KR20170102980A - 벤조디아제핀 이량체, 그의 접합체, 및 제조 및 사용 방법 - Google Patents
벤조디아제핀 이량체, 그의 접합체, 및 제조 및 사용 방법 Download PDFInfo
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Abstract
하기에 의해 나타내어진 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체.
화학식 I, Ia, 및 Ib에서의 가변기는 본 출원에 정의된 바와 같다. 이러한 이량체는 특히 항체-약물 접합체 (ADC)에 사용 시에 항암제로서 유용하다.
화학식 I, Ia, 및 Ib에서의 가변기는 본 출원에 정의된 바와 같다. 이러한 이량체는 특히 항체-약물 접합체 (ADC)에 사용 시에 항암제로서 유용하다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2015년 1월 14일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 USSN 62/103,157 및 2015년 9월 9일에 출원된 USSN 62/215,928에 대한 우선권을 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 벤조디아제핀 이량체, 그로부터 유도된 이량체-링커 화합물, 및 그의 접합체, 및 그의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
벤조디아제핀 고리계를 갖는 여러 자연 발생 세포독성 화합물이 공지되어 있다. 디아제핀 고리에 융합된 5-원 피롤리딘 고리의 분자 스캐폴드의 추가의 존재를 반영하여, 이러한 화합물은 흔히 피롤로벤조디아제핀, 또는 PBD로 지칭된다. 예는 토메이마이신 및 안트라마이신을 포함한다.
PBD는 항생제 및 항종양 활성을 보유하며, 후자의 형질은 항암 약물로서 이들에서의 관심으로 이어진다. 기계론적으로, PBD는 서열 선택적 방식으로 DNA의 작은 홈에 결합하고, 일단 결합되면, DNA를 알킬화시킨다. 상이한 치환기의 구조-활성 관계 (SAR)가 연구된 바 있다 (Antonow et al. 2010; Thurston et al. 1999).
추가의 연구는 PBD 이량체가 항암제로서의 특수한 유망성을 나타냄을 제시한 바 있다. 전형적인 PBD 이량체의 코어 구조는 화학식 (A-1)에 의해 나타내어질 수 있으며, 여기서 X는 2개의 이량체 반쪽을 연결시키는 가교 기이다.
단량체 PBD와 같이, 이량체는 DNA 작은 홈 결합제-알킬화제이다. 이관능성이므로, 이량체에 의한 알킬화는 가교된 DNA를 생성시켜 DNA 복구를 더 어렵게 한다. (DNA 알킬화는 이민 기를 통해 발생한다. 이민 기 중 1개가 환원된 PDB는 여전히 DNA를 알킬화시킬 수 있지만, 이를 가교시킬 수는 없다. 이들은 비록 일반적으로 더 적게 생물학적 활성이더라도 여전히 생물학적 활성이지만, 그의 상이한 약동학적 프로파일은 일부 적용에 바람직할 수 있다.) 자연 발생 단량체 내지 합성 단량체로부터 합성 이량체로의, 항종양제로서의 PBD의 발생에 관한 종설에 대해, 문헌 [Hartley 2011]을 참조한다.
PBD 이량체의 SAR은 A/A' 및 C/C' 고리 상의 치환기, C/C' 고리 내의 불포화, 가교 기 X의 구조 및 길이, 및 고리 B/B' 내의 이민 이중 결합의 산화 또는 환원, 및 이러한 특색의 조합을 통해 연구된 바 있다. 문헌 [Bose et al. 1992, Gregson et al. 1999, Gregson et al. 2001a and 2001b, Gregson et al. 2004, Gregson et al. 2009, Hartley et al. 2012, Howard et al. 2007, Howard et al. 2009a. Howard et al. 2010, Howard et al. 2013a and 2013b, Liu et al. 2007, Thurston et al. 1996, Thurston et al. 2006, 및 Thurston et al. 2008]을 참조한다. 대부분의 PBD 이량체는 상기 제시된 바와 같은 8/8' 가교를 통해 연결되지만, 7/7' 가교가 또한 개시된 바 있다 (Howard et al. 2009b).
강하게 관심받고 있는 항암제의 유형은 항체-약물 접합체 (ADC, 면역접합체로도 지칭됨)이다. ADC에서, 치료제 (약물, 페이로드, 또는 워헤드로도 지칭됨)는 그 항원이 암 세포에 의해 발현되는 것 (종양 연관 항원)인 항체에 공유 연결된다. 항체는 항원에 결합함으로써, ADC를 암 부위에 전달한다. 그곳에서, 공유 연결의 절단 또는 항체의 분해는 치료제의 방출로 이어진다. 반대로, ADC는 혈액계를 순환하며, 치료제는 항체에 대한 그의 공유 연결 때문에 불활성으로 유지된다. 따라서, ADC에 사용되는 치료제는 그의 국한된 방출 때문에 통상의 화학요법제보다 훨씬 더 강력 (즉, 세포독성)할 수 있다. ADC에 관한 종설에 대해, 문헌 [Schrama et al. 2006]을 참조한다.
PBD 이량체는 ADC에서 약물로서 제안된 바 있다. 항체에 연결시키는 링커의 부착은 가교 기 X인 C/C' 고리에 위치하는 관능기를 통해, 또는 B/B' 고리 내의 이민 기를 가로지르는 부가에 의해 이루어질 수 있다. 문헌 [Beau-Larvor et al. 2014, Bouchard et al. 2013, Commercon et al. 2013a and 2013b, Flygare et al. 2013, Gauzy et al. 2012, Howard 2104a-2014e, Howard et al. 2011, Howard et al. 2013c and 2013d, Howard et al. 2014a-2014h, Jeffrey et al. 2013, Jeffrey et al. 2014a and 2014b, 및 Zhao et al. 2014]을 참조한다.
벤조디아제핀 이량체의 또 다른 유형은 또한 ADC에 사용하기 위한 치료제로서 제안된 바 있다. 구조적으로, 이러한 유형은 PBD 이량체가 화학식 (A-2) 및 (A-3)에 제시된 바와 같이 각각의 C/C' 고리에 융합된 페닐 고리를 추가로 갖는 것으로 볼 수 있다. 문헌 [Chari et al. 2013, Li et al. 2013, Fishkin et al. 2014, Li et al. 2014]을 참조한다.
다른 고리계를 갖는 벤조디아제핀 화합물, 예컨대 테트라히드로이소퀴놀리노[2,1-c][1,4]벤조디아제핀이 또한 개시된 바 있다. 문헌 [Kothakonda et al. 2004].
제1 저자 또는 발명자 및 연도에 의해 본원에 인용된 문헌에 대한 전체 인용은 본 명세서의 말미에 열거되어 있다.
본 발명은 바람직하게는 벤조디아제핀 단위 중 적어도 1개가 벤조디아제핀 고리계에 융합된 테트라히드로이소퀴놀린 (THIQ) 고리계를 갖는 것인 신규 벤조디아제핀 이량체를 제공한다. 임의로, 벤조디아제핀 고리계 내의 이민 결합은 환원될 수 있다.
이량체의 둘 다의 단위 (반쪽)가 THIQ 고리계를 가질 수 있거나 ("THIQ-THIQ 이량체" 또는 "THIQ 동종이량체"), 또는 1개의 단위가 THIQ 고리계를 가지며, 다른 단위가 상이한 벤조디아제핀 고리계, 예컨대 PBD 고리계를 가질 수 있다 (일반적으로, "THIQ 이종이량체", 또는 이러한 특정한 예에서 "THIQ-PBD 이량체"). THIQ-THIQ 이량체에서, 2개의 단위는 동일할 수 있거나 ("대칭 THIQ-THIQ 이량체") 또는 상이할 수 있다 ("비대칭 THIQ-THIQ 이량체").
따라서, 본 발명은 화학식 I에 의해 나타내어진 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
여기서
R1은 화학식 Ia 또는 화학식 Ib에 따르고;
각각의 G 및 G'는 C 또는 N이며, 단 2개 이하의 G 또는 2개 이하의 G'가 N이고;
각각의 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C5 알킬이고;
각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, F, Cl, Br, OH, C1-C3 알킬, O(C1-C3 알킬), 시아노, (CH2)0- 5NH2, 또는 NO2이고;
디아제핀 고리계 내의 각각의 이중선 
는 독립적으로 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고;
각각의 R5는 이것이 부착 - 즉, 회합 -되어 있는 N에 대한 이중선 
가 단일 결합인 경우에는 H이고, 이중선이 이중 결합인 경우에는 부재하고;
각각의 R6은 이것이 부착 - 즉, 회합 -되어 있는 C에 대한 이중선 
가 단일 결합인 경우에는 H, OH, SO3Na, 또는 SO3K이고, 이중선이 이중 결합인 경우에는 부재하고;
각각의 R7, R8, R9, 및 R10은 독립적으로 H, C1-C5 알킬, C≡C(CH2)1 -5X2, OH, O(C1-C5 알킬), 시아노, NO2, F, Cl, Br, O(CH2CH2O)1-8(C1-3 알킬), (CH2)0-5X2, O(CH2)2- 5X2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 3- 내지 7-원 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2-5X2로 치환된 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴,
이거나;
또는 R7, R8, R9, 또는 R10이, N인 G 또는 G'에 부착 - 즉, 그와 회합 -되어 있는 경우에, 이러한 R7, R8, R9, 또는 R10은 부재하고;
화학식 Ib의 고리 C 내의 점선은 C1-C2, C2-C3, 또는 C2-R11 이중 결합의 임의적인 존재를 나타내고;
R11은 H, =O, =CH2, =CH(C1-C5 알킬), CH=CH(CH2)1- 5X2, C≡C(CH2)1 -5X2, C1-C5 알킬, OH, O(C1-C5 알킬), 시아노, NO2, F, Cl, Br, O(CH2CH2O)1-8(C1-3 알킬), (CH2)0- 5X2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2로 치환된 4- 내지 7-원 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 또는 헤테로시클로알킬, O(CH2)2- 5X2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 3- 내지 7-원 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴이고;
R11'는 C1-C2, C2-C3, 또는 C2-R11 이중 결합이 존재하는 경우에는 부재하고, 다른 경우에는 H이고;
X는
이고;
X1은 CH2, O, NH, S(O)0-2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 3- 내지 7-원 시클로알킬렌 또는 헤테로시클로알킬렌, 비치환되거나 또는 (CH2)0-5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 6-원 아릴렌, 또는 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 5-원 헤테로아릴렌이고;
각각의 X2는 독립적으로 H, F, Cl, Br, OH, O(C1-C3 알킬), O(C1-C3 알킬렌), CO2H, N3, CN, NO2, CO2(C1-C3 알킬), NH2, NH(C1-C5 알킬), N(C1-C5 알킬)2, SH, CHO, N(CH2CH2)2N(C1-C3 알킬), NHNH2, 또는 C(=O)NHNH2이고;
x 및 y는 독립적으로 1, 2, 또는 3이고;
각각의 Y는 독립적으로 CH2, C=O, 또는 CHR12이고; 여기서 각각의 R12는 독립적으로 F, Cl, Br, 또는 C1-C3 알킬이고;
Y' 및 Y"는 독립적으로 CH2, C=O, 또는 CHR12이고; 여기서 각각의 R12는 독립적으로 F, Cl, Br, 또는 C1-C3 알킬이며, 단 Y' 및 Y" 중 적어도 1개가 존재한다 (즉, 연관된 아래첨자는 1임).
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포 상의 화학 물질에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 표적화 모이어티에 공유 결합된 화학식 I의 이량체를 포함하는 접합체를 제공하며, 이러한 표적 세포는 바람직하게는 암 세포이다. 바람직하게는, 표적화 모이어티는 항체 - 보다 바람직하게는 모노클로날 항체; 보다 더 바람직하게는 인간 모노클로날 항체 -이고, 화학 물질은 종양 연관 항원이다. 종양 연관 항원은 암 세포의 표면 상에서 나타나는 것, 또는 암 세포에 의해 주위의 세포외 공간으로 분비되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 종양 연관 항원은 정상 세포와 비교하여 암 세포에 의해 과다-발현되는 것, 또는 암 세포에 의해 발현되지만 정상 세포에 의해서는 발현되지 않는 것이다.
또 다른 실시양태에서, 표적화 모이어티에 대한 접합에 적합한, 반응성 관능기를 갖는 링커 모이어티에 공유 결합된 화학식 I에 따른 이량체가 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 암을 앓고 있는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 이량체 또는 그와 표적화 모이어티의 접합체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 암을 앓고 있는 대상체에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 이량체 또는 그와 표적화 모이어티의 접합체의 용도가 제공된다. 본 발명의 이량체 또는 그와 표적화 모이어티의 접합체는 또한 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 암 세포의 증식을 억제하는데 사용될 수 있다. 특히, 암은 폐암, 위암, 난소암, 신암, 또는 간암일 수 있다.
도 1, 2 및 3은 본 발명의 이량체의 제조에 사용되는 다양한 중간체의 합성을 위한 반응식을 제시한다.
도 4는 대칭 THIQ-THIQ 이량체를 제조하기 위한 일반적 반응식을 제시한다. 도 4a는 특정한 THIQ-THIQ 이량체의 합성을 제시한다.
도 5는 비대칭 THIQ-THIQ 이량체를 제조하기 위한 일반적 반응식을 제시한다.
도 6은 2개의 이량체 반쪽을 연결시키는 가교가 양측 대칭이 아닌 본 발명의 이량체를 제조하기 위한 반응식을 제시한다.
도 7a 및 7b는 THIQ-PBD 이량체의 제조를 위한 반응식을 제시한다.
도 8은 추가의 비대칭 THIQ-THIQ 이량체의 제조를 위한 반응식을 제시한다.
도 9는 또 다른 THIQ-PBD 이량체의 제조를 위한 반응식을 제시한다.
도 10 및 11은 ADC의 구성을 위한 링커 기의 부착에 적합한, 2개의 이량체 반쪽을 연결시키는 가교가 아민 기를 갖는 것인 본 발명의 이량체의 합성을 위한 반응식을 제시한다.
도 12 및 13은 하기에 "유형 (a)"로 지칭되는 이량체-링커 화합물의 합성을 위한 반응식을 도시한다.
도 14 및 15는 하기에 "유형 (b)"로 지칭되는 이량체-링커 화합물을 제조하는데 사용되는 중간체의 합성을 위한 반응식을 도시하며, 도 16은 이렇게 하여 제조된 중간체로부터의 이러한 이량체-링커 화합물의 합성을 도시한다.
도 17은 하기에 THIQ-AZI 이량체로 지칭되는 유형의 이량체의 제조를 위한 반응식을 제시한다.
도 18a 및 18b는 조합하여, 유형 (a) 이량체-링커 화합물의 제조에 적합한 이량체 및 그로부터 제조된 이량체-링커의 합성을 제시한다.
도 19 및 20은 추가의 THIQ-THIQ 이량체의 합성을 위한 반응식을 제시한다.
도 21 및 22는 추가의 "유형 (b)" 이량체-링커 화합물의 합성을 위한 반응식을 제시한다.
도 23은 트랜스글루타미나제-매개 접합에서 아민 공여자로서 작용할 수 있는 알킬아미노 기를 갖는 이량체-링커 화합물의 합성에 관한 것이다.
도 4는 대칭 THIQ-THIQ 이량체를 제조하기 위한 일반적 반응식을 제시한다. 도 4a는 특정한 THIQ-THIQ 이량체의 합성을 제시한다.
도 5는 비대칭 THIQ-THIQ 이량체를 제조하기 위한 일반적 반응식을 제시한다.
도 6은 2개의 이량체 반쪽을 연결시키는 가교가 양측 대칭이 아닌 본 발명의 이량체를 제조하기 위한 반응식을 제시한다.
도 7a 및 7b는 THIQ-PBD 이량체의 제조를 위한 반응식을 제시한다.
도 8은 추가의 비대칭 THIQ-THIQ 이량체의 제조를 위한 반응식을 제시한다.
도 9는 또 다른 THIQ-PBD 이량체의 제조를 위한 반응식을 제시한다.
도 10 및 11은 ADC의 구성을 위한 링커 기의 부착에 적합한, 2개의 이량체 반쪽을 연결시키는 가교가 아민 기를 갖는 것인 본 발명의 이량체의 합성을 위한 반응식을 제시한다.
도 12 및 13은 하기에 "유형 (a)"로 지칭되는 이량체-링커 화합물의 합성을 위한 반응식을 도시한다.
도 14 및 15는 하기에 "유형 (b)"로 지칭되는 이량체-링커 화합물을 제조하는데 사용되는 중간체의 합성을 위한 반응식을 도시하며, 도 16은 이렇게 하여 제조된 중간체로부터의 이러한 이량체-링커 화합물의 합성을 도시한다.
도 17은 하기에 THIQ-AZI 이량체로 지칭되는 유형의 이량체의 제조를 위한 반응식을 제시한다.
도 18a 및 18b는 조합하여, 유형 (a) 이량체-링커 화합물의 제조에 적합한 이량체 및 그로부터 제조된 이량체-링커의 합성을 제시한다.
도 19 및 20은 추가의 THIQ-THIQ 이량체의 합성을 위한 반응식을 제시한다.
도 21 및 22는 추가의 "유형 (b)" 이량체-링커 화합물의 합성을 위한 반응식을 제시한다.
도 23은 트랜스글루타미나제-매개 접합에서 아민 공여자로서 작용할 수 있는 알킬아미노 기를 갖는 이량체-링커 화합물의 합성에 관한 것이다.
정의
"항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉 "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄 변이체를 의미한다. 전체 항체는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL 또는 Vk), 및 1개의 단일 도메인, CL을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. VH 및 VL 영역은 더 보존된 프레임워크 영역 (FR) 사이에 배치된 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭하는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR를 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 포함한 숙주 조직 또는 인자에 대한 항체의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 항체가 항원 X에 5 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 6 x 10-9 M 이하, 보다 바람직하게는 3 x 10-9 M 이하, 보다 더 바람직하게는 2 x 10-9 M 이하의 KD로 결합하는 경우에, 항원 X에 "특이적으로 결합하다"로 언급된다. 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 바람직하게는 인간 항체일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 글리코실화 유형 또는 정도에 영향을 미치거나, 항체 반감기를 연장시키거나, 이펙터 세포 또는 보체계와의 상호작용을 증진 또는 감소시키거나, 또는 일부 다른 특성을 조정하기 위해 조작될 수 있다. 조작은 1개 이상의 아미노산의 대체, 부가, 또는 결실에 의해, 또는 도메인의 또 다른 이뮤노글로불린 유형으로부터의 도메인으로의 대체에 의해, 또는 상기의 조합에 의해 달성될 수 있다.
항체의 "항원 결합 단편" 및 "항원 결합 부분" (또는 간단하게 "항체 부분" 또는 "항체 단편")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는, 항체의 1개 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편, 예컨대 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab인 Fab' 단편 (예를 들어, 문헌 [Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th Ed., Saunders Elsevier 2007] 참조); (iv) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (v) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (vi) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (viii) 단일 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역인 나노바디에 의해 수행될 수 있는 것으로 제시된 바 있다. 바람직한 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', Fv, 및 Fd 단편이다. 게다가, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, 이들을 VL 및 VH 영역이 쌍형성하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄 (단일쇄 Fv, 또는 scFv로 공지됨)로서 제조되도록 할 수 있는 합성 링커에 의해 연결될 수 있으며; 예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]을 참조한다. 이러한 단일 쇄 항체는 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 또한 포괄된다.
"단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체를 실질적으로 함유하지 않는 항체를 의미한다 (예를 들어, 항원 X에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 항원 X 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 함유하지 않음). 그러나, 항원 X에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종으로부터의 항원 X 분자와 같은 다른 항원에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 단리된 항체는 인간 항원 X에 특이적으로 결합하고, 다른 (비-인간) 항원 X 항원과는 교차-반응하지 않는다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다.
"모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타내는, 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 의미한다.
"인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다 (및 존재하는 경우에 불변 영역)가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 것인 가변 영역을 갖는 항체를 의미한다. 인간 항체는 천연 또는 합성 변형을 포함한 후기 변형을 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 그라프트된 것인 항체는 포함하지 않는다.
"인간 모노클로날 항체"는 단일 결합 특이성을 나타내며, 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 것인 가변 영역을 갖는 항체를 의미한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는, 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
"지방족"은 명시된 수의 탄소 원자를 갖거나 (예를 들어, "C3 지방족", "C1-5 지방족", "C1-C5 지방족" 또는 "C1 내지 C5 지방족"에서와 같으며, 후자 3개의 어구는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 지방족 모이어티에 대한 동의어임) 또는 탄소 원자의 수가 명확하게 명시되지 않은 경우에는 1 내지 4개의 탄소 원자 (불포화 지방족 모이어티의 경우에는 2 내지 4개의 탄소)를 갖는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화, 비-방향족 탄화수소 모이어티를 의미한다. 유사한 이해가 C2-4 알켄, C4-C7 시클로지방족 등에서와 같은 다른 유형에서의 탄소의 수에 적용된다.
"알킬"은 포화 지방족 모이어티를 의미하며, 여기서 탄소 원자의 수의 지정에 대한 동일한 규정이 적용가능하다. 예시로서, C1-C4 알킬 모이어티는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸, 1-부틸, 2-부틸 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "알킬렌"은 알킬 기의 2가 대응물, 예컨대 CH2CH2, CH2CH2CH2, 및 CH2CH2CH2CH2를 의미한다.
"알케닐"은 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 지방족 모이어티를 의미하며, 여기서 탄소 원자의 수의 지정에 대한 동일한 규정이 적용가능하다. 예시로서, C2-C4 알케닐 모이어티는 에테닐 (비닐), 2-프로페닐 (알릴 또는 프로프-2-에닐), 시스-1-프로페닐, 트랜스-1-프로페닐, E- (또는 Z-) 2-부테닐, 3-부테닐, 1,3-부타디에닐 (부트-1,3-디에닐) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"알키닐"은 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 지방족 모이어티를 의미하며, 여기서 탄소 원자의 수의 지정에 대한 동일한 규정이 적용가능하다. 예시로서, C2-C4 알키닐 기는 에티닐 (아세틸레닐), 프로파르길 (프로프-2-이닐), 1-프로피닐, 부트-2-이닐 등을 포함한다.
"시클로지방족"은 1 내지 3개의 고리를 가지며, 각각의 고리가 3 내지 8개 (바람직하게는 3 내지 6개)의 탄소 원자를 갖는 것인 포화 또는 불포화, 비-방향족 탄화수소 모이어티를 의미한다. "시클로알킬"은 각각의 고리가 포화된 것인 시클로지방족 모이어티를 의미한다. "시클로알케닐"은 적어도 1개의 고리가 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 것인 시클로지방족 모이어티를 의미한다. "시클로알키닐"은 적어도 1개의 고리가 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 것인 시클로지방족 모이어티를 의미한다. 예시로서, 시클로지방족 모이어티는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 및 아다만틸을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 시클로지방족 모이어티는 시클로알킬 모이어티, 특히 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 및 시클로헥실이다. "시클로알킬렌"은 시클로알킬 기의 2가 대응물을 의미한다.
"헤테로시클로지방족"은 그의 적어도 1개의 고리 내에서, 최대 3개 (바람직하게는 1 내지 2개)의 탄소가 N, O, 또는 S로부터 독립적으로 선택된 헤테로원자로 대체된 것인 시클로지방족 모이어티를 의미하며, 여기서 N 및 S는 임의로 산화될 수 있고, N은 임의로 4급화될 수 있다. 유사하게, "헤테로시클로알킬", "헤테로시클로알케닐", 및 "헤테로시클로알키닐"은 각각 적어도 1개의 고리가 이렇게 하여 변형된 것인 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 시클로알키닐 모이어티를 의미한다. 예시적인 헤테로시클로지방족 모이어티는 아지리디닐, 아제티디닐, 1,3-디옥사닐, 옥세타닐, 테트라히드로푸릴, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 테트라히드로티오피라닐 술폰, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 티오모르폴리닐 술폭시드, 티오모르폴리닐 술폰, 1,3-디옥솔라닐, 테트라히드로-1,1-디옥소티에닐, 1,4-디옥사닐, 티에타닐 등을 포함한다. "헤테로시클로알킬렌"은 헤테로시클로알킬 기의 2가 대응물을 의미한다.
"알콕시", "아릴옥시", "알킬티오", 및 "아릴티오"는 각각 -O(알킬), -O(아릴), -S(알킬), 및 -S(아릴)을 의미한다. 예는 각각 메톡시, 페녹시, 메틸티오, 및 페닐티오이다.
"할로겐" 또는 "할로"는 플루오린, 염소, 브로민 또는 아이오딘을 의미한다.
"아릴"은 각각의 고리가 3 내지 7개의 탄소 원자를 갖고 적어도 1개의 고리가 방향족인 모노시클릭, 비시클릭, 또는 트리시클릭 고리계를 갖는 탄화수소 모이어티를 의미한다. 고리계 내의 고리는 서로 융합될 수 있거나 (비페닐에서와 같음) 또는 서로 결합될 수 있으며 (나프틸에서와 같음), 비-방향족 고리에 융합 또는 결합될 수 있다 (인다닐 또는 시클로헥실페닐에서와 같음). 추가 예시로서, 아릴 모이어티는 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 인다닐, 비페닐, 페난트릴, 안트라세닐, 및 아세나프틸을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "아릴렌"은 아릴 기의 2가 대응물, 예를 들어 1,2-페닐렌, 1,3-페닐렌, 또는 1,4-페닐렌을 의미한다.
"헤테로아릴"은 각각의 고리가 3 내지 7개의 탄소 원자를 갖고 적어도 1개의 고리가 N, O, 또는 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 방향족 고리인 모노시클릭, 비시클릭, 또는 트리시클릭 고리계를 갖는 모이어티를 의미하며, 여기서 N 및 S는 임의로 산화될 수 있고, N은 임의로 4급화될 수 있다. 이러한 적어도 1개의 헤테로원자 함유 방향족 고리는 다른 유형의 고리에 융합될 수 있거나 (페닐피리딜 또는 2-시클로펜틸피리딜에서와 같음) 또는 다른 유형의 고리에 직접 결합될 수 있다 (벤조푸라닐 또는 테트라히드로이소퀴놀릴에서와 같음). 추가 예시로서, 헤테로아릴 모이어티는 피롤릴, 푸라닐, 티오페닐 (티에닐), 이미다졸릴, 피라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피리딜, N-옥소피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 퀴노잘리닐, 나프티리디닐, 벤조푸라닐, 인돌릴, 벤조티오페닐, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 페노티아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조트리아졸릴, 디벤조푸라닐, 카르바졸릴, 디벤조티오페닐, 아크리디닐 등을 포함한다. "헤테로아릴렌"은 헤테로아릴 기의 2가 대응물을 의미한다.
"비치환 또는 치환된 C1-C5 알킬" 또는 "임의로 치환된 헤테로아릴"에서와 같은 "비치환 또는 치환된" 또는 "임의로 치환된" 어구의 사용에 의해서와 같이 모이어티가 치환될 수 있는 것으로 나타낸 경우에, 이러한 모이어티는 1개 이상의 독립적으로 선택된 치환기, 바람직하게는 수에 있어서 1 내지 5개, 보다 바람직하게는 수에 있어서 1 또는 2개를 가질 수 있다. 치환기 및 치환 패턴은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해, 치환기가 부착되는 모이어티를 고려하여, 화학적으로 안정하고 관련 기술분야에 공지된 기술 뿐만 아니라 본원에 제시된 방법에 의해 합성될 수 있는 화합물을 제공하도록 선택될 수 있다.
"아릴알킬", "(헤테로시클로지방족)알킬", "아릴알케닐", "아릴알키닐", "비아릴알킬" 등은, 예를 들어 벤질, 페네틸, N-이미다조일에틸, N-모르폴리노에틸 등에서와 같이, 경우에 따라 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 모이어티에서 개방 (비충족) 원자가를 갖는, 경우에 따라 아릴, 헤테로시클로지방족, 비아릴 등의 모이어티로 치환된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 모이어티를 의미한다. 반대로, "알킬아릴", "알케닐시클로알킬" 등은, 경우에 따라 예를 들어 메틸페닐 (톨릴) 또는 알릴시클로헥실에서와 같이, 경우에 따라 알킬, 알케닐 등의 모이어티로 치환된 아릴, 시클로알킬 등의 모이어티를 의미한다. "히드록시알킬", "할로알킬", "알킬아릴", "시아노아릴" 등은, 경우에 따라 확인된 치환기 (경우에 따라 히드록실, 할로 등) 중 1개 이상으로 치환된 알킬, 아릴 등의 모이어티를 의미한다.
예를 들어, 허용되는 치환기는 알킬 (특히 메틸 또는 에틸), 알케닐 (특히 알릴), 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 시클로지방족, 헤테로시클로지방족, 할로 (특히 플루오로), 할로알킬 (특히 트리플루오로메틸), 히드록실, 히드록시알킬 (특히 히드록시에틸), 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -O(할로알킬) (특히 -OCF3), -O(시클로알킬), -O(헤테로시클로알킬), -O(아릴), 알킬티오, 아릴티오, =O, =NH, =N(알킬), =NOH, =NO(알킬), -C(=O)(알킬), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NH(히드록시알킬), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(알킬), -SH, -S(알킬), -S(아릴), -S(시클로알킬), -S(=O)알킬, -SO2(알킬), -SO2NH2, -SO2NH(알킬), -SO2N(알킬)2 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
치환될 모이어티가 지방족 모이어티인 경우에, 바람직한 치환기는 아릴, 헤테로아릴, 시클로지방족, 헤테로시클로지방족, 할로, 히드록실, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -O(할로알킬), -O(시클로알킬), -O(헤테로시클로알킬), -O(아릴), 알킬티오, 아릴티오, =O, =NH, =N(알킬), =NOH, =NO(알킬), -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NH(히드록시알킬), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(알킬), -SH, -S(알킬), -S(아릴), -S(=O)알킬, -S(시클로알킬), -SO2(알킬), -SO2NH2, -SO2NH(알킬), 및 -SO2N(알킬)2이다. 보다 바람직한 치환기는 할로, 히드록실, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(아릴), =O, =NOH, =NO(알킬), -OC(=O)(알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, 및 -NHC(=NH)NH2이다. 페닐, 시아노, 할로, 히드록실, 니트로, C1-C4알콕시, O(C2-C4 알킬렌)OH, 및 O(C2-C4 알킬렌)할로가 특히 바람직하다.
치환될 모이어티가 시클로지방족, 헤테로시클로지방족, 아릴, 또는 헤테로아릴 모이어티인 경우에, 바람직한 치환기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 할로알킬, 히드록실, 히드록시알킬, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -O(할로알킬), -O(아릴), -O(시클로알킬), -O(헤테로시클로알킬), 알킬티오, 아릴티오, -C(=O)(알킬), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NH(히드록시알킬), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(알킬), -SH, -S(알킬), -S(아릴), -S(시클로알킬), -S(=O)알킬, -SO2(알킬), -SO2NH2, -SO2NH(알킬), 및 -SO2N(알킬)2이다. 보다 바람직한 치환기는 알킬, 알케닐, 할로, 할로알킬, 히드록실, 히드록시알킬, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -C(=O)(알킬), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, 및 -NHC(=NH)NH2이다. C1-C4 알킬, 시아노, 니트로, 할로, 및 C1-C4알콕시가 특히 바람직하다.
"C1-C5 알킬" 또는 "5 내지 10%"에서와 같이 범위가 언급된 경우에, 이러한 범위는 첫 번째 경우에서는 C1 및 C5 및 두 번째 경우에서는 5% 및 10%에서와 같은 범위의 종점을 포함한다.
특정한 입체이성질체가 구체적으로 (예를 들어, 구조 화학식에서의 관련 입체중심에서 굵은선 또는 파선 결합에 의해, 구조 화학식에서 E 또는 Z 배위를 갖는 것으로서의 이중 결합의 도시에 의해, 또는 입체화학-지정 명명법 사용에 의해) 나타내지 않는 한, 모든 입체이성질체는 순수한 화합물 뿐만 아니라 그의 혼합물로서, 본 발명의 범주 내에 포함된다. 달리 나타내지 않는 한, 개별 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 및 그의 조합 및 혼합물은 모두 본 발명에 의해 포괄된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 화합물이 구조 화학식에 도시된 것들과 등가인 호변이성질체 형태 (예를 들어, 케토 및 엔올 형태), 공명 형태, 및 쯔비터이온 형태를 가질 수 있고, 구조 화학식이 이러한 호변이성질체, 공명, 또는 쯔비터이온 형태를 포괄함을 인지할 것이다.
