KR20210091711A - 항 cdh6 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 컨쥬게이트 - Google Patents

항 cdh6 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 컨쥬게이트 Download PDF

Info

Publication number
KR20210091711A
KR20210091711A KR1020217014567A KR20217014567A KR20210091711A KR 20210091711 A KR20210091711 A KR 20210091711A KR 1020217014567 A KR1020217014567 A KR 1020217014567A KR 20217014567 A KR20217014567 A KR 20217014567A KR 20210091711 A KR20210091711 A KR 20210091711A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
antibody
acid sequence
seq
positions
Prior art date
Application number
KR1020217014567A
Other languages
English (en)
Inventor
아츠코 사이토
나오야 하라다
고조 요네다
이치로 하야카와
마사키 메구로
후미나오 도이
Original Assignee
다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 filed Critical 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Publication of KR20210091711A publication Critical patent/KR20210091711A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

본 발명의 과제는, CDH6 에 대해 특이적으로 결합하는 높은 내재화 활성을 갖는 항체, 그 항체를 함유하는 높은 항종양 활성을 갖는 항체-약물 컨쥬게이트, 그 항체-약물 컨쥬게이트를 사용한 종양에 대한 치료 효과를 갖는 의약품, 및, 당해 항체, 항체-약물 컨쥬게이트 또는 의약품을 사용한 종양의 치료 방법 등을 제공하는 것이다.
본 발명에 의해, 내재화 활성을 갖는 항 CDH6 항체, 당해 항 CDH6 항체와 신규 PBD 유도체를 결합시킨, 높은 항종양 활성을 나타내는 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트, 이들을 사용하는 의약품 및 종양의 치료 방법이 제공된다

