KR20200061376A - 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘쥬게이트 - Google Patents

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유스케 오타
후미나오 도이
마사키 메구로
이치로 하야카와
신지 아시다
다케시 마스다
다카시 나카다
미츠히로 이와모토
나오야 하라다
도모코 데라우치
다이스케 오카지마
겐스케 나카무라
히로아키 우치다
히로후미 하마다
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다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 신규 항체-피롤로디아제핀 유도체 및 그것을 사용한 신규 항체-피롤로디아제핀 유도체 콘쥬게이트, 그리고 신규 CLDN6 및/또는 CLDN9 항체를 제공한다.

Description

항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 콘쥬게이트
본 발명은, 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 항체와 피롤로벤조디아제핀 유도체를 링커 구조 부분을 개재하여 결합시킨, 항종양약으로서 유용한 항체-약물 콘쥬게이트에 관한 것이다.
항체-약물 콘쥬게이트 (Antibody-Drug Conjugate ; ADC) 는, 암 세포 표면에 발현하고 있는 항원에 결합하고, 그 결합에 의해 항원을 세포 내에 내재화할 수 있는 항체에, 세포 상해 활성을 갖는 약물을 결합시킨 것이다. ADC 는, 암 세포에 효율적으로 약물을 송달할 수 있음으로써, 암 세포 내에 약물을 축적시켜, 암 세포를 사멸시키는 것을 기대할 수 있다.
ADC 로서 예를 들어, 항 CD30 모노클로날 항체에 모노메틸아우리스타틴 E 를 결합시킨 아드세트리스 (상표) (브렌툭시맙 베도틴) 가 호지킨 림프종과 미분화 대세포 림프종의 치료약으로서 인가되어 있다. 또, 항 HER2 모노클로날 항체에 엠탄신을 결합시킨 카드사일라 (상표) (트라스트주맙 엠탄신) 가 HER2 양성의 진행, 재발 유암의 치료에 이용되고 있다.
ADC 에 결합시키는 약물로서 유용한 것의 하나로 피롤로벤조디아제핀 (PBD) 을 들 수 있다. PBD 는 DNA 소구의 PuGPu 서열 등에 결합함으로써 세포 독성을 나타낸다. 천연 유래의 PBD 인 안트라마이신 (anthramycin) 은 1965년에 처음으로 발견되고, 그 이후 여러 가지 천연 유래, 또 그 유연체의 PBD 가 발견되었다 (비특허문헌 1 ∼ 4).
PBD 의 일반적인 구조식은 하기 식
[화학식 1]
Figure pct00001
으로 나타낸다. PBD 는 각각 A, C 고리부에 있어서 치환기의 수, 종류, 부위에 있어서 상이하고, 또, 각각 B, C 고리부의 불포화도가 상이한 것이 알려져 있다.
PBD 는 2 량체 구조로 함으로써, 비약적으로 세포 독성이 향상되는 것이 알려져 있고 (비특허문헌 5, 6), 2 량체 PBD 를 ADC 화한 것도 여러 가지 보고되어 있다 (특허문헌 1 ∼ 13). 그러나, C2 위치에 있어서 스피로 고리를 갖는 PBD 또는 그 ADC 체는 알려져 있지 않다.
인간 CLDN6 (Claudin-6, 이하 hCLDN6 으로 표기한다) 은, Claudin (CLDN) 패밀리 단백질의 일종이고, 220 아미노산 잔기로 이루어지는 4 회 막관통형의 막단백질이다. 이전부터, hCLDN6 은 일부의 암에 있어서 과잉 발현하여, 매력적인 암 치료 표적인 것이 시사되고 있다 (비특허문헌 7 ∼ 9). 또, CLDN 패밀리 단백질은 엔도사이토시스에 의해 세포 내에 흡수되고, 턴오버 시간이 짧은 패밀리 단백질도 보고되어 있으므로 (비특허문헌 10), 항체 약물 복합체 (ADC) 의 표적에 적합하다고 생각된다.
이와 같은 암과의 관련성을 시사하는 정보로부터, 지금까지 hCLDN6 을 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체가 발견되고 (특허문헌 14, 15), CLDN6 특이적인 모노클로날 항체에 튜불린 중합 저해약의 모노메틸오리스타틴 E (MMAE) 나 메이탄시노이드 (DM1) 를 결합시킨 ADC 가 보고되어 있다 (비특허문헌 11).
한편, 복수의 CLDN 패밀리를 인식하는 항체는 치료의 적응 범위를 넓힐 수 있는 가능성이 있다고 하여 CLDN6 과 CLDN9 를 인식하는 항체 (특허문헌 16) 에 강력한 살세포 효과를 갖는 피롤로벤조디아제핀 (PBD) 을 결합시킨 ADC 도 개시되어 있다 (특허문헌 17).
그러나, 그들의 활성의 강도는 아직 충분하지 않아, hCLDN6 을 치료 표적으로 하는 미충족 의료 요구가 존재하고 있다.
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본 발명은, 신규 항체-피롤로벤조디아제핀 (PBD) 유도체 콘쥬게이트 및 신규 피롤로벤조디아제핀 (PBD) 유도체를 제공하는 것이다.
본 발명은, 신규 항 CLDN6 항체를 제공하는 것이다.
또, 본 발명은, 항종양 활성을 갖는 상기 항체-PBD 유도체 콘쥬게이트, PBD 유도체 또는 항 CLDN6 항체를 함유하는 의약 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은, 상기 항체-PBD 유도체 콘쥬게이트, PBD 유도체 또는 항 CLDN6 항체를 사용한 암의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 예의 검토한 결과, 신규 항체-피롤로벤조디아제핀 (PBD) 유도체 콘쥬게이트가, 강한 항종양 활성을 갖는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.
즉 본원 발명은, 이하에 관한 것이다.
[1] 다음 식 :
[화학식 2]
Figure pct00002
(식 중, m1 은 1 내지 10 의 정수, 바람직하게는, 2 내지 8 의 정수) 을 나타내고,
Ab 는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 나타내고, 그 항체의 당사슬은 리모델링되어 있어도 되고,
L 은, Ab 와 D 를 연결하는 링커를 나타내고,
Ab 는 그 아미노산 잔기로부터 직접 L 에 결합하거나, Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬로부터 L 에 결합하고 있어도 되고,
D 는, 다음 식으로 나타내는 약물을 나타내고,
[화학식 3]
Figure pct00003
식 중, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고,
n1 은, 2 내지 8 의 정수를 나타내고,
A 는, 1 ∼ 4 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 또는 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리를 나타내고,
R1 및 R2 는, 각각 독립적으로, C1 ∼ C6 알콕시기, C1 ∼ C6 알킬기, 수소 원자, 수산기, 티올기, C1 ∼ C6 알킬티오기, 할로겐 원자 또는 -NR'R'' 를 나타내고,
여기서, R' 및 R'' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C6 알킬기를 나타내고,
R3, R4 및 R5 는, 하기 (i) ∼ (iii) 에서 선택되고,
(i) R3 및 R4 가 하나로 합쳐져, 각각의 기가 결합하는 탄소 원자와 함께 이중 결합을 형성하고,
R5 는, 군 1 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기 혹은 헤테로아릴기, 또는 군 2 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기를 나타낸다,
(ii) R3 은, 수소 원자를 나타내고,
R4 및 R5 가, R4 및 R5 가 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 혹은 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리 또는 CH2= 를 형성한다,
(iii) R3, R4 및 R5 가, R3 이 결합하고 있는 탄소 원자 그리고 R4 및 R5 가 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 군 3 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 벤젠 고리 또는 6 원의 복소 고리를 형성한다,
R6 및 R7 은, 함께 수소 원자를 나타내거나, R6 및 R7 이 하나로 합쳐져 이민 결합 (C=N) 인 것을 나타내고,
R8 은, 수산기 또는 C1 ∼ C3 알콕시기이며,
X 및 Y 는, 각각 독립적으로, 산소 원자, 질소 원자 또는 황 원자이며,
군 1 은, a) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알콕시기,
b) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자, 수산기, -OCOR', -NR'R'', -C(=NR')-NR''R''' 및 -NHC(=NR')-NR''R''' 에서 선택되는 어느 하나로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기,
c) 할로겐 원자,
d) C3 ∼ C5 시클로알콕시기,
e) C1 ∼ C6 알킬티오기,
f) -NR'R'',
g) -C(=NR')-NR''R''',
h) -NHC(=NR')-NR''R''',
i) -NHCOR', 또는
j) 수산기를 나타내고,
여기서, R' 및 R'' 는, 앞에서 정의한 바와 같고, R''' 는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C6 알킬기를 나타내고,
군 2 는, 할로겐 원자, 수산기, 또는 C1 ∼ C6 알콕시기를 나타내고, 그리고,
군 3 은, 할로겐 원자, 또는 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기 혹은 C1 ∼ C6 알콕시기를 나타낸다)
으로 나타내는 항체-약물 콘쥬게이트.
[2] A 가, 1 ∼ 2 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리를 나타내고,
R1 및 R2 가, 각각 독립적으로, C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내고,
R3 및 R4 가 하나로 합쳐져, 각각의 기가 결합하는 탄소 원자와 함께 이중 결합을 형성하고,
R5 가, 군 4 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기 혹은 헤테로아릴기, 또는 군 5 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기인 것을 나타내고,
X 및 Y 가 산소 원자이며,
군 4 는, a) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알콕시기,
b) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자, 수산기, -OCOR'', -C(=NR')-NR''R''', 및 -NHC(=NR')-NR''R''' 에서 선택되는 어느 하나로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기,
c) C3 ∼ C5 시클로알콕시기,
d) -C(=NR')-NR''R''',
e) -NHC(=NR')-NR''R''', 또는
f) 수산기를 나타내고,
여기서, R', R'', 및 R''' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기를 나타내고, 그리고,
군 5 는, 할로겐 원자, 수산기, 또는 C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내는, [1] 에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[3] A 가, 1 ∼ 2 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리를 나타내고,
R1 및 R2 가, 각각 독립적으로, C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내고,
R3 이, 수소 원자를 나타내고,
R4 및 R5 가, R4 및 R5 가 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 또는 =CH2 를 형성하고, 그리고,
X 및 Y 가 산소 원자인, [1] 에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[4] A 가, 1 ∼ 2 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리를 나타내고,
R1 및 R2 가, 각각 독립적으로, C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내고,
R3, R4 및 R5 가, R3 이 결합하고 있는 탄소 원자 그리고 R4 및 R5 가 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 군 6 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 벤젠 고리를 형성하고,
X 및 Y 가 산소 원자이며, 그리고,
군 6 은, 할로겐 원자, 또는 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기 혹은 C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내는, [1] 에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[5] D 가, 이하의 2 식 중 어느 것으로 나타내어지고,
[화학식 4]
Figure pct00004
식 중, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내는, [1] 또는 [2] 에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[6] D 가, 이하의 2 식 중 어느 것으로 나타내어지고,
[화학식 5]
Figure pct00005
식 중, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내는, [1] 또는 [3] 에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[7] L 이, -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-* 로 나타내어지고,
식 중, 아스테리스크는, D 와 결합하고 있는 것을 나타내고,
B 는, 페닐기 또는 헤테로아릴기를 나타내고,
Lp 는, 표적 세포에 있어서 절단 가능한 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 나타내고,
La 는, 이하의 군 :
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-C(=O)-, 및, -(CH2)n4-O-C(=O)-
에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
n2 는 1 ∼ 3 의 정수, n3 은 1 ∼ 5 의 정수, n4 는 0 ∼ 2 의 정수를 나타내고,
Lb 는, La 와 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬을 결합하는 스페이서를 나타내는, [1] ∼ [6] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[8] B 가, 1,4-페닐기, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기, 2,5-티에닐기에서 선택되는 어느 하나인, [7] 에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[9] B 가, 1,4-페닐기인, [8] 에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[10] Lp 가, 2 내지 7 개의 아미노산으로 구성되는 아미노산 잔기인, [7] ∼ [9] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[11] Lp 가, 글리신, 발린, 알라닌, 페닐알라닌, 글루탐산, 이소류신, 프롤린, 시트룰린, 류신, 세린, 리신 및 아스파르트산에서 선택되는 아미노산으로 이루어지는 아미노산 잔기인, [7] ∼ [10] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[12] Lp 가, 이하의 군 :
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG(D-)PI-, 및, -GGPL- 에서 선택되는, [7] ∼ [11] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[13] La 가, 이하의 군 :
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -CH2-OC(=O)-, 및, -OC(=O)-
에서 선택되는, [7] ∼ [12] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[14] Lb 가, 다음 식으로 나타내어지고,
[화학식 6]
Figure pct00006
[화학식 7]
Figure pct00007
, 또는,
[화학식 8]
Figure pct00008
상기에서 나타내는 Lb 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타내는, [7] ∼ [13] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[15] L 이, -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*
로 나타내어지고,
식 중, B 는, 1,4-페닐기이며,
Lp 는, 이하의 군 :
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, 및, -GGPL-
에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
La 는, 이하의 군 :
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -CH2-OC(=O)-, 및, -OC(=O)-
에서 선택되는 어느 하나를 나타내고, 그리고,
Lb 는, 다음 식으로 나타내어지고,
[화학식 9]
Figure pct00009
[화학식 10]
Figure pct00010
, 또는,
[화학식 11]
Figure pct00011
여기서, 상기에서 나타내는 Lb 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타내는, [7] ∼ [14] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[16] L 이, 이하의 군 :
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 및
-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- 에서 선택되고,
여기서, Z1 은, 이하의 구조식 :
[화학식 12]
Figure pct00012
을 나타내고,
Z2 는, 이하의 구조식 :
[화학식 13]
Figure pct00013
을 나타내고,
Z3 은, 이하의 구조식 :
[화학식 14]
Figure pct00014
을 나타내고,
여기서, Z1, Z2 및 Z3 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타내고, 그리고,
B 는, 1,4-페닐기를 나타내는, [7] ∼ [15] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[17] L 이, 이하의 군 :
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 및
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)- 에서 선택되고,
여기서, B 는 1,4-페닐기이며, Z1 은 이하의 구조식 :
[화학식 15]
Figure pct00015
을 나타내고,
여기서, Z1 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 Z1 에 인접하는 C(=O) 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타내는, [16] 에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[18] L 이, -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-* 로 나타내어지고,
식 중, 아스테리스크는, D 와 결합하고 있는 것을 나타내고,
B 는, 1,4-페닐기를 나타내고,
Lp 는, -GGVA-, 또는 -VA 를 나타내고,
La 는, -(CH2)n9-C(=O)-, 또는, -(CH2CH2)n10-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n11-CH2CH2-C(=O)- 를 나타내고,
n9 는 2 ∼ 7 의 정수, n10 은 1 ∼ 3 의 정수, n11 은 6 ∼ 10 의 정수를 나타내고,
Lb 는, -(숙신이미드-3-일-N)- 인, [1] ∼ [6] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[19] L 이, 이하의 군 :
-(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 및,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
에서 선택되는 어느 하나인 것을 나타내고,
여기서, B 는 1,4-페닐기인, [18] 에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[20] 항체가, IgG 인, [1] ∼ [19] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[21] 항체가, IgG1, IgG2 또는 IgG4 인, [20] 에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[22] 항체가, 종양 세포에 결합하고, 종양 세포 내에 흡수되어 내재화하는 것을 특징으로 하는, [1] ∼ [21] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[23] 항체가, 추가로 항종양 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, [22] 에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[24] 항체가, 항체의 Asn297 에 결합하는 당사슬 (N297 당사슬) 로부터 L 에 결합하고 있는, [1] ∼ [17], [20] ∼ [23] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[25] N297 당사슬이, 리모델링된 당사슬인, [24] 에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[26] N297 당사슬이, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 인, [24] 또는 [25] 에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트 :
[화학식 16]
Figure pct00016
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH- 를 나타내고, 여기서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
아스테리스크는, 상기 링커 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 10 의 정수를 나타낸다 ;
[화학식 17]
Figure pct00017
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH- 를 나타내고, 여기서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
아스테리스크는, 상기 링커 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 10 의 정수를 나타낸다 ; 그리고,
[화학식 18]
Figure pct00018
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH- 를 나타내고, 여기서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
아스테리스크는, 상기 링커 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
n5 는 2 ∼ 10 의 정수를 나타낸다.
[27] n5 가 2 ∼ 5 의 정수인, [26] 에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[28] 다음 식 :
[화학식 19]
Figure pct00019
(식 중, m2 는 1 또는 2 를 나타내고,
L 은, Ab 의 N297 당사슬과 D 를 연결하는 링커이고, 이하의 군 :
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 및
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
에서 선택되는 어느 하나의 링커이며,
여기서, B 는 1,4-페닐기이며, Z1 은 이하의 구조식 :
[화학식 20]
Figure pct00020
을 나타내고,
여기서, 상기에서 나타내는 Z1 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 Z1 에 인접하는 C(=O) 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 N297 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타내고,
Ab 는, IgG 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 나타내고,
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
[화학식 21]
Figure pct00021
[화학식 22]
Figure pct00022
[화학식 23]
Figure pct00023
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
N297 당사슬 중의 L(PEG) 는, -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)n5-* 를 나타내고,
여기서, n5 는 2 ∼ 5 의 정수인 것을 나타내고, 좌단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, 아스테리스크는, 상기 링커 L 에 있어서의 Z1 의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
D 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나이며,
[화학식 24]
Figure pct00024
여기서, 식 중, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
으로 나타내는 [25] ∼ [28] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[30] 다음의 군 :
[화학식 25]
Figure pct00025
[화학식 26]
Figure pct00026
[화학식 27]
Figure pct00027
[화학식 28]
Figure pct00028
에서 선택되고,
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 인 것을 나타내고,
Ab 는 IgG 항체 또는 그 기능성 단편인 것을 나타내고,
Ab 의 N297 당사슬은 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
[화학식 29]
Figure pct00029
[화학식 30]
Figure pct00030
[화학식 31]
Figure pct00031
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
N297 당사슬 중의 L(PEG) 는, -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-* 인 것을 나타내고,
여기서, 좌단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, 아스테리스크는, 각각의 구조식에 있어서의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 콘쥬게이트.
[30] CLDN6 및/또는 CLDN9 에 결합하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
[31] CLDN6 이 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 분자이며, CLDN9 가 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 분자인, [30] 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
[32] 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는 중사슬, 그리고 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는, [30] 또는 [31] 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
(a) 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 그리고, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3,
(b) 서열 번호 15 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 그리고, 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3.
[33] 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는 중사슬, 그리고 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는, [32] 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
(a) 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3,
(b) 서열 번호 15 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3.
[34] 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 포함하는, [30] ∼ [33] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
(a) 서열 번호 21 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(b) 서열 번호 25 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 23 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역.
[35] 이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및 (f) ∼ (k) 로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는, [30] ∼ [34] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
(a) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열,
(b) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열,
(c) 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열,
(d) (a) ∼ (c) 의 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열,
(e) (a) ∼ (c) 의 서열에 있어서의 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열,
(f) 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열,
(g) 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열,
(h) 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열,
(i) 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열,
(j) (f) ∼ (i) 의 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및
(k) (f) ∼ (i) 의 서열에 있어서의 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열.
[36] 이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 포함하는, [35] 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
(a) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(b) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(c) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(d) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역으로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및,
(e) 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역.
[37] 항체가 키메라 항체인, [30] ∼ [36] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
[38] 항체가 인간화 항체인, [30] ∼ [36] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
[39] 항체가, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 의 중사슬 정상 영역을 포함하는, [30] ∼ [38] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
[40] 이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 및 경사슬을 포함하는, [38] 또는 [39] 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
(a) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 36 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 (H1L1),
(b) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는, 중사슬 및 서열 번호 40 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 (H2L2),
(c) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 (H1L3),
(d) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 48 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 (H2L4), 및,
(e) 서열 번호 60 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 (H3L3).
[41] [32] ∼ [36] 및 [40] 중 어느 하나에 기재된 항체가 인식하는 항원 상의 부위에 결합하는, [30] 또는 [31] 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
[42] [32] ∼ [36] 및 [40] 중 어느 하나에 기재된 항체와, CLDN6 및/또는 CLDN9 에의 결합에 있어서 경합하는, [30] 또는 [31] 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
[43] [30] ∼ [42] 중 어느 1 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
[44] 이하의 (a) ∼ (j) 로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, [43] 에 기재된 폴리뉴클레오티드 :
(a) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
(b) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
(c) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
(d) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
(e) 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
(f) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 36 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
(g) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 40 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
(h) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
(i) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 48 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및,
(j) 서열 번호 60 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
[45] [43] 또는 [44] 중 어느 1 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터.
[46] [45] 에 기재된 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
[47] 숙주 세포가 진핵 세포인 [46] 에 기재된 숙주 세포.
[48] 숙주 세포가 동물 세포인 [47] 에 기재된 숙주 세포.
[49] [46] ∼ [48] 중 어느 하나에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적의 항체를 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, [30] ∼ [42] 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편의 제조 방법.
[50] [49] 에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
[51] N-결합형 당사슬 부가, O-결합형 당사슬 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 있어서의 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, 및 중사슬의 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 잔기의 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 포함하는, [30] ∼ [42] 및 [50] 중 어느 1 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
[52] 중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 수개의 아미노산 잔기가 결실하고 있는, [51] 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
[53] 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산 잔기가 결실하고 있는, [52] 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
[54] 중사슬의 카르복실 말단의 프롤린 잔기가 추가로 아미드화되어 있는, [50] ∼ [53] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
[55] 이하의 공정 :
i) [46] ∼ [48] 중 어느 하나에 기재된 숙주 세포를 배양하고, 얻어진 배양물로부터 목적의 항체를 채취하는 공정,
ii) 공정 i) 에서 얻어진 항체를 가수분해 효소로 처리하여, (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 제조하는 공정, 및,
iii)-1 MSG(9) 또는 SG(10) 의 시알산의 2 위치의 카르복실산의 카르보닐기에 아지드기를 갖는 PEG 링커를 도입하고, 환원 말단을 옥사졸린화하여 얻은 당사슬 도너 분자와, 당전이 효소 존재하에서 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 반응시키는 공정, 또는,
iii)-2 α-아미노기가 보호되어 있어도 되는 (MSG-)Asn 또는 (SG-)Asn 의 시알산의 2 위치의 카르복실산의 카르보닐기 및 상기 Asn 의 카르복실산의 카르보닐기에 아지드기를 갖는 PEG 링커를 도입해, 가수분해 효소를 작용시킨 후, 환원 말단을 옥사졸린화하여 얻은 당사슬 도너 분자와, 당전이 효소 존재하에서 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 반응시키는 공정을 포함하는, 당사슬 리모델링 항체의 제조 방법.
[56] 추가로, 공정 ii) 의 반응액을, 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제에 의해 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 정제하는 공정을 포함하는, [55] 에 기재된 제조 방법.
[57] 이하의 공정 :
i) [55] 또는 [56] 에 기재된 방법에 의해, 당사슬 리모델링 항체를 제조하는 공정, 및
ii) DBCO 를 갖는 드러그 링커 (제조 중간체) 를 공정 i) 에서 제조된 당사슬 리모델링 항체의 당사슬에 있어서의 아지드기와 반응시키는 공정을 포함하는, [1] ∼ [29] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트체의 제조 방법.
[58] [55] 또는 [56] 에 기재된 제조 방법으로 얻어지는 것을 특징으로 하는, 당사슬 리모델링 항체.
[59] [57] 에 기재된 제조 방법으로 얻어지는 것을 특징으로 하는, 항체-약물 콘쥬게이트.
[60] 다음의 군 :
[화학식 32]
Figure pct00032
[화학식 33]
Figure pct00033
[화학식 34]
Figure pct00034
, 또는,
[화학식 35]
Figure pct00035
에서 선택되고,
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 인 것을 나타내고,
Ab 는, [30] ∼ [42], [50] ∼ [54] 및 [58] 중 어느 하나에 기재된 항체 혹은 그 항체의 기능성 단편 또는 항 HER2 항체인 것을 나타내고,
Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
[화학식 36]
Figure pct00036
[화학식 37]
Figure pct00037
[화학식 38]
Figure pct00038
식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-* 인 것을 나타내고, 여기서, 좌단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, 아스테리스크는, 각각의 구조식에 있어서의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 콘쥬게이트.
[61] 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수가, 1 ∼ 3 또는 3 ∼ 5 인, [1] ∼ [29], [59] ∼ [60] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[62] 다음 식
[화학식 39]
Figure pct00039
(식 중, l 은, 2 내지 8 의 정수를 나타내고,
E 는, 1 ∼ 4 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리, 또는 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리를 나타내고,
R9 및 R10 은, 각각 독립적으로, C1 ∼ C6 알콕시기, C1 ∼ C6 알킬기, 수소 원자, 수산기, 티올기, C1 ∼ C6 알킬티오기, 할로겐 원자 또는 -NR'R'' 를 나타내고,
여기서, R' 및 R'' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C6 알킬기를 나타내고,
R11, R12 및 R13 은, 하기 (i) ∼ (iii) 에서 선택되고,
(i) R11 및 R12 가 하나로 합쳐져, 각각의 기가 결합하는 탄소 원자와 함께, 이중 결합을 형성하고,
R13 은, 군 7 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기 혹은 헤테로아릴기, 또는 군 8 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기를 나타낸다,
(ii) R11 은, 수소 원자를 나타내고,
R12 및 R13 이 하나로 합쳐져, 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 혹은 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리 또는 CH2= 를 형성한다, 또는,
(iii) R11 및 R12 가 하나로 합쳐져, 군 9 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 벤젠 고리 또는 6 원의 복소 고리를 형성하고,
R13 은, 단결합을 나타낸다,
R14 및 R15 는, 함께 수소 원자를 나타내거나, R14 및 R15 가 하나로 합쳐져, 이민 결합 (C=N) 인 것을 나타내고,
R16 및 R17 은, 하기 (a) 또는 (b) 를 나타내고,
(a) R16 및 R17 이 하나로 합쳐져, 이민 결합 (N=C) 을 형성한다,
(b) R16 은, J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*
식 중, 아스테리스크는, R16 에 인접하는 질소 원자에 결합하고 있는 것을 나타내고,
B' 는 페닐기 또는 헤테로아릴기를 나타내고,
Lp' 는, 표적 세포에 있어서 절단 가능한 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 나타내고,
La' 는, 이하의 군 :
-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-NH-(CH2CH2)n7-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n7-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n6-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n7-CH2CH2-C(=O)-, -(CH2)n8-O-C(=O)-,
-(CH2)n12-C(=O)-, 및, -(CH2CH2)n13-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n14-CH2CH2-C(=O)-
에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
여기서, 식 중, n6 은 1 ∼ 3 의 정수, n7 은 1 ∼ 5 의 정수, n8 은 0 ∼ 2 의 정수, n12 는 2 ∼ 7 의 정수, n13 은 1 ∼ 3 의 정수, n14 는 6 ∼ 10 의 정수를 나타내고,
J 는, 이하에서 나타내는 어느 하나를 나타내고,
[화학식 40]
Figure pct00040
여기서, 상기에서 나타내는 J 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La' 와 결합하고 있는 것을 나타내고,
R17 은, 수산기 또는 C1 ∼ C3 알콕시기인 것을 나타내고,
V 및 W 는, 각각 독립적으로, 산소 원자, 질소 원자, 또는 황 원자이며,
군 7 은, a) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알콕시기,
b) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자, 수산기, -OCOR', -NR'R'', -C(=NR')-NR''R''' 및 -NHC(=NR')-NR''R''' 에서 선택되는 어느 하나로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기,
c) 할로겐 원자,
d) C3 ∼ C5 시클로알콕시기,
e) C1 ∼ C6 알킬티오기,
f) -NR'R'',
g) -C(=NR')-NR''R''',
h) -NHC(=NR')-NR''R''',
i) -NHCOR', 또는
j) 수산기를 나타내고,
여기서, R' 및 R'' 는, 전술에서 정의한 바와 같고, R''' 는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C6 알킬기를 나타내고,
군 8 은, 할로겐 원자, 수산기, 또는 C1 ∼ C6 알콕시기를 나타내고, 그리고,
군 9 는, 할로겐 원자, 또는 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기 혹은 C1 ∼ C6 알콕시기를 나타낸다)
으로 나타내는 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
[63] E 가, 1 ∼ 2 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리를 나타내고,
R9 및 R10 이, 각각 독립적으로, C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내고,
R11 및 R12 가 하나로 합쳐져, 각각의 기가 결합하는 탄소 원자와 함께 이중 결합을 형성하고,
R13 이, 군 10 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기 혹은 헤테로아릴기, 또는 군 11 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기인 것을 나타내고,
V 및 W 가, 산소 원자이며,
군 10 은, a) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알콕시기,
b) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자, 수산기, -OCOR'', -C(=NR')-NR''R''', 및 -NHC(=NR')-NR''R''' 에서 선택되는 어느 하나로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기,
c) C3 ∼ C5 시클로알콕시기,
d) -C(=NR')-NR''R''',
e) -NHC(=NR')-NR''R''', 또는
f) 수산기를 나타내고,
여기서, R', R'', 및 R''' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기를 나타내고, 그리고,
군 11 은, 할로겐 원자, 수산기, 또는 C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내는, [62] 에 기재된 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
[64] E 가, 1 ∼ 2 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리를 나타내고,
R9 및 R10 이, 각각 독립적으로, C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내고,
R11 이, 수소 원자를 나타내고,
R12 및 R13 이, R12 및 R13 이 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 또는 CH2= 를 형성하고, 그리고,
V 및 W 가, 산소 원자인, [62] 에 기재된 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
[65] E 가, 1 ∼ 2 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리를 나타내고,
R9 및 R10 이, 각각 독립적으로, C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내고,
R11, R12 및 R13 이, R11 이 결합하고 있는 탄소 원자 그리고 R12 및 R13 이 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 군 12 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 벤젠 고리를 형성하고,
V 및 W 가, 산소 원자이며, 그리고,
군 12 는, 할로겐 원자, 또는 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기 혹은 C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내는, [62] 에 기재된 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
[66] B' 가, 1,4-페닐기, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기, 2,5-티에닐기에서 선택되는 어느 하나인, [62] ∼ [65] 중 어느 하나에 기재된 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물.
[67] B' 가, 1,4-페닐기인, [66] 에 기재된 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
[68] Lp' 가, 이하의 군 :
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG(D-)P-I-, 및 -GGPL- 에서 선택되는 아미노산 잔기인, [62] ∼ [67] 중 어느 하나에 기재된 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
[69] La' 가, 이하의 군 :
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -CH2-OC(=O)-, -OC(=O)-,
-(CH2)5-C(=O)-, 및, -CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-
에서 선택되는, [62] ∼ [68] 중 어느 하나에 기재된 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물.
[70] R16 이, J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*
로 나타내어지고,
식 중, B' 는, 1,4-페닐기이며,
Lp' 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, 및, -GGPL-,
La' 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -CH2-OC(=O)-, -OC(=O)-,
-(CH2)5-C(=O)-, 및, -CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-,
그리고,
J 는, 이하에서 나타내는 어느 하나를 나타내고,
[화학식 41]
Figure pct00041
여기서, J 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La' 와 결합하고 있는 것을 나타내는, [62] ∼ [69] 중 어느 하나에 기재된 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물.
[71] R16 이, 이하의 군 :
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J2-OC(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J4-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J4-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-, 및
J4-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-
에서 선택되고,
여기서, J1, J2, J3 및 J4 는, 이하의 구조식 :
[화학식 42]
Figure pct00042
을 나타내고,
여기서, J1, J2, J3 및 J4 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 인접하는 기와 결합하고 있는 것을 나타내고, 그리고,
B' 는, 1,4-페닐기인, [62] ∼ [70] 중 어느 하나에 기재된 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
[72] R16 이, 이하의 군 :
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(=O)-, J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J4-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-, 및,
J4-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-
에서 선택되고,
여기서, B' 는 1,4-페닐기이며,
J1, J4 는, 이하의 구조식 :
[화학식 43]
Figure pct00043
을 나타내고,
여기서, J1 및 J4 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 인접하는 기와 결합하고 있는 것을 나타내는, [62] ∼ [71] 중 어느 하나에 기재된 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물.
[73] 다음 식 :
[화학식 44]
Figure pct00044
으로 나타내는 어느 하나의 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물.
[74] 다음 식 :
[화학식 45]
Figure pct00045
으로 나타내는 어느 하나의 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물.
[75] D 는, 다음 식 :
[화학식 46]
Figure pct00046
으로 나타내는 [1] ∼ [29] 및 [59] ∼ [61] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[76] 다음 식 :
[화학식 47]
Figure pct00047
으로 나타내는 [62] ∼ [72] 및 [74] 중 어느 하나에 기재된 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물.
[77] D 는, 다음 식 :
[화학식 48]
Figure pct00048
으로 나타내는 [1] ∼ [29] 및 [59] ∼ [61] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트.
[78] 다음 식 :
[화학식 49]
Figure pct00049
으로 나타내는 [62] ∼ [72] 및 [74] 중 어느 하나에 기재된 하나의 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물.
[79] [1] ∼ [29], [59] ∼ [61], [75] 및 [77] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물, [30] ∼ [42], [50] ∼ [54] 및 [58] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 및, [62] ∼ [74], [76] 및 [78] 중 어느 하나에 기재된 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
[80] 항종양약인 것을 특징으로 하는, [79] 에 기재된 의약 조성물.
[81] 종양이 CLDN6 및/또는 CLDN9 가 발현하고 있는 종양인 것을 특징으로 하는, [80] 에 기재된 의약 조성물.
[82] 종양이 난소암 (표층 상피성 종양, 사이질성 종양, 배세포 종양), 폐암 (비소세포폐암, 소세포폐암), 위암, 자궁체암, 정소암 (세미노마, 비세미노마), 자궁경암, 정소암, 태반융모암, 신암, 요로상피암, 대장암, 전립선암, 다형신경교아종, 뇌종양, 췌암, 유암, 멜라노마, 간암, 방광암 또는 식도암인 것을 특징으로 하는, [80] 또는 [81] 에 기재된 의약 조성물.
[83] [1] ∼ [29], [59] ∼ [61], [75] 및 [77] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물, [30] ∼ [42], [50] ∼ [54] 및 [58] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 및, [62] ∼ [74], [76] 및 [78] 중 어느 하나에 기재된 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물에서 선택되는 어느 것을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 종양의 치료 방법.
[84] 종양이 CLDN6 및/또는 CLDN9 가 발현하고 있는 종양인 것을 특징으로 하는, [83] 에 기재된 종양의 치료 방법.
[85] 종양이, 난소암 (표층 상피성 종양, 사이질성 종양, 배세포 종양), 폐암 (비소세포폐암, 소세포폐암), 위암, 자궁체암, 정소암 (세미노마, 비세미노마), 자궁경암, 정소암, 태반융모암, 신암, 요로상피암, 대장암, 전립선암, 다형신경교아종, 뇌종양, 췌암, 유암, 멜라노마, 간암, 방광암 또는 식도암인 것을 특징으로 하는, [83] 또는 [84] 에 기재된 치료 방법.
[86] [1] ∼ [29], [59] ∼ [61], [75] 및 [77] 중 어느 하나에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물, [30] ∼ [42], [50] ∼ [54] 및 [58] 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 및, [62] ∼ [74], [76] 및 [78] 중 어느 하나에 기재된 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 의약 조성물, 및 적어도 하나의 항종양약을, 동시에, 따로따로 또는 연속하여 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 종양의 치료 방법.
[87] Table1 또는 Table2 에 기재된 것에 실질적으로 유사한 피크 위치를 갖는 프로톤 NMR 을 나타내는 화합물.
본 발명이 제공하는 신규 항체-피롤로벤조디아제핀 (PBD) 유도체 콘쥬게이트는 우수한 항종양 활성과 안전성을 가지므로, 항종양제로서 유용하다. 또, 본 발명의 PBD 유도체는 항종양 활성을 가져, 그 콘쥬게이트의 약물로서 유용하다. 또한, 본 발명의 항체는 종양 세포를 인식 또는 종양 세포에 결합하기 때문에, 그 콘쥬게이트의 항체로서 유용하다.
도 1 은 본 발명의 약물-콘쥬게이트체 ((I) 의 분자) 를 모식적으로 나타낸 것이다. (a) 는 약물 D, (b) 는 링커 L, (c) 는 N3-L(PEG)-, (d) 는 N297 당사슬 (여기서, 백색의 타원은 NeuAc(Sia), 백색의 육각형은 Man, 전부 칠한 육각형은 GlcNAc, 백색의 마름모꼴은 Gal, 및, 백색의 역삼각형은 Fuc) 을 각각 나타낸다. (b) 와 (c) 는 (c) 의 아지드기 (흑색의 눈물형) 와 (b) 의 스페이서 (백색의 반원) 에 있어서의 알킨 구조가 반응하여, 트리아졸 고리를 형성하여 결합하고 있다. Y 자형은, 항체 Ab 를 나타낸다. 또, 본 모식도에서는, N297 당사슬을 편의상 N297-(Fuc)MSG 로서 표시하고, N297 당사슬 각각의 일방의 분기 사슬에 있어서만 아지드기를 갖는 PEG 링커 (N3-L(PEG)-) 가 결합한 시알산을 갖고, 타방의 분기 사슬의 비환원 말단에 시알산을 가지지 않는 양태를 나타내고 있지만, N297-(Fuc)SG 를 채용함으로써, 양방의 분기 사슬의 비환원 말단에 아지드기를 갖는 PEG 링커가 결합한 시알산을 갖는 양태여도 된다. 이와 같은 표시 방법은, 특별히 언급이 없는 한, 본 명세서의 전체를 통해서 적용된다.
도 2 는 본 발명의 약물-콘쥬게이트체의 제조 중간체인, (Fucα1,6)GlcNAc-항체 (도 2 의 A 의 (II) 의 분자), 및, MSG 형 당사슬 리모델링 항체 (도 2 의 B 의 (III) 의 분자) 의 구조를 나타내는 모식도이다. 양방의 도면에 있어서, Y 자형은 도 1 과 동일하게 항체 Ab 를 나타낸다. 도 2 의 A 에 있어서, (e) 는 Fuc 의 1 위치와, 6 위치에 있어서 α 글리코사이드 결합한 GlcNAc 만으로 이루어지는 N297 당사슬을 나타낸다. 도 2 의 B 에 있어서, (d) 는 도 1 과 동일한 N297 당사슬을 나타내고, (f) 는, 아지드기를 갖는 PEG 링커 부분의 구조이며, 말단에 링커 L 과의 결합에 제공되는 아지드기를 나타낸다. 아지드기를 갖는 PEG 링커의 결합 양식은, 도 1 의 설명과 동일하다.
도 3 은 동물 세포로 산생된 항체로부터 MSG 형 당사슬 리모델링 항체를 제조하는 공정의 모식도이다. 도면 중의 분자 (II), (III) 은, 도 2 와 동일하게, (Fucα1,6)GlcNAc-항체 및 MSG 형 당사슬 리모델링 항체를 각각 나타낸다. (IV) 의 분자는 동물 세포로 산생된 항체이며, N297 당사슬이 불균일한 분자의 혼합물이다. 도 3A 는, (IV) 의 불균일한 N297 당사슬을, EndoS 와 같은 가수분해 효소로 처리함으로써, 균일한 (Fucα1,6)GlcNAc-항체 (II) 가 제조되는 공정을 나타낸다. 도 3B 는, 항체 (II) 의 N297 당사슬의 GlcNAc 에 대해, EndoS D233Q/Q303L 변이체와 같은 당전이 효소를 사용하여, MSG 형 당사슬 도너 분자의 당사슬을 당사슬 전이시킴으로써, (III) 의 MSG 형 당사슬 리모델링 항체가 제조되는 공정을 나타낸다. 여기서 사용되는 MSG 형 당사슬 도너 분자는, MSG 의 비환원 말단의 시알산이 아지드기를 갖는 PEG 링커로 수식된 것이며, 제조되는 MSG 형 N297 당사슬 리모델링 항체에 있어서도, 도 2B 에서 설명한 바와 같이, 비환원 말단의 시알산이 동일한 수식을 받은 것이 된다. 도 3B 에 있어서는, 편의상 도너 분자로서 MSG 를 표시하고 있지만, SG(10) 을 당사슬 도너로 함으로써, (III) 의 리모델링 항체는 N297 당사슬의 양방의 비환원 말단에 아지드기를 갖는 링커 분자가 결합한 당사슬 리모델링 항체가 합성된다.
도 4 는 피하 이식한 인간 위암주인 NCI-N87 세포에의 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC26, ADC19, ADC54 의 효과를 나타낸다.
도 5 는 피하 이식한 인간 위암주인 NCI-N87 세포에의 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49, 트라스트주맙 (Trastuzumab), 항 LPS 항체-약물 콘쥬게이트 ADC53 의 효과를 나타낸다.
도 6 은 피하 이식한 인간 유암주인 KPL-4 세포에의 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49, 항 LPS 항체-약물 콘쥬게이트 ADC53 또는 트라스트주맙-테시린 (Trastuzumab-Tesirine) (참고예 1) 의 효과를 나타낸다.
도 7 은 피하 이식한 인간 유암주인 JIMT-1 세포에의 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49, 또는 트라스트주맙-테시린 (참고예 1) 의 효과를 나타낸다.
도 8 은 피하 이식한 인간 난소암주인 OV-90 세포에의 항 CLDN6 항체-약물 콘쥬게이트 ADC40, 또는 항 CLDN6 항체 (H1L1)-테시린 (참고예 1) 의 효과를 나타낸다.
도 9 는 피하 이식한 인간 난소암주인 NIH : OVCAR-3 세포에의 항 CLDN6 항체-약물 콘쥬게이트 ADC40, 또는 항 CLDN6 항체 (H1L1)-테시린 (참고예 1) 의 효과를 나타낸다.
도 10 은 피하 이식한 인간 두경부암 세포주인 FaDu 세포에의 항체-약물 콘쥬게이트 항 TROP2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC50, 또는 항 LPS 항체-약물 콘쥬게이트 ADC53 의 효과를 나타낸다.
도 11 은 인간 CLDN6 의 전체 길이 아미노산 서열 (서열 번호 1) 및 전체 길이 cDNA 의 염기 서열 (서열 번호 2) 을 나타낸다.
도 12 는 인간 CLDN9 의 전체 길이 아미노산 서열 (서열 번호 3) 및 전체 길이 cDNA 의 염기 서열 (서열 번호 4) 을 나타낸다.
도 13 은 B1 항체 경사슬의 CDRL1 ∼ 3 의 아미노산 서열 (서열 번호 5 ∼ 7) 을 나타낸다.
도 14 는 인간화 B1 항체 경사슬 L4 의 CDRL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 8) 을 나타낸다.
도 15 는 B1 항체 중사슬의 CDRH1 ∼ 3 의 아미노산 서열 (서열 번호 9 ∼ 11) 을 나타낸다.
도 16 은 C7 항체 경사슬의 CDRL1 ∼ 3 의 아미노산 서열 (서열 번호 12 ∼ 14) 을 나타낸다.
도 17 은 C7 항체 중사슬의 CDRH1 ∼ 3 의 아미노산 서열 (서열 번호 15 ∼ 17) 을 나타낸다.
도 18 은 B1 항체 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 18) 및 B1 항체 경사슬의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 19) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 19 는 B1 항체 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 20) 및 B1 항체 중사슬의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 21) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 20 은 C7 항체 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 22) 및 C7 항체 경사슬의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 23) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 21 은 C7 항체 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 24) 및 C7 항체 중사슬의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 25) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 22 는 chB1 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 28) 및 chB1 경사슬의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 29) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 23 은 chB1 경사슬의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 30) 및 chB1 경사슬 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 31) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 24 는 chB1 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 32) 및 chB1 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 33) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 25 는 chB1 중사슬의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 34) 및 chB1 중사슬의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 35) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 26 은 인간화 항체 경사슬 hL1 의 아미노산 서열 (서열 번호 36) 및 인간화 항체 경사슬 hL1 을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 37) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 27 은 인간화 항체 경사슬 hL1 의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 38) 및 인간화 항체 경사슬 hL1 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 39) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 28 은 인간화 항체 경사슬 hL2 의 아미노산 서열 (서열 번호 40) 및 인간화 항체 경사슬 hL2 를 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 41) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 29 는 인간화 항체 경사슬 hL2 의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 42) 및 인간화 항체 경사슬 hL2 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 43) 을 나타낸다.
도 30 은 인간화 항체 경사슬 hL3 의 아미노산 서열 (서열 번호 44) 및 인간화 항체 경사슬 hL3 을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 45) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 31 은 인간화 항체 경사슬 hL3 의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 46) 및 인간화 항체 경사슬 hL3 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 47) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 32 는 인간화 항체 경사슬 hL4 의 아미노산 서열 (서열 번호 48) 및 인간화 항체 경사슬 hL4 를 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 49) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 33 은 인간화 항체 경사슬 hL4 의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 50) 및 인간화 항체 경사슬 hL4 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 51) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 34 는 인간화 항체 중사슬 hH1 의 아미노산 서열 (서열 번호 52) 및 인간화 항체 중사슬 hH1 을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 53) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 35 는 인간화 항체 중사슬 hH1 의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 54) 및 인간화 항체 중사슬 hH1 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 55) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 36 은 인간화 항체 중사슬 hH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 56) 및 인간화 항체 중사슬 hH2 를 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 57) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 37 은 인간화 항체 중사슬 hH2 의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 58) 및 인간화 항체 중사슬 hH2 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 59) 을 나타낸다.
도 38 은 인간화 항체 중사슬 hH3 의 아미노산 서열 (서열 번호 60) 및 인간화 항체 중사슬 hH3 을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 61) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 39 는 인간화 항체 중사슬 hH3 의 가변 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 62) 및 인간화 항체 중사슬 hH3 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 63) 을 나타낸다. 아미노산 서열에 있어서의 밑줄은 CDR 서열을 나타낸다.
도 40 은 B1 항체 및 C7 항체의 플로우 사이토메트리에 의한 인간 CLDN6 및 패밀리 분자 CLDN3, CLDN4, CLDN9 에 대한 결합능을 나타낸다.
도 41 은 B1 항체 및 C7 항체의 Mab-ZAP 에 의한 항체 내재화 활성능을 나타낸다.
도 42 는 인간화 항 CLDN6 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, 및 H3L3 의 플로우 사이토메트리에 의한 CLDN6 및 패밀리 분자에 대한 결합능을 나타낸다.
도 43 은 트라스트주맙 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 64) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 65) 을 나타낸다.
도 44 는 트라스트주맙 변이체의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 73) 및 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 75) 을 나타낸다.
도 45 는 인간 키메라화 항 CLDN6 항체 chB1 의 중사슬인 chB1_H, 인간화 항체 중사슬인 hH1, hH2 및 hH3 의 아미노산 서열의 비교를 나타내는 도면이다. 「·」 은 chB1_H 와 동일한 아미노산 잔기를 나타내고, 아미노산 잔기가 기재되어 있는 지점은 치환된 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 46 은 인간 키메라화 항 CLDN6 항체 chB1 의 경사슬인 chB1_L, 인간화 항체 경사슬인 hL1, hL2, hL3 및 hL4 의 아미노산 서열의 비교를 나타내는 도면이다. 「·」 은 chB1_L 과 동일한 아미노산 잔기를 나타내고, 아미노산 잔기가 기재되어 있는 지점은 치환된 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 47 은 피하 이식한 인간 유암주인 KPL-4 세포에의 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49 및 ADC55 의 효과를 나타낸다.
도 48 은 피하 이식한 인간 유암주인 JIMT-1 세포에의 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC55 의 효과를 나타낸다.
도 49 는 피하 이식한 인간 췌장암주인 CFPAC-1 세포에의 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49 및 ADC55, 항 LPS 항체-약물 콘쥬게이트 ADC53 의 효과를 나타낸다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트는, 종양 세포를 인식 또는 결합할 수 있는 항체에, 링커 구조 부분을 개재하여 항종양성 화합물을 결합시킨 항종양성 약물이다.
본 발명에 있어서 「할로겐 원자」로는, 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「C1 ∼ C6 알킬기」란, 탄소수 1 ∼ 6 의 직사슬, 분기 사슬의 알킬기를 의미한다. 「C1 ∼ C6 알킬기」로는, 예를 들어, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기, n-부틸기, i-부틸기, s-부틸기, t-부틸, n-펜틸기, n-헥실 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「C1 ∼ C6 알콕시기」란, 탄소수 1 ∼ 6 의 직사슬, 분기 사슬의 알킬기를 갖는 알콕시기를 의미한다. 「C1 ∼ C6 알콕시기」로는, 예를 들어, 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, i-프로폭시기, n-부톡시기, i-부톡시, s-부톡시기, n-펜틸옥시기, n-헥실옥시 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「C1 ∼ C6 알킬티오기」란, 탄소수 1 ∼ 6 의 직사슬, 분기 사슬의 알킬기를 갖는 알킬티오기를 의미한다. 「C1 ∼ C6 알킬티오기」로는, 예를 들어, 메틸티오기, 에틸티오기, n-프로필티오기, i-프로필티오기, n-부틸티오기, i-부틸티오기, s-부틸티오기, t-부틸티오기, n-펜틸티오기, n-헥실티오기 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리」란, 탄소수 3 ∼ 5 의 포화 고리형 탄화수소기를 의미한다. 「3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리」로는, 예를 들어, 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「C3 ∼ C5 시클로알콕시기」란, 탄소수 3 ∼ 5 의 포화 고리형 탄화수소기를 갖는 시클로알콕시기를 의미한다. 「C3 ∼ C5 시클로알콕시기」로는, 예를 들어, 시클로프로폭시기, 시클로부톡시기, 시클로펜틸옥시기를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리」란, 1,3-프로필렌옥사이드, 아자시클로부탄, 트리메틸렌술파이드, 테트라하이드로푸란, 피롤리딘 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「아릴기」란, 페닐기, 벤질기, 인데닐기, 나프틸기, 플루오레닐기, 안트라닐기, 페난트레닐기 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「헤테로아릴기」란, 티에닐기, 피롤릴기, 피라졸릴기, 트리아졸릴기, 옥사졸릴기, 옥사디아졸릴기, 티아졸릴기, 피리딜기, 피리미딜기, 피리다질기, 피라지닐기, 퀴놀릴기, 퀴녹살릴기, 벤조티오페닐기, 벤조이미다졸릴기, 벤조트리아졸릴기, 벤조푸라닐기 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「6 원의 복소 고리」란, 피리딘 고리, 피리미딘 고리, 피리다진 고리 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「스피로 결합의」란, 실시예에서 예시된 바와 같이, A 및 A 가 결합하는 피롤리딘 고리 또는 E 및 E 가 결합하는 피롤리딘 고리가 스피로 고리를 형성하는 것을 의미한다.
[항체-약물 콘쥬게이트]
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트는, 다음 식으로 나타낸다.
[화학식 50]
Figure pct00050
m1 은 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 결합수를 나타내고, Ab 는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 나타내고, L 은, Ab 와 D 를 연결하는 링커를 나타내고, D 는 약물을 나타낸다.
＜약물＞
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트에 결합되는 약물 D 에 대해 서술한다. 본 발명의 약물 D 는 항종양성 화합물인 것이 바람직하다. 본 항종양성 화합물은, 링커의 일부 또는 전부가 종양 세포 내에서 절단되어 항종양성 화합물 부분이 유리되어 항종양 효과가 발현된다. 링커가 약물과의 결합 부분에서 절단되면 항종양성 화합물이 본래의 구조에서 유리되고, 그 본래의 항종양 효과가 발휘된다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항종양성 화합물은, 일반식 (V)
[화학식 51]
Figure pct00051
로 나타내는 피롤로벤조디아제핀 유도체 (PBD 유도체) 이다. 이하에 설명한다.
아스테리스크는 링커 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다.
n1 은, 2 내지 8 의 정수를 나타내고, 바람직하게는 2 내지 6 의 정수이며, 보다 바람직하게는 3 내지 5 의 정수이다.
상기 n1 이 2 내지 8 의 정수, 바람직하게는 2 내지 6 의 정수이며, 보다 바람직하게는 3 내지 5 의 정수로 나타내는 알킬 사슬은 이중 결합을 포함하고 있어도 된다.
A 는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 또는 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리를 나타내고, 바람직하게는 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 (시클로프로판, 시클로부탄, 시클로펜탄) 이며, 보다 바람직하게는 시클로프로판, 시클로부탄이며, 가장 바람직하게는 시클로프로판이다.
상기 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리는 1 ∼ 4 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되고, 바람직하게는, 1 또는 2 개의 불소 원자로 치환되어 있어도 된다 (예를 들어, 2,2-디플루오로시클로프로판 등).
R1, R2 는, 각각 독립적으로, C1 ∼ C6 알콕시기, C1 ∼ C6 알킬기, 수소 원자, 수산기, 티올기, C1 ∼ C6 알킬티오기, 할로겐 원자 또는 -NR'R'' 를 나타내고, 바람직하게는, C1 ∼ C6 알콕시기, C1 ∼ C6 알킬기, 수산기이며, 보다 바람직하게는, C1 ∼ C3 알콕시기이며, 가장 바람직하게는, 메톡시기이다.
R3, R4 및 R5 는, 하기 (i) ∼ (iii) 을 나타낸다.
(i) R3 및 R4 는 하나로 합쳐져, 이하에 나타내는 바와 같이, 각각의 기가 결합하는 탄소 원자와 함께, 이중 결합을 형성하는 경우,
[화학식 52]
Figure pct00052
R5 는, 군 1 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기 또는 헤테로아릴기, 군 2 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기를 나타내고, 바람직하게는 상기 군 1 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기이다.
R5 의 「군 1 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기 또는 헤테로아릴기」 의 「아릴기」는, 바람직하게는, 페닐기, 나프틸기이며, 보다 바람직하게는 페닐기이다.
R5 의 「군 1 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기 또는 헤테로아릴기」 의 「헤테로아릴기」 는, 바람직하게는, 티에닐기, 피리딜기, 피리미딜기, 퀴놀릴기, 퀴녹살릴기, 벤조티오페닐기이며, 보다 바람직하게는, 2-티에닐기, 3-티에닐기, 2-피리딜기, 3-피리딜기, 4-피리딜기이며, 더욱 바람직하게는 3-피리딜기, 3-티에닐기이다.
상기 R5 의 아릴기 또는 헤테로아릴기의 치환기로는, 이하, a) ∼ j) 를 들 수 있다.
a) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알콕시기,
b) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자, 수산기, -OCOR', -NR'R'', -C(=NR')-NR''R''' 및 -NHC(=NR')-NR''R''' 에서 선택되는 어느 하나로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기,
c) 할로겐 원자,
d) C3 ∼ C5 시클로알콕시기,
e) C1 ∼ C6 알킬티오기,
f) -NR'R'',
g) -C(=NR')-NR''R''',
h) -NHC(=NR')-NR''R''',
i) -NHCOR'
j) 수산기
여기서, b), f) ∼ i) 에 있어서의 R', R'', 및 R''' 는 각각 독립적으로, 수소 원자, C1 ∼ C6 알킬기를 나타내고, 바람직하게는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기이다.
a) ∼ j) 는, 바람직하게는, 이하이다.
a) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알콕시기이며,
보다 바람직하게는, 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, i-프로폭시기, 트리플루오로메톡시기이며, 더욱 바람직하게는 메톡시기, 에톡시기, 트리플루오로메톡시기이며, 가장 바람직하게는 메톡시기이다.
b) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자, 수산기, -OCOR', -C(=NR')-NR''R''', -NHC(=NR')-NR''R''' 로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기이며, R', R'', 및 R''' 는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기이며, 보다 바람직하게는, 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자, 수산기, -OCOR', -C(=NR')-NR''R''', -NHC(=NR')-NR''R''' 에서 선택되는 어느 것으로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기이며, R', R'', 및 R''' 는 각각 독립적으로, 수소 원자, 메틸기이며, 더욱 바람직하게는, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기, 플루오로메틸기, 디플루오로메틸기, 트리플루오로메틸기, 하이드록시메틸기, -CH2OCOMe, -CH2-NHC(=NH)-NH2, -CH2-NHC(=NMe)-NH2 이다.
c) 할로겐 원자이며, 바람직하게는 불소 원자, 염소 원자이다.
d) C3 ∼ C5 시클로알콕시기이며, 보다 바람직하게는 시클로프로폭시기이다.
e) C1 ∼ C3 알킬티오기이며, 보다 바람직하게는 메틸티오기, 에틸티오기이다.
f) -NR'R'' 이며, R' 및 R'' 는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기이며, 보다 바람직하게는, -NH2, -NHMe, -NMe2, -NHEt, -NEt2 이다.
g) -C(=NR')-NR''R''' 이며, R', R'', 및 R''' 는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기이며, 보다 바람직하게는, -C(=NH)-NH2, -C(=NMe)-NH2 이다.
h) -NHC(=NR')-NR''R''' 이며, R', R'' 및 R''' 는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기이며, 보다 바람직하게는, -NHC(=NH)-NH2, -NHC(=NMe)-NH2 이다.
i) -NHCOR' 이며, R' 는, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기이며, 보다 바람직하게는, -NHCOMe, -NHCOEt 이며,
j) 수산기이다.
R5 의 아릴기 (바람직하게는, 페닐기) 또는 헤테로아릴기 (바람직하게는, 피리딜기) 의 치환기의 위치는 어디여도 되고, 치환기가 복수개인 경우에, 그것들이 동일해도 되고 상이해도 된다.
R5 가 아릴기인 경우의 치환기는, 바람직하게는, a), b), d), g), h), j), 보다 바람직하게는, a), b), d), j) 이다.
R5 가 페닐기인 경우, 치환기의 위치는 어디여도 되고, 치환기는 복수개 있어도 되지만, 바람직하게는, 치환기의 위치는 3 위치 또는/및 4 위치이며, 치환기는 1 개 또는 2 개이며, 보다 바람직하게는, 4 위치이며, 치환기는 1 개이다.
R5 가 나프틸기인 경우, 치환기의 위치는 어디여도 되고, 치환기는 복수개 있어도 되지만, 바람직하게는, 치환기의 위치는 6 위치이며, 치환기는 1 개이다.
R5 가 페닐기인 경우, 보다 바람직하게는, 페닐기, 4-메톡시페닐기, 3-메톡시페닐기, 4-에톡시페닐기, 4-(n-프로폭시)-페닐기, 4-(i-프로폭시)-페닐기, 4-시클로프로폭시-페닐기, 4-트리플루오로메틸페닐기, 4-하이드록시메틸-페닐기, 4-아세톡시메틸-페닐기, 4-카르밤이미드아미도메틸-페닐기이며, 더욱 바람직하게는, 페닐기, 4-메톡시페닐기, 3-메톡시페닐기, 4-시클로프로폭시-페닐기, 4-하이드록시메틸-페닐기, 4-아세톡시메틸-페닐기, 4-카르밤이미드아미도메틸-페닐기, 4-트리플루오로메틸페닐기이다.
R5 가 나프틸기인 경우, 보다 바람직하게는, 나프틸기, 6-메톡시-2-나프틸기이다.
가장 바람직하게는, 4-메톡시페닐기이다.
R5 가 헤테로아릴기인 경우의 치환기는, 바람직하게는, a), b), d), g), h), j), 보다 바람직하게는, a), b) 이다.
R5 가 헤테로아릴기인 경우, 치환기의 위치는 어디여도 되지만, 3-피리딜기인 경우, 바람직하게는, 6 위치 또는/및 5 위치이며, 2-피리딜인 경우, 바람직하게는, 5 위치 또는/및 4 위치, 또는 5 위치 또는/및 6 위치이며, 4-피리딜인 경우, 바람직하게는, 2 위치 또는/및 6 위치이다.
R5 가 헤테로아릴기인 경우의 치환기는 복수개 있어도 되지만, 바람직하게는, 1 개 또는 2 개이며, 바람직하게는 1 개이다.
R5 가 피리딜기인 경우, 바람직하게는, 6-메톡시-3-피리딜기, 6-메틸-3-피리딜기이다.
R5 가 3-티에닐기 또는 6-퀴녹살릴기인 경우, 바람직하게는, 무치환이다.
R5 의 「군 2 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기」 의 「C1 ∼ C6 알킬기」는, 바람직하게는, C1 ∼ C3 알킬기이며, 보다 바람직하게는, 메틸기, 에틸기이다.
R5 의 「군 2 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기」 의 치환기는, 할로겐 원자, 수산기, C1 ∼ C6 알콕시기 (바람직하게는, C1 ∼ C3 알콕시기) 이며, 바람직하게는, 수산기, 메톡시기, 에톡시기이며, 보다 바람직하게는, 수산기이다.
(ii) R3 이, 수소 원자를 나타내는 경우,
R4 및 R5 는, R4 및 R5 가 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 이하에 나타내는 바와 같이, 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 혹은 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리를 형성하거나, 또는 CH2= 를 형성한다.
[화학식 53]
Figure pct00053
, 또는,
[화학식 54]
Figure pct00054
상기 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리는 1 ∼ 4 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되고, 바람직하게는, 1 또는 2 개의 불소 원자로 치환되어 있어도 된다.
R4 및 R5 는 하나로 합쳐져, 바람직하게는 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 또는 CH2= 를 형성하고, 보다 바람직하게는 시클로프로판, 시클로부탄 또는 CH2= (엑소메틸렌기) 를 형성하고, 더욱 바람직하게는 시클로프로판이다.
R4 및 R5 는 하나로 합쳐져, 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 혹은 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리를 형성하는 경우, A 와 동일한 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 혹은 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, A 는 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리이며, R4 및 R5 는 하나로 합쳐져, 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리를 형성하고, 더욱 바람직하게는, A 는 시클로프로판 고리이며, R4 및 R5 는 하나로 합쳐져 시클로프로판 고리를 형성한다.
(iii) R3, R4 및 R5 가, R3 이 결합하고 있는 탄소 원자 그리고 R4 및 R5 가 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 군 3 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 벤젠 고리 또는 6 원의 복소 고리를 형성한다.
다음 식은, R3 및 R4 가 하나로 합쳐져, 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 벤젠 고리를 형성하는 경우를 나타낸다.
[화학식 55]
Figure pct00055
상기 벤젠 고리 또는 복소 고리의 치환기의 위치는 어디여도 되고, 치환기가 복수개인 경우에, 그것들이 동일해도 되고 상이해도 된다.
벤젠 고리 또는 복소 고리의 치환기는, 할로겐 원자, 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기 또는 C1 ∼ C6 알콕시기이며, 바람직하게는, 할로겐 원자, 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기 또는 C1 ∼ C3 알콕시이며, 보다 바람직하게는, 할로겐 원자, 메틸기, 메톡시기이다.
「1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 벤젠 고리 또는 6 원의 복소 고리」 는, 바람직하게는, 무치환의 벤젠 고리이다.
R3, R4 및 R5 는, 가장 바람직하게는, 상기 (i) 이다.
R6, R7 은, 함께 수소 원자를 나타내거나, R6 및 R7 이 하나로 합쳐져, 이민 결합 (C=N) 을 나타낸다.
R8 은, 수산기 또는 C1 ∼ C3 알콕시기이며, 바람직하게는, 수산기, 메톡시기이며, 보다 바람직하게는 수산기이다. R8 은, 아황산수소염 부가물 (OSO3M (M 은 금속 카티온이다)) 이어도 된다.
R8 은, 부제 탄소 원자에 결합하고 있으므로, 하기 부분 구조 (Va) 혹은 (Vb) 로 나타내는 입체 배치를 갖는다. 파선은 일반식 (V) 에 있어서의 Y 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다.
[화학식 56]
Figure pct00056
X, Y 는, 각각 독립적으로, 산소 원자, 질소 원자, 황 원자이며, 바람직하게는, 산소 원자이다.
본 발명의 약물 D 는, 바람직하게는, 다음의 군에서 선택되는 1 의 화합물이다.
[화학식 57]
Figure pct00057
,
[화학식 58]
Figure pct00058
[화학식 59]
Figure pct00059
＜링커 구조＞
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서 항종양성 약물을 항체에 결합하는 링커 구조에 대해 설명한다.
당해 링커 L 은, 다음 식 :
-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-*
로 나타낸다.
아스테리스크는 약물 D 의 N10' 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고, Lb 는, La 와 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬을 결합하는 스페이서, 또는 La 와 항체 Ab 의 아미노산 잔기 (예를 들어, 시스테인, 리신 등) 의 측사슬을 결합하는 스페이서를 나타낸다.
B 는, 페닐기 또는 헤테로아릴기를 나타내고, 바람직하게는, 1,4-페닐기, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기, 2,5-티에닐기이며, 보다 바람직하게는, 1,4-페닐기이다.
Lp 는, 생체 내 또는 표적 세포에 있어서 절단 가능한 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 나타낸다. Lp 는, 예를 들어, 에스테라아제나 펩티다아제 등의 효소의 작용에 의해, 절단된다.
Lp 는, 2 내지 7 개 (바람직하게는, 2 내지 4 개) 의 아미노산으로 구성되는 펩티드 잔기이다. 즉, 2 내지 7 개의 아미노산이 펩티드 결합한 올리고펩티드의 잔기에 의해 구성된다.
Lp 는, N 말단에 있어서 Lb-La- 의 La 의 카르보닐기에 결합하고, C 말단에 있어서 링커의 -NH-B-CH2-O(C=O)- 부분의 아미노기 (-NH-) 와 아미드 결합을 형성한다. 상기 에스테라아제 등의 효소에 의해, Lp 의 C 말단과 -NH- 간의 결합이 절단된다.
Lp 를 구성하는 아미노산은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, L- 또는 D-아미노산이며, 바람직하게는 L-아미노산이다. 또, α-아미노산 외에, β-알라닌, ε-아미노카프로산, γ-아미노부티르산 등의 구조의 아미노산이어도 되고, 나아가서는 예를 들어 N-메틸화된 아미노산 등의 비천연형의 아미노산이어도 된다.
Lp 의 아미노산 서열은, 특별히 한정되지 않지만, 구성하는 아미노산으로서, 글리신 (Gly ; G), 발린 (Val ; V), 알라닌 (Ala ; A), 페닐알라닌 (Phe ; F), 글루탐산 (Glu ; E), 이소류신 (Ile ; I), 프롤린 (Pro ; P), 시트룰린 (Cit), 류신 (Leu ; L), 세린 (Ser ; S), 리신 (Lys ; K) 및 아스파르트산 (Asp ; D) 등을 들 수 있다. 이들 중에서 바람직하게는, 글리신 (Gly ; G), 발린 (Val ; V), 알라닌 (Ala ; A), 시트룰린 (Cit) 이다.
이들 아미노산은 중복되어도 되고, 임의로 선택된 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 또, 아미노산의 종류에 의해, 약물 유리의 패턴을 컨트롤할 수 있다.
링커 Lp 의 구체예로서,
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG(D-)PI-, -GGPL-, -EGGVA, -PI-, -GGF-, DGGF-, (D-)D-GGF-, -EGGF-, -SGGF-, -KGGF-, -DGGFG-, -GGFGG-, -DDGGFG-, -KDGGFG-, -GGFGGGF-
를 들 수 있다.
여기서, 상기 『(D-)V』는 D-발린, 『(D-)P』 는 D-프롤린, 『(D-)D』 는 D-아스파르트산을 의미한다.
링커 Lp 는, 바람직하게는, 이하이다.
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG(D-)PI-, -GGPL-
링커 Lp 는, 보다 바람직하게는, 이하이다.
-GGVA-, -GGVCit-, -VA-
Lb 는, i) La 와 항체 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬을 결합하는 스페이서이거나 ii) La 와 항체 Ab 의 아미노산 잔기 (예를 들어, 시스테인, 리신 등) 의 측사슬을 결합하는 스페이서를 나타낸다.
Lb 가, i) 인 경우, La 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타낸다.
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-C(=O)-, -(CH2)n4-O-C(=O)-
여기서, 식 중, n2 는 1 ∼ 3 의 정수 (바람직하게는, 1 또는 2), n3 은 1 ∼ 5 의 정수 (바람직하게는, 2 ∼ 4 의 정수, 보다 바람직하게는, 2 또는 4), n4 는 0 ∼ 2 의 정수 (바람직하게는, 0 또는 1) 를 나타낸다.
Lb 가, i) 인 경우, La 는, 바람직하게는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -CH2-OC(=O)-, 및, -OC(=O)-
La 는, 보다 바람직하게는, -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, 또는, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)- 이다.
Lb 의 스페이서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 다음 식으로 나타내는 스페이서를 들 수 있다.
[화학식 60]
Figure pct00060
[화학식 61]
Figure pct00061
[화학식 62]
Figure pct00062
상기에서 나타내는 Lb 의 각각의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La 의 좌단의 -(C=O), 또는 -(CH2)n4 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타낸다.
상기에서 나타내는 Lb (Lb-1, Lb-2 또는 Lb-3) 의 각각의 구조식에 있어서, 아지드기와 DBCO 의 click reaction 으로 형성되는 트리아졸 고리 부위는, 기하 이성 구조를 갖고, 하나의 Lb 중에, 이들 2 종류의 구조 중 어느 일방, 또는, 그들의 혼합물로서 존재한다. 본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트 1 분자 중에는 m1 개의 『-L-D』가 존재하고, m1 개 각각의 『-L-D』에 있어서의 L 중의 각각의 Lb (Lb-1, Lb-2 또는 Lb-3) 는, 이들 2 종류의 구조 중 어느 일방, 또는, 그 양방이 혼재하고 있다.
Lb 가, i) 인 경우, L 은, 바람직하게는, -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-* 로 나타내고,
B 는, 1,4-페닐기이며,
Lp 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG(D-)PI-, -GGPL-
La 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -CH2-OC(=O)-, -OC(=O)-
Lb 는, 상기에서 나타내는 Lb 중 어느 구조식을 나타낸다.
Lb 가, i) 인 경우, L 은, 보다 바람직하게는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나이다.
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-
여기서, Z1 은, 상기 Lb 의 이하로 나타내는 구조식 :
[화학식 63]
Figure pct00063
을 나타내고, Z2 는, 상기 Lb 의 이하로 나타내는 구조식 :
[화학식 64]
Figure pct00064
을 나타내고, Z3 은 상기 Lb 의 이하로 나타내는 구조식 :
[화학식 65]
Figure pct00065
을 나타내고, B 는 1,4-페닐기이다.
L 은, 가장 바람직하게는, 이하 중 어느 것이다.
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 및
-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
여기서, B 는 1,4-페닐기이며, Z1 은 상기 Lb 의 이하로 나타내는 구조식 :
[화학식 66]
Figure pct00066
이다.
Lb 가, ii) 인 경우, 당해 아미노산 잔기가 시스테인 잔기인 경우, Lb 의 스페이서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, -(숙신이미드-3-일-N)- 를 들 수 있다.
『-(숙신이미드-3-일-N)-』 는, 다음 식
[화학식 67]
Figure pct00067
으로 나타내는 구조를 갖는다. 상기에서 나타내는 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La 와 결합하고 있는 것을 나타낸다. 파선은 항체의 시스테인 잔기의 티올기에 티올 결합을 개재하여 결합하고 있는 것을 나타내고, 부위 특이적 (Site specific) 인 시스테인 콘쥬게이션이어도 된다 (RSC Adv., 2017, 7, 24828-24832 etc).
Lb 가 ii) 인 경우, L 은 -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-* 로 나타내고,
B 는, 1,4-페닐기이고,
Lp 는, -GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, 또는 -GGFG- 중 어느 하나를 나타내고,
La 는, -(CH2)n9-C(=O)-, 또는
-(CH2CH2)n10-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n11-CH2CH2-C(=O)-
n9 는 2 ∼ 7 의 정수 (바람직하게는, 2 ∼ 5 의 정수, 보다 바람직하게는, 2 또는 5), n10 은 1 ∼ 3 의 정수(바람직하게는, 1), n11 은 6 ∼ 10 의 정수 (바람직하게는, 8) 를 나타내고,
Lb 는, -(숙신이미드-3-일-N)- 를 나타낸다.
Lb 가 ii) 인 경우, L 은, 바람직하게는, 이하 중 어느 것이다.
-(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 또는,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
여기서, B 는 1,4-페닐기이다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트는, 그 대부분이 종양 세포 내로 이행한 후에 링커 부분 (예를 들어, Lp) 이 효소 등에 의해 절단되어 활성화되면, 약물 D 부분이 유리되고 (이하, 유리 약물 (후기) 이라고 한다), 항종양 활성을 발휘한다고 생각된다.
따라서, 본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트는 종양 세포 외에서 안정적인 것이 바람직하다.
＜유리 약물 및 제조 중간체＞
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트의 중간체 및 유리 약물은, 다음 식
[화학식 68]
Figure pct00068
으로 나타낸다. 이하에 설명한다.
