JP2003535037A - 炎症を治療する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 IL−20誘導炎症を治療する方法。IL−20に対するアンタゴニストを投与して、炎症および関連する疾患を治療する。アンタゴニストは、IL−20またはそのレセプターまたはIL−20に結合する可溶性レセプターに結合する抗体である。このような疾患の例は、大人の呼吸疾患、乾癬、湿疹、接触性皮膚疾患、アトピー性皮膚炎、敗血症性ショック、多発性器官不全、炎症性損傷、細菌性肺炎、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、ぜん息、潰瘍化大腸炎およびクローン病である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 本明細書において引用するすべての参考文献の教示は、それらの全体において
引用することによって本明細書の一部とされる。 炎症は、通常、損傷性因子および損傷した組織を破壊し、希釈し、または隔て
る外傷または微生物の侵襲に対する、局在化した、保護的反応である。それは急
性形態において、疼痛、熱、赤み、腫脹、および機能喪失により特徴づけられる
。微視的に、それは複雑な系列の事象、例えば、動脈、毛細血管、および細静脈
の拡張を含み、透過性および血流の増加、流体、例えば、血漿タンパク質の滲出
、および炎症領域の中への白血球の移動を伴う。

【０００２】 炎症により特徴づけられる疾患は、ヒトにおける病的状態および死亡率の有意
な原因である。普通に、炎症は外来物質、特に微生物による宿主の侵襲に対する
防御反応として起こる。機械的外傷、トキシン、および新形成に対する反応は、
また、炎症反応を生ずることがある。白血球の蓄積および引き続く活性化は、炎
症の大部分の形態の病原性における中枢的事象である。炎症の欠乏は宿主を危う
くする。

【０００３】 炎症プロセスの外来性および延長として、宿主組織の異常な認識により引き起
こされる過剰の炎症は、炎症性疾患、例えば、糖尿病、アテローム性動脈硬化症
、白内障、再灌流損傷、および癌に導き、感染後ん症候群、例えば、感染性髄膜
炎、リウマチ熱に導き、そしてリウマチ性疾患、例えば、全身性エリテマトーデ
スおよび慢性関節リウマチに導くことがある。これらの変化する疾患プロセスに
おける炎症反応の集中性は、ヒト疾患の予防的コントロールまたは治癒ににおい
てその調節を主要な要素とする。

【０００４】 炎症プロセスにおける重要なサイトカインはインターロイキン−8（IL−8）で
ある。IL−8はケモカインである。それは2つの作用、化学走性および顆粒酵素の
解放に基づいて、好中球に対するアゴニストとして同定された。IL−8は好中球
上のレセプターに結合する。また、IL−8レセプターは、単球、好塩基球、およ
び好酸球上に見出された。ヒト繊維芽細胞において、サイトメガロウイルスはIL
−8レセプターの発現を誘導し、細胞をIL−8に対する暴露したとき、いっそう急
速に複製することが示された。

【０００５】 IL−8は好中球に対する効力のある化学誘引物質であり、そして歯根膜疾患は
好中球の流入により特徴づけられる。IL−8はいくつかの血管形成依存的慢性炎
症状態、例えば、慢性関節リウマチ、乾癬、および特発性肺性繊維症における血
管形成の効力のある誘導因子である。さらに、IL−8はヒト肺癌における重要な
血管形成活性源である。また、IL−8の発現はいくつかの黒色腫細胞系統の実験
的転移活性と相関する。こうして、炎症を治療する有効な方法はIL−8を阻害す
る因子を投与することであろう。

【０００６】 発明の説明 本発明は、炎症の治療を必要とする哺乳動物に、IL−20に対するアンタゴニス
トまたはIL−20レセプターに対するアンタゴニストを投与することを含む、IL−
20ポリペプチドがある役割を演ずる炎症を治療する方法を提供することによって
、この要求を満足する。IL−20に対するアンタゴニストは、IL−20に結合する抗
体、抗体フラグメントまたは一本鎖抗体、IL−20に結合する可溶性レセプターで
あることができる。IL−20レセプターに対するアンタゴニストは、IL−20レセプ
ターに結合する抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体または小分子であることが
できる。また、IL−20をコードするmRNAに結合するアンチセンスポリヌクレオチ
ドをアンタゴニストとして使用することができる。IL−20IL−8をアップレギュ
レートすることを我々は示した。

【０００７】 IL−20ポリペプチドがある役割を演じ、かつIL−8が有益である疾患は、大人
の呼吸疾患（ARD）、敗血症性ショック、多発性器官不全、炎症肺損傷、例えば
、ぜん息または気管支炎、細菌性肺炎、乾癬および炎症性腸疾患、例えば、潰瘍
化大腸炎およびクローン病、湿疹、アトピー性皮膚炎および接触性皮膚疾患であ
ろう。こうして、IL−20に対するアンタゴニストはこれらの疾患を治療するため
に使用することができる。 本明細書において引用するすべての参考文献の教示は、それらの全体において
引用することによって本明細書の一部とされる。

【０００８】定義 本発明を詳細に説明する前に、下記の用語を定義することはその理解の助けと
なるであろう： 用語「アミノ末端」または「カルボキシル末端」は、本明細書において、ポリ
ペプチド内の位置を表すために使用される。この関係が許す場合、これらの用語
は近接性または相対的位置を表すためにポリペプチドの特定の配列または部分を
参照して使用される。例えば、ペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端
に位置するある種の配列は、参照配列のカルボキシル末端に対して近接して位置
するが、完全なポリペプチドのカルボキシル末端に必ずしも存在しない。

【０００９】 本明細書において使用するとき、「抗融合タンパク質」は、抗体成分と、治療
剤とを含んでなる組換え分子を意味する。このような融合タンパク質のために適
当な治療剤の例は、免疫モジュレーター（「抗体−免疫モジュレーター融合タン
パク質」）およびトキシン（「抗体−トキシン融合タンパク質」）を包含する。 用語「相補体／抗相補体の対」は、適当な条件下に非共有結合的にアソシエー
トした安定な対を形成する、非同一部分を表す。例えば、ビオチンおよびアビジ
ン（またはストレプトアビジン）は、相補体／抗相補体の対のプロトタイプのメ
ンバーである。他の典型的な相補体／抗相補体の対は、レセプター／リガンドの
対、抗体／抗原（またはハプテンまたはエピトープ）の対、センス／アンチセン
スポリヌクレオチドの対、およびその他を包含する。相補体／抗相補体の対の引
き続く解離を望む場合、相補体／抗相補体の対は好ましくは＜10⁹／Mの結合アフ
ィニティーを有する。

【００１０】 用語「ポリヌクレオチド分子の相補体」は、相補的塩基配列を有しかつ参照配
列に比較して逆の向きを有するポリヌクレオチド分子である。例えば、配列5'
ATGCACGGG 3'は5' CCCGTGCAT 3'に対して相補的である。 用語「contig」は、他のポリヌクレオチドに対して同一であるか、あるいは相
補的な配列の隣接するストレッチを有するポリヌクレオチドを表す。隣接する配
列は、それらの全体においてあるいはポリヌクレオチドの部分的ストレッチに沿
って、ポリヌクレオチド配列の所定のストレッチを「オーバーラップ」させると
言われる。例えば、ポリヌクレオチド配列5'−ATGGAGCTT−3'に対する代表的なc
ontigは5'−AGCTTgagt−3'および3'−tcgacTACC−3'である。

【００１１】 用語「縮重ヌクレオチド配列」は、1またはそれ以上のデジェネレイトコドン
を含むヌクレオチド配列（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子
に比較して）を表す。デジェネレイトコドンはヌクレオチドの異なるトリプレッ
トを含有するが、同一アミノ酸残基をコードする（すなわち、GAUおよびGACのト
リプレットの各々はAspをコードする）。

【００１２】 用語「発現ベクター」は、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に
連鎖された、問題のポリペプチドをコードするセグメントからなる、線状または
円形のDNA分子を表すために使用される。このような追加のセグメントは、プロ
モーターおよびターミネーターの配列を包含し、そして、また、1またはそれ以
上の複製起点、1またはそれ以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリア
デニル化シグナル、およびその他を包含することができる。発現ベクターは、一
般に、プラスミドまたはウイルスDNAから誘導されるか、あるいは双方の因子を
含有することができる。

【００１３】 用語「単離された」は、ポリヌクレオチドに適用されるとき、ポリヌクレオチ
ドがその自然の遺伝的環境から取出され、こうして、他の余分または望ましくな
いコーディング配列を含まず、そして遺伝子操作されたタンパク質の産生系内で
使用するために適当な形態であることを表す。このような単離された分子は、そ
れらの自然の環境から分離されたものであり、そしてcDNAおよびゲノムのクロー
ンを包含する。本発明の単離されたDNA分子は、それらが通常アソシエートされ
る他の遺伝子を含まないが、天然に存在する5'および3'の非翻訳領域、例えば、
プロモーターおよびターミネーター、およびその他を包含することができる。ア
ソシエートされた領域の同定は、当業者にとって明らかであろう（例えば、Dyna
nおよびTijan、Nature 316：774−78、1985、参照）。

【００１４】 「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その自然環境、例えば、血
液および動物の組織、以外の条件において見出されるポリペプチドまたはタンパ
ク質である。好ましい形態において、単離されたポリペプチドは他のポリペプチ
ド、特に動物由来の他のポリペプチドを実質的に含まない。高度に精製された形
態、すなわち、95％より大きい純度、より好ましくは99％より大きい純度のポリ
ペプチドを提供することが好ましい。この関係において使用するとき、用語「単
離された」は別の物理的形態、例えば、二量体、あるいはグリコシル化または誘
導化された形態の同一のポリペプチドの存在を排除しない。

【００１５】 用語「作用可能に連鎖された」は、DNAセグメントについて言及するとき、セ
グメントがそれらの意図する目的のために調和して機能するように、例えば、転
写がプロモーターにおいて開始し、コーディングセグメントを通してターミネー
ターに進行するように、セグメントが配置されていることを示す。

【００１６】 「ポリヌクレオチド」は、5'→3'末端の方向に読んだ、デオキシリボヌクレオ
チドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖のポリマーである。ポリ
ヌクレオチドはRNAおよびDNAを包含し、天然源から単離され、in vitroで合成
されるか、あるいは天然の分子と合成の分子との組合わせから製造することがで
きる。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（略号「bp」）、ヌクレオチド（「
nt」）、またはキロ塩基（「kb」）として表される。

【００１７】 この関係が許す場合、後者の2つの用語は一本鎖または二本鎖であるポリヌク
レオチドを記載することができる。この用語を二本鎖の分子に適用するとき、そ
れは全体の長さを表すために使用され、そして用語「塩基対」に等しいと理解さ
れるであろう。当業者は認識するように、二本鎖ポリヌクレオチドの2つの鎖は
わずかに長さが異なることがあり、そして酵素の切断の結果その末端は食い違う
ことがある；こうして、二本鎖ポリヌクレオチド内のすべてのヌクレオチドは対
合していなことがある。