Description

항 CDH6 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 컨쥬게이트
본 발명은, CDH6 에 결합하여 내재화 작용을 갖는 항 CDH6 항체와 피롤로벤조디아제핀 유도체를 링커 구조 부분을 개재하여 결합시킨, 항종양약으로서 유용한 항체-약물 컨쥬게이트에 관한 것이다.
카드헤린 (Cadherin) 은, 세포막 표면에 존재하는 당단백질로, 칼슘 이온 의존적으로 N 말단측의 세포외 도메인끼리가 결합함으로써, 세포간 접착 분자로서, 또 세포간 상호 작용을 담당하는 시그널 분자로서 기능한다. 카드헤린 슈퍼 패밀리 중, 클래식 카드헤린으로 분류되는 분자군은, 5 개의 세포외 도메인 (extracellular domain, EC 도메인) 과 1 개의 막관통 영역, 및 세포내 도메인으로 구성되는 1 회 막관통 단백질이다. 클래식 카드헤린은 아미노산 서열의 상동성으로부터, E-카드헤린이나 N-카드헤린으로 대표되는 타입 I 패밀리와, 타입 II 패밀리로 분류된다.
카드헤린 6 (Cadherin-6, CDH6) 은, 타입 II 카드헤린 패밀리로 분류되는, 790 아미노산으로 이루어지는 1 회 막관통 단백질이고, N 말단측을 세포외, C 말단측을 세포내에 갖는다. 인간 CDH6 유전자는 1995년에 처음으로 클로닝되어 (비특허문헌 1), NM_004932, NP_004923 (NCBI) 등의 액세션 번호에 의해 참조 가능하다.
CDH6 은 발생기에 있어서 뇌나 신장에서 특이적으로 발현되어 있고, 중추 신경계의 회로 형성 (비특허문헌 2, 비특허문헌 3) 이나 신장의 네프론 발생시 (비특허문헌 4, 비특허문헌 5) 에 중요한 역할을 담당하는 것이 보고되어 있다. 성인의 정상 조직에서는, CDH6 의 발현은 신뇨세관이나 담관 상피 세포 등에 국한되어 있다.
한편, 성인의 몇 가지 암종에 있어서, 종양부에서 특이적으로 CDH6 의 발현이 항진되는 것이 알려져 있으며, 인간 신세포암, 특히 신(腎)담명세포암에서는, CDH6 발현과 예후 불량과의 상관이나, 종양 마커로서의 이용 가능성이 보고되어 있다 (비특허문헌 6, 비특허문헌 7). 인간 난소암에서도 CDH6 의 고(高)발현이 보고되어 있고 (비특허문헌 8), 인간 갑상선암의 상피 간엽 변환과 전이에 CDH6 이 관여한다는 보고도 있다 (비특허문헌 9). 또, CDH6 은, 인간 담관암 및 인간 소세포폐암에서도 발현되고 있는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 12, 13).
암은 사망 원인의 상위를 차지하며, 그 이환수는 인구의 고령화와 함께 증가하는 것이 예상되고 있지만, 여전히 치료 요구는 충분히 충족되어 있지 않다. 종래의 화학 요법제는, 그 선택성의 낮음으로부터 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에 대해서도 상해성을 갖는 것에 의한 부작용이나, 충분한 약제량을 투여할 수 없음으로써 약제의 효과를 충분히 얻을 수 없는 것이 문제가 되고 있다. 이 때문에 최근에는, 암세포에 특징적인 변이나 고발현을 나타내는 분자, 세포의 암화에 관여하는 특정한 분자를 표적으로 한 보다 선택성이 높은 분자 표적약이나 항체 의약의 개발이 이루어지고 있다.
항체는 혈중 안정성이 높고, 표적 항원에 특이적으로 결합하므로 부작용의 경감이 기대되고 있어, 암세포 표면에 고발현되어 있는 분자에 대한 항체 의약이 다수 개발되고 있다. 항체의 항원 특이적인 결합능을 이용한 기술의 하나로서, 항체-약물 컨쥬게이트 (Antibody-Drug Conjugate ; ADC) 를 들 수 있다. ADC 는, 암세포 표면에 발현되어 있는 항원에 결합하여, 그 결합에 의해 항원을 세포 내에 내재화할 수 있는 항체에, 세포 상해 활성을 갖는 약물을 결합시킨 것이다. ADC 는, 암세포에 효율적으로 약물을 송달할 수 있음으로써, 암세포 내에 약물을 축적시켜, 암세포를 사멸시키는 것을 기대할 수 있다 (비특허문헌 10, 특허문헌 1 및 2). ADC 로서 예를 들어, 항 CD30 모노클로날 항체에 모노메틸아우리스타틴 E 를 결합시킨 애드세트리스 (상표) (브렌툭시맙 베도틴) 가 호지킨 림프종과 미분화 대세포 림프종의 치료약으로서 인가되어 있다. 또, 항 HER2 모노클로날 항체에 엠탄신을 결합시킨 캐싸일라 (상표) (트라스투주맙 엠탄신) 가 HER2 양성의 진행, 재발 유방암의 치료에 사용되고 있다.
항종양약으로서의 ADC 에 적합한 표적 항원의 특징으로는, 암세포 표면에서 특이적으로 고발현되고, 정상 세포에서는 저발현 또는 발현되어 있지 않은 것, 세포 내에 내재화할 수 있는 것, 항원이 세포 표면으로부터 분비되지 않는 것 등을 들 수 있다. 또, ADC 에 적합한 항체의 중요한 특징으로는, 표적이 되는 항원에 특이적으로 결합하는 것에 추가하여, 높은 내재화능을 갖는 것을 들 수 있다. 항체의 내재화능은 표적 항원과 항체의 양방의 성질에 의존하는 것으로, 표적의 분자 구조로부터 내재화에 적합한 항원 결합 부위를 추정하거나, 항체의 결합 강도나 물성 등으로부터 용이하게 내재화능이 높은 항체를 추측하거나 하는 것은 곤란하다. 이 때문에, 표적 항원에 대하여 높은 내재화능을 갖는 항체를 취득하는 것은, 유효성이 높은 ADC 를 개발하는 데에 있어서 중요한 과제가 되고 있다 (비특허문헌 11).
CDH6 을 표적으로 한 ADC 로는, CDH6 의 EC 도메인 5 (EC5) 에 특이적으로 결합하는 항 CDH6 항체에 DM4 를 결합시킨 ADC 가 알려져 있다 (특허문헌 3).
ADC 에 결합시키는 약물로서 유용한 것의 하나로 피롤로벤조디아제핀 (PBD) 을 들 수 있다. PBD 는 DNA 소구 (小溝) 의 PuGPu 서열 등에 결합함으로써 세포 독성을 나타낸다. 천연 유래의 PBD 인 안트라마이신 (anthramycin) 은 1965년에 처음 발견되어, 그 이후 여러 가지 천연 유래, 또 그 유연체 (類緣體) 의 PBD 가 발견되었다 (비특허문헌 14 ∼ 17).
PBD 의 일반적인 구조식은 하기 식
[화학식 1]
Figure pct00001
으로 나타낸다. PBD 는 각각 A, C 고리부에 있어서 치환기의 수, 종류, 부위에 있어서 상이하고, 또, 각각 B, C 고리부의 불포화도가 상이한 것이 알려져 있다.
PBD 는 이량체 구조로 함으로써, 비약적으로 세포 독성이 향상되는 것이 알려져 있고 (비특허문헌 18, 19), 이량체 PBD 를 ADC 화한 것도 여러 가지가 보고되어 있다 (특허문헌 4 ∼ 16). 그러나, C2 위치에 있어서 스피로 고리를 갖는 PBD 또는 그 ADC 체는 알려져 있지 않다.
WO2014/057687 US2016/0297890 WO2016/024195 WO2013/173496 WO2014/130879 WO2017/004330 WO2017/004025 WO2017/020972 WO2016/036804 WO2015/095124 WO2015/052322 WO2015/052534 WO2016/115191 WO2015/052321 WO2015/031693 WO2011/130613
Shimoyama Y, et al., Cancer Research, 2206-2211, 55, May 15, 1995 Inoue T, et al., Developmental Biology, 183-194, 1997 Osterhout J A, et al., Neuron, 632-639, 71, Aug 25, 2011 Cho E A, et al., Development, 803-812, 125, 1998 Mah S P, et al., Developmental Biology, 38-53, 223, 2000 Paul R, et al., Cancer Research, 2741-2748, July 1, 57, 1997 Shimazui T, et al., Cancer, 963-968, 101(5), Sep.1, 2004 Koebel M, et al., PLoS Medicine, 1749-1760, 5(12), e232, Dec.2008 Gugnoni M, et al., Oncogene, 667-677, 36, 2017 Polakis P., Pharmacological Reviews, 3-19, 68, 2016 Peters C, et al., Bioscience Reports, 1-20, 35, 2015 Goeppert B, et al., Epigenetics, 780-790, 11(11), 2016 Yokoi S, et al., American Journal of Pathology, 207-216, 161, 1, 2002 Julia Mantaj, et al., Angewandte Chemie Internationl Edition 2016, 55, 2-29 Dyeison Antonow. et al., Chemical Reviews 2010, 111, 2815-2864 In Antibiotics III. Springer Verlag, New York, pp.3-11 Accounts of Chemical Research 1986, 19, 230 Journal of the American Chemical Society 1992, 114,4939 Journal of Organic Chemistry 1996, 61, 8141
본 발명의 과제는, CDH6 에 대해 특이적으로 결합하는 높은 내재화 활성을 갖는 항체, 그 항체를 함유하는 높은 항종양 활성을 갖는 항체-약물 컨쥬게이트, 그 항체-약물 컨쥬게이트를 사용한 종양에 대한 치료 효과를 갖는 의약품, 및, 당해 항체, 항체-약물 컨쥬게이트 또는 의약품을 사용한 종양의 치료 방법 등을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 달성하기 위해 예의 검토한 결과, 놀랍게도 CDH6 의 세포외 도메인 3 (본 명세서 중, EC3 이라고도 부른다) 에 특이적으로 결합하는 항체가, CDH6 을 발현하는 세포에 있어서 매우 높은 내재화 활성을 가져 ADC 용 항체로서 유용한 것을 알아내었다. 또, 본 발명자들은, 당해 항 CDH6 항체와 신규 PBD 유도체를 결합시킨 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트를 취득하는 것에 성공하여, 당해 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트가 강한 항종양 활성을 나타내는 일을 알아내었다.
본원 발명은, 이하에 관한 것이다.
[1] 다음 식 (X) :
[화학식 2]
Figure pct00002
(식 중, m2 는 1 또는 2 의 정수를 나타내고,
Ab 는, 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하여, 세포 내에 도입되는 내재화능을 갖는, IgG 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 나타내고,
L 은, Ab 의 N297 에 결합하는 당사슬 (N297 당사슬) 과 D 를 연결하는 링커이고,
N297 당사슬은, 리모델링되어 있어도 되는 당사슬을 나타내고,
D 는, 이하 :
[화학식 3]
Figure pct00003
에서 선택되는 어느 하나이고, 식 중, * (아스테리스크) 는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
으로 나타내는 항체-약물 컨쥬게이트.
[2] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에의 결합에 대하여, 이하의 (1) ∼ (8) :
(1) 서열 번호 23 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 26 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
(2) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 39 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
(3) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
(4) 서열 번호 35 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
(5) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 47 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
(6) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 65 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
(7) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 67 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체, 및
(8) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
로 이루어지는 군에서 선택되는 항체 중 적어도 어느 하나와 경합 저해 활성을 나타내는,
[1] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[3] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 이하의 (1) ∼ (4) :
(1) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
(2) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 30 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
(3) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 57 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 59 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및
(4) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
으로 이루어지는 군에서 선택되는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 및, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 함유하는,
[1] 또는 [2] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[4] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 이하의 (1) ∼ (4) :
(1) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(2) 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(3) (1) 또는 (2) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및
(4) (1) ∼ (3) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역, 그리고,
이하의 (5) ∼ (11) :
(5) 서열 번호 41 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(6) 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(7) 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(8) 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(9) 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(10) (5) ∼ (9) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및
(11) (5) ∼ (10) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역,
을 포함하는, [1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[5] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 이하의 (1) ∼ (6) :
(1) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 41 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(2) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(3) 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(4) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(5) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 또는
(6) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
중 어느 것의 경사슬 가변 영역 및 중사슬 가변 영역,
을 포함하는, [1] ∼ [4] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[6] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 이하의 (1) ∼ (7) :
(1) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 39 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(2) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(3) 서열 번호 35 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(4) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 47 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(5) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 65 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(6) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 67 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 또는
(7) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
중 어느 것을 갖는, [1] ∼ [5] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[7] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 39 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, [6] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[8] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, [6] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[9] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 35 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, [6] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[10] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 47 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, [6] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[11] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 65 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 [6] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[12] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 67 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 [6] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[13] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 [6] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[14] L 이, -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-* 로 나타내어지고,
식 중, * 는 상기 D 의 N10' 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
B 는, 1,4-페닐기, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기 또는 2,5-티에닐기이고,
Lp 는, 이하 :
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, 및, -GGPL-,
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
La 는, 이하 :
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-OC(=O)-, 및,
-OC(=O)-,
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고, 그리고,
Lb 는, 다음 식 :
[화학식 4]
Figure pct00004
[화학식 5]
Figure pct00005
, 또는,
[화학식 6]
Figure pct00006
(여기서, 상기에서 나타내는 Lb 의 구조식에 있어서, * 는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선 (波線) 은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 으로 나타내어지는, [1] ∼ [13] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[15] L 이, 이하 :
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 및
-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
여기서, Z1 은, 이하의 구조식 :
[화학식 7]
Figure pct00007
을 나타내고,
Z2 는, 이하의 구조식 :
[화학식 8]
Figure pct00008
을 나타내고,
Z3 은, 이하의 구조식 :
[화학식 9]
Figure pct00009
를 나타내고,
여기서, Z1, Z2 및 Z3 의 구조식에 있어서, * 는 Z1, Z2 또는 Z3 에 인접하는 C(=O), O 또는 CH2 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타내고, 그리고,
B 는, 1,4-페닐기를 나타내는,
[1] ∼ [14] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[16] L 이, 이하 :
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 및
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
여기서, B 는 1,4-페닐기이고, Z1 은 이하의 구조식 :
[화학식 10]
Figure pct00010
을 나타내고,
여기서, Z1 의 구조식에 있어서, * 는 Z1 에 인접하는 C(=O) 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 N297 에 결합하는 당사슬 (N297 당사슬) 또는 그 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타내는, [1] ∼ [15] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[17] 항체가, IgG1, IgG2 또는 IgG4 인, [1] ∼ [16] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[18] N297 당사슬이, 리모델링된 당사슬인, [1] ∼ [17] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[19] N297 당사슬이, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 인, [1] ∼ [18] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트 :
[화학식 11]
Figure pct00011
[화학식 12]
Figure pct00012
[화학식 13]
Figure pct00013
식 중, 파선은 항체의 Asn297 (N297) 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
N297 당사슬 중의 *-L(PEG)- 는, *-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH- 를 나타내고,
여기서, n5 는 2 ∼ 5 의 정수인 것을 나타내고, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, * 는, 각각의 구조식에 있어서의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타낸다.
[20] n5 가 3 인, [19] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[21] 다음 식 (XII) :
[화학식 14]
Figure pct00014
로 나타내는 항체-약물 컨쥬게이트로서, 여기서,
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 의 정수인 것을 나타내고,
Ab 는 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하여, 세포 내에 도입되는 내재화능을 갖는, IgG 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 나타내고,
Ab 의 N297 당사슬은 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
[화학식 15]
Figure pct00015
[화학식 16]
Figure pct00016
[화학식 17]
Figure pct00017
식 중, 파선은 항체의 Asn297 (N297) 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
N297 당사슬 중의 *-L(PEG)- 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH- 인 것을 나타내고,
여기서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, * 는, 각각의 구조식에 있어서의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 컨쥬게이트.
[22] 식 (XII) 로 나타내는 화합물이, 다음 식 (XII') :
[화학식 18]
Figure pct00018
로 나타내어지는, [21] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[23] 다음 식 (XIII) :
[화학식 19]
Figure pct00019
으로 나타내는 항체-약물 컨쥬게이트로서, 여기서,
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 의 정수인 것을 나타내고,
Ab 는 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하여, 세포 내에 도입되는 내재화능을 갖는, IgG 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 나타내고,
Ab 의 N297 당사슬은 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
[화학식 20]
Figure pct00020
[화학식 21]
Figure pct00021
[화학식 22]
Figure pct00022
식 중, 파선은 항체의 Asn297 (N297) 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
N297 당사슬 중의 *-L(PEG)- 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH-인 것을 나타내고,
여기서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, * 는, 각각의 구조식에 있어서의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 컨쥬게이트.
[24] 식 (XIII) 으로 나타내는 화합물이, 다음 식 (XIII') :
[화학식 23]
Figure pct00023
로 나타내어지는, [23] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[25] 다음 식 (XIV) :
[화학식 24]
Figure pct00024
로 나타내는 항체-약물 컨쥬게이트로서, 여기서,
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 의 정수인 것을 나타내고,
Ab 는 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하여, 세포 내에 도입되는 내재화능을 갖는, IgG 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 나타내고,
Ab 의 N297 당사슬은 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
[화학식 25]
Figure pct00025
[화학식 26]
Figure pct00026
[화학식 27]
Figure pct00027
식 중, 파선은 항체의 Asn297 (N297) 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
N297 당사슬 중의 *-L(PEG)- 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH- 인 것을 나타내고,
여기서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, * 는, 각각의 구조식에 있어서의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 컨쥬게이트.
[26] 식 (XIV) 로 나타내는 화합물이, 다음 식 (XIV') :
[화학식 28]
Figure pct00028
로 나타내어지는, [25] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[27] 다음 식 (XV) :
[화학식 29]
Figure pct00029
로 나타내는 항체-약물 컨쥬게이트로서, 여기서,
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 의 정수인 것을 나타내고,
Ab 는 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하여, 세포 내에 도입되는 내재화능을 갖는, IgG 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 나타내고,
Ab 의 N297 당사슬은 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
[화학식 30]
Figure pct00030
[화학식 31]
Figure pct00031
[화학식 32]
Figure pct00032
식 중, 파선은 항체의 Asn297 (N297) 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
N297 당사슬 중의 *-L(PEG)- 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH- 인 것을 나타내고,
여기서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, * 는, 각각의 구조식에 있어서의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 컨쥬게이트.
[28] 식 (XV) 로 나타내는 화합물이, 다음 식 (XV') :
[화학식 33]
Figure pct00033
로 나타내어지는, [27] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[29] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 이하의 (1) ∼ (4) :
(1) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
(2) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 30 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
(3) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 57 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 59 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및
(4) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
으로 이루어지는 군에서 선택되는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 및, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 함유하는,
[21] ∼ [28] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[30] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 이하의 (1) ∼ (6) :
(1) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 41 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(2) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(3) 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(4) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
(5) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 또는
(6) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
중 어느 것의 경사슬 가변 영역 및 중사슬 가변 영역,
을 포함하는, [21] ∼ [29] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[31] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 이하의 (1) ∼ (7) :
(1) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 39 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(2) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(3) 서열 번호 35 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(4) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 47 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(5) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 65 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(6) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 67 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 또는
(7) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
중 어느 것을 갖는, [21] ∼ [30] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[32] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 39 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, [31] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[33] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, [31] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[34] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 35 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, [31] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[35] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 47 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, [31] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[36] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 65 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, [31] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[37] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 67 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, [31] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[38] 상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 [31] 에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[39] 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수가 1 ∼ 3 인, [1] ∼ [38] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[40] 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수가 3 ∼ 5 인, [1] ∼ [38] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[41] 중사슬이 N-결합에의 당사슬 부가, O-결합에의 당사슬 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화 및 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실된 중사슬로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식 (修飾) 을 포함하는 항체인, [1] ∼ [40] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[42] 중사슬의 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실된, [1] ∼ [41] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[43] 이하의 공정 :
i) 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하여, 세포 내에 도입되는 내재화능을 갖는, IgG 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 제조하는 공정,
ii) 공정 i) 에서 얻어진 항체를 가수분해 효소로 처리하여, (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 제조하는 공정, 및,
iii)-1 MSG (9) 또는 SG (10) 의 시알산의 2 위치의 카르복실산의 카르보닐기에 아지드기를 갖는 PEG 링커를 도입하고, 환원 말단을 옥사졸린화하여 얻은 당사슬 도너 분자와, 당전이 효소 존재하에서 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 반응시키는 공정, 또는,
iii)-2 α-아미노기가 보호되어 있어도 되는 (MSG-)Asn 또는 (SG-)Asn 의 시알산의 2 위치의 카르복실산의 카르보닐기 및 상기 Asn 의 카르복실산의 카르보닐기에 아지드기를 갖는 PEG 링커를 도입하고, 가수분해 효소를 작용시킨 후, 환원 말단을 옥사졸린화하여 얻은 당사슬 도너 분자와, 당전이 효소 존재하에서 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 반응시키는 공정,
을 포함하는, 당사슬 리모델링 항체의 제조 방법.
[44] [43] 에 기재된 방법에 의해 얻어진 당사슬 리모델링 항체와 드러그 링커를 반응시키는 공정을 포함하는, [1] ∼ [42] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 방법.
[45] [44] 에 기재된 방법으로 제조된, [1] ∼ [42] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트.
[46] 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 함유하는 경사슬 가변 영역, 및, 서열 번호 57 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 59 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 함유하는 중사슬 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 기능성 단편.
[47] 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 함유하는 경사슬 가변 영역, 및, 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 함유하는 중사슬 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 기능성 단편.
[48] 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는, [46] 에 기재된 항체 또는 그 기능성 단편.
[49] 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는, [47] 에 기재된 항체 또는 그 기능성 단편.
[50] 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 67 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, [46] 또는 [48] 에 기재된 항체 또는 그 기능성 단편.
[51] 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, [47] 또는 [49] 에 기재된 항체 또는 그 기능성 단편.
[52] 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 65 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체 또는 그 기능성 단편.
[53] [46] ∼ [52] 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
[54] [53] 에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터.
[55] [54] 에 기재된 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
[56] [55] 에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적의 항체를 채취하는 공정을 포함하는, [46] ∼ [52] 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편의 제조 방법.
[57] [56] 에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
[58] [1] ∼ [42] 혹은 [45] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트, 또는, [46] ∼ [52] 혹은 [57] 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 포함하는, 의약 조성물.
[59] 항종양약인, [58] 에 기재된 의약 조성물.
[60] 종양이 CDH6 이 발현되어 있는 종양인, [59] 에 기재된 의약 조성물.
[61] 종양이 신세포암, 신담명세포암, 유두상 신세포암, 난소암, 난소 장액성선암, 갑상선암, 담관암, 폐암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 신경교아종, 중피종, 자궁암, 췌장암, 윌름스 종양 또는 신경아종인, [60] 에 기재된 의약 조성물.
[62] [1] ∼ [42] 혹은 [45] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트, [46] ∼ [52] 혹은 [57] 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 또는, [58] ∼ [61] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물을 개체에 투여하는 공정을 포함하는, 종양의 치료 방법.
[63] 종양이 CDH6 이 발현되어 있는 종양인, [62] 에 기재된 치료 방법.
[64] 종양이, 신세포암, 신담명세포암, 유두상 신세포암, 난소암, 난소 장액성선암, 갑상선암, 담관암, 폐암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 신경교아종, 중피종, 자궁암, 췌장암, 윌름스 종양 또는 신경아종인, [62] 또는 [63] 에 기재된 치료 방법.
[65] [1] ∼ [42] 혹은 [45] 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트, [46] ∼ [52] 혹은 [57] 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 또는, [58] ∼ [61] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물과 적어도 하나의 항종양약을, 동시에, 따로따로 또는 연속해서 개체에 투여하는 공정을 포함하는, [62] ∼ [64] 중 어느 한 항에 기재된 치료 방법.
본 발명의 항 CDH6 항체는, CDH6 의 EC 도메인 3 (EC3) 을 특이적으로 인식하고, 높은 내재화 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 항 CDH6 항체와 본 발명의 신규 PBD 유도체를 링커를 개재하여 결합시킨 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트는, CDH6 을 발현하는 암세포를 갖는 환자에게 투여함으로써, 우수한 항종양 효과 및 안전성을 달성하는 것을 기대할 수 있다. 즉, 본 발명의 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트는, 항종양제로서 유용하다.
도 1 은, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 rG019 또는 음성 컨트롤 항체 래트 IgG2b 의, 컨트롤 세포 (망점) 또는 hCDH6 도입 293T 세포 (백발 (白拔) 실선) 에 대한 결합을 조사한 플로우 사이토메트리의 결과를 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 2a 의 (1) 은, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 rG019 또는 음성 컨트롤 항체 래트 IgG2b 의, 컨트롤 세포 (망점) 또는 전장 hCDH6 도입 293 세포 (백발 실선) 에 대한 결합성을 나타낸다. (2) 는, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 rG019 또는 음성 컨트롤 항체 래트 IgG2b 의, 컨트롤 세포 (망점) 또는 EC1 결실 hCDH6 도입 293 세포 (백발 실선) 에 대한 결합성을 나타낸다. (3) 은, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 rG019 또는 음성 컨트롤 항체 래트 IgG2b 의, 컨트롤 세포 (망점) 또는 EC2 결실 hCDH6 도입 293 세포 (백발 실선) 에 대한 결합성을 나타낸다. (1) ∼ (3) 의 각 도면에 있어서, 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 2b 의 (4) 는, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 rG019 또는 음성 컨트롤 항체 래트 IgG2b 의, 컨트롤 세포 (망점) 또는 EC3 결실 hCDH6 도입 293 세포 (백발 실선) 에 대한 결합성을 나타낸다. (5) 는, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 rG019 또는 음성 컨트롤 항체 래트 IgG2b 의, 컨트롤 세포 (망점) 또는 EC4 결실 hCDH6 도입 293 세포 (백발 실선) 에 대한 결합성을 나타낸다. (6) 은, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 rG019 또는 음성 컨트롤 항체 래트 IgG2b 의, 컨트롤 세포 (망점) 또는 EC5 결실 hCDH6 도입 293 세포 (백발 실선) 에 대한 결합성을 나타낸다. (4) ∼ (6) 에 각 도면에 있어서, 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 3 은, 5 종류의 인간 종양 세포주 (인간 난소 종양 세포주 NIH : OVCAR-3, PA-1, OV-90, 및 인간 신세포 종양 세포주 786-O, Caki-1) 의 세포막 표면에서의 CDH6 의 발현을 평가한 플로우 사이토메트리의 결과를 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다. 망점으로 나타내는 히스토그램은 음성 컨트롤 mIgG1 로 염색했을 경우를 나타내고, 백발 실선으로 나타내는 히스토그램은 항 인간 CDH6 항체로 염색했을 경우를 나타낸다.
도 4 는, 인간 키메라 항 CDH6 항체 chG019 의 인간 CDH6 및 원숭이 CDH6 에 대한 결합을 나타낸다. 가로축은 항체 농도를 나타내고, 세로축은 결합량을 MeanFluorescent Intensity (평균 형광 강도) 로 나타낸다.
도 5a 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 또는 음성 컨트롤 항체 hIgG1 의, 컨트롤 세포 (망점) 또는 전장 hCDH6 도입 293α 세포 (백발 실선) 에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 APC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 5b 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 또는 음성 컨트롤 항체 hIgG1 의, 컨트롤 세포 (망점) 또는 EC1 결실 hCDH6 도입 293α 세포 (백발 실선) 에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 APC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 5c 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 또는 음성 컨트롤 항체 hIgG1 의, 컨트롤 세포 (망점) 또는 EC2 결실 hCDH6 도입 293α 세포 (백발 실선) 에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 APC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 5d 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 또는 음성 컨트롤 항체 hIgG1 의, 컨트롤 세포 (망점) 또는 EC3 결실 hCDH6 도입 293α 세포 (백발 실선) 에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 APC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 5e 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 또는 음성 컨트롤 hIgG1 의, 컨트롤 세포 (망점) 또는 EC4 결실 hCDH6 도입 293α 세포 (백발 실선) 에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 APC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 5f 는, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 또는 음성 컨트롤 hIgG1 의, 컨트롤 세포 (망점) 또는 EC5 결실 hCDH6 도입 293α 세포 (백발 실선) 에 대한 결합성을 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 APC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 6 은, 786-O/hCDH6 안정 발현 세포주 (백발 실선) 및 친(親)세포주 786-O (망점) 에 있어서의 인간 CDH6 의 발현을 조사한 플로우 사이토메트리의 결과를 나타낸다. 가로축은 항체 결합량을 나타내는 Alexa Fluor 647 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 7 은, 라벨화 NOV0712 (상단) 또는 라벨화 H01L02 (하단) 를 사용한, 라벨화하지 않은 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 또는 음성 컨트롤 hIgG1 과의 결합 경합 어세이를 나타낸다. 가로축은 라벨화하지 않은 항체의 첨가시의 종농도를 나타내고, 세로축은 결합량을 MeanFluorescent Intensity (평균 형광 강도) 로 나타낸다.
도 8 은, 인간화 hG019 항체 4 종 (H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 항 CDH6 항체 NOV0712 및 음성 컨트롤 항체의 내재화 활성을, 단백질 합성을 저해하는 독소 (사포린) 를 결합시킨 항인간 IgG 시약 Hum-ZAP 또는 음성 컨트롤로서 독소를 결합하지 않은 F(ab')2 단편 염소 항인간 IgG (F(ab')2 Fragment Goat Anti-human IgG), Fc(감마) 단편 특이성 (Fc(ga㎜a) Fragment Specific) 을 사용하여, NIH : OVCAR-3, 786-O 또는 PA-1 에 있어서 평가한 결과를 나타낸다. Hum-ZAP 대신에 음성 컨트롤을 첨가한 웰의 생존 세포수를 100 ％ 로 한 상대 생존률로서 산출된 세포 생존률 (％) 을 나타낸다.
도 9 는, 항 LPS 항체-PBD (ADC11), H01L02-PBD (ADC1), H01L02A-PBD (ADC5), H11L02A-PBD (ADC7), 또는 H31L02A-PBD (ADC6) 의, CDH6 양성 인간 난소 종양 세포주 NIH : OVCAR-3, OV-90, PA-1 또는 CDH6 양성 인간 신(腎)세포 종양 세포주 786-O 에 대한 IC50 (50 ％ 억제 농도) (nM) 를 나타낸다.
도 10 은, H01L02-PBD (ADC1), NOV0712-DM4 또는 항 LPS 항체-PBD (ADC11) 의 in vivo 항종양 효과를 나타낸다. CDH6 양성 인간 난소 종양 세포주 OV-90 을 면역 부전 마우스에 이식한 동물 모델을 사용하여 평가하였다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 표준오차 (SE) 값을 나타낸다.
도 11 은, H01L02-PBD (ADC1), NOV0712-DM4, 항 LPS 항체-PBD (ADC11) 의 in vivo 항종양 효과를 나타낸다. CDH6 양성 인간 신세포 종양 세포주 Caki-1 을 면역 부전 마우스에 이식한 동물 모델을 사용하여 평가하였다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 표준오차 (SE) 값을 나타낸다.
도 12 는, H01L02-PBD (ADC1), H01L02A-PBD (ADC5), H31L02A-PBD (ADC6), 항 LPS 항체-PBD (ADC11) 의 in vivo 항종양 효과를 나타낸다. CDH6 양성 인간 난소 종양 세포주 NIH : OVCAR-3 을 면역 부전 마우스에 이식한 동물 모델을 사용하여 평가하였다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
도 13 은, H01L02-PBD (ADC1), H01L02A-PBD (ADC5), H31L02A-PBD (ADC6), 또는 H11L02A-PBD (ADC7) 의 in vivo 항종양 효과를 나타낸다. CDH6 양성 인간 난소 종양 세포주 OV-90 을 면역 부전 마우스에 이식한 동물 모델을 사용하여 평가하였다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
도 14 는, H01L02A-PBD (ADC5), H31L02A-PBD (ADC6) 또는 항 LPS 항체-PBD (ADC11) 의 in vivo 항종양 효과를 나타낸다. CDH6 양성 인간 난소 종양 세포주 PA-1 을 면역 부전 마우스에 이식한 동물 모델을 사용하여 평가하였다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
도 15 는, H01L02A-PBD (ADC5), H31L02A-PBD (ADC6), 또는 항 LPS 항체-PBD (ADC11) 의 in vivo 항종양 효과를 나타낸다. CDH6 양성 인간 신세포 종양 세포주 786-O 를 면역 부전 마우스에 이식한 동물 모델을 사용하여 평가하였다. 가로축은 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 형태에 대해 도면을 참조하면서 설명한다. 또한, 이하에 설명하는 실시형태는, 본 발명의 대표적인 실시형태의 일례를 나타낸 것으로, 이것에 의해 본 발명의 범위가 좁게 해석되는 일은 없다.
본 명세서 중, 「암」, 「암종」 및 「종양」은 동일한 의미로 사용된다.
본 명세서 중, 「유전자」라는 단어에는, DNA 뿐만 아니라 그 mRNA, cDNA 및 그 cRNA 도 포함된다.
본 명세서 중, 「폴리뉴클레오티드」 또는 「뉴클레오티드」는, 핵산과 동일한 의미로 사용하고 있고, DNA, RNA, 프로브, 올리고 뉴클레오티드, 및 프라이머도 포함된다. 본 명세서 중, 「폴리뉴클레오티드」와 「뉴클레오티드」는, 특별히 지정되지 않는 한, 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본 명세서 중, 「폴리펩티드」와 「단백질」은 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본 명세서 중, 「세포」에는, 동물 개체 내의 세포, 배양 세포도 포함한다.
본 명세서 중, 「CDH6」 는, CDH6 단백질과 동일한 의미로 사용될 수 있다. 본 명세서 중, 인간 CDH6 을 「hCDH6」이라고 기재하는 경우가 있다.
본 명세서 중, 「세포 상해 활성」이란, 어떠한 형태로, 세포에 병리적인 변화를 일으키는 것을 말하고, 직접적인 외상에 그치지 않고, DNA 의 절단이나 염기의 이량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하 등 온갖 세포의 구조나 기능상의 손상을 일으키는 것을 말한다.
본 명세서 중, 「세포 내에서 독성을 발휘한다」란, 어떠한 형태로, 세포 내에서 독성을 나타내는 것을 말하고, 직접적인 외상에 그치지 않고, DNA 의 절단이나 염기의 이량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하, 세포 증식 인자의 작용의 억제 등 온갖 세포의 구조나 기능, 대사에 영향을 가져오는 것을 말한다.
본 발명에 있어서, 「항체의 기능성 단편」이란, 「항체의 항원 결합 단편」으로도 불리우며, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하고 있고, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, diabody, 선상 항체 및 항체 단편으로 형성된 다특이성 항체 등을 포함한다. 또, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 항원 결합 단편에 포함된다. 단, 항원과의 결합능을 가지고 있는 한 이들 분자에 한정되지 않는다. 또, 이들 항원 결합 단편에는, 항체 단백질의 전장 분자를 적당한 효소로 처리한 것 뿐만 아니라, 유전자 공학적으로 개변된 항체 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 단백질도 포함된다.
본 발명의 기능성 단편은, IgG 중사슬의 Fc 영역에 있어서 잘 보존된 N 결합형 당사슬에 의한 수식을 받는 아스파라긴 (Asn297 혹은 N297) 및 그 주변의 아미노산을 유지하고, 또한 항원과의 결합능을 가지고 있는 기능성 단편을 포함한다.
본 명세서 중, 「에피토프」란, 항 CDH6 항체가 결합하는 CDH6 의 특정한 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조를 의미한다. 상기 CDH6 의 부분 펩티드인 에피토프는 면역 어세이법 등 당업자에게는 잘 알려져 있는 방법에 의해 결정할 수 있다. 먼저, 항원의 여러 가지 부분 구조를 제조한다. 부분 구조의 제조에 있어서는, 공지된 올리고 뉴클레오티드 합성 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, CDH6 의 C 말단 또는 N 말단으로부터 적당한 길이로 순차 짧게 한 일련의 폴리펩티드를 당업자에게 주지된 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조한 후, 그것들에 대한 항체의 반응성을 검토하고, 대략적인 인식 부위를 결정한 후에, 또한 짧은 펩티드를 합성하여 그들 펩티드와의 반응성을 검토함으로써, 에피토프를 결정할 수 있다. 또, 복수의 세포외 도메인으로 이루어지는 막단백질에 결합하는 항체가, 복수의 도메인으로 이루어지는 입체 구조를 에피토프로 하고 있는 경우에는, 특정한 세포외 도메인의 아미노산 서열을 개변함으로써, 입체 구조를 개변함으로써 어느 도메인과 결합하는가를 결정할 수 있다. 특정한 항체가 결합하는 항원의 부분 입체 구조인 에피토프는, X 선 구조 해석에 의해 항체와 인접하는 항원의 아미노산 잔기를 특정함으로써도 결정할 수 있다.
본 명세서 중, 「동일한 에피토프에 결합한다」란, 공통된 에피토프에 결합하는 항체를 의미하고 있다. 제 1 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 제 2 항체가 결합하면, 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 혹은, 제 1 항체의 항원에 대한 결합에 제 2 항체가 경합하는 (즉, 제 2 항체가 제 1 항체와 항원의 결합을 방해한다) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 서열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 제 1 항체와 제 2 항체의 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 본 명세서 중, 「동일한 에피토프에 결합한다」란, 제 1 항체와 제 2 항체가, 당해 판정 방법 중 어느 일방 또는 양방에 의해, 공통된 에피토프에 결합한다고 판정되었을 경우를 말한다. 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 에피토프에 결합하고, 또한 제 1 항체가 항종양 활성이나 내재화 활성 등의 특수한 효과를 갖는 경우, 제 2 항체도 동일한 활성을 갖는 것을 기대할 수 있다.
본 명세서 중, 「CDR」이란, 상보성 결정 영역 (CDR ; Complementarity Determining Region) 을 의미한다. 항체 분자의 중사슬 및 경사슬에는 각각 3 지점의 CDR 이 있는 것이 알려져 있다. CDR 은, 초가변 영역 (hypervariable region) 이라고도 불리고, 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 내에 있고, 1 차 구조의 변이성이 특히 높은 부위이며, 중사슬 및 경사슬의 폴리펩티드 사슬의 1 차 구조 상에 있어서, 각각 3 지점으로 분리되어 있다. 본 명세서 중에 있어서는, 항체의 CDR 에 대하여, 중사슬의 CDR 을 중사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRH1, CDRH2, CDRH3 으로 표기하고, 경사슬의 CDR 을 경사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRL1, CDRL2, CDRL3 으로 표기한다. 이들 부위는 입체 구조 상에서 서로 근접하여, 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정하고 있다.
본 명세서 중, 「스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈한다」란, 시판되는 하이브리다이제이션 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (클론텍사) 중, 68 ℃ 에서 하이브리다이즈하는 것, 또는 DNA 를 고정시킨 필터를 사용하여 0.7 ∼ 1.0 M 의 NaCl 존재하 68 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1 ∼ 2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도 SSC 란 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨으로 이루어진다) 을 사용하여, 68 ℃ 에서 세정함으로써 동정할 수 있는 조건 또는 그것과 동등한 조건으로 하이브리다이즈하는 것을 말한다.
본 명세서 중, 「1 ∼ 수 개」란, 1 ∼ 10 개, 1 ∼ 9 개, 1 ∼ 8 개, 1 ∼ 7 개, 1 ∼ 6 개, 1 ∼ 5 개, 1 ∼ 4 개, 1 ∼ 3 개 또는 1 ∼ 2 개를 의미한다.
1. CDH6
카드헤린은, 세포막 표면에 존재하는 당단백질로, 칼슘 이온 의존적으로 N 말단측의 세포외 도메인끼리가 결합함으로써, 세포간 접착 분자로서, 또 세포간 상호 작용을 담당하는 시그널 분자로서 기능한다. 카드헤린 슈퍼 패밀리 중, 클래식 카드헤린으로 분류되는 분자군은, 세포 밖에 5 개의 세포외 도메인 (EC 도메인) 과 1 개의 막관통 영역, 및 세포내 도메인으로 구성되는 1 회 막관통 단백질이다.
CDH6 (Cadherin-6) 은, 타입 II 카드헤린 패밀리로 분류되는, 790 아미노산으로 이루어지는 1 회 막관통 단백질이고, N 말단측을 세포외, C 말단측을 세포내에 갖는다. 인간 CDH6 유전자는 1995년에 처음으로 클로닝되어 (비특허문헌 1), NM_004932, NP_004923 (NCBI) 등의 액세션 번호에 의해 참조 가능하다.
본 발명에서 사용하는 CDH6 단백질은, 인간, 비인간 포유 동물 (래트, 마우스, 원숭이 등) 의 CDH6 발현 세포로부터 직접 정제하여 사용하거나, 혹은 당해 세포의 세포막 획분을 조제하여 사용할 수 있고, 또, CDH6 을 in vitro 에서 합성하거나, 혹은 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다. 유전자 조작에서는, 구체적으로는, CDH6 cDNA 를 발현 가능한 벡터에 삽입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 포함하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 다른 원핵 생물, 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 CDH6 을 발현시킴으로써, 그 단백질을 얻을 수 있다. 또, 상기의 유전자 조작에 의한 CDH6 발현 세포, 혹은 CDH6 을 발현하고 있는 세포주를 CDH6 단백질로서 사용할 수도 있다. 또, CDH6 의 cDNA 를 삽입한 발현 벡터를 직접 피면역 동물에 투여하여 피면역 동물의 체내에서 CDH6 을 발현시킬 수도 있다.
또, 상기 CDH6 의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 당해 단백질과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 CDH6 에 포함된다.
인간 CDH6 단백질은, 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 인간 CDH6 단백질의 세포외 영역은, 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열의 54 ∼ 159 번째의 아미노산 서열을 갖는 세포외 도메인 1 (본 명세서 중, EC1 이라고도 칭한다), 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열의 160 ∼ 268 번째의 아미노산 서열을 갖는 세포외 도메인 2 (본 명세서 중, EC2 라고도 칭한다), 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열의 269 ∼ 383 번째의 아미노산 서열을 갖는 세포외 도메인 3 (본 명세서 중, EC3 이라고도 칭한다), 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열의 384 ∼ 486 번째의 아미노산 서열을 갖는 세포외 도메인 4 (본 명세서 중, EC4 라고도 칭한다), 및 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열의 487 ∼ 608 번째의 아미노산 서열을 갖는 세포외 도메인 5 (본 명세서 중, EC5 라고도 칭한다) 로 구성된다. EC1 ∼ EC5 의 아미노산 서열을, 각각, 서열 번호 2 ∼ 6 으로 한다 (표 1).
2. 항 CDH6 항체의 제조
본 발명의 항 CDH6 항체의 일례로서, 서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 인식하고, 또한 내재화 활성을 갖는 항 CDH6 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항 CDH6 항체의 일례로서, 서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 특이적으로 인식하고, 또한 내재화 활성을 갖는 항 CDH6 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항 CDH6 항체의 일례로서, 서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 아미노산 서열을 인식하고, 또한 내재화 활성을 갖는 항 CDH6 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항 CDH6 항체의 일례로서, 서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 아미노산 서열을 특이적으로 인식하고, 또한 내재화 활성을 갖는 항 CDH6 항체를 들 수 있다. 항체가 「서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 특이적으로 인식」한다 또는 「EC3 도메인을 특이적으로 인식」한다 란, 항체가, CDH6 의 EC3 도메인을 CDH6 의 다른 세포외 도메인과 비교하여 강하게 인식하거나 또는 강하게 결합하는 것을 말한다.
본 발명의 항 CDH6 항체는, 어느 종에서 유래해도 되지만, 바람직하게는, 인간, 원숭이, 래트, 마우스 또는 토끼를 예시할 수 있다. 인간 이외의 종에서 유래하는 경우에는, 주지된 기술을 사용하여, 키메라화 또는 인간화하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체는, 폴리클로날 항체여도 되고, 모노클로날 항체여도 되지만, 모노클로날 항체가 바람직하다.
본 발명의 항 CDH6 항체는 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 항체이고, 즉 종양 세포를 인식할 수 있는 특성, 종양 세포에 결합할 수 있는 특성, 및/또는 종양 세포 내에 도입되어 내재화되는 특성 등을 구비하고 있다. 따라서, 본 발명의 항 CDH6 항체와 항종양 활성을 갖는 화합물을, 링커를 통하여 결합시켜 항체-약물 컨쥬게이트로 할 수 있다.
항체의 종양 세포에 대한 결합성은, 플로우 사이토메트리를 사용하여 확인할 수 있다. 종양 세포 내로의 항체의 도입은, (1) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지) 를 사용하여 세포 내에 도입된 항체를 형광 현미경으로 가시화하는 어세이 (Cell Death and Differentiation, 2008, 15, 751-761), (2) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지) 를 사용하여 세포 내에 도입된 형광량을 측정하는 어세이 (Molecular Biology of the Cell Vol.15, 5268-5282, December 2004) 또는 (3) 치료 항체에 결합하는 이뮤노톡신을 사용하여, 세포 내에 도입되면 독소가 방출되어 세포 증식이 억제된다는 Mab-ZAP 어세이 (Bio Techniques 28 : 162-165, January 2000) 를 사용하여 확인할 수 있다. 이뮤노톡신으로는, 디프테리아 독소의 촉매 영역과 프로테인 G 의 리컴비넌트 복합 단백질 단백질도 사용 가능하다.
본 명세서에서 말하는 「높은 내재화능」이란, 당해 항체와 사포린 표지 항래트 IgG 항체를 투여한 CDH6 발현 세포의 생존율 (항체 미첨가시의 세포 생존율을 100 ％ 로 한 상대율로 나타낸 것) 이, 바람직하게는 70 ％ 이하, 보다 바람직하게는 60 ％ 이하인 것을 의미한다.
항체-약물 컨쥬게이트는 항종양 효과를 발휘하는 화합물을 결합시키고 있으므로, 항체 자체가 항종양 효과를 갖는 것은 바람직하지만, 필수는 아니다. 항종양성 화합물의 세포 상해성을 종양 세포에 있어서 특이적 및/또는 선택적으로 발휘시키는 목적에서는, 항체가 내재화되어 종양 세포 내로 이행하는 성질을 갖는 것이 중요하고, 바람직하다.
항 CDH6 항체는, 이 분야에서 통상 실시되는 방법을 사용하여, 항원이 되는 폴리펩티드를 동물에 면역시켜, 생체 내에 산생되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있지만, 바람직하게는, 입체 구조를 유지한 CDH6 을 항원으로서 사용하는 것이 바람직하다. 그러한 방법으로서, DNA 면역법을 들 수 있다.
항원의 유래는 인간에 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 항원을 동물에 면역시킬 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 항원에 결합하는 항체와 인간 항원의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.
또, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, 495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, 365-367, Plenum Press, N. Y. (1980)) 에 따라, 항원에 대한 항체를 산생하는 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하여, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다.
이하, 구체적으로 CDH6 에 대한 항체의 취득 방법을 설명한다.
(1) 항원의 조제
항원은 항원 단백질을 코드하는 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다. 구체적으로는, 항원 유전자를 발현 가능한 벡터를 제조하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 그 유전자를 발현시키고, 발현된 항원을 정제하면 된다. 상기의 유전자 조작에 의한 항원 발현 세포, 혹은 항원을 발현하고 있는 세포주를 동물에 면역시키는 방법을 사용하는 것에 의해서도 항체를 취득할 수 있다.
또, 항원 단백질을 사용하지 않고, 항원 단백질의 cDNA 를 발현 벡터에 삽입하여 피면역 동물에 투여하고, 피면역 동물의 체내에서 항원 단백질을 발현시켜, 항원 단백질에 대한 항체를 산생시킴으로써도 항체를 취득할 수 있다.
(2) 항 CDH6 모노클로날 항체의 제조
본 발명에서 사용되는 항 CDH6 항체는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 본원의 서열표로 나타낸 아미노산 서열로 특정되는 항체를 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 사용되는 항 CDH6 항체로는, 이하의 특성을 갖는 것이 바람직하다.
(1) 이하의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 ;
(a) CDH6 에 특이적으로 결합한다,
(b) CDH6 과 결합함으로써 CDH6 발현 세포에 내재화되는 활성을 갖는다,
(2) CDH6 이 인간 CDH6 인 상기 (1) 에 기재된 항체 또는 당해 항체,
(3) 인간 CDH6 의 EC3 을 특이적으로 인식하고, 또한 내재화 활성을 갖는다.
본 발명의 CDH6 에 대한 항체의 취득 방법은, 항 CDH6 항체를 취득할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않지만, 고차 구조를 유지한 CDH6 을 항원으로서 사용하는 것이 바람직하다.
바람직한 항체의 취득 방법의 일례로서 DNA 면역법을 들 수 있다. DNA 면역법이란, 항원 발현 플라스미드를 마우스나 래트 등의 동물 개체에 유전자 도입하여, 항원을 개체 내에서 발현시킴으로서, 항원에 대한 면역을 유도하는 수법이다. 유전자 도입의 수법에는, 직접 플라스미드를 근육에 주사하는 방법이나, 리포솜이나 폴리에틸렌이민 등의 도입 시약을 정맥 주사하는 방법, 바이러스 벡터를 사용하는 수법, 플라스미드를 부착시킨 금 입자를 Gene Gun 에 의해 쏘아 넣는 수법, 급속히 대량의 플라스미드 용액을 정맥 주사하는 Hydrodynamic 법 등이 존재한다. 발현 플라스미드의 근주 (筋注) 에 의한 유전자 도입법에 관해, 발현량을 향상시키는 수법으로서, 플라스미드를 근주 후, 동일한 부위에 일렉트로포레이션을 가하는 in vivo electroporation 이라는 기술이 알려져 있다 (Aihara H, Miyazaki J. Nat Biotechnol. 1998 Sep ; 16(9) : 867-70 또는 Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Delaere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Apr 13 ; 96(8) : 4262-7.). 본 수법은 플라스미드의 근주 전에 히알루로니다아제로 근육을 처리함으로써, 더욱 발현량이 향상된다 (McMahon JM1, Signori E, Wells KE, Fazio VM, Wells DJ. Gene Ther. 2001 Aug ; 8(16) : 1264-70). 또, 하이브리도마의 제조는 공지된 방법에 의해 실시할 수 있고, 예를 들어, Hybrimune Hybridoma Production System (Cyto Pulse Sciences 사) 을 사용하여 실시할 수도 있다.