"제약상 허용되는 에스테르"는 생체내에서 (예를 들어 인간 신체에서) 가수분해되어 모 화합물 또는 그의 염을 생산하거나, 또는 그 자체로 모 화합물의 것과 유사한 활성을 갖는 에스테르를 의미한다. 적합한 에스테르는 C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐 또는 C2-C5 알키닐 에스테르, 특히 메틸, 에틸 또는 n-프로필을 포함한다.
"제약상 허용되는 염"은 제약 제제에 적합한 화합물의 염을 의미한다. 화합물이 1개 이상의 염기성 기를 갖는 경우에, 염은 산 부가염, 예컨대 술페이트, 히드로브로마이드, 타르트레이트, 메실레이트, 말레에이트, 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트, 파모에이트 (엠보네이트), 히드로아이오다이드, 니트레이트, 히드로클로라이드, 락테이트, 메틸술페이트, 푸마레이트, 벤조에이트, 숙시네이트, 메실레이트, 락토비오네이트, 수베레이트, 토실레이트 등일 수 있다. 화합물이 1개 이상의 산성 기를 갖는 경우에, 염은 칼슘 염, 칼륨 염, 마그네슘 염, 메글루민 염, 암모늄 염, 아연 염, 피페라진 염, 트로메타민 염, 리튬 염, 콜린 염, 디에틸아민 염, 4-페닐시클로헥실아민 염, 벤자틴 염, 나트륨 염, 테트라메틸암모늄 염 등과 같은 염일 수 있다. 다형성 결정질 형태 및 용매화물은 본 발명의 범주 내에 또한 포괄된다.
본 명세서의 화학식에서, 결합에 대한 파상선 (
) 또는 결합의 말단에서의 별표 (*)는 공유 부착 부위를 나타낸다. 예를 들어, R은 
이다라는 언급은 화학식 
에서 
를 지칭한다.
본 명세서의 화학식에서, 방향족 고리를 그의 2개의 탄소 사이에서 가로지르는 결합은 해당 결합에 부착된 기가 방향족 고리의 임의의 이용가능한 위치에 위치할 수 있음을 의미한다. 예시로서, 화학식 
는 
를 나타낸다.
이량체
화학식 I, Ia, 및 Ib에서, 바람직하게는 각각의 R2는 Me이다. 보다 바람직하게는, 각각의 R2는 Me이고, 각각의 R3, R4, R7, R8, 및 R10은 (R7, R8, 및 R10에 대해서는, 존재하는 경우에) H이다.
화학식 I 및 Ia에서, 바람직하게는 각각의 R7, R8, 및 R10은 H이고, 각각의 R9는 독립적으로 H, OH, OMe, NH2, NMe2, O(CH2CH2O)1- 8Me, OCH2CH2OH, 또는 
(특히 파라- 이성질체)이다.
화학식 Ia의 바람직한 실시양태에서, 각각의 G'는 C이고, Y' 및 Y"는 둘 다 CH2이다. 화학식 Ia의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 1개의 G'는 N이고, Y'는 CH2이고, Y"는 부재한다 (즉, 연관된 아래첨자는 0임).
바람직하게는, 화학식 I에서, 각각의 X2는 독립적으로 Me, CO2H, NH2, NH(C1-C5 알킬), N(C1-C5 알킬)2, SH, CHO, N(CH2CH2)2N(C1-C3 알킬), NHNH2, 또는 C(=O)NHNH2이다.
화학식 Ib에서, R11은 바람직하게는 H, =CH2, CH=CHMe, =CHMe, C≡CCH2NH2, 
(특히 파라- 이성질체), 또는 
이다.
화학식 I에서, X는 바람직하게는
이고;
여기서 X1은 CH2, O, 또는 NH이고; X2는 CO2H, 또는 NH2이고; x 및 y의 합계는 2 또는 4이다.
보다 바람직하게는, X는
이다.
바람직하게는, 화학식이 각각 이중선 
와 함께 제시된 2개의 벤조디아제핀 고리계를 포함하는 경우에, 이러한 이중선 중 적어도 1개는 이중 결합이다.
본 발명의 이량체는 THIQ-THIQ 이량체일 수 있으며; 즉, 화학식 I에서, R1은 화학식 Ia에 따른다. 이러한 이량체는 화학식 IIa에 의해 나타내어질 수 있다.
여기서
R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, 이중선 
, 및 X는 화학식 I에 대해 상기 발명의 내용 섹션에 정의된 바와 같다.
화학식 IIa에 따른 바람직한 실시양태에서, THIQ-THIQ 이량체는 화학식 IIa'에 의해 나타내어진다.
여기서
각각의 R9는 독립적으로 H, OH, OMe, NH2, NMe2, O(CH2CH2O)1- 8Me, OCH2CH2OH, 또는 
(특히 파라- 이성질체)이고;
X는
이다.
THIQ-THIQ 이량체의 구체적 예는 하기를 포함한다.
특히 바람직한 THIQ-THIQ 이량체는 (IIa-16) 및 (IIa-20)이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이량체는 THIQ-PBD 이량체이며; 즉, 화학식 I에서, R1은 화학식 Ib에 따른다. 이러한 이량체는 화학식 IIb에 의해 나타내어질 수 있다.
여기서
R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R11', 이중선 
, 고리 C 내의 점선, 및 X는 화학식 I에 대해 상기 발명의 내용 섹션에 정의된 바와 같다.
화학식 IIb에 따른 바람직한 THIQ-PBD 이량체는 화학식 IIb'에 의해 나타내어진다.
여기서
R9는 H, OH, OMe, NH2, NMe2, O(CH2CH2O)1- 8Me, OCH2CH2OH, 또는 
(특히 파라- 이성질체)이고;
R11은 H, =CH2, CH=CHMe, =CHMe, C≡CCH2NH2, 
(특히 파라- 이성질체), 또는 
이고;
X는
이다.
THIQ-PBD 이량체의 구체적 예는 하기를 포함한다.
특히 바람직한 THIQ-PBD 이량체는 (IIb-03)이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이량체는 THIQ 고리계를 갖는 벤조디아제핀 단위 및 아자인돌린 (AZI) 고리계를 갖는 벤조디아제핀 단위를 포함한다 ("THIQ-AZI 이량체"). 이러한 이량체는 화학식 IIc에 의해 나타내어질 수 있다.
여기서
1개의 G'는 N이고, 나머지는 C이고;
R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, 이중선 
, 및 X는 화학식 I에 대해 상기 발명의 내용 섹션에 정의된 바와 같다.
THIQ-AZI 이량체의 예는 화합물 (IIc-01)이다.
접합체
일반사항
본 발명의 이량체는 그 자체로 치료제로서 사용될 수 있지만, 바람직하게는 암 세포 상의 화학 물질에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 표적화 모이어티와의 접합체로서 사용된다. 바람직하게는, 표적화 모이어티는 항체 또는 그의 항원 결합 부분이고, 화학 물질은 종양 연관 항원이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 화학식 II에 의해 나타내어진, 본 발명의 이량체 및 리간드를 포함하는 접합체이다.
여기서 Z는 리간드이고, D는 본 발명의 이량체이고, -(XD)aC(XZ)b-는 이들이 Z 및 D를 연결시키기 때문에 집합적으로 "링커 모이어티" 또는 "링커"로 지칭된다. 링커 내에서, C는 이량체 D의 의도된 생물학적 작용 부위에서 또는 그 근처에서 절단되도록 설계된 절단가능한 기이고; XD 및 XZ는 이들이 각각 D와 C 및 C와 Z를 이격시키기 때문에 스페이서 모이어티 (또는 "스페이서")로 지칭되고; 아래첨자 a, b, 및 c는 독립적으로 0 또는 1이다 (즉, XD, XZ, 및 C의 존재는 임의적임). 아래첨자 m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 (바람직하게는 1, 2, 3, 또는 4)이다. D, XD, C, XZ, 및 Z는 하기에 더 완전히 기재되어 있다.
리간드 Z - 예를 들어 항체 -는 표적화 기능을 수행한다. 항원 또는 수용체가 위치하는 표적 조직 또는 세포에 결합함으로써, 리간드 Z는 그곳에서 접합체를 유도한다. 리간드 Z가 항체인 경우에, 접합체는 때때로 항체-약물 접합체 (ADC) 또는 면역접합체로 지칭된다. 바람직하게는, 표적 조직 또는 세포는 암 조직 또는 세포이고, 항원 또는 수용체는 종양-연관 항원, 즉 암성 세포에 의해 특유하게 발현되거나 또는 비-암성 세포와 비교하여 암 세포에 의해 과다발현되는 항원이다. 표적 조직 또는 세포에서의 기 C의 절단은 이량체 D를 방출하여 그의 세포독성 효과를 국부로 표출한다. 일부 경우에, 접합체는 세포내이입에 의해 표적 세포에 내재화되고, 절단은 표적 세포 내에서 일어난다. 이러한 방식으로, 이량체 D의 정밀한 전달이 의도된 작용 부위에서 달성되어, 필요한 투여량이 감소된다. 또한, 이량체 D는 그의 접합된 상태에서 통상적으로 생물학적으로 불활성 (또는 유의하게 덜 활성)이고, 그에 의해 비-표적 조직 또는 세포에 대한 목적하지 않는 독성이 감소된다. 항암 약물은 일반적으로 세포에 대해 종종 고도로 독성이기 때문에, 이는 중요한 고려사항이다.
아래첨자 m에 의해 반영된 바와 같이, 리간드 Z의 각각의 분자는 리간드 Z가 갖는 접합에 이용가능한 부위의 수 및 사용되는 실험 조건에 따라, 1개 초과의 이량체 D와 접합할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 리간드 Z의 각각의 개별 분자가 정수개의 이량체 D에 접합되며, 접합체의 제조가 통계적 평균을 반영하여 비-정수 비의 이량체 D 대 리간드 Z에 대해 분석될 수 있음을 인지할 것이다. 이러한 비는 치환 비 (SR)로, 또는 동의어로 약물-항체 비 (DAR)로 지칭된다.
리간드 Z
바람직하게는, 리간드 Z는 항체이다. 편의성 및 간결성을 위해 및 제한 없이, 리간드 Z의 접합에 대한 본원의 상세한 후속 논의는 그것이 항체라는 문맥으로 기록되어 있지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 필요한 변경을 가하여 다른 유형의 리간드 Z가 접합될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 리간드로서의 폴산과의 접합체는 그의 표면 상에 폴레이트 수용체를 갖는 세포를 표적화할 수 있다 (Leamon et al., Cancer Res. 2008, 68 (23), 9839). 동일한 이유로, 하기 상세한 논의는 주로 1:1 비의 항체 Z 대 유사체 D (m = 1)의 관점에서 기록되어 있다.
바람직하게는, 리간드 Z는 암 세포의 선택적 표적화를 가능하게 하는, 종양 연관 항원에 대한 항체이다. 이러한 항원의 예는 메소텔린, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), CD19, CD22, CD30, CD70, B7H3, B7H4 (O8E로도 공지됨), 단백질 티로신 키나제 7 (PTK7), 글리피칸-3, RG1, 푸코실-GM1, CTLA-4, 및 CD44를 포함한다. 항체는 동물 항체 (예를 들어, 뮤린), 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 바람직하게는 인간 항체일 수 있다. 항체는 바람직하게는 모노클로날, 특히 모노클로날 인간 항체이다. 상기 언급된 항원 중 일부에 대한 인간 모노클로날 항체의 제조는 문헌 [Korman et al., US 8,609,816 B2 (2013; B7H4, 08E로도 공지됨; 특히 항체 2A7, 1G11, 및 2F9); Rao-Naik et al., 8,097,703 B2 (2012; CD19; 특히 항체 5G7, 13F1, 46E8, 21D4, 21D4a, 47G4, 27F3, 및 3C10); King et al., US 8,481,683 B2 (2013; CD22; 특히 항체 12C5, 19A3, 16F7, 및 23C6); Keler et al., US 7,387,776 B2 (2008; CD30; 특히 항체 5F11, 2H9, 및 17G1); Terrett et al., US 8,124,738 B2 (2012; CD70; 특히 항체 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 및 69A7); Korman et al., US 6,984,720 B1 (2006; CTLA-4; 특히 항체 10D1, 4B6, 및 1E2); Vistica et al., US 8,383,118 B2 (2013, 푸코실-GM1, 특히 항체 5B1, 5B1a, 7D4, 7E4, 13B8, 및 18D5) Korman et al., US 8,008,449 B2 (2011; PD-1; 특히 항체 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3, 및 5F4); Huang et al., US 2009/0297438 A1 (2009; PSMA. 특히 항체 1C3, 2A10, 2F5, 2C6); Cardarelli et al., US 7,875,278 B2 (2011; PSMA; 특히 항체 4A3, 7F12, 8C12, 8A11, 16F9, 2A10, 2C6, 2F5, 및 1C3); Terrett et al., US 8,222,375 B2 (2012; PTK7; 특히 항체 3G8, 4D5, 12C6, 12C6a, 및 7C8); Terrett et al., US 8,680,247 B2 (2014; 글리피칸-3; 특히 항체 4A6, 11E7, 및 16D10); Harkins et al., US 7,335,748 B2(2008; RG1; 특히 항체 A, B, C, 및 D); Terrett et al., US 8,268,970 B2 (2012; 메소텔린; 특히 항체 3C10, 6A4, 및 7B1); Xu et al., US 2010/0092484 A1 (2010; CD44; 특히 항체 14G9.B8.B4, 2D1.A3.D12, 및 1A9.A6.B9); Deshpande et al., US 8,258,266 B2 (2012; IP10; 특히 항체 1D4, 1E1, 2G1, 3C4, 6A5, 6A8, 7C10, 8F6, 10A12, 10A12S, 및 13C4); Kuhne et al., Us 8,450,464 B2 (2013; CXCR4; 특히 항체 F7, F9, D1, 및 E2); 및 Korman et al., US 7,943,743 B2 (2011; PD-L1; 특히 항체 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7, 및 13G4)]에 개시되어 있으며; 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 각각의 상기 언급된 항체는 본 발명의 이량체와의 ADC에 사용될 수 있다.
리간드 Z는 또한 항체 단편 또는 항체 모방체, 예컨대 아피바디, 도메인 항체 (dAb), 나노바디, 유니바디, DARPin, 안티칼린, 베르사바디, 듀오칼린, 리포칼린, 또는 아비머일 수 있다.
리간드 Z의 여러 상이한 반응성 기 중 임의의 1개는 리신 잔기 내의 ε-아미노 기, 펜던트 탄수화물 모이어티, 카르복실산 기, 디술피드 기, 및 티올 기를 포함한 접합 부위일 수 있다. 각각의 유형의 반응성 기는 일부 이점 및 일부 단점을 갖는 트레이드-오프를 나타낸다. 접합에 적합한 항체 반응성 기에 대한 종설에 대해, 예를 들어 문헌 [Garnett, Adv. Drug Delivery Rev. 53 (2001), 171-216 및 Dubowchik and Walker, Pharmacology & Therapeutics 83 (1999), 67-123]을 참조하며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, 리간드 Z는 리신 ε-아미노 기를 통해 접합된다. 대부분의 항체는 다중 리신 ε-아미노 기를 가지며, 이는 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 아미드, 우레아, 티오우레아, 또는 카르바메이트 결합을 통해 접합될 수 있다. 그러나, 어떠한 및 얼마나 많은 ε-아미노 기가 반응하는지를 제어하는 것은 어려우며, 이는 접합체 제조에서 잠재적인 배치별 변동성으로 이어진다. 또한, 접합은 항체의 천연 입체형태를 유지하는데 중요한 양성자화된 ε-아미노 기의 중화를 일으킬 수 있거나, 또는 항원 결합 부위 근처 또는 그 부위의 리신에서 일어날 수 있으며, 어떠한 것도 바람직한 경우는 아니다.
또 다른 실시양태에서, 많은 항체가 글리코실화되는 것과 같이, 리간드 Z는 탄수화물 측쇄를 통해 접합될 수 있다. 탄수화물 측쇄는 퍼아이오데이트를 사용하여 산화되어 알데히드 기를 생성할 수 있고, 이는 또한 아민과 반응하여 세미카르바존, 옥심 또는 히드라존에서와 같이 이민 기를 형성할 수 있다. 원하는 경우에, 이민 기는 소듐 시아노보로히드라이드를 사용한 환원에 의해 더 안정한 아민 기로 전환될 수 있다. 탄수화물 측쇄를 통한 접합에 관한 추가의 개시내용에 대해, 예를 들어 문헌 [Rodwell et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83, 2632-2636 (1986)]을 참조하며; 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 리신 ε-아미노 기와 같이, 접합 부위(들)의 위치의 재현성 및 화학량론에 대한 우려가 존재한다.
또 다른 실시양태에서, 리간드 Z는 카르복실산 기를 통해 접합될 수 있다. 한 실시양태에서, 말단 카르복실산 기는 관능화되어 카르보히드라지드를 생성하고, 이는 이어서 알데히드-보유 접합 모이어티와 반응한다. 문헌 [Fisch et al., Bioconjugate Chemistry 1992, 3, 147-153]을 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 Z는 항체 Z 상의 시스테인 잔기 및 접합체의 다른 부분 상의 황을 가교하는 디술피드 기를 통해 접합될 수 있다. 일부 항체는 유리 티올 (술프히드릴) 기가 결여되어 있지만, 예를 들어 힌지 영역 내에 디술피드 기를 갖는다. 이러한 경우에, 유리 티올 기는 천연 디술피드 기의 환원에 의해 생성될 수 있다. 이렇게 하여 생성된 티올 기는 이어서 접합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Packard et al., Biochemistry 1986, 25, 3548-3552; King et al., Cancer Res. 54, 6176-6185 (1994); 및 Doronina et al., Nature Biotechnol. 21(7), 778-784 (2003)]을 참조하며; 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 다시, 접합 부위 위치 및 화학량론, 및 항체 천연 입체형태의 가능한 파괴에 대한 우려가 존재한다.
천연 디술피드 결합을 파괴하지 않으면서 유리 티올 기를 항체에 도입하기 위한 다수의 방법이 공지되어 있으며, 이러한 방법은 본 발명의 리간드 Z를 사용하여 실시될 수 있다. 사용되는 방법에 따라, 미리 결정된 위치에 예측가능한 수의 유리 술프히드릴을 도입하는 것이 가능할 수 있다. 한 접근법에서는, 시스테인이 또 다른 아미노산 대신에 치환된 돌연변이된 항체를 제조한다. 예를 들어, 문헌 [Eigenbrot et al., US 7,521,541 B2 (2009); Chilkoti et al., Bioconjugate Chem. 1994, 5, 504-507; Urnovitz et al., US 4,698,420 (1987); Stimmel et al., J. Biol. Chem., 275 (39), 30445-30450 (2000); Bam et al., US 7,311,902 B2 (2007); Kuan et al., J. Biol. Chem., 269 (10), 7610-7618 (1994); Poon et al., J. Biol. Chem., 270 (15), 8571-8577 (1995)]을 참조한다. 또 다른 접근법에서는, 여분의 시스테인을 C-말단에 부가한다. 예를 들어, 문헌 [Cumber et al., J. Immunol., 149, 120-126 (1992); King et al., Cancer Res., 54, 6176-6185 (1994); Li et al., Bioconjugate Chem., 13, 985-995 (2002); Yang et al., Protein Engineering, 16, 761-770 (2003); 및 Olafson et al., Protein Engineering Design & Selection, 17, 21-27 (2004)]을 참조한다. 유리 시스테인을 도입하기 위한 바람직한 방법은 문헌 [Liu et al., WO 2009/026274 A1]에 교시된 것이며, 여기서는 시스테인 보유 아미노산 서열을 항체 중쇄의 C-말단에 부가한다. 이러한 방법은 공지된 수의 시스테인 잔기 (중쇄당 1개)를 항원 결합 부위로부터 멀리있는 공지된 위치에 도입한다. 본 단락에 인용된 문헌의 개시내용은 모두 본원에 참조로 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 리신 ε-아미노 기를 시약 예컨대 2-이미노티올란 또는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP)를 사용하여 변형시켜, ε-아미노 기를 티올 또는 디술피드 기로 전환시킬 수 있으며 - 이를테면 시스테인 대용물을 생성시킬 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 적절한 ε-아미노 기와 연관된 동일한 접합 위치 및 화학량론 제한을 겪는다.
링커 성분
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 접합체의 링커 부분은 최대 3종의 요소: 절단가능한 기 C 및 임의적인 스페이서 XZ 및 XD를 포함한다.
절단가능한 기 C는 생리학적 조건 하에 절단가능한 기이며, 바람직하게는 접합체가 혈장 내에서 일반적으로 순환되는 동안에는 비교적 안정하지만, 일단 접합체가 그의 의도된 작용 부위, 즉 표적 세포 근처에, 표적 세포에 또는 표적 세포 내에 도달하면 용이하게 절단되도록 선택된다. 바람직하게는, 접합체는 표적 세포의 표면 상에 나타난 항원에 대한 항체 Z의 결합 시에 표적 세포에 의해 내재화된다. 후속적으로, 기 C의 절단이 표적 세포의 소포체 (초기 엔도솜, 후기 엔도솜, 또는 특히 리소솜)에서 발생한다.
한 실시양태에서, 기 C는 pH 감수성 기이다. 혈장 내의 pH는 중성을 약간 초과하며, 리소솜 내부의 pH는 약 5인 산성이다. 따라서, 절단이 산 촉매되는 것인 기 C는 혈장 내 속도보다 리소솜 내부에서 여러 자릿수 더 빠른 속도로 절단될 것이다. 적합한 산-감수성 기의 예는 문헌 [Shen et al., US 4,631,190 (1986); Shen et al., US 5,144,011 (1992); Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102, 1048-1054 (1981) 및 Yang et al., Proc. Natl Acad. Sci (USA), 85, 1189-1193 (1988)]에 기재된 바와 같은 시스-아코니틸 아미드 및 히드라존을 포함하며; 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 기 C는 디술피드이다. 디술피드는 티올-디술피드 교환 메카니즘에 의해, 주위 티올 농도에 의존성인 속도로 절단될 수 있다. 글루타티온 및 다른 티올의 세포내 농도는 그의 혈청 농도보다 더 높기 때문에, 디술피드의 절단 속도는 세포내에서 더 높을 것이다. 추가로, 티올-디술피드 교환의 속도는 디술피드의 입체 및 전자 특징의 조정 (예를 들어, 알킬-아릴 디술피드 대 알킬-알킬 디술피드; 아릴 고리 상에서의 치환 등)에 의해 조정될 수 있으며, 이는 증진된 혈청 안정성 또는 특정한 절단 속도를 갖는 디술피드 연결의 설계를 가능하게 한다. 접합체 내의 디술피드 절단가능한 기에 관한 추가의 개시내용에 대해, 예를 들어 문헌 [Thorpe et al., Cancer Res. 48, 6396-6403 (1988); Santi et al., US 7,541,530 B2 (2009); Ng et al., US 6,989,452 B2 (2006); Ng et al., WO 2002/096910 A1; Boyd et al., US 7,691,962 B2; 및 Sufi et al., US 2010/0145036 A1]을 참조하며; 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
바람직한 절단가능한 기는, 혈청 내의 프로테아제에 의한 것과 대조적으로, 표적 세포 내부의 프로테아제에 의해 선택적으로 절단되는 펩티드이다. 전형적으로, 절단가능한 펩티드 기는 1 내지 20개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 6개의 아미노산, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산을 포함한다. 아미노산(들)은 천연 및/또는 비-천연 α-아미노산일 수 있다. 천연 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 것들, 뿐만 아니라 그로부터 유래된 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 시트룰린, 및 O-포스포세린이다. 이러한 문맥에서, 용어 "아미노산"은 아미노산 유사체 및 모방체를 또한 포함한다. 유사체는 R 기가 천연 아미노산 중에서 발견되는 것이 아닌 것을 제외하고는, 천연 아미노산의 동일한 일반적 H2N(R)CHCO2H 구조를 갖는 화합물이다. 유사체의 예는 호모세린, 노르류신, 메티오닌-술폭시드, 및 메티오닌 메틸 술포늄을 포함한다. 아미노산 모방체는 α-아미노산의 일반적 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 그와 유사한 방식으로 기능하는 화합물이다. 아미노산은 유전자 코딩되는 아미노산의 "L" 입체화학, 뿐만 아니라 거울상이성질체 "D" 입체화학의 것일 수 있다.
바람직하게는, 기 C는 프로테아제에 대한 절단 인식 서열인 아미노산 서열을 함유한다. 많은 절단 인식 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Matayoshi et al. Science 247: 954 (1990); Dunn et al. Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah et al. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber et al. Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith et al. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994); 및 Bouvier et al. Meth. Enzymol. 248: 614 (1995)]을 참조하며; 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
세포에 의해 내재화되도록 의도된 것이 아닌 접합체의 경우, 기 C는 표적 조직의 부근에서 세포외 매트릭스에 존재하는 프로테아제, 예를 들어 근처의 사멸 중인 세포에 의해 방출되는 프로테아제 또는 종양-연관 프로테아제에 의해 절단되도록 선택될 수 있다. 예시적인 세포외 종양-연관 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP), 티메트 올리고펩티다제 (TOP) 및 CD10이다.
세포에 의해 내재화되도록 설계된 접합체의 경우, 기 C는 바람직하게는 엔도솜 또는 리소솜 프로테아제, 특히 후자에 의한 절단을 위해 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 프로테아제의 비제한적 예는 카텝신 B, C, D, H, L 및 S, 특히 카텝신 B를 포함한다. 카텝신 B는 서열 -AA2-AA1- (여기서 AA1은 염기성 또는 강한 수소 결합 아미노산 (예컨대 리신, 아르기닌, 또는 시트룰린)이고, AA2는 소수성 아미노산 (예컨대 페닐알라닌, 발린, 알라닌, 류신, 또는 이소류신)임), 예를 들어 Val-Cit (여기서 Cit는 시트룰린을 나타냄) 또는 Val-Lys에서의 펩티드를 우선적으로 절단한다. (여기서, 아미노산 서열은 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한, H2N-AA2-AA1-CO2H에서와 같이 N에서 C 방향으로 기록되어 있음.) 일부 경우에 절단 속도가 더 느릴 수는 있지만, Lys-Val-Ala, Asp-Val-Ala, Val-Ala, Lys-Val-Cit, 및 Asp-Val-Cit가 또한 카텝신 B에 대한 기질 펩티드 모티프이다. 카텝신-절단가능한 기에 관한 추가의 정보에 대해, 문헌 [Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 8, 3341-3346 (1998); Dubowchik et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8 3347-3352 (1998); 및 Dubowchik et al., Bioconjugate Chem. 13, 855-869 (2002)]을 참조하며; 그의 개시내용은 참조로 포함된다. 펩티딜 링커를 절단하기 위해 이용될 수 있는 또 다른 효소는 Ala-Ala-Asn에서 우선적으로 절단하는 리소솜 시스테인 프로테아제인 레구마인이다.
한 실시양태에서, 기 C는 2개-아미노산 서열 -AA2-AA1- (여기서 AA1은 리신, 아르기닌, 또는 시트룰린이고, AA2는 페닐알라닌, 발린, 알라닌, 류신, 또는 이소류신임)을 포함하는 펩티드이다. 또 다른 실시양태에서, C는 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Ala-Asn, Lys, Cit, Ser, 및 Glu로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 아미노산의 서열로 이루어진다.
단일 아미노산으로 이루어진 절단가능한 기 C의 제조 및 설계는 문헌 [Chen et al., US 8,664,407 B2 (2014)]에 개시되어 있으며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
기 C는 또한 광절단가능한 것, 예를 들어 광에 노출 시에 절단되는 니트로벤질 에테르일 수 있다.
기 C는 항체 Z 또는 유사체 D에 직접 결합될 수 있으며; 즉, 스페이서 XZ 및 XD는 경우에 따라 부재할 수 있다. 예를 들어, 기 C가 디술피드인 경우에, 2개의 황 중 1개는 항체 Z 상의 시스테인 잔기 또는 그의 대용물일 수 있다. 또는, 기 C는 항체의 탄수화물 측쇄 상의 알데히드에 결합된 히드라존일 수 있다. 또는, 기 C는 항체 Z의 리신 ε-아미노 기로 형성된 펩티드 결합일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이량체 D는 이량체 D 내의 카르복실 또는 아민 기에 대한 펩티딜 결합을 통해 기 C에 직접 결합된다.
존재하는 경우에, 스페이서 XZ는 기 C와 항체 Z 사이의 공간적 분리를 제공하여, 전자가 후자에 의한 항원 결합을 입체적으로 방해하거나 또는 후자가 전자의 절단을 입체적으로 방해하지 않도록 한다. 추가로, 스페이서 XZ는 상승된 용해도 또는 감소된 응집 특성을 접합체에 부여하는데 사용될 수 있다. 스페이서 XZ는 1개 이상의 모듈 절편을 포함할 수 있으며, 이는 임의의 수의 조합으로 조립될 수 있다. 스페이서 XZ에 대한 적절한 절편의 예는
및 그의 조합이며,
여기서 아래첨자 g는 0 또는 1이고, 아래첨자 h는 1 내지 24, 바람직하게는 2 내지 4이다. 이들 절편은 하기 예시된 바와 같이 조합될 수 있다.
스페이서 XD는 존재하는 경우에 기 C와 이량체 D 사이의 공간적 분리를 제공하여, 후자가 전자의 절단을 입체적으로 또는 전자적으로 방해하지 않도록 한다. 스페이서 XD는 또한 추가의 분자 질량 및 화학적 관능기를 접합체에 도입하도록 기능할 수 있다. 일반적으로, 추가의 질량 및 관능기는 접합체의 혈청 반감기 및 다른 특성에 영향을 미칠 것이다. 따라서, 스페이서 기의 신중한 선택을 통해, 접합체의 혈청 반감기는 조정될 수 있다. 스페이서 XD는 또한 스페이서 XZ의 문맥에 상기 기재된 바와 같이 모듈 절편으로부터 조립될 수 있다.
스페이서 XZ 및/또는 XD는 존재하는 경우에 바람직하게는 각각 Z와 C 또는 D와 C 사이에 4 내지 25개의 원자, 보다 바람직하게는 4 내지 20개의 원자의 선형 분리를 제공한다.
링커는 항체 및 약물을 공유 연결시키는 것 이외에도 다른 기능을 수행할 수 있다. 예를 들어, 링커는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 기를 함유할 수 있으며, 이는 접합 화학 수행 동안 또는 최종 ADC 생성물에서 용해도를 증진시킨다. PEG 기가 존재하는 경우에, 이는 스페이서 XZ 또는 XD 중 어느 하나 또는 둘 다에 혼입될 수 있다. PEG 기 내의 반복 단위의 수는 2 내지 20개, 바람직하게는 4 내지 10개일 수 있다.
스페이서 XZ 또는 XD 중 어느 하나 또는 둘 다는 자기-희생 모이어티를 포함할 수 있다. 자기-희생 모이어티는 (1) 기 C 및 항체 Z 또는 이량체 D에 결합되고, (2) 기 C로부터의 절단이 경우에 따라 항체 Z 또는 이량체 D로부터의 자기-희생 모이어티 결합분리 그 자체를 생성하는 반응 순서를 개시하도록 하는 구조를 갖는 모이어티이다. 다시 말해서, 항체 Z 또는 이량체 D로부터의 원위 부위에서의 반응 (기 C로부터의 절단)은 XZ-Z 또는 XD-D 결합이 또한 파열되도록 한다. 자기-희생 모이어티의 존재는 스페이서 XD의 경우에 바람직하며, 이는 접합체의 절단 후, 스페이서 XD 또는 그의 일부가 계속 이량체 D에 부착되도록 유지되어야 하는 경우에, 후자의 생물학적 활성이 손상될 수 있기 때문이다. 자기-희생 모이어티의 사용은 절단가능한 기 C가 폴리펩티드인 경우에 특히 바람직하며, 이러한 경우에 자기-희생 모이어티는 전형적으로 그에 인접하게 위치한다.
파트너 분자 D 상의 히드록실 또는 아미노 기에 결합된 예시적인 자기-희생 모이어티 (i)-(v)는 하기 제시되어 있다.