본 발명의 유리 약물은 종양 세포 내로 이행한 후, 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 링커 L 부분이 절단되어 생성된다. 예를 들어, 실시예 45 ∼ 54, 150 ∼ 152 의 약물 1 ∼ 16 을 들 수 있다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트는 본 제조 중간체를 사용하여 제작된다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 유리 약물은, (a) R16, R17 은, R16 및 R17 이 하나로 합쳐져, 이민 결합 (N=C) 을 형성하는 경우이다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 제조 중간체는, (b) R16 은, J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*
로 나타내는 경우이다.
따라서, 식 중, l 과 상기 n1, E 와 상기 A, R9 와 상기 R1, R10 과 상기 R2, R11 과 상기 R3, R12 와 상기 R4, R13 과 상기 R5, R14 와 상기 R6, R15 와 상기 R7, V 와 상기 X, W 와 상기 Y, 군 7 과 상기 군 1, 군 8 과 상기 군 2, 군 9 와 상기 군 3, 군 10 과 상기 군 4, 군 11 과 상기 군 5, 군 12 와 상기 군 6 은 동의이다.
l 은, 2 내지 8 의 정수를 나타내고, 바람직하게는 2 내지 6 의 정수이며, 보다 바람직하게는 3 내지 5 의 정수이다.
상기 l 이 2 내지 8 의 정수, 바람직하게는 2 내지 6 의 정수이며, 보다 바람직하게는 3 내지 5 의 정수로 나타내는 알킬 사슬은 이중 결합을 포함하고 있어도 된다.
E 는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 또는 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리를 나타내고, 바람직하게는 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 (시클로프로판, 시클로부탄, 시클로펜탄) 이며, 보다 바람직하게는 시클로프로판, 시클로부탄이며, 가장 바람직하게는 시클로프로판이다.
상기 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리는 1 ∼ 4 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되고, 바람직하게는, 1 또는 2 개의 불소 원자로 치환되어 있어도 된다 (예를 들어, 2,2-디플루오로시클로프로판 등).
R9, R10 은, 각각 독립적으로, C1 ∼ C6 알콕시기, C1 ∼ C6 알킬기, 수소 원자, 수산기, 티올기, C1 ∼ C6 알킬티오기, 할로겐 원자 또는 -NR'R'' 를 나타내고, 바람직하게는, C1 ∼ C6 알콕시기, C1 ∼ C6 알킬기, 수산기이며, 보다 바람직하게는, C1 ∼ C3 알콕시기이며, 가장 바람직하게는, 메톡시기이다.
R11, R12 및 R13 은, 하기 (i) ∼ (iii) 을 나타낸다.
(i) R11 및 R12 는 하나로 합쳐져, 각각의 기가 결합하는 탄소 원자와 함께, 이중 결합을 형성하는 경우,
R13 은, 군 7 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기 또는 헤테로아릴기, 군 8 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기를 나타내고, 바람직하게는 상기 군 7 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기이다.
R13 의 「군 7 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기 또는 헤테로아릴기」 의 「아릴기」는, 바람직하게는, 페닐기, 나프틸기이며, 보다 바람직하게는 페닐기이다.
R13 의 「군 7 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기 또는 헤테로아릴기」 의 「헤테로아릴기」는, 바람직하게는, 티에닐기, 피리딜기, 피리미딜기, 퀴놀릴기, 퀴녹살릴기, 벤조티오페닐기이며, 보다 바람직하게는, 2-티에닐기, 3-티에닐기, 2-피리딜기, 3-피리딜기, 4-피리딜기이며, 더욱 바람직하게는 3-피리딜기, 3-티에닐기이다.
상기 R13 의 아릴기 또는 헤테로아릴기의 치환기로는, 이하, a) ∼ j) 를 들 수 있다.
a) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알콕시기,
b) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자, 수산기, -OCOR', -NR'R'', -C(=NR')-NR''R''' 및 -NHC(=NR')-NR''R''' 에서 선택되는 어느 하나로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기,
c) 할로겐 원자,
d) C3 ∼ C5 시클로알콕시기,
e) C1 ∼ C6 알킬티오기,
f) -NR'R'',
g) -C(=NR')-NR''R''',
h) -NHC(=NR')-NR''R''',
i) -NHCOR',
j) 수산기
여기서, b), f) ∼ i) 에 있어서의 R', R'', 및 R''' 는 각각 독립적으로, 수소 원자, C1 ∼ C6 알킬기를 나타내고, 바람직하게는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기이다.
a) ∼ j) 는, 바람직하게는, 이하이다.
a) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알콕시기이며,
보다 바람직하게는, 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, i-프로폭시기, 트리플루오로메톡시기이며,
더욱 바람직하게는 메톡시기, 에톡시기, 트리플루오로메톡시기이며, 가장 바람직하게는 메톡시기이다.
b) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자, 수산기, -OCOR', -C(=NR')-NR''R''', -NHC(=NR')-NR''R''' 에서 선택되는 어느 것으로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기이며, R', R'', 및 R''' 는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기이며,
보다 바람직하게는, 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자, 수산기, -OCOR', -C(=NR')-NR''R''', -NHC(=NR')-NR''R''' 로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기이며, R', R'', 및 R''' 는 각각 독립적으로, 수소 원자, 메틸기이며,
더욱 바람직하게는, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, i-프로필기, 플루오로메틸기, 디플루오로메틸기, 트리플루오로메틸기, 하이드록시메틸기, -CH2OCOMe, -CH2-NHC(=NH)-NH2, -CH2-NHC(=NMe)-NH2 이다.
c) 할로겐 원자이며, 바람직하게는 불소 원자, 염소 원자이다.
d) C3 ∼ C5 시클로알콕시기이며, 보다 바람직하게는 시클로프로폭시기이다.
e) C1 ∼ C3 알킬티오기이며, 보다 바람직하게는 메틸티오기, 에틸티오기이다.
f) -NR'R'' 이며, R' 및 R'' 는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기이며,
보다 바람직하게는, -NH2, -NHMe, -NMe2, -NHEt, -NEt2 이다.
g) -C(=NR')-NR''R''' 이며, R', R'', 및 R''' 는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기이며,
보다 바람직하게는, -C(=NH)-NH2, -C(=NMe)-NH2 이다.
h) -NHC(=NR')-NR''R''' 이며, R', R'', 및 R''' 는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기이며,
보다 바람직하게는, -NHC(=NH)-NH2, -NHC(=NMe)-NH2 이다.
i) -NHCOR' 이며,
R' 는, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기이며,
보다 바람직하게는, -NHCOMe, -NHCOEt 이며,
j) 수산기이다.
R13 의 아릴기 (바람직하게는, 페닐기) 또는 헤테로아릴기 (바람직하게는, 피리딜기) 의 치환기의 위치는 어디여도 되고, 치환기가 복수개인 경우에, 그것들이 동일해도 되고 상이해도 된다.
R13 이 아릴기인 경우의 치환기는, 바람직하게는, a), b), d), g), h), j), 보다 바람직하게는, a), b), d), j) 이다.
R13 이 페닐기인 경우, 치환기의 위치는 어디여도 되고, 치환기는 복수개 있어도 되지만, 바람직하게는, 치환기의 위치는 3 위치 또는/및 4 위치이며, 치환기는 1 개 또는 2 개이며, 보다 바람직하게는, 4 위치이며, 치환기는 1 개이다.
R5 가 나프틸기인 경우, 치환기의 위치는 어디여도 되고, 치환기는 복수개 있어도 되지만, 바람직하게는, 치환기의 위치는 6 위치이며, 치환기는 1 개이다.
R13 이 페닐기인 경우, 보다 바람직하게는, 페닐기, 4-메톡시페닐기, 3-메톡시페닐기, 4-에톡시페닐기, 4-(n-프로폭시)-페닐기, 4-(i-프로폭시)-페닐기, 4-시클로프로폭시-페닐기, 4-트리플루오로메틸페닐기, 4-하이드록시메틸-페닐기, 4-아세톡시메틸-페닐기, 4-카르밤이미드아미도메틸-페닐기이며,
더욱 바람직하게는, 페닐기, 4-메톡시페닐기, 3-메톡시페닐기, 4-시클로프로폭시-페닐기, 4-하이드록시메틸-페닐기, 4-아세톡시메틸-페닐기, 4-카르밤이미드아미도메틸-페닐기, 4-트리플루오로메틸페닐기이다.
R13 이 나프틸기인 경우, 보다 바람직하게는, 나프틸기, 6-메톡시-2-나프틸기이다.
가장 바람직하게는, 4-메톡시페닐기이다.
R13 이 헤테로아릴기인 경우의 치환기는, 바람직하게는, a), b), d), g), h), j), 보다 바람직하게는, a), b) 이다.
R13 이 헤테로아릴기인 경우, 치환기의 위치는 어디여도 되지만, 3-피리딜기인 경우, 바람직하게는, 6 위치 또는/및 5 위치이며, 2-피리딜인 경우, 바람직하게는, 5 위치 또는/및 4 위치, 또는 5 위치 또는/및 6 위치이며, 4-피리딜인 경우, 바람직하게는, 2 위치 또는/및 6 위치이다.
R13 이 헤테로아릴기인 경우의 치환기는 복수개 있어도 되지만, 바람직하게는, 1 개 또는 2 개이며, 바람직하게는 1 개이다.
R13 이 피리딜기인 경우, 바람직하게는, 6-메톡시-3-피리딜기, 6-메틸-3-피리딜기이다.
R13 이 3-티에닐기 또는 6-퀴녹살릴기인 경우, 바람직하게는, 무치환이다.
R13 의 「군 8 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기」의 「C1 ∼ C6 알킬기」는, 바람직하게는, C1 ∼ C3 알킬기이며, 보다 바람직하게는, 메틸기, 에틸기이다.
R13 의 「군 8 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기」의 치환기는, 할로겐 원자, 수산기, C1 ∼ C6 알콕시기 (바람직하게는, C1 ∼ C3 알콕시기) 이며, 바람직하게는, 수산기, 메톡시기, 에톡시기이며, 보다 바람직하게는, 수산기이다.
(ii) R11 이, 수소 원자를 나타내는 경우,
R12 및 R13 은, R12 및 R13 이 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 혹은 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리를 형성하거나, 또는 CH2= 를 형성한다.
상기 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리는 1 ∼ 4 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되고, 바람직하게는, 1 또는 2 개의 불소 원자로 치환되어 있어도 된다.
R12 및 R13 은 하나로 합쳐져, 바람직하게는 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 또는 CH2= 를 형성하고, 보다 바람직하게는 시클로프로판, 시클로부탄 또는 CH2= (엑소메틸렌기) 를 형성하고, 더욱 바람직하게는 시클로프로판이다.
R12 및 R13 은 하나로 합쳐져, 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 혹은 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리를 형성하는 경우, E 와 동일한 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 혹은 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, E 는 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리이며, R12 및 R13 은 하나로 합쳐져, 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리를 형성하고, 더욱 바람직하게는, E 는 시클로프로판 고리이며, R12 및 R13 은 하나로 합쳐져 시클로프로판 고리를 형성한다.
(iii) R11, R12 및 R13 이, R11 이 결합하고 있는 탄소 원자 그리고 R12 및 R13 이 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 군 9 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 벤젠 고리 또는 6 원의 복소 고리를 형성한다.
상기 벤젠 고리 또는 복소 고리의 치환기의 위치는 어디여도 되고, 치환기가 복수개인 경우에, 그것들이 동일해도 되고 상이해도 된다.
벤젠 고리 또는 복소 고리의 치환기는, 할로겐 원자, 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기 또는 C1 ∼ C6 알콕시기이며, 바람직하게는, 할로겐 원자, 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기 또는 C1 ∼ C3 알콕시이며, 보다 바람직하게는, 할로겐 원자, 메틸기, 메톡시기이다.
「1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 벤젠 고리 또는 6 원의 복소 고리」는, 바람직하게는, 무치환의 벤젠 고리이다.
R11, R12 및 R13 은, 가장 바람직하게는, 상기 (i) 이다.
R14, R15 는, 함께 수소 원자를 나타내거나, R14 및 R15 가 하나로 합쳐져, 이민 결합 (C=N) 을 나타낸다.
V, W 는, 각각 독립적으로, 산소 원자, 질소 원자, 황 원자이며, 바람직하게는, 산소 원자이다.
R16, R17 은,
(a) R16, R17 은, R16 및 R17 이 하나로 합쳐져, 이민 결합 (N=C) 을 형성하거나, 또는,
(b) R16 은, J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-* 를 나타내고, R17 은, 수산기 또는 C1 ∼ C3 알콕시기로 나타낸다.
상기 (b) R16 이, J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-* 인 경우, 식 중, 아스테리스크는, 상기 식으로 나타내는 피롤로벤조디아제핀 고리의 N10' 위치에 결합하고 있는 것을 나타낸다.
B' 는, 페닐기 또는 헤테로아릴기를 나타내고, 바람직하게는, 1,4-페닐기, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기, 2,5-티에닐기이며, 보다 바람직하게는, 1,4-페닐기이다.
Lp' 는, 생체 내 또는 표적 세포에 있어서 절단 가능한 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 나타낸다. Lp 는, 예를 들어, 에스테라아제나 펩티다아제 등의 효소의 작용에 의해 절단된다.
링커 Lp' 의 구체예로서,
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG(D-)PI-, -GGPL-, -EGGVA, -PI-, -GGF-, DGGF-, (D-)D-GGF-, -EGGF-, -SGGF-, -KGGF-, -DGGFG-, -GGFGG-, -DDGGFG-, -KDGGFG-, -GGFGGGF- 를 들 수 있다.
여기서, 상기 『(D-)V』는 D-발린, 『(D-)P』는 D-프롤린, 『(D-)D』는 D-아스파르트산을 의미한다.
링커 Lp' 는, 바람직하게는, 이하이다.
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG(D-)PI-, -GGPL-
보다 바람직하게는, -GGVA-, -GGVCit-, -VA- 를 들 수 있다.
La' 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타낸다.
-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-NH-(CH2CH2)n7-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n7-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2)n6-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n7-CH2CH2-C(=O)-, -(CH2)n8-O-C(=O)-,
-(CH2)n12-C(=O)-, 및, -(CH2CH2)n13-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n14-CH2CH2-C(=O)-
여기서, 식 중, n6 은 1 ∼ 3 의 정수 (바람직하게는, 1 또는 2), n7 은 1 ∼ 5 의 정수 (바람직하게는, 2 ∼ 4 의 정수, 보다 바람직하게는, 2 또는 4), n8 은 0 ∼ 2 의 정수 (바람직하게는, 0 또는 1), n12 는 2 ∼ 7 의 정수 (바람직하게는, 2 ∼ 5 의 정수, 보다 바람직하게는, 2 또는 5), n13 은 1 ∼ 3 의 정수 (바람직하게는, 1), n14 는 6 ∼ 10 의 정수 (바람직하게는, 8) 를 나타낸다.
La' 는, 바람직하게는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -CH2-OC(=O)-, -OC(=O)-,
-(CH2)2-C(=O)-, -(CH2)5-C(=O)-, 및,
-CH2CH2-C(=O)-NH -(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-
La' 는, 보다 바람직하게는, -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-, 또는 -(CH2)5-C(=O)- 이다.
J 는, 아지드기와 반응하여, 1,2,3-트리아졸 고리를 형성하는 알킨 구조를 포함하는 고리형 구조이면, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 다음 식으로 나타내는 화합물을 들 수 있다.
[화학식 69]
Figure pct00069
상기에서 나타내는 J 의 각각의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La' 의 좌단의 -(C=O) 또는 -(CH2)n8 과 결합하고 있는 것을 나타낸다.
또는, J 는, 항체 Ab 의 아미노산 잔기 (예를 들어, 시스테인, 리신 등) 의 측사슬과 결합하는 화합물 또는 할로겐 원자여도 되고, 예를 들어, 다음 식으로 나타내는 말레이미딜기를 들 수 있다.
[화학식 70]
Figure pct00070
상기에서 나타내는 말레이미딜기에 있어서, 아스테리스크는 La' 의 좌단의 -(CH2)n12, 또는 -(CH2CH2)n13 과 결합하고 있는 것을 나타낸다.
R16 은, 바람직하게는, J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-* 로 나타내고,
B' 는, 1,4-페닐기이며,
Lp' 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
-GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG(D-)PI-, -GGPL-
La' 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -OC(=O)-, -CH2-OC(=O)-,
-(CH2)5-C(=O)-, 및, -CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-
J 는, 이하에서 나타내는 어느 구조식을 나타내고,
[화학식 71]
Figure pct00071
여기서, J 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La' 와 결합하고 있는 것을 나타낸다.
R16 은, 보다 바람직하게는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나이다.
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J2-OC(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-, J3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J4-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J4-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-, 및
J4-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-
여기서, J1, J2, J3, J4 는 이하에서 나타내는 구조식을 나타내고,
[화학식 72]
Figure pct00072
여기서, J1, J2, J3 및 J4 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 J1, J2, J3 또는 J4 에 인접하는 기와 결합하고 있는 것을 나타내고,
B' 는 1,4-페닐기이다.
R16 은, 가장 바람직하게는, 이하 중 어느 것이다.
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
J4-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-
여기서, B' 는 1,4-페닐기이며,
J1, J4 는 상기 J 의 이하에서 나타내는 구조식 :
[화학식 73]
Figure pct00073
여기서, J1 및 J4 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 J1 또는 J4 에 인접하는 기와 결합하고 있는 것을 나타낸다.
R17 은, 수산기 또는 C1 ∼ C3 알콕시기이며, 바람직하게는, 수산기, 메톡시기이다.
R17 은, 아황산수소염 부가물 (OSO3M (M 은 금속 카티온이다)) 이어도 된다.
R17 은, 부제 탄소 원자에 결합하고 있으므로, 하기 부분 구조 (VIa) 혹은 (VIb) 로 나타내는 입체 배치를 갖는다. 파선은 일반식 (VI) 으로 나타내는 중간체 및 유리 약물에 있어서의 W 와 결합하고 있는 것을 나타낸다.
[화학식 74]
Figure pct00074
유리 약물은, 바람직하게는, 다음의 군에서 선택되는 1 의 화합물이다.
[화학식 75]
Figure pct00075
본 유리 약물은, 링커 L 의 일부가 결합한 상태로 종양 세포 내에 있어서 유리하는 경우도 있지만, 이러한 상태여도 우수한 항종양 효과가 발휘되는 우수한 약물이다. 본 유리 약물은, 종양 세포로 이행한 후, 또한 산화되어 R16, R17 이 탈수 소하는 경우도 있지만, 이러한 상태여도 우수한 항종양 효과를 발휘한다.
제조 중간체는, 바람직하게는, 다음의 군에서 선택되는 1 의 화합물이다.
[화학식 76]
Figure pct00076
[화학식 77]
Figure pct00077
제조 중간체는, 바람직하게는, 다음의 군에서 선택되는 1 의 화합물이다.
[화학식 78]
Figure pct00078
[화학식 79]
Figure pct00079
[화학식 80]
Figure pct00080
[화학식 81]
Figure pct00081
＜항체＞
본 발명에 있어서, 「암」과「종양」은 동일한 의미로 사용하고 있다.
본 발명에 있어서, 「유전자」란, 단백질의 아미노산을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 뉴클레오티드 혹은 뉴클레오티드 서열, 또는 그 상보 사슬을 의미하고, 예를 들어, 단백질의 아미노산을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 뉴클레오티드 서열 또는 그 상보 사슬인 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, DNA, mRNA, cDNA, RNA 등은 「유전자」의 의미에 포함된다. 본 발명의 「CLDN6 유전자」로는, 예를 들어, CLDN6 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 포함되는 DNA, mRNA, cDNA, cRNA 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「뉴클레오티드」, 「폴리뉴클레오티드」 또는 「뉴클레오티드 서열」 과 「핵산」은 동의이며, 예를 들어, DNA, RNA, 프로브, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 프라이머 등도 「뉴클레오티드」또 는 「뉴클레오티드 서열」의 의미에 포함된다.
본 발명에 있어서는, 「폴리펩티드」, 「펩티드」, 「단백질」은 구별하지 않고 사용하고 있다.
본 발명에 있어서, 「CLDN6」은, CLDN6 단백질과 동일한 의미로 사용하고 있다.
본 발명에 있어서, 「세포」에는, 동물 개체 내의 세포, 배양 세포도 포함하고 있다.
본 발명에 있어서, 「세포 상해 활성」이란, 어떠한 형태로, 세포에 병리적인 변화를 일으키는 것을 말하고, 직접적인 외상뿐만 아니라, DNA 의 절단이나 염기의 2 량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하 등 일체의 세포의 구조나 기능상의 손상을 일으키는 것을 말한다.
본 발명에 있어서, 「항체의 기능성 단편」이란, 「항체의 항원 결합 단편」이라고도 불리고, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하고 있고, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, diabody, 선상 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이성 항체 등을 포함한다. 또, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 항원 결합 단편에 포함된다. 단, 항원과의 결합능을 가지고 있는 한 이들 분자로 한정되지 않는다. 또, 이들 항원 결합 단편에는, 항체 단백질의 전체 길이 분자를 적당한 효소로 처리한 것뿐만 아니라, 유전자 공학적으로 개편된 항체 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 단백질도 포함된다.
본 발명의 기능성 단편은, IgG 중사슬의 Fc 영역에 있어서 잘 보존된 N 결합형 당사슬에 의한 수식을 받는 아스파르트산 (Asn297) 및 그 주변의 아미노산을 보유하고, 또한 항원과의 결합능을 가지고 있는 기능성 단편을 포함한다.
본 발명에 있어서, 「에피토프」란, 특정 항체 (예를 들어, 항 CLDN6 항체) 가 결합하는 항원의 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조 (예를 들어, CLDN6 의 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조) 를 의미한다. 상기 부분 펩티드 (예를 들어, CLDN6 의 부분 펩티드) 인 에피토프는 면역어세이법 등 당업자에게는 잘 알려져 있는 방법에 의해, 결정할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「CDR」 이란, 상보성 결정 영역 (CDR : Complementarity determining region) 을 의미한다. 항체 분자의 중사슬 및 경사슬에는 각각 3 지점의 CDR 이 있는 것이 알려져 있다. CDR 은, 초가변 영역 (hypervariable region) 이라고도 불리고, 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 내에 있고, 1 차 구조의 변이성이 특히 높은 부위이며, 중사슬 및 경사슬의 폴리펩티드 사슬의 1 차 구조 상에 있어서, 각각 3 지점으로 분리되어 있다. 본 명세서 중에 있어서는, 항체의 CDR 에 대해, 중사슬의 CDR 을 중사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRH1, CDRH2, CDRH3 으로 표기하고, 경사슬의 CDR 을 경사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRL1, CDRL2, CDRL3 으로 표기한다. 이들 부위는 입체 구조 상에서 서로 근접하여, 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정하고 있다.
본 발명에 있어서, 「스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈한다」란, 시판되는 하이브리다이제이션 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (클론테크사) 중, 68 ℃ 에서 하이브리다이즈하는 것, 또는 DNA 를 고정한 필터를 사용하여 0.7-1.0 M 의 NaCl 존재하 68 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1-2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도 SSC 란 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨으로 이루어진다) 을 이용하여, 68 ℃ 에서 세정함으로써 동정할 수 있는 조건 또는 그것과 동등한 조건에서 하이브리다이즈하는 것을 말한다.
본 발명에 있어서, 「1 ∼ 수개」란, 1 ∼ 10 개, 1 ∼ 9 개, 1 ∼ 8 개, 1 ∼ 7 개, 1 ∼ 6 개, 1 ∼ 5 개, 1 ∼ 4 개, 1 ∼ 3 개 또는 1 ∼ 2 개를 의미한다.
본 발명에 있어서, CLDN6 혹은 CLDN6 및 CLDN9 를 인식하는 또는 결합하는 항체를, 각각 「항 CLDN6 항체」, 「항 CLDN6/CLDN9 항체」라고 표기하는 경우가 있다. 이러한 항체에는, 키메라화 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등이 포함된다. CLDN6 및 CLDN9 를 인식하는 또는 결합하는 항체를, 「항 CLDN6 항체」라고 표기하는 경우가 있다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트에 사용되는 항체는, 면역 글로불린을 의미하고, 항원과 면역 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자이다. 본 발명의 항체로서, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY 중 어느 클래스여도 되지만, IgG 가 바람직하다. 또, 서브 클래스로서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 중 어느 것이어도 되지만 IgG1, IgG2, IgG4 가 바람직하다. IgG1 또는 IgG4 를 사용하는 경우에는, 정상 영역의 아미노산 잔기의 일부를 치환함으로써, 이펙터 기능을 조정하는 것이 가능하다 (WO88/07089, WO94/28027, WO94/29351 참조).
항체는, 어느 종에서 유래해도 되지만, 바람직하게는, 인간, 래트, 마우스 및 토끼를 예시할 수 있다. 인간 이외의 종에서 유래하는 경우에는, 주지의 기술을 사용하여, 키메라화 또는 인간화하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체는, 폴리클로날 항체여도 되고, 모노클로날 항체여도 되지만, 모노클로날 항체가 바람직하다. 모노클로날 항체에는, 래트 항체, 마우스 항체, 토끼 항체 등의 비인간 동물 유래의 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 그들의 기능성 단편, 또는 그들의 수식체가 포함된다.
본 발명의 항체는, 바람직하게는 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 항체이다. 즉 항종양 활성을 갖는 약물을 링커를 개재하여 결합시키는 점에서, 항체로는, 종양 세포를 인식할 수 있는 특성, 종양 세포에 결합할 수 있는 특성, 종양 세포 내에 흡수되어 내재화하는 특성, 나아가서는 종양 세포를 상해하는 특성의 하나 또는 그 이상의 특성을 구비하고 있는 것이 바람직하다.
항체의 종양 세포에의 결합성은, 플로우 사이토메트리를 사용하여 확인할 수 있다. 종양 세포 내에의 항체의 흡수는, (1) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지) 를 사용하여 세포 내에 흡수된 항체를 형광 현미경으로 가시화하는 어세이 (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지) 를 사용하여 세포 내에 흡수된 형광량을 측정하는 어세이 (Molecular Biology of the Cell Vol. 15, 5268-5282, December 2004) 또는 (3) 치료 항체에 결합하는 이뮤노톡신을 사용하고, 세포 내에 흡수되면 독소가 방출되어 세포 증식이 억제된다는 Mab-ZAP 어세이 (Bio Techniques 28 : 162-165, January 2000) 를 사용하여 확인할 수 있다. 이뮤노톡신으로는, 디프테리아 독소의 촉매 영역과 프로테인 G 의 리콤비넌트 복합 단백질도 사용 가능하다.
본 발명에 있어서, 「높은 내재화능」이란, 당해 항체와 사포린 표지 항마우스 또는 래트 IgG 항체를 첨가한 표적 항원 발현 세포 (예를 들어, CLDN6 발현 세포) 의 생존률 (항체 미첨가 시의 세포 생존률을 100 ％ 로 한 상대율로 나타낸 것) 이, 바람직하게는 70 ％ 이하, 보다 바람직하게는 60 ％ 이하인 것을 의미한다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트는 항종양 효과를 발휘하는 화합물을 결합시키고 있으므로, 항체 자체가 항종양 효과를 갖는 것은, 바람직하지만, 필수는 아니다. 항종양성 화합물의 세포 상해성을 종양 세포에 있어서 특이적·선택적으로 발휘시킬 목적으로부터는, 항체가 내재화하여 종양 세포 내로 이행하는 성질을 갖는 것이 중요하고, 바람직하다. 항종양 효과의 발휘의 점에서는 항체가 내재화하여 종양 세포 내로 이행하는 성질을 갖는 것이, 약물에 의해 종양 세포를 특이적·선택적으로 상해를 주는 점에서 중요하고, 바람직하다. 항체의 항종양 활성은, 종양 세포에의 세포 상해 활성, 항세포 효과를 말한다. 공지된 in vitro 또는 In vivo 의 평가계를 사용하여, 항종양 활성을 확인할 수 있다.
이와 같은 항체로서, 종양 관련 항원에 대한 항체를 들 수 있고, 항 CLDN6 항체, 항 CLDN6/CLDN9 항체, 항 HER2 항체, 항 DLL3 (Delta like protein3) 항체, 항 A33 항체, 항 CanAg 항체, 항 CD19 항체, 항 CD20 항체, 항 CD22 항체, 항 CD30 항체, 항 CD33 항체, 항 CD56 항체, 항 CD70 항체, 항 CD98 항체, 항 TROP2 항체, 항 CEA 항체, 항 Cripto 항체, 항 EphA2 항체, 항 FGFR2 항체 (WO201315206 등), 항 G250 항체, 항 MUC1 항체 (WO2011012309 등), 항 GPNMB 항체, 항 Integrin 항체, 항 PSMA 항체, 항 Tenascin-C 항체, 항 SLC44A4 항체, 항 Mesothelin 항체, 항 EGFR 항체, 항 DR5 항체를 예시할 수 있지만 이것으로 한정되지 않는다.
본 발명의 항체로서, 바람직하게는, 항 CLDN6 항체, 항 CLDN6/CLDN9 항체, 항 HER2 항체, 항 CD98 항체, 항 TROP2 항체이며, 더욱 바람직하게는 항 CLDN6 항체, 항 HER2 항체 (예를 들어, 트라스트주맙, 트라스트주맙 변이체) 이다.
본 발명의 항체는, 이 분야에서 통상 실시되는 방법을 사용하여, 항원이 되는 폴리펩티드를 동물에 면역하고, 생체 내에서 산생되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. 항원의 유래는 인간으로 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 항원을 동물에 면역할 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 (異種) 항원에 결합하는 항체와 인간 항원의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.
또, 공지된 방법 (예를 들어, Nature (1975) 256, p.495-497, Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N. Y. (1980)) 에 따라, 항원에 대한 항체를 산생하는 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하여, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다 (후술).
또한, 항원은 항원 단백질을 코드하는 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 키메라 항체, 인간화 항체는 공지된 방법 (예를 들어, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81, 6851-6855, (1984), Nature (1986) 321, p.522-525, WO90/07861) 에 따라 취득할 수 있다.
항 HER2 항체 (미국 특허 제5,821,337호 등), 항 TROP2 항체 (WO2003/074566 등), 항 CD98 항체 (WO2015/146132 등) 는, 공지된 수단에 의해 취득할 수 있다.
이하에, 본 발명에 있어서 사용되는 항 CLDN6 항체에 대해 설명한다. 또한, 이하에 설명하는 실시형태는, 본 발명의 대표적인 실시형태의 일례를 나타낸 것이며, 이것에 의해 본 발명의 범위가 좁게 해석되는 일은 없다.
1. CLDN6 및 CLDN9
CLDN6 은, Claudin 패밀리에 속하는, 220 아미노산으로 이루어지는 4 회 막관통형의 단백질이며, N 말단 및 C 말단을 세포 내에 가진다.
인간 CLDN6 의 아미노산 서열 및 DNA 서열은 공적 데이터베이스상에 공개되어 있고, 예를 들어 NP_067018 (서열 번호 1 (도 11)), NM_021195 (서열 번호 2 (도 11) (모두 NCBI) 등의 액세션 번호에 의해 참조 가능하다.
인간 CLDN6 단백질의 아미노산 서열 (이하, 「CLDN6 아미노산 서열」) 에 대해, 세포 외 영역은, 서열표의 서열 번호 1 의 아미노산 번호 29 ∼ 81 로 이루어지는 세포 외 도메인 (EC1), 아미노산 번호 138 ∼ 160 으로 이루어지는 세포 외 도메인 (EC2) 으로 구성되어 있다.
CLDN9 는, Claudin 패밀리에 속하는, 217 아미노산으로 이루어지는 4 회 막관통형의 단백질이며, N 말단 및 C 말단을 세포 내에 가진다. CLDN9 는 CLDN6 과 높은 상동성을 가진다.
인간 CLDN9 의 아미노산 서열 및 DNA 서열은 공적 데이터베이스상에 공개되어 있고, 예를 들어 NP_066192 (서열 번호 3 (도 12)), NM_020982 (서열 번호 4 (도 12)) (모두 NCBI) 등의 액세션 번호에 의해 참조 가능하다.
2. 항 CLDN6 항체
본 발명의 항 CLDN6 항체의 일례로서, 서열표의 서열 번호 1 에 나타내는 CLDN6 의 N 말단으로부터 29 내지 81 번째의 아미노산 서열, 및 138 내지 160 번째의 아미노산 서열의 2 개의 세포 외 영역으로 이루어지는 고차 구조를 인식하고, 또한 내재화 활성을 갖는 항 CLDN6 항체를 들 수 있다.
본 발명의 항 CLDN6 항체는 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 항체이며, 즉 종양 세포를 인식할 수 있는 특성, 종양 세포에 결합할 수 있는 특성, 그리고 종양 세포 내에 흡수되어 내재화하는 특성 등을 구비하고 있다. 따라서, 본 발명의 항 CLDN6 항체와 항종양 활성을 갖는 화합물을, 링커를 개재하여 결합시켜 항체-약물 콘쥬게이트로 할 수 있다.
본 발명의 항 CLDN6 항체는 항종양 활성을 가지고 있어도 된다.
항 CLDN6 항체는, 이 분야에서 통상 실시되는 방법을 사용하여, 항원이 되는 폴리펩티드를 동물에 면역하고, 생체 내에서 산생되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. CLDN6 이 4 회 막관통형의 단백질인 점에서, 입체 구조를 유지한 단백질을 항원으로서 사용할 수 있고, 그러한 방법으로서, 세포 면역법을 들 수 있다.
또, 상기 공지된 방법에 따라, 항원에 대한 항체를 산생하는 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하여, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다.
이하, 구체적으로 CLDN6 에 대한 항체의 취득 방법을 설명한다.
1) 항원의 조제
CLDN6 은, 인간의 종양 조직 혹은 종양 세포로부터 직접 정제하여 사용하거나, 혹은 당해 세포의 세포막 획분을 조제하여 사용할 수 있다. 또, CLDN6 을 in vitro (예를 들어 로슈 다이아그노스틱스사 제조의 래피드 트랜슬레이션 시스템 (RTS)) 에서 합성하거나, 혹은 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다.
유전자 조작에서는, 구체적으로는, CLDN6 의 cDNA 를 발현 가능한 벡터에 삽입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 포함하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 다른 원핵생물 또는 진핵생물의 숙주 세포를 형질 전환하여 CLDN6 을 발현시킴으로써, 항원을 얻을 수 있다. 또, 상기 유전자 조작에 의한 CLDN6 발현 세포, 혹은 CLDN6 을 발현하고 있는 세포주를 CLDN6 단백질로서 사용할 수도 있다.
막단백질인 CLDN6 의 세포 외 영역과 항체의 정상 영역을 연결한 융합 단백질을 적절한 숙주·벡터계에 있어서 발현시킴으로써, 분비 단백질로서 항원을 얻을 수도 있다.
상기에 서술한 형질 전환체 자체를 항원으로서 사용할 수도 있다.
또한, CLDN6 을 발현하는 세포주를 항원으로서 사용할 수도 있다. 이와 같은 세포주로는, 인간 췌암 세포주 NOR-P1 세포, 인간 난소암주 NIH : OVCAR-3, OV-90, 또는 OAW28, 인간 난소 기형종 세포주 PA-1, 인간 간장암주 HuH-7, 인간 임신성 융모암주 JEG-3, 그리고 인간 다능성 태생기암주 NTERA-2 clone D1 을 들 수 있지만, CLDN6 을 발현하는 한, 이들 세포주로 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용하는 CLDN9 단백질도 동일하게 조제하여 사용할 수 있다.
2) 항 CLDN6 모노클로날 항체의 제조
본 발명에서 사용되는 항 CLDN6 항체는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 본원의 서열표에서 나타낸 아미노산 서열로 특정되는 항체를 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 사용되는 항 CLDN6 항체로는, 이하의 특성을 갖는 것이 바람직하다.
(1) 이하 (a) 및 (b) 의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 ;
(a) CLDN 패밀리를 인식 또는 결합한다.
본 발명의 항체는 CLDN 패밀리를 인식한다. 바꿔 말하면, 본 발명의 항체는 CLDN 패밀리에 결합한다. 본 발명의 항체는, 바람직하게는 CLDN6 에 결합하고, 보다 바람직하게는, CLDN6 에 특이적으로 결합한다. 또한, 본 발명의 항체는 CLDN9 를 인식하거나 또는 CLDN9 에 결합해도 된다.
본 발명에 있어서 「특이적인 인식」, 즉 「특이적인 결합」이란, 비특이적인 흡착이 아닌 결합을 의미한다. 결합이 특이적인지 여부의 판정 기준으로는, 예를 들어, 해리 정수 (Dissociation Constant : 이하, 「KD 라고 한다」) 를 들 수 있다. 본 발명의 바람직한 항체의 CLDN6 및/또는 CLDN9 에 대한 KD 값은 1 × 10 -5 M 이하, 5 × 10-6 M 이하, 2×10-6 M 이하 또는 1 × 10-6 M 이하, 보다 바람직하게는 5 × 10-7 M 이하, 2 × 10-7 M 이하 또는 1 × 10-7 M 이하이다.
본 발명에 있어서의 항원과 항체의 결합은, ELISA 법, RIA 법, Surface Plasmon Resonance (이하, 「SPR」이라고 한다) 해석법 등에 의해 측정 또는 판정할 수 있다. 세포 표면 상에 발현하고 있는 항원과 항체의 결합은, 플로우 사이토메트리법 등에 의해 측정할 수 있다.
(b) CLDN6 및/또는 CLDN9 와 결합함으로써 CLDN6 및/또는 CLDN9 발현 세포에 내재화하는 활성을 갖는다.
(2) CLDN6 및/또는 CLDN9 가 인간 CLDN6 및/또는 인간 CLDN9 인 상기 (1) 에 기재된 항체.
본 발명의 CLDN6 에 대한 항체의 취득 방법은, 통상, 하기와 같은 공정을 거치지만, 이것으로 한정되지 않는다.
(하이브리도마를 사용하는 방법)
(a) 항원으로서 사용하는 생체 고분자의 정제, 또는 항원 발현 세포의 조제, 및 당해 생체 고분자 또는 항원 발현 세포의 동물에의 투여,
(b) 면역 반응이 야기된 상기 서술한 동물로부터, 항체 산생 세포를 포함하는 조직 (예를 들어 림프절) 을 채취,
(c) 골수종 세포 (이하 「미엘로마」라고 한다) (예를 들어, 마우스 미엘로마 SP2/0-ag14 세포) 의 조제,
(d) 항체 산생 세포와 미엘로마의 세포 융합,
(e) 목적으로 하는 항체를 산생하는 하이브리도마군의 선별,
(f) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝),
(g) 경우에 따라서는, 모노클로날 항체를 대량으로 제조하기 위한 하이브리도마의 배양, 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육,
(h) 이와 같이 하여 제조된 모노클로날 항체의 생리 활성 (내재화 활성), 및 그 결합 특이성의 검토, 혹은 표지 시약으로서의 특성의 검정
여기서 사용되는 항체가의 측정법으로는, 예를 들어, 플로우 사이토메트리 또는 Cell-ELISA 법을 들 수 있지만 이들 방법으로 제한되지 않는다.
이와 같이 하여 취득된 모노클로날 항 CLDN6 항체의 예로는, 마우스 항 CLDN6 항체 B1 및 C7 을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서는, 당해 「B1」 을 「B1 항체」, 당해 「C7」 을 「C7 항체」로 표기하는 경우도 있다.
B1 항체의 중사슬 가변 영역의 염기 서열은, 서열표의 서열 번호 20 (도 19) 에, 아미노산 서열은 서열 번호 21 (도 19) 에 기재되어 있다. 또, B1 항체의 경사슬 가변 영역의 염기 서열은, 서열표의 서열 번호 18 (도 18) 에, 아미노산 서열은 서열 번호 19 (도 18) 에 기재되어 있다.
B1 항체의 CDRH1 의 아미노산 서열은 서열 번호 9 (도 15) 에, CDRH2 의 아미노산 서열은 서열 번호 10 (도 15) 에, CDRH3 의 아미노산 서열은 서열 번호 11 (도 15) 에, CDRL1 의 아미노산 서열은 서열 번호 5 (도 13) 에, CDRL2 의 아미노산 서열은 서열 번호 6 (도 13) 에, CDRL3 의 아미노산 서열은 서열 번호 7 (도 13) 에 기재되어 있다.
C7 항체의 중사슬 가변 영역의 염기 서열은, 서열표의 서열 번호 24 (도 21) 에, 아미노산 서열은 서열 번호 25 (도 21) 에 기재되어 있다. 또, C7 항체의 경사슬 가변 영역의 염기 서열은, 서열표의 서열 번호 22 (도 20) 에, 아미노산 서열은 서열 번호 23 (도 20) 에 기재되어 있다.
C7 항체의 CDRH1 의 아미노산 서열은 서열 번호 15 (도 17) 에, CDRH2 의 아미노산 서열은 서열 번호 16 (도 17) 에, CDRH3 의 아미노산 서열은 서열 번호 17 (도 17) 에, CDRL1 의 아미노산 서열은 서열 번호 12 (도 16) 에, CDRL2 의 아미노산 서열은 서열 번호 13 (도 16) 에, CDRL3 의 아미노산 서열은 서열 번호 14 (도 16) 에 기재되어 있다.
또한, 「항 CLDN6 항체의 제조」(a) ∼ (h) 의 공정을 재차 실시하여 별도로 독립적으로 모노클로날 항체를 취득한 경우나 다른 방법에 의해 별도로 모노클로날 항체를 취득한 경우에 있어서도, B1 항체 또는 C7 항체와 동등의 내재화 활성을 갖는 항체를 취득할 수 있다. 이와 같은 항체의 일례로서, B1 항체 또는 C7 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 들 수 있다. 새로 제작된 모노클로날 항체가, B1 항체 또는 C7 항체의 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 결합하면, 그 모노클로날 항체가 B1 항체 또는 C7 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 또, B1 항체 또는 C7 항체의 CLDN6 에 대한 결합에 대해 그 모노클로날 항체가 경합하는 (즉, 그 모노클로날 항체가, B1 항체 또는 C7 항체와 CLDN6 의 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 서열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 그 모노클로날 항체가 항 CLDN6 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 에피토프가 동일한 것이 확인된 경우, 그 모노클로날 항체가 B1 항체 또는 C7 항체와 동등의 항원 결합능, 생물 활성 및/또는 내재화 활성을 가지고 있는 것이 강하게 기대된다.
본 발명의 항체에는, 상기 CLDN6 에 대한 모노클로날 항체에 더하여, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 (Chimeric) 항체, 인간화 (Humanized) 항체, 인간 항체 등도 포함된다. 이들 항체는, 이미 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
(1) 키메라 항체
키메라 항체로는, 항체의 가변 영역과 정상 영역이 서로 이종인 항체, 예를 들어 마우스 또는 래트 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 접합한 키메라 항체를 들 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81, 6851-6855, (1984) 참조).
본 발명의 키메라 항체로서 예시되는 마우스 항인간 CLDN6 항체 B1 항체 유래의 키메라 항체는, 서열 번호 21 (도 19) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 서열 번호 19 (도 18) 에 나타내는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬을 포함하는 항체이며, 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.
마우스 항인간 CLDN6 항체 B1 항체 유래의 키메라 항체의 구체예로서, 마우스 항인간 CLDN6 항체 B1 항체 유래의 키메라 항체 chB1 항체 (이하, 「chB1」이라고도 기재한다.) 를 들 수 있다. chB1 항체의 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 32 (도 24) 의 20 ∼ 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 및 서열표의 서열 번호 28 (도 22) 의 21 ∼ 234 로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 경사슬을 포함하는 항체를 들 수 있다.
또한, 서열표의 서열 번호 32 (도 24) 에 나타내는 중사슬 서열 중에서, 1 ∼ 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이며, 20 ∼ 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 가변 영역이며, 142 ∼ 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 정상 영역이다. 또, 서열표의 서열 번호 28 (도 22) 에 나타내는 경사슬 서열 중에서, 1 ∼ 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이며, 21 ∼ 127 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 가변 영역이며, 128 ∼ 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 정상 영역이다.
chB1 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역의 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 34 (도 25), 서열 번호 30 (도 23) 에 기재되어 있다.
chB1 항체의 중사슬 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 33 (도 24) 에 나타내는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되고 있다. 서열표의 서열 번호 33 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 1 ∼ 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 chB1 항체 중사슬의 시그널 서열을 코드하고 있고, 서열표의 서열 번호 33 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 58 ∼ 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 chB1 항체의 중사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 서열표의 서열 번호 33 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 424 ∼ 1413 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 chB1 항체의 중사슬 정상 영역을 코드하고 있다.
chB1 항체의 중사슬 가변 영역의 염기 서열은 서열표의 서열 번호 35 (도 25) 에 기재되어 있다.
chB1 항체의 경사슬 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 29 (도 22) 에 나타내는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되고 있다. 서열표의 서열 번호 29 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 26 ∼ 85 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 chB1 항체 경사슬의 시그널 서열을 코드하고 있고, 서열표의 서열 번호 29 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 86 ∼ 406 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 chB1 항체의 경사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 서열표의 서열 번호 29 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 407 ∼ 727 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 chB1 항체의 경사슬 정상 영역을 코드하고 있다.
chB1 항체의 경사슬 가변 영역의 염기 서열은 서열표의 서열 번호 31 (도 23) 에 기재되어 있다.
(2) 인간화 항체
인간화 항체로는, 상보성 결정 영역 (CDR ; complementarity determining region) 만을 인간 유래의 항체에 삽입한 항체 (Nature (1986) 321, p.522-525 참조), CDR 이식법에 의해, CDR 의 서열에 더하여 일부의 프레임 워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식한 항체 (WO90/07861호), 또한, 항원에 대한 결합능을 유지하면서, 일부의 CDR 의 아미노산 서열을 개변한 항체를 들 수 있다.
단, B1 항체 또는 C1 항체 유래의 인간화 항체로는, B1 항체 또는 C1 항체의 6 종 모든 CDR 서열을 유지하고, CLDN6 결합 활성을 갖는 한, 특정 인간화 항체로 한정되지 않고, 또한 1 ∼ 수개 (바람직하게는, 1 ∼ 2 개, 보다 바람직하게는 1 개) 의 CDR 의 아미노산 서열을 개변한 인간화 항체 변이체도 CLDN6 단백질을 인식하는 한 또는 그 항체의 CLDN6 단백질 결합 활성을 갖는 한, 특정 인간화 항체로 한정되지 않는다.
본 발명의 항 CLDN6 인간화 항체 또는 그 기능성 단편으로는, 예를 들어,
서열표의 서열 번호 9 (도 15) 에 나타내는 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열의 1 ∼ 수개 (바람직하게는, 1 ∼ 2 개) 의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1,
서열표의 서열 번호 10 (도 15) 에 나타내는 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열의 1 ∼ 수개 (바람직하게는, 1 ∼ 2 개) 의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 및,
서열표의 서열 번호 11 (도 15) 에 나타내는 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열의 1 ∼ 수개 (바람직하게는, 1 ∼ 2 개) 의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 포함하는 가변 영역을 갖는 중사슬, 그리고,
서열표의 서열 번호 5 (도 13) 에 나타내는 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열의 1 ∼ 수개 (바람직하게는, 1 ∼ 2 개) 의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1,
서열표의 서열 번호 6 (도 13) 에 나타내는 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열의 1 ∼ 수개 (바람직하게는, 1 ∼ 2 개) 의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및,
서열표의 서열 번호 7 (도 13) 에 나타내는 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열의 1 ∼ 수개 (바람직하게는, 1 ∼ 2 개) 의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함하는 가변 영역을 갖는 경사슬을 포함하고,
본 발명의 CLDN6 단백질을 인식하는 또는 그 항체의 CLDN6 단백질 결합 활성을 유지하고 있는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 등을 들 수 있다.
상기 항 CLDN6 인간화 항체 또는 그 기능성 단편에 있어서의 CDR 의 아미노산 치환의 예로는, 바람직하게는, 상기 CDRL3 의 1 ∼ 수개 (바람직하게는, 1 ∼ 2 개) 의 아미노산 치환을 들 수 있고, 서열표의 서열 번호 7 의 아미노산 번호 4 번과 5 번의 아미노산을 치환한 서열표의 서열 번호 8 (도 14) 에 나타내는 CDRL3 을 예시할 수 있다.
상기 CDRH 를 갖는 인간화 항체의 중사슬 가변 영역으로서, 서열표의 서열 번호 54 (도 35) 에 나타내는 아미노산 서열, 서열표의 서열 번호 58 (도 37) 에 나타내는 아미노산 서열, 및 서열표의 서열 번호 62 (도 39) 에 나타내는 아미노산 서열을 예시할 수 있고, 상기 CDRL 을 갖는 인간화 항체의 경사슬 가변 영역으로서 서열표의 서열 번호 38 (도 27) 에 나타내는 아미노산 서열, 서열표의 서열 번호 42 (도 29) 에 나타내는 아미노산 서열, 서열표의 서열 번호 46 (도 31) 에 나타내는 아미노산 서열, 및 서열표의 서열 번호 50 (도 33) 에 나타내는 아미노산 서열을 예시할 수 있다.
상기, 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역의 조합을 포함하는 인간화 항체로서,
서열표의 서열 번호 54 (도 35) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열표의 서열 번호 38 (도 27) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체,
서열표의 서열 번호 58 (도 37) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열표의 서열 번호 42 (도 29) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체,
서열표의 서열 번호 54 (도 35) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열표의 서열 번호 46 (도 31) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체,
서열표의 서열 번호 58 (도 37) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열표의 서열 번호 50 (도 33) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체,
서열표의 서열 번호 62 (도 39) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및, 서열표의 서열 번호 46 (도 31) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체를 바람직하게 예시할 수 있다.
상기 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역의 조합을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체의 전체 길이 서열로서,
서열표의 서열 번호 52 (도 34) 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및, 서열표의 서열 번호 36 (도 26) 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체 (H1L1),
서열표의 서열 번호 56 (도 36) 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및, 서열표의 서열 번호 40 (도 28) 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체 (H2L2),
서열표의 서열 번호 52 (도 34) 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및, 서열표의 서열 번호 44 (도 30) 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체 (H1L3),
서열표의 서열 번호 56 (도 36) 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및, 서열표의 서열 번호 48 (도 32) 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체 (H2L4), 또는,
서열표의 서열 번호 60 (도 38) 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및, 서열표의 서열 번호 44 (도 30) 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 것으로 이루어지는 인간화 항체 (H3L3) 를 예시할 수 있다.
또한, 서열표의 서열 번호 52 (도 34), 56 (도 36), 또는 60 (도 38) 에 나타내는 중사슬 아미노산 서열 중에서, 1 ∼ 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이며, 20 ∼ 141 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 가변 영역이며, 142 ∼ 471 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 중사슬 정상 영역이다.
또, 서열표의 서열 번호 36 (도 26), 40 (도 28), 44 (도 30) 또는 48 (도 32) 에 나타내는 경사슬 아미노산 서열 중에서, 1 ∼ 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이며, 21 ∼ 127 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 가변 영역이며, 128 ∼ 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 경사슬 정상 영역이다.
상기 인간화 항체 H1L1 의 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 53 (도 34), 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 37 (도 26),
인간화 항체 H2L2 의 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 57 (도 36), 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 41 (도 28),
인간화 항체 H1L3 의 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 53 (도 34), 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 45 (도 30),
인간화 항체 H2L4 의 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 57 (도 36), 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 49 (도 32),
인간화 항체 H3L3 의 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 61 (도 38), 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 45 (도 30) 로 나타내는 폴리뉴클레오티드이다.
상기 인간화 항체 H1L1 의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 55 (도 35), 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 39 (도 27),
인간화 항체 H2L2 의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 59 (도 37), 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 43 (도 29),
인간화 항체 H1L3 의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 55 (도 35), 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 47 (도 31),
인간화 항체 H2L4 의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 59 (도 37), 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 51 (도 33),
인간화 항체 H3L3 의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 63 (도 39), 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은 서열 번호 47 (도 31) 로 나타내는 폴리뉴클레오티드이다.
또한, 서열표의 서열 번호 53 (도 34), 57 (도 36), 61 (도 38) 에 나타내는 각 뉴클레오티드 서열의 1 ∼ 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 그 인간화 항체 중사슬의 시그널 서열을 코드하고 있고, 58 ∼ 423 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 그 인간화 항체 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하고 있고, 424 ∼ 1413 번째의 염기 서열의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 그 항체 중사슬 정상 영역을 코드하고 있다.
또, 서열표의 서열 번호 37 (도 26), 41 (도 28), 45 (도 30), 49 (도 32) 에 나타내는 각 뉴클레오티드 서열의 1 ∼ 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 그 인간화 항체 경사슬의 시그널 서열을 코드하고 있고, 61 ∼ 381 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 그 인간화 항체 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하고 있고, 382 ∼ 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 그 항체 경사슬 정상 영역을 코드하고 있다.
상기 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역의 조합을 포함하는 것으로 이루어지는 항체, 또는, 상기 중사슬 및 경사슬의 조합을 포함하는 것으로 이루어지는 항체의 아미노산 서열과의 동일성 또는 상동성이 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 97 ％ 이상, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상인 항체도 CLDN6 에의 결합 활성을 갖는 한, 본 발명의 항체에 포함된다.
또, 상기 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역의 조합을 포함하는 것으로 이루어지는 항체, 또는, 상기 중사슬 및 경사슬의 조합을 포함하는 것으로 이루어지는 항체의 CDR 과 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 CDR 을 갖고, 또한 그 항체의 CDR 의 아미노산 서열을 제외한 아미노산 서열의 동일성 또는 상동성이 80 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 97 ％ 이상, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상인 항체도 CLDN6 에의 결합 활성을 갖는 한, 본 발명의 항체에 포함된다.
또한, 중사슬 또는 경사슬의 아미노산 서열에 1 ∼ 수개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 조합함으로써도, 상기 각 항체와 동등의 생물 활성을 갖는 항체를 선택할 수 있다. 또, 본 명세서 중에 있어서의 아미노산의 치환으로는 보존적 아미노산 치환이 바람직하다 (WO2013154206).
보존적 아미노산 치환이란, 아미노산 측사슬에 관련이 있는 아미노산 그룹 내에서 생기는 치환이다. 이러한 아미노산 치환은 원래의 아미노산 서열을 갖는 물질의 특성을 저하시키지 않는 범위에서 실시하는 것이 바람직하다.
2 종류의 아미노산 서열 간의 상동성은, Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), 「Gapped BLAST and PSI-BLAST : a new generation of protein database search programs」, Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402) 의 디폴트 파라미터를 사용함으로써 결정할 수 있다. Blast algorithm 은, 인터넷으로 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast 에 액세스함으로써도 사용할 수 있다.
(3) 인간 항체
본 발명의 항체로는, 또한, CLDN6 및/또는 CLDN9 에 결합하는, 인간 항체를 들 수 있다. 항 CLDN6 및/또는 CLDN9 인간 항체란, 인간 염색체 유래의 항체의 유전자 서열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항 CLDN6 인간 항체는, 인간 항체의 중사슬과 경사슬의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 산생 마우스를 사용한 방법 (Nature Genetics (1997) 16, p.133-143, ; Nucl. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448 ; Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects vol.10, p.69-73, Kluwer Academic Publishers, 1999. ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727 등을 참조.) 에 의해 취득할 수 있다.
이와 같은 인간 항체 산생 마우스는, 구체적으로는, 내재성 면역 글로불린 중사슬 및 경사슬의 유전자좌가 파괴되고, 대신에 효모 인공 염색체 (Yeast artificial chromosome, YAC) 벡터 등을 개재하여 인간 면역 글로불린 중사슬 및 경사슬의 유전자좌가 도입된 유전자 재조합 동물로서, 녹아웃 동물 및 트랜스제닉 동물의 제작 및 이들 동물끼리를 교배시킴으로써 만들어 낼 수 있다.
또, 유전자 재조합 기술에 의해, 그러한 인간 항체의 중사슬 및 경사슬의 각각을 코드하는 cDNA, 바람직하게는 그 cDNA 를 포함하는 벡터에 의해 진핵 세포를 형질 전환하고, 유전자 재조합 인간 모노클로날 항체를 산생하는 형질 전환 세포를 배양함으로써, 이 항체를 배양 상청 중에서 얻을 수도 있다.
여기서, 숙주로는 예를 들어 진핵 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 림프구나 미엘로마 등의 포유 동물 세포를 사용할 수 있다.
또, 인간 항체 라이브러리에서 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p.2301-2308 ; Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p.189-203 ; Ophthalmology (2002) 109 (3), p.427-431 등 참조.) 도 알려져 있다.
예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 1 개 사슬 항체 (scFv) 로서 파지 표면에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 파지 디스플레이법 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p.1105-1116) 을 사용할 수 있다.
항원에 결합함으로써 선택된 파지의 유전자를 해석하는 것에 의해, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다.
항원에 결합하는 scFv 의 DNA 서열이 밝혀지면, 당해 서열을 갖는 발현 벡터를 제작하고, 적당한 숙주에 도입하여 발현시킴으로써 인간 항체를 취득할 수 있다 (WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p.433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p.1105-1116).
이상의 방법에 의해 얻어진 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체 등은, 공지된 방법 등에 의해 항원에 대한 결합성을 평가하고, 바람직한 항체를 선발할 수 있다.
항체의 성질을 비교할 때의 다른 지표의 일례로는, 항체의 안정성을 들 수 있다. 시차 주사 칼로리메트리 (DSC) 는, 단백의 상대적 구조 안정성이 양호한 지표가 되는 열변성 중점 (Tm) 을 빠르게, 또 정확하게 측정할 수 있는 장치이다. DSC 를 사용하여 Tm 값을 측정하고, 그 값을 비교함으로써, 열안정성의 차이를 비교할 수 있다. 항체의 보존 안정성은, 항체의 열안정성과 어느 정도의 상관을 나타내는 것이 알려져 있고 (Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p.265-273), 열안정성을 지표로, 바람직한 항체를 선발할 수 있다. 항체를 선발하기 위한 다른 지표로는, 적절한 숙주 세포에 있어서의 수량이 높은 것, 및 수용액 중에서의 응집성이 낮은 것을 들 수 있다. 예를 들어 수량이 가장 높은 항체가 가장 높은 열안정성을 나타낸다고는 할 수 없기 때문에, 이상에 서술한 지표에 기초하여 종합적으로 판단하여, 인간에의 투여에 가장 적합한 항체를 선발할 필요가 있다.
본 발명의 항체는, 본 발명이 제공하는 항 CLDN6 항체와 「동일한 부위에 결합하는 항체」도 포함한다. 즉, 본 발명의 B1 또는 C7 이 인식하는 CLDN6 단백질 상의 부위에 결합하는 항체도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항체에는 항체의 수식체도 포함된다. 당해 수식체란, 본 발명의 항체에 화학적 또는 생물학적인 수식이 실시되어 이루어지는 것을 의미한다. 화학적인 수식체에는, 아미노산 골격에의 화학 부분의 결합, N-결합 또는 O-결합 탄수화물 사슬의 화학 수식체 등이 포함된다. 생물학적인 수식체에는, 번역 후 수식 (예를 들어, N-결합 또는 O-결합형 당사슬 부가, N 말단 또는 C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화) 된 것, 원핵생물 숙주 세포를 사용하여 발현시킴으로써 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가한 것 등이 포함된다. 또, 본 발명의 항체 또는 항원의 검출 또는 단리를 가능하게 하기 위해서 표지된 것, 예를 들어, 효소 표지체, 형광 표지체, 어피니티 표지체도 이러한 수식체의 의미에 포함된다. 이와 같은 본 발명의 항체의 수식체는, 항체의 안정성 및 혈중 체류성의 개선, 항원성의 저감, 항체 또는 항원의 검출 또는 단리 등에 유용하다.
또, 본 발명의 항체에 결합하고 있는 당사슬 수식을 조절하는 것 (글리코실화, 탈푸코오스화 등) 에 의해, 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강하는 것이 가능하다. 항체의 당사슬 수식의 조절 기술로는, WO1999/54342, WO2000/61739, WO2002/31140 등이 알려져 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체에는 당해 당사슬 수식이 조절된 항체도 포함된다.
이러한 수식에는, 항체 또는 그 기능성 단편에 있어서의 임의의 위치에, 또는 원하는 위치에 있어서도 실시되어도 되고, 1 개 또는 2 개 이상의 위치에 동일 또는 2 종 이상의 상이한 수식이 이루어져 있어도 된다.
본 발명에 있어서 「항체 단편의 수식체」 는 「항체의 수식체의 단편」 도 그 의미에 포함하는 것이다.
항체 유전자를 일단 단리한 후, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제작하는 경우에는, 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 항체 유전자의 구체예로는, 본 명세서에 기재된 항체의 중사슬 서열 등을 코드하는 유전자, 및 경사슬 서열 등을 코드하는 유전자를 조합한 것을 들 수 있다. 숙주 세포를 형질 전환할 때에는, 중사슬 서열 유전자 등과 경사슬 서열 유전자 등은, 동일한 발현 벡터에 삽입되어 있는 것이 가능하고, 또 각각의 발현 벡터에 삽입되어 있는 것도 가능하다.
진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진핵 미생물을 사용할 수 있다. 특히 동물 세포로는, 포유류 세포, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아세포 NIH3T3 (ATCC No.CRL-1658) 이나 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로 엽산 환원 효소 결손주 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1980) 77, p.4126-4220), FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 를 들 수 있다.
원핵 세포를 사용하는 경우에는, 예를 들어, 대장균, 고초균을 들 수 있다.
이들 세포에 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하고, 형질 전환된 세포를 in vitro 에서 배양함으로써 항체가 얻어진다. 당해 배양에 있어서는 항체의 서열에 따라 수량이 상이한 경우가 있고, 동등한 결합 활성을 가지는 항체 중에서 수량을 지표로 의약으로서의 생산이 용이한 것을 선별하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 항체에는, 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정으로 얻어진 배양물로부터 목적의 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편을 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당해 항체의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체도 포함된다.
상기 항체 유전자는, 바람직하게는, 이하의 (a) ∼ (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
(a) B1 혹은 C7 항체, chB1 항체, 및, 인간화 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, H3L3 중 어느 하나의 항체의 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 조합,
(b) B1 혹은 C7 항체, chB1 항체, 및, 인간화 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, H3L3 중 어느 하나의 항체의 CDRH1 ∼ CDRH3 을 포함하는 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 CDRL1 ∼ CDRL3 을 포함하는 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 조합
(c) B1 혹은 C7 항체, chB1 항체, 및, 인간화 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, H3L3 중 어느 하나의 항체의 중사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 중사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드와 경사슬 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경사슬 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 조합
(d) (a) ∼ (c) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한, CDLN6 에 결합하는 항체의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및,
(e) (a) ∼ (c) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 있어서 1 ∼ 50 개, 1 ∼ 45 개, 1 ∼ 40 개, 1 ∼ 35 개, 1 ∼ 30 개, 1 ∼ 25 개, 1 ∼ 20 개, 1 ∼ 15 개, 1 ∼ 10 개, 1 ∼ 8 개, 1 ∼ 6 개, 1 ∼ 5 개, 1 ∼ 4 개, 1 ∼ 3 개, 1 혹은 2 개, 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입되어 이루어지는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코드하고, 또한, CLDN6 에 결합하는 항체의 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
본 발명은, 본 발명의 항체 혹은 그 기능성 단편 또는 그 수식체를 코드하는 뉴클레오티드, 그 유전자가 삽입된 재조합 벡터, 그 유전자 또는 그 벡터가 도입된 세포를 포함한다.
또, 본 발명은, 상기 세포를 배양하는 공정, 및, 그 배양물로부터 항체 혹은 그 기능성 단편 또는 그 수식체를 회수하는 공정을 포함하는, 항체 혹은 그 기능성 단편 또는 그 수식체의 제조 방법도 포함한다.
또한, 포유류 배양 세포에서 생산되는 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실하는 것이 알려져 있고 (Journal of Chromatography A, 705 : 129-134 (1995)), 또, 동일하게 중사슬 카르복실 말단의 글리신, 리신의 2 아미노산 잔기가 결실하고, 새로 카르복실 말단에 위치하는 프롤린 잔기가 아미드화되는 것이 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, 360 : 75-83 (2007)). 그러나, 이들 중사슬 서열의 결실 및 수식은, 항체의 항원 결합능 및 이펙터 기능 (보체의 활성화나 항체 의존성 세포 상해 작용 등) 에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명에 관련된 항체에는, 당해 수식을 받은 항체 및 당해 항체의 기능성 단편도 포함되고, 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실한 결실체, 및 아미드화된 당해 결실체 (예를 들어, 카르복실 말단 부위의 프롤린 잔기가 아미드화된 중사슬) 등도 포함된다. 단, 항원 결합능 및 이펙터 기능이 유지되고 있는 한, 본 발명에 관련된 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 결실체는 상기 종류로 한정되지 않는다. 본 발명에 관련된 항체를 구성하는 2 개의 중사슬은, 완전체 길이 및 상기 결실체로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 중 어느 1 종이어도 되고, 어느 2 종을 조합한 것이어도 된다. 각 결실체의 양비는 본 발명에 관련된 항체를 산생하는 포유류 배양 세포의 종류 및 배양 조건에 영향을 받을 수 있지만, 본 발명에 관련된 항체의 주성분으로는 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단의 1 개의 아미노산 잔기가 결실하고 있는 경우를 들 수 있다.
본 발명의 항 CLDN6 항체의 아이소타입으로는, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 IgG4 를 들 수 있다.
본 발명의 항체의 아이소타입으로서 IgG1 을 사용하는 경우에는, 정상 영역의 아미노산 잔기의 일부를 치환함으로써, 이펙터 기능을 조정하는 것이 가능하다. 이펙터 기능을 저감 또는 감약시킨 IgG1 의 변이체로는, IgG1 LALA (IgG1-L234A, L235A), IgG1 LAGA (IgG1-L235A, G237A) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 IgG1 LALA 이다. 또한, 상기 L234A, L235A 는 EU index (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Vol.63, No.1 (May 15, 1969), pp.78-85) 에 의해 특정되는 234 위치, 235 위치의 류신의 알라닌으로의 치환, G237A 는 EU index 에 의해 특정되는 237 위치의 글리신의 알라닌으로의 치환을 나타낸다.
항체의 생물 활성으로는, 일반적으로는 항원 결합 활성, 항원과 결합함으로써 그 항원을 발현하는 세포에 내재화하는 활성, 항원의 활성을 중화하는 활성, 항원의 활성을 증강하는 활성, 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성, 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성 및 항체 의존성 세포 매개 식작용 (ADCP) 을 들 수 있지만, 본 발명에 관련된 항체가 갖는 기능은, CLDN6 에 대한 결합 활성이며, 바람직하게는 CLDN6 과 결합함으로써 CLDN6 발현 세포에 내재화하는 활성이다. 또한, 본 발명의 항체는, 세포 내재화 활성에 더하여, ADCC 활성, CDC 활성 및/또는 ADCP 활성을 겸비하고 있어도 된다.
얻어진 항체는, 균일하게까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다. 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 필터 여과, 한외 여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있지만 (Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ; Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이들로 한정되는 것은 아니다.
크로마토그래피로는, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다.
이들 크로마토그래피는, HPLC 나 FPLC 등의 액체 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있다.
어피니티 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다.
또 항원을 고정화한 담체를 사용하고, 항원에의 결합성을 이용하여 항체를 정제할 수도 있다.
본 발명의 항 HER2 항체는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 이하의 특성을 갖는 것이 바람직하다.
(1) 이하의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 항 HER2 항체 ;
(a) HER2 에 특이적으로 결합한다.
(b) HER2 와 결합함으로써 HER2 발현 세포에 내재화하는 활성을 갖는다.
(2) HER2 의 세포 외 도메인에 결합하는 상기 (1) 에 기재된 항체.
(3) 상기 항체가 모노클로날 항체인 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 항체.
(4) 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성 및/또는 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성을 갖는 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(5) 마우스 모노클로날 항체, 키메라 모노클로날 항체 또는 인간화 모노클로날 항체인, 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(6) 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이며, ADCC 및/또는 CDC 활성의 저감을 초래하는 변이를 포함하는, 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(7) 중사슬 정상 영역이 인간 IgG1 의 중사슬 정상 영역이며, EU Index 에 의해 나타내어진 234 위치 및 235 위치의 류신이 알라닌으로 치환되어 있는, 상기 (6) 에 기재된 항체.
(8) 서열 번호 65 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 64 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (4) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(9) 서열 번호 75 의 아미노산 번호 20 ∼ 469 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 73 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 인간화 모노클로날 항체인 상기 (1) ∼ (3), (6) 또는 (7) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(10) 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실하고 있는 상기 (1) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(11) 서열 번호 65 의 아미노산 번호 1 ∼ 449 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 64 의 아미노산 번호 1 ∼ 214 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 상기 (1) ∼ (3), (8) 또는 (10) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(12) 서열 번호 75 의 아미노산 번호 20 ∼ 468 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 73 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하여 이루어지는 상기 (1) ∼ (3), (6), (7), (9) 또는 (10) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(13) 상기 (1) ∼ (12) 중 어느 하나에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정 및 당해 공정으로 얻어진 배양물로부터 목적의 항체를 채취하는 공정을 포함하는 당해 항체의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체.
＜당사슬 리모델링＞
최근, 불균일한 항체의 당단백질을, 효소 반응 등에 의해 리모델링하여, 관능기를 갖는 당사슬을 균일하게 도입하는 방법이 보고되어 있다 (ACS Chemical Biology 2012, 7, 110, ACS Medicinal Chemistry Letters 2016, 7, 1005). 이 당사슬 리모델링 기술을 사용하여, 부위 특이적으로 약물을 도입하고, 균일한 ADC 를 합성하는 시도도 이루어지고 있다 (Bioconjugate Chemistry 2015, 26, 2233, Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367, US2016361436).
본 발명의 당사슬의 리모델링은 먼저 가수분해 효소를 이용하여, 단백질 (항체 등) 에 부가되어 있는 불균일한 당사슬을 말단의 GlcNAc 만 남기고 절제해, GlcNAc 가 부가된 균일한 단백질 부분을 조제한다 (이하, 「억셉터」라고 한다). 다음으로, 별도 조제한 임의의 당사슬을 준비하고 (이하, 「도너」라고 한다), 이 억셉터와 도너를 당전이 효소를 사용하여 연결한다. 이로써, 임의의 당사슬 구조를 가진 균일한 당단백질을 합성할 수 있다.
본 발명에 있어서 「당사슬」이란, 2 개 이상의 단당이 글리코사이드 결합에 의해 결합된 구조 단위를 의미한다. 구체적인 단당이나 당사슬을, 예를 들어 "GlcNAc-", "MSG-" 와 같이, 약호로서 표기하는 경우가 있다. 구조식 중에서 이들 약호로 기재한 경우, 환원 말단에서 다른 구조 단위와의 글리코사이드 결합에 귀속하는 산소 원자 또는 질소 원자는, 특별한 정의가 있는 경우를 제외하고, 당해 당사슬을 나타내는 약호에는 포함되지 않는 것으로서 표시된다.
본 발명에 있어서, 당사슬의 기본 단위가 되는 단당의 기재는, 별도로 정하는 경우를 제외하고, 편의상, 그 고리 구조에 있어서, 고리를 구성하는 산소 원자에 결합하고, 또한, 수산기 (또는 글리코사이드 결합에 귀속하는 산소 원자) 와 직접 결합한 탄소 원자를 1 위치 (시알산에 있어서만 2 위치) 로서 표기한다. 실시예 화합물의 명칭은, 화학 구조 전체로서 첨부된 것이며, 이 룰은 반드시 적용되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 당사슬을 기호 (예를 들어, GLY, SG, MSG, GlcNAc 등) 로서 기재하는 경우, 별도로 정의되는 경우를 제외하고, 환원 말단의 탄소까지를, 당해 기호에 포함하는 것으로 하고, N- 또는 O-글리코사이드 결합에 귀속하는 N 또는 O 는, 당해 기호에는 포함되지 않는 것으로 한다.
본 발명에 있어서, 특별한 기재가 없는 한, 아미노산의 측사슬에 있어서 당사슬과 연결한 경우의 부분 구조는, 측사슬 부분을 괄호로 표시하고, 예를 들어, 「(SG-)Asn」과 같이 표기하는 것으로 한다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트는, 다음 식
[화학식 82]
Figure pct00082
으로 나타내고, 항체 Ab 또는 그 기능성 단편은, 그 아미노산 잔기 (예를 들어, 시스테인, 리신 등) 의 측사슬로부터 직접 L 에 결합하거나, Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬로부터 L 에 결합하고 있어도 되고, 바람직하게는, Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬로부터 L 에 결합하고 있고, 보다 바람직하게는, Ab 의 리모델링된 당사슬로부터 L 에 결합하고 있다.
본 발명에 있어서의 Ab 의 당사슬은, N 결합형 당사슬이나 O 결합형 당사슬이며, 바람직하게는, N 결합형 당사슬이다.
N 결합형 당사슬은 N 글리코사이드 결합, O 결합형 당사슬은 O 글리코사이드 결합에 의해, 항체의 아미노산 측사슬과 결합하고 있다.
본 발명의 Ab 는, IgG 이며, 바람직하게는, IgG1, IgG2 또는 IgG4 이다.
IgG 는 그 중사슬의 Fc 영역에 있어서의 297 번째의 아스파라긴 잔기 (이하, 「Asn297 또는 N297」이라고 한다.) 에 양호하게 보존된 N 결합형 당사슬을 가지고 있고, 항체 분자의 활성이나 동태 등에 기여하는 것이 알려져 있다 (Biotechnol. Prog., 2012, 28, 608-622, Sanglier-Cianferani, S., Anal. Chem., 2013, 85, 715-736).
IgG 의 정상 영역에 있어서의 아미노산 서열은 양호하게 보존되어 있고, Edelman et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Vol.63, No.1 (May 15, 1969), pp.78-85) 에 있어서, 각각의 아미노산이 Eu 번호 (Eu INDEX) 로 특정되어 있다. 예를 들어, Fc 영역에 있어서 N 결합형 당사슬이 부가하는 Asn297 은, Eu 번호에 있어서 297 위치에 상당하는 것이며, 분자의 단편화나 영역 결손에 의해 실제의 아미노산 위치가 변동한 경우여도 Eu 번호로 표시함으로써 아미노산이 일의적으로 특정된다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서, 보다 바람직하게는, 항체 또는 그 기능성 단편은 그 Asn297 의 측사슬에 결합하는 당사슬 (이하, 「N297 당사슬」이라고 한다) 로부터 L 에 결합하고 있고, 더욱 바람직하게는, 항체 또는 그 기능성 단편은 상기 N297 당사슬로부터 L 에 결합하고 있고, 당해 N297 당사슬이 리모델링된 당사슬이다.
하기 식은 본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트가 항체 또는 그 기능성 단편의 상기 N297 당사슬로부터 L 에 결합하고 있는 경우를 나타낸다.
[화학식 83]
Figure pct00083
또한, 당해 리모델링된 당사슬을 갖는 항체를 당사슬 리모델링 항체라고 한다.
SGP 는 Sialyl GlycoPeptide 의 약어이며, N 결합형 복합 당사슬의 대표적인 것이다. 계란의 난황으로부터, SGP 는, 예를 들어, WO2011/0278681 에 기재된 방법에 따라 단리, 정제할 수 있다. 또, SGP 의 정제품이 시판 (토쿄 화성 (주), (주) 후시미 제약소) 되고 있어, 구입할 수 있다. SG 의 당사슬 부분에 있어서 환원 말단의 GlcNAc 가 1 개 결손한 당사슬 (이하, 「SG(10)」) 만으로 이루어지는 디시알로옥타사카라이드 (토쿄 화성 (주)) 등이 시판되고 있다.
본 발명에 있어서, SG(10) 의 β-Man 의 분기 사슬 중 어느 일방만에서 비환원 말단의 시알산이 결실한 당사슬 구조를 MSG(9) 로 하고, 분기 사슬의 1-3 당사슬에만 시알산을 갖는 것을 MSG1, 분기 사슬의 1-6 당사슬에만 시알산을 갖는 것을 MSG2 로 각각 표기하는 것으로 한다.
본 발명의 리모델링된 당사슬은, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 N297-(Fuc)MSG1 과 N297-(Fuc)MSG2 의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 이며, 바람직하게는, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 또는 N297-(Fuc)SG 이며, 보다 바람직하게는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 이다.
N297-(Fuc)MSG1 은 이하의 구조식 또는 서열식으로 나타낸다.
[화학식 84]
Figure pct00084
[화학식 85]
Figure pct00085
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH- 를 나타내고, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
아스테리스크는, 상기 링커 L, 특히 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
여기서, n5 는 2 ∼ 10 의 정수이며, 바람직하게는, 2 ∼ 5 의 정수이다.
N297-(Fuc)MSG2 는 이하의 구조식 또는 서열식으로 나타낸다.
[화학식 86]
Figure pct00086
[화학식 87]
Figure pct00087
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH- 를 나타내고, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
아스테리스크는, 상기 링커 L, 특히 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
여기서, n5 는 2 ∼ 10 의 정수이며, 바람직하게는, 2 ∼ 5 의 정수이다.
N297-(Fuc)SG 는 이하의 구조식 또는 서열식으로 나타낸다.
[화학식 88]
Figure pct00088
[화학식 89]
Figure pct00089
상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH- 를 나타내고, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, 아스테리스크는, 상기 링커 L, 특히 링커 L 에 있어서의 Lb 의 1,2,3-트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
여기서, n5 는 2 ∼ 10 의 정수이며, 바람직하게는, 2 ∼ 5 의 정수이다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체의 N297 당사슬이, N297-(Fuc)MSG1 혹은 N297-(Fuc)MSG2 또는 그들의 혼합물인 경우, 항체는 2 량체이기 때문에, 항체-약물 콘쥬게이트는 2 개의 링커 L 및 2 개의 약물 D 가 결합된 분자 (상기 m2 = 1) 가 된다 (도 1 참조).
예를 들어, 실시예 74 : ADC8 은 N297 당사슬이 N297-(Fuc)MSG1 인 경우이며, 실시예 67 : ADC1 은, N297 당사슬이 N297-(Fuc)MSG1 및 N297-(Fuc)MSG2 의 혼합물인 경우이다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체의 N297 당사슬이, N297-(Fuc)SG 인 경우, 항체는 2 량체이기 때문에, 항체-약물 콘쥬게이트는 4 개의 링커 L 및 4 개의 약물 D 가 결합된 분자 (상기 m2 = 2) 가 된다. 예를 들어, 실시예 72 : ADC6 은 N297 당사슬이 N297-(Fuc)SG 인 경우이다.
N297 당사슬은, 바람직하게는, N297-(Fuc)MSG1 혹은 N297-(Fuc)MSG2 또는 N297-(Fuc)SG 이며, 보다 바람직하게는, N297-(Fuc)MSG1 혹은 N297-(Fuc)MSG2 이다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체의 N297 당사슬이 N297-(Fuc)MSG1 혹은 N297-(Fuc)MSG2 또는 N297-(Fuc)SG 인 경우, 균일한 ADC 를 취득할 수 있다.
본 발명은, 이하 i) ∼ iii) 의 공정을 포함하는 리모델링 항체 또는 그 항체의 기능성 단편의 제조 방법을 제공한다.
i) 상기 [46] ∼ [48] 중 어느 하나에 기재된 숙주 세포 (예를 들어, 동물 세포 (CHO 세포 등)) 를 배양하고, 얻어진 배양물로부터 목적의 항체를 채취하는 공정,
ii) 공정 i) 에서 얻어진 항체를 가수분해 효소로 처리하고, N297 당사슬이 (Fucα1,6)GlcNAc 인 항체 ((Fucα1,6)GlcNAc-항체) 를 제조하는 공정 (도 3A),
바람직하게는, 추가로 당해 반응액을, 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제를 포함하는 공정에 의해 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 정제하는 공정을 포함한다, 및,
iii)-1 또는 iii)-2 중 어느 하나의 공정 (도 3B).
iii)-1 MSG(9) 또는 SG(10) 의 시알산의 2 위치의 카르복실산의 카르보닐기에 아지드기를 갖는 PEG 링커 (N3-L(PEG)) 를 도입하고, 환원 말단을 옥사졸린화한 당사슬 도너 분자와, 당전이 효소 존재하에서 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 반응시켜, 시알산에 아지드기가 도입된 당사슬 리모델링 항체를 합성하는 공정,
iii)-2 α-아미노기가 보호 혹은 수식되어 있어도 되는 (MSG-)Asn 또는 (SG-)Asn 의 시알산의 2 위치의 카르복실산의 카르보닐기 및 상기 Asn 의 카르복실산의 카르보닐기에 아지드기를 갖는 PEG 링커 (N3-L(PEG)) 를 도입하고, 가수분해 효소를 작용시킨 후, 환원 말단을 옥사졸린화한 당사슬 도너 분자와, 당전이 효소 존재하에서 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 반응시켜, 시알산에 아지드기가 도입된 당사슬 리모델링 항체를 합성하는 공정.
또, 이러한 제조 방법에 의해 얻어진 당사슬 리모델링 항체 혹은 그 기능성 단편, 또는 그들의 수식체도 본 발명에 포함된다.
상기 본 항체-약물 콘쥬게이트의 제조 중간체는 DBCO (Dibenzocyclooctyne) 등의 아지드기와 반응하는 알킨 구조를 갖는다. 따라서, 당해 제조 중간체를 상기 i) ∼ iii) 의 공정으로 얻어지는 당사슬의 시알산에 아지드기를 갖는 PEG 링커가 도입된 MSG1 형, MSG2 형 또는 SG 형 당사슬 리모델링 항체 또는 그 항체의 기능성 단편과 반응시킴으로써, 본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트를 제조할 수 있다.
본 발명의 N297 당사슬에 있어서, 환원 말단의 푸코오스 부가한 GlcNAc(Fucα1,6)GlcNAc) 는, 동물 세포로 산생된 항체에서 유래하고, 그것으로부터 비환원 말단측의 당사슬은, 상기 서술한 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 와 동일한 당사슬 구조로 리모델링된 것이 바람직하다. 모두 그 비환원 말단의 시알산 2 위치에 결합한 카르복실산을 이용하여, L(PEG) 와 결합하고 있다.
이와 같은 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 N297 당사슬을 갖는 당사슬 리모델링 항체는, 예를 들어 WO2013/120066 등에 기재된 방법에 준해, 도 3 에 나타내는 바와 같은 방법으로 제조할 수 있다. 공지된 방법에 준해 숙주로서 동물 세포를 사용하고, 유전자 재조합 단백질로서 항체를 산생시킨 경우 (상기 공정 i), N297 당사슬은, 기본 구조로서 푸코오스 부가한 N 결합형 당사슬 구조를 갖지만, 비환원 말단의 구조나 구성당에 다양한 수식이 된 여러 가지 구조로 이루어지는 당사슬을 갖는 항체 또는 그 단편의 혼합물로서 얻어진다 (도 3A 의 IV). 이와 같이 동물 세포로 산생된 항체는, EndoS 등의 가수분해 효소로 처리함으로써, 환원 말단의 키토비오스 구조의 GlcNAcβ1- 4GlcNAc 사이의 글리코사이드 결합이 가수분해되어, N297 당사슬로서 (Fucα1,6)GlcNAc 만을 갖는 단일의 당사슬 구조를 갖는 항체 분자 (「(Fucα1,6)GlcNAc-항체」라고 한다, 도 2 의 A 참조) 가 얻어진다 (도 3A) (상기 공정 ii)).
N297 당사슬의 가수분해 반응에 사용하는 효소로는, EndoS 또는 그 가수분해 활성을 유지한 변이 효소 등을 사용할 수 있다.
상기 가수분해 반응에 의해 얻어진 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 당사슬 억셉터 분자로서, EndoS D233Q 또는 EndoS D233Q/Q303L 변이체와 같은 당전이 효소 (WO2017010559 등) 를 사용하여 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 당사슬 도너 분자와 반응시킴으로써, 상기 서술한 구조로 이루어지는 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 N297 당사슬을 갖는 항체 (도 2 의 B 참조) 를 얻을 수 있다 (도 3B) (상기 공정 iii)-1, iii)-2).
항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 결합수 m2 가 1 인 경우, 당사슬로서 MSG, MSG1 또는 MSG2 를 갖는 당사슬 도너 분자를 채용한다. 이와 같은 당사슬은, 시판되는 monosialo-Asn free (1S2G/1G2S-10NC-Asn, (주) 당사슬 공학 연구소, 이하 「(MSG-)Asn」이라고 한다) 를 원료로 실시예 56 에 기재된 방법에 준해 (MSG-)Asn1 또는 (MSG2-)Asn 를 분리하여 채용할 수도 있고, 분리하지 않고 혼합물로서 채용할 수도 있다.
