BR112015021965B1 - Conjugados e compostos de pirrolobenzodiazepinas, composição farmacêutica, uso dos mesmos para o tratamento de uma doença proliferativa e método de síntese dos ditos compostos - Google Patents

Conjugados e compostos de pirrolobenzodiazepinas, composição farmacêutica, uso dos mesmos para o tratamento de uma doença proliferativa e método de síntese dos ditos compostos Download PDF

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Abstract

PIRROLOBENZODIAZEPINAS E CONJUGADOS DAS MESMAS Um conjugado da fórmula (A): A em que: D representa o grupo D1 ou D2: D1 D2 ; a linha pontilhada indica a presença opcional de uma ligação dupla entre C2 e C3; quando existe uma ligação dupla presente entre C2 e C3, R(2) é selecionado a partir do grupo que consiste de: (ia) grupo arila C(5-10) opcionalmente substituído por um ou mais substituintes selecionados a partir do grupo que compreende: halo, nitro, ciano, éter, carbóxi, éster, alquila C(1-7), heterociclila C(3-7) e bis-óxi-alquileno C(1-3); (ib) alquila alifático saturado C(1-5); (ic) cicloalquila saturado C(3-6); (id) , em que cada um entre R(31), R(32) e R(33) é, independentemente, selecionado a partir de H, alquila saturado C(1-3), alquenila C(2-3), alquinila C 2-3 e ciclopropila, onde o número total de átomos de c arbono no grupo R 2 é de não mais do que 5; (ie) , em que um entre R(35a) e R(35b) é H e o outro é selecionado a partir de: fenila, em que fenila é opcionalmente substituído por um grupo selecionado a partir de halo, metila, metóxi; piridila; e tiofenila; e (if) , onde R(34) é selecionado a partir de: H; alquila saturado C(1-3); alquenila C(2-3); alquinila C((...).

Description

[001] A presente invenção se refere às pirrolobenzodiazepinas (PBDs), em particular, pirrolobenzodiazepinas que apresentam um grupo ligador conectado a um agente de ligação celular.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO PIRROLOBENZODIAZEPINAS
[002] Algumas pirrolobenzodiazepinas (PBDs) têm a capacidade de reconhecimento de, e ligação às sequências específicas de DNA; a sequência preferida é PuGPu. O primeiro antibiótico antitumor de PBD, antramicina, foi descoberto em 1965 (Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5793 - 5795 (1965); Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5791 - 5793 (1965)). Desde então, PBDs de ocorrência natural foram relatadas e mais do que 10 vias sintéticas foram desenvolvidas para uma variedade de análogos (Thurston, et al., Chem. Rev. 1994, 433 - 465 (1994); Antonow, D. e Thurston, D.E., Chem. Rev. 2011 111 (4), 2815 - 2864). Membros da família incluem abeimicina (Hochlowski, et al., J. Antibióticos, 40, 145 - 148 (1987)), cicamicina (Konishi, et al., J. Antibiotics, 37, 200 - 206 (1984)), DC-81 (Patente Japonesa 58 - 180 487; Thurston, et al., Chem. Brit., 26, 767 - 772 (1990); Bose, et al., Tetrahedron, 48, 751 - 758 (1992)), mazetramicina (Kuminoto, et al., J. Antibiotics, 33, 665 - 667 (1980)), neotramicinas A e B (Takeuchi, et al., J. Antibiotics, 29, 93 - 96 (1976)), porotramicina (Tsunakawa, et al., J. Antibiotics, 41, 1366 - 1373 (1988)), protracarcina (Shimizu, et al, J. Antibiotics, 29, 2492 - 2503 (1982); Langley e Thurston, J. Org. Chem., 52, 91 - 97 (1987)), sibanomicina (DC102) (Hara, et al., J. Antibiotics, 41, 702 - 704 (1988); Itoh, et al., J. Antibiotics, 41, 1281 - 1284 (1988)), sibiromicina (Leber, et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 2992 - 2993 (1988)) e tomamicina (Arima, et al., J. Antibiotics, 25, 437 - 444 (1972)). PBDs apresentam a estrutura geral:
Figure img0001
[003] Elas diferem no número, tipo e posição de substituintes, em seus anéis A aromáticos e anéis C pirrolo, e no grau de saturação do anel C. No anel B existe uma imina (N=C), uma carbinolamina(NH-CH(OH)) ou um éter metílico de carbinolamina (NH-CH(OMe)) na posição N10-C11 que é o centro eletrofílico responsável pela alquilação do DNA. Todos os produtos naturais conhecidos têm uma configuração (S) na posição C11a quiral que fornece os mesmos com uma torção pela direita quando observados a partir do anel C em direção ao anel A. Isto fornece aos mesmos a forma tridimensional apropriada para isohelicidade com a ranhura menor do DNA forma B, levando a um ajuste apertado no sítio de ligação (Kohn, Em Antibiotics III. Springer-Verlag, Nova Iorque, páginas 3 - 11 (1975); Hurley e Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230 - 237 (1986)). Sua capacidade de formar um aduto na ranhura menor, permite que os mesmos interfiram no processamento de DNA, consequentemente, seu uso como agentes antitumor.
[004] Um composto de pirrolobenzodiazepina particularmente vantajoso é descrito por Gregson et al. (Chem. Commun. 1999, 797 - 798) como composto 1 e por Gregson et al. (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161 - 1174) como composto 4a. Este composto, também conhecido como SJG-136, é mostrado abaixo:
Figure img0002
[005] Outros compostos de PBD diméricos, tais como aqueles portadores de substituintes arila C2 no WO 2005/085251, foram divulgados, um exemplo sendo:
Figure img0003
[006] Foi mostrado que estes compostos são agentes citotóxicos altamente úteis.
CONJUGADOS DE ANTICORPO-FÁRMACO
[007] A terapia com anticorpo foi estabelecida para o tratamento alvejado de pacientes com câncer, transtornos imunológicos e angiogênicos (Carter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343 - 357). O uso de conjugados de anticorpo- fármaco (ADC), isto é, imunoconjugados, para a liberação local de agentes citotóxicos ou citostáticos, isto é, fármacos para matar ou inibir células de tumor no tratamento de câncer, liberação de alvos da porção de fármaco aos tumores e acúmulo intracelular nos mesmos, ao passo que a administração sistêmica destes agentes de fármaco não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade às células normais, assim como às células de tumor que serão eliminadas (Xie et al. (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281 - 291; Kovtun et al (2006) Cancer Res. 66(6):3214 - 3121; Law et al (2006) Cancer Res. 66(4):2328 - 2337; Wu et al. (2005) Nature Biotech. 23(9):1137 - 1145; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543 - 549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15(9):1087 - 1103; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207 - 212; Trail et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328 - 337; Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605 - 614).
[008] Eficácia máxima com toxicidade mínima é, desse modo, buscada. Esforços para projetar e refinar ADC se concentraram na seletividade de anticorpos monoclonais (mAbs), assim como no mecanismo de ação do fármaco, ligação ao fármaco, razão fármaco/anticorpo (carregamento) e propriedades de liberação do fármaco (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925 - 932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721 - 2729; US 7521541; US 7723485; WO 2009/052249; McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel. 19(7): 299 - 307; Doronina et al (2006) Bioconj. Chem. 17:114 - 124; Erickson et al (2006) Cancer Res. 66(8):1 - 8; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843 - 852; Jeffrey et al (2005) J. Med. Chem. 48:1344 - 1358; Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063 - 7070). Porções de fármaco podem comunicar seus efeitos citotóxicos e citostáticos através de mecanismos, incluindo ligação de tubulina, ligação de DNA ou inibição de topoisomerase. Alguns fármacos citotóxicos tendem a ser inativam ou menos ativos quando conjugados a anticorpos grandes ou ligantes de receptor de proteína.
PBDS EM ADCS
[009] PBDs diméricas foram divulgadas como os fármacos em conjugados de fármaco. Por exemplo, no WO 2011/130598, compostos PBD diméricos que apresentam grupos ligadores para a conexão a um agente de ligação celular, tal como um anticorpo, são divulgados onde o grupo ligador é ligado a uma das posições N10 disponíveis e são, em geral, clivados pela ação de uma enzima no grupo ligador.
[010] Ao contrário, no WO 2011/130613 e WO 2011/130616, compostos de PBD diméricos que apresentam grupos ligadores para a conexão a um agente de ligação celular, tal como um anticorpo, são divulgados, onde o grupo ligador é ligado por intermédio de um grupo aromático em uma das posições C2 e são, em geral, clivados pela ação de uma enzima no grupo ligador. Tais conjugados de anticorpo- fármaco também são descritos em Flygare, J., et al., Chem. Biol. Drugs Des. 81: 113 - 121 (2013), que também descreve outros tipos de conjugados de anticorpo- fármaco.
[011] Um outro método é descrito no WO 2007/085930, em que dímeros do tipo tomamicina apresentam um grupo ligador para a conexão a um agente de ligação celular, tal como um anticorpo, onde o grupo ligador é ligado à amarração entre as unidades de tomamicina e são, em geral, clivados pela ação de uma enzima no grupo ligador.
[012] Os presentes inventores desenvolveram um novo método para formar conjugados de PBD com agentes de ligação celular e, em particular, Conjugados de PBD-anticorpo. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[013] Em um aspecto geral, a presente invenção fornece um conjugado compreendendo um composto dimérico de PBD com um ligador para conectar a um agente de ligação celular, em que o ligador tem um grupo triazol, piperazina, propargileno ou oxima ligado a um fenileno ou piriidileno na ponte que liga os dois monômeros de PBD. O agente de ligação celular é, preferivelmente, um anticorpo.
[014] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece novos compostos conjugados da fórmula (A):
Figure img0004
em que: D representa o grupo D1 ou D2:
Figure img0005
[015] a linha pontilhada indica a presença opcional de uma ligação dupla entre C2 e C3;
[016] quando existe uma ligação dupla presente entre C2 e C3, R2 é selecionado a partir do grupo que consiste de:
[017] (ia) grupo arila C5-10, opcionalmente substituído por um ou mais substituintes selecionados a partir do grupo que compreende: halo, nitro, ciano, éter, carbóxi, éster, alquila C1-7, heterociclila C3-7 e bis-óxi-alquileno C1-3;
[018] (ib) alquila alifático saturado C1-5;
[019] (ic) cicloalquila saturado C3-6;
[020] (id)
Figure img0006
, em que R31, R32 e R33 são, independentemente, selecionados a partir de H, alquila saturado C1-3, alquenila C2-3, alquinila C2-3 e ciclopropila, onde o número total de átomos de carbono no grupo R2 é de não mais do que 5;
[021] (ie)
Figure img0007
, em que um entre R35a e R35b é H e o outro é selecionado a partir de: fenila, que fenila é, opcionalmente, substituído por um grupo selecionado a partir de halo, metila, metóxi; piridila; e tiofenila; e
[022] (if)
Figure img0008
, onde R34 é selecionado a partir de: H; alquila saturado C1-3; alquenila C2-3; alquinila C2-3; ciclopropila; fenila, que fenila é, opcionalmente, substituído por um grupo selecionado a partir de halo, metila, metóxi; piridila; e tiofenila; (ig) halo;
[023] quando existe uma ligação única presente entre C2 e C3,
[024] R2 é
Figure img0009
onde R36a e R36b são, independentemente, selecionados a partir de H, F, alquila saturado C1-4, alquenila C2-3, em que os grupos alquila e alquenila são, opcionalmente, substituídos por um grupo selecionado a partir de alquilamido C1-4 e éster alquílico C1-4; ou, quando um entre R16a e R16b é H, o outro é selecionado a partir de nitrila e um éster alquílico C1-4;
[025] D’ representa o grupo D’1 ou D’2:
Figure img0010
[026] em que a linha pontilhada indica a presença opcional de uma ligação dupla entre C2’ e C3’;
[027] R6 e R9 são, independentemente, selecionados a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn e halo;
[028] R7 é, independentemente, selecionado a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn e halo;
[029] Y é selecionado a partir das fórmulas A1, A2, A3, A4, A5 e A6:
Figure img0011
Figure img0012
[030] L é um ligador conectado a um agente de ligação celular;
[031] CBA é o agente de ligação celular;
[032] n é um número inteiro selecionado na faixa de 0 a 48;
[033] RA4 é um grupo alquileno C1-6;
[034] R10 é H, e R11 é OH, ORA, onde RA é alquila C1-4; ou
[035] R10 e R11 formam uma ligação dupla nitrogênio-carbono entre os átomos de nitrogênio e carbono aos quais eles são ligados; ou
[036] R10 é H e R11 é OSOzM, onde z é 2 ou 3 e M é um cátion monovalente farmaceuticamente aceitável;
[037] R e R’ são, independentemente, selecionados a partir de alquila C1-12 opcionalmente substituído, grupos heterociclila C3-20 e arila C5-20, e, opcionalmente, em relação ao grupo NRR’, R e R’ juntamente com o átomo de nitrogênio a qual eles são ligado formam um anel heterocíclico de 4, 5, 6 ou 7 membros opcionalmente substituído;
[038] em que R16, R17, R19, R20, R21 e R22 são definidos para R6, R7, R9, R10, R11 e R2, respectivamente;
[039] em que Z é CH ou N;
[040] em que T e T’’ são, independentemente, selecionados a partir de uma ligação única ou um alquileno C1-9, em que a cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, O, S, N(H), NMe, contanto que o número de átomos na cadeia mais curta de átomos entre X e X’ seja de 3 a 12 átomos;
[041] X e X’ são, independentemente, selecionados a partir de O, S e N(H);
[042] exceto que não pode ocorrer ligações duplas entre C2 e C3 e C2’ e C3’.
[043] Assim, a fórmula A é selecionada a partir das seguintes fórmulas A-I,
Figure img0013
Figure img0014
Figure img0015
[044] Um segundo aspecto da presente invenção fornece novos compostos de fármaco-ligador da fórmula (B):
Figure img0016
[045] Onde todos os grupos são definidos no primeiro aspecto da invenção;
[046] YL é selecionado a partir de um grupo das fórmulas B1, B2, B3, B4, B5
Figure img0017
[047] onde G é um grupo reativo para conectar a um agente de ligação celular.
[048] Um terceiro aspecto da presente invenção fornece compostos da fórmula (C) que podem ser usados na preparação dos compostos e compostos de conjugado da invenção:
Figure img0018
[049] onde YC é selecionado a partir de um grupo das fórmulas C1, C2, C3, C4, C5 e C6:
Figure img0019
Figure img0020
[050] R30 é H, e R31 é OH, ORA, onde RA é alquila C1-4; ou
[051] R30 e R31 formam uma ligação dupla nitrogênio-carbono entre os átomos de nitrogênio e carbono aos quais eles são ligados; ou
[052] R30 é H e R31 é OSOzM, onde z é 2 ou 3 e M é um cátion monovalente farmaceuticamente aceitável; ou
[053] R30 é um grupo de proteção nitrogênio e R31 é OProtO, onde ProtO é um grupo de proteção hidróxi; e
[054] R40 e R41 são definidos para R30 e R31, respectivamente; e
[055] todos os grupos remanescentes são definidos no primeiro aspecto da invenção.
[056] Um quarto aspecto da presente invenção fornece compostos da fórmula (D) que podem ser usados na preparação dos compostos do segundo e terceiro aspectos da invenção:
Figure img0021
[057] YD é selecionado a partir de um grupo das fórmulas D2, D3, D4 e D6:
Figure img0022
[058] e todos os grupos remanescentes são definidos no terceiro aspecto da invenção.
[059] Um quinto aspecto da presente invenção fornece compostos da fórmula (E) que podem ser usados na preparação dos compostos do segundo, terceiro e quarto aspectos da invenção:
Figure img0023
[060] YE é selecionado a partir de um grupo das fórmulas E1, E2 e E5:
Figure img0024
onde
[061] RE1 é selecionado a partir de H e TMS;
[062] RE2 é selecionado a partir de Br, Cl e I; e
[063] todos os grupos remanescentes são definidos no terceiro aspecto da invenção.
[064] Um sexto aspecto da presente invenção fornece o uso de um composto do primeiro aspecto da invenção em um método de tratamento médico. O quarto aspecto também fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto do primeiro aspecto e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[065] Um sétimo aspecto da presente invenção fornece um composto do primeiro aspecto da invenção ou uma composição farmacêutica do quarto aspecto da invenção para o uso em um método de tratamento de uma doença proliferativa. O quinto aspecto também fornece o uso de um composto do primeiro aspecto em um método de fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença proliferativa, e um método para tratar um mamífero que apresenta uma doença proliferativa, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um composto do primeiro aspecto ou uma composição farmacêutica do quarto aspecto.
[066] Um oitavo aspecto da presente invenção fornece um método de síntese de um composto do primeiro aspecto da presente invenção, compreendendo a etapa de conjugar um fármaco-ligador do segundo aspecto com um agente de ligação celular.
[067] A presente invenção também fornece a síntese de compostos do segundo aspecto da invenção a partir dos compostos do terceiro, quarto ou quinto aspecto da invenção através da reação dos mesmos com reagentes adequados.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[068] A presente invenção fornece um conjugado compreendendo um dímero de PBD conectado através da porção ligada em ponte ao dímero por intermédio de um ligador especificado a um agente de ligação celular.
[069] A presente invenção é adequada para o uso no fornecimento de um conjugado de PBD a um sítio preferido em um indivíduo.
GRUPOS DE PROTEÇÃO NITROGÊNIO
[070] Os grupos de proteção nitrogênio são bem conhecidos na técnica. Grupos de proteção nitrogênio preferidos para o uso na presente invenção são grupos de proteção carbamato que apresentam a fórmula geral:
Figure img0025
[071] em que R’30 é um grupo alquila opcionalmente substituído (por exemplo, alquila C1-20), arila (por exemplo, arila C5-20) ou heteroarila (por exemplo, heterociclila C3-20).
[072] Um grande número de grupos de proteção nitrogênio carbamato possíveis é listado na páginas 706 a 772 de Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 4a Edição, John Wiley & Sons, Inc., 2007 (ISBN 978-0-471-69754-1), que é incorporado neste relatório como referência.
[073] Grupos de proteção particularmente preferidos incluem Alloc, Troc, Teoc, BOC, TcBOC, Fmoc, 1-Adoc e 2-Adoc.
GRUPOS DE PROTEÇÃO HIDROXILA
[074] Grupos de proteção hidroxila são bem conhecidos na técnica. Um grande número de grupos adequados é descrito nas páginas 24 a 298 de Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 4a Edição, John Wiley & Sons, Inc., 2007 (ISBN 978-0-471-69754-1), que é incorporado neste relatório como referência.
[075] Classes de interesse particular incluem éteres silílicos, éteres metílicos, éteres alquílicos, éteres benzílicos, ésteres, benzoatos, carbonatos e sulfonatos. Grupos de proteção hidroxila particularmente preferidos incluem THP. PREFERÊNCIAS As seguintes preferências podem ser aplicadas a todos os aspectos da invenção, conforme descrito acima, ou podem se relacionar a um aspecto único. As preferências podem ser combinadas em qualquer combinação. R2
[076] Quando R2 é um grupo arila C5-10, em algumas formas de realização, ele pode ser um grupo arila C5-7. Um grupo arila C5-7 pode ser um grupo fenila ou um grupo heteroarila C5 - 7, por exemplo, furanila, tiofenila e piridila. Em algumas formas de realização, R2 pode ser fenila. Em outras formas de realização, R2 pode ser tiofenila, por exemplo, tiofen-2-ila e tiofen-3-ila.
[077] Quando R2 é um grupo arila C5-10, em algumas formas de realização, ele pode ser um arila C8-10, por exemplo, um grupo quinolinila ou isoquinolinila. O grupo quinolinila ou isoquinolinila pode ser ligado ao núcleo de PBD através de qualquer posição no anel disponível. Por exemplo, o quinolinila pode ser quinolin-2- ila, quinolin-3-ila, quinolin-4-ila, quinolin-5-ila, quinolin-6-ila, quinolin-7-ila e quinolin- 8-ila. Entre estes, quinolin-3-ila e quinolin-6-ila podem ser preferidos. O isoquinolinila pode ser isoquinolin-1-ila, isoquinolin-3-ila, isoquinolin-4-ila, isoquinolin-5-ila, isoquinolin-6-ila, isoquinolin-7-ila e isoquinolin-8-ila. Entre estes, isoquinolin-3-ila e isoquinolin-6-ila podem ser preferidos.
[078] Quando R2 é um grupo arila C5-10, ele pode ser portador de qualquer número de grupos substituintes. Em algumas formas de realização, ele pode ser portador de 1 a 3 grupos substituintes. Em algumas formas de realização, ele pode ser portador de 1 ou 2 grupos substituintes. Em algumas formas de realização, ele pode ser portador de um grupo substituinte único. Os substituintes podem estar em qualquer posição.
[079] Onde R2 é grupo arila C5-7, em algumas formas de realização, um substituinte único pode ser em um átomo no anel que não é adjacente à ligação ao restante do composto, isto é, pode ser β ou Y à ligação ao restante do composto. Portanto, em formas de realização onde o grupo arila C5-7 é fenila, o substituinte pode estar nas posições meta- ou para- ou pode estar na posição para-.
[080] Onde R2 é um grupo arila C8-10, por exemplo, quinolinila ou isoquinolinila, em algumas formas de realização, pode ser qualquer número de substituintes em qualquer posição dos anéis quinolina ou isoquinolina. Em algumas formas de realização, ele é portador de um, dois ou três substituintes, e estes podem estar nos anéis proximais e distais ou ambos (se mais do que um substituinte).
SUBSTITUINTES R2, QUANDO R2 É UM GRUPO ARILA C5-10
[081] Em formas de realização onde um substituinte em R2 quando R2 é um grupo arila C5-10 é halo, ele pode ser F ou Cl e, em algumas destas formas de realização, Cl.
[082] Em formas de realização onde um substituinte em R2 quando R2 é um grupo arila C5-10 é éter, em algumas formas de realização, ele pode ser um grupo alcóxi, por exemplo, um grupo alcóxi C1-7 (por exemplo, metóxi, etóxi) ou, em algumas formas de realização, pode ser um grupo arilóxi C5-7 (por exemplo, fenóxi, piridilóxi, furanilóxi). O grupo alcóxi pode, por si só, ser ainda substituído, por exemplo, por um grupo amino (por exemplo, dimetilamino).
[083] Em formas de realização onde um substituinte em R2 quando R2 é um grupo arila C5-10 é alquila C1-7, ele pode ser um grupo alquila C1-4 (por exemplo, metila, etila, propila, butila).
[084] Em formas de realização onde um substituinte em R2 quando R2 é um grupo arila C5-10 é heterociclila C3-7, ele pode ser grupo heterociclila contendo nitrogênio C6, por exemplo, morfolino, tiomorfolino, piperidinila, piperazinila. Estes grupos podem ser ligado ao restante da porção de PBD por intermédio do átomo de nitrogênio. Estes grupos podem ser ainda substituídos, por exemplo, por grupos alquila C1-4. Se o grupo heterociclila contendo nitrogênio C6 é piperazinila, o outro substituinte pode estar no segundo átomo de nitrogênio no anel.
[085] Em formas de realização onde um substituinte em R2 quando R2 é um grupo arila C5-10 é bis-óxi-alquileno C1-3, este pode ser bis-óxi-metileno ou bis-óxi- etileno.
[086] Em formas de realização onde um substituinte em R2 quando R2 é um grupo arila C5-10 é éster, este é, preferivelmente, éster metílico ou éster etílico.
[087] Em algumas formas de realização, os substituintes quando R2 é um grupo arila C5-10 podem incluir metóxi, etóxi, flúor, cloro, ciano, bis-óxi-metileno, metil-piperazinila, morfolino, metil-tiofenila, dimetilaminopropilóxi e carbóxi.
[088] Em algumas formas de realização, R2 pode ser selecionado a partir de 4-metóxi-fenila, 3-metóxi-fenila, 4-etóxi-fenila, 3-etóxi-fenila, 4-fluoro-fenila, 4-cloro- fenila, 3,4-bisoximetileno-fenila, 4-metiltiofenila, 4-cianofenila, 4-fenóxi-fenila, quinolin-3-ila e quinolin-6-ila, isoquinolin-3-ila e isoquinolin-6-ila, 2-tienila, 2-furanila, metoxinaftila, naftila, 4-nitrofenila, 4-(4-metilpiperazin-1-il)fenila e 3,4-bisoximetileno- fenila.
[089] Quando R2 é alquila alifático saturado C1-5, este pode ser metila, etila, propila, butila ou pentila. Em algumas formas de realização, pode ser metila, etila ou propila (n-pentila ou isopropila). Em algumas destas formas de realização, pode ser metila. Em outras formas de realização, pode ser butila ou pentila, que pode ser linear ou ramificado.
[090] Quando R2 é cicloalquila saturado C3-6, este pode ser ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila ou ciclo-hexila. Em algumas formas de realização, pode ser ciclopropila.
[091] Quando R2 é
Figure img0026
, em algumas formas de realização, o número total de átomos de carbono no grupo R2 é de não mais do que 4 ou não mais do que 3.
[092] Em algumas formas de realização, um entre R31, R32 e R33 é H, com os outros dois grupos sendo selecionados a partir de H, alquila saturado C1-3, alquenila C2-3, alquinila C2-3 e ciclopropila.
[093] Em outras formas de realização, dois entre R31, R32 e R33 são H, com o outro grupo sendo selecionado a partir de H, alquila saturado C1-3, alquenila C2-3, alquinila C2-3 e ciclopropila.
[094] Em algumas formas de realização, os grupos que não são H são selecionados a partir de metila e etila. Em algumas destas formas de realização, os grupos que não são H são metila.
[095] Em algumas formas de realização, R31 é H.
[096] Em algumas formas de realização, R32 é H.
[097] Em algumas formas de realização, R33 é H.
[098] Em algumas formas de realização, R31 e R32 são H.
[099] Em algumas formas de realização, R31 e R33 são H.
[0100] Em algumas formas de realização, R32 e R33 são H.
[0101] Um grupo R2 de interesse particular é:
Figure img0027
[0102] Quando R2 é
Figure img0028
, em algumas formas de realização, o grupo (R35a ou R35b) que não é H é fenila opcionalmente substituído. Se o substituinte fenila opcional é halo, este pode ser flúor. Em algumas formas de realização, o grupo fenila não é substituído.
[0103] Quando R2 é
Figure img0029
, em algumas formas de realização onde R34 é fenila, este não é substituído. Em outras formas de realização, o grupo fenila é portador de um substituinte de flúor único. Em outras formas de realização, R14 é selecionado a partir de H, metila, etila, etenila e etinila. Em algumas destas formas de realização, R14 é selecionado a partir de H e metila.
[0104] Quando R2 é halo, em algumas formas de realização, este é flúor.
[0105] Quando existe uma ligação única presente entre C2 e C3, R2 é 36a
Figure img0030
[0106] Em algumas formas de realização, R36a e R36b são H.
[0107] Em outras formas de realização, R36a e R36b são metila.
[0108] Em formas de realização adicionais, um entre R36a e R36b é H, e o outro é selecionado a partir de alquila saturado C1-4, alquenila C2-3, em que os grupos alquila e alquenila são, opcionalmente, substituídos. Em algumas destas formas de realização adicionais, o grupo que não é H pode ser selecionado a partir de metila e etila.
[0109] R22
[0110] As preferências acima para R2 quando existe uma ligação dupla presente entre C2 e C3 se aplicam igualmente a R22, quando existe uma ligação dupla presente entre C2’ e C3’.
[0111] As preferências acima para R2 quando existe uma ligação única presente entre C2 e C3 se aplicam igualmente a R22, quando existe uma ligação única presente entre C2’ e C3’.
[0112] Conforme descrito acima, não pode ocorrer ligações duplas entre C2 e C3 e C2’ e C3’.
[0113] R6
[0114] Em uma forma de realização, R6 é, independentemente, selecionado a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn- e Halo.
[0115] Em uma forma de realização, R6 é, independentemente, selecionado a partir de H, OH, OR, SH, NH2, NO2 e Halo.
[0116] Em uma forma de realização, R6 é, independentemente, selecionado a partir de H e Halo.
[0117] Em uma forma de realização, R6 é, independentemente, H.
[0118] Em uma forma de realização, R6 e R7 formam um grupo -O-(CH2)p-O-, onde p é 1 ou 2.
[0119] Estas formas de realização também se aplicam a R16.
[0120] R7
[0121] R7 é, independentemente, selecionado a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn e halo.
[0122] Em uma forma de realização, R7 é, independentemente, OR.
[0123] Em uma forma de realização, R7 é, independentemente, OR7A, onde R7A é independentemente, alquila C1-6 opcionalmente substituído.
[0124] Em uma forma de realização, R7A é independentemente, alquila C1-6 saturado opcionalmente substituído.
[0125] Em uma forma de realização, R7A é independentemente, opcionalmente, substituído alquenila C2-4.
[0126] Em uma forma de realização, R7A é, independentemente, Me.
[0127] Em uma forma de realização, R7A é, independentemente, CH2Ph.
[0128] Em uma forma de realização, R7A é, independentemente, alila.
[0129] Estas formas de realização também se aplicam a R17.
[0130] R9
[0131] Em uma forma de realização, R9 é, independentemente, selecionado a partir de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn- e Halo.
[0132] Em uma forma de realização, R9 é, independentemente, H.
[0133] Em uma forma de realização, R9 é, independentemente, R ou OR.
[0134] Estas formas de realização também se aplicam a R19.
[0135] N10-C11
[0136] Em algumas formas de realização, R10 é H, e R11 é OH, ORA, onde RA é alquila C1-4. Em algumas destas formas de realização, R11 é OH. Em outras formas de realização, R11 é ORA, onde RA é alquila C1-4. Em algumas destas formas de realização, RA é metila.
[0137] Em algumas formas de realização, R10 e R11 formam uma ligação dupla nitrogênio-carbono entre os átomos de nitrogênio e carbono aos quais eles são ligados.
[0138] Em algumas formas de realização, R10 é H e R11 é OSOzM, onde z é 2 ou 3 e M é um cátion monovalente farmaceuticamente aceitável. Em algumas destas formas de realização, M é um cátion monovalente farmaceuticamente aceitável e pode ser Na+. Além disso, em algumas formas de realização, z é 3.
[0139] As preferências acima se aplicam igualmente a R20 e R21.
[0140] Em algumas formas de realização, R30 é H, e R31 é OH, ORA, onde RA é alquila C1-4. Em algumas destas formas de realização, R31 é OH. Em outras formas de realização, R31 é ORA, onde RA é alquila C1-4. Em algumas destas formas de realização, RA é metila.
[0141] Em algumas formas de realização, R30 e R31 formam uma ligação dupla nitrogênio-carbono entre os átomos de nitrogênio e carbono aos quais eles são ligados.
[0142] Em algumas formas de realização, R30 é H e R31 é OSOzM, onde z é 2 ou 3 e M é um cátion monovalente farmaceuticamente aceitável. Em algumas destas formas de realização, M é um cátion monovalente farmaceuticamente aceitável e pode ser Na+. Além disso, em algumas formas de realização, z é 3.
[0143] Em algumas formas de realização, R30 é um grupo de proteção nitrogênio e R31 é OProtO, onde ProtO é um grupo de proteção hidróxi.
[0144] Em algumas destas formas de realização, o grupo de proteção nitrogênio pode ser selecionado a partir de Alloc, Troc, Teoc, BOC, TcBOC, Fmoc, 1- Adoc e 2-Adoc e, mais preferivelmente, ser Boc.
[0145] Em algumas destas formas de realização, o grupo de proteção nitrogênio pode ser THP.
[0146] Para os compostos da fórmula D, pode ser preferido que R30 e R31 formem uma ligação dupla nitrogênio-carbono entre os átomos de nitrogênio e carbono aos quais eles são ligados.
[0147] Para os compostos da fórmula E, pode ser preferido que R30 seja um grupo de proteção nitrogênio e R31 seja OProtO, onde ProtO é um grupo de proteção hidróxi.
[0148] Para os compostos da fórmula C, onde YC é da fórmula C2, C3 ou C4, pode ser preferido que R30 e R31 formem uma ligação dupla nitrogênio-carbono entre os átomos de nitrogênio e carbono aos quais eles são ligados.
[0149] Para os compostos da fórmula C, onde YC é da fórmula C1 ou C5, pode ser preferido que R30 seja um grupo de proteção nitrogênio e R31 seja OProtO, onde ProtO é um grupo de proteção hidróxi.
[0150] As preferências acima se aplicam igualmente a R40 e R41.
[0151] T e T’
[0152] Cada um entre T e T’ é, independentemente, selecionado a partir de uma ligação única ou um grupo alquileno C1-9, em que a cadeia pode ser interrompida por um ou mais heteroátomos, por exemplo, O, S, N(H) e/ou NMe, contanto que o número de átomos na cadeia mais curta de átomos entre X e X’ seja de 3 a 12 átomos.
[0153] Em uma forma de realização, cada grupo alquileno de T e T’ é, opcionalmente, interrompido por um ou mais heteroátomos selecionados a partir de O, S e NMe.
[0154] Em uma forma de realização, cada um entre T e T’’ é, independentemente, selecionado a partir de uma ligação única e um grupo alquileno C1-9.
[0155] Em uma forma de realização, T é selecionado a partir de uma ligação única, grupo alquileno C1, C2, C3 e C4 e T’ é selecionado a partir de uma ligação única, grupo alquileno C1, C2, C3 e C4.
[0156] Em uma forma de realização, T é selecionado a partir de uma ligação única, grupo alquileno C1 e C2 e T’ é selecionado a partir de uma ligação única, grupo alquileno C1 e C2.
[0157] Em uma forma de realização, T é selecionado a partir de uma ligação única e um grupo alquileno C1 e T’ é selecionado a partir de uma ligação única e um grupo alquileno C1.
[0158] Em uma forma de realização, T é uma ligação única e T’ é uma ligação única.
[0159] Em uma forma de realização, T é um grupo alquileno C1 e T’ é um grupo alquileno C1.
[0160] Em algumas formas de realização, T e T’ são os mesmos.
[0161] Os grupos alquileno listados acima podem ser, opcionalmente, interrompidos por um ou mais heteroátomos.
[0162] Os grupos alquileno listados acima podem ser grupos alquileno alifáticos lineares não substituídos.
[0163] X
[0164] Em uma forma de realização, X é selecionado a partir de O, S ou N(H).
[0165] Preferivelmente, X é O.
[0166] DÍMEROS
[0167] Em algumas formas de realização, os grupos R22, R16, R17, R19, R20 e R21 são similares aos grupos R2, R6, R9, R7, R10 e R11, respectivamente. Nestas formas de realização, as unidades de monômero de PBD têm os mesmos substituintes.
[0168] Compostos particularmente preferidos do primeiro aspecto da presente invenção podem ser da fórmula Ia:
Figure img0031
[0169] onde
[0170] R10, R11, R20, R21 e Y são definidos acima;
[0171] t1 e t2 são, independentemente, selecionados a partir de 0, 1 e 2;
[0172] R7a e R17a são, independentemente, selecionados a partir de metila e
[0173] R2a e R22a são, independentemente, selecionados a partir de:
Figure img0032
[0174] Estes compostos podem ser, preferivelmente, simétricos.
[0175] Compostos particularmente preferidos do segundo aspecto da presente invenção podem ser da fórmula IIa:
Figure img0033
onde
[0176] R10, R11, R20, R21 e YL são definidos acima;
[0177] t1 e t2 são, independentemente, selecionados a partir de 0, 1 e 2;
[0178] R7a e R17a são, independentemente, selecionados a partir de metila e
[0179] R2a e R22a são, independentemente, selecionados a partir de:
Figure img0034
[0180] Estes compostos podem ser, preferivelmente, simétricos.
[0181] Compostos particularmente preferidos do terceiro aspecto da
Figure img0035
[0182] onde
[0183] R10, R11, R20, R21 e YC são definidos acima;
[0184] t1 e t2 são, independentemente, selecionados a partir de 0, 1 e 2;
[0185] R7a e R17a são, independentemente, selecionados a partir de metila e fenila;
[0186] R2a e R22a são, independentemente, selecionados a partir de:
Figure img0036
[0187] Estes compostos podem ser, preferivelmente, simétricos.
[0188] n (Y, YL)
[0189] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é um número inteiro entre 0 e 24.
[0190] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é um número inteiro entre 0 e 12.
[0191] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é um número inteiro entre 0 e 8.
[0192] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é um número inteiro entre 0 e 6.
[0193] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 0.
[0194] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 1.
[0195] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 2.
[0196] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 3.
[0197] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 4.
[0198] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 5.
[0199] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 6.
[0200] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 7.
[0201] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 8.
[0202] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 9.
[0203] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 10.
[0204] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 11.
[0205] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 12.
[0206] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 13.
[0207] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 14.
[0208] Em algumas formas de realização, n (em Y ou YL) é 15.
[0209] Em algumas formas de realização, quando Y é A1, ou YL
[0210] Em algumas formas de realização, quando Y é A2, ou YL pode ser selecionado a partir de 4 e 6.
[0211] Em algumas formas de realização, quando Y é A3, ou YL é B3, n pode ser 4.
[0212] Em algumas formas de realização, quando Y é A4, ou YL é B4, n pode ser 4.
[0213] Em algumas formas de realização, quando Y é A5, ou YL é B5, n pode ser 11.
[0214] Em algumas formas de realização, quando Y é A6, ou YL é B6, n pode ser 2.
[0215] L e G
[0216] L é um ligador conectado ao agente de ligação celular no composto conjugado. G é um grupo reativo para conectar o dímero de PBD ao agente de ligação celular para formar o composto conjugado.