【００１８】 「ポリペプチド」は、自然にまたは合成的に生産された、ペプチド結合により
結合されたアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸残基より小さいポリペ
プチドは普通に「ペプチド」と呼ばれる。 用語「プロモーター」は、本明細書において、RNAポリメラーゼの結合を提供
しかつ転写を開始させるDNA配列を含有する遺伝子の部分を表す、この分野にお
いて認識されている意味において使用される。プロモーター配列は普通に、しか
し常にではないが、遺伝子の5'非コーディング領域の中に見出される。

【００１９】 「タンパク質」は、1または2以上のポリペプチド鎖を含んでなる高分子である
。タンパク質は、また、非ペプチド成分、例えば、炭水化物基からなることがで
きる。炭水化物および他の非ペプチド置換基を細胞によりタンパク質に付加する
ことができ、細胞においてタンパク質は産生され、そして細胞の型とともに変化
するであろう。タンパク質はアミノ酸主鎖構造により本明細書において定義され
る；置換基、例えば、炭水化物基は一般に特定されないが、それにもかかわらず
、存在することができる。

【００２０】 用語「レセプター」は、生物活性分子（すなわち、リガンド）に結合し、細胞
上のリガンドの作用を伝達する、細胞関連タンパク質を表す。膜に結合したレセ
プターは、細胞外リガンド結合ドメインと、典型的にはシグナルトランスダクシ
ョンに関係する細胞内エフェクタードメインとからなる、多ペプチド構造により
特徴づけられる。レセプターへのリガンドの結合は、エフェクタードメインと、
細胞中の1またはそれ以上の他の分子との間の相互作用を引き起こす、レセプタ
ーにおけるコンフォメーションの変化を生ずる。この相互作用は、引き続いて、
細胞の代謝の変更に導く。

【００２１】 レセプター−リガンドの相互作用に関係する代謝の事象は、遺伝子の転写、リ
ン酸化、脱リン酸化、サイクル的AMP産生の増加、細胞のカルシウムの移動化、
膜脂質の移動化、細胞の接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の
加水分解を包含する。一般に、レセプターは、膜結合、細胞質ゾルまたは核レセ
プター；モノマーのレセプター（例えば、甲状腺刺激ホルモンのレセプター、ベ
ータ−アドレナリン作動性レセプター）またはマルチマーのレセプター（例えば
、PDGFレセプター、成長ホルモンレセプター、IL−3レセプター、GM−CSFレセプ
ター、G−CSFレセプター、エリトロポイエチンレセプターおよびIL−6レセプタ
ー）であることができる。

【００２２】 用語「分泌シグナル配列」は、ポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコードす
るDNA配列を表し、それは、より大きいポリペプチドの1成分として、より大きい
ポリペプチドが合成される細胞の分泌経路を通してそのポリペプチドを向ける。
通常、より大きいポリペプチドは、分泌経路を通る移行の間に切断されて、分泌
ペプチドを除去する。

【００２３】 用語「スプライス変異型」は、本明細書において、遺伝子から転写されたRNA
の別の形態を表すために使用される。スプライス変異型は転写されたRNA分子内
の、あるいはそれ程普通ではないが別々に転写されたRNA分子の間の、オールタ
ネイトスプライス部位の使用により自然に発生し、そして同一遺伝子から転写さ
れたいくつかのmRNAを生ずることがある。スプライス変異型は、変更されたアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。また、スプライス変
異型という用語は、本明細書において、ある遺伝子から転写されたmRNAのスプラ
イス変異型によりコードされるタンパク質を表すために使用される。

【００２４】 不正確な分析法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されたポリマーの分子量
および長さは、近似値であると理解されるであろう。このような値を「約」Xま
たは「ほぼ」Xとして表すとき、Xの記載する値は±10％の正確さであると理解さ
れるであろう。

【００２５】 序論 本発明は、苦しめられる個体にIL−20に対するアンタゴニスト投与することに
よって、IL−20が開始または広がりまたは維持においてある役割を演ずる炎症お
よび炎症性疾患を治療することに関する。そのアンタゴニストは、IL−20に対す
る抗体、IL−20に結合する可溶性レセプター、IL−20レセプターのIL−20RAサブ
ユニットまたはIL−20RBサブユニットに結合するアンチセンス分子または抗体で
あることができる。

【００２６】 下記の特許出願明細書において、IL−20は定義され、それを製造する方法およ
びIL−20に対する抗体は記載されている：国際特許出願No．PCT／98／25228、公
開WO99／27103、公開1998年11月25日発行、および米国特許出願第09／313,458号
、1999年5月17日提出。ヒトIL−20のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは配
列番号1〜4により表され、そしてマウスIL−20は配列番号5〜9により表される。

【００２７】 IL−20に対するレセプターは発見され、「IL−20RA」（形式的にZcytoR7と呼
ぶ）と命名されるポリペプチドと、「IL−20RB」と命名されるポリペプチドとか
ら構成されている。IL−20RAポリペプチド、それをコードする核酸、IL−20RAに
対する抗体、およびそれを製造する方法は、米国特許第5,945,511号、1999年8月
31日発行、に開示されている。配列番号10〜12はIL−20RAポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドである。ヒトIL−20RAの細胞外ドメインは配列番号12、38、55、
63、および65から成る群から選択されるポリペプチドから構成され、全長レセプ
ターサブユニットは配列番号11から構成されている。マウスIL−20RAの細胞外ド
メインは配列番号38であり、配列番号37は全マウスIL−20RAである。

【００２８】 IL−20RB（配列番号13〜14、および変異型配列番号18および19）の細胞外ドメ
インは、配列番号15、59、61、67、68、および69から成る群から選択されるポリ
ペプチドから構成されたヘテロダイマーである。好ましくは、IL−20RAポリペプ
チドの細胞外ドメインおよびIL−20RBポリペプチドの細胞外ドメインが一緒に共
有結合されている。好ましい態様において、一方の細胞外サブユニットはそのカ
ルボキシ末端に融合された免疫グロブリンの重鎖の定常領域を有し、そして他方
の細胞外サブユニットはそのカルボキシ末端に融合された免疫グロブリン（Ig）
の軽鎖の定常領域を有し、こうして2つのポリペプチドは一緒に可溶性レセプタ
ーを形成し、そして重鎖および軽鎖Ig鎖の間でジサルファイド結合が形成される
。他の方法において、ペプチドリンカーはポリペプチドの2つのカルボキシ末端
に融合して共有結合した可溶性レセプターを形成する。

【００２９】 配列番号22および23は、実施例5に記載する手順に従い製造された、突然変異
したヒト免疫グロブリンガンマ1定常領域に融合されたIL−20RAの細胞外ドメイ
ンの構築物である。配列番号62は、シグナル配列を含まない予測された成熟配列
である。配列番号20および21は、実施例5に記載する手順に従い製造された、野
生型ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域に融合されたIL−20RBの細胞外ドメ
インの構築物である。配列番号60は、シグナル配列を含まない予測された成熟配
列である。実施例5により製造されたヘテロダイマーを第1図に描写する。

【００３０】 配列番号52および53は、実施例12に記載する手順に従い製造された、突然変異
したヒト免疫グロブリンガンマ1定常領域に融合されたIL−20RAの細胞外ドメイ
ンの構築物である。配列番号54は、シグナル配列を含まない予測された成熟配列
である。配列番号56および57は、実施例12に記載する手順に従い製造された、野
生型ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域に融合されたIL−20RBの細胞外ドメ
インの構築物である。配列番号58は、シグナル配列を含まない予測された成熟配
列である。

【００３１】 生ずるヘテロダイマーは実施例5により製造されたヘテロダイマーとほとんど
同一であり、主要な差は細胞外ドメインと、Ig定常領域の開始、第1図において2
2との間のポリペプチドリンカーの非存在である。以後において、用語「レセプ
ターの細胞外ドメイン」は、レセプターの細胞外ドメイン、またはリガンドがIL
−20である場合において、そのリガンドに結合するために必要である細胞外ドメ
インの部分を意味する。

【００３２】 生ずる可溶性レセプターがIL−20に結合することができる多数の方法において
、IL−20RAおよびIL−20RBの細胞外ドメインを一緒に結合することができる。第
1図〜第8図は、本発明の代表的数の態様を例示する。図面の各々において共通な
要素は同一数字で記載されている。第1図は、下記の実施例5に従い製造された本
発明の態様を表す。10と表示する可溶性レセプター構築物は、12および14と表示
する2つのIL−20結合部位のポリペプチド鎖から構成されている。各結合部位は
、16と表示するIL−20RAの細胞外ドメインと、18と表示するIL−20RBの細胞外ド
メインとから構成されている。

【００３３】 IL−20RAの細胞外ドメインは、配列番号72である、リンカー22を介して、ヒト
免疫グロブリンガンマ1重鎖定常領域の定常重（CH1）ドメイン20に結合されてい
る。次いで、CH1ドメイン20は、ヒンジ領域23を介して、CH2ドメイン24に結合さ
れている。CH2ドメイン24は、ヒンジ領域25を介して、CH3ドメイン26に結合され
ている。

【００３４】 第1図の構築物を配列番号22と比較すると、IL−20RAの細胞外ドメイン16は配
列番号22のアミノ酸残基36、バリンからアミノ酸残基249、グルタミンまで伸長
し、かつそれを含む。ポリペプチドリンカー22は、配列番号22のアミノ酸残基25
0、グリシンからアミノ酸残基264、セリンまで伸長し、かつそれを含む。第1図
のCH1ドメイン22は、配列番号22のアミノ酸残基265、アラニンからアミノ酸残基
362、バリンまで伸長し、かつそれを含む。第1図のヒンジ領域23は、配列番号22
のアミノ酸残基363、グルタミン酸からアミノ酸残基377、プロリンまで伸長し、
かつそれを含む。鎖12および14は、ジサルファイド結合28および30により一緒に
のジサルファイド結合されている。ジサルファイド結合は、2つの重鎖の各々の
配列番号22の位置373および376においてシステイン残基により重鎖間で形成され
る。

【００３５】 IL−20RBの細胞外ドメイン18は、ポリペプチド配列番号72である、ポリペプチ
ドリンカー32を介して第1図のヒトカッパ軽鎖（Cl）34の定常領域に結合されて
いる。IL−20RBの細胞外ドメイン18は配列番号20のアミノ酸残基30、バリンから
アミノ酸残基230、アラニンまで伸長し、かつそれを含む。ポリペプチドリンカ
ー32は、配列番号20のアミノ酸残基231、グリシンからアミノ酸残基245、セリン
まで伸長し、かつそれを含む。

【００３６】 カッパ定常軽領域34は、配列番号20のアミノ酸残基246、アルギニンからアミ
ノ酸残基352、システインまで伸長し、かつそれを含む。配列番号20の位置352に
おけるシステインは、配列番号22の位置367におけるシステインと、第1図におい
てジサルファイド結合36を形成する。こうして、定常軽鎖34はジサルファイド結
合36によりヒンジ領域23に結合されている。このようにして、IL−20RAの細胞外
ドメイン16はIL−20RBの細胞外ドメイン18に結合して、可溶性レセプターを形成
する。

