ES2387394T3

ES2387394T3 - Procedimiento de tratamiento de la inflamación

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Publication number: ES2387394T3
Application number: ES05020542T
Authority: ES
Inventors: Penny; Foster Donald C. Thompson; Wenfeng; Madden Karen L. Xu; James D.; Sprecher Cindy A. Kelly; Hal; Eagan Maribeth A. Blumberg; Stephen R.; Chandrasekher Yasmin A Jaspers; Julia E. Novak
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2012-09-21
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: EP1743648B1; EP2295079A3; AU2458001A; JP2012025766A; WO2001046261A1; DE60030769T2; PT1616575E; EP2248828A1; EP1244708B1; EP1616575A1; CA2395406A1; EP2295078A2; EP1244708A1; JP2012025737A; EP1616575B1; DE60030769D1; EP1743648A1; DE60043957D1; JP2003535037A; ATE339450T1

Abstract

El uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupoque consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de dermatitisatópica.

Description

Procedimiento para el tratamiento de la inflamación

La inflamación es normalmente una respuesta protectora localizada a traumatismo o invasión microbiana que destruye, diluye o separa el agente perjudicial y el tejido lesionado. Se caracteriza en la forma aguda por los signos clásicos de dolor, calor, rojez, hinchazón y pérdida de función. Microscópicamente implica una serie compleja de acontecimientos que incluyen dilatación de arteriolas, capilares y vénulas, con aumento de la permeabilidad y circulación sanguínea, exudación de fluidos, que incluye proteínas del plasma, y migración de leucocitos al área de inflamación.

Las enfermedades caracterizadas por inflamación son causas significativas de morbilidad y mortalidad en seres humanos. Comúnmente, la inflamación se produce como una respuesta defensiva a invasión del huésped por material extraño, particularmente microbiano. Las respuestas a traumatismo mecánico, toxinas y neoplasia también pueden producir reacciones inflamatorias. La acumulación y posterior activación de leucocitos son acontecimientos centrales en la patogénesis de la mayoría de las formas de inflamación. Las deficiencias de la inflamación comprometen al huésped. La inflamación excesiva producida por el reconocimiento anormal del tejido huésped como extraño o prolongación del proceso inflamatorio puede conducir a enfermedades inflamatorias tan diversas como diabetes, arteriosclerosis, cataratas, lesión por reperfusión y cáncer, a síndromes pos-infecciosos tales como en meningitis infecciosa, fiebre reumática y a enfermedades reumáticas tales como lupus eritematoso sistémico y artritis reumatoide. La centralidad de la respuesta inflamatoria en estos variados procesos de enfermedad hace que su regulación sea un elemento importante en el control de la prevención o cura de enfermedad humana.

Una citocina importante en el proceso inflamatorio es la interleucina-8 (IL-8). La IL-8 es una quimiocina. Se identificó como un agonista para neutrófilos basándose en dos efectos, la quimiotaxia y la liberación de enzimas granulares. La IL-8 se une a dos receptores sobre neutrófilos. Los receptores de IL-8 también se encuentran sobre monocitos, basófilos y eosinófilos. En fibroblastos humanos se ha mostrado que el citomegalovirus induce la expresión de receptores de IL-8 y se replica más rápidamente cuando las células se exponen a IL-8. La IL-8 es un potente quimioatrayente para neutrófilos; y las fases tempranas de enfermedad periodontal se caracterizan por el flujo de entrada de neutrófilos. La IL-8 es un potente inductor de angiogénesis en varias afecciones inflamatorias crónicas dependientes de angiogénesis que incluyen artritis reumatoide, psoriasis y fibrosis pulmonar idiopática. Adicionalmente, la IL-8 es una fuente importante de actividad angiogénica en cáncer de pulmón humano. Por tanto, la expresión de IL-8 establece una correlación con actividad metastásica experimental de algunas líneas celulares de melanoma. Por tanto, un procedimiento eficaz para tratar enfermedades inflamatorias sería administrar un agente que inhibiera IL-8.

El documento WO 99/27103 describe un polipéptido similar a citocina de mamífero llamado Zcyto10 (IL-20), polinucleótidos que codifican el mismo, anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido y usos del mismo para promover la curación de heridas y para estimular la proliferación de plaquetas.

El documento WO 99/03982 describe una proteína de IL-20, moléculas de ácidos nucleicos correspondientes, procedimientos de diagnóstico para detectar trastornos relacionados con el sistema inmunitario y procedimientos terapéuticos para tratar dichos trastornos. El polipéptido desvelado en el documento WO 99/03982 es 100% idéntico a IL-17.

Las Figuras 1-8 son representaciones esquemáticas de un número representativo de realizaciones del receptor soluble de IL-20.

La presente invención proporciona el uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de dermatitis atópica; una enfermedad inflamatoria del intestino seleccionada de colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn; y artritis reumatoide.

La presente invención proporciona el uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de la piel inflamatoria dermatitis de contacto; una enfermedad pulmonar inflamatoria seleccionada de enfermedad respiratoria del adulto, fibrosis quística, neumonía, neumonía bacteriana y fibrosis pulmonar idiopática; una enfermedad inflamatoria seleccionada de choque séptico y insuficiencia multiorgánica y una enfermedad seleccionada de cáncer de pulmón y melanoma humanos, en el que dicha enfermedad es producida por la regulación por incremento inducida por IL-20 de IL-8.

Los inventores han mostrado que IL-20 regula por incremento IL-8. Enfermedades inflamatorias en las que IL-8 desempeña una función significativa y para las que sería beneficiosa una disminución en IL-8 son enfermedad respiratoria del adulto (ERA), choque séptico, insuficiencia multiorgánica, lesión pulmonar inflamatoria tal como asma o bronquitis, neumonía bacteriana, psoriasis y enfermedad inflamatoria del intestino tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, eccema, dermatitis atópica y dermatitis de contacto. Por tanto, los antagonistas para IL-20 pueden usarse para tratar estas enfermedades.

Definiciones

Antes de exponer la invención en detalle, para el entendimiento de la misma puede ser útil definir los siguientes términos.

Los términos “extremo amino” y “extremo carboxilo” se usan en este documento para denotar posiciones dentro de polipéptidos. Si el contexto lo permite, estos términos se usan con referencia a una secuencia particular o porción de un polipéptido para denotar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia posicionada en el extremo carboxilo con respecto a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido se localiza proximal al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo.

El término “par complemento/anti-complemento” denota restos no idénticos que forman un par estable no covalentemente asociado bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, biotina y avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de un par complemento/anti-complemento. Otro pares complemento/anti-complemento a modo de ejemplo incluyen pares receptor/ligando, pares anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítope), pares de polinucleótidos sentido/antisentido y similares. Si se desea la posterior disociación del par complemento/anticomplemento, el par complemento/anti-complemento tiene preferentemente una afinidad de unión de <109 M-1.

La expresión “complementos de una molécula de polinucleótido” es una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de bases complementarias y orientación inversa con respecto a una secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCA 3'.

El término “cóntigo” denota un polinucleótido que tiene un estiramiento contiguo de secuencia idéntica o complementaria a otro polinucleótido. Se dice que las secuencias contiguas se “solapan” con un estiramiento dado de secuencia de polinucleótidos tanto en su totalidad como a lo largo de un estiramiento parcial del polinucleótido. Por ejemplo, cóntigos representativos para la secuencia de polinucleótidos 5'-ATGGCITAGCTT-3' son 5'-TAGCTTgagtct-3' y 3'-gtcgacTACCGA-5'.

La expresión “secuencia de nucleótidos degenerada” denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (con respecto a una molécula de polinucleótidos de referencia que codifica un polipéptido). Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo residuo de aminoácido (es decir, los tripletes GAU y GAC codifican cada uno Asp).

El término “vector de expresión” se usa para denotar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés operativamente ligado a segmentos adicionales que se proporcionan para su transcripción. Tales segmentos adicionales incluyen secuencias promotoras y terminadoras, y también pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores de selección, un potenciador, una señal de poliadenilación, etc. Los vectores de expresión se derivan generalmente de ADN de plásmido o vírico, o pueden contener elementos de ambos.

El término “aislado”, cuando se aplica a un polinucleótido, denota que el polinucleótido se ha sacado de su medio genético natural y, por tanto, está libre de otras secuencias codificantes superfluas o no deseadas y está en una forma adecuada para su uso dentro de sistemas de producción de proteínas genéticamente manipuladas. Tales moléculas aisladas son aquellas que se separan de su entorno natural e incluyen ADNc y clones genómicos. Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención están libres de otros genes con los que están generalmente asociados, pero pueden incluir regiones sin traducir de 5' y 3' que se producen naturalmente tales como promotores y terminadores. La identificación de regiones asociadas será evidente para un experto en la materia (véase, por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316:774-78 (1985).

Un polipéptido o proteína “aislado” es un polipéptido o proteína que se encuentra en una condición distinta de su entorno nativo, tal como aparte de sangre y tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal: se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, es decir, superior al 95% de pureza, más preferentemente superior al 99% de pureza. Si se usa en este contexto, el término “aislado” no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas tales como dímeros o formas alternativamente glicosiladas o derivatizadas.

El término “operativamente ligado”, cuando es con referencia a segmentos de ADN, indica que los segmentos están dispuestos de manera que funcionan conjuntamente para sus fines previstos, por ejemplo, la transcripción se inicia en el promotor y avanza por el segmento codificante al terminador.

Un “polinucleótido” es un polímero mono o bicatenario de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos leídas del extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden aislarse de fuentes naturales, sintetizarse in vitro o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos se expresan como pares de bases (abreviado “pb”), nucleótidos (“nt”) o kilobases (“kb”). Si el contexto lo permite, los dos últimos términos pueden describir polinucleótidos que son monocatenarios o bicatenarios. Cuando el término se aplica a moléculas bicatenarias se usa para denotar la longitud global y se

entenderá que es equivalente al término “pares de bases”. Se reconocerá por aquellos expertos en la materia que las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden diferenciarse ligeramente en la longitud y que los extremos de las mismas pueden escalonarse como resultado de escisión enzimática; por tanto, todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido bicatenaria pueden no estar emparejados. Tales extremos sin emparejar no superarán en general 20 nucleótidos de longitud.

Un “polipéptido” es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, tanto si se produce naturalmente como sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos se denominan comúnmente en lo sucesivo “péptidos”.

El término “promotor” se usa en este documento para su significado reconocido en la técnica para denotar una parte de un gen que contiene secuencias de ADN que se proporcionan para la unión de ARN polimerasa e iniciación de la transcripción. Las secuencias promotoras se encuentran comúnmente, pero no siempre, en las regiones no codificantes de 5' de los genes.

Una “proteína” es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos tales como grupos hidrato de carbono. Los hidratos de carbono y otros sustituyentes no peptídicos pueden añadirse a una proteína por la célula en la que se produce la proteína, y variará con el tipo de célula. Las proteínas se definen en este documento en términos de sus estructuras de esqueleto de aminoácidos; sustituyentes tales como grupos hidrato de carbono no se especifican generalmente, pero sin embargo pueden estar presentes.