자기-희생 모이어티는 점선 a 와 b (또는 점선 b와 c) 사이의 구조이며, 여기서 인접한 구조적 특색부는 문맥을 제공하도록 제시되어 있다. 자기-희생 모이어티 (i) 및 (v)는 이량체 D-NH2에 결합되며 (즉, 이량체 D는 아미노 기를 통해 접합됨), 자기-희생 모이어티 (ii), (iii), 및 (iv)는 이량체 D-OH에 결합된다 (즉, 이량체 D는 히드록실 또는 카르복실 기를 통해 접합됨). 점선 b에서의 (예를 들어, 펩티다제에 의한) 아미드 결합의 절단은 아미드 질소를 아민 질소로서 방출하여, 점선 a에서의 결합의 절단 및 경우에 따라 D-OH 또는 D-NH2의 결과적 방출을 생성하는 반응 순서를 개시한다. 대안적으로, 자기-희생 반응을 촉발하는 절단은 구조 (vi)의 경우에서와 같이, 다양한 유형의 효소에 의해, 예를 들어 β-글루쿠로니다제에 의해 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 자기-희생 기는 구조 (vii)에 의해 제시된 바와 같이 탠덤으로 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 점선 c에서의 절단은 1,6-제거 반응에 의한 점선 b와 c 사이의 모이어티의 자기-희생, 이어서 고리화-제거 반응에 의한 점선 a와 b 사이의 모이어티의 자기-희생을 촉발한다. 자기-희생 모이어티에 관한 추가의 개시내용에 대해, 문헌 [Carl et al., J. Med. Chem., 24 (3), 479-480 (1981); Carl et al., WO 81/01145 (1981); Dubowchik et al., Pharmacology & Therapeutics, 83, 67-123 (1999); Firestone et al., US 6,214,345 B1 (2001); Toki et al., J. Org. Chem. 67, 1866-1872 (2002); Doronina et al., Nature Biotechnology 21 (7), 778-784 (2003) (erratum, p. 941); Boyd et al., US 7,691,962 B2; Boyd et al., US 2008/0279868 A1; Sufi et al., WO 2008/083312 A2; Feng, US 7,375,078 B2; Jeffrey et al., US 8039,273; 및 Senter et al., US 2003/0096743 A1]을 참조하며; 그의 개시내용은 참조로 포함된다. 바람직한 자기-희생 기는 구조 (i)에 제시된 바와 같은 p-아미노벤질 옥시카르보닐 (PABC) 기이다.
또 다른 실시양태에서, 항체 표적화 모이어티 및 이량체 D는 비-절단가능한 링커에 의해 연결되며, 즉 요소 C는 부재한다. 항체의 분해는 결국 링커를 이량체 D의 생물학적 활성을 방해하지 않는 작은 첨부된 모이어티로 감소시킨다.
접합 기술
본 발명의 접합체는 바람직하게는 먼저 본 발명의 유사체 (하기 화학식에서 D에 의해 나타내어짐) 및 링커 (XD)a(C)c(XZ)b (여기서 XD, C, XZ, a, b, 및 c는 화학식 II에 대해 정의된 바와 같음)를 포함하는 화합물을 제조하여 화학식 III에 의해 나타내어진 유사체-링커 조성물을 형성함으로써 제조된다.
여기서 R31은 항체 Z 상의 상보적 관능기와 반응하여 접합체를 형성하기에 적합한 관능기이다. 적합한 기 R31의 예는 아미노, 아지드, 시클로옥틴,
를 포함하고,
여기서 R32는 Cl, Br, F, 메실레이트, 또는 토실레이트이고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-숙신이미딜, -O-(4-니트로페닐), -O-펜타플루오로페닐, 또는 -O-테트라플루오로페닐이다. 적합한 모이어티 D-(XD)aC(XZ)b-R31의 제조에 일반적으로 사용가능한 화학은 문헌 [Ng et al., US 7,087,600 B2 (2006); Ng et al., US 6,989,452 B2 (2006); Ng et al., US 7,129,261 B2 (2006); Ng et al., WO 02/096910 A1; Boyd et al., US 7,691,962 B2; Chen et al., US 7,517,903 B2 (2009); Gangwar et al., US 7,714,016 B2 (2010); Boyd et al., US 2008/0279868 A1; Gangwar et al., US 7,847,105 B2 (2010); Gangwar et al., US 7,968,586 B2 (2011); Sufi et al., US 2010/0145036 A1; 및 Chen et al., US 2010/0113476 A1]에 개시되어 있으며; 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
바람직하게는 반응성 관능기 -R31은 -NH2, -OH, -CO2H, -SH, 말레이미도, 시클로옥틴, 아지도 (-N3), 히드록실아미노 (-ONH2) 또는 N-히드록시숙신이미도이다. 특히 바람직한 관능기 -R31은 하기이다.
-OH 기는 항체 상의, 예를 들어 아스파르트산 또는 글루탐산 측쇄 상의 카르복시 기와 함께 에스테르화될 수 있다.
-CO2H 기는 -OH 기와 함께 에스테르화되거나 또는 항체 상의 (예를 들어 리신 측쇄 상의) 아미노 기와 함께 아미드화될 수 있다.
N-히드록시숙신이미드 기는 기능적으로 활성화된 카르복실 기이고, (예를 들어, 리신으로부터의) 아미노 기와의 반응에 의해 편리하게 아미드화될 수 있다.
말레이미드 기는 마이클 부가 반응에서, (예를 들어, 시스테인으로부터의, 또는 술프히드릴 관능기를 도입하기 위한 항체의 화학적 변형으로부터의) 항체 상의 -SH 기와 접합될 수 있다.
-SH 기를 항체에 도입하는 다양한 기술이 존재할 수 있다. 바람직한 것에서, 항체 내의 리신 잔기의 측쇄에서의 ε-아미노 기를 2-이미노티올란과 반응시켜 유리 티올 (-SH) 기를 도입한다. 티올 기를 말레이미드 또는 다른 친핵체 수용자 기와 반응시켜 접합을 실시할 수 있다.
전형적으로, 항체당 2 내지 3개의 티올의 티올화 수준이 달성된다. 대표적인 절차에 대해, 문헌 [Cong et al. 2014]을 참조하며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 이량체에 대한 접합을 위한 항체는 이미노티올란과의 반응에 의해 변형된 1개 이상의 리신 잔기 (바람직하게는 2 또는 3개)를 갖는다.
-SH 기는 또한 상기 기재된 것의 "거울상"인 마이클 부가 반응에서 항체가 말레이미드 기를 그에 도입하도록 변형되는 접합에 사용될 수 있다. 항체는 N-숙신이미딜 4-(말레이미도메틸)-시클로헥산카르복실레이트 (SMCC) 또는 그의 술폰화 변이체 술포-SMCC를 사용하여 말레이미드 기를 갖도록 변형될 수 있으며, 이들 둘 다의 시약은 시그마-알드리치로부터 입수가능하다.
대안적 접합 기술은 아지드 기를 시클로옥틴의 스트레인드 알킨 결합을 가로질러 부가하여 1,2,3-트리아졸 고리를 형성하는 구리-무함유 "클릭 화학"을 사용한다. 예를 들어, 문헌 [Agard et al., J. Amer. Chem. Soc. 2004, 126, 15046; Best, Biochemistry 2009, 48, 6571]을 참조하며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 아지드는 항체 상에 위치하고, 시클로옥틴은 약물 모이어티 상에 위치할 수 있거나, 또는 그 반대의 경우일 수 있다. 바람직한 시클로옥틴 기는 디벤조시클로옥틴 (DIBO)이다. DIBO 기를 갖는 다양한 시약은 오레곤주 유진 소재의 인비트로젠/몰레큘라 프로브스로부터 입수가능하다. 하기 반응은 DIBO 기가 항체 (Ab)에 부착된 경우에 대한 클릭 화학 접합을 예시한다.
또 다른 접합 기술은 비-천연 아미노산을 항체에 도입하는 것을 수반하며, 여기서 비-천연 아미노산은 약물 모이어티 내의 반응성 관능기와의 접합을 위한 관능기를 제공한다. 예를 들어, 비-천연 아미노산인 p-아세틸페닐알라닌은 문헌 [Tian et al., WO 2008/030612 A2 (2008)]에 교시된 바와 같이 항체 또는 다른 폴리펩티드에 혼입될 수 있다. p-아세틸페닐알라닌 내의 케톤 기는 링커-약물 모이어티 상의 히드록실아미노 기와의 옥심의 형성을 통한 접합 부위일 수 있다. 대안적으로, 비-천연 아미노산인 p-아지도페닐알라닌은 항체에 혼입되어 상기 논의된 바와 같은 클릭 화학을 통한 접합을 위한 아지드 관능기를 제공할 수 있다. 비-천연 아미노산은 또한 문헌 [Goerke et al., US 2010/0093024 A1 (2010) 및 Goerke et al., Biotechnol. Bioeng. 2009, 102 (2), 400-416]에 교시된 바와 같은 무세포 방법을 사용하여, 항체 또는 다른 폴리펩티드에 혼입될 수 있다. 상기 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 이량체와의 접합체를 제조하는데 사용되는 항체는 바람직하게는 p-아세틸페닐알라닌 또는 p-아지도페닐알라닌, 보다 바람직하게는 p-아세틸페닐알라닌인 비-천연 아미노산에 의해 대체된 1개 이상의 아미노산을 갖는다.
또 다른 접합 기술은 문헌 [Jeger et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995]에 따라, 효소 트랜스글루타미나제 (바람직하게는 박테리아 트랜스글루타미나제 또는 BTG)를 사용한다. BTG는 글루타민의 측쇄 카르복스아미드 (아민 수용자)와, 예를 들어 리신의 ε-아미노 기 또는 5-아미노-n-펜틸 기일 수 있는 알킬렌아미노 기 (아민 공여자) 사이의 아미드 결합을 형성한다. 전형적 접합 반응에서, 하기 제시된 바와 같이, 글루타민 잔기는 항체 상에 위치하며, 알킬렌아미노 기는 링커-약물 모이어티 상에 위치한다.
폴리펩티드 쇄 상의 글루타민 잔기의 위치설정은 BTG 매개 아미드교환에 대한 그의 감수성에 대해 큰 효과를 갖는다. 항체 상의 어떠한 글루타민 잔기도 통상적으로 BTG 기질이 아니다. 그러나, 항체가 탈글리코실화되는 경우 - 글리코실화 부위는 아스파라긴 297 (N297)임 -에, 근처의 글루타민 295 (Q295)가 BTG 감수성이게 된다. 항체는 PNGase F (펩티드-N-글리코시다제 F)로의 처리에 의해 효소적으로 탈글리코실화될 수 있다. 대안적으로, 항체는 N297A 돌연변이를 불변 영역에 도입하여 N297 글리코실화 부위를 제거함으로써 글리코시드 무함유로 합성될 수 있다. 추가로, 항체에서의 N297Q 치환은 글리코실화를 제거할 뿐만 아니라, 또한 아민 수용자인 제2 글루타민 잔기 (위치 297)를 도입하는 것으로 제시된 바 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 이량체에 접합되는 항체는 탈글리코실화된다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 N297Q 치환을 갖는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 합성후 변형에 의한 또는 N297A 돌연변이를 도입하는 것에 의한 탈글리코실화가 항체당 2개의 BTG-반응성 글루타민 잔기 (위치 295에서, 중쇄당 1개)를 생성하며, N297Q 치환을 갖는 항체가 4개의 BTG-반응성 글루타민 잔기 (위치 295 및 297에서, 중쇄당 2개)를 가질 것임을 인지할 것이다.
접합은 또한 문헌 [Levary et al., PLoS One 2011, 6(4), e18342; Proft, Biotechnol. Lett. 2010, 32, 1-10; Ploegh et al., WO 2010/087994 A2 (2010); 및 Mao et al., WO 2005/051976 A2 (2005)]에 교시된 바와 같이 효소 소르타제 A를 사용하여 실시될 수 있다. 소르타제 A 인식 모티프 (전형적으로 LPXTG, 여기서 X는 임의의 천연 아미노산임)는 리간드 Z 상에 위치할 수 있고, 친핵성 수용자 모티프 (전형적으로 GGG)는 화학식 III에서의 기 R31일 수 있거나, 또는 그 반대의 경우일 수 있다.
이량체-링커 화합물
일반적으로, 본 발명의 이량체의 ADC는 이량체 상의 관능기에 부착된 링커를 포함하며, 이러한 링커는 항체에 부착된다. 이용가능한 접합 기술의 다양성을 반영하여, 본 발명의 이량체는 항체에 대한 접합에 적합한 많은 상이한 이량체-링커 화합물로 정교화될 수 있다.
일반적으로, 하기 도면에 예시된 바와 같이 본 발명의 이량체에 대한 링커의 3종의 상이한 부착 방식이 존재한다 (여기서 고리 내의 가변기 및 임의적인 치환기는 단순성을 위해 나타내지 않음).
유형 (a) 이량체-링커 화합물에서, 링커의 부착을 위한 관능기는 2개의 이량체 반쪽 사이의 가교 X에 위치한다. 유형 (b) 이량체-링커 화합물에서, 링커는 이민 이중 결합을 가로지르는 부가 생성물로서 부착된다. 유형 (c) 및 (c') 이량체-링커 화합물에서, 링커의 부착을 위한 관능기는 THIQ, AZI, 또는 PBD 이량체 단위의 "외부" 고리에 위치한다.
한 실시양태에서, 유형 (a) 이량체-링커 화합물은 화학식 IIIa에 의해 나타내어질 수 있다.
여기서
T는 자기-희생 기이고;
t는 0 또는 1이고;
AAa 및 각각의 AAb는 독립적으로 알라닌, β-알라닌, γ-아미노부티르산, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, γ-카르복시글루탐산, 시트룰린, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 노르류신, 노르발린, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
u는 0 또는 1이고;
p는 1, 2, 3 또는 4이고;
q는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 (바람직하게는 2, 3, 4 또는 8)이고;
r은 1, 2, 3, 4 또는 5이고;
s는 0 또는 1이고;
R31은
이고;
XA는
이고,
여기서 각각의 x 및 y는 1, 2, 또는 3이며, 단 x 및 y의 합계가 2 또는 4이고; 별표 (*)는 인접한 O 및 R1에 대한 각각의 XA의 결합 위치를 나타내고; 파상선 
는 T가 존재하는 경우에는 T에 대한 또는 T가 부재하는 경우에는 AAa에 대한 각각의 XA의 결합 위치를 나타내고;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, G, Y, 및 이중선 
는 화학식 I에 대해 상기 발명의 내용 섹션에 정의된 바와 같다.
하나의 바람직한 실시양태에서, u는 화학식 IIIa에서 1이다.
화학식 IIIa에 따른 바람직한 유형 (a) 이량체-링커 화합물은 화학식 IIIa'에 의해 나타내어진다.
여기서 각각의 R9는 독립적으로 H, O(CH2CH2O)1-4H, (CH2CH2O)1-4(C1-C3 알킬), OH, Cl, F, 또는 Br이다.
바람직하게는, 화학식 IIIa 및 IIIa'에서, XA는
이다.
유형 (a) 이량체-링커 화합물의 예는 하기를 포함한다.
이량체-링커의 바람직한 아속은 하기 화학식에 따른다.
여기서 아래첨자 n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12이다.
특히 바람직한 유형 (a) 이량체 링커 화합물은 (IIIa-03) 및 (IIIa-04)이다.
또 다른 실시양태에서, 유형 (b) 이량체-링커 화합물은 화학식 IIIb에 의해 나타내어질 수 있다.
여기서
T, t, AAa, AAb, u, p, q, s, r와 R31은 화학식 IIIa에 대해 정의된 바와 같고;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, X, Y, 및 G는 상기 발명의 내용 섹션에 정의된 바와 같다.
하나의 바람직한 실시양태에서, u는 화학식 IIIb에서 1이다.
화학식 IIIb에 따른 바람직한 유형 (b) 이량체는 화학식 IIIb'에 의해 나타내어진다.
여기서
각각의 R9는 독립적으로 H, O(CH2CH2O)1-4H, (CH2CH2O)1-4(C1-C3 알킬), OH, Cl, F, 또는 Br이고;
X는
이다.
유형 (b) 이량체-링커 화합물의 예는 하기를 포함한다.
한 실시양태에서, 유형 (c) 이량체-링커 화합물은 화학식 IIIc에 의해 나타내어질 수 있다.
여기서
T, t, AAa, AAb, u, p, q, s, r, 및 R31은 화학식 IIIa에 대해 정의된 바와 같고;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, Z, 및 이중선 
는 상기 발명의 내용 섹션에 정의된 바와 같다.
바람직한 실시양태에서, u는 화학식 IIIc에서 1이다.
화학식 IIIc에 따른 바람직한 유형 (c) 이량체-링커 화합물은 화학식 IIIc'에 의해 나타내어진다.
여기서
R9는 H, O(CH2CH2O)1-4H, (CH2CH2O)1-4(C1-C3 알킬), OH, Cl, F, 또는 Br이고;
X는
이다.
유형 (c) 이량체-링커 화합물의 예는 하기를 포함한다.
바람직한 유형 (c') 이량체-링커는 화학식 IIIc"에 의해 나타내어진다.
여기서
T, t, AAa, AAb, u, p, q, s, r와 R31은 화학식 IIIa에 대해 정의된 바와 같고;
각각의 R50은 독립적으로 H, O(C1-C3 알킬), O(C2-C3 알킬렌), O(C2-C3 알키닐), F, Cl, Br, 또는 CN이다.
바람직하게는, 화학식 IIIc"에서, 모이어티
화학식 IIIc"에 따른 이량체-링커의 예는 하기이다.
특히 바람직한 유형 (c)/(c') 이량체-링커 화합물은 (IIIc-08)이다.
화학식 IIIa, IIIa', IIIb, IIIb', IIIc, IIIc' 및 IIIc"에서의 R31은 상기 기재된 바와 같이 항체 상의 상보적 관능기와 반응하여 접합을 실시할 수 있는 반응성 관능기이다.
화학식 IIIa, IIIa', IIIb, IIIb', IIIc, IIIc', 및 IIIc"에서, -AAa-[AAb]p-는 그 길이가 p의 값에 의해 결정되는 것인 폴리펩티드 (p가 1인 경우에는 디펩티드, p가 3인 경우에는 테트라펩티드 등)를 나타낸다. AAa는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 있고, 그의 카르복실 기는 이량체의 아민 질소와 함께 펩티드 (아미드) 결합을 형성한다. 반대로, 마지막 AAb는 폴리펩티드의 아미노 말단에 있고, 그의 α-아미노 기는 s가 각각 1인지 또는 0인지에 따라 하기와 함께 펩티드 결합을 형성한다.
바람직한 폴리펩티드 -AAa-[AAb]p-는 H2N-Val-Cit-CO2H에서와 같이 통상적인 N에서 C 방향으로 기록하여, Val-Cit, Val-Lys, Lys-Val-Ala, Asp-Val-Ala, Val-Ala, Lys-Val-Cit, Ala-Val-Cit, Val-Gly, Val-Gln, 및 Asp-Val-Cit이다. 보다 바람직하게는, 폴리펩티드는 Val-Cit, Val-Lys, 또는 Val-Ala이다. 바람직하게는, 폴리펩티드 -AAa-[AAb]p-는 표적 (암) 세포 내부에서 발견되는 효소, 예를 들어 카텝신, 특히 카텝신 B에 의해 절단가능하다.
0 또는 1인 아래첨자 t에 의해 나타낸 바와 같이, 자기-희생 기 T는 화학식 IIIa, IIIa', IIIb, IIIb', IIIc, IIIc' 및 IIIc"의 이량체-링커 화합물에 임의로 존재한다. 존재하는 경우에, 자기-희생 기 T는 바람직하게는 그 구조가 하기 제시된 것인 p-아미노벤질 옥시카르보닐 (PABC) 기이며, 여기서 별표 (*)는 이량체의 아민 질소와 결합된 PABC의 말단을 나타내고, 파상선 (
)은 폴리펩티드 -AAa-[AAb]p-에 결합된 말단을 나타낸다.
바람직한 실시양태에서, 화학식 IIIa, IIIa', IIIb, IIIb', IIIc, IIIc' 또는 IIIc"에서, 기 R31은 
이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 화학식 IIIa, IIIa', IIIb, IIIb', IIIc, IIIc' 또는 IIIc"에서, 기 R31은 
이다.
접합체의 제조
이러한 일반적 절차는 리신 ε-아미노 기와 2-이미노티올란의 반응, 이어서 상기 기재된 바와 같은 말레이미드-함유 약물-링커 모이어티와의 반응에 의해 유리 티올 기를 항체에 도입하는 것을 기반으로 한다. 처음에, 항체를 50 mM NaCl 및 2 mM 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (DTPA)을 함유하는 0.1 M 포스페이트 완충제 (pH 8.0)로 완충제 교환하고, 5-10 mg/mL로 농축시킨다. 티올화는 항체에 대한 2-이미노티올란의 첨가를 통해 달성된다. 첨가될 2-이미노티올란의 양은 예비 실험에 의해 결정될 수 있고, 항체마다 달라진다. 예비 실험에서, 증가하는 양의 2-이미노티올란의 적정액을 항체에 첨가하고, RT (실온, 약 25℃)에서 1시간 동안 항체와 함께 인큐베이션한 후, 항체를 세파덱스(SEPHADEX)™ G-25 칼럼을 사용하여 50 mM HEPES, 5 mM 글리신, 2 mM DTPA, pH 5.5로 탈염시키고, 도입된 티올 기의 수를 디티오디피리딘 (DTDP)과의 반응에 의해 신속하게 결정한다. 티올 기와 DTDP의 반응은 티오피리딘의 유리를 생성하며, 이를 324 nm에서 분광학적으로 모니터링할 수 있다. 단백질 농도 0.5-1.0 mg/mL의 샘플을 전형적으로 사용한다. 280 nm에서의 흡광도를 사용하여 샘플 중 단백질의 농도를 정확하게 결정할 수 있고, 이어서 각각의 샘플의 분취물 (0.9 mL)을 RT에서 10분 동안 0.1 mL DTDP (에탄올 중 5 mM 원액)와 함께 인큐베이션한다. 완충제 단독 플러스 DTDP의 블랭크 샘플을 또한 나란히 인큐베이션한다. 10분 후, 324 nm에서의 흡광도를 측정하고, 티올 기의 수를 19,800 M-1의 티오피리딘에 대한 흡광 계수를 사용하여 정량화한다.
전형적으로 항체당 약 2 내지 3개의 티올 기의 티올화 수준이 바람직하다. 예를 들어, 일부 항체 하에, 이는 15배 몰 과량의 2-이미노티올란을 첨가하고, 이어서 RT에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 달성된다. 이어서, 항체를 목적 몰비의 2-이미노티올란과 함께 인큐베이션한 다음, 접합 완충제 (50 mM HEPES, 5 mM 글리신, 2 mM DTPA, pH 5.5)로 탈염시킨다. 티올화된 물질을 얼음 상에서 유지하면서, 도입된 티올의 수를 상기 기재된 바와 같이 정량화한다.
도입된 티올의 수의 확인 후, 약물 (이량체)-링커 모이어티를 티올당 2.5배 몰 과량으로 첨가한다. 접합 반응이 최종 농도 25% 프로필렌 글리콜 및 5% 트레할로스를 함유하는 접합 완충제 중에서 진행되도록 한다. 흔히, 약물-링커 원액을 100% DMSO 중에 용해시킨다. 원액을 티올화된 항체에 직접 첨가한다.
접합 반응 혼합물을 완만하게 교반하면서 RT에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 10배 몰 과량의 N-에틸 말레이미드 (DMSO 중 100 mM 원액)를 접합 혼합물에 첨가하고, 추가로 1시간 동안 교반하여 임의의 미반응 티올을 차단한다.
이어서, 샘플을 0.2 μ 필터를 통해 여과한다. 물질을 TFF 비바플로우 50 사토리우스 30 MWCO PES 막을 통해 10 mg/mL 글리신, 20 mg/mL 소르비톨, 15% 아세토니트릴 pH 5.0 (5X TFF 완충제 교환 부피)로 완충제 교환하여 임의의 미반응 약물을 제거한다. 최종 제제화를 TFF에 의해 20 mg/mL 소르비톨, 10 mg/mL 글리신, pH 5.0로 수행한다.
하기 절차는 이량체-링커 화합물의 트랜스글루타미나제 매개 접합에 사용될 수 있으며, 여기서 링커는 아민 공여자로서 작용할 수 있는 아민 기를 갖는다. 항체는 트랜스글루타미나제-반응성 글루타민을 갖는 것, 예를 들어 N297A 또는 N297Q 치환을 갖는 것일 수 있다. 접합을 5:1의 항체:효소의 몰비를 갖는 재조합 박테리아 트랜스글루타미나제에 의해 수행한다. 접합을 50 mM 트리스 완충제, pH 8.0 중에서 표준 프로토콜을 사용하여 수행하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션한다. 생성된 접합체를 50 mM 트리스, pH 8.0으로 예비 평형화된 단백질 A 칼럼 상에서 정제한다. 접합체를 0.1 M 시트르산나트륨 완충제, pH 3.5로 용리시킨다. 용리된 분획을 1M 트리스 pH 9.0으로 중화시킨다. 접합된 것을 20 mg/mL 소르비톨, 10 mg/mL 글리신, pH 5.0 중에 제제화할 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 기재된 조건 및 방법론이 예시적이고 비-제한적이며, 접합을 위한 다른 접근법이 관련 기술분야에 공지되어 있고 본 발명에 사용가능함을 이해할 것이다.
접합체
한 실시양태에서, 본 발명의 접합체는 유형 (a) 이량체-링커 화합물로부터 유도되고, 화학식 IVa에 의해 나타내어질 수 있다.
여기서
Ab는 항체이고;
R40은
이고;
여기서 Ab에 결합되어 있는 R40의 개방 원자가는 별표 (*)에 의해 나타내고, (CH2)r에 결합되어 있는 R40의 개방 원자가는 파상선 (
)에 의해 나타내고;
m은 1, 2, 3, 또는 4이고;
T, t, AAa, AAb, u, p, q, s, r, 및 XA는 화학식 IIIa에 대해 정의된 바와 같고;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, Y, G, 및 이중선 
는 상기 발명의 내용 섹션에 정의된 바와 같다.
바람직한 실시양태에서, u는 화학식 IVa에서 1이다.
화학식 IVa에 따른 바람직한 접합체는 화학식 IVa'에 의해 나타내어진다.
여기서
R9는 H, OH, OMe, NH2, NMe2, O(CH2CH2O)1- 8Me, OCH2CH2OH, 또는 
(특히 파라- 이성질체)이고;
XA는
이고;
여기서 별표 (*)는 인접한 O 및 R1에 대한 각각의 XA의 결합 위치를 나타내고, 파상선 
는 T가 존재하는 경우에는 T에 대한 또는 T가 부재하는 경우에는 AAa에 대한 각각의 XA의 결합 위치를 나타낸다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 접합체는 유형 (b) 이량체-링커 화합물로부터 유도되고, 화학식 IVb에 의해 나타내어질 수 있다.
여기서
Ab, R40, m, T, t, AAa, AAb, u, p, q, s, 및 r은 화학식 IVa에 대해 정의된 바와 같고;
R1, R2, R3, R4, R7, R8, R9, R10, Y, G, 및 X는 화학식 I에 대해 상기 발명의 내용 섹션에 정의된 바와 같다.
바람직한 실시양태에서, u는 화학식 IVb에서 1이다.
화학식 IVb에 따른 바람직한 접합체는 화학식 IVb'에 의해 나타내어진다.
여기서
R9는 H, OH, OMe, NH2, NMe2, O(CH2CH2O)1- 8Me, OCH2CH2OH, 또는 
(특히 파라- 이성질체)이고;
X는
이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 접합체는 유형 (c) 이량체-링커 화합물로부터 유도되고, 화학식 IVc에 의해 나타내어질 수 있다.
여기서
Ab, R40, m, T, t, AAa, AAb, u, p, q, s, 및 r은 화학식 IVa에 대해 정의된 바와 같고;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, Y, X, 및 이중선 
는 상기 발명의 내용 섹션에 정의된 바와 같다.
바람직한 실시양태에서, u는 화학식 IVc에서 1이다.
화학식 IVc에 따른 바람직한 접합체는 화학식 IVc'에 의해 나타내어진다.
여기서
R9는 H, OH, OMe, NH2, NMe2, O(CH2CH2O)1- 8Me, OCH2CH2OH, 또는 
(특히 파라- 이성질체)이고;
X는
이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 접합체는 화학식 IVc"에 의해 나타내어진 구조를 갖는다.
여기서 Ab, R40, m, T, t, AAa, AAb, u, p, q, s, 및 r은 화학식 IVa에 대해 정의된 바와 같고; 각각의 R50은 독립적으로 H, O(C1-C3 알킬), O(C2-C3 알킬렌), O(C2-C3 알키닐), F, Cl, Br, 또는 CN이다.
폴리펩티드 -AAa-[AAb]p- 및 자기-희생 기 T에 대한 화학식 IIIa, IIIa', IIIb, IIIb', IIIc, IIIc' 및 IIIc"의 이량체 링커에 대해 상기 언급된 바람직한 것은 또한 화학식 IVa, IVa', IVb, IVb', IVc, IVc' 및 IVc"의 접합체에 적용가능하다.
화학식 IVa, IVb, IVc 및 IVc"에서, 아래첨자 t 및 u가 둘 다 0인 경우에, 링커는 비-절단가능한 유형의 것이고, 약물을 방출하기 위해 항체 Ab의 분해에 의존한다. 폴리에틸렌 글리콜 성분은 그의 존재가, 예를 들어 접합 동안 약물-링커 화합물의 용해도를 증가시킴으로써 유익하고, 약물의 생물학적 활성을 방해하지 않는 경우에, 임의로 존재할 수 있다 (즉, s는 1임).
제약 조성물
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 제제화된 본 발명의 화합물 또는 그의 접합체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이는 1종 이상의 추가의 제약 활성 성분, 예컨대 항체 또는 또 다른 약물을 임의로 함유할 수 있다. 제약 조성물은 또 다른 치료제, 특히 또 다른 항암제와의 조합 요법으로 투여될 수 있다.
제약 조성물은 1종 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 담체, 표면 활성제, 증점제 또는 유화제, 고체 결합제, 분산 또는 현탁 보조제, 가용화제, 착색제, 향미제, 코팅, 붕해제, 윤활제, 감미제, 보존제, 등장화제, 및 그의 조합을 포함한다. 적합한 부형제의 선택 및 사용은 문헌 [Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)]에 교시되어 있으며, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
바람직하게는, 제약 조성물은 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물은 이를 불활성화시킬 수 있는 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 이를 보호하기 위한 물질로 코팅될 수 있다. 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의한, 경장 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식을 의미하며, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 대안적으로, 제약 조성물은 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
제약 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액 형태일 수 있다. 이들은 또한 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도를 달성하기에 적합한 다른 정렬된 구조로 제제화될 수 있다. 조성물은 또한 투여 전에 물 중 재구성을 위해, 동결건조물 형태로 제공될 수 있다.
단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 대상체 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이며, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100 퍼센트 중, 이러한 양은 제약상 허용되는 담체와 조합하여 약 0.01 퍼센트 내지 약 99 퍼센트의 활성 성분, 바람직하게는 약 0.1 퍼센트 내지 약 70 퍼센트, 가장 바람직하게는 약 1 퍼센트 내지 약 30 퍼센트의 활성 성분 범위일 것이다.
투여 요법은 치료 반응을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 또는 용량이 상황의 위급성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. "투여 단위 형태"는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합화된 물리적 이산 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 목적하는 치료 반응을 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을, 필요한 제약 담체와 함께 함유한다.
투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 통상적으로 0.01 내지 5 mg/kg 범위이다. 예를 들어 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중 또는 1-10 mg/kg, 또는 대안적으로 0.1 내지 5 mg/kg 범위 내일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월에 1회, 3개월마다 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여이다. 바람직한 투여 요법은 하기 투여 스케줄: (i) 6회 투여에 대해 4주마다, 이어서 3개월마다; (ii) 3주마다; (iii) 3 mg/kg 체중으로 1회, 이어서 3주마다 1 mg/kg 체중 중 1종을 사용하여, 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중을 정맥내 투여하는 것을 포함한다. 일부 방법에서, 투여량은 약 1-1000 μg/mL, 및 일부 방법에서는 약 25-300 μg/mL의 혈장 항체 농도가 달성되도록 조정된다.
"치료 유효량"의 본 발명의 화합물은 바람직하게는 질환 증상의 중증도에서의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속기간에서의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 생성한다. 예를 들어, 종양-보유 대상체의 치료를 위해, "치료 유효량"은 바람직하게는 종양 성장을 비치료 대상체에 비해 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 80% 억제한다. 치료 유효량의 치료 화합물은 전형적으로 인간이지만 또 다른 포유동물일 수 있는 대상체에서 종양 크기를 감소시키거나 또는 증상을 달리 호전시킬 수 있다.