【００３７】 配列番号22の位置373および376におけるシステイン残基が異なるアミノ酸残基
に変化する場合、2つのIL−20結合性ポリペプチド12および14は一緒にジサルフ
ァイド結合し、ヒンジ領域27を有する第2図に示す構築物を形成するであろう。 第3図は本発明の非常に簡単な可溶性レセプター38を示し、ここでIL−20RAの
細胞外ドメイン16はポリペプチドリンカー40によりIL−20RBの細胞外ドメイン18
に接続されている。ポリペプチドリンカーはIL−20RAの細胞外ドメイン16のアミ
ノ末端から伸長し、IL−20RBの細胞外ドメイン18のカルボキシ末端に接続されて
いる。ポリペプチドリンカーは100〜240アミノ酸長さ、好ましくは約170アミノ
酸残基長さである。適当なリンカーはグリシン残基およびセリン残基から構成さ
れている。可能なリンカーは配列番号72の多重単位、好ましくは約12である。

【００３８】 第4図は、第3図におけるように、リンカー40によりIL−20RBの細胞外ドメイン
18に結合されたIL−20RAの細胞外ドメイン16を有する態様を示す。IL−20RAの細
胞外ドメイン16が、第1図に示すように、ポリペプチドリンカー42によりCH1ドメ
イン20に結合されており、ポリペプチドリンカー42は約30アミノ酸残基長さであ
ろう。理想的リンカーは、配列番号72におけるようにグリシンおよびセリン、お
よび第1図のヒンジ領域23から構成されている。

【００３９】 第5図は、本発明の他の可能な態様を示す。この態様において、例えば、配列
番号72の、約15アミノ酸残基のポリペプチドリンカー44は、IL−20RBの細胞外ド
メイン18のカルボキシル末端をIL−20RAの細胞外ドメイン16のアミノ末端に結合
する。約30アミノ酸残基のポリペプチドリンカー46は、IL−20RAの細胞外ドメイ
ン16のカルボキシ末端からCH2ドメインに伸長している。リンカー46のカルボキ
シル末端は、好ましくは、配列番号22のアミノ酸残基363、グルタミン酸からア
ミノ酸残基377、プロリンまで伸長し、かつそれを含む。それにもかかわらず、
ポリペプチドリンカー46は理想的にはそのカルボキシル末端に少なくとも1つの
システイン残基を有するので、ジサルファイド結合を形成することができる。

【００４０】 第6図の可溶性IL−20レセプターは第1図のそれと同一であり、ただし第1図のC
H3ドメイン26は第6図の態様の中に存在しない。CH3領域はアミノ酸残基488、グ
リシンにおいて開始し、配列番号22の少なくとも594に伸長する。 第7図は、CH2およびCH3の両方のドメインが存在しない以外、第1図の概念と同
一である、可溶性IL−20レセプター構築物を示す。CH2およびCH3ドメインはアミ
ノ酸残基378、アラニンから、配列番号22のポリペプチド配列の末端に伸長する
。

【００４１】 第8図は、IL−20RA、16、およびIL−20RBの両方が、それらのそれぞれのカル
ボキシル末端に融合されたポリペプチドリンカー48を有する構築物を示す。各ポ
リペプチドリンカーは2つのシステインを有し、こうしてそれらが発現されると
き、システインは2つのジサルファイド結合50を形成する。この場合において、
ポリペプチドリンカーは第1図においてヒンジ領域23から構成されている。ヒン
ジ領域は、配列番号22のアミノ酸残基363、グルタミン〜アミノ酸残基377から構
成されている。

【００４２】 本発明の他の面において、IL−20RAおよびIL−20RBの細胞外ドメインから構成
された可溶性レセプターを製造する方法が提供され、この方法は下記の工程を含
む： （a）第1分泌シグナル配列に作用可能に連鎖された転写プロモーターと、下流
の適切なリーディングフレームでIL−20RAの細胞外部分をコードするDNAおよび
免疫グロブリン軽鎖定常領域をコードするDNAとから構成された第1DNA配列を宿
主細胞の中に導入し；

【００４３】 （b）第2分泌シグナル配列に作用可能に連鎖された転写プロモーターと、下流
の適切なリーディングフレームでIL−20RBの細胞外部分をコードするDNA配列お
よびC_H1、C_H2、C_H3およびC_H4から成る群から選択される免疫グロブリン重鎖定常
領域をコードするDNA配列とから構成された第2DNA構築物を宿主細胞の中に導入
し； （c）IL−20RAおよびIL−20RBの細胞外ドメインから構成された融合タンパク
質の分泌を可能とする生理学的条件下に、適当な成長培地中で宿主細胞を成長さ
せ；そして

【００４４】 （d）ポリペプチドを宿主細胞から単離する。 1つの態様において、第2DNA配列は免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域をさらにコ
ードし、ここでヒンジ領域は重鎖定常領域ドメインに結合されている。他の態様
において、第2DNA配列は上流において適切なリーディングフレームで免疫グロブ
リン重鎖定常領域と結合した免疫グロブリン可変領域をさらにコードする。

【００４５】 本発明の選択的面において、IL−20RAおよびIL−20RBの細胞外ドメインから構
成された可溶性レセプターを製造する方法が提供され、この方法は下記の工程を
含む： （a）第1分泌シグナル配列に作用可能に連鎖された転写プロモーターと、下流
の適切なリーディングフレームでIL−20RBの細胞外部分をコードするDNAおよび
免疫グロブリン軽鎖定常領域をコードするDNAとから構成された第1DNA配列を宿
主細胞の中に導入し；

【００４６】 （b）第2分泌シグナル配列に作用可能に連鎖された転写プロモーターと、下流
の適切なリーディングフレームでIL−20RAの細胞外部分をコードするDNA配列お
よびC_H1、C_H2、C_H3およびC_H4から成る群から選択される免疫グロブリン重鎖定常
領域をコードするDNA配列とから構成された第2DNA構築物を宿主細胞の中に導入
し； （c）IL−20RAおよびIL−20RBの細胞外ドメインから構成された二量化ヘテロ
ダイマーの融合タンパク質の分泌を可能とする生理学的条件下に、適当な成長培
地中で宿主細胞を成長させ；そして

【００４７】 （d）二量化ポリペプチドを宿主細胞から単離する。1つの態様において、第2D
NA配列は免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域をさらにコードし、ここでヒンジ領域は
重鎖定常領域ドメインに結合されている。 他の態様において、第2DNA配列は上流において適切なリーディングフレームで
免疫グロブリン重鎖定常領域と結合した免疫グロブリン可変領域をさらにコード
する（米国特許第5,843,725号参照）。

【００４８】 本明細書において使用するとき、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、アフ
ィニティー精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および抗原結
合性フラグメント、例えば、F（ab'）₂、およびFabタンパク質分解フラグメント
を包含する。遺伝子操作された無傷の抗体またはフラグメント、例えば、キメラ
抗体、Fvフラグメント、一本鎖抗体およびその他、ならびに合成抗原結合性ペプ
チドおよびポリペプチドもまた包含される。非ヒトCDRをヒトフレームワークお
よび定常領域上にグラフト化するか、あるいは全非ヒト可変ドメインを組込むこ
とによって（必要に応じて暴露された残基の置換によりヒト様表面でそれらを「
クローキング（cloaking）」し、ここで「ベニヤ化」抗原が得られる）非ヒト抗
体をヒト化することができる。

【００４９】 ある場合において、ヒト化抗体はヒト可変領域フレームワークドメイン内に非
ヒト残基を保持して、適切な結合特性を増強することができる。ヒト化抗体によ
り、生物学的半減期を増加することができ、ヒトへの投与時における悪い免疫反
応に対する可能性は減少する。 例えば、スキャッチャード分析により、当業者
は抗体の結合アフィニティーを容易に測定することができる。この分野において
知られている種々のアッセイを利用して、タンパク質またはペプチドに対する抗
体を検出することができる。

【００５０】 典型的なアッセイは下記の文献に詳細に記載されている：Antibodies：A Lab
oratory Manual、HarlowおよびLane（編者）（Cold Spring Harbor Laborat
ory Press、1988）。このようなアッセイの代表例は下記のものを包含する：並
流免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵素結合イム
ノアッセイ（ELISA）、ドットブロットまたはウェスタンブロットアッセイ、阻
害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ。

【００５１】 我々はIL−20がIL−8をアップレギュレートすることを示した。IL−8が有意な
役割を演じ、かつIL−8の減少が有益である炎症疾患は、大人の呼吸疾患（ARD）
、敗血性ショック、多発性器官不全、炎症性肺損傷、例えば、ぜん息または気管
支炎、細菌性肺炎、乾癬、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、および炎症
性腸疾患、例えば、潰瘍化大腸炎およびクローン病である。こうして、本発明の
IL−20に対するアンタゴニストは、これらの疾患を治療するために患者に投与す
ることができる。

【００５２】 IL−20の生物学、そのレセプターおよび乾癬におけるその役割 2つのオーファン（orphan）クラスIIのサイトカインレセプターの両方は皮膚
において発現され、IL−20レセプターサブユニットとして同定された。IL−20レ
セプターサブユニットの両方は、リガンドの結合、それらの役割を4つの既知ク
ラスIIのサイトカインレセプターにおけるサブユニットの役割と区別するために
必要である。また、IL−20RAおよびIL−20RBは皮膚以外の多数のヒト組織、例え
ば、卵巣、副腎、精巣、唾液腺、筋肉、肺、腎臓、心臓において発現され、そし
てより少ない程度に小腸において発現され、IL−20の追加のターゲット組織が示
唆される。IL−20ヘテロダイマーレセプターは他のクラスIIのサイトカインレセ
プターに類似する構造を有し、我々がIL−20リガンドの活性を証明した皮膚にお
いて発現されると、我々は結論する。

【００５３】 2つの系統の証拠は、IL−20およびそのレセプターの役割が乾癬に関係するこ
とを示す。多発性皮膚疾患は、ケラチノサイト増殖の増加、ケラチノサイト分化
の変更、および皮膚の中への免疫細胞の浸潤により特徴づけられる。乾癬におけ
るIL−20の役割についての証拠の第1系統は、トランスジェニックマウスにおい
て観測された過角質化および表皮肥厚がヒト乾癬の異常性に類似することを示す
。欠陥ケラチン化に関係すると考えられる、トノフィラメントの数の減少は、ヒ
ト乾癬の顕著な特徴である。ミトコンドリア内封入は、マウスにおける化学的に
誘導されかつ天然に起こる増殖性皮膚症状であることが見出された。封入体の原
因およびミトコンドリア機能に対するそれらの作用は、いずれかと言えば、未知
である。IL−20トランスジェニックマウスはヒト乾癬において観測される多数の
特性を示すと、我々は結論する。