[0217] Preferivelmente, o ligador/grupo reativo contém um grupo funcional eletrofílico para a reação com um grupo funcional nucleofílico sobre o agente de ligação celular. Grupos nucleofílicos sobre os anticorpos incluem, mas não são limitadas a: (i) grupos amina N-terminais, (ii) grupos amina de cadeia lateral, por exemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadeia lateral, por exemplo, cisteína e (iv) grupo hidroxila ou amino de açúcar onde o anticorpo é glicosilado. Grupos amina, tiol e hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos sobre porções ligadoras e reagentes ligadores, incluindo: (i) grupos maleimida (ii) dissulfetos ativados, (iii) ésteres ativos, tais como ésteres de NHS (N-hidroxissuccinimida), ésteres de HOBt (N-hidroxibenzotriazol), haloformiatos e haletos de ácido; (iv) haletos de alquila e benzila, tais como haloacetamidas; e (v) aldeídos, cetonas, carboxila, e, alguns dos quais são exemplificados, como segue:
Figure img0037
[0218] Certos anticorpos têm dissulfetos entre cadeias redutíveis, isto é, pontes de cisteína. Os anticorpos podem ser feitos reativos para a conjugação com reagentes ligadores através de tratamento com um agente redutor, tal como DTT (ditiotreitol). Cada ponte de cisteína, assim, formará, teoricamente, dois nucleófilos tiol reativos. Grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos nos anticorpos através da reação de lisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut) resultando na conversão de uma amina em um tiol. Grupos tiol reativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou fragmento do mesmo) através da introdução de um, dois, três, quatro ou mais resíduos de cisteína (por exemplo, preparação de anticorpos mutantes compreendendo um ou mais resíduos de aminoácido cisteína não nativos). O US 7521541 mostra a construção de anticorpos através da introdução de aminoácidos cisteína reativos.
[0219] Em algumas formas de realização, um Ligador tem um grupo nucleofílico reativo que é reativo com um grupo eletrofílico presente em um anticorpo. Grupos eletrofílicos úteis em um anticorpo incluem, mas não são limitados a grupos aldeído e cetona carbonila. O heteroátomo de um grupo nucleofílico de um Ligador pode reagir com um grupo eletrofílico em um anticorpo e formar uma ligação covalente ao uma unidade de anticorpo. Grupos nucleofílicos úteis em um Ligador incluem, mas não são limitados à hidrazida, oxima, amino, hidroxila, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e aril-hidrazida. O grupo eletrofílico em um anticorpo fornece um sítio conveniente para a ligação a um Ligador.
[0220] Em uma forma de realização, o grupo L é:
Figure img0038
[0221] onde o asterisco indica o ponto de ligação ao restante do grupo Y, a linha ondulada indica o ponto de ligação ao agente de ligação celular, e m é um número inteiro selecionado a partir da faixa de 0 a 6. Em uma forma de realização, m é selecionado a partir de 2, 3, 4 e 5.
[0222] Em uma forma de realização, a conexão entre o agente de ligação celular e L ocorre através de um resíduo de tiol do agente de ligação celular e um grupo maleimida de L.
[0223] Em uma forma de realização, a conexão entre o agente de ligação celular e L é:
Figure img0039
[0224] onde o asterisco indica o ponto de ligação à porção remanescente do grupo L ou a porção remanescente do grupo Y e a linha ondulada indica o ponto de ligação à porção remanescente do agente de ligação celular. Nesta forma de realização, o átomo de S é, tipicamente, derivado do agente de ligação celular.
[0225] Em cada uma das formas de realização acima, uma funcionalidade alternativa pode ser usada no lugar do grupo derivado de maleimida mostrado abaixo:
Figure img0040
[0226] onde a linha ondulada indica o ponto de ligação ao agente de ligação celular como antes, e o asterisco indica a ligação à porção remanescente do grupo L ou à porção remanescente do grupo Y.
[0227] Em uma forma de realização, o grupo derivado de maleimida é substituído com o grupo:
Figure img0041
[0228] onde a linha ondulada indica o ponto de ligação ao agente de ligação celular, e o asterisco indica a ligação à porção remanescente do grupo L ou à porção remanescente do grupo Y.
[0229] Em uma forma de realização, o grupo derivado de maleimida é substituído com um grupo, que, opcionalmente, juntamente com o agente de ligação celular, é selecionado a partir de: -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -NHC(=O)NH, -C(=O)NHC(=O)-, -S-, -S-S-, -CH2C(=O)- -C(=O)CH2-, =N-NH-, e -NH-N=.
[0230] Em uma forma de realização, o grupo derivado de maleimida é substituído com um grupo, que, opcionalmente, juntamente com o agente de ligação celular, é selecionado a partir de:
Figure img0042
[0231] onde a linha ondulada indica o ponto de ligação ao agente de ligação celular ou a ligação à porção remanescente do grupo L ou à porção remanescente do grupo Y, e o asterisco indica o outro ponto de ligação ao agente de ligação celular ou a ligação à porção remanescente do grupo L ou à porção remanescente do grupo Y.
[0232] Outros grupos que podem ser usados como L para conectar a porção remanescente do grupo Y ao agente de ligação celular são descritos no WO 2005/082023.
[0233] Assim, em formas de realização da presente invenção, L é da fórmula:
[0234] -LA-(CH2)m-
[0235] Onde m é a partir de 0 a 6; e
[0236] LA é selecionado a partir de:
Figure img0043
Figure img0044
[0237] onde Ar representa um grupo arileno C5-6, por exemplo, fenileno.
[0238] Em algumas formas de realização, onde L é L1, m pode ser 2, 3 ou 5.
[0239] Em algumas formas de realização, onde L é L1, LA pode ser LA1-1.
[0240] Em formas de realização da presente invenção, L é da fórmula:
[0241] -LA-(CH2)m-O- (L2)
[0242] Onde m é a partir de 0 a 6; e
[0243] LA é selecionado a partir dos grupos acima.
[0244] Sem limitar a invenção a uma teoria, tal grupo pode ser clivado a partir do anticorpo, tal que o grupo carbamato fornece uma amina terminal.
[0245] Em algumas formas de realização, onde L é L2, LA pode ser LA3-2.
[0246] Em algumas formas de realização, onde L é L2, m pode ser 1.
[0247] Em formas de realização da presente invenção, L é da fórmula:
[0248] -LA-(CH2)q-O-C(=O)-NH-(CH2)p- (L3)
[0249] Onde q é a partir de 1 a 3, e p é a partir de 1 a 3; e
[0250] LA é selecionado a partir dos grupos acima.
[0251] Sem limitar a invenção a uma teoria, tal grupo pode ser clivado a partir do anticorpo, tal que o grupo carbamato fornece o grupo: H2N-(CH2)p- (L3’).
[0252] Em algumas formas de realização, onde L é L3, q pode ser 1 e p pode ser 2.
[0253] Em algumas formas de realização, onde L é L3, LA pode ser selecionado a partir de LA7, LA8-1 e LA8-2.
[0254] Em formas de realização da presente invenção, L é da fórmula:
Figure img0045
[0255] Onde m é a partir de 0 a 6;
[0256] X1 e X2 são grupos aminoácido, selecionados a partir de aminoácidos naturais que podem ser modificados;
[0257] LA é selecionado a partir dos grupos acima.
[0258] Os aminoácidos naturais podem ser selecionados, tal que o grupo dipeptídeo é lábil em catepsina.
[0259] Em uma forma de realização, o grupo -X1-X2- é selecionado a partir de: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-, -Phe-Cit-, -Leu-Cit-, -Ile-Cit-, -Phe-Arg-, -Trp-Cit- onde Cit é citrulina. Preferivelmente, o grupo -X1-X2- é selecionado a partir de: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-.
[0260] Mais preferivelmente, o grupo -X1-X2- é -Phe-Lys- ou -Val-Ala-.
[0261] Em algumas formas de realização, onde L é L4, m pode ser 1.
[0262] Outras combinações de dipeptídeo podem ser usadas, incluindo aquelas descritas por Dubowchik et al., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13,855 - 869, que é incorporada neste relatório como referência.
[0263] Em uma forma de realização, a cadeia lateral do aminoácido é derivatizada, onde apropriado. Por exemplo, um grupo amino ou grupo carbóxi de uma cadeia lateral do aminoácido pode ser derivatizada.
[0264] Em uma forma de realização, um grupo amino NH2 de uma cadeia lateral do aminoácido, tal como lisina, é uma forma derivatizada selecionada a partir do grupo que consiste de NHR e NRR’.
[0265] Em uma forma de realização, um grupo carbóxi COOH de uma cadeia lateral do aminoácido, tal como ácido aspártico, é uma forma derivatizada selecionada a partir do grupo que consiste de COOR, CONH2, CONHR e CONRR’.
[0266] Em uma forma de realização, a cadeia lateral do aminoácido é quimicamente protegida, onde apropriado. O grupo de proteção da cadeia lateral pode ser um grupo, conforme debatido abaixo, em relação ao grupo RL. Os presentes inventores estabeleceram que as sequências de aminoácidos protegidas são cliváveis por enzimas. Por exemplo, foi estabelecido que uma sequência de dipeptídeos compreendendo um resíduo de Lys protegido na cadeia lateral Boc é clivável por catepsina.
[0267] Grupos de proteção para as cadeias laterais de aminoácidos são bem conhecidos na técnica e são descritos no Novabiochem Catalog. Estratégias de grupos de proteção adicionais são apresentadas em Protective Groups in Organic Synthesis, Greene e Wuts.
[0268] Grupos de proteção de cadeia lateral possíveis são mostrados abaixo para aqueles aminoácidos que apresentam funcionalidade de cadeia lateral reativa: Arg: Z, Mtr, Tos; Asn: Trt, Xan; Asp: Bzl, t-Bu; Cys: Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, Trt; Glu: Bzl, t-Bu; Gln: Trt, Xan; His: Boc, Dnp, Tos, Trt; Lys: Boc, Z-Cl, Fmoc, Z, Alloc; Ser: Bzl, TBDMS, TBDPS; Thr: Bz; Trp: Boc; Tyr: Bzl, Z, Z-Br.
[0269] Assim, em formas de realização da presente invenção, G é da fórmula:
[0270] GA-(CH2)m-
[0271] Onde m é a partir de 0 a 6; e
[0272] GA é selecionado a partir de:
Figure img0046
Figure img0047
[0273] onde Ar representa um grupo arileno C5-6, por exemplo, fenileno.
[0274] Em algumas formas de realização, onde G é G1, m pode ser 2, 3 ou 5.
[0275] Em algumas formas de realização, onde G é G1, GA pode ser GA1-1.
[0276] Em formas de realização da presente invenção, G é da fórmula:
[0277] GA-(CH2)m-O- (G2)
[0278] Onde m é a partir de 0 a 6; e
[0279] GA é selecionado a partir dos grupos acima.
[0280] Em algumas formas de realização, onde G é G2, GA pode ser GA3-2.
[0281] Em algumas formas de realização, onde G é G2, m pode ser 1.
[0282] Em formas de realização da presente invenção, G é da fórmula:
[0283] GA-(CH2)q-O-C(=O)-NH-(CH2)p- (L3)
[0284] Onde q é a partir de 1 a 3, e p é a partir de 1 a 3; e
[0285] GA é selecionado a partir dos grupos acima.
[0286] Em algumas formas de realização, onde G é G3, q pode ser 1, e p pode ser 2.
[0287] Em algumas formas de realização, onde G é G3, GA pode ser selecionado a partir de GA7 e GA8.
[0288] Em formas de realização da presente invenção, G é da fórmula:
Figure img0048
[0289] Onde m é a partir de 0 a 6;
[0290] X1 e X2 são definidos acima para L4;
[0291] GA é selecionado a partir dos grupos acima.
[0292] R e R’
[0293] Em uma forma de realização, R é, independentemente, selecionado a partir de alquila C1-12 opcionalmente substituído, grupos heterociclila C3-20 e arila C520. Estes grupos são definidos na seção substituintes abaixo.
[0294] Em uma forma de realização, R é independentemente, alquila C1-12 opcionalmente substituído.
[0295] Em uma forma de realização, R é independentemente, heterociclila C3-20 opcionalmente substituído.
[0296] Em uma forma de realização, R é independentemente, arila C5-20 opcionalmente substituído.
[0297] Em uma forma de realização, R é independentemente, alquila C1-12 opcionalmente substituído.
[0298] As preferências para R também se aplicam a R’.
[0299] Em algumas formas de realização da invenção é fornecido um composto que apresenta um grupo substituinte -NRR’. Em uma forma de realização, R e R’ juntamente com o átomo de nitrogênio a qual eles são ligados formam um anel heterocíclico de 4, 5, 6 ou 7 membros opcionalmente substituído. O anel pode conter um heteroátomo adicional, por exemplo, N, O ou S.
[0300] Em uma forma de realização, o anel heterocíclico é por si só substituído com um grupo R. Onde um heteroátomo de N adicional está presente, o substituinte pode estar no heteroátomo de N. RA4
[0301] Em uma forma de realização, RA4 é um grupo alquileno C2-4.
[0302] Em uma forma de realização, RA4 é um grupo alquileno C2.
[0303] Em uma forma de realização, RA4 é um grupo alquileno C3.
[0304] Em uma forma de realização, RA4 é um grupo alquileno C1-6 não substituído.
[0305] Em uma forma de realização, RA4 é um grupo alquileno C1-6 linear.
[0306] Em uma forma de realização, RA4 é selecionado a partir do grupo que consiste de -CH2CH2-, -CH2CH2CH2- e -CH2CH2CH2CH2-. AGENTE DE LIGAÇÃO CELULAR Um agente de ligação celular pode ser de qualquer tipo, e inclui peptídeos e não peptídeos. Estes podem incluir anticorpos ou um fragmento de um anticorpo que contém pelo menos um sítio de ligação, linfocinas, hormônios, fatores de crescimento, moléculas de transporte de nutrientes ou qualquer outra molécula ou substância de ligação celular.
[0307] O termo “anticorpo” neste relatório é usado no sentido mais amplo e especificamente cobre anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, dímeros, multímeros, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (Miller et al. (2003) Jour. of Immunology 170:4854 - 4861). Os anticorpos podem ser de murino, humanos, humanizados, quiméricos ou derivado de outra espécie. Um anticorpo é uma proteína gerada pelo sistema imune que é capaz de reconhecer e se ligar a um antígeno específico. (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5a Ed., Garland Publishing, Nova Iorque). Um antígeno alvo, em geral, tem diversos sítios de ligação, também chamados epítopos, reconhecidos pelas CDRs em múltiplos anticorpos. Cada anticorpo que se liga especificamente a um epítopo diferente tem uma estrutura diferente. Assim, um antígeno pode ter mais do que um anticorpo correspondente. Um anticorpo inclui uma molécula de imunoglobulina de comprimento total ou uma porção imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina de comprimento total, isto é, uma molécula que contém um sítio de ligação ao antígeno que se liga imunoespecificamente a um antígeno de um alvo de interesse ou parte do mesmo, tais alvos incluindo, mas não limitados às células de câncer ou células que produzem anticorpos autoimunes associados com uma doença autoimune. A imunoglobulina pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. As imunoglobulinas podem ser derivadas de qualquer espécie, incluindo origem humana, de murino ou coelho.
[0308] “Fragmentos de anticorpos” compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento total, em geral, a ligação ao antígeno ou região variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id), CDR (região determinante de complementaridade) e fragmentos de ligação ao epítopo de qualquer um entre os citados acima que se ligam imunoespecificamente aos antígenos de células de câncer, antígenos virais ou antígenos microbianos, moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[0309] O termo “anticorpo monoclonal”, conforme usado neste relatório, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, exceto para possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um sítio antigênico único. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpo policlonal que incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um determinante único no antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos, em que eles podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigência de produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais que serão usados, de acordo com a presente invenção, podem ser preparados pelo método do hibridoma descrito primeiro por Kohler et al. (1975) Nature 256:495, ou podem ser preparados por métodos de DNA recombinante (veja, US 4816567). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas em Clackson et al. (1991) Nature, 352:624 - 628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581 - 597.
[0310] Os anticorpos monoclonais neste relatório especificamente incluem anticorpos “quiméricos” em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse do anticorpo particular, enquanto o restante da cadeia é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencentes a uma outra classe ou subclasse do anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (US 4816567; e Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 - 6855). Anticorpos quiméricos incluem anticorpos “primatizados” compreendendo sequências de ligação ao antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Macaco do Velho Mundo) e sequências de região constante humana.
[0311] Um “anticorpo intacto” neste relatório é aquele que compreende domínios VL e VH, assim como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou variante de sequência de aminoácidos dos mesmos. O anticorpo intacto pode ter uma ou mais “funções efetoras” que se referem àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou região Fc da variante de sequência de aminoácidos) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras do anticorpo incluem ligação de; citotoxicidade dependente do complemento; ligação do receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC); fagocitose; e infrarregulação de receptores de superfície celular, tal como receptor de células B e BCR.
[0312] Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, anticorpo intactos podem ser determinados como “classes” diferentes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias entre estas ainda podem ser divididas em “subclasses” (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de anticorpos são chamados α, δ, ε, Y, e μ, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidos.
[0313] Exemplos de agentes de ligação celular incluem aqueles agentes descritos para o uso no WO 2007/085930, que é incorporado neste relatório.
[0314] O agente de ligação celular pode ser, ou compreender, um polipeptídeo. O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo cíclico. O agente de ligação celular pode ser anticorpo. Assim, em uma forma de realização, a presente invenção fornece um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC).
CARREGAMENTO DO FÁRMACO
[0315] O carregamento do fármaco é o número médio de fármacos de PBD por anticorpo. O carregamento do fármaco pode variar de 1 a 8 fármacos (D) por anticorpo (Ab), isto é, onde 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 porções de fármaco são covalentemente ligadas ao anticorpo. As composições de ADC incluem coletas de anticorpos conjugados com uma faixa de fármacos, de 1 a 8. O número médio de fármacos por anticorpo nas preparações de ADC a partir das reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais, tais como espectroscopia de massas, ensaio ELISA, eletroforese e HPLC. A distribuição quantitativa de ADC em termos de p também pode ser determinada. Através de ELISA, o valor médio de p em uma preparação particular de ADC pode ser determinado (Hamblett et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063 - 7070; Sanderson et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:843 - 852). Entretanto, a distribuição de valores p (fármaco) não é discernível pela ligação de anticorpo-antígeno e limitação de detecção de ELISA. Além disso, o ensaio ELISA para detecção de conjugados de anticorpo-fármaco não determina onde as porções de fármaco são ligadas ao anticorpo, tal como os fragmentos de cadeia pesada ou cadeia leve, ou os resíduos de aminoácidos particulares. Em alguns exemplos, separação, purificação e caracterização de ADC homogêneo onde p é um certo valor a partir de ADC com outros carregamentos de fármaco podem ser obtidas através de meios, tais como HPLC em fase reversa ou eletroforese.
[0316] Para alguns conjugados de anticorpo-fármaco, p pode ser limitado pelo número de sítios de ligação no anticorpo. Por exemplo, um anticorpo pode ter apenas um ou vários grupos cisteína tiol, ou pode ter apenas um ou vários grupos tiol suficientemente reativos através dos quais um ligador pode ser ligado. Carregamento do fármaco maior, por exemplo, p >5, pode causar agregação, insolubilidade, toxicidade ou perda de permeabilidade celular de certos conjugados de anticorpo-fármaco.
[0317] Tipicamente, menos do que o teórico máximo de porções de fármaco é conjugado a um anticorpo durante uma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, muitos resíduos de lisina que não reagem com o intermediário de fármaco-ligador (D-L) ou reagente ligador. Apenas os grupos lisina mais reativos podem reagir com um reagente ligador amina-reativo. Além disso, apenas os grupos cisteína tiol mais reativos podem reagir com um reagente ligador tiol-reativo. Em geral, os anticorpos não contêm muitos, se algum, grupos cisteína tiol livres e reativos que podem ser ligados a um porção de fármaco. A maioria dos resíduos de cisteína tiol nos anticorpos do compostos existe como pontes dissulfeto e devem ser reduzidos com um agente redutor, tal como ditiotreitol (DTT) ou TCEP, sob condições de redução parciais ou totais. O carregamento (razão fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlado em várias maneiras diferentes, incluindo: (i) limitação do excesso molar do intermediário de fármaco-ligador (D-L) ou reagente ligador em relação ao anticorpo, (ii) limitação do tempo ou temperatura da reação de conjugação, e (iii) condições redutivas parciais ou limitantes para a modificação de cisteína tiol.
[0318] Os aminoácidos cisteína podem ser construídos em sítios reativos em um anticorpo e que não formam ligações dissulfeto intracadeia ou intermoleculares (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925 - 932; Dornan et al. (2009) Sangue 114(13):2721 - 2729; US 7521541; US 7723485; WO 2009/052249, Shen et al. (2012) Nature Biotech., 30(2):184 - 191; Junutula et al. (2008) Jour of Immun. Methods 332:41 - 52). Os cisteína tióis construídos podem reagir com reagentes ligadores ou fármaco-reagentes ligadores da presente invenção que têm grupos eletrofílicos tiol-reativos, tais como maleimida ou alfa-halo amidas para formar ADC com anticorpos construídos com cisteína (TioMabs) e as porções de PBD-fármaco. A localização da porção de fármaco pode, assim, ser designada, controlada e conhecida. O carregamento do fármaco pode ser controlado, visto que os grupos cisteína tiol construídos tipicamente reagem com reagentes ligadores tiol-reativos ou fármaco-reagentes ligadores em alto rendimento. A construção de um anticorpo IgG para introduzir um aminoácido cisteína através da substituição em um sítio único na cadeia pesada ou leve fornece duas novas cisteínas no anticorpo simétrico. Um carregamento do fármaco próximo a 2 pode ser obtido e próximo à homogeneidade do produto de conjugação ADC.
[0319] Onde mais do que um grupo nucleofílico ou eletrofílico do anticorpo reage com um intermediário de fármaco-ligador, ou reagente ligador seguido pelo reagente de porção de fármaco, depois o produto resultante é uma mistura de compostos de ADC com uma distribuição de porções de fármaco ligadas a um anticorpo, por exemplo, 1, 2, 3, etc. Métodos de cromatografia líquida, tais como fase reversa polimérica (PLRP) e interação hidrofóbica (HIC) podem separar compostos na mistura através de valor de carregamento do fármaco. As preparações de ADC com um valor de carregamento do fármaco único (p) podem ser isoladas, entretanto, estes ADCs com valor de carregamento único podem ser ainda misturas heterogêneas porque as porções de fármaco podem ser ligadas, por intermédio do ligador, em sítios diferentes no anticorpo.
[0320] Assim, as composições de conjugado de anticorpo-fármaco da invenção incluem misturas de conjugados de composto de anticorpo-fármaco onde o anticorpo tem uma ou mais porções de fármaco de PBD e onde as porções de fármaco podem ser ligadas ao anticorpo em vários resíduos de aminoácidos.
[0321] Em uma forma de realização, o número médio de grupos de pirrolobenzodiazepina diméricos por agente de ligação celular está na faixa de 1 a 20. Em algumas formas de realização, a faixa é selecionada a partir de 1 a 8, 2 a 8, 2 a 6, 2 a 4, e 4 a 8.
[0322] Em algumas formas de realização, existe um grupo de pirrolobenzodiazepina dimérico por agente de ligação celular.
PEPTÍDEOS
[0323] Em uma forma de realização, a agente de ligação celular é um peptídeo linear ou cíclico compreendendo 4 a 20, preferivelmente, 6 a 20, resíduos de aminoácidos contíguos. Nesta formas de realização, é preferido que um agente de ligação celular seja ligado a um composto de pirrolobenzodiazepina monomérico ou dimérico.
[0324] Em uma forma de realização, o agente de ligação celular compreende um peptídeo que se liga à integrina αvβ6. O peptídeo pode ser seletivo para αvβ6 sobre XYS.
[0325] Em uma forma de realização, o agente de ligação celular compreende o polipeptídeo A20FMDV-Cys. O A20FMDV-Cys tem a sequência: NAVPNLRGDLQVLAQKVARTC. Alternativamente, uma variante da sequência de A20FMDV-Cys pode ser usada, em que um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez resíduos de aminoácidos são substituídos com um outro resíduo de aminoácido.
[0326] Em uma forma de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal; anticorpo quimérico; anticorpo humanizado; anticorpo completamente humano; ou um anticorpo de cadeia única. Em uma forma de realização, o anticorpo é um fragmento de um destes anticorpos que apresentam atividade biológica. Exemplos de tais fragmentos incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv.
[0327] Nestas formas de realização, cada anticorpo pode ser ligado a um ou vários grupos de pirrolobenzodiazepina diméricos. As razões preferidas de pirrolobenzodiazepina para agente de ligação celular são fornecidas acima.
[0328] O anticorpo pode ser um anticorpo de domínio (DAB).
[0329] Em uma forma de realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
[0330] Os anticorpos para o uso na presente invenção incluem aqueles anticorpos descritos no WO 2005/082023 que é incorporado neste relatório. Particularmente preferidos são aqueles anticorpos para antígenos associados ao tumor. Exemplos de tais antígenos conhecidos na técnica incluem, mas não são limitados àqueles antígenos associados ao tumor apresentados no WO 2005/082023. Veja, por exemplo, páginas 41 a 55.
[0331] Os conjugados da invenção são designados para alvejar células de tumor por intermédio de seus antígenos de superfície celular. Os antígenos são usualmente antígenos de superfície celular normais que são superexpressados ou expressados em tempos anormais. De maneira ideal, o antígeno alvo é expressado apenas em células proliferativas (preferivelmente, células de tumor), entretanto, isto é raramente observado na prática. Como um resultado, antígenos alvo são usualmente selecionados na base de expressão diferencial entre tecido proliferativo e saudável.
[0332] Antígenos associados ao tumor (TAA) são conhecidos na técnica e podem ser preparados para o uso na geração de anticorpos usando métodos e informação que são bem conhecidos na técnica. Em tentativas para descobrir alvos celulares eficazes para diagnóstico e terapia contra o câncer, pesquisadores procuraram identificar polipeptídeos transmembrana ou, de outro modo, polipeptídeos associados ao tumor que são especificamente expressados sobre a superfície de um ou mais tipos particulares de células de câncer em comparação em uma ou mais células não cancerosas normais. Frequentemente, tais polipeptídeos associados ao tumor são mais abundantemente expressados sobre a superfície das células de câncer em comparação na superfície das células não cancerosas. A identificação de tais polipeptídeos de antígeno de superfície celular associados ao tumor originou a capacidade de alvejar especificamente células de câncer para a destruição por intermédio de terapias com base em anticorpo.
[0333] Exemplos de TAA incluem, mas não são limitados a TAA (1)-(36) listado abaixo. Por conveniência, a informação que se relaciona a estes antígenos, todos os quais são conhecidos na técnica, é listada abaixo e inclui nomes, nomes alternativos, números de acesso Genbank e referências primárias, seguindo as convenções de identificação de sequência de ácidos nucleicos e proteínas do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Sequências de ácidos nucleicos e proteínas correspondentes a TAA (1)-(36) estão disponíveis em bancos de dados públicos, tais como GenBank. Antígenos associados ao tumor alvejados por anticorpos incluem todas as variantes de sequências de aminoácidos e isoformas possuindo pelo menos cerca de 70 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade de sequência em relação às sequências identificadas nas referências citadas, ou que exibem substancialmente as mesmas propriedades biológicas ou características de um TAA que apresenta uma sequência encontrada nas referências citadas. Por exemplo, um TAA que apresenta uma sequência variante, em geral, é capaz de se ligar especificamente a um anticorpo que se liga especificamente ao TAA com a sequência correspondente listada. As sequências e divulgação na referência especificamente citada neste relatório são expressamente incorporadas como referência.
ANTÍGENOS ASSOCIADOS AO TUMOR (1)-(36):
[0334] BMPR1B (receptor da proteína morfogenética do osso-tipo IB, Genbank acesso no NM_001203) dez Dijke,P., et al. Science 264 (5155):101 - 104 (1994), Oncogene 14 (11):1377 - 1382 (1997)); WO 2004/063362 (Reivindicação 2); WO 2003/042661 (Reivindicação 12); US 2003/134790-A1 (Páginas 38 - 39); WO 2002/102235 (Reivindicação 13; Páginas 296); WO 2003/055443 (Páginas 91 - 92); WO 2002/99122 (Exemplo 2; Páginas 528 - 530); WO 2003/029421 (Reivindicação 6); WO 2003/024392 (Reivindicação 2; Fig 112); WO 2002/98358 (Reivindicação 1; Páginas 183); WO 2002/54940 (Páginas 100 - 101); WO 2002/59377(Páginas 349 - 350); WO 2002/30268 (Reivindicação 27; Páginas 376); WO 2001/48204 (Exemplo; Fig 4); NP_001194 receptor da proteína morfogenética do osso, tipo IB/pid=NP_001194.1. Referências cruzadas: MIM:603248; NP_001194,1; AY065994
[0335] E16 (LAT1, SLC7A5, Genbank acesso no NM_003486) Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283 - 288 (1999), Nature 395 (6699):288 - 291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267 - 11273); WO 2004/048938 (Exemplo 2); WO 2004/032842 (Exemplo IV); WO 2003/042661 (Reivindicação 12); WO 2003/016475 (Reivindicação 1); WO 2002/78524 (Exemplo 2); WO 2002/99074 (Reivindicação 19; Páginas 127 - 129); WO 2002/86443 (Reivindicação 27; Páginas 222, 393); WO 2003/003906 (Reivindicação 10; Páginas 293); WO 2002/64798 (Reivindicação 33; Páginas 93 - 95); WO 2000/14228 (Reivindicação 5; Páginas 133 - 136); US 2003/224454 (Fig 3); WO 2003/025138 (Reivindicação 12; Páginas 150); NP_003477 família do veículo de soluto 7 (transportador de aminoácido catiônico, y+sistema), membro 5/pid=NP_003477.3 - Homo sapiens; Referências cruzadas: MIM:600182; NP_003477,3; NM_015923; NM_003486_1
[0336] STEAP1 (antígeno epitelial seis transmembrana da próstata, Genbank acesso no NM_012449); Cancer Res. 61 (15), 5857 - 5860 (2001), Hubert, R.S., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (25):14523 - 14528); WO 2004/065577 (Reivindicação 6); WO 2004/027049 (Fig 1L); EP1394274 (Exemplo 11); WO 2004/016225 (Reivindicação 2); WO 2003/042661 (Reivindicação 12); US 2003/157089 (Exemplo 5); US 2003/185830 (Exemplo 5); US 2003/064397 (Fig 2); WO 2002/89747 (Exemplo 5; Páginas 618 - 619); WO 2003/022995 (Exemplo 9; Fig 13A, Exemplo 53; Páginas 173, Exemplo 2; Fig 2A); NP_036581 antígeno epitelial seis transmembrana da próstata; Referências cruzadas: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1
[0337] 0772P (CA125, MUC16, Genbank acesso no AF361486); J. Biol. Chem. 276 (29):27371 - 27375 (2001)); WO 2004/045553 (Reivindicação 14); WO 2002/92836 (Reivindicação 6; Fig 12); WO 2002/83866 (Reivindicação 15; Páginas 116 - 121); US 2003/124140 (Exemplo 16); Referências cruzadas: GI:34501467; AAK74120,3; AF361486_1
[0338] MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potenciação de megacariócitos, mesotelina, Genbank acesso no NM_005823) Yamaguchi, N., et al. Biol. Chem. 269 (2), 805 - 808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20):11531 - 11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (1):136 - 140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984 - 21990 (1995)); WO 2003/101283 (Reivindicação 14); (WO 2002/102235 (Reivindicação 13; Páginas 287 - 288); WO 2002/101075 (Reivindicação 4; Páginas 308 - 309); WO 2002/71928 (Páginas 320 - 321); WO 94/10312 (Páginas 52 - 57); Referências cruzadas: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1
[0339] Napi3b (NAPI-3B, NaPi2B, NPTIIb, SLC34A2, família do veículo de soluto 34 (fosfato de sódio), membro 2, transportador de fosfato dependente de sódio tipo II 3b, Genbank acesso no NM_006424) J. Biol. Chem. 277 (22):19665 - 19672 (2002), Genomics 62 (2):281 - 284 (1999), Feild, J.A., et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578 - 582); WO 2004/022778 (Reivindicação 2); EP1394274 (Exemplo 11); WO 2002/102235 (Reivindicação 13; Páginas 326); EP0875569 (Reivindicação 1; Páginas 17 - 19); WO 2001/57188 (Reivindicação 20; Páginas 329); WO 2004/032842 (Exemplo IV); WO 2001/75177 (Reivindicação 24; Páginas 139 - 140); Referências cruzadas: MIM:604217; NP_006415.1; NM_006424_1.
[0340] Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de trombospondina (tipo 1 e similar ao tipo 1), domínio transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B, Genbank acesso no AB040878); Nagase T., et al. (2000) DNA Res. 7 (2):143 - 150); WO 2004/000997 (Reivindicação 1); WO 2003/003984 (Reivindicação 1); WO 2002/06339 (Reivindicação 1; Páginas 50); WO 2001/88133 (Reivindicação 1; Páginas 41 - 43, 48 - 58); WO 2003/054152 (Reivindicação 20); WO 2003/101400 (Reivindicação 11); Acesso: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1. Genew; HGNC:10737
[0341] PSCA hlg(2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 gene, Genbank acesso no AY358628); Ross et al. (2002) Cancer Res. 62:2546 - 2553; US2003/129192 (Reivindicação 2); US 2004/044180 (Reivindicação 12); US 2004/044179 (Reivindicação 11); US 2003/096961 (Reivindicação 11); US 2003/232056 (Exemplo 5); WO 2003/105758 (Reivindicação 12); US 2003/206918 (Exemplo 5); EP1347046 (Reivindicação 1); WO 2003/025148 (Reivindicação 20); Referências cruzadas: GI:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1
[0342] ETBR (receptor de endotelina tipo B, Genbank acesso no AY275463); Nakamuta M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34 - 39, 1991; Ogawa Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248 - 255, 1991; Arai H., et al. Jpn. Circ. J. 56, 1303 - 1307, 1992; Arai H., et al. J. Biol. Chem. 268, 3463 - 3470, 1993; Sakamoto UM., Yanagisawa M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656 - 663, 1991; Elshourbagy N.A., et al. J. Biol. Chem. 268, 3873 - 3879, 1993; Haendler B., et al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M., et al. Gene 228, 43 - 49, 1999; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899 - 16903, 2002; Bourgeois C., et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116 - 3123, 1997; Okamoto Y., et al. Biol. Chem. 272, 21589 - 21596, 1997; Verheij J.B., et al. Am. J. Med. Genet. 108, 223 - 225, 2002; Hofstra R.M.W., et al. Eur. J. Hum. Genet. 5, 180 - 185, 1997; Puffenberger E. G., et al. Cell 79, 1257 - 1266, 1994; Attie T., et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407 - 2409, 1995; Auricchio A., et al. Hum. Mol. Genet. 5:351 - 354, 1996; Amiel J., et al. Hum. Mol. Genet. 5, 355 - 357, 1996; Hofstra R.M.W., et al. Nat. Genet. 12, 445 - 447, 1996; Svensson P.J., et al. Hum. Genet. 103, 145 - 148, 1998; Fuchs S., et al. Mol. Med. 7, 115 - 124, 2001; Pingault V., et al. (2002) Hum. Genet. 111, 198 - 206; WO 2004/045516 (Reivindicação 1); WO 2004/048938 (Exemplo 2); WO 2004/040000 (Reivindicação 151); WO 2003/087768 (Reivindicação 1); WO 2003/016475 (Reivindicação 1); WO 2003/016475 (Reivindicação 1); WO 2002/61087 (Fig 1); WO 2003/016494 (Fig 6); WO 2003/025138 (Reivindicação 12; Páginas 144); WO 2001/98351 (Reivindicação 1; Páginas 124 - 125); EP 0522868 (Reivindicação 8; Fig 2); WO 2001/77172 (Reivindicação 1; Páginas 297 - 299); US 2003/109676; US 6518404 (Fig 3); US 5773223 (Reivindicação 1a; Col 31 - 34); WO 2004/001004
[0343] MSG783 (RNF124, proteína hipotética de FLJ20315, Genbank acesso no NM_017763); WO 2003/104275 (Reivindicação 1); WO 2004/046342 (Exemplo 2); WO 2003/042661 (Reivindicação 12); WO 2003/083074 (Reivindicação 14; Páginas 61); WO 2003/018621 (Reivindicação 1); WO 2003/024392 (Reivindicação 2; Fig 93); WO 2001/66689 (Exemplo 6); Referências cruzadas: LocusID:54894; NP_060233.2; NM_017763_1
[0344] STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene associado ao câncer de próstata 1, proteína associada ao câncer de próstata 1, antígeno epitelial seis transmembrana da próstata 2, seis proteínas transmembranares da próstata, Genbank acesso no AF455138); Lab. Invest. 82 (11):1573 - 1582 (2002)); WO 2003/087306; US 2003/064397 (Reivindicação 1; Fig 1); WO 2002/72596 (Reivindicação 13; Páginas 54 - 55); WO 2001/72962 (Reivindicação 1; Fig 4B); WO 2003/104270 (Reivindicação 11); WO 2003/104270 (Reivindicação 16); US 2004/005598 (Reivindicação 22); WO 2003/042661 (Reivindicação 12); US 2003/060612 (Reivindicação 12; Fig 10); WO 2002/26822 (Reivindicação 23; Fig 2); WO 2002/16429 (Reivindicação 12; Fig 10); Referências cruzadas: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1
[0345] TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de cátion do receptor de potencial transitório, subfamília M, membro 4, Genbank acesso no NM_017636); Xu, X.Z., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (19):10692 - 10697 (2001), Cell 109 (3):397 - 407 (2002), J. Biol. Chem. 278 (33):30813 - 30820 (2003)); US 2003/143557 (Reivindicação 4); WO 2000/40614 (Reivindicação 14; Páginas 100 - 103); WO 2002/10382 (Reivindicação 1; Fig 9A); WO 2003/042661 (Reivindicação 12); WO 2002/30268 (Reivindicação 27; Páginas 391); US 2003/219806 (Reivindicação 4); WO 2001/62794 (Reivindicação 14; Fig 1A-D); Referências cruzadas: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017636_1
[0346] CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma, Genbank acesso no NP_003203 ou NM_003212); Ciccodicola, A., et al. EMBO J. 8 (7):1987 - 1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555 - 565 (1991)); US 2003/224411 (Reivindicação 1); WO 2003/083041 (Exemplo 1); WO 2003/034984 (Reivindicação 12); WO 2002/88170 (Reivindicação 2; Páginas 52 - 53); WO 2003/024392 (Reivindicação 2; Fig 58); WO 2002/16413 (Reivindicação 1; Páginas 94 - 95, 105); WO 2002/22808 (Reivindicação 2; Fig 1); US 5854399 (Exemplo 2; Col 17 - 18); US 5792616 (Fig 2); Referências cruzadas: MIM:187395; NP_003203.1; NM_003212_1
[0347] CD21 (CR2 (Receptor do complemento 2) ou C3DR (C3d/receptor do vírus Epstein Barr) ou Hs.73792 Genbank acesso no M26004); Fujisaku et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118 - 2125); Weis J.J., et al. J. Exp. Med. 167, 1047 - 1066, 1988; Moore M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 9194 - 9198, 1987; Barel M., et al. Mol. Immunol. 35, 1025 - 1031, 1998; Weis J.J., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5639 - 5643, 1986; Sinha S.K., et al. (1993) J. Immunol. 150, 5311 - 5320; WO 2004/045520 (Exemplo 4); US 2004/005538 (Exemplo 1); WO 2003/062401 (Reivindicação 9); WO 2004/045520 (Exemplo 4); WO 91/02536 (Fig 9.1 - 9.9); WO 2004/020595 (Reivindicação 1); Acesso: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1.
