JPWO2020100954A1 - 抗cdh6抗体−ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート - Google Patents
抗cdh6抗体−ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート Download PDFInfo
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Abstract
Description
[1]次式(X):
Abは、配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列に特異的に結合し、細胞内に取り込まれる内在化能を有する、IgG抗体又は当該抗体の機能性断片を示し、
Lは、AbのN297に結合する糖鎖(N297糖鎖)とDを連結するリンカーであり、
N297糖鎖は、リモデリングされていてもよい糖鎖を示し、
Dは、以下:
で示される抗体−薬物コンジュゲート。
[2]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列への結合に対して、以下の(1)〜(8):
(1)配列番号23の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号26の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
(2)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号39の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
(3)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
(4)配列番号35の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
(5)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号47の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
(6)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号65の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
(7)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号67の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、及び
(8)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号69の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
からなる群から選択される抗体のうち少なくともいずれか1つと競合阻害活性を示す、
[1]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[3]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、以下の(1)〜(4):
(1)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号17に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号18に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号19に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、
(2)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号17に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号30に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号19に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、
(3)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号57に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号58に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号59に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、及び
(4)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号62に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号63に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号64に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、
からなる群から選択されるCDRL1、CDRL2及びCDRL3、及び、CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む、
[1]又は[2]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[4]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、以下の(1)〜(4):
(1)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(2)配列番号37に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(3)(1)又は(2)のアミノ酸配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
(4)(1)〜(3)のアミノ酸配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
からなる群から選択されるいずれか1つに記載の軽鎖可変領域、並びに、
以下の(5)〜(11):
(5)配列番号41に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(6)配列番号45に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(7)配列番号49に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(8)配列番号55に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(9)配列番号60に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(10)(5)〜(9)のアミノ酸配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
(11)(5)〜(10)のアミノ酸配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
からなる群から選択されるいずれか1つに記載の重鎖可変領域、
を含む、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[5]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、以下の(1)〜(6):
(1)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号41に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(2)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号45に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(3)配列番号37に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号45に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(4)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号49に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(5)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号55に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、又は
(6)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号60に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
のいずれかの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域、
を含む、[1]〜[4]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[6]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、以下の(1)〜(7):
(1)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号39の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(2)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(3)配列番号35の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(4)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号47の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(5)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号65の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(6)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号67の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、又は
(7)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号69の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
のいずれかを有する、[1]〜[5]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[7]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号39の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、[6]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[8]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、[6]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[9]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号35の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、[6]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[10]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号47の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、[6]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[11]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号65の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する[6]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[12]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号67の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する[6]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[13]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号69の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する[6]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[14]Lが、−Lb−La−Lp−NH−B−CH2−O(C=O)−*で示され、
式中、*は前記DのN10’位の窒素原子と結合していることを示し、
Bは、1,4−フェニル基、2,5−ピリジル基、3,6−ピリジル基、2,5−ピリミジル基又は2,5−チエニル基であり、
Lpは、以下:
−GGVA−、−GG−(D−)VA−、−VA−、−GGFG−、−GGPI−、−GGVCit−、−GGVK−、及び、−GGPL−、
からなる群から選択されるいずれか1つを示し、
Laは、以下:
−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−、
−C(=O)−(CH2CH2)2−C(=O)−、
−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2)2−C(=O)−、
−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2O)2−CH2−C(=O)−、
−C(=O)−CH2CH2−NH−C(=O)−(CH2CH2O)4−CH2CH2−C(=O)−、
−CH2−OC(=O)−、及び、
−OC(=O)−、
からなる群から選択されるいずれか1つを示し、並びに、
Lbは、次式:
[1]〜[13]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[15]Lが、以下:
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGVA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GG−(D−)VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−(CH2CH2)2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGPI−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGFG−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGVCit−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGVK−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGPL−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2)2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2O)2−CH2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−NH−C(=O)−(CH2CH2O)4−CH2CH2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z2−OC(=O)−GGVA−NH−B−CH2−OC(=O)−、及び
−Z3−CH2−OC(=O)−GGVA−NH−B−CH2−OC(=O)−
からなる群から選択されるいずれか1つを示し、
ここで、Z1は、以下の構造式:
Z2は、以下の構造式:
Z3は、以下の構造式:
ここで、Z1、Z2及びZ3の構造式において、*はZ1、Z2又はZ3に隣接するC(=O)、O又はCH2と結合していることを示し、波線はAbの糖鎖又はリモデリングされた糖鎖と結合していることを示し、並びに、
Bは、1,4−フェニル基を示す、
[1]〜[14]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[16]Lが、以下:
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGVA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−(CH2CH2)2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGVCit−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2)2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2O)2−CH2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、及び
−Z1−C(=O)−CH2CH2−NH−C(=O)−(CH2CH2O)4−CH2CH2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−
からなる群から選択されるいずれか1つを示し、
ここで、Bは1,4−フェニル基であり、Z1は以下の構造式:
ここで、Z1の構造式において、*はZ1に隣接するC(=O)と結合していることを示し、波線はAbのN297に結合する糖鎖(N297糖鎖)又はそのリモデリングされた糖鎖と結合していることを示す、[1]〜[15]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[17]抗体が、IgG1、IgG2又はIgG4である、[1]〜[16]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[18]N297糖鎖が、リモデリングされた糖鎖である、[1]〜[17]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[19]N297糖鎖が、次式で示される構造を有するN297−(Fuc)MSG1、N297−(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297−(Fuc)SGである、[1]〜[18]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート:
N297糖鎖中の*−L(PEG)−は、*−(CH2CH2−O)n5−CH2CH2−NH−をを示し、
ここで、n5は2〜5の整数であることを示し、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ−Manの分岐鎖の1−3鎖側又は/及び1−6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合していることを示し、*は、それぞれの構造式におけるトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す。
[20]n5が3である、[19]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[21]次の式(XII):
上記で示されるそれぞれの構造式において、m2は1又は2の整数であることを示し、
Abは配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列に特異的に結合し、細胞内に取り込まれる内在化能を有する、IgG抗体又は当該抗体の機能性断片を示し、
AbのN297糖鎖は次式で示される構造を有するN297−(Fuc)MSG1、N297−(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297−(Fuc)SGのいずれか1つであることを示し、
N297糖鎖中の*−L(PEG)−は、*−(CH2CH2−O)3−CH2CH2−NH−であることを示し、
ここで、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ−Manの分岐鎖の1−3鎖側又は/及び1−6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合していることを示し、*は、それぞれの構造式におけるトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す、抗体−薬物コンジュゲート。
[22]式(XII)で表される化合物が、次の式(XII’):
[23]次の式(XIII):
上記で示されるそれぞれの構造式において、m2は1又は2の整数であることを示し、
Abは配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列に特異的に結合し、細胞内に取り込まれる内在化能を有する、IgG抗体又は当該抗体の機能性断片を示し、
AbのN297糖鎖は次式で示される構造を有するN297−(Fuc)MSG1、N297−(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297−(Fuc)SGのいずれか1つであることを示し、
N297糖鎖中の*−L(PEG)−は、*−(CH2CH2−O)3−CH2CH2−NH−であることを示し、
ここで、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ−Manの分岐鎖の1−3鎖側又は/及び1−6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合していることを示し、*は、それぞれの構造式におけるトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す、抗体−薬物コンジュゲート。
[24]式(XIII)で表される化合物が、次の式(XIII’):
[25]次の式(XIV):
上記で示されるそれぞれの構造式において、m2は1又は2の整数であることを示し、
Abは配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列に特異的に結合し、細胞内に取り込まれる内在化能を有する、IgG抗体又は当該抗体の機能性断片を示し、
AbのN297糖鎖は次式で示される構造を有するN297−(Fuc)MSG1、N297−(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297−(Fuc)SGのいずれか1つであることを示し、
N297糖鎖中の*−L(PEG)−は、*−(CH2CH2−O)3−CH2CH2−NH−であることを示し、
ここで、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ−Manの分岐鎖の1−3鎖側又は/及び1−6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合していることを示し、*は、それぞれの構造式におけるトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す、抗体−薬物コンジュゲート。
[26]式(XIV)で表される化合物が、次の式(XIV’):
[27]次の式(XV):
上記で示されるそれぞれの構造式において、m2は1又は2の整数であることを示し、
Abは配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列に特異的に結合し、細胞内に取り込まれる内在化能を有する、IgG抗体又は当該抗体の機能性断片を示し、
AbのN297糖鎖は次式で示される構造を有するN297−(Fuc)MSG1、N297−(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297−(Fuc)SGのいずれか1つであることを示し、
N297糖鎖中の*−L(PEG)−は、*−(CH2CH2−O)3−CH2CH2−NH−であることを示し、
ここで、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ−Manの分岐鎖の1−3鎖側又は/及び1−6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合していることを示し、*は、それぞれの構造式におけるトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す、抗体−薬物コンジュゲート。
[28]式(XV)で表される化合物が、次の式(XV’):
[29]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、以下の(1)〜(4):
(1)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号17に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号18に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号19に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、
(2)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号17に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号30に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号19に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、
(3)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号57に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号58に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号59に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、及び
(4)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号62に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号63に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号64に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、
からなる群から選択されるCDRL1、CDRL2及びCDRL3、及び、CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む、
[21]〜[28]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[30]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、以下の(1)〜(6):
(1)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号41に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(2)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号45に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(3)配列番号37に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号45に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(4)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号49に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(5)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号55に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、又は
(6)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号60に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
のいずれかの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域、
を含む、[21]〜[29]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[31]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、以下の(1)〜(7):
(1)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号39の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(2)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(3)配列番号35の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(4)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号47の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(5)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号65の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(6)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号67の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、又は
(7)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号69の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
のいずれかを有する、[21]〜[30]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[32]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号39の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、[31]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[33]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、[31]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[34]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号35の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、[31]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[35]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号47の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、[31]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[36]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号65の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、[31]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[37]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号67の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、[31]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[38]前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号69の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する[31]に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[39]抗体―薬物コンジュゲートにおける抗体1分子あたりの平均薬物結合数が、1〜3である、[1]〜[38]のいずれか1項に記載の抗体―薬物コンジュゲート。
[41]重鎖がN−結合への糖鎖付加、O−結合への糖鎖付加、N末のプロセッシング、C末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、N末にメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化及びカルボキシル末端において1つ又は2つのアミノ酸が欠失した重鎖からなる群より選択される1又は2以上の修飾を含む抗体である、[1]〜[40]のいずれか1項に記載の抗体―薬物コンジュゲート。
[42]重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失した、[1]〜[41]のいずれか1項に記載の抗体―薬物コンジュゲート。
[43]以下の工程:
i)配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列に特異的に結合し、細胞内に取り込まれる内在化能を有する、IgG抗体又は当該抗体の機能性断片を製造する工程、
ii)工程i)で得られた抗体を加水分解酵素で処理し、(Fucα1,6)GlcNAc−抗体を製造する工程、及び、
iii)−1 MSG(9)又はSG(10)のシアル酸の2位のカルボン酸のカルボニル基にアジド基を有するPEGリンカーを導入し、還元末端をオキサゾリン化して得た糖鎖ドナー分子と、糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc−抗体を反応させる工程、又は、
iii)−2 α−アミノ基が保護されていてもよい(MSG−)Asn又は(SG−)Asnのシアル酸の2位のカルボン酸のカルボニル基及び前記Asnのカルボン酸のカルボニル基にアジド基を有するPEGリンカーを導入し、加水分解酵素を作用させた後、還元末端をオキサゾリン化して得た糖鎖ドナー分子と、糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc−抗体を反応させる工程、
を含む、糖鎖リモデリング抗体の製造方法。
[44][43]に記載の方法により得られた糖鎖リモデリング抗体とドラッグリンカーを反応させる工程を含む、[1]〜[42]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの製造方法。
[45][44]に記載の方法で製造された、[1]〜[42]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
[47]配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖可変領域、及び、配列番号62に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号63に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号64に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖可変領域を含む、抗体又はその機能性断片。
[48]配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号55に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む、[46]に記載の抗体又はその機能性断片。
[49]配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号60に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む、[47]に記載の抗体又はその機能性断片。
[50]配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号67の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、[46]又は[48]に記載の抗体又はその機能性断片。
[51]配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号69の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、[47]又は[49]に記載の抗体又はその機能性断片。
[52]配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号65の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、抗体又はその機能性断片。
[53][46]〜[52]のいずれか1項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
[55][54]に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
[56][55]に記載の宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体を採取する工程を含む、[46]〜[52]に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の製造方法。
[57][56]に記載の製造方法により得られる、抗体又は該抗体の機能性断片。
[58][1]〜[42]若しくは[45]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、又は、[46]〜[52]若しくは[57]のいずれか1項に記載の抗体又は該抗体の機能性断片を含む、医薬組成物。
[59]抗腫瘍薬である、[58]に記載の医薬組成物。
[60]腫瘍がCDH6が発現している腫瘍である、[59]に記載の医薬組成物。
[61]腫瘍が腎細胞癌、腎淡明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、卵巣癌、卵巣漿液性腺癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、中皮腫、子宮癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍又は神経芽腫である、[60]に記載の医薬組成物。
[62][1]〜[42]若しくは[45]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、[46]〜[52]若しくは[57]のいずれか1項に記載の抗体又は該抗体の機能性断片、又は、[58]〜[61]のいずれか1項に記載の医薬組成物を個体に投与する工程を含む、腫瘍の治療方法。
[63]腫瘍がCDH6が発現している腫瘍である、[62]に記載の治療方法。
[64]腫瘍が、腎細胞癌、腎淡明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、卵巣癌、卵巣漿液性腺癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、中皮腫、子宮癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍又は神経芽腫である、[62]又は[63]に記載の治療方法。
[65][1]〜[42]若しくは[45]のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、[46]〜[52]若しくは[57]のいずれか1項に記載の抗体又は該抗体の機能性断片、又は、[58]〜[61]のいずれか1項に記載の医薬組成物と少なくとも一つの抗腫瘍薬を、同時に、別々に又は連続して個体に投与する工程を含む、[62]〜[64]のいずれか1項に記載の治療方法。
カドヘリンは、細胞膜表面に存在する糖タンパク質で、カルシウムイオン依存的にN末端側の細胞外ドメイン同士が結合することで、細胞間接着分子として、また細胞間相互作用を担うシグナル分子として機能する。カドヘリンスーパーファミリーの内、クラシックカドヘリンに分類される分子群は、細胞外に5個の細胞外ドメイン(ECドメイン)と1個の膜貫通領域、及び細胞内ドメインから構成される1回膜貫通タンパク質である。
