TW202330618A - 抗ｃｄｈ６抗體及其抗體－藥物偶聯物 - Google Patents

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Abstract

本發明關於具有以下特性的抗原結合蛋白：(a)特異性結合CDH6，以及(b)具有藉由結合CDH6而內化至表達CDH6的細胞中的活性。本揭露進一步提供了包含特異性結合CDH6的表位並具有內化活性的抗體或其抗原結合片段的免疫偶聯物、包含該免疫偶聯物並對腫瘤具有治療效果的藥物產品、使用該免疫偶聯物或該藥物產品治療腫瘤的方法等。

Description

抗CDH6抗體及其抗體-藥物偶聯物
本專利申請要求2021年12月10日提交的PCT申請PCT/CN2021/136994和2021年12月10日提交的CN申請CN2021115076855的優先權，這些在先申請的公開內容被認為是本發明公開內容的一部分，上述申請的全部內容被納入本文。
本發明藉由引用與本發明一起作為XML檔的序列列表，該檔題為"0283-PA-002.xml"，創建於2022年11月01日，其大小為149,920位元組。
本發明關於具有以下特性的抗原結合蛋白：(a)特異性結合CDH6，以及(b)具有藉由結合CDH6而內化至表達CDH6的細胞中的活性，進一步提供包含特異性結合CDH6的表位並具有內化活性的抗體或其抗原結合片段的免疫偶聯物、包含該免疫偶聯物並對腫瘤具有治療效果的藥物產品、使用該免疫偶聯物或該藥物產品治療腫瘤的方法等。
鈣黏蛋白6(CDH6)在發育階段在腦或腎中特異性表達，並且已有報導稱其在中樞神經系統的回路形成和腎中腎單位發育中起重要作用。CDH6在成人正常組織中的表達定位於腎小管、膽管上皮細胞等。
同時，已知CDH6在某些類型的成人癌症中在腫瘤位點處特異性過表達。CDH6在人腎細胞癌，特別是腎透明細胞癌和乳頭狀腎細胞癌中的表達與不良預後的相關性及其作為腫瘤標記物的適用性已有報導。CDH6在人卵巢癌中高表達也已有報導。也有報導稱CDH6參與人甲狀腺癌的上皮-間質細胞轉換。此外，還有報導稱CDH6也在人膽管癌和人小細胞肺癌中表達。
抗體-藥物偶聯物(“ADC”)已經用於在癌症治療中局部遞送細胞毒性劑(參見例如Lambert，Curr.Opinion In Pharmacology，第5卷：第543-549頁，2005年)。ADC允許靶向遞送藥物部分，在這種情況下可實現最大療效和最小毒性。儘管最近FDA批准了六種新的抗體-藥物偶聯物(ADC)，ADC研發看似前景不錯，但在臨床開發期間ADC的損耗仍然很高。
由Daiichi Sankyo開發的DS-6000a是唯一報導的正在研究中(I期臨床階段)的CDH6定向抗體-藥物偶聯物(ADC)。DS-6000a由人源化抗CDH6 IgG1單株抗體組成，該單株抗體經由基於四肽的可切割接頭附接到拓撲異構酶I抑制劑有效載荷(依喜替康衍生物)上。DS-6000a尚未在任何國家被批准用於任何適應症，並且其安全性和有效性有待確定。
因此，仍然需要用於治療對酪胺酸激酶抑制劑、絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑和/或化療藥物具有抗性或具有高度抗性傾向的癌症的改善方法，特別是使用CDH6-ADC。
本發明提供了一種抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白具有以下性質中的一種或多種：
i)在ELISA測定中能夠以小於12.5ng/mL的靈敏度結合CDH6蛋白；
ii)在ELISA測定中能夠以低於約3.1×10-9M的KD值結合CDH6蛋白；以及
iii)在結合CDH6時能夠被表達CDH6的細胞內化。
在一些實施方案中，CDH6是哺乳動物CDH6蛋白。
在一些實施方案中，CDH6是人CDH6蛋白。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白與參比抗體競爭結合CDH6蛋白，其中該參比抗體包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)；其中，
VH包含如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，並且VL包含如SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列；或者
VH包含如SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列，並且VL包含如SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，該抗體包括單株抗體、多株抗體、二聚體、多聚體、完整抗體、人抗體、人源化抗體和/或嵌合抗體。
在一些實施方案中，該抗原結合片段包括Fab、Fab'、Fv片段、F(ab')2、scFv、di-scFv和/或dAb。
在一些實施方案中，該抗體是單株抗體。
在一些實施方案中，該抗體是嵌合抗體、人源化抗體和/或人抗體。
在一些實施方案中，該抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)的至少一個CDR(互補決定區)，VH包含如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗體或抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)的至少一個CDR，VL包含如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VH，其中VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，HCDR1包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VH，其中VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，HCDR1包含如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VH，其中VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，HCDR2包含如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VH，其中VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，HCDR3包含如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VH，其中VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，HCDR1包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，並且HCDR3包含如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VH，其中VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，並且HCDR3包含如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列；或者
其中HCDR1包含如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，並且HCDR3包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列；或者
其中HCDR1包含如SEQ ID NO：89所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，並且HCDR3包含如SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列；或者
其中HCDR1包含如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列，並且HCDR3包含如SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VH，其中VH包含框架區HFR1，HFR1的C末端直接或間接連接至HCDR1的N末端，並且HFR1包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VH，其中VH包含框架區HFR2，HFR2位於HCDR1和HCDR2之間，並且HFR2包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VH，其中VH包含框架區HFR3，HFR3位於HCDR2和HCDR3之間，並且HFR3包含SEQ ID NO：16、 SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VH，其中VH包含框架區HFR4，HFR4的N末端直接或間接連接至HCDR3的C末端，並且HFR4包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VH，其中VH包含框架區HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，HFR1的C末端直接或間接連接至HCDR1的N末端，HFR2位於HCDR1和HCDR2之間，HFR3位於HCDR2和HCDR3之間，並且HFR4的N末端直接或間接連接至HCDR3的C末端；其中HFR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，HFR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，HFR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，並且HFR4包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列；或者
HFR1包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列，HFR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，HFR3包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，並且HFR4包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列；或者
HFR1包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列，HFR2包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，HFR3包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，並且HFR4包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列；或者
HFR1包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，HFR2包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，HFR3包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列，並且HFR4包含SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列；或者
HFR1包含SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列，HFR2包含SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列，HFR3包含SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列，並且HFR4包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列；或者
HFR1包含SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列，HFR2包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，HFR3包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列，並且HFR4包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VH，其中VH包含如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含抗體重鏈恆定區。
在一些實施方案中，該抗體重鏈恆定區包含源自人IgG的恆定區；視需要地，該抗體重鏈恆定區包含源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定區。
在一些實施方案中，該抗體重鏈恆定區包含如SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗體重鏈包含如SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VL，其中VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，LCDR1包含如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VL，其中VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，LCDR2包含如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VL，其中VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，LCDR3包含如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VL，其中VL包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，LCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，並且LCDR3包含如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；或者
其中LCDR1包含如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，並且LCDR3包含如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；或者
其中LCDR1包含如SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：93所示的胺基酸序列，並且LCDR3包含如SEQ ID NO：94所示的胺基酸序列；或者
其中LCDR1包含如SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列，並且LCDR3包含如SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VH和VL，其中VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，並且VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，並且HCDR3包含如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，LCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：6 所示的胺基酸序列，並且LCDR3包含如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；或者
其中HCDR1包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，並且HCDR3包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，LCDR1包含如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，並且LCDR3包含如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VH和VL，其中VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，並且VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，並且HCDR3包含如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，LCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，並且LCDR3包含如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；或者
其中HCDR1包含如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，並且HCDR3包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，LCDR1包含如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，並且LCDR3包含如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；或者
其中HCDR1包含如SEQ ID NO：89所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，並且HCDR3包含如SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列，LCDR1包含如SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：93所示的胺基酸序列，並且LCDR3包含如SEQ ID NO：94所示的胺基酸序列；或者
其中HCDR1包含如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列，並且HCDR3包含如SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列，LCDR1包含如SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列，並且LCDR3包含如SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VL，其中VL包含框架區LFR1，LFR1的C末端直接或間接連接至LCDR1的N末端，並且LFR1包含SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VL，其中VL包含框架區LFR2，LFR2位於LCDR1和LCDR2之間，並且LFR2包含SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VL，其中VL包含框架區LFR3，LFR3位於LCDR2和LCDR3之間，並且LFR3包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VL，其中VL包含框架區LFR4，LFR4的N末端直接或間接連接至LCDR3的C末端，並且LFR4包含 SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VL，其中VL包含框架區LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，其中LFR1的C末端直接或間接連接至LCDR1的N末端，LFR2位於LCDR1和LCDR2之間，LFR3位於LCDR2和LCDR3之間，並且LFR4的N末端直接或間接連接至LCDR3的C末端；其中LFR1包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列，LFR2包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，LFR3包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列，並且LFR4包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列；或者
LFR1包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，LFR2包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，LFR3包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，並且LFR4包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列；或者
LFR1包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，LFR2包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，LFR3包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列，並且LFR4包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列；或者
LFR1包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列，LFR2包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列，LFR3包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列，並且LFR4包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列；或者
LFR1包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列，LFR2包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列，LFR3包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列，並且LFR4包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列；或者
LFR1包含SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列，LFR2包含SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列，LFR3包含SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列，並且LFR4包含SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列；或者
LFR1包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，LFR2包含SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列，LFR3包含SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列，並且LFR4包含SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VL，其中VL包含如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含VH和VL，其中VH包含如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，並且VL包含如SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列；或者
其中VH包含如SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列，並且VL包含如SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列；或者
其中VH包含如SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列，並且VL包含如SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列；或者
其中VH包含如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列，並且VL包含如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列；或者
其中VH包含如SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列，並且VL包含如SEQ ID NO：96所示的胺基酸序列；或者
其中VH包含如SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列，並且VL包含如SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含抗體輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，該抗體輕鏈恆定區包含人Igκ恆定區或人Igλ恆定區。
在一些實施方案中，該抗體輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗體輕鏈包含如SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：88所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，該抗原結合蛋白包含抗體重鏈和抗體輕鏈，其中該抗體重鏈包含如SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列，並且該抗體輕鏈包含如SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列；或者
其中該抗體重鏈包含如SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列，並且該抗體輕鏈包含如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列；或者
其中該抗體重鏈包含如SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列，並且該抗體輕鏈包含如SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列；或者
其中該抗體重鏈包含如SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列，並且該抗體輕鏈包含如SEQ ID NO：88所示的胺基酸序列。
在另一方面，本發明提供了一種特異性結合CDH6的抗原結合蛋白，包括
(i)VL包含VL CDR1、CDR2以及CDR3，其中VL包含如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列；和/或VH包含VH CDR1、CDR2以及CDR3，其中VH包含如SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列；
(ii)VL包含VL CDR1、CDR2以及CDR3，其中VL包含如SEQ ID NO：41 所示的胺基酸序列；和/或VH包含VH CDR1、CDR2以及CDR3，其中VH包含如SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列；
(iii)VL包含VL CDR1、CDR2以及CDR3，其中VL包含如SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列；和/或VH包含VH CDR1、CDR2以及CDR3，其中VH包含如SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列；
(iv)VL包含VL CDR1、CDR2以及CDR3，其中VL包含如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列；和/或VH包含VH CDR1、CDR2以及CDR3，其中VH包含如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列；
