CN117693526A - 抗-c-Met抗体药物缀合物 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了c‑Met抗体药物缀合物(ADC)，包括使用这样的ADC的组合物和方法。

Description

抗-c-Met抗体药物缀合物
1.对相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月29日提交的美国临时申请系列号63/181,963的权益，其特此通过引用整体并入。
2.序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交，且特此通过引用整体并入。所述ASCII副本创建于2022年4月28日，名为632WO_SL_ST25.txt，且为22,918字节大小。
3.技术领域
本申请尤其涉及新的拓扑异构酶抑制剂药物、药物接头、抗-c-Met抗体药物缀合物(ADC)及其制备方法。
4.背景
c-Met是在上皮细胞和内皮细胞的表面上表达的信号传递酪氨酸激酶受体。肝细胞生长因子(HGF)(c-Met唯一已知的配体)对c-Met的活化已经被证实控制细胞增殖、血管生成、存活和细胞运动。
非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的85％，并且是全球癌症相关死亡的主要原因。异常的c-Met信号传递在NSCLC中是常见的，并且被认为通过多种机制发生。失调的c-Met信号传递与预后不良、肿瘤发生、对化学疗法/放射疗法的抗性以及对表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的获得性抗性相关联。
抗体药物缀合物(ADC)代表了一类相对新的治疗剂，其包含通过化学接头缀合至细胞毒性药物的抗体。ADC的治疗概念是将抗体的结合能力与药物结合，其中使用所述抗体通过结合靶表面抗原(包括在肿瘤细胞中过表达或扩增的靶表面抗原)而将所述药物递送至肿瘤细胞。
但是，尚未批准抗体药物缀合物用于治疗非小细胞肺癌。本领域中仍然需要可以用于治疗目的的抗体药物缀合物，诸如在非小细胞肺癌的治疗中。
5.概述
本公开内容提供了特异性结合人c-Met的抗体药物缀合物。在下面的详细描述中提供了示例性CDR的氨基酸序列以及示例性抗-c-Met ADC的抗体的重链和轻链的VH和VL区域的氨基酸序列。
在另一个方面，本公开内容提供了包括本文描述的抗-c-Met ADC的组合物。所述组合物通常包含一种或多种如本文描述的抗-c-Met ADC以及一种或多种赋形剂、载体或稀释剂。
本公开内容提供了治疗具有NSCLC的受试者(诸如人类受试者)的方法，所述方法包括施用有效量的本文中公开的抗-c-Met ADC。抗-c-Met ADC通常作为静脉内输注和/或注射来施用。
6.附图简述
图1显示了式I的拓扑异构酶I(TOP1)抑制剂的一种合成途径。
图2A-2B显示了施用Calu-6(肺腺癌；图2A)和A375(恶性黑素瘤；FIG 2B)的TOP1抑制剂化合物之后的细胞增殖。
图3A-3J显示了本公开内容的ADC(ADC-1)对细胞系的体外活性，所述细胞系包括(A)SNU-5(人胃癌)、(B)Hs 746T(胃腺癌)、(C)EBC1(人肺鳞状细胞癌)、(D)NCI-H441(人肺腺癌)、(E)NCI-H1573(肺腺癌)、(F)HCC827(肺腺癌)、(G)NCI-H820(肺乳头状腺癌)、(H)Calu-3(肺腺癌)、(I)MIA PaCa-2(胰腺导管腺癌)和(J)HEK-293。
图4A-4B显示了ADC-1在NCI-H441(人腺癌，图4A)和Hs 746T(胃腺癌，图4B)异种移植肿瘤模型中的体内活性。
7.详细描述
本发明的各个方面涉及拓扑异构酶I(TOP1)抑制剂和包含这样的TOP1抑制剂的抗-c-Met抗体药物缀合物。在某些实施方案中，本发明提供了抗-c-Met ADC，包括包含TOP1抑制剂的抗-c-Met ADC，可用于合成ADC的合成子，制备ADC的方法，以及使用ADC的各种方法。
7.1.拓扑异构酶1抑制剂(TOP1i)
拓扑异构酶1(TOP1)除去在DNA复制过程中形成的超螺旋。TOP1抑制剂(TOP1i)可以结合并稳定TOP1-DNA复合物，从而诱导DNA链断裂和细胞凋亡。本文呈现了根据结构式(I)的拓扑异构酶I抑制剂药物(“TOP1i药物”)，其可用于通过与抗体缀合而靶向递送至细胞。
在实施方案中，TOP1i药物是根据式(I)的化合物。在实施方案中，所述TOP1i药物是(7S)-14-(3-氨基二环[1.1.1]戊烷-1-基)-7-乙基-7-羟基-2H,10H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-8,11(7H,13H)-二酮或其结构等效形式。
本文考虑的TOP1i药物可以缀合至ADC中的抗体，如在结构式(II)中所示：
其中代表接头与TOP1i药物的连接点。
7.2.抗-c-Met ADC
如本文描述的拓扑异构酶抑制剂可以缀合至抗-c-Met抗体以形成抗-c-MetTOP1i抗体药物缀合物(ADC)。抗体-药物缀合物可以增加抗体在治疗疾病中的治疗效果，因为ADC能够选择性地将一个或多个药物部分递送至靶组织，诸如肿瘤相关抗原，例如表达c-Met的肿瘤。因而，在实施方案中，本公开内容提供了用于治疗用途的抗-c-MetTOP1iADC，例如，在非小细胞肺癌的治疗中。
在某些实施方案中，TOP1i药物经由根据结构式(III)的接头缀合至抗体：
其中X代表溴或N-连接的马来酰亚胺。
在本文描述的抗-c-Met ADC中，TOP1i药物经由接头部分缀合至抗-c-Met抗体。如熟练的技术人员将理解的，所述接头通过在一个位置处形成与TOP1i药物的共价键并在另一个位置处形成与抗体的共价键而将TOP1i药物连接至抗-c-Met抗体。所述共价键通过接头上的官能团与TOP1i药物和抗-c-Met抗体上的官能团之间的反应而形成。
可用于形成ADC的合成中间体化合物可以包括：
7.2.1.接头药物LD1(结构式(V))
(2S)-2-(2-溴乙酰胺基)-N-[(2S)-1-({3-[(7S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氢-2H,10H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]二环[1.1.1]戊烷-1-基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]-3-甲基丁酰胺
7.2.2.接头药物LD2(结构式(VI))
(2S)-2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺基]-N-[(2S)-1-({3-[(7S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氢-2H,10H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]二环[1.1.1]戊烷-1-基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]-3-甲基丁酰胺
7.2.3.接头药物LD3(结构式(VII))
(2S,3S,4R,5R,6S)-6-[2-(5-{[(2S)-2-({(2S)-2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺基]-3-甲基丁酰基}氨基)丙酰基]氨基}-2-{[({3-[(7S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氢-2H,10H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]二环[1.1.1]戊烷-1-基}氨基甲酰基)氧基]甲基}苯基)乙基]-3,4,5-三羟基氧杂环己烷-2-甲酸
7.2.4.连接的药物的数目
本文公开的ADC包含以各种化学计量摩尔比连接至抗体部分的药物分子，所述摩尔比取决于抗体的构型且至少部分取决于用于实现缀合的方法。
术语“药物载荷”或“药物负载”是指在单个ADC分子中每个抗体的药物分子数目。与抗-c-Met ADC连接的TOP1i药物的数目可以变化，并且将受限于抗-c-Met抗体上可用附着位点的数目。如关于本发明的抗-c-MetADC所考虑的，接头将单个TOP1i药物连接至抗-c-MetADC的抗体。只要抗-c-MetADC在使用和/或储存条件下不表现出不可接受的聚集水平，则考虑n最多为10的抗-c-Met ADC(即，结构式(III))。在某些实施方案中，所述抗-c-MetADC具有在1-10的范围内的n。在某些实施方案中，所述抗-c-MetADC具有选自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的n。在实施方案中，n是2、4、6、8或10。在实施方案中，n是6。在实施方案中，所述药物负载可以包含1个药物分子、2个药物分子、3个药物分子、4个药物分子、5个药物分子、6个药物分子、7个药物分子、8个药物分子、9个药物分子或10个药物分子。