El término “receptor” denota una proteína asociada a célula que se une a una molécula bioactiva (es decir, un ligando) y media en el efecto del ligando sobre la célula. Los receptores unidos a membrana se caracterizan por una estructura multi-dominio que comprende un dominio de unión a ligando extracelular y un dominio efector intracelular que normalmente participa en la transducción de señales. La unión del ligando al receptor produce un cambio conformacional en el receptor que produce una interacción entre el dominio efector y otra(s) molécula(s) en la célula. Esta interacción conduce a su vez a una alteración en el metabolismo de la célula. Los acontecimientos metabólicos que están ligados a interacciones receptor-ligando incluyen transcripción génica, fosforilación, desfosforilación, aumento en la producción de AMP cíclico, movilización de calcio celular, movilización de lípidos de membrana, adhesión de células, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos. En general, los receptores pueden unirse a la membrana, citosólica o nuclear, monomérica (por ejemplo, receptor de la hormona estimulante tiroidea, receptor beta-adrenérgico) o multimérica (por ejemplo, receptor de PDGF, receptor de la hormona de crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-6).

La expresión “secuencia señal secretora” denota una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un “péptido secretor”) que, como componente de un polipéptido más largo, dirige el polipéptido más largo a través de una ruta secretora de una célula en la que se sintetiza. El polipéptido más largo se escinde comúnmente para eliminar el péptido secretor durante el tránsito por la ruta secretora.

Se entenderá que los pesos moleculares y longitudes de polímeros determinados por procedimientos analíticos imprecisos (por ejemplo, electroforesis en gel) son valores aproximados. Cuando un valor tal se expresa como “aproximadamente” X, el valor establecido de X se entenderá que es preciso a ±10%.

Introducción

Por tanto, la presente invención se refiere al uso de un antagonista de IL-20 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias específicas en las que IL-20 desempeña una función tanto en la iniciación o la propagación como en el mantenimiento. El antagonista es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº 1, 2, 3 y 4.

Se define IL-20 y procedimientos para producirla y anticuerpos para IL-20 están contenidos en la solicitud de patente internacional nº PCT/US98/25228, publicación nº WO 99/27103 publicada el 25 de noviembre de 1998 y la solicitud de patente de EE.UU. nº 09/313.458 presentada el 17 de mayo de 1999. El polinucleótido y polipéptido de IL-20 humana se representan por SEC ID Nº: 1 - 4 e IL-20 de ratón por SEC ID Nº: 5-9.

Se ha descubierto el receptor para IL-20 y es un heterodímero que comprende el polipéptido llamado 'IL-20RA' (formalmente llamado Zcytor7) y un polipéptido llamado 'IL-20RB'. El polipéptido de IL-20RA, el ácido nucleico que lo codifica, anticuerpos para IL-20RA y procedimientos para producirlo se desvelan en la patente de EE.UU. nº

5.945.511 concedida el 31 de agosto de 1999. SEC ID Nº: 10 - 12 son los polinucleótidos y polipéptidos de IL-20RA. El dominio extracelular de IL-20RA humano comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 12, 55, 63 y 65, comprendiendo la subunidad del receptor de longitud completa SEC Nº: 11. El dominio extracelular de IL-20RA de ratón es SEC ID Nº: 38, siendo SEC ID Nº: 37 el IL-20RA de ratón entero.

El dominio extracelular de IL-20RB (SEC ID Nº: 13-14, y una variante SEC ID Nº: 18 y 19) comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 15, 59, 61, 67, 68 y 69. Preferentemente, el dominio extracelular del polipéptido de IL-20RA y el dominio extracelular del polipéptido de IL-20KB están ligados covalentemente juntos. En un aspecto, un polipéptido de subunidad extracelular tiene una región constante de una cadena pesada de una

inmunoglobulina fusionada con su extremo carboxi y la otra subunidad extracelular tiene una cadena ligera constante de una inmunoglobulina (Ig) fusionada con su extremo carboxi de forma que los dos polipéptidos forman juntos un receptor soluble y se forma un enlace disulfuro entre las cadenas de Ig pesadas y ligeras. En otro aspecto, un conector de péptidos podría fusionarse con los dos extremos carboxi de los polipéptidos para formar un receptor soluble covalentemente unido.

SEC ID Nº: 22 y 23 son construcciones del dominio extracelular de IL-20RA fusionadas con una región constante de la inmunoglobulina gamma 1 humana mutada producida según el procedimiento expuesto en el Ejemplo 5. SEC ID Nº: 62 es la secuencia madura predicha sin la secuencia señal. SEC ID Nº: 20 y 21 son construcciones del dominio extracelular de IL-20RB fusionadas con la región constante de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana natural producidas según el procedimiento del Ejemplo 5. SEC ID Nº: 60 es la secuencia madura predicha sin la secuencia señal. La Figura 1 representa el heterotetrámero producido por el Ejemplo 5.

SEC ID Nº: 52 y 53 son construcciones del dominio extracelular de IL-20RA fusionadas con una región constante de la inmunoglobulina gamma 1 humana mutada producida según el procedimiento expuesto en el ejemplo 12. SEC ID Nº: 54 es la secuencia madura predicha sin la secuencia señal. SEC ID Nº: 56 y 57 son construcciones del dominio extracelular de IL-20RB fusionadas con la región constante de la cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana natural producida según el procedimiento del Ejemplo 12. SEC ID Nº: 58 es la secuencia madura predicha sin la secuencia señal. El heterotetrámero resultante es casi idéntico al producido por el Ejemplo 5, siendo la diferencia primaria la ausencia de un conector de polipéptidos entre los dominios extracelulares y el principio de las regiones constantes de Ig, 22 en la Figura 1. En lo sucesivo, el término “dominio extracelular de un receptor” significa el dominio extracelular del receptor o una parte del dominio extracelular que es necesaria para unirse a su ligando, siendo en este caso el ligando IL-20.

Pueden unirse juntos los dominios extracelulares de IL-20RA y IL-20RB en varias formas, de forma que el receptor soluble resultante pueda unirse a IL-20. Las Figuras 1-8 ilustran un número representativo de realizaciones de la presente invención. A los elementos comunes en cada uno de los dibujos se les da el mismo número. La Figura 1 representa la realización de la presente invención producida según el Ejemplo 5 más adelante. La construcción del receptor soluble, designada 10, comprende dos cadenas de polipéptidos del sitio de unión de IL-20 designadas 12 y

14. Cada sitio de unión comprende el dominio extracelular de IL-20RA, designado 16, y el dominio extracelular de IL20RB, designado 18.

El dominio extracelular, 16, de IL-20RA está ligado al dominio pesado contante uno (CH1), 20, de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina gamma 1 humana por el conector 22, que es SEC ID Nº: 72. Entonces, el dominio CH1, 20, está unido al dominio CH2, 24, por la región bisagra 23. El dominio CH2, 24, está ligado al dominio CH3, 26, por la región bisagra 25.

Comparando la construcción de la Figura 1 con SEC ID Nº:22, el dominio extracelular, 16, de IL-20RA se extiende desde los residuos de aminoácidos 36, una valina, hasta e incluyendo el residuo de aminoácido 249, una glutamina, de SEC ID Nº:22. El conector de polipéptidos, 22, se extiende desde el residuo de aminoácido 250, una glicina, hasta e incluyendo el residuo de aminoácido 264, una serina, de SEC ID Nº:22. El dominio CH1, 22 de la Figura 1, se extiende desde el residuo de aminoácido 265, una alanina, hasta e incluyendo el residuo de aminoácido 362, una valina, de SEC ID Nº:22. La región bisagra 23 de la Figura 1 se extiende desde el residuo de aminoácido 363, un ácido glutámico, hasta e incluyendo el residuo de aminoácido 377, una prolina, de SEC ID Nº: 22. Las cadenas 12 y 14 están unidas juntas por disulfuro por medio de los enlaces disulfuro 28 y 30. Los enlaces disulfuro se forman entre las cadenas pesadas por los residuos de cisteína en las posiciones 373 y 376 de SEC ID Nº: 22 de cada una de las dos cadenas pesadas.

El dominio extracelular, 18, de IL-20RB está ligado a la región constante de la cadena ligera kappa humana (CL), 34 de la Figura 1, por el conector de polipéptidos 32, que es el polipéptido SEC ID Nº: 72. El dominio extracelular, 18, de IL-20RB se extiende desde el residuo de aminoácido 30, una valina, hasta e incluyendo el residuo de aminoácido 230, una alanina, de SEC ID Nº: 20. El conector de polipéptidos, 32, se extiende desde el residuo de aminoácido 231, una glicina, hasta e incluyendo el residuo de aminoácido 245, una serina, de SEC ID Nº:20. La región ligera constante kappa, 34, se extiende desde el residuo de aminoácido 246, una arginina, hasta e incluyendo el residuo de aminoácido final 352, una cisteína, de SEC ID Nº:20. La cisteína en la posición 352 de SEC ID Nº: 20 forma un enlace disulfuro, 36 en la Figura 1, con la cisteína en la posición 367 de SEC ID Nº: 22. Por tanto, la cadena ligera constante 34 está ligada a la región bisagra, 23, por enlace disulfuro, 36. De esta forma, el dominio extracelular, 16, de IL-20RA está ligado al dominio extracelular, 18, de IL-20RB para formar un receptor soluble.

Si los residuos de cisteína en las posiciones 373 y 376 de SEC ID Nº:22 se cambiaran por residuos de aminoácidos diferentes, los dos polipéptidos de unión a IL-20, 12 y 14, no se unirían juntos por disulfuro y formarían una construcción mostrada en la Figura 2 que tiene la región bisagra, 27.

La Figura 3 muestra un receptor soluble 38 muy simple de la presente invención en el que el dominio extracelular, 16, de IL-20RA está conectado con el dominio extracelular, 18, de IL-20RB por medio de un conector de polipéptidos, 40. El conector de polipéptidos se extiende desde el extremo amino del dominio extracelular, 16, de IL20RA y está conectado con el extremo carboxilo del dominio extracelular, 18, de IL-20RB. El conector de

polipéptidos debería estar entre 100-240 aminoácidos de longitud, preferentemente aproximadamente 170 residuos de aminoácidos de longitud. Un conector adecuado comprendería residuos de glicina y serina. Un conector posible sería múltiples unidades de SEC ID Nº: 72, preferentemente aproximadamente 12.

La Figura 4 muestra una realización que tiene el dominio extracelular, 16, de IL-20RA ligado al dominio extracelular, 18, de IL-20RB por medio del conector 40, como en la Figura 3. Mientras que el dominio extracelular, 16, de IL-20RA está ligado al dominio CH1, 20, como en la Figura 1, por medio del conector de polipéptidos 42, que debería tener aproximadamente 30 residuos de aminoácidos de longitud. Un conector ideal comprendería glicina y serina como en SEC ID Nº: 72, y la secuencia bisagra, 23 de la Figura 1.