(v)VL包含VL CDR1、CDR2以及CDR3，其中VL包含如SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列；和/或VH包含VH CDR1、CDR2以及CDR3，其中VH包含如SEQ ID NO：96所示的胺基酸序列；
(vi)VL包含VL CDR1、CDR2以及CDR3，其中VL包含如SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列；和/或VH包含VH CDR1、CDR2以及CDR3，其中VH包含如SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列。
在另一方面，本發明提供了一種抗原結合蛋白，其與前述抗原結合蛋白競爭性結合CDH6。
在另一方面，本發明提供了一種多肽，該多肽包含上述抗原結合蛋白。
在另一方面，本發明提供了一種或多種核酸分子，該一種或多種核酸分子編碼上述抗原結合蛋白或上述多肽。
在另一方面，本發明提供了一種載體，該載體包含上述核酸分子。
在另一方面，本發明提供了一種細胞，該細胞包含上述核酸分子或上述載體，或者表達上述抗原結合蛋白或上述多肽。
在另一方面，本發明提供了一種用於製備上述抗原結合蛋白的方法，其中該方法包括在表達上述抗原結合蛋白的條件下培養上述細胞。
在另一方面，本發明提供了一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含上述抗原結合蛋白、上述多肽、上述核酸分子、上述載體和/或上述細胞，以及視需要的藥學上可接受的載體。
在另一方面，本發明提供了一種試劑盒，該試劑盒包含上述抗原結合蛋白、上述多肽或上述醫藥組成物。
在另一方面，本發明提供了上述抗原結合蛋白、上述多肽、上述核酸分子、上述載體和/或上述細胞以及/或者上述醫藥組成物在製備用於預防和/或治療CDH6相關疾病或病症的藥物中的用途。
在一些實施方案中，該CDH6相關疾病或病症包括腫瘤。
在一些實施方案中，該腫瘤包括表達CDH6的腫瘤。
在一些實施方案中，該腫瘤包括腎細胞癌、腎透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌、甲狀腺癌、膽管癌、肺癌、小細胞肺癌、肝癌、成膠質細胞瘤、間皮瘤、子宮癌、胰腺癌、維爾姆斯瘤或成神經細胞瘤。
在一些實施方案中，該藥物進一步包含另外的治療劑。
在另一方面，本發明提供了一種免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，該免疫偶聯物包含上述抗原結合蛋白。
在一些實施方案中，該免疫偶聯物進一步包含偶聯到抗體或其抗原結合片段的活性部分。
在一些實施方案中，該活性部分包含藥物部分和/或標記。
在一些實施方案中，該藥物部分選自由以下項組成的組：細胞毒性劑、細胞因子、核酸、核酸相關分子、放射性核素、趨化因子、免疫(共)刺激分子、免疫抑制分子、死亡配體、凋亡誘導蛋白、激酶、前藥轉化酶、核糖核酸酶、激動性抗體或抗體片段、拮抗性抗體或抗體片段、生長因子、激素、凝血因子、纖溶活性蛋白、模擬這些物質的肽，以及它們的片段、融合蛋白或衍生物。
在一些實施方案中，該標記選自由以下項組成的組：放射性標記、螢光團、發色團、顯影劑和金屬離子。
在一些實施方案中，該細胞毒性劑包含微管破壞藥物和/或DNA損傷劑。
在一些實施方案中，該細胞毒性劑包含微管蛋白抑制劑和/或拓撲異構酶抑制劑。
在一些實施方案中，該細胞毒性劑包含拓撲異構酶I抑制劑。
在一些實施方案中，該細胞毒性劑包含喜樹鹼(CPT)或其衍生物。
在一些實施方案中，該細胞毒性劑包含式II的結構或其同分異構體(tautomer)、內消旋體(mesomer)、外消旋體(racemate)、對映體(enantiomer)或非對映體(diastereomer)，或其混合物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
Figure 111147444-A0202-12-0017-1
在一些實施方案中，該免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物包含式(I)的抗體-藥物偶聯物(ADC)：
Ab-(L-(D)m)n， (I)
其中Ab是前述抗原結合蛋白；
L是接頭；
D是藥物部分；
m是1至8的整數；並且
n是1至10的任何數。
在一些實施方案中，L選自：可切割接頭和不可切割接頭。
在一些實施方案中，L包括可切割肽。
在一些實施方案中，該可切割肽可被酶切割。
在一些實施方案中，該酶包括組織蛋白酶B。
在一些實施方案中，該可切割肽或L包含胺基酸單元。
在一些實施方案中，該胺基酸單元包括二肽、三肽、四肽或五肽。
在一些實施方案中，該胺基酸單元選自：Val-Cit、Val-Ala(VA)、Glu-Val-Cit、Ala-Ala-Asn(AAN)、Gly-Val-Cit、Gly-Gly-Gly(GGG)和Gly-Gly-Phe-Gly(GGFG)。
在一些實施方案中，L包含間隔子。
在一些實施方案中，該間隔子包括自降解間隔子。
在一些實施方案中，該自降解間隔子包括對胺基苯氧基羰基(PABC)或對胺基苄基(PAB)。
在一些實施方案中，該可切割肽直接剪接至間隔子。
在一些實施方案中，L包括：-Val-Cit-PABC-、-Val-Ala-PABC-、-Glu-Val-Cit-PABC-、-Ala-Ala-Asn-PABC-、-Gly-Val-Cit-PABC-、-Gly-Gly-Gly-PABC-、-Gly-Gly-Phe-Gly-PABC-、-Val-Cit-PAB-、-Val-Ala-PAB-、-Glu-Val-Cit-PAB-、-Ala-Ala-Asn-PAB-、-Gly-Val-Cit-PAB-、-Gly-Gly-Gly-PAB-或-Gly-Gly-Phe-Gly-PAB-。
在一些實施方案中，該間隔子包括-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-所示的結構，其中La表示-O-或單鍵；Lb表示-CR2(-CR3)-或單鍵，其中R2和R3各自獨立地表示C1-C6烷基、-(CH2)na-NH2、-(CH2)nb-COOH或-(CH2)nc-OH，n1表示0至6的整數，na、nb和nc各自獨立地表示1至4的整數，但當na為0時，R2和R3不相同，並且Lc表示-C(=O)-。
在一些實施方案中，該間隔子包括-NH-(CH2)3-C(=O)-、-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-或-NH-(CH2)2-O-CH2-C(=O)-。
在一些實施方案中，L包括-L1-L2-L3-所示的結構，其中L1表示-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-(CH2)n2-C(=O)-、-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-或- C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-，其中n2表示2至8的整數，n3表示1至8的整數，並且n4表示1至8的整數；L2表示胺基酸單元；L3表示自降解間隔子。
在一些實施方案中，L選自：
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2o-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；及
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
在一些實施方案中，對胺基苯氧基羰基(PABC)或對胺基苄基(PAB)包含聚肌胺酸(聚-N-甲基甘胺酸)殘基。
在一些實施方案中，L選自以下結構：
Figure 111147444-A0202-12-0022-2
其中n5表示0至20的整數。
在一些實施方案中，n5表示1至15的整數。
在一些實施方案中，n5表示1至7的整數。
在一些實施方案中，n5表示8至15的整數。
在一些實施方案中，L選自以下結構：
Figure 111147444-A0202-12-0023-3
在一些實施方案中，該抗體-藥物偶聯物選自以下結構：
Figure 111147444-A0202-12-0023-4
Figure 111147444-A0202-12-0024-5
其中n是1至10的任何數。
在一些實施方案中，n是2至9的任何數。
本發明進一步提供了一種製備本發明的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的方法，該方法包括使本發明的抗體或其抗原結合片段與藥物-接頭中間體化合物反應的步驟。
本發明進一步提供了一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含本發明的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
在一些實施方案中，該醫藥組成物進一步包含藥學上可接受的載體或賦形劑。
本發明進一步提供了本發明的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或本發明的醫藥組成物在製備用於治療腫瘤的藥物中的用途。
在一些實施方案中，該腫瘤是表達CDH6的腫瘤。
在一些實施方案中，該腫瘤包括腎細胞癌、腎透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌、甲狀腺癌、膽管癌、肺癌、小細胞肺癌、成膠質細胞瘤、間皮瘤、子宮癌、胰腺癌、維爾姆斯瘤或成神經細胞瘤。
本發明進一步提供了一種用於治療腫瘤的方法，該方法包括向受試者施用本發明的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
在一些實施方案中，該腫瘤是表達CDH6的腫瘤。
在一些實施方案中，該腫瘤包括腎細胞癌、腎透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌、甲狀腺癌、膽管癌、肺癌、小細胞肺癌、成膠質細胞瘤、間皮瘤、子宮癌、胰腺癌、維爾姆斯瘤或成神經細胞瘤。
本發明進一步提供了一種用於治療腫瘤的方法，該方法包括同時、分開或序貫地向受試者施用醫藥組成物，該醫藥組成物包含至少一種組分和至 少一種抗腫瘤藥物，該至少一種組分選自本發明的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
本發明的有益效果
可預期藉由向具有表達CDH6的癌細胞的患者施用包含經由具有特定結構的接頭與在細胞中發揮毒性的藥物偶聯的本發明的抗CDH6抗體的抗CDH6抗體-藥物偶聯物會獲得極好的抗腫瘤效果和安全性。具體地，本發明的抗CDH6抗體-藥物偶聯物可用作抗腫瘤劑。
根據以下具體實施方式，本揭露的另外的方面和優點對於所屬技術領域具通常知識者將變得顯而易見，在具體實施方式中僅示出和描述了本揭露的例示性實施方案。如將認識到的，本揭露能夠具有其他實施方案和不同實施方案，並且其若干細節能夠在各種明顯的方面進行修改，所有這些修改都不背離本揭露。因此，圖式和說明書本質上應被認為是例示性的，而非限制性的。
引用合併
本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請均藉由引用併入本文，其程度如同每篇單獨的出版物、專利或專利申請被具體且單獨地指明藉由引用併入本文。
本發明的新穎特徵在所附申請專利範圍中具體闡述。藉由參考以下具體實施方式，可以更好地理解本發明的特徵和優點，該具體實施方式闡述了採用本發明原理的說明性實施方案，以及圖式(在本文中也稱為“圖”)，其中，
圖1A至圖1B示出了檢測抗CDH6嵌合抗體(Ch069707)及其人源化變體(CL069707-H1L1、CL069707-H1L2、CL069707-H2L1和CL069707-H2L2)與卵巢癌細胞系OVCAR-3結合的流式細胞術結果。
圖2示出了檢測抗CDH6嵌合抗體(Ch069463)及其人源化變體(CL069463-H1L1、CL069463-H2L2和CL069463-H2L3)與卵巢癌細胞系OVCAR-3結合的流式細胞術結果。
圖3示出了檢測CL069707-H1L1與人CDH6-ECD-His、CDH9-ECD-His和CDH10-ECD-His重組蛋白結合的ELISA結果。
圖4示出了檢測CL069707-H1L1與人、食蟹猴、小鼠和大鼠CDH6-ECD-His重組蛋白結合的ELISA結果。
圖5A示出了藉由常規規程G測量的CL069707-H1L1的體積排阻色譜圖。
圖5B示出了藉由常規規程H測量的CL069707-H1L1的疏水層析色譜圖。
圖6A示出了藉由常規規程G測量的抗體-藥物偶聯物CL069707-H1L1-LP1中聚集體的體積排阻色譜圖。
圖6B示出了藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物CL069707-H1L1-LP1的疏水層析色譜圖。
圖7A示出了藉由常規規程G測量的抗體-藥物偶聯物CL069707-H1L1-LP2中聚集體的體積排阻色譜圖。
圖7B示出了藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物CL069707-H1L1-LP2的疏水層析色譜圖。
圖8A示出了藉由常規規程G測量的抗體-藥物偶聯物CL069707-H1L1-GGFG-DXd中聚集體的體積排阻色譜圖。
圖8B示出了藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物CL069707-H1L1-GGFG-DXd的疏水層析色譜圖。
圖9A示出了藉由常規規程G測量的抗體-藥物偶聯物DS-6000a中聚集體的體積排阻色譜圖。
圖9B示出了藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物DS-6000a的疏水層析色譜圖。
圖10A示出了藉由常規規程G測量的抗體-藥物偶聯物對照抗體-LP1中聚集體的體積排阻色譜圖。
圖10B示出了藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物對照抗體-LP1的疏水層析色譜圖。
圖11A示出了藉由常規規程G測量的抗體-藥物偶聯物人IgG-LP1中聚集體的體積排阻色譜圖。
圖11B示出了藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物人IgG-LP1的疏水層析色譜圖。
圖12A示出了藉由常規規程G測量的抗體-藥物偶聯物人IgG-LP2中聚集體的體積排阻色譜圖。
圖12B示出了藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物人IgG-LP2的疏水層析色譜圖。
圖13A示出了藉由常規規程G測量的抗體-藥物偶聯物人IgG-GGFG-DXd中聚集體的體積排阻色譜圖。
圖13B示出了藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物人IgG-GGFG-DXd的疏水層析色譜圖。
圖14示出了PA-1、OVCAR-3和786-O細胞對CL069707-H1L1-LP1的內化。
圖15A至圖15D示出了評價抗CDH6抗體-藥物偶聯物(CL069707-H1L1-LP1、CL069707-H1L1-LP2、CL069707-H1L1-GGFG-DXd、CL069707-H1L2-GGFG-DXd、CL069707-H2L1-GGFG-DXd和CL069707-H2L2-GGFG-DXd)對CDH6陽性腫瘤細胞系OVCAR-3和PA-1的體外細胞生長抑制活性的結果。
圖16A示出了與vc-MMAE偶聯的抗CDH6抗體(CL069707、CL069439和CL069066)的體外細胞殺傷活性的結果。
圖16B示出了與GGFG-DXd偶聯的抗CDH6抗體(CL069707、CL069439和CL069066)的體外細胞殺傷活性的結果。
圖17A示出了3個人源化抗CDH6抗體-藥物偶聯物(CL069707-H1L1-LP1、CL069707-H1L1-LP2和CL069707-H1L1-GGFG-DXd)的體內抗腫瘤效果。
圖17B示出了3個人源化抗CDH6抗體-藥物偶聯物(CL069707-H1L1-LP1、CL069707-H1L1-LP2和CL069707-H1L1-GGFG-DXd)對小鼠體重的影響。使用動物模型進行評價，其中將CDH6陽性人卵巢畸胎瘤細胞系PA-1接種到免疫缺陷小鼠中。
圖18A示出了在單劑量給藥後CL069707-H1L1-LP1和CL069707-H1L1-LP2表現出劑量依賴性腫瘤消退。圖18B示出了不同劑量的CL069707- H1L1-LP1和CL069707-H1L1-LP2對小鼠體重的影響。使用動物模型進行評價，其中將CDH6陽性人卵巢畸胎瘤細胞系PA-1接種到免疫缺陷小鼠中。
圖19A示出了CL069707-H1L1-LP1的體內抗腫瘤效果。圖19B示出了單劑量的CL069707-H1L1-LP1對小鼠體重的影響。使用動物模型進行評價，其中將CDH6陽性腫瘤細胞系OVCAR-3接種到免疫缺陷小鼠中。
圖20A示出了CL069707-H1L1-LP1的體內抗腫瘤效果。圖20B示出了CL069707-H1L1-LP1對小鼠體重的影響。使用動物模型進行評價，其中將CDH6陽性腫瘤細胞系786-O接種到免疫缺陷小鼠中。
圖21A示出了CL069707-H1L1-LP1的體內抗腫瘤效果。圖21B示出了CL069707-H1L1-LP1對小鼠體重的影響。使用腎癌患者來源的異種移植物(PDX)模型進行評價。
圖22A至圖22C示出了CL069707-H1L1-LP1、CL069707-H1L1-LP2和CL069707-H1L1-GGFG-DXd的結構。
圖23示出了本發明所述抗體與CDH6抗原結合的檢測靈敏度。
圖24示出了本發明所述抗體對細胞表面表達的CDH6抗原的特異性識別。
雖然本文已經示出並描述了本發明的各種實施方案，但是對於所屬技術領域具通常知識者來說顯而易見的是，這些實施方案僅以示例的方式提供。在不背離本發明的情況下，所屬技術領域具通常知識者可以想到許多變化、 改變和替換。應當理解，可以採用本文所述的本發明的實施方案的各種替代方案。
定義
除非另有說明，否則本文所用的下列術語和短語旨在具有下列含義：
在本發明中，術語“烷基”通常是指具有指定碳原子數的單價飽和烴鏈。例如，C1-C6烷基是指具有1個至6個碳原子的烷基基團。烷基基團可以是直鏈或支鏈的。代表性的支鏈烷基基團具有一條、兩條或三條支鏈。烷基基團的示例包括但不限於甲基、乙基、丙基(正丙基和異丙基)、丁基(正丁基、異丁基、第二丁基和第三丁基)、戊基(正戊基、異戊基和新戊基)和己基。
在本發明中，如本文所用，術語“抗體”通常是指免疫球蛋白家族的多肽，其能夠非共價地、可逆地並且以特異性方式結合對應抗原。例如，天然存在的IgG抗體是四聚體，其包含藉由二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每條重鏈由重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區和VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其中散佈有更保守的區域，稱為框架區(FR)。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從胺基端到羧基端以如下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈和輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，這些宿主組織或因子包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(Clq)。
術語“抗體”包括但不限於單株抗體、人抗體、人源化抗體、駱駝抗體和嵌合抗體。抗體可以是任何同種型/類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亞類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
在本發明中，術語“互補決定結構域”在本文中與術語“互補決定區”(“CDR”)互換使用，並且通常是指VL和VH的高變區。CDR是抗體鏈的靶蛋白結合位點，其對這種靶蛋白具有特異性。在每個人VL或VH中存在三個CDR(CDR1-3，從N末端開始按順序編號)，構成可變結構域的約15%至20%。CDR可按其區和順序引用。例如，“VH CDR1”或“HCDR1”兩者均是指重鏈可變區的第一個CDR。CDR在結構上與靶蛋白的表位互補，並且因此直接負責結合特異性。VL或VH的其餘區段，即所謂的框架區，在胺基酸序列上表現出較少的變異(Kuby，Immunology，第4版，第4章，W.H.Freeman & Co.，New York，2000年)。在本領域中，抗體的CDR可藉由各種方法定義，諸如基於序列變異性的Kabat定義規則(參見Kabat等人，protein sequence in immunology，第5版，美國國立衛生研究院，馬里蘭州貝塞斯達，1991年)、基於結構環區位置的Chothia定義規則(參見A1-Lazikani等人，JMol Biol，第273卷：第927-948頁，1997年)以及基於IMGT-ONTOLOGY概念和IMGT科學圖表規則的IMGT定義規則。在某些實施方案中，本發明使用IMGT規則來定義抗體的CDR。本發明還包括Martin、PyIgClassify的定義規則和Kabat、Chothia、IMGT、Martin和PyIgClassify的聯合定義規則。(見Mark L.Chiu等人，Antibodies 8(4),55,2019)。
表A.對每個區域的胺基酸的編號系統(用Chothia編號)
Figure 111147444-A0202-12-0033-6
其中，Laa-Lbb或Haa-Hbb可分別指從N端開始的輕鏈或重鏈的NO.aa至NO.bb的胺基酸序列。例如，L24-L34指的是輕鏈中從NO.24到NO.34的胺基酸序列。
輕鏈和重鏈兩者均被分成結構和功能同源區。術語“恆定”和“可變”是功能性的。在這點上，應當理解，輕鏈(VL)和重鏈(VH)部分兩者的可變結構域決定了抗原識別和特異性。相反，輕鏈的恆定結構域(CL)和重鏈的恆定結構域(CH1、CH2或CH3)賦予重要的生物學特性，諸如分泌、經胎盤遷移、Fc受體結合、補體結合等。按照慣例，恆定區結構域的編號隨著它們變得更加遠離抗體的抗原結合位點或胺基末端而增加。N末端是可變區，並且C末端是恆定區；CH3和CL結構域實際上分別包含重鏈和輕鏈的羧基末端結構域。
在本發明中，如本文所用，術語“抗原結合片段”通常是指包括抗體的一個或多個部分的多肽，該一個或多個部分保留了與抗原的表位特異性相互作用(例如，藉由結合、位阻、穩定/去穩定、空間分佈)的能力。結合片段的示例包括但不限於單鏈Fv(scFv)、二硫鍵連接的Fv(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；F(ab')2片段，包含在鉸鏈區由 二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；由VH和CH1結構域組成的Fd片段；由抗體的單臂的VL結構域和VH結構域組成的Fv片段；dAb片段(Ward等人，Nature，第341卷：第544-546頁，1989年)，其由VH結構域構成；以及抗體的分離的互補決定區(CDR)或其他表位結合片段。
抗原結合片段也可包括單結構域抗體、巨型抗體、微型抗體、奈米抗體、胞內抗體、雙抗體、三抗體、四抗體和雙scFv中(參見例如Hollinger和Hudson，Nature Biotechnology，第23卷：第1126-1136頁，2005年)。抗原結合片段也可包括包含一對串聯Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的單鏈分子中，該對片段與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata等人，Protein Eng.，第8卷：第1057-1062頁，1995年)。常規抗體的片段也可以是單結構域抗體，諸如重鏈抗體或VHH。
在本發明中，如本文所用，術語“單株抗體”通常是指多肽，包括具有基本上相同的胺基酸序列或源自相同遺傳來源的抗體和抗原結合片段。該術語也包括單分子組成物的抗體分子的製劑。單株抗體組成物對特定表位元顯示出單一結合特異性和親和力。
在本發明中，術語“人源化抗體”通常是指包括源自非人物種(例如小鼠)的重鏈可變區和輕鏈可變區的序列但其中至少一部分VH和/或VL序列已經被改變為與人種系可變序列相似的抗體。例如，術語“人源化抗體”是可以免疫特異性結合相關抗原並且包括基本上包括人抗體的胺基酸序列的框架區(FR)和基本上包括非人抗體的胺基酸序列的互補決定區(CDR)的抗體或其變體、衍生物、類似物或片段。在CDR的上下文中，術語“基本上”意指CDR的胺基酸序列與非人抗體的CDR的胺基酸序列有至少80%，例如至少85%、至少90%、至少 95%、至少98%或至少99%的同一性。人源化抗體基本上包括至少一個，通常兩個可變結構域(Fab、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv)，其中所有或基本上所有CDR區對應於非人免疫球蛋白的CDR區，並且所有或基本上所有框架區是具有人免疫球蛋白共有序列的框架區。在一些實施方案中，人源化抗體可進一步包括免疫球蛋白(Fc)的恆定區(通常是人免疫球蛋白的恆定區)的至少一部分。
在本發明中，術語“人抗體”通常是指具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區的抗體。人抗體是現有技術中熟知的(例如，請參考van Dijk,M.A.和van de Winkel,J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.，2001年，第5卷：第368-374頁)。人抗體也可在轉基因動物(例如小鼠)中產生，這些轉基因動物可在免疫後在不存在產生的內源免疫球蛋白的情況下產生完整的或選擇的一組人抗體(例如Jakobovits,A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993年，第90卷：第2551-2555頁；Jakobovits,A.等人，Nature，1993年，第362卷：第255-258頁；Brueggemann,M.等人，YearImmunol.，1993年，第7卷：第33-40頁)。人抗體也可在噬菌體展示文庫(例如Hoogenboom,H.R.和Winter,G.，J.Mol.Biol.，1992年，第227卷：第381-388頁；Marks,J.D.等人，J.Mol.Biol.，1991年，第222卷：第581-597頁)中產生。術語“人抗體”也可包括在恆定區中修飾的抗體。
在本發明中，術語“嵌合抗體”通常是指工程化抗體，其最廣義地包含一種抗體的一個或多個區和一種或多種其他抗體的一個或多個區。特別地，嵌合抗體包含源自非人動物的抗體的VH結構域和VL結構域，以及另一抗體，特別是人抗體的CH結構域和CL結構域。作為非人動物，可使用任何動物，諸如小鼠、大鼠、倉鼠、兔等。嵌合抗體也可表示對至少兩種不同抗原具有特異性的多特異性抗體。
當提及多肽(即本發明的抗體)或核苷酸序列時，所謂“純化的”和“分離的”意指所示分子在基本上不存在相同類型的其他生物大分子的情況下存在。如本文所用，術語“純化的”特別意指存在至少75重量%、85重量%、95重量%或98重量%的相同類型的生物大分子。編碼特定多肽的“分離的”核酸分子是指基本上不含不編碼本主題多肽的其他核酸分子的核酸分子；然而，該分子可包括一些額外鹼基或部分，其不會有害地影響組成物的基本特徵。本發明可以包含，例如，一個分離的抗原結合蛋白，一個分離的抗體或其抗原結合片段，一個分離的多肽，一個或多個分離的核酸分子。
在本發明中，術語“親和力”通常由完整抗體和抗原之間的平衡締合來定義。親和力可例如以半最大有效濃度(EC50)或平衡解離常數(KD)表示。親和力可藉由多種已知方法進行實驗性評估，諸如用表面電漿共振測量締合和解離速率或者在免疫化學測定(ELISA和FACS)中測量EC50。
“半最大有效濃度”或“EC50”通常是指在指定暴露時間後在基線和最大值之間的中途誘導回應的藥物、抗體或毒劑的濃度。EC50與親和力呈反比關係，即EC50值越低，抗體的親和力越高。
“KD”是抗體與其抗原之間的平衡解離常數，即koff/kon的比率。KD和親和力呈反比關係。KD值與抗體濃度有關，即KD值越低，抗體的親和力越高。本揭露的抗體通常將具有小於約10-7M或10-8M，例如小於約10-9M或10-10M，在一些方面中，小於約10-11M、10-12M或10-13M的平衡解離常數。
術語“保守修飾的變體”適用於胺基酸和核酸序列兩者。關於特定核酸序列，保守修飾的變體是指編碼相同或基本相同的胺基酸序列的那些核酸，或在核酸不編碼胺基酸序列的情況下，是指基本相同的序列。由於遺傳密碼的簡 併性，許多功能上相同的核酸編碼任何給定的蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼胺基酸丙胺酸。因此，在由密碼子指定的丙胺酸的每個位置，密碼子可以改變為所述的任何對應密碼子而不改變所編碼的多肽。這種核酸變異是“沉默變異”，其是保守修飾的變異中的一種。本文中編碼多肽的每個核酸序列也描述了核酸的每一種可能的沉默變異。所屬技術領域具通常知識者將認識到，核酸中的每個密碼子(除了通常是甲硫胺酸的唯一密碼子的AUG和通常是色胺酸的唯一密碼子的TGG之外)都可以被修飾以產生功能上相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每個沉默變異都隱含在每個所述序列中。