7.2.5.抗体AbA
AbA是小鼠单克隆抗体224G11的人源化形式，其首次公开并体现在美国专利号8,329,173中。鼠抗体m224G11具有如SEQ ID NO:13所示的可变重结构域和如SEQ ID NO:14所示的可变轻结构域：
m224G11重链可变结构域(CDR标有下划线，且如SEQ ID NO:15、16和17所示)
m224G11轻链可变结构域(CDR标有下划线，且如SEQ ID NO:18、19和20所示)：
AbA是一种人源化的重组IgG1κ(在美国专利号8,741,290中公开为224G11[TH7Hz3])，其靶向位于免疫球蛋白-丛蛋白-转录因子同源性(IPT)结构域1内的c-Met的独特表位，从而导致HGF依赖性的和HGF非依赖性的c-Met信号传递的阻断。
如在IMGT命名法下所定义的，AbA的CDR序列包含下述序列：
CDR-H1:GYIFTAYT(SEQ ID NO:1)
CDR-H2:IKPNNGLA(SEQ ID NO:2)
CDR-H3:ARSEITTEFDY(SEQ ID NO:3)
CDR-L1:ESVDSYANSF(SEQ ID NO:4)
CDR-L2:RAS(SEQ ID NO:5)
CDR-L3:QQSKEDPLT(SEQ ID NO:6)
在某些实施方案中，构成本公开内容的ADC的抗-c-Met抗体包含具有如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的CDR-H1、具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的CDR-H2；具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的CDR-H3、具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的CDR-L1、具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的CDR-L2；和具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的CDR-L3。
在某些实施方案中，构成本公开内容的ADC的抗-c-Met抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列：
所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:8)。
在某些实施方案中，构成本公开内容的ADC的抗-c-Met抗体包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列(恒定区为；CDR标有下划线(按出现的顺序，分别公开为SEQ ID NO:1-3))：
(全长序列公开为SEQ ID NO:9)
所述轻链包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列(按出现的顺序，CDR序列分别公开为SEQ ID NO:4-6)：
(全长序列公开为SEQ ID NO:10)。
在实施方案中，本公开内容的抗体包含SEQ ID NO:9的重链和SEQ ID NO:10的轻链。
在一个实施方案中，构成本公开内容的ADC的抗-c-Met抗体的重链由下述核苷酸序列(全长序列公开为SEQ ID NO:21)编码：
分泌信号肽为；包括最终的终止密码子(TGA)；恒定区为/>；CDR标有下划线(按出现的顺序，CDR序列分别公开为SEQ ID NO:22-24)。
在一个实施方案中，构成本公开内容的ADC的抗-c-Met抗体的轻链由下述核苷酸序列(全长序列公开为SEQ ID NO:25)编码：
分泌信号肽为；包括最终的终止密码子(TGA)；恒定区为/>；CDR标有下划线(按出现的顺序，CDR序列分别公开为SEQ ID NO:26-28)。
7.2.6.示例性抗-c-Met ADC
在特定实施方案中，本发明的抗-c-Met ADC包含通过可切割的缬氨酸丙氨酸(va)接头缀合至TOP1i药物的抗-c-Met抗体，所述抗-c-Met抗体包含与抗体AbA的CDR对应的六个互补性决定区(CDR)。在某些实施方案中，所述接头包含用于与来自ADC的抗-c-Met抗体的还原半胱氨酸的巯基缀合的溴乙酰胺官能团。在其它实施方案中，所述接头包含用于与来自ADC的抗-c-Met抗体的还原半胱氨酸的巯基缀合的马来酰亚胺官能团。在某些实施方案中，所述接头进一步包含自切割(self-immolating)的间隔基团，优选对氨基苄基羰基(PABC)或其类似物。
在实施方案中，抗-c-Met ADC包含通过与抗-c-Met抗体的半胱氨酸残基的巯基形成的键缀合至接头药物LD1(结构式(V))的抗-c-Met抗体，所述抗-c-Met抗体包含与抗体AbA的CDR对应的六个互补性决定区(CDR)。在某些实施方案中，所述抗-c-Met抗体包含抗体AbA的可变重(VH)链和可变轻(VL)链区域序列。在某些实施方案中，所述抗-c-Met抗体包含抗体AbA的重链(HC)和轻链(LC)序列。
在实施方案中，抗-c-Met ADC具有以下结构式(VIII)：
其中n是1-10的整数，且其中Ab是IgG1抗-c-Met抗体，其包含如SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、如SEQ ID NO:2所示的重链CDR2、如SEQ ID NO:3所示的重链CDR3、如SEQ IDNO:4所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和如SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。在实施方案中，所述抗体Ab是IgG1抗-c-Met抗体，其包含：包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的轻链可变区。在实施方案中，所述抗体Ab是抗-c-Met抗体，其包含：包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链。在实施方案中，接头-药物与抗体的缀合是通过与所述抗体的半胱氨酸残基的巯基形成的键。在实施方案中，n具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的值。在实施方案中，n具有2、4、6、8或10的值。在实施方案中，n是6。在一个实施方案中，结构式(VIII)的抗-c-MetADC包含抗体Ab，其具有包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链，且n具有2、4、6、8或10的值。在一个实施方案中，结构式(VIII)的抗-c-Met ADC包含抗体Ab，其具有包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链，且n具有6的值。
在某些实施方案中，抗-c-Met ADC包含通过与抗-c-Met抗体的半胱氨酸残基的巯基形成的键缀合至接头药物LD2(结构式(VI))的抗-c-Met抗体，其包含与抗体AbA的CDR对应的六个互补性决定区(CDR)。在某些实施方案中，所述抗-c-Met抗体包含抗体AbA的可变重(VH)链和可变轻(VL)链区域序列。在某些实施方案中，所述抗-c-Met抗体包含抗体AbA的重链(HC)和轻链(LC)序列。
在某些实施方案中，抗-c-Met ADC具有以下结构式(IX)：
其中n是1-10的整数，且其中Ab是IgG1抗-c-Met抗体，其包含如SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、如SEQ ID NO:2所示的重链CDR2、如SEQ ID NO:3所示的重链CDR3、如SEQ IDNO:4所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和如SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。在实施方案中，所述抗体Ab是IgG1抗-c-Met抗体，其包含：包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的轻链可变区。在实施方案中，所述抗体Ab是抗-c-Met抗体，其包含：包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链。在实施方案中，接头-药物与抗体的缀合是通过与所述抗体的半胱氨酸残基的巯基形成的键。在实施方案中，n具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的值。在实施方案中，n具有2、4、6、8或10的值。在实施方案中，n是6。在一个实施方案中，结构式(IX)的抗-c-MetADC包含抗体Ab，其具有包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链，且n具有2、4、6、8或10的值。在一个实施方案中，结构式(IX)的抗-c-Met ADC包含抗体Ab，其具有包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链，且n具有6的值。