【００５４】 乾癬にIL−20レセプターを関係づける証拠の第2系統は、IL−20RAおよびIL−2
0RBの両方が正常皮膚に比較してヒト乾癬皮膚において顕著にアップレギュレー
トされることである。両方のIL−20レセプターは表皮を通じてケラチノサイト中
で発現され、また、免疫細胞および内皮細胞のサブセットにおいて発現される。
活性化されたIL−20レセプターの発現の増加は、内皮細胞、免疫細胞およびケラ
チノサイトの間の相互作用を変更して、ケラチノサイトの増殖および分化の調節
不良に導くことを我々は提案する。

【００５５】 新規なサイトカインの機能を理解するときのきわめて重要な工程は、そのコグ
ネイトレセプターの同定および特性決定である。新規なインターロイキンを単離
するために構造に基づくアプローチを使用することに我々は成功し、これはその
レセプターの単離に直ちに導いた。IL−20はヒトケラチノサイトHaCaT細胞系統
におけるシグナルトランスダクションを刺激し、皮膚におけるこの新規なリガン
ドの直接的作用を支持する。

【００５６】 さらに、ケラチノサイトにおいて活性でありかつ皮膚における増殖および前炎
症シグナルに関係づけられることが知られているタンパク質であるIL−1β、EGF
およびTNF−αはIL−20に対する応答を増強する。IL−20レセプターを発現するH
aCaTおよびBHK細胞の両方において、IL−20シグナルはSTAT3を通してシグナルす
る。こうして、IL−20はケラチノサイト上のそのレセプターに結合し、STAT3を
含有するシグナルトランスダクション経路を刺激する。

【００５７】 乾癬を治療するためのIL−20に対するアンタゴニストの使用 上の論考および下記の実施例において示すように、IL−20は乾癬の病理学に関
係する。こうして、本発明の可溶性レセプターを個体に投与してIL−20をダウン
レギュレートし、こうして乾癬を治療する。 乾癬は、世界の人口の1〜2％までに影響を与える、最も普通の皮膚科学的疾患
である。それは銀様雲母状鱗片により被覆された、紅班の、鋭く分画された丘疹
および丸いプラークにより特徴づけられる、慢性炎症性皮膚疾患である。乾癬の
皮膚病変は変動的かゆみをを引き起こす。外傷を受けた領域はしばしば乾癬の病
変を発生する。さらに、他の外部因子、例えば、感染、ストレス、および投薬、
例えば、リチウム、ベータ遮断薬、および抗マラリア剤は乾癬を増悪させる。

【００５８】 最も普通の種類の乾癬はプラーク型と呼ばれる。プラーク型乾癬の患者は、安
定な、ゆっくり増殖するプラークを有し、これは基本的には長期間にわたって未
変化のままである。プラーク乾癬が発生する最も普通の領域は、肘膝、臀裂溝、
および頭皮である。包含は対称である傾向がある。逆位乾癬は、腋窩、鼠径部、
乳腺下領域、および臍を含む間擦性領域に影響を与え、また、頭皮、手のひら、
および足裏に影響を与える傾向がある。個々の病変は鋭く分画されたプラークで
あるが、これらの位置のために湿ることがある。プラーク型乾癬は一般にゆっく
り発生し、無痛性過程をたどる。それは稀に自発的に寛解する。

【００５９】 発疹性乾癬（滴状乾癬）は子供および若い成人において最も普通である。それ
は乾癬をもたない個体、または慢性プラーク乾癬をもつ個体において急性的に発
生する。患者は、しばしばベータ溶血性スタヒロコッカスによる上部気道感染後
に、多数の紅班、鱗片状丘疹を提示する。乾癬の患者は、また、嚢胞性病変を発
生する。これらは手のひらおよび足裏に局在化することがあるか、あるいは一般
化し、熱、倦怠、下痢、および関節痛に関連することがある。

【００６０】 すべての乾癬患者のほぼ半分は、点状くぼみ、爪の肥厚または爪下過角質化と
して出現する、爪の包含を有する。乾癬患者の約5〜10％は関連した関節病訴を
有し、これらは爪の包含を有する患者において最もしばしば見出される。あるも
のは古典的慢性関節リウマチの同時発生を有するが、多数は5つの乾癬に関連す
る型の1つに入る関節疾患を有する：（1）単一またはわずかの関節に制限される
疾患（症例の70％）；（2）血清陰性慢性関節リウマチ様疾患；（3）指節間関節
の包含；（4）「破壊性関節炎」の発生を伴う重度の破壊的関節炎；および（5）
脊髄に限定される疾患。

【００６１】 乾癬はIL−20に対するアンタゴニストの投与により治療することができる。好
ましいアンタゴニストはIL−20に対する可溶性レセプター、またはIL−20レセプ
ターまたはIL−20に結合する抗体、抗体フラグメントまたは一本鎖抗体である。
IL−20に対するアンタゴニストは単独でまたは他の確立された治療剤、例えば、
滑剤、角質溶解剤、局所用コルチコステロイド、局所用ビタミンD誘導体、アン
トラニン、全身的抗代謝物質、例えば、メトトレキセート、プソラレン−紫外線
治療（PUVA）、エトレチネート、イソトレチノイン、シクロスポリン、および局
所用ビタミンD3誘導体カルシポトリオールと組合わせて投与することができる。

【００６２】 アンタゴニスト、特にIL−20またはIL−20レセプターに結合する可溶性レセプ
ターまたは抗体は、個体に皮下的、静脈内、または経皮的にIL−20に対するアン
タゴニストを含有するクリームまたは経皮的パッチを使用して投与することがで
きる。皮下投与する場合、アンタゴニストは1またはそれ以上の乾癬プラークの
中に注射することができる。経皮的に投与する場合、アンタゴニストはIL−20に
対するアンタゴニストを含有するクリームを使用してプラーク上に直接投与する
ことができる。

【００６３】 肺の炎症症状を治療するためのIL−20に対するアンタゴニストの使用 本発明のIL−20の可溶性レセプターは、ぜん息、気管支炎または嚢胞性繊維症
または他の炎症性肺疾患を有する人に投与して、この疾患を治療することができ
る。アンタゴニストは、静脈内、皮下、気管支洗浄、およびIL−20に対するアン
タゴニストを含有する吸入剤の使用を包含する任意の適当な方法により投与する
ことができる。

【００６４】 IL−20の可溶性レセプターの投与 有効な治療に必要なIL−20の可溶性レセプターの量は、多数の異なる因子、例
えば、投与手段、ターゲット部位、患者の生理学的状態、および投与する他の薬
剤に依存するであろう。こうして、治療投与量は安全性および効能を最適化する
ために滴定すべきである。典型的には、in vitroにおいて使用する投与量はこ
れらの薬剤のin vivo投与に有効な量において有用な指針を提供するであろう。
特定の障害の治療のために有効な投与量の動物試験は、ヒト投与量のそれ以上の
予測的指示を提供する。

【００６５】 投与方法は、経口、静脈内、腹腔、筋肉内、経皮または肺または気管内への噴
霧化装置または微粉化装置によるスプレー形態の投与を包含する。薬学上許容さ
れる担体は、なかでも、水、生理食塩水、緩衝剤を包含する。投与量範囲は通常
1μg〜1000μg／kg体重／日である。平均的成人のためのIL−20の可溶性レセプ
ターの投与量は、皮下注射として約25mg×2回／週であろう。注射は乾癬の治療
のために乾癬病変に行われる。IL−20に対するアンタゴニストの皮下または静脈
内投与のために、抗体または可溶性レセプターはリン酸塩緩衝液の中に存在させ
ることができる。

【００６６】 また、皮膚疾患、例えば、乾癬において、IL−20に対するアンタゴニストは軟
膏または経皮パッチを介して投与することができる。通常の技量を有する医師は
決定できるように、投与量はより多いか、より少ないことができる。薬剤処方物
および投与量範囲の完全な説明については、下記の文献を参照のこと：Remingto
n's Pharmaceutical Sciences、第18版、（Mack Publishing Co.、Easton、
Penn.、1996）およびGoodmanおよびGilman's：The Pharmacological Bases o
f Therapeutics、第9版、（Pergamon Press、1996）。 下記の実施例は本発明の例示であるが、本発明を限定するものと解釈すべきで
はない。

【００６７】実施例1 ．IL−20によりIL−8のアップレギュレーション方法 継代培養2における正常ヒト表皮新生児ケラチノサイト（NHEK）（Cloneticsか
ら）を12ウェルの組織培養プレートの中にプレートし、コンフルエンシーに増殖
させた。KGM（ケラチノサイト増殖培地）をクロネチクス（Clonetics）から購入
した。細胞がコンフルエンシーに到達したとき、細胞を増殖因子を含有しないKG
M培地＝KBM（ケラチノサイト基底培地）で洗浄した。細胞をKBM中の72時間血清
飢餓させた後、被検化合物を添加した。1IU／mlのトロンビンおよび25nMのトリ
プシンを陽性対照として使用した。1mlの培地／ウェルを添加した。

【００６８】 IL−20をKBM培地の中に入れ、第1実験において2.5μg／mlから618ng／mlまで
、そして第2実験において2.5μg／mlから3ng／mlまで変化する濃度で添加した。 細胞を37℃、5％CO₂において48時間インキュベートした。上清を取出し、−80
℃において数日間凍結させた後、IL−8およびGM−CSFレベルについてアッセイし
た。ヒトIL−8イムノアッセイキット＃D8050（RandD Systems，Inc.）およびヒ
トGM−CSFイムノアッセイキット＃HSGMO（RandD Systems，Inc.）を製造業者の
使用説明書に従い使用して、サイトカイン産生を測定した。

【００６９】 結果 IL−8およびGM−CSFはIL−20により誘導されることが、結果により示された。

【００７０】実施例2 ．IL−20RBのクローニング IL−20RBコーディング領域のクローニング 国際特許出願No．PCT／US99／03735（公開No.WO99／46379）1999年3月8日提出
からの配列に基づいて、2つのPCRプライマーを設計した。配列番号16はEcoRI制
限部位をもつATG（Met1）コドンを含有する。配列番号17はXhoI制限部位をもつ
停止コドン（TAG）を含有する。鋳型としてヒトケラチノサイト（HaCaT）cDNAラ
イブラリーDNAおよびプライマーとして配列番号16および配列番号17を使用して
、PCR増幅を実施した。

【００７１】 PCR反応を次のようにして実施した：94℃における1分間のインキュベーション
、次いで30サイクルの94℃において30秒間および60℃において2分間、次いでさ
らに68℃において4分間、反応を4℃において貯蔵した。PCR生成物を1％のアガロ
ースゲル上で開発し、そして1kbのDNAが観測された。PCR生成物をゲルから切断
し、QIAquickゲル抽出キット（Qiagen）を使用してDNAを精製した。精製したDNA
をEcoRIおよびXhoIで消化し、pZPベクターの中にクローニングし、これをpZP7N
と呼んだ。