對於多肽序列，“保守修飾的變體”包括對多肽序列的單獨取代、缺失或添加，這導致胺基酸被化學相似的胺基酸取代。提供功能上相似的胺基酸的保守取代表是本領域熟知的。此類保守修飾的變體是對多態性變體、種間同源物和等位基因的補充並且不排除它們。以下八組含有互為保守取代的胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、谷胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、穀胺醯胺(Q)；4)精胺酸(R)、賴胺酸(K)；5)異亮胺酸(I)、亮胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；和8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見例如，Creighton，Proteins，1984年)。在一些方面，術語“保守序列修飾”用於指不顯著影響或改變含有胺基酸序列的抗體的結合特徵的胺基酸修飾。
在本發明中，在兩個或更多個核酸或多肽序列的上下文中，術語“相同性百分比”或“同一性百分比”是指兩個或更多個序列或子序列相同的程度。如果兩個序列在被比較的區域上具有相同的胺基酸或核苷酸序列，則它們是“相同的”。如使用以下序列比較演算法中的一者或藉由人工比對和目視檢查測量 的，當在比較視窗或指定區域上進行最大對應性的比較和比對時，如果兩個序列具有相同的指定百分比的胺基酸殘基或核苷酸(即，在指定區域上或當未指定時在整個序列上具有60%同一性，視需要地65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性)，則兩個序列是“基本上相同的”。視需要地，同一性存在於長度為至少約30個核苷酸(或10個胺基酸)的區域上，或更佳地存在於長度為100個至500個或1000個或更多個核苷酸(或20個、50個、200個或更多個胺基酸)的區域上。適用於確定序列同一性百分比和序列相似性的演算法的兩個示例為BLAST和BLAST 2.0演算法，其分別在以下中所述：Altschul等人，Nuc.Acids Res.，第25卷：第3389-3402頁，1977年；以及Altschul等人，J.Mol.Biol.，第215卷：第403-410頁，1990年。
除了上述序列同一性百分比之外，兩個核酸序列或多肽基本上相同的另一個指示是由第一核酸編碼的多肽與針對由第二核酸編碼的多肽產生的抗體具有免疫交叉反應性。因此，多肽通常與第二多肽基本上相同，例如，這兩種多肽的不同之處僅在於保守取代。兩個核酸序列基本上相同的另一個指示是兩個分子或它們的補體在嚴格條件下彼此雜交。兩個核酸序列基本上相同的又一個指示是相同的引子可用於擴增序列。
在本發明中，術語“核酸”在本文中可與術語“多核苷酸”互換使用，並且通常是指單鏈或雙鏈形式的去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它們的聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或連接的核酸，其是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有與參比核酸相似的結合特性，並且以與參比核苷酸相似的方式代謝。此類類似物的示例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
在本發明中，術語“多肽”在本文中可與術語“蛋白”互換使用，並且是指胺基酸殘基的聚合物。這些術語適用於其中一個或多個胺基酸殘基是對應天然存在的胺基酸的人工化學類比物的胺基酸聚合物，以及適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。除非另有說明，否則特定的多肽序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變體。
在本發明中，如本文所用，術語“免疫偶聯物”通常是指抗體或其抗原結合片段與另一種試劑(諸如有效載荷、藥物部分、化學治療劑、毒素、免疫治療劑、顯影探針等)的連接。該連接可以是共價鍵或非共價相互作用，諸如藉由靜電力。可使用本領域已知的各種接頭以形成免疫偶聯物。另外，免疫偶聯物可以融合蛋白的形式提供，該融合蛋白可由編碼免疫偶聯物的多核苷酸表達。如本文所用，“融合蛋白”是指藉由連接最初編碼獨立的蛋白(包括肽和多肽)的兩個或更多個基因或基因片段而產生的蛋白。融合基因的翻譯產生了具有源自原始蛋白中的每一者的功能特性的單一蛋白。
如本文所用，術語“活性部分”或“有效載荷”通常是指構成活性劑的共軛化合物的部分，其介導的藥物效果包括但不限於預防、治療和/或診斷效果，例如，抗癌、抗炎、抗感染(如抗真菌、抗菌、抗病毒)或麻醉劑。將這些東西中的每一個附加到與本揭露的抗體和方法相容的連接物上的方法在本領域中是已知的。例如，見Singh等人，(2009)Therapeutic Antibodies：Methods and Protocols,vol.525,445-457.此外，"活性分子"或"有效載荷"可以是生物物理探針、螢光團、自旋標籤、紅外探針、親和探針、螯合劑、光譜探針、放射性探針、脂質分子。聚乙二醇、聚合物、DNA、RNA、蛋白質、肽、表面、抗體、抗體片段、奈米粒子、量子點、脂質體、PLGA粒子、糖類或多糖。。
在本發明中，術語“藥物部分”或“D”通常是指具有所需生物活性和反應性官能團的可用於將藥物併入本揭露的偶聯物中的任何化合物。在一些實施方案中，藥物部分表示在癌症治療中有用的細胞毒性藥物；具有所需生物活性的蛋白或多肽，諸如毒素，例如相思豆毒蛋白(abrin)、蓖麻毒蛋白A(ricin A)、假單胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin)和白喉毒素(diphtheria toxin)；其他合適的蛋白包括腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖溶酶原啟動子(tissue plasminogen activator)和生物應答調節劑，例如淋巴因子、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-6(IL-6)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或其他生長因子。在一些實施方案中，術語"藥物分子"可以是一個化學分子。在某些方面，藥物分子選自V-ATP酶抑制劑、HSP90抑制劑、IAP抑制劑、mTor抑制劑、微管穩定劑、微管不穩定劑、澳瑞他汀(Auristatin)、度拉他汀(Dolastatin)、美登素(Maytansinoid)、MetAP(蛋胺酸胺肽酶)、蛋白質CRM1的核出口抑制劑、DPPIV抑制劑。線粒體中磷酸轉移反應的抑制劑、蛋白質合成抑制劑、激酶抑制劑、CDK2抑制劑、CDK9抑制劑、蛋白酶體抑制劑、驅動蛋白抑制劑、HDAC抑制劑、DNA損傷劑、DNA烷基化劑、DNA插層劑、DNA小溝黏合劑和DHFR抑制劑。
在一個實施方案中，藥物部分可以是微管破壞藥物，諸如澳瑞他汀，例如單甲基澳瑞他汀E(MMAE)、單甲基澳瑞他汀F(MMAF)和澳瑞他汀F(AF)。在另一實施方案中，藥物部分可以是微管破壞藥物，諸如美登素(maytansinoid)，例如DM1、DM3和DM4。在另一實施方案中，藥物部分可以是DNA損傷劑，諸如卡奇黴素(calicheamicin)、倍癌黴素(duocarmycin)、SN-38和 吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮雜卓(PBD)。在其他實施方案中，藥物部分可以是鵝膏蕈鹼(amanitin)、蒽環類(anthracycline)、漿果赤黴素(baccatin)、喜樹鹼(camptothecin)、西馬多丁(cemadotin)、秋水仙鹼(colchicine)、秋水仙胺(colcimid)、考布他汀(combretastatin)、念珠藻素(cryptophycin)、圓皮海綿內酯(discodermolide)、多西他賽(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、棘黴素(echinomycins)、軟珊瑚醇(eleutherobin)、埃坡黴素(epothilone)、雌莫司汀(estramustine)、來希菌素(lexitropsin)、美登新(maytansine)、甲胺蝶呤(methotrexate)、紡錘菌素(netropsin)、嘌呤黴素(puromycin)、根瘤菌素(rhizoxin)、紫杉烷(taxane)、微管溶素(tubulysin)或長春花生物鹼(vinca alkaloid)。
在本發明中，術語“拓撲異構酶抑制劑”通常是指抑制拓撲異構酶活性的化合物。稱為拓撲異構酶I抑制劑的化合物具有針對拓撲異構酶I的活性，並且拓撲異構酶II抑制劑具有針對拓撲異構酶II的活性。一些化合物具有針對拓撲異構酶I和拓撲異構酶II兩者的活性，並且稱為拓撲異構酶I/II抑制劑。用於本發明的較佳拓撲異構酶I抑制劑是喜樹鹼和喜樹鹼類似物。喜樹鹼是最初從喜樹的木材和樹皮中分離的五環生物鹼，喜樹是中國本土的樹(Wall,M.E.等人，J.Am.Chem.Soc，第94卷：第388頁，1966年)。喜樹鹼藉由不可逆地抑制拓撲異構酶I發揮其藥理學效果，喜樹鹼和喜樹鹼類似物或衍生物的合成方法是已知的，並且在美國專利號5,244,903中進行了總結和描述，該專利全文以引用方式併入本文。
在本發明中，術語“喜樹鹼”通常包括喜樹鹼和喜樹鹼衍生物，包括伊立替康(irinotecan)、托泊替康(topotecan)、勒托替康(lurtotecan)、斯拉替康(silatecan)、依替立替康聚乙二醇(etirinotecan pegol)、TAS 103、9-胺基喜樹鹼(9- aminocamptothecin)、7-乙基喜樹鹼(7-ethylcamptothecin)、10-羥基喜樹鹼(10-hydroxycamptothecin)、9-硝基喜樹鹼(9-nitrocamptothecin)、10,11-亞甲二氧基喜樹鹼(10,11-methylenedioxycamptothecin)、9-胺基-10,11-亞甲二氧基喜樹鹼(9-amino-10,11-methylenedioxycamptothecin)、9-氯-10,11-亞甲二氧基喜樹鹼(9-chloro-10,11-methylenedioxycamptothecin)、7-(4-甲基哌嗪基亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹鹼(7-(4-methylpiperazinomethylene)-10)、7-(4-甲基哌嗪基亞甲基)-10,11-亞甲二氧基-20(S)-喜樹鹼(7-(4-methylpiperazinomethylene)-10,11-methylenedioxy-20(S)-camptothecin)和7-(2-(N-異丙基胺基)乙基)-(20S)-喜樹鹼(7-(2-(N-isopropylamino)ethyl)-(20S)-camptothecin)以及它們的立體異構體、鹽和酯。
應當注意，藥物不限於上述種類，並且包括所有可用於ADC的藥物。
在本發明中，本揭露中描述的術語“接頭”包括可切割接頭或不可切割接頭。可切割接頭可以是化學上不穩定的接頭和酶不穩定的接頭。由於高的血漿穩定性和良好的細胞內切割選擇性和效率，酶不穩定接頭被廣泛地選擇為ADC中的可切割接頭候選物。在一些實施方案中，酶不穩定接頭可包括選自由以下項組成的組的肽單元(-AAs-)：-纈胺酸-瓜胺酸-(-Val-Cit-)、-纈胺酸-賴胺酸-(-Val-Lys-)、-纈胺酸-精胺酸-(-Val-Arg-)、-苯丙胺酸-瓜胺酸-(-Phe-Cit-)、-苯丙胺酸-賴胺酸-(-Phe-Lys-)和-苯丙胺酸-精胺酸-(-Phe-Arg-)。典型的酶不穩定接頭包括可被組織蛋白酶B識別的-Val-Cit-和-Phe-Lys-。在一些實施方案中，不可切割接頭可以是能夠增加所得ADC的親水性的接頭。在一個實施方案中，不可切割接頭可包括一種或多種聚(乙二醇)(PEG)。在其他實施方案中，不可切割接頭可以是PEG、PEG二胺(NH2-PEG-NH2)、胺-PEG-羥基(NH2-PEG-OH)、胺-PEG- COOH(NH2-PEG-COOH)、二伸乙基三胺或它們的組合。在一些實施方案中，PEG可表示為-(CH2CH2O)x-，其中x可以是1至20的整數。
在本發明中，如本文所用，術語“毒素”、“細胞毒素”或“細胞毒性劑”通常是指對細胞的生長和增殖有害並且可起到減少、抑制或破壞細胞或惡性腫瘤的作用的任何試劑。
在本發明中，如本文所用，術語“抗腫瘤劑”或“抗腫瘤藥物”通常是指可用於治療細胞增殖性病症諸如癌症的任何試劑，包括但不限於細胞毒性劑、化學治療劑、放射治療和放射治療劑、靶向抗癌劑和免疫治療劑。
在本發明中，術語“腫瘤”或“癌症”通常是指惡性或良性的贅生性細胞生長和增殖，以及所有癌前和癌細胞和組織。
在本發明中，術語“抗腫瘤活性”意指腫瘤細胞增殖、生存力或轉移活性的速率的降低。顯示抗腫瘤活性的一種可能方式是顯示腫瘤細胞生長速率的下降、腫瘤大小的停滯或腫瘤大小的減小。可使用接受的體外或體內腫瘤模型來評估這樣的活性，這些模型包括但不限於異種移植物模型、同種異體移植物模型、MMTV模型和本領域已知的用於研究抗腫瘤活性的其他已知模型。
在本發明中，術語“鈣黏蛋白6”或“CDH6”通常是指由790個胺基酸組成的單次跨膜蛋白，該蛋白被分類為II型鈣黏蛋白家族，並且該蛋白具有N末端胞外和C末端胞內結構域。人類CDH6基因於1995年首次被選殖，其序列可參考NM_004932和NP_004923(NCBI)等登錄號。此外，由包含上述CDH6胺基酸序列中一個或幾個胺基酸的取代、缺失和/或添加的胺基酸序列組成並且具有與CDH6蛋白的生物活性相當的生物活性的蛋白也包括在術語“CDH6”中。
在本說明書中，術語“表位”通常用於意指CDH6的部分肽或部分三維結構，特異性抗CDH6抗體結合至該部分肽或部分三維結構。
術語“表達CDH6的腫瘤”或“CDH6陽性腫瘤”通常是指在腫瘤細胞表面表達CDH6和/或CDH6的突變形式的腫瘤。
在本發明中，術語“受試者”包括人和非人動物。非人動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，諸如非人靈長類動物、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除非另有說明，否則術語“患者”或“受試者”在本文中可互換使用。
在本發明中，術語“藥學上可接受的”通常是指不干擾活性成分生物學活性的有效性的一種或多種無毒物質。這類製劑通常可含有鹽、緩衝劑、防腐劑、相容性載體和視需要的其它治療劑。這類藥學上可接受的製劑通常也可包含適合給予人的相容性固體或液體填料、稀釋劑或包囊材料。用於醫藥時，鹽應該是藥學上可接受的鹽，但可方便地使用非藥學上可接受的鹽來製備藥學上可接受的鹽，不能將它們排除在本發明範圍以外。這類藥理學和藥學上可接受的鹽包括但不限於由以下酸製備的鹽：氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、檸檬酸、硼酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。藥學上可接受的鹽也可製備成鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽，如鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。在本文中所述術語“溶劑化物”按照常規意義使用，是指溶質(例如，活性化合物，活性化合物的鹽)和溶劑的配合物。溶劑化物通常不會顯著改變化合物的生理活性或毒性，因此可以起藥理學等效物的作用。如果溶劑是水，則溶劑化物可以方便地稱為水合物，例如，單水合物、二水合物、三水合物等。
在本發明中，術語“治療”(“treat”、“treating”或“treatment”)任何疾病或病症在一個方面通常是指改善疾病或病症(即，減緩或阻止或減少疾病或其臨床症狀中的至少一種的發展)。在另一方面，“治療”是指減輕或改善至少一種身體參數，包括患者可能無法辨別的那些。在又一方面，“治療”是指在身體上(例如，穩定可辨別的症狀)、在生理上(例如，穩定身體參數)或在兩者上調節疾病或病症。在又一方面，“治療”是指預防或延遲疾病或病症的發作或發展或進展。
在本發明中，術語“治療上可接受的量”或“治療有效劑量”可互換地指足以實現期望結果(即，腫瘤大小的減小，腫瘤生長的抑制，轉移的預防，病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染的抑制或預防)的量。在一些方面，治療上可接受的量不會誘導或引起不期望的副作用。治療上可接受的量可藉由首先施用低劑量，並且然後遞增地增加該劑量直到實現期望的效果來確定。本揭露的分子的“預防有效劑量”和“治療有效劑量”可分別預防疾病症狀(包括與癌症相關的症狀)的發作或導致疾病症狀的嚴重程度的降低。
在本發明中，術語“共同施用”通常是指在個體的血液中同時存在兩種活性劑。共同施用的活性劑可同時或依次遞送。
在本發明中，除非另有說明，術語“由......組成”、“含有”、“具有”、“包括”和“包含”應理解為“包括但不限於”。在描述本發明的上下文中，並且具體地在所附申請專利範圍的上下文中，除非另有說明，否則術語“一個”、“一者”和“該”以及類似的指代應理解為包括單數和複數。除非另有要求，否則任何和所有示例或示例性語言(“例如”、“如”、“諸如”)的使用僅旨在說明本發明的各方面或實施方案，並且不應理解為限制其範圍。
在本發明中，當涉及可測量值諸如量、時間期限等時，術語“約”意指涵蓋指定值的±20%或在一些情況下±10%或在一些情況下±5%或在一些情況下±1%或在一些情況下±0.1%的變化，因為此類變化適於執行所公開的方法。
抗CDH6抗體
雖然本文已經示出並描述了本發明的各種實施方案，但是對於所屬技術領域具通常知識者來說顯而易見的是，這些實施方案僅以示例的方式提供。在不背離本發明的情況下，所屬技術領域具通常知識者可以想到許多變化、改變和替換。應當理解，可以採用本文所述的本發明的實施方案的各種替代方案。
本發明的抗CDH6抗體可源自任何物種。較佳的物種示例可包括人、猴、大鼠、小鼠和兔。當本發明的抗CDH6抗體源自人以外的物種時，較佳藉由熟知技術嵌合或人源化抗CDH6抗體。本發明的抗體可以是多株抗體，或者可以是單株抗體，並且較佳單株抗體。
本發明的抗CDH6抗體是可靶向腫瘤細胞的抗體。具體地，本發明的抗CDH6抗體具有能夠識別腫瘤細胞的特性、能夠結合腫瘤細胞的特性和/或藉由細胞攝取內化至腫瘤細胞中的特性等。因此，本發明的抗CDH6抗體可經由接頭偶聯到活性部分以製備免疫偶聯物(例如，本發明的抗CDH6抗體可經由接頭偶聯到具有抗腫瘤活性的化合物以製備抗體-藥物偶聯物)。
抗CDH6抗體可藉由本領域通常進行的方法用作為抗原的多肽對動物進行免疫並且然後收集並純化其活體中產生的抗體而獲得。抗原的來源不限於人，並且因此，動物也可用源自非人動物諸如小鼠或大鼠的抗原進行免疫。 在這種情況下，藉由檢查與異源抗原結合的所獲得的抗體與人抗原的交叉反應性，可選擇適用於人疾病的抗體。
此外，可根據已知方法(例如，Kohler和Milstein，Nature，1975年，第256卷：第495-497頁；以及Kennet,R.編輯，Monoclonal Antibodies，第365-367頁，Plenum Press，N.Y.，1980年)將產生針對該抗原的抗體的產生抗體的細胞與骨髓瘤細胞融合以建立融合瘤，以便獲得單株抗體。
用於本發明的抗CDH6抗體沒有特別限制。例如，可適當地使用在本發明的序列表中列出的胺基酸序列所指定的抗體。用於本發明的抗CDH6抗體理想地是具有以下特性的抗體：(a)與CDH6特異性結合，以及(b)藉由與CDH6結合而具有內化至表達CDH6的細胞中的活性；其中CDH6可以是人CDH6。
在下文中，將具體描述獲得抗CDH6抗體的方法。
(a)CDH6的胞外區(Ser 54-Ala 615)可用作免疫原(ACRO Biosystems，CA6-H5229)，並將抗原直接施用給待免疫的動物(例如大鼠或小鼠)。如果需要增強抗體滴度，則抗原的施用可進行一次或多次，較佳多次；
(b)從已經誘導了免疫應答的上述動物中收集含有產生抗體的細胞的組織(例如，淋巴結)；
(c)製備骨髓瘤細胞(下文稱作“骨髓瘤”)(例如，小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞)；
(d)產生抗體的細胞與骨髓瘤之間的細胞融合；
(e)選擇產生目的抗體的融合瘤組；
(f)分裂成單細胞株(株)；
(g)視需要地，培養用於大量生產單株抗體的融合瘤或培育接種了融合瘤的動物；以及/或者
(h)研究由此產生的單株抗體的生理活性(內化活性)和結合特異性或檢查作為標記試劑的抗體的特性。
用於測量本文所用抗體滴度的方法的示例可包括但不限於流式細胞術和Cell-ELISA。
本文定義的特定CDR序列通常基於IMGT定義。然而，應當理解，對特定抗體的重鏈CDR或CDRs和/或輕鏈CDR或CDRs的引用包括所屬技術領域具通常知識者已知的所有CDR定義。
在一些實施方案中，本文提供的抗CDH6抗體或抗原結合片段包含本文所述抗體中任一種的一個、兩個、三個、四個、五個和/或六個CDR。在一些實施方案中，本文提供的抗CDH6抗體或抗原結合片段包含表1中的一個、兩個和/或三個VL CDR的VL。在一些實施方案中，本文提供的抗CDH6抗體或抗原結合片段包含表1中的一個、兩個和/或三個VH CDR的VH。在一些實施方案中，本文提供的抗CDH6抗體或抗原結合片段包含表1中的一個、兩個和/或三個VL CDR以及表1中一個、二個和/或者三個VH CDR。
在一些實施方案中，抗CDH6抗體或其抗原結合片段包含來自本文所述抗體或抗原結合片段的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3、VH CDR1、VH CDR2和/或VH CDR3。在一些實施方案中，抗CDH6抗體或其抗原結合片段包含本文所述的抗CDH6抗體或抗原結合片段的變體。在一些實施方案中，抗CDH6抗體或抗原結合片段的變體包含抗CDH6抗體或抗原結合片段中的1至30個胺基酸替換、添加和/或缺失。在一些實施方案中，抗CDH6抗體或抗原 結合片段的變體包含抗CDH6抗體或抗原結合片段中的1至25個胺基酸替換、添加和/或缺失。在一些實施方案中，抗CDH6抗體或抗原結合片段的變體包含抗CDH6抗體或抗原結合片段中的1至20個胺基酸替換、添加和/或缺失。在一些實施方案中，抗CDH6抗體或抗原結合片段的變體包含抗CDH6抗體或抗原結合片段中的1至15個胺基酸替換、添加和/或缺失。在一些實施方案中，抗CDH6抗體或抗原結合片段的變體包含抗CDH6抗體或抗原結合片段中的1至10個胺基酸替換、添加和/或缺失。在一些實施方案中，抗CDH6抗體或抗原結合片段的變體包含抗CDH6抗體或抗原結合片段中的1至5個胺基酸替換、添加和/或缺失。在一些實施方案中，抗CDH6抗體或抗原結合片段的變體包含抗CDH6抗體或抗原結合片段中的1至3個胺基酸替換、添加和/或缺失。在一些實施方案中，胺基酸取代、添加和/或缺失是保守的胺基酸取代。在一些實施方案中，保守胺基酸取代位於抗體或抗原結合片段的CDR中。在一些實施方案中，保守胺基酸取代不在抗體或抗原結合片段的CDR中。在一些實施方案中，保守胺基酸取代位於抗體或抗原結合片段的框架區域中。
在一些實施方案中，本文提供了特異性結合CDH6(例如，人CDH6)的抗體或其抗原結合片段，包括：
a)重鏈可變區(VH)，其包含(1)具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列的重鏈CDR1(HCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列的重鏈CDR2(HCDR2)；或(3)具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的重鏈CDR3(HCDR3)；或其變體，其在HCDR中具有多達約3、約5、約8、約10、約12或約15個胺基酸取代、添加和/或缺失；
和/或b)輕鏈可變區(VH)，其包含(1)具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的輕鏈CDR1(HCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的輕鏈CDR2(HCDR2)；或(3)具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列的輕鏈CDR3(HCDR3)；或其變體，其在HCDR中具有多達約3、約5、約8、約10、約12或約15個胺基酸取代、添加和/或缺失；
在一些實施方案中，變體在HCDR中具有多達約5個胺基酸取代、添加和/或缺失，和/或變體在LCDR中具有多達約5個核苷酸取代、添加或缺失。
在一些實施方案中，本文提供了特異性結合CDH6(例如人CDH6)的抗體或其抗原結合片段，其包括：a)和SEQ ID NO：18的胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的VH，或100%序列同一性的VH；和/或b)與SEQ ID NO：23的胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的VL。
在一些實施方案中，本文提供了特異性結合CDH6(例如，人CDH6)的抗體或其抗原結合片段，包括：
a)重鏈可變區(VH)，其包含(1)具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列的重鏈CDR1(HCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：9的胺基酸序列的重鏈CDR2(HCDR2)；或(3)具有SEQ ID NO：10的胺基酸序列的重鏈CDR3(HCDR3)；或其變體，其在 HCDR中具有多達約3、約5、約8、約10、約12或約15個胺基酸取代、添加和/或缺失；
和/或b)輕鏈可變區(VL)，其包含(1)具有SEQ ID NO：11的胺基酸序列的輕鏈CDR1(LCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：12的胺基酸序列的輕鏈CDR2(LCDR2)；或(3)具有SEQ ID NO：13的胺基酸序列的輕鏈CDR3(LCDR3)；或其變體，其在LCDR中具有多達約3、約5、約8、約10、約12或約15個胺基酸取代、添加和/或缺失。
在一些實施方案中，變體在HCDR中具有多達約5個胺基酸取代、添加和/或缺失，和/或變體在LCDR中具有多達約5個核苷酸取代、添加或缺失。
在一些實施方案中，本文提供了特異性結合CDH6(例如人CDH6)的抗體或其抗原結合片段，其包括：a)和SEQ ID NO：41的胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的VH，或100%序列同一性的VH；和/或b)與SEQ ID NO：46的胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的VL。
在一些實施方案中，本文提供了特異性結合CDH6(例如，人CDH6)的抗體或其抗原結合片段，包括：
a)重鏈可變區(VH)，其包含(1)具有SEQ ID NO：89的胺基酸序列的重鏈CDR1(HCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：90的胺基酸序列的重鏈CDR2(HCDR2)： 或(3)具有SEQ ID NO：91的胺基酸序列的重鏈CDR3(HCDR3)；或其變體，其在HCDR中具有多達約3、約5、約8、約10、約12或約15個胺基酸取代、添加和/或缺失；
和/或b)輕鏈可變區(VL)，其包含(1)具有SEQ ID NO：92的胺基酸序列的輕鏈CDR1(LCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：93的胺基酸序列的輕鏈CDR2(LCDR2)；或(3)具有SEQ ID NO：94的胺基酸序列的輕鏈CDR3(LCDR3)；或其變體，其在LCDR中具有多達約3、約5、約8、約10、約12或約15個胺基酸取代、添加和/或缺失。
在一些實施方案中，變體在HCDR中具有多達約5個胺基酸取代、添加和/或缺失，和/或變體在LCDR中具有多達約5個核苷酸取代、添加或缺失。
在一些實施方案中，本文提供了特異性結合CDH6(例如人CDH6)的抗體或其抗原結合片段，其包括：a)和SEQ ID NO：95的胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的VH，或100%序列同一性的VH；和/或b)與SEQ ID NO：96的胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的VL。
在一些實施方案中，本文提供了特異性結合CDH6(例如，人CDH6)的抗體或其抗原結合片段，包括：
a)重鏈可變區(VH)，其包含(1)具有SEQ ID NO：97的胺基酸序列的重鏈CDR1(HCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：98的胺基酸序列的重鏈CDR2(HCDR2)：或(3)具有SEQ ID NO：99的胺基酸序列的重鏈CDR3(HCDR3)；或其變體，其在HCDR中具有多達約3、約5、約8、約10、約12或約15個胺基酸取代、添加和/或缺失；
和/或b)輕鏈可變區(VL)，其包含(1)具有SEQ ID NO：100的胺基酸序列的輕鏈CDR1(LCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：101的胺基酸序列的輕鏈CDR2(LCDR2)；或(3)具有SEQ ID NO：102的胺基酸序列的輕鏈CDR3(LCDR3)；或其變體，其在LCDR中具有多達約3、約5、約8、約10、約12或約15個胺基酸取代、添加和/或缺失。
在一些實施方案中，變體在HCDR中具有多達約5個胺基酸取代、添加和/或缺失，和/或變體在LCDR中具有多達約5個核苷酸取代、添加或缺失。
在一些實施方案中，本文提供了特異性結合CDH6(例如人CDH6)的抗體或其抗原結合片段，其包括：a)和SEQ ID NO：103的胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的VH，或100%序列同一性的VH；和/或b)與SEQ ID NO：104的胺基酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的VL。