在某些实施方案中，抗-c-Met ADC包含通过与抗-c-Met抗体的半胱氨酸残基的巯基形成的键缀合至接头药物LD3(结构式(VII))的抗-c-Met抗体，其包含与抗体AbA的CDR对应的六个互补性决定区(CDR)。在某些实施方案中，所述抗-c-Met抗体包含抗体AbA的可变重(VH)链和可变轻(VL)链区域序列。在某些实施方案中，所述抗-c-Met抗体包含抗体AbA的重链(HC)和轻链(LC)序列。
在某些实施方案中，抗-c-Met ADC具有以下结构式(X)：
其中n是1-10的整数，且其中Ab是IgG1抗-c-Met抗体，其包含如SEQ ID NO:1所示的重链CDR1、如SEQ ID NO:2所示的重链CDR2、如SEQ ID NO:3所示的重链CDR3、如SEQ IDNO:4所示的轻链CDR1、如SEQ ID NO:5所示的轻链CDR2和如SEQ ID NO:6所示的轻链CDR3。在实施方案中，所述抗体Ab是IgG1抗-c-Met抗体，其包含：包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的重链可变区和包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的轻链可变区。在实施方案中，所述抗体Ab是抗-c-Met抗体，其包含：包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链。在实施方案中，接头-药物与抗体的缀合是通过与所述抗体的胱氨酸残基的巯基形成的键。在实施方案中，n具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的值。在实施方案中，n具有2、4、6、8或10的值。在实施方案中，n是6。在一个实施方案中，结构式(X)的抗-c-Met ADC包含抗体Ab，其具有包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链和包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链，且n具有2、4、6、8或10的值。在一个实施方案中，结构式(X)的抗-c-MetADC包含抗体Ab，其具有包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链和包含如SEQID NO:10所示的氨基酸序列的轻链，且n具有6的值。
本公开内容的ADC可以作为适合施用给受试者的组合物提供。在某些实施方案中，所述ADC组合物是药物组合物，其包含本公开内容的ADC和药学上可接受的载体。本文公开的ADC的给定制剂可以包含具有不同药物负载(即不同的n值)的抗体分布。
7.3.使用方法
在实施方案中，本文描述的方法涉及用本发明的抗-c-Met ADC治疗患有非鳞状NSCLC的患者。
8.实施例
为了说明的目的，提供了以下实施例，它们突出了本文描述的抗体和结合片段的示例性实施方案的某些特征和性质。
实施例1
(2S)-2-(2-溴乙酰胺基)-N-[(2S)-1-({3-[(7S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氢-2H,10H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]二环[1.1.1]戊烷-1-基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]-3-甲基丁酰胺
实施例1A
(3-(甲氧基(甲基)氨基甲酰基)二环[1.1.1]戊烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯
在10℃向3-((叔丁氧基羰基)氨基)二环[1.1.1]戊烷-1-甲酸(4.9g)、N,O-二甲基羟胺盐酸盐(2.2g)和N,N-二异丙基乙胺(11.30mL)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中逐份加入1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐(8.61g)。将反应混合物在20℃搅拌12小时。如上所描述建立另外两个反应并使其在20℃搅拌12小时。合并所有三个反应。将反应用二氯甲烷(200mL)稀释并加入1NHCl水溶液(50mL)中。将形成的沉淀物过滤并使滤液分离。将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)和盐水(50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶上的色谱法纯化，用1-50％乙酸乙酯/石油醚洗脱以产生标题化合物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 4.97(br s,1H),3.66(s,3H),3.18(s,3H),2.34(s,6H),1.45(s,9H)。MS(ESI+)m/z 271.2(M+H)+。
实施例1B
(3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-羰基)二环[1.1.1]戊烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯
在-65℃在氮气下向5-溴苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯(8.83g)在四氢呋喃(100mL)中的溶液中缓慢地加入正丁基锂(17.57mL,2.5M在己烷中)。将混合物在-65℃搅拌30分钟。缓慢地加入实施例1A(4.75g)在四氢呋喃(40mL)中的溶液。将混合物在-65℃搅拌3小时。建立另外三个反应并使其在-65℃搅拌3小时。合并所有四个反应。将混合物用饱和氯化铵水溶液(500mL)淬灭，并用乙酸乙酯(3×500mL)萃取。将合并的有机层用盐水(500mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶上的色谱法纯化，用1-50％乙酸乙酯/石油醚洗脱以产生标题化合物。1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.63(dd,1H),7.45(d,1H),6.82(d,1H),6.03(s,2H),5.04(br s,1H),2.50(s,6H),1.46(s,9H)。MS(ESI+)m/z354.2(M+Na)+。
实施例1C
N-(3-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-羰基)二环[1.1.1]戊烷-1-基)-2,2,2-三氟乙酰胺
步骤1:在0℃向实施例1B(6.2g)在二氯甲烷(62mL)中的溶液中缓慢地加入三氟乙酸(62mL)。将反应在25℃搅拌4小时。建立另外两个反应，并在25℃搅拌4小时。将每个混合物在减压下浓缩。将每个残余物不经进一步纯化用在下一步中。
步骤2:在0℃向上述粗产物在二氯甲烷(62mL)中的溶液中逐滴加入N,N-二异丙基乙胺(16.34mL)和三氟乙酸酐(3.96mL)。将混合物在25℃搅拌2小时。如上所描述建立另外两个反应并在25℃搅拌2小时。合并所有三个反应并倒入水(200mL)中，用二氯甲烷(2×200mL)萃取。将有机层用盐水(200mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶上的柱色谱法纯化，用25％乙酸乙酯/石油醚洗脱以产生标题化合物。1HNMR(501MHz,CDCl3)δppm 7.61(dd,1H),7.43(d,1H),7.00(s,1H),6.85(d,1H),6.05(s,2H),2.62(s,6H)。MS(ESI+)m/z 328.2(M+H)+。
实施例1D
