BR112021009251A2 - conjugado anticorpo-fármaco, anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, polinucleotídeo, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, e, métodos para produção de um anticorpo com glicano remodelado, de um conjugado anticorpo-fármaco, do anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo e para tratamento de um tumor. - Google Patents

conjugado anticorpo-fármaco, anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, polinucleotídeo, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, e, métodos para produção de um anticorpo com glicano remodelado, de um conjugado anticorpo-fármaco, do anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo e para tratamento de um tumor. Download PDF

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Naoya HARADA
Kozo Yoneda
Ichiro Hayakawa
Masaki Meguro
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Abstract

CONJUGADO ANTICORPO-FÁRMACO, ANTICORPO OU UM FRAGMENTO FUNCIONAL DO MESMO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO COM GLICANO REMODELADO, DE UM CONJUGADO ANTICORPO-FÁRMACO, DO ANTICORPO OU UM FRAGMENTO FUNCIONAL DO MESMO E PARA TRATAMENTO DE UM TUMOR. A presente invenção aborda o problema de prover: um anticorpo que pode se ligar especificamente a CDH6 e tem alta atividade de internalização; um conjugado anticorpo-fármaco que contém o anticorpo e tem uma alta atividade antitumoral; um produto farmacêutico que é preparado usando o conjugado anticorpo-fármaco e tem um efeito terapêutico sobre tumores, um método para tratar um tumor utilizando o anticorpo, o conjugado anticorpo-fármaco ou o produto farmacêutico, e semelhantes. De acordo com a presente invenção, são providos: um anticorpo anti-CDH6 preparado que tem atividade de internalização; um conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco que compreende o anticorpo anti-CDH6 e um novo derivado de PBD ligados um ao outro e exibindo alta atividade antitumoral; e um produto farmacêutico e um método para tratar um tumor, em cada um dos quais o anticorpo anti-CDH6 ou o conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco é usado.

Description

1 / 272 CONJUGADO ANTICORPO-FÁRMACO, ANTICORPO OU UM FRAGMENTO FUNCIONAL DO MESMO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO COM GLICANO REMODELADO, DE UM CONJUGADO ANTICORPO-FÁRMACO, DO ANTICORPO OU UM FRAGMENTO
FUNCIONAL DO MESMO E PARA TRATAMENTO DE UM TUMOR Campo da invenção
[001] A presente invenção refere-se a um conjugado anticorpo- fármaco útil como fármaco antitumoral, obtido conectando um anticorpo anti- CDH6, que se liga à CDH6 e exerce um efeito de internalização, e um derivado de pirrolbenzodiazepina por intermédio de uma porção com estrutura de ligante. Fundamentos da invenção
[002] Caderinas são glicoproteínas presentes na superfície de membranas celulares e atuam como moléculas de adesão célula-célula através da ligação dependente do íon cálcio a seus domínios extracelulares N- terminais, ou como moléculas de sinal responsáveis pela interação célula- célula. As caderinas clássicas pertencem à superfamília das caderinas e são proteínas transmembrana de passagem única, compostas por cinco domínios extracelulares (domínios EC), uma região transmembrana e um domínio intracelular. As caderinas clássicas são classificadas na família tipo I, tipificada pela E-caderina e N-caderina, e na família tipo II de acordo com as homologias de suas sequências de aminoácidos.
[003] Caderina-6 (CDH6) é uma proteína transmembrana de passagem única, composta por 790 aminoácidos, que está classificada na família de caderinas tipo II, e essa proteína possui domínios extracelular N- terminal e intracelular C-terminal. O gene CDH6 humano foi clonado pela primeira vez em 1995 (Literatura Não de Patente 1), e sua sequência pode ser
2 / 272 citada sob, por exemplo, Nos de acesso NM_004932 e NP_004923 (NCBI).
[004] CDH6 é especificamente expressa no cérebro e no rim durante o desenvolvimento e foi relatado que desempenha um importante papel na formação de circuitos do sistema nervoso central (Literatura Não de Patente 2 e 3) e no desenvolvimento de néfrons no rim (Literatura Não de Patente 4 e 5). A expressão de CDH6 nos tecidos normais de adultos humanos está localizada nos túbulos do rim, em células epiteliais dos ductos biliares e semelhantes.
[005] Enquanto isso, é conhecida a superexpressão específica de CDH6 em sítios tumorais de alguns tipos de cânceres em adultos humanos. A correlação da expressão de CDH6 com mau prognóstico e sua aplicabilidade como marcador tumoral foi relatada em relação ao carcinoma humano de células renais, particularmente, carcinoma de células renais claras (Literatura Não de Patente 6 e 7). A alta expressão de CDH6 foi também relatada em relação ao câncer de ovário humano (Literatura Não de Patente 8). Foi igualmente relatado que CDH6 está envolvida na transição epitélio- mesenquimal do câncer de tireoide humano (Literatura Não de Patente 9). Além disso, foi relatado que CDH6 é também expressa no câncer de ducto biliar humano e câncer de pulmão de pequenas células humano (Literatura Não de Patente 12 e 13).
[006] Cânceres classificam-se no topo das causas de morte. Apesar de se esperar que o número de pacientes com câncer aumente com o envelhecimento da população, as necessidades de tratamento não foram ainda suficientemente satisfeitas. Os problemas dos quimioterápicos convencionais são que: devido à sua baixa seletividade, esses quimioterápicos são tóxicos não só para as células tumorais, mas também para células normais e, assim, provocam reações adversas; e os quimioterápicos não podem ser administrados em quantidades suficientes e, deste modo, não conseguem produzir seus efeitos até um grau suficiente. Consequentemente, nos últimos
3 / 272 aos, mais fármacos contra alvos moleculares altamente seletivos ou fármacos do tipo anticorpo foram desenvolvidos, os quais são direcionados contra moléculas que exibem mutações ou com alta expressão característica em células cancerosas ou moléculas específicas envolvidas na transformação maligna de células.
[007] Os anticorpos são altamente estáveis no sangue e se ligam especificamente a seus alvos antigênicos. Por esses motivos, prevê-se uma redução nas reações adversas, e um grande número de anticorpos terapêuticos foi desenvolvido contra moléculas com alto nível de expressão na superfície de células cancerosas. Uma das técnicas que se baseia na capacidade de ligação específica ao antígeno de anticorpos é o uso de um conjugado anticorpo-fármaco (ADC). Um ADC é um conjugado no qual um anticorpo que se liga a um antígeno expresso na superfície de células cancerosas e pode internalizar o antígeno na célula através de tal ligação é conjugado a um fármaco com atividade citotóxica. Um ADC pode entregar com eficiência o fármaco às células cancerosas, e pode-se, assim, prever que elimine as células cancerosas ao acumular o fármaco nas células cancerosas (Literatura Não de Patente 10 e Literatura de Patente 1 e 2). Em relação a ADCs, Adcetris (TM) (brentuximabe vedotina), compreendendo um anticorpo monoclonal anti- CD30 conjugado a monometil auristatina E foi, por exemplo, aprovado como fármaco terapêutico para linfoma de Hodgkin e linfoma anaplásico de grandes células. Além disso, Kadcyla (TM) (trastuzumabe entansina), compreendendo um anticorpo monoclonal anti-HER2 conjugado a entansina, é usado no tratamento de câncer de mama progressivo ou recorrente positivo para HER2.
[008] As características de um antígeno alvo adequado para um ADC como um fármaco antitumoral são que: o antígeno é específica e altamente expresso na superfície de células cancerosas, mas com baixa expressão ou não é expresso em células normais; o antígeno pode ser internalizado em células; o antígeno não é secretado desde a superfície
4 / 272 celular; etc. Além disso, as características importantes de um anticorpo adequado para um ADC são que o anticorpo possui alta capacidade de internalização além de se ligar especificamente ao antígeno alvo. A capacidade de internalização do anticorpo depende das propriedades de ambos, o antígeno alvo e o anticorpo. É difícil predizer um sítio de ligação ao antígeno adequado para internalização a partir da estrutura molecular de um alvo ou predizer um anticorpo que tenha alta capacidade de internalização a partir da força de ligação, propriedades físicas e semelhantes do anticorpo. Consequentemente, um desafio importante no desenvolvimento de um ADC com alta eficácia é obter um anticorpo tendo alta capacidade de internalização contra o antígeno alvo (Literatura Não de Patente 11).
[009] É conhecido um ADC que compreende DM4 conjugado a um anticorpo anti-CDH6 que se liga especificamente ao domínio EC 5 (EC5) de CDH6 como um ADC direcionado para CDH6 (Literatura de Patente 3).
[0010] Exemplos úteis de fármacos a serem conjugados para ADCs são as pirrolbenzodiazepinas (PBDs). As PBDs exibem citotoxicidade, por exemplo, ao se ligarem à sequência PuGPu no sulco menor do DNA. Antramicina, uma PBD natural, foi primeiramente descoberta em 1965 e, desde essa descoberta, várias PBDs naturais e análogos de PBD das mesmas foram descobertos (Literaturas Não de Patente 14 a 17).
[0011] A fórmula estrutural geral de PBDs é representada pela seguinte fórmula: [Fórmula 1]
[0012] São conhecidas PBDs que diferem no número, tipos e sítios de substituintes nas partes do anel A e C, e aquelas que diferem no grau de
5 / 272 instauração nas partes do anel B e C.
[0013] As PBDs são conhecidas por exibirem citotoxicidade drasticamente intensificada através da formação de uma estrutura dimérica (Literaturas Não de Patente 18, 19), e foram relatados vários ADCs com uma PBD dimérica (Literaturas de Patente 4 a 16). No entanto, não se conhece ainda uma PBD com um anel espiro em sua posição C2 e uma forma de ADC da mesma. Lista de citações Literaturas de Patente
[0014] Literatura de Patente 1: WO2014/057687 Literatura de Patente 2: US2016/0297890 Literatura de Patente 3: WO2016/024195 Literatura de Patente 4: WO2013/173496 Literatura de Patente 5: WO2014/130879 Literatura de Patente 6: WO2017/004330 Literatura de Patente 7: WO2017/004025 Literatura de Patente 8: WO2017/020972 Literatura de Patente 9: WO2016/036804 Literatura de Patente 10: WO2015/095124 Literatura de Patente 11: WO2015/052322 Literatura de Patente 12: WO2015/052534 Literatura de Patente 13: WO2016/115191 Literatura de Patente 14: WO2015/052321 Literatura de Patente 15: WO2015/031693 Literatura de Patente 16: WO2011/130613 Literaturas Não de Patente
[0015] Literatura Não de Patente 1: Shimoyama Y, et al., Cancer Research, 2206-2211, 55, May 15, 1995 Literatura Não de Patente 2: Inoue T, et al., Developmental
6 / 272
Biology, 183-194, 1997 Literatura Não de Patente 3: Osterhout J A, et al., Neuron, 632-639, 71, Aug 25, 2011 Literatura Não de Patente 4: Cho E A, et al., Development, 803-812, 125, 1998 Literatura Não de Patente 5: Mah S P, et al., Developmental Biology, 38-53, 223, 2000 Literatura Não de Patente 6: Paul R, et al., Cancer Research, 2741-2748, July 1, 57, 1997 Literatura Não de Patente 7: Shimazui T, et al., Cancer, 963- 968, 101(5), Sep.1, 2004 Literatura Não de Patente 8: Koebel M, et al., PLoS Medicine, 1749-1760, 5(12), e232, Dec. 2008 Literatura Não de Patente 9: Gugnoni M, et al., Oncogene, 667-677, 36, 2017 Literatura Não de Patente 10: Polakis P., Pharmacological Reviews, 3-19, 68, 2016 Literatura Não de Patente 11: Peters C, et al., Bioscience Reports, 1-20, 35, 2015 Literatura Não de Patente 12: Goeppert B, et al., Epigenetics, 780-790, 11(11), 2016 Literatura Não de Patente 13: Yokoi S, et al., American Journal of Pathology, 207-216, 161, 1, 2002 Literatura Não de Patente 14: Julia Mantaj, et al., Angewandte Chemie Internationl Edition 2016, 55, 2-29 Literatura Não de Patente 15: Dyeison Antonow.et al., Chemical Reviews 2010, 111, 2815-2864 Literatura Não de Patente 16: In Antibiotics III.
Springer Verlag, New York, pp.3-11
7 / 272 Literatura Não de Patente 17: Accounts of Chemical Research 1986, 19, 230 Literatura Não de Patente 18: Journal of the American Chemical Society 1992, 114, 4939 Literatura Não de Patente 19: Journal of Organic Chemistry 1996, 61, 8141 Sumário da invenção Problema técnico
[0016] A presente invenção tem por objeto prover um anticorpo que se liga especificamente a CDH6 e tendo alta atividade de internalização, um conjugado anticorpo-fármaco que compreende o anticorpo e tendo alta atividade antitumoral, um produto farmacêutico compreendendo o conjugado anticorpo-fármaco e tendo efeitos terapêuticos sobre um tumor, um método para tratar um tumor utilizando o anticorpo, o conjugado anticorpo-fármaco ou o produto farmacêutico e semelhantes. Solução para o problema
[0017] Os presentes inventores conduziram estudos intensos direcionados para alcançar o objeto descrito acima e verificaram, surpreendentemente, que um anticorpo que se liga especificamente ao domínio extracelular 3 (na presente descrição, também referido como EC3) de CDH6 exibe atividade de internalização excessivamente alta contra células que expressão CDH6 e é útil como um anticorpo para ADCs. Os presentes inventores também conseguiram obter um conjugado anticorpo anti-CDH6- fármaco ao conectarem o anticorpo anti-CDH6 a um novo derivado de PBD, e verificaram que o conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco exibe forte atividade antitumoral.
[0018] A presente invenção refere-se ao seguinte:
[1] Um conjugado anticorpo-fármaco representado pela seguinte fórmula (X):
8 / 272 [Fórmula 2] glicano em que m2 representa um número inteiro igual a 1 ou 2, Ab representa um anticorpo IgG que se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4 e tendo capacidade de permitindo a absorção celular, ou um fragmento funcional do mesmo, L representa um ligante que liga um glicano unido ao N297 de Ab (N297 glicano) e D, N297 glicano pode ser um glicano remodelado e D é qualquer uma das seguintes fórmulas: [Fórmula 3] ou em que o asterisco (*) representa a união ao L.
[0019] [2] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [1], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo exibe atividade inibitória competitiva, pela ligação à sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4, contra ao menos um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste nos anticorpos seguintes (1) a (8): (1) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 23 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 26,
9 / 272 (2) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 39, (3) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 43, (4) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 43, (5) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 47, (6) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 65, (7) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 67 e (8) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 69.
[0020] [3] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [1] ou [2],
10 / 272 em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende CDRL1, CDRL2 e CDRL3; e CDRH1, CDRH2 e CDRH3 selecionadas a partir do grupo que consiste nas seguintes (1) a (4): (1) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14; e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 18 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 19, (2) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14; e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 30 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 19, (3) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14; e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 57, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 58 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 59, e (4) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de
11 / 272 aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14 e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 62, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 63 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:
64.
[0021] [4] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende qualquer região variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste nas regiões variáveis seguintes (1) a (4): (1) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33, (2) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 37, (3) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 95% com a sequência de uma região framework, exceto as sequências de CDR na sequência de aminoácidos de (1) ou (2) e (4) uma sequência de aminoácidos com uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de uma região framework, exceto as sequências de CDR nas sequências de aminoácidos de (1) a (3); e qualquer região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste nas regiões variáveis seguintes (5) a (11): (5) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 41, (6) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 45, (7) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 49,
12 / 272 (8) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 55, (9) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 60, (10) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 95% com a sequência de uma região framework que não seja a sequência de cada CDR nas sequências de aminoácidos de (5) a (9) e (11) uma sequência de aminoácidos com uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de uma região framework que não seja a sequência de cada CDR nas sequências de aminoácidos de (5) a (10).
[0022] [5] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [4], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende qualquer uma das seguintes (1) a (6): (1) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 41, (2) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 45, (3) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 37 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 45, (4) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável
13 / 272 de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 49, (5) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 55 e (6) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 60.
[0023] [6] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [5], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo possui qualquer uma das seguintes (1) a (7): (1) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 39, (2) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 43, (3) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 43, (4) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 47, (5) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 65, (6) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos
14 / 272 das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 67 e (7) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 69.
[0024] [7] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [6], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo possui uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 39.
[0025] [8] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [6], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo possui uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 43.
[0026] [9] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [6], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo possui uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 43.
[0027] [10] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [6], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo possui uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 47.
[0028] [11] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [6], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo possui uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das
15 / 272 posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 65
[0029] [12] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [6], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo possui uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 67.
[0030] [13] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [6], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo possui uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 69.
[0031] [14] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [13], em que L é representado por -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*, em que o asterisco * representa a união ao átomo de nitrogênio na posição N10’ de D, B representa um grupo 1,4-fenila, um grupo 2,5-piridila, um grupo 3,6-piridila, um grupo 2,5-pirimidila ou um grupo 2,5-tienila, Lp representa qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em: -GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, - GGVK- e -GGPL-, La representa qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em: -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-, -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-, -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-, -C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-
16 / 272 , -CH2-OC(=O)- e -OC(=O)-, e Lb representa a fórmula seguinte: [Fórmula 4] ou [Fórmula 5] ou ou [Fórmula 6] ou em que, em cada fórmula estrutural de Lb mostrada acima, cada asterisco * representa a união ao La e cada linha ondulada representa a união ao glicano apresentado por Ab ou um glicano remodelado.
[0032] [15] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [14], em que: L representa qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste nas fórmulas estruturais seguintes:
17 / 272
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2- OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA- NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)- VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2- C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- e -Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, em que Z1 representa a fórmula estrutural seguinte: [Fórmula 7]
ou
Z2 representa a fórmula estrutural seguinte: [Fórmula 8]
18 / 272 ou Z3 representa a fórmula estrutural seguinte: [Fórmula 9] ou em que, em cada fórmula estrutural para Z1, Z2 e Z3, cada asterisco * representa a união ao C(=O), O ou CH2 vizinho de Z1, Z2 ou Z3; cada linha ondulada representa a união ao glicano apresentado por Ab ou um glicano remodelado, e B representa um grupo 1,4-fenila.
[0033] [16] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [15], em que: L representa qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em: -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA- NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)- VA-NH-B-CH2-OC(=O)- e
19 / 272 -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2- C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, em que B representa um grupo 1,4-fenila e Z1 representa a fórmula estrutural seguinte: [Fórmula 10] ou em que, na fórmula estrutural para Z1, cada asterisco * representa a união ao C(=O) vizinho de Z1, e cada linha ondulada representa a união ao glicano unido ao N297 de Ab (N297 glicano) ou unido a um glicano remodelado.
[0034] [17] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [16], em que o anticorpo é IgG1, IgG2 ou IgG4.
[0035] [18] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [17], em que o N297 glicano é um glicano remodelado.
[0036] [19] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [18], em que o N297 glicano é N297-(Fuc)MSG1, N297- (Fuc)MSG2, ou uma mistura dos mesmos, ou N297-(Fuc)SG, com N297- (Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 e N297-(Fuc)SG tendo as estruturas representadas pelas seguintes fórmulas: [Fórmula 11] [Fórmula 12]
20 / 272 [Fórmula 13] em que a linha ondulada representa a união ao Asn297 do anticorpo, *-L(PEG)-, no N297 glicano, representa *-(CH2CH2-O)n5- CH2CH2-NH-, em que n5 representa um número inteiro de 2 a 5, o grupo amino na extremidade direita é unido, por meio de uma ligação amida, ao ácido carboxílico na posição 2 do ácido siálico no terminal não redutor em cada uma ou qualquer uma das cadeias ramificadas 1-3 e 1-6 do β-Man no N297 glicano, e cada asterisco * representa a união ao átomo de nitrogênio na posição 1 ou 3 do anel triazol nas fórmulas estruturais individuais.
[0037] [20] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [19], em que n5 representa 3.
[0038] [21] Um conjugado anticorpo-fármaco representado pela seguinte fórmula (XII): [Fórmula 14]
21 / 272 glicano ou glicano em que, em cada fórmula estrutural mostrada acima, m2 representa um número inteiro igual a 1 ou 2, Ab representa um anticorpo IgG que se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4 e tendo capacidade de permitindo a absorção celular, ou um fragmento funcional do mesmo, o N297 glicano de Ab representa qualquer um dentre N297- (Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, e uma mistura dos mesmos, e N297- (Fuc)SG, com N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 e N297-(Fuc)SG tendo as estruturas representadas pelas seguintes fórmulas: [Fórmula 15]
[Fórmula 16]
22 / 272 [Fórmula 17] em que cada linha ondulada representa a união ao Asn297 (N297) do anticorpo, *-L(PEG)-, no N297 glicano, representa *-(CH2CH2-O)3- CH2CH2-NH-, em que: o grupo amino na extremidade direita é unido, por meio de uma ligação amida, ao ácido carboxílico na posição 2 do ácido siálico no terminal não redutor em cada uma ou qualquer uma das cadeias ramificadas 1-3 e 1-6 do β-Man no N297 glicano, e cada asterisco * representa a união ao átomo de nitrogênio na posição 1 ou 3 do anel triazol na fórmula estrutural correspondente.
[0039] [22] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [21], em que o composto representado pela fórmula (XII) é representado pela seguinte fórmula (XII’): [Fórmula 18]
23 / 272 glicano ou glicano
[0040] [23] Um conjugado anticorpo-fármaco representado pela seguinte fórmula (XIII): [Fórmula 19]
24 / 272 glicano ou glicano em que, em cada fórmula estrutural mostrada acima, m2 representa um número inteiro igual a 1 ou 2, Ab representa um anticorpo IgG que se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4 e tendo capacidade de permitindo a absorção celular, ou um fragmento funcional do mesmo, e o N297 glicano de Ab representa qualquer um dentre N297- (Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, e uma mistura dos mesmos, e N297- (Fuc)SG, com N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 e N297-(Fuc)SG tendo as estruturas representadas pelas seguintes fórmulas: [Fórmula 20]
[Fórmula 21]
25 / 272 [Fórmula 22] em que cada linha ondulada representa a união ao Asn297 (N297) do anticorpo, *-L(PEG)-, no N297 glicano, representa *-(CH2CH2-O)3- CH2CH2-NH-, em que o grupo amino na extremidade direita é unido, por meio de uma ligação amida, ao ácido carboxílico na posição 2 do ácido siálico no terminal não redutor em cada uma ou qualquer uma das cadeias ramificadas 1-3 e 1-6 do β-Man no N297 glicano, e cada asterisco * representa a união ao átomo de nitrogênio na posição 1 ou 3 do anel triazol nas fórmulas estruturais individuais.
[0041] [24] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [23], em que o composto representado pela fórmula (XIII) é representado pela seguinte fórmula (XIII’): [Fórmula 23]
26 / 272 glicano ou glicano
[0042] [25] Um conjugado anticorpo-fármaco representado pela seguinte fórmula (XIV): [Fórmula 24]
27 / 272 glicano ou glicano em que, em cada fórmula estrutural mostrada acima, m2 representa um número inteiro igual a 1 ou 2, Ab representa um anticorpo IgG que se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4 e tendo capacidade de permitindo a absorção celular, ou um fragmento funcional do mesmo, e o N297 glicano de Ab representa qualquer um dentre N297- (Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, e uma mistura dos mesmos, e N297- (Fuc)SG, com N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 e N297-(Fuc)SG tendo as estruturas representadas pelas seguintes fórmulas: [Fórmula 25]
[Fórmula 26]
28 / 272 [Fórmula 27] em que cada linha ondulada representa a união ao Asn297 (N297) do anticorpo, *-L(PEG)-, no N297 glicano, representa *-(CH2CH2-O)3- CH2CH2-NH-, em que o grupo amino na extremidade direita é unido, por meio de uma ligação amida, ao ácido carboxílico na posição 2 do ácido siálico no terminal não redutor em cada uma ou qualquer uma das cadeias ramificadas 1-3 e 1-6 do β-Man no N297 glicano, e cada asterisco * representa a união ao átomo de nitrogênio na posição 1 ou 3 do anel triazol nas fórmulas estruturais individuais.
[0043] [26] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [25], em que o composto representado pela fórmula (XIV) é representado pela seguinte fórmula (XIV’): [Fórmula 28]
29 / 272 glicano ou glicano
[0044] [27] Um conjugado anticorpo-fármaco representado pela seguinte fórmula (XV): [Fórmula 29]
30 / 272 glicano ou glicano em que, em cada fórmula estrutural mostrada acima, m2 representa um número inteiro igual a 1 ou 2, Ab representa um anticorpo IgG que se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4 e tendo capacidade de permitindo a absorção celular, ou um fragmento funcional do mesmo, e o N297 glicano de Ab representa qualquer um dentre N297- (Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, e uma mistura dos mesmos, e N297- (Fuc)SG, com N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 e N297-(Fuc)SG tendo as estruturas representadas pelas seguintes fórmulas: [Fórmula 30]
[Fórmula 31]
31 / 272 [Fórmula 32] em que cada linha ondulada representa a união ao Asn297 (N297) do anticorpo, *-L(PEG)-, no N297 glicano, representa *-(CH2CH2-O)3- CH2CH2-NH-, em que o grupo amino na extremidade direita é unido, por meio de uma ligação amida, ao ácido carboxílico na posição 2 do ácido siálico no terminal não redutor em cada uma ou qualquer uma das cadeias ramificadas 1-3 e 1-6 of the β-Man no N297 glicano, e cada asterisco * representa a união ao átomo de nitrogênio na posição 1 ou 3 do anel triazol nas fórmulas estruturais individuais.
[0045] [28] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [27], em que o composto representado pela fórmula (XV) é representado pela seguinte fórmula (XV’): [Fórmula 33]
32 / 272 glicano ou glicano
[0046] [29] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [21] a [28], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende CDRL1, CDRL2 e CDRL3 e CDRH1, CDRH2 e CDRH3 selecionadas a partir do grupo que consiste nas seguintes (1) a (4): (1) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14; e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 18 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 19, (2) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na
33 / 272 sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14; e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 30 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 19, (3) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14; e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 57, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 58 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 59, e (4) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14 e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 62, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 63 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:
64.
[0047] [30] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [21] a [29], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende qualquer uma das seguintes (1) a (6): (1) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 41, (2) uma região variável de cadeia leve que consiste na
34 / 272 sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 45, (3) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 37 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 45, (4) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 49, (5) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 55, e (6) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 60.
[0048] [31] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [21] a [30], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende qualquer uma das seguintes (1) a (7): (1) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 39, (2) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 43, (3) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos
35 / 272 das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 43, (4) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 47, (5) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 65, (6) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 67, e (7) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 69.
[0049] [32] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [31], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 39.
[0050] [33] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [31], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 43.
[0051] [34] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [31], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 43.
36 / 272
[0052] [35] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [31], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 47.
[0053] [36] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [31], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 65.
[0054] [37] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [31], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 67.
[0055] [38] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com [31], em que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 69.
[0056] [39] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [38], em que o número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo no conjugado anticorpo-fármaco é 1 a 3.
[0057] [40] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [38], em que o número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo no conjugado anticorpo-fármaco é 3 a 5.
[0058] [41] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [40], em que o anticorpo contém uma cadeia pesada com uma ou duas ou mais modificações selecionado a partir do grupo que consiste em
37 / 272 glicosilação N-ligada, glicosilação O-ligada, processamento N-terminal, processamento C-terminal, desamidação, isomerização de ácido aspártico, oxidação de metionina, adição de um resíduo de metionina ao N-terminal, amidação de um resíduo de prolina e deleção de um ou dois aminoácidos da terminação carboxila.
[0059] [42] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [41], em que o resíduo de lisina na terminação carboxila da cadeia pesada é deletado.
[0060] [43] Um método para produção de um anticorpo com glicano remodelado, em que o método compreende as etapas de: i) produzir um anticorpo IgG que se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4 e tendo capacidade de permitindo a absorção celular, ou um fragmento funcional do mesmo, ii) tratar o anticorpo obtido na etapa i) com hidrolase para produzir um (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo; e iii)-1 reagir o (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo e uma molécula doadora de glicano na presença de uma transglicosidase, a molécula doadora de glicano obtida introduzindo-se um ligante PEG com um grupo azida no grupo carbonila de ácido carboxílico na posição 2 de um ácido siálico em MSG (9) ou SG (10) e tratando o terminal redutor com oxazolina, ou iii)-2 reagir o (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo e uma molécula doadora de glicano na presença de uma transglicosidase, a molécula doadora de glicano obtida introduzindo-se um ligante PEG com um grupo azida no grupo carbonila de ácido carboxílico na posição 2 de um ácido siálico em (MSG-)Asn ou (SG-)Asn com um grupo α-amino opcionalmente protegido e no grupo carbonila de ácido carboxílico na Asn, provocando ação da hidrolase e, a seguir, tratando o terminal redutor com oxazolina.
[0061] [44] Um método para produção de um conjugado anticorpo-
38 / 272 fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [42], o qual compreende uma etapa de reação do anticorpo com glicano remodelado obtido pelo método de acordo com [43] e um ligante-fármaco.
[0062] [45] O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [42], produzido pelo método de acordo com [44].
[0063] [46] Um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve, a qual contém CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14, e uma região variável de cadeia pesada, a qual contém CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 57, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 58 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:
59.
[0064] [47] Um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve, a qual contém CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14; e uma região variável de cadeia pesada, a qual contém CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 62, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 63 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:
64.
[0065] [48] O anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com [46], compreendendo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos
39 / 272 mostrada em SEQ ID NO: 55.
[0066] [49] O anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com [47], compreendendo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 60.
[0067] [50] O anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com [46] ou [48], tendo uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 67.
[0068] [51] O anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com [47] ou [49], tendo uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 69.
[0069] [52] Um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo tendo uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 em SEQ ID NO: 65.
[0070] [53] Um polinucleotídeo que codifica o anticorpo de acordo com qualquer um de [46] a [52].
[0071] [54] Um vetor de expressão que contém o polinucleotídeo de acordo com [53].
[0072] [55] Uma célula hospedeira transformada com o vetor de expressão de acordo com [54].
[0073] [56] Um método para produção do anticorpo ou de um fragmento funcional do mesmo de acordo com qualquer um de [46] a [52], compreendendo uma etapa de cultivo da célula hospedeira de acordo com
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[55] e de coleta do anticorpo alvo na cultura obtida da etapa de cultivo.
[0074] [57] Um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, obtido pelo método de acordo com [56].
[0075] [58] Uma composição farmacêutica contendo o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [42] e [45] ou o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com qualquer um de [46] a [52] e [57].
[0076] [59] A composição farmacêutica de acordo com [58], que é um fármaco antitumoral.
[0077] [60] A composição farmacêutica de acordo com [59], em que o tumor é um tumor que expressa CDH6.
[0078] [61] A composição farmacêutica de acordo com [60], em que o tumor é carcinoma de células renais, carcinoma de células renais claras, carcinoma papilar de células renais, câncer de ovário, adenocarcinoma seroso de ovário, câncer de tireoide, câncer de ducto biliar, câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de não pequenas células, glioblastoma, mesotelioma, câncer de útero, câncer de pâncreas, tumor de Wilms ou neuroblastoma.
[0079] [62] Um método para tratar um tumor, o qual compreende administrar o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [42] e [45], o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com qualquer um de [46] a [52] e [57] ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [58] a [61] a um indivíduo.
[0080] [63] O método de tratamento de acordo com [62], em que o tumor é um tumor que expressa CDH6.
[0081] [64] O método de tratamento de acordo com [62] ou [63], em que o tumor é carcinoma de células renais, carcinoma de células renais claras, carcinoma papilar de células renais, câncer de ovário, adenocarcinoma seroso de ovário, câncer de tireoide, câncer de ducto biliar, câncer de pulmão, câncer
41 / 272 de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de não pequenas células, glioblastoma, mesotelioma, câncer de útero, câncer de pâncreas, tumor de Wilms ou neuroblastoma.
[0082] [65] O método de tratamento de acordo com qualquer um de
[62] a [64], o qual compreende administrar o conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [42] e [45]; o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com qualquer um de [46] a [52] e [57]; ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer um de [58] a [61] e pelo menos um fármaco antitumoral a um indivíduo, simultânea, separada ou continuamente. Efeitos vantajosos da invenção
[0083] As características do anticorpo anti-CDH6 da presente invenção são reconhecer o domínio EC 3 (EC3) de CDH6 especificamente e ter alta atividade de internalização. É possível prever que um conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco, que é preparado conjugado conectando o anticorpo anti-CDH6 da presente invenção e um novo derivado de PBD da presente invenção por meio de um ligante, alcance excelentes efeitos antitumorais e segurança pela administração a pacientes com células cancerosas que expressam CDH6. Especificamente, o conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco da presente invenção é útil como um agente antitumoral. Breve descrição dos desenhos
[0084] [Figura 1] A Figura 1 mostra resultados de citometria de fluxo ao se examinar a ligação de rG019, anticorpo monoclonal de rato anti-CDH6, e de IgG2b, um anticorpo de rato de controle negativo, a células controle (área sombreada) ou a células 293T transfectadas com hCDH6 (área clara, linha contínua). A abscissa representa a intensidade de fluorescência de FITC, indicando a quantidade do anticorpo ligado, e a ordenada representa a contagem de células.
[0085] [Figura 2-1] A figura (1) mostra a atividade de ligação de
42 / 272 rG019, anticorpo monoclonal de rato anti-CDH6, ou IgG2b, anticorpo de rato de controle negativo, contra células controle (área sombreada) ou células 293 transfectadas com hCDH6 completa (área clara, linha contínua). A figura (2) mostra a atividade de ligação de rG019, anticorpo monoclonal de rato anti- CDH6, ou de IgG2b, anticorpo de rato de controle negativo, contra células controle (área sombreada) ou contra células 293 transfectadas com hCDH6 e EC1 deletado (área clara, linha contínua). A figura (3) mostra a atividade de ligação de rG019, anticorpo monoclonal de rato anti-CDH6, ou de IgG2b, anticorpo de rato de controle negativo, contra células controle (área sombreada) ou células 293 transfectadas com hCDH6 e EC2 deletado (área clara, linha contínua). Nas figuras (1) a (3), a abscissa representa a intensidade de fluorescência de FITC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa a contagem de células.
[0086] [Figura 2-2] A figura (4) mostra a atividade de ligação de rG019, anticorpo monoclonal de rato anti-CDH6, ou de IgG2b, anticorpo de rato de controle negativo, contra células controle (área sombreada) ou células 293 transfectadas com hCDH6 e EC3 deletado (área clara, linha contínua). A figura (5) mostra a atividade de ligação de rG019, anticorpo monoclonal de rato anti-CDH6, ou de IgG2b, anticorpo de rato de controle negativo, contra células controle (área sombreada) ou células 293 transfectadas com hCDH6 e EC4 deletado (área clara, linha contínua). A figura (6) mostra a atividade de ligação de rG019, anticorpo monoclonal de rato anti-CDH6, ou de IgG2b, anticorpo de rato de controle negativo, contra células controle (área sombreada) ou células 293 transfectadas com hCDH6 e EC5 deletado (área clara, linha contínua). Nas figuras (4) a (6), a abscissa representa a intensidade de fluorescência de FITC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa contagem de células.
[0087] [Figura 3] A Figura 3 mostra os resultados de citometria de fluxo ao se avaliar a expressão de CDH6 na superfície da membrana celular
43 / 272 de 5 tipos de linhagens celulares de tumores humanos (linhagens celulares NIH:OVCAR-3, PA-1 e OV-90 de tumor ovariano humano e linhagens celulares 786-O e Caki-1 de tumor de células renais humano). A abscissa representa a intensidade de fluorescência de FITC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa contagem de células. O histograma sombreado mostra que o controle negativo mIgG1 foi usado na coloração, e o histograma claro mostra que o anticorpo anti-CDH6 humana foi usado na coloração.
[0088] [Figura 4] A Figura 4 mostra a ligação de chG019, anticorpo quimérico humano anti-CDH6 a CDH6 humana e CDH6 de macaco. A abscissa representa concentração do anticorpo e a ordenada representa a quantidade de anticorpo ligado tendo por base a intensidade média de fluorescência.
[0089] [Figura 5-1] A Figura 5-1 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos humanizados hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), do anticorpo NOV0712 anti-CDH6 ou do anticorpo hIgG1 de controle negativo contra células controle (área sombreada) ou células 293α transfectadas com hCDH6 completa (área clara, linha contínua). A abscissa representa a intensidade de fluorescência de APC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa contagem de células.
[0090] [Figura 5-2] A Figura 5-2 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos humanizados hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), do anticorpo NOV0712 anti-CDH6 ou do anticorpo hIgG1 de controle negativo contra células controle (área sombreada) ou células 293α transfectadas com hCDH6 e EC1 deletado (área clara, linha contínua). A abscissa representa a intensidade de fluorescência de APC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa contagem de células.
[0091] [Figura 5-3] A Figura 5-3 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos humanizados hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 e
44 / 272 H04L02), anticorpo NOV0712 anti-CDH6 ou anticorpo hIgG1 de controle negativo contra células controle (área sombreada) ou células 293α transfectadas com hCDH6 e EC2 deletado (área clara, linha contínua). A abscissa representa a intensidade de fluorescência de APC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa contagem de células.
[0092] [Figura 5-4] Figura 5-4 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos humanizados hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), anticorpo NOV0712 anti-CDH6 ou anticorpo hIgG1 de controle negativo contra células controle (área sombreada) ou células 293α transfectadas com hCDH6 e EC3 deletado (área clara, linha contínua). A abscissa representa a intensidade de fluorescência de APC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa contagem de células.
[0093] [Figura 5-5] A Figura 5-5 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos humanizados hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), do anticorpo NOV0712 anti-CDH6 ou do anticorpo hIgG1 de controle negativo contra células controle (área sombreada) ou células 293α transfectadas com hCDH6 e EC4 deletado (área clara, linha contínua). A abscissa representa a intensidade de fluorescência de APC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa contagem de células.
[0094] [Figura 5-6] A Figura 5-6 mostra a atividade de ligação de quatro anticorpos humanizados hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), do anticorpo NOV0712 anti-CDH6 ou do anticorpo hIgG1 de controle negativo contra células controle (área sombreada) ou células 293α transfectadas com hCDH6 e EC5 deletado (área clara, linha contínua). A abscissa representa a intensidade de fluorescência de APC, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa contagem de células.
[0095] [Figura 6] A Figura 6 mostra resultados de citometria de fluxo ao se examinar a expressão de CDH6 humana em uma linhagem celular expressando 786-O/hCDH6 estavelmente (área clara, linha contínua) e sua
45 / 272 linhagem celular parental 786-O (área sombreada). A abscissa representa a intensidade de fluorescência de Alexia Fluor 647, indicando a quantidade de anticorpo ligado, e a ordenada representa contagem de células.
[0096] [Figura 7] A Figura 7 mostra o ensaio de ligação competitiva de quatro anticorpos humanizados hG019 não marcados (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), o anticorpo NOV0712 anti-CDH6 ou hIgG1 de controle negativo usando NOV0712 marcado (estágio superior) ou H01L02 marcado (estágio inferior). A abscissa representa a concentração final do anticorpo não marcado adicionado e a ordenada representa a quantidade de anticorpo ligado com base na intensidade média de fluorescência.
[0097] [Figura 8] A Figura 8 mostra os resultados nos quais a atividade de internalização de quatro anticorpos humanizados hG019 (H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), do anticorpo NOV0712 anti-CDH6 e de um anticorpo de controle negativo foi avaliada em células NIH:OVCAR-3, células 786-O ou células PA-1, usando o reagente Hum-ZAP, anti-IgG humana, conjugado com uma toxina (saporina) que inibe a síntese de proteínas, ou com o fragmento F(ab’)2 de cabra anti-IgG humana, Fragmento Específico Fc (gama) não conjugado com a toxina como controle negativo. Uma taxa de sobrevida celular (%), calculada como uma taxa de sobrevida relativa em que o número de células vivas em um poço suplementado com o controle negativo em vez de Hum-ZAP era definido como 100%, é mostrada embaixo de cada inserção.
[0098] [Figura 9] A Figura 9 mostra a IC50 (concentração com inibição de 50%) (nM) de cada um, anticorpo anti-LPS-PBD (ADC11), H01L02-PBD (ADC1), H01L02A-PBD (ADC5), H11L02A-PBD (ADC7) e H31L02A-PBD (ADC6), em relação às linhagens celulares NIH:OVCAR-3, OV-90, PA-1 de tumor ovariano humano positivo e a linhagem celular 786-O de carcinoma de células renais humano, positivo para CDH6.
[0099] [Figura 10] A Figura 10 mostra o efeito antitumoral in vivo de
46 / 272 cada um, H01L02-PBD (ADC1), NOV0712-DM4 e anticorpo anti-LPS-PBD (ADC11). A avaliação foi conduzida usando modelos animais nos quais a linhagem celular OV-90 de tumor ovariano humano positivo para CDH6 foi inoculada em camundongos imunodeficientes. A abscissa representa o número de dias, e a ordenada representa o volume do tumor. A faixa de erro representa um valor de SE.
[00100] [Figura 11] A Figura 11 mostra o efeito antitumoral in vivo de cada um, H01L02-PBD (ADC1), NOV0712-DM4 e anticorpo anti-LPS-PBD (ADC11). A avaliação foi conduzida usando modelos animais nos quais a linhagem celular Caki-1 de tumor renal humano positivo para CDH6 foi inoculada em camundongos imunodeficientes. A abscissa representa o número de dias, e a ordenada representa o volume do tumor. A faixa de erro representa um valor de SE.
[00101] [Figura 12] A Figura 12 mostra o efeito antitumoral in vivo de cada um, H01L02-PBD (ADC1), H01L02A-PBD (ADC5), H31L02A-PBD (ADC6) e anticorpo anti-LPS-PBD (ADC11). A avaliação foi conduzida usando modelos animais nos quais a linhagem celular NIH:OVCAR-3 de tumor ovariano humano positivo para CDH6 foi inoculada em camundongos imunodeficientes. A abscissa representa o número de dias, e a ordenada representa o volume do tumor. A faixa de erro representa um valor de SE.
[00102] [Figura 13] A Figura 13 mostra o efeito antitumoral in vivo de cada um, H01L02-PBD (ADC1), H01L02A-PBD (ADC5), H31L02A-PBD (ADC6) e H11L02A-PBD (ADC7). A avaliação foi conduzida usando modelos animais no quais a linhagem celular OV-90 de tumor ovariano humano positivo para CDH6 foi inoculada em camundongos imunodeficientes. A abscissa representa o número de dias, e a ordenada representa o volume do tumor. A faixa de erro representa um valor de SE.
[00103] [Figura 14] A Figura 14 mostra o efeito antitumoral in vivo de cada um, H01L02A-PBD (ADC5), H31L02A-PBD (ADC6) e anticorpo anti-
47 / 272 LPS-PBD (ADC11). A avaliação foi conduzida usando modelos animais nos quais a linhagem celular PA-1 de tumor ovariano humano positivo para CDH6 foi inoculada em camundongos imunodeficientes. A abscissa representa o número de dias, e a ordenada representa o volume do tumor. A faixa de erro representa um valor de SE.
[00104] [Figura 15] A Figura 15 mostra o efeito antitumoral in vivo de cada um, H01L02A-PBD (ADC5), H31L02A-PBD (ADC6) e anticorpo anti- LPS-PBD (ADC11). A avaliação foi conduzida usando modelos animais nos quais a linhagem celular 786-Ode tumor renal humano positivo para CDH6 foi inoculada em camundongos imunodeficientes. A abscissa representa o número de dias, e a ordenada representa o volume do tumor. A faixa de erro representa um valor de SE. Descrição de modalidades
[00105] A seguir, as modalidades preferidas para realizar a presente invenção serão descritas com referência aos desenhos. Deve-se notar que as modalidades descritas abaixo simplesmente ilustram as modalidades representativas da presente invenção, e a interpretação do âmbito da presente invenção são será estreitada em decorrência desses exemplos.
[00106] Na presente descrição, o termo “câncer” é usado para que tenha o mesmo significado que aquele do termo “carcinoma” e “tumor”.
[00107] Na presente descrição, o termo “gene” é usado para que inclua não só DNA, mas também seu mRNA, e cDNA e cRNA do mesmo.
[00108] Na presente descrição, o termo “polinucleotídeo” ou “nucleotídeo” é usado para que tenha o mesmo significado que aquele de um ácido nucleico, e também inclui DNA, RNA, uma sonda, um oligonucleotídeo e um primer. Na presente descrição, os termos “polinucleotídeo” e “nucleotídeo” podem ser usados alternadamente um com o outro a menos que especificado o contrário.
[00109] Na presente descrição, os termos “polipeptídeo” e “proteína”
48 / 272 podem ser usados alternadamente um com o outro.
[00110] Na presente descrição, o termo “célula” inclui células em um animal individual e células cultivadas.
[00111] Na presente descrição, o termo “CDH6” pode ser usado para que tenha o mesmo significado que aquele da proteína CDH6. Na presente descrição, CDH6 humana é também referida como “hCDH6”.
[00112] Na presente descrição, pelo termo “atividade citotóxica”, entende-se uma alteração patológica que é causada a células de qualquer maneira. O termo não só significa um trauma direto, mas também significa todos os tipos de danos estruturais ou funcionais causados às células, como clivagem do DNA, formação de um dímero de base, clivagem de cromossomo, danos ao aparelho mitótico da célula e uma redução nas atividades de vários tipos de enzimas.
[00113] Na presente descrição, pela expressão “exercendo toxicidade em células”, entende-se que a toxicidade é exibida em células de qualquer maneira. O termo não só significa um trauma direto, mas também significa todos os tipos de influências estruturais, funcionais ou metabólicas causadas a células, como clivagem do DNA, formação de um dímero de base, clivagem de cromossomo, danos ao aparelho mitótico da célula, uma redução nas atividades de vários tipos de enzimas e supressão de efeitos de fatores de crescimento celular.
[00114] Na presente invenção, pelo termo “fragmento funcional de um anticorpo”, também chamado “fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo”, entende-se um fragmento parcial do anticorpo com atividade de ligação contra um antígeno, e inclui Fab, F(ab’)2, Fv, scFv, um diabody, um anticorpo linear e um anticorpo multiespecífico formado a partir de fragmentos de anticorpos e semelhantes. Fab’, que é um fragmento monovalente de regiões variáveis de anticorpos obtidas pelo tratamento de F(ab’)2 sob condições redutoras, e está incluído no fragmento de ligação ao
49 / 272 antígeno de um anticorpo. No entanto, o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo não se limita a essas moléculas, desde que o fragmento de ligação ao antígeno tenha capacidade de se ligar antígeno. Esses fragmentos de ligação ao antígeno incluem não só aqueles obtidos pelo tratamento de uma molécula proteica completa de um anticorpo com a enzima apropriada, mas proteínas produzidas em células hospedeiras apropriadas usando um gene modificado geneticamente do anticorpo.
[00115] O fragmento funcional da presente invenção inclui um fragmento funcional que possui asparagina bem conservada (Asn297 ou N297) a ser modificada com um glicano N-ligado na região Fc da cadeia pesada de IgG e aminoácidos em torno de Asn297, enquanto retendo a atividade de ligação a um antígeno.
[00116] Na presente descrição, pelo termo “epítopo”, entende-se o peptídeo parcial específico ou a estrutura tridimensional parcial de CDH6, ao qual se liga um anticorpo anti-CDH6. Tal epítopo, que é o peptídeo parcial de CDH6 descrito acima, pode ser determinado por um método bem conhecido pelo técnico no assunto, como um imunoensaio. Primeiramente, são produzidas várias estruturas parciais de um antígeno. Em relação à produção de tais estruturas parciais, pode-se aplicar uma técnica conhecida de síntese de oligonucleotídeos. Por exemplo, vários polipeptídeos, nos quais CDH6 tenha sido sucessivamente truncada em um comprimento adequado a partir do C- terminal ou N-terminal da mesma, são produzidos por uma técnica de recombinação genética bem conhecida pelo técnico no assunto. Posteriormente, a reatividade de um anticorpo frente a tais polipeptídeos é estudada, e os sítios de reconhecimento são aproximadamente determinados. Depois disso, peptídeos mais curtos adicionais são sintetizados, e a reatividade dos mesmos frente a esses peptídeos pode então ser estudada, de modo a determinar um epítopo. Quando a ligação de um anticorpo contra uma proteína da membrana com uma pluralidade de domínios extracelulares é
50 / 272 dirigida a uma estrutura tridimensional composta por uma pluralidade de domínios como um epítopo, a domínio ao qual se liga o anticorpo pode ser determinado modificando a sequência de aminoácidos de um domínio extracelular específico e, assim, modificando a estrutura tridimensional. O epítopo, que é uma estrutura tridimensional parcial de um antígeno que se liga a um anticorpo específico, pode também ser determinado especificando os resíduos de aminoácidos de um antígeno adjacente ao anticorpo utilizando análise estrutural por raios-X.
[00117] Na presente descrição, pela expressão “anticorpos ligando-se ao mesmo epítopo”, entende-se anticorpos que se ligam a um epítopo comum. Caso um segundo anticorpo se ligue a um peptídeo parcial ou uma estrutura tridimensional parcial ao qual se liga um primeiro anticorpo, pode-se determinar que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo se ligam ao mesmo epítopo. Alternativamente, ao ser confirmado que um segundo anticorpo compete com um primeiro anticorpo pela ligação do primeiro anticorpo a um antígeno (ou seja, um segundo anticorpo interfere com a ligação de um primeiro anticorpo a um antígeno), pode-se determinar que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo se ligam ao mesmo epítopo, mesmo que a sequência ou a estrutura específica do epítopo não tenha sido determinada. Na presente descrição, a expressão “ligam-se ao mesmo epítopo” refere-se ao caso em que se determina que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo se ligam a um epítopo comum por qualquer um ou por ambos esses métodos de determinação. Quando um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo se ligam ao mesmo epítopo e, adicionalmente, o primeiro anticorpo possui efeitos especiais, como atividade antitumoral ou atividade de internalização, pode-se esperar que o segundo anticorpo tenha a mesma atividade que aquela do primeiro anticorpo.
[00118] Na presente descrição, pelo termo “CDR”, entende-se uma região determinante de complementaridade. É conhecido que a cadeia pesada
51 / 272 e a cadeia leve de uma molécula de anticorpo têm, cada uma, três CDRs. Tal CDR é também referida como uma região hipervariável, e está localizada nas regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de um anticorpo. Essas regiões possuem uma estrutura primária particular e altamente variável e são separadas em três sítios na estrutura primária da cadeia polipeptídica na cadeia pesada e na cadeia leve. Na presente descrição, em relação à CDR de um anticorpo, as CDRs de uma cadeia pesada são referidas como CDRH1, CDRH2 e CDRH3, respectivamente, a partir do lado amino-terminal da sequência de aminoácidos da cadeia pesada, enquanto as CDRs de uma cadeia leve são referidas como CDRL1, CDRL2 e CDRL3, respectivamente, a partir do lado amino-terminal da sequência de aminoácidos da cadeia leve. Esses sítios estão localizados próximos uns dos outros na estrutura tridimensional e determinam a especificidade do anticorpo por um antígeno ao qual se liga o anticorpo.
[00119] Na presente descrição, pela expressão “hibridizar sob condições rigorosas”, entende-se que a hibridização é realizada na solução de hibridização disponível comercialmente ExpressHyb Hybridization Solution (fabricada pelo Clontech Laboratories, Inc.) a 68 ºC, ou que a hibridização é realizada sob condições nas quais a hibridização é realizada utilizando um filtro com DNA imobilizado na presença de NaCl 0,7 a 1,0 M a 68 ºC, e o resultante é então lavado a 68 ºC com solução SSC em 0,1 a 2 vezes a concentração (em que 1 vez a concentração de SSC consiste em NaCl 150 mM e citrato de sódio 15 mM) para identificação, ou condições equivalentes às mesmas.
[00120] Na presente descrição, pelo termo “um a vários”, entende-se 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3 ou 1 ou 2.
1. CDH6
[00121] Caderinas são glicoproteínas presentes na superfície de membranas celulares e funcionam como moléculas de adesão célula-célula
52 / 272 através da ligação dependente do íon cálcio de seus domínios extracelulares N-terminais, ou como moléculas sinalizadoras responsáveis por interação célula-célula. As caderinas clássicas estão na superfamília das caderinas e são proteínas transmembranas de passagem única, compostas por cinco domínios extracelulares (domínios EC), uma região transmembrana e um domínio intracelular.