如此建立的融合瘤株的示例可包括產生抗CDH6抗體的融合瘤707和463。應當注意，在本說明書中，由產生抗CDH6抗體的融合瘤707產生的抗體稱為“707抗體”或簡稱為“707”，由融合瘤463產生的抗體稱為“463抗體”或簡稱為“463”，由融合瘤066產生的抗體稱為“066抗體”或簡稱為“066”，並且由融合瘤439產生的抗體稱為“439抗體”或簡稱為“439”。
707抗體的重鏈可變區具有由如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列組成的HCDR1、由如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列組成的HCDR2和由如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列組成的HCDR3。707抗體的輕鏈可變區具有包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列的LCDR1、包含如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列的LCDR2和包含如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列的LCDR3。
此外，707抗體的重鏈可變區由如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列組成。707抗體的輕鏈可變區由如SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列組成。
463抗體的重鏈可變區具有由如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列組成的HCDR1、由如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列組成的HCDR2和由如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列組成的HCDR3。463抗體的輕鏈可變區具有包含如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列的LCDR1、包含如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列的LCDR2和包含如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列的LCDR3。
此外，463抗體的重鏈可變區由如SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列組成。463抗體的輕鏈可變區由如SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列組成。
066抗體的重鏈可變區具有由如SEQ ID NO：89所示的胺基酸序列組成的HCDR1、由如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列組成的HCDR2和由如SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列組成的HCDR3。066抗體的輕鏈可變區具 有包含如SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列的LCDR1、包含如SEQ ID NO：93所示的胺基酸序列的LCDR2和包含如SEQ ID NO：94所示的胺基酸序列的LCDR3。
此外，066抗體的重鏈可變區由如SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列組成。066抗體的輕鏈可變區由如SEQ ID NO：96所示的胺基酸序列組成。
439抗體的重鏈可變區具有由如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列組成的HCDR1、由如SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列組成的HCDR2和由如SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列組成的HCDR3。439抗體的輕鏈可變區具有包含如SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列的LCDR1、包含如SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列的LCDR2和包含如SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列的LCDR3。
此外，439抗體的重鏈可變區由如SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列組成。439抗體的輕鏈可變區由如SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列組成。
其他抗體
本發明的抗體也包括為了降低對人的異質性抗原性而人工修飾的基因重組抗體，諸如嵌合抗體、人源化抗體和人抗體，以及上述抗CDH6單株抗體。這些抗體可藉由已知方法製備。
在一些實施方案中，抗CDH6抗體或抗原結合片段是人抗體或抗原結合片段。可以使用本領域已知的各種技術製備人抗體。在一些實施方案中，人抗體由體外免疫的永生化人B淋巴細胞產生。在一些實施方案中，人抗體由從免疫個體分離的淋巴細胞產生。在任何情況下，都可以產生和分離產生針對靶抗原的抗體的細胞。在一些實施方案中，人抗體選自噬菌體庫，其中噬菌體庫表 達人抗體。可替代地，噬菌體展示技術可用於從未接種供體的免疫球蛋白可變區基因庫中體外產生人抗體和抗體片段。用於產生和使用抗體噬菌體庫的技術是本領域公知的。一旦識別出抗體，本領域已知的成熟親和力策略，包括但不限於鏈重排和定點突變，可用於產生更高親和力的人抗體。在一些實施方案中，在含有人免疫球蛋白基因座的轉基因小鼠中產生人抗體。免疫後，這些小鼠能夠在缺乏內源性免疫球蛋白產生的情況下產生全部人類抗體。
嵌合抗體的示例可包括其中可變區和恆定區彼此異源的抗體，諸如藉由將小鼠或大鼠來源的抗體的可變區與人源恆定區偶聯形成的嵌合抗體(參見Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第81卷：第6851-6855頁，1984年)。
源自小鼠抗人CDH6抗體的嵌合抗體的示例包括由輕鏈和重鏈組成的抗體，該輕鏈包含本說明書中描述的每種小鼠抗人CDH6抗體(例如，707抗體或463抗體)的輕鏈可變區和人源恆定區，該重鏈包含其重鏈可變區和人源恆定區。
源自小鼠抗人CDH6抗體的嵌合抗體的其他示例包括由輕鏈和重鏈組成的抗體，該輕鏈包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區在本說明書中描述的每種小鼠抗人CDH6抗體(例如，707抗體或463抗體)的輕鏈可變區中的胺基酸的一個至幾個殘基、1個至3個殘基、1個或2個殘基，較佳1個殘基被其他胺基酸殘基取代，該重鏈包含重鏈可變區，該重鏈可變區在其重鏈可變區中的胺基酸的一個至幾個殘基、1個至3個殘基、1個或2個殘基，較佳1個殘基被其他胺基酸殘基取代。該抗體可具有任何給定的人源恆定區。
源自小鼠抗人CDH6抗體的嵌合抗體的其他示例包括由輕鏈和重鏈組成的抗體，該輕鏈包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區在本說明書中描述的每種 小鼠抗人CDH6抗體(例如，707抗體或463抗體)的輕鏈可變區中的任何1個至3個CDR中的胺基酸的1個或2個殘基，較佳1個殘基被其他胺基酸殘基取代，該重鏈包含重鏈可變區，該重鏈可變區在其重鏈可變區中的任何1個至3個CDR中的胺基酸的1個或2個殘基，較佳1個殘基被其他胺基酸殘基取代。該抗體可具有任何給定的人源恆定區。
本領域已知，抗體的恆定區介導多種效應器功能，這些效應器功能可根據抗體的同種型而變化。在一些實施方案中，本文所述的抗CDH6抗體或抗原結合片段包含人IgA抗體的至少一個恆定區。在一些實施方案中，本文所述的抗CDH6抗體或抗原結合片段包含人IgD抗體的至少一個恆定區。在一些實施方案中，本文所述的抗CDH6抗體或抗原結合片段包含人IgE抗體的至少一個恆定區。在一些實施方案中，本文所述的抗CDH6抗體或抗原結合片段包含人IgG抗體的至少一個恆定區。在一些實施方案中，本文所述的抗CDH6抗體或抗原結合片段包含人IgM抗體的至少一個恆定區。在一些實施方案中，本文所述的抗CDH6抗體或抗原結合片段包含人IgG1抗體的至少一個恆定區。在一些實施方案中，本文所述的抗CDH6抗體或抗原結合片段包含人IgG2抗體的至少一個恆定區。在一些實施方案中，本文所述的抗CDH6抗體或抗原結合片段包含人IgG3抗體的至少一個恆定區。在一些實施方案中，本文所述的抗CDH6抗體或抗原結合片段包含人IgG4抗體的至少一個恆定區。在一些實施例中，Fc區域藉由鉸鏈融合。鉸鏈可以是IgG1鉸鏈、IgG2鉸鏈或IgG3鉸鏈。所屬技術領域具有通常知識者已知人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc區的胺基酸序列。在某些情況下，天然抗體中已鑑定出具有胺基酸變異的Fc區。
源自707抗體的嵌合抗體的示例包括由重鏈和輕鏈組成的抗體，該重鏈包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，該輕鏈包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。該抗體可具有任何給定的人源恆定區。視需要地，重鏈恆定區可以是人IgG1恆定區，並且輕鏈恆定區可以是人Igκ恆定區。
在一個實施方案中，重鏈可包含如SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列，並且輕鏈可包含如SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列，並且嵌合抗體命名為Ch069707。
源自463抗體的嵌合抗體的示例包括由重鏈和輕鏈組成的抗體，該重鏈包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列，該輕鏈包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列。該抗體可具有任何給定的人源恆定區。視需要地，重鏈恆定區可以是人IgG1恆定區(SEQ ID NO：70)，並且輕鏈恆定區可以是人Igκ恆定區(SEQ ID NO：71)。
在一個實施方案中，重鏈可包含如SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列，並且輕鏈可包含如SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列，並且嵌合抗體命名為Ch069463。
人源化抗體的示例可包括藉由僅將互補決定區(CDR)整合到人源抗體中形成的抗體(參見Nature，1986年，第321卷，第522-525頁)，藉由根據CDR移植方法(國際公開號WO90/07861)將來自一些框架的胺基酸殘基以及CDR序列整合到人抗體中形成的抗體，以及藉由修飾一些CDR的胺基酸序列同時保持抗原結合能力形成的抗體。
在本說明書中，源自707抗體、Ch069707抗體、463抗體或Ch069463抗體的人源化抗體不限於特定的人源化抗體，只要該人源化抗體保留707抗體、Ch069707抗體、463抗體或Ch069463抗體所特有的所有6個CDR序列，並具有內化活性。該人源化抗體的一些CDR的胺基酸序列可進一步修飾，只要其具有內化活性。
Ch069707抗體的人源化抗體的具體示例可包括重鏈和輕鏈的任意給定的組合，該重鏈包含重鏈可變區，該重鏈可變區由選自以下項組成的組的任一個胺基酸序列組成：(1)如SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列，(2)與上述胺基酸序列(1)具有至少95%或更高同一性的胺基酸序列(較佳與除每個CDR序列之外的框架區的序列具有至少95%或更高序列同一性的胺基酸序列)，和(3)包含上述胺基酸序列(1)中一個或幾個胺基酸的缺失、取代或添加的胺基酸序列；該輕鏈包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區由選自以下項組成的組的任一個胺基酸序列組成：(4)如SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列，(5)與上述胺基酸序列(4)具有至少95%或更高同一性的胺基酸序列(較佳與除每個CDR序列之外的框架區序列具有至少95%或更高序列同一性的胺基酸序列)，和(6)包含上述胺基酸序列(4)中一個或幾個胺基酸的缺失、取代或添加的胺基酸序列。視需要地，重鏈恆定區可以是人IgG1恆定區(SEQ ID NO：70)，並且輕鏈恆定區可以是人Igκ恆定區(SEQ ID NO：71)，並且人源化抗體分別命名為CL069707-H1L1、CL069707-H1L2、CL069707-H2L1和CL069707-H2L2，具體地描述如下。
在一些實施方案中，重鏈可包含如SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：85具有至少95%或更高同一性的胺基酸序列，並且輕鏈 可包含如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：86具有至少95%或更高同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，Ch069707抗體的人源化抗體可以包括以下任意給定的組合：重鏈，其包含由選自SEQ ID NO：27或29中所列胺基酸序列的任意一個胺基酸序列組成的重鏈可變區；和包含輕鏈可變區的輕鏈，該輕鏈可變區域由選自SEQ ID NO：34或36中所列胺基酸序列的任何一個胺基酸序列組成。
在一個實施方案中，重鏈可包含如SEQ ID NO：74所示的胺基酸序列，並且輕鏈可包含如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列，並且人源化抗體命名為CL069707-H1L1。
在一個實施方案中，重鏈可包含如SEQ ID NO：74所示的胺基酸序列，並且輕鏈可包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，並且人源化抗體命名為CL069707-H1L2。
在一個實施方案中，重鏈可包含如SEQ ID NO：75所示的胺基酸序列，並且輕鏈可包含如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列，並且人源化抗體命名為CL069707-H2L1。
在一個實施方案中，重鏈可包含如SEQ ID NO：75所示的胺基酸序列，並且輕鏈可包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，並且人源化抗體命名為CL069707-H2L2。
Ch069463抗體的人源化抗體的具體示例可包括重鏈和輕鏈的任意給定的組合，該重鏈包含重鏈可變區，該重鏈可變區由選自以下項組成的組的任一個胺基酸序列組成：(1)如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列，(2)與上述胺基酸序列(1)具有至少95%或更高同一性的胺基酸序列(較佳與除每個CDR序列 之外的框架區的序列具有至少95%或更高序列同一性的胺基酸序列)，和(3)包含上述胺基酸序列(1)中一個或幾個胺基酸的缺失、取代或添加的胺基酸序列；該輕鏈包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區由選自以下項組成的組的任一個胺基酸序列組成：(4)如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列，(5)與上述胺基酸序列(4)具有至少95%或更高同一性的胺基酸序列(較佳與除每個CDR序列之外的框架區序列具有至少95%或更高序列同一性的胺基酸序列)，和(6)包含上述胺基酸序列(4)中一個或幾個胺基酸的缺失、取代或添加的胺基酸序列。視需要地，重鏈恆定區可以是人IgG1恆定區(SEQ ID NO：70)，並且輕鏈恆定區可以是人Igκ恆定區(SEQ ID NO：71)，並且人源化抗體命名為CL069463-H1L1、CL069463-H1L2、CL069463-H1L3、CL069463-H2L1、CL069463-H2L2和CL069463-H2L3。
在一些實施方案中，Ch069463抗體的人源化抗體可以包括以下任意給定的組合：重鏈，其包含由選自SEQ ID NO：51或54中所列胺基酸序列的任意一個胺基酸序列組成的重鏈可變區；和包含輕鏈可變區的輕鏈，該輕鏈可變區域由選自SEQ ID NO：58、63或65中所列胺基酸序列的任何一個胺基酸序列組成。
在一些實施方案中，重鏈可包含如SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：87具有至少95%或更高同一性的胺基酸序列，並且輕鏈可包含如SEQ ID NO：88所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：88具有至少95%或更高同一性的胺基酸序列。
在一個實施方案中，重鏈可包含如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列，並且輕鏈可包含如SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列，並且人源化抗體命名為CL069463-H1L1。
在一個實施方案中，重鏈可包含如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列，並且輕鏈可包含如SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列，並且人源化抗體命名為CL069463-H1L2。
在一個實施方案中，重鏈可包含如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列，並且輕鏈可包含如SEQ ID NO：84所示的胺基酸序列，並且人源化抗體命名為CL069463-H1L3。
在一個實施方案中，重鏈可包含如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列，並且輕鏈可包含如SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列，並且人源化抗體命名為CL069463-H2L1。
在一個實施方案中，重鏈可包含如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列，並且輕鏈可包含如SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列，並且人源化抗體命名為CL069463-H2L2。
在一個實施方案中，重鏈可包含如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列，並且輕鏈可包含如SEQ ID NO：84所示的胺基酸序列，並且人源化抗體命名為CL069463-H2L3。
表1.小鼠抗體、嵌合抗體和人源化抗體的序列
Figure 111147444-A0202-12-0062-7
Figure 111147444-A0202-12-0063-8
Figure 111147444-A0202-12-0064-9
Figure 111147444-A0202-12-0065-10
Figure 111147444-A0202-12-0066-11
Figure 111147444-A0202-12-0067-12
本說明書中的胺基酸取代較佳是保守胺基酸取代。保守胺基酸取代是在與某些胺基酸側鏈相關的胺基酸組內發生的取代。較佳的胺基酸基團如下：酸性基團=天冬胺酸和谷胺酸；鹼性基團=賴胺酸、精胺酸和組胺酸；非極性基團=丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸和色胺酸；以及不帶電荷的極性家族=甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸和酪胺酸。其他較佳的胺基酸基團如下：脂族羥基=絲胺酸和蘇胺酸；含醯胺基團=天冬醯胺和穀胺醯胺；脂族基團=丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸和異亮胺酸；以及芳基=苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸。較佳在不損害具有原始胺基酸序列的物質的特性的情況下進行這樣的胺基酸取代。
藉由將與上述重鏈胺基酸序列和輕鏈胺基酸序列顯示高度同一性的序列組合在一起，有可能選擇具有與上述抗體中每一者的生物活性相當的生物活性的抗體。這種同一性通常是80%或更高，較佳90%或更高，更佳95%或 更高，最佳99%或更高的同一性。此外，藉由將重鏈和輕鏈的胺基酸序列組合，該重鏈和輕鏈的胺基酸序列包含相對於重鏈或輕鏈的胺基酸序列其一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加，也有可能選擇具有與上述抗體中每一者的生物活性相當的生物活性的抗體。
也可藉由根據遺傳重組技術用編碼此類人抗體的重鏈和輕鏈中每一者的cDNA或較佳用包含cDNA的載體轉化真核細胞，並且然後培養產生基因修飾的人單株抗體的轉化細胞，使得可從培養上清液獲得抗體來獲得抗CDH6人抗體。在該上下文中，例如可使用真核細胞，並且較佳哺乳動物細胞諸如CHO細胞、淋巴細胞或骨髓瘤作為宿主。
此外，獲得從人抗體文庫(參見Wormstone,I.M.等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science，2002年，第43卷第7期：第2301-2308頁；Carmen,S.等人，Briefings in Functional Genomics and Proteomics，2002年，第1卷第2期：第189-203頁；Siriwardena,D.等人，Ophthalmology，2002年，第109卷第3期：第427-431頁；等等)中選擇的噬菌體展示源人抗體的方法也是已知的。
免疫偶聯物
本發明的抗CDH6抗體可偶聯到活性部分，並且該活性部分可包括藥物部分和/或標記。
在一些實施方案中，該藥物部分選自由以下項組成的組：細胞毒性劑、細胞因子、核酸、核酸相關分子、放射性核素、趨化因子、免疫(共)刺激分子、免疫抑制分子、死亡配體、凋亡誘導蛋白、激酶、前藥轉化酶、核糖核酸 酶、激動性抗體或抗體片段、拮抗性抗體或抗體片段、生長因子、激素、凝血因子、纖溶活性蛋白、模擬這些物質的肽，以及它們的片段、融合蛋白或衍生物。
在一些實施方案中，該標記選自由以下項組成的組：放射性標記、螢光團、發色團、顯影劑和金屬離子。
在一些實施方案中，該細胞毒性劑包含微管破壞藥物和/或DNA損傷劑。
在一些實施方案中，細胞毒性劑可選自：紫杉醇(Paclitaxel)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、短細菌素D(short bacteriocin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根鹼(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、翁秋硫苷(onychothioside)、噻吩苷(thienoside)、長春新鹼(vincristine)、秋水仙鹼(colchicine)、多柔比星(doxorubicin)、紅黴素(erythromycin)、二羥卡巴黴素(dihydroxycarbamycin)二羥卡巴黴素二酮(dihydroxycarbamycin dione)、微管蛋白抑制劑、米托蒽醌(mitoxantrone)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮質激素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、布比卡因(bupivacaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)、激肽釋放酶(kallikrein)或其類似物或衍生物、抗代謝物、烷化劑、抗生素、抗有絲分裂劑、白喉毒素(diphtheria toxin)和相關分子及其活性片段和異二聚體分子、蓖麻毒蛋白毒素(ricin toxin)、霍亂毒素(cholera toxin)、志賀樣毒素(shiga-like toxin)、LT毒素、C3毒素、志賀毒素(shiga toxin)、百日咳毒素(pertussis toxin)、破傷風毒素(tetanus toxin)、大豆鮑曼-伯克蛋白酶抑制劑(soybean Bowman-Birk protease inhibitor)、假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、蘆薈素(alorin)、岩藻糖苷(fucoside)、衣殼素(capsidin)、傑拉寧(gelanin)、菜豆毒素鏈A(phaseolus toxin chain A)、衣殼素鏈A(capsidin chain A)、α-溴毒素(alpha-bromotoxin)、橄欖苦苷(oleuropein)、葡萄球菌溶素蛋白(staphylin protein)、美國商業蛋白、苦瓜抑制劑(bitter melon inhibitor)、麻風樹毒素(jatropha toxin)、巴豆毒素(croton toxin)、肥皂草抑制劑(soapwort inhibitor)、白樹毒素(white tree toxin)、邁托黴素(mitogellin)、極限單端孢黴烯(limiting trichothecene)、酚黴素(phenomycin)和烯氧黴素(enoxycin)、核糖核酸酶(RNase)、DNase I、葡萄球菌內毒素A(staphylococcal endotoxin A)、美國商陸抗病毒蛋白(American commercial land antiviral protein)、白喉毒素(diphtheria toxin)和假單胞菌內毒素(Pseudomonas endotoxin)。
在一些實施方案中，微管蛋白抑制劑可以是美登新(medensin)I或其類似物或衍生物；抗代謝物是胺基蝶呤(aminopterin)、6-巰嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟達拉濱(fludarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、達卡巴嗪(dacarbazine)、羥基脲(hydroxyurea)、天冬醯胺酶(asparaginase)、吉西他濱(gemcitabine)或克拉屈濱(cladribine)；烷化劑是阿紮胞苷(azacitidine)、托布津(thiophan)、苯甲酸阿紮胞苷(azacitidine benzoate)、美法侖(melphalan)、carazacitidine(BSNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、二溴甘露聚醣(dibromomannan)、鏈脲黴素(streptozotocin)、達卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)、甲基苄肼(procarbazine)、絲裂黴素C(mitomycin C)、順鉬(cis-molybdenum)、碳鉬(carbomolybdenum)、倍癌黴素A(duocarmycin A)、倍癌黴素SA(duocarmycin SA)、瑞吉兒黴素(rachelmycin，CC-1065)或其類似物或衍生物；抗生素是博來黴素(bleomycin)、阿黴素(adriamycin)、伊達比星(idarubicin)(或絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、撲卡黴素 (puccamycin)、安曲可欣(antrixin)(AMC))；抗有絲分裂劑是單甲基澳瑞他汀E或F；白喉毒素相關分子是白喉A鏈(diphtheria A chain)；蓖麻毒蛋白毒素(ricin toxin)是蓖麻毒蛋白A(ricin A)或去糖基化蓖麻毒蛋白A鏈毒素(deglycosylated ricin A chain toxin)；志賀樣毒素(shiga-like toxin)是SLT I、SLT II和SLT IIV；美國商業蛋白是PAPI、PAPII、PAP S。
在一些實施方案中，放射性核素包括：At211、I131、I125、I123、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、Tc99、S35、F19、N15、C14、C13或H3，視需要地，放射性核素可經由螯合劑與抗體偶聯。
在一些實施方案中，細胞因子包括：IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、IL-24、IL-27、IL_28a、IL_28b、IL-29、KGF IFNα、IFNβ、IFNγ、GM-CSF、CD40L、Flt3配體、幹細胞因子、茴香胺或TNFα。
抗CDH6抗體-藥物偶聯物