本発明の抗CDH6抗体の一例として、配列番号4に示すアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を認識し、かつ内在化活性を有する抗CDH6抗体を挙げることができる。本発明の抗CDH6抗体の一例として、配列番号4に示すアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を特異的に認識し、かつ内在化活性を有する抗CDH6抗体を挙げることができる。本発明の抗CDH6抗体の一例として、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を認識し、かつ内在化活性を有する抗CDH6抗体を挙げることができる。本発明の抗CDH6抗体の一例として、配列番号4に示すアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を特異的に認識し、かつ内在化活性を有する抗CDH6抗体を挙げることができる。抗体が「配列番号4に示すアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を特異的に認識」する又は「EC3ドメインを特異的に認識」するとは、抗体が、CDH6のEC3ドメインをCDH6の他の細胞外ドメインと比較して強く認識する又は強く結合することをいう。
抗原は抗原タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子操作によって宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、抗原遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現した抗原を精製すればよい。上記の遺伝子操作による抗原発現細胞、あるいは抗原を発現している細胞株を動物に免疫する方法を用いることによっても抗体を取得できる。
本発明で使用される抗CDH6抗体は、特に制限はないが、例えば、本願の配列表で示されたアミノ酸配列で特定される抗体を好適に使用することができる。本発明において使用される抗CDH6抗体としては、以下の特性を有するものが望ましい。
(1)以下の特性を有することを特徴とする抗体;
(a)CDH6に特異的に結合する、
(b)CDH6と結合することによってCDH6発現細胞に内在化する活性を有する、
(2)CDH6がヒトCDH6である上記(1)に記載の抗体又は当該抗体、
(3)ヒトCDH6のEC3を特異的に認識し、かつ内在化活性を有する。
(a)CDH6のcDNAを発現ベクター(例えば、pcDNA3.1:Thermo Fisher Scientific)に組み込み、エレクトロポレーションや遺伝子銃等の方法によって、そのベクターを直接被免疫動物(例えば、ラットやマウス)に投与することによって、動物体内においてCDH6を発現させることによって、免疫反応を誘起させることができる。エレクトロポレーション等によるベクターの投与は抗体価を上げるために必要であれば、1回でも複数回でもよく、好ましくは複数回である;
(b)免疫反応を誘起された上述の動物より、抗体産生細胞を含む組織(例えばリンパ節)を採取する;
(c)骨髄腫細胞(以下「ミエローマ」という)(例えば、マウスミエローマSP2/0−ag14細胞)の調製;
(d)抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合;
(e)目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別;
(f)単一細胞クローンへの分割(クローニング);
(g)場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育;及び/又は
(h)このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性(内在化活性)、及びその結合特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定。
本発明の抗体には、上記CDH6に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ(Chimeric)抗体、ヒト化(Humanized)抗体又はヒト抗体等も含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
配列番号33に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列(本明細書中、hL02軽鎖可変領域アミノ酸配列とも称する)を有する軽鎖又は配列番号37に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列(本明細書中、hL03軽鎖可変領域アミノ酸配列とも称する)を有する軽鎖、及び、配列番号41に示される重鎖可変領域アミノ酸配列(本明細書中、hH01重鎖可変領域アミノ酸配列とも称する)を有する重鎖、配列番号45に示される重鎖可変領域アミノ酸配列(本明細書中、hH02重鎖可変領域アミノ酸配列とも称する)を有する重鎖、配列番号49に示される重鎖可変領域アミノ酸配列(本明細書中、hH04重鎖可変領域アミノ酸配列とも称する)、配列番号55に示される重鎖可変領域アミノ酸配列(本明細書中、hH11重鎖可変領域アミノ酸配列とも称する)又は配列番号60に示される重鎖可変領域アミノ酸配列(本明細書中、hH31重鎖可変領域アミノ酸配列とも称する)を有する重鎖からなる抗体が挙げられる。
配列番号33に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号41に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;
配列番号33に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号45に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;
配列番号33に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号49に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;
配列番号33に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号55に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;
配列番号33に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号60に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;
配列番号37に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号41に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;
配列番号37に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号45に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;
配列番号37に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号49に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;
配列番号37に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号55に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;又は
配列番号37に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号60に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;
が挙げられる。
配列番号33に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号41に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;
配列番号33に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号45に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;
配列番号33に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号49に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;
配列番号37に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号45に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;
配列番号33に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号55に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;又は
配列番号33に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号60に示される重鎖可変領域アミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体;
が挙げられる。
配列番号31に示される軽鎖全長アミノ酸配列(本明細書中、hL02軽鎖全長アミノ酸配列とも称する)の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖又は配列番号35に示される軽鎖全長アミノ酸配列(本明細書中、hL03軽鎖全長アミノ酸配列とも称する)の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖、及び、
配列番号39に示される重鎖全長アミノ酸配列(本明細書中、hH01重鎖全長アミノ酸配列とも称する)の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、配列番号43に示される重鎖全長アミノ酸配列(本明細書中、hH02重鎖全長アミノ酸配列とも称する)の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、配列番号47に示される重鎖全長アミノ酸配列(本明細書中、hH04重鎖全長アミノ酸配列とも称する)の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、配列番号65に示される重鎖全長アミノ酸配列(本明細書中、hH01Aの重鎖全長アミノ酸配列とも称する)の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、配列番号67に示される重鎖全長アミノ酸配列(本明細書中、hH11Aの重鎖全長アミノ酸配列とも称する)の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖又は配列番号69に示される重鎖全長アミノ酸配列(本明細書中、hH31Aの重鎖全長アミノ酸配列とも称する)の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖
からなる抗体が挙げられる。
配列番号31に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号39に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体;
配列番号31に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体;
配列番号31に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号47に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体;
配列番号31に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号65に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体;
配列番号31に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号67に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体;
配列番号31に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号69に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体;
配列番号35に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号39に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体;
配列番号35に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体;
配列番号35に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号47に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体;
配列番号35に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号65に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体;
配列番号35に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号67に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体;又は
配列番号35に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号69に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体;
が挙げられる。
配列番号31に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号39に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体(本明細書中、「H01L02抗体」又は「H01L02」とも称する);
配列番号31に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体(本明細書中、「H02L02抗体」又は「H02L02」とも称する);
配列番号31に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号47に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体(本明細書中、「H04L02抗体」又は「H04L02」とも称する);
配列番号35に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体(本明細書中、「H02L03抗体」又は「H02L03」とも称する);
配列番号31に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号65に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体(本明細書中、「H01L02A抗体」又は「H01L02A」とも称する);
配列番号31に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号67に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体(本明細書中、「H11L02A抗体」又は「H11L02A」とも称する);又は
配列番号31に示される軽鎖全長アミノ酸配列の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号69に示される重鎖全長アミノ酸配列の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖からなる抗体(本明細書中、「H31L02A抗体」又は「H31L02A」とも称する);
が挙げられる。
(a)本発明のCDH6抗体の重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと軽鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの組み合わせ、
(b)本発明のCDH6抗体のいずれか一つの抗体のCDRH1〜CDRH3を含む重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとCDRL1〜CDRL3を含む軽鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの組み合わせ
(c)本発明のCDH6抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む重鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む軽鎖アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの組み合わせ
(d)(a)〜(c)のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなるヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、CDH6に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、及び、
(e)(a)〜(c)のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドにおいて1〜50個、1〜45個、1〜40個、1〜35個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、1〜8個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1若しくは2個、または1個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなるポリペプチドのアミノ酸配列をコードし、且つ、CDH6に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
本発明の抗体薬物コンジュゲートは、次式:
Abは、配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列に特異的に結合し、細胞内に取り込まれる内在化能を有する、IgG抗体又は当該抗体の機能性断片を示し、
Lは、AbのN297に結合する糖鎖(N297)とDを連結するリンカーであり、
Dは、以下:
で表される。
上記「2.抗CDH6抗体の製造」にて取得された抗CDH6抗体はリンカー構造部分を介して薬物を結合させることによって、抗CDH6抗体−薬物コンジュゲートとすることができる。薬物としては、リンカー構造に結合できる置換基、部分構造を有するものであれば特に制限はない。抗CDH6抗体−薬物コンジュゲートは結合する薬物に応じて種々の用途に用いることができる。そのような薬物の例としては、抗腫瘍活性を有する物質、血液疾患に対する効果を有する物質、自己免疫疾患に対する効果を有する物質、抗炎症物質、抗菌物質、抗真菌物質、抗寄生虫物質、抗ウイルス物質、抗麻酔物質等を挙げることができる。
本発明の抗CDH6抗体−薬物コンジュゲートに結合される化合物として抗腫瘍性化合物を用いる例について以下に述べる。抗腫瘍性化合物としては、抗腫瘍効果を有する化合物であって、リンカー構造に結合できる置換基、部分構造を有するものであれば特に制限はない。抗腫瘍性化合物は、リンカーの一部又は全部が腫瘍細胞内で切断されて抗腫瘍性化合物部分が遊離されて抗腫瘍効果が発現される。リンカーが薬物との結合部分で切断されれば抗腫瘍性化合物が本来の構造で遊離され、その本来の抗腫瘍効果が発揮される。当該遊離薬物として実施例10−7〜10−10に記載の薬物1〜4が挙げられる。
<リンカー構造>
本発明の抗体−薬物コンジュゲートにおいて抗腫瘍性薬物を抗体に結合するリンカー構造について説明する。
−Lb−La−Lp−NH−B−CH2−O(C=O)−*
で示される。
これらのアミノ酸は重複してもよく、任意に選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。また、アミノ酸の種類によって、薬物遊離のパターンをコントロールすることができる。
−GGVA−、−GG−(D−)VA−、−VA−、−GGFG−、−GGPI−、−GGVCit−、−GGVK−、−GG(D−)PI−、−GGPL−、−EGGVA、−PI−、−GGF−、DGGF−、(D−)D−GGF−、−EGGF−、−SGGF−、−KGGF−、−DGGFG−、−GGFGG−、−DDGGFG−、−KDGGFG−、−GGFGGGF−
を挙げることができる。
−GGVA−、−GG−(D−)VA−、−VA−、−GGFG−、−GGPI−、−GGVCit−、−GGVK−、−GG(D−)PI−、−GGPL−
リンカーLpは、より好ましくは、以下である。
Lbは、Laと抗体Abの糖鎖又はリモデリングされた糖鎖を結合するスペーサーを示す。
−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−、
−C(=O)−(CH2CH2)2−C(=O)−、
−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2)2−C(=O)−、
−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2O)2−CH2−C(=O)−、
−C(=O)−CH2CH2−NH−C(=O)−(CH2CH2O)4−CH2CH2−C(=O)−、
−CH2−OC(=O)−、及び、
−OC(=O)−、
からなる群から選択されるいずれか一つを示し、Laは、より好ましくは、−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−、又は、−C(=O)−(CH2CH2)2−C(=O)−である。
Lが、以下の群:
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGVA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GG−(D−)VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−(CH2CH2)2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGPI−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGFG−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGVCit−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGVK−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGPL−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2)2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2O)2−CH2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−NH−C(=O)−(CH2CH2O)4−CH2CH2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z2−OC(=O)−GGVA−NH−B−CH2−OC(=O)−、及び
−Z3−CH2−OC(=O)−GGVA−NH−B−CH2−OC(=O)−から選択され、
ここで、Z1は、以下の構造式:
Z2は、以下の構造式:
Z3は、以下の構造式:
ここで、Z1、Z2及びZ3の構造式において、*はZ1、Z2又はZ3に隣接するC(=O)、O又はCH2と結合していることを示し、波線はAbの糖鎖又はリモデリングされた糖鎖と結合していることを示し、並びに、
Bは、1,4−フェニル基を示す。
近年、不均一な抗体の糖タンパク質を、酵素反応等によってリモデリングし、官能基を有する糖鎖を均一に導入する方法が報告されている(ACS Chemical Biology 2012,7,110、ACS Medicinal Chemistry Letters 2016,7,1005)。この糖鎖リモデリング技術を用いて、部位特異的に薬物を導入し、均一なADCを合成する試みもなされている(Bioconjugate Chemistry 2015,26,2233、Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,2361−2367、US2016361436)。
L(PEG)は、−(CH2CH2−O)n5−CH2CH2−NH−を示し、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ−Manの分岐鎖の1−3鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合していることを示し、
*は、前記リンカーL、特にリンカーLにおけるLbの1,2,3−トリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示し、
ここで、n5は2〜10の整数であり、好ましくは、2〜5の整数である。
L(PEG)は、−(CH2CH2−O)n5−CH2CH2−NH−を示し、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ−Manの分岐鎖の1−6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合していることを示し、
*は、前記リンカーL、特にリンカーLにおけるLbの1,2,3−トリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示し、
ここで、n5は2〜10の整数であり、好ましくは、2〜5の整数である。
L(PEG)は、−(CH2CH2−O)n5−CH2CH2−NH−を示し、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ−Manの分岐鎖の1−3鎖側及び1−6鎖側の両方の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合していることを示し、*は、前記リンカーL、特にリンカーLにおけるLbの1,2,3−トリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示し、
ここで、n5は2〜10の整数であり、好ましくは、2〜5の整数である。
糖鎖リモデリング抗体、例えばWO2013/120066などに記載の方法に準じて、次式に示すような方法で製造することができる。
本工程は目的の抗体に対して、公知の酵素反応を用いて抗体のアミノ酸配列297番目のアスパラギンに結合するN結合型糖鎖(N297結合糖鎖)を切断し、糖鎖切断抗体を調製する工程である。
本工程は上述の(Fucα1,6)GlcNAc抗体に対し、酵素反応を用いてアジド基を含むPEGリンカーを有するMSG(MSG1、MSG2)又はSG型糖鎖オキサゾリン体(以下、「アジド糖鎖オキサゾリン体」)を結合させ、糖鎖リモデリング抗体を製造する工程である。
Amicon Ultra(30,000乃至50,000 MWCO,Millipore Co.)の容器内に抗体又は抗体−薬物コンジュゲート溶液を入れ、遠心機(Allegra X−15R,Beckman Coulter,Inc.)を用いた遠心操作(2000G乃至4000Gで5乃至20分間遠心)にて、抗体および後述する抗体−薬物コンジュゲート溶液を濃縮した。
UV測定器(Nanodrop 1000,Thermo Fisher Scientific Inc.)を用いて、メーカー規定の方法に従い、抗体濃度の測定を行った。その際に、抗体ごとに異なる280nm吸光係数(1.3mLmg−1cm−1乃至1.8mLmg−1cm−1)を用いた。
抗体水溶液は緩衝溶液(リン酸緩衝生理食塩水(pH6.0)、リン酸緩衝液(pH6.0)等)を加え共通操作Aを用いて濃縮した。この操作を数回行った後、共通操作Bを用いて抗体濃度の測定を行い、緩衝溶液(リン酸緩衝生理食塩水(pH6.0)、リン酸緩衝液(pH6.0)等)を用いて10mg/mLに抗体濃度を調整した。
本製造法は、上述の糖鎖リモデリング抗体と製造中間体(2)をSPAAC(strain−promoted alkyne azide cycloaddition :J. AM. CHEM. SOC. 2004, 126, 15046−15047)反応により結合させ、抗体−薬物コンジュゲートを製造する方法である。
La’、Lp’、B’は、La、Lp、Bと同義であり、
Jは、以下で示されるいずれかの構造式を示し、
式中、アステリスクはLa’と結合していることを示す。
市販のSorbitol(5%)を含む酢酸緩衝液(10mM,pH5.5;本明細書でABSと称する)のいずれかの緩衝液でNAP−25カラムを平衡化させた。このNAP−25カラムに、抗体−薬物コンジュゲート反応水溶液(約1.5〜2.5mL)をのせ、メーカー規定の量の緩衝液で溶出させることで、抗体画分を分取した。この分取画分を再びNAP−25カラムにのせ、緩衝液で溶出させるゲルろ過精製操作を計2乃至3回繰り返すことで、未結合の薬物リンカーやジメチルスルホキシド、プロピレングリコールを除いた抗体−薬物コンジュゲートを得た。必要に応じて、共通操作AおよびCにより抗体−薬物コンジュゲート溶液の濃度を調製した。
抗体−薬物コンジュゲートにおける結合薬物濃度は、下記に示すランベルト・ベールの法則を用いて、算出することができる。
以下にランバルトベールの法則を用いた式(I)を示す。
上記式(I)より抗体−薬物コンジュゲートのモル濃度C(mol・L−1)は以下の式(II)で求められる。
抗体薬物コンジュゲートのモル吸光係数ε280は、以下の式(IV)によって求めることができる。
εAb,280は抗体のアミノ酸配列から、既知の計算方法(Protein Science,1995,vol.4,2411−2423)によって推定することができる値を用いた。実施例において、H01L02抗体のモル吸光係数は、εAb,280=223400(計算推定値)を用いた。H01L02A抗体のモル吸光係数は、εAb,280=223674(計算推定値)、H31L02A抗体のモル吸光係数は、εAb,280=223314(計算推定値)、H11L02A抗体のモル吸光係数は、εAb,280=220490(計算推定値)、LPS抗体のモル吸光係数は、εAb,280=230300(計算推定値)を、を用いた。
εDL,280は、都度UV測定で得た実測値より算出したものを使用した。すなわち、コンジュゲート前駆体(薬物)をあるモル濃度に溶解させた溶液の吸光度を測定し、ランベルト・ベールの法則、式(I)を適用することで得られる値を使用した。
抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体一分子あたりの平均薬物結合数は、以下の方法を用いる高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析によって求めることができる。
抗体−薬物コンジュゲート溶液(約1mg/mL、60μL)をジチオトレイトール(DTT)水溶液(100mM、15μL)と混合する。混合物を37℃で30分インキュベートすることで、抗体−薬物コンジュゲートのL鎖及びH鎖間のジスルフィド結合を切断したサンプルを、HPLC分析に用いる。
HPLC分析を、下記の測定条件にて行う。
検出器:紫外吸光度計(測定波長:280nm、329nm)
カラム:BEH Phenyl(2.1×50mm、1.7μm、Waters Acquity)
カラム温度:75℃
移動相A:0.1%トリフルオロ酢酸(TFA),15%イソプロピルアルコール水溶液
移動相B:0.075%TFA、15%イソプロピルアルコールアセトニトリル溶液
グラジエントプログラム:14%−36%(0分−15分)、36%−80%(15−17分)、80%−14%(17分―17.1分)、14%−14%(17.1分―23分)
サンプル注入量:5μL
(F−3.データ解析)
(F−3−1) 薬物の結合していない抗体のL鎖(L0)及びH鎖(H0)に対して、薬物の結合したH鎖(薬物が一つ結合したH鎖:H1、薬物が一つ結合したH鎖:H2)は、結合した薬物の数に比疎水性が増して保持時間が大きくなることから、L0、H0、H1、H2の順に溶出されることからL0及びH0との保持時間比較により検出ピークをL0、H0、H1、H2のいずれかに割り当てることができる。また薬物が結合しているかは、薬物の特徴的な329nmの波長吸収でも確認できる。
上記、「2.抗CDH6抗体の製造」の項及び実施例に記載された本発明の抗CDH6抗体及び当該抗体の機能性断片は、腫瘍細胞表面のCDH6に結合し、内在化活性を有することから、単独であるいは他の薬剤と組み合わせて、医薬として、腎細胞腫瘍及び卵巣腫瘍等のがん、例えば、腎細胞癌、腎淡明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、卵巣癌、卵巣漿液性腺癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌(例えば、小細胞肺癌又は非小細胞肺癌)、神経膠芽腫、中皮腫、子宮癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍又は神経芽腫の治療剤として用いることができる。
1)−1 ヒトおよびカニクイザルCDH6発現ベクターの構築
ヒトCDH6タンパク質(NP_004923)をコードするcDNA発現ベクター(OriGene社、RC217889)を用いて、当業者に公知な方法に従い哺乳動物発現用ベクターに組み込むことによってヒトCDH6発現ベクターpcDNA3.1−hCDH6が作製された。ヒトCDH6 ORF(Open Reading Frame)のアミノ酸配列を配列番号1に示す。
免疫にはWKY/Izmラットの雌(日本エスエルシー社)を使用した。まずラット両足下腿部をHyaluronidase(SIGMA−ALDRICH社)にて前処理後、同部位に実施例1)− 1で作製したヒトCDH6発現ベクターpcDNA3.1−hCDH6を筋肉内注射した。続けて、ECM830(BTX社)を使用し、2ニードル電極を用いて、同部位にインビボエレクトロポレーションを実施した。約二週間に一度、同様のインビボエレクトロポーレーションを繰り返した後、ラットのリンパ節又は脾臓を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
リンパ節細胞あるいは脾臓細胞とマウスミエローマSP2/0−ag14細胞(ATCC, No.CRL−1 581)とをLF301 Cell Fusion Unit(BEX社)を用いて電気細胞融合した後、ClonaCell−HY Selection Medium D(StemCell Technologies社)に懸濁し、希釈して37℃、5% CO2の条件下で培養した。出現した各々のハイブリドーマコロニーは、モノクローンとして回収され、ClonaCell−HY Selection Medium E(StemCell Technologies社)に懸濁して37℃、5% CO2の条件下で培養した。適度に細胞が増殖した後、各々のハイブリドーマ細胞の凍結ストックを作製すると共に、得られたハイブリドーマ培養上清を抗ヒトCDH6抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングに用いた。
1)−4−1 Cell−ELISA用抗原遺伝子発現細胞の調製
293α細胞(インテグリンαv及びインテグリンβ3を発現するHEK293由来の安定発現細胞株)を10% FBS含有DMEM培地中5x105細胞/mLになるよう調製した。Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scienftific社)を用いた形質移入手順に従って、この293α細胞に対して、pcDNA3.1−hCDH6もしくはpcDNA3.1−cynoCDH6または、陰性コントロールとしてpcDNA3.1のDNAを導入し、96−well plate(Corning社)に100μLずつ分注後、10% FBS含有DMEM培地中で37℃、5% CO2の条件下で24から27時間培養した。得られた形質移入細胞を接着状態のまま、Cell−ELISAに使用した。
実施例1)−4−1で調製した発現ベクター導入293α細胞の培養上清を除去後、pcDNA3.1−hCDH6もしくはpcDNA3.1−cynoCDH6またはpcDNA3.1導入293α細胞の各々に対しハイブリドーマ培養上清を添加し、4℃で1時間静置した。well中の細胞を5% FBS含有PBS(+)で1回洗浄後、5% FBS含有PBS(+)で500倍に希釈したAnti−Rat IgG−Peroxidase antibody produced in rabbit(SIGMA社)を加えて、4℃で1時間静置した。well中の細胞を5% FBS含有PBS(+)で3回洗浄した後、OPD発色液(OPD溶解液(0.05 M クエン酸3ナトリウム、0.1M リン酸水素2ナトリウム・12水 pH4.5)にo−フェニレンジアミン二塩酸塩(和光純薬社)、H2O2をそれぞれ0.4mg/mL、0.6%(v/v)になるように溶解)を100μL/wellで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、1M HClを100μL/wellで添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー(ENVISION:PerkinElmer社)で490nmの吸光度を測定した。コントロールのpcDNA3.1導入293α細胞と比較し、pcDNA3.1−hCDH6ならびにpcDNA3.1−cynoCDH6発現ベクター導入293α細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマをヒト、かつ、カニクイサルCDH6に結合する抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
1)−5−1 フローサイトメトリー解析用抗原遺伝子発現細胞の調製
293T細胞を5×104細胞/cm2になるよう225cm2フラスコ(住友ベークライト社)に播種し、10% FBS含有DMEM培地中で37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した。この293T細胞に、pcDNA3.1−cynoCDH6または、陰性コントロールとしてpcDNA3.1をLipofectamine 2000を用いて導入し、37℃、5% CO2の条件下でさらに一晩培養した。各ベクターを導入した293T細胞をTrypLE Express(Thermo Fisher Scienftific社)で処理し、10% FBS含有DMEMで細胞を洗浄した後、5% FBS含有PBSに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
実施例1)−4のCell−ELISAで選択されたヒト、かつ、カニクイサルCDH6に結合する抗体産生ハイブリドーマが産生する抗体のカニクイサルCDH6に対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例1)−5−1で調製した一過性発現293T細胞の懸濁液を遠心し、上清を除去した後、各々に対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAnti−Rat IgG FITC conjugate(SIGMA社)を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、2μg/mL 7−aminoactinomycin D(Molecular Probes社)を含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500:BeckmanCoulter社)で検出した。データ解析はFlowJo(TreeStar社)で行った。7−aminoactinomycin D陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるpcDNA3.1導入293T細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しpcDNA3.1−cynoCDH6導入293T細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしている抗体を産生するハイブリドーマを細胞膜表面上に発現するカニクイサルCDH6に特異的に結合する抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
実施例1)− 5で選択したラット抗CDH6抗体産生ハイブリドーマの中から、ヒトならびにサルCDH6に強く特異的に結合することが示唆されたクローンrG019を選抜し、各抗体のアイソタイプを同定した。抗体の重鎖のサブクラス、軽鎖のタイプは、RAT MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT(DSファーマバイオメディカル社)により決定された。その結果、rG019のサブクラスは、IgG2b、タイプはκ鎖であることが確認された。
1)−7−1 培養上清作製
ラット抗ヒトCDH6モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から精製した。まず、ラット抗CDH6モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをClonaCell−HY Selection Medium E(StemCell Technologies社)で充分量まで増殖させた後、Ultra Low IgG FBS(Thermo Fisher Scienftific社)を20%添加したHybridoma SFM(Thermo Fisher Scienftific社)に培地交換し、4−5日間培養した。本培養上清を回収し、0.8μmのフィルターに通した後、さらに0.2μmのフィルターに通して不溶物を除去した。
実施例1)−7−1で作製したハイブリドーマの培養上清からラット抗CDH6抗体rG019をProtein Gアフィニティークロマトグラフィーで精製した。Protein Gカラム(GE Healthcare Bioscience社)に抗体を吸着させ、PBSでカラムを洗浄後に0.1M グリシン/塩酸水溶液(pH2.7)で溶出した。溶出液に1M Tris−HCl(pH9.0)を加えてpH7.0〜7.5に調整した後に、Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分画分子量UF30K、Sartorius社)にてHBSor(25mM ヒスチジン/5% ソルビトール、pH6.0)へのバッファー置換を行うとともに抗体の濃縮を行い、抗体濃度を1mg/mLに調製した。最後にMinisart−Plus filter(Sartorius社)でろ過し、精製サンプルとした。