2,2,2-三氟-N-(3-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-羰基)二环[1.1.1]戊烷-1-基)乙酰胺
在0℃向实施例1C(4.3g)在乙酸酐(25mL)中的溶液中逐份加入硝酸铜(II)三水合物(4.76g)。将混合物在0℃搅拌3小时。如上所描述建立另外三个反应并在0℃搅拌3小时。合并所有四个反应。将混合物倒入水(50mL)中，并用乙酸乙酯(5×100mL)萃取。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，在减压下浓缩。将残余物通过硅胶上的柱色谱法纯化，用75％乙酸乙酯/石油醚洗脱以产生标题化合物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.61(s,1H),6.77(br s,1H),6.64(s,1H),6.21(s,2H),2.43(s,6H)。MS(APCI+)m/z 373.1(M+H)+。
实施例1E
N-(3-(6-氨基苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-羰基)二环[1.1.1]戊烷-1-基)-2,2,2-三氟乙酰胺
在氮气下向实施例1D(4g)在乙醇(40mL)和水(8mL)中的溶液中加入铁(5.4g)和氯化铵(5.17g)。将混合物在100℃搅拌3小时。如上所描述建立另外三个反应并在100℃搅拌3小时。冷却至环境温度以后，合并所有四个反应。将混合物倒入水(1L)中，并用乙酸乙酯(5×500mL)萃取。将合并的有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶上的柱色谱法纯化，用10-75％乙酸乙酯/石油醚洗脱以产生标题化合物。1HNMR(400MHz,CDCl3)δppm 7.22(s,1H),6.70(s,1H),6.50(s,2H),6.14(s,1H),5.92(s,2H),2.63(s,6H)。MS(ESI+)m/z343.2(M+H)+。
实施例1F
(S)-N-(3-(7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-8,10,11,13-四氢-7H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)二环[1.1.1]戊烷-1-基)-2,2,2-三氟乙酰胺
向实施例1E(3.5g)和(S)-4-乙基-4-羟基-7,8-二氢-1H-吡喃并[3,4-f]吲嗪-3,6,10(4H)-三酮(2.69g)在甲苯(140mL)中的悬浮液中加入对甲苯磺酸一水合物(1.945g)。将混合物在115℃搅拌12小时。如上所描述建立另外三个反应并在115℃搅拌12小时。冷却至环境温度以后，合并所有四个反应。将混合物过滤并将收集的固体与乙腈(200mL)一起研磨以产生标题化合物。1H NMR(400MHz，二甲亚砜-d6)δppm 10.28(s,1H),7.64(s,1H),7.52(s,1H),7.24(s,1H),6.47(s,1H),6.30(dd,2H),5.42(s,2H),5.36(s,2H),2.87(s,6H),1.94-1.77(m,2H),0.88(t,3H)。MS(ESI+)m/z 570.3(M+H)+。
实施例1G:(7S)-14-(3-氨基二环[1.1.1]戊烷-1-基)-7-乙基-7-羟基-2H,10H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-8,11(7H,13H)-二酮
向实施例1F(3g)在甲醇(30mL)中的溶液中加入HCl(60mL,4M在甲醇中)。将混合物在65℃搅拌4小时。如上所描述建立另外四个反应并在65℃搅拌4小时。冷却至环境温度以后，合并所有五个反应。将混合物在减压下浓缩并将残余物与甲醇(200mL)一起研磨以产生标题化合物。1HNMR(400MHz，二甲亚砜-d6)δppm 9.23(s,3H),7.54(s,1H),7.51(s,1H),7.24(s,1H),6.30(d,2H),5.41(s,2H),5.39-5.26(m,2H),2.79(s,6H),1.87(hept,2H),0.88(t,3H)。MS(ESI+)m/z 474.3(M+H)+。
实施例1H
((S)-1-(((S)-1-((3-((S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-8,10,11,13-四氢-7H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)二环[1.1.1]戊烷-1-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯
向(S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酸(2.49g)、2-羟基吡啶1-氧化物(1.31g)和N1-((乙基亚氨基)亚甲基)-N3,N3-二甲基丙烷-1,3-二胺盐酸盐(2.26g)在乙腈(40mL)中的悬浮液中加入2,6-二甲基吡啶(2.74mL)。将混合物在环境温度搅拌30分钟。在单独的烧瓶中，在N,N-二甲基甲酰胺(40mL)中合并实施例1G(4g)和2,6-二甲基吡啶(2.74mL)，并加入上述溶液。将混合物在环境温度搅拌过夜。将混合物在减压下浓缩并将残余物溶解在二氯甲烷(300mL)中，用饱和氯化铵水溶液(100mL)、盐水(100mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶上的柱色谱法纯化，用0-10％的甲醇/二氯甲烷洗脱以产生标题化合物。1HNMR(400MHz，二甲亚砜-d6)δppm8.65(s,1H),7.89(d,1H),7.61(s,1H),7.49(s,1H),7.22(s,1H),6.77(d,1H),6.46(s,1H),6.29(d,2H),5.41(s,2H),5.32(s,2H),4.29(q,1H),3.87-3.77(m,1H),2.76(s,6H),1.99(q,1H),1.92-1.81(m,2H),1.41(s,9H),1.25(d,3H),0.92-0.80(m,9H)。MS(ESI+)m/z 744.4(M+H)+。
实施例1I
(S)-2-氨基-N-((S)-1-((3-((S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-8,10,11,13-四氢-7H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)二环[1.1.1]戊烷-1-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基丁酰胺
在环境温度将实施例1H(5.5g)用三氟乙酸(30mL)处理30分钟。将混合物在减压下浓缩并将残余物溶解在50％的乙腈/水(200mL)中。将溶液冻干以产生标题化合物。1HNMR(600MHz，二甲亚砜-d6)δppm8.80(s,1H),8.59(d,1H),8.10(d,3H),7.60(s,1H),7.48(s,1H),7.23(s,1H),6.33-6.26(m,2H),5.41(d,2H),5.35-5.23(m,2H),4.35(p,1H),3.66-3.63(m,1H),2.77(s,6H),2.17-2.06(m,1H),1.91-1.83(m,2H),1.31(d,3H),1.01-0.96(dd,6H),0.89(t,3H)。MS(ESI+)m/z 644.4(M+H)+。
实施例1J
(2S)-2-(2-溴乙酰胺基)-N-[(2S)-1-({3-[(7S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氢-2H,10H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]二环[1.1.1]戊烷-1-基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]-3-甲基丁酰胺
向2-溴乙酸(1.435g)在N,N-二甲基甲酰胺(26mL)中的溶液中加入2-乙氧基喹啉-1(2H)-甲酸乙酯(2.55g)。将混合物在环境温度搅拌10分钟。在单独的烧瓶中，在N,N-二甲基甲酰胺(26mL)中合并实施例1I(4.5g)和2,6-二甲基吡啶(3.61mL)并加入上述溶液。将混合物在环境温度搅拌30分钟。将混合物用三氟乙酸(4mL)酸化并通过Teledyne Isco系统上的反相HPLC使用Luna柱(250×50mm,10mm)纯化，用5-75％的乙腈/水(含有0.1％三氟乙酸)历时30分钟洗脱，在冻干以后产生标题化合物。1H NMR(600MHz，二甲亚砜-d6)δppm 8.57(s,1H),8.32(d,1H),8.16(d,1H),7.67(s,1H),7.52(s,1H),7.24(s,1H),6.30(dd,2H),5.42(s,2H),5.38(d,2H),4.28-4.19(m,2H),4.03-3.91(m,2H),2.76(s,6H),2.02(h,1H),1.86(ddp,2H),1.25(d,3H),0.93-0.84(m,9H)。MS(ESI+)m/z 764.46(M+H)+。