항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 결합수 m2 가 2 인 경우, 이 당전이 반응에는 당사슬로서 SG(10) 을 갖는 당사슬 도너 분자를 사용한다. 이와 같은 SG(10) 당사슬은, 예를 들어 SGP 로부터 가수분해 등에 의해 취득된 것을 사용해도 되고, 시판되는 디시알로옥타사카라이드 (토쿄 화성 공업 (주)) 와 같은 SG(10) 당사슬을 사용해도 된다.
도너 분자에 포함되는 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 당사슬은 그 시알산의 2 위치에 아지드기를 포함하는 PEG 링커 (N3-L(PEG)) 를 갖는다. 시알산의 2 위치에의 아지드기를 포함하는 PEG 링커 (N3-L(PEG)) 의 도입에는, MSG (MSG(9)), MSG1 혹은 MSG2 또는 디시알로옥타사카라이드 (SG(10)) 와 아지드기를 포함하는 PEG 링커 (N3-L(PEG)) 인 N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2 (n5 는 2 ∼ 10 의 정수이며, 바람직하게는, 2 ∼ 5 의 정수를 나타낸다.) 를 유기 합성 과학 분야에서 공지된 반응 (축합 반응 등) 을 이용할 수 있다. 즉, 시알산 2 위치에의 카르복실산과 N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2 의 우말단의 아미노기가 축합 반응에 의해 아미드 결합을 형성한다.
또, MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 당사슬은, 예를 들어 α-아미노기가 보호 혹은 수식되어 있어도 되는 (MSG1-)Asn, (MSG2-)Asn 또는 (SG-)Asn (당사슬 공학 연구소) 등의 원료의 시알산의 2 위치의 카르복실산 및 상기 Asn 의 카르복실산에 축합 반응을 이용하여 아지드기를 갖는 PEG 링커 (N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2) 를 도입하고, EndoM 이나 EndoRp 와 같은 가수분해 효소를 작용시켜 얻을 수도 있다 (상기 iii)-2). α-아미노기의 보호기로는 아세틸 (Ac) 기, t-부톡시카보닐기 (t-Butoxycarbonyl (Boc)) 기, 벤조일 (Bz) 기, 벤질 (Bzl) 기, 카르보벤즈옥시 (Carbobenzoxy (Cbz)) 기, 9-플루오렌닐메틸옥시카르보닐 (9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)) 기 등을 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. α-아미노기의 보호기는, 바람직하게는, Fmoc 기이다.
α-아미노기의 수식기로는 하이드록시아세틸기, 또는 PEG 구조 등을 갖는 수용성을 향상시키는 수식기를 들 수 있다.
(MSG1-)Asn, (MSG-2)Asn 또는 (SG-)Asn 은, 바람직하게는, α-아미노기가 상기 보호기로 보호되고 있다. α-아미노기가 보호기 (예를 들어, Fmoc 기) 로 보호되고 있는 경우, 필요에 따라, 아지드기를 갖는 PEG 링커를 도입한 후, 가수분해 효소를 작용시키기 전에 보호기를 제거할 수 있다.
분자에 포함되는 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 당사슬의 환원 말단의 GlcNAc 는, 예를 들어 2-클로로-1,3-디메틸-1H-벤즈이미다졸-3-이움-클로라이드 처리에 의한 옥사졸린화와 같은 형태로 활성화된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
당전이 반응에 사용하는 효소 (당전이 효소) 로는, N297 당사슬에 복합형 당사슬을 전이시키는 활성을 갖는 것이면 다양한 것을 채용할 수 있지만, 바람직한 것은 EndoS 의 233 번째의 Asp 를 Gln 으로 치환함으로써 가수분해 반응을 억제한 개변체인 EndoS D233Q 이다. EndoS D233Q 를 사용한 당전이 반응에 대해서는, WO2013/120066 등에 기재되어 있다. 또, EndoS D233Q 에 대해, 추가로 변이를 가한 EndoS D233Q/Q303L 과 같은 개변체 효소 (WO2017010559) 를 이용해도 된다.
항체의 당사슬 리모델링 (당가수분해, 및 당사슬 전이 반응) 후의 항체의 정제 조작은, 반응에 사용한 저분자 화합물 및 효소와의 분리를 목적으로 하고, 이와 같은 정제에는, 통상, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등이 사용되지만, 또한 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 추가 정제를 실시해도 된다. 즉, 본 발명은, 항체의 당가수분해 후의 반응액으로부터의 중간체의 정제 공정에 있어서, 추가로 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제 공정을 포함하는, 약물-콘쥬게이트체의 제조 방법을 제공한다. 당사슬 리모델링 보고예 (J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308-12318., Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367) 에 따르면, 항체를 가수분해 효소로 처리한 반응액을 프로테인 A 칼럼 (어피니티 크로마토그래피 칼럼) 으로 정제하기만 하지만, 이 정제 방법에서는, 가수분해 효소 (EndoS 등) 가 완전히는 제거되지 않고, 잔류 효소가 영향을 주어, 다음의 당전이 반응에 영향을 주는 것이 판명되었다. 여기서, 정제법을 검토한 결과, 항체를 가수분해 효소로 처리한 반응액을 프로테인 A 칼럼, 하이드록시 아파타이트 칼럼 (CHT 칼럼, Bio-Rad Laboratories, Inc.) 의 순서로 정제함으로써, 잔류 효소의 영향이 없고, 다음의 당사슬 전이 반응의 반응 효율이 향상되었다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트는, 가장 바람직하게는, 다음의 군에서 선택되는 1 의 항체-약물 콘쥬게이트이다.
[화학식 90]
Figure pct00090
[화학식 91]
Figure pct00091
[화학식 92]
Figure pct00092
[화학식 93]
Figure pct00093
[화학식 94]
Figure pct00094
[화학식 95]
Figure pct00095
[화학식 96]
Figure pct00096
[화학식 97]
Figure pct00097
[화학식 98]
Figure pct00098
[화학식 99]
Figure pct00099
[화학식 100]
Figure pct00100
, 또는,
[화학식 101]
Figure pct00101
상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 (바람직하게는, m2 는 1) 인 것을 나타내고,
항체 Ab 는 IgG 항체 (바람직하게는, IgG1, IgG2, IgG4, 보다 바람직하게는, IgG1) 또는 그 기능성 단편이며,
N297 당사슬은, N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물 또는 N297-(Fuc)SG (바람직하게는, N297-(Fuc)MSG1) 중 어느 하나인 것을 나타내고,
L(PEG) 는, -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-* 인 것을 나타내고, 좌단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측 (바람직하게는, 1-3 사슬측) 의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, 아스테리스크는, 상기 링커 L 에 있어서의 Lb 의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타낸다.
편의상, 상기 가장 바람직한 항체-약물 콘쥬게이트로서, 콘쥬게이트체 1 분자 중에 「N297 당사슬이 L 중의 Lb 의 트리아졸 고리 상의 1 위치의 질소 원자와 결합한 『-(N297 당사슬)-L-D』(『(N297 당사슬)- (N1Lb)L-D』) 를 2 또는 4 개 (m2 = 1 또는 2) 갖거나, 「3 위치의 질소 원자와 결합한 『-(N297 당사슬)-L-D』 ( 『(N297 당사슬)- (N3Lb)L-D』)」를 2 또는 4 개 (m2 = 1 또는 2) 갖는 구조를 기재하고 있지만, 콘쥬게이트체 1 분자 중에 『(N297 당사슬)- (N1Lb)L-D』 (m2 = 1 인 경우, 1 개, m2 = 2 인 경우, 1,2,3 개) 및 『(N297 당사슬)- (N3Lb)L-D』 (m2 = 1 인 경우, 1 개, m2 = 2 인 경우, 3,2,1 개) 의 양방을 갖는 항체-약물 콘쥬게이트도 포함한다. 즉, 콘쥬게이트체 1 분자 중에 『(N297 당사슬)- (N1Lb)L-D』나 『(N297 당사슬)- (N3Lb)L-D』 중 어느 일방만, 또는, 그 양방이 혼재하고 있다.
또한, Ab 는, 바람직하게는, 항 CLDN6 항체, 항 CLDN6/CLDN9 항체, 항 HER2 항체, 항 DLL3 항체, 항 FAP 항체, 항 CDH11 항체, 항 A33 항체, 항 CanAg 항체, 항 CD19 항체, 항 CD20 항체, 항 CD22 항체, 항 CD30 항체, 항 CD33 항체, 항 CD56 항체, 항 CD70 항체, 항 CD98 항체, 항 TROP2 항체, 항 CEA 항체, 항 Cripto 항체, 항 EphA2 항체, 항 FGFR2 항체, 항 G250 항체, 항 MUC1 항체, 항 GPNMB 항체, 항 Integrin 항체, 항 PSMA 항체, 항 Tenascin-C 항체, 항 SLC44A4 항체, 항 Mesothelin 항체, 항 EGFR 항체, 항 DR5 항체이며, 보다 바람직하게는, 항 CLDN6 항체, 항 CLDN6/CLDN9 항체, 항 HER2 항체, 항 CD98 항체, 항 TROP2 항체이며, 더욱 바람직하게는 상기 항 CLDN6 항체 (예를 들어, 실시예 106, 107, 108, 109), 항 HER2 항체 (예를 들어, 트라스트주맙, 트라스트주맙 변이체) 이다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트 및 본 발명의 항 CLDN6 항체 혹은 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트는, 강한 종양 활성 (in vivo 항종양 활성, in vitro 항세포 활성), 양호한 체내 동태 및 물성을 나타내고, 또한 안전성이 높기 때문에, 의약품으로서 유용하다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트, 그 유리 약물 혹은 그 제조 중간체에는, 입체 이성체 혹은 부제 탄소 원자에서 유래하는 광학 이성체, 기하 이성체, 호변 이성체 또는 d 체, l 체, 아트로프 이성체 등의 광학 이성체가 존재하는 경우도 있지만, 이들 이성체, 광학 이성체 및 이들의 혼합물 모두 본 발명에 포함된다. 본 발명의 PBD 유도체 (V) 또는 (VI) 은 11' 위치에 부제 탄소가 존재하기 때문에, 광학 이성체가 존재한다. 본 명세서에 있어서, 이들 이성체, 및 이들 이성체의 혼합물이 모두 단일의 식, 즉 일반식 (V) 또는 (VI) 으로 나타내어져 있다. 따라서, (V) 또는 (VI) 은 광학 이성체 및 광학 이성체의 임의의 비율로의 혼합물도 모두 포함하는 것이다. (V) 또는 (VI) 의 11' 위치의 절대 입체 배치는 결정성의 생성물 또는 중간체 혹은 그들의 유도체의 X 선 결정 구조 해석이나 Mosher 법 등의 NMR 에 의해 결정할 수 있다. 그때, 입체 배치가 이미 알려진 부제 중심을 가지는 시약으로 유도화된 결정성의 생성물 또는 중간체를 사용하여 절대 입체 배치를 결정해도 된다. 입체 이성체는, 합성한 본 발명에 관련된 화합물을 원하는 바에 따라 통상적인 광학 분할법 또는 분리법을 사용하여 단리함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서, 항체 1 분자에의 약물의 결합수는, 그 유효성, 안전성에 영향을 주는 중요 인자이다. 항체-약물 콘쥬게이트의 제조는, 약물의 결합수가 일정한 수가 되도록, 반응시키는 원료·시약의 사용량 등의 반응 조건을 규정하여 실시되지만, 저분자 화합물의 화학 반응과는 상이하고, 상이한 수의 약물이 결합한 혼합물로서 얻어지는 것이 통상이다. 항체 1 분자에의 약물의 결합수는 평균값, 즉, 평균 약물 결합수 (DAR : Drug to Antibody Ratio) 로서 특정할 수 있다. 항체 분자에의 피롤로벤조디아제핀 유도체의 결합수는 컨트롤 가능하고, 1 항체당의 약물 평균 결합수 (DAR) 로서, 1 내지 10 의 범위의 피롤로벤조디아제핀 유도체를 결합시킬 수 있지만, 바람직하게는 1 내지 8 개이며, 보다 바람직하게는 1 내지 5 개이다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서, 항체가, 항체의 리모델링된 당사슬로부터 L 에 결합하고 있는 경우, 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 결합수 m2 는 1 또는 2 의 정수이다. 당해 당사슬이 N297 당사슬이며, 당사슬이 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 또는 N297-(Fuc)MSG1 과 N297-(Fuc)MSG2 의 혼합물인 경우, m2 는 1 이며, DAR 은 1 ∼ 3 의 범위 (바람직하게는, 1.0 ∼ 2.5 의 범위, 보다 바람직하게는, 1.2 ∼ 2.2 의 범위) 이다. N297 당사슬이, N297-(Fuc)SG 인 경우, m2 는 2 이며, DAR 은 3 ∼ 5 의 범위 (바람직하게는, 3.2 ∼ 4.8 의 범위이며, 보다 바람직하게는, 3.5 ∼ 4.2 의 범위) 이다.
또한, 당업자이면 본원의 실시예의 기재로부터 항체에 필요한 수의 약물을 결합시키는 반응을 설계할 수 있어, 피롤로벤조디아제핀 유도체의 결합수를 컨트롤한 항체를 취득할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트, 유리 약물 또는 제조 중간체는, 대기 중에 방치하거나, 또는 재결정함으로써, 수분을 흡수하여, 흡착수가 생기거나, 수화물이 되는 경우가 있고, 그러한 물을 포함하는 화합물 및 염도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트, 유리 약물 또는 제조 중간체가, 아미노기 등의 염기성기를 갖는 경우, 원하는 바에 따라 의약적으로 허용되는 염으로 할 수 있다. 그러한 염으로는, 예를 들어 염산염, 요오드화수소산염 등의 할로겐화수소산염 ; 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염 ; 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염 등의 저급 알칸술폰산염 ; 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염 등의 아릴술폰산염 ; 포름산, 아세트산, 말산, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염 ; 및 오르니틴산염, 글루탐산염, 아스파르트산염 등의 아미노산염을 들 수 있다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트, 유리 약물 또는 제조 중간체가, 카르복시기 등의 산성기를 갖는 경우, 일반적으로 염기 부가염을 형성하는 것이 가능하다. 의약적으로 허용되는 염으로는, 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등의 알칼리 금속염 ; 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염 ; 암모늄염 등의 무기염 ; 디벤질아민염, 모르폴린염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 시클로헥실아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 디에탄올아민염, N-벤질-N-(2-페닐에톡시)아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄염 등의 유기 아민염 등을 들 수 있다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트, 유리 약물 또는 제조 중간체는, 공기 중의 수분을 흡수하는 것 등에 의해 수화물로서 존재하는 경우도 있다. 본 발명의 용매화물로는, 의약적으로 허용할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는, 수화물, 에탄올화물, 2-프로판올화물 등이 바람직하다. 또, 본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트, 유리 약물 또는 제조 중간체 중에 질소 원자가 존재하는 경우에는 N-옥사이드체로 되어 있어도 되고, 이들 용매화물 및 N-옥사이드체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또, 본 발명에는, 여러 가지 방사성 또는 비방사성 동위체로 라벨된 화합물도 포함된다. 본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트, 유리 약물 또는 제조 중간체를 구성하는 원자의 1 이상에, 원자 동위체의 비천연 비율도 함유할 수 있다. 원자 동위체로는, 예를 들어, 중수소 (2H), 트리튬 (3H), 요오드-125(125I) 또는 탄소-14 (14 C) 등을 들 수 있다. 또, 본 발명 화합물은, 예를 들어, 트리튬 (3H), 요오드-125 (125I) 또는 탄소-14 (14C) 와 같은 방사성 동위체로 방사성 표지될 수 있다. 방사성 표지된 화합물은, 치료 또는 예방제, 연구 시약, 예를 들어, 어세이 시약, 및 진단제, 예를 들어, 인비보 화상 진단제로서 유용하다. 본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트의 모든 동위체 변이종은, 방사성인지 여부를 불문하고, 본 발명의 범위에 포함된다.
[제조 방법]
다음으로, 본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트 및 유리 약물 혹은 그들의 제조 중간체의 대표적인 제조 방법에 대해 설명한다. 또한, 이하에 있어서, 화합물을 나타내기 위해, 각 반응식 중에 나타내는 화합물의 번호를 사용한다. 즉, 『식 (1) 의 화합물』, 『화합물 (1)』 등으로 칭한다. 또 이 이외의 번호의 화합물에 대해서도 동일하게 기재한다.
1. 제조 방법 1
본 발명의 화합물 (1) 은, 이하에 기재하는 A 법 내지 Q 법에 따라 제조할 수 있다.
[화학식 102]
Figure pct00102
A 법 내지 M 법은 본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 제조 중간체의 제조법이다.
N 법 내지 Q 법은 본 발명의 유리 약물의 제조법이다.
하기 A 법 내지 Q 법의 각 공정은 공지된 유기 화학적 수법을 사용하여 원하는 반응을 실시할 수 있다.
하기 A 법 내지 Q 법의 각 공정의 반응에 있어서 사용되는 용매는, 반응을 저해하지 않고, 반응에 악영향을 미치지 않고, 출발 원료를 어느 정도 용해하는 것이면 특별히 한정은 없다.
하기 A 법 내지 Q 법의 각 공정의 반응에 있어서, 반응 온도는, 용매, 출발 원료, 시약 등에 따라 상이하고, 반응 시간은, 용매, 출발 원료, 시약, 반응 온도 등에 따라 상이하다.
하기 A 법 내지 Q 법의 각 공정의 반응에 있어서, 반응 종료 후, 각 목적 화합물은 통상적인 방법에 따라, 반응 혼합물로부터 채취된다. 예를 들어, 반응 혼합물을 적절히 중화하고, 또, 불용물이 존재하는 경우에는 여과에 의해 제거한 후, 물과 아세트산에틸과 같은 혼화하지 않는 유기 용매를 첨가하고, 목적 화합물을 포함하는 유기층을 분리하고, 물 등으로 세정 후, 무수 황산마그네슘, 무수 황산나트륨 등으로 건조, 여과 후, 용제를 증류 제거함으로써 얻어진다. 얻어진 목적 화합물은 필요하다면, 통상적인 방법, 예를 들어 재결정, 재침전, 크로마토그래피 (예를 들어, 실리카 겔, 알루미나, 마그네슘-실리카 겔계의 플로리실, SO3H-실리카 (후지 실리시아 제조) 와 같은 담체를 사용한 흡착 칼럼 크로마토그래피법 ; 세파덱스 LH-20 (파마시아사 제조), 암버라이트 XAD-11 (롬 앤드 하스사 제조), 다이아이온 HP-20 (미츠비시 화학사 제조) 과 같은 담체를 사용한 분배 칼럼 크로마토그래피 등의 합성 흡착제를 사용하는 방법 ; 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 방법 ; 실리카 겔 혹은 알킬화 실리카 겔에 의한 순상·역상 칼럼 크로마토그래피법 (바람직하게는, 고속 액체 크로마토그래피) 을 적절히 조합, 적절한 용리제로 용출한다) 등의 통상, 유기 화합물의 분리 정제에 관용되고 있는 방법을 적절히 조합, 분리, 정제할 수 있다. 용매에 불용인 목적 화합물에서는, 얻어진 고체의 미정제 생성물을 용매로 세정하고, 정제할 수 있다. 또, 각 공정의 목적 화합물은 정제하지 않고 그대로 다음의 반응에 사용할 수도 있다.
하기 A 법 내지 Q 법의 각 공정의 반응에 있어서, J, La', Lp', B', E, V, W, R9, R10, R11, R12, R13, R14, R15, R16, R17, l, n7, n6, m1 은 전술한 것과 동의를 나타낸다. (Lp')' 는 -VA-, -FG-, -PI-, -VCit-, -VK-, -(D-)PI-, -PL-, -(D-)VA-, -GF- 로 나타내는 어느 디펩티드 잔기를 나타낸다. (R13)' 는 R13 의 치환기 상에 수산기, 아미노기가 있던 경우 보호기를 사용하고 있어도 되고, 보호기가 없는 경우에는 R13 을 나타낸다. (R17)' 는 tert-부틸디메틸실릴옥시기 등의 보호기로 수산기가 보호된 상태 또는 R17 어느 것을 나타낸다.
PRO1, PRO4, PRO6, PRO8, PRO9 는 아미노기의 보호기를 나타낸다. 바람직하게는, PRO1, PRO4, PRO8, PRO9 는 알릴옥시카르보닐기, 2,2,2-트리클로로에틸옥시카르보닐기, 트리메틸실릴에톡시메톡시기, 벤질옥시카르보닐기 또는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기 등이다. 또 PRO6 은 바람직하게는 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸기, 메톡시메틸기 등이다.
또, PRO2, PRO3, PRO5, PRO7, PRO10, PRO11, PRO12 는, 유기 합성 화학의 분야에서 사용되는 하이드록시기, 페놀기 또는 카르복실기의 보호기를 나타낸다. 바람직하게는, 아세틸기, 벤질기, tert-부틸디메틸실릴 (TBDMS) 기 또는 트리이소프로필실릴기 또는 tert-부틸기이다.
X2 는 유기 합성 화학의 분야에서 사용되는 탈리기를 나타낸다. 바람직하게는 염소 원자, 브롬 원자, 요오드 원자, 메탄술포닐기, p-톨루엔술포닐기이다.
Ra, Rc 는 카르복실기에 결합한 치환기를 나타내고, 바람직하게는 메틸기, 에틸기, 벤질기, tert-부틸기 등이다.
Rb 는 에놀술포네이트를 형성하는 탈리기를 나타내고, 바람직하게는 트리플루오로메탄술포닐기 등이다.
또, A 법 내지 Q 법에서 보호에 관해서 명시하고 있지 않은 아미노기, 하이드록시기는, 필요에 따라 보호기를 사용하여, 보호해도 된다. 또, 필요에 따라 탈보호도 해도 되고, 보호한 후, 탈보호를 실시하고, 다른 보호기를 교체 부착해도 된다.
A 법
본 제조법은 화합물 (1) 을 제조하기 위해서 필요한 합성 중간체, 화합물 (12a) 를 제조하는 방법이다.
[화학식 103]
Figure pct00103
A-1 공정 (1a) → (2a) : 환원 반응
화합물 (1a) 를 용매 (디에틸에테르, 테트라하이드로푸란 (THF), 디클로로메탄, 에탄올 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -78 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 -78 ℃ 부터 50 ℃ 까지에 있어서, 환원제 (수소화리튬알루미늄, 디보란, 수소화붕소리튬, 수소화붕소나트륨, 보란-테트라하이드로푸란 착물 또는 수소화비스(2-메톡시에톡시)알루미늄나트륨 등) 로 처리함으로써 실시된다. 환원제는, 화합물 (1a) 에 대해 1 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 5 몰을 사용한다. 필요에 따라, 루이스산 (염화리튬, 염화칼슘, 염화주석, 트리플루오로보란에테르 착물 등) 을 첨가하여 실시한다. 반응 시간은 1 분 내지 60 시간, 바람직하게는 5 분 내지 24 시간이다.
A-2 공정 (2a) → (3a) : 보호기 도입 (tert-부틸디메틸실릴기 등)
PRO2 가 TBDMS 기인 경우, 화합물 (2a) 를 용매 (디클로로메탄, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -20 ℃ 부터 120 ℃ 까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 100 ℃ 에 있어서, 실릴화 시제 (試劑) (염화 tert-부틸디메틸실릴, 트리플루오로메탄술폰산 tert-부틸디메틸실릴 등) 와 반응시켜 실시한다. 필요에 따라, 염기 (이미다졸, 피리딘, 2,6-루티딘, 4-디메틸아미노피리딘, 수소화나트륨 등) 를 첨가하여 실시한다. 화합물 (2a) 의 1 몰에 대해, 실릴화제는 1 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 5 몰을 사용하고, 염기는 1 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 5 몰을 사용한다. 반응 시간은 1 분 내지 72 시간, 바람직하게는 5 분 내지 24 시간이다.
A-3 공정 (3a) → (4a) : 탈보호기화 반응
PRO1 이 벤질옥시카르보닐기인 경우, 화합물 (3a) 를 용매 (에탄올, 프로판올, 메탄올, 아세트산에틸, THF, 1,4-디옥산 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, 천이 금속 촉매 (팔라듐탄소 등) 존재하, 0 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 50 ℃ 에 있어서, 접촉 수소화시킴으로써 실시한다. 통상 수소 분위기하에서 실시하지만, 필요에 따라, 수소 공여체로서 시클로헥센, 1,4-시클로헥사디엔 등을 사용해도 된다. 반응 시간은 10 분 내지 100 시간, 바람직하게는 30 분 내지 72 시간이다.
A-4 공정 (4a) → (5a) : 축합 반응
화합물 (4a) 를 용매 (벤젠, 톨루엔, 디에틸에테르, 디클로로메탄, THF, DMF, 물 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -30 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 50 ℃ 에 있어서, N,N-디시클로헥실카르보디이미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로보레이트, N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드 등의 축합제의 존재하, 카르복실산 (화합물 (A)) 과 반응시켜 실시한다. 축합제는, 화합물 (4a) 의 1 몰에 대해, 카르복실산 (화합물 (A)) 은 0.3 내지 5 몰, 바람직하게는 0.4 내지 2 몰을 사용하고, 축합제는 1 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 5 몰을 사용한다. 또, 필요에 따라 염기 (트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린, 4-디메틸아미노피리딘 등) 및 첨가제 (1-하이드록시벤조트리아졸, 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸 등) 를 첨가하여 실시한다. 염기는, 화합물 (4a) 의 1 몰에 대해 촉매량 내지 과잉몰, 바람직하게는 0.2 내지 3 몰을 사용한다. 첨가제는, 화합물 (4a) 의 1 몰에 대해 촉매량 내지 과잉량, 바람직하게는 0.01 내지 3 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
또, 카르복실산 (화합물 (A)) 을 산할로겐화물로 하여 축합 반응하는 경우, 화합물 (4a) 를 용매 (벤젠, 톨루엔, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 테트라하이드로푸란, 디클로로메탄 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -78 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 -50 ℃ 내지 100 ℃ 에 있어서, 염기 (트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린, 4-디메틸아미노피리딘 등) 의 존재하, 카르복실산 (화합물 (A)) 의 산할로겐화물과 반응시켜 실시한다. 화합물 (4a) 의 1 몰에 대해, 산할로겐화물은 0.3 몰 내지 5 몰, 바람직하게는 0.4 몰 내지 2 몰을 사용하고, 염기는 촉매량 내지 과잉몰, 바람직하게는 0.2 내지 5 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
카르복실산 (화합물 (A)) 의 산할로겐 화합물을 조제하려면, 카르복실산 (화합물 (A)) 을 용매 (벤젠, 톨루엔, 디클로로메탄, 디클로로에탄 등, 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, 0 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 100 ℃ 에 있어서, 염화옥살릴, 염화티오닐 등으로 처리함으로써 실시한다. 필요에 따라, 촉매량의 N,N-디메틸포름아미드 등을 첨가하여 실시한다. 카르복실산 (화합물 (A)) 에 대해, 염화옥살릴 또는 염화티오닐은 1 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 10 몰 사용한다. 반응 시간은, 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간으로 실시한다.
A-5 공정 (5a) → (6a) : 환원 반응
화합물 (5a) 를 용매 (에탄올, 프로판올, 메탄올, 아세트산에틸, THF, 1,4-디옥산, DMF 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, 천이 금속 촉매 (팔라듐탄소, 니켈 등) 존재하, 0 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 50 ℃ 에 있어서, 접촉 수소화시킴으로써 실시한다. 통상 수소 분위기하에서 실시하지만, 필요에 따라, 수소 공여체로서 시클로헥센, 1,4-시클로헥사디엔, 하이드라진 등을 사용해도 된다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
또, 니트로기의 환원은 이하의 조건으로도 실시할 수 있다.
화합물 (5a) 를 용매 (에탄올, 메탄올, 디에틸에테르, 아세트산에틸, 물 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, 0 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 90 ℃ 에 있어서, 환원제 (철, 아연, 염화주석 등) 와 반응시켜 실시한다. 필요에 따라, 산 (아세트산, 포름산, 염화암모늄 등) 을 첨가하여 실시한다. 화합물 (5a) 의 1 몰에 대해, 환원제는 1 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 100 몰을 사용하고, 산은 1 내지 과잉몰 첨가하여 실시한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
A-6 공정 (6a) → (7a) : 카르바메이트화 반응
화합물 (6a) 를 용매 (THF, 디클로로메탄, DMF 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -30 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 50 ℃ 에 있어서, 트리포스겐 (이소시아네이트화 제조) 과 반응시켜, 이소시아네이트 중간체를 계 내에서 발생시킨 후, 일반식 (B) 로 나타내는 알코올로 처리함으로써 실시한다. 필요에 따라, 염기 (트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 탄산나트륨, 수산화나트륨 등) 를 첨가하여 실시한다. 화합물 (6a) 의 1 몰에 대해 트리포스겐 (이소시아네이트화제) 은, 0.3 내지 과잉몰, 바람직하게는 0.35 내지 3 몰을 사용하고, 염기는, 0.5 내지 5 몰 첨가하여 실시한다. 이소시아네이트 중간체를 형성할 때까지의 반응 시간은 10 분 내지 24 시간, 바람직하게는 30 분 내지 1 시간이다. 또, 이소시아네이트 중간체와 알코올 (B) 의 반응 시간은, 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 24 시간이다.
본 공정에서 사용되는 알코올 (B) 는, 후술하는 L 법에 따라 제조할 수 있다.
A-7 공정 (7a) → (8a) : 탈보호기화 반응
PRO2 가 TBDMS 기인 경우, 화합물 (7a) 를 용매 (디클로로메탄, 클로로포름, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, THF, 물 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -20 ℃ 부터 100 ℃ 까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 50 ℃ 에 있어서, 산 (아세트산 등) 또는 탈실릴화시제 (불화수소산-피리딘, 불화수소산-트리에틸아민, 불화수소산염, 불화수소산, 불화테트라 n-부틸암모늄 등), 및 이들의 혼합물 중 어느 것과 반응시켜 실시한다. 화합물 (7a) 의 1 몰에 대해 산은 1 내지 과잉몰 사용하고, 산 및 탈실릴화 시제는 1 내지 과잉몰 바람직하게는 1 내지 10 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
A-8 공정 (8a) → (9a) : 산화 반응
화합물 (8a) 를 용매 (아세톤, 디클로로메탄, 피리딘 등 또는 그들의 혼합 용매) 중, -78 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 -78 ℃ 부터 30 ℃ 까지에 있어서, 산화제 (클로로술포늄염, 데스마틴 시약, 테트라부틸암모늄테네이트, 피리디늄클로로크로메이트, 니트록시라디칼 산화 촉매 등) 와 반응시켜 실시한다. 필요에 따라, 염기 (트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 탄산수소나트륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨 등) 및 재산화제 (N-메틸모르폴린 N-옥사이드, 요오드벤젠디아세테이트, 차아염소산나트륨 등) 나 첨가제 (테트라부틸암모늄브로마이드, 브롬화칼륨 등) 를 첨가하여 실시한다. 산화제는 화합물 (8a) 의 1 몰에 대해 0.005 내지 과잉몰, 바람직하게는 0.005 내지 10 몰을 사용한다. 또, 화합물 (8a) 의 1 몰에 대해 염기 또는 재산화제는 1 내지 10 몰, 첨가제는 0.02 내지 1 몰을 첨가하여 실시한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
A-9 공정 (9a) → (10a) : 보호기 도입
(R17)' 가 tert-부틸디메틸실릴옥시기인 경우, A-2 공정에 따라 제조된다.
A-10 공정 (10a) → (11a) : 탈보호기화 반응
PRO3 이 트리이소프로필실릴기인 경우, 화합물 (10a) 를 용매 (DMF, 물 등 또는 그들의 혼합물) 중에서, 0 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 50 ℃ 에 있어서, 아세트산리튬으로 처리함으로써 제조한다. 아세트산리튬은, 화합물 (10a) 의 1 몰에 대해, 1 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 5 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
A-11 공정 (11a) → (12a) : 알킬화 반응
화합물 (11a) 를 용매 (THF, DMF, N,N-디메틸아세트아미드 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -20 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 부터 비점까지에 있어서, 알킬화제 (C) (1,5-디브로모펜탄, 1,3-디브로모프로판 등) 와 반응시킴으로써 제조된다. 필요에 따라, 염기 (탄산칼륨, 탄산세슘 등) 를 첨가하여 실시한다. 화합물 (11a) 의 1 몰에 대해, 알킬화제는 1 몰 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 10 몰을 사용하고, 염기는 0.4 내지 과잉몰, 바람직하게는 0.5 내지 5 몰을 사용한다. 반응 시간은 1 분 내지 60 시간, 바람직하게는 5 분 내지 24 시간이다.
B 법
본 제조법은 화합물 (1) 중, R11 과 R12 가 하나로 합쳐져, 각각의 기가 결합하는 탄소 원자와 함께 이중 결합을 형성하고, R14, R15 가 수소인 화합물을 제조하기 위해서 필요한 중간체, 화합물 (10b) 를 제조하는 방법이다.
[화학식 104]
Figure pct00104
B-1 공정 (1b) → (2b) : 탈보호기화 반응
PRO7 이 트리이소프로필실릴기인 경우, A 법 A-10 공정에 따라 제조된다.
PRO7 이 벤질기인 경우, A 법 A-3 공정에 따라 제조된다.
B-2 공정 (2b) → (3b) : 알킬화 반응
A 법 A-11 공정에 따라 제조된다.
B-3 공정 (3b) → (4b) : 탈보호기화 반응
PRO5 가 TBDMS 기인 경우, A 법 A-7 공정에 따라 제조된다.
PRO5 가 아세틸기인 경우, 화합물 (3b) 를 용매 (메탄올, 에탄올, THF 또는 물 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서 -20 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 50 ℃ 에 있어서, 적당한 염기 (탄산칼륨, 나트륨메톡사이드 또는 수산화나트륨 등) 를 반응시켜 실시한다. 염기의 양으로는 촉매량 내지 과잉몰, 바람직하게는 0.1 내지 10 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
B-4 공정 (4b) → (5b) : 산화 반응
A 법 A-8 공정에 따라 제조된다.
B-5 공정 (5b) → (6b) : 에놀술포닐화 반응
Rb 가 트리플루오로메탄술포닐기인 경우, 화합물 (5b) 를 용매 (디클로로메탄 등) 중에서, -78 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 -78 ℃ 내지 30 ℃ 에 있어서, 트리플루오로메탄술폰산 무수물 등을 반응시켜 실시한다. 필요에 따라, 염기 (2,6-루티딘 등) 를 첨가하여 실시한다. 트리플루오로메탄술폰산 무수물은 화합물 (5b) 의 1 몰에 대해 1 몰 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 몰 내지 5 몰을 사용한다. 염기는 1 몰 내지 10 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 24 시간, 바람직하게는 30 분 내지 6 시간이다.
B-6 공정 (6b) → (7b) : 천이 금속 촉매 크로스 커플링 반응 (예를 들어, 스즈키-미야우라 반응 등)
화합물 (6b) 를 용매 (에탄올, 톨루엔, 1,4-디옥산, DMF, 테트라하이드로푸란, 물 등 또는 이들의 혼합 용매) 중에서, 0 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 120 ℃ 에 있어서, 천이 금속 촉매 (테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐, 디클로로비스(벤조니트릴)팔라듐 (II) 등) 존재하, 유기 붕소 화합물 (4-메톡시페닐보론산 등) 을 사용하여 실시한다. 필요에 따라, 염기 (탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산세슘, 탄산수소나트륨, 수산화나트륨 등), 첨가제 (산화은, 트리페닐아르신 등) 를 첨가하여 실시한다. 팔라듐 촉매는 화합물 (6b) 의 1 몰에 대해 0.01 몰 내지 1 몰, 바람직하게는 0.01 몰 내지 0.5 몰을 사용한다. 또, 화합물 (6b) 의 1 몰에 대해, 유기 붕소 화합물은 1 몰 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 몰 내지 10 몰을 사용하고, 염기는 1 몰 내지 5 몰, 첨가제는 0.1 몰 내지 5 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
B-7 공정 (7b) → (8b) : 환원 반응
예를 들어 PRO6 이 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸기인 경우, 화합물 (7b) 를 용매 (디에틸에테르, THF, 디클로로메탄, 에탄올 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -78 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 -78 ℃ 부터 50 ℃ 까지에 있어서, 환원제 (수소화붕소리튬, 수소화붕소나트륨 등) 로 처리함으로써 실시된다. 환원제는, 화합물 (7b) 의 1 몰에 대해 1 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 30 몰을 사용한다. 반응 시간은 1 분 내지 24 시간, 바람직하게는 5 분 내지 6 시간이다. 환원 반응에 의해 얻어지는 미정제 생성물의 용액 (디클로로메탄, 에탄올, 물 또는 그들의 혼합 용매) 에, 실리카 겔을 첨가하고, 교반 처리함으로써 화합물 (8b) 를 제조할 수 있다. 실리카 겔은, 화합물 (7b) 에 대해 과잉량 사용한다. 처리 시간은, 12 시간 내지 150 시간, 바람직하게는 12 시간 내지 100 시간이다.
B-8 공정 (8b) → (9b) : 이미노기의 환원
화합물 (8b) 를 용매 (THF, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -78 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 -78 ℃ 부터 50 ℃ 까지에 있어서, 환원제 (수소화붕소나트륨, 시아노수소화붕소, 수소화트리아세톡시붕소나트륨, 2-피콜린보란, 피리딘보란 등) 로 처리함으로써 실시된다. 환원제는, 화합물 (8b) 의 1 몰에 대해 1 내지 과잉 몰, 바람직하게는 1 내지 5 몰을 사용한다. 반응 시간은 1 분 내지 60 시간, 바람직하게는 5 분 내지 24 시간이다.
B-9 공정 (9b) → (10b) : 보호기의 도입
PRO8 이 알릴옥시카르보닐기인 경우, 화합물 (9b) 를 용매 (벤젠, 톨루엔, 피리딘, 디에틸에테르, 디클로로메탄, THF, 1,4-디옥산, 물 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -30 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 50 ℃ 에 있어서, 클로로포름산알릴, 디탄산디알릴에스테르 등과 반응시켜 실시한다. 필요에 따라, 염기 (트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 피리딘, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 수산화나트륨 등) 를 첨가하여 실시한다. 화합물 (9b) 의 1 몰에 대해, 클로로포름산알릴은 1 몰 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 몰 내지 10 몰 사용하고, 염기는 1 몰 내지 과잉량, 바람직하게는 1 내지 10 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 10 분 내지 48 시간이다.
PRO8 이 2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐기인 경우,
화합물 (9b) 를 용매 (벤젠, 톨루엔, 피리딘, 디에틸에테르, 디클로로메탄, THF, 1,4-디옥산, 물 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -30 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 50 ℃ 에 있어서, 클로로포름산 2,2,2-트리클로로에틸 등과 반응시켜 실시한다. 필요에 따라, 염기 (트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 피리딘, 탄산나트륨, 수산화나트륨 등) 를 첨가하여 실시한다. 화합물 (9b) 의 1 몰에 대해, 클로로포름산 2,2,2-트리클로로에틸은 1 몰 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 몰 내지 10 몰 사용하고, 염기는 1 몰 내지 과잉량, 바람직하게는 1 내지 10 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 48 시간이다.
C 법
본 제조법은 화합물 (1) 중, R11 과 R12 가 하나로 합쳐져, 각각의 기가 결합하는 탄소 원자와 함께 이중 결합을 형성하고, R14, R15 가 수소인 화합물을 제조하기 위해서 필요한 중간체, 화합물 (14c) 를 제조하는 방법이다. 또 화합물 (10b) 는, 본 제조법으로도 제조할 수 있다.
[화학식 105]
Figure pct00105
C-1 공정 (1c) → (2c) : 보호기의 도입
PRO5 가 아세틸기인 경우, 화합물 (1c) 를 용매 (디클로로메탄, DMF, 피리딘, THF, 1,4-디옥산 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -20 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 100 ℃ 에 있어서, 아세틸화 시제 (무수 아세트산, 염화아세틸 등) 와 반응시켜 실시한다. 필요에 따라, 염기 (트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 피리딘, 4-디메틸아미노피리딘 등) 를 첨가하여 실시한다. 화합물 (1c) 의 1 몰에 대해 아세틸화제는 1 몰 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 몰 내지 20 몰, 염기는 촉매량 내지 과잉몰, 바람직하게는 0.1 내지 20 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
PRO5 가 TBDMS 기인 경우, A 법 A-2 공정에 따라 제조된다.
C-2 공정 ∼ C-5 공정 및 C-7 공정 ∼ C-14 공정
C-2 공정은 A 법의 A-5 공정, C-3 공정은 B 법의 B-9 공정, C-4 공정은 A 법 A-7 공정, C-5 공정은 A 법 A-8 공정, C-7 공정은 B 법 B-8 공정, C-8 공정은 B 법의 B-9 공정, C-9 공정은 B 법 B-3 공정, C-10 공정은 A 법의 A-8 공정, C-11 공정은 B 법의 B-5 공정, C-12 공정은 B 법의 B-6 공정, C-13 공정은 A 법의 A-10 공정, C-14 공정은 A 법 A-11 공정에 따라 제조된다.
C-6 공정 (6c) → (7c) : 탈보호기화 반응
PRO9 가 2'2'2'-트리클로로에톡시카르보닐기인 경우, 화합물 (6c) 를 용매 (THF, 아세트산, 아세트산암모늄 수용액, 물 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -20 ℃ 내지 용매의 비점, 바람직하게는 0 ℃ 내지 40 ℃ 에 있어서, 금속 시약 (아연, 아연-납 합금, 카드뮴, 카드뮴납 등) 과 반응시켜 실시한다. 금속 시제는, 화합물 (6c) 의 1 몰에 대해 1 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 10 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
PRO9 가 알릴옥시카르보닐기인 경우, 화합물 (6c) 를 용매 (디클로로메탄, DMF, THF 등 또는 그들의 혼합물) 중에서, 0 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 30 ℃ 에 있어서, 팔라듐 촉매 (테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 등) 와 알릴기의 포착제 (피롤리딘, 모르폴린, 바르비투르산 등) 를 사용하여 실시한다. 팔라듐 촉매는 화합물 (6c) 의 1 몰에 대해 0.005 몰 내지 1 몰, 바람직하게는 0.005 몰 내지 0.5 몰을 사용한다. 알릴기의 보착제는 1 몰 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 몰 내지 10 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
D 법
화합물 (13c) 는, 본법으로도 제조할 수 있다.
[화학식 106]
Figure pct00106
D-1 공정 ∼ D-6 공정, D-9 공정, D-10 공정
D-1 공정은 B 법의 B-6 공정, D-2 공정은 A 법의 A-5 공정, D-3 공정은 B 법의 B-9 공정, D-4 공정은 A 법 A-7 공정, D-5 공정은 A 법 A-8 공정, D-6 공정은 C 법 C-6 공정, D-9 공정은 B 법 B-8 공정, D-10 공정은 B 법의 B-9 공정에 따라 제조된다.
D-7 공정 및 D-8 공정
화합물 (7d) 는, B 법 B-6 공정과 동일한 D-7 공정, B 법 B-7 공정과 동일한 D-8 공정에 따라 제조할 수도 있다.
E 법
E 법은, A 법으로 제조되는 화합물 (11a) 및 (12a) 와 B 법 또는 C 법으로 제조되는 화합물 (10b) 및 (14c) 를 결합시켜 화합물 (4e) 를 제조하는 방법이다.
[화학식 107]
Figure pct00107
E-1 공정
본 공정은, A 법으로 제조되는 화합물 (11a) 와 B 법으로 제조되는 화합물 (10b) 의 커플링 반응에 의해, 화합물 (1e) 를 제조하는 공정이다.
화합물 (11a) 를 용매 (THF, DMF, N,N-디메틸아세트아미드 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -20 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 부터 50 ℃ 까지에 있어서, 염기 (탄산칼륨, 탄산세슘 등) 존재하, 화합물 (10b) 와 커플링 반응시킴으로써 제조된다. 화합물 (10b) 는, 화합물 (11a) 의 0.5 몰에 대해 1 몰 내지 과잉몰, 바람직하게는 0.7 내지 1.5 몰을 사용한다. 염기는 1 내지 5 몰을 사용한다. 반응 시간은 1 분 내지 60 시간, 바람직하게는 5 분 내지 24 시간이다.
E-2 공정
화합물 (1e) 는, A 법으로 제조되는 화합물 (12a) 와 C 법으로 제조되는 화합물 (14c) 에 대해, E-1 공정과 동일하게 커플링 반응을 실시함으로써도 제조할 수 있다.
E-3 공정
E-3 공정은, A 법 A-7 공정에 따라 제조된다.
E-4 공정
본 공정은, 화합물 (2e) 에서 PRO4 와 PRO8 이 동일한 보호기인 경우, C 법 C-6 공정과 동일하게 탈보호기화 반응시킴으로써 화합물 (4e) 를 제조하는 공정이다.
화합물 (2e) 의 PRO4 와 PRO8 이 상이한 보호기인 경우, 화합물 (4e) 는 탈보호화 반응을 E-5 공정 및 E-6 공정을 거쳐 단계적으로 실시함으로써 제조할 수도 있다.
E-5 공정 및 E-6 공정은, C 법 C-6 공정에 따라 제조된다.
F 법
화합물 (4e) 는, 본 합성법의 중간체 화합물 (10f) 로부터도 제조할 수 있다. 본 제조법은, 화합물 (10f) 및 화합물 (4e) 를 제조하는 방법을 나타낸다.
[화학식 108]
Figure pct00108
F-1 공정 ∼ F-10 공정, F-15 공정
F-1 공정은 A 법 A-2 공정, F-2 공정은 B 법 B-3 공정, F-3 공정은 A 법의 A-8 공정, F-4 공정은 B 법의 B-5 공정, F-5 공정은 B 법의 B-6 공정, F-6 공정은 A 법 A-2 공법, F-7 공정은 A 법의 A-10 공정, F-8 공정은 A 법 A-11 공정, F-9 공정은 E 법 E-1 공정, F-10 공정은 E 법 E-1 공정, F-15 공정은 B 법 B-8 공정에 따라 제조된다.
F-11 공정
PRO10 과 (R17)' 에 있어서의 수산기의 보호기가 함께 TBDMS 기인 경우, A 법 A-7 공정에 따라 제조된다.
F-12 공정
본 공정은 화합물 (9f) 에서 보호기 PRO4 와 PRO9 가 동일한 경우, C 법 C-6 공정과 동일하게 탈보호기화 반응시킴으로써 화합물 (10f) 를 제조하는 공정이다.
F-13 공정 및 F-14 공정
화합물 (9f) 의 PRO4 와 PRO9 가 상이한 보호기인 경우, 화합물 (10f) 는 탈보호기화 반응을 F-13 공정 및 F-14 공정을 거쳐 단계적으로 실시함으로써 제조할 수도 있다. F-13 공정 및 F-14 공정은 C 법 C-6 공정에 따라 제조된다.
G 법
본 제조법은, 화합물 (1) 중, R11 이 수소 원자를 나타내고, R12 및 R13 은 하나로 합쳐져 스피로 고리를 형성하고, R14, R15 가 수소 원자를 나타내는 화합물을 제조하기 위한 중간체, 화합물 (11g) 를 제조하는 방법이다.
[화학식 109]
Figure pct00109
G-1 ∼ G-2 공정, G-5 ∼ G-11 공정,
G-1 공정은 A 법의 A-4 공정, G-2 공정은 A 법의 A-5 공정, G-5 공정은 A 법 A-11 공정, G-6 공정은 B 법 B-7 공정, G-7 공정은 B 법 B-8 공정, G-8 공정은 B 법 B-9 공정, G-9 공정은 E 법 E-1 공정, G-10 공정은 A 법 A-7 공정, G-11 공정은 C 법 C-6 공정에 따라 제조된다.
G-3 공정 : 보호기의 도입
화합물 (2g) 를 용매 (THF, DMF, 디옥산 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -78 ℃ 부터 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 50 ℃ 에 있어서, 클로로메톡시에테르계 시약 (2-(클로로메톡시)에틸트리메틸실란, 클로로메틸메틸에테르, 벤질클로로메틸에테르 등) 과 반응시켜 실시한다. 필요에 따라, 염기 (수소화나트륨, n-부틸리튬, 헥사메틸디실라잔리튬) 를 첨가하여 실시한다. 시약은, 화합물 (2 g) 의 1 몰에 대해, 1 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 5 몰을 사용한다. 염기는, 화합물 (2g) 의 1 몰에 대해, 1 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 5 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
G-4 공정
PRO7 이 벤질기인 경우, A 법 A-3 공정에 따라 제조된다.
PRO7 이 트리이소프로필실릴기인 경우, A 법 A-10 공정에 따라 제조된다.
H 법
본 제조법은, 화합물 (1) 중, R11 이 수소 원자를 나타내고, R12 및 R13 은 하나로 합쳐져 스피로 고리를 형성하고, R14, R15 가 하나로 합쳐져, 이민 결합 (C=N) 인 화합물을 제조하기 위한 중간체, 화합물 (9h) 를 제조하는 방법이다. 본 제조법에 있어서는 R12 및 R13 으로 형성하는 스피로 고리는 E 와 동의이기 때문에, 표기도 E 로 나타낸다.
[화학식 110]
Figure pct00110
H-1 공정 ∼ H-10 공정
H-1 공정은 A 법의 A-4 공정, H-2 공정은 A 법의 A-1 공정, H-3 공정은 C 법 C-1 공정, H-4 공정은 A 법의 A-4 공정, H-5 공정은 A 법의 A-5 공정, H-6 공정은 B 법 B-9 공정, H-7 공정은 A 법 A-6 공정, H-8 공정은 B 법 B-3 공정, H-9 공정은 A 법 A-8 공정, H-10 공정은 C 법 C-6 공정에 따라 제조된다.
I 법
본 제조법은 화합물 (1) 중, R11 과 R12 가 하나로 합쳐져 벤젠 고리를 형성하고, R13 은 단결합이며, R14, R15 가 하나로 합쳐져 이민을 형성하는 화합물을 제조하기 위한 중간체, 화합물 (11i) 를 제조하는 방법이다.
[화학식 111]
Figure pct00111
I-1 공정 ∼ I-11 공정
I-1 공정은 A 법의 A-4 공정, I-2 공정은 A 법의 A-5 공정, I-3 공정은 B 법 B-9 공정, I-4 공정은 A 법 A-7 공정, I-5 공정은 A 법 A-8 공정, I-6 공정은 A 법 A-2 공정, I-7 공정은 A 법의 A-10 공정, I-8 공정은 A 법의 A-11 공정, I-9 공정은 E 법 E-1 공정, I-10 공정은 A 법 A-7 공정, I-11 공정은 C 법 C-6 공정에 따라 제조된다.
J 법
본 제조법은 화합물 (1) 중, R12 와 R13 이 하나로 합쳐져 CH2= 를 형성하고 R11 은 수소이며, R14, R15 가 하나로 합쳐져 이민을 형성하는 화합물의 중간체, 화합물 (12j) 의 제조 방법이다.
[화학식 112]
Figure pct00112
J-1 공정
본 공정은, 화합물 (1j) 에 대해 Wittig 반응시킴으로써, 화합물 (2j) 를 제조하는 공정이다.
J-2 공정 : 보호기 도입
PRO7 이 트리이소프로필실릴기인 경우, 화합물 (2j) 를 용매 (디클로로메탄, 아세토니트릴, THF, DMF 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -20 ℃ 부터 120 ℃ 까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 100 ℃ 에 있어서, 실릴화 시제 (트리이소프로필실릴클로라이드, 트리이소프로필실릴트리플레이트 등) 와 반응시켜 실시한다. 필요에 따라, 염기 (이미다졸, 피리딘, 2,6-루티딘, 4-디메틸아미노피리딘, 수소화나트륨 등) 를 첨가하여 실시한다. 화합물 (2a) 의 1 몰에 대해, 실릴화제는 1 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 3 몰 사용하고, 염기는 1 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 5 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
J-3 공정 ∼ J-11 공정
J-3 공정은 A 법의 A-5 공정, J-4 공정은 B 법의 B-9 공정, J-5 공정은 A 법 A-7 공정, J-6 공정은 A 법 A-8 공정, J-7 공정은 A 법 A-2 공정, J-8 공정은 A 법의 A-10 공정, J-9 공정은 E 법의 E-1 공정, J-10 공정은 A 법 A-7 공정, J-11 공정은 C 법 C-6 공정에 따라 제조된다.
K 법
K 법은, 화합물 (1) 중, R11 과 R12 가 하나로 합쳐져, 각각의 기가 결합하는 탄소 원자와 함께 이중 결합을 형성하고, R13 은 하이드록시메틸기이며, R14, R15 가 하나로 합쳐져 이민을 형성하는 화합물을 제조하기 위해서 필요한 중간체, 화합물 (7k) 를 제조하는 방법이다.
[화학식 113]
Figure pct00113
K-1 공정
본 공정은, 화합물 (6b) 에 대해 카르보닐화 반응을 실시하여, 화합물 (1k) 를 제조하는 공정이다.
K-2 공정
본 공정은, 화합물 (1k) 에 대해 알데하이드 선택적인 환원 반응을 실시함으로써, 화합물 (2k) 를 제조하는 공정이다.
K-3 공정 ∼ K-7 공정
K-3 공정은 A 법 A-2 공정, K-4 공정은 B 법 B-7 공정, K-5 공정은 E 법 E-1 공정, K-6 공정은 A 법 A-7 공정, K-7 공정은 C 법 C-6 공정에 따라 제조된다.
L 법
L 법은, 화합물 (B) 의 대표적인 제조 방법이다.
[화학식 114]
Figure pct00114
일반식 (Lp')' 로 나타내는 펩티드 잔기는, 아미노산의 축합 반응에 의해 제조할 수 있다.
PRO4 는 펩티드 잔기 (Lp')' 에서의 N 말단을 보호하고 있고, PRO12 는 C 말단을 보호하고 있다.
L-1 공정
L-1 공정은, B 법 B-9 공정에 따라 제조된다.
L-2 공정 : 탈보호기화 반응
PRO12 가 tert-부틸기인 경우, 화합물 (2l) 을 용매 (디클로로메탄 등) 중에서, 0 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 40 ℃ 에 있어서, 산 (트리플루오로아세트산, p-톨루엔술폰산, 염산, 아세트산 등) 과 반응시켜 실시한다. 산은, 화합물 (2l) 의 1 몰에 대해 촉매량 내지 과잉몰 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
L-3 공정 ∼ L-4 공정
L-3 공정은 B 법 B-9 공정, L-4 공정은 A 법의 A-4 공정에 따라 제조된다.
L-5 공정
화합물 (B) 는, B 법 B-9 공정에 따라 L-5 공정에 의해서도 제조할 수 있다.
M 법
M 법은, 화합물 (2) 의 제조 방법이다.
본 제조 방법으로 나타내는 화합물 (2) 는, 화합물 (1) 중, 본 발명의 제조 중간체에 있어서의 R6 이 J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-* 와 동의이다.
[화학식 115]
Figure pct00115
상기 제조 방법으로 나타내는 화합물 (1m) 은 E 내지 K 법으로 제조된 화합물 (4e), (4f), (11g), (9h), (11i), (12j), (7k), (8k) 를 나타낸다.
상기 제조 방법으로 나타내는 (PBD)' 는,
[화학식 116]
Figure pct00116
을 나타내고,
PBD 는
[화학식 117]
Figure pct00117
을 나타낸다.
(PBD)' 는 PBD 중의 R13 상의 치환기 (수산기 등) 가 보호기로 보호되고 있어도 되고, 보호기가 없는 경우에는 PBD 와 동의 (R13=(R13)') 이다.
상기 제조 방법 중에 (Lp')''t-(Lp')' 로 나타내는 펩티드 잔기는, Lp' 로 나타내는 아미노산 잔기의 측사슬 상 관능기 (아미노기 등) 가 보호기로 보호되고 있어도 되고, 보호기가 무치환인 경우에는 Lp' 와 동의이다.
여기서, (Lp')' 는, 이하에 나타내는 바와 같은 2 개의 아미노산 서열을 나타내고, 측사슬에 관능기 (아미노기, 수산기) 가 있는 경우에는 보호되고 있어도 된다.
-VA-, (D-)VA-, -FG-, -PI-, -VCit-, -VK-, -PL-, -(D-)P-I-, 또는 -GF-
(Lp')'' 는, 이하에 나타내는 바와 같은 2 ∼ 4 개의 아미노산 서열을 나타내고, 측사슬에 관능기 (아미노기, 수산기) 가 존재하는 경우에는 보호되어 있어도 된다.
-GG-, -EGG-, -DG-, -(D-)DG-, -EG-, -GGF-, -SG-, -KG-, -DGG-, -GGF-, -DDGG-, -KDGG-, 또는 -GGFG-
(La')' 는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타낸다.
-C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O), -C(=O)-(CH2CH2)n6-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n7-CH2CH2-C(=O)-, -(CH2)n8-O-C(=O)-, -(CH2)n12-C(=O)-, 및,
-(CH2CH2)n13-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n14-CH2CH2-C(=O)-
(La')'' 는 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타낸다.
-NH-(CH2CH2)n7-C(=O)-, 또는 -NH-(CH2CH2O)n7-CH2-C(=O)-,
s 또는 t 는 각각 독립적으로 0 또는 1 을 나타낸다.
예를 들어, 하기 M-1 공정은 s 및 t 는 0, M-3 공정은 s 는 1, t 는 0, M-5 공정은 s 는 0, t 는 1 인 경우이다.
(La')'-(La')''s 는 La' 와 동의이다.
(Lp')''t-(Lp')' 는 보호기가 있는 경우, 탈보호함으로써 Lp' 가 되지만, 보호기가 없는 경우에는 Lp' 와 동의이다.
상기 제조 방법 중에 나타내는 Lx 는 수소 원자 또는 탈리기 (하이드록시숙신이미드 등) 를 나타낸다.
상기 제조 방법 중에 나타내는 1m, 9m, 10m, 11m, 화합물 (2) 에 있어서의 PBD 또는 (PBD)' 는 아스테리스크 (N10' 위치) 에서 -O-C(=O)- 의 우단의 C(=O)- 와 결합하고 있는 것을 나타낸다.
M-1 공정
본 공정은, E 내지 K 법으로 제조되는 화합물 (1m) 과 화합물 (2m) 의 축합 반응을 실시하여, 화합물 (11m) 을 제조하는 방법이다.
Lx=H 에서 화합물 (2m) 이 카르복실산인 경우, A 법 A-4 공정에 따라, 화합물 (2m) 을 제조할 수 있다.
Lx 가 탈리기 (하이드록시숙신이미드나 p-니트로페녹시기 등) 인 경우, 화합물 (1m) 을 용매 (벤젠, 톨루엔, 디에틸에테르, 디클로로메탄, THF, DMF, 메탄올, 물 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -30 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 50 ℃ 에 있어서, 화합물 (2m) 과 반응시켜 실시한다. 화합물 (1m) 의 1 몰에 대해 화합물 (2m) 은 0.9 내지 과잉몰, 바람직하게는 0.9 내지 2 몰을 사용한다. 또, 필요에 따라, 염기 (트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린, 4-디메틸아미노피리딘, 디아자비시클로운데센 등) 를 첨가하여 실시한다. 화합물 (1m) 의 1 몰에 대해 염기는, 1 몰 내지 과잉량, 바람직하게는 1 내지 5 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 36 시간이다.
M-2 공정 ∼ M-5 공정 및 M-8 공정
M-2 공정은 M-1 공정, M-3 공정은 A 법 A-4 공정, M-4 공정은 M-1 공정, M-5 공정은 A 법 A-4 공정, M-8 공정은 A 법 A-4 공정에 따라 제조된다.
M-6 공정
본 공정은, 화합물 (6m) 에 대해, 축합 반응을 실시하여, 활성 에스테르 중간체 (7m) 을 제조하는 공정이다.
화합물 (6m) 을 용매 (벤젠, 톨루엔, 디에틸에테르, 디클로로메탄, THF, DMF 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -30 ℃ 부터 반응에 사용하는 용매의 비점까지, 바람직하게는 0 ℃ 내지 50 ℃ 에 있어서, N,N-디시클로헥실카르보디이미드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 등의 축합제의 존재하, 하이드록시숙신이미드 등과 반응시켜 실시한다. 축합제는, 화합물 (6m) 의 1 몰에 대해 1 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 5 몰을 사용한다. 하이드록시숙신이미드는, 화합물 (6m) 의 1 몰에 대해 1 몰 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 몰 내지 5 몰을 사용한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 30 분 내지 24 시간이다.
M-7 공정
본 공정은, 화합물 (1m) 과 화합물 (7m) 을 M-1 공정과 동일하게 축합 반응을 실시하여, 화합물 (11m) 을 제조하는 공정이다.
M-9 공정
본 공정은, 화합물 (9m) 에 대해, 탈보호화 반응을 실시하여, 화합물 (10m) 을 제조하는 공정이다. PRO4 가 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기인 경우, 화합물 (9m) 을 용매 (THF, 디클로로메탄, DMF 등 또는 그들의 혼합 용매) 중에서, -20 ℃ 내지 용매의 비점, 바람직하게는 0 ℃ 내지 40 ℃ 에 있어서, 염기 (1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센, 피페리딘 등) 와 반응시켜 실시한다. 화합물 (9m) 의 1 몰에 대해, 염기는 1 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 내지 10 몰을 사용한다. 반응 시간은 1 분 내지 72 시간, 바람직하게는 5 분 내지 24 시간이다.
M-10 공정
본 공정은, 화합물 (10m) 과 화합물 (2m) 또는 (4m) 을 A 법 A-4 공정과 동일한 축합 반응을 실시하여, 화합물 (11m) 을 제조하는 공정이다.
M-11 공정
본 공정은, 화합물 (11m) 에서 (Lp')"t-(Lp')' 또는 PBD' 가 보호기를 갖는 경우, 탈보호화를 실시함으로써, 화합물 (2) 를 제조하는 공정이다. B 법 B-3 공정 및 C 법 C-6 공정에 따라 제조된다.
또, (Lp')' 또는 PBD' 에 보호기가 없는 경우 M-11 공정은 생략되고, 그 경우, 화합물 (11m) 은 (2) 와 동의이다.
N 법
N 법은 (1) 로 나타내는 유리 약물 중, R11 과 R12 가 하나로 합쳐져 각각의 기가 결합하는 탄소 원자와 함께 이중 결합을 형성하고, R14, R15 가 수소이며, R16 과 R17 이 하나로 합쳐져, 이민 결합을 형성하는 화합물의 합성법을 나타낸다.
[화학식 118]
Figure pct00118
N-1 공정 ∼ N-8 공정
N-1 공정은 B 법의 B-9 공정, N-2 공정은 A 법 A-7 공정, N-3 공정은 A 법 A-8 공정, N-4 공정은 A 법 A-2 공정, N-5 공정은 A 법 A-10 공정, N-6 공정은 A 법 A-11 공정, N-7 공정은 E 법 E-1 공정, N-8 공정은 E 법 E-1 공정에 따라 제조된다.
(R13)'=R13 인 경우, 이하의 N-9 공정 및 N-10 공정에 따라 제조한다.
N-9 공정
N-9 공정은, A 법 A-7 공정에 따라 제조된다.
N-10 공정
PRO4 와 PRO8 이 동일한 보호기인 경우, E 법 E-4 공정에 따라 제조된다. PRO4 와 PRO8 이 상이한 보호기인 경우, E 법 E-5 및 6 공정에 따라 제조된다.
(R13)' 가 보호기를 가지는 경우, 이하의 N-11 공정 및 N-12 공정에 따라 제조한다.
N-11 공정
B 법 B-3 공정에 따라 제조된다.
N-12 공정
PRO4 와 PRO8 이 동일한 보호기인 경우, E 법 E-3 및 4 공정에 따라 제조된다. PRO4 와 PRO8 이 상이한 보호기인 경우, E 법 E-3, 5 및 6 공정에 따라 제조된다.
O 법
O 법은, (1) 로 나타내는 유리 약물 중, R11 과 R12 가 하나로 합쳐져, 각각의 기가 결합하는 탄소 원자와 함께 이중 결합을 형성하고, R14 와 R15 및 R16 과 R17 이 하나로 합쳐져, 이민 결합 (C=N) 인 화합물 (6o) 를 제조하는 방법이다.
[화학식 119]
Figure pct00119
O-1 공정 ∼ O-6 공정
O-1 공정은 E 법 E-1 공정, O-2 공정은 B 법 B-3 공정, O-3 공정은 A 법의 A-8 공정, O-4 공정은 B 법의 B-5 공정, O-5 공정은 B 법의 B-6 공정, O-6 공정은 B 법 B-7 공정에 따라 제조된다.
P 법
본 제조법은 (1) 로 나타내는 유리 약제 중, R11 이 수소 원자를 나타내고, R12 및 R13 은 하나로 합쳐져 스피로 고리를 형성하고, R14 와 R15 및 R16 과 R17 이 하나로 합쳐져, 이민 결합 (C=N) 인 화합물을 제조하는 방법이다. 본 제조법에 있어서, 출발 원료인 화합물 (4h) 로 나타내는 R12 및 R13 으로 형성하는 스피로 고리는 E 와 동의이기 때문에, 표기도 E 로 나타낸다.
[화학식 120]
Figure pct00120
P-1 공정 ∼ P-4 공정
P-1 공정은 B 법의 B-9 공정, P-2 공정은 B 법 B-3 공정, P-3 공정은 A 법 A-8 공정, P-4 공정은 C 법 C-6 공정에 따라 제조된다.
Q 법
본 제조법은 (1) 로 나타내는 유리 약제 중, R11, R14 와 R15 가 수소 원자를 나타내고, R12 및 R13 은 하나로 합쳐져 스피로 고리를 형성하고, 및 R16 과 R17 이 하나로 합쳐져, 이민 결합 (C=N) 인 화합물을 제조하는 방법이다.
[화학식 121]
Figure pct00121
Q-1 공정 ∼ Q-6 공정
Q-1 공정은 A 법의 A-1 공정, Q-2 공정은 A 법 A-8 공정, Q-3 공정은 A 법 A-5 공정, Q-4 공정은 E 법 E-1 공정, Q-5 공정은 A 법 A-7 공정, Q-6 공정은 C 법 C-6 공정에 따라 제조된다.
상기에 있어서, 보호되어도 되는, 아미노기, 하이드록시기 보호기란, 가수소분해, 가수분해, 전기분해, 광분해와 같은 화학적 방법에 의해 개열할 수 있는 보호기를 말하고, 유기 합성 화학에서 일반적으로 사용되는 보호기를 나타낸다 (예를 들어, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. (1999년) 참조).
상기에 있어서, 보호되어도 되는 하이드록시기의 「보호기」(예를 들어, 알킬카르보닐기, 실릴기 또는 아르알킬기), 보호되어도 되는 카르복시기의 「보호기」(예를 들어, C1-C6 알킬기 또는 아르알킬기), 보호되어도 되는 아미노기의 「보호기」(예를 들어, 알콕시카르보닐기) 는, 유기 합성 화학의 분야에서 사용되는 하이드록시기, 카르복시기, 아미노기의 보호기이면 특별히 한정은 되지 않는다.
보호·탈보호가 필요한 공정은, 이미 알려진 방법 (예를 들어, "Protective Groups in Organic Synthesis" (Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts 저, 1999년, Wiley-Interscience Publication 발행) 등에 기재된 방법) 에 준해 실시된다.
R 법 : 항체의 조제
당사슬 리모델링 항체, 예를 들어 WO2013/120066 등에 기재된 방법에 준해, 도 3 에 나타내는 바와 같은 방법으로 제조할 수 있다.
[화학식 122]
Figure pct00122
R-1 공정 환원 말단의 키토비오스 구조의 GlcNAcβ1- 4GlcNAc 간의 글리코사이드 결합의 가수분해
본 공정은 목적의 항체에 대해, 공지된 효소 반응을 이용하여 항체의 아미노산 서열 297 번째의 아스파르트산에 결합하는 N 결합형 당사슬 (N297 결합 당사슬) 을 절단하여, 당사슬 절단 항체를 조제하는 공정이다.
목적의 항체 (20 mg/ml) 를 완충 용액 (50 mM 인산 완충 용액 등) 중, 0 ℃ 부터 40 ℃ 까지에 있어서, EndoS 효소 등의 가수분해 효소를 사용하여 환원 말단의 키토비오스 구조의 GlcNAcβ1 과 4GlcNAc 간의 글리코사이드 결합의 가수분해 반응을 실시한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 6 시간이다. 야생형 EndoS 효소는 항체 100 mg 에 대해, 0.1 내지 10 mg, 바람직하게는 0.1 내지 3 mg 을 사용한다. 반응 종료 후, 후술하는 어피니티 크로마토그래피 정제 및/또는 하이드록시 아파타이트 칼럼 정제를 실시함으로써 GlcNAcβ1 과 4GlcNAc 간의 당사슬이 가수분해된 (Fucα1,6)GlcNAc 항체를 제조할 수 있다.
R-2 공정 당사슬 전이 반응
본 공정은 상기 서술한 (Fucα1,6)GlcNAc 항체에 대해, 효소 반응을 이용하여 아지드기를 포함하는 PEG 링커를 갖는 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 당사슬 옥사졸린체 (이하, 「아지드 당사슬 옥사졸린체」) 를 결합시켜, 당사슬 리모델링 항체를 제조하는 공정이다.
상기 당사슬 절단 항체를 완충 용액 (인산 완충 용액 등) 중, 0 ℃ 부터 40 ℃ 까지에 있어서, 촉매량의 EndoS (D233Q/Q303L) 등의 당전이 효소 존재하, 아지드 당사슬 옥사졸린체와 반응시킴으로써, 당사슬 전이 반응을 실시한다. 반응 시간은 10 분 내지 72 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 6 시간이다. EndoS 효소 (D233Q/Q303L) 는 항체 100 mg 에 대해, 1 내지 10 mg, 바람직하게는 1 내지 3 mg 을 사용하고, 아지드 당사슬 옥사졸린체는 2 내지 과잉 당량, 바람직하게는 2 내지 20 당량을 사용한다.
반응 종료 후, 어피니티 크로마토그래피 정제와 하이드록시 아파타이트 칼럼 정제를 실시함으로써 정제한 당사슬 리모델링 항체를 얻을 수 있다.
아지드 당사슬 옥사졸린체는 실시예 55 ∼ 57 에 기재된 방법에 따라 조제할 수 있다. MSG (MSG1, MSG2) 또는 디시알로옥타사카라이드 (토쿄 화성 공업 (주)) 에 유기 합성 과학 분야에서 공지된 반응 (축합 반응 등) 을 이용하여, 아지드기를 포함하는 PEG 링커 (N3-L(PEG)) 인 N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2 를 도입할 수 있다. 즉, 시알산 2 위치에의 카르복실산과 N3-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH2 의 우말단의 아미노기가 축합 반응에 의해 아미드 결합을 형성한다.
축합 반응을 이용하는 경우, 축합제로는, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDCI), 카르보닐디이미다졸 (CDI), 2-(2H-벤조트리아졸-2-일)-4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페놀 (BOP), 1H-벤조트리아졸-1-일옥시트리피롤리디노포스포늄헥사플루오로인산염 (PyBOP), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로인산염 (HATU) 등을, 반응에 사용되는 용매로는, 디클로로메탄, DMF, THF, 아세트산에틸 등, 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다.
반응 온도는, 통상 -20 ℃ 내지 100 ℃ 혹은 용매의 비점까지의 범위이지만, 바람직하게는 -5 ℃ 부터 50 ℃ 까지의 범위이다. 또, 필요에 따라 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸모르폴린 또는 4-디메틸아미노피리딘 등의 유기 염 기, 또는 탄산칼륨, 탄산나트륨, 탄산수소칼륨, 탄산수소나트륨 등의 무기 염기를 첨가할 수 있다. 또한, 1-하이드록시벤조트리아졸, N-하이드록시숙신이미드 등을 반응 촉진제로서 첨가할 수도 있다.
또한, MSG, MSG1 또는 MSG2 는, 상기 (MSG-)Asn 또는 분리 정제한 (MSG1-)Asn 혹은 (MSG2-)Asn (실시예 56) 을 EndoM 등의 가수분해 효소로 가수분해함으로써 얻을 수 있다.
옥사졸린화는 MSG (MSG1, MSG2) 또는 SG 형 당사슬의 환원 말단의 GlcNAc 로부터, 공지된 논문 (J. Org Chem., 2009, 74 (5), 2210-2212. Helv. Chim. Acta, 2012, 95, 1928-1936.) 에 따라 조제할 수 있다.
상기 당사슬 리모델링 항체의 조제에 있어서, 항체 수용액의 농축, 농도 측정, 버퍼 교환은 이하의 공통 조작 A 내지 C 에 따라 실시할 수 있다.
공통 조작 A : 항체 수용액의 농축
Amicon Ultra (30,000 내지 50,000 MWCO, Millipore Co.) 의 용기 내에 항체 또는 항체-약물 콘쥬게이트 용액을 넣고, 원심기 (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.) 를 사용한 원심 조작 (2000 G 내지 4000 G 로 5 내지 20 분간 원심) 으로, 항체 및 후술하는 항체-약물 콘쥬게이트 용액을 농축하였다.
공통 조작 B : 항체의 농도 측정
UV 측정기 (Nanodrop 1000, Thermo Fisher ScientificInc.) 를 사용하고, 메이커 규정의 방법에 따라, 항체 농도의 측정을 실시하였다. 그때에, 항체마다 상이한 280 nm 흡광 계수 (1.3 mLmg-1cm-1 내지 1.8 mLmg-1cm-1) 를 사용하였다.
공통 조작 C : 항체의 버퍼 교환
항체 수용액은 완충 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0), 인산 완충액 (pH 6.0) 등) 을 첨가하고 공통 조작 A 를 이용하여 농축하였다. 이 조작을 수회 실시한 후, 공통 조작 B 를 이용하여 항체 농도의 측정을 실시하고, 완충 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0), 인산 완충액 (pH 6.0) 등) 을 사용하여 10 mg/mL 로 항체 농도를 조정하였다.
S 법 : 콘쥬게이션
본 제조법은, 상기 서술한 당사슬 리모델링 항체와 제조 중간체 (2) 를 SPAAC (strain-promoted alkyne azide cycloaddition : J. AM. CHEM. SOC. 2004, 126, 15046-15047) 반응에 의해 결합시켜, 항체-약물 콘쥬게이트를 제조하는 방법이다. 식 중 Ab 는 당사슬 리모델링 항체를 나타낸다.
[화학식 123]
Figure pct00123
항체 Ab 의 완충 용액 (아세트산나트륨 용액, 인산나트륨, 붕산나트륨 용액 등 또는 그들의 혼합물) 과, 화합물 (2) 를 적당한 용매 (디메틸술폭사이드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸아세트아미드 (DMA), N-메틸-2-피롤리돈 (NMP), 프로필렌글리콜 (PG) 등 또는 그들의 혼합물) 에 용해시킨 용액을 혼합함으로써, SPAAC 반응은 진행된다.
항체 1 몰에 대해, 화합물 (2) 는 2 몰 내지 과잉몰, 바람직하게는 1 몰 내지 30 몰이며, 유기 용매의 비율은, 항체의 완충액에 대해 1 내지 200 ％v/v 가 바람직하다. 반응 온도는 0 ℃ 내지 37 ℃, 바람직하게는 10 ℃ 내지 25 ℃ 이며, 반응 시간은 1 내지 150 시간, 바람직하게는 6 시간 내지 100 시간이다. 반응 시의 pH 는 5 내지 9 가 바람직하다.
항체-약물 콘쥬게이트는, 전술한 공통 조작 A 내지 C 및 후술하는 공통 조작 D 내지 F 에 의해 버퍼 교환, 정제, 항체 농도, 및 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수의 측정을 실시하여, 항체-약물 콘쥬게이트 화합물 (ADC) 의 동정을 실시할 수 있다.
공통 조작 D : 항체-약물 콘쥬게이트의 정제
시판되는 Sorbitol (5 ％) 을 포함하는 아세트산 완충액 (10 mM, pH 5.5 ; 본 명세서에서 ABS 라고 칭한다) 중 어느 완충액으로 NAP-25 칼럼을 평형화시켰다. 이 NAP-25 칼럼에, 항체-약물 콘쥬게이트 반응 수용액 (약 1.5 ∼ 2.5 mL) 을 얹고, 메이커 규정의 양의 완충액으로 용출시킴으로써, 항체 획분을 분취하였다. 이 분취 획분을 재차 NAP-25 칼럼에 얹고, 완충액으로 용출시키는 겔 여과 정제 조작을 합계 2 내지 3 회 반복함으로써, 미결합의 약물 링커나 디메틸술폭사이드, 프로필렌글리콜을 제거한 항체-약물 콘쥬게이트를 얻었다. 필요에 따라, 공통 조작 A 및 C 에 의해 항체-약물 콘쥬게이트 용액의 농도를 조제하였다.
공통 조작 E : 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 농도의 측정
항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 결합 약물 농도는, 하기에 나타내는 램버트 ·비어의 법칙을 이용하여, 산출할 수 있다.
이하에 램버트 비어의 법칙을 이용한 식 (I) 을 나타낸다.
Figure pct00124
여기서, A280 은 항체-약물 콘쥬게이트 수용액의 280 nm 에 있어서의 흡광도를 나타내고, ε280 은 항체-약물 콘쥬게이트의 280 nm 에 있어서의 몰 흡광 계수를 나타내고, C(mol·L-1) 는 항체-약물 콘쥬게이트의 몰 농도를 나타낸다.
상기 식 (I) 로부터 항체-약물 콘쥬게이트의 몰 농도 C(mol·L-1) 는 이하의 식 (II) 로 구한다.
Figure pct00125
또한 양변에 항체-약물 콘쥬게이트의 몰 질량 MW(g·mol-1) 를 곱함으로써, 항체-약물 콘쥬게이트의 중량 농도 C'(mg·mL-1) 를 구할 수 있다 (식 (III)).
Figure pct00126
이하에, 상기 식을 이용하여 본 실시예에 적용한 각 값에 대해 기재한다.
흡광도 A280 은, 항체-약물 콘쥬게이트 수용액의 280 nm 에 있어서의 UV 흡광도의 실측값을 사용하였다. 몰 질량 MW(g·mol-1) 는 항체의 아미노산 서열로부터 구해지는 항체 분자량의 계산 추정값을 항체-약물 콘쥬게이트의 몰 질량의 근삿값으로서 이용하고 있다. 광로 길이 l(cm) 은 1 cm 로 측정하였다.
항체 약물 콘쥬게이트의 몰 흡광 계수 ε280 은, 이하의 식 (IV) 에 의해 구할 수 있다.
Figure pct00127
여기서, εAb,280 은 280 nm 에 있어서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εDL,280 은 280 nm 에 있어서의 약물의 몰 흡광 계수를 나타낸다.
εAb,280 은 항체의 아미노산 서열로부터, 이미 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423) 에 의해 추정할 수 있다. 실시예에 있어서, 트라스트주맙의 몰 흡광 계수는, εAb,280 = 215400 (계산 추정값) 을 사용하였다. CLDN6 항체의 몰 흡광 계수는, εAb,280 = 221340 (계산 추정값), TROP2 항체의 몰 흡광 계수는, εAb,280 = 226400 (계산 추정값), CD98 항체의 몰 흡광 계수는, εAb,280 = 240400 (계산 추정값), LPS 항체의 몰 흡광 계수는, εAb,280 = 230300 (계산 추정값) 을, 트라스트주맙 변이체의 몰 흡광 계수는, εAb,280 = 215057 (계산 추정값) 을 사용하였다.
εDL,280 은, 매회 UV 측정으로 얻은 실측값으로부터 산출한 것을 사용하였다. 즉, 콘쥬게이트 전구체 (약물) 를 어느 몰 농도로 용해시킨 용액의 흡광도를 측정하고, 램버트·비어의 법칙, 식 (I) 을 적용함으로써 얻어지는 값을 사용하였다.
공통 조작 F : 항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수의 측정
항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수는, 이하의 방법을 이용하는 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석에 의해 구할 수 있다.
[F-1. HPLC 분석용 샘플의 조제 (항체-약물 콘쥬게이트의 환원)]
항체-약물 콘쥬게이트 용액 (약 1 mg/mL, 60 μL) 을 디티오트레이톨 (DTT) 수용액 (100 mM, 15 μL) 과 혼합한다. 혼합물을 37 ℃ 에서 30 분 인큐베이트함으로써, 항체-약물 콘쥬게이트의 L 사슬 및 H 사슬 간의 디술파이드 결합을 절단한 샘플을, HPLC 분석에 사용한다.
[F-2. HPLC 분석]
HPLC 분석을, 하기 측정 조건으로 실시한다.
HPLC 시스템 : Agilent 1290 HPLC 시스템 (Agilent Technologies)
검출기 : 자외 흡광도계 (측정 파장 : 280 nm, 329 nm)
칼럼 : BEH Phenyl (2.1 × 50 mm, 1.7 ㎛, Waters Acquity)
칼럼 온도 : 75 ℃
이동상 A : 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 (TFA), 15 ％ 이소프로필알코올 수용액
이동상 B : 0.075 ％ TFA, 15 ％ 이소프로필알코올아세토니트릴 용액
그라디언트 프로그램 : 14 ％-36 ％ (0 분-15 분), 36 ％-80 ％ (15-17 분), 80 ％-14 ％ (17 분-17.1 분), 14 ％-14 ％ (17.1 분-23 분)
샘플 주입량 : 5 μL
[F-3. 데이터 해석]
〔F-3-1〕약물이 결합하고 있지 않은 항체의 L 사슬 (L0) 및 H 사슬 (H0) 에 대해, 약물이 결합한 L 사슬 (약물이 1 개 결합한 L 사슬 : L1) 및 H 사슬 (약물이 1 개 결합한 H 사슬 : H1, 약물이 2 개 결합한 H 사슬 : H2, 약물이 3 개 결합한 H 사슬 : H3) 은, 결합한 약물의 수에 비례하여 소수성이 증가해 유지 시간이 커지므로, L0, L1, H0, H1, H2, H3 의 순서로 용출된다. L1, H0 의 순서는 전후하는 경우가 있지만, 약물이 결합하고 있지 않은 H0 은, 약물에 특장적인 329 nm 의 파장 흡수가 없다. 따라서 329 nm 의 파장 흡수를 확인하므로써, L1, H0 을 판별할 수 있다. L0 및 H0 의 유지 시간 비교에 의해 검출 피크를 L0, L1, H0, H1, H2, H3 중 어느 것에 할당할 수 있다.
〔F-3-2〕약물 링커에 UV 흡수가 있기 때문에, 약물 링커의 결합수에 따라, L 사슬, H 사슬 및 약물 링커의 몰 흡광 계수를 이용하여 하기 식에 따라 피크 면적값의 보정을 실시한다.
Figure pct00128
여기서, 각 항체에 있어서의 L 사슬 및 H 사슬의 몰 흡광 계수 (280 nm) 는, 이미 알려진 계산 방법 (Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423) 에 의해, 각 항체의 L 사슬 및 H 사슬의 아미노산 서열로부터 추정되는 값을 사용할 수 있다. 트라스트주맙의 경우, 그 아미노산 서열에 따라, L 사슬의 몰 흡광 계수로서 26150 을, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 81290 을 추정값으로서 사용하였다. 동일하게, CLDN6 항체의 경우, L 사슬의 몰 흡광 계수로서 33140 을, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 77280 을, TROP2 항체의 경우, L 사슬의 몰 흡광 계수로서 26210 을, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 68990 을, CD98 항체의 경우, L 사슬의 몰 흡광 계수로서 41680 을, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 78500 을, LPS 항체의 경우, L 사슬의 몰 흡광 계수로서 31710 을, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 77470 을, 트라스트주맙 변이체의 경우, 또, L 사슬의 몰 흡광 계수로서 26251 을, H 사슬의 몰 흡광 계수로서 81488 을, 약물 링커의 몰 흡광 계수 (280 nm) 는, 콘쥬게이트 전구체인 화합물 (1) 의 실측의 몰 흡광 계수 (280 nm) 를 사용하였다.
〔F-3-3〕피크 면적 보정값 합계에 대한 각 사슬 피크 면적비 (％) 를 하기 식에 따라 계산한다.
Figure pct00129
〔F-3-4〕항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수를, 하기 식에 따라 계산한다.
약물 평균 결합수 = (L0 피크 면적비 x 0 ＋ L0 피크 면적비 x 1 ＋ H0 피크 면적비 x 0 ＋ H1 피크 면적비 x 1 ＋ H2 피크 면적비 x 2 ＋ H3 피크 면적비 x 3)/100 x 2
＜의약＞
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트는, 암 세포에 대해 세포 상해 활성을 나타내므로, 의약으로서, 특히 암에 대한 치료제 및/또는 예방제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트가 적용되는 암의 종류로는, 폐암 (비소세포폐암, 소세포폐암 등), 신암, 요로상피암, 대장암, 전립선암, 다형신경교아종, 난소암 (표층 상피성 종양, 사이질성 종양, 배세포 종양 등), 췌암, 유암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암 등, 자궁체암, 정소암 (세미노마, 비세미노마), 자궁경암, 태반융모암, 다형신경교아종, 뇌종양, 두경부암 그리고 그들의 전이성 형태 등을 들 수 있지만, 치료 대상이 되는 암 세포에 있어서 항체-약물 콘쥬게이트 중의 항체를 인식할 수 있는 단백질을 발현하고 있는 암 세포이면 이들로는 한정지 않는다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트는, 포유 동물에 대해 바람직하게 투여할 수 있지만, 보다 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트가 포함되는 의약 조성물에 있어서 사용되는 물질로는, 투여량이나 투여 농도에 있어서, 이 분야에 있어서 통상 사용되는 제제 첨가물, 기타로부터 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트는, 1 종 이상의 약학적으로 적합성의 성분을 포함하는 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은, 대표적으로는, 1 종 이상의 약학적 캐리어 (예를 들어, 멸균한 액체 (예를 들어, 물 및 기름 (석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 기름 (예를 들어, 낙화생유, 대두유, 광유, 참깨유 등) 을 포함한다)) 을 포함한다. 물은, 상기 약학적 조성물이 정맥내 투여되는 경우에, 보다 대표적인 캐리어이다. 식염수 용액, 그리고 덱스트로오스 수용액 및 글리세롤 수용액도 또한, 액체 캐리어로서 특히, 주사용 용액을 위해서 사용될 수 있다. 적절한 약학적 부형제는, 당해 분야에서 공지이다. 상기 조성물은 또, 원한다면, 미량의 습윤제 혹은 유화제, 또는 pH 완충화제를 포함할 수 있다. 적절한 약학적 캐리어의 예는, E. W. Martin 에 의한 「Remington's Pharmaceutical Sciences」에 기재된다. 그 처방은, 투여의 양태에 대응한다.
여러 가지 송달 시스템이 공지이며, 본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트를 투여하기 위해서 사용될 수 있다. 도입 방법으로는, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 및 피하의 경로를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 투여는, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사에 의한 것일 수 있다. 특정의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 리간드 약물 결합체의 투여는, 주입에 의한 것이다. 비경구적 투여는, 바람직한 투여 경로이다.
대표적 실시형태에 있어서, 상기 약학적 조성물은, 인간에의 정맥내 투여에 적합한 약학적 조성물로서, 상습적 순서에 따라 처방된다. 대표적으로는, 정맥내 투여를 위한 조성물은, 멸균의 등장성의 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 의약은 또, 가용화제 및 주사 부위에서의 동통을 완화하기 위한 국소 마취제 (예를 들어, 리그노카인) 를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분은, (예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰 등의 밀봉하여 시일된 용기 중의 건조 동결건조 분말 또는 무수의 농축물로서, 별개로, 또는 단위제형 중에서 함께 혼합한 것 중 어느 것으로 공급된다. 상기 의약이 주입에 의해 투여될 예정인 경우, 그것은, 예를 들어, 멸균의 제약 그레이드의 물 또는 식염수를 포함하는 주입 보틀로 투약될 수 있다. 상기 의약이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플은, 예를 들어, 상기 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에는 본원의 항체-약물 콘쥬게이트만을 포함하는 의약 조성물이어도 되고, 항체-약물 콘쥬게이트 및 적어도 1 개의 이 이외의 암 치료제를 포함하는 의약 조성물이어도 된다. 본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트는, 다른 암치료제와 함께 투여할 수도 있고, 이로써 항암 효과를 증강시킬 수 있다. 이와 같은 목적으로 사용되는 다른 항암제는, 항체-약물 콘쥬게이트와 동시에, 따로따로, 혹은 연속하여 개체에 투여되어도 되고, 각각의 투여 간격을 변경하여 투여해도 된다. 이와 같은 암치료제로서, 아브락산 (abraxane), 카보플라틴 (carboplatin), 시스플라틴 (cisplatin), 젬시타빈 (gemcitabine), 이리노테칸 (irinotecan(CPT-11)), 파클리탁셀 (paclitaxel), 페메트렉시드 (pemetrexed), 소라페니브 (sorafenib), 빈블라스틴 (vinblastin) 또는 WO2003/038043호 팜플렛에 기재된 약제, 또한 LH-RH 아날로그 (류프로렐린, 고세렐린 등), 에스트라무스틴·포스페이트, 에스트로겐 길항약 (타목시펜, 랄록시펜 등), 아로마타아제 저해제 (아나스트로졸, 레트로졸, 엑스메스탄 등) 등을 들 수 있지만, 항종양 활성을 갖는 약제이면 한정되지 않는다.
이와 같은 의약 조성물은, 선택된 조성과 필요한 순도를 가지는 제제로서, 동결건조 제제 혹은 액상 제제로서 제제화하면 된다. 동결건조 제제로서 제제화할 때에는, 이 분야에 있어서 사용되는 적당한 제제 첨가물이 포함되는 제제여도 된다. 또 액제에 있어서도 동일하게 하여, 이 분야에 있어서 사용되는 각종 제제 첨가물을 포함하는 액상 제제로서 제제화할 수 있다.
의약 조성물의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라서도 변화하지만, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 항체-약물 콘쥬게이트는, 항체-약물 콘쥬게이트의 항원에 대한 친화성, 즉, 항원에 대한 해리 정수 (Kd 값) 의 점에 있어서, 친화성이 높을수록 (Kd 값이 낮을수록), 소량의 투여량이어도 약효를 발휘시킬 수 있다. 따라서, 항체-약물 콘쥬게이트의 투여량 결정 시에는, 항체-약물 콘쥬게이트와 항원의 친화성의 상황에 기초하여 투여량을 설정할 수도 있다. 본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트를 인간에 대해 투여할 때에는, 예를 들어, 약 0.001 ∼ 100 mg/kg 을 1 회 혹은 1 ∼ 180 일간에 1 회의 간격으로 복수회 투여하면 된다.
또, 본 발명의 항체 또는 그 항체의 기능성 단편도 또, 의약으로서 사용할 수 있다. 이 경우, 상기 서술한 ＜의약＞ 에 관한 「항체-약물 콘쥬게이트」에 관한 기재를, 적절히 「항체 또는 그 항체의 기능성 단편」에 관한 기재라고 바꿔 읽을 수 있다.
또한, 본 발명의 유리 약물 (신규 PBD 유도체 화합물), 그 염, 또는 그들의 수화물도 또, 의약으로서 사용할 수 있다. 이 경우, 상기 서술한 ＜의약＞ 에 관한 「항체-약물 콘쥬게이트」에 관한 기재를, 적절히 「유리 약물 (신규 PBD 유도체 화합물), 그 염, 또는 그들의 수화물」에 관한 기재라고 바꿔 읽을 수 있다.
실시예
이하에 나타내는 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되지 않는다. 또, 이들은 어떠한 의미에 있어서도 한정적으로 해석되지 않는다. 또, 본 명세서에 있어서, 특별히 기재가 없는 시약, 용매 및 출발 재료는, 시판되는 공급원으로부터 용이하게 입수 가능하다.
참고예 1 : 트라스트주맙-테시린 (Trastuzumab-Tesirine)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
트라스트주맙 (참고예 3) 의 5 mM 4 아세트산에틸렌디아민-인산 완충 생리 식염수 (pH 6.5) 용액 (9.91 mg/mL, 0.70 mL) 에, 20 ℃ 에서 인산 2 칼륨 수용액 (1.0 M, 0.0112 mL), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀염산염 수용액 (10 mM, 0.0086 mL) 을 첨가하고, 20 ℃ 에서 60 분간, 실온에서 30 분간 반응시켰다. 반응 용액에 문헌 (Med. Chem. Lett. 2016, 7, 983-987) 을 참고로 하여 합성한 Tesirine (0.36 mg) 의 디메틸아세트아미드 용액 (0.0415 mL) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 반응 용액에 N-아세틸시스테인 수용액 (100 mM, 0.0024 mL) 을 첨가하고, 30 분간 반응시키고 반응을 정지하였다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 3.5 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.40 mg/mL, 항체 수량 : 4.90 mg (71 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 2.0
참고예 2 : 항 CLDN6(H1L1)-테시린
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
항 CLDN6(H1L1) 항체의 5 mM 4 아세트산에틸렌디아민-인산 완충 생리 식염수 (pH 6.5) 용액 (9.87 mg/mL, 0.45 mL) 에, 20 ℃ 에서 인산 2 칼륨 수용액 (1.0 M, 0.0072 mL), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀염산염 수용액 (10 mM, 0.0041 mL) 을 첨가하고, 20 ℃ 에서 90 분간 반응시켰다. 반응 용액에 문헌 (Med. Chem. Lett. 2016, 7, 983-987) 을 참고로 하여 합성한 테시린 (0.15 mg) 의 N,N-디메틸아세트아미드 용액 (0.0277 mL) 을 첨가하고, 20 도에서 1 시간 반응시켰다. 반응 용액에 N-아세틸시스테인 수용액 (100 mM, 0.001 mL) 을 첨가하고, 30 분간 반응시키고 반응을 정지하였다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 3.5 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.56 mg/mL, 항체 수량 : 3.90 mg (88 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 2.1
참고예 3 : 항 HER2 항체 트라스트주맙
항 HER2 항체는 US5821337 을 참조하여 제조하였다. 트라스트주맙의 경사슬 및 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 64 및 서열 번호 65 에 나타냈다.
참고예 4 : 항 LPS 항체 h＃1G5-H1L1
항 LPS 항체는 WO2015/046505 를 참조하여 제조하였다. h＃1G5-H1L1 의 경사슬 및 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 66 및 서열 번호 67 에 나타냈다.
참고예 5 : 항 TROP2 항체 hRS7
항 TROP2 항체는 WO2003/074566, WO2015/098099 (참고예 1) 를 참조하여 제조하였다. hRS7 의 경사슬 및 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 68 및 서열 번호 69 에 나타냈다.
참고예 6 : 항 CD98 항체 hM23-H1L1
항 CD98 항체는 WO2015/146132 를 참조하여 제조하였다. hM23-H1L1 의 경사슬 및 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 70 및 서열 번호 71 에 나타냈다.
〔제조 중간체의 합성〕
실시예 1 : 중간체 1
[화학식 124]
Figure pct00130
공정 1 : 벤질 (6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5-카르복실 레이트
5-벤질 6-메틸(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5,6-디카르복실레이트 (104 mmol, WO2012087596) 의 THF (500 mL) 용액에, 수소화붕소리튬 (4.30 g, 178 mmol) 을 0 ℃ 에서 소량씩 첨가하였다. 0 ℃ 에서 30 분 교반한 후, 실온에서 2 시간 교반하였다. 0 ℃ 에서 물 (180 mL), 2 규정 염산 (186 mL) 을 첨가하고, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 아세트산에틸로 4 회 추출하고, 유기층을 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물 (27.9 g, 90 ％) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 2 : 벤질 (6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5-카르복실레이트
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (27.9 g, 107 mmol) 과 이미다졸 (14.5 g, 214 mmol) 의 디클로로메탄 (300 mL) 용액에, 실온에서 tert-부틸디메틸실릴클로라이드 (24.2 g, 160 mmol) 를 첨가하고, 실온에서 18 시간 교반하였다. 반응 용액을 포화 시트르산 수용액, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (32.5 g, 81 ％) 을 얻었다.
Figure pct00131
공정 3 : (6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵탄
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (32.5 g, 86.5 mmol) 의 에탄올 (400 mL) 용액에, 실온에서 7.5 ％ 팔라듐탄소 촉매 (54 ％ 수분, 5.00 g) 를 첨가하고, 실온, 수소 분위기하에서 6 시간 교반하였다. 반응 용액을 셀라이트 여과하고, 여과액을 감압 증류 제거하여, 목적물 (21.3 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00132
공정 4 : [(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일](5-메톡시-2-니트로-4-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)메탄온
5-메톡시-2-니트로-4-{트리(프로판-2-일)실릴]옥시}벤조산 (52.2 g, 141 mmol, US20150283262) 과 1-하이드록시벤조트리아졸 1 수화물 (23.8 g, 155 mmol) 의 디클로로메탄 (500 mL) 용액에, 빙랭하에서 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (35.0 g, 170 mmol) 를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 카르복실산 소실 후, -60 ℃ 에서 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (34.1 g, 141 mmol) 과 트리에틸아민 (29.4 mL, 212 mmol) 의 디클로로메탄 (100 mL) 용액을 천천히 적하하였다. 반응 용액을 실온에서 하룻밤 교반한 후, 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물에 아세트산에틸과 디에틸에테르를 첨가하고, 고체 성분을 여과에 의해 제거하고, 여과액을 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 25 : 75 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (55.0 g, 66 ％) 을 얻었다.
Figure pct00133
공정 5 : (2-아미노-5-메톡시-4-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]메탄온
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (55.0 g, 92.8 mmol) 의 에탄올 (300 mL) 용액에, 질소 분위기하에서, 7.5 ％ 팔라듐탄소 (10.0 g) 를 첨가하였다. 질소 풍선을 즉시 수소 풍선으로 교체 부착하고, 반응 혼합물을 수소 분위기하, 실온에서 격렬하게 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 감압 증류 제거하고, 얻어진 목적물 (52.2 g, 100 ％) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
Figure pct00134
공정 6 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (18.6 g, 33.0 mmol) 및 트리에틸아민 (6.26 mL, 45.2 mmol) 의 THF (300 mL) 용액에, 에탄올-빙욕 상에서, 트리포스겐 (4.22 g, 14.2 mmol) 을 천천히 첨가하였다. 첨가 후, 빙랭한 반응 혼합물에, N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]-L-알라닌아미드 (11.4 g, 30.2 mmol, WO2011130598) 와 트리에틸아민 (6.26 mL, 45.2 mmol) 의 THF (100 mL), N,N-디메틸포름아미드 (30 mL) 혼합 용액을 천천히 적하하였다. 적하 후, 빙욕을 제거하고, 반응 혼합물을, 질소 분위기하, 40 ℃ 에서 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 40 : 60 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (23.5 g, 74 ％) 을 얻었다.
Figure pct00135
공정 7 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (23.5 g, 24.3 mmol) 의 THF (50 mL), 메탄올 (50 mL), 물 (44 mL) 용액에, 실온하에서 아세트산 (200 mL) 을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (18.0 g, 87 ％) 을 얻었다.
Figure pct00136
공정 8 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
디메틸술폭사이드 (3.75 mL, 52.8 mmol) 의 디클로로메탄 (300 mL) 용액에, 질소 분위기하, -78 ℃ 에서, 염화옥살릴 (2.17 mL, 25.3 mmol) 을 천천히 적하하였다. 적하 후, 반응 혼합물을 -78 ℃ 에서 교반하였다. 반응 혼합물에, 상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (18.0 g, 21.1 mmol) 의 디클로로메탄 (50.0 mL) 용액을 천천히 적하하였다. 반응 용액에 -78 ℃ 에서, 트리에틸아민 (14.6 mL, 105 mmol) 을 첨가하였다. 첨가 후, 냉매욕을 제거하고, 실온까지 천천히 승온하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 클로로포름 (200 mL) 으로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 60 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (16.5 g, 92 ％) 을 얻었다.
Figure pct00137