La Figura 5 muestra otra realización posible. En esta realización, un conector de polipéptidos 44 de aproximadamente 15 residuos de aminoácidos, por ejemplo SEC ID Nº: 72, liga el extremo carboxilo del dominio extracelular, 18, de IL-20RB con el extremo amino del dominio extracelular, 16, de IL-20RA. Un conector de polipéptidos 46 de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos se extiende desde el extremo carboxi del dominio extracelular, 16, de IL-20RA hasta el dominio CH2. El extremo carboxilo del conector 46 comprendería preferentemente la región bisagra que se extiende desde el residuo de aminoácido 363, un ácido glutámico, hasta e incluyendo el residuo de aminoácido 377, una prolina, de SEC ID Nº: 22. Sin embargo, el conector de polipéptidos 46 tendría idealmente al menos un residuo de cisteína en su extremo carboxilo, así podría formarse un enlace disulfuro.

El receptor de IL-20 soluble de la Figura 6 es idéntico al de la Figura 1, excepto que el dominio CH3, 26 de la Figura 1, no está presente en la realización de la Figura 6. La región CH3 empieza en el residuo de aminoácido 488, una glicina, y se extiende hasta el último residuo 594 de SEC ID Nº: 22.

La Figura 7 muestra una construcción de receptor de IL-20 soluble que es idéntica a la construcción de la Figura 1, excepto que ambos dominios CH2 y CH3 están ausentes. Los dominios CH2 y CH3 van del residuo de aminoácido 378, una alanina, hasta el extremo de la secuencia de polipéptidos de SEC ID Nº: 22.

La Figura 8 muestra una construcción en la que tanto IL-20RA, 16, como IL-20RB tienen un conector de polipéptidos, 48, fusionado con sus extremos carboxilo respectivos. Cada conector de polipéptidos tiene dos residuos de cisteína de forma que cuando se expresan las cisteínas forman dos enlaces disulfuro, 50 y 52. En este caso, el conector de polipéptidos comprende la región bisagra, 23 en la Figura 1. La región bisagra comprende el residuo de aminoácido 363, una glutamina, hasta e incluyendo el residuo de aminoácido 377 de SEC ID Nº: 22.

Un procedimiento para producir un receptor soluble que comprende dominios extracelulares de IL-20RA y IL-20RB comprende (a) introducir en una célula huésped una primera secuencia de ADN que comprende un promotor de la transcripción operativamente ligado a una primera secuencia señal secretora seguida en la dirección 3' por, y en el marco de lectura apropiado, el ADN que codifica la porción extracelular de IL-20RA y el ADN que codifica una región constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina;(b) introducir en la célula huésped una segunda construcción de ADN que comprende un promotor de la transcripción operativamente ligado a una segunda señal secretora seguida en la dirección 3' por, y en el marco de lectura apropiado, una secuencia de ADN que codifica la porción extracelular de IL-20RB y una secuencia de ADN que codifica un dominio de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en CH1, CH2, CH3 y CH4; (c) cultivar la célula huésped en un medio de crecimiento apropiado bajo condiciones fisiológicas para permitir la secreción de una proteína de fusión que comprende el dominio extracelular de IL-20RA y IL-20RB; y (d) aislar el polipéptido de la célula huésped. En una realización, la segunda secuencia de ADN codifica adicionalmente una cadena pesada de la región bisagra de la inmunoglobulina en la que la región bisagra está unida al dominio de la región constante de la cadena pesada. En otra realización, la segunda secuencia de ADN codifica adicionalmente una región variable de la inmunoglobulina unida en la dirección 5' de y en el marco de lectura apropiado con la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina.

En una realización alternativa se proporciona un procedimiento para producir un receptor soluble que comprende los dominios extracelulares de IL-20RA y IL-20RB que comprende (a) introducir en una célula huésped una primera secuencia de ADN que comprende un promotor de la transcripción operativamente ligado a una primera secuencia señal secretora seguida en la dirección 3' por, y en el marco de lectura apropiado, el ADN que codifica la porción extracelular de IL-20RB y el ADN que codifica una región constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina; (b) introducir en la célula huésped una segunda construcción de ADN que comprende un promotor de la transcripción operativamente ligado a una segunda señal secretora seguida en la dirección 3' por, y en el marco de lectura apropiado, una secuencia de ADN que codifica la porción extracelular de IL-20RA y una secuencia de ADN que codifica un dominio de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en CH1, CH2, CH3 y CH4; (c) cultivar la célula huésped en un medio de crecimiento apropiado bajo condiciones fisiológicas para permitir la secreción de una proteína de fusión heterodímera dimerizada que comprende el dominio extracelular de IL-20RA y IL-20RB; y (d) aislar el polipéptido dimerizado de la célula huésped. En una realización, la segunda secuencia de ADN codifica adicionalmente una cadena pesada de la región bisagra de la inmunoglobulina en la que la región bisagra está unida al dominio de la región constante de la cadena pesada. En otra realización, la segunda secuencia de ADN codifica adicionalmente una región variable de la inmunoglobulina unida en la dirección 5' de y en el marco de lectura apropiado con la región constante de la cadena pesada de la

inmunoglobulina (véase la patente de EE.UU. nº 5.843.725.)

Como se usa en este documento, el término “anticuerpos” incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígeno tales como los fragmentos proteolíticos F(ab')2 y Fab. También están incluidos anticuerpos o fragmentos intactos genéticamente manipulados, tales como anticuerpos quiméricos, fragmentos Fv, anticuerpos monocatenarios y similares, además de péptidos y polipéptidos de unión a antígeno sintéticos. Los anticuerpos no humanos pueden humanizarse injertando CDR no humanas sobre regiones estructurales y constantes humanas, o incorporando los dominios variables no humanos enteros (opcionalmente “encubriéndolos” con una superficie similar a humana por sustitución de residuos expuestos, en el que el resultado es un anticuerpo “chapado”). En algunos casos, los anticuerpos humanizados pueden retener residuos no humanos dentro de los dominios estructurales de la región variable humana para potenciar las características de unión apropiadas. Mediante anticuerpos humanizantes, la semivida biológica puede aumentarse, y se reducen las posibilidades de reacciones inmunitarias adversas tras la administración a seres humanos. La afinidad de unión de un anticuerpo puede determinarse fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, por análisis de Scatchard. Puede utilizarse una variedad de ensayos conocidos para aquellos expertos en la materia para detectar anticuerpos que se unen a proteína o péptido. Ensayos a modo de ejemplo se describen en detalle en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (Eds.) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Ejemplos representativos de tales ensayos incluyen: inmunoelectroforesis simultánea, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), ensayo de transferencia puntual o de transferencia Western, ensayo de inhibición o competición y ensayo tipo sándwich.

Biología de IL-20, su receptor y su función en psoriasis

Dos receptores huérfanos de citocinas de la clase II, ambos de los cuales se expresan en la piel, se identificaron como subunidades de receptores de IL-20. Ambas subunidades de receptores de IL-20 se requieren para la unión a ligando, distinguiéndose su función de la de subunidades en los cuatro otros receptores de citocinas de la clase II conocidos. IL-20RA y IL-20RB también se coexpresan en varios tejidos humanos, además de la piel, que incluyen ovario, glándula suprarrenal, testículos, glándula salival, músculo, pulmón, riñón, corazón y, a un menor grado, el intestino delgado, sugiriendo tejidos diana adicionales para la acción de IL-20. Adicionalmente, los inventores han detectado ARNm de IL-20RA, pero no ARNm de IL-20RB, en varios tejidos humanos que incluyen estómago, tiroides, páncreas, útero, cerebro y próstata, sugiriendo que IL-20RA puede emparejarse con otras subunidades de receptores de la clase II. Los inventores llegan a la conclusión de que el receptor heterodimérico de IL-20 es estructuralmente similar a los receptores de citocinas de la clase II y se expresa en la piel en la que los inventores han demostrado actividad del ligando de IL-20.

Dos líneas de evidencia indican que IL-20 y su receptor participan en psoriasis. Esta enfermedad de la piel multigénica se caracteriza por aumento de la proliferación de queratinocitos, diferenciación de queratinocitos alterada e infiltración de células inmunitarias en la piel. La primera línea de evidencia para una función de IL-20 en psoriasis es que la hiperqueratosis observada y la epidermis engrosada en los ratones transgénicos se parecen a anomalías psoriásicas humanas. La disminución en los números de tonofilamentos, aunque está relacionada con queratinización defectuosa, es una característica sorprendente de la psoriasis humana. Se han encontrado inclusiones intramitocondriales en afecciones de la piel hiperplásicas tanto químicamente inducidas como que se producen naturalmente en ratones. La causa de las inclusiones y sus efectos sobre la función mitocondrial, si la hay, son desconocidos. Los inventores llegan a la conclusión de que los ratones transgénicos para IL-20 presentan muchas de las características observadas en psoriasis humana.

Una segunda línea de evidencia que implica el receptor de IL-20 en psoriasis es que tanto el ARNm de IL-20RA como de IL-20RB están notablemente regulados por incremento en piel psoriásica humana en comparación con piel normal. Ambas subunidades de receptores de IL-20 se expresan en queratinocitos en toda la epidermis y también se expresan en un subconjunto de células inmunitarias y endoteliales. Los inventores proponen que el aumento de la expresión de un receptor de IL-20 activado puede alterar las interacciones entre células endoteliales, células inmunitarias y queratinocitos, conduciendo a la desregulación de la proliferación y diferenciación de queratinocitos.

Una etapa crucial en el entendimiento de la función de una citocina novedosa es la identificación y caracterización de su receptor relacionado. Los inventores han usado satisfactoriamente un enfoque basado en estructura para aislar una interleucina novedosa que por último lugar conduce al aislamiento de su receptor. La IL-20 estimula la transducción de señales en la línea celular HaCaT de queratinocitos humanos, soportando una acción directa de este novedoso ligando en la piel. Además, IL-1�, EGF y TNF-a, proteínas que se sabe que son activas en queratinocitos y que participan en señales proliferativas y pro-inflamatorias en la piel, potencian la respuesta a IL-20. En tanto las células HaCaT como BHK que expresan el receptor de IL-20, IL-20 señaliza mediante STAT3.

Uso de antagonista para IL-20 para tratar psoriasis

Como se indica en la discusión anterior y los ejemplos más adelante, la IL-20 participa en la patología de psoriasis. La psoriasis puede tratarse administrando antagonistas para IL-20. Los antagonistas para IL-20 pueden ser tanto un receptor soluble que se une a IL-20 como anticuerpos, anticuerpos monocatenarios o fragmentos de anticuerpos que se unen tanto a IL-20 como al receptor de IL-20. Por tanto, los antagonistas prevendrán la activación del receptor de IL-20.

La psoriasis es una de las enfermedades dermatológicas más comunes que afecta a del 1 al 2 por ciento de la población mundial. Es un trastorno de la piel inflamatorio crónico caracterizado por pápulas eritematosas claramente delimitadas y placas redondeadas cubiertas por escamas micáceas plateadas. Las lesiones de la piel de psoriasis son variablemente pruríticas. Las áreas traumatizadas frecuentemente desarrollan lesiones de psoriasis. Adicionalmente, otros factores externos pueden agravar la psoriasis que incluyen infecciones, estrés y medicaciones, por ejemplo, litio, beta-bloqueadores y antipalúdicos.

