi; un anti-progesterona tal como onapristona (ver, EP 616 812) ; o un anti-andrógeno tal como flutamide, en dosificaciones conocidas para tales moléculas . Cuando el cáncer a tratar es un cáncer andrógeno independiente, el paciente puede haberse sometido previamente a la terapia anti-andrógeno y, después de que el cáncer se convierte en andrógeno independiente, puede administrarse al paciente el anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica (y opcionalmente otros agentes como se describe en la presente) . Algunas veces, puede ser benéfico co-administrar también un cardioprotector (para prevenir o reducir la disfunción miocardial asociada con la terapia) o una o más citosinas al paciente . En adición a los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede someterse al retiro quirúrgico de las células cancerosas y/o a terapia de radiación, antes de, simultáneamente con o posterior a la terapia de anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica. Las dosis adecuadas para cualquiera de los agentes coadministrados anteriores son aquellas actualmente utilizadas y pueden disminuirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente y el anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica . Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis y el modo de administración se seleccionarán por el médico de acuerdo con criterios conocidos. La dosis apropiada del anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica dependerá del tipo de enfermedad a tratar, como se definió anteriormente, la severidad y el curso de la enfermedad ya sea que el anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se administre para propósitos preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica y la discreción del médico que lo atiende. El anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se administra adecuadamente al paciente en una vez o sobre una serie de tratamientos. Preferentemente, el anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica se administra mediante infusión intravenosa o mediante inyecciones subcutáneas . Dependiendo del tipo y la severidad de la enfermedad, de aproximadamente 1 µg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal [e.g., aproximadamente 0.1-15 mg/kg/dosis) del anticuerpo puede ser una dosis inicial candidato para la administración al paciente ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Un régimen de dosificación puede comprender la administración de una dosis inicial de carga de aproximadamente 4 mg/kg, seguida por una dosis semanal de mantenimiento de aproximadamente 2 mg/kg del anticuerpo anti-TAT. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación.
- - Una dosis diaria típica puede fluctuar desde aproximadamente 1 µg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores antes mencionados . Para administraciones repetidas durante varios días o más largas, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que se presenta una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. El progreso de esta terapia puede verificarse fácilmente mediante métodos y análisis convencionales en base al criterio conocido por el médico u otras personas expertas en la técnica. Además de la administración de la proteína de anticuerpo al paciente, la presente solicitud contempla la administración del anticuerpo mediante terapia genética. Tal administración de ácido nucleico que codifica el anticuerpo se abarca en la expresión "administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo" . Ver, por ejemplo, WO96/07321 publicada el 14 de Marzo de 1996 referente al uso de la terapia genética para generar anticuerpos intracelulares . Existen dos importantes tentativas para introducir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células del paciente; in vivo y ex vivo. Para el suministro in vivo el ácido nucleico se inyecta directamente dentro del paciente, comúnmente en el sitio en donde se requiere el anticuerpo. Para el tratamiento ex vivo, las células del paciente se retiran, el ácido nucleico se - - introduce en estas células aisladas y las células modificadas se administran al paciente ya sea directamente o, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que se implantan dentro del paciente (ver, e.g. , Patentes de E.U. Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables . Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere dentro de células cultivadas in vítro o in vivo en las células del huésped pretendido. Las técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucleico dentro de células de mamífero in vi tro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextran, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Un vector comúnmente utilizado para el suministro ex vivo del gen es un vector retroviral . Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen la transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de Herpes simplex I o virus adeno-asociado) y sistemas a base de lípidos (los lípidos útiles para la transferencia lípido-mediada del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . Para una revisión de los protocolos de marcación de gen y terapia genética actualmente conocidos ver Anderson et al . , Science 256:808-813 (1992). Ver, también WO 93/25673 y las referencias citadas en la misma.
Los anticuerpos anti-TAT de la invención pueden encontrarse en diferentes formas abarcadas por la definición de "anticuerpo" en la presente. De este modo, los anticuerpos incluyen anticuerpo de longitud total o intacto, fragmentos de anticuerpo, anticuerpo de secuencia nativa o variantes de aminoácido, anticuerpos humanizados, quiméricos o de fusión, inmunoconjugados y sus fragmentos funcionales. En los anticuerpos de fusión una secuencia de anticuerpo se fusiona a una secuencia heteróloga de polipéptido. Los anticuerpos pueden modificarse en la región Fe para proporcionar las funciones de efector deseadas . Como se trató en mayor detalle en las secciones de la presente, con las regiones Fe apropiadas, el anticuerpo desnudo unido sobre la superficie celular puede inducir citotoxicidad, e.g., a través de la citotoxicidad celular anticuerpo-dependiente (ADCC) o mediante el complemento de suministro en la citotoxicidad complemento-dependiente o algún otro mecanismo. Alternativamente, cuando es deseable eliminar o reducir la función efectora, a fin de minimizar los efectos laterales o las complicaciones terapéuticas, pueden utilizarse ciertas otras regiones Fe . En una modalidad, el anticuerpo compite para enlazarse o enlazarse sustancialmente a, el mismo epítope que los anticuerpos de la invención. Se contemplan también los anticuerpos que tienen las características biológicas de los - 27 - presentes anticuerpos anti-TAT de la invención, incluyendo específicamente la dirección al tumor in vivo y cualquier inhibición de la proliferación celular o características citotóxicas . Los métodos para producir los anticuerpos anteriores se describen en detalle en la presente. Los presentes anticuerpos anti-TAT oligopeptidos y moléculas orgánicas son útiles en el tratamiento de un cáncer que expresa TAT o para aliviar uno o más síntomas del cáncer en un mamífero. Tal cáncer incluye cáncer de próstata, cáncer del tracto urinario, cáncer pulmonar, cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer ovárico, más específicamente, adenocarcinoma prostático, carcinomas de célula renal, adenocarcinomas colorrectales, adenocarcinomas pulmonares, carcinomas de célula escamosa pulmonar y mesotelioma pleural . Los cánceres abarcan cánceres metastáticos de cualquiera de los precedentes . El anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica es capaz de enlazarse a al menos una porción de las células cancerosas que expresan el polipéptido TAT en el mamífero. En una modalidad preferida, el anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica es efectivo para destruir o matar las células tumorales que expresan TAT o para inhibir el crecimiento de tales células tumorales, in vi tro o in vivo, al enlazarse al polipéptido TAT en la célula. Tal anticuerpo incluye un anticuerpo anti-TAT desnudo (no - - conjugado a ningún agente) . Los anticuerpos desnudos que tienen propiedades citotóxicas o de inhibición del crecimiento celular pueden reforzarse adicionalmente con un agente citotóxico para hacerlos incluso más potentes en la eliminación de la célula tumoral . Pueden conferirse propiedades citotóxicas a cualquier anticuerpo anti-TAT, e.gr. , conjugando el anticuerpo con un agente citotóxico, para formar un inmunoconjugado como se describe en la presente. El agente citotóxico o un agente de inhibición del crecimiento es de preferencia una molécula menor. Se prefieren las toxinas tales como calicheamicina o un maytansinoide y análogos o derivados de los mismos. La invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica de la invención y un vehículo. Para el propósito del tratamiento del cáncer, pueden administrarse las composiciones al paciente que necesita tal tratamiento, en donde las composiciones pueden comprender uno o más anticuerpos anti-TAT presentes como inmunoconjugados o como el anticuerpo desnudo. En una modalidad adicional, las composiciones pueden comprender estos anticuerpos oligopéptidos o moléculas orgánicas en combinación con otros agentes terapéuticos tales como agentes citotóxicos o inhbidores de crecimiento, incluyendo agentes quimioterapéuticos . La invención proporciona también formulaciones que comprenden un anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica de la invención y un vehículo. En una modalidad, la formulación es una formulación terapéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto de la invención es ácidos nucleicos aislados que codifican anticuerpos anti-TAT. Se abarcan los ácidos nucleicos que codifican ambas cadenas H y L y especialmente los residuos de región hipervariable, las cadenas que codifican el anticuerpo de secuencia nativa así como las variantes, modificaciones y versiones humanizadas del anticuerpo. La invención proporciona también métodos útiles para el tratamiento de un cáncer que expresa el polipeptido TAT o para aliviar uno o más síntomas del cáncer en un mamífero, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica al mamífero. Las composiciones terapéuticas de anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica pueden administrarse a corto plazo (agudo) o crónico o intermitente como lo dirija el médico. También se proporcionan métodos para inhibir el crecimiento y destruir una célula que expresa el polipéptido TAT. La invención proporciona también equipos y artículos de manufactura que comprenden al menos un - - anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica. Los equipos que contienen anticuerpos anti-TAT oligopéptidos o moléculas orgánicas encuentran su uso, e.g., para análisis de eliminación de célula TAT, para la purificación o inmunoprecipitación del polipeptido TAT de las células . Por ejemplo, para el aislamiento y la purificación de TAT, el equipo puede contener un anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica acoplado a perlas {e.g., perlas de sefarosa) . Pueden proporcionarse equipos que contienen los anticuerpos oligopéptidos o moléculas orgánicas para la detección y cuantificación de TAT in vitro, e.g., en un ELISA o una inmunotransferencia . Tal anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica útil para la detección puede proveerse con una etiqueta tal como una radioetxqueta fluorescente. L. Artículos de Manufactura y Equipos Otra modalidad de la invención es un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento del cáncer que expresa anti-TAT. El articulo de manufactura comprende un contenedor y una etiqueta o inserto de empaque en o asociado con el contenedor. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los contenedores pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El contenedor contiene una composición que es efectiva para tratar una condición cancerosa y puede tener una puerta estéril de acceso (por ejemplo el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un obturador perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica de la invención. La etiqueta o inserto de empaque indica que la composición se utiliza para tratar el cáncer. La etiqueta o inserto de empaque comprenderá además instrucciones para adiministrar la composición de anticuerpo oligopéptido o molécula orgánica para el paciente con cáncer. Adicionalmente, el articulo de manufactura puede comprender además un segundo contenedor que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (B FI) , salina fosfato-amortiguada, solución de inger y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. También se proporcionan equipos que son útiles para varios propósitos, e.g., para análisis de eliminación de célula que expresa TAT, para la purificación o inmunoprecipitación del polipéptido TAT de las células. Para el aislamiento y purificación del polipéptido TAT, el equipo puede contener un anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica acoplada a perlas {e.g., perlas de sefarosa) . Pueden proporcionarse equipos que contienen los anticuerpos - - oligopéptidos o moléculas orgánicas para la detección y cuantificación del polipéptido TAT in vitro, e.g., en un ELISA o una inmunotransferencia . Como con el artículo de manufactura, el equipo comprende un contenedor y una etiqueta o inserto de empaque en o asociado con el contenedor. El contenedor contiene una composición que comprende al menos un anticuerpo anti-TAT oligopéptido o molécula orgánica de la invención. Pueden incluirse contenedores adicionales que contienen, e.g., diluyentes y amortiguadores, anticuerpos de control. La etiqueta del inserto de empaque puede proporcionar una descripción de la composición asi como instrucciones para el uso pretendido in vivo o diagnóstico. M. Usos para Ácidos Nucleicos que Codifican Polipeptidos TAT y Polipéptido TAT Las secuencias de nucleótidos (o su complemento) que codifican polipeptidos TAT tienen varias aplicaciones en la técnica de la biología molecular, incluyendo usos como sondas de hibridización, en mapeo de cromosoma y gen y en la generación de sondas anti-sentido de ARN y ADN. El ácido nucleico que codifica TAT también será útil para la preparación de polipeptidos TAT mediante las técnicas recombinantes descritas en la presente, en donde aquellos polipéptidos TAT pueden encontrar su uso, por ejemplo, en la preparación de anticuerpos anti-TAT como se describe en la presente .