【００７２】 pZPプラスミドはマウスメタロチオネイン−1プロモーター、ヒトtPAリーダー
ペプチド、コーディング配列を挿入するための多重制限部位、Glu−Gluタグ、お
よびヒト成長ホルモンターミネーターを有する発現カセットを含有する哺乳動物
発現ベクターである。このプラスミドは、また、大腸菌（E. coli）複製起点、
SV40プロモーターを有する選択可能なマーカー発現単位、エンハンサーおよび複
製起点、ならびにDHFR遺伝子、およびSV40ターミネーターを有する。いくつかの
IL−20RB−pZP7Nを配列決定した。それらのすべてはPCT／US99／03735中のIL−2
0RBと比較して3つの非保存突然変異を含有する：（配列IL−20RB−pZP7N）、146
Pro（CCC）、148His（CAT）−Asp（GAT）、および171Thr（ACG）−Arg（AGG）。

【００７３】 IL−20RB−pZP7Nクローン中の3つの置換を確認するために、3つの異なるcDNA
源−胎児皮膚マラソンcDNA、HaCaT cDNAライブラリーDNA、および前立腺平滑筋
cDNAライブラリーDNA−を鋳型として使用して、PCR増幅を実施した。PCR生成物
をゲル精製し、配列決定した。3つのPCR生成物の各々の配列は、IL−20RB−pZP7
Nクローンの配列と一致した。IL−20RBは配列番号13および14であり、そして成
熟細胞外ドメインは配列番号15である。

【００７４】実施例3 ．IL−20RB／IL−20RAヘテロダイマーに対するIL−20の結合 細胞をベースとする結合アッセイを使用して、IL−20RA−IL−20RBヘテロダイ
マーに対するIL−20を確認した。 既知のオーファンクラスIIサイトカインレセプター（IL−20RAおよびIL−20RB
を包含する）を含有する発現ベクターを種々の組合わせでCOS細胞の中に一時的
にトランスフェクトし、次いでこれらをビオチン標識化IL−20タンパク質に結合
する能力についてアッセイした。IL−20RA−IL−20RBヘテロダイマーはIL−20に
対するレセプターであることが、結果により示される。使用した手順を後述する
。

【００７５】 COS細胞のトランスフェクションを次のようにして12ウェルの組織培養プレー
ト中の実行した：92μlの無血清ダルベッコ変性イーグル培地（DMEM）（200mlの
DMEM中の55mgのピルビン酸ナトリウム、146mgのL−グルタミン、5mgのトランス
フェリン、2.5mgのインスリン、1μgのセレンおよび5mgのフェツイン）の中に5
μlのリポフェタミンを含有する培地と、0.5μgのDNAを混合し、室温において30
分間インキュベートし、次いで400μlの無血清DMEM培地に添加した。次いでこの
500μlの混合物を1.5×10⁵COS細胞／ウェルに添加し、37℃において5時間インキ
ュベートした。500μlの20％の胎仔ウシ血清（FBS）DMEM培地を添加し、一夜イ
ンキュベートした。

【００７６】 アッセイ、「分泌トラップ」（Davis、S.他、Cell 87：1161−1169（1996）
の変法を次のようにして実施した：細胞をPBS／1％ウシ血清アルブミン（BSA）
でリンスし、TNB（水中の0.1MのTris−HCl、0.15MのNaClおよび0.5％のブロッキ
ング試薬（NEN Renaissance TSA−Direct Kit Cat＃NEL701））で1時間ブロ
ックした。次いでTNB中で3μg／mlのビオチニル化IL−20タンパク質と1時間イン
キュベートした。細胞をPBS／1％BSAで洗浄し、TNB中の1：300希釈ストレプトア
ビジン−HRP（NENキット）とさらに1時間インキュベートした。

【００７７】 さらに洗浄した後、細胞をリン酸塩緩衝液（PBS）中の1.8％のホルムアルデヒ
ドで15分間固定した。次いで細胞をTNB（水中の0.1MのTris−HCl、0.15MのNaCl
および0.05％のTween−20）で洗浄した。希釈緩衝液（NENキット）中で1：50に
希釈したフルオレセインチラミド試薬と5分間インキュベートした後、陽性結合
シグナルを検出した。細胞をTNTで洗浄し、TNT中で1：5に希釈したヴェクタシー
ルドマウント培地（Vectashield Mounting Media）（Vector Labs）で保存し
、倒立蛍光顕微鏡によりFITCフィルターを使用して可視化した。

【００７８】実施例4 ．IL−20による炎症性サイトカインのアップレギュレーション 細胞処理 ヒトケラチノサイト細胞系統、HaCaTを、37℃においてコンフルエンス後数日
間T−75組織培養フラスコ中で増殖させる。この時点において、正常増殖培地（D
MEM＋10％FBS）を取出し、無血清培地と置換した。次いで細胞を37℃において2
日間インキュベートした。次いでDMEMを取出し、4フラスコの細胞／処理を下記
の条件の各々の1つで37℃において4時間処理した：組換えヒト（rh）IL−1アル
ファ、5ng／ml；rhIL−1アルファ、20ng／ml；rhIL−1アルファ、5ng／ml＋IL−
20、1μg／ml；IL−20、1μg／ml；またはIL−10、10ng／ml。

【００７９】 RNAの単離 サイトカイン処理後、培地を取出し、細胞をチオシアン酸グアニジニウム溶液
で溶解した。塩化セシウム勾配で一夜回転することによって、細胞ライゼイトか
ら全RNAを単離した。次の日に、RNAペレットをTE／SDS溶液中に再懸濁させ、エ
タノール沈降させた。次いでRNAを分光光度計で定量し、次いで下記の文献に記
載されているようにDNアーゼ処理した：Clontech's cDNA Expression Arrays User Manual、Section V.B.（バージョンPT3140−1／PR9X390、1999年11月5
日発行）。RNA試料の品質を規格書の読みに基づく純度の計算、およびアガロー
スゲル上の可視化により確認した。RNA試料のゲノムの汚染をベータ−アクチン
遺伝子のPCR分析により除外した。

【００８０】 プローブ合成 ポリA＋の濃縮、プローブ合成およびAtlas^TMアレイに対するハイブリダイゼー
ションについてのクロンテク（Clontech）のプロトコルに従った（前述参照、＋
Atlas^TM Pure Total RNA Labeling System Unser Manual、PT3231−1／P
R96157、1999年6月22日発行）。簡単に述べると、ストレプトアビジン被覆磁気
ビーズ（Clontech、カリフォルニア州パロアルト）および磁気粒子分離装置を使
用して、ポリA＋RNAを50mgの全RNAから単離した。次いでポリA＋RNAをアルファ^{3 2} P−dATPでRT−PCRにより標識化した。Atlas^TMヒトサイトカイン／レセプターア
レイ（Cat＃7744−1）上の268遺伝子に対して特異的なクロンテクCDSプライマー
を反応において使用した。標識化プローブをカラムクロマトグラフィーにより単
離し、シンチレーション流体中で計数した。

【００８１】 アレイ膜ハイブリダイゼーション Atlas^TMアッセイをクロンテクExpressHyb＋100mg／mlの加熱変性サケ精子DNA
と、68℃において少なくとも30分間連続的に撹拌しながら前ハイブリダイゼーシ
ョンした。次いで、膜を1.9×10⁶CPM／ml（合計1.14×10⁷CPM）と一夜68℃にお
いて連続的に撹拌しながらハイブリダイゼーションさせた。次の日に、膜を2×S
SC、1％SDS中で68℃において30分間4回洗浄し、次いで0.1×SSC、0.5％SDS中で6
8℃において30分間1回洗浄し、次いで最後に2×SSC中で室温において5分間洗浄
した。次いでアレイ膜をコダック（Kodak）プラスチックパウチの中に入れ、シ
ールし、リン光体イメジャースクリーンに対して室温において一夜露出した。次
の日に、リン光体スクリーンをリン光体イメジャー上で走査し、クロンテクのAt
lasImage^TM1.0ソフトウェアで解析した。

【００８２】 結果IL−20によりアップレギュレートされた遺伝子 1. 腫瘍壊死因子（TNF）はIL−20により1.9〜2.4倍アップレギュレートされ
た。 2. 血小板増殖因子1および2（PLGF）はIL−20により1.9〜2.0倍アップレギュ
レートされた。 3. 凝固因子IIレセプターはIL−20により2.0〜2.5倍アップレギュレートされ
た。 4. カルシトニンレセプターはIL−20により2.2〜2.3倍アップレギュレートさ
れた。 5. TNF誘導可能なヒアルロネート結合性タンパク質TSG−6はIL−20により2.1
〜2.2倍アップレギュレートされた。 6. 脈管内皮増殖因子（VEGF）レセプター−1前駆体、チロシン−タンパク質
キナーゼレセプター（FLT−1）（SFLT）はIL−20により2.1〜2.7倍アップレギュ
レートされた。 7. MRP−8（マクロファージ中のカルシウム結合性タンパク質、MIF関係）はI
L−20により2.9〜4.1倍アップレギュレートされた。 8. MRP−14（マクロファージ中のカルシウム結合性タンパク質、MIF関係）は
IL−20により3.0〜3.8倍アップレギュレートされた。 9. レラクシンH2はIL−20により3.14倍アップレギュレートされた。 10. 形質転換性増殖因子ベータ（TGFβ）レセプターIII300kDaはIL−20によ
り2.4〜3.6倍アップレギュレートされた。

【００８３】IL−20＋IL−1処理と相乗性を示す遺伝子 1. 骨形態形成タンパク質2aは、IL−20処理単独で1.8倍、IL−1処理単独で2.
5倍、そしてIL−20およびIL−1の両方の組合わせ処理で8.2倍アップレギュレー
トされた。 2. MRP−8は、IL−20処理単独で2.9倍、IL−1処理単独で10.7倍、そしてIL−
20およびIL−1の両方の組合わせ処理で18.0倍アップレギュレートされた。 3. 赤血球系分化タンパク質（EDF）は、IL−20処理単独で1.9倍、IL−1処理
単独で9.7倍、そしてIL−20およびIL−1の両方の組合わせ処理で19.0倍アップレ
ギュレートされた。

【００８４】 4. MRP−14（マクロファージ中のカルシウム結合性タンパク質、MIF関係）は
、IL−20処理単独で3.0倍、IL−1処理単独で12.2倍、そしてIL−20およびIL−1
の両方の組合わせ処理で20.3倍アップレギュレートされた。 5. ヘパリン結合性EGF様増殖因子は、IL−20処理単独で2.0倍、IL−1処理単
独で14倍、そしてIL−20およびIL−1の両方の組合わせ処理で25.0倍アップレギ
ュレートされた。

【００８５】 6. ベータ−トロンボグロブリン様タンパク質は、IL−20処理単独で1.5倍、I
L−1処理単独で15倍、そしてIL−20およびIL−1の両方の組合わせ処理で27倍ア
ップレギュレートされた。 7. 脳由来神経向性因子（BDNF）は、IL−20処理単独で1.7倍、IL−1処理単独
で25倍、そしてIL−20およびIL−1の両方の組合わせ処理で48倍アップレギュレ
ートされた。 8. 単球化学走性および活性化因子MCAFは、IL−20処理単独で1.3倍、IL−1処
理単独で32倍、そしてIL−20およびIL−1の両方の組合わせ処理で56倍アップレ
ギュレートされた。