2)−1 フローサイトメトリーによるラット抗CDH6抗体の結合能評価
実施例1)−7で作製したラット抗CDH6抗体のヒトCDH6結合性をフローサイトメトリー法により評価した。実施例1)−1で作製したpcDNA3.1−hCDH6を293T細胞(ATCC)にLipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)を用いて一過性に導入し、37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した後、TrypLE Express(Thermo Fisher Scienftific社)で処理し細胞懸濁液を調製した。遺伝子導入した293T細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、実施例1)−7で調製したラット抗CDH6モノクローナル抗体rG019又はラットIgGコントロール(R&D Systems)を終濃度10ng/mL加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで50倍に希釈したAnti−Rat IgG(whole molecule)−FITC antibody produced in rabbit(SIGMA)を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、フローサイトメーター(FC500:Beckman Coulter)で検出を行った。データ解析はFlowJo(TreeStar)で行った。その結果を図1に示す。図1のヒストグラムにおいて、横軸は抗体結合量を表すFITCの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。網掛けで示すヒストグラムはhCDH6を導入していない陰性コントロール293T細胞を用いた場合を示し、白抜き実線で示すヒストグラムは、hCDH6導入293T細胞を用いた場合を示す。細胞表面のhCDH6に抗体が結合したことによって蛍光強度が増強したことを示す。ラットIgGコントロールはいずれの細胞にも結合しない。この結果、作製したラット抗CDH6モノクローナル抗体4種はpcDNA3.1−hCDH6導入293T細胞に結合することを確認した。
2)−2−1 ヒトCDH6各ドメイン欠失体発現ベクターの構築
ヒトCDH6の細胞外全長には5つの細胞外ドメイン、EC1(配列番号2)、EC2(配列番号3)、EC3(配列番号4)、EC4(配列番号5)、EC5(配列番号6)が存在する。ヒトCDH6全長から、5つのECドメインを各一箇所ずつ欠失発現した遺伝子をGeneArt社で合成し、当業者に公知な方法に従い哺乳動物発現用ベクターp3xFLAG−CMV−9ベクター(SIGMA−ALDRICH社)へ組み込み、EC1からEC5をそれぞれ欠失した、各ドメイン欠失体発現ベクターを作製した。
各ECドメイン欠失ベクターを導入した293α細胞株を用いたフローサイトメトリー解析により、ラット抗ヒトCDH6抗体の結合エピトープを同定した。インテグリンαvおよびインテグリンβ3発現ベクターをHEK293細胞内に安定形質移入した細胞株293α細胞株に対して、実施例2)−2−1で作成した各ドメイン欠失体発現ベクター、及び全長ヒトCDH6を発現するpcDNA3.1−hCDH6をLipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)を用いて一過性に導入し、37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した後、TrypLE Express(Thermo Fisher Scienftific社)で処理し細胞懸濁液を調製した。導入293α細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、実施例1)−7で調製したrG019)又はラットIgGコントロール(R&D Systems)を終濃度20nMで加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで50倍に希釈したAnti−Rat IgG(whole molecule)−FITC antibody produced in rabbit(SIGMA)を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、フローサイトメーター(CantoII:BD Biosciences)で検出を行った。データ解析はFlowJo(TreeStar)で行った。その結果を図2−1及び図2−2に示す。図2−1及び図2−2のヒストグラムにおいて、横軸は抗体結合量を表すFITCの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。網掛けで示すヒストグラムは遺伝子を導入していない陰性コントロール293α細胞を用いた場合を示し、白抜き実線で示すヒストグラムは、全長hCDH6又は各ECドメイン欠失293細胞を用いた場合を示す。細胞表面の全長hCDH6又は各ECドメイン欠失体に抗体が結合した場合は、蛍光強度が増強する。ラットIgGコントロールはいずれの導入細胞にも結合しない。rG019は、全長hCDH6、EC1欠失体、EC2欠失体、EC4欠失体、及びEC5欠失体には結合するが、EC3欠失体には結合しない。この結果から、rG019はhCDH6のEC3をエピトープとして特異的に結合することが示された。
取得抗体の評価に用いるCDH6陽性ヒト腫瘍細胞株を選抜するため、公知データベースからCDH6発現情報を検索し、フローサイトメトリー法により細胞膜表面でのCDH6の発現を評価した。ヒト卵巣腫瘍細胞株NIH:OVCAR−3、PA−1、OV−90及びヒト腎細胞腫瘍細胞株786−O、Caki−1(全てATCCから入手)を37℃、5% CO2の条件下で培養した後、TrypLE Express(Thermo Fisher Scienftific社)で処理し、細胞懸濁液を調製した。細胞を遠心し、上清を除去した後、市販抗ヒトCDH6抗体(MABU2715,R&D Systems)又は陰性コントロールとしてマウスIgG1(BD Pharmingen)を終濃度50ug/mL加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで50倍に希釈したF(ab’)2 Fragment of FITC−conjugated Goat Anti−mouse immunoglobulins(Dako)を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、フローサイトメーター(CantoII:BD Biosciences)で検出を行った。データ解析はFlowJo(TreeStar)で行った。その結果を図3に示す。図3のヒストグラムにおいて、横軸は抗体結合量を表すFITCの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。網掛けで示すヒストグラムは陰性コントロールmIgG1で染色した場合を示し、白抜き実線で示すヒストグラムは抗ヒトCDH6抗体で染色した場合を示す。細胞表面のhCDH6に抗体が結合したことによって蛍光強度が増強したことを示す。mIgG1コントロールはいずれの細胞にも結合しない。この結果、NIH:OVCAR−3、PA−1、OV−90及び786−O,Caki−1細胞株は、内在的にCDH6を細胞表面上に発現することが示された。
3)−1 G019抗体産生ハイブリドーマからのtotal RNAの調製
rG019の可変領域を含むcDNAを増幅するためG019抗体産生ハイブリドーマよりTRIzol Reagent(Ambion社)を用いてtotal RNAを調製した。
重鎖可変領域を含むcDNAの増幅は、実施例3)−1で調製したtotal RNAの約1μgとSMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech社)を用いて実施した。rG019の重鎖遺伝子の可変領域のcDNAをPCRで増幅するためのプライマーとして、UPM (Universal Primer A Mix:SMARTer RACE cDNA Amplification Kitに付属)、及び公知のラット重鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。
実施例3)−2と同様の方法で実施した。ただし、rG019の軽鎖遺伝子の可変領域のcDNAをPCRで増幅するためのプライマーとして、UPM (Universal Primer A Mix:SMARTer RACE cDNA Amplification Kitに付属)、及び公知のラット軽鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。
4)−1 ヒトキメラ化抗CDH6抗体chG019の発現ベクターの構築
4)−1−1 キメラ及びヒト化軽鎖発現ベクターpCMA−LKの構築
プラスミドpcDNA3.3−TOPO/LacZ(Invitrogen社)を制限酵素XbaI及びPmeIで消化して得られる約5.4kbのフラグメントと、配列番号20に示すヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片をIn−Fusion Advantage PCRクローニングキット(Clontech社)を用いて結合して、pcDNA3.3/LKを作製した。
pCMA−LKをXbaI及びPmeIで消化して軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたDNA断片と、配列番号21で示されるヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG1定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片をIn−Fusion Advantage PCRクローニングキット(Clontech社)を用いて結合して、pCMA−G1を構築した。
配列番号27に示すchG019重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至440に示されるDNA断片を合成した(GENEART社)。In−Fusion HD PCRクローニングキット(Clontech社)を用いて、pCMA−G1を制限酵素BlpIで切断した箇所に合成したDNA断片を挿入することによりchG019重鎖発現ベクターを構築した。なお、chG019重鎖は予期せぬジスルフィド結合を防ぐため、CDR中のシステインをプロリンに置換した配列を用いた。
配列番号22に示すchG019軽鎖をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。In−Fusion HD PCRクローニングキット(Clontech社)を用いて、合成したDNA断片とpCMA−LKをXbaI及びPmeIで消化して軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたDNA断片を結合することにより、chG019軽鎖発現ベクターを構築した。
4)−2−1 chG019の生産
FreeStyle 293F細胞(Invitrogen社)はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の1.2×109個のFreeStyle 293F細胞(Invitrogen社)を3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING社)に播種し、FreeStyle293 expression medium(Invitrogen社)で希釈して2.0×106細胞/mlに調製した。40mlのOpti−Pro SFM培地(Invitrogen社)に0.24mgの重鎖発現ベクターと0.36mgの軽鎖発現ベクターと1.8mgのPolyethyleneimine(Polyscience #24765)を加えて穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle 293F細胞に添加した。37℃、8%CO2インキュベーターで4時間、90rpmで振とう培養後に600mlのEX−CELL VPRO培地(SAFC Biosciences社)、18mlのGlutaMAX I(GIBCO社)、及び30mlのYeastolate Ultrafiltrate(GIBCO社)を添加し、37℃、8%CO2インキュベーターで7日間、90rpmで振とう培養して得られた培養上清をDisposable Capsule Filter (Advantec #CCS−045−E1H)でろ過した。
実施例4)−2−1で得られた培養上清をrProtein Aアフィニティークロマトグラフィーの1段階工程で精製した。培養上清をPBSで平衡化したMabSelectSuReが充填されたカラム(GE Healthcare Bioscience社製)にアプライしたのちに、カラム容量の2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液(pH4.0)で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析(Thermo Scientific社、Slide−A−Lyzer Dialysis Cassette)によりHBSor(25mM ヒスチジン/5% ソルビトール、pH6.0)へのバッファー置換を行った。Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分画分子量UF10K,Sartorius社)で抗体を濃縮し、IgG濃度を5mg/ml以上に調製した。最後にMinisart−Plus filter(Sartorius社)でろ過し、精製サンプルとした。
4)−2で精製したヒトキメラ化抗CDH6抗体chG019のCDH6結合性をフローサイトメトリー法により確認した。実施例1)−1で作製したpcDNA3.1−hCDH6、又はpcDNA3.1−cynoCDH6、又はpcDNA3.1をそれぞれ293α細胞にLipofectamine 2000を用いて一過性に導入し、37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した後、TrypLE Express(Thermo Fisher Scienftific社)で処理し細胞懸濁液を調製した。これらの細胞懸濁液にchG019を加えて4℃で1時間静置した後、5% FBS含有PBSで2回洗浄し、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したPE標識F(ab’)2 Fragment抗ヒトIgG,Fcγ抗体(JACKSON IMMUNORESEARCH)を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(CantoII:BD Biosciences)で検出を行った。データ解析はFlowJo(TreeStar)で行った。図4に示すとおり、chG019は陰性コントロールであるpcDNA3.1導入293T細胞には結合せず、pcDNA3.1−hCDH6及びpcDNA3.1−cynoCDH6導入293T細胞に抗体濃度依存的に結合した。図4において横軸は抗体濃度を示し、縦軸は結合量をMeanFluorescent Intensity(平均蛍光強度)で示す。この結果から、chG019が、ヒトおよびカニクイザルCDH6に対して特異的に結合し、結合活性はほぼ同等であることがわかる。
5)−1 抗CDH6抗体のヒト化体デザイン
5)−1−1 chG019の可変領域の分子モデリング
chG019の可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法(Methods in Enzymology,203,121−153,(1991))を利用した。chG019の重鎖と軽鎖の可変領域に対して高い配列同一性を有するProtein Data Bank(Nuc.Acid Res.35,D301−D303(2007))に登録されている構造(PDB ID:2I9L)を鋳型に、市販のタンパク質立体構造解析プログラムBioLuminate(Schrodinger社製)を用いて行った。
chG019は、CDRグラフティング(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))によりヒト化した。KABAT et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))において既定されるヒトのgamma鎖サブグループ1およびkappa鎖サブグループ1のコンセンサス配列が、chG019のフレームワーク領域に対して高い同一性を有することから、それぞれ、重鎖と軽鎖のアクセプターとして選択された。アクセプター上に移入すべきドナー残基は、Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029−10033(1989))によって与えられる基準などを参考に三次元モデルを分析することで選択された。
設計された3種の重鎖をhH01、hH02及びhH04と命名した。hH01の重鎖全長アミノ酸配列を、配列番号39に記載する。配列番号39のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号40に記載する。hH02の重鎖全長アミノ酸配列を、配列番号43に記載する。配列番号43のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号44に記載する。hH04の重鎖全長アミノ酸配列を、配列番号47に記載する。配列番号47のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号48に記載する。
設計された2種の軽鎖をhL02およびhL03と命名した。hL02の軽鎖全長アミノ酸配列を、配列番号31に記載する。配列番号31のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号32に記載する。hL03の軽鎖全長アミノ酸配列を、配列番号35に記載する。配列番号35のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号36に記載する。
hH01及びhL02からなる抗体を「H01L02抗体」又は「H01L02」と称する。hH02及びhL02からなる抗体を「H02L02抗体」又は「H02L02」と称する。hH02及びhL03からなる抗体を「H02L03抗体」又は「H02L03」と称する。hH04及びhL02からなる抗体を「H04L02抗体」又は「H04L02」と称する。
5)−5−1 ヒト化hG019の重鎖発現ベクターの構築
5)−5−1−1 hH01重鎖発現ベクターの構築
配列番号40に示すhH01重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至440に示されるDNA断片を合成した(GENEART社)。実施例4)−1−3と同様の方法でhH01重鎖発現ベクターを構築した。
配列番号44に示すhH02重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至440に示されるDNA断片を合成した(GENEART社)。実施例4)−1−3と同様の方法でhH02重鎖発現ベクターを構築した。
配列番号48に示すhH04重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至440に示されるDNA断片を合成した(GENEART社)。実施例4)−1−3と同様の方法でhH04重鎖発現ベクターを構築した。
5)−5−2−1 hL02軽鎖発現ベクターの構築
配列番号32に示すhL02軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号37乃至399に示されるhL02軽鎖の可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。In−Fusion HD PCRクローニングキット(Clontech社)を用いて、pCMA−LKを制限酵素BsiWIで切断した箇所に合成したDNA断片を挿入することによりhL02軽鎖発現ベクターを構築した。
配列番号36に示すhL03軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号37乃至399に示されるhL03軽鎖の可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。実施例5)−5−2−1と同様の方法でhL03軽鎖発現ベクターを構築した。
5)−5−3−1 H01L02、H02L02、H02L03、H04L02の生産
実施例4)−2−1と同様の方法で生産した。実施例5)−4に示した重鎖と軽鎖の組み合わせにより、H01L02、H02L02、H02L03、H04L02を生産した。
実施例5)−5−3−1で得られた培養上清をrProtein Aアフィニティークロマトグラフィーとセラミックハイドロキシアパタイトの2段階工程で精製した。培養上清をPBSで平衡化したMabSelectSuReが充填されたカラム(GE Healthcare Bioscience社製)にアプライした後に、カラム容量の2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液(pH4.0)で抗体を溶出した。抗体の含まれる画分を透析(Thermo Scientific社、Slide−A−Lyzer Dialysis Cassette)によりPBSへのバッファー置換を行い、5mMリン酸ナトリウム/50mM MES/pH7.0のバッファーで5倍希釈した後に、5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0のバッファーで平衡化したセラミックハイドロキシアパタイトカラム(日本バイオラッド、Bio−Scale CHT Type―1 Hydroxyapatite Column)にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析(Thermo Scientific社、Slide−A−Lyzer Dialysis Cassette)によりHBSor(25mM ヒスチジン/5% ソルビトール、pH6.0)へのバッファー置換を行った。Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分画分子量UF10K,Sartorius社)にて抗体を濃縮し、IgG濃度を20mg/mlに調製した。最後にMinisart−Plus filter(Sartorius社)でろ過し、精製サンプルとした。
実施例で用いた抗CDH6抗体NOV0712は、国際公開第2016/024195号に記載のNOV0712の軽鎖全長、及び重鎖全長のアミノ酸配列(それぞれ、国際公開第2016/024195の配列番号235及び配列番号234)を参照して作製した。
参考例1)−1−1 抗CDH6抗体NOV0712の重鎖発現ベクターの構築
配列番号54に示すNOV0712の重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至428に示されるNOV0712の重鎖の可変領域を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。実施例4)−1−3と同様の方法でNOV0712の重鎖発現ベクターを構築した。当該NOV0712の重鎖発現ベクターにより発現するNOV0712の重鎖のアミノ酸配列を、配列番号53に示す。配列番号53に示されるアミノ酸配列中、1〜19番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列である。
配列番号52に示すNOV0712の軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号37乃至405に示されるNOV0712の軽鎖の可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。実施例5)−5−2−1と同様の方法でNOV0712の軽鎖発現ベクターを構築した。当該NOV0712の軽鎖発現ベクターにより発現するNOV0712の軽鎖のアミノ酸配列を、配列番号51に示す。配列番号51に示されるアミノ酸配列中、1〜20番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列である。
参考例1)−2−1 抗CDH6抗体NOV0712の生産
実施例4)−2−1と同様の方法でNOV0712を生産した。
参考例1)−2−1で得られた培養上清から実施例4)−2−2と同様の方法で抗CDH6抗体NOV0712を精製した(抗体濃度HBSorで5mg/l)。
6)−1 ヒト化hG019の結合性評価
抗体と抗原(Recombinant Human CDH6 Fc His chimera, R&D Systems)との解離定数測定は、Biacore T200(GEヘルスケアバイオサイエンス)を使用し、固定化した抗His抗体に抗原をリガンドとして捕捉(キャプチャー)し、抗体をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。抗ヒスチジン抗体(His capture kit、GEヘルスケアバイオサイエンス)は、センサーチップCM5(GEヘルスケアバイオサイエンス)へ、アミンカップリング法にて約1000RU共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとして1mM CaCl2を添加したHBS−P+(10mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl、0.05% Surfactant P20)を用いた。抗ヒスチジン抗体を固定化したチップ上に、抗原を60秒間添加した後、抗体の希釈系列溶液(0.391−100nM)を流速30μl/分で300秒間添加し、引き続き600秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、5M MgCl2を添加したGlycine溶液pH1.5を流速10μl/分で30秒間、2回添加した。データの解析は、分析ソフトウェア(BIAevaluation software, version 4.1)のSteady State Affinityモデルを用いて、解離定数(KD)を算出した。結果を表2に示す。
6)−2−1 ドメイン欠失体を用いたエピトープ解析
実施例2)−2−1で作成した各ドメイン欠失体発現ベクター、及び全長hCDH6を発現するpcDNA3.1−hCDH6をLipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)を用いて一過性に導入し、37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した後、細胞懸濁液を調製した。遺伝子導入した293α細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、実施例5)−5−3で調製したヒト化hG019抗体4種(クローン番号は、H01L02、H02L02、H02L03およびH04L02)、又は、参考例1で調製した抗CDH6抗体NOV0712、又は、陰性コントロールとしてヒトIgG1(Calbiochem)を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAPC−anti−human IgG goat F(ab’)2(Jackson laboratory)を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、フローサイトメーター(CantoII:BD Biosciences)で検出を行った。データ解析はFlowJo(TreeStar)で行った。その結果を図5−1〜図5−6に示す。図5−1〜図5−6のヒストグラムにおいて、横軸は抗体結合量を表すAPCの蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。網掛けで示すヒストグラムは遺伝子を導入していない陰性コントロール293α細胞を用いた場合を示し、白抜き実線で示すヒストグラムは、全長hCDH6又は各ECドメイン欠失293α細胞を用いた場合を示す。細胞表面の全長hCDH6又は各ECドメイン欠失体に抗体が結合した場合は、蛍光強度が増強する。ヒトIgG1コントロールはいずれの導入細胞にも結合しない。ヒト化hG019抗体4種(クローン番号は、H01L02、H02L02、H02L03およびH04L02)は、全長hCDH6、EC1欠失体、EC2欠失体、EC4欠失体、及びEC5欠失体には結合するが、EC3欠失体には結合しない。すなわち、ヒト化hG019抗体4種はhCDH6のEC3をエピトープとして特異的に結合することが示された。一方、抗CDH6抗体NOV0712は、全長hCDH6、EC1欠失体、EC2欠失体、EC3欠失体、及びEC4欠失体には結合するが、EC5欠失体には結合しない。すなわち、抗CDH6抗体NOV0712抗体はhCDH6のEC5をエピトープとして特異的に結合することが示され、国際公開第2016/024195号に記載されているNOV0712のエピトープ情報と一致する。この結果から、NOV0712と本明細書で取得したヒト化hG019抗体4種は、異なる性質を示す抗CDH6抗体であることが示された。
6)−2−2−1 786−O/hCDH6安定発現細胞株の作製
786−O/hCDH6安定発現細胞株は、786−O細胞(ATCC)にヒトCDH6全長発現用組換えレトロウイルスを感染させることにより作製した。ヒトCDH6発現レトロウイルスベクター(pQCXIN−hCDH6)は、ヒトCDH6タンパク質(NP_004923)をコードするcDNA発現ベクター(OriGene社RC217889)を用いて、当業者に公知な方法に従いレトロウイルスベクターpQCXIN(CLONTECH)に組み込むことにより作製された。FuGene HD(Promega)を用いてレトロウイルスパッケージング細胞RetroPack PT67(CLONTECH)にpQCXIN−hCDH6を一過性に導入し、48時間後に組換えレトロウイルスを含む培養上清を回収し、786−O細胞培養系に添加することで同細胞に感染させた。感染3日後から、G418(Gibco)を終濃度50mg/mLで添加した培地で37℃、5% CO2の条件下で培養を行い感染細胞の薬剤選抜を行うことで、ヒトCDH6を安定的に発現する細胞株786−O/hCDH6を樹立した。実施例2)−3−1と同様にフローサイトメトリーにて安定発現株でのヒトCDH6の高発現を確認した(図6)。検出用抗体には5% FBS含有PBSで500倍に希釈したGoat anti−Mouse IgG1 Secondary Antibody Alexa Fluor 647(Thermo Fisher Scientific)を使用した。その結果を図6に示す。図8のヒストグラムにおいて、横軸は抗体結合量を表すAlexa Fluor 647の蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。網掛けで示すヒストグラムは陰性コントロールmIgG1で染色した場合を示し、白抜き実線で示すヒストグラムは抗ヒトCDH6抗体で染色した場合を示す。細胞表面のhCDH6に抗体が結合したことによって蛍光強度が増強したことを示す。mIgG1コントロールはいずれの細胞にも結合しない。この結果、786−O/hCDH6安定発現細胞株では親株786−O細胞と比較して、ヒトCDH6を高発現することが示された。
Alexa Fluor 488 Monoclonal Antibody Labeling Kit(Thermo Fisher)を用いて、ラベル化H01L02及びラベル化NOV0712を作製した。6)−2−2−1で作製した786−O/hCDH6安定発現細胞株の細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、ラベル化NOV0712又はラベル化H01L02を終濃度5nMで添加し、さらに実施例5)−5−3で調製したヒト化hG019抗体4種(クローン番号は、H01L02、H02L02、H02L03およびH04L02)、又は、参考例1で調製した抗CDH6抗体NOV0712、又は、陰性コントロールとしてヒトIgG1(Calbiochem)を図7の横軸で示す終濃度で添加して懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、フローサイトメーター(CantoII:BD Biosciences)で検出を行った。データ解析はFlowJo(TreeStar)で行った。その結果を図7に示す。横軸はラベル化していない抗体の添加時の終濃度を示し、縦軸は結合量をMeanFluorescent Intensity(平均蛍光強度)で示す。ラベル化NOV0712を添加した細胞にラベル化していないNOV0712を添加した場合は、同じエピトープを持ち結合が競合するため、添加濃度依存的にラベル化していない抗体に置き換わりラベル化抗体の結合量が減少する。一方、ラベル化NOV0712を添加した細胞にヒト化hG019抗体4種、又は陰性コントロールとしてヒトIgG1を添加しても、ラベル化抗体の結合量に変化は無いことから、これらの抗体はエピトープが異なり結合が競合しないことが示される。同様に、ラベル化H01L02を添加した細胞にラベル化していないヒト化hG019抗体4種を添加した場合は、同じエピトープを持ち結合が競合するため、添加濃度依存的にラベル化していない抗体に置き換わりラベル化抗体の結合量が減少する。一方、ラベル化H01L02を添加した細胞にNOV0712、又は陰性コントロールとしてヒトIgG1を添加しても、ラベル化抗体の結合量に変化は無いことから、これらの抗体はエピトープが異なり結合が競合しないことが示される。
ヒト化hG019およびNOV0712の内在化活性は、タンパク質合成を阻害する毒素(サポリン)を結合させた抗ヒトIgG試薬Hum−ZAP(ADVANCED TARGETING SYSTEMS)を用いて評価した。すなわち、ヒトCDH6陽性卵巣腫瘍細胞株NIH:OVCAR−3(ATCC)を4x103 cells/wellで96wellプレートに播種して37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した。ヒトCDH6陽性腎細胞腫瘍細胞株786−O(ATCC)は1x103 cells/wellで96wellプレートに播種して一晩培養した。ヒトCDH6陽性卵巣腫瘍細胞株PA−1(ATCC)を1x103 cells/wellで96wellプレートに播種して37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した。翌日、抗CDH6抗体(終濃度:1nM)、又は、陰性コントロール抗体としてヒトIgG1抗体(Calbiochem)を添加した。さらにHum−ZAP(終濃度:0.5nM)または、陰性コントロールとして毒素を結合していないF(ab’)2 Fragment Goat Anti−human IgG,Fc(gamma) Fragment Specific(JACKSON IMMUNORESEARCH)(終濃度:0.5nM)を添加し、3日間37℃、5%CO2条件下で培養した。生存細胞数は、CellTiter−GloTM Luminescent Cell Viability AssayによるATP活性(RLU)の定量で測定した。この評価では、ヒト化抗CDH6抗体の内在化活性に依存してHum−ZAPが細胞内に取り込まれ、タンパク合成を阻害するサポリンが細胞内に放出されることで、細胞増殖が抑制される。抗CDH6抗体添加による細胞増殖抑制作用は、Hum−ZAPの代わりに陰性コントロールを添加したウェルの生存細胞数を100%とした相対生存率で表記した。図8に細胞生存率の表を示す。本実験において内在化活性が強い抗体は低い細胞生存率を示すと考えられる。この結果、ヒト化hG019抗体4種は3種の細胞株いずれにおいても細胞生存率から予測される内在化率は約50〜75%であり、非常に高い内在化活性を示し、NOV0712と比較して、さらに高い内在活性を示す。ADCの薬効メカニズムから、高い内在化活性を有する抗体は、ADC化抗体をして、より適していると考えられる。
7)−1 ヒト化hG019の改変体の設計
7)−1−1 H01L02の可変領域改変体の設計
実施例5)−2に記載のhH01アミノ酸配列において71番目のチロシンをアラニンへ置換した重鎖をhH11と命名し、81番目のグルタミンをセリンに置換し、123番目のフェニルアラニンをアラニンに置換した重鎖をhH31と命名した。hH11の重鎖可変領域アミノ酸配列を、配列番号55に記載する。配列番号55のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号56に記載する。hH31の重鎖可変領域アミノ酸配列を、配列番号60に記載する。配列番号60のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号61に記載する。
実施例5)−2に記載のhH01のアミノ酸配列において、EU indexにより特定される234位、235位のロイシンをアラニンへ置換した重鎖を設計した(本明細書中、「hH01A」と称する)。また、実施例7)−1−1で設計したhH11の可変領域を有し、IgG1のアイソタイプであり、かつ、EU indexにより特定される234位、235位のロイシンをアラニンへ置換した重鎖を設計した(本明細書中、「hH11A」と称する)。 実施例7)−1−1で設計したhH31の可変領域を有し、IgG1のアイソタイプであり、かつ、EU indexにより特定される234位、235位のロイシンをアラニンへ置換した重鎖を設計した(本明細書中、「hH31A」と称する)。
hH01A及びhL02からなる抗体を「H01L02A抗体」又は「H01L02A」と称する。hH11A及びhL02からなる抗体を「H11L02A抗体」又は「H11L02A」と称する。hH31A及びhL02からなる抗体を「H31L02A抗体」又は「H31L02A」と称する。
7)−3−1 ヒト化IgG1LALAタイプ重鎖発現ベクターpCMA−G1LALAの構築
配列番号71で示されるヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG1LALA定常領域のアミノ酸をコードするDNA配列を含むDNA断片をもちいて、実施例4)−1−2と同様の方法でpCMA−G1LALAを構築した。
配列番号66に示すhH01Aのヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至440に示されるDNA断片を合成した(GENEART社)。In−Fusion HD PCRクローニングキット(Clontech社)を用いて、pCMA−G1LALAを制限酵素BlpIで切断した箇所に合成したDNA断片を挿入することによりhH01A発現ベクターを構築した。
配列番号68に示すhH11Aのヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至440に示されるDNA断片を合成した(GENEART社)。実施例7)−3−2と同様の方法でhH11A発現ベクターを構築した。
配列番号70に示すhH31Aのヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36乃至440に示されるDNA断片を合成した(GENEART社)。実施例7)−3−2と同様の方法でhH31A発現ベクターを構築した。
7)−4−1 H01L02A、H11L02A、H31L02Aの生産
実施例4)−2−1と同様の方法で生産した。実施例5)−5−2−1で構築した軽鎖発現ベクターと実施例7)−3で構築した重鎖発現ベクターを用いて、実施例7)−2に示したH鎖とL鎖の組み合わせに対応したH鎖発現ベクターとL鎖発現ベクターの組み合わせで、H01L02A、H11L02A、H31L02Aを取得した。
実施例7)−4−1で得られた培養上清を用いて、実施例5)−5−3−2と同様の方法で精製した。
8)−1 H01L02A、H11L02A、H31L02Aの結合性評価
実施例7)−4で作製したH01L02A、H11L02A、H31L02AとヒトCDH6との解離定数測定は、Biacore T200(GE Healthcare Bioscience社製)を使用し、His Capture Kit(GE Healthcare Bioscience社製)を用いて固定化したAnti−histidine antibodyに抗原をリガンドとして捕捉(キャプチャー)し、抗体をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。センサーチップとしてCM5(GE Healthcare Bioscience社製)、ランニングバッファーとして20mM Tris−HCl、150mM NaCl、1mM CaCl2、0.05% SurfactantP20、pH7.4を用いた。チップ上に1μg/mLのRecombinant Human Cadherin―6 (KCAD)/Fc Chimera(RD−SYSTEMS)を10μL/分で60秒間添加した後、実施例7)−4で調製した抗体の希釈系列溶液0.11〜81μg/mL)を流速30μL/分で180秒間添加し、引き続き180秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、Glycine 1.5(GE Healthcare Bioscience社製)を流速20μL/分で30秒間添加した。データの解析にはSteady State Affinityモデルを用いて、解離定数(KD)を算出した。結果を表3に示す。
抗LPS抗体はWO2015/046505を参照して作製した。本実施例で使用した抗LPS抗体は、アイソタイプがIgG1である(本明細書中、抗LPS抗体ともいう)。本実施例で使用した抗LPS抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を配列番号72及び配列番号73に示す。
[実施例10−1:中間体1]
5−ベンジル 6−メチル(6S)−5−アザスピロ[2.4]ヘプタン−5,6−ジカルボキシレ−ト(1−1)(104mmol,WO2012087596)のテトラヒドロフラン(500mL)溶液に、水素化ホウ素リチウム(4.30g,178mmol)を0℃にて少量ずつ加えた。0℃にて30分撹拌した後、室温にて2時間撹拌した。0℃にて水(180mL)、2規定塩酸(186mL)を加え、減圧留去した。得られた残渣を酢酸エチルで4回抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣(1−2)(27.9g,90%)をそのまま次の反応に用いた。
上記工程1にて得られた化合物(1−2)(27.9g,107mmol)とイミダゾ−ル(14.5g,214mmol)のジクロロメタン(300mL)溶液に、室温にてtert−ブチルジメチルシリルクロリド(24.2g,160mmol)を加え、室温にて18時間撹拌した。反応溶液を飽和クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−[ヘキサン:酢酸エチル=100:0(v/v)〜50:50(v/v)]にて精製し、目的物(1−3)(32.5g,81%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.39−7.34(5H,m),5.23−5.11(2H,m),4.10−3.48(4H,m),3.16−3.14(1H,m),2.15−2.04(1H,m),1.81−1.77(1H,m),0.91−0.88(9H,m),0.65−0.55(4H,m),0.08−0.01(6H,m).