- - El gen TAT de longitud total de la secuencia nativa o sus porciones, puede utilizarse como sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el ADNc TAT de longitud total o para aislar aún otros ADNcs (por ejemplo, aquellos que codifican las variantes de TAT que se presentan naturalmente o TAT de otras especies) que tienen una identidad de secuencia deseada para la secuencia TAT nativa descrita en la presente. Opcionalmente, la longitud de las sondas será de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 bases . Las sondas de hibridación pueden derivarse de regiones al menos parcialmente nuevas de la secuencia de nucleótido de longitud total nativa en donde aquellas regiones pueden determinarse sin experimentación indebida o a partir de secuencias genómicas incluyendo promotores, elementos aumentadores e intrones de TAT de secuencia nativa. A modo de ejemplo, un método de selección comprenderá aislar la región de codificación del gen TAT utilizando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden marcarse mediante una variedad de marcas, incluyendo radionucleótidos tales como 32P o 35S o marcas enzimáticas tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda a través de sistemas de acoplamiento de avidina/biotina . Las sondas marcadas que tienen una secuencia complementaria para la del gen TAT de la presente invención pueden utilizarse para - - seleccionar bibliotecas de ADNc humano, ADN genómico o ttiARW para determinar a cuáles miembros de tales bibliotecas se hibridizan a la sonda. Las técnicas de hibridación se describen en mayor detalle en los Ejemplos a continuación. Cualquiera de las secuencias EST descritas en la presente solicitud pueden emplearse de manera similar como sondas, utilizando los métodos descritos en la presente. Otros fragmentos útiles de los ácidos nucleicos que codifican TAT incluyen oligonucleótidos anti-sentido o de sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico monocatenario (ya sea de ARN o ADN) capaz de enlazarse para dirigirse a las secuencias de mARN TAT (sensible) o ADN TAT (anti-sentido) . Los oligonucleótidos anti-sentido o de sentido, de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento de la región de codificación del ADN TAT. Tal fragmento generalmente comprende al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferentemente desde aproximadamente 14 hasta 30 nucleótidos. La habilidad para derivar un oligonucleótido anti-sentido o sensible, en base a la secuencia de ADNc que codifica una proteína dada se describe, por ejemplo, en Stein and Cohén (Cáncer Res. , 48:2659, 1988) y van der Krol et al., (BioTechniques 6:958, 1988). El enlace de los oligonucleótidos anti-sentido o de sentido a las secuencias de ácido nucleico objetivo da como resultado la formación de duplos que bloquean la - - transcripción o translación de la secuencia objetivo mediante uno de varios medios, incluyendo la reticulación aumentada de los duplos, la terminación prematura de la transcripción o translación o por otros mdios . Tales métodos se encuentran abarcados por la presente invención. De este modo, los oligonucleotidos anti-sentido pueden utilizarse para bloquear la expresión de las proteínas TAT, en donde aquellas proteínas TAT pueden jugar un papel en la inducción del cáncer en mamíferos. Los oligonucleotidos anti-sentido o de sentido comprenden además oligonucleotidos que tienen estructuras modificadas de azúcar-fosfodiéster (u otros enlaces de azúcar, tales como los descritos en la O 91/06629 y en donde tales enlaces de azúcar son resistentes a las nucleasas endógenas. Tales oligonucleotidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (i.e., capaces de resistir la reticulación enzimática) pero retienen la especificidad de secuencia para ser capaces de enlazarse a las secuencias de nucleótido objetivo. Los sitios intragénicos preferidos para el enlace anti-sentido incluyen la región que incorpora el codón de iniciación/arranque (5 ' -AUG/5 ' -ATG) o el codón de terminación/paro (5'-UAG y 5-UGA/5 ' -TAA, 5 ' -TAG y 5'-TGA) del marco de lectura abierta (ORF) del gen. Estas regiones se refieren a una porción del mAR o gen que abarca desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 50 nucleótidos - - contiguos en cualquier dirección (i.e., 5' o 3') desde un codón de iniciación o terminación de translación. Otras regiones preferidas para el enlace anti-sentido incluyen: intrones; exones; uniones de intron-exon; el marco de lectura abierta (ORF) o "región de codificación" , que es la región entre el codón de iniciación de translación y el codón de terminación de translación; la cima 5' de un mARN que comprende un residuo de guanosina N7-metilado unido al residuo más 5' del mARN a través de un enlace 5' -5' de trifosfato e incluye en sí la estructura de la cima 5' así como los primeros 50 nucleótidos adyacentes a la tapa; la región 5' no traducida (5'U R) , la porción de un mARN en la dirección 5' desde el codón de iniciación de translación y de este modo incluyendo los nucleótidos entre el sitio de la cima 5' y el codón de iniciación de translación de un mARN o los nucleótidos correspondientes en el gen; y la región no traducida 3' (3'UTR), la porción de un mARN en la dirección 3' desde el codón de terminación de translación y de este modo incluyendo los nucleótidos entre el codón de terminación de translación y el extremo 3' de un mARN o los nucleótidos corespondientes en el gen. Ejemplos específicos de los compuestos anti-sentido preferidos útiles para inhibir la expresión de las proteínas TAT incluyen oligonucleótidos que contienen estructuras modificadas o enlaces internucleósido no-naturales . Los - - oligonucleotidos que tienen estructuras modificadas incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en la estructura y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la estructura. Para los propósitos de esta especificación y como se refiere algunas veces en la técnica, los oligonucleotidos que no tienen un átomo de fósforo en su estructura internucleósido también puede considerarse que son oligonucleósidos . Las estructuras de oligonucleótido modificadas preferidas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotri-ésteres, metilo y otros fosfonatos de alquilo incluyendo fosfonatos de 3 ' -alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo fosforamidato de 3'-amino y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos , tionoalquilfosfotriésteres , selenofosfatos y borano-fosfatos que tienen enlaces 3 '-5' normales, análogos 2 '-3' enlazados de éstos y aquellos que tienen polaridad invertida en donde uno o más enlaces intemucleótido son un enlace 3' a 3', 5' a 5' o 2' a 2' . Los oligonucleotidos preferidos que tienen polaridad invertida comprenden un solo enlace 3' a 3' en el enlace intemucleótido más 3' i.e., un solo residuo nucleósido invertido que puede ser básico (la nucleobase se pierde o tiene un grupo hidroxilo en su lugar) . Se encuentran también incluidas varias sales, sales mezcladas y formas de ácido libre . Las Patentes de los Estados Unidos que muestran la preparación de enlaces que contienen fósforo, incluyen, pero no se limitan a, las Pats . de E.U. Nos. : 3 , 687, 808; 4,469,863; 4,476, 301; 5,023,243; 5,177, 196; 5, 188, 897; 5,264,423; 5,276, 019; 5,278,302; 5,286, 717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405, 676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476, 925; 5, 519, 126; 5,536, 821; 5, 541, 306; 5,550,111; 5,563,253 ; 5,571,799; 5,587,361; 5, 194, 599; 5,565,555; 5,527,899; 5, 721,218; 5,672,697 y 5,625,050, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia . Las estructuras de oligonucleótido modificadas preferidas que no incluyen un átomo de fósforo en las mismas tienen estructuras que se encuentran formadas por enlaces internucleósido de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleósido de heteroátomo mezclado y de alquilo o cicloalquilo o uno o más enlaces internucleósido heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte de la porción de azúcar de un nucleósido) ; estructuras de siloxano; sulfuro, estructuras de sulfóxido y sulfona; estructuras de formacetilo y tioformacetilo; estructuras de metileno formacetilo y tioformacetilo; estructuras de riboacetilo; estructuras que contienen alqueno; estructuras de sulfamato; estructuras de metilenoimino y - - metilenohidrazino; estructuras de sulfonato y sulfonamida; estructuras de amida; y otras que tienen partes mezcladas del componente sub.2 de N o, S y CH. Las patentes representativas de los Estados Unidos que muestran la preparación de tales oligonucleósidos incluyen, pero no se limitan a, las Pats. de E .U. Nos . 5,034,506; 5,166,315 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5 ,235,033; 5,264, 562 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5 ,466,677; 5,470, 967 5,489, 677; 5, 541, 307; 5, 561, 225; 5 , 596, 086; 5, 602 , 240 5,610,289; 5, 602,240; 5, 608, 046; 5 , 610,289; 5, 618, 704 5,623, 070; 5, 663 ,312; 5,633,360; 5 , 677,437; 5,792,608 5,646,269 y 5,677,439, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia. En otros oligonucleótidos anti-sentido preferidos, tanto el enlace de azúcar como el internucleósido, i.e., la estructura, de las unidades de nucleótido se reemplazan por nuevos grupos . Las unidades base se mantienen para hibridación con un compuesto objetivo de ácido nucleico apropiado. Un compuesto oligomérico tal, un mimético de oligonucleótido que ha mostrado tener excelentes propiedades de hibridización, se refiere como un ácido nucleco péptido (???) . En los compuestos de PNA, la estructura de azúcar de un oligonucleótido se reemplaza con una estructura que contiene amida, en particular un estructura aminoetilglicina . Las nucleasas se retienen y se unen directamente o - - indirectamente a los átomos aza del nitrógeno de la porción amida de la estructura. Las patentes de los Estados Unidos representativas que muestran la preparación de los compuestos de PNA incluyen, pero no se limitan a las Pats de E.U. Nos.: 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia. Una enseñanza adicional de los compuestos de PNA puede encontrarse en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500. Los oligonucleótidos anti-sentido preferidos incorporan estructuras de fosforotioato y/o estructuras de heteroátomo y en particular -CH2-NH-0-CH2- , -CH2-N (CH3) -0-C¾- [conocida como estructura de metileno (metilimino) o MMI] , -C¾-0-N(CH3) -CH2-, -CH2-N(C¾) -N(C¾) -C¾~ y -0- (C¾) -CH2-C¾- [en donde la estructura nativa de fosfodiéster se encuentra representada como -0-P-0-CH2-] descritas en la Pat . de E.U. antes referida No. 5,489,677 y las estructuras de amida de la pat. de E.U. antes referida No. 5,602,240. También se prefieren los oligonucleótidos anti-sentido que tienen estructuras de morfolino de la Pat. de E.U. No. 5,034,506 antes referida . Los oligonucleótidos modificados también pueden contener una o más mitades de azúcar sustituidas . Los oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-alquilo; S-alquilo; o N-alquilo; o-alquenilo; S-alquenilo; o N-alquenilo; O-alquinilo, S- - - alquinilo o N-alquinilo; o O-alquil-0-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo Ci a Cxo o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituido o no sustituido. Son particularmente preferidos O [ (C¾) n0] mCH3 o(CH2)n0CH3 o(CH2)nNH2 o(CH2)C¾ o(CH2)nONH2 y O (C¾) nON [ (C¾) nCH3) ] 2, donde n y m son de 1 hasta aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos anti sentido preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2' : alquilo menor Ci a C10f alquilo menor sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo o-alcarilo o O-aralquilo, SH, SC¾ OCN, Cl, Br, CN, CF3 OCF3, S0CH3, S02C¾ ON02, N02/ N3, NH2/ heterocicloalquilo, heterocicloarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido y un grupo de partición de ARN, un grupo reportero, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleotido o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleotido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2'metoxietoxi (2'0-CH2CH2OCH3í también conocido como 2'0-(2-metoxietil) o 2'- 0E) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) i.e., un grupo alcoxialcoxi . Una modificación adicional preferida incluye 2 ' dimetilaminoetoxi, i.e., un grupo 0(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2'DMAOE, como se describe en los ejemplos a continuación y 2 ' dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como - - 2' -O-dimetilaminoetoxietilo o 2 ' -DMAEOE) , i.e., 2'-0-C¾-0-C¾-N(CH2) . Una modificación adicional preferida incluye Ácidos Nucleicos Cerrados (LNAs) en los cuales el grupo 2'-hidroxilo se encuentra enlazado al átomo de carbono 3' o 4' del anillo de azúcar formando con ello una mitad bicíclica de azúcar. El enlace es de preferencia un grupo metileno (-0?2-)? que une el átomo 2 ' de oxígeno y el átomo 4 ' de carbono en donde n es 1 o 2. Los LNAs y su preparación se describen en la WO 98/39352 y WO 99/14226. Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2 ' -0-C¾) , 2 ' -aminopropoxi (2 ' -OCH2CH2CH2NH2 ) , 2 ' -alilo(2'-CH2-CH=CH2) , 2 ' -O-alilo- (2 ' -0-CH2-CH=C¾) y 2'-fluoro (2' -F) . La modificación 2' puede encontrarse en la posición arabino (superior) o en la posición ribo (inferior) . Una modificación 2 '-arabino preferida es 2'-F. También pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones en el oligonucleótido, particularmente en la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3' terminal o en los oligonucleotidos enlazados 2 '-5' y en la posición 5' del oligonucleótido 5' terminal. Los oligonucleotidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como las mitades ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo . Las Patentes representativas de los Estados Unidos que muestran la preparación de tales estructuras de azúcar modificadas - - incluyen, pero no se limitan a, las Pats. de E.U. Nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; y 5,700,920, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Los oligonucleótidos también pueden incluir modificaciones o sustituciones de nucleobase (frecuentemente referida en la técnica simplemente como "base") . Como se utiliza en la presente, las nucleobases "no-modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G) y las bases de pirimidina timina (T) , citosina (C) y uracilo (U) . Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C) , 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2 -propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-C=C-CH3 o -CH2-C=CH) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituídas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5- - 29 - trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituldos , 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Las nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricíclicas tales como fenoxazina citidina (IH-pirimido [5,4-b] [1 , ] benzoxazin-2 (3H) -ona) , fenotiazina citidina (1H-pirimido [5, 4-b] [1,4] benzotiazin-2 (3H) -ona) , G-clamps tales como una fenoxazina citidina sustituida (e.g., 9- (2-aminoetoxi) -H-pirimido [5 , 4-b] [1 , 4] benzoxazin-2- (3H) -ona) , carbazolo citidina (2H-pirimido [4,5-b] indol-2-ona) , piridoindolo citidina (H-pirido [3 ' , 2 ' : 4 , 5] pirrólo [2,3-d] pirimidin-2-ona) . Las nucleasas modificadas pueden incluir también aquellas en las cuales la base purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Nucleobases adicionales incluyen aquellas descritas en la Pat. de E.U. No. 3,687,808 , aquellas descritas en The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J.I., edic. John Wiley & Sons, 1990 y aquellas descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, Inernational Edition, 1991, 30, 613. Ciertas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de enlace de los compuestos oligoméricos de la invención. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina . Las sustituciones 5-metilcitosina han mostrado incrementar la estabilidad de los duplos de ácido nucleico por 0.6-1.2 grados C. (Sanghvi et al., Antisense Research and Application, CRC Press, Boca Ratón, 1993, pp. 276-278) y son sustituciones de base preferidas, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones 2'-0-metoxietilo de azúcar. Las patentes representativas de los Estados Unidos que muestran la preparación de nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a: la Pat . de E.U. No. 3,687,808, asi como las Pats. de E.U. Nos. 4,945,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,681,941 y 5,750,692, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia. Otra modificación de los oligonucleótidos anti-sentido es enlazar químicamente al oligonucleótido una o más mitades o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la absorción celular del oligonucleótido. Los compuestos de la invención pueden incluir grupos de conjugados covalentemente unidos a grupos funcionales tales como los grupos hidroxilo primarios o - - secundarios. Los grupos de conjugados de la invención incluyen intercaladores , moléculas reporteras, poliaminas, poliamidas, polietilen glicoles, poliéteres, grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas de los oligómeros y grupos que mejoran las propiedades farmacocineticas de los oligómeros. Los grupos típicos de conjugados incluyen colesteroles, lípidos, lípidos de catión, fosfolípidos, fosfolipidos catiónicos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluorescencias, rodaminas, cumarinas y tintes. Los grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas , en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la absorción de oligómero, mejoran la resistencia del oligómero a la reticulación y/o refuerzan la hibridiación secuencia-específica con el ARN. Los grupos que mejoran las propiedades farmacocineticas en el contexto de esta invención, incluyen grupos que mejoran la absorción, distribución, metabolismo o excreción del oligómero. Las mitades de conjugado incluyen pero no se limitan a mitades de lípido tales como la mitad de colesterol (Letsinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), un tioéter, e.g., hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. ?.?. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al. , Nucí . Acids Res., 1992, 20, 533-538), una cadena alifática, e.g., residuos de dodecandiol o de undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J. , 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), un fosfolípido, e.g., di-hexadecil-rac-glicerol o trietil-amonio 1, 2-di-0-hexadecil-rac-glicerol-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucí. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilen glicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973) o ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), una mitad de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237) o una mitad de octadecilamina o de hexilamino-carbonilo-oxicolesterol . Los oligonucleótidos de la invención también pueden conjugarse a sustancias de droga activa, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, cetoprofeno, (S) - (+) -pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triyodobenzoico, ácido flufenámico , ácido folínico, una benzotiazida, clorotiazida, una diazepina, indometicina, un barbiturato, una cefalosporina, una droga sulfa, un antidiabético, un antibacterial o un antibiótico. Los conjugados de oligonucleótido-droga y su preparación se describen en la solicitud de patente de E.U. Ser. No. - - 09/334, 130 (presentada el 15 de Junio de 1999) y las patentes de los Estados Unidos Nos.: 4,828,979; 4,948,882 ; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5, 545, 730; 5,552,538; 5,578,717; 5,580, 731; 5,591,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118, 802; 5, 138, 045; 5,414,077; 5,486, 603; 5.512,439; 5,578,718; 5, 608, 046; 4,487,044; 4, 605, 735; 4,667,025; 4,762,779; 4, 789, 737; 4, 824, 941, 4,835,263; 4, 876, 335; 4,904,582; 4,958,013; 5, 082, 830, 5,112, 963 ; 5,214,136; 5, 082, 830; 5,112, 963; 5,214,136, 5,245, 022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250, 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241; 5,391, 723; 5,416,203, 5,451,463; 5, 510,475; 5,512, 667; 5,514, 785; 5,565,552, 5,567, 810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597, 696; 5,599,923; 5,599,928 y 5, 688, 941, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia. No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado se encuentren uniformemente modificadas y de hecho más de una de las modificaciones anteriormente mencionadas puede incorporarse en un solo compuesto o incluso en un solo nucleósido dentro de un oligonucleótido . La presente invención incluye también compuestos anti-sentido que son compuestos quiméricos. Los compuestos anti-sentido "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta invención, son compuestos anti-sentido, particularmente oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones - - químicamente distintas, cada una preparada de al menos una unidad de monómero, i.e., un nucleótido en el caso de un compuesto de oligonucleótido . Estos oligonucleótidos contienen típicamente al menos una región en donde el oligonucleótido se modifica a fin de conferir, sobre la aumentada resistencia del oligonucleótido a la reticulación de nucleasa, absorción celular incrementada y/o afinidad de enlace aumentada para el ácido nucleico objetivo. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como un sustrato para enzimas capaz de separar híbridos de ARN:ADN o de ARN:ARN. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que separa la cuerda de ARN de un duplo ARN:ADN. La activación de la RNasa H, por tanto, da como resultado una separación del objetivo ARN, por lo cual mejora grandemente la eficiencia en la inhbición en el oligonuclrótido de la expresión del gen. Consecuentemente, frecuentemente pueden obtenerse resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se utilizan oligonucleótidos quiméricos, en comparación a los desoxioligonucleótidos de fosforotioato que se hibridizan a la misma región objetivo. Los compuestos anti-sentido quiméricos de la invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos oligonucleótidos modificados oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótido como se describió anteriormente. Los oligonucleótidos anti-sentido quiméricos preferidos - - incorporan al menos un azúcar 2 ' modificado (preferentemente 2 ' -O- (CH2) 2-O-CH3) en la terminal 3' para conferir resistencia a la nucleasa y una región con al menos 4 azúcares 2 ' -H contiguos para conferir actividad de RNasa H. Tales compuestos también se han referido en la técnica como híbridos o gapmers. Los gapmers preferidos tienen una región de azúcares 2' modificados (preferentemente 2 ' -0- (C¾) 2-0-CH3) en la terminal 3' y en la terminal 5' separados por al menos una región que tiene al menos 4 azúcares 2 ' -H contiguos y de preferencia incorporan enlaces de estructura de fosforotioato . Las patentes representativas de los Estados Unidos que muestran la preparación de tales estructuras híbridas incluyen, pero no se limitan a, las Pats. de los E.U. Nos. 5,013,830; 5,149,797, 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; y 5,700,922, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Los compuestos anti-sentido utilizados de acuerdo con esta invención pueden prepararse convenientemente y rutinariamente a través de la bien conocida técnica de síntesis de fase sólida. El equipo para tal síntesis es vendido por varios vendedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Cualquier otro medio para tal síntesis conocido en la técnica puede emplearse adicionalmente o alternativamente. Es bien - - conocido el uso de técnicas similares para preparar oligonucleotidos tales como los fosforotioatos y derivados alquilados. Los compuestos de la invención también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse. o de otra manera asociarse con otras moléculas, estructuras de molécula o mezclas de compuestos, por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas al receptor, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para asistir en la absorción, distribución y/o absorción. Las patentes representativas de los Estados Unidos que muestran la preparación de tales formulaciones de asistencia para la absorción, distribución y/o absorción incluyen. pero no se limitan a, las Pats. de E.U. Nos. 5,108, 921; 5,354,844; 5,416, 016 ; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5, 547, 932 ; 5, 583, 020 5,591,721; 4,426,330; 4,534, 899; 5, 013, 899; 5, 013, 556 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5, 264, 221; 5,356, 633 5,395,619; 5,416, 016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469, 854 5,512,295; 5, 527, 528; 5,534,259; 5,543,152; 5, 556,948; 5, 580,575; y 5,595,756, cada una de las cuales se incorpora en la presente por referencia. Otros ejemplos de oligonucleotidos de sentido o anti-sentido incluyen aquellos oligonucleotidos que se encuentran covalentemente enlazados a mitades orgánicas, tales como aquellas descritas en la WO 90/10048 y a otras mitades que incrementan la afinidad de los oligonucleotidos para una secuencia objetivo de ácido nucleico, tal como - - poli (L-lisina) . Aún adicionalmente, los agentes de intercalación, tales como elipticina y los agentes de alquilación o complejos de metal pueden unirse a oligonucleótidos de sentido o anti-sentido para modificar las especificidades de enlace del oligonucleótido sensible o anti-sentido para la secuencia de nucleotido objetivo. Los oligonucleótidos anti-sentido o de sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia objetivo de ácido nucleico mediante cualquier método de transferencia de gen, incluyendo, por ejemplo, transfección de ADN CaP04~mediada, electoporación o utilizando vectores de transferencia de gen tales como el virus Epstein-Barr . En un procedimiento preferido, un oligonucleótido anti-sentido o sensible se inserta en un vector retroviral adecuado. Una célula que contiene la secuencia objetivo de ácido nucleico se pone en contacto con el vector recombinante retroviral ya sea in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados del retrovirus murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV) o los vectores de copia doble designados DCT5A, DCT5B y DCT5C (ver WO 90/13641) . Los oligonucleótidos de sentido o anti-sentido también pueden introducirse en una célula que contenga la secuencia de nucleótidos objetivo mediante la formación de un conjugado con una molécula de enlace a ligando, como se - 3 - describe en la WO91/04753. Las moléculas de enlace a ligando adecuadas incluyen, pero no se limitan a, receptores de superficie celular, factores del crecimiento otras citocinas u otros ligando que se unan a los receptores de superficie celular. Preferentemente, la conjugación de las moléculas de enlace a ligando no interfieren sustancialmente con la capacidad de la molécula de enlace a ligando para unirse a su molécula o receptor o entrada de bloque correspondiente del oligonucléotido de sentido o anti-sentido o su versión conjugada en la célula. Alternativamente, puede introducirse un oligopéptido de sentido o anti-sentido en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante la formación de un complejo de oligonucleótido-lípido, como se describe en la WO 90/10448. El complejo oligonucleótido-lipido de sentido o antisentido preferentemente se disocia dentro de la célula mediante una lipasa endógena. Las moléculas de AR o ADN anti-sentido o de sentido generalmente son de al menos aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, - - 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, S30, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 o 1000 nucleótidos de longitud, en donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de la secuencia de nucleótidos referida más o menos 10% de esa longitud referida. Las sondas pueden también emplearse en técnicas de PCR para generar una agrupación de secuencias para la identificación de secuencias de codificación TAT cercanamente relacionadas . Las secuencias de nucleótidos que codifican para un TAT también pueden utilizarse para construir sondas de hibridación para representar el gen que codifica para ese TAT y para el análisis genético de individuales con trastornos genéticos . Las secuencias de nucleótidos proporcionadas en la presente pueden representarse para un cromosoma y regiones específicas de un cromosoma utilizando técnicas conocidas, tales como hibridación in sítu, análisis de enlace contra marcadores cromosomales conocidos y selección por hibridación con las bibliotecas . Cuando las secuencias de codificación para TAT - - codifican una proteina que se enlaza a otra proteína (ejemplo, en donde el TAT es un receptor) , el TAT puede utilizarse en ensayos para identificar las otras proteínas o moléculas involucradas en la interacción del enlace. Mediante tales métodos, pueden identificarse los inhibidores de la interacción del enlace receptor/ligando. Las proteínas involucradas en tales interacciones del enlace puede también utilizarse para clasificar el péptido o inhibidores de molécula pequeña o agonistas de la interacción del enlace. También, el receptor TAT puede utilizarse para aislar el (los) ligando (s) correlativos (s) . Los ensayos de selección pueden diseñarse para encontrar compuestos guía que imitan la actividad biológica de un TAT natural o un receptor para TAT. Tales ensayos de selección incluirán ensayos dóciles para selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar candidatos de droga de molécula pequeña. Las moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos sintéticos orgánicos o inorgánicos . Los ensayos pueden llevarse a cabo en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de selección bioquímica, inmunoensayos y ensayos en base a células, que se encuentran bien caracterizados en la técnica. Los ácidos nucleicos que codifican TAT o sus formas modificadas pueden también utilizarse para generar ya sea - - animales transgenicos o animales "knock out" que a su vez, son útiles en el desarrollo y selección de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (e.gr.,, un ratón o rata) es un animal que tiene células que contienen un transgen cuyo transgen se introdujo en el animal o un ascendiente del animal en un prenatal, e.g. una etapa embriónica. Un transgen es un ADN el cual se integra en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una modalidad, el ADNc que codifica TAT puede utilizarse para clonar ADN genómico que codifica TAT de acuerdo con técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para generar animales transgenicos que contienen células que expresan el ADN que codifica TAT. Los métodos para generar animales transgénicos , particularmente animales tales como ratones o ratas se han vuelto convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de E.U. Nos. 4,736,866 y 4,870,009. Típicamente, las células particulares se dirigirían a la incorporación del transgen TAT con mej oradores específicos del tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgen que codifica TAT introducido en la línea germinal del animal en una etapa embriónica pueden utilizarse para examinar el efecto de la expresión incrementada del ADN que codifica TAT. Tales animales pueden utilizarse como animales de prueba para los reactivos considerados para - - conferir protección a partir de por ejemplo, condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. De acuerdo con esta faceta de la invención, un animal se trata con el reactivo y una incidencia reducida de la condición patológica, comparada a animales no tratados que portan el transgen, puede indicar una intervención terapéutica potencial para la condición patológica. Alternativamente, los homólogos no humanos de TAT pueden utilizarse para construir un animal "knock out" TAT que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica TAT como un resultado de la recombinación homologa entre el gen endógeno que codifica TAT y el ADN genómico alterado que codifica TAT introducido en una célula germinal embriónica del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica TAT puede utilizarse para clonar el ADN genómico que codifica TAT de acuerdo con técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que codifica TAT puede suprimirse o reemplazarse con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que puede utilizarse para monitorear la integración. Típicamente, se incluyen varias kilobases de ADN flanqueador no alterado (tanto en los extremos 5' como 3') en el vector [ver e.g., Thomas y Capecchi, Cell , 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homologa] . El vector se introduce en una línea celular germinal embriónica (e.g., mediante electroporación) y se - - seleccionan las células en las cuales el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno [ver e.g., Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan entonces en una blastocisto de un animal (e.g., un ratón o rata) para formar quimeras de agregación [ver e.g., Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, {Teratocarcino as y Células Germinales Emh iónicas.· Una Procedimiento Práctico) E. J. Robertson, ed. (IRL oxford, 1987) , pp. 113-152] . Un embrión quimérico puede entonces implantarse en un animal criado, hembra seudopreñada adecuada y el embrión llevado a término para crear un animal ¦"knock out" . La descendencia que alberga el ADN homólogamente recombinado en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas estándar y utilizarse para animales creados en los cuales todas las células de los animales contienen el ADN homólogamente recombinado . Los animales knock out pueden caracterizarse por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido TAT. El ácido nucleico que codifica los polipéptidos TAT también puede utilizarse en la terapia genética. En las aplicaciones de terapia genética, los genes se introducen en las células a fin de lograr la síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente efectivo, por ejemplo, - - para el reemplazo de un gen defectuoso. La "terapia genética" incluye tanto la terapia genética convencional en donde se logra un efecto duradero mediante un solo tratamiento como en la administración de agentes terapéuticos del gen, que involucra la administración de una sola vez o repetida de un ADN o ARNm terapéuticamente efectivo. Los ADNs y ARNs de antisentido pueden utilizarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión in vivo de ciertos genes . Ya se ha demostrado que los oligonucleótidos de antisentido cortos pueden importarse en las células en donde ellos actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares causadas por su absorción limitada por la membrana celular. (Zamecnik et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 83:4143-4146
[1986]). Los oligonucleótidos pueden modificarse para mejorar su absorción, e.g., al sustituir sus grupos de fosfodiéster negativamente cargados por grupos no cargados. Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables . Las técnicas varían dependiendo ya sea si el ácido nucleico se transfiere en las células cultivadas in vi tro o in vivo en las células del huésped propuesto. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácidos nucleicos en las células de mamíferos in vivo incluye el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextr no, método de - - precipitación de fosfato de calcio, etc. Las técnicas de transferencia de gen in vivo actualmente preferidas incluyen la transfección con vectores virales (típicamente retrovirales) y la transfección mediada por el recubrimiento viral de proteína-liposoma (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210
[1993] ) . En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que dirija las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o la célula objetivo, un ligando para un receptor en la célula objetivo, etc. En donde se emplean los liposomas, puen utilizarse proteínas que se enlazan a una proteína de membrana de superficie celular asociada con la endocitosis para dirigir y/o facilitar la absorción, e.g., proteínas de cápside o fragmentos de los mismos, trópicos para un tipo de célula ( particular, anticuerpos para las proteínas que experimentan la internalización en el ciclo de las proteínas que dirigen la localización intracelular y mejoran la media vida intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por el receptor se describe, por ejemplo, por Wu et al., J. Biol . Chem. 262, 4429-4432 (1987); y agner et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 87, 3410-3414 (1990). Para la revisión de los protocolos de marcación de gen y terapia genética ver Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992) .
- - Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos TAT o fragmentos de los mismos descritos en la presente son útiles para la identificación del cromosoma. A este respecto, existe una necesidad en curso para identificar nuevos marcadores de cromosomas ya que actualmente se encuentran disponibles relativamente pocos reactivos de marcación de cromosoma, en base a los datos de secuencia actual . Cada molécula de ácido nucleico TAT de la presente invención puede utilizarse como un marcador de cromosoma. Los polipéptidos TAT y las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden también utilizarse diagnósticamente para el histotipado, en donde los polipéptidos TAT de la presente invención pueden expresarse diferencialmente en un tejido en comparación a otro, preferentemente en un tejido enfermo en comparación a un tejido normal del mismo tipo de tejido. Las moléculas de ácido nucleico TAT encontrarán uso para generar sondas para PCR, análisis Northern, análisis Southern y análisis Western. Esta invención abarca métodos para seleccionar compuestos para identificar aquellos que imitan al polipéptido TAT (agonistas) o evitan el efecto del polipéptido TAT (antagonistas) . Los ensayos de selección para candidatos de drogas antagonistas se diseñan para identificar compuestos que se enlazan o acomplejan con los polipéptidos TAT codificados por los genes identificados en - 1 - la presente o de otro modo interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares, incluyendo e.g., inhibir la expresión del polipeptido TAT a partir de las células. Tales ensayos de selección incluirán ensayos disponibles para selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas, marcándo los particularmente adecuados para identificar candidatos de droga de molécula pequeña. Los ensayos pueden llevarse a cabo en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteina, ensayos de selección bioquímica, inmunoensayos y ensayos en base a las células, los cuales se encuentran bien caracterizados en la técnica. Todos los ensayos para los antagonistas, son comunes en que llaman para ser contacto con el candidato de droga con un polipéptido TAT codificado por un ácido nucleico identificado en la presente bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interactúen. En los ensayos de unión, la interacción es la unión y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una modalidad particular, el polipéptido TAT codificado por el gen identificado en la presente o el candidato de droga se inmoviliza sobre una fase sólida, e.g., sobra una placa de microtitulación, mediante uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente - 2 - generalmente se lleva a cabo al cubrir la superficie sólida con una solución del polipéptido TAT y secando. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, e.g., un anticuerpo monoclonal, especifico para el polipéptido TAT a ser inmovilizado puede utilizarse para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se lleva a cabo al agregar el componente no inmovilizado, el cual puede marcarse por una marca detectable, para el componente inmovilizado, e.g., la superficie cubierta que contiene el componente anclado. Cuando se completa la reacción, los componentes sin reaccionar se retiran, e.g., mediante lavado y se detectan los complejos anclados sobre la superficie sólida. Cuando los componentes originalmente no inmovilizados portan una marca detectable, la detección de la marca inmovilizada sobre la superficie indica que ocurrió el acomplejamiento. En donde los componentes originalmente no inmovilizados no portan una marca, puede detectarse el acomple amiento, por ejemplo, al utilizar un anticuerpo marcado uniendo específicamente el complejo inmovilizado. Si el compuesto candidato interactúa pero no se enlaza a un polipéptido TAT particular codificado por un gen identificado en la presente, puede ensayarse su interacción con ese polipéptido mediante métodos bien conocidos para detectar las interacciones proteína-proteína. Tales ensayos incluyen procedimientos tradicionales, tales como, e.g., - - enlace cruzado, co-inmunoprecipitación y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas . Además, las interacciones proteína-proteína pueden monitorearse al utilizar un sistema genético en base a levadura descrito por Fields y colaboradores (Fields y Song, ature (London) , 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) como se describió por Chevray y Nathans, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991) . Muchos activadores transcripcionales , tales como GAL4 de levadura, consisten de dos dominios modulares físicamente separados, uno actúa como el dominio de unión a ADN, el otro funciona como el dominio de activación de la transcripción. El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones anteriores (generalmente referido como el "sistema de dos híbridos") toma ventaja de esta propiedad y emplea dos proteínas híbridas, una en la cual la proteína objetivo se fusiona al dominio de unión a ADN de GAL4 y la otra en la cual las proteínas de activación del candidato se fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen que reporta GALl-lacZ bajo en control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 a través de una interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen polipeptidos interactuantes se detectan con un sustrato cromogénico para ß-galactosidasa . Un equipo completo (MATCHMAKER™) para identificar las interacciones proteína-proteína entre dos proteínas especificas utilizando la técnica de dos híbridos se encuentra comercialmente disponible por Clontech. Este sistema puede también extenderse para representar los dominios de proteína involucrados en las interacciones específicas de la proteína así como para localizar exactamente los residuos de aminoácido que son cruciales en estas interacciones . Los compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica un polipeptido TAT identificado en la presente y otros componentes intra- o extracelulares pueden probarse como sigue : usualmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intra- o extracelular bajo las condiciones y por un tiempo que permita la interacción y unión de los dos productos. Para probar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se corre en la ausencia y en la presencia del compuesto de prueba . Además , puede agregarse un placebo para un tercera mezcla de reacción, para servir como un control positivo. La unión (formación del complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intra- o extracelular presente en la mezcla, se monitorea como se describió aquí antes. La formación de un complejo en la(s) reacción (es) de control pero no en la mezcla de reacción contiene el compuesto de prueba que indica que el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de - 15 - prueba y su socio de reacción. Para el ensayo de los antagosnistas , el polipeptido TAT puede agregarse a una célula junto con el compuesto a seleccionarse para una actividad particular y la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en la presencia del polipéptido TAT indica que el compuesto es un antagonista para el polipéptido TAT. Alternativamente, los antagonistas pueden detectarse al combinar el polipéptido TAT y un antagonista potencial con los receptores del polipéptido TAT que se enlazan a la membrana o receptores recombinantes bajo condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitivo. El polipéptido TAT puede marcarse, tal como mediante radioactividad, de tal forma que el número de moléculas del polipéptido TAT enalazadas al receptor pueden utilizarse para determinar la efectividad del antagonista potencial . El gen que codifica al receptor puede identificarse por varios métodos conocidos por aquellos de experiencia en la técnica, por ejemplo, toma panorámica de ligando y clasificación de FACS . Coligan et al., Current Protocols in Immun. 1(2): Capítulo 5 (1991). Preferentemente, la expresión clonación se emplea en donde se prepara ARN poliadenilado a partir de una célula que responde al polipéptido TAT y una biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN, que se divide en agrupamientos y se utilizan para transfectar células COS u otras células que no responden - - al polipéptido TAT. Las células transfectadas que se desarrollan en los portaobjetos de vidrio se exponen al polipéptido TAT marcado. El polipéptido TAT puede marcarse mediante una variedad de medios incluyendo la impregnación con yodo o la inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa de sitio especifico. Después de la fijación e incubación, los portaobjetos se someten a un análisis autoradiográfico. Los agrupamientos positivos se identifican y los sub-agrupamientos se preparan y se re-transfectan utilizando un sub-agrupamiento interactivo y un proceso de re-clasificación, produciendo eventualmente un solo clon que codifica al receptor putativo. Como un procedimiento alternativo para la identificación del receptor, el polipéptido TAT marcado puede enlazarse por fotoafinidad con la membrana celular o las preparaciones de extracto que expresan la molécula receptora. El material reticulado se reduce mediante PAGE y se expone a la película de rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor puede cortarse, reduciéndose en fragmentos de péptido y someterse a la micro-secuenciación de la proteína. La secuencia de aminoácidos obtenida a partir de la micro-secuenciación puede utilizarse para diseñar un conjunto de sondas oligonucleótidas degeneradas para clasificar una biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica al receptor putativo.
En otro ensayo para los antagonistas, las células de mamífero o una preparación de membrana que expresa al receptor puede incubarse con un polipéptido TAT marcado en la presencia del compuesto candidato. Puede medirse entonces la capacidad del compuesto para mejorar o bloquear esta interacción. Más ejemplos específicos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se enlaza a las fusiones de inmunoglobulina con un polipéptido TAT y en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos poli- y monoclonales, anticuerpos de cadena única, anticuerpos anti-idiotípicos y versiones quiméricas o humanizadas de tales anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanos. Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína relacionada cercanamente, por ejemplo, una forma mutada de un polipéptido TAT que reconoce al receptor pero no imparte ningún efecto, inhibiendo por lo tanto competitivamente la acción del polipéptido TAT. Otro antagonista del polipéptido TAT potencial es una construcción de ARN o ADN de antisentido preparada utilizando tecnología de antisentido, en donde, e.g., una molécula de ARN o ADN de antisentido actúa para bloquear directamente la traducción del ARNm mediante hibridación para el ARNm objetivado y evitar la traducción de la protexna. La - - tecnología de antisentido puede utilizarse para controlar la expresión del gen a través de la formación de triple hélice o ADN o ARN de antisentido, basándose ambos de tales métodos en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de la secuencia de polinucleótidos, que codifica a los polipéptidos TAT maduros de la presente, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de ARN de antisentido de desde aproximadamente 10 hasta 40 pares base de longitud. Un oligonucleótido de ADN se diseña para ser complementario para una región del gen involucrado en la transcripción (de triple hélice ver Lee et al., Nucí. Acid. Res. 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), evitando por lo tanto la transcripción y la producción del polipéptido TAT. El oligonucleótido de ARN de antisentido hibridiza al ARNm in vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido TAT (antisentido - Okano, Neurochem. , 56:560 (1991) ; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (Oligodesoxinucleótidos como Inhibidores de Antisentido de la Expresión del Gen) (CRC Press :Boca Ratón, FL, 1988) . Los oliginucleótidos descritos arriba pueden también suministrarse a las células de tal manera que el ARN o ADN de antisentido pueda expresarse in vivo para inhibir la producción del polipéptido TAT. Cuando se utiliza ADN de antisentido, se prefieren los oligodesoxiribonucleótidos - - derivador a partir del sitio de traducción-iniciación, e.g., entre aproximadamente -10 y +10 posiciones de la secuencia de nucleótidos del gen objetivo. Los antagonistas potenciales incluyen moléculas pequeñas que se enlazan al sitio activo, el sitio de unión a receptor o el factor de crecimiento u otro sitio de unión relevante del polipeptido TAT, bloqueando por lo tanto la actividad biológica normal del polipeptido TAT. Ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a péptidos pequeños o moléculas similares a péptidos, preferentemente péptidos solubles y compuestos orgánicos o inorgánicos sin peptidilo sintéticos. Los ribozomas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar el desdoblamiento específico de ARN. Los ribozomas actúan mediante hibridación específica de la secuencia hacia el ARN objetivo complementario, seguido por el desdoblamiento endonucleolltico . Los sitios específicos de desdoblamiento de ribosoma dentro de un objetivo de ARN potencial pueden identificarse mediante técnicas conocidas. Para detalles adicionales ver, e.g., Rossi, Current Biology, 4:459-471 (1994) y la publicación de PCT No. WO 97/33551 (publicada en Septiembre 18, 1997) . Las moléculas de ácido nucleico en formación de triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deben ser monocatenarias y compuestas de desoxinucleótidos . La composición base de estos oligonucleótidos se diseña de tal forma que promueve la formación de triple hélice a través de reglas Hoogsteen de pares base, que generalmente requieren alargamientos considerables de purinas o pirimidinas en un filamento de un dúplex. Para detalles adicionales ver e.g., la publicación de PCT No. WO 97/33551, supra. Estas moléculas pequeñas pueden identificarse mediante cualquiera de uno o más ensayos de selección descritos aqui antes y/o mediante cualquier otra técnica de selección bien conocida por aquellos expertos en la materia. El ácido nucleico que codifica al polipeptido TAT aislado puede utilizarse en la presente para producir recombinantemente al polipéptido TAT utilizando técnicas bien conocidas en la materia como se describe en la presente. A su vez, los polipéptidos TAT producidos pueden emplearse para generar anticuerpos anti-TAT utilizando técnicas bien conocidas en la materia y como se describe en la presente . Los anticuerpos que específicamente se enlazan al polipéptido TAT identificado en la presente, asi como otras moléculas identificadas mediante los ensayos de selección hasta ahora descritos, pueden administrarse para el tratamiento de varios trastornos, incluyendo el cáncer, en la forma de composiciones farmacéuticas. Si el polipéptido TAT es intracelular y los anticuerpos completos se utilizan como inhibidores, se - - prefiere la internalización de los anticuerpos. Sin embargo, las lipofecciones o liposomas también pueden utilizarse para suministrar el anticuerpo o un fragmento de anticuerpo en las células. Cuando se utilizan los fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se enlaza específicamente al dominio de unión de la proteína objetivo. Por ejemplo, en base a las secuencias de región variable de un anticuerpo, las moléculas de péptido pueden diseñarse para retener la capacidad para unirse a la secuencia de la proteína objetivo. Tales péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante . Ver, e.g., Marasco et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993) . La formulación de la presente también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular de que se trate, preferentemente aquellas con actividades complemen arias que no se afectan adversamente entre sí. Alternativamente o además, la composición puede comprender un agente que mejora su función, tal como por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas se encuentran presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito propuesto . Los siguientes ejemplos se ofrecen solamente para - - propósitos de ilustración y no intentan limitar de ninguna manera el alcance de la presente invención. Todas las patentes y referencias de literatura citadas en la presente especificación se incorporan en la presente mediante la referencia en su totalidad. EJEMPLOS Los reactivos comercialmente disponibles referidos en los ejemplos se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del los fabricantes a menos que se indique de otro modo. La fuente de estas células identificadas en los siguientes ejemplos y a través de la especificación, mediante los números de acceso ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, VA. EJEMPLO 1 : Perfil de la Expresión del Tejido Utilizando GeneExpress® La base de datos patentada que contiene la información de la expresión del gen (GeneExpress®, Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD) se analizó en un intento para identificar polipéptidos (y sus ácidos nucleicos de codificación) cuya expresión se sobre-regula significativamente en el (los) tejido (s) de tumor particular (es) de interés en comparación a otro (s) tumor (es) y/o tejidos normales. Específicamente, el análisis de la base de datos GeneExpress® se condujo utilizando ya sea software disponible a través de Gene Logic Inc., - - Gaithersburg, MD, para utilizarse con la base de datos GeneExpress® o con el software patentado escrito y desarrollado en Genentech, Inc., para utilizarse con la base de datos GeneExpress®. La clasificación de los alcances positivos en el análisis se basan en varios criterios incluyendo, por ejemplo, especificidad del tejido, especificidad del tumor y nivel de expresión en tejidos esenciales normales y/o de proliferación normal . La siguiente es una lista de moléculas cuyo perfil de expresión del tejido como se determinó a partir de un análisis de la base de datos GeneExpress® evidencia alta expresión del tejido y sobre-regulación significativa de la expresión en un tumor o tumores específicos en comparación a otro(s) tumor (es) y/o tejidos normales y opcionalmente la expresión relativamente baja en tejidos esenciales normales y/o de proliferación normal. Como tales, las moléculas listadas abajo son objetivos de polipéptido excelentes para el diagnóstico y terapia del cáncer en mamíferos .