공정 9 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (12.0 g, 14.1 mmol) 및 2,6-루티딘 (6.58 mL, 56.5 mmol) 의 디클로로메탄 (200 mL) 용액에, 질소 분위기하, 0 ℃ 에서, 트리플루오로메틸술폰산 tert-부틸디메틸실릴 (9.73 mL, 42.3 mmol) 을 천천히 적하하였다. 빙랭하, 10 분간 교반한 후에, 빙욕을 제거하고, 실온에서 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 25 : 75 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (8.12 g, 60 ％) 을 얻었다.
Figure pct00138
공정 10 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (8.12 g, 8.42 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (90 mL) 와 물 (2 mL) 용액에, 아세트산리튬 (0.611 g, 9.26 mmol) 을 첨가하고, 실온하에서 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (5.48 g, 81 ％) 을 얻었다.
Figure pct00139
공정 11 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-8'-(3-브로모프로폭시)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (2.40 g, 2.97 mmol) 을, 실시예 4 공정 1 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.73 g, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00140
실시예 2 : 중간체 2
[화학식 125]
Figure pct00141
공정 1 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리신
글리실글리신 (0.328 g, 2.49 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (0.433 mL, 2.49 mmol) 을 N,N-디메틸포름아미드 (20 mL) 의 혼합물에, 1-{[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]옥시}피롤리딘-2,5-디온 (1.00 g, 2.49 mmol, Click Chemistry Tools), 물 (10 mL) 을 실온에서 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : CMW = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.930 g, 89 ％) 을 얻었다.
CMW 란, 클로로포름 : 메탄올 : 물 = 7 : 3 : 1 (v/v/v) 의 분배 유기층
Figure pct00142
공정 2 :2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리시네이트
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.612 g, 1.46 mmol)), N-하이드록시숙신이미드 (0.168 g, 1.459 mmol) 의 디클로로메탄 (6 mL) 용액에, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 (0.420 g, 2.19 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 21 시간 교반하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : CMW = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.375 g, 50 ％) 을 얻었다.
CMW 란, 클로로포름 : 메탄올 : 물 = 7 : 3 : 1 (v/v/v) 의 분배 유기층
실시예 3 : 약물 링커 1
[화학식 126]
Figure pct00143
공정 1 : (2R,11aS)-2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8-하이드록시-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온
(2R,11aS)-8-(벤질옥시)-2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온 (25.5 g, 41.6 mmol, WO2016149546) 의 THF (150 mL), 에탄올 (150 mL) 용액에, 질소 분위기하, 5 ％ 팔라듐탄소 (54 ％ 수분, 10.0 g) 를 첨가한 후, 반응 용액을 수소 분위기하, 실온에서 3 일간 교반하였다. 반응 용액에 클로로포름을 첨가하고, 셀라이트 여과한 후, 여과액을 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (19.4 g, 89 ％) 을 얻었다.
Figure pct00144
공정 2 : (2R,11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (10.8 g, 20.7 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (30 mL) 용액에, 1,5-디브로모펜탄 (23.8 g, 103 mmol), 탄산칼륨 (3.43 g, 24.8 mmol) 을 실온에서 첨가하였다. 실온에서 3 시간 교반한 후, 반응 용액에 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 얻어진 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 황산나트륨으로 건조한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 90 : 10 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (14.5 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00145
공정 3 : (2R,11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-2-하이드록시-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (21.5 mmol) 의 THF (40 mL) 용액에, 1 mol/L 의 테트라부틸암모늄플루오라이드 THF 용액 (28.0 mL, 28.0 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하였다. 실온에서 30 분간 교반한 후, 반응 용액에 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하고, 얻어진 유기층을 포화 식염수로 세정하였다. 황산나트륨으로 건조한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 97.5 : 2.5 (v/v) ∼ 92.5 : 7.5 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (11.3 g, 94 ％) 을 얻었다.
Figure pct00146
공정 4 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2,5,11(3H,10H,11aH)-트리온
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (11.3 g, 20.2 mmol), 테트라부틸암모늄브로마이드 (0.325 g, 1.01 mmol), 브롬화칼륨 (0.240 g, 2.02 mmol) 을 포화 탄산수소나트륨 수용액 (60 mL), 디클로로메탄 (60 mL) 에 용해시키고, nor-AZADO (0.0279 g, 0.202 mmol), 차아염소산나트륨 5 수화물 (2.03 g, 27.2 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 0 ℃ 에서 30 분간 교반하였다. 원료가 잔존했기 때문에, 차아염소산나트륨 5 수화물 (1.00 g, 13.4 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 0 ℃ 에서 15 분 교반하였다. 추가로 차아염소산나트륨 5 수화물 (0.300 g, 4.03 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 0 ℃ 에서 15 분 교반하고, 원료의 소실을 TLC 로 확인하였다. 반응 용액에 티오황산나트륨 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하고, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 75 : 25 (v/v) ∼ 40 : 60 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (9.74 g, 87 ％) 을 얻었다.
Figure pct00147
공정 5 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-5,11-디옥소-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일 트리플루오로메탄술포네이트
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (9.74 g, 17.5 mmol) 의 디클로로메탄 (160 mL) 용액에, 2,6-루티딘 (8.17 mL, 70.1 mmol) 을 -40 ℃ 에서 첨가하고, -40 ℃ 에서 10 분간 교반하였다. 반응 용액에 무수 트리플루오로메탄술폰산 (8.85 mL, 52.6 mmol) 을 -40 ℃ 에서 첨가하고, -40 ℃ 에서 30 분간 교반하였다. 반응 용액에 10 ％ 시트르산 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하고, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 95 : 5 (v/v) ∼ 70 : 35 (v/v)] 로 정제한 후, NH2 실리카 겔 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 95 : 5 (v/v) ∼ 65 : 35 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (7.10 g, 59 ％) 을 얻었다.
Figure pct00148
공정 6 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (2.00 g, 2.91 mmol), 4-메톡시페닐보론산 (0.884 g, 5.82 mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (0.336 g, 0.291 mmol), 탄산나트륨 (1.23 g, 11.6 mmol) 의 혼합물에 톨루엔 (20 mL), 에탄올 (10 mL), 물 (10 mL) 을 실온에서 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 30 분 교반한 후, 반응 용액을 아세트산에틸로 추출하고, 물, 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 90 : 10 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1.71 g, 91 ％) 을 얻었다.
Figure pct00149
공정 7 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-1,11a-디하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.789 g, 1.22 mmol) 을 에탄올 (10 mL), THF (10 mL) 에 용해하고, 2.0 M 의 수소화붕소리튬테트라하이드로푸란 용액 (6.11 mL, 12.2 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 0 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 반응 용액에 물을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하고, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 디클로로메탄 (10 mL), 에탄올 (20 mL), 물 (10 mL) 에 용해하고, 실리카 겔 (4 g) 을 실온에서 첨가하고, 실온에서 4 일간 교반하였다. 실리카 겔을 여과에 의해 제거하고, 물을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하고, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 60 : 40 (v/v) ∼ 25 : 75 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.496 g, 81 ％) 을 얻었다.
Figure pct00150
공정 8 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-1,10,11,11a-테트라하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.496 g, 0.992 mmol) 의 디클로로메탄 (20 mL) 용액에 나트륨트리아세톡시보로하이드라이드 (0.421 g, 1.99 mmol) 를 0 ℃ 에서 첨가하였다. 실온에서 2 시간 교반한 후, 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 60 : 40 (v/v) ∼ 25 : 75 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.426 g, 86 ％) 을 얻었다.
Figure pct00151
공정 9 : 프로프-2-엔-1-일 (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.426 g, 0.849 mmol) 의 디클로로메탄 (30 mL) 용액에, 피리딘 (0.102 mL 1.27 mmol), 클로로포름산알릴 (0.374 mL, 3.54 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 0 ℃ 에서 15 분간 교반하였다. 반응 용액에 10 ％ 시트르산 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하고, 얻어진 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정 후, 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 90 : 10 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.465 g, 94 ％) 을 얻었다.
Figure pct00152
공정 10 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-{[5-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
실시예 1 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.130 g, 0.161 mmol) 과 상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.104 g, 0.177 mmol,) 의 N,N-디메틸포름아미드 (3 mL) 용액에 탄산칼륨 (0.0266 g, 0.193 mmol) 을 실온에서 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 용액을 아세트산에틸로 희석하고, 물, 포화 식염수로 세정한 후, 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 NH2-실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 70 : 30 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.184 g, 87 ％) 을 얻었다.
Figure pct00153
공정 11 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-{[5-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.1837 g, 0.140 mmol) 과 아세트산 (0.048 mL, 0.840 mmol) 의 THF (5.00 mL) 용액에 1 mol/L 의 테트라부틸암모늄플루오라이드테트라하이드로푸란 용액 (0.700 mL, 0.700 mmol) 을 실온에서 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응 용액을 아세트산에틸로 희석하고, 유기층을 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정한 후, 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 99.5 : 0.5 (v/v) ∼ 95 : 5 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.178 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00154
공정 12 : L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.140 mmol) 의 디클로로메탄 (2 mL) 용액에, 실온에서 피롤리딘 (0.0579 mL, 0.700 mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0) (0.0162 g, 0.0140 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 15 분 교반하였다. 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 99.5 : 0.5 (v/v) ∼ 92.5 : 7.5 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.143 g, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00155
[화학식 127]
Figure pct00156
공정 13 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
실시예 2 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.0640 g, 0.153 mmol), N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린 (0.0446 g, 0.180 mmol) 의 혼합물에 디클로로메탄 (2 mL) 을 실온에서 첨가하고, 실온에서 15 분 교반하였다. 반응 용액에 상기 공정 13 에서 얻어진 화합물 (0.143 g, 0.139 mmol) 의 디클로로메탄 (2 mL) 용액을 첨가하고, 실온에서 5 시간 교반한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 99.5 : 0.5 (v/v) ∼ 92.5 : 7.5 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.103 g, 52 ％) 을 얻었다.
Table 1 : 약물 링커 1 에 대한 프로톤 NMR 피크 위치 및 MS
Figure pct00157
실시예 4 : 약물 링커 2
[화학식 128]
Figure pct00158
공정 1 : (2R,11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-2-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온
실시예 3 공정 1 에서 얻어진 화합물 (5.06 g, 9.67 mmol) 과 1,3-디브로모프로판 (4.93 mL, 48.4 mmol) 을, 실시예 3 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (4.85 g, 78 ％) 을 얻었다.
Figure pct00159
공정 2 : (2R,11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-2-하이드록시-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (4.85 g, 7.54 mmol) 을, 실시예 3 공정 3 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4.05 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00160
공정 3 : (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2,5,11(3H,10H,11aH)-트리온
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (7.54 mmol) 을, 실시예 3 공정 4 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (3.73 g, 93 ％) 을 얻었다.
Figure pct00161
공정 4 : (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-5,11-디옥소-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일 트리플루오로메탄술포네이트
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (3.73 g, 7.08 mmol) 을, 실시예 3 공정 5 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (3.27 g, 70 ％) 을 얻었다.
Figure pct00162
공정 5 : (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (3.27 g, 4.96 mmol) 을, 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.49 g, 81 ％) 을 얻었다.
Figure pct00163
공정 6 : (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-1,11a-디하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (2.49 g, 4.04 mmol) 을, 실시예 3 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.59 g, 84 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 473[81Br, (M+H)+], 471[79Br, (M+H)+].
공정 7 : (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-1,10,11,11a-테트라하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (1.59 g, 3.38 mmol) 을, 실시예 3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.39 g, 87 ％) 을 얻었다.
Figure pct00164
공정 8 : 프로프-2-엔-1-일 (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (1.40 g, 0.2.95 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.885 g, 54 ％) 을 얻었다.
Figure pct00165
공정 9 : N-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-L-발릴-N-[4-({[(11'aS)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.0381 g, 0.0683 mmol) 을, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0712 g, 81 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1284(M+H)+.
공정 10 : N-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-L-발릴-N-[4-({[(11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-{[(프로프-2-엔-1-일)옥시]카르보닐}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.0712 g, 0.0554 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0671 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1170(M+H)+.
공정 11 : L-발릴-N-[4-({[(11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.0571 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0574 g, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00166
공정 12 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-[4-({[(11'aS)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11'a-디하이드로-1'H,3'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.189 g, 0.189 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.169 g, 64 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1402(M+H)+.
실시예 5 : 약물 링커 3
[화학식 129]
Figure pct00167
공정 1 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-L-이소류신
L-프롤릴-L-이소류신 (1.00 g, 4.40 mmol) 의 1 mol/l 수산화나트륨 수용액 (8.80 mL, 8.80 mmol), 1,4-디옥산 (30 mL) 용액에, 0 ℃ 에 있어서, 클로로포름산알릴 (0.690 mL, 6.53 mmol) 을 천천히 적하하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5 시간 교반한 후, 반응 혼합물에 황산수소칼륨 수용액을 첨가하고, pH 4 정도로 조정하고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 감압하에서 농축하고, 잔류물에 헥산을 첨가하였다. 생성된 고체를 여과 채취, 건조시킴으로써 목적물 (1.20 g, 88 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 311(M-H)-
공정 2 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]-L-이소류신아미드
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (13.7 g, 43.4 mmol) 과 4-아미노벤질알코올 (6.00 g, 48.7 mmol) 의 THF 용액 (100 mL) 에, N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린 (12.0 g, 48.7 mmol) 을 실온에서 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 23 시간 교반하고, 디에틸에테르 (200 mL) 를 첨가한 후, 생성된 고체를 여과 채취하고, 얻어진 화합물 (13.2 g, 65 ％) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 3 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-이소류신아미드
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (6.87 g, 16.5 mmol) 을, 실시예 1 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (7.46 g, 56 ％) 을 얻었다.
Figure pct00168
공정 4 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-이소류신아미드
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (7.46 g, 7.41 mmol) 을, 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (6.07 g, 92 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 892(M+H)+
공정 5 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-이소류신아미드
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (6.07 g, 6.80 mmol) 을, 실시예 1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4.18 g, 69 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 890(M+H)+
공정 6 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-이소류신아미드
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (4.18 g, 4.70 mmol) 을, 실시예 1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (4.26 g, 90 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1004(M+H)+
공정 7 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-이소류신아미드
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (4.26 g, 4.70 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.48 g, 69 ％) 을 얻었다.
Figure pct00169
공정 8 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11'-[(트리메틸실릴)옥시]-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-이소류신아미드
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.200 g, 0.236 mmol) 을, 실시예 4 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.308 g, 99 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1324(M+H)+
공정 9 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-이소류신아미드
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.308 g, 0.233 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.261 g, 93 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1210(M+H)+
공정 10 : L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-이소류신아미드
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.261 g, 0.216 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.183 g, 81 ％) 을 얻었다.
Figure pct00170
공정 11 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-이소류신아미드
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.0474 g, 0.455 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0495 g, 75 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1443(M+H)+
실시예 6 : 약물 링커 4
[화학식 130]
Figure pct00171
공정 1 : 실시예 4 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.0564 g, 0.0563 mmol), 트리에틸아민 (0.00936 mL, 0.0675 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (5 mL) 용액에, 실온에서 1-{[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]옥시}피롤리딘-2,5-디온 (0.0249 g, 0.0619 mmol) 을 첨가하였다. 실온에서 2 시간 교반한 후, 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 99.5 : 0.5 (v/v) ∼ 90 : 10 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.0490 g, 68 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1289(M+H)+
실시예 7 : 약물 링커 5
[화학식 131]
Figure pct00172
공정 1 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-페닐알라닐-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]글리신아미드
출발 물질 7-1 (1.24 g, 3.80 mmol, Bioorganic & Medicinal Chemistry 2015, 3, 3237-3247), 탄산칼륨 (0.945 g, 6.84 mmol) 의 THF (18 mL), 물 (12 mL) 용액에, 0 ℃ 에서 클로로포름산알릴 (0.482 mL, 4.560 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 첨가하였다. 아세트산에틸로 추출한 후, 물, 포화 식염수로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 소량의 아세트산에틸에 용해시키고, 디에틸에테르를 첨가하였다. 생성된 고체 (1.30 g, 83 ％) 를 여과 채취하고, 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 2 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-페닐알라닐-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]글리신아미드
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.30 g, 3.16 mmol) 을, 실시예 1 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.32 g, 54 ％) 을 얻었다.
Figure pct00173
공정 3 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-페닐알라닐-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]글리신아미드
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.32 g, 1.32 mmol) 을, 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.23 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00174
공정 4 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-페닐알라닐-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}글리신아미드
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.32 mmol) 을, 실시예 1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.660 g, 57 ％) 을 얻었다.
Figure pct00175
공정 5 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-페닐알라닐-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}글리신아미드
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.834 g, 0.943 mmol) 을, 실시예 1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.555 g, 59 ％) 을 얻었다.
Figure pct00176
공정 6 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-페닐알라닐-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}글리신아미드
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.555 g, 0.556 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.451 g, 96 ％) 을 얻었다.
Figure pct00177
공정 7 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-페닐알라닐-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}글리신아미드
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.115 g, 0.137 mmol) 을, 실시예 4 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.160 g, 89 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1318(M+H)+
공정 8 : N-[(프로프-2-엔-1-일)카르보닐]-L-페닐알라닐-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}글리신아미드
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.160 g, 0.121 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.136 g, 93 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1204(M+H)+
공정 9 : L-페닐알라닐-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}글리신아미드
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.136 g, 0.113 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0372 g, 32 ％) 을 얻었다.
Figure pct00178
공정 10 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-페닐알라닐-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}글리신아미드
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.0372 g, 0.0359 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0170 g, 33 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1437(M+H)+
실시예 8 : 약물 링커 6
[화학식 132]
Figure pct00179
공정 1 : N-[(11,12-디데하이드로-5,6-디하이드로디벤조[a,e][8]아눌렌-5-일옥시)카르보닐]글리실글리신
11,12-디데하이드로-5,6-디하이드로디벤조[a,e][8]아눌렌-5-일4-니트로페닐카르바메이트 (0.437 g, 1.14 mmol), N,N-디이소프로필에틸아민 (0.198 mL, 1.14 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (6 mL) 용액에 글리실글리신 (0.150 g, 1.14 mmol), 물 (3 mL) 을 실온에서 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : CMW = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.324 g, 75 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 378(M+H)+
공정 2 : N-[(11,12-디데하이드로-5,6-디하이드로디벤조[a,e][8]아눌렌-5-일옥시)카르보닐]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.0306 g, 0.0305 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0361 g, 87 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1362(M+H)+
실시예 9 : 약물 링커 7
[화학식 133]
Figure pct00180
공정 1 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드
출발 물질 9-1 을, 실시예 1 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.37 g, 45 ％) 을 얻었다.
Figure pct00181
공정 2 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N5-카르바모일-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.37 g, 1.31 mmol) 을, 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.00 g, 82 ％) 을 얻었다.
Figure pct00182
공정 3 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N5-카르바모일-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥시-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-오르니틴아미드
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.00 g, 1.07 mmol), 디클로로메탄 (80 mL), 디메틸포름아미드 (10 mL) 의 혼합물에, 0 ℃ 에서 데스마틴퍼아이오디난 (0.455 g, 1.07 mmol) 을 첨가하였다. 0 ℃ 에서 1 시간 교반한 후, 데스마틴퍼아이오디난 (0.455 g, 1.07 mmol) 을 한번 더 첨가하고, 0 ℃ 에서 1 시간 교반하였다. 반응 용액에 포화 탄산수소나트륨 수용액을 첨가하고, 클로로포름으로 추출한 후, 포화 식염수로 세정하였다. 감압 증류 제거한 후, 아세트산에틸을 첨가하고, 고체를 여과 채취하였다. 여과액을 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 50 : 50 ∼ 헥산 : 아세트산에틸 = 0 : 100 (v/v)] 로 정제하고, 고체와 합쳐 목적물 (0.671 g, 67 ％) 을 얻었다.
Figure pct00183
공정 4 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.671 g, 0.712 mmol) 을 디클로로메탄 (80 mL), 디메틸포름아미드 (5 mL) 의 혼합 용매를 사용하고, 실시예 1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.335 g, 44 ％) 을 얻었다.
Figure pct00184
공정 5 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.355 g, 0.712 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.264 g, 93 ％) 을 얻었다.
Figure pct00185
공정 6 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N5-카르바모일-L-오르니틴아미드
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.113 g, 0.126 mmol) 을, 실시예 4 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.149 g, 86 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1370(M+H)+
공정 7 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N5-카르바모일-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-오르니틴아미드
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.149 g, 0.109 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.119 g, 87 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1256(M+H)+
공정 8 : L-발릴-N5-카르바모일-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-오르니틴아미드
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.050 g, 0.0398 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0347 g, 80 ％) 을 얻었다.
Figure pct00186
공정 9 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N5-카르바모일-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-오르니틴아미드
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.0347 g, 0.0319 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.00650 g, 14 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1489(M+H)+
실시예 10 : 약물 링커 8
[화학식 134]
Figure pct00187
공정 1 : N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N6-[(2,2,2-트리클로로에톡시)카르보닐]-L-리신
출발 물질 10-1 (2.78 g, 7.75 mmol, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2012, 76, 205) 의 1,2-디메톡시에탄 (30 mL), 물 (30 mL), THF (15 mL) 용액에 탄산수소나트륨 (1.30 g, 15.5 mmol), 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발리네이트 (3.39 g, 7.76 mmol) 를 실온에서 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 5 일간 교반한 후, 클로로포름과 메탄올 혼합액 (10 : 1, v/v) 으로 추출하였다. 유기층을 물, 포화 식염수로 세정한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 디에틸에테르로 세정하고 고체를 여과 제거하였다. 여과액을 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 30 : 70 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (2.13 g, 43 ％) 을 얻었다.
Figure pct00188
공정 2 : N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]-N6-[(2,2,2-트리클로로에톡시)카르보닐]-L-리신아미드
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2.11 g, 3.29 mmol) 을, 실시예 5 공정 2 와 동일하게 반응시키고, 얻어진 화합물 (2.24 g, 91 ％) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 3 : L-발릴-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]-N6-[(2,2,2-트리클로로에톡시)카르보닐]-L-리신아미드
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (2.24 g, 3.00 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (20 mL) 용액에 피페리딘 (0.5934 mL, 5.994 mmol) 을 실온에서 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물 (1.576 g, 정량적) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 4 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]-N6-[(2,2,2-트리클로로에톡시)카르보닐]-L-리신아미드
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.58 g, 3.00 mmol) 을, 실시예 7 공정 1 과 동일하게 반응시키고, 얻어진 화합물 (1.50 g, 82 ％) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 5 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-N6-[(2,2,2-트리클로로에톡시)카르보닐]-L-리신아미드
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.57 g, 2.57 mmol) 을, 실시예 1 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.691 g, 71 ％) 을 얻었다.
Figure pct00189
공정 6 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-N6-[(2,2,2-트리클로로에톡시)카르보닐]-L-리신아미드
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1.69 g, 1.41 mmol) 을, 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.43 g, 94 ％) 을 얻었다.
Figure pct00190
공정 7 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N6-[(2,2,2-트리클로로에톡시)카르보닐]-L-리신아미드
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (1.43 g, 1.32 mmol) 을, 실시예 9 공정 3 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.714 g, 50 ％) 을 얻었다.
Figure pct00191
공정 8 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N6-[tert-부틸(디메틸)실릴]-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N6-[(2,2,2-트리클로로에톡시)카르보닐]-L-리신아미드
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.714 g, 0.660 mmol) 을, 실시예 1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.476 g, 60 ％) 을 얻었다.
Figure pct00192
공정 9 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N6-[tert-부틸(디메틸)실릴]-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N6-[(2,2,2-트리클로로에톡시)카르보닐]-L-리신아미드
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.476 g, 0.398 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.283 g, 68 ％) 을 얻었다.
Figure pct00193
공정 10 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조지아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N6-[(2,2,2-트리클로로에톡시)카르보닐]-L-리신아미드
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.119 g, 0.114 mmol) 을, 실시예 4 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.134 g, 77 ％) 을 얻었다.
공정 11 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N6-[(2,2,2-트리클로로에톡시)카르보닐]-L-리신아미드
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.134 g, 0.0881 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.120 g, 97 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1423(M+Na)+
공정 12 : L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N6-[(2,2,2-트리클로로에톡시)카르보닐]-L-리신아미드
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.120 g, 0.0855 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0813 g, 77 ％) 을 얻었다.
Figure pct00194
공정 13 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-N6-[(2,2,2-트리클로로에톡시)카르보닐]-L-리신아미드
상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (0.0813 g, 0.0659 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0721 g, 67 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1656(M+Na)+
공정 14 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-리신아미드
상기 공정 13 으로부터 얻어진 화합물 (0.0721 g, 0.0441 mmol) 을, 실시예 21 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0348 g, 54 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1460(M+H)+
실시예 11 : 약물 링커 9
[화학식 135]
Figure pct00195
공정 1 : N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-D-발릴-L-알라닌
L-알라닌 (0.0721 g, 0.0441 mmol) 을, 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-L-발리네이트 대신에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-D-발리네이트 (0.528 g, 5.92 mmol) 를 사용하여, 실시예 10 공정 1 과 동일하게 반응시켰다. 얻어진 화합물 (0.0348 g, 54 ％) 은 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
Figure pct00196
공정 2 : N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]-D-발릴-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]-L-알라닌아미드
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2.05 g, 4.99 mmol) 을, 실시예 5 공정 2 와 동일하게 반응시키고, 얻어진 화합물 (2.19 g, 85 ％) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 3 : D-발릴-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]-L-알라닌아미드
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (2.19 g, 4.25 mmol) 을, 실시예 10 공정 3 과 동일하게 반응시키고, 얻어진 화합물 (0.966 g, 76 ％) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 4 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-D-발릴-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]-L-알라닌아미드
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.966 g, 3.29 mmol) 을, 실시예 7 공정 1 과 동일하게 반응시키고, 얻어진 화합물 (1.11 g, 89 ％) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 5 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-D-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.11 g, 2.93 mmol) 을, 실시예 1 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.75 g, 80 ％) 을 얻었다.
Figure pct00197
공정 6 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-D-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1.75 g, 1.81 mmol) 을, 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.53 g, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00198
공정 7 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-D-발릴-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (1.53 g, 1.79 mmol) 을, 실시예 9 공정 3 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.24 g, 81 ％) 을 얻었다.
Figure pct00199
공정 8 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-D-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (1.24 g, 1.45 mmol) 을, 실시예 1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.979 g, 70 ％) 을 얻었다.
Figure pct00200
공정 9 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-D-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.979 g, 1.02 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.769 g, 94 ％) 을 얻었다.
Figure pct00201
공정 10 : N-[(프로프-2-엔)-1-일옥시)카르보닐]-D-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.100 g, 0.124 mmol) 을 사용하고, 실시예 4 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.148 g, 94 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1284(M+H)+
공정 11 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-D-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.148 g, 0.124 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.132 g, 98 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1170(M+H)+
공정 12 : D-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.132 g, 0.113 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0963 g, 85 ％) 을 얻었다.
Figure pct00202
공정 13 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-D-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (0.0455 g, 0.0454 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0416 g, 65 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1403(M+H)+
실시예 12 : 약물 링커 10
[화학식 136]
Figure pct00203
공정 1 : 화합물 12-2
출발 물질 12-1 (2.01 g, 5.94 mmol) 의 디클로로메탄 (50 mL) 에 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드염산염 (1.37 g, 7.3 mmol) 을 실온에서 첨가하고, 실온에서 10 분 교반한 후, 0 ℃ 에서 N-하이드록시숙신이미드 (0.821 g, 7.13 mmol) 를 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 하룻밤 교반한 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물에 아세트산에틸, 물을 첨가하고, 유기층을 물, 10 ％ 시트르산 수용액, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 90 : 10 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (2.11 g, 82 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 435(M+H)+
공정 2 : 화합물 12-3
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (2.11 g, 4.85 mmol) 을, N6-[(2,2,2-트리클로로에톡시)카르보닐]-L-리신염산염 대신에 L-이소류신을 사용하고, 실시예 10 공정 1 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.16 g, 99 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 451(M+H)+
공정 3 : 화합물 12-4
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (2.16 g, 4.85 mmol) 을, 실시예 5 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.48 g, 56 ％) 을 얻었다.
공정 4 : 화합물 12-5
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.48 g, 2.67 mmol) 을, 실시예 10 공정 3 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.794 g, 89 ％) 을 얻었다.
공정 5 : 화합물 12-6
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.794 g, 2.38 mmol) 을, 실시예 7 공정 1 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.886 g, 89 ％) 을 얻었다.
공정 6 : 화합물 12-7
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.794 g, 2.12 mmol) 을, 실시예 1 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.19 g, 72 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1006(M+H)+
공정 7 : 화합물 12-8
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (1.19 g, 1.18 mmol) 을, 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.07 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 892(M+H)+
공정 8 : 화합물 12-9
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (1.18 mmol) 을, 실시예 1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.800 g, 76 ％) 을 얻었다. MS(APCI, ESI)m/z : 890(M+H)+
공정 9 : 화합물 12-10
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.800 g, 0.899 mmol) 을, 실시예 1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.567 g, 90 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1004(M+H)+
공정 10 : 화합물 12-11
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.567 g, 0.564 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.454 g, 94 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 848(M+H)+
공정 11 : 화합물 12-12
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.100 g, 0.118 mmol) 을, 실시예 4 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.159 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1324(M+H)+
공정 12 : 화합물 12-13
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.118 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.139 g, 97 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1210(M+H)+
공정 13 : 화합물 12-14
상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (0.139 g, 0.114 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0667 g, 56 ％) 을 얻었다.
Figure pct00204
공정 14 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-D-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-이소류신아미드
상기 공정 13 에서 얻어진 화합물 (0.0314 g, 0.0301 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0300 g, 69 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1443(M+H)+
실시예 13 : 약물 링커 11
[화학식 137]
Figure pct00205
공정 1 : [2-(2-{[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]아미노}에톡시)에톡시]아세트산
출발 물질 13-1 (3.00 g, 7.78 mmol, 토쿄 화성 공업 주식회사) 의 N,N-디메틸포름아미드 (10 mL) 용액에, 실온에서 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (1.16 mL, 7.78 mL) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반한 후, 실온에서 1-{[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]옥시}피롤리딘-2,5-디온 (1.10 g, 2.72 mmol), 트리에틸아민 (1.94 mL, 14.0 mmol) 을 첨가하였다. 반응 용액을 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 클로로포름 : 메탄올 = 90 : 10 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.410 g, 12 ％) 을 얻었다.
Figure pct00206
공정 2 : N-{[2-(2-{[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]아미노}에톡시)에톡시]아세틸}-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.050 g, 0.0499 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0590 g, 82 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1434(M+H)+
실시예 14 : 약물 링커 12
[화학식 138]
Figure pct00207
공정 1 : N-[20-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-16,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-17-아자이코산-1-오일]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
실시예 4 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.0500 g, 0.0499 mmol), 출발 물질 14-1 (0.050 g, 0.0499 mmol, Alfa Aesar 로부터 판매), 트리에틸아민 (0.00830 mL, 0.0599 mmol) 의 디클로로메탄 (3 mL) 용액을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 클로로포름 : 메탄올 = 90 : 10 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.0490 g, 64 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1536(M＋H)＋
실시예 15 : 약물 링커 13
[화학식 139]
Figure pct00208
공정 1 : 디메틸 (6S,6'S)-5,5'-{1,5-펜탄디일비스[옥시(5-메톡시-2-니트로벤젠-4,1-디일)카르보닐]}비스(5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실레이트)
출발 물질 15-1 (5.41 g, 10.9 mmol, Journal of Medicinal Chemistry 2004, 47, 1161) 의 디클로로메탄 (50 mL) 용액에, 0 ℃ 에서 염화옥살릴 (5.63 mL, 65.7 mmol) 을 첨가하고, N,N-디메틸포름아미드 (0.0844 mL, 1.09 mmol) 적하하였다. 반응 용액을 실온까지 승온시키고, 2 시간 교반하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 디클로로메탄 (100 mL) 에 용해하고, 메틸(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실레이트염산염 (4.28 g, 24.1 mmol, Tetrahedron Letters 2012. 53. 3847) 과 트리에틸아민 (6.07 mL, 43.8 mmol) 의 디클로로메탄 용액 (100 mL) 에 질소 분위기하, -40 ℃ 에서 적하하였다. 반응 용액을 0 ℃ 로 승온시키고 2 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 1 규정 염산 (100 mL) 을 첨가하고, 유기층을 물, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하여, 목적물 (8.40 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00209
공정 2 : {1,5-펜탄디일비스[옥시(5-메톡시-2-니트로벤젠-4,1-디일)]}비스{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]메탄온}
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (8.40 g, 10.9 mmol) 의 THF (100 mL) 용액에, 수소화붕소리튬 (714 mg, 32.8 mmol) 을 첨가하고, 0 ℃ 에서 30 분 교반하고, 실온으로 승온시켜 1 시간 교반하였다. 0 ℃ 에서 1 규정 염산을 첨가한 후, 아세트산에틸로 추출하고, 포화 식염수로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압하에서 용매 증류 제거하여, 목적물 (7.70 g, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00210
공정 3 : 펜탄-1,5-디일비스[옥시(5-메톡시-2-니트로벤젠-4,1-디일)카르보닐(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5,6-디일메탄디일] 디아세테이트
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (7.70 g, 10.8 mmol) 을 피리딘 (20 mL) 및 무수 아세트산 (10 mL, 105.9 mmol) 에 용해하고, 실온에서 교반하였다. 감압 증류 제거하여, 목적물 (8.38 g, 97 ％) 을 얻었다.
Figure pct00211
공정 4 : 1,5-펜탄디일비스[옥시(2-아미노-5-메톡시벤젠-4,1-디일)카르보닐(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5,6-디일메탄디일]디아세테이트
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (8.28 g, 10.4 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (100 mL) 용액에, 5 ％ 팔라듐탄소 (54 ％ 수분, 1.00 g) 를 첨가한 후, 반응 용액을 수소 분위기하, 실온에서 6 시간 격렬하게 교반하였다. 셀라이트 여과한 후, 여과액을 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 90 : 10 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (5.05 g, 66 ％) 을 얻었다.
Figure pct00212
공정 5 : {(6S)-5-[4-({5-[4-({(6S)-6-[(아세틸옥시)메틸]-5-아자스피로[2. 4]헵트-5-일}카르보닐)-5-아미노-2-메톡시페녹시]펜틸}옥시)-5-메톡시-2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}벤조일]-5-아자스피로[2.4]헵트-6-일}메틸 아세테이트 (모노알릴옥시카르보닐체)
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (5.05 g, 6.85 mmol) 의 디클로로메탄 (100 mL) 용액에, 피리딘 (1.10 mL, 13.7 mmol) 을 첨가하고, 질소 분위기하, -78 ℃ 에서 클로로포름산알릴 (0.725 mL, 6.85 mmol) 을 첨가하고, 2 시간 교반하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 70 : 30 (v/v) ∼ 100 : 0 (v/v), 클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 90 : 10 (v/v)] 로 정제하여, 목적물인 비스알릴옥시카르보닐체 (1.36 g, 22 ％) 와, 모노알릴옥시카르보닐체 (2.63 g, 47 ％) 를 얻었다.
펜탄-1,5-디일비스[옥시(5-메톡시-2-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}벤젠-4,1-디일)카르보닐(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-5,6-디일메탄디일] 디아세테이트 (비스알릴옥시카르보닐체) :
Figure pct00213
모노알릴옥시카르보닐체 : 1H-NMR (DMSO-D6)
Figure pct00214
공정 6 : N-[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[2-({(6S)-6-[(아세틸옥시)메틸]-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일}카르보닐)-5-({5-[4-({(6S)-6-[(아세틸옥시)메틸]-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일}카르보닐)-2-메톡시-5-{[(2-프로 펜-1-일옥시)카르보닐]아미노}페녹시]펜틸}옥시)-4-메톡시페닐]카르바모일}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 5 에서 얻어진 모노알릴옥시카르보닐체 (2.00 g, 2.44 mmol) 를, 실시예 1 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.64 g, 89 ％) 을 얻었다.
Figure pct00215
공정 7 : N-[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-5-{[5-(4-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-2-메톡시-5-{[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]아미노}페녹시)펜틸]옥시}-4-메톡시페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (2.64 g, 2.16 mmol) 의 메탄올 (10 mL) 용액에, 탄산칼륨 (1.49 g, 10.8 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 염화암모늄 수용액 (100 mL) 을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하여, 목적물 (2.21 g, 90 ％) 을 얻었다.
Figure pct00216
공정 8 : N-[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-8'-{[5-({(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-10'-[(2-프로펜-1-일옥시)카르보닐]-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일}옥시)펜틸]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (2.03 g, 1.78 mmol) 의 디클로로메탄 (50 mL) 용액에, 데스마틴퍼아이오디난 (1.59 g, 3.74 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 수용액 (100 mL) 을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 90 : 10 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (2.05 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00217
공정 9 : L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (2.05 g, 1.80 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.02 g, 60 ％) 을 얻었다.
Figure pct00218
공정 10 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.710 g, 0.747 mmol) 과 실시예 2 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.313 g, 0.747 mmol) 을 디클로로메탄 (1.5 mL) 과 메탄올 (0.1 mL) 의 혼합 용매에 용해하였다. 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄클로라이드 (0.264 g, 0.897 mmol) 를 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 80 : 20 (v/v)] 로 정제하여 목적물 (0.671 g, 66 ％) 을 얻었다.
Table 2 : 약물 링커 13 의 프로톤 NMR 의 피크 위치 및 MS
Figure pct00219
실시예 16 : 약물 링커 14
[화학식 140]
Figure pct00220
공정 1 : N-[6-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-6-옥소헥사노일]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
실시예 15 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.100 g, 0.105 mmol) 과 아자디벤조시클로옥틴산 (0.0351 g, 0.105 mmol) 을 실시예 15 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0702 g, 53 ％) 을 얻었다.
Figure pct00221
실시예 17 : 약물 링커 15
[화학식 141]
Figure pct00222
공정 1 : 화합물 17-2
출발 원료 17-1 (2.00 g, 2.81 mmol, WO2013053872) 과 2-메톡시-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리딘 (2.00 g, 8.51 mmol) 을 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜 목적물 (1.89 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 672(M+H)+.
공정 2 : 화합물 17-3
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.89 g, 2.81 mmol) 을 에탄올 (30 mL) 과 포름산 (1.5 mL) 의 혼합 용매에 용해하였다. 아연 분말 (3.68 g) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 셀라이트 여과하고, 여과액에 포화 탄산수소나트륨 수용액 (100 mL) 을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하여, 목적물 (1.81 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 642(M+H)+.
공정 3 : 화합물 17-4
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.81 g, 2.82 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.76 g, 86 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 726(M+H)+.
공정 4 : 화합물 17-5
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.76 g, 2.42 mmol) 을, 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.05 g, 71 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 612(M+H)+.
공정 5 : 화합물 17-6
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.05 g, 1.71 mmol) 을, 실시예 9 공정 3 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.686 g, 66 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 610(M+H)+.
공정 6 : 화합물 17-7
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.481 g, 0.789 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.288 g, 72 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 508(M+H)+.
공정 7 : 화합물 17-8
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.288 g, 0.567 mmol) 을, 실시예 3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.268 g, 93 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 510(M+H)+.
공정 8 : 화합물 17-9
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.267 g, 0.525 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.278 g, 89 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 594(M+H)+.
공정 9 : 화합물 17-10
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.278 g, 0.468 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.207 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 438(M+H)+.
공정 10 : 화합물 17-11
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.0964 g, 0.220 mmol) 을, 실시예 1 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.307 g, 0.331 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.224 g, 79 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1285(M+H)+.
공정 11 : 화합물 17-12
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.294 g, 0.228 mmol) 을 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.284 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1171(M+H)+.
공정 12 : 화합물 17-13
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.284 g, 0.242 mmol) 을 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.114 g, 47 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1003(M+H)+.
공정 13 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[7-메톡시-2-(6-메톡시-3-피리디닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (0.114 g, 0.113 mmol) 을 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0121 g, 8 ％) 을 얻었다.
Figure pct00223
실시예 18 : 약물 링커 16
[화학식 142]
Figure pct00224
공정 1 : 화합물 18-1
출발 원료 17-1 (2.00 g, 2.81 mmol) 과 2-메틸-5-피리디닐보론산 (1.00 g, 7.30 mmol) 을 사용하여 실시예 3 공정 6 과 동일하게 스즈키 미야우라 커플링 반응시켜, 목적물 (0.901 g, 49 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 656(M+H)+.
공정 2 : 화합물 18-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.98 g, 3.02 mmol) 을, 실시예 17 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.86 g, 98 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 626(M+H)+.
공정 3 : 화합물 18-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.86 g, 2.97 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.36 g, 65 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 710(M+H)+.
공정 4 : 화합물 18-4
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.36 g, 2.42 mmol) 을, 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.991 g, 87 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 596(M+H)+.
공정 5 : 화합물 18-5
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.991 g, 1.66 mmol) 을 실시예 9 공정 3 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.608 g, 62 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 594(M+H)+.
공정 6 : 화합물 18-6
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.405 g, 0.682 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.239 g, 71 ％) 을 얻었다.
Figure pct00225
공정 7 : 화합물 18-7
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.239 g, 0.485 mmol) 을, 실시예 3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.180 g, 75 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 494(M+H)+.
공정 8 : 화합물 18-8
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.180 g, 0.364 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.179 g, 85 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 578(M+H)+.
공정 9 : 화합물 18-9
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.179 g, 0.309 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.137 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 422(M+H)+.
공정 10 : 화합물 18-10
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.0780 g, 0.185 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 에서 얻어진 화합물 대신에 실시예 1 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.258 g, 0.278 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.213 g, 91 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1269(M+H)+.
공정 11 : 화합물 18-11
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.213 g, 0.168 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.182 g, 94 ％) 을 얻었다.
Figure pct00226
공정 12 : 화합물 18-12
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.182 g, 0.157 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0751 g, 48 ％) 을 얻었다.
Figure pct00227
공정 13 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[7-메톡시-2-(6-메틸-3-피리디닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (0.0751 g, 0.0761 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0117 g, 11 ％) 을 얻었다.
Figure pct00228
실시예 19 : 약물 링커 17
[화학식 143]
Figure pct00229
공정 1 : [(2S)-2-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-4-(4-메톡시페닐)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-일](5-메톡시-2-니트로-4-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)메탄온
출발 물질 17-1 (2.00 g, 2.81 mmol) 을, 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.31 g, 93 ％) 을 얻었다.
Figure pct00230
공정 2 : (2-아미노-5-메톡시-4-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)[(2S)-2-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-4-(4-메톡시페닐)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-일]메탄온
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (1.31 g, 1.95 mmol) 을 실시예 17 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.12 g, 90 ％) 을 얻었다.
Figure pct00231
공정 3 : 프로프-2-엔-1-일 (2-{[(2S)-2-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-4-(4-메톡시페닐)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바메이트
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.12 g, 1.59 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.890 g, 77 ％) 을 얻었다.
Figure pct00232
공정 4 : 프로프-2-엔-1-일 (2-{[(2S)-2-(하이드록시메틸)-4-(4-메톡시페닐)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바메이트
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.890 g, 1.23 mmol) 을 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.696 g, 93 ％) 을 얻었다.
Figure pct00233
공정 5 : 프로프-2-엔-1-일 (11aS)-11-하이드록시-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-8-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.696 g, 1.14 mmol) 을, 실시예 1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.532 g, 77 ％) 을 얻었다.
Figure pct00234
공정 6 : 프로프-2-엔-1-일 (11aS)-11-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-8-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.532 g, 0.874 mmol) 을, 실시예 1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.532 g, 95 ％) 을 얻었다.
Figure pct00235
공정 7 : 프로프-2-엔-1-일 (11aS)-11-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8-하이드록시-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.532 g, 0.756 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.359 g, 86 ％) 을 얻었다.
Figure pct00236
공정 8 : 프로프-2-엔-1-일 (11aS)-8-(3-브로모프로폭시)-11-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.405 g, 0.715 mmol) 을, 실시예 4 공정 1 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.490 g, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00237
공정 9 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-8'-[3-({(11aS)-11-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.490 g, 0.713 mmol) 을, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.600 g, 60 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1414(M+H)+
공정 10 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-8'-[3-({(11aS)-11-하이드록시-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.600 g, 0.424 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.500 g, 99 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1184(M-H)+
공정 11 : L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.500 g, 0.421 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.113 g, 27 ％) 을 얻었다.
Figure pct00238
공정 12 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.157 g, 0.157 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.120 g, 49 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1401(M+H)+
실시예 20 : 약물 링커 18
[화학식 144]
Figure pct00239
공정 1 : {프로판-1,3-디일비스[옥시(5-메톡시-2-니트로벤젠-4,1-디일)]}비스{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]메탄온}
출발 원료 20-1 (3.00 g, 6.43 mmol, Journal of the American Chemical Society 1992, 13, 4939) 과 실시예 1 공정 3 에서 얻어진 화합물 (3.42 g, 14.2 mmol) 을 실시예 15 공정 1 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (3.74 g, 64 ％) 을 얻었다.
Figure pct00240
공정 2 : {프로판-1,3-디일비스[옥시(2-아미노-5-메톡시벤젠-4,1-디일)]}비스{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]메탄온}}
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3.74 g, 4.10 mmol) 을, 실시예 15 공정 4 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.97 g, 85 ％) 을 얻었다.
Figure pct00241
공정 3 : 프로프-2-엔-1-일 (5-[3-(5-아미노-4-{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-2-메톡시페닐)프로폭시]-2-{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시페닐)카르바메이트
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (2.97 g, 3.48 mmol) 을 실시예 15 공정 5 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.549 g, 17 ％) 을 얻었다.
Figure pct00242
공정 4 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-5-[3-(4-{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-2-메톡시-5-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}페녹시)프로폭시]-4-메톡시페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.549 g, 0.586 mmol) 을, 실시예 1 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.402 g, 51 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1341(M＋H)＋
공정 5 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-5-[3-(4-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-2-메톡시-5-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}페녹시)프로폭시]-4-메톡시페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-알라닌아미드
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.402 g, 0.300 mmol) 을, 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.282 g, 85 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1120(M＋H)＋
공정 6 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-8'-[3-({(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-10'-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일}옥시)프로폭시]-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.282 g, 0.253 mmol) 을, 실시예 1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0600 g, 21 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1106(M-H)＋
공정 7 : L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.0600 g, 0.0541 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0347 g, 70 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 922(M＋H)＋
공정 8 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.0347 g, 0.0376 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.00770 g, 16 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1323(M＋H)＋
실시예 21 : 약물 링커 19
[화학식 145]
Figure pct00243
공정 1 : 화합물 21-2
출발 원료 21-1 (11.8 g, 20.2 mmol, WO2013053872) 및 피리딘 (1.79 mL, 22.2 mmol) 의 THF (50 mL) 용액에, 빙랭하에서, 무수 아세트산 (2.10 mL, 22.3 mmol) 을 천천히 첨가하였다. 이어서 4-디메틸아미노피리딘 (0.459 g, 3.76 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 90 : 10 (v/v) ∼ 60 : 40 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (12.3 g, 97 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 625(M+H)+
공정 2 : 화합물 21-3
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (12.3 g, 19.7 mmol) 을, 실시예 15 공정 4 와 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (11.3 g, 97 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 595(M+H)+
공정 3 : 화합물 21-4
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (11.3 g, 19.0 mmol) 을, 클로로포름산알릴 대신에 클로로포름산 2,2,2-트리클로로에틸 (2.93 mL, 21.9 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (12.4 g, 85 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 769(M+H)+
공정 4 : 화합물 21-5
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (12.4 g, 16.1 mmol) 을 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (9.90 g, 94 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 655(M+H)+
공정 5 : 화합물 21-6
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (9.90 g, 15.1 mmol) 을, 실시예 1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (8.19 g, 83 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 653(M+H)+
공정 6 : 화합물 21-7
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (3.00 g, 4.59 mmol) 의 테트라하이드로푸란 (10 mL), 10 ％ 아세트산암모늄 수용액 (10 mL) 에, 10 ％ Cd/Pb (3.00 g, 24.0 mmol, 90 mass％) 를 첨가하고, 질소 분위기하, 격렬하게 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물을 여과하였다. 여과액을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 화합물 (2.10 g, 99 ％) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
MS(APCI, ESI)m/z : 461(M+H)+
공정 7 : 화합물 21-8
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (2.10 g, 4.56 mmol) 을, 실시예 3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.09 g, 99 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 463(M+H)+
공정 8 : 화합물 21-9
공정 7 에서 얻어진 화합물 (2.09 g, 4.52 mmol) 을, 실시예 21 공정 3 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.88 g, 100 ％) 을 얻었다.
Figure pct00244
공정 9 : 화합물 21-10
공정 8 에서 얻어진 화합물 (2.28 g, 4.51 mmol) 의 메탄올 (15 mL), 테트라하이드로푸란 (5 mL) 혼합 용액에, 탄산칼륨 (0.624 g, 4.52 mmol) 의 물 (15 mL) 용액을 천천히 적하하고, 실온에서 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 90 : 10 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (2.08 g, 77 ％) 을 얻었다.
Figure pct00245
공정 10 : 화합물 21-11