구체적인 모노클로날 항체 취득의 예로는, 이하를 들 수 있다.
(a) CDH6 의 cDNA 를 발현 벡터 (예를 들어, pcDNA3.1 : Thermo Fisher Scientific) 에 삽입하고, 일렉트로포레이션이나 유전자 총 등의 방법에 의해, 그 벡터를 직접 피면역 동물 (예를 들어, 래트나 마우스) 에 투여함으로써, 동물 체내에 있어서 CDH6 을 발현시킴으로서, 면역 반응을 야기시킬 수 있다. 일렉트로포레이션 등에 의한 벡터의 투여는 항체가를 높이기 위해서 필요하다면, 1 회여도 되고 복수회여도 되며, 바람직하게는 복수회이다 ;
(b) 면역 반응이 야기된 상기 서술한 동물로부터, 항체 산생 세포를 포함하는 조직 (예를 들어 림프절) 을 채취한다 ;
(c) 골수종 세포 (이하 「미엘로마」라고 한다) (예를 들어, 마우스 미엘로마 SP2/0-ag14 세포) 의 조제 ;
(d) 항체 산생 세포와 미엘로마의 세포 융합 ;
(e) 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마군의 선별 ;
(f) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝) ;
(g) 경우에 따라서는, 모노클로날 항체를 대량으로 제조하기 위한 하이브리도마의 배양, 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육 ; 및/또는
(h) 이와 같이 하여 제조된 모노클로날 항체의 생리 활성 (내재화 활성), 및 그 결합 특이성의 검토, 혹은 표지 시약으로서의 특성의 검정.
여기서 사용되는 항체값의 측정법으로는, 예를 들어, 플로우 사이토메트리 또는 Cell-ELISA 법을 들 수 있지만 이들 방법에 제한되지 않는다.
이와 같이 하여 수립된 하이브리도마주의 예로는, 항 CDH6 항체 산생 하이브리도마 rG019 를 들 수 있다. 또한, 본 명세서 중에 있어서는, 항 CDH6 항체 산생 하이브리도마 rG019 가 산생하는 항체를, 「rG019 항체」 또는 간단히 「rG019」로 기재한다.
rG019 항체의 경사슬 가변 영역은, 서열 번호 10 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. 그 rG019 항체의 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호 11 에 나타내는 뉴클레오티드 서열에서 코드된다. rG019 항체의 경사슬 가변 영역은, 서열 번호 12 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 갖는다. rG019 항체의 중사슬 가변 영역은, 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. 그 rG019 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열은, 서열 번호 16 에 나타내는 뉴클레오티드 서열에서 코드된다. rG019 항체의 중사슬 가변 영역은, 서열 번호 17 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 18 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다.
또한 「2. 항 CDH6 항체의 제조」(a) 내지 (h) 의 공정을 다시 실시하여 별도로 독립적으로 모노클로날 항체를 취득한 경우나 다른 방법에 의해 별도로 모노클로날 항체를 취득한 경우에 있어서도, rG019 항체와 동등한 내재화 활성을 갖는 항체를 취득하는 것이 가능하다. 이와 같은 항체의 일례로서, rG019 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 들 수 있다. 새롭게 제조된 모노클로날 항체가 rG019 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 결합하면, 그 모노클로날 항체가 rG019 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 또, rG019 항체의 CDH6 에 대한 결합에 대하여 그 모노클로날 항체가 경합하는 (즉, 그 모노클로날 항체가 rG019 항체와 CDH6 의 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 서열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 그 모노클로날 항체가 항 CDH6 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 에피토프가 동일하다는 것이 확인되었을 경우, 그 모노클로날 항체가 rG019 항체와 동등한 항원 결합능, 생물 활성 및/또는 내재화 활성을 가지고 있는 것이 강하게 기대된다.
(3) 그 밖의 항체
본 발명의 항체에는, 상기 CDH6 에 대한 모노클로날 항체에 더하여, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 (Chimeric) 항체, 인간화 (Humanized) 항체 또는 인간 항체 등도 포함된다. 이들 항체는, 이미 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
키메라 항체로는, 항체의 가변 영역과 정상 영역이 서로 이종인 항체, 예를 들어 마우스 또는 래트 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 접합한 키메라 항체를 들 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984) 참조).
래트 항인간 CDH6 항체 유래의 키메라 항체의 예로는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CDH6 항체 (예를 들어, rG019 항체) 의 경사슬 가변 영역과 인간 유래의 정상 영역을 포함하는 경사슬, 및 상기 래트 항인간 CDH6 항체의 중사슬 가변 영역과 인간 유래의 정상 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
래트 항인간 CDH6 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CDH6 항체 (예를 들어, rG019 항체) 의 경사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 상기 래트 항인간 CDH6 항체의 중사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.
래트 항인간 CDH6 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CDH6 항체 (예를 들어, rG019 항체) 의 경사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 개의 CDR 중의 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 상기 래트 항인간 CDH6 항체의 중사슬 가변 영역 중 어느 1 ∼ 3 개의 CDR 중의 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.
rG019 항체 유래의 키메라 항체로는, 예를 들어, 서열 번호 10 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.
rG019 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 서열 번호 10 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 중의 1 ∼ 수 잔기, 1 ∼ 3 잔기, 1 ∼ 2 잔기, 바람직하게는 1 잔기의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.
rG019 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 서열 번호 10 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 개의 CDR 중의 1 또는 2 잔기 (바람직하게는 1 잔기) 의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 중의 어느 1 ∼ 3 개의 CDR 중의 1 또는 2 잔기 (바람직하게는 1 잔기) 의 아미노산을 다른 아미노산 잔기로 치환한 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.
rG019 항체 유래의 키메라 항체의 다른 예로는, 예를 들어, 서열 번호 10 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 및 서열 번호 28 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 항체는 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다. 서열 번호 28 에 나타내는 아미노산 서열은, 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열 중의 CDRH2 중의 시스테인 잔기를 프롤린 잔기로 치환한 서열이다.
rG019 항체 유래의 키메라 항체의 구체예로는, 서열 번호 23 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및 서열 번호 26 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있고, 당해 키메라 항인간 CDH6 항체를 본 명세서 중, 「키메라 G019 항체」, 「chG019 항체」 또는 「chG019」라고 칭한다. chG019 항체의 경사슬 전장 아미노산 서열은 서열 번호 24 에 나타내는 뉴클레오티드 서열에서 코드되고, chG019 항체의 중사슬 전장 아미노산 서열은 서열 번호 27 에 나타내는 뉴클레오티드 서열에서 코드된다.
chG019 항체의 경사슬 가변 영역 아미노산 서열은, rG019 항체의 경사슬 가변 영역 아미노산 서열과 동일하고, 서열 번호 10 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. chG019 항체의 경사슬은, 서열 번호 12 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 갖고, 각각, rG019 의 경사슬의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 과 동일하다. chG019 항체의 경사슬 가변 영역 아미노산은, 서열 번호 25 에 나타내는 뉴클레오티드 서열에서 코드된다.
chG019 항체의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열은, 서열 번호 28 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어진다. chG019 항체의 중사슬은, 서열 번호 17 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 30 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다. 서열 번호 28 에 나타내는 아미노산 서열은, 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열 중의 CDRH2 중의 시스테인 잔기를 프롤린 잔기로 치환한 서열이다. 서열 번호 30 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 는, 서열 번호 18 에 나타내는 rG019 CDRH2 중의 시스테인 잔기를 프롤린 잔기로 치환한 서열이다. chG019 항체의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열은, 서열 번호 29 에 나타내는 뉴클레오티드 서열에서 코드된다.
인간화 항체로는, 상보성 결정 영역 (CDR ; Complementarity Determining Region) 만을 인간 유래의 항체에 삽입한 항체 (Nature (1986) 321, p.522-525 참조), CDR 이식법에 의해, CDR 의 서열에 더하여 일부의 프레임워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식한 항체 (국제 공개 제90/07861호), 또한, 항원에 대한 결합능을 유지하면서, 일부의 CDR 의 아미노산 서열을 개변한 항체를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, rG019 항체 또는 chG019 항체 유래의 인간화 항체란, rG019 항체 또는 chG019 항체 중 어느 것에 대하여, 각각에 고유의 6 개의 CDR 서열을 모두 유지하면서, 또한 내재화 활성을 갖는 인간화 항체이면 되고, 특정한 인간화 항체에 한정되지 않는다. 당해 인간화 항체는, 내재화 활성을 갖는 한, 추가로 일부의 CDR 의 일부의 아미노산 서열이 개변되어 있어도 된다.
chG019 항체의 인간화 항체의 실례로는, (1) 서열 번호 33 또는 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, (2) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 (바람직하게는, 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열), 및 (3) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 그리고 (4) 서열 번호 41, 45, 49, 55 또는 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, (5) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 (바람직하게는, 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열), 및 (6) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬의 임의의 조합을 들 수 있다.
또, 중사슬 또는 경사슬의 일방을 인간화하고, 타방을 래트 항체나 키메라 항체의 경사슬 또는 중사슬로 한 항체도 사용할 수 있다. 그러한 항체의 예로는, (1) 서열 번호 33 또는 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, (2) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 (바람직하게는, 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열), 및 (3) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 그리고 (4) 서열 번호 15 또는 28 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, (5) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 (바람직하게는, 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열), 및 (6) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬의 임의의 조합을 들 수 있다. 다른 예로는, (1) 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, (2) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 (바람직하게는, 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열), 및 (3) 상기 (1) 의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬, 그리고 (4) 서열 번호 41, 45, 49, 55 또는 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, (5) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 (바람직하게는, 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열), 및 (6) 상기 (4) 의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬의 임의의 조합을 들 수 있다.
또, 본 명세서 중에 있어서의 아미노산의 치환으로는 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 보존적 아미노산 치환이란, 아미노산 측사슬에 관련이 있는 아미노산 그룹 내에서 발생하는 치환이다. 바람직한 아미노산 그룹은, 다음과 같다 : 산성 그룹 = 아스파르트산, 글루탐산 ; 염기성 그룹 = 리신, 아르기닌, 히스티딘 ; 비극성 그룹 = 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판 ; 및 비대전 극성 패밀리 = 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 다른 바람직한 아미노산 그룹은 다음과 같다 : 지방족 하이드록시 그룹 = 세린 및 트레오닌 ; 아미드 함유 그룹 = 아스파라긴 및 글루타민 ; 지방족 그룹 = 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신 ; 그리고 방향족 그룹 = 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신. 이러한 아미노산 치환은 원래의 아미노산 서열을 갖는 물질의 특성을 저하시키지 않는 범위에서 실시하는 것이 바람직하다.
상기 경사슬 및 중사슬의 바람직한 조합의 항체로는,
서열 번호 33 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hL02 경사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다) 을 갖는 경사슬 또는 서열 번호 37 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hL03 경사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다) 을 갖는 경사슬, 및, 서열 번호 41 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH01 중사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다) 을 갖는 중사슬, 서열 번호 45 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH02 중사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다) 을 갖는 중사슬, 서열 번호 49 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH04 중사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다), 서열 번호 55 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH11 중사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다) 또는 서열 번호 60 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH31 중사슬 가변 영역 아미노산 서열이라고도 칭한다) 을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
서열 번호 55 에 나타내는 hH11 중사슬 가변 영역 아미노산 서열은, 서열 번호 57 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 58 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 59 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다. 서열 번호 60 에 나타내는 hH31 중사슬 가변 영역 아미노산 서열은, 서열 번호 62 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 63 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 64 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다.
바람직한 항체의 예로는,
서열 번호 33 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 41 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 33 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 45 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 33 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 49 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 33 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 55 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 33 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 60 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 37 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 41 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 37 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 45 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 37 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 49 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 37 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 55 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 또는
서열 번호 37 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 60 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
를 들 수 있다.
보다 바람직한 항체의 예로는,
서열 번호 33 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 41 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 33 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 45 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 33 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 49 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 37 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 45 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 33 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 55 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 또는
서열 번호 33 에 나타내는 경사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 경사슬 및 서열 번호 60 에 나타내는 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
를 들 수 있다.
상기 경사슬 및 중사슬의 바람직한 조합의 항체의 다른 예로는,
서열 번호 31 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열 (본 명세서 중, hL02 경사슬 전장 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 또는 서열 번호 35 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열 (본 명세서 중, hL03 경사슬 전장 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬, 및,
서열 번호 39 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH01 중사슬 전장 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 서열 번호 43 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH02 중사슬 전장 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 서열 번호 47 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH04 중사슬 전장 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 서열 번호 65 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH01A 의 중사슬 전장 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 서열 번호 67 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH11A 의 중사슬 전장 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 또는 서열 번호 69 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열 (본 명세서 중, hH31A 의 중사슬 전장 아미노산 서열이라고도 칭한다) 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬
로 이루어지는 항체를 들 수 있다.
다른 바람직한 항체의 예로는,
서열 번호 31 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 39 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 31 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 31 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 47 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 31 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 65 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 31 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 67 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 31 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 35 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 39 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 35 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 35 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 47 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 35 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 65 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
서열 번호 35 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 67 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ; 또는
서열 번호 35 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 ;
를 들 수 있다.
보다 바람직한 항체의 예로는,
서열 번호 31 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 39 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 (본 명세서 중, 「H01L02 항체」 또는 「H01L02」라고도 칭한다) ;
서열 번호 31 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 (본 명세서 중, 「H02L02 항체」 또는 「H02L02」라고도 칭한다) ;
서열 번호 31 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 47 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 (본 명세서 중, 「H04L02 항체」 또는 「H04L02」라고도 칭한다) ;
서열 번호 35 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 (본 명세서 중, 「H02L03 항체」 또는 「H02L03」라고도 칭한다) ;
서열 번호 31 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 65 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 (본 명세서 중, 「H01L02A 항체」 또는 「H01L02A」이라고도 칭한다) ;
서열 번호 31 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 67 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 (본 명세서 중, 「H11L02A 항체」 또는 「H11L02A」이라고도 칭한다) ; 또는
서열 번호 31 에 나타내는 경사슬 전장 아미노산 서열의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 에 나타내는 중사슬 전장 아미노산 서열의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬로 이루어지는 항체 (본 명세서 중, 「H31L02A 항체」 또는 「H31L02A」이라고도 칭한다) ;
를 들 수 있다.
상기의 중사슬 아미노산 서열 및 경사슬 아미노산 서열과 높은 동일성을 나타내는 서열을 조합함으로써, 상기의 각 항체와 동등한 생물 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다. 이와 같은 동일성은, 일반적으로는 80 ％ 이상의 동일성이고, 바람직하게는 90 ％ 이상의 동일성이고, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 동일성이며, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상의 동일성이다. 또, 중사슬 또는 경사슬의 아미노산 서열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 조합하는 것에 의해서도, 상기의 각 항체와 동등한 생물 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다.
2 종류의 아미노산 서열간의 동일성은, ClustalW version2 (Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ and Higgins DG (2007), 「Clustal W and Clustal X version 2.0」, Bioinformatics. 23(21) : 2947-2948) 의 디폴트 파라미터를 사용하여 서열을 정렬시킴으로써 결정할 수 있다.
또한, 서열 번호 31 에 나타내는 hL02 경사슬 전장 아미노산 서열 중, 1 ∼ 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 21 ∼ 128 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 129 ∼ 233 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다.
서열 번호 35 에 나타내는 hL03 경사슬 전장 아미노산 서열 중, 1 ∼ 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 21 ∼ 128 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 129 ∼ 233 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다.
서열 번호 39 에 나타내는 hH01 중사슬 전장 아미노산 서열 중, 1 ∼ 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 ∼ 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 142 ∼ 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다.
서열 번호 43 에 나타내는 hH02 중사슬 전장 아미노산 서열 중, 1 ∼ 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 ∼ 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 142 ∼ 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다.
서열 번호 47 에 나타내는 hH04 중사슬 전장 아미노산 서열 중, 1 ∼ 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 ∼ 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 142 ∼ 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다.
서열 번호 65 에 나타내는 hH01A 중사슬 전장 아미노산 서열 중, 1 ∼ 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 ∼ 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 142 ∼ 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다.
서열 번호 67 에 나타내는 hH11A 중사슬 전장 아미노산 서열 중, 1 ∼ 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 ∼ 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 142 ∼ 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다.
서열 번호 69 에 나타내는 hH31A 중사슬 전장 아미노산 서열 중, 1 ∼ 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 ∼ 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 142 ∼ 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다.
본 발명의 항체로는, 또한, CDH6 에 결합하는, 인간 항체를 들 수 있다. 항 CDH6 인간 항체란, 인간 염색체 유래의 항체의 유전자 서열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항 CDH6 인간 항체는, 인간 항체의 중사슬과 경사슬의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 산생 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133-143, ; Kuroiwa, Y. et. al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448 ; Yoshida, H. et.al., Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects vol.10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999. ; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727 등을 참조.) 에 의해 취득할 수 있다.
이와 같은 인간 항체 산생 마우스는, 구체적으로는, 내재성 면역 글로블린 중사슬 및 경사슬의 유전자좌가 파괴되고, 대신에 효모 인공 염색체 (Yeast artificial chromosome, YAC) 벡터 등을 통하여 인간 면역 글로블린 중사슬 및 경사슬의 유전자좌가 도입된 유전자 재조합 동물로서, 녹아웃 동물 및 트랜스제닉 동물의 제조 및 이들 동물끼리를 교배시킴으로써 만들어 낼 수 있다.
또, 유전자 재조합 기술에 의해, 그러한 인간 항체의 중사슬 및 경사슬의 각각을 코드하는 cDNA, 바람직하게는 그 cDNA 를 포함하는 벡터에 의해 진핵 세포를 형질 전환하고, 유전자 재조합 인간 모노클로날 항체를 산생하는 형질 전환 세포를 배양함으로써, 이 항체를 배양 상청 중에서 얻을 수도 있다.
여기서, 숙주로는 예를 들어 진핵 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 림프구나 미엘로마 등의 포유 동물 세포를 사용할 수 있다.
또, 인간 항체 라이브러리로부터 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology ＆ Visual Science. (2002) 43(7), p.2301-2308 ; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1(2), p.189-203 ; Siriwardena, D. et. al., Ophthalmology (2002) 109(3), p.427-431 등 참조.) 도 알려져 있다.
예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 1 본쇄 항체 (scFv) 로서 파지 표면에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 파지 디스플레이법 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p.1105-1116) 을 사용할 수 있다.
항원에 결합함으로써 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다.
항원에 결합하는 scFv 의 DNA 서열이 명확해지면, 당해 서열을 갖는 발현 벡터를 제조하고, 적당한 숙주에 도입하여 발현시킴으로서 인간 항체를 취득할 수 있다 (국제 공개 제92/01047호, 동 92/20791호, 동 93/06213호, 동 93/11236호, 동 93/19172호, 동 95/01438호, 동 95/15388호, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p.433-455, Nature Biotechnology (2005) 23(9), p.1105-1116).
새롭게 제조된 인간 항체가, 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CDH6 항체, 키메라 항인간 CDH6 항체 또는 인간화 항인간 CDH6 항체 (예를 들어, rG019 항체, chG019 항체, H01L02 항체, H02L02 항체, H02L03 항체, H04L02 항체, H01L02A 항체, H11L02A 항체 또는 H31L02A 항체) 중 어느 하나가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 결합하면, 그 인간 항체가 당해 래트 항인간 CDH6 항체, 키메라 항인간 CDH6 항체 또는 인간화 항인간 CDH6 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 혹은, 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CDH6 항체, 키메라 항인간 CDH6 항체 또는 인간화 항인간 CDH6 항체 (예를 들어, G019 항체, chG019 항체, H01L02 항체, H02L02 항체, H02L03 항체, H04L02 항체, H01L02A 항체, H11L02A 항체 또는 H31L02A 항체) 의 CDH6 에 대한 결합에 대하여 그 인간 항체가 경합하는 (예를 들어, 그 인간 항체가, rG019 항체, chG019 항체, H01L02 항체, H02L02 항체, H02L03 항체, H04L02 항체, H01L02A 항체, H11L02A 항체 또는 H31L02A 항체와 CDH6, 바람직하게는 CDH6 의 EC3 에 대한 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 서열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 그 인간 항체가 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CDH6 항체, 키메라 항인간 CDH6 항체 또는 인간화 항인간 CDH6 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 당해 판정 방법의 적어도 어느 일방의 방법에 의해 「동일한 에피토프에 결합한다」고 판정되었을 경우, 새롭게 제조된 인간 항체가, 본 명세서에 기재된 래트 항인간 CDH6 항체, 키메라 항인간 CDH6 항체 또는 인간화 항인간 CDH6 항체와 「동일한 에피토프에 결합한다」고 할 수 있다. 에피토프가 동일하다는 것이 확인되었을 경우, 그 인간 항체가 래트 항인간 CDH6 항체, 키메라 항인간 CDH6 항체 또는 인간화 항인간 CDH6 항체 (예를 들어, rG019 항체, chG019 항체, H01L02 항체, H02L02 항체, H02L03 항체, H04L02 항체, H01L02A 항체, H11L02A 항체 또는 H31L02A 항체) 와 동등한 생물 활성을 가지고 있는 것이 기대된다.
이상의 방법에 의해 얻어진 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체는, 공지된 방법 등에 의해 항원에 대한 결합성을 평가하여, 바람직한 항체를 선발할 수 있다.
항체의 성질을 비교할 때의 다른 지표의 일례로는, 항체의 안정성을 들 수 있다. 시차 주사 칼로리메트리(DSC) 는, 단백의 상대적 구조 안정성이 양호한 지표가 되는 열변성 중점 (Tm) 을 재빠르게, 또 정확하게 측정할 수 있는 장치이다. DSC 를 사용하여 Tm 값을 측정하고, 그 값을 비교함으로써, 열안정성의 차이를 비교할 수 있다. 항체의 보존 안정성은, 항체의 열안정성과 어느 정도의 상관을 나타내는 것이 알려져 있어 (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p.265-273), 열안정성을 지표로, 바람직한 항체를 선발할 수 있다. 항체를 선발하기 위한 다른 지표로는, 적절한 숙주 세포에 있어서의 수량이 높은 것, 및 수용액 중에서의 응집성이 낮은 것을 들 수 있다. 예를 들어 수량이 가장 높은 항체가 가장 높은 열안정성을 나타낸다고는 할 수 없기 때문에, 이상에 서술한 지표에 기초하여 종합적으로 판단하여, 인간에 대한 투여에 가장 적합한 항체를 선발할 필요가 있다.
본 발명의 항체에는 항체의 수식체도 포함된다. 당해 수식체란, 본 발명의 항체에 화학적 또는 생물학적인 수식이 실시되어 이루어지는 것을 의미한다. 화학적인 수식체에는, 아미노산 골격에 대한 화학 부분의 결합, N- 결합 또는 O- 결합 탄수화물 사슬의 화학 수식체 등이 포함된다. 생물학적인 수식체에는, 번역 후 수식 (예를 들어, N- 결합 또는 O- 결합에의 당사슬 부가, N 말단 또는 C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, 또는 N 말단 글루타민 혹은 N 말단 글루탐산의 피로글루탐산화) 된 것, 원핵 생물 숙주 세포를 사용하여 발현시킴으로서 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가된 것 등이 포함된다. 또, 본 발명의 항체 또는 항원의 검출 또는 단리를 가능하게 하기 위해서 표지된 것, 예를 들어, 효소 표지체, 형광 표지체, 어피니티 표지체도 이러한 수식물의 의미에 포함된다. 이와 같은 본 발명의 항체의 수식물은, 항체의 안정성 및 혈중 체류성의 개선, 항원성의 저감, 항체 또는 항원의 검출 또는 단리 등에 유용하다.
또, 본 발명의 항체에 결합하고 있는 당사슬 수식을 조절하는 것 (글리코실화, 탈푸코오스화 등) 에 의해, 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강시키는 것이 가능하다. 항체의 당사슬 수식의 조절 기술로는, 국제 공개 제1999/54342호, 동 2000/61739호, 동 2002/31140호, WO2007/133855 등이 알려져 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체에는 당해 당사슬 수식이 조절된 항체도 포함된다.
항체 유전자를 일단 단리한 후, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제조하는 경우에는, 적당한 숙주과 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 항체 유전자의 구체예로는, 본 명세서에 기재된 항체의 중사슬 서열을 코드하는 유전자, 및 경사슬 서열을 코드하는 유전자를 조합한 것을 들 수 있다. 숙주 세포를 형질 전환할 때에는, 중사슬 서열 유전자와 경사슬 서열 유전자는, 동일한 발현 벡터에 삽입되어 있는 것이 가능하고, 또 각각의 발현 벡터에 삽입되어 있는 것도 가능하다.
진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진핵 미생물을 사용할 수 있다. 특히 동물 세포로는, 포유류 세포, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아 세포 NIH3T3 (ATCC No.CRL-1658) 이나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로 엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p.4126-4220), FreeStyle 293F 세포 (invitrogen 사) 를 들 수 있다.
원핵 세포를 사용하는 경우에는, 예를 들어, 대장균, 고초균을 들 수 있다.
이들 세포에 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하고, 형질 전환된 세포를 in vitro 에서 배양함으로써 항체가 얻어진다. 당해 배양에 있어서는 항체의 서열에 의해 수량이 상이한 경우가 있DJ, 동등한 결합 활성을 갖는 항체 중에서 수량을 지표로 의약으로서의 생산이 용이한 것을 선별하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 항체에는, 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당해 항체의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체도 포함된다.
또한, 포유류 배양 세포에서 생산되는 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실되는 것이 알려져 있고 (Journal of Chromatography A, 705 : 129-134 (1995)), 또, 마찬가지로 중사슬 카르복실 말단의 글리신, 리신의 2 아미노산 잔기가 결실되고, 새롭게 카르복실 말단에 위치하는 프롤린 잔기가 아미드화되는 것이 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, 360 : 75-83 (2007)). 그러나, 이들 중사슬 서열의 결실 및 수식은, 항체의 항원 결합능 또는 이펙터 기능 (보체 (補體) 의 활성화나 항체 의존성 세포 상해 작용 등) 에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명에 관련된 항체에는, 당해 수식을 받은 항체 및 당해 항체의 기능성 단편도 포함되고, 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실된 결실체, 및 아미드화된 당해 결실체 (예를 들어, 카르복실 말단 부위의 프롤린 잔기가 아미드화된 중사슬) 등도 포함된다. 단, 항원 결합능 또는 이펙터 기능이 유지되어 있는 한, 본 발명에 관련된 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 결실체는 상기의 종류에 한정되지 않는다. 본 발명에 관련된 항체를 구성하는 2 개의 중사슬은, 완전 길이 및 상기의 결실체로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 중 어느 1 종이어도 되고, 어느 2 종을 조합한 것이어도 된다. 각 결실체의 양비는 본 발명에 관련된 항체를 산생하는 포유류 배양 세포의 종류 및 배양 조건에 영향을 받을 수 있지만, 본 발명에 관련된 항체의 주성분으로는 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단의 하나의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 경우를 들 수 있다.
본 발명의 항체의 아이소 타입으로는, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 를 들 수 있다.
본 발명의 항체의 아이소 타입으로서 IgG1 을 사용하는 경우에는, 정상 영역의 아미노산 잔기의 일부를 치환함으로써, 이펙터 기능을 조정하는 것이 가능하다. 이펙터 기능을 저감 또는 감약시킨 IgG1 의 변이체로는, IgG1 LALA (IgG1-L234A, L235A), IgG1 LAGA (IgG1-L235A, G237A) 등을 들 수 있고 (Journal of Virology, Vol.75, No.24 (Dec. 15, 2001), pp.12161-12168), 바람직하게는 IgG1 LALA 이다. 또한, 상기 L234A, L235A 는 EU index (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Vol. 63, No.1 (May 15, 1969), pp.78-85) 에 의해 특정되는 234 위치, 235 위치의 류신의 알라닌으로의 치환, G237A 는 EU index 에 의해 특정되는 237 위치의 글리신의 알라닌으로의 치환을 나타낸다.
항체의 생물 활성으로는, 일반적으로는 항원 결합 활성, 항원과 결합함으로써 그 항원을 발현하는 세포에 내재화되는 활성, 항원의 활성을 중화시키는 활성, 항원의 활성을 증강시키는 활성, 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성, 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성 및 항체 의존성 세포 매개 식작용 (ADCP) 을 들 수 있지만, 본 발명에 관련된 항체가 갖는 기능은, CDH6 에 대한 결합 활성이고, 바람직하게는 CDH6 과 결합함으로써 CDH6 발현 세포에 내재화되는 활성이다. 또한 본 발명의 항체는, 세포 내재화 활성에 더하여, ADCC 활성, CDC 활성 및/또는 ADCP 활성을 겸비하고 있어도 된다.
얻어진 항체는 균일해질 때까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다. 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 필터 여과, 한외 여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있지만 (Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ; Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이들에 한정되는 것은 아니다.
크로마토그래피로는, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다.
이들 크로마토그래피는, HPLC 나 FPLC 등의 액체 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있다.
어피니티 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들어 프로테인 A 칼럼을 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (파르마시아) 등을 들 수 있다.
또 항원을 고정화시킨 담체를 사용하고, 항원에 대한 결합성을 이용하여 항체를 정제할 수도 있다.
본 발명은 또, 본 발명의 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 바람직하게는, 이하의 (a) ∼ (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
(a) 본 발명의 CDH6 항체의 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 조합,
(b) 본 발명의 CDH6 항체 중 어느 하나의 항체의 CDRH1 ∼ CDRH3 을 함유하는 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 CDRL1 ∼ CDRL3 을 함유하는 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 조합,
(c) 본 발명의 CDH6 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 조합
(d) (a) ∼ (c) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한, CDH6 에 결합하는 항체의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및,
(e) (a) ∼ (c) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 있어서 1 ∼ 50 개, 1 ∼ 45 개, 1 ∼ 40 개, 1 ∼ 35 개, 1 ∼ 30 개, 1 ∼ 25 개, 1 ∼ 20 개, 1 ∼ 15 개, 1 ∼ 10 개, 1 ∼ 8 개, 1 ∼ 6 개, 1 ∼ 5 개, 1 ∼ 4 개, 1 ∼ 3 개, 1 혹은 2 개, 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입되어 이루어지는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하며, 또한, CDH6 에 결합하는 항체의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명은, 본 발명의 항체 혹은 그 기능성 단편 또는 그 수식체를 코드하는 뉴클레오티드, 그 유전자가 삽입된 재조합 벡터, 그 유전자 또는 그 벡터가 도입된 세포를 포함한다.
또, 본 발명은, 상기 세포를 배양하는 공정, 및, 그 배양물로부터 항체 혹은 그 기능성 단편 또는 그 수식체를 회수하는 공정을 포함하는, 항체 혹은 그 기능성 단편 또는 그 수식체의 제조 방법도 포함한다.
본 발명의 항체의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열, 그리고, 본 발명에 있어서 사용된 단백질의 아미노산 서열 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열을 표 1-1 ∼ 표 1-14 에 나타낸다.
[표 1-1]
Figure pct00034
[표 1-2]
Figure pct00035
[표 1-3]
Figure pct00036
[표 1-4]
Figure pct00037
[표 1-5]
Figure pct00038
[표 1-6]
Figure pct00039
[표 1-7]
Figure pct00040
[표 1-8]
Figure pct00041
[표 1-9]
Figure pct00042
[표 1-10]
Figure pct00043
[표 1-11]
Figure pct00044
[표 1-12]
Figure pct00045
[표 1-13]
Figure pct00046
[표 1-14]
Figure pct00047
3. 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는, 다음 식 :
[화학식 34]
Figure pct00048
(식 중, m2 는 1 또는 2 의 정수를 나타내고,
Ab 는, 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하여, 세포 내에 도입되는 내재화능을 갖는, IgG 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 나타내고,
L 은, Ab 의 N297 에 결합하는 당사슬 (N297) 과 D 를 연결하는 링커이고,
D 는, 이하 :
[화학식 35]
Figure pct00049
에서 선택되는 어느 하나이고, 식 중, * 는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
으로 나타내어진다.
<약물>
상기 「2. 항 CDH6 항체의 제조」에서 취득된 항 CDH6 항체는 링커 구조 부분을 개재하여 약물을 결합시킴으로써, 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트로 할 수 있다. 약물로는, 링커 구조에 결합할 수 있는 치환기, 부분 구조를 갖는 것이면 특별히 제한은 없다. 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트는 결합하는 약물에 따라 여러 가지 용도에 사용할 수 있다. 그러한 약물의 예로는, 항종양 활성을 갖는 물질, 혈액 질환에 대한 효과를 갖는 물질, 자기 면역 질환에 대한 효과를 갖는 물질, 항염증 물질, 항균 물질, 항진균 물질, 항기생충 물질, 항바이러스 물질, 항마취 물질 등을 들 수 있다.
<항종양 화합물>
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트에 결합되는 화합물로서 항종양성 화합물을 사용하는 예에 대하여 이하에 서술한다. 항종양성 화합물로는, 항종양 효과를 갖는 화합물로서, 링커 구조에 결합할 수 있는 치환기, 부분 구조를 갖는 것이면 특별히 제한은 없다. 항종양성 화합물은, 링커의 일부 또는 전부가 종양 세포 내에서 절단되어 항종양성 화합물 부분이 유리되어 항종양 효과가 발현된다. 링커가 약물과의 결합 부분에서 절단되면 항종양성 화합물이 본래의 구조에서 유리되어, 그 본래의 항종양 효과가 발휘된다. 당해 유리 약물로서 실시예 10-7 ∼ 10-10 에 기재된 약물 1 ∼ 4 를 들 수 있다.
상기 「2. 항 CDH6 항체의 제조」에서 취득된 항 CDH6 항체는 링커 구조 부분을 개재하여 항종양성 화합물을 결합시킴으로써, 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트로 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항종양성 화합물은, 이하 :
[화학식 36]
Figure pct00050
에서 선택되는 어느 하나이다 (식 중, * 는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다). 본 발명의 PBD 유도체는 11' 위치에 부제 탄소가 존재하기 때문에, 광학 이성체가 존재한다. 본 명세서에 있어서, 이들 이성체, 및 이들 이성체의 혼합물이 모두 단일의 식으로 나타내어지고 있다. 따라서, 상기한 본 발명의 PBD 유도체는, 각각, 광학 이성체 및 광학 이성체의 임의의 비율로의 혼합물을 포함한다. 상기한 본 발명의 PBD 유도체의 11' 위치의 절대 입체 배치는 결정성의 생성물 또는 중간체 혹은 그들의 유도체의 X 선 결정 구조 해석이나 Mosher 법 등의 NMR 에 의해 결정할 수 있다. 그 때, 입체 배치가 이미 알려진 부제 중심을 갖는 시약으로 유도화된 결정성의 생성물 또는 중간체를 사용하여 절대 입체 배치를 결정해도 된다. 입체 이성체는, 합성한 본 발명에 관련된 화합물을 원하는 바에 따라서 통상적인 광학 분할법 또는 분리법을 사용하여 단리함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트, 그 유리 약물 혹은 그 제조 중간체에는, 입체 이성체 혹은 부제 탄소 원자에서 유래하는 광학 이성체, 기하 이성체, 호변 이성체 또는 d 체, l 체, 아트로프 이성체 등의 광학 이성체가 존재하는 경우도 있는데, 이들 이성체, 광학 이성체 및 이들의 혼합물의 모두가 본 발명에 포함된다.
본 발명에서 사용되는 항종양성 화합물은, 이하 :
[화학식 37]
Figure pct00051
에서 선택되는 어느 하나이다 (식 중, * 는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다).
＜링커 구조＞
본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서 항종양성 약물을 항체에 결합하는 링커 구조에 대해 설명한다.
당해 링커 L 은, 다음 식 :
-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*
으로 나타낸다.
* 는 상기 D 로 나타내는 항종양성 화합물의 N10' 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, Lb 는, La 와 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬을 결합하는 스페이서를 나타낸다.
B 는, 페닐기 또는 헤테로아릴기를 나타내고, 바람직하게는, 1,4-페닐기, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기, 2,5-티에닐기이고, 보다 바람직하게는 1,4-페닐기이다.
Lp 는, 생체내 또는 표적 세포에 있어서 절단 가능한 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 나타낸다. Lp 는, 예를 들어, 에스테라아제나 펩티다아제 등의 효소의 작용에 의해, 절단된다.
Lp 는, 2 내지 7 개 (바람직하게는, 2 내지 4 개) 의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기이다. 즉, 2 내지 7 개의 아미노산이 펩티드 결합한 올리고 펩티드의 잔기에 의해 구성된다.
Lp 는, N 말단에 있어서 Lb-La- 의 La 의 카르보닐기에 결합하고, C 말단에 있어서 링커의 -NH-B-CH2-O(C=O)- 부분의 아미노기 (-NH-) 와 아미드 결합을 형성한다. 상기 에스테라아제 등의 효소에 의해, Lp 의 C 말단과 -NH- 사이의 결합이 절단된다.
Lp 를 구성하는 아미노산은 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들어, L- 또는 D-아미노산이고, 바람직하게는 L-아미노산이다. 또, α-아미노산 외에, β-알라닌, ε-아미노카프로산, γ-아미노부티르산 등의 구조의 아미노산이어도 되고, 나아가서는 예를 들어 N-메틸화된 아미노산 등의 비천연형 아미노산이어도 된다.
Lp 의 아미노산 서열은, 특별히 한정되지 않지만, 구성하는 아미노산으로서, 글리신 (Gly ; G), 발린 (Val ; V), 알라닌 (Ala ; A), 페닐알라닌 (Phe ; F), 글루탐산 (Glu ; E), 이소류신 (Ile ; I), 프롤린 (Pro ; P), 시트룰린 (Cit), 류신 (Leu ; L), 세린 (Ser ; S), 리신 (Lys ; K) 및 아스파르트산 (Asp ; D) 등을 들 수 있다. 이들 중에서 바람직하게는, 글리신 (Gly ; G), 발린 (Val ; V), 알라닌 (Ala ; A), 시트룰린 (Cit) 이다.
이들 아미노산은 중복되어도 되고, 임의로 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 또, 아미노산의 종류에 의해, 약물 유리의 패턴을 컨트롤할 수 있다.
링커 Lp 의 구체예로서,
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG(D-)PI-, -GGPL-, -EGGVA, -PI-, -GGF-, DGGF-, (D-)D-GGF-, -EGGF-, -SGGF-, -KGGF-, -DGGFG-, -GGFGG-, -DDGGFG-, -KDGGFG-, -GGFGGGF-
를 들 수 있다.
여기서, 상기 「(D-)V」는 D-발린, 「(D-)P」는 D-프롤린, 「(D-)D」는 D-아스파르트산을 의미한다.
링커 Lp 는, 바람직하게는 이하이다.
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG(D-)PI-, -GGPL-
링커 Lp 는, 보다 바람직하게는 이하이다.
-GGVA-, -GGVCit-, -VA-
Lb 는, La 와 항체 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬을 결합하는 스페이서를 나타낸다.
La 는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타낸다.
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-OC(=O)-, 및,
-OC(=O)-,
로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고, La 는, 보다 바람직하게는 -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, 또는, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)- 이다.
Lb 의 스페이서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 다음 식으로 나타내는 스페이서를 들 수 있다.
[화학식 38]
Figure pct00052
[화학식 39]
Figure pct00053
[화학식 40]
Figure pct00054
상기에서 나타내는 Lb 의 각각의 구조식에 있어서, * 는 La 의 좌단의 -(C=O), O 또는 -CH2 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다.
상기에서 나타내는 Lb (Lb-1, Lb-2 또는 Lb-3) 의 각각의 구조식에 있어서, 아지드기와 시클로옥티닐기의 click reaction 에 의해 형성되는 트리아졸 고리 부위는, 기하 이성 구조를 갖고, 1 개의 Lb 중에, 이들 2 종류의 구조 중 어느 일방, 또는, 그들의 혼합물로서 존재한다. 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트 1 분자 중에는 2 또는 4 개 (상기 m2 가 1 또는 2) 의 「-L-D」가 존재하고, 각각의 「-L-D」에 있어서의 L 중의 각각의 Lb (Lb-1, Lb-2 또는 Lb-3) 는, 이들 2 종류의 구조 중 어느 일방, 또는, 그 양방이 혼재하고 있다.
Lb 가, i) 인 경우, L 은, 바람직하게는, -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-* 로 나타내어지고,
L 이, 이하의 군 :
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 및
-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- 에서 선택되고,
여기서, Z1 은, 이하의 구조식 :
[화학식 41]
Figure pct00055
을 나타내고,
Z2 는, 이하의 구조식 :
[화학식 42]
Figure pct00056
을 나타내고,
Z3 은, 이하의 구조식 :
[화학식 43]
Figure pct00057
을 나타내고,
여기서, Z1, Z2 및 Z3 의 구조식에 있어서, * 는 Z1, Z2 또는 Z3 에 인접하는 C(=O), O 또는 CH2 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타내고, 그리고,
B 는, 1,4-페닐기를 나타낸다.
본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트는, 그 대부분이 종양 세포 내로 이행된 후에 링커 부분 (예를 들어, Lp) 이 효소 등에 의해 절단되고 활성화되면, 약물 D 부분이 유리되어 (이하, 유리 약물이라고 한다), 항종양 활성을 발휘하는 것으로 생각된다.
따라서, 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트는 종양 세포 밖에서 안정되어 있는 것이 바람직하다.
＜당사슬 리모델링＞
최근, 불균일한 항체의 당 단백질을, 효소 반응 등에 의해 리모델링하여, 관능기를 갖는 당사슬을 균일하게 도입하는 방법이 보고되어 있다 (ACS Chemical Biology 2012, 7, 110, ACS Medicinal Chemistry Letters 2016, 7, 1005). 이 당사슬 리모델링 기술을 사용하여, 부위 특이적으로 약물을 도입하고, 균일한 ADC 를 합성하는 시도도 이루어져 있다 (Bioconjugate Chemistry 2015, 26, 2233, Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367, US2016361436).
본 발명의 당사슬의 리모델링은 먼저 가수분해 효소를 이용하여, 단백질 (항체 등) 에 부가되어 있는 불균일한 당사슬을 말단의 GlcNAc 만 남기고 절제하여, GlcNAc 가 부가된 균일한 단백질 부분을 조제한다 (이하, 「억셉터」라고 한다). 다음으로, 별도 조제한 임의의 당사슬을 준비하고 (이하, 「도너」라고 한다), 이 억셉터와 도너를 당전이 효소를 사용하여 연결한다. 이로써, 임의의 당사슬 구조를 가진 균일한 당단백질을 합성할 수 있다.
본 발명에 있어서 「당사슬」이란, 2 개 이상의 단당이 글리코사이드 결합에 의해 결합된 구조 단위를 의미한다. 구체적인 단당이나 당사슬을, 예를 들어 "GlcNAc-", "MSG-" 와 같이, 약호로서 표기하는 경우가 있다. 구조식 중에서 이들 약호로 기재한 경우, 환원 말단에서 다른 구조 단위와의 글리코사이드 결합에 귀속되는 산소 원자 또는 질소 원자는, 특별한 정의가 있는 경우를 제외하고, 당해 당사슬을 나타내는 약호에는 포함되지 않는 것으로서 표시된다.
본 발명에 있어서, 당사슬의 기본 단위가 되는 단당의 기재는, 별도로 정하는 경우를 제외하고, 편의상, 그 고리 구조에 있어서, 고리를 구성하는 산소 원자에 결합하고, 또한, 수산기 (또는 글리코사이드 결합에 귀속되는 산소 원자) 와 직접 결합한 탄소 원자를 1 위치 (시알산에 있어서만 2 위치) 로서 표기한다. 실시예 화합물의 명칭은, 화학 구조 전체로서 부여된 것이며, 이 룰은 반드시 적용되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 당사슬을 기호 (예를 들어, GLY, SG, MSG, GlcNAc 등) 로서 기재하는 경우, 별도로 정의되는 경우를 제외하고, 환원 말단의 탄소까지를, 당해 기호에 포함하는 것으로 하고, N- 또는 O-글리코사이드 결합에 귀속되는 N 또는 O 는, 당해 기호에는 포함되지 않는 것으로 한다.
본 발명에 있어서, 특별한 기재가 없는 한, 아미노산의 측사슬에 있어서 당사슬과 연결된 경우의 부분 구조는, 측사슬 부분을 괄호로 표시하여, 예를 들어, 「(SG-)Asn」과 같이 표기하는 것으로 한다.
본 발명에 있어서의 Ab 의 당사슬은, N 결합형 당사슬이나 O 결합형 당사슬이고, 바람직하게는 N 결합형 당사슬이다.
N 결합형 당사슬은 N 글리코사이드 결합, O 결합형 당사슬은 O 글리코사이드 결합에 의해, 항체의 아미노산 측사슬과 결합하고 있다.
IgG 는 그 중사슬의 Fc 영역에 있어서의 297 번째의 아스파라긴 잔기 (이하, 「Asn297 또는 N297」이라고 한다.) 에 양호하게 보존된 N 결합형 당사슬을 가지고 있고, 항체 분자의 활성이나 동태 등에 기여하는 것이 알려져 있다 (Biotechnol. Prog., 2012, 28, 608-622, Sanglier-Cianferani, S., Anal. Chem., 2013, 85, 715-736).
IgG 의 정상 영역에 있어서의 아미노산 서열은 잘 보존되어 있고, Edelman et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Vol.63, No.1 (May 15, 1969), pp.78-85) 에 있어서, 각각의 아미노산이 Eu 번호 (Eu INDEX) 로 특정되어 있다. 예를 들어, Fc 영역에 있어서 N 결합형 당사슬이 부가되는 Asn297 은, Eu 번호에 있어서 297 위치에 상당하는 것이고, 분자의 단편화나 영역 결손에 의해 실제의 아미노산 위치가 변동한 경우라도 Eu 번호로 표시함으로써 아미노산이 일의적으로 특정된다.
본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서, 보다 바람직하게는, 항체 또는 그 기능성 단편은 그 Asn297 의 측사슬에 결합하는 당사슬 (이하, 「N297 당사슬」이라고 한다) 로부터 L 에 결합하고 있고, 더욱 바람직하게는, 항체 또는 그 기능성 단편은 상기 N297 당사슬로부터 L 에 결합하고 있으며, 당해 N297 당사슬이 리모델링된 당사슬이다.
또한, 당해 리모델링된 당사슬을 갖는 항체를 당사슬 리모델링 항체라고 한다.
SGP 는 Sialyl GlycoPeptide 의 약어이고, N 결합형 복합 당사슬의 대표적인 것이다. 계란의 난황으로부터, SGP 는, 예를 들어, WO2011/0278681 에 기재된 방법에 따라 단리, 정제할 수 있다. 또, SGP 의 정제품이 시판 (토쿄 화성 (주), (주) 후시미 제약소) 되고 있어, 구입할 수 있다. SG 의 당사슬 부분에 있어서 환원 말단의 GlcNAc 가 1 개 결손된 당사슬 (이하, 「SG (10)」) 만으로 이루어지는 디시알로옥타사카라이드 (토쿄 화성 (주)) 등이 시판되고 있다.
본 발명에 있어서, SG (10) 의 β-Man 의 분기 사슬 중 어느 일방에서만 비환원 말단의 시알산이 결실된 당사슬 구조를 MSG (9) 로 하고, 분기 사슬의 1-3 당사슬에만 시알산을 갖는 것을 MSG1, 분기 사슬의 1-6 당사슬에만 시알산을 갖는 것을 MSG2 로 각각 표기하는 것으로 한다.
본 발명의 리모델링된 당사슬은, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 N297-(Fuc)MSG1 과 N297-(Fuc)MSG2 의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 이고, 바람직하게는, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 또는 N297-(Fuc)SG 이며, 보다 바람직하게는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 이다.
N297-(Fuc)MSG1 은 이하의 구조식 또는 서열식으로 나타낸다.
[화학식 44]
Figure pct00058
[화학식 45]
Figure pct00059
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH- 를 나타내고, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
* 는, 상기 링커 L, 특히 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
여기서, n5 는 2 ∼ 10 의 정수이며, 바람직하게는, 2 ∼ 5 의 정수이다.
N297-(Fuc)MSG2 는 이하의 구조식 또는 서열식으로 나타낸다.
[화학식 46]
Figure pct00060
[화학식 47]
Figure pct00061
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH- 를 나타내고, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
* 는, 상기 링커 L, 특히 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
여기서, n5 는 2 ∼ 10 의 정수이며, 바람직하게는, 2 ∼ 5 의 정수이다.
N297-(Fuc)SG 는 이하의 구조식 또는 서열식으로 나타낸다.
[화학식 48]
Figure pct00062
[화학식 49]
Figure pct00063
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH- 를 나타내고, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, * 는, 상기 링커 L, 특히 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
여기서, n5 는 2 ∼ 10 의 정수이며, 바람직하게는, 2 ∼ 5 의 정수이다.
본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체의 N297 당사슬이, N297-(Fuc)MSG1 혹은 N297-(Fuc)MSG2 또는 그들의 혼합물인 경우, 항체는 이량체이기 때문에, 항체-약물 컨쥬게이트는 2 개의 링커 L 및 2 개의 약물 D 가 결합된 분자 (상기 m2 = 1) 가 된다.
＜항체의 조제＞
당사슬 리모델링 항체, 예를 들어 WO2013/120066 등에 기재된 방법에 준하여, 다음 식에 나타내는 바와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
[화학식 50]
Figure pct00064
R-1 공정 환원 말단의 키토비오스 구조의 GlcNAcβ1-4GlcNAc 간의 글리코사이드 결합의 가수분해
본 공정은 목적의 항체에 대해, 공지된 효소 반응을 이용하여 항체의 아미노산 서열 297 번째의 아스파라긴에 결합하는 N 결합형 당사슬 (N297 결합 당사슬) 을 절단하여, 당사슬 절단 항체를 조제하는 공정이다.
목적의 항체 (20 ㎎/mL) 를 완충 용액 (50 mM 인산 완충 용액 등) 중, 0 ℃ 에서 40 ℃ 까지에 있어서, EndoS 효소 등의 가수분해 효소를 사용하여 환원 말단의 키토비오스 구조의 GlcNAcβ1 과 4GlcNAc 간의 글리코사이드 결합의 가수분해 반응을 실시한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 6 시간이다. 야생형 EndoS 효소는 항체 100 ㎎ 에 대해, 0.1 내지 10 ㎎, 바람직하게는 0.1 내지 3 ㎎ 을 사용한다. 반응 종료 후, 후술하는 어피니티 크로마토그래피 정제 및/또는 하이드록시 아파타이트 칼럼 정제를 실시함으로써 GlcNAcβ1 과 4GlcNAc 간의 당사슬이 가수분해된 (Fucα1,6)GlcNAc 항체를 제조할 수 있다.
R-2 공정 당사슬 전이 반응
본 공정은 상기 서술한 (Fucα1,6)GlcNAc 항체에 대해, 효소 반응을 이용하여 아지드기를 함유하는 PEG 링커를 갖는 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 당사슬 옥사졸린체 (이하, 「아지드 당사슬 옥사졸린체」) 를 결합시켜, 당사슬 리모델링 항체를 제조하는 공정이다.
상기 당사슬 절단 항체를 완충 용액 (인산 완충 용액 등) 중, 0 ℃ 부터 40 ℃ 까지에 있어서, 촉매량의 EndoS (D233Q/Q303L) 등의 당전이 효소 존재하, 아지드 당사슬 옥사졸린체와 반응시킴으로써, 당사슬 전이 반응을 실시한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 6 시간이다. EndoS 효소 (D233Q/Q303L) 는 항체 100 ㎎ 에 대해, 1 내지 10 ㎎, 바람직하게는 1 내지 3 ㎎ 을 사용하고, 아지드 당사슬 옥사졸린체는 2 내지 과잉 당량, 바람직하게는 2 내지 20 당량을 사용한다.