[00122] CDH6 (caderina-6) é uma proteína transmembrana de passagem única, composta por 790 aminoácidos, que é classificada na família de caderinas do tipo II, e essa proteína possui domínios extracelular N- terminal e intracelular C-terminal. O gene CDH6 humano foi clonado pela primeira vez em 1995 (Literatura Não de Patente 1), e sua sequência pode ser citada sob, por exemplo, os Nos de acesso NM_004932 e NP_004923 (NCBI).
[00123] A proteína CDH6 utilizada na presente invenção pode ser purificada diretamente a partir de células que expressam CDH6 de um humano ou um mamífero não humano (por exemplo, um rato, um camundongo ou um macaco) e pode ser então utilizada, ou uma fração da membrana celular das células mencionadas acima pode ser utilizada como a proteína CDH6. Alternativamente, CDH6 pode também ser obtida por sua síntese in vitro ou permitindo que células hospedeiras produzam CDH6 por manipulação genética. De acordo com tal manipulação genética, a proteína CDH6 pode ser obtida, especificamente, pela incorporação do cDNA de CDH6 em um vetor capaz de expressar o cDNA de CDH6 e, a seguir, a síntese de CDH6 em uma solução contendo enzimas, substrato e materiais enérgicos necessários para transcrição e tradução, ou pela transformação de células hospedeiras de outros procariotos ou eucariotos, para que possam expressar CDH6. Além disso, células que expressam CDH6, com base na manipulação genética descrita acima, ou uma linhagem celular que expressa CDH6 pode ser utilizada para apresentar a proteína CDH6. Alternativamente,
53 / 272 o vetor de expressão no qual o cDNA de CDH6 tenha sido incorporado pode ser administrado diretamente a um animal a ser imunizado, e CDH6 pode ser expressa no corpo do animal assim imunizado.
[00124] Além disso, uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos compreendendo uma substituição, deleção e/ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos descrita acima de CDH6 e com uma atividade biológica equivalente àquela da proteína CDH6 é abrangida também pelo termo “CDH6”.
[00125] A proteína CDH6 humana possui a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1. A região extracelular da proteína CDH6 humana é constituída pelo domínio extracelular 1 (no relatório descritivo, também referido como EC1), tendo o 54o ao 159o aminoácido na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1, o domínio extracelular 2 (no relatório descritivo, também referido como EC2), tendo o 160o ao 268o aminoácido na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1, o domínio extracelular 3 (no relatório descritivo, também referido como EC3), tendo o 269o ao 383o aminoácido na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1, o domínio extracelular 4 (no relatório descritivo, também referido como EC4), tendo o 384o ao 486o aminoácido na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 e o domínio extracelular 5 (no relatório descritivo, também referido como EC5) tendo o 487o ao 608o aminoácido na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1. As sequências de aminoácidos e EC1 a EC5 são respectivamente representadas por SEQ ID NOs: 2 a 6 (Tabela 1).
2. Produção de anticorpo anti-CDH6
[00126] Um exemplo do anticorpo anti-CDH6 da presente invenção pode incluir um anticorpo anti-CDH6 que reconhece uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4, e possui atividade de internalização. Um exemplo do anticorpo
54 / 272 anti-CDH6 da presente invenção pode incluir um anticorpo anti-CDH6 que reconhece especificamente uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4, e possui atividade de internalização. Um exemplo do anticorpo anti-CDH6 da presente invenção pode incluir um anticorpo anti-CDH6 que reconhece uma sequência de aminoácidos que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4, e possui atividade de internalização. Um exemplo do anticorpo anti- CDH6 da presente invenção pode incluir um anticorpo anti-CDH6 que reconhece especificamente uma sequência de aminoácidos que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4, e possui atividade de internalização. Pela expressão “reconhece especificamente uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4” ou “reconhece especificamente um domínio EC3”, quando aplicada a um anticorpo, entende-se que o anticorpo reconhece fortemente ou se liga fortemente ao domínio EC3 de CDH6 em comparação com os outros domínios extracelulares de CDH6.
[00127] O anticorpo anti-CDH6 da presente invenção pode ser derivado de qualquer espécie. Os exemplos preferidos da espécie podem incluir humanos, macacos, ratos, camundongos e coelhos. Quando o anticorpo anti-CDH6 da presente invenção é derivado de uma espécie que seja não humana, prefere-se que o anticorpo anti-CDH6 seja quimerizado ou humanizado por uma técnica bem conhecida. O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal ou pode ser um anticorpo monoclonal, e um anticorpo monoclonal é preferido.
[00128] O anticorpo anti-CDH6 da presente invenção é um anticorpo que pode ser direcionado para células tumorais. Especificamente, o anticorpo anti-CDH6 da presente invenção possui a propriedade de ser capaz de reconhecer células tumorais, a propriedade de ser capaz de ligar-se a células tumorais e/ou a propriedade de ser internalizado em células tumorais por
55 / 272 absorção celular, e semelhantes. Deste modo, o anticorpo anti-CDH6 da presente invenção pode ser conjugado a um composto que tenha atividade antitumoral por meio de um ligante para preparar um conjugado anticorpo- fármaco.
[00129] A atividade de ligação de um anticorpo contra células tumorais pode ser confirmada por citometria de fluxo. A absorção de um anticorpo nas células tumorais pode ser confirmada por (1) um ensaio em que a absorção celular de um anticorpo é visualizada sob um microscópio fluorescente usando a ligação de um segundo anticorpo (marcado com fluorescência) ao anticorpo (Cell Death and Differentiation, 2008, 15, 751-761), (2) um ensaio em que a quantidade de fluorescência celular absorvida é medida usando a ligação de um anticorpo secundário (marcado com fluorescência) ao anticorpo (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 5268-5282, December 2004) ou (3) um ensaio Mab-ZAP que usa a ligação de uma imunotoxina ao anticorpo, em que a toxina é liberada quando da absorção celular, de modo a suprimir o crescimento celular (Bio Techniques, 28: 162-165, January 2000). Uma proteína recombinante conjugada de uma região catalítica da toxina diftérica e proteína G pode ser utilizada como a imunotoxina.
[00130] Na presente descrição, pelo termo “alta capacidade de internalização”, entende-se que a taxa de sobrevida (que é indicada por uma razão em relação a uma taxa de sobrevida sem a adição do anticorpo, definida como 100%) de células que expressam CDH6, às quais o anticorpo mencionado acima e um anticorpo anti-IgG de rato marcado com saporina foram administrados, é preferivelmente igual ou inferior a 70% e mais preferivelmente igual ou inferior a 60%.
[00131] O conjugado anticorpo-fármaco compreende um composto conjugado que exerce um efeito antitumoral. Portanto, prefere-se, mas não é essencial, que o próprio anticorpo deva ter um efeito antitumoral. Para fins de exercer específica e/ou seletivamente a citotoxicidade do composto
56 / 272 antitumoral em células tumorais, é importante e preferido que o anticorpo deva ter uma propriedade de ser internalizado e transferido para células tumorais.
[00132] O anticorpo anti-CDH6 pode ser obtido imunizando um animal com um polipeptídeo que serve como antígeno por um método normalmente realizado nesse campo e, a seguir, coletando e purificando um anticorpo produzido no corpo vivo do mesmo. Prefere-se utilizar CDH6 retendo a estrutura tridimensional como um antígeno. Os exemplos de tal método podem incluir um método de imunização com DNA.
[00133] A origem do antígeno não se limita a um humano e, assim, um animal pode também ser imunizado com um antígeno derivado de um animal não humano, como um camundongo ou um rato. Nesse caso, um anticorpo aplicável à doença de um humano pode ser selecionado examinando-se a reatividade cruzada da ligação do anticorpo obtido ao antígeno heterólogo com o antígeno humano.
[00134] Além disso, células produtoras do anticorpo que produzem um anticorpo contra o antígeno podem ser fundidas com células de mieloma de acordo com um método conhecido (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature (1975) 256, 495-497; e Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, 365-367, Plenum Press, N. Y. (1980)) para estabelecer hibridomas, de modo a obter um anticorpo monoclonal.
[00135] A seguir, o método para obter um anticorpo contra CDH6 será especificamente descrito. (1) Preparação do antígeno
[00136] O antígeno pode ser obtido permitindo que células hospedeiras produzam um gene que codifica a proteína do antígeno de acordo com a manipulação genética. Especificamente, um vetor capaz de expressar o gene do antígeno é produzido, e o vetor é então introduzido em células hospedeiras para que o gene seja expresso nas mesmas e, depois disso, o antígeno
57 / 272 expresso pode ser purificado. O anticorpo pode também ser obtido por um método em que um animal é imunizado com as células que expressam o antígeno tendo por base a manipulação genética descrita acima, ou uma linhagem celular que expresse o antígeno.
[00137] Alternativamente, o anticorpo pode também ser obtido sem o uso da proteína do antígeno, pela incorporação de cDNA da proteína do em um vetor de expressão, então administrando o vetor de expressão a um animal a ser imunizado e expressando a proteína do antígeno no corpo do animal assim imunizado, para que um anticorpo contra a proteína do antígeno seja produzido no mesmo. (2) Produção de anticorpo monoclonal anti-CDH6
[00138] O anticorpo anti-CDH6 utilizado na presente invenção não é particularmente limitado. Por exemplo, um anticorpo especificado por uma sequência de aminoácidos mostrada na listagem de sequências do presente pedido de patente pode ser adequadamente utilizado. O anticorpo anti-CDH6 utilizado na presente invenção é desejavelmente um anticorpo com as propriedades seguintes: (1) um anticorpo tendo as propriedades seguintes: (a) ligar-se especificamente a CDH6, e (b) ter a atividade de ser internalizado em células que expressam CDH6 pela ligação a CDH6; (2) o anticorpo de acordo com o (1) acima, em que a CDH6 é CDH6 humana; ou (3) reconhecer especificamente EC3 de CDH6 humana e ter atividade de internalização.
[00139] O método para obter o anticorpo contra CDH6 da presente invenção não é particularmente limitado desde que um anticorpo anti-CDH6 possa ser obtido. Prefere-se utilizar CDH6 que retenha sua conformação como um antígeno.
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[00140] Um exemplo preferido do método para obter o anticorpo pode incluir um método de imunização com DNA. O método de imunização com DNA é uma abordagem que envolve transfectar um animal (por exemplo, camundongo ou rato) individual com um plasmídeo de expressão do antígeno e, a seguir, expressar o antígeno no indivíduo para induzir imunidade contra o antígeno. A abordagem de transfecção inclui um método de injetar diretamente o plasmídeo em um músculo, um método de injetar um reagente de transfecção, como um lipossoma ou polietilenimina, em uma veia, uma abordagem usando um vetor viral, uma abordagem de injetar partículas de ouro anexadas ao plasmídeo utilizando uma pistola de genes, um método hidrodinâmico de injetar rapidamente uma solução do plasmídeo em grande quantidade em uma veia e semelhantes. Em relação ao método de transfecção para injeção do plasmídeo de expressão em um músculo, uma técnica denominada eletroporação in vivo, que envolve aplicar eletroporação ao sítio de injeção intramuscular do plasmídeo, é conhecida como uma abordagem para melhorar os níveis de expressão (Aihara H, Miyazaki, J. Nat Biotechnol. 1998 Sep; 16 (9): 867-70 ou Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Delaere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D., Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Apr 13; 96 (8): 4262-7). Essa abordagem melhora adicionalmente o nível de expressão pelo tratamento do músculo com hialuronidase antes da injeção intramuscular do plasmídeo (McMahon JM1, Signori E, Wells KE, Fazio VM, Wells DJ., Gene Ther. 2001 Aug; 8 (16): 1264-70). Além disso, a produção de hibridoma pode ser realizada por um método conhecido, e pode também ser realizada utilizando, por exemplo, um sistema Hybrimune Hybridoma Production System (Cyto Pulse Sciences, Inc.).
[00141] Exemplos específicos de como obter um anticorpo monoclonal podem incluir os seguintes procedimentos: (a) a resposta imune pode ser induzida incorporando um
59 / 272 cDNA de CDH6 em um vetor de expressão (por exemplo, pcDNA3.1; Thermo Fisher Scientific Inc.) e administrando diretamente o vetor a um animal (por exemplo, um rato ou um camundongo) a ser imunizado por um método como eletroporação ou uma pistola de genes, de modo a expressar CDH6 no corpo do animal. A administração do vetor por eletroporação ou semelhantes pode ser realizada uma ou mais vezes, de preferência, uma pluralidade de vezes, se necessário para intensificar o título do anticorpo; (b) coleta de tecido (por exemplo, um linfonodo) contendo células produtoras do anticorpo do animal mencionado acima no qual a resposta imune foi induzida; (c) preparação de células de mieloma (a seguir referidas como “mielomas”) (por exemplo, células mieloma SP2/0-ag14 de camundongo); (d) fusão celular entre as células produtoras do anticorpo e as mielomas; (e) seleção de um grupo do hibridoma produzir um anticorpo de interesse; (f) divisão em clones de célula única (clonagem); (g) opcionalmente, a cultura de hibridomas para a produção em massa de anticorpos monoclonais, ou a criação de animais nos quais os hibridomas são inoculados; e/ou (h) estudo da atividade fisiológica (atividade de internalização) e especificidade de ligação do anticorpo monoclonal assim produzido, ou exame das propriedades do anticorpo como um reagente de marcação.
[00142] Os exemplos do método para medir o título do anticorpo aqui utilizado podem incluir, entre outros, citometria de fluxo e Cell-ELISA.
[00143] Os exemplos da cepa do hibridoma assim estabelecido pode incluir o hibridoma rG019 produtor do anticorpo anti-CDH6. Deve-se notar que, na presente descrição, um anticorpo produzido pelo hibridoma rG019 produtor do anticorpo anti-CDH6 é referido como “anticorpo rG019” ou
60 / 272 simplesmente como “rG019”.
[00144] A região variável da cadeia leve do anticorpo rG019 consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 10. A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rG019 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 11. A região variável da cadeia leve do anticorpo rG019 possui CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14. A região variável da cadeia pesada do anticorpo rG019 consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 15. A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo rG019 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 16. A região variável da cadeia pesada do anticorpo rG019 possui CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 18 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 19.
[00145] Além disso, mesmo que um anticorpo monoclonal tivesse sido obtido independentemente pelas etapas (a) a (h) em “2. Produção do anticorpo anti-CDH6” novamente, ou um anticorpo monoclonal tivesse sido obtido separadamente utilizando outro método, é possível obter um anticorpo tendo atividade de internalização equivalente àquela do anticorpo rG019. Um exemplo de tais anticorpos é um anticorpo que se liga a um epítopo idêntico ao epítopo ao qual se liga o anticorpo rG019. Se um anticorpo monoclonal recém-produzido se ligar a um peptídeo parcial ou estrutura tridimensional parcial ao qual se liga o anticorpo rG019, pode-se determinar que o anticorpo monoclonal se liga a um epítopo idêntico ao epítopo ao qual se liga o anticorpo rG019. Com a confirmação de que o anticorpo monoclonal compete com o anticorpo rG019 pela ligação a CDH6 (ou seja, o anticorpo monoclonal
61 / 272 interfere com a ligação entre o anticorpo rG019 e CDH6), pode-se determinar, mesmo quando a sequência ou estrutura específica de um epítopo não tenha sido determinada, que o anticorpo monoclonal se liga a um epítopo idêntico ao epítopo ao qual se liga o anticorpo anti-CDH6. Se a identidade do epítopo tiver sido confirmada, é fortemente previsto que o anticorpo monoclonal tenha atividade de ligação ao antígeno, atividade biológica e/ou atividade de internalização equivalentes àquelas do anticorpo rG019. (3) Outros anticorpos
[00146] O anticorpo da presente invenção também inclui anticorpos geneticamente recombinantes que tenham sido modificados artificialmente com o objetivo de reduzir a antigenicidade heterogênica contra humanos, tal como um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano, bem como o anticorpo monoclonal descrito acima contra CDH6. Esses anticorpos podem ser produzidos por métodos conhecidos.
[00147] Os exemplos do anticorpo quimérico podem incluir anticorpos nos quais uma região variável e uma região constante são heterólogas entre si, tal como um anticorpo quimérico formado pela conjugação da região variável de um anticorpo derivado de camundongo ou rato com uma região constante derivada de humano (ver, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984)).
[00148] Os exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo do rato anti-CDH6 humana incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve compreendendo a região variável da cadeia leve de um anticorpo de rato anti-CDH6 humana descrito na presente descrição (por exemplo, anticorpo rG019) e uma região constante derivada de humano, e uma cadeia pesada compreendendo a região variável da cadeia pesada do anticorpo de rato anti- CDH6 humana e uma região constante derivada de humano.
[00149] Outros exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo de rato anti-CDH6 humana incluem um anticorpo que consiste em
62 / 272 uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve com uma substituição de um a vários resíduos, 1 a 3 resíduos, 1 ou 2 resíduos, de preferência 1 resíduo de aminoácido na região variável da cadeia leve de um anticorpo de rato anti-CDH6 humana descrito na presente descrição (por exemplo, anticorpo rG019) por outros resíduos de aminoácidos, e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada com uma substituição de um a vários resíduos, 1 a 3 resíduos, 1 ou 2 resíduos, de preferência 1 resíduo de aminoácido na região variável da cadeia pesada do anticorpo de rato anti-CDH6 humana por outros resíduos de aminoácidos. Esse anticorpo pode ter qualquer região constante derivada de humano.
[00150] Outros exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo de rato anti-CDH6 humana incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve com uma substituição igual a 1 ou 2 resíduos, de preferência 1 resíduo de aminoácido em qualquer 1 a 3 CDRs na região variável da cadeia leve de um anticorpo de rato anti-CDH6 humana descrito na presente descrição (por exemplo, o anticorpo rG019) por outros resíduos de aminoácidos, e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada com uma substituição de 1 ou 2 resíduos, de preferência 1 resíduo de aminoácido em qualquer 1 a 3 CDRs na região variável da cadeia pesada do anticorpo de rato anti-CDH6 humana por outros resíduos de aminoácidos. Esse anticorpo pode ter qualquer região constante derivada de humano.
[00151] Os exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo rG019 incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 10, e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 15. Esse anticorpo pode ter qualquer região constante derivada de humano.
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[00152] Outros exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo rG019 incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve com uma substituição de um a vários resíduos, 1 a 3 resíduos, 1 ou 2 resíduos, de preferência 1 resíduo de aminoácido na região variável da cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 10 por outros resíduos de aminoácidos, e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada com uma substituição de um a vários resíduos, 1 a 3 resíduos, 1 ou 2 resíduos, de preferência 1 resíduo de aminoácido na região variável da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 15 por outros resíduos de aminoácidos. Esse anticorpo pode ter qualquer região constante derivada de humano.
[00153] Outros exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo rG019 incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve com uma substituição de 1 ou 2 resíduos (de preferência 1 resíduo) de aminoácidos em qualquer 1 a 3 CDRs na região variável da cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 10 por outros resíduos de aminoácidos, e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada com uma substituição de 1 ou 2 resíduos (de preferência 1 resíduo) e aminoácidos em qualquer 1 a 3 CDRs na região variável da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 15 por outros resíduos de aminoácidos. Esse anticorpo pode ter qualquer região constante derivada de humano.
[00154] Outros exemplos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo rG019 incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 10, e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada que consiste na
64 / 272 sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 28. Esse anticorpo pode ter qualquer região constante derivada de humano. A sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 28 é uma sequência com um resíduo de cisteína substituído por um resíduo de prolina em CDRH2 na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 15.
[00155] Exemplos específicos do anticorpo quimérico derivado do anticorpo rG019 incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 23, e uma cadeia pesada que consiste na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 26. Na presente descrição, esse anticorpo quimérico anti-CDH6 humana é referido como um “anticorpo quimérico G019”, um “anticorpo chG019” ou “chG019”. A sequência completa de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo chG019 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 24, e a sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo chG019 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 27.
[00156] A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo chG019 é idêntica à sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo rG019, e consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 10. A cadeia leve do anticorpo chG019 possui CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14, as quais são idênticas às CDRL1, CDRL2 e CDRL3, respectivamente, da cadeia leve de rG019. A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo chG019 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 25.
[00157] A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo chG019 consiste na sequência de aminoácidos mostrada
65 / 272 em SEQ ID NO: 28. A cadeia pesada do anticorpo chG019 possui CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 30 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 19. A sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 28 é uma sequência com um resíduo de cisteína substituído por um resíduo de prolina em CDRH2 na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 15. A CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 30 é uma sequência com um resíduo de cisteína substituído por um resíduo de prolina na CDRH2 de rG019 mostrada em SEQ ID NO: 18. A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada do anticorpo chG019 é codificada pela sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 29.
[00158] Os exemplos do anticorpo humanizado podem incluir um anticorpo formado incorporando somente regiões determinantes de complementaridade (CDRs) em um anticorpo derivado de humano (ver Nature (1986) 321, p. 522-525), um anticorpo formado incorporando os resíduos de aminoácidos de algumas regiões frameworks, bem como de CDRs, em um anticorpo humano de acordo com um método de enxertia de CDRs (Publicação Internacional No WO90/07861) e um anticorpo formado modificando as sequências de aminoácidos de algumas CDRs enquanto mantendo a capacidade para ligar-se ao antígeno.
[00159] Na presente descrição, o anticorpo humanizado derivado do anticorpo rG019 ou o anticorpo chG019 não está limitado a um anticorpo humanizado específico, desde que o anticorpo humanizado retenha todas as seis sequências de CDRs exclusivas do anticorpo rG019 ou do anticorpo chG019 e tenha atividade de internalização. As sequências de aminoácidos de algumas CDRs desse anticorpo humanizado podem ser adicionalmente modificadas desde que o anticorpo tenha atividade de internalização.
[00160] Exemplos concretos do anticorpo humanizado do anticorpo
66 / 272 chG019 podem incluir qualquer dada combinação de: uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em qualquer sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em (1) a região variável da cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 ou 37, (2) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade (de preferência uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de uma região framework que não seja a sequência de cada CDR) com a sequência de aminoácidos (1) descrita acima, e (3) uma sequência de aminoácidos compreendendo uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos (1) descrita acima; e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em qualquer sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em (4) a região variável da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 41, 45, 49, 55 ou 60, (5) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade (de preferência uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência de com a sequência de uma região framework que não seja a sequência de cada CDR) com a sequência de aminoácidos (4) descrita acima, e (6) uma sequência de aminoácidos compreendendo uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos (4) descrita acima.
[00161] Alternativamente, pode-se utilizar um anticorpo com uma cadeia pesada ou cadeia leve humanizada e a outra cadeia derivada de um anticorpo de rato ou um anticorpo quimérico. Os exemplos de tal anticorpo podem incluir qualquer dada combinação de: uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em qualquer sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em (1) a região variável da cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada
67 / 272 em SEQ ID NO: 33 ou 37, (2) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade (de preferência uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de uma região framework que não seja a sequência de cada CDR) com a sequência de aminoácidos (1) descrita acima, e (3) uma sequência de aminoácidos compreendendo uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos in na sequência de aminoácidos (1) descrita acima; e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em qualquer sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em (4) a região variável da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 15 ou 28, (5) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade (de preferência uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de uma região framework que não seja a sequência de cada CDR) com a sequência de aminoácidos (4) descrita acima, e (6) uma sequência de aminoácidos compreendendo uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos (4) descrita acima.
Outros exemplos de tal anticorpo podem incluir qualquer dada combinação de: uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em qualquer sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em (1) a região variável da cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 10, (2) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade (de preferência uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de uma região framework que não seja a sequência de cada CDR) com a sequência de aminoácidos (1) descrita acima, e (3) uma sequência de aminoácidos compreendendo uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos (1) descrita acima; e uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia
68 / 272 pesada consistindo em qualquer sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em (4) a região variável da cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 41, 45, 49, 55 ou 60, (5) uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade (de preferência uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de uma região framework que não seja a sequência de cada CDR) com a sequência de aminoácidos (4) descrita acima, e (6) uma sequência de aminoácidos compreendendo uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos (4) descrita acima.
[00162] A substituição de aminoácido na presente descrição é preferivelmente uma substituição conservadora de aminoácido. A substituição conservadora de aminoácido é uma substituição ocorrida dentro de um grupo de aminoácidos associados com certas cadeias laterais dos aminoácidos. Os grupos preferidos de aminoácidos são os seguintes: grupo ácido = ácido aspártico e ácido glutâmico; grupo básico = lisina, arginina e histidina; grupo não polar = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina e triptofano; e família polar sem carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina e tirosina. Outros grupos preferidos de aminoácidos são os seguintes: grupo hidroxi alifático = serina e treonina; grupo contendo amida = asparagina e glutamina; grupo alifático = alanina, valina, leucina e isoleucina; e grupo aromático = fenilalanina, triptofano e tirosina. Tal substituição de aminoácido é realizada preferivelmente sem prejudicar as propriedades de uma substância com a sequência original de aminoácidos.
[00163] Os exemplos do anticorpo tendo uma combinação preferida das cadeias leves e pesadas descritas acima incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 33 (na presente descrição,
69 / 272 também referida como uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve hL02) ou uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 37 (na presente descrição, também referida como uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve hL03), e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 41 (na presente descrição, também referida como uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH01), uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 45 (na presente descrição, também referida como uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH02) ou uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 49 (na presente descrição, também referida como uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH04), uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 55 (na presente descrição, também referida como uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH11) ou uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 60 (na presente descrição, também referida como uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH31).
[00164] A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH11 mostrada em SEQ ID NO: 55 possui CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 57, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 58 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 59. A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH31 mostrada em SEQ ID NO: 60 possui CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 62, CDRH2 que consiste na sequência de
70 / 272 aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 63 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 64.
[00165] Os exemplos preferidos do anticorpo incluem: um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 41; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 45; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 49; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 55; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 60; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 37 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 41; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ
71 / 272 ID NO: 37 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 45; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 37 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 49; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 37 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 55; e um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 37 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 60.
[00166] Os exemplos mais preferidos do anticorpo incluem: um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 41; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 45; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 49; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ
72 / 272 ID NO: 37 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 45; um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 55; e um anticorpo que consiste em uma cadeia leve com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma cadeia pesada com a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 60.
[00167] Outros exemplos do anticorpo tendo uma combinação preferida de cadeias leves e cadeias pesadas incluem um anticorpo que consiste em uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 31 (na presente descrição, também referida como a hL02 sequência completa de aminoácidos da cadeia leve hL02) ou uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 35 (na presente descrição, também referida como a sequência completa de aminoácidos da cadeia leve hL03), e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 39 (na presente descrição, também referida como a sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH01), uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 43 (na presente descrição, também referida como a sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH02), uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em
73 / 272 SEQ ID NO: 47 (na presente descrição, também referida como a sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH04), uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 65 (na presente descrição, também referida como a sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH01A), uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 67 (na presente descrição, também referida como a sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH11A) ou uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 69 (na presente descrição, também referida como a sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH31A).
[00168] Exemplos de outro anticorpo preferível incluem: um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 39, um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 43, um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de
74 / 272 aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 47, um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 65, um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 67, um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 69, um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 39, um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na
75 / 272 sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 43, um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 47, um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 65, um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 67 ou um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 69.
76 / 272
[00169] Os exemplos de um anticorpo mais preferível incluem: um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 39 (na presente descrição, também referido como o “anticorpo H01L02” ou “H01L02”), um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 43 (na presente descrição, também referido como o “anticorpo H02L02” ou “H02L02”), um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 47 (na presente descrição, também referido como o “anticorpo H04L02” ou “H04L02”), um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 43 (na presente descrição, também referido como o “anticorpo H02L03” ou “H02L03”),
77 / 272 um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 65 (na presente descrição, também referido como o “anticorpo H01L02A” ou “H01L02A), um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 67 (na presente descrição, também referido como o “anticorpo H11L02A” ou “H11L02A) e um anticorpo que consiste em uma cadeia leve consistindo na sequência de aminoácidos das posições 21 a 233 na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada consistindo na sequência de aminoácidos das posições 20 a 471 na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 69 (na presente descrição, também referido como o “anticorpo H31L02A” ou “H31L02A).
[00170] Com a combinação de sequências que mostram alta identidade com as sequências de aminoácidos da cadeia pesada e com as sequências de aminoácidos da cadeia leve descritas acima, é possível selecionar um anticorpo que tenha uma atividade biológica equivalente àquela de cada um dos anticorpos descritos acima. Tal identidade é uma identidade geralmente igual ou superior a 80%, de preferência igual ou superior a 90%, mais preferivelmente igual ou superior a 95% e o mais preferivelmente igual ou superior a 99%. Além disso, com a combinação também de sequências de
78 / 272 aminoácidos de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve que compreendam uma substituição, deleção ou adição de um ou vários resíduos de aminoácidos das mesmas, em relação à sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada ou de uma cadeia leve, é possível selecionar um anticorpo que tenha uma atividade biológica equivalente àquela de cada um dos anticorpos descritos acima.
[00171] A identidade entre dois tipos de sequências de aminoácidos pode ser determinada pelo alinhamento das sequências utilizando os parâmetros padrão de Clustal W versão 2 (Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ e Higgins DG (2007), “Clustal W and Clustal X version 2.0”, Bioinformatics.23 (21): 2947-2948).
[00172] Deve-se notar que, na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve hL02, mostrada em SEQ ID NO: 31, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 1 a 20 é uma sequência sinal, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 21 a 128 é uma região variável e a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 129 a 233 é uma região constante.
[00173] Na sequência completa de aminoácidos da cadeia leve hL03, mostrada em SEQ ID NO: 35, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 1 a 20 é uma sequência sinal, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 21 a 128 é uma região variável e a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 129 a 233 é uma região constante.
[00174] Na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH01, mostrada em SEQ ID NO: 39, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 1 a 19 é a sequência sinal, a
79 / 272 sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 20 a 141 é uma região variável e a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 142 a 471 é uma região constante.
[00175] Na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH02, mostrada em SEQ ID NO: 43, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 1 a 19 é uma sequência sinal, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 20 a 141 é uma região variável e a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 142 a 471 é uma região constante.
[00176] Na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH04, mostrada em SEQ ID NO: 47, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 1 a 19 é uma sequência sinal, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 20 a 141 é uma região variável e a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 142 a 471 é uma região constante.
[00177] Na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH01A, mostrada em SEQ ID NO: 65, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 1 a 19 é uma sequência sinal, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 20 a 141 é uma região variável e a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 142 a 471 é uma região constante.
[00178] Na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH11A, mostrada em SEQ ID NO: 67, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 1 a 19 é uma sequência sinal, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos
80 / 272 das posições 20 a 141 é uma região variável e a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 142 a 471 é uma região constante.
[00179] Na sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH31A, mostrada em SEQ ID NO: 69, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 1 a 19 é uma sequência sinal, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 20 a 141 é uma região variável e a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 142 a 471 é uma região constante.
[00180] Um exemplo adicional do anticorpo da presente invenção pode incluir um anticorpo humano que se liga a CDH6. O anticorpo humano anti- CDH6 refere-se a um anticorpo humano cuja sequência de genes de anticorpo seja somente derivada de cromossomos humanos. O anticorpo humano anti- CDH6 pode ser obtido por um método que utiliza um camundongo produtor de anticorpos humanos tendo um fragmento cromossômico humano compreendendo os genes da cadeia pesada e da cadeia leve de um anticorpo humano (ver, Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects, vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. e Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p. 722-727; etc.).
[00181] Tal camundongo produtor de anticorpos humanos pode ser especificamente produzido utilizando um animal geneticamente modificado, cujos loci de genes da cadeia pesada e cadeia leve da imunoglobulina endógena tenham sido alterados e, em vez disso, os loci de genes da cadeia pesada e cadeia leve de imunoglobulina humana tenham sido introduzidos usando um vetor de cromossomos artificiais de levedura (YAC) ou
81 / 272 semelhantes, produzindo então um animal knock-out e um animal transgênico a partir de tal animal geneticamente modificado, e a seguir, reproduzindo tais animais uns com outros.
[00182] Do contrário, o anticorpo humano anti-CDH6 pode também ser obtido pela transformação de células eucarióticas com cDNA codificador da cadeia pesada e da cadeia leve de tal anticorpo humano ou, de preferência, com um vetor compreendendo tal cDNA, de acordo com técnicas de recombinação genética e, a seguir, cultivando as células transformadas e produzindo um anticorpo monoclonal geneticamente modificado, para que o anticorpo possa ser obtido no sobrenadante da cultura.
[00183] Nesse contexto, células eucarióticas e, de preferência, células de mamíferos, como células CHO, linfócitos ou mielomas podem, por exemplo, ser usadas como hospedeiro.
[00184] Além disso, também se conhece um método para como obter um anticorpo humano derivado de expressão em fagos que tenha sido selecionado a partir de uma biblioteca de anticorpos humanos (ver Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p. 427-431; etc.).
[00185] Por exemplo, pode ser aplicado um método de expressão em fagos, o qual compreende permitir que as várias regiões variáveis de um anticorpo humano sejam expressas como um anticorpo de cadeia única (scFv) na superfície de fagos e, a seguir, selecionar um fago que se ligue a um antígeno (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116).
[00186] Com a análise do gene do fago que foi selecionado por sua capacidade de ligação ao antígeno, pode-se determinar a sequência de DNA que codifica a região variável de um anticorpo humano que se liga ao antígeno.
82 / 272
[00187] Uma vez seja determinada a sequência de DNA do scFv que se liga ao antígeno, um vetor de expressão tendo a sequência mencionada acima é produzido, e o vetor de expressão produzido e, a seguir, introduzido em um hospedeiro adequado e permitido que se expresse no mesmo, obtendo, assim, um anticorpo humano (Publicação Internacional Nos WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438 e WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116).
[00188] Se um anticorpo humano recém-produzido ligar-se a um peptídeo parcial ou a uma estrutura tridimensional parcial ao qual se liga qualquer um dentre anticorpo de rato anti-CDH6 humana, anticorpo quimérico anti-CDH6 humana e anticorpo humanizado anti-CDH6 humana descritos na presente descrição (por exemplo, o anticorpo rG019, o anticorpo chG019, o anticorpo H01L02, o anticorpo H02L02, o anticorpo H02L03, o anticorpo H04L02, o anticorpo H01L02A, o anticorpo H011L02A ou o anticorpo H031L02A), pode-se determinar que o anticorpo humano se liga ao mesmo epítopo ao qual se liga o anticorpo de rato anti-CDH6 humana, o anticorpo quimérico anti-CDH6 humana ou o anticorpo humanizado anti- CDH6 humana. Alternativamente, com a confirmação de que o anticorpo humano compete com o anticorpo de rato anti-CDH6 humana, o anticorpo quimérico anti-CDH6 humana ou o anticorpo humanizado anti-CDH6 humana descritos na presente descrição (por exemplo, o anticorpo rG019, o anticorpo chG019, o anticorpo H01L02, o anticorpo H02L02, o anticorpo H02L03, o anticorpo H04L02, o anticorpo H01L02A, o anticorpo H011L02A ou o anticorpo H031L02A) na ligação do anticorpo a CDH6 (por exemplo, o anticorpo humano interfere com a ligação do anticorpo rG019, do anticorpo chG019, do anticorpo H01L02, do anticorpo H02L02, do anticorpo H02L03, do anticorpo H04L02, do anticorpo H01L02A, do anticorpo H011L02A ou do anticorpo H031L02A a CDH6, de preferência ao EC3 de CDH6), pode-se
83 / 272 determinar que o anticorpo humano se liga ao mesmo epítopo ao qual se liga o anticorpo de rato anti-CDH6 humana, o anticorpo quimérico anti-CDH6 humana ou o anticorpo humanizado anti-CDH6 humana descritos na presente descrição, mesmo que a sequência ou a estrutura específica do epítopo não tenha sido determinada. Na presente descrição, quando se determina por pelo menos um desses métodos de determinação que o anticorpo humano “se liga ao mesmo epítopo”, é concluído que o anticorpo humano recém-preparado “se liga ao mesmo epítopo” que aquele para o anticorpo de rato anti-CDH6 humana, o anticorpo quimérico anti-CDH6 humana ou o anticorpo humanizado anti-CDH6 humana descritos na presente descrição. Quando é confirmado que o anticorpo humano se liga ao mesmo epítopo, então, prevê- se que o anticorpo humano deve ter uma atividade biológica equivalente àquela do anticorpo de rato anti-CDH6 humana, do anticorpo quimérico anti- CDH6 humana ou do anticorpo humanizado anti-CDH6 humana (por exemplo, o anticorpo rG019, o anticorpo chG019, o anticorpo H01L02, o anticorpo H02L02, o anticorpo H02L03, o anticorpo H04L02, o anticorpo H01L02A, o anticorpo H011L02A ou o anticorpo H031L02A).
[00189] Os anticorpos quiméricos, os anticorpos humanizados ou os anticorpos humanos obtidos pelos métodos descritos acima são avaliados quanto às suas atividades de ligação contra o antígeno de acordo com um método conhecido, etc., para que um anticorpo preferido possa ser selecionado.
[00190] Um exemplo de outro indicador para comparação das propriedades de anticorpos pode incluir a estabilidade de um anticorpo. Um calorímetro de varredura diferencial (DSC) é um aparelho capaz de medir prontamente e com exatidão um ponto médio de desnaturação térmica (Tm) que serve como um bom indicador da estabilidade estrutural relativa de uma proteína. Com o uso de DSC para medir valores de Tm e realizar uma comparação referente aos valores obtidos, as diferenças em estabilidade
84 / 272 térmica podem ser comparadas. É conhecido que a estabilidade de conservação de um anticorpo tem certa correlação com a estabilidade térmica do anticorpo (Lori Burton, et al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p. 265-273) e, assim, um anticorpo preferido pode ser selecionado usando a estabilidade térmica como um indicador. Outros exemplos de indicador para seleção de um anticorpo podem incluir alto rendimento em células hospedeiras adequadas e baixa aglutinação em uma solução aquosa. Por exemplo, considerando que um anticorpo com o maior rendimento nem sempre exibe a estabilidade térmica maior, é necessário selecionar um anticorpo mais adequado para administração a um humano pela determinação abrangente com base nos indicadores acima mencionados.
[00191] O anticorpo da presente invenção também inclui uma modificação de um anticorpo. Por modificação de um anticorpo da presente invenção, entende-se que este é modificado química ou biologicamente. Exemplos de tal modificação química incluem a ligação de uma porção química a um esqueleto de aminoácidos e a modificação química de uma cadeia de carboidrato N-ligada ou O-ligada. Exemplos de tal modificação biológica incluem anticorpos que passaram por uma modificação pós- traducional (por exemplo, glicosilação N-ligada ou O-ligada, processamento N-terminal ou C-terminal, desamidação, isomerização de ácido aspártico, oxidação de metionina e conversão da glutamina N-terminal ou do ácido glutâmico N-terminal em ácido piroglutâmico) e anticorpos aos quais é adicionado um resíduo de metionina ao N-terminal como resultado de ter sido permitido que fossem expressos utilizando células hospedeiras procarióticas. Além disso, tal modificação também se destina a incluir anticorpos marcados para permitir a detecção ou o isolamento do anticorpo da presente invenção ou de um antígeno, por exemplo, um anticorpo marcado por enzima, um anticorpo marcado por fluorescência e um anticorpo marcado por afinidade. Tal modificação do anticorpo da presente invenção é útil para melhoria da
85 / 272 estabilidade e retenção no sangue de um anticorpo; redução na antigenicidade; detecção ou isolamento de um anticorpo ou um antígeno; etc.
[00192] Além disso, com a regulação de uma modificação na cadeia de açúcar (glicosilação, desfucosilação etc.) que se liga ao anticorpo da presente invenção, a atividade citotóxica celular dependente de anticorpo pode ser intensificada. Como técnicas para regular a modificação na cadeia de açúcar de um anticorpo, são conhecidas aquelas descritas na Publicação Internacional Nos WO1999/54342, WO2000/61739, WO2002/31140 e WO2007/133855 etc., embora as técnicas não se limitem às mesmas. O anticorpo da presente invenção também inclui anticorpos em relação aos quais a modificação na cadeia de açúcar mencionada acima tenha sido regulada.
[00193] Uma vez um gene de anticorpo seja isolado, o gene pode ser introduzido em um hospedeiro adequado para produzir um anticorpo, usando uma combinação adequada de hospedeiro e vetor de expressão. Um exemplo específico do gene de anticorpo pode ser uma combinação de um gene que codifica a sequência da cadeia pesada do anticorpo descrito na presente descrição e um gene que codifica a sequência da cadeia leve do anticorpo descrito na mesma. Quando da transformação de células hospedeiras, tal gene da sequência da cadeia pesada e tal gel da sequência da cadeia leve podem ser inseridos em um único vetor de expressão, ou esses genes podem, em vez disso, ser inserido cada um em diferentes vetores de expressão.
[00194] Quando células eucarióticas são utilizadas como hospedeiras, é possível utilizar células de animais, células de plantas ou microrganismos eucarióticos. Em particular, os exemplos das células de animais podem incluir células de mamíferos como células COS que são células de macaco (Gluzman, Y., Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos NIH3T3 de camundongos (ATCC No CRL-1658), uma linhagem celular deficiente em dihidrofolato redutase de células do ovário de hamster chinês (células CHO, ATCC CCL-61) (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl.
86 / 272 Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p. 4126-4220) e células 293F FreeStyle (Invitrogen Corp.).
[00195] Quando células procarióticas são utilizadas como hospedeiras, podem ser utilizados Escherichia coli ou Bacillus subtilis, por exemplo.
[00196] Um gene de anticorpo de interesse é introduzido nessas células para transformação, e as células transformadas são então cultivadas in vitro para obter um anticorpo. Na cultura mencionada acima, há casos em que o rendimento é diferente dependendo da sequência do anticorpo e, desta forma, é possível selecionar um anticorpo, que é facilmente produzido como um medicamento, dentre anticorpos com atividade de ligação equivalente, usando o rendimento como um indicador. Consequentemente, o anticorpo da presente invenção também inclui um anticorpo obtido pelo método descrito acima para produção de um anticorpo, o qual compreende uma etapa de cultivo das células hospedeiras transformadas e uma etapa de coleta de um anticorpo de interesse ou de um fragmento funcional do anticorpo da cultura obtida na etapa mencionada acima.
[00197] É conhecido que o resíduo de lisina na terminação carboxila da cadeia pesada de um anticorpo produzido pelo cultivo de células de mamíferos é deletado (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), e além disso, é conhecido que os dois resíduos de aminoácidos na terminação carboxila da cadeia pesada, glicina e lisina, são deletados, e que o resíduo de prolina recém-posicionado na terminação carboxila é amidado (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). No entanto, tal deleção e modificação dessas sequências de cadeia pesada não têm influência sobre a atividade de ligação ao antígeno e a função efetora (ativação do complemento, citotoxicidade celular dependente de anticorpo etc.) e um anticorpo. Consequentemente, o anticorpo de acordo com a presente invenção também inclui um anticorpo, e um fragmento funcional do anticorpo, que sofreu a modificação mencionada acima, e exemplos específicos de tal anticorpo
87 / 272 incluem um mutante por deleção compreendendo uma deleção de 1 ou 2 aminoácidos na terminação carboxila da cadeia pesada, e um mutante por deleção formado pela amidação do mutante por deleção mencionado acima (por exemplo, uma cadeia pesada na qual o resíduo de prolina no sítio carboxi-terminal seja amidado). No entanto, os mutantes por deleção envolvendo uma deleção na terminação carboxila da cadeia pesada do anticorpo de acordo com a presente invenção não estão limitados aos mutantes por deleção descritos acima, desde que eles retenham a atividade de ligação ao antígeno e a função efetora. As duas cadeias pesadas que constituem o anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser qualquer tipo de cadeia pesada selecionado a partir do grupo que consiste em de um anticorpo completo e dos mutantes por deleção descritos acima, ou podem ser uma combinação de quaisquer dois tipos selecionados dentre o grupo mencionado acima. A razão de mutantes por deleção individuais pode ser influenciada pelos tipos de células de mamíferos cultivadas que produzem o anticorpo de acordo com a presente invenção e pelas condições de cultura. Os exemplos do principal ingrediente do anticorpo de acordo com a presente invenção podem incluir anticorpos em um resíduo de aminoácido é deletado em cada uma das terminações carboxila das duas cadeias pesadas.
[00198] Os exemplos do isotipo do anticorpo da presente invenção podem incluir IgG (IgG1, IgG3 e IgG4). Entre outros, IgG1, IgG2 e IgG4 são preferíveis.
[00199] Se IgG1 for utilizada como o isotipo do anticorpo da presente invenção, a função efetora pode ser ajustada substituindo alguns resíduos de aminoácidos na região constante. Os exemplos de variantes de IgG1 com a função efetora diminuída ou atenuada podem incluir, entre outras, IgG1 LALA (IgG1-L234A, L235A) e IgG1 LAGA (IgG1-L235A, G237A) (Journal of Virology, Vol. 75, No. 24 (Dec. 15, 2001), pp. 12161-12168), e uma variante preferida de IgG1 é IgG1 LALA. A L234A, L235A indica
88 / 272 substituição de leucina por alanina nas posições 234 e 235 especificadas pela numeração segundo o índice EU (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 63, No. 1 (May 15, 1969), pp. 78-85), e a G237A indica substituição de glicina por alanina na posição 237 especificada pela numeração segundo o índice EU.
[00200] Os exemplos típicos de bioatividade de anticorpos podem incluir, entre outros, atividade de ligação ao antígeno, atividade de internalização em células que expressam um antígeno por ligação ao antígeno, atividade de neutralização da atividade do antígeno, atividade de intensificação da atividade do antígeno, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente do complemento (CDC), e fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), e a função do anticorpo de acordo com a presente invenção é atividade de ligação a CDH6 e, de preferência, atividade de internalização em células que expressam CDH6 por ligação a CDH6. Além da atividade de internalização celular, o anticorpo da presente invenção pode ter atividades de ADCC, CDC e/ou ADCP em combinação.
[00201] O anticorpo obtido pode ser purificado até um estado homogêneo. Para separação/purificação do anticorpo, podem ser utilizados os métodos de separação/purificação comumente usados para proteína. Por exemplo, o anticorpo pode ser separado/purificado selecionado e combinando adequadamente cromatografia em coluna, filtração em filtro, ultrafiltração, salting-out, diálise, eletroforese preparativa com gel de poliacrilamida, focalização isoelétrica e assim por diante (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); e Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), mas os métodos de separação/purificação não se limitam aos mesmos.
[00202] Os exemplos de cromatografia podem incluir cromatografia de
89 / 272 afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia com filtração em gel, cromatografia em fase reversa e cromatografia por absorção.
[00203] Essas cromatografias podem ser realizadas utilizando cromatografia líquida como HPLC ou FPLC.
[00204] Os exemplos de colunas para cromatografia de afinidade podem incluir, entre outras, coluna de Proteína A e coluna de Proteína G. Os exemplos de colunas que podem ser utilizadas como coluna de Proteína A incluem Hyper D, POROS e Sepharose F. F. (Pharmacia).
[00205] Alternativamente, o anticorpo pode ser purificado utilizando a atividade de ligação a um antígeno com um suporte ao qual o antígeno tenha sido imobilizado.
[00206] A presente invenção refere-se a um polinucleotídeo que codifica o anticorpo da presente invenção. O polinucleotídeo da presente invenção é preferivelmente um polinucleotídeo compreendendo o polinucleotídeo descrito em qualquer um dos seguintes (a) a (e): (a) uma combinação de um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada com um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de cadeia leve do anticorpo contra CDH6 da presente invenção, (b) uma combinação de um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada incluindo as sequências de CDRH1 a CDRH3 com um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de cadeia leve incluindo as sequências de CDRL1 a CDRL3 de qualquer um dos anticorpos contra CDH6 da presente invenção, (c) uma combinação de um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada e um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de cadeia leve compreendendo a
90 / 272 sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve do anticorpo contra CDH6 da presente invenção, (d) um polinucleotídeo que pode se hibridizar com nucleotídeos que consistem em um polinucleotídeo complementar ao polinucleotídeo de acordo com qualquer um de (a) a (c) sob condições rigorosas e está codificando a sequência de aminoácidos do anticorpo capaz de se ligar a CDH6 e (e) um polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo obtido pela substituição, deleção, adição ou inserção de 1 a 50, 1 a 45, 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, um a oito, um a seis, um a cinco, um a quatro, um a três, um ou dois ou de um aminoácido no polinucleotídeo de acordo com qualquer um de (a) a (c) e que esteja codificando a sequência de aminoácidos do anticorpo capaz de se ligar a CDH6.
[00207] A presente invenção inclui um nucleotídeo que codifica o anticorpo da presente invenção ou um fragmento funcional do anticorpo, ou uma variante modificada do anticorpo ou fragmento funcional; um vetor recombinante incluindo o gene inserido no mesmo; e uma célula incluindo o gene ou o vetor introduzido na mesma.
[00208] A presente invenção inclui um método para produção de um anticorpo ou um fragmento funcional do anticorpo, ou uma variante modificada do anticorpo ou fragmento funcional, o método incluindo as etapas de: cultura da célula; e coleta na cultura de um anticorpo ou um fragmento funcional do anticorpo, ou uma variante modificada do anticorpo ou fragmento funcional.
[00209] As sequências de aminoácidos ou as sequências de nucleotídeos dos anticorpos da presente invenção e the as de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos das proteínas usadas na presente invenção estão listadas nas Tabelas 1-1 a Tabelas 1-14.
91 / 272 Tabela 1-1
SEQ ID NO Sequência Sequência de aminoácidos de ORF de CDH6 humana EC1 de CDH6 humana EC2 de CDH6 humana EC3 de CDH6 humana EC4 de CDH6 humana EC5 de CDH6 humana Sequência de aminoácidos de ORF de macaco cynomolgus Primer 1 da CDH6 de Cynomolgus Tabela 1-2
92 / 272
Primer 2 da CDH6 de Cynomolgus Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de rG019
Sequência nucleotídica da região variável da cadeia leve de rG019
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de rG019
Sequência nucleotídica da região variável da cadeia pesada de rG019
Fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica sequência sinal da cadeia leve humana e a região constante da cadeia κ
Tabela 1-3
93 / 272 Fragmento de
DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a sequência sinal da cadeia pesada humana e a região constante de IgG1 humana Fragmento de
DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a cadeia leve de chG019 Sequência completa de aminoácidos da cadeia leve de chG019 Tabela 1-4
94 / 272
Sequência nucleotídica completa da cadeia leve de chG019
Sequência da região variável da cadeia leve de chG019
Sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada de chG019
Tabela 1-5
95 / 272
Sequência nucleotídica completa da cadeia pesada de chG019
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de chG019
Sequência nucleotídica da região variável da cadeia pesada de chG019
Sequência completa de aminoácidos da cadeia leve de hL02
Tabela 1-6
96 / 272
Sequência nucleotídica completa da cadeia leve de hL02
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de hL02
Sequência nucleotídica da região variável da cadeia leve de hL02 Sequência completa de aminoácidos da cadeia leve de hL03
Sequência nucleotídica completa da cadeia leve de hL03
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de hL03
Tabela 1-7
97 / 272
Sequência nucleotídica da região variável da cadeia leve de hL03 Sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada de hH01
Sequência nucleotídica completa da cadeia pesada de hH01
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de hH01
Tabela 1-8
98 / 272
Sequência nucleotídica da região variável da cadeia pesada de hL01
Sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada de hH02
Sequência nucleotídica completa da cadeia pesada de hH02
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de hH02
Tabela 1-9
99 / 272
Sequência nucleotídica da região variável da cadeia pesada de hH02 Sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada de hH04
Sequência nucleotídica completa da cadeia pesada de hH04
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de hH04
Tabela 1-10
100 / 272
Sequência nucleotídica da região variável da cadeia pesada de hH04 Sequência completa de aminoácidos da cadeia leve de NOVO0712
Sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 51
Sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada de NOVO0712
Tabela 1-11
101 / 272
Sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 53
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de hH11
Sequência nucleotídica da região variável da cadeia pesada de hH11
Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de hH31
Tabela 1-12
102 / 272
Sequência nucleotídica da região variável da cadeia pesada de hH31
Sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada de hH01A
Sequência nucleotídica completa da cadeia pesada de hH01A
Tabela 1-13
103 / 272
Sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada de hH11A
Sequência nucleotídica completa da cadeia pesada de hH11A
Sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada de hH31A
Tabela 1-14
104 / 272 Sequência nucleotídica completa da cadeia pesada de hH31A Fragmento de
DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a sequência de aminoácidos da sequência sinal da cadeia pesada humana e região constante humana de IgG1
LALA
3. Conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco
[00210] O conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção é representado pela seguinte fórmula: [Fórmula 34]
105 / 272 glicano , em que: m2 representa um número inteiro igual a 1 ou 2, Ab representa um anticorpo IgG que se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4 e tendo capacidade de permitindo a absorção celular, ou um fragmento funcional do mesmo, L representa um ligante que liga o glicano unido ao N297 de Ab e D e D é qualquer uma das seguintes fórmulas: [Fórmula 35] ou em que o asterisco (*) representa a união ao L. Fármaco
[00211] O anticorpo anti-CDH6 obtido no “2. Produção do anticorpo anti-CDH6” acima pode ser conjugado a um fármaco por meio de uma porção ligante para preparar um conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco. O fármaco não é particularmente limitado desde que tenha um substituinte ou uma parte molecular que possa ser conectado a um ligante. O conjugado anticorpo anti- CDH6-fármaco pode ser utilizado para várias finalidades de acordo com o fármaco conjugado. Os exemplos de tal fármaco podem incluir substâncias com atividade antitumoral, substâncias eficazes para doenças hematológicas, substâncias eficazes para doenças autoimunes, substâncias anti-inflamatórias,
106 / 272 substâncias antimicrobianas, substâncias antifúngicas, substâncias antiparasitárias, substâncias antivirais e substâncias antianestésicas. Composto antitumoral
[00212] Os exemplos usando um composto antitumoral como o composto a ser utilizado no conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco da presente invenção serão descritos abaixo. O composto antitumoral não é particularmente limitado desde que o composto exerça um efeito antitumoral e tenha um substituinte ou uma estrutura parcial que possa ser conectado a uma estrutura do ligante. Quando da clivagem de uma parte ou do ligante inteiro em células tumorais, a porção do composto antitumoral é liberada para que o composto antitumoral exiba um efeito antitumoral. Como o ligante é clivado em uma posição de conexão com o fármaco, o composto antitumoral é liberado em sua estrutura original para exercer seu efeito antitumoral original. Os compostos liberados que servem como o fármaco são, por exemplo, os fármacos 1 a 4 descritos nos Exemplos 10-7 a 10-10.