공정 9 에서 얻어진 화합물 (2.08 g, 3.49 mmol) 및 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리딜옥시라디칼 (0.109 g, 0.698 mmol) 의 디클로로메탄 (50 mL) 용액에, 빙랭하에서, 요오드벤젠디아세테이트 (2.00 g, 6.21 mmol) 를 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온하에서 2 시간 교반하였다. 원료 소실 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 90 : 10 (v/v) ∼ 60 : 40 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1. 94 g, 94 ％) 을 얻었다.
Figure pct00246
공정 11 : 화합물 21-12
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (1.94 g, 3.27 mmol) 을, 실시예 3 공정 5 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.17 g, 92 ％) 을 얻었다.
Figure pct00247
공정 12 : 화합물 21-13
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.837 g, 1.15 mmol) 과 퀴녹살린-6-보론산피나콜에스테르 (1.18 g, 4.61 mmol) 를, 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.713 g, 88 ％) 을 얻었다.
Figure pct00248
공정 13 : 화합물 21-14
상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (0.713 g, 1.01 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.400 g, 72 ％) 을 얻었다.
Figure pct00249
공정 14 : 화합물 21-15
상기 공정 13 에서 얻어진 화합물 (0.200 g, 0.364 mmol) 을, 실시예 1 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.321 g, 0.346 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 커플링 반응시켜, 목적물 (0.475 g, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00250
공정 15 : 화합물 21-16
상기 공정 14 에서 얻어진 화합물 (0.475 g, 0.340 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.310 g, 71 ％) 을 얻었다.
Figure pct00251
공정 16 : 화합물 21-17
상기 공정 15 에서 얻어진 화합물 (0.310 g, 0.242 mmol) 을, 실시예 21 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.168 g, 63 ％) 을 얻었다.
Figure pct00252
공정 17 : 화합물 21-18
상기 공정 16 에서 얻어진 화합물 (0.168 g, 0.152 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.112 g, 72 ％) 을 얻었다.
Figure pct00253
공정 18 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-5-옥소-2-(퀴녹살린-6-일)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 18 에서 얻어진 화합물 (0.112 g, 0.109 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.110 g, 71 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1425(M＋H)＋
실시예 22 : 약물 링커 20
[화학식 146]
Figure pct00254
공정 1 : 화합물 22-1
실시예 21 공정 5 에서 얻어진 화합물 (5.11 g, 7.81 mmol) 을, 실시예 1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (5.70 g, 95.0 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 767(M+H)+
공정 2 : 화합물 22-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (5.70 g, 7.42 mmol) 을, 실시예 21 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (5.07 g, 94 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 725(M+H)+
공정 3 : 화합물 22-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (5.07 g, 6.98 mmol) 을, 실시예 21 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (4.44 g, 88 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 723(M+H)+
공정 4 : 화합물 22-4
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (4.44 g, 6.13 mmol) 을, 실시예 3 공정 5 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (4.85 g, 92 ％) 을 얻었다.
Figure pct00255
공정 5 : 화합물 22-5
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.20 g, 1.40 mmol) 과 6-메톡시-2-나프틸보론산 (0.850 g, 4.21 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜 목적물 (1.06 g, 88 ％) 을 얻었다.
Figure pct00256
공정 6 : 화합물 22-6
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1.06 g, 1.23 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.6126 g, 71 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 707(M+H)+
공정 7 : 화합물 22-7
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.205 g, 0.290 mmol) 과 실시예 1 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.255 g, 0.274 mmol) 을, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 커플링 반응시켜, 목적물 (0.375 g, 83 ％) 을 얻었다.
Figure pct00257
공정 8 : 화합물 22-8
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.375 g, 0.241 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.236 g, 74 ％) 을 얻었다.
Figure pct00258
공정 9 : 화합물 22-9
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.236 g, 0.178 mmol) 을, 실시예 21 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.201 g, 99 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1134(M+H)+
공정 10 : 화합물 22-10
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.201 g, 0.177 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.180 g, 97 ％) 을 얻었다.
Figure pct00259
공정 11 : 화합물 22-11
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.0870 g, 0.0828 mmol) 을, 실시예 3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0650 g, 75 ％) 을 얻었다.
Figure pct00260
공정 12 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(6-메톡시나프탈렌-2-일)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.065 g, 0.062 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.048 g, 54 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1453(M＋H)＋
실시예 23 : 약물 링커 21
[화학식 147]
Figure pct00261
공정 1 : 화합물 23-2
출발 원료 23-1 (14.8 g, 54.4 mmol, WO2011130613) 을, 실시예 5 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (12.2 g, 63 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 379(M+H)+
공정 2 : 화합물 23-3
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3.78 g, 10.0 mmol) 을, 실시예 1 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (3.86 g, 40 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 967(M+H)+
공정 3 : 화합물 23-4
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (3.860 g, 3.99 mmol) 을, 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (3.11 g, 92 ％) 을 얻었다.
Figure pct00262
공정 4 : 화합물 23-5
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (3.11 g, 3.65 mmol) 을, 실시예 1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.58 g, 84 ％) 을 얻었다.
Figure pct00263
공정 5 : 화합물 23-6
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (2.58 g, 3.03 mmol) 을, 실시예 1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.75 g, 94 ％) 을 얻었다.
Figure pct00264
공정 6 : 화합물 23-7
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (2.75 g, 2.85 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.28 g, 99 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 809(M+H)+
공정 7 : 화합물 23-8
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.340 g, 0.420 mmol) 을, 실시예 4 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.530 g, 98 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1285(M+H)+
공정 8 : 화합물 23-9
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.530 g, 0.412 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.362 g, 75 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1171(M+H)+
공정 9 : 화합물 23-10
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.444 g, 0.379 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.347 g, 91 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1103(M＋H)＋
공정 10 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{6-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]피리딘-3-일}-L-알라닌아미드
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.100 g, 0.0997 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.067 g, 48 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1404(M＋H)＋
실시예 24 : 약물 링커 22
[화학식 148]
Figure pct00265
공정 1 : 화합물 24-2
질소 분위기하, 메틸트리페닐포스포늄브로마이드 (7.28 g, 20.4 mmol) 의 테트라하이드로푸란 (30 mL) 현탁 용액에, 0 ℃ 에서 칼륨tert-부톡사이드 (2.06 g, 18.3 mmol) 를 소량씩 첨가한 후, 2 시간 교반하였다. 화합물 24-1 (1.8 g, 2.04 mmol, WO2013053872) 의 THF (10 mL) 용액을 2 분간에 걸쳐 적하하고, 0 ℃ 에서 28 시간 교반하였다. 반응액에 물, 및 시트르산 수용액을 첨가한 후 (pH = 4.0), 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.450 g, 52 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 423(M+H)+.
공정 2 : 화합물 24-3
질소 분위기하, 상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.668 g, 1.58 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (10 mL) 용액에 이미다졸 (0.211 g, 3.16 mmol) 를 첨가하였다. 그 후, 트리이소프로필실릴클로라이드 (0.502 mL, 2.37 mmol) 를 적하하고 실온에서 6 시간 교반하였다. 반응액에 10 ％ 시트르산 수용액을 첨가하고, 아세트산에틸로 2 회 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제를 실시하여, 목적물 (0.520 g, 57 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 579(M+H)+.
공정 3 : 화합물 24-4
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.520 g, 0.898 mmol) 을, 실시예 17 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.478 g, 97 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 547(M-H)+.
공정 4 : 화합물 24-5
질소 분위기하, 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.478 g, 0.871 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켰다. 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물 (0.570 g) 을 이대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 5 : 화합물 24-6
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.570 g) 을, 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.446 g, 95 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 519(M+H)+.
공정 6 : 화합물 24-7
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.446 g, 0.859 mmol) 을, 실시예 1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.196 g, 44 ％) 을 얻었다.
Figure pct00266
공정 7 : 화합물 24-8
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.195 g, 0.377 mmol) 을, 실시예 1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.230 g, 97 ％) 을 얻었다.
Figure pct00267
공정 8 : 화합물 24-9
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.230 g, 0.365 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켰다. 본 공정에서는, 반응 종료 후, 분액 조작을 실시하고, 유기 용매를 감압 증류 제거하여 얻어진 미정제 생성물 (0.238 g, 정량적) 을 다음의 반응에 사용하였다.
공정 9 : 화합물 24-10
상기 공정에서 얻어진 화합물과 실시예 1 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.251 g, 0.311 mmol) 을, 실시예 3 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.185 g, 62 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 958[81Br, (M+H)+], 956[79Br, (M+H)+].
공정 10 : 화합물 24-11
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.0660 g, 0.139 mmol) 과 상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.133 g, 0.139 mmol) 을 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.123 g, 66 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1350(M+H)+.
공정 11 : 화합물 24-12
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.123 g, 0.0910 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응을 실시하여, 목적물 (0.0950 g, 92 ％) 을 얻었다.
Figure pct00268
공정 12 : 화합물 24-13
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.0950 g, 0.0847 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0610 g, 76 ％) 을 얻었다.
Figure pct00269
공정 13 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-메틸리덴-5-옥소-2,3,5,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (0.0600 g, 0.0629 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.075 g, 89 ％) 을 얻었다.
Figure pct00270
실시예 25 : 약물 링커 23
[화학식 149]
Figure pct00271
공정 1 : 화합물 25-1
출발 물질 17-1 (3.81 g, 5.34 mmol) 과 tert-부틸 4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보란-2-일)페닐카르보네이트 (5.13 g, 16.0 mmol) 를 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (3.05 g, 75 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 757(M+H)+.
공정 2 : 화합물 25-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3.05 g, 4.09 mmol) 을, 실시예 17 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.67 g, 91 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 727(M+H)+.
공정 3 : 화합물 25-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (2.67 g, 3.67 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켰다. 본 공정에서는, 반응 종료 후, 분액 조작을 실시하고, 유기 용매를 감압 농축하여 얻어진 미정제 생성물 (3.00 g, 정량적) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 4 : 화합물 25-4
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (3.05 g) 을, 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응을 실시하여, 목적물 (2.67 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00272
공정 5 : 화합물 25-5
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.22 g, 1.75 mmol) 을, 실시예 9 공정 3 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.838 g, 69 ％) 을 얻었다.
Figure pct00273
공정 6 : 화합물 25-6
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.838 g, 1.21 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.745 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00274
공정 7 ∼ 9 : 화합물 25-9
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.745 g, 1.26 mmol) 을, 실시예 3 공정 8, 공정 9 및 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.516 g, 3 공정 수율 78 ％) 을 얻었다.
Figure pct00275
공정 10 : 화합물 25-10
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.105 g, 0.200 mmol) 과 실시예 1 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.186 g, 0.200 mmol) 을 실시예 3 공정 10 과 동일하게 커플링 반응시켜, 목적물 (0.248 g, 90 ％) 을 얻었다.
Figure pct00276
공정 11 : 화합물 25-11
상기 공정 11 에서 얻은 화합물 (0.248 g, 0.181 mmol) 의 디클로로메탄 (3 mL) 용액에 피페리딘 (3 mL) 을 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액을 시트르산 수용액으로 희석하고, 아세트산에틸로 2 회 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 유기 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 90 : 10 (v/v)] 로 정제를 실시하여, 목적물 (0.153 g, 93 ％) 을 얻었다.
Figure pct00277
공정 12 : 화합물 25-12
상기 공정 11 에서 얻은 화합물 (0.175 g, 0.138 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.162 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1156(M＋H)＋.
공정 13 : 화합물 25-13
상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (0.116 g, 0.100 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0410 g, 41 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 988(M＋H)＋.
공정 14 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-8'-(3-{[(11aS)-2-(4-하이드록시페닐)-7-메톡시-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 13 에서 얻어진 화합물 (0.00500 g, 0.00506 mmol), 실시예 2 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.0100 g, 0.0202 mmol) 을 디클로로메탄 (0.3 mL) 과 메탄올 (0.3 mL) 에 용해하고, N,N-디이소프로필에틸아민 (3.5 μL, 0.0202 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응액을 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : CMW = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제를 실시하여, 목적물 (0.00350 g, 50 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1389(M＋H)＋.
실시예 26 : 약물 링커 24
[화학식 150]
Figure pct00278
공정 1 : 화합물 26-1
출발 물질 17-1 (3.93 g, 5.51 mmol) 과 4-(하이드록시메틸)페닐보론산을 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (3.09 g, 84 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 671(M+H)+.
공정 2 : 화합물 26-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3.09 g, 4.61 mmol) 의 디클로로메탄 (100 mL) 용액을 빙랭하고, 트리에틸아민 (1.60 mL, 11.5 mmol) 을 첨가한 후, 아세틸클로라이드 (0.491 mL, 6.91 mmol) 를 적하하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응액을 시트르산 수용액으로 희석하고, 클로로포름으로 3 회 추출하였다. 유기층을 포화 탄산나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조한 후, 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 화합물 (3.75 g, 정량적) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 3 : 화합물 26-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (3.28 g, 4.60 mmol) 을, 실시예 17 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.09 g, 67 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 682(M+H)+.
공정 4 : 화합물 26-4
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.01 g, 1.48 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켰다. 감압 증류 제거한 후, 얻어진 화합물 (1.19 g, 정량적) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 5 : 화합물 26-5
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.19 g, 1.55 mmol) 을, 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.885 g, 87 ％) 을 얻었다.
Figure pct00279
공정 6 ∼ 7 : 화합물 26-7
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.885 g, 1.36 mmol) 을, 실시예 9 공정 3 및 실시예 3 공정 12 와 동일하게 하여, 목적물 (0.515 g, 85 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 549(M＋H)＋.
공정 8-10 : 화합물 26-10
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.515 g, 0.983 mmol) 을, 실시예 3 공정 8, 공정 9 및 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.448 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00280
공정 11 : 화합물 26-11
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.0690 g, 0.144 mmol) 과 실시예 1 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.134 g, 0.144 mmol) 을 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.118 g, 62 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1325(M+H)+.
공정 12 ∼ 13 : 화합물 26-13
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.134 g, 0.101 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 및 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0950 g, 2 공정 수율 90 ％) 을 얻었다.
Figure pct00281
공정 14 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-8'-(3-{[(11aS)-2-{4-[(아세틸옥시)메틸]페닐}-7-메톡시-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 13 에서 얻어진 화합물 (0.0700 g, 0.0670 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0520 g, 54 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1445(M＋H)＋.
실시예 27 : 약물 링커 25
[화학식 151]
Figure pct00282
공정 1 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-8'-[3-({(11aS)-2-[4-(하이드록시메틸)페닐]-7-메톡시-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
실시예 26 공정 14 에서 얻어진 화합물 (0.0230 g, 0.0159 mmol) 의 메탄올 (2 mL) 용액에 1 규정의 수산화나트륨 용액 (0.0175 mL, 0.0175 mmol) 을 첨가하고 실온에서 1 시간 교반하였다. 추가로 1 규정의 수산화나트륨 용액 (0.0175 mL, 0.0175 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 30 분간 교반하였다. 반응액에 1 규정의 염산 수용액 (0.0350 mL), 및 물을 첨가하고, 클로로포름으로 3 회 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : CMW = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제를 실시하여, 목적물 (0.0190 g, 85 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1403(M＋H)＋.
실시예 28 : 약물 링커 26
[화학식 152]
Figure pct00283
공정 1 : 화합물 28-1
실시예 4 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.12 g, 1.70 mmol) 과 4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보란-2-일)트리플루오로메틸벤젠 (0.924 g, 3.40 mmol) 을, 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.918 g, 83 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 657[81Br, (M+H)+], 655[79Br, (M+H)+].
공정 2 : 화합물 28-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.918 g, 1.40 mmol) 을, 실시예 3 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.425 g, 60 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 511[81Br, (M+H)+], 509[79Br, (M+H)+].
공정 3 : 화합물 28-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.425 g, 0.834 mmol) 을, 실시예 3 공정 8 과 동일하게 반응시켰다. 분액 조작 후, 감압 증류 제거하고, 얻어진 화합물 (0.410 g) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 4 : 화합물 28-4
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.425 g, 0.834 mmol) 을, 실시예 3 공정 8 및 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.420 g, 85 ％) 을 얻었다. MS(APCI, ESI)m/z : 597[81Br, (M+H)+], 595[79Br, (M+H)+].
공정 5 : 화합물 28-5
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.0960 g, 0.160 mmol) 을, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.212 g, 99 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1321(M+H)+.
공정 6 : 화합물 28-6
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.210 g, 0.159 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.162 g, 84 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1208(M+H)+.
공정 7 : 화합물 28-7
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.160 g, 0.132 mmol) 을 사용하고 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응을 실시하여, 목적물 (0.103 g, 75 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1039(M+H)+.
공정 8 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-5-옥소-2-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
출발 원료 4-4 를 상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.101 g, 0.0971 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.107 g, 76 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1441(M＋H)＋.
실시예 29 : 약물 링커 27
[화학식 153]
Figure pct00284
공정 1 : tert-부틸 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-L-류시네이트
tert-부틸-L-프롤릴-L-류시네이트 (4.64 g, 16.3 mmol) 를, 피리딘 대신에 트리에틸아민 (3.41 mL, 24.5 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켰다. 반응 종료 후, 분액 조작을 하고, 유기 용매를 감압 증류 제거함으로써 얻어진 화합물 (5.79 g, 96 ％) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 2 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-L-류신
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (5.79 g, 15.7 mmol) 의 디클로로메탄 (60 mL) 용액에 트리플루오로아세트산 (20 mL) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응액에 톨루엔을 첨가하고 감압 증류 제거함으로써, 얻어진 화합물 (2.69 g, 55 ％) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 3 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-N-[4-(하이드록시메틸)페닐]-L-류신아미드
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (6.10 g, 19.5 mmol) 의 THF (100 mL) 용액에 N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린 (5.07 g, 20.5 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 4-아미노벤질알코올 (2.16 g, 20.5 mmol) 을 첨가하고, 하룻밤 교반하였다. 반응액을 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 아세트산에틸에 용해하였다. 묽은 염산, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정하고, 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 90 : 10 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1.60 g, 20 ％) 을 얻었다.
Figure pct00285
공정 4 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-류신아미드
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.838 g, 2.01 mmol) 을, 실시예 1 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.535 g, 37 ％) 을 얻었다.
Figure pct00286
공정 5 ∼ 6 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-류신아미드
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.535 g, 0.531 mmol) 을, 실시예 1 공정 7 및 실시예 9 공정 3 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.367 g, 78 ％) 을 얻었다.
Figure pct00287
공정 7 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-류신아미드
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.367 g, 0.412 mmol) 을 사용하고 실시예 1 공정 9 와 동일하게 반응을 실시하여, 목적물 (0.181 g, 44 ％) 을 얻었다.
Figure pct00288
공정 8 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-류신아미드
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.181 g, 0.180 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 하여, 목적물 (0.153 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00289
공정 9 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-류신아미드
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.153 g, 0.180 mmol) 을 실시예 4 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.137 g, 57 ％) 을 얻었다.
Figure pct00290
공정 10 : 1-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-류신아미드
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.136 g, 0.103 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.116 g, 93 ％) 을 얻었다.
Figure pct00291
공정 11 : L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-류신아미드
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.116 g, 0.0958 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0530 g, 53 ％) 을 얻었다.
Figure pct00292
공정 12 : N-[(9H-플루오렌-9-일옥시)카르보닐]글리실글리실-L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-류신아미드
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.0410 g, 0.0393 mmol) 과 N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실글리신 (0.0410 g, 0.0393 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (1 mL) 용액에, 1-하이드록시벤조트리아졸 1 수화물 (0.000602 g, 0.00393 mmol) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 (0.00905 g, 0.0472 mmol) 을 첨가하여 실온에서 1 시간 교반하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 ∼ 90 : 10) 로 정제를 실시하여, 목적물 (0.0520 g, 94 ％) 을 얻었다.
Figure pct00293
공정 13 : 글리실글리실-L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-류신아미드
상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (0.0520 g, 0.0377 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (2 mL) 용액에 1,8-디아자비시클로[5.4.0]-7-운데센 (67 μL, 0.0453 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : CMW = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제를 실시하여, 목적물 (0.0420 g, 92 ％) 을 얻었다.
Figure pct00294
공정 14 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-프롤릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-류신아미드
상기 공정 13 에서 얻어진 화합물 (0.0400 g, 0.0346 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (1 mL) 용액에 1-{[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]옥시}피롤리딘-2,5-디온 (0.0140 g, 0.0346 mmol, Click Chemistry Tools) 과 디이소프로필아민 (0.0240 mL, 0.138 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 18 시간 교반하였다. 반응액을 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 90 : 10 (v/v)] 로 정제를 실시하여, 목적물 (0.0230 g, 46 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1443(M＋H)＋.
실시예 30 : 약물 링커 28
[화학식 154]
Figure pct00295
공정 1 : N-{[(1R,8S)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메톡시]카르보닐}글리실글리신
출발 물질 30-1 (0.215 g, 0.682 mmol, Chemistry-A European Journal 2016, 22, 639) 의 N,N-디메틸포름아미드 (4 mL) 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.119 mL, 0.682 mmol), 글리실-글리신 (0.0900 g, 0.682 mmol), 및 물 (2 mL) 을 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응액을 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : CMW = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제를 실시하여, 목적물 (0.205 g, 98 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 309(M+H)+.
공정 2 : N-{[(1R,8S)-비시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메톡시]카르보닐}글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.0180 g, 0.0587 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0420 g, 60 ％) 을 얻었다.
Figure pct00296
실시예 31 : 약물 링커 29
[화학식 155]
Figure pct00297
공정 1 : 화합물 31-1
실시예 4 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.00 g, 1.52 mmol) 과 4-메틸페닐보론산 (0.309 g, 2.27 mmol) 을 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.653 g, 72 ％) 을 얻었다.
공정 2 : 화합물 31-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.653 g, 1.09 mmol) 을, 실시예 3 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.377 g, 76 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 457[81Br, (M+H)+], 455[79Br, (M+H)+].
공정 3 : 화합물 31-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.377 g, 0.828 mmol) 을, 실시예 3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.311 g, 82 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 459[81Br, (M+H)+], 457[79Br, (M+H)+].
공정 4 : 화합물 31-4
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.311 g, 0.68 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.320 g, 87 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 543[81Br, (M+H)+], 541[79Br, (M+H)+].
공정 5 : 화합물 31-5
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.0737 g, 0.136 mmol) 을, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.145 g, 92 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1272(M＋H)＋.
공정 6 : 화합물 31-6
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.145 g, 0.114 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.122 g, 93 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1158(M＋H)＋.
공정 7 : 화합물 31-7
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.122 g, 0.114 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0598 g, 53 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 990(M＋H)＋.
공정 8 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.0300 g, 0.0304 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0184 g, 44 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1391(M＋H)＋.
실시예 32 : 약물 링커 30
[화학식 156]
Figure pct00298
공정 1 : 화합물 32-1
실시예 4 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.00 g, 1.52 mmol) 과 4-플루오로페닐보론산 (0.318 g, 2.27 mmol) 을 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.623 g, 68 ％) 을 얻었다.
공정 2 : 화합물 32-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.623 g, 1.03 mmol) 을, 실시예 3 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.244 g, 52 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 461[81Br, (M+H)+], 459[79Br, (M+H)+].
공정 3 : 화합물 32-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.244 g, 0.531 mmol) 을, 실시예 3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.144 g, 59 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 463[81Br, (M+H)+], 461[79Br, (M+H)+].
공정 4 : 화합물 32-4
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.144 g, 0.2.95 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.139 g, 82 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 547[81Br, (M+H)+], 545[79Br, (M+H)+].
공정 5 : 화합물 32-5
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.0742 g, 0.136 mmol) 을, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.138 g, 88 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1284(M＋H)＋.
공정 6 : 화합물 32-6
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.138 g, 0.108 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.109 g, 87 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1170(M＋H)＋.
공정 7 : 화합물 32-7
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.109 g, 0.101 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0613 g, 61 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1002(M+H)+.
공정 8 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-8'-(3-{[(11aS)-2-(4-플루오로페닐)-7-메톡시-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.0300 g, 0.0333 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0191 g, 45 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1402(M＋H)＋.
실시예 33 : 약물 링커 31
[화학식 157]
Figure pct00299
공정 1 : 화합물 33-1
실시예 4 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.00 g, 1.52 mmol) 과 티오펜-3-보론산 (0.582 g, 4.55 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.611 g, 68 ％) 을 얻었다.
공정 2 : 화합물 33-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.611 g, 1.03 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.397 g, 86 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 449[81Br, (M+H)+], 447[79Br, (M+H)+].
공정 3 : 화합물 33-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.397 g, 0.887 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.341 g, 86 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 451[81Br, (M+H)+], 449[79Br, (M+H)+].
공정 4 : 화합물 33-4
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.341 g, 0.759 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.368 g, 91 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 535[81Br, (M+H)+], 533[79Br, (M+H)+].
공정 5 : 화합물 33-5
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.0726 g, 0.136 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.125 g, 80 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1260(M＋H)＋.
공정 6 : 화합물 33-6
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.125 g, 0.0992 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.109 g, 96 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1146(M＋H)＋.
공정 7 : 화합물 33-7
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.109 g, 0.0951 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0723 g, 78 ％) 을 얻었다.
Figure pct00300
공정 8 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-5-옥소-2-(티오펜-3-일)-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.0300 g, 0.0307 mmol) 를 사용하고, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0101 g, 24 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1379(M＋H)＋.
실시예 34 : 약물 링커 32
[화학식 158]
Figure pct00301
공정 1 : 화합물 34-2
출발 물질 34-1 (4.00 g, 10.8 mmol, US20150283262) 의 디클로로메탄 (100 mL) 용액에, N,N-디메틸포름아미드 (0.2 mL), 염화옥살릴 (2.75 g, 21.7 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 실온에서 30 분간 교반하였다. 용매를 감압 증류 제거한 후, 잔류물을 감압하 건조시키고, 디클로로메탄 (60 mL) 에 녹였다. (2S)-2-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-2,3-디하이드로-1H-인돌 (4.28 g, 16.2 mmol, Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 14264), 트리에틸아민 (1.64 g, 16.2 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 실온에서 15 분간 교반하였다. 반응 용액에 물을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 얻어진 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 80 : 20 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (6.10 g, 92 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 615(M＋H)＋
공정 2 : 화합물 34-3
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (6.10 g, 9.90 mmol) 의 에탄올 (100 mL) 용액에, 질소 분위기하, 5 ％ 팔라듐탄소 (54 ％ 수분, 1.00 g) 를 첨가한 후, 반응 용액을 수소 분위기하, 실온에서 4 시간 교반하였다. 반응 용액을 셀라이트 여과한 후, 여과액을 감압 증류 제거하여, 목적물 (5.80 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 585(M+H)+
공정 3 : 화합물 34-4
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (2.90 g, 5.00 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (3.20 g, 96 ％) 을 얻었다.
Figure pct00302
공정 4 : 화합물 34-5
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (3.20 g, 4.80 mmol) 을 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.32 g, 87 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 555(M+H)+
공정 5 : 화합물 34-6
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (2.32 g, 4.18 mmol) 을, 실시예 1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.68 g, 73 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 553(M+H)+
공정 6 : 화합물 34-7
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (1.68 g, 3.04 mmol) 을, 실시예 1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.32 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00303
공정 7 : 화합물 34-8
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (2.32 g, 3.48 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.42 g, 80 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 511(M+H)+
공정 8 : 화합물 34-9
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.720 g, 1.41 mmol) 을, 실시예 4 공정 1 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.580 g, 65 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 633[81Br, (M+H)+], 631[79Br, (M+H)+].
공정 9 : 화합물 34-10
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.235 g, 0.371 mmol) 을, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.347 g, 83 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1359(M＋H)＋
공정 10 : 화합물 34-11
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.347 g, 0.255 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 실릴 탈보호체 (0.265 g, 92 ％) 를 얻었다. 실릴 탈보호체 (0.265 g, 0.234 mmol) 를 실시예 1 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.086 g, 39 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 944(M＋H)＋
공정 11 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(5aS)-10-메톡시-12-옥소-5a,12-디하이드로-5H-인돌[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-9-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.0860 g, 0.0911 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0800 g, 65 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1345(M＋H)＋
실시예 35 : 약물 링커 33
[화학식 159]
Figure pct00304
공정 1 : 화합물 35-1
실시예 34 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.700 g, 1.37 mmol) 을, 실시예 3 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.790 g, 87 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 661[81Br, (M+H)+], 659[79Br, (M+H)+].
공정 2 : 화합물 35-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.245 g, 0.371 mmol) 을, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.368 g, 86 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1387(M＋H)＋
공정 3 : 화합물 35-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.368 g, 0.265 mmol) 을, 실시예 3 공정 11, 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.180 g, 81 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 972(M＋H)＋
공정 4 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(5aS)-10-메톡시-12-옥소-5a,12-디하이드로-5H-인돌로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-9-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.0700 g, 0.0720 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0440 g, 44 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1373(M＋H)＋
실시예 36 : 약물 링커 34
[화학식 160]
Figure pct00305
공정 1 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-7-메톡시-5,11-디옥소-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-카르발데하이드
실시예 3 공정 5 에서 얻어진 화합물 (3.54 g, 5.15 mmol) 을 N,N-디메틸포름아미드 (52 mL) 에 용해하고, N-포르밀사카린 (5.44 g, 25.7 mmol), 아세트산팔라듐 (0.0578 g, 0.257 mmol), 1,4-비스(디페닐포스피노)부탄 (0.154 g, 0.360 mmol), 탄산나트륨 (2.73 g, 25.7 mmol), 트리에틸실란 (1.20 g, 10.3 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 19 시간 교반하였다. 반응 용액에 물을 첨가하고, 반응 용액을 아세트산에틸로 추출하고, 물, 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 40 : 60 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.760 g, 26 ％) 을 얻었다.
Figure pct00306
공정 2 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-2-(하이드록시메틸)-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.760 g, 1.34 mmol) 을 디클로로메탄 (14 mL) 에 용해하고, 수소화붕소나트륨 (0.101 g, 2.68 mmol) 을 -78 ℃ 에서 첨가한 후, 실온까지 승온시켰다. 반응 용액에 1 규정 염산을 첨가하고, 유기층을 물, 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘으로 건조 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.432 g, 57 ％) 을 얻었다.
Figure pct00307
공정 3 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-2-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-7-메톡시-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.432 g, 0.758 mmol) 을 N,N-디메틸포름아미드 (8 mL) 에 용해하고, 이미다졸 (0.0775 g, 1.14 mmol), tert-부틸디메틸실릴클로라이드 (0.137 g, 0.910 mmol) 를 실온에서 첨가하고, 실온에서 10 분간 교반하였다. 반응 용액에 물을 첨가하고, 반응 용액을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물, 포화 식염수로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조하였다. 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 30 : 70 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.485 g, 94 ％) 을 얻었다.
Figure pct00308
공정 4 : (11aS)-8-[(5-브로모펜틸)옥시]-2-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-7-메톡시-1,11a-디하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.103 g, 0.151 mmol) 을 실시예 3 공정 7 과 동일하게 반응시켜 목적물 (0.0590 g, 73 ％) 을 얻었다.
Figure pct00309
공정 5 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8'-[(5-{[(11aS)-2-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.251 g, 0.467 mmol) 을, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.300 g, 51 ％) 을 얻었다.
공정 6 : L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-8'-[(5-{[(11aS)-2-(하이드록시메틸)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.300 g, 0.237 mmol) 을, 실시예 33 공정 11, 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0540 g, 53 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 952(M＋H)＋
공정 7 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-8'-[(5-{[(11aS)-2-(하이드록시메틸)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.0500 mg, 0.0525 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0340 mg, 48 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1351(M-H)-
실시예 37 : 약물 링커 35
[화학식 161]
Figure pct00310
공정 1 : 메틸(6S)-5-[4-(벤질옥시)-5-메톡시-2-니트로벤조일]-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실레이트
4-(벤질옥시)-5-메톡시-2-니트로벤조산 (6.07 g, 20.0 mmol, Tetrahedron 1995, 51, 5617), N,N-디메틸포름아미드 (1.08 mL, 13.9 mmol) 의 디클로로메탄 (100 mL) 용액에, 빙랭하에서 염화옥살릴 (3.43 mL, 40.0 mmol) 을 5 분간에 걸쳐 적하하였다. 실온에서 반응 용액을 5 시간 교반한 후, 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 디클로로메탄 (20 mL) 에 용해시키고, 감압 증류 제거하였다. 이 조작을 3 회 반복한 후에, 잔류물을 디클로로메탄 (5 mL) 에 현탁시키고, 이것에 과잉의 디에틸에테르와 헥산을 첨가하고, 여과하고, 감압하에 건조시킴으로써 미정제 산클로라이드를 얻었다. 얻어진 산클로라이드를 디클로로메탄에 용해시키고, -40 ℃ (드라이아이스-아세토니트릴욕) 로 냉각하고, 메틸(6S)-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르복실레이트염산염 (4.22 g, 22.0 mmol, Tetrahedron Letters 2012. 53. 3847), 트리에틸아민 (3.36 mL, 24.2 mmol) 을 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 하룻밤에 걸쳐 실온으로까지 승온시켰다. 반응 혼합물에 1 규정 염산을 첨가하고, 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 물, 포화 탄산수소나트륨 수용액 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 ∼ 50 : 50] 로 정제하여, 목적물 (6.55 g, 80 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 441(M＋H)＋
공정 2 : (11a'S)-8'-(벤질옥시)-7'-메톡시-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5',11'(10'H,11a'H)-디온
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (6.55 g, 16.0 mmol) 의 에탄올 (150 mL), THF (150 mL) 용액에 질소 분위기하, 라니 니켈 (7.00 g) 을 첨가하였다. 반응 혼합물에 하이드라진 1 수화물 (7 mL) 을 첨가하고, 50 ℃ 까지 서서히 승온시켰다. 50 ℃ 에서 2 시간 교반한 후에 라니 니켈 (3.00 g), 하이드라진 1 수화물 (3 mL) 을 첨가하고, 1 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 THF (100 mL) 를 첨가하고, 셀라이트 여과하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 25 : 75 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (4.42 g, 73 ％) 을 얻었다.
Figure pct00311
공정 3 : (11a'S)-8'-(벤질옥시)-7'-메톡시-10'-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5',11'(10'H,11a'H)-디온
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (10.0 g, 26.4 mmol) 의 THF (150 mL) 용액에 -40 ℃ 에서, 2.6 mol/L 의 노르말부틸리튬노르말헥산 용액 (12.0 mL, 31.8 mmol) 을 천천히 적하하였다. 반응 용액을 -40 ℃ 에서 15 분간 교반한 후, 2-(클로로메톡시)에틸트리메틸실란 (5.57 mL, 31.7 mmol) 을 천천히 적하하였다. 반응 용액을 실온에서 3 시간 교반한 후, 물을 첨가하고 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 30 : 70 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (11.8 g, 88 ％) 을 얻었다.
Figure pct00312
공정 4 : (11a'S) -8'-하이드록시-7'-메톡시-10'-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5',11'(10'H,11a'H)-디온
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (18.7 g, 36.8 mmol) 의 THF (50 mL), 에탄올 (100 mL) 용액에, 질소 분위기하에 있어서 5 ％ 의 팔라듐탄소 촉매 (5.00 g) 를 첨가하였다. 즉시 질소 풍선을 수소 풍선으로 교체 부착하고, 반응 혼합물을 수소 분위기하에서 6 시간 교반하였다. 반응 혼합물에 클로로포름을 첨가하여 희석하고, 셀라이트 여과를 한 후, 여과액을 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 25 : 75 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (15.1 g, 98 ％) 을 얻었다.
Figure pct00313
공정 5 : (11a'S)-8'-[(5-브로모펜틸)옥시]-7'-메톡시-10'-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5',11'(10'H,11a'H)-디온
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물에서 얻어진 화합물 (2.77 g, 6.62 mmol) 을, 실시예 3 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (3.31 g, 88 ％) 을 얻었다.
Figure pct00314
공정 6 : (11a'S)-8'-[(5-브로모펜틸)옥시]-7'-메톡시-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (3.31 g, 5.83 mmol) 을, 실시예 3 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.11 g, 45 ％) 을 얻었다.
Figure pct00315
공정 7 : (11a'S)-8'-[(5-브로모펜틸)옥시]-7'-메톡시-1',10',11',11a'-테트라하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (2.56 g, 6.08 mmol) 을, 실시예 3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.15 g, 45 ％) 을 얻었다.
Figure pct00316
공정 8 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-8'-[(5-브로모펜틸)옥시]-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (1.15 g, 2.72 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.14 g, 82 ％) 을 얻었다.
Figure pct00317
공정 9 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-{[5-({(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-10'-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.374 g, 0.737 mmol) 을, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.589 g, 65 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1234(M＋H)＋
공정 10 : N-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-{[5-({(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-10'-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.589 g, 0.477 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.382 g, 71 ％) 을 얻었다.
Figure pct00318
공정 11 : L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.382 g, 0.341 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.200 g, 62 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 952(M＋H)＋
공정 12 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.0560 g, 0.0588 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0500 g, 63 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1354(M＋H)＋
실시예 38 : 약물 링커 36
[화학식 162]
Figure pct00319
공정 1 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
실시예 37 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.0410 g, 0.0430 mmol) 을, 실시예 6 공정 1 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0210 g, 39 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1240(M＋H)＋
실시예 39 : 약물 링커 37
[화학식 163]
Figure pct00320
공정 1 : 화합물 39-1
실시예 4 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.00 g, 1.52 mmol) 과 페닐보론산 (0.370 g, 3.03 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.726 g, 81 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 589[81Br, (M+H)+], 587[79Br, (M+H)+].
공정 2 : 화합물 39-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.726 g, 1.24 mmol) 을, 실시예 3 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.344 g, 63 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 443[81Br, (M+H)+], 441[79Br, (M+H)+].
공정 3 : 화합물 39-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.344 g, 0.779 mmol) 을, 실시예 3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.248 g, 72 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 445[81Br, (M+H)+], 443[79Br, (M+H)+].
공정 4 : 화합물 39-4
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.248 g, 0.559 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.267 g, 90 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 529[81Br, (M+H)+], 527[79Br, (M+H)+].
공정 5 : 화합물 39-5
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.100 g, 0.190 mmol) 을, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.201 g, 85 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1255(M＋H)＋.
공정 6 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-5-옥소-2-페닐-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥소)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.201 g, 0.160 mmol) 을, 실시예 3 공정 11, 12, 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.080 g, 36 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1372(M＋H)＋.
실시예 40 : 약물 링커 38
[화학식 164]
Figure pct00321
공정 1 : 화합물 40-1
실시예 4 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.48 g, 2.24 mmol) 과 4-(디메틸아미노)페닐보론산 (0.741 g, 4.49 mmol) 을 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.520 g, 37 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 632[81Br, (M+H)+], 630[79Br, (M+H)].
공정 2 : 화합물 40-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.520 g, 0.825 mmol) 을, 실시예 3 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.167 g, 42 ％) 을 얻었다.
공정 3 : 화합물 40-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.167 g, 0.345 mmol) 을, 실시예 3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0650 g, 39 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 488[81Br, (M+H)+], 486[79Br, (M+H)+].
공정 4 : 화합물 40-4
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.0650 g, 0.134 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0690 g, 90 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 572[81Br, (M+H)+], 570[79Br, (M+H)+].
공정 5 : 화합물 40-5
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.0690 g, 0.121 mmol) 을, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0660 g, 42 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1297(M＋H)＋.
공정 6 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-8'-[3-({(11aS)-2-[4-(디메틸아미노)페닐]-7-메톡시-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.0660 g, 0.0509 mmol) 을, 실시예 3 공정 11, 12, 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0350 g, 49 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1417(M＋H)＋.
실시예 41 : 약물 링커 39
[화학식 165]
Figure pct00322
공정 1 : 5-{[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]아미노}발레르산 N,N-디메틸포름아미드 부가물
5-아미노발레르산 (0.436 g, 3.72 mmol) 을 N,N-디메틸포름아미드 (10 mL) 에 용해하고, 1-{[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]옥시}피롤리딘-2,5-디온 (1.36 g, 3.38 mmol), 트리에틸아민 (0.937 mL, 6.76 mmol) 을 실온에서 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 교반하였다. 반응 용액에 1 규정 염산을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하고, 얻어진 유기층을 물, 포화 식염수로 세정 후, 황산마그네슘으로 건조하였다. 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 ∼ 클로로포름 : 메탄올 : 물 = 7 : 3 : 1 (v/v/v) 의 분배 유기층] 로 정제하여, 목적물 (0.730 g, 45 ％) 을 고체로서 얻었다.
Figure pct00323
공정 2 : N-(5-{[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]아미노}펜타노일)-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.0176 g, 0.0368 mmol) 을, 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.00880 g, 18 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1339(M＋H)＋
실시예 42 : 약물 링커 40
[화학식 166]
Figure pct00324
공정 1 : 화합물 42-1
실시예 3 공정 1 에서 얻어진 화합물 (5.00 g, 9.66 mmol) 을 실시예 3 공정 3 과 동일하게 반응시켜 목적물 (3.95 g, 100 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 409(M+H)+
공정 2 : 화합물 42-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (3.95 g, 9.67 mmol) 을 실시예 24 공정 2 와 동일하게 반응시켜 목적물 (4.78 g, 87 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 565(M+H)+
공정 3 : 화합물 42-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (4.78 g, 8.43 mmol) 을, 실시예 3 공정 4 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (2.36 g, 50 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 563(M+H)+
공정 4 : 화합물 42-4
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (1.53 g, 2.72 mmol) 을 실시예 3 공정 5 와 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (1.27 g, 69 ％) 을 얻었다.
Figure pct00325
공정 5 : 화합물 42-5
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.255 g, 0.367 mmol) 과, 4-(아미노메틸)페닐보론산 (0.344 g, 1.84 mmol) 을 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜 목적물 (0.148 g, 62 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 652(M+H)+
공정 6 : 화합물 42-6
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.142 g, 0.218 mmol) 과 디프로프-2-엔-1-일 [(Z)-(메틸술파닐)메틸리덴]비스카르바메이트 (0.079 g, 0.079 mmol, WO9920628) 의 디메틸포름아미드 (2.2 mL) 의 용액에, 트리에틸아민 (0.090 mL, 0.653 mmol) 과 염화수은(II) (0.083 g, 0.305 mmol) 를 실온에서 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 30 분간 교반한 후, 반응 용액에 아세트산에틸을 첨가하여 희석하고, 수은염을 여과에 의해 제거하였다. 얻어진 유기층을 0.1 규정의 인산 완충액과 포화 식염수로 세정하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 60 : 40 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.157 g, 83 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 863(M+H)+
공정 7 : 화합물 42-7
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.153 g, 0.177 mmol) 의 THF (1.8 mL) 용액에, 1 mol/L 의 테트라부틸암모늄플루오라이드테트라하이드로푸란 용액 (0.266 mL, 0.266 mmol) 을 실온에서 첨가하였다. 실온에서 50 분간 교반한 후, 반응 용액에 0.1 규정 인산 완충액 (pH 7.0) 을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하고, 얻어진 유기층을 0.1 규정 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 세정하였다. 황산나트륨으로 건조한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.115 g, 92 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 706(M+H)+
공정 8 : 화합물 42-8
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.115 g, 0.163 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (1.0 mL) 용액에, 1,5-디브로모펜탄 (0.088 mL, 0.652 mmol), 탄산세슘 (0.032 g, 0.098 mmol) 을 실온에서 첨가하였다. 실온에서 2 시간 교반한 후, 반응 용액에 0.1 규정 인산 완충액 (pH 7.0) 을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 얻어진 유기층을 0.1 규정 인산 완충액 (pH 7.0) 과 포화 식염수로 세정하고, 황산나트륨으로 건조한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.111 g, 80 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 856[81Br, (M+H)+], 854[79Br, (M+H)+]
공정 9 : 화합물 42-9
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.105 g, 0.123 mmol) 을 실시예 3 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.036 g, 41 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 772[81Br, (M+H)+], 770[79Br, (M+H)+]
공정 10 : 화합물 42-10
상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.163 g, 0.169 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.132 g, 88 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 880(M+H)+
공정 11 : 화합물 42-11
상기 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.13 g, 0.147 mmol), 5-{[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]아미노}펜탄산 (0.0386 g, 0.192 mmol) 과 1-하이드록시벤조트리아졸 1 수화물 (0.038 g, 0.251 mmol) 의 디클로로메탄 (3 mL) 용액에, 트리에틸아민 (0.035 mL, 0.251 mmol) 과 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염 (0.048 g, 0.251 mmol) 을 실온에서 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응 용액에 0.1 규정 인산 완충액 (pH 7.0) 을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 얻어진 유기층을 0.1 규정 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 세정하고, 아세트산에틸을 감압 증류 제거하였다. 톨루엔 공비하고, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 50 : 50 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.150 g, 95 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1063(M+H)+
공정 12 : 화합물 42-12
상기 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.150 g, 0.141 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (3.5 mL) 용액에, 실온에서 아세트산리튬 수용액 (1.52 M, 0.088 mL) 을 첨가하였다. 실온에서 1.5 시간 교반 후, 반응 용액에 물을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물로 세정 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 95 : 5 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.135 g, 96 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 907(M+H)+
공정 13 : 화합물 42-13
상기 공정 12 에서 얻어진 화합물 (0.048 g, 0.053 mmol) 과 상기 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.034 g, 0.048 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 (0.5 mL) 용액에, 탄산세슘 (0.011 g, 0.034 mmol) 을 실온에서 첨가하였다. 실온에서 1.5 시간 교반한 후, 45 ℃ 에서 5 시간 교반하였다. 반응 용액에 0.1 규정 인산 완충액 (pH 7.0) 을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 얻어진 유기층을 0.1 규정 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 세정하고, 황산나트륨으로 건조한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 97 : 3 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.038 g, 52 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1534(M＋H)＋
공정 14 : 화합물 42-14
상기 공정 13 에서 얻어진 화합물 (0.038 g, 0.247 mmol) 을 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켰다. 반응 용액을 분액 후, 유기 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 화합물을 그대로 다음의 반응에서 사용하였다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1420(M＋H)＋
공정 15 : 화합물 42-15
상기 공정 14 에서 얻어진 화합물 (0.034 g, 0.140 mmol) 의 디메틸포름아미드 (2 mL) 용액에, 실온에서 피롤리딘 (0.048 mL, 0.574 mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (0.0054 g, 0.0046 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 50 분 교반하였다. 유기 용매를 감압 증류 제거한 후, 얻어진 잔류물을 디메틸술폭사이드에 용해시키고, 역상 칼럼 크로마토그래피 (column : DevelosilCombi-RP-5 (Nomurachemical), 20 mm x 100 mm. : 0.1 ％ 포름산 수용액 : 0.1 ％ 아세토니트릴 = 79.2 : 20.8 to 51.4 : 48.6, 유속 : 25 mL/분, 온도 : 25 ℃) 로 정제하여, 목적 화합물 (0.020 g, 72 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1168(M＋H)＋
공정 16 : 화합물 42-16
상기 공정 15 에서 얻어진 화합물 (0.002 g, 0.0017 mmol) 의 디메틸포름아미드 (0.5 mL) 용액에, 트리에틸아민 (0.007 mL, 0.051 mmol) 과 시판되는 1-{[4-(11,12-디데하이드로벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]옥소피롤리딘-2,5-디온 (0.083 g, 0.0205 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 10 시간 교반하였다. 유기 용매를 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 디메틸술폭사이드에 용해시키고, 역상 칼럼 크로마토그래피 (column : DevelosilCombi-RP-5 (Nomurachemical), 20 mm x 100 mm. : 0.1 ％ 포름산 수용액 : 0.1 ％ 아세토니트릴 = 62.5 : 37.5 to 34.7 : 65.3, 유속 : 25 mL/분, 온도 : 25 ℃), 및 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 ∼ 클로로포름 : 메탄올 : 물 = 7 : 3 : 1 (v/v/v) 의 분배 유기층] 로 정제하여, 목적물 (0.033 g, 14 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1455(M＋H)＋
실시예 43 : 약물 링커 41
[화학식 167]
Figure pct00326
공정 1 : 화합물 43-1
실시예 4 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.72 g, 1.09 mmol) 과 3-메톡시페닐보론산 (0.332 g, 2.18 mmol) 을 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.526 g, 78 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 619[81Br, (M+H)+], 617[79Br, (M+H)+]
공정 2 : 화합물 43-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.526 g, 0.851 mmol) 을 실시예 3 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.195 g, 49 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 473[81Br, (M+H)+], 471[79Br, (M+H)+]
공정 3 : 화합물 43-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.195 g, 0.414 mmol) 을 실시예 3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.195 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 475[81Br, (M+H)+], 473[79Br, (M+H)+]
공정 4 : 화합물 43-4
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.413 mmol) 을 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.106 g, 46 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 559[81Br, (M+H)+], 557[79Br, (M+H)+]
공정 5 : 화합물 43-5
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.069 g, 0.124 mmol) 을, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.128 g, 80 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1284(M＋H)＋
공정 6 : 화합물 43-6
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.128 g, 0.099 mmol) 을 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.105 g, 90 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1170(M＋H)＋
공정 7 : 화합물 43-7
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.105 g, 0.089 mmol) 을 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.072 g, 80 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z:1002(M+H)+
공정 8 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(3-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.072 g, 0.072 mmol) 을 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.053 g, 52 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1403(M＋H)＋
실시예 44 : 약물 링커 42
[화학식 168]
Figure pct00327
공정 1 : 화합물 44-1
실시예 4 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.68 g, 1.03 mmol) 과 3,4-디메톡시페닐보론산 (0.375 g, 2.06 mmol) 을 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.506 g, 75 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 649[81Br, (M+H)+], 647[79Br, (M+H)+]
공정 2 : 화합물 44-2
상기 공정 1 에서 얻어지는 화합물 (0.506 g, 0.781 mmol) 을 실시예 3 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.199 g, 50 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 503[81Br, (M+H)+], 501[79Br, (M+H)+]
공정 3 : 화합물 44-3
상기 공정 2 에서 얻어지는 화합물 (0.169 g, 0.337 mmol) 을 실시예 3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.231 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 505[81Br, (M+H)+], 503[79Br, (M+H)+]
공정 4 : 화합물 44-4
상기 공정 3 에서 얻어지는 화합물 (0.337 mmol) 을 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.170 g, 86 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 589[81Br, (M+H)+], 587[79Br, (M+H)+]
공정 5 : 화합물 44-5
상기 공정 4 에서 얻어지는 화합물 (0.076 g, 0.136 mmol) 을 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.116 g, 71 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1314(M＋H)＋
공정 6 : 화합물 44-6
상기 공정 5 에서 얻어지는 화합물 (0.116 g, 0.088 mmol) 을 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.108 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1200(M＋H)＋
공정 7 : 화합물 44-7
상기 공정 6 에서 얻어지는 화합물 (0.090 mmol) 을 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.066 g, 71 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1032(M+H)+
공정 8 : N-[4-(11,12-디데하이드로디벤조[b,f]아조신-5(6H)-일)-4-옥소부타노일]글리실글리실-L-발릴-N-{4-[({[(11a'S)-8'-(3-{[(11aS)-2-(3,4-디메톡시페닐)-7-메톡시-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-일]카르보닐}옥시)메틸]페닐}-L-알라닌아미드