La variedad más común de psoriasis se llama de tipo placa. Los pacientes con psoriasis de tipo placa tendrán placas estables lentamente crecientes que permanecen básicamente invariables durante largos periodos de tiempo. Las áreas más comunes para que se produzca la psoriasis en placa son los codos, las rodillas, la hendidura interglútea y el cuero cabelludo. La afectación tiende a ser simétrica. La psoriasis inversa afecta a las regiones intertriginosas que incluyen la axila, la ingle, la región submamaria y el ombligo, y también tiende a afectar el cuero cabelludo, las palmas y las plantas. Las lesiones individuales son placas claramente delimitadas, pero pueden estar húmedas debido a su localización. La psoriasis de tipo placa se desarrolla generalmente lentamente y sigue un curso indolente. Raramente remite espontáneamente.

La psoriasis eruptiva (psoriasis en gotas) es la más común en niños y adultos jóvenes. Se desarrolla agudamente en individuos sin psoriasis o en aquellos con psoriasis en placa crónica. Los pacientes presentan muchas pápulas eritematosas pequeñas de descamación, frecuentemente después de infección del tracto respiratorio superior porestreptococos beta-hemolíticos. Los pacientes con psoriasis también pueden desarrollar lesiones pustulosas. Éstas pueden estar localizadas en las palmas y las plantas o pueden ser generalizadas y estar asociadas a fiebre, malestar, diarrea y artralgias.

Aproximadamente la mitad de todos los pacientes con psoriasis tienen afectación de las uñas de las manos, apareciendo como lesiones punteadas, engrosamiento de las uñas o hiperqueratosis subungueal. Aproximadamente del 5 al 10 por ciento de los pacientes con psoriasis tienen asociadas dolencias de las articulaciones, y éstas se encuentran casi siempre en pacientes con afectación de las uñas de las manos. Aunque algunos tienen la presencia coincidente de artritis reumatoide clásica, muchos pueden tener enfermedad de las articulaciones que se clasifica en uno de cinco tipos asociados a psoriasis: (1) enfermedad limitada a una única o a algunas articulaciones pequeñas (70 por ciento de los casos); (2) una enfermedad similar a artritis reumatoide seronegativa; (3) afectación de las articulaciones interfalángicas distales; (4) artritis destructiva grave con el desarrollo de “artritis mutilante”; y (5) enfermedad limitada a la columna vertebral.

La psoriasis pueden tratarse administrando antagonistas para IL-20. Los antagonistas preferidos son tanto un receptor soluble para IL-20 como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o anticuerpos monocatenarios que se unen tanto al receptor de IL-20 como a IL-20. Los antagonistas para IL-20 pueden administrarse solos o en combinación con otras terapias establecidas tales como lubricantes, queratolíticos, corticosteroides tópicos, derivados de la vitamina D tópica, antralina, antimetabolitos sistémicos tales como metotrexato, terapia con psoraleno-luz ultravioleta (PUVA), etretinato, isotretinoína, ciclosporina y el derivado de la vitamina D3 tópica calcipotriol. Los antagonistas, en particular el receptor soluble o los anticuerpos que se unen a IL-20 o al receptor de IL-20, pueden administrarse al individuo subcutáneamente, intravenosamente o transdérmicamente usando una crema o parche transdérmico que contiene el antagonista de IL-20. Si se administra subcutáneamente, el antagonista puede inyectarse en una o más placas psoriásicas. Si se administran transdérmicamente, los antagonistas pueden administrarse directamente sobre las placas usando una crema que contiene el antagonista para IL-20.

Uso de antagonistas para IL-20 para tratar afecciones inflamatorias del pulmón.

Los antagonistas para IL-20 pueden administrarse a una persona que tiene asma, bronquitis o fibrosis quística u otra enfermedad pulmonar inflamatoria para tratar la enfermedad. Los antagonistas pueden administrarse mediante cualquier procedimiento adecuado que incluye intravenoso, subcutáneo, lavado bronquial y el uso de inhalante que contiene un antagonista para IL-20.

Administración de antagonistas para IL-20

Las cantidades de antagonistas para IL-20 necesarias para la terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes que incluyen medios de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente y otras medicaciones administradas. Por tanto, las dosificaciones de tratamiento deberán valorarse para optimizar la seguridad y la eficacia. Normalmente, dosificaciones usadas in vitro pueden proporcionar una orientación útil en las cantidades útiles para administración in vivo de estos reactivos. Las pruebas en animales de dosis eficaces para el tratamiento

de trastornos particulares proporcionarán más indicación predictiva de la dosificación humana. Los procedimientos para administración incluyen administración por vía oral, intravenosa, peritoneal, intramuscular, transdérmica o en el pulmón o la tráquea en forma de espray por medio de un nebulizador o atomizador. Vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, tampones, por mencionar sólo algunos. Generalmente se esperarían intervalos de dosificación de 1 µg a 1000 µg por kilogramo de peso corporal por día. Una dosificación para un adulto promedio del receptor soluble de IL-20 sería aproximadamente 25 mg administrados dos veces a la semana como una inyección subcutánea. Una dosificación de un anticuerpo que se une a IL-20 sería aproximadamente 25 mg administrados dos veces a la semana. Una mezcla de anticuerpos que se une a las subunidades de IL-20RA y IL20RB sería aproximadamente 25 mg administrados dos veces a la semana para un adulto. Las inyecciones podrían administrarse al sitio de las lesiones psoriásicas para el tratamiento de psoriasis. Para administración subcutánea o intravenosa del antagonista para IL-20, el anticuerpo o receptor soluble puede estar en solución salina tamponada con fosfato. En enfermedades de la piel tales como psoriasis, el antagonista para IL-20 también puede administrarse mediante una pomada o parche transdérmico. Las dosis pueden ser mayores o menores como pueden determinarse por un doctor en medicina con experiencia en la materia. Para una completa discusión de formulaciones de fármacos e intervalos de dosificación véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed., (Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1996) y Goodman y Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 9ª ed. (Pergamon Press 1996).

La invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Regulación por incremento de IL-8 por IL-20

Procedimientos:

Queratinocitos neonatales epidérmicos humanos normales (NHEK) (de Clonetics) en el pase 2 se sembraron y se cultivaron hasta confluencia en placas de cultivo de tejido de 12 pocillos. Se compró KGM (medio de crecimiento de queratinocitos) de Clonetics. Cuando la células alcanzaron la confluencia, se lavaron con medio KGM menos factores de crecimiento = KBM (medio basal de queratinocitos). Las células se privaron de suero en KBM durante 72 horas antes de la adición de compuestos de prueba. Se usaron trombina a 1 LU/ml y tripsina a 25 nM como controles positivos. Se añadió un ml de medio/pocillo. Se usó KBM solo como control negativo.

Se preparó IL-20 en medio KBM y se añadió a concentraciones variables, de 2,5 µg/ml hasta 618 ng/ml en un primer experimento y de 2,5 µg/ml hasta 3 ng/ml en un segundo experimento.

Las células se incubaron a 37ºC, 5% de CO2 durante 48 horas. Los sobrenadantes se eliminaron y se congelaron a 80ºC durante varios días antes de ensayarse para niveles de IL-8 y GM-CSF. Se usaron el kit de inmunoensayo para IL-8 humana nº D8050 (RandD Systems, Inc.) y el kit de inmunoensayo para GM-CSF humano nº HSGMO (RandD Systems, Inc.) para determinar la producción de citocinas siguiendo las instrucciones del fabricante.

Resultados

Los resultados indicaron que la expresión de IL-8 y GM-CSF fue inducida por IL-20.

Ejemplo 2

Clonación de IL-20RB

Clonación de la región codificante de IL-20RB

Se diseñaron cebadores de PCR basándose en la secuencia de la solicitud de patente internacional nº PCT/US99/03735 (publicación nº WO 99/46379) presentada el 8 de marzo de 1999. La SEC ID Nº: 16 contiene el codón ATG (Met1) con un sitio de restricción EcoRI, la SEC ID Nº: 17 contiene el codón de terminación (TAG) con un sitio de restricción XhoI. La amplificación por PCR se llevó a cabo usando un ADN de biblioteca de ADNc de queratinocito humano (HaCaT) como molde y la SEC ID Nº: 16 y SEC ID Nº: 17 como cebadores. La reacción de PCR se realizó del siguiente modo: incubación a 94ºC durante 1 min seguido por 30 ciclos de 94ºC durante 30 s y 68ºC durante 2 min, después 68ºC adicionales durante 4 min, la reacción se almacenó a 4ºC. Los productos de PCR se ejecutaron en un gel de agarosa al 1% y se observó una banda de ADN de 1 kb. Los productos de PCR se cortaron del gel y el ADN se purificó usando un kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen). El ADN purificado se digirió con EcoRI y XhoI y se clonó en un vector pZP que se llamó pZP7N. Un plásmido pZP es un vector de expresión de mamífero que contiene un casete de expresión que tiene el promotor de metalotioneína-1 de ratón, péptido conductor tPA humano, múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias de codificación, una marca Glu-Glu y un terminador de hormona de crecimiento humano. El plásmido también tiene un origen de E. coli de replicación, una unidad de expresión de marcador de selección mamífero que tiene un promotor SV40, un potenciador y un origen de replicación, además de un gen DHFR, y el terminador SV40. Se secuenciaron varios clones IL-20RB-pZP7N. Todos contienen tres mutaciones no conservativas en comparación con la secuencia de IL20RB en el documento PCT/US99/03735: (secuencia IL-20RB-pZP7N), 146 Pro (CCC) -- Thr (ACC), 148 His (CAT)

-: Asp (GAT) y 171 Thr (ACG) -- Arg (AGG).

Para verificar las tres sustituciones en el clon IL-20RB-pZP7N, se llevó a cabo la amplificación por PCR usando tres fuentes de ADNc diferentes -- ADNc Marathon de piel fetal, ADN de biblioteca de ADNc HaCaT y ADN de biblioteca de ADNc de músculo liso de la próstata -- como moldes. Los productos de PCR se purificaron en gel y se secuenciaron. La secuencia de cada uno de los tres productos de PCR era coherente con la del clon IL-20RBpZP7N. La IL-20RB es SEC ID Nº: 13 y 14, y el dominio extracelular maduro es SEC ID Nº: 15.

Ejemplo 3

Unión de IL-20 al heterodímero de IL-20RB/IL-20RA

Se usó un ensayo de unión basado en células para verificar que la IL-20 se une al heterodímero de IL-20RA-IL20RB.

Se transfectaron transitoriamente vectores de expresión que contenían receptores de citocinas de la clase II conocidos y huérfanos (incluyendo IL-20RA y IL-20RB) en células COS en diversas combinaciones, que luego se ensayaron para su capacidad para unirse a la proteína IL-20 marcada con biotina. Los resultados muestran que el heterodímero de IL-20RB-IL-20RA es un receptor para IL-20. El procedimiento usado se describe a continuación.