[00213] O anticorpo anti-CDH6 obtido no “2. Produção do anticorpo anti-CDH6” acima pode ser conjugado ao composto antitumoral por meio de uma porção com estrutura de ligante para preparar um conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco.
[00214] O composto antitumoral a ser utilizado na presente invenção é representado por qualquer uma das fórmulas abaixo: [Fórmula 36] ou em que o asterisco (*) representa a união ao L.
[00215] O derivado PBD da presente invenção possui um carbono
107 / 272 assimétrico na posição 11’ e, assim, existem isômeros ópticos. Neste relatório descritivo, esses isômeros e uma mistura desses isômeros são todos representados por uma única fórmula. Consequentemente, os derivados PBD da presente invenção incluem todos os isômeros ópticos e misturas dos isômeros ópticos em qualquer proporção. A configuração estérica na posição 11’ dos derivados PBD da presente invenção pode ser determinada através da análise da estrutura cristalina por raios-X ou RMN, como um método de Mosher para seu produto cristalino ou intermediário, ou um derivado dos mesmos. Então, a configuração estérica absoluta pode ser determinada usando um produto cristalino ou intermediário derivado com um reagente tendo um centro assimétrico cuja configuração estérica é conhecida. Se desejado, estereoisômeros do composto sintetizado de acordo com a presente invenção podem ser obtidos pelo isolamento com um método de resolução óptica ou método de separação comum.
[00216] Podem existir estereoisômeros, isômeros ópticos em decorrência de um átomo de carbono assimétrico, isômeros ópticos, tautômeros, ou isômeros ópticos como formas d, formas l e atropisômeros do conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção, o fármaco livre ou intermediários da produção do conjugado anticorpo-fármaco, e esses isômeros, isômeros ópticos e suas misturas estão todos incluídos na presente invenção.
[00217] O composto antitumoral a ser utilizado na presente invenção é representado por qualquer uma das fórmulas abaixo: [Fórmula 37] ou
108 / 272 em que o asterisco (*) representa a união ao L. Estrutura do ligante
[00218] A estrutura do ligante para unir o fármaco antitumoral a um anticorpo no conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção será descrita.
[00219] O ligante L é representado pela seguinte fórmula: -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*.
[00220] O asterisco* representa a união ao átomo de nitrogênio na posição N10’ do composto antitumoral representado por D; Lb representa um espaçador que conecta La ao glicano ou glicano remodelado de Ab.
[00221] B representa um grupo fenila ou um grupo heteroarila e é, de preferência, um grupo 1,4-fenila, um grupo 2,5-piridila, um grupo 3,6-piridila, um grupo 2,5-pirimidila ou um grupo 2,5-tienila e, mais preferivelmente, um grupo 1,4-fenila.
[00222] Lp representa um ligante consistindo em uma sequência de aminoácidos que pode ser clivada in vivo ou em uma célula alvo. Lp é, por exemplo, clivado pela ação de uma enzima como uma esterase ou peptidase.
[00223] Lp é um resíduo peptídico composto por dois a sete (de preferência, dois a quatro) aminoácidos. Ou seja, Lp é composto por um resíduo de oligopeptídeo no qual dois a sete aminoácidos são conectados por meio de uma ligação peptídica.
[00224] Lp é ligado ao N terminal no grupo carbonila de La em Lb-La- , e forma, no C-terminal, uma ligação amida com o grupo amino (-NH-) da parte -NH-B-CH2-O(C=O)- do ligante. A ligação entre o C-terminal de Lp e - NH- é clivada por uma enzima como uma esterase.
[00225] Os aminoácidos que constituem Lp não são limitados a aminoácidos em particular e, por exemplo, são L- ou D-aminoácidos e, de preferência, L-aminoácidos. Os aminoácidos podem ser não só α- aminoácidos, mas também incluir um aminoácido com estrutura, por exemplo, de β-alanina, ácido ε-aminocaproico ou ácido γ-aminobutírico, e
109 / 272 podem incluir adicionalmente um aminoácido não natural como um aminoácido N-metilado.
[00226] A sequência de aminoácidos de Lp não se limita a uma sequência de aminoácidos em particular, e exemplos de aminoácidos que constituem Lp podem incluir, entre outros, glicina (Gly; G), valina (Val; V), alanina (Ala; A), fenilalanina (Phe; F), ácido glutâmico (Glu; E), isoleucina (Ile; I), prolina (Pro; P), citrulina (Cit), leucina (Leu; L), serina (Ser; S), lisina (Lys; K) e ácido aspártico (Asp; D). Os preferidos entre eles são glicina (Gly; G), valina (Val; V), alanina (Ala; A) e citrulina (Cit).
[00227] Qualquer um desses aminoácidos pode aparecer múltiplas vezes, e Lp possui uma sequência de aminoácidos incluindo aminoácidos selecionados arbitrariamente. O padrão de liberação do fármaco pode ser controlado através do tipo de aminoácido.
[00228] Exemplos específicos do ligante Lp podem incluir, entre outros, -GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK- , -GG(D-)PI-, -GGPL-, -EGGVA, -PI-, -GGF-, DGGF-, (D-)D-GGF-, - EGGF-, -SGGF-, -KGGF-, -DGGFG-, -GGFGG-, -DDGGFG-, -KDGGFG- e -GGFGGGF-.
[00229] Aqui, “(D-)V” indica D-valina, “(D)-P” indica D-prolina e “(D-)D” indica ácido D-aspártico.
[00230] De preferência, o ligante Lp é qualquer um dos seguintes: - GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, - GG(D-)PI- e -GGPL-, O ligante Lp é mais preferivelmente qualquer um dos seguintes: -GGVA-, -GGVCit- e -VA-.
[00231] Lb representa um espaçador que conecta La ao glicano ou glicano remodelado de Ab.
[00232] La, que não é particularmente limitado, representa qualquer um selecionado a partir do grupo seguinte:
110 / 272 -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-, -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-, -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-, -C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)- , -CH2-OC(=O)- e -OC(=O)-.
[00233] La é mais preferivelmente, -C(=O)-CH2CH2-C(=O)- ou - C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-.
[00234] O espaçador Lb não é limitado a um espaçador em particular e, por exemplo, um espaçador representado pelas fórmulas seguintes está incluído. [Fórmula 38] ou [Fórmula 39] ou [Fórmula 40]
111 / 272 ou
[00235] Nas fórmulas estruturais de Lb mostradas acima, cada asterisco* representa a união ao -(C=O) ou -(CH2)n4 na extremidade esquerda de La, e cada linha ondulada representa a união ao glicano ou glicano remodelado de Ab.
[00236] Em cada fórmula estrutural de Lb (Lb-1, Lb-2 ou Lb-3) mostrada acima, o sítio do anel triazol formado através reação de clique de um grupo azida e um grupo ciclooctinila provê estruturas de isômeros geométricos, e as moléculas de Lb existem como qualquer uma das duas estruturas ou como uma mistura de ambas. Existem duas ou quarto porções (m2 é 1 ou 2) “-L-D” por molécula do conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção, e qualquer uma das duas estruturas existem ou ambas coexistem como Lb (Lb-1, Lb-2 ou Lb-3) em L de cada uma das porções “-L- D”.
[00237] Se Lb for i), L é preferivelmente representado por -Lb-La-Lp- NH-B-CH2-O(C=O)-*
[00238] L é selecionado a partir do grupo: -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2- OC(=O)- -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-,
112 / 272
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA- NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)- VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2- C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- e -Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, em que Z1 representa a fórmula estrutural seguinte: [Fórmula 41]
ou
Z2 representa a fórmula estrutural seguinte: [Fórmula 42]
ou
Z3 representa a fórmula estrutural seguinte:
113 / 272 [Fórmula 43] ou em que, nas fórmulas estruturais de Z1, Z2 e Z3, o asterisco * representa a união ao C(=O), O ou CH2 vizinho de Z1, Z2 ou Z3 e a linha ondulada representa a união ao glicano ou glicano remodelado de Ab; e B representa um grupo 1,4-fenila.
[00239] O conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção supostamente exibe atividade antitumoral através de um processo no qual a maioria das moléculas do conjugado anticorpo-fármaco migra para as células tumorais, e uma porção ligante (por exemplo, Lp) é então clivada por uma enzima, ou semelhantes, para ativar o conjugado anticorpo-fármaco, o qual libera a porção do fármaco D (a seguir, referida como o fármaco livre (descrito mais adiante)).
[00240] Portanto, é preferível que o conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção seja estável fora das células tumorais. Remodelagem de glicanos
[00241] Recentemente foi relatado um método para remodelar glicoproteínas heterogêneas de um anticorpo por reação enzimática, ou semelhantes, para introduzir um glicano homogêneo com um grupo funcional (ACS Chemical Biology 2012, 7, 110, ACS Medicinal Chemistry Letters 2016, 7, 1005). Além disso, foi tentado o uso dessa técnica de remodelagem de glicanos para introduzir em um sítio específico um fármaco, visando sintetizar um ADC homogêneo (Bioconjugate Chemistry 2015, 26, 2233,
114 / 272 Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367, US 2016361436).
[00242] Na remodelagem de glicanos da presente invenção, com o uso de uma hidrolase, glicanos heterogêneos unidos a uma proteína (por exemplo, um anticorpo) são removidos por clivagem, deixando somente GlcNAc em cada terminação, produzindo, assim, uma porção de proteína homogênea com GlcNAc (a seguir, referida como um “aceitador”). Subsequentemente, provê- se um glicano arbitrário preparado separadamente (a seguir, referido como um “doador”), e o aceitador e o doador são unidos com o uso de uma transglicosidase. Deste modo, uma glicoproteína homogênea com uma estrutura arbitrária do glicano pode ser sintetizada.
[00243] Na presente invenção, “glicano” refere-se a uma unidade estrutural de dois ou mais monossacarídeos unidos por ligações glicosídicas. Monossacarídeos e glicanos específicos são ocasionalmente abreviados, por exemplo, como “GlcNAc-”, “MSG-” e assim por diante. Quando qualquer uma dessas abreviações é usada em uma fórmula estrutural, a abreviação é mostrada com a esteja incluído na abreviação indicando o glicano, a menos que especificamente definido.
[00244] Na presente invenção, um monossacarídeo como uma unidade básica de um glicano é indicado por conveniência para que, na estrutura do anel, a posição de um átomo de carbono unido a um átomo de oxigênio constituindo o anel e unido diretamente a um grupo hidroxi (ou um átomo de oxigênio envolvido em uma ligação glicosídica) é definida como a posição 1 (a posição 2 somente para ácidos siálicos), a menos que especificado de outra forma. Os nomes de compostos nos Exemplos são fornecidos cada um tendo em vista a estrutura química como um todo, e essa regra não é necessariamente aplicada.
[00245] Quando um glicano é indicado como um sinal (por exemplo, GLY, SG, MSG, GlcNAc) na presente invenção, o sinal destina-se, a menos que definido de outra forma, a incluir os átomos de carbono abrangidos até o
115 / 272 terminal redutor e a não incluir o N ou O envolvido em uma ligação N- ou O- glicosídica.
[00246] Na presente invenção, a menos que especificamente declarado, uma estrutura parcial quando um glicano está ligado a uma cadeia lateral de um aminoácido é indicada de tal maneira que a porção da cadeia lateral é indicada em parênteses, por exemplo, “(SG-)Asn”.
[00247] Os glicanos em Ab da presente invenção são glicanos N- ligados ou glicanos O-ligados e, de preferência, glicanos N-ligados.
[00248] Os glicanos N-ligados e os glicanos O-ligados unem-se a uma cadeia lateral do aminoácido de um anticorpo por meio de uma ligação N- glicosídica e uma ligação O-glicosídica, respectivamente.
[00249] IgG possui um glicano N-ligado bem conservado em um resíduo de asparagina na posição 297 da região Fc da cadeia pesada (a seguir, referido como “Asn297 ou N297”), e o glicano N-ligado é conhecido por contribuir para a atividade e cinética da molécula do anticorpo (Biotechnol. Prog., 2012, 28, 608-622, Sanglier-Cianferani, S., Anal. Chem., 2013, 85, 715-736).
[00250] A sequência de aminoácidos na região constante de IgG é bem conservada, e cada aminoácido é especificado pela numeração segundo o índice EU em Edelman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 63, No. 1 (May 15, 1969), pp. 78-85). Por exemplo, Asn297, à qual um glicano N- ligado é adicionado na região Fc, corresponde à posição 297 na numeração pelo índice EU, e cada aminoácido é especificado exclusivamente pela numeração segundo o índice EU, mesmo que a posição real do aminoácido tenha variado pela fragmentação da molécula ou a deleção de uma região.
[00251] No conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção, o anticorpo ou fragmento funcional do anticorpo mais preferivelmente une-se a L por meio de um glicano unido a uma cadeia lateral de Asn297 do mesmo (a seguir, referido como “N297 glicano”), e o anticorpo ou fragmento funcional
116 / 272 do anticorpo ainda mais preferivelmente une-se, por meio do N297 glicano, a L, em que o N297 glicano é um glicano remodelado.
[00252] Um anticorpo tendo o glicano remodelado é referido como um anticorpo com glicano remodelado.
[00253] SGP, uma abreviação para sialil glicopeptídeo, é representativo de um glicano complexo N-ligado. SGP pode ser separado/purificado da gema de um ovo de galinha, por exemplo, utilizando um método descrito em WO 2011/0278681. Produtos purificados de SGP estão disponíveis comercialmente (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., FUSHIMI Pharmaceutical Co., Ltd.). Por exemplo, disialil-octassacarídeo (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), um glicano formado pela deleção de um GlcNAc no terminal redutor na porção glicano de SG (a seguir, referido como “SG (10)”, está disponível comercialmente.
[00254] Na presente invenção, uma estrutura de glicano, formada pela deleção de um ácido siálico em um terminal não redutor somente em uma das cadeias ramificadas de β-Man em SG (10), refere-se a MSG (9), e uma estrutura tendo um ácido siálico somente na cadeia 1-3-ramificada é denominada MSG1, e uma estrutura tendo um ácido siálico somente na cadeia 1-6-ramificada é denominada MSG2.
[00255] O glicano remodelado da presente invenção é N297- (Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, uma mistura de N297-(Fuc)MSG1 e N297- (Fuc)MSG2 ou N297-(Fuc)SG, e é preferivelmente N297-(Fuc)MSG1, N297- (Fuc)MSG2 ou N297-(Fuc)SG, e é mais preferivelmente N297-(Fuc)MSG1 ou N297-(Fuc)MSG2.
[00256] N297-(Fuc)MSG1 é representado pela fórmula estrutural ou formula da sequência a seguir: [Fórmula 44]
117 / 272 [Fórmula 45]
[00257] Nas fórmulas, cada linha ondulada representa a união ao Asn297 do anticorpo, L(PEG) representa -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-, em que o grupo amino na extremidade direita representa a ligação de amida ao ácido carboxílico na posição 2 do ácido siálico no terminal não redutor na cadeia 1- 3-ramificada do β-Man no N297 glicano, cada asterisco* representa a união ao ligante L, em particular, o átomo de nitrogênio na posição 1 ou 3 do anel 1,2,3-triazol de Lb no ligante Le n5 representa um número inteiro de 2 a 10 e, preferivelmente, um número inteiro de 2 a 5.
[00258] N297-(Fuc)MSG2 é representado pela fórmula estrutural ou fórmula de sequência a seguir. [Fórmula 46]
118 / 272 [Fórmula 47]
[00259] Nas fórmulas, cada linha ondulada representa a união ao Asn297 do anticorpo, L(PEG) representa -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-, em que o grupo amino na extremidade direita representa a ligação de amida ao ácido carboxílico na posição 2 do ácido siálico no terminal não redutor na cadeia 1- 6-ramificada do β-Man no N297 glicano, o asterisco* representa a união ao ligante L, em particular, o átomo de nitrogênio na posição 1 ou 3 do anel 1,2,3-triazol de Lb no ligante L e n5 é um número inteiro de 2 a 10 e, preferivelmente, um número inteiro de 2 a 5.
[00260] N297-(Fuc)SG é representado pela fórmula estrutural ou fórmula de sequência a seguir. [Fórmula 48]
119 / 272 [Fórmula 49] Nas fórmulas, cada linha ondulada representa a união ao Asn297 do anticorpo, L(PEG) representa -(CH2CH2-O) n5-CH2CH2-NH-, em que o grupo amino na extremidade direita representa a ligação de amida ao ácido carboxílico na posição 2 do ácido siálico no terminal não redutor em cada um das cadeias 1-3 e 1-6 ramificadas do β-Man no N297 glicano, cada asterisco* representa a união ao ligante L, em particular, o átomo de nitrogênio na posição 1 ou 3 do anel 1,2,3-triazol de Lb no ligante Le n5 é um número inteiro de 2 a 10 e, preferivelmente, um número inteiro de 2 a 5.
[00261] Se o N297 glicano do anticorpo no conjugado anticorpo- fármaco da presente invenção for N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 ou uma mistura deles, o conjugado anticorpo-fármaco é uma molécula à qual
120 / 272 duas moléculas do ligante L e duas moléculas do fármaco D foram conjugadas (m2 = 1), pois o anticorpo é um dímero. Preparação do anticorpo
[00262] Um anticorpo com glicano remodelado pode ser produzido utilizando um método como ilustrado em uma fórmula seguinte, por exemplo, de acordo com um método descrito em WO2013/120066. [Fórmula 50] Ligante azida-PEG (r1, r2) é qualquer um dentre (1, 0), (0, 1) e (1,1) Etapa R-1: Hidrólise de ligação glicosídica em GlcNAcβ1- 4GlcNAc da estrutura de quitobiose no terminal redutor
[00263] Esta é uma etapa de preparação de um anticorpo com glicano truncado pela clivagem do glicano N-ligado à asparagina na posição 297 da sequência de aminoácidos de um anticorpo alvo (glicano N297-ligado) com o uso de uma reação enzimática conhecida.
[00264] Um anticorpo alvo (20 mg/mL) em solução tampão (por exemplo, solução tampão fosfato 50 mM) é submetido a uma reação de hidrólise da ligação glicosídica entre GlcNAcβ1 e 4GlcNAc na estrutura de quitobiose no terminal redutor com o uso de hidrolase, como a enzima EndoS, de 0 ºC a 40 ºC. O tempo de reação é 10 minutos a 72 horas e, preferivelmente, 1 hora a 6 horas. A quantidade da EndoS do tipo selvagem a ser utilizada é 0,1 a 10 mg, preferivelmente, 0,1 a 3 mg, para 100 mg do anticorpo. Depois de concluída a reação, a purificação com cromatografia de afinidade e/ou a purificação com uma coluna de hidroxiapatita, cada uma descrita mais tarde, são/é realizada(s) para produzir um (Fucα1,6)GlcNAc- anticorpo com o glicano hidrolisado entre GlcNAcβ1 e 4GlcNAc.
121 / 272 Etapa R-2: Reação de transglicosilação
[00265] Esta é uma etapa para produção de um anticorpo com glicano remodelado pela ligação do (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo ao glicano oxazolina do tipo MSG (MSG1, MSG2) ou SG (a seguir, referido como “glicano azida- oxazolina”), tendo um ligante PEG incluindo um grupo azida, com o uso de uma reação enzimática.
[00266] O anticorpo com glicano truncado em solução tampão (por exemplo, solução tampão fosfato) é submetido à reação de transglicosilação reagindo com um glicano azida-oxazolina na presença de uma quantidade catalítica de transglicosidase, como EndoS (D233Q/Q303L), de 0 ºC a 40 ºC. O tempo de reação é 10 minutos a 72 horas e, preferivelmente, 1 hora a 6 horas. A quantidade da EndoS (D233Q/Q303L) a ser utilizada é 1 a 10 mg, preferivelmente, 1 a 3 mg, para 100 mg do anticorpo, e a quantidade do glicano azida-oxazolina a ser utilizada é 2 equivalentes a um excesso do equivalente, preferivelmente, 2 equivalentes a 20 equivalentes.
[00267] Depois de concluída a reação, a purificação com cromatografia de afinidade e a purificação com uma coluna de hidroxiapatita são realizadas para fornecer um anticorpo purificado com glicano remodelado.
[00268] A forma do glicano azida-oxazolina pode ser preparada de acordo com métodos descritos no Exemplo 11. Com o uso de uma reação conhecida no campo da química orgânica sintética (por exemplo, uma reação de condensação), N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2, um ligante PEG incluindo um grupo azida (N3-L(PEG)), pode ser introduzido em MSG1. Especificamente, o ácido carboxílico na posição 2 de um ácido siálico e o grupo amino na extremidade à direita de N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2 sofrem uma reação de condensação para formar uma ligação amida.
[00269] Os exemplos do agente de condensação na reação de condensação podem incluir, entre outros, N, N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDCI),
122 / 272 carbonildiimidazol (CDI), 2-(2H-benzotriazol-2-il)-4-(1,1,3,3- tetrametilbutil)fenol (BOP), hexafluorofosfato de 1H-benzotriazol-1- iloxitripirrolidinofosfônio (PyBOP) e hexafluorofosfato de O-(7- azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametilurônio (HATU), e exemplos do solvente para a reação podem incluir, entre outros, diclorometano, DMF, THF, acetato de etila e solvente misto dos mesmos.
[00270] A temperatura de reação é tipicamente -20 ºC a 100 ºC ou o ponto de ebulição do solvente e, preferivelmente, na faixa de -5 ºC a 50 ºC. Se necessário, pode ser adicionada uma base orgânica, como trietilamina, diisopropiletilamina, N-metilmorfolina e 4-dimetilaminopiridina ou uma base inorgânica como carbonato de potássio, carbonato de sódio, hidrogenocarbonato de potássio e hidrogenocarbonato de sódio. Além disso, por exemplo, 1-hidroxibenzotriazol ou N-hidroxissuccinimida pode ser adicionado como acelerador da reação.
[00271] MSG1 pode ser obtido por hidrólise do (MSG-)Asn separado/purificado (no Exemplo 11) com uma hidrolase como EndoM.
[00272] A oxazolinação pode ser preparada a partir de GlcNAc no terminal redutor de MSG1 de acordo com um artigo conhecido (J. Org Chem., 2009, 74(5), 2210-2212. Helv. Chim. Acta, 2012, 95, 1928-1936.).
[00273] Em relação à enzima para a reação de hidrólise de N297 glicano, por exemplo, EndoS ou uma variante da enzima retendo a atividade de hidrólise pode ser utilizada.
[00274] Com a reação do (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo obtido na reação de hidrólise, como uma molécula aceitadora de glicano, e uma molécula doadora de glicano do tipo MSG (MSG1, MSG2) ou SG, pelo uso de uma glicosiltransferase (por exemplo, WO 2017010559), como uma EndoS D233Q ou variante EndoS D233Q/Q303L, um anticorpo da estrutura descrita acima, incluindo um glicano N297 do tipo MSG (MSG1, MSG2) ou SG pode ser obtido.
123 / 272
[00275] Se o número de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo, m2, no conjugado anticorpo-fármaco for 1, é empregada uma molécula doadora de glicano com MSG, MSG1 ou MSG2 como glicano. Para tal glicano, monosialo-Asn livre disponível comercialmente (1S2G/1G2S- 10NC-Asn, GlyTech, Inc., a seguir, referido como “(MSG-)Asn”), como matéria-prima, pode ser separado, de acordo com um método descrito no Exemplo 11, para obter (MSG-)Asn1 ou (MSG2-)Asn, o qual pode cada um ser empregado, ou uma mistura deles pode ser empregada sem separação.
[00276] Se o número de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo, m2, no conjugado anticorpo-fármaco por 2, uma molécula doadora de glicano incluindo SG (10) como glicano é utilizada para a reação de transglicosilação. Para tal glicano SG (10), por exemplo, pode ser utilizado aquele obtido a partir de SGP através de hidrólise ou semelhantes, ou o glicano SG (10) como disialil-octassacarídeo disponível comercialmente (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) pode ser utilizado.
[00277] O glicano do tipo MSG (MSG1, MSG2) ou SG, incluindo na molécula do doador, possui um ligante PEG com um grupo azida (N3- L(PEG)) na posição 2 de um ácido siálico no mesmo. Para introduzir um ligante PEG com um grupo azida (N3-L(PEG)) na posição 2 de um ácido siálico, uma reação conhecida no campo da química orgânica sintética (por exemplo, uma reação de condensação) pode ser utilizada para MSG (MSG (9)), MSG1 ou MSG2, ou disialil-octassacarídeo (SG (10)) e o ligante PEG com um grupo azida (N3-L(PEG)) N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2, em que n5 é um número inteiro de 2 a 10 e, preferivelmente, representa um número inteiro de 2 a 5. Especificamente, o ácido carboxílico na posição 2 de um ácido siálico e o grupo amino na extremidade à direita de N3-(CH2CH2- O)n5-CH2CH2-NH2 sofrem uma reação de condensação para formar uma ligação amida.
[00278] Alternativamente, um glicano do tipo MSG (MSG1, MSG2)
124 / 272 ou SG pode ser obtido introduzindo-se um ligante PEG com um grupo azida (N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2) no ácido carboxílico na posição 2 de um ácido siálico de uma matéria-prima, como (MSG1-)Asn, (MSG2-)Asn e (SG-)Asn (GlyTech, Inc.) com um grupo α-amino opcionalmente protegido ou modificado, e no ácido carboxílico da Asn com o uso de uma reação de condensação, e utilizando uma hidrolase como EndoM e EndoRp. Os exemplos de grupos protetores para grupos α-amino incluem, entre outros, um grupo acetila (Ac), um grupo t-butoxicarbonila (Boc), um grupo benzoíla (Bz), um grupo benzila (Bzl), um grupo carbobenzoxi (Cbz) e um grupo 9- fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc). O grupo protetor para grupos α-amino é preferivelmente um grupo Fmoc.
[00279] Os exemplos de grupos modificadores de grupos α-amino incluem grupos modificadores que intensificam a solubilidade em água com um grupo hidroxiacetila, uma estrutura PEG, ou semelhantes.
[00280] Um grupo α-amino de (MSG1-)Asn, (MSG-2)Asn ou (SG-)Asn é preferivelmente protegido com qualquer um dos grupos protetores. Se um grupo α-amino for protegido com um grupo protetor (por exemplo, um grupo Fmoc), o grupo protetor pode ser removido, se necessário, depois da introdução de um ligante PEG com um grupo azida e antes de provocada a ação de uma hidrolase.
[00281] É preferido usar uma forma ativada, tal como uma oxazolina formada pelo tratamento com cloreto de 2-cloro-1,3-dimetil-1H- benzimidazol-3-ío, para GlcNAc no terminal redutor do glicano do tipo MSG (MSG1, MSG2) ou SG incluído na molécula.
[00282] Podem ser empregadas várias enzimas, para uso em uma reação de transglicosilação (transglicosidases), que tenham a atividade de transferir um glicano complexo para N297 glicano; no entanto, EndoS D233Q, um produto modificado para o qual uma reação de hidrólise é suprimida substituindo Asp na posição 233 de EndoS por Gln, é uma
125 / 272 transglicosidase preferida. Uma reação de transglicosilação usando EndoS D233Q é descrita, por exemplo, em WO 2013/120066. Alternativamente, pode ser utilizada uma enzima modificada como EndoS D233Q/Q303L (WO 2017010559), a qual é obtida adicionando-se ainda uma mutação a EndoS D233Q.
[00283] A operação de purificação do anticorpo depois da remodelagem do glicano para o anticorpo (glicohidrólise e a reação de transglicosilação) destina-se a separar compostos de baixo peso molecular e enzimas usadas para a reação, e cromatografia de filtração em gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade e assim por diante são tipicamente utilizadas para tal purificação, e a purificação adicional com uma coluna de hidroxiapatita pode ser ainda realizada. Ou seja, a presente invenção provê um método para produção de uma forma conjugada a fármaco, em que o método inclui, subsequentemente a uma etapa de purificação de uma forma intermediária a partir da solução de reação após a glicohidrólise de um anticorpo, a etapa adicional de purificação com uma coluna de hidroxiapatita. De acordo com um exemplo de relatórios sobre remodelagem de glicanos (J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308-12318., Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367), uma solução de reação após o tratamento de um anticorpo com hidrolase pode ser purificada somente com uma coluna de Proteína A (coluna de cromatografia de afinidade); no entanto, esse método de purificação demonstrou ser incapaz de remover completamente a hidrolase (por exemplo, EndoS), o que afeta a reação subsequente de transglicosilação por causa da enzima residual. Em vista de tal resultado, métodos de purificação foram examinados, sendo verificado que, quando a purificação de uma solução de reação após o tratamento de um anticorpo com hidrolase foi realizada usando uma coluna de Proteína A e uma coluna de hidroxiapatita (CHT column, Bio-Rad Laboratories, Inc.), na ordem apresentada, a eficiência de reação da reação subsequente de glicosilação foi
126 / 272 intensificada, sem a influência de qualquer enzima residual.
[00284] Na preparação de um anticorpo com glicano remodelado, a concentração de uma solução aquosa de um anticorpo, a medição da concentração e a troca do tampão podem ser realizados de acordo com as operações comuns A a C a seguir. Operação comum A: Concentração da solução aquosa do anticorpo
[00285] Uma solução de um anticorpo ou conjugado anticorpo-fármaco foi colocada em um recipiente de um Amicon Ultra (30.000 a 50.000 MWCO, Millipore Corporation), e a solução de um anticorpo ou conjugado anticorpo- fármaco, que é descrita adiante, foi concentrada por uma operação de centrifugação (centrifugação de 2000 G a 4000 G por 5 a 20 minutos) usando uma centrífuga (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.). Operação comum B: Medição da concentração do anticorpo
[00286] A medição da concentração do anticorpo foi realizada utilizando um aparelho de medição UV (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.) de acordo com um método especificado pelo fabricante. Em seguida, foram utilizados coeficientes de absorção a 280 nm, que são diferentes entre anticorpos (1,3 mL mg-1 cm-1 a 1,8 mL mg-1 cm-1). Operação comum C: Troca de tampão para anticorpo
[00287] Uma solução tampão (por exemplo, solução salina com tampão fosfato (pH 6,0), tampão fosfato (pH 6,0)) foi adicionada a uma solução aquosa de um anticorpo, a qual foi concentrada de acordo com a operação comum A. Essa operação foi realizada várias vezes, e a concentração do anticorpo foi então medida usando a operação comum B, e ajustada para 10 mg/mL com uma solução tampão (por exemplo, solução salina com tampão fosfato (pH 6,0), tampão fosfato (pH 6,0)). Conjugação
[00288] Esse método de produção é um método para produção de um conjugado anticorpo-fármaco em que o anticorpo com glicano remodelado
127 / 272 descrito acima é conjugado ao intermediário da produção (2) através de uma reação SPAAC (strain-promoted alkyne azide cycloaddiction: J. AM. CHEM. SOC. 2004, 126, 15046-15047). [Fórmula 51] glicano em que Ab representa o anticorpo com glicano remodelado, La’, Lp’ e B’ são os mesmos que os definidos em La, Lp e B, respectivamente, e J representa qualquer uma dessas fórmulas estruturais, em que o asterisco* representa a união a La’. [Fórmula 52] J-La’-Lp’-NH-B’-CH2-O(C=O)-PBD podem ser sintetizados pelo método descrito em qualquer um dos Exemplos 10-1 a 10-6.
[00289] A reação SPAAC prossegue misturando uma solução tampão (solução de acetato de sódio, fosfato de sódio, solução de borato de sódio ou semelhantes, ou uma mistura dos mesmos) do anticorpo Ab e uma solução do composto (2) dissolvido em um solvente adequado (dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMA), N-metil-2- piridona (NMP), propilenoglicol (PG), ou semelhantes, ou uma mistura dos mesmos).
[00290] A quantidade de moles do composto (2) a ser utilizada é 2 moles até uma quantidade com excesso de moles, de preferência 1 mol a 30 mol, por mol do anticorpo, e a razão entre o solvente orgânico e o tampão do anticorpo é preferivelmente 1 a 200% v/v. A temperatura de reação é 0 ºC a
128 / 272 37 ºC e, preferivelmente, 10 ºC a 25 ºC, e o tempo de reação é 1 a 150 horas e, preferivelmente, 6 horas a 100 horas. O pH na reação é preferivelmente 5 a
9.
[00291] Os compostos conjugados anticorpo-fármaco (ADCs) podem ser identificados uns dos outros através de troca de tampão, purificação e medição de concentração do anticorpo e número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo (Razão DAR: Fármaco para Anticorpo) de acordo com as operações comuns A a C descritas acima e as operações comuns D a F descritas adiante. Operação comum D: Purificação do conjugado anticorpo-fármaco
[00292] Uma coluna NAP-25 foi equilibrada com solução tampão acetato (10 mM, pH 5,5; aqui, referida como ABS) contendo sorbitol disponível comercialmente (5%). A essa coluna NAP-25, uma solução de reação aquosa de um conjugado anticorpo-fármaco (aproximadamente 1,5 a 2,5 mL) foi aplicada e eluída com um tampão em uma quantidade especificada pelo fabricante para separar e coletar uma fração do anticorpo. A fração separada e coletada foi novamente aplicada à coluna NAP-25, e uma operação de purificação por filtração em gel para eluição com um tampão foi repetida duas ou três vezes, no total, para fornecer o conjugado anticorpo- fármaco com um ligante de fármaco não ligado, dimetilsulfóxido e propilenoglicol removidos. Se necessário, a concentração da solução do conjugado anticorpo-fármaco foi ajustada através das operações comuns A a C. Operação comum E: Medição da concentração do anticorpo do conjugado anticorpo-fármaco
[00293] A concentração do fármaco conjugado em um conjugado anticorpo-fármaco pode ser calculada usando a lei de Lambert-Beer mostrada abaixo. A equação (I), usando a lei de Lambert-Beer, é como segue: [Expressão 1]
129 / 272 Expressão (I) Concentração Absorbância Coeficiente de absorção molar Comprimento do molar caminho óptico
[00294] Aqui, A280 indica a absorbância de uma solução aquosa de um conjugado anticorpo-fármaco a 280 nm, ε280 indica o coeficiente de absorção molar de um conjugado anticorpo-fármaco a 280 nm e C (mol⋅L-1) indica a molaridade de um conjugado anticorpo-fármaco. A partir da expressão (I), pode-se determinar a molaridade de um conjugado anticorpo- fármaco, C (mol⋅L-1), usando a expressão (II) abaixo. [Expressão 2] Expressão (II)
[00295] Além disso, os dois lados são multiplicados pela massa molar do conjugado anticorpo-fármaco, MW (g⋅mol-1), para determinar a concentração em massa do conjugado anticorpo-fármaco, C’ (mg⋅ mL-1) (expressão (III)). [Expressão 3] Expressão (III)
[00296] Os valores usados para a expressão e aplicados aos Exemplos serão descritos.
[00297] A absorbância A280 usada foi um valor medido da absorbância de UV de uma solução aquosa de um conjugado anticorpo- fármaco a 280 nm. Para massa molar, MW (g⋅mol-1), um valor estimado do peso molecular de um anticorpo foi calculado a partir da sequência de aminoácidos do anticorpo, e usado como um valor aproximado da massa molar de um conjugado anticorpo-fármaco. O comprimento do caminho óptico, l (cm), usado na medição foi 1 cm.
[00298] O coeficiente de absorção molar, ε280, do conjugado anticorpo-fármaco pode ser determinado usando a expressão (IV) abaixo: [Expressão 4]
130 / 272
[00299] ε280 = Coeficiente de absorção molar do anticorpo εAb, 280 + Coeficiente de absorção molar do fármaco εDL, 280 × Número de moléculas do fármaco conjugado Expressão (IV)
[00300] Aqui, εAb, 280 indica o coeficiente de absorção molar de um anticorpo a 280 nm e εDL, 280 indica o coeficiente de absorção molar de um fármaco a 280 nm.
[00301] Com o uso de um método de cálculo conhecido (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423), εAb, 280 pode ser estimado a partir da sequência de aminoácidos de um anticorpo. Nos Exemplos, o coeficiente de absorção molar do anticorpo H01L02 usado foi εAb, 280 = 223400 (valor estimado calculado). O coeficiente de absorção molar do anticorpo H01L02A usado foi εAb, 280 = 223674 (valor estimado calculado), o coeficiente de absorção molar do anticorpo H31L02A usado foi εAb, 280 = 223314 (valor estimado calculado), o coeficiente de absorção molar do anticorpo H11L02A usado foi εAb, 280 =220490 (valor estimado calculado) e o coeficiente de absorção molar do anticorpo LPS usado foi εAb, 280 = 230300 (valor estimado calculado).
[00302] εDL, 280 foi calculado para uso a partir de um valor medido obtido em cada medição de UV. Especificamente, a absorbância de uma solução dissolvendo um precursor do conjugado (ligante de fármaco) com certa molaridade foi medida, e a expressão (I), lei de Lambert-Beer, foi aplicada à mesma, e o valor resultante foi utilizado. Operação comum F: Medição de número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo no conjugado anticorpo-fármaco
[00303] O número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo em um conjugado anticorpo-fármaco pode ser determinado através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com o método a seguir.
131 / 272 F-1 Preparação de amostra para análise de HPLC (redução de conjugado anticorpo-fármaco)
[00304] Uma solução de um conjugado anticorpo-fármaco (aproximadamente 1 mg/mL, 60 µL) é misturada com uma solução aquosa de ditiotreitol (DTT) (100 mM, 15 µL). A mistura é incubada a 37 ºC por 30 minutos para preparar uma amostra na qual a ligação dissulfeto entre a cadeia L e a cadeia H do conjugado anticorpo-fármaco é clivada, e essa amostra é usada para análise de HPLC. F-2. Análise de HPLC
[00305] A análise de HPLC é realizada sob as condições seguintes: Sistema de HPLC: sistema de HPLC Agilent 1290 (Agilent Technologies) Detector: Espectrômetro de absorção de ultravioleta (comprimento de onda de medição: 280 nm, 329 nm) Coluna: BEH Phenyl (2,1 × 50 mm, 1,7 µm, Waters Acquity) Temperatura da coluna: 75 ºC Fase móvel A: Solução aquosa de ácido trifluoroacético 0,1% (TFA) – álcool isopropílico 15% Fase móvel B: Solução de TFA 0,075% - álcool isopropílico 15%-acetonitrila Programa do gradiente: 14%-36% (0 min. a 15 min.), 36%- 80% (15 min. a 17 min.), 80%-14% (17 min. a 17,1 min.), 14%-14% (17,1 min. a 23 min.) Volume de injeção da amostra: 5 µL F-3. Análise de dados
[00306] (F-3-1) Uma cadeia H com molécula(s) de fármaco conjugado (Cadeia H com uma molécula de fármaco conjugado: H1, cadeia H com duas moléculas de fármaco conjugado: H2) têm a hidrofobicidade aumentada em proporção ao número de moléculas de fármaco conjugado e têm tempo de
132 / 272 retenção mais longo em comparação à cadeia L (L0) e à cadeia H (H0) de um anticorpo sem qualquer molécula de fármaco conjugado e, consequentemente, L0, H0, H1 e H2 são eluídas na ordem apresentada. Portanto, através da comparação do tempo de retenção entre L0 e H0, cada pico detectado pode ser atribuído a L0, H0, H1 ou H2. Se um fármaco é conjugado ou não pode ser confirmado verificando a absorção em um comprimento de onda de 329 nm característico ao fármaco.
[00307] (F-3-2) Considerando que cada ligante de fármaco absorve UV, os valores da área de pico são corrigidos usando a expressão a seguir com os coeficientes de absorção molar de uma cadeia H e de um ligante de fármaco de acordo com o número de moléculas de ligante de fármaco conjugado. [Expressão 5] Coeficiente de absorção molar da Valor de correção da área de pico Área de cadeia H da cadeia H pico Coeficiente de absorção molar da cadeia H + número de moléculas do fármaco conectado × coeficiente de absorção molar do ligante de fármaco
[00308] Aqui, para os coeficientes de absorção molar (280 nm) da cadeia L e cadeia H de cada anticorpo, os valores foram estimados a partir das sequências de aminoácidos da cadeia L e cadeia H do anticorpo usando um método de cálculo conhecido (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). No caso do anticorpo H01L02, usou-se 81480 como o coeficiente de absorção molar da cadeia H estimado a partir da sequência de aminoácidos. No caso do anticorpo H01L02A, do mesmo modo, usou-se 79829 como o coeficiente de absorção molar da cadeia H; no caso do anticorpo H031L02A, usou-se 80131 como o coeficiente de absorção molar da cadeia H; no caso do anticorpo H011L02A, usou-se 78696 como o coeficiente de absorção molar da cadeia H; no caso do anticorpo LPS, usou-se 77470 como o coeficiente de absorção molar da cadeia H; e o coeficiente de absorção molar (280 nm) medido para o ligante de fármaco 1-4, como um precursor do conjugado, foi usado como o coeficiente de absorção molar (280 nm) de cada ligante de fármaco.
[00309] (F-3-3) As razões entre a área de pico (%) de cada cadeia e o
133 / 272 total de áreas de pico corrigidas são calculadas usando a expressão a seguir. [Expressão 6] Valor de correção da área de pico da cadeia H Valor corrigido da área de pico de cada cadeia
[00310] (F-3-4) O número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo em um conjugado anticorpo-fármaco é calculado usando a expressão a seguir. [Expressão 7]
[00311] Número médio de moléculas do fármaco conjugado = (razão da área de pico H0 × 0 + razão da área de pico H1 × 1 + razão da área de pico H2 × 2)/100 × 2
4. Medicamento
[00312] Considerando que o anticorpo anti-CDH6 da presente invenção ou o fragmento funcional do anticorpo descrito na seção acima “2. Produção do anticorpo anti-CDH6” e nos Exemplos se liga a CDH6 na superfície de células tumorais e possui atividade de internalização, ele pode ser utilizado como um medicamento e, em particular, como um agente terapêutico para câncer, como tumor de células renais ou tumor ovariano, por exemplo, carcinoma de células renais, carcinoma de células renais claras, carcinoma papilar de células renais, câncer de ovário, adenocarcinoma seroso de ovário, câncer de tireoide, câncer de ducto biliar, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células ou câncer de pulmão de não pequenas células), glioblastoma, mesotelioma, câncer de útero, câncer de pâncreas, tumor de Wilms ou neuroblastoma, quer isoladamente ou em combinação com um fármaco adicional.
[00313] Além disso, anticorpo anti-CDH6 da presente invenção ou o fragmento funcional do anticorpo pode ser utilizado na detecção de células que expressam CDH6.
134 / 272
[00314] Além disso, considerando que o anticorpo anti-CDH6 da presente invenção ou o fragmento funcional do anticorpo possui atividade de internalização, ele pode ser aplicado como o anticorpo em um conjugado anticorpo-fármaco.
[00315] Quando um fármaco com atividade antitumoral, como atividade citotóxica, é utilizado como o fármaco, o conjugado anticorpo anti- CDH6-fármaco da presente invenção, descrito na seção acima “3. Conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco” e nos Exemplos, é um conjugado do anticorpo anti-CDH6 e/ou do fragmento funcional do anticorpo tendo atividade de internalização, e o fármaco tendo atividade antitumoral como atividade citotóxica. Dado que esse conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco exibe atividade antitumoral contra células cancerosas que expressam CDH6, ele pode ser utilizado como um medicamento e, em particular, como um agente terapêutico e/ou um agente profilático para câncer.
[00316] O conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco da presente invenção pode absorver umidade ou conter água de adsorção, por exemplo, para tornar-se um hidrato quando for deixado ao ar ou submetido a procedimentos de recristalização ou purificação. Tal composto ou sal farmacologicamente aceitável contendo água é igualmente incluído na presente invenção.
[00317] Quando o conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco da presente invenção possui um grupo básico, como um grupo amino, ele pode formar um sal de adição de ácido farmacologicamente aceitável, se desejado. Os exemplos de tal sal de adição de ácido podem incluir: hidrohaletos como fluoridrato, cloridrato, bromidrato e iodidrato; sais de ácidos inorgânicos como nitrato, perclorato, sulfato e fosfato; alcanossulfonatos inferiores como metanossulfonato, trifluorometanossulfaonto e etanossulfonato; arilsulfonatos como benzenossulfonato e p-toluenossulfonato; sais de ácidos orgânicos como formato, acetato, trifluoroacetato, malato, fumarato, succinato, citrato,
135 / 272 oxalato e maleato; e sais de aminoácidos como sal de orntina, glutamato e aspartato.
[00318] Quando o conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco da presente invenção possui um grupo ácido, como grupo carboxi, ele pode formar um sal de adição de base farmacologicamente aceitável, se desejado. Os exemplos de tal sal de adição de base podem incluir: sais de metais alcalinos como um sal de sódio, um sal de potássio e sal de lítio; sais de metais alcalinos terrosos como um sal de cálcio e um sal de magnésio; sais inorgânicos como um sal de amônio; e sais de aminas orgânicas como um sal de dibenzilamina, um sal de morfolina, um sal de alquil éster de fenilglicina, um sal de etilenediamina, um sal de N-metilglucamina, um sal de dietilamina, um sal de trietilamina, um sal de ciclohexilamina, um sal de diciclohexilamina, um sal de N,N’-dibenziletilenodiamina, um sal de dietanolamina, um sal de N-benzil-N-(2-feniletoxi)amina, um sal de piperazina, um sal de tetrametilamônio e um sal de tris(hidroximetil)aminometano.
[00319] A presente invenção pode também incluir um conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco no qual um ou mais átomos que constituem o conjugado anticorpo-fármaco são substituídos por isótopos dos átomos. Existem dois tipos de isótopos: radioisótopos e isótopos estáveis. Os exemplos do isótopo podem incluir isótopos de hidrogênio (2H e 3H), isótopos de carbono (11C, 13C e 14C), isótopos de nitrogênio (13N e 15N), isótopos de oxigênio (15O, 17O e 18O) e isótopos de flúor (18F). Uma composição compreendendo o conjugado anticorpo-fármaco marcado com tal isótopo é útil como, por exemplo, um agente terapêutico, um agente profilático, um reagente de pesquisa, um reagente de ensaio, um agente diagnóstico e um agente diagnóstico de imagem in vivo. Todo e cada conjugado anticorpo-fármaco marcado com um isótopo, e misturas de conjugados anticorpo-fármaco marcados com isótopo em qualquer dada razão
136 / 272 estão incluídos na presente invenção. O conjugado anticorpo-fármaco marcado com um isótopo pode ser produzido, por exemplo, utilizando um material de partida marcado com um isótopo, em vez de um material de partida para o método de produção da presente invenção mencionado adiante, de acordo com um método conhecido na técnica.
[00320] A citotoxicidade in vitro pode ser medida com base na atividade de suprimir as respostas proliferativas de células, por exemplo. Por exemplo, uma linhagem celular de câncer com superexpressão de CDH6 é cultivada, e o conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco é adicionado em diferentes concentrações ao sistema da cultura. Depois disso, sua atividade supressora contra a formação de focos, a formação de colônias e o crescimento esferoide pode ser medida. Nesse contexto, por exemplo, com o uso de uma linhagem de células de câncer, derivadas de um tumor de células renais ou um tumor ovariano, pode-se examinar a atividade de inibição do crescimento celular contra tumor de células renais ou tumor ovariano.
[00321] Os efeitos terapêuticos in vivo no câncer em um animal experimental podem ser medidos, por exemplo, administrando o conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco a um camundongo nude no qual uma linhagem de células tumorais com alta expressão de CDH6 tenha sido inoculado e, a seguir, medindo uma mudança nas células cancerosas. Nesse contexto, por exemplo, com o uso de um modelo animal derivado de um camundongo imunodeficiente pela inoculação de células derivadas de carcinoma de células renais, de carcinoma de células renais claras, de carcinoma papilar de células renais, de câncer de ovário, de adenocarcinoma seroso de ovário ou de câncer de tireoide, os efeitos sobre carcinoma de células renais, carcinoma de células renais claras, carcinoma papilar de células renais, câncer de ovário, adenocarcinoma seroso de ovário ou câncer de tireoide podem ser medidos.
[00322] O tipo de câncer ao qual se aplica o conjugado anticorpo anti- CDH6-fármaco da presente invenção não é particularmente limitado desde
137 / 272 que CDH6 seja expressa nas células do câncer a ser tratado. Os exemplos do mesmo podem incluir carcinoma de células renais (por exemplo, carcinoma de células renais claras ou carcinoma papilar de células renais), câncer de ovário, adenocarcinoma seroso de ovário, câncer de tireoide, câncer de ducto biliar, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células ou câncer de pulmão de não pequenas células), glioblastoma, mesotelioma, câncer de útero, câncer de pâncreas, tumor de Wilms e neuroblastoma, embora o câncer não se limite aos mesmos, desde que o câncer expresse CDH6. Exemplos mais preferidos do câncer podem incluir carcinoma de células renais (por exemplo, carcinoma de células renais claras e carcinoma papilar de células renais) e câncer de ovário.
[00323] O conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco da presente invenção pode preferivelmente ser administrado a um mamífero e, mais preferivelmente, a um humano.
[00324] As substâncias utilizadas em uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco da presente invenção podem ser adequadamente selecionadas dentre aditivos farmacêuticos e outras normalmente usadas nesse campo, em termos da dose aplicada ou da concentração aplicada e, então, utilizadas.
[00325] O conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco da presente invenção pode ser administrado como uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais componentes farmaceuticamente compatíveis. Por exemplo, a composição farmacêutica tipicamente compreende um ou mais veículos farmacêuticos (por exemplo, líquidos esterilizados (por exemplo, água e óleo (incluindo óleo de petróleo e óleo de origem animal, origem vegetal ou origem sintética (por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral e óleo de gergelim))). Água é o veículo mais típico quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Uma solução salina aquosa, uma solução aquosa de dextrose e uma solução aquosa de
138 / 272 glicerol podem também ser usadas como um veículo líquido, em particular, para uma solução injetável. Veículos farmacêuticos adequados são conhecidos na técnica. Se desejado, a composição pode também compreender uma quantidade traço de um agente hidratante, um agente emulsificante ou um agente de tamponamento do pH. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em “Remington’s Pharmaceutical Sciences” por E. W. Martin. A prescrição corresponde a um modo de administração.