제약 조성물은 임플란트, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 또는 지속 방출 제제일 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 의료 디바이스 예컨대 (1) 무바늘 피하 주사 디바이스 (예를 들어, US 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 및 4,596,556); (2) 마이크로-주입 펌프 (US 4,487,603); (3) 경피 디바이스 (US 4,486,194); (4) 주입 장치 (US 4,447,233 및 4,447,224); 및 (5) 삼투 디바이스 (US 4,439,196 및 4,475,196)를 통해 투여될 수 있으며; 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 생체내에서 적절한 분포가 보장되도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 치료 화합물이 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 것을 보장하기 위해, 이들은 리포솜 중에 제제화될 수 있으며, 이는 특이적 세포 또는 기관에 대한 선택적 수송을 증진하기 위한 표적화 모이어티를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, US 4,522,811; 5,374,548; 5,416,016; 및 5,399,331; 문헌 [V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; 및 Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조한다.
용도
본 발명의 화합물 또는 그의 접합체는 질환 예컨대 비제한적으로 두부, 경부, 비강, 부비동, 비인두, 구강, 구인두, 후두, 하인두, 타액선, 및 부신경절종의 종양을 포함한 두경부암; 간 및 담도계의 암, 특히 간세포성 암종; 장암, 특히 결장직장암; 난소암; 소세포 및 비소세포 폐암 (SCLC 및 NSCLC); 유방암 육종, 예컨대 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 배아성 횡문근육종, 평활근육종, 신경섬유육종, 골육종, 활막 육종, 지방육종, 및 폐포 연부 육종; 백혈병 예컨대 급성 전골수구성 백혈병 (APL), 급성 골수 백혈병 (AML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 및 만성 골수 백혈병 (CML); 중추 신경계의 신생물, 특히 뇌암; 다발성 골수종 (MM), 림프종 예컨대 호지킨 림프종, 림프형질세포양 림프종, 여포성 림프종, 점막-연관 림프성 조직 림프종, 외투 세포 림프종, B-계통 대세포 림프종, 버킷 림프종, 및 T-세포 역형성 대세포 림프종을 포함한 과다증식성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 임상적으로, 본원에 기재된 방법의 실시 및 조성물의 사용은 암성 성장의 크기 또는 수에서의 감소 및/또는 연관 증상에서의 감소 (적용가능한 경우)를 생성할 것이다. 병리학적으로, 본원에 기재된 방법의 실시 및 조성물의 사용은 병리학적 관련 반응, 예컨대 암 세포 증식의 억제, 암 또는 종양의 크기에서의 감소, 추가 전이의 예방, 및 종양 혈관신생의 억제를 생성할 것이다. 이러한 질환을 치료하는 방법은 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 조합물을 투여하는 것을 포함한다. 방법은 필요에 따라 반복될 수 있다. 특히, 암은 신암, 폐암, 위암, 또는 난소암일 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 그의 접합체는 항체, 알킬화제, 혈관신생 억제제, 항대사물, DNA 절단제, DNA 가교제, DNA 삽입제, DNA 작은 홈 결합제, 에네디인, 열 쇼크 단백질 90 억제제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 면역조정제, 미세관 안정화제, 뉴클레오시드 (퓨린 또는 피리미딘) 유사체, 핵 유출 억제제, 프로테아솜 억제제, 토포이소머라제 (I 또는 II) 억제제, 티로신 키나제 억제제, 및 세린/트레오닌 키나제 억제제를 포함한 다른 치료제와 조합되어 투여될 수 있다. 구체적 치료제는 아달리무맙, 안사미토신 P3, 아우리스타틴, 벤다무스틴, 베바시주맙, 비칼루타미드, 블레오마이신, 보르테조밉, 부술판, 칼리스타틴 A, 캄프토테신, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르무스틴, 세툭시맙, 시스플라틴, 클라드리빈, 시타라빈, 크립토피신, 다카르바진, 다사티닙, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신, 두오카르마이신, 디네마이신 A, 에포틸론, 에토포시드, 플록수리딘, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 게피티닙, 겜시타빈, 이필리무맙, 히드록시우레아, 이마티닙, 인플릭시맙, 인터페론, 인터류킨, β-라파콘, 레날리도미드, 이리노테칸, 메이탄신, 메클로레타민, 멜팔란, 6-메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토마이신 C, 닐로티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 프로카르바진, 수베로일아닐리드 히드록삼산 (SAHA), 6-티오구아니딘, 티오테파, 테니포시드, 토포테칸, 트라스투주맙, 트리코스타틴 A, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 빈데신을 포함한다.
실시예
본 발명의 실시는 하기 실시예를 참조하여 더욱 이해될 수 있으며, 이는 제한이 아니라 예시로서 제공된다. 하기 일반적 절차는 예시적이며, 여기서 관련 기술분야의 통상의 기술자는 대안적이지만 등가인 방법이 사용될 수 있음을 이해한다.
일부 1H NMR 스펙트럼은 브루커 600, 500, 또는 400 MHz 기기 상에서 실행하였으며, 화학적 이동은 테트라메틸실란 (δ=0.0)을 참조하여 ppm (δ) 단위로 보고하였다. 일반적으로, 증발은 감압 하에 수행하였다.
이들 2종의 LC/MS 분석 방법은 예시적이다:
A 칼럼: 워터스 BEH C18, 2.0 x 50 mm, 1.7-μm 입자; 이동상 A: 물, 0.05%TFA 포함; 이동상 B: 아세토니트릴, 0.05%TFA 포함; [1.5분 내에 2-98%와, 3분 실행 시간]; 온도: 40℃; 유량: 0.8 mL/분 및 220 또는 254nm에서의 UV 검출기 설정.
B 칼럼: 페노메넥스루나, 2.0 x 30 mm, 3-μm 입자; 이동상 A: 10% 아세토니트릴/90% 물, 0.1%TFA 포함; 이동상 B: 90% 아세토니트릴/10% 물, 0.1%TFA 포함; [2분 내에 0-100%와, 4분 실행 시간]; 온도: 40℃; 유량: 1.0 mL/분 및 220 또는 254nm에서의 UV 검출기 설정.
실시예 1 - 중간체 화합물 6
본 실시예 및 도 1은 본 발명의 이량체의 제조에 사용되는 중간체 화합물 6의 합성에 관한 것이다.
4-(벤질옥시)-5-메톡시-2-니트로벤조일 클로라이드 1을 상응하는 메틸 에스테르로부터 하기와 같이 제조하였다: 테트라히드로푸란 (THF, 350 mL) 중 메틸 4-(벤질옥시)-5-메톡시-2-니트로벤조에이트 (하베 켐, 15 g, 47.3 mmol)의 용액에 수성 NaOH의 용액 (56.7 mL, 142 mmol, 2.5M)을 첨가하였다. 반응물을 50℃에서 5시간 동안 교반하였다. 반응물을 실온 (RT)으로 냉각시킨 다음, 진공 하에 농축시켜 THF를 제거하였다. 나머지 수성 층을 수성 HCl (6 N)을 사용하여 pH 2로 산성화시켰다. 생성된 황색 침전물을 여과하고, 물로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 4-(벤질옥시)-5-메톡시-2-니트로벤조산을 수득하였다 (14.32 g, 100% 수율).
LCMS (M+H) = 304.08.
1H NMR (400MHz, 메탄올-d4) δ 7.60 (s, 1H), 7.53 - 7.45 (m, 2H), 7.45 - 7.31 (m, 3H), 7.29 (s, 1H), 5.23 (s, 2H), 3.98 (s, 3H).
THF (150 mL) 중 상기 니트로벤조산 (3.5 g, 11.54 mmol)의 용액에 옥살릴 클로라이드 (1.212 mL, 13.85 mmol)에 이어서 N,N-디메틸포름아미드 (DMF, 50 uL)를 적가하였다. 생성된 용액을 RT에서 2시간 동안 교반한 후, 이것을 진공 하에 농축시켜 산 클로라이드 1을 황색 고체로서 수득하였다.
산 클로라이드 1을 THF (35 mL) 중에 용해시키고, 0℃에서 THF (80 mL) 중 (S)-벤질 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실레이트 p-톨루엔술폰산 염 2 (액셀라, 5.58 g, 12.70 mmol) 및 트리에틸아민 (4.83 mL, 34.6 mmol)의 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 4시간 교반한 후, 물로 켄칭하고, 농축시켜 THF를 제거하였다. 생성된 혼합물을 EtOAc (3x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 포화 수성 NaHCO3에 이어서 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물 혼합물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (80 g 칼럼, 15분 내에 0%에서 100% EtOAc/디클로로메탄 (DCM)의 구배)를 사용하여 정제하여 에스테르 3을 수득하였다 (6.25 g, 98% 수율).
LCMS (M+H) = 553.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.95 - 7.72 (m, 1H), 7.57 - 7.35 (m, 5H), 7.34 - 7.0 (m, 8H), 7.14 - 6.98 (m, 1H), 6.94 - 6.69 (m, 1H), 5.39 - 5.19 (m, 2H), 5.19 - 5.08 (m, 1H), 4.99 (q, J=12.4 Hz, 1H), 4.75 (d, J=17.4 Hz, 1H), 4.65 - 4.40 (m, 2H), 4.28 (d, J=15.6 Hz, 1H), 3.86 (br. s., 3H), 3.71 (s, 1H), 3.50 - 3.18 (m, 1H).
MeOH (50 mL) 중 에스테르 3 (6.25 g, 11.31 mmol), 아연 (4.44 g, 67.9 mmol), 및 NH4Cl (7.26 g, 136 mmol)의 현탁액을 50℃에서 16시간 동안 가열하였다. 반응물을 RT로 냉각시키고, MeOH로 희석하였다. 생성된 혼합물을 EtOAc, DCM 및 MeOH로 연속적으로 세척하면서 셀라이트(CELITE)™의 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 합하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물 혼합물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (120 g 칼럼, 15분 내에 0%에서 100% EtOAc/DCM의 구배)를 사용하여 정제하여 디온 4를 수득하였다 (4.5 g, 96% 수율).
LCMS (M+H) = 415.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.49 - 7.40 (m, 4H), 7.32 (br. s., 6H),, 6.45 (s, 1H), 5.19 (s, 2H), 5.13 (d, J=15.4 Hz, 1H), 4.47 (d, J=15.2 Hz, 1H), 4.21 (t, J=6.7 Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.52 (dd, J=15.4, 7.0 Hz, 1H), 3.02 (dd, J=15.4, 6.4 Hz, 1H).
DMF (54.3 ml) 중 디온 4 (4.5 g, 10.86 mmol)의 용액을 0℃로 냉각시킨 후, NaH (미네랄 오일 중 60% 분산액, 0.54 g, 13.57 mmol)를 배치식으로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 30분 동안 교반한 후, (2-(클로로메톡시)에틸)트리메틸실란 (SEM-Cl, 2.31 ml, 13.03 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT로 가온하고, 물을 사용하여 1시간 동안 교반한 후, 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 EtOAc (3x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물 혼합물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (80 g 칼럼, 15분 내에 0%에서 50% EtOAc/DCM의 구배)를 사용하여 정제하여 SEM-디온 5를 수득하였다 (4.60 g, 78% 수율).
LCMS (M+H) = 545.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.59 - 7.41 (m, 2H), 7.40 - 7.21 (m, 9H), 5.43 (d, J=9.9 Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 5.14 (d, J=15.2 Hz, 1H), 4.50 (d, J=9.7 Hz, 1H), 4.41 (d, J=15.2 Hz, 1H), 4.33 - 4.16 (m, 1H), 4.13 (d, J=7.3 Hz, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.82 - 3.46 (m, 3H), 3.06 - 2.84 (m, 1H), 1.26 (t, J=7.2 Hz, 1H), 0.97 (ddd, J=9.9, 6.8, 2.6 Hz, 2H), 0.10 - 0.01 (m, 9H).
EtOH (10 mL) 중 SEM-디온 5 (4.68 g, 8.59 mmol) 및 Pd/C (10%, 0.457 g)의 현탁액을 RT에서 H2의 풍선 하에 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 셀라이트™ 패드를 통해 여과하고, EtOH로 세척하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물 혼합물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (120 g 칼럼, 15분 내에 0%에서 100% EtOAc/DCM의 구배)를 사용하여 정제하여 화합물 6을 수득하였다 (3.23 g, 83% 수율).
LCMS (M+H) = 455.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.40 - 7.21 (m, 5H), 5.97 (s, 1H), 5.46 (d, J=9.7 Hz, 1H), 5.18 (d, J=15.4 Hz, 1H), 4.72 (d, J=9.7 Hz, 1H), 4.58 - 4.24 (m, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.83 - 3.44 (m, 3H), 3.14 - 2.88 (m, 1H), 0.99 (t, J=8.0 Hz, 2H), 0.14 (s, 9H).
실시예 2 - 중간체 화합물 13
본 실시예 및 도 2는 본 발명의 이량체의 제조에 사용되는 중간체 화합물 13의 합성에 관한 것이다.
산 클로라이드 1을 THF (30 mL) 중에 용해시키고, 0℃에서 THF (20 mL) 중 카르복실레이트 7 (문헌 [Borzilleri et al., WO 2014/047024 A1 (2014)], 1.6 g, 6.39 mmol) 및 NEt3 (2.67 mL, 19.2 mmol)의 용액에 적가하였다. 반응 용액을 RT로 천천히 가온하고, 30분 동안 교반하였다. 반응물을 물로 켄칭하고, 농축시켜 THF를 제거하였다. 생성된 혼합물을 EtOAc (3x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 포화 수성 NaHCO3에 이어서 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물 혼합물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (80 g 칼럼, 15분 내에 0%에서 100% EtOAc/헥산의 구배)를 사용하여 정제하여 에틸 에스테르 8을 수득하였다 (2.66 g, 78% 수율).
LCMS (M+H) = 536.4.
MeOH (10 mL) 중 에틸 에스테르 8 (1.75 g, 3.55 mmol), 아연 (1.394 g, 21.32 mmol), 및 NH4Cl (2.281 g, 42.6 mmol)의 현탁액을 50℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 방대한 양의 DCM 중 20% MeOH로 세척하면서 셀라이트™의 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 농축시켜 아미노-디온 9를 백색 고체로서 수득하였다 (1.25 g, 2.90 mmol, 82% 수율).
LCMS (M+H) = 430.3.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.26 (br. s., 1H), 7.53 - 7.31 (m, 6H), 7.24 (s, 1H), 6.92 (d, J=7.9 Hz, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.50 - 6.41 (m, 2H), 5.07 (d, J=4.6 Hz, 2H), 5.00 - 4.88 (m, 2H), 4.84 (d, J=15.0 Hz, 1H), 4.09 (d, J=15.0 Hz, 1H), 4.01 (t, J=6.9 Hz, 1H), 3.75 (s, 3H), 3.12 (dd, J=15.3, 7.6 Hz, 1H), 2.78 (dd, J=15.2, 6.2 Hz, 1H).
DCM (10 mL) 중 아미노-디온 9 (1.6 g, 3.73 mmol) 및 트리틸 클로라이드 (1.246 g, 4.47 mmol)의 용액에 NEt3 (0.779 mL, 5.59 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 3시간 동안 교반하고, 농축시켰다. 조 생성물 혼합물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (80 g 칼럼, 0-50% EtOAc/헥산)를 사용하여 정제하여 트리틸-디온 10을 백색 고체로서 수득하였다 (2.2 g, 3.27 mmol, 88% 수율).
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 8.01 (s, 1H), 7.50 - 7.12 (m, 22H), 6.77 (d, J=8.4 Hz, 1H), 6.47 - 6.34 (m, 2H), 6.16 (dd, J=8.1, 2.4 Hz, 1H), 5.02 (br. s., 1H), 4.91 (d, J=15.2 Hz, 1H), 4.18 - 4.09 (m, 2H), 4.05 (t, J=6.9 Hz, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.28 (dd, J=15.4, 7.7 Hz, 1H), 2.75 (dd, J=15.4, 6.4 Hz, 1H).
0℃에서 DMF (15 mL) 중 트리틸-디온 10 (2.2 g, 3.27 mmol)의 용액에 NaH (미네랄 오일 중 60% 분산액, 0.236 g, 3.93 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반한 후, SEM-Cl (0.697 ml, 3.93 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반한 후, 이것을 염수로 켄칭하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (3x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물 혼합물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g 칼럼, 0-50% EtOAc/헥산)를 사용하여 정제하여 SEM-디온 11을 수득하였다 (2.1 g, 2.62 mmol, 80% 수율).
LCMS (M-트리틸) = 560.4.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.48 - 7.42 (m, 2H), 7.41 - 7.32 (m, 9H), 7.31 - 7.18 (m, 11H), 6.77 (d, J=8.1 Hz, 1H), 6.38 (d, J=2.2 Hz, 1H), 6.19 (dd, J=8.3, 2.3 Hz, 1H), 5.45 (d, J=9.7 Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 5.08 - 4.92 (m, 2H), 4.49 (d, J=9.7 Hz, 1H), 4.13 - 4.08 (m, 1H), 4.02 (d, J=15.2 Hz, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.71 (td, J=9.6, 7.0 Hz, 1H), 3.61 (td, J=9.6, 7.2 Hz, 1H), 3.36 (dd, J=15.5, 8.3 Hz, 1H), 2.72 (dd, J=15.5, 6.5 Hz, 1H), 1.05 - 0.92 (m, 2H), 0.06 (s, 9H).
EtOAc (20 mL) 중 SEM-디온 11 (950mg, 1.18 mmol) 및 Pd/C (10%, 200 mg)의 현탁액을 H2의 풍선 하에 2일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트™의 패드를 통해 여과하고, EtOAc에 이어서 MeOH로 세척하였다. 합한 여과물을 농축시키고, 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g 칼럼, 0-100% EtOAc/헥산)를 사용하여 정제하여 화합물 12를 수득하였다 (510 mg, 1.08 mmol, 90% 수율).
LCMS (M+H) = 470.2.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.33 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.09 (d, J=8.6 Hz, 1H), 6.67 - 6.54 (m, 2H), 6.02 (s, 1H), 5.47 (d, J=9.7 Hz, 1H), 5.11 (d, J=15.2 Hz, 1H), 4.71 (d, J=9.7 Hz, 1H), 4.29 (d, J=15.2 Hz, 1H), 4.22 (dd, J=7.7, 6.5 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.79 - 3.60 (m, 4H), 3.47 (dd, J=15.4, 7.7 Hz, 1H), 2.90 (dd, J=15.5, 6.4 Hz, 1H), 1.09 - 0.94 (m, 2H), 0.05 (s, 9H).
0℃에서 THF (3 mL) 중 화합물 12 (500 mg, 1.065 mmol)의 용액에 NEt3 (0.742 mL, 5.32 mmol)을 첨가하였다. 알릴 클로로포르메이트 12a (513 mg, 4.26 mmol)를 적가하였다. 생성된 용액을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 MeOH (5mL)로 희석하고, 수성 LiOH (2 mL, 2N)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 RT에서 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 EtOAc로 희석하고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (24 g 칼럼, 0-10% MeOH/DCM)에 의해 정제하여 화합물 13을 백색 고체로서 수득하였다 (440 mg, 0.795 mmol, 74.6% 수율).
LCMS (M+H) = 554.2.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.38 - 7.30 (m, 3H), 7.27 - 7.21 (m, 2H), 6.96 (s, 1H), 6.28 (s, 1H), 6.02 - 5.89 (m, 1H), 5.44 (d, J=9.8 Hz, 1H), 5.35 (dq, J=17.2, 1.5 Hz, 1H), 5.26 (dq, J=10.4, 1.3 Hz, 1H), 5.10 (d, J=15.4 Hz, 1H), 4.70 (d, J=9.8 Hz, 1H), 4.66 (d, J=5.1 Hz, 2H), 4.40 (d, J=15.4 Hz, 1H), 4.31 - 4.23 (m, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.79 - 3.58 (m, 2H), 3.51 (dd, J=15.6, 7.3 Hz, 1H), 2.96 (dd, J=15.5, 6.4 Hz, 1H), 1.07 - 0.95 (m, 2H), 0.03 (s, 9H).
실시예 3 - 중간체 화합물 19
본 실시예 및 도 3은 본 발명의 이량체의 합성을 위한 중간체로서 사용되는 화합물 19의 합성에 관한 것이다.
산 클로라이드 1을 THF (30 mL) 중에 용해시키고, 0℃에서 THF (20 mL) 중 카르복실레이트 14 (문헌 [Buchstaller et al., US 2007/0191423 A1 (2007)], 1.6 g, 5.21 mmol) 및 NEt3 (2.9 mL, 20.8 mmol)의 용액에 적가하였다. 반응 용액을 0℃에서 2시간 동안 교반한 후, 이것을 물로 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 EtOAc (3x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척한 다음, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이어서, 생성된 혼합물을 MeOH (50 mL)에 녹였다. 탄산칼륨 (1 g)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 RT에서 1시간 동안 교반한 후, 이것을 셀라이트™의 패드를 통해 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물 혼합물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (220 g 칼럼, 15분 내에 0%에서 50% EtOAc/헥산의 구배)를 사용하여 정제하여 에스테르 15를 수득하였다 (1.75 g g, 68% 수율).
LCMS (M+H) = 493.1.
MeOH (10 mL) 중 에스테르 15 (1.75 g, 3.55 mmol), 아연 (1.394 g, 21.32 mmol), 및 NH4Cl (2.281 g, 42.6 mmol)의 현탁액을 50℃에서 밤새 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 20% MeOH/DCM으로 세척하면서 셀라이트™의 패드를 통해 여과하였다. 여과물을 농축시켜 화합물 16을 수득하였다 (1.25 g, 2.90 mmol, 82% 수율).
LCMS (M+H) = 431.3.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.25 (br. s., 1H), 9.26 (s, 1H), 7.53 - 7.32 (m, 5H), 7.24 (s, 1H), 7.07 (d, J=8.1 Hz, 1H), 6.79 (s, 1H), 6.71 - 6.60 (m, 2H), 5.08 (d, J=4.0 Hz, 2H), 4.83 (d, J=15.2 Hz, 1H), 4.22 (d, J=15.4 Hz, 1H), 4.08 (t, J=6.7 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.16 (dd, J=15.4, 6.8 Hz, 1H), 2.85 (dd, J=15.1, 6.3 Hz, 1H).
DCM (40 mL) 중 화합물 16 (1.25 g, 2.90 mmol)의 용액에 피리디늄 p-톨루엔술포네이트 (PPTS, 0.073 g, 0.290 mmol) 및 테트라히드로피란 (THP, 2.84 mL, 29.0 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT에서 밤새 교반한 다음, 포화 수성 NaHCO3으로 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 DCM (3x)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물 혼합물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g 칼럼 0-100% EtOAc/헥산)를 사용하여 정제하여 화합물 17을 백색 고체로서 수득하였다 (1.15 g, 2.235 mmol, 77% 수율).
LCMS (M+H) = 515.3.
DMF (10 mL) 중 화합물 17 (1.2 g, 2.332 mmol)의 냉각된 용액에 NaH (미네랄 오일 중 60% 분산액, 0.168 g, 2.80 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반한 다음, RT로 가온하고, 10분 동안 교반한 후, 이것을 0℃로 다시 냉각시켰다. 이어서, SEM-Cl (0.496 mL, 2.80 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 30분 동안 교반한 후, 이것을 RT로 가온되도록 하고, 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 염수로 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 EtOAc (3x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물 혼합물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g 칼럼, 0-50% EtOAc/헥산)를 사용하여 정제하여 화합물 18을 수득하였다 (875 mg, 1.357 mmol, 58.2%).
LCMS (M+H) = 645.5.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.48 - 7.41 (m, 2H), 7.39 - 7.28 (m, 4H), 7.24 (s, 1H), 7.19 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.02 - 6.92 (m, 2H), 5.51 - 5.32 (m, 2H), 5.20 (s, 2H), 5.12 (dd, J=15.3, 3.2 Hz, 1H), 4.50 (dd, J=9.8, 1.7 Hz, 1H), 4.33 (dd, J=15.3, 5.2 Hz, 1H), 4.22 (ddd, J=7.4, 6.5, 4.3 Hz, 1H), 3.91 (s, 4H), 3.76 - 3.56 (m, 3H), 3.47 (dd, J=15.4, 7.7 Hz, 1H), 2.92 (dd, J=15.4, 6.4 Hz, 1H), 2.03 - 1.92 (m, 1H), 1.88 - 1.81 (m, 2H), 1.74 - 1.57 (m, 3H), 0.97 (ddd, J=9.7, 6.8, 2.6 Hz, 2H), 0.09 - 0.01 (m, 9H).
EtOAc (10 mL) 중 화합물 18 (875mg, 1.357 mmol) 및 Pd/C (10%, 87 mg)의 현탁액을 H2의 풍선 하에 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 셀라이트™의 패드를 통해 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물 혼합물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g 칼럼, 0-100% EtOAc/헥산)를 사용하여 정제하여 화합물 19를 백색 고체로서 수득하였다 (485 mg, 0.874 mmol, 64.4% 수율).
LCMS (M+H) = 555.1.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.33 (d, J=0.7 Hz, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.22 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.04 - 6.95 (m, 2H), 6.01 (s, 1H), 5.46 (d, J=9.7 Hz, 1H), 5.44 - 5.34 (m, 1H), 5.16 (dd, J=15.3, 2.6 Hz, 1H), 4.71 (dd, J=9.7, 1.8 Hz, 1H), 4.35 (dd, J=15.3, 4.5 Hz, 1H), 4.25 (ddd, J=7.7, 6.4, 4.0 Hz, 1H), 4.01 - 3.87 (m, 4H), 3.80 - 3.59 (m, 3H), 3.52 (dd, J=15.5, 7.8 Hz, 1H), 2.95 (dd, J=15.5, 6.4 Hz, 1H), 2.05 - 1.96 (m, 1H), 1.92 - 1.82 (m, 2H), 1.77 - 1.62 (m, 3H), 1.06 - 0.97 (m, 2H), 0.05 (s, 9H).
실시예 4 - 대칭 THIQ-THIQ 이량체
도 4는 대칭 THIQ-THIQ 이량체를 제조하기 위한 일반적 반응식을 제시한다. 2개의 단량체 반쪽을 연결시키는 가교는 화합물 20a로부터 유도한다.
기 X5는 이탈기, 예컨대 I, Br, Cl, 메실레이트, 및 토실레이트이다. 기 RX는 가교에서의 구조적 가변성을 허용한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정 경우에 RX에서의 관능기가 합성 과정 동안 필요에 따라 보호 및 탈보호되는 것이 필요할 수 있음을 인지할 것이다. 예시적인 RX는 하기를 포함한다.
도 4의 반응식은 일반적 적용성을 갖지만, THIQ 고리계 내의 방향족 고리는 단순성을 위해 비치환된 것으로 도시된 바 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이것이 상기 정의된 바와 같은 치환기를 보유할 수 있음을 이해할 것이다.
도 4의 개념에 따라, 화합물 (IIa-02)를 하기와 같이 합성하였다.
DMF (1 mL) 중 화합물 6 (50 mg, 0.11 mmol) 및 1,5-디아이오도펜탄 (17.8 mg, 0.055 mmol) 및 K2CO3 (15.2 mg, 0.11 mmol)의 현탁액을 RT에서 14시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 H2O로 희석하고, EtOAc (3x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물 혼합물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g 칼럼, 15분 내에 0%에서 10% MeOH/DCM의 구배)를 사용하여 정제하여 각각의 R9가 H인 화합물 21을 수득하였다 (22 mg, 21% 수율).
LCMS (M+H) = 977.8.
THF/EtOH (1:1, 1 mL) 중 이전 반응의 생성물 (22mg, 0.023 mmol)의 용액에 0℃에서 THF 중 LiBH4의 용액 (2M, 116 μL, 0.232 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT로 천천히 가온하고, 15분 동안 교반한 후, 이것을 염수로 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 클로로포름으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이어서, 조 생성물을 EtOH/클로로포름 (1:1, 2 mL)에 녹였다. 실리카 겔 (700 mg)을 첨가하고, 이어서 물 (0.6 mL)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 RT에서 24시간 동안 교반한 다음, 10% MeOH/클로로포름으로 세척하면서 여과하였다. 여과물을 농축시키고, 역상 HPLC (칼럼: 페노메넥스 루나 C18 20x100mm; 이동상 A: 10:90 아세토니트릴:물, 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA) 포함; 이동상 B: 90:10 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 산 포함; 구배: 15분에 걸쳐 20-70% B; 유량: 20 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV)를 사용하여 정제하여 이량체 (IIa-02)를 수득하였다 (7.5 mg, 9.86 μmol, 43.8% 수율).
LCMS M+H =685.2
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.55 (s, 2H), 7.49 (d, J=5.3 Hz, 2H), 7.42 - 7.31 (m, 8H), 6.82 (s, 2H), 5.03 (d, J=15.6 Hz, 2H), 4.58 (d, J=15.4 Hz, 2H), 4.26 - 4.04 (m, 4H), 4.00 - 3.92 (m, 8H), 3.37 - 3.25 (m, 2H), 3.21 - 3.10 (m, 2H), 2.02 - 1.90 (m, 4H), 1.70 (d, J=7.3 Hz, 2H).
도 4의 반응식에 따라, 추가의 대칭 THIQ-THIQ 이량체를 합성하였다:
(a) 화합물 6 및 1,3-디브로모프로판으로부터의 이량체 (IIa-01): LCMS M+H = 657.2. 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.55 (s, 2H), 7.49 (d, J=5.3 Hz, 2H), 7.42 - 7.30 (m, 8H), 6.87 (s, 2H), 5.03 (d, J=15.6 Hz, 2H), 4.58 (d, J=15.4 Hz, 2H), 4.31 (tdd, J=9.6, 6.1, 3.6 Hz, 4H), 3.95 (s, 6H), 3.94 (s, 2H), 3.37 - 3.24 (m, 2H), 3.21 - 3.10 (m, 2H), 2.44 (t, J=6.1 Hz, 2H).
(b) 화합물 6 및 1-아이오도-2-(2-아이오도에톡시)에탄으로부터의 이량체 (IIa-07): LCMS M+H = 687.2. 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.55 (s, 2H), 7.49 (d, J=5.3 Hz, 2H), 7.40 - 7.31 (m, 8H), 6.86 (s, 2H), 5.02 (d, J=15.4 Hz, 2H), 4.58 (d, J=15.4 Hz, 2H), 4.36 - 4.18 (m, 4H), 4.07 - 4.00 (m, 4H), 3.97 - 3.92 (m, 8H), 3.35 - 3.24 (m, 2H), 3.22 - 3.12 (m, 2H).
(c) 화합물 13 및 1,5-디아이오도펜탄으로부터의 이량체 (IIa-08): LCMS M+H = 883.3. 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.55 (s, 2H), 7.49 (d, J=5.3 Hz, 2H), 7.44 - 7.33 (m, 6H), 6.81 (s, 2H), 6.69 (s, 2H), 6.00 (dd, J=17.1, 10.5 Hz, 2H), 5.40 (dd, J=17.3, 1.4 Hz, 2H), 5.30 (dd, J=10.5, 1.2 Hz, 2H), 5.01 (d, J=15.6 Hz, 2H), 4.71 (d, J=5.5 Hz, 4H), 4.53 (d, J=15.6 Hz, 2H), 3.96 (s, 6H), 3.31 - 3.19 (m, 2H), 3.17 - 3.06 (m, 2H), 1.97 (br. s., 4H), 1.75 - 1.66 (m, 2H).
실시예 5 - 화합물 (IIa-05)
본 실시예 및 도 4a는 역시 도 4의 일반적 합성 반응식에 따르지만, 제시된 바와 같은 보호-탈보호 사이클을 수반하는 화합물 (IIa-05) ((6aS,6a'S)-3,3'-(((5-아미노-1,3-페닐렌)비스(메틸렌))비스(옥시))비스(2-메톡시-6a,7-디히드로벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-b]이소퀴놀린-14(12H)-온))의 합성에 관한 것이다.
MeOH (50 mL) 중 5-니트로-m-크실렌-α,α-디올 24a (알드리치, 1g, 5.46 mmol) 및 Pd/C (291 mg, 0.273 mmol)의 현탁액을 H2의 풍선 하에 RT에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 셀라이트™를 통해 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 5-아미노-1,3-페닐렌)디메탄올 24b를 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
LCMS (M+H) = 154.