Molécula Sobrerregulación de la En comparación a: expresión en: DNA225785 (TAT295) tumor de seno tejido normal de seno DNA225785 (TAT295) tumor de colon tejido normal de colon DNA225785 (TAT295) tumor linfoide tejido normal linfoide DNA88158 (TAT298) tumor ovárico tejido normal ovárico - - DNA88158 (TAT298) tumor uterino tejido normal uterino DNA88158 (TAT298) tumor de seno tejido normal de seno DNA88158 (TAT298) tumor de riñon tejido normal de riñon DNA225800 (TAT347) tumor ovárico tejido normal ovárico DNA225800 (TAT347) tumor uterino tejido normal uterino DKA225800 (TAT347) tumor de seno tejido normal de seno DNA225800 (TAT347) tumor se riñon tejido normal de riñon DNA299884 (TAT304) tumor pulmonar tejido normal pulmonar DNA299884 (TAT304) tumor de colon tejido normal de colon DNA299884 (TAT304) tumor rectal tejido normal rectal DNA299884 (TAT304) tumor ovárico tejido normal ovárico DNA299884 (TAT304) tumor de seno tejido normal de seno DNA299884 (TAT304) tumor uterino tejido normal uterino DNA293550 (TAT293) tumor de seno tejido normal de seno DNA293550 (TAT293) tumor de colon tejido normal de colon D A293550 (TAT293) tumor rectal tejido normal rectal DNA293550 (TAT293) tumor uterino tej ido normal uterino DNA293550 (TAT293) tumor pulmonar tej ido normal pulmonar DNA293550 (TAT293) tumor ovárico tejido normal ovárico DNA293550 (TAT293) tumor pancreático tejido normal pancreático DNA293550 (TAT293) tumor de próstata tejido normal de próstata DNA22S313 (TAT29S) tumor de piel tejido normal de piel DNA226313 (TAT296) tumor de melanoraa tej ido normal de melanocito DNA225865 (TAT300) tumor de seno tejido normal de seno DNA225865 (TAT300) tumor de colon tejido normal de colon - - DNA225865 (TAT300) tumor rectal tejido normal rectal DNA225865 (TAT300) tumor pulmonar tejido normal pulmonar DNA225865 (TAT300) tumor ovárico tejido normal ovárico DNA225865 (TAT300) tumor pancreático tejido normal pancreático DNA225865 (TAT300) tumor de piel te ido normal de piel DNA225865 (TAT300) tumor de tejido blando tejido blando normal DNA226403 (TAT302) tumor de seno tejido normal de seno DNA226403 (TAT302) tumor de próstata tejido normal de próstata DNA73736 (TAT303) tumor uterino tejido normal uterino DNA73736 (TAT303) tumor pulmonar tejido normal pulmonar D1TA73736 (TAT303) tumor ovárico tejido normal ovárico DNA73736 (TAT303) tumor testicular tejido normal tersticular DKA299885 (TAT305) tumor de piel tejido normal de piel EJEMPLO 2 : Analisi£3 Cuantitativo de la Expresión de ARNm en TAT En este análisis, se utilizó un análisis de 5' nucleasa (por ejemplo, TaqMan®) y PCR cuantitativa en tiempo real (por ejemplo, ABI Prizm 7700 Sequence Detection System® (Perkin Elmer, Applied Biosystems División, Foster City, CA) ) , para encontrar genes que se encuentran significativamente sobreexpresados en un tumor o tumores cancerosos comparados con otros tumores cancerosos o tejido normal no canceroso. La reacción del análisis de 5' nucleasa es una técnica fluorescente en base a PCR que hace uso de la actividad 5' de la exonucleasa de la enzima polimerasa de ADN - - Taq para monitorear la expresión del gen en tiempo real. Dos iniciadores de oligonucleótido (cuyas secuencias se basan en el gen o la secuencia EST de interés) se utilizan para generar un amplicon típico de una reacción PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, se diseña para detectar una secuencia de nucleótidos localizada entre los dos iniciadores de PCR. La sonda no es extendible por medio de la enzima polimerasa de ADN Taq y se encuentra marcada con un colorante fluorescente informador y un colorante fluorescente atenuador. Cualquier emisión inducida por láser del colorante informador se atenúa por medio del colorante atenuador cuando los dos colorantes se localizan juntos mientras se encuentran en la sonda. Durante la reacción de amplificación PCR, la enzima polimerasa de ADN Taq desdobla la sonda de una manera dependiente del modelo . Los fragmentos de sonda resultantes se disocian en solución, y la señal del colorante informador liberado se libera del efecto atenuador del segundo fluoroforo. Se libera una molécula del colorante informador para cada nueva molécula sintetizada, y la detección del colorante informador no atenuado proporciona las bases para la interpretación cuantitativa de los datos. El procedimiento de nucleasa 5' se ejecuta en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real tal como el ABI Prism 7700TM Sequence Detection. El sistema consiste de un termociclador, láser, dispositivo de carga acoplada (CCD) - - cámara y computadora. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 pozos en un termociclador . Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser se colecta en tiempo real a través de cables de fibra óptica para todos los 96 pozos, y se detecta en el CCD. El sistema incluye software para ejecutar el instrumento y para analizar los datos . El material de inicio para la selección fue ARNm aislado de una variedad de diferentes tejidos cancerosos. El ARNm se cuantifica precisamente, e.g., fluorométricamente . Como un control negativo, el AR se aisló a partir de varios tejidos normales del mismo tipo de tejido que los tejidos cancerosos que se analizaron. Los datos del análisis de nucleasa 5' se expresan inicialmente como Ct, o ciclo de umbral. Este se define como el ciclo en el cual la señal de informador se acumula por encima del nivel de fondo de fluorescencia. Los valores ACt se utilizan como medición cuantitativa del relativo número de copias iniciales de una secuencia objetivo particular en una muestra de ácido nucleico al comparar los resultados del ARNm canceroso con los resultados del ARNm humano normal . Dado que una unidad Ct corresponde a 1 ciclo PCR o aproximadamente a un aumento relativo de 2 veces en relación al normal , dos unidades corresponden a un aumento relativo de 4 veces, 3 unidades corresponden a un aumento relativo de 8 veces y asi - - sucesivamente, se puede medir cuantitativamente el aumento de veces relativo en la expresión del AR m entre dos o más tejidos diferentes. Utilizando esta técnica, las moléculas enlistadas abajo se han identificado como significativamente sobreexpresadas (i.e., al menos 2 veces) en un tumor (es) particular (es) en comparación con su(s) contraparte (s) de tejido (s) no cancerosos normales (de donantes tanto del mismo como de diferente tejido) y de este modo, representan excelentes objetivos de polipéptido para el diagnóstico y la terapia del cáncer en mamíferos. Molécula Sobrerregulación de la En comparación a: expresión en: DNA88158 (TAT298) tumor ovárico tejido normal ovárico DNA225800 (TAT347) tumor ovárico tejido normal ovárico DNA293550 (TAT293) tumor de seno tejido normal de seno DWA103386 (TAT299) tumor de pulmón tejido normal de pulmón DNA273438 (TAT351) tumor de pulmón tejido normal de pulmón D A225865 (TAT300) tumor de colon tejido normal de colon DWA226403 (TAT302) tumor de seno tejido normal de seno DNA73736 (TAT303) tumor ovárico tejido normal ovárico EJEMPLO 3: Hibridación In situ La hibridación in situ es una poderosa y versátil técnica para la detección y localización de secuencias de ácido nucleico dentro de preparaciones de células o tej idos . Puede ser útil, por ejemplo, para identificar sitios de - - expresión del gen, analizar la distribución del tejido de transcripción, identificar y localizar la infección viral, seguir los cambios en la síntesis de ARNm específica y ayudar al mapeo del cromosoma. La hibridación in situ se llevó a cabo siguiendo una versión optimizada del protocolo por Lu y Gillett, Cell Vision 1:159-176 (1994), utilizando ribosondas generadas por PCR marcadas con 33P. Brevemente, se seccionaron tejidos humanos fijados con formalina cubiertos con parafina, se desparafinizaron, de desproteinaron en proteinasa K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37°C, y se procesaron posteriormente para la hibridación in situ como se describe por Lu y Gillett, supra. Se generó una ribosonda anti-sentido de [33-P] marcada con UTP a partir de un producto de PCR y se hibridó a 55°C durante la noche. Los portaobjetos se sumergieron en emulsión de rastreo nuclear Kodak NTB2 y se expusieron durante 4 semanas . Síntesis de la Ribosonda de 33P . 6.0 ß? (125 mCi) de 33P-UTP (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol) se secaron al vacío. A cada tubo conteniendo 33P-UTP seco, se agregaron los siguientes ingredientes : 2.0 µ? amortiguador de transcripción 5x 1.0 /¿l DTT (100 m ) 2.0 ¡xl mezcla de NTP (2.5 mM : 10 µ; cada uno de - - 10 t?? GTP, CTP & ATP + 10 µ? ?20) 1.0 µ? UTP (50 µ?) 1.0 µ? Rnasin 1.0 µ? modelo de ADM (lMg) 1.0 µ? polimerasa de AR (para los productos de PCR T3 = AS, T7 = S, comúnmente) Los tubos se incubaron a 37°C durante una hora. Se agregaron 1.0 µ? de RQ1 DNasa, seguidos por la incubación a 37°C durante 15 minutos. Se agregaron 90 µ? de TE (10 m de Tris pH 7.6/lmM de EDTA pH 8.0), y la mezcla se pipeteó sobre papel DE81. La solución restante se cargó en una unidad Microcon-50 de ultrafiltración, y se centrifugó utilizando el programa 10 (S minutos) . La unidad de filtración se invirtió sobre un segundo tubo y se centrifugó utilizando el programa 2 (3 minutos) . Después del centrifugado final de recuperación, se agregaron 100 µ? de TE. Se pipeteó 1 µ? del producto final sobre papel DE81 y se contó en 6 mi de Biofluor II . La sonda se corrió en un gel de TBE/urea. Se agregaron 1-3 µ? de la sonda o 5 µ? de ARN Mrk II a 3 µ? de amortiguador de carga. Después de calentar en un bloque térmico a 95°C durante tres minutos, la sonda se colocó inmediatamente en hielo. Los pozos de gel se lavaron, la muestra se cargó, y se corrió a 180-250 voltios durante 45 - - minutos . El gel se envolvió en envoltura sarán y se expuso a película XAR con un filtro intensificador en un congelador a -70°C de una hora hasta durante la noche. Hibridación 33P ?. Pretratamiento de las secciones congeladas Los portaobjetos se retiraron del congelador, se colocaron en charolas de aluminio y se descongelaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las charolas se colocaron en un incubador a 55°C durante cinco minutos para reducir la condensación. Los portaobjetos se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído al 4% sobre hielo en la campana de ventilación, y se lavaron en 0.5 x SSC durante 5 minutos, a temperatura ambiente (25 mi 20 x SSC + 975 mi SQ ¾0) . Después de la desproteinación en 0.5 µg/ml de proteinasa de K durante 10 minutos a 37°C (12.5 µ? de la existencia de 10 mg/ml en 250 mi de amortiguador de RNAsa libre de RHasa precalentado), las secciones se lavaron en 0.5 x SSC durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron en etanol al 70%, 95%, 100%, 2 minutos cada una. B. Pretratamiento de las secciones recubiertas con parafina Los portaobjetos se desparafinizaron, se colocaron en SQ H20, y se enjuagaron dos veces en 2 x SSC a temperatura ambiente, durante 5 minutos cada vez. Las secciones se - 3 2 - desproteinaron en 20 µg/ l de proteinasa de K (500 µ.1 de 10 mg/ml en 250 mi de amortiguador de RNasa libre de RNasa; 37°C, 15 minutos) - embrión humano, o 8 x proteinasa de K (100 µ? en 250 mi de amortiguador de RNasa, 37°C, 30 minutos) - tejidos de formalina. El enjuague subsecuente en 0.5 x SSC y la deshidratación se llevaron a cabo como se describió anteriormente . C . Prehibridacion Los portaobjetos se colocaron en una bolsa plástica recubierta con amortiguador Box (4 x SSC, formamida al 50%) -papel filtro saturado. D. Hibridación La sonda cpm de 1.0 x 106 y 1.0 µ? de ARNt (existencias de 50 mg/ml) por portaobjeto se calentaron a 95°C durante 3 minutos. Los portaobjetos se enfriaron sobre hielo, y se agregaron 48 µ? de amortiguador de hibridación por portaobjeto. Después de la agitación, se agregaron 50 µ.1 de la mezcla de 33P a 50 µ? de la prehibridacion en el portaobjetos. Los portaobjetos se incubaron durante la noche a 55°C. E . Lavados El lavado se realizó a 2 x 10 minutos con 2xSSC, EDTA a temperatura ambiente (400 mi 20 x SSC + 16 mi 0.25M EDTA, Vf=4L) , seguido por un tratamiento