[00326] Vários sistemas de liberação são conhecidos, e podem ser utilizados para administrar o conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco da presente invenção. Os exemplos da via administração podem incluir, entre outras, as vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea. A administração pode ser feita, por exemplo, por injeção ou injeção de bolus, por exemplo. De acordo com uma modalidade preferida específica, a administração do conjugado anticorpo-fármaco descrito acima é realizada por injeção. A administração parenteral é uma via de administração preferida.
[00327] De acordo com uma modalidade representativa, a composição farmacêutica é prescrita como uma composição farmacêutica adequada para administração intravenosa a um humano, de acordo com procedimentos convencionais. A composição para administração intravenosa é tipicamente uma solução em uma solução tampão aquosa estéril e isotônica. Se necessário, o medicamento pode também conter um agente solubilizante e um anestésico local para aliviar a dor em uma área de injeção (por exemplo, lignocaína). Em geral, os ingredientes descritos acima são providos, quer separadamente ou junto em uma mistura em forma de dose unitária, como um pó liofilizado ou um concentrado anidro contido em um recipiente que é obtido por vedação em, por exemplo, uma ampola ou sachê indicando a quantidade do agente ativo. Quando tiver que ser administrado por injeção, o medicamento pode ser administrado usando, por exemplo, um frasco de
139 / 272 injeção contendo água ou solução salina de grau farmacêutico estéril. Quando o medicamento tiver que ser administrado por injeção, uma ampola de água estéril ou solução salina para injeção pode ser fornecida de modo que os ingredientes descritos acima são misturados um com o outro antes da administração.
[00328] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser uma composição farmacêutica compreendendo somente o conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco do presente pedido de patente, ou pode ser uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado anticorpo anti-CDH6- fármaco e pelo menos outro agente terapêutico para câncer. O conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco da presente invenção pode também ser administrado junto com um agente terapêutico adicional para câncer, e pode, assim, intensificar um efeito anticâncer. O agente anticâncer adicional utilizado para tal finalidade pode ser administrado a um indivíduo de modo simultâneo, separado ou contínuo, juntamente com o conjugado anticorpo- fármaco. Caso contrário, o agente anticâncer adicional e o conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco podem cada um ser administrado ao indivíduo em intervalos diferentes de administração. Os exemplos de tal agente terapêutico para câncer podem incluir inibidores de tirosina quinase incluindo imatinibe, sunitinibe e regorafenibe, inibidores de CDK4/6 incluindo palbociclibe, inibidores de HSP90 incluindo TAS-116, inibidores de MEK incluindo MEK162 e inibidores de checkpoints imunológicos incluindo nivolumabe, pembrolizumabe e ipilimumabe, embora o agente terapêutico para câncer não se limite aos mesmos desde que o fármaco tenha atividade antitumoral.
[00329] Tal composição farmacêutica pode ser preparada como uma formulação com uma composição selecionada e uma pureza necessária na forma de uma formulação liofilizada ou uma formulação líquida. A composição farmacêutica preparada como uma formulação liofilizada pode
140 / 272 ser uma formulação contendo um aditivo farmacêutico adequado usado nesse campo. Do mesmo modo, a formulação líquida pode ser preparada de modo que a formulação líquida contenha vários aditivos farmacêuticos usados nesse campo.
[00330] A composição e concentração da composição farmacêutica também variam dependendo do método de administração. Em relação à afinidade do conjugado anticorpo anti-CDH6-fármaco compreendido na composição farmacêutica da presente invenção pelo antígeno, ou seja, a constante de dissociação (valor de Kd) do conjugado anticorpo anti-CDH6- fármaco para o antígeno, à medida que a afinidade aumenta (ou seja, o valor de Kd é baixo), a composição farmacêutica pode exercer efeitos medicinais, mesmo que a sua dose aplicada seja diminuída. Consequentemente, a dose aplicada do conjugado anticorpo-fármaco pode também ser determinada definindo a dose aplicada com base no status da afinidade do conjugado anticorpo-fármaco pelo antígeno. Quando administrado a um humano, o conjugado anticorpo-fármaco da presente invenção pode ser administrado em uma dose entre, por exemplo, aproximadamente 0,001 e 100 mg/kg uma vez ou uma pluralidade de vezes em intervalos de 1 a 180 dias. Preferivelmente, pode ser administrado em uma dose entre 0,1 e 50 mg/kg e, mais preferivelmente, de 1 a 50 mg/kg, 1 a 30 mg/kg, 1 a 20 mg/kg, 1 a 15 mg/kg, 2 a 50 mg/kg, 2 a 30 mg/kg, 2 a 20 mg/kg ou 2 a 15 mg/kg uma pluralidade de times em intervalos de 1 a 4 semanas, de preferência 2 a 3 semanas. Exemplos
[00331] A seguir, a presente invenção será especificamente descrita nos exemplos seguintes. No entanto, a presente invenção não se limita a esses. Além disso, esses exemplos não devem ser interpretados de maneira limitada por qualquer meio. Deve-se notar que, nos exemplos a seguir, a menos que especificado de outra forma, as operações individuais referentes à manipulação genética foram realizadas de acordo com o método descrito em
141 / 272 “Molecular Cloning” (Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press em 1989) ou outros métodos descritos em manuais experimentais por técnicos no assunto, ou quando disponíveis comercialmente, foram usados reagentes ou kits e os exemplos foram realizados de acordo com as instruções incluídas nos produtos disponíveis comercialmente. Na presente descrição, reagentes, solventes e materiais de partida são prontamente disponibilizados por fornecedores comerciais, a menos que especificado de outra forma. Exemplo 1: Obtenção de anticorpo de rato anti-CDH6 humana com atividade de internalização 1)-1 Construção de vetores de expressão de CDH6 humana e de macaco cynomolgus
[00332] Com o uso de um vetor de expressão com o cDNA codificador da proteína CDH6 humana (NP_004923) (OriGene Technologies Inc., RC217889), o cDNA foi incorporado em um vetor para expressão em mamíferos de acordo com um método conhecido pelo técnico no assunto para produzir o vetor de expressão de CDH6 humana, pcDNA3.1-hCDH6. A sequência de aminoácidos da ORF (fase de leitura aberta) de CDH6 humana é mostrada em SEQ ID No: 1.
[00333] O cDNA que codifica a proteína CDH6 de macaco cynomolgus foi clonado com cDNA sintetizado a partir de RNA total do rim de macaco cynomolgus usando como molde o primer 1 (5’- CACCATGAGAACTTACCGCTACTTCTTGCTGCTC-3’) (SEQ ID No: 8) e o primer 2 (5’-TTAGGAGTCTTTGTCACTGTCCACTCCTCC-3’) (SEQ ID No: 9). Foi confirmado que a sequência obtida correspondia à região extracelular da CDH6 de macaco cynomolgus (NCBI, XP_005556691.1). Foi igualmente confirmado que a sequência correspondia à sequência completa da CDH6 de macaco cynomolgus (EHH54180,1) registrada no EMBL. O cDNA foi incorporado em um vetor para expressão em mamífero de acordo com um
142 / 272 método conhecido pelo técnico no assunto para produzir um vetor de expressão de CDH6 de macaco cynomolgus, pcDNA3.1-cynoCDH6. A sequência de aminoácidos da ORF de CDH6 de macaco cynomolgus é mostrada em SEQ ID No: 7.
[00334] O kit EndoFree Plasmid Giga (Qiagen N.V.) foi utilizado para a produção em massa do DNA plasmidial produzido. 1)-2 Imunização
[00335] For imunização, foram usados ratos WKY/Izm fêmeas (Japan SLC, Inc.). Primeiramente, os membros inferiores de cada rato foram pré- tratados com hialuronidase (Sigma-Aldrich Co. LLC) e, posteriormente, o vetor de expressão de CDH6 humana, pcDNA3.1-hCDH6 produzido no Exemplo 1)-1, foi injetado por via intramuscular nos mesmos locais. Subsequentemente, empregando ECM830 (BTX), realizou-se eletroporação in vivo nos mesmos locais com um eletrodo de duas agulhas. Aproximadamente uma vez a cada duas semanas, a mesma eletroporação in vivo foi repetida e, depois, linfonodos ou o baço foram coletados do rato e usados para produção de hibridomas. 1)-3 Produção de hibridomas
[00336] As células de linfonodos ou as células do baço foram fundidas com as células SP2/0-ag14 de mieloma (ATCC, No CRL-1 581), de acordo com fusão celular elétrica, usando uma unidade LF301 Cell Fusion Unit (BEX Co., Ltd.), e as células foram então suspensas e diluídas com o meio ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies Inc.) e, a seguir cultivadas sob condições de 37 ºC e CO2 5%. Colônias individuais de hibridomas surgidas no meio de cultura foram coletadas como hibridomas monoclonais, depois suspensas em meio ClonaCell-HY Selection Medium E (StemCell Technologies Inc.) e, a seguir, cultivadas sob condições de 37 ºC e CO2 5%. Depois da proliferação moderada de células, foram produzidos estoques congelados de células dos hibridomas individuais, enquanto o
143 / 272 sobrenadante obtido da cultura de hibridomas foi utilizado para o rastreamento de hibridomas produtores do anticorpo anti-CDH6 humana. 1)-4 Rastreamento do anticorpo anti-CDH6 humana de acordo com o método Cell-ELISA 1)-4-1 Preparação de células expressando o gene do antígeno para uso no Cell-ELISA
[00337] Células 293α (uma linhagem celular com expressão estável derivada de células HEK293 expressando integrina αv e integrina β3) foram preparadas para 5 x 105 células/mL em meio DMEM suplementado com FBS 10%. De acordo com procedimentos de transdução ao se usar Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.), o DNA de pcDNA3.1-hCDH6 ou pcDNA3.1-cynoCDH6 ou pcDNA3.1, como um controle negativo, foi introduzido nas células 293α, e as células foram dispensadas em uma quantidade de 100 µL/poço em uma placa de 96 poços (Corning Inc.). Depois disso, as células foram cultivadas sob condições de 37 ºC e CO2 5% em meio DMEM suplementado com FBS 10% por 24 a 27 horas. As células transfectadas obtidas foram usadas para o Cell-ELISA em estado adesivo. 1)-4-2 Cell-ELISA
[00338] O sobrenadante da cultura das células 293α transfectadas com o vetor de expressão preparado no Exemplo 1)-4-1 foi removido, e o sobrenadante da cultura de cada hibridoma foi então adicionado às células 293α transfectadas com pcDNA3.1-hCDH6 ou pcDNA3.1-cynoCDH6, ou pcDNA3.1. As células foram deixadas em repouso a 4 ºC por 1 hora. As células nos poços foram lavadas uma vez com PBS (+) suplementado com FBS 5% e, depois disso, o anticorpo anti-IgG de rato-Peroxidase produzido em coelho (Sigma-Aldrich Co. LLC), que havia sido diluído 500 vezes com PBS (+) suplementado com FBS 5%, foi adicionado aos poços. As células foram deixadas em repouso a 4 ºC por 1 hora. As células nos poços foram lavadas três vezes com PBS (+) suplementado com FBS 5% e, depois disso,
144 / 272 uma solução de coloração com OPD (que havia sido preparada dissolvendo dicloridrato de o-fenilenodiamina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e H2O2 em uma solução de OPD (citrato trissódico 0,05 M, hidrogenofosfato dissódico 0,1 M 12-água; pH 4,5), para que as substâncias ficassem 0,4 mg/ml e 0,6% (v/v), respectivamente) foi adicionada em uma quantidade de 100 µL/poço aos poços. Uma reação de coloração foi realizada com agitação ocasional. Depois disso, HCl 1 M foi adicionado à placa (100 µL/poço) para encerrar a reação de coloração, seguido pela medição da absorbância a 490 nm por um leitor de placas (ENVISION: PerkinElmer, Inc.). Hibridomas que produziram um sobrenadante de cultura exibindo absorbância maior nas células 293α transfectadas com o vetor de expressão pcDNA3.1-hCDH6 ou pcDNA3.1-cynoCDH6 do que aquela nas células 293α transfectadas com o pcDNA3.1 controle, foram selecionados como hibridomas produtores de anticorpos que se ligam à CDH6humana e à CDH6 de macaco cynomolgus. 1)-5 Rastreamento seletivo por ligação de anticorpo à CDH6 de macaco cynomolgus de acordo com citometria de fluxo 1)-5-1 Preparação de células expressando o gene do antígeno para uso na análise de citometria de fluxo
[00339] Células 293T foram semeadas em um frasco de 225 cm2 (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) a 5 × 104 células/cm2, e as células foram então cultivadas durante a noite sob condições de 37 ºC e CO2 5% em meio DMEM suplementado com FBS 10%. pcDNA3.1-cynoCDH6 ou pcDNA3.1, como controle negativo, foi introduzido nas células 293T usando Lipofectamine 2000, e as células foram adicionalmente cultivadas durante a noite sob condições de 37 ºC e CO2 5%. As células 293T transfectadas com cada vetor foram tratadas com TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific Corp.), depois lavadas com DMEM suplementado com FBS 10% e, a seguir, suspensas em PBS suplementado com FBS 5%. A suspensão celular obtida foi utilizada na análise de citometria de fluxo.
145 / 272 1)-5-2 Análise de citometria de fluxo
[00340] A especificidade de ligação à CDH6 de macaco cynomolgus de um anticorpo produzido a partir de hibridomas produtores de anticorpos que se ligam à CDH6 humana e à CDH6 de macaco cynomolgus, que haviam sido selecionados por Cell-ELISA no Exemplo 1)-4, foi adicionalmente confirmada por citometria de fluxo. A suspensão das células 293T expressando transitoriamente, preparadas no Exemplo 1)-5-1, foi centrifugada, e o sobrenadante foi então removido. Depois disso, as células foram suspensas pela adição do sobrenadante da cultura de cada hibridoma. As células foram deixadas em repouso a 4 ºC por 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com FBS 5% e, depois, as células foram suspensas pela adição do conjugado Anti-IgG de rato-FITC (Sigma- Aldrich Co. LLC) que havia sido diluído 500 vezes com PBS suplementado com FBS 5%. As células foram deixadas em repouso a 4 ºC por 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com FBS 5% e, a seguir, ressuspensas em PBS suplementado com FBS 5% e 7- aminoactinomicina D 2 µg/ml (Molecular Probes, Inc.), seguido por detecção usando um citômetro de fluxo (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Os dados foram analisados com FlowJo (TreeStar, Inc.). Depois que as células mortas foram removidas da análise pela saída de células positivas para 7- aminoactinomicina D, gerou-se um histograma da intensidade de fluorescência de FITC das células vivas. Os hibridomas produtores de anticorpos que se ligam especificamente a CDH6 de macaco cynomolgus expressa na superfície da membrana celular foram selecionados, com base em resultados onde o histograma para o anticorpo se desviou para o lado de intensidade forte de fluorescência nas células 293T transfectadas com pcDNA3.1-cynoCDH6 em comparação com as células 293T transfectadas com o pcDNA3.1 controle. 1)-6 Determinação de isotipo do anticorpo monoclonal de rato
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[00341] O clone rG019, que pareceu ligar-se específica e fortemente à CDH6 humana e à CDH6 de macaco, foi selecionado dentre os hibridomas produtores de anticorpos anti-CDH6 de rato selecionados no Exemplo 1)-5, e o isotipo de cada anticorpo foi identificado. A subclasse da cadeia pesada e o tipo de cadeia leve do anticorpo foram determinados usando um kit Rat Monoclonal Antibody Isotyping Test Kit (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). Como resultado, confirmou-se que rG019 tinha uma cadeia pesada da subclasse IgG2b e uma cadeia leve do tipo de cadeia κ. 1)-7 Preparação de anticorpo de rato anti-CDH6 humana 1)-7-1 Produção de sobrenadante de cultura
[00342] O anticorpo monoclonal de rato anti-CDH6 humana foi purificado do sobrenadante de cultura do hibridoma. Primeiramente, o volume de cada hibridoma produtor de anticorpo monoclonal de rato anti-CDH6 foi aumentado suficientemente com o meio ClonaCell-HY Selection Medium E (StemCell Technologies Inc.) e, depois disso, o meio foi trocado com Hybridoma SFM (Thermo Fisher Scientific Corp.) ao qual havia sido adicionado 20% de Ultra Low IgG FBS (Thermo Fisher Scientific Corp.). Depois, o hibridoma foi cultivado por 4 a 5 dias. O sobrenadante de cultura resultante foi colhido, e a matéria insolúvel foi removida do mesmo pela passagem através de um filtro de 0,8 µm e através de um filtro de 0,2 µm. 1)-7-2 Purificação de anticorpo de rato anti-CDH6
[00343] Um anticorpo (anticorpo de rato anti-CDH6 (rG019)) foi purificado do sobrenadante da cultura de hibridomas preparados no Exemplo 1)-7-1 de acordo com cromatografia de afinidade com Proteína G. O anticorpo foi adsorvido em uma coluna de Proteína G (GE Healthcare Biosciences Corp.), a coluna foi então lavada com PBS, e o anticorpo foi eluído com uma solução aquosa de glicina 0,1 M/HCl (pH 2,7). Tris-HCl 1 M (pH 9,0) foi adicionado ao eluído, para que o pH fosse ajustado para pH 7,0 a 7,5. Depois disso, com um dispositivo Centrifugal UF Filter Device
147 / 272 VIVASPIN20 (corte para peso molecular: UF30K, Sartorius Inc.), o tampão foi substituído por HBSor (histidina 25 mM/sorbitol 5%, pH 6,0), enquanto o anticorpo era concentrado, para que a concentração do anticorpo fosse ajustada para 1 mg/mL. Finalmente, o anticorpo foi filtrado através de um filtro Minisart-Plus (Sartorius Inc.) para obter uma amostra purificada. Exemplo 2: Avaliação in vitro de anticorpo de rato anti-CDH6 2)-1 Avaliação da capacidade de ligação do anticorpo de rato anti-CDH6 por citometria de fluxo
[00344] A atividade de ligação à CDH6 humana do anticorpo de rato anti-CDH6 produzido no Exemplo 1)-7 foi avaliada por citometria de fluxo. Usando Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.), pcDNA3.1- hCDH6 produzido no Exemplo 1)-1 foi introduzido transitoriamente em células 293T (ATCC). As células foram cultivadas durante a noite sob condições de 37 ºC e CO2 5%, tratadas com TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific Inc.) e, depois, uma suspensão celular foi preparada. A suspensão das células 293T transfectadas foi centrifugada, e o sobrenadante foi então removido. Depois disso, as células foram suspensas pela adição do anticorpo monoclonal de rato anti-CDH6 (clone No: rG019), que havia sido preparado no Exemplo 1)-7, ou IgG de rato controle (R&D Systems, Inc.) (concentração final: 10 ng/mL). As células foram deixadas em repouso a 4 ºC por 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com FBS 5% e, a seguir, suspensas pela adição de anticorpo anti-IgG de rato (molécula inteira)- FITC produzido em coelho (Sigma-Aldrich Co. LLC) que havia sido diluído 50 vezes com PBS suplementado com FBS 5%. As células foram deixadas em repouso a 4 ºC por 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com FBS 5%, seguido por detecção usando um citômetro de fluxo (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Os dados foram analisados com FlowJo (TreeStar, Inc.). Os resultados são mostrados na Figura 1. No histograma da Figura 1, a abscissa representa a intensidade de fluorescência
148 / 272 de FITC indicando a quantidade do anticorpo ligado, e a ordenada representa a contagem de células. O histograma sombreado mostra que foram usadas células 293T não transfectadas com hCD6 de controle negativo, e o histograma com área clara, linha contínua mostra que células 293T transfectadas com hCDH6 foram usadas. Conforme visto, a intensidade de fluorescência foi intensificada pela ligação do anticorpo a hCDH6 na superfície das células. A IgG de rato de controle não se liga a nenhuma das células. Como resultado, confirmou-se que os 4 anticorpos monoclonais de rato anti-CDH6 produzidos se ligam a células 293T transfectadas com pcDNA3.1-hCDH6. 2)-2 Análise do sítio de ligação a CDH6 do anticorpo de rato anti-CDH6 por citometria de fluxo 2)-2-1 Construção do vetor de expressão para cada mutante por deleção de domínio de CDH6 humana
[00345] A região extracelular completa da CDH6 humana possui cinco domínios extracelulares, EC1 (SEQ ID NO: 2), EC2 (SEQ ID NO: 3), EC3 (SEQ ID NO: 4), EC4 (SEQ ID NO: 5) e EC5 (SEQ ID NO: 6). Um gene a ser expresso de modo que cada um dos cinco domínios EC pudesse ser deletado da CDH6 humana completa foi sintetizado pela GeneArt, e incorporado em vetores p3xFLAG-CMV-9 para expressão em mamíferos (Sigma-Aldrich Co. LLC) de acordo com um método conhecido pelo técnico no assunto a fim de produzir um vetor de expressão para cada mutante por deleção de domínio, desprovido de qualquer um de EC1 a EC5. 2)-2-2 Análise de epítopos do anticorpo de rato anti-CDH6 por citometria de fluxo usando mutante por deleção de domínio
[00346] Os epítopos, aos quais os anticorpos de rato anti-CDH6 humana se ligaram, foram identificados por análise de citometria de fluxo usando uma linhagem de células 293α transfectadas com vetor de cada deleção do domínio EC. Usando Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher
149 / 272
Scientific Inc.), cada vetor de expressão do mutante por deleção de domínio produzido no Exemplo 2)-2-1, ou pcDNA3.1-hCDH6 para a expressão de CDH6 humana completa, foi introduzido transitoriamente em uma linhagem de células 293α, que era uma linhagem celular derivada de células HEK293 por transfecção estável com vetores de expressão de integrina αv e integrina β3. As células foram cultivadas durante a noite sob condições de 37 ºC e CO2 5%, tratadas com TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific Inc) e, depois disso, uma suspensão celular foi preparada.
A suspensão das células 293α transfectadas foi centrifugada, e o sobrenadante foi então removido.
Depois, as células foram suspensas pela adição do anticorpo monoclonal anti-CDH6 (clone No: rG019), que havia sido preparado no Exemplo 1)-7, ou IgG de rato de controle (R&D Systems, Inc.) (concentração final: 20 nM). As células foram deixadas em repouso a 4 ºC por 1 hora.
As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com FBS 5% e, a seguir, suspensas pela adição do anticorpo anti-IgG de rato (molécula inteira)-FITC produzido em coelho (Sigma-Aldrich Co.
LLC) que havia sido diluído 50 vezes com PBS suplementado com FBS 5%. As células foram deixadas em repouso a 4 ºC por 1 hora.
As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com FBS 5%, seguido por detecção usando um citômetro de fluxo (Canto II; BD Biosciences). Os dados foram analisados com FlowJo (TreeStar, Inc.). Os resultados são mostrados nas Figuras 2-1 a 2-2. Nos histogramas das Figuras 2-1 a 2-2, a abscissa representa a intensidade de fluorescência de FITC indicando a quantidade do anticorpo ligado, e a ordenada representa contagem de células.
O histograma sombreado mostra que foram usadas células 293α não transfectadas de controle negativo, e o histograma de área clara, linha contínua mostra que células 293 expressando hCDH6 completa ou cada mutante por deleção de domínio EC foram usadas.
A intensidade de fluorescência é intensificada quando o anticorpo se liga à hCDH6 completa ou a cada mutante por deleção de domínio EC na superfície de células.
A IgG
150 / 272 de rato de controle não se liga a nenhuma das células transfectadas. rG019 liga-se à hCDH6 completa, ao mutante por deleção de EC1, ao mutante por deleção de EC2, ao mutante por deleção de EC4 e ao mutante por deleção de EC5, mas não se liga ao mutante por deleção de EC3. A partir desse resultado, demonstrou-se que rG019 se liga especificamente a hCDH6 com EC3 como um epítopo. 2)-3 Confirmação da expressão de CDH6 em linhagem de células tumorais humanas
[00347] A fim de selecionar uma linhagem de células tumorais humanas positivas para CDH6 para uso na avaliação dos anticorpos obtidos, informações sobre a expressão de CDH6 foram recuperadas de um banco de dados conhecido, e a expressão de CDH6 na superfície da membrana celular foi avaliada por citometria de fluxo. Linhagens celulares de tumor ovariano humano NIH:OVCAR-3, PA-1, OV-90 e linhagens celulares de tumor humano de células renais 786-O e Caki-1 (todas obtidas da ATCC) foram cultivadas cada uma sob condições de 37 ºC e CO2 5%, tratadas com TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific Inc) e, depois disso, uma suspensão celular foi preparada. As células foram centrifugadas, e o sobrenadante foi então removido. Depois disso, as células foram suspensas pela adição de um anticorpo anti-CDH6 humana disponível comercialmente (MABU2715, R&D Systems, Inc.) ou IgG1 de camundongo (BD Pharmingen) como controle negativo (concentração final: 50 µg/mL). As células foram deixadas em repouso a 4 ºC por 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com FBS 5% e, a seguir, suspensas pela adição de fragmento F(ab’)2 de cabra anti-imunoglobulinas de camundongo, conjugado a FITC (Dako) que havia sido diluído 50 vezes com PBS suplementado com FBS 5%. As células foram deixadas em repouso a 4 ºC por 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com FBS 5%, seguido por detecção usando um citômetro de fluxo (Canto II; BD Biosciences). Os dados
151 / 272 foram analisados com FlowJo (TreeStar, Inc.). Os resultados são mostrados na Figura 3. No histograma da Figura 3, a abscissa representa a intensidade de fluorescência de FITC indicando a quantidade do anticorpo ligado, e a ordenada representa contagem de células. O histograma sombreado mostra que a mIgG1 de controle negativo foi utilizada na coloração, e o histograma de área clara, linha contínua mostra que o anticorpo anti-CDH6 humana foi utilizado na coloração. Conforme visto, a intensidade de fluorescência foi intensificada pela ligação do anticorpo a hCDH6 na superfície de células. A mIgG1 controle não se liga a nenhuma das células. Como resultado, confirmou-se que as linhagens de células NIH:OVCAR-3, PA-1, OV-90, 786- O e Caki-1 expressam endogenamente CDH6 na superfície das células. Exemplo 3: Amplificação e sequenciamento de fragmentos gênicos da região variável da cadeia pesada e da região variável da cadeia leve de rG019 3)-1 Preparação de RNA total do hibridoma produtor do anticorpo rG019
[00348] A fim de amplificar o cDNA que codifica cada região variável de rG019, foi preparado RNA total a partir do hibridoma produtor do anticorpo G019 usando reagente TRIzol (Ambion, Inc.).
[00349] 3)-2 Amplificação do cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada de rG019 por 5’-RACE PCR e determinação da sequência de nucleotídeos
[00350] O cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada foi amplificado usando aproximadamente 1 µg do RNA total preparado no Exemplo 3)-1 um kit de amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clontech Laboratories, Inc.). Como primers usados para amplificar o cDNA da região variável do gene da cadeia pesada de rG019 de acordo com PCR, UPM (Universal Primer A Mix: incluída com o kit de amplificação de cDNA SMARTer RACE) e primers desenhados a partir das sequências das regiões constantes de cadeias pesadas conhecidas de rato foram utilizados.
[00351] O cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada,
152 / 272 amplificado por 5’-RACE PCR, foi clonado em plasmídeo e, depois disso, a sequência de nucleotídeos do cDNA da região variável da cadeia pesada foi submetida à análise da sequência.
[00352] A sequência nucleotídica determinada do cDNA codificador da região variável da cadeia pesada de rG019 é mostrada em SEQ ID NO: 16, e a sequência de aminoácidos da mesma é mostrada em SEQ ID NO: 15.
[00353] 3)-3 Amplificação do cDNA que codifica a região variável da cadeia leve de rG019 por 5’-RACE PCR e determinação da sequência de nucleotídeos
[00354] A amplificação e sequenciamento foram realizados pelo mesmo método que aquele aplicado no Exemplo 3)-2. No entanto, como primers usados para amplificar o cDNA da região variável do gene da cadeia leve de rG019 de acordo com PCR, UPM (Universal Primer A Mix: incluídos com o kit de amplificação de cDNA SMARTer RACE) e primers desenhados a partir das sequências das regiões constantes de cadeias leves conhecidas de ratos foram usados.
[00355] A sequência nucleotídica determinada do cDNA codificador da região variável da cadeia leve de rG019 é mostrada em SEQ ID NO: 11, e a sequência de aminoácidos da mesma é mostrada em SEQ ID NO: 10. Exemplo 4: Produção de chG019, anticorpo quimérico humano anti-CDH6 4)-1 Construção do vetor de expressão chG019, anticorpo quimérico humano anti-CDH6 4)-1-1 Construção do vetor de expressão pCMA-LK da cadeia leve quimérica e humanizada
[00356] Um fragmento de aproximadamente 5,4 kb, que havia sido obtido por digestão do plasmídeo pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corp.) com as enzimas de restrição XbaI e PmeI, foi ligado a um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA (SEQ ID NO: 20) codificadora de uma sequência sinal de cadeia leve humana e uma região constante da cadeia
153 / 272 κ humana, usando um kit de clonagem In-Fusion Advantage PCR (Clontech Laboratories, Inc.) para produzir pcDNA3.3/LK.
[00357] Uma unidade de expressão de neomicina foi removida de pcDNA3.3/LK para construir pCMA-LK. 4)-1-2 Construção do vetor de expressão pCMA-G1 da cadeia pesada quimérica e humanizada do tipo IgG1
[00358] Um fragmento de DNA, que havia sido obtido por digestão de pCMA-LK com XbaI e PmeI para remover a sequência de DNA codificadora da sequência sinal da cadeia leve e da região constante da cadeia κ humana da mesma, foi ligado a um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA (SEQ ID NO: 21) que codifica uma sequência sinal da cadeia pesada humana e uma região constante de IgG1 humana, usando um kit de clonagem In-Fusion Advantage PCR (Clontech Laboratories, Inc.), para construir pCMA-G1. 4)-1-3 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada de chG019
[00359] Um fragmento de DNA das posições de nucleotídeo 36 a 440 na sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de chG019, mostrada em SEQ ID NO: 27, foi sintetizado (GENEART). Usando um kit de clonagem In- Fusion HD PCR (Clontech Laboratories, Inc.), o fragmento de DNA sintetizado foi inserido em um sítio de pCMA-G1 que havia sido clivado com a enzima de restrição BlpI, para que fosse construído um vetor de expressão da cadeia pesada de chG019. Deve-se notar que, para a cadeia pesada de chG019, utilizou-se uma sequência de CDR com cisteína substituída por prolina a fim de evitar ligações dissulfeto imprevisíveis. 4)-1-4 Construção do vetor de expressão da cadeia leve de chG019
[00360] Um fragmento de DNA, compreendendo uma sequência de DNA (SEQ ID NO: 22) que codifica a cadeia leve de chG019, foi sintetizado (GENEART). Usando um kit de clonagem In-Fusion HD PCR (Clontech Laboratories, Inc.), o fragmento de DNA sintetizado foi ligado a um
154 / 272 fragmento de DNA, que havia sido obtido pela digestão de pCMA-LK com XbaI e PmeI para remover a sequência de DNA que codifica a sequência sinal da cadeia leve e a região constante da cadeia κ humana da mesma, para que fosse construído o vetor de expressão da cadeia leve de chG019. 4)-2 Produção e purificação de chG019, anticorpo quimérico humano anti- CDH6 4)-2-1 Produção de chG019
[00361] De acordo com o manual, células FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.) foram cultivadas e submetidas a passagens. 1,2 × 109 células FreeStyle 293F (Invitrogen Corp.), na fase de crescimento logarítmico, foram semeadas em um frasco de Fernbach Erlenmeyer de 3 litros (Corning Inc.), a seguir, diluídas com meio de expressão FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) a 2,0 × 106 células/mL. A 40 ml do meio Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.), foram adicionados 0,24 mg do vetor de expressão da cadeia pesada, 0,36 mg do vetor de expressão da cadeia leve e 1,8 mg de Polietilenoimina (Polyscience no 24765), e a mistura obtida foi agitada gentilmente. Depois de incubação por 5 minutos, a mistura foi adicionada às células FreeStyle 293F. As células foram cultivadas sob agitação a 90 rpm em uma incubadora com CO2 8% a 37 ºC por 4 horas e, depois disso, 600 mL de meio EX-CELL VPRO (SAFC Biosciences Inc.), 18 mL de GlutaMAX I (GIBCO) e 30 mL de Yeastolate Ultrafiltrate (GIBCO) foram adicionados à cultura. As células foram adicionalmente cultivadas sob agitação a 90 rpm em uma incubadora com CO2 8% a 37 ºC por 7 dias. O sobrenadante de cultura obtido foi filtrado através de um filtro com cápsula descartável (Advantec no CCS-045-E1H). 4)-2-2 Purificação de chG019
[00362] Um anticorpo foi purificado a partir do sobrenadante da cultura obtido no Exemplo 4)-2-1 por um processo em uma etapa de acordo com cromatografia de afinidade por rProteína A. O sobrenadante da cultura foi aplicado a uma coluna que havia sido empacotada com MabSelectSuRe
155 / 272 (GE Healthcare Biosciences Corp.), equilibrada com PBS e, depois disso, a coluna foi lavada com PBS em uma quantidade igual a duas ou mais vezes o volume da coluna. Subsequentemente, o anticorpo foi eluído com uma solução de cloridrato de arginina 2 M (pH 4,0), para que uma fração contendo um anticorpo fosse coletada. A fração foi dialisada (Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette), para que o tampão fosse substituído por HBSor (histidina 25 mM/sorbitol 5%, pH 6,0). Usando um dispositivo Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (corte para peso molecular: UF10K, Sartorius Inc.), o anticorpo foi concentrado, de modo que a concentração de IgG fosse ajustada para 5 mg/ml ou mais. Finalmente, o anticorpo foi filtrado através de um filtro Minisart-Plus (Sartorius Inc.) para obter uma amostra purificada. 4)-3 Avaliação da atividade de ligação do anticorpo chG019, anticorpo quimérico humano anti-CDH6
[00363] A atividade de ligação a CDH6 do chG019, anticorpo quimérico humano anti-CDH6 purificado em 4)-2 foi confirmada por citometria de fluxo. Usando Lipofectamine 2000, pcDNA3.1-hCDH6 ou pcDNA3.1-cynoCDH6 produzidos no Exemplo 1)-1, ou pcDNA3.1, foi introduzido transitoriamente em células 293α. As células foram cultivadas durante a noite sob condições de 37 ºC e CO2 5%, tratadas com TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific Inc) e, depois disso, uma suspensão celular foi preparada. chG019 foi adicionado à suspensão de cada uma dessas células. As células foram deixadas em repouso a 4 ºC por 1 hora. Depois disso, as células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com FBS 5% e, a seguir, suspensas pela adição de fragmento F(ab’)2 marcado com PE anti-IgG humana, anticorpo Fcγ (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), que havia sido diluído 500 vezes com PBS suplementado com FBS 5%. As células foram deixadas em repouso a 4 ºC por 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com FBS 5% e, então,
156 / 272 ressuspensas em PBS suplementado com FBS 5%, seguido por detecção usando um citômetro de fluxo (Canto II; BD Biosciences). Os dados foram analisados com FlowJo (TreeStar, Inc.). Como mostrado na Figura 4, chG019 não se ligou às células 293T transfectadas com pcDNA3.1, como controle negativo, mas se ligou às células 293T transfectadas com pcDNA3.1-hCDH6 ou pcDNA3.1-cynoCDH6 de maneira dependente da concentração do anticorpo. Na Figura 4, a abscissa representa a concentração do anticorpo, e a ordenada representa a quantidade do anticorpo ligado, com base na intensidade média de fluorescência. É evidente a partir desse resultado que chG019 se liga especificamente à CDH6 humana e à CDH6 de macaco cynomolgus com atividade de ligação quase equivalente. Exemplo 5: Produção de anticorpo humanizado anti-CDH6 5)-1 Desenho da forma humanizada do anticorpo anti-CDH6 5)-1-1 Modelagem molecular da região variável de chG019
[00364] A modelagem molecular das regiões variáveis de chG019 explorou um método conhecido como modelagem por homologia (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Empregou-se o programa disponível comercialmente de análise de estruturas tridimensionais de proteínas BioLuminate (fabricado pela Schrodinger, LLC) usando, como molde, uma estrutura (PDB ID: 2I9L) registrada no Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) com alta identidade de sequência com as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de chG019. 5)-1-2 Desenho da sequência de aminoácidos de hG019 humanizado
[00365] chG019 foi humanizado por enxertia de CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). As sequências consenso do subgrupo 1 de cadeia gama humana e do subgrupo 1 de cadeia kappa, determinadas por KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)), tinham alta identidade com as regiões framework de chG019 e,
157 / 272 com base nisso, foram selecionadas como aceitadoras para a cadeia pesada e a cadeia leve, respectivamente. Os resíduos de doadores a serem enxertados nas aceitadoras foram selecionados analisando modelos tridimensionais com referência a, por exemplo, os critérios fornecidos por Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). 5)-2 Humanização da cadeia pesada de chG019
[00366] As três cadeias pesadas assim desenhadas foram nomeadas hH01, hH02 e hH04. A sequência complete de aminoácidos da cadeia pesada hH01 é mostrada em SEQ ID NO: 39. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 é mostrada em SEQ ID NO: 40. A sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH02 é mostrada em SEQ ID NO: 43. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 é mostrada em SEQ ID NO: 44. A sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH04 é mostrada em SEQ ID NO: 47. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 é mostrada em SEQ ID NO: 48. 5)-3 Humanização da cadeia leve de chG019
[00367] Duas cadeias leves assim desenhadas foram nomeadas hL02 e hL03. A sequência completa de aminoácidos da cadeia leve hL02 é mostrada em SEQ ID NO: 31. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 é mostrada em SEQ ID NO: 32. A sequência completa de aminoácidos da cadeia leve hL03 é mostrada em SEQ ID NO:
35. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 é mostrada em SEQ ID NO: 36. 5)-4 Desenho de hG019 humanizado por combinação da cadeia pesada e cadeia leve
[00368] Um anticorpo que consiste em hH01 e hL02 foi nomeado “anticorpo H01L02” ou “H01L02”. Um anticorpo que consiste em hH02 e hL02 foi nomeado “anticorpo H02L02” ou “H02L02”. Um anticorpo que
158 / 272 consiste em hH02 e hL03 foi nomeado “anticorpo H02L03” ou “H02L03”. Um anticorpo que consiste em hH04 e hL02 foi nomeado “anticorpo H04L02” ou “H04L02”. 5)-5 Expressão do anticorpo humanizado anti-CDH6 5)-5-1 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada humanizada de hG019 5)-5-1-1 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada hH01
[00369] Um fragmento de DNA, a partir das posições de nucleotídeo 36 a 440 na sequência de nucleotídeos da cadeia pesada hH01 mostrada em SEQ ID NO: 40, foi sintetizado (GENEART). Um vetor de expressão da cadeia pesada hH01 foi construído pelo mesmo método que aquele aplicado no Exemplo 4)-1-3. 5)-5-1-2 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada hH02
[00370] Um fragmento de DNA, a partir das posições de nucleotídeo 36 a 440 na sequência de nucleotídeos da cadeia pesada hH02 mostrada em SEQ ID NO: 44, foi sintetizado (GENEART). Um vetor de expressão da cadeia pesada hH02 foi construído pelo mesmo método que aquele aplicado no Exemplo 4)-1-3. 5)-5-1-3 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada hH04
[00371] Um fragmento de DNA, a partir das posições de nucleotídeo 36 a 440 na sequência de nucleotídeos da cadeia pesada hH04 mostrada em SEQ ID NO: 48, foi sintetizado (GENEART). Um vetor de expressão da cadeia pesada hH04 foi construído pelo mesmo método que aquele aplicado no Exemplo 4)-1-3. 5)-5-2 Construção do vetor de expressão da cadeia leve humanizada de hG019 5)-5-2-1 Construção do vetor de expressão da cadeia leve hL02
[00372] Um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA codificadora da região variável da cadeia leve hL02, a partir das
159 / 272 posições de nucleotídeo 37 a 399 na sequência de nucleotídeos da cadeia leve hL02 em SEQ ID NO: 32, foi sintetizado (GENEART). Usando um kit de clonagem In-Fusion HD PCR (Clontech Laboratories, Inc.), o fragmento de DNA sintetizado foi inserido em um sítio de pCMA-LK que havia sido clivado com a enzima de restrição BsiWI, para que fosse construído o vetor de expressão da cadeia leve hL02. 5)-5-2-2 Construção do vetor de expressão da cadeia leve hL03
[00373] Um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA codificadora da região variável da cadeia leve hL03, a partir das posições de nucleotídeo 37 a 399 na sequência de nucleotídeos da cadeia leve hL03 mostrada em SEQ ID NO: 36, foi sintetizado (GENEART). Um vetor de expressão da cadeia leve hL03 foi construído pelo mesmo método que aquele aplicado no Exemplo 5)-5-2-1. 5)-5-3 Preparação de hG019 humanizado 5)-5-3-1 Produção de H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02
[00374] Os anticorpos foram produzidos pelo mesmo método que aquele aplicado no Exemplo 4)-2-1. H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02 foram produzidos pela combinação da cadeia pesada e da cadeia leve mostrada em Exemplo 5)-4. 5)-5-3-2 Purificação em duas etapas de H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02
[00375] O anticorpo foi purificado a partir do sobrenadante da cultura obtido no Exemplo 5)-5-3-1, por um processo em duas etapas, a saber, por cromatografia de afinidade por rProteína A e cerâmica de hidroxiapatita. O sobrenadante da cultura foi aplicado a uma coluna que havia sido empacotada com MabSelectSuRe (fabricada pelo GE Healthcare Biosciences Corp.), equilibrada com PBS e, depois disso, a coluna foi lavada com PBS em uma quantidade igual a duas ou mais vezes o volume da coluna. Subsequentemente, o anticorpo foi eluído com uma solução de cloridrato de arginina 2 M (pH 4,0). Uma fração contendo o anticorpo foi dialisada
160 / 272 (Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette), de modo que o tampão foi substituído com PBS. A solução do anticorpo foi diluída 5 vezes com um tampão de fosfato de sódio 5 mM/MÊS 50 mM/pH 7,0 e, então, aplicada a uma coluna cerâmica de hidroxiapatita (Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column) que havia sido equilibrada com um tampão de NaPi 5 mM/MES 50 mM/NaCl 30 mM/pH 7,0. A eluição foi realizada em um gradiente linear de linear de cloreto de sódio, de modo que uma fração contendo um anticorpo foi coletada. Essa fração foi dialisada (Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A- Lyzer Dialysis Cassette), para que o tampão fosse substituído por HBSor (histidina 25 mM/sorbitol 5%, pH 6,0). O anticorpo foi concentrado com o dispositivo Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (corte para peso molecular: UF10K, Sartorius Inc.), ajustando, assim, a concentração de IgG para 20 mg/ml. Finalmente, o anticorpo foi filtrado através de um filtro Minisart-Plus (Sartorius Inc.) para obter uma amostra purificada. Exemplo de Referência 1: Produção de anticorpo NOV0712 anti-CDH6
[00376] O anticorpo anti-CDH6 NOV0712 usado nos Exemplos foi produzido tendo como referência as sequências de aminoácidos completas da cadeia leve e da cadeia pesada (SEQ ID NO: 235 e SEQ ID NO: 234, respectivamente, na Publicação Internacional No WO 2016/024195) de NOV0712 descrito na Publicação Internacional No WO 2016/024195. Exemplo de Referência 1)-1 Anticorpo NOV0712 anti-CDH6 Exemplo de Referência 1)-1-1 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada do anticorpo NOV0712 anti-CDH6
[00377] Um fragmento de DNA que codifica a região variável da cadeia pesada de NOV0712, a partir das posições de nucleotídeo 36 a 428 na sequência de nucleotídeos da cadeia pesada de NOV0712 mostrada em SEQ ID NO: 54, foi sintetizado (GENEART). Um vetor de expressão da cadeia pesada de NOV0712 foi construído pelo mesmo método que aquele aplicado
161 / 272 no Exemplo 4)-1-3. A sequência de aminoácidos da cadeia pesada de NOV0712, expressa pelo vetor de expressão da cadeia pesada de NOV0712, é mostrada em SEQ ID NO: 53. Na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 53, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 1 a 19 é uma sequência sinal. Exemplo de Referência 1)-1-2 Construção vetor de expressão da cadeia leve do anticorpo NOV0712 anti-CDH6
[00378] Um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de DNA que codifica a região variável da cadeia leve de NOV0712, a partir das posições de nucleotídeo 37 a 405 na sequência de nucleotídeos da cadeia leve de NOV0712 mostrada em SEQ ID NO: 52, foi sintetizado (GENEART). Um vetor de expressão da cadeia leve de NOV0712 foi construído pelo mesmo método que aquele aplicado no Exemplo 5)-5-2-1. A sequência de aminoácidos da cadeia leve de NOV0712, expressa pelo vetor de expressão da cadeia leve de NOV0712, é mostrada em SEQ ID NO: 51. Na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 51, a sequência de aminoácidos que consiste nos resíduos de aminoácidos das posições 1 a 20 é uma sequência sinal. Exemplo de Referência 1)-2 Preparação de anticorpo NOV0712 anti-CDH6 Exemplo de Referência 1)-2-1 Produção de anticorpo NOV0712 anti-CDH6
[00379] NOV0712 foi produzido pelo mesmo método que aquele aplicado no Exemplo 4)-2-1. Exemplo de Referência 1)-2-2 Purificação em uma etapa do anticorpo NOV0712 anti-CDH6
[00380] O anticorpo anti-CDH6 NOV0712 foi purificado a partir do sobrenadante da cultura obtido no Exemplo de Referência 1)-2-1 pelo mesmo método que aquele aplicado no Exemplo 4)-2-2 (concentração do anticorpo: 5 mg/l HBSor). Exemplo 6: Avaliação in vitro de hG019 humanizado e NOV0712
162 / 272 6)-1 Avaliação da atividade de ligação de hG019 humanizado
[00381] A constante de dissociação entre o anticorpo e o antígeno (Recombinant Human CDH6 Fc His chimera, R&D Systems, Inc.) foi medida usando Biacore T200 (GE Healthcare Biosciences Corp.), de acordo com um método de captura, o qual compreende capturar o antígeno como um ligando com o anticorpo anti-His imobilizado e, a seguir, medir a constante de dissociação usando um anticorpo como analito. Aproximadamente 1000 RU do anticorpo anti-histidina (His capture kit, GE Healthcare Biosciences Corp.) foi ligado covalentemente ao chip sensor CM5 (GE Healthcare Biosciences Corp.) pelo método de acoplamento com amina. O anticorpo foi também imobilizado em células de referência da mesma maneira que acima. HBS-P+ (HEPES 10 Mm, pH 7,4, NaCl 0,15 M, Surfactante P20 0,05%) suplementado com CaCl2 1 mM foi utilizado como tampão de corrida. O antígeno foi adicionado ao chip com o anticorpo anti-histidina imobilizado por 60 segundos, e uma solução com diluição em série (0,391 a 100 nM) do anticorpo foi então adicionada a uma vazão de 30 µl/min. por 300 segundos. Subsequentemente, a fase de dissociação foi monitorada por 600 segundos. Como uma solução de regeneração, uma solução de glicina (pH 1,5) suplementada com MgCl2 5 M foi adicionada duas vezes a uma vazão de 10 µl/min. por 30 segundos. Um modelo de Afinidade no Estado de Equilíbrio no software de análise (software BIAevaluation, versão 4.1) foi utilizado na análise de dados, e a constante de dissociação (KD) foi calculada. Os resultados são mostrados na Tabela 2. Tabela 2
163 / 272 Anticorpo 6)-2 Análise de sítios de ligação a CDH6 de hG019 humanizado e NOV0712 6)-2-1 Análise de epítopos usando mutante com defeito em domínio
[00382] Usando Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.), cada vetor de expressão de mutante por deleção de domínio produzido no Exemplo 2)-2-1, ou pcDNA3.1-hCDH6 para a expressão de CDH6 humana completa, foi introduzido transitoriamente em células. As células foram cultivadas durante a noite sob condições de 37 ºC e CO2 5% e, depois, uma suspensão celular foi preparada. A suspensão das células 293α transfectadas foi centrifugada, e o sobrenadante foi então removido. Depois disso, as células foram suspensas pela adição de cada um dos 4 anticorpos humanizados hG019 (clone Nos: H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), que haviam sido preparados no Exemplo 5)-5-3, ou o anticorpo anti-CDH6 NOV0712, que havia sido preparado no Exemplo de Referência 1, ou IgG1 humana (Calbiochem) como controle negativo. As células foram deixadas em repouso a 4 ºC por 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com FBS 5% e, a seguir, suspensas pela adição de F(ab’)2 de cabra APC-anti-IgG humana (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) que havia sido diluído 500 vezes com PBS suplementado com FBS 5%. As células foram deixadas em repouso a 4 ºC por 1 hora. As células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com FBS 5%, seguido por detecção usando um citômetro de fluxo (Canto II; BD Biosciences). Os dados foram analisados com FlowJo (TreeStar, Inc.). Os resultados são mostrados
164 / 272 nas Figuras 5-1 a 5-6. Nos histogramas das Figuras 5-1 a 5-6, a abscissa representa a intensidade de fluorescência de APC indicando a quantidade do anticorpo ligado, e a ordenada representa a contagem de células.
O histograma sombreado mostra que foram usadas células 293α não transfectadas de controle negativo, e o histograma de área clara, linha contínua mostra que células 293α expressando hCDH6 completa ou cada mutante por deleção de domínio EC foram usadas.
A intensidade de fluorescência é intensificada quando o anticorpo se liga à hCDH6 completa ou a cada mutante por deleção de domínio EC na superfície das células.
A IgG1 humana de controle não se liga a nenhuma das células transfectadas.
Os 4 anticorpos humanizados hG019 (clone Nos: H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02) ligam-se à hCDH6 completa, ao mutante por deleção de EC1, ao mutante por deleção de EC2, ao mutante por deleção de EC4 e ao mutante por deleção de EC5, mas não se ligam ao mutante por deleção de EC3. Especificamente, demonstrou-se que os 4 anticorpos humanizados hG019 se ligam especificamente à hCDH6 com EC3 como um epítopo.
Por outro lado, o anticorpo anti-CDH6 NOV0712 liga-se à hCDH6 completa, ao mutante por deleção de EC1, ao mutante por deleção de EC2, o mutante por deleção de EC3 e ao mutante por deleção de EC4, mas não se liga ao mutante por deleção de EC5. Especificamente, demonstrou-se que o anticorpo anti-CDH6 NOV0712 se liga especificamente a hCDH6 com EC5 como um epítopo.