반응 종료 후, 어피니티 크로마토그래피 정제와 하이드록시 아파타이트 칼럼 정제를 실시함으로써 정제한 당사슬 리모델링 항체를 얻을 수 있다.
아지드 당사슬 옥사졸린체는 실시예 11 에 기재된 방법에 따라 조제할 수 있다. MSG1 에 유기 합성 과학 분야에서 공지된 반응 (축합 반응 등) 을 이용하여, 아지드기를 함유하는 PEG 링커 (N3-L(PEG)) 인 N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2 를 도입할 수 있다. 즉, 시알산 2 위치로의 카르복실산과 N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2 의 우말단의 아미노기가 축합 반응에 의해 아미드 결합을 형성한다.
축합 반응을 이용하는 경우, 축합제로는, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDCI), 카르보닐디이미다졸 (CDI), 2-(2H-벤조트리아졸-2-일)-4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페놀 (BOP), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로인산염 (PyBOP), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로인산염 (HATU) 등을, 반응에 사용되는 용매로는, 디클로로메탄, DMF, THF, 아세트산에틸 등, 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다.
반응 온도는, 통상 -20 ℃ 내지 100 ℃ 혹은 용매의 비점까지의 범위이지만, 바람직하게는 -5 ℃ 부터 50 ℃ 까지의 범위이다. 또, 필요에 따라 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린 또는 4-디메틸아미노피리딘 등의 유기 염기, 또는 탄산칼륨, 탄산나트륨, 탄산수소칼륨, 탄산수소나트륨 등의 무기 염기를 첨가할 수 있다. 또한, 1-하이드록시벤조트리아졸, N-하이드록시숙신이미드 등을 반응 촉진제로서 첨가할 수도 있다.
또한, MSG1 은, 분리 정제한 (MSG1-)Asn (실시예 11) 을 EndoM 등의 가수분해 효소로 가수분해함으로써 얻을 수 있다.
옥사졸린화는 MSG1 의 환원 말단의 GlcNAc 로부터, 공지된 논문 (J. Org Chem., 2009, 74 (5), 2210-2212. Helv. Chim. Acta, 2012, 95, 1928-1936.) 에 따라 조제할 수 있다.
N297 당사슬의 가수분해 반응에 사용하는 효소로는, EndoS 또는 그 가수분해 활성을 유지한 변이 효소 등을 사용할 수 있다.
상기한 가수분해 반응에 의해 얻어진 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 당사슬 억셉터-분자로서, EndoS D233Q 또는 EndoS D233Q/Q303L 변이체와 같은 당전이 효소 (WO2017010559 등) 를 사용하여 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 당사슬 도너 분자와 반응시킴으로써, 상기 서술한 구조로 이루어지는 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 N297 당사슬을 갖는 항체를 얻을 수 있다.
항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 결합수 m2 가 1 인 경우, 당사슬로서 MSG, MSG1 또는 MSG2 를 갖는 당사슬 도너 분자를 채용한다. 이와 같은 당사슬은, 시판되는 monosialo-Asn free (1S2G/1G2S-10NC-Asn, (주) 당사슬 공학 연구소, 이하 「(MSG-)Asn」이라고 한다) 을 원료로 실시예 11 에 기재된 방법에 준하여 (MSG-)Asn1 또는 (MSG2-)Asn 를 분리하여 채용할 수도 있고, 분리하지 않고 혼합물로서 채용할 수도 있다.
항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 결합수 m2 가 2 인 경우, 이 당전이 반응에는 당사슬로서 SG (10) 을 갖는 당사슬 도너 분자를 사용한다. 이와 같은 SG (10) 당사슬은, 예를 들어 SGP 로부터 가수분해 등에 의해 취득된 것을 사용해도 되고, 시판되는 디시알로옥타사카라이드 (토쿄 화성 공업 (주)) 와 같은 SG (10) 당사슬을 사용해도 된다.
도너 분자에 포함되는 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 당사슬은 그 시알산의 2 위치에 아지드기를 함유하는 PEG 링커 (N3-L(PEG)) 를 갖는다. 시알산의 2 위치로의 아지드기를 함유하는 PEG 링커 (N3-L(PEG)) 의 도입에는, MSG (MSG (9)), MSG1 혹은 MSG2 또는 디시알로옥타사카라이드 (SG (10)) 와 아지드기를 함유하는 PEG 링커 (N3-L(PEG)) 인 N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2 (n5 는 2 ∼ 10 의 정수이며, 바람직하게는 2 ∼ 5 의 정수를 나타낸다.) 를 유기 합성 과학 분야에서 공지된 반응 (축합 반응 등) 을 사용할 수 있다. 즉, 시알산 2 위치로의 카르복실산과 N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2 의 우말단의 아미노기가 축합 반응에 의해 아미드 결합을 형성한다.
또, MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 당사슬은, 예를 들어 α-아미노기가 보호 혹은 수식되어 있어도 되는 (MSG1-)Asn, (MSG2-)Asn 또는 (SG-)Asn (당사슬 공학 연구소) 등의 원료의 시알산의 2 위치의 카르복실산 및 상기 Asn 의 카르복실산에 축합 반응을 이용하여 아지드기를 갖는 PEG 링커 (N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2) 를 도입하고, EndoM 이나 EndoRp 와 같은 가수분해 효소를 작용시켜 얻을 수도 있다. α-아미노기의 보호기로는 아세틸 (Ac) 기, t-Butoxycarbonyl (Boc) 기, 벤조일 (Bz) 기, 벤질 (Bzl) 기, Carbobenzoxy (Cbz) 기, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) 기 등을 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. α-아미노기의 보호기는, 바람직하게는, Fmoc 기이다.
α-아미노기의 수식기로는 하이드록시아세틸기, 또는 PEG 구조 등을 갖는 수용성을 향상시키는 수식기를 들 수 있다.
(MSG1-)Asn, (MSG-2)Asn 또는 (SG-)Asn 은, 바람직하게는, α-아미노기가 상기 보호기로 보호되어 있다. α-아미노기가 보호기 (예를 들어, Fmoc 기) 로 보호되고 있는 경우, 필요에 따라, 아지드기를 갖는 PEG 링커를 도입한 후, 가수분해 효소를 작용시키기 전에 보호기를 제거할 수 있다.
분자에 포함되는 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 당사슬의 환원 말단의 GlcNAc 는, 예를 들어 2-클로로-1,3-디메틸-1H-벤즈이미다졸-3-이움-클로라이드 처리에 의한 옥사졸린화와 같은 형태로 활성화된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
당전이 반응에 사용하는 효소 (당전이 효소) 로는, N297 당사슬에 복합형 당사슬을 전이시키는 활성을 갖는 것이면 다양한 것을 채용할 수 있지만, 바람직한 것은 EndoS 의 233 번째의 Asp 를 Gln 으로 치환함으로써 가수분해 반응을 억제한 개변체인 EndoS D233Q 이다. EndoS D233Q 를 사용한 당전이 반응에 대해서는, WO2013/120066 등에 기재되어 있다. 또, EndoS D233Q 에 대해, 추가로 변이를 가한 EndoS D233Q/Q303L 과 같은 개변체 효소 (WO2017010559) 를 이용해도 된다.
항체의 당사슬 리모델링 (당가수분해, 및 당사슬 전이 반응) 후의 항체의 정제 조작은, 반응에 사용한 저분자 화합물 및 효소와의 분리를 목적으로 하고, 이와 같은 정제에는, 통상, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등이 사용되지만, 추가로 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 추가 정제를 실시해도 된다. 즉, 본 발명은, 항체의 당가수분해 후의 반응액으로부터의 중간체의 정제 공정에 있어서, 추가로 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제 공정을 포함하는, 약물-컨쥬게이트체의 제조 방법을 제공한다. 당사슬 리모델링 보고예 (J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308-12318., Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367) 에 따르면, 항체를 가수분해 효소로 처리한 반응액을 프로테인 A 칼럼 (어피니티 크로마토그래피 칼럼) 으로 정제하는 것만이지만, 이 정제 방법으로는, 가수분해 효소 (EndoS 등) 가 완전하게는 제거되지 않고, 잔류 효소가 영향을 미쳐, 다음의 당전이 반응에 영향을 주는 것이 판명되었다. 여기서, 정제법을 검토한 결과, 항체를 가수분해 효소로 처리한 반응액을 프로테인 A 칼럼, 하이드록시 아파타이트 칼럼 (CHT 칼럼, Bio-Rad Laboratories, Inc.) 의 순서로 정제함으로써, 잔류 효소의 영향이 없이, 다음의 당사슬 전이 반응의 반응 효율이 향상되었다.
상기 당사슬 리모델링 항체의 조제에 있어서, 항체 수용액의 농축, 농도 측정, 버퍼 교환은 이하의 공통 조작 A 내지 C 에 따라서 실시할 수 있다.
(공통 조작 A : 항체 수용액의 농축)
Amicon Ultra (30,000 내지 50,000 MWCO, Millipore Co.) 의 용기 내에 항체 또는 항체-약물 컨쥬게이트 용액을 넣고, 원심기 (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.) 를 사용한 원심 조작 (2000G 내지 4000G 로 5 내지 20 분간 원심) 으로, 항체 및 후술하는 항체-약물 컨쥬게이트 용액을 농축하였다.
(공통 조작 B : 항체의 농도 측정)
UV 측정기 (Nanodrop 1000, Thermo Fisher ScientificInc.) 를 사용하고, 메이커 규정의 방법에 따라서, 항체 농도의 측정을 실시하였다. 그때에, 항체마다 상이한 280 nm 흡광 계수 (1.3 mL㎎-1cm-1 내지 1.8 mL㎎-1cm-1) 를 사용하였다.
(공통 조작 C : 항체의 버퍼 교환)
항체 수용액은 완충 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0), 인산 완충액 (pH 6.0) 등) 을 첨가하고 공통 조작 A 를 사용하여 농축하였다. 이 조작을 수 회 실시한 후, 공통 조작 B 를 사용하여 항체 농도의 측정을 실시하고, 완충 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0), 인산 완충액 (pH 6.0) 등) 을 사용하여 10 ㎎/mL 로 항체 농도를 조정하였다.
<컨쥬게이션>
본 제조법은, 상기 서술한 당사슬 리모델링 항체와 제조 중간체 (2) 를 SPAAC (strain-promoted alkyne azide cycloaddition : J. AM. CHEM. SOC. 2004, 126, 15046-15047) 반응에 의해 결합시켜, 항체-약물 컨쥬게이트를 제조하는 방법이다.
[화학식 51]
Figure pct00065
식 중 Ab 는 당사슬 리모델링 항체를 나타내고,
La', Lp', B' 는, La, Lp, B 와 동일한 의미이고,
J 는, 이하에서 나타내는 어느 것의 구조식을 나타내고,
식 중, 아스테리스크는 La' 와 결합하고 있는 것을 나타낸다.
[화학식 52]
Figure pct00066
J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-PBD 는 실시예 10-1 ∼ 10-6 에 기재된 방법 등에 의해 합성할 수 있다.
항체 Ab 의 완충 용액 (아세트산나트륨 용액, 인산나트륨, 붕산나트륨 용액 등 또는 그들의 혼합물) 과, 화합물 (2) 를 적당한 용매 (디메틸술폭사이드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드 (DMA), N-메틸-2-피롤리돈 (NMP), 프로필렌글리콜 (PG) 등 또는 그들의 혼합물) 에 용해시킨 용액을 혼합함으로써, SPAAC 반응은 진행된다.
항체 1 몰에 대해, 화합물 (2) 는 2 몰 내지 과잉 몰, 바람직하게는 1 몰 내지 30 몰이고, 유기 용매의 비율은, 항체의 완충액에 대해 1 내지 200 ％ v/v 가 바람직하다. 반응 온도는 0 ℃ 내지 37 ℃, 바람직하게는 10 ℃ 에서 25 ℃ 이고, 반응 시간은 1 에서 150 시간, 바람직하게는 6 시간부터 100 시간이다. 반응시의 pH 는 5 내지 9 가 바람직하다.
항체-약물 컨쥬게이트는, 전술한 공통 조작 A 내지 C 및 후술하는 공통 조작 D 내지 F 에 의해 버퍼 교환, 정제, 항체 농도, 및 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수 (DAR : Drug to Antibody Ratio) 의 측정을 실시하여, 항체-약물 컨쥬게이트 화합물 (ADC) 의 동정을 실시할 수 있다.
(공통 조작 D : 항체-약물 컨쥬게이트의 정제)
시판되는 소르비톨 (Sorbitol) (5 ％) 을 함유하는 아세트산 완충액 (10 mM, pH 5.5 ; 본 명세서에서 ABS 라고 칭한다) 중 어느 완충액으로 NAP-25 칼럼을 평형화시켰다. 이 NAP-25 칼럼에, 항체-약물 컨쥬게이트 반응 수용액 (약 1.5 ∼ 2.5 mL) 을 올리고, 메이커에 규정된 양의 완충액으로 용출시킴으로써, 항체 획분을 분취하였다. 이 분취 획분을 재차 NAP-25 칼럼에 올리고, 완충액으로 용출시키는 겔 여과 정제 조작을 합계 2 내지 3 회 반복함으로써, 미결합의 약물 링커나 디메틸술폭사이드, 프로필렌글리콜을 제거한 항체-약물 컨쥬게이트를 얻었다. 필요에 따라, 공통 조작 A 및 C 에 의해 항체-약물 컨쥬게이트 용액의 농도를 조제하였다.
(공통 조작 E : 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 농도의 측정)
항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 결합 약물 농도는, 하기에 나타내는 램버트·비어의 법칙을 사용하여, 산출할 수 있다.
이하에 램버트 비어의 법칙을 사용한 식 (I) 을 나타낸다.
Figure pct00067
여기서, A280 은 항체-약물 컨쥬게이트 수용액의 280 nm 에 있어서의 흡광도를 나타내고, ε280 은, 항체-약물 컨쥬게이트의 280 nm 에 있어서의 몰 흡광 계수를 나타내고, C(mol·L-1) 는 항체-약물 컨쥬게이트의 몰 농도를 나타낸다.
상기 식 (I) 로부터 항체-약물 컨쥬게이트의 몰 농도 C (mol·L-1) 는 이하의 식 (II) 로 구한다.
Figure pct00068
또한 양변에 항체-약물 컨쥬게이트의 몰 질량 MW (g·mol-1) 을 곱함으로써, 항체-약물 컨쥬게이트의 중량 농도 C'(㎎·mL-1) 를 구할 수 있다 (식 (III)).
Figure pct00069
이하에, 상기 식을 이용하여 본 실시예에 적용한 각 값에 대해 기재한다.
흡광도 A280 은, 항체-약물 컨쥬게이트 수용액의 280 nm 에 있어서의 UV 흡광도의 실측값을 사용하였다. 몰 질량 MW (g·mol-1) 는 항체의 아미노산 서열로부터 구해지는 항체 분자량의 계산 추정값을 항체-약물 컨쥬게이트의 몰 질량의 근사값으로서 사용하고 있다. 광로 길이 l (cm) 은 1 cm 로 측정하였다.
항체 약물 컨쥬게이트의 몰 흡광 계수 ε280 은, 이하의 식 (IV) 에 의해 구할 수 있다.
Figure pct00070
여기서, εAb,280 은 280 nm 에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εDL,280 은 280 nm 에 있어서의 약물의 몰 흡광 계수를 나타낸다.
εAb,280 은 항체의 아미노산 서열로부터, 이미 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423) 에 의해 추정할 수 있는 값을 사용하였다. 실시예에 있어서, H01L02 항체의 몰 흡광 계수는, εAb,280 = 223400 (계산 추정치) 을 사용하였다. H01L02A 항체의 몰 흡광 계수는, εAb,280 = 223674 (계산 추정치), H31L02A 항체의 몰 흡광 계수는, εAb,280 = 223314 (계산 추정치), H11L02A 항체의 몰 흡광 계수는, εAb,280 = 220490 (계산 추정치), LPS 항체의 몰 흡광 계수는, εAb,280 = 230300 (계산 추정치) 을을 사용하였다.
εDL,280 은, 매회 UV 측정에서 얻은 실측치로부터 산출한 것을 사용하였다. 즉, 컨쥬게이트 전구체 (약물) 를 어느 몰 농도로 용해시킨 용액의 흡광도를 측정하고, 램버트·비어의 법칙, 식 (I) 을 적용함으로써 얻어지는 값을 사용하였다.
(공통 조작 F : 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수의 측정)
항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수는, 이하의 방법을 사용하는 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석에 의해 구할 수 있다.
(F-1. HPLC 분석용 샘플의 조제 (항체-약물 컨쥬게이트의 환원))
항체-약물 컨쥬게이트 용액 (약 1 ㎎/mL, 60 ㎕) 을 디티오트레이톨 (DTT) 수용액 (100 mM, 15 ㎕) 과 혼합한다. 혼합물을 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이트함으로써, 항체-약물 컨쥬게이트의 L 사슬 및 H 사슬 간의 디술파이드 결합을 절단한 샘플을, HPLC 분석에 사용한다.
(F-2. HPLC 분석)
HPLC 분석을, 하기 측정 조건으로 실시한다.
HPLC 시스템 : Agilent 1290 HPLC 시스템 (Agilent Technologies)
검출기 : 자외 흡광도계 (측정 파장 : 280 nm, 329 nm)
칼럼 : BEH Phenyl (2.1 × 50 mm, 1.7 ㎛, Waters Acquity)
칼럼 온도 : 75 ℃
이동상 A : 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 (TFA), 15 ％ 이소프로필알코올 수용액
이동상 B : 0.075 ％ TFA, 15 ％ 이소프로필알코올아세토니트릴 용액
그래디언트 프로그램 : 14 ％-36 ％ (0 분-15 분), 36 ％-80 ％ (15-17 분), 80 ％-14 ％ (17 분-17.1 분), 14 ％-14 ％ (17.1 분-23 분)
샘플 주입량 : 5 ㎕
(F-3. 데이터 해석)
(F-3-1) 약물이 결합되어 있지 않은 항체의 L 사슬 (L0) 및 H 사슬 (H0) 에 대해, 약물이 결합한 H 사슬 (약물이 1 개 결합한 H 사슬 : H1, 약물이 1 개 결합한 H 사슬 : H2) 은, 결합한 약물의 수에 비례하여 소수성이 증가하여 유지 시간이 커지므로, L0, H0, H1, H2 의 순서로 용출되는 점에서 L0 및 H0 의 유지 시간 비교에 의해 검출 피크를 L0, H0, H1, H2 중 어느 것에 할당할 수 있다. 또 약물이 결합되어 있는지는, 약물의 특징적인 329 ㎚ 의 파장 흡수로도 확인할 수 있다.
(F-3-2) 약물 링커에 UV 흡수가 있기 때문에, 약물 링커의 결합수에 따라서, L 사슬, H 사슬 및 약물 링커의 몰 흡광 계수를 사용하여 하기 식에 따라 피크 면적값의 보정을 실시한다.
Figure pct00071
여기서, 각 항체에 있어서의 L 사슬 및 H 사슬의 몰 흡광 계수 (280 nm) 는, 이미 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423) 에 의해, 각 항체의 L 사슬 및 H 사슬의 아미노산 서열로부터 추정되는 값을 사용할 수 있다. H01L02 항체의 경우, 그 아미노산 서열에 따라서, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 81480 을 추정값으로서 사용하였다. 마찬가지로, H01L02A 항체의 경우, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 79829 를, H31L02A 항체의 경우, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 80131 을, H11L02A 항체의 경우, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 78696 을, LPS 항체의 경우, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 77470 을, 약물 링커의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 는, 컨쥬게이트 전구체인 약물 링커 1-4 의 실측의 몰 흡광 계수 (280 ㎚) 를 사용하였다.
(F-3-3) 피크 면적 보정값 합계에 대한 각 사슬 피크 면적비 (％) 를 하기 식에 따라 계산한다.
Figure pct00072
(F-3-4) 항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수를, 하기 식에 따라 계산한다.
Figure pct00073
4. 의약
상기 「2. 항 CDH6 항체의 제조」의 항 및 실시예에 기재된 본 발명의 항 CDH6 항체 및 당해 항체의 기능성 단편은, 종양 세포 표면의 CDH6 에 결합하여, 내재화 활성을 가지므로, 단독으로 혹은 다른 약제와 조합하여, 의약으로서, 신세포 종양 및 난소 종양 등의 암, 예를 들어, 신세포암, 신담명세포암, 유두상 신세포암, 난소암, 난소 장액성선암, 갑상선암, 담관암, 폐암 (예를 들어, 소세포폐암 또는 비소세포폐암), 신경교아종, 중피종, 자궁암, 췌장암, 윌름스 종양 또는 신경아종의 치료제로서 사용할 수 있다.
또, CDH6 을 발현하고 있는 세포의 검출에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 항 CDH6 항체 및 당해 항체의 기능성 단편은, 내재화 활성을 가지므로, 항체-약물 컨쥬게이트에 사용하는 항체로서 제공할 수 있다.
상기 「3. 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트」의 항 및 실시예에 기재된 본 발명의 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트 중에서 약물로서 세포 상해 활성 등의 항종양 활성을 갖는 약물이 사용되고 있는 것은, 내재화 활성을 갖는 항 CDH6 항체 및/또는 당해 항체의 기능성 단편과 세포 상해 활성 등의 항종양 활성을 갖는 약물의 컨쥬게이트이고, CDH6 을 발현하고 있는 암세포에 대하여 항종양 활성을 나타내므로, 의약으로서, 특히 암에 대한 치료제 및/또는 예방제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트는, 대기 중에 방치하거나, 또는 재결정이나 정제 조작을 하거나 함으로써, 수분을 흡수하거나, 혹은 흡착수가 부착되는 등을 하여, 수화물이 되는 경우가 있고, 그러한 물을 함유하는 화합물 또는 약리학적으로 허용될 수 있는 염도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트가 아미노기 등의 염기성기를 갖는 경우, 원하는 바에 따라 약리학적으로 허용될 수 있는 산 부가염을 형성할 수 있다. 그러한 산 부가염으로는, 예를 들어 불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염 등의 할로겐화수소산염 ; 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염 ; 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염 등의 저급 알칸술폰산염 ; 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염 등의 아릴술폰산염 ; 포름산염, 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 말산염, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염 ; 또는 오르니틴산염, 글루탐산염, 아스파르트산염 등의 아미노산염 등을 들 수 있다.
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트가 카르복시기 등의 산성기를 갖는 경우, 원하는 바에 따라 약리학적으로 허용될 수 있는 염기 부가염을 형성할 수 있다. 그러한 염기 부가염으로는, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등의 알칼리 금속염 ; 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염 ; 암모늄염 등의 무기염 ; 디벤질아민염, 모르폴린염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 시클로헥실아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 디에탄올아민염, N-벤질-N-(2-페닐에톡시)아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염 등의 유기 아민염 등을 들 수 있다.
본 발명은 또, 항체-약물 컨쥬게이트를 구성하는 원자의 1 이상이, 그 원자의 동위체로 치환된 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. 동위체에는 방사성 동위체 및 안정 동위체의 2 종류가 존재하고, 동위체의 예로는, 예를 들어, 수소의 동위체 (2H 및 3H), 탄소의 동위체 (11C, 13C 및 14C), 질소의 동위체 (13N 및 15N), 산소의 동위체 (15O, 17O 및 18O), 불소의 동위체 (18F) 등을 들 수 있다. 동위체로 표지된 항체-약물 컨쥬게이트를 함유하는 조성물은, 예를 들어, 치료제, 예방제, 연구 시약, 어세이 시약, 진단제, 인비보 화상 진단제 등으로서 유용하다. 동위체로 표지된 항체-약물 컨쥬게이트, 및 동위체로 표지된 항체-약물 컨쥬게이트의 임의의 비율의 혼합물도 모두 본 발명에 포함된다. 동위체로 표지된 항체-약물 컨쥬게이트는, 당해 분야에서 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 후술하는 본 발명의 제조 방법에 있어서의 원료 대신에 동위체로 표지된 원료를 사용함으로써, 제조할 수 있다.
in vitro 에서의 살세포 활성은 예를 들어, 세포의 증식 억제 활성으로 측정할 수 있다. 예를 들어, CDH6 을 과잉 발현하고 있는 암 세포주를 배양하고, 배양계에 여러 가지 농도로 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트를 첨가하고, 포커스 활성, 콜로니 형성 및 스페로이드 증식에 대한 억제 활성을 측정할 수 있다. 여기서, 예를 들어, 신세포 종양 및 난소 종양 유래 암세포주 등을 사용함으로써, 신세포 종양 및 난소 종양에 대한 세포 증식 억제 활성을 조사할 수 있다.
in vivo 에서의 실험 동물을 사용한 암에 대한 치료 효과는, 예를 들어, CDH6 을 고발현하고 있는 종양 세포주를 이식한 누드 마우스에 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트를 투여하고, 암세포의 변화를 측정할 수 있다. 여기서, 예를 들어, 신세포암, 신담명세포암, 유두상 신세포암, 난소암, 난소 장액성선암 또는 갑상선암 유래의 세포를 면역 부전 마우스에 이식한 동물 모델을 사용함으로써, 신세포암, 신담명세포암, 유두상 신세포암, 난소암, 난소 장액성선암 또는 갑상선암에 대한 치료 효과를 측정할 수 있다.
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트가 적용되는 암의 종류로는, 치료 대상이 되는 암세포에 있어서 CDH6 을 발현하고 있는 암이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 신세포암 (예를 들어, 신담명세포암 또는 유두상 신세포암), 난소암, 난소 장액성선암, 갑상선암, 담관암, 폐암 (예를 들어, 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암), 신경 교아종, 중피종, 자궁암, 췌장암, 윌름스 종양 또는 신경아종을 들 수 있지만, CDH6 을 발현하고 있는 한 이들에 제한되지 않는다. 보다 바람직한 암의 예로는, 신세포암 (예를 들어, 신담명세포암, 유두상 신세포암) 또는 난소암을 들 수 있다.
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트는, 포유 동물에 대하여 바람직하게 투여할 수 있지만, 보다 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트가 함유되는 의약 조성물에 있어서 사용되는 물질로는, 투여량이나 투여 농도에 있어서, 이 분야에 있어서 통상 사용되는 제제 첨가물 그 외로부터 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명의 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트는, 1 종 이상의 약학적으로 적합성의 성분을 함유하는 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은, 대표적으로는, 1 종 이상의 약학적 캐리어 (예를 들어, 멸균한 액체 (예를 들어, 물 및 기름 (석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 기름 (예를 들어, 낙화생유, 대두유, 광유, 참깨유 등) 을 포함한다)) 을 포함한다. 물은, 상기 약학적 조성물이 정맥내 투여되는 경우에, 보다 대표적인 캐리어이다. 식염수 용액, 그리고 덱스트로오스 수용액 및 글리세롤 수용액도 또한, 액체 캐리어로서 특히, 주사용 용액을 위해 사용될 수 있다. 적절한 약학적 부형제는, 당해 분야에서 공지되어 있다. 상기 조성물은 또, 원한다면, 미량의 습윤제 혹은 유화제, 또는 pH 완충화제를 포함할 수 있다. 적절한 약학적 캐리어의 예는, E. W. Martin 에 의한 「Remington's Pharmaceutical Sciences」에 기재된다. 그 처방은 투여의 양태에 대응한다.
여러 가지 송달 시스템이 공지되어 있고, 본 발명의 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트를 투여하기 위해서 사용될 수 있다. 도입 방법으로는, 피내 (皮內), 근육내, 복강내, 정맥내, 및 피하의 경로를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 투여는, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사에 의한 것일 수 있다. 특정한 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 항체-약물 컨쥬게이트의 투여는 주입에 의한 것이다. 비경구적 투여는, 바람직한 투여 경로이다.
대표적 실시형태에 있어서, 상기 약학적 조성물은, 인간에 대한 정맥내 투여에 적합한 약학적 조성물로서, 상습적 순서에 따라 처방된다. 대표적으로는, 정맥내 투여를 위한 조성물은, 멸균의 등장성의 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 의약은 또, 가용화제 및 주사 부위에서의 동통을 완화시키기 위한 국소 마취제 (예를 들어, 리그노카인) 를 함유할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분은, (예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰 등에 밀봉하여 시일된 용기 중의 건조 동결 건조 분말 또는 무수의 농축물로 하여, 별개로, 또는 단위 제형 중에서 함께 혼합하는 것 중 어느 것으로 공급된다. 상기 의약이 주입에 의해 투여될 예정인 경우, 그것은, 예를 들어, 멸균의 제약 그레이드의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 보틀로 투약될 수 있다. 상기 의약이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플은, 예를 들어, 상기 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에는 본원의 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트만을 포함하는 의약 조성물이어도 되고, 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트 및 적어도 하나의 이 이외의 암 치료제를 함유하는 의약 조성물이어도 된다. 본 발명의 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트는, 다른 암 치료제와 함께 투여할 수도 있고, 이로써 항암 효과를 증강시킬 수 있다. 이와 같은 목적으로 사용되는 다른 항암제는, 항체-약물 컨쥬게이트와 동시에, 따로따로, 혹은 연속해서 개체에 투여되어도 되고, 각각의 투여 간격을 바꾸어 투여해도 된다. 이와 같은 암 치료제로서, Imatinib, Sunitinib, Regorafenib 등을 포함하는 티로신키나아제 저해제, Palbociclib 등을 포함하는 CDK4/6 저해제, TAS-116 등을 포함하는 HSP90 저해제, MEK162 등을 포함하는 MEK 저해제, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 이필리무맙 등을 포함하는 면역 체크 포인트 저해제 등을 들 수 있지만, 항종양 활성을 갖는 약제이면 한정되지 않는다.
이와 같은 의약 조성물은, 선택된 조성과 필요한 순도를 갖는 제제로서, 동결 건조 제제 혹은 액상 제제로서 제제화하면 된다. 동결 건조 제제로서 제제화할 때에는, 이 분야에 있어서 사용되는 적당한 제제 첨가물이 함유되는 제제이어도 된다. 또 액제에 있어서도 동일하게 하여, 이 분야에 있어서 사용되는 각종 제제 첨가물을 함유하는 액상 제제로서 제제화할 수 있다.
의약 조성물의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라서도 변화하지만, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항 CDH6 항체-약물 컨쥬게이트는, 항체-약물 컨쥬게이트의 항원에 대한 친화성, 즉, 항원에 대한 해리 정수 (定數) (Kd 값) 의 점에 있어서, 친화성이 높을 (Kd 값이 낮을) 수록, 소량의 투여량으로서도 약효를 발휘시킬 수 있다. 따라서, 항체-약물 컨쥬게이트의 투여량의 결정에 있어서는, 항체-약물 컨쥬게이트와 항원의 친화성의 상황에 기초하여 투여량을 설정할 수도 있다. 본 발명의 항체-약물 컨쥬게이트를 인간에 대하여 투여할 때에는, 예를 들어, 약 0.001 ∼ 100 ㎎/㎏ 을 1 회 혹은 1 ∼ 180 일간에 1 회의 간격으로 복수회 투여하면 된다. 바람직하게는, 0.1 ∼ 50 ㎎/㎏ 을, 더욱 바람직하게는, 1 ∼ 50 ㎎/㎏, 1 ∼ 30 ㎎/㎏, 1 ∼ 20 ㎎/㎏, 1 ∼ 15 ㎎/㎏, 2 ∼ 50 ㎎/㎏, 2 ∼ 30 ㎎/㎏, 2 ∼ 20 ㎎/㎏ 또는 2 ∼ 15 ㎎/㎏ 을 1 ∼ 4 주에 1 회, 바람직하게는 2 ∼ 3 주에 1 회의 간격으로 복수회 투여하면 된다.
실시예
이하에 나타내는 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 또, 이들은 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석되는 것은 아니다. 또한, 하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, 「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning) 」(Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold SpringHarbor Laboratory Press 로부터 1989년 발간) 에 기재된 방법 및 그 밖의 당업자가 사용하는 실험서에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 실시하였다. 또, 본 명세서에 있어서, 특별히 기재가 없는 시약, 용매 및 출발 재료는, 시판되는 공급원으로부터 용이하게 입수할 수 있다.
[실시예 1 : 내재화 활성을 갖는 래트 항인간 CDH6 항체의 취득]
1)-1 인간 및 게잡이 원숭이 CDH6 발현 벡터의 구축
인간 CDH6 단백질 (NP_004923) 을 코드하는 cDNA 발현 벡터 (OriGene 사, RC217889) 를 사용하여, 당업자에게 공지인 방법에 따라 포유 동물 발현용 벡터에 삽입함으로써 인간 CDH6 발현 벡터 pcDNA3.1-hCDH6 이 제조되었다. 인간 CDH6 ORF (Open Reading Frame) 의 아미노산 서열을 서열 번호 1 에 나타낸다.
게잡이 원숭이 CDH6 단백질을 코드하는 cDNA 는, 게잡이 원숭이 신장의 total RNA 로부터 합성한 cDNA 를 주형으로 프라이머 1 (5'-CACCATGAGAACTTACCGCTACTTCTTGCTGCTC-3') (서열 번호 8) 및 프라이머 2 (5'-TTAGGAGTCTTTGTCACTGTCCACTCCTCC-3') (서열 번호 9) 를 사용하여 클로닝을 실시하였다. 얻어진 서열이, 게잡이 원숭이 CDH6 (NCBI, XP_005556691.1) 의 세포외 영역과 일치하는 것을 확인하였다. 또, EMBL 에서 등록된 게잡이 원숭이 CDH6 (EHH54180.1) 과 전장 서열이 일치하는 것을 확인하였다. 당업자에게 공지된 방법에 따라 포유 동물 발현용 벡터에 삽입함으로써 게잡이 원숭이 CDH6 발현 벡터 pcDNA3.1-cynoCDH6 이 제조되었다. 게잡이 원숭이 CDH6 ORF 의 아미노산 서열을 서열 번호 7 에 나타낸다.
제조한 플라스미드 DNA 의 대량 조제는, EndoFree Plasmid Giga Kit (QIAGEN) 를 사용하여 실시하였다.
1)-2 면역
면역에는 WKY/Izm 래트의 암컷 (닛폰 SLC 사) 을 사용하였다. 먼저 래트 양다리 하퇴부를 Hyaluronidase (SIGMA-ALDRICH 사) 로 전처리 후, 동일한 부위에 실시예 1)-1 에서 제조한 인간 CDH6 발현 벡터 pcDNA3.1-hCDH6 을 근육내 주사하였다. 계속해서, ECM830 (BTX 사) 을 사용하고, 2 니들 전극을 사용하여, 동일한 부위에 인비보 일렉트로포레이션을 실시하였다. 약 2 주에 한 번, 동일한 인비보 일렉트로포레이션을 반복한 후, 래트의 림프절 또는 비장을 채취하고 하이브리도마 제조에 사용하였다.
1)-3 하이브리도마 제조
림프절 세포 혹은 비장 세포와 마우스 미엘로마 SP2/0-ag14 세포 (ATCC, No.CRL-1 581) 를 LF301 Cell Fusion Unit (BEX 사) 을 사용하여 전기 세포 융합한 후, ClonaCell-HY 선택 배지 D (StemCell Technologies 사) 에 현탁하고, 희석시켜 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 배양하였다. 출현한 각각의 하이브리도마 콜로니는, 모노클론으로서 회수되고, ClonaCell-HY 선택 배지 E (StemCell Technologies 사) 에 현탁하여 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 배양하였다. 적당히 세포가 증식된 후, 각각의 하이브리도마 세포의 동결 스톡을 제조함과 함께, 얻어진 하이브리도마 배양 상청을 항인간 CDH6 항체 산생 하이브리도마의 스크리닝에 사용하였다.
1)-4 Cell-ELISA 법에 의한 항체 산생 하이브리도마의 스크리닝
1)-4-1 Cell-ELISA 용 항원 유전자 발현 세포의 조제
293α 세포 (인테그린 αv 및 인테그린 β3 을 발현하는 HEK293 유래의 안정 발현 세포주) 를 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중 5 x 105 세포/㎖ 가 되도록 조제하였다. Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scienftific 사) 를 사용한 형질 이입 순서에 따라, 이 293α 세포에 대하여, pcDNA3.1-hCDH6 혹은 pcDNA3.1-cynoCDH6 또는 음성 컨트롤로서 pcDNA3.1 의 DNA 를 도입하고, 96-웰 플레이트 (Corning 사) 에 100 ㎕ 씩 분주 후, 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 24 내지 27 시간 배양하였다. 얻어진 형질 이입 세포를 접착 상태인 채로, Cell-ELISA 에 사용하였다.
1)-4-2 Cell-ELISA
실시예 1)-4-1 에서 조제한 발현 벡터 도입 293α 세포의 배양 상청을 제거 후, pcDNA3.1-hCDH6 혹은 pcDNA3.1-cynoCDH6 또는 pcDNA3.1 도입 293α 세포의 각각에 대하여 하이브리도마 배양 상청을 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS(+) 로 1 회 세정 후, 5 ％ FBS 함유 PBS(+) 로 500 배로 희석시킨 토끼에서 생산되는 항래트 IgG-페록시다아제 항체 (Anti-Rat IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit) (SIGMA 사) 을 첨가하여, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS(+) 로 3 회 세정한 후, OPD 발색액 (OPD 용해액 (0.05 M 시트르산 3 나트륨, 0.1 M 인산수소 2 나트륨·12 물 pH4.5) 에 o-페닐렌디아민 2 염산염 (와코우 순약사), H2O2 를 각각 0.4 ㎎/mL, 0.6 ％ (v/v) 가 되도록 용해) 을 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 때때로 교반하면서 발색 반응을 실시하고, 1 M HCl 을 100 ㎕/웰로 첨가하여 발색 반응을 정지시킨 후, 플레이트 리더 (ENVISION : PerkinElmer 사) 로 490 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 컨트롤의 pcDNA3.1 도입 293α 세포와 비교하여, pcDNA3.1-hCDH6 그리고 pcDNA3.1-cynoCDH6 발현 벡터 도입 293α 세포쪽에서 보다 높은 흡광도를 나타내는 배양 상청을 산생하는 하이브리도마를 인간, 또한 게잡이 원숭이 CDH6 에 결합하는 항체 산생 하이브리도마로서 선택하였다.
1)-5 플로우 사이토메트리에 의한 게잡이 원숭이 CDH6 에 대한 선택적 결합 항체의 스크리닝
1)-5-1 플로우 사이토메트리 해석용 항원 유전자 발현 세포의 조제
293T 세포를 5 × 104 세포/㎠ 가 되도록 225 ㎠ 플라스크 (스미토모 베이크라이트사) 에 파종하고, 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 이 293T 세포에, pcDNA3.1-cynoCDH6, 또는 음성 컨트롤로서 pcDNA3.1 을 Lipofectamine 2000 을 사용하여 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 추가로 하룻밤 배양하였다. 각 벡터를 도입한 293T 세포를 TrypLE Express (Thermo Fisher Scienftific 사) 로 처리하고, 10 ％ FBS 함유 DMEM 으로 세포를 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 에 현탁하였다. 얻어진 세포 현탁액을 플로우 사이토메트리 해석에 사용하였다.
1)-5-2 플로우 사이토메트리 해석
실시예 1)-4 의 Cell-ELISA 에서 선택된 인간, 또한 게잡이 원숭이 CDH6 에 결합하는 항체 산생 하이브리도마가 산생하는 항체의 게잡이 원숭이 CDH6 에 대한 결합 특이성을 플로우 사이토메트리법에 의해 추가로 확인하였다. 실시예 1)-5-1 에서 조제한 일과성 발현 293T 세포의 현탁액을 원심하여, 상청을 제거한 후, 각각에 대하여 하이브리도마 배양 상청을 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석시킨 항래트 IgG FITC 컨쥬게이트 (SIGMA 사) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 2 ㎍/㎖ 7-아미노액티모머이신 D (7-aminoactinomycin D) (Molecular Probes 사) 를 포함하는 5 ％ FBS 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (FC500 : BeckmanCoulter 사) 로 검출하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar 사) 로 실시하였다. 7-아미노액티모머이신 D (7-aminoactinomycin D) 양성의 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포의 FITC 형광 강도의 히스토그램을 작성하였다. 컨트롤인 pcDNA3.1 도입 293T 세포의 형광 강도 히스토그램에 대하여 pcDNA3.1-cynoCDH6 도입 293T 세포의 히스토그램이 강형광 강도측으로 시프트되어 있는 항체를 산생하는 하이브리도마를 세포막 표면 상에 발현되는 게잡이 원숭이 CDH6 에 특이적으로 결합하는 항체 산생 하이브리도마로서 선택하였다.
1)-6 래트 모노클로날 항체의 아이소 타입의 결정
실시예 1)-5 에서 선택한 래트 항 CDH6 항체 산생 하이브리도마 중에서, 인간 그리고 원숭이 CDH6 에 강하게 특이적으로 결합하는 것이 시사된 클론 rG019 를 선발하고, 각 항체의 아이소 타입을 동정하였다. 항체의 중사슬의 서브클래스, 경사슬의 타입은, RAT MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING 테스트 키트 (DS 파마 바이오메디컬사) 에 의해 결정되었다. 그 결과, rG019 의 서브클래스는, IgG2b, 타입은 κ사슬인 것이 확인되었다.
1)-7 래트 항 CDH6 항체의 조제
1)-7-1 배양 상청 제조
래트 항인간 CDH6 모노클로날 항체는, 하이브리도마 배양 상청으로부터 정제하였다. 먼저, 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 산생 하이브리도마를 ClonaCell-HY 선택 배지 E (StemCell Technologies 사) 로 충분량까지 증식시킨 후, Ultra Low IgG FBS (Thermo Fisher Scienftific 사) 를 20 ％ 첨가한 Hybridoma SFM (Thermo Fisher Scienftific 사) 으로 배지 교환하여, 4 - 5 일간 배양하였다. 본 배양 상청을 회수하고, 0.8 ㎛ 의 필터에 통과시킨 후, 추가로 0.2 ㎛ 의 필터에 통과시켜 불용물을 제거하였다.
1)-7-2 래트 항 CDH6 항체의 정제
실시예 1)-7-1 에서 제조한 하이브리도마의 배양 상청으로부터 래트 항 CDH6 항체 rG019 를 Protein G 어피니티 크로마토그래피로 정제하였다. Protein G 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사) 에 항체를 흡착시키고, PBS 로 칼럼을 세정 후에 0.1 M 글리신/염산 수용액 (pH2.7) 으로 용출하였다. 용출액에 1 M Tris-HCl (pH9.0) 을 첨가하여 pH 7.0 ∼ 7.5 로 조정한 후에, Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF30K, Sartorius 사) 으로 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH 6.0) 로의 버퍼 치환을 실시함과 함께 항체의 농축을 실시하여, 항체 농도를 1 ㎎/mL 로 조제하였다. 마지막으로 Minisart-Plus filter (Sartorius 사) 로 여과하여, 정제 샘플로 하였다.
[실시예 2 : 래트 항 CDH6 항체의 in vitro 평가]
2)-1 플로우 사이토메트리에 의한 래트 항 CDH6 항체의 결합능 평가
실시예 1)-7 에서 제조한 래트 항 CDH6 항체의 인간 CDH6 결합성을 플로우 사이토메트리법에 의해 평가하였다. 실시예 1)-1 에서 제조한 pcDNA3.1-hCDH6 을 293T 세포 (ATCC) 에 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하여 일과성으로 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양한 후, TrypLE Express (Thermo Fisher Scienftific 사) 로 처리하여 세포 현탁액을 조제하였다. 유전자 도입한 293T 세포 현탁액을 원심하여, 상청을 제거한 후, 실시예 1)-7 에서 조제한 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 rG019 또는 래트 IgG 컨트롤 (R＆D Systems) 을 종농도 10 ng/㎖ 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 50 배로 희석시킨 토끼에서 생산되는 항래트 IgG (전체 분자)-FITC 항체 (Anti-Rat IgG (whole molecule)-FITC antibody produced in rabbit) (SIGMA) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 플로우 사이토미터 (FC500 : Beckman Coulter) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 실시하였다. 그 결과를 도 1 에 나타낸다. 도 1 의 히스토그램에 있어서, 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다. 망점으로 나타내는 히스토그램은 hCDH6 을 도입하지 않은 음성 컨트롤 293T 세포를 사용한 경우를 나타내고, 백발 실선으로 나타내는 히스토그램은, hCDH6 도입 293T 세포를 사용한 경우를 나타낸다. 세포 표면의 hCDH6 에 항체가 결합함으로써 형광 강도가 증강된 것을 나타낸다. 래트 IgG 컨트롤은 어느 세포에도 결합하지 않는다. 이 결과, 제조한 래트 항 CDH6 모노클로날 항체 4 종은 pcDNA3.1-hCDH6 도입 293T 세포에 결합하는 것을 확인하였다.
2)-2 플로우 사이토메트리에 의한 래트 항 CDH6 항체의 CDH6 결합 부위의 해석
2)-2-1 인간 CDH6 각 도메인 결실체 발현 벡터의 구축
인간 CDH6 의 세포외 전장에는 5 개의 세포외 도메인, EC1 (서열 번호 2), EC2 (서열 번호 3), EC3 (서열 번호 4), EC4 (서열 번호 5), EC5 (서열 번호 6) 가 존재한다. 인간 CDH6 전장로부터, 5 개의 EC 도메인을 각 1 지점씩 결실 발현한 유전자를 GeneArt 사에서 합성하고, 당업자에게 공지인 방법에 따라 포유 동물 발현용 벡터 p3xFLAG-CMV-9 벡터 (SIGMA-ALDRICH 사) 에 삽입하여, EC1 내지 EC5 를 각각 결실한, 각 도메인 결실체 발현 벡터를 제조하였다.
2)-2-2 플로우 사이토메트리에 의한 도메인 결실체를 사용한 래트 항 CDH6 항체의 에피토프 해석
각 EC 도메인 결실 벡터를 도입한 293α 세포주를 사용한 플로우 사이토메트리 해석에 의해, 래트 항인간 CDH6 항체의 결합 에피토프를 동정하였다. 인테그린 αv 및 인테그린 β3 발현 벡터를 HEK293 세포 내에 안정 형질 이입한 세포주 293α 세포주에 대하여, 실시예 2)-2-1 에서 작성한 각 도메인 결실체 발현 벡터, 및 전장 인간 CDH6 을 발현하는 pcDNA3.1-hCDH6 을 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하여 일과성으로 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양한 후, TrypLE Express (Thermo Fisher Scienftific 사) 로 처리하여 세포 현탁액을 조제하였다. 도입 293α 세포 현탁액을 원심하여, 상청을 제거한 후, 실시예 1)-7 에서 조제한 rG019 또는 래트 IgG 컨트롤 (R＆D Systems) 을 종농도 20 nM 으로 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 50 배로 희석시킨 토끼에서 생산되는 항래트 IgG (전체 분자)-FITC 항체 (Anti-Rat IgG (whole molecule)-FITC antibody produced in rabbit) (SIGMA)) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 플로우 사이토미터 (CantoII : BD Biosciences) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 실시하였다. 그 결과를 도 2a 및 도 2b 에 나타낸다. 도 2a 및 도 2b 의 히스토그램에 있어서, 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다. 망점으로 나타내는 히스토그램은 유전자를 도입하지 않은 음성 컨트롤 293α 세포를 사용한 경우를 나타내고, 백발 실선으로 나타내는 히스토그램은, 전장 hCDH6 또는 각 EC 도메인 결실 293 세포를 사용한 경우를 나타낸다. 세포 표면의 전장 hCDH6 또는 각 EC 도메인 결실체에 항체가 결합한 경우에는, 형광 강도가 증강된다. 래트 IgG 컨트롤은 어느 도입 세포에도 결합하지 않는다. rG019 는, 전장 hCDH6, EC1 결실체, EC2 결실체, EC4 결실체, 및 EC5 결실체에는 결합하지만, EC3 결실체에는 결합하지 않는다. 이 결과로부터, rG019 는 hCDH6 의 EC3 을 에피토프로 하여 특이적으로 결합하는 것이 나타났다.
2)-3 인간 종양 세포주에 있어서의 CDH6 의 발현 확인
취득 항체의 평가에 사용하는 CDH6 양성 인간 종양 세포주를 선발하기 위해, 공지 데이터베이스로부터 CDH6 발현 정보를 검색하고, 플로우 사이토메트리법에 의해 세포막 표면에서의 CDH6 의 발현을 평가하였다. 인간 난소 종양 세포주 NIH : OVCAR-3, PA-1, OV-90 및 인간 신세포 종양 세포주 786-O, Caki-1 (모두 ATCC 로부터 입수) 을 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 배양한 후, TrypLE Express (Thermo Fisher Scienftific사) 로 처리하여, 세포 현탁액을 조제하였다. 세포를 원심하여, 상청을 제거한 후, 시판 항인간 CDH6 항체 (MABU2715, R＆D Systems) 또는 음성 컨트롤로서 마우스 IgG1 (BD Pharmingen) 을 종농도 50 ug/㎖ 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 50 배로 희석시킨 F(ab')2 Fragment of FITC-conjugated Goat Anti-mouse immunoglobulins (Dako)) 을 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 플로우 사이토미터 (CantoII : BD Biosciences) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 실시하였다. 그 결과를 도 3 에 나타낸다. 도 3 의 히스토그램에 있어서, 가로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다. 망점으로 나타내는 히스토그램은 음성 컨트롤 mIgG1 로 염색했을 경우를 나타내고, 백발 실선으로 나타내는 히스토그램은 항인간 CDH6 항체로 염색했을 경우를 나타낸다. 세포 표면의 hCDH6 에 항체가 결합함으로써 형광 강도가 증강된 것을 나타낸다. mIgG1 컨트롤은 어느 세포에도 결합하지 않는다. 이 결과, NIH : OVCAR-3, PA-1, OV-90 및 786-O, Caki-1 세포주는, 내재적으로 CDH6 을 세포 표면 상에 발현하는 것이 나타났다.
[실시예 3 : rG019 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역의 유전자 단편의 증폭 및 서열 결정
3)-1 rG019 항체 산생 하이브리도마로부터의 total RNA 의 조제
rG019 의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 증폭시키기 위해 G019 항체 산생 하이브리도마로부터 TRIzol Reagent (Ambion 사) 를 사용하여 total RNA 를 조제하였다.
3)-2 5'-RACE PCR 에 의한 rG019 의 중사슬 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭과 뉴클레오티드 서열의 결정
중사슬 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭은, 실시예 3)-1 에서 조제한 total RNA 의 약 1 ㎍ 과 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 를 사용하여 실시하였다. rG019 의 중사슬 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속), 및 공지된 래트 중사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계한 프라이머를 사용하였다.
5'-RACE PCR 로 증폭시킨 중사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 플라스미드에 클로닝하고, 다음으로 중사슬의 가변 영역의 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 시퀀스 해석을 실시하였다.
결정된 rG019 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 16 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 15 에 나타냈다.
3)-3 5'-RACE PCR 에 의한 rG019 의 경사슬 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭과 뉴클레오티드 서열의 결정
실시예 3)-2 와 동일한 방법으로 실시하였다. 단, rG019 의 경사슬 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속), 및 공지된 래트 경사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계한 프라이머를 사용하였다.
결정된 rG019 의 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 11 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 10 에 나타냈다.
[실시예 4 : 인간 키메라화 항 CDH6 항체 chG019 의 제조]
4)-1 인간 키메라화 항 CDH6 항체 chG019 의 발현 벡터의 구축
4)-1-1 키메라 및 인간화 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 의 구축
플라스미드 pcDNA3.3-TOPO/LacZ (invitrogen 사) 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 얻어지는 약 5.4 kb 의 프래그먼트와, 서열 번호 20 에 나타내는 인간 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 결합하여, pcDNA3.3/LK 를 제조하였다.
pcDNA3.3/LK 로부터 네오마이신 발현 유닛을 제거함으로써 pCMA-LK 를 구축하였다.
4)-1-2 키메라 및 인간화 IgG1 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1 의 구축
pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편과, 서열 번호 21 로 나타내는 인간 중사슬 시그널 서열 및 인간 IgG1 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 결합하여, pCMA-G1 을 구축하였다.
4)-1-3 chG019 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 27 에 나타내는 chG019 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여, pCMA-G1 을 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써 chG019 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 또한, chG019 중사슬은 예기치 않은 디술파이드 결합을 방지하기 위해, CDR 중의 시스테인을 프롤린으로 치환한 서열을 사용하였다.
4)-1-4 chG019 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 22 에 나타내는 chG019 경사슬을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여, 합성한 DNA 단편과 pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편을 결합함으로써, chG019 경사슬 발현 벡터를 구축하였다.
4)-2 인간 키메라화 항 CDH6 항체 chG019 의 생산 및 정제
4)-2-1 chG019 의 생산
FreeStyle 293F 세포 (invitrogen 사) 는 매뉴얼에 따라, 계대, 배양을 실시하였다. 대수 증식기의 1.2 × 109 개의 FreeStyle 293F 세포 (invitrogen 사) 를 3L Fernbach Erlenmeyer Flask (CORNING 사) 에 파종하고, FreeStyle293 발현 배지 (invitrogen 사) 으로 희석시켜 2.0 × 106 세포/㎖ 로 조제하였다. 40 ㎖ 의 Opti-Pro SFM 배지 (invitrogen 사) 에 0.24 ㎎ 의 중사슬 발현 벡터와 0.36 ㎎ 의 경사슬 발현 벡터와 1.8 ㎎ 의 폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine) (Polyscience #24765) 을 첨가하여 조심스럽게 교반하고, 또한 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터로 4 시간, 90 rpm 으로 진탕 배양 후에 600 ㎖ 의 EX-CELL VPRO 배지 (SAFC Biosciences 사), 18 ㎖ 의 GlutaMAX I (GIBCO 사), 및 30 ㎖ 의 Yeastolate Ultrafiltrate (GIBCO 사) 를 첨가하고, 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터로 7 일간, 90 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 Disposable Capsule Filter (Advantec #CCS-045-E1H) 로 여과하였다.
4)-2-2 chG019 의 정제
실시예 4)-2-1 에서 얻어진 배양 상청을 rProtein A 어피니티 크로마토그래피의 1 단계 공정으로 정제하였다. 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe 가 충전된 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 에 어플라이한 후에, 칼럼 용량의 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하여, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH 6.0) 로의 버퍼 치환을 실시하였다. Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사) 으로 항체를 농축하여, IgG 농도를 5 ㎎/mL 이상으로 조제하였다. 마지막으로 Minisart-Plus filter (Sartorius 사) 로 여과하고, 정제 샘플로 하였다.
4)-3 인간 키메라화 항 CDH6 항체 chG019 의 결합성 평가
4)-2 에서 정제한 인간 키메라화 항 CDH6 항체 chG019 의 CDH6 결합성을 플로우 사이토메트리법에 의해 확인하였다. 실시예 1)-1 에서 제조한 pcDNA3.1-hCDH6, 또는 pcDNA3.1-cynoCDH6, 또는 pcDNA3.1 을 각각 293α 세포에 Lipofectamine 2000 을 사용하여 일과성으로 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양한 후, TrypLE Express (Thermo Fisher Scienftific사) 로 처리하여 세포 현탁액을 조제하였다. 이들 세포 현탁액에 chG019 를 첨가하고 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시킨 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정하고, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석시킨 PE 표지 F(ab')2 Fragment 항인간 IgG, Fcγ 항체 (JACKSON IMMUNORESEARCH) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (CantoII : BD Biosciences) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 실시하였다. 도 4 에 나타내는 바와 같이, chG019 는 음성 컨트롤인 pcDNA3.1 도입 293T 세포에는 결합하지 않고, pcDNA3.1-hCDH6 및 pcDNA3.1-cynoCDH6 도입 293T 세포에 항체 농도 의존적으로 결합하였다. 도 4 에 있어서 가로축은 항체 농도를 나타내고, 세로축은 결합량을 MeanFluorescent Intensity (평균 형광 강도) 로 나타낸다. 이 결과로부터, chG019 가 인간 및 게잡이 원숭이 CDH6 에 대하여 특이적으로 결합하고, 결합 활성은 거의 동등하다는 것을 알 수 있다.
[실시예 5 : 인간화 항 CDH6 항체의 제조]
5)-1 항 CDH6 항체의 인간화체 디자인
5)-1-1 chG019 의 가변 영역의 분자 모델링
chG019 의 가변 영역의 분자 모델링은, 호몰로지 모델링으로서 공지된 방법 (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)) 을 이용하였다. chG019 의 중사슬과 경사슬의 가변 영역에 대해 높은 서열 동일성을 갖는 Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) 에 등록되어 있는 구조 (PDB ID : 2I9L) 를 주형으로, 시판되는 단백질 입체 구조 해석 프로그램 BioLuminate (Schrodinger 사 제조) 를 사용하여 실시하였다.
5)-1-2 인간화 hG019 에 대한 아미노산 서열의 설계
chG019 는, CDR 그래프팅 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 인간화하였다. KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 에 있어서 이미 정해진 인간의 gamma 사슬 서브그룹 1 및 kappa 사슬 서브그룹 1 의 콘센서스 서열이, chG019 의 프레임워크 영역에 대하여 높은 동일성을 갖는 점에서, 각각, 중사슬과 경사슬의 억셉터로서 선택되었다. 억셉터 상에 이입해야 할 도너 잔기는, Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 주어지는 기준 등을 참고로 삼차원 모델을 분석함으로써 선택되었다.
5)-2 chG019 중사슬의 인간화
설계된 3 종의 중사슬을 hH01, hH02 및 hH04 로 명명하였다. hH01 의 중사슬 전장 아미노산 서열을, 서열 번호 39 에 기재한다. 서열 번호 39 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 40 에 기재한다. hH02 의 중사슬 전장 아미노산 서열을, 서열 번호 43 에 기재한다. 서열 번호 43 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 44 에 기재한다. hH04 의 중사슬 전장 아미노산 서열을, 서열 번호 47 에 기재한다. 서열 번호 47 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 48 에 기재한다.
5)-3 chG019 경사슬의 인간화
설계된 2 종의 경사슬을 hL02 및 hL03 으로 명명하였다. hL02 의 경사슬 전장 아미노산 서열을 서열 번호 31 에 기재한다. 서열 번호 31 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 32 에 기재한다. hL03 의 경사슬 전장 아미노산 서열을 서열 번호 35 에 기재한다. 서열 번호 35 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 36 에 기재한다.
5)-4 중사슬 및 경사슬의 조합에 의한 인간화 hG019 의 설계
hH01 및 hL02 로 이루어지는 항체를 「H01L02 항체」또는 「H01L02」라고 칭한다. hH02 및 hL02 로 이루어지는 항체를 「H02L02 항체」또는 「H02L02」라고 칭한다. hH02 및 hL03 으로 이루어지는 항체를 「H02L03 항체」또는 「H02L03」이라고 칭한다. hH04 및 hL02 로 이루어지는 항체를 「H04L02 항체」또는 「H04L02」라고 칭한다.
5)-5 인간화 항 CDH6 항체의 발현
5)-5-1 인간화 hG019 의 중사슬 발현 벡터의 구축
5)-5-1-1 hH01 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 40 에 나타내는 hH01 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 4)-1-3 과 동일한 방법으로 hH01 중사슬 발현 벡터를 구축하였다.
5)-5-1-2 hH02 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 44 에 나타내는 hH02 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 4)-1-3 과 동일한 방법으로 hH02 중사슬 발현 벡터를 구축하였다.
5)-5-1-3 hH04 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 48 에 나타내는 hH04 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 4)-1-3 과 동일한 방법으로 hH04 중사슬 발현 벡터를 구축하였다.
5)-5-2 인간화 hG019 의 경사슬 발현 벡터의 구축
5)-5-2-1 hL02 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 32 에 나타내는 hL02 경사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 399 에 나타내는 hL02 경사슬의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여, pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써 hL02 경사슬 발현 벡터를 구축하였다.
5)-5-2-2 hL03 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 36 에 나타내는 hL03 경사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 399 에 나타내는 hL03 경사슬의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 5)-5-2-1 과 동일한 방법으로 hL03 경사슬 발현 벡터를 구축하였다.
5)-5-3 인간화 hG019 의 조제
5)-5-3-1 H01L02, H02L02, H02L03, H04L02 의 생산
실시예 4)-2-1 과 동일한 방법으로 생산하였다. 실시예 5)-4 에 나타낸 중사슬과 경사슬의 조합에 의해, H01L02, H02L02, H02L03, H04L02 를 생산하였다.
5)-5-3-2 H01L02, H02L02, H02L03, H04L02 의 2 스텝 정제
실시예 5)-5-3-1 에서 얻어진 배양 상청을 rProtein A 어피니티 크로마토그래피와 세라믹 하이드록시아파타이트의 2 단계 공정으로 정제하였다. 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe 가 충전된 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 에 어플라이한 후에, 칼럼 용량의 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 항체를 용출하였다. 항체가 포함되는 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 PBS 로의 버퍼 치환을 실시하고, 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/pH 7.0 의 버퍼로 5 배 희석시킨 후에, 5 mM NaPi/50 mM MES/30 mM NaCl/pH 7.0 의 버퍼로 평형화한 세라믹 하이드록시아파타이트 칼럼 (닛폰 바이오래드, Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column) 에 어플라이하였다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하여, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH 6.0) 로의 버퍼 치환을 실시하였다. Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사) 으로 항체를 농축하고, IgG 농도를 20 ㎎/mL 로 조제하였다. 마지막으로 Minisart-Plus 필터 (Sartorius 사) 로 여과하고, 정제 샘플로 하였다.
[참고예 1 : 항 CDH6 항체 NOV0712 의 제조]
실시예에서 사용한 항 CDH6 항체 NOV0712 는, 국제 공개 제2016/024195호에 기재된 NOV0712 의 경사슬 전장, 및 중사슬 전장의 아미노산 서열 (각각, 국제 공개 제2016/024195 의 서열 번호 235 및 서열 번호 234) 을 참조하여 제조하였다.
참고예 1)-1 항 CDH6 항체 NOV0712
참고예 1)-1-1 항 CDH6 항체 NOV0712 의 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 54 에 나타내는 NOV0712 의 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 428 에 나타내는 NOV0712 의 중사슬의 가변 영역을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 4)-1-3 과 동일한 방법으로 NOV0712 의 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 당해 NOV0712 의 중사슬 발현 벡터에 의해 발현하는 NOV0712 의 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 53 에 나타낸다. 서열 번호 53 에 나타내는 아미노산 서열 중, 1 ∼ 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이다.
참고예 1)-1-2 항 CDH6 항체 NOV0712 의 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 52 에 나타내는 NOV0712 의 경사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 405 에 나타내는 NOV0712 의 경사슬의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 5)-5-2-1 과 동일한 방법으로 NOV0712 의 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. 당해 NOV0712 의 경사슬 발현 벡터에 의해 발현하는 NOV0712 의 경사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 51 에 나타낸다. 서열 번호 51 에 나타내는 아미노산 서열 중, 1 ∼ 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이다.
참고예 1)-2 항 CDH6 항체 NOV0712 의 조제
참고예 1)-2-1 항 CDH6 항체 NOV0712 의 생산
실시예 4)-2-1 과 동일한 방법으로 NOV0712 를 생산하였다.
참고예 1)-2-2 항 CDH6 항체 NOV0712 의 1 스텝 정제
참고예 1)-2-1 에서 얻어진 배양 상청으로부터 실시예 4)-2-2 와 동일한 방법으로 항 CDH6 항체 NOV0712 를 정제하였다 (항체 농도 HBSor 로 5 ㎎/ℓ).
[실시예 6 : 인간화 hG019 및 NOV0712 의 in vitro 평가]
6)-1 인간화 hG019 의 결합성 평가
항체와 항원 (Recombinant Human CDH6 Fc His chimera, R＆D Systems) 의 해리 정수 측정은, Biacore T200 (GE 헬스케어 바이오사이언스) 을 사용하여, 고정화시킨 항 His 항체에 항원을 리간드로서 포착 (캡처) 하고, 항체를 아날라이트로서 측정하는 캡처법으로 실시하였다. 항히스티딘 항체 (His capture kit, GE 헬스케어 바이오사이언스) 는, 센서 칩 CM5 (GE 헬스케어 바이오사이언스) 에, 아민 커플링법으로 약 1000 RU 공유 결합시켰다. 레퍼런스 셀에도 동일하게 고정화시켰다. 런닝 버퍼로서 1 mM CaCl2 를 첨가한 HBS-P+ (10 mM HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 0.05 ％ Surfactant P20) 를 사용하였다. 항히스티딘 항체를 고정화시킨 칩 상에, 항원을 60 초간 첨가한 후, 항체의 희석 계열 용액 (0.391 - 100 nM) 을 유속 30 ㎕/분으로 300 초간 첨가하고, 계속해서 600 초간의 해리상을 모니터하였다. 재생 용액으로서, 5 M MgCl2 를 첨가한 Glycine 용액 pH 1.5 를 유속 10 ㎕/분으로 30 초간, 2 회 첨가하였다. 데이터의 해석은, 분석 소프트웨어 (BIAevaluation software, version 4.1) 의 Steady State Affinity 모델을 사용하여, 해리 정수 (KD) 를 산출하였다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00074
6)-2 인간화 hG019 및 NOV0712 의 CDH6 결합 부위의 해석
6)-2-1 도메인 결실체를 사용한 에피토프 해석