La transfección de células COS se realizó en una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos del siguiente modo: se mezclaron 0,5 µg de ADN con medio que contenía 5 µl de lipofectamina en 92 µl de medio de Eagle modificado por Dulbecco sin suero (DMEM) (55 mg de piruvato de sodio, 146 mg de L-glutamina, 5 mg de transferrina, 2,5 mg de insulina, 1 µg de selenio y 5 mg de fetuína en 500 ml DMEM), se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se añadieron a 400 µl de medio DMEM sin suero. Entonces, esta mezcla de 500 µl se añadió a 1,5 x 105 células COS/pocillo y se incubaron durante 5 horas a 37ºC. Se añadieron 500 µl de medio DMEM con suero bovino fetal al 20% (SBF) y se incubaron durante la noche.

El ensayo, una modificación de la “trampa de secreción” (Davis, S. y col., Cell 87: 1161-1169 (1996), se realizó del siguiente modo: se aclararon células con PBS/albúmina de suero bovino al 1% (BSA) y se bloquearon durante 1 hora con TNB (Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,15 M y reactivo de bloqueo al 0,5% (kit NEN Renaissance TSA-Direct, nº de catálogo NEL701) en agua). A esto le siguió una hora de incubación con 3 µg/ml de proteína de IL-20 biotinilada en TNB. Las células se lavaron con PBS/BSA al 1% y se incubaron durante otra hora con 1:300 de estreptavidina diluida-HRP (kit NEN) en TNB. Tras otro lavado, las células se fijaron durante 15 minutos con formaldehído al 1,8% en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Entonces, las células se lavaron con TNT (Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,15 M y Tween-20 al 0,05% en agua). Las señales de unión positiva se detectaron tras una incubación de cinco minutos con reactivo fluoresceína-tiramida diluido 1:50 en tampón de dilución (kit NEN). Las células se lavaron con TNT, se conservaron con medio de montaje Vectashield (Vector Labs) diluido 1:5 en TNT, y se visualizaron usando un filtro de FITC sobre un microscopio invertido de fluorescencia.

Ejemplo 4

Regulación por incremento de citocinas inflamatorias por IL-20

Tratamiento de células

La línea celular de queratinocitos humanos, HaCaT, se cultivó a 37ºC hasta varios días después de la confluencia en matraces de cultivo de tejido T-75. En este momento se eliminó el medio de crecimiento normal (DMEM + SBF al 10%) y se sustituyó por medio sin suero. Entonces, las células se incubaron durante dos días a 37ºC. Luego se elimino el DMEM y cuatro matraces de células por tratamiento se trataron con una de cada una de las siguientes condiciones durante cuatro horas a 37ºC: IL-1 alfa recombinante humana (rh) a 5 ng/ml, IL-1 alfa rh a 20 ng/ml, IL-1 alfa rh a 5 ng/ml + IL-20 a 1 µg/ml, IL-20 a 1 µg/ml, o IL-10 rh a 10 ng/ml.

Aislamiento de ARN

Tras el tratamiento de citocinas, el medio se eliminó y las células se lisaron usando una disolución de tiocianato de guanidio. El ARN total se aisló del lisado de células mediante centrifugación durante la noche en un gradiente de cloruro de cesio. Al día siguiente, el sedimento de ARN se resuspendió en una disolución de TE/SDS y se precipitó en etanol. Entonces, el ARN se cuantificó usando un espectrofotómetro, seguido por un tratamiento con ADNsa como por la sección V.B. de Clontech's Atlas™ cDNA Expression Arrays User Manual (versión PT3140-1/PR9X390, publicada 11/5/99). La calidad de las muestras de ARN se verificó por los cálculos de pureza basados en lecturas de espectrofotometría y por la visualización en gel de agarosa. La contaminación genómica de las muestras de ARN se descartó por el análisis por PCR del gen beta-actina.

Síntesis de sondas

Se siguieron los protocolos de Clontech para la síntesis de sondas enriquecidas en poliA+ y la hibridación a matrices Atlas™ (véase anteriormente, más Atlas™ Pure Total RNA Labeling System User Manual, PT3231-1/PR96157, publicado 6/22/99). Brevemente, el ARN poliA+ se aisló de 50 mg de ARN total usando perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina (de Clontech, Palo Alto, CA) y un separador de partículas magnéticas. Entonces, el ARM poliA+ se marcó con alfa32P-dATP mediante RT-PCR. Los cebadores CDS de Clontech específicos para los 268 genes en la matriz de citocina humana/receptor Atlas™ (nº de cat. nº7744-1) se usaron en la reacción. La sonda marcada se aisló usando cromatografía en columna y se contó en fluido de centelleo.

Hibridación de membranas de matrices

Las matrices Atlas™ se prehibridaron con ExpressHyb de Clontech más 100 mg/ml de AND de esperma de salmón desnaturalizado por calor durante al menos treinta minutos a 68ºC con agitación continua. Entonces, las membranas se hibridaron con 1,9 x 106 CPM/ml (un total de 1,14 x 107 CPM) durante la noche a 68ºC con agitación continua. Al día siguiente, las membranas se lavaron durante treinta minutos x 4 en 2X SSC, SDS al 1% a 68ºC, más durante treinta minutos x 1 en 0,1X SSC, SDS al 0,5% a 68ºC, seguido por un lavado final a temperatura ambiente durante cinco minutos en 2X SSC. Entonces, las membranas de matrices se colocaron en bolsas de plástico Kodak selladas y se expusieron a una pantalla de un sistema de detección y cuantificación de la radiactividad durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, las pantallas de fósforo se cribaron en un sistema de detección y cuantificación de la radiactividad y se analizaron usando el software AtlasImage™ 1.0 de Clontech.

Resultados

Genes regulados por incremento por IL-20

1.: El factor de necrosis tumoral (TNF) se reguló por incremento 1,9-2,4 veces en IL-20.

2.: Los factores de crecimiento placentarios 1 & 2 (PLGF) se regularon por incremento 1,9-2,0 veces en IL-20.

3.: El receptor del factor II de la coagulación se reguló por incremento 2,0-2,5 veces en IL-20.

4.: El receptor de la calcitonina se reguló por incremento 2,2-2,3 veces en IL-20.

5.: La proteína de unión a hialuronato inducible por TNF TSG-6 se reguló por incremento 2,1-2,2 veces en IL

20.

6.: El precursor del receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el receptor de la proteína tirosina-cinasa (FLT-1) (SFLT) se reguló por incremento 2,1-2,7 veces en IL-20.

7.: MRP-8 (proteína de unión a calcio en macrófagos, relacionada con MIF) se reguló por incremento 2,9-4,1 veces en IL-20.

8.: MRP-14 (proteína de unión a calcio en macrófagos, relacionada con MIF) se reguló por incremento 3,0-3,8 veces en IL-20.

9.: La relaxina H2 se reguló por incremento 3,14 veces en IL-20.

10.: El receptor III del factor de crecimiento transformante beta (TGFβ) de 300 kDa se reguló por incremento 2,4-3,6 veces en IL-20.

Genes que muestran sinergia con tratamiento con IL-20 + IL-1

1.: La proteína morfogénica ósea 2a se reguló por incremento 1,8 veces con tratamiento con IL-20 solo, 2,5 veces con tratamiento con IL-1 solo y 8,2 veces con ambos tratamientos con IL-20 y IL-1 juntos.

2.: La MRP-8 se reguló por incremento 2,9 veces con tratamiento con IL-20 solo, 10,7 veces con tratamiento con IL-1 solo y 18,0 veces con ambos tratamientos con IL-20 y IL-1 juntos.

3.: La proteína de diferenciación eritroide (EDF) se reguló por incremento 1,9 veces con tratamiento con IL-20 solo, 9,7 veces con tratamiento con IL-1 solo y 19,0 veces con ambos tratamientos con IL-20 y IL-1 juntos.

4.: La MRP-14 (proteína de unión a calcio en macrófagos, relacionada con MSI) se reguló por incremento 3,0 veces con tratamiento con IL-20 solo, 12,2 veces con tratamiento con IL-1 solo y 20,3 veces con ambos tratamientos con IL-20 y IL-1 juntos.

5.: El factor de crecimiento similar a EGF de unión a heparina se reguló por incremento 2,0 veces con tratamiento con IL-20 solo, 14 veces con tratamiento con IL-1 solo y 25,0 veces con ambos tratamientos con IL-20 y IL-1 juntos.

6.: La proteína similar a beta-tromboglobulina se reguló por incremento 1,5 veces con tratamiento con IL-20 solo, 15 veces con tratamiento con IL-1 solo y 27 veces con ambos tratamientos con IL-20 y IL-1 juntos.

7.: El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) se reguló por incremento 1,7 veces con tratamiento con IL-20 solo, 25 veces con tratamiento con IL-1 solo y 48 veces con ambos tratamientos con IL-20 y IL-1 juntos.

8. El factor quimiotáctico y de activación de monocitos MCAF se reguló por incremento 1,3 veces con tratamiento con IL-20 solo, 32 veces con tratamiento con IL-1 solo y 56 veces con ambos tratamientos con IL20 y IL-1 juntos.

Ejemplo 5

Heterotetrámero de fusión de receptor de IL-20RA/RB-Ig

El vector de expresión pEZE3 se usó para expresar la proteína de fusión recombinante de receptor de IL-20-Ig. El plásmido pEZE3 se deriva de pDC312. El pDC312 se obtuvo mediante licencia de Immunex Corporation. Los plásmidos pDC312 y pEZE3 contienen un segmento EASE como se describe en el documento WO 97/25420. La presencia del segmento EASE en un vector de expresión puede mejorar la expresión de proteínas recombinantes de dos a ocho veces en conjuntos de células estables.

El plásmido pEZE3 es un vector de expresión tricistrónico que puede usarse para expresar hasta tres proteínas diferentes en células de mamífero, preferentemente células de ovario de hámster chino (CHO). La unidad de expresión de pEZE3 contiene el potenciador/promotor de citomegalovirus (CMV), la secuencia conductora tripartita del adenovirus, un sitio de clonación múltiple para la inserción de la región de codificación para la primera proteína recombinante, el sitio interno de entrada al ribosoma del virus de la poliomielitis tipo 2, un segundo sitio de clonación múltiple para la inserción de la región de codificación para la segunda proteína recombinante, un sitio interno de entrada al ribosoma del virus de la encefalomiocarditis, un segmento de codificación para la dihidrofolato reductasa de ratón y el terminador de la transcripción SV40. Además, pEZE3 contiene un origen de E. coli de replicación y el gen de beta-lactamasa bacteriano.

La proteína de fusión de receptor de IL-20-Ig es un heterotetrámero ligado por disulfuro que está constituido por dos cadenas del dominio extracelular de la IL-20RB humana fusionada a la región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana de tipo salvaje y dos cadenas del dominio extracelular de la proteína de IL-20RA humana fusionadas a una región constante de inmunoglobulina gamma 1 humana mutada. La región constante de inmunoglobulina gamma 1 humana contiene sustituciones de aminoácidos para reducir la unión de FcγRI y la fijación del complemento C1q.