[0348] CD79b (CD79B, CD79β, IGb (imunoglobulina beta-associada), B29, Genbank acesso no NM_000626 ou 11038674); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (7):4126 - 4131, Blood (2002) 100 (9):3068 - 3076, Muller et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621 - 1625); WO 2004/016225 (reivindicação 2, Fig 140); WO 2003/087768, US 2004/101874 (reivindicação 1, páginas 102); WO 2003/062401 (reivindicação 9); WO 2002/78524 (Exemplo 2); US 2002/150573 (reivindicação 5, páginas 15); US 5644033; WO 2003/048202 (reivindicação 1, páginas 306 e 309); WO 99/58658, US 6534482 (reivindicação 13, Fig 17A/B); WO 2000/55351 (reivindicação 11, páginas 1145 - 1146); Referências cruzadas: MIM:147245; NP_000617.1; NM_000626_1
[0349] FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 domínio contendo proteína âncora de fosfatase 1a), SPAP1B, SPAP1C, Genbank acesso no NM_030764, AY358130); Genome Res. 13 (10):2265 - 2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87 - 95 (2002), Blood 99 (8):2662 - 2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17):9772 - 9777 (2001), Xu, M.J., et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768 - 775; WO 2004/016225 (Reivindicação 2); WO 2003/077836; WO 2001/38490 (Reivindicação 5; Fig 18D-1 - 18D-2); WO 2003/097803 (Reivindicação 12); WO 2003/089624 (Reivindicação 25); Referências cruzadas: MIM:606509; NP_110391.2; NM_030764_1
[0350] HER2 (ErbB2, Genbank acesso no M11730); Coussens L., et al. Science (1985) 230(4730):1132 - 1139); Yamamoto T., et al. Nature 319, 230 - 234, 1986; Semba K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6497 - 6501, 1985; Swiercz J.M., et al. J. Cell Biol. 165, 869 - 880, 2004; Kuhns J.J., et al. J. Biol. Chem. 274, 36422 - 36427, 1999; Cho H.-S., et al. Nature 421, 756 - 760, 2003; Ehsani A., et al. (1993) Genomics 15, 426 - 429; WO 2004/048938 (Exemplo 2); WO 2004/027049 (Fig 1I); WO 2004/009622; WO 2003/081210; WO 2003/089904 (Reivindicação 9); WO 2003/016475 (Reivindicação 1); US 2003/118592; WO 2003/008537 (Reivindicação 1); WO 2003/055439 (Reivindicação 29; Fig 1A-B); WO 2003/025228 (Reivindicação 37; Fig 5C); WO 2002/22636 (Exemplo 13; Páginas 95 - 107); WO 2002/12341 (Reivindicação 68; Fig 7); WO 2002/13847 (Páginas 71 - 74); WO 2002/14503 (Páginas 114 - 117); WO 2001/53463 (Reivindicação 2; Páginas 41 - 46); WO 2001/41787 (Páginas 15); WO 2000/44899 (Reivindicação 52; Fig 7); WO 2000/20579 (Reivindicação 3; Fig 2); US 5869445 (Reivindicação 3; Col 31 - 38); WO 9630514 (Reivindicação 2; Páginas 56 - 61); EP 1439393 (Reivindicação 7); WO 2004/043361 (Reivindicação 7); WO 2004/022709; WO 2001/00244 (Exemplo 3; Fig 4); Acesso: P04626; EMBL; M11767; AAA35808,1. EMBL; M11761; AAA35808.1. Em certas formas de realização, composto conjugados da invenção compreendem anticorpos anti-HER2. Em uma forma de realização da invenção, um anticorpo anti- HER2 de um ADC da invenção compreende um anticorpo anti-HER2 humanizado, por exemplo, huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5- 5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8, conforme descrito na Tabela 3 do US 5821337. Tais anticorpos contêm regiões de estrutura humana com as regiões determinantes de complementaridade de um anticorpo de murino (4D5) que se liga a HER2. O anticorpo humanizado huMAb4D5-8 também é referido como trastuzumabe, comercialmente disponível sob o nome comercial HERCEPTIN. Em uma outra forma de realização da invenção, um anticorpo anti-HER2 de um ADC da invenção compreende um anticorpo anti-HER2 humanizado, por exemplo, 2C4 humanizado, conforme descrito no US 7862817. Um anticorpo 2C4 humanizado exemplar é pertuzumabe, comercialmente disponível sob o nome comenrcial PERJETA.
[0351] NCA (CEACAM6, Genbank acesso no M18728); Barnett T., et al. Genomics 3, 59 - 66, 1988; Tawaragi Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89 - 96, 1988; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:16899 - 16903, 2002; WO 2004/063709; EP 1439393 (Reivindicação 7); WO 2004/044178 (Exemplo 4); WO 2004/031238; WO 2003/042661 (Reivindicação 12); WO 2002/78524 (Exemplo 2); WO 2002/86443 (Reivindicação 27; Páginas 427); WO 2002/60317 (Reivindicação 2); Acesso: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728
[0352] MDP (DPEP1, Genbank acesso no BC017023); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26):16899 - 16903 (2002)); WO 2003/016475 (Reivindicação 1); WO 2002/64798 (Reivindicação 33; Páginas 85 - 87); JP 05003790 (Fig 6 - 8); WO 99/46284 (Fig 9); Referências cruzadas: MIM:179780; AAH17023.1; BC017023_1
[0353] IL20Rα (IL20Ra, ZCYTOR7, Genbank acesso no AF184971); Clark H.F., et al. Genome Res. 13, 2265 - 2270, 2003; Mungall A.J., et al. Nature 425, 805 - 811, 2003; Blumberg H., et al. Cell 104, 9 - 19, 2001; Dumoutier L., et al. J. Immunol. 167, 3545 - 3549, 2001; Parrish-Novak J., et al. J. Biol. Chem. 277, 47517 - 47523, 2002; Pletnev S., et al. (2003) Biochemistry 42:12617 - 12624; Sheikh F., et al. (2004) J. Immunol. 172, 2006 - 2010; EP 1394274 (Exemplo 11); US 2004/005320 (Exemplo 5); WO 2003/029262 (Páginas 74 - 75); WO 2003/002717 (Reivindicação 2; Páginas 63); WO 2002/22153 (Páginas 45 - 47); US 2002/042366 (Páginas 20 - 21); WO 2001/46261 (Páginas 57 - 59); WO 2001/46232 (Páginas 63 - 65); WO 98/37193 (Reivindicação 1; Páginas 55 - 59); Acesso: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1.
[0354] Brevican (BCAN, BEHAB, Genbank acesso no AF229053); Gary S.C., et al. Gene 256, 139 - 147, 2000; Clark H.F., et al. Genome Res. 13, 2265 - 2270, 2003; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16899 - 16903, 2002; US 2003/186372 (Reivindicação 11); US 2003/186373 (Reivindicação 11); US 2003/119131 (Reivindicação 1; Fig 52); US 2003/119122 (Reivindicação 1; Fig 52); US 2003/119126 (Reivindicação 1); US 2003/119121 (Reivindicação 1; Fig 52); US 2003/119129 (Reivindicação 1); US 2003/119130 (Reivindicação 1); US 2003/119128 (Reivindicação 1; Fig 52); US 2003/119125 (Reivindicação 1); WO 2003/016475 (Reivindicação 1); WO 2002/02634 (Reivindicação 1)
[0355] EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, Genbank acesso no NM_004442); Chan, J. e Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057 - 1061 (1991) Oncogene 10 (5):897 - 905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309 - 345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177 - 244 (2000)); WO 2003042661 (Reivindicação 12); WO 200053216 (Reivindicação 1; Páginas 41); WO 2004065576 (Reivindicação 1); WO 2004020583 (Reivindicação 9); WO 2003004529 (Páginas 128 - 132); WO 200053216 (Reivindicação 1; Páginas 42); Referências cruzadas: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1
[0356] ASLG659 (B7h, Genbank acesso no AX092328); US 2004/0101899 (Reivindicação 2); WO 2003104399 (Reivindicação 11); WO 2004000221 (Fig 3); US 2003/165504 (Reivindicação 1); US 2003/124140 (Exemplo 2); US 2003/065143 (Fig 60); WO 2002/102235 (Reivindicação 13; Páginas 299); US 2003/091580 (Exemplo 2); WO 2002/10187 (Reivindicação 6; Fig 10); WO 2001/94641 (Reivindicação 12; Fig 7b); WO 2002/02624 (Reivindicação 13; Fig 1A-1B); US 2002/034749 (Reivindicação 54; Páginas 45 - 46); WO 2002/06317 (Exemplo 2; Páginas 320 - 321, Reivindicação 34; Páginas 321 - 322); WO 2002/71928 (Páginas 468 - 469); WO 2002/02587 (Exemplo 1; Fig 1); WO 2001/40269 (Exemplo 3; Páginas 190 - 192); WO 2000/36107 (Exemplo 2; Páginas 205 - 207); WO 2004/053079 (Reivindicação 12); WO 2003/004989 (Reivindicação 1); WO 2002/71928 (Páginas 233 - 234, 452 - 453); WO 01/16318
[0357] PSCA (precursor do antígeno de células tronco da próstata, Genbank acesso no AJ297436); Reiter R.E., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1735 - 1740, 1998; Gu Z., et al. Oncogene 19, 1288 - 1296, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783 - 788; WO 2004/022709; EP 1394274 (Exemplo 11); US 2004/018553 (Reivindicação 17); WO 2003/008537 (Reivindicação 1); WO 2002/81646 (Reivindicação 1; Páginas 164); WO 2003/003906 (Reivindicação 10; Páginas 288); WO 2001/40309 (Exemplo 1; Fig 17); US 2001/055751 (Exemplo 1; Fig 1b); WO 2000/32752 (Reivindicação 18; Fig 1); WO 98/51805 (Reivindicação 17; Páginas 97); WO 98/51824 (Reivindicação 10; Páginas 94); WO 98/40403 (Reivindicação 2; Fig 1B); Acesso: O43653; EMBL; AF043498; AAC39607.1
[0358] GEDA (Genbank acesso No AY260763); AAP14954 lipoma HMGIC proteína do tipo par de fusão/pid=AAP14954,1 - Homo sapiens (humano); WO 2003/054152 (Reivindicação 20); WO 2003/000842 (Reivindicação 1); WO 2003/023013 (Exemplo 3, Reivindicação 20); US 2003/194704 (Reivindicação 45); Referências cruzadas: GI:30102449; AAP14954.1; AY260763_1
[0359] BAFF-R (receptor do fator de ativação de células B, receptor 3 de BLyS, BR3, Genbank acesso No AF116456); receptor de BAFF /pid=NP_443177,1 - Homo sapiens: Thompson, J.S., et al. Science 293 (5537), 2108 - 2111 (2001); WO 2004/058309; WO 2004/011611; WO 2003/045422 (Exemplo; Páginas 32 - 33); WO 2003/014294 (Reivindicação 35; Fig 6B); WO 2003/035846 (Reivindicação 70; Páginas 615 - 616); WO 2002/94852 (Col 136 - 137); WO 2002/38766 (Reivindicação 3; Páginas 133); WO 2002/24909 (Exemplo 3; Fig 3); Referências cruzadas: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1; AF132600
[0360] CD22 (receptor de células B isoforma CD22-B, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, Genbank acesso No AK026467); Wilson et al. (1991) J. Exp. Med. 173:137 - 146; WO 2003/072036 (Reivindicação 1; Fig 1); Referências cruzadas: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1.
[0361] CD79a (CD79A, CD79α, imunoglobulina-alfa associada, uma proteína específica de células B que covalentemente interage com Ig beta (CD79B) e forma um complexo sobre a superfície com moléculas de Ig M, transduz um sinal envolvido na diferenciação de células B), pI: 4.84, MW: 25028 TM: 2 [P] Cromossomo do Gene: 19q13.2, Genbank acesso No NP_001774,10); WO 2003/088808, US 2003/0228319; WO 2003/062401 (reivindicação 9); US 2002/150573 (reivindicação 4, páginas 13 - 14); WO 99/58658 (reivindicação 13, Fig 16); WO 92/07574 (Fig 1); US 5644033; Ha et al. (1992) J. Immunol. 148(5):1526 - 1531; Müller et al. (1992) Eur. J. Immunol.. 22:1621 - 1625; Hashimoto et al. (1994) Immunogenetics 40(4):287 - 295; Preud’homme et al. (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1):141 - 146; Yu et al. (1992) J. Immunol. 148(2) 633 - 637; Sakaguchi et al. (1988) EMBO J. 7(11):3457 - 3464
[0362] CXCR5 (receptor do linfoma de Burkitt 1, um receptor ligado à proteína G que é ativado pela quimiocina CXCL13, funciona na migração de linfócitos e defesa humoral, desempenha um papel na infecção por HIV-2 e possível desenvolvimento de AIDS, linfoma, mieloma e leucemia); 372 aa, pI: 8,54 MW: 41959 TM: 7 [P] Cromossomo do Gene: 11q23.3, Genbank acesso No NP_001707,1); WO 2004/040000; WO 2004/015426; US 2003/105292 (Exemplo 2); US 6555339 (Exemplo 2); WO 2002/61087 (Fig 1); WO 2001/57188 (Reivindicação 20, páginas 269); WO 2001/72830 (páginas 12 - 13); WO 2000/22129 (Exemplo 1, páginas 152 - 153, Exemplo 2, páginas 254 - 256); WO 99/28468 (reivindicação 1, páginas 38); US 5440021 (Exemplo 2, col 49 - 52); WO 94/28931 (páginas 56 - 58); WO 92/17497 (reivindicação 7, Fig 5); Dobner et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795 - 2799; Barella et al. (1995) Biochem. J. 309:773 - 779
[0363] HLA-DOB (subunidade beta da molécula MHC classe II (antígeno Ia) que se liga aos peptídeos e apresenta os mesmos aos linfócitos T CD4+); 273 aa, pI: 6.56, MW: 30820.TM: 1 [P] Cromossomo do Gene: 6p21.3, Genbank acesso No NP_002111,1); Tonnelle et al. (1985) EMBO J. 4(11):2839 - 2847; Jonsson et al. (1989) Immunogenetics 29(6):411 - 413; Beck et al. (1992) J. Mol. Biol. 228:433 - 441; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899 - 16903; Servenius et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:8759 - 8766; Beck et al. (1996) J. Mol. Biol. 255:1 - 13; Naruse et al. (2002) Tissue Antigens 59:512 - 519; WO 99/58658 (reivindicação 13, Fig 15); US 6153408 (Col 35 - 38); US 5976551 (col 168 - 170); US 6011146 (col 145 - 146); Kasahara et al. (1989) Immunogenetics 30(1):66 - 68; Larhammar et al. (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111 - 14119
[0364] P2X5 (canal iônico ativado por ligante de P2X 5 do receptor purinérgico, um canal iônico ativado por ATP extracelular, pode estar envolvido na transmissão sináptica e neurogênese, a deficiência pode contribuir para a patofisiologia da instabilidade detrusora idiopática); 422 aa), pI: 7.63, MW: 47206 TM: 1 [P] Cromossomo do Gene: 17p13.3, Genbank acesso No NP_002552,2); Le et al. (1997) FEBS Lett. 418(1 - 2):195 - 199; WO 2004/047749; WO 2003/072035 (reivindicação 10); Touchman et al. (2000) Genome Res. 10:165 - 173; WO 2002/22660 (reivindicação 20); WO 2003/093444 (reivindicação 1); WO 2003/087768 (reivindicação 1); WO 2003/029277 (páginas 82)
[0365] CD72 (antígeno de diferenciação de células B CD72, Lyb-2); 359 aa, pI: 8.66, MW: 40225, TM: 1 [P] Cromossomo do Gene: 9p13.3, Genbank acesso No NP_001773,1); WO 2004042346 (reivindicação 65); WO 2003/026493 (páginas 51 - 52, 57 - 58); WO 2000/75655 (páginas 105 - 106); Von Hoegen et al. (1990) J. Immunol. 144(12):4870 - 4877; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899 - 16903.
[0366] LY64 (antígeno de linfócito 64 (RP105), proteína de membrana tipo I da família de repetição rica em leucina (LRR), regula a ativação de células B e apoptose, a perda de função está associada com atividade da doença aumentada em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico); 661 aa, pI: 6,20, MW: 74147 TM: 1 [P] Cromossomo do Gene: 5q12, Genbank acesso No NP_005573,1); US2002/193567; WO 97/07198 (reivindicação 11, páginas 39 - 42); Miura et al. (1996) Genomics 38(3):299 - 304; Miura et al. (1998) Blood 92:2815 - 2822; WO 2003/083047; WO 97/44452 (reivindicação 8, páginas 57 - 61); WO 2000/12130 (páginas 24 - 26)
[0367] FcRH1 (proteína similar ao receptor Fc 1, um receptor putativo para o domínio Fc de imunoglobulina que contém domínios do tipo Ig e ITAM tipo C2, pode ter um papel na diferenciação de linfócitos B); 429 aa, pI: 5,28, MW: 46925 TM: 1 [P] Cromossomo do Gene: 1q21 - 1q22, Genbank acesso No NP_443170,1); WO 2003/077836; WO 2001/38490 (reivindicação 6, Fig 18E-1 - 18-E-2); Davis et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772 - 9777; WO 2003/089624 (reivindicação 8); EP 1347046 (reivindicação 1); WO 2003/089624 (reivindicação 7)
[0368] IRTA2 (receptor da superfamília das imunoglobulinas associado a translocação 2, um imunorreceptor putativo com possíveis papéis no desenvolvimento e linfomagênese de células B; a desregulação do gene através de translocação ocorre em algumas malignidades de células B); 977 aa, pI: 6,88, MW: 106468, TM: 1 [P] Cromossomo do Gene: 1q21, Genbank acesso No Humano:AF343662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; Camundongo:AK089756, AY158090, AY506558; NP_112571,1; WO 2003/024392 (reivindicação 2, Fig 97); Nakayama et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1):124 - 127; WO 2003/077836; WO 2001/38490 (reivindicação 3, Fig 18B-1 - 18B-2)
[0369] TENB2 (TMEFF2, tomorregulina, TPEF, HPP1, TR, proteoglicano transmembrana putativo, relacionado à família EGF/heregulina de fatores de crescimento e folistatina); 374 aa, NCBI Acesso: AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeq: NP_057276; NCBI Gene: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; Genbank acesso No AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436; WO 2004/074320; JP 2004113151; WO 2003/042661; WO 2003/009814; EP 1295944 (páginas 69 - 70); WO 2002/30268 (páginas 329); WO 2001/90304; US 2004/249130; US 2004/022727; WO 2004/063355; US 2004/197325; US 2003/232350; US 2004/005563; US 2003/124579; Horie et al. (2000) Genomics 67:146 - 152; Uchida et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:593 - 602; Liang et al. (2000) Cancer Res. 60:4907 - 12; Glynne-Jones et al. (2001) Int J Cancer. Oct 15; 94(2):178 - 84.
[0370] CD33 (molécula CD33, SIGLEC-3, SIGLEC3, p67; antígeno de CD33 (gp67); gp67; antígeno de superfície de mielócitos CD33; lectina similar a Ig de ligação ao ácido siálico 3; lectina similar a Ig de ligação ao ácido siálico); Nucleotídeo : Genbank acesso no M_23197; Genbank versão no NM_23197,1 GI:180097; Genbank dados de atualização de registro: Jun 23, 2010 08:47 AM; Polipeptídeo: Genbank acesso no AAA51948; Genbank versão no AAA51948.1 GI:188098; Genbank dados de atualização de registro: Jun 23, 2010 08:47 AM; Simmons D., et al. J. Immunol. 141 (8), 2797 - 2800 (1988)L_Anticorpos: H195 (Lintuzumabe)- Raza A., et al. Leuk Lymphoma. 2009 Ago ;50(8):1336 - 44; US 6.759.045 (Seattle Genetics/Immunomedics); mAb OKT9: Sutherland, D.R. et al. Proc Natl Acad Sci USA 78(7): 4515 - 4519 1981, Schneider,C., et al. J Biol Chem 257, 8516 - 8522 (1982); mAb E6: Hoogenboom, H.R., et al. J Immunol 144, 3211 - 3217 (1990); US 6.590.088 (Human Genome Sciences), por exemplo, SEQ ID NOs: 1 e 2 e ATCC acesso no 97521; US 7.557.189 (Imunógeno)-por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada que compreende três CDRs que apresentam as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs:1 - 3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo três CDRs que apresentam as sequências de aminoácidos da SEQ ID NOs:4 - 6.
[0371] LGR5/GPR49; Nucleotídeo: Genbank acesso no NM_003667; Genbank versão no NM_003667,2 GI:24475886; Genbank dados de atualização de registro: Jul 22, 2012 03:38 PM; Polipeptídeo: Genbank acesso no NP_003658; Genbank versão no NP_003658,1 GI:4504379; Genbank dados de atualização de registro: Jul 22, 2012 03:38 PM.
[0372] O anticorpo precursor também pode ser uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de peptídeos de ligação à albumina (ABP) (Dennis et al. (2002) “Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins” J Biol Chem. 277:35035 - 35043; WO 01/45746). Os anticorpos da invenção incluem proteínas de fusão com sequências de ABP mostradas por: (i) Dennis et al. (2002) J Biol Chem. 277:35035 - 35043 nas Tabelas III e IV, páginas 35038; (ii) US 2004/0001827 em [0076]; e (iii) WO 01/45746 nas páginas 12 - 13, e os quais são incorporados neste relatório como referência.
[0373] Em uma forma de realização, o anticorpo foi recrutado para alvejar antígeno relacionado ao tumor específico αvβε.
[0374] O agente de ligação celular pode ser marcado, por exemplo, para auxiliar na detecção ou purificação do agente antes da incorporação como um conjugado ou como parte do conjugado. A marcação pode ser uma marcação de biotina. Em uma outra forma de realização, o agente de ligação celular pode ser marcado com um radioisótopo. SUBSTITUINTES A frase “opcionalmente substituído”, conforme usado neste relatório, pertence ao um grupo precursor que pode ser não substituído ou que pode ser substituído.
[0375] A menos que de outro modo especificado, o termo “substituído”, conforme usado neste relatório, pertence a um grupo precursor que é portador de um ou mais substituintes. O termo “substituinte” é usado neste relatório no sentido convencional e se refere a uma porção química que é covalentemente ligada a, ou, se apropriado, fundida a um grupo precursor. Uma ampla variedade de substituintes é bem conhecida e métodos para sua formação e introdução em uma variedade de grupos precursores também são bem conhecidos.
[0376] Em uma forma de realização preferida, os substituintes descritos neste relatório (que incluem substituintes opcionais) são limitados àqueles grupos que não são reativos a um agente de ligação celular. A ligação ao agente de ligação celular no presente caso é formada a partir da ponte entre as duas porções de PBD através de um grupo ligador ao agente de ligação celular. Grupos funcionais reativos localizados em outras partes da estrutura de PBD podem ser capazes de formar ligações adicionais ao agente de ligação celular (isto pode ser referido como reticulação). Estas ligações adicionais podem alterar o transporte e atividade biológica do conjugado. Portanto, em algumas formas de realização, os substituintes adicionais são limitados àqueles desprovidos de funcionalidade reativa.
[0377] Em uma forma de realização, os substituintes são selecionados a partir do grupo que consiste de R, OR, SR, NRR’, NO2, halo, CO2R, COR, CONH2, CONHR, e CONRR’.
[0378] Em uma forma de realização, os substituintes são selecionados a partir do grupo que consiste de R, OR, SR, NRR’, NO2, CO2R, COR, CONH2, CONHR e CONRR’.
[0379] Em uma forma de realização, os substituintes são selecionados a partir do grupo que consiste de R, OR, SR, NRR’, NO2 e halo.
[0380] Em uma forma de realização, os substituintes são selecionados a partir do grupo que consiste de R, OR, SR, NRR’ e NO2.
[0381] Qualquer uma das formas de realização mencionadas acima pode ser aplicada a qualquer um entre os substituintes descritos neste relatório. Alternativamente, os substituintes podem ser selecionados a partir de um ou mais entre os grupos listados abaixo.
[0382] Exemplos de substituintes são descritos em mais detalhes abaixo.
[0383] Alquila C1-12: O termo “alquila C1-12” conforme usado neste relatório, pertence a uma porção monovalente obtida através da remoção de um átomo de hidrogênio a partir de um átomo de carbono de um composto de hidrocarboneto que apresenta de 1 a 12 átomos de carbono, que pode ser alifático ou alicíclico, e que pode ser saturado ou insaturado (por exemplo, parcialmente insaturado, completamente insaturado). Assim, o termo “alquila” inclui as subclasses alquenila, alquinila, cicloalquila, etc., debatidas abaixo.
[0384] Exemplos de grupos alquila saturados incluem, mas não são limitados a metila (C1), etila (C2), propila (C3), butila (C4), pentila (C5), hexila (C6) e heptila (C7).
[0385] Exemplos de grupos alquila lineares saturados incluem, mas não são limitados a metila (C1), etila (C2), n-propila (C3), n-butila (C4), n-pentila (amila) (C5), n- hexila (C6) e n-heptila (C7).
[0386] Exemplos de grupos alquila ramificados saturados incluem iso-propila (C3), iso-butila (C4), sec-butila (C4), terc-butila (C4), iso-pentila (C5) e neo-pentila (C5).
[0387] Um grupo alquila pode ser opcionalmente interrompido por um ou mais heteroátomos selecionados a partir de O, N(H) e S. Tais grupos podem ser referidos como “heteroalquila”.
[0388] Heteroalquila C2-12: O termo “heteroalquila C2-12”, conforme usado neste relatório, pertence a uma porção monovalente obtida através da remoção de um átomo de hidrogênio a partir de um átomo de carbono de um composto de hidrocarboneto que apresenta de 2 a 12 átomos de carbono, e um ou mais heteroátomos selecionados a partir de O, N(H) e S, preferivelmente, O e S.
[0389] Exemplos de grupos heteroalquila incluem, mas não são limitados àqueles compreendendo uma ou mais unidades de etileno glicol do tipo - (OCH2CH2)-. O terminal de um grupo heteroalquila pode ser a forma primária de um heteroátomo, por exemplo, -OH, -SH ou -NH2. Em uma forma de realização preferida, o terminal é -CH3.
[0390] Alquenila C2-12: O termo “alquenila C2-12”, conforme usado neste relatório, pertence a um grupo alquila que apresenta uma ou mais ligações duplas carbono-carbono.
[0391] Exemplos de grupos alquenila insaturados incluem, mas não são limitados a etenila (vinila, -CH=CH2), 1-propenila (-CH=CH-CH3), 2-propenila (alila, -CH-CH=CH2), isopropenila (1-metilvinila, -C(CH3)=CH2), butenila (C4), pentenila (C5) e hexenila (C6).
[0392] Alquinila C2-12: O termo “alquinila C2-12”, conforme usado neste relatório, pertence a um grupo alquila tendo uma ou mais ligações triplas carbono- carbono.
[0393] Exemplos de grupos alquinila insaturados incluem, mas não são limitados a etinila (-C=CH) e 2-propinila (propargila, -CH2-C=CH).
[0394] Cicloalquila C3-12: O termo “cicloalquila C3-12” conforme usado neste relatório, pertence a um grupo alquila que também é um grupo ciclila; isto é, uma porção monovalente obtida através da remoção de um átomo de hidrogênio a partir de um átomo no anel alicíclico de um composto de hidrocarboneto cíclico (carbocíclico), em que porção a tem de 3 a 7 átomos de carbono, incluindo de 3 a 7 átomos no anel.
[0395] Exemplos de grupos cicloalquila incluem, mas não são limitados àqueles derivados de:
[0396] compostos de hidrocarboneto monocíclicos saturados:
[0397] ciclopropano (C3), ciclobutano (C4), ciclopentano (C5), cicloexano (C6), cicloeptano (C7), metilciclopropano (C4), dimetilciclopropano (C5), metilciclobutano (C5), dimetilciclobutano (C6), metilciclopentano (C6), dimetilciclopentano (C7) e metilciclohexano (C7);
[0398] compostos de hidrocarboneto monocíclicos insaturados:
[0399] ciclopropeno (C3), ciclobuteno (C4), ciclopenteno (C5), cicloexeno (C6), metilciclopropeno (C4), dimetilciclopropeno (C5), metilciclobuteno (C5), dimetilciclobuteno (C6), metilciclopenteno (C6), dimetilciclopenteno (C7) e metilciclohexeno (C7); e
[0400] compostos de hidrocarboneto policíclicos saturados:
[0401] norcarano (C7), norpinano (C7), norbornano (C7).
[0402] Heterociclila C3-20: O termo “heterociclila C3-20”, conforme usado neste relatório, pertence a um porção monovalente obtida através da remoção um átomo de hidrogênio a partir de um átomo no anel de um composto heterocíclico, em que a porção apresenta de 3 a 20 átomos no anel, dos quais de 1 a 10 são heteroátomos no anel. Preferivelmente, cada anel tem de 3 a 7 átomos no anel, dos quais de 1 a 4 são heteroátomos no anel.
[0403] Neste contexto, os prefixos (por exemplo, C3-20, C3-7, C5-6, etc.) denotam o número de átomos no anel, ou faixa de número de átomos no anel, se átomos de carbono ou heteroátomos. Por exemplo, o termo “heterociclila C5-6”, conforme usado neste relatório, pertence a um grupo heterociclila que apresenta 5 ou 6 átomos no anel.
[0404] Exemplos de grupos heterociclila monocíclicos incluem, mas não são limitados àqueles derivados de:
[0405] N1: aziridina (C3), azetidina (C4), pirrolidina (tetra-hidropirrol) (C5), pirrolina (por exemplo, 3-pirrolina, 2,5-di-hidropirrol) (C5), 2H-pirrol ou 3H-pirrol (isopirrol, isoazol) (C5), piperidina (C6), di-hidropiridina (C6), tetra-hidropiridina (C6), azepina (C7);
[0406] O1: oxirano (C3), oxetano (C4), oxolano (tetra-hidrofurano) (C5), oxol (di-hidrofurano) (C5), oxano (tetra-hidropirano) (C6), di-hidropirano (C6), pirano (C6), oxepina (C7);
[0407] S1: tiirano (C3), tietano (C4), tiolano (tetra-hidrotiofeno) (C5), tiano (tetra-hidrotiopirano) (C6), tiepano (C7);
[0408] O2: dioxolano (C5), dioxano (C6) e dioxepano (C7);
[0409] O3: trioxano (C6);
[0410] N2: imidazolidina (C5), pirazolidina (diazolidina) (C5), imidazolina (C5), pirazolina (di-hidropirazol) (C5), piperazina (C6);
[0411] N1O1: tetra-hidro-oxazol (C5), di-hidro-oxazol (C5), tetra-hidroisoxazol (C5), di-hidroisoxazol (C5), morfolina (C6), tetra-hidro-oxazina (C6), di-hidro-oxazina (C6), oxazina (C6);
[0412] N1S1: tiazolina (C5), tiazolidina (C5), tiomorfolina (C6);
[0413] N2O1: oxadiazina (C6);
[0414] O1S1: oxatiol (C5) e oxatiano (tioxano) (C6); e,
[0415] N1O1S1: oxatiazina (C6).
[0416] Exemplos de grupos heterociclila monocíclicos substituídos incluem aqueles derivados de sacarídeos, na forma cíclica, por exemplo, furanoses (C5), tais como arabinofuranose, lixofuranose, ribofuranose e xilofuranse e piranoses (C6), tais como alopiranose, altropiranose, glicopiranose, manopiranose, gulopiranose, idopiranose, galactopiranose e talopiranose.
[0417] Arila C5-20: O termo “arila C5-20”, conforme usado neste relatório, pertence a uma porção monovalente obtida através da remoção de um átomo de hidrogênio a partir de um átomo no anel aromático de um composto aromático, em que a porção apresenta de 3 a 20 átomos no anel. Preferivelmente, cada anel apresenta de 5 a 7 átomos no anel.
[0418] Neste contexto, os prefixos (por exemplo, C3-20, C5-7, C5-6, etc.) denotam o número de átomos no anel, ou faixa de número de átomos no anel, se átomos de carbono ou heteroátomos. Por exemplo, o termo “arila C5-6”, conforme usado neste relatório, pertence a um grupo arila que apresenta 5 ou 6 átomos no anel.
[0419] Os átomos no anel podem ser todos os átomos de carbono, como nos “grupos carboarila”.
[0420] Exemplos de grupos carboarila incluem, mas não são limitados àqueles derivados de benzeno (isto é, fenila) (C6), naftaleno (C10), azuleno (C10), antraceno (C14), fenantreno (C14), naftaceno (C18) e pireno (C16).
[0421] Exemplos de grupos arila que compreendem anéis fundidos, pelo menos um dos quais é um anel aromático, incluem, mas não são limitados a grupos derivados de indano (por exemplo, 2,3-di-hidro-1H-indeno) (C9), indeno (C9), isoindeno (C9), tetralina (1,2,3,4-tetra-hidronaftaleno (C10), acenafteno (C12), fluoreno (C13), fenaleno (C13), acefenantreno (C15) e aceantreno (C16).
[0422] Alternativamente, os átomos no anel podem incluir um ou mais heteroátomos, como nos “grupos heteroarila”. Exemplos de grupos heteroarila monocíclicos incluem, mas não são limitados àqueles derivados de: N1: pirrol (azol) (C5), piridina (azina) (C6); O1: furano (oxol) (C5); S1: tiofeno (tiol) (C5); N1O1: oxazol (C5), isoxazol (C5), isoxazina (C6); N2O1: oxadiazol (furazano) (C5); N3O1: oxatriazol (C5); N1S1: tiazol (C5), isotiazol (C5); N2: imidazol (1,3-diazol) (C5), pirazol (1,2-diazol) (C5), piridazina (1,2-diazina) (C6), pirimidina (1,3-diazina) (C6) (por exemplo, citosina, timina, uracil), pirazina (1,4-diazina) (C6); N3: triazol (C5), triazina (C6); e, N4: tetrazol (C5).
[0423] Exemplos de heteroarila que compreendem anéis fundidos, incluem, mas não são limitados a:
[0424] C9 (com 2 anéis fundidos) derivado de benzofurano (O1), isobenzofurano (O1), indol (N1), isoindol (N1), indolizina (N1), indolina (N1), isoindolina (N1), purina (N4) (por exemplo, adenina, guanina), benzimidazol (N2), indazol (N2), benzoxazol (N1O1), benzisoxazol (N1O1), benzodioxol (O2), benzofurazano (N2O1), benzotriazol (N3), benzotiofurano (S1), benzotiazol (N1S1), benzotiadiazol (N2S);
[0425] C10 (com 2 anéis fundidos) derivado de cromeno (O1), isocromeno (O1), cromano (O1), isocromano (O1), benzodioxano (O2), quinolina (N1), isoquinolina (N1), quinolizina (N1), benzoxazina (N1O1), benzodiazina (N2), piridopiridina (N2), quinoxalina (N2), quinazolina (N2), cinolina (N2), ftalazina (N2), naftiridina (N2), pteridina (N4);
[0426] C11 (com 2 anéis fundidos) derivado de benzodiazepina (N2);
[0427] C13 (com 3 anéis fundidos) derivado de carbazol (N1), dibenzofurano (O1), dibenzotiofeno (S1), carbolina (N2), perimidina (N2), piridoindol (N2); e,
[0428] C14 (com 3 anéis fundidos) derivado de acridina (N1), xanteno (O1), tioxanteno (S1), oxantreno (O2), fenoxatiina (O1S1), fenazina (N2), fenoxazina (N1O1), fenotiazina (N1S1), tiantreno (S2), fenantridina (N1), fenantrolina (N2), fenazina (N2).