상기 공정 7 에서 얻어지는 화합물 (0.066 g, 0.064 mmol) 을 실시예 3 공정 13 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.053 g, 58 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1434(M＋H)＋
〔약물 D 의 합성〕
실시예 45 : 약물 1
[화학식 169]
Figure pct00328
공정 1 : 프로프-2-엔-1-일 (2-{[(6S)-6-({[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바메이트
실시예 1 공정 5 에서 얻어진 화합물 (4.59 g, 8.15 mmol) 을, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (4.86 g, 92 ％) 을 얻었다.
Figure pct00329
공정 2 : 프로프-2-엔-1-일 (2-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시-5-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}페닐)카르바메이트
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (4.86 g, 7.51 mmol) 을, 실시예 1 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (3.42 g, 86 ％) 을 얻었다.
Figure pct00330
공정 3 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (6.68 g, 12.5 mmol) 을, 실시예 1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (6.44 g, 97 ％) 을 얻었다.
Figure pct00331
공정 4 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-8'-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (3.24 g, 6.10 mmol) 을, 실시예 1 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (3.86 g, 98 ％) 을 얻었다.
Figure pct00332
공정 5 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-8'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (4.49 g, 6.96 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (3.24 g, 95 ％) 을 얻었다.
Figure pct00333
공정 6 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-{[5-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.080 g, 0.164 mmol) 을, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.160 g, 98 ％) 을 얻었다.
Figure pct00334
공정 7 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-{[5-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)펜틸]옥시}-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (160 mg, 0.161 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (141 mg, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00335
공정 8 : (11a'S)-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}펜틸)옥시]-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (141 mg, 0.161 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (109.8 mg, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00336
실시예 46 : 약물 2
[화학식 170]
Figure pct00337
공정 1 : 화합물 46-1
실시예 26 공정 10 에서 얻어진 화합물 (0.246 g, 0.514 mmol) 을 사용하고, 실시예 4 공정 1 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.122 g, 40 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 601[81Br, (M+H)+], 599[79Br, (M+H)+].
공정 2 : 화합물 46-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.122 g, 0.204 mmol) 을, 실시예 45 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.176 g, 86 ％) 을 얻었다.
공정 3 : 화합물 46-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.0870 g, 0.0864 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0660 g, 86 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 892(M+H)+
공정 4 : 4-[(11aS)-7-메톡시-8-(3-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}프로폭시)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-2-일]벤질 아세테이트
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.0660 g, 0.0793 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0444 g, 85 ％) 을 얻었다.
Figure pct00338
실시예 47 : 약물 3
[화학식 171]
Figure pct00339
공정 1 : [4-(벤질)-5-메톡시-2-니트로페닐][(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]메탄온
실시예 37 공정 1 에서 얻어진 화합물 (6.49 g, 14.7 mmol) 의 테트라하이드로푸란 (147 mL) 용액에, 수소화붕소리튬 (0.642 g, 29.5 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응 용액에 1 규정 염산을 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 얻어진 유기층을, 포화 식염수로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조한 후, 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물 (6.94 g, 정량적) 은 정제하지 않고 다음 공정에서 사용하였다.
MS(APCI, ESI)m/z : 413(M＋H)＋
공정 2 : (6S)-5-[4-(벤질옥시)-5-메톡시-2-니트로벤조일]-5-아자스피로[2.4]헵탄-6-카르발데하이드
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (4.50 g, 11.0 mmol) 을, 실시예 1 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (1.94 g, 43 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 411(M＋H)＋
공정 3 : (11a'S)-8'-하이드록시-7'-메톡시-1',10',11',11a'-테트라하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (1.94 g, 4.73 mmol) 의 테트라하이드로푸란 (25 mL), 아세트산에틸 (25 mL), 메탄올 (25 mL) 의 혼합 용액에, 질소 분위기하, 5 ％ 팔라듐탄소 (54 ％ 수분, 1.0 g) 를 첨가한 후, 반응 용액을 수소 분위기하, 실온에서 22 시간 교반하였다. 반응 용액을 셀라이트 여과한 후, 여과액을 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 80 : 20 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (1.20 g, 93 ％) 을 얻었다.
Figure pct00340
공정 4 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-8'-[(5-브로모펜틸)옥시]-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트
실시예 45 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.300 g, 0.614 mmol) 을, 실시예 3 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.388 g, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00341
공정 5 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.203 g, 0.318 mmol) 과 상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.131 g, 0.478 mmol) 을, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0880 g, 33 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 831(M＋H)＋
공정 6 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',10',11',11a'-테트라하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.0880 g, 0.106 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0500 g, 66 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 717(M＋H)＋
공정 7 : (11a'S)-7'-메톡시-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-메톡시-5'-옥소-5',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-8'-일]옥시}펜틸)옥시]-1',10',11',11a'-테트라하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온
상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.0500 g, 0.0698 mmol) 을 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0330 g, 77 ％) 을 얻었다.
Figure pct00342
실시예 48 : 약물 4
[화학식 172]
Figure pct00343
공정 1 : 화합물 48-1
실시예 39 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.165 g, 0.313 mmol) 을, 실시예 45 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.270 g, 92 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 935(M＋H)＋.
공정 2 : 화합물 48-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.270 g, 0.289 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.208 g, 88 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 821(M＋H)＋.
공정 3 : (11a'S)-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-5-옥소-2-페닐-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.208 g, 0.253 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.130 g, 80 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 635(M＋H)＋.
실시예 49 : 약물 5
[화학식 173]
Figure pct00344
공정 1 : 화합물 49-1
화합물 4-1 (8.52 g, 13.2 mmol) 과 실시예 37 공정 4 에서 얻어진 화합물 37-5 (6.09 g, 14.5 mmol) 를 사용하고, 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (10.7 g, 83 ％) 을 얻었다.
Figure pct00345
공정 2 : 화합물 49-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (10.7 g, 10.9 mmol) 을 실시예 3 공정 3 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (9.45 g, 100 ％) 을 얻었다.
Figure pct00346
공정 3 : 화합물 49-3
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (9.45 g, 10.9 mmol) 을, 실시예 3 공정 4 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (9.14 g, 97 ％) 을 얻었다.
Figure pct00347
공정 4 : 화합물 49-4
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (4.27 g, 4.94 mmol) 을 실시예 3 공정 5 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (3.16 g, 64 ％) 을 얻었다.
Figure pct00348
공정 5 : 화합물 49-5
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (1.00 g, 1.00 mmol) 을, 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.900 g, 94 ％) 을 얻었다.
Figure pct00349
공정 6 : (11a'S)-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.900 g, 0.942 mmol) 의 THF (30 mL), 에탄올 (3 mL) 용액에, 0 ℃ 에서 수소화붕소리튬 (0.456 g, 18.8 mmol) 을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서, 1.5 시간 교반한 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 격렬하게 교반하였다. 반응 혼합물을 클로로포름으로 추출하고, 유기층을 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물을 디클로로메탄 (10 mL), 에탄올 (20 mL), 물 (5 mL) 에 용해시켰다. 반응 혼합물에, 실리카 겔 (15.0 g) 을 첨가하고, 질소 분위기하, 3 일간 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 유기층을 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 감압 증류 제거하여 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [클로로포름 : 메탄올 = 100 : 0 (v/v) ∼ 92 : 8 (v/v)] 로 정제하여, 목적물 (0.308 g, 49 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 663(M＋H)＋
실시예 50 : 약물 6
[화학식 174]
Figure pct00350
공정 1 : 디-2-프로펜-1-일 {1,5-펜탄디일비스[옥시(6-{[(6S)-6-(하이드록시메틸)-5-아자스피로[2.4]헵트-5-일]카르보닐}-4-메톡시벤젠-3,1-디일)]}비스카르바메이트
실시예 15 공정 5 에서 얻어진 비스알릴옥시카르보닐체 15-6 (0.460 g, 0.508 mmol) 을 메탄올 (10 mL) 에 용해한 후, 탄산칼륨 (351 mg, 2.54 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 30 분 교반하였다. 포화 염화암모늄 수용액 50 mL 를 첨가하고, 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 증류 제거하여, 목적물 (0.421 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00351
공정 2 : 디프로프-2-엔-1-일 (11a'S,11a''''S)-8',8''-[펜탄-1,5-디일비스(옥시)]비스(11'-하이드록시-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트)
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.421 g, 0.513 mmol) 을, 실시예 15 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.326 g, 78 ％) 을 얻었다.
Figure pct00352
공정 3 : (11a'S,11a''''S)-8',8''-[1,5-펜탄디일비스(옥시)]비스(7'-메톡시-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온)
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.326 g, 0.399 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.208 g, 85 ％) 을 얻었다.
Figure pct00353
실시예 51 : 약물 7
[화학식 175]
Figure pct00354
공정 1 : 화합물 51-1
화합물 46-2 (0.0870 g, 0.0863 mmol) 를, 실시예 27 공정 1 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0660 mg, 79 ％) 을 얻었다.
Figure pct00355
공정 2 : 화합물 51-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.0660 g, 0.0683 mmol) 을, 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.0590 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 851(M+H)+.
공정 3 : (11a'S)-8'-[3-({(11aS)-2-[4-(하이드록시메틸)페닐]-7-메톡시-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-7'-메톡시-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.0590 g, 0.0693 mmol) 을, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응을 실시하여, 목적물 (0.0290 g, 63 ％) 을 얻었다.
Figure pct00356
실시예 52 : 약물 8
[화학식 176]
Figure pct00357
공정 1 : (11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-10-{[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸}-8-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5,11(10H,11aH)-디온
실시예 42 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.519 g, 0.747 mmol) 을, 실시예 3 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.511 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00358
공정 2 : (11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-8-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-1,11a-디하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.178 g, 0.272 mmol) 을, 실시예 3 공정 7 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.094 g, 68 ％) 을 얻었다.
Figure pct00359
공정 3 : (11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-8-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-1,10,11,11a-테트라하이드로-5H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-5-온
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.063 g, 0.124 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 8 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.046 g, 72 ％) 을 얻었다.
Figure pct00360
공정 4 : 프로프-2-엔-1-일 (11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-8-{[트리(프로판-2-일)실릴]옥시}-11,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트
상기 공정 3 에서 얻어진 화합물 (0.046 g, 0.090 mmol) 을 사용하고, 실시예 3 공정 9 와 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.03 g, 56 ％) 을 얻었다.
Figure pct00361
공정 5 : 프로프-2-엔-1-일 (11aS)-8-하이드록시-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트
상기 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.030 g, 0.050 mmol) 을, 실시예 1 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.015 g, 0.034 mmol) 을 얻었다.
Figure pct00362
공정 6 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-8'-(3-브로모프로폭시)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트
실시예 45 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.131 g, 0.268 mmol) 을 실시예 4 공정 1 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.086 g, 52 ％) 을 얻었다.
Figure pct00363
공정 7 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-{[tert-부틸(디메틸)실릴]옥시}-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트
상기 공정 5 에서 얻어진 화합물 (0.015 g, 0.034 mmol) 과 상기 공정 6 에서 얻어진 화합물 (0.030 g, 0.048 mmol) 을 실시예 3 공정 10 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.032 g, 96 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 965(M＋H)＋
공정 8 : 프로프-2-엔-1-일 (11a'S)-11'-하이드록시-7'-메톡시-8'-[3-({(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-10-[(프로프-2-엔-1-일옥시)카르보닐]-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일}옥시)프로폭시]-5'-옥소-11',11a'-디하이드로-1'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-10'(5'H)-카르복실레이트
상기 공정 7 에서 얻어진 화합물 (0.031 g, 0.032 mmol) 을 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.026 g, 95 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 851(M＋H)＋
공정 9 : (11a'S)-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온
상기 공정 8 에서 얻어진 화합물 (0.026 g, 0.030 mmol) 을 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.018 g, 88 ％) 을 얻었다.
Figure pct00364
실시예 53 : 약물 9
[화학식 177]
Figure pct00365
공정 1 : 화합물 53-1
실시예 43 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.027 g, 0.048 mmol) 을, 실시예 45 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.037 g, 79 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 965(M＋H)＋
공정 2 : 화합물 53-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.037 g, 0.038 mmol) 을 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (35 mg, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 851[(M＋H)＋]
공정 3 : (11a'S)-7'-메톡시-8'-(3-{[(11aS)-7-메톡시-2-(3-메톡시페닐)-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.038 mmol) 을 실시예 45 공정 6 ∼ 8 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (25 mg, 99 ％) 을 얻었다.
Figure pct00366
실시예 54 : 약물 10
[화학식 178]
Figure pct00367
공정 1 : 화합물 54-1
실시예 44 공정 4 에서 얻어진 화합물 (0.027 g, 0.046 mmol) 을 실시예 45 공정 6 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.037 g, 81 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 995(M＋H)＋
공정 2 : 화합물 54-2
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (0.037 g, 0.037 mmol) 을 실시예 3 공정 11 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.034 g, 정량적) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 881(M＋H)＋
공정 3 : (11a'S)-8'-(3-{[(11aS)-2-(3,4-디메톡시페닐)-7-메톡시-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일]옥시}프로폭시)-7'-메톡시-1',11a'-디하이드로-5'H-스피로[시클로프로판-1,2'-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀]-5'-온
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (0.037 mmol) 을 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (0.027 g, 정량적) 을 얻었다.
Figure pct00368
〔당사슬 도너의 합성〕
실시예 55 : [N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox
[화학식 179]
Figure pct00369
(상기 도면에 있어서, 구조식 우측의 모식도는, 실시예 58 의 반응식에 표시되는 아지드기가 도입된 링커 구조를 갖는 중간체의 모식도 중의 대응 구조를 나타낸다.)
공정 1 : [N3-PEG(3)]2-SG(10)
5 ml 샘플링 튜브 ((주) 이나·옵티카) 에, 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 (0.096 mL, 0.485 mmol), 디시알로옥타사카라이드 (50 mg, 0.24 mmol) 의 수용액 (0.5 mL) 을 첨가하고, 1 시간 교반한 후에, 동결건조하였다. 동결건조 후의 5 ml 샘플링 튜브에, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스파이트 (92 mg, 0.24 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (0.6 mL) 과 디이소프로필에틸아민 (0.042 mL, 0.24 mmol) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 4 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 미리 디에틸에테르 (20 ml) 를 첨가한 원심관 (50 ml) 으로 반응액을 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 공기, CF16RX) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 디에틸에테르 (20 ml) 를 첨가하고, 데칸테이션하였다. 계속해서, 아세토니트릴 (20 mL) 을 첨가하고, 데칸테이션한 후에, 감압하 건조하여, 미정제 생성물을 얻었다. 얻어진 고형물을 적당량의 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액에 용해시키고, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 nm) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 동결건조하여, 목적물 (42 mg) 을 얻었다.
공정 2 : [N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox
5 mL 샘플링 튜브 ((주) 이나·옵티카 제조) 에, 상기 공정 1 에서 합성한 화합물 (40 mg), 2-클로로-1,3-디메틸-1H-벤즈이미다졸-3-이움-클로라이드 (후시미 제약소 제조, 17.9 mg, 0.083 mmol) 의 수용액 (200 μl) 을 첨가하였다. 빙랭 후의 반응액에 인산 3 칼륨 (52.6 mg, 0.25 mmol) 의 수용액 (200 μl) 을 첨가하고, 빙랭하에서 2 시간 교반하였다. 얻어진 반응액을, 아미콘 울트라 (울트라 셀 30K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 한외 여과하고, 고형물을 제거하였다. 그 통과액을, 겔 여과 크로마토그래피로 정제하였다. 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 HiPrep 26/10 Desalting (GE 헬스케어 제조) 을 사용하고, 이동상에 0.03 ％-NH3 수용액을 사용하고, 유속을 10 mL/분, 분획 용량을 10 mL 로 하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 nm) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 1N 수산화나트륨 수용액 (33 μl, 0.033 mmol) 을 첨가하여 동결건조해, 목적물 (34 mg) 을 얻었다.
실시예 56 : [N3-PEG(3)]-MSG1-Ox
[화학식 180]
Figure pct00370
(상기 도면에 있어서, 구조식 우측의 모식도는, 실시예 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 의 반응식에 표시되는 아지드기가 도입된 링커 구조를 갖는 중간체의 모식도 중의 대응 구조를 나타낸다.)
공정 1 : (MSG1-)Asn
시판품인 monosialo-Asn 프리 (1S2G/1G2S-10NC-Asn, (주) 당사슬 공학 연구소 제조) (「(MSG-)Asn」이라고 부른다) (500 mg) 를 이하의 조건으로 역상 HPLC 분리 정제하고, 첫번째 메인 피크 (1st main peak) 로서 용출되는 (MSG1-)Asn (유지 시간 15 ∼ 19 분 부근) 과 두번째 메인 피크 (2nd main peak) 로서 용출되는 (MSG2-)Asn (유지 시간 21 ∼ 26 분 부근) 으로 분리하였다. 0.1 ％ 포름산 수용액을 용리액으로서 사용하고, 장치에는 ELS-PDA 트리거 분취 시스템 (닛폰 분광 주식회사 제조) 을 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (10 um, 30Φ x 250 mm, GL 사이언스사 제조) 을 사용하고, 유속을 30 mL/분으로 하였다. 용출 중에 UV 검출 (210 nm) 된 최초의 피크에 귀속하는 프랙션을 하나로 모으고, 동결건조하여, 목적물 (238 mg) 을 얻었다.
공정 2 : MSG1
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (229 mg) 을 200 mM 인산 완충 용액 (pH 6.25) (1145 μL) 에 용해시키고, EndoM (토쿄 화성 공업 (주) 제조, 1 U/mL)) 수용액 (100 μL) 을 첨가하고, 35 ℃ 에서 6 일간 인큐베이트하였다. 반응 종료 후, 반응액을 VIVASPIN 15R (Hydrosart 막, 30K, 6,000 g) 을 사용하여 한외 여과하고, 얻어진 통과액을 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액을 용리액으로서 사용하고, 장치에는 ELS-PDA 트리거 분취 시스템 (닛폰 분광 주식회사 제조), 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스사 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (210 nm) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 동결건조하여, 목적물 (117 mg) 을 얻었다.
공정 3 : [N3-PEG(3)]-MSG1
상기 공정 2 에서 합성한 화합물 (169 mg) 을, 실시예 55 공정 1 과 동일하게 반응시켜, 목적물 (94.2 mg) 을 얻었다.
공정 4 [N3-PEG(3)]-MSG1-Ox
상기 공정 3 에서 합성한 화합물 (100 mg) 을, 실시예 55 공정 2 와 동일하게 반응시켜, 목적물 (89 mg) 을 얻었다.
실시예 57 : [N3-PEG(3)]-MSG-Ox
[화학식 181]
Figure pct00371
(상기 도면에 있어서, 구조식 우측의 모식도는, 실시예 59 의 반응식에 표시되는 아지드기가 도입된 링커 구조를 갖는 중간체의 모식도 중의 대응 구조를 나타낸다.)
공정 1 : (MSG-)Asn 의 조제
시판품인 1S2G/1G2S-10NC-Asn-Fmoc ((주) 당사슬 공학 연구소 제조) (「Fmoc-(MSG-)Asn」이라고 부른다) (1000 mg) 를 에탄올/물 (1/1) (10 mL) 에 용해시키고, 1 규정의 수산화나트륨 수용액 (1.75 mL, 4 당량) 을 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 아미콘 울트라 (30K, 밀리포어사 제조) 를 사용하여 한외 여과하고, 고형물을 제거하고, 얻어진 통과액에 1N 염산 (832 μl, 1.9 당량) 을 첨가하였다. 고속 농축 장치 V-10 (Biotage 사 제조) 을 사용하여, 용매를 제거하였다. 아세토니트릴을 첨가하고, 고속 농축 장치 V-10 (Biotage 사 제조) 을 사용하여, 용매를 제거한 후에, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 nm) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 동결건조하였다. 재차, 순수에 용해시키면, pH 시험지로 산성인 것이 확인되었으므로, 18 ％ 암모니아수 (150 μl) 를 첨가하고, pH 시험지로 염기성이 된 것을 확인하고, 재차 동결건조하였다. 얻어진 목적물 (840 mg) 을 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
공정 2 : MSG 의 합성
공정 1 에서 얻어진 화합물 (840 mg) 을 200 mM 인산 완충 용액 (pH 6.25) (6000 μL) 에 용해시키고, EndoM (토쿄 화성 공업 (주) 제조, 1 U/mL)) 수용액 (200 μL) 을 첨가하고, 28 ℃ 에서 26 시간 인큐베이트하였다. 반응이 완료되어 있지 않기 때문에, EndoM (토쿄 화성 공업 (주) 제조, 1 U/mL)) 수용액 (50 μL) 을 첨가하고, 28 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트한 후에, 반응이 완료될 때까지 실온에서 방치하였다. 반응 종료 후, 반응액을 아미콘 울트라 (30K, 밀리포어사 제조) 를 사용하여 한외 여과하였다. 얻어진 통과액에 트리플루오로아세트산 (80 μl) 을 첨가하고, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 nm) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 동결건조하였다. 잔류 트리플루오로아세트산을 제거할 목적으로, 재차 순수에 용해시켜, 목적 화합물 (618 mg) 을 무색 고체로서 얻었다.
ESI-MS : C66H110N4O49 : [M+H]+ 계산치 1743.62, 실측치 1743.63
공정 3 : [N3-PEG(3)]-MSG 의 합성
상기 공정 2 에서 얻어진 화합물 (120 mg) 을 사용하고, 공정 55 공정 1 과 동일한 수법에 따라, 목적물 (88.6 mg) 을 얻었다.
ESI-MS : C73H124N8O51 : [M+2H]2+ 계산치 965.37, 실측치 965.37
공정 4 : [N3-PEG(3)]-MSG-Ox 의 합성
상기 공정 4 에서 얻어진 합성한 화합물 (100 mg) 을 사용하고, 공정 55 공정 2 와 동일한 수법에 따라, 목적물 (88 mg) 을 얻었다.
〔당사슬 리모델링 항체의 조제〕
실시예 58 : 당사슬 변환 1 (T-SG)
[화학식 182]
Figure pct00372
(상기 식은, SG 형 N297 당사슬의 비환원 말단 시알산에 아지드기가 도입된 링커 구조를 나타낸다. 실시예 58 에 있어서, N297 당사슬에 아지드기를 도입한 중간체의 링커 구조는 모두 상기 식과 동일한 구조이다.)
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-트라스트주맙의 조제
참고예 3 에서 조제한 트라스트주맙 용액 22 mg/mL 의 (25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0), 5 ％ 소르비톨 용액) (45.5 mL) 을 공통 조작 C 를 사용하고, 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로의 완충액 교환을 2 회로 나누어 실시하였다. 얻어진 28.1 mg/mL 의 트라스트주맙 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (18 mL) 과 28.0 mg/mL 의 동 용액 (18 mL) 에, 2.0 mg/mL 야생형 EndoS 용액 (PBS) 을 각각 1.26 mL, 1.27 mL 첨가하고, 37 ℃ 에서 4 시간 인큐베이트하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 이하의 방법에 따라, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제를 실시하였다.
(1) 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA pure150 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : HiTrap rProtein A FF (5 mL) (GE 헬스케어 제조)
유속 : 5 mL/분 (차지 시에는 1.25 mL/분)
상기에서 얻은 반응액을 복수회로 나누어 정제하였다. 칼럼은 2 연결하고, 칼럼에의 결합 시에는, 반응액을 칼럼 상부에 첨가하고, 결합 버퍼 (20 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) 를 1.25 mL/분으로 2 CV 흘리고, 추가로 5 mL/분으로 5 CV 흘렸다. 중간 세정 시에는, 세정 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 염화나트륨 용액) 을 15 CV 흘렸다. 용출 시에는, 용출 버퍼 (ImmunoPure IgG Eution buffer, PIERCE 제조) 를 6 CV 흘렸다. 용출액을 1M 트리스 완충액 (pH 9.0) 으로 즉시 중화하였다. 용출 중에 UV 검출 (280 nm) 된 프랙션에 대해, 미량 분광 광도계 Xpose (Trinean 제조), 및 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 를 사용하여, 5 mM인산 완충액 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8) 으로의 완충액 교환을 실시하였다.
(2) 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA avant25 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : Bio-Scale Mini CHT Type I 카트리지 (5 mL) (BIO-RAD 제조)
유속 : 5 mL/분 (차지 시레는 1.25 mL/분)
칼럼을 2 연결하고, 상기 (1) 에서 얻어진 용액을 복수회로 나누어 정제하였다. 용액을 칼럼의 상부에 첨가하고, A 액 (5 mM 인산 완충액, 50 mM2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8)) 을 1.25 mL/분으로 2 CV 흘리고, 추가로 5 mL/분으로 3 CV 흘렸다. 그 후, A 액과 B 액 (5 mM 인산 완충액 50 mM2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8), 2M 염화나트륨 용액) 을 사용하여, 용출하였다. 용출 조건은, A 액 : B 액 = 100 : 0 ∼ 0 : 100 (15CV) 이다. 또한, 세정 용액 (500 mM 인산 완충액 (pH 6.5)) 을 5 CV 흘렸다.
목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 를 사용하여 완충액 교환을 실시하여, 25.5 mg/mL 의 (Fucα1,6)GlcNAc-트라스트주맙 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (35 mL) 을 얻었다.
공정 2 : 트라스트주맙[SG-(N3)2]2 의 조제
상기 공정 1 에서 얻어진 23.9 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-트라스트주맙 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (3.37 mL) 에, 실시예 55 공정 2 에서 합성한 화합물 (12.9 mg) 의 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 용액 (0.258 mL), 4.90 mg/mL 의 EndoS D233Q/Q303L 용액 (PBS) (0.328 mL) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 4.5 시간 인큐베이트하였다. 이상의 조작을 2 로트 실시하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 상기 공정 1 과 동일하게 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제를 실시한 후, 목적물을 포함하는 프랙션을 공통 조작 C 를 사용하여 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 로 완충액 교환을 실시하여, 10.0 mg/mL 의 트라스트주맙[SG-(N3)2]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (15.5 mL) 을 얻었다.
실시예 59 : 당사슬 변환 2 (T-MSG)
[화학식 183]
Figure pct00373
(상기 식은, MSG 형 N297 당사슬의 비환원 말단 시알산에 아지드기가 도입된 링커 구조를 나타낸다. 실시예 59 에 있어서, N297 당사슬에 아지드기를 도입한 중간체의 링커 구조는 모두 상기 식과 동일한 구조이다.)
공정 1 : 트라스트주맙[MSG-N3]2
이하의 조작을 5 로트 실시하였다. 실시예 58 공정 1 에서 얻어진 화합물 (20 mg/mL, 15.0 mL) 을 사용하고, 실시예 57 공정 4 에서 얻어진 화합물 (25.5 mg) 을 당사슬 공여체로서 사용하여, 30 ℃ 에서 3 시간 인큐베이트하고, 실시예 59 공정 2 와 동일한 조작을 실시하였다. 5 로트 합쳐, 14.4 mg/mL 트라스트주맙[MSG-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (93.5 mL) 을 얻었다.
실시예 60 : 당사슬 변환 3 (T-MSG1)
[화학식 184]
Figure pct00374
(상기 식은, MSG1 형 N297 당사슬의 비환원 말단 시알산에 아지드기가 도입된 링커 구조를 나타낸다. 실시예 60 에 있어서, N297 당사슬에 아지드기를 도입한 중간체의 링커 구조는 모두 상기 식과 동일한 구조이다. 실시예 61-66 도 동일하다.)
공정 1 : 트라스트주맙[MSG1-N3]2
이하의 조작을 2 로트 실시하였다. 실시예 58 공정 1 에서 얻어진 화합물 (25.5 mL, 7.8 mL) 을 사용하고, 실시예 56 공정 4 에서 얻어진 화합물 (25.5 mg) 을 당사슬 공여체로서 사용하여, 30 ℃ 에서 3 시간 인큐베이트하고, 실시예 59 공정 2 와 동일한 조작을 실시하였다. 2 로트 합쳐, 10.6 mg/mL 트라스트주맙[MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (31 mL) 을 얻었다.
실시예 61 : 당사슬 변환 4 (CLDN6-MSG1(H1L1))
[화학식 185]
Figure pct00375
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 항체 (H1L1)
실시예 136 에서 조제한 항 CLDN6 항체 용액 ca. 37.7 mg/mL (25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0), 5 ％ 소르비톨 용액) (2.5 mL) 를 사용하고, 실시예 58 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 19.2 mg/mL 의 (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 항체 (H1L1) 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (4.8 mL) 을 얻었다.
공정 2 : 항 CLDN6 항체 (H1L1)-[MSG1-N3]2
상기 공정 1 에서 얻어진 19.2 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 (H1L1) 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (4.8 mL) 을 사용하고, 실시예 60 공정 1 과 동일한 조작을 실시함으로써, 10.2 mg/mL 항 CLDN6 항체 (H1L1)-[MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (7.2 mL) 을 얻었다.
실시예 62 : 당사슬 변환 5 (CLDN6-MSG1(H2L2))
[화학식 186]
Figure pct00376
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 항체 (H2L2)
실시예 136 에서 조제한 항 CLDN6 항체 용액 ca. 20 mg/mL (25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0), 5 ％ 소르비톨 용액) (6 mL) 를 사용하고, 실시예 58 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 21.84 mg/mL 의 (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 항체 (H2L2) 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (5.7 mL) 을 얻었다.
공정 2 : 항 CLDN6 항체 (H2L2)-[MSG1-N3]2
상기 공정 1 에서 얻어진 21.8 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6(H2L2) 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (5.7 mL) 을 사용하고, 실시예 60 공정 1 과 동일한 조작을 실시함으로써, 10.2 mg/mL항 CLDN6 항체 (H2L2)-[MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (11.1 mL) 을 얻었다.
실시예 63 : 당사슬 변환 6 (CLDN6-MSG1(H1L3))
[화학식 187]
Figure pct00377
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 항체 (H1L3)
실시예 136 에서 조제한 항 CLDN6 항체 용액 ca. 39.4 mg/mL (25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0), 5 ％ 소르비톨 용액) (3 mL) 를 사용하고, 실시예 58 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 39.2 mg/mL 의 (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6 항체 (H1L3) 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (4.5 mL) 을 얻었다.
공정 2 : 항 CLDN6 항체 (H1L3)-[MSG1-N3]2
상기 공정 1 에서 얻어진 39.2 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-항 CLDN6(H1L3) 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (4.5 mL) 을 사용하고, 실시예 60 공정 1 과 동일한 조작을 실시함으로써, 9.83 mg/mL 항 CLDN6 항체 (H1L3)-[MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (7.2 mL) 을 얻었다.
실시예 64 : 당사슬 변환 7 (CD98-MSG1)
[화학식 188]
Figure pct00378
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-항 CD98 항체
참고예 6 에서 조제한 항 CD98 항체 용액 ca. 20 mg/mL (25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0), 5 ％ 소르비톨 용액) (6 mL) 를 사용하고, 실시예 58 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 21.7 mg/mL 의 (Fucα1,6)GlcNAc-항 CD98 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (4.7 mL) 을 얻었다.
공정 2 : 항 CD98 항체-[MSG1-N3]2
상기 공정 1 에서 얻어진 21.7 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-항 CD98 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (4.7 mL) 을 사용하고, 실시예 60 공정 1 과 동일한 조작을 실시함으로써, 10.1 mg/mL 의 항 CD98 항체-[MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (7.6 mL) 을 얻었다.
실시예 65 : 당사슬 변환 8 (TROP2-MSG1)
[화학식 189]
Figure pct00379
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-항 Trop2 항체
참고예 5 에서 조제한 항 Trop2 항체 용액 ca. 20 mg/mL (25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0), 5 ％ 소르비톨 용액) (6 mL) 를 사용하고, 실시예 58 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 21.69 mg/mL 의 (Fucα1,6)GlcNAc-항 Trop2 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (3.3 mL) 을 얻었다.
공정 2 : 항 Trop2 항체-[MSG1-N3]2
상기 공정 1 에서 얻어진 21.69 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-항 Trop2 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (3.35 mL) 을 사용하고, 실시예 60 공정 1 과 동일한 조작을 실시함으로써, 10.3 mg/mL 의 항 Trop2 항체-[MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (6.4 mL) 을 얻었다.
실시예 66 : 당사슬 변환 9 (LPS-MSG1)
[화학식 190]
Figure pct00380
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-항 LPS 항체
참고예 4 에서 조제한 항 LPS 항체 용액 ca. 17 mg/mL (25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0), 5 ％ 소르비톨 용액) (6.6 mL) 를 사용하고, 실시예 58 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 21.03 mg/mL 의 (Fucα1,6)GlcNAc-항 LPS 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (5.4 mL) 을 얻었다.
공정 2 : 항 LPS 항체-[MSG1-N3]2
상기 공정 1 에서 얻어진 21.03 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-항 LPS 항체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (5.4 mL) 을 사용하고, 실시예 60 공정 1 과 동일한 조작을 실시함으로써, 9.89 mg/mL 의 항 LPS 항체-[MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (7.9 mL) 을 얻었다.
〔ADC 의 합성〕
실시예 67 ∼ 71, 77 ∼ 80, 82 ∼ 88, 92 ∼ 95, 109 ∼ 114, 120 에 기재된 ADC 는, 하기 반응식으로 나타내는 바와 같이 실시예 59 의 공정 1 에서 얻어진 항체와 약물 링커를 콘쥬게이션함으로써 합성하였다. 식 중, R 은 각 실시예에서 사용된 약물 링커에 따라 상이하다.
[화학식 191]
Figure pct00381
실시예 72, 73, 75, 91 에 기재된 ADC 는, 하기 반응식으로 나타내는 바와 같이, 실시예 58 공정 2 에서 얻어진 항체와 약물 링커를 콘쥬게이트함으로써 합성하였다. 식 중, R 은 각 실시예에서 사용된 약물 링커에 따라 상이하다.
[화학식 192]
Figure pct00382
실시예 74, 81, 89, 90, 96 ∼ 105, 115, 118 에 기재된 ADC 는, 하기 반응식으로 나타내는 바와 같이 실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체와 약물 링커를 콘쥬게이션함으로써 합성하였다. 식 중, R 기는 각 실시예에서 사용된 약물 링커에 따라 상이하다.
[화학식 193]
Figure pct00383
실시예 67 : ADC1
[화학식 194]
Figure pct00384
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 67 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 24 공정 13 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 14.00 mL 얻었다. 이 용액을 공통 조작 A 를 이용하여 농축하여, 목적의 화합물을 갖는 용액을 0.75 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 11.4 mg/mL, 항체 수량 : 8.56 mg (86 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 68 : ADC2
[화학식 195]
Figure pct00385
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 68 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 25 공정 14 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.48 mg/mL, 항체 수량 : 8.88 mg (89 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 69 : ADC3
[화학식 196]
Figure pct00386
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 69 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 26 공정 14 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.45 mg/mL, 항체 수량 : 8.67 mg (89 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 70 : ADC4
[화학식 197]
Figure pct00387
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 70 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 27 공정 1 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.30 mg/mL, 항체 수량 : 7.80 mg (78 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 71 : ADC5
[화학식 198]
Figure pct00388
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 71 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 28 공정 8 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.08 mg/mL, 항체 수량 : 6.48 mg (65 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.6
실시예 72 : ADC6
[화학식 199]
Figure pct00389
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 72 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 58 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.835 mL), 실시예 27 공정 1 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.165 mL ; 항체 1 분자에 대해 24 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 4.50 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.75 mg/mL, 항체 수량 : 7.86 mg (79 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 3.8
실시예 73 : ADC7
[화학식 200]
Figure pct00390
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 73 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 58 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올(0.835 mL), 실시예 4 공정 12 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.165 mL ; 항체 1 분자에 대해 24 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 4.50 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.66 mg/mL, 항체 수량 : 7.48 mg (75 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 3.8
실시예 74 : ADC8
[화학식 201]
Figure pct00391
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 74 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 29 공정 14 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.36 mg/mL, 항체 수량 : 8.17 mg (82 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 75 : ADC9
[화학식 202]
Figure pct00392
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 75 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 58 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.835 mL), 실시예 9 공정 9 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.165 mL ; 항체 1 분자에 대해 24 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 8.50 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 0.86 mg/mL, 항체 수량 : 7.35 mg (73 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 3.6
실시예 76 : ADC10
[화학식 203]
Figure pct00393
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 76 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 106 의 반응식으로 나타내는 바와 같이, 실시예 61 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.2 mg/mL, 0.400 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.200 mL), 실시예 30 공정 2 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0549 mL ; 항체 1 분자에 대해 20 당량), 및 디메틸술폭사이드 (0.145 mL) 를 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 72 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 2.50 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.19 mg/mL, 항체 수량 : 2.98 mg (75 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 77 : ADC11
[화학식 204]
Figure pct00394
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 77 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (9.88 mg/mL, 0.500 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.459 mL), 실시예 19 공정 12 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0408 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시하고, 얻어진 용액을 공통 조작 A 를 이용하여 농축해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 0.470 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 8.31 mg/mL, 항체 수량 : 3.90 mg (79 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 78 : ADC12
[화학식 205]
Figure pct00395
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 78 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 20 공정 8 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시한 후, 얻어진 용액을 공통 조작 A 를 이용하여 농축해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 0.75 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 8.70 mg/mL, 항체 수량 : 6.94 mg (69 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.7
실시예 79 : ADC13
[화학식 206]
Figure pct00396
공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 79 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 21 공정 18 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 0.96 mg/mL, 항체 수량 : 5.77 mg (58 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 80 : ADC14
[화학식 207]
Figure pct00397
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 80 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 22 공정 12 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.28 mg/mL, 항체 수량 : 7.70 mg (77 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 81 : ADC15
[화학식 208]
Figure pct00398
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 81 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 23 공정 10 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.60 mg/mL, 항체 수량 : 9.60 mg (96 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 82 : ADC16
[화학식 209]
Figure pct00399
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 82 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (9.88 mg/mL, 0.500 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.459 mL), 실시예 34 공정 11 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0408 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 1 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 10.5 mL 얻었다. 이 용액을 공통 조작 A 를 이용하여 농축해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 0.500 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 6.94 mg/mL, 항체 수량 : 3.47 mg (70 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 83 : ADC17
[화학식 210]
Figure pct00400
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 83 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (9.88 mg/mL, 0.500 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.459 mL), 실시예 35 공정 4 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0408 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 1 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시하고, 이 용액을 공통 조작 A 를 이용하여 농축해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 0.500 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 8.07 mg/mL, 항체 수량 : 4.03 mg (82 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 84 : ADC18
[화학식 211]
Figure pct00401
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 86 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 36 공정 7 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 1 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 14.0 mL 얻었다. 이 용액을 공통 조작 A 를 이용하여 농축해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 0.700 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 12.9 mg/mL, 항체 수량 : 9.00 mg (90 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 85 : ADC19
[화학식 212]
Figure pct00402
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 85 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 37 공정 12 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.33 mg/mL, 항체 수량 : 7.97 mg (80 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 86 : ADC20
[화학식 213]
Figure pct00403
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 86 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 38 공정 1 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.56 mg/mL, 항체 수량 : 9.37 mg (94 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 2.0
실시예 87 : ADC21
[화학식 214]
Figure pct00404
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 87 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 39 공정 6 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.89 mg/mL, 항체 수량 : 11.4 mg (정량적), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 88 : ADC22
[화학식 215]
Figure pct00405
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 88 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 40 공정 6 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.47 mg/mL, 항체 수량 : 8.84 mg (88 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 89 : ADC23
[화학식 216]
Figure pct00406
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 89 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 37 공정 12 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.46 mg/mL, 항체 수량 : 8.76 mg (88 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 90 : ADC24
[화학식 217]
Figure pct00407
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 90 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 41 공정 2 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.53 mg/mL, 항체 수량 : 9.17 mg (92 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 91 : ADC25
[화학식 218]
Figure pct00408
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 91 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 58 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.835 mL), 실시예 37 공정 12 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.165 mL ; 항체 1 분자에 대해 24 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 10.5 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 0.73 mg/mL, 항체 수량 : 7.70 mg (77 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 3.8
실시예 92 : ADC26
[화학식 219]
Figure pct00409
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 92 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (9.88 mg/mL, 0.500 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.459 mL), 실시예 15 공정 10 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0408 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 1 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다. 이 용액을 공통 조작 A 를 이용하여 농축해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 0.420 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 7.27 mg/mL, 항체 수량 : 3.54 mg (72 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 93 : ADC27
[화학식 220]
Figure pct00410
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 93 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (9.88 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 16 공정 1 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 1 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 10.5 mL 얻었다. 이 용액을 공통 조작 A 를 이용하여 농축해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 0.850 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 8.90 mg/mL, 항체 수량 : 7.56 mg (77 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 94 : ADC28
[화학식 221]
Figure pct00411
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 94 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.2 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 17 공정 13 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.24 mg/mL, 항체 수량 : 7.43 mg (73 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.5
실시예 95 : ADC29
[화학식 222]
Figure pct00412
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 95 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.2 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 18 공정 13 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.29 mg/mL, 항체 수량 : 7.76 mg (76 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 96 : ADC30
[화학식 223]
Figure pct00413
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 96 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 5.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (4.59 mL), 실시예 4 공정 12 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.413 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 30.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.30 mg/mL, 항체 수량 : 38.9 mg (78 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 97 : ADC31
[화학식 224]
Figure pct00414
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 97 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 5 공정 11 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.47 mg/mL, 항체 수량 : 8.82 mg (88 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 98 : ADC32
[화학식 225]
Figure pct00415
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 98 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 6 공정 1 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.35 mg/mL, 항체 수량 : 8.10 mg (81 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 99 : ADC33
[화학식 226]
Figure pct00416
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 99 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 7 공정 10 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.41 mg/mL, 항체 수량 : 8.44 mg (84 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 100 : ADC34
[화학식 227]
Figure pct00417
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 100 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 9 공정 9 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.47 mg/mL, 항체 수량 : 8.79 mg (88 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 101 : ADC35
[화학식 228]
Figure pct00418
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 101 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 10 공정 14 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.67 mg/mL, 항체 수량 : 10.0 mg (정량적), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 102 : ADC36
[화학식 229]
Figure pct00419
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 103 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 11 공정 13 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.40 mg/mL, 항체 수량 : 8.39 mg (84 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 103 : ADC37
[화학식 230]
Figure pct00420
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 103 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 12 공정 14 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.41 mg/mL, 항체 수량 : 8.49 mg (85 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 104 : ADC : 38
[화학식 231]
Figure pct00421
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 104 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 13 공정 2 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.63 mg/mL, 항체 수량 : 9.80 mg (98 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 105 : ADC39
[화학식 232]
Figure pct00422
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 105 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 14 공정 1 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.72 mg/mL, 항체 수량 : 10.3 mg (정량적), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 106 : ADC40
[화학식 233]
Figure pct00423
Figure pct00424
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 106 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 61 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.2 mg/mL, 2.50 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (2.29 mL), 실시예 3 공정 13 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.206 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 14.5 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.54 mg/mL, 항체 수량 : 22.3 mg (89 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 107 : ADC41
[화학식 234]
Figure pct00425
Figure pct00426
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 107 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 62 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (9.96 mg/mL, 2.50 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (2.29 mL), 실시예 3 공정 13 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.206 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 14.5 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.52 mg/mL, 항체 수량 : 22.0 mg (88 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 108 : ADC42
[화학식 235]
Figure pct00427
Figure pct00428
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 108 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 63 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (9.83 mg/mL, 2.50 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (2.29 mL), 실시예 3 공정 13 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.206 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 14.5 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.45 mg/mL, 항체 수량 : 21.0 mg (84 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 109 : ADC43
[화학식 236]
Figure pct00429
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 109 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 42 공정 16 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 3.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.30 mg/mL, 항체 수량 : 7.79 mg (78 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 110 : ADC44
[화학식 237]
Figure pct00430
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 110 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 43 공정 8 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 0.93 mg/mL, 항체 수량 : 5.58 mg (56 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 111 : ADC45
[화학식 238]
Figure pct00431
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 111 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 44 공정 8 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.0 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 0.99 mg/mL, 항체 수량 : 5.95 mg (59 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 112 : ADC46
[화학식 239]
Figure pct00432
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 112 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.2 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 31 공정 8 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.49 mg/mL, 항체 수량 : 8.94 mg (89 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 113 : ADC47
[화학식 240]
Figure pct00433
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 113 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.2 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 32 공정 8 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.45 mg/mL, 항체 수량 : 8.73 mg (87 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 114 : ADC48
[화학식 241]
Figure pct00434
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 114 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.2 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 33 공정 8 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.45 mg/mL, 항체 수량 : 8.70 mg (87 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 115 : ADC49
[화학식 242]
Figure pct00435
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 115 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.2 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 3 공정 13 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.41 mg/mL, 항체 수량 : 8.45 mg (85 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 116 : ADC50
[화학식 243]
Figure pct00436
Figure pct00437
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 116 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 65 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 3 공정 13 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.47 mg/mL, 항체 수량 : 8.8 mg (88 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.9
실시예 117 : ADC51
[화학식 244]
Figure pct00438
Figure pct00439
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 117 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 64 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.2 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 3 공정 13 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.36 mg/mL, 항체 수량 : 8.19 mg (82 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 118 : ADC52
[화학식 245]
Figure pct00440
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 118 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 60 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 8 공정 2 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 3 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.06 mg/mL, 항체 수량 : 6.35 mg (63 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.2
실시예 119 : ADC53
[화학식 246]
Figure pct00441
Figure pct00442
공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 119 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 66 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (9.89 mg/mL, 0.40 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.367 mL), 실시예 3 공정 13 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0328 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 2 일간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 2.50 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.16 mg/mL, 항체 수량 : 2.89 mg (72 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 120 : ADC54
[화학식 247]
Figure pct00443
(공정 1 에서 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 실시예 120 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 59 공정 1 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.0 mg/mL, 1.00 mL) 에, 실온에서 1,2-프로판디올 (0.917 mL), 실시예 4 공정 12 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸술폭사이드 용액 (0.0825 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 6 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 1.49 mg/mL, 항체 수량 : 8.94 mg (89 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 121 : 항체-약물 콘쥬게이트의 항세포 효과 (1)
HER2 항원 양성 세포의 인간 위암주인 NCI-N87 (American Type Culture Collection ; ATCC CRL-5822) 은, 10 ％ 의 소 태아 혈청 (Hyclone) 을 포함하는 RPMI1640 배지 (Thermo Fisher Scientific ; 이하, RPMI 배지) 에서 배양하였다. HER2 항원 음성 세포의 MDA-MB-468 (ATCC HTB-132) 은, 10 ％ 의 소 태아 혈청 (Hyclone) 을 포함하는 Leibovitz's L-15 배지 (Thermo Fisher Scientific ; 이하, Leibovitz's 배지) 에서 배양하였다. NCI-N87 을 RPMI 배지, MDA-MB-468 세포를 Leibovitz's 배지로, 각각 2.5 × 104 세포/mL 가 되도록 조제하고, 96 웰 세포 배양용 마이크로 플레이트에 80 μL 씩 첨가하였다. 세포 첨가 후, NCI-N87 은 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 하룻밤 배양하고, MDA-MB-468 은 37 ℃, CO2 농도 설정 없음하에서 하룻밤 배양하였다.
다음날, RPMI 배지 또는 Leibovitz's 배지로 100 nM, 10 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM, 0.001 nM 으로 희석한 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트를 마이크로 플레이트에 20 μL 씩 첨가하였다. 항체-약물 콘쥬게이트 비첨가 웰에는 RPMI 배지 또는 Leibovitz's 배지를 20 μL 씩 첨가하였다. NCI-N87 은 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 6 일간, MDA-MB-468 은 37 ℃, CO2 농도 설정 없음하에서 6 일간 배양하였다. 배양 후, 마이크로 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 실온에서 30 분간 정치하였다. 배양액과 등량의 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 를 첨가하여 플레이트 믹서로 교반하였다. 실온에서 10 분간 정치 후에 플레이트 리더 (PerkinElmer) 로 발광량을 계측하였다.
생세포율은 다음 식으로 산출하였다.
생세포율 (％) = a ÷ b × 100
a : 피험물질 첨가 웰의 발광량의 평균값
b : 배지 첨가 웰의 발광량의 평균값
IC50 값은 다음 식으로 산출하였다.
IC50 (nM) = antilog((50 - d) × (LOG10(b) - LOG10(a)) ÷ (d - c) + LOG10(b))
a : 피험물질의 농도 a
b : 피험물질의 농도 b
c : 농도 a 의 피험물질을 첨가했을 때의 생세포율
d : 농도 b 의 피험물질을 첨가했을 때의 생세포율
a, b 는 생세포율 50 ％ 를 사이에 두는 2 점에서 a＞b.
NCI-N87 세포에 대해 항체-약물 콘쥬게이트 ADC17, ADC18, ADC1, ADC54, ADC20, ADC34, ADC23, ADC24, ADC25 는 IC50 ＜ 0.001 (nM) 의 항세포 효과를 나타냈다. 항체-약물 콘쥬게이트 ADC26, ADC27, ADC16, ADC11, ADC12, ADC2, ADC3, ADC4, ADC43, ADC5, ADC21, ADC48, ADC44, ADC6, ADC7, ADC28, ADC29, ADC13, ADC14, ADC30, ADC31, ADC32, ADC33, ADC35, ADC36, ADC8, ADC9, ADC38, ADC39 는 0.001 ≤ IC50 ＜ 0.1 (nM) 의 항세포 효과를 나타냈다. 또, 어느 항체-약물 콘쥬게이트도 MDA-MB-468 세포에 대해서는 항세포 효과를 나타내지 않았다 (IC50 ＞ 0.1 (nM)).
실시예 122 : 항체-약물 콘쥬게이트의 항세포 효과 (2)
HER2 항원 양성 세포의 인간 위암주인 NCI-N87 (ATCC CRL-5822) 은, 10 ％ 의 소 태아 혈청 (Hyclone) 을 포함하는 RPMI1640 배지 (Thermo Fisher Scientific ; 이하, RPMI 배지) 에서 배양하였다. HER2 항원 양성 세포의 인간 유암주인 JIMT-1 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH ; DSMZ ACC 589) 은 10 ％ 의 소 태아 혈청 (Hyclone) 을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle 배지 (Thermo Fisher Scientific ; 이하, DMEM 배지) 에서 배양하였다. NCI-N87 을 RPMI 배지로 5.0 × 104 세포/mL 로, JIMT-1 세포를 DMEM 배지로 1.3 × 104 세포/mL 가 되도록 조제하고, 96 웰 세포 배양용 마이크로 플레이트에 80 μL 씩 첨가하여 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 하룻밤 배양하였다.
다음날, RPMI 배지 또는 DMEM 배지로 400 nM, 80 nM, 16 nM, 3.2 nM, 0.64 nM, 0.13 nM, 0.026 nM, 0.0051 nM, 0.0010 nM 으로 희석한 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49, 또는 항 LPS 항체-약물 콘쥬게이 ADC53 을 마이크로 플레이트에 20 μL 씩 첨가하였다. 항체-약물 콘쥬게이트 비첨가 웰에는 RPMI 배지 또는 DMEM 배지를 20 μL 씩 첨가하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 6 일간 배양하였다. 배양 후, 마이크로 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 실온에서 30 분간 정치하였다. 배양액과 등량의 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 를 첨가하여 플레이트 믹서로 교반하였다. 실온에서 10 분간 정치 후에 플레이트 리더 (PerkinElmer) 로 발광량을 계측하였다.
생세포율은 다음 식으로 산출하였다.
생세포율 (％) = a ÷ b × 100
a : 피험물질 첨가 웰의 발광량의 평균값
b : 배지 첨가 웰의 발광량의 평균값
IC50 값은 다음 식으로 산출하였다.
IC50 (nM) = antilog((50 - d) × (LOG10(b) - LOG10(a)) ÷ (d - c) + LOG10(b))
a : 피험물질의 농도 a
b : 피험물질의 농도 b
c : 농도 a 의 피험물질을 첨가했을 때의 생세포율
d : 농도 b 의 피험물질을 첨가했을 때의 생세포율
a, b 는 생세포율 50 ％ 를 사이에 두는 2 점에서 a ＞ b.
NCI-N87, JIMT-1 양쪽 세포에 대해 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49 는 0.001 ＜ IC50 ＜ 0.1 (nM) 의 항세포 효과를 나타냈다. 한편, 항 LPS 항체-약물 콘쥬게이트 ADC53 은 어느 세포에 대해서도 항세포 효과를 나타내지 않았다 (IC50 ＞ 0.1 (nM)).
실시예 123 : 항체-약물 콘쥬게이트의 항세포 효과 (3)
CLDN6 항원 양성 세포의 인간 난소암주인 OV-90 (ATCC CRL-11732) 은, 15 ％ 의 소 태아 혈청 (Hyclone) 을 포함하는, Medium199 (Thermo Fisher Scientific) 와 MCDB 105 배지 (Sigma-Aldrich) 의 1 대 1 혼합 배지 (이하, 배지) 에서 배양하였다. OV-90 세포를 배지로 1.9 × 104 세포/mL 가 되도록 조제하고, 96 웰 세포 배양용 마이크로 플레이트에 80 μL 첨가하여 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 하룻밤 배양하였다.
다음날, 배지로 50 nM, 10 nM, 2.0 nM, 400 pM, 80 pM, 16 pM, 3.2 pM, 0.64 pM, 0.13 pM 으로 희석한 항 CLDN6 항체-약물 콘쥬게이트 ADC40, ADC41, ADC42 를 마이크로 플레이트에 20 μL 씩 첨가하였다. 항체-약물 콘쥬게이트 비첨가 웰에는 배지를 20 μL 씩 첨가하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 6 일간 배양하였다. 배양 후, 마이크로 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 실온에서 30 분간 정치하였다. 배양액과 등량의 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 를 첨가하여 플레이트 믹서로 교반하였다. 실온에서 10 분간 정치 후에 플레이트 리더 (PerkinElmer) 로 발광량을 계측하였다.
생세포율은 다음 식으로 산출하였다.
생세포율 (％) = a ÷ b × 100
a : 피험물질 첨가 웰의 발광량의 평균값
b : 배지 첨가 웰의 발광량의 평균값
IC50 값은 다음 식으로 산출하였다.
IC50 (nM) = antilog((50 - d) × (LOG10(b) - LOG10(a)) ÷ (d - c) ＋ LOG10(b))
a : 피험물질의 농도 a
b : 피험물질의 농도 b
c : 농도 a 의 피험물질을 첨가했을 때의 생세포율
d : 농도 b 의 피험물질을 첨가했을 때의 생세포율
a, b 는 생세포율 50 ％ 를 사이에 두는 2 점에서 a ＞ b.
OV-90 세포에 대해 항 CLDN6 항체-약물 콘쥬게이트 ADC40, ADC41, ADC42 는 0.001 ＜ IC50 ＜ 0.1 (nM) 의 항세포 효과를 나타냈다.
실시예 124 : 항체-약물 콘쥬게이트의 항종양 시험 (1)
마우스 : 4-5 주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스 (닛폰 찰스·리버) 를 실험 사용 전에 SPF 조건하에서 4-7 일간 순화하였다. 마우스에게는 멸균한 고형 사료 (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) 를 급이하고, 멸균한 수돗물 (5-15 ppm 차아염소산나트륨 용액을 첨가하여 조제) 을 주었다.
측정·계산식 : 모든 연구에 있어서, 종양의 장경 및 단경을 전자식 디지털 캘리퍼 (CD-15CX, Mitutoyo Corp.) 로 일주일 동안에 2-3 회 측정하고, 종양 체적 (㎣) 을 계산하였다. 계산식은 이하에 나타내는 바와 같다.
종양 체적 (㎣) = 장경 (mm) × [단경 (mm)]2 × 1/2
항체-약물 콘쥬게이트 및 항체는 모두 10 mM-Acetate Buffer, 5 ％ Sorbitol, pH 5.5 (나카라이테스크 주식회사 ; ABS 완충액) 로 희석하고, 10 mL/kg 의 액량을 꼬리 정맥 내 투여하였다. 또, 컨트롤군 (Vehicle 군) 으로서 ABS 완충액을 동일하게 투여하였다.
NCI-N87 세포 (ATCC CRL-5822) 를 생리 식염수 (주식회사 오오츠카 제약 공장) 에 현탁하고, 1 × 107 세포를 암컷 누드 마우스의 우체 측부 (側部) 에 피하 이식하고 (Day0), Day7 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC26 을 Day7 에 0.3 mg/kg 의 용량으로, ADC19, 또는 ADC54 를 Day7 에 1 mg/kg 의 용량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 또, 컨트롤군 (Vehicle 군) 으로서 ABS 완충액을 동일하게 투여하였다.