Isso é compatível com as informações sobre epítopo em NOV0712 descritas na Publicação Internacional No WO 2016/024195. A partir desse resultado, demonstrou-se que os 4 anticorpos humanizados hG019 obtidos na presente descrição são anticorpos anti-CDH6 que exibem propriedades diferentes daqueles de NOV0712. 6)-2-2 Ensaio de ligação competitiva de anticorpos 6)-2-2-1 Produção da linhagem de células 786-O/hCDH6 com expressão estável
165 / 272
[00383] A linhagem de células 786-O/hCDH6 com expressão estável foi produzida por infecção de células 786-O (ATCC) com um retrovírus recombinante para expressão de CDH6 humana completa. Um vetor de expressão retroviral para expressão de CDH6 humana (pQCXIN-hCDH6) foi produzido utilizando um vetor de expressão com cDNA que codifica a proteína CDH6 humana (NP_004923) (OriGene Technologies Inc., RC217889), e incorporando o cDNA no vetor retroviral pQCXIN (Clontech Laboratories, Inc.) de acordo com um método conhecido pelo técnico no assunto. Usando FuGene HD (Promega Corp.), pQCXIN-hCDH6 foi introduzido transitoriamente em células de empacotamento com retrovírus RetroPack PT67 (Clontech Laboratories, Inc.). Depois de 48 horas, um sobrenadante de cultura contendo o retrovírus recombinante foi recuperado e, a seguir, adicionado ao sistema de cultura de células 786-O, para que as células fossem infectadas. A partir de 3 dias depois da infecção, as células infectadas foram cultivadas sob condições de 37 ºC e CO2 5% em um meio suplementado com G418 (Gibco) (concentração final: 50 mg/mL) e rastreadas com o fármaco, para estabelecer uma linhagem de células 786-O/hCDH6 expressando estavelmente CDH6 humana. A alta expressão de CDH6 humana na linhagem com expressão estável foi confirmada por citometria de fluxo da mesma maneira que aquela aplicada no Exemplo 2)-3-1 (Figura 6). Anticorpo secundário de cabra anti IgG1 de camundongo-Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific Inc.), que havia sido diluído 500 vezes com PBS suplementado com FBS 5%, foi utilizado como um anticorpo para detecção. Os resultados são mostrados na Figura 6. No histograma da Figura 6, a abscissa representa a intensidade de fluorescência de Alexia Fluor 647 indicando a quantidade do anticorpo ligado, e a ordenada representa a contagem de células. O histograma sombreado mostra que mIgG1 de controle negativo foi utilizada na coloração, e o histograma de área clara, linha contínua mostra que o anticorpo anti-CDH6 humana foi utilizado na
166 / 272 coloração. Conforme visto, a intensidade de fluorescência foi intensificada pela ligação do anticorpo a hCDH6 na superfície de células. A mIgG1 controle não se liga a nenhuma das células. Como resultado, demonstrou-se que a linhagem de células 786-O/hCDH6 com expressão estável expressa CDH6 humana em nível mais alto do que as células 786-O da linhagem original. 6)-2-2-2 Ensaio de ligação competitiva usando H01L02 marcado e NOV0712 marcado
[00384] H01L02 marcado e NOV0712 marcado foram produzidos usando um kit de marcação de anticorpo monoclonal com Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific Inc.). A suspensão celular da linhagem de células 786-O/hCDH6 com expressão estável produzida em 6)-2-2-1 foi centrifugada, e o sobrenadante foi então removido. Depois disso, as células foram suspensas pela adição de NOV0712 marcado ou H01L02 marcado (concentração final: 5 nM) e, além disso, a adição de cada um dos 4 anticorpos humanizados hG019 (clone Nos: H01L02, H02L02, H02L03 e H04L02), que haviam sido preparados no Exemplo 5)-5-3, ou o anticorpo anti-CDH6 NOV0712, que havia sido preparado no Exemplo de Referência 1, ou IgG1 humana (Calbiochem) como controle negativo (concentração final: como mostrada na abscissa da Figura 7). As células foram deixadas em repouso a 4 ºC por 1 hora. Depois disso, as células foram lavadas duas vezes com PBS suplementado com FBS 5%, seguido por detecção usando um citômetro de fluxo (Canto II; BD Biosciences). Os dados foram analisados com FlowJo (TreeStar, Inc.). Os resultados são mostrados na Figura 7. A abscissa representa a concentração final do anticorpo não marcado adicionado, e a ordenada representa a quantidade do anticorpo ligado com base na intensidade média de fluorescência. Quando NOV0712 não marcado é adicionado às células, suplementado com NOV0712 marcado, a quantidade do anticorpo marcado ligado é diminuída pela substituição com o anticorpo
167 / 272 não marcado de maneira dependente da adição de concentração, pois eles competem um com o outro pela ligação ao mesmo epítopo. Por outro lado, mesmo que cada um dos 4 anticorpos humanizados hG019 ou IgG1 humana, como controle negativo, seja adicionado às células, suplementado com NOV0712 marcado, não há alteração na quantidade do anticorpo marcado ligado, indicando que esses anticorpos diferem no epítopo e, deste modo, não competem entre si pela ligação. Do mesmo modo, quando cada um dos 4 anticorpos humanizados hG019 não marcados é adicionado às células, suplementado com H01L02 marcado, a quantidade do anticorpo marcado ligado é diminuída pela substituição pelo anticorpo não marcado de maneira dependente da adição da concentração, pois eles competem um com cada um dos outros pela ligação ao mesmo epítopo. Por outro lado, mesmo que NOV0712 ou IgG1 humana, como controle negative, seja adicionado às células, suplementado com H01L02 marcado, não há alteração na quantidade do anticorpo marcado ligado, indicando que esses anticorpos diferem no epítopo e, deste modo, não competem entre si pela ligação. 6)-3 Avaliação da atividade de internalização de hG019 humanizado e NOV0712
[00385] A atividade de internalização de hG019 humanizado e NOV0712 foi avaliada usando um reagente Hum-ZAP anti-IgG humana (Advanced Targeting Systems) conjugado com uma toxina (saporina) que inibe a síntese de proteínas. Especificamente, a linhagem de células NIH:OVCAR-3 de tumor ovariano, positivas para CDH6 humana (ATCC) foi semeada a 4 x 103 células/poço em uma placa de 96 poços e, a seguir, cultivada durante a noite sob condições de 37 ºC e CO2 5%. A linhagem de células 786-O de tumor de células renais, positivas para CDH6 humana (ATCC) foi semeada a 1 x 103 células/poço em uma placa de 96 poços e, a seguir, cultivada durante a noite. A linhagem de células PA-1 de tumor ovariano, positivas para CDH6 humana (ATCC) foi semeada a 1 x 103
168 / 272 células/poço em uma placa de 96 poços e, a seguir, cultivada durante a noite sob condições de 37 ºC e CO2 5%. No dia seguinte, cada anticorpo anti- CDH6 (concentração final: 1 nM) ou anticorpo IgG1 humana (Calbiochem), como anticorpo de controle negativo, foi adicionado à placa.
Hum-ZAP (concentração final: 0,5 nM) ou fragmento F(ab’)2 de cabra anti-IgG humana, fragmento específico Fc (gama) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) não conjugado com a toxina (concentração final: 0,5 nM), como controle negativo, foi ainda adicionado à placa, e as células foram cultivadas sob condições de 37 ºC e CO2 5% por 3 dias.
O número de células vivas foi medido pela quantificação da atividade de ATP (RLU) por um ensaio de viabilidade celular CellTiter-Glo(TM) Luminescent Cell.
Nessa avaliação, Hum-ZAP é absorvido pelas células de maneira dependente da atividade de internalização do anticorpo humanizado anti-CDH6, de modo que saporina, que inibe a síntese de proteínas, é liberada nas células, de modo a suprimir o crescimento celular.
Um efeito de inibição do crescimento celular ocasionado pela adição do anticorpo anti-CDH6 foi indicado por uma taxa de sobrevida relativa, em que o número de células vivas em um poço suplementado com o controle negativo em vez de Hum-ZAP foi definido como 100%. A Figura 8 mostra uma tabela da taxa de sobrevida das células.
Nesse experimento, um anticorpo com forte atividade de internalização é considerado para oferecer uma baixa taxa de sobrevida celular.
Como resultado, os 4 anticorpos humanizados hG019 apresentam uma taxa de internalização de aproximadamente 50 a 75%, prevista a partir das taxas de sobrevida celular para todas as 3 linhagens de células.
Assim, os 4 anticorpos humanizados hG019 exibem atividade de internalização muito alta e exibem atividade de internalização muito mais alta do que aquela de NOV0712. A partir do mecanismo dos efeitos medicinais de ADC, um anticorpo tendo maior atividade de internalização é considerado mais adequado como um anticorpo ADC.
169 / 272 Exemplo 7: Produção de variante de hG019 humanizado 7)-1 Desenho de variante de hG019 humanizado 7)-1-1 Desenho de variante com região variável modificada H01L02
[00386] Uma cadeia pesada projetada substituindo a 71a tirosina na sequência de aminoácidos hH01 descrita no Exemplo 5)-2, por alanina foi designada hH11 e uma cadeia pesada projetada substituindo a 81a glutamina na sequência por serina e a 123a fenilalanina por alanina foi designada hH31. A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH11 é mostrada em SEQ ID No: 55. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 55 é mostrada em SEQ ID No: 56. A sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH31 é mostrada em SEQ ID No: 60. A sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID No: 60 é mostrada em SEQ ID No: 61. 7)-1-2 Desenho da cadeia pesada humana LALA
[00387] Uma cadeia pesada foi projetada substituindo os resíduos de leucina nas posições 234 e 235 (especificadas pelo índice EU) da hH01 sequência de aminoácidos hH01 descrita no Exemplo 5)-2 por resíduos de alanina (aqui referida como “hH01A”). Uma cadeia pesada tendo a região variável hH11 projetada no Exemplo 7)-1-1, ou seja, um isotipo de IgG1, foi projetado substituindo os resíduos de leucina nas posições 234 e 235 (especificadas pelo índice EU) por resíduos de alanina (aqui referida como “hH11A”). Uma cadeia pesada tendo a região variável hH31 (projetada no Exemplo 7)-1-1), ou seja, um isotipo de IgG1, foi projetado substituindo os resíduos de leucina nas posições 234 e 235 (especificadas pelo índice EU) por resíduos de alanina (aqui referida como “hH31A”). 7)-2 Desenho de variante de hG019 humanizado com afinidade de ligação alterada pelo uso da cadeia pesada e cadeia leve em combinação
[00388] O anticorpo tendo hH01A e hL02 é designado “anticorpo H01L02A” ou “H01L02A”. O anticorpo tendo hH11A e hL02 é designado
170 / 272 “anticorpo H11L02A” ou “H11L02A”. O anticorpo tendo hH31A e hL02 é designado “anticorpo H31L02A” ou “H31L02A”. 7)-3 Expressão de variante de hG019 humanizado com afinidade de ligação alterada 7)-3-1 Construção do vetor de expressão pCMA-G1LALA da cadeia pesada de IgG1 humanizada tipo LALA
[00389] Usando um fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a sequência de aminoácidos da sequência sinal da cadeia pesada humana mostrada em SEQ ID No: 71 e a região constante de IgG1 LALA humana, pCMA-G1LALA foi construído da mesma maneira que no Exemplo 4)-1-2. 7)-3-2 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada hH01A
[00390] Um fragmento de DNA, a partir das posições de nucleotídeo 36 a 440 na sequência de nucleotídeos da hH01A mostrada em SEQ ID No: 66, foi sintetizado (GENEART). Usando um kit de clonagem In-Fusion HD PCR (Clontech Laboratories, Inc.), o fragmento de DNA sintetizado foi inserido em um sítio de pCMA-G1LALA que havia sido clivado com a enzima de restrição BlpI, a fim de construir um vetor de expressão de hH01A. 7)-3-3 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada hH11A
[00391] Um fragmento de DNA, a partir das posições de nucleotídeo 36 a 440 na sequência de nucleotídeos da hH11A mostrada em SEQ ID No: 68, foi sintetizado (GENEART). Um vetor de expressão de hH11A foi construído da mesma maneira que no Exemplo 7)-3-2. 7)-3-4 Construção do vetor de expressão da cadeia pesada hH31A
[00392] Um fragmento de DNA, a partir das posições de nucleotídeo 36 a 440 na sequência de nucleotídeos da hH31A mostrada em SEQ ID No: 70, foi sintetizado (GENEART). Um vetor de expressão de hH31A foi construído da mesma maneira que no Exemplo 7)-3-2. 7)-4 Preparação de variante de hG019 humanizada com afinidade de ligação
171 / 272 alterada 7)-4-1 Produção de H01L02A, H11L02A e H31L02A
[00393] A produção foi realizada in da mesma maneira que no Exemplo 4)-2-1. Usando o vetor de expressão da cadeia leve construído no Exemplo 5)-5-2-1 e o vetor de expressão da cadeia pesada construído no Exemplo 7)-3, foram obtidas combinações de um vetor de expressão de cadeia H e um vetor de expressão de cadeia L, ou seja, H01L02A, H11L02A, H31L02A, que correspondem às combinações de cadeias H e L descritas no Exemplo 7)-2. 7)-4-2 Purificação em duas etapas de H01L02A, H11L02A e H31L02A
[00394] A purificação foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 5)-5-3-2, usando o sobrenadante da cultura obtido no Exemplo 7)-4-1. Exemplo 8: Avaliação in vitro de variante de hG019 humanizado com afinidade de ligação alterada 8)-1 Avaliação da atividade de ligação de H01L02A, H11L02A, H31L02A
[00395] A constante de dissociação de cada uma das construções H01L02A, H11L02A e H31L02A, preparadas no Exemplo 7)-4, e a CDH6 humana foi medida utilizando Biacore T200 (GE Healthcare Biosciences Corp.), de acordo com um método de captura, o qual compreende capturar o antígeno como um ligando com anticorpo anti-histidina imobilizado por meio de um kit de captura de His (fabricado pela GE Healthcare Bioscience) e, a seguir, medir a constante de dissociação usando um anticorpo como analito. Como o chip sensor, usou-se o CM5 (fabricado pela GE Healthcare Bioscience). Como o tampão de corrida, o tampão contendo Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 1 mM e Surfactante P20 0,05% (pH7,4), foi utilizado. No chip, uma quimera Caderina-6 humana recombinante (KCAD)/Fc (RD- SYSTEMS) 1 µg/mL foi adicionada a uma taxa de 10 µL/minuto por 60 segundos, e uma solução com diluição em série (0,11 a 81 µg/mL) do anticorpo preparado no Exemplo 7)-4 foi então adicionada a uma vazão de 30
172 / 272 µl/min. por 180 segundos. Subsequentemente, a fase de dissociação foi monitorada por 180 segundos. Como uma solução de regeneração, uma Glicina 1,5 (GE Healthcare Bioscience feita pela empresa) foi adicionada a uma vazão de 20 µl/min. por 30 segundos. Um modelo de Afinidade no Estado de Equilíbrio foi utilizado na análise de dados, e a constante de dissociação (KD) foi calculada. Os resultados são mostrados na Tabela 3. Tabela 3 Nome Exemplo 9: Produção do anticorpo anti-LPS como controle
[00396] Um anticorpo anti-LPS foi produzido tendo como referência a WO2015/046505. O isotipo do anticorpo anti-LPS usado no Exemplo é IgG1 (também referido como anticorpo anti-LPS). As sequências de aminoácidos de uma cadeia leve e cadeia peada do anticorpo anti-LPS usado no Exemplo são mostradas na SEQ ID No: 72 e SEQ ID No: 73, respectivamente. Exemplo 10: Síntese de intermediário de produção Exemplo 10-1: Intermediário 1 [Fórmula 53]
173 / 272 Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa p p Etapa Etapa Etapa p Etapa Etapa 1: (6S)-6-(hidroximetil)-5-azaspiro[2.4]heptano-5-carboxilato de benzila (1-2)
[00397] A uma solução de 6-metil(6S)-5-azaspiro[2.4]heptano-5,6- dicarboxilato de 5-benzila (1-1) (104 mmol, WO 2012087596) em THF (500 mL), adicionou-se borohidreto de lítio (4,30 g, 178 mmol) em pequenas porções a 0 ºC. A solução foi agitada a 0 ºC por 30 minutos e, a seguir, agitada à temperatura ambiente por 2 horas. Água (180 mL) e ácido clorídrico 2 N (186 mL) foram adicionados a 0 ºC, e o resultante foi destilado sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi extraído com acetato de etila quatro vezes, e a camada orgânica foi lavada com salmoura e então seca com sulfato de sódio anidro. O resultante foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo resultante (1-2) (27,9 g, 90%) foi usado diretamente para a reação subsequente. Etapa 2: (6S)-6-({[terc-butil(dimetil)silil]oxi}metil)-5-azaspiro[2.4]heptano- 5-carboxilato de benzila (1-3)
[00398] A uma solução do composto obtido na etapa 1 (1-2) (27,9 g, 107 mmol) e imidazol (14,5 g, 214 mmol) em diclorometano (300 mL), adicionou-se cloreto de terc-butildimetilsilila (24,2 g, 160 mmol) à temperatura ambiente, e o resultante foi agitado à temperatura ambiente por 18 horas. A solução de reação foi lavada com ácido cítrico aquoso saturado,
174 / 272 hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado e salmoura, seco com sulfato de sódio anidro e, a seguir, destilado sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 100:0 (v/v) a 50:50 (v/v)] para fornecer o composto desejado (1-3) (32,5 g, 81%).
[00399] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,39-7,34 (5H, m), 5,23-5,11 (2H, m), 4,10-3,48 (4H, m), 3,16-3,14 (1H, m), 2,15-2,04 (1H, m), 1,81-1,77 (1H, m), 0,91-0,88 (9H, m), 0,65-0,55 (4H, m), 0,08-0,01 (6H, m).
[00400] MS (APCI) m/z: 376 (M+H)+ Etapa 3: (6S)-6-({[terc-Butil(dimetil)silil]oxi}metil)-5-azaspiro[2.4]heptano (1-4)
[00401] A uma solução do composto obtido na etapa 2 (1-3) (32,5 g, 86,5 mmol) em etanol (400 mL), adicionou-se catalisador de paládio em carbono 7,5% (teor de umidade: 54%, 5,00 g) à temperatura ambiente, e o resultante foi agitado sob atmosfera de hidrogênio à temperatura ambiente por 6 horas. A solução de reação foi filtrada através de Celite, e o filtrado foi destilado sob pressão reduzida para fornecer o composto desejado (1-4) (21,3 g, quantitativo).
[00402] RMN 1H (CDCl3) δ: 3,79-3,77 (1H, m), 3,71-3,69 (1H, m), 3,65-3,60 (1H, m), 3,01-2,98 (2H, m), 1,81-1,71 (2H, m), 0,90 (9H, s), 0,65- 0,57 (4H, m), 0,08 (3H, s), 0,07 (3H, s).
[00403] MS (APCI, ESI) m/z: 242 (M+H)+ Etapa 4: [(6S)-6-({[terc-Butil(dimetil)silil]oxi}metil)-5-azaspiro[2.4]hept-5- il](5-metoxi-2-nitro-4-{[tri(propan-2-il)silil]oxi}fenil)metanona (1-5)
[00404] A uma solução de ácido 5-metoxi-2-nitro-4-{tri(propan-2- il)silil]oxi}benzoico (52,2 g, 141 mmol, US 20150283262) e 1- hidroxibenzotriazol monohidratado (23,8 g, 155 mmol) em diclorometano (500 mL), adicionou-se N,N’-diciclohexilcarbodiimida (35,0 g, 170 mmol) sob resfriamento com gelo. A mistura de reação foi agitada à temperatura
175 / 272 ambiente. Depois que o ácido carboxílico desapareceu, uma solução do composto obtido na etapa 3 (1-4) (34,1 g, 141 mmol) e trietilamina (29,4 mL, 212 mmol) em diclorometano (100 mL) foi lentamente adicionada gota a gota à mesma. Depois que a solução de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, adicionou-se hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado à mistura de reação, e a mistura de reação foi extraída com clorofórmio. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura e seca com sulfato de magnésio anidro. O resultante foi destilado sob pressão reduzida e, ao resíduo resultante, acetato de etila e éter dietílico foram adicionados, e o conteúdo sólido foi removido através de filtração, o filtrado destilado sob pressão reduzida e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 100:0 (v/v) a 25:75 (v/v)] para fornecer o composto desejado (1-5) (55,0 g, 66%).
[00405] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,72-7,66 (1H, m), 6,80-6,73 (1H, m), 4,53-4,49 (1H, m), 4,04-3,95 (1H, m), 3,91-3,88 (3H, m), 3,59-3,54 (1H, m), 3,36-3,25 (0,5H, m), 3,01-2,96 (1,5H, m), 2,24-2,20 (0,3H, m), 2,09-2,05 (0,7H, m), 2,00-1,97 (0,7H, m), 1,69-1,67 (0,3H, m), 1,32-1,24 (3H, m), 1,12- 1,05 (18H, m), 0,93-0,91 (6H, m), 0,79-0,77 (3H, m), 0,71-0,62 (2H, m), 0,57-0,40 (2H, m), 0,12-0,10 (4H, m), 0,11-0,15 (2H, m).
[00406] MS (APCI, ESI) m/z: 593 (M+H)+ Etapa 5: (2-Amino-5-metoxi-4-{[tri(propan-2-il)silil]oxi}fenil)[(6S)-6- ({[terc-butil(dimetil)silil]oxi}metil)-5-azaspiro[2.4]hept-5-il]metanona (1-6)
[00407] A uma solução do composto obtido na etapa 4 (1-5) (55,0 g, 92,8 mmol) em etanol (300 mL), adicionou-se paládio em carbono 7,5% (10,0 g) sob atmosfera de nitrogênio. O balão de nitrogênio foi imediatamente substituído por um balão de hidrogênio, e a mistura de reação foi agitada vigorosamente sob atmosfera de hidrogênio à temperatura ambiente. Depois que as matérias-primas desapareceram, a mistura de reação foi filtrada, e o filtrado foi destilado sob pressão reduzida para fornecer o composto desejado
176 / 272 (1-6) (52,2 g, 100%), que foi usado diretamente para a reação subsequente.
[00408] RMN 1H (CDCl3) δ: 6,71 (1H, s), 6,25 (1H, s), 4,55-4,28 (2H, m), 3,97 (1H, m), 3,75-3,62 (3H, m), 3,70 (3H, s), 3,09-3,07 (1H, m), 2,24- 2,19 (1H, m), 1,81-1,68 (1H, m), 1,27-1,22 (3H, m), 1,09-1,05 (18H, m), 0,90 (9H, s), 0,65-0,46 (4H, m), 0,07-0,03 (6H, m).
[00409] MS (APCI, ESI) m/z: 563 (M+H)+ Etapa 6: N-[(Prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[terc- butil(dimetil)silil]oxi}metil)-5-azaspiro[2.4]hept-5-il]carbonil}-4-metoxi-5- {[tri(propan-2-il)silil]oxi}fenil)carbamoil]oxi}metil)fenil]-L-alaninamida (1- 7)
[00410] A uma solução do composto obtido na etapa 5 (1-6) (18,6 g, 33,0 mmol) e trietilamina (6,26 mL, 45,2 mmol) em THF (300 mL), adicionou-se trifosgênio (4,22 g, 14,2 mmol) lentamente em banho de etanol gelado. Depois da adição, uma solução de N-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L- valil-N-[4-(hidroximetil)fenil]-L-alaninamida (11,4 g, 30,2 mmol, WO 2011130598) e trietilamina (6,26 mL, 45,2 mmol) em THF (100 mL) e N,N- dimetilformamida (30 mL) foi lentamente adicionada gota a gota à mistura de reação gelada. Depois da adição gota a gota, o banho de gelo foi removido, e a mistura de reação foi agitada sob atmosfera de nitrogênio a 40 ºC. Depois que as matérias-primas desapareceram, adicionou-se água à mistura de reação, e a mistura de reação foi extraída com acetato de etila. A camada orgânica foi lavada com salmoura e seca com sulfato de sódio anidro. Após filtração seguida por destilação sob pressão reduzida, o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 100:0 (v/v) a 40:60 (v/v)] para fornecer o composto desejado (1-7) (23,5 g, 74%).
[00411] RMN 1H (CDCl3) δ: 8,99 (1H, m), 8,58 (1H, s), 7,80 (1H, s), 7,55-7,53 (2H, m), 7,34-7,32 (2H, m), 6,77-6,75 (2H, m), 5,94-5,87 (1H, m), 5,40-5,38 (1H, m), 5,33-5,29 (1H, m), 5,23-5,21 (1H, m), 5,13 (1H, m), 5,10
177 / 272 (2H, m), 4,69-4,64 (1H, m), 4,62-4,52 (2H, m), 4,06-4,03 (1H, m), 3,98 (1H, m), 3,76-3,65 (6H, m), 3,04 (1H, m), 2,28-2,26 (1H, m), 2,18-2,13 (1H, m), 1,46 (3H, m), 1,32-1,25 (3H, m), 1,11-1,09 (18H, m), 0,99-0,84 (15H, m), 0,65-0,40 (4H, m), 0,08-0,00 (6H, m).
[00412] MS (APCI, ESI) m/z: 966 (M+H)+ Etapa 7: N-[(Prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-[4-({[(2-{[(6S)-6- (hidroximetil)-5-azaspiro[2.4]hept-5-il]carbonil}-4-metoxi-5-{[tri(propan-2- il)silil]oxi}fenil)carbamoil]oxi}metil)fenil]-L-alaninamida (1-8)
[00413] A uma solução do composto obtido na etapa 6 (1-7) (23,5 g, 24,3 mmol) em THF (50 mL), metanol (50 mL) e água (44 mL), adicionou-se ácido acético (200 mL) à temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente. Depois que as matérias-primas desapareceram, a mistura de reação foi extraída com acetato de etila. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura e seca com sulfato de sódio anidro. Após filtração seguida por destilação sob pressão reduzida, o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 100:0 (v/v) a 0:100 (v/v)] para fornecer o composto desejado (1-8) (18,0 g, 87%).
[00414] RMN 1H (CDCl3) δ: 8,64-8,62 (1H, m), 8,50 (1H, m), 7,69 (1H, m), 7,55-7,53 (2H, m), 7,34-7,32 (2H, m), 6,79-6,75 (3H, m), 5,91-5,89 (1H, m), 5,39 (1H, m), 5,32-5,29 (1H, m), 5,23-5,21 (1H, m), 4,68-4,54 (4H, m), 4,31 (1H, m), 4,06-4,04 (1H, m), 3,81-3,79 (3H, m), 3,76 (3H, s), 3,63- 3,61 (1H, m), 3,13-3,11 (1H, m), 2,16-2,13 (1H, m), 1,87-1,81 (2H, m), 1,46- 1,43 (3H, m), 1,30-1,24 (3H, m), 1,12-1,08 (18H, m), 0,98-0,91 (6H, m), 0,63-0,45 (4H, m).
[00415] MS (APCI, ESI) m/z: 852 (M+H)+ Etapa 8: N-[(Prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4-[({[(11a’S)-11’- hidroxi-7’-metoxi-5’-oxo-8’-{[tri(propan-2-il)silil]oxi}-11’,11a’-dihidro-1’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-
178 / 272 il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (1-9)
[00416] A uma solução de dimetilsulfóxido (3,75 mL, 52,8 mmol) em diclorometano (300 mL), adicionou-se lentamente cloreto de oxalila (2,17 mL, 25,3 mmol) gota a gota sob atmosfera de nitrogênio a -78 ºC. Depois da adição gota a gota, a mistura de reação foi agitada a -78 C. Uma solução do composto obtido na etapa 7 (1-8) (18,0 g, 21.1 mmol) em diclorometano (50.0 mL) foi lentamente adicionada à mistura de reação. Trietilamina (14,6 mL, 105 mmol) foi adicionada à solução de reação a -78 ºC. Depois da adição, o banho frio foi removido, e a temperatura foi lentamente elevada até a temperatura ambiente. Depois que as matérias-primas desapareceram, adicionou-se água à mistura de reação, e a mistura de reação foi extraída com clorofórmio (200 mL). A camada orgânica foi lavada com água e salmoura e seca com sulfato de magnésio anidro. Após filtração seguida por destilação sob pressão reduzida, o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 100:0 (v/v) a 0:60 (v/v)] para fornecer o composto desejado (1-9) (16,5 g, 92%).
[00417] RMN 1H (CDCl3) δ: 8,51-8,36 (1H, m), 7,54-7,38 (2H, m), 7,22-7,07 (3H, m), 6,73-6,64 (1H, m), 5,94-5,87 (2H, m), 5,33-5,22 (3H, m), 5,09 (1H, m), 4,97 (1H, m), 4,64-4,58 (4H, m), 4,02-4,00 (1H, m), 3,86-3,83 (3H, m), 3,75-3,70 (1H, m), 3,61-3,54 (2H, m), 3,38-3,29 (1H, m), 2,40 (1H, m), 2,16-2,14 (1H, m), 1,74-1,71 (1H, m), 1,44 (3H, m), 1,18-1,16 (3H, m), 1,05-1,00 (18H, m), 0,97-0,92 (6H, m), 0,72-0,60 (4H, m).
[00418] MS (APCI, ESI) m/z: 850 (M+H)+ Etapa 9: N-[(Prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4-[({[(11a’S)-11’-{[terc- butil(dimetil)silil]oxi}-7’-metoxi-5’-oxo-8’-{[tri(propan-2-il)silil]oxi}- 11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (1-10)
[00419] A uma solução do composto obtido na etapa 8 (1-9) (12,0 g,
179 / 272 14,1 mmol) e 2,6-lutidina (6,58 mL, 56,5 mmol) em diclorometano (200 mL), adicionou-se lentamente trifluorometilsulfonato de terc-butildimetilsilila (9,73 mL, 42,3 mmol) gota a gota sob atmosfera de nitrogênio a 0 ºC. Após agitação sob resfriamento com gelo por 10 minutos, o banho de gelo foi removido e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente. Depois que as matérias-primas desapareceram, adicionou-se água à mistura de reação, que foi extraída com clorofórmio. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura e seca com sulfato de sódio anidro. Após filtração seguida por destilação sob pressão reduzida, o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 100:0(v/v) a 25:75(v/v)] para fornecer o composto desejado (1-10) (8,12 g, 60%).
[00420] RMN 1H (CDCl3) δ: 8,67-8,45 (1H, m), 7,50-7,44 (2H, m), 7,19 (1H, s), 7,13 (2H, m), 6,95 (2H, m), 6,62-6,57 (2H, m), 6,01 (1H, m), 5,95-5,86 (1H, m), 5,33-5,13 (3H, m), 4,82 (1H, m), 4,65-4,54 (3H, m), 4,03- 4,01 (1H, m), 3,84-3,82 (3H, m), 3,73-3,66 (1H, m), 3,50-3,48 (1H, m), 3,27 (1H, m), 2,37-2,33 (1H, m), 2,19-2,13 (1H, m), 1,54-1,43 (3H, m), 1,22-1,13 (3H, m), 1,10-1,00 (18H, m), 0,97-0,91 (6H, m), 0,81 (9H, s), 0,76-0,59 (4H, m), 0,19-0,09 (6H, m).
[00421] MS (APCI, ESI) m/z: 964 (M+H)+ Etapa 10: N-[(Prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4-[({[(11a’S)-11’- {[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-8’-hidroxi-7’-metoxi-5’-oxo-11’,11a’-dihidro- 1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)- il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (1-11)
[00422] A uma solução do composto obtido na etapa 9 (1-10) (8,12 g, 8,42 mmol) em N,N-dimetilformamida (90 mL) e água (2 mL), adicionou-se acetato de lítio (0,611 g, 9,26 mmol), e o resultante foi agitado à temperatura ambiente. Depois que as matérias-primas desapareceram, adicionou-se água à mistura de reação, que foi extraída com acetato de etila. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura e seca com sulfato de sódio anidro. Após
180 / 272 filtração seguida por destilação sob pressão reduzida, o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 100:0 (v/v) a 0:100 (v/v)] para fornecer o composto desejado (1-11) (5,48 g, 81%).
[00423] RMN 1H (CDCl3) δ: 8,76-8,60 (1H, m), 8,02-7,56 (1H, m), 7,45-7,44 (2H, m), 7,21 (1H, s), 7,10-7,09 (2H, m), 6,81-6,74 (1H, m), 6,65 (1H, s), 6,23 (1H, s), 6,01-5,99 (1H, m), 5,95-5,84 (1H, m), 5,41-5,20 (2H, m), 5,16 (1H, m), 4,84 (1H, m), 4,67-4,54 (4H, m), 4,05-4,03 (1H, m), 3,87 (3H, s), 3,71 (1H, m), 3,55-3,51 (1H, m), 3,26 (1H, m), 2,35 (1H, m), 2,18- 2,12 (1H, m), 1,55-1,42 (3H, m), 0,97-0,92 (6H, m), 0,81 (9H, s), 0,76-0,61 (4H, m), 0,20-0,06 (6H, m).
[00424] MS (APCI, ESI) m/z: 808 (M+H)+ Exemplo 10-2: Intermediário 2 [Fórmula 54] Etapa Etapa 1: N-[4-(11,12-Didehidrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-il)-4- oxobutanoil]glicilglicina (2-2)
[00425] A uma solução de glicilglicina (0,328 g, 2,49 mmol), N,N- diisopropiletilamina (0,433 mL, 2,49 mmol) em N,N-dimetilformamida(20 mL), 1-{[4-(11,12-didehidrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-il)-4- oxobutanoil]oxi}pirrolidin-2,5-diona (2-1) (1,00 g, 2,49 mmol, Click Chemistry Tools) e água (10 mL) foram adicionadas à temperatura ambiente, e o resultante foi agitado à temperatura ambiente durante a noite. O resultante foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [clorofórmio:CMW = 100:0(v/v) a 0:100(v/v)] para fornecer o composto desejado (0,930 g, 89%).
181 / 272
[00426] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 12,58 (1H, s), 8,14-8,12 (1H, m), 8,08-8,07 (1H, m), 7,69-7,68 (1H, m), 7,62-7,61 (1H, m), 7,53-7,45 (3H, m), 7,40-7,29 (3H, m), 5,05-5,01 (1H, m), 3,73-3,72 (2H, m), 3,66-3,60 (3H, m), 2,66-2,60 (1H, m), 2,33-2,24 (1H, m), 2,08-2,04 (1H, m), 1,81-1,77 (1H, m).
[00427] MS (APCI, ESI) m/z: 420 [(M+H)+]. Exemplo 10-3: Ligante de fármaco 1 [Fórmula 55] Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa 1: (2R,11aS)-2-{[terc-Butil(dimetil)silil]oxi}-8-hidroxi-7-metoxi-10- {[2-(trimetilsilil)etoxi]metil}-2,3-dihidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin- 5,11(10H,11aH)-diona (3-2)
[00428] A uma solução de (2R,11aS)-8-(benziloxi)-2-{[terc- butil(dimetil)silil]oxi}-7-metoxi-10-{[2-(trimetilsilil)etoxi]metil}-2,3-dihidro- 1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5,11(10H,11aH)-diona (3-1) (25,5 g, 41,6 mmol, WO 2016149546) em THF (150 mL) e etanol (150 mL), adicionou-se paládio em carbono 5% (teor de umidade: 54%, 10,0 g) sob atmosfera de nitrogênio, e a solução de reação foi então agitada sob atmosfera de hidrogênio à temperatura ambiente por 3 dias. Adicionou-se clorofórmio à
182 / 272 solução de reação, que foi filtrada através de Celite, e o filtrado foi então destilado sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 100:0 (v/v) a 50:50 (v/v)] para fornecer o composto desejado (3-2) (19,4 g, 89%).
[00429] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,36 (1H, s), 7,25 (1H, s), 6,01 (1H, s), 5,45-5,43 (1H, m), 4,69-4,67 (1H, m), 4,60-4,55 (1H, m), 4,23-4,21 (1H, m), 3,96 (3H, s), 3,76-3,68 (2H, m), 3,63-3,61 (1H, m), 3,56-3,53 (1H, m), 2,88- 2,83 (1H, m), 2,03-2,00 (1H, m), 1,00-0,98 (2H, m), 0,87 (9H, s), 0,10 (6H, s), 0,02 (9H, s).
[00430] MS (APCI, ESI) m/z: 523 (M+H)+ Etapa 2: (2R,11aS)-8-[(5-Bromopentil)oxi]-2-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-7- metoxi-10-{[2-(trimetilsilil)etoxi]metil}-2,3-dihidro-1H-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepin-5,11(10H,11aH)-diona (3-3)
[00431] A uma solução do composto obtido na etapa 1 (3-2) (10,8 g, 20,7 mmol) em N,N-dimetilformamida (30 mL), 1,5-dibromopentano (23,8 g, 103 mmol) e carbonato de potássio (3,43 g, 24,8 mmol) foram adicionados à temperatura ambiente. Depois de agitação à temperatura ambiente por 3 horas, adicionou-se água à solução de reação, que foi extraída com acetato de etila. A camada orgânica obtida foi lavada com salmoura, seca com sulfato de sódio e destilada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 90:10 (v/v) a 50:50 (v/v)] para fornecer o composto desejado (3-3) (14,5 g, quantitativo).
[00432] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,34 (1H, s), 7,21 (1H, s), 5,52-5,49 (1H, m), 4,63-4,62 (1H, m), 4,58-4,55 (1H, m), 4,24-4,22 (1H, m), 4,07-4,04 (2H, m), 3,92 (3H, s), 3,82-3,64 (3H, m), 3,56-3,53 (1H, m), 3,45-3,43 (2H, m), 2,86-2,84 (1H, m), 2,04-2,00 (1H, m), 1,97-1,87 (4H, m), 1,66-1,62 (2H, m), 1,01-0,98 (2H, m), 0,87 (9H, s), 0,10 (6H, s), 0,04 (9H, s).
[00433] MS (APCI, ESI) m/z: 673 [81Br, (M+H)+], 671 [79Br, (M+H)+].
183 / 272 Etapa 3: (2R,11aS)-8-[(5-Bromopentil)oxi]-2-hidroxi-7-metoxi-10-{[2- (trimetilsilil)etoxi]metil}-2,3-dihidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin- 5,11(10H,11aH)-diona (3-4)
[00434] A uma solução do composto obtido na etapa 2 (3-3) (21,5 mmol) em THF (40 mL), adicionou-se uma solução de fluoreto de tetrabutilamônio 1 mol/L em THF (28,0 mL, 28,0 mmol) a 0 ºC. Depois de agitação à temperatura ambiente por 30 minutos, adicionou-se água à solução de reação, que foi extraída com acetato de etila, e a camada orgânica obtida foi lavada com salmoura. O resultante foi seco com sulfato de sódio e, a seguir, destilado sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [clorofórmio:metanol = 97,5:2,5 (v/v) a 92,5:7,5 (v/v)] para fornecer o composto desejado (3-4) (11,3 g, 94%).
[00435] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,34 (1H, s), 7,21 (1H, s), 5,53-5,50 (1H, m), 4,69-4,64 (2H, m), 4,32-4,30 (1H, m), 4,10-4,00 (2H, m), 3,91 (3H, s), 3,88-3,75 (2H, m), 3,73-3,64 (2H, m), 3,45-3,44 (2H, m), 2,99-2,96 (1H, m), 2,15-2,09 (1H, m), 1,99-1,85 (5H, m), 1,68-1,62 (2H, m), 1,01-0,95 (2H, m), 0,04 (9H, s).
[00436] MS (APCI, ESI) m/z: 559 [81Br, (M+H)+], 557 [79Br, (M+H)+]. Etapa 4: (11aS)-8-[(5-Bromopentil)oxi]-7-metoxi-10-{[2- (trimetilsilil)etoxi]metil}-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin- 2,5,11(3H,10H,11aH)-triona (3-5)
[00437] O composto obtido na etapa 3 (3-4) (11,3 g, 20,2 mmol), brometo de tetrabutilamônio (0,325 g, 1,01 mmol) e brometo de potássio (0,240 g, 2,02 mmol) foram dissolvidos em hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado (60 mL)/diclorometano (60 mL), aos quais foram adicionados nor-AZADO (0,0279 g, 0,202 mmol) e hipoclorito de sódio pentahidratado (2,03 g, 27,2 mmol) a 0 ºC, e o resultante foi agitado a 0 ºC por 30 minutos. Como ainda restasse as matérias-primas, adicionou-se
184 / 272 hipoclorito de sódio pentahidratado (1,00 g, 13,4 mmol) às mesmas a 0 ºC, e o resultante foi agitado a 0 ºC por 15 minutos. Hipoclorito de sódio pentahidratado (0,300 g, 4,03 mmol) foi adicionalmente acrescentado ao mesmo a 0 ºC, o resultante foi agitado a 0 ºC por 15 minutos e o desaparecimento das matérias-primas foi confirmado por TLC. Adicionou-se uma solução aquosa de tiossulfato de sódio à solução de reação, que foi extraída com clorofórmio, e a camada orgânica obtida foi seca com sulfato de sódio. O resultante foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 75:25(v/v) a 40:60(v/v)] para fornecer o composto desejado (3-5) (9,74 g, 87%).
[00438] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,33 (1H, s), 7,24 (1H, s), 5,56-5,53 (1H, m), 4,71-4,69 (1H, m), 4,66-4,63 (1H, m), 4,27-4,22 (1H, m), 4,12-4,02 (2H, m), 3,93-3,88 (4H, m), 3,82-3,75 (1H, m), 3,69-3,67 (1H, m), 3,61-3,56 (1H, m), 3,46-3,44 (2H, m), 2,82-2,77 (1H, m), 1,97-1,89 (4H, m), 1,68-1,64 (2H, m), 1,05-0,93 (2H, m), 0,04 (9H, s).
[00439] MS (APCI, ESI) m/z: 557 [81Br, (M+H)+], 555 [79Br, (M+H)+]. Etapa 5: Trifluorometanossulfonato de (11aS)-8-[(5-Bromopentil)oxi]-7- metoxi-5,11-dioxo-10-{[2-(trimetilsilil)etoxi]metil}-5,10,11,11a-tetrahidro- 1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-ila (3-6)
[00440] A uma solução do composto obtido na etapa 4 (3-5) (9,74 g, 17,5 mmol) em diclorometano (160 mL), adicionou-se 2,6-lutidina (8,17 mL, 70,1 mmol) a -40 ºC, e o resultante foi agitado a -40 ºC por 10 minutos. Adicionou-se ácido trifluorometanosulfônico anidro (8,85 mL, 52,6 mmol) à solução de reação a -40 ºC, e o resultante foi agitado a -40 ºC por 30 minutos. À solução de reação, adicionou-se uma solução aquosa 10% de ácido cítrico, que foi extraída com clorofórmio, e a camada orgânica obtida foi seca com sulfato de sódio. O resultante foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo
185 / 272 resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 95:5 (v/v) a 70:35 (v/v)] e então purificado por cromatografia em sílica gel-NH2 [hexano:acetato de etila = 95:5 (v/v) a 65:35 (v/v)] para fornecer o composto desejado (3-6) (7,10 g, 59%).
[00441] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,32 (1H, s), 7,24 (1H, s), 7,15-7,14 (1H, m), 5,56-5,53 (1H, m), 4,70-4,68 (1H, m), 4,66-4,63 (1H, m), 4,11-4,01 (2H, m), 3,94-3,90 (4H, m), 3,84-3,75 (1H, m), 3,73-3,68 (1H, m), 3,46-3,44 (2H, m), 3,18-3,14 (1H, m), 1,96-1,88 (4H, m), 1,69-1,61 (2H, m), 1,02-0,92 (2H, m), 0,04 (9H, s).
[00442] MS (APCI, ESI) m/z: 689 [81Br, (M+H)+], 687 [79Br, (M+H)+]. Etapa 6: (11aS)-8-[(5-Bromopentil)oxi]-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-10-{[2- (trimetilsilil)etoxi]metil}-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin- 5,11(10H,11aH)-diona (3-7)
[00443] A uma mistura do composto obtido na etapa 5 (3-6) (2,00 g, 2,91 mmol), ácido 4-metoxifenilborônico (0,884 g, 5,82 mmol), tetraquis(trifenilfosfina)paládio (0) (0,336 g, 0,291 mmol) e carbonato de sódio (1,23 g, 11,6 mmol), tolueno (20 mL), etanol (10 mL) e água (10 mL) foram adicionados à temperatura ambiente. A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 30 minutos e, então, extraída com acetato de etila, e o extrato foi lavado com água e salmoura. A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio e, a seguir, destilada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 90:10 (v/v) a 50:50 (v/v)] para fornecer o composto desejado (3-7) (1,71 g, 91%).
[00444] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,38-7,37 (3H, m), 7,33 (1H, s), 7,25 (1H, s), 6,89-6,88 (2H, m), 5,56-5,54 (1H, m), 4,71-4,68 (1H, m), 4,65-4,62 (1H, m), 4,09-4,04 (2H, m), 3,96-3,91 (4H, m), 3,85-3,66 (5H, m), 3,46-3,45 (2H, m), 3,16-3,12 (1H, m), 1,99-1,94 (4H, m), 1,69-1,64 (2H, m), 1,00-0,98
186 / 272 (2H, m), 0,04 (9H, s).
[00445] MS (APCI, ESI) m/z: 647 [81Br, (M+H)+], 645 [79Br, (M+H)+]. Etapa 7: (11aS)-8-[(5-Bromopentil)oxi]-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-1, 11a- dihidro-5H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona (3-8)
[00446] O composto obtido na etapa 6 (3-7) (0,789 g, 1,22 mmol) foi dissolvido em etanol (10 mL) e THF (10 mL), adicionou-se uma solução de borohidreto de lítio em tetrahidrofurano 2,0 M (6,11 mL, 12,2 mmol) ao mesmo a 0 ºC, e o resultante foi agitado a 0 ºC por 3 horas. Adicionou-se água à solução de reação, que foi extraída com clorofórmio, e a camada orgânica obtida foi seca com sulfato de sódio. O resultante foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi dissolvido em diclorometano (10 mL), etanol (20 mL) e água (10 mL), aos quais se adicionou sílica gel (4 g) à temperatura ambiente, e o resultante foi agitado à temperatura ambiente por 4 dias. A sílica gel foi removida através de filtração, adicionou-se água ao mesmo e o resultante foi extraído com clorofórmio. A camada orgânica obtida foi seca com sulfato de sódio. O resultante foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 60:40 (v/v) a 25:75 (v/v)] para fornecer o composto desejado (3-8) (0,496 g, 81%).
[00447] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,90-7,89 (1H, m), 7,53 (1H, s), 7,40- 7,40 (1H, m), 7,35-7,34 (2H, m), 6,92-6,90 (2H, m), 6,83-6,81 (1H, m), 4,43- 4,40 (1H, m), 4,13-4,06 (2H, m), 3,96 (3H, s), 3,84 (3H, s), 3,61-3,57 (1H, m), 3,47-3,36 (3H, m), 2,00-1,92 (4H, m), 1,67-1,63 (2H, m).
[00448] MS (APCI, ESI) m/z: 501 [81Br, (M+H)+], 499 [79Br, (M+H)+]. Etapa 8: (11aS)-8-[(5-Bromopentil)oxi]-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)- 1,10,11,11a-tetrahidro-5H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona (3-9)
[00449] A uma solução do composto obtido na etapa 7 (3-8) (0,496 g,
187 / 272 0,992 mmol) em diclorometano (20 mL), adicionou-se triacetoxiborohidreto de sódio (0,421 g, 1,99 mmol) a 0 ºC. Depois de agitação à temperatura ambiente por 2 horas, adicionou-se hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado ao mesmo, e o resultante foi extraído com clorofórmio. A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio, destilada sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi então purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 60:40 (v/v) a 25:75 (v/v)] para fornecer o composto desejado (3-9) (0,426 g, 86%).
[00450] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,53-7,53 (2H, m), 7,32-7,30 (2H, m), 6,89-6,87 (2H, m), 6,05 (1H, s), 4,33-4,27 (2H, m), 4,00-3,98 (2H, m), 3,86 (3H, s), 3,82 (3H, s), 3,57-3,55 (2H, m), 3,42-3,38 (3H, m), 2,76-2,72 (1H, m), 1,96-1,88 (4H, m), 1,65-1,62 (2H, m).
[00451] MS (APCI, ESI) m/z: 503 [81Br, (M+H)+], 501 [79Br, (M+H)+]. Etapa 9: (11aS)-8-[(5-bromopentil)oxi]-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo- 11,11a-dihidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-10(5H)-carboxilato de prop-2-en-1-ila (3-10)
[00452] A uma solução do composto obtido na etapa 8 (3-9) (0,426 g, 0,849 mmol) em diclorometano (30 mL), piridina (0,102 mL 1,27 mmol) e cloroformato de alila (0,374 mL, 3,54 mmol) foram adicionados a 0 ºC, e o resultante foi agitado a 0 ºC por 15 minutos. À solução de reação, adicionou- se uma solução aquosa 10% de ácido cítrico, que foi extraída com clorofórmio, e a camada orgânica obtida foi lavada com hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado e, então, seca com sulfato de sódio. O resultante foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 90:10 (v/v) a 50:50 (v/v)] para fornecer o composto desejado (3-10) (0,465 g, 94%).
[00453] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,38 (1H, s), 7,31-7,29 (2H, m), 7,26- 7,25 (1H, m), 6,89-6,87 (2H, m), 6,71 (1H, s), 5,80-5,78 (1H, m), 5,14-5,11
188 / 272 (2H, m), 4,65-4,62 (1H, m), 4,39-4,26 (3H, m), 4,03-4,01 (2H, m), 3,92 (3H, s), 3,82 (3H, s), 3,66-3,64 (1H, m), 3,46-3,44 (2H, m), 3,30-3,27 (1H, m), 2,72-2,68 (1H, m), 1,96-1,88 (4H, m), 1,68-1,60 (2H, m).
[00454] MS (APCI, ESI) m/z: 587 [81Br, (M+H)+], 585 [79Br, (M+H)+]. Etapa 10: N-[(Prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4-[({[(11a’S)-11’- {[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-7’-metoxi-8’-{[5-({(11aS)-7-metoxi-2-(4- metoxifenil)-5-oxo-10-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-5,10,11,11a-tetrahidro- 1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il}oxi)pentil]oxi}-5’-oxo-11’,11a’- dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]- 10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (3-11)
[00455] A uma solução do composto obtido na etapa 10 do Exemplo 10-1 (1-11) (0,130 g, 0,161 mmol) e do composto obtido na etapa 9 (3-10) (0,104 g, 0,177 mmol) em N,N-dimetilformamida (3 mL), adicionou-se carbonato de potássio (0,0266 g, 0,193 mmol) à temperatura ambiente, e o resultante foi agitado à temperatura ambiente durante a noite. A solução de reação foi diluída com acetato de etila, lavada com água e salmoura, a seguir, seca com sulfato de sódio. O resultante foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi então purificado por cromatografia em coluna de sílica gel-NH2 [hexano:acetato de etila = 70:30 (v/v) a 0:100 (v/v)] para fornecer o composto desejado (3-11) (0,184 g, 87%).
[00456] RMN 1H (CDCl3) δ: 8,76 (1H, s), 7,58-7,56 (2H, m), 7,39 (1H, s), 7,32-7,30 (2H, m), 7,26-7,24 (2H, m), 7,19-7,17 (3H, m), 6,90-6,88 (2H, m), 6,78 (1H, s), 6,68-6,66 (1H, m), 6,37 (1H, s), 5,99-5,93 (3H, m), 5,34-5,20 (6H, m), 4,66-4,01 (11H, m), 3,90 (3H, s), 3,89 (3H, s), 3,78-3,54 (9H, m), 3,31-3,28 (2H, m), 2,73-2,69 (1H, m), 2,38-2,35 (1H, m), 2,19-2,13 (1H, m), 1,82-1,80 (2H, m), 1,46-1,29 (6H, m), 0,98-0,90 (6H, m), 0,83 (9H, s), 0,69-0,63 (4H, m), 0,19-0,16 (6H, m).
[00457] MS (APCI, ESI) m/z: 1312 (M+H)+
189 / 272 Etapa 11: N-[(Prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4-[({[(11a’S)-11’- hidroxi-7’-metoxi-8’-{[5-({(11aS)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-10- [(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepin-8-il}oxi)pentil]oxi}-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)- il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (3-12)
[00458] A uma solução do composto obtido na etapa 10 (3-11) (0,1837 g, 0,140 mmol) e ácido acético (0,048 mL, 0,840 mmol) em THF (5,00 mL), adicionou-se uma solução de fluoreto de tetrabutilamônio em tetrahidrofurano 1 mol/L (0,700 mL, 0,700 mmol) à temperatura ambiente, e o resultante foi agitado à temperatura ambiente por 3 horas. A solução de reação foi diluída com acetato de etila, e a camada orgânica foi lavada com a hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado e salmoura e, então, seca com sulfato de sódio. O resultante foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em sílica gel [clorofórmio:metanol = 99,5:0,5(v/v) a 95:5(v/v)] para fornecer o composto desejado (3-12) (0,178 g, quantitativo).
[00459] RMN 1H (CDCl3) δ: 8,86 (1H, s), 7,60-7,59 (2H, m), 7,39 (1H, s), 7,32-7,20 (7H, m), 6,90-6,88 (2H, m), 6,78 (1H, s), 6,68 (1H, s), 6,38 (1H, s), 5,90-5,87 (3H, m), 5,39-5,22 (6H, m), 4,72-4,02 (11H, m), 3,90 (3H, s), 3,88 (3H, s), 3,83 (3H, s), 3,70-3,63 (6H, m), 3,32-3,29 (3H, m), 2,73-2,69 (1H, m), 2,43-2,40 (1H, m), 2,12-2,06 (1H, m), 1,77-1,74 (2H, m), 1,39-1,25 (6H, m), 0,96-0,89 (6H, m), 0,73-0,66 (4H, m).
[00460] MS (APCI, ESI) m/z: 1198 (M+H)+ Etapa 12: L-Valil-N-{4-[({[(11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi-8’-[(5-{[(11aS)-7- metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepin-8-il]oxi}pentil)oxi]-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)- il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (3-13)
190 / 272
[00461] A uma solução do composto obtido na etapa 11 (3-12) (0,140 mmol) em diclorometano (2 mL), pirrolidina (0,0579 mL, 0,700 mmol) e tetraquis(trifenilfosfina)paládio (0) (0,0162 g, 0,0140 mmol) foram adicionados à temperatura ambiente, e o resultante foi agitado à temperatura ambiente por 15 minutos. Após destilação sob pressão reduzida, o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em sílica gel [clorofórmio:metanol = 99,5:0,5(v/v) a 92,5:7,5(v/v)] para fornecer o composto desejado (3-13) (0,143 g, 99%).