A de RNasa a 37°C durante 30 minutos (500 µ? de 10 mg/ml en 250 mi de - - amortiguador de Rnasa = 20 xg/ml) . Los portaobjetos se lavaron a 2 x 10 minutos con 2 x SSC, EDTA a temperatura ambiente. Las rigurosas condiciones de lavado fueron como sigue: 2 horas a 55°C, 0.1 x SSC, EDTA (20 mi 20 x SSC + 16 mi EDTA, V£=4L) . F . Oligonucleótidos El análisis in situ se llevó a cabo en una variedad de las secuencias de ADN descritas en la presente. Los oligonucleótidos empleados para estos análisis se obtuvieron de modo que fueran complementarios a los ácidos nucleicos ( o sus complementos) como se muestra en las figuras que la acompañan . G. Resultados El análisis in situ se llevó a cabo en una variedad de las secuencias de ADN descritas en la presente. Los resultados de estos análisis son como sigue. (1) DNA226313 (TAT296) Todos los tejidos normales analizados son negativos para la expresión. Las muestras de tejido de melanoma maligno 11/21 son positivas para la expresión y de los casos positivos 6 despliegan una señal extremadamente fuerte. (2) DNA103386 (TAT299) Se observa una fuerte señal en las células malignas de un neoplasma testicular (seminoma) mientras que el tejido testicular normal es negativo para la expresión. - - (3) DNA273438 (TAT351) Se observa una fuerte señal en las células malignas de un neoplasma testicular (seminoma) mientras que el tejido testicular normal es negativo para la expresión. (4) DNA73736 (TAT303) Los tejidos ováricos y endometriales normales son negativos para la expresión. Por otra parte, 6 de 11 adenocarcinomas ováricos y 2 de 8 endometriales son positivos para la expresión. Adicionalmente, en otro experimento, 5 de 11 carcinomas de células claras, 18 de 26 cistadenocarcinomas serosos y 15 de 21 adenocarcinomas endometrioides son positivos para la expresión. (5) DNA299885 (TAT305) El tejido de piel normal es negativo para la expresión mientras que 5 de 5 muestras de melanoma maligno analizadas son positivas para la expresión. EJEMPLO 4 : Verificación y Análisis de la Expresión Diferencial de Polipéptidos TAT mediante GEPIS Los polipéptidos TAT que pueden haberse identificado como antlgeno tumoral como se describe en uno o más de los Ejemplos anteriores se analizaron y se verificaron como sigue. Se investigó una base de datos de ADN de marca de secuencia expresada (EST) (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals , Palo Alto, CA) y se identificaron interesantes secuencias EST mediante GEPIS . El perfilado de - - la expresión del gen in silico (GEPIS) es una herramienta de bioinformática desarrollada en Genentech, Inc. que caracteriza los genes de interés para nuevos objetivos terapéuticos del cáncer. GEPIS toma ventaja de grandes cantidades de información de la secuencia EST y de la biblioteca para determinar los perfiles de expresión del gen. GEPIS es capaz de determinar el perfil de expresión de un gen en base a su correlación proporcional con el número de sus ocurrencias en las bases de datos EST, y funciona integrando la base de datos relacional LIFESEQ® EST y la información propia de Genentech de una manera rigurosa y estadísticamente significativa. En este ejemplo, GEPIS se utiliza para identificar y validar de manera cruzada los nuevos antígenos tumorales, aunque GEPIS puede configurarse para desempeñar tanto tareas de análisis muy específicos como de amplia selección. Para la selección inicial, GEPIS se utiliza para identificar las secuencias EST de la base de datos LIFESE Q® que se correlacionan con la expresión en un tejido o tejidos particulares de interés (frecuentemente un tejido tumoral de interés) . Las secuencias EST identificadas en esta selección inicial (o las secuencias de consenso obtenidas de la alineación de secuencias EST múltiples relacionadas y sobrepuestas obtenidas de la selección inicial) se sometieron entonces a una selección propuesta para identificar la presencia de al menos un dominio de transmetribrana en la - - proteína codificada. Finalmente GEPIS se empleó para generar un perfil completo de expresión de tejido para las diversas secuencias de interés. Utilizando este tipo de bioinformática de selección, se identificaron varios polipéptidos TAT (y sus moléculas de codificación de ácido nucleico) como significativamente sobreexpresadas en un tipo particular de cáncer o ciertos cánceres en comparación con otros cánceres y/o tejidos normales no cancerosos. La clasificación de los aciertos de GEPIS se basa en varios criterios que incluyen, por ejemplo, especificidad del tejido, especificidad del tumor y el nivel de expresión en tejidos normales esenciales y/o normales de proliferación. Lo siguiente es una lista de moléculas cuyo perfil de expresión del tejido determinado por GEPIS evidencia una alta expresión en tejido y significativa sobrerregulación de la expresión en un tumor o tumores específicos comparado con otro(s) tumor (es) y/o tejidos normales y opcionalmente relativamente baja expresión en tejidos normales esenciales y/o normales de proliferación. Como tales, las moléculas abajo enlistadas son excelentes objetivos de polipéptido para el diagnóstico y terapia del cáncer en mamíferos. Molécula Sobrerregulación de la En comparación a: expresión en: DNA225785 (TAT295) tumor de colon tejido normal de colon DNA88158 (TAT298) tumor uterino tejido normal uterino - - DNA225800 (TAT347) tumor uterino tejido normal uterino DNA293550 (TAT293) tumor de próstata tejido normal de próstata DNA293550 (TAT293) tumor de seno tejido normal de seno DNA293550 (TAT293) tumor de colon tejido normal de colon DNA293550 (TAT293) tumor uterino tejido normal uterino DNA293550 (TAT293) tumor pancreático tejido normal pancreático DNA293550 (TAT293) tumor ovárico tejido normal ovárico DNA293550 (TAT293) tumor de ve ga tejido normal de vejiga ???293550 (TAT293) tumor cerebral tejido normal cerebral DNA103386 (TAT299) tumor testicular tejido normal testicular DNA273438 (TAT351) tumor testicular te ido normal testicular DNA225865 (TAT300) tumor uterino tejido normal uterino DNA225865 (TAT300) tumor de riñon tejido normal de riñon DNA225865 (TAT3O0) tumor óseo tejido normal óseo DNA225865 (TAT300) tumor de esófago tejido normal de esófago DNA225865 (TAT300) tumor de vejiga tejido normal de vejiga DNA226403 (TAT302) tumor de próstata tejido normal de próstata DNA73736 (TAT303) tumor testicular tejido normal testicular DNA73736 (TAT303) tumor ovárico te ido normal ovárico D A73736 (TAT303) tumor de próstata tejido normal de próstata EJEMPLO 5 : Identificación de los Polipéptidos TAT que se encuentran Específicamente Expresados por o Sobreexpresados en Tejido (s) Linfoide(s) Utilizando los análisis de expresión en tejido GeneExpress® y asociados con GEPIS descritos en ciertos - - Ejemplos anteriormente, se han identificado varios polipeptidos TAT ya sea como específicamente expresados en la superficie de células B tanto normales como malignas o sobreexpresadas en tejido(s) canceroso (s) linfoide (s) en comparación con su contraparte de tej ido normal . Por "específicamente expresado" en cierto tejido o tipo celular, se entiende que el polipéptido TAT se expresa mediante ese cierto tej ido o tipo celular y no se expresa significativamente por ningún otro tejido o tipo celular. Los polipeptidos TAT que se expresan específicamente en la superficie de las células B tanto normales como malignas o se sobreespresan en tejido (s) canceroso (s) linfoide (s) en comparación con su contraparte de tej ido normal son excelentes objetivos de polipéptido para el tratamiento de la célula B y otros cánceres asociados a linfoide que incluyen, por ejemplo, linfornas de alto, intermedio y bajo grado (incluyendo linfornas de célula B tales como, por ejemplo, linfoma de célula B de tejido linfoide asociado a la mucosa y linfoma no de Hodgkin, linfoma de célula de corteza cerebral, linfoma de Burkitt, linfoma de zona marginal, linfoma de gran célula difusa, linfoma folicular, y linfoma de Hodkin) y leucemias (incluyendo leucemia linfocítica crónica) , mieloma múltiple, y otros cánceres hematológicos y/o asociados a la célula B. A este respecto, notamos que RITUXA ® (Genentech Inc., South San Francisco, California) es un anticuerpo que - - se enlaza al antígeno CD20 que se expresa específicamente en la superficie de las células B tanto normales como malignas y que se ha utilizado con éxito para tratar el linfoma no de Hodgkin en humanos. Los siguientes son polipéptidos TAT que se han identificado en la presente como específicamente expresados en la superficie de células B tanto normales como malignas o sobreexpresados en tejido(s) canceroso (s) linfoide (s) en comparación con su contraparte de tejido normal y, en consecuencia, servirán como excelentes objetivos de polipéptido para el tratamiento de la célula B y otros cánceres asociados a linfoide: TAT294 (DNA150813) , TAT297 (DNA103365) , TAT301 (DNA196665) y TAT352 (DNA287183). EJEMPLO 6 : El uso de TAT como una sonda de hibridación El siguiente método describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica TAT como una sonda de hibridación para i.e., el diagnóstico de la presencia de un tumor en un mamífero. El ADN que comprende la secuencia de codificación de longitud total o el TAT maduro como se describe en la presente también puede emplearse como una sonda para la selección de ADNs homólogos (tal como aquellos que codifican las variantes de TAT que ocurren de manera natural) en las bibliotecas de ADNc de tejido humano o las bibliotecas genómicas de tejido humano. La hibridación y el lavado de los filtros que - - contienen ya sea ADNs de biblioteca se llevan a cabo bajo las siguientes condiciones altamente rigurosas . La hibridación de la sonda derivada de TAT radioetiquetada para los filtros se lleva a cabo en una solución de formamida al 50%, 5 x SSC, SDS al 0.1%, pirofosfato de sodio al 0.1%, fosfato de sodio 50 mM, pH 6.8, 2 x solución de Denhardt y sulfato de dextrano al 10% a 42 °C durante 20 horas. El lavado de los filtros se llevó a cabo en una solución acuosa de 0.1 x SSC y SDS al 1% a 42°C. Los ADNs que tienen una identidad de secuencia deseada con el ADN que codifica TAT de secuencia nativa de longitud total pueden identificarse entonces utilizando técnicas estándar conocidas en la materia.
EJEMPLO 7 : Expresión de TAT en E. coli Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de TAT mediante la expresión recombinante en E. coli . La secuencia de ADN que codifica TAT se amplifica inicialmente utilizando iniciadores PCR seleccionados. Los iniciadores deben contener sitios de enzima de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión seleccionado. Pueden emplearse una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de vector adecuado es pBR322 (derivado a partir de E. colí; ver Bolívar - - et al., Gene, 2^:95 (1977)) que contiene genes para la resistencia a la ampicilina y tetraciclina . El vector se digiere con la enzima de restricción y se desfosforilata. Las secuencias amplificadas de PCR se ligan entonces al vector. El vector preferentemente incluirá secuencias que codifican para un gen de resistencia al antibiótico, un promotor trp, un conductor polyhis (incluyendo los primeros seis codones STII, la secuencia polyhis y el sitio de desdoblamiento de la eteroquinasa) , la región de codificación TAT, el terminador transcripcional lambda y un gen argU. La mezcla de ligación se utiliza entonces para transforma una cepa de E. coli seleccionada utilizando los métodos descritos por Sambrook et al., supra . Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en las placas LB y se seleccionan entonces las colonias resistentes al antibiótico. El ADN de plásmido puede aislarse y confirmarse mediante el análisis de restricción y la secuenciación de ADN. Los clones seleccionados pueden crecer durante la noche en un medio de cultivo líquido tal como ciado LB suplementado con antibióticos . El cultivo durante la noche puede utilizarse subsecuentemente para inocular un cultivo de escala más grande. Las células crecen entonces a una densidad óptica deseada durante la cual se inicia el promotor de expresión.