实施例2
(2S)-2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺基]-N-[(2S)-1-({3-[(7S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氢-2H,10H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]二环[1.1.1]戊烷-1-基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]-3-甲基丁酰胺
向实施例1I(2g)在N,N-二甲基甲酰胺(54mL)中的溶液中加入2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(0.7g)，随后加入N,N-二异丙基乙胺(2.3mL)。将混合物在环境温度搅拌30分钟。将反应用三氟乙酸(2mL)淬灭并通过GilsonPLC 2020系统上的反相HPLC使用Luna柱(250×50mm,10mm)纯化，用5-75％的乙腈/水(含有0.1％三氟乙酸)历时30分钟洗脱，在冻干以后提供标题化合物。1H NMR(500MHz，二甲亚砜-d6)δppm 8.50(s,1H),8.29(d,1H),8.13(d,1H),7.64(s,1H),7.51(s,1H),7.23(s,1H),7.12(s,2H),6.30(d,2H),5.42(s,2H),5.36(d,2H),4.24(p,1H),4.20-4.14(m,3H),2.75(s,6H),2.01(h,1H),1.86(dp,2H),1.26(d,3H),0.93-0.83(m,9H)。MS(ESI+)m/z 781.14(M+H)+。
实施例3
(2S,3S,4R,5R,6S)-6-[2-(5-{[(2S)-2-({(2S)-2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺基]-3-甲基丁酰基}氨基)丙酰基]氨基}-2-{[({3-[(7S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氢-2H,10H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]二环[1.1.1]戊烷-1-基}氨基甲酰基)氧基]甲基}苯基)乙基]-3,4,5-三羟基氧杂环己烷-2-甲酸
实施例3A
三乙酸(2S,3S,4R,5S,6S)-2-(5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-((((3-((S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-8,10,11,13-四氢-7H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)二环[1.1.1]戊烷-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯乙基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基酯
向三乙酸(2S,3S,4R,5S,6S)-2-(5-((S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯乙基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基酯(如在WO2016094509中所述制备，2.99g)、实施例1G(1.35g)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(0.361g)在N,N-二甲基甲酰胺(26.5mL)中的混合物中加入N,N-二异丙基乙胺(1.39mL)。将混合物在环境温度搅拌4小时。将混合物在减压下浓缩并将残余物通过硅胶上的柱色谱法纯化，用0-8％的甲醇/二氯甲烷洗脱以产生标题化合物。1H NMR(501MHz,CDCl3)δppm 8.43(br s,1H),7.74(d,2H),7.61(br s,1H),7.57-7.46(d,4H),7.43(s,1H),7.38(t,3H),7.33-7.27(m,3H),6.43(br s,1H),6.17(s,2H),5.89(br s,1H),5.72(d,1H),5.37-5.02(m,8H),4.94(t,1H),4.67-4.56(m,1H),4.53-4.44(t,2H),4.19(br s,1H),4.00(d,2H),3.77(s,3H),3.48(dt,1H),2.94(d,1H),2.88-2.66(m,6H),2.16(br s,1H),2.08-1.97(m,9H),1.94-1.80(ddt,4H),1.45(d,3H),1.02(t,3H),0.98-0.90(m,6H)。MS(ESI+)m/z 1359.5(M+H)+。
实施例3B
(2S,3S,4R,5R,6S)-6-(5-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-2-((((3-((S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-8,10,11,13-四氢-7H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基)二环[1.1.1]戊烷-1-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯乙基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-甲酸
向实施例3A(3.2g)在甲醇(24mL)和四氢呋喃(24mL)中的溶液中加入在水(24mL)中的氢氧化锂一水合物(846mg)。将混合物在环境温度搅拌30分钟。将反应用三氟乙酸(3mL)淬灭，并用庚烷(5×30mL)萃取。将水层通过Teledyne Isco系统上的反相HPLC使用Luna柱(250×50mm,10mm)纯化，用5-75％的乙腈/水(含有0.1％三氟乙酸)历时30分钟洗脱，在冻干以后提供标题化合物。1H NMR(400MHz，二甲亚砜-d6)δppm 10.03(s,1H),8.62(d,1H),8.02(br s,4H),7.55(s,1H),7.43(s,1H),7.41(d,2H),7.35(s,1H),7.22(d,1H),7.16(s,1H),6.40(br s,1H),6.23(s,2H),5.35(s,2H),5.27(s,2H),4.97(s,2H),4.43(p,1H),3.60-3.47(m,3H),3.15-3.01(m,3H),2.90(t,1H),2.64(s,6H),2.00(tq,2H),1.79(hept,2H),1.60-1.46(m,1H),1.29(d,3H),0.89(dd,6H),0.80(t,3H)。MS(ESI+)m/z997.3(M+H)+。/>
实施例3C
(2S,3S,4R,5R,6S)-6-[2-(5-{[(2S)-2-({(2S)-2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺基]-3-甲基丁酰基}氨基)丙酰基]氨基}-2-{[({3-[(7S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氢-2H,10H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]二环[1.1.1]戊烷-1-基}氨基甲酰基)氧基]甲基}苯基)乙基]-3,4,5-三羟基氧杂环己烷-2-甲酸