실시예 2)-2-1 에서 작성한 각 도메인 결실체 발현 벡터, 및 전장 hCDH6 을 발현하는 pcDNA3.1-hCDH6 을 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하여 일과성으로 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양한 후, 세포 현탁액을 조제하였다. 유전자 도입한 293α 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 실시예 5)-5-3 에서 조제한 인간화 hG019 항체 4 종 (클론 번호는 H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 또는 참고예 1 에서 조제한 항 CDH6 항체 NOV0712, 또는 음성 컨트롤로서 인간 IgG1 (Calbiochem) 을 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석시킨 APC-항인간 IgG 염소 F(ab')2 (Jackson laboratory) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 플로우 사이토미터 (CantoII : BD Biosciences) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 실시하였다. 그 결과를 도 5a ∼ 도 5f 에 나타낸다. 도 5a ∼ 도 5f 의 히스토그램에 있어서, 가로축은 항체 결합량을 나타내는 APC 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다. 망점으로 나타내는 히스토그램은 유전자를 도입하지 않은 음성 컨트롤 293α 세포를 사용한 경우를 나타내고, 백발 실선으로 나타내는 히스토그램은, 전장 hCDH6 또는 각 EC 도메인 결실 293α 세포를 사용한 경우를 나타낸다. 세포 표면의 전장 hCDH6 또는 각 EC 도메인 결실체에 항체가 결합한 경우에는, 형광 강도가 증강된다. 인간 IgG1 컨트롤은 어느 도입 세포에도 결합하지 않는다. 인간화 hG019 항체 4 종 (클론 번호는 H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02) 은, 전장 hCDH6, EC1 결실체, EC2 결실체, EC4 결실체, 및 EC5 결실체에는 결합하지만, EC3 결실체에는 결합하지 않는다. 즉, 인간화 hG019 항체 4 종은 hCDH6 의 EC3 을 에피토프로 하여 특이적으로 결합하는 것이 나타났다. 한편, 항 CDH6 항체 NOV0712 는, 전장 hCDH6, EC1 결실체, EC2 결실체, EC3 결실체, 및 EC4 결실체에는 결합하지만, EC5 결실체에는 결합하지 않는다. 즉, 항 CDH6 항체 NOV0712 항체는 hCDH6 의 EC5 를 에피토프로 하여 특이적으로 결합하는 것이 나타나고, 국제 공개 제2016/024195호에 기재되어 있는 NOV0712 의 에피토프 정보와 일치한다. 이 결과로부터, NOV0712 와 본 명세서에서 취득한 인간화 hG019 항체 4 종은, 상이한 성질을 나타내는 항 CDH6 항체인 것이 나타났다.
6)-2-2 항체의 결합 경합 어세이
6)-2-2-1 786-O/hCDH6 안정 발현 세포주의 제조
786-O/hCDH6 안정 발현 세포주는, 786-O 세포 (ATCC) 에 인간 CDH6 전장 발현용 재조합 레트로바이러스를 감염시킴으로써 제조하였다. 인간 CDH6 발현 레트로바이러스 벡터 (pQCXIN-hCDH6) 는, 인간 CDH6 단백질 (NP_004923) 을 코드하는 cDNA 발현 벡터 (OriGene 사 RC217889) 를 사용하여, 당업자에게 공지된 방법에 따라 레트로바이러스 벡터 pQCXIN (CLONTECH) 에 삽입함으로써 제조되었다. FuGene HD (Promega) 를 사용하여 레트로바이러스 패키징 세포 RetroPack PT67 (CLONTECH) 에 pQCXIN-hCDH6 을 일과성으로 도입하고, 48 시간 후에 재조합 레트로바이러스를 포함하는 배양 상청을 회수하고, 786-O 세포 배양계에 첨가함으로써 동 세포에 감염시켰다. 감염 3 일 후부터, G418 (Gibco) 를 종농도 50 ㎎/mL 로 첨가한 배지에서 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 배양을 실시하여 감염 세포의 약제 선발을 실시함으로써, 인간 CDH6 을 안정적으로 발현하는 세포주 786-O/hCDH6 을 수립하였다. 실시예 2)-3-1 과 동일하게 플로우 사이토메트리로 안정 발현주에서의 인간 CDH6 의 고발현을 확인하였다 (도 6). 검출용 항체에는 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석시킨 염소 항 마우스 IgG1 2 차 항체 Alexa Fluor 647 (Goat anti-Mouse IgG1 Secondary Antibody Alexa Fluor 647) (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하였다. 그 결과를 도 6 에 나타낸다. 도 8 의 히스토그램에 있어서, 가로축은 항체 결합량을 나타내는 Alexa Fluor 647 의 형광 강도, 세로축은 세포수를 나타낸다. 망점으로 나타내는 히스토그램은 음성 컨트롤 mIgG1 로 염색했을 경우를 나타내고, 백발 실선으로 나타내는 히스토그램은 항인간 CDH6 항체로 염색했을 경우를 나타낸다. 세포 표면의 hCDH6 에 항체가 결합함으로써 형광 강도가 증강된 것을 나타낸다. mIgG1 컨트롤은 어느 세포에도 결합하지 않는다. 이 결과, 786-O/hCDH6 안정 발현 세포주에서는 친주 (親株) 786-O 세포와 비교하여, 인간 CDH6 을 고발현하는 것이 나타났다.
6)-2-2-2 라벨화 H01L02 및 라벨화 NOV0712 를 사용한 결합 경합 어세이
Alexa Fluor 488 Monoclonal Antibody Labeling 키드 (Thermo Fisher) 를 사용하여, 라벨화 H01L02 및 라벨화 NOV0712 를 제조하였다. 6)-2-2-1 에서 제조한 786-O/hCDH6 안정 발현 세포주의 세포 현탁액을 원심하여, 상청을 제거한 후, 라벨화 NOV0712 또는 라벨화 H01L02 를 종농도 5 nM 으로 첨가하고, 또한 실시예 5)-5-3 에서 조제한 인간화 hG019 항체 4 종 (클론 번호는 H01L02, H02L02, H02L03 및 H04L02), 또는 참고예 1 에서 조제한 항 CDH6 항체 NOV0712, 또는 음성 컨트롤로서 인간 IgG1 (Calbiochem) 을 도 7 의 가로축에서 나타내는 종농도로 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 플로우 사이토미터 (CantoII : BD Biosciences) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 실시하였다. 그 결과를 도 7 에 나타낸다. 가로축은 라벨화되어 있지 않은 항체의 첨가시의 종농도를 나타내고, 세로축은 결합량을 MeanFluorescent Intensity (평균 형광 강도) 로 나타낸다. 라벨화 NOV0712 를 첨가한 세포에 라벨화되어 있지 않은 NOV0712 를 첨가한 경우에는, 동일한 에피토프를 가져 결합이 경합하기 때문에, 첨가 농도 의존적으로 라벨화되어 있지 않은 항체로 치환되어 라벨화 항체의 결합량이 감소한다. 한편, 라벨화 NOV0712 를 첨가한 세포에 인간화 hG019 항체 4 종, 또는 음성 컨트롤로서 인간 IgG1 을 첨가해도, 라벨화 항체의 결합량에 변화는 없으므로, 이들 항체는 에피토프가 상이하여 결합이 경합하지 않는 것이 나타난다. 동일하게, 라벨화 H01L02 를 첨가한 세포에 라벨화되어 있지 않은 인간화 hG019 항체 4 종을 첨가한 경우에는, 동일한 에피토프를 가져 결합이 경합하기 때문에, 첨가 농도 의존적으로 라벨화되어 있지 않은 항체로 치환되어 라벨화 항체의 결합량이 감소한다. 한편, 라벨화 H01L02 를 첨가한 세포에 NOV0712, 또는 음성 컨트롤로서 인간 IgG1 을 첨가해도, 라벨화 항체의 결합량에 변화는 없으므로, 이들 항체는 에피토프가 상이하여 결합이 경합하지 않는 것이 나타난다.
6)-3 인간화 hG019 및 NOV0712 의 내재화 활성 평가
인간화 hG019 및 NOV0712 의 내재화 활성은, 단백질 합성을 저해하는 독소 (사포린) 를 결합시킨 항인간 IgG 시약 Hum-ZAP (ADVANCED TARGETING SYSTEMS) 을 사용하여 평가하였다. 즉, 인간 CDH6 양성 난소 종양 세포주 NIH : OVCAR-3 (ATCC) 을 4 x 103 세포/웰로 96 웰 플레이트에 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 인간 CDH6 양성 신세포 종양 세포주 786-O (ATCC) 는 1 x 103 세포/웰로 96 웰 플레이트에 파종하고 하룻밤 배양하였다. 인간 CDH6 양성 난소 종양 세포주 PA-1 (ATCC) 을 1 x 103 세포/웰로 96 웰 플레이트에 파종하고 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 항 CDH6 항체 (종농도 : 1 nM), 또는 음성 컨트롤 항체로서 인간 IgG1 항체 (Calbiochem) 를 첨가하였다. 또한 Hum-ZAP (종농도 : 0.5 nM), 또는 음성 컨트롤로서 독소를 결합하지 않은 F(ab')2 단편 염소 항인간 IgG (F(ab')2 Fragment Goat Anti-human IgG), Fc(감마) 단편 특이성 (Fc(ga㎜a) Fragment Specific) (JACKSON IMMUNORESEARCH) (종농도 : 0.5 nM) 을 첨가하고, 3 일간 37 ℃, 5 ％ CO2 조건하에서 배양하였다. 생존 세포수는, CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay 에 의한 ATP 활성 (RLU) 의 정량으로 측정하였다. 이 평가에서는, 인간화 항 CDH6 항체의 내재화 활성에 의존하여 Hum-ZAP 이 세포 내에 도입되고, 단백 합성을 저해하는 사포린이 세포 내에 방출됨으로써, 세포 증식이 억제된다. 항 CDH6 항체 첨가에 의한 세포 증식 억제 작용은, Hum-ZAP 대신에 음성 컨트롤을 첨가한 웰의 생존 세포수를 100 ％ 로 한 상대 생존율로 표기하였다. 도 8 에 세포 생존율의 표를 나타낸다. 본 실험에 있어서 내재화 활성이 강한 항체는 낮은 세포 생존율을 나타내는 것으로 생각된다. 이 결과, 인간화 hG019 항체 4 종은 3 종의 세포주 중 어느 것에 있어서도 세포 생존율로부터 예측되는 내재화율은 약 50 ∼ 75 ％ 로, 매우 높은 내재화 활성을 나타내고, NOV0712 와 비교하여, 더욱 높은 내재 활성을 나타낸다. ADC 의 약효 메커니즘으로부터, 높은 내재화 활성을 갖는 항체는, ADC 화 항체로서, 보다 적합한 것으로 생각된다.
[실시예 7 : 인간화 hG019 의 개변체의 제조]
7)-1 인간화 hG019 의 개변체의 설계
7)-1-1 H01L02 의 가변 영역 개변체의 설계
실시예 5)-2 에 기재된 hH01 아미노산 서열에 있어서 71 번째의 티로신을 알라닌으로 치환한 중사슬을 hH11 로 명명하고, 81 번째의 글루타민을 세린으로 치환하고, 123 번째의 페닐알라닌을 알라닌으로 치환한 중사슬을 hH31 로 명명하였다. hH11 의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을, 서열 번호 55 에 기재한다. 서열 번호 55 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 56 에 기재한다. hH31 의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열을, 서열 번호 60 에 기재한다. 서열 번호 60 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 61 에 기재한다.
7)-1-2 인간 중사슬 LALA 체의 설계
실시예 5)-2 에 기재된 hH01 의 아미노산 서열에 있어서, EU index 에 의해 특정되는 234 위치, 235 위치의 류신을 알라닌으로 치환한 중사슬을 설계하였다 (본 명세서 중, 「hH01A」라고 칭한다). 또, 실시예 7)-1-1 에서 설계한 hH11 의 가변 영역을 갖고, IgG1 의 아이소 타입이며, 또한, EU index 에 의해 특정되는 234 위치, 235 위치의 류신을 알라닌으로 치환한 중사슬을 설계하였다 (본 명세서 중, 「hH11A」라고 칭한다). 실시예 7)-1-1 에서 설계한 hH31 의 가변 영역을 갖고, IgG1 의 아이소 타입이며, 또한, EU index 에 의해 특정되는 234 위치, 235 위치의 류신을 알라닌으로 치환한 중사슬을 설계하였다 (본 명세서 중, 「hH31A」라고 칭한다).
7)-2 중사슬 및 경사슬의 조합에 의한 인간화 hG019 의 결합 친화성 개변체의 설계
hH01A 및 hL02 로 이루어지는 항체를 「H01L02A 항체」 또는 「H01L02A」라고 칭한다. hH11A 및 hL02 로 이루어지는 항체를 「H11L02A 항체」 또는 「H11L02A」라고 칭한다. hH31A 및 hL02 로 이루어지는 항체를 「H31L02A 항체」 또는 「H31L02A」라고 칭한다.
7)-3 인간화 hG019 의 결합 친화성 개변체의 발현
7)-3-1 인간화 IgG1 LALA 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1LALA 의 구축
서열 번호 71 에서 나타내는 인간 중사슬 시그널 서열 및 인간 IgG1 LALA 정상 영역의 아미노산을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 사용하여, 실시예 4)-1-2 와 동일한 방법으로 pCMA-G1LALA 를 구축하였다.
7)-3-2 hH01A 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 66 에 나타내는 hH01A 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여, pCMA-G1LALA 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써 hH01A 발현 벡터를 구축하였다.
7)-3-3 hH11A 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 68 에 나타내는 hH11A 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 7)-3-2 와 동일한 방법으로 hH11A 발현 벡터를 구축하였다.
7)-3-4 hH31A 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 70 에 나타내는 hH31A 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 7)-3-2 와 동일한 방법으로 hH31A 발현 벡터를 구축하였다.
7)-4 인간화 hG019 의 결합 친화성 개변체의 조제
7)-4-1 H01L02A, H11L02A, H31L02A 의 생산
실시예 4)-2-1 과 동일한 방법으로 생산하였다. 실시예 5)-5-2-1 에서 구축한 경사슬 발현 벡터와 실시예 7)-3 에서 구축한 중사슬 발현 벡터를 사용하여, 실시예 7)-2 에 나타낸 H 사슬과 L 사슬의 조합에 대응한 H 사슬 발현 벡터와 L 사슬 발현 벡터의 조합으로, H01L02A, H11L02A, H31L02A 를 취득하였다.
7)-4-2 H01L02A, H11L02A, H31L02A 의 2 step 정제
실시예 7)-4-1 에서 얻어진 배양 상청을 사용하여, 실시예 5)-5-3-2 와 동일한 방법으로 정제하였다.
[실시예 8 : 인간화 hG019 의 결합 친화성 개변체의 in vitro 평가]
8)-1 H01L02A, H11L02A, H31L02A 의 결합성 평가
실시예 7)-4 에서 제조한 H01L02A, H11L02A, H31L02A 와 인간 CDH6 의 해리 정수 측정은, Biacore T200 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 를 사용하여, His Capture Kit (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 를 이용해서 고정화한 항 히스티딘 항체 (Anti-histidine antibody) 에 항원을 리간드로서 포착 (캡처) 하고, 항체를 아날라이트로서 측정하는 캡처법으로 실시하였다. 센서 칩으로서 CM5 (GE Healthcare Bioscience 사 제조), 런닝 버퍼로서 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.05 ％ SurfactantP20, pH 7.4 를 사용하였다. 칩 상에 1 ㎍/㎖ 의 리컴비넌트 인간 (Recombinant Human) Cadherin―6 (KCAD)/Fc 키메라 (RD-SYSTEMS) 를 10 ㎕/분으로 60 초간 첨가한 후, 실시예 7)-4 에서 조제한 항체의 희석 계열 용액 0.11 ∼ 81 ㎍/㎖ 을 유속 30 ㎕/분으로 180 초간 첨가하고, 계속해서 180 초간 해리상을 모니터하였다. 재생 용액으로서, 글리신 (Glycine) 1.5 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 를 유속 20 ㎕/분으로 30 초간 첨가하였다. 데이터의 해석에는 Steady State Affinity 모델을 사용하여, 해리 정수 (KD) 를 산출하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00075
[실시예 9 : 컨트롤용 항 LPS 항체의 제조]
항 LPS 항체는 WO2015/046505 를 참조하여 제조하였다. 본 실시예에서 사용한 항 LPS 항체는, 아이소 타입이 IgG1 이다 (본 명세서 중, 항 LPS 항체라고도 한다). 본 실시예에서 사용한 항 LPS 항체의 경사슬 및 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 72 및 서열 번호 73 에 나타낸다.
[실시예 10 제조 중간체의 합성]
[실시예 10-1 : 중간체 1]
[화학식 53]
Figure pct00076
공정 1 : 벤질 (6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5-카르복실레이트 (1-2)
5-벤질 6-메틸(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5,6-디카르복실레이트 (1-1) (104 mmol, WO2012087596) 의 테트라하이드로푸란 (500 mL) 용액에, 수소화붕소리튬 (4.30 g, 178 mmol) 을 0 ℃ 에서 소량씩 첨가하였다. 0 ℃ 에서 30 분 교반한 후, 실온에서 2 시간 교반하였다. 0 ℃ 에서 물 (180 mL), 2 규정 염산 (186 mL) 을 첨가하고, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 아세트산에틸로 4 회 추출하고, 유기층을 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물 (1-2) (27.9 g, 90 ％) 를 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 2 : 벤질 (6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5-카르복실레이트 (1-3)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1-2) (27.9 g, 107 mmol) 와 이미다졸 (14.5 g, 214 mmol) 의 디클로로메탄 (300 mL) 용액에, 실온에서 tert-부틸디메틸실릴클로라이드 (24.2 g, 160 mmol) 를 첨가하고, 실온에서 18 시간 교반하였다. 반응 용액을 포화 시트르산 수용액, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸=100 : 0 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1-3) (32.5 g, 81 ％) dmf 얻었다.
Figure pct00077
공정 3 : (6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵탄 (1-4)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1-3) (32.5 g, 86.5 mmol) 의 에탄올 (400 mL) 용액에, 실온에서 7.5 ％ 팔라듐 탄소 촉매 (54 ％ 수분, 5.00 g) 를 첨가하고, 실온, 수소 분위기하에서 6 시간 교반하였다. 반응 용액을 셀라이트 여과하고, 여과액을 감압 증류 제거하여, 목적물 (1-4) (21.3 g, 정량적) 를 얻었다.
Figure pct00078
공정 4 : [(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵토-5-일](5-메톡시-2-니트로-4-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)메타논 (1-5)
5-메톡시-2-니트로-4-{트리(프로판-2-일)실릴]옥시}벤조산 (52.2 g, 141 mmol, US20150283262) 과 1-하이드록시벤조트리아졸 1 수화물 (23.8 g, 155 mmol) 의 디클로로메탄 (500 mL) 용액에, 빙랭하에서 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (35.0 g, 170 mmol) 를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 카르복실산 소실 후, -60 ℃ 에서 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1-4) (34.1 g, 141 mmol) 와 트리에틸아민 (29.4 mL, 212 mmol) 의 디클로로메탄 (100 mL) 용액을 천천히 적하하였다. 반응 용액을 실온에서 하룻밤 교반한 후, 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물에 아세트산에틸과 디에틸에테르를 첨가하고, 고체 성분을 여과에 의해 제거하고, 여과액을 감압 증류 제거하여, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 25 : 75 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1-5) (55.0 g, 66 ％) 를 얻었다.
Figure pct00079
공정 5 : (2-아미노-5-메톡시-4-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵토-5-일]메타논 (1-6)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1-5) (55.0 g, 92.8 mmol) 의 에탄올 (300 mL) 용액에, 질소 분위기하에서, 7.5 ％ 팔라듐 탄소 (10.0 g) 를 첨가하였다. 질소 풍선을 즉시 수소 풍선으로 바꾸어, 반응 혼합물을 수소 분위기하, 실온에서 격렬하게 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 감압 증류 제거하여, 얻어진 목적물 (1-6) (52.2 g, 100 ％) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
Figure pct00080
공정 6 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵토-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (1-7)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1-6) (18.6 g, 33.0 mmol) 및 트리에틸아민 (6.26 mL, 45.2 mmol) 의 THF (300 mL) 용액에, 에탄올-빙욕 상에서, 트리포스겐 (4.22 g, 14.2 mmol) 을 천천히 첨가하였다. 첨가 후, 빙랭한 반응 혼합물에, N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (11.4 g, 30.2 mmol, WO2011130598) 과 트리에틸아민 (6.26 mL, 45.2 mmol) 의 테트라하이드로푸란 (100 mL), N,N-디메틸포름아미드 (30 mL) 혼합 용액을 천천히 적하하였다. 적하 후, 빙욕을 떼어내고, 반응 혼합물을, 질소 분위기하, 40 ℃ 에서 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 40 : 60 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1-7) (23.5 g, 74 ％) 을 얻었다.
Figure pct00081
공정 7 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵토-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (1-8)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (1-7) (23.5 g, 24.3 mmol) 의 테트라하이드로푸란 (50 mL), 메탄올 (50 mL), 물 (44 mL) 용액에, 실온하에서 아세트산 (200 mL) 을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1-8) (18.0 g, 87 ％) 을 얻었다.
Figure pct00082
공정 8 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (1-9)
디메틸술폭시드 (3.75 mL, 52.8 mmol) 의 디클로로메탄 (300 mL) 용액에, 질소 분위기하, -78 ℃ 에서, 염화옥살릴 (2.17 mL, 25.3 mmol) 을 천천히 적하하였다. 적하 후, 반응 혼합물을 -78 ℃ 에서 교반하였다. 반응 혼합물에, 상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (1-8) (18.0 g, 21.1 mmol) 의 디클로로메탄 (50.0 mL) 용액을 천천히 적하하였다. 반응 용액에 -78 ℃ 에서, 트리에틸아민 (14.6 mL, 105 mmol) 을 첨가하였다. 첨가 후, 냉매욕을 떼어내고, 실온까지 천천히 승온하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 클로로포름 (200 mL) 으로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 60 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1-9) (16.5 g, 92 ％) 를 얻었다.
Figure pct00083
공정 9 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (1-10)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (1-9) (12.0 g, 14.1 mmol) 및 2,6-루티딘 (6.58 mL, 56.5 mmol) 의 디클로로메탄 (200 mL) 용액에, 질소 분위기하, 0 ℃ 에서, 트리플루오로메틸술폰산 tert-부틸디메틸실릴 (9.73 mL, 42.3 mmol) 을 천천히 적하하였다. 빙랭하, 10 분간 교반한 후에, 빙욕을 떼어내고, 실온에서 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 클로로포름으로 추출한 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 25 : 75 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1-10) (8.12 g, 60 ％) 을 얻었다.
Figure pct00084
공정 10 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (1-11)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (1-10) (8.12 g, 8.42 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (90 mL), 물 (2 mL) 용액에, 아세트산리튬 (0.611 g, 9.26 mmol) 을 첨가하고, 실온하에서 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1-11) (5.48 g, 81 ％) 를 얻었다.
Figure pct00085
[실시예 10-2 : 중간체 2]
[화학식 54]
Figure pct00086
공정 1 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리신 (2-2)
글리실글리신 (0.328 g, 2.49 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (0.433 mL, 2.49 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (20 mL) 용액에, 1-{[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]옥시}피롤리딘-2,5-디온 (2-1) (1.00 g, 2.49 mmol, Click Chemistry Tools), 물 (10 mL) 을 실온에서 첨가하고, 동온도에서 하룻밤 교반하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 ∼ 클로로포름 : 메탄올 : 물 = 7 : 3 : 1 (v/v/v) 의 분배 유기층] 로 정제하여, 목적물 (0.930 g, 89 ％) 을 얻었다.
Figure pct00087
[실시예 10-3 : 약물 링커 1]
[화학식 55]
Figure pct00088
공정 1 : (2R,11aS)-2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8-하이드록시-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (3-2)
(2R,11aS)-8-(벤질옥시)-2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (3-1) (25.5 g, 41.6 mmol, WO2016149546) 의 테트라하이드로푸란 (150 mL), 에탄올 (150 mL) 용액에, 질소 분위기하, 5 ％ 팔라듐 탄소 (54 ％ 수분, 10.0 g) 를 첨가한 후, 반응 용액을 수소 분위기하, 실온에서 3 일간 교반하였다. 반응 용액에 클로로포름을 첨가하고, 셀라이트 여과한 후, 여과액을 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-2) (19.4 g, 89 ％) 를 얻었다.
Figure pct00089
공정 2 : (2R,11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (3-3)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3-2) (10.8 g, 20.7 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (30 mL) 용액에, 1,5-디브로모펜탄 (23.8 g, 103 mmol), 탄산칼륨 (3.43 g, 24.8 mmol) 을 실온에서 첨가하였다. 실온에서 3 시간 교반한 후, 반응 용액에 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 얻어진 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 황산나트륨으로 건조한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 90 : 10 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-3) (14.5 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00090
공정 3 : (2R,11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-2-하이드록시-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (3-4)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (3-3) (21.5 mmol) 의 테트라하이드로푸란 (40 mL) 용액에, 1 mol/L 의 테트라부틸암모늄플루오라이드 테트라하이드로푸란 용액 (28.0 mL, 28.0 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하였다. 실온에서 30 분간 교반한 후, 반응 용액에 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하고, 얻어진 유기층을 포화 식염수로 세정하였다. 황산나트륨으로 건조한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 97.5 : 2.5 (v/v) ∼ 92.5 : 7.5 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-4) (11.3 g, 94 ％) 를 얻었다.
Figure pct00091
공정 4 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2,5,11(3H,10H,11aH)-트리온 (3-5)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (3-4) (11.3 g, 20.2 mmol), 테트라부틸암모늄브로마이드 (0.325 g, 1.01 mmol), 브롬화칼륨 (0.240 g, 2.02 mmol) 을 포화 탄산수소나트륨 수용액 (60 mL), 디클로로메탄 (60 mL) 에 용해시키고, nor-AZADO (0.0279 g, 0.202 mmol), 차아염소산나트륨 5 수화물 (2.03 g, 27.2 mmol) 를 0 ℃ 에서 첨가하여, 0 ℃ 에서 30 분간 교반하였다. 원료가 잔존했기 때문에, 차아염소산나트륨 5 수화물 (1.00 g, 13.4 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 0 ℃ 에서 15 분 교반하였다. 다시 차아염소산나트륨 5 수화물 (0.300 g, 4.03 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 0 ℃ 에서 15 분 교반하여, 원료의 소실을 TLC 로 확인하였다. 반응 용액에 티오황산나트륨 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하여, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하여, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 75 : 25 (v/v) ∼ 40 : 60 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-5) (9.74 g, 87 ％) 를 얻었다.
Figure pct00092
공정 5 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-5,11-디옥소-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일 트리플루오로메탄술포네이트 (3-6)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (3-5) (9.74 g, 17.5 mmol) 의 디클로로메탄 (160 mL) 용액에, 2,6-루티딘 (8.17 mL, 70.1 mmol) 을 -40 ℃ 에서 첨가하고, -40 ℃ 에서 10 분간 교반하였다. 반응 용액에 무수 트리플루오로메탄술폰산 (8.85 mL, 52.6 mmol) 을 -40 ℃ 에서 첨가하고, -40 ℃ 에서 30 분간 교반하였다. 반응 용액에 10 ％ 시트르산 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하여, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하여, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 95 : 5 → 70 : 35] 로 정제한 후, NH2 실리카 겔 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 95 : 5 (v/v) ∼ 65 : 35 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-6) (7.10 g, 59 ％) 을 얻었다.
Figure pct00093
공정 6 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (3-7)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (3-6) (2.00 g, 2.91 mmol), 4-메톡시페닐보론산 (0.884 g, 5.82 mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (0.336 g, 0.291 mmol), 탄산나트륨 (1.23 g, 11.6 mmol) 의 혼합물에 톨루엔 (20 mL), 에탄올 (10 mL), 물 (10 mL) 을 실온에서 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 30 분 교반한 후, 반응 용액을 아세트산에틸로 추출하고, 물, 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 90 : 10 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-7) (1.71 g, 91 ％) 을 얻었다.
Figure pct00094
공정 7 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-1,11a-디하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온 (3-8)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (3-7) (0.789 g, 1.22 mmol) 을 에탄올 (10 mL), 테트라하이드로푸란 (10 mL) 에 용해하고, 2.0 M 의 수소화붕소리튬테트라하이드로푸란 용액 (6.11 mL, 12.2 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 0 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 반응 용액에 물을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하여, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하여, 얻어진 잔류물을 디클로로메탄 (10 mL), 에탄올 (20 mL), 물 (10 mL) 에 용해하고, 실리카 겔 (4 g) 을 실온에서 첨가하여, 실온에서 4 일간 교반하였다. 실리카 겔을 여과에 의해 제거하고, 물을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하여, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하여, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 60 : 40 (v/v) ∼ 25 : 75 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-8) (0.496 g, 81 ％) 을 얻었다.
Figure pct00095
공정 8 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-1,10,11,11a-테트라하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온 (3-9)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (3-8) (0.496 g, 0.992 mmol) 의 디클로로메탄 (20 mL) 용액에 나트륨트리아세톡시보로하이드리드 (0.421 g, 1.99 mmol) 를 0 ℃ 에서 첨가하였다. 실온에서 2 시간 교반한 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 60 : 40 (v/v) ∼ 25 : 75 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-9) (0.426 g, 86 ％) 를 얻었다.
Figure pct00096
공정 9 : 프로프-2-엔-1-일 (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 (3-10)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (3-9) (0.426 g, 0.849 mmol) 의 디클로로메탄 (30 mL) 용액에, 피리딘 (0.102 mL, 1.27 mmol), 클로로포름산알릴 (0.374 mL, 3.54 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 0 ℃ 에서 15 분간 교반하였다. 반응 용액에 10 ％ 시트르산 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하여, 얻어진 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정 후, 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하여, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 90 : 10 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-10) (0.465 g, 94 ％) 을 얻었다.
Figure pct00097
공정 10 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-{[5-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (3-11)
실시예 10-1 공정 10 에서 얻어진 화합물 (1-11) (0.130 g, 0.161 mmol) 과 상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (3-10) (0.104 g, 0.177 mmol,) 의 N,N-디메틸포름아미드 (3 mL) 용액에 탄산칼륨 (0.0266 g, 0.193 mmol) 을 실온에서 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 용액을 아세트산에틸로 희석하고, 물, 포화 식염수로 세정한 후, 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 NH2-실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 70 : 30 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-11) (0.184 g, 87 ％) 을 얻었다.
Figure pct00098
공정 11 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-{[5-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (3-12)
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (3-11) (0.1837 g, 0.140 mmol) 과 아세트산 (0.048 mL, 0.840 mmol) 의 테트라하이드로푸란 (5.00 mL) 용액에 1 mol/L 의 테트라부틸암모늄플루오라이드 테트라하이드로푸란 용액 (0.700 mL, 0.700 mmol) 을 실온에서 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응 용액을 아세트산에틸로 희석하고, 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 99.5 : 0.5 (v/v) ∼ 95 : 5 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-12) (0.178 g, 정량적) 를 얻었다.
Figure pct00099
공정 12 : L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (3-13)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (3-12) (0.140 mmol) 의 디클로로메탄 (2 mL) 용액에, 실온에서 피롤리딘 (0.0579 mL, 0.700 mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (0.0162 g, 0.0140 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 15 분 교반하였다. 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 99.5 : 0.5 (v/v) ∼ 92.5 : 7.5 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-13) (0.143 g, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00100
공정 13 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (3-14)
실시예 10-2 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2-2) (0.0640 g, 0.153 mmol), N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린 (0.0446 g, 0.180 mmol) 의 혼합물에 디클로로메탄 (2 mL) 을 실온에서 첨가하고, 실온에서 15 분 교반하였다. 반응 용액에 상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (3-13) (0.143 g, 0.139 mmol) 의 디클로로메탄 (2 mL) 용액을 첨가하고, 실온에서 5 시간 교반한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 클로로포름 : 메탄올 = 99.5 : 0.5 (v/v) ∼ 92.5 : 7.5 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (3-14) (0.103 g, 52 ％) 를 얻었다.
Figure pct00101
[실시예 10-4 : 약물 링커 2]
[화학식 56]
Figure pct00102
공정 1 : (2R,11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (4-1)
실시예 10-3 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3-2) (5.06 g, 9.67 mmol) 와 1,3-디브로모프로판 (4.93 mL, 48.4 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-1) (4.85 g, 78 ％) 을 얻었다.
Figure pct00103
공정 2 : (2R,11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-2-하이드록시-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (4-2)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (4-1) (4.85 g, 7.54 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 3 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-2) (4.05 g, 정량적) 를 얻었다.
Figure pct00104
공정 3 : (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2,5,11(3H,10H,11aH)-트리온 (4-3)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (4-2) (7.54 mmol) 를, 실시예 10-3 공정 4 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-3) (3.73 g, 93 ％) 을 얻었다.
Figure pct00105
공정 4 : (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일 트리플루오로메탄술포네이트 (4-4)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (4-3) (3.73 g, 7.08 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 5 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-4) (3.27 g, 70 ％) 를 얻었다.
Figure pct00106
공정 5 : (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (4-5)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (4-4) (3.27 g, 4.96 mmol) 를, 실시예 10-3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-5) (2.49 g, 81 ％) 를 얻었다.
Figure pct00107
공정 6 : (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-1,11a-디하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온 (4-6)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (4-5) (2.49 g, 4.04 mmol) 를, 실시예 10-3 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-6) (1.59 g, 84 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 473[81Br, (M＋H)＋], 471[79Br, (M＋H)＋].
공정 7 : (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-1,10,11,11a-테트라하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온 (4-7)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (4-6) (1.59 g, 3.38 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-7) (1.39 g, 87 ％) 을 얻었다.
Figure pct00108
공정 8 : 프로프-2-엔-1-일 (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 (4-8)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (4-7) (1.40 g, 0.2.95 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-8) (0.885 g, 54 ％) 을 얻었다.
Figure pct00109
공정 9 : N-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-L-발릴-N-[4-({[(11'aS)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (4-9)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (4-8) (0.0381 g, 0.0683 mmol) 과 실시예 10-1 공정 10 에서 얻어진 화합물 (1-11) (0.0552 g, 0.0683 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-9) (0.0712 g, 81 ％) 를 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1284(M＋H)＋.
공정 10 : N-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-L-발릴-N-[4-({[(11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (4-10)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (4-9) (0.0712 g, 0.0554 mmol) 를, 실시예 10-3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-10) (0.0671 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1170(M＋H)＋.
공정 11 : L-발릴-N-[4-({[(11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (4-11)
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (4-10) (0.0571 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-11) (0.0574 g, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00110
공정 12 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-[4-({[(11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (4-12)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (4-11) (0.189 g, 0.189 mmol) 과 실시예 10-2 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2-2) (0.087 g, 0.207 mmol) 를, 실시예 10-3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4-12) (0.169 g, 64 ％) 를 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1402(M＋H)＋.
[실시예 10-5 : 약물 링커 3]
[화학식 57]
Figure pct00111
공정 1 : 디메틸(6S,6'S)-5,5'-{1,5-펜탄디일비스[옥시(5-메톡시-2-니트로벤젠-4,1-디일)카르보닐]}비스(5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실레이트) (5-2)
4,4'-[1,5-펜탄디일비스(옥시)비스(5-메톡시-2-니트로벤조산) (5-1) (5.41 g, 10.9 mmol, Journal of Medicinal Chemistry 2004,47, 1161) 의 디클로로메탄 (50 mL) 용액에, 0 ℃ 에서 염화옥살릴 (5.63 mL, 65.7 mmol) 을 첨가하고, N,N-디메틸포름아미드 (0.0844 mL, 1.09 mmol) 를 적하하였다. 반응 용액을 실온까지 승온하고, 2 시간 교반하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 디클로로메탄 (100 mL) 에 용해하고, 메틸(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실레이트염산염 (4.28 g, 24.1 mmol, Tetrahedron Letters 2012.53.3847) 과 트리에틸아민 (6.07 mL, 43.8 mmol) 의 디클로로메탄 용액 (100 mL) 에 질소 분위기하, -40 ℃ 에서 적하하였다. 반응 용액을 0 ℃ 로 승온하여 2 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 1 규정 염산 (100 mL) 을 첨가하고, 유기층을 물, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하여, 목적물 (5-2) (8.40 g, 정량적) 를 얻었다.
Figure pct00112
공정 2 : {1,5-펜탄디일비스[옥시(5-메톡시-2-니트로벤젠-4,1-디일)}비스{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵토-5-일]메타논} (5-3)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (5-2) (8.40 g, 10.9 mmol) 의 테트라하이드로푸란 (100 mL) 용액에, 수소화붕소리튬 (714 ㎎, 32.8 mmol) 을 첨가하고, 0 ℃ 에서 30 분 교반하고, 실온으로 승온하여 1 시간 교반하였다. 0 ℃ 에서 1 규정 염산을 첨가한 후, 아세트산에틸로 추출하고, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압하에서 용매 증류 제거하여, 목적물 (5-3) (7.70 g, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00113
공정 3 : 펜탄-1,5-디일비스[옥시(5-메톡시-2-니트로벤젠-4,1-디일)카르보닐(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5,6-디일메탄디일] 디아세테이트 (5-4)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (5-3) (7.70 g, 10.8 mmol) 을 피리딘 (20 mL) 및 무수 아세트산 (10 mL, 105.9 mmol) 에 용해하고, 실온에서 교반하였다. 감압 증류 제거하여, 목적물 (5-4) (8.38 g, 97 ％) 를 얻었다.
Figure pct00114
공정 4 : 1,5-펜탄디일비스[옥시(2-아미노-5-메톡시벤젠-4,1-디일)카르보닐 (6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5,6-디일메탄디일]디아세테이트 (5-5)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (5-4) (8.28 g, 10.4 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (100 mL) 용액에, 5 ％ 팔라듐 탄소 (54 ％ 수분, 1.00 g) 를 첨가한 후, 반응 용액을 수소 분위기하, 실온에서 6 시간 격렬하게 교반하였다. 셀라이트 여과한 후, 여과액을 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 90 : 10 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (5-5) (5.05 g, 66 ％) 를 얻었다.
Figure pct00115
공정 5 : {(6S)-5-[4-({5-[4-({(6S)-6-[(아세틸옥시)메틸]-5-아자스피로[2.4]헵토-5-일}카르보닐)-5-아미노-2-메톡시페녹시]펜틸}옥시)-5-메톡시-2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}벤조일]-5-아자스피로[2.4]헵토-6-일}메틸 아세테이트 (모노알릴옥시카르보닐체) (5-6)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (5-5) (5.05 g, 6.85 mmol) 의 디클로로메탄 (100 mL) 용액에, 피리딘 (1.10 mL, 13.7 mmol) 을 첨가하고, 질소 분위기하, -78 ℃ 에서 클로로포름산알릴 (0.725 mL, 6.85 mmol) 을 첨가하고, 2 시간 교반하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 70 : 30 (v/v) ∼ 100 : 0 (v/v), 클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 90 : 10 (v/v)] 로 정제하여, 목적물인 비스알릴옥시카르보닐체 (5-6b) (1.36 g, 22 ％) 와, 모노알릴옥시카르보닐체 (5-6) (2.63 g, 47 ％) 을 얻었다.
펜탄-1,5-디일비스[옥시(5-메톡시-2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}벤젠-4,1-디일)카르보닐 (6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5,6-디일메탄디일] 디아세테이트 (비스알릴옥시카르보닐체) (5-6b) :
Figure pct00116
모노알릴옥시카르보닐체 (5-6) :
Figure pct00117
공정 6 : N-[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[2-({(6S)-6-[(아세틸옥시)메틸]-5-아자스피로[2.4]헵토-5-일}카르보닐)-5-({5-[4-({(6S)-6-[(아세틸옥시)메틸]-5-아자스피로[2.4]헵토-5-일}카르보닐)-2-메톡시-5-{[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]아미노}페녹시]펜틸}옥시)-4-메톡시페닐]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (5-7)
상기 공정 5 에서 얻어진 모노알릴옥시카르보닐체 (5-6) (2.00 g, 2.44 mmol) 과 N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (1.10 g, 2.92 mmol, WO2011130598) 를, 실시예 10-1 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (5-7) (2.64 g, 89 ％) 을 얻었다.
Figure pct00118
공정 7 : N-[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵토-5-일]카르보닐}-5-{[5-(4-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵토-5-일]카르보닐}-2-메톡시-5-{[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]아미노}페녹시)펜틸]옥시}-4-메톡시페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (5-8)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (5-7) (2.64 g, 2.16 mmol) 의 메탄올 (10 mL) 용액에, 탄산칼륨 (1.49 g, 10.8 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 염화암모늄 수용액 (100 mL) 을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하여, 목적물 (5-8) (2.21 g, 90 ％) 을 얻었다.
Figure pct00119
공정 8 : N-[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-8'-{[5-({(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-10'-[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일}옥시)펜틸]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (5-9)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (5-8) (2.03 g, 1.78 mmol) 의 디클로로메탄 (50 mL) 용액에, 데스마틴 퍼아이오디난 (1.59 g, 3.74 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액 (100 mL) 을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 90 : 10 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (5-9) (2.05 g, 정량적) 를 얻었다.
Figure pct00120
공정 9 : L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (5-10)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (5-9) (2.05 g, 1.80 mmol) 를, 실시예 10-3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (5-10) (1.02 g, 60 ％) 을 얻었다.
Figure pct00121
공정 10 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (5-11)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (5-10) (0.710 g, 0.747 mmol) 과 실시예 10-2 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2-2) (0.313 g, 0.747 mmol) 를 디클로로메탄 (1.5 mL) 과 메탄올 (0.1 mL) 의 혼합 용매에 용해하였다. 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드 (0.264 g, 0.897 mmol) 를 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 80 : 20 (v/v)] 로 정제하여 목적물 (5-11) (0.671 g, 66 ％) 을 얻었다.
Figure pct00122
[실시예 10-6 : 약물 링커 4]
[화학식 58]
Figure pct00123
공정 1 : 메틸(6S)-5-[4-(벤질옥시)-5-메톡시-2-니트로벤조일]-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실레이트 (6-2)
4-(벤질옥시)-5-메톡시-2-니트로벤조산 (6-1) (6.07 g, 20.0 mmol, Tetrahedron 1995, 51, 5617), N,N-디메틸포름아미드 (1.08 mL, 13.9 mmol) 의 디클로로메탄 (100 mL) 용액에, 빙랭하에서 염화옥살릴 (3.43 mL, 40.0 mmol) 을 5 분간 걸쳐서 적하하였다. 실온에서 반응 용액을 5 시간 교반한 후, 감압 증류 제거하여, 얻어진 잔류물을 디클로로메탄 (20 mL) 에 용해시키고, 감압 증류 제거하였다. 이 조작을 3 회 반복한 후에, 잔류물을 디클로로메탄 (5 mL) 에 현탁시키고, 이것에 과잉의 디에틸에테르와 헥산을 첨가하고, 여과하여, 감압하에 건조시킴으로써 조(粗) 산클로라이드를 얻었다. 얻어진 산클로라이드를 디클로로메탄에 용해시키고, -40 ℃ (드라이아이스-아세토니트릴욕) 로 냉각하여, 메틸(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실레이트염산염 (4.22 g, 22.0 mmol, Tetrahedron Letters 2012.53.3847), 트리에틸아민 (3.36 mL, 24.2 mmol) 을 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 하룻밤 걸쳐 실온까지 승온하였다. 반응 혼합물에 1 규정 염산을 첨가하고, 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 물, 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 ∼ 50 : 50] 로 정제하여, 목적물 (6-2) (6.55 g, 80 ％) 를 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 441(M＋H)＋
공정 2 : (11a'S)-8'-(벤질옥시)-7'-메톡시-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5',11'(10'H,11a'H)-디온 (6-3)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (6-2) (6.55 g, 16.0 mmol) 의 에탄올 (150 mL), 테트라하이드로푸란 (150 mL) 용액에 질소 분위기하, 라니 니켈 (7.00 g) 을 첨가하였다. 반응 혼합물에 히드라진 1 수화물 (7 mL) 을 첨가하고, 50 ℃ 까지 서서히 승온하였다. 50 ℃ 에서 2 시간 교반한 후에 라니 니켈 (3.00 g), 히드라진 1 수화물 (3 mL) 을 첨가하고, 1 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 THF (100 mL) 를 첨가하고, 셀라이트 여과하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 ∼ 25 : 75] 로 정제하여, 목적물 (6-3) (4.42 g, 73 ％) 을 얻었다.
Figure pct00124
공정 3 : (11a'S)-8'-(벤질옥시)-7'-메톡시-10'-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5',11'(10'H,11a'H)-디온 (6-4)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (6-3) (10.0 g, 26.4 mmol) 의 테트라하이드로푸란 (150 mL) 용액에 -40 ℃ 에서, 2.6 mol/L 의 노르말부틸리튬노르말헥산 용액 (12.0 mL, 31.8 mmol) 을 천천히 적하하였다. 반응 용액을 -40 ℃ 에서 15 분간 교반한 후, 2-(클로로메톡시)에틸트리메틸실란 (5.57 mL, 31.7 mmol) 을 천천히 적하하였다. 반응 용액을 실온에서 3 시간 교반한 후, 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 ∼ 30 : 70] 로 정제하여, 목적물 (6-4) (11.8 g, 88 ％) 를 얻었다.
Figure pct00125
공정 4 : (11a'S)-8'-하이드록시-7'-메톡시-10'-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5',11'(10'H,11a'H)-디온 (6-5)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (6-4) (18.7 g, 36.8 mmol) 의 테트라하이드로푸란 (50 mL), 에탄올 (100 mL) 용액에, 질소 분위기하에서 5 ％ 의 팔라듐 탄소 촉매 (5.00 g) 를 첨가하였다. 즉시 질소 풍선을 수소 풍선으로 바꾸어, 반응 혼합물을 수소 분위기하에서 6 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 클로로포름을 첨가하고, 희석하고, 셀라이트 여과를 한 후, 여과액을 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 ∼ 25 : 75] 로 정제하여, 목적물 (6-5) (15.1 g, 98 ％) 를 얻었다.
Figure pct00126
공정 5 : (11a'S)-8'-[(5-브로모펜틸)옥시]-7'-메톡시-10'-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5',11'(10'H,11a'H)-디온 (6-6)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물에서 얻어진 화합물 (6-5) (2.77 g, 6.62 mmol) 를, 실시예 10-3 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-6) (3.31 g, 88 ％) 을 얻었다.
Figure pct00127
공정 6 : (11a'S)-8'-[(5-브로모펜틸)옥시]-7'-메톡시-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온 (6-7)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (6-6) (3.31 g, 5.83 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-7) (1.11 g, 45 ％) 을 얻었다.
Figure pct00128
공정 7 : (11a'S)-8'-[(5-브로모펜틸)옥시]-7'-메톡시-1',10',11',11a'-테트라하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온 (6-8)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (6-7) (2.56 g, 6.08 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-8) (1.15 g, 45 ％) 을 얻었다.
Figure pct00129
공정 8 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-8'-[(5-브로모펜틸)옥시]-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트 (6-9)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (6-8) (1.15 g, 2.72 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-9) (1.14 g, 82 ％) 를 얻었다.
Figure pct00130
공정 9 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-{[5-({(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-10'-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5',10',11',11a'-테트라하이드로'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (6-10)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (6-9) (0.374 g, 0.737 mmol) 와 실시예 10-1 공정 10 에서 얻어진 화합물 (1-11) (0.452 g, 0.56 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-10) (0.589 g, 65 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1234(M＋H)＋
공정 10 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-{[5-({(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-10'-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (6-11)
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (6-10) (0.589 g, 0.477 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-11) (0.382 g, 71 ％) 을 얻었다.
Figure pct00131
공정 11 : L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (6-12)
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (6-11) (0.382 g, 0.341 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-12) (0.200 g, 62 ％) 를 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 952(M＋H)＋
공정 12 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (6-13)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (6-12) (0.0560 g, 0.0588 mmol) 와 실시예 10-2 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2-2) (0.022 g, 0.053 mmol) 를, 실시예 10-3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (6-13) (0.0500 g, 63 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1354(M＋H)＋
[약물 부분의 합성]
[실시예 10-7 : 약물 1]
[화학식 59]
Figure pct00132
공정 1 : 프로프-2-엔-1-일 (2-{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵토-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바메이트 (7-1)
실시예 1 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1-6) (4.59 g, 8.15 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-1) (4.86 g, 92 ％) 을 얻었다.
Figure pct00133
공정 2 : 프로프-2-엔-1-일 (2-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵토-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바메이트 (7-2)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (7-1) (4.86 g, 7.51 mmol) 을, 실시예 10-1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-2) (3.42 g, 86 ％) 를 얻었다.
Figure pct00134
공정 3 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트 (7-3)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (7-2) (6.68 g, 12.5 mmol) 를, 실시예 10-1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-3) (6.44 g, 97 ％) 을 얻었다.
Figure pct00135
공정 4 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트 (7-4)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (7-3) (3.24 g, 6.10 mmol) 을, 실시예 10-1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-4) (3.86 g, 98 ％) 를 얻었다.
Figure pct00136
공정 5 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트 (7-5)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (7-4) (4.49 g, 6.96 mmol) 를, 실시예 10-1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-5) (3.24 g, 95 ％) 를 얻었다.
Figure pct00137
공정 6 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-{[5-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트 (7-6)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (7-5) (0.080 g, 0.164 mmol) 와 실시예 10-3 공정 9 에서 얻어진 화합물 (3-10) (0.095 g, 0.163 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-6) (0.160 g, 98 ％) 을 얻었다.
Figure pct00138
공정 7 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-{[5-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트 (7-7)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (7-6) (160 ㎎, 0.161 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-7) (141 ㎎, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00139
공정 8 : (11a'S)-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온 (7-8)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (7-7) (141 ㎎, 0.161 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (7-8) (109.8 ㎎, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00140