[0429] Os grupos acima, se sozinhos ou parte de um outro substituinte, podem, por si só, ser opcionalmente substituídos com um ou mais grupos selecionados a partir dos substituintes adicionais listados abaixo. Halo: -F, -Cl, -Br e -I. Hidróxi: -OH.
[0430] Éter: -OR, em que R é um substituinte de éter, por exemplo, um grupo alquila C1-7 (também referido como um grupo alcóxi C1-7, debatido abaixo), um grupo heterociclila C3-20 (também referido como um grupo heterociclilóxi C3-20) ou um grupo arila C5-20 (também referido como um grupo arilóxi C5-20), preferivelmente, um grupo alquila C1-7.
[0431] Alcóxi: -OR, em que R é um grupo alquila, por exemplo, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos alcóxi C1-7 incluem, mas não são limitados a -OMe (metóxi), -OEt (etóxi), -O(nPr) (n-propóxi), -O(iPr) (isopropóxi), -O(nBu) (n-butóxi), -O(sBu) (sec-butóxi), -O(iBu) (isobutóxi) e -O(tBu) (terc-butóxi).
[0432] Acetal: -CH(OR1)(OR2), em que R1 e R2 são, independentemente, substituintes de acetal, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C320 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7, ou, no caso de um grupo acetal “cíclico”, R1 e R2, juntamente com os dois átomos de oxigênio aos quais eles são ligados, e os átomos de carbono aos quais eles são ligados, formam um anel heterocíclico que apresenta de 4 a 8 átomos no anel. Exemplos de grupos acetal incluem, mas não são limitados a -CH(OMe)2, -CH(OEt)2 e -CH(OMe)(OEt).
[0433] Hemiacetal: -CH(OH)(OR1), em que R1 é um substituinte de hemiacetal, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20, ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos hemiacetal incluem, mas não são limitados a -CH(OH)(OMe) e -CH(OH)(OEt).
[0434] Cetal: -CR(OR1)(OR2), onde R1 e R2 são definidos para acetais, e R é um substituinte de cetal, exceto hidrogênio, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos cetal incluem, mas não são limitados a -C(Me)(OMe)2, -C(Me)(OEt)2, -C(Me)(OMe)(OEt), -C(Et)(OMe)2, -C(Et)(OEt)2 e -C(Et)(OMe)(OEt).
[0435] Hemicetal: -CR(OH)(OR1), onde R1 é definido para hemiacetais, e R é um substituinte de hemicetal, exceto hidrogênio, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos hemiacetal incluem, mas não são limitados a -C(Me)(OH)(OMe), -C(Et)(OH)(OMe), -C(Me)(OH)(OEt) e -C(Et)(OH)(OEt). Oxo (ceto, -ona): =O. Tiona (tiocetona): =S.
[0436] Imino (imina): =NR, em que R é um substituinte de imino, por exemplo, hidrogênio, grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, hidrogênio, ou um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos éster incluem, mas não são limitados a =NH, =NMe, =NEt e =NPh.
[0437] Formila (carbaldeído, carboxaldeído): -C(=O)H.
[0438] Acila (ceto): -C(=O)R, em que R é um substituinte de acila, por exemplo, um grupo alquila C1-7 (também referido como alquilacila C1-7 ou alcanoila C1-7), um grupo heterociclila C3-20 (também referido como heterociclilacila C3-20) ou um grupo arila C5-20 (também referido como arilacila C5-20), preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos acila incluem, mas não são limitados a -C(=O)CH3 (acetila), -C(=O)CH2CH3 (propionila), -C(=O)C(CH3)3 (t-butirila) e -C(=O)Ph (benzoila, fenona).
[0439] Carbóxi (ácido carboxílico): -C(=O)OH.
[0440] Tiocarbóxi (ácido tiocarboxílico): -C(=S)SH.
[0441] Tiolocarbóxi (ácido tiolocarboxílico): -C(=O)SH.
[0442] Tionocarbóxi (ácido tionocarboxílico): -C(=S)OH.
[0443] Ácido imídico: -C(=NH)OH.
[0444] Ácido hidroxâmico: -C(=NOH)OH.
[0445] Éster (carboxilato, éster do ácido carboxílico, oxicarbonila): -C(=O)OR, em que R é um substituinte de éster, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos éster incluem, mas não são limitados a -C(=O)OCH3, -C(=O)OCH2CH3, -C(=O)OC(CH3)3 e -C(=O)OPh.
[0446] Acilóxi (éster reverso): -OC(=O)R, em que R é um substituinte de acilóxi, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos acilóxi incluem, mas não são limitados a -OC(=O)CH3 (acetóxi), -OC(=O)CH2CH3, -OC(=O)C(CH3)3, -OC(=O)Ph e -OC(=O)CH2Ph.
[0447] Oxicarboilóxi: -OC(=O)OR, em que R é um substituinte de éster, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos éster incluem, mas não são limitados a -OC(=O)OCH3, -OC(=O)OCH2CH3, -OC(=O)OC(CH3)3 e - OC(=O)OPh.
[0448] Amino: -NR1R2, em que R1 e R2 são, independentemente, substituintes de amino, por exemplo, hidrogênio, um grupo alquila C1-7 (também referido como alquilamino C1-7 ou di-alquilamino C1-7), um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, H, ou um grupo alquila C1-7, ou, no caso de um grupo amino “cíclico”, R1 e R2, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados, formam um anel heterocíclico que apresenta de 4 a 8 átomos no anel. Grupos amino podem ser primários (-NH2), secundários (-NHR1) ou terciários (- NHR1R2), e, na forma catiônica, podem ser quaternários (-+NR1R2R3). Exemplos de grupos amino incluem, mas não são limitados a -NH2, -NHCH3, -NHC(CH3)2, -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2 e -NHPh. Exemplos de grupos amino cíclicos incluem, mas não são limitados a aziridino, azetidino, pirrolidino, piperidino, piperazino, morfolino e tiomorfolino.
[0449] Amido (carbamoila, carbamila, aminocarbonila, carboxamida): -C(=O)NR1R2, em que R1 e R2 são, independentemente, substituintes de amino, conforme definido para grupos amino. Exemplos de grupos amido incluem, mas não são limitados a -C(=O)NH2, -C(=O)NHCH3, -C(=O)N(CH3)2, -C(=O)NHCH2CH3 e -C(=O)N(CH2CH3)2, assim como grupos amido em que R1 e R2, juntamente com o átomo de nitrogênio ao qual eles são ligados, formam uma estrutura heterocíclica como, por exemplo, em piperidinocarbonila, morfolinocarbonila, tiomorfolinocarbonila e piperazinocarbonila.
[0450] Tioamido (tiocarbamila): -C(=S)NR1R2, em que R1 e R2 são, independentemente, substituintes de amino, conforme definido para grupos amino. Exemplos de grupos amido incluem, mas não são limitados a -C(=S)NH2, -C(=S)NHCH3, -C(=S)N(CH3)2 e -C(=S)NHCH2CH3.
[0451] Acilamido (acilamino): -NR1C(=O)R2, em que R1 é um substituinte de amida, por exemplo, hidrogênio, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, hidrogênio ou um grupo alquila C1-7, e R2 é um substituinte de acila, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, hidrogênio ou um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos acilamida incluem, mas não são limitados a -NHC(=O)CH3, -NHC(=O)CH2CH3 e -NHC(=O)Ph. R1 e R2 podem formam uma estrutura cíclica, como, por exemplo, em succinimidila, maleimidila e ftalimidila:
Figure img0049
[(succinimidila nimidy maleimidila eimidyl ftalimidila alimidyl
[0453] Aminocarbonilóxi: -oC(=o)NR1R2, em que R1 e R2 são, independentemente, substituintes de amino, conforme definido para grupos amino. Exemplos de grupos aminocarbonilóxi incluem, mas não são limitados a - oC(=o)NH2, -oC(=o)NHMe, -oC(=o)NMe2 e -oC(=o)NEt2.
[0454] Ureido: -N(R1)CoNR2R3, em que R2 e R3 são, independentemente, substituintes de amino, conforme definido para grupos amino, e R1 é um substituinte de ureido, por exemplo, hidrogênio, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3- 20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, hidrogênio, ou um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos ureido incluem, mas não são limitados a -NHCONH2, - NHCONHMe, -NHCONHEt, -NHCONMe2, -NHCONEt2, -NMeCONH2, - NMeCONHMe, -NMeCONHEt, -NMeCONMe2 e -NMeCONEt2.
[0455] Guanidino: -NH-C(=NH)NH2.
[0456] Tetrazolila: um anel aromático de cinco membros que apresenta quatro átomos de nitrogênio e um átomo de carbono,
Figure img0050
[0457] Imino: =NR, em que R é um substituinte de imino, por exemplo, hidrogênio, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C520, preferivelmente, H ou um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos imino incluem, mas não são limitados a =NH, =NMe e =NEt.
[0458] Amidina (amidino): -C(=NR)NR2, em que cada R é um substituinte de amidina, por exemplo, hidrogênio, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, H, ou um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos amidina incluem, mas não são limitados a -C(=NH)NH2, -C(=NH)NMe2 e -C(=NMe)NMe2. Nitro: -NO2. Nitroso: -NO. Azido: -N3. Ciano (nitrila, carbonitrila): -CN. Isociano: -NC. Cianato: -OCN. Isocianato: -NCO. Tiociano (tiocianato): -SCN. Isotiociano (isotiocianato): -NCS. Sulfidrila (tiol, mercapto): -SH.
[0459] Tioéter (sulfeto): -SR, em que R é um substituinte de tioéter, por exemplo, um grupo alquila C1-7 (também referido como um grupo alquilatio C1-7), um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de alquila grupos tio C1-7 incluem, mas não são limitados a -SCH3 e -SCH2CH3.
[0460] Dissulfeto: -SS-R, em que R é um substituinte de dissulfeto, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7 (também referido neste relatório como dissulfeto de alquila C1-7). Exemplos de grupos de dissulfeto de alquila C1-7 incluem, mas não são limitados a -SSCH3 e -SSCH2CH3.
[0461] Sulfina (sulfinila, sulfóxido): -S(=O)R, em que R é um substituinte de sulfina, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos sulfina incluem, mas não são limitados a -S(=O)CH3 e -S(=O)CH2CH3.
[0462] Sulfona (sulfonila): -S(=O)2R, em que R é um substituinte de sulfona, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C520, preferivelmente, um grupo alquila C1-7, incluindo, por exemplo, um grupo alquila C1-7 fluorado ou perfluorado. Exemplos de grupos sulfona incluem, mas não são limitados a -S(=O)2CH3 (metanossulfonila, mesila), -S(=O)2CF3 (triflila), -S(=O)2CH2CH3 (esila), -S(=O)2C4F9 (nonaflila), -S(=O)2CH2CF3 (tresila), -S(=O)2CH2CH2NH2 (taurila), -S(=O)2Ph (fenilsulfonila, besila), 4-metilfenilsulfonila (tosila), 4-clorofenilsulfonila (closila), 4-bromofenilsulfonila (brosila), 4-nitrofenila (nosila), 2-naftalenossulfonato (napsila) e 5-dimetilamino-naftalen-1-ilsulfonato (dansila).
[0463] Ácido sulfínico (sulfino): -S(=O)OH, -SO2H.
[0464] Ácido sulfônico (sulfo): -S(=O)2OH, -SO3H.
[0465] Sulfinato (éster do ácido sulfínico): -S(=O)OR; em que R é um substituinte de sulfinato, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos sulfinato incluem, mas não são limitados a -S(=O)OCH3 (metoxissulfinila; sulfinato de metila) e -S(=O)OCH2CH3 (etoxissulfinila; sulfinato de etila).
[0466] Sulfonato (éster do ácido sulfônico): -S(=O)2OR, em que R é um substituinte de sulfonato, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos sulfonato incluem, mas não são limitados a -S(=O)2OCH3 (metoxissulfonila; sulfonato de metila) e -S(=O)2OCH2CH3 (etoxissulfonila; sulfonato de etila).
[0467] Sulfinilóxi: -OS(=O)R, em que R é um substituinte de sulfinilóxi, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos sulfinilóxi incluem, mas não são limitados a -OS(=O)CH3 e -OS(=O)CH2CH3.
[0468] Sulfonilóxi: -OS(=O)2R, em que R é um substituinte de sulfonilóxi, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos sulfonilóxi incluem, mas não são limitados a -OS(=O)2CH3 (mesilato) e -OS(=O)2CH2CH3 (esilato).
[0469] Sulfato: -OS(=O)2OR; em que R é um substituinte de sulfato, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos sulfato incluem, mas não são limitados a -OS(=O)2OCH3 e -SO(=O)2OCH2CH3.
[0470] Sulfamila (sulfamoila; amida do ácido sulfínico; sulfinamida): -S(=O)NR1R2, em que R1 e R2 são, independentemente, substituintes de amino, conforme definido para grupos amino. Exemplos de grupos sulfamila incluem, mas não são limitados a -S(=O)NH2, -S(=O)NH(CH3), -S(=O)N(CH3)2, -S(=O)NH(CH2CH3), -S(=O)N(CH2CH3)2 e -S(=O)NHPh.
[0471] Sulfonamido (sulfinamoila; amida do ácido sulfônico; sulfonamida): -S(=O)2NR1R2, em que R1 e R2 são, independentemente, substituintes de amino, conforme definido para grupos amino. Exemplos de grupos sulfonamido incluem, mas não são limitados a -S(=O)2NH2, -S(=O)2NH(CH3), -S(=O)2N(CH3)2, -S(=O)2NH(CH2CH3), -S(=O)2N(CH2CH3)2 e -S(=O)2NHPh.
[0472] Sulfamino: -NR1S(=O)2OH, em que R1 é um substituinte de amino, conforme definido para grupos amino. Exemplos de grupos sulfamino incluem, mas não são limitados a -NHS(=O)2OH e -N(CH3)S(=O)2OH.
[0473] Sulfonamino: -NR1S(=O)2R, em que R1 é um substituinte de amino, conforme definido para grupos amino, e R é um substituinte de sulfonamino, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos sulfonamino incluem, mas não são limitados a -NHS(=O)2CH3 e -N(CH3)S(=O)2C6H5.
[0474] Sulfinamino: -NR1S(=O)R, em que R1 é um substituinte de amino, conforme definido para grupos amino, e R é um substituinte de sulfinamino, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7. Exemplos de grupos sulfinamino incluem, mas não são limitados a -NHS(=O)CH3 e -N(CH3)S(=O)C6H5.
[0475] Fosfino (fosfina): -PR2, em que R é um substituinte de fosfino, por exemplo, -H, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C520, preferivelmente, -H, um grupo alquila C1-7 ou um grupo arila C5-20. Exemplos de grupos fosfino incluem, mas não são limitados a -PH2, -P(CH3)2, -P(CH2CH3)2, -P(t- Bu)2 e -P(Ph)2.
[0476] Fosfo: -P(=O)2.
[0477] Fosfinila (óxido de fosfina): -P(=O)R2, em que R é um substituinte de fosfinila, por exemplo, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, um grupo alquila C1-7 ou um grupo arila C5-20. Exemplos de grupos fosfinila incluem, mas não são limitados a -P(=O)(CH3)2, -P(=O)(CH2CH3)2, -P(=O)(t-Bu)2 e -P(=O)(Ph)2.
[0478] Ácido fosfônico (fosfono): -P(=O)(OH)2.
[0479] Fosfonato (éster de fosfono): -P(=O)(OR)2, onde R é um substituinte de fosfonato, por exemplo, -H, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, -H, um grupo alquila C1-7, ou um grupo arila C520. Exemplos de grupos fosfonato incluem, mas não são limitados a -P(=O)(OCH3)2, -P(=O)(OCH2CH3)2, -P(=O)(O-t-Bu)2 e -P(=O)(OPh)2.
[0480] Ácido fosfórico (fosfono-óxi): -OP(=O)(OH)2.
[0481] Fosfato (éster de fosfono-óxi): -OP(=O)(OR)2, onde R é um substituinte de fosfato, por exemplo, -H, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, -H, um grupo alquila C1-7 ou um grupo arila C5-20. Exemplos de grupos fosfato incluem, mas não são limitados a -OP(=O)(OCH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)2, -OP(=O)(O-t-Bu)2 e -OP(=O)(OPh)2.
[0482] Ácido fosforoso: -OP(OH)2.
[0483] Fosfito: -OP(OR)2, onde R é um substituinte de fosfito, por exemplo, - H, um grupo alquila C1-7, um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, -H, um grupo alquila C1-7 ou um grupo arila C5-20. Exemplos de grupos fosfito incluem, mas não são limitados a -OP(OCH3)2, -OP(OCH2CH3)2, -OP(O-t-Bu)2 e -OP(OPh)2.
[0484] Fosforamidita: -OP(OR1)-NR22, onde R1 e R2 são substituintes de fosforamidita, por exemplo, -H, um grupo alquila C1-7 (opcionalmente substituído), um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, -H, um grupo alquila C1-7 ou um grupo arila C5-20. Exemplos de grupos fosforamidita incluem, mas não são limitados a -OP(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2 e -OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2.
[0485] Fosforamidato: -OP(=O)(OR1)-NR22, onde R1 e R2 são substituintes de fosforamidato, por exemplo, -H, um grupo alquila C1-7 (opcionalmente substituído), um grupo heterociclila C3-20 ou um grupo arila C5-20, preferivelmente, -H, um grupo alquila C1-7 ou um grupo arila C5-20. Exemplos de grupos fosforamidato incluem, mas não são limitados a -OP(=O)(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)- N(i-Pr)2 e -OP(=O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2. Alquileno
[0486] Alquileno C3-12: O termo “alquileno C3-12”, conforme usado neste relatório, pertence a uma porção de bidentato obtida através da remoção de dois átomos de hidrogênio, a partir do mesmo átomo de carbono, ou um a partir de cada um dos dois átomos de carbono diferentes, de um composto de hidrocarboneto que apresenta de 3 a 12 átomos de carbono (a menos que de outro modo especificado), que pode ser alifático ou alicíclico, e que pode ser saturado, parcialmente insaturado ou completamente insaturado. Assim, o termo “alquileno” inclui as subclasses alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, etc., debatidos abaixo.
[0487] Exemplos de grupos alquileno saturados lineares C3-12 incluem, mas não são limitados a -(CH2)n-, onde n é um número inteiro de 3 a 12, por exemplo, -CH2CH2CH2-(propileno), -CH2CH2CH2CH2-(butileno), -CH2CH2CH2CH2CH2- (pentileno) e -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-(heptileno).
[0488] Exemplos de grupos alquileno saturados ramificados C3-12 incluem, mas não são limitados a -CH(CH3)CH2-, -CH(CH3)CH2CH2-, -CH(CH3)CH2CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2-, -CH2CH(CH3)CH2CH2-, -CH(CH2CH3)-, -CH(CH2CH3)CH2- e -CH2CH(CH2CH3)CH2-.
[0489] Exemplos de grupos alquileno lineares parcialmente insaturados C3-12 (alquenileno C3-12 e grupos alquinileno) incluem, mas não são limitados a -CH=CH-CH2-, -CH2-CH=CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-CH2-, -CH=CH-CH=CH-, -CH=CH-CH=CH-CH2-, -CH=CH-CH=CH-CH2-CH2-, -CH=CH- CH2-CH=CH-, -CH=CH-CH2-CH2-CH=CH- e -CH2-CEC-CH2-.
[0490] Exemplos de grupos alquileno ramificados parcialmente insaturados C3-12 (alquenileno C3-12 e grupos alquinileno) incluem, mas não são limitados a -C(CH3)=CH-, -C(CH3)=CH-CH2-, -CH=CH-CH(CH3)- e -CEC-CH(CH3)-.
[0491] Exemplos de grupos alquileno alicíclicos saturados C3-12 (cicloalquilenos C3-12) incluem, mas não são limitados a ciclopentileno (por exemplo, ciclopent-1,3-ileno), e ciclohexileno (por exemplo, ciclohex-1,4-ileno).
[0492] Exemplos de grupos alquileno alicíclicos parcialmente insaturados C312 (cicloalquilenos C3-12) incluem, mas não são limitados a ciclopentenileno (por exemplo, 4-ciclopenten-1,3-ileno), ciclohexenileno (por exemplo, 2-ciclohexen-1,4- ileno; 3-ciclohexen-1,2-ileno; 2,5-ciclohexadien-1,4-ileno). INCLUI OUTRAS FORMAS
[0493] A menos que de outro modo especificado, incluídos naqueles citados acima são as formas iônicas, de sal, solvato e protegidas bem conhecidas destes substituintes. Por exemplo, uma referência ao ácido carboxílico (-COOH) também inclui a forma aniônica (carboxilato) (-COO-), um sal ou solvato do mesmo, assim como formas protegidas convencionais. Similarmente, uma referência a um grupo amino inclui a forma protonada (-N+HR1R2), um sal ou solvato do grupo amino, por exemplo, um sal de cloridreto, assim como formas protegidas convencionais de um grupo amino. Similarmente, uma referência a um grupo hidroxila também inclui a forma aniônica (-O-), um sal ou solvato do mesmo, assim como formas protegidas convencionais.
SAIS
[0494] Pode ser conveniente ou desejável preparar, purificar e/ou manejar um sal correspondente do composto ativo, por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitável. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis são debatidos em Berge, et al., J. Pharm. Sci., 66, 1 - 19 (1977).
[0495] Por exemplo, se o composto é aniônico ou tem um grupo funcional que pode ser aniônico (por exemplo, -COOH pode ser -COO-), então um sal pode ser formado com um cátion adequado. Exemplos de cátions inorgânicos adequados incluem, mas não são limitados a íons de metal alcalino, tais como Na+ e K+, cátions alcalinos terrosos, tais como Ca2+ e Mg2+, e outros cátions, tais como Al+3. Exemplos de cátions orgânicos adequados incluem, mas não são limitados ao íon amônio (isto é, NH4+) e íons amônio substituídos (por exemplo, NH3R+, NH2R2+, NHR3+, NR4+). Exemplos de alguns íons amônio substituídos adequados são aqueles derivados de: etilamina, dietilamina, diciclohexilamina, trietilamina, butilamina, etilenodiamino, etanolamina, dietanolamina, piperazina, benzilamina, fenilbenzilamina, colina, meglumina e trometamina, assim como aminoácidos, tais como lisina e arginina. Um exemplo de um íon amônio quaternário comum é N(CH3)4+.
[0496] Se o composto é catiônico ou tem um grupo funcional que pode ser catiônico (por exemplo, -NH2 pode ser -NH3+), então um sal pode ser formado com um ânion adequado. Exemplos de ânions inorgânicos adequados incluem, mas não são limitadas àqueles derivados dos seguintes ácidos inorgânicos: clorídrico, bromídrico, iodídrico, sulfúrico, sulfuroso, nítrico, nitroso, fosfórico e fosforoso.
[0497] Exemplos de ânions orgânicos adequados incluem, mas não são limitados àqueles derivados dos seguintes ácidos orgânicos: ácido 2-acetioxibenzoico, acético, ascórbico, aspártico, benzoico, canforsulfônico, cinâmico, cítrico, edético, etanodissulfônico, etanossulfônico, fumárico, gluceptônico, glicônico, glutâmico, glicólico, hidroximaleico, hidroxinaftaleno carboxílico, isetiônico, láctico, lactobiônico, láurico, maleico, málico, metanossulfônico, múcico, oleico, oxálico, palmítico, pamoico, pantotênico, fenilacético, fenilsulfônico, propiônico, pirúvico, salicílico, esteárico, succínico, sulfanílico, tartárico, toluenossulfônico, trifluoroacético e valérico. Exemplos de ânions orgânicos poliméricos adequados incluem, mas não são limitados àqueles derivados dos seguintes ácidos poliméricos: ácido tânico, carboximetilcelulose.
SOLVATOS
[0498] Pode ser conveniente ou desejável preparar, purificar e/ou manejar um solvato correspondente do composto ativo. O termo “solvato” é usado neste relatório no sentido convencional para se referir a um complexo de soluto (por exemplo, composto ativo, sal do composto ativo) e solvente. Se o solvente é água, o solvato pode ser convenientemente referido como um hidrato, por exemplo, um mono-hidrato, um di-hidrato, um tri-hidrato, etc.
[0499] A invenção inclui compostos onde um solvente adiciona através da ligação imina da porção de PBD, que é ilustrada abaixo, onde o solvente é água ou um álcool (RAOH, onde RA é alquila C1-4):
Figure img0051
[0500] Estas formas podem ser chamadas as formas de carbinolamina e éter de carbinolamina da PBD (conforme descrito na seção que se relaciona a R10 acima). O balanceamento destes equilíbrios depende das condições em que os compostos são encontrados, assim como da natureza da porção por si só.
[0501] Estes compostos particulares podem ser isolados na forma sólida, por exemplo, através de liofilização.
ISÔMEROS
[0502] Certos compostos da invenção podem existir em uma ou mais formas geométricas, ópticas, enantioméricas, diasterioméricas, epiméricas, atrópicas, estereoisoméricas, tautoméricas, conformacionais ou anoméricas particulares, incluindo, mas não limitadas às formas cis e trans; formas E e Z; formas c, t e r; formas endo e exo; formas R, S e meso; formas D e L; formas d e l; formas (+) e (-); formas ceto, enol e enolato; formas syn e anti; formas sinclinais e anticlinais; formas α e β; formas axiais e equatoriais; formas de barco, cadeira, trança, envelope e semicadeira; e combinações das mesmas, em seguida, coletivamente referidas como “isômeros” (ou “formas isoméricas”).
[0503] O termo “quiral” se refere às moléculas que apresentam a propriedade de não superponibilidade do par de imagem no espelho, enquanto o termo “aquiral” se refere às moléculas que são superponíveis em seu par de imagem no espelho.
[0504] O termo “estereoisômeros” se refere a compostos que têm constituição química idêntica, mas diferem com respeito ao arranjo dos átomos ou grupos no espaço.
[0505] “Diastereômero” se refere a um estereoisômero com dois ou mais centros de quiralidade e cujas moléculas não são imagens no espelho entre si. Os diastereômeros têm propriedades físicas diferentes, por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, propriedades espectrais e reatividades. As misturas de diastereômeros podem ser separadas sob procedimentos analíticos de alta resolução, tais como eletroforese e cromatografia.
[0506] “Enantiômeros” se referem a dois estereoisômeros de um composto que são imagens no espelho não superponíveis.
[0507] Definições e convenções estereoquímicas usadas neste relatório, em geral, seguem S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nova Iorque; e Eliel, E. e Wilen, S., “Stereochemistry of Organico Compounds”, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, 1994. Os compostos da invenção podem conter centros assimétricos ou quirais e, portanto, existem nas formas estereoisoméricas diferentes. Pretende-se que todas as formas estereoisoméricas dos compostos da invenção, incluindo, mas não limitadas aos diastereômeros, enantiômeros e atropisômeros, assim como misturas dos mesmos, tais como misturas racêmicas, formem parte da presente invenção. Muitos compostos orgânicos existem nas formas opticamente ativas, isto é, elas apresentam a capacidade de girar no plano da luz polarizada no plano. Na descrição de um composto opticamente ativo, os prefixos D e L, ou R e S, são usados para denotar a configuração absoluta da molécula sobre seus centros quirais. Os prefixos d e l ou (+) e (-) são utilizados para designar o sinal de rotação da luz polarizada no plano pelo composto, com (-) ou l significando que o composto é levorrotatório. Um composto prefixado com (+) ou d é dextrorrotatório. Para uma dada estrutura química, estes estereoisômeros são idênticos, exceto que eles são imagens no espelho entre si. Um estereoisômero específico também pode ser referido como um enantiômero e uma mistura de tais isômeros é frequentemente chamada de uma mistura enantiomérica. Uma mistura 50:50 de enantiômeros é referida como uma mistura racêmica ou um racemato, que pode ocorrer onde não ocorreu estereosseleção ou estereoespecificidade em uma reação ou processo químico. Os termos “mistura racêmica” e “racemato” se referem a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, desprovidas de atividade óptica.
[0508] Observe que, exceto conforme debatido abaixo para formas tautoméricas, especificamente excluídas do termo “isômeros”, conforme usado neste relatório, são isômeros estruturais (ou constitucionais) (isto é, isômeros que diferem nas conexões entre átomos ao invés de meramente pela posição de átomos no espaço). Por exemplo, uma referência a um grupo metóxi, -OCH3, não deve ser interpretada como uma referência a seu isômero estrutural, um grupo hidroximetila, -CH2OH. Similarmente, uma referência ao orto-clorofenila não deve ser interpretada como uma referência a seu isômero estrutural, meta-clorofenila. Entretanto, uma referência a uma classe de estruturas pode incluir formas estruturalmente isoméricas em tal classe (por exemplo, alquila C1-7 inclui n-propila e iso-propila; butila inclui n-, iso-, sec-, e terc-butila; metoxifenila inclui orto-, meta- e para-metoxifenila).
[0509] A exclusão acima não pertence às formas tautoméricas, por exemplo, formas ceto, enol e enolato, como, por exemplo, nos seguintes pares tautoméricos: ceto/enol (ilustrados abaixo), imina/enamina, amida/imino álcool, amidina/amidina, nitroso/oxima, tiocetona/enetiol, N-nitroso/hiroxiazo e nitro/aci-nitro.
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ceto enol enolato
[0510] O termo “tautômero” ou “forma tautomérica” se refere a isômeros estruturais de energias diferentes que são interconversíveis por intermédio de uma barreira de baixa energia. Por exemplo, tautômeros protônicos (também conhecidos como tautômeros prototrópicos) incluem interconversões por intermédio de migração de um próton, tal como isomerizações de ceto-enol e imina-enamina. Tautômeros de valência incluem interconversões através da reorganização de alguns dos elétrons de ligação.
[0511] Observe que especificamente incluídos no termo “isômero” estão os compostos com uma ou mais substituições isotópicas. Por exemplo, H pode estar em qualquer forma isotópica, incluindo 1H, 2H (D) e 3H (T); C pode estar em qualquer forma isotópica, incluindo 12C, 13C, e 14C; O pode estar em qualquer forma isotópica, incluindo 16O e 18O; e semelhantes.
[0512] Exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos compostos da invenção incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fosforosos, flúor e cloro, tais como, mas não limitados a 2H (deutério, D), 3H (trítio), 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 36Cl e 125I. Vários compostos isotopicamente marcados da presente invenção, por exemplo, aqueles em que isótopos radioativos, tais como 3H, 13C e 14C são incorporados. Tais compostos isotopicamente marcados podem ser úteis em estudos metabólicos, estudos cinéticos de reação, detecção ou técnicas de imageamento, tais como tomografia de emissão positrônica (PET) ou tomografia computadorizada com emissão de fóton único (SPECT), incluindo ensaios de distribuição de fármaco ou tecido de substrato, ou em tratamento radioativo de pacientes. Os compostos terapêuticos marcados ou substituídos com deutério da invenção pode ter propriedades de DMPK aperfeiçoadas (metabolismo e farmacocinética do fármaco), com relação à distribuição, metabolismo e excreção (ADME). A substituição com isótopos mais pesados, tais como deutério, pode fornecer certas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida in vivo aumentada ou exigências de dosagem reduzida. Um composto marcado com 18F pode ser útil para estudos PET ou SPECT. Os compostos isotopicamente marcados desta invenção e pró-fármacos dos mesmos podem, em geral, ser preparados através da realização dos procedimentos divulgados nos esquemas ou nos exemplos e preparações descritos abaixo através da substituição de um reagente isotopicamente marcado facilmente disponível por um reagente não isotopicamente marcado. Além disso, a substituição com isótopos mais pesados, particularmente, deutério (isto é, 2H ou D), pode fornecer certas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida in vivo aumentada ou exigências de dosagem reduzida ou um aperfeiçoamento no índice terapêutico. Deve ser entendido que deutério, neste contexto, é considerado como um substituinte. A concentração de tal isótopo mais pesado, especificamente, deutério, pode ser definida por um fator de enriquecimento isotópico. Nos compostos desta invenção, qualquer átomo não especificamente designado como um isótopo particular representa qualquer isótopo estável de tal átomo.
[0513] A menos que de outro modo especificado, uma referência a um composto particular inclui todas as tais formas isoméricas, incluindo racêmicas (total ou parcialmente) e outras misturas das mesmas. Métodos para a preparação (por exemplo, síntese assimétrica) e separação (por exemplo, cristalização parcial e meios cromatográficos) de tais formas isoméricas são conhecidos na técnica ou são facilmente obtidos através da adaptação dos métodos mostrados neste relatório ou métodos conhecidos em uma maneira conhecida.
ATIVIDADE BIOLÓGICA ENSAIOS DE PROLIFERAÇÃO CELULAR IN VITRO
[0514] Em geral, a atividade citotóxica ou citostática de um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) é medida por: exposição das células de mamíferos que apresentam proteínas de receptor, por exemplo, HER2, ao anticorpo do ADC em um meio de cultura celular; cultivo das células durante um período de cerca de 6 horas a cerca de 5 dias; e medição da viabilidade celular. Ensaios in vitro com base em células são usados para medir a viabilidade (proliferação), citotoxicidade e indução de apoptose (ativação de caspase) de um ADC da invenção.
[0515] A potência in vitro de conjugados de anticorpo-fármaco pode ser medida através de um ensaio de proliferação celular. O Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter-Glo® é um método de ensaio homogêneo comercialmente disponível (Promega Corp., Madison, WI) com base na expressão recombinante da luciferase de Coleoptera (Patentes U.S. Nos 5583024; 5674713 e 5700670). Este ensaio de proliferação celular determina o número de células viáveis na cultura com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas (Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81 - 88; US 6602677). O Ensaio CellTiter-Glo® é conduzido no formato de 96 poços, tornando o mesmo acessível à triagem automática de alto rendimento (HTS) (Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398 - 404). O procedimento de ensaio homogêneo envolve adicionar o reagente único (Reagente CellTiter-Glo®) diretamente às células cultivadas em meio suplementado com soro. Lavagem celular, remoção do meio e múltiplas etapas de pipetagem não são exigidas. O sistema detecta 15 células/poço em um formato de 384 poços em 10 minutos depois da adição do reagente e mistura. As células podem ser continuamente tratadas com ADC ou podem ser tratadas e separadas de ADC. Em geral, as células brevemente tratadas, isto é, 3 horas, mostraram os mesmos efeitos de potência das células continuamente tratadas.
[0516] O formato “adição-mistura-medição” homogênea resulta em lise celular e geração de um sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente. A quantidade de ATP é diretamente proporcional ao número de células presentes na cultura. O Ensaio CellTiter-Glo® gera um sinal luminescente do “tipo brilho intenso”, produzido pela reação de luciferase, que tem uma meia-vida, em geral, maior do que cinco horas, dependendo do tipo celular e meio usados. Células viáveis são refletidas em unidades de luminescência relativa (RLU). O substrato, Luciferina de besouro, é oxidativamente descarboxilado por luciferase de vaga-lume recombinante com conversão concomitante de ATP em AMP e geração de fótons.
[0517] A potência in vitro de conjugados de anticorpo-fármaco também pode ser medida por um ensaio de citotoxicidade. Células aderentes cultivadas são lavadas com PBS, desacopladas com tripsina, diluídas em meio completo, contendo FCS 10 %, centrifugadas, recolocadas em suspensão em meio fresco e contadas com um hemocitômetro. As culturas de suspensão são diretamente contadas. Suspensões celulares monodispersas adequadas para contagem podem exigir a agitação da suspensão através de aspiração repetida para quebrar agrupamentos celulares.
[0518] A suspensão celular é diluída à densidade de semeadura desejada e dispensada (100 μl por poço) em placas de 96 poços pretas. As placas de linhagens celulares aderentes são incubadas durante a noite para possibilitar aderência. As culturas celulares de suspensão podem ser usadas no dia da semeadura.
[0519] Uma solução estoque (1 ml) de ADC (20 μg/ml) é preparada no meio de cultura celular apropriado. Diluições em série 10 vezes de ADC estoque são preparadas em tubos de centrífuga de 15ml através da transferência em série de 100 μl a 900 μl de meio de cultura celular.
[0520] Quatro poços em replicata de cada diluição de ADC (100 μl) são dispensados em placas de 96 poços pretas, previamente plaqueados com suspensão celular (100 μl), resultando em um volume final de 200 μl. Poços controle recebem meio de cultura celular (100 μl).
[0521] Se o tempo de duplicação da linhagem celular é maior do que 30 horas, a incubação de ADC é para 5 dias, de outro modo, um quatro dia de incubação é feito.
[0522] No final do período de incubação, a viabilidade celular é avaliada com o ensaio Alamar blue. AlamarBlue (Invitrogen) é dispensado sobre a placa total (20 μl por poço) e incubado durante 4 horas. A fluorescência de Alamar blue é medida em 570 nm de excitação, 585 nm de emissão no leitor de placa instantâneo Varioskan. A porcentagem de sobrevivência celular é calculada a partir da fluorescência média nos poços tratados com ADC em comparação à fluorescência média nos poços controle.
EFICÁCIA IN VIVO
[0523] A eficácia in vivo de conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) da invenção pode ser medida por estudos de xenoenxerto de tumor em camundongos. Por exemplo, a eficácia in vivo de um ADC anti-HER2 da invenção pode ser medida através de um modelo de camundongo de explante transgênico de HER2 de alta expressão. Um alotransplante é propagado a partir do camundongo transgênico Fo5 mmtv que não responde a, ou responde deficientemente à terapia com HERCEPTIN®. Os indivíduos foram tratados uma vez com ADC em certos níveis de dose (mg/kg) e exposição ao fármaco de PBD (μg/m2); e controle tampão placebo (Veículo) e monitorados durante duas semanas ou mais para medir o tempo para a dobra do tumor, morte celular log e redução do tumor. USO
[0524] Os conjugados da invenção podem ser usados para fornecer um conjugado de PBD em uma localização alvo.