向实施例3B(1.02g)在N,N-二甲基甲酰胺(16mL)中的溶液中加入2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(0.28g)，随后加入N,N-二异丙基乙胺(0.8mL)。将混合物在环境温度搅拌30分钟。将反应用乙酸(0.8mL)淬灭并通过GilsonPLC 2020系统上的反相HPLC使用Luna柱(250×50mm,10mm)纯化，用5-75％的乙腈/水(含有0.1％三氟乙酸)历时30分钟洗脱，在冻干以后提供标题化合物。1HNMR(501MHz，二甲亚砜-d6)δppm 9.90(s,1H),8.29-8.25(m,2H),8.11(s,1H),7.64(s,1H),7.51(s,1H),7.47(d,1H),7.42(s,1H),7.27(d,1H),7.23(s,1H),7.08(s,2H),6.30(s,2H),5.42(s,2H),5.36(s,2H),5.03(s,2H),4.38(p,1H),4.22(dd,1H),4.13(s,2H),3.58(d,2H),3.15(d,4H),2.97(t,1H),2.71(s,6H),2.10-1.93(m,2H),1.86(dp,2H),1.64-1.52(m,1H),1.31(d,3H),0.91-0.79(m,9H)。MS(ESI+)m/z 1134.3(M+H)+。
实施例4:细胞增殖
通过监测代谢活跃细胞的ATP存在来评估TOP1i药物对细胞活力的影响。使用CellTiter-发光对Calu-6细胞(肺腺癌)和A375细胞(恶性黑素瘤)的增殖进行定量。如在图2A和表1中所示，式I的化合物(实施例1G)表现出降低增殖中的Calu-6细胞(0.57nM，图2A)和A375(0.50nM，图2B)的活力的亚纳摩尔效力。这种亚纳摩尔效力比相同测定中TOP1i药物SN-38的性能有所改善，后者表现出6.58nM(Calu-6)和2.30nM(A375)的EC50。/>
实施例5:AbA的制备和纯化
在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达AbA，其重链和轻链序列分别为SEQ ID NO:9和10。在缀合前将AbA分离和纯化。
实施例6:缀合程序(ADC-1)
缀合步骤1
在还原之前，将抗-c-Met抗体AbA的溶液在4℃温育最少12小时。然后加入0.5M乙二胺四乙酸二钠盐溶液(EDTA,Sigma Aldrich)，最终浓度为5mM。将三(2-羧乙基)膦(TCEP,100mM,2.67摩尔当量,Bond BreakerTM,Thermo ScientificTM)加入溶液(大约10mg/mL在1XDPBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)中)中，温和搅拌板混合(225rpm)5分钟。在冰箱中在4℃温育17小时以后，在225rpm搅拌板混合下使溶液达到22℃。然后加入10％v/v N,N-二甲基乙酰胺(DMA,Sigma Aldrich)共溶剂，随后加入20％v/v的制备的1M硼酸，pH 8.0(SigmaAldrich)，然后逐滴加入在N,N-二甲基乙酰胺中的6摩尔当量的50mM接头药物LD1(结构式V，实施例1J)。在20分钟以后停止混合，并将溶液在22℃温育3.3小时。温育之后，将在1XDPBS中制备的2摩尔当量的50mM N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC,Sigma Aldrich)加入溶液中，并通过手动搅拌容器轻轻混合。在22℃温育1小时以后，将溶液使用691mL G25 FineDesalting(CytivaTM)柱脱盐到1X DPBS中。
缀合步骤2
在还原之前，将抗-c-Met抗体AbA的溶液在4℃温育最少12小时。然后加入0.5M乙二胺四乙酸二钠盐溶液(EDTA,Sigma Aldrich)，最终浓度为5mM。将三(2-羧乙基)膦(TCEP,100mM,1.00mol当量，Bond BreakerTM,Thermo ScientificTM)加入抗体溶液(大约4mg/mL在1X DPBS中)中，温和搅拌板混合(225rpm)5分钟。在冰箱中在4℃温育17小时以后，在225rpm搅拌板混合下使溶液达到22℃。然后加入10％v/v N,N-二甲基乙酰胺(DMA,SigmaAldrich)共溶剂，随后加入20％v/v 1M硼酸，pH 8.0(Sigma Aldrich)，然后逐滴加入在N,N-二甲基乙酰胺中的4摩尔当量的50mM接头药物LD1(结构式V，实施例1J)。在20分钟以后停止混合，并将溶液在22℃温育2.1小时。温育之后，将在1X DPBS中制备的2摩尔当量的10mMN-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC,SigmaAldrich)加入溶液中，并通过手动搅拌容器轻轻混合。在22℃温育5小时之后，将溶液浓缩，并通过超滤渗滤(UF/DF)进行缓冲液交换。
UF/DF步骤
将30.22m2盒(Millipore)用2L无菌水和然后0.5L配制缓冲液冲洗。以250mL/分钟的进料流速和12-13psi的跨膜压力(TMP)进行超滤(UF)，开始体积为1.3L。最终的渗透物体积为1.1L。以与UF步骤相同的进料流速和TMP，用25个透析体积(DV)的最终配制缓冲液进行渗滤(DF)。在DF之后，进行第二个UF步骤以进一步减少ADC溶液体积至100mL。除去ADC溶液，并将盒用125mL配制缓冲液冲洗两次，然后将其超滤至各20mL。然后将这些冲洗液加入主体ADC溶液中。在表征之前，将最终溶液用0.22μm过滤器无菌过滤。
实施例7:缀合程序(ADC-2)
在还原之前，将抗-c-Met抗体AbA的溶液在湿冰上温育35分钟。然后加入0.5M乙二胺四乙酸二钠盐溶液(EDTA,SigmaAldrich)，最终浓度为5mM。将三(2-羧乙基)膦(TCEP,25mM,3.50摩尔当量,Bond BreakerTM,Thermo ScientificTM)加入溶液(大约10mg/mL在1XDPBS中)中，并通过缓慢翻转试管数次来轻轻混合。然后将溶液置于湿冰上并置于4℃冰箱中24小时。温育之后，加入10％v/v N,N-二甲基乙酰胺共溶剂，然后加入在N,N-二甲基乙酰胺(DMA,SigmaAldrich)溶液中的10摩尔当量的10mM接头药物LD2(结构式VI，实施例2)，并通过缓慢翻转试管数次来轻轻混合。然后将溶液置于湿冰上30分钟，并在22℃温育90分钟。温育之后，将在PBS中制备的8摩尔当量的10mM N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC,SigmaAldrich)加入溶液中，并通过缓慢翻转试管数次来轻轻混合。在22℃温育60分钟以后，通过HiPrepTM26/10脱盐柱将溶液脱盐到1X DPBS(CytivaTM)中。然后通过添加制备好的10％v/v1M硼酸，pH 8.0(SigmaAldrich)和在22℃温育96小时，将脱盐的ADC水解。通过对脱盐色谱(2x 1mL HiTrap MabSelect SuRe,HiPrepTM26/10脱盐,CytivaTM)的偶联亲和力，将水解的ADC纯化到最终配制的1XDPBS中。在表征之前，将收集的级分合并并通过0.22μm过滤器无菌过滤。
实施例8:缀合程序(ADC-3)
将乙二胺四乙酸二钠盐水溶液(EDTA,0.5M,21.3μL,Sigma Aldrich)加入5.337mL的抗-c-Met抗体溶液(AbA,13.34mg/mL在1X DPBS中,pH 7.4)中。将三(2-羧乙基)膦(TCEP,10mM,3.0摩尔当量，142.4μL,Bond BreakerTM,Thermo ScientificTM)加入溶液中，轻轻搅拌，并在37℃保持75分钟。将溶液冷却至环境温度并加入接头-药物LD3(结构式VII，实施例3C)(10当量，527μL的10mM LD3溶液(结构式VII，实施例3C在N,N-二甲基乙酰胺中,90％纯度))。将缀合反应物轻轻搅拌并使其在环境温度静置1.2小时。将ADC溶液通过脱盐进行纯化。脱盐以后，将ADC溶液穿过0.22μm过滤器过滤并将所得样品在4℃储存。将所得ADC通过添加10％v/v 1.0M硼酸盐缓冲液，pH 8.0进行水解，并在环境温度在黑暗环境中温育72小时。水解以后，将所得ADC溶液通过吸附至蛋白A树脂柱(MabSelectTMSuReTMLX,GEHealthcare)进行纯化；用4个柱体积的1X DPBS(pH 7.4)洗涤；用5个柱体积的IgG洗脱缓冲液(Thermo ScientificTM)洗脱树脂；并脱盐至1X DPBS(pH 7.4)中。脱盐以后，将ADC溶液穿过0.22μm过滤器过滤并将所得样品在4℃储存。
实施例9:缀合程序(ADC-4)