本發明的抗CDH6抗體可經由接頭結構部分偶聯到藥物以製備抗CDH6抗體-藥物偶聯物。藥物沒有特別限制，只要其具有可與接頭結構連接的取代基或部分結構。根據偶聯的藥物，抗CDH6抗體-藥物偶聯物可用於多種目的。該藥物的示例可包括具有抗腫瘤活性的物質、對血液疾病有效的物質、對自身免疫疾病有效的物質、抗炎症物質、抗菌物質、抗真菌物質、抗寄生蟲物質、抗病毒物質和抗麻醉物質。
細胞毒性劑
下文將描述使用細胞毒性劑作為偶聯到本發明抗CDH6抗體-藥物偶聯物的化合物的示例。細胞毒性劑沒有特別限制，只要該化合物具有抗腫瘤 效果並具有可與接頭結構連接的取代基或部分結構。在腫瘤細胞中切割部分或全部接頭時，細胞毒性劑釋放，使得細胞毒性劑顯示出抗腫瘤效果。由於接頭在與藥物的連接位置被切割，因此細胞毒性劑以其原始結構釋放，以發揮其原始抗腫瘤效果。
在一些實施方案中，該細胞毒性劑包含微管蛋白抑制劑和/或拓撲異構酶抑制劑。例如，細胞毒性劑可包括：單甲基澳瑞他汀E(MMAE)、單甲基澳瑞他汀F(MMAF)、美登新(medensin)I、吡咯并苯并二氮雜卓(PBD)、喜樹鹼、奈莫柔比星(nemorubicin)、PNU-159682、蒽環類、倍他卡黴素(betacamycin)、紫蘇生物鹼(perillyl alkaloids)、紫杉醇(paclitaxel)、孟魯司特(montelukast)、依利奈法德(elinafide)、激肽釋放酶(kallikrein)、倍癌黴素(duocarmycin)、瑞吉兒黴素(rachelmycin，CC-1065)或其類似物、衍生物或前藥。
在一些實施方案中，該細胞毒性劑包含拓撲異構酶I抑制劑。例如，細胞毒性劑可包括喜樹鹼(CPT)或其衍生物。
作為非限制性示例，喜樹鹼可包括喜樹鹼和喜樹鹼衍生物，包括但不限於伊立替康(irinotecan)、托泊替康(topotecan)、勒托替康(lurtotecan)、斯拉替康(silatecan)、依替立替康聚乙二醇(etirinotecan pegol)、TAS 103、9-胺基喜樹鹼(9-aminocamptothecin)、7-乙基喜樹鹼(7-ethylcamptothecin)、10-羥基喜樹鹼(10-hydroxycamptothecin)、9-硝基喜樹鹼(9-nitrocamptothecin)、10,11-亞甲二氧基喜樹鹼(10,11-methylenedioxycamptothecin)、9-胺基-10,11-亞甲二氧基喜樹鹼(9-amino-10,11-methylenedioxycamptothecin)、9-氯-10,11-亞甲二氧基喜樹鹼(9-chloro-10,11-methylenedioxycamptothecin)、7-(4-甲基哌嗪基亞甲基)-10,11-亞乙二氧基-20(S)-喜樹鹼(7-(4-methylpiperazinomethylene)-10)、7-(4-甲基哌嗪基亞甲 基)-10,11-亞甲二氧基-20(S)-喜樹鹼(7-(4-methylpiperazinomethylene)-10,1 1-methylenedioxy-20(S)-camptothecin)和7-(2-(N-異丙基胺基)乙基)-(20S)-喜樹鹼(7-(2-N-isopropylamino)ethyl)-(20S)-camptothecin)以及它們的立體異構體、鹽和酯。
作為本發明中使用的細胞毒性劑的一個示例，可較佳使用由下式表示的依喜替康(exatecan)(一種喜樹鹼衍生物)：(1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮((1S,9S)-1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano[3’,4’：6,7]indolizino[1,2-b]quinoline-10,13(9H,15H)-dione)。
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依喜替康可藉由例如美國專利公開號US2016/0297890中描述的方法或其他已知方法容易地獲得，並且第1位的胺基可較佳用作與接頭結構連接的位置。
由於依喜替康具有喜樹鹼結構，因此已知在酸性含水介質(例如pH為3的量級)中，平衡轉變為具有形成的內酯環(閉環)的結構，而在鹼性含水 介質(例如pH為10的量級)中，平衡轉變為具有開放的內酯環(開環)的結構。本文討論的式II包括其同分異構體、內消旋體、外消旋體、對映體或非對映體，或其混合物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。其中已經引入了對應於這種閉環結構和開環結構的依喜替康殘基的藥物偶聯物也預期具有相當的抗腫瘤效果，並且不用說，這種藥物綴合物中的任一者都包括在本發明的範圍內。
細胞毒性劑的其他示例可包括在文獻(Pharmacological Reviews，第68卷：第3-19頁，2016年)中描述的細胞毒性劑。其具體示例可包括柔比星(doxorubicin)、加利車黴素(calicheamicin)、海兔毒素10(dolastatin 10)、澳瑞他汀(auristatin)諸如單甲基澳瑞他汀E(MMAE)和單甲基澳瑞他汀F(MMAF)、美登素(maytansinoid)諸如DM1和DM4、吡咯並苯并二氮雜卓二聚體SG2000(SJG-136)、喜樹鹼衍生物SN-38、倍癌黴素(duocarmycin)諸如CC1065、鵝膏蕈鹼(amanitin)、柔紅黴素(daunorubicin)、絲裂黴素C(mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)、環胞苷(cyclocytidine)、長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、胺甲蝶呤(methotrexate)、鉑基抗腫瘤劑(順鉑(cisplatin)及其衍生物)和紫杉醇(Taxo)及其衍生物。
在該抗體-藥物偶聯物中，每個抗體分子的偶聯藥物分子的數量是影響其療效和安全性的關鍵因素。該抗體-藥物偶聯物的製備藉由指定反應條件諸如用於反應的起始材料和試劑的量來進行，以便獲得恆定數量的偶聯藥物分子。與低分子量化合物的化學反應不同，通常獲得含有不同數量的偶聯藥物分子的混合物。每個抗體分子的偶聯藥物分子的數量被定義並表示為平均值，即偶聯藥物分子的平均數量。除非另有說明，即，除了代表在具有不同數量的偶聯藥物分子的抗體-藥物偶聯物混合物中包括的具有指定數量的偶聯藥物分子的抗體- 藥物偶聯物的情況下，否則根據本發明的偶聯藥物分子的數量通常也意指平均值。與抗體分子偶聯的依喜替康分子的數量是可控的，並且作為每個抗體的偶聯藥物分子的平均數，可偶聯大約1個至10個依喜替康分子。依喜替康分子的數量較佳為2至8、3至8、4至8、5至8、6至8或7至8，更佳為5至8，進一步佳為7至8，再進一步佳為8。應當注意，所屬技術領域具通常知識者可基於本發明的實施例的描述設計用於將所需數量的藥物分子偶聯到抗體分子的反應，並且可獲得具有控制數量的偶聯的依喜替康分子的抗體-藥物偶聯物。
接頭結構
將描述本發明的抗CDH6抗體-藥物偶聯物中藥物偶聯到抗CDH6抗體的接頭結構。在本發明的抗體-藥物偶聯物中，將抗CDH6抗體偶聯到藥物的接頭結構沒有特別限制，只要所得抗體-藥物偶聯物可使用。接頭結構可根據使用目的適當地進行選擇和使用。接頭結構的一個示例可包括已知文獻(Pharmacol Rev，第68卷：第3-19頁，2016年1月，Protein Cell DOI 10.1007/s13238-016-0323-0等)中描述的接頭。
可較佳使用下文給出的任何接頭結構。應當注意，該結構的左末端是與抗體連接的位置，並且其右末端是與藥物連接的位置。此外，以下給定的接頭結構中的VA表示由藉由肽鍵連接的纈胺酸-丙胺酸(VA)組成的胺基酸序列，並且以下給定的接頭結構中的GGFG表示由藉由肽鍵連接的甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸(GGFG)組成的胺基酸序列。
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2o-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；及
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
在一些實施方案中，該間隔子包括自降解間隔子。例如，該自降解間隔子可包括對胺基苯氧基羰基(PABC)或對胺基苄基(PAB)。
在一些實施方案中，該可切割肽可直接剪接至間隔子。
在一些實施方案中，L可包括：-Val-Cit-PABC-、-Val-Ala-PABC-、-Glu-Val-Cit-PABC-、-Ala-Ala-Asn-PABC-、-Gly-Val-Cit-PABC-、-Gly-Gly-Gly-PABC-、-Gly-Gly-Phe-Gly-PABC-、-Val-Cit-PAB-、-Val-Ala-PAB-、- Glu-Val-Cit-PAB-、-Ala-Ala-Asn-PAB-、-Gly-Val-Cit-PAB-、-Gly-Gly-Gly-PAB-或-Gly-Gly-Phe-Gly-PAB-。
例如，L可選自以下結構：
Figure 111147444-A0202-12-0079-14
在一些實施方案中，對胺基苯氧基羰基(PABC)或對胺基苄基(PAB)包含聚肌胺酸(聚-N-甲基甘胺酸)殘基。
在一些實施方案中，L選自以下結構：
Figure 111147444-A0202-12-0079-15
其中n5表示0至20的整數，視需要地，n5可表示1至15的整數。
例如，n5可表示0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20。
例如，n5可表示1到20，1到19，1到18，1到17，1到16，1到15，1到14，1到13，1到12，1到11，1到10，1到9，1到8，1到7，1到6的整數。1到5，1到4，1到3，1到2，2到20，2到19，2到18，2到17，2到16，2到15，2到14，2到13，2到12，2到11，2到10，2到9，2到8，2到7，2到6。2至5，2至4，2至3，3至20，3至19，3至18，3至17，3至16，3至15，3至14，3至13，3至12，3至11，3至10，3至9，3至8，3至7，3至6，3至5。3到4，4到20，4到19，4到18，4到17，4到16，4到15，4到14，4到13，4到12，4到11，4到10，4到9，4到8，4到7，4到6，4到5，5到20，5到19。5至18，5至17，5至16，5至15，5至14，5至13，5至12，5至11，5至10，5至9，5至8，5至7，5至6，6至20，6至19，6至18，6至17，6至16，6至15。6至14，6至13，6至12，6至11，6至10，6至9，6至8，6至7，7至20，7至19，7至18，7至17，7至16，7至15，7至14，7至13，7至12，7至11。7至10，7至9，7至8，8至20，8至19，8至18，8至17，8至16，8至15，8至14，8至13，8至12，8至11，8至10，8至9，9至20，9至19，9至18，9至17。9至16，9至15，9至14，9至13，9至12，9至11，9至10，10至20，10至19，10至18，10至17，10至16，10至15，10至14，10至13，10至12或10至11的整數。
例如，n5可表示從1到7的整數。又例如，n5可以表示從8到15的整數。
例如，L可選自以下結構：
Figure 111147444-A0202-12-0081-16
抗體-藥物偶聯物可藉由使可由已知方法獲得的化合物(例如，可藉由專利公開文獻US2016/297890中描述的方法獲得(例如，可藉由段落[0336]至[0374]中描述的方法獲得))與具有巰基的抗體反應來產生。具有巰基的抗體可藉由所屬技術領域具通常知識者熟知的方法(Hermanson,G.T，Bioconjugate Techniques，第56-136頁，第456-493頁，Academic Press，1996年)獲得。
本發明的抗體-藥物偶聯物的一個具體示例可包括具有由下式表示的結構的抗體-藥物偶聯物：
Figure 111147444-A0202-12-0081-17
Figure 111147444-A0202-12-0082-18
其中n可以是1至10的任何數。例如，n可以是1至9.5、1至9、1至8.5、 1至8、1至7.5、1至7、1至6.5、1至5.5、1至5、1至4.5、1至4、1至3.5、1至2.5、1至2、1至1.5、1.5至9.5，1.5至9，1.5至8.5，1.5至8，1.5至7.5，1.5至7，1.5至6.5，1.5至6，1.5至5.5，1.5至4.5，1.5至4，1.5至3.5，1.5至2.5，1.5至2，2至9.5，2至9，2至8。5，2至8，2至7.5，2至7，2至6.5，2至6，2至5.5，2至4.5，2至4，2至3.5，2至3，2至2.5，2.5至9.5，2.5至9，2.5至8.5，2.5至8，2.5至7.5，2.5至7，2．5至6，2.5至5.5，2.5至5，2.5至4.5，2.5至3.5，2.5至3，3至9.5，3至9，3至8.5，3至8，3至7.5，3至7，3至6.5，3至6，3至5.5，3至4.5，3至4，3至3.5，3。5至9.5，3.5至9，3.5至8.5，3.5至8，3.5至7.5，3.5至6.5，3.5至6，3.5至5.5，3.5至4.5，3.5至4，4至9.5，4至9，4至8.5，4至7.5，4至7，4至6。5，4至6，4至5．5，4至4．5，4至9．5，4至9，4至8．5，5至7，5至6．5，6.5至9，6.5至8.5，6.5至8，6.5至7.5，6.5至7，7至9.5，7至8.5，7至8，7至7.5，7.5至9.5，7.5至9，7.5至8.5，7.5至8，8至9.5，8至8.5，8.5至9，或8.5至9的任何數值。
在該上下文中，Ab代表本說明書中公開的抗CDH6抗體，並且該抗體經由源自該抗體的巰基與接頭-有效載荷偶聯。在該上下文中，n與所謂的DAR(藥物-抗體比)具有相同的含義，並且表示每種抗體的藥物-抗體比。具體地，n表示每個抗體分子的偶聯藥物分子的數量，其是定義並表示為平均值的數值，即偶聯藥物分子的平均數量。在本發明中，在藉由常規規程F測量時，n可以是2至8，較佳5至8，更佳7至8，並且還更佳8。
本發明的抗體-藥物偶聯物的一個示例可包括具有上述式所示結構的抗體-藥物偶聯物，其中由Ab表示的抗體包括選自由以下抗體(a)至(k)組成 的組的任一種抗體或該抗體的功能片段或該抗體-藥物偶聯物的藥理學上可接受的鹽：
(a)由包含如SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列的輕鏈組成的抗體；
(b)由包含如SEQ ID NO：74所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列的輕鏈組成的抗體；
(c)由包含如SEQ ID NO：74所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列的輕鏈組成的抗體；
(d)由包含如SEQ ID NO：75所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列的輕鏈組成的抗體；
(e)由包含如SEQ ID NO：75所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列的輕鏈組成的抗體；
(f)由包含如SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列的輕鏈組成的抗體；
(g)由包含如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列的輕鏈組成的抗體；
(h)由包含如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列的輕鏈組成的抗體；
(i)由包含如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：84所示的胺基酸序列的輕鏈組成的抗體；
(j)由包含如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列的輕鏈組成的抗體；
(k)由包含如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列的輕鏈組成的抗體；
(l)由包含如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列的重鏈和包含如SEQ ID NO：84所示的胺基酸序列的輕鏈組成的抗體；
(m)選自由抗體(a)至(j)組成的組的任一種抗體，其中重鏈或輕鏈包含一個或兩個或多個修飾，該一個或兩個或多個修飾選自由以下項為代表的翻譯後修飾組成的組：N連接的糖基化、O連接的糖基化、N末端加工、C末端加工、脫醯胺、天冬胺酸異構化、甲硫胺酸氧化、甲硫胺酸殘基添加到N末端、脯胺酸殘基醯胺化和N末端穀胺醯胺或N末端谷胺酸轉化為焦谷胺酸，以及羧基末端缺失一個或兩個胺基酸。
本發明的抗體-藥物結合物的一個例子可以包括具有由下式代表的結構的抗體-藥物結合物：
Figure 111147444-A0202-12-0085-19
Figure 111147444-A0202-12-0086-20
 ；其中，n可以是1至10的任何數位；
其中Ab所代表的抗體包括一個重鏈可變區(VH)，包括(1)具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列的重鏈CDR1(HCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列的重鏈CDR2(HCDR2)；和(3)具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的重鏈CDR3(HCDR3)；和/或輕鏈可變區(VL)，包括(1)具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的輕鏈CDR1(LCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的輕鏈CDR2(LCDR2)；和(3)具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列的輕鏈CDR3(LCDR3)； 和其中n是1至10的任意數值(例如2到10，4到10，5到10，6到10，7到10，和8到10)。在一些實施方案中，Ab所代表的抗體包括具有SEQ ID NO：18的胺基酸序列的重鏈可變區，和具有SEQ ID NO：23的胺基酸序列的輕鏈可變區域。在一些實施方案中，Ab所代表的抗體包括具有SEQ ID NO：66的胺基酸序列的重鏈可變區域，和具有SEQ ID NO：68的胺基酸序列的輕鏈可變區域。在一些實施方案中，Ab代表的抗體包括CL069707-H1L1、CL069707-H1L2、CL069707-H2L1或CL069707-H2L2。
本發明的抗體-藥物結合物的另一個例子可以包括具有由下式代表的結構的抗體-藥物結合物：
Figure 111147444-A0202-12-0087-22
Figure 111147444-A0202-12-0088-23
 ；其中，n可以是1至10的任何數位；
其中Ab所代表的抗體包括一個重鏈可變區(VH)，包括(1)具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列的重鏈CDR1(HCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：9的胺基酸序列的重鏈CDR2(HCDR2)；和(3)具有SEQ ID NO：10的胺基酸序列的重鏈CDR3(HCDR3)；和/或輕鏈可變區(VL)，包括(1)具有SEQ ID NO：11的胺基酸序列的輕鏈CDR1(LCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：12的胺基酸序列的輕鏈CDR2(LCDR2)；和(3)具有SEQ ID NO：13的胺基酸序列的輕鏈CDR3(LCDR3)； 和其中n是1至10的任意數值(例如2到10，4到10，5到10，6到10，7到10，和8到10)。在一些實施方案中，Ab所代表的抗體包括具有SEQ ID NO：41的胺基酸序列的重鏈可變區，和具有SEQ ID NO：46的胺基酸序列的輕鏈可變區域。在一些實施方案中，Ab所代表的抗體包括具有SEQ ID NO：67的胺基酸序列的重鏈可變區域，和具有SEQ ID NO：69的胺基酸序列的輕鏈可變區域。在一些實施方案中，Ab代表的抗體包括CL069463-H1L1，CL069463-H1L2，CL069463-H1L3，CL069463-H2L1，CL069463-H2L2或CL069463-H2L3。
本發明的抗體-藥物結合物的另一個例子可以包括具有由下式代表的結構的抗體-藥物結合物：
Figure 111147444-A0202-12-0089-24
Figure 111147444-A0202-12-0090-25
 ；其中，n可以是1至10的任何數位；
其中Ab所代表的抗體包括一個重鏈可變區(VH)，包括(1)具有SEQ ID NO：89的胺基酸序列的重鏈CDR1(HCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：90的胺基酸序列的重鏈CDR2(HCDR2)；和(3)具有SEQ ID NO：91的胺基酸序列的重鏈CDR3(HCDR3)；和/或輕鏈可變區(VL)，包括(1)具有SEQ ID NO：92的胺基酸序列的輕鏈CDR1(LCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：93的胺基酸序列的輕鏈CDR2(LCDR2)；和(3)具有SEQ ID NO：94的胺基酸序列的輕鏈CDR3(LCDR3)； 和其中n是1至10的任意數值(例如2到10，4到10，5到10，6到10，7到10，和8到10)。在一些實施方案中，Ab所代表的抗體包括具有SEQ ID NO：95的胺基酸序列的重鏈可變區，和具有SEQ ID NO：96的胺基酸序列的輕鏈可變區域。
本發明的抗體-藥物結合物的另一個例子可以包括具有由下式代表的結構的抗體-藥物結合物：
Figure 111147444-A0202-12-0091-94
Figure 111147444-A0202-12-0092-27
 ；其中，n可以是1至10的任何數位；
其中Ab所代表的抗體包括一個重鏈可變區(VH)，包括(1)具有SEQ ID NO：97的胺基酸序列的重鏈CDR1(HCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：98的胺基酸序列的重鏈CDR2(HCDR2)；和(3)具有SEQ ID NO：99的胺基酸序列的重鏈CDR3(HCDR3)；和/或輕鏈可變區(VL)，包括(1)具有SEQ ID NO：100的胺基酸序列的輕鏈CDR1(LCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：101的胺基酸序列的輕鏈CDR2(LCDR2)；和(3)具有SEQ ID NO：102的胺基酸序列的輕鏈CDR3(LCDR3)； 和其中n是1至10的任意數值(例如2到10，4到10，5到10，6到10，7到10，和8到10)。在一些實施方案中，Ab所代表的抗體包括具有SEQ ID NO：103的胺基酸序列的重鏈可變區，和具有SEQ ID NO：104的胺基酸序列的輕鏈可變區域。
本發明的抗體-藥物結合物的另一個例子可以包括具有由下式代表的結構的抗體-藥物結合物：
Figure 111147444-A0202-12-0093-28
其中，n可以是1至10的任何數位；
其中Ab所代表的抗體包括一個重鏈可變區(VH)，包括(1)具有SEQ ID NO：2的胺基酸序列的重鏈CDR1(HCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列的重鏈CDR2(HCDR2)；和(3)具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列的重鏈CDR3(HCDR3)；和/或輕鏈可變區(VL)，包括(1)具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的輕鏈CDR1(LCDR1)；(2)具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列的輕鏈CDR2(LCDR2)；和(3)具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列的輕鏈CDR3(LCDR3)；和其中n是1至10的任意數值(例如2到10，4到10，5到10，6到10，7到10，和8到10)。在一些實施方案中，Ab所代表的抗體包括具有SEQ ID NO：18 的胺基酸序列的重鏈可變區，和具有SEQ ID NO：23的胺基酸序列的輕鏈可變區域。在一些實施方案中，Ab所代表的抗體包括具有SEQ ID NO：66的胺基酸序列的重鏈可變區域，和具有SEQ ID NO：68的胺基酸序列的輕鏈可變區域。在一些實施方案中，Ab代表的抗體包括CL069707-H1L1。
藥物
實施例中的抗CDH6抗體-藥物偶聯物是抗CDH6抗體和/或具有內化活性的抗體的功能片段與具有抗腫瘤活性(諸如細胞毒性活性)的藥物的偶聯物。由於該抗CDH6抗體-藥物偶聯物對表達CDH6的癌細胞顯示出抗腫瘤活性，因此其可用作藥物，並且特別是用作癌症的治療劑和/或預防劑。
本發明的抗CDH6抗體-藥物偶聯物可吸收水分或具有吸附水，以例如當其留在空氣中或進行重結晶或純化規程時轉化為水合物。這種含水的化合物或藥理學上可接受的鹽也包括在本發明中。本發明也可包括抗CDH6抗體-藥物偶聯物，其中構成該抗體-藥物偶聯物的一個或多個原子被原子的同位素替代。包含用這種同位素標記的抗體-藥物偶聯物的組成物可用作例如治療劑、預防劑、研究試劑、測定試劑、診斷劑和體內診斷顯影劑。
應用本發明的抗CDH6抗體-藥物偶聯物的癌症類型沒有特別限制，只要癌症在待治療的癌細胞中表達CDH6即可。其示例可包括腎細胞癌(例如，腎透明細胞癌或乳頭狀腎細胞癌)、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌、甲狀腺癌、膽管癌、肺癌(例如，小細胞肺癌或非小細胞肺癌)、成膠質細胞瘤、間皮瘤、子宮癌、胰腺癌、維爾姆斯瘤和成神經細胞瘤，不過癌症並不限於此，只要癌症表達CDH6即可。癌症的更較佳示例可包括腎細胞癌(例如，腎透明細胞癌和乳頭狀腎細胞癌)和卵巢癌。
本發明的抗CDH6抗體-藥物偶聯物可較佳施用給哺乳動物，並且更較佳施用給人。
用於包含本發明的抗CDH6抗體-藥物偶聯物的醫藥組成物的物質可根據應用劑量或應用濃度適當地選自藥物添加劑和本領域常用的其他物質，然後使用。
本發明的抗CDH6抗體-藥物偶聯物可以包含一種或多種藥學上相容的組分的醫藥組成物的形式施用。例如，醫藥組成物通常包含一種或多種藥物載體(例如，無菌液體(例如，水和油(包括石油和動物來源、植物來源或合成來源的油(例如，花生油、大豆油、礦物油和芝麻油))))。當靜脈內施用醫藥組成物時，水是更典型的載體。鹽水溶液、葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可用作液體載體，特別是用於注射溶液。合適的藥物溶媒是本領域已知的。如有需要，組成物也可包含痕量的保濕劑、乳化劑或pH緩衝劑。
已知多種遞送系統，並且它們可用於施用本發明的抗CDH6抗體-藥物偶聯物。施用途徑的示例可包括但不限於皮內、肌內、腹膜內、靜脈內和皮下途徑。例如，可藉由注射或推注(bolus injection)進行施用。根據具體的較佳實施方案，上述抗體-藥物偶聯物的施用藉由注射進行。腸胃外施用是較佳的施用途徑。
實施例
闡述以下實施例是為了向所屬技術領域具有通常知識者提供如何製備和使用本發明的完整公開和描述，而不是為了限制發明人視為其發明的範圍，也不是為了表示以下實驗是所進行的全部或唯一實驗。已努力確保所使用的數位(例如數量、溫度等)的準確性，但應將一些實驗誤差和偏差考慮在內。除非 另有說明，否則份數是重量份數，分子量是重均分子量，溫度單位為攝氏度，壓力是大氣壓或接近大氣壓。可使用標準縮寫，例如bp表示鹼基對，kb表示千鹼基，pl表示皮升，s或sec表示秒，min表示分鐘，h或hr表示小時，aa表示胺基酸，nt表示核苷酸，i.m.表示肌內的(地)，i.p.表示腹膜內的(地)，s.c.表示皮下的(地)，等等。
實施例1 接頭-有效載荷的製備
1.1 化合物LP-1的製備
步驟1：中間體11-1的合成
在室溫下，向化合物11-1A(Mc-Val-Ala-OH，購自MedChemExpress Shanghai，2.4g，6.29mmol)和11-1B(3.18g，6.29mmol)的DCM：MeOH(v：v=2：1，90mL)混合物的溶液中加入EEDQ(1.86g，7.55mmol)。將反應體系在室溫下攪拌24小時，真空除去溶劑，藉由快速色譜法進一步純化粗殘餘物，得到化合物11-1(3.9g，71%)。LC-MS(ESI,m/z)：868.49(M+H).
步驟2：中間體11-2的合成
將化合物11-1(2g，2.3mmol)溶解在無水THF(50mL)中，在0℃下在氬氣氣氛下加入氟化氫-吡啶(4.6g，46mmol)，然後將反應混合物在0℃下攪拌2小時。加入水淬滅反應體系，用DCM萃取，並將有機相乾燥並濃縮。藉由矽膠色譜法純化殘餘物，得到化合物11-2(1.1g，76%)。LC-MS(ESI,m/z)：630.31(M+H).
步驟3：中間體11-3的合成
將化合物11-2(700mg，1.11mmol)溶解在無水DMF(4mL)中，在室溫下在氬氣氣氛下加入DIPEA(0.39mL，2.23mmol)和4,4'-二硝基碳酸二苯酯 (406mg，1.33mmol)，並在室溫下攪拌過夜。藉由濃縮除去溶劑，並從MTBE中沉澱出產物，藉由過濾收集黃色固體，用乙醚洗滌，並乾燥，得到化合物11-3，其直接用於下一步驟。LC-MS(ESI,m/z)：795.41(M+H).