La construcción de fusión de dominio extracelular de IL-20RB humana/región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana se generó mediante PCR de superposición. El segmento que codifica IL-20RB está constituido por los aminoácidos 1 a 230. El molde usado para la amplificación por PCR del segmento de IL-20R se generó por la construcción de expresión de región constante de cadena ligera kappa humana de IL-20RB como se describe más adelante en el Ejemplo 12. Se usaron los cebadores de oligonucleótidos SEC ID Nº: 24 y SEC ID Nº: 25 para amplificar el segmento de IL-20RB. Se usó toda la región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana de tipo salvaje. El molde usado para la amplificación por PCR del segmento de la región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana de tipo salvaje se generó por la construcción de expresión de la región constante de cadena ligera kappa humana de IL-20RB como se describe en Ejemplo 12. Se usaron los cebadores de oligonucleótidos SEC ID Nº: 26 y SEC ID Nº: 27 para amplificar la región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana de tipo salvaje. Los dos dominios que codificaban proteínas se ligaron mediante PCR de superposición usando los oligonucleótidos SEC ID Nº: 24 y SEC ID Nº: 27. Un conector de péptidos (Gly4Ser)3 (SEC ID Nº: 72) se introdujo entre los dos dominios de proteínas. El conector de péptidos (Gly4Ser)3 se codificó en los cebadores de PCR SEC ID Nº: 26 y SEC ID Nº: 25. La construcción de fusión de dominio extracelular de IL-20RB/región constante de cadena ligera kappa resultante se muestra por la SEC ID Nº: 20 y 21. El polipéptido maduro predicho menos la secuencia señal es SEC ID Nº: 60. La parte del dominio extracelular de IL-20RB que se usó estaba compuesta en realidad por la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 61. La secuenciación del extremo N produjo la secuencia de aminoácidos predicha.

La construcción de fusión de dominio extracelular de IL-20RA humana/región constante de cadena pesada de la inmunoglobulina gamma 1 humana se generó mediante PCR de superposición de cuatro fragmentos de ADN separados, generado cada uno por reacciones de amplificación por PCR separadas. El primer fragmento contuvo una secuencia señal de tPA optimizada (activador de plasminógeno tisular). La secuencia señal de tPA se amplificó usando cebadores de oligonucleótidos SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 29 usando un vector de expresión previamente generado en la empresa como molde. El segundo fragmento contuvo la región de codificación del dominio extracelular de IL-20RA que estaba constituida por los aminoácidos 30 a 243 de SEC ID Nº: 11. Se usaron los cebadores de oligonucleótidos SEC ID Nº: 30 y SEC ID Nº: 31 para amplificar este segmento de IL-20RA usando un clon previamente generado de IL-20RA como molde.

La región constante de cadena pesada de gamma 1 humana se generó a partir de 2 segmentos. El primer segmento que contenía el dominio CH1 se amplificó usando cebadores de oligonucleótidos SEC ID Nº: 32 y SEC ID Nº: 33 usando un clon de la región constante de cadena pesada de gamma 1 humana de tipo salvaje como molde. El segundo segmento que contenía los dominios bisagra restantes, CH2 y CH3, de la región constante de cadena pesada de la inmunoglobulina gamma 1 humana se generó mediante amplificación por PCR usando los cebadores de oligonucleótidos SEC ID Nº: 34 y SEC ID Nº: 35. El molde usado para esta amplificación por PCR fue de una construcción Fc de gamma 1 humana previamente generado que contenía codones para las sustituciones de

aminoácidos para reducir la unión de FcγRI y la fijación del complemento C1q como se describe en el Ejemplo 12.

Los dominios de codificación de cuatro proteínas se ligaron mediante PCR de superposición usando los oligonucleótidos SEC ID Nº: 28 y SEC ID Nº: 35. Un conector de péptidos (Gly4Ser)3 se introdujo entre los dominios de proteínas de IL-20RA y CH1. El conector de péptidos (Gly4Ser)3 se codificó en los cebadores de PCR SEC ID Nº: 32 y SEC ID Nº: 31. La proteína de fusión de dominio extracelular de IL-20RA/región constante de cadena pesada de la inmunoglobulina gamma 1 humana y la secuencia de ADN se muestran en SEC ID Nº: 22 y 23. La secuencia de polipéptidos madura predicha, menos la secuencia señal, es SEC ID Nº: 62. La parte del dominio extracelular de IL-20RA que se usó estaba compuesta en realidad por SEC ID Nº: 63.

El segmento de codificación de la fusión de dominio extracelular de IL-20RB/ región constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana se clonó en el segundo MCS, mientras que el segmento de codificación de la fusión de dominio extracelular de IL-20RA humana/región constante de cadena pesada de la inmunoglobulina gamma 1 humana se clonó en el primer MCS de pEZE3. El plásmido se usó para transfectar células CHO. Las células se seleccionaron en medio sin hipoxantina o timidina y el transgén se amplificó usando metotrexato. La presencia de proteína se ensayó mediante transferencia Western usando anticuerpos anti-región constante de cadena pesada de gamma 1 humana y anti-cadena ligera kappa humana. La secuenciación del extremo N reveló que el conductor tPA optimizado no se había escindido completamente. La masa observada indicó que el primer residuo de la secuencia de polipéptidos era ácido piroglutámico, y la secuencia del extremo N parece ser piroEEIHAELRRFRRVPCVSGG (SEC ID Nº: 64), siendo la parte subrayada restos del conductor tPA.

Ejemplo 6

Fenotipo transgénico de IL-20

Se expresaron en exceso IL-20 tanto humanas como de ratón en ratones transgénicos usando una variedad de promotores. El promotor de albúmina de ratón específica para hígado, que dirige la expresión de IL-20 humana, se usó inicialmente en un intento por lograr niveles en circulación de proteína. Se realizaron estudios posteriores usando el promotor de queratina 14 (K14), que elige principalmente como diana la expresión a la epidermis y otros epitelios escamosos estratificados; el promotor de la metalotioneína-1 de ratón, que da un amplio modelo de expresión; y el EµLCK, que impulsa la expresión en células de la línea linfoide. Se obtuvieron resultados similares en los cuatro casos, posiblemente porque todos estos promotores producen niveles en circulación de IL-20.

En todos los casos, las crías transgénicas que expresan los transgenes de IL-20 fueron más pequeñas que sus compañeros de jaula no transgénicos, tenían un aspecto brillante con piel dura arrugada y murieron en el plazo de los primeros días después del nacimiento. Las crías tenían leche en sus estómagos que indicaba que podían amamantar. Estos ratones tenían las extremidades, las regiones de la cola, los orificios nasales y la boca hinchados y tenían dificultades en el movimiento. Además, los ratones estaban débiles, carecían de tejido adiposo visible y tenían un desarrollo retardado del oído y los dedos. Los bajos niveles de expresión en el hígado (inferiores a 100 moléculas de ARNm/célula) fueron suficientes para tanto la letalidad neonatal como las anomalías de la piel. Los ratones transgénicos sin un fenotipo visible ni expresaron el transgén ni lo expresaron a niveles detectables, o fueron mosaico.

El análisis histológico de la piel de los ratones transgénicos para IL-20 mostró una epidermis engrosada, hiperqueratosis y un estrato córneo compacto en comparación con los compañeros de jaula no transgénicos. Ocasionalmente se observaron costras serocelulares (escaras). El análisis por microscopio electrónico (ME) de la piel de ratones transgénicos mostró inclusiones de lípidos intramitocondriales, gránulos de queratohialina moteados y relativamente pocos tonofilamentos similares a los observados en la piel psoriásica humana y en modelos de enfermedades de la piel de ratón. Además, muchos de los ratones transgénicos tenían linfocitos tímicos apoptósicos. No se detectó ninguna otra anomalía mediante el análisis histopatológico. Estos resultados histológicos y de ME respaldan y extienden las alteraciones macroscópicas de la piel observadas.

Ejemplo 7

Especificidad y afinidad de IL-20 por su receptor

La especificidad y la afinidad de IL-20 por su receptor se determinó usando células BHK establemente transfectadas con IL-20RA, IL-20RB o ambas subunidades de receptores. Los ensayos de unión usando ligando radiomarcado demostraron que la IL-20 se unió a transfectantes de BHK que expresan tanto IL-20RA como IL-20RB, pero no a células sin transfectar ni a transfectantes que no expresan ninguna de las dos subunidades de receptor solas. La unión de IL-20 marcada con 125 se eliminó en presencia de un exceso de 100 veces de IL-20 sin marcar, pero no con un exceso de 100 veces de la citocina sin relacionar, IL-21. Se determinó que la afinidad de unión (kD) de IL-20 por el receptor heterodimérico de IL-20RA/IL-20RB era aproximadamente 1,5 nM.

Ejemplo 8

Activación de receptores de IL-20

Para determinar si la unión de IL-20 conduce a la activación de receptores, la línea de células pre-B dependiente del factor BaF3 se cotransfectó con IL-20RA y IL-20RB y se trató con IL-20 a diversas concentraciones. La IL-20 estimuló la proliferación en un modo dependiente de la dosis y dio una señal detectable a 1,1 pM, con una respuesta media máxima a 3,4 pM. Los inventores observan que la concentración de IL-20 para la respuesta proliferativa media máxima en células BaF3 es 1000X inferior a la afinidad de unión media máxima en células BHK. Las posibles explicaciones para esta gran diferencia incluyen el uso de diferentes líneas celulares, diferentes niveles de expresión de receptores y diferentes resultados de ensayos. La IL-20 también estimuló la transducción de señales en la línea celular de queratinocitos humanos biológicamente relevante HaCaT, que expresa naturalmente IL-20RA y IL-20RB. Por tanto, la IL-20 se une a y activa el receptor heterodimérico de IL-20RA/IL-20RB a concentraciones esperadas para una citocina.

Ejemplo 9

Análisis de expresión de IL-20RA y IL-20RB

Se realizaron análisis de RT-PCR en una variedad de tejidos humanos para determinar el modelo de expresión de IL-20RA y IL-20RB. Las dos subunidades de receptores son las más altamente expresadas en la piel y los testículos. El resultado significativo es que la IL-20RA y la IL-20RB se expresan ambas en la piel, en la que se ha mostrado que median en la respuesta inducida por IL-20. Tanto IL-20RA como IL-20RB también se expresan en monocitos, pulmón, ovario, músculo, testículo, glándula suprarrenal, corazón, glándula salival y placenta. La IL-20RA también está en el cerebro, riñón, hígado, colon, intestino delgado, estómago, tiroides, páncreas, útero y próstata, mientras que no está la IL-20RB.