0℃에서 THF (10 mL) 중 디메탄올 24b (600 mg, 3.92 mmol), K2CO3 (650 mg, 4.7 mmol)의 현탁액에 알릴 클로로포르메이트 12a (0.5 mL, 4.7 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반한 후, 이것을 RT로 가온되도록 하고, RT에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 물로 켄칭하고, EtOAc (2x)로 추출하였다. 유기 층을 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g 칼럼, 15분 내에 0%에서 100% EtOAc/DCM의 구배)를 사용하여 정제하여 알릴 카르바메이트 24c를 수득하였다 (200 mg, 21.5% 수율).
LCMS (M+23) = 261.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 7.31 (s, 2H), 6.91 (s, 1H), 5.99 (ddt, J=17.2, 10.6, 5.4 Hz, 1H), 5.36 (dq, J=17.2, 1.6 Hz, 1H), 5.24 (dq, J=10.6, 1.4 Hz, 1H), 5.13 (t, J=5.7 Hz, 2H), 4.60 (dt, J=5.4, 1.3 Hz, 2H), 4.44 (d, J=5.5 Hz, 4H).
DCM (20 mL) 중 상기 알릴 카르바메이트 (462.5 mg, 1.949 mmol) 및 트리에틸아민 (0.815 mL, 5.85 mmol)의 현탁액을 -10℃로 냉각시키고, 메탄술포닐 클로라이드 (Ms-Cl, 0.395 mL, 5.07 mmol)로 처리하였다. 유기 층을 빙냉수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 디메탄술포네이트 24d를 수득하였다 (750 mg, 95% 수율).
LCMS (M+H) = 394.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.52 (s, 2H), 7.15 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.09 - 5.87 (m, 1H), 5.39 (dd, J=17.2, 1.5 Hz, 1H), 5.29 (dd, J=10.3, 1.3 Hz, 1H), 5.21 (s, 4H), 4.69 (dt, J=5.7, 1.2 Hz, 2H), 3.02 (s, 6H).
디메틸술폭시드 (DMSO, 16 mL) 중 디메탄술포네이트 24d (135 mg, 0.343 mmol)의 용액을 화합물 6 (312 mg, 0.686 mmol) 및 K2CO3 (142 mg, 1.029 mmol)으로 RT에서 2시간 동안 처리하였다. 반응물을 물로 켄칭하고, EtOAc (3x)로 추출하였다. 혼합물을 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g 칼럼, 15분 내에 0%에서 100% EtOAc/헥산의 구배)에 의해 정제하여 카르바메이트 24e를 수득하였다 (250 mg, 66% 수율).
LCMS (M+1) = 1110.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.51 (s, 2H), 7.38 - 7.13 (m, 14H), 6.96 - 6.75 (m, 1H), 6.12 - 5.86 (m, 1H), 5.48 (d, J=10.1 Hz, 2H), 5.43 - 5.32 (m, 1H), 5.32 - 5.23 (m, 1H), 5.23 - 4.99 (m, 6H), 4.74 - 4.53 (m, 4H), 4.41 (d, J=15.2 Hz, 2H), 4.30 (d, J=0.9 Hz, 2H), 3.96 - 3.83 (m, 6H), 3.81 - 3.46 (m, 6H), 2.98 (s, 2H), 1.14 - 0.85 (m, 4H), 0.13 - 0.08 (m, 18H).
0℃에서 THF (5 mL) 중 카르바메이트 24e (200 mg, 0.180 mmol)의 용액에 Pd(Ph3P)4 (8.33 mg, 7.20 μmol) 및 모르폴린 (0.038 mL, 0.432 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 염화암모늄 (5 mL)으로 켄칭하고, EtOAc (10 mL)로 추출하였다. 유기 층을 포화 수성 NaHCO3에 이어서 포화 수성 NaCl로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g 칼럼, 15분 내에 0%에서 10% 메탄올 /DCM의 구배)를 사용하여 정제하여 화합물 24f를 수득하였다 (160 mg, 87% 수율).
LCMS (M+1) = 1026.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.38 - 7.30 (m, 6H), 7.28 (d, J=5.1 Hz, 7H), 6.92 - 6.85 (m, 1H), 6.76 (d, J=1.1 Hz, 2H), 5.47 (d, J=10.1 Hz, 2H), 5.18 (d, J=15.2 Hz, 2H), 5.08 (d, J=8.6 Hz, 4H), 4.65 (d, J=10.1 Hz, 2H), 4.42 (d, J=15.4 Hz, 2H), 4.30 (d, J=0.9 Hz, 2H), 3.92 (s, 6H), 3.82 - 3.50 (m, 8H), 3.09 - 2.94 (m, 2H), 1.11 - 0.88 (m, 4H), 0.10 - 0.03 (m, 18H).
THF (233 μL) 및 EtOH (233 μL) 중 화합물 24f (22 mg, 0.021 mmol)의 0℃ 용액에 LiBH4의 용액 (214 μL, 0.429 mmol, THF 중 2M)을 첨가하였다. 반응물을 RT로 천천히 가온하고, RT에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 물로 켄칭하고, 클로로포름 (2x)에 이어서 클로로포름/MeOH (2x)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 클로로포름/EtOH/물 (1:1:1, 2 mL) 중에 용해시키고, 실리카 겔 (0.7 g)을 첨가하고, 반응물을 RT에서 3일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 클로로포름으로 세척하면서 셀라이트™ 플러그를 통해 여과하고, 용액을 농축시켰다. 잔류물을 역상 HPLC (칼럼: 페노메넥스 루나 C18 20x100mm; 이동상 A: 10:90 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 이동상 B: 90:10 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 구배: 20분에 걸쳐 20-80% B; 유량: 20 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV)에 의해 정제하여 담황색 고체로서 단리된 이량체 (IIa-05)를 수득하였다 (8.1 mg, 46.3% 수율).
LCMS (M+1) = 734.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) d 7.57 (s, 1H), 7.47 (d, J=5.3 Hz, 1H), 7.43 - 7.30 (m, 4H), 6.99 - 6.79 (m, 1H), 6.73 (s, 1H), 5.40 - 4.90 (m, 4H), 4.59 (d, J=15.4 Hz, 1H), 4.17 - 3.85 (m, 4H), 3.39 - 3.05 (m, 2H).
실시예 6 - 이민 이중 결합의 환원
본 실시예는 1개 또는 둘 다의 이민 결합이 환원된 다양한 THIQ-THIQ 이량체의 제조를 기재한다.
본 실시예의 제1 섹션에서, 제조된 이량체는 (IIa-03) 및 (IIa-04)였다.
0℃에서 THF (0.7 mL) 중 이량체 (IIa-01) (6mg, 9.14 μmol)의 용액에 NaBH4 (0.691 mg, 0.018 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 40분 동안 교반한 후, 이것을 물로 켄칭하였다. 혼합물을 클로로포름 (3x)으로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 진공 하에 농축시켰다. 이량체 (IIa-03) (LCMS (M+1): 659.1) 및 (IIa-04) (LCMS (M+1): 661.1)를 역상 HPLC (칼럼: 페노메넥스 루나 C18 20x100mm; 이동상 A: 10:90 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 이동상 B: 90:10 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 구배: 20분에 걸쳐 15-60% B; 유량: 20 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV)에 의해 분리하였다.
본 실시예의 다음 섹션에서, (6aS,6a'S)-3,3'-(펜탄-1,5-디일비스(옥시))비스(2-메톡시-5,6,6a,7-테트라히드로벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-b]이소퀴놀린-14(12H)-온) (IIa-06)을 제조하였다: THF/MeOH (1:1, 1 mL) 중 이량체 (IIa-02) (28 mg, 0.041 mmol)의 용액에 NaBH4 (1.548 mg, 0.041 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 RT에서 2시간 동안 교반하였다. NaBH4 (1.548 mg, 0.041 mmol)의 제2 배치를 첨가하고, 반응물을 RT에서 밤새 교반하였다. 이어서, 반응물을 물로 켄칭하고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 농축시키고, 역상 HPLC (칼럼: 페노메넥스 루나 C18 20x100mm; 이동상 A: 10:90 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 이동상 B: 90:10 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 구배: 20분에 걸쳐 20-80% B; 유량: 20 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV)를 사용하여 정제하여 화합물 (IIa-06)을 수득하였다 (4.2 mg, 5.49 μmol, 13.41% 수율; LCMS (M+1): 689.2).
실시예 7 - 비대칭 THIQ-THIQ 이량체
본 실시예는 비대칭 THIQ-THIQ 이량체의 합성에 관한 것이다. 도 5는 그의 합성을 위한 반응식을 제시한다. 도면에서 기 RE 및 RE'는 상기 정의된 바와 같은 다양한 치환기일 수 있다.
본 실시예의 제1 섹션은 하기 반응식에 따른 이량체 (S)-10-히드록시-2-메톡시-3-((5-(((S)-2-메톡시-14-옥소-6a,7,12,14-테트라히드로벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-b]이소퀴놀린-3-일)옥시)펜틸)옥시)-6a,7-디히드로벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-b]이소퀴놀린-14(12H)-온 (IIa-15)의 합성에 관한 것이다.
DMSO (5 mL) 중 화합물 6 (250mg, 0.550 mmol) 및 K2CO3 (304 mg, 2.200 mmol)의 현탁액에 1,5-디아이오도펜탄 (891 mg, 2.75 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT에서 2시간 동안 교반한 후, 이것을 EtOAc로 희석하고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (12 g 칼럼, 구배 0-10% MeOH/DCM)를 사용하여 정제하여 화합물 6a를 황색 오일로서 수득하였다 (275 mg, 0.423 mmol, 77% 수율).
LCMS: (M+H) = 651.2.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.33 - 7.24 (m, 5H), 7.21 (s, 1H), 5.50 (d, J=9.9 Hz, 1H), 5.15 (d, J=15.4 Hz, 1H), 4.66 (d, J=9.9 Hz, 1H), 4.41 (d, J=15.4 Hz, 1H), 4.33 - 4.25 (m, 1H), 4.05 (d, J=8.6 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.80 (td, J=9.6, 6.9 Hz, 1H), 3.72 - 3.62 (m, 1H), 3.56 (dd, J=15.5, 7.4 Hz, 1H), 3.22 (t, J=6.9 Hz, 2H), 3.00 (dd, J=15.6, 6.4 Hz, 1H), 1.98 - 1.80 (m, 4H), 1.67 - 1.54 (m, 2H), 0.98 (ddd, J=9.8, 6.7, 2.9 Hz, 2H), 0.04 (s, 9H).
DMSO (3 mL) 중 화합물 6a (135 mg, 0.208 mmol) 및 화합물 19 (110 mg, 0.198 mmol)의 용액에 K2CO3 (82 mg, 0.595 mmol)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 RT에서 5시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 EtOAc로 희석하고, 물로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 MeOH (10 mL)에 녹였다. PPTS (~15 mg)를 첨가하고, 반응물을 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 농축시키고, 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (0-100% EtOAc/헥산, 24 g 칼럼)를 사용하여 정제하여 화합물 6b를 수득하였다 (141 mg, 0.142 mmol, 71.6% 수율).
LCMS (M+H) = 993.7.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.36 - 7.29 (m, 4H), 7.27 - 7.24 (m, 1H), 7.23 - 7.10 (m, 4H), 6.94 (d, J=2.2 Hz, 1H), 6.79 (dd, J=8.1, 2.4 Hz, 1H), 5.51 (t, J=9.6 Hz, 2H), 5.18 (dd, J=19.4, 15.2 Hz, 2H), 4.69 (dd, J=9.9, 7.5 Hz, 2H), 4.42 (d, J=15.4 Hz, 1H), 4.37 - 4.26 (m, 2H), 4.22 (dd, J=7.7, 6.6 Hz, 1H), 4.09 - 4.00 (m, 3H), 3.88 (d, J=2.6 Hz, 6H), 3.80 (dd, J=7.0, 4.6 Hz, 2H), 3.68 (dd, J=6.8, 5.1 Hz, 2H), 3.60 - 3.43 (m, 2H), 3.10 - 2.82 (m, 2H), 2.00 - 1.87 (m, 4H), 1.69 (br. s., 2H), 0.98 (td, J=6.6, 3.3 Hz, 4H), 0.10 - 0.02 (m, 18H).
-78℃에서 THF (0.6 mL) 중 화합물 6b (18 mg, 0.018 mmol)의 용액에 리튬 트리에틸보로히드라이드의 용액 (THF 중 1 M, 362 μL, 0.362 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 후, 이것을 물 (1mL)로 켄칭하였다. 이어서, 반응물을 클로로포름 (3x)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 이어서, 잔류물을 클로로포름/EtOH (1:1, 2 mL)에 녹였다. 실리카 겔 (0.8 g)을 첨가하고, 이어서 물 (0.6 mL)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 RT에서 1일 동안 교반한 다음, 10% MeOH/클로로포름으로 세척하면서 여과하였다. 여과물을 진공 하에 농축시키고, 역상 HPLC (칼럼: 페노메넥스 루나 C18 20x100mm; 이동상 A: 10:90 아세토니트릴:물, 0.1% 트리플루오로아세트산 포함; 이동상 B: 90:10 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 구배: 20분에 걸쳐 20-80% B; 유량: 20 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV)를 사용하여 정제하여 이량체 (IIa-15)를 수득하였다 (4.8 mg, 6.16 μmol, 34.0% 수율).
LCMS (M+H) =701.2.
화합물 6b로부터의 이량체 (S)-2,10-디메톡시-3-((5-(((S)-2-메톡시-14-옥소-6a,7,12,14-테트라히드로벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-b]이소퀴놀린-3-일)옥시)펜틸)옥시)-6a,7-디히드로벤조[5,6][1,4]디아제핀[1,2-b]이소퀴놀린-14(12H)-온 (IIa-12)의 합성을 하기와 같이 수행하였다. 화합물 6b를 K2CO3을 사용하여 아이오도메탄으로 알킬화시켜 상응하는 메톡시 생성물을 수득하였다. LCMS (M+H) = 1007.6. 일반적으로 상기 기재된 절차에 따라 LiEt3BH를 사용하여 환원시켜 이량체 (IIa-12)를 수득하였다.
LCMS (M+H) = 715.3.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.55 (d, J=1.6 Hz, 2H), 7.50 (d, J=5.3 Hz, 2H), 7.41 - 7.30 (m, 5H), 6.94 - 6.86 (m, 2H), 6.81 (m, 1H), 5.01 (t, J=14.9 Hz, 2H), 4.67 - 4.47 (m, 2H), 4.24 - 4.01 (m, 5H), 3.96 (s, 6H), 3.86 (s, 3H), 3.34 - 3.02 (m, 4H), 2.02 - 1.88 (m, 4H).
필요한 변경을 가하여 상기 절차에 따라, 추가의 비대칭 THIQ-THIQ 이량체를 합성하였다:
(a) (IIa-13): LCMS (M+H) = 758.3. 1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.55 (d, J=2.2 Hz, 2H), 7.49 (dd, J=5.3, 3.4 Hz, 2H), 7.42 - 7.33 (m, 5H), 6.95 - 6.89 (m, 2H), 6.86 - 6.77 (m, 2H), 6.54 (br. s., 1H), 5.57 (br. s., 1H), 5.02 (dd, J=15.5, 10.9 Hz, 2H), 4.62-4.56 (m., 2H), 4.20-4.02 (m, 6H), 3.96 (s, 3H), 3.96 (s, 3H), 3.90 - 3.84 (m, 3H), 3.31 - 3.05 (m, 5H), 1.96 (m, 4H).
(b) (IIa-14): LCMS (M+H) = 803.3.
(c) (IIa-17): LCMS (M+H) = 745.2.
실시예 8 - 비대칭 가교를 갖는 이량체
본 실시예 및 도 6은 2개의 이량체 반쪽을 연결시키는 가교가 양측 대칭이 아닌 이량체를 제조하기 위한 합성 전략을 예시한다. 구체적 예시는 이량체 (IIa-09)에 대한 것이다.
벤질 (2-히드록시에틸)카르바메이트 29 (알드리치, 0.781 g, 4 mmol) 및 NEt3 (1.115 mL, 8.00 mmol)의 용액에 p-톨루엔술포닐 클로라이드 (TsCl, 0.915 g, 4.80 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 RT에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (0-100% EtOAc/Hex, 40 g 칼럼)를 사용하여 정제하여 톨루엔술포네이트 30을 수득하였다 (0.85 g, 2.43 mmol, 60.8% 수율).
LCMS (M+H) = 350.
DMF (3 mL) 중 화합물 6 (160mg, 0.352 mmol) 및 톨루엔술포네이트 30 (135 mg, 0.387 mmol)의 용액에 K2CO3 (97 mg, 0.704 mmol)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 RT에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 EtOAc로 희석하고, 수성 LiCl 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (0-10% MeOH/DCM, 24 g 칼럼)를 사용하여 정제하여 화합물 31을 수득하였다.
LCMS (M+H) = 632.3.
MeOH (8 mL) 중 화합물 31 및 10% Pd/C (25 mg)의 현탁액을 H2의 풍선 하에 5시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 N2로 퍼징하고, 셀라이트™의 패드를 통해 여과하고, 농축시켜 화합물 32를 수득하였다 (150 mg, 0.301 mmol, 86% 수율).
LCMS (M+H) = 498.
1H NMR (500MHz, 클로로포름-d) δ 7.65 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.38 - 7.23 (m, 4H), 7.21 (s, 1H), 7.07 (d, J=7.9 Hz, 1H), 6.90 - 6.64 (m, 3H), 5.41 (d, J=10.2 Hz, 1H), 5.14 (d, J=15.3 Hz, 1H), 4.76 (d, J=10.1 Hz, 1H), 4.44 - 4.33 (m, 2H), 4.32 - 4.17 (m, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.72 - 3.50 (m, 4H), 3.39 - 3.30 (m, 2H), 3.05 - 2.93 (m, 1H), 0.98 - 0.87 (m, 2H), 0.00 (s, 9H).
0℃에서 DCM (2 mL) 중 화합물 32 (65mg, 0.131 mmol)의 용액에 NEt3 (0.055 mL, 0.39 mmol) 및 2-클로로아세틸 클로라이드 32a (22.13 mg, 0.196 mmol)를 첨가하였다. 용액을 1시간 동안 교반한 다음, DCM으로 희석하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 화합물 6 (59.4 mg, 0.131 mmol) 및 K2CO3 (4.2 mg, 0.392 mmol)과 합하고, DMSO (1 mL) 중에 현탁시켰다. 생성된 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 가열하였다. RT로 냉각시킨 후, 반응물을 EtOAc로 희석하고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (0-10% MeOH/DCM, 24 g 칼럼)를 사용하여 정제하여 아세트아미드 33을 수득하였다 (95 mg, 0.096 mmol, 73.3% 수율).
LCMS (M+H) = 992.5.
-78℃에서 THF (0.6 mL) 중 아세트아미드 33 (40mg, 0.040 mmol)의 용액에 LiEt3BH의 용액 (0.4 mL, THF 중 1 M)을 첨가하였다. 이어서, 반응물을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 후, 이것을 물 (1mL)로 켄칭하였다. 이어서, 반응 혼합물을 클로로포름 (3x)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 이어서, 잔류물을 클로로포름/EtOH (1:1, 2 mL)에 녹였다. 실리카 겔 (0.8 g)을 첨가하고, 이어서 물 (0.6 mL)을 첨가하였다. 이어서, 생성된 현탁액을 RT에서 1일 동안 교반한 다음, 10% MeOH/클로로포름으로 세척하면서 여과하였다. 여과물을 진공 하에 농축시키고, 역상 HPLC (칼럼: 페노메넥스 루나 C18 20x100mm; 이동상 A: 10:90 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 이동상 B: 90:10 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 구배: 15분에 걸쳐 15-70% B; 유량: 20 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV)를 사용하여 정제하여 이량체 (IIa-09)를 수득하였다 (11 mg, 0.014 mmol, 35.1% 수율).
LCMS (M+H) = 700.2.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.57 (d, J=9.5 Hz, 2H), 7.48 (dd, J=5.3, 0.9 Hz, 2H), 7.40 - 7.31 (m, 9H), 6.83 (d, J=4.0 Hz, 2H), 5.01 (d, J=15.6 Hz, 2H), 4.64 - 4.51 (m, 4H), 4.20 (td, J=9.4, 5.0 Hz, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 3.91 - 3.82 (m, 4H), 3.34 - 3.23 (m, 2H), 3.20 - 3.11 (m, 2H).
실시예 9 - THIQ-PBD 이량체
도 5의 반응식은 2개의 THIQ 단량체 단위 중 1개가 PBD 단량체 단위에 의해 대체된 THIQ-PBD 이량체를 제조하는데 사용될 수 있다. THIQ 단량체 단위를 먼저 알킬화시킨 다음, PBD 단량체 단위를 부착할 수 있거나, 또는 그 반대의 경우일 수 있다.
본 실시예 및 도 7a 및 7b는 구체적으로 이량체 (IIb-01) 및 (IIb-02)를 참조하여 THIQ-PBD 이량체의 합성을 예시한다.
이량체 (IIb-01)의 제조를 먼저 기재한다. 합성 반응식은 도 7a에 요약되어 있으며, THIQ를 먼저 알킬화시키는 접근법을 예시한다.
DMF (1.5 mL) 중 화합물 6a (상기 실시예 7, 50mg, 0.077 mmol), K2CO3 (31.9 mg, 0.231 mmol) 및 디온 35 (CAS 등록 번호 132391-70-9, 문헌 [Howard et al. 2014c], 40.3 mg, 0.154 mmol)의 현탁액을 50℃에서 2시간 동안 가열하였다. 반응물을 RT로 냉각시키고, 물로 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 EtOAc (3x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (24 g 칼럼, 0-10% MeOH/DCM)를 사용하여 정제하여 화합물 36을 수득하였다.
LCMS (M+H) = 785.4.
화합물 36을 DMF (0.5 mL) 중에 용해시켰다. 용액을 0℃로 냉각시킨 후, NaH (미네랄 오일 중 60% 분산액, 3.07 mg, 0.077 mmol) 및 SEM-Cl (0.014 mL, 0.077 mmol)을 순차적으로 첨가하였다. 반응물을 RT로 가온하고, 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 물로 켄칭하고, EtOAc로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 화합물 37을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다 (14mg, 0.015 mmol, 20% 수율).
LCMS (M+H) = 915.7.
0℃에서 THF/EtOH (1:1, 1 mL) 중 조 화합물 37 (14mg, 0.015 mmol)의 용액에 LiBH4의 용액 (101 μl, 0.202 mmol, THF 중 2 M)을 첨가하였다. 반응물을 RT로 천천히 가온하고, 15분 동안 교반한 후, 이것을 염수로 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 CHCl3 (3x)으로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이어서, 잔류물을 EtOH/클로로포름 (1:1, 2 mL)에 녹였다. 실리카 겔 (700 mg)을 첨가하고, 이어서 물 (0.6 mL)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 RT에서 1일 동안 교반한 다음, 10% MeOH/CHCl3으로 세척하면서 여과하였다. 여과물을 농축시키고, 역상 HPLC (칼럼: 페노메넥스 루나 C18 20x100mm; 이동상 A: 10:90 CH3CN:물, 0.1% TFA 포함; 이동상 B: 90:10 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 구배: 20분에 걸쳐 15-60% B; 유량: 20 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV)에 의해 정제하여 (IIb-01)을 수득하였다 (0.92mg, 1.330 μmol, 8.69% 수율).
LCMS (M+H) = 623.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.69 (d, J=4.4 Hz, 1H), 7.57 - 7.53 (m, 2H), 7.50 (d, J=5.1 Hz, 1H), 7.41 - 7.32 (m, 4H), 6.82 (d, J=1.5 Hz, 2H), 5.03 (d, J=15.6 Hz, 1H), 4.59 (d, J=15.6 Hz, 1H), 4.18 - 4.06 (m, 4H), 3.97 (s, 3H), 3.96 (s, 3H), 3.75 (d, J=7.3 Hz, 4H), 3.61 (dt, J=11.8, 7.8 Hz, 1H), 3.34 - 3.26 (m, 1H), 3.22 - 3.15 (m, 1H), 2.34 (br. s., 2H), 2.11 - 2.06 (m, 1H), 2.01 - 1.94 (m, 4H), 1.71 - 1.66 (m, 2H).
이제 이량체 (IIb-02)의 합성으로 전환하면, 합성 반응식은 도 7b에 요약되어 있다. 이러한 경우에, 이는 먼저 알킬화된 다음, THIQ 단량체 단위에 커플링된 PBD 단량체 단위이다.
MeOH (3 mL) 및 THF (3 mL) 중 화합물 9 (220mg, 0.512 mmol)의 용액에 포름알데히드 (37% 수성 용액, 0.572 mL, 7.68 mmol) 및 몇 방울의 아세트산을 첨가하였다. 용액을 RT에서 10분 동안 교반한 후, Na(CN)BH3 (129 mg, 2.049 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 반응물을 RT에서 2시간 동안 교반한 후, 이것을 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (0-10% MeOH/DCM, 24 g 칼럼)를 사용하여 정제하여 화합물 38a를 수득하였다 (230 mg, 0.503 mmol, 98% 수율).
LCMS (M+H) = 458.
0℃에서 DMF (5 mL) 중 화합물 38a (230mg, 0.503 mmol)의 용액에 NaH (미네랄 오일 중 60% 분산액, 25.1 mg, 0.628 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 교반한 후, SEM-Cl (0.111 mL, 0.628 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT로 천천히 가온하고, 밤새 교반하였다. 이어서, 반응물을 물로 켄칭하고, EtOAc (3x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (0-10% MeOH/DCM)를 사용하여 정제하여 화합물 38b를 수득하였다.
LCMS (M+H) = 588.2.
화합물 38b를 10% Pd/C (20 mg)와 합하고, EtOH/EtOAc (1:1, 10 mL) 중에 현탁시켰다. 혼합물을 N2로 퍼징한 다음, H2의 풍선 하에 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 셀라이트™의 패드를 통해 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (0-10% MeOH/DCM, 40 g 칼럼)를 사용하여 정제하여 화합물 38c를 수득하였다 (190 mg, 0.382 mmol, 76% 수율).
LCMS (M+H) = 498.2.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.45 (s, 1H), 7.21 (s, 1H), 7.18 - 7.10 (m, 1H), 6.69 (m., 2H), 5.51 (d, J=9.9 Hz, 1H), 5.12 (d, J=15.2 Hz, 1H), 4.65 (d, J=10.1 Hz, 1H), 4.33 (d, J=15.2 Hz, 1H), 4.24 (d, J=0.4 Hz, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.79 (s, 1H), 3.72 - 3.63 (m, 1H), 3.52 - 3.40 (m, 1H), 2.93 (s, 6H), 1.05 - 0.89 (m, 2H), 0.03 (s, 9H).
화합물 38d를 일반적으로 상기 기재된 절차에 따름으로써 제조하였다.
LCMS (M+H) = 393.4.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.38 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 6.34 (s, 1H), 5.46 (d, J=9.8 Hz, 1H), 4.70 (d, J=9.8 Hz, 1H), 4.19 - 4.06 (m, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.80 - 3.60 (m, 3H), 3.60 - 3.53 (m, 1H), 3.50 (d, J=2.9 Hz, 2H), 2.78 - 2.68 (m, 1H), 2.19 - 1.95 (m, 3H), 1.05 - 0.96 (m, 2H), 0.08 - 0.02 (m, 9H).
DMF (10 mL) 중 화합물 38d (1.2 g, 3.06 mmol)의 용액에 K2CO3 (1.268 g, 9.17 mmol) 및 1,5-디아이오도펜탄 (5.94 g, 18.34 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT에서 2시간 동안 교반한 후, 이것을 물로 켄칭하였다. 생성된 혼합물을 EtOAc (3x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (24 g 칼럼, 0-10% MeOH/DCM)를 사용하여 정제하여 화합물 38e를 수득하였다 (1.52 g, 2.58 mmol, 84% 수율).
LCMS (M+H) = 589.1
DMSO (1 mL) 중 화합물 38e (22.12 mg, 0.038 mmol) 및 화합물 38c (17mg, 0.034 mmol)의 용액에 K2CO3 (9.44 mg, 0.068 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 RT에서 14시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 EtOAc로 희석하고, 물 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (0-10% MeOH/DCM, 24 g 칼럼)를 사용하여 정제하여 화합물 38f를 수득하였다 (27 mg, 0.028 mmol, 82% 수율).
LCMS (M+H) = 958.3.
화합물 38f를 상기 기재된 절차에 따른 환원에 의해 이량체 (IIb-02)로 전환시켰다.
LCMS (M+H) =666.2.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.68 (d, J=4.4 Hz, 1H), 7.54 (d, J=1.8 Hz, 2H), 7.52 (d, J=5.3 Hz, 1H), 7.23 (d, J=8.8 Hz, 1H), 6.82 (d, J=1.8 Hz, 2H), 6.73 - 6.65 (m, 2H), 4.97 (d, J=15.4 Hz, 1H), 4.53 (d, J=15.4 Hz, 1H), 4.29 - 4.03 (m, 4H), 3.96 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.84 (ddd, J=11.7, 7.1, 4.5 Hz, 1H), 3.78 - 3.72 (m, 1H), 3.66 - 3.56 (m, 1H), 3.28 - 3.17 (m, 1H), 3.06 (dd, J=15.4, 4.2 Hz, 1H), 3.01 - 2.95 (m, 6H), 2.34 (td, J=6.7, 3.0 Hz, 2H), 2.16 - 1.90 (m, 6H), 1.78 - 1.62 (m, 3H).
실시예 10 - THIQ-THIQ 이량체 (IIa-10) 및 (IIa-11)
본 실시예 및 도 8은 이량체 (IIa-10) 및 (IIa-11)의 제조에 관한 것이다.
DMSO (3 mL) 중 화합물 6a (100 mg, 0.154 mmol) 및 화합물 13 (68 mg, 0.123 mmol)의 용액에 K2CO3 (50.9 mg, 0.368 mmol)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 RT에서 5시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 EtOAc로 희석하고, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (0-10% MeOH/DCM, 12 g 칼럼)를 사용하여 정제하여 카르바메이트 39를 수득하였다 (124 mg, 0.115 mmol, 94% 수율).
LCMS (M+H) = 1076.3.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.30 (d, J=0.9 Hz, 6H), 7.27 - 7.18 (m, 5H), 6.89 (s, 1H), 6.01 - 5.88 (m, 1H), 5.49 (dd, J=9.9, 4.0 Hz, 2H), 5.34 (dd, J=17.3, 1.4 Hz, 1H), 5.25 (dd, J=10.3, 1.1 Hz, 1H), 5.18 - 5.04 (m, 2H), 4.71 - 4.62 (m, 4H), 4.40 (d, J=15.4 Hz, 2H), 4.32 - 4.22 (m, 2H), 4.09 - 3.97 (m, 4H), 3.90 - 3.84 (m, 6H), 3.82 - 3.73 (m, 2H), 3.71 - 3.44 (m, 5H), 3.08 - 2.90 (m, 2H), 1.99 - 1.90 (m, 4H), 1.04 - 0.91 (m, 4H), 0.02 (s, 9H), 0.02 (s, 9H).
0℃에서 DCM (6 mL) 중 카르바메이트 39 (124 mg, 0.115 mmol)의 용액에 모르폴린 (0.080 mL, 0.922 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 N2로 퍼징한 후, Pd(Ph3P)4 (13.31 mg, 0.012 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 RT로 천천히 가온하고, N2 하에 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 농축시키고, 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (0-10% MeOH/DCM)를 사용하여 정제하여 상응하는 아닐린 화합물을 수득하였다 (90 mg, 0.091 mmol, 79% 수율).
LCMS (M+H) = 992.5.
-78℃에서 THF (3 mL) 중 상기 아닐린 화합물 (89mg, 0.090 mmol)의 용액에 LiEt3BH (THF 중 1 M, 0.448 mL, 0.448 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 -78℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 물 (1mL)로 켄칭하고, 클로로포름 (3x)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 이어서, 잔류물을 클로로포름/EtOH (1:1, 2 mL)에 녹였다. 실리카 겔 (0.7 g)을 첨가하고, 이어서 물 (0.6 mL)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 RT에서 1일 동안 교반한 다음, 10% MeOH/클로로포름으로 세척하면서 여과하였다. 여과물을 농축시키고, HPLC (칼럼: 페노메넥스 루나 C18 20x100mm; 이동상 A: 10:90 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 이동상 B: 90:10 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 구배: 20분에 걸쳐 20-70% B; 유량: 20 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV) 상에서 정제하여 이량체 (IIa-10)을 수득하였다 (19mg, 0.024 mmol, 27.2% 수율).