[0525] A localização alvo é, preferivelmente, uma população celular proliferativa. O anticorpo é um anticorpo para um antígeno presente em uma população celular proliferativa.
[0526] Em uma forma de realização, o antígeno é ausente ou presente em um nível reduzido em uma população celular não proliferativa em comparação à quantidade de antígeno presente na população celular proliferativa, por exemplo, uma população de células de tumor.
[0527] A localização alvo pode ser in vitro, in vivo ou ex vivo.
[0528] O conjugado dos compostos de anticorpo-fármaco (ADC) da invenção inclui aquele com utilidade para atividade anticâncer. Em particular, os compostos incluem um anticorpo conjugado, isto é, covalentemente ligado por um ligador, a uma porção de PBD.
[0529] Na localização alvo, o ligador pode não ser clivado. O conjugado de anticorpo-fármaco (os compostos de ADC da invenção podem ter um efeito citotóxico sem a clivagem do ligador para liberar uma porção de fármaco de PBD. Os conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) da invenção liberam seletivamente agente citotóxico ao tecido de tumor, por meio do qual maior seletividade, isto é, uma dose eficaz menor, pode ser obtida.
[0530] Assim, em um aspecto, a presente invenção fornece um composto conjugado, conforme descrito neste relatório, para o uso em terapia.
[0531] Em um outro aspecto, também fornece um composto conjugado, conforme descrito neste relatório, para o uso no tratamento de uma doença proliferativa. Um segundo aspecto da presente invenção fornece o uso de um composto conjugado na fabricação de um medicamento para tratar uma doença proliferativa.
[0532] Uma pessoa de habilidade comum na técnica é prontamente capaz de determinar se uma conjugado candidato trata ou não uma condição proliferativa para qualquer tipo celular particular. Por exemplo, os ensaios que podem ser convenientemente usados para avaliar a atividade oferecida por um composto particular são descritos nos exemplos abaixo.
[0533] O termo “doença proliferativa” pertence a uma proliferação celular indesejada ou descontrolada de células excessivas ou anormais que é indesejada, tal como, crescimento neoplásico ou hiperplásico, se in vitro ou in vivo.
[0534] Exemplos de condições proliferativas incluem, mas não são limitados à proliferação celular benigna, pré-maligna e maligna, incluindo, mas não limitada a neoplasmas e tumores (por exemplo, histocitoma, glioma, astrocioma, osteoma), cânceres (por exemplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, câncer gastrointestinal, câncer de intestino, câncer de cólon, carcinoma da mama, carcinoma do ovário, câncer de próstata, câncer testicular, câncer de fígado, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de pâncreas, câncer cerebral, sarcoma, osteossarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma), leucemias, psoríase, doenças ósseas, transtornos fibroproliferativos (por exemplo, de tecidos conjuntivos) e aterosclerose. Cânceres de interesse particular incluem, mas não são limitados a leucemias e cânceres ovarianos.
[0535] Qualquer tipo de célula pode ser tratado, incluindo, mas não limitada a pulmão, gastrointestinal (incluindo, por exemplo, intestino, cólon), mama (mamário), ovário, próstata, fígado (hepático), rim (renal), bexiga, pâncreas, cérebro e pele.
[0536] Em uma forma de realização, o tratamento é de um câncer pancreático.
[0537] Em uma forma de realização, o tratamento é de um tumor que apresenta αvβ6 integrina sobre a superfície da célula.
[0538] Deve ser considerado que os conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) da presente invenção podem ser usados para tratar várias doenças ou transtornos, por exemplo, caracterizadas pela superexpressão de um antígeno de tumor. Condições exemplares ou transtornos hiperproliferativos incluem tumores benignos ou malignos; leucemia, malignidades hematológicas e linfoides. Outros incluem transtornos neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos, glandulares, de macrófagos, epiteliais, estromais, blastocélicos, inflamatórios, angiogênicos e imunológicos, incluindo autoimune.
[0539] Em geral, a doença ou transtorno que será tratada é uma doença hiperproliferativa, tal como câncer. Exemplos de câncer que será tratado neste relatório incluem, mas não são limitados a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epiteliais), câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer de estômago ou gástrico, incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de reto, câncer colorretal, carcinoma do endométrio ou uterino, carcinoma da glândula salivar, renal câncer, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer da tireoide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma do pênis, assim como câncer de cabeça e pescoço.
[0540] Doenças autoimunes para as quais os compostos de ADC podem ser usados no tratamento incluem transtornos reumatológicos (tais como, por exemplo, artrite reumatoide, síndrome de Sjogren, esclerodermia, lúpus, tal como SLE e lúpus nefrite, polimiosite/dermatomiosite, crioglobulinemia, síndrome do anticorpo antifosfolipídico e artrite psoriática), osteoartrite, transtornos autoimunes gastrointestinais e hepáticos (tais como, por exemplo, doenças inflamatórias intestinais (por exemplo, colite ulcerativa e doença de Crohn), gastrite autoimune e anemia perniciosa, hepatite autoimune, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária e doença celíaca), vasculite (tal como, por exemplo, vasculite associado a ANCA, incluindo vasculite de Churg-Strauss, granulomatose de Wegener e poliarterite), transtornos neurológicos autoimunes (tais como, por exemplo, esclerose múltipla, síndrome de opsoclonia-mioclonia, miastenia gravis, neuromielite óptica, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e polineuropatias autoimunes), transtornos renais (tais como, por exemplo, glomerulonefrite, síndrome de Goodpasture e doença de Berger), transtornos dermatológicos autoimunes (tais como, por exemplo, psoríase, urticária, pênfigo vulgar, penfigoide bolhoso e lúpus eritematoso cutâneo), transtornos hematológicos (tais como, por exemplo, púrpura trombocitopênica, púrpura trombocitopênica trombótica, púrpura pós-transfusão e autoanemia hemolítica imune), aterosclerose, uveíte, doenças da audição autoimunes (tais como, por exemplo, doença do ouvido interno e perda auditiva), doença de Behcet, síndrome de Raynaud, transplante de órgãos e transtornos endócrinos autoimunes (tais como, por exemplo, doenças autoimunes diabéticas, tais como diabetes mellitus insulino-dependente (IDDM), doença de Addison e doença da tireoide autoimune (por exemplo, doença de Graves e tireoidite)). Tais doenças mais preferidas incluem, por exemplo, artrite reumatoide, colite ulcerativa, vasculite associada a ANCA, lúpus, esclerose múltipla, síndrome de Sjogren, doença de Graves, IDDM, anemia perniciosa, tireoidite e glomerulonefrite.
MÉTODOS DE TRATAMENTO
[0541] Os conjugados da presente invenção podem ser usados em um método de terapia. Também fornecido é um método de tratamento compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade de tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto conjugado da invenção. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma quantidade suficiente para mostrar benefício a um paciente. Tal benefício pode ser pelo menos a melhora de pelo menos um sintoma. A quantidade real administrada e taxa e curso da administração, dependerá da natureza e severidade do que será tratado. A prescrição do tratamento, por exemplo, decisões sobre a dosagem, é de responsabilidade dos profissionais da saúde, em geral, e de médicos.
[0542] Um composto da invenção pode ser administrado sozinha ou em combinação com outros tratamentos, simultânea ou sequencialmente, dependendo da condição que será tratada. Exemplos de tratamentos e terapias incluem, mas não são limitados à quimioterapia (a administração de agentes ativos, incluindo, por exemplo, fármacos, tais como produtos quimioterápicos), cirurgia e terapia de radiação.
[0543] Um “agente quimioterápico” é um composto químico útil no tratamento de câncer, independentemente do mecanismo de ação. Classes de agentes quimioterápicos incluem, mas não são limitadas a: agentes alquilantes, antimetabólitos, alcaloides antimitóticos de origem vegetal, antibióticos citotóxico/antitumor, inibidores de topoisomerase, anticorpos, fotossensibilizadores e inibidores de cinase. Agentes quimioterápicos incluem compostos usados em “terapia alvejada” e quimioterapia convencional.
[0544] Exemplos de agentes quimioterápicos incluem: erlotinibe (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), docetaxel (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5- FU (fluorouracila, 5-fluorouracila, CAS No 51-21-8), gencitabina (GEMZAR®, Lilly), PD-0325901 (CAS No 391210-10-9, Pfizer), cisplatina (cis-diamina, dicloroplatina(II), CAS No 15663 - 27 - 1), carboplatina (CAS No 41575 - 94 - 4), paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), trastuzumabe (HERCEPTIN®, Genentech), temozolomida (4-metila-5-oxo-2,3,4,6,8-pentazabiciclo [4,3,0] nona- 2,7,9-trieno-9-carboxamida, CAS No 85622 - 93 - 1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), tamoxifeno ((Z)-2-[4-(1,2-difenilbut-1-enil)fenóxi]-N,N- dimetiletanamina, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®) e doxorrubicina (ADRIAMYCIN®), Akti-1/2, HPPD e rapamicina.
[0545] Mais exemplos de agentes quimioterápicos incluem: oxaliplatina (ELOXATIN®, Sanofi), bortezomibe (VELCADE®, Millennium Pharm.), sutent (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), mesilato de imatinibe (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (inibidor de Mek, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (inibidor de Mek, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (inibidor de PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (PI3K inibidor, Novartis), XL-147 (inibidor de PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestranto (FASLODEX®, AstraZeneca), leucovorina (ácido folínico), rapamicina (sirolimo, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinibe (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafarnibe (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), sorafenibe (NEXAVAR®, BAY43 - 9006, Bayer Labs), gefitinibe (IRESSA®, AstraZeneca), irinotecano (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), tipifarnibe (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (Cremophor-livre), formulações de nanopartículas construídas com albumina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Il), vandetanibe (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), clorambucila, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), tensirolimo (TORISEL®, Wyeth), pazopanibe (GlaxoSmithKline), canfosfamida (TELCYTA®, Telik), tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN®, NEOSAR®); sulfonatos de alquila, tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente, bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o topotecano análogo sintético); briostatina; calistatina; CC1065 (incluindo seus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente, criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictiina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucila, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridreto do óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosoureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enediina (por exemplo, caliqueamicina, caliqueamicina gamma1I, caliqueamicina omegaI1 (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183 - 186); dinemicina, dinemicina A; bisfosfonatos, tais como clodronato; uma esperamicina; assim como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos de antibiótico de enediina de cromoproteína relacionada), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino- doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e deoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, nemorrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabólitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenérgicos, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; renovador de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil; ansacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofílinico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo polissacarídico PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxana; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2”-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente, toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorrelbina (NAVELBINE®); novantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODA®, Roche); ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tais como ácido retinoico; e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos e derivados de qualquer um entre os citados acima.
[0546] Também incluídos na definição de “agente quimioterápico” estão: (i) agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação do hormônio sobre tumores, tais como anti-estrógenos e moduladores seletivos do receptor de estrógeno (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo NOLVADEX®; citrato de tamoxifeno), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona e FARESTON® (citrato de toremifina); (ii) inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrógeno nas glândulas adrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, MEGASE® (acetato de megestrol), AROMASIN® (exemestano; Pfizer), formestano, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis), e ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca); (iii) antiandrógenos, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; assim como troxacitabina (um análogo de 1,3-dioxolano nucleosídeo citosina); (iv) inibidores de proteína cinase, tais como inibidores de MEK (WO 2007/044515); (v) inibidores de lipídeo cinase; (vi) oligonucleotídeos antissentido, particularmente, aqueles que inibem a expressão de genes nas vias de sinalização implicadas em proliferação celular anormal, por exemplo, PKC-alfa, Raf e H-Ras, tais como oblimerseno (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) ribozimas, tais como inibidores de expressão de VEGF (por exemplo, ANGIOZYME®) e inibidores de expressão de HER2; (viii) vacinas, tais como vacinas de geno terapia, por exemplo, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® e VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inibidores de topoisomerase 1, tais como LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) agentes antiangiogênicos, tais como bevacizumabe (AVASTIN®, Genentech); e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos e derivados de qualquer um entre os citados acima.
[0547] Também incluídos na definição de “agente quimioterápico” estão anticorpos terapêuticos, tais como alemtuzumabe (Campath), bevacizumabe (AVASTIN®, Genentech); cetuximabe (ERBITUX®, Imclone); panitumumabe (VECTIBIX®, Amgen), rituximabe (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), pertuzumabe (OMNITARG™, 2C4, Genentech), trastuzumabe (HERCEPTIN®, Genentech), tositumomabe (Bexxar, Corixia) e o conjugado de anticorpo-fármaco, gemtuzumabe ozogamicina (MYLOTARG®, Wyeth).
[0548] Anticorpos monoclonais humanizados com potencial terapêutico como agentes quimioterápicos em combinação com os conjugados da invenção incluem: alemtuzumabe, apolizumabe, aselizumabe, atlizumabe, bapineuzumabe, bevacizumabe, bivatuzumabe mertansina, cantuzumabe mertansina, cedelizumabe, certolizumabe pegol, cidfusituzumabe, cidtuzumabe, daclizumabe, eculizumabe, efalizumabe, epratuzumabe, erlizumabe, felvizumabe, fontolizumabe, gemtuzumabe ozogamicina, inotuzumabe ozogamicina, ipilimumabe, labetuzumabe, lintuzumabe, matuzumabe, mepolizumabe, motavizumabe, motovizumabe, natalizumabe, nimotuzumabe, nolovizumabe, numavizumabe, ocrelizumabe, omalizumabe, palivizumabe, pascolizumabe, pecfusituzumabe, pectuzumabe, pertuzumabe, pexelizumabe, ralivizumabe, ranibizumabe, reslivizumabe, reslizumabe, resivizumabe, rovelizumabe, ruplizumabe, sibrotuzumabe, siplizumabe, sontuzumabe, tacatuzumabe tetraxetano, tadocizumabe, talizumabe, tefibazumabe, tocilizumabe, toralizumabe, trastuzumabe, tucotuzumabe celmoleucina, tucusituzumabe, umavizumabe, urtoxazumabe e visilizumabe.
[0549] Composições farmacêuticas, de acordo com a presente invenção e para o uso, de acordo com a presente invenção, podem compreender, além do ingrediente ativo, isto, é um composto conjugado, um excipiente, portador, tampão, estabilizador ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos àqueles habilitados na técnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do portador ou outro material dependerá da via de administração, que pode ser oral, ou através de injeção, por exemplo, cutânea, subcutânea ou intravenosa.
[0550] Composições farmacêuticas para administração oral podem estar em tablete, cápsula, pó ou forma líquida. Um tablete pode compreender um portador sólido ou um adjuvante. Composições farmacêuticas líquidas, em geral, compreendem um portador líquido, tal como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução de sacarídeo ou glicóis, tais como etilenoglicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol, pode ser incluída. Uma cápsula pode compreender um portador sólido, tal como uma gelatina.
[0551] Para injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea, ou injeção no sítio de doença, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é livre de pirogênio e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Aqueles de habilidade relevante na técnica serão capazes de preparar soluções adequadas usando, por exemplo, veículos isotônicos, tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer Lactada. Preservantes, estabilizadores, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, conforme exigido. FORMULAÇÕES
[0552] Embora seja possível que o composto conjugado seja usado (por exemplo, administrado) sozinha, é frequentemente preferível apresentar o mesmo como uma composição ou formulação.
[0553] Em uma forma de realização, a composição é uma composição farmacêutica (por exemplo, formulação, preparação, medicamento) compreendendo um composto conjugado, conforme descrito neste relatório, e um portador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0554] Em uma forma de realização, a composição é uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um composto conjugado, conforme descrito neste relatório, juntamente com um ou mais outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos àqueles habilitados na técnica, incluindo, mas não limitados a portadores, diluentes, excipientes, adjuvantes, enchedores, tampões, preservantes, antioxidantes, lubrificantes, estabilizadores, solubilizadores, tensoativos (por exemplo, agentes umectantes), agentes de mascaramento, agentes corantes, agentes flavorizantes e agentes adoçantes farmaceuticamente aceitáveis.
[0555] Em uma forma de realização, a composição compreende ainda outros agentes ativos, por exemplo, outros agentes terapêuticos ou profiláticos.
[0556] Portadores, diluentes, excipientes, etc. adequados podem ser encontrados em textos farmacêuticos padrão. Veja, por exemplo, Handbook of Pharmaceutical Additives, 2a Edição (eds. M. Ash e I. Ash), 2001 (Sinapse Information Resources, Inc., Endicott, Nova Iorque, USA), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20a edição, pub. Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2a edição, 1994.
[0557] Um outro aspecto da presente invenção pertence a métodos para preparar uma composição farmacêutica compreendendo misturar pelo menos um composto conjugado ou do tipo conjugado radiomarcado com [11C], conforme definido neste relatório, juntamente com um ou mais outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos àqueles habilitados na técnica, por exemplo, portadores, diluentes, excipientes, etc. Se formulada como unidades distintas (por exemplo, tabletes, etc.), cada unidade contém uma quantidade pré- determinada (dosagem) do composto ativo.
[0558] O termo “farmaceuticamente aceitável”, conforme usado neste relatório, pertence a compostos, ingredientes, materiais, composições, formas de dosagem, etc., que estão no escopo do julgamento médico, adequados para o uso em contato com os tecidos do indivíduo em questão (por exemplo, um ser humano) sem toxicidade, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação excessivo, correspondente a uma razão benefício/risco razoável. Cada portador, diluente, excipiente, etc. também deve ser “aceitável” no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação.
[0559] As formulações podem ser preparada por quaisquer métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Tais métodos incluem a etapa de associar o composto ativo com um portador que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas associando uniforme e intimamente o composto ativo com portadores (por exemplo, portadores líquidos, portador sólido finamente dividido, etc.), e, depois moldando o produto, se necessário.
[0560] A formulação pode ser preparada para fornecer liberação rápida ou lenta; imediata, retardada, cronometrada ou sustentada; ou uma combinação das mesmas.
[0561] As formulações adequadas para administração parenteral (por exemplo, através de injeção), incluem líquidos aquosos ou não aquosos, isotônicos, livres de pirogênio, estéreis (por exemplo, soluções, suspensões), em que o ingrediente ativo é dissolvido, colocado em suspensão ou, de outro modo, fornecido (por exemplo, em um lipossoma ou outro microparticulado). Tais líquidos podem conter contêm outros ingredientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como antioxidantes, tampões, preservantes, estabilizadores, bacteriostatos, agentes de suspensão, agentes espessantes e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue (ou outro fluido corpóreo relevante) do recipiente intencionado. Exemplos de excipientes incluem, por exemplo, água, álcoois, polióis, glicerol, óleos vegetais e semelhantes. Exemplos de portadores isotônicos adequados para o uso em tais formulações incluem Injeção de Cloreto de Sódio, Solução de Ringer ou Injeção de Ringer Lactada. Tipicamente, a concentração do ingrediente ativo no líquido é de cerca de 1 ng/ml a cerca de 10 μg/ml, por exemplo, de cerca de 10 ng/ml a cerca de 1 μg/ml. As formulações podem ser apresentadas em dose unitária ou múltiplas doses em recipientes vedados, por exemplo, ampolas e frascos, e podem ser armazenadas em uma condição liofilizada que exige apenas a adição do portador líquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões de injeções extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos, e tabletes. DOSAGEM
[0562] Deve ser avaliado por uma pessoa de habilidade na técnica que dosagens apropriadas do composto conjugado, e composições compreendendo o composto conjugado, podem variar de paciente para paciente. A determinação da dosagem ideal em geral, envolverá o equilíbrio do nível de benefício terapêutico contra qualquer risco ou efeitos colaterais deletérios. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores incluindo, mas não limitados à atividade do composto particular, via de administração, tempo de administração, taxa de excreção do composto, duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação, severidade da condição e espécie, sexo, idade, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente. A quantidade de composto e via de administração, basicamente, estarão sob o julgamento do médico, veterinário ou clínico, embora, em geral, a dosagem seja selecionada para obter concentrações locais no sítio de ação que obtém o efeito desejado sem causar dano substancial ou efeitos colaterais deletérios.
[0563] A administração pode ser efetuada em uma dose, continuamente ou intermitentemente (por exemplo, em doses divididas em intervalos apropriados) durante todo o curso do tratamento. Os métodos para determinar os meios mais eficazes e dosagem de administração são bem conhecidos àqueles de habilidade na técnica e variarão com a formulação usada para terapia, propósito da terapia, células alvo que serão tratadas e indivíduo que será tratados. Administrações únicas ou múltiplas podem ser realizadas com o nível de dose e padrão que serão selecionados pelo médico, veterinário ou clínico.
[0564] Em geral, uma dose adequada do composto ativo está na faixa de cerca de 100 ng a cerca de 25 mg (mais tipicamente, cerca de 1 μg a cerca de 10 mg) por quilograma de peso corpóreo do indivíduo por dia. Onde o composto ativo é um sal, um éster, uma amida, um pró-fármaco ou semelhantes, a quantidade administrada é calculada na base do composto precursor e de modo que o peso real que será usado seja proporcionalmente aumentado.
[0565] Em uma forma de realização, o composto ativo é administrado a um paciente humano, de acordo com o seguinte regime de dosagem: cerca de 100 mg, 3 vezes ao dia.
[0566] Em uma forma de realização, o composto ativo é administrado a um paciente humano, de acordo com o seguinte regime de dosagem: cerca de 150 mg, 2 vezes ao dia.
[0567] Em uma forma de realização, o composto ativo é administrado a um paciente humano, de acordo com o seguinte regime de dosagem: cerca de 200 mg, 2 vezes ao dia.
[0568] Entretanto, em uma forma de realização, o composto conjugado é administrado a um paciente humano, de acordo com o seguinte regime de dosagem: cerca de 50 ou cerca de 75 mg, 3 ou 4 vezes ao dia.
[0569] Em uma forma de realização, o composto conjugado é administrado a um paciente humano, de acordo com o seguinte regime de dosagem: cerca de 100 ou cerca de 125 mg, 2 vezes ao dia.
[0570] As quantidades de dosagem descritas acima podem se aplicar ao conjugado (incluindo a porção de PBD e o ligador ao anticorpo) ou à quantidade eficaz de composto de PBD fornecido, por exemplo, a quantidade de composto que é liberável depois da clivagem do ligador.
[0571] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um ADC da invenção dependerá do tipo de doença que será tratada, conforme definido acima, severidade e curso da doença, se a molécula é administrada para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, histórico clínico do paciente e resposta ao anticorpo e julgamento do médico. A molécula é adequadamente administrada ao paciente em uma vez ou durante uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 a 20 mg/kg) de molécula é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se, por exemplo, através de uma ou mais administrações separadas ou através de infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Uma dosagem exemplar de ADC que será administrada a um paciente está na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg de peso do paciente. Para administrações repetidas durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até que uma supressão desejada dos sintomas de doença ocorra. Um regime de dosagem exemplar compreende um curso de administração de uma dose de carregamento inicial de cerca de 4 mg/kg, seguido por doses adicionais a cada semana, duas semanas ou três semanas de um ADC. Outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.
TRATAMENTO
[0572] O termo “tratamento”, conforme usado neste relatório no contexto de tratar uma condição, pertence, em geral, ao tratamento e terapia, se de um humano ou um animal (por exemplo, em aplicações veterinárias), em que algum efeito terapêutico desejado é obtido, por exemplo, a inibição do progresso da condição, e inclui uma redução na taxa de progresso, uma parada na taxa de progresso, regressão da condição, melhora da condição e cura da condição. O tratamento como uma medida profilática (isto é, profilaxia, prevenção) também é incluído.
[0573] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, conforme usado neste relatório, pertence àquela quantidade de um composto ativo, ou um material, composição ou forma de dosagem compreendendo um composto ativo, que é eficaz para produzir algum efeito terapêutico desejado, correspondente a uma razão benefício/risco razoável, quando administrado, de acordo com um regime de tratamento desejado.
[0574] Similarmente, o termo “quantidade profilaticamente eficaz”, conforme usado neste relatório, pertence àquela quantidade de um composto ativo, ou um material, composição ou forma de dosagem compreendendo um composto ativo, que é eficaz para produzir algum efeito profilático desejado, correspondente a uma razão benefício/risco razoável, quando administrado, de acordo com um regime de tratamento desejado. PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE ANTICORPO-FÁRMACO
[0575] Os conjugados de anticorpo-fármaco podem ser preparados por várias vias, utilizando reações de química orgânica, condições e reagentes conhecidos àqueles habilitados na técnica, incluindo: (1) reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo com um reagente ligador bivalente, para formar intermediário de anticorpo-ligador Ab-L, por intermédio de uma ligação covalente, seguido por reação com um reagente de porção de fármaco ativado ; e (2) reação de um reagente de porção de fármaco com um reagente ligador, para formar fármaco- reagente ligador D-L, por intermédio de uma ligação covalente, seguido por reação com o nucleofílico de um anticorpo. Os métodos de conjugação (1) e (2) podem ser utilizados com uma variedade de anticorpos e ligadores para preparar os conjugados de anticorpo-fármaco da invenção.
[0576] Os grupos nucleofílicos nos anticorpos incluem, mas não são limitados a grupos tiol de cadeia lateral, por exemplo, cisteína. Os grupos tiol são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em porções ligadoras, tais como aquelas da presente invenção. Certos anticorpos têm dissulfetos entre cadeias redutíveis, isto é, pontes de cisteína. Os anticorpos podem ser reativos para conjugação com reagentes ligadores através de tratamento com um agente redutor, tal como DTT (reagente de Cleland, ditiotreitol) ou TCEP cloridreto de (tris(2-carboxietila)fosfina; Getz et al. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73 - 80; Soltec Ventures, Beverly, MA). Cada ponte dissulfeto de cisteína, assim, formará, teoricamente, dois nucleófilos de tiol reativos. Os grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos nos anticorpos através da reação de lisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut) resultante da conversão de uma amina em um tiol.
O INDIVÍDUO/PACIENTE
[0577] O indivíduo/paciente pode ser um animal, mamífero, um mamífero placentário, um marsupial (por exemplo, canguru, wombat), um monotremado (por exemplo, ornitorrinco), um roedor (por exemplo, um porquinho da índia, um hamster, um rato, um camundongo), murino (por exemplo, um camundongo), um lagomorfo (por exemplo, um coelho), ave (por exemplo, um pássaro), canino (por exemplo, um cão), felino (por exemplo, um gato), equino (por exemplo, um cavalo), suíno (por exemplo, um porco), ovino (por exemplo, uma ovelha), bovino (por exemplo, uma vaca), um primata, símio (por exemplo, um macaco), um macaco (por exemplo, sagüi, babuíno), um macaco (por exemplo, gorila, chimpanzé, orangotango, gibão) ou um ser humano.
[0578] Além disso, o indivíduo/paciente pode estar em qualquer uma de suas formas de desenvolvimento, por exemplo, um feto. Em uma forma de realização preferida, o indivíduo/paciente é um ser humano.
[0579] Em uma forma de realização, o paciente é uma população onde cada paciente tem um tumor que apresenta αvβ6 integrina sobre a superfície da célula.
SÍNTESE
[0580] Uma via de síntese possível a um intermediário dimérico da fórmula IV é mostrada abaixo:
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[0581] O intermediário IV pode ser usado para preparar o intermediário VII
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[0582] O intermediário IV pode ser usado para preparar o intermediário IX:
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[0583] Alternativamente, o intermediário IV pode ser ligado ao intermediário X para preparar o intermediário IX:
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[0584] O intermediário IV pode ser usado para preparar o intermediário XVI
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[0585] O intermediário IV pode ser usado para preparar o intermediário XIX
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[0586] Uma via de síntese possível a um XIV é mostrada abaixo:
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[0587] O intermediário XXI pode ser usado para preparar o intermediário
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[0588] Nos esquemas acima, RN, RN’ e RN’’, independentemente, representam um grupo de proteção nitrogênio. RC e RC’, independentemente, representam OH ou OProtO, onde ProtO é um grupo de proteção hidróxi. Os grupos de proteção são bem conhecidos na técnica. RN, RN’ e RN’’ podem ser, por exemplo, BOC. ProtO pode ser THP. A proteção das ligações imina N10-C11 é removida em um estágio diferente nos métodos de síntese àqueles mostrados acima, dependendo das químicas utilizadas.
[0589] Em geral, os compostos e conjugados podem ser preparados através da primeira ligação a dois monômeros de PBD com uma ponte dimérica de fenileno ou piridileno para produzir o intermediário IV ou XXI. O grupo halogênio no anel arila na ponte dimérica do intermediário IV depois pode ser usado para formar a amarração (incluindo o grupo ligador G ou L) para conectar o dímero de PBD ao agente de ligação celular.
[0590] Em mais detalhes, dois monômeros de PBD com os grupos -XH e - X’H na posição C8 de cada monômero de PBD (intermediários I e II, respectivamente) podem ser reagidos com os grupos -T-Hal e -T’-Hal no intermediário III ou intermediário XX. Tal método de síntese permite que os monômeros de PBD sejam diferentes e de modo que o dímero de PBD resultante seja assimétrico. Igualmente, os monômeros de PBD podem ser os mesmos.
[0591] O intermediário de dímero de PBD IV pode ser usado para fornecer os compostos e conjugados da presente invenção através da reação do grupo arila halogênio na ponte em diversas formas.
[0592] Primeiro, o intermediário IV pode ser usado em uma reação de ligação cruzada de Sonogishira para fornecer um grupo acetileno no grupo arila da ponte dimérica. As reações de ligação cruzada de Sonogishira são bem conhecidas na técnica para ligar um terminal alcino com um haleto de arila na presença de um catalisador de paládio, tal como Pd(Ph3)4, um catalisador de cobre, tal como CuI, e uma base, tal como dietilamina.
[0593] Quando acetileno é usado como o acetileno terminal, um lado da molécula de acetileno é, tipicamente, protegida, por exemplo, com TMS, de modo a prevenir a ligação cruzada dos dímeros de PBD. Uma vez que a reação de Sonogishira é concluída, o grupo TMS pode ser clivado para fornecer o intermediário de alcino V.
[0594] O intermediário V pode ser reagido com um composto de azido para formar um derivado de triazol em uma cicloadição de Huisgen de azida-alcino. Tal reação pode ser catalisada por um catalisador de cobre. Para formar os compostos e conjugados da presente invenção, a azida é ligada a um grupo etileno e um número variável de grupos PEG. A azida pode ser terminada com um grupo amina para reagir adicionalmente. A reação do intermediário V com um composto de amino- azida fornecerá o intermediário VI.
[0595] O grupo amina livre do intermediário VI depois pode ser reagido com um grupo ácido carboxílico de um grupo ligador para conectar a uma unidade de ligação celular para formar o grupo amido que liga o dímero de PBD ao grupo ligador G ou L para fornecer o composto VII.
[0596] O grupo ligador/grupo reativo, G, do intermediário VII pode ser conjugado a um agente de ligação celular para fornecer os conjugados da presente invenção.
[0597] Como uma reação de Sonogishira alternativa, o intermediário IV pode ser ligado a uma acetilamina, tal como propargilamina, na presença de paládio e catalisadores de cobre e base. Tal reação fornece parte de uma amarração ligada à ponte dimérica de PBD onde o grupo alcino é preservado e uma amina terminal livre está disponível para reação adicional. Por exemplo, a reação de intermediário IV com propargilamina fornece o intermediário VIII.
[0598] A amina terminal do intermediário VIII pode ser reagida, por exemplo, com um grupo ácido carboxílico ligado a um ligador/grupo reativo G (para conectar a um agente de ligação celular) para fornecer o intermediário IX.
[0599] Como uma síntese alternativa do intermediário IX, o grupo ácido carboxílico do intermediário XI pode ser reagido com propargilamina para formar o intermediário XII. A reação de intermediário IV com o intermediário XII em uma reação de Sonogoshira produz o intermediário XIII.
[0600] O grupo amina protegido terminado na cadeia de PEG variável pode ser desprotegido e reagido com o grupo ácido carboxílico do intermediário XIV, de modo a ligar o ligador/grupo reativo G sobre o dímero de PBD e produzir o intermediário XIV.
[0601] O intermediário IV também pode ser usado em uma reação de aminação de ligação cruzada, tal como uma aminação de Buchwald-Hartwig. Uma ligação carbono-nitrogênio é formada por intermédio de um ligação cruzada catalisada por paládio de uma amina com um haleto de arila. Um número de catalisadores de paládio para o uso em tais reações de ligação cruzada é conhecido, tal como Pd(Ph3)4 ou RuPhos/RuPhosPd.
[0602] A reação do intermediário IV com uma piperizina funcionalizada com uma propan-1-amina protegida fornece o intermediário XV. A amina protegida do intermediário XV pode ser ainda reagida, por exemplo, com um grupo ácido carboxílico ligado a um ligador/grupo reativo, G, para conectar a um agente de ligação celular para fornecer o intermediário XVI.
[0603] A reação de aminação de ligação cruzada, tal como uma aminação de Buchwald-Hartwig, do intermediário IV com uma piperazina parcialmente protegida, seguido por desproteção (por exemplo, com ácido trifluoroacético) fornece o intermediário XVII.
[0604] O grupo piperazina amina desprotegido do intermediário XVII pode ser reagido com um grupo ácido carboxílico no intermediário XVIII para fornecer o intermediário XIX.
[0605] O intermediário XXI pode ser usado para formar o intermediário de oxima XXIV. Por exemplo, uma PEG-diamina parcialmente protegida, intermediário XXII, pode ser reagida com o grupo ácido carboxílico do intermediário XIV. A desproteção fornece o intermediário XIII.
[0606] A reação dos intermediários XXI e XXIII fornece o intermediário de oxima XXIV. As syn e anti oximas podem ser resolvidas usando HPLC preparativa.
[0607] O intermediário XXI também pode ser usado para formar o intermediário de acrilamida XXVII. Por exemplo, o intermediário de aldeído XXI pode ser reagido com ácido malônico em uma condensação de Knoevenagel para fornecer o intermediário de ácido acríclico XXV. Este pode ser reagido com uma PEG-diamina parcialmente protegida para fornecer o intermediário XXVI. A desproteção e ligação com o intermediário XIV fornecem o intermediário de acrilamida XXVII.
[0608] A síntese dos compostos de PBD contendo duas porções imina é extensivamente debatido nas seguintes referências, nas quais as discussões são incorporadas neste relatório como referência: WO 00/12508 (páginas 14 a 30); WO 2005/023814 (páginas 3 a 10); WO 2005/085259 (páginas 31 a 39) WO 2011/128650 (páginas 2 a 12 e 42 a 51); PCT/EP2012/070232, depositado em 12 Outubro de 2012 (páginas 2 a 15 e 49 a 58).
EXEMPLOS MÉTODOS EXPERIMENTAIS GERAIS
[0609] Rotações ópticas foram medidas em um polarímetro ADP 220 (Bellingham Stanley Ltd.) e as concentrações (c) são fornecidas em g/100mL. Pontos de fusão foram medidos usando um aparelho de ponto de fusão digital (Electrothermal). Espectros de IR foram registrados em um espectrômetro Perkin- Elmer Spectrum 1000 FT IR. Espectros de RMN de 1H e 13C foram adquiridos a 300 K usando um espectrômetro de RMN Bruker Avance a 400 e 100 MHz, respectivamente. Substituições químicas são relatadas em relação a TMS (δ = 0,0 ppm) e os sinais são designados como s (singleto), d (dubleto), t (tripleto), dt (duplo tripleto), dd (dubleto de dubletos), ddd (duplo dubleto de dubletos) ou m (multipleto) com constantes de ligação fornecidas em Hertz (Hz). Os dados de espectroscopia de massas (MS) foram coletados usando um instrumento Waters Micromass ZQ ligado a uma HPLC Waters 2695 com um Waters 2996 PDA. Os parâmetros de Waters Micromass ZQ usados foram: Capilar (kV), 3,38; Cone (V), 35; Extrator (V), 3,0; Temperatura de fonte (°C), 100; Temperatura de dessolvatação (°C), 200; Taxa de fluxo de cone (L/h), 50; taxa de fluxo de dessolvatação (L/h), 250. Os dados de espectroscopia de massas de alta resolução (HRMS) foram registrados em um Waters Micromass QTOF Global em modo W positivo usando pontas de vidro de borossilicato revestidas com metal para introduzir as amostras no instrumento. Cromatografia de Camada Fina (TLC) foi realizada em placas de alumínio em gel de sílica (Merck 60, F254) e cromatografia instantânea utilizou gel de sílica (Merck 60, 230 a 400 malhas ASTM. Todos os produtos químicos e solventes foram adquiridos a partir da Sigma-Aldrich e foram usados, conforme fornecido sem purificação adicional.
[0610] Condições de LC/MS - Método A: A HPLC (Waters Alliance 2695) foi conduzida usando uma fase móvel de água (A) (ácido fórmico 0,1 %) e acetonitrila (B) (ácido fórmico 0,1 %). Gradiente: composição inicial B 5 % durante 1,0 min depois B 5 % a 9B 5 % dentro de 3 min. A composição foi mantida durante 0,5 min a 9B 5 % e depois retornada a B 5 % em 0,3 minutos. O tempo de condução de gradiente total é igual a 5 min. Taxa de fluxo 3,0 mL/min, 400 μL foram divididos por intermédio de um peça em T com volume morto nulo que passa no espectrômetro de massas. Faixa de detecção de comprimento de onda e: 220 a 400 nm. Tipo de Função: arranjo de diodo (535 varreduras). Coluna: Fenomenex® Onyx Monolithic C18 50 x 4,60 mm.