[00462] RMN 1H (CDCl3) δ: 9,12 (1H, s), 7,94-7,92 (1H, m), 7,57- 7,53 (4H, m), 7,33-7,31 (2H, m), 7,20-7,18 (3H, m), 6,90-6,88 (2H, m), 6,36 (1H, s), 6,07 (1H, s), 5,91-5,88 (1H, m), 5,47-5,44 (1H, m), 5,21-5,13 (1H, m), 4,66-4,58 (3H, m), 4,32 (1H, s), 4,03-3,49 (17H, m), 3,38-3,29 (4H, m), 3,15-3,14 (1H, m), 2,77-2,73 (1H, m), 2,57 (2H, s), 2,43-2,40 (1H, m), 2,32- 2,27 (1H, m), 1,81-1,39 (8H, m), 0,98-0,96 (3H, m), 0,85-0,83 (3H, m), 0,75- 0,62 (4H, m).
[00463] MS (APCI, ESI) m/z: 1030 (M+H)+ Etapa 13: N-[4-(11,12-Didehidrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-il)-4- oxobutanoil]glicilglicil-L-valil-N-{4-[({[(11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi-8’- [(5-{[(11aS)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-5,10,11,11a-tetrahidro-1H- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il]oxi}pentil)oxi]-5’-oxo-11’,11a’-dihidro- 1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)- il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (3-14)
[00464] A uma mistura do composto obtido na etapa 1 do Exemplo 10- 2 (2-2) (0,0640 g, 0,153 mmol) e N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2- dihidroquinolina (0,0446 g, 0,180 mmol), adicionou-se diclorometano (2 mL) à temperatura ambiente, e o resultante foi agitado à temperatura ambiente por 15 minutos. À solução de reação, adicionou-se uma solução do composto obtido na etapa 12 (3-13) (0,143 g, 0,139 mmol) em diclorometano (2 mL), e o resultante foi agitado à temperatura ambiente por 5 horas e então destilado
191 / 272 sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [clorofórmio:metanol = 99,5:0,5 (v/v) a 92,5:7,5 (v/v)] para fornecer o composto desejado (3-14) (0,103 g, 52%).
[00465] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 9,93 (1H, s), 8,21-8,16 (2H, m), 8,07-8,04 (1H, m), 7,83-7,64 (2H, m), 7,60-7,55 (3H, m), 7,51-7,28 (10H, m), 7,19-7,16 (2H, m), 7,10-7,04 (1H, m), 6,92-6,90 (2H, m), 6,76-6,70 (1H, m), 6,39 (1H, s), 5,77-5,75 (1H, m), 5,21-5,18 (1H, m), 5,03-4,99 (1H, m), 4,82- 4,79 (1H, m), 4,37-4,35 (1H, m), 4,21-4,20 (2H, m), 4,02-3,24 (26H, m), 3,16-3,13 (1H, m), 2,79-2,59 (2H, m), 2,39-2,28 (2H, m), 2,05-1,97 (2H, m), 1,91-1,77 (4H, m), 1,57-1,54 (3H, m), 1,28-1,23 (3H, m), 0,85-0,80 (6H, m), 0,67-0,61 (4H, m).
[00466] MS (APCI, ESI) m/z: 1431 (M+H)+ Exemplo 10-4: Ligante de fármaco 2 [Fórmula 56] Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa 1: (2R,11aS)-8-(3-Bromopropoxi)-2-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-7- metoxi-10-{[2-(trimetilsilil)etoxi]metil}-2,3-dihidro-1H-pirrol[2,1-
192 / 272 c][1,4]benzodiazepin-5,11(10H,11aH)-diona (4-1)
[00467] O composto obtido na etapa 1 do Exemplo 10-3 (3-2) (5,06 g,
9.67 mmol) foi reagido com 1,3-dibromopropano (4,93 mL, 48,4 mmol) da mesma maneira que na etapa 2 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (4-1) (4,85 g, 78%).
[00468] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,35 (1H, s), 7,26 (1H, s), 5,52-5,50 (1H, m), 4,65-4,63 (1H, m), 4,61-4,55 (1H, m), 4,25-4,14 (3H, m), 3,92 (3H, s), 3,82-3,62 (5H, m), 3,57-3,54 (1H, m), 2,86-2,84 (1H, m), 2,41-2,39 (2H, m), 2,06-1,99 (1H, m), 1,03-0,97 (2H, m), 0,87 (9H, s), 0,10 (6H, s), 0,04 (9H, s).
[00469] MS (APCI, ESI) m/z: 645 [81Br, (M+H)+], 643 [79Br, (M+H)+]. Etapa 2: (2R,11aS)-8-(3-Bromopropoxi)-2-hidroxi-7-metoxi-10-{[2- (trimetilsilil)etoxi]metil}-2,3-dihidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin- 5,11(10H,11aH)-diona (4-2)
[00470] O composto obtido na etapa 1 (4-1) (4,85 g, 7,54 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 3 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (4-2) (4,05 g, quantitativo).
[00471] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,35 (1H, s), 7,26 (1H, s), 5,53-5,51 (1H, m), 4,66-4,61 (2H, m), 4,32-4,30 (1H, m), 4,21-4,16 (2H, m), 3,91-3,85 (4H, m), 3,82-3,74 (1H, m), 3,71-3,59 (4H, m), 2,99-2,96 (1H, m), 2,43-2,37 (2H, m), 2,15-2,09 (2H, m), 1,04-0,96 (2H, m), 0,04 (9H, s).
[00472] MS (APCI, ESI) m/z: 531 [81Br, (M+H)+], 529 [79Br, (M+H)+]. Etapa 3: (11aS)-8-(3-Bromopropoxi)-7-metoxi-10-{[2- (trimetilsilil)etoxi]metil}-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin- 2,5,11(3H,10H,11aH)-triona (4-3)
[00473] O composto obtido na etapa 2 (4-2) (7,54 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 4 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (4-3) (3,73 g, 93%).
193 / 272
[00474] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,34 (1H, s), 7,29 (1H, s), 5,56-5,53 (1H, m), 4,72-4,69 (1H, m), 4,67-4,61 (1H, m), 4,23-4,17 (3H, m), 3,97-3,88 (4H, m), 3,82-3,75 (1H, m), 3,74-3,56 (4H, m), 2,82-2,77 (1H, m), 2,43-2,38 (2H, m), 1,06-0,94 (2H, m), 0,08-0,00 (9H, m). Etapa 4: (11aS)-8-(3-Bromopropoxi)-7-metoxi-5,11-dioxo-10-{[2- (trimetilsilil)etoxi]metil}-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepin-2-il trifluorometanosulfonato (4-4)
[00475] O composto obtido na etapa 3 (4-3) (3,73 g, 7,08 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 5 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (4-4) (3,27 g, 70%).
[00476] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,33 (1H, s), 7,29 (1H, s), 7,15-7,15 (1H, m), 5,56-5,54 (1H, m), 4,70-4,65 (2H, m), 4,21-4,18 (2H, m), 3,94-3,91 (4H, m), 3,81-3,79 (1H, m), 3,70-3,64 (3H, m), 3,19-3,15 (1H, m), 2,47-2,38 (2H, m), 1,02-1,00 (2H, m), 0,04 (9H, s).
[00477] MS (APCI, ESI) m/z: 661 [81Br, (M+H)+], 659 [79Br, (M+H)+]. Etapa 5: (11aS)-8-(3-Bromopropoxi)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil-10-{[2- (trimetilsilil)etoxi]metil}-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin- 5,11(10H,11aH)-diona (4-5)
[00478] O composto obtido na etapa 4 (4-4) (3,27 g, 4,96 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 6 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (4-5) (2,49 g, 81%).
[00479] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 7,49-7,47 (2H, m), 7,40 (1H, s), 7,31-7,24 (2H, m), 6,93-6,88 (2H, m), 5,33-5,31 (1H, m), 5,25-5,18 (1H, m), 4,81-4,80 (1H, m), 4,23-4,10 (2H, m), 3,85 (3H, s), 3,77 (3H, s), 3,70-3,59 (3H, m), 3,52-3,40 (2H, m), 3,15-3,08 (1H, m), 2,33-2,27 (2H, m), 0,86-0,74 (2H, m), -0,07 (9H, s).
[00480] MS (APCI, ESI) m/z: 619 [81Br, (M+H)+], 617 [79Br, (M+H)+].
194 / 272 Etapa 6: (11aS)-8-(3-Bromopropoxi)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-1, 11a- dihidro-5H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona (4-6)
[00481] O composto obtido na etapa 5 (4-5) (2,49 g, 4,04 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 7 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (4-6) (1,59 g, 84%).
[00482] MS (APCI, ESI) m/z: 473 [81Br, (M+H)+], 471 [79Br, (M+H)+]. Etapa 7: (11aS)-8-(3-Bromopropoxi)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-1,10,11,11a- tetrahidro-5H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona (4-7)
[00483] O composto obtido na etapa 6 (4-6) (1,59 g, 3,38 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 8 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (4-7) (1,39 g, 87%).
[00484] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,54 (1H, s), 7,54-7,51 (1H, m), 7,32- 7,29 (2H, m), 6,89-6,87 (2H, m), 6,10 (1H, s), 4,32-4,28 (2H, m), 4,14-4,13 (2H, m), 3,85 (3H, s), 3,82 (3H, s), 3,63-3,62 (2H, m), 3,57-3,55 (2H, m), 3,40-3,36 (1H, m), 2,76-2,72 (1H, m), 2,40-2,37 (2H, m).
[00485] MS (APCI, ESI) m/z: 475 [81Br, (M+H)+], 473 [79Br, (M+H)+]. Etapa 8: (11aS)-8-(3-bromopropoxi)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo- 11,11a-dihidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-10(5H)-carboxilato de prop-2-en-1-ila (4-8)
[00486] O composto obtido na etapa 7 (4-7) (1,40 g, 0,295 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 9 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (4-8) (0,885 g, 54%).
[00487] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,34 (1H, s), 7,27-7,25 (2H, m), 7,22 (1H, s), 6,86-6,84 (2H, m), 6,73 (1H, s), 5,76-5,74 (1H, m), 5,11-5,09 (2H, m), 4,62-4,59 (2H, m), 4,33-4,31 (1H, m), 4,16-4,13 (3H, m), 3,88 (3H, s), 3,79 (3H, s), 3,60-3,59 (3H, m), 3,27-3,23 (1H, m), 2,69-2,65 (1H, m), 2,37- 2,34 (2H, m).
195 / 272
[00488] MS (APCI, ESI) m/z: 559 [81Br, (M+H)+], 557 [79Br, (M+H)+]. Etapa 9: N-{[(Prop-2-en-1-il)oxi]carbonil}-L-valil-N-[4-({[(11’aS)-11’- {[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-7’-metoxi-8’-(3-{[(11aS)-7-metoxi-2-(4- metoxifenil)-5-oxo-10-{[(prop-2-en-1-il)oxi]carbonil}-5,10,11,11a-tetrahidro- 1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il]oxi}propoxi)-5’-oxo-11’,11’a- dihidro-1’H,3’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]- 10’(5’H)-carbonil]oxi}metil)fenil]-L-alaninamida (4-9)
[00489] O composto obtido na etapa 8 (4-8) (0,0381 g, 0,0683 mmol) foi reagido com o composto obtido na etapa 10 do Exemplo 10-1 (1-11) (0,0552 g, 0,0683 mmol) da mesma maneira que na etapa 10 do Exemplo 10- 3 para fornecer o composto desejado (4-9) (0,0712 g, 81%).
[00490] MS (APCI, ESI) m/z: 1284 (M+H)+. Etapa 10: N-{[(Prop-2-en-1-il)oxi]carbonil}-L-valil-N-[4-({[(11’aS)-11’- hidroxi-7’-metoxi-8’-(3-{[(11aS)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-10- {[(prop-2-en-1-il)oxi]carbonil}-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepin-8-il]oxi}propoxi)-5’-oxo-11’,11’a-dihidro-1’H,3’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)- carbonil]oxi}metil)fenil]-L-alaninamida (4-10)
[00491] O composto obtido na etapa 9 (4-9) (0,0712 g, 0,0554 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 11 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (4-10) (0,0671 g, quantitativo).
[00492] MS (APCI, ESI) m/z: 1170 (M+H)+. Etapa 11: L-Valil-N-[4-({[(11’aS)-11’-hidroxi-7’-metoxi-8’-(3-{[(11aS)-7- metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepin-8-il]oxi}propoxi)-5’-oxo-11’,11’a-dihidro-1’H,3’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)- carbonil]oxi}metil)fenil]-L-alaninamida (4-11)
[00493] O composto obtido na etapa 10 (4-10) (0,0571 mmol) foi
196 / 272 reagido da mesma maneira que na etapa 12 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (4-11) (0,0574 g, 99%).
[00494] RMN 1H (CDCl3) δ: 9,16 (1H, s), 7,93-7,91 (1H, m), 7,55- 7,52 (1H, m), 7,50-7,47 (3H, m), 7,35-7,32 (2H, m), 7,21 (1H, s), 7,13-7,11 (2H, m), 6,90-6,87 (2H, m), 6,40 (1H, s), 6,08 (1H, s), 5,90-5,87 (1H, m), 5,37-5,34 (1H, m), 4,73-4,53 (3H, m), 4,23-4,08 (5H, m), 3,89 (3H, s), 3,82 (3H, s), 3,78-3,72 (5H, m), 3,57-3,51 (3H, m), 3,38-3,30 (3H, m), 2,76-2,71 (1H, m), 2,36-2,24 (4H, m), 1,78-1,42 (6H, m), 1,00-0,98 (3H, m), 0,87-0,84 (3H, m), 0,74-0,62 (4H, m).
[00495] MS (APCI, ESI) m/z: 1002 (M+H)+. Etapa 12: N-[4-(11,12-Didehidrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-il)-4- oxobutanoil]glicilglicil-L-valil-N-[4-({[(11’aS)-11’-hidroxi-7’-metoxi-8’-(3- {[(11aS)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-5,10,11,11a-tetrahidro-1H- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il]oxi}propoxi)-5’-oxo-11’,11’a-dihidro- 1’H,3’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)- carbonil]oxi}metil)fenil]-L-alaninamida (4-12)
[00496] O composto obtido na etapa 11 (4-11) (0,189 g, 0,189 mmol) foi reagido com o composto obtido na etapa 1 do Exemplo 10-2 (2-2) (0,087 g, 0,207 mmol) da mesma maneira que na etapa 13 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (4-12) (0,169 g, 64%).
[00497] MS (APCI, ESI) m/z: 1402 (M+H)+. Exemplo 10-5: Ligante de fármaco 3 [Fórmula 57]
197 / 272 Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa 1: (6S,6’S)-5,5’-{1,5-pentanodiilbis[oxi(5-metoxi-2-nitrobenzen-4,1- diil)carbonil]}bis(5-azaspiro[2.4]heptano-6-carboxilato) de dimetila (5-2)
[00498] A uma solução de ácido 4,4’-[1,5-pentanodiilbis(oxi)]bis(5- metoxi-2-nitrobenzoico) (5-1) (5,41 g, 10,9 mmol, Journal of Medicinal Chemistry 2004, 47, 1161) em diclorometano (50 mL), adicionou-se cloreto de oxalila (5,63 mL, 65,7 mmol) a 0 ºC, e N,N-dimetilformamida (0,0844 mL, 1,09 mmol) foi adicionada gota a gota à mesma. A temperatura da solução de reação foi elevada até a temperatura ambiente, e a solução de reação foi agitada por 2 horas. O resultante foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo resultante dissolvido em diclorometano (100 mL), o qual foi adicionado gota a gota a uma solução em diclorometano (100 mL) de cloridrato de metil (6S)-5-azaspiro[2.4]heptano-6-carboxilato de metila (4,28 g, 24.1 mmol, Tetrahedron Letters 2012. 53. 3847) e trietilamina (6,07 mL, 43,8 mmol) sob atmosfera de nitrogênio a -40 ºC. A temperatura da solução de reação foi elevada até 0 ºC, e a solução de reação foi agitada por 2 horas. À mistura de reação, adicionou-se ácido clorídrico 1 N (100 mL), e a camada orgânica foi lavada com água e salmoura e seca com sulfato de sódio anidro. O resultante foi destilado sob pressão reduzida para fornecer o composto desejado (5-2) (8,40 g, quantitativo).
198 / 272
[00499] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 7,71 (2H, s), 6,88 (2H, s), 4,63 (2H, m), 4,15-4,12 (4H, m), 3,94 (6H, s), 3,71 (6H, s), 3,25 (2H, m), 3,10 (2H, m), 2,31-2,28 (2H, m), 1,90-1,83 (6H, m), 1,60-1,58 (2H, m), 0,71-0,49 (8H, m).
[00500] MS (APCI, ESI) m/z: 769 (M+H)+.
[0456] Etapa 2: {1,5-Pentanodiilbis[oxi(5-metoxi-2-nitrobenzen-4,1-diil)]}bis{[(6S)- 6-(hidroximetil)-5-azaspiro[2.4]hept-5-il]metanona} (5-3)
[00501] A uma solução do composto obtido na etapa 1 (5-2) (8,40 g, 10,9 mmol) em THF (100 mL), adicionou-se borohidreto de lítio (714 mg, 32,8 mmol), e o resultante foi agitado a 0 C por 30 minutos. A temperatura foi elevada até a temperatura ambiente e agitou-se por 1 hora. Depois de adicionado ácido clorídrico 1 N a 0 ºC, o resultante foi extraído com acetato de etila, lavado com salmoura e, então, seco com sulfato de sódio anidro. O solvente foi removido por destilação sob pressão reduzida para fornecer o composto desejado (5-3) (7,70 g, 99%).
[00502] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 7,67 (2H, s), 7,05 (2H, s), 4,86-4,74 (2H, m), 4,22-4,12 (6H, m), 3,92 (6H, s), 3,83-3,73 (2H, m), 3,62-3,51 (2H, m), 3,29 (1H, m), 3,11 (2H, m), 2,96 (1H, m), 2,12-2,03 (2H, m), 1,82-1,77 (6H, m), 1,59-1,56 (2H, m), 0,67-0,41 (8H, m).
[00503] MS (APCI, ESI) m/z: 713 (M+H)+. Etapa 3: Pentano-1,5-diilbis[oxi(5-metoxi-2-nitrobenzen-4,1-diil)carbonil (6S)-5-azaspiro[2.4]heptan-5,6-diilmetanodiil] diacetato (5-4)
[00504] O composto obtido na etapa 2 (5-3) (7,70 g, 10,8 mmol) foi dissolvido em piridina (20 mL) e anidrido acético (10 mL, 105,9 mmol), o qual foi agitado à temperatura ambiente. O resultante foi destilado sob pressão reduzida para fornecer o composto desejado (5-4) (8,38 g, 97%).
[00505] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 7,68 (2H, s), 7,03 (2H, s), 4,47-4,46 (2H, m), 4,36-4,27 (4H, m), 4,13-4,11 (6H, m), 3,92 (6H, s), 3,16 (2H, m), 2,98 (2H, m), 2,17 (1H, m), 2,06 (6H, s), 1,84 (4H, m), 1,68 (1H, m), 1,58
199 / 272 (2H, m), 0,64-0,45 (8H, m).
[00506] MS (APCI, ESI) m/z: 797 (M+H)+. Etapa 4: 1,5-Pentanodiilbis[oxi(2-amino-5-metoxibenzen-4,1-diil)carbonil (6S)-5-azaspiro[2.4]heptan-5,6-diilmetanodiil] diacetato (5-5)
[00507] A uma solução do composto obtido na etapa 3 (5-4) (8,28 g, 10,4 mmol) em N,N-dimetilformamida (100 mL), adicionou-se paládio em carbono 5% (teor de umidade: 54%, 1,00 g), e a solução de reação foi então agitada vigorosamente sob atmosfera de hidrogênio à temperatura ambiente por 6 horas. O resultante foi filtrado através de Celite, o filtrado foi então destilado sob pressão reduzida e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [clorofórmio:metanol = 100:0(v/v) a 90:10(v/v)] para fornecer o composto desejado (5-5) (5,05 g, 66%).
[00508] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 6,66 (2H, s), 6,36 (2H, s), 5,11 (4H, s), 4,49 (2H, s), 4,19 (4H, m), 3,90 (4H, m), 3,62 (6H, s), 3,48-3,46 (2H, m), 3,33 (2H, s), 3,23-3,20 (2H, m), 2,01 (6H, s), 1,78-1,74 (6H, m), 1,55 (2H, m), 0,61-0,58 (4H, m), 0,49-0,48 (4H, m).
[00509] MS (APCI, ESI) m/z: 737 (M+H)+. Etapa 5: Acetato de {(6S)-5-[4-({5-[4-({(6S)-6-[(Acetiloxi)metil]-5- azaspiro[2.4]hept-5-il}carbonil)-5-amino-2-metoxifenoxi]pentil}oxi)-5- metoxi-2-{[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]amino}benzoil]-5-azaspiro[2.4]hept- 6-il}metila (forma monoaliloxicarbonila) (5-6)
[00510] A uma solução do composto obtido na etapa 4 (5-5) (5,05 g, 6,85 mmol) em diclorometano (100 mL), adicionou-se piridina (1,10 mL, 13,7 mmol), seguida por cloroformato de alila (0,725 mL, 6,85 mmol) sob atmosfera de nitrogênio a -78 ºC, e o resultante foi agitado por 2 horas. O resultante foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 70:30 (v/v) a 100:0 (v/v), clorofórmio:metanol = 100:0 (v/v) a 90:10 (v/v)] para fornecer a forma bisaliloxicarbonila (5-6b) (1,36 g, 22%) e forma
200 / 272 monoaliloxicarbonila (5-6) (2,63 g, 47%) como o composto desejado.
[00511] Pentano-1,5-diilbis[oxi(5-metoxi-2-{[(prop-2-en-1- iloxi)carbonil]amino}benzen-4,1-diil)carbonil(6S)-5-azaspiro[2.4]heptan-5,6- diilmetanodiil] diacetato (forma bisaliloxicarbonila) (5-6b):
[00512] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 9,14 (2H, s), 7,14 (2H, s), 6,85 (2H, s), 5,94 (2H, m), 5,33 (2H, m), 5,21 (2H, m), 4,55 (4H, m), 4,47 (1H, s), 4,23 (3H, s), 3,96 (4H, m), 3,74 (6H, s), 3.34 (6H, s), 3,31 (2H, m), 3,21 (2H, m), 2,04 (6H, s), 1,79 (4H, m), 1,67 (2H, m), 1,56 (2H, m), 0,56-0,48 (8H, m).
[00513] MS (APCI, ESI) m/z: 905 (M+H)+. Forma monoaliloxicarbonila (5-6):
[00514] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 9,14 (1H, s), 7,14 (1H, s), 6,85 (1H, s), 6,65 (1H, s), 6,35 (1H, s), 5,95 (1H, m), 5,33 (1H, m), 5,22 (1H, m), 5,11 (2H, s), 4,55 (2H, m), 4,48 (2H, s), 4,23-4,14 (4H, m), 3,96 (2H, m), 3,90 (2H, m), 3,74 (3H, s), 3,63 (3H, s), 3,49 (1H, m), 3,38-3,30 (4H, m), 3,21 (1H, m), 2,04 (3H, s), 2,01 (3H, s), 1,77 (5H, m), 1,68 (1H, m), 1,56 (2H, m), 0,63-0,48 (8H, m).
[00515] MS (APCI, ESI) m/z: 821 (M+H)+. Etapa 6: N-[(2-Propen-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4-[({[2-({(6S)-6- [(acetiloxi)metil]-5-azaspiro[2.4]hept-5-il}carbonil)-5-({5-[4-({(6S)-6- [(acetiloxi)metil]-5-azaspiro[2.4]hept-5-il}carbonil)-2-metoxi-5-{[(2-propen- 1-iloxi)carbonil]amino}fenoxi]pentil}oxi)-4- metoxifenil]carbamoil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (5-7)
[00516] A forma monoaliloxicarbonila obtida na etapa 5 (5-6) (2,00 g, 2,44 mmol) foi reagida com N-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-[4- (hidroximetil)fenil]-L-alaninamida (1,10 g, 2,92 mmol, WO2011130598) da mesma maneira que na etapa 6 do Exemplo 10-1 para fornecer o composto desejado (5-7) (2,64 g, 89%).
[00517] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 10,02 (1H, s), 9,14 (2H, s), 8,18 (1H, m), 7,59 (2H, m), 7,33 (2H, m), 7,27 (1H, m), 7,14 (2H, s), 6,85 (2H, s), 5,99-
201 / 272 5,86 (2H, m), 5,31 (2H, n), 5,19 (2H, m), 5,03 (2H, s), 4,55 (2H, m), 4,48 (2H, n), 4,41 (2H, m), 4,23-4,21 (3H, m), 3,94-3,91 (4H, m), 3,88-3,86 (2H, m), 3,74 (3H, s), 3,74 (3H, s), 3.34 (4H, s), 3,32-3,30 (2H, m), 3,20-3,18 (2H, m), 2,03 (6H, s), 1,96 (1H, m), 1,79 (4H, s), 1,66 (1H, m), 1,55 (2H, s), 1,30 (3H, m), 0,88 (3H, m), 0,83 (3H, m), 0,54-0,49 (8H, m).
[00518] MS (APCI, ESI) m/z: 1224 (M+H)+. Etapa 7: N-[(2-Propen-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-[4-({[(2-{[(6S)-6- (hidroximetil)-5-azaspiro[2.4]hept-5-il]carbonil}-5-{[5-(4-{[(6S)-6- (hidroximetil)-5-azaspiro[2.4]hept-5-il]carbonil}-2-metoxi-5-{[(2-propen-1- iloxi)carbonil]amino}fenoxi)pentil]oxi}-4- metoxifenil)carbamoil]oxi}metil)fenil]-L-alaninamida (5-8)
[00519] A uma solução do composto obtido na etapa 6 (5-7) (2,64 g, 2,16 mmol) em metanol (10 mL), adicionou-se carbonato de potássio (1,49 g, 10,8 mmol), e o resultante foi agitado à temperatura ambiente por 3 horas. Adicionou-se cloreto de amônio aquoso saturado (100 mL) à mistura de reação, que foi extraída com acetato de etila. A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro. O resultante foi destilado sob pressão reduzida para fornecer o composto desejado (5-8) (2,21 g, 90%).
[00520] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 10,04 (1H, s), 9,18 (1H, s), 8,18 (1H, m), 7,59 (2H, m), 7,33 (2H, m), 7,26 (1H, m), 7,22 (1H, s), 7,14 (2H, s), 6,89 (2H, s), 5,98-5,86 (2H, m), 5,31 (2H, m), 5,19 (2H, m), 5,04 (2H, s), 4,80 (2H, m), 4,55 (2H, m), 4,48 (2H, m), 4,41 (1H, m), 4,26 (2H, s), 3,96-3,94 (4H, m), 3,90-3,85 (1H, m), 3,74 (6H, s), 3,59 (2H, m), 3,33 (6H, s), 3,09 (1H, m), 1,93-1,83 (8H, m), 1,57-1,54 (2H, m), 1,30 (3H, m), 0,88 (3H, m), 0,83 (3H, m), 0,52-0,43 (8H, m).
[00521] MS (APCI, ESI) m/z: 1140 (M+H)+. Etapa 8: N-[(2-Propen-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4-[({[(11a’S)-11’-hidroxi- 8’-{[5-({(11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi-5’-oxo-10’-[(2-propen-1- iloxi)carbonil]-5’,10’,11’,11a’-tetrahidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-
202 / 272 pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-8’-il}oxi)pentil]oxi}-7’-metoxi-5’-oxo- 11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (5-9)
[00522] A uma solução do composto obtido na etapa 7 (5-8) (2,03 g, 1,78 mmol) em diclorometano (50 mL), adicionou-se periodinano de Dess- Martin (1,59 g, 3,74 mmol), e o resultante foi agitado à temperatura ambiente durante a noite. Adicionou-se hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado (100 mL) à mistura de reação, que foi extraída com clorofórmio. A camada orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro. O resultante foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [clorofórmio:metanol = 100:0(v/v) a 90:10(v/v)] para fornecer o composto desejado (5-9) (2,05 g, quantitativo).
[00523] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 9,99 (1H, s), 8,16 (1H, m), 7,54 (2H, m), 7,32-7,22 (3H, m), 7,08-7,04 (2H, m), 6,80-6,72 (2H, m), 6,55 (2H, s), 5,94-5,86 (2H, m), 5,75 (2H, m), 5,31-5,04 (2H, m), 4,81 (1H, m), 4,62 (1H, m), 4,48-4,38 (4H, m), 4,00-3,87 (4H, m), 3,79-3,76 (7H, m), 3,54 (2H, m), 3,42-3,40 (2H, m), 3,33 (4H, s), 3,14 (2H, m), 2,35 (2H, m), 1,80-1,78 (4H, m), 1,59-1,56 (4H, m), 1,29 (3H, m), 0,87 (3H, m), 0,83 (3H, m), 0,70-0,59 (8H, m).
[00524] MS (APCI, ESI) m/z: 1136 (M+H)+. Etapa 9: L-Valil-N-{4-[({[(11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi-8’-[(5-{[(11a’S)-7’- metoxi-5’-oxo-5’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepina]-8’-il]oxi}pentil)oxi]-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)- il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (5-10)
[00525] O composto obtido na etapa 8 (5-9) (2,05 g, 1,80 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 12 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (5-10) (1,02 g, 60%).
203 / 272
[00526] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 10,08 (1H, s), 7,57 (2H, m), 7,32- 7,20 (3H, m), 7,05 (2H, s), 6,68-6,60 (3H, m), 5,74 (1H, m), 4,99-4,58 (4H, m), 3,99-3,94 (4H, m), 3,78-3,73 (6H, m), 3,66-3,38 (4H, m), 3,15-3,01 (3H, m), 2,40-2,34 (3H, m), 1,89-1,81 (6H, m), 1,57-1,53 (4H, m), 1,28 (3H, m), 0,88 (3H, m), 0,78 (3H, m), 0,64-0,55 (8H, m).
[00527] MS (APCI, ESI) m/z: 950 (M+H)+. Etapa 10: N-[4-(11,12-Didehidrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-il)-4- oxobutanoil]glicilglicil-L-valil-N-{4-[({[(11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi-8’- [(5-{[(11a’S)-7’-metoxi-5’-oxo-5’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-8’-il]oxi}pentil)oxi]-5’-oxo-11’,11a’- dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]- 10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (5-11)
[00528] O composto obtido na etapa 9 (5-10) (0,710 g, 0,747 mmol) e o composto obtido na etapa 1 do Exemplo 10-2 (2-2) (0,313 g, 0,747 mmol) foram dissolvidos em um solvente misto de diclorometano (1,5 mL) e metanol (0,1 mL). Ao mesmo, adicionou-se cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2- il)-4-metilmorfolínio (0,264 g, 0,897 mmol), e o resultante foi agitado à temperatura ambiente por 1 hora. O resultante foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [clorofórmio:metanol = 100:0 (v/v) a 80:20 (v/v)] para fornecer o composto desejado (5-11) (0,671 g, 66%).
[00529] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 9,91 (1H, s), 8,32 (1H, s), 8,23-7,91 (3H, m), 7,81-7,19 (14H, m), 7,04 (1H, m), 6,80-6,62 (3H, m), 5,77-5,75 (1H, m), 5,20 (1H, m), 5,01 (1H, m), 4,79 (1H, m), 4,46-4,35 (1H, m), 4,04 (4H, m), 3,86-3,38 (18H, m), 3,22-3,15 (2H, m), 2,67-2,63 (1H, m), 2,46-2,23 (3H, m), 2,09-1,91 (2H, m), 1,80-1,78 (5H, m), 1,57 (3H, m), 1,27 (3H, s), 1,11- 1,04 (1H, m), 0,87-0,79 (6H, m), 0,63-0,55 (6H, m).
[00530] MS (APCI, ESI) m/z: 1351 (M+H)+. Exemplo 10-6: Ligante de fármaco 4
204 / 272 [Fórmula 58] Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa 1: (6S)-5-[4-(benziloxi)-5-metoxi-2-nitrobenzoil]-5- azaspiro[2.4]heptano-6-carboxilato de metila (6-2)
[00531] A uma solução de ácido 4-(benziloxi)-5-metoxi-2- nitrobenzoico (6-1) (6,07 g, 20,0 mmol, Tetrahedron 1995, 51, 5617) e N,N- dimetilformamida (1,08 mL, 13,9 mmol) em diclorometano (100 mL), adicionou-se cloreto de oxalila (3,43 mL, 40,0 mmol) gota a gota sob resfriamento com gelo ao longo de 5 minutos. A solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 5 horas, então, destilada sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi dissolvido em diclorometano (20 mL), que foi destilado sob pressão reduzida. Depois que essa operação foi repetida três vezes, o resíduo foi suspenso em diclorometano (5 mL), ao qual, foram adicionadas quantidades em excesso de éter dietílico e hexano, e a filtração e secagem seguintes sob pressão reduzida forneceu o cloreto de acila bruto. O cloreto de acila obtido foi dissolvido em diclorometano e resfriado até -40 º C (banho de acetonitrila em gelo seco), ao qual, foram adicionados lentamente cloridrato
205 / 272 de (6S)-5-azaspiro[2.4]heptano-6-carboxilato de metila (4,22 g, 22,0 mmol, Tetrahedron Letters 2012. 53. 3847) e trietilamina (3,36 mL, 24,2 mmol). A temperatura da mistura de reação foi elevada até a temperatura ambiente durante a noite. À mistura de reação, adicionou-se ácido clorídrico 1 N, e a mistura de reação foi extraída com diclorometano. A camada orgânica foi lavada com água, hidrogenocarbonato de sódio aquoso saturado e salmoura e seca com sulfato de sódio anidro. O resultante foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 100:0 a 50:50] para fornecer o composto desejado (6-2) (6,55 g, 80%).
[00532] MS (APCI, ESI) m/z: 441 (M+H)+ Etapa 2: (11a’S)-8’-(Benziloxi)-7’-metoxi-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-5’,11’(10’H,11a’H)-diona (6-3)
[00533] A uma solução do composto obtido na etapa 1 (6-2) (6,55 g, 16,0 mmol) em etanol (150 mL) e THF (150 mL), adicionou-se níquel de Raney (7,00 g) sob atmosfera de nitrogênio. Adicionou-se hidrazina monohidratada (7 mL) à mistura de reação e a temperatura foi gradualmente elevada até 50 ºC. Depois de agitação a 50 ºC por 2 horas, níquel de Raney (3,00 g) e hidrazina monohidratada (3 mL) foram adicionados à mesma, e o resultante foi agitado por 1 hora. Adicionou-se THF (100 mL) à mistura de reação, que foi filtrada através de Celite. O resultante foi destilado sob pressão reduzida, e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 100:0(v/v) a 25:75(v/v)] para fornecer o composto desejado (6-3) (4,42 g, 73%).
[00534] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,82 (1H, s), 7,48 (1H, s), 7,42-7,35 (4H, m), 7,32-7,31 (1H, m), 6,44 (1H, s), 5,16 (2H, s), 4,16-4,10 (1H, m), 3,93 (3H, s), 3,78-3,76 (1H, m), 3,39-3,37 (1H, m), 2,45-2,43 (1H, m), 2,24-2,21 (1H, m), 0,83-0,61 (4H, m).
[00535] MS (APCI, ESI) m/z: 379 (M+H)+
206 / 272 Etapa 3: (11a’S)-8’-(Benziloxi)-7’-metoxi-10’-{[2-(trimetilsilil)etoxi]metil}- 1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]- 5’,11’(10’H,11a’H)-diona (6-4)
[00536] A uma solução do composto obtido na etapa 2 (6-3) (10,0 g, 26,4 mmol) em THF (150 mL), adicionou-se lentamente solução de butil-lítio normal em hexano normal 2,6 moles/L (12,0 mL, 31,8 mmol) gota a gota a - 40 ºC. A solução de reação foi agitada a -40 ºC por 15 minutos, e 2- (clorometoxi)etiltrimetilsilano (5,57 mL, 31,7 mmol) foi então adicionado lentamente gota a gota à mesma. Depois que a solução de reação foi agitada à temperatura ambiente por 3 horas, adicionou-se água à mesma, e o resultante foi extraído com acetato de etila. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura e seca com sulfato de sódio anidro. Depois de destilação sob pressão reduzida, o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 100:0(v/v) a 30:70(v/v)] para fornecer o composto desejado (6-4) (11,8 g, 88%).
[00537] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,45-7,44 (2H, m), 7,37-7,32 (4H, m), 7,28 (1H, s), 5,48-5,46 (1H, m), 5,21 (2H, s), 4,50-4,48 (1H, m), 4,22-4,20 (1H, m), 3,95 (3H, s), 3,73-3,70 (2H, m), 3,62-3,60 (1H, m), 3,41-3,38 (1H, m), 2,45-2,43 (1H, m), 2,23-2,20 (1H, m), 0,98-0,96 (2H, m), 0,83-0,68 (4H, m), 0,04 (9H, s).
[00538] MS (APCI, ESI) m/z: 509 (M+H)+ Etapa 4: (11a’S)-8’-Hidroxi-7’-metoxi-10’-{[2-(trimetilsilil)etoxi]metil}-1’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]- 5’,11’(10’H,11a’H)-diona (6-5)
[00539] A uma solução do composto obtido na etapa 3 (6-4) (18,7 g, 36,8 mmol) em THF (50 mL) e etanol (100 mL), adicionou-se catalisador de paládio em carbono 5% (5,00 g) sob atmosfera de nitrogênio. O balão de nitrogênio foi imediatamente substituído por um balão de hidrogênio, e a mistura de reação foi agitada sob atmosfera de hidrogênio por 6 horas. A
207 / 272 mistura de reação foi diluída pela adição de clorofórmio, filtrada através de Celite, o filtrado foi então destilado sob pressão reduzida e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 100:0(v/v) a 25:75(v/v)] para fornecer o composto desejado (6-5) (15,1 g, 98%).
[00540] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,38 (1H, s), 7,28 (1H, s), 6,01 (1H, s), 5,49-5,47 (1H, m), 4,70-4,68 (1H, m), 4,24-4,22 (1H, m), 3,96 (3H, s), 3,76- 3,71 (2H, m), 3,66-3,64 (1H, m), 3,42-3,39 (1H, m), 2,47-2,45 (1H, m), 2,23- 2,21 (1H, m), 1,01-0,99 (2H, m), 0,89-0,63 (4H, m), 0,03 (9H, s).
[00541] MS (APCI, ESI) m/z: 419 (M+H)+ Etapa 5: (11a’S)-8’-[(5-Bromopentil)oxi]-7’-metoxi-10’-{[2- (trimetilsilil)etoxi]metil}-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepina]-5’,11’(10’H,11a’H)-diona (6-6)
[00542] O composto obtido na etapa 4 (6-5) (2,77 g, 6,62 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 2 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (6-6) (3,31 g, 88%).
[00543] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,36 (1H, s), 7,25 (1H, s), 5,55 (1H, m), 4,65 (1H, m), 4,24-4,23 (1H, m), 4,11-4,03 (2H, m), 3,93 (3H, s), 3,85-3,78 (1H, m), 3,72-3,69 (2H, m), 3,46-3,39 (3H, m), 2,47-2,44 (1H, m), 2,25-2,22 (1H, m), 1,95-1,91 (4H, m), 1,67-1,59 (1H, m), 1,03-0,95 (2H, m), 0,90-0,85 (1H, m), 0,70-0,66 (4H, m), 0,05 (9H, s). Etapa 6: (11a’S)-8’-[(5-Bromopentil)oxi]-7’-metoxi-1’,11a’-dihidro-5’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-5’-ona (6-7)
[00544] O composto obtido na etapa 5 (6-6) (3,31 g, 5,83 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 7 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (6-7) (1,11 g, 45%).
[00545] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,81 (1H, m), 7,53 (1H, s), 6,82 (1H, s), 4,13-4,06 (2H, m), 3,97 (3H, s), 3,88-3,83 (1H, m), 3,69 (1H, m), 3,52-3,39 (3H, m), 2,55-2,52 (1H, m), 2,06-1,89 (5H, m), 1,67-1,63 (2H, m), 0,76-0,72
208 / 272 (4H, m). Etapa 7: (11a’S)-8’-[(5-Bromopentil)oxi]-7’-metoxi-1’,10’,11’,11a’- tetrahidro-5’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-5’- ona (6-8)
[00546] O composto obtido na etapa 6 (6-7) (2,56 g, 6,08 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 8 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (6-8) (1,15 g, 45%).
[00547] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,60 (1H, s), 6,07 (1H, s), 4,11-4,04 (1H, m), 3,99 (2H, m), 3,87-3,84 (1H, m), 3,85 (3H, s), 3,73 (1H, m), 3,58-3,53 (2H, m), 3,47-3,42 (3H, m), 2,03-1,78 (6H, m), 1,65-1,63 (2H, m), 0,77-0,56 (4H, m). Etapa 8: (11a’S)-8’-[(5-bromopentil)oxi]-7’-metoxi-5’-oxo-11’,11a’-dihidro- 1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)- carboxilato de prop-2-en-1-ila (6-9)
[00548] O composto obtido na etapa 7 (6-8) (1,15 g, 2,72 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 9 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (6-9) (1.14 g, 82%).
[00549] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,23 (1H, s), 6,69 (1H, s), 5,79 (1H, s), 5,13-5,10 (2H, m), 4,68-4,66 (1H, m), 4,48-4,45 (2H, m), 4,01 (2H, m), 3,92 (3H, s), 3,76 (1H, m), 3,54-3,37 (3H, m), 2,39 (1H, m), 1,95-1,90 (4H, m), 1,68-1,61 (3H, m), 1,44 (1H, m), 0,75-0,66 (4H, m). Etapa 9: N-[(Prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4-[({[(11a’S)-11’-{[terc- butil(dimetil)silil]oxi}-7’-metoxi-8’-{[5-({(11a’S)-7’-metoxi-5’-oxo-10’- [(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-5’,10’,11’,11a’-tetrahidro-1'H,3’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-8’- il}oxi)pentil]oxi}-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L- alaninamida (6-10)
[00550] O composto obtido na etapa 8 (6-9) (0,374 g, 0,737 mmol) foi
209 / 272 reagido com o composto obtido na etapa 10 do Exemplo 10-1 (1-11) (0,452 g, 0,56 mmol) da mesma maneira que na etapa 10 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (6-10) (0,589 g, 65%).
[00551] MS (APCI, ESI) m/z: 1234 (M+H)+ Etapa 10: N-[(Prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4-[({[(11a’S)-11’- hidroxi-7’-metoxi-8’-{[5-({(11a’S)-7’-metoxi-5’-oxo-10’-[(prop-2-en-1- iloxi)carbonil]-5’,10’,11’,11a’-tetrahidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-8’-il}oxi)pentil]oxi}-5’-oxo-11’,11a’- dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]- 10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (6-11)
[00552] O composto obtido na etapa 9 (6-10) (0,589 g, 0,477 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 11 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (6-11) (0,382 g, 71%).
[00553] RMN 1H (CDCl3) δ: 8,90 (1H, s), 7,55 (2H, m), 7,25-7,21 (2H, m), 6,74 (2H, m), 6,38 (1H, s), 5,90-5,87 (5H, m), 5,33-5,09 (8H, m), 4,66-4,60 (8H, m), 3,98-3,91 (10H, m), 3,77-3,30 (12H, m), 2,42-2,36 (2H, m), 1,77-1,39 (6H, m), 0,91-0,70 (14H, m). Etapa 11: L-Valil-N-{4-[({[(11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi-8’-[(5-{[(11a’S)- 7’-metoxi-5’-oxo-5’,10’,11’,11a’-tetrahidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-8’-il]oxi}pentil)oxi]-5’-oxo-11’,11a’- dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]- 10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (6-12)
[00554] O composto obtido na etapa 10 (6-11) (0,382 g, 0,341 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 12 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (6-12) (0,200 g, 62%).
[00555] MS (APCI, ESI) m/z: 952 (M+H)+ Etapa 12: N-[4-(11,12-Didehidrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-il)-4- oxobutanoil]glicilglicil-L-valil-N-{4-[({[(11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi-8’- [(5-{[(11a’S)-7’-metoxi-5’-oxo-5’,10’,11’,11a’-tetrahidro-1’H-
210 / 272 spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-8’- il]oxi}pentil)oxi]-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L- alaninamida (6-13)
[00556] O composto obtido na etapa 11 (6-12) (0,0560 g, 0,0588 mmol) foi reagido com o composto obtido na etapa 1 do Exemplo 10-2 (2-2) (0,022 g, 0,053 mmol) da mesma maneira que na etapa 13 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (6-13) (0,0500 g, 63%).
[00557] MS (APCI, ESI) m/z: 1354 (M+H)+ Síntese da porção do fármaco Exemplo 10-7: Fármaco 1 [Fórmula 59] Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa 1: (2-{[(6S)-6-({[terc-butil(dimetil)silil]oxi}metil)-5-azaspiro[2.4]hept- 5-il]carbonil}-4-metoxi-5-{[tri(propan-2-il)silil]oxi}fenil)carbamato de prop- 2-en-1-ila (7-1)
[00558] O composto obtido na etapa 5 do Exemplo 1 (1-6) (4,59 g, 8,15 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 9 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (7-1) (4,86 g, 92%).
[00559] RMN 1H (CDCl3) δ: 8,97 (1H, s), 7,77 (1H, s), 6,77 (1H, s), 5,97-5,94 (1H, m), 5,39-5,21 (2H, m), 4,67-4,59 (3H, m), 4,00-3,98 (1H, m), 3,74-3,66 (5H, m), 3,05-3,03 (1H, m), 2,30-2,28 (1H, m), 1,72-1,70 (1H, m), 1,30-1,27 (3H, m), 1,11-1,05 (18H, m), 0,99-0,91 (9H, m), 0,61-0,53 (4H, m),
211 / 272 0,10-0,06 (6H, m).MS (APCI, ESI) m/z: 647 (M+H)+ Etapa 2: (2-{[(6S)-6-(hidroximetil)-5-azaspiro[2.4]hept-5-il]carbonil}-4- metoxi-5-{[tri(propan-2-il)silil]oxi}fenil)carbamato de prop-2-en-1-ila (7-2)
[00560] O composto obtido na etapa 1 (7-1) (4,86 g, 7,51 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 7 do Exemplo 10-1 para fornecer o composto desejado (7-2) (3,42 g, 86%).
[00561] RMN 1H (CDCl3) δ: 8,52 (1H, s), 7,71 (1H, s), 6,77 (1H, s), 6,00-5,94 (1H, m), 5,35-5,27 (2H, m), 4,65-4,64 (3H, m), 4,33-4,31 (1H, m), 3,82-3,77 (5H, m), 3,68-3,66 (1H, m), 3,15-3,13 (1H, m), 1,89-1,86 (2H, m), 1,30-1,26 (3H, m), 1.14-1,10 (18H, m), 0,66-0,51 (4H, m).
[00562] MS (APCI, ESI) m/z: 533 (M+H)+ Etapa 3: (11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi-5’-oxo-8’-{[tri(propan-2-il)silil]oxi}- 11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-carboxilato de prop-2-en-1-ila (7-3)
[00563] O composto obtido na etapa 2 (7-2) (6,68 g, 12,5 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 8 do Exemplo 10-1 para fornecer o composto desejado (7-3) (6,44 g, 97%).
[00564] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,20 (1H, s), 6,69 (1H, s), 5,89-5,78 (2H, m), 5,18-5,15 (2H, m), 4,62-4,60 (1H, m), 4,49-4,47 (1H, m), 3,85 (3H, s), 3,74-3,71 (1H, m), 3,59-3,57 (1H, m), 3,33-3,30 (2H, m), 2,43-2,40 (1H, m), 1,76-1,73 (1H, m), 1,28-1,20 (3H, m), 1,09-1,07 (18H, m), 0,74-0,65 (4H, m).
[00565] MS (APCI, ESI) m/z: 531 (M+H)+ Etapa 4: (11a’S)-11’-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-7’-metoxi-5’-oxo-8’- {[tri(propan-2-il)silil]oxi}-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-carboxilato de prop-2-en-1-ila (7- 4)
[00566] O composto obtido na etapa 3 (7-3) (3,24 g, 6,10 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 9 do Exemplo 10-1 para fornecer o composto desejado (7-4) (3,86 g, 98%).
212 / 272
[00567] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,20 (1H, s), 6,67 (1H, s), 6,01-5,98 (1H, m), 5,79-5,73 (1H, m), 5,14-5,10 (2H, m), 4,64-4,61 (1H, m), 4,37-4,34 (1H, m), 3,86 (3H, s), 3,72-3,69 (1H, m), 3,52-3,50 (1H, m), 3,29-3,26 (1H, m), 2,38-2,34 (1H, m), 1,55-1,51 (1H, m), 1,28-1,24 (3H, m), 1,15-1,07 (18H, m), 0,81-0,66 (13H, m), 0,21 (3H, s), 0,18 (3H, s).
[00568] MS (APCI, ESI) m/z: 645 (M+H)+ Etapa 5: (11a’S)-11’-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-8’-hidroxi-7’-metoxi-5’- oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-carboxilato de prop-2-en-1-ila (7-5)
[00569] O composto obtido na etapa 4 (7-4) (4,49 g, 6,96 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 10 do Exemplo 10-1 para fornecer o composto desejado (7-5) (3,24 g, 95%).
[00570] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,25 (1H, s), 6,73 (1H, s), 6,02-6,00 (1H, m), 5,91 (1H, s), 5,77-5,75 (1H, m), 5,11-5,09 (2H, m), 4,64-4,62 (1H, m), 4,41-4,40 (1H, m), 3,95 (3H, s), 3,72-3,70 (1H, m), 3,54-3,53 (1H, m), 3,29- 3,26 (1H, m), 2,36-2,34 (1H, m), 1,56-1,54 (1H, m), 0,79-0,67 (13H, m), 0,21 (3H, s), 0,20 (3H, s).
[00571] MS (APCI, ESI) m/z: 489 (M+H)+ Etapa 6: (11a’S)-11’-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-7’-metoxi-8’-{[5-({(11aS)- 7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-10-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]- 5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8- il}oxi)pentil]oxi}-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-carboxilato de prop-2-en-1-ila (7- 6)
[00572] O composto obtido na etapa 5 (7-5) (0,080 g, 0,164 mmol) foi reagido com o composto obtido na etapa 9 do Exemplo 10-3 (3-10) (0,095 g, 0,163 mmol) da mesma maneira que na etapa 10 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (7-6) (0,160 g, 98%).
[00573] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 7,44-7,42 (3H, m), 7,12-7,10 (2H,
213 / 272 m), 7,05-7,03 (1H, m), 6,92-6,90 (2H, m), 6,61-6,59 (1H, m), 5,87-5,81 (3H, m), 5,10-5,07 (4H, m), 4,66-4,55 (3H, m), 4,43-4,39 (2H, m), 4,21-3,94 (5H, m), 3,83 (3H, s), 3,81 (3H, s), 3,76 (3H, s), 3,65-3,62 (1H, m), 3,56-3,54 (1H, m), 3,42-3,39 (1H, m), 3,22-3,14 (2H, m), 2,77-2,73 (1H, m), 2,42-2,33 (1H, m), 1,81-1,79 (4H, m), 1,55-1,44 (3H, m), 0,82 (9H, s), 0,72-0,53 (4H, m), 0,19 (3H, s), 0,17 (3H, s).
[00574] MS (APCI, ESI) m/z: 993 (M+H)+ Etapa 7: (11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi-8’-{[5-({(11aS)-7-metoxi-2-(4- metoxifenil)-5-oxo-10-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-5,10,11,11a-tetrahidro- 1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il}oxi)pentil]oxi}-5’-oxo-11’,11a’- dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]- 10’(5’H)-carboxilato de prop-2-en-1-ila (7-7)
[00575] O composto obtido na etapa 6 (7-6) (160 mg, 0,161 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 11 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (7-7) (141 mg, quantitativo).