步驟4：中間體11-4的合成
將化合物11-3(300mg，0.44mmol)溶解在無水DMF(4mL)中，加入乾燥的吡啶(1mL)，隨後加入甲磺酸依喜替康(購自MedChemExpress Shanghai，234mg，0.44mmol)和HOBt(60mg，0.44mmol)。將反應混合物在室溫下在氬氣下攪拌過夜。藉由製備型HPLC純化產物，得到中間體11-4(230mg，48%)。LC-MS(ESI,m/z)：1091.53(M+H).
步驟5：中間體11-5的合成
將化合物11-4(200mg，0.183mmol)溶解在1mL無水DCM中，在0℃下加入300μL TFA，將反應混合物在室溫下攪拌30分鐘，藉由濃縮除去溶劑，得到中間體11-5，為TFA鹽，其不經進一步純化用於下一步驟。LC-MS(ESI,m/z)：991.47(M+H).
步驟6：化合物LP-1的合成
將化合物11-5(120mg，0.109mmol)溶解在1mL無水DMF中，加入Ac-Sar10-COOH(84mg，0.109mmol)，隨後加入HATU(50mg，0.130mmol)和DIPEA(38μL，0.22mmol)，將反應混合物在室溫下攪拌過夜，藉由濃縮除去溶劑，藉由製備型HPLC純化粗產物，得到化合物LP-1(74mg，38%)。LC-MS(ESI,m/z)：1743.85(M+H).
Figure 111147444-A0202-12-0098-29
1.2 化合物LP-2的製備
Figure 111147444-A0202-12-0099-30
化合物LP-2的合成按照化合物LP-1的規程進行，起始材料11-1A用Mc-GGFG-OH(購自MedChemExpress Shanghai)替代，得到化合物LP-2，呈米色無定形固體。LC-MS(ESI,m/z)：1891.90(M+H).
實施例2 人源化抗CDH6抗體的製備和篩選
小鼠抗CDH6抗體CL069707藉由CDR移植(Proc.Nal.Acad.Sci.USA，第86卷：第10029-10033頁，1989年)人源化。將CL069707的CDR區移植到最相似的人種系序列中。一些重要的關鍵殘基基於例如Queen等人(Proc.Nal.Acad.Sci.USA，第86卷：第10029-10033頁，1989年)給出的標準被回復突變。
將兩種人源化重鏈變體命名為CL069707-H1、CL069707-H2。CL069707-H1重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：74所示。CL069707-H2重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：75所示。將兩種人源化輕鏈變體命名為CL069707-L1、CL069707-L2。CL069707-L1輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：76所示。CL069707-L2輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：77所示。
合成編碼全長CL069707-H1、CL069707-H2、CL069707-L1、CL069707-L2胺基酸序列的DNA序列，並構建到pCDNA3.1表達載體中。在293 細胞中藉由組合重鏈和輕鏈產生抗體CL069707-H1L1、CL069707-H1L2、CL069707-H2L1和CL069707-H2L2。
如下測試人源化抗體對腫瘤細胞的結合EC50。在37℃下在5%CO2氣氛中，將人卵巢癌細胞系OVCAR-3(購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)細胞培養物作為獨立單層培養物在體外維持。使用胰蛋白酶-EDTA部分消化收穫細胞，隨後以1000rpm離心5分鐘。將細胞重新懸浮於冷PBS中，並加入Ch069707以及CL069707-H1L1、CL069707-H1L2、CL069707-H2L1和CL069707-H2L2抗體的系列稀釋液。Ch069707抗體是嵌合抗體。可變區與CL069707的可變區相同，恆定區與人IgG1恆定區(SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71)相同。將細胞溶液混合，在4℃下溫育，並在加入第二抗體偶聯物(用於檢測目的)之前用冷PBS洗滌。在4℃下孵育後，用PBS洗滌細胞，並且然後進行流式細胞術(FACS)分析。圖1A顯示CL069707-H1L1、CL069707-H1L2、CL069707-H2L1和CL069707-H2L2對OVCAR-3細胞的EC50相似。圖1B顯示CL069707-H1L1對OVCAR-3細胞的EC50略低於Ch069707。
小鼠抗CDH6抗體CL069463也用同樣的方法人源化。結果示於圖2中。CL069463-H1L1、CL069463-H2L2、CL069463-H2L3對OVCAR-3細胞的EC50與Ch069463相似。Ch069463抗體是嵌合抗體。可變區與CL069463的可變區相同，恆定區與人IgG1恆定區(SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71)相同。
實施例3 人源化CL069707-H1L1的體外評價
3.1 CL069707-H1L1對人CDH6、CDH9和CDH10的結合的分析
CDH9和CDH10是與CDH6最密切相關的家族成員。藉由ELISA結合測定分析CL069707-H1L1對人CDH6、CDH9和CDH10 ECD結構域的結 合。人CDH6-EC6D-His、CDH9-ECD-His和CDH10-ECD-His抗原獲自百普賽斯公司。將100μLPBS稀釋的1μg/mL抗原加入到96孔板中，並在4℃下溫育過夜。將孔板用300μL洗滌緩衝液洗滌3次。然後將100μL/孔的1% BSA封閉劑加入孔板中，並在37℃下溫育1h，然後棄去封閉劑。將CL069707-H1L1的3倍系列稀釋液加入孔板中，並且然後在37℃下溫育1h。然後將孔板用300μL洗滌緩衝液洗滌3次。將1% BSA稀釋的100μL/孔的HRP偶聯的抗人抗體加入到孔板中，並且然後在37℃下溫育1h。將孔板用300μL洗滌緩衝液洗滌3次。將100μL/孔的TMB受質加入到孔板中，並在室溫下溫育約10min。然後用100μL/孔的終止液終止反應體系。用酶標儀讀取OD450並處理資料。結果示於圖3中。CL069707-H1L1以0.1nM的EC50與人CDH6-ECD-His結合，CL069707-H1L1不與CDH9-ECD-His或CDH10-ECD-His蛋白結合。
3.2 評估CL069707-H1L1對人、食蟹猴、小鼠和大鼠CDH6抗原的ELISA結合EC50
藉由ELISA分析CL069707-H1L1對人、食蟹猴、小鼠或大鼠CDH6抗原的結合。人、食蟹猴、小鼠和大鼠CDH6-ECD-His抗原獲自百賽普斯公司。ELISA用與實施例3.1中該相同的方法進行。結果示於圖4中。CL069707-H1L1以相似的EC50與人、食蟹猴、小鼠和大鼠CDH6-ECD-His抗原結合。
3.3 評估CL069707-H1L1和Ch069707對人和食蟹猴CDH6抗原的結合常數
使用基於生物膜層干涉(BLI)技術的Octet®系統測量CL069707-H1L1和Ch069707的結合親和力。將抗體以100nM濃度載入到AHC(抗hIgG Fc捕獲)。然後將3.13nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM和100nM的人CDH6- ECD-His或食蟹猴CDH6-ECD-His抗原與抗體偶聯的生物感測器尖端一起溫育以測量抗原和抗體之間的結合。根據由各抗原濃度獲得的六個不同的結合曲線，基於1：1結合模型計算結合常數(KD)。結果示於表2中。CL069707-H1L1和Ch069707以相似的親和力與人CDH6-ECD-His抗原結合。CL069707-H1L1以相似的親和力與人CDH6-ECD-His和食蟹猴CDH6-ECD-His抗原結合。
表2
Figure 111147444-A0202-12-0102-31
實施例4 抗體-藥物偶聯物的製備
用於製備抗體-藥物偶聯物的一般方法
可用於本發明的抗體-藥物偶聯物的抗體沒有特別限制，只要它是具有內化活性的抗CDH6抗體或該抗體的功能片段即可。
接下來，將描述製備本發明的抗體-藥物偶聯物的典型方法。應當注意，在以下說明中，每個反應方案中所示的“化合物編號”用於表示化合物。具體地，將各化合物稱為“式(1)的化合物”、“化合物(1)”等。這同樣適用於其他化合物編號。
藉由使具有藉由還原抗CDH6抗體，抗體硫鍵轉化為巰基，並與化合物(2)反應，可製備下文給出的其中抗CDH6抗體經由硫醚與接頭結構連接的式(1)所示的抗體-藥物偶聯物。該抗體-藥物偶聯物可例如藉由以下方法製備。
Figure 111147444-A0202-12-0103-32
其中Ab表示具有巰基的抗體，其中L1具有-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-所示的結構，並且L1'表示下式所示的馬來醯亞胺基。
Figure 111147444-A0202-12-0103-33
其中(NH-DX)具有下式所示的結構。
Figure 111147444-A0202-12-0103-34
-L1-Lx-具有下式中的任一者所示的結構：
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2o-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；和
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
在上述反應方案中，抗體-藥物偶聯物(1)可理解為具有以下結構：其中從藥物到接頭末端的一個結構部分連接到一個抗體。然而，僅為了方便起見給出了本說明，並且實際上存在許多其中多個上述結構部分連接到一個抗體分子的情況。這同樣適用於下文該製備方法的解釋。
具有巰基的抗體可藉由所屬技術領域具通常知識者熟知的方法(Hermanson,G.T，Bioconjugate Techniques，第56-136頁，第456-493頁，Academic Press，1996年)獲得。該方法的示例可包括但不限於：使特勞特試劑與抗體的胺基反應；使N-琥珀醯亞胺基S-乙醯基硫代鏈烷酸酯與抗體的胺基反應，隨後與羥胺反應；使N-琥珀醯亞胺基3-(吡啶基二硫代)丙酸酯與抗體反應，然後與還原劑反應；使抗體與還原劑諸如二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇或三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)反應以還原抗體中的鏈間二硫鍵，以便形成巰基。
具體地，鏈間二硫鍵被部分或完全還原的抗體可藉由使用0.3莫耳當量至3莫耳當量的TCEP作為抗體中每個鏈間二硫鍵的還原劑，並使還原劑與抗體在含有螯合劑的緩衝溶液中反應來獲得。螯合劑的示例可包括乙二胺四乙酸(EDTA)和二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。螯合劑可以1mM至20mM的濃度使用。磷酸鈉、硼酸鈉、乙酸鈉等溶液可用作緩衝溶液。
應當注意，藉由使巰基與藥物-接頭部分進行加成反應，該藥物-接頭部分可藉由硫醚鍵偶聯。
然後，對於每個具有巰基的抗體，使用2莫耳當量至20莫耳當量的化合物(2)可製備抗體-藥物偶聯物(1)，其中每個抗體偶聯2個至8個藥物分子。具體地，可將含有溶解於其中的化合物(2)的溶液加入到含有具有巰基的抗體的緩衝溶液中以進行反應。在該上下文中，醋酸鈉溶液、磷酸鈉、硼酸鈉等可用作緩衝溶液。反應的pH為5至9，並且更佳地，反應體系可在接近pH 7的條件下進行。有機溶劑諸如二甲基亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMA)或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)可用作溶解化合物(2)的溶劑。反應體系可藉由將含有以1%至20% v/v溶解在有機溶劑中的化合物(2)的溶液加入到含有具有巰基的抗體的緩衝溶液中來進行。反應溫度為0℃至37℃，更佳為10℃至25℃，並且反應時間為0.5小時至2小時。可藉由使未反應的化合物(2)與含硫醇 試劑的反應性失活來終止反應體系。含硫醇試劑是例如半胱胺酸或N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)。更具體地，藉由向所用的化合物(2)中加入1莫耳當量至2莫耳當量的NAC，並將所得混合物在室溫下溫育10分鐘至30分鐘，可終止反應體系。
抗體-藥物偶聯物的鑑定
可根據下述常規規程對製備的抗體-藥物偶聯物(1)進行濃縮、緩衝液交換、純化並測量抗體濃度和每個抗體分子偶聯的藥物分子的平均數，以鑑定抗體-藥物偶聯物(1)。
常規規程A：抗體或抗體-藥物偶聯物水溶液的濃縮
向Amicon Ultra(50000 MWCO，密理博公司)容器中加入抗體或抗體-藥物偶聯物的溶液，並藉由離心(在2000G至3800G下離心5分鐘至20分鐘)濃縮抗體或抗體-藥物偶聯物的溶液。
常規規程B：抗體濃度的測量
使用酶標儀(Multiskan GO，賽默飛世爾科技公司)，根據製造商定義的方法進行抗體吸收的測量。在這一方面，使用了抗體間不同的280nm吸收係數(1.3mL mg-1 cm-1至1.8mL mg-1 cm-1)。
常規規程C：抗體的緩衝液交換
根據製造商定義的方法，用含有氯化鈉(50mM)和EDTA(2mM)的磷酸鹽緩衝液(50mM，pH 7.0)(在本說明書中稱為PBS7.0/EDTA)平衡ZebaTM旋轉脫鹽管柱(5mL，40K MWCO，Thermo ScientificTM)。將抗體水溶液以2mL/ZebaTM(5mL)管柱的量上樣，然後藉由離心脫鹽管柱(在1000G下離心4分 鐘)收集級分(約2mL)。該級分可藉由常規規程A濃縮。在使用常規規程B測量抗體濃度後，使用PBS7.0/EDTA將抗體濃度調節至大於10mg/mL。
常規規程D：抗體-藥物偶聯物的純化
用任何可獲得的製劑緩衝溶液(諸如含有氯化鈉(150mM)的組胺酸-乙酸鹽緩衝液(20mM組胺酸，pH 5.5)或含有氯化鈉(50mM)的磷酸鹽緩衝液(50mM，pH 7.0))平衡ZebaTM旋轉脫鹽管柱(5mL，40K MWCO，Thermo ScientificTM)。將抗體-藥物偶聯物的反應水溶液(約2mL)上樣到ZebaTM管柱(5mL)上，然後藉由離心脫鹽管柱(在1000G下離心4分鐘)收集抗體級分(約2mL)。將凝膠過濾純化過程(其中將收集的級分再次上樣到ZebaTM脫鹽管柱上，並藉由離心進行沖提)重複總共2次，以獲得不含非偶聯的接頭-有效載荷和低分子量化合物(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)和二甲基亞碸)的抗體-藥物偶聯物。
常規規程E：抗體-藥物偶聯物中的抗體濃度和每個抗體分子偶聯的藥物分子的平均數的測量
可藉由測量抗體-藥物偶聯物的水溶液在280nm和370nm兩個波長處的UV吸光度，然後進行如下所示的計算來計算抗體-藥物偶聯物中的偶聯藥物濃度。
任何給定波長處的總吸光度等於存在於系統中的所有光吸收化學物質的吸光度的總和[吸光度的加和性]。因此，基於抗體和藥物的莫耳吸收係數在抗體和藥物之間的偶聯前後不變化這一假設，抗體-藥物偶聯物中的抗體濃度和藥物濃度由以下方程表示。
A280=AD,280+AA,280=εD,280CD+εA,280CA 公式(1)
A370=AD,370+AA,370=εD,370CD+εA,370CA 公式(2)
在該上下文中，A280表示抗體-藥物偶聯物的水溶液在280nm處的吸光度，A370表示抗體-藥物偶聯物的水溶液在370nm處的吸光度，AA,280表示抗體在280nm處的吸光度，AA,370表示抗體在370nm處的吸光度，AD,280表示偶聯物前體在280nm處的吸光度，AD,370表示偶聯物前體在370nm處的吸光度，εA,280表示抗體在280nm處的莫耳吸光係數，εA,370表示抗體在370nm處的莫耳吸光係數，εD,280表示偶聯物前體在280nm處的莫耳吸光係數，εD,370表示偶聯物前體在370nm處的莫耳吸光係數，CA表示抗體-藥物偶聯物中的抗體濃度，並且CD表示抗體-藥物偶聯物中的藥物濃度。
在該上下文中，關於εA,280、εA,370、εD,280和εD,370，使用預先準備的值(基於計算的估計值或藉由化合物的UV測量獲得的測量值)。例如，εA,280可藉由已知的計算方法(Protein Science，1995年，第4卷：第2411-2423頁)從抗體的胺基酸序列中估計。εA,370通常為零。εD,280和εD,370可根據朗伯-比爾定律(吸光度莫耳濃度×莫耳吸收係數×光程)藉由測量所用偶聯物前體以一定莫耳濃度溶解於其中的溶液的吸光度來獲得。CA和CD可藉由測量抗體-藥物偶聯物的水溶液的A280和A370，並且然後藉由代入這些值求解聯立公式(1)和(2)來確定。此外，藉由將CD除以CA，可確定每個抗體的偶聯藥物分子的平均數。
常規規程F：每個抗體分子的偶聯藥物分子的平均數的測量-(2)
除了上述“常規規程E”外，抗體-藥物偶聯物中每個抗體分子的偶聯藥物分子的平均數也可藉由液相色譜-質譜儀(LC-MS)分析使用以下方法測定。在下文中，將描述當抗體藉由二硫鍵與接頭-有效載荷偶聯時藉由LC-MS測量偶聯的藥物分子的平均數的方法。所屬技術領域具通常知識者能夠參考該方 法，根據抗體和接頭-有效載荷之間的連接方式，藉由LC-MS適當地測量偶聯的藥物分子的平均數。
用於LC-MS分析的樣品的製備(抗體-藥物偶聯物的還原)
將抗體-藥物偶聯物溶液(大約5mg/mL，6μL)與二硫蘇糖醇(DTT)(100mM，3μL)和21μL水的水溶液混合。藉由在37℃下溫育混合物30分鐘，抗體-藥物偶聯物的輕鏈和重鏈之間的二硫鍵被切割。將所得樣品用於LC-MS分析。
HPLC參數
管柱：Agilent PLRP-S，1000Å，50×2.1mm，8μm。
檢測波長：280nm
頻寬：4nm
管柱溫箱溫度：80℃
自動採樣恆溫器：5℃
流速：0.5mL/min
注入量：5μL
流動相A：0.05% TFA，H2O
流動相B：0.05% TFA，ACN
梯度程式(B%)：25%至34%(0min至0.7min)，34%至45%(0.7min至5min)，45%至90%(5min至6min)，90%(6min至7min)，90%至25%(7min至7.10min)，25%(7.10min至10min)
MS參數
氣體溫度：350℃
乾燥氣體：13L/min
霧化氣壓力：45psig
毛細管電壓：5000V
碎裂電壓：350V
品質範圍：500m/z至8000m/z
採集速率：1光譜/s
資料分析
根據ESI掃描圖，可檢測與藥物分子結合的輕鏈(與i藥物分子結合的輕鏈：Li)和與藥物分子結合的重鏈(與i藥物分子結合的重鏈：Hi)。
根據以下運算式，對於峰面積的總校正值，計算每條鏈的峰面積比(%)。
結合的輕鏈的峰面積比
i藥物分子=100%×ALi/(AL0+AL1)
結合的重鏈的峰面積比
i藥物分子=100%×AHi/(AH0+AH1+AH2+AH3)
根據以下運算式計算抗體-藥物偶聯物每個抗體分子的偶聯的藥物分子的平均數。
偶聯的藥物分子的平均數=(L0峰面積比×0+L1峰面積比×1+H0峰面積比×0+H1峰面積比×1+H2峰面積比×2+H3峰面積比×3)×2
常規規程G：抗體-藥物偶聯物中抗體聚集的測量
可使用以下方法藉由高效液相色譜(HPLC)分析中的體積排阻色譜(SEC)來確定抗體-藥物偶聯物中的聚集。
HPLC系統：Agilent 1260 Infinity II HPLC系統(安捷倫科技公司)
檢測器：紫外吸收光譜儀(測量波長：280nm)
SEC-管柱：TOSOH TSKgel G3000SWXL(7.8×300mm，5μm)
流動相：200mmol/L KHPO4，150mmol/L NaCl，15%(v/v)異丙醇，pH7.0
流速：0.75mL/min
等度沖提操作：18min
管柱溫：室溫
進樣量：50μg
資料分析
品質控制(QC，CL069707-H1L1)的SEC色譜圖示於圖5A中，證實了主QC產物的分子量為約150kDa，並且單體保留時間為約9.5min至10.5min。同時，聚集的保留時間早於單體的保留時間。
常規規程H：抗體-藥物偶聯物中抗體親水性的比較
可使用以下方法藉由高效液相色譜(HPLC)分析中的疏水作用色譜(HIC)來確定抗體-藥物偶聯物的親水性。
HPLC系統：Agilent 1260 Infinity II HPLC系統(安捷倫科技公司)
檢測器：紫外吸收光譜儀(測量波長：280nm)
HIC-管柱：TOSOH TSKgel Butyl-NPR(4.6mm內徑×3.5cm，2.5μm)
流動相A：1.5mol/L(NH4)2SO4，50mmol/L KHPO4，pH7.0
流動相B：50mmol/L KHPO4，25%(v/v)異丙醇，pH7.0
等度沖提操作：25min
管柱溫：室溫
梯度程式(B%)：0%至25%(0min至1min)，25%(1min至3min)，25%至80%(3min至13min)，80%(13min至17min)，80%至0%(17min至17.10min)，0%(17.10min至25min)
進樣量：10μL
資料分析：品質控制(QC，CL069707-H1L1)的HIC色譜圖示於圖5B中。與非偶聯抗體相比，抗體-藥物偶聯物表現出較高的疏水性，並且因此具有更大的保留時間。可以確認，保留時間越短，樣品的親水性越好
4.1：CL069707-H1L1-藥物偶聯物的製備
4.1.1 抗體-藥物偶聯物CL069707-H1L1-LP1的製備
步驟1：抗體-藥物偶聯物
抗體的還原：使用製備方法中描述的常規規程B(使用1.423mL mg-1 cm-1作為280nm吸收係數)和C，用PBS7.0/EDTA將CL069707-H1L1調節至9mg/mL。向該溶液(1.099mL)中加入5mM TCEP(0.101mL；7.0當量/抗體分子)的水溶液。在確認pH在7.0±0.1內之後，將該溶液在37℃下溫育2小時，還原抗體的鏈間二硫鍵。
抗體和接頭-有效載荷之間的偶聯：將上述溶液在4℃下溫育10分鐘。隨後，向其中加入10mM LP1的二甲基乙醯胺(0.108mL；15當量/抗體分子)溶液，並將獲得的混合物在22℃下溫育30分鐘以將接頭-有效載荷偶聯到抗體。
純化：藉由製備方法中描述的常規規程D純化上述溶液，獲得1.2mL含有標題抗體-藥物偶聯物“CL069707-H1L1-LP1”的溶液。
表徵：使用製備方法中描述的常規規程E(使用εD,280=6384並且εD,370=16180)、規程F、規程G和規程H，獲得下列特徵值。
抗體濃度：7.82mg/mL，藉由常規規程E測量的每個抗體分子的偶聯的藥物分子的平均數(n)：8.55。藉由常規規程F測量的每個抗體分子的偶聯的藥物分子的平均數(n)：7.65。藉由常規規程G測量抗體-藥物偶聯物的聚集：2.83%(圖6A)。藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物的保留時間：7.505min(圖6B)。
4.1.2 抗體-藥物偶聯物CL069707-H1L1-LP2的製備
步驟1：抗體-藥物偶聯物
抗體的還原：使用製備方法中描述的常規規程B(使用1.423mL mg-1 cm-1作為280nm吸收係數)和C，用PBS7.0/EDTA將CL069707-H1L1調節至9mg/mL。向該溶液(1.099mL)中加入5mM TCEP(0.101mL；7.0當量/抗體分子)的水溶液。在確認pH在7.0±0.1內之後，將該溶液在37℃下溫育2小時，還原抗體的鏈間二硫鍵。
抗體和接頭-有效載荷之間的偶聯：將上述溶液在4℃下溫育10分鐘。隨後，向其中加入10mM LP2的二甲基乙醯胺(0.108mL；15當量/抗體分子)溶液，並將獲得的混合物在22℃下溫育30分鐘以將接頭-有效載荷偶聯到抗體。
純化：藉由製備方法中描述的常規規程D純化上述溶液，獲得1.2mL含有標題抗體-藥物偶聯物“CL069707-H1L1-LP2”的溶液。
表徵：使用製備方法中描述的常規規程E(使用εD,280=5814並且εD,370=14742)、規程F、規程G和規程H，獲得下列特徵值。
抗體濃度：7.37mg/mL，藉由常規規程E測量的每個抗體分子的偶聯的藥物分子的平均數(n)：9.27。藉由常規規程F測量的每個抗體分子的偶聯的藥物分子的平均數(n)：7.72。藉由常規規程G測量抗體-藥物偶聯物的聚集： 2.96%(圖7A)。藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物的保留時間：7.820min(圖7B)。
4.1.3 抗體-藥物偶聯物CL069707-H1L1-GGFG-DXd的製備
步驟1：抗體-藥物偶聯物
抗體的還原：使用製備方法中描述的常規規程B(使用1.423mL mg-1 cm-1作為280nm吸收係數)和C，用PBS7.0/EDTA將CL069707-H1L1調節至9mg/mL。向該溶液(0.275mL)中加入5mM TCEP(0.025mL；7.0當量/抗體分子)的水溶液。在確認pH在7.0±0.1內之後，將該溶液在37℃下溫育2小時，還原抗體的鏈間二硫鍵。
抗體和接頭-有效載荷之間的偶聯：將上述溶液在4℃下溫育10分鐘。隨後，向其中加入10mM GGFG-DXd(購自DC Chemicals，DC7556)的二甲基乙醯胺(0.027mL；15當量/抗體分子)溶液，並將獲得的混合物在22℃下溫育30分鐘以將接頭-有效載荷偶聯到抗體。
純化：藉由製備方法中描述的常規規程D純化上述溶液，獲得0.3mL含有標題抗體-藥物偶聯物“CL069707-H1L1-GGFG-DXd”的溶液。
表徵：使用製備方法中描述的常規規程E(使用εD,280=5178並且εD,370=20217)、規程G和規程H，獲得下列特徵值。
抗體濃度：6.78mg/mL，藉由常規規程E測量的每個抗體分子的偶聯的藥物分子的平均數(n)：6.88。藉由常規規程G測量抗體-藥物偶聯物的聚集：0.92%(圖8A)。藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物的保留時間：8.802min(圖8B)。
4.1.4 抗體-藥物偶聯物DS-6000a(本文稱為對照ADC)的製備
步驟1：抗體-藥物偶聯物
DS-6000a mAb(本文稱為對照抗體)的序列公開於US 2020/0390900 A1(抗體H01L02)中。對照抗體的重鏈可變區的序列如SEQ ID NO：105所示。對照抗體的輕鏈可變區的序列如SEQ ID NO：106所示。對照抗體的重鏈恆定區和輕鏈恆定區的序列分別如SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：71所示。
Figure 111147444-A0202-12-0117-35
Figure 111147444-A0202-12-0117-36
Figure 111147444-A0202-12-0117-37
(SEQ ID NO：109).