[0611] Condições de LC/MS - Método B: A HPLC (Waters Alliance 2695) foi conduzida usando uma fase móvel de água (A) (ácido fórmico 0,1 %) e acetonitrila (B) (ácido fórmico 0,1 %). Gradiente: composição inicial B 5 % mantida durante 1,0 min, depois aumento a partir de B 5 % a 9B 5 % durante um período de 2,5 min. A composição foi mantida durante 0,5 min a 9B 5 %, depois retornada para B 5 % em 0,1 minuto e mantida durante 0,9 min. Tempo de condução de gradiente total é igual a 5 min. Taxa de fluxo 3,0 mL/min, 400 μL foram divididos por intermédio de uma peça em T com volume morto nulo que passa no espectrômetro de massas. Faixa de detecção de comprimento de onda: 220 a 400 nm. Tipo de função: arranjo de diodo (535 varreduras). Coluna: Fenomenex Onyx Monolithic C18 50 x 4,60 mm.
[0612] Condições de LC/MS - Método C: Espectrometria de massas com eletrospray modo positivo foi realizada usando um Shimadzu Nexera®/Prominence® LCMS-2020. Fases móveis usado foram solvente A (H2O com ácido fórmico 0,1 %) e solvente B (CH3CN com ácido fórmico 0,1 %). Gradiente: Composição inicial B 5 % mantida em 0,25 min, depois aumento de B 5 % a B 100 % durante um período de 2 min. A composição foi mantida durante 0,50 min a B 100 %, depois retornada para B 5 % em 0,05 min e mantida durante 0,05 min. A duração total da condução do gradiente foi de 3,0 min. A taxa de fluxo foi de 0,8 mL/min. A detecção foi a 214 e 254 nm. Coluna: Waters Acquity UPLC® BEH Shield RP18 1,7 μm 2,1 x 50 mm a 50 °C.
[0613] As condições de HPLC preparativa para os Exemplos 2 e 3 foram as seguintes: A cromatografia líquida de alto desempenho em fase reversa ultra rápida (UFLC) foi realizada em uma máquina Shimadzu Prominence® usando colunas Fenomenex® Gemini NX 5μ C18 (a 50 °C) nas seguintes dimensões: 150 x 4,6 mm para análise, e 150 x 21,2 mm para trabalho preparativo. Eluentes usados foram solvente A (H2O com ácido fórmico 0,1 %) e solvente B (CH3CN com ácido fórmico 0,1 %). Todos os experimentos de UFLC foram realizados com as condições de gradiente: A partir de 0 a 30 min a composição de B foi aumentada de 0 a 100 % e mantida a B 100 % durante um adicional de 2 min. A composição de B foi diminuída de 100 % a 0 % a partir de 32,0 min a 32,1 min e mantido a 0 % B até 35,0 min. A duração total da condução do gradiente foi de 35,0 min. As taxas de fluxo usadas foram 1,0 mL/min para HPLC analítica e 20,0 mL/min para preparativa. A detecção foi a 254 e 280 nm.
[0614] Condições de LC/MS - Método D: Shimazu LCMS-2020, usando uma fase móvel de água (A) (ácido fórmico 0,1 %) e acetonitrila (B) (ácido fórmico 0,1 %). Gradiente: composição inicial B 5 % mantida durante 0,25 min, depois aumento de B 5 % a B 100 % durante um período de 2 min. A composição foi mantida durante 0,50 min a B 100 %, depois retornada para B 5 % em 0,05 minuto e mantida durante 0,05 min. O tempo de condução de gradiente total é igual a 3 min. Taxa de fluxo 0,8 mL/min. Faixa de detecção de comprimento de onda: 190 a 800 nm. Temperatura do forno: 50 °C. Coluna: Kinetex 2,6u XB-C18 100A 50x2,10 mm.
[0615] Condições de LC/MS - Método E: Shimazu LCMS-2020, usando uma fase móvel de água (A) (ácido fórmico 0,1 %) e acetonitrila (B) (ácido fórmico 0,1 %). Gradiente: composição inicial B 5 % mantida durante 1 min, depois aumento de B 5 % a B 100 % durante um período de 9 min. A composição foi mantida durante 2 min a B 100 %, depois retornada para B 5 % em 0,10 minutos e mantida durante 3 min. O tempo de condução de gradiente total é igual a 15 min. Taxa de fluxo 0,6 mL/min. Faixa de detecção de comprimento de onda: 190 a 800 nm. Temperatura do forno: 50 °C. Coluna: Gemini-NX 3u C18 110A 100 x 2,00 mm. Síntese de Intermediários
[0616] (15-oxo-3,6,9,12-tetraoxa-16-azanonadec-18-in-1-il)carbamato (I3) de terc-butila
Figure img0069
[0617] EDCI (263 mg, 1,37 mmol, 1 eq) foi adicionado a uma solução de propargilamina (88 μL, 1,37 mmol, 1 eq) e ácido t-boc-N-amido-dPEG®4 (365,42 mmols, 1,37 mmol, 1 eq) em diclorometano (10 mL). A reação foi agitada na temperatura ambiente durante 3 horas depois de que a conversão total foi observada através de TLC. A mistura de reação foi diluída em diclorometano e lavada com água e salmoura. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio, filtrada e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia em coluna instantânea (gel de sílica; gradiente, 0 % a 10 % metanol em diclorometano). Frações puras foram coletadas e combinadas e o excesso de eluente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto I3 (490 mg, 89 %). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 6,90 (s, 1H), 5,06 (d, J = 23,2 Hz, 1H), 4,03 (dd, J = 5,3, 2,5 Hz, 2H), 3,72 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 3,69 - 3,57 (m, 12H), 3,53 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 3,30 (d, J = 5,0 Hz, 2H), 2,49 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 2,20 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 1,43 (s, 9H).
Exemplo 1
[0618] 8,8’-(((5-halo-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(7-metóxi-5-oxo- 11-((tetra-hidro-2H-piran-2-il)óxi)-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila
Figure img0070
[0619] 8,8’-(((5-iodo-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(7-metóxi-5-oxo- 11-((tetra-hidro-2H-piran-2-il)óxi)-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila (2a)
[0620] 1,3-bis(bromometil)-5-iodobenzeno (906 mg, 2,34 mmols) foi adicionado a uma solução agitada de unidade de capeamento de PBD Boc/THP- protegido 1 (2,1 g, 4,68 mmols), TBAI (86 mg, 0,234 mmol) e K2CO3 (647 mg, 4,68 mmols) em DMF seca (30 mL). A mistura de reação foi aquecida a 60 °C e agitada sob uma atmosfera de argônio durante 3 horas ponto no qual a análise através de LC/MS revelou a formação de produto substancial no tempo de retenção 4,00 min (ES+) m/z 1125 ([M+ H]+., ~50 % de intensidade relativa). A mistura de reação foi esfriada até a temperatura ambiente e a DMF foi removida através de evaporação a vácuo. O resíduo resultante foi particionado entre água (50 mL) e EtOAc (50 mL) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 15 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (2 x 20 mL), salmoura (40 mL), secas (MgSO4), filtradas e evaporadas a vácuo para fornecer o produto bruto. A purificação por cromatografia instantânea (eluição por gradiente: 50:50 v/v EtOAc/hexano a EtOAc 100 %) forneceu o bis-éter 2a como uma espuma branca (2,05 g, 78 % de rendimento): RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) (mistura de 3 diastereoisômeros) δ 7,78-7,74 (m, 2H), 7,50 (d, 1H, J = 4,76 Hz), 7,26 (s, 1H), 7,22 (s, 1H), 6,87 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 5,80 (d, 1H, J = 8,52 Hz), 5,70 (d, 1H, J = 9,44 Hz), 5,16-4,95 (m, 6H), 3,93-3,87 (m, 8H), 3,74-3,40 (m, 8H), 2,22-1,99 (m, 8H), 1,79-1,22 (m, 30H); RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) (mistura de 3 diastereoisômeros) δ 167,4, 167,2, 154,9, 149,6, 149,4, 149,2, 148,8, 139,6, 139,4, 135,6 (x2), 129,8, 129,6, 127,9, 127,4, 125,0, 116,0, 115,8, 111,0, 110,4, 100,8, 95,8, 94,8, 91,2, 88,2, 81,4, 80,9, 70,4, 70,0, 64,9, 63,4, 60,2, 60,0, 56,2, 56,1 (x2), 46,3, 31,4, 30,9, 29,2, 28,9, 28,2, 28,1, 25,3, 23,3, 23,2, 20,9, 19,9.
[0621] (ii) 8,8’-(((5-bromo-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(7-metóxi-5- oxo-11-((tetra-hidro-2H-piran-2-il)óxi)-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila (2b).
[0622] 1-bromo-3,5-bis(bromometil)benzeno (331 mg, 0,97 mmol) foi adicionado a uma solução agitada de unidade de capeamento de PBD Boc/THP- protegido 1 (876 mg, 1,95 mmol), TBAI (36 mg, 97,4 μmols) e K2CO3 (270 mg, 1,95 mmol) em DMF seca (16 mL). A mistura de reação foi aquecida a 60 °C e agitada sob uma atmosfera de argônio durante 2,5 horas ponto no qual a análise através de LC/MS revelou a formação de produto substancial no tempo de retenção 4,00 min (ES+) m/z 1079 ([M+ H]+., ~95 % de intensidade relativa). A mistura de reação foi esfriada até a temperatura ambiente e a DMF foi removida através de evaporação a vácuo. O resíduo resultante foi particionado entre água (25 mL) e DCM (25 mL) e a fase aquosa foi extraída com DCM (3 x 10 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (20 mL), salmoura (30 mL), secas (MgSO4), filtradas e evaporadas a vácuo para fornecer o produto bruto. A purificação por cromatografia instantânea (eluição por gradiente: 50:50 v/v EtOAc/hexano a EtOAc 100 %) forneceu o bis-éter 2b como uma espuma branca (725 mg, 69 % de rendimento): RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) (mistura de 3 diastereoisômeros) δ 7,57-7,53 (m, 2H), 7,50 (d, 1H, J = 4,92 Hz), 7,27 (s, 1H), 7,22 (s, 1H), 6,87 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 5,80 (d, 1H, J = 7,88 Hz), 5,70 (d, 1H, J = 9,36 Hz), 5,18-4,94 (m, 6H), 3,93-3,85 (m, 8H), 3,75-3,40 (m, 8H), 2,14-1,99 (m, 8H), 1,79-1,22 (m, 30H); RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) (mistura de 3 diastereoisômeros) δ 167,4, 167,2, 154,9, 149,6, 149,4, 149,2, 148,8, 139,6, 139,4, 129,8, 127,9, 128,0, 127,4, 124,2, 123,2, 116,0, 115,8, 111,0, 110,4, 100,9, 95,8, 91,3, 88,2, 81,3, 80,9, 70,5, 70,1, 64,9, 63,4, 60,2, 60,0, 56,2, 56,1, 46,4, 31,4, 30,9, 29,2, 28,9, 28,2, 28,1, 25,3, 23,3, 23,1, 20,9, 19,9.
[0623] (iii) 8,8’-(((5-cloro-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(7-metóxi-5- oxo-11-((tetra-hidro-2H-piran-2-il)óxi)-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila (2c)
[0624] 1,3-bis(bromometil)-5-clorobenzeno (470 mg, 1,57 mmol) foi adicionado a uma solução agitada de unidade de capeamento de PBD Boc/THP- protegido 1 (1,41 g, 3,15 mmols), TBAI (58 mg, 0,16 mmol) e K2CO3 (435 mg, 3,15 mmols) em DMF seca (20 mL). A mistura de reação foi aquecida a 60 °C e agitada sob uma atmosfera de argônio durante 2 horas ponto no qual a análise através de LC/MS (Método A) revelou a formação de produto substancial no tempo de retenção 1,94 min (ES+) m/z 1033 ([M+ H]+., ~50 % de intensidade relativa). A mistura de reação foi esfriada até a temperatura ambiente e a DMF foi removida através de evaporação a vácuo. O resíduo resultante foi particionado entre água (50 mL) e EtOAc (50 mL) e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 15 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (2 x 20 mL), salmoura (40 mL), secas (MgSO4), filtradas e evaporadas a vácuo para fornecer o produto bruto. A purificação por cromatografia instantânea (eluição por gradiente: 50:50 v/v EtOAc/hexano a EtOAc 100 %) forneceu o bis-éter 2c como uma espuma branca (825 mg, 51 % de rendimento).
[0625] (b) 8,8’-(((5-etinil-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(7-metóxi-5- oxo-11-((tetra-hidro-2H-piran-2-il)óxi)-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila (4)
Figure img0071
[0626] 8,8’-(((5-((trimetilsilil)etinil)-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(7- metóxi-5-oxo-11-((tetra-hidro-2H-piran-2-il)óxi)-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila (3).
[0627] Uma quantidade catalítica de Pd(PPh3)4 (14,9 mg, 12,9 μmols) foi adicionada a uma mistura do bis-éter 2a (721 mg, 0,64 mmol), TMS-acetileno (273 μL, 190 mg, 1,93 mmol), CuI (4,9 mg, 25,8 μmols), dietilamina (1,33 mL, 942 mg, 12,9 mmols) e pelotas de peneira molecular 4A secas em estufa em DMF seca (4,8 mL) em um vaso vedado seco em estufa. A mistura foi desgaseificada e fluxada com argônio 3 vezes, depois aquecida em um micro-ondas a 100 °C durante 1,5 horas, ponto no qual a análise através de LC/MS (Método A) revelou o consumo completo do material de partida e formação de produto substancial no tempo de retenção 4,27 min (ES+) m/z 1096 ([M+ H]+., ~35 % de intensidade relativa). O pico no tempo de retenção 3,82 min (ES+) m/z 1023 ([M+ H]+., ~35 % de intensidade relativa) observou que corresponde à clivagem de TMS sob condições de LC/MS (Método A). A mistura de reação foi esfriada até a temperatura ambiente e depois foi filtrada através de um sintetizador para remover as peneiras (lavadas com DMF). O filtrado foi evaporado a vácuo e o resíduo resultante submetido à cromatografia instantânea (eluição por gradiente: 50:50 v/v EtOAc/hexano a EtOAc 100 %) para fornecer o TMS-acetileno 3 como uma espuma amarela (656 mg, 93 % de rendimento): RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) (mistura de 3 diastereoisômeros) δ 7,52-7,46 (m, 3H), 7,26 (s, 1H), 7,21 (s, 1H), 6,87 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 5,80 (d, 1H, J = 8,68 Hz), 5,69 (d, 1H, J = 9,36 Hz), 5,18-4,94 (m, 6H), 3,93-3,86 (m, 8H), 3,73-3,40 (m, 8H), 2,13-1,97 (m, 8H), 1,78-1,22 (m, 30H), 0,22, 0,23 e 0,24 (sx3, 9H); RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) δ 167,6, 167,4, 155,2, 155,0, 149,9, 149,6, 149,2, 148,8, 137,8, 137,6, 130,2, 129,9, 129,7, 127,8, 127,2, 125,8, 124,4, 116,0, 115,8, 111,0, 110,4, 104,4, 101,0, 95,8, 91,4, 88,3, 81,4, 81,0, 71,0, 70,6, 65,0, 63,5, 60,3, 60,1, 56,2, 46,4, 31,0, 29,2, 29,0, 28,2, 25,4, 23,4, 23,3, 21,1, 20,0, 0,28, 0,09, 0,00, -0,28.
[0628] (ii) 8,8’-(((5-etinil-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(7-metóxi-5- oxo-11-((tetra-hidro-2H-piran-2-il)óxi)-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila (4).
[0629] K2CO3 sólido (296 mg, 2,14 mmols) foi adicionado a uma solução agitada do composto TMS-protegido 3 (1,17 g, 1,07 mmol) em MeOH (20 mL). Depois de 3 horas de agitação na temperatura ambiente, a reação foi considerada concluída, conforme mostrado através de LC/MS (Método A) [pico do produto desejado no tempo de retenção 3,82 min (ES+) m/z 1023 ([M+ H]+., ~30 % de intensidade relativa)]. O MeOH foi removido através de evaporação a vácuo e o resíduo resultante foi particionado entre água (25 mL) e EtOAc (25 mL). As camadas foram separadas e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 15 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (3 x 30 mL), salmoura (40 mL), secas (MgSO4), filtradas e evaporadas a vácuo para fornecer o produto bruto. A purificação por cromatografia instantânea (eluição por gradiente: 50:50 v/v EtOAc/hexano a EtOAc 100 %) forneceu o acetileno 4 como uma espuma laranja (1,02 g, 94 % de rendimento: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) (mistura de 3 diastereoisômeros) δ 7,55-7,52 (m, 3H), 7,26 (s, 1H), 7,22 (s, 1H), 6,88 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 5,80 (d, 1H, J = 8,68 Hz), 5,69 (d, 1H, J = 9,48 Hz), 5,18-4,94 (m, 6H), 3,933,86 (m, 8H), 3,73-3,40 (m, 8H), 3,09 e 3,08 (sx3, 1H), 2,13-1,97 (m, 8H), 1,78-1,22 (m, 30H); RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) (mistura de 3 diastereoisômeros) δ 167,5, 167,3, 155,2, 149,7, 149,5, 149,1, 148,8, 137,8, 137,7, 130,3, 129,8, 129,6, 127,8, 127,2, 126,1, 123,2, 115,9, 115,7, 110,9, 110,4, 100,9, 100,0, 95,7, 91,3, 88,2, 82,9, 81,3, 80,9, 78,0, 70,7, 70,4, 64,9, 63,4, 60,2, 60,0, 56,1, 46,3, 31,4, 30,9, 29,2, 28,9, 28,1 (x2), 25,3, 23,3, 23,2, 20,9, 19,9.
[0630] (c) 8,8’-(((5-(1-(2-(2-(2-(2-aminoetóxi)etóxi)etóxi)etil)-1H-1,2,3-triazol- 4-il)-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(7-metóxi-5-oxo-11-((tetra-hidro-2H-piran- 2-il)óxi)-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepino-10(5H)- carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila (5).
Figure img0072
[0631] CuSO4.5H2O sólido (10,3 mg, 41,4 μmols) e L-ascorbato de (+)-sódio (33,0 mg, 0,17 mmol) foram adicionados a uma solução agitada de 11-Azido-3,6,9- trioxaundecan-1-amina (181 mg, 164 μL, 0,83 mmol) e o alcino 4 (846 mg, 0,83 mmol) em terc-BuOH (5 mL) e H2O (5 mL) na temperatura ambiente. Uma mudança de cor de amarelo para verde foi observada, conforme a reação progrediu. Depois da agitação durante 1,5 hora, análise através de LC/MS (Método A) revelou uma quantidade substancial de produto desejado formado correspondente ao pico no tempo de retenção 3,02 min (ES+) m/z 1242 ([M+ H]+., ~35 % de intensidade relativa). [NOTA: Em algumas ocasiões, o progresso da reação foi interrompido, entretanto, a reação foi direcionada à conclusão após a adição de CuSO4.5H2O adicional (0,05 equivalentes) e L-ascorbato de (+)-sódio (0,2 equivalentes)]. A mistura de reação foi particionada (sem agitação do funil de separação) entre água (50 mL) e EtOAc (50 mL). A fase aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 20 mL) e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (20 mL), salmoura (30 mL), secas (MgSO4), filtradas e evaporadas a vácuo para fornecer o produto bruto 5 como uma espuma verde (817 mg, 80 % de rendimento bruto). O produto bruto foi levado à etapa seguinte sem purificação adicional: RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) (mistura de 3 diastereoisômeros) δ 7,98-7,83 (m, 3H), 7,55-7,48 (br s, 1H), 7,31-7,22 (m, 2H), 6,96 (br s, 1H), 6,57 (s, 1H), 5,85-5,78 (m, 1H), 5,72-5,68 (m, 1H), 5,18-4,94 (m, 6H), 4,60-4,50 (m, 2H), 3,93-3,80 (m, 12H), 3,73-3,40 (m, 12H), 2,13-1,80 (m, 8H), 1,71-1,10 (m, 30H).
[0632] (d) 8,8’-(((5-(1-(18-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-13-oxo-3,6,9- trioxa-12-azaoctadecil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(7- metóxi-5-oxo-11-((tetra-hidro-2H-piran-2-il)óxi)-2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]-benzodiazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila (6).
Figure img0073
[0633] Éster de N-hidroxissuccinimida do ácido 6-maleimidohexanoico sólido (136 mg, 0,44 mmol) foi adicionado a uma solução agitada da amina primária 5 (523 mg, 0,42 mmol) em DCM seco (10 mL) na temperatura ambiente. O progresso foi monitorado através de LC/MS (Método A) e depois de 3 dias, a agitação da reação não foi continuada, uma quantidade substancial de produto desejado foi observada no tempo de retenção 3,48 min (ES+) m/z 1434 ([M+ H]+., ~30 % de intensidade relativa) acompanhada por um pico de ombro no tempo de retenção 3,40 min e material de partida não reagido no tempo de retenção 3,02 min. A mistura de reação foi tratada com gel de sílica e o solvente removido através de evaporação a vácuo. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia instantânea (eluição por gradiente: DCM 100 % a 97:3 v/v DCM/MeOH) para fornecer a maleimida 6 como uma espuma branca (253 mg, 42 % de rendimento): RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) (mistura de 3 diastereoisômeros) δ 8,05-7,99 (m, 1H), 7,92-7,87 (m, 2H), 7,56, 7,55 e 7,53 (sx3, 1H), 7,26 e 7,22 (sx2, 2H), 6,94 (s, 1H), 6,66 (s, 2H), 6,58 (s, 1H), 6,04 (br s, 1H), 5,80 (d, 1H, J = 6,88 Hz), 5,70 (d, 1H, J = 9,16 Hz), 5,24-4,94 (m, 6H), 4,60 (t, 2H, J = 4,68 Hz), 3,95-3,86 (m, 10H), 3,69-3,37 (m, 22H), 2,15-1,97 (m, 10H), 1,75-1,22 (m, 36H); RMN de 13C (100 MHz, CDCl3) (mistura de 3 diastereoisômeros) δ 172,8, 170,8, 167,6, 167,4, 149,1, 137,9, 134,1, 129,8, 124,2, 115,8, 115,6, 110,3, 95,8, 71,1, 70,8, 70,6, 70,5 (x2), 70,2, 69,9, 69,5, 63,4, 60,2, 56,1, 53,4, 50,5, 46,4, 39,1, 37,7, 36,3, 31,4, 30,9, 29,2, 28,9, 28,3, 28,1, 26,4, 25,3 (x2), 25,1, 23,3, 23,2, 19,9.
[0634] (e) N-(2-(2-(2-(2-(4-(3,5-bis((((S)-7-metóxi-5-oxo-2,3,5,11a-tetra-hidro- 1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)óxi)metil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1- il)etóxi)etóxi)etóxi)etil)-6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanamida (7).
Figure img0074
[0635] Uma solução de 95:5 v/v TFA/H2O (3 mL) foi adicionado a uma amostra do composto Boc/THP-protegido 6 (253 mg, 0,18 mmol) a 0 °C (gelo/acetona). Depois da agitação a 0 °C durante 1 hora, a reação foi considerada concluída, conforme mostrado através de LC/MS (Método A), pico do produto desejado no tempo de retenção 2,63 min (ES+) m/z 1030 ([M+ H]+., ~30 % de intensidade relativa). A mistura de reação foi mantida fria e adicionada às gotas a uma solução aquosa saturada esfriada de NaHCO3 (50 mL). A mistura foi extraída com DCM (3 x 15 mL) e as camadas orgânicas combinadas lavadas com salmoura (20 mL), secas (MgSO4), filtradas e evaporadas a vácuo para fornecer o produto bruto. A purificação por cromatografia instantânea (eluição por gradiente: CHCl3 100 % a CHCl3/MeOH 97:3 v/v) forneceu o composto do título como uma espuma laranja (127 mg, 70 % de rendimento). Exemplo 2
Figure img0075
[0636] 8,8’-(((5-(3-aminoprop-1-in-1-il)-1,3- fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(7-metóxi-5-oxo-11-((tetra-hidro-2H-piran-2-il)óxi)- 2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila (8)
[0637] Uma quantidade catalítica de Pd(PPh3)4 (2,05 mg, 1,75 μmol) foi adicionada a uma mistura do bis-éter 2a (100 mg, 0,089 mmol), propargilamina (17 μL, 15 mg, 0,26 mmol), CuI (0,65 mg, 3,5 μmols), dietilamina (18 μL, 13 mg, 1,75 mmol) e pelotas de peneira molecular 4A secas em estufa em DMF seca (1,5 mL) em um vaso vedado seco em estufa. A mistura foi desgaseificada e fluxada com argônio 3 vezes, depois aquecida a 100 °C durante 2 horas no vaso vedado. Neste ponto, a análise através de LC/MS (Método C) revelou o consumo completo do material de partida e formação de produto substancial no tempo de retenção 1,36 min (ES+) m/z 1052,95 ([M+ H]+., 100 % de intensidade relativa). A mistura de reação foi esfriada até a temperatura ambiente e depois foi filtrada através de um sintetizador para remover as peneiras (lavadas com DMF). O filtrado foi evaporado a vácuo para fornecer produto bruto instável 8, que foi usado imediatamente na etapa seguinte sem purificação ou análise.
[0638] (b) 8,8’-(((5-(1-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-3,19-dioxo- 7,10,13,16-tetraoxa-4,20-diazatricos-22-in-23-il)-1,3- fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(7-metóxi-5-oxo-11-((tetra-hidro-2H-piran-2-il)óxi)- 2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila (9)
[0639] Ácido MAL-dPEG®4 (37 mg, 0,089 mmol) foi adicionado a uma solução agitada de EDCI (17 mg, 0,089 mmol) e a amina primária bruta 8 em DCM seco (4 mL) na temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada sob uma atmosfera de argônio durante 3 horas, ponto no qual a análise através de LC/MS (Método C) mostrou uma quantidade substancial do produto desejado no tempo de retenção 1,69 min (ES+) m/z 1450,55 ([M+ H]+., ~10 % de intensidade relativa), 1498 ([M+ Na]+., ~80 % de intensidade relativa). A mistura de reação foi diluída com DCM (30 mL) e lavada com H2O (3 x 10 mL), salmoura (20 mL), seca (MgSO4), filtrada e evaporada a vácuo para fornecer o produto bruto. A purificação por cromatografia instantânea (eluição por gradiente: DCM 100 % a DCM/MeOH 96:4 v/v) forneceu maleimida 9 como uma espuma (80 mg, 62 % de rendimento em 2 etapas).
[0640] (c) N-(3-(3,5-bis((((S)-7-metóxi-5-oxo-2,3,5,11a-tetra-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)metil)fenil)prop-2-in-1-il)-1-(3-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (10)
[0641] Uma solução de TFA/H2O 95:5 v/v (1 mL) foi adicionada a uma amostra do composto Boc/THP-protegido 9 (80 mg, 55 μmols) a 0 °C (gelo/acetona). Depois da agitação a 0 °C durante 1 hora, a reação foi considerada concluída, conforme mostrado através de LC/MS (Método C), pico do produto desejado no tempo de retenção 1,24 min (ES+) m/z 1046,35 ([M+ H]+., 100 % de intensidade relativa). A mistura de reação foi mantida fria e adicionada às gotas a uma solução aquosa saturada esfriada de NaHCO3 (50 mL). A mistura foi extraída com DCM (3 x 15 mL) e as camadas orgânicas combinadas lavadas com salmoura (40 mL), secas (MgSO4), filtradas e evaporadas a vácuo para fornecer o produto bruto. A purificação por cromatografia instantânea (eluição por gradiente: CHCl3 100 % a CHCl3/MeOH 96:4 v/v) forneceu 10 como um sólido laranja (9 mg, 16 % de rendimento). Exemplo 3
Figure img0076
[0642] 8,8’-(((5-(4-(tert-butoxicarbonil)piperazin-1-il)-1,3- fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(7-metóxi-5-oxo-11-((tetra-hidro-2H-piran-2-il)óxi)- 2,3,11,11a-tetra-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila (11)
[0643] Uma quantidade catalítica de RuPhosPd (15,8 mg, 0,019 mmol) foi adicionado a uma mistura do bis-éter 2c (200 mg, 0,19 mmol), 1-Boc-piperazina (39,6 mg, 0,21 mmol), CsCO3 (157 mg, 0,48 mmol) e RuPhos (9 mg, 0,019 mmol) em THF seco (4 mL) em um vaso vedado seco em estufa. A mistura foi desgaseificada e fluxada com argônio 3 vezes, depois aquecida em um Drysyn pré- aquecido a 85 °C durante 2 h possibilitando o aumento da pressão no frasco. Neste ponto, a análise através de LC/MS (Método C) revelou o consumo completo do material de partida e formação de produto substancial no tempo de retenção 1,97 min (ES+) m/z 1083,45 ([M+ H]+., 5 % de intensidade relativa). A mistura de reação foi esfriada até a temperatura ambiente e diluída com acetato de etila (50 mL). Os orgânicos foram lavados com H2O (2 x 25 mL) e salmoura (25 mL), e antes foram secos em MgSO4, filtrados e os voláteis removidos sob pressão reduzida. O material bruto foi purificado através de cromatografia em coluna em gel de sílica (eluição por gradiente: CHCl3 100 % a CHCl3/MeOH 9:1 v/v) e isolado puro como uma espuma branca (210 mg, 91 % de rendimento).
[0644] (b) (11aS,11a’S)-8,8’-(((5-(piperazin-1-il)-1,3- fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(7-metóxi-2,3-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepin-5(11aH)-ona) (12)
[0645] Uma solução de TFA/H2O 95:5 v/v (1 mL) foi adicionada a uma amostra do composto Boc/THP-protegido 11 (100 mg, 0,084 mmol) a 0 °C (gelo/água). Depois da agitação a 0 °C durante 1 hora, a reação foi considerada concluída, conforme mostrado através de LC/MS (Método C), pico do produto desejado no tempo de retenção 1,02 min (nenhuma ionização observada para este composto). A mistura de reação foi mantida fria e adicionada às gotas a uma solução aquosa saturada esfriada de NaHCO3 (50 mL). A mistura foi extraída com DCM (3 x 15 mL) e as camadas orgânicas combinadas, lavadas com salmoura (40 mL), secas (MgSO4), filtradas e evaporadas a vácuo para fornecer o produto bruto que foi usado na etapa seguinte.
[0646] (c) N-(15-(4-(3,5-bis((((S)-7-metóxi-5-oxo-2,3,5,11a-tetra-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)metil)fenil)piperazin-1-il)-15-oxo-3,6,9,12- tetraoxapentadecil)-3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamida (13)
[0647] Ácido MAL-dPEG®4 (35 mg, 0,084 mmol) foi adicionado a uma solução agitada de EDCI (16 mg, 0,084 mmol) e a amina primária bruta 12 em DCM seco (3 mL) na temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada sob uma atmosfera de argônio durante 3 horas, ponto no qual a análise através de LC/MS (Método C) mostrou uma quantidade substancial do produto desejado no tempo de retenção 1,24 min (ES+) m/z 1077,40 ([M+ H]+., 90 % de intensidade relativa). A mistura de reação foi diluída com DCM (30 mL) e lavada com H2O (3 x 10 mL), salmoura (20 mL), seca (MgSO4), filtrada e evaporada a vácuo para fornecer o produto bruto. A purificação por UPLC preparatória (eluição por gradiente: H2O/CH3CN 87:13 v/v a H2O/CH3CN 15:75 v/v durante 11 min) forneceu o produto final 13 como um óleo marrom claro (4,7 mg, 5 % de rendimento em 2 etapas). Exemplo 4
[0648] (S)-(2-amino-5-metóxi-4-((triisopropilsilil)óxi)fenil)(2-(((terc- butiladimetilsilil)óxi)metil)-4-metil-2,3-di-hidro-1H-pirrol-1-il)metanona (17)
Figure img0077
[0649] trifluorometanossulfonato de (S)-5-(((terc-butiladimetilsilil)óxi)metil)-1- (5-metóxi-2-nitro-4-((triisopropilsilil)óxi)benzoil)-4,5-di-hidro-1H-pirrol-3-ila (15)
[0650] Anidrido tríflico (26 mL, 155 mmols, 3 eq) foi injetado (temperatura controlada) a uma suspensão vigorosamente agitada de cetona 14 (30 g, 52 mmols, 1 eq) em diclorometano seco (500 mL) na presença de 2,6-lutidina (24 mL, 207 mmols, 4 eq, seca em peneiras) a -50 °C (acetona/banho de gelo seco). A mistura de reação foi agitada durante 1 hora. Água foi adicionada à mistura de reação ainda fria, e a camada orgânica foi separada e lavada com bicarbonato de sódio saturado, salmoura e sulfato de magnésio. A fase orgânica foi filtrada e o excesso de solvente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo foi submetido a uma cromatografia instantânea em coluna (gel de sílica; acetato de etila/hexano 5 %). As frações puras foram coletadas e combinadas, e o excesso de eluente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida fornecendo o produto 15 (31,5 g, 86 %). LC/MS, método B, 4,32 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 712,89 ([M + H]+., 100); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,71 (s, 1H), 6,75 (s, 1H), 6,05 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 4,78 (dd, J = 9,8, 5,5 Hz, 1H), 4,15 - 3,75 (m, 5H), 3,17 (ddd, J = 16,2, 10,4, 2,3 Hz, 1H), 2,99 (ddd, J = 16,3, 4,0, 1,6 Hz, 1H), 1,45 - 1,19 (m, 3H), 1,15 - 1,08 (m, 18H), 1,05 (s, 6H), 0,95 - 0,87 (m, 9H), 0,15 - 0,08 (m, 6H).
[0651] (ii) (S)-(2-(((terc-butiladimetilsilil)óxi)metil)-4-metil-2,3-di-hidro-1H- pirrol-1-il)(5-metóxi-2-nitro-4-((triisopropilsilil)óxi)fenil)metanona (16)
[0652] Trifenilarsina (1,71 g, 5,60 mmols, 0,4 eq) foi adicionado a uma mistura de triflato 15 (10,00 g, 14 mmols, 1eq), ácido metilborônico (2,94 g, 49,1 mmols, 3,5 eq), óxido de prata (13 g, 56 mmols, 4 eq) e fosfato de potássio tribásico (17,8 g, 84 mmols, 6 eq) em dioxano seco (80 mL) sob uma atmosfera de argônio. A reação foi fluxada com argônio 3 vezes, e cloreto de bis(benzonitrila)paládio(II) (540 mg, 1,40 mmol, 0,1 eq) foi adicionado. A reação foi fluxada com argônio mais 3 vezes antes de ser aquecida instantaneamente a 110 °C. Depois de 10 minutos, a reação foi esfriada até a temperatura ambiente e filtrada através de uma almofada de celite. O solvente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia instantânea em coluna (gel de sílica; acetato de etila/hexano 10 %). As frações puras foram coletadas e combinadas, e o excesso de eluente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida fornecendo o produto 16 (4,5 g, 55 %). LC/MS, método B, 4,27 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 579,18 ([M + H]+., 100); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,70 (s, 1H), 6,77 (s, 1H), 5,51 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 4,77 - 4,59 (m, 1H), 3,89 (s, 3H), 2,92 - 2,65 (m, 1H), 2,55 (d, J = 14,8 Hz, 1H), 1,62 (d, J = 1,1 Hz, 3H), 1,40 - 1,18 (m, 3H), 1,11 (s, 9H), 1,10 (s, 9H), 0,90 (s, 9H), 0,11 (d, J = 2,3 Hz, 6H).
[0653] (iii) (S)-(2-amino-5-metóxi-4-((triisopropilsilil)óxi)fenil)(2-(((terc- butiladimetilsilil)óxi)metil)-4-metil-2,3-di-hidro-1H-pirrol-1-il)metanona (17)
[0654] Pó de zinco (5,6 g, 86 mmols, 5 eq) foi adicionado a uma solução de composto 3 (10 g, 17,3 mmols) em ácido fórmico 5 % em metanol v/v (100 mL) em torno de 15 °C. Depois de 30 minutos, a mistura de reação foi filtrada através de uma almofada de celite. O filtrado foi diluído com acetato de etila e a fase orgânica foi lavada com água, bicarbonato de sódio aquoso saturado e salmoura. A fase orgânica foi seca em sulfato de magnésio, filtrada e o excesso de solvente removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia em coluna instantânea (gel de sílica; acetato de etila 10 % em hexano). As frações puras foram coletadas e combinadas e o excesso de solvente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 17 (5,1 g, 80 %). LC/MS, método B, 4,23 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 550,21 ([M + H]+., 100); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,28 (s, 1H), 6,67 (s, 1H), 6,19 (s, 1H), 4,64 - 4,53 (m, J = 4,1 Hz, 1H), 4,17 (s, 1H), 3,87 (s, 1H), 3,77 - 3,69 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 2,71 - 2,60 (m, 1H), 2,53 - 2,43 (m, 1H), 2,04 - 1,97 (m, J = 11,9 Hz, 1H), 1,62 (s, 3H), 1,26 - 1,13 (m, 3H), 1,08 - 0,99 (m, 18H), 0,82 (s, 9H), 0,03 - 0,03 (m, J = 6,2 Hz, 6H).