MS(APCI)m/z:376(M+H)+
上記工程2で得られた化合物(1−3)(32.5g,86.5mmol)のエタノ−ル(400mL)溶液に、室温にて7.5%パラジウム炭素触媒(54%水分、5.00g)を加え、室温、水素雰囲気下にて6時間撹拌した。反応溶液をセライト濾過し、濾液を減圧留去し、目的物(1−4)(21.3g,定量的)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:3.79−3.77(1H,m),3.71−3.69(1H,m),3.65−3.60(1H,m),3.01−2.98(2H,m),1.81−1.71(2H,m),0.90(9H,s),0.65−0.57(4H,m),0.08(3H,s),0.07(3H,s).
MS(APCI、ESI)m/z:242(M+H)+
5−メトキシ−2−ニトロ−4−{トリ(プロパン−2−イル)シリル]オキシ}安息香酸(52.2g,141mmol,US20150283262)と1−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル一水和物(23.8g,155mmol)のジクロロメタン(500mL)溶液に、氷冷下にてN,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(35.0g,170mmol)を加えた。反応混合物を室温にて撹拌した。カルボン酸消失後、−60℃にて上記工程3にて得られた化合物(1−4)(34.1g,141mmol)とトリエチルアミン(29.4mL,212mmol)のジクロロメタン(100mL)溶液をゆっくりと滴下した。反応溶液を室温にて一晩撹拌した後、反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、反応混合物をクロロホルムで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧留去して得られた残渣に酢酸エチルとジエチルエ−テルを加え、固体成分を濾過により取り除き、濾液を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=100:0(v/v)〜25:75(v/v)]にて精製し、目的物(1−5)(55.0g,66%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.72−7.66(1H,m),6.80−6.73(1H,m),4.53−4.49(1H,m),4.04−3.95(1H,m),3.91−3.88(3H,m),3.59−3.54(1H,m),3.36−3.25(0.5H,m),3.01−2.96(1.5H,m),2.24−2.20(0.3H,m),2.09−2.05(0.7H,m),2.00−1.97(0.7H,m),1.69−1.67(0.3H,m),1.32−1.24(3H,m),1.12−1.05(18H,m),0.93−0.91(6H,m),0.79−0.77(3H,m),0.71−0.62(2H,m),0.57−0.40(2H,m),0.12−0.10(4H,m),0.11−0.15(2H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:593(M+H)+
上記工程4で得られた化合物(1−5)(55.0g,92.8mmol)のエタノ−ル(300mL)溶液に、窒素雰囲気下にて、7.5%パラジウム炭素(10.0g)を加えた。窒素風船を直ちに水素風船に付け替え、反応混合物を水素雰囲気下、室温で激しく撹拌した。原料消失後、反応混合物を濾過し、濾液を減圧留去し、得られた目的物(1−6)(52.2g,100%)をそのまま次の反応に用いた。
1H−NMR(CDCl3)δ:6.71(1H,s),6.25(1H,s),4.55−4.28(2H,m),3.97(1H,m),3.75−3.62(3H,m),3.70(3H,s),3.09−3.07(1H,m),2.24−2.19(1H,m),1.81−1.68(1H,m),1.27−1.22(3H,m),1.09−1.05(18H,m),0.90(9H,s),0.65−0.46(4H,m),0.07−0.03(6H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:563(M+H)+
上記工程5で得られた化合物(1−6)(18.6g,33.0mmol)およびトリエチルアミン(6.26mL,45.2mmol)のTHF(300mL)溶液に、エタノ−ル−氷浴上にて、トリホスゲン(4.22g,14.2mmol)をゆっくりと添加した。添加後、氷冷した反応混合物に、N−[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]−L−バリル−N−[4−(ヒドロキシメチル)フェニル]−L−アラニンアミド(11.4g,30.2mmol,WO2011130598)とトリエチルアミン(6.26mL,45.2mmol)のテトラヒドロフラン(100mL)、N,N−ジメチルホルムアミド(30mL)混合溶液をゆっくりと滴下した。滴下後、氷浴をはずし、反応混合物を、窒素雰囲気下、40℃にて撹拌した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ−[ヘキサン:酢酸エチル=100:0(v/v)〜40:60(v/v)]にて精製し、目的物(1−7)(23.5g,74%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:8.99(1H,m),8.58(1H,s),7.80(1H,s),7.55−7.53(2H,m),7.34−7.32(2H,m),6.77−6.75(2H,m),5.94−5.87(1H,m),5.40−5.38(1H,m),5.33−5.29(1H,m),5.23−5.21(1H,m),5.13(1H,m),5.10(2H,m),4.69−4.64(1H,m),4.62−4.52(2H,m),4.06−4.03(1H,m),3.98(1H,m),3.76−3.65(6H,m),3.04(1H,m),2.28−2.26(1H,m),2.18−2.13(1H,m),1.46(3H,m),1.32−1.25(3H,m),1.11−1.09(18H,m),0.99−0.84(15H,m),0.65−0.40(4H,m),0.08−0.00(6H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:966(M+H)+
上記工程6で得られた化合物(1−7)(23.5g,24.3mmol)のテトラヒドロフラン(50mL),メタノ−ル(50mL),水(44mL)溶液に、室温下にて酢酸(200mL)を加えた。反応混合物を室温にて撹拌した。原料消失後、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ−[ヘキサン:酢酸エチル=100:0(v/v)〜0:100(v/v)]にて精製し、目的物(1−8)(18.0g,87%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:8.64−8.62(1H,m),8.50(1H,m),7.69(1H,m),7.55−7.53(2H,m),7.34−7.32(2H,m),6.79−6.75(3H,m),5.91−5.89(1H,m),5.39(1H,m),5.32−5.29(1H,m),5.23−5.21(1H,m),4.68−4.54(4H,m),4.31(1H,m),4.06−4.04(1H,m),3.81−3.79(3H,m),3.76(3H,s),3.63−3.61(1H,m),3.13−3.11(1H,m),2.16−2.13(1H,m),1.87−1.81(2H,m),1.46−1.43(3H,m),1.30−1.24(3H,m),1.12−1.08(18H,m),0.98−0.91(6H,m),0.63−0.45(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:852(M+H)+
ジメチルスルホキシド(3.75mL,52.8mmol)のジクロロメタン(300mL)溶液に、窒素雰囲気下、−78℃にて、塩化オキサリル(2.17mL,25.3mmol)をゆっくりと滴下した。滴下後、反応混合物を−78℃にて撹拌した。反応混合物に、上記工程7で得られた化合物(1−8)(18.0g,21.1mmol)のジクロロメタン(50.0mL)溶液をゆっくりと滴下した。反応溶液に−78℃にて、トリエチルアミン(14.6mL,105mmol)を加えた。添加後、冷媒浴をはずし、室温までゆっくりと昇温した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物をクロロホルム(200mL)で抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ−[ヘキサン:酢酸エチル=100:0(v/v)〜0:60(v/v)]にて精製し、目的物(1−9)(16.5g,92%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:8.51−8.36(1H,m),7.54−7.38(2H,m),7.22−7.07(3H,m),6.73−6.64(1H,m),5.94−5.87(2H,m),5.33−5.22(3H,m),5.09(1H,m),4.97(1H,m),4.64−4.58(4H,m),4.02−4.00(1H,m),3.86−3.83(3H,m),3.75−3.70(1H,m),3.61−3.54(2H,m),3.38−3.29(1H,m),2.40(1H,m),2.16−2.14(1H,m),1.74−1.71(1H,m),1.44(3H,m),1.18−1.16(3H,m),1.05−1.00(18H,m),0.97−0.92(6H,m),0.72−0.60(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:850(M+H)+
上記工程8で得られた化合物(1−9)(12.0g,14.1mmol)および2,6−ルチジン(6.58mL,56.5mmol)のジクロロメタン(200mL)溶液に、窒素雰囲気下、0℃にて、トリフルオロメチルスルホン酸tert−ブチルジメチルシリル(9.73mL,42.3mmol)をゆっくりと滴下した。氷冷下、10分間撹拌した後に、氷浴をはずし、室温にて撹拌した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物をクロロホルムで抽出した水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−[ヘキサン:酢酸エチル=100:0(v/v)〜25:75(v/v)]にて精製し、目的物(1−10)(8.12g,60%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:8.67−8.45(1H,m),7.50−7.44(2H,m),7.19(1H,s),7.13(2H,m),6.95(2H,m),6.62−6.57(2H,m),6.01(1H,m),5.95−5.86(1H,m),5.33−5.13(3H,m),4.82(1H,m),4.65−4.54(3H,m),4.03−4.01(1H,m),3.84−3.82(3H,m),3.73−3.66(1H,m),3.50−3.48(1H,m),3.27(1H,m),2.37−2.33(1H,m),2.19−2.13(1H,m),1.54−1.43(3H,m),1.22−1.13(3H,m),1.10−1.00(18H,m),0.97−0.91(6H,m),0.81(9H,s),0.76−0.59(4H,m),0.19−−0.09(6H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:964(M+H)+
上記工程9で得られた化合物(1−10)(8.12g,8.42mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド(90mL)、水(2mL)溶液に、酢酸リチウム(0.611g,9.26mmol)を加え、室温下で撹拌した。原料消失後、反応混合物に水を加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過後、減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−[ヘキサン:酢酸エチル=100:0(v/v)〜0:100(v/v)]にて精製し、目的物(1−11)(5.48g,81%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:8.76−8.60(1H,m),8.02−7.56(1H,m),7.45−7.44(2H,m),7.21(1H,s),7.10−7.09(2H,m),6.81−6.74(1H,m),6.65(1H,s),6.23(1H,s),6.01−5.99(1H,m),5.95−5.84(1H,m),5.41−5.20(2H,m),5.16(1H,m),4.84(1H,m),4.67−4.54(4H,m),4.05−4.03(1H,m),3.87(3H,s),3.71(1H,m),3.55−3.51(1H,m),3.26(1H,m),2.35(1H,m),2.18−2.12(1H,m),1.55−1.42(3H,m),0.97−0.92(6H,m),0.81(9H,s),0.76−0.61(4H,m),0.20−−0.06(6H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:808(M+H)+
[実施例10−2:中間体2]
グリシルグリシン(0.328g,2.49mmol)、N,N−ジイソプロピルエチルアミン(0.433mL,2.49mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド(20mL)溶液に、1−{[4−(11,12−ジデヒドロジベンゾ[b,f]アゾシン−5(6H)−イル)−4−オキソブタノイル]オキシ}ピロリジン−2,5−ジオン(2−1)(1.00g,2.49mmol,Click Chemistry Tools)、水(10mL)を室温にて加え、同温度にて一晩撹拌した。減圧留去し、得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー[クロロホルム〜クロロホルム:メタノール:水=7:3:1(v/v/v)の分配有機層]にて精製し、目的物(0.930g,89%)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:12.58(1H,s),8.14−8.12(1H,m),8.08−8.07(1H,m),7.69−7.68(1H,m),7.62−7.61(1H,m),7.53−7.45(3H,m),7.40−7.29(3H,m),5.05−5.01(1H,m),3.73−3.72(2H,m),3.66−3.60(3H,m),2.66−2.60(1H,m),2.33−2.24(1H,m),2.08−2.04(1H,m),1.81−1.77(1H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:420[(M+H)+].
[実施例10−3:薬物リンカー1]
(2R,11aS)−8−(ベンジルオキシ)−2−{[tert−ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}−7−メトキシ−10−{[2−(トリメチルシリル)エトキシ]メチル}−2,3−ジヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−5,11(10H,11aH)−ジオン(3−1)(25.5g,41.6mmol,WO2016149546)のテトラヒドロフラン(150mL)、エタノール(150mL)溶液に、窒素雰囲気下、5%パラジウム炭素(54%水分、10.0g)を加えた後、反応溶液を水素雰囲気下、室温にて三日間撹拌した。反応溶液にクロロホルムを加え、セライト濾過した後、濾液を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=100:0(v/v)〜50:50(v/v)]にて精製し、目的物(3−2)(19.4g,89%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.36(1H,s),7.25(1H,s),6.01(1H,s),5.45−5.43(1H,m),4.69−4.67(1H,m),4.60−4.55(1H,m),4.23−4.21(1H,m),3.96(3H,s),3.76−3.68(2H,m),3.63−3.61(1H,m),3.56−3.53(1H,m),2.88−2.83(1H,m),2.03−2.00(1H,m),1.00−0.98(2H,m),0.87(9H,s),0.10(6H,s),0.02(9H,s).
MS(APCI、ESI)m/z:523(M+H)+
上記工程1にて得られた化合物(3−2)(10.8g,20.7mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド(30mL)溶液に、1,5−ジブロモペンタン(23.8g,103mmol)、炭酸カリウム(3.43g,24.8mmol)を室温で加えた。室温で3時間撹拌した後、反応溶液に水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=90:10(v/v)〜50:50(v/v)]にて精製し、目的物(3−3)(14.5g,定量的)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.34(1H,s),7.21(1H,s),5.52−5.49(1H,m),4.63−4.62(1H,m),4.58−4.55(1H,m),4.24−4.22(1H,m),4.07−4.04(2H,m),3.92(3H,s),3.82−3.64(3H,m),3.56−3.53(1H,m),3.45−3.43(2H,m),2.86−2.84(1H,m),2.04−2.00(1H,m),1.97−1.87(4H,m),1.66−1.62(2H,m),1.01−0.98(2H,m),0.87(9H,s),0.10(6H,s),0.04(9H,s).
MS(APCI、ESI)m/z:673[81Br,(M+H)+],671[79Br,(M+H)+].
上記工程2にて得られた化合物(3−3)(21.5mmol)のテトラヒドロフラン(40mL)溶液に、1mol/Lのテトラブチルアンモニウムフロリド テトラヒドロフラン溶液(28.0mL,28.0mmol)を0℃にて加えた。室温にて30分間撹拌した後、反応溶液に水を加え、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[クロロホルム:メタノール=97.5:2.5(v/v)〜92.5:7.5(v/v)]にて精製し、目的物(3−4)(11.3g,94%)を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:559[81Br,(M+H)+],557[79Br,(M+H)+].
上記工程3にて得られた化合物(3−4)(11.3g,20.2mmol)、テトラブチルアンモニウムブロミド(0.325g,1.01mmol)、臭化カリウム(0.240g,2.02mmol,)を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(60mL)、ジクロロメタン(60mL)に溶解させ、nor−AZADO(0.0279g,0.202mmol)、次亜塩素酸ナトリウム五水和物(2.03g,27.2mmol)を0℃にて加え、0℃にて30分間撹拌した。原料が残存したため、次亜塩素酸ナトリウム五水和物(1.00g、13.4mmol)を0℃にて加え、0℃にて15分撹拌した。さらに次亜塩素酸ナトリウム五水和物(0.300g、4.03mmol)を0℃にて加え、0℃にて15分撹拌し、原料の消失をTLCにて確認した。反応溶液にチオ硫酸ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=75:25(v/v)〜40:60(v/v)]にて精製し、目的物(3−5)(9.74g,87%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.33(1H,s),7.24(1H,s),5.56−5.53(1H,m),4.71−4.69(1H,m),4.66−4.63(1H,m),4.27−4.22(1H,m),4.12−4.02(2H,m),3.93−3.88(4H,m),3.82−3.75(1H,m),3.69−3.67(1H,m),3.61−3.56(1H,m),3.46−3.44(2H,m),2.82−2.77(1H,m),1.97−1.89(4H,m),1.68−1.64(2H,m),1.05−0.93(2H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI、ESI)m/z:557[81Br,(M+H)+],555[79Br,(M+H)+].
上記工程4にて得られた化合物(3−5)(9.74g,17.5mmol)のジクロロメタン(160mL)溶液に、2,6−ルチジン(8.17mL,70.1mmol)を−40℃にて加え、−40℃にて10分間撹拌した。反応溶液に無水トリフルオロメタンスルホン酸(8.85mL,52.6mmol)を−40℃にて加え、−40℃にて30分間撹拌した。反応溶液に10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=95:5→70:35]にて精製した後,NH2シリカゲルクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=95:5(v/v)〜65:35(v/v)]にて精製し、目的物(3−6)(7.10g,59%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.32(1H,s),7.24(1H,s),7.15−7.14(1H,m),5.56−5.53(1H,m),4.70−4.68(1H,m),4.66−4.63(1H,m),4.11−4.01(2H,m),3.94−3.90(4H,m),3.84−3.75(1H,m),3.73−3.68(1H,m),3.46−3.44(2H,m),3.18−3.14(1H,m),1.96−1.88(4H,m),1.69−1.61(2H,m),1.02−0.92(2H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI、ESI)m/z:689[81Br,(M+H)+],687[79Br,(M+H)+].
上記工程5にて得られた化合物(3−6)(2.00g,2.91mmol)、4−メトキシフェニルボロン酸(0.884g,5.82mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(0.336g,0.291mmol)、炭酸ナトリウム(1.23g,11.6mmol)の混合物にトルエン(20mL)、エタノール(10mL)、水(10mL)を室温にて加えた。反応溶液を室温にて30分撹拌した後、反応溶液を酢酸エチルで抽出し、水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=90:10(v/v)〜50:50(v/v)]にて精製し、目的物(3−7)(1.71g,91%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.38−7.37(3H,m),7.33(1H,s),7.25(1H,s),6.89−6.88(2H,m),5.56−5.54(1H,m),4.71−4.68(1H,m),4.65−4.62(1H,m),4.09−4.04(2H,m),3.96−3.91(4H,m),3.85−3.66(5H,m),3.46−3.45(2H,m),3.16−3.12(1H,m),1.99−1.94(4H,m),1.69−1.64(2H,m),1.00−0.98(2H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI、ESI)m/z:647[81Br,(M+H)+],645[79Br,(M+H)+].
上記工程6にて得られた化合物(3−7)(0.789g,1.22mmol)をエタノール(10mL)、テトラヒドロフラン(10mL)に溶解し、2.0Mの水素化ホウ素リチウムテトラヒドロフラン溶液(6.11mL,12.2mmol)を0℃にて加え、0℃にて3時間撹拌した。反応溶液に水を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をジクロロメタン(10mL)、エタノール(20mL)、水(10mL)に溶解し、シリカゲル(4g)を室温にて加え、室温で4日間撹拌した。シリカゲルをろ過により除き、水を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=60:40(v/v)〜25:75(v/v)]にて精製し、目的物(3−8)(0.496g,81%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.90−7.89(1H,m),7.53(1H,s),7.40−7.40(1H,m),7.35−7.34(2H,m),6.92−6.90(2H,m),6.83−6.81(1H,m),4.43−4.40(1H,m),4.13−4.06(2H,m),3.96(3H,s),3.84(3H,s),3.61−3.57(1H,m),3.47−3.36(3H,m),2.00−1.92(4H,m),1.67−1.63(2H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:501[81Br,(M+H)+],499[79Br,(M+H)+].
上記工程7にて得られた化合物(3−8)(0.496g,0.992mmol)のジクロロメタン(20mL)溶液にナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(0.421g,1.99mmol)を0℃にて加えた。室温にて2時間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=60:40(v/v)〜25:75(v/v)]にて精製し、目的物(3−9)(0.426g,86%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.53−7.53(2H,m),7.32−7.30(2H,m),6.89−6.87(2H,m),6.05(1H,s),4.33−4.27(2H,m),4.00−3.98(2H,m),3.86(3H,s),3.82(3H,s),3.57−3.55(2H,m),3.42−3.38(3H,m),2.76−2.72(1H,m),1.96−1.88(4H,m),1.65−1.62(2H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:503[81Br,(M+H)+],501[79Br,(M+H)+].
上記工程8にて得られた化合物(3−9)(0.426g,0.849mmol)のジクロロメタン(30mL)溶液に、ピリジン(0.102mL1.27mmol)、クロロぎ酸アリル(0.374mL,3.54mmol)を0℃にて加え、0℃にて15分間撹拌した。反応溶液に10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=90:10(v/v)〜50:50(v/v)]にて精製し、目的物(3−10)(0.465g,94%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.38(1H,s),7.31−7.29(2H,m),7.26−7.25(1H,m),6.89−6.87(2H,m),6.71(1H,s),5.80−5.78(1H,m),5.14−5.11(2H,m),4.65−4.62(1H,m),4.39−4.26(3H,m),4.03−4.01(2H,m),3.92(3H,s),3.82(3H,s),3.66−3.64(1H,m),3.46−3.44(2H,m),3.30−3.27(1H,m),2.72−2.68(1H,m),1.96−1.88(4H,m),1.68−1.60(2H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:587[81Br,(M+H)+],585[79Br,(M+H)+].
実施例10−1工程10にて得られた化合物(1−11)(0.130g,0.161mmol)と上記工程9にて得られた化合物(3−10)(0.104g,0.177mmol,)のN,N−ジメチルホルムアミド(3mL)溶液に炭酸カリウム(0.0266g,0.193mmol)を室温にて加え、室温にて一晩撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、水、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去した後、得られた残渣をNH2−シリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=70:30(v/v)〜0:100(v/v)]にて精製し、目的物(3−11)(0.184g,87%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:8.76(1H,s),7.58−7.56(2H,m),7.39(1H,s),7.32−7.30(2H,m),7.26−7.24(2H,m),7.19−7.17(3H,m),6.90−6.88(2H,m),6.78(1H,s),6.68−6.66(1H,m),6.37(1H,s),5.99−5.93(3H,m),5.34−5.20(6H,m),4.66−4.01(11H,m),3.90(3H,s),3.89(3H,s),3.78−3.54(9H,m),3.31−3.28(2H,m),2.73−2.69(1H,m),2.38−2.35(1H,m),2.19−2.13(1H,m),1.82−1.80(2H,m),1.46−1.29(6H,m),0.98−0.90(6H,m),0.83(9H,s),0.69−0.63(4H,m),0.19−0.16(6H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:1312(M+H)+
上記工程10にて得られた化合物(3−11)(0.1837g,0.140mmol)と酢酸(0.048mL,0.840mmol)のテトラヒドロフラン(5.00mL)溶液に1mol/Lのテトラブチルアンモニウムフロリド テトラヒドロフラン溶液(0.700mL,0.700mmol)を室温にて加え、室温にて3時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチルで希釈し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー[クロロホルム:メタノール=99.5:0.5(v/v)〜95:5(v/v)]にて精製し、目的物(3−12)(0.178g、定量的)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:8.86(1H,s),7.60−7.59(2H,m),7.39(1H,s),7.32−7.20(7H,m),6.90−6.88(2H,m),6.78(1H,s),6.68(1H,s),6.38(1H,s),5.90−5.87(3H,m),5.39−5.22(6H,m),4.72−4.02(11H,m),3.90(3H,s),3.88(3H,s),3.83(3H,s),3.70−3.63(6H,m),3.32−3.29(3H,m),2.73−2.69(1H,m),2.43−2.40(1H,m),2.12−2.06(1H,m),1.77−1.74(2H,m),1.39−1.25(6H,m),0.96−0.89(6H,m),0.73−0.66(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:1198(M+H)+
上記工程11にて得られた化合物(3−12)(0.140mmol)のジクロロメタン(2mL)溶液に、室温にてピロリジン(0.0579mL,0.700mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(0.0162g,0.0140mmol)を加え、室温にて15分撹拌した。減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー[クロロホルム:メタノール=99.5:0.5(v/v)〜92.5:7.5(v/v)]にて精製し、目的物(3−13)(0.143g,99%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:9.12(1H,s),7.94−7.92(1H,m),7.57−7.53(4H,m),7.33−7.31(2H,m),7.20−7.18(3H,m),6.90−6.88(2H,m),6.36(1H,s),6.07(1H,s),5.91−5.88(1H,m),5.47−5.44(1H,m),5.21−5.13(1H,m),4.66−4.58(3H,m),4.32(1H,s),4.03−3.49(17H,m),3.38−3.29(4H,m),3.15−3.14(1H,m),2.77−2.73(1H,m),2.57(2H,s),2.43−2.40(1H,m),2.32−2.27(1H,m),1.81−1.39(8H,m),0.98−0.96(3H,m),0.85−0.83(3H,m),0.75−0.62(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:1030(M+H)+
実施例10−2工程1にて得られた化合物(2−2)(0.0640g,0.153mmol)、N−エトキシカルボニル−2−エトキシ−1,2−ジヒドロキノリン(0.0446g,0.180mmol)の混合物にジクロロメタン(2mL)を室温にて加え、室温にて15分撹拌した。反応溶液に上記工程12にて得られた化合物(3−13)(0.143g,0.139mmol)のジクロロメタン(2mL)溶液を加え、室温にて五時間撹拌した後、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィークロロホルム:メタノール=99.5:0.5(v/v)〜92.5:7.5(v/v)]で精製し、目的物(3−14)(0.103g,52%)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:9.93(1H,s),8.21−8.16(2H,m),8.07−8.04(1H,m),7.83−7.64(2H,m),7.60−7.55(3H,m),7.51−7.28(10H,m),7.19−7.16(2H,m),7.10−7.04(1H,m),6.92−6.90(2H,m),6.76−6.70(1H,m),6.39(1H,s),5.77−5.75(1H,m),5.21−5.18(1H,m),5.03−4.99(1H,m),4.82−4.79(1H,m),4.37−4.35(1H,m),4.21−4.20(2H,m),4.02−3.24(26H,m),3.16−3.13(1H,m),2.79−2.59(2H,m),2.39−2.28(2H,m),
2.05−1.97(2H,m),1.91−1.77(4H,m),1.57−1.54(3H,m),1.28−1.23(3H,m),
0.85−0.80(6H,m),0.67−0.61(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:1431(M+H)+
[実施例10−4:薬物リンカー2]
実施例10−3工程1にて得られた化合物(3−2)(5.06g,9.67mmol)と1,3−ジブロモプロパン(4.93mL,48.4mmol)を、実施例10−3工程2と同様に反応させ、目的物(4−1)(4.85g,78%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.35(1H,s),7.26(1H,s),5.52−5.50(1H,m),4.65−4.63(1H,m),4.61−4.55(1H,m),4.25−4.14(3H,m),3.92(3H,s),3.82−3.62(5H,m),3.57−3.54(1H,m),2.86−2.84(1H,m),2.41−2.39(2H,m),2.06−1.99(1H,m),1.03−0.97(2H,m),0.87(9H,s),0.10(6H,s),0.04(9H,s).