LCMS (M+H) = 700.2.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.54 (d, J=2.4 Hz, 2H), 7.50 (t, J=4.7 Hz, 2H), 7.41 - 7.31 (m, 5H), 7.15 (d, J=8.6 Hz, 1H), 6.81 (d, J=1.8 Hz, 2H), 6.73 - 6.59 (m, 2H), 5.02 (d, J=15.6 Hz, 1H), 4.92 (d, J=15.4 Hz, 1H), 4.58 (d, J=15.6 Hz, 1H), 4.47 (d, J=15.4 Hz, 1H), 4.22 - 4.03 (m, 3H), 4.00 - 3.70 (m, 9H), 3.34 - 3.25 (m, 1H), 3.18 (dt, J=15.4, 4.2 Hz, 2H), 3.09 - 3.00 (m, 1H), 2.03 - 1.92 (m, 4H), 1.76 - 1.63 (m, 2H).
DMF (0.5 mL) 중 이량체 (IIa-10) (4.5mg, 6.43 μmol), Fmoc-GLY-OH (켐-임펙스, 3.82 mg, 0.013 mmol), 및 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 4.89 mg, 0.013 mmol)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA, 3.37 μL, 0.019 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT에서 4시간 동안 교반한 후, 피페리딘 (100 uL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 조 반응 혼합물을 DMF로 희석하고, 여과하고, 역상 HPLC (칼럼: 페노메넥스 루나 C18 20x100mm; 이동상 A: 10:90 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 이동상 B: 90:10 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 구배: 20분에 걸쳐 20-70% B; 유량: 20 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV) 상에서 정제하여 이량체 (IIa-11)을 수득하였다 (0.94mg, 1.180 μmol, 18.35% 수율).
LCMS (M+H) = 757.2.
실시예 11 - THIQ-PBD 이량체 (IIb-03)
본 실시예 및 도 9는 THIQ-PBD 이량체 (IIb-03)의 제조에 관한 것이다.
화합물 41을 일반적으로 상기 실시예에서의 절차에 따라 제조하였다.
LCMS (M+H) = 409.1.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.32 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.30 (s, 1H), 5.45 (d, J=9.7 Hz, 1H), 4.71 (d, J=9.8 Hz, 1H), 4.65 (br. s., 1H), 4.30 (dd, J=7.9, 5.9 Hz, 1H), 4.00 - 3.84 (m, 4H), 3.79 - 3.57 (m, 3H), 2.97 (dt, J=13.5, 5.5 Hz, 1H), 2.86 (br. s., 1H), 2.21 - 2.08 (m, 1H), 1.00 (t, J=8.4 Hz, 2H), 0.03 (s, 9H).
DMSO (3 mL) 중 디온 41 (500mg, 1.224 mmol)의 용액에 1,3-디브로모프로판 42 (1730 mg, 8.57 mmol) 및 K2CO3 (423 mg, 3.06 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 물로 켄칭하고, EtOAc (3x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (0-10% MeOH/DCM, 40 g 칼럼)를 사용하여 정제하여 브로모프로폭시 PBD 43 (540 mg, 0.918 mmol, 75%)을 백색 발포체로서 수득하였다.
LCMS (M+H) = 531.2.
DMSO (2 mL) 중 일반적으로 상기 실시예의 절차에 따라 제조된 THIQ 단량체 19 (100 mg, 0.180 mmol), 및 브로모프로폭시 PBD 43 (117 mg, 0.198 mmol)의 용액에 K2CO3 (62.3 mg, 0.451 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 EtOAc로 희석하고, 물 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 생성된 혼합물을 MeOH (10 mL)에 녹이고, PPTS (20 mg)를 첨가하였다. 반응물을 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 농축시키고, EtOAc에 녹이고, 수성 NaHCO3에 이어서 염수로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (0-20% EtOAc/헥산, 24 g 칼럼)를 사용하여 정제하여 화합물 45를 수득하였다 (150 mg, 0.163 mmol, 91% 수율).
LCMS: (M+H) = 919.3
DMSO (2 mL) 중 화합물 45 (150mg, 0.163 mmol)의 용액에 K2CO3 (67.7 mg, 0.490 mmol) 및 아이오도메탄 (46.3 mg, 0.326 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 EtOAc로 희석하고, 물로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물 46을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다.
LCMS (M+H) = 933.5.
DCM (804 μL) 및 DMSO (804 μL) 중 조 46 (150 mg, 0.161 mmol)의 0℃ 용액에 트리에틸아민 (112 μl, 0.804 mmol)에 이어서 삼산화황 피리딘 착물 (51.2 mg, 0.321 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT로 가온되도록 하고, 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 DCM (30 mL)으로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (10 mL), H2O (2 x 10 mL), 및 포화 수성 NaHCO3 (10 mL)으로 순차적으로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 이스코 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피 (24 g 칼럼; 구배 0-100% EtOAc-CH2Cl2)에 의해 정제하여 케톤 47을 수득하였다 (112 mg, 0.084 mmol, 52.4% 수율).
LCMS (M+H) = 930.5.
DCM (2 mL) 중 케톤 47 (112 mg, 0.120 mmol)의 용액에 2,6-루티딘 (0.028 mL, 0.241 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 용액을 -78℃로 냉각시켰다. 이어서, 트리플산 무수물 (0.030 mL, 0.180 mmol)을 적가하였다. 반응물을 0℃로 천천히 가온하고, 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 염수로 켄칭하고, DCM으로 추출하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (0-10% MeOH/DCM, 24 g 칼럼)를 사용하여 정제하여 트리플레이트 48을 수득하였다 (81 mg, 0.076 mmol, 63.3% 수율).
LCMS (M+H) = 1062.
상부에 스크류 마개를 갖춘 바이알에 트리플레이트 48 (81 mg, 0.076 mmol), 4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)아닐린 48a (20.03 mg, 0.091 mmol) 및 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II) (2.79 mg, 3.81 μmol)을 첨가하였다. 바이알을 배기시키고, N2로 재충전하였다. THF (2 mL) 및 수성 K3PO4의 용액 (1 M, 0.38 μl, 0.38 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 하에 45℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 EtOAc로 희석하고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 조 물질을 이스코 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피 (12 g 칼럼; 선형 구배 0-100% EtOAc-Hex)를 사용하여 정제하여 화합물 49를 수득하였다 (53 mg, 0.053 mmol, 69.1% 수율).
LCMS (M+H) = 1006.3.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.41 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.29 - 7.20 (m, 6H), 6.91 - 6.80 (m, 2H), 6.68 (d, J=8.6 Hz, 2H), 5.51 (dd, J=11.9, 10.0 Hz, 2H), 5.13 (d, J=15.4 Hz, 1H), 4.75 (dd, J=16.8, 10.0 Hz, 2H), 4.60 (dd, J=10.6, 3.4 Hz, 1H), 4.39 (d, J=15.3 Hz, 1H), 4.33 - 4.21 (m, 5H), 3.93 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.80 - 3.74 (m, 3H), 3.69 (tdd, J=9.5, 7.2, 5.0 Hz, 2H), 3.51 (dd, J=15.5, 7.5 Hz, 1H), 3.12 (ddd, J=16.1, 10.6, 2.1 Hz, 1H), 3.03 - 2.87 (m, 1H), 2.44 (t, J=5.9 Hz, 2H), 1.03 - 0.92 (m, 4H), 0.04 (s, 9H), 0.03 (s, 9H).
-78℃에서 THF (1 mL) 중 화합물 49 (7mg, 6.96 μmol)의 용액에 리튬 트리에틸보로히드라이드의 용액 (0.070 mL, 0.070 mmol, THF 중 1M)을 적가하였다. 반응물을 -78℃에서 1시간 동안 교반한 후, 이것을 염수로 켄칭하였다. 혼합물을 10% MeOH/클로로포름 (3x)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 THF/EtOH (1:1, 2 mL)에 녹였다. 수성 포름산 (0.05%, 1 mL)을 첨가하였다. 이어서, 반응물을 RT에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 수성 NaHCO3으로 중화시키고, 클로로포름 (3x)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 농축시키고, 이스코 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피 (0-6% MeOH/DCM, 4 g 칼럼)를 사용하여 정제하여 이량체 (IIb-03)을 수득하였다 (2.1 mg, 2.65 μmol, 38.1% 수율).
LCMS (M+H) = 714.0.
실시예 12 - 이량체 (IIa-16) 및 (IIa-18)
본 실시예 및 도 10 및 11은 이량체의 2개의 반쪽을 연결시키는 가교 내에 아민 기를 갖는 이량체의 합성에 관한 것이며, 이러한 아민 기는 링커의 부착에 적합한 관능기이다. (상기 논의된 유형 (a) 이량체-링커 화합물 참조.)
이량체 (IIa-16) ((6aS,6a'S)-3,3'-((아잔디일비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(2-메톡시-6a,7-디히드로벤조[5,6][1,4]디아제피노[1,2-b]이소퀴놀린-14(12H)-온))의 합성을 위한 반응식은 도 10에 제시되어 있다.
0℃에서 아세토니트릴 (50 mL) 중 2,2'-아잔디일디에탄올 50 (5 g, 47.6 mmol, 플루카) 및 K2CO3 (6.57 g, 47.6 mmol)의 현탁액에 알릴 클로로포르메이트 12a (5.07 mL, 47.6 mmol)를 첨가하고, RT에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS는 생성물의 형성을 나타내었다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 물 (200 mL)로 켄칭하고, EtOAc (3 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 포화 NaHCO3 (100 mL), 물 (100 mL), 및 염수 (100 mL)로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시켜 카르바메이트 51을 담황색 오일로서 수득하였다 (2.55 g, 13.48 mmol, 28.3% 수율).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.94 (m, 1H), 5.32 (dd, J = 17.6, 1.6 Hz, 1H), 5.24 (dd, J = 10.4, 1.2 Hz, 1H), 4.62 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 3.84 (d, J = 12.4 Hz, 2H), 3.52 (s, 2H), 2.86 (s, 2H).
LCMS: [M+1] = 190.1.
0℃에서 DCM (5 mL) 중 카르바메이트 51 (600 mg, 3.17 mmol) 및 NEt3 (1.768 mL, 12.68 mmol)의 용액에 DCM (5 mL) 중 TsCl (1814 mg, 9.51 mmol)을 첨가하고, RT에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 생성물 형성을 나타내었다. 반응 용액을 농축시키고, 조 생성물을 콤비플래쉬(COMBIFLASH)™ 상에서 80 g 실리카 칼럼 및 0-70% EtOAc/헥산을 사용하여 25분에 걸쳐 정제하였다. 70% 분획은 화합물 52를 농후한 오일로서 제공하였다 (54% 수율).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78 (m, 4H), 7.38 (m, 4H), 5.82 (m, 1H), 5.22 (m, 2H), 4.48 (m, 2H), 4.13 (m, 4H), 3.52 (m, 4H), 2.47 (s, 6H).
LCMS: [M+Na] = 520.1.
DMSO (1.5 mL) 중 화합물 52 (39.8 mg, 0.080 mmol) 및 화합물 6 (80 mg, 0.176 mmol) 및 K2CO3 (33.2 mg, 0.240 mmol)의 용액을 50℃에서 19시간 동안 교반하였다. LCMS는 생성물에 상응하는 주요 피크를 나타내었다. 반응 혼합물을 AcOH (0.027 mL, 0.480 mmol, 30 mL)를 함유하는 물에 부었다. 포화 염수 (10 mL)를 첨가하고, EtOAc (3x15 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 농축시키고, 이스코 콤비플래쉬™ 24 g 칼럼 상에서 30분에 걸쳐 0-100% EtOAc/헥산을 사용하여 정제하였다. 70% EtOAc/헥산 분획은 화합물 53을 제공하였다 (64% 수율).
LCMS (m+1) = 1062.5.
THF (4 mL) 중 화합물 53 (54 mg, 0.051 mmol)의 용액에 모르폴린 (0.022 mL, 0.254 mmol) 및 Pd(Ph3P)4 (2.94 mg, 2.54 μmol)를 첨가하고, 질소 분위기 하에 RT에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 농축시키고, 이스코 콤비플래쉬™ 24 g 칼럼 상에서 0-8% MeOH/DCM을 사용하여 정제하여 화합물 54를 백색 고체로서 수득하였다 (64% 수율).
LCMS: (m+1) = 978.5.
THF (4 mL) 중 화합물 54 (35 mg, 0.036 mmol)의 용액에 -76℃에서 LiEt3BH (0.179 mL, 0.179 mmol)를 첨가하였다. 용액을 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응물을 냉수 (20 mL)로 켄칭하고, 반응 혼합물을 CHCl3 (3x10 mL)으로 추출하였다. 생성된 잔류물을 DCM/EtOH/물 (1:2:1 = 4 mL) 및 실리카 겔 (1g)로 4일 동안 처리하였다. 이 혼합물을 소결 유리 깔때기를 통해 여과하고, 실리카 겔을 CHCl3-MeOH (8:2, 100 mL)로 세척하였다. 여과물을 고진공 하에 농축시키고, 24 g 실리카 겔 칼럼 상에서 MeOH/DCM을 사용하여 정제하였다. 20% MeOH/DCM 분획은 이량체 (IIa-16)을 65% 수율로 제공하였다.
LCMS: (m+1) = 686.3.
이량체 (IIa-18)을 2-아미노-프로판올-1,3-디올 55로부터 출발하고 화합물 56, 57, 58, 및 59를 통해 진행하여 유사하게 제조하였다.
화합물 56: 담황색 오일, 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.94 (m, 1H), 5.50 (brs, 1H), 5.29 (m, 2H), 4.60 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 3.83 (m, 5H). LCMS (m+1) = 176.
화합물 57: 백색 고체, 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78 (m, 4H), 7.38 (m, 4H), 5.88 (m, 1H), 5.25 (m, 2H), 5.02 (brs, 1H), 4.53 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 4.09 (m, 5H), 2.48 (s, 6H).
화합물 58: MS (m+1) = 1048.
화합물 59: LCMS (m+1) = 964.46.
이량체 (IIa-18): LCMS (m+1) = 672.3.
실시예 13 - 유형 (a) 이량체-링커 (IIIa-01)
본 실시예 및 도 12는 유형 (a) 이량체-링커 (IIIa-01)의 제조를 기재한다.
100 mL 둥근 바닥 플라스크에 Fmoc-Val-Cit 60 (문헌 [Firestone et al., US 6,214,345 B1 (2001), Example 56], 363 mg, 0.731 mmol), HATU (278mg, 0.731 mmol), 및 DMF (20 mL)를 첨가하였다. 생성된 용액을 0℃에서 10분 동안 교반한 후, 2,6-루티딘 (0.113 mL, 0.97 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 화합물 24f (500 mg, 0.487 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT로 천천히 가온하고, 5시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 10% LiCl 용액으로 켄칭하고, EtOAc (3x)로 추출하였다. 합한 유기 층을 10% LiCl에 이어서 염수로 세척한 후, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물 혼합물을 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g 칼럼, 15분 내에 0%에서 10% MeOH / DCM의 구배)를 사용하여 정제하여 화합물 61a를 수득하였다 (520 mg, 71% 수율).
LCMS (M+1) = 1504.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.83 - 7.69 (m, 4H), 7.58 (br. s., 2H), 7.45 - 7.17 (m, 16H), 7.15 - 6.93 (m, 1H), 5.45 (d, J=10.1 Hz, 2H), 5.24 - 4.97 (m, 7H), 4.71 (d, J=9.7 Hz, 5H), 4.56 - 4.02 (m, 8H), 3.87 (s, 6H), 3.79 - 3.49 (m, 8H), 3.03 (d, J=6.4 Hz, 3H), 1.77 (s, 7H), 1.09 - 0.82 (m, 11H), 0.10 - 0.10 (m, 18H).
DMF (7.7 mL) 중 화합물 61a (580 mg, 0.385 mmol)의 용액에 피페리딘 (191 μl, 1.927 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 조 생성물 혼합물을 농축시키고, 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (40 g 칼럼, 15분 내에 0%에서 10% MeOH / DCM의 구배)를 사용하여 정제하여 화합물 61b를 수득하였다 (318 mg, 64% 수율).
LCMS (M+1) = 1282.
THF (4 mL) 중 화합물 61b (200 mg, 0.156 mmol)의 -78℃ 용액에 LiEt3BH의 용액 (0.780 mL, 0.780 mmol) (THF 중 1M)을 첨가하였다. 반응물을 -78℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 물로 켄칭하고, 클로로포름 (2x)에 이어서 클로로포름/MeOH (2x)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 건조시키고, 농축시켰다. 이어서, 잔류물을 클로로포름/EtOH/물 (1:1:1, 4 mL)에 녹이고, 실리카 겔 (0.7 g)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 RT에서 3일 동안 교반한 후, 이것을 셀라이트™ 플러그를 통해 여과하고, 클로로포름으로 세척하고, 농축시켰다. 물질을 DMF에 녹이고, 역상 HPLC에 의해 정제하여 화합물 62를 수득하였다 (57 mg, 36.9% 수율).
LCMS (M+H) = 990.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.62 - 7.50 (m, 2H), 7.50 - 7.25 (m, 12H), 6.88 - 6.68 (m, 1H), 5.33 - 4.67 (m, 6H), 4.66 - 4.29 (m, 3H), 4.02 - 3.69 (m, 6H), 3.47 - 2.84 (m, 6H), 2.46 - 1.74 (m, 2H), 1.59 (br. s., 4H), 1.09 - 0.74 (m, 6H).
DMSO (1.4 mL) 중 화합물 62 (23 mg, 0.023 mmol) 및 화합물 62a (퀀타바이오로부터 MAL-dPEG8-NHS® 에스테르로서 입수가능함; 32 mg, 0.046 mmol)의 용액에 2,6-루티딘 (5.41 μl, 0.046 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT에서 2시간 동안 교반하였다. 조 생성물 혼합물을 여과하고, 역상 HPLC (칼럼: 루나 C18 20x100mm; 이동상 A: 10:90 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 이동상 B: 90:10 아세토니트릴:물, 0.1% 트리플루오로아세트산 포함; 구배: 17분에 걸쳐 20-70% B; 유량: 20 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV)에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 PL-HCO3 MP 500 mg 카트리지 (애질런트)에 통과시켰다. 여과물을 중력에 의해 수집하고, 칼럼을 ACN 4 mL로 세척하였다. 합한 여과물을 농축시키고, 동결건조시켜 이량체-링커 (IIIa-01)을 수득하였다 (3 mg, 35.8% 수율).
LCMS (M+1) = 1564.
실시예 14 - 유형 (a) 이량체-링커 (IIIa-02)
본 실시예 및 도 13은 유형 (a) 이량체-링커 (IIIa-02)의 제조를 기재한다.
DMSO (0.2 mL) 중 카르보네이트 63 (2 mg, 2.92 μmol, 제조는 상기 기재됨) 및 이량체 (IIa-16) (3.92 mg, 3.50 μmol)의 용액에 DIEA (1.528 μL, 8.75 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 밤새 교반하였다. R-HPLC에 의해 30분에 걸쳐 아세토니트릴/물 (0.05% 포름산)을 사용하여 정제하여 생성물-함유 분획을 수득하였으며, 이를 염기성 수지 (PL-HCO3 MP -수지 1.8 mmol/g; 애질런트 파트 # PL3540-C603)를 통해 여과하고, 아세토니트릴 (5 mL)로 세척하였다. 동결건조시켜 이량체-링커 (IIIa-02)를 백색 고체로서 52% 수율로 수득하였다.
LCMS (m+1) = 1666.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 이러한 및 상기 실시예에서의 유형 (a) 이량체 링커 화합물을 제조하기 위한 절차가 필요한 변경을 가하여 다른 유형 (a) 이량체 링커 화합물에 대해 적합화될 수 있음을 인지할 것이다.
실시예 15 - 유형 (b) 이량체-링커 화합물
본 실시예 및 도 14-16은 유형 (b) 이량체-링커 화합물의 합성에 사용되는 화합물 73 및 74의 제조, 및 이들로부터의 이러한 이량체-링커 화합물의 제조에 관한 것이다.
플라스크에 0℃에서 DCM (100 mL) 중 5-메톡시-2-니트로-4-((트리이소프로필실릴)옥시)벤조산 64 (CAS 등록 번호 1430738-03-6, 9.0 g, 24.36 mmol) 및 HATU (10.19 g, 26.8 mmol)를 채웠다. 반응 혼합물을 10분 동안 교반하고, DIEA (4.68 mL, 26.8 mmol) 및 이소퀴놀린 65 (CAS 등록 번호 215928-81-7, 7.43 g, 26.8 mmol)로 처리하였다. 반응물을 0℃에서 3시간 동안 유지한 다음, RT에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NH4Cl 및 DCM에 부었다. 유기 상을 수집하고, 잔류물로 농축시켰다. 잔류물을 추가로 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 헥산 중 10%-30% EtOAc로 용리시키면서 정제하였다. 생성물을 수집하고, 농축시켜 아미드 66을 담황갈색 오일로서 수득하였다 (10.15g, 66% 수율).
LCMS M+H=629.65.
MeOH (200 mL) 중 아미드 66 (10.1 g, 16.06 mmol)의 용액을 0℃로 냉각시키고, NH4Cl (4.29 g, 80 mmol) 및 아연 분진 (5.25 g, 80 mmol)을 첨가하였다. 생성된 녹색 현탁액을 0℃에서 45분 동안 교반한 다음, RT로 밤새 가온되도록 하였다. 반응 혼합물을 셀라이트™ 패드를 통해 (MeOH로 세척하면서) 여과하고, 여과물을 잔류물로 농축시켰다. 잔류물을 DCM에 녹이고, 실리카 겔 패드 상에 로딩하였다. 이를 50% EtOAc 및 헥산으로 플러싱하여 아닐린 67을 수득하였다 (8.02g, 83% 수율).
LCMS M+H=599.35.
아닐린 67 (2500 mg, 4.17 mmol)을 DCM (50 mL) 중에 용해시키고, 피리딘 (0.878 mL, 10.85 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 -78℃로 냉각시키고, 알릴 클로로포르메이트 12a (0.579 mL, 5.43 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 이 온도에서 1시간 동안 유지한 다음, RT로 가온되도록 하였다. 반응 혼합물을 포화 NH4Cl 및 DCM에 부었다. 혼합물을 DCM으로 추출하고, 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 헥산 중 10%-50% EtOAc로 용리시키면서 정제하여 카르바메이트 68을 수득하였다 (2.5g, 88% 수율).
LCMS M+H=683.40.
카르바메이트 68 (1.372g, 2.009 mmol)을 MeOH (20 mL) 중에 용해시켰다. MeOH 중 10% 농도의 HCl (2 mL, 6.58 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 20분 동안 숙성시키고, 물 중 NaHCO3 (0.591 g, 7.03 mmol)으로 켄칭하였다. 혼합물을 물로 희석하고, DCM으로 4x 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 10-50% EtOAc/헥산으로 용리시키면서 정제하여 알콜 69를 수득하였다 (963mg, 84% 수율).
LCMS M+H=569.25.
옥살릴 클로라이드 (2.0M, 1.450 mL, 2.90 mmol)를 DCM (30 mL) 중에 용해시킨 다음, 혼합물을 드라이 아이스/아세톤 조에서 -78℃로 냉각시켰다. 여기에 DMSO (0.515 mL, 7.25 mmol, 첨가 동안의 동결을 방지하기 위해 ~2mL DCM 중에 용해됨)을 첨가하고, 온도를 -78℃에서 유지하였다. 20분 후, DCM (10 mL) 중에 용해시킨 알콜 69 (1.65 g, 2.90 mmol)를 반응물에 첨가하였다. 이를 추가로 30분 동안 교반되도록 하고, 이어서 NEt3 (2.022 mL, 14.50 mmol)을 첨가하였다. 10분 후, 반응물을 RT로 가온되도록 하였다. 이를 포화 NH4Cl로 켄칭하고, DCM (2x)으로 추출하였다. 유기 상을 합하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 잔류물로 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 헥산 중 30%-100% EtOAc로 용리시키면서 정제하였다. 생성물을 수집하고, 농축시켜 아미날 70을 백색 고체로서 수득하였다 (1.51g, 92% 수율).
LCMS M+H = 567.30.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.39 - 7.24 (m, 5H), 7.22 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 5.75 (dd, J=11.2, 5.6 Hz, 1H), 5.31 (dd, J=9.5, 4.0 Hz, 1H), 5.22 - 5.07 (m, 2H), 4.84 (d, J=15.8 Hz, 1H), 4.64 - 4.49 (m, 2H), 4.44 (d, J=5.3 Hz, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.77 - 3.61 (m, 1H), 3.28 - 3.01 (m, 3H), 1.34 - 1.18 (m, 3H), 1.09 (dd, J=7.4, 2.6 Hz, 18H).
아미날 70 (776 mg, 1.369 mmol)을 DCM (12 mL) 중에 용해시키고, 2,6-루티딘 (0.638 mL, 5.48 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, tert-부틸디메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트 (TBSOTf, 0.943 mL, 4.11 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 숙성시키고, DCM으로 희석하고, 포화 NaHCO3 용액으로 켄칭하고, DCM으로 2x 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 10-30% EtOAc/ 헥산으로 용리시키면서 정제하여 실릴 에테르 71을 수득하였다 (907.6 mg, 1.333 mmol, 97% 수율). 1H NMR은 정제된 물질이 ~0.25 당량 2,6-루티딘 (~4 중량%)으로 오염되었음을 나타내었지만, 이를 어떠한 추가 정제도 없이 사용하였다.
LCMS M+H = 681.25.
실릴 에테르 71 (907 mg, 1.332 mmol)을 DMF (5 mL) 및 물 (0.1 ml) 중에 용해시켰다. 아세트산리튬 (88 mg, 1.332 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 밤새 숙성시켰다. 대부분의 DMF를 질소의 스트림 하에 증발시켰다. 잔류물을 EtOAc로 희석하고, 0.1M 시트르산으로 2x 세척한 다음, 염수로 1회 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 30-70% EtOAc/헥산으로 용리시키면서 정제하여, 1H NMR에 의하면 약간의 EtOAc (대략 1.3 당량; 수율은 EtOAc를 해명하도록 조정됨)를 함유하는 페놀 72를 수득하였다 (707.4 mg, 1.107 mmol, 83% 수율).
LCMS M+H = 525.10.
페놀 72 (290 mg, 0.553 mmol)를 아세톤 (2800 μl) 및 탄산세슘 (180 mg, 0.553 mmol) 중에 용해시키고, 1,5-디아이오도펜탄 (400 μL, 2.69 mmol)을 첨가하였다. 바이알을 밀봉하고, 60℃로 밤새 가열하였다. 반응이 밤새 진행되도록 한 후, 용매를 증발시키고, 잔류물을 EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 혼합물을 2회 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 조 잔류물을 수득하였으며, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 10-50% EtOAc/헥산으로 용리시키면서 정제하여 화합물 73을 수득하였다 (381 mg, 96% 수율).
LCMS M+H = 721.10.
화합물 74를 1,3-디아이오도프로판을 사용하여 페놀 72로부터 유사하게 제조하였다.
이제 도 15의 반응식으로 전환하면, 화합물 67 (2.1g, 3.51 mmol)을 DCM (30 mL) 중에 용해시키고, 피리딘 (0.3 mL, 3.71 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 4-니트로페닐 카르보노클로리데이트 67a (0.707 g, 3.51 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 동일한 온도에서 7분 동안 숙성시켰다. DMF (3 mL) 중 화합물 75 (CAS 등록 번호 1343407-91-9, 1.323 g, 3.51 mmol) 및 DIEA (0.750 mL, 4.29 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 회전 증발기 상에 배치하여 DCM을 제거하였다. 20분 후, DMF를 질소의 스트림 하에 증발시킨 다음, 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 헥산 중 10-100% EtOAc로 용리시키면서 정제하여 화합물 76을 수득하였다 (1.579 g, 1.575 mmol, 44.9% 수율).
LCMS M+H=1002.50.
MeOH (14.4 ml) 중 화합물 76 (1.579g, 1.575 mmol)의 용액을 MeOH 중 10% 농도의 HCl (1.6 ml, 5.27 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 30분 동안 숙성시키고, 포화 NaHCO3으로 켄칭하고, 클로로포름 (3x)으로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 정제를 위해 동일한 반응의 또 다른 배치 (0.816g의 화합물 76으로 출발함)와 합하였다. 합한 조 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 20-100% EtOAc/헥산으로 용리시키면서 정제하여 카르바메이트 77을 수득하였다 (1.7412 g, 1.961 mmol, 82% 수율).
LCMS M+H=888.30.
10 mL DCM 중 옥살릴 클로라이드의 용액 (2.0M, 1.00 mL, 2.000 mmol)을 -78℃로 냉각시켰다. 5mL DCM 중 DMSO (0.348 mL, 4.90 mmol)의 용액을 적가하고, 혼합물을 동일한 온도에서 10분 동안 숙성시켰다. 5mL DCM 중 카르바메이트 77 (1741.2 mg, 1.961 mmol)의 용액을 적가하고, 혼합물을 15분 동안 다시 숙성시켰다. NEt3 (1.366 mL, 9.80 mmol)을 적가하고; 혼합물을 동일한 온도에서 5분 동안 숙성시킨 다음, 냉각 조를 제거하고, 혼합물을 RT로 가온되도록 하였다. 혼합물을 NH4Cl 용액으로 켄칭하고, DCM으로 2회 추출하였다. 합한 유기 상을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 50-80% EtOAc/헥산으로 용리시키면서 정제하여 화합물 78을 수득하였다 (1376.7 mg, 1.554 mmol, 79% 수율).
LCMS M+H=886.30.
화합물 78 (1045 mg, 1.179 mmol)을 DCM (10 ml) 중에 용해시키고, 2,6-루티딘 (0.549 ml, 4.72 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, TBSOTf (0.813 ml, 3.54 mmol)를 첨가하였다. 1시간 후, 혼합물을 DCM으로 희석하고, 포화 NaHCO3 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 20-100% EtOAc/헥산으로 용리시키면서 정제하였다. 약간 혼합된 분획을 수득하였으며, 이를 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 50% EtOAc/헥산 (등용매)으로 용리시키면서 재정제하였다. 순수한 분획을 합하여 화합물 79를 수득하였다 (676.9 mg, 0.677 mmol, 57.4% 수율).
LCMS M+H=1000.30.
DMF (5 mL) 및 물 (0.1 mL) 중 화합물 79 (676 mg, 0.676 mmol)의 용액을 아세트산리튬 (44.6 mg, 0.676 mmol)으로 처리하였다. 혼합물을 밤새 숙성시키고, 용매를 질소의 스트림 하에 증발시켰다. 잔류물을 EtOAc와 0.1M 시트르산 사이에 분배하였다. 상을 분리하고, 유기 상을 0.1M 시트르산으로 2회 세척하고, 염수로 1회 세척한 다음, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 50-100% EtOAc/헥산으로 용리시키면서 정제하여 화합물 80을 수득하였다 (543.6 mg, 0.644 mmol, 95% 수율).
LCMS M+H=844.35.
이제 도 16으로 전환하면, 이는 상기 제조된 중간체 화합물 73 및 80을 이량체-링커 (IIIb-01)을 제조하는데 사용된 반응식을 제시한다.
아세톤 (1884 μl) 중 화합물 73 (326 mg, 0.452 mmol) 및 화합물 80 (318 mg, 0.377 mmol)의 용액을 탄산세슘 (123 mg, 0.377 mmol)으로 처리하였다. 혼합물을 함유하는 바이알을 밀봉하고, 60℃에서 가온하였다. 반응이 밤새 진행되도록 한 후, 반응 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 0.1M 시트르산 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 50-80% EtOAc/헥산으로 용리시키면서 정제하였다. 이렇게 하여 근접-용리 불순물로 오염된 화합물 81을 수득하였다 (338 mg, 0.235 mmol, 62.4% 수율). 혼합물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다 (수율은 순도에 대해 보정되지 않았음).
LCMS M+H = 1436.65. HRMS 실측치 M+H = 1436.6881, 계산치 = 1436.6916. 근접-용리 불순물에 대한 HRMS, M+H = 1378.6485.
THF (2 mL) 중 화합물 81 (107 mg, 0.074 mmol, 이전 단계로부터의 불순한 것)의 용액에 테트라부틸 암모늄 플루오라이드 (TBAF, 1.0M, 0.16 mL, 0.160 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 숙성시키고, EtOAc로 희석하고, 순차적으로 물, 포화 NaHCO3 및 염수로 세척한 다음, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 조 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 1-10% MeOH/DCM으로 용리시키면서 정제하여 근접 용리 불순물로 오염된 화합물 82를 수득하였다 (71 mg, 0.059 mmol, 79% 수율) (수율은 순도에 대해 보정되지 않았음).