[실시예 10-8 : 약물 2]
[화학식 60]
Figure pct00141
공정 1 : [4-(벤질)-5-메톡시-2-니트로페닐][(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵토-5-일]메타논 (8-1)
실시예 6 공정 1 에서 얻어진 화합물 (6-2) (6.49 g, 14.7 mmol) 의 테트라하이드로푸란 (147 mL) 용액에, 수소화붕소리튬 (0.642 g, 29.5 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응 용액에 1 규정 염산을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 얻어진 유기층을, 포화 식염수로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 조생성물 (8-1) (6.94 g, 정량적) 을 다음 공정에서 사용하였다.
MS(APCI, ESI)m/z : 413(M＋H)＋
공정 2 : (6S)-5-[4-(벤질옥시)-5-메톡시-2-니트로벤조일]-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르발데히드 (8-2)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (8-1) (4.50 g, 11.0 mmol) 을, 실시예 10-1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (8-2) (1.94 g, 43 ％) 를 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 411(M＋H)＋
공정 3 : (11a'S)-8'-하이드록시-7'-메톡시-1',10',11',11a'-테트라하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온 (8-3)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (8-2) (1.94 g, 4.73 mmol) 의 테트라하이드로푸란 (25 mL), 아세트산에틸 (25 mL), 메탄올 (25 mL) 의 혼합 용액에, 질소 분위기하, 5 ％ 팔라듐 탄소 (54 ％ 수분, 1.0 g) 를 첨가한 후, 반응 용액을 수소 분위기하, 실온에서 22 시간 교반하였다. 반응 용액을 셀라이트 여과한 후, 여과액을 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 80 : 20 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (8-3) (1.20 g, 93 ％) 을 얻었다.
Figure pct00142
공정 4 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-8'-[(5-브로모펜틸오)옥시]-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트 (8-4)
실시예 10-7 공정 5 에서 얻어진 화합물 (7-5) (0.300 g, 0.614 mmol) 를, 실시예 10-3 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (8-4) (0.388 g, 99 ％) 를 얻었다.
Figure pct00143
공정 5 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트 (8-5)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (8-4) (0.203 g0.318 mmol) 와 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (8-3) (0.131 g, 0.478 mmol) 을, 실시예 10-3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (8-5) (0.0880 g, 33 ％) 를 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 831(M＋H)＋
공정 6 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트 (8-6)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (8-5) (0.0880 g, 0.106 mmol) 를, 실시예 10-3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (8-6) (0.0500 g, 66 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 717(M＋H)＋
공정 7 : (11a'S)-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-1',10',11',11a'-테트라하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온 (8-7)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (8-6) (0.0500 g, 0.0698 mmol) 을 실시예 10-3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (8-7) (0.0330 g, 77 ％) 을 얻었다.
Figure pct00144
[실시예 10-9 : 약물 3]
[화학식 61]
Figure pct00145
공정 1 : 디-2-프로펜-1-일{1,5-펜탄디일비스[옥시(6-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵토-5-일]카르보닐}-4-메톡시벤젠-3,1-디일)}비스카르바메이트 (9-1)
실시예 10-5 공정 5 에서 얻어진 비스알릴옥시카르보닐체 (5-6b) (0.460 g, 0.508 mmol) 를 실시예 10-5 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (9-1) (0.421 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00146
공정 2 : 디프로프-2-엔-1-일 (11a'S,11a''''S)-8',8''-[펜탄-1,5-디일비스(옥시)비스(11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트) (9-2)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (9-1) (0.421 g, 0.513 mmol) 을, 실시예 10-5 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (9-2) (0.326 g, 78 ％) 를 얻었다.
Figure pct00147
공정 3 : (11a'S,11a''''S)-8',8''-[1,5-펜탄디일비스(옥시)비스(7'-메톡시-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온) (9-3)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (9-2) (0.326 g, 0.399 mmol) 를, 실시예 10-3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (9-3) (0.208 g, 85 ％) 을 얻었다.
Figure pct00148
[실시예 10-10 : 약물 4]
[화학식 62]
Figure pct00149
공정 1 : (2R,11aS)-2,8-디하이드록시-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (10-1)
실시예 10-3 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3-2) (5.00 g, 9.66 mmol) 를 실시예 10-3 공정 3 과 동일하게 반응시켜 목적물 (10-1) (3.95 g, 100 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 409(M＋H)＋
공정 2 : (2R,11aS)-2-하이드록시-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-8-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (10-2)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (10-1) (3.95 g, 9.67 mmol) 의 디클로로메탄 (97 mL) 용액에, 이미다졸 (1.65 g, 24.2 mmol), 트리이소프로필실릴클로라이드 (2.46 mL, 11.6 mmol) 와 디메틸포름아미드 (5 mL) 를 첨가하고, 실온에서 21 시간 교반하였다. 반응 용액에 물을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하여, 얻어진 유기층을 물로 세정하고, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 20 : 80 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (10-2) (4.78 g, 87 ％) 를 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 565(M＋H)＋
공정 3 : (11aS)-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-8-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2,5,11(3H,10H,11aH)-트리온
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (10-2) (4.78 g, 8.43 mmol) 를, 실시예 10-3 공정 4 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (10-3) (2.36 g, 50 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 563(M＋H)＋
공정 4 : (11aS)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-8-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일 트리플루오로메탄술포네이트 (10-4)
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (10-3) (1.53 g, 2.72 mmol) 을 실시예 10-3 공정 5 와 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (10-4) (1.27 g, 69 ％) 를 얻었다.
Figure pct00150
공정 5 : (11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-8-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (10-5)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (10-4) (0.519 g, 0.747 mmol) 를, 실시예 10-3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (10-5) (0.511 g, 정량적) 를 얻었다.
Figure pct00151
공정 6 : (11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-8-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-1,11a-디하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온 (10-6)
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (10-5) (0.178 g, 0.272 mmol) 를, 실시예 10-3 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (10-6) (0.094 g, 68 ％) 을 얻었다.
Figure pct00152
공정 7 : (11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-8-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-1,10,11,11a-테트라하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온 (10-7)
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (10-6) (0.063 g, 0.124 mmol) 을 사용하여, 실시예 10-3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (10-7) (0.046 g, 72 ％) 을 얻었다.
Figure pct00153
공정 8 : 프로프-2-엔-1-일 (11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-8-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 (10-8)
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (10-7) (0.046 g, 0.090 mmol) 을 사용하여, 실시예 10-3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (10-8) (0.03 g, 56 ％) 을 얻었다.
Figure pct00154
공정 9 : 프로프-2-엔-1-일 (11aS)-8-하이드록시-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트 (10-9)
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (10-8) (0.030 g, 0.050 mmol) 을, 실시예 10-1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (10-9) (0.015 g, 0.034 mmol) 를 얻었다.
Figure pct00155
공정 10 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-8'-(3-브로모프로폭시)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트 (10-10)
실시예 7 공정 5 에서 얻어진 화합물 (7-5) (0.131 g, 0.268 mmol) 를 실시예 10-4 공정 1 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (10-10) (0.086 g, 52 ％) 을 얻었다.
Figure pct00156
공정 11 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트 (10-11)
상기 공정 10 에서 얻어지는 화합물 (10-10) (0.015 g, 0.034 mmol) 과, 상기 공정 9 에서 얻어지는 화합물 (10-9) (0.030 g, 0.048 mmol) 를 사용하여, 실시예 10-3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (10-11) (0.032 g, 96 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 965[(M＋H)＋]
공정 12 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트 (10-12)
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (10-11) (0.031 g, 0.032 mmol) 을 실시예 10-3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (10-12) (0.026 g, 95 ％) 를 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 851[(M＋H)＋]
공정 13 : (11a'S)-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온 (10-13)
상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (10-12) (0.026 g, 0.030 mmol) 를 실시예 10-3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (10-13) (0.018 g, 88 ％) 을 얻었다.
Figure pct00157
[실시예 11 : [N3-PEG(3)]-MSG1-Ox]
[N3-PEG(3)]-MSG1 합성
[화학식 63]
Figure pct00158
(상기 도에 있어서, 구조식의 오른쪽의 모식도는, 실시예 12, 13, 14, 15 의 반응식에 표시되는 중간체의 모식도 중의 대응 구조를 나타낸다.)
공정 1 : (MSG1-)Asn
시판품인 monosialo-Asn free (1S2G/1G2S-10NC-Asn, ㈜ 당사슬 공학 연구소 제조) (「(MSG-)Asn」이라고 부른다) (500 ㎎) 를 이하의 조건으로 역상 HPLC 분리 정제하여, 첫번째 메인 피크로서 용출되는 (MSG1-)Asn (유지 시간 15 ∼ 19 분 부근) 과 두번째 메인 피크로서 용출되는 (MSG2-)Asn (유지 시간 21 ∼ 26 분 부근) 으로 분리하였다. 0.1 ％ 포름산 수용액을 용리액으로서 사용하고, 장치에는 ELS-PDA 트리거-분취 시스템 (닛폰 분광 주식회사 제조) 을 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (10 ㎛m, 30Φ x 250 ㎜, GL 사이언스사 제조) 을 사용하여, 유속을 30 mL/분으로 하였다. 용출 중에 UV 검출 (210 ㎚) 된 최초의 피크로 귀속되는 프랙션을 하나로 모아 동결 건조시켜, 목적물 (238 ㎎) 을 얻었다.
공정 2 : MSG1
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (229 ㎎) 을 200 mM 인산 완충 용액 (pH 6.25) (1145 ㎕) 에 용해시키고, EndoM (도쿄 화성 공업 (주) 제조, 1 U/㎖)) 수용액 (100㎕) 을 첨가하여, 35 ℃ 에서 6 일간 인큐베이트하였다. 반응 종료 후, 반응액을 VIVASPIN 15R (Hydrosart 막, 30K, 6,000 x G) 을 사용하여 한외 여과하고, 얻어진 통과액을 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액을 용리액으로서 사용하고, 장치에는 ELS-PDA 트리거-분취 시스템 (닛폰 분광 주식회사 제조), 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스사 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (210 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으로, 동결 건조시켜, 목적물 (117 ㎎) 을 얻었다.
공정 3 : [N3-PEG(3)]-MSG1
5 ㎖ 샘플링 튜브 ((주) 이나·옵티카) 에, 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 (0.096 mL, 0.485 mmol) 과 상기 공정 2 에서 얻어진 MSG1 (117 mg, 0.68 mmol) 의 수용액 (1.2 mL) 을 첨가하고, 1 시간 교반한 후에, 동결 건조하였다. 동결 건조 후의 5 ㎖ 샘플링 튜브에, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스파이트 (103 mg, 0.27 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (1.2 mL) 과 디이소프로필에틸아민 (0.046 mL, 0.27 mmol) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 미리 디에틸에테르 (20 ㎖) 를 첨가한 원심관 (50 ㎖) 으로 반응액을 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 공기, CF16RX) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 다시 디에틸에테르 (10 ㎖) 를 첨가하고, 원심 분리 조작 후, 디캔테이션하였다. 계속해서, 아세토니트릴 (10 mL) 을 첨가하고, 원심 분리 후, 디캔테이션하는 조작을 2 회 반복한 후, 감압하 건조하여, 조생성물을 얻었다. 얻어진 고형물을 상기 공정 2 와 동일한 조건으로 역상 HPLC 정제를 실시하여, 목적물 (94.2 mg) 을 얻었다.
공정 4 : [N3-PEG(3)]-MSG1-Ox
5 mL 샘플링 튜브 ((주) 이나·옵티카 제조) 에, 상기 공정 3 에서 합성한 화합물 (100 mg), 2-클로로-1,3-디메틸-1H-벤즈이미다졸-3-이움-클로라이드 (후시미 제약소 제조, 56 mg, 0.257 mmol) 의 수용액 (200 ㎕) 을 첨가하였다. 빙랭 후의 반응액에 인산 3 칼륨 (165 mg, 0.78 mmol) 의 수용액 (520 ㎕) 을 첨가하고, 빙랭하에서 3 시간 교반하였다. 얻어진 반응액을, 아미콘 울트라 (울트라셀 30K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 한외 여과하고, 고형물을 제거하였다. 그 통과액을, 겔 여과 크로마토그래피로 정제하였다. 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 HiPrep 26/10 Desalting (GE 헬스케어 제조) 을 사용하고, 이동상에 0.03 ％- NH3 수용액을 사용하고, 유속을 10 mL/분, 분획 용량을 10 mL 로 하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 nm) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 1 N 수산화나트륨 수용액 (104 ㎕, 0.104 mmol) 을 첨가하여 동결 건조하여, 목적물 (84 mg) 을 얻었다.
실시예 12 ∼ 16 은, 당사슬 리모델링 항체의 조제를 기재한다.
[실시예 12 : H01L02 항체-[MSG1-N3]2]
[화학식 64]
Figure pct00159
(상기 식은, MSG1 형 N297 당사슬의 비환원 말단 시알산에 아지드기가 도입된 링커 구조를 나타낸다. 실시예 12 에 있어서, N297 당사슬에 아지드기를 도입한 중간체의 링커 구조는 상기 식과 동일한 구조이다.)
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-H01L02 항체의 조제
H01L02 항체 용액 ca. 21.1 ㎎/mL (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (4.07 mL) 에, 7.7 ㎎/mL 야생형 EndoS 용액 (PBS) 을 0.233 mL 첨가하고, 37 ℃ 에서 4 시간 인큐베이트하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 이하의 방법에 따라, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제를 실시하였다.
(1) 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA avant (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : HiTrap rProtein A FF (5 mL) (GE 헬스케어 제조)
유속 : 5 mL/분 (차지시에는 1.25 mL/분)
상기에서 얻은 반응액을 복수회로 나누어 정제하였다. 칼럼에의 결합시에는, 반응액을 칼럼 상부에 첨가하고, 결합 버퍼 (20 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) 를 1.25 mL/분으로 4 CV (Column Volume) 흘리고, 추가로 5 mL/분으로 5 CV 흘렸다. 중간 세정시에는, 세정 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 염화나트륨 용액) 을 15 CV 흘렸다. 용출시에는, 용출 버퍼 (ImmunoPure IgG Eution buffer, PIERCE 제조) 를 6 CV 흘렸다. 용출액을 1 M 트리스 완충액 (pH 9.0) 으로 즉시 중화하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 를 사용하여, 5 mM 인산 완충액 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8) 으로의 완충액 교환을 실시하였다.
(2) 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA avant (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : Bio-Scale Mini CHT Type I 카트리지 (5 mL) (BIO-RAD 제조)
유속 : 5 mL/분 (차지시에는 1.25 mL/분)
상기 (1) 에서 얻어진 용액을 칼럼의 상부에 첨가하고, A 액 (5 mM 인산 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8)) 을 1.25 mL/분으로 4 CV 흘리고, 추가로 5 mL/분으로 3 CV 흘렸다. 그 후, A 액과 B 액 (5 mM 인산 완충액 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8), 2 M 염화나트륨 용액) 을 사용하여, 용출하였다. 용출 조건은, A 액 : B 액 = 100 : 0 ∼ 0 : 100 (15 CV) 이다. 또한, 세정 용액 (500 mM 인산 완충액 (pH 6.5)) 을 5 CV 흘렸다.
목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 를 사용하여 완충액 교환을 실시하여, 11.4 mg/mL 의 (Fucα1,6)GlcNAc-H01L02 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (5.00 mL) 을 얻었다.
공정 2 : H01L02 항체-[MSG1-N3]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 11.4 ㎎/mL (Fucα1,6)GlcNAc-H01L02 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (5.00 mL) 에, 실시예 11 공정 4 에서 합성한 당사슬 (9.00 ㎎) 의 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 용액 (0.180 mL), 5.10 ㎎/mL 의 EndoS D233Q/Q303L 용액 (PBS) (0.230 mL) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 3 시간 인큐베이트하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 상기 공정 1 과 동이일하게 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제를 실시한 후, 목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 를 사용하여 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 로 완충액 교환을 실시하여, 9.91 ㎎/mL 의 H01L02 항체 [MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (4.00 mL) 를 얻었다.
[실시예 13 : H01L02A 항체-[MSG1-N3]2]
[화학식 65]
Figure pct00160
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-H01L02A 항체의 조제
H01L02A 항체 용액 ca. 21.6 ㎎/mL (50 mM 인산 완충 용액 (pH 6.0)) (1.85 mL) 을 사용하여, 상기 실시예 12 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 14.6 ㎎/mL 의 (Fucα1,6)GlcNAc-H01L02A 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (2.0 mL) 을 얻었다.
공정 2 : H01L02A 항체-[MSG1-N3]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 14.6 ㎎/mL (Fucα1,6)GlcNAc-H01L02A 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (2.0 mL) 을 사용하여, 실시예 12 공정 2 와 동일한 조작을 실시함으로써, 10.0 ㎎/mL 의 H01L02A 항체-[MSG1-N3]2 용액 (아세트산 완충액 (pH 5.5, 함(含)소르비톨)) (2.5 mL) 을 얻었다.
[실시예 14 : H31L02A 항체-[MSG1-N3]2]
[화학식 66]
Figure pct00161
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAcH31L02A 항체의 조제
H31L02A 항체 용액 ca. 23.2 ㎎/mL (50 mM 인산 완충 용액 (pH 6.0)) (3.45 mL) 를 사용하여, 상기 실시예 12 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 8.43 ㎎/mL 의 (Fucα1,6)GlcNAc-H31L02A 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (6.1 mL) 을 얻었다.
공정 2 : H31L02A 항체-[MSG1-N3]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 8.43 ㎎/mL (Fucα1,6)GlcNAc-H31L02A 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (5.00 mL) 을 사용하여, 실시예 12 공정 2 와 동일한 조작을 실시함으로써, 6.52 ㎎/mL 의 H31L02A 항체-[MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (4.00 mL) 을 얻었다.
[실시예 15 : H11L02A 항체-[MSG1-N3]2]
[화학식 67]
Figure pct00162
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-H11L02A 항체의 조제
H11L02A 항체 용액 ca. 24.2 ㎎/mL (50 mM 인산 완충 용액 (pH 6.0)) (3.0 mL) 을 사용하여, 상기 실시예 12 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 20.42 ㎎/mL 의 (Fucα1,6)GlcNAc-H11L02A 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (2.7 mL) 을 얻었다.
공정 2 : H11L02A 항체-[MSG1-N3]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 20.39 ㎎/mL (Fucα1,6)GlcNAc-H11L02A 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (1.55 mL) 을 사용하여, 상기 실시예 12 공정 2 와 동일한 조작을 실시함으로써, 10.26 ㎎/mL 의 H11L02A 항체-[MSG1-N3]2 용액 (아세트산 완충액 (pH 5.5, 함소르비톨)) (2.6 mL) 을 얻었다.
[실시예 16 : 항 LPS 항체-[MSG1-N3]2]
[화학식 68]
Figure pct00163
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-항 LPS 항체의 조제
항 LPS 항체 용액 ca. 17 ㎎/mL (25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0), 5 ％ 소르비톨 용액) (6.6 mL) 을 사용해서, 실시예 12 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 21.03 ㎎/mL 의 (Fucα1,6)GlcNAc-항 LPS 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (5.4 mL) 을 얻었다.
공정 2 : 항 LPS 항체-[MSG1-N3]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 21.03 ㎎/mL (Fucα1,6)GlcNAc-항 LPS 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (5.4 mL) 을 사용하여, 실시예 12 공정 2 와 동일한 조작을 실시함으로써, 9.89 ㎎/mL 의 항 LPS 항체-[MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (7.9 mL) 을 얻었다.
실시예 17 ∼ 27 은, ADC 의 합성을 기재한다.
[실시예 17 : ADC1]
실시예 17 에 기재된 ADC 는, 하기 반응식에 나타내는 바와 같이 실시예 12 의 공정 2 에서 얻어진 항체와 실시예 10-3 공정 13 에서 얻어진 약물 링커 (3-14) 를 컨쥬게이션함으로써 합성하였다. 식 중, R 은 실시예에서 사용된 약물 링커를 나타낸다.
[화학식 69]
Figure pct00164
[화학식 70]
Figure pct00165
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 17 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 컨쥬게이션
실시예 12 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (6.76 ㎎/mL, 1.50 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (1.42 mL), 실시예 10-3 공정 13 에서 얻어진 화합물 (3-14) 의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.0836 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 사용하여 하기의 특성치를 얻었다.
항체 농도 : 1.37 ㎎/mL, 항체 수량 : 8.23 ㎎ (81 ％), 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수 (n) : 1.7
[실시예 18 ADC2]
실시예 18 에 기재된 ADC 는, 하기 반응식에 나타내는 바와 같이 실시예 13 공정 2 에서 얻어진 항체와 실시예 10-4 공정 12 에서 얻어진 약물 링커 (4-12) 를 컨쥬게이션함으로써 합성하였다. 식 중, R 은 실시예에서 사용된 약물 링커를 나타낸다.
[화학식 71]
Figure pct00166
[화학식 72]
Figure pct00167
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 18 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 컨쥬게이션
실시예 13 공정 2 에서 얻어진 항체의 10 mM 아세트산 완충액, 5 ％ 소르비톨 (pH 5.5) 용액 (10.0 ㎎/mL, 100㎕) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (25㎕), 실시예 10-4 공정 12 에서 얻어진 화합물 (4-12) 의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (8 ㎕ ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 과 1,2-프로판디올 (67 ㎕) 의 혼합 용액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 갖는 용액을 1.2 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 사용하여 하기의 특성치를 얻었다.
항체 농도 : 0.56 ㎎/mL, 항체 수량 : 0.67 ㎎ (67 ％), 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수 (n) : 1.9
[실시예 19 : ADC3]
실시예 19 에 기재된 ADC 는, 실시예 13 공정 2 에서 얻어진 항체와 실시예 10-5 공정 10 에서 얻어진 약물 링커 (5-11) 을 컨쥬게이션함으로써 합성하였다.
[화학식 73]
Figure pct00168
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 19 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 컨쥬게이션
실시예 13 공정 2 에서 얻어진 항체의 10 mM 아세트산 완충액, 5 ％ 소르비톨 (pH 5.5) 용액 (10.0 ㎎/mL, 100㎕) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (25 ㎕), 실시예 10-5 공정 10 에서 얻어진 화합물 (5-11) 의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (8 ㎕ ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 과 1,2-프로판디올 (67 ㎕) 의 혼합 용액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 갖는 용액을 1.2 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 사용하여 하기의 특성치를 얻었다.
항체 농도 : 0.53 ㎎/mL, 항체 수량 : 0.64 ㎎ (64 ％), 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수 (n) : 1.9
[실시예 20 : ADC4]
실시예 20 에 기재된 ADC 는, 실시예 13 의 공정 2 에서 얻어진 항체와 실시예 10-6 공정 12 에서 얻어진 약물 링커 (6-13) 을 컨쥬게이션함으로써 합성하였다.
[화학식 74]
Figure pct00169
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 20 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 컨쥬게이션
실시예 13 공정 2 에서 얻어진 항체의 10 mM 아세트산 완충액, 5 ％ 소르비톨 (pH 5.5) 용액 (10.0 ㎎/mL, 100 ㎕) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (25 ㎕), 실시예 10-6 공정 12 에서 얻어진 화합물 (6-13) 의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (8 ㎕ ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 과 1,2-프로판디올 (67 ㎕) 의 혼합 용액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 갖는 용액을 1.2 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 사용하여 하기의 특성치를 얻었다.
항체 농도 : 0.56 ㎎/mL, 항체 수량 : 0.67 ㎎ (67 ％), 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수 (n) : 1.9
[실시예 21 : ADC5]
실시예 21 에 기재된 ADC 는, 실시예 13 공정 2 에서 얻어진 항체와 실시예 10-3 공정 13 에서 얻어진 약물 링커 (3-14) 를 컨쥬게이션함으로써 합성하였다.
[화학식 75]
Figure pct00170
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 21 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 컨쥬게이션
실시예 13 공정 2 에서 얻어진 항체의 10 mM 아세트산 완충액, 5 ％ 소르비톨 (pH 5.5) 용액 (10.0 ㎎/mL, 1.70 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.850 mL), 실시예 10-3 공정 13 에서 얻어진 화합물 (3-14) 의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.141 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 과 1,2-프로판디올 (0.710 mL) 의 혼합 용액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 갖는 용액을 10.5 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 사용하여 하기의 특성치를 얻었다.
항체 농도 : 1.19 ㎎/mL, 항체 수량 : 12.5 ㎎ (73 ％), 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수 (n) : 1.8
[실시예 22 : ADC6]
실시예 22 에 기재된 ADC 는, 하기 반응식에 나타내는 바와 같이 실시예 14 의 공정 2 에서 얻어진 항체와 실시예 10-3 공정 13 에서 얻어진 약물 링커 (3-14) 를 컨쥬게이션함으로써 합성하였다. 식 중, R 은 실시예에서 사용된 약물 링커를 나타낸다.
[화학식 76]
Figure pct00171
[화학식 77]
Figure pct00172
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 22 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 컨쥬게이션
실시예 14 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.1 ㎎/mL, 0.400 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.367 mL), 실시예 10-3 공정 13 에서 얻어진 화합물 (3-14) 의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.0333 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 갖는 용액을 3.50 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 사용하여 하기의 특성치를 얻었다.
항체 농도 : 0.820 ㎎/mL, 항체 수량 : 2.88 ㎎ (81 ％), 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수 (n) : 1.9
실시예 23 ∼ 26 에 기재된 ADC 는, 하기 반응식에 나타내는 바와 같이 실시예 15 의 공정 2 에서 얻어진 항체와 실시예 10-3 ∼ 10-6 에서 얻어진 약물 링커를 컨쥬게이션함으로써 합성하였다. 식 중, R 은 각 실시예에서 사용된 약물 링커에 따라 상이하다.
[실시예 23 : ADC7]
[화학식 78]
Figure pct00173
[화학식 79]
Figure pct00174
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 23 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 컨쥬게이션
실시예 15 공정 2 에서 얻어진 항체의 10 mM 아세트산 완충액, 5 ％ 소르비톨 (pH 5.5) 용액 (10.54 ㎎/mL, 0.4 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.100 mL), 실시예 10-3 공정 13 에서 얻어진 화합물 (3-14) 의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (0.035 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 과 1,2-프로판디올 (0.266 mL) 의 혼합 용액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 갖는 용액을 2.5 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 사용하여 하기의 특성치를 얻었다.
항체 농도 : 1.01 ㎎/mL, 항체 수량 : 2.53 ㎎ (73 ％), 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수 (n) : 1.9
[실시예 24 : ADC8]
[화학식 80]
Figure pct00175
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 24 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 컨쥬게이션
실시예 15 공정 2 에서 얻어진 항체의 10 mM 아세트산 완충액, 5 ％ 소르비톨 (pH 5.5) 용액 (2.8 ㎎/mL, 0.3 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (75 ㎕), 실시예 10-4 공정 12 에서 얻어진 화합물 (4-12) 의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (7 ㎕ ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 과 1,2-프로판디올 (218 ㎕) 의 혼합 용액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 갖는 용액을 2.5 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 사용하여 하기의 특성치를 얻었다.
항체 농도 : 0.22 ㎎/mL, 항체 수량 : 0.56 ㎎ (67 ％), 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수 (n) : 1.8
[실시예 25 : ADC9]
[화학식 81]
Figure pct00176
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 25 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 컨쥬게이션
실시예 15 공정 2 에서 얻어진 항체의 10 mM 아세트산 완충액, 5 ％ 소르비톨 (pH 5.5) 용액 (2.8 ㎎/mL, 300 ㎕) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (75 ㎕), 실시예 10-5 공정 10 에서 얻어진 화합물 (5-11) 의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 (7 ㎕ ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 과 1,2-프로판디올 (218 ㎕) 의 혼합 용액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 갖는 용액을 2.5 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 사용하여 하기의 특성치를 얻었다.
항체 농도 : 0.25 ㎎/mL, 항체 수량 : 0.62 ㎎ (64 ％), 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수 (n) : 1.8
[실시예 26 : ADC10]
[화학식 82]
Figure pct00177
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 26 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 컨쥬게이션
실시예 15 공정 2 에서 얻어진 항체의 10 mM 아세트산 완충액, 5 ％ 소르비톨 (pH 5.5) 용액 (2.8 ㎎/mL, 300 ㎕) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (75 ㎕), 실시예 10-6공정 12 에서 얻어진 화합물 (6-13) 의 10 mM 디메틸술폭시드 용액 용액 (7 ㎕ ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 과 1,2-프로판디올 (218 ㎕) 의 혼합 용액을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 갖는 용액을 2.5 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 사용하여 하기의 특성치를 얻었다.
항체 농도 : 0.25 ㎎/mL, 항체 수량 : 0.62 ㎎ (74 ％), 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수 (n) : 1.8
실시예 27 에 기재된 ADC 는, 하기 반응식에 나타내는 바와 같이 실시예 16 의 공정 2 에서 얻어진 항체와 실시예 10-3 공정 13 에서 얻어진 약물 링커 (3-14) 를 컨쥬게이션함으로써 합성하였다. 식 중, R 은 실시예에서 사용된 약물 링커를 나타낸다.
[실시예 27 : ADC11]
[화학식 83]
Figure pct00178
[화학식 84]
Figure pct00179
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 27 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 식의 좌우의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 컨쥬게이션
실시예 16 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (9.89 ㎎/mL, 0.40 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.367 mL), 실시예 10-3 공정 13 에서 얻어진 화합물 (3-14) 를 10 mM 함유하는 디메틸술폭시드 용액 (0.0328 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 사용하여 정제를 실시하여, 목적의 화합물을 갖는 용액을 2.50 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 사용하여 하기의 특성치를 얻었다.
항체 농도 : 1.16 ㎎/mL, 항체 수량 : 2.89 ㎎ (72 ％), 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수 (n) : 1.8
[실시예 28] 실시예 10-1 에 나타내는 화합물 (1-11) 의 입체 배치 해석
[실시예 10-1 : 중간체 1] 에 기재된 화합물 (1-11) 에 대해 selective 1D ROESY 스펙트럼에서 얻어진 상관 (하기 도) 으로부터, 11' 위치의 절대 입체 배치의 해석을 실시하였다. 1'α-H 와 11'-H 의 사이, 3'α-H 와 11'-H 의 사이, 및 1'β-H 와 3'β-H 의 사이에 상관이 인정되는 점에서, 11' 위치의 절대 입체 배치는 S 배치인 것을 알았다.
[화학식 85]
Figure pct00180
선택적 1D ROESY 스펙트럼에서 얻어진 유의한 상관
선택적 1D ROESY 스펙트럼 상관 측정시에 사용한 1H-NMR
Figure pct00181
따라서, [실시예 10-1 : 중간체 1] 에 기재된 화합물 (1-9), (1-10) 및 (1-11) 그리고 화합물 (1-11) 을 사용하여 합성된 약물 링커 1, 2 및 4 그리고 이들의 합성 중간체 11' 위치의 절대 입체 배치는 S 배치인 것을 알았다. 또, 동일한 합성 수법에 의해 얻어지는 약물 링커 3 및 그 중간체 11' 위치의 절대 입체 배치도 S 배치로 결정하였다.
따라서, [실시예 10-1 : 중간체 1] 에 나타내는 공정 1 ∼ 10 은, 다음과 같이 나타내어진다.
[화학식 86]
Figure pct00182
(1-9) : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
(1-10) : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
(1-11) : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
[실시예 10-3 : 약물 링커 1] 에 나타내는 공정 1 ∼ 13 은, 다음과 같이 나타내어진다.
[화학식 87]
Figure pct00183
(3-11) : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-{[5-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
(3-12) : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-{[5-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
(3-13) : L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드 (3-13)
(3-14) : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
[실시예 10-4 : 약물 링커 2] 에 나타내는 공정 1 ∼ 12 는, 다음과 같이 나타내어진다.
[화학식 88]
Figure pct00184
(4-9) : N-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-L-발릴-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
(4-10) : N-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-L-발릴-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
(4-11) : L-발릴-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
(4-12) : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
[실시예 10-5 : 약물 링커 3] 에 나타내는 공정 1 ∼ 10 은, 다음과 같이 나타내어진다.
[화학식 89]
Figure pct00185
(5-9) : N-[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-8'-{[5-({(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-10'-[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일}옥시)펜틸]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
(5-10) : L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
(5-11) : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
[실시예 10-6 : 약물 링커 4] 에 나타내는 공정 1 ∼ 12 는, 다음과 같이 나타내어진다.
[화학식 90]
Figure pct00186
(6-10) : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-{[5-({(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-10'-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5',10',11',11a'-테트라하이드로'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
(6-11) : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-{[5-({(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-10'-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
(6-12) : L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
(6-13) : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
또, 실시예 17 ∼ 27 에서 얻어지는 ADC 의 식 중 R 은 이하이다.
실시예 17, 21, 22, 23 또는 27 에 기재된 R :
[화학식 91]
Figure pct00187
실시예 18 또는 24 에 기재된 R :
[화학식 92]
Figure pct00188
실시예 19 또는 25 에 기재된 R :
[화학식 93]
Figure pct00189
실시예 20 또는 26 에 기재된 R :
[화학식 94]
Figure pct00190
[참고예 2 : NOV0712-약물 컨쥬게이트의 제조]
참고예 2)-1 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 NOV0712-DM4
항체와 약물 링커의 컨쥬게이션 : 참고예 1 에서 제조한 NOV0712 를, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 B (280 ㎚ 흡광 계수로서 1.51 mL㎎-1㎝-1 을 사용) 및 C 를 사용하여, 20 mM HEPES8.1 (LIFE TECHNOLOGIES 사 제조 HEPES, 1 M Buffer Solution (20 mL) 을 1 M 수산화나트륨에 의해 pH 8.1 로 한 후, 증류수로 1 L 로 하였다) 로 9.7 ㎎/mL 로 조제하고, 20 ℃ 에서 10 분간 인큐베이트하였다. 이어서 WO2016/024195호 공개 특허 공보에 기재된 10 mM 1-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일옥시)-1-옥소-4-(피리딘-2-일디술파닐)부탄-2-술폰산의 DMA 용액 (0.366 mL ; 항체 1 분자에 대해 5.2 당량), 10 mM N2'-데아세틸-데아세틸-N2'-(4-메틸-4-메르캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신 (DM4) 의 DMA 용액 (0.366 mL ; 항체 1 분자에 대해 6.8 당량), 및 0.243 mL 의 DMA 를 첨가하고, 20 ℃ 에서 16 시간 인큐베이트하여, 약물 링커를 항체에 결합시켰다. 다음으로, 1 M 아세트산 수용액을 첨가하여 pH 5.0 으로 하고, 다시 실온에서 20 분간 교반하여, 약물 링커의 반응을 정지시켰다.
정제 : 상기 용액을, 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 D 에 의한 정제를 실시하여, 표기 항체-약물 컨쥬게이트 「NOV0712-DM4」를 함유하는 용액을 28 mL 얻었다.
특성 평가 : 제조 방법 1 에 기재한 공통 조작 E (εA, 280 = 200500, εA, 252 = 76295, εD, 280 = 43170, 및 εD, 252 = 23224 를 사용) 를 사용하여, 하기의 특성치를 얻었다.
항체 농도 : 2.58 ㎎/mL, 항체 수량 : 72.2 ㎎ (93 ％), 공통 조작 E 에서 측정된 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수 (n) : 3.0.
[실시예 29 : 항체-약물 컨쥬게이트의 in vitro 활성 평가]
CDH6 양성 인간 종양 세포주에 대한 항체-약물 컨쥬게이트의 in vitro 세포 증식 억제 활성 평가
실시예 2)-3 에서 CDH6 의 발현을 확인한, 인간 난소 종양 세포주 NIH : OVCAR-3, OV-90, PA-1 및 인간 신세포 종양 세포주 786-O (모두 ATCC 로부터 입수) 를 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 배양한 후, 도 9 에 나타내는 각 세포주의 파종수/100 ㎕/well 이 되도록 96 웰 플레이트에 파종하여, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 실시예 27 에서 제조한 ADC11, 실시예 17 에서 제조한 ADC1, 실시예 21 에서 제조한 ADC5, 실시예 23 에서 제조한 ADC7, 또는 실시예 22 에서 제조한 ADC6 을, 종농도 100 (nM) 에서 0.000256 (nM) 이 되도록, 5 배 공비로 희석한 항체-약물 컨쥬게이트를 첨가하였다. 6 일간 배양 후에 생존 세포수를 CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 에 의한 ATP 의 정량으로 측정하였다. 세포 증식 억제 활성으로서의 IC50 값은 다음 식으로 산출하고, 소수점 3 번째 자리를 사사오입하여 소수점 2 번째 자리까지 표기하였다.
IC50 (nM) = antilog ((50 － d) × (LOG10(b) － LOG10(a)) ÷ (d － c) ＋ LOG10(b))
a : 검체 농도 a
b : 검체 농도 b
c : 검체 농도 a 에 있어서의 생세포율
d : 검체 농도 b 에 있어서의 생세포율
a, b 는 생세포율 50 ％ 를 사이에 두는 2 점에서 a ＞ b
도 9 에 항체-약물 컨쥬게이트를 각각 첨가했을 때의 IC50 (nM) 을 나타내었다. In vitro 에서의 CDH6 발현량이 많은 난소 종양 세포주 3 주에서는, CDH6 에 결합하지 않는 항체-약물 컨쥬게이트인 ADC11 의 IC50 값에 비해, 3 종의 항 CDH6 항체의 약물 컨쥬게이트의 IC50 값은 매우 낮은 점에서, CDH6 의 발현에 특이적인 매우 강한 세포 증식 억제 활성을 갖는 것이 나타났다. 또, 항체의 CDH6 에 대한 결합 활성 (표 3) 과, 항체-약물 컨쥬게이트의 세포 증식 억제 활성에 상관이 인정되었다. In vitro 에서의 CDH6 발현량이 낮은 신세포 종양 세포주에 있어서도, 동일한 경향이 인정되었다 (도 9).
[실시예 30 : 항체-약물 컨쥬게이트의 in vivo 항종양 효과 1]
항체-약물 컨쥬게이트의 항종양 효과는, CDH6 양성 인간 종양 세포주의 세포를 면역 부전 마우스에 이식한 동물 모델을 사용하여 평가하였다. 4 - 5 주령의 BALB/c 누드 마우스 (CAnN.Cg-Foxnl[nu]/CrlCrlj[Foxnlnu/Foxnlnu], 닛폰 찰스·리버), 및 SCID 마우스 (CB17/Icr-Prkdc[scid]/CrlCrlj, 닛폰 찰스·리버) 를 실험 사용 전에 SPF 조건화에서 3 일간 이상 순화 (馴化) 시켰다. 마우스에는 멸균한 고형 사료 (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) 를 먹이고, 멸균한 수돗물 (5 - 15 ppm 차아염소산나트륨 용액을 첨가하여 조제) 을 주었다. 이식한 종양의 장경 및 단경을 전자식 디지털노기스 (CD-15CX, Mitutoyo Corp.) 로 1 주에 2 회 측정하고, 이하에 나타내는 계산식에 의해 종양 체적을 산출하였다.
종양 체적 (㎣) = 1/2 × 장경 (㎜) × [단경 (㎜)]2
항체-약물 컨쥬게이트는 모두 ABS 완충액 (10 mM-Acetate Buffer, 5 ％ 소르비톨, pH 5.5) (NACALAI) 으로 희석하고, 각 실시예에 나타내는 용량으로 미정맥내 투여하였다. 또, 컨트롤군 (Vehicle 군) 으로서 ABS 완충액을 동일하게 투여하였다. 1 군당 6 마리의 마우스를 실험에 사용하였다.
30)-1 항종양 효과 (1)
실시예 2)-3 에서 CDH6 의 발현을 확인한, CDH6 양성 인간 난소 종양 세포주 OV-90 (ATCC) 을 마트리겔 (코닝사) 에 현탁하고, 2.5×106 세포를 암컷 누드 마우스의 우측 복부에 피하 이식하여 (Day 0), Day 14 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 군나누기 실시일에, 실시예 17 에서 제조한 ADC1, 또는 실시예 27 에서 제조한 ADC11 을, 0.4 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 또, 참고예 2)-1 에서 제조한 NOV0712-DM4 를, 10 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 결과를 도 10 에 나타낸다. 가로축은 투여후 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
본 종양 모델에 있어서, NOV0712-DM4 는 투여 후 30 일 후부터 종양의 재증식이 인정되었지만, ADC1 은 0.4 ㎎/㎏ 의 매우 낮은 용량으로 강력한 종양 퇴축 효과를 나타내고, 투여 후 42 일간의 장기에 걸쳐서 강한 항종양 효과가 지속되었다. 항종양 시험에 사용하는 마우스 및 이식된 인간 종양 세포의 어느 것에도 결합을 나타내지 않는, 컨트롤로서의 ADC11 은 항종양 효과를 나타내지 않았다. 모든 약제 투여군에 있어서, 대조군인 ABS 완충액 투여군과 비교한 마우스의 체중 감소는 인정되지 않았다.
30)-2 항종양 효과 (2)
실시예 2)-3 에서 CDH6 의 발현을 확인한, CDH6 양성 인간 신세포 종양 세포주 Caki-1 (ATCC) 을 마트리겔 (코닝사) 에 현탁하고, 2.5×106 세포를 암컷 누드 마우스의 우측 복부에 피하 이식하여 (Day 0), Day 13 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 군나누기 실시일에, 실시예 17 에서 제조한 항체-약물 컨쥬게이트 ADC1, 또는 실시예 27 에서 제조한 ADC11 을, 0.4 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 또, 참고예 2)-1 에서 제조한 NOV0712-DM4 를, 10 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 결과를 도 11 에 나타낸다. 가로축은 투여후 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
본 종양 모델에 있어서 NOV0712-DM4 는 10 ㎎/㎏ 의 용량에서 항종양 효과를 나타내지 않았다. 한편, ADC1 은 0.4 ㎎/㎏ 의 매우 낮은 용량에서 항종양 효과를 발휘하였다. 항종양 시험에 사용하는 마우스 및 이식된 인간 종양 세포의 어느 것에도 결합을 나타내지 않는, 컨트롤로서의 ADC11 은, 0.4 ㎎/㎏ 에서 항종양 효과를 나타내지 않았다 (도 11). 즉, ADC1 이 나타내는 항종양 효과는 종양 세포에서의 CDH6 발현에 의존한 특이적 작용인 것이 나타났다. 본 발명의 ADC1 은, 선행 기술인 NOV0712-DM4 와 비교하여 항종양 효과가 매우 우수한 항체-약물 컨쥬게이트인 것이 나타났다. 모든 약제 투여군에 있어서, 대조군인 ABS 완충액 투여군과 비교한 마우스의 체중 감소는 인정되지 않았다.
30)-3 항종양 효과 (3)
실시예 2)-3 에서 CDH6 의 발현을 확인한, CDH6 양성 인간 난소 종양 세포주 NIH : OVCAR-3 (ATCC) 을 마트리겔 (코닝사) 에 현탁하고, 1×107 세포를 암컷 누드 마우스의 우측 복부에 피하 이식하여 (Day 0), Day 28 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 군나누기 실시일에, 실시예 17 에서 제조한 ADC1, 실시예 21 에서 제조한 ADC5, 실시예 22 에서 제조한 ADC6, 또는 실시예 27 에서 제조한 ADC11 을, 0.4 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 결과를 도 12 에 나타낸다. 가로축은 투여후 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
본 종양 모델에 있어서, ADC6 이 가장 강한 항종양 효과를 나타내고, 이어서 ADC1 및 ADC5 가 거의 동등한 항종양 효과를 나타내었다. 즉, 항체-약물 컨쥬게이트로서의 항종양 효과에 있어서, 인간 항체 중사슬의 EU index 에 의해 특정되는 234 위치, 235 위치의 류신을 알라닌으로 치환한 것에 의한 영향은 거의 없음이 나타났다. 컨트롤로서의 ADC11 은, 0.4 ㎎/㎏ 에서 항종양 효과를 나타내지 않았다 (도 12). 즉, ADC1, ADC5 및 ADC5 가 나타내는 항종양 효과는 종양 세포에서의 CDH6 발현에 의존한 특이적 작용인 것이 나타났다. 모든 약제 투여군에 있어서, 대조군인 ABS 완충액 투여군과 비교한 마우스의 체중 감소는 인정되지 않았다.
30)-4 항종양 효과 (4)
실시예 2)-3 에서 CDH6 의 발현을 확인한, CDH6 양성 인간 난소 종양 세포주 OV-90 (ATCC) 을 마트리겔 (코닝사) 에 현탁하고, 2.5×106 세포를 암컷 누드 마우스의 우측 복부에 피하 이식하여 (Day 0), Day 17 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 군나누기 실시일에, 실시예 17 에서 제조한 ADC1, 실시예 21 에서 제조한 ADC5, 실시예 23 에서 제조한 ADC7, 또는 실시예 22 에서 제조한 ADC6 을, 0.2 ㎎/㎏ 또는 0.4 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 결과를 도 13 에 나타낸다. 가로축은 투여후 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
본 종양 모델에 있어서, ADC5 및 ADC6 의 0.4 ㎎/㎏ 투여가 가장 강한 항종양 효과를 나타내고, 이어서 ADC7 의 0.4 ㎎/㎏ 투여가 강한 항종양 효과를 나타내었다 (도 13). 또, ADC5 의 0.4 ㎎/㎏ 투여와 0.2 ㎎/㎏ 투여의 결과로부터, 용량 의존적인 항종양 효과를 확인하였다. 0.2 ㎎/㎏ 투여에 있어서 ADC1 및 ADC5 가 거의 동등한 항종양 효과를 나타내었다. 즉, 항체-약물 컨쥬게이트로서의 항종양 효과에 있어서, 인간 항체 중사슬의 EU index 에 의해 특정되는 234 위치, 235 위치의 류신을 알라닌으로 치환한 것에 의한 영향은 거의 없음이 나타났다. 모든 약제 투여군에 있어서, 대조군인 ABS 완충액 투여군과 비교한 마우스의 체중 감소는 인정되지 않았다.
30)-5 항종양 효과 (5)
실시예 2)-3 에서 CDH6 의 발현을 확인한, CDH6 양성 인간 난소 종양 세포주 PA-1 (ATCC) 을 마트리겔 (코닝사) 에 현탁하고, 7.5×106 세포를 암컷 누드 마우스의 우측 복부에 피하 이식하여 (Day 0), Day 17 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 군나누기 실시일에, 실시예 21 에서 제조한 ADC5, 실시예 22 에서 제조한 ADC6 또는 실시예 27 에서 제조한 ADC11 을, 0.4 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 결과를 도 14 에 나타낸다. 가로축은 투여후 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
본 종양 모델에 있어서, ADC5 가 가장 강한 항종양 효과를 나타내고, 35 일간의 장기에 걸쳐서 종양의 소실을 확인하였다. 이어서 ADC6 이 강한 항종양 효과를 나타내었다 (도 14). 모든 약제 투여군에 있어서, 대조군인 ABS 완충액 투여군과 비교한 마우스의 체중 감소는 인정되지 않았다.
30)-6 항종양 효과 (6)
실시예 2)-3 에서 CDH6 의 발현을 확인한, CDH6 양성 인간 신세포 종양 세포주 786-O (ATCC) 를 마트리겔 (코닝사) 에 현탁하고, 5×106 세포를 수컷 SCID 마우스의 우측 복부에 피하 이식하여 (Day 0), Day 38 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 군나누기 실시일에, 실시예 21 에서 제조한 ADC5, 실시예 22 에서 제조한 ADC6 을, 0.4 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 또, 실시예 27 에서 제조한 ADC11 을, 0.4 ㎎/㎏ 의 용량으로 미정맥내 투여하였다. 결과를 도 15 에 나타낸다. 가로축은 투여후 일수, 세로축은 종양 체적, 오차 범위는 SE 값을 나타낸다.
본 종양 모델에 있어서, ADC5 및 ADC6 은 강한 항종양 효과를 나타내었다 (도 15). 컨트롤로서의 ADC11 은, 항종양 효과를 나타내지 않았다 (도 15). 즉, ADC5 및 ADC6 이 나타내는 항종양 효과는 종양 세포에서의 CDH6 발현에 의존한 특이적 작용인 것이 나타났다. 모든 약제 투여군에 있어서, 대조군인 ABS 완충액 투여군과 비교한 마우스의 체중 감소는 인정되지 않았다.
산업상 이용가능성
본 발명에 의해, 내재화 활성을 갖는 항 CDH6 항체 및 그 항체를 함유하는 항체-약물 컨쥬게이트가 제공되었다. 그 항체-약물 컨쥬게이트는 암에 대한 치료약 등으로서 사용할 수 있다.
서열표 프리텍스트
서열 번호 1 : 인간 CDH6 ORF
서열 번호 2 : EC1
서열 번호 3 : EC2
서열 번호 4 : EC3
서열 번호 5 : EC4
서열 번호 6 : EC5
서열 번호 7 : 게잡이 원숭이 CDH6 ORF
서열 번호 8 : 게잡이 원숭이 CDH6 프라이머 1
서열 번호 9 : 게잡이 원숭이 CDH6 프라이머 2
서열 번호 10 : rG019 의 경사슬의 가변 영역 아미노산 서열
서열 번호 11 : rG019 의 경사슬의 가변 영역 뉴클레오티드 서열
서열 번호 12 : rG019 CDRL1
서열 번호 13 : rG019 CDRL2
서열 번호 14 : rG019 CDRL3
서열 번호 15 : rG019 의 중사슬의 가변 영역 아미노산 서열
서열 번호 16 : rG019 의 중사슬의 가변 영역 뉴클레오티드 서열
서열 번호 17 : rG019 CDRH1
서열 번호 18 : rG019 CDRH2
서열 번호 19 : rG019 CDRH3
서열 번호 20 : 인간 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편
서열 번호 21 : 인간 중사슬 시그널 서열 및 인간 IgG1 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편
서열 번호 22 : chG019 경사슬을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편
서열 번호 23 : chG019 경사슬 전장 아미노산 서열
서열 번호 24 : chG019 경사슬 전장 뉴클레오티드 서열
서열 번호 25 : chG019 경사슬 가변 영역 뉴클레오티드 서열
서열 번호 26 : chG019 중사슬 전장 아미노산 서열
서열 번호 27 : chG019 중사슬 전장 뉴클레오티드 서열
서열 번호 28 : chG019 중사슬 가변 영역 아미노산 서열
서열 번호 29 : chG019 중사슬 가변 영역 뉴클레오티드 서열
서열 번호 30 : chG019 CDRH2
서열 번호 31 : hL02 의 경사슬 전장 아미노산 서열
서열 번호 32 : hL02 의 경사슬 전장 뉴클레오티드 서열
서열 번호 33 : hL02 의 경사슬 가변 영역 아미노산 서열
서열 번호 34 : hL02 의 경사슬 가변 영역 뉴클레오티드 서열
서열 번호 35 : hL03 의 경사슬 전장 아미노산 서열
서열 번호 36 : hL03 의 경사슬 전장 뉴클레오티드 서열
서열 번호 37 : hL03 의 경사슬 가변 영역 아미노산 서열
서열 번호 38 : hL03 의 경사슬 가변 영역 뉴클레오티드 서열
서열 번호 39 : hH01 의 중사슬 전장 아미노산 서열
서열 번호 40 : hH01 의 중사슬 전장 뉴클레오티드 서열
서열 번호 41 : hH01 의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열
서열 번호 42 : hH01 의 중사슬 가변 영역 뉴클레오티드 서열
서열 번호 43 : hH02 의 중사슬 전장 아미노산 서열
서열 번호 44 : hH02 의 중사슬 전장 뉴클레오티드 서열
서열 번호 45 : hH02 의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열
서열 번호 46 : hH02 의 중사슬 가변 영역 뉴클레오티드 서열
서열 번호 47 : hH04 의 중사슬 전장 아미노산 서열
서열 번호 48 : hH04 의 중사슬 전장 뉴클레오티드 서열
서열 번호 49 : hH04 의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열
서열 번호 50 : hH04 의 중사슬 가변 영역 뉴클레오티드 서열
서열 번호 51 : NOV0712 경사슬 전장 아미노산 서열
서열 번호 52 : 서열 번호 51 에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 53 : NOV0712 중사슬 전장 아미노산 서열
서열 번호 54 : 서열 번호 53 에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 55 : hH11 의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열
서열 번호 56 : hH11 의 중사슬 가변 영역 뉴클레오티드 서열
서열 번호 57 : hH11 CDRH1
서열 번호 58 : hH11 CDRH2
서열 번호 59 : hH11 CDRH3
서열 번호 60 : hH31 의 중사슬 가변 영역 아미노산 서열
서열 번호 61 : hH31 의 중사슬 가변 영역 뉴클레오티드 서열
서열 번호 62 : hH31 CDRH1
서열 번호 63 : hH31 CDRH2
서열 번호 64 : hH31 CDRH3
서열 번호 65 : hH01A 의 중사슬 전장 아미노산 서열
서열 번호 66 : hH01A 의 중사슬 전장 뉴클레오티드 서열
서열 번호 67 : hH11A 의 중사슬 전장 아미노산 서열
서열 번호 68 : hH11A 의 중사슬 전장 뉴클레오티드 서열
서열 번호 69 : hH31A 의 중사슬 전장 아미노산 서열
서열 번호 70 : hH31A 의 중사슬 전장 뉴클레오티드 서열
서열 번호 71 : 인간 중사슬 시그널 서열 및 인간 IgG1 LALA 정상 영역의 아미노산을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편
서열 번호 72 : 항 LPS 항체 경사슬 전장 아미노산 서열