Figure 111147444-A0202-12-0117-38
Figure 111147444-A0202-12-0117-39
Figure 111147444-A0202-12-0117-40
(SEQ ID NO：110).
抗體的還原：使用製備方法中描述的常規規程B(使用1.678mL mg-1 cm-1作為280nm吸收係數)和C，用PBS7.0/EDTA將對照抗體調節至14.8mg/mL。向該溶液(0.659mL)中加入5mM TCEP(0.130mL；10.0當量/抗體分子)的水溶液。在確認pH在7.0±0.1內之後，將該溶液在37℃下溫育2小時，還原抗體的鏈間二硫鍵。
抗體和接頭-有效載荷之間的偶聯：將上述溶液在4℃下溫育10分鐘。隨後，向其中加入10mM GGFG-DXd的二甲基乙醯胺(0.098mL；15當量/抗體分子)的溶液，並將獲得的混合物在22℃下溫育30分鐘以將接頭-有效載荷偶聯到抗體。
純化：藉由製備方法中描述的常規規程D純化上述溶液，獲得1.4mL含有標題抗體-藥物偶聯物“對照ADC”的溶液。
表徵：使用製備方法中描述的常規規程E(使用εD,280=5178並且εD,370=20217)、規程G和規程H，獲得下列特徵值。
抗體濃度：4.46mg/mL，藉由常規規程E測量的每個抗體分子的偶聯的藥物分子的平均數(n)：7.02。藉由常規規程G測量抗體-藥物偶聯物的聚集：2.68%(圖9A)。藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物的保留時間：7.672min(圖9B)。
4.1.5 抗體-藥物偶聯物對照抗體-LP1的製備
步驟1：抗體-藥物偶聯物
抗體的還原：使用製備方法中描述的常規規程B(使用1.678mL mg-1 cm-1作為280nm吸收係數)和C，用PBS7.0/EDTA將對照抗體調節至12.7mg/mL。向該溶液(0.106mL)中加入5mM TCEP(12.6μL；7當量/抗體分子)的水溶液。在確認pH在7.0±0.1內之後，將該溶液在37℃下溫育2小時，還原抗體的鏈間二硫鍵。
抗體和接頭-有效載荷之間的偶聯：將上述溶液在4℃下溫育10分鐘。隨後，向其中加入10mM LP1的二甲基乙醯胺(13.5μL；15當量/抗體分子)溶液，並將獲得的混合物在22℃下溫育30分鐘以將接頭-有效載荷偶聯到抗體。
純化：藉由製備方法中描述的常規規程D純化上述溶液，獲得200μL含有標題抗體-藥物偶聯物“對照抗體-LP1”的溶液。
表徵：使用製備方法中描述的常規規程E(使用εD,280=6384並且εD,370=16180)、規程G和規程H，獲得下列特徵值。
抗體濃度：8.07mg/mL，藉由常規規程E測量的每個抗體分子的偶聯的藥物分子的平均數(n)：7.11。藉由常規規程G測量抗體-藥物偶聯物的聚 集：0.89%(圖10A)。藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物的保留時間：6.422min(圖10B)。
4.1.6 抗體-藥物偶聯物人IgG-LP1的製備
步驟1：抗體-藥物偶聯物
抗體的還原：使用製備方法中描述的常規規程B(使用1.35mL mg-1 cm-1作為280nm吸收係數)和C，用PBS7.0/EDTA將人IgG(購自索萊寶)調節至10mg/mL。向該溶液(1.33mL)中加入5mM TCEP(0.267mL；10當量/抗體分子)的水溶液。在確認pH在7.0±0.1內之後，將該溶液在37℃下溫育2小時，還原抗體的鏈間二硫鍵。
抗體和接頭-有效載荷之間的偶聯：將上述溶液在4℃下溫育10分鐘。隨後，向其中加入10mM LP1的二甲基乙醯胺(0.2mL；15當量/抗體分子)溶液，並將獲得的混合物在22℃下溫育30分鐘以將接頭-有效載荷偶聯到抗體。
純化：藉由製備方法中描述的常規規程D純化上述溶液，獲得2mL含有標題抗體-藥物偶聯物“人IgG-LP1”的溶液。
表徵：使用製備方法中描述的常規規程E(使用εD,280=6384並且εD,370=16180)、規程G和規程H，獲得下列特徵值。
抗體濃度：11.08mg/mL，藉由常規規程E測量的每個抗體分子的偶聯的藥物分子的平均數(n)：9.15。藉由常規規程G測量抗體-藥物偶聯物的聚集：4.38%(圖11A)。藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物的保留時間：6.213min(圖11B)。
4.1.7 抗體-藥物偶聯物人IgG-LP2的製備
步驟1：抗體-藥物偶聯物
抗體的還原：使用製備方法中描述的常規規程B(使用1.35mL mg-1 cm-1作為280nm吸收係數)和C，用PBS7.0/EDTA將人IgG(購自索萊寶)調節至10mg/mL。向該溶液(0.467mL)中加入5mM TCEP(0.093mL；10當量/抗體分子)的水溶液。在確認pH在7.0±0.1內之後，將該溶液在37℃下溫育2小時，還原抗體的鏈間二硫鍵。
抗體和接頭-有效載荷之間的偶聯：將上述溶液在4℃下溫育10分鐘。隨後，向其中加入10mM LP2的二甲基乙醯胺(0.07mL；15當量/抗體分子)溶液，並將獲得的混合物在22℃下溫育30分鐘以將接頭-有效載荷偶聯到抗體。
純化：藉由製備方法中描述的常規規程D純化上述溶液，獲得1mL含有標題抗體-藥物偶聯物“人IgG-LP2”的溶液。
表徵：使用製備方法中描述的常規規程E(使用εD,280=5814並且εD,370=14742)、規程G和規程H，獲得下列特徵值。
抗體濃度：4.68mg/mL，藉由常規規程E測量的每個抗體分子的偶聯的藥物分子的平均數(n)：9.18。藉由常規規程G測量抗體-藥物偶聯物的聚集：2.92%(圖12A)。藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物的保留時間：6.506min(圖12B)。
4.1.8 抗體-藥物偶聯物人IgG-GGFG-DXd的製備
步驟1：抗體-藥物偶聯物
抗體的還原：使用製備方法中描述的常規規程B(使用1.35mL mg-1 cm-1作為280nm吸收係數)和C，用PBS7.0/EDTA將人IgG(購自索萊寶)調節至10mg/mL。向該溶液(2.45mL)中加入5mM TCEP(0.327mL；10當量/抗體分子)的 水溶液。在確認pH在7.0±0.1內之後，將該溶液在37℃下溫育2小時，還原抗體的鏈間二硫鍵。
抗體和接頭-有效載荷之間的偶聯：將上述溶液在4℃下溫育10分鐘。隨後，向其中加入10mM GGFG-DXd的二甲基乙醯胺(0.294mL；18當量/抗體分子)的溶液，並將獲得的混合物在22℃下溫育30分鐘以將接頭-有效載荷偶聯到抗體。
純化：藉由製備方法中描述的常規規程D純化上述溶液，獲得1mL含有標題抗體-藥物偶聯物“人IgG-GGFG-DXd”的溶液。
表徵：使用製備方法中描述的常規規程E(使用εD,280=5178並且εD,370=20217)、規程G和規程H，獲得下列特徵值。
抗體濃度：8.20mg/mL，藉由常規規程E測量的每個抗體分子的偶聯的藥物分子的平均數(n)：7.08。藉由常規規程G測量抗體-藥物偶聯物的聚集：4.25%(圖13A)。藉由常規規程H測量的抗體-藥物偶聯物的保留時間：8.222min(圖13B)。
其他抗體-藥物偶聯物“CL069707-MMAE”、“CL069707-DXd”、“CL069066-MMAE”、“CL069066-DXd”、“CL069439-MMAE”和“CL069439-DXd”的製備與上述樣品相同。
實施例5 抗體-藥物偶聯物的體外評價
5.1 抗體-藥物偶聯物的內化活性
在37℃下在5% CO2氣氛中，將人卵巢癌細胞系PA-1(浙江美森細胞科技有限公司)、OVCAR-3(購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)和人腎癌細胞系786-O(上海勳慶生物科技有限公司)細胞培養物作為獨立單層培 養物在體外維持。使用胰蛋白酶-EDTA部分消化收穫細胞，隨後以1000rpm離心5分鐘。將細胞重新懸浮於冷PBS中，並加入50μg/mL CL069707-H1L1-LP1。將細胞溶液混合，在4℃下溫育30min，然後用PBS洗滌細胞，再等分成5份，並在37℃下溫育0h、0.5h、1h、2h和4h。在各時間點取一份樣品並用冷PBS洗滌，然後加入第二抗體偶聯物(用於檢測目的)。在4℃下孵育後，用PBS洗滌細胞，並且然後進行流式細胞術(FACS)分析。結果示於圖14中。CL069707-H1L1-LP1以時間依賴性方式內化到PA-1、OVCAR-3和786-O中。
5.2 抗體-藥物偶聯物的體外腫瘤生長抑制活性
將CDH6陽性人卵巢癌細胞系OVCAR-3(購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)及PA-1(浙江美森細胞科技有限公司)以2000細胞/100μL/孔接種於96孔板的培養基中，然後將細胞培養過夜。第二天，將這些偶聯物中的每一者加入細胞中，使得最終濃度為0.01nM至100nM。在培養5天之後，從細胞中除去培養基，並根據製造商的說明進行CCK-8(細胞計數試劑盒-8)活力測定。細胞活力計算為僅具有腫瘤細胞的對照孔的%。圖15A至圖15D示出了將抗體-藥物偶聯物中的每一者加入CDH6陽性OVCAR-3和PA-1細胞時的濃度依賴性細胞生長抑制活性。在圖15A和圖15B中，所有人源化CL069707-GGFG-DXd(H1L1、H1L2、H2L1和H2L2)對OVCAR-3細胞和PA-1細胞均表現出相似的優異腫瘤細胞生長抑制活性。在圖15C和圖15D中，兩種陽性抗體-藥物偶聯物均表現出優異的腫瘤細胞生長抑制活性，其中CL069707-H1L1-LP1表現出對OVCAR-3細胞的最顯著的抑制活性，隨後是CL069707-H1L1-LP2，並且其中CL069707-H1L1-LP1和CL069707-H1L1-LP2表現出對PA-1細胞的相當的抑制活性。
實施例6 偶聯到vc-MMAE或GGFG-DXd的小鼠抗CDH6抗體CL069707、CL069439、CL069066的體外細胞殺傷活性
將CDH6陽性人卵巢癌細胞系OVCAR-3(購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)以2000細胞/100μL/孔接種於96孔板的培養基中，然後將細胞培養過夜。第二天，將CL069707-vc-MMAE、CL069439-vc-MMAE和CL069066-vc-MMAE中的每一者加入細胞中，使得最終濃度為0.005nM至30nM；並將CL069707-GGFG-DXd、CL069439-GGFG-DXd和CL069066-GGFG-DXd中的每一者加入到細胞中，使得最終濃度為0.05nM至300nM。在培養5天之後，從細胞中除去培養基，並根據製造商的說明進行CCK-8(細胞計數試劑盒-8)活力測定。細胞活力計算為僅具有腫瘤細胞的對照孔的%。圖16A顯示3種偶聯物對OVCAR-3細胞均具有濃度依賴性細胞生長抑制活性。此外，CL069707-vc-MMAE顯示出比CL069439-vc-MMAE和CL069066-vc-MMAE更強的細胞殺傷活性。圖16B顯示3種偶聯物對OVCAR-3細胞均具有濃度依賴性細胞生長抑制活性。此外，CL069707-GGFG-DXd顯示出比CL069439-GGFG-DXd和CL069066-GGFG-DXd更強的細胞殺傷活性。
實施例7 抗體-藥物偶聯物在PA-1異種移植物模型中的體內抗腫瘤效果。
6週雌性Balb/c小鼠購自JSJ Laboratory(中國上海)。將人卵巢癌細胞系PA-1(浙江美森細胞科技有限公司)細胞與基質膠混合，然後以1000萬細胞/隻進行皮下植入。在PA-1細胞植入後第15天(平均腫瘤大小約150mm3)，給小鼠靜脈內注射10mg/kg的以下物質中的一種：IgG-LP2、CL069707-H1L1-LP1、CL069707-H1L1-LP2或CL069707-H1L1-GGFG-DXd。從治療開始之日起，用卡尺每週測量兩次腫瘤體積，並如下計算：TV=(寬度*長度)2/2。結果示於圖17A 至圖17B中。所有抗體-藥物偶聯物在單劑量給藥後均顯著減小了腫瘤體積，而不顯著影響小鼠體重。
實施例8 抗體-藥物偶聯物在PA-1異種移植物模型中的體內抗腫瘤效果。
6週雌性Balb/c小鼠購自JSJ Laboratory(中國上海)。將人卵巢癌細胞系PA-1(浙江美森細胞科技有限公司)細胞與基質膠混合，然後以1000萬細胞/隻進行皮下植入。在PA-1細胞植入後第14天(平均腫瘤大小約150mm3)，給小鼠靜脈內注射以下物質中的一種：PBS、CL069707-H1L1-LP1(2.5mg/kg和5mg/kg)、CL069707-H1L1-LP2(2.5mg/kg和5mg/kg)或CL069707-H1L1-GGFG-DXd(5mg/kg)。從治療開始之日起，用卡尺每週測量兩次腫瘤體積，並如下計算：TV=(寬度*長度)2/2。結果示於圖18A至圖18B中。所有抗體-藥物偶聯物在單劑量給藥後均以劑量依賴性方式減小腫瘤體積，而不顯著影響小鼠體重。值得注意的是，5mg/kg CL067707-H1L1-LP1具有比CL069707-H1L1-LP2和CL067707-H1L1-GGFG-DXd更好的腫瘤抑制效果。
實施例9 抗體-藥物偶聯物在OVCAR-3異種移植物模型中的體內抗腫瘤效果。
6週至8週的Balb/c小鼠購自上海靈暢生物科技有限公司(中國上海)。將人卵巢癌細胞系OVCAR-3(ATCC-HTB-161)細胞與基質膠混合，然後以1000萬細胞/隻進行皮下植入。在OVCAR-3細胞植入後第35天(平均腫瘤大小約150mm3)，給小鼠靜脈內注射以下物質中的一種：PBS和10mg/kg CL069707-H1L1-LP1。從治療開始之日起，用卡尺每週測量兩次腫瘤體積，並如下計算：TV=(寬度*長度)2/2。結果示於圖19A至圖19B中。單劑量CL069707-H1L1-LP1顯著減小了腫瘤體積，而不影響小鼠體重。
實施例10 抗體-藥物偶聯物在786-O異種移植物模型中的體內抗腫瘤效果。
6週NCG小鼠購自集萃藥康(中國蘇州)。將人腎癌細胞系786-O(購自上海勳慶生物科技有限公司)細胞重新懸浮於無血清培養基中，然後以650萬細胞/隻進行皮下植入。在786-O細胞植入後第15天(平均腫瘤大小約150mm3)和第36天，給小鼠靜脈內注射以下物質中的一種：PBS、10mg/kg IgG-LP1和10mg/kg CL069707-H1L1-LP1。從治療開始之日起，用卡尺每週測量兩次腫瘤體積，並如下計算：TV=(寬度*長度)2/2。結果示於圖20A至圖20B中。與IgG-LP1相比，CL069707-H1L1-LP1顯著減小了腫瘤體積，而不影響小鼠體重。
實施例11 抗體-藥物偶聯物在腎癌患者來源的異種移植物(PDX)模型中的體內抗腫瘤效果。
6週至8週的Nu/Nu小鼠購自浙江查理斯河有限公司。將腫瘤切成3mm×3mm×3mm(約50mg至90mg)大小的碎片並皮下植入到小鼠右側腹。然後每天檢查動物的腫瘤生長情況和體重。當平均腫瘤體積達到約150mm3時，將小鼠隨機分成5組。分組日視為第0天。然後給小鼠靜脈內注射10mg/kg的以下物質中的一種：10mg/kg IgG-LP1、CL069707-H1L1-LP1、IgG-GGFG-DXd、對照ADC和對照抗體-LP1。從治療開始之日起，用卡尺每週測量兩次腫瘤體積，並如下計算：TV=(寬度*長度)2/2。結果示於圖21A至圖21B中。與IgG-LP1相比，CL069707-H1L1-LP1顯著減小了腫瘤體積，其次是對照抗體-LP1，而不影響小鼠體重。當與IgG-GGFG-DXd比較時，對照ADC未顯示出腫瘤生長抑制活性。
實施例12 CDH6蛋白的小鼠單株抗體融合瘤細胞的製備
12.1 抗原的製備
將CDH6胞外區(Ser 54-Ala 615)用作免疫原，並且該抗原購自百賽普斯公司，目錄號CA6-H5229。
12.2 小鼠免疫
每組抗原將被用於免疫12隻Balb/c小鼠(8週齡至12週齡)，並且將監測免疫小鼠的血清滴度以確定免疫的最佳次數。優化的佐劑和免疫方法可產生對大多數抗原性多肽具有高親和力的抗體(IgG亞型)。在初次免疫後，進行3次至4次增強免疫，並且在增強免疫後，取小鼠血清檢測滴度(將重組蛋白用作抗原包被)。血清滴度合格的小鼠將進行增強免疫以進行融合，而血清滴度不合格的小鼠將繼續進行一次到兩次的增強免疫以達到融合前的最高滴度。
12.3 血清檢測和篩選
對免疫後的小鼠進行眼眶採血，藉由ELISA檢測血清滴度(將重組蛋白用作抗原包被)。要求血清滴度大於10K，否則繼續增強免疫。
12.4 融合和篩選
取出整個脾臟和1/2淋巴結，並與骨髓瘤SP2/0細胞系融合。該過程是優化的PEG融合。將融合的細胞接種在4個384孔板中(102個至104個細胞/孔)並培養。收集所有孔的上清液，藉由ELISA篩選陽性細胞株以檢測細胞上清液對CDH6重組蛋白的應答，並將細胞鏡檢的孔轉移至96孔板以進一步培養。在生長幾天之後，收集所有孔的上清液，並且藉由ELISA檢測與CDH6重組蛋白的反應性。進一步檢測陽性孔中各種稀釋度的細胞上清液與CDH6重組蛋白的結合能力以進行親和力排序，並選擇120個具有最高親和力的親本株進行亞選殖。
12.5 亞選殖和篩選
藉由有限稀釋方法和ELISA篩選進行亞選殖，以獲得單株融合瘤細胞。將細胞鋪在96孔板中，並培養至覆蓋大約1/6個板底。藉由ELISA檢測每個孔中的上清液對CDH6重組蛋白的應答，並且具有高OD值和良好細胞狀態的兩個孔用於下一輪亞選殖。重複上述步驟，直到孔中細胞株的陽性率為100%。然後獲得單株細胞株。在最後一輪亞選殖之後，立即擴增所有陽性細胞，一部分冷凍備用，另一部分製備為腹水。
12.6 腹水製備和抗體純化
最後，獲得13種單株細胞株，並經腹部注射到F1小鼠中以產生抗體。所產生的腹水用蛋白A/G純化並用於隨後的檢測。
實施例13 抗體與抗原的結合活性
在4℃下將重組蛋白CDH6以1μg/mL在ELISA板上包被過夜；在用PBST洗滌之後，向板中加入10%胎牛血清，並將混合物在37℃下封閉1小時；在板中加入13種不同稀釋度的CDH6單株抗體(0.1ng/mL至100ng/mL)，並將混合物在37℃下反應1h；在用PBST洗滌之後，向板中加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG第二抗體(山羊抗小鼠(HRP)，賽默飛世爾科技)，並將混合物在37℃下反應30min；在用PBST重複洗滌板5次之後，盡可能多地拍打吸水紙上剩餘的液滴；向板的每個孔中加入100μL TMB(eBioscience)並在室溫下(20±5℃)避光放置1.5min；向板的每個孔中加入100μL 2N H2SO4終止緩衝液以終止受質反應，使用酶標儀讀取450nm處的OD值，並分析抗體與靶抗原CDH6的結合能力。如表1和圖23所示，本發明的抗CDH6抗體和CDH6重組蛋白的靈敏度不超過12.5ng/mL，其中第13號(CL069463抗體)不超過3.125ng/mL，第 23號(CL069707抗體)不超過1.56ng/mL，第4號(CL069066抗體)不超過6.3ng/mL，並且第16號(CL069439抗體)不超過1.0ng/mL。
表3.藉由ELISA檢測抗體與CDH6抗原的結合活性
Figure 111147444-A0202-12-0128-41
實施例14 藉由抗體特異性識別細胞表面表達的CDH6抗原
使用OVCAR-3細胞(人卵巢癌細胞)作為陽性細胞以及HepG2細胞(人肝癌細胞)作為陰性細胞，藉由流式細胞術(FCM)分析13種CDH6單株抗體與細胞表面上的CDH6的結合。收集對數生長期的細胞，調節至5×106個細胞 /mL的細胞密度，並在冰上預冷。將13種CDH6單株抗體在含有2% FBS的預冷鹽水中稀釋至20μg/mL。取100μL細胞，並加入等體積稀釋的上述CDH6單株抗體，並使混合物在4℃下避光反應30min。在反應完成之後，用含有2% FBS的預冷鹽水(6000rpm，45s)洗滌細胞兩次。用含有2% FBS的預冷鹽水以1：500稀釋第二抗體PE抗小鼠IgG(BD Pharmingen)，並將洗滌後的細胞分別用100μL稀釋的第二抗體重新懸浮，並在4℃下避光反應30min。在反應完成之後，用含有2% FBS的預冷鹽水(6000rpm，45s)洗滌細胞兩次。將細胞重新懸浮於400μL鹽水中。使用流式細胞儀(BD Calibur)分析抗體與細胞表面抗原的結合能力。
結果示於圖24中。結果顯示，包括CL069463、CL069707等的共11種抗體能夠特異性識別OVCAR-3細胞(人卵巢癌細胞)(圖24)，而在陰性細胞HepG2細胞(人肝癌細胞)中未觀察到結合。
雖然本文已經示出並描述了本發明的較佳實施方案，但是對於所屬技術領域具通常知識者來說顯而易見的是，這些實施方案僅以示例的方式提供。本發明不受限於本說明書中提供的具體實施例。儘管已經參照上述說明書對本發明進行了描述，但對本文實施方案的描述和說明不應以限制性的方式去理解。在不背離本發明的情況下，所屬技術領域具通常知識者將會想到許多變化、改變和替換。此外，應當理解，本發明的所有方面不限於本文所述的具體描述、配置或相對比例，其取決於各種條件和變數。
雖然本文已經示出並描述了本發明的較佳實施方案，但是對於所屬技術領域具通常知識者來說顯而易見的是，這些實施方案僅以示例的方式提供。本發明不受限於本說明書中提供的具體實施例。儘管已經參照上述說明書對本發明進行了描述，但對本文實施方案的描述和說明不應以限制性的方式去理 解。在不背離本發明的情況下，所屬技術領域具通常知識者將會想到許多變化、改變和替換。此外，應當理解，本發明的所有方面不限於本文所述的具體描述、配置或相對比例，其取決於各種條件和變數。
應當理解，在實施本發明時可以採用本文所述的本發明的實施方案的各種替代方案。因此，可以預期本發明還將涵蓋任何此類替代方案、修改、變化或等價形式。以下申請專利範圍旨在限定本發明的範圍，並由此涵蓋這些申請專利範圍內的方法和結構及其等價形式。
參考資料
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Claims (102)

  1. 一種抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白具有以下性質中的一種或多種：
    i)在ELISA測定中能夠以小於12.5ng/mL的靈敏度結合CDH6蛋白；
    ii)在ELISA測定中能夠以低於約3.1×10-9M的KD值結合CDH6蛋白；以及
    iii)具有藉由結合CDH6而內化至表達CDH6的細胞中的活性。
  2. 如請求項1所述的抗原結合蛋白，其中該CDH6是哺乳動物CDH6蛋白。
  3. 如請求項1或2所述的抗原結合蛋白，其中該CDH6是人CDH6蛋白。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白與參比抗體競爭結合CDH6蛋白，其中該參比抗體包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)；其中，
    該VH包含如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，並且該VL包含如SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列；或者
    該VH包含如SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列，並且該VL包含如SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含抗體或其抗原結合片段。
  6. 如請求項5所述的抗原結合蛋白，其中該抗體或其抗原結合片段包括單株抗體、多株抗體、二聚體、聚合物、多特異性抗體、完整抗體、人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
  7. 如請求項5或6所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合片段包括Fab、Fab'、Fv片段、F(ab')2、scFv、di-scFv和/或dAb。
  8. 如請求項5至7中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗體包括嵌合抗體、人源化抗體和/或人抗體。
  9. 如請求項5至8中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗體是單株抗體。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含重鏈可變區(VH)的至少一個CDR，其中該VH包含如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含輕鏈可變區(VL)的至少一個CDR，其中該VL包含如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列。
  12. 如請求項1至11中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VH，其中該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，並且該HCDR1包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
  13. 如請求項1至12中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VH，其中該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，並且該HCDR1包含如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列。
  14. 如請求項1至13中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原 結合蛋白包含VH，其中該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，並且該HCDR2包含如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列。
  15. 如請求項1至14中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VH，其中該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，並且該HCDR3包含如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列。
  16. 如請求項1至15中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VH，其中該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中該HCDR1包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2包含如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，並且該HCDR3包含如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
  17. 如請求項1至16中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VH，其中該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中該HCDR1包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2包含如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，並且該HCDR3包含如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列；或者
    該HCDR1包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，所示HCDR2包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，並且該HCDR3包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
  18. 如請求項1至17中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VH，其中該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中該HCDR1包含如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，該HCDR2包含如SEQ ID NO：3所示 的胺基酸序列，並且該HCDR3包含如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列；或者
    該HCDR1包含如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，該HCDR2包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，並且該HCDR3包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列；
    其中該HCDR1包含如SEQ ID NO：89所示的胺基酸序列，該HCDR2包含如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，並且該HCDR3包含如SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列；或者
    其中該HCDR1包含如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列，該HCDR2包含如SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列，並且該HCDR3包含如SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列。
  19. 如請求項1至18中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VH，其中該VH包含框架區HFR1，該HFR1的C末端直接或間接連接至該HCDR1的N末端，並且該HFR1包含如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列。
  20. 如請求項1至19中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VH，其中該VH包含框架區HFR2，該HFR2位於該HCDR1和該HCDR2之間，並且該HFR2包含如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列。
  21. 如請求項1至20中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VH，其中該VH包含框架區HFR3，該HFR3位於該HCDR2和該HCDR3之間，並且該HFR3包含如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列。
  22. 如請求項1至21中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VH，其中該VH包含框架區HFR4，該HFR4的N末端直接或間接連接至該HCDR3的C末端，並且該HFR4包含如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列。
  23. 如請求項1至22所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VH，其中該VH包含框架區HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，該HFR1的C末端直接或間接連接至該HCDR1的N末端，該HFR2位於該HCDR1和該HCDR2之間，該HFR3位於該HCDR2和該HCDR3之間，並且該HFR4的N末端直接或間接連接至該HCDR3的C末端；其中該HFR1包含如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，該HFR2包含如SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，該HFR3包含如SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，並且該HFR4包含如SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列；或者
    該HFR1包含如SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列，該HFR2包含如SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，該HFR3包含如SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，並且該HFR4包含如SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列；或者
    該HFR1包含如SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列，該HFR2包含如SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，該HFR3包含如SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，並且該HFR4包含如SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列；或者
    該HFR1包含如SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，該HFR2包含如SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，該HFR3包含如SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列，並且該HFR4包含如SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列；或者
    該HFR1包含如SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列，該HFR2包含如SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列，該HFR3包含如SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列，並且該HFR4包含如SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列；或者
    該HFR1包含如SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列，該HFR2包含如SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，該HFR3包含如SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列，並且該HFR4包含如SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列。
  24. 如請求項1至23中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VH，其中該VH包含如SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列。
  25. 如請求項1至24中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含抗體重鏈恆定區。
  26. 如請求項25所述的抗原結合蛋白，其中該抗體重鏈恆定區包含源自人IgG的恆定區。
  27. 如請求項25所述的抗原結合蛋白，其中該抗體重鏈恆定區包含源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恆定區。