LCMS M+Na = 1230.25. HRMS 실측치 M+H = 1208.5170, 계산치 = 1208.5187. 근접-용리 불순물에 대한 HRMS, M+H = 1150.4755.
바이알에 화합물 82 (71 mg, 0.059 mmol, 이전 단계로부터의 불순한 것)를 채우고, DCM 중 피롤리딘의 0.042 M 용액 (3.50 mL, 0.147 mmol)을 첨가하고, 이어서 팔라듐 테트라키스트리페닐포스핀 (4.07 mg, 3.53 μmol)을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 숙성시키고, DCM으로 희석하고, 포화 NH4Cl로 세척하였다. 수성부를 DCM으로 재추출하고, 유기 상을 합하고, 염수로 세척하고, 염수 층을 다시 DCM으로 재추출하고, 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 DMF 중에 용해시키고, 3회 주입에 걸쳐 정제용 HPLC (선파이어 C18 정제용 OBD 칼럼 19x100mm, 용매 A = 95% 물, 5% ACN + 0.1% TFA, 용매 B = 55% 물, 95% ACN + 0.1% TFA; 구배는 10분에 걸쳐 0-100%B, 및 12분까지 유지였음, 분획은 254nm에서의 UV에 의해 수집하였음)에 의해 정제하였다. 정제된 분획을 PL-HCO3- MP SPE 500mg/6mL 카트리지에 통과시켜 유리 염기로서의 생성물을 수득하였다. 유리 염기의 용액을 증발시켜 화합물 83을 수득하였다 (30 mg, 0.029 mmol, 49.9% 수율).
LCMS M+H=1022.25.
바이알에 화합물 83 (18.10 mg, 0.059 mmol)에 이어서 DMF 중 0.05M DIEA (0.8 ml, 0.040 mmol)를 채웠다. 이 혼합물을 밤새 숙성되도록 한 다음, DMF (~0.4mL)로 희석하고, 정제용 HPLC (1회 주입) (선파이어 C18 정제용 OBD 칼럼 19x100mm, 용매 A = 95% 물, 5% ACN + 0.1% TFA, 용매 B = 55% 물, 95% ACN + 0.1% TFA; 구배는 10분에 걸쳐 0-100%B, 및 12분까지 유지였음, 분획은 254nm에서의 UV에 의해 수집하였음)에 의해 정제하였다. 정제된 분획을 PL-HCO3- MP SPE 500mg/6mL 카트리지에 통과시켜 유리 염기로서의 이량체-링커 (IIIb-01)을 수득하였다 (19.6 mg, 0.015 mmol, 52.2% 수율).
LCMS M+H=1216. HRMS 실측치 M+H=1215.5387, 계산치 = 1215.5397.
유사하게 상기 기재된 절차에 따라, 추가의 이량체-링커 화합물을 제조하였다:
(a) 화합물 74 및 80을 사용하여 이량체-링커 (IIIb-03)을 제조하였다: LCMS M+H=1187.20. HRMS 실측치 M+H=1187.5087, 계산치 = 1187.5084.
(b) 이량체-링커 (IIIb-01) 및 (IIIb-03)을 소듐 시아노보로히드라이드를 사용하여 환원시켜 이량체-링커 (IIIb-05) (LCMS (M+2H)/2=609.55. HRMS 실측치 M+H=1217.5561, 계산치 = 1217.5554) 및 (IIIb-06) (LCMS M+H=1189. HRMS 실측치 M+H=1189.5268, 계산치 = 1189.5241)을 각각 수득하였다.
(c) 화합물 83을 화합물 62a와의 커플링에 의해 이량체-링커 (IIIb-02)로 전환시켰다: LCMS (M+2H)/2=799.25. HRMS 실측치 M+H=1596.7390, 계산치 = 1596.7396.
(d) 화합물 81을 팔라듐 테트라키스트리페닐포스핀으로의 환원 및 화합물 84와의 커플링에 의해 이량체-링커 (IIIb-04)로 전환시켰다: LCMS M+H=1329. HRMS 실측치 M+H=1329.6247, 계산치 = 1329.6262.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 유형 (b) THIQ-PBD 이량체-링커 화합물을 PBD 당량의 화합물 73 또는 74 또는 화합물 80을 사용하여 또는 달리 유사하게 상기 기재된 절차에 따라 제조할 수 있음을 인지할 것이다.
실시예 16 - 유형 (c) 이량체-링커
화합물 39 (실시예 10)로부터의 Alloc 기의 제거에 의해 제조된 화합물 85를 화합물 60과 커플링시키고, 유사하게 상기 기재된 절차에 따라 화합물 86으로 전환시켰다.
DMSO (0.7 mL) 중 화합물 86 (9.6 mg, 10.04 μmol) 및 2,6-디메틸피리딘 (2.152 mg, 0.020 mmol)의 용액에 DMSO (100 uL) 중 MAL-dPEG®8-NHS 에스테르 (13.85 mg, 0.020 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 RT에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 용액을 아세토니트릴로 희석하고, 여과하고, 역상 HPLC (칼럼: 루나 C18 20x100mm; 이동상 A: 10:90 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 이동상 B: 90:10 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 구배: 15분에 걸쳐 0-70% B; 유량: 20 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV)를 사용하여 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 PL-HCO3 MP 500 mg 카트리지 (애질런트)에 통과시켰다. 여과물을 중력에 의해 수집하고, 칼럼을 ACN 4 mL로 세척하였다. 합한 여과물을 농축시키고, 동결건조시켜 이량체-링커 (IIIc-01)을 수득하였다 (9.4 mg, 5.53 μmol, 55.0% 수율).
LCMS (M+H) = 1530.
화합물 87 (LCMS (M+2H) = 435.9)을 필요한 변경을 가하여 유사하게 상기 기재된 절차에 따라 화합물 85로부터 제조하였다.
DMSO (0.2 mL) 중 화합물 87 (5 mg, 5.75 μmol) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥사노에이트 (1.949 mg, 6.32 μmol)의 용액에 2,6-루티딘 (1.339 μl, 0.011 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 DMF (1 mL)로 희석하고, 여과하고, 역상 HPLC (칼럼: 루나 C18 20x100mm; 이동상 A: 10:90 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 이동상 B: 90:10 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 구배: 15분에 걸쳐 20-80% B; 유량: 20 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV)를 사용하여 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 PL-HCO3 MP 500 mg 카트리지 (애질런트)에 통과시켰다. 여과물을 중력에 의해 수집하고, 칼럼을 아세토니트릴 4 mL로 세척하였다. 합한 여과물을 농축시키고, 동결건조시켜 이량체 링커 (IIIc-07)을 수득하였다 (1.8 mg, 1.524 μmol, 26.5% 수율).
LCMS (M+H) = 1063.4.
화합물 88을 유사하게 상기 절차에 따라 화합물 49로부터 제조하였다.
LCMS (M+H) = 884.7
DMSO (0.2 mL) 중 화합물 84 (12.03 mg, 0.039 mmol) 및 화합물 88 (23 mg, 0.026 mmol)의 용액에 2,6-루티딘 (6.06 μl, 0.052 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT에서 5시간 동안 교반한 다음, DCM으로 희석하고, 이스코 실리카 겔 크로마토그래피 (0-15% MeOH/DCM, 12 g 칼럼)를 사용하여 정제하였다. 이어서, 목적 생성물을 함유하는 분획을 농축시켜 미황색 발포체를 수득하였으며, 이를 H2O/THF (2:1, 4 mL)에 녹이고, 동결건조시켜 이량체-링커 (IIIc-08)을 수득하였다 (9.5 mg, 7.94 μmol, 30.5% 수율).
LCMS (M+H) = 1077.8.
실시예 17 - 링커 내에 자기-희생 기를 갖는 유형 (c) 이량체-링커
본 실시예는 링커가 PABC 자기-희생 기를 갖는 것인 이량체-링커 화합물, 예컨대 이량체-링커 (IIIc-02)의 제조를 예시한다. 링커 모이어티를 하기 제시된 바와 같이 조립하였다:
DMF (2 ml) 및 THF (8 mL) 중 화합물 89 (문헌 [Firestone et al. US 6,124,345 B1 (2001), Example 57]; 0.75 g, 1.246 mmol)의 용액에 디에틸아민 (2.81 ml, 26.9 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT에서 1.5시간 동안 교반하고, 농축시켰다. 조 생성물을 DCM으로 연화처리하고, 여과하고, 진공 하에 건조시켜 화합물 90을 백색 고체로서 수득하였다.
LCMS (M+H) = 380.2.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.06 (s, 1H), 8.15 (d, J=7.3 Hz, 1H), 7.56 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.26 (d, J=8.3 Hz, 2H), 6.00 (t, J=5.4 Hz, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.13 (t, J=5.3 Hz, 1H), 4.56 - 4.33 (m, 3H), 3.07 - 2.93 (m, 3H), 2.00 - 1.55 (m, 5H), 1.49 - 1.32 (m, 2H), 0.90 (d, J=6.8 Hz, 3H), 0.80 (d, J=6.8 Hz, 3H).
DMSO (2 mL) 중 화합물 90 (79 mg, 0.209 mmol)의 용액에 DMSO (1 mL) 중 MAL-dPEG®8-NHS 에스테르 (120 mg, 0.174 mmol)의 용액에 이어서 2,6-루티딘 (37.3 mg, 0.348 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT에서 3시간 동안 교반하였다. DMF (2 mL) 중 비스(4-니트로페닐) 카르보네이트 (63.5 mg, 0.209 mmol)의 용액을 첨가하고, 이어서 2,6-루티딘 (37.3 mg, 0.348 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 반응물을 RT에서 12시간 동안 교반하였다. 이어서, DIPEA (0.061 mL, 0.348 mmol)를 첨가하고, 반응물을 RT에서 3시간 동안 교반하였다. 조 생성물 혼합물을 DMF로 희석하고, 여과하고, 역상 HPLC (칼럼: 페노메넥스 루나 C18 20x100mm; 이동상 A: 10:90 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 이동상 B: 90:10 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 구배: 15분에 걸쳐 0-70% B; 유량: 20 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV)를 사용하여 정제하여 화합물 63을 수득하였다 (40 mg, 0.036 mmol, 20.54% 수율).
LCMS (M+H) = 1119.5.
화합물 (IIa-10) (3.5mg, 5.00 μmol)에 DMSO (0.16 mL) 중 화합물 91 (5.60 mg, 5.00 μmol)의 용액에 이어서 DIPEA (2.62 μL, 0.015 mmol), 및 HOAt (0.6 mg, 5.00 μmol)를 첨가하였다. 반응물을 RT에서 24시간 동안 교반하고, DMF로 희석하고, 여과하고, 역상 HPLC (칼럼: 페노메넥스 루나 C18 20x100 mm; 이동상 A: 10:90 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 이동상 B: 90:10 아세토니트릴:물, 0.1% TFA 포함; 구배: 15분에 걸쳐 20-80% B; 유량: 20 mL/분; 검출: 220 nm에서의 UV)를 사용하여 정제하여 이량체-링커 (IIIc-02)를 백색 고체로서 수득하였다 (2.1 mg, 1.188 μmol, 23.74% 수율).
LCMS (M+H) = 1679.6.
유사하게 상기 절차에 따라, 자기-희생 기를 갖는 추가의 이량체-링커 화합물을 제조하였다:
(IIIc-03) LCMS (M+2H)/2 = 876.1.
(IIIc-04) LCMS (M+2H)/2 = 790.5.
(IIIc-05) LCMS (M+H) = 1650.9.
(IIIc-06) LCMS (M+H) = 1593.9.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 유형 (c)이거나 또는 달리 PABC 자기-희생 기 또는 다른 것을 갖는 다른 이량체-링커 화합물을 필요한 변경을 가하여 유사하게 제조할 수 있음을 인지할 것이다.
실시예 18 - THIQ-AZI 이량체
본 실시예 및 도 17은 특정한 이량체 (IIc-01)에서의 THIQ-AZI 이량체의 제조에 관한 것이다.
파르 병에 에탄올 (60 mL) 및 아세트산 (10 mL) 중에 현탁된 화합물 90a (CAS 등록 번호 1210045-50-3, 3.0 g, 8.27 mmol) 및 탄소 상 수산화팔라듐 (20%, 50% 습윤; 1.0 g, 0.712 mmol)을 채웠다. 이를 파르 장치에 두고, 55 psi 수소를 채웠다. 밤새 진탕한 후, 반응 혼합물을 셀라이트™를 통해 여과하고, 여과물을 농축시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 EtOAc로 희석하고, 포화 NaHCO3으로 세척하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 헥산 중 20%-50% EtOAc로 용리시키면서 정제하여 라세미 생성물을 투명한 오일로서 수득하였다 (2.49g, 83% 수율).
LCMS (M+H) =365.55.
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 8.44 - 8.16 (m, 2H), 7.79 - 7.42 (m, 1H), 4.48 (br. s., 1H), 3.74 (d, J=6.5 Hz, 2H), 3.36 - 3.18 (m, 1H), 3.18 - 3.00 (m, 1H), 1.65 - 1.49 (m, 9H), 0.75 (s, 9H), 0.11 - 0.23 (m, 6H).
이 라세미체를 추가로 키랄 SFC 크로마토그래피 (룩스 셀룰로스-2 21.2 x 250mm, 5uM 칼럼, 140 bar 및 35℃에서 CO2 중 30% 아세토니트릴로 용리시킴.)에 의해 정제하여 2개의 피크를 수득하였다. 제2 용리 피크 ((-) 이성질체))를 수집하여 아자인돌린 91을 무색 오일로서 수득하였다 (1.01g, 34% 전체 수율).
바이알에 MeOH (4 mL) 중 아자인돌린 91 (850 mg, 2.332 mmol)을 채웠다. 여기에 디옥산 중 4M HCl (8.5 ml, 34.0 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 RT에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 잔류물로 농축시킨 다음, MeOH 및 에테르에 녹였다. 이를 다시 (2x) 농축시켜 탈보호된 잔류물을 수득하였다. 이 잔류물을 아세토니트릴 (1 mL)과 함께 플라스크에 채웠다. 여기에 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 (TBS-Cl, 446 mg, 2.96 mmol) 및 이미다졸 (671 mg, 9.86 mmol)을 첨가하고, 반응물을 RT에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고, 포화 NH4Cl로 세척하였다. 유기 상을 2회 세척한 다음, 잔류물로 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 클로로포름 중 5% (10% NH4OH/MeOH)로 용리시키면서 정제하였다. 생성물을 수집하고, 투명한 오일로서의 화합물 92로 농축시켰다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) d 8.00 - 7.84 (m, 2H), 6.77 (br. s., 1H), 6.40 (d, J=5.8 Hz, 1H), 3.95 (dd, J=9.9, 5.1 Hz, 1H), 3.54 (d, J=5.8 Hz, 2H), 3.05 (dd, J=16.2, 9.9 Hz, 1H), 2.77 - 2.59 (m, 1H), 0.83 (s, 9H), 0.03 (d, J=7.5 Hz, 6H).
바이알에 5mL DMF 중 화합물 93 (CAS 등록 번호 313644-41-6, 420 mg, 0.863 mmol)을 채웠다. 여기에 HATU (821 mg, 2.159 mmol)를 첨가하였다. 30분 동안 숙성시킨 후, 2mL DMF 중 화합물 65 (252 mg, 0.907 mmol) 및 화합물 92 (240 mg, 0.907 mmol) 및 DIPEA (0.754 mL, 4.32 mmol)의 용액을 첨가하였다. 추가 1시간 동안 숙성시킨 후, 혼합물을 ~100mL 물이 들은 플라스크로 옮기고, 혼합물을 1N HCl로 산성화시켰다. 생성된 고체를 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하였다. 습윤 고체를 수집하고, DCM 중에 용해시키고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 조 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 0-10% MeOH/DCM으로 용리시키면서 정제하여 3종의 생성물을 수득하였다. 중간-용리 피크는 이종이량체 아미드 94였다 (353.1 mg, 0.356 mmol, 41.2% 수율).
LCMS (M+H) = 992.30.
아미드 94 (200 mg, 0.202 mmol)를 THF (2 mL) 중에 용해시켰다. 여기에 물 (200 μl, 11.10 mmol) 및 P(Me)3 (605 μL, 0.605 mmol)을 첨가하였다. ~30분 동안 숙성시킨 후, 용매를 증발시키고, 샘플을 톨루엔과 공비시켰다. 잔류물을 DCM (10 mL) 중에 용해시켰다. 피리딘 (0.08 mL, 1.00 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 -78℃로 냉각시켰다. 알릴 클로로포르메이트 12a (64.5 μL, 0.605 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 동일한 온도에서 30분 동안 교반한 다음, RT로 가온되도록 하였다. 혼합물을 NH4Cl로 켄칭하고, DCM으로 2회 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물을 7:1:1:2 AcOH/THF/MeOH/물 (총 3 mL) 중에 다시 용해시키고, 밤새 교반하였다. 탈보호가 부진하였기 때문에, 밤새 교반한 후, MeOH 중 10% HCl 0.5ml를 첨가하여, 추가로 30분 후에 완전한 탈보호를 생성하였다. 반응 혼합물을 조심스럽게 포화 NaHCO3에 옮겨 이것을 중화시켰다. 혼합물을 DCM으로 3회 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 조 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (바이오타지)에 의해 클로로포름 중 3-6% (10% NH4OH/MeOH)로 용리시키면서 정제하였다. 주요 피크를 수집하여 화합물 95를 수득하였다 (95.7 mg, 0.109 mmol, 54.0% 수율).
LCMS (M+H) = 880.15.
플라스크에 0.5mL DCM 중 DMSO (0.018 mL, 0.256 mmol)를 채우고, -78℃로 냉각시켰다. 옥살릴 클로라이드 (0.061 mL, 0.123 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 동일한 온도에서 10분 동안 숙성시키고, 그 시점에 0.5mL DCM 중 화합물 95 (45 mg, 0.051 mmol)의 용액을 적가하였다. 30분 동안 다시 숙성시킨 후, 트리에틸아민 (0.071 mL, 0.511 mmol)을 적가하였다. -78℃에서 30분 동안 교반한 후, 냉각 조를 제거하고, 반응 혼합물을 주위 온도로 가온되도록 하였다. 혼합물을 포화 NH4Cl로 켄칭하고, DCM으로 3회 추출하였다. 추출물을 NH4Cl로 3회, 염수로 1회 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 조 잔류물을 DCM (3 mL) 및 피롤리딘 (0.017 mL, 0.201 mmol) 중에 용해시키고, 팔라듐 테트라키스 트리페닐포스핀 (2.90 mg, 2.51 μmol)을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 숙성시키고, NH4Cl에 이어서 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 잔류물로 증발시켰다. 잔류물을 정제용 HPLC (선파이어 ACN/물 0.1% TFA)에 의해, 실행 전에 소듐 NaHCO3 용액을 튜브에 넣어 샘플을 즉시 중화시키면서 정제하였다. 주요 피크를 수집하여 과량의 용매를 증발시킨 다음, DCM으로 추출함으로써 목적 생성물을 수득하였다. 생성물을 바이오타지 DCM/MeOH 3-6% 단계 구배 (각 시간에 1% 증가)에 의해 재정제하였다. 주요 피크를 수집하고, 클로로포름과 다수회 공비시켜 메탄올을 제거하고, THIQ-AZI 이량체 (IIc-01)을 수득하였다 (7 mg, 8.34 μmol, 16.60% 수율).
LCMS (M+H) = 672.15.
실시예 19 - 이량체-링커 (IIIa-03)
DMSO (0.5 mL) 중 화합물 96 (문헌 [Senter et al. 2010]; 10 mg, 0.014 mmol) 및 이량체 IIa-16 (13.01 mg, 0.019 mmol)의 용액에 휘니그 염기 (7.10 μL, 0.041 mmol)를 첨가하고, RT에서 밤새 교반하였다. 이를 시마즈 R-HPLC 상에서 엑스브리지 정제용 C18, 5μm 칼럼 및 30분에 걸쳐 5-55% 아세토니트릴/물 (0.05% 포름산)을 사용하여 정제하였다.
24분에서 수집된 분획은 이량체-링커 IIIa-03을 제공하였다 (5.6 mg, 4.36 μmol, 32.2% 수율). 정확한 질량을 갖는 분획을 염기성 수지 (PL-HCO3 MP -수지 1.8 mmol/g; 애질런트 파트 # PL3540-#603)를 통해 여과하고, 아세토니트릴 (5 mL)로 세척한 후, 동결건조시켰다.
MS (m+1) = 1284.
실시예 20 - 이량체 IIa-20 및 이량체-링커 IIIa-04
본 실시예 및 도 18a 및 18b는 이량체 (IIa-20) 및 이량체-링커 (IIIa-04)의 합성에 관한 것이다.
THF (10 mL) 중 트리페닐포스핀 (1.385 g, 5.28 mmol), 화합물 20 (2 g, 4.40 mmol) 및 화합물 51 (1.165 g, 6.16 mmol)의 용액에 디이소프로필 아조디카르복실레이트 (DIAD, 1.026 mL, 5.28 mmol)를 0℃에서 적가하였다. RT에서 밤새 교반한 후, 농축시키고, 이스코 콤비플래쉬™ 120 g 칼럼 상에서 0-100% EtOAc/헥산 용리액을 사용하여 정제하여 알콜 108을 백색 고체로서 수득하였다 (1.28 g, 2.045 mmol, 46.5% 수율).
MS (m+Na) = 648.2.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.48 (m, 3H), 7.33 (m, 2H), 7.22 (m, 1H), 5.93 (m, 1H), 5.50 (t, J =10.0 Hz, 1H), 5.31 (d, J=16.0 Hz, 1H), 5.22 (dd, J=10.8, 1.6 Hz, 1H), 5.17 (d, J=15.2 Hz, 1H), 4.70 (t, J =11.2 Hz, 1H), 4.63 (m, 2H), 4.43 (m, 1H), 4.30 (m, 2H), 4.22 (m, 1H), 3.97 (m, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.79 (m, 4H), 3.57 (m, 4H), 3.01 (dd, J=15.2, 2.0 Hz, 1H), 2.07 (m, 2H), 1.88 (m, 2H), 0.997 (m, 2H), 0.06 (s, 9H).
DCM (10 mL) 중 알콜 108 (0.64 g, 1.023 mmol) 및 트리에틸아민 (TEA, 0.214 mL, 1.534 mmol)의 현탁액을 0℃로 냉각시키고, 메탄술포닐 클로라이드 (MsCl, 0.104 mL, 1.330 mmol)로 처리하였다. 0℃에서 60분 동안 교반한 후, LCMS는 생성물로의 50% 전환율을 나타내었다. 추가의 TEA (0.214 mL, 1.534 mmol) 및 MsCl (0.104 mL, 1.330 mmol)을 첨가하고, 교반을 1시간 동안 계속하여 완전한 전환을 수득하였다. 반응물을 빙냉수 (30 mL)로 켄칭하고, DCM (2x30 mL)으로 추출하고, 빙냉수 (30 ml)로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 회전 증발기에서 농축시켜 메실레이트 109를 수득하였다 (0.713 g, 1.012 mmol, 99% 수율).
MS (m+1) = 704.2.
DMSO (2 mL) 중 화합물 106 (336 mg, 0.852 mmol) 및 메실레이트 109 (500 mg, 0.710 mmol)의 용액에 K2CO3 (196 mg, 1.421 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (50 mL) 및 물 (50 mL)로 희석하였다. 수성 층을 EtOAc (2x50 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 농축시키고, 이스코 콤비플래쉬™ 80 g 칼럼 상에서 45분에 걸쳐 0-100% EtOAc/헥산 용리 구배를 사용하여 정제하여 화합물 110을 수득하였다 (180 mg, 0.180 mmol, 25.3% 수율).
MS (m+1) = 1003.3
THF (4 mL) 중 화합물 110 (180 mg, 0.180 mmol)의 용액에 -76℃에서 리튬 트리에틸보로히드라이드 (슈퍼 히드라이드(SUPER HYDRIDE)™, 0.898 mL, 0.898 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 냉수 (1 mL)로 켄칭하고, DCM (3x10 mL)으로 추출하였다. 유기 층을 농축시키고, DCM/EtOH/물 (1:2:1 = 4 mL) 및 실리카 겔 (1 g)로 2일 동안 처리하였다. 이 혼합물을 소결 깔때기를 통해 여과하고, 실리카 겔을 DCM-MeOH (8:2, 50 mL)로 세척하였다. 여과물을 고진공 하에 농축시키고, 40 g 실리카 겔 칼럼 상에서 15분에 걸쳐 MeOH/DCM 용리액을 사용하여 정제하였다. 9분에서의 10% MeOH/DCM 분획은 화합물 111을 백색 고체로서 제공하였다 (151 mg, 0.143 mmol, 80% 수율).
MS (m+1) = 856.3.
DCM (3 mL) 중 화합물 111 (151 mg, 0.176 mmol)의 용액에 Pd(PPh3)4 (10.19 mg, 8.82 μmol) 및 피롤리딘 (0.058 mL, 0.706 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 하에 RT에서 교반하였다. 농축시키고, 이스코 24g 실리카 겔 칼럼 상에서 0-20% MeOH/DCM을 사용하여 정제하여 이량체 (IIa-20)을 백색 고체로서 수득하였다 (42 mg, 0.058 mmol, 32.9% 수율).
MS (m+1) = 688.2.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.55 (s, 1H), 7.48 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.25-7.40 (m, 9H), 7.21 (m, 1H), 6.85 (s, 1H), 6.27 (s, 1H), 5.03 (d, J =15.6 Hz, 1H), 4.83 (q, J = 15.6 Hz, 2H), 4.57 (d, J = 15.2, 1H), 4.30 (m, 2H), 4.21 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 4.13 (m, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.51 (s, 1H), 3.46 (dd, J = 10.8, 2.0 Hz, 1H), 3.20-3.30 (m, 6H), 3.12 (dd, J = 15.2, 6.0 Hz, 2H), 2.83 (dd, J = 15.2, 5.6 Hz, 2H).
DMSO (1 mL) 중 p-니트로페닐 카르보네이트 96 (20 mg, 0.027 mmol) 및 이량체 (IIa-20) (22.37 mg, 0.033 mmol)의 용액에 DIPEA (0.014 mL, 0.081 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 밤새 교반하였다. 반응 생성물을 R-HPLC에 의해 엑스브리지 정제용 OBD C18, 5 μm 칼럼 (30x250 mm) 및 40분에 걸쳐 5-55% 아세토니트릴/물 (0.05% 포름산) (4회 주입)을 사용하여 정제하였다. 31.8분에서 수집된 분획을 염기성 수지 (PL-HCO3 MP -수지 1.8 mmol/g; 애질런트 파트 # PL3540-#603)를 통해 여과하고, 아세토니트릴 (5 mL)로 세척하였다. 동결건조시켜 이량체-링커 (IIIa-04)를 백색 고체로서 수득하였다 (8 mg, 5.91 μmol, 21.79% 수율).
MS (m+1) = 1286.5.
실시예 21 - 이량체 IIa-21
본 실시예 및 도 19는 이량체 (IIa-21)의 합성에 관한 것이다.
아세톤 (0.4 ml) 중 페놀 72 (68 mg, 0.13 mmol), 1,3-비스(브로모메틸)벤젠 97 (17 mg, 0.065 mmol) 및 Cs2CO3 (42 mg, 0.13 mmol)의 현탁액을 40℃로 1시간 동안 가온하였다. 혼합물을 0.1 M 시트르산으로 켄칭하고, EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기부를 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 헥산 중 30-80% EtOAc의 구배로 용리시키면서 정제하여 2종의 화합물을 수득하였다. 제1 용리물은 모노-알킬화 화합물 99였다 (15.6 mg, 17% 수율). LCMS M+H=707.10. 제2 용리물은 이량체 98이었다 (13.5 mg, 18% 수율). LCMS M+H=1151.20.
이량체 98 (13.5 mg, 0.012 mmol)을 DCM 중 피롤리딘의 용액 (0.042 M, 0.7 ml, 0.029 mmol) 중에 용해시키고, Pd(PPh3)4 (2.0 mg, 1.7 μmol)를 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, DCM과 포화 NH4Cl 사이에 분배하였다. 상을 분리하고, 수성 분획을 DCM으로 2회 더 추출하였다. 합한 유기부를 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 잔류물로 증발시키고, 이를 이어서 정제용 HPLC (선파이어 C18 정제용 OBD 칼럼 19x100mm, 용매 A = 95% 물, 5% 아세토니트릴 +0.1% TFA; 용매 B = 5% 물, 95% 아세토니트릴 +0.1% TFA. 10분에 걸쳐 0-100%의 구배)에 의해 정제하였다. 샘플을 2개의 동등한 주입으로 나누었다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, PL-HCO3- MP SPE 500 mg/6 mL 카트리지에 아세토니트릴로 용리시키면서 통과시켜 유리 염기로서의 생성물의 용액을 수득하였다. 벌크의 유기 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 물을 동결건조에 의해 제거하여 이량체 (IIa-21)을 백색 분말로서 수득하였다 (5.18 mg, 58% 수율).
LCMS M+H=719.10. HRMS 실측치: M+H=719.2851, 계산치: 719.2864.
실시예 22 - 이량체 IIa-22
본 실시예 및 도 20은 이량체 (IIa-22)의 제조에 관한 것이다.
DCM (5 mL) 중 디올 100 (0.25 g, 1.40 mmol, 문헌 [J. Med. Chem. 2011, 4350]에 따라 제조됨) 및 NEt3 (0.58 mL, 4.19 mmol)의 현탁액을 빙수조에서 냉각시키고, MsCl (0.25 mL, 3.2 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 동일한 온도에서 2시간 동안 교반한 다음, 물을 첨가하여 켄칭하였다. 2상 혼합물의 층을 분리하고, 수성 상을 DCM의 부분으로 다시 추출하였다. 합한 유기 상을 차가운 묽은 HCl (0.05N)에 이어서 염수로 세척한 다음, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 증발시켜 메실레이트 101을 백색 고체로서 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다 (0.425g, 91% 수율)
1H NMR (400MHz, 클로로포름-d) δ 7.25 (s, 1H), 7.11 (s, 2H), 5.29 - 5.18 (m, 4H), 3.05 (s, 6H).
아세톤 (0.4 ml) 중 페놀 72 (94 mg, 0.18 mmol), 메실레이트 101 (30 mg, 0.089 mmol) 및 Cs2CO3 (73 mg, 0.22 mmol)의 현탁액을 40℃로 1시간 동안 가온하였다. 혼합물을 0.1 M 시트르산으로 켄칭하고, EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 헥산 중 30-80% EtOAc의 구배로 용리시키면서 정제하여 이량체 102를 수득하였다 (82.6 mg, 77% 수율).
LCMS M+H=1192.15.
이량체 102 (41.3 mg, 0.035 mmol)를 이량체 (IIa-21)에 대한 방법에 따라 탈보호시켜 이량체 (IIa-22)를 백색 분말로서 수득하였다 (7.08 mg, 26% 수율).
LCMS M+H=760.10. HRMS 실측치: M+H=760.2872, 계산치: 760.2878.
실시예 23 - 이량체-링커 IIIb-07 및 IIIb-08
본 실시예 및 도 21은 이량체 링커 (IIIb-07) 및 (IIIb-08)의 제조에 관한 것이다.
화합물 104a를 하기와 같이 페놀 80 및 모노-알킬화 화합물 99로부터 제조하였다. 페놀 80 (18.6 mg, 0.022 mmol), 화합물 99 (15.6 mg, 0.022 mmol) 및 Cs2CO3 (7.18 mg, 0.022 mmol)을 아세톤 (0.11 mL) 중에 현탁시키고, 40℃로 1.5시간 동안 가온하였다. 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 0.1M 시트르산으로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 조 물질을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 헥산 중 30-100% EtOAc로 용리시키면서 정제하여 생성물 104a를 수득하였다 (23.3 mg, 72% 수율).
LCMS M+H=1472.20.
이량체 104a (23.3 mg, 0.016 mmol)를 THF (0.4 mL) 중에 용해시키고, THF 중 TBAF의 용액 (0.035 mL, 1.0 M, 0.035 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0.5시간 동안 교반하고, EtOAc와 포화 NH4Cl 사이에 분배하고, 상을 분리하고, 수성 분획을 DCM으로 2회 더 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 잔류물로 증발시키고, 이를 이어서 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 DCM 중 0-10% MeOH의 구배로 용리시키면서 정제하여 화합물 105a를 수득하였다 (16.4 mg, 83% 수율).