MS(APCI、ESI)m/z:645[81Br,(M+H)+],643[79Br,(M+H)+].
上記工程1にて得られた化合物(4−1)(4.85g,7.54mmol)を、実施例10−3工程3と同様に反応させ、目的物(4−2)(4.05g,定量的)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.35(1H,s),7.26(1H,s),5.53−5.51(1H,m),4.66−4.61(2H,m),4.32−4.30(1H,m),4.21−4.16(2H,m),3.91−3.85(4H,m),3.82−3.74(1H,m),3.71−3.59(4H,m),2.99−2.96(1H,m),2.43−2.37(2H,m),2.15−2.09(2H,m),1.04−0.96(2H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI、ESI)m/z:531[81Br,(M+H)+],529[79Br,(M+H)+].
上記工程2にて得られた化合物(4−2)(7.54mmol)を、実施例10−3工程4と同様に反応させ、目的物(4−3)(3.73g,93%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.34(1H,s),7.29(1H,s),5.56−5.53(1H,m),4.72−4.69(1H,m),4.67−4.61(1H,m),4.23−4.17(3H,m),3.97−3.88(4H,m),3.82−3.75(1H,m),3.74−3.56(4H,m),2.82−2.77(1H,m),2.43−2.38(2H,m),1.06−0.94(2H,m),0.08−0.00(9H,m).
上記工程3にて得られた化合物(4−3)(3.73g,7.08mmol)を、実施例10−3工程5と同様に反応させ、目的物(4−4)(3.27g,70%)を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:661[81Br,(M+H)+],659[79Br,(M+H)+].
上記工程4にて得られた化合物(4−4)(3.27g,4.96mmol)を、実施例10−3工程6と同様に反応させ、目的物(4−5)(2.49g,81%)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:7.49−7.47(2H,m),7.40(1H,s),7.31−7.24(2H,m),6.93−6.88(2H,m),5.33−5.31(1H,m),5.25−5.18(1H,m),4.81−4.80(1H,m),4.23−4.10(2H,m),3.85(3H,s),3.77(3H,s),3.70−3.59(3H,m),3.52−3.40(2H,m),3.15−3.08(1H,m),2.33−2.27(2H,m),0.86−0.74(2H,m),−0.07(9H,s).
MS(APCI、ESI)m/z:619[81Br,(M+H)+],617[79Br,(M+H)+].
上記工程5にて得られた化合物(4−5)(2.49g,4.04mmol)を、実施例10−3工程7と同様に反応させ、目的物(4−6)(1.59g,84%)を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:473[81Br,(M+H)+],471[79Br,(M+H)+].
上記工程6にて得られた化合物(4−6)(1.59g,3.38mmol)を、実施例10−3工程8と同様に反応させ、目的物(4−7)(1.39g,87%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.54(1H,s),7.54−7.51(1H,m),7.32−7.29(2H,m),6.89−6.87(2H,m),6.10(1H,s),4.32−4.28(2H,m),4.14−4.13(2H,m),3.85(3H,s),3.82(3H,s),3.63−3.62(2H,m),3.57−3.55(2H,m),3.40−3.36(1H,m),2.76−2.72(1H,m),2.40−2.37(2H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:475[81Br,(M+H)+],473[79Br,(M+H)+].
上記工程7にて得られた化合物(4−7)(1.40g,0.2.95mmol)を、実施例10−3工程9と同様に反応させ、目的物(4−8)(0.885g,54%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.34(1H,s),7.27−7.25(2H,m),7.22(1H,s),6.86−6.84(2H,m),6.73(1H,s),5.76−5.74(1H,m),5.11−5.09(2H,m),4.62−4.59(2H,m),4.33−4.31(1H,m),4.16−4.13(3H,m),3.88(3H,s),3.79(3H,s),3.60−3.59(3H,m),3.27−3.23(1H,m),2.69−2.65(1H,m),2.37−2.34(2H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:559[81Br,(M+H)+],557[79Br,(M+H)+].
上記工程8にて得られた化合物(4−8)(0.0381g,0.0683mmol)と実施例10−1工程10で得られた化合物(1−11)(0.0552g、0.0683mmol)を、実施例10−3工程10と同様に反応させ、目的物(4−9)(0.0712g,81%)を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:1284(M+H)+.
上記工程9にて得られた化合物(4−9)(0.0712g,0.0554mmol)を、実施例10−3工程11と同様に反応させ、目的物(4−10)(0.0671g,定量的)を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:1170(M+H)+.
上記工程10にて得られた化合物(4−10)(0.0571mmol)を、実施例10−3工程12と同様に反応させ、目的物(4−11)(0.0574g,99%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:9.16(1H,s),7.93−7.91(1H,m),7.55−7.52(1H,m),7.50−7.47(3H,m),7.35−7.32(2H,m),7.21(1H,s),7.13−7.11(2H,m),6.90−6.87(2H,m),6.40(1H,s),6.08(1H,s),5.90−5.87(1H,m),5.37−5.34(1H,m),4.73−4.53(3H,m),4.23−4.08(5H,m),3.89(3H,s),3.82(3H,s),3.78−3.72(5H,m),3.57−3.51(3H,m),3.38−3.30(3H,m),2.76−2.71(1H,m),2.36−2.24(4H,m),1.78−1.42(6H,m),1.00−0.98(3H,m),0.87−0.84(3H,m),0.74−0.62(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:1002(M+H)+.
上記工程11にて得られた化合物(4−11)(0.189g,0.189mmol)と実施例10−2工程1で得られた化合物(2−2)(0.087g、0.207mmol)を、実施例10−3工程13と同様に反応させ、目的物(4−12)(0.169g,64%)を得た。
[実施例10−5:薬物リンカー3]
4,4’−[1,5−ペンタンジイルビス(オキシ)]ビス(5−メトキシ−2−ニトロ安息香酸)(5−1)(5.41g,10.9mmol,Journal of Medicinal Chemistry 2004,47,1161)のジクロロメタン(50mL)溶液に、0℃にて塩化オキサリル(5.63mL,65.7mmol)を加え、N,N−ジメチルホルムアミド(0.0844mL,1.09mmol)滴下した。反応溶液を室温まで昇温し、2時間撹拌した。減圧留去して得られた残渣をジクロロメタン(100mL)に溶解し、メチル(6S)−5−アザスピロ[2.4]ヘプタン−6−カルボキシレート塩酸塩(4.28g,24.1mmol,Tetrahedron Letters 2012. 53. 3847)とトリエチルアミン(6.07mL,43.8mmol)のジクロロメタン溶液(100mL)に窒素雰囲気下、−40℃で滴下した。反応溶液を0℃に昇温して2時間撹拌した。反応混合物に1規定塩酸(100mL)を加え、有機層を水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去し、目的物(5−2)(8.40g、定量的)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:7.71(2H,s),6.88(2H,s),4.63(2H,m),4.15−4.12(4H,m),3.94(6H,s),3.71(6H,s),3.25(2H,m),3.10(2H,m),2.31−2.28(2H,m),1.90−1.83(6H,m),1.60−1.58(2H,m),0.71−0.49(8H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:769(M+H)+.
上記工程1にて得られた化合物(5−2)(8.40g,10.9mmol)のテトラヒドロフラン(100mL)溶液に、水素化ほう素リチウム(714mg,32.8mmol)を加え、0℃にて30分撹拌し、室温に昇温して1時間撹拌した。0℃にて1規定塩酸を加えた後、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧下にて溶媒留去して、目的物(5−3)(7.70g,99%)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:7.67(2H,s),7.05(2H,s),4.86−4.74(2H,m),4.22−4.12(6H,m),3.92(6H,s),3.83−3.73(2H,m),3.62−3.51(2H,m),3.29(1H,m),3.11(2H,m),2.96(1H,m),2.12−2.03(2H,m),1.82−1.77(6H,m),1.59−1.56(2H,m),0.67−0.41(8H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:713(M+H)+.
上記工程2にて得られた化合物(5−3)(7.70g、10.8mmol)をピリジン(20mL)及び無水酢酸(10mL,105.9mmol)に溶解して、室温にて撹拌した。減圧留去して、目的物(5−4)(8.38g,97%)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:7.68(2H,s),7.03(2H,s),4.47−4.46(2H,m),4.36−4.27(4H,m),4.13−4.11(6H,m),3.92(6H,s),3.16(2H,m),2.98(2H,m),2.17(1H,m),2.06(6H,s),1.84(4H,m),1.68(1H,m),1.58(2H,m),0.64−0.45(8H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:797(M+H)+.
上記工程3にて得られた化合物(5−4)(8.28g,10.4mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド(100mL)溶液に、5%パラジウム炭素(54%水分、1.00g)を加えた後、反応溶液を水素雰囲気下、室温にて6時間激しく撹拌した。セライトろ過した後、ろ液を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[クロロホルム:メタノール=100:0(v/v)〜90:10(v/v)]にて精製し、目的物(5−5)(5.05g,66%)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:6.66(2H,s),6.36(2H,s),5.11(4H,s),4.49(2H,s),4.19(4H,m),3.90(4H,m),3.62(6H,s),3.48−3.46(2H,m),3.33(2H,s),3.23−3.20(2H,m),2.01(6H,s),1.78−1.74(6H,m),1.55(2H,m),0.61−0.58(4H,m),0.49−0.48(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:737(M+H)+.
上記工程4にて得られた化合物(5−5)(5.05g,6.85mmol)のジクロロメタン(100mL)溶液に、ピリジン(1.10mL,13.7mmol)を加え、窒素雰囲気下、−78℃にてクロロギ酸アリル(0.725mL,6.85mmol)を加え、2時間撹拌した。減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=70:30(v/v)〜100:0(v/v)、クロロホルム:メタノール=100:0(v/v)〜90:10(v/v)]にて精製し、目的物であるビスアリルオキシカルボニル体(5−6b)(1.36g,22%)と、モノアリルオキシカルボニル体(5−6)(2.63g,47%)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:9.14(2H,s),7.14(2H,s),6.85(2H,s),5.94(2H,m),5.33(2H,m),5.21(2H,m),4.55(4H,m),4.47(1H,s),4.23(3H,s),3.96(4H,m),3.74(6H,s),3.34(6H,s),3.31(2H,m),3.21(2H,m),2.04(6H,s),1.79(4H,m),1.67(2H,m),1.56(2H,m),0.56−0.48(8H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:905(M+H)+.
モノアリルオキシカルボニル体(5−6):
1H−NMR(DMSO−D6)
δ:9.14(1H,s),7.14(1H,s),6.85(1H,s),6.65(1H,s),6.35(1H,s),5.95(1H,m),5.33(1H,m),5.22(1H,m),5.11(2H,s),4.55(2H,m),4.48(2H,s),4.23−4.14(4H,m),3.96(2H,m),3.90(2H,m),3.74(3H,s),3.63(3H,s),3.49(1H,m),3.38−3.30(4H,m),3.21(1H,m),2.04(3H,s),2.01(3H,s),1.77(5H,m),1.68(1H,m),1.56(2H,m),0.63−0.48(8H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:821(M+H)+.
上記工程5で得られたモノアリルオキシカルボニル体(5−6)(2.00g,2.44mmol)とN−[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]−L−バリル−N−[4−(ヒドロキシメチル)フェニル]−L−アラニンアミド(1.10g,2.92mmol,WO2011130598)を、実施例10−1工程6と同様に反応させ、目的物(5−7)(2.64g,89%)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:10.02(1H,s),9.14(2H,s),8.18(1H,m),7.59(2H,m),7.33(2H,m),7.27(1H,m),7.14(2H,s),6.85(2H,s),5.99−5.86(2H,m),5.31(2H,n),5.19(2H,m),5.03(2H,s),4.55(2H,m),4.48(2H,n),4.41(2H,m),4.23−4.21(3H,m),3.94−3.91(4H,m),3.88−3.86(2H,m),3.74(3H,s),3.74(3H,s),3.34(4H,s),3.32−3.30(2H,m),3.20−3.18(2H,m),2.03(6H,s),1.96(1H,m),1.79(4H,s),1.66(1H,m),1.55(2H,s),1.30(3H,m),0.88(3H,m),0.83(3H,m),0.54−0.49(8H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:1224(M+H)+.
上記工程6にて得られた化合物(5−7)(2.64g,2.16mmol)のメタノール(10mL)溶液に、炭酸カリウム(1.49g,10.8mmol)を加え、室温で3時間撹拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液(100mL)を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧留去して、目的物(5−8)(2.21g,90%)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:10.04(1H,s),9.18(1H,s),8.18(1H,m),7.59(2H,m),7.33(2H,m),7.26(1H,m),7.22(1H,s),7.14(2H,s),6.89(2H,s),5.98−5.86(2H,m),5.31(2H,m),5.19(2H,m),5.04(2H,s),4.80(2H,m),4.55(2H,m),4.48(2H,m),4.41(1H,m),4.26(2H,s),3.96−3.94(4H,m),3.90−3.85(1H,m),3.74(6H,s),3.59(2H,m),3.33(6H,s),3.09(1H,m),1.93−1.83(8H,m),1.57−1.54(2H,m),1.30(3H,m),0.88(3H,m),0.83(3H,m),0.52−0.43(8H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:1140(M+H)+.
上記工程7にて得られた化合物(5−8)(2.03g,1.78mmol)のジクロロメタン(50mL)溶液に、デスマーチンペルヨージナン(1.59g,3.74mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(100mL)を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[クロロホルム:メタノール=100:0(v/v)〜90:10(v/v)]にて精製し、目的物(5−9)(2.05g,定量的)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:9.99(1H,s),8.16(1H,m),7.54(2H,m),7.32−7.22(3H,m),7.08−7.04(2H,m),6.80−6.72(2H,m),6.55(2H,s),5.94−5.86(2H,m),5.75(2H,m),5.31−5.04(2H,m),4.81(1H,m),4.62(1H,m),4.48−4.38(4H,m),4.00−3.87(4H,m),3.79−3.76(7H,m),3.54(2H,m),3.42−3.40(2H,m),3.33(4H,s),3.14(2H,m),2.35(2H,m),1.80−1.78(4H,m),1.59−1.56(4H,m),1.29(3H,m),0.87(3H,m),0.83(3H,m),0.70−0.59(8H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:1136(M+H)+.
上記工程8にて得られた化合物(5−9)(2.05g,1.80mmol)を、実施例10−3工程12と同様に反応させ、目的物(5−10)(1.02g,60%)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:10.08(1H,s),7.57(2H,m),7.32−7.20(3H,m),7.05(2H,s),6.68−6.60(3H,m),5.74(1H,m),4.99−4.58(4H,m),3.99−3.94(4H,m),3.78−3.73(6H,m),3.66−3.38(4H,m),3.15−3.01(3H,m),2.40−2.34(3H,m),1.89−1.81(6H,m),1.57−1.53(4H,m),1.28(3H,m),0.88(3H,m),0.78(3H,m),0.64−0.55(8H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:950(M+H)+.
上記工程9にて得られた化合物(5−10)(0.710g,0.747mmol)と実施例10−2工程1にて得られた化合物(2−2)(0.313g、0.747mmol)をジクロロメタン(1.5mL)とメタノール(0.1mL)の混合溶媒に溶解した。4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリド(0.264g,0.897mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー[クロロホルム:メタノール=100:0(v/v)〜80:20(v/v)]にて精製し目的物(5−11)(0.671g,66%)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:9.91(1H,s),8.32(1H,s),8.23−7.91(3H,m),7.81−7.19(14H,m),7.04(1H,m),6.80−6.62(3H,m),5.77−5.75(1H,m),5.20(1H,m),5.01(1H,m),4.79(1H,m),4.46−4.35(1H,m),4.04(4H,m),3.86−3.38(18H,m),3.22−3.15(2H,m),2.67−2.63(1H,m),2.46−2.23(3H,m),2.09−1.91(2H,m),1.80−1.78(5H,m),1.57(3H,m),1.27(3H,s),1.11−1.04(1H,m),0.87−0.79(6H,m),0.63−0.55(6H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:1351(M+H)+.
[実施例10−6:薬物リンカー4]
4−(ベンジルオキシ)−5−メトキシ−2−ニトロ安息香酸(6−1)(6.07g,20.0mmol,Tetrahedron 1995,51,5617)、N,N−ジメチルホルムアミド(1.08mL,13.9mmol)のジクロロメタン(100mL)溶液に、氷冷下にて塩化オキサリル(3.43mL,40.0mmol)を5分間かけて滴下した。室温にて反応溶液を5時間撹拌した後、減圧留去し、得られた残渣をジクロロメタン(20mL)に溶解させ、減圧留去した。この操作を3回繰り返した後に、残渣をジクロロメタン(5mL)に懸濁させ、これに過剰のジエチルエーテルとヘキサンを加え、ろ過し、減圧下に乾燥させることにより粗酸クロリドを得た。得られた酸クロリドをジクロロメタンに溶解させ、−40℃(ドライアイス−アセトニトリル浴)に冷却し、メチル(6S)−5−アザスピロ[2.4]ヘプタン−6−カルボキシレート塩酸塩(4.22g,22.0mmol,Tetrahedron Letters 2012.53.3847)、トリエチルアミン(3.36mL,24.2mmol)を徐々に加えた。反応混合物を一晩かけて室温にまで昇温した。反応混合物に1規定塩酸を加え、反応混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層を水,飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=100:0〜50:50]にて精製し、目的物(6−2)(6.55g,80%)を得た。
上記工程1にて得られた化合物(6−2)(6.55g,16.0mmol)のエタノール(150mL),テトラヒドロフラン(150mL)溶液に窒素雰囲気下、ラネーニッケル(7.00g)を加えた。反応混合物にヒドラジン一水和物(7mL)を加え、50℃まで徐々に昇温した。50℃にて2時間撹拌した後にラネーニッケル(3.00g)、ヒドラジン一水和物(3mL)を加え、1時間撹拌した。反応混合物にTHF(100mL)を加えて、セライトろ過した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=100:0〜25:75]にて精製し、目的物(6−3)(4.42g,73%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.82(1H,s),7.48(1H,s),7.42−7.35(4H,m),7.32−7.31(1H,m),6.44(1H,s),5.16(2H,s),4.16−4.10(1H,m),3.93(3H,s),3.78−3.76(1H,m),3.39−3.37(1H,m),2.45−2.43(1H,m),2.24−2.21(1H,m),0.83−0.61(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:379(M+H)+
上記工程2にて得られた化合物(6−3)(10.0g,26.4mmol)のテトラヒドロフラン(150mL)溶液に−40℃にて、2.6mol/Lのノルマルブチルリチウムノルマルヘキサン溶液(12.0mL,31.8mmol)をゆっくりと滴下した。反応溶液を−40℃にて15分間撹拌し後、2−(クロロメトキシ)エチルトリメチルシラン(5.57mL,31.7mmol)をゆっくりと滴下した。反応溶液を室温にて3時間撹拌した後、水を加え酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=100:0〜30:70]にて精製し、目的物(6−4)(11.8g,88%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.45−7.44(2H,m),7.37−7.32(4H,m),7.28(1H,s),5.48−5.46(1H,m),5.21(2H,s),4.50−4.48(1H,m),4.22−4.20(1H,m),3.95(3H,s),3.73−3.70(2H,m),3.62−3.60(1H,m),3.41−3.38(1H,m),2.45−2.43(1H,m),2.23−2.20(1H,m),0.98−0.96(2H,m),0.83−0.68(4H,m),0.04(9H,s).
MS(APCI、ESI)m/z:509(M+H)+
上記工程3にて得られた化合物(6−4)(18.7g,36.8mmol)のテロラヒドロフラン(50mL)、エタノール(100mL)溶液に、窒素雰囲気下において5%のパラジウム炭素触媒(5.00g)を加えた。直ちに窒素風船を水素風船に付け替え、反応混合物を水素雰囲気下にて6時間撹拌した。反応混合物にクロロホルムを加えて希釈し、セライトろ過をした後、濾液を減圧留去して得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=100:0〜25:75]にて精製し、目的物(6−5)(15.1g,98%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.38(1H,s),7.28(1H,s),6.01(1H,s),5.49−5.47(1H,m),4.70−4.68(1H,m),4.24−4.22(1H,m),3.96(3H,s),3.76−3.71(2H,m),3.66−3.64(1H,m),3.42−3.39(1H,m),2.47−2.45(1H,m),2.23−2.21(1H,m),1.01−0.99(2H,m),0.89−0.63(4H,m),0.03(9H,s).
MS(APCI、ESI)m/z:419(M+H)+
上記工程4にて得られた化合物にて得られた化合物(6−5)(2.77g,6.62mmol)を、実施例10−3工程2と同様に反応させ、目的物(6−6)(3.31g,88%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.36(1H,s),7.25(1H,s),5.55(1H,m),4.65(1H,m),4.24−4.23(1H,m),4.11−4.03(2H,m),3.93(3H,s),3.85−3.78(1H,m),3.72−3.69(2H,m),3.46−3.39(3H,m),2.47−2.44(1H,m),2.25−2.22(1H,m),1.95−1.91(4H,m),1.67−1.59(1H,m),1.03−0.95(2H,m),0.90−0.85(1H,m),0.70−0.66(4H,m),0.05(9H,s).
上記工程5にて得られた化合物(6−6)(3.31g,5.83mmol)を、実施例10−3工程7と同様に反応させ、目的物(6−7)(1.11g,45%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.81(1H,m),7.53(1H,s),6.82(1H,s),4.13−4.06(2H,m),3.97(3H,s),3.88−3.83(1H,m),3.69(1H,m),3.52−3.39(3H,m),2.55−2.52(1H,m),2.06−1.89(5H,m),1.67−1.63(2H,m),0.76−0.72(4H,m).