将乙二胺四乙酸二钠盐水溶液(EDTA,0.5M,974μL,Sigma Aldrich)加入243.3mL纯化的MSL109-C6v1抗体溶液(12.3mg/mL在20mM Tris缓冲液中，pH 7.4)中。MSL109-C6v1是结合CMV糖蛋白H的单克隆抗体。MSL109-C6v1包含如SEQ ID NO:11所示的重链和如SEQID NO:12所示的轻链，并且被用作非靶向对照抗体。将三(2-羧乙基)膦(TCEP,500mM,6.0摩尔当量，242.4μL,Bond BreakerTM,Thermo ScientificTM)加入含有2mM EDTA的MSL109-C6v1溶液中，轻轻搅拌并在4℃保持20小时。将在4℃的Tris缓冲液(1.0M,pH 8.0)加入溶液(24.5mL,10％v/v)中。将接头-药物LD1(实施例1J,(2S)-2-(2-溴乙酰胺基)-N-[(2S)-1-({3-[(7S)-7-乙基-7-羟基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氢-2H,10H-[1,3]二氧杂环戊烯并[4,5-g]吡喃并[3’,4’:6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-14-基]二环[1.1.1]戊烷-1-基}氨基)-1-氧代丙烷-2-基]-3-甲基丁酰胺)加入还原的抗体，pH 8.0(10当量，22.5mL的10mM LD1溶液，结构式V，实施例1J，在N,N-二甲基乙酰胺中,90％纯度)中。将缀合反应物轻轻搅拌并使其在环境温度水浴中静置1.5小时。通过加入4当量的N-乙酰基-L-半胱氨酸水溶液(NAC,SigmaAldrich,100mM在1X DPBS中的溶液,0.8mL)淬灭缀合。将混合物轻轻搅拌并使其在环境温度静置1小时。加入Tris缓冲液(15％,Sigma,1.0M,pH 7.4,44mL)以将ADC溶液调至pH7.5。将ADC溶液在4℃储存过夜。将ADC溶液浓缩，并通过超滤渗滤(30.22m2盒(Millipore))进行缓冲液交换。将最终的ADC溶液穿过0.22μm过滤器过滤并将所得ADC样品在4℃储存。ADC的终体积为138mL。
实施例10:DAR(药物抗体之比)确定
通过LC-MS确定DAR。使用与Agilent LC/MSD TOF 6220ESI质谱仪连接的Agilent1100HPLC系统进行LC-MS分析。将ADC用5mM(终浓度)Bond-BreakerTMTCEP溶液(ThermoScientificTM,Rockford,IL)还原，加载到Protein Microtrap(Michrom Bioresources,Auburn,CA)脱盐柱上，并用10％B至75％B的梯度在环境温度在0.2分钟内洗脱。流动相A为含0.1％甲酸(FA)的H2O，流动相B为含0.1％FA的乙腈，并且流速为0.2mL/分钟。使用Agilent MassHunterTM采集软件获取共洗脱轻链和重链的电喷雾-电离飞行时间质谱图。使用MassHunterTM软件的最大熵特征对相对于m/z谱的提取的强度进行解卷积，以确定每个还原的抗体片段的质量。通过将轻链和重链的裸露峰和修饰峰的强度相加，将强度乘以附着的药物的数目来归一化，从解卷积的谱计算DAR。将求和的归一化强度除以强度的总和，两条轻链和两条重链的求和结果产生完整ADC的最终平均DAR值。可以通过电喷雾质谱法来监测生物缀合物的硫代琥珀酰亚胺水解，因为水向缀合物的添加导致缀合物的可观察分子量增加18道尔顿。
实施例11:体外细胞毒性测定
将肿瘤细胞在180μL含有10％FBS(胎牛血清)的生长培养基中以2000-5000个细胞/孔铺板于96-孔平板中，并在37℃和5％CO2下在保湿培养箱中培养。18至24小时后，加入20μL抗体或ADC的滴定液，并将细胞温育6天，除了HCC827、NCI-H820和HEK-293(5天)和MIAPaCa2(4天)。根据制造商的说明书，使用CellTiter-发光细胞活力测定(Promega)确定细胞活力。在所有测定中还包括非结合的、不相关的阴性对照ADC(ADC-4，结构式VIII，其中Ab是MSL109-C6v1)，以确认细胞杀死是抗原依赖性的。所有ADC具有大致相当的平均DAR。/>
实施例12:受体密度的确定
通过使用(Dako/Agilent)对培养的细胞上的细胞表面抗原进行间接免疫荧光染色来确定c-Met细胞表面密度(每个细胞的抗原结合能力)。简而言之，如上所述从培养瓶中收获细胞用于FACS(荧光活化的细胞分选)分析，以100μL/孔加入圆底96-孔平板中，并在4℃与3μg/mL c-Met抗体m224G11一起温育。用3μg/mL的相同同种型(mIgG1)的不相关小鼠单克隆抗体处理的孔被包括作为对照。与一级抗体一起温育一小时后，将细胞在300x g离心3分钟并用FACS缓冲液洗涤两次。对于/>珠的间接免疫荧光染色，将来自小瓶1(设置珠)和小瓶2(校准珠)的100μL重新悬浮珠加入单独的孔中，在300x g离心3分钟，并用FACS缓冲液洗涤一次。将所有孔在4℃与100μL抗-小鼠Alexa/>488缀合的抗体(Invitrogen，目录号A-11029)(在FACS缓冲液中1:250稀释)一起温育一小时。将细胞在300x g离心3分钟，用FACS缓冲液洗涤两次，并用100μL/孔的1％甲醛/PBS(磷酸盐缓冲盐水)固定。在BDTMLSRII流式细胞计上采集数据，记录5个珠群的几何平均值并用于根据每个珠的批次特异性抗体分子生成标准曲线。使用标准曲线将ABC(抗体结合能力或受体的数目)指派给染色的细胞样品。
结果
为了确定c-Met表达水平与对ADC-1的敏感性的潜在相关性，在体外增殖测定中测试了一组9种细胞系。FACS分析证实，这些细胞系具有一系列c-Met表达水平，如通过代表细胞表面c-Met分子数目的c-Met抗体结合能力进行量化的(表3)。将在细胞增殖测定中对ADC-1的敏感性量化为最大杀死和IC50(表3)。ADC-1抑制过表达c-Met的癌细胞的增殖，所述癌细胞包括扩增MET的细胞系(表3)。作为对比，未缀合的AbA抑制具有MET扩增的细胞(即，Hs 746T、SNU-5和EBC-1)的增殖(图3A-C)，但不抑制没有MET扩增并且其中ADC-1也具有活性的细胞系(即，NCI-H441、NCI-H1573、HCC827、NCI-H820和Calu-3)的增殖(图3D-H)。未缀合的AbA和ADC-1对低c-Met表达细胞HEK-293和MIA PaCa2都没有活性(表3，图3I和图3J)，表明存在ADC-1显著杀死所需的c-Met表达的阈值水平。
a通过FACS分析确定的细胞表面上的c-Met分子的大约数目，作为0.01mg/mL的m224GI I(AbA的鼠亲本)结合的抗体结合能力
bMax是在增殖测定中相对于未经处理的对照的最大下降百分比。
c由于曲线拟合问题进行估计
d与对照没有不同
end是指未确定
实施例13：靶向c-Met的TOP1i ADC抑制体内癌异种移植物的生长
细胞系Hs 746T和NCI-H441得自ATCC(美国典型培养物保藏中心)。根据供应商的推荐，将细胞在单层培养中维持最多3代。将2x106个细胞在培养基中的悬浮液(与混合(1:1，体积:体积))皮下注射到雌性C.B-17SCID小鼠的右胁腹中，以产生来自胃癌细胞系Hs 746T的异种移植物。为了从NSCLC细胞系生成异种移植物，将5x106个细胞在培养基中的NCI-H441悬浮液(与Matrigel混合(1:1，体积:体积))皮下注射到雌性SCID/bg小鼠中。当侧腹肿瘤的大小为约200mm3时开始治疗。
施用媒介物(0mg/kg)和四个剂量水平(剂量A-D，从最低到最高)。每只动物接受单次剂量。
图4A和4B显示ADC-1抑制作为异种移植物在免疫受损小鼠中生长的人NSCLC的生长。在以剂量C和剂量D施用一剂ADC-1以后显示稳健的生长抑制，在给药剂量B以后在Hs746T和NCI-H441异种移植物中出现中度肿瘤生长延迟。
实施例14:靶向c-MET的TOP1i ADC在体内抑制患者衍生的癌细胞的生长
通过在雌性免疫缺陷NOD/SCID小鼠(Charles River Laboratories)中皮下植入患者活检组织片段，在内部建立NSCLC患者衍生的异种移植物(PDX)模型LU450、LU120、LU572、LU123和LU413。一旦建立肿瘤，通过将肿瘤解离成细胞悬浮液来扩增PDX肿瘤细胞，并将在培养基中的5x 104个细胞与混合(1:1，体积:体积)，皮下注射到雌性NOD/SCID小鼠的乳房脂肪垫区域中。为了效力研究，将荷瘤小鼠随机分为治疗组，每组具有相等的平均肿瘤体积(130-200mm3)。通过腹膜内注射以六个剂量水平(剂量A-F，从最低到最高)作为单次剂量施用c-Met-ADC。将c-Met靶向效力与类似的媒介物施用进行对比。每周测量肿瘤体积一到两次，并通过绘制肿瘤体积(mm3)与时间的关系图以计算至肿瘤进展的时间(TTP)来评估效力。TTP(以天数表示)是单次剂量治疗以后肿瘤重新生长至治疗前(在随机分配时)两倍大小的时间。持久应答(治愈)的TTP指示为研究长度，在数字前面带有“>”符号。
10＝媒介物对照
具有根据结构式(VIII)的结构的ADC表现出改善的体内毒性。
/>
/>
/>
/>
序列表
<110> AbbVie Inc.