결과를 도 4 에 나타낸다. 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC26, ADC19, 내지 ADC54 는 종양의 퇴축을 수반하는 강한 항종양 효과가 확인되었다. 어느 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트가 투여된 마우스에 있어서도, 체중 감소는 확인되지 않았다.
이하의 항종양 시험에 관한 평가예에 있어서, 특별히 기재가 없는 경우, 본 평가예에서 사용한 수법으로 시험이 실시되고 있다.
실시예 125 : 항체-약물 콘쥬게이트의 항종양 시험 (2)
NCI-N87 세포 (ATCC CRL-5822) 를 Dulbecco's phosphate buffered saline (Sigma-Aldrich) 에 현탁하고, 1 × 107 세포를 암컷 누드 마우스의 우체 측부에 피하 이식하고 (Day0), Day4 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49, 항 HER2 항체 트라스트주맙 (참고예 3), 또는 항 LPS 항체-약물 콘쥬게이트 ADC53 을 Day4 에 모두 0.33 mg/kg 의 용량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 또, 컨트롤군 (Vehicle 군) 으로서 ABS 완충액을 동일하게 투여하였다.
결과를 도 5 에 나타낸다. 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49 는 종양의 퇴축을 수반하는 강한 항종양 효과가 확인되었다. 한편, 항 HER2 항체 트라스트주맙, 항 LPS 항체-약물 콘쥬게이트 ADC53 에서는 종양의 증식을 억제하지 않았다. 또, 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49, ADC53, 또는 항 HER2 항체 투여에 의한 마우스의 체중 감소는 확인되지 않았다.
실시예 126 : 항체-약물 콘쥬게이트의 항종양 시험 (3)
KPL-4 세포 (가와사키 의과 대학·쿠레바야시 준이치 선생, British Journal of Cancer, (1999) 79 (5/6). 707-717) 를 Dulbecco's phosphate buffered saline (Sigma-Aldrich) 에 현탁하고, 1.5 × 107 세포를 암컷 누드 마우스의 우체 측부에 피하 이식하고 (Day0), Day14 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49, 항 LPS 항체-약물 콘쥬게이트 ADC53, 또는 트라스트주맙 테시린 (참고예 1) 을 Day14 에 0.4 mg/kg 의 용량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 또, 컨트롤군 (Vehicle 군) 으로서 ABS 완충액을 동일하게 투여하였다.
결과를 도 6 에 나타낸다. 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49 는 종양의 퇴축을 수반하는 강한 항종양 효과가 확인되었다. 한편, ADC53, 트라스트주맙 테시린에서는 종양의 퇴축은 확인되지 않았다. 또, ADC49, 트라스트주맙 테시린 투여에 의한 마우스의 체중 감소는 확인되지 않았다.
실시예 127 : 항체-약물 콘쥬게이트의 항종양 시험 (4)
JIMT-1 세포 (DSMZ ACC 589) 를 생리 식염수 (주식회사 오오츠카 제약 공장) 에 현탁하고, 5 × 106 세포를 암컷 누드 마우스의 우체 측부에 피하 이식하고 (Day0), Day10 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49, 또는 트라스트주맙 테시린 (참고예 1) 을 Day10 에 0.4 mg/kg 의 용량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 또, 컨트롤군 (Vehicle 군) 으로서 ABS 완충액을 동일하게 투여하였다.
결과를 도 7 에 나타낸다. 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49 는 종양의 퇴축을 수반하는 강한 항종양 효과가 확인되었다. 한편, 트라스트주맙 테시린에서는 항종양 효과가 확인되었지만, 종양의 퇴축은 확인되지 않았다. 또, ADC49, 트라스트주맙 테시린 투여에 의한 마우스의 체중 감소는 확인되지 않았다.
실시예 128 : 항체-약물 콘쥬게이트의 항종양 시험 (5)
OV-90 세포 (ATCC CRL-11732) 를 마트리겔 (CORNING) 에 현탁하고, 2.5 × 106 세포를 암컷 누드 마우스의 우체 측부에 피하 이식하고 (Day0), Day15 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 항 CLDN6 항체-약물 콘쥬게이트 ADC40, 또는 항 CLDN6 항체 (H1L1) 테시린을 Day15 에 0.33 mg/kg 의 용량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 또, 컨트롤군 (Vehicle 군) 으로서 ABS 완충액을 동일하게 투여하였다.
결과를 도 8 에 나타낸다. 항 CLDN6 항체-약물 콘쥬게이트 ADC40 은 종양의 퇴축을 수반하는 강한 항종양 효과가 확인되었다. 한편, 항 CLDN6 항체 (H1L1)-테시린에서는, 종양의 퇴축은 확인되지 않았다. 또, ADC40, H1L1-테시린 투여에 의한 마우스의 체중 감소는 확인되지 않았다.
실시예 129 : 항체-약물 콘쥬게이트의 항종양 시험 (6)
NIH : OVCAR-3 세포 (ATCC HTB-161) 를 마트리겔 (CORNING) 에 현탁하고, 1 × 107 세포를 암컷 누드 마우스의 우체 측부에 피하 이식하고 (Day0), Day25 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 항 CLDN6 항체-약물 콘쥬게이트 ADC40, 또는 항 CLDN6 항체 (H1L1)-테시린을 Day25 에 0.33 mg/kg 의 용량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 또, 컨트롤군 (Vehicle 군) 으로서 ABS 완충액을 동일하게 투여하였다.
결과를 도 9 에 나타낸다. 항 CLDN6 항체-약물 콘쥬게이트 ADC40 은 종양의 퇴축을 수반하는 강한 항종양 효과가 확인되었다. 한편, H1L1-테시린에서는 항종양 효과는 확인되었지만, 종양의 퇴축은 확인되지 않았다. 또, ADC40, H1L1-테시린 투여에 의한 마우스의 체중 감소는 확인되지 않았다.
실시예 130 : 항체-약물 콘쥬게이트의 항종양 시험 (7)
FaDu 세포 (ATCC HTB-43) 를 생리 식염수 (주식회사 오오츠카 제약 공장) 에 현탁하고, 3 × 106 세포를 암컷 누드 마우스의 우체 측부에 피하 이식하고 (Day0), Day10 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 항 TROP2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC50, 또는 항 LPS 항체-약물 콘쥬게이트 ADC53 을 Day10 에 0.4 mg/kg 의 용량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 또, 컨트롤군 (Vehicle 군) 으로서 ABS 완충액을 동일하게 투여하였다.
결과를 도 10 에 나타낸다. 항 TROP2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC50 은 종양의 퇴축을 수반하는 강한 항종양 효과가 확인되었다. 한편, 항 LPS 항체-약물 콘쥬게이트 ADC53 은 종양의 증식을 억제하지 않았다. 또, ADC50, ADC53 투여에 의한 마우스의 체중 감소는 확인되지 않았다.
실시예 131 : 마우스 항 CLDN6 항체 B1 산생 하이브리도마 (218B1) 및 마우스 항 CLDN6 항체 C7 산생 하이브리도마 (218C7)
131-1. 마우스의 면역과 하이브리도마의 취득
1-1) 마우스 면역에 사용하는 세포의 준비
2 × 106 개 혹은 5 × 106 개의 NOR-P1 세포 (인간 췌암 세포주, RIKEN RCB-2139) 를 RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute-1640) 10 ％ FBS (소 태아 혈청) (＋) 배지 (10 ml 혹은 20 ml) 에서 5 일간 배양 후에 회수하고, PBS (인산 완충 생리 식염수) 로 2 회 세정하고, PBS (300 μl) 중에 재현탁하였다.
1-2) 마우스에의 면역
BALB/c 마우스 (12 주령) 에 대해, 1 ∼ 5 회째의 면역은 약 1 주간 간격으로 NOR-P1 세포 (2 × 106 개) 를 복강 내에 면역하였다. 5 회째의 면역으로부터 약 2 주간 후에 NOR-P1 세포 (5 × 106 개) 를 복강 내에 면역하였다. 6 회째의 면역으로부터 약 3 주간 후에 NOR-P1 세포 (2 × 106 개) 를 복강 내에 면역하였다. 8 ∼ 10 회째는 약 2 주간 간격으로 2 × 106 개의 NOR-P1 세포를 복강 내에 면역하였다. 10 회째의 약 3 주간 후 (11 회째) 및 그 3 일 후 (12 회째, 최종 면역) 에서는, 5 × 106 개의 NOR-P1 세포를 복강 내에 면역하였다. 비장 세포는 최종 면역으로부터 3 일 후에 적출하였다.
1-3) 면역한 마우스의 비장 세포의 준비
면역이 완료된 마우스의 비장을 적출하고, 갈아 으깨어 RPMI1640 10 ％ FBS(＋) 배지에 현탁하였다. 세포 현탁액을 셀 스트레이너 (70 ㎛, BD Falcon 사) 에 통과시킨 후, 1500 rpm 으로 5 분간, 실온에서 원심하고 상청을 폐기하였다. Tris-NH4Cl 용액 (20 mM Tris-HCl pH 7.2, 77.6 mM NH4Cl ; 20 mL) 을 첨가하고, 실온에서 5 분간 처리하였다. PBS (20 mL) 를 첨가하고, 1500 rpm 으로 5 분간, 실온에서 원심하였다. 상청을 폐기한 후에, RPMI1640 FBS (＋) 배지 (10 ml) 를 첨가하였다.
1-4) 미엘로마 세포의 준비
P3U1 세포 (마우스 미엘로마 세포주) 를 RPMI1640 FBS(＋) 배지에서 5 일간 배양한 후에 회수하고, RPMI1640 FBS(＋) 배지 (20 ml) 에 재현탁하였다.
1-5) 세포 융합
비장 세포와 미엘로마 세포를 5 : 1 이 되도록 혼합하고, 1500 rpm 으로 5 분간, 실온에서 원심하였다. RPMI1640 FBS(-) 배지 (10 ml) 로 2 회 세정한 후에, 원심분리 (1500 rpm, 5 분간) 하였다. 얻어진 침전 획분의 세포군을 잘 푼 후, 교반하면서, 폴리에틸렌글리콜-1500 (PEG-1500 ; 1 ml) 을 약 1 분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 3 분 30 초간 교반한 후에, 30 초간 실온에서 정치하였다. 그 후, 그 세포액에 1 분에 걸쳐 RPMI 배지 10 ％ Low IgG FBS(＋) (10 ml) 를 첨가하였다. 그 세포 현탁액을 원심분리 (1500 rpm, 5 분간) 하고, 얻어진 침전 획분의 세포를 천천히 푼 후, HAT 배지 (10 ％ Low IgG FBS, HAT Media Supplement, 5 ％ BriClone 을 포함하는 RPMI1640 배지 ; 200 ml) 중에 천천히 현탁하였다. 그 현탁액을 96 웰 배양용 플레이트에 200 μl/웰씩 분주하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 중에서, 6 일간 배양하였다.
1-6) 하이브리도마의 스크리닝·프로브의 준비
항체의 내재화 및 이뮤노톡신 활성의 측정을 목적으로 리콤비넌트 복합 단백질인 DT3C 를 제조하였다. 이 DT3C 는, 디프테리아 독소 (DT) 의 촉매 영역과 연쇄 구균 프로테인 G 의 항체 결합 영역을 유전자 공학적으로 융합시킨 단백질이다. DT3C 는 항체의 Fc 부분에 특이적으로 결합하고, 세포 내에 흡수되면 단백질 합성 저해에 의해 세포사를 유도한다. 이 계를 사용함으로써 항체의 내재화와 이뮤노톡신에 의한 살세포 효과를 동시에 관찰할 수 있다 (Yamaguchi, M. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 454 (2014) 600-603).
1-7) DT3C 에 의한 하이브리도마의 스크리닝
96 웰 플레이트에 4 μg/ml 의 DT3C (25 μl) 를 첨가하고, 추가로 공정 1-5 에서 취득된 하이브리도마의 배양 상청 (25 μl) 을 첨가하고, 실온에서 30 분 인큐베이션하였다. 2 × 105 개/ml (RPMI 배지 10 ％ Low IgG FBS(＋)) 의 NOR-P1 세포 (50 μl) 를 파종하고, 37 ℃ CO2 인큐베이터로 3 일간 배양하였다. 배양 후의 현미경 관찰에 의해, 음성 대조 항체를 사용했을 때의 부착 세포수의 약 25 ％ 이하의 부착 세포수를 나타낸 웰을 양성으로 판정하였다. 선발한 클론은 1 ∼ 2 회 서브 클로닝을 실시하여, 모노클로날한 하이브리도마 세포주 8 주를 수립하였다.
131-2 : 하이브리도마의 산생하는 항체의 결합하는 항원의 동정
실시예 131-1 에 있어서 조제된 하이브리도마의 산생하는 항체 중 2 개의 클론 218B1 및 218C7 에 대해 항원의 동정을 실시하였다.
2-1) 비오틴 라벨한 세포 표면 단백질의 218B1 항체 및 218C7 항체를 사용한 면역 침강
2 × 106 개의 NTERA-2 세포 (인간 정소암 세포주, ATCC CRL-1973) 의 배양 상청을 제거하고, PBS 로 2 회 세정하였다. EZ-Link Sulfo-NHS-비오틴 (Thermo Fisher SCIENTIFIC 사) 을 0.1 mg/ml 의 농도로 PBS 에 현탁하였다. PBS 를 제거한 후에, 비오틴/PBS 용액을 첨가하고, 30 분간 진탕기 상에서 인큐베이션한 후에 100 mM 글리신/PBS 용액 (25 ml) 으로 2 회 세정하고, 그 후, PBS (10 ml) 로 1 회 세정하였다. 세정 후의 세포를 200 μl 의 용해 버퍼 (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 ％ DDM, 프로테아제 인히비터 (Protease inhibitor), 컴플리트 EDTA 프리 (Roche 사) 1 입/50 ml) 중에 재현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분간 처리하였다. 원심분리 (13000 rpm, 20 분간, 4 ℃) 하여 세포 용해액을 조제하였다. Protein G Sepharose (Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare 사)) 의 버퍼를 용해 버퍼로 치환하여 얻어진 Protein G Sepharose/용해 버퍼 (50 ％ 슬러리 ; 30 μl) 를 세포 용해액에 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 로테이트한 후에 4 ℃ 에서 1 분간 원심하고, 상청을 회수하였다. 이 상청에 218B1 항체 혹은 218C7 항체 (약 3 ㎍) 를 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 로테이트한 후에 Protein G Sepharose/용해 버퍼 (50 ％ 슬러리 ; 60 μl) 를 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 로테이트하였다. 용해 버퍼 (1 ml) 로 Protein G Sepharose 를 6 회 세정한 후에 1 × SDS 샘플 버퍼 (BioRad 사) 에 재현탁하였다. 100 ℃ 에서 5 분간 현탁액을 처리한 후, 용액을 회수하여, SDS-PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기 영동) 를 위한 샘플로 하였다.
2-2) SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅
2-1) 에서 조제한 SDS-PAGE 샘플을 SuperSep Ace 5-20 ％ (Wako 사) 를 사용하고, 50 mV 로 30 분간 스태킹한 후에, 200 mV 로 1 시간 영동한 후, 겔로부터 멤브레인으로 12 mV 로 47 분간 블로팅하였다. 멤브레인을 PBS-T (PBS(-)-0.02 ％ Tween 20) 로 세정한 후, 1 시간 블로킹을 실시하였다. 멤브레인을 PBS-T 로 5 분간 3 회 세정한 후에 콘쥬게이트 (Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (GE Healthcare 사 ; PBS-T 로 2000 배로 희석하여 사용)) 와 1 시간 반응시켰다. 멤브레인을 PBS-T 로 5 분간 2 회 세정한 후에, 목적의 밴드를 증강된 화학 루미네센스 (enhanced chemiluminecscence (ECL)) 법을 사용하여 검출하였다. 218B1 항체 및 218C7 항체를 사용한 어느 경우에 있어서도, DTT 의 첨가의 유무에 의하지 않고 분자량 18 kDa 의 밴드가 검출되었다.
2-3) 세포 단백질의 218B1 항체 및 218C7 항체를 사용한 면역 침강 산물의 질량 분석
2 × 107 개의 NTERA-2 세포를 회수하고, PBS 로 2 회 세정하였다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 회수하고, 1500 rpm, 5 분간 원심하였다. 상청을 제거한 후에 2 ml 의 용해 버퍼 중에 재현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분간 처리하였다. 원심분리 (13000 rpm, 20 분간, 4 ℃) 하여 세포 용해액을 조제하였다. Protein G Sepharose/용해 버퍼 (50 ％ 슬러리 ; 180 μl) 를 세포 용해액에 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 로테이트한 후에 4 ℃ 에서 1 분간 원심하고, 상청을 회수하였다. 이 상청에 218B1 항체 (약 9 μg) 를 첨가하고, 4 ℃ 에서 30 분간 로테이트한 후에 Protein G Sepharose/용해 버퍼 (50 ％ 슬러리 ; 180 μl) 를 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 로테이트하였다. 용해 버퍼 (1 ml) 로 Protein G Sepharose 를 6 회 세정한 후에 1 × SDS 샘플 버퍼에 재현탁하였다. 100 ℃ 에서 5 분간 현탁액을 처리한 후, 용액을 회수하여, SDS-PAGE 를 위한 샘플로 하였다. 2-2) 와 동일한 방법으로 SDS-PAGE 를 실시하고, 영동겔을 CBB 염색하였다. 영동겔로부터 18 kDa 에 상당하는 부분을 잘라 내고, 질량 분석에 제공하였다. 질량 분석의 결과, 그 겔편은 Claudin-6 을 포함하는 것이 판명되었다.
2-4) FACS 해석
질량 분석으로부터 218B1 항체 및 218C7 항체의 항원이 Claudin-6 인 것을 예측할 수 있었기 때문에, cDNA 의 유전자 도입에 의한 강제 발현 해석을 실시하였다. FACS 해석의 결과, 인간 Claudin-6 발현 CHO-K1 세포에서는 218B1 항체 및 218C7 항체는 강양성 반응을 나타냈기 때문에, 218B1 항체 및 218C7 항체의 항원은 Claudin-6 인 것이 나타났다.
실시예 132 : 하이브리도마 배양 상청으로부터의 항체의 정제
실시예 131 에서 제조한 마우스 항 CLDN6 항체 B1 산생 하이브리도마 (218B1) 및 마우스 항 CLDN6 항체 C7 산생 하이브리도마 (218C7) 를, 10 ％ 의 소 태아 혈청 (Fetal Bovine Serum), Ultra-Low IgG (Thermo Fisher Scientific) 를 포함하는 하이브리도마-SFM (Hybridoma-SFM (Thermo Fisher Scientific)) 에서 배양하였다. 배양 상청을 원심에 의해 회수하고 0.45 ㎛ 의 필터 (Corning 사 제조) 로 여과하였다. rProtein A 어피니티 크로마토그래피 (4 ∼ 6 ℃ 하) 1 단계 공정으로, 배양 상청으로부터 항체를 정제하였다. rProtein A 어피니티 크로마토그래피 정제 후의 버퍼 치환 공정은 4 ∼ 6 ℃ 하에서 실시하였다. 처음으로 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 가 충전된 칼럼에 어플라이하였다. 배양액이 칼럼에 모두 들어간 후, 칼럼 용량 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 PBS(-) 로의 액치환을 실시하였다. 마지막으로 원심 UF 필터 장치 VIVASPIN20 (Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사, 4 ℃ 하)) 으로 농축하고, IgG 농도를 1 mg/mL 이상으로 조제하였다. Minisart-Plusfilter (Sartorius 사) 로 여과하여, 정제 샘플로 하였다.
실시예 133 : 마우스 항 CLDN6 항체 B1 및 C7 의 in vitro 평가
133-1 : 플로우 사이토메트리에 의한 마우스 항 CLDN6 항체의 결합능 평가
실시예 132 에서 제조한 마우스 항 CLDN6 항체의 인간 CLDN6 및 패밀리 분자 CLDN3, CLDN4, CLDN9 결합성을 플로우 사이토메트리법에 의해 평가하였다. Origene 사로부터 구입한 인간 CLDN3/pCMV6-Entry, 인간CLDN4/pCMV6-Entry, 인간 CLDN6/pCMV-Entry, 인간 CLDN9/pCMV6-Entry, 또는 pCMV6-Entry 를, 293T 세포 (Thermo Fisher Scientific HCL4517) 에 Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) 을 사용하여 일과성으로 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양한 후, 세포 현탁액을 조제하였다. 유전자 도입한 293T 세포 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 마우스 항 CLDN6 항체 (클론 번호는 B1, C7), 또는 마우스 IgG1 컨트롤 항체 (R＆D Systems) 를 최종 농도 30 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 3.3 ㎍/mL, 1.1 ㎍/mL 로 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 정치하였다. 5 ％ 의 소 태아 혈청 (Hyclone) 을 포함하는 Dulbecco's phosphate buffered saline (Sigma-Aldrich) (이하, 5 ％ FBS 함유 PBS) 으로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배 희석한 FLUORESCEIN-CONJUGATED GOAT IGG FRACTION TO MOUSE IGG (WHOLE MOLECULE) (MP BIOMEDICALS) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 플로우 사이토미터 (FC500 ; Beckman Coulter) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 실시하였다. 또한, 각 유전자 도입의 확인은, 세포를 0.25 ％ Tween20 함유 PBS 로 투과 처리한 후에 마우스 항 FLAG 항체 (Sigma-Aldrich) 를 사용하여 실시하였다. 결과를 도 40 에 나타낸다. 도 40 의 그래프에 있어서, 세로축은 항체 결합량을 나타내는 FITC 의 형광 강도, 가로축은 항체 농도를 나타낸다. 제조한 마우스 항 CLDN6 항체는 인간 CLDN6 과 인간 CLDN9 에 동일한 정도로 결합하고, 인간 CLDN3, 인간 CLDN4 에는 결합하지 않았다. 마우스 컨트롤 IgG1 은 어느 세포에도 결합하지 않았다.
133-2 : 항체 내재화 활성
마우스 항 CLDN6 항체 B1 및 C7 의 내재화 활성은, 단백질 합성을 저해하는 독소 (사포린) 를 결합시킨 항마우스 IgG 시약 Mab-ZAP (ADVANCED TARGETING SYSTEMS) 을 사용하여 평가하였다. 이 평가에서는, 마우스 항 CLDN6 항체의 내재화 활성에 의존하여 Mab-ZAP 이 세포 내에 흡수되고, 단백질 합성을 저해하는 사포린이 세포 내로 방출됨으로써, 세포 증식이 억제된다.
인간 CLDN6 양성 세포의 인간 융모암주인 JEG-3 (ATCC HTB-36), 인간 CLDN6 양성 세포의 인간 난소암주인 NIH : OVCAR-3 (ATCC HTB-161), 또는 인간 CLDN6 음성 세포의 인간 췌장암주인 BxPC-3 (ATCC CRL-1687) 을 2 x 103 세포/웰로 96 웰 세포 배양용 마이크로 플레이트에 파종하고 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 마우스 항 CLDN6 항체, 또는 마우스 IgG1 항체 (R＆D Systems) 를 최종 농도 1 nM 이 되도록, Mab-ZAP (최종 농도 : 0.5 nM), 또는 독소를 결합하고 있지 않은 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch) (최종 농도 : 0.5 nM) 과 혼합한 혼합 용액을 첨가하여, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 5 일간 배양하였다. 생존 세포수는, CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 를 사용한 ATP 활성의 정량으로 측정하였다. 항 CLDN6 항체 첨가에 의한 세포 증식 억제 작용은, 혼합 용액 비첨가 웰의 값을 100 ％ 로 하는 상대 생존률로 구하였다. 도 41 에 결과를 나타낸다. 마우스 항 CLDN6 항체 (B1, C7) 는 인간 CLDN6 양성 세포주 JEG-3 과 NIH : OVCAR-3 에 대해 세포 증식 억제 효과를 확인하였다. 한편, 인간 CLDN6 음성 세포주 BxPC-3 에 대해서는 세포 증식 억제 효과를 확인할 수 없었다. 또, 마우스 IgG1 항체는 어느 세포주에 대해서도 세포 증식 억제 효과를 확인할 수 없었다. 이 결과, 제조한 항 CLDN6 항체 (B1, C7) 는 내재화 활성을 가져, 항체-약물 콘쥬게이트용의 항체로서 적합하다고 생각된다.
실시예 134 : 마우스 항 CLDN6 항체 B1 및 C7 의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 결정
134-1 : B1 항체의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 결정
134-1-1 : B1 항체 산생 하이브리도마의 total RNA 의 조제
B1 항체의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 증폭하기 위해, B1 항체 산생 하이브리도마로부터 TRIzol Reagent (Ambion 사) 를 사용하여 total RNA 를 조제하였다.
134-1-2 : 5'-RACE PCR 에 의한 B1 항체의 경사슬 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 증폭과 서열의 결정
경사슬 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 증폭은, 실시예 134-1-1 에서 조제한 total RNA 의 약 1 ㎍ 과 SMARTer RACE 5'/3' 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 실시하였다. B1 항체의 경사슬 유전자의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 PCR 로 증폭하기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE 5'/3' 키트에 부속), 및 공지된 마우스 경사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계한 프라이머를 사용하였다.
5'-RACE PCR 로 증폭한 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 플라스미드에 클로닝하고, 다음으로 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 시퀀스 해석을 실시하였다.
결정된 B1 항체의 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 18 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 19 에 나타낸다.
134-1-3 : 5'-RACE PCR 에 의한 B1 항체의 중사슬 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 증폭과 서열의 결정
중사슬 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 증폭은, 실시예 134-1-1 에서 조제한 total RNA 의 약 1 ㎍ 과 SMARTer RACE 5'/3' 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 실시하였다. LB1 항체의 중사슬 유전자의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 PCR 로 증폭하기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE 5'/3' 키트에 부속), 및 공지된 마우스 중사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계한 프라이머를 사용하였다.
5'-RACE PCR 로 증폭한 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 플라스미드에 클로닝하고, 다음으로 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 시퀀스 해석을 실시하였다.
결정된 B1 항체의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 20 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 21 에 나타낸다.
134-2 : C7 항체의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 결정
실시예 134-1 과 동일한 방법으로 실시하였다. 결정된 C7 항체의 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 22 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 23 에 나타낸다. 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 24 에 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 25 에 나타낸다.
실시예 135 : 키메라화 항 CLDN6 항체 chB1 의 제조
135-1 : 키메라화 항 CLDN6 항체 chB1 의 발현 벡터의 구축
135-1-1 : 키메라화 및 인간화 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 의 구축
플라스미드 pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen 사) 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 얻어지는 약 5.4 kb 의 프래그먼트와, 서열 번호 26 에 나타내는 인간 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 결합해, pcDNA3.3/LK 를 제조하였다. pcDNA3.3/LK 로부터 네오마이신 발현 유닛을 제거함으로써 pCMA-LK 를 구축하였다.
135-1-2 : 키메라화 및 인간화 IgG1LALA 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1LALA 의 구축
pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편과, 서열 번호 27 로 나타내는 인간 중사슬 시그널 서열 및 인간 IgG1LALA 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 결합해, pCMA-G1LALA 를 구축하였다.
135-1-3 : 키메라화 chB1 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 33 에 나타내는 chB1 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하고, pCMA-G1LALA 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써 chB1 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. chB1 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 32 에 나타낸다.
135-1-4 : 키메라화 chB1 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 29 에 나타내는 chB1 경사슬을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하고, 합성한 DNA 단편과 pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편을 결합함으로써, chB1 경사슬 발현 벡터를 구축하였다. chB1 경사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 28 에 나타낸다.
135-2 : 키메라화 항 CLDN6 항체 chB1 의 생산 및 정제
135-2-1 : 키메라화 항체 chB1 의 생산
FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 는 매뉴얼에 따라, 계대, 배양을 실시하였다. 대수 증식기의 1.2 × 109 개의 FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 를 3L Fernbach Erlenmeyer Flask (CORNING 사) 에 파종하고, FreeStyle293 expression 배지 (Invitrogen 사) 으로 희석하여 2.0 × 106 세포/mL 로 조제하였다. 40 mL 의 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사) 에 0.24 mg 의 중사슬 발현 벡터와 0.36 mg 의 경사슬 발현 벡터와 1.8 mg 의 폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine (Polyscience ＃24765)) 을 첨가하여 천천히 교반하고, 추가로 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터로 4 시간, 90 rpm 으로 진탕 배양 후에 600 mL 의 EX-CELL VPRO 배지 (SAFC Biosciences 사), 18 mL 의 GlutaMAX I (GIBCO 사), 및 30 mL 의 Yeastolate Ultrafiltrate (GIBCO 사) 를 첨가하고, 37 ℃, 8 ％ CO2 인큐베이터로 7 일간, 90 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 Disposable Capsule 필터 (Advantec ＃CCS-045-E1H) 로 여과하였다. 취득한 키메라화 항 CLDN6 항체를 「chB1」로 명명하였다.
135-2-2 : 키메라화 항체 chB1 의 정제
실시예 135-2-1 에서 얻어진 배양 상청으로부터 항체를 rProteinA 어피니티 크로마토그래피의 1 단계 공정으로 정제하였다. 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe 가 충전된 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 에 어플라이한 후에, 칼럼 용량의 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하고, 항체가 포함된 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 PBS(-) 로의 버퍼 치환을 실시하였다. 원심 UF 필터 장치 VIVASPIN20 (Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사)) 으로 항체를 농축하고, IgG 농도를 1 mg/mL 이상으로 조제하였다. 마지막으로 Minisart-Plus 필터 (Sartorius 사) 로 여과하여, 정제 샘플로 하였다.
실시예 136 : 인간화 항 CLDN6 항체의 제조
136-1 : 항 CLDN6 항체의 인간화체 디자인
136-1-1 : 키메라화 항체 chB1 의 가변 영역의 분자 모델링
chB1 의 가변 영역의 분자 모델링은, 호몰로지 모델링으로서 공지된 방법 (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)) 을 이용하였다. chB1 의 중사슬과 경사슬의 가변 영역에 대해 높은 서열 동일성을 갖는 Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) 에 등록되어 있는 구조 (PDB ID : 1XIW) 를 주형으로, 시판되는 단백질 입체 구조 해석 프로그램 BioLuminate (Schrodinger 사 제조) 를 사용하여 실시하였다.
136-1-2 : 인간화 아미노산 서열의 설계
chB1 은, CDR 그래프팅 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 인간화하였다. Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 에 있어서 기정된 인간의 감마 (gamma) 사슬 서브 그룹 1 및 kappa 사슬 서브 그룹 1 의 콘센서스 서열이, chB1 의 프레임 워크 영역에 대해 높은 동일성을 갖는 점에서, 각각, 중사슬과 경사슬의 억셉터로서 선택되었다. 억셉터 상에 이입해야 하는 도너 잔기는, Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 부여되는 기준 등을 참고로 삼차원 모델을 분석함으로써 선택되었다. 또한, CDRL3 이 소수적인 아미노산이 풍부하기 때문에, CDRL3 에 변이를 도입한 인간화 경사슬도 설계하였다.
136-2 : chB1 중사슬의 인간화
설계된 3 종의 중사슬을 hH1, hH2 및 hH3 으로 명명하였다. hH1 의 중사슬 전체 길이 아미노산 서열을, 서열 번호 52 (도 34) 에 기재한다. 서열 번호 52 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 53 (도 34) 에 기재한다. hH2 의 중사슬 전체 길이 아미노산 서열을, 서열 번호 56 (도 36) 에 기재한다. 서열 번호 56 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 57 (도 36) 에 기재한다. hH3 의 중사슬 전체 길이 아미노산 서열을, 서열 번호 60 (도 38) 에 기재한다. 서열 번호 60 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 61 (도 38) 에 기재한다.
실시예 135 에서 나타내는 인간 키메라화 항 CLDN6 항체 chB1 의 중사슬인 chB1_H, 인간화 항체 중사슬 hH1, hH2, 및 hH3 의 아미노산 서열의 비교를 도 45 에 나타낸다. hH1, hH2 및 hH3 의 서열에 있어서 「·」 는 chB1_H 와 동일한 아미노산 잔기를 나타내고, 아미노산 잔기가 기재되어 있는 지점은 치환된 아미노산 잔기를 나타낸다.
136-3 : chB1 경사슬의 인간화
설계된 4 종의 경사슬을 hL1, hL2, hL3 및 hL4 로 명명하였다. hL1 의 경사슬 전체 길이 아미노산 서열을, 서열 번호 36 (도 26) 에 기재한다. 서열 번호 36 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 37 (도 26) 에 기재한다. hL2 의 경사슬 전체 길이 아미노산 서열을, 서열 번호 40 (도 28) 에 기재한다. 서열 번호 40 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 41 (도 28) 에 기재한다. hL3 의 경사슬 전체 길이 아미노산 서열을, 서열 번호 44 (도 30) 에 기재한다. 서열 번호 44 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열 번호 45 (도 30) 에 기재한다. hL4 의 경사슬 전체 길이 아미노산 서열을, 서열 번호 48 (도 32) 에 기재한다. 서열 번호 48 의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을, 서열 번호 49 (도 32) 에 기재한다.
실시예 135 로 나타내는 인간 키메라화 항 CLDN6 항체 chB1 의 경사슬인 chB1_L, 인간화 항체 경사슬 hL1, hL2, hL3 및 hL4 의 아미노산 서열의 비교를 도 46 에 나타낸다. hL1, hL2, hL3 및 hL4 의 서열에 있어서, 「·」 는 chB1_L 과 동일한 아미노산 잔기를 나타내고, 아미노산 잔기가 기재되어 있는 지점은 치환된 아미노산 잔기를 나타낸다.
136-4 : 중사슬 및 경사슬의 조합에 의한 인간화 항체의 설계
hH1 및 hL1 로 이루어지는 항체를 「H1L1 항체」 또는 「H1L1」로 칭한다. hH2 및 hL2 로 이루어지는 항체를 「H2L2 항체」 또는 「H2L2」로 칭한다. hH1 및 hL3 으로 이루어지는 항체를 「H1L3 항체」 또는 「H1L3」으로 칭한다. hH2 및 hL4 로 이루어지는 항체를 「H2L4 항체」 또는 「H2L4」로 칭한다. hH3 및 hL3 으로 이루어지는 항체를 「H3L3 항체」 또는 「H3L3」으로 칭한다.
136-5 : 인간화 항 CLDN6 항체의 제조
136-5-1 : 인간화 중사슬 발현 벡터의 구축
136-5-1-1 : hH1 발현 벡터의 구축
서열 번호 53 에 나타내는 hH1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 135-1-3 과 동일한 방법으로 hH1 발현 벡터를 구축하였다.
136-5-1-2 : hH2 발현 벡터의 구축
서열 번호 57 에 나타내는 hH2 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 135-1-3 과 동일한 방법으로 hH2 발현 벡터를 구축하였다.
136-5-1-3 : hH3 발현 벡터의 구축
서열 번호 61 에 나타내는 hH2 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 440 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 135-1-3 과 동일한 방법으로 hH3 발현 벡터를 구축하였다.
136-5-2 : 인간화 경사슬 발현 벡터의 구축
136-5-2-1 : hL1 발현 벡터의 구축
서열 번호 37 에 나타내는 hL1 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 402 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여, pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에 합성한 DNA 단편을 삽입함으로써 hL1 발현 벡터를 구축하였다.
136-5-2-2 : hL2 발현 벡터의 구축
서열 번호 41 에 나타내는 hL2 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 402 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 136-5-2-1 과 동일한 방법으로 hL2 발현 벡터를 구축하였다.
136-5-2-3 : hL3 발현 벡터의 구축
서열 번호 45 에 나타?는 hL3 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 402 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 136-5-2-1 과 동일한 방법으로 hL3 발현 벡터를 구축하였다.
136-5-2-4 : hL4 발현 벡터의 구축
서열 번호 49 에 나타내는 hL4 의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 402 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 136-5-2-1 과 동일한 방법으로 hL4 발현 벡터를 구축하였다.
136-5-3 : 인간화 항체의 조제
136-5-3-1 : 인간화 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, 및 H3L3 의 생산
실시예 135-2-1 과 동일한 방법으로 생산하였다. 실시예 136-4 에 나타낸 중사슬과 경사슬의 조합에 대응하는 중사슬 발현 벡터와 경사슬 발현 벡터의 조합에 의해, H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, 및 H3L3 을 생산하였다.
136-5-3-2 : 인간화 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, 및 H3L3 의 2step 정제
실시예 136-5-3-1 에서 얻어진 배양 상청을 rProtein A 어피니티 크로마토그래피와 세라믹 하이드록시 아파타이트의 2 단계 공정으로 정제하였다. 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe 가 충전된 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 에 어플라이한 후에, 칼럼 용량의 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 항체를 용출하였다. 항체가 포함되는 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 PBS 로의 버퍼 치환을 실시하고, 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/pH 7.0 의 버퍼로 5 배 희석한 후에, 5 mM NaPi/50 mM MES/30 mM NaCl/pH 7.0 의 버퍼로 평형화한 세라믹 하이이드록시 아파타이트 칼럼 (닛폰 바이오라드, Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column) 에 어플라이 하였다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH 6.0) 로의 버퍼 치환을 실시하였다. Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사) 으로 항체를 농축하고, IgG 농도를 50 mg/mL 로 조제하였다. 마지막으로 Minisart-Plus 필터 (Sartorius 사) 로 여과하여, 정제 샘플로 하였다.
실시예 137 : 플로우 사이토메트리에 의한 인간화 항 CLDN6 항체의 결합능 평가
실시예 136 에서 제조한 인간화 항 CLDN6 항체의 인간 CLDN6 및 패밀리 분자 CLDN3, CLDN4, CLDN9 결합성을 플로우 사이토메트리법에 의해 평가하였다. 실시예 133-1 과 동일한 수법으로 일과성으로 유전자 도입한 293T 세포를 사용하였다. 인간 CLDN6 또는 인간 CLDN9 유전자를 도입한 세포에는, 인간화 항 CLDN6 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, 및 H3L3, 또는 인간 IgG1 컨트롤 항체 (CALBIOCHEM) 를 최종 농도 100 nM, 20 nM, 4 nM, 0.8 nM 으로 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 인간 CLDN3, 인간 CLDN4 유전자, 또는 빈 벡터를 도입한 세포에는, 인간화 항 CLDN6 항체 H1L1, H2L2, H1L3, H2L4, 및 H3L3 을 최종 농도 100 nM 으로 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ 의 소 태아 혈청 (Hyclone) 을 포함하는 Dulbecco's phosphate buffered saline (Sigma-Aldrich) (이하, 5 ％ FBS 함유 PBS) 으로 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 150 배 희석한 FITC AffiniPureF (ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG (H＋L) (Jackson ImmunoResearch) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 30 분 정치하였다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 세정한 후, 플로우 사이토미터 (FC500 ; Beckman Coulter) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 FlowJo (TreeStar) 로 실시하고, 항체의 결합량을 나타내는 FITC 의 평균 형광 강도 (MFI) 를 산출하였다. 결과를 도 42 에 나타낸다. 도 42 의 그래프에 있어서, 가로축은 항체 농도, 세로축은 MFI 를 나타낸다. 제조한 인간화 항 CLDN6 항체는 인간 CLDN6 과 인간 CLDN9 에 동일한 정도로 결합하고, 인간 CLDN3, 인간 CLDN4 에는 결합하지 않았다. 인간 컨트롤 IgG1 은 어느 세포에도 결합하지 않았다.
실시예 138 : 트라스트주맙 변이체의 제조
138-1 : 트라스트주맙-LALA 의 중사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 74 에 나타내는 트라스트주맙-LALA 의 중사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 36 내지 434 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 135-1-3 과 동일한 방법으로 발현 벡터를 구축하였다. 트라스트주맙-LALA 의 중사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 75 에 나타낸다.
138-2 : 트라스트주맙-LALA 의 경사슬 발현 벡터의 구축
서열 번호 72 에 나타내는 트라스트주맙-LALA 의 경사슬의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 37 내지 402 에 나타내는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 실시예 136-5-2-1 과 동일한 방법으로 발현 벡터를 구축하였다. 트라스트주맙-LALA 의 경사슬의 아미노산 서열을 서열 번호 73 에 나타낸다.
138-3 : 트라스트주맙 변이체의 생산
실시예 135-2-1 과 동일한 방법으로 생산하였다.
138-4 : 트라스트주맙 변이체의 정제
실시예 138-3 에서 얻어진 배양 상청으로부터 실시예 135-2-2 와 동일한 방법으로 트라스트주맙-LALA 를 정제하였다. 단, PBS(-) 가 아니라 50 mM 인산 완충 용액 (pH 6.0) 으로의 버퍼 치환을 실시하였다.
실시예 139 : 당사슬 변환 (트라스트주맙 변이체-MSG1)
공정 1 : (Fucα1,6)GlcNAc-트라스트주맙 변이체
실시예 138 에서 조정한 트라스트주맙 변이체 용액 ca. 22.3 mg/ml (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (2.7 ml) 를 사용하고, 실시예 58 공정 1 과 동일한 조작을 실시하여, 6.1 mg/ml 의 (Fucα1,6)GlcNAc-트라스트주맙 변이체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (6. 1 mL) 을 얻었다.
공정 2 : 트라스트주맙 변이체-[MSG1-N3]2
상기 공정 1 에서 얻어진 6.1 mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-트라스트주맙 변이체 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (6.1 ml) 을 사용하고, 실시예 60 공정 1 과 동일한 조작을 실시함으로써, 10.2 mg/ml 트라스트주맙 변이체-[MSG1-N3]2 용액 (인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0)) (3.7 ml) 을 얻었다.
실시예 140 : ADC55
[화학식 248]
Figure pct00444
(공정 1 에서 얻어지는 화합물은, 상기 식으로 나타내는 바와 같이 트리아졸 고리 기하 이성체를 갖고, 실시예 140 공정 1 에서 얻어진 화합물은 상기 R 로서 나타낸 2 종류의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 보유한다.)
공정 1 : 항체와 약물 링커의 콘쥬게이션
실시예 139 공정 2 에서 얻어진 항체의 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (10.2 mg/mL, 0.40 mL) 에, 실온에서 인산 완충 생리 식염수 (pH 6.0) 용액 (0.40 mL) 1,2-프로판디올 (0.767 mL), 디메틸포름아미드 (0.20 mL), 실시예 3 공정 13 에서 얻어진 화합물을 10 mM 포함하는 디메틸포름아미드 용액 (0.033 mL ; 항체 1 분자에 대해 12 당량) 을 첨가하고, 튜브 로테이터 (MTR-103, 애즈원 주식회사) 를 사용하여, 실온에서 48 시간 반응시켰다.
정제 조작 : 상기 용액을 공통 조작 D 를 이용하여 정제를 실시해, 목적의 화합물을 갖는 용액을 7.00 mL 얻었다.
특성 평가 : 공통 조작 E, F 를 이용하여 하기 특성값을 얻었다.
항체 농도 : 0.39 mg/mL, 항체 수량 : 1.38 mg (35 ％), 항체 1 분자당의 약물 평균 결합수 (n) : 1.8
실시예 141 : 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트의 항세포 효과
HER2 항원 양성 세포의 인간 유암주인 KPL-4 세포 (가와사키 의과 대학·쿠레바야시 준이치 선생) 를, 10 ％ 의 소 태아 혈청 (Hyclone) 을 포함하는 RPMI1640 배지 (Thermo Fisher Scientific ; 이하, RPMI 배지) 으로 6.25 × 103 세포/mL 가 되도록 조제하고, 96 웰 세포 배양용 마이크로 플레이트에 80 μL 씩 첨가하였다. 세포 첨가 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 하룻밤 배양하였다.
다음날, RPMI 배지로 100 nM, 20 nM, 4 nM, 0.8 nM, 0.16 nM, 0.032 nM, 6.4 pM, 1.3 pM, 0.26 pM 으로 희석한 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트를 마이크로 플레이트에 20 μL 씩 첨가하였다. 항체-약물 콘쥬게이트 비첨가 웰에는 RPMI 배지를 20 μL 씩 첨가하였다. KPL-4 는 37 ℃, 5 ％ CO2 하에서 6 일간 배양하였다. 배양 후, 마이크로 플레이트를 인큐베이터로부터 꺼내고 실온에서 30 분간 정치하였다. 배양액과 등량의 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) 를 첨가하여 플레이트 믹서로 교반하였다. 실온에서 10 분간 정치 후에 플레이트 리더 (PerkinElmer) 로 발광량을 계측하였다.
생세포율은 실시예 123 과 동일한 방법으로 산출하였다.
KPL-4 세포에 대해 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49 및 ADC55 는 모두 0.001 ＜ IC50 ＜ 0.01 (nM) 의 항세포 효과를 나타냈다.
실시예 142 : 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트의 항종양 시험 (1)
실시예 124 와 동일한 실험 동물 및 수법을 사용하여, 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트의 항종양의 항종양 효과를 측정하였다.
KPL-4 세포 (가와사키 의과 대학·쿠레바야시 준이치 선생) 를 Dulbecco's phosphate buffered saline (Sigma-Aldrich) 에 현탁하고, 1.5 × 107 세포를 암컷 누드 마우스의 우체 측부에 피하 이식하고 (Day0), Day14 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49, 또는 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC55 를 Day14 에 0.33 mg/kg 의 용량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 또, 컨트롤군 (Vehicle 군) 으로서 ABS 완충액을 동일하게 투여하였다.
결과를 도 47 에 나타낸다. ADC49 와 ADC55 는 모두 0.33 mg/kg 투여로, 동등의 항종양 활성을 나타냈다. 또, ADC49, ADC55 투여에 의한 마우스의 체중 감소는 확인되지 않았다.
실시예 143 : 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트의 항종양 시험 (2)
JIMT-1 세포 (DSMZ ACC 589) 를 생리 식염수 (주식회사 오오츠카 제약 공장) 에 현탁하고, 5 × 106 세포를 암컷 누드 마우스의 우체 측부에 피하 이식하고 (Day0), Day11 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. ADC55 를 Day11 에 0.4 mg/kg 또는 0.2 mg/kg 의 용량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 또, 컨트롤군 (Vehicle 군) 으로서 ABS 완충액을 동일하게 투여하였다.
결과를 도 48 에 나타낸다. ADC55 는 0.4 mg/kg 투여 시에 종양의 퇴축을 수반하는 강한 항종양 효과를 확인하였다. 또, 어느 투여 용량에 있어서도 ADC55 투여에 의한 마우스의 체중 감소는 확인되지 않았다.
실시예 144 : 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트의 항종양 시험 (3)
CFPAC-1 세포 (ATCC CRL-1918) 를 생리 식염수 (주식회사 오오츠카 제약 공장) 에 현탁하고, 5 × 106 세포를 암컷 누드 마우스의 우체 측부에 피하 이식하고 (Day0), Day10 에 무작위로 군나누기를 실시하였다. 항 HER2 항체-약물 콘쥬게이트 ADC49, ADC55 또는 항 LPS 항체-약물 콘쥬게이트 ADC53 을 Day10 에 0.4 mg/kg 의 용량으로 꼬리 정맥 내 투여하였다. 또, 컨트롤군 (Vehicle 군) 으로서 ABS 완충액을 동일하게 투여하였다.
결과를 도 49 에 나타낸다. ADC49 와 ADC55 어느 것을 투여한 마우스에 있어서도, 종양의 퇴축을 수반하는 강한 항종양 효과가 확인되었다. 또, ADC49, ADC55, 또는 ADC53 투여에 의한 마우스의 체중 감소는 확인되지 않았다.
실시예 145 : 약물 링커 43
[화학식 249]
Figure pct00445
실시예 3 공정 12 에서 얻어지는 화합물 (0.051 g, 0.049 mmol) 과 시판되는 말레이미도카프로산 (0.011 g, 0.054 mmol) 의 디클로로메탄 (5 mL) 용액에, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드염산염 (0.010 g, 0.054 mmol) 을 실온에서 첨가하고, 실온에서 2 시간 교반하였다. 반응 용액을 클로로포름으로 희석 후, 유기층을 물로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하였다. 유기 용매를 농축한 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (클로로포름 : 메탄올 = 97.5 : 2.5 (v/v) ∼ 90 : 10 (v/v)) 로 정제하여, 목적 화합물 (41 mg, 69 ％) 을 얻었다.
Figure pct00446
공지된 방법 (WO2014/057687) 을 사용하여 약물 링커 43 및 약물 링커 44 (실시예 146) 의 항 CLDN6 항체 (실시예 136 (H1L1))-PBD ADC (시스테인 콘쥬게이션, m1 = 2) 를 제조하였다. 당해 ADC 는 강한 항종양 효과를 나타냈다.
실시예 146 : 약물 링커 44
[화학식 250]
Figure pct00447
실시예 3 공정 12 에서 얻어지는 화합물 (0.047 g, 0.046 mmol) 과 시판되는 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리신 (0.016 g, 0.050 mmol) 을 실시예 145 와 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (30 mg, 50 ％) 을 얻었다.
Figure pct00448
실시예 147 : 약물 링커 45
[화학식 251]
Figure pct00449
실시예 3 공정 12 에서 얻어지는 화합물 (0.050 g, 0.049 mmol) 과 시판되는 31-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-29-옥소-4,7,10,13,16,19,22,25-옥타옥사-28-아자헨트리아콘탄-1-오익애시드 (0.029 g, 0.049 mmol) 를 실시예 145 와 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (45 mg, 57 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1604(M＋H)＋
실시예 148 : 약물 링커 46
[화학식 252]
Figure pct00450
실시예 15 공정 9 에서 얻어진 화합물 (0.081 g, 0.085 mmol) 과 시판되는 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리신 (0.042 g, 0.13 mmol) 을 실시예 16 공정 1 과 동일하게 반응시켜, 목적 화합물 (0.089 g, 82 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1257(M＋H)＋
실시예 149 : 약물 링커 47
[화학식 253]
Figure pct00451
시판되는 N-[6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)헥사노일]글리실글리신 (0.036 g, 0.11 mmol) 의 디클로로메탄 (10 mL) 용액에, N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린 (0.035 g, 0.14 mmol) 을 실온에서 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응 용액에, 실시예 4 공정 11 에서 얻어진 화합물 (0.10 g, 0.10 mmol) 과 메탄올 (1 mL) 을 첨가하고, 실온에서 18 시간 교반하였다. 반응 용액을 농축 후, 얻어진 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (클로로포름 ∼ 클로로포름 : 메탄올 = 80 : 20 (v/v)) 로 정제하여, 목적 화합물 (0.078 g, 60 ％) 을 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 1309(M＋H)＋
실시예 150 : 약물 11
[화학식 254]
Figure pct00452
[공정 1 ∼ 4]
실시예 19 공정 7 에서 얻어진 화합물을 실시예 3 공정 2, 실시예 3 공정 10, 실시예 3 공정 11, 실시예 3 공정 12 와 동일하게 반응시킴으로써 약물 11 을 얻었다.
Figure pct00453
실시예 151 : 약물 12
[화학식 255]
Figure pct00454
[공정 1]
실시예 47 공정 3 에서 얻어지는 화합물 (0.77 g, 2.8 mmol) 을 디클로로메탄 (20 mL) 에 용해하고, 피리딘 (0.338 mL, 4.20 mmol), 클로로포름산알릴 (0.355 mL, 3.36 mmol) 을 0 ℃ 에서 첨가하고, 실온에서, 2 시간 교반하였다. 반응 용액을 농축 후, 얻어진 잔류물을 메탄올 (20 mL) 에 용해하고, 탄산칼륨 (1.93 g, 14.0 mmol) 을 실온에서 첨가하고, 그대로 3 시간 교반하였다. 반응 용액에 물을 첨가하고, 메탄올을 감압 증류 제거하고, 얻어진 잔류물에, 1 규정 염산을 첨가하고, 클로로포름으로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 여과 후, 용매를 감압 증류 제거하였다. 얻어진 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 [헥산 : 아세트산에틸 = 100 : 0 (v/v) ∼ 0 : 100 (v/v)] 로 정제하여, 목적 화합물 (0.921 g, 92 ％) 을 담황색 고체로서 얻었다.
MS(APCI, ESI)m/z : 359(M＋H)＋.
[공정 2 ∼ 4]
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물을 실시예 3 공정 10-12 와 동일하게 반응시킴으로써 약물 12 를 얻었다.
Figure pct00455
실시예 152 : 약물 13 ∼ 16
[화학식 256]
Figure pct00456
[시클로부틸 유도체 : 약물 13] n = 1, R = F
[공정 1]
시판되는 N-T-BOC-4-(3,3-디플루오로시클로부틸)-L-프롤린 (오메가켐사 OC-0707) (12 g, 41 mmol) 의 메탄올 (200 mL) 용액에, -78 ℃ (드라이아이스-아세톤욕) 에서, 염화티오닐 (10 mL, 138 mmol) 을 천천히 적하하였다. 적하 후, 냉매욕을 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에서 농축하고, 잔류물을 디에틸에테르로 세정하여, 목적 화합물 (10 g, quant.) 을 얻었다.
[공정 2]
상기 공정 1 에서 얻어진 화합물 (10 g, 41.4 mmol) 과 탄산나트륨 (8.77 g, 82.7 mmol) 의 1,4-디옥산 (200 mL), 물 (50 mL) 현탁 용액에, 빙랭하에서, 클로로포름산벤질 (8.82 mL, 62.0 mmol) 을 천천히 적하하였다. 반응 종료 후, 물을 첨가하고, 반응 혼합물을 아세트산에틸로 추출하였다. 유기층을 물 및 포화 식염수로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 여과 후, 감압하에서 용매를 증류 제거하여 목적 화합물을 얻었다.
[공정 3 ∼ 15]
상기 공정에서 얻어진 화합물을, 실시예 1 공정 1 ∼ 5, 실시예 45 공정 1 ∼ 8 과 동일하게 반응시킴으로써 약물 13 을 얻었다.
Figure pct00457
[시클로부틸 유도체 : 약물 14] n = 1, R = H
[공정 2 ∼ 15]
시판되는 4-시클로부틸-L-프롤린메틸에스테르염산염 (오메가켐사 OC-0728) 을, 상기 공정 2, 실시예 1 공정 1 ∼ 5, 실시예 45 공정 1 ∼ 8 과 동일하게 반응시킴으로써 약물 링커 14 를 얻었다.
Figure pct00458
[시클로프로필 유도체 : 약물 15] n = 0, R = F, * : (S)
시판되는 N-t-BOC-4S-(2,2-디플루오로시클로프로필)-L-프롤린 (오메가켐사 OC-0732) 을, 상기 공정 1 ∼ 15 와 동일하게 반응시킴으로써 약물 링커 15 를 얻었다.
Figure pct00459
[시클로프로필 유도체 : 약물 16] n = 0, R = F, * : (R)
시판되는 N-t-BOC-4R-(2,2-디플루오로시클로프로필)-L-프롤린 (오메가켐사 OC-0722) 을, 상기 공정 1 ∼ 15 와 동일하게 반응시킴으로써 약물 링커 16 을 얻었다.
Figure pct00460
실시예 153 : [N3-PEG(3)]2-SG(10)
공정 1 : Fmoc-(SG-)Asn 프리체
Fmoc-(SG-)Asn (1S2S-11NC-Asn-Fmoc, 당사슬 공학 연구소 제조, 2 g) 을 적당량의 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액에 용해시키고, 복수회로 나누어 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 nm) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 동결건조하였다. 무색 고체 (1.8 g) 를 얻었다.
공정 2 : ([N3-PEG(3)]2-SG)-Asn-PEG(3)-N3 의 합성
[화학식 257]
Figure pct00461
공정 1 에서 조제한 Fmoc-(SG-)Asn 프리체 (1000 mg) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ml) 에 대해, HATU (891 mg, 2.34 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 ml), 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 (토쿄 화성 공업 (주), 511 mg, 2.34 mmol) 과 디이소프로필에틸아민 (816 μL, 4.69 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 ml) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 추가로, HATU (148 mg, 0.39 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (500 μL) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 1 시간 교반하였다. 그 후에, 피페리딘 (386 μL, 3.91 mmol) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 1 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 아세트산 (469 μL) 첨가하였다.
미리 디에틸에테르 (100 ml) 를 첨가한 점보 코니칼 튜브 (175 ml) 2 개에 반응액 절반씩 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 공기, CF16RX) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 검상의 고형물을 원심관 (50 ml) 으로 옮기고, 디에틸에테르 (30 ml), 아세토니트릴 (10 ml) 을 첨가하고, 데칸테이션하였다. 이 조작을 2 회 반복하였다. 동일하게 하여, 적당량의 아세토니트릴, 혹은 적당량의 디에틸에테르를 첨가하고, 데칸테이션한 후에, 감압하 건조하여, 미정제 생성물을 얻었다. 얻어진 고형물을 적당량의 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액에 용해시키고, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 nm) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 동결건조하여, 표기 목적 화합물 (637 mg) 을 무색 고체로서 얻었다.
ESI-MS : C112H192N20O70 : [M+3H]3+ 계산치 980.6 (ave.), 실측치 980.4
공정 3 : [N3-PEG(3)]2-SG(10) 의 합성
[화학식 258]
Figure pct00462
2 ml 의 튜브에, 공정-2 에서 합성한 ([N3-PEG(3)]2-SG)-Asn-PEG(3)-N3 (78.6 mg) 을 100 mM 인산 버퍼, pH 6.0 (나카라이테스크 (주), 465 μL) 에 용해시켰다. 1 U/mL EndoM (토쿄 화성 공업 (주), 70 μL) 첨가하고, 28 ℃ 에서 5 시간 진탕한 후에, 실온에서 4 일간 정치하였다. 반응 종료 후, 적당량의 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액을 첨가하고, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 nm) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 동결건조하여, 표기 목적 화합물 (40 mg) 을 무색 고체로서 얻었다.
ESI-MS : C92H157N13O61 : [M+2H]2+ 계산치 1211.7 (ave.), 실측치 1211.5
실시예 154 : [N3-PEG(3)]-MSG2(9), [N3-PEG(3)]-MSG1(9)
공정 1 : (MSG1-)Asn 과 (MSG2-)Asn
시판품인 monosialo-Asn 프리 (1S2G/1G2S-10NC-Asn, (주) 당사슬 공학 연구소 제조) (「(MSG-)Asn」으로 부른다) (500 mg) 를 이하의 조건으로 역상 HPLC 분리 정제하고, 첫번째 메인 피크로서 용출되는 (MSG1-)Asn (유지 시간 15 ∼ 19 분 부근) 과 두번째 메인 피크로서 용출되는 (MSG2-)Asn (유지 시간 21 ∼ 26 분 부근) 으로 분리하였다. 0.1 ％ 포름산 수용액을 용리액으로서 사용하고, 장치에는 ELS-PDA 트리거-분취 시스템 (닛폰 분광 주식회사 제조) 을 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (10 um, 30Φ x 250 mm, GL 사이언스사 제조) 을 사용하고, 유속을 30 ml/분으로 하였다. 용출 중에 UV 검출 (210 nm) 된 최초의 피크에 귀속하는 프랙션을 하나로 모으고, 동결건조하여, (MSG1-)Asn (238 mg) 을 무색 고체로서 얻었다. UV 검출되는 2 번째의 피크에 귀속하는 프랙션을 하나로 모으고, 동결건조하여, (MSG2-)Asn (193 mg) 을 무색 고체로서 얻었다.
공정-2 : Fmoc-(MSG2-)Asn 프리체
[화학식 259]
Figure pct00463
공정 1 에서 합성한 (MSG2-)Asn (900 mg) 을 N,N-디메틸포름아미드 용액 (6 ml)/증류수 (2 ml) 에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (0.23 ml) 과 탄산 9-플루오레닐메틸 N-숙신이미딜 (223 mg) 을 첨가하고, 실온에서 30 분 교반하였다. 추가로, 디이소프로필에틸아민 (0.16 ml) 과 탄산 9-플루오레닐메틸 N-숙신이미딜 (74 mg) 과 N,N-디메틸포름아미드 용액 (1 ml) 첨가하고, 실온에서 30 분 교반하였다.
미리 디에틸에테르 (80 ml)/아세토니트릴 (4 ml) 을 첨가한 점보 코니칼 튜브 (175 ml) 2 개에 반응액 절반씩 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 공기, CF16RX) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 검상의 고형물을 원심관 (50 ml) 으로 옮기고, 디에틸에테르 (30 ml), 아세토니트릴 (10 ml) 을 첨가하고, 데칸테이션하였다. 이 조작을 2 회 반복하였다. 동일하게 하여, 적당량의 아세토니트릴, 혹은 적당량의 디에틸에테르를 첨가하고, 데칸테이션한 후에, 감압하 건조하여, 미정제 생성물을 얻었다. 얻어진 고형물을 적당량의 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액에 용해시키고, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 nm) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 동결건조하여, 표기 목적 화합물 (830 mg) 을 무색 고체로서 얻었다.
공정 3 : ([N3-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N3
[화학식 260]
Figure pct00464
공정 2 에서 합성한 Fmoc-(MSG2-)Asn (830 mg) 을 사용하고, 실시예 153 의 공정 2 와 동일한 방법으로, 표기 목적물의 미정제 생성물 (1.06 g) 을 고체로서 얻었다. 이 이상 정제하지 않고, 다음의 반응에 사용하였다.
동일하게 하여, Fmoc-(MSG1-)Asn 으로부터, 하기 ([N3-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N3 의 합성이 가능하다.
[화학식 261]
Figure pct00465
공정 4 : [N3-PEG(3)]-MSG2(9)
[화학식 262]
Figure pct00466
2 ml 의 콜렉션 바이알에, 공정 3 에서 합성한 ([N3-PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N3 미정제 생성물 (150 mg) 을, 200 mM KH2PO4 와 200 mM KH2PO4 로 조제한 200 mM 인산칼륨 버퍼, pH 6.25 (750 μL) 에 용해시켰다. Endo-Rp (3 ug) 첨가하고, 50 ℃ 에서 16 시간 정치하였다. 반응 종료 후, 5 ％ 트리플루오로아세트산 수용액 (150 μL) 을 첨가하고, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 ELS-PDA 트리거 분취 시스템 (닛폰 분광 주식회사 제조) 을 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (210 nm) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모으고, 동결건조하여, 표기 목적 화합물 (62 mg) 을 무색 고체로서 얻었다.
ESI-MS : C73H124N8O51 : [M+2H]2+ 계산치 965.3 (ave.), 실측치 965.4
동일하게 하여 ([N3-PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N3 으로부터, 하기 [N3-PEG(3)]-MSG1(9) 의 합성이 가능하다.
[화학식 263]
Figure pct00467
산업상 이용가능성
본 발명의 항체-약물 콘쥬게이트, 항체 및/또는 PBD 유도체 등을 사용함으로써, 각종 암의 치료 또는 예방이 가능해진다.
서열표 프리텍스트
서열 번호 1 : 인간 CLDN6 의 아미노산 서열
서열 번호 2 : 인간 CLDN6 의 아미노산 서열을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 3 : 인간 CLDN9 의 아미노산 서열
서열 번호 4 : 인간 CLDN9 의 아미노산 서열을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 5 : B1 항체 경사슬의 CDRL1 의 아미노산 서열
서열 번호 6 : B1 항체 경사슬의 CDRL2 의 아미노산 서열
서열 번호 7 : B1 항체 경사슬의 CDRL3 의 아미노산 서열
서열 번호 8 : 인간화 B1 항체 경사슬 L4 의 CDRL3 의 아미노산 서열
서열 번호 9 : B1 항체 중사슬의 CDRH1 의 아미노산 서열
서열 번호 10 : B1 항체 중사슬의 CDRH2 의 아미노산 서열
서열 번호 11 : B1 항체 중사슬의 CDRH3 의 아미노산 서열
서열 번호 12 : C7 항체 경사슬의 CDRL1 의 아미노산 서열
서열 번호 13 : C7 항체 경사슬의 CDRL2 의 아미노산 서열
서열 번호 14 : C7 항체 경사슬의 CDRL3 의 아미노산 서열
서열 번호 15 : C7 항체 중사슬의 CDRH1 의 아미노산 서열
서열 번호 16 : C7 항체 중사슬의 CDRH2 의 아미노산 서열
서열 번호 17 : C7 항체 중사슬의 CDRH3 의 아미노산 서열
서열 번호 18 : B1 항체 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 19 : B1 항체 경사슬의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 20 : B1 항체 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 21 : B1 항체 중사슬의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 22 : C7 항체 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 23 : C7 항체 경사슬의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 24 : C7 항체 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 서열
서열 번호 25 : C7 항체 중사슬의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 26 : 인간 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편
서열 번호 27 : 인간 중사슬 시그널 서열 및 인간 IgG1LALA 정상 영역을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편
서열 번호 28 : chB1 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 29 : chB1 경사슬의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편
서열 번호 30 : chB1 경사슬의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 31 : chB1 경사슬 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 32 : chB1 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 33 : chB1 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 34 : chB1 중사슬의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 35 : chB1 중사슬의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 36 : 인간화 항체 경사슬 hL1 의 아미노산 서열
서열 번호 37 : 인간화 항체 경사슬 hL1 을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 38 : 인간화 항체 경사슬 hL1 의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 39 : 인간화 항체 경사슬 hL1 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 40 : 인간화 항체 경사슬 hL2 의 아미노산 서열
서열 번호 41 : 인간화 항체 경사슬 hL2 를 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 42 : 인간화 항체 경사슬 hL2 의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 43 : 인간화 항체 경사슬 hL2 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 44 : 인간화 항체 경사슬 hL3 의 아미노산 서열
서열 번호 45 : 인간화 항체 경사슬 hL3 을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 46 : 인간화 항체 경사슬 hL3 의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 47 : 인간화 항체 경사슬 hL3 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 48 : 인간화 항체 경사슬 hL4 의 아미노산 서열
서열 번호 49 : 인간화 항체 경사슬 hL4 를 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 50 : 인간화 항체 경사슬 hL4 의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 51 : 인간화 항체 경사슬 hL4 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 52 : 인간화 항체 중사슬 hH1 의 아미노산 서열
서열 번호 53 : 인간화 항체 중사슬 hH1 을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 54 : 인간화 항체 중사슬 hH1 의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 55 : 인간화 항체 중사슬 hH1 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 56 : 인간화 항체 중사슬 hH2 의 아미노산 서열
서열 번호 57 : 인간화 항체 중사슬 hH2 를 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 58 : 인간화 항체 중사슬 hH2 의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 59 : 인간화 항체 중사슬 hH2 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 60 : 인간화 항체 중사슬 hH3 의 아미노산 서열
서열 번호 61 : 인간화 항체 중사슬 hH3 을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 62 : 인간화 항체 중사슬 hH3 의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 63 : 인간화 항체 중사슬 hH3 의 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 64 : 트라스트주맙 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 65 : 트라스트주맙 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 66 : 항 LPS 항체 (h#1G5-H1L1) 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 67 : 항 LPS 항체 (h#1G5-H1L1) 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 68 : 항 TROP2 항체 (hRS7) 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 69 : 항 TROP2 항체 (hRS7) 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 70 : 항 CD98 항체 (hM23-H1L1) 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 71 : 항 CD98 항체 (hM23-H1L1) 중사슬의 아미노산 서열
서열 번호 72 : 트라스트주맙 변이체 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 73 : 트라스트주맙 변이체 경사슬의 아미노산 서열
서열 번호 74 : 트라스트주맙 변이체 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열
서열 번호 75 : 트라스트주맙 변이체 중사슬의 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Antibody-Pyrrolobenzodiazepine Derivative Conjugate <130> SAP-850-PCT <141> 2018-09-28 <150> JP 2017190713 <151> 2017-09-29 <160> 75 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of human CLDN6 <400> 1 Met Ala Ser Ala Gly Met Gln Ile Leu Gly Val Val Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Gly Trp Val Asn Gly Leu Val Ser Cys Ala Leu Pro Met Trp Lys Val 20 25 30 Thr Ala Phe Ile Gly Asn Ser Ile Val Val Ala Gln Val Val Trp Glu 35 40 45 Gly Leu Trp Met Ser Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys 50 55 60 Lys Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ala Leu Cys Val Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Phe Gly Leu Leu 85 90 95 Val Tyr Leu Ala Gly Ala Lys Cys Thr Thr Cys Val Glu Glu Lys Asp 100 105 110 Ser Lys Ala Arg Leu Val Leu Thr Ser Gly Ile Val Phe Val Ile Ser 115 120 125 Gly Val Leu Thr Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile 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Leu Leu Leu Ala 115 120 125 Gly Ile Leu Val Leu Ile Pro Val Cys Trp Thr Ala His Ala Ile Ile 130 135 140 Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Glu Ala Leu Lys Arg Glu Leu 145 150 155 160 Gly Ala Ser Leu Tyr Leu Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Met Leu 165 170 175 Gly Gly Gly Leu Leu Cys Cys Thr Cys Pro Pro Pro Gln Val Glu Arg 180 185 190 Pro Arg Gly Pro Arg Leu Gly Tyr Ser Ile Pro Ser Arg Ser Gly Ala 195 200 205 Ser Gly Leu Asp Lys Arg Asp Tyr Val 210 215 <210> 4 <211> 654 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> nucleotide sequence of cDNA encoding amino acid sequence of human CLDN9 <400> 4 atggcttcga ccggcttaga actgctgggc atgaccctgg ctgtgctggg ctggctgggg 60 accctggtgt cctgcgccct gcccctgtgg aaggtgaccg ccttcatcgg caacagcatc 120 gtggtggccc aggtggtgtg ggagggcctg tggatgtcct gcgtggtgca gagcacgggc 180 cagatgcagt gcaaggtgta cgactcactg ctggctctgc cgcaggacct gcaggccgca 240 cgtgccctct gtgtcattgc cctcctgctg gccctgcttg gcctcctggt ggccatcaca 300 ggtgcccagt gtaccacgtg tgtggaggac gaaggtgcca aggcccgtat cgtgctcacc 360 gcgggggtca tcctcctcct cgccggcatc ctggtgctca tccctgtgtg ctggacggcg 420 cacgccatca tccaggactt ctacaacccc ctggtggctg aggccctcaa gcgggagctg 480 ggggcctccc tctacctggg ctgggcggcg gctgcactgc ttatgctggg cggggggctc 540 ctctgctgca cgtgcccccc gccccaggtc gagcggcccc gcggacctcg gctgggctac 600 tccatcccct cccgctcggg tgcatctgga ctggacaaga gggactacgt gtga 654 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRL1 of B1 antibody light chain <400> 5 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRL2 of B1 antibody light chain <400> 6 Phe Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of CDRL3 of B1 antibody light chain <400> 7 Gln Gln Gly Tyr Pro Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized 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variable region of B1 antibody light chain <400> 18 gatatccaga tgacacagac tgcatcctcc ctgtctgcct ctcttggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctacttc acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacacat tattctctca ccattactaa cctggaacaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatccgc ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaaac tggaaatcaa a 321 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of variable region of B1 antibody light chain <400> 19 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ala Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr 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Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Val Asn Pro Asn Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Gly Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> nucleotide sequence of cDNA encoding variable region of C7 antibody light chain <400> 22 gatatccaga tgacacagac tgcatcctcc ctgtctgcct ctcttggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctactcc acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacacat tattctctca ccattactca cctggaacaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatccgc ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaaac tggaaatcaa a 321 <210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of variable region of C7 antibody light chain <400> 23 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ala Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Thr Ile Thr His Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Pro Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 366 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> nucleotide sequence of cDNA encoding variable region of C7 antibody heavy chain <400> 24 gaggtccagc ttcaacagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatacacca tgcactgggt gcagcagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggaggt gttaatccta atagtggtga tactagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg 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comprising DNA sequence encoding human light chain signal sequence and human ? chain constant region <400> 26 gcctccggac tctagagcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60 gtggatctcc ggcgcgtacg gcgatatcgt gatgattaaa cgtacggtgg ccgccccctc 120 cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtggtgtg 180 cctgctgaat aacttctacc ccagagaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct 240 gcagtccggg aactcccagg agagcgtgac cgagcaggac agcaaggaca gcacctacag 300 cctgagcagc accctgaccc tgagcaaagc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg 360 cgaggtgacc caccagggcc tgagctcccc cgtcaccaag agcttcaaca ggggggagtg 420 ttaggggccc gtttaaacgg gggaggcta 449 <210> 27 <211> 1137 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> DNA fragment comprising DNA sequence encoding human heavy chain signal sequence and human IgG1 LALA constant region <400> 27 ccagcctccg gactctagag ccaccatgaa acacctgtgg ttcttcctcc tgctggtggc 60 agctcccaga tgggtgctga gccaggtgca attgtgcagg cggttagctc agcctccacc 120 aagggcccaa gcgtcttccc 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accgtggaca agagcaggtg gcagcagggc 1020 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ccagaagagc 1080 ctctccctgt ctcccggcaa atgagatatc gggcccgttt aaacggggga ggctaac 1137 <210> 28 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chimeric antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of chB1 light chain <400> 28 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ala Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Thr Ile Thr 85 90 95 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr 100 105 110 Pro Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 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<221> misc_feature <223> nucleotide sequence encoding humanized antibody heavy chain hH2 <400> 57 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgaa 60 gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120 tgcaagacca gcggctacac ctttaccgag tacaccatgc actgggtgcg ccaggcccct 180 ggcaagagcc tggaatggat gggcggcgtg aaccccaaca gcggcgatac aagctacgcc 240 cagaaattcc agggcagagt gaccatcacc gccgacacca gcacctccac cgcctacatg 300 gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgtgctag acctggcggc 360 tacgacgtgg gctactacgc catggattac tggggccagg gcaccctcgt gaccgtcagc 420 tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540 agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga 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180 ggccagggac tggaatggat gggcggcgtg aaccccaaca gcggcgatac aagctacgcc 240 cagaaattcc agggcagagt gaccctgacc gtggacaaga gcaccagcac cgcctacatg 300 gaactgagca gcctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgtgctag acctggcggc 360 tacgacgtgg gctactacgc catggattac tggggccagg gcaccctcgt gaccgtcagc 420 tcagcctcca ccaagggccc aagcgtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 480 ggcggcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc cgtgaccgtg 540 agctggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tccccgctgt cctgcagtcc 600 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 660 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 720 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccctgcc cagcacctga agccgcgggg 780 ggaccctcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 840 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 900 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccccggga ggagcagtac 960 aacagcacgt accgggtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020 aaggagtaca 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of Trastuzumab light chain <400> 64 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 68 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of anti-TROP2 antibody (hRS7) light chain <400> 68 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Ser Ile Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 100 105 110 Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 69 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of anti-TROP2 antibody (hRS7) heavy chain <400> 69 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr 65 70 75 80 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp 115 120 125 Val Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 225 230 235 240 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 325 330 335 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 355 360 365 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 370 375 380 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 450 455 460 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 70 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of anti-CD98 antibody (hM23-H1L1) light chain <400> 70 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Arg Tyr Tyr Gly Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 71 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of anti-CD98 antibody (hM23-H1L1) heavy chain <400> 71 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Val Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 210 215 220 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 225 230 235 240 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 290 295 300 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 435 440 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 72 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> misc_feature <223> nucleotide sequence encoding Trastuzumab mutant light chain <400> 72 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60 gacatccaga tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgacc 120 atcacctgta gagccagcca ggacgtgaac acagccgtgg cttggtatca gcagaagcct 180 ggcaaggccc ctaagctgct gatctacagc gccagctttc tgtacagcgg cgtgcccagc 240 agattcagcg gctctagaag cggcaccgac ttcaccctga ccataagcag tctgcagccc 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtcagcag cactacacca cacctccaac ctttggccag 360 ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 73 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of Trastuzumab mutant light chain <400> 73 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 100 105 110 Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 74 <211> 1407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> misc_feature <223> nucleotide sequence encoding Trastuzumab mutant heavy chain <400> 74 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgag 60 gtgcagctgg ttgaatctgg cggaggactg gttcagcctg gcggatctct gagactgtct 120 tgtgccgcca gcggcttcaa catcaaggac acctacatcc actgggtccg acaggcccct 180 ggcaaaggac ttgaatgggt cgccagaatc taccccacca acggctacac cagatacgcc 240 gactctgtga agggcagatt caccatcagc gccgacacca gcaagaacac cgcctacctg 300 cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgttctag atggggaggc 360 gacggcttct acgccatgga ttattggggc cagggcaccc tggttaccgt tagctcagcc 420 tccaccaagg gcccaagcgt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctggcggc 480 acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aacccgtgac cgtgagctgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ctgtcctgca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa 720 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccc tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccc 780 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagcccc gggaggagca gtacaacagc 960 acgtaccggg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaaggcc agccccggga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 cagggcaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacccag 1380 aagagcctct ccctgtctcc cggcaaa 1407 <210> 75 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody <220> <221> MISC_FEATURE <223> amino acid sequence of Trastuzumab mutant heavy chain <400> 75 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 245 250 255 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465