上記工程6にて得られた化合物(6−7)(2.56g,6.08mmol)を、実施例10−3工程8と同様に反応させ、目的物(6−8)(1.15g,45%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.60(1H,s),6.07(1H,s),4.11−4.04(1H,m),3.99(2H,m),3.87−3.84(1H,m),3.85(3H,s),3.73(1H,m),3.58−3.53(2H,m),3.47−3.42(3H,m),2.03−1.78(6H,m),1.65−1.63(2H,m),0.77−0.56(4H,m).
上記工程7にて得られた化合物(6−8)(1.15g,2.72mmol)を、実施例10−3工程9と同様に反応させ、目的物(6−9)(1.14g,82%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.23(1H,s),6.69(1H,s),5.79(1H,s),5.13−5.10(2H,m),4.68−4.66(1H,m),4.48−4.45(2H,m),4.01(2H,m),3.92(3H,s),3.76(1H,m),3.54−3.37(3H,m),2.39(1H,m),1.95−1.90(4H,m),1.68−1.61(3H,m),1.44(1H,m),0.75−0.66(4H,m).
上記工程8にて得られた化合物(6−9)(0.374g,0.737mmol)と実施例10−1工程10にて得られた化合物(1−11)(0.452g、0.56mmol)を、実施例10−3工程10と同様に反応させ、目的物(6−10)(0.589g,65%)を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:1234(M+H)+
上記工程9にて得られた化合物(6−10)(0.589g,0.477mmol)を、実施例10−3工程11と同様に反応させ、目的物(6−11)(0.382g,71%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:8.90(1H,s),7.55(2H,m),7.25−7.21(2H,m),6.74(2H,m),6.38(1H,s),5.90−5.87(5H,m),5.33−5.09(8H,m),4.66−4.60(8H,m),3.98−3.91(10H,m),3.77−3.30(12H,m),2.42−2.36(2H,m),1.77−1.39(6H,m),0.91−0.70(14H,m).
上記工程10にて得られた化合物(6−11)(0.382g,0.341mmol)を、実施例10−3工程12と同様に反応させ、目的物(6−12)(0.200g,62%)を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:952(M+H)+
上記工程11にて得られた化合物(6−12)(0.0560g,0.0588mmol)と実施例10−2工程1にて得られた化合物(2−2)(0.022g、0.053mmol)を、実施例10−3工程13と同様に反応させ、目的物(6−13)(0.0500g,63%)を得た。
[薬物部分の合成]
[実施例10−7:薬物1]
実施例1工程5にて得られた化合物(1−6)(4.59g,8.15mmol)を、実施例10−3工程9と同様に反応させ、目的物(7−1)(4.86g,92%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:8.97(1H,s),7.77(1H,s),6.77(1H,s),5.97−5.94(1H,m),5.39−5.21(2H,m),4.67−4.59(3H,m),4.00−3.98(1H,m),3.74−3.66(5H,m),3.05−3.03(1H,m),2.30−2.28(1H,m),1.72−1.70(1H,m),1.30−1.27(3H,m),1.11−1.05(18H,m),0.99−0.91(9H,m),0.61−0.53(4H,m),0.10−0.06(6H,m). MS(APCI、ESI)m/z:647(M+H)+
上記工程1にて得られた化合物(7−1)(4.86g,7.51mmol)を、実施例10−1工程7と同様に反応させ、目的物(7−2)(3.42g,86%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:8.52(1H,s),7.71(1H,s),6.77(1H,s),6.00−5.94(1H,m),5.35−5.27(2H,m),4.65−4.64(3H,m),4.33−4.31(1H,m),3.82−3.77(5H,m),3.68−3.66(1H,m),3.15−3.13(1H,m),1.89−1.86(2H,m),1.30−1.26(3H,m),1.14−1.10(18H,m),0.66−0.51(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:533(M+H)+
上記工程2にて得られた化合物(7−2)(6.68g,12.5mmol)を、実施例10−1工程8と同様に反応させ、目的物(7−3)(6.44g,97%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.20(1H,s),6.69(1H,s),5.89−5.78(2H,m),5.18−5.15(2H,m),4.62−4.60(1H,m),4.49−4.47(1H,m),3.85(3H,s),3.74−3.71(1H,m),3.59−3.57(1H,m),3.33−3.30(2H,m),2.43−2.40(1H,m),1.76−1.73(1H,m),1.28−1.20(3H,m),1.09−1.07(18H,m),0.74−0.65(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:531(M+H)+
上記工程3にて得られた化合物(7−3)(3.24g,6.10mmol)を、実施例10−1工程9と同様に反応させ、目的物(7−4)(3.86g,98%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.20(1H,s),6.67(1H,s),6.01−5.98(1H,m),5.79−5.73(1H,m),5.14−5.10(2H,m),4.64−4.61(1H,m),4.37−4.34(1H,m),3.86(3H,s),3.72−3.69(1H,m),3.52−3.50(1H,m),3.29−3.26(1H,m),2.38−2.34(1H,m),1.55−1.51(1H,m),1.28−1.24(3H,m),1.15−1.07(18H,m),0.81−0.66(13H,m),0.21(3H,s),0.18(3H,s). MS(APCI、ESI)m/z:645(M+H)+
上記工程4にて得られた化合物(7−4)(4.49g,6.96mmol)を、実施例10−1工程10と同様に反応させ、目的物(7−5)(3.24g,95%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.25(1H,s),6.73(1H,s),6.02−6.00(1H,m),5.91(1H,s),5.77−5.75(1H,m),5.11−5.09(2H,m),4.64−4.62(1H,m),4.41−4.40(1H,m),3.95(3H,s),3.72−3.70(1H,m),3.54−3.53(1H,m),3.29−3.26(1H,m),2.36−2.34(1H,m),1.56−1.54(1H,m),0.79−0.67(13H,m),0.21(3H,s),0.20(3H,s).
MS(APCI、ESI)m/z:489(M+H)+
上記工程5にて得られた化合物(7−5)(0.080g,0.164mmol)と実施例10−3工程9にて得られた化合物(3−10)(0.095g、0.163mmol)を、実施例10−3工程10と同様に反応させ、目的物(7−6)(0.160g,98%)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:7.44−7.42(3H,m),7.12−7.10(2H,m),7.05−7.03(1H,m),6.92−6.90(2H,m),6.61−6.59(1H,m),5.87−5.81(3H,m),5.10−5.07(4H,m),4.66−4.55(3H,m),4.43−4.39(2H,m),4.21−3.94(5H,m),3.83(3H,s),3.81(3H,s),3.76(3H,s),3.65−3.62(1H,m),3.56−3.54(1H,m),3.42−3.39(1H,m),3.22−3.14(2H,m),2.77−2.73(1H,m),2.42−2.33(1H,m),1.81−1.79(4H,m),1.55−1.44(3H,m),0.82(9H,s),0.72−0.53(4H,m),0.19(3H,s),0.17(3H,s).
MS(APCI、ESI)m/z:993(M+H)+
上記工程6にて得られた化合物(7−6)(160mg,0.161mmol)を、実施例10−3工程11と同様に反応させ、目的物(7−7)(141mg,定量的)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:7.44−7.42(3H,m),7.08−7.06(3H,m),6.92−6.90(2H,m),6.82−6.79(1H,m),6.56−6.54(1H,m),5.77−5.74(3H,m),5.09(4H,s),4.58−4.55(3H,m),4.43−4.41(2H,m),4.16−4.01(5H,m),3.81−3.81(6H,m),3.76(3H,s),3.64(1H,s),3.56−3.53(1H,m),3.42−3.38(1H,m),3.25−3.13(2H,m),2.74−2.70(1H,m),2.37−2.34(1H,m),1.82−1.79(4H,m),1.59−1.56(3H,m),0.66−0.62(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:879(M+H)+
上記工程7にて得られた化合物(7−7)(141mg,0.161mmol)を、実施例10−3工程12と同様に反応させ、目的物(7−8)(109.8mg,99%)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:7.92−7.91(1H,m),7.45(1H,s),7.39−7.37(2H,m),7.33(1H,s),7.29(1H,s),6.92−6.89(2H,m),6.85(1H,s),6.56−6.54(1H,m),6.31(1H,s),4.19−4.12(2H,m),4.05−3.99(1H,m),3.95−3.93(2H,m),3.82−3.79(4H,m),3.76(3H,s),3.66(3H,s),3.52−3.46(3H,m),3.30−3.21(2H,m),2.78−2.74(1H,m),2.45−2.42(1H,m),2.06−2.05(1H,m),1.89−1.82(4H,m),1.60−1.58(2H,m),0.80−0.63(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:693(M+H)+
[実施例10−8:薬物2]
実施例6工程1にて得られた化合物(6−2)(6.49g,14.7mmol)のテトラヒドロフラン(147mL)溶液に、水素化ホウ素リチウム(0.642g,29.5mmol)を0℃で加え、室温で2時間撹拌した。反応溶液に1規定塩酸を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧留去した。得られた粗生成物(8−1)(6.94g,定量的)を次工程で使用した。
MS(APCI、ESI)m/z:413(M+H)+
上記工程1にて得られた化合物(8−1)(4.50g,11.0mmol)を、実施例10−1工程8と同様に反応させ、目的物(8−2)(1.94g,43%)を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:411(M+H)+
上記工程2にて得られた化合物(8−2)(1.94g,4.73mmol)のテトラヒドロフラン(25mL)、酢酸エチル(25mL)、メタノール(25mL)の混合溶液に、窒素雰囲気下、5%パラジウム炭素(54%水分、1.0g)を加えた後、反応溶液を水素雰囲気下、室温にて22時間撹拌した。反応溶液をセライト濾過した後、濾液を減圧留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=80:20(v/v)〜0:100(v/v)]にて精製し、目的物(8−3)(1.20g,93%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.55(1H,s),6.16(1H,s),5.86(1H,s),4.08−4.02(2H,m),3.86(3H,s),3.72−3.69(1H,m),3.57−3.37(3H,m),2.04−2.01(1H,m),1.78−1.75(1H,m),0.79−0.53(4H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:275(M+H)+
実施例10−7工程5にて得られた化合物(7−5)(0.300g,0.614mmol)を、実施例10−3工程2と同様に反応させ、目的物(8−4)(0.388g,99%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.24(1H,s),6.60(1H,s),6.02−5.98(1H,m),5.80−5.75(1H,m),5.11−5.06(2H,m),4.68−4.64(1H,m),4.40−4.38(1H,m),4.02−3.98(2H,m),3.92(3H,s),3.72−3.69(1H,m),3.54−3.52(1H,m),3.46−3.41(2H,m),3.29−3.26(1H,m),2.38−2.34(1H,m),1.94−1.87(4H,m),1.65−1.62(2H,m),1.55−1.55(1H,m),0.86(9H,s),0.75−0.67(4H,m),0.24−0.22(6H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:639[81Br,(M+H)+],637[79Br,(M+H)+].
上記工程4にて得られた化合物(8−4)(0.203g0.318mmol)と上記工程3にて得られた化合物(8−3)(0.131g,0.478mmol)を、実施例10−3工程10と同様に反応させ、目的物(8−5)(0.0880g,33%)を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:831(M+H)+
上記工程5にて得られた化合物(8−5)(0.0880g,0.106mmol)を、実施例10−3工程11と同様に反応させ、目的物(8−6)(0.0500g、66%)を得た。
MS(APCI、ESI)m/z:717(M+H)+
上記工程6にて得られた化合物(8−6)(0.0500g、0.0698mmol)を実施例10−3工程12と同様に反応させ、目的物(8−7)(0.0330g,77%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.80(1H,m),7.58(1H,s),7.52(1H,s),6.81(1H,s),6.05(1H,s),4.17−3.97(5H,m),3.94(3H,s),3.87(1H,m),3.84(3H,s),3.72−3.68(3H,m),3.51−3.45(5H,m),2.54−2.51(1H,m),2.03−1.90(6H,m),1.75−1.68(2H,m),0.66(8H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:615(M+H)+
[実施例10−9:薬物3]
実施例10−5工程5にて得られたビスアリルオキシカルボニル体(5−6b)(0.460g,0.508mmol)を実施例10−5工程7と同様に反応させ、目的物(9−1)(0.421g,定量的)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:9.19(2H,s),7.22(2H,s),6.89(2H,s),5.97−5.92(2H,m),5.33(2H,m),5.22(2H,m),4.81(2H,m),4.55(4H,m),4.26(2H,s),3.96(4H,m),3.74(6H,s),3.62(2H,m),3.56(2H,s),3.37(2H,m),3.11(2H,m),1.88−1.78(8H,m),1.56−1.54(2H,m),0.54−0.43(8H,m).
MS(APCI、ESI)m/z:821(M+H)+.
上記工程1にて得られた化合物(9−1)(0.421g,0.513mmol)を、実施例10−5工程8と同様に反応させ、目的物(9−2)(0.326g,78%)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:7.07(2H,s),6.80(2H,s),6.55(2H,m),5.84−5.81(2H,m),5.75(2H,m),5.09−5.05(4H,m),4.62(2H,mz),4.40(2H,m),3.98(4H,m),3.81(6H,s),3.54(2H,m),3.43−3.37(2H,m),3.14(2H,m),2.35(2H,m),1.81−1.79(4H,m),1.59−1.56(4H,m),0.70−0.59(8H,m). MS(APCI、ESI)m/z:817(M+H)+.
上記工程2にて得られた化合物(9−2)(0.326g,0.399mmol)を、実施例10−3工程12と同様に反応させ、目的物(9−3)(0.208g,85%)を得た。
1H−NMR(DMSO−D6)δ:7.91(2H,m),7.32(2H,s),6.84(2H,s),4.11(2H,m),4.06(2H,m),3.82(6H,s),3.51−3.31(6H,m),2.43(2H,m),2.05(2H,m),1.82−1.80(4H,m),1.60−1.58(2H,m),0.79−0.77(2H,m),0.68−0.64(6H,m).MS(APCI、ESI)m/z:613(M+H)+.
[実施例10−10:薬物4]
実施例10−3工程1で得られた化合物(3−2)(5.00g,9.66mmol)を実施例10−3工程3と同様に反応させ目的物(10−1)(3.95g,100%)を得た。MS(APCI,ESI)m/z:409(M+H)+
上記工程1で得られた化合物(10−1)(3.95g,9.67mmol)のジクロロメタン(97mL)溶液に、イミダゾール(1.65g,24.2mmol)、トリイソプロピルシリルクロリド(2.46mL,11.6mmol)とジメチルホルムアミド(5mL)を加え、室温で21時間攪拌した。反応溶液に水を加え、クロロホルムで抽出し、得られた有機層を水で洗浄し、減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー[ヘキサン:酢酸エチル=100:0(v/v)〜20:80(v/v)]にて精製し、目的物(10−2)(4.78g,87%)を得た。
MS(APCI,ESI)m/z:565(M+H)+
上記工程2にて得られた化合物(10−2)(4.78g,8.43mmol)を、実施例10−3工程4と同様に反応させ、目的物(10−3)(2.36g,50%)を得た。MS(APCI,ESI)m/z:563(M+H)+
上記工程3にて得られた化合物(10−3)(1.53g,2,72mmol)を実施例10−3工程5と同様に反応させ、目的化合物(10−4)(1.27g,69%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.31(2H,s),7.15(1H,m),5.52(1H,m),4.65(1H,m),4.57(1H,m),3.95−3.89(1H,m),3.87(3H,s),3.75−3.58(2H,m),3.18−3.14(1H,m),1.33−1.25(3H,m),1.10(18H,m),1.00−0.96(2H,m),0.03(9H,s).
上記工程4で得られた化合物(10−4)(0.519g,0.747mmol)を、実施例10−3工程6と同様に反応させ、目的化合物(10−5)(0.511g,定量的)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.41−7.31(5H,m),6.91−6.85(2H,m),5.52(1H,m),4.64(1H,m),4.57(1H,m),3.97−3.90(1H,m),3.88(3H,s),3.83(3H,s),3.75−3.56(2H,m),3.19−3.09(1H,m),1.36−1.23(3H,m),1.11(18H,m),1.02−0.97(2H,m),0.03(9H,s).
MS (APCI,ESI)m/z:653[(M+H)+]
上記工程5で得られた化合物(10−5)(0.178g,0.272mmol)を、実施例10−3工程7と同様に反応させ、目的化合物(10−6)(0.094g,68%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.87(1H,m),7.51(1H,s),7.41−7.39(1H,m),7.36−7.33(2H,m),6.93−6.89(2H,m),6.86(1H,s),4.44−4.38(1H,m),3.90(3H,s),3.83(3H,s),3.61−3.53(1H,m),3.41−3.34(1H,m),1.33−1.25(3H,m),1.11−1.06(18H,m).
MS (APCI,ESI)m/z:507[(M+H)+]
上記工程6で得られた化合物(10−6)(0.063g,0.124mmol)を用いて、実施例10−3工程8と同様に反応させ、目的化合物(10−7)(0.046g,72%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.53−7.48(2H,m),7.33−7.29(2H,m),6.90−6.86(2H,m),6.13−6.11(1H,m),4.36−4.29(1H,m),4.11(1H,s),3.82(3H,s),3.79(3H,s),3.59−3.50(2H,m),3.40−3.31(1H,m),2.78−2.68(1H,m),1.31−1.20(3H,m),1.13−1.02(18H,m). MS(APCI,ESI)m/z:509[(M+H)+]
上記工程7で得られた化合物(10−7)(0.046g,0.090mmol)を用いて、実施例10−3工程9と同様に反応させ、目的化合物(10−8)(0.03g,56%)を得た。1H−NMR(CDCl3)δ:7.39−7.36(1H,m),7.31−7.28(2H,m),7.22(1H,s),6.90−6.86(3H,m),6.75−6.72(1H,m),5.82−5.69(1H,m),5.18−5.08(2H,m),4.59−4.52(1H,m),4.48−4.39(1H,m),4.39−4.29(1H,m),4.23−4.12(1H,m),3.86(3H,s),3.82(3H,s),3.64−3.58(1H,m),3.32−3.25(1H,m),2.73−2.65(1H,m),1.30−1.20(2H,m),1.12−1.06(18H,m).
MS(APCI,ESI)m/z:593[(M+H)+]
上記工程8で得られた化合物(10−8)(0.030g,0.050mmol)を、実施例10−1工程10と同様に反応させ、目的化合物(10−9)(0.015g,0.034mmol)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.39−7.25(4H,m),6.92−6.78(3H,m),6.03−5.92(1H,m),5.86−5.68(1H,m),5.20−5.07(2H,m),4.66−4.57(1H,m),4.52−4.40(1H,m),4.40−4.27(1H,m),4.27−4.16(1H,m),3.95(3H,s),3.82(3H,s),3.66−3.59(1H,m),3.32−3.21(1H,m),2.74−2.64(1H,m).
MS(APCI,ESI)m/z:437[(M+H)+]
実施例7工程5で得られた化合物(7−5)(0.131g,0.268mmol)を実施例10−4工程1と同様に反応させ、目的物(10−10)(0.086g,52%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.24(1H,s),6.65(1H,s),6.02(1H,m),5.87−5.71(1H,m),5.15−5.04(2H,m),4.72−4.62(1H,m),4.44−4.32(1H,m),4.23−4.07(3H,m),3.92(3H,s),3.77−3.47(4H,m),3.28(1H,m),2.37(3H,m),1.57−1.52(1H,m),0.86(9H,s),0.82−0.57(4H,m),0.21(6H,m).
MS(APCI,ESI)m/z:611[81Br,(M+H)+],609[79Br,(M+H)+]
上記工程10で得られる化合物(10−10)(0.015g,0.034mmol)と、上記工程9で得られる化合物(10−9)(0.030g,0.048mmol)を用いて、実施例10−3工程10と同様に反応させ、目的化合物(10−11)(0.032g,96%)を得た。
MS(APCI,ESI)m/z:965[(M+H)+]
上記工程11で得られた化合物(10−11)(0.031g,0.032mmol)を実施例10−3工程11と同様に反応させ、目的物(10−12)(0.026g,95%)を得た。
MS(APCI,ESI)m/z:851[(M+H)+]
上記工程12で得られた化合物(10−12)(0.026g,0.030mmol)を実施例10−3工程12と同様に反応させ、目的物(10−13)(0.018g,88%)を得た。
1H−NMR(CDCl3)δ:7.80(1H,m),7.54−7.51(3H,m),7.33−7.29(2H,m),6.91−6.85(3H,m),6.14(1H,s),4.35−4.17(6H,m),3.95(3H,s),3.85(3H,s),3.82(3H,s),3.76−3.25(5H,m),2.79−2.69(1H,m),2.52(1H,m),2.45−2.35(1H,m),2.03−1.96(1H,m),1.28−1.23(2H,m),0.78−0.69(4H,m).