서열 번호 73 : 항 LPS 항체 중사슬 전장 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> ANTI-CDH6 ANTIBODY-PYRROLOBENZODIAZEPINE DERIVATIVES CONJUGATE <130> DSPCT-FP1936 <150> JP2018-214110 <151> 2018-11-14 <150> JP2019-057327 <151> 2019-03-25 <160> 73 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 790 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Thr Tyr Arg Tyr Phe Leu Leu Leu Phe Trp Val Gly Gln Pro 1 5 10 15 Tyr Pro Thr Leu Ser Thr Pro Leu Ser Lys Arg Thr Ser Gly Phe Pro 20 25 30 Ala Lys Lys Arg Ala Leu Glu Leu Ser Gly Asn Ser Lys Asn Glu Leu 35 40 45 Asn Arg Ser Lys Arg Ser Trp Met Trp Asn Gln Phe Phe Leu Leu Glu 50 55 60 Glu Tyr Thr Gly Ser Asp Tyr Gln Tyr Val Gly Lys Leu His Ser Asp 65 70 75 80 Gln Asp Arg Gly Asp Gly Ser Leu Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Asp Gly 85 90 95 Ala Gly Asp Leu Phe Ile Ile Asn Glu Asn Thr Gly Asp Ile Gln Ala 100 105 110 Thr Lys Arg Leu Asp Arg Glu Glu Lys Pro Val Tyr Ile Leu Arg Ala 115 120 125 Gln Ala Ile Asn Arg Arg Thr Gly Arg Pro Val Glu Pro Glu Ser Glu 130 135 140 Phe Ile Ile Lys Ile His Asp Ile Asn Asp Asn Glu Pro Ile Phe Thr 145 150 155 160 Lys Glu Val Tyr Thr Ala Thr Val Pro Glu Met Ser Asp Val Gly Thr 165 170 175 Phe Val Val Gln Val Thr Ala Thr Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr Gly 180 185 190 Asn Ser Ala Lys Val Val Tyr Ser Ile Leu Gln Gly Gln Pro Tyr Phe 195 200 205 Ser Val Glu Ser Glu Thr Gly Ile Ile Lys Thr Ala Leu Leu Asn Met 210 215 220 Asp Arg Glu Asn Arg Glu Gln Tyr Gln Val Val Ile Gln Ala Lys Asp 225 230 235 240 Met Gly Gly Gln Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Thr Val Asn Ile 245 250 255 Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Arg Phe Pro Gln Ser Thr 260 265 270 Tyr Gln Phe Lys Thr Pro Glu Ser Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ile Gly 275 280 285 Arg Ile Lys Ala Ser Asp Ala Asp Val Gly Glu Asn Ala Glu Ile Glu 290 295 300 Tyr Ser Ile Thr Asp Gly Glu Gly Leu Asp Met Phe Asp Val Ile Thr 305 310 315 320 Asp Gln Glu Thr Gln Glu Gly Ile Ile Thr Val Lys Lys Leu Leu Asp 325 330 335 Phe Glu Lys Lys Lys Val Tyr Thr Leu Lys Val Glu Ala Ser Asn Pro 340 345 350 Tyr Val Glu Pro Arg Phe Leu Tyr Leu Gly Pro Phe Lys Asp Ser Ala 355 360 365 Thr Val Arg Ile Val Val Glu Asp Val Asp Glu Pro Pro Val Phe Ser 370 375 380 Lys Leu Ala Tyr Ile Leu Gln Ile Arg Glu Asp Ala Gln Ile Asn Thr 385 390 395 400 Thr Ile Gly Ser Val Thr Ala Gln Asp Pro Asp Ala Ala Arg Asn Pro 405 410 415 Val Lys Tyr Ser Val Asp Arg His Thr Asp Met Asp Arg Ile Phe Asn 420 425 430 Ile Asp Ser Gly Asn Gly Ser Ile Phe Thr Ser Lys Leu Leu Asp Arg 435 440 445 Glu Thr Leu Leu Trp His Asn Ile Thr Val Ile Ala Thr Glu Ile Asn 450 455 460 Asn Pro Lys Gln Ser Ser Arg Val Pro Leu Tyr Ile Lys Val Leu Asp 465 470 475 480 Val Asn Asp Asn Ala Pro Glu Phe Ala Glu Phe Tyr Glu Thr Phe Val 485 490 495 Cys Glu Lys Ala Lys Ala Asp Gln Leu Ile Gln Thr Leu His Ala Val 500 505 510 Asp Lys Asp Asp Pro Tyr Ser Gly His Gln Phe Ser Phe Ser Leu Ala 515 520 525 Pro Glu Ala Ala Ser Gly Ser Asn Phe Thr Ile Gln Asp Asn Lys Asp 530 535 540 Asn Thr Ala Gly Ile Leu Thr Arg Lys Asn Gly Tyr Asn Arg His Glu 545 550 555 560 Met Ser Thr Tyr Leu Leu Pro Val Val Ile Ser Asp Asn Asp Tyr Pro 565 570 575 Val Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Thr Val Arg Val Cys Ala Cys Asp 580 585 590 His His Gly Asn Met Gln Ser Cys His Ala Glu Ala Leu Ile His Pro 595 600 605 Thr Gly Leu Ser Thr Gly Ala Leu Val Ala Ile Leu Leu Cys Ile Val 610 615 620 Ile Leu Leu Val Thr Val Val Leu Phe Ala Ala Leu Arg Arg Gln Arg 625 630 635 640 Lys Lys Glu Pro Leu Ile Ile Ser Lys Glu Asp Ile Arg Asp Asn Ile 645 650 655 Val Ser Tyr Asn Asp Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Thr Gln Ala Phe 660 665 670 Asp Ile Gly Thr Leu Arg Asn Pro Glu Ala Ile Glu Asp Asn Lys Leu 675 680 685 Arg Arg Asp Ile Val Pro Glu Ala Leu Phe Leu Pro Arg Arg Thr Pro 690 695 700 Thr Ala Arg Asp Asn Thr Asp Val Arg Asp Phe Ile Asn Gln Arg Leu 705 710 715 720 Lys Glu Asn Asp Thr Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu Ala 725 730 735 Thr Tyr Ala Tyr Glu Gly Thr Gly Ser Val Ala Asp Ser Leu Ser Ser 740 745 750 Leu Glu Ser Val Thr Thr Asp Ala Asp Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu Ser 755 760 765 Asp Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly Val 770 775 780 Asp Ser Asp Lys Asp Ser 785 790 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Trp Met Trp Asn Gln Phe Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Thr Gly Ser 1 5 10 15 Asp Tyr Gln Tyr Val Gly Lys Leu His Ser Asp Gln Asp Arg Gly Asp 20 25 30 Gly Ser Leu Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Asp Gly Ala Gly Asp Leu Phe 35 40 45 Ile Ile Asn Glu Asn Thr Gly Asp Ile Gln Ala Thr Lys Arg Leu Asp 50 55 60 Arg Glu Glu Lys Pro Val Tyr Ile Leu Arg Ala Gln Ala Ile Asn Arg 65 70 75 80 Arg Thr Gly Arg Pro Val Glu Pro Glu Ser Glu Phe Ile Ile Lys Ile 85 90 95 His Asp Ile Asn Asp Asn Glu Pro Ile Phe 100 105 <210> 3 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Thr Lys Glu Val Tyr Thr Ala Thr Val Pro Glu Met Ser Asp Val Gly 1 5 10 15 Thr Phe Val Val Gln Val Thr Ala Thr Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Ala Lys Val Val Tyr Ser Ile Leu Gln Gly Gln Pro Tyr 35 40 45 Phe Ser Val Glu Ser Glu Thr Gly Ile Ile Lys Thr Ala Leu Leu Asn 50 55 60 Met Asp Arg Glu Asn Arg Glu Gln Tyr Gln Val Val Ile Gln Ala Lys 65 70 75 80 Asp Met Gly Gly Gln Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Thr Val Asn 85 90 95 Ile Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Arg Phe 100 105 <210> 4 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Gln Ser Thr Tyr Gln Phe Lys Thr Pro Glu Ser Ser Pro Pro Gly 1 5 10 15 Thr Pro Ile Gly Arg Ile Lys Ala Ser Asp Ala Asp Val Gly Glu Asn 20 25 30 Ala Glu Ile Glu Tyr Ser Ile Thr Asp Gly Glu Gly Leu Asp Met Phe 35 40 45 Asp Val Ile Thr Asp Gln Glu Thr Gln Glu Gly Ile Ile Thr Val Lys 50 55 60 Lys Leu Leu Asp Phe Glu Lys Lys Lys Val Tyr Thr Leu Lys Val Glu 65 70 75 80 Ala Ser Asn Pro Tyr Val Glu Pro Arg Phe Leu Tyr Leu Gly Pro Phe 85 90 95 Lys Asp Ser Ala Thr Val Arg Ile Val Val Glu Asp Val Asp Glu Pro 100 105 110 Pro Val Phe 115 <210> 5 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Lys Leu Ala Tyr Ile Leu Gln Ile Arg Glu Asp Ala Gln Ile Asn 1 5 10 15 Thr Thr Ile Gly Ser Val Thr Ala Gln Asp Pro Asp Ala Ala Arg Asn 20 25 30 Pro Val Lys Tyr Ser Val Asp Arg His Thr Asp Met Asp Arg Ile Phe 35 40 45 Asn Ile Asp Ser Gly Asn Gly Ser Ile Phe Thr Ser Lys Leu Leu Asp 50 55 60 Arg Glu Thr Leu Leu Trp His Asn Ile Thr Val Ile Ala Thr Glu Ile 65 70 75 80 Asn Asn Pro Lys Gln Ser Ser Arg Val Pro Leu Tyr Ile Lys Val Leu 85 90 95 Asp Val Asn Asp Asn Ala Pro 100 <210> 6 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Phe Ala Glu Phe Tyr Glu Thr Phe Val Cys Glu Lys Ala Lys Ala 1 5 10 15 Asp Gln Leu Ile Gln Thr Leu His Ala Val Asp Lys Asp Asp Pro Tyr 20 25 30 Ser Gly His Gln Phe Ser Phe Ser Leu Ala Pro Glu Ala Ala Ser Gly 35 40 45 Ser Asn Phe Thr Ile Gln Asp Asn Lys Asp Asn Thr Ala Gly Ile Leu 50 55 60 Thr Arg Lys Asn Gly Tyr Asn Arg His Glu Met Ser Thr Tyr Leu Leu 65 70 75 80 Pro Val Val Ile Ser Asp Asn Asp Tyr Pro Val Gln Ser Ser Thr Gly 85 90 95 Thr Val Thr Val Arg Val Cys Ala Cys Asp His His Gly Asn Met Gln 100 105 110 Ser Cys His Ala Glu Ala Leu Ile His Pro 115 120 <210> 7 <211> 790 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 7 Met Arg Thr Tyr Arg Tyr Phe Leu Leu Leu Phe Trp Val Gly Gln Pro 1 5 10 15 Tyr Pro Thr Leu Ser Thr Pro Leu Ser Lys Arg Thr Ser Gly Phe Pro 20 25 30 Ala Lys Lys Arg Ala Leu Glu Leu Ser Gly Asn Ser Lys Asn Glu Leu 35 40 45 Asn Arg Ser Lys Arg Ser Trp Met Trp Asn Gln Phe Phe Leu Leu Glu 50 55 60 Glu Tyr Thr Gly Ser Asp Tyr Gln Tyr Val Gly Lys Leu His Ser Asp 65 70 75 80 Gln Asp Arg Gly Asp Gly Ser Leu Lys Tyr Ile Leu Ser Gly Asp Gly 85 90 95 Ala Gly Asp Leu Phe Ile Ile Asn Glu Asn Thr Gly Asp Ile Gln Ala 100 105 110 Thr Lys Arg Leu Asp Arg Glu Glu Lys Pro Val Tyr Ile Leu Arg Ala 115 120 125 Gln Ala Ile Asn Arg Arg Thr Gly Arg Pro Val Glu Pro Glu Ser Glu 130 135 140 Phe Ile Ile Lys Ile His Asp Ile Asn Asp Asn Glu Pro Ile Phe Thr 145 150 155 160 Lys Glu Val Tyr Thr Ala Thr Val Pro Glu Met Ser Asp Val Gly Thr 165 170 175 Phe Val Val Gln Val Thr Ala Thr Asp Ala Asp Asp Pro Thr Tyr Gly 180 185 190 Asn Ser Ala Lys Val Val Tyr Ser Ile Leu Gln Gly Gln Pro Tyr Phe 195 200 205 Ser Val Glu Ser Glu Thr Gly Ile Ile Lys Thr Ala Leu Leu Asn Met 210 215 220 Asp Arg Glu Asn Arg Glu Gln Tyr Gln Val Val Ile Gln Ala Lys Asp 225 230 235 240 Met Gly Gly Gln Met Gly Gly Leu Ser Gly Thr Thr Thr Val Asn Ile 245 250 255 Thr Leu Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Arg Phe Pro Gln Ser Thr 260 265 270 Tyr Gln Phe Lys Thr Pro Glu Ser Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ile Gly 275 280 285 Arg Ile Lys Ala Ser Asp Ala Asp Val Gly Glu Asn Ala Glu Ile Glu 290 295 300 Tyr Ser Ile Thr Asp Gly Glu Gly Leu Asp Met Phe Asp Val Ile Thr 305 310 315 320 Asp Gln Glu Thr Gln Glu Gly Ile Ile Thr Val Lys Lys Leu Leu Asp 325 330 335 Phe Glu Lys Lys Lys Val Tyr Thr Leu Lys Val Glu Ala Ser Asn Pro 340 345 350 His Val Glu Pro Arg Phe Leu Tyr Leu Gly Pro Phe Lys Asp Ser Ala 355 360 365 Thr Val Arg Ile Val Val Glu Asp Val Asp Glu Pro Pro Val Phe Ser 370 375 380 Lys Leu Ala Tyr Ile Leu Gln Ile Arg Glu Asp Ala Gln Ile Asn Thr 385 390 395 400 Thr Ile Gly Ser Val Thr Ala Gln Asp Pro Asp Ala Ala Arg Asn Pro 405 410 415 Val Lys Tyr Ser Val Asp Arg His Thr Asp Met Asp Arg Ile Phe Asn 420 425 430 Ile Asp Ser Gly Asn Gly Ser Ile Phe Thr Ser Lys Leu Leu Asp Arg 435 440 445 Glu Thr Leu Leu Trp His Asn Ile Thr Val Ile Ala Thr Glu Ile Asn 450 455 460 Asn Pro Lys Gln Ser Ser Arg Val Pro Leu Tyr Ile Lys Val Leu Asp 465 470 475 480 Val Asn Asp Asn Ala Pro Glu Phe Ala Glu Phe Tyr Glu Thr Phe Val 485 490 495 Cys Glu Lys Ala Lys Ala Asp Gln Leu Ile Gln Thr Leu Arg Ala Val 500 505 510 Asp Lys Asp Asp Pro Tyr Ser Gly His Gln Phe Ser Phe Ser Leu Ala 515 520 525 Pro Glu Ala Ala Ser Gly Ser Asn Phe Thr Ile Gln Asp Asn Lys Asp 530 535 540 Asn Thr Ala Gly Ile Leu Thr Arg Lys Asn Gly Tyr Asn Arg His Glu 545 550 555 560 Met Ser Thr Tyr Leu Leu Pro Val Val Ile Ser Asp Asn Asp Tyr Pro 565 570 575 Val Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Thr Val Arg Val Cys Ala Cys Asp 580 585 590 His His Gly Asn Met Gln Ser Cys His Ala Glu Ala Leu Ile His Pro 595 600 605 Thr Gly Leu Ser Thr Gly Ala Leu Val Ala Ile Leu Leu Cys Ile Val 610 615 620 Ile Leu Leu Val Thr Val Val Leu Phe Ala Ala Leu Arg Arg Gln Arg 625 630 635 640 Lys Lys Glu Pro Leu Ile Ile Ser Lys Glu Asp Ile Arg Asp Asn Ile 645 650 655 Val Ser Tyr Asn Asp Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Thr Gln Ala Phe 660 665 670 Asp Ile Gly Thr Leu Arg Asn Pro Glu Ala Ile Glu Asp Asn Lys Leu 675 680 685 Arg Arg Asp Ile Val Pro Glu Ala Leu Phe Leu Pro Arg Arg Thr Pro 690 695 700 Thr Ala Arg Asp Asn Thr Asp Val Arg Asp Phe Ile Asn Gln Arg Leu 705 710 715 720 Lys Glu Asn Asp Thr Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu Ala 725 730 735 Thr Tyr Ala Tyr Glu Gly Thr Gly Ser Val Ala Asp Ser Leu Ser Ser 740 745 750 Leu Glu Ser Val Thr Thr Asp Gly Asp Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu Ser 755 760 765 Asp Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly Val 770 775 780 Asp Ser Asp Lys Asp Ser 785 790 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 8 caccatgaga acttaccgct acttcttgct gctc 34 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 9 ttaggagtct ttgtcactgt ccactcctcc 30 <210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Lys Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Gly Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Asn Thr Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Gly Trp Ala 85 90 95 Phe Gly Gly Val Thr Asn Leu Glu Leu Lys Arg Ala 100 105 <210> 11 <211> 324 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 11 gacatccaga tgacccagtc tccttcactc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcact 60 ctcaactgca aagcaagtca gaatatttat aagaacttag cctggtatca gcaaaagctt 120 ggagaaggtc ccaaactcct gatttatgat gcaaacactt tgcaaacggg catcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tggttcagat ttcacactca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatgttg ccacatattt ctgccagcag tactatagcg ggtgggcgtt cggtggagtc 300 accaacctgg aattgaaacg ggct 324 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 12 Lys Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Lys Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 13 Asp Ala Asn Thr Leu Gln Thr 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 14 Gln Gln Tyr Tyr Ser Gly Trp Ala 1 5 <210> 15 <211> 122 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn 20 25 30 Phe Met His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Cys Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 366 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 16 caggtacagc tgcagcaatc tggggctgaa ctggtgaagc ctgggtcctc agtgaaaatt 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc aggaacttta tgcactggat aaaacagcag 120 cctggaaatg gccttgagtg gattgggtgg atttattgtg gagatggtga gacagagtac 180 aatcaaaagt tcaatgggaa ggcaacactc actgcggaca gatcctccag cacagcctat 240 atggagctca gcagactgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagaggggtt 300 tacggagggt ttgccggggg ctactttgat ttctggggcc aaggagtcat ggtcacagtc 360 tcctca 366 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 17 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn Phe Met His 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 18 Trp Ile Tyr Cys Gly Asp Gly Glu Thr Glu 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 19 Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 20 <211> 449 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA comprising DNA sequence coding for human light chain signal sequence and kappa chain constant region <400> 20 gcctccggac tctagagcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60 gtggatctcc ggcgcgtacg gcgatatcgt gatgattaaa cgtacggtgg ccgccccctc 120 cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtggtgtg 180 cctgctgaat aacttctacc ccagagaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct 240 gcagtccggg aactcccagg agagcgtgac cgagcaggac agcaaggaca gcacctacag 300 cctgagcagc accctgaccc tgagcaaagc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg 360 cgaggtgacc caccagggcc tgagctcccc cgtcaccaag agcttcaaca ggggggagtg 420 ttaggggccc gtttaaacgg gggaggcta 449 <210> 21 <211> 1132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA comprising DNA sequence coding for human heavy chain signal sequence and IgG1 constant region <400> 21 gcctccggac tctagagcca ccatgaaaca cctgtggttc ttcctcctgc tggtggcagc 60 tcccagatgg gtgctgagcc aggtgcaatt gtgcaggcgg ttagctcagc ctccaccaag 120 ggcccaagcg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggcgg cacagccgcc 180 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacccgtga ccgtgagctg gaactcaggc 240 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 300 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 360 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 420 aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 480 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 540 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 600 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 660 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 720 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 780 cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 840 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 900 gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 960 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1020 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1080 tccctgtctc ccggcaaatg agatatcggg cccgtttaaa cgggggaggc ta 1132 <210> 22 <211> 749 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA comprising DNA sequence coding for chG019 light chain <400> 22 ccagcctccg gactctagag ccaccatggt gctgcagacc caggtgttca tcagcctgct 60 gctgtggatc agcggcgcct acggcgacat ccagatgacc cagagcccta gcctgctgag 120 cgccagcgtg ggcgatagag tgaccctgaa ctgcaaggcc agccagaaca tctacaagaa 180 cctggcctgg tatcagcaga agctgggcga gggccccaag ctgctgatct acgacgccaa 240 caccctgcag accggcatcc ccagcagatt ttctggcagc ggcagcggct ccgacttcac 300 cctgacaatc agcagcctgc agcccgagga cgtggccacc tacttttgcc agcagtacta 360 cagcggctgg gccttcggcg gcgtgaccaa cctggaactg aagagagccg tggccgctcc 420 ctccgtgttc atcttcccac ctagcgacga gcagctgaag tccggcacag cctctgtcgt 480 gtgcctgctg aacaacttct acccccgcga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc 540 cctgcagtct ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta 600 cagcctgagc agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc 660 ctgcgaagtg acccaccagg gcctgtctag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga 720 gtgttgagtt taaacggggg aggctaact 749 <210> 23 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of chG019 light chain full-length <400> 23 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn 35 40 45 Ile Tyr Lys Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Gly Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Asn Thr Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr 100 105 110 Ser Gly Trp Ala Phe Gly Gly Val Thr Asn Leu Glu Leu Lys Arg Ala 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 24 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of chG019 light chain full-length <400> 24 atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatcagcgg cgcctacggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagcctg ctgagcgcca gcgtgggcga tagagtgacc 120 ctgaactgca aggccagcca gaacatctac aagaacctgg cctggtatca gcagaagctg 180 ggcgagggcc ccaagctgct gatctacgac gccaacaccc tgcagaccgg catccccagc 240 agattttctg gcagcggcag cggctccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 300 gaggacgtgg ccacctactt ttgccagcag tactacagcg gctgggcctt cggcggcgtg 360 accaacctgg aactgaagag agccgtggcc gctccctccg tgttcatctt cccacctagc 420 gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 480 cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aatgccctgc agtctggcaa cagccaggaa 540 agcgtgaccg agcaggacag caaggactcc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 600 agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 660 tctagccccg tgaccaagag cttcaaccgg ggcgagtgt 699 <210> 25 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of chG019 light chain variable region <400> 25 gacatccaga tgacccagag ccctagcctg ctgagcgcca gcgtgggcga tagagtgacc 60 ctgaactgca aggccagcca gaacatctac aagaacctgg cctggtatca gcagaagctg 120 ggcgagggcc ccaagctgct gatctacgac gccaacaccc tgcagaccgg catccccagc 180 agattttctg gcagcggcag cggctccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 240 gaggacgtgg ccacctactt ttgccagcag tactacagcg gctgggcctt cggcggcgtg 300 accaacctgg aactgaagag agcc 324 <210> 26 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of chG019 heavy chain full-length <400> 26 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Arg Asn Phe Met His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Phe Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 27 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of chG019 heavy chain full-length <400> 27 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60 gtgcagctgc agcagtctgg cgccgagctc gtgaagcctg gcagcagcgt gaagatcagc 120 tgcaaggcca gcggctacac cttcacccgg aacttcatgc actggatcaa gcagcagccc 180 ggcaacggcc tggaatggat cggctggatc tatcccggcg acggcgagac agagtacaac 240 cagaagttca acggcaaggc caccctgacc gccgacagaa gcagctccac cgcctacatg 300 gaactgagcc ggctgaccag cgaggacagc gccgtgtact tttgcgccag aggcgtgtac 360 ggcggcttcg ctggcggcta cttcgatttt tggggccagg gcgtgatggt caccgtcagc 420 tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540 agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga actcctgggg 780 ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320 tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413 <210> 28 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of chG019 heavy chain variable region <400> 28 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn 20 25 30 Phe Met His Trp Ile Lys Gln Gln Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Asn Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of chG019 heavy chain variable region <400> 29 caggtgcagc tgcagcagtc tggcgccgag ctcgtgaagc ctggcagcag cgtgaagatc 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc cggaacttca tgcactggat caagcagcag 120 cccggcaacg gcctggaatg gatcggctgg atctatcccg gcgacggcga gacagagtac 180 aaccagaagt tcaacggcaa ggccaccctg accgccgaca gaagcagctc caccgcctac 240 atggaactga gccggctgac cagcgaggac agcgccgtgt acttttgcgc cagaggcgtg 300 tacggcggct tcgctggcgg ctacttcgat ttttggggcc agggcgtgat ggtcaccgtc 360 agctca 366 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chG019 CDRH2 <400> 30 Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu 1 5 10 <210> 31 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hL02 light chain full-length <400> 31 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn 35 40 45 Ile Tyr Lys Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Asn Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr 100 105 110 Ser Gly Trp Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 32 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hL02 light chain full-length <400> 32 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120 atcacatgca aggccagcca gaacatctac aagaacctgg cctggtatca gcagaagccc 180 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgac gccaacaccc tgcagaccgg cgtgcccagc 240 agattttctg gcagcggcag cggctccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 300 gaggacttcg ccacctactt ttgccagcag tactacagcg gctgggcctt cggccagggc 360 accaaggtgg aaatcaagcg tacggtggcc gccccctccg tgttcatctt ccccccctcc 420 gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtggtgtgcc tgctgaataa cttctacccc 480 agagaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccgggaa ctcccaggag 540 agcgtgaccg agcaggacag caaggacagc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 600 agcaaagccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aggtgaccca ccagggcctg 660 agctcccccg tcaccaagag cttcaacagg ggggagtgt 699 <210> 33 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hL02 light chain variable region <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Lys Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Asn Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Gly Trp Ala 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 34 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hL02 light chain variable region <400> 34 gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggccagcca gaacatctac aagaacctgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgac gccaacaccc tgcagaccgg cgtgcccagc 180 agattttctg gcagcggcag cggctccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctactt ttgccagcag tactacagcg gctgggcctt cggccagggc 300 accaaggtgg aaatcaagcg tacg 324 <210> 35 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hL03 light chain full-length <400> 35 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn 35 40 45 Ile Tyr Lys Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Gly Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Asn Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr 100 105 110 Ser Gly Trp Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 36 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hL03 light chain full-length <400> 36 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120 atcacatgca aggccagcca gaacatctac aagaacctgg cctggtatca gcagaagctg 180 ggcgagggcc ccaagctgct gatctacgac gccaacaccc tgcagaccgg cgtgcccagc 240 agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 300 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tactacagcg gctgggcctt tggccagggc 360 accaaggtgg aaatcaagcg tacggtggcc gccccctccg tgttcatctt ccccccctcc 420 gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctcc gtggtgtgcc tgctgaataa cttctacccc 480 agagaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccgggaa ctcccaggag 540 agcgtgaccg agcaggacag caaggacagc acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg 600 agcaaagccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aggtgaccca ccagggcctg 660 agctcccccg tcaccaagag cttcaacagg ggggagtgt 699 <210> 37 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hL03 light chain variable region <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Lys Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Gly Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Asn Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Gly Trp Ala 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 <210> 38 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hL03 light chain variable region <400> 38 gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggccagcca gaacatctac aagaacctgg cctggtatca gcagaagctg 120 ggcgagggcc ccaagctgct gatctacgac gccaacaccc tgcagaccgg cgtgcccagc 180 agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tactacagcg gctgggcctt tggccagggc 300 accaaggtgg aaatcaagcg tacg 324 <210> 39 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hH01 heavy chain full-length <400> 39 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Arg Asn Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 40 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hH01 heavy chain full-length <400> 40 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgaa 60 gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcca gcggctacac ctttacccgg aacttcatgc actgggtgcg ccaggctcca 180 ggccagggac tggaatggat gggctggatc tatcccggcg acggcgagac agagtacgcc 240 cagaaattcc agggcagagt gaccatcacc gccgacacca gcacctccac cgcctacatg 300 gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact attgtgccag aggcgtgtac 360 ggcggcttcg ctggcggcta cttcgatttt tggggccagg gcaccctcgt gaccgtcagc 420 tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540 agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga actcctgggg 780 ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320 tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413 <210> 41 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hH01 heavy chain variable region <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn 20 25 30 Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hH01 heavy chain variable region <400> 42 gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc cggaacttca tgcactgggt gcgccaggct 120 ccaggccagg gactggaatg gatgggctgg atctatcccg gcgacggcga gacagagtac 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccatc accgccgaca ccagcacctc caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggcgtg 300 tacggcggct tcgctggcgg ctacttcgat ttttggggcc agggcaccct cgtgaccgtc 360 agctca 366 <210> 43 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hH02 heavy chain full-length <400> 43 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Arg Asn Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 44 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hH02 heavy chain full-length <400> 44 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgaa 60 gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcca gcggctacac ctttacccgg aacttcatgc actgggtgcg ccaggctcca 180 ggccagggac tggaatggat gggctggatc tatcccggcg acggcgagac agagtacaac 240 cagaaattcc agggcagagt gaccatcacc gccgacagaa gcaccagcac cgcctacatg 300 gaactgagca gcctgcggag cgaggatacc gccgtgtact tctgtgccag aggcgtgtac 360 ggcggcttcg ctggcggcta cttcgatttt tggggccagg gcaccctcgt gaccgtcagc 420 tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540 agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga actcctgggg 780 ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320 tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413 <210> 45 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hH02 heavy chain variable region <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn 20 25 30 Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 46 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hH02 heavy chain variable region <400> 46 gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc cggaacttca tgcactgggt gcgccaggct 120 ccaggccagg gactggaatg gatgggctgg atctatcccg gcgacggcga gacagagtac 180 aaccagaaat tccagggcag agtgaccatc accgccgaca gaagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggat accgccgtgt acttctgtgc cagaggcgtg 300 tacggcggct tcgctggcgg ctacttcgat ttttggggcc agggcaccct cgtgaccgtc 360 agctca 366 <210> 47 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hH04 heavy chain full-length <400> 47 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Arg Asn Phe Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 48 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hH04 heavy chain full-length <400> 48 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcca gcggctacac ctttacccgg aacttcatgc actggatccg gcaggcccct 180 ggacagggcc tggaatggat gggctggatc tatcccggcg acggcgagac agagtacgcc 240 cagaaattcc agggcagagt gaccctgacc gccgacagaa gcaccagcac cgcctacatg 300 gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact attgtgccag aggcgtgtac 360 ggcggcttcg ctggcggcta cttcgatttt tggggccagg gcaccctcgt gaccgtcagc 420 tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540 agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga actcctgggg 780 ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320 tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413 <210> 49 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hH04 heavy chain variable region <400> 49 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn 20 25 30 Phe Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 50 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hH04 heavy chain variable region <400> 50 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc cggaacttca tgcactggat ccggcaggcc 120 cctggacagg gcctggaatg gatgggctgg atctatcccg gcgacggcga gacagagtac 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccctg accgccgaca gaagcaccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggcgtg 300 tacggcggct tcgctggcgg ctacttcgat ttttggggcc agggcaccct cgtgaccgtc 360 agctca 366 <210> 51 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of NOV0712 light chain full-length <400> 51 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Val Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly 100 105 110 Thr Phe Pro Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 52 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence coding for amino acid sequence of sequence number 51 <400> 52 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120 atcacctgta gagccagcca gagcatcagc agctacctga actggtatca gcagaagccc 180 ggcaaggccc ccaaactgct gatctacgcc gtgtccacac tgcagagcgg cgtgcccagc 240 agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtcagcag tccggcacct tcccccccac cacatttggc 360 cagggcacca aggtggaaat caagcgtacg gtggccgccc cctccgtgtt catcttcccc 420 ccctccgacg agcagctgaa gtccggcacc gcctccgtgg tgtgcctgct gaataacttc 480 taccccagag aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cgggaactcc 540 caggagagcg tgaccgagca ggacagcaag gacagcacct acagcctgag cagcaccctg 600 accctgagca aagccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag 660 ggcctgagct cccccgtcac caagagcttc aacagggggg agtgt 705 <210> 53 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of NOV0712 heavy chain full-length <400> 53 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Val Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asn Thr Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Trp Gly Ser Tyr Ala Phe Asp Ser Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 54 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence coding for amino acid sequence of sequence number 53 <400> 54 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60 gtgcagctgc tggaatctgg cggaggactg gtgcagcctg gcggctctct gagactgtct 120 tgtgccgcca gcggcttcac cttcagcagc cacggaatgc actgggtgcg ccaggcccct 180 ggaaagggac tggaatgggt gtccgtgatc agcggcagcg gctccaatac cggctacgcc 240 gatagcgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaaca gcaagaacac cctgtacctg 300 cagatgaaca gcctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact attgtgccag acagtggggc 360 agctacgcct tcgattcttg gggccagggc accctcgtga ccgtcagctc agcctccacc 420 aagggcccaa gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accctgccca gcacctgaac tcctgggggg accctcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 ggccagcccc gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc 1380 ctctccctgt ctcccggcaa a 1401 <210> 55 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hH11 heavy chain variable region <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn 20 25 30 Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ala Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 56 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hH11 heavy chain variable region <400> 56 gaagtgcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaaaaagc ctggcgcctc tgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctctggcta cacattcacc cggaacttca tgcactgggt ccgacaggct 120 ccaggacagg gacttgaatg gatgggatgg attgctcccg gcgacggcga gacagagtac 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccatc accgccgaca cctctacaag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggcgtg 300 tacggcggat tcgctggcgg ctactttgat ttttggggcc agggcaccct ggtcaccgtg 360 agctca 366 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hH11 CDRH1 <400> 57 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn Phe Met His 1 5 10 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hH11 CDRH2 <400> 58 Trp Ile Ala Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu 1 5 10 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hH11 CDRH3 <400> 59 Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 60 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hH31 heavy chain variable region <400> 60 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn 20 25 30 Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Ala Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 61 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hH31 heavy chain variable region <400> 61 gaagtgcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaaaaagc ctggcgcctc tgtgaaggtg 60 tcctgcaagg cctctggcta cacattcacc cggaacttca tgcactgggt ccgacaggct 120 ccaggacagg gacttgaatg gatgggctgg atctatcccg gcgacggcga gacagagtac 180 gccagcaaat ttcagggcag agtgaccatc accgccgaca cctctacaag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggcgtt 300 tacggcggag ccgctggcgg ctactttgat ttttggggcc agggcaccct ggtcaccgtg 360 agctca 366 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hH31 CDRH1 <400> 62 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Asn Phe Met His 1 5 10 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hH31 CDRH2 <400> 63 Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu 1 5 10 <210> 64 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hH31 CDRH3 <400> 64 Gly Val Tyr Gly Gly Ala Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 65 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hH01A heavy chain full-length <400> 65 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Arg Asn Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 66 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hH01A heavy chain full-length <400> 66 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgaa 60 gtgcagctgg ttcagtctgg cgccgaagtg aaaaagcctg gcgcctctgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcct ctggctacac attcacccgg aacttcatgc actgggtccg acaggctcca 180 ggacagggac ttgaatggat gggctggatc tatcccggcg acggcgagac agagtacgcc 240 cagaaattcc agggcagagt gaccatcacc gccgacacct ctacaagcac cgcctacatg 300 gaactgagca gcctgagaag cgaggacacc gccgtgtact attgtgccag aggcgtgtac 360 ggcggattcg ctggcggcta ctttgatttt tggggccagg gcaccctggt caccgtgagc 420 tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540 agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga agccgcgggg 780 ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320 tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413 <210> 67 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hH11A heavy chain full-length <400> 67 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Arg Asn Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Ala Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Phe Ala Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 68 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hH11A heavy chain full-length <400> 68 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgaa 60 gtgcagctgg ttcagtctgg cgccgaagtg aaaaagcctg gcgcctctgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcct ctggctacac attcacccgg aacttcatgc actgggtccg acaggctcca 180 ggacagggac ttgaatggat gggatggatt gctcccggcg acggcgagac agagtacgcc 240 cagaaattcc agggcagagt gaccatcacc gccgacacct ctacaagcac cgcctacatg 300 gaactgagca gcctgagaag cgaggacacc gccgtgtact attgtgccag aggcgtgtac 360 ggcggattcg ctggcggcta ctttgatttt tggggccagg gcaccctggt caccgtgagc 420 tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540 agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga agccgcgggg 780 ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320 tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413 <210> 69 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hH31A heavy chain full-length <400> 69 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Arg Asn Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Glu Tyr Ala 65 70 75 80 Ser Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Val Tyr Gly Gly Ala Ala Gly Gly Tyr Phe 115 120 125 Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 210 215 220 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu 225 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 245 250 255 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 260 265 270 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 275 280 285 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 290 295 300 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 325 330 335 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 340 345 350 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 355 360 365 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 370 375 380 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 385 390 395 400 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 405 410 415 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 70 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hH31A heavy chain full-length <400> 70 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgaa 60 gtgcagctgg ttcagtctgg cgccgaagtg aaaaagcctg gcgcctctgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcct ctggctacac attcacccgg aacttcatgc actgggtccg acaggctcca 180 ggacagggac ttgaatggat gggctggatc tatcccggcg acggcgagac agagtacgcc 240 agcaaatttc agggcagagt gaccatcacc gccgacacct ctacaagcac cgcctacatg 300 gaactgagca gcctgagaag cgaggacacc gccgtgtact attgtgccag aggcgtttac 360 ggcggagccg ctggcggcta ctttgatttt tggggccagg gcaccctggt caccgtgagc 420 tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540 agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga agccgcgggg 780 ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080 tccaaagcca aaggccagcc ccgggaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1140 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200 atcgccgtgg agtgggagag caatggccag cccgagaaca actacaagac cacccctccc 1260 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320 tggcagcagg gcaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380 acccagaaga gcctctccct gtctcccggc aaa 1413 <210> 71 <211> 1137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA comprising DNA sequence coding for amino acid for human heavy chain signal sequence and human IgG1 LALA constant region <400> 71 ccagcctccg gactctagag ccaccatgaa acacctgtgg ttcttcctcc tgctggtggc 60 agctcccaga tgggtgctga gccaggtgca attgtgcagg cggttagctc agcctccacc 120 aagggcccaa gcgtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg cggcacagcc 180 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgaccgtgag ctggaactca 240 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc cccgctgtcc tgcagtcctc aggactctac 300 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 360 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagcc caaatcttgt 420 gacaaaactc acacatgccc accctgccca gcacctgaag ccgcgggggg accctcagtc 480 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 540 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 600 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccccgggagg agcagtacaa cagcacgtac 660 cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 720 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 780 ggccagcccc gggaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 840 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 900 tgggagagca atggccagcc cgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggactcc 960 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1020 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc 1080 ctctccctgt ctcccggcaa atgagatatc gggcccgttt aaacggggga ggctaac 1137 <210> 72 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of anti-LPS antibody (h#1G5-H1L1) light chain <400> 72 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Val Gly Asn Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr 100 105 110 Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 73 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of anti-LPS antibody (h#1G5-H1L1) heavy chain <400> 73 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ile Tyr Asn Tyr Gly Ser Ser Gly Tyr Asn 115 120 125 Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 145 150 155 160 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 210 215 220 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 370 375 380 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 435 440 445 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