- - Después de cultivar las células por varias horas más, las células pueden recolectarse mediante centrifugación. La bolita de célula obtenida por la centrifugación puede solubilizarse utilizando varios agentes conocidos en la técnica y la proteína TAT solubilizada puede purificarse entonces utilizando una columna quelante metálica bajo condiciones que permitan la unión hermética de la proteína. TAT puede expresarse en E. coli en una forma marcada poli-His, utilizando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica a TAT se amplifica inicialmente utilizando iniciadores PCR seleccionados . Los iniciadores contendrán sitios de enzima de restricción que correspondan a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión seleccionado y otras secuencias útiles proporcionadas para la iniciación de la traslación eficiente y confiable, la rápida purificación en una columna de quelación metálica y retirar el proteolítico con enteroquinasa . Las secuencias marcadas poli-His amplificadas por PCR se ligan entonces a un vector de expresión, que se utiliza para transformar un huésped de E. coli en base a la cepa 52 (W3110 fuhA (tonA) Ion galE rpoHts (htpRts) clpP(lacIq). Los transformantes crecen primero en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30°C con sacudimiento hasta que se alcance un O.D.600 de 3-5. Los cultivos se diluyen entonces 50-100 veces en el medio CRAP (preparado al mezclar 3.57g de ( H4)2S04í 0.71 g de citrato de - - sodio-2H20, 1.07 g de KC1, 5.36 g de extracto de levadura Difco, 5.36 g de SF Sheffield hicasa en 500 mi de agua, así como 110 mM de POS, pH 7.3, 0.55% (w/v) de glucosa y 7 mM de MgS0 ) y crece por aproximadamente 20-30 horas a 30°C con sacudimiento. Se retiran las muestras para verificar la expresión mediante el análisis SDS-PAGE y el cultivo de volumen se centrifuga para hacer bolitas las células. Las bolitas de células se congelan hasta la purificación y repliegue . La pasta de E. coli desde 0.5 hasta 1 L de fermentaciones (bolitas de 6-10 g) se resuspende en 10 volúmenes (w/v) en 7 M de guanidina, 20 mM de Tris, amortiguador de pH 8. El sulfito de sodio sólido y el tetraionato de sodio se agregan para elaborar las concentraciones finales de 0.1 M y 0.02 M respectivamente y la solución se agita durante la noche a 4°C. Esta etapa da como resultado una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados mediante sulfitolización. La solución se centrífuga a 40,000 rpm en una Ultracentrífuga Beckman durante 30 minutos. El sobrenadante se diluyó con 3-5 volúmenes de amortiguador de columna de quelato metálico (6 M de guanidina, 20 mM de Tris, pH 7.4) y se filtró a través de filtros de 0.22 micrones para clarificar. El extracto clarificado se cargó en una columna de quelato metálica Quiagen Ni-NTA de 5 mi equilibrada con el amortiguador de - - columna de quelato metálico. La columna se lavó con amortiguador adicional conteniendo 50 mM de imidazol (Calbiochem, clase Utrol) , pH 7.4. La proteína se extrajo con amortiguador conteniendo 250 mM de imidazol. Las fracciones que contienen la protelna deseada se agrupan y se almacenan a 4°C. La concentración de la proteína se estima por su absorbencia a 280 nm utilizando el coeficiente de destrucción calculada en base a su secuencia de aminoácidos. Las proteínas se repliegan al diluir la muestra lentamente en amortiguador de repliegue preparado en fresco que consiste de: 20 mM de Tris, pH 8.6, 0.3 M de NaCl , 2.5 M de urea, 5 mM de cisteína, 20 mM de glicina y 1 mM de EDTA. Los volúmenes de repliegue se escogen de manera que la concentración final de la proteína se encuentra entre 50 hasta 100 microgramos/ml . La solución de repliegue se agita suavemente a 4°C durante 12-36 horas. La reacción de repliegue se enfría mediante la adición de TFA hacia una concentración final de o. % (pH de aproximadamente 3) . Antes de la purificación adicional de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0.22 micrones y se agrega el acetonitrilo a la concentración final de 2-10%. La proteína replegada se cromatografía en una columna de fase inversa Poros Rl/H utilizando un amortiguador movible de 0.1% de TFA con elusión con un gradiente de acetonitrilo desde 10 hasta 80%. Las alícuotas de las fracciones con una absorbencia - - ?280 se analizan sobre geles de poliacrilamida SDS y se agrupan fracciones que contienen la proteina replegada homogénea. Generalmente, las especies adecuadamente replegadas de la mayoría de las proteínas se eluyen a concentraciones más inferiores de acetonitrilo ya que aquellas especies son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos a partir de la interacción con la resina de fase inversa. Las especies agregadas se eluyen usualmente a concentraciones de acetonitrilo mayores . Además para resolver las formas no plegadas de las proteínas a partir de la forma deseada, la etapa de fase inversa también retira endotoxina de las muestras . Las fracciones que contienen el polipéptido ??? replegado deseado se agrupan y se retira el acetonitrilo utilizando una corriente suave de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas se formulan en 20 ttiM de Hepes, pH 6.8 con 0.14 M de cloruro de sodio y 4% de manitol mediante diálisis o mediante filtración de gel utilizando resinas de G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el amortiguador de la formulación y filtradas de manera estéril . Ciertos de los polipéptidos TAT descritos en la presente se han expresado y purificado exitosamente utilizando esta(s) técnica (s). EJEMPLO 8 : Expresión de TAT en células de mamífero Este ejemplo ilustra la preparación de una forma - - potencialmente glicosilada de TAT mediante la expresión recombinante en células de mamífero. El vector, pRK5 (ver EP 307,247 publicada en Marzo 15 de 1989) se emplea como el vector de expresión. Opcionalmente, el ADN TAT se liga en pR 5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN TAT utilizando métodos de ligación tales como se describen por Sambrook et al., supra . El vector resultante se llama pRK5-TA . En una modalidad, las células huésped seleccionadas pueden ser 293 células (ATCC CCL 1573) que crecen para confluenciar en las placas de cultivo del tejido en el medio tales como DMEM suplementado con suero fetal de ternero y opcionalmente componentes nutrientes y/o antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 µg de ADN de pRK5-TAT con aproximadamente 1 µg de ADN que codifica al gen ARN VA [Thimmapaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelve en 500 µ? de 1 mM de Tris-HCl, 0.1 mM de EDTA, 0.227 M de CaCl2 - A esta mezcla se agrega gota a gota, 500 µ? de 50 mM de HEPES (pH 7.35), 280 mM de NaCl , 1.5 mM de NaP04 y se dej a un precipitado para formar durante 10 minutos a 25°C. El precipitado se suspende y se agrega a las 293 células y se deja reposar durante aproximadamente cuatro horas a 37°C. El medio de cultivo se deja de extraer y se agregan 2 mi de 20% de glicerol durante 30 segundos. Las 293 células se lavan - - entonces con un medio libre de suero, el medio fresco se agrega y las células se incuban durante aproximadamente 5 días . Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se retira y se reemplaza con un medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 µ??/?t?? de 35S-cisteína y 200 µ??/p?? de 35S-metionina. Después de 12 horas de incubación, se recolecta el medio condicionado, se concentra en un filtro centrífugo y se carga en un 15% de gel SDS. El gel procesado puede secarse y exponerse a la película por un periodo seleccionado de tiempo para revelar la presencia del polipeptido TAT. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden sufrir incubación adicional (en el medio libre de suero) y el medio se prueba en los bioensayos seleccionados . En una técnica alternativa, TAT puede introducirse temporalmente en las 293 células utilzando el método de sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al. , Proc . Nati. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Las 293 células crecen a la densidad máxima en un matraz giratorio y se agregan 700 µg de ADN de pRK5-TAT. Las células se concentran primero desde el matraz giratorio mediante centrifugación y se lavan con PBS . El precipitado de dextrano de ADN se incuba en la bolita de célula durante cuatro horas . Las células se tratan con 20% de glicerol durante 90 segundos, se lavan con el - - medio de cultivo del tejido y se reintroducen en el matraz giratorio que contiene el medio de cultivo del tejido, 5 µ9/t?1 de insulina bovina y 0.1 µg/ml de transferrina bovina. Después de aproximadamente cuatro días, el medio condicionado se centrífuga y se filtra para retirar las células y los desechos . La muestra que contiene TAT expresado puede concentrarse y purificarse entonces mediante cualquier método seleccionado, tal como la diálisis y/o cromatografía de columna . En otra modalidad, TAT puede expresarse en las células CHO. El pR 5-TAT puede transfectarse en las células CHO utilizando reactivos conocidos tales como CaP0 o DEAE-dextrano. Como se describió anteriormente, los cultivos celulares pueden incubarse y el medio reemplazarse con el medio de cultivo (solo) o el medio que contiene una radiomarca tal como 35S-metionina. Después de determinar la presencia del polipéptido TAT, el medio de cultivo puede reemplazarse con el medio libre de suero. Preferentemente, los cultivos se incuban por aproximadamente 6 días y se recolecta entonces el medio condicionado. El medio que contiene TAT expresado puede concentrarse y purificarse entonces mediante cualquier método seleccionado. El TAT marcado de Epítope también puede expresarse en las células huésped CHO. El TAT puede subclonarse fuera del vector pRK5. El inserto del subclon puede someterse a - - PCR para fusionarse en la estructura con una marca de epítope seleccionada tal como una marca poli-his en un vector de expresión Baculovirus. El inserto TAT poli-his marcado puede subclonarse entonces en un vector SV40 impulsado que contiene un marcador de selección tal como DHFR para la selección de clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (como se describió anteriormente) con el vector SV40 impulsado. El marcamiento puede llevarse a cabo, como se describió anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el TAT de poli-His expresado puede concentrarse y purificarse entonces por un método seleccionado, tal como mediante cromatografía por afinidad Ni2+-quelato. TAT también puede expresarse en las células CHO y/o COS mediante un procedimiento de expresión transitorio o en células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable . La expresión estable en las células CHO se lleva a cabo utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan como una construcción IgG (inmunoadhesina) , en la cual las secuencias de codificación para las formas solubles (e.g. , dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una secuencia de región constante IgGl que contiene la articulación CH2 y los dominios CH2 y/o es una forma poli-His marcada. Después de la amplificación de PCR, los ADNs - - respectivos se subclonaron en un vector de expresión CHO utilizando técnicas estándar como se describe por Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology (Protocolos Actuales de la Biología Molecular), Unidad 3.16, John Wiley y Sons (1997) . Los vectores de expresión CHO se construyen para tener sitios de restricción compatibles 5' y 3' del ADN de interés para permitir el movimiento conveniente de ADNcs. El vector que utiliza la expresión en células CHO como se describe por Lucas et al., Nucí . Acids Res . 24:9 (1774-1779 (1996) y usos del promotor/mejorador para dirigir la expresión de ADNc de interés y el dihidrofolato de reductasa (DHFR) . La expresión de DHPR permite la selección para la mantenencia estable del plásmido siguiendo a la transfección. Se introdujeron doce microgramos del ADN del plásmido deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos de transfección comercialmente disponibles Superfect® (Quiagen) , Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim) . Las células crecieron como se describió por Lucas et al., supra . Aproximadamente células de 3 x 107 se congelaron en una ampolleta para crecimiento y producción adicional como se describe abajo. Las ampolletas que contienen el ADN de plásmido se disolvieron al colocarlas en un baño de agua y mezclarlas mediante agitadora vorticial . Los contenidos se pipetearon en un tubo centrífugo que contiene 10 mis del medio y se - - centrífugo a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 10 mi del medio selectivo (0.2 µt? de PS20 filtrado con 5% de 0.2 µt? de suero bovino fetal diafiltrado) . Las células se alicuaron entonces en un centrifugador de 100 mi que contiene 90 mi del medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfirieron en un centrifugador de 250 mi llenado con 150 mi del medio de crecimiento selectivo e incubado a 37°C. Después de otros 2-3 días, se sembraron centrifugadores de 250 mi, 500 mi y 2000 mi con 3 x 105 células/ml. El medio celular se intercambió con medio fresco mediante centrifugación y resuspensión en el medio de producción. Aunque puede emplearse cualquier medio CHO adecuado, un medio de producción puede actualmente utilizarse como se describe en la Patente de E.U. No. 5,122,469, expedida en Junio 16 de 1992. Un centrifugador de 3 1 de producción se siembra a 1.2 x 106 células/ml. En el día 0, se determina por ejemplo, el pH del número de célula. En el día 1 inicia con el centrifugador que se muestrea y rocía con aire filtrado. En el día 2 se muestrea el centrifugador, la temperatura cambia a 33°C y se toman 30 mi de 500 g/1 de glucosa y 0.6 1 de 10% de antiespumante (e.g. 35% de emulsión de polidimetilsiloxano, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsión) . A través de toda la producción, el pH se ajustó según fue necesario para conservarlo a alrededor de 7.2 Después de 10 días o hasta que cayó la viabilidad por - - debajo del 70%, el cultivo celular se recolectó mediante centrifugación y se filtró a través de un filtro de 0.22 um. El filtro se almacenó ya sea a 4°C o inmediatamente se cargó en las columnas para purificación. Para las construcciones de poli-His marcadas, las proteínas se purificaron utilizando una columna de Ni-NTA (Quiagen) . Antes de la purificación, se agregó imidazol al medio condicionado a una concentración de 5 mM. El medio condicionado se bombeó a otra columna Ni-NTA de 6 mi equilibrada en 20 mM de Hepes, pH 7.4, amortiguador que contiene 0.3 M de NaCl y 5 mM de imidazol a una tasa de flujo de 4-5 ml/min a 4°C. Después de cargar, la columna se lavó ocn amortiguador de equilibrio adicional y la proteína se eluyó con amortiguador de equilibrio que contiene 0.25 M de imidazol. La proteína altamente purificada se desaló en un amortiguador de almacenamiento que contiene 10 mM de Hepes, 0.14 M de NaCl y 4% de manitol, pH 6.8, con una columna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 mi y se almacenó a -80°C. Las construcciones de inmunoadhesina (que contienen Fe) se purificaron a partir del medio condicionado como sigue. El medio condicionado se bombeó en una columna Protein A (Pharmacia) de 5 mi la cual se había equilibrado con 20 mM de amortiguador de fosfato, pH 6.8. Después de cargar, la columna se lavó extensamente con amortiguador de equilibrio antes de la elución con 100 mM de ácido cítrico, - - H 3.5. La protelna eluída se neutralizó inmediatamente al recolectar fracciones de 1 mi en tubos que contienen 275 µ? de 1 M de amortiguador Tris, pH 9. La proteína altamente purificada se desaló subsecuentemente en un amortiguador de almacén como se describió anteriormente para las proteínas poli-His marcadas. Se valoró la homogeneidad mediante geles de poliacrilamida de SDS y mediante la secuenciación aminoácida M-terminal por la degradación de Edman. Ciertos de los polipéptidos TAT descritos en la presente se han expresado y purificado exitosamente utilizando esta(s) técnica (s).