Ejemplo 10

Los ARNm de IL-20RA y IL-20RB están regulados por incremento en psoriasis

Se usó la hibridación in situ para determinar si la expresión de receptores de IL-20 está alterada en psoriasis. Muestras de piel de cuatro pacientes con psoriasis y tres pacientes sin afectar se ensayaron con sondas específicas para el ARNm de la subunidad de dos receptores. Las cuatro muestras de piel psoriásica tenían altos niveles de ARNm de IL-20RA y IL-20RB en los queratinocitos, mientras que las muestras de piel normal no tenían niveles detectables de ningún ARNm de la subunidad de receptores. También se observaron señales positivas en piel psoriásica en células inmunitarias mononucleares y en células endoteliales en un subconjunto de vasos. Por tanto, tanto la IL-20RA como la IL-20RB se expresan en queratinocitos, células inmunitarias y células endoteliales, los principales tipos de células que se cree que interactúan en la psoriasis.

Ejemplo 11

Clonación de IL-20RA de ratón

Se generó una sonda de hibridación de especies cruzadas que contenía el fragmento de ADNc de longitud completa que codifica la IL-20RA humana. Se realizaron una transferencia Southern de ADN genómico de ratón y transferencias de Northern de ARN de ratón para demostrar que el ADNc de IL-20RA humana podría hibridarse específicamente a secuencias de ratón. Los resultados de la transferencia de Northern indicaron que el ARN de IL20RA de ratón estaba presente en embrión de ratón el día 15 y 17, además de corazón, cerebro, pulmón, hígado, riñón, testículos, bazo, timo, hígado, estómago e intestino delgado.

La sonda de hibridación de ADN de longitud completa de IL-20RA humana se usó para cribar una biblioteca genómica de ratón. La biblioteca, que se obtuvo de Clontech (Palo Alto, CA), se generó a partir de una digestión parcial con MboI de ADN genómico de ratón y se clonó en el sitio BamHI del bacteriófago lambda EMBL3 SP6/T7. El bacteriófago positivo se purificó en placa y el ADN de bacteriófago se preparó usando el sistema de purificación de ADN Promega's Wizard Lambda Preps. Se generaron dos fragmentos de enzima de restricción genómica, un fragmento EcoRI de 5,7 kb y un fragmento SacI de 8,0 kb, a partir del bacteriófago positivo y se subclonaron en pBluescript. El análisis de secuencias de ADN reveló la presencia de 3 exones del ortólogo de ratón para IL-20RA humana.

Se diseñaron cebadores de PCR de 5' UTR, SEC ID Nº: 40, y 3' UTR, SEC ID Nº: 41, para generar una secuencia de IL-20RA de ratón de longitud completa mediante amplificación por PCR. Se usó embrión de ratón de 15 días más ADNc de 17 días como molde para la amplificación por PCR. Los productos de PCR se subclonaron y se secuenciaron para la confirmación. Las secuencias de ratón son SEC ID Nº: 36 y 37. El dominio extracelular maduro está compuesto por SEC ID Nº: 38.

Ejemplo 12

Construcción de un heterotetrámero de receptor de IL-20

Se construyó un vector que expresaba un heterodímero de hIL-20RA/hIL-20B secretada. En esta construcción, el dominio extracelular de hIL-20RA se fusionó a la cadena pesada de IgG gamma 1 (IgGγ1), mientras que la parte

extracelular de IL-20RB se fusionó a cadena ligera kappa humana (cadena ligera K humana).

Construcción de vectores de fusión de IgG gamma 1 y de cadena ligera κ humana

La cadena pesada de IgGγ1 se clonó en el vector de expresión mamífero Zem229R (nº de depósito de ATCC 69447) de forma que cualquier parte extracelular de un receptor que tuviera un sitio 5' EcoRI y 3' NheI pudiera clonarse produciendo una fusión de dominio extracelular del extremo N-IgGγ1 del extremo C. El fragmento de IgGγ1 usado en esta construcción se preparó usando PCR para aislar la secuencia de IgGγ1 de una biblioteca de ADNc de hígado fetal humano de Clontech como molde. Se ejecutó una reacción de PCR usando oligonucleótidos SEC ID Nº: 42 y SEC ID Nº: 43 del siguiente modo: 40 ciclos de 94ºC durante 60 s, 53ºC durante 60 s y 72ºC durante 120 s; y 72ºC durante 7 minutos. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se purificaron usando un kit de extracción en gel QiaQuick™ (Qiagen Inc., Valencia, CA). El fragmento de ADN aislado de 990 pb se digirió con Mlul y EcoRI (Boerhinger-Mannheim), se extrajo con el kit de extracción en gel QiaQuick™ y se ligó con oligonucleótidos SEC ID Nº: 44 y SEC ID Nº: 45, que comprenden un conector de Mlul/EcoRI, en Zem229R previamente digerido con Mlul y EcoRI usando técnicas de biología molecular estándar desveladas en este documento. Este vector de clonación genérico se llamó el vector nº 76 hIgG gamma 1 w/ Ch1 nº 786 Zem229R (vector nº76). La secuencia de polinucleótidos del dominio extracelular de hIL-20RA fusionada a la cadena pesada de IgG gamma 1 se muestra en SEC ID Nº: 52 y la secuencia de polipéptidos correspondiente se muestra en SEC ID Nº: 53, el polipéptido maduro, menos la secuencia señal que comprende SEC ID Nº: 54. La porción del dominio extracelular de IL-20RA usada comprendió SEC ID Nº: 55.

La cadena ligera K humana se clonó en el vector de expresión de mamífero Zem228R (nº de depósito ATCC 69446) de forma que cualquier parte extracelular de un receptor que tuviera un sitio 5' EcoRI y un sitio 3' KpnI pudiera clonarse produciendo una fusión de dominio extracelular del extremo N-cadena ligera K humana del extremo C. El fragmento de cadena ligera K humana usado en esta construcción se preparó usando PCR para aislar la secuencia de cadena ligera K humana de la misma biblioteca de ADNc de hígado fetal humano Clontech usada anteriormente. Se ejecutó una reacción de PCR usando oligonucleótidos SEC ID Nº: 46 y SEC ID Nº: 47. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se purificaron usando un kit de extracción en gel QiaQuick™ (Qiagen). El fragmento de ADN aislado de 315 pb se digirió con Mlul y EcoRI (Boerhinger-Mannheim), se extrajo con el kit de extracción en gel QiaQuick™ y se ligó con el conector Mlul/EcoRI descrito anteriormente en el Zem228R previamente digerido con Mlul y EcoRI usando técnicas de biología molecular estándar desveladas en este documento. Este vector de clonación genérico se llamó el vector nº 77 K ligera humana nº 774 Zem228R (vector nº 77). La secuencia de polinucleótidos de la parte extracelular de IL-20RB fusionada a la cadena ligera kappa humana se muestra en SEC ID Nº: 56 y la secuencia de polipéptidos correspondiente se muestra en SEC ID Nº: 57, el polipéptido maduro, menos la secuencia señal, comprende SEC ID Nº: 58. La porción del dominio extracelular de IL20RB en realidad usada comprendió SEC ID Nº: 59.

Inserción de dominios extracelulares de hIL-20RA y IL-20RB en construcciones de vectores de fusión

Usando los vectores de construcción anteriores, se preparó una construcción que tenía IL-20RA humana fusionada a IgGγ1. Esta construcción se hizo usando PCR para obtener el receptor de IL-20RA humana a partir del vector nº 102 de hIL-20RA/IgG con los oligonucleótidos SEC ID Nº: 48 y SEC ID Nº: 49 en condiciones descritas del siguiente modo: 30 ciclos de 94ºC durante 60 s, 57ºC durante 60 s y 72ºC durante 120 s; y 72ºC durante 7 min. El producto de PCR resultante se digirió con EcoRI y NheI, se purificó en gel, como se describe en este documento, y se ligó en un vector nº 76 previamente digerido con EcoRI y NheI y purificado por bandas (anteriormente). El vector resultante se secuenció para confirmar que la fusión de IL-20Ra humana/IgG gamma 1 (hIL-20RA/IgG de Ch1) era correcta. El vector Zem229R de hIL-20RA/IgG gamma 1 de Ch1 nº 1825 se llamó el vector nº 195. La secuencia de IgGγ1 de IL20RA/Ch1 así obtenida se representa por SEC ID Nº: 52 y 53. La secuenciación del extremo N indicó la presencia de la secuencia de polipéptidos madura predicha de SEC ID Nº: 54.

También se construyó una construcción separada que tenía IL-20RB fusionada a la cadena ligera K. La construcción de IL-20RB/cadena ligera K humana se realizó como antes mediante PRC a partir de DR1/7N-4 con los oligonucleótidos SEC ID Nº: 50 y SEC ID Nº: 51 digiriendo la banda resultante con EcoRI y KpnI y luego ligando este producto en un vector nº 77 previamente digerido con EcoRI y KpnI y purificado por bandas (anteriormente). El vector resultante se secuenció para confirmar que la fusión de IL-20RB/cadena ligera K humana (IL-20RB/K ligera) era correcta. Esta construcción de IL-20RB/K ligera se muestra por SEC ID Nº: 56 y 57. La secuenciación del extremo N del polipéptido resultante indicó la presencia de la secuencia de aminoácidos madura predicha que comprende SEC ID Nº: 58. La SEC ID Nº: 59 es la porción madura del dominio extracelular de IL-20RB usado.

Coexpresión de los receptores de IL-20RA humana y IL-20RB humana

Se cotransfectaron aproximadamente 16 µg de cada uno de los vectores nº 194 y nº 195, anteriormente, en células BHK-570 (nº de ATCC CRL-10314) usando el reactivo Lipofectamine™ (Gibco/BRL) según las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se seleccionaron durante 10 días en DMEM + SBF al 5% (Gibco/BRL) que contenía 1 µM de metotrexato (MTX) (Sigma, St. Louis, MO) y 0,5 mg/ml de G418 (Gibco/BRL) durante 10 días. El conjunto resultante de transfectantes se seleccionó de nuevo en MTX 10 µM y 0,5 mg/ml de G418 durante 10 días.

El conjunto resultante de células doblemente seleccionadas se usó para generar proteína. Se usaron tres factorías (Nunc, Dinamarca) de este conjunto para generar 8 l de medio acondicionado sin suero. Este medio acondicionado se pasó por un columna de 1 ml de proteína A y se eluyó en (10) fracciones de 750 microlitros. Se recogieron 4 de estas fracciones que se encontró que tenían la mayor concentración y se dializaron (PM de corte 10 kD) contra PBS. Finalmente, el material dializado se analizó por BCA (Pierce) y se encontró que tenía una concentración de 317 µg/ml. De esta purificación de 8 l se obtuvieron un total de 951 µg.