[00576] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 7,44-7,42 (3H, m), 7,08-7,06 (3H, m), 6,92-6,90 (2H, m), 6,82-6,79 (1H, m), 6,56-6,54 (1H, m), 5,77-5,74 (3H, m), 5,09 (4H, s), 4,58-4,55 (3H, m), 4,43-4,41 (2H, m), 4,16-4,01 (5H, m), 3,81-3,81 (6H, m), 3,76 (3H, s), 3,64 (1H, s), 3,56-3,53 (1H, m), 3,42-3,38 (1H, m), 3,25-3,13 (2H, m), 2,74-2,70 (1H, m), 2,37-2,34 (1H, m), 1,82-1,79 (4H, m), 1,59-1,56 (3H, m), 0,66-0,62 (4H, m).
[00577] MS (APCI, ESI) m/z: 879 (M+H)+ Etapa 8: (11a’S)-7’-Metoxi-8’-[(5-{[(11aS)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5- oxo-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8- il]oxi}pentil)oxi]-1’,11a’-dihidro-5’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepina]-5’-ona (7-8)
[00578] O composto obtido na etapa 7 (7-7) (141 mg, 0,161 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 12 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (7-8) (109,8 mg, 99%).
214 / 272
[00579] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 7,92-7,91 (1H, m), 7,45 (1H, s), 7,39-7,37 (2H, m), 7,33 (1H, s), 7,29 (1H, s), 6,92-6,89 (2H, m), 6,85 (1H, s), 6,56-6,54 (1H, m), 6,31 (1H, s), 4,19-4,12 (2H, m), 4,05-3,99 (1H, m), 3,95- 3,93 (2H, m), 3,82-3,79 (4H, m), 3,76 (3H, s), 3,66 (3H, s), 3,52-3,46 (3H, m), 3,30-3,21 (2H, m), 2,78-2,74 (1H, m), 2,45-2,42 (1H, m), 2,06-2,05 (1H, m), 1,89-1,82 (4H, m), 1,60-1,58 (2H, m), 0,80-0,63 (4H, m).
[00580] MS (APCI, ESI) m/z: 693 (M+H)+ Exemplo 10-8: Fármaco 2 [Fórmula 60] Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa 1: [4-(Benzil)-5-metoxi-2-nitrofenil][(6S)-6-(hidroximetil)-5- azaspiro[2.4]hept-5-il]metanona (8-1)
[00581] A uma solução do composto obtido na etapa 1 do Exemplo 6 (6-2) (6,49 g, 14,7 mmol) em tetrahidrofurano (147 mL), adicionou-se borohidreto de lítio (0,642 g, 29,5 mmol) a 0 ºC, e o resultante foi agitado à temperatura ambiente por 2 horas. Adicionou-se ácido clorídrico 1 N à solução de reação, que foi extraída com acetato de etila. A camada orgânica obtida foi lavada com salmoura, seca com sulfato de magnésio e, a seguir, destilada sob pressão reduzida. O produto bruto obtido (8-1) (6,94 g, quantitativo) foi utilizado para a etapa subsequente.
[00582] MS (APCI, ESI) m/z: 413 (M+H)+ Etapa 2: (6S)-5-[4-(Benziloxi)-5-metoxi-2-nitrobenzoil]-5- azaspiro[2.4]heptano-6-carbaldeído (8-2)
215 / 272
[00583] O composto obtido na etapa 1 (8-1) (4,50 g, 11,0 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 8 do Exemplo 10-1 para fornecer o composto desejado (8-2) (1,94 g, 43%).
[00584] MS (APCI, ESI) m/z: 411 (M+H)+ Etapa 3: (11a’S)-8’-Hidroxi-7’-metoxi-1’,10’,11’,11a’-tetrahidro-5’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-5’-ona (8-3)
[00585] A uma solução do composto obtido na etapa 2 (8-2) (1,94 g, 4,73 mmol) em tetrahidrofurano (25 mL), acetato de etila (25 mL) e metanol (25 mL), adicionou-se paládio em carbono 5% (teor de umidade: 54%, 1,0 g) sob atmosfera de nitrogênio, e a solução de reação foi então agitada sob atmosfera de hidrogênio à temperatura ambiente por 22 horas. Depois que a solução de reação foi filtrada através de Celite, o filtrado foi destilado sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel [hexano:acetato de etila = 80:20 (v/v) a 0:100 (v/v)] para fornecer o composto desejado (8-3) (1,20 g, 93%).
[00586] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,55 (1H, s), 6,16 (1H, s), 5,86 (1H, s), 4,08-4,02 (2H, m), 3,86 (3H, s), 3,72-3,69 (1H, m), 3,57-3,37 (3H, m), 2,04- 2,01 (1H, m), 1,78-1,75 (1H, m), 0,79-0,53 (4H, m).
[00587] MS (APCI, ESI) m/z: 275 (M+H)+ Etapa 4: (11a’S)-8’-[(5-bromopentilo)oxi]-11’-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}- 7’-metoxi-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-carboxilato de prop-2-en-1-ila (8-4)
[00588] O composto obtido na etapa 5 do Exemplo 10-7 (7-5) (0,300 g, 0,614 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 2 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (8-4) (0,388 g, 99%).
[00589] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,24 (1H, s), 6,60 (1H, s), 6,02-5,98 (1H, m), 5,80-5,75 (1H, m), 5,11-5,06 (2H, m), 4,68-4,64 (1H, m), 4,40-4,38 (1H, m), 4,02-3,98 (2H, m), 3,92 (3H, s), 3,72-3,69 (1H, m), 3,54-3,52 (1H, m), 3,46-3,41 (2H, m), 3,29-3,26 (1H, m), 2,38-2,34 (1H, m), 1,94-1,87 (4H, m),
216 / 272 1,65-1,62 (2H, m), 1,55-1,55 (1H, m), 0,86 (9H, s), 0,75-0,67 (4H, m), 0,24- 0,22 (6H, m).
[00590] MS (APCI, ESI) m/z: 639 [81Br, (M+H)+], 637 [79Br, (M+H)+]. Etapa 5: (11a’S)-11’-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-7’-metoxi-8’-[(5- {[(11a’S)-7’-metoxi-5’-oxo-5’,10’,11’,11a’-tetrahidro-1’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-8’- il]oxi}pentil)oxi]-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-carboxilato de prop-2-en-1-ila (8- 5)
[00591] O composto obtido na etapa 4 (8-4) (0,203 g, 0,318 mmol) foi reagido com o composto obtido na etapa 3 (8-3) (0,131 g, 0,478 mmol) da mesma maneira que na etapa 10 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (8-5) (0,0880 g, 33%).
[00592] MS (APCI, ESI) m/z: 831 (M+H)+ Etapa 6: (11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi-8’-[(5-{[(11a’S)-7’-metoxi-5’-oxo- 5’,10’,11’,11a’-tetrahidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepina]-8’-il]oxi}pentil)oxi]-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)- carboxilato de prop-2-en-1-ila (8-6)
[00593] O composto obtido na etapa 5 (8-5) (0,0880 g, 0,106 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 11 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (8-6) (0,0500 g, 66%).
[00594] MS (APCI, ESI) m/z: 717 (M+H)+ Etapa 7: (11a’S)-7’-Metoxi-8’-[(5-{[(11a’S)-7’-metoxi-5’-oxo-5’,11a’- dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-8’- il]oxi}pentil)oxi]-1’,10’,11’,11a’-tetrahidro-5’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-5’-ona (8-7)
[00595] O composto obtido na etapa 6 (8-6) (0,0500 g, 0,0698 mmol)
217 / 272 foi reagido da mesma maneira que na etapa 12 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (8-7) (0,0330 g, 77%).
[00596] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,80 (1H, m), 7,58 (1H, s), 7,52 (1H, s), 6,81 (1H, s), 6,05 (1H, s), 4,17-3,97 (5H, m), 3,94 (3H, s), 3,87 (1H, m), 3,84 (3H, s), 3,72-3,68 (3H, m), 3,51-3,45 (5H, m), 2,54-2,51 (1H, m), 2,03-1,90 (6H, m), 1,75-1,68 (2H, m), 0,66 (8H, m).
[00597] MS (APCI, ESI) m/z: 615 (M+H)+ Exemplo 10-9: Fármaco 3 [Fórmula 61] Etapa Etapa Etapa Etapa 1: {1,5-pentanodiilbis[oxi(6-{[(6S)-6-(hidroximetil)-5- azaspiro[2.4]hept-5-il]carbonil}-4-metoxibenzen-3, 1-diil)]biscarbamato de di-2-propen-1-ila (9-1)
[00598] A forma bisaliloxicarbonila (5-6b) (0,460 g, 0,508 mmol), obtida na etapa 5 do Exemplo 10-5, foi reagida da mesma maneira que na etapa 7 do Exemplo 10-5 para fornecer o composto desejado (9-1) (0,421 g, quantitativo).
[00599] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 9,19 (2H, s), 7,22 (2H, s), 6,89 (2H, s), 5,97-5,92 (2H, m), 5,33 (2H, m), 5,22 (2H, m), 4,81 (2H, m), 4,55 (4H, m), 4,26 (2H, s), 3,96 (4H, m), 3,74 (6H, s), 3,62 (2H, m), 3,56 (2H, s), 3,37 (2H, m), 3,11 (2H, m), 1,88-1,78 (8H, m), 1,56-1,54 (2H, m), 0,54-0,43 (8H, m).
[00600] MS (APCI, ESI) m/z: 821 (M+H)+. Etapa 2: (11a’S, 11a’’’’S)-8’,8’’-[pentan-1,5-diilbis(oxi)]bis(11’-hidroxi-7’- metoxi-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-carboxilato) de diprop-2-en-1-ila (9-2)
218 / 272
[00601] O composto obtido na etapa 1 (9-1) (0,421 g, 0,513 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 8 do Exemplo 10-5 para fornecer o composto desejado (9-2) (0,326 g, 78%).
[00602] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 7,07 (2H, s), 6,80 (2H, s), 6,55 (2H, m), 5,84-5,81 (2H, m), 5,75 (2H, m), 5,09-5,05 (4H, m), 4,62 (2H, mz), 4,40 (2H, m), 3,98 (4H, m), 3,81 (6H, s), 3,54 (2H, m), 3,43-3,37 (2H, m), 3,14 (2H, m), 2,35 (2H, m), 1,81-1,79 (4H, m), 1,59-1,56 (4H, m), 0,70-0,59 (8H, m).MS (APCI, ESI) m/z: 817 (M+H)+. Etapa 3: (11a’S,11a’’’’S)-8’,8’’-[1,5-Pentanodiilbis(oxi)]bis(7’-metoxi- 1’,11a’-dihidro-5’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepina]-5’-ona) (9-3)
[00603] O composto obtido na etapa 2 (9-2) (0,326 g, 0,399 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 12 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (9-3) (0,208 g, 85%).
[00604] RMN 1H (DMSO-D6) δ: 7,91 (2H, m), 7,32 (2H, s), 6,84 (2H, s), 4,11 (2H, m), 4,06 (2H, m), 3,82 (6H, s), 3,51-3,31 (6H, m), 2,43 (2H, m), 2,05 (2H, m), 1,82-1,80 (4H, m), 1,60-1,58 (2H, m), 0,79-0,77 (2H, m), 0,68- 0,64 (6H, m).MS (APCI, ESI) m/z: 613 (M+H)+. Exemplo 10-10: Fármaco 4 [Fórmula 62]
219 / 272 Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa 1: (2R,11aS)-2,8-Dihidroxi-7-metoxi-10-{[2-(trimetilsilil)etoxi]metil}- 2,3-dihidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-5,11(10H,11aH)-diona (10- 1)
[00605] O composto obtido na etapa 1 do Exemplo 10-3 (3-2) (5,00 g,
9.66 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 3 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (10-1) (3,95 g, 100%).
[00606] MS (APCI, ESI) m/z: 409 (M+H)+ Etapa 2: (2R,11aS)-2-Hidroxi-7-metoxi-10-{[2-(trimetilsilil)etoxi]metil}-8- {[tri(propan-2-il)silil]oxi}-2,3-dihidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina- 5,11(10H,11aH)-diona (10-2)
[00607] A uma solução do composto obtido na etapa 1 (10-1) (3,95g,
9.67mmol) em diclorometano (97 mL), foram adicionados imidazol (1,65 g, 24,2 mmol), cloreto de triisopropilsilila (2,46 mL, 11,6 mmol) e dimetilformamida (5 mL), e o resultante foi agitado à temperatura ambiente por 21 horas. Adicionou-se água à solução de reação, que foi extraída com clorofórmio, e a camada orgânica obtida foi lavada com água e, a seguir, destilada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por
220 / 272 cromatografia em sílica gel [hexano:acetato de etila = 100:0 (v/v) a 20:80 (v/v)] para fornecer o composto desejado (10-2) (4,78 g, 87%).
[00608] MS (APCI, ESI) m/z: 565 (M+H)+ Etapa 3: (11aS)-7-Metoxi-10-{[2-(trimetilsilil)etoxi]metil}-8-{[tri(propan-2- il)silil]oxi}-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-2,5,11(3H,10H,11aH)-triona
[00609] O composto obtido na etapa 2 (4,78 g, 8,43 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 4 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (10-3) (2,36 g, 50%).
[00610] MS (APCI, ESI) m/z: 563 (M+H)+ Etapa 4: Trifluorometanossulfonato de (11aS)-7-metoxi-5,11-dioxo-10-{[2- (trimetilsilil)etoxi]metil}-8-{[tri(propan-2-il)silil]oxi}-5,10,11,11a-tetrahidro- 1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-ila (10-4)
[00611] O composto obtido na etapa 3 (10-3) (1,53 g, 2,72 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 5 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (1,27 g, 69%).
[00612] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,31 (2H, s), 7,15 (1H, m), 5,52 (1H, m), 4,65 (1H, m), 4,57 (1H, m), 3,95-3,89 (1H, m), 3,87 (3H, s), 3,75-3,58 (2H, m), 3,18-3,14 (1H, m), 1,33-1,25 (3H, m), 1,10 (18H, m), 1,00-0,96 (2H, m), 0,03 (9H, s). Etapa 5: (11aS)-7-Metoxi-2-(4-metoxifenil)-10-{[2-(trimetilsilil)etoxi]metil}- 8-{[tri(propan-2-il)silil]oxi}-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina- 5,11(10H,11aH)-diona (10-5)
[00613] O composto obtido na etapa 4 (10-4) (0,519 g, 0,747 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 6 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (10-5) (0,511 g, quantitativo).
[00614] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,41-7,31 (5H, m), 6,91-6,85 (2H, m), 5,52 (1H, m), 4,64 (1H, m), 4,57 (1H, m), 3,97-3,90 (1H, m), 3,88 (3H, s), 3,83 (3H, s), 3,75-3,56 (2H, m), 3,19-3,09 (1H, m), 1,36-1,23 (3H, m), 1,11 (18H, m), 1,02-0,97 (2H, m), 0,03 (9H, s).
221 / 272
[00615] MS (APCI, ESI) m/z: 653 [(M+H)+] Etapa 6: (11aS)-7-Metoxi-2-(4-metoxifenil)-8-{[tri(propan-2-il)silil]oxi}-1, 11a-dihidro-5H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-5-ona (10-6)
[00616] O composto obtido na etapa 5 (10-5) (0,178 g, 0,272 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 7 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (10-6) (0,094 g, 68%).
[00617] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,87 (1H, m), 7,51 (1H, s), 7,41-7,39 (1H, m), 7,36-7,33 (2H, m), 6,93-6,89 (2H, m), 6,86 (1H, s), 4,44-4,38 (1H, m), 3,90 (3H, s), 3,83 (3H, s), 3,61-3,53 (1H, m), 3,41-3.34 (1H, m), 1,33- 1,25 (3H, m), 1,11-1,06 (18H, m).
[00618] MS (APCI, ESI) m/z: 507 [(M+H)+] Etapa 7: (11aS)-7-Metoxi-2-(4-metoxifenil)-8-{[tri(propan-2-il)silil]oxi}- 1,10,11,11a-tetrahidro-5H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-5-ona (10-7)
[00619] O composto obtido na etapa 6 (10-6) (0,063 g, 0,124 mmol) foi utilizado e reagido da mesma maneira que na etapa 8 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (10-7) (0,046 g, 72%).
[00620] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,53-7,48 (2H, m), 7,33-7,29 (2H, m), 6,90-6,86 (2H, m), 6,13-6,11 (1H, m), 4,36-4,29 (1H, m), 4,11 (1H, s), 3,82 (3H, s), 3,79 (3H, s), 3,59-3,50 (2H, m), 3,40-3,31 (1H, m), 2,78-2,68 (1H, m), 1,31-1,20 (3H, m), 1,13-1,02 (18H, m).
[00621] MS (APCI, ESI) m/z: 509 [(M+H)+] Etapa 8: (11aS)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-8-{[tri(propan-2- il)silil]oxi}-11,11a-dihidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-10 (5H)- carboxilato de prop-2-en-1-ila (10-8)
[00622] O composto obtido na etapa 7 (10-7) (0,046 g, 0,090 mmol) foi utilizado e reagido da mesma maneira que na etapa 9 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (10-8) (0,03 g, 56%).
[00623] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,39-7,36 (1H, m), 7,31-7,28 (2H, m), 7,22 (1H, s), 6,90-6,86 (3H, m), 6,75-6,72 (1H, m), 5,82-5,69 (1H, m), 5,18-
222 / 272 5,08 (2H, m), 4,59-4,52 (1H, m), 4,48-4,39 (1H, m), 4,39-4,29 (1H, m), 4,23- 4,12 (1H, m), 3,86 (3H, s), 3,82 (3H, s), 3,64-3,58 (1H, m), 3,32-3,25 (1H, m), 2,73-2,65 (1H, m), 1,30-1,20 (2H, m), 1,12-1,06 (18H, m).
[00624] MS (APCI, ESI) m/z: 593 [(M+H)+] Etapa 9: (11aS)-8-hidroxi-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-11,11a-dihidro- 1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-10 (5H)-carboxilato de prop-2-en-1-ila (10-9)
[00625] O composto obtido na etapa 8 (10-8) (0,030 g, 0,050 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 10 do Exemplo 10-1 para fornecer o composto desejado (10-9) (0,015 g, 0,034 mmol).
[00626] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,39-7,25 (4H, m), 6,92-6,78 (3H, m), 6,03-5,92 (1H, m), 5,86-5,68 (1H, m), 5,20-5,07 (2H, m), 4,66-4,57 (1H, m), 4,52-4,40 (1H, m), 4,40-4,27 (1H, m), 4,27-4,16 (1H, m), 3,95 (3H, s), 3,82 (3H, s), 3,66-3,59 (1H, m), 3,32-3,21 (1H, m), 2,74-2,64 (1H, m).
[00627] MS (APCI, ESI) m/z: 437 [(M+H)+] Etapa 10: (11a’S)-8’-(3-bromopropoxi)-11’-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-7’- metoxi-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-carboxilato de prop-2-en-1-ila (10-10)
[00628] O composto obtido na etapa 5 do Exemplo 10-7 (0,131 g, 0,268 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 1 do Exemplo 10-4 para fornecer o composto desejado (10-10) (0,086 g, 52%).
[00629] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,24 (1H, s), 6,65 (1H, s), 6,02 (1H, m), 5,87-5,71 (1H, m), 5,15-5,04 (2H, m), 4,72-4,62 (1H, m), 4,44-4,32 (1H, m), 4,23-4,07 (3H, m), 3,92 (3H, s), 3,77-3,47 (4H, m), 3,28 (1H, m), 2,37 (3H, m), 1,57-1,52 (1H, m), 0,86 (9H, s), 0,82-0,57 (4H, m), 0,21 (6H, m).
[00630] MS (APCI, ESI) m/z: 611 [81Br, (M+H)+], 609 [79Br, (M+H)+] Etapa 11: (11a’S)-11’-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-7’-metoxi-8’-[3-({(11aS)- 7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-10-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-
223 / 272 5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-8- il}oxi)propoxi]-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-carboxilato de prop-2-en-1-ila (10-11)
[00631] O composto obtido na etapa 10 (10-10) (0,015 g, 0,034 mmol) e o composto obtido na etapa 9 (10-9) (0,030 g, 0,048 mmol) foram reagidos da mesma maneira que na etapa 10 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (10-11) (0,032 g, 96%).
[00632] MS (APCI, ESI) m/z: 965 [(M+H)+] Etapa 12: (11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi-8’-[3-({(11aS)-7-metoxi-2-(4- metoxifenil)-5-oxo-10-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-5,10,11,11a-tetrahidro- 1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-8-il}oxi)propoxi]-5’-oxo-11’,11a’- dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]- 10’(5’H)-carboxilato de prop-2-en-1-ila (10-12)
[00633] O composto obtido na etapa 11 (10-11) (0,031 g, 0,032 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 11 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (10-12) (0,026 g, 95%).
[00634] MS (APCI, ESI) m/z: 851 [(M+H)+] Etapa 13: (11a’S)-7’-Metoxi-8’-(3-{[(11aS)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5- oxo-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-8- il]oxi}propoxi)-1’,11a’-dihidro-5’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepina]-5’-ona (10-13)
[00635] O composto obtido na etapa 12 (10-12) (0,026 g, 0,030 mmol) foi reagido da mesma maneira que na etapa 12 do Exemplo 10-3 para fornecer o composto desejado (10-13) (0,018 g, 88%).
[00636] RMN 1H (CDCl3) δ: 7,80 (1H, m), 7,54-7,51 (3H, m), 7,33- 7,29 (2H, m), 6,91-6,85 (3H, m), 6,14 (1H, s), 4,35-4,17 (6H, m), 3,95 (3H, s), 3,85 (3H, s), 3,82 (3H, s), 3,76-3,25 (5H, m), 2,79-2,69 (1H, m), 2,52 (1H, m), 2,45-2,35 (1H, m), 2,03-1,96 (1H, m), 1,28-1,23 (2H, m), 0,78-0,69 (4H,
224 / 272 m).
[00637] MS (APCI, ESI) m/z: 665 [(M+H)+] Exemplo 11: [N3-PEG (3)]-MSG1-Ox Síntese de [N3-PEG (3)]-MSG1 [Fórmula 63] Ligante azida-PEG
[00638] Na figura, o diagrama esquemático à direita da fórmula estrutural formula representa a estrutura correspondente no diagrama esquemático de um intermediário como representado pela fórmula de reação de cada um dos Exemplos 12, 13, 14, 15. Etapa 1: (MSG1-)Asn
[00639] O produto disponível comercialmente monosialo-Asn livre (1S2G/1G2S-10NC-Asn, produzido pela GlyTech, Inc.) (referido como “(MSG-)Asn”) (500 mg) foi submetido à separação/purificação por HPLC em fase reversa sob as condições descritas abaixo para separar (MSG1-)Asn, eluído como o 1o pico principal (tempo de retenção: por volta de 15 a 19 min.) e (MSG2-)Asn eluído como o 2o pico principal (tempo de retenção: por volta de 21 a 26 min.). O eluente usado foi uma solução aquosa de ácido fórmico 0,1%, o aparelho usado foi um sistema preparativo com gatilho ELS- PDA (produzido pela JASCO Corporation), a coluna usada foi Inertsil ODS-3 (10 um, 30φ × 250 mm, produzida pela GL Sciences, Inc.) e a vazão foi 30 mL/min. As frações pertencentes ao primeiro pico, detectadas por UV (210
225 / 272 nm) durante a eluição, foram coletadas juntas e liofilizadas para fornecer o composto desejado (238 mg). Etapa 2: MSG1
[00640] O composto obtido na etapa 1 (229 mg) foi dissolvido em solução tampão fosfato 200 mM (pH 6,25) (1145 µL), à qual adicionou-se uma solução aquosa (100 µL) de EndoM (produzida pela Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 1 U/mL)), e o resultante foi incubado a 35 ºC por 6 dias. Depois de concluída a reação, a solução de reação foi submetida à ultrafiltração com VIVASPIN 15R (membrana Hydrosart, 30K, 6.000 g), e a solução filtrada obtida foi submetida à separação/purificação por HPLC em fase reversa. O eluente usado foi uma solução aquosa de ácido trifluoroacético 0,1%, o aparelho usado foi um sistema preparativo com gatilho ELS-PDA (produzido pela JASCO Corporation) e a coluna usada foi Inertsil ODS-3 (produzida pela GL Sciences, Inc.). As frações contendo o composto desejado, detectadas por UV (210 nm) durante a eluição, foram coletadas juntas e liofilizadas para fornecer o composto desejado (117 mg). Etapa 3: [N3-PEG (3)]-MSG1
[00641] A um tubo de amostragem de 5 mL (Ina-Optica Co., Ltd.), foram adicionados uma solução aquosa (1,2 mL) de 11-azida-3,6,9- trioxaundecano-1-amina (0,108 mL, 0,541 mmol) e o MSG1 obtido na etapa 2 (117 mg, 0,068 mmol), e o resultante foi agitado por 1 hora e então liofilizado. Ao tubo de amostragem de 5 mL depois da liofilização, foram adicionados uma solução em N,N-dimetilformamida (1,2 mL) de hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametilurônio (103 mg, 0,27 mmol) e diisopropiletilamina (0,046 mL, 0,27 mmol), seguido por agitação a 37 ºC por 3 horas. Depois de concluída a reação, a solução de reação foi transferida para um tubo de centrífuga (50 mL) ao qual éter dietílico (20 mL) havia sido adicionado antes. A matéria sólida foi precipitada usando uma centrífuga pequena (Hitachi Koki Co., Ltd., CF16RX) e o
226 / 272 sobrenadante foi removido. Além disso, adicionou-se éter dietílico (10 mL) e o resultante foi centrifugado e decantado. Subsequentemente, adicionou-se acetonitrila (10 mL) e o resultante foi centrifugado e decantado. Essa operação foi repetida duas vezes e, então, o resultante foi seco sob pressão reduzida para fornecer um produto bruto. A matéria sólida resultante foi submetida à purificação por HPLC em fase reversa nas mesmas condições que na etapa 2 para fornecer o composto desejado (94,2 mg). Etapa 4: [N3-PEG (3)]-MSG1-Ox
[00642] A um tubo de amostragem de 5 mL (produzido pela Ina-Optica Co., Ltd), o composto sintetizado na etapa 3 (100 mg) e uma solução aquosa (520 µL) de cloreto de 2-cloro-1,3-dimetil-1H-benzimidazol-3-ío (produzido pela FUSHIMI Pharmaceutical Co., Ltd. 56 mg, 0,257 mmol) foram adicionados. À solução de reação depois de ser resfriada com gelo, adicionou- se uma solução aquosa (520 µL) de fosfato tripotássico (165 mg, 0,78 mmol), seguido por agitação sob resfriamento com gelo por 3 horas. A solução de reação resultante foi submetida à ultrafiltração com um Amicon Ultra (Ultracel 30K, produzido pela Merck Millipore) para remover a matéria sólida. A solução filtrada foi purificada por cromatografia com filtração em gel. O aparelho usado foi Purif-Rp2 (produzido pela Shoko Scientific Co., Ltd.), a coluna usada foi HiPrep 26/10 Desalting (produzida pela GE Healthcare), a fase móvel usada foi solução aquosa de NH3 0,03%, a vazão foi 10 mL/min. e o volume da fração foi 10 mL. As frações contendo o composto desejado, detectadas por UV (220 nm) durante a eluição, foram coletadas juntas, às quais, uma solução aquosa 1 N de hidróxido de sódio (104 µL, 0,104 mmol) foi adicionada, e o resultante foi liofilizado para fornecer o composto desejado (84 mg).
[00643] Nos Exemplos 12 a 16, será descrita a preparação de um anticorpo com glicano remodelado. Exemplo 12: Anticorpo H01L02-[MSG1-N3]2]
227 / 272 [Fórmula 64] Etapa Etapa Ligante Azida-PEG Anticorpo Anticorpo H01L02-[MSG1-N3]2 (Fuc α 1,6)GlcNAc- anticorpo H01L02
[00644] Essa fórmula representa uma estrutura de ligante na qual um grupo azida foi introduzido a um ácido siálico no terminal não redutor de um glicano MSG1-tipo N297. No Exemplo 12, as estruturas de ligantes intermediários formados pela introdução de um grupo azida a um glicano N297 são as mesmas que a estrutura representada pela fórmula. Etapa 1: Preparação de (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo H01L02
[00645] A uma solução do anticorpo H01L02 (aproximadamente 21,1 mg/mL) (tampão fosfato 50 mM (pH 6,0)) (4,07 ml), adicionou-se 0,233 mL de solução de EndoS do tipo selvagem (7,7 mg/mL, PBS), e as soluções foram incubadas a 37 ºC por 4 horas. O progresso da reação foi verificado por uma estação de eletroforese Experion (produzida pela Bio-Rad Laboratories, Inc.). Depois de concluída a reação, a purificação por cromatografia de afinidade e purificação com uma coluna de hidroxiapatita foram realizadas de acordo com os métodos a seguir. (1) Purificação por cromatografia de afinidade
[00646] Aparelho de purificação: AKTA avant (produzido pela GE Healthcare) Coluna: HiTrap rProteína A FF (5 mL) (produzida pela GE Healthcare) Vazão: 5 mL/min. (1,25 mL/min. no carregamento)
228 / 272
[00647] Cada solução de reação obtida acima foi purificada em múltiplas operações separadas. Na aplicação da amostra, a solução de reação foi adicionada a à parte superior da coluna, e 4 CV de tampão de ligação (tampão fosfato 20 mM (pH 6,0)) fluíram a 1,25 mL/min. e 5 CV (volume da coluna) da mesma foram ainda escoados a 5 mL/min. Em uma etapa de lavagem intermediária, 15 CV de solução de lavagem (tampão fosfato20 mM (pH 7,0), solução de cloreto de sódio 0,5 M) foram escoados. Na eluição, 6 CV de tampão de eluição (Tampão ImmunoPure IgG Eution, produzido pela Pierce) foram escoados. O eluído foi imediatamente neutralizado com tampão Tris 1 M (pH 9,0). As frações contendo o composto desejado foram submetidas à troca de tampão para solução tampão fosfato 5 mM/ácido 2- morfolinoetanossulfônico (MES) 50 mM (pH 6,8) utilizando a operação comum C. (2) Purificação por cromatografia com hidroxiapatita
[00648] Aparelho de purificação: AKTA avant (produzido pela GE Healthcare) Coluna: Bio-Scale Mini CHT Tipo I cartucho (5 mL) (produzido pela Bio-Rad Laboratories, Inc.) Vazão: 5 mL/min. (1,25 mL/min. no carregamento)
[00649] A solução obtida em (1) foi aplicada à parte superior da coluna, e 4 CV de solução A (solução tampão fosfato 5 mM, ácido 2- morfolinoetanossulfônico (MES) 50 mM (pH 6,8)) foi escoada a 1,25 mL/min. e 3 CV da mesma foi adicionalmente escoada a 5 mL/min. Depois disso, foi realizada a eluição com a solução A e a solução B (tampão fosfato 5 mM, ácido 2-morfolinoetanossulfônico (MES) 50 mM (pH 6,8) e cloreto de sódio 2 M). As condições da eluição foram solução A:solução B = 100:0 a 0:100 (15 CV). Além disso, 5 CV de solução de lavagem (tampão fosfato 500 mM (pH 6,5)) foram escoados.
[00650] As frações contendo o composto desejado foram submetidas à
229 / 272 troca de tampão utilizando a operação comum C para fornecer uma solução de (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo H01L02 11,4 mg/mL (tampão fosfato 50 mM (pH 6,0)) (5,00 mL). Etapa 2: Preparação de anticorpo H01L02-[MSG1-N3]2
[00651] À solução de 11,4 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo H01L02 11,4 mg/mL (tampão fosfato 50 mM (pH 6,0)) obtida na etapa 1 (5,00 mL), foram adicionadas uma solução (0,180 mL) do glicano sintetizado na etapa 4 do Exemplo 11 (9,00 mg) em tampão fosfato 50 mM (pH 6,0) e uma solução de EndoS D233Q/Q303L 5,10 mg/mL (PBS) (0,230 mL), e o resultante foi incubado a 30 ºC por 3 horas. O progresso da reação foi verificado utilizando uma estação de eletroforese Experion (produzida pela Bio-Rad Laboratories, Inc.). Depois da reação, foram realizadas purificação por cromatografia de afinidade e purificação por cromatografia em hidroxiapatita como na etapa 1, e as frações contendo o composto desejado foram então submetidas à troca de tampão para solução salina com tampão fosfato (pH 6,0) utilizando a operação comum C para fornecer uma solução de anticorpo H01L02-[MSG1-N3]2 9,91 mg/mL (solução salina com tampão fosfato (pH 6,0)) (4,00 mL). Exemplo 13: Anticorpo H01L02A-[MSG1-N3]2 [Fórmula 65] Step Step Ligante Azida-PEG Anticorpo (Fuc α 1,6)GlcNAc-anticorpo Anticorpo H01L02A-[MSG1-N3]2 H01L02A Etapa 1: Preparação de (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo H01L02A
230 / 272
[00652] A operação na etapa 1 do Exemplo 12 foi realizada com uma solução do anticorpo H01L02A a aproximadamente 21,6 mg/mL (tampão fosfato 50 mM (pH 6,0)) (1,85 mL) para fornecer uma solução de (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo H01L02A 14,6 mg/mL (tampão fosfato 50 mM (pH 6,0)) (2.0 mL). Etapa 2: Preparação de anticorpo H01L02A-[MSG1-N3]2]
[00653] A operação na etapa 2 no Exemplo 12 foi realizada com a solução de (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo H01L02A 14,6 mg/mL (tampão fosfato 50 mM (pH 6,0)) (2.0 mL) obtida na etapa 1 para fornecer uma solução de anticorpo H01L02A-[MSG1-N3]2 10,0 mg/mL (tampão acetato (pH 5,5, contendo sorbitol)) (2,5 mL). Exemplo 14: Anticorpo H31L02A-[MSG1-N3]2 [Fórmula 66] Step Step Ligante Azida-PEG Anticorpo (Fuc α 1,6)GlcNAc- Anticorpo H31L02A-[MSG1-N3]2 anticorpo H31L02A Etapa 1: Preparação de (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo H31L02A
[00654] A operação na etapa 1 do Exemplo 12 foi realizada com uma solução de anticorpo H31L02A a aproximadamente 23,2 mg/mL (tampão fosfato 50 mM (pH 6,0)) (3,45 mL) para fornecer uma solução de (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo H31L02A 8,43 mg/mL (tampão fosfato 50 mM (pH 6,0)) (6,1 mL). Etapa 2: Preparação de anticorpo H31L02A-[MSG1-N3]2]
[00655] A operação na etapa 2 do Exemplo 12 foi realizada com a
231 / 272 solução de (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo H31L02A 8,43 mg/mL (tampão fosfato 50 mM (pH 6,0)) (5,00 mL), obtida na etapa 1, para fornecer uma solução de anticorpo H31L02A-[MSG1-N3]2 6,52 mg/mL (tampão fosfato saline (pH 6,0)) (4,00 mL). Exemplo 15: Anticorpo H11L02A-[MSG1-N3]2 [Fórmula 67] Step Step Ligante Azida-PEG Anticorpo Anticorpo H11L02A-[MSG1-N3]2 (Fuc α 1,6)GlcNAc- anticorpo H11L02A Etapa 1: Preparação de (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo H11L02A
[00656] A operação na etapa 1 do Exemplo 12 foi realizada com uma solução de anticorpo H11L02A a aproximadamente 24,2 mg/mL (tampão fosfato 50 mM (pH 6,0)) (3,0 mL) para fornecer uma solução de 20,42 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo H11L02A 20,42 mg/mL (tampão fosfato 50 mM (pH 6,0)) (2,7 mL). Etapa 2: Preparação de anticorpo H11L02A-[MSG1-N3]2]
[00657] A operação na etapa 2 do Exemplo 12 foi realizada com a solução de (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo H11L02A 20,39 mg/mL (tampão fosfato 50 mM (pH 6,0)) (1,55 mL), obtida na etapa 1, para fornecer uma solução de anticorpo H11L02A-[MSG1-N3]2 10,26 mg/mL (tampão acetato (pH 5,5, contendo sorbitol)) (2,6 mL). Exemplo 16: Anticorpo anti-LPS-[MSG1-N3]2] [Fórmula 68]
232 / 272 Step Step Ligante Azida-PEG Anticorpo anti-LPS Anticorpo anti-LPS Anticorpo anti-LPS-[MSG1-N3]2 Etapa 1: Preparação de (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo anti-LPS
[00658] A operação in etapa 1 do Exemplo 12 foi realizada usando uma solução de anticorpo anti-LPS a aproximadamente 17 mg/mL (solução de histidina 25 mM (pH 6,0), sorbitol 5%) (6,6 mL) para fornecer uma solução de (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo anti-LPS 21,03 mg/mL (tampão fosfato 50 mM (pH 6,0)) (5,4 mL). Etapa 2: Preparação de anticorpo anti-LPS-[MSG1-N3]2]
[00659] A operação na etapa 2 do Exemplo 12 foi realizada usando a solução de (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo anti-LPS 21,03 mg/mL (tampão fosfato 50 mM (pH 6,0)), obtida na etapa 1 (5,4 mL), para fornecer uma solução de anticorpo anti-LPS-[MSG1-N3]2 9,89 mg/mL (solução salina com tampão fosfato (pH 6,0)) (7,9 mL).
[00660] Nos Exemplos 17 a 27, será descrita a síntese de ADCs. Exemplo 17: ADC1
[00661] O ADC descrito no Exemplo 17 foi sintetizado, como ilustrado na fórmula de reações a seguir, conjugando o anticorpo obtido na etapa 2 do Exemplo 12 com o ligante de fármaco obtido na etapa 13 do Exemplo 10-3 (3-14). Na fórmula, R representa o ligante de fármaco usado no Exemplo. [Fórmula 69]
233 / 272 Etapa anticorpo [Fórmula 70] ou
[00662] O anel triazol a ser formado na etapa 1 possui isômeros geométricos, e o composto obtido na etapa 1 do Exemplo 17 tem um ligante em uma mistura das duas estruturas mostradas acima como R. Etapa 1: Conjugação de anticorpo e ligante de fármaco
234 / 272
[00663] A uma solução salina com tampão fosfato (pH 6,0) do anticorpo (6,76 mg/mL, 1,50 mL) obtido na etapa 2 do Exemplo 12, foram adicionados 1,2-propanodiol (1,42 mL) e uma solução em dimetilsulfóxido 10 mM do composto obtido na etapa 13 do Exemplo 10-3 (3-14) (0,0836 mL; 12 equivalentes por molécula de anticorpo) à temperatura ambiente, e o resultante foi reagido usando um rotador de tubos (MTR-103, AS ONE Corporation) à temperatura ambiente por 48 horas.
[00664] Operação de purificação: A solução foi purificada usando a operação comum D para fornecer 6,00 mL de uma solução do composto desejado.
[00665] Caracterização: Os valores característicos a seguir foram obtidos usando as operações comuns E e F.
[00666] Concentração do anticorpo: 1,37 mg/mL, rendimento do anticorpo: 8,23 mg (81%), número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo (n): 1,7. Exemplo 18 ADC2
[00667] O ADC descrito no Exemplo 18 foi sintetizado, como ilustrado na fórmula de reações a seguir, conjugando o anticorpo obtido na etapa 2 do Exemplo 13 com o ligante de fármaco obtido na etapa 12 do Exemplo 10-4 (4-12). Na fórmula, R representa o ligante de fármaco usado no Exemplo. [Fórmula 71]
235 / 272
Etapa
Anticorpo
[Fórmula 72]
ou
236 / 272
[00668] O anel triazol a ser formado na etapa 1 possui isômeros geométricos, e o composto obtido na etapa 1 do Exemplo 18 tem um ligante em uma mistura das duas estruturas mostradas acima como R. Etapa 1: Conjugação de anticorpo e ligante de fármaco
[00669] A uma solução tampão acetato 10 mM, sorbitol 5% (pH 5,5) do anticorpo (10,0 mg/mL, 100 µL), obtido na etapa 2 do Exemplo 13, foram adicionados 1,2-propanodiol (25 µL) e uma solução mista com uma solução em dimetilsulfóxido 10 mM do composto obtido na etapa 12 do Exemplo 10- 4 (4-12) (8 µL; 12 equivalentes por molécula de anticorpo) e 1,2-propanodiol (67 µL) à temperatura ambiente, e o resultante foi reagido usando um rotador de tubos (MTR-103, AS ONE Corporation) à temperatura ambiente por 48 horas.
[00670] Operação de purificação: A solução foi purificada usando a operação comum D para fornecer 1,2 mL de uma solução do composto desejado.
[00671] Caracterização: Os valores característicos a seguir foram obtidos usando as operações comuns E e F.
[00672] Concentração do anticorpo: 0,56 mg/mL, rendimento do anticorpo: 0,67 mg (67%), número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo (n): 1,9. Exemplo 19: ADC3
[00673] O ADC descrito no Exemplo 19 foi sintetizado conjugando o anticorpo obtido na etapa 2 do Exemplo 13 com o ligante de fármaco obtido na etapa 10 do Exemplo 10-5 (5-11). [Fórmula 73]
237 / 272 ou
[00674] O anel triazol a ser formado na etapa 1 possui isômeros geométricos, e o composto obtido na etapa 1 do Exemplo 19 tem um ligante em uma mistura das duas estruturas mostradas acima como R. Etapa 1: Conjugação de anticorpo e ligante de fármaco
[00675] A uma solução tampão acetato 10 mM, sorbitol 5% (pH 5,5) do anticorpo (10,0 mg/mL, 100 µL), obtido na etapa 2 do Exemplo 13, foram adicionados 1,2-propanodiol (25 µL) e uma solução mista com uma solução em dimetilsulfóxido 10 mM do composto obtido na etapa 10 do Exemplo 10- 5 (5-11) (8 µL; 12 equivalentes por molécula de anticorpo) e 1,2-propanodiol (67 µL) à temperatura ambiente, e o resultante foi reagido usando um rotador de tubos (MTR-103, AS ONE Corporation) à temperatura ambiente por 48 horas.
[00676] Operação de purificação: A solução foi purificada usando a operação comum D para fornecer 1,2 mL de uma solução do composto desejado.
[00677] Caracterização: Os valores característicos a seguir foram obtidos usando as operações comuns E e F.
[00678] Concentração do anticorpo: 0,53 mg/mL, rendimento do
238 / 272 anticorpo: 0,64 mg (64%), número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo (n): 1,9. Exemplo 20: ADC4
[00679] O ADC descrito no Exemplo 20 foi sintetizado conjugando o anticorpo obtido na etapa 2 do Exemplo 13 com o ligante de fármaco obtido na etapa 12 do Exemplo 10-6 (6-13). [Fórmula 74] ou
[00680] O anel triazol a ser formado na etapa 1 possui isômeros geométricos, e o composto obtido na etapa 1 do Exemplo 20 tem um ligante em uma mistura das duas estruturas mostradas acima como R. Etapa 1: Conjugação de anticorpo e ligante de fármaco
[00681] A uma solução tampão acetato 10 mM, sorbitol 5% (pH 5,5) do anticorpo (10,0 mg/mL, 100 µL), obtido na etapa 2 do Exemplo 13, foram adicionados 1,2-propanodiol (25 µL) e uma solução mista com uma solução em dimetilsulfóxido 10 mM do composto obtido na etapa 12 do Exemplo 10- 6 (6-13) (8 µL; 12 equivalentes por molécula de anticorpo) e 1,2-propanodiol (67 µL) à temperatura ambiente, e o resultante foi reagido usando um rotador de tubos (MTR-103, AS ONE Corporation) à temperatura ambiente por 48
239 / 272 horas.
[00682] Operação de purificação: A solução foi purificada usando a operação comum D para fornecer 1,2 mL de uma solução do composto desejado.
[00683] Caracterização: Os valores característicos a seguir foram obtidos usando as operações comuns E e F.
[00684] Concentração do anticorpo: 0,56 mg/mL, rendimento do anticorpo: 0,67 mg (67%), número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo (n): 1,9. Exemplo 21: ADC5
[00685] O ADC descrito no Exemplo 21 foi sintetizado conjugando o anticorpo obtido na etapa 2 do Exemplo 13 com o ligante de fármaco obtido na etapa 13 do Exemplo 10-3 (3-14). [Fórmula 75] ou
[00686] O anel triazol a ser formado na etapa 1 possui isômeros geométricos, e o composto obtido na etapa 1 do Exemplo 21 tem um ligante em uma mistura das duas estruturas mostradas acima como R. Etapa 1: Conjugação de anticorpo e ligante de fármaco
240 / 272
[00687] A uma solução tampão acetato 10 mM, sorbitol 5% (pH 5,5) do anticorpo (10,0 mg/mL, 1,70 mL), obtido na etapa 2 do Exemplo 13, foram adicionados 1,2-propanodiol (0,850 mL) e uma solução mista com uma solução em dimetilsulfóxido 10 mM do composto obtido na etapa 13 do Exemplo 10-3 (3-14) (0,141 mL; 12 equivalentes por molécula de anticorpo) e 1,2-propanodiol (0,710 mL) à temperatura ambiente, e o resultante foi reagido usando um rotador de tubos (MTR-103, AS ONE Corporation) à temperatura ambiente por 48 horas.
[00688] Operação de purificação: A solução foi purificada usando a operação comum D para fornecer 10,5 mL de uma solução do composto desejado.
[00689] Caracterização: Os valores característicos a seguir foram obtidos usando as operações comuns E e F.
[00690] Concentração do anticorpo: 1,19 mg/mL, rendimento do anticorpo: 12,5 mg (73%), número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo (n): 1,8. Exemplo 22: ADC6
[00691] O ADC descrito no Exemplo 22 foi sintetizado, como ilustrado na fórmula de reações a seguir, conjugando o anticorpo obtido na etapa 2 do Exemplo 14 com o ligante de fármaco obtido na etapa 13 do Exemplo 10-3 (3-14). Na fórmula, R representa o ligante de fármaco usado no Exemplo. [Fórmula 76]
241 / 272 Etapa Anticorpo [Fórmula 77] ou
[00692] O anel triazol a ser formado na etapa 1 possui isômeros geométricos, e o composto obtido na etapa 1 do Exemplo 22 tem um ligante
242 / 272 em uma mistura das duas estruturas mostradas acima como R. Etapa 1: Conjugação de anticorpo e ligante de fármaco
[00693] A uma solução salina com tampão fosfato (pH 6,0) do anticorpo (10,1 mg/mL, 0,400 mL), obtido na etapa 2 do Exemplo 14, foram adicionados 1,2-propanodiol (0,367 mL) e uma solução em dimetilsulfóxido 10 mM do composto obtido na etapa 13 do Exemplo 10-3 (3-14) (0,0333 mL; 12 equivalentes por molécula de anticorpo) à temperatura ambiente, e o resultante foi reagido usando um rotador de tubos (MTR-103, AS ONE Corporation) à temperatura ambiente por 48 horas.
[00694] Operação de purificação: A solução foi purificada usando a operação comum D para fornecer 3,50 mL de uma solução do composto desejado.
[00695] Caracterização: Os valores característicos a seguir foram obtidos usando as operações comuns E e F.
[00696] Concentração do anticorpo: 0,820 mg/mL, rendimento do anticorpo: 2,88 mg (81%), número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo (n): 1,9.
[00697] Os ADCs descritos nos Exemplos 23 a 26 foram sintetizados, como ilustrado na fórmula de reações a seguir, conjugando o anticorpo obtido na etapa 2 do Exemplo 15 com o ligante de fármaco obtido nos Exemplos 10- 3 a 10-6. Na fórmula, R difere pelos ligantes de fármaco usados naqueles Exemplos. Exemplo 23: ADC7 [Fórmula 78]
243 / 272 Etapa Anticorpo [Fórmula 79] ou
[00698] O anel triazol a ser formado na etapa 1 possui isômeros geométricos, e o composto obtido na etapa 1 do Exemplo 23 tem um ligante em uma mistura das duas estruturas mostradas acima como R. Etapa 1: Conjugação de anticorpo e ligante de fármaco
244 / 272
[00699] A uma solução tampão acetato 10 mM, sorbitol 5% (pH 5,5) do anticorpo (10,54 mg/mL, 0,4 mL), obtido na etapa 2 do Exemplo 15, foram adicionados 1,2-propanodiol (0,100 mL) e uma solução mista com uma solução em dimetilsulfóxido 10 mM do composto obtido na etapa 13 do Exemplo 10-3 (3-14) (0,035 mL; 12 equivalentes por molécula de anticorpo) e 1,2-propanodiol (0,266 mL) à temperatura ambiente, e o resultante foi reagido usando um rotador de tubos (MTR-103, AS ONE Corporation) à temperatura ambiente por 48 horas.
[00700] Operação de purificação: A solução foi purificada usando a operação comum D para fornecer 2,5 mL de uma solução do composto desejado.
[00701] Caracterização: Os valores característicos a seguir foram obtidos usando as operações comuns E e F.
[00702] Concentração do anticorpo: 1,01 mg/mL, rendimento do anticorpo: 2,53 mg (73%), número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo (n): 1,9. Exemplo 24: ADC8 [Fórmula 80] ou
245 / 272
[00703] O anel triazol a ser formado na etapa 1 possui isômeros geométricos, e o composto obtido na etapa 1 do Exemplo 24 tem um ligante em uma mistura das duas estruturas mostradas acima como R. Etapa 1: Conjugação de anticorpo e ligante de fármaco
[00704] A uma solução tampão acetato 10 mM, sorbitol 5% (pH 5,5) do anticorpo (2,8 mg/mL, 0,3 mL), obtido na etapa 2 do Exemplo 15, foram adicionados 1,2-propanodiol (75 µL) e uma solução mista com uma solução em dimetilsulfóxido 10 mM do composto obtido na etapa 12 do Exemplo 10- 4 (4-12) (7 µL; 12 equivalentes por molécula de anticorpo) e 1,2-propanodiol (218 µL) à temperatura ambiente, e o resultante foi reagido usando um rotador de tubos (MTR-103, AS ONE Corporation) à temperatura ambiente por 48 horas.
[00705] Operação de purificação: A solução foi purificada usando a operação comum D para fornecer 2,5 mL de uma solução do composto desejado.
[00706] Caracterização: Os valores característicos a seguir foram obtidos usando as operações comuns E e F.
[00707] Concentração do anticorpo: 0,22 mg/mL, rendimento do anticorpo: 0,56 mg (67%), Número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo (n): 1,8. Exemplo 25: ADC9 [Fórmula 81]
246 / 272 ou
[00708] O anel triazol a ser formado na etapa 1 possui isômeros geométricos, e o composto obtido na etapa 1 do Exemplo 25 tem um ligante em uma mistura das duas estruturas mostradas acima como R. Etapa 1: Conjugação de anticorpo e ligante de fármaco
[00709] A uma solução tampão acetato 10 mM, sorbitol 5% (pH 5,5) do anticorpo (2,8 mg/mL, 300 µL), obtido na etapa 2 do Exemplo 15, foram adicionados 1,2-propanodiol (75 µL) e uma solução mista com uma solução em dimetilsulfóxido 10 mM do composto obtido na etapa 10 do Exemplo 10- 5 (5-11) (7 µL; 12 equivalentes por molécula de anticorpo) e 1,2-propanodiol (218 µL) à temperatura ambiente, e o resultante foi reagido usando um rotador de tubos (MTR-103, AS ONE Corporation) à temperatura ambiente por 48 horas.
[00710] Operação de purificação: A solução foi purificada usando a operação comum D para fornecer 2,5 mL de uma solução do composto desejado.
[00711] Caracterização: Os valores característicos a seguir foram obtidos usando as operações comuns E e F.
[00712] Concentração do anticorpo: 0,25 mg/mL, rendimento do anticorpo: 0,62 mg (64%), número médio de moléculas de fármaco conjugado
247 / 272 por molécula de anticorpo (n): 1,8. Exemplo 26: ADC10 [Fórmula 82] ou
[00713] O anel triazol a ser formado na etapa 1 possui isômeros geométricos, e o composto obtido na etapa 1 do Exemplo 26 tem um ligante em uma mistura das duas estruturas mostradas acima como R. Etapa 1: Conjugação de anticorpo e ligante de fármaco
[00714] A uma solução tampão acetato 10 mM, sorbitol 5% (pH 5,5) do anticorpo (2,8 mg/mL, 300 µL), obtido na etapa 2 do Exemplo 15, foram adicionados 1,2-propanodiol (75 µL) e uma solução mista com uma solução em dimetilsulfóxido 10 mM do composto obtido na etapa 12 do Exemplo 10- 6 (6-13) (7 µL; 12 equivalentes por molécula de anticorpo) e 1,2-propanodiol (218 µL) à temperatura ambiente, e o resultante foi reagido usando um rotador de tubos (MTR-103, AS ONE Corporation) à temperatura ambiente por 48 horas.