[0655] (b) 11-((terc-butiladimetilsilil)óxi)-8-hidróxi-7-metóxi-2-metil-5-oxo- 11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-terc-butila (22)
Figure img0078
[0656] (2-(2-(((terc-butiladimetilsilil)óxi)metil)-4-metil-2,3-di-hidro-1H-pirrol- 1-carbonil)-4-metóxi-5-((triisopropilsilil)óxi)fenil)carbamato de (S)-terc-butila (18)
[0657] Dicarbonato de di-terc-butila (2,8 g, 12,90 mmols, 1,2 eq) foi fundido com amina 17 (5,9 g, 10,75 mmols) a 100 °C. Depois de 10 minutos, a conversão total foi observada e o resíduo foi submetido à cromatografia em coluna instantânea (gel de sílica; acetato de etila em hexano 5 %). As frações puras foram coletadas e combinadas e o excesso de solvente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 18 (6 g, 86 %). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,22 (s, 1H), 7,72 (s, 1H), 6,72 (s, 1H), 6,15 (s, 1H), 4,63 (s, 1H), 3,91 (s, 1H), 3,79 (s, 1H), 3,73 (s, 3H), 2,71 (dd, J = 16,1, 10,2 Hz, 1H), 2,60 - 2,46 (m, 1H), 1,64 (s, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,33 - 1,15 (m, 3H), 1,10 (s, 9H), 1,08 (s, 9H), 0,87 (s, 9H), 0,02 (s, 6H).
[0658] (ii) (2-(2-(hidroximetil)-4-metil-2,3-di-hidro-1H-pirrol-1-carbonil)-4- metóxi-5-((triisopropilsilil)óxi)fenil)carbamato de (S)-terc-butila (19)
[0659] 18 (9,87 g, 15,2 mmols) foi dissolvido em uma mistura de ácido acético/metanol/tetraidrofurano/água 7:1:1:2 (168:24:24:48 mL) e agitado na temperatura ambiente. Depois de 1 hora, a conversão completa foi observada. O solvente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com acetato de etila e lavado sequencialmente com água (2 x 500 mL), bicarbonato de sódio aquoso saturado (200 mL) e salmoura. A fase orgânica foi seca em sulfato de magnésio, filtrada e o excesso de acetato de etila removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto desejado 19 (7,91 g, 97 %). LC/MS, Método C, 2,13 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1092,45 [[2M +Na]+; RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,93 (s, 1H), 7,60 (s, 1H), 6,74 (s, 1H), 6,11 (s, 1H), 4,69 (br, 1H), 4,55 (br, 1H), 3,84 - 3,76 (m, 2H), 3,74 (s, 3H), 2,84 (dd, J = 16,6, 10,3 Hz, 1H), 2,19 (dd, J = 16,4, 4,0 Hz, 1H), 1,67 (s, 3H), 1,46 (s, 9H), 1,32 - 1,19 (m, 3H), 1,09 (s, 9H), 1,08 (s, 9H).
[0660] (iii) 11-hidróxi-7-metóxi-2-metil-5-oxo-8-((triisopropilsilil)óxi)-11,11a-di- hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-terc- butila (20)
[0661] Sulfóxido de dimetila (2,3 mL, 32,2 mmols, 2,5 eq) foi adicionado às gotas a uma solução de cloreto de oxalila (1,3 mL, 15,5 mmols, 1,2 eq) em diclorometano seco (70 mL) a -78 °C (banho de gelo seco/acetona) sob uma atmosfera de argônio. Depois de 10 minutos, uma solução de 19 (6,9 g, 12,9 mmols) em diclorometano seco (50 mL) foi adicionada lentamente com a temperatura ainda a -78 °C. Depois de 15 minutos, trietilamina (9 mL, seca em peneiras moleculares 4A, 64,5 mmols, 5 eq) foi adicionado às gotas e o banho de gelo seco/acetona foi removido. A mistura de reação foi atingiu a temperatura ambiente e foi extraída com ácido clorídrico frio (0,1 M), bicarbonato de sódio aquoso saturado e salmoura. A fase orgânica foi seca em sulfato de magnésio, filtrada e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 20 (4,36 g, 63 %). LC/MS, Método C, 2,01 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1087,45 ([2M + Na]+); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,17 (s, 1H), 6,70 (d, 1H), 6,65 (s, 1H), 5,74 - 5,61 (m, 1H), 4,03 (s, 1H), 3,82 (s, 3H), 3,75 (td, J = 9,9, 3,3 Hz, 1H), 2,94 (dd, J = 17,1, 10,2 Hz, 1H), 2,57 (d, J = 18,5 Hz, 1H), 1,75 (d, J = 7,5 Hz, 3H), 1,37 (s, 9H), 1,30 - 1,19 (m, 3H), 1,08 (s, 9H), 1,06 (s, 9H).
[0662] (iv) 11-((terc-butiladimetilsilil)óxi)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-8- ((triisopropilsilil)óxi)-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)- carboxilato de (11S,11aS)-terc-butila (21)
[0663] Terc-butiladimetilsililtriflato (6,5 mL, 28,39 mmols, 3 eq) foi adicionado a uma solução de composto 20 (5,04 g, 9,46 mmols) e 2,6-lutidina (4,4 mL, 37,86 mmols, 4 eq) em diclorometano seco (60 mL) a 0 °C sob argônio. Depois de 10 minutos, o banho frio foi removido e a mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura de reação foi extraída com água, bicarbonato de sódio aquoso saturado e salmoura. A fase orgânica foi seca em sulfato de magnésio, filtrada e o excesso foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 21 (5,18 g, 85 %). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,17 (s, 1H), 6,67 (s, 1H), 6,63 (s, 1H), 5,79 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,65 (td, J = 9,9, 3,8 Hz, 1H), 2,89 (dd, J = 16,9, 10,3 Hz, 1H), 2,35 (d, J = 16,7 Hz, 1H), 1,75 (s, 3H), 1,31 (s, 9H), 1,28 - 1,18 (m, 3H), 1,09 (s, 9H), 1,08 (s, 9H), 0,85 (s, 9H), 0,25 (s, 3H), 0,18 (s, 3H).
[0664] (v) 11-((terc-butiladimetilsilil)óxi)-8-hidróxi-7-metóxi-2-metil-5-oxo- 11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-terc-butila (22)
[0665] Acetato de lítio (800 mg, 7,73 mmols) foi adicionado a uma solução de composto 21 (5 g, 7,73 mmols) em dimetilformamida úmida (50 mL, DMF/água 50:1). Depois de 2 horas, a reação foi concluída e a mistura de reação foi diluída com acetato de etila (250 mL) e lavada com solução de ácido cítrico aquosa (pH ~ 3), água e salmoura. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio, filtrada e o excesso de acetato de etila foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia em coluna instantânea (gel de sílica; gradiente, acetato de etila em hexano 25 % a 50 %). As frações puras foram coletadas, combinadas e o excesso de eluente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 22 (3,14 g, 83 %). LC/MS, Método C, (1,92 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 491,25 ([M+H]+). RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,20 (s, 1H), 6,68 (s, 2H), 6,08 (s, 1H), 5,81 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 3,91 (s, 3H), 3,71 (td, J = 9,8, 3,8 Hz, 1H), 2,89 (dd, J = 16,9, 10,3 Hz, 1H), 2,36 (d, J = 16,9 Hz, 1H), 1,75 (s, 3H), 1,31 (s, 9H), 0,85 (s, 9H), 0,23 (s, 3H), 0,21 (s, 3H).
[0666] (c) 8,8’-(((5-(1-amino-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxa-16-azanonadec-18-in- 19-il)-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(11-hidróxi-7-metóxi-2-metil-5-oxo-11,11a- di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de
Figure img0079
(i) 8,8’-(((5-iodo-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(11-((terc-butiladimetilsilil)óxi)- 7-metóxi-2-metil-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino- 10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila (23)
[0667] 1,3-bis(bromometil)-5-iodobenzeno (400 mg, 1,02 mmol) foi adicionado a uma solução agitada de 22 (1 g, 2,04 mmols, 2 eq), TBAI (38 mg, 0,102 mmol, 0,1eq) e K2CO3 (282 mg, 2,04 mmols, 2 eq) em DMF seca (10 mL). A mistura de reação foi aquecida a 60 °C e agitada sob uma atmosfera de argônio durante 2 horas, ponto no qual a análise através de TLC mostrou a conversão total. A mistura de reação foi esfriada até a temperatura ambiente e a DMF foi removida pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi diluído em EtOAc e lavado com água, salmoura. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio, filtrada e o excesso de acetato de etila foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia em coluna instantânea (gel de sílica; gradiente, acetato de etila em hexano 50 % a 80 %). As frações puras foram coletadas e combinadas e o excesso de eluente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 22 (1,27 g, quant.). LC/MS, Método C, (2,38 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1232,35. ([M+Na]+), RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,75 (s, 2H), 7,50 (s, 1H), 7,24 (s, 2H), 6,67 (s, 2H), 6,51 (s, 2H), 5,78 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 5,03 (dd, J = 34,2, 12,8 Hz, 4H), 3,93 (s, 6H), 3,68 (td, J = 9,8, 3,7 Hz, 2H), 2,89 (dd, J = 16,9, 10,3 Hz, 2H), 2,34 (d, J = 17,0 Hz, 2H), 1,75 (s, 6H), 1,22 (d, J = 8,5 Hz, 16H), 0,84 (s, 18H), 0,22 (s, 6H), 0,16 (s, 6H).
[0668] (ii) 8,8’-(((5-(2,2-dimetil-4,20-dioxo-3,8,11,14,17-pentaoxa-5,21- diazatetracos-23-in-24-il)-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(11-((terc- butiladimetilsilil)óxi)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila (24)
[0669] Uma quantidade catalítica de Pd(PPh3)4 (22,8 mg, 19,9 μmols, 0,02 eq) foi adicionada a uma mistura de 23 (1,2 g, 0,995 mmol, 1 eq), I3 (400 mg, 0,995 mmol, 1 eq), CuI (7,6 mg, 39,6 μmols, 0,04 eq), dietilamina (0,20 mL, 1,99 mmol, 2 eq) e pelotas de peneira molecular 4A secas em estufa em DMF seca (1 mL). A mistura foi desgaseificada e fluxada com argônio 3 vezes, depois aquecida em um micro-ondas a 100 °C durante 10 minutos. DMF foi removida pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. A mistura de reação foi diluída em acetato de etila e lavada com água e salmoura. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio filtrado e o excesso de acetato de etila foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia em coluna instantânea (gel de sílica; metanol em diclorometano 5 %). As frações puras foram coletadas e combinadas e o excesso de eluente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 24 (1,17 g, 79 %). LC/MS, Método D, (2,43 min (ES+) m/z (intensidade relativa) nenhuma ionização; RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,49 (s, 1H), 7,47 (s, 2H), 7,24 (s, 2H), 6,68 (s, 2H), 6,56 (s, 2H), 5,79 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 5,04 (dd, J = 28,9, 12,3 Hz, 4H), 4,25 (d, J = 5,4 Hz, 2H), 3,93 (s, 6H), 3,79 - 3,56 (m, 16H), 3,52 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,29 (d, J = 5,0 Hz, 2H), 2,97 - 2,83 (m, 2H), 2,51 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 2,35 (d, J = 16,1 Hz, 2H), 1,76 (s, 6H), 1,43 (s, 9H), 1,22 (s, 18H), 0,85 (s, 18H), 0,22 (s, 6H), 0,17 (s, 6H).
[0670] (iii) 8,8’-(((5-(1-amino-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxa-16-azanonadec-18-in- 19-il)-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(11-hidróxi-7-metóxi-2-metil-5-oxo-11,11a- di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila (25) Terc-butiladimetilsililtriflato (0,77 mL, 3,37 mmols, 10 eq) foi adicionado a uma solução de composto 24 (500 g, 0,337 mmol) e 2,6-lutidina (0,51 mL, 4,38 mmols, 12 eq) em diclorometano seco (10 mL). A reação foi agitada durante 12 horas na temperatura ambiente. A mistura de reação foi lavada com cloreto de amônio aquoso saturado e salmoura. A fase orgânica foi seca em sulfato de magnésio, filtrado e o excesso de solvente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o intermediário carbamato de TBS. O resíduo foi dissolvido em tetraidrofurano (10mL) e uma mistura de fluoreto de tetra-n-butilamônio (1M, 1,7 mL, 1,685 mmol, 5 eq) e ácido acético (0,1 mL, 1,685 mmol, 5 eq) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada 3 horas na temperatura ambiente; depois lavada com água, bicarbonato de sódio aquoso saturado e salmoura. A fase orgânica foi seca em sulfato de magnésio, filtrado e o excesso de solvente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer 25 como produto bruto. LC/MS, Método D, (1,27 min (ES+) m/z (intensidade relativa)1155,30. ([M+H]+)).
[0671] (d) N-(3-(3,5-bis((((S)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)metil)fenil)prop-2-in-1-il)-1-(3-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida 27 [SG3376]
Figure img0080
[0672] 8,8’-(((5-(1-(2, 5-dioxo-2,5-di-hidro- 1H-pirrol- 1-il)-3,19-dioxo- 7,10,13,16-tetraoxa-4,20-diazatricos-22-in-23-il)-1,3- fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(11-hidróxi-7-metóxi-2-metil-5-oxo-11,11a-di-hidro- 1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila 26
[0673] EDCI (65 mg, 0,34 mmol, 1 eq) foi adicionado a uma solução de produto bruto 25 (0,34 mmol, 1 eq) e ácido 3-maleimidopropiônico (57,5 mg, 0,34 mmol, 1 eq) em diclorometano (10 mL). A reação foi agitada na temperatura ambiente durante 12 horas depois de que a conversão total foi observada através de LCMS. A mistura de reação foi diluída em diclorometano e lavada com água e salmoura. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio filtrado e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o composto 26 como produto bruto. LC/MS, Método D, (1,49 min (ES+) m/z (intensidade relativa) nenhuma ionização).
[0674] (ii) N-(3-(3,5-bis((((S)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)metil)fenil)prop-2-in-1-il)-1-(3-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida 27
[0675] Ácido trifluoroacético (9,5 mL) foi adicionado a uma mistura de produto bruto 26 (0,337 mmol) em água (0,5 mL) a 0 °C. A reação foi agitada 2 horas a 0 °C. Depois, a mistura de reação foi adicionada às gotas em bicarbonato de sódio aquoso saturado frio. A mistura de reação foi extraída com diclorometano. A camada orgânica depois foi lavada com salmoura, seca em sulfato de magnésio filtrado e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia em coluna instantânea (gel de sílica; gradiente; metanol em diclorometano 2 a 5 %). As frações puras foram coletadas e combinadas e o excesso de eluente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 27 (70,4 mg, 20 %). LC/MS, Método E, (4,96 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1070,25. ([M+H]+); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,78 (d, J = 4,0 Hz, 2H), 7,52 (s, 2H), 7,44 (s, 2H), 7,40 (s, 1H), 7,02 - 6,93 (m, 1H), 6,88 (s, 1H), 6,77 (s, 2H), 6,74 (s, 2H), 6,65 (s, 2H), 5,22 - 5,01 (m, 4H), 4,31 - 4,15 (m, 4H), 3,94 (s, 6H), 3,89 - 3,72 (m, 4H), 3,65 - 3,54 (m, 10H), 3,54 - 3,45 (m, 4H), 3,43 - 3,34 (m, 2H), 3,25 - 3,12 (m, 2H), 2,94 (dd, J = 27,0, 10,2 Hz, 2H), 2,51 (dd, J = 13,6, 6,7 Hz, 4H), 1,83 (s, 6H).
[0676] (e) N-(3-(3,5-bis((((S)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)metil)fenil)prop-2-in-1-il)-1-(2- iodoacetamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida 29 [SG3378]
Figure img0081
[0677] 8,8’-(((5-(1-iodo-2,18-dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3,19-diazadocos-21-in- 22-il)-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(11-hidróxi-7-metóxi-2-metil-5-oxo-11,11a- di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila 28
[0678] Iodoanidrido acético (53 mg, 0,150 mmol, 1 eq) foi adicionado a uma solução de produto bruto 25 (0,150 mmol, 1 eq) em diclorometano (5 mL). A reação foi agitada na temperatura ambiente durante 20 minutos, depois de que a conversão total foi observada através de LCMS. A mistura de reação foi diluída em diclorometano e lavada com água. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio filtrado e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o composto 28 como produto bruto. LC/MS, Método D, (1,50 min (ES+) m/z (intensidade relativa) nenhuma ionização).
[0679] (ii) N-(3-(3,5-bis((((S)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)metil)fenil)prop-2-in-1-il)-1-(2- iodoacetamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida 29
[0680] Ácido trifluoroacético (0,45 mL) foi adicionado a uma mistura de produto bruto 28 (0,337 mmol) em água (0,05 mL) a 0 °C. A reação foi agitada 30 minutos a 0 °C. Depois, a mistura de reação foi adicionada às gotas em bicarbonato de sódio aquoso saturado frio. A mistura de reação foi extraída com diclorometano. A camada orgânica depois foi lavada com salmoura, seca em sulfato de magnésio filtrado e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia em coluna instantânea (gel de sílica; gradiente; metanol em diclorometano 2 a 5 %). As frações puras foram coletadas e combinadas e o excesso de eluente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 29 (4,23 mg, 5 %). LC/MS, Método D, (1,35 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1087,20 ([M+H]+); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,79 (d, J = 4,0 Hz, 2H), 7,53 (s, 2H), 7,45 (s, 3H), 7,07 (br, 1H), 6,94 (br, 1H), 6,78 (s, 2H), 6,73 (s, 2H), 5,15 (q, J = 12,6 Hz, 4H), 4,32 - 4,19 (m, 4H), 3,96 (s, 6H), 3,76 (dd, J = 12,0, 6,4 Hz, 2H), 3,69 (s, 2H), 3,64 (d, J = 3,6 Hz, 8H), 3,60 (s, 4H), 3,55 - 3,49 (m, 2H), 3,42 (dd, J = 10,3, 5,2 Hz, 2H), 3,23 - 3,11 (m, 2H), 3,00 - 2,89 (m, 2H), 2,53 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 1,83 (s, 6H). Exemplo 5
[0681] 8,8’-(((5-(1-(20-amino-3,6,9,12,15,18-hexaoxaicosil)-1H-1,2,3-triazol- 4-il)-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(11-((terc-butiladimetilsilil)óxi)-7-metóxi-2- metil-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)- carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila 32
Figure img0082
[0682] 8,8’-(((5-((trimetilsilil)etinil)-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(11- ((terc-butiladimetilsilil)óxi)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)- di-terc-butila 30
[0683] Uma quantidade catalítica de Pd(PPh3)4 (11 mg, 0,01 mmol, 0,02 eq) foi adicionada a uma mistura de 23 (600 mg, 0,496 mmol), TMS-acetileno (0,21 mL, 1,488 mmol, 3 eq), CuI (4,0 mg, 0,02 mmol, 0,04 eq), dietilamina (0,1 mL, 0,992 mmol, 2 eq) e pelotas de peneira molecular 4A secas em estufa em DMF seca (4 mL). A mistura foi desgaseificada e fluxada com argônio 3 vezes, depois aquecida em um micro-ondas a 100 °C durante 10 minutos. DMF foi removida pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. A mistura de reação foi diluída em acetato de etila e lavada com água e salmoura. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio filtrado e o excesso de acetato de etila foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia em coluna instantânea (gel de sílica; acetato de etila em hexano 50 %). As frações puras foram coletadas e combinadas e o excesso de eluente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 30 (530 mg, 91 %). LC/MS, Método C, (2,45 min (ES+); nenhuma ionização); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,52 (s, 1H), 7,49 (s, 2H), 7,23 (s, 2H), 6,67 (s, 2H), 6,54 (s, 2H), 5,78 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 5,06 (dd, J = 41,6, 12,8 Hz, 4H), 3,93 (s, 6H), 3,68 (td, J = 9,8, 3,7 Hz, 2H), 2,90 (dd, J = 17,0, 10,4 Hz, 2H), 2,35 (d, J = 17,0 Hz, 2H), 1,76 (s, 6H), 1,20 (s, 18H), 0,84 (s, 18H), 0,22 (s, 15H), 0,17 (s, 6H).
[0684] (ii) 8,8’-(((5-etinil-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(11-((terc- butiladimetilsilil)óxi)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila 31
[0685] K2CO3 sólido (124 mg, 0,90 mmol, 2 eq) foi adicionado a uma solução agitada de o composto TMS-protegido 30 (530 mg, 0,449 mmol) em MeOH (10 mL). Depois de 1 hora de agitação na temperatura ambiente, a reação foi concluída. Metanol foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. A mistura de reação foi diluída em diclorometano e lavada com água e salmoura. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio filtrado e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 31 (477 mg, 95 %). LC/MS, Método C, (2,32 min (ES+); nenhuma ionização); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,53 (s, 3H), 7,24 (s, 2H), 6,68 (s, 2H), 6,54 (s, 2H), 5,79 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 5,07 (dd, J = 33,2, 12,8 Hz, 4H), 3,93 (s, 6H), 3,69 (td, J = 9,7, 3,6 Hz, 2H), 3,08 (s, 1H), 2,90 (dd, J = 16,9, 10,3 Hz, 2H), 2,35 (d, J = 16,8 Hz, 2H), 1,76 (s, 6H), 1,25 - 1,13 (m, 18H), 0,85 (s, 18H), 0,22 (s, 6H), 0,16 (m, 6H).
[0686] (iii) 8,8’-(((5-(1-(20-amino-3,6,9,12,15,18-hexaoxaicosil)-1H-1,2,3- triazol-4-il)-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(11-((terc-butiladimetilsilil)óxi)-7- metóxi-2-metil-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)- carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila 32
[0687] CuSO4.5H2O sólido (5 mg, 0,021 mmol, 0,05 eq) e L-ascorbato de (+)- sódio (17,0 mg, 0,086 mmol, 0,2 eq) foram adicionados a uma solução agitada de 20-azido-3,6,9,12,15,18-hexaoxaicosan-1-amina (151 mg, 0,43 mmol, 1 eq) e o alcino 31 (477 mg, 0,43 mmol 1 eq) em terc-BuOH (5 mL) e H2O (5 mL) na temperatura ambiente. A mistura foi desgaseificada e fluxada com argônio. Depois da agitação durante 2 horas, a reação foi concluída. A mistura de reação foi diluída em acetato de etila e lavada com água e salmoura. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio filtrado e o excesso de acetato de etila foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 32 (640 mg, quant). LC/MS, Método C, (1,67 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1457,35 ([M+H]+)); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,10 (s, 1H), 7,93 (br, 3H), 7,54 (s, 1H), 7,25 (s, 2H), 6,68 (s, 2H), 6,62 (s, 2H), 5,79 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 5,14 (dd, J = 30,6, 11,8 Hz, 4H), 4,68 - 4,59 (m, 2H), 4,00 - 3,94 (m, 2H), 3,94 (s, 6H), 3,75 - 3,47 (m, 24H), 2,91 (dd, J = 16,9, 10,3 Hz, 2H), 2,35 (d, J = 16,7 Hz, 2H), 1,76 (s, 6H), 1,31 - 1,11 (m, 18H), 0,85 (d, J = 8,1 Hz, 18H), 0,20 (s, 6H), 0,16 (s, 6H).
[0688] (b) N-(20-(4-(3,5-bis((((S)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)metil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)- 3,6,9,12,15,18-hexaoxaicosil)-3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamida (34) [SG3387]
Figure img0083
[0689] 8,8’-(((5-(1-(24-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-22-oxo- 3,6,9,12,15,18-hexaoxa-21-azatetracosil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)-1,3- fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(11-((terc-butiladimetilsilil)óxi)-7-metóxi-2-metil-5- oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila 33
[0690] EDCI (40 mg, 0,21 mmol, 1 eq) foi adicionado a uma solução de 32 (300 mg, 0,206 mmol, 1 eq) e ácido 3-maleimidopropiônico (35 mg, 0,21 mmol, 1 eq) em diclorometano (10 mL). A reação foi agitada na temperatura ambiente durante 12 horas depois de que conversão total foi observada através de LCMS. A mistura de reação foi diluída em diclorometano e lavada com água e salmoura. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio filtrado e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o composto 33 como produto bruto (320 mg, quant), LC/MS, Método C, (2,13 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1609,55([M+H]+).
[0691] (ii) N-(20-(4-(3,5-bis((((S)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)metil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)- 3,6,9,12,15,18-hexaoxaicosil)-3-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanamida 34
[0692] Ácido trifluoroacético (19 mL) foi adicionado a uma mistura de produto bruto 33 (0,186 mmol) em água (1 mL) a 0 °C. A reação foi agitada 30 minutos a 0 °C. Depois, a mistura de reação foi adicionada às gotas em bicarbonato de sódio aquoso saturado frio (~2 L). A mistura de reação foi extraída com diclorometano (~1 L). A camada orgânica depois foi lavada com salmoura, seca em sulfato de magnésio, filtrada e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia em coluna instantânea (gel de sílica; gradiente; metanol em diclorometano 2 a 10 %). As frações puras foram coletadas e combinadas e o excesso de eluente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 34 (56 mg, 26 %). LC/MS, Método E, (4,99 min (ES+) m/z (intensidade relativa)1144,35 ([M+H]+); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,01 (s, 1H), 7,86 (s, 2H), 7,75 (d, J = 3,9 Hz, 2H), 7,50 (s, 2H), 7,48 (s, 1H), 6,81 (s, 2H), 6,71 (s, 2H), 6,65 (s, 2H), 6,39 (br, 1H), 5,21 (q, J = 12, 4 Hz, 4H), 4,58 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 4,25 - 4,17 (m, 2H), 3,96 - 3,87 (m, 8H), 3,85 - 3,77 (m, 2H), 3,65 - 3,43 (m, 22H), 3,37 (dd, J = 9,9, 4,8 Hz, 2H), 3,20 - 3,08 (m, 2H), 2,92 (dd, J = 16,9, 4,6 Hz, 2H), 2,49 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 1,81 (s, 6H).
[0693] (c) N-(20-(4-(3,5-bis((((S)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)metil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)- 3,6,9,12,15,18-hexaoxaicosil)-2-iodoacetamida 36 [SG3389]
Figure img0084
[0694] 8,8’-(((5-(1-(1-iodo-2-oxo-6,9,12,15,18,21-hexaoxa-3-azatricosan-23- il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(11-((terc- butiladimetilsilil)óxi)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila 35
[0695] Iodoanidrido acético (37 mg, 0,103 mmol, 1 eq) foi adicionado a uma solução de 32 (150 mg, 0,103 mmol, 1 eq) em diclorometano (5 mL). A reação foi agitada na temperatura ambiente durante 20 minutos depois de que a conversão total foi observada através de LCMS. A mistura de reação foi diluída em diclorometano e lavada com água. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio filtrado e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o composto 35 como produto bruto.
[0696] LC/MS, Método C, (2,17 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1625,35 ([M+H]+).
[0697] (ii) N-(20-(4-(3,5-bis((((S)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)metil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)- 3,6,9,12,15,18-hexaoxaicosil)-2-iodoacetamida 36
[0698] Ácido trifluoroacético (4,95 mL) foi adicionado a uma mistura de produto bruto 35 (0,103 mmol) em água (0,05 mL) a 0 °C. A reação foi agitada 30 minutos a 0 °C. Depois, a mistura de reação foi adicionada às gotas em bicarbonato de sódio aquoso saturado frio (200 mL). A mistura de reação foi extraída com diclorometano. A camada orgânica depois foi lavada com salmoura, seca em sulfato de magnésio, filtrada e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia em coluna instantânea (gel de sílica; gradiente; metanol em diclorometano 2 a 10 %). As frações puras foram coletadas e combinadas e o excesso de eluente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 36 (32 mg, 27 %). LC/MS, Método E, (5,16 min (ES+) m/z (intensidade relativa)1161,10 ([M+H]+); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,03 (s, 1H), 7,87 (s, 2H), 7,76 (d, J = 3,9 Hz, 2H), 7,51 (s, 2H), 7,48 (s, 1H), 6,95 (br, 1H), 6,82 (s, 2H), 6,72 (s, 2H), 5,21 (q, J = 12,4 Hz, 4H), 4,59 - 4,58 (m, 2H), 4,24 - 4,20 (m, 2H), 3,96 - 3,87 (m, 8H), 3,70 (s, 2H), 3,66 - 3,47 (m, 22H), 3,41 (dd, J = 10,3, 5,2 Hz, 2H), 3,19 - 3,07 (m, 2H), 2,98 - 2,85 (m, 2H), 1,78 (d, J = 22,4 Hz, 6H). Exemplo 6
[0699] N-(20-(4-(3,5-bis((((S)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)metil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)- 3,6,9,12,15,18-hexaoxaicosil)pent-4-inamida (38)
Figure img0085
[0700] 8,8’-(((5-(1-(22-oxo-3,6,9,12,15,18-hexaoxa-21-azahexacos-25-in-1- il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))bis(11-((terc- butiladimetilsilil)óxi)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de (11S,11aS,11’S,11a’S)-di-terc-butila 37
[0701] EDCI (20 mg, 0,103 mmol, 1 eq) foi adicionado a uma solução de 32 (150 mg, 0,103 mmol, 1 eq) e ácido pent-4-inoico (20 mg, 0,103 mmol, 1 eq) em diclorometano (5 mL). A reação foi agitada na temperatura ambiente durante 12 horas depois de que a conversão total foi observada através de LCMS. A mistura de reação foi diluída em diclorometano e lavada com água e salmoura. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio filtrado e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o composto 37 como produto bruto. LC/MS, método C, (2,16 min (ES+) m/z (intensidade relativa) nenhuma ionização).
[0702] (ii) N-(20-(4-(3,5-bis((((S)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)metil)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)- 3,6,9,12,15,18-hexaoxaicosil)pent-4-inamida 38
[0703] Ácido trifluoroacético (4,95 mL) foi adicionado a uma mistura de produto bruto 37 (0,103 mmol) em água (0,05 mL) a 0 °C. A reação foi agitada 30 minutos a 0 °C. Depois, a mistura de reação foi adicionada às gotas em bicarbonato de sódio aquoso saturado frio (200 mL). A mistura de reação foi extraída com diclorometano. A camada orgânica depois foi lavada com salmoura, seca em sulfato de magnésio, filtrada e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia em coluna instantânea (gel de sílica; gradiente; metanol em diclorometano 2 a 10 %). As frações puras foram coletadas e combinadas e o excesso de eluente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 38 (40 mg, 36 %). LC/MS, método E, (5,11 min (ES+) m/z (intensidade relativa)1073,30 ([M+H]+); RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 8,01 (s, 1H), 7,87 (s, 2H), 7,77 (d, J = 3,8 Hz, 2H), 7,52 (s, 2H), 7,49 (s, 1H), 6,82 (s, 2H), 6,72 (s, 2H), 6,42 (s, 1H), 5,22 (q, J = 12,3 Hz, 4H), 4,59 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 4,28 - 4,17 (m, 2H), 3,99 - 3,88 (m, 8H), 3,57 (dt, J = 9,5, 8,0 Hz, 22H), 3,50 - 3,39 (m, 2H), 3,20 - 3,07 (m, 2H), 2,93 (dd, J = 16,7, 3,9 Hz, 2H), 2,51 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 2,39 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,01 (dd, J = 11,6, 5,4 Hz, 1H), 1,82 (s, 6H). Exemplo 7
Figure img0086
[0704] 8,8’-(((5-formil-1,3- fenileno)bis(metileno))bis(óxi))(11S,11aS,11’S,11a’S)-bis(11-((terc- butiladimetilsilil)óxi)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de di-terc-butila 40
[0705] 3,5-bis(bromometil)benzaldeído 39 (30 mg, 0,102 mmol) foi adicionado a uma solução agitada de 22 (100 mg, 0,204 mmol, 2 eq), TBAI (7 mg, 0,02 mmol, 0,1eq) e K2CO3 (28 mg, 0,204 mmol, 2 eq) em DMF seca (2 mL). A mistura de reação foi aquecida a 60 °C e agitada sob uma atmosfera de argônio durante 4 horas e 12 horas na temperatura ambiente. A mistura foi diluída em EtOAc e lavada com água, salmoura. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio, filtrada e o excesso de acetato de etila foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia em coluna instantânea (gel de sílica; gradiente, acetato de etila em hexano 50 % a 70 %). As frações puras foram coletadas e combinadas e o excesso de eluente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 40 (90 mg, 79 %). LC/MS, método C, (2,27 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1111,35. ([M+H]+), RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 10,05 (s, 1H), 7,95 (s, 2H), 7,86 (s, 1H), 7,26 (s, 2H), 6,69 (s, 2H), 6,58 (s, 2H), 5,80 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 5,17 (s, 4H), 3,94 (s, 6H), 3,72 - 3,68 (m, 2H), 2,91 (dd, J = 16,7, 10,3 Hz, 2H), 2,36 (d, J = 17,4 Hz, 2H), 1,77 (s, 6H), 1,25 (s, 18H), 0,84 (s, 18H), 0,22 (s, 6H), 0,15 (s, 6H).
[0706] (ii) ácido (E)-3-(3,5-bis((((11S,11aS)-10-(tert-butoxicarbonil)-11-((terc- butiladimetilsilil)óxi)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-5,10,11,11a-tetra-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)metil)fenil)acrílico 41
[0707] Ácido malônico (14 mg, 0,138 mmol, 2,2 eq) e composto 40 foram dissolvidos em uma mistura de piperidina (1 μL) e piridina (0,1 mL). A mistura de reação foi aquecida a 95 °C e agitada sob uma atmosfera de argônio durante 2 horas. A mistura foi diluída em EtOAc e lavada com água, salmoura. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio, filtrada e o excesso de acetato de etila foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à cromatografia em coluna instantânea (gel de sílica; gradiente, acetato de etila em hexano 50 % a 100 % seguido por MeOH em EtOAc 2 %). As frações puras foram coletadas e combinadas e o excesso de eluente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o produto 41 (50 mg, 53 %). LC/MS, método C, (2,21 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1153,35. ([M+H]+), RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) δ 7,73 (d, J = 15,9 Hz, 1H), 7,58 (s, 2H), 7,55 (s, 1H), 7,26 (s, 2H), 6,68 (s, 2H), 6,54 (s, 2H), 6,46 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 5,77 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 5,11 (dd, J = 27,4, 12,3 Hz, 4H), 3,94 (s, 6H), 3,68 (dd, J = 8,9, 6,4 Hz, 2H), 2,89 (dd, J = 16,8, 10,3 Hz, 2H), 2,34 (d, J = 16,7 Hz, 2H), 1,75 (s, 6H), 1,29 - 1,09 (m, 18H), 0,82 (s, 18H), 0,21 (s, 6H), 0,13 (s, 6H).
[0708] (iii) 8,8’-(((5-((E)-2,2-dimetil-4,15-dioxo-3,8,11-trioxa-5,14- diazaheptadec-16-en-17-il)-1,3- fenileno)bis(metileno))bis(óxi))(11S,11aS,11’S,11a’S)-bis(11-((terc- butiladimetilsilil)óxi)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de di-terc-butila 42
[0709] EDCI (9 mg, 0,045 mmol, 1 eq) foi adicionado a uma solução de 41 (50 mg, 0,043 mmol, 1 eq) e (2-(2-(2-aminoetóxi)etóxi)etil)carbamato de terc-butila (11 mg, 0,045 mmol, 1 eq) em diclorometano (2 mL). A reação foi agitada na temperatura ambiente durante 1 hora depois de que a conversão total foi observada através de LCMS. A mistura de reação foi diluída em diclorometano e lavada com água e salmoura. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio filtrado e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o composto 42 como produto bruto. LC/MS, método C, (2,29 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1384,35([M+H]+)).
[0710] (iv) 8,8’-(((5-((E)-3-((2-(2-(2-aminoetóxi)etóxi)etil)amino)-3-oxoprop-1- en-1-il)-1,3-fenileno)bis(metileno))bis(óxi))(11S,11aS,11’S,11a’S)-bis(11-((terc- butiladimetilsilil)óxi)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de di-terc-butila 43 Terc-butiladimetilsililtriflato (0,10 mL, 0,43 mmol, 10 eq) foi adicionado a uma solução de composto 42 (0,043 mmol) e 2,6-lutidina (0,07 mL, 0,56 mmol, 13 eq) em diclorometano seco (2 mL). A reação foi agitada durante 2 horas na temperatura ambiente. A mistura de reação foi lavada com cloreto de amônio aquoso saturado, água e salmoura. A fase orgânica foi seca em sulfato de magnésio, filtrada e o excesso de solvente foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer uma mistura de amina 43 e mono composto de TBS-desprotegido como produto bruto. LC/MS, método C, (1,72 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1283,35 ([M+H]+)).
[0711] (v) 8,8’-(((5-((E)-16-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)-3,14-dioxo- 7,10-dioxa-4,13-diazahexadec-1-en-1-il)-1,3- fenileno)bis(metileno))bis(óxi))(11S,11aS,11’S,11a’S)-bis(11-((terc- butiladimetilsilil)óxi)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-11,11a-di-hidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepino-10(5H)-carboxilato) de di-terc-butila 44
[0712] EDCI (9 mg, 0,045 mmol, 1 eq) foi adicionado a uma solução de 43 (0,043 mmol, 1 eq) e ácido 3-maleimidopropiônico (8 mg, 0,045 mmol, 1 eq) em diclorometano (2 mL). A reação foi agitada na temperatura ambiente durante 12 horas depois de que a conversão total foi observada através de LCMS. A mistura de reação foi diluída em diclorometano e lavada com água e salmoura. A camada orgânica foi seca em sulfato de magnésio filtrado e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida para fornecer o composto 44 como produto bruto, LC/MS, método C, (2,19 min (ES+) m/z (intensidade relativa) 1435,40([M+H]+).