MS(APCI,ESI)m/z:665[(M+H)+]
[実施例11:[N3−PEG(3)]−MSG1−Ox]
[N3−PEG(3)]−MSG1合成
工程1:(MSG1−)Asn
市販品であるmonosialo−Asn free (1S2G/1G2S−10NC−Asn 、(株)糖鎖工学研究所製)(「(MSG−)Asn」と呼ぶ)(500mg)を以下の条件で逆相HPLC分離精製し、1st main peakとして溶出される(MSG1−)Asn(保持時間 15〜19 min 付近)と2nd main peakとして溶出される(MSG2−)Asn(保持時間 21〜26 min 付近)に分離した。0.1%ぎ酸水溶液を溶離液として使用し、装置にはELS−PDAトリガー分取システム(日本分光株式会社製)を使用し、カラムにはInertsil ODS−3(10um、 30Φx250mm、GLサイエンス社製)を使用し、流速を30mL/minとした。溶出中にUV検出(210nm)された最初のピークに帰属するフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥して、目的物(238mg)を得た。
上記工程1で得られた化合物(229mg)を200mMりん酸緩衝溶液(pH6.25)(1145μL)に溶解させ、EndoM(東京化成工業(株)製、1U/mL))水溶液(100μL)を加え、35℃で6日間インキュベートした。反応終了後、反応液をVIVASPIN 15R (Hydrosart膜、30K,6,000xG)を用いて限外ろ過し、得られた通過液を逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液を溶離液として使用し、装置にはELS−PDA トリガー分取システム(日本分光株式会社製)、カラムにはInertsil ODS−3(GLサイエンス社製)を使用した。溶出中にUV検出(210nm)された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥し、目的物(117mg)を得た。
5mlサンプリングチューブ((株)イナ・オプティカ)に、11−アジド−3,6,9−トリオキサウンデカン−1−アミン(0.108mL,0.541mmol)と上記工程2で得られたMSG1(117mg,0.068mmol)の水溶液(1.2mL)を加え、1時間撹拌した後に、凍結乾燥した。凍結乾燥後の5mlサンプリングチューブに、O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(103mg,0.27mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(1.2mL)とジイソプロピルエチルアミン(0.046mL,0.27mmol)を加え、37℃で3時間撹拌した。反応終了後、あらかじめジエチルエーテル(20ml)を加えた遠沈管(50ml)に反応液を移した。小型遠心機(日立工機、CF16RX)を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。さらにジエチルエーテル(10ml)を加えて、遠心分離操作後、デカンテーションを行った。続いて、アセトニトリル(10mL)を加え、遠心分離後、デカンテーションする操作を二回繰り返した後、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。得られた固形物を上記工程2と同様の条件にて逆相HPLC精製を行い、目的物(94.2mg)を得た。
5mLサンプリングチューブ((株)イナ・オプティカ製)に、上記工程3で合成した化合物(100mg)、2−クロロ−1,3−ジメチル−1H−ベンズイミダゾール−3−イウム−クロライド(伏見製薬所製、56mg,0.257mmol)の水溶液(520μl)を加えた。氷冷後の反応液にりん酸三カリウム(165mg, 0.78mmol)の水溶液(520μl)を加え、氷冷下で3時間撹拌した。得られた反応液を、アミコンウルトラ(ウルトラセル30K、 Merck Millipore製)を用いて限外ろ過し、固形物を除去した。その通過液を、ゲルろ過クロマトグラフィーにて精製した。装置にはPurif−Rp2(昭光サイエンティフィック製)を使用し、カラムにはHiPrep 26/10 Desalting(GEヘルスケア製)を使用し、移動相に0.03%− NH3水溶液を使用し、流速を10mL/min、分画容量を10mLとした。溶出中にUV検出(220nm)された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、1N水酸化ナトリウム水溶液(104μl,0.104mmol)を加えて凍結乾燥し、目的物(84mg)を得た。
工程1:(Fucα1,6)GlcNAc−H01L02抗体の調製
H01L02抗体溶液ca.21.1mg/mL(50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(4.07mL)に、7.7mg/mL野生型EndoS溶液(PBS)を0.233mL加え、37℃で4時間インキュベートした。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション(BIO−RAD製)を用いて確認した。反応終了後、以下の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトカラムによる精製を行った。
精製装置:AKTA avant(GE ヘルスケア製)
カラム:HiTrap rProtein A FF (5mL)(GE ヘルスケア製)
流速:5mL/min(チャージ時は1.25mL/min)
上記で得た反応液を複数回に分けて精製した。カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー(20mMりん酸緩衝液(pH6.0))を1.25mL/minで4CV(Column Volume)流し、更に5mL/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液(20mMりん酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 塩化ナトリウム溶液)を15CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Eution buffer、PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。目的物を含むフラクションを共通操作Cを用いて、5mMりん酸緩衝液50mM2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH6.8)への緩衝液交換を行った。
精製装置:AKTA avant(GE ヘルスケア製)
カラム:Bio−Scale Mini CHT Type Iカートリッジ(5mL)(BIO−RAD製)
流速:5mL/min(チャージ時は1.25mL/min)
上記(1)で得られた溶液をカラムの上部へ添加し、A液(5mM りん酸緩衝液、50mM2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH6.8))を1.25mL/minで4CV流し、更に5mL/minで3CV流した。その後、A液とB液(5mMりん酸緩衝液50mM2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH6.8)、2M塩化ナトリウム溶液)を用いて、溶出した。溶出条件は、A液:B液=100:0〜0:100(15CV)である。さらに、洗浄溶液(500mMりん酸緩衝液(pH6.5))を5CV流した。
上記工程1にて得られた11.4mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc−H01L02抗体溶液(50mM りん酸緩衝液(pH6.0))(5.00mL)に、実施例11工程4で合成した糖鎖(9.00mg)の50mMりん酸緩衝液(pH6.0)溶液(0.180mL)、5.10mg/mLのEndoS D233Q/Q303L溶液(PBS)(0.230mL)を加えて、30℃で3時間インキュベートした。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション(BIO−RAD製)を用いて確認した。反応終了後、上記工程1と同様にアフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製を行った後、目的物を含むフラクションを共通操作Cを用いてりん酸緩衝生理食塩水(pH6.0)へ緩衝液交換を行い、9.91mg/mLのH01L02抗体[MSG1−N3]2溶液(りん酸緩衝生理食塩水(pH6.0))(4.00mL)を得た。
H01L02A抗体溶液ca.21.6mg/mL(50mリン酸緩衝溶液(pH6.0))(1.85mL)を用いて、上記実施例12工程1と同様の操作を行い、14.6mg/mLの(Fucα1,6)GlcNAc−H01L02A抗体溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(2.0mL)を得た。
上記工程1で得られた14.6mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc−H01L02A抗体溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(2.0mL)を用いて、実施例12工程2と同様の操作を行うことによって、10.0mg/mLのH01L02A抗体−[MSG1−N3]2溶液(酢酸緩衝液(pH5.5,含ソルビトール))(2.5mL)を得た。
H31L02A抗体溶液ca.23.2mg/mL(50mリン酸緩衝溶液(pH6.0))(3.45mL)を用いて、上記実施例12工程1と同様の操作を行い、8.43mg/mLの(Fucα1,6)GlcNAc−H31L02A抗体溶液(50mM りん酸緩衝液(pH6.0))(6.1mL)を得た。
上記工程1で得られた8.43mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc−H31L02A抗体溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(5.00mL)を用いて、実施例12工程2と同様の操作を行うことによって、6.52mg/mLのH31L02A抗体−[MSG1−N3]2溶液(リン酸緩衝生理食塩水(pH6.0))(4.00mL)を得た。
H11L02A抗体溶液ca.24.2mg/mL(50mリン酸緩衝溶液(pH6.0))(3.0mL)を用いて、上記実施例12工程1と同様の操作を行い、20.42mg/mLの(Fucα1,6)GlcNAc−H11L02A抗体溶液(50mM りん酸緩衝液(pH6.0))(2.7mL)を得た。
上記工程1で得られた20.39mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc−H11L02A抗体溶液(50mM りん酸緩衝液(pH6.0))(1.55mL)を用いて、上記実施例12工程2と同様の操作を行うことによって、10.26mg/mLのH11L02A抗体−[MSG1−N3]2溶液(酢酸緩衝液(pH5.5,含ソルビトール))(2.6mL)を得た。
抗LPS抗体溶液ca.17mg/mL(25mMヒスチジン溶液(pH6.0)、5%ソルビトール溶液)(6.6mL)を用いて、実施例12工程1と同様の操作を行い、21.03mg/mLの(Fucα1,6)GlcNAc−抗LPS抗体溶液(50mM りん酸緩衝液(pH6.0))(5.4mL)を得た。
上記工程1で得られた21.03mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc−抗LPS抗体溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(5.4mL)を用いて、実施例12工程2と同様の操作を行うことによって、9.89mg/mLの抗LPS抗体−[MSG1−N3]2溶液(リン酸緩衝生理食塩水(pH6.0))(7.9mL)を得た。
実施例17に記載のADCは、下記の反応式に示すように実施例12の工程2で得られた抗体と実施例10−3工程13で得られた薬物リンカー(3−14)をコンジュゲーションすることによって合成した。式中、Rは実施例で用いられた薬物リンカーを示す。
工程1:抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
実施例12工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水(pH6.0)溶液(6.76mg/mL,1.50mL)に、室温にて1,2−プロパンジオール(1.42mL)、実施例10−3工程13にて得られた化合物(3−14)の10mMジメチルスルホキシド溶液(0.0836mL;抗体1分子に対して12当量)を加え、チューブローテーター(MTR−103、アズワン株式会社)を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作:上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を6.00mL得た。
[実施例18 ADC2]
実施例18に記載のADCは、下記の反応式に示すように実施例13工程2で得られた抗体と実施例10−4工程12で得られた薬物リンカー(4−12)をコンジュゲーションすることによって合成した。式中、Rは実施例で用いられた薬物リンカーを示す。
工程1:抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
実施例13工程2にて得られた抗体の10mM 酢酸緩衝液, 5% ソルビトール(pH5.5)溶液(10.0mg/mL,100μL)に、室温にて1,2−プロパンジオール(25μL)、実施例10−4工程12にて得られた化合物(4−12)の10mMジメチルスルホキシド溶液(8μL;抗体1分子に対して12当量)と1,2−プロパンジオール(67μL)の混合溶液を加え、チューブローテーター(MTR−103、アズワン株式会社)を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作:上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を1.2mL得た。
[実施例19:ADC3]
実施例19に記載のADCは、実施例13工程2で得られた抗体と実施例10−5工程10で得られた薬物リンカー(5−11)をコンジュゲーションすることによって合成した。
工程1:抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
実施例13工程2にて得られた抗体の10mM 酢酸緩衝液,5% ソルビトール(pH5.5)溶液(10.0mg/mL,100μL)に、室温にて1,2−プロパンジオール(25μL)、実施例10−5工程10にて得られた化合物(5−11)の10mMジメチルスルホキシド溶液(8μL;抗体1分子に対して12当量)と1,2−プロパンジオール(67μL)の混合溶液を加え、チューブローテーター(MTR−103、アズワン株式会社)を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作:上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を1.2mL得た。
[実施例20:ADC4]
実施例20に記載のADCは、実施例13の工程2で得られた抗体と実施例10−6工程12で得られた薬物リンカー(6−13)をコンジュゲーションすることによって合成した。
工程1:抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
実施例13工程2にて得られた抗体の10mM 酢酸緩衝液,5% ソルビトール(pH5.5)溶液(10.0mg/mL,100μL)に、室温にて1,2−プロパンジオール(25μL)、実施例10−6工程12にて得られた化合物(6−13)の10mMジメチルスルホキシド溶液(8μL;抗体1分子に対して12当量)と1,2−プロパンジオール(67μL)の混合溶液を加え、チューブローテーター(MTR−103、アズワン株式会社)を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作:上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を1.2mL得た。
[実施例21:ADC5]
実施例21に記載のADCは、実施例13工程2で得られた抗体と実施例10−3工程13で得られた薬物リンカー(3−14)をコンジュゲーションすることによって合成した。
工程1:抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
実施例13工程2にて得られた抗体の10mM 酢酸緩衝液,5% ソルビトール(pH5.5)溶液(10.0mg/mL,1.70mL)に、室温にて1,2−プロパンジオール(0.850mL)、実施例10−3工程13にて得られた化合物(3−14)の10mMジメチルスルホキシド溶液(0.141mL;抗体1分子に対して12当量)と1,2−プロパンジオール(0.710mL)の混合溶液を加え、チューブローテーター(MTR−103、アズワン株式会社)を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作:上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を10.5mL得た。
[実施例22:ADC6]
実施例22に記載のADCは、下記の反応式に示すように実施例14の工程2で得られた抗体と実施例10−3工程13で得られた薬物リンカー(3−14)をコンジュゲーションすることによって合成した。式中、Rは実施例で用いられた薬物リンカーを示す。
工程1:抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
実施例14工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水(pH6.0)溶液(10.1mg/mL,0.400mL)に、室温にて1,2−プロパンジオール(0.367mL)、実施例10−3工程13にて得られた化合物(3−14)の10mMジメチルスルホキシド溶液(0.0333mL;抗体1分子に対して12当量)を加え、チューブローテーター(MTR−103、アズワン株式会社)を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作:上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を3.50mL得た。
実施例23〜26に記載のADCは、下記の反応式に示すように実施例15の工程2で得られた抗体と実施例10−3〜10−6で得られた薬物リンカーをコンジュゲーションすることによって合成した。式中、Rは各実施例で用いられた薬物リンカーによって異なる。
工程1:抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
実施例15工程2にて得られた抗体の10mM 酢酸緩衝液,5% ソルビトール(pH5.5)溶液(10.54mg/mL,0.4mL)に、室温にて1,2−プロパンジオール(0.100mL)、実施例10−3工程13にて得られた化合物(3−14)の10mMジメチルスルホキシド溶液(0.035mL;抗体1分子に対して12当量)と1,2−プロパンジオール(0.266mL)の混合溶液を加え、チューブローテーター(MTR−103、アズワン株式会社)を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作:上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を2.5mL得た。
[実施例24:ADC8]
工程1:抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
実施例15工程2にて得られた抗体の10mM 酢酸緩衝液, 5% ソルビトール(pH5.5)溶液(2.8mg/mL,0.3mL)に、室温にて1,2−プロパンジオール(75μL)、実施例10−4工程12にて得られた化合物(4−12)の10mMジメチルスルホキシド溶液(7μL;抗体1分子に対して12当量)と1,2−プロパンジオール(218μL)の混合溶液を加え、チューブローテーター(MTR−103、アズワン株式会社)を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作:上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を2.5mL得た。
[実施例25:ADC9]
工程1:抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
実施例15工程2にて得られた抗体の10mM 酢酸緩衝液, 5% ソルビトール(pH5.5)溶液(2.8mg/mL,300μL)に、室温にて1,2−プロパンジオール(75μL)、実施例10−5工程10にて得られた化合物(5−11)の10mMジメチルスルホキシド溶液(7μL;抗体1分子に対して12当量)と1,2−プロパンジオール(218μL)の混合溶液を加え、チューブローテーター(MTR−103、アズワン株式会社)を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作:上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を2.5mL得た。
[実施例26:ADC10]
工程1:抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
実施例15工程2にて得られた抗体の10mM 酢酸緩衝液,5% ソルビトール(pH5.5)溶液(2.8mg/mL,300μL)に、室温にて1,2−プロパンジオール(75μL)、実施例10−6工程12にて得られた化合物(6−13)の10mMジメチルスルホキシド溶液溶液(7μL;抗体1分子に対して12当量)と1,2−プロパンジオール(218μL)の混合溶液を加え、チューブローテーター(MTR−103、アズワン株式会社)を用いて、室温にて48時間反応させた。
精製操作:上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を2.5mL得た。
実施例27に記載のADCは、下記の反応式に示すように実施例16の工程2で得られた抗体と実施例10−3工程13で得られた薬物リンカー(3−14)をコンジュゲーションすることによって合成した。式中、Rは実施例で用いられた薬物リンカーを示す。
工程1:抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション
実施例16工程2にて得られた抗体のリン酸緩衝生理食塩水(pH6.0)溶液(9.89mg/mL,0.40mL)に、室温にて1,2−プロパンジオール(0.367mL)、実施例10−3工程13にて得られた化合物(3−14)を10mM含むジメチルスルホキシド溶液(0.0328mL;抗体1分子に対して12当量)を加え、チューブローテーター(MTR−103、アズワン株式会社)を用いて、室温にて2日間反応させた。
精製操作:上記溶液を共通操作Dを用いて精製を行い、目的の化合物を有する溶液を2.50mL得た。
[実施例28] 実施例10−1に示される化合物(1−11)の立体配置解析 [実施例10−1:中間体1]に記載の化合物(1−11)についてselective 1D ROESYスペクトルで得られた相関(下図)より、11’位の絶対立体配置の解析を行った。1’α−Hと11’−Hとの間、3’α−Hと11’−Hとの間、及び1’β−Hと3’β−Hとの間に相関が認められることから、11’位の絶対立体配置はS配置であることが分かった。
Selective 1D ROESYスペクトル相関測定時に使用した1H−NMR
1HNMR(500MHz,CDCl3,27℃)δ:8.76(1H,s),7.43(2H,brd),7.20(1H,s),7.08(2H,d,J=8.3Hz),7.00(1H,br),6.66(1H,s),6.44(1H,s),6.00(1H,H11’,d,J11’,11’a=9.2Hz),5.89(1H,m),5.53(1H,brd),5.30(1H,d,J=17.2Hz),5.20(1H,d,J=10.3Hz),5.15(1H,d,JABq=12.5Hz),4.85(1H,d,JABq=12.5Hz),4.66(1H,m),4.604.52(2H,m),4.07(1H,m),3.84(3H,s),3.71(1H,H―3’β,d,Jgem=11.7Hz),3.53(1H,H−11’a,m),3.26(1H,H−3’α,d,Jgem=11.7Hz),2.35(1H,H−1’β,dd,J1’ β,11’a=8.30Hz,Jgem=13.1Hz),2.14(1H,m),1.54(1H,H−1’α,d,Jgem=13.1Hz),1.41(3H,d,J=6.90Hz),0.95(3H,d,J=6.80Hz),0.92(3H,d,J=6.80Hz),0.81(9H,s),0.80−0.70(1H,m),0.70−0.59(3H,m),0.2−0.06(6H,m)
従って、[実施例10−1:中間体1]に記載の化合物(1−9)、(1−10)及び(1−11)並びに化合物(1−11)を用いて合成された薬物リンカー1、2及び4並びにこれらの合成中間体11’位の絶対立体配置はS配置であることが分かった。また、同様の合成手法で得られる薬物リンカー3およびその中間体11’位の絶対立体配置もS配置と決定した。
(1−10):N−[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]−L−バリル−N−{4−[({[(11’S,11a’S)−11’−{[tert−ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}−7’−メトキシ−5’−オキソ−8’−{[トリ(プロパン−2−イル)シリル]オキシ}−11’,11a’−ジヒドロ−1’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−10’(5’H)−イル]カルボニル}オキシ)メチル]フェニル}−L−アラニンアミド
(1−11):N−[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]−L−バリル−N−{4−[({[(11’S,11a’S)−11’−{[tert−ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}−8’−ヒドロキシ−7’−メトキシ−5’−オキソ−11’,11a’−ジヒドロ−1’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−10’(5’H)−イル]カルボニル}オキシ)メチル]フェニル}−L−アラニンアミド
[実施例10−3:薬物リンカー1]に示される工程1〜13は、以下のように表される。
(3−12):N−[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]−L−バリル−N−{4−[({[(11’S,11a’S)−11’−ヒドロキシ−7’−メトキシ−8’−{[5−({(11aS)−7−メトキシ−2−(4−メトキシフェニル)−5−オキソ−10−[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]−5,10,11,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−8−イル}オキシ)ペンチル]オキシ}−5’−オキソ−11’,11a’−ジヒドロ−1’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−10’(5’H)−イル]カルボニル}オキシ)メチル]フェニル}−L−アラニンアミド
(3−13):L−バリル−N−{4−[({[(11’S,11a’S)−11’−ヒドロキシ−7’−メトキシ−8’−[(5−{[(11aS)−7−メトキシ−2−(4−メトキシフェニル)−5−オキソ−5,10,11,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−8−イル]オキシ}ペンチル)オキシ]−5’−オキソ−11’,11a’−ジヒドロ−1’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−10’(5’H)−イル]カルボニル}オキシ)メチル]フェニル}−L−アラニンアミド(3−13)
(3−14):N−[4−(11,12−ジデヒドロジベンゾ[b,f]アゾシン−5(6H)−イル)−4−オキソブタノイル]グリシルグリシル−L−バリル−N−{4−[({[(11’S,11a’S)−11’−ヒドロキシ−7’−メトキシ−8’−[(5−{[(11aS)−7−メトキシ−2−(4−メトキシフェニル)−5−オキソ−5,10,11,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−8−イル]オキシ}ペンチル)オキシ]−5’−オキソ−11’,11a’−ジヒドロ−1’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−10’(5’H)−イル]カルボニル}オキシ)メチル]フェニル}−L−アラニンアミド
[実施例10−4:薬物リンカー2]に示される工程1〜12は、以下のように表される。
(4−10):N−{[(プロプ−2−エン−1−イル)オキシ]カルボニル}−L−バリル−N−[4−({[(11’S,11’aS)−11’−ヒドロキシ−7’−メトキシ−8’−(3−{[(11aS)−7−メトキシ−2−(4−メトキシフェニル)−5−オキソ−10−{[(プロプ−2−エン−1−イル)オキシ]カルボニル}−5,10,11,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−8−イル]オキシ}プロポキシ)−5’−オキソ−11’,11’a−ジヒドロ−1’H,3’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−10’(5’H)−カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]−L−アラニンアミド
(4−11):L−バリル−N−[4−({[(11’S,11’aS)−11’−ヒドロキシ−7’−メトキシ−8’−(3−{[(11aS)−7−メトキシ−2−(4−メトキシフェニル)−5−オキソ−5,10,11,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−8−イル]オキシ}プロポキシ)−5’−オキソ−11’,11’a−ジヒドロ−1’H,3’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−10’(5’H)−カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]−L−アラニンアミド
(4−12):N−[4−(11,12−ジデヒドロジベンゾ[b,f]アゾシン−5(6H)−イル)−4−オキソブタノイル]グリシルグリシル−L−バリル−N−[4−({[(11’S,11’aS)−11’−ヒドロキシ−7’−メトキシ−8’−(3−{[(11aS)−7−メトキシ−2−(4−メトキシフェニル)−5−オキソ−5,10,11,11a−テトラヒドロ−1H−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン−8−イル]オキシ}プロポキシ)−5’−オキソ−11’,11’a−ジヒドロ−1’H,3’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−10’(5’H)−カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]−L−アラニンアミド
[実施例10−5:薬物リンカー3]に示される工程1〜10は、以下のように表される。
(5−10):L−バリル−N−{4−[({[(11’S,11a’S)−11’−ヒドロキシ−7’−メトキシ−8’−[(5−{[(11a’S)−7’−メトキシ−5’−オキソ−5’,11a’−ジヒドロ−1’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−8’−イル]オキシ}ペンチル)オキシ]−5’−オキソ−11’,11a’−ジヒドロ−1’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−10’(5’H)−イル]カルボニル}オキシ)メチル]フェニル}−L−アラニンアミド
(5−11):N−[4−(11,12−ジデヒドロジベンゾ[b,f]アゾシン−5(6H)−イル)−4−オキソブタノイル]グリシルグリシル−L−バリル−N−{4−[({[(11’S,11a’S)−11’−ヒドロキシ−7’−メトキシ−8’−[(5−{[(11a’S)−7’−メトキシ−5’−オキソ−5’,11a’−ジヒドロ−1’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−8’−イル]オキシ}ペンチル)オキシ]−5’−オキソ−11’,11a’−ジヒドロ−1’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−10’(5’H)−イル]カルボニル}オキシ)メチル]フェニル}−L−アラニンアミド
[実施例10−6:薬物リンカー4]に示される工程1〜12は、以下のように表される。
(6−11):N−[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]−L−バリル−N−{4−[({[(11’S,11a’S)−11’−ヒドロキシ−7’−メトキシ−8’−{[5−({(11a’S)−7’−メトキシ−5’−オキソ−10’−[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]−5’,10’,11’,11a’−テトラヒドロ−1’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−8’−イル}オキシ)ペンチル]オキシ}−5’−オキソ−11’,11a’−ジヒドロ−1’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−10’(5’H)−イル]カルボニル}オキシ)メチル]フェニル}−L−アラニンアミド
(6−12):L−バリル−N−{4−[({[(11’S,11a’S)−11’−ヒドロキシ−7’−メトキシ−8’−[(5−{[(11a’S)−7’−メトキシ−5’−オキソ−5’,10’,11’,11a’−テトラヒドロ−1’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−8’−イル]オキシ}ペンチル)オキシ]−5’−オキソ−11’,11a’−ジヒドロ−1’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−10’(5’H)−イル]カルボニル}オキシ)メチル]フェニル}−L−アラニンアミド
(6−13):N−[4−(11,12−ジデヒドロジベンゾ[b,f]アゾシン−5(6H)−イル)−4−オキソブタノイル]グリシルグリシル−L−バリル−N−{4−[({[(11’S,11a’S)−11’−ヒドロキシ−7’−メトキシ−8’−[(5−{[(11a’S)−7’−メトキシ−5’−オキソ−5’,10’,11’,11a’−テトラヒドロ−1’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−8’−イル]オキシ}ペンチル)オキシ]−5’−オキソ−11’,11a’−ジヒドロ−1’H−スピロ[シクロプロパン−1,2’−ピロロ[2,1−c][1,4]ベンゾジアゼピン]−10’(5’H)−イル]カルボニル}オキシ)メチル]フェニル}−L−アラニンアミド
また、実施例17〜27で得られるADCの式中Rは以下である。
参考例2)−1 抗体−薬物コンジュゲートの作製 NOV0712−DM4
抗体と薬物リンカーのコンジュゲーション:参考例1にて作製したNOV0712を、製造方法1に記載した共通操作B(280nm吸光係数として1.51mLmg−1cm−1を使用)及びCを用いて、20mM HEPES8.1(LIFE TECHNOLOGIES社製 HEPES, 1M Buffer Solution(20mL)を1M水酸化ナトリウムでpH8.1とした後、蒸留水にて1Lとした)にて9.7mg/mLに調製し、20℃で10分間インキュベートした。次いでWO2016/024195号公開特許公報に記載の10mM 1−(2,5−ジオキソピロリジン−1−イルオキシ)−1−オキソ−4−(ピリジン−2−イルジスルファニル)ブタン−2−スルフォン酸のDMA溶液(0.366mL;抗体一分子に対して5.2当量)、10mM N2’−デアセチル−デアセチル−N2’−(4−メチル−4−メルカプト−1−オキソペンチル)−メイタンシン(DM4)のDMA溶液(0.366mL;抗体一分子に対して6.8当量)、及び0.243mLのDMAを加え、20℃で16時間インキュベートし、薬物リンカーを抗体へ結合させた。次に、1M 酢酸水溶液を加えpH5.0とし、さらに室温にて20分間撹拌し、薬物リンカーの反応を停止させた。
抗体濃度:2.58mg/mL,抗体収量:72.2mg(93%),共通操作Eにて測定された抗体一分子あたりの平均薬物結合数(n):3.0。
CDH6陽性ヒト腫瘍細胞株に対する抗体−薬物コンジュゲートのin vitro細胞増殖抑制活性評価
実施例2)−3にてCDH6の発現を確認した、ヒト卵巣腫瘍細胞株NIH:OVCAR−3,OV−90,PA−1及びヒト腎細胞腫瘍細胞株786−O(全てATCCから入手)を37℃、5% CO2の条件下で培養した後、図9に示す各細胞株の播種数/100μL/wellになるよう96ウェルプレートに播種し、37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した。翌日、実施例27で作製したADC11、実施例17で作製したADC1、実施例21で作製したADC5、実施例23で作製したADC7、又は実施例22で作製したADC6を、終濃度100(nM)から0.000256(nM)になるように、5倍公比で希釈した抗体−薬物コンジュゲートを添加した。6日間培養後に生存細胞数をCellTiter−GloTM Luminescent Cell Viability Assay(Promega)によるATPの定量で測定した。細胞増殖抑制活性としてのIC50値は次式で算出し、小数点第3位を四捨五入し小数点第2位まで表記した。
IC50(nM)=antilog((50−d)×(LOG10(b)−LOG10(a))÷(d−c)+LOG10(b))
a:検体濃度a
b:検体濃度b
c:検体濃度aにおける生細胞率
d:検体濃度bにおける生細胞率
a、bは生細胞率50%を挟む2点でa>b
図9に抗体−薬物コンジュゲートを各々添加した際のIC50(nM)を示した。In vitroでのCDH6発現量が高い卵巣腫瘍細胞株3株では、CDH6へ結合しない抗体−薬物コンジュゲートであるADC11のIC50値に比べて、3種の抗CDH6抗体の薬物コンジュゲートのIC50値は極めて低いことから、CDH6の発現に特異的な非常に強い細胞増殖抑制活性を有することが示された。また、抗体のCDH6への結合活性(表3)と、抗体−薬物コンジュゲートの細胞増殖抑制活性に相関が認められた。In vitroでのCDH6発現量が低い腎細胞腫瘍細胞株においても、同様の傾向が認められた(図9)。
抗体−薬物コンジュゲートの抗腫瘍効果は、CDH6陽性ヒト腫瘍細胞株の細胞を免疫不全マウスに移植した動物モデルを用いて評価した。4−5週齢のBALB/c ヌードマウス(CAnN.Cg−Foxnl[nu]/CrlCrlj[Foxnlnu/Foxnlnu]、日本チャールス・リバー)及び、SCIDマウス(CB17/Icr−Prkdc[scid]/CrlCrlj、日本チャールス・リバー)を実験使用前にSPF条件化で3日間以上馴化した。マウスには滅菌した固形飼料(FR−2,Funabashi Farms Co.,Ltd)を給餌し、滅菌した水道水(5−15ppm次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加して調製)を与えた。移植した腫瘍の長径及び短径を電子式デジタルノギス(CD−15CX,Mitutoyo Corp.)で1週間に2回測定し、以下に示す計算式により腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積(mm3)=1/2×長径(mm)×[短径(mm)]2
抗体−薬物コンジュゲートは全てABS緩衝液(10mM−Acetate Buffer, 5% Sorbitol, pH5.5)(NACALAI)で希釈し、各実施例に示す用量にて尾静脈内投与した。また、コントロール群(Vehicle群)としてABS緩衝液を同様に投与した。1群あたり6匹のマウスを実験に用いた。
実施例2)−3にてCDH6の発現を確認した、CDH6陽性ヒト卵巣腫瘍細胞株OV−90(ATCC)をマトリゲル(コーニング社)に懸濁し、2.5×106cellsを雌ヌードマウスの右側腹部に皮下移植し(Day0)、Day14に無作為に群分けを実施した。群分け実施日に、実施例17で作製したADC1、又は実施例27で作製したADC11を、0.4mg/kgの用量で尾静脈内投与した。また、参考例2)−1で作製したNOV0712−DM4を、10mg/kgの用量で尾静脈内投与した。結果を図10に示す。横軸は投与後日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲はSE値を示す。
実施例2)−3にてCDH6の発現を確認した、CDH6陽性ヒト腎細胞腫瘍細胞株Caki−1(ATCC)をマトリゲル(コーニング社)に懸濁し、2.5×106cellsを雌ヌードマウスの右側腹部に皮下移植し(Day0)、Day13に無作為に群分けを実施した。群分け実施日に、実施例17で作製した抗体−薬物コンジュゲートADC1、又は実施例27で作製したADC11を、0.4mg/kgの用量で尾静脈内投与した。また、参考例2)−1で作製したNOV0712−DM4を、10mg/kgの用量で尾静脈内投与した。結果を図11に示す。横軸は投与後日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲はSE値を示す。
実施例2)−3にてCDH6の発現を確認した、CDH6陽性ヒト卵巣腫瘍細胞株NIH:OVCAR−3(ATCC)をマトリゲル(コーニング社)に懸濁し、1×107cellsを雌ヌードマウスの右側腹部に皮下移植し(Day0)、Day28に無作為に群分けを実施した。群分け実施日に、実施例17で作製したADC1、実施例21で作製したADC5、実施例22で作製したADC6、又は実施例27で作製したADC11を、0.4mg/kgの用量で尾静脈内投与した。結果を図12に示す。横軸は投与後日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲はSE値を示す。
実施例2)−3にてCDH6の発現を確認した、CDH6陽性ヒト卵巣腫瘍細胞株OV−90(ATCC)をマトリゲル(コーニング社)に懸濁し、2.5×106cellsを雌ヌードマウスの右側腹部に皮下移植し(Day0)、Day17に無作為に群分けを実施した。群分け実施日に、実施例17で作製したADC1、実施例21で作製したADC5、実施例23で作製したADC7、又は実施例22で作製したADC6を、0.2mg/kg又は0.4mg/kgの用量で尾静脈内投与した。結果を図13に示す。横軸は投与後日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲はSE値を示す。
実施例2)−3にてCDH6の発現を確認した、CDH6陽性ヒト卵巣腫瘍細胞株PA−1(ATCC)をマトリゲル(コーニング社)に懸濁し、7.5×106cellsを雌ヌードマウスの右側腹部に皮下移植し(Day0)、Day17に無作為に群分けを実施した。群分け実施日に、実施例21で作製したADC5、実施例22で作製したADC6又は実施例27で作製したADC11を、0.4mg/kgの用量で尾静脈内投与した。結果を図14に示す。横軸は投与後日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲はSE値を示す。
実施例2)−3にてCDH6の発現を確認した、CDH6陽性ヒト腎細胞腫瘍細胞株786−O(ATCC)をマトリゲル(コーニング社)に懸濁し、5×106cellsを雄SCIDマウスの右側腹部に皮下移植し(Day0)、Day38に無作為に群分けを実施した。群分け実施日に、実施例21で作製したADC5、実施例22で作製したADC6を、0.4mg/kgの用量で尾静脈内投与した。また、実施例27で作製したADC11を、0.4mg/kgの用量で尾静脈内投与した。結果を図15に示す。横軸は投与後日数、縦軸は腫瘍体積、誤差範囲はSE値を示す。
配列番号2:EC1
配列番号3:EC2
配列番号4:EC3
配列番号5:EC4
配列番号6:EC5
配列番号7:カニクイザルCDH6 ORF
配列番号8:カニクイザルCDH6 プライマー1
配列番号9:カニクイザルCDH6 プライマー2
配列番号10:rG019の軽鎖の可変領域アミノ酸配列
配列番号11:rG019の軽鎖の可変領域ヌクレオチド配列