【００８６】実施例5 ．IL−20RA／RBレセプター−Ig融合ヘテロダイマー 発現ベクターpEZE3を使用して、組換えIL−20レセプター−Ig融合タンパク質
を発現させた。プラスミドpEZE3をpDC312から誘導する。pDC312はイムイネック
ス・コーポレーション（Imuunex Corporation）からライセンスにより入手した
。WO97／25420に記載されているように、プラスミドpDC312およびpEZE3はEASEセ
グメントを含有する。発現ベクター中のEASEセグメントの存在は、安定な細胞プ
ールにおける組換えタンパク質の発現を2〜8倍改良する。

【００８７】 プラスミドpEZE3は、哺乳動物細胞、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣
（CHO）細胞において3つまでの異なるタンパク質を発現させるために使用できる
トリシストロン発現ベクターである。pEZE3発現単位は、サイトメガロウイルス
（CMV）エンハンサー／プロモーター、アデノウイルス三部分リーダー配列、第1
組換えタンパク質のコーディング領域を挿入するための多重クローニング部位、
ポリオウイルス2型内部リボソームエントリー部位、第2組換えタンパク質のコー
ディング領域を挿入するための第2多重クローニング部位、脳心筋炎ウイルス内
部リボソームエントリー部位、マウスジヒドロフォレートレダクターゼ、および
SV40転写ターミネーターを含有する。さらに、pEZE3は大腸菌（E. coli）複製
起点および細菌ベータラクタマーゼ遺伝子を含有する。

【００８８】 IL−20レセプター−Ig融合タンパク質は、野生型ヒト免疫グロブリンカッパ軽
鎖定常領域に融合されたヒトIL−20RBの細胞外ドメインの2つの鎖と、突然変異
したヒト免疫グロブリンガンマ1定常領域に融合されたヒトIL−20RAタンパク質
の細胞外ドメインの2つの鎖とから成るジサルファイド結合ヘテロダイマーであ
る。ヒト免疫グロブリンガンマ1定常領域は、FcγRI結合およびC1q補体結合を減
少させるアミノ酸置換を含有する。

【００８９】 ヒトIL−20RB細胞外ドメインヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域融合構築
物は、オーバーラップPCRにより発生させた。IL−20RBコーディングセグメント
はアミノ酸1〜230から成る。IL−20RセグメントのPCR増幅に使用した鋳型は、実
施例12に後述するように発生させたIL−20RBヒトカッパ軽鎖定常領域発現構築物
であった。オリゴヌクレオチドプライマー配列番号24および配列番号25を使用し
て、IL−20RBセグメントを増幅した。全野生型ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定
常領域を使用した。

【００９０】 野生型ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域セグメントのPCR増幅に使用し
た鋳型は、実施例12に記載するように発生させたIL−20RBヒトカッパ軽鎖定常領
域発現構築物であった。オリゴヌクレオチドプライマー配列番号26および配列番
号27を使用して、野生型ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域を増幅した。オ
リゴヌクレオチドプライマー配列番号24および配列番号27を使用してオーバーラ
ップPCRにより、2つのタンパク質コーディングドメインを結合させた。

【００９１】 （Gly₄Ser）₃（配列番号72）ペプチドリンカーを2つのタンパク質ドメイン間
に挿入した。（Gly₄Ser）₃ペプチドリンカーは、PCRプライマー配列番号26およ
び配列番号25上にコードされた。生ずるIL−20RB細胞外ドメイン／カッパ軽鎖定
常領域融合構築物を配列番号20および21で示す。予測された成熟ポリペプチド、
マイナスシグナル配列は、配列番号60である。実際に使用したIL−20RBの細胞外
ドメインの部分を、配列番号61アミノ酸配列から構成した。N末端の配列決定は
予測されたアミノ酸配列を生じた。

【００９２】 各々がPCR増幅反応により発生された、4つの別々のDNAフラグメントのオーバ
ーラップPCRにより、ヒトIL−20RA細胞外ドメインヒト免疫グロブリンガンマ1重
鎖定常領域融合構築物を発生させた。第1フラグメントは最適化tPA（組織プラス
ミノゲンアクチベーター）シグナル配列を含有した。鋳型として組織内で以前発
生させた発現ベクターを用いオリゴヌクレオチドプライマー配列番号28および配
列番号29を使用して、tPAシグナル配列を増幅した。第2フラグメントは、配列番
号11のアミノ酸30〜243から成るIL−20RA細胞外ドメインコーディング領域を含
有した。IL−20RAの以前に発生させたクローンを鋳型として用いオリゴヌクレオ
チドプライマー配列番号30および配列番号31を使用して、このIL−20RAセグメン
トを増幅した。

【００９３】 ヒトガンマ1重鎖定常領域を2つのセグメントから発生させた。鋳型として野生
型ヒトガンマ1重鎖定常領域のクローンを用いオリゴヌクレオチドプライマー配
列番号32および配列番号33を使用して、C_H1ドメインを含有する第1セグメントを
増幅した。オリゴヌクレオチドプライマー配列番号34および配列番号35を使用す
るPCR増幅により、ヒト免疫グロブリンガンマ1重鎖定常領域の残留ヒンジ領域、
C_H2、およびC_H3領域を含有する第2フラグメントを発生させた。このPCR増幅に使
用した鋳型は、実施例12に記載されているようにFcγRI結合およびC1q補体結合
を減少させるアミノ酸置換のコドンを含有する、以前に発生させたヒトガンマ1F
c構築物からのものであった。

【００９４】 オリゴヌクレオチド配列番号28および配列番号35を使用するオーバーラップPC
Rにより、4つのコーディングドメインを結合した。（Gly₄Ser）₃ペプチドリンカ
ーをIL−20RAおよびCH1タンパク質ドメインの間に挿入した。（Gly₄Ser）₃ペプ
チドリンカーはPCRプライマー配列番号32および配列番号31上にコードされた。I
L−20RA細胞外ドメイン／ドメインヒト免疫グロブリンガンマ1重鎖定常領域融合
タンパク質およびDNA配列を配列番号22および配列番号23に示す。予測されたポ
リペプチド配列、マイナスシグナル配列は、配列番号62に示されている。実際に
使用したIL−20RAの細胞外ドメインの部分は配列番号63から構成されていた。

【００９５】 IL−20RB細胞外ドメインヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖定常領域融合コーディ
ングセグメントをpEZE3の第2MCSの中にクローニングしたが、ヒトIL−20RA細胞
外ドメインヒトヒト免疫グロブリンガンマ1重鎖定常領域融合コーディングセグ
メントを第1MCSの中にクローニングした。このプラスミドを使用してCHO細胞を
トランスフェクトした。ハイポキサンチンまたはチミジンを含まない培地中で細
胞を選択し、そしてメトトレキセートを使用してトランスジーンを増幅した。

【００９６】 抗ヒトガンマ1重鎖定常領域および抗ヒトカッパ軽鎖抗体を使用するウェスタ
ンブロッティングにより、タンパク質の存在アッセイした。N末端の配列決定に
より、最適化tPAリーダーは完全には切断されないことが明らかにされた。観測
された質量はポリペプチド配列の第1残基がピログルタミン酸であることを示し
、そしてN末端はピロEEIHAELRRFRRVPCVSGG（配列番号64）であるように見え、下
線が引かれている部分はtPAリーダーのレムナントである。

【００９７】実施例6 ．IL−20トランスジェニック表現型 種々のプロモーターを使用してトランスジェニックマウスにおいて、ヒトIL−
20およびマウスIL−20の両方を過剰発現させた。ヒトIL−20の発現を指令する、
肝臓特異的マウスアルブミンを最初に使用して、タンパク質の循環レベルを達成
する試みをした。表皮および他の重層偏平表皮に発現をターゲッティングするケ
ラチン14（K14）プロモーター；広い発現パターンを与えるマウスメタロチオネ
イン−1プロモーター；およびリンパ系細胞における発現を推進するEμLCLプロ
モーターを使用して、引き続く研究を実施した。多分これらのプロモーターのす
べてはIL−20循環レベルを発生させるので、すべての4つの場合において、同様
な結果が得られた。

【００９８】 すべての場合において、IL−20トランスジーンを発現するトランスジェニック
子は非トランスジェニック同腹子よりも小さく、堅い、しわが形成した皮膚もつ
輝いた外観を有し、出産後最初の数日以内に死亡した。子はそれらの胃内に乳を
有し、乳を飲むことができることが示された。これらのマウスは腫脹した四肢、
尾、鼻孔および口領域を有し、動くことが困難であった。さらに、マウスは虚弱
であり、脂肪組織を欠如し、耳および足指の発育が遅れていた。肝臓における低
い発現レベル（100mRNA分子／細胞より低い）は新生児の死亡率および皮膚の異
常性の両方について十分であった。いずれの可視の表現型をもたないトランスジ
ェニックマウスはトランスジーンを発現せず、それを検出可能なレベルで発現せ
ず、またはモザイクであった。

【００９９】 IL−20トランスジェニックマウスの皮膚の組織学的分析は、非トランスジェニ
ック同腹子に比較して、肥厚表皮、過角質化およびコンパクトな角質層を示した
。漿液細胞外層（かさぶた）は時々観測された。トランスジェニックマウスから
の皮膚の電子顕微鏡（EM）解析は、ミトコンドリア内リポイド封入体、斑状ケラ
トヒアリン顆粒、およびヒト乾癬皮膚およびマウス皮膚疾患モデルにおいて観測
されるものに類似する比較的わずかのトノフィラメントを示した。さらに、トラ
ンスジェニックマウスの多数はアポトーシス胸腺リンパ球を有した。他の異常性
は組織学的分析により観測されなかった。これらの組織学的およびEMの結果は、
観測された全般的皮膚変更を支持し、拡張する。

【０１００】実施例7 ．IL−20のそのレセプターに対する特異性およびアフィニティー IL−20RA、IL−20RBまたは両方のレセプターサブユニットで安定にトランスフ
ェクトしたBHKを使用して、 IL−20のそのレセプターに対する特異性およびア
フィニティーを測定した。放射能標識化リガンドを使用する結合アッセイにおい
て、IL−20はIL−20RAおよびIL−20RBの両方を発現するBHKトランスフェクタン
トに結合するが、非トランスフェクト細胞またはレセプターサブユニット単独を
発現するトランスフェクタントには結合しないことが証明された。¹²⁵I標識化IL
−20の結合は100倍過剰の非標識化IL−20の存在下に排除されたが、100倍過剰の
無関係のサイトカインIL−21で排除されなかった。IL−20RA／IL−20RBヘテロダ
イマーレセプターに対するIL−20の結合アフィニティー（k_D）は、ほぼ1.5nMで
あると測定された。

【０１０１】実施例8 ．IL−20レセプターの活性化 IL−20結合がレセプターの活性化に導くかどうかを決定するために、因子依存
性pre−B細胞系統BaF3をIL−20RAおよびIL−20RBと共トランスフェクトし、種々
の濃度のIL−20で処理した。IL−20を投与量依存的方法で刺激し、IL−20は1.1p
Mにおいて検出可能なシグナルを与え、1／2最大応答は3.4pMにおいて得られた。
BaF3における1／2最大増殖応答についてのIL−20濃度はBHK細胞における1／2最
大結合アフィニティーについてよりも1000×低ことが認められる。