[00715] Operação de purificação: A solução foi purificada usando a operação comum D para fornecer 2,5 mL de uma solução do composto desejado.
[00716] Caracterização: Os valores característicos a seguir foram
248 / 272 obtidos usando as operações comuns E e F.
[00717] Concentração do anticorpo: 0,25 mg/mL, rendimento do anticorpo: 0,62 mg (74%), número médio de moléculas do fármaco conjugado por molécula de anticorpo (n): 1,8.
[00718] O ADC descrito no Exemplo 27 foi sintetizado, como ilustrado na fórmula de reações a seguir, conjugando o anticorpo obtido na etapa 2 do Exemplo 16 com o ligante de fármaco obtido na etapa 13 do Exemplo 10-3 (3-14). Na fórmula, R representa o ligante de fármaco usado no Exemplo. Exemplo 27: ADC11 [Fórmula 83] Etapa Anticorpo anti-LPS [Fórmula 84]
249 / 272 ou
[00719] O anel triazol a ser formado na etapa 1 possui isômeros geométricos, e o composto obtido na etapa 1 do Exemplo 27 possui dois tipos dos ligantes diferentes na estrutura. Etapa 1: Conjugação de anticorpo e ligante de fármaco
[00720] A uma solução salina com tampão fosfato (pH 6,0) do anticorpo (9,89 mg/mL, 0,40 mL), obtido na etapa 2 do Exemplo 16, foram adicionados 1,2-propanodiol (0,367 mL) e uma solução em dimetilsulfóxido 10 mM do composto obtido na etapa 13 do Exemplo 10-3 (3-14) (0,0328 mL; 12 equivalentes por molécula de anticorpo) à temperatura ambiente, e o resultante foi reagido usando um rotador de tubos (MTR-103, AS ONE Corporation) à temperatura ambiente por 2 dias.
[00721] Operação de purificação: A solução foi purificada usando a operação comum D para fornecer 2,50 mL de uma solução do composto desejado.
[00722] Caracterização: Os valores característicos a seguir foram obtidos usando as operações comuns E e F.
[00723] Concentração do anticorpo: 1,16 mg/mL, rendimento do anticorpo: 2,89 mg (72%), número médio de moléculas de fármaco conjugado
250 / 272 por molécula de anticorpo (n): 1,8. Exemplo 28. Análise da configuração do composto (1-11) mostrada no Exemplo 10-1
[00724] O composto (1-11) descrito no [Exemplo 10-1: intermediário 1] foi analisado quanto à configuração estérica absoluta da posição 11’ com base na correlação (figura a seguir) obtida pelo espectro Selective 1D ROESY. Foi observada correlação entre 1’α-H e 11’-H; entre 3’α-H e 11’-H; e entre 1’β-H e 3’β-H. A partir da análise, verificou-se que a configuração estérica absoluta da posição 11’ é a configuração S. [Fórmula 85] Legenda: Correlação ROESY (tracejado: correlação fraca)
[00725] Correlação significativa obtida no espectro Selective 1D ROESY por RMN 1H, usado na análise de correlação pelo espectro Selective 1D ROESY
[00726] RMN 1H (500 MHz, CDCl3, 27 ºC) δ: 8,76 (1H, s), 7,43 (2H, brd), 7,20 (1H, s), 7,08 (2H, d, J=8,3 Hz), 7,00 (1H, br), 6,66 (1H, s), 6,44 (1H, s), 6,00 (1H, H11’, d, J11’, 11’a = 9,2 Hz), 5,89 (1H, m), 5,53 (1H, brd), 5,30 (1H, d, J = 17,2 Hz), 5,20 (1H, d, J=10,3 Hz), 5,15 (1H, d, JABq = 12,5 Hz), 4,85 (1H, d, JABq = 12,5 Hz), 4,66 (1H, m), 4,604,52 (2H, m), 4,07 (1H, m), 3,84 (3H, s), 3,71 (1H, H-3’ β, d, Jgem = 11,7 Hz), 3,53 (1H, H-11’a, m),
251 / 272 3,26 (1H, H-3’α, d, Jgem = 11,7 Hz), 2,35 (1H, H-1’ β, dd, J1’ β, 11’a = 8,30 Hz, Jgem = 13.1 Hz), 2,14 (1H, m), 1,54 (1H, H-1’ α, d, Jgem = 13.1 Hz), 1,41 (3H, d, J = 6,90 Hz), 0,95 (3H, d, J = 6,80 Hz), 0,92 (3H, d, J = 6,80 Hz), 0,81 (9H, s), 0,80-0,70 (1H, m), 0,70-0,59 (3H, m), 0,2-0,06 (6H, m)
[00727] Como resultado, determinou-se que as configurações estéricas absolutas dos ligantes de fármaco 1,2 e 4 e a posição 11’ desses intermediários sintéticos, os quais foram sintetizados utilizando os compostos (1-9), (1-10) e (1-11) descritos no [Exemplo 10-1: Intermediário 1] e compostos (1-11), são cada uma S. Foi também determinado que as configurações estéricas absolutas do ligante de fármaco 3 e de um intermediário (a posição 11’) são cada uma S.
[00728] Consequentemente, as etapas 1 a 10 descritas no [Exemplo 10- 1: intermediário 1] são mostradas como segue: [Fórmula 86] Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa
[00729] (1-9): N-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4- [({[(11’S,11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi-5’-oxo-8’-{[tri(propan-2-il)silil]oxi}- 11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (1-10): N-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4- [({[(11’S,11a’S)-11’-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-7’-metoxi-5’-oxo-8’-
252 / 272 {[tri(propan-2-il)silil]oxi}-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L- alaninamida (1-11): N-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4- [({[(11’S,11a’S)-11’-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-8’-hidroxi-7’-metoxi-5’- oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1- c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida
[00730] As etapas 1 a 13 mostradas no [Exemplo 10-3: Ligante de fármaco 1] são mostradas como segue: [Fórmula 87] Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa
[00731] (3-11): N-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4- [({[(11’S,11a’S)-11’-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-7’-metoxi-8’-{[5- ({(11aS)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-10-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]- 5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-8- il}oxi)pentil]oxi}-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L- alaninamida
253 / 272 (3-12): N-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4- [({[(11’S,11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi-8’-{[5-({(11aS)-7-metoxi-2-(4- metoxifenil)-5-oxo-10-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-5,10,11,11a-tetrahidro- 1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-8-il}oxi)pentil]oxi}-5’-oxo-11’,11a’- dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]- 10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (3-13): L-valil-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi- 8’-[(5-{[(11aS)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-5,10,11,11a-tetrahidro-1H- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-8-il]oxi}pentil)oxi]-5’-oxo-11’,11a’-dihidro- 1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)- il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (3-13) (3-14): N-[4-(11,12-didehidrodibenzo[b,f]azocina-5(6H)-il)-4- oxobutanoil]glicilglicil-L-valil-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi- 8’-[(5-{[(11aS)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-5,10,11,11a-tetrahidro-1H- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-8-il]oxi}pentil)oxi]-5’-oxo-11’,11a’-dihidro- 1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)- il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida
[00732] As etapas 1 a 12 mostradas no [Exemplo 10-4: Ligante de fármaco 2] são mostradas como segue. [Fórmula 88]
254 / 272 Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa
[00733] (4-9): N-{[(prop-2-en-1-il)oxi]carbonil}-L-valil-N-[4- ({[(11’S,11’aS)-11’-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-7’-metoxi-8’-(3-{[(11aS)- 7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-10-{[(prop-2-en-1-il)oxi]carbonil}- 5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-8- il]oxi}propoxi)-5’-oxo-11’,11’a-dihidro-1’H,3’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-carbonil]oxi}metil)fenil]-L- alaninamida (4-10): N-{[(prop-2-en-1-il)oxi]carbonil}-L-valil-N-[4- ({[(11’S,11’aS)-11’-hidroxi-7’-metoxi-8’-(3-{[(11aS)-7-metoxi-2-(4- metoxifenil)-5-oxo-10-{[(prop-2-en-1-il)oxi]carbonil}-5,10,11,11a-tetrahidro- 1H-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-8-il]oxi}propoxi)-5’-oxo-11’,11’a- dihidro-1’H,3’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]- 10’(5’H)-carbonil]oxi}metil)fenil]-L-alaninamida (4-11): L-valil-N-[4-({[(11’S,11’aS)-11’-hidroxi-7’-metoxi-8’- (3-{[(11aS)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-5,10,11,11a-tetrahidro-1H- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-8-il]oxi}propoxi)-5’-oxo-11’,11’a-dihidro-
255 / 272 1’H,3’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)- carbonil]oxi}metil)fenil]-L-alaninamida (4-12): N-[4-(11,12-didehidrodibenzo[b,f]azocina-5(6H)-il)-4- oxobutanoil]glicilglicil-L-valil-N-[4-({[(11’S,11’aS)-11’-hidroxi-7’-metoxi- 8’-(3-{[(11aS)-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-5-oxo-5,10,11,11a-tetrahidro-1H- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina-8-il]oxi}propoxi)-5’-oxo-11’,11’a-dihidro- 1’H,3’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)- carbonil]oxi}metil)fenil]-L-alaninamida
[00734] As etapas 1 a 10 mostradas no [Exemplo 10-5: Ligante de fármaco 3] são mostradas como segue. [Fórmula 89] Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa
[00735] (5-9): N-[(2-propen-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4- [({[(11’S,11a’S)-11’-hidroxi-8’-{[5-({(11’S,11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi-5’- oxo-10’-[(2-propen-1-iloxi)carbonil]-5’,10’,11’,11a’-tetrahidro-1’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-8’- il}oxi)pentil]oxi}-7’-metoxi-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano- 1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}- L-alaninamida (5-10): L-valil-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi- 8’-[(5-{[(11a’S)-7’-metoxi-5’-oxo-5’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-
256 / 272 1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-8’-il]oxi}pentil)oxi]-5’-oxo-11’,11a’- dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]- 10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida (5-11): N-[4-(11,12-didehidrodibenzo[b,f]azocina-5(6H)-il)-4- oxobutanoil]glicilglicil-L-valil-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi- 8’-[(5-{[(11a’S)-7’-metoxi-5’-oxo-5’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano- 1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-8’-il]oxi}pentil)oxi]-5’-oxo-11’,11a’- dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]- 10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L-alaninamida
[00736] As etapas 1 a 12 mostradas no [Exemplo 10-6: Ligante de fármaco 4] são mostradas como segue: [Fórmula 90] Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa Etapa
[00737] (6-10): N-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4- [({[(11’S,11a’S)-11’-{[terc-butil(dimetil)silil]oxi}-7’-metoxi-8’-{[5- ({(11a’S)-7’-metoxi-5’-oxo-10’-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-5’,10’,11’,11a’- tetrahidro’H-spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-8’-
257 / 272 il}oxi)pentil]oxi}-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L- alaninamida (6-11): N-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-L-valil-N-{4- [({[(11’S,11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi-8’-{[5-({(11a’S)-7’-metoxi-5’-oxo- 10’-[(prop-2-en-1-iloxi)carbonil]-5’,10’,11’,11a’-tetrahidro-1’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-8’- il}oxi)pentil]oxi}-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L- alaninamida (6-12): L-valil-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi- 8’-[(5-{[(11a’S)-7’-metoxi-5’-oxo-5’,10’,11’,11a’-tetrahidro-1’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-8’- il]oxi}pentil)oxi]-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L- alaninamida (6-13): N-[4-(11,12-didehidrodibenzo[b,f]azocina-5(6H)-il)-4- oxobutanoil]glicilglicil-L-valil-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-hidroxi-7’-metoxi- 8’-[(5-{[(11a’S)-7’-metoxi-5’-oxo-5’,10’,11’,11a’-tetrahidro-1’H- spiro[ciclopropano-1,2’-pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-8’- il]oxi}pentil)oxi]-5’-oxo-11’,11a’-dihidro-1’H-spiro[ciclopropano-1,2’- pirrol[2,1-c][1,4]benzodiazepina]-10’(5’H)-il]carbonil}oxi)metil]fenil}-L- alaninamida
[00738] Nas fórmulas dos ADCs obtidos nos Exemplos 17 a 27, R representa o seguinte.
[00739] R descrito no Exemplo 17, 21,22, 23 ou 27: [Fórmula 91]
258 / 272 ou
R descrito no Exemplo 18 ou 24: [Fórmula 92]
ou
259 / 272
R descrito no Exemplo 19 ou 25: [Fórmula 93]
ou
R descrito no Exemplo 20 ou 26: [Fórmula 94]
ou
Exemplo de Referência 2: Produção de conjugado NOV0712-fármaco
260 / 272 Exemplo de Referência 2)-1 Produção de conjugado anticorpo-fármaco NOV0712-DM4
[00740] Conjugação de anticorpo e ligante de fármaco: NOV0712 produzido no Exemplo de Referência 1 foi ajustado para 9,7 mg/mL com HEPES8,1 20 mM (Solução tampão HEPES 1 M (20 mL) fabricada pela Life Technologies Corp. teve o pH ajustado para 8,1 com hidróxido de sódio 1 M e, então, levada a 1 L com água destilada), utilizando os procedimentos comuns B (usando 1,51 mLmg-1cm-1 como coeficiente de absorção a 280 nm) e C descrito no método de produção 1. A solução foi incubada a 20 ºC por 10 minutos. Subsequentemente, uma solução 10 mM de ácido 1-(2,5- dioxopirrolidin-1-iloxi)-1-oxo-4-(piridin-2-ildisulfanil)butano-2-sulfônico, descrito em WO2016/024195, em DMA (0,366 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo), uma solução 10 mM de N2’-deacetil-deacetil-N2’-(4- metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (DM4) em DMA (0,366 mL; 6,8 equivalentes por molécula de anticorpo) e 0,243 mL de DMA foram adicionados à mesma, e a mistura obtida foi incubada a 20 ºC por 16 horas para conjugação do ligante de fármaco ao anticorpo. Subsequentemente, adicionou-se uma solução aquosa de ácido acético 1 M à mesma para ajustar o pH para 5,0, e a mistura obtida foi adicionalmente agitada à temperatura ambiente por 20 minutos para encerrar a reação do ligante de fármaco.
[00741] Purificação: a solução descrita acima foi purificada pelo procedimento comum D, descrito no método de produção 1, para obter 28 mL de uma solução contendo o conjugado anticorpo-fármaco “NOV0712-DM4” do título.
[00742] Caracterização: Usando o procedimento comum E (com εA,280 = 200500, εA,252 = 76295, εD,280 = 43170 e εD,252 = 23224), descrito no método de produção 1, os valores característicos a seguir foram obtidos.
[00743] Concentração do anticorpo: 2,58 mg/mL, rendimento do
261 / 272 anticorpo: 72,2 mg (93%), número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo (n): 3,0. Exemplo 29: Avaliação da atividade in vitro do conjugado anticorpo-fármaco
[00744] Avaliação da atividade in vitro de inibição do crescimento do conjugado anticorpo-fármaco contra linhagem de células tumorais humanas positivas para CDH6
[00745] Linhagens celulares de tumor ovariano humano NIH:OVCAR- 3, OV-90 e PA-1, e a linhagem de células 786-O de tumor de células renais humanas (todas obtidas da ATCC), nas quais a expressão de CDH6 foi confirmada no Exemplo 2)-3, foram cultivadas sob condições de 37 ºC e CO2 5% e semeadas sobre uma placa de 96 poços, de modo que cada linhagem celular tivesse uma densidade (por 100 µL/poço) descrita na Figura 9, e cultivadas sob condições de 37 ºC e CO2. No dia seguinte, cada um dos conjugados anticorpo-fármaco, por exemplo, ADC11 (preparado no Exemplo 27), ADC1 (preparado no Exemplo 17), ADC5 (preparado no Exemplo 21), ADC7 (preparado no Exemplo 23) e ADC6 (preparado no Exemplo 22), diluído em uma razão comum de 5 vezes, foi adicionado para que fosse obtida uma concentração final de 100 (nM) a 0,000256 (nM). Depois de cultivadas por 6 dias, o número de células vivas foi medido pela quantificação de ATP utilizando o ensaio de viabilidade celular CellTiter-GloTM Luminescent Cell (Promega). O valor de IC50, representando a atividade inibitória do crescimento celular, foi calculado de acordo com a expressão seguinte e a terceira casa após a vírgula decimal foi arredondada para a segunda casa.
[00746] IC50 (nM) = antilog ((50-d) × (LOG10(b)-LOG10(a)) / (d-c) + LOG10 (b)) a: concentração do agente em teste a b: concentração do agente em teste b c: taxa de células viáveis na concentração do agente em teste a d: taxa de células viáveis na concentração do agente em teste b
262 / 272 a, b satisfazem a relação: a > b em dois pontos situados entre uma taxa de células viáveis de 50%
[00747] Os valores de IC50 (nM) de linhagens celulares, às quais são adicionados os conjugados anticorpo-fármaco individuais, são mostrados na Figura 9. Nas três linhagens celulares de tumor ovariano exibindo um nível de expressão alto de CDH6 in vitro, os valores de IC50 de três tipos de conjugados anticorpo anti-CDH6-fármaco são extremamente baixos, em comparação ao valor de IC50 de ADC11, ou seja, um conjugado anticorpo- fármaco que não se liga a CDH6. A partir disso, demonstrou-se que esses três tipos de conjugados anticorpo anti-CDH6-fármaco têm uma atividade inibitória do crescimento celular extremamente forte de maneira específica para expressão de CDH6, além disso, a atividade de ligação (Tabela 3) de um anticorpo contra CDH6 correlaciona-se com a atividade inibitória do crescimento celular de um conjugado anticorpo-fármaco. Em uma linhagem celular de tumor de células renais com baixo nível de expressão de CDH6 in vitro, uma tendência semelhante foi também confirmada (Figura 9). Exemplo 30: Efeito antitumoral 1 in vivo do conjugado anticorpo-fármaco
[00748] Os efeitos antitumorais dos conjugados anticorpo-fármaco foram avaliados usando modelos animais derivados de camundongos imunodeficientes pela inoculação de células de linhagens celulares de tumores humanos positivos para CDH6. Camundongos BALB/c nude de quatro a cinco semanas de idade (CAnN.Cg-Foxnl[nu]/CrlCrlj[Foxnlnu/Foxnlnu], Charles River Laboratories Japan Inc.) e camundongos SCID (CB17/Icr- Prkdc[scid]/CrlCrlj, Charles River Laboratories Japan Inc.) foram aclimatizados por 3 dias ou período mais longo sob condições SPF antes do uso no experimento. Os camundongos foram alimentados com uma dieta sólida esterilizada (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) e receberam água corrente esterilizada (que havia sido preparada pela adição de solução de hipoclorito de sódio 5 a 15 ppm à água corrente). O diâmetro longo e o
263 / 272 diâmetro curto do tumor inoculado foram medidos duas vezes por semana com paquímetros digitais eletrônicos (CD-15CX, Mitutoyo Corp.), e o volume do tumor foi então calculado de acordo com a expressão seguinte: Volume do tumor (mm3) = 1/2 × Diâmetro longo (mm) × [Diâmetro curto (mm)]2
[00749] Cada conjugado anticorpo-fármaco foi diluído com tampão ABS (tampão acetato 10 mM, sorbitol 5%, pH 5,5) (Nacalai Tesque, Inc.), e a diluição foi administrada por via intravenosa na dose mostrada em cada Exemplo à cauda de cada camundongo. O tampão ABS foi administrado da mesma maneira que acima a um grupo controle (grupo veículo). Seis camundongos por grupo foram usados nos experimentos. 30)-1 Efeito antitumoral (1)
[00750] A linhagem de células OV-90 de tumor ovariano humano, positivas para CDH6 (ATCC), nas quais a expressão de CDH6 foi confirmada no Exemplo 2)-3, foi suspensa em Matrigel (Corning Inc.), e a suspensão celular foi inoculada por via subcutânea em uma dose de 2,5 × 106 células à região do flanco direito de cada camundongo nude fêmea (Dia 0). No Dia 14, os camundongos foram agrupados aleatoriamente. No dia do agrupamento, ADC1 produzido no Exemplo 17 ou ADC11 produzido no Exemplo 27 foi administrado por via intravenosa em doses de 0,4 mg/kg à cauda de cada camundongo. Além disso, NOV0712-DM4 produzido no Exemplo de Referência 2)-1 foi administrado por via intravenosa em doses de 10 mg/kg à cauda de cada camundongo. Os resultados são mostrados na Figura 10. A abscissa representa o número de dias após a administração, e a ordenada representa o volume do tumor. A faixa de erro representa um valor de SE.
[00751] Nesse modelo de tumor administrado com NOV0712-DM4, novo crescimento do tumor foi observado 30 dias após a administração; no entanto, ADC1 exibiu um forte efeito de regressão do tumor em uma dose extremamente baixa de 0,4 mg/kg e sustentou o forte efeito antitumoral por
264 / 272 um período longo de 42 dias após a administração. ADC11, como controle, que não se liga nem às células tumorais do camundongo, nem às células tumorais humanas inoculadas usadas no teste antitumoral, não mostrou efeito antitumoral. Confirmou-se que não houve perda de peso em todos os grupos de administração do fármaco, em comparação ao grupo controle (o grupo de administração de tampão ABS). 30)-2 Efeito antitumoral (2)
[00752] A linhagem de células Caki-1de tumor humano de células renais, positivas para CDH6 (ATCC), nas quais a expressão de CDH6 foi confirmada no Exemplo 2)-3, foi suspensa em Matrigel (Corning Inc.), e a suspensão celular foi inoculada por via subcutânea em uma dose de 2,5 × 106 células à região do flanco direito de cada camundongo nude fêmea (Dia 0). No Dia 13, os camundongos foram agrupados aleatoriamente. No dia do agrupamento, o conjugados anticorpo-fármaco ADC1 produzido no Exemplo 17 ou ADC11 produzido no Exemplo 27 foram administrados por via intravenosa em uma dose de 0,4 mg/kg à cauda de cada camundongo. Além disso, NOV0712-DM4 produzido no Exemplo de Referência 2)-1 foi administrado por via intravenosa em doses de 10 mg/kg à cauda de cada camundongo. Os resultados são mostrados na Figura 11. A abscissa representa o número de dias após a administração, e a ordenada representa o volume do tumor. A faixa de erro representa um valor de SE.
[00753] Nesse modelo de tumor, NOV0712-DM4 não exibiu efeito antitumoral na dose de 10 mg/kg. Por outro lado, ADC1 exerceu um efeito antitumoral em uma dose extremamente baixa de 0,4 mg/kg. ADC11, como controle, que não se liga nem às células tumorais do camundongo, nem às células tumorais humanas inoculadas usadas no teste antitumoral, não mostrou efeito antitumoral em uma dose de 0,4 mg/kg (Figura 11). A partir disso, foi mostrado que o efeito antitumoral exibido por ADC1 é especificamente obtido dependendo da expressão de CDH6 em células
265 / 272 tumorais. Demonstrou-se que ADC1 da presente invenção é um conjugado anticorpo-fármaco tendo efeito antitumoral extremamente forte em comparação ao conjugado convencional, NOV0712-DM4. Confirmou-se que não houve perda de peso em todos os grupos de administração do fármaco, em comparação ao grupo controle (o grupo de administração de tampão ABS). 30)-3 Efeito antitumoral (3)
[00754] A linhagem de células NIH:OVCAR-3 de tumor ovariano humano, positivas para CDH6 (ATCC), nas quais a expressão de CDH6 foi confirmada no Exemplo 2)-3, foi suspensa em Matrigel (Corning Inc.), e a suspensão celular foi inoculada por via subcutânea em uma dose de 1 × 107 células à região do flanco direito de cada camundongo nude fêmea (Dia 0). No Dia 28, os camundongos foram agrupados aleatoriamente. No dia do agrupamento, ADC1 produzido no Exemplo 17, ADC5 produzido no Exemplo 21, ADC6 produzido no Exemplo 22 ou ADC11 produzido no Exemplo 27 foi administrado por via intravenosa em doses de 0,4 mg/kg à cauda de cada camundongo. Os resultados são mostrados na Figura 12. A abscissa representa o número de dias após a administração, e a ordenada representa o volume do tumor. A faixa de erro representa um valor de SE.
[00755] Nesse modelo de tumor, ADC6 exibiu o efeito antitumoral mais forte, ADC1 e ADC5 exibiram quase o mesmo segundo efeito antitumoral mais forte. A partir disso, foi mostrado que a substituição de resíduos de leucina nas posições 234 e 235 (especificadas com base no índice EU) de uma cadeia pesada de anticorpo humano por resíduos de alanina quase nunca afeta o efeito antitumoral de um conjugado anticorpo-fármaco. ADC11 como controle não exibiu um efeito antitumoral em uma dose de 0,4 mg/kg (Figura 12). A partir disso, foi mostrado que os efeitos antitumorais exibidos por ADC1, ADC5 e ADC6 são especificamente obtidos dependendo da expressão de CDH6 em células tumorais. Confirmou-se que não houve perda
266 / 272 de peso em todos os grupos de administração do fármaco, em comparação ao grupo controle (o grupo de administração de tampão ABS). 30)-4 Efeito antitumoral (4)
[00756] A linhagem de células OV-90 de tumor ovariano humano, positivas para CDH6 (ATCC), nas quais a expressão de CDH6 foi confirmada no Exemplo 2)-3, foi suspensa em Matrigel (Corning Inc.), e a suspensão celular foi inoculada por via subcutânea em uma dose de 2,5 × 106 células à região do flanco direito de cada camundongo nude fêmea (Dia 0). No Dia 17, os camundongos foram agrupados aleatoriamente. No dia do agrupamento, ADC1 produzido no Exemplo 17, ADC5 produzido no Exemplo 21, ADC7 produzido no Exemplo 23 ou ADC6 produzido no Exemplo 22 foi administrado por via intravenosa em doses de 0,2 mg/kg ou 0,4 mg/kg à cauda de cada camundongo. Os resultados são mostrados na Figura 13. A abscissa representa o número de dias após a administração, e a ordenada representa o volume do tumor. A faixa de erro representa um valor de SE.
[00757] Nesse modelo de tumor, ADC5 e ADC6 exibiram cada um o efeito antitumoral mais forte em uma dose de 0,4 mg/kg e ADC7 exibiu o segundo efeito antitumoral mais forte em uma dose de 0,4 mg/kg (Figura 13). A partir dos resultados da administração de ADC5 (0,4 mg/kg) e ADC5 (0,2 mg/kg), confirmou-se que o efeito antitumoral muda dependendo da dose. Em uma dose de 0,2 mg/kg, ADC1 e ADC5 exibiram substancialmente o mesmo efeito antitumoral. A partir disso, foi demonstrado que a substituição de resíduos de leucina nas posições 234 e 235 (especificadas com base no índice EU) de uma cadeia pesada de anticorpo humano por resíduos de alanina resíduos quase nunca afeta o efeito antitumoral de um conjugado anticorpo- fármaco. Confirmou-se que não houve perda de peso em todos os grupos de administração do fármaco, em comparação ao grupo controle (o grupo de administração de tampão ABS). 30)-5 Efeito antitumoral (5)
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[00758] A linhagem de células PA-1 do tumor ovariano humano, positivas para CDH6 humana (ATCC), cuja expressão CDH6 havia sido confirmada no Exemplo 2)-3, foi suspensa em Matrigel (Corning Inc.), e a suspensão celular foi inoculada por via subcutânea em uma dose de 7,5 × 106 células à região do flanco direito de cada camundongo nude fêmea (Dia 0). No Dia 17, os camundongos foram agrupados aleatoriamente. No dia do agrupamento, ADC5 produzido no Exemplo 21, ADC6 produzido no Exemplo 22 ou ADC11 produzido no Exemplo 27 foi administrado por via intravenosa em doses de 0,4 mg/kg à cauda de cada camundongo. Os resultados são mostrados na Figura 14. A abscissa representa o número de dias após a administração, e a ordenada representa o volume do tumor. A faixa de erro representa um valor de SE.
[00759] Nesse modelo de tumor, ADC5 exibiu o efeito antitumoral mais forte. Confirmou-se que tumores não são observados por um período longo de 35 dias. ADC6 exibiu o segundo efeito antitumoral mais forte (Figura 14). Confirmou-se que não houve perda de peso em todos os grupos de administração do fármaco, em comparação ao grupo controle (o grupo de administração de tampão ABS). 30)-6 Efeito antitumoral (6)
[00760] A linhagem de células 786-O de tumor humano de células renais positivas para CDH6 (ATCC), nas quais a expressão de CDH6 foi confirmada no Exemplo 2)-3, foi suspensa em Matrigel (Corning Inc.), e a suspensão celular foi inoculada por via subcutânea em uma dose de 5 × 106 células à região do flanco direito de cada camundongo SCID macho (Dia 0). No Dia 38, os camundongos foram agrupados aleatoriamente. No dia do agrupamento, ADC5 produzido no Exemplo 21 ou ADC6 produzido no Exemplo 22 foi administrado por via intravenosa em uma dose de 0,4 mg/kg à cauda de cada camundongo. Além disso, ADC11 produzido no Exemplo 27 foi administrado por via intravenosa em uma dose de 0,4 mg/kg à cauda de
268 / 272 cada camundongo. Os resultados são mostrados na Figura 15. A abscissa representa o número de dias após a administração, e the ordenada representa o volume do tumor. A faixa de erro representa um valor de SE.
[00761] Nesse modelo de tumor, ADC5 e ADC6 exibiram um forte efeito antitumoral (Figura 15). ADC11 (controle) não exibiu efeito antitumoral (Figura 15). A partir disso, foi mostrado que efeitos antitumorais de ADC5 e ADC6 são especificamente obtidos dependendo da expressão de CDH6 em células tumorais. Confirmou-se que não há perda de peso em todos os grupos de administração do fármaco, em comparação ao grupo controle (o grupo de administração de tampão ABS). Aplicabilidade industrial
[00762] A presente invenção provê um anticorpo anti-CDH6 tendo atividade de internalização e um conjugado anticorpo-fármaco compreendendo o anticorpo. O conjugado anticorpo-fármaco pode ser utilizado como um fármaco terapêutico para câncer e semelhantes. Texto livre da listagem de sequências
[00763] SEQ ID No: 1: ORF de CDH6 humana SEQ ID No: 2: EC1 SEQ ID No: 3: EC2 SEQ ID No: 4: EC3 SEQ ID No: 5: EC4 SEQ ID No: 6: EC5 SEQ ID No: 7: ORF de CDH6 de macaco cynomolgus SEQ ID No: 8: Primer 1 de CDH6 de macaco cynomolgus SEQ ID No: 9: Primer 2 de CDH6 de macaco cynomolgus SEQ ID No: 10: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de rG019 SEQ ID No: 11: Sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve de rG019
269 / 272
SEQ ID No: 12: CDRL1 de rG019 SEQ ID No: 13: CDRL2 de rG019 SEQ ID No: 14: CDRL3 de rG019 SEQ ID No: 15: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de rG019 SEQ ID No: 16: Sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada de rG019 SEQ ID No: 17: CDRH1 de rG019 SEQ ID No: 18: CDRH2 de rG019 SEQ ID No: 19: CDRH3 de rG019 SEQ ID No: 20: Fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a sequência sinal da cadeia leve humana e a região constante da cadeia κ humana SEQ ID No: 21: Fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a sequência sinal da cadeia pesada humana e a região constante de IgG1 humana SEQ ID No: 22: Fragmento de DNA compreendendo um fragmento de DNA que codifica a cadeia leve de chG019 SEQ ID No: 23: Sequência completa de aminoácidos da cadeia leve de chG019 SEQ ID No: 24: Sequência nucleotídica completa da cadeia leve de chG019 SEQ ID No: 25: Sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve de chG019 SEQ ID No: 26: Sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada de chG019 SEQ ID No: 27: Sequência nucleotídica completa da cadeia pesada de chG019 SEQ ID No: 28: Sequência de aminoácidos da região variável
270 / 272 da cadeia pesada de chG019 SEQ ID No: 29: Sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada de chG019 SEQ ID No: 30: CDRH2 de chG019 SEQ ID No: 31: Sequência completa de aminoácidos da cadeia leve hL02 SEQ ID No: 32: Sequência nucleotídica completa da cadeia leve hL02 SEQ ID No: 33: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve hL02 SEQ ID No: 34: Sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve hL02 SEQ ID No: 35: Sequência completa de aminoácidos da cadeia leve hL03 SEQ ID No: 36: Sequência nucleotídica completa da cadeia leve hL03 SEQ ID No: 37: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve hL03 SEQ ID No: 38: Sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia leve hL03 SEQ ID No: 39: Sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH01 SEQ ID No: 40: Sequência nucleotídica completa da cadeia pesada hH01 SEQ ID No: 41: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH01 SEQ ID No: 42: Sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada hH01 SEQ ID No: 43: Sequência completa de aminoácidos da cadeia
271 / 272 pesada hH02 SEQ ID No: 44: Sequência nucleotídica completa da cadeia pesada hH02 SEQ ID No: 45: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH02 SEQ ID No: 46: Sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada hH02 SEQ ID No: 47: Sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH04 SEQ ID No: 48: Sequência nucleotídica completa da cadeia pesada hH04 SEQ ID No: 49: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH04 SEQ ID No: 50: Sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada hH04 SEQ ID No: 51: Sequência completa de aminoácidos da cadeia leve de NOV0712 SEQ ID No: 52: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID No. 51 SEQ ID No: 53: Sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada de NOV0712 SEQ ID No: 54: Sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID No. 53 SEQ ID No: 55: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH11 SEQ ID No: 56: Sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada hH11 SEQ ID No: 57: CDRH1 de hH11 SEQ ID No: 58: CDRH2 de hH11
272 / 272
SEQ ID No: 59: CDRH3 de hH11 SEQ ID No: 60: Sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada hH31 SEQ ID No: 61: Sequência de nucleotídeos da região variável da cadeia pesada hH31 SEQ ID No: 62: CDRH1 de hH31 SEQ ID No: 63: CDRH2 de hH31 SEQ ID No: 64: CDRH3 de hH31 SEQ ID No: 65: Sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH01A SEQ ID No: 66: Sequência nucleotídica completa da cadeia pesada hH01A SEQ ID No: 67: Sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH11A SEQ ID No: 68: Sequência nucleotídica completa da cadeia pesada hH11A SEQ ID No: 69: Sequência completa de aminoácidos da cadeia pesada hH31A SEQ ID No: 70: Sequência nucleotídica completa da cadeia pesada hH31A SEQ ID No: 71: Fragmento de DNA compreendendo a sequência de DNA que codifica a sequência de aminoácidos da sequência sinal da cadeia pesada humana e região constante de IgG1 LALA humana SEQ ID No: 72: Sequência completa de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo anti-LPS SEQ ID No: 73: Sequência completa da cadeia pesada do anticorpo anti-LPS

Claims (34)

1 / 34 REIVINDICAÇÕES
1. Conjugado anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de ser representado pela seguinte fórmula (X): [Fórmula 1] glicano em que m2 representa um número inteiro igual a 1 ou 2, Ab representa um anticorpo IgG que se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4 e tendo capacidade de internalização que permite absorção celular, ou um fragmento funcional do mesmo, L representa um ligante que liga um glicano unido ao N297 de Ab (N297 glicano) e D, N297 glicano pode ser um glicano remodelado e D é qualquer uma das seguintes fórmulas: [Fórmula 2] ou em que o asterisco (*) representa a união ao L.
2. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo, ou um fragmento funcional do mesmo, exibe atividade inibitória competitiva pela ligação à sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4, contra ao menos qualquer anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste nos anticorpos seguintes (1) a (8):
2 / 34
(1) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 23 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 26, (2) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 39, (3) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 43, (4) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 43, (5) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 47, (6) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 65, (7) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 67 e
3 / 34 (8) um anticorpo com uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 69.
3. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende CDRL1, CDRL2 e CDRL3; e CDRH1, CDRH2 e CDRH3 selecionadas a partir do grupo que consiste nas seguintes (1) a (4): (1) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14; e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 18 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 19, (2) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID No: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14; e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 30 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 19, (3) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14; e CDRH1 que
4 / 34 consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 57, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 58 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 59 e (4) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14 e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 62, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 63 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:
64.
4. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende qualquer região variável de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste nas regiões variáveis seguintes (1) a (4): (1) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33, (2) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 37, (3) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 95% com a sequência de uma região framework, exceto as sequências de CDR na sequência de aminoácidos de (1) ou (2) e (4) uma sequência de aminoácidos com uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de uma região framework, exceto as sequências de CDR nas sequências de aminoácidos de (1) a (3); e
5 / 34 qualquer região variável de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste nas regiões variáveis seguintes (5) a (11): (5) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 41, (6) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 45, (7) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 49, (8) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 55, (9) uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 60, (10) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de pelo menos 95% com a sequência de uma região framework que não seja cada sequência de CDR nas sequências de aminoácidos de (5) a (9) e (11) uma sequência de aminoácidos com uma deleção, substituição ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de uma região framework que não seja cada sequência de CDR nas sequências de aminoácidos de (5) a (10).
5. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende qualquer uma das seguintes (1) a (6): (1) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 41, (2) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável
6 / 34 de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 45, (3) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 37 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 45, (4) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 49, (5) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 55 e (6) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 60.
6. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo possui qualquer uma das seguintes (1) a (7): (1) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 39, (2) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 43,
7 / 34 (3) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 43, (4) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 47, (5) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 65, (6) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 67 e (7) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 69.
7. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo possui uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 39.
8. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo possui uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 43.
9. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento
8 / 34 funcional do mesmo possui uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 43.
10. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo possui uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 47.
11. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo possui uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 65.
12. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo possui uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 67.
13. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo possui uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 69.
9 / 34
14. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que: L é representado por -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*, em que o asterisco * representa a união ao átomo de nitrogênio na posição N10’ de D, B representa um grupo 1,4-fenila, um grupo 2,5-piridila, um grupo 3,6-piridila, um grupo 2,5-pirimidila ou um grupo 2,5-tienila, Lp representa qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em: -GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, - GGVK- e -GGPL-, La representa qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em: -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-, -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-, -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-, -C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -CH2-OC(=O)- e -OC(=O)-, e Lb representa a fórmula seguinte: [Fórmula 3] ou [Fórmula 4]
10 / 34 ou [Fórmula 5] ou em que, em cada fórmula estrutural de Lb mostrada acima, cada asterisco * representa a união ao La, e cada linha ondulada representa a união ao glicano apresentado por Ab ou um glicano remodelado.
15. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que: L representa qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste nas fórmulas estruturais seguintes: -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B- CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA- NH-B-CH2-OC(=O)-,
11 / 34
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)- VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- e -Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- em que Z1 representa a fórmula estrutural seguinte: [Fórmula 6]
ou
Z2 representa a fórmula estrutural seguinte: [Fórmula 7]
ou
Z3 representa a fórmula estrutural seguinte: [Fórmula 8]
ou em que, em cada fórmula estrutural representada por Z1, Z2 e Z3, cada asterisco * representa a união ao C(=O), O ou CH2 vizinho de Z1, Z2 ou Z3; cada linha ondulada representa a união ao glicano apresentado por Ab ou um glicano remodelado, e B representa um grupo 1,4-fenila.
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16. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que: L representa qualquer um selecionado a partir do grupo que consiste em: -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-, - Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA- NH-B-CH2-OC(=O)- e -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)- VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, em que B representa um grupo 1,4-fenila e Z1 representa a fórmula estrutural seguinte: [Fórmula 9] ou em que, na fórmula estrutural para Z1, cada asterisco * representa a união ao C(=O) vizinho de Z1 e cada linha ondulada representa a união ao glicano a união ao N297 de Ab (N297 glicano) ou a união a um glicano remodelado.
17. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é IgG1, IgG2 ou IgG4.
13 / 34
18. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o N297 glicano é um glicano remodelado.
19. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o N297 glicano é N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, ou uma mistura dos mesmos, ou N297-(Fuc)SG, com N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 e N297-(Fuc)SG tendo as estruturas representadas pelas seguintes fórmulas: [Fórmula 10] [Fórmula 11] [Fórmula 12] em que a linha ondulada representa a união ao Asn297 do anticorpo, *-L(PEG)-, no N297 glicano, representa *-(CH2CH2-O)n5- CH2CH2-NH-, em que n5 representa um número inteiro de 2 a 5, o grupo amino na extremidade direita é unido, por meio de uma ligação amida, ao ácido carboxílico na posição 2 do ácido siálico no terminal não redutor em cada uma ou qualquer uma das cadeias ramificadas 1-3 e 1-6 do β-Man no
14 / 34 N297 glicano, e cada asterisco * representa a união ao átomo de nitrogênio na posição 1 ou 3 do anel triazol nas fórmulas estruturais individuais.
20. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que n5 representa 3.
21. Conjugado anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de ser representado pela seguinte fórmula (XII): [Fórmula 13] glicano ou glicano em que, em cada fórmula estrutural mostrada acima, m2 representa um número inteiro igual a 1 ou 2, Ab representa um anticorpo IgG que se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4 e tendo capacidade de internalização que permite absorção celular, ou um fragmento funcional do mesmo, o N297 glicano de Ab representa qualquer um dentre N297- (Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, e uma mistura dos mesmos, e N297- (Fuc)SG, com N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 e N297-(Fuc)SG tendo as estruturas representadas pelas seguintes fórmulas,
15 / 34 [Fórmula 14] [Fórmula 15] [Fórmula 16] em que cada linha ondulada representa a união ao Asn297 (N297) do anticorpo, *-L(PEG)-, no N297 glicano, representa *-(CH2CH2-O)3- CH2CH2-NH-, em que: o grupo amino na extremidade direita é unido, por meio de uma ligação amida, ao ácido carboxílico na posição 2 do ácido siálico no terminal não redutor em cada uma ou qualquer uma das cadeias ramificadas 1-3 e 1-6 do β-Man no N297 glicano, e cada asterisco * representa a união ao átomo de nitrogênio na posição 1 ou 3 do anel triazol na fórmula estrutural correspondente.
22. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o composto representado pela fórmula (XII) é representado pela seguinte fórmula (XII’): [Fórmula 17]
16 / 34 glicano ou glicano
23. Conjugado anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de ser representado pela seguinte fórmula (XIII): [Fórmula 18] glicano ou glicano
17 / 34 em que, em cada fórmula estrutural mostrada acima, m2 representa um número inteiro igual a 1 ou 2, Ab representa um anticorpo IgG que se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4 e tendo capacidade de internalização que permite absorção celular, ou um fragmento funcional do mesmo, e o N297 glicano de Ab representa qualquer um dentre N297- (Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, e uma mistura dos mesmos, e N297- (Fuc)SG, com N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 e N297-(Fuc)SG tendo as estruturas representadas pelas seguintes fórmulas, [Fórmula 19]
[Fórmula 20]
[Fórmula 21]
em que cada linha ondulada representa a união ao Asn297 (N297) do anticorpo, *-L(PEG)-, no N297 glicano, representa *-(CH2CH2-O)3- CH2CH2-NH-, em que o grupo amino na extremidade direita é unido, por meio de uma ligação amida, ao ácido carboxílico na posição 2 do ácido siálico no terminal não redutor em cada uma ou qualquer uma das cadeias
18 / 34 ramificadas 1-3 e 1-6 do β-Man no N297 glicano, e cada asterisco * representa a união ao átomo de nitrogênio na posição 1 ou 3 do anel triazol nas fórmulas estruturais individuais.
24. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o composto representado pela fórmula (XIII) é representado pela seguinte fórmula (XIII’): [Fórmula 22] glicano ou glicano
25. Conjugado anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de ser representado pela seguinte fórmula (XIV): [Fórmula 23]
19 / 34 glicano ou glicano em que, em cada fórmula estrutural mostrada acima, m2 representa um número inteiro igual a 1 ou 2, Ab representa um anticorpo IgG que se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4 e tendo capacidade de internalização que permite absorção celular, ou um fragmento funcional do mesmo, e o N297 glicano de Ab representa qualquer um dentre N297- (Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, e uma mistura dos mesmos, e N297- (Fuc)SG, com N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 e N297-(Fuc)SG tendo as estruturas representadas pelas seguintes fórmulas: [Fórmula 24]
[Fórmula 25]
20 / 34 [Fórmula 26] em que cada linha ondulada representa a união ao Asn297 (N297) do anticorpo, *-L(PEG)-, no N297 glicano, representa *-(CH2CH2-O)3- CH2CH2-NH-, em que o grupo amino na extremidade direita é unido, por meio de uma ligação amida, ao ácido carboxílico na posição 2 do ácido siálico no terminal não redutor em cada uma ou qualquer uma das cadeias ramificadas 1-3 e 1-6 do β-Man no N297 glicano, e cada asterisco * representa a união ao átomo de nitrogênio na posição 1 ou 3 do anel triazol nas fórmulas estruturais individuais.
26. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o composto representado pela fórmula (XIV) é representado pela seguinte fórmula (XIV’): [Fórmula 27]
21 / 34 glicano ou glicano
27. Conjugado anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de ser representado pela seguinte fórmula (XV): [Fórmula 28]
22 / 34 glicano ou glicano em que, em cada fórmula estrutural mostrada acima, m2 representa um número inteiro igual a 1 ou 2, Ab representa um anticorpo IgG que se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4 e tendo capacidade de internalização que permite absorção celular, ou um fragmento funcional do mesmo, e o N297 glicano de Ab representa qualquer um dentre N297- (Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2, e uma mistura dos mesmos, e N297- (Fuc)SG, com N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 e N297-(Fuc)SG tendo as estruturas representadas pelas seguintes fórmulas: [Fórmula 29]
[Fórmula 30]
23 / 34 [Fórmula 31] em que cada linha ondulada representa a união ao Asn297 (N297) do anticorpo, *-L(PEG)-, no N297 glicano, representa *-(CH2CH2-O)3- CH2CH2-NH-, em que o grupo amino na extremidade direita é unido, por meio de uma ligação amida, ao ácido carboxílico na posição 2 do ácido siálico no terminal não redutor em cada uma ou qualquer uma das cadeias ramificadas 1-3 e 1-6 do β-Man no N297 glicano, e cada asterisco * representa a união ao átomo de nitrogênio na posição 1 ou 3 do anel triazol nas fórmulas estruturais individuais.
28. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o composto representado pela fórmula (XV) é representado pela seguinte fórmula (XV’): [Fórmula 32]
24 / 34 glicano ou glicano
29. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 28, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende CDRL1, CDRL2 e CDRL3 e CDRH1, CDRH2 e CDRH3 selecionadas a partir do grupo que consiste nas seguintes (1) a (4): (1) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14 e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 18 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 19, (2) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de
25 / 34 aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14 e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 17, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 30 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 19, (3) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14 e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 57, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 58 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 59 e (4) CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14 e CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 62, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 63 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO:
64.
30. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende qualquer uma das seguintes (1) a (6): (1) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável
26 / 34 de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 41, (2) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 45, (3) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 37 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 45, (4) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 49, (5) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 55 ou (6) uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 60.
31. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 30, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende qualquer uma das seguintes (1) a (7): (1) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 39,
27 / 34 (2) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 43, (3) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 43, (4) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 47, (5) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 65, (6) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 67 e (7) uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 69.
32. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 39.
33. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia
28 / 34 pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 43.
34. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 35 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 43.
35. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 47.
36. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 65.
37. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 67.
38. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo compreende uma cadeia leve que consiste na sequência
29 / 34 de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 69.
39. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que o número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo no conjugado anticorpo-fármaco é 1 a 3.
40. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que o número médio de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo no conjugado anticorpo-fármaco é 3 a 5.
41. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que o anticorpo contém uma cadeia pesada com uma ou duas ou mais modificações selecionado a partir do grupo que consiste em glicosilação N-ligada, glicosilação O-ligada, processamento N-terminal, processamento C-terminal, desamidação, isomerização de ácido aspártico, oxidação de metionina, adição de um resíduo de metionina ao N-terminal, amidação de um resíduo de prolina e delação de um ou dois aminoácidos do terminal carboxila.
42. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizado pelo fato de que o resíduo de lisina no terminal carboxila de uma cadeia pesada é deletado.
43. Método para produção de um anticorpo com glicano remodelado, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas de: i) produzir um anticorpo IgG que se liga especificamente a uma sequência de aminoácidos compreendendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 4 e tendo capacidade de internalização que permite absorção celular, ou um fragmento funcional do mesmo,
30 / 34 ii) tratar o anticorpo obtido na etapa i) com hidrolase para produzir um (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo; e iii)-1 reagir o (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo e uma molécula doadora de glicano na presença de uma transglicosidase, a molécula doadora de glicano obtida introduzindo-se um ligante PEG com um grupo azida no grupo carbonila de ácido carboxílico na posição 2 de um ácido siálico em MSG (9) ou SG (10) e tratando o terminal redutor com oxazolina ou iii)-2 reagir o (Fucα1,6)GlcNAc-anticorpo e uma molécula doadora de glicano na presença de uma transglicosidase, a molécula doadora de glicano obtida introduzindo-se um ligante PEG com um grupo azida no grupo carbonila de ácido carboxílico na posição 2 de um ácido siálico, em (MSG-)Asn ou (SG-)Asn, com um grupo α-amino opcionalmente protegido, e no grupo carbonila de ácido carboxílico no Asn, provocando ação de hidrolase e, a seguir, tratando o terminal redutor com oxazolina.
44. Método para produção de um conjugado anticorpo- fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de reagir o anticorpo com glicano remodelado obtido pelo método como definido na reivindicação 43 e um ligante-fármaco.
45. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizado pelo fato de ser produzido pelo método como definido na reivindicação 44.
46. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve, a qual contém CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14, e uma região variável de cadeia pesada, a qual contém CDRH1 que consiste na sequência
31 / 34 de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 57, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 58 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 59.
47. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve, a qual contém CDRL1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 12, CDRL2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 13 e CDRL3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 14; e uma região variável de cadeia pesada, a qual contém CDRH1 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 62, CDRH2 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 63 e CDRH3 que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 64.
48. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 55.
49. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 33 e uma região variável de cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 60.
50. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com a reivindicação 46 ou 48, caracterizado pelo fato de ter uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 67.
32 / 34
51. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com a reivindicação 47 ou 49, caracterizado pelo fato de ter uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 69.
52. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de ter uma cadeia leve que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 21 a 233 de SEQ ID NO: 31 e uma cadeia pesada que consiste na sequência de aminoácidos nas posições 20 a 471 de SEQ ID NO: 65.
53. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 46 a 52.
54. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que contém o polinucleotídeo como definido na reivindicação 53.
55. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de ser transformada com o vetor de expressão como definido na reivindicação 54.
56. Método para produção do anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 52, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 55 e coletar o anticorpo alvo da cultura obtida na etapa de cultura.
57. Anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, caracterizado pelo fato de ser obtido pelo método como definido na reivindicação 56.
58. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de conter o conjugado anticorpo-fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 42 e 45 ou um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 46 a 52 e 57.
33 / 34
59. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de ser um fármaco antitumoral.
60. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 59, caracterizada pelo fato de que o tumor é tumor que expressa CDH6.
61. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que o tumor é carcinoma de células renais, carcinoma de células renais claras, carcinoma papilar de células renais, câncer de ovário, adenocarcinoma seroso de ovário, câncer de tireoide, câncer de ducto biliar, câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de não pequenas células, glioblastoma, mesotelioma, câncer de útero, câncer de pâncreas, tumor de Wilms ou neuroblastoma.
62. Método para tratamento de um tumor, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o conjugado anticorpo-fármaco definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 42 e 45, o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 46 a 52 e 57 ou a composição farmacêutica definida em qualquer uma das reivindicações 58 a 61 a um indivíduo.
63. Método para tratamento de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o tumor é um tumor com expressão de CDH6.
64. Método para tratamento de acordo com a reivindicação 62 ou 63, caracterizado pelo fato de que o tumor é carcinoma de células renais, carcinoma de células renais claras, carcinoma papilar de células renais, câncer de ovário, adenocarcinoma seroso de ovário, câncer de tireoide, câncer de ducto biliar, câncer de pulmão, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de não pequenas células, glioblastoma, mesotelioma, câncer de útero, câncer de pâncreas, tumor de Wilms ou neuroblastoma.
65. Método para tratamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 64, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o conjugado anticorpo-fármaco como definido em qualquer uma
34 / 34 das reivindicações 1 a 42 e 45, o anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 46 a 52 e 57 ou a composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 58 a 61 e pelo menos um fármaco antitumoral a um indivíduo, simultânea, separada ou continuamente.
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