配列番号12:rG019 CDRL1
配列番号13:rG019 CDRL2
配列番号14:rG019 CDRL3
配列番号15:rG019の重鎖の可変領域アミノ酸配列
配列番号16:rG019の重鎖の可変領域ヌクレオチド配列
配列番号17:rG019 CDRH1
配列番号18:rG019 CDRH2
配列番号19:rG019 CDRH3
配列番号20:ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片
配列番号21:ヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG1定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片
配列番号22:chG019軽鎖をコードするDNA断片を含むDNA断片
配列番号23:chG019軽鎖全長アミノ酸配列
配列番号24:chG019軽鎖全長ヌクレオチド配列
配列番号25:chG019軽鎖可変領域ヌクレオチド配列
配列番号26:chG019重鎖全長アミノ酸配列
配列番号27:chG019重鎖全長ヌクレオチド配列
配列番号28:chG019重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号29:chG019重鎖可変領域ヌクレオチド配列
配列番号30:chG019 CDRH2
配列番号31:hL02の軽鎖全長アミノ酸配列
配列番号32:hL02の軽鎖全長ヌクレオチド配列
配列番号33:hL02の軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号34:hL02の軽鎖可変領域ヌクレオチド配列
配列番号35:hL03の軽鎖全長アミノ酸配列
配列番号36:hL03の軽鎖全長ヌクレオチド配列
配列番号37:hL03の軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号38:hL03の軽鎖可変領域ヌクレオチド配列
配列番号39:hH01の重鎖全長アミノ酸配列
配列番号40:hH01の重鎖全長ヌクレオチド配列
配列番号41:hH01の重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号42:hH01の重鎖可変領域ヌクレオチド配列
配列番号43:hH02の重鎖全長アミノ酸配列
配列番号44:hH02の重鎖全長ヌクレオチド配列
配列番号45:hH02の重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号46:hH02の重鎖可変領域ヌクレオチド配列
配列番号47:hH04の重鎖全長アミノ酸配列
配列番号48:hH04の重鎖全長ヌクレオチド配列
配列番号49:hH04の重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号50:hH04の重鎖可変領域ヌクレオチド配列
配列番号51:NOV0712軽鎖全長アミノ酸配列
配列番号52:配列番号51に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号53:NOV0712重鎖全長アミノ酸配列
配列番号54:配列番号53に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号55:hH11の重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号56:hH11の重鎖可変領域ヌクレオチド配列
配列番号57:hH11 CDRH1
配列番号58:hH11 CDRH2
配列番号59:hH11 CDRH3
配列番号60:hH31の重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号61:hH31の重鎖可変領域ヌクレオチド配列
配列番号62:hH31 CDRH1
配列番号63:hH31 CDRH2
配列番号64:hH31 CDRH3
配列番号65:hH01Aの重鎖全長アミノ酸配列
配列番号66:hH01Aの重鎖全長ヌクレオチド配列
配列番号67:hH11Aの重鎖全長アミノ酸配列
配列番号68:hH11Aの重鎖全長ヌクレオチド配列
配列番号69:hH31Aの重鎖全長アミノ酸配列
配列番号70:hH31Aの重鎖全長ヌクレオチド配列
配列番号71:ヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG1LALA定常領域のアミノ酸をコードするDNA配列を含むDNA断片
配列番号72:抗LPS抗体軽鎖全長アミノ酸配列
配列番号73:抗LPS抗体重鎖全長アミノ酸配列
Claims (65)
- 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列への結合に対して、以下の(1)〜(8):
(1)配列番号23の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号26の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
(2)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号39の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
(3)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
(4)配列番号35の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
(5)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号47の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
(6)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号65の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
(7)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号67の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、及び
(8)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号69の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する抗体、
からなる群から選択される抗体のうち少なくともいずれか1つと競合阻害活性を示す、
請求項1に記載の抗体−薬物コンジュゲート。 - 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、以下の(1)〜(4):
(1)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号17に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号18に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号19に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、
(2)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号17に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号30に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号19に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、
(3)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号57に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号58に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号59に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、及び
(4)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号62に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号63に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号64に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、
からなる群から選択されるCDRL1、CDRL2及びCDRL3、及び、CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む、
請求項1又は2のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。 - 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、以下の(1)〜(4):
(1)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(2)配列番号37に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(3)(1)又は(2)のアミノ酸配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
(4)(1)〜(3)のアミノ酸配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
からなる群から選択されるいずれか1つに記載の軽鎖可変領域、並びに、
以下の(5)〜(11):
(5)配列番号41に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(6)配列番号45に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(7)配列番号49に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(8)配列番号55に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(9)配列番号60に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(10)(5)〜(9)のアミノ酸配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び
(11)(5)〜(10)のアミノ酸配列において各CDR配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
からなる群から選択されるいずれか1つに記載の重鎖可変領域、
を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。 - 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、以下の(1)〜(6):
(1)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号41に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(2)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号45に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(3)配列番号37に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号45に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(4)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号49に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(5)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号55に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、又は
(6)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号60に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
のいずれかの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域、
を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。 - 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、以下の(1)〜(7):
(1)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号39の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(2)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(3)配列番号35の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(4)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号47の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(5)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号65の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(6)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号67の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、又は
(7)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号69の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
のいずれかを有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。 - 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号39の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項6に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項6に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号35の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項6に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号47の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項6に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号65の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する請求項6に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号67の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する請求項6に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号69の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する請求項6に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- Lが、−Lb−La−Lp−NH−B−CH2−O(C=O)−*で示され、
式中、*は前記DのN10’位の窒素原子と結合していることを示し、
Bは、1,4−フェニル基、2,5−ピリジル基、3,6−ピリジル基、2,5−ピリミジル基又は2,5−チエニル基であり、
Lpは、以下:
−GGVA−、−GG−(D−)VA−、−VA−、−GGFG−、−GGPI−、−GGVCit−、−GGVK−、及び、−GGPL−、
からなる群から選択されるいずれか1つを示し、
Laは、以下:
−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−、
−C(=O)−(CH2CH2)2−C(=O)−、
−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2)2−C(=O)−、
−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2O)2−CH2−C(=O)−、
−C(=O)−CH2CH2−NH−C(=O)−(CH2CH2O)4−CH2CH2−C(=O)−、
−CH2−OC(=O)−、及び、
−OC(=O)−、
からなる群から選択されるいずれか1つを示し、並びに、
Lbは、次式:
請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。 - Lが、以下:
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGVA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GG−(D−)VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−(CH2CH2)2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGPI−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGFG−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGVCit−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGVK−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGPL−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2)2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2O)2−CH2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−NH−C(=O)−(CH2CH2O)4−CH2CH2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z2−OC(=O)−GGVA−NH−B−CH2−OC(=O)−、及び
−Z3−CH2−OC(=O)−GGVA−NH−B−CH2−OC(=O)−
からなる群から選択されるいずれか1つを示し、
ここで、Z1は、以下の構造式:
Z2は、以下の構造式:
Z3は、以下の構造式:
ここで、Z1、Z2及びZ3の構造式において、*はZ1、Z2又はZ3に隣接するC(=O)、O又はCH2と結合していることを示し、波線はAbの糖鎖又はリモデリングされた糖鎖と結合していることを示し、並びに、
Bは、1,4−フェニル基を示す、
請求項1〜14のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。 - Lが、以下:
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGVA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−(CH2CH2)2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−GGVCit−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2)2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、
−Z1−C(=O)−CH2CH2−C(=O)−NH−(CH2CH2O)2−CH2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−、及び
−Z1−C(=O)−CH2CH2−NH−C(=O)−(CH2CH2O)4−CH2CH2−C(=O)−VA−NH−B−CH2−OC(=O)−
からなる群から選択されるいずれか1つを示し、
ここで、Bは1,4−フェニル基であり、Z1は以下の構造式:
ここで、Z1の構造式において、*はZ1に隣接するC(=O)と結合していることを示し、波線はAbのN297に結合する糖鎖(N297糖鎖)又はそのリモデリングされた糖鎖と結合していることを示す、請求項1〜15のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。 - 抗体が、IgG1、IgG2又はIgG4である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- N297糖鎖が、リモデリングされた糖鎖である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- N297糖鎖が、次式で示される構造を有するN297−(Fuc)MSG1、N297−(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297−(Fuc)SGである、請求項1〜18のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート:
N297糖鎖中の*−L(PEG)−は、*−(CH2CH2−O)n5−CH2CH2−NH−を示し、
ここで、n5は2〜5の整数であることを示し、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ−Manの分岐鎖の1−3鎖側又は/及び1−6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合していることを示し、*は、それぞれの構造式におけるトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す。 - n5が3である、請求項19に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 次の式(XII):
上記で示されるそれぞれの構造式において、m2は1又は2の整数であることを示し、
Abは配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列に特異的に結合し、細胞内に取り込まれる内在化能を有する、IgG抗体又は当該抗体の機能性断片を示し、
AbのN297糖鎖は次式で示される構造を有するN297−(Fuc)MSG1、N297−(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297−(Fuc)SGのいずれか1つであることを示し、
N297糖鎖中の*−L(PEG)−は、*−(CH2CH2−O)3−CH2CH2−NH−であることを示し、
ここで、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ−Manの分岐鎖の1−3鎖側又は/及び1−6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合していることを示し、*は、それぞれの構造式におけるトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す、抗体−薬物コンジュゲート。 - 次の式(XIII):
上記で示されるそれぞれの構造式において、m2は1又は2の整数であることを示し、
Abは配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列に特異的に結合し、細胞内に取り込まれる内在化能を有する、IgG抗体又は当該抗体の機能性断片を示し、
AbのN297糖鎖は次式で示される構造を有するN297−(Fuc)MSG1、N297−(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297−(Fuc)SGのいずれか1つであることを示し、
N297糖鎖中の*−L(PEG)−は、*−(CH2CH2−O)3−CH2CH2−NH−であることを示し、
ここで、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ−Manの分岐鎖の1−3鎖側又は/及び1−6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合していることを示し、*は、それぞれの構造式におけるトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す、抗体−薬物コンジュゲート。 - 次の式(XIV):
上記で示されるそれぞれの構造式において、m2は1又は2の整数であることを示し、
Abは配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列に特異的に結合し、細胞内に取り込まれる内在化能を有する、IgG抗体又は当該抗体の機能性断片を示し、
AbのN297糖鎖は次式で示される構造を有するN297−(Fuc)MSG1、N297−(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297−(Fuc)SGのいずれか1つであることを示し、
N297糖鎖中の*−L(PEG)−は、*−(CH2CH2−O)3−CH2CH2−NH−でであることを示し、
ここで、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ−Manの分岐鎖の1−3鎖側又は/及び1−6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合していることを示し、*は、それぞれの構造式におけるトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す、抗体−薬物コンジュゲート。 - 次の式(XV):
上記で示されるそれぞれの構造式において、m2は1又は2の整数であることを示し、
Abは配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列に特異的に結合し、細胞内に取り込まれる内在化能を有する、IgG抗体又は当該抗体の機能性断片を示し、
AbのN297糖鎖は次式で示される構造を有するN297−(Fuc)MSG1、N297−(Fuc)MSG2もしくはそれらの混合物、又はN297−(Fuc)SGのいずれか1つであることを示し、
N297糖鎖中の*−L(PEG)−は、*−(CH2CH2−O)3−CH2CH2−NH−でであることを示し、
ここで、右端のアミノ基がN297糖鎖のβ−Manの分岐鎖の1−3鎖側又は/及び1−6鎖側の非還元末端のシアル酸の2位のカルボン酸とアミド結合していることを示し、*は、それぞれの構造式におけるトリアゾール環上の1位又は3位の窒素原子と結合していることを示す、抗体−薬物コンジュゲート。 - 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、以下の(1)〜(4):
(1)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号17に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号18に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号19に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、
(2)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号17に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号30に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号19に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、
(3)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号57に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号58に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号59に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、及び
(4)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、及び、配列番号62に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号63に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号64に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、
からなる群から選択されるCDRL1、CDRL2及びCDRL3、及び、CDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む、
請求項21〜28のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。 - 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、以下の(1)〜(6):
(1)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号41に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(2)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号45に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(3)配列番号37に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号45に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(4)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号49に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(5)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号55に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、又は
(6)配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号60に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
のいずれかの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域、
を含む、請求項21〜29のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。 - 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、以下の(1)〜(7):
(1)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号39の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(2)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(3)配列番号35の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(4)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号47の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(5)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号65の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
(6)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号67の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、又は
(7)配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号69の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖、
のいずれかを有する、請求項21〜30のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。 - 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号39の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項31に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項31に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号35の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号43の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項31に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号47の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項31に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号65の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項31に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号67の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項31に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 前記抗体又は当該抗体の機能性断片が、配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号69の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項31に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 抗体―薬物コンジュゲートにおける抗体1分子あたりの平均薬物結合数が、1〜3である、請求項1〜38のいずれか1項に記載の抗体―薬物コンジュゲート。
- 抗体―薬物コンジュゲートにおける抗体1分子あたりの平均薬物結合数が、3〜5である、請求項1〜38のいずれか1項に記載の抗体―薬物コンジュゲート。
- 重鎖がN−結合への糖鎖付加、O−結合への糖鎖付加、N末のプロセッシング、C末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、N末にメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化及びカルボキシル末端において1つ又は2つのアミノ酸が欠失した重鎖からなる群より選択される1又は2以上の修飾を含む抗体である、請求項1〜40のいずれか1項に記載の抗体―薬物コンジュゲート。
- 重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失した、請求項1〜41のいずれか1項に記載の抗体―薬物コンジュゲート。
- 以下の工程:
i)配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列に特異的に結合し、細胞内に取り込まれる内在化能を有する、IgG抗体又は当該抗体の機能性断片を製造する工程、
ii)工程i)で得られた抗体を加水分解酵素で処理し、(Fucα1,6)GlcNAc−抗体を製造する工程、及び、
iii)−1 MSG(9)又はSG(10)のシアル酸の2位のカルボン酸のカルボニル基にアジド基を有するPEGリンカーを導入し、還元末端をオキサゾリン化して得た糖鎖ドナー分子と、糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc−抗体を反応させる工程、又は、
iii)−2 α−アミノ基が保護されていてもよい(MSG−)Asn又は(SG−)Asnのシアル酸の2位のカルボン酸のカルボニル基及び前記Asnのカルボン酸のカルボニル基にアジド基を有するPEGリンカーを導入し、加水分解酵素を作用させた後、還元末端をオキサゾリン化して得た糖鎖ドナー分子と、糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc−抗体を反応させる工程、
を含む、糖鎖リモデリング抗体の製造方法。 - 請求項43に記載の方法により得られた糖鎖リモデリング抗体とドラッグリンカーを反応させる工程を含む、請求項1〜42のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの製造方法。
- 請求項44に記載の方法で製造された、請求項1〜42のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
- 配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖可変領域、及び、配列番号57に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号58に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号59に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖可変領域を含む、抗体又はその機能性断片。
- 配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号13に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号14に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3を含む軽鎖可変領域、及び、配列番号62に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号63に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号64に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を含む重鎖可変領域を含む、抗体又はその機能性断片。
- 配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号55に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む、請求項46に記載の抗体又はその機能性断片。
- 配列番号33に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号60に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む、請求項47に記載の抗体又はその機能性断片。
- 配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号67の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項46又は48に記載の抗体又はその機能性断片。
- 配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号69の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、請求項47又は49に記載の抗体又はその機能性断片。
- 配列番号31の21〜233番目のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号65の20〜471番目のアミノ酸配列からなる重鎖を有する、抗体又はその機能性断片。
- 請求項46〜52のいずれか1項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項53に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
- 請求項54に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 請求項55に記載の宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体を採取する工程を含む、請求項46〜52に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の製造方法。
- 請求項56に記載の製造方法により得られる、抗体又は該抗体の機能性断片。
- 請求項1〜42若しくは45のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、又は、請求項46〜52若しくは57のいずれか1項に記載の抗体又は該抗体の機能性断片を含む、医薬組成物。
- 抗腫瘍薬である、請求項58に記載の医薬組成物。
- 腫瘍がCDH6が発現している腫瘍である、請求項59に記載の医薬組成物。
- 腫瘍が腎細胞癌、腎淡明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、卵巣癌、卵巣漿液性腺癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、中皮腫、子宮癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍又は神経芽腫である、請求項60に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜42若しくは45のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、請求項46〜52若しくは57のいずれか1項に記載の抗体又は該抗体の機能性断片、又は、請求項58〜61のいずれか1項に記載の医薬組成物を個体に投与する工程を含む、腫瘍の治療方法。
- 腫瘍がCDH6が発現している腫瘍である、請求項62に記載の治療方法。
- 腫瘍が、腎細胞癌、腎淡明細胞癌、乳頭状腎細胞癌、卵巣癌、卵巣漿液性腺癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠芽腫、中皮腫、子宮癌、膵臓癌、ウィルムス腫瘍又は神経芽腫である、請求項62又は63に記載の治療方法。
- 請求項1〜42若しくは45のいずれか1項に記載の抗体−薬物コンジュゲート、請求項46〜52若しくは57のいずれか1項に記載の抗体又は該抗体の機能性断片、又は、請求項58〜61のいずれか1項に記載の医薬組成物と少なくとも一つの抗腫瘍薬を、同時に、別々に又は連続して個体に投与する工程を含む、請求項62〜64のいずれか1項に記載の治療方法。
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