【０１０２】 この大きい差に対する可能な説明は、異なる細胞系統の使用、異なるレセプタ
ー発現レベルおよび異なるアッセイアウトプットを包含する。また、IL−20は生
物学的に関係するヒトケラチノサイト細胞系統HaCaTにおけるシグナルトランス
ダクションを刺激し、HaCaTはIL−20RAおよびIL−20RBを自然に発現する。した
がって、IL−20はサイトカインについて期待される濃度においてヘテロダイマー
IL−20RA／IL−20RBに結合しかつそれらを活性化する。しかし陰性対照は非トラ
ンスフェクトBaF3を含有する。

【０１０３】実施例9 ．IL−20RAおよびIL−20RBの発現分析 RT−PCR分析を種々のヒト組織について実施して、IL−20RAおよびIL−20RBの
発現パターンを測定した。両方レセプターサブユニットは、皮膚および精巣にお
いて最も高度に発現される。有意な結果が得られ、IL−20RAおよびIL−20RBの両
方は皮膚において発現され、ここでそれらはIL−20誘導応答を仲介することが示
された。また、IL−20RAおよびIL−20RBの両方は、単球、肺、卵、筋肉、精巣、
副腎、心臓、唾液腺および胎盤において発現される。IL−20RAは、また、脳、腎
臓、肝臓、結腸、小腸、胃、甲状腺、膵臓、子宮および前立腺において発現され
るが、IL−20RBは発現されない。

【０１０４】実施例10 ．IL−20RAおよびIL−20RBは乾癬においてアップレギュレートされる in situハイブリダイゼーションを使用して、IL−20レセプターの発現が乾癬
において変更されるかどうかを決定した。2つのレセプターサブユニットmRNAに
対して特異的なプローブを使用して、4人の乾癬患者および3人の影響を受けてい
ない患者からの皮膚試料をアッセイした。

【０１０５】 すべての4つの乾癬皮膚試料はケラチノサイトにおいてIL−20RAおよびIL−20R
B mRNAの高いレベルを有したが、正常皮膚試料はいずれのレセプターサブユニ
ットmRNAの検出可能なレベルをもたなかった。また、単核免疫細胞および血管の
サブユニット中の内皮細胞において、乾癬皮膚における陽性シグナルが観測され
た。したがって、IL−20RAおよびIL−20RBの両方は、乾癬において相互作用する
と考えられる主要な細胞型である、ケラチノサイト、免疫細胞および内皮細胞に
おいて発現される。

【０１０６】実施例11 ．マウスIL−20RAのクローニング ヒトIL−20RAをコードする全長cDNAフラグメントを含有する交差種ハイブリダ
イゼーションプローブを発生させた。マウスゲノムDNAのサザンブロットおよび
マウスRNAのノザンブロットを実行して、ヒトIL−20RA cDNAがマウス配列に特
異的にハイブリダイゼーションできることを証明した。ノザンブロットの結果は
、マウスIL−20RA RNAが15日および17日のマウス胚、ならびに心臓、脳、肺、
肝臓、腎臓、精巣、脾臓、胸腺、肝臓、胃、および小腸の中に存在することを示
した。

【０１０７】 ヒトIL−20RA全長DNAハイブリダイゼーションプローブを使用して、マウスゲ
ノムライブラリーをスクリーニングした。クロンテク（Clontech、カリフォルニ
ア州パロアルト）から入手したライブラリーをマウスゲノムDNAのMboI消化から
発生させ、ラムダバクテリオファージEMBL3 SP6／T7のBamHI部位の中にクロー
ニングした。

【０１０８】 陽性バクテリオファージをプラーク精製し、そしてプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ
）ウィザード・ラムダ・プレプスＤＮＡ精製システム（Ｗｉｚａｒｄ Ｌａｍｂ
ｄａ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用
して、バクテリオファージＤＮＡを調製した。２つのゲノム制限酵素フラグメン
ト、５．７ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントおよび８．０ｋｂのＳａｃＩフラグメ
ントを陽性バクテリオファージから発生させ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの中にサ
ブクローニングした。ＤＮＡ配列分析は、ヒトＩＬ−２０ＲＡに対するマウスオ
ーソログからの３エクソンの存在を明らかにした。

【０１０９】 5'UTRからPCRプライマー配列番号40および3'UTRからPCRプライマー配列番号41
を設計して、PCR増幅により全長マウスIL−20RA配列を増幅した。マウス胚15日
＋17日のcDNAをPCR増幅の鋳型として使用した。PCR生成物をサブクローニングし
、確認のために配列決定した。マウス配列は配列番号36および37であった。成熟
細胞外ドメインは配列番号38から構成されている。

【０１１０】実施例12 ．IL−20レセプターヘテロダイマーの構築 分泌されたhIL−20RA／hIL−20Bヘテロダイマーを構築した。この構築物にお
いて、hIL−20RAの細胞外ドメインをIgGガンマ1（IgGγ1）の重鎖に対して融合
させ、IL−20RBの細胞外部分をヒトカッパ軽鎖（ヒトκ軽鎖）に対して融合させ
た。

【０１１１】IgGガンマ1およびヒトκ軽融合ベクターの構築 IgGγ1の重鎖をZem229R哺乳動物発現ベクター（ATCC受託No.69447）の中にサ
ブクローニングし、こうして5'EcoRIおよび3'NdeI部位を有するレセプターの細
胞外部分をクローニングして、N末端細胞外ドメイン−C末端IgGγ1融合物を生ず
ることができるようにした。PCRにより鋳型としてクロンテク（Calbiochem）ヒ
ト胎児肝臓cDNAライブラリーからIgGγ1配列をPCRにより単離することによって
、この構築物において使用するIgGγ1フラグメントを作った。オリゴ配列番号42
および配列番号43を使用するPCR反応を次のようにして実施した：40サイクルの9
4℃、60秒間、53℃、60秒、および72℃、120秒間；および72℃、7分間。

【０１１２】 PCR生成物をアガロースゲル電気泳動により分離し、QiaQuick^TM（Qiagen，Inc
.、カリフォルニア州バレンシア）ゲル抽出キットを使用して精製した。単離さ
れた990bpのDNAフラグメントをMluIおよびEcoRI（Boehringer−Mannheim）で消
化し、QiaQuick^TMゲル抽出キットを使用して抽出し、本明細書に開示する標準分
子生物学的技術に従い、MluI／EcoRIリンカーを含んでなる、オリゴ配列番号44
および配列番号45を使用して、以前にMluIおよびEcoRIで消化したZem229Rの中に
結合した。

【０１１３】 この遺伝学的クローニングベクターをベクター＃76hIgGgammal w／Ch1＃786
Zem229R（ベクター＃76）と呼んだ。IgGガンマ1の重鎖に融合したhIL−20RAの
細胞外ドメインのポリヌクレオチド配列を配列番号52に示し、そして対応するポ
リペプチド配列を配列番号53に示し、成熟ポリペプチド、マイナスシグナル配列
は配列番号54から構成されている。使用したIL−20RAの細胞外ドメインの部分は
配列番号55から構成された。

【０１１４】 ヒトκ軽鎖をZem228R哺乳動物発現ベクター（ATCC受託No.69446）の中にサブ
クローニングし、こうして5'EcoRIおよび3'KpnI部位を有するレセプターの細胞
外部分をクローニングして、N末端細胞外ドメイン−C末端ヒトκ軽鎖融合物を生
ずることができるようにした。上で使用したクロンテク（Calbiochem）ヒト胎児
肝臓cDNAライブラリーからヒトκ軽鎖配列をPCRにより単離することによって、
この構築物において使用するヒトκ軽鎖フラグメントを作った。オリゴ配列番号
46および配列番号47を使用してPCR反応を実施した。PCR生成物をアガロースゲル
電気泳動により分離し、QiaQuick^TM（Qiagen）ゲル抽出キットを使用して精製し
た。

【０１１５】 単離された315bpのDNAフラグメントをMluIおよびEcoRI（Boehringer−Mannhei
m）で消化し、QiaQuick^TMゲル抽出キットで抽出し、本明細書に開示する標準分
子生物学的技術に従い、MluI／EcoRIリンカーを使用して、以前にMluIおよびEco
RIで消化したZem228Rの中に結合した。この遺伝学的クローニングベクターをベ
クター＃77hκlight＃774 Zem228R（ベクター＃77）と呼んだ。ヒトカッパ軽鎖
に融合したIL−20RBの細胞外部分のポリヌクレオチド配列を配列番号56に示し、
そして対応するポリペプチド配列を配列番号57に示し、成熟ポリペプチド、マイ
ナスシグナル配列は配列番号58から構成されている。実際に使用したIL−20RBの
細胞外ドメインの部分は配列番号59から構成された。

【０１１６】融合ベクター構築物の中へのhIL−20RAおよびIL−20RB細胞外ドメインの挿入 上記構築ベクターを使用して、IgGγ1に融合されたヒトIL−20RAを有する構築
物を作った。この構築をPCRにより実施して、hIL−20RA／IgGベクター＃102から
オリゴ配列番号48および配列番号49を使用して下記の条件下にヒトIL−20RAレセ
プターを得た：30サイクルの94℃、60秒間、57℃、60秒間、および72℃、120秒
間；および72℃、7分間。

【０１１７】 本明細書に記載するように、生ずるPCR生成物をEcoRIおよびNdeIで消化し、ゲ
ル精製し、そして以前にEcoRIおよびNdeI消化し、バンド精製したベクター＃76
（上記）の中に結合した。生ずるベクターを配列決定して、ヒトIL−20Rα／IgG
ガンマ1融合物（hIL−20RA／Ch1 IgG）が正しいことを確認した。hIL−20RA／C
h1 IgGガンマ1＃1825 Zem229Rベクターをベクター＃195と呼んだ。こうして得
られたIL−20RA／Ch1 IgG1配列を配列番号52および53の描写する。N末端配列決
定は、配列番号54の予測された成熟ポリペプチド配列の存在を示した。

【０１１８】 κ軽鎖に融合した２ｒｖを有する別々の構築物をまた構築した。前述したよう
に、PCRによりDR1／7N−4からオリゴ配列番号50および配列番号51を使用して、I
L−20RB／ヒトκ軽鎖の構築を実行し、生ずるバンドをEcoRIおよびKpnIで消化し
、次いでこの生成物を以前にEcoRIおよびKpnI消化し、バンド精製したベクター
＃77（上記）の中に結合した。生ずるベクターを配列決定して、IL−20RB ／ヒ
トκ軽鎖融合物（IL−20RB／ κ軽鎖）が正しいことを確認した。このIL−20RB
／ κ軽構築物を配列番号56および57で示す。N末端配列決定は、配列番号58の予
測された成熟ポリペプチド配列の存在を示した。配列番号59は使用したIL−20RB
の細胞外ドメインの成熟部分である。