Claims (65)

  1. 다음 식 (X) :
    Figure pct00191

    (식 중, m2 는 1 또는 2 의 정수를 나타내고,
    Ab 는, 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하여, 세포 내에 도입되는 내재화능을 갖는, IgG 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 나타내고,
    L 은, Ab 의 N297 에 결합하는 당사슬 (N297 당사슬) 과 D 를 연결하는 링커이고,
    N297 당사슬은, 리모델링되어 있어도 되는 당사슬을 나타내고,
    D 는, 이하 :
    Figure pct00192

    에서 선택되는 어느 하나이고, 식 중, * 는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
    으로 나타내는 항체-약물 컨쥬게이트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에의 결합에 대하여, 이하의 (1) ∼ (8) :
    (1) 서열 번호 23 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 26 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
    (2) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 39 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
    (3) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
    (4) 서열 번호 35 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
    (5) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 47 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
    (6) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 65 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체,
    (7) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 67 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체, 및
    (8) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는 항체
    로 이루어지는 군에서 선택되는 항체 중 적어도 어느 하나와 경합 저해 활성을 나타내는,
    항체-약물 컨쥬게이트.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 이하의 (1) ∼ (4) :
    (1) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
    (2) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 30 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
    (3) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 57 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 59 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및
    (4) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3
    으로 이루어지는 군에서 선택되는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 및, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 함유하는,
    항체-약물 컨쥬게이트.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 이하의 (1) ∼ (4) :
    (1) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (2) 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (3) (1) 또는 (2) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및
    (4) (1) ∼ (3) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열
    로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 경사슬 가변 영역, 그리고,
    이하의 (5) ∼ (11) :
    (5) 서열 번호 41 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (6) 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (7) 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (8) 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (9) 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (10) (5) ∼ (9) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 대하여 적어도 95 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및
    (11) (5) ∼ (10) 의 아미노산 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열
    로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 중사슬 가변 영역
    을 포함하는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 이하의 (1) ∼ (6) :
    (1) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 41 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (2) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (3) 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (4) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (5) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 또는
    (6) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역
    중 어느 것의 경사슬 가변 영역 및 중사슬 가변 영역
    을 포함하는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 이하의 (1) ∼ (7) :
    (1) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 39 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (2) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (3) 서열 번호 35 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (4) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 47 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (5) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 65 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (6) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 67 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 또는
    (7) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬
    중 어느 것을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 39 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  9. 제 6 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 35 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  10. 제 6 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 47 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  11. 제 6 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 65 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  12. 제 6 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 67 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  13. 제 6 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    L 이, -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-* 로 나타내어지고,
    식 중, * 는 상기 D 의 N10' 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
    B 는, 1,4-페닐기, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기 또는 2,5-티에닐기이고,
    Lp 는, 이하 :
    -GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, 및, -GGPL-
    로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
    La 는, 이하 :
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-,
    -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-,
    -CH2-OC(=O)-, 및,
    -OC(=O)-
    로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고, 그리고,
    Lb 는, 다음 식 :
    Figure pct00193

    Figure pct00194

    , 또는,
    Figure pct00195

    (여기서, 상기에서 나타내는 Lb 의 구조식에 있어서, * 는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다) 으로 나타내어지는,
    항체-약물 컨쥬게이트.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    L 이, 이하 :
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 및
    -Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-
    로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
    여기서, Z1 은, 이하의 구조식 :
    Figure pct00196

    을 나타내고,
    Z2 는, 이하의 구조식 :
    Figure pct00197

    을 나타내고,
    Z3 은, 이하의 구조식 :
    Figure pct00198

    을 나타내고,
    여기서, Z1, Z2 및 Z3 의 구조식에 있어서, * 는 Z1, Z2 또는 Z3 에 인접하는 C(=O), O 또는 CH2 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타내고, 그리고,
    B 는, 1,4-페닐기를 나타내는,
    항체-약물 컨쥬게이트.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    L 이, 이하 :
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 및
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
    로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
    여기서, B 는 1,4-페닐기이고, Z1 은 이하의 구조식 :
    Figure pct00199

    을 나타내고,
    여기서, Z1 의 구조식에 있어서, * 는 Z1 에 인접하는 C(=O) 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 N297 에 결합하는 당사슬 (N297 당사슬) 또는 그 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, IgG1, IgG2 또는 IgG4 인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    N297 당사슬이, 리모델링된 당사슬인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    N297 당사슬이, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 인, 항체-약물 컨쥬게이트 :
    Figure pct00200

    Figure pct00201

    Figure pct00202

    식 중, 파선은 항체의 Asn297 (N297) 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
    N297 당사슬 중의 *-L(PEG)- 는, *-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH- 를 나타내고,
    여기서, n5 는 2 ∼ 5 의 정수인 것을 나타내고, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, * 는, 각각의 구조식에 있어서의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타낸다.
  20. 제 19 항에 있어서,
    n5 가 3 인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  21. 다음 식 (XII) :
    Figure pct00203

    로 나타내는 항체-약물 컨쥬게이트로서, 여기서,
    상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 의 정수인 것을 나타내고,
    Ab 는 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하여, 세포 내에 도입되는 내재화능을 갖는, IgG 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 나타내고,
    Ab 의 N297 당사슬은 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
    Figure pct00204

    Figure pct00205

    Figure pct00206

    식 중, 파선은 항체의 Asn297 (N297) 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
    N297 당사슬 중의 *-L(PEG)- 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH- 인 것을 나타내고,
    여기서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, * 는, 각각의 구조식에 있어서의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  22. 제 21 항에 있어서,
    식 (XII) 로 나타내는 화합물이, 다음 식 (XII') :
    Figure pct00207

    로 나타내어지는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  23. 다음 식 (XIII) :
    Figure pct00208

    으로 나타내는 항체-약물 컨쥬게이트로서, 여기서,
    상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 의 정수인 것을 나타내고,
    Ab 는 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하여, 세포 내에 도입되는 내재화능을 갖는, IgG 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 나타내고,
    Ab 의 N297 당사슬은 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
    Figure pct00209

    Figure pct00210

    Figure pct00211

    식 중, 파선은 항체의 Asn297 (N297) 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
    N297 당사슬 중의 *-L(PEG)- 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH-인 것을 나타내고,
    여기서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, * 는, 각각의 구조식에 있어서의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  24. 제 23 항에 있어서,
    식 (XIII) 으로 나타내는 화합물이, 다음 식 (XIII') :
    Figure pct00212

    로 나타내어지는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  25. 다음 식 (XIV) :
    Figure pct00213

    로 나타내는 항체-약물 컨쥬게이트로서, 여기서,
    상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 의 정수인 것을 나타내고,
    Ab 는 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하여, 세포 내에 도입되는 내재화능을 갖는, IgG 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 나타내고,
    Ab 의 N297 당사슬은 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
    Figure pct00214

    Figure pct00215

    Figure pct00216

    식 중, 파선은 항체의 Asn297 (N297) 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
    N297 당사슬 중의 *-L(PEG)- 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH- 인 것을 나타내고,
    여기서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, * 는, 각각의 구조식에 있어서의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  26. 제 25 항에 있어서,
    식 (XIV) 로 나타내는 화합물이, 다음 식 (XIV') :
    Figure pct00217

    로 나타내어지는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  27. 다음 식 (XV) :
    Figure pct00218

    로 나타내는 항체-약물 컨쥬게이트로서, 여기서,
    상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 의 정수인 것을 나타내고,
    Ab 는 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하여, 세포 내에 도입되는 내재화능을 갖는, IgG 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 나타내고,
    Ab 의 N297 당사슬은 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
    Figure pct00219

    Figure pct00220

    Figure pct00221

    식 중, 파선은 항체의 Asn297 (N297) 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
    N297 당사슬 중의 *-L(PEG)- 는, *-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH- 인 것을 나타내고,
    여기서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, * 는, 각각의 구조식에 있어서의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  28. 제 27 항에 있어서,
    식 (XV) 로 나타내는 화합물이, 다음 식 (XV') :
    Figure pct00222

    로 나타내어지는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  29. 제 21 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 이하의 (1) ∼ (4) :
    (1) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 18 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
    (2) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 30 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3,
    (3) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 57 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 59 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및
    (4) 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3, 및, 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3
    으로 이루어지는 군에서 선택되는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3, 및, CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 함유하는
    항체-약물 컨쥬게이트.
  30. 제 21 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 이하의 (1) ∼ (6) :
    (1) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 41 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (2) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (3) 서열 번호 37 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 45 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (4) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 49 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역,
    (5) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 또는
    (6) 서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역
    중 어느 것의 경사슬 가변 영역 및 중사슬 가변 영역
    을 포함하는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  31. 제 21 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 이하의 (1) ∼ (7) :
    (1) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 39 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (2) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (3) 서열 번호 35 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (4) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 47 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (5) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 65 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
    (6) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 67 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 또는
    (7) 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬
    중 어느 것을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  32. 제 31 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 39 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  33. 제 31 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  34. 제 31 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 35 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 43 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  35. 제 31 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 47 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  36. 제 31 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 65 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  37. 제 31 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 67 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  38. 제 31 항에 있어서,
    상기 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편이, 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체-약물 컨쥬게이트.
  39. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수가 1 ∼ 3 인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  40. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체-약물 컨쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수가 3 ∼ 5 인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  41. 제 1 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
    중사슬이 N-결합에의 당사슬 부가, O-결합에의 당사슬 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화 및 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실된 중사슬로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 포함하는 항체인, 항체-약물 컨쥬게이트.
  42. 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
    중사슬의 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실된, 항체-약물 컨쥬게이트.
  43. 이하의 공정 :
    i) 서열 번호 4 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하여, 세포 내에 도입되는 내재화능을 갖는, IgG 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 제조하는 공정,
    ii) 공정 i) 에서 얻어진 항체를 가수분해 효소로 처리하여, (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 제조하는 공정, 및,
    iii)-1 MSG (9) 또는 SG (10) 의 시알산의 2 위치의 카르복실산의 카르보닐기에 아지드기를 갖는 PEG 링커를 도입하고, 환원 말단을 옥사졸린화하여 얻은 당사슬 도너 분자와, 당전이 효소 존재하에서 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 반응시키는 공정, 또는,
    iii)-2 α-아미노기가 보호되어 있어도 되는 (MSG-)Asn 또는 (SG-)Asn 의 시알산의 2 위치의 카르복실산의 카르보닐기 및 상기 Asn 의 카르복실산의 카르보닐기에 아지드기를 갖는 PEG 링커를 도입하고, 가수분해 효소를 작용시킨 후, 환원 말단을 옥사졸린화하여 얻은 당사슬 도너 분자와, 당전이 효소 존재하에서 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 반응시키는 공정
    을 포함하는, 당사슬 리모델링 항체의 제조 방법.
  44. 제 43 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 당사슬 리모델링 항체와 드러그 링커를 반응시키는 공정을 포함하는, 제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 방법.
  45. 제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 44 항에 기재된 방법으로 제조된, 항체-약물 컨쥬게이트.
  46. 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 함유하는 경사슬 가변 영역, 및, 서열 번호 57 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 59 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 함유하는 중사슬 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 기능성 단편.
  47. 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 함유하는 경사슬 가변 영역, 및, 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 63 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 함유하는 중사슬 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 기능성 단편.
  48. 제 46 항에 있어서,
    서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 55 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 기능성 단편.
  49. 제 47 항에 있어서,
    서열 번호 33 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역 및 서열 번호 60 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 기능성 단편.
  50. 제 46 항 또는 제 48 항에 있어서,
    서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 67 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체 또는 그 기능성 단편.
  51. 제 47 항 또는 제 49 항에 있어서,
    서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 69 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체 또는 그 기능성 단편.
  52. 서열 번호 31 의 21 ∼ 233 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 및 서열 번호 65 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 갖는, 항체 또는 그 기능성 단편.
  53. 제 46 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  54. 제 53 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터.
  55. 제 54 항에 기재된 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
  56. 제 55 항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적의 항체를 채취하는 공정을 포함하는, 제 46 항 내지 제 52 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편의 제조 방법.
  57. 제 56 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
  58. 제 1 항 내지 제 42 항 혹은 제 45 항 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트, 또는, 제 46 항 내지 제 52 항 혹은 제 57 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 포함하는, 의약 조성물.
  59. 제 58 항에 있어서,
    항종양약인, 의약 조성물.
  60. 제 59 항에 있어서,
    종양이 CDH6 이 발현되어 있는 종양인, 의약 조성물.
  61. 제 60 항에 있어서,
    종양이 신세포암, 신담명세포암, 유두상 신세포암, 난소암, 난소 장액성선암, 갑상선암, 담관암, 폐암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 신경교아종, 중피종, 자궁암, 췌장암, 윌름스 종양 또는 신경아종인, 의약 조성물.
  62. 제 1 항 내지 제 42 항 혹은 제 45 항 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트, 제 46 항 내지 제 52 항 혹은 제 57 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 또는, 제 58 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물을 개체에 투여하는 공정을 포함하는, 종양의 치료 방법.
  63. 제 62 항에 있어서,
    종양이 CDH6 이 발현되어 있는 종양인, 종양의 치료 방법.
  64. 제 62 항 또는 제 63 항에 있어서,
    종양이, 신세포암, 신담명세포암, 유두상 신세포암, 난소암, 난소 장액성선암, 갑상선암, 담관암, 폐암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 신경교아종, 중피종, 자궁암, 췌장암, 윌름스 종양 또는 신경아종인, 종양의 치료 방법.
  65. 제 62 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 항 내지 제 42 항 혹은 제 45 항 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 컨쥬게이트, 제 46 항 내지 제 52 항 혹은 제 57 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 또는, 제 58 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물과 적어도 하나의 항종양약을, 동시에, 따로따로 또는 연속해서 개체에 투여하는 공정을 포함하는, 종양의 치료 방법.
KR1020217014567A 2018-11-14 2019-11-13 항 cdh6 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 컨쥬게이트 KR20210091711A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2018-214110 2018-11-14
JP2018214110 2018-11-14
JP2019057327 2019-03-25
JPJP-P-2019-057327 2019-03-25
PCT/JP2019/044588 WO2020100954A1 (ja) 2018-11-14 2019-11-13 抗ｃｄｈ６抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210091711A true KR20210091711A (ko) 2021-07-22

Family

ID=70732133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217014567A KR20210091711A (ko) 2018-11-14 2019-11-13 항 cdh6 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 컨쥬게이트

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20220016257A1 (ko)
EP (1) EP3882349A4 (ko)
JP (1) JP7401456B2 (ko)
KR (1) KR20210091711A (ko)
CN (1) CN113166764A (ko)
AU (1) AU2019379418A1 (ko)
BR (1) BR112021009251A2 (ko)
CA (1) CA3119956A1 (ko)
SG (1) SG11202104993SA (ko)
TW (1) TW202031298A (ko)
WO (1) WO2020100954A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020196474A1 (ja) * 2019-03-25 2020-10-01 第一三共株式会社 抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
CA3191804A1 (en) * 2019-03-25 2020-10-01 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
TW202102226A (zh) * 2019-03-27 2021-01-16 日商第一三共股份有限公司 抗體-吡咯并苯二氮呯衍生物結合物及parp抑制劑之組合
TW202330608A (zh) 2021-09-30 2023-08-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 吡咯并苯并二氮雜卓類衍生物及其偶聯物、其製備方法及其應用
TW202330618A (zh) * 2021-12-10 2023-08-01 大陸商普衆發現醫藥科技（上海）有限公司 抗ｃｄｈ６抗體及其抗體－藥物偶聯物

Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011130613A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Seattle Genetics, Inc. Targeted pyrrolobenzodiazapine conjugates
WO2013173496A2 (en) 2012-05-18 2013-11-21 Seattle Genetics, Inc. Cd33 antibodies and use of same to treat cancer
WO2014057687A1 (ja) 2012-10-11 2014-04-17 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲート
WO2014130879A2 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Stem Centrx, Inc. Novel antibody conjugates and uses thereof
WO2015031693A1 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Stem Centrx, Inc. Engineered anti-dll3 conjugates and methods of use
WO2015052322A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015052321A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015052534A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2015095124A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
WO2016024195A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Novartis Ag Anti-cdh6 antibody drug conjugates
WO2016036804A1 (en) 2014-09-03 2016-03-10 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
WO2016115191A1 (en) 2015-01-14 2016-07-21 Bristol-Myers Squibb Company Benzodiazepine dimers, conjugates thereof, and methods of making and using
US20160297890A1 (en) 2013-12-25 2016-10-13 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-trop2 antibody-drug conjugate
WO2017004025A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Immunogen, Inc. Conjugates of cysteine engineered antibodies
WO2017004330A1 (en) 2015-06-30 2017-01-05 Seattle Genetics, Inc. Anti-ntb-a antibodies and related compositions and methods
WO2017020972A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 VAN BERKEL, Patricius Hendrikus Cornelis Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
DK1024191T3 (da) 1991-12-02 2008-12-08 Medical Res Council Fremstilling af autoantistoffer fremvist på fag-overflader ud fra antistofsegmentbiblioteker
CA2131151A1 (en) 1992-03-24 1994-09-30 Kevin S. Johnson Methods for producing members of specific binding pairs
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
CA2177367A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Andrew David Griffiths Recombinant binding proteins and peptides
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US7763534B2 (en) 2007-10-26 2010-07-27 Tela Innovations, Inc. Methods, structures and designs for self-aligning local interconnects used in integrated circuits
EP2001358B1 (en) 2006-03-27 2016-07-13 University Of Maryland, Baltimore Glycoprotein synthesis and remodeling by enzymatic transglycosylation
KR101738203B1 (ko) 2010-04-15 2017-05-19 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
CA2822037A1 (en) 2010-12-20 2012-06-28 Gilead Sciences, Inc. Methods for treating hcv
US9434786B2 (en) 2012-02-10 2016-09-06 University Of Maryland, Baltimore Chemoenzymatic glycoengineering of antibodies and Fc fragments thereof
HUE042731T2 (hu) 2012-10-12 2019-07-29 Adc Therapeutics Sa Pirrolobenzodiazepin-antitest konjugátumok
CA2925897A1 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-lps o11 antibody
US11559581B2 (en) 2015-01-09 2023-01-24 Oxford University Innovation Limited Antibody conjugates and methods of making the antibody conjugates
US9504694B2 (en) 2015-03-19 2016-11-29 Cellerant Therapeutics, Inc. Isoquinolidinobenzodiazepines
EP3323886B1 (en) 2015-07-16 2020-10-21 Daiichi Sankyo Company, Limited Endos mutant enzyme
CN108289964B (zh) 2015-08-10 2022-08-12 杭州多禧生物科技有限公司 新型连接体及其用于药物和生物分子的特异性偶联
GB201602363D0 (en) * 2016-02-10 2016-03-23 Adc Therapeutics Sa And Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
EP3480211A4 (en) * 2016-07-01 2019-12-25 Daiichi Sankyo Company, Limited HANP FC CONTAINING MOLECULAR CONJUGATE
MX2019008059A (es) * 2017-01-17 2019-12-11 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpo anti-gpr20 y conjugado de anticuerpo-medicamento anti-gpr20.
TWI794230B (zh) * 2017-05-15 2023-03-01 日商第一三共股份有限公司 抗ｃｄｈ６抗體及抗ｃｄｈ６抗體-藥物結合物、以及其製造方法
CN111164208B (zh) * 2017-09-29 2023-08-04 第一三共株式会社 抗体－吡咯并苯并二氮杂卓衍生物偶联物
CA3191804A1 (en) * 2019-03-25 2020-10-01 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
WO2020196474A1 (ja) * 2019-03-25 2020-10-01 第一三共株式会社 抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
TW202102226A (zh) * 2019-03-27 2021-01-16 日商第一三共股份有限公司 抗體-吡咯并苯二氮呯衍生物結合物及parp抑制劑之組合

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011130613A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Seattle Genetics, Inc. Targeted pyrrolobenzodiazapine conjugates
WO2013173496A2 (en) 2012-05-18 2013-11-21 Seattle Genetics, Inc. Cd33 antibodies and use of same to treat cancer
WO2014057687A1 (ja) 2012-10-11 2014-04-17 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲート
WO2014130879A2 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Stem Centrx, Inc. Novel antibody conjugates and uses thereof
WO2015031693A1 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Stem Centrx, Inc. Engineered anti-dll3 conjugates and methods of use
WO2015052322A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015052321A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2015052534A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
WO2015095124A1 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
US20160297890A1 (en) 2013-12-25 2016-10-13 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-trop2 antibody-drug conjugate
WO2016024195A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Novartis Ag Anti-cdh6 antibody drug conjugates
WO2016036804A1 (en) 2014-09-03 2016-03-10 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
WO2016115191A1 (en) 2015-01-14 2016-07-21 Bristol-Myers Squibb Company Benzodiazepine dimers, conjugates thereof, and methods of making and using
WO2017004025A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Immunogen, Inc. Conjugates of cysteine engineered antibodies
WO2017004330A1 (en) 2015-06-30 2017-01-05 Seattle Genetics, Inc. Anti-ntb-a antibodies and related compositions and methods
WO2017020972A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 VAN BERKEL, Patricius Hendrikus Cornelis Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates

Non-Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Accounts of Chemical Research 1986, 19, 230
Cho E A, et al., Development, 803-812, 125, 1998
Dyeison Antonow. et al., Chemical Reviews 2010, 111, 2815-2864
Goeppert B, et al., Epigenetics, 780-790, 11(11), 2016
Gugnoni M, et al., Oncogene, 667-677, 36, 2017
In Antibiotics III. Springer Verlag, New York, pp.3-11
Inoue T, et al., Developmental Biology, 183-194, 1997
Journal of Organic Chemistry 1996, 61, 8141
Journal of the American Chemical Society 1992, 114,4939
Julia Mantaj, et al., Angewandte Chemie Internationl Edition 2016, 55, 2-29
Koebel M, et al., PLoS Medicine, 1749-1760, 5(12), e232, Dec.2008
Mah S P, et al., Developmental Biology, 38-53, 223, 2000
Osterhout J A, et al., Neuron, 632-639, 71, Aug 25, 2011
Paul R, et al., Cancer Research, 2741-2748, July 1, 57, 1997
Peters C, et al., Bioscience Reports, 1-20, 35, 2015
Polakis P., Pharmacological Reviews, 3-19, 68, 2016
Shimazui T, et al., Cancer, 963-968, 101(5), Sep.1, 2004
Shimoyama Y, et al., Cancer Research, 2206-2211, 55, May 15, 1995
Yokoi S, et al., American Journal of Pathology, 207-216, 161, 1, 2002

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020100954A1 (ja) 2020-05-22
BR112021009251A2 (pt) 2021-08-10
JP7401456B2 (ja) 2023-12-19
EP3882349A4 (en) 2023-04-05
EP3882349A1 (en) 2021-09-22
TW202031298A (zh) 2020-09-01
CN113166764A (zh) 2021-07-23
SG11202104993SA (en) 2021-06-29
US20220016257A1 (en) 2022-01-20
CA3119956A1 (en) 2020-05-22
AU2019379418A1 (en) 2021-06-03
JPWO2020100954A1 (ja) 2021-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20200006061A (ko) 항 cdh6 항체 및 항 cdh6 항체-약물 콘주게이트
JP6679762B2 (ja) 抗ｇｐｒ２０抗体及び抗ｇｐｒ２０抗体−薬物コンジュゲート
KR20200061376A (ko) 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘쥬게이트
KR101972446B1 (ko) Ｂｃｍａ（ｃｄ２６９／ｔｎｆｒｓｆ１７）­결합 단백질
EP2814509B1 (en) Antibodies to integrin v 6 and use of same to treat cancer
KR20210143237A (ko) 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 컨쥬게이트
KR20210091711A (ko) 항 cdh6 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 컨쥬게이트
KR20210143839A (ko) 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트와 parp 저해제의 조합
JP2020055870A (ja) 抗ｎｔｂ−ａ抗体ならびに関連する組成物および方法
IL290488B1 (en) Therapeutic antibodies and their uses
KR20210141630A (ko) 항 her2 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘주게이트
KR20220110231A (ko) 항-αvβ6 항체 및 항체-약물 접합체
RU2798285C2 (ru) Анти-cdh6-антитело и конъюгат анти-cdh6-антитело-лекарственное средство
WO2023125652A1 (zh) 抗cd40×cldn18.2双特异性抗体及其用途
RU2785293C2 (ru) Антитело против cd147
TW202404648A (zh) 抗體－吡咯并苯二氮呯衍生物複合體
TW202404649A (zh) 抗體－吡咯并苯二氮呯衍生物複合體
TW202405006A (zh) 抗體－吡咯并苯二氮呯衍生物複合體