Ejemplo 13

La unión de IL-20 activa STAT3 en la línea celular de queratinocitos HaCaT

La IL-20 se une a líneas celulares transfectadas con ambas subunidades de su receptor. Sin embargo, estas líneas celulares expresan en exceso el receptor de IL-20 respecto a su nivel normal y no está clara su relevancia para la función fisiológica de IL-20. La línea celular de queratinocitos humanos HaCaT, que expresa IL-20RA y IL-20RB endógenas, se usó para examinar la transducción de señales de IL-20 en un tipo de célula biológicamente relevante. Las células HaCaT se infectaron con adenovirus recombinante que contenía una construcción indicadora para permitir la detección de la señalización intracelular. La construcción está constituida por el gen de luciferasa de luciérnaga impulsado por secuencias promotoras/potenciadoras que comprenden el elemento de respuesta al suero (SRE) y transductores de señales y activadores de elementos de transducción (STAT). Este sistema de ensayo detecta interacciones ligando-receptor productivas e indica posibles componentes de transducción de señales aguas abajo que participan en la activación de receptores. El tratamiento con IL-20 solo produjo un aumento dependiente de la dosis en la actividad de la luciferasa con una respuesta media máxima que se produce a aproximadamente 2,3 nM. Los posteriores ensayos de indicadores de luciferasa usando vectores de adenovirus que sólo contenían el elemento SRE o sólo los elementos STAT produjeron activación indicadora detectable sólo mediante STAT.

Para determinar si otras citocinas actúan conjuntamente con IL-20, las células HaCaT se trataron con IL-20 sola o en combinación con una única dosis inferior a la máxima de EGF, IL-1β o TNFα. En presencia de cada una de estas tres proteínas, el tratamiento con IL-20 produjo un aumento dependiente de la dosis en la actividad de luciferasa. La IL-20 en combinación con la IL-1β da como resultado una respuesta media máxima a aproximadamente 0,5 nM, aproximadamente cinco veces inferior que con IL-20 sola. Además, la activación del gen indicador es detectable a IL-20 0,1 nM, una dosis que es al menos diez veces inferior a la dosis de IL-20 requerida sola.

Las células BHK transfectadas con IL-20RA, IL-20RB o ambas subunidades de receptor se usaron para determinar si se requería el apareamiento de receptores para la estimulación de IL-20 de STAT-luciferasa. Como era el caso con los ensayos de unión, sólo las células transfectadas con ambas subunidades de receptores respondieron a IL-20 y lo hicieron con una respuesta media máxima de 5,7 pM. Los inventores observan que la concentración de IL-20 para la respuesta media máxima en células BHK es 400 veces inferior que para la respuesta media máxima en células HaCaT. Es probable que se necesite una menor concentración de IL-20 para la respuesta media máxima en células BHK, con respecto a células HaCaT, debido a los mayores niveles de receptor en los transfectantes de receptores de IL-20 de BHK.

Se usó un ensayo de translocación nuclear para identificar proteínas STAT que participaban en la acción de IL-20. Tanto las células HaCaT, con receptores de IL-20 endógenos, como las células BHK transfectadas con IL-20RA y IL20RB, se trataron con proteína de IL-20 y la translocación de factores de transcripción de STAT3 y STAT1 desde el citoplasma hasta el núcleo se ensayó por inmunofluorescencia.

En células HaCaT sin estimular, la tinción de STAT3 fue predominantemente en el citosol. El tratamiento de células HaCaT con IL-20 produjo una acumulación distinta de STAT3 en el núcleo. La translocación nuclear de STAT3 en respuesta a concentraciones crecientes de IL-20 se produjo con una concentración de IL-20 media máxima de 7 nM. A diferencia de la translocación de STAT3, las células HaCaT tratadas con IL-20 no mostraron ninguna acumulación nuclear detectable de STAT1.

Se usaron células BHK transfectadas con IL-20RA y IL-20RB para confirmar que el receptor de IL-20 era requerido para la estimulación de IL-20 de la translocación nuclear de STAT3. En células BHK que carecen del receptor de IL20, la STAT3 quedó citosólica tras el tratamiento con IL-20. A diferencia, en células BHK transfectadas con el receptor de IL-20, la STAT3 se translocó hacia el núcleo en respuesta a IL-20. De nuevo, la STAT1 quedó citosólica independientemente del tratamiento con IL-20 o la expresión de receptores de IL-20. Los inventores concluyen que el receptor de IL-20 es requerido para la activación de STAT3 mediada por IL-20.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> ZymoGenetics. Inc.

<120> Procedimiento para el tratamiento de la inflamación

<130> 99-108PC 5 <150> 09/470.898

<151>

<150> 60/213.341

<151>

<160> 72 10 <170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

<210> 1

<211> 176

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <400> 1

<210> 2

<211> 152 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 151

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 176

<212>: PRT 15 <213> Mus musculis

<400> 5

<210> 6

<211> 152

<212> PRT

<213> Mus musculis

<400> 6

<210> 7

<211> 144

<212> PRT

<213> Mus musculis

<400> 7

<210> 8

<211> 154

<212>: PRT 15 <213> Mus musculis

<400> 8

<210> 9

<211> 130

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 3516

<212>: ADN 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (237)...(1895)

<210> 11

<211> 553

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 221

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 971

<212>: ADN 15 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (18)...(950)

<400> 13

<210> 14

<211> 311

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 203

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 33

<212>: ADN 15 <213> Homo sapiens

10 <400> 10

<400> 16

<210> 17

<211> 32

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 1379 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 20 <222> (132)...(1034)

<400> 18

<210> 19

<211> 301

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 1081 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 10 <222>(9)...(1067)

<400> 20

<210> 21

<211> 352

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 1801 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 10 <222> (8)...(1789)

<400> 22

<210> 23

<211> 594

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 29

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 52

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 25

10 <210> 26

<211> 53

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15 <400> 26

<210> 27 20 <211> 38

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 27 25

<210> 28

<211> 30 30 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 30

<212> ADN 40 <213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens 50

<400> 30

55 <210> 31

<211> 53

<212> ADN

<213> Homo sapiens

60 <400> 31

<210> 3

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33 10 <211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 20 20 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 34

<210> 35

<211> 31

<212> ADN 30 <213> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 1806

<212> ADN

<213> Mus musculus 40

<220>

<221> CDS

<222> (38)...(1675)

45 <400> 36

<210> 37

<211> 546

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 37

5 <210> 38

<211> 217

<212> PRT

<213> Mus musculus

10 <400> 38

<210> 39

<211> 514

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 39

<210> 40

<211> 18

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 40

<210> 41

<211> 24

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 41

<210> 42

<211> 36

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 42

<210> 43

<211> 32

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 44

<211> 8

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 44

45 <210> 45

<211> 8

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 45

<210> 46 55 <211> 37

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 46

<210> 47

<211>: 32 65 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 47

<210> 48

<211> 38

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 48

<210> 49

<211>: 35 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 49

<210> 50

<211> 43

<212> ADN 25 <213> Homo sapiens

<400> 50

<210> 51

<211> 86

<212> ADN

<213> Homo sapiens 35

<400> 51

40 <210> 52

<211> 1720

<212> ADN

<213> Homo sapiens

45 <220>

<221> CDS

<222> (1)...(1713)

<400> 52 50

<210> 53

<211> 571

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53

<210> 54

<211> 547

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

<210> 55

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 55

<210> 56

<211> 1011 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)...(1008)

<400> 56

<210> 57

<211> 336

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 307

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58

<210> 59

<211> 201

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

<210> 60

<211> 323

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

<210> 61

<211> 201

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

<210> 62

<211> 559

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62

<210> 63

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

<210> 64

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64

<210> 65

<211> 207

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 65

<210> 66

<211> 150

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

<210> 67

<211> 196

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 67

<210> 68

<211> 203

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 68

<210> 69

<211> 196

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

<210> 70

<211> 135

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 70

<210> 71

<211> 135

<212>: PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 71 <210> 72

<211> 15 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 72

Claims

REIVINDICACIONES

1.

El uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de dermatitis atópica.
2.

El uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria del intestino seleccionada de colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn.
3.

El uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de artritis reumatoide.
4.

El uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de la piel inflamatoria dermatitis de contacto, en el que dicha enfermedad de la piel inflamatoria es producida por la regulación por incremento inducida por IL-20 de IL-8.
5.

El uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad pulmonar inflamatoria seleccionada de enfermedad respiratoria del adulto, neumonía bacteriana y fibrosis pulmonar idiopática, en el que dicha enfermedad pulmonar inflamatoria es producida por la regulación por incremento inducida por IL-20 de IL-8.
6.

El uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria seleccionada de choque séptico e insuficiencia multiorgánica, en el que dicha enfermedad inflamatoria es producida por la regulación por incremento inducida por IL-20 de IL-8.
7.

El uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada de cáncer de pulmón y melanoma humanos, en el que dicha enfermedad es producida por la regulación por incremento inducida por IL-20 de IL-8.
8.

Uso según cualquier reivindicación previa en combinación con otro agente terapéutico seleccionado de lubricantes, queratolíticos, corticosteroides tópicos, derivados de la vitamina D tópica, antralina, antimetabolitos sistémicos tales como metotrexato, terapia con psoraleno-luz ultravioleta (PUVA), etretinato, isotretinoína, ciclosporina y el derivado de la vitamina D3 tópica calcipotriol.
9.

Uso según la reivindicación 8, en el que dicho antimetabolito sistémico es metrotrexato.
10.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para su uso en el tratamiento de dermatitis atópica.
11.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria del intestino seleccionada de colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn.
12.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para su uso en el tratamiento de artritis reumatoide.
13.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de la piel inflamatoria, dermatitis de contacto, en el que dicha enfermedad de la piel inflamatoria es producida por la regulación por incremento inducida por IL-20 de IL-8.
14.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para su uso en el tratamiento de una enfermedad pulmonar inflamatoria seleccionada de enfermedad respiratoria del adulto, neumonía bacteriana y fibrosis pulmonar idiopática, en el que dicha enfermedad pulmonar inflamatoria es producida por la regulación por incremento inducida por IL-20 de IL-8.
15.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria seleccionada de choque séptico e insuficiencia multiorgánica, en el que dicha enfermedad inflamatoria es producida por la regulación por incremento inducida por IL-20 de IL-8.
16.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido de IL-20 seleccionado del grupo que consiste en SEC ID Nº: 1, 2, 3 y 4 para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada de cáncer de

pulmón y melanoma humanos, en el que dicha enfermedad es producida por la regulación por incremento inducida por IL-20 de IL-8.
17.

Un anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 10-16, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal o monoclonal.
18.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 10-16, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está genéticamente manipulado.
19.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 10-16, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un fragmento F(ab')2 o Fab.
20.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso según la reivindicación 18, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está humanizado; en el que dicho anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDR) no humanas injertadas sobre una región estructural y regiones constantes humanas.
21.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso según la reivindicación 18, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo quimérico, fragmento Fv o anticuerpo monocatenario.
22.

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso según la reivindicación 20 ó 21, en el que los dominios variables son de origen no humano.
23.

Un uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal o monoclonal.
24.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está genéticamente manipulado.
25.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un fragmento F(ab')2 o Fab.
26.

Uso según la reivindicación 24, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo está humanizado; en el que dicho anticuerpo humanizado o fragmento de anticuerpo tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDR) no humanas injertadas sobre una región estructural y regiones constantes humanas.
27.

Uso según la reivindicación 24, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo quimérico, fragmento Fv o anticuerpo monocatenario.
28.

Uso según las reivindicaciones 26 ó 27, en el que los dominios variables son de origen no humano.