[0713] (vi) (E)-3-(3,5-bis((((S)-7-metóxi-2-metil-5-oxo-5,11a-di-hidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)óxi)metil)fenil)-N-(2-(2-(2-(3-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)etóxi)etóxi)etil)acrilamida 45
[0714] Ácido trifluoroacético (4,95 mL) foi adicionado a uma mistura de produto bruto 44 (0,043 mmol) em água (0,05 mL) a 0 °C. A reação foi agitada 1 hora a 0 °C. Depois, a mistura de reação foi adicionada às gotas em bicarbonato de sódio aquoso saturado frio (100 mL). A mistura de reação foi extraída com diclorometano. A camada orgânica depois foi lavada com salmoura, seca em sulfato de magnésio, filtrada e o excesso de diclorometano foi removido pela evaporação rotatória sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi submetido à HPLC preparativa. As frações puras foram coletadas e combinadas e o excesso de eluente foi removido através de liofilização para fornecer o produto 45 (4,26 mg, 10 %). LC/MS, método C, (1,35 min (ES+) m/z (intensidade relativa)968,25 ([M+H]+). Exemplo 8 PROCEDIMENTO DE CONJUGAÇÃO DE ANTICORPO GERAL
[0715] Os anticorpos são diluídos entre 1 a 5 mg/mL em um tampão de redução (exemplos: solução salina tamponada com fosfato PBS, tampão histidina, tampão borato de sódio, tampão TRIS). Uma solução recém preparada de TCEP (cloridreto de tris(2-carboxietil)fosfina) é adicionada para reduzir seletivamente pontes dissulfeto de cisteína. A quantidade de TCEP é proporcional ao nível alvo de redução, dentro de 1 a 4 equivalentes molares por anticorpo, gerando 2 a 8 tióis reativos. Depois da redução durante várias horas a 37 °C, a mistura é resfriada até a temperatura ambiente e excesso de fármaco-ligador (7, 10) adicionado como uma solução de DMSO diluída (teor de DMSO final de até 10 % de volume/volume de mistura de reação). A mistura foi suavemente agitada a 4 °C ou na temperatura ambiente durante o tempo apropriado, em geral, 1 a 3 horas. O excesso de tióis reativos pode ser reagido com um “reagente de capeamento de tiol”, tal como N-etil maleimida (NEM) na extremidade da conjugação. Os conjugados de anticorpo- fármaco são concentrados usando filtros giratórios de centrífuga com um corte de peso molecular de 10 kDa ou maior, depois purificados por filtração de fluxo tangencial (TFF) ou Cromatografia Líquida de Proteína Rápida (FPLC). Os conjugados de anticorpo-fármaco correspondentes podem ser determinados por análise através de Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) ou Cromatografia Líquida de Ultra Alto Desempenho (UHPLC) para avaliar a razão fármaco-por-anticorpo (DAR) usando cromatografia em fase reversa (RP) ou Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC), acoplada com detecção Visível por UV, Fluorescência ou Espectrômetro de Massas; nível agregado e pureza do monômero podem ser analisados por HPLC ou UHPLC usando cromatografia de exclusão por tamanho acoplada com detecção Visível por UV, Fluorescência ou Espectrômetro de Massas. A concentração de conjugado final é determinada por uma combinação de ensaios espectroscópicos (absorvância a 280, 214 e 330 nm) e bioquímicos (ácido bicinconínico BCA; Smith, P.K., et al. (1985) Anal. Biochem. 150 (1): 76-85; usando um anticorpo IgG com concentração conhecida como referência). Conjugados de anticorpo-fármaco são, em geral, estéreis e filtrados usando filtros de 0,2 μm sob condições assépticas e armazenados a 4 °C, -20 °C ou -80 °C. Exemplos de conjugações particulares são descritos abaixo. Conjugado A (Ab-7, ConjA)
[0716] O anticorpo (Ab) (2,0 mg, 13,3 nanomols) foi diluído em 1,8 mL de um tampão de redução contendo borato de sódio 10 mM pH 8,4, EDTA 2,5 mM e uma concentração de anticorpo final de 1,11 mg/mL. Uma solução 10 mM de TCEP foi adicionada (2 equivalentes molares/anticorpo, 26,6 nanomols, 2,66 μL) e a mistura de redução foi aquecida a 37 °C durante 2,3 horas em um bloco de aquecimento. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, o composto 7 foi adicionado como uma solução de DMSO (3,5 equivalentes molares/anticorpo, 46,7 nanomols, em DMSO 0,2 mL). A solução foi misturada durante 1 hora na temperatura ambiente, depois a conjugação foi interrompida através da adição de N-etil maleimida (1 micromol, 10 μL a 100 mM) 15 minutos mais tarde por N-acetil cisteína (1,5 micromol, 15 μL a 100 mM), depois injetada em um AKTA™FPLC usando uma coluna GE Healthcare XK16/70 empacotada com Superdex 200 PG, eluindo com 1,5 mL/min de Solução salina tamponada com fosfato filtrada e estéril (PBS). Frações correspondentes ao pico de monômero de ConjA foram agrupadas, concentradas usando um filtro giratório Amicon Ultracell 50KDa MWCO 15mL, analisadas e filtradas e esterilizadas. O ensaio de BCA fornece uma concentração de ConjA final a 1,25 mg/mL em 1,4 mL, a massa obtida de ConjA é 1,75 mg (87 % de rendimento).
[0717] A análise por UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Phenomenex Aeris 3,6u XB-C18 150 x 2,1 mm eluindo com um gradiente de água e acetonitrila em uma amostra reduzida de ConjA a 280 nm e 330 nm (Composto 7 específico) mostra uma mistura de cadeias leves e pesadas ligadas a várias moléculas do composto 7, compatível com uma razão fármaco-por-anticorpo (DAR) de 2,8 moléculas do composto 7 por anticorpo.
[0718] A análise por UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Waters Acquity UPLC BEH200 SEC 1,7 um 4,6 x 150 mm eluindo com Solução salina tamponada com fosfato filtrada e esterilizada (PBS) contendo isopropanol 5 % (v/v) em uma amostra de ConjA a 280 nm mostra uma pureza de monômero de mais do que 99 % sem impureza detectada. Conjugado B (Ab-10, ConjB)
[0719] O anticorpo (Ab) (2,0 mg, 13,3 nanomols) foi diluído em 1,8 mL de um tampão de redução contendo borato de sódio 10 mM pH 8,4, EDTA 2,5 mM e uma concentração de anticorpo final de 1,11 mg/mL. Uma solução 10 mM de TCEP foi adicionada (2 equivalentes molares/anticorpo, 26,6 nanomols, 2,66 μL) e a mistura de redução foi aquecida a 37 °C durante 1,5 hora em um bloco de aquecimento. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, o composto 10 foi adicionado como uma solução de DMSO (3,5 equivalentes molares/anticorpo, 46,7 nanomols, em DMSO 0,2 mL). A solução foi misturada durante 2 horas na temperatura ambiente, depois a conjugação foi interrompida pela adição de N-etil maleimida (1 micromol, 10 μL a 100 mM), 15 minutos mais tarde por N-acetil cisteína (1,5 micromol, 15 μL a 100 mM), depois injetada em um AKTA™FPLC usando uma coluna GE Healthcare XK16/70 empacotada com Superdex 200 PG, eluindo com 1,5 mL/min de Solução salina tamponada com fosfato filtrada e esterilizada (PBS). As frações correspondentes ao pico de monômero de ConjB foram agrupadas, concentradas usando um filtro giratório de 15 mL Amicon Ultracell 50KDa MWCO, analisadas e filtradas e esterilizadas. O ensaio de BCA fornece uma concentração de ConjB final a 0,99 mg/mL em 1,4 mL, a massa obtida de ConjB é de 1,39 mg (70 % de rendimento).
[0720] A análise por UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Phenomenex Aeris 3,6u XB-C18 150 x 2,1 mm eluindo com um gradiente de água e acetonitrila em uma amostra reduzida de ConjB a 280 nm e 330 nm (Composto 10 específico) mostra uma mistura de cadeias leves e pesadas ligadas a várias moléculas do composto B, compatível com uma razão fármaco-por- anticorpo (DAR) de 3,8 moléculas do composto 10 por anticorpo.
[0721] A análise por UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Waters Acquity UPLC BEH200 SEC 1,7 um 4,6 x 150 mm eluindo com solução salina tamponada com fosfato filtrada e esterilizada (PBS) contendo isopropanol 5 % (v/v) em uma amostra de ConjB at 280 nm mostra uma pureza de monômero de mais do que 99 % sem impureza detectada. Conjugado C (Ab-27, ConjC)
[0722] O anticorpo (2,5 mg, 16,7 nanomols) foi diluído em 2,25 mL de um tampão de redução contendo borato de sódio 10 mM pH 8,4, EDTA 2,5 mM e uma concentração de anticorpo final de 1,11 mg/mL. Uma solução 10 mM de TCEP foi adicionada (1,65 equivalente molar/anticorpo, 27,5 nanomols, 2,75 mL) e a mistura de redução foi aquecida a 37 °C durante 1,6 hora em uma incubadora. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, o composto 27 foi adicionado como uma solução de DMSO (7,5 equivalentes molares/anticorpo, 125 nanomols, em DMSO 0,25 mL). A solução foi misturada durante 1,3 hora na temperatura ambiente, depois a conjugação foi interrompida pela adição de N-acetil cisteína (250 nanomols, 25 mL a 10 mM), depois injetada em um AKTA™ Pure FPLC usando uma coluna GE Healthcare HiLoadTM 26/600 empacotada com Superdex 200 PG, eluindo com 2,6 mL/min de solução salina tamponada com fosfato filtrada e esterilizada (PBS). As frações correspondentes ao pico de monômero ConjC foram agrupadas, concentradas usando um filtro giratório de 15 mL Amicon Ultracell 50KDa MWCO, analisadas e filtradas e esterilizadas.
[0723] A análise por UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Fenomenex Aeris 3,6u XB-C18 150 x 2,1 mm eluindo com um gradiente de água e acetonitrila em uma amostra reduzida de ConjC a 280 nm e 330 nm (composto 27 específico) mostra uma mistura de cadeias leves e pesadas ligadas a várias moléculas do composto 27, compatível com uma razão fármaco-por-anticorpo (DAR) de 2,56 moléculas do composto 27 por anticorpo.
[0724] A análise por UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Tosoh Bioscience TSKgel G3000SWXL 5 μm 7,8 x 300 mm (com uma coluna de proteção de 7 μm 6,0 x 40 mm) eluindo com tampão SEC filtrado e esterilizado contendo fosfato de potássio 200 mM pH 6,95, cloreto de potássio 250 mM e isopropanol 10 % (v/v) em uma amostra de ConjC a 280 nm mostra uma pureza de monômero de mais do que 99 % sem impureza detectada. A análise por UHPLC SEC fornece uma concentração de ConjC final a 0,77 mg/mL em 2,5 mL, a massa obtida de ConjC é 1,93 mg (77 % de rendimento). Conjugado D (Ab-29, ConjD)
[0725] O anticorpo (3,5 mg, 23,3 nanomols) foi diluído em 3,15 mL de um tampão de redução contendo borato de sódio 10 mM pH 8,4, EDTA 2,5 mM e uma concentração de anticorpo final de 1,11 mg/mL. Uma solução 10 mM de TCEP foi adicionada (2,0 equivalentes molares/anticorpo, 46,7 nanomols, 4,67 mL) e a mistura de redução foi aquecida a 37 °C durante 1,6 hora em uma incubadora. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, o composto 29 foi adicionado como uma solução de DMSO (10 equivalentes molares/anticorpo, 233 nanomols, em DMSO 0,175 mL). A solução foi misturada durante 3,9 horas na temperatura ambiente, ponto no qual mais composto 29 foi adicionado como uma solução de DMSO (10 equivalentes molares/anticorpo, 233 nanomols, em 0,175 mL DMSO) e a solução foi misturada durante um adicional de 19 horas na temperatura ambiente. A conjugação foi interrompida pela adição de N-acetil cisteína (933 nanomols, 93,3 mL a 10 mM), depois injetada em um AKTA™ Pure FPLC usando uma coluna GE Healthcare HiLoadTM 26/600 empacotada com Superdex 200 PG, eluindo com 2,6 mL/min de solução salina tamponada com fosfato filtrada e esterilizada (PBS). As frações correspondentes ao pico de monômero de ConjD foram agrupadas, concentradas usando um filtro giratório de 15 mL Amicon Ultracell 50KDa MWCO, analisadas e filtradas e esterilizadas.
[0726] A análise por UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Phenomenex Aeris 3,6u XB-C18 150 x 2,1 mm eluindo com um gradiente de água e acetonitrila em uma amostra reduzida de ConjD a 280 nm e 330 nm (Composto 29 específico) mostra uma mistura de cadeias leves e pesadas ligadas a várias moléculas do composto 29, compatível com um razão fármaco-por- anticorpo (DAR) de 2,43 moléculas do composto 29 por anticorpo.
[0727] A análise por UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Tosoh Bioscience TSKgel G3000SWXL 5 μm 7,8 x 300 mm (com uma coluna de proteção 7 μm 6,0 x 40 mm) eluindo com tampão SEC filtrado e esterilizado contendo fosfato de potássio 200 mM pH 6,95, cloreto de potássio 250 mM e isopropanol 10 % (v/v) em uma amostra de ConjB a 280 nm mostra uma pureza de monômero de mais do que 99 % sem impureza detectada. A análise por UHPLC SEC fornece uma concentração de ConjB final a 0,73 mg/mL em 3,3 mL, a massa obtida de ConjB é 2,42 mg (69 % de rendimento). Conjugado E (Ab-34, ConjE)
[0728] O anticorpo (2,5 mg, 16,7 nanomols) foi diluído em 2,25 mL de um tampão de redução contendo borato de sódio 10 mM pH 8,4, EDTA 2,5 mM e uma concentração de anticorpo final de 1,11 mg/mL. Uma solução 10 mM de TCEP foi adicionada (1,65 equivalente molar/anticorpo, 27,5 nanomols, 2,75 mL) e a mistura de redução foi aquecida a 37 °C durante 1,6 hora em uma incubadora. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, o composto 34 foi adicionado como uma solução de DMSO (7,5 equivalentes molares/anticorpo, 125 nanomols, em DMSO 0,25 mL). A solução foi misturada durante 1,3 hora na temperatura ambiente, depois a conjugação foi interrompida pela adição de N-acetil cisteína (250 nanomols, 25 mL a 10 mM), depois injetada em um AKTA™ Pure FPLC usando uma coluna GE Healthcare HiLoadTM 26/600 empacotada com Superdex 200 PG, eluindo com 2,6 mL/min de solução salina tamponada com fosfato filtrada e esterilizada (PBS). As frações correspondentes ao pico de monômero de ConjE foram agrupadas, concentradas usando um filtro giratório de 15 mL Amicon Ultracell 50KDa MWCO, analisadas e filtradas e esterilizadas.
[0729] A análise por UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Phenomenex Aeris 3,6u XB-C18 150 x 2,1 mm eluindo com um gradiente de água e acetonitrila em uma amostra reduzida de ConjCE a 280 nm e 330 nm (Composto 34 específico) mostra uma mistura de cadeias leves e pesadas ligadas a várias moléculas do composto 34, compatível com uma razão fármaco-por- anticorpo (DAR) de 2,45 moléculas do composto 34 por anticorpo.
[0730] A análise por UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Tosoh Bioscience TSKgel G3000SWXL 5 μm 7,8 x 300 mm (com uma coluna de proteção 7 μm 6,0 x 40 mm) eluindo com tampão SEC filtrado e esterilizado contendo fosfato de potássio 200 mM pH 6,95, cloreto de potássio 250 mM e isopropanol 10 % (v/v) em uma amostra de ConjE a 280 nm mostra uma pureza de monômero de mais do que 99 % sem impureza detectada. A análise por UHPLC SEC fornece uma concentração de ConjE final a 1,05 mg/mL em 2,0 mL, a massa obtida de ConjE é 2,09 mg (84 % de rendimento). Conjugado F (Ab-36, ConjF)
[0731] O anticorpo (3,5 mg, 23,3 nanomols) foi diluído em 3,15 mL de um tampão de redução contendo borato de sódio 10 mM pH 8,4, EDTA 2,5 mM e uma concentração de anticorpo final de 1,11 mg/mL. Uma solução 10 mM de TCEP foi adicionada (2,0 equivalentes molares/anticorpo, 46,7 nanomols, 4,67 mL) e a mistura de redução foi aquecida a 37 °C durante 1,6 hora em uma incubadora. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, o composto 36 foi adicionado como uma solução de DMSO (10 equivalentes molares/anticorpo, 233 nanomols, em DMSO 0,175 mL). A solução foi misturada durante 3,9 horas na temperatura ambiente, ponto no qual mais composto 36 foi adicionado como uma solução de DMSO (10 equivalentes molares/anticorpo, 233 nanomols, em DMSO 0,175 mL) e a solução foi misturada durante um adicional de 19 horas na temperatura ambiente. A conjugação foi interrompida pela adição de N-acetil cisteína (933 nanomols, 93,3 mL a 10 mM), depois injetada em um AKTA™ Pure FPLC usando uma coluna GE Healthcare HiLoadTM 26/600 empacotada com Superdex 200 PG, eluindo com 2,6 mL/min de solução salina tamponada com fosfato filtrada e esterilizada (PBS). As frações correspondentes ao pico de monômero de ConjF foram agrupadas, concentradas usando um filtro giratório de 15 mL Amicon Ultracell 50KDa MWCO, analisadas e filtradas e esterilizadas.
[0732] A análise por UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Phenomenex Aeris 3,6u XB-C18 150 x 2,1 mm eluindo com um gradiente de água e acetonitrila em uma amostra reduzida de ConjF a 280 nm e 330 nm (Composto 36 específico) mostra uma mistura de cadeias leves e pesadas ligadas a várias moléculas do composto 36, compatível com uma razão fármaco-por- anticorpo (DAR) de 2,57 moléculas do composto 36 por anticorpo.
[0733] A análise por UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Tosoh Bioscience TSKgel G3000SWXL 5 μm 7,8 x 300 mm (com uma coluna de proteção 7 μm 6,0 x 40 mm) eluindo com tampão SEC filtrado e esterilizado contendo fosfato de potássio 200 mM pH 6,95, cloreto de potássio 250 mM e isopropanol 10 % (v/v) em uma amostra de ConjF a 280 nm mostra uma pureza de monômero de mais do que 99 % sem impureza detectada. A análise por UHPLC SEC fornece uma concentração de ConjF final a 0,75 mg/mL em 3,8 mL, a massa obtida de ConjF é 2,84 mg (81 % de rendimento). Conjugado G (Ab-45, ConjG)
[0734] O anticorpo (2,5 mg, 16,7 nanomols) foi diluído em 2,25 mL de um tampão de redução contendo borato de sódio 10 mM pH 8,4, EDTA 2,5 mM e uma concentração de anticorpo final de 1,11 mg/mL. Uma solução 10 mM de TCEP foi adicionada (1,65 equivalente molar/anticorpo, 27,5 nanomols, 2,75 mL) e a mistura de redução foi aquecida a 37 °C durante 1,6 hora em uma incubadora. Depois de esfriar até a temperatura ambiente, o composto 45 foi adicionado como uma solução de DMSO (7,5 equivalentes molares/anticorpo, 125 nanomols, em DMSO 0,25 mL). A solução foi misturada durante 1,3 hora na temperatura ambiente, depois a conjugação foi interrompida pela adição de N-acetil cisteína (250 nanomols, 25 mL a 10 mM), depois injetada em um AKTA™ Pure FPLC usando uma coluna GE Healthcare HiLoadTM 26/600 empacotada com Superdex 200 PG, eluindo com 2,6 mL/min de solução salina tamponada com fosfato filtrada e esterilizada (PBS). As frações correspondentes ao pico de monômero de ConjG foram agrupadas, concentradas usando um filtro giratório de 15 mL Amicon Ultracell 50KDa MWCO, analisadas e filtradas e esterilizadas.
[0735] A análise por UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Phenomenex Aeris 3,6u XB-C18 150 x 2,1 mm eluindo com um gradiente de água e acetonitrila em uma amostra reduzida de ConjG a 280 nm e 330 nm (Composto 45 específico) mostra uma mistura de cadeias leves e pesadas ligadas a várias moléculas do composto 45, compatível com uma razão fármaco-por- anticorpo (DAR) de 2,13 moléculas do composto 45 por anticorpo.
[0736] A análise por UHPLC em um sistema Shimadzu Prominence usando uma coluna Tosoh Bioscience TSKgel G3000SWXL 5 μm 7,8 x 300 mm (com uma coluna de proteção 7 μm 6,0 x 40 mm) eluindo com tampão SEC filtrado e esterilizado contendo fosfato de potássio 200 mM pH 6,95, cloreto de potássio 250 mM e isopropanol 10 % (v/v) em uma amostra de ConjG a 280 nm mostra uma pureza de monômero de mais do que 99 % sem impureza detectada. A análise por UHPLC SEC fornece uma concentração de ConjG final a 0,67 mg/mL em 2,9 mL, a massa obtida de ConjG é 1,94 mg (78 % de rendimento). O Anticorpo usado nas conjugações acima foi HERCEPTIN. Exemplo 9: Estudos de eficácia de ADC in vivo
[0737] Camundongos SCID CB.17, com 8 a 12 semanas de vida, podem ser injetados com fragmentos de tumor de 1 mm3 subcutaneamente no flanco. Quando os tumores atingem um tamanho médio de 100 a 150 mg, o tratamento pode ser iniciado. Os camundongos podem ser pesados duas vezes por semana. O tamanho do tumor pode ser medido duas vezes por semana. Os animais podem ser individualmente monitorados. A meta do experimento é um volume de tumor de 1000 mm3 ou 60 dias, o que ocorrer primeiro. Os respondedores pode ser seguidos durante mais tempo.
[0738] Grupos de 10 camundongos xenoenxertados podem ser injetados i.v. com 0,2 ml de conjugado de anticorpo-fármaco (ADC), ou anticorpo nu, em solução salina tamponada com fosfato (veículo) ou com 0,2 ml de veículo sozinho. A concentração de ADC pode ser ajustada para fornecer, por exemplo, 0,3 ou 1,0 mg de ADC/kg de peso corpóreo em uma dose única. Três doses idênticas podem ser fornecidas a cada camundongo em intervalos, por exemplo, de 1 semana. Exemplo 10: Estudos de eficácia de ADC in vitro
[0739] O meio a partir de células subconfluentes (cerca de 80 a 90 % de confluência) SK-BR-3 em um frasco T75 foi aspirado e PBS (cerca de 20 ml) foi adicionada para enxaguar o meio de cultura. A PBS foi aspirada e Tripsina-EDTA (5ml) adicionado. O frasco foi retornado para a incubadora gaseificada a 37 °C durante até cerca de 5 minutos. O frasco foi batido rapidamente para desalojar e dissociar as células do plástico. A suspensão celular foi transferida para um tubo de centrífuga com tampa de rosca estéril de 50 ml. O meio (McCoy’s + FCS 10 %) foi adicionado a um volume final de 15 ml, depois o tubo foi centrifugado (400 g durante 5 min). O sobrenadante foi aspirado e a pelota recolocada em suspensão em meio de cultura 10ml. A aspiração repetida (uma pipeta de 10 ml para cima e para baixo) pode ser necessária para quebrar agregados celulares e produzir suspensões celulares monodispersas adequadas para contagem. A suspensão celular (10μl) foi misturada com Trypan blue (10μl) e células vivas/mortas contadas com um hemocitômetro para determinar concentração e viabilidade celulares. A suspensão celular foi diluída a 20 x 104/ml e 50 μl foram dispensados em placas de fundo plano claras de 96 poços. As células foram incubadas durante a noite para permitir a recuperação antes do uso.
[0740] Uma solução estoque (1 ml) de conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) (20 μg/ml) foi preparada através de diluição de ADC esterilizado com filtro em meio de cultura celular. Um conjunto de diluições de 8 x 10 vezes de ADC estoque foi preparado em uma placa de 24 poços através de transferência em série de 100 μl em 900 μl de meio de cultura celular.
[0741] 50 μl de cada diluição de ADC são dispensados em 4 poços de replicata da placa de 96 poços, contendo 50 μl de suspensão celular semeados no dia anterior. Poços controle receberam 50 μl de meio de cultura celular. A placa de 96 poços contendo células e ADCs foi incubada a 37 °C em uma incubadora gaseificada com CO2 durante 4 dias. No final do período de incubação, as células viáveis foram medidas por ensaio MTS. MTS (Promega) foi dispensado (20 μl por poço) em cada poço e incubado durante 4 horas a 37 °C na incubadora gaseificada com CO2. A absorvância do poço foi medida a 490 nm. A porcentagem de sobrevivência celular é calculada a partir da absorvância média nos 4 poços tratados com ADC em comparação à absorvância média nos 4 poços controle (100
Figure img0087
Abreviações Ac acetila Acm acetamidometila Alloc aliloxicarbonila Boc dicarbonato de di-terc-butila t-Bu terc-butila Bzl benzila, onde Bzl-OMe é metoxibenzila e Bzl-Me é metilbenzeno Cbz ou Z benzilóxi-carbonila, onde Z-Cl e Z-Br são cloro- e bromobenzilóxi carbonila, respectivamente DMF N,N-dimetilformamida Dnp dinitrofenila DTT ditiotreitol Fmoc 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonila Imp grupo de proteção imina N-10: 3-(2-metoxietóxi)propanoato-Val-Ala-PAB MC-OSumaleimidocaproil-O-N-succinimida Moc metoxicarbonila MP maleimidopropanamida Mtr 4-metóxi-2,3,6-trimetilbenzenossulfonila PAB para-aminobenziloxicarbonila PEG etileno-óxi PNZ carbamato de p-nitrobenzila Psec 2-(fenilsulfonil)etoxicarbonila TBDMS terc-butildimetilsilila TBDPS terc-butildifenilsilila Teoc 2-(trimetilsilil)etoxicarbonila Tos tosila Troc cloreto de 2,2,2-tricloretoxicarbonila Trt tritila Xan xantila
[0742] As seguintes referências são integralmente incorporadas como referência: EP 0522868 EP 0875569 EP 1295944 EP 1347046 EP 1394274 EP 1394274 EP 1439393 JP 05003790 JP 2004113151 JP 58180487 US 2001/055751 US 2002/034749 US 2002/042366 US 2002/150573 US 2002/193567 US 2003/0228319 US 2003/060612 US 2003/064397 US 2003/065143 US 2003/091580 US 2003/096961 US 2003/105292 US 2003/109676 US 2003/118592 US 2003/119121 US 2003/119122 US 2003/119125 US 2003/119126 US 2003/119128 US 2003/119129 US 2003/119130 US 2003/119131 US 2003/124140 US 2003/124579 US 2003/129192 US 2003/134790-A1 US 2003/143557 US 2003/157089 US 2003/165504 US 2003/185830 US 2003/186372 US 2003/186373 US 2003/194704 US 2003/206918 US 2003/219806 US 2003/224411 US 2003/224454 US 2003/232056 US 2003/232350 US 20030096743 US 20030130189 US 2003096743 US 2003130189 US 2004/0001827 US 2004/005320 US 2004/005538 US 2004/005563 US 2004/005598 US 2004/0101899 US 2004/018553 US 2004/022727 US 2004/044179 US 2004/044180 US 2004/101874 US 2004/197325 US 2004/249130 US 20040018194 US 20040052793 US 20040052793 US 20040121940 US 2005/271615 US 2006/116422 US 4816567 US 5362852 US 5440021 US 5583024 US 5621002 US 5644033 US 5674713 US 5700670 US 5773223 US 5792616 US 5854399 US 5869445 US 5976551 US 6011146 US 6153408 US 6214345 US 6218519 US 6268488 US 6518404 US 6534482 US 6555339 US 6602677 US 6677435 US 6759509 US 6835807 US 7223837 US 7375078 US 7521541 US 7723485 WO 00/012508 WO 00/12507 WO 00/12508 WO 01/16318 WO 01/45746 WO 02/088172 WO 03/026577 WO 03/043583 WO 04/032828 WO 2000/12130 WO 2000/14228 WO 2000/20579 WO 2000/22129 WO 2000/32752 WO 2000/36107 WO 2000/40614 WO 2000/44899 WO 2000/55351 WO 2000/75655 WO 200053216 WO 2001/00244 WO 2001/38490 WO 2001/40269 WO 2001/40309 WO 2001/41787 WO 2001/46232 WO 2001/46261 WO 2001/48204 WO 2001/53463 WO 2001/57188 WO 2001/62794 WO 2001/66689 WO 2001/72830 WO 2001/72962 WO 2001/75177 WO 2001/77172 WO 2001/88133 WO 2001/90304 WO 2001/94641 WO 2001/98351 WO 2002/02587 WO 2002/02624 WO 2002/06317 WO 2002/06339 WO 2002/101075 WO 2002/10187 WO 2002/102235 WO 2002/10382 WO 2002/12341 WO 2002/13847 WO 2002/14503 WO 2002/16413 WO 2002/16429 WO 2002/22153 WO 2002/22636 WO 2002/22660 WO 2002/22808 WO 2002/24909 WO 2002/26822 WO 2002/30268 WO 2002/38766 WO 2002/54940 WO 2002/59377 WO 2002/60317 WO 2002/61087; WO 2002/64798 WO 2002/71928 WO 2002/72596 WO 2002/78524 WO 2002/81646 WO 2002/83866 WO 2002/86443 WO 2002/88170 WO 2002/89747 WO 2002/92836 WO 2002/94852 WO 2002/98358 WO 2002/99074 WO 2002/99122 WO 2003/000842 WO 2003/002717 WO 2003/003906 WO 2003/003984 WO 2003/004989 WO 2003/008537 WO 2003/009814 WO 2003/014294 WO 2003/016475 WO 2003/016494 WO 2003/018621 WO 2003/022995 WO 2003/023013 WO 2003/024392 WO 2003/025138 WO 2003/025148 WO 2003/025228 WO 2003/026493 WO 2003/029262 WO 2003/029277 WO 2003/029421 WO 2003/034984 WO 2003/035846 WO 2003/042661 WO 2003/045422 WO 2003/048202 WO 2003/054152 WO 2003/055439 WO 2003/055443 WO 2003/062401 WO 2003/062401 WO 2003/072035 WO 2003/072036 WO 2003/077836 WO 2003/081210 WO 2003/083041 WO 2003/083047 WO 2003/083074 WO 2003/087306 WO 2003/087768 WO 2003/088808 WO 2003/089624 WO 2003/089904 WO 2003/093444 WO 2003/097803 WO 2003/101283 WO 2003/101400 WO 2003/104270 WO 2003/104275 WO 2003/105758 WO 2003004529 WO 2003042661 WO 2003104399 WO 2004/000997 WO 2004/001004 WO 2004/009622 WO 2004/011611 WO 2004/015426 WO 2004/016225 WO 2004/020595 WO 2004/022709 WO 2004/022778 WO 2004/027049 WO 2004/031238 WO 2004/032828 WO 2004/032842 WO 2004/040000 WO 2004/043361 WO 2004/043963 WO 2004/044178 WO 2004/045516 WO 2004/045520 WO 2004/045553 WO 2004/046342 WO 2004/047749 WO 2004/048938 WO 2004/053079 WO 2004/063355 WO 2004/063362 WO 2004/063709 WO 2004/065577 WO 2004/074320 WO 2004000221 WO 2004020583 WO 2004042346 WO 2004065576 WO 2005/023814 WO 2005/082023 WO 2005/085251 WO 2006/111759 WO 2007/044515 WO 2007/085930 WO 2009/052249 WO 2010/091150 WO 91/02536 WO 92/07574 WO 92/17497 WO 94/10312 WO 94/28931 WO 9630514 WO 97/07198 WO 97/44452 WO 98/13059 WO 98/37193 WO 98/40403 WO 98/51805 WO 98/51824 WO 99/28468 WO 99/46284 WO 99/58658 Am. 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Claims (15)

1. Conjugado CARACTERIZADO pelo fato de que apresenta a fórmula (Ia):
Figure img0088
em que:
Figure img0089
R7a e R17a são independentemente selecionados dentre metila e fenila; Y é selecionado das fórmulas A1, A2, A3, A4, A5 e A6:
Figure img0090
Figure img0091
L é um ligante conectado a um agente de ligação celular; CBA é o agente de ligação celular; n é um número inteiro selecionado na faixa de 0 a 48; RA4 é um grupo alquileno C1-6; (a) R10 é H, e R11 é OH, ORA, em que RA é alquila C1-4; ou (b) R10 e R11 formam uma ligação dupla nitrogênio-carbono entre os átomos de nitrogênio e carbono aos quais eles são ligados; ou (c) R10 é H e R11 é OSOzM, em que z é 2 ou 3 e M é um cátion monovalente farmaceuticamente aceitável; em que R20 e R21 são como definidos para R10e R11, respectivamente; em que Z é CH ou N; e t1 e t2 são independentemente selecionados dentre 0, 1 a 2.
2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R10 é H, e R11 é OH.
3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R10 e R11 formam uma ligação dupla nitrogênio-carbono entre os átomos de nitrogênio e carbono aos quais eles são ligados.
4. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que R17a, R20, R21 e t2 são os mesmo que R7a, R10, R11 e t1, respectivamente.
5. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que L é da fórmula: (a) -LA-(CH2)m- (L1) em que m é de 0 a 6; (b) -LA-(CH2)m-O- (L2) em que m é de 0 a 6; (c) -LA-(CH2)q-O-C(=O)-NH-(CH2)p- (L3)
Figure img0092
X1 e X2 são grupos de aminoácidos, selecionados dentre aminoácidos naturais, que podem ser modificados e LA é selecionado dentre:
Figure img0093
Figure img0094
em que Ar representa um grupo arileno C5-6.
6. Conjugado, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo -X1-X2- é selecionado dentre: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-.
7. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de ligação celular é um anticorpo ou um fragmento ativo do mesmo.
8. Conjugado, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento do anticorpo é um anticorpo que se liga a um ou mais antígenos associados ao tumor ou receptores de superfície celular selecionado de (1) a (36): (1) BMPR1B (receptor da proteína morfogenética do osso-tipo IB); (2) E16 (LAT1, SLC7A5); (3) STEAP1 (antígeno epitelial das seis transmembrana da próstata); (4) 0772P (CA125, MUC16); (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potenciação de megacariócitos, mesotelina); (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família do veículo de soluto 34 (fosfato de sódio), membro 2, transportador de fosfato dependente de sódio tipo II 3b); (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de trombospondina (tipo 1 e similar ao tipo 1), domínio transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B); (8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, gene RIKEN cDNA 2700050C12); (9) ETBR (receptor de endotelina tipo B); (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética de FLJ20315); (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, geno associado ao câncer de próstata 1, proteína associada ao câncer de próstata 1, antígeno epitelial das seis transmembrana da próstata 2, seis proteínas transmembranares da próstata); (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de cátion do receptor de potencial transitório, subfamília M, membro 4); (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma); (14) CD21 (CR2 (Receptor do complemento 2) ou C3DR (C3d/receptor do vírus Epstein Barr) ou Hs 73792); (15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (imunoglobulina beta-associada), B29); (16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (domínio SH2 contendo proteína âncora de fosfatase 1a), SPAP1B, SPAP1C); (17) HER2; (18) NCA; (19) MDP; (20) IL20Rα; (21) Brevican; (22) EphB2R; (23) ASLG659; (24) PSCA; (25) GEDA; (26) BAFF-R (receptor do fator de ativação de células B, receptor de BLyS 3, BR3); (27) CD22 (isoforma de CD22-B do receptor de células B); (28) CD79a (CD79A, CD79α, imunoglobulina-alfa associada); (29) CXCR5 (receptor do linfoma de Burkitt 1); (30) HLA-DOB (subunidade beta da molécula MHC classe II (antígeno Ia)); (31) P2X5 (canal iônico ativado por ligante de P2X 5 do receptor purinérgico); (32) CD72 (antígeno de diferenciação de células B CD72, Lyb-2); (33) LY64 (antígeno de linfócitos 64 (RP105), proteína de membrana tipo I da família de repetição rica em leucina (LRR)); (34) FcRH1 (proteína similar ao receptor Fc 1); (35) IRTA2 (receptor da superfamília das imunoglobulinas associado a translocação 2); (36) TENB2 (proteoglicano transmembranar putativo); (37) CD33 (molécula de CD33, SIGLEC-3, SIGLEC3, p67; antígeno de CD33 (gp67); gp67; antígeno de superfície de mielócitos CD33; lectina similar a Ig de ligação ao ácido siálico 3; lectina similar a Ig de ligação ao ácido siálico); e (38) LGR5/GPR49.
9. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que é para o uso na terapia.
10. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
11. Uso do conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença proliferativa em um indivíduo.
12. Composto, CARACTERIZADO pelo fato de que apresenta a fórmula (IIa):
Figure img0095
em que: reivindicação 1; YL é selecionado de um grupo das fórmulas B1, B2, B3, B4, B5 e B6:
Figure img0096
Figure img0097
G é um grupo reativo para conectar a um agente de ligação celular em que n e RA4 são como definidos na reivindicação 1.
13. Composto, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que G é da fórmula: (a) GA-(CH2)m- (G1), em que m é de 0 a 6; (b) GA-(CH2)m-O- (G2), em que m é de 0 a 6; (c) GA-(CH2)q-O-C(=O)-NH-(CH2)p- (G3), em que q é de 1 a 3, e p é de 1 a 3;
Figure img0098
X1 e X2 são grupos de aminoácidos selecionados dentre aminoácidos naturais, que podem ser modificados; e GA é selecionado dentre:
Figure img0099
Figure img0100
em que Ar representa um grupo arileno C5-6.
14. Composto, CARACTERIZADO pelo fato de que apresenta a fórmula (IIIa):
Figure img0101
em que: R2a, R7a, R10, R11, R17a, R20, R21, R22a, Z, t1 e t2 são como definidos na reivindicação 1; e YC é selecionado de um grupo das fórmulas C1, C2, C3, C4, C5 e C6:
Figure img0102
Figure img0103
em que n e RA4 são como definidos na reivindicação 1.
15. Método de síntese de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de conjugar um fármaco-ligante, como definido na reivindicação 12 ou 13, com um agente de ligação celular.
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