LCMS M+Na=1265.25.
이량체 105a (16.4mg, 0.013 mmol)를 DCM 중 피롤리딘의 용액 (0.042 M, 0.8 ml, 0.033 mmol) 중에 용해시키고, Pd(PPh3)4 (1.2 mg, 1.04 μmol)를 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하고, DCM과 포화 NH4Cl 사이에 분배하고, 상을 분리하고, 수성 분획을 DCM으로 2회 더 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 잔류물로 증발시켜 아민 106a를 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다 (정량적 수율을 가정하였음).
아민 106a (13.7 mg, 0.13 mmol)를 DMF 중 DIPEA의 용액 (0.05 M, 0.31 mL, 0.016 mmol) 중에 용해시키고, 화합물 84 (8 mg, 0.026 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 20시간 동안 교반하였으며, 그 시점에 이것을 DMF로 희석하고, 정제용 HPLC (선파이어 C18 정제용 OBD 칼럼 19x100mm, 용매 A = 95% 물, 5% 아세토니트릴 +0.1% TFA; 용매 B = 5% 물, 95% 아세토니트릴 +0.1% TFA. 10분에 걸쳐 0-100%의 구배)에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, PL-HCO3- MP SPE 500 mg/6 mL 카트리지에 아세토니트릴로 용리시키면서 통과시켜 유리 염기로서의 생성물의 용액을 수득하였다. 벌크의 유기 용매를 회전 증발에 의해 제거하고, 물을 동결건조에 의해 제거하여 이량체-링커 (IIIb-07)을 백색 분말로서 수득하였다 (7.10 mg, 42% 수율).
LCMS M+H=1249.35. HRMS 실측치: M+H = 1249.5221, 계산치: 1249.5241.
비스-메실레이트 101 (100 mg, 0.191 mmol)을 화합물 99의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 72와 반응시켜 모노-메실레이트 103을 수득하였다 (74.6 mg, 51% 수율).
LCMS M+H=764.10.
모노-메실레이트 103 (46.8 mg, 0.061 mmol)을 화합물 104a의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 80과 반응시켜 화합물 104b를 수득하였다 (68.8 mg, 74% 수율).
LCMS M+H=1511.95.
화합물 104b (68.8 mg, 0.046 mmol)를 화합물 105a의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 탈보호시켜 화합물 105b를 수득하였다 (51.4 mg, 88% 수율).
화합물 105b (51.4 mg, 0.040 mmol)를 화합물 106a의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 탈보호시켜 아민 106b를 수득하였다 (44 mg, 100% 수율, 조 물질을 후속 단계에 사용하였음).
아민 106b (46.8 mg, 0.061 mmol)를 이량체-링커 (IIIb-07)의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 84와 반응시켜 이량체-링커 (IIIb-08)을 수득하였다 (13.5 mg, 25% 수율).
HRMS 실측치: M+H=1290.5245, 계산치: 1290.5255.
실시예 24 - 이량체-링커 IIIb-04
본 실시예 및 도 22는 이량체-링커 (IIIb-09)의 합성에 관한 것이다.
비스-아이오도에틸 에테르 (46 mg, 0.088 mmol)를 화합물 99의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 72와 반응시켜 화합물 107을 수득하였다 (29 mg, 46% 수율).
LCMS M+H=723.20.
실릴 에테르 78 (431 mg, 0.486 mmol)을 DMF (2.0 ml) 및 물 (0.04 ml) 중에 용해시키고, 아세트산리튬 (32 mg, 0.486 mmol)으로 처리하였다. 혼합물을 40℃로 2.5시간 동안 가온하고, RT에서 추가로 1시간 동안 교반한 다음, 용매를 질소의 스트림 하에 (3일에 걸쳐) 제거하였다. 잔류물을 0.1 M 시트르산으로 처리하고, EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 DCM 중 0-10% MeOH의 구배로 용리시키면서 정제하여 페놀 108을 수득하였다 (297 mg, 84% 수율).
LCMS M+H=730.40.
모노-아이오도 화합물 107 (29 mg, 0.04 mmol)을 화합물 104a의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 페놀 108과 반응시켜 화합물 109를 수득하였다 (18.8 mg, 35% 수율).
LCMS M+Na=1347.15.
화합물 109 (18.8 mg, 0.014 mmol)를 화합물 106a의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 탈보호시켜 아민 110을 수득하였다 (13 mg, 100% 수율, 조 물질을 후속 단계에 사용하였음).
아민 110 (14 mg, 0.014 mmol)을 이량체-링커 (IIIb-07)의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방식으로 화합물 84와 반응시켜 이량체-링커 (IIIb-09)를 수득하였다 (8.6 mg, 53% 수율).
LCMS M+Na=1239.75.
실시예 25 - 이량체-링커 IIIa-05, -06, -07, 및 -08
본 실시예 및 도 23은 이량체-링커 IIIa-05, IIIa-06, IIIa-07, 및 IIIa-08의 제조에 관한 것이다. 이들 이량체-링커는 링커 성분 내에 알킬아미노 기를 가지며, ADC를 제조하기 위한 트랜스글루타미나제 매개 접합에서 아민 공여자로서 기능할 수 있다.
NMP (7 mL) 중 화합물 54 (850 mg, 0.869 mmol) 및 화합물 111 (CAS 등록 번호 863971-53-3, 666 mg, 0.869 mmol)의 용액에 DIPEA (0.228 mL, 1.303 mmol)를 첨가하였다. 용액을 RT에서 밤새 교반하였다. LCMS는 생성물 형성을 나타내었다. 조 반응물을 직접 120 g 실리카 겔 칼럼 상에서 콤비플래쉬™ 크로마토그래피로, 45분에 걸쳐 MeOH/DCM으로 용리시키면서 처리하였다. 18분에서의 분획은 화합물 112를 백색 고체로서 제공하였다 (0.8 g, 57% 수율).
MS (m+1) = 1605.6.
THF (5 mL) 중 화합물 112 (0.7 g, 0.436 mmol)의 용액에 피페리딘 (0.5 ml, 5.05 mmol)을 첨가하였다. 용액을 RT에서 30분 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 농축시키고, 80 g 콤비플래쉬™ 실리카 겔 칼럼 상에서 40분에 걸쳐 MeOH/DCM을 사용하여 정제하여 19-23분에서 30% MeOH/DCM 분획을 수득하였으며, 이는 화합물 113을 백색 고체로서 제공하였다 (0.475 g, 0.343 mmol, 79% 수율).
MS (m+1) = 1383.6.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.11 (s, 2H), 8.13 (s, 2H), 7.57 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.23 (m, 14 H), 5.96 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 5.76 (s, 1H), 5.39 (s, 4H), 5.26 (t, J = 6.0 Hz, 4H), 5.08 (dd, J = 22.0, 10.4 Hz, 4H), 5.01 (s, 2H), 4.92 (d, J = 15.6 Hz, 4H), 4.47 (m, 2H), 4.31 (m, 5H), 4.21 (m, 5 H), 4.10 (q, J = 5.2 Hz, 2H), 3.76 (m, 10 H), 3.18 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 3.03 (m, 6H), 2.68 (m, 2H), 2.34 (m, 2H), 1.93 (m, 3H), 1.50-1.70 (m, 6H), 1.39 (m, 5H), 0.88 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.78 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.74 (m, 9H), 0.09, 0.10 (m, 9H).
-76℃에서 THF (10 mL) 중 화합물 113 (975 mg, 0.705 mmol)의 용액에 LiEt3BH (슈퍼 히드라이드™, 3.52 mL, 3.52 mmol)를 첨가하였다. 용액을 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응물을 냉수 (1 mL)로 켄칭하고, 농축시켰다. 생성된 잔류물을 DCM/EtOH/물 (1:2:1 = 8 mL) 및 실리카 겔 (1 g)로 3일 동안 처리하였다. 이 혼합물을 소결 깔때기를 통해 여과하고, 실리카 겔을 DCM-MeOH (8:2, 100 mL)로 세척하였다. 여과물을 고진공 하에 농축시키고, 24 g 실리카 겔 칼럼 상에서 15분에 걸쳐 MeOH/DCM을 사용하여 정제하였다. 20% MeOH/DCM 분획은 화합물 114를 백색 고체로서 제공하였다 (422 mg, 0.387 mmol, 54.9% 수율).
MS (m+1) = 1091.6.
DMF (1 mL) 중 화합물 114 (67 mg, 0.061 mmol) 및 N-히드록시숙신이미드 에스테르 115 (30.4 mg, 0.068 mmol)의 용액에 2,6-루티딘 (0.014 mL, 0.123 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 생성물 116으로의 거의 완전한 전환을 나타내었다. 피페리딘 (0.1 mL, 1.010 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 이스코 150 g C18 칼럼 상에 주입하고, 30분에 걸쳐 물/아세토니트릴 (0.05% 포름산)로 용리시켰다. 27분에서의 34% 물/아세토니트릴 분획을 염기성 수지 (PL-HCO3 MP -수지 1.8 mmol/g; 애질런트 파트 # PL3540-#603)를 통해 여과하고, 아세토니트릴 (5 mL)로 세척하였다. 동결건조시켜 이량체-링커 IIIa-08을 백색 고체로서 수득하였다 (27.5 mg, 0.020 mmol, 33.1% 수율).
MS (m+1) = 1204.6.
이량체-링커 IIIa-05 (MS (m+1) = 1338.5), IIIa-06 (MS (m+1) = 1514.06), 및 IIIa-07 (MS (m+1) = 1250.2)을 상응하는 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 사용하여 화합물 114로부터 유사하게 제조하였다.
실시예 26 - 이량체의 생물학적 활성
본 발명의 이량체의 세포독성 활성을 H226 폐암, 786-O 신암, N87 위암, 및/또는 OVCAR3 난소암 세포주에 대해 시험하였다. 세포 증식을 억제하는 것에 대한 이량체의 능력을 또한 ATP 발광 검정 또는 MTS 세포 증식 검정에 의해 측정할 수 있다. 일반적으로, 이들 2종의 방법은 비슷한 결과를 생성한다.
하기는 ATP 발광 검정에 대한 일반적 절차이다: 세포를 각각 ATP 셀타이터글로(CellTiterGlo)™ 검정을 위해 3시간 동안 96-웰 플레이트에 1 x 103개 세포/웰로 시딩하였다. 화합물의 연속 희석물 (1:3)을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 72시간 동안 인큐베이션되도록 하였다. 프로메가로부터의 셀타이터글로™ 세포 생존율 키트를 제조업체의 지침에 따라 시험 화합물로 처리된 세포의 ATP 함량을 측정하는데 사용하였다. ATP 함량의 감소는 세포 생존율의 감소의 척도이다. EC50 값 - 작용제가 세포 생존율을 최대 효과의 50%만큼 감소시키는 농도 -은 프리즘(PRISM)™ 소프트웨어, 버전 5.0 (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 라 졸라)을 사용하여 계산할 수 있다.
MTS 세포 증식 검정을 하기와 같이 수행하였다: 프로메가 (위스콘신주 매디슨)로부터의 셀타이터 96 수성 비-방사성 세포 증식 키트를 사용하여 세포 증식 검정에서 생존 세포의 수를 결정하였다. 종양 세포를 웰당 40 μL에서의 멸균 384-웰 흑색 투명 바닥 매트릭스 플레이트에 특정 시딩 밀도로 플레이팅하고, 검정 전에 5% CO2 중에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날에, 한 세트의 세포 플레이트 (10개의 플레이트)를 사용하여 제0 시점 세포 밀도를 결정하고, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨은 10개의 플레이트에 4 μL/웰로 첨가하고, 이어서 5% CO2 중에서 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 이 테트라졸륨 시약은 간 세포에 의해 생체환원되어 수용액 중에 가용성인 포르마잔 생성물을 형성한다. 490 nm에서의 흡광도를 엔비전 판독기 (퍼킨 엘머, 매사추세츠주 보스톤) 상에서 측정하였다. 동일한 날에, 화합물을 남아있는 세포 플레이트 (T72 플레이트)에 첨가하고, 5% CO2 중에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 72시간 후, 4 μL MTS 시약을 이어서 이들 세포 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 추가로 5% CO2 중에서 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하고, A490에서의 흡광도 값을 엔비전 판독기 상에서 측정하였다.
결과는 표 IA에 제시되어 있다.
DMS 79 및 H187 소세포 폐암 세포주에 대해 시험하는 추가의 결과는 표 IB에 제시되어 있다.
실시예 27 - 접합체의 생물학적 활성
이량체-링커 화합물을 상기 기재된 일반적 절차에 따라 여러 항체에 접합하였다: 항체 4A6 (항-글리피칸 3 항체; 문헌 [Terrett et al., US 8,680,247 B2 (2014)]); 항체 1F4 (항-CD70 항체; 문헌 [Coccia et al., US 2010/0150950 A1 (2010)]); 및 항체 6A4 (항-메소텔린 항체; 문헌 [Terrett et al., US 8,268,970 B2 (2012)]). 이들 항체의 CDR 서열 및 다른 서열 및 구조적 정보는 상기 인용된 참고문헌에 개시되어 있으며, 이러한 정보는 본원에 참조로 포함된다.
시험을 N87 위암 세포 및 Hep 3B 간암 세포에 대해 수행하였다. 활성을 3H 티미딘 검정 (Cong et al. 2014)을 사용하여 측정하였다. N87 세포는 메소텔린을 발현하지만 CD70 또는 글리피칸-3을 발현하지 않는다. Hep 3B 세포는 글리피칸-3을 발현하지만 메소텔린을 발현하지 않는다.
결과는 표 IIA 및 IIB에 제공되어 있다. 비교 데이터는 PBD-PBD 이량체-링커의 접합체, 화합물 A에 대해 또한 제공되어 있다.
항원 푸코실 GM1을 발현하는 DMS 79 및 H187 소세포 폐암 세포주에 대해 시험하는 추가의 결과는 표 IIC에 제시되어 있다.
N87, H226, 786-O 암 세포주에 대한 또한 추가의 결과는 표 IID에 제시되어 있다. N297A 치환을 갖는 항체를 상기 기재된 바와 같이 트랜스글루타미나제를 사용하여 접합하였다. 실제로 1.5 내지 2 범위의 DAR를 갖는 접합체가 수득되지만, N297A 돌연변이는 Q295를 트랜스글루타미나제에 대한 아민 수용자로서 접근가능하게 하여 2의 이론적 DAR을 갖는 접합체를 생성한다.
N87은 메소텔린을 발현하지만 CD70 또는 푸코실 GM1을 발현하지 않는 위 (위장) 암 세포주이다. H226은 메소텔린을 발현하지만 CD70 또는 푸코실 GM1을 발현하지 않는 폐암 세포주이다. 786-O는 CD70을 발현하지만 메소텔린 또는 푸코실 GM1을 발현하지 않는 신암 세포주이다.
* 항체는 N297A 치환을 갖는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 접합체에서, 항체는 항-메소텔린, 항-CD70, 항-글리피칸 3, 또는 항-푸코실 GM1 항체이다.
상기 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정한 부분 또는 측면과 주로 또는 배타적으로 관련된 구절을 포함한다. 이는 명료성 및 편의성을 위한 것이고, 특정한 특색은 단지 개시된 구절보다 많은 것과 관련될 수 있으며, 본원의 개시내용은 상이한 구절에서 발견되는 정보의 모든 적절한 조합을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 유사하게, 본원의 다양한 도면 및 설명은 본 발명의 구체적 실시양태에 관한 것이지만, 구체적 특색이 특정한 도면 또는 실시양태의 문맥에 개시된 경우에, 이러한 특색은 또한 적절한 정도로, 또 다른 도면 또는 실시양태의 문맥에, 또 다른 특징과 조합하여, 또는 일반적으로 본 발명에 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
추가로, 본 발명은 특히 특정의 바람직한 실시양태의 관점에서 기재되어 있지만, 본 발명은 이러한 바람직한 실시양태에 제한되지는 않는다. 오히려, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해 정의된다.
참고문헌
본 명세서에 이전에 제1 저자 (또는 발명자) 및 날짜에 의해 요약된 방식으로 인용된 하기 참고문헌에 대한 전체 인용은 하기 제공되어 있다. 각각의 이들 참고문헌은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
Claims (25)
- 화학식 I에 의해 나타내어진 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체 또는 그의 제약상 허용되는 염.
여기서
R1은 화학식 Ia 또는 화학식 Ib에 따르고;
각각의 G 및 G'는 C 또는 N이며, 단 2개 이하의 G 또는 2개 이하의 G'가 N이고;
각각의 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C5 알킬이고;
각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, F, Cl, Br, OH, C1-C3 알킬, O(C1-C3 알킬), 시아노, (CH2)0-5NH2, 또는 NO2이고;
디아제핀 고리계 내의 각각의 이중선는 독립적으로 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고;
각각의 R5는 이것이 부착 - 즉, 회합 -되어 있는 N에 대한 이중선가 단일 결합인 경우에는 H이고, 이중선이 이중 결합인 경우에는 부재하고;
각각의 R6은 이것이 부착 - 즉, 회합 -되어 있는 C에 대한 이중선가 단일 결합인 경우에는 H, OH, SO3Na, 또는 SO3K이고, 이중선이 이중 결합인 경우에는 부재하고;
각각의 R7, R8, R9, 및 R10은 독립적으로 H, C1-C5 알킬, C≡C(CH2)1 -5X2, OH, O(C1-C5 알킬), 시아노, NO2, F, Cl, Br, O(CH2CH2O)1-8(C1-3 알킬), (CH2)0-5X2, O(CH2)2- 5X2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 3- 내지 7-원 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2-5X2로 치환된 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴,
이거나;
또는 R7, R8, R9, 또는 R10이, N인 G 또는 G'에 부착 - 즉, 그와 회합 -되어 있는 경우에, 이러한 R7, R8, R9, 또는 R10은 부재하고;
화학식 Ib의 고리 C 내의 점선은 C1-C2, C2-C3, 또는 C2-R11 이중 결합의 임의적인 존재를 나타내고;
R11은 H, =O, =CH2, =CH(C1-C5 알킬), CH=CH(CH2)1- 5X2, C≡C(CH2)1 -5X2, C1-C5 알킬, OH, O(C1-C5 알킬), 시아노, NO2, F, Cl, Br, O(CH2CH2O)1-8(C1-3 알킬), (CH2)0- 5X2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2로 치환된 4- 내지 7-원 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 또는 헤테로시클로알킬, O(CH2)2- 5X2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 3- 내지 7-원 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴이고;
R11'는 C1-C2, C2-C3, 또는 C2-R11 이중 결합이 존재하는 경우에는 부재하고, 다른 경우에는 H이고;
X는
이고;
X1은 CH2, O, NH, S(O)0-2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 3- 내지 7-원 시클로알킬렌 또는 헤테로시클로알킬렌, 비치환되거나 또는 (CH2)0-5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 6-원 아릴렌, 또는 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2-5X2로 치환된 5-원 헤테로아릴렌이고;
각각의 X2는 독립적으로 H, F, Cl, Br, OH, O(C1-C3 알킬), O(C1-C3 알킬렌), CO2H, N3, CN, NO2, CO2(C1-C3 알킬), NH2, NH(C1-C5 알킬), N(C1-C5 알킬)2, SH, CHO, N(CH2CH2)2N(C1-C3 알킬), NHNH2, 또는 C(=O)NHNH2이고;
x 및 y는 독립적으로 1, 2, 또는 3이고;
각각의 Y는 독립적으로 CH2, C=O, 또는 CHR12이고; 여기서 각각의 R12는 독립적으로 F, Cl, Br, 또는 C1-C3 알킬이고;
Y' 및 Y"는 독립적으로 CH2, C=O, 또는 CHR12이고; 여기서 각각의 R12는 독립적으로 F, Cl, Br, 또는 C1-C3 알킬이며, 단 Y' 및 Y" 중 적어도 1개가 존재한다 (즉, 연관된 아래첨자는 1임). - 제1항에 있어서, 화학식 IIa에 의해 나타내어진 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체.
- 제2항에 있어서, 화학식 IIa'에 의해 나타내어진 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체.
여기서
각각의 R9는 독립적으로 H, OH, OMe, NH2, NMe2, O(CH2CH2O)1- 8Me, OCH2CH2OH, 또는이고;
X는
이다. - 제1항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체.
- 제1항에 있어서, 화학식 IIb에 의해 나타내어진 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체.
- 제5항에 있어서, 화학식 IIb'에 의해 나타내어진 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체.
여기서
R9는 H, OH, OMe, NH2, NMe2, O(CH2CH2O)1- 8Me, OCH2CH2OH, 또는이고;
R11은 H, =CH2, CH=CHMe, =CHMe, C≡CCH2NH2,이고;
X는
이다. - 제1항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체.
- 제1항에 있어서, 화학식 IIc에 의해 나타내어진 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체.
여기서
1개의 G'는 N이고, 나머지는 C이다. - 제1항에 있어서, 화학식 IIc-01에 의해 나타내어진 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체.
- 화학식 IIIa, IIIb, IIIc 또는 IIIc"에 의해 나타내어진 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체-링커 화합물.
여기서
R1은 화학식 Ia 또는 화학식 Ib에 따르고;
각각의 G 및 G'는 C 또는 N이며, 단 2개 이하의 G 또는 2개 이하의 G'가 N이고;
각각의 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C5 알킬이고;
각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, F, Cl, Br, OH, C1-C3 알킬, O(C1-C3 알킬), 시아노, (CH2)0-5NH2, 또는 NO2이고;
디아제핀 고리계 내의 각각의 이중선는 독립적으로 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고;
각각의 R5는 이것이 부착되어 있는 N에 대한 이중선가 단일 결합인 경우에는 H이고, 이중선이 이중 결합인 경우에는 부재하고;
각각의 R6은 이것이 부착되어 있는 C에 대한 이중선가 단일 결합인 경우에는 H, OH, SO3Na, 또는 SO3K이고, 이중선이 이중 결합인 경우에는 부재하고;
각각의 R7, R8, R9, 및 R10은 독립적으로 H, C1-C5 알킬, C≡C(CH2)1 -5X2, OH, O(C1-C5 알킬), 시아노, NO2, F, Cl, Br, O(CH2CH2O)1-8(C1-3 알킬), (CH2)0-5X2, O(CH2)2- 5X2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 3- 내지 7-원 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2-5X2로 치환된 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴,
이거나;
또는 R7, R8, R9, 또는 R10이, N인 G 또는 G'에 부착되어 있는 경우에, 이러한 R7, R8, R9, 또는 R10은 부재하고;
화학식 Ib의 고리 C 내의 점선은 C1-C2, C2-C3, 또는 C2-R11 이중 결합의 임의적인 존재를 나타내고;
R11은 H, =O, =CH2, =CH(C1-C5 알킬), CH=CH(CH2)1- 5X2, C≡C(CH2)1 -5X2, C1-C5 알킬, OH, O(C1-C5 알킬), 시아노, NO2, F, Cl, Br, O(CH2CH2O)1-8(C1-3 알킬), (CH2)0- 5X2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2로 치환된 4- 내지 7-원 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 또는 헤테로시클로알킬, O(CH2)2- 5X2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 3- 내지 7-원 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴이고;
R11'는 C1-C2, C2-C3, 또는 C2-R11 이중 결합이 존재하는 경우에는 부재하고, 다른 경우에는 H이고;
각각의 R50은 독립적으로 H, O(C1-C3 알킬), O(C2-C3 알킬렌), O(C2-C3 알키닐), F, Cl, Br, 또는 CN이고;
X는
이고;
X1은 CH2, O, NH, S(O)0-2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 3- 내지 7-원 시클로알킬렌 또는 헤테로시클로알킬렌, 비치환되거나 또는 (CH2)0-5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 6-원 아릴렌, 또는 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2-5X2로 치환된 5-원 헤테로아릴렌이고;
각각의 X2는 독립적으로 H, F, Cl, Br, OH, O(C1-C3 알킬), O(C1-C3 알킬렌), CO2H, N3, CN, NO2, CO2(C1-C3 알킬), NH2, NH(C1-C5 알킬), N(C1-C5 알킬)2, SH, CHO, N(CH2CH2)2N(C1-C3 알킬), NHNH2, 또는 C(=O)NHNH2이고;
x 및 y는 독립적으로 1, 2, 또는 3이고;
각각의 Y는 독립적으로 CH2, C=O, 또는 CHR12이고; 여기서 각각의 R12는 독립적으로 F, Cl, Br, 또는 C1-C3 알킬이고;
Y' 및 Y"는 독립적으로 CH2, C=O, 또는 CHR12이고; 여기서 각각의 R12는 독립적으로 F, Cl, Br, 또는 C1-C3 알킬이며, 단 Y' 및 Y" 중 적어도 1개가 존재하고;
T는 자기-희생 기이고;
t는 0 또는 1이고;
AAa 및 각각의 AAb는 독립적으로 알라닌, β-알라닌, γ-아미노부티르산, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, γ-카르복시글루탐산, 시트룰린, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 노르류신, 노르발린, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
u는 0 또는 1이고;
p는 1, 2, 3, 또는 4이고;
q는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12이고;
r은 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
s는 0 또는 1이고;
R31은
이고;
XA는
이고,
여기서 각각의 x 및 y는 1, 2, 또는 3이며, 단 x 및 y의 합계가 2 또는 4이고; 별표 (*)는 인접한 O 및 R1에 대한 각각의 XA의 결합 위치를 나타내고; 파상선는 T가 존재하는 경우에는 T에 대한 또는 T가 부재하는 경우에는 AAa에 대한 각각의 XA의 결합 위치를 나타낸다.
- 제10항에 있어서, 화학식 IIIa'에 의해 나타내어진 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체-링커 화합물.
여기서
각각의 R9는 독립적으로 H, O(CH2CH2O)1-4H, (CH2CH2O)1-4(C1-C3 알킬), OH, Cl, F, 또는 Br이다. - 제10항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체-링커 화합물.
- 제10항에 있어서, 화학식 IIIb'에 의해 나타내어진 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체-링커 화합물.
- 제10항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체-링커 화합물.
- 제10항에 있어서, 화학식 IIIc'에 의해 나타내어진 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체-링커 화합물.
- 제10항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체-링커 화합물.
- 제10항에 있어서, 화학식 IIIc-08에 의해 나타내어진 구조를 갖는 벤조디아제핀 이량체-링커.
- 화학식 IVa, IVb, IVc, 또는 IVc"에 따른 구조를 갖는, 벤조디아제핀 이량체 및 항체의 접합체.
여기서
Ab는 항체이고;
T는 자기-희생 기이고;
t는 0 또는 1이고;
AAa 및 각각의 AAb는 독립적으로 알라닌, β-알라닌, γ-아미노부티르산, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, γ-카르복시글루탐산, 시트룰린, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 노르류신, 노르발린, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
u는 0 또는 1이고;
p는 1, 2, 3, 또는 4이고;
q는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12이고;
r은 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
s는 0 또는 1이고;
XA는
이고;
여기서 별표 (*)는 인접한 O에 대한 XA의 결합 위치를 나타내고, 파상선는 T가 존재하는 경우에는 T에 대한 또는 T가 부재하는 경우에는 AAa에 대한 XA의 결합 위치를 나타내고,
R40은
이고;
여기서 Ab에 결합되어 있는 R40의 개방 원자가는 별표 (*)에 의해 나타내고, (CH2)r에 결합되어 있는 R40의 개방 원자가는 파상선 ()에 의해 나타내고;
m은 1, 2, 3, 또는 4이고;
R1은 화학식 Ia 또는 화학식 Ib에 따르고;
각각의 G 및 G'는 C 또는 N이며, 단 2개 이하의 G 또는 2개 이하의 G'가 N이고;
각각의 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C5 알킬이고;
각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, F, Cl, Br, OH, C1-C3 알킬, O(C1-C3 알킬), 시아노, (CH2)0-5NH2, 또는 NO2이고;
디아제핀 고리계 내의 각각의 이중선는 독립적으로 단일 결합 또는 이중 결합을 나타내고;
각각의 R5는 이것이 부착되어 있는 N에 대한 이중선가 단일 결합인 경우에는 H이고, 이중선이 이중 결합인 경우에는 부재하고;
각각의 R6은 이것이 부착되어 있는 C에 대한 이중선가 단일 결합인 경우에는 H, OH, SO3Na, 또는 SO3K이고, 이중선이 이중 결합인 경우에는 부재하고;
각각의 R7, R8, R9, 및 R10은 독립적으로 H, C1-C5 알킬, C≡C(CH2)1 -5X2, OH, O(C1-C5 알킬), 시아노, NO2, F, Cl, Br, O(CH2CH2O)1-8(C1-3 알킬), (CH2)0-5X2, O(CH2)2- 5X2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 3- 내지 7-원 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2-5X2로 치환된 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴,
이거나;
또는 R7, R8, R9, 또는 R10이, N인 G 또는 G'에 부착되어 있는 경우에, 이러한 R7, R8, R9, 또는 R10은 부재하고;
화학식 Ib의 고리 C 내의 점선은 C1-C2, C2-C3, 또는 C2-R11 이중 결합의 임의적인 존재를 나타내고;
R11은 H, =O, =CH2, =CH(C1-C5 알킬), CH=CH(CH2)1- 5X2, C≡C(CH2)1 -5X2, C1-C5 알킬, OH, O(C1-C5 알킬), 시아노, NO2, F, Cl, Br, O(CH2CH2O)1-8(C1-3 알킬), (CH2)0- 5X2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2로 치환된 4- 내지 7-원 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 또는 헤테로시클로알킬, O(CH2)2- 5X2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 3- 내지 7-원 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 5- 내지 6-원 아릴 또는 헤테로아릴이고;
R11'는 C1-C2, C2-C3, 또는 C2-R11 이중 결합이 존재하는 경우에는 부재하고, 다른 경우에는 H이고;
각각의 R50은 독립적으로 H, O(C1-C3 알킬), O(C2-C3 알킬렌), O(C2-C3 알키닐), F, Cl, Br, 또는 CN이고;
X는
이고;
X1은 CH2, O, NH, S(O)0-2, 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 3- 내지 7-원 시클로알킬렌 또는 헤테로시클로알킬렌, 비치환되거나 또는 (CH2)0-5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 6-원 아릴렌, 또는 비치환되거나 또는 (CH2)0- 5X2 또는 O(CH2)2- 5X2로 치환된 5-원 헤테로아릴렌이고;
각각의 X2는 독립적으로 H, F, Cl, Br, OH, O(C1-C3 알킬), O(C1-C3 알킬렌), CO2H, N3, CO2(C1-C3 알킬), NH2, NH(C1-C5 알킬), N(C1-C5 알킬)2, SH, CHO, N(CH2CH2)2N(C1-C3 알킬), NHNH2, 또는 C(=O)NHNH2이고;
x 및 y는 독립적으로 1, 2, 또는 3이고;
각각의 Y는 독립적으로 CH2, C=O, 또는 CHR12이고; 여기서 각각의 R12는 독립적으로 F, Cl, Br, 또는 C1-C3 알킬이고;
Y' 및 Y"는 독립적으로 CH2, C=O, 또는 CHR12이고; 여기서 각각의 R12는 독립적으로 F, Cl, Br, 또는 C1-C3 알킬이며, 단 Y' 및 Y" 중 적어도 1개가 존재한다. - 제18항에 있어서, 화학식 IVa'에 의해 나타내어진 구조를 갖는 접합체.
여기서
각각의 R9는 독립적으로 H, OH, OMe, NH2, NMe2, O(CH2CH2O)1- 8Me, OCH2CH2OH, 또는이다.
- 제18항에 있어서, 화학식 IVb'에 의해 나타내어진 구조를 갖는 접합체.
여기서
R9는 H, OH, OMe, NH2, NMe2, O(CH2CH2O)1- 8Me, OCH2CH2OH, 또는이고;
X는
이다. - 제18항에 있어서, 화학식 IVc'에 의해 나타내어진 구조를 갖는 접합체.
여기서
R9는 H, OH, OMe, NH2, NMe2, O(CH2CH2O)1- 8Me, OCH2CH2OH, 또는이고;
X는
이다. - 제18항에 있어서, 항체가 항-메소텔린, 항-글리피칸-3, 항-CD70, 또는 항-푸코실 GM1 항체인 접합체.
- 제18항에 따른 접합체 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 제제.
- 암을 앓고 있는 대상체에게 치료 유효량의 제18항에 따른 접합체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법.
- 제24항에 있어서, 암이 폐암, 난소암, 위암, 신암, 또는 간암인 방법.
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