<120> 抗-c-Met抗体药物缀合物
<130> 397835-632WO
<160> 28
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr Thr
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
Ala Arg Ser Glu Ile Thr Thr Glu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4
Glu Ser Val Asp Ser Tyr Ala Asn Ser Phe
1 5 10
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
Arg Ala Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 6
Gln Gln Ser Lys Glu Asp Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Ile Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Ala Asn Ser Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Ile Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Cys His
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 10
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Ala Asn Ser Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 11
<211> 460
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
Glu Glu Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Ser Val Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Ser Asp Ser Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Ser Ile Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ser Tyr Tyr Ala Phe Ser Ser Gly Ser Leu Ser Asp
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ile Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
130 135 140
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
145 150 155 160
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
165 170 175
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
195 200 205
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
210 215 220
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
225 230 235 240
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
245 250 255
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
260 265 270
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
275 280 285
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
290 295 300
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
305 310 315 320
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
325 330 335
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
340 345 350
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
355 360 365
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
370 375 380
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
385 390 395 400
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
405 410 415
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
420 425 430
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
435 440 445
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 12
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Thr
20 25 30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Thr Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85 90 95
Leu Gln Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ala
210 215
<210> 13
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ser Leu Gly Glu Ser Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Glu Ile Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ala Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Ala Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 15
Gly Tyr Ile Phe Thr Ala Tyr Thr
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 16
Ile Lys Pro Asn Asn Gly Leu Ala
1 5
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 17
Ala Arg Ser Glu Ile Thr Thr Glu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
Glu Ser Val Asp Ser Tyr Ala Asn Ser Phe
1 5 10
<210> 19
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
Arg Ala Ser
1
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 20
Gln Gln Ser Lys Glu Asp Pro Leu Thr
1 5
<210> 21
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 21
atgggatggt cttggatctt tctgctgttt ctgtctggta ctgctggtgt gctgagccag 60
gtccagctgg tgcaatccgg cgcagaggtg aagaagccag gcgcttccgt gaaggtgagc 120
tgtaaggcct ctggctacat cttcacagca tacaccatgc actgggtgag gcaagctcct 180
gggcagggac tggagtggat gggatggatt aaacccaaca atgggctggc caactacgcc 240
cagaaattcc agggtagggt cactatgaca agggatacca gcatcagcac cgcatatatg 300
gagctgagca ggctgaggtc tgacgacact gctgtctatt attgcgccag gagcgaaatt 360
acaacagaat tcgattactg ggggcagggc accctggtga ccgtgtcctc tgccagcacc 420
aagggcccaa gcgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc 480
gccctgggct gcctggtgaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 540
ggagccctca cttctggagt tcataccttc ccagcagtat tgcagagcag tggcctgtat 600
tcactgtctt ccgtcgtaac agttccatcc tccagcctcg ggacacagac ttacatttgt 660
aacgtgaatc acaagcctag caacaccaag gtcgacaaga gagttgaacc aaagagttgt 720
gattgccact gtcctccctg cccagctcct gagctgcttg gcggtcccag tgtcttcttg 780
tttcccccta aacccaaaga caccctgatg atctcaagga ctcccgaggt gacatgcgtg 840
gtggtggatg tgtctcatga ggacccagag gtgaagttca actggtacgt ggacggcgtg 900
gaggtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggagcagt acaacagcac ctacagggtg 960
gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgtaag 1020
gtgtccaaca aggccctgcc agccccaatc gaaaagacca tcagcaaggc caagggccag 1080
ccaagagagc cccaggtgta caccctgcca cccagcaggg aggagatgac caagaaccag 1140
gtgtccctga cctgtctggt gaagggcttc tacccaagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200
agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc cagtgctgga cagcgacggc 1260
agcttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaagagca gatggcagca gggcaacgtg 1320
ttcagctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgagc 1380
ctgtccccag gctga 1395
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 22
ggctacatct tcacagcata cacc 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 23
attaaaccca acaatgggct ggcc 24
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 24
gccaggagcg aaattacaac agaattcgat tac 33
<210> 25
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 25
atggaaactg atacactgct gctgtgggtc ctgctgctgt gggtccctgg aagcacaggg 60
gacattgtga tgacccagtc tcccgatagc ctggccgtgt ccctgggcga gagggctacc 120
atcaactgta aaagctccga atctgtggac tcttacgcaa acagctttct gcactggtat 180
cagcaaaagc caggccaacc tccaaagctg ctgatttaca gggcttctac cagggagagc 240
ggcgtgcccg ataggttcag cggatctggc agcggcaccg actttacact gaccatctcc 300
agcctgcagg ccgaagatgt ggcagtctat tactgccagc agtccaagga ggaccccctg 360
actttcgggg gtggtactaa agtggagatc aagcgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 420
atcttccccc caagcgacga gcagctgaag agcggcaccg ccagcgtggt gtgtctgctg 480
aacaacttct accccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 540
ggcaacagcc aggagagcgt caccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 600
agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 660
acccaccagg gcctgtccag ccccgtgacc aagagcttca acaggggcga gtgctga 717
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 26
gaatctgtgg actcttacgc aaacagcttt 30
<210> 27
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 27
agggcttct 9
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 28
cagcagtcca aggaggaccc cctgact 27

Claims (7)

1.包含以下结构的抗-c-Met抗体药物缀合物：
其中n是1至10的整数，且其中Ab是包含重链可变区和轻链可变区的IgG1抗-c-Met抗体，
所述重链可变区包含：包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的重链CDR3结构域、包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的重链CDR2结构域和包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链CDR1结构域；且
所述轻链可变区包含：包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的轻链CDR3结构域、包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链CDR2结构域和包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的轻链CDR1结构域。
2.根据权利要求1所述的抗-c-Met抗体药物缀合物，其中所述抗体Ab包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗-c-Met抗体药物缀合物，其中所述抗体Ab包含重链和轻链，所述重链包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述轻链包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
4.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的抗-c-Met抗体药物缀合物。
5.治疗非小细胞肺癌的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用根据权利要求1-3所述的抗体-药物缀合物。
6.根据以下结构的化合物：
7.根据以下结构的化合物：
CN202280045959.XA 2021-04-29 2022-04-29 抗-c-Met抗体药物缀合物 Pending CN117693526A (zh)

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