  28. 如請求項25所述的抗原結合蛋白，其中該抗體重鏈恆定區包含如SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列。
  29. 如請求項1至28中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含抗體重鏈，其中該抗體重鏈包含如SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列。
  30. 如請求項1至29中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VL，其中該VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且該LCDR1 包含如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：92或SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列。
  31. 如請求項1至30中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VL，其中該VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且該LCDR2包含如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列。
  32. 如請求項1至31中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VL，其中該VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且該LCDR3包含如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列。
  33. 如請求項1至32中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VL，其中該VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該LCDR2包含如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，並且該LCDR3包含如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；或者
    該LCDR1包含如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該LCDR2包含如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，並且該LCDR3包含如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；或者
    其中該LCDR1包含如SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列，該LCDR2包含如SEQ ID NO：93所示的胺基酸序列，並且該LCDR3包含如SEQ ID NO：94所示的胺基酸序列；或者
    其中該LCDR1包含如SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列，該LCDR2包含如SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列，並且該LCDR3包含如SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列。
  34. 如請求項1至33中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VH和VL，其中該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，並且該VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中該HCDR1包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2包含如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR3包含如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該LCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該LCDR2包含如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，並且該LCDR3包含如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；或者
    該HCDR1包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，該HCDR2包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該HCDR3包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，該LCDR1包含如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該LCDR2包含如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，並且該LCDR3包含如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。
  35. 如請求項1至34中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VH和VL，其中該VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，並且該VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中該HCDR1包含如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，該HCDR2包含如SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列，該HCDR3包含如SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該LCDR1包含如SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，該LCDR2包含如SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列，並且該LCDR3包含如SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；或者
    該HCDR1包含如SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，該HCDR2包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，該HCDR3包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，該LCDR1包含如SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該LCDR2包含如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，並且該LCDR3包含如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；或者
    其中HCDR1包含如SEQ ID NO：89所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，並且HCDR3包含如SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列，LCDR1包含如SEQ ID NO：92所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：93所示的胺基酸序列，並且LCDR3包含如SEQ ID NO：94所示的胺基酸序列；或者
    其中HCDR1包含如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列，並且HCDR3包含如SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列，LCDR1包含如SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列，並且LCDR3包含如SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列。
  36. 如請求項1至35中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VL，其中該VL包含框架區LFR1，該LFR1的C末端直接或間接連接至該LCDR1的N末端，並且該LFR1包含如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列。
  37. 如請求項1至36中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VL，其中該VL包含框架區LFR2，該LFR2位於該LCDR1和該 LCDR2之間，並且該LFR2包含如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列。
  38. 如請求項1至37中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VL，其中該VL包含框架區LFR3，該LFR3位於該LCDR2和該LCDR3之間，並且該LFR3包含如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列。
  39. 如請求項1至38中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VL，其中該VL包含框架區LFR4，該LFR4的N末端直接或間接連接至該LCDR3的C末端，並且該LFR4包含如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列。
  40. 如請求項1至39中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VL，其中該VL包含框架區LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，其中該LFR1的C末端直接或間接連接至該LCDR1的N末端，該LFR2位於該LCDR1和該LCDR2之間，該LFR3位於該LCDR2和該LCDR3之間，並且該LFR4的N末端直接或間接連接至該LCDR3的C末端；其中該LFR1包含如SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列，該LFR2包含如SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，該LFR3包含如SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列，並且該LFR4包含如SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列；或者
    該LFR1包含如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，該LFR2包含如SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，該LFR3包含如SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，並且該LFR4包含如SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列；或者
    該LFR1包含如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，該LFR2包含如SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，該LFR3包含如SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列，並且該LFR4包含如SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列；或者
    該LFR1包含如SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列，該LFR2包含如SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列，該LFR3包含如SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列，並且該LFR4包含如SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列；或者
    該LFR1包含如SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列，該LFR2包含如SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列，該LFR3包含如SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列，並且該LFR4包含如SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列；或者
    該LFR1包含如SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列，該LFR2包含如SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列，該LFR3包含如SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列，並且該LFR4包含如SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列；或者
    該LFR1包含如SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，該LFR2包含如SEQ ID NO：60所示的胺基酸序列，該LFR3包含如SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列，並且該LFR4包含如SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列。
  41. 如請求項1至40中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VL，其中該VL包含如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列。
  42. 如請求項1至41中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含VH和VL，其中該VH包含如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，並且該VL包含如SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列；或者
    該VH包含如SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列，並且該VL包含如SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列；或者
    該VH包含如SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列，並且該VL包含如SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列；或者
    該VH包含如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列，並且該VL包含如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列；或者
    其中VH包含如SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列，並且VL包含如SEQ ID NO：96所示的胺基酸序列；或者
    其中VH包含如SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列，並且VL包含如SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列。
  43. 如請求項1至42中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含抗體輕鏈恆定區。
  44. 如請求項1至43中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗體輕鏈恆定區包含人Igκ恆定區或人Igλ恆定區。
  45. 如請求項1至44中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗體輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列。
  46. 如請求項1至45中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含抗體輕鏈，其中該抗體輕鏈包含如SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：88所示的胺基酸序列。
  47. 如請求項1至46中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含抗體重鏈和抗體輕鏈，其中該抗體重鏈包含如SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列，並且該抗體輕鏈包含如SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列；或 者
    該抗體重鏈包含如SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列，並且該抗體輕鏈包含如SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列；或者
    該抗體重鏈包含如SEQ ID NO：85所示的胺基酸序列，並且該抗體輕鏈包含如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列；或者
    該抗體重鏈包含如SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列，並且該抗體輕鏈包含如SEQ ID NO：88所示的胺基酸序列。
  48. 一種多肽，該多肽包含如請求項1至47中任一項所述的抗原結合蛋白。
  49. 一種核酸分子，該核酸分子編碼如請求項1至47中任一項所述的抗原結合蛋白或如請求項48所述的多肽。
  50. 一種載體，該載體包含如請求項49所述的核酸分子。
  51. 一種細胞，其中該細胞包含如請求項49所述的核酸分子或如請求項50所述的載體，或者該細胞表達如請求項1至47所述的抗原結合蛋白或如請求項48所述的多肽。
  52. 一種用於製備如請求項1至47中任一項所述的抗原結合蛋白的方法，其中該方法包括在表達如請求項1至47中任一項所述的抗原結合蛋白的條件下培養如請求項51所述的細胞。
  53. 一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含如請求項1至47中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項48所述的多肽、如請求項49所述的核酸分子、如請求項50所述的載體和/或如請求項51所述的細胞，以及視需要的藥學上可接受的載體。
  54. 一種試劑盒，該試劑盒包含如請求項1至47中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項48所述的多肽或如請求項53所述的醫藥組成物。
  55. 一種如請求項1至47中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項48所述的多肽、如請求項49所述的核酸分子、如請求項50所述的載體和/或如請求項51所述的細胞和/或如請求項53所述的醫藥組成物在製備用於預防和/或治療與CDH6相關的疾病或病症的藥物中的用途。
  56. 如請求項55所述的用途，其中該與CDH6相關的疾病或病症包括腫瘤。
  57. 如請求項55或56所述的用途，其中該腫瘤包括表達CDH6的腫瘤。
  58. 如請求項55至57中任一項所述的用途，其中該腫瘤包括腎細胞癌、腎透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌、甲狀腺癌、膽管癌、肺癌、小細胞肺癌、肝癌、成膠質細胞瘤、間皮瘤、子宮癌、胰腺癌、維爾姆斯瘤或成神經細胞瘤。
  59. 如請求項55至58中任一項所述的用途，其中該藥物進一步包含另外的治療劑。
  60. 一種免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，該免疫偶聯物包含如請求項1至47中任一項所述的抗原結合蛋白或如請求項48所述的多肽。
  61. 如請求項60所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該免疫偶聯物進一步包含偶聯到該抗體或其抗原結合片段的活性部分。
  62. 如請求項61所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該活性部分包含藥物部分和/或標記。
  63. 如請求項62所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該藥物部分選自由以下項組成的組：細胞毒性劑、細胞因子、核酸、核酸相關分子、放射性核素、趨化因子、免疫(共)刺激分子、免疫抑制分子、死亡配體、凋亡誘導蛋白、激酶、前藥轉化酶、核糖核酸酶、激動性抗體或抗體片段、拮抗性抗體或抗體片段、生長因子、激素、凝血因子、纖溶活性蛋白、模擬這些物質的肽，以及它們的片段、融合蛋白或衍生物。
  64. 如請求項62所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該標記選自由以下項組成的組：放射性標記、螢光團、發色團、顯影劑和金屬離子。
  65. 如請求項63或64所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該細胞毒性劑包括微管破壞藥物和/或DNA損傷劑。
  66. 如請求項63至65中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該細胞毒性劑包括微管蛋白抑制劑和/或拓撲異構酶抑制劑。
  67. 如請求項63至66中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該細胞毒性劑包括拓撲異構酶I抑制劑。
  68. 如請求項63至67中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該細胞毒性劑包括喜樹鹼或其衍生物。
  69. 如請求項63至68中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該細胞毒性劑包含下式II的結構或其同分異構體、內 消旋體、外消旋體、對映體或非對映體，或其混合物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
    Figure 111147444-A0202-13-0016-42
  70. 如請求項60至69中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該免疫偶聯物包含式(I)的抗體-藥物偶聯物(ADC)：
    Ab-(L-(D)m)n， (I)
    其中Ab是如請求項1至47中任一項所述的抗原結合蛋白
    L是接頭；
    D是藥物部分；
    m是1至8的整數；並且
    n是1至10的任何數。
  71. 如請求項70所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該L選自：可切割接頭和不可切割接頭。
  72. 如請求項70或71所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該L包括可切割肽。
  73. 如請求項72所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該可切割肽可被酶切割。
  74. 如請求項73所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該酶包括組織蛋白酶B。
  75. 如請求項72至74中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該可切割肽或L包含胺基酸單元。
  76. 如請求項75所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該胺基酸單元包括二肽、三肽、四肽或五肽。
  77. 如請求項75或76所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該胺基酸單元選自：Val-Cit、Val-Ala、Glu-Val-Cit、Ala-Ala-Asn、Gly-Val-Cit、Gly-Gly-Gly和Gly-Gly-Phe-Gly。
  78. 如請求項70至77中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該L包含間隔子。
  79. 如請求項78所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該間隔子包括自降解間隔子。
  80. 如請求項79所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該自降解間隔子包括對胺基苯氧基羰基(PABC)或對胺基苄基(PAB)。
  81. 如請求項72至80中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該可切割肽直接剪接至該間隔子。
  82. 如請求項70至81中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該L包括：-Val-Cit-PABC-、-Val-Ala-PABC-、-Glu-Val-Cit-PABC-、-Ala-Ala-Asn-PABC-、-Gly-Val-Cit-PABC-、-Gly-Gly- Gly-PABC-、-Gly-Gly-Phe-Gly-PABC-、-Val-Cit-PAB-、-Val-Ala-PAB-、-Glu-Val-Cit-PAB-、-Ala-Ala-Asn-PAB-、-Gly-Val-Cit-PAB-、-Gly-Gly-Gly-PAB-或-Gly-Gly-Phe-Gly-PAB-。
  83. 如請求項70至82中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該間隔子包含-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-所示的結構，其中La表示-O-或單鍵；Lb表示-CR2(-CR3)-或單鍵，其中R2和R3各自獨立地表示C1-C6烷基、-(CH2)na-NH2、-(CH2)nb-COOH或-(CH2)nc-OH，n1表示0至6的整數，na、nb和nc各自獨立地表示1至4的整數，但當na為0時，R2和R3不相同，並且Lc表示-C(=O)-。
  84. 如請求項83所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該間隔子包括-NH-(CH2)3-C(=O)-、-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-或-NH-(CH2)2-O-CH2-C(=O)-。
  85. 如請求項70至84中任一項該免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該L包含-L1-L2-L3-所示的結構，其中L1表示-(琥珀醯亞胺基-3-基-N)-(CH2)n2-C(=O)-、-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-或-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-，其中n2表示2至8的整數，n3表示1至8的整數，並且n4表示1至8的整數；L2表示胺基酸單元；L3表示該自降解間隔子。
  86. 如請求項70至85中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該L選自：
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-PABC-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
    -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
    -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-PABC-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-；
    -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
    -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-PABC-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2o-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
    -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
    -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-PABC-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；
    -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2-C(=O)-；
    -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-；和
    -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-VA-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-。
  87. 如請求項70至86中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該對胺基苯氧基羰基(PABC)或對胺基苄基(PAB)包含聚肌胺酸鈉(聚-N-甲基甘胺酸)殘基。
  88. 如請求項70至87中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該L選自以下結構：
    Figure 111147444-A0202-13-0022-43
    其中n5表示0至20的整數。
  89. 如請求項88所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中n5表示1至15的整數。
  90. 如請求項70至89中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該L選自以下結構：
    Figure 111147444-A0202-13-0022-44
    Figure 111147444-A0202-13-0023-45
  91. 如請求項60至90中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該抗體-藥物偶聯物選自以下結構：
    Figure 111147444-A0202-13-0023-46
    Figure 111147444-A0202-13-0024-47
    其中n是1至10的任何數。
  92. 如請求項91所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中n是2至9的任何數。
  93. 一種製備如請求項60至92中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的方法，該方法包括使如請求項1至47中任一項所述的抗原結合蛋白與藥物-接頭中間體化合物反應的步驟。
  94. 一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含如請求項60至92中任一 項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
  95. 如請求項94所述的醫藥組成物，該醫藥組成物進一步包含藥學上可接受的載體或賦形劑。
  96. 一種如請求項60至92中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或如請求項94或95所述的醫藥組成物在製備用於治療腫瘤的藥物中的用途。
  97. 如請求項96所述的用途，其中該腫瘤是表達CDH6的腫瘤。
  98. 如請求項96或97所述的用途，其中該腫瘤包括腎細胞癌、腎透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌、甲狀腺癌、膽管癌、肺癌、小細胞肺癌、成膠質細胞瘤、間皮瘤、子宮癌、胰腺癌、維爾姆斯瘤或成神經細胞瘤。
  99. 一種用於治療腫瘤的方法，該方法包括向受試者施用如請求項60至92中任一項該免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
  100. 如請求項99所述的方法，其中該腫瘤是表達CDH6的腫瘤。
  101. 如請求項99或100所述的方法，其中該腫瘤包括腎細胞癌、腎透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌、卵巢癌、卵巢漿液性腺癌、甲狀腺癌、膽管癌、肺癌、小細胞肺癌、成膠質細胞瘤、間皮瘤、子宮癌、胰腺癌、維爾姆斯瘤或成神經細胞瘤。
  102. 一種用於治療腫瘤的方法，該方法包括同時、分開或序貫地向受試者施用醫藥組成物，該醫藥組成物包含至少一種組分和至少一種抗腫瘤藥物，該至少一種組分選自如請求項60至92中任一項所述的免疫偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。
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