【０１１９】ヒトIL−20RAおよびヒトIL−20RBレセプターの共発現 リポフェクタミン（Lipofectamine^TM）試薬（Gibco／BRL）を製造業者の使用
説明書に従い使用して、ほぼ16μgの上記ベクター＃194および＃195の各々をBHK
−50細胞（ATCC No. CRL−10314）の中に共トランスフェクトした。1μgのメ
トトレキセート（MTX）（Sigma、ミゾリー州セントルイス）および0.5mg／mlのG
418（Gibco／BRL）を含有するDMEM＋5％FBS（Gibco／BRL）中で、トランスフェ
クトされた細胞を10日間選択した。生ずるトランスフェクタントのプールを再び
10μMのMTXおよび0.5mg／mlのG418中で10日間選択した。

【０１２０】 生ずる二重選択した細胞のプールを使用して、タンパク質を発生させた。この
プールの3つのファクトリー（デンマーク国ヌンク）を使用して、8リットルのコ
ンディショニングした無血清培地を1mlのプロテインAカラム上に通過させ、（10
）750μlの画分で溶離した。最高濃度を有することが見出されたこれらの画分の
うちの4つをプールし、PBSに対して透析（10kDの分子量カットオフ）した。最後
に、透析した物質をBCA（Pierce）により分析し、317μg／mlの濃度を有するこ
とが見出された。合計951μgが8リットルの精製から得られた。

【０１２１】実施例13 ．IL−20の結合はHaCaTケラチノサイト細胞系統においてSTAT3を活性化 する IL−20はそのレセプターの両方サブユニットでトランスフェトした細胞系統に
結合する。しかしながら、これらの細胞系統はその正常レベルに関してIL−20レ
セプターを過剰に発現し、そしてIL−20の生理学的役割に対するそれらの関連性
は不明瞭である。内因性IL−20RAおよびIL−20RBを発現する、ヒトHaCaTケラチ
ノサイト細胞系統を使用して、生物学的に関係する細胞型におけるIL−20のシグ
ナルトランスダクションを検査した。レセプター構築物を含有する組換えアデノ
ウイルスでHaCaT細胞を感染させて、細胞内シグナリングの検出を可能とした。

【０１２２】 この構築物は新鮮なルシフェラーゼ遺伝子から成り、この遺伝子は血清応答性
因子（SRE）およびトランスダクション因子のシグナルトランスデューサーおよ
びアクチベーター（STAT）から構成されたプロモーター／エンハンサー配列によ
り推進される。このアッセイ系は産生的リガンド−レセプターの相互作用を検出
し、レセプター活性化に関係する可能な下流のシグナルトランスダクション成分
を示す。IL−20単独を使用する処理はルシフェラーゼ活性の投与量依存的増加を
生じ、1／2最大応答はほぼ2.3nMにおいて起こった。SRE因子のみまたはSTAT因子
のみを含有するアデノウイルスベクターを使用する、引き続くルシフェラーゼリ
ポーターアッセイは、STATを通してのみ検出可能なリポーター活性化を産生した
。

【０１２３】 他のサイトカインがIL−20と共同して作用するかどうかを決定するために、Ha
CaT細胞をIL−20単独で、またはIL−20と単一の最大より少ない量のEGF、IL−1
βまたはTNFαと組合わせで処理した。これらの3つのタンパク質の存在下に、IL
−20処理は投与量依存的にルシフェラーゼ活性を増加させた。IL−20はIL−1β
と組み合わせてほぼ0.5nMにおいて1／2最大を生じ、IL−20単独で約5倍より低か
った。さらに、IL−20単独が必要とする投与量の少なくとも10倍低い、0.1nMのI
L−20において、リポーター遺伝子の活性化は検出可能である。

【０１２４】 IL−20RA、IL−20RBまたは両方のレセプターサブユニットでトランスフェトし
たBHK細胞を使用して、STAT−ルシフェラーゼのIL−20刺激にレセプターの対合
が必要であるかどうかを決定した。結合アッセイを使用する場合におけるように
、両方レセプターサブユニットを使用してトランスフェトした細胞のみがIL−20
に対して応答し、また1／2最大応答は5.7pMにおいて発生した。BHK細胞における
1／2最大応答についてのIL−20濃度は、HaCaT細胞における1／2最大の応答につ
いての濃度よりも400倍低いことが認められる。BHK IL−20レセプタートランス
フェクタントにおけるレセプターレベルがより高いために、HaCaT細胞に比較し
て、BHKにおける1／2最大応答について、より低い濃度のIL−20が必要であるこ
とが推定される。

【０１２５】 核トランスロケーションアッセイを使用して、IL−20作用に関係するSTATタン
パク質を同定した。内因性IL−20レセプターを有するHaCaT細胞、およびIL−20R
AおよびIL−20RBでトランスフェトしたBHK細胞の両方をIL−20タンパク質で処理
し、そしてSTAT3およびSTAT1転写因子のサイトカインから核へのトランスロケー
ションを免疫蛍光によりアッセイした。 非刺激HaCaT細胞において、STAT3染色は主として細胞質ゾル中で起こた。IL−
20を使用するHaCaT細胞の処理は、核におけるSTAT3の明確な蓄積を生じた。増加
する濃度のIL−20に対して応答するSTAT3のトランスロケーションが起こり、1／
2最大IL−20濃度は7nMであった。STAT3トランスロケーションと対照的に、IL−2
0で処理したHaCaT細胞はSTAT1の検出可能な核蓄積を示さなかった。

【０１２６】 IL−20RAおよびIL−20RBでトランスフェトしたBHK細胞を使用して、STAT3核ト
ランスフェクションのIL−20刺激のためにIL−20レセプターが必要であることを
確認した。IL−20レセプターを欠如するBHK細胞において、IL−20処理後にSTAT3
は細胞質ゾルの中に止まった。対照的に、IL−20でトランスフェトしたBHK細胞
において、STAT3はIL−20に応答して核に転位した。再び、STAT1はIL−20の処理
またはIL−20レセプターの発現に無関係に細胞質ゾルの中に止まった。IL−20レ
セプターはIL−20仲介STAT3活性化するために必要であると、我々は結論する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明の可溶性レセプターの概略的表示である。

【図２】 図２は、本発明の可溶性レセプターの概略的表示である。

【図３】 図３は、本発明の可溶性レセプターの概略的表示である。

【図４】 図４は、本発明の可溶性レセプターの概略的表示である。

【図５】 図５は、本発明の可溶性レセプターの概略的表示である。

【図６】 図６は、本発明の可溶性レセプターの概略的表示である。

【図７】 図７は、本発明の可溶性レセプターの概略的表示である。

【図８】 図８は、本発明の可溶性レセプターの概略的表示である。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 17/00 17/00 17/06 17/06 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 フォスター，ドナルド シー． アメリカ合衆国，ワシントン 98155，レ イク フォレスト パーク，ノースイース ト ワンハンドレッドエイティーファース ト ストリート 3002 (72)発明者 シュー，ウェンフェン アメリカ合衆国，ワシントン 98275，ム キルテオ，フィフティーフォース アベニ ュ ウエスト 12432 (72)発明者 マデン，カレン エル． アメリカ合衆国，ワシントン 98004，ベ ルビュー，サウスイースト トゥエンティ ーナインス プレイス 11148 (72)発明者 ケリー，ジェームス ディー． アメリカ合衆国，ワシントン 98040，マ ーサー アイランド，ウエスト マーサー ウェイ 3330 (72)発明者 スプレッチャー，シンディー エー． アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シ アトル，サーティーナインス アベニュ ノースイースト 8207 (72)発明者 ブラムバーグ，ハル アメリカ合衆国，ワシントン 98103，シ アトル，サニーサイド アベニュ ノース 4620 (72)発明者 イーガン，マリベス エー． アメリカ合衆国，ワシントン 98117，シ アトル，ノースウエスト エイティーフォ ース ストリート 620 (72)発明者 ジャスパース，スティーブン アール． アメリカ合衆国，ワシントン 98026，エ ドモンズ，ワンハンドレッドフィフティー ス プレイス サウスウエスト 5829 (72)発明者 チャンドラセクハー，ジャスミン エー． アメリカ合衆国，ワシントン 98040，マ ーサー アイランド，エイティーサード プレイス サウスイースト 5912 (72)発明者 ノバック，ジュリア イー． アメリカ合衆国，ワシントン 98110，ベ インブリッジ アイランド，バトル ポイ ント ドライブ ノースイースト 10699 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA04 DA02 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 4C084 AA01 AA16 DC50 MA28 MA55 MA63 MA66 NA14 ZA592 ZA892 4C085 AA13 AA14 BB11 CC22 CC23 EE01 GG02 GG05

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号1、2、3、4、5、6、7、8および9から成る群から選
   択されるアミノ酸配列から構成されたIL−20ポリペプチドに対するアンタゴニス
   トを個体に投与することを含む、IL−20ポリペプチドがある役割を演ずる疾患に
   苦しめられている哺乳動物を治療する方法。
2. 【請求項２】 前記アンタゴニストが、前記IL−20ポリペプチドに結合する
   抗体、抗体フラグメントまたは一本鎖抗体、前記IL−20に結合する可溶性レセプ
   ター、およびIL−20の可溶性レセプターに結合する抗体、抗体フラグメントまた
   は一本鎖抗体から成る群から選択され、ここで前記可溶性レセプターがIL−20RA
   サブユニットおよびIL−20RBサブユニットから構成されている、請求項1に記載
   の方法。
3. 【請求項３】 前記可溶性レセプターがIL−20RAの細胞外ドメインおよびIL
   −20RBの細胞外ドメインから構成されている、請求項2に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記IL−20RAの細胞外ドメインが免疫グロブリン（Ig）分子
   の重鎖の定常領域に融合されており、そしてIL−20RBの細胞外ドメインがIg分子
   の軽鎖の定常領域に融合されている、請求項3に記載の方法。
5. 【請求項５】 IL−20レセプターに結合する抗体、抗体フラグメントまたは
   一本鎖抗体がIL−20RAサブユニットに結合する、請求項2に記載の方法。
6. 【請求項６】 IL−20レセプターに結合する抗体、抗体フラグメントまたは
   一本鎖抗体がIL−20RBサブユニットに結合する、請求項2に記載の方法。
7. 【請求項７】 IL−20ポリペプチドがある役割を演ずる疾患が、乾癬、湿疹
   、アトピー性皮膚炎および接触性皮膚炎から成る群から選択される皮膚疾患であ
   る、請求項1に記載の方法。
8. 【請求項８】 IL−20ポリペプチドがある役割を演ずる疾患が、大人の呼吸
   疾患、ぜん息、気管支炎および肺炎から成る群から選択される炎症性肺である、
   請求項1に記載の方法。
9. 【請求項９】 細胞をIL−20と接触させることを含む、細胞におけるIL−8
   の発現を促進する方法。
10. 【請求項１０】 個体にIL−20を投与することを含む、個体におけるIL−8
    の発現を増加させる方法。