EJEMPLO 9: Expresión de TAT en Levadura El siguiente método describe la expresión recombinante de TAT en la levadura. Primero, los vectores de expresión de la levadura se construyen para la producción o secreción intracelular de TAT a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica TAT y el promotor se insertan en sitios de enzima de restricción adecuado en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de TAT. Para la secreción, ADN codifica TAT puede clonarse en el plásmido seleccionado, junto con ADN que codifica al promotor ADH2/GAPDH, un péptido de señal TAT natural u otro péptido de señal de mamífero o por ejemplo, un factor alfa de levadura o secuencia de - - señal/conductora secretora invertasa y secuencias enlazadoras (si se necesitan) para la expresión de TAT. Las células de levadura, tales como la cepa de levadura AB110, pueden transformarse entonces con los plásmidos de expresión descritos arriba y cultivarse en el medio de fermentación seleccionado. Los supernadantes de levadura transformados pueden analizarse mediante precipitación con 10% de ácido tricloroacético y la separación mediante SDS-PAGE, seguida por teñido de los geles con tinte Coomassie Blue. El ??? recombinante puede aislarse y purificarse subsecuentemente al retirar las células de levadura desde el medio de fermentación mediante centrifugación y concentrar entonces el medio utilizando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene TAT puede purificarse adicionalmente utilizando resinas de cromatografía de columna seleccionadas . Ciertos de los polipéptidos TAT descritos en la presente se han expresado y purificado exitosamente utilizando esta(s) técnica (s).
EJEMPLO 1Q : Expresión de TAT en Células de Insecto Infectadas con Baculovirus El siguiente método describe la expresión recombinante de TAT en células de insecto infectadas con - - Baculovirus . La codificación de secuencia para TAT se fusiona aguas arriba de una marca de epítope contenido dentro de un vector de expresión de baculovirus . Tales marcas de epítope incluyen marcas de poli-his y marcas de inmunoglobulina (como las regiones Fe de IgG) . Pueden emplearse una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados a partir de plásmidos comercialmente disponibles tales como pVL1393 (Novagen) . Brevemente, la secuencia que codifica TAT o la porción deseada de la secuencia de codificación de TAT tal como la secuencia que codifica un dominio extracelular de una proteína de transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular se amplifica por PCR con iniciadores complementarios con las regiones 5' y 3'. El iniciador 5' puede incorporar flanquear los sitios de enzima de restricción (seleccionados) . El producto se digiere entonces con aquellas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión. El baculovirus recombinante se genera mediante la co-transfección del plásmido anterior y el ADN del virus BaculoGold™ (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (comercialmente disponible por GIBCO-BRL) . Después de 4-5 días de incubación a 28°C, los virus liberados se recolectaron y utilizaron para amplificaciones adicionales.
- - La infección viral y la expresión de la proteína se lleva a cabo como se describe por O'Reilley et al . , Baculovirus expression vectors : A Laboratory Manual (Vectores de expresión de baculovirus: Un Manual de Laboratorio) oxford: Oxford University Press (1994) . Los TAT poli-his marcados expresados pueden purificarse entonces, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad de Ni2+-quelato como sigue. Los extractos se prepararon a partir de células Sf9 recombinantes infectadas con virus como se describe por Rupert et al . , ature, 362 : 175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se lavaron, se resuspendieron en amortiguador de sonicación (25 mi de Hepes, pH 7.9; 12.5 mM de MgCl2; 0.1 mM de EDTA; 10% de glicerol; 0.1% de NP-40; 0.4 M de KC1) y se sonicaron dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se clarificaron mediante centrifugación y el sobrenadante se diluyó 50 veces en amortiguador de carga (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, 10% de glicerol, pH 7.8) y se filtraron a través de un filtro de 0.45 µt?. Se preparó una columna de agarosa Ni2+-NTA (comercialmente disponible por Qiagen) con un volumen de lecho de 5 mi, se lavó con 25 mi de agua y se equilibró con 25 mi de amortiguador de carga. El extracto de célula filtrada se cargó en la columna a 0.5 mi por minuto. La columna se lavó para una baselina ?2e? con amortiguador de carga, en cuyo punto inició la recolección de la fracción.
- - Después, la columna se lavó con un amortiguador de lavado secundario (50 mM de fosfato; 300 mM de NaCl, 10% de glicerol, pH 6.0), el cual eluye a la proteína de unión no especifica. Después de alcanzar de nuevo la baselina A28o, la columna se desarrolló con un gradiente de Imidazol de 0 hasta 500 mM en el amortiguador de lavado secundario. Se recolectaron y analizaron fracciones de un mi mediante SDS-PAGE y tintura de plata o Western blot con conjugado de Ni2+-NTA para fosfatasa alcalina (Qiagen) . Las fracciones que contienen el TAT Hisi0 marcado eluído se agrupan y dializan contra el amortiguador de carga. Alternativamente, la purificación del TAT de IgG marcado (o Fe marcado) puede llevarse a cabo utilizando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por ejemplo, la Proteína A o la cromatografía de columna de la proteína G. Ciertos de los polipéptidos TAT descritos en la presente se han expresado y purificado exitosamente utilizando esta(s) técnica (s).
EJEMPLO 11: Preparación de Anticuerpos que se Unen a TAT Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente a TAT. Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales se conocen en la técnica y se describen por ejemplo, en Goding, supra. Los inmunógenos que pueden - - emplearse incluyen TAT purificado, las proteínas de fusión que contienen TAT y células que expresan a TAT recombinante sobre la superficie celular. La selección del inmunógeno puede hacerse por el experto en la técnica sin experimentación indebida . Los ratones tales como Balb/c se inmunizaron con el inmunógeno TAT emulsionado en el adyuvante de Freund completo y se inyectaron subcutánea o intraperitonealmente en una cantidad a partir de 1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno se emulsificó en el adyuvante MPL-TDM (Rbi Immunochemical Research, Hamilton, MT) y se inyectó en las plantas de los patas posteriores del animal . Los ratones inmunizados se sobrealimentaron entonces 10 a 12 días después con inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado. Las muestras de suero pueden obtenerse periódicamente desde los ratones mediante sangrado retro-orbital para probarse en los ensayos de ELISA para detectar anticuerpos anti- AT. Después de que se ha detectado un título de anticuerpo adecuado, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden inyectarse con una inyección intravenosa final de TAT. Tres a cuatro días después, los ratones se sacrifican y se recolectan las células del bazo. Las células del bazo se fusionan entonces (utilizando 35% de polietilen glicol) hacia una línea celular de mieloma murino tal como - - P3X63AgU.l, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que pueden emplacarse entonces en placas de cultivo de tejido de 96 cavidades que contienen el medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, de híbridos de mieloma e híbridos de células de bazo. Las células de hibridoma se clasificaron en un ELISA para la reactividad contra ???. La determinación de "positivo" en la selección de células de hibridoma de los anticuerpos monoclonales deseados contra TAT se encuentra con el experto en la materia. Las células de hibridoma positivas pueden inyectarse intraperitonealmente en ratones Balb/c singenéicos para producir ascitis que contienen los anticuerpos monoclonales anti-TAT. Alternativamente, las células de hibridoma puedne crecer en los frascos de cultivo de tejido o botellas cilindricas. La purificación de los anticuerpos monoclonales producida en las ascitis pueden llevarse a cabo utilizando la precipitación de sulfato de amonio seguida por la cromatografía de exclusión de gel . Alternativamente, puede emplearse la cromatografía por afinidad en base a la unión del anticuerpo hacia la proteína A o la proteína G. EJEMPLO 12: Purificación de los Polipéptidos TAT Utilizando Anticuerpos Específicos Los polipéptidos TAT naturales o recombinant - - pueden purifcarse mediante una variedad de técnicas estándar en la materia de la purificación de la proteina. Por ejemplo, el polipéptido pro-TAT, el polipéptido TAT completo o el polipéptido pre-TAT se purifica mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido TAT de interés. En general, se construye una columna de inmunoafinidad mediante acoplar covalentemente el anticuerpo del polipéptido anti-TAT a una resina cromatogáficamente activada. Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de sueros inmunes ya sea mediante precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación sobre la Proteína A inmovilizada (Pharmacia L B Biotechnology, Piscataway, N.J.). De igual modo, los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de fluidos de ascitis de ratón mediante precipitación o cromatografía con sulfato de amonio sobre la Proteína A inmovilizada. Una inmunoglobulina parcialmente purificada se enlaza covalentemente a una resina cromatográfica tal como la SEPHAROSE™ CnBr-activada (Pharmacia LKB Biotechnology) . El anticuerpo se acopla a la resina, la resina se bloquea y la resina de derivación se lava de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes . Tal columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación del polipéptido TAT al preparar una fracción a partir de las células que contienen el polipéptido TAT en una - - forma soluble . Esta preparación se deriva mediante la solubilización de toda la célula o de una fracción subcelular obtenida via la centrifugación diferencial mediante la adición del detergente o mediante otros métodos conocidos en la materia. Alternativamente, el polipeptido TAT soluble que contiene una secuencia de señal puede sercretarse en una cantidad útil en la cual crecen las células. Una preparación que contiene el polipéptido TAT soluble se pasa sobre la columna de inmunoafinidad y la columna se lava bajo condiciones que permitan la absorbencia preferencial del polipéptido TAT (e.g., amortiguadores de alta resistencia iónica en la presencia de un detergente) . Entonces, la columna se eluye bajo condiciones que rompen la unión del anticuerpo/polipéptido TAT [e.g., un amortiguador de pH bajo tal como aproximadamente pH de 2-3 o una alta concentración de un chaotrope tal como la urea o ion de tiocianato) y se recolecta el polipéptido TA .
EJEMPLO 13 : Ensayo de la Eliminación in vitro de la Célula Tumoral Las células de mamífero que expresan al polipéptido TAT de interés pueden obtenerse utilizando vector de expresión estándar y técnicas de clonación.
Alternativamente, muchas líneas celulares de tumor que expresan polipéptidos TAT de interés se encuentran - - disponibles públicamente,, por ejemplo, a través del ATCC y pueden identificarse rutinariamente utilizando análisis estándar ELISA o FACS . Los anticuerpos monoclonales del polipéptido anti-TAT (y derivados de toxina conjugados de los mismos) pueden emplearse entonces en ensayos para determinar la capacidad del anticuerpo para suprimir al polipéptido TAT que expresa las células in vitro. Por ejemplo, las células que expresan al polipéptido TAT de interés se obtienen como se describió anteriormente y emplacan en placas de 96 cavidades. En un análisis, el conjugado de an icuerpo/toxina (o anticuerpo sin protección) se incluye a través de toda la incubación celular por un periodo de 4 días. En un segundo análisis independiente, las células se incuban durante 1 hora con el conjugado de anticuerpo/toxina por un periodo de 4 días. La viabilidad celular se mide entonces utilizando el Ensayo de Luminiscencia Celular CellTiter-Glo de Promega (Cat# G7571) . Las células no tratadas sirven como un control negativo.
EJEMPLO 1 : Ensayo de la Eliminación in vivo de la Célula Tumoral Para probar la eficacia de los anticuerpos monoclonales anti-TAT112 conjugados o no conjugados, los anticuerpos anti-TAT se inyectaron intraperitonealmente en ratones desnudos 24 horas antes de recibir células que - - promueven el tumor subcutáneamente en el costado. Las inyecciones del anticuerpo continuaron dos veces por semana durante el resto del estudio. El volumen del tumor se midió dos veces por semana. La especificación escrita anterior se considera que es suficiente para capacitar a un experto en la técnica para practicar la invención. La presente invención no debe limitarse en alcance por la construcción depositada ya que la modalidad depositada se propone como una simple ilustración de ciertos aspectos de la invención y cualquier construcción que sea funcionalmente equivalente se encuentra dentro del alcance de esta invención. El depósito del material en la presente no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida en la presente sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni se consideran como limitación al alcance de las reivindicaciones las ilustraciones específicas que se representan. Efectivamente, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas como se describió en la presente, serán aparentes para aquellos expertos en la materia a partir de la descripción anterior y caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas .

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo aislado que se enlaza a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos para: (a) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS:17-32); (b) el polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) que carece de su péptido de señal asociado; (c) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS : 17-32) con su péptido de señal asociado; (d) un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) que carece de su péptido de señal asociado; (e) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) ; O (f) un polipéptido codificado por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID N0S:1-16) . 2. Un anticuerpo aislado que se enlaza a un polipéptido que tiene: (a) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32); (b) la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS : 17-32) que carece de su secuencia de péptido de señal asociado; (c) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS: 17-32) con su secuencia de péptido de señal asociado; (d) una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular del polipéptido mostrado en cualquiera de las Figuras 17-32 (SEQ ID NOS : 17-32) que carece de su secuencia de péptido de señal asociado; (e) una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16); o (f) una secuencia de aminoácidos codificada por la región de codificación de longitud total de la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de las Figuras 1-16 (SEQ ID NOS: 1-16) . 3. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo monoclonal . 4. El anticuerpo de la Reivindicación 1 que es un fragmento de anticuerpo. 5. El anticuerpo de la Reivindicación 1 que es un anticuerpo quimérico o humanizado. 6. El anticuerpo de la Reivindicación 1 que se conjuga a un agente inhibidor del crecimiento. 7. El anticuerpo de la Reivindicación 1 que se conjuga a un agente citotóxico. 8. El anticuerpo de la Reivindicación 7 en donde el agente citotóxico se selecciona del grupo que consiste de toxinas, antibióticos, isótopos radioactivos y enzimas nucleolíticas . 9. El anticuerpo de la Reivindicación 7 en donde el agente citotóxico es una toxina. 10. El anticuerpo de la Reivindicación 9 en donde la toxina se selecciona del grupo que consiste de maytansinoide y calicheamicina. 11. El anticuerpo de la Reivindicación 9 en donde la toxina es un maytansinoide. 12. El anticuerpo de la Reivindicación 1 que se produce en una bacteria. 13. El anticuerpo de la Reivindicación 1 que se produce en células CHO. 1 . El anticuerpo de la Reivindicación 1 que induce la destrucción de una célula a la cual se enlaza. 15. El anticuerpo de la Reivindicación 1 que se marca detectablemente . 16. Un ácido nucleico aislado que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de la Reivindicación 1. 17. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la Reivindicación 16 operablemente enlazado a las secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector. 18. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la Reivindicación 17. 19. La célula huésped de la Reivindicación 18 que es una célula CHO, una célula de E. coli o una célula de levadura . 20. Un proceso para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la Reivindicación 18 bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho anticuerpo y recuperar dicho anticuerpo del cultivo celular.
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