Claims (82)

  1. 다음 식 :
    Figure pct00468

    (식 중, m1 은 1 내지 10 의 정수를 나타내고,
    Ab 는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 나타내고, 그 항체의 당사슬은 리모델링되어 있어도 되고,
    L 은, Ab 와 D 를 연결하는 링커를 나타내고,
    Ab 는 그 아미노산 잔기로부터 직접 L 에 결합하거나, Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬로부터 L 에 결합하고 있어도 되고,
    D 는, 다음 식으로 나타내는 약물을 나타내고,
    Figure pct00469

    식 중, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고,
    n1 은, 2 내지 8 의 정수를 나타내고,
    A 는, 1 ∼ 4 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 또는 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리를 나타내고,
    R1 및 R2 는, 각각 독립적으로, C1 ∼ C6 알콕시기, C1 ∼ C6 알킬기, 수소 원자, 수산기, 티올기, C1 ∼ C6 알킬티오기, 할로겐 원자 또는 -NR'R'' 를 나타내고,
    여기서, R' 및 R'' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C6 알킬기를 나타내고,
    R3, R4 및 R5 는, 하기 (i) ∼ (iii) 에서 선택되고,
    (i) R3 및 R4 가 하나로 합쳐져, 각각의 기가 결합하는 탄소 원자와 함께 이중 결합을 형성하고,
    R5 는, 군 1 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기 혹은 헤테로아릴기, 또는 군 2 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기를 나타낸다,
    (ii) R3 은, 수소 원자를 나타내고,
    R4 및 R5 가, R4 및 R5 가 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 혹은 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리 또는 CH2= 를 형성한다,
    (iii) R3, R4 및 R5 가, R3 이 결합하고 있는 탄소 원자 그리고 R4 및 R5 가 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 군 3 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 벤젠 고리 또는 6 원의 복소 고리를 형성한다,
    R6 및 R7 은, 함께 수소 원자를 나타내거나, R6 및 R7 이 하나로 합쳐져, 이민 결합 (C=N) 인 것을 나타내고,
    R8 은, 수산기 또는 C1 ∼ C3 알콕시기이며,
    X 및 Y 는, 각각 독립적으로, 산소 원자, 질소 원자 또는 황 원자이며,
    군 1 은, a) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알콕시기,
    b) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자, 수산기, -OCOR', -NR'R'', -C(=NR')-NR''R''' 및 -NHC(=NR')-NR''R''' 에서 선택되는 어느 하나로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기,
    c) 할로겐 원자,
    d) C3 ∼ C5 시클로알콕시기,
    e) C1 ∼ C6 알킬티오기,
    f) -NR'R'',
    g) -C(=NR')-NR''R''',
    h) -NHC(=NR')-NR''R''',
    i) -NHCOR', 또는
    j) 수산기를 나타내고,
    여기서, R' 및 R'' 는, 전술에서 정의한 바와 같고, R''' 는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C6 알킬기를 나타내고,
    군 2 는, 할로겐 원자, 수산기, 또는 C1 ∼ C6 알콕시기를 나타내고, 그리고,
    군 3 은, 할로겐 원자, 또는 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기 혹은 C1 ∼ C6 알콕시기를 나타낸다)
    으로 나타내는 항체-약물 콘쥬게이트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    A 가, 1 ∼ 2 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리를 나타내고,
    R1 및 R2 가, 각각 독립적으로, C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내고,
    R3 및 R4 가 하나로 합쳐져, 각각의 기가 결합하는 탄소 원자와 함께 이중 결합을 형성하고,
    R5 가, 군 4 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기 혹은 헤테로아릴기, 또는 군 5 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기인 것을 나타내고,
    X 및 Y 가 산소 원자이며,
    군 4 는, a) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알콕시기,
    b) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자, 수산기, -OCOR'', -C(=NR')-NR''R''', 및 -NHC(=NR')-NR''R''' 에서 선택되는 어느 하나로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기,
    c) C3 ∼ C5 시클로알콕시기,
    d) -C(=NR')-NR''R''',
    e) -NHC(=NR')-NR''R''', 또는
    f) 수산기를 나타내고,
    여기서, R', R'', 및 R''' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기를 나타내고, 그리고,
    군 5 는, 할로겐 원자, 수산기, 또는 C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  3. 제 1 항에 있어서,
    A 가, 1 ∼ 2 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리를 나타내고,
    R1 및 R2 가, 각각 독립적으로, C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내고,
    R3 이, 수소 원자를 나타내고,
    R4 및 R5 가, R4 및 R5 가 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 또는 =CH2 를 형성하고, 그리고,
    X 및 Y 가 산소 원자인, 항체-약물 콘쥬게이트.
  4. 제 1 항에 있어서,
    A 가, 1 ∼ 2 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리를 나타내고,
    R1 및 R2 가, 각각 독립적으로, C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내고,
    R3, R4 및 R5 가, R3 이 결합하고 있는 탄소 원자 그리고 R4 및 R5 가 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 군 6 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 벤젠 고리를 형성하고,
    X 및 Y 가 산소 원자이며, 그리고,
    군 6 은, 할로겐 원자, 또는 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기 혹은 C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    D 가, 이하의 2 식 중 어느 것으로 나타내어지고,
    Figure pct00470

    식 중, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  6. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    D 가, 이하의 2 식 중 어느 것으로 나타내어지고,
    Figure pct00471

    식 중, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    L 이, -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-* 로 나타내어지고,
    식 중, 아스테리스크는, D 와 결합하고 있는 것을 나타내고,
    B 는, 페닐기 또는 헤테로아릴기를 나타내고,
    Lp 는, 표적 세포에 있어서 절단 가능한 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 나타내고,
    La 는, 이하의 군 :
    -C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-,
    -C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2)n3-C(=O)-,
    -C(=O)-(CH2CH2)n2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n3-CH2-C(=O)-,
    -C(=O)-(CH2CH2)n2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n3-CH2CH2-C(=O)-, 및,
    -(CH2)n4-O-C(=O)-
    에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
    n2 는 1 ∼ 3 의 정수, n3 은 1 ∼ 5 의 정수, n4 는 0 ∼ 2 의 정수를 나타내고,
    Lb 는, La 와 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬을 결합하는 스페이서를 나타내는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  8. 제 7 항에 있어서,
    B 가, 1,4-페닐기, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기, 2,5-티에닐기에서 선택되는 어느 하나인, 항체-약물 콘쥬게이트.
  9. 제 8 항에 있어서,
    B 가, 1,4-페닐기인, 항체-약물 콘쥬게이트.
  10. 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Lp 가, 2 내지 7 개의 아미노산으로 구성되는 아미노산 잔기인, 항체-약물 콘쥬게이트.
  11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Lp 가, 글리신, 발린, 알라닌, 페닐알라닌, 글루탐산, 이소류신, 프롤린, 시트룰린, 류신, 세린, 리신 및 아스파르트산에서 선택되는 아미노산으로 이루어지는 아미노산 잔기인, 항체-약물 콘쥬게이트.
  12. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Lp 가, 이하의 군 :
    -GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG(D-)PI-, 및, -GGPL- 에서 선택되는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  13. 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    La 가, 이하의 군 :
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -CH2-OC(=O)-, 및, -OC(=O)-
    에서 선택되는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  14. 제 7 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Lb 가, 다음 식으로 나타내어지고,
    Figure pct00472

    Figure pct00473

    , 또는,
    Figure pct00474

    상기에서 나타내는 Lb 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  15. 제 7 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    L 이, -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-* 로 나타내어지고,
    식 중, B 는, 1,4-페닐기이며,
    Lp 는, 이하의 군 :
    -GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, 및, -GGPL-
    에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
    La 는, 이하의 군 :
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -CH2-OC(=O)-, 및, -OC(=O)-
    에서 선택되는 어느 하나를 나타내고, 그리고,
    Lb 는, 다음 식으로 나타내고,
    Figure pct00475

    Figure pct00476

    , 또는,
    Figure pct00477

    여기서, 상기에서 나타내는 Lb 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  16. 제 7 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    L 이, 이하의 군 :
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 및
    -Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)- 에서 선택되고,
    여기서, Z1 은, 이하의 구조식 :
    Figure pct00478

    을 나타내고,
    Z2 는, 이하의 구조식 :
    Figure pct00479

    을 나타내고,
    Z3 은, 이하의 구조식 :
    Figure pct00480

    을 나타내고,
    여기서, Z1, Z2 및 Z3 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타내고, 그리고,
    B 는, 1,4-페닐기를 나타내는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  17. 제 16 항에 있어서,
    L 이, 이하의 군 :
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-, -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 및
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)- 에서 선택되고,
    여기서, B 는 1,4-페닐기이며, Z1 은 이하의 구조식 :
    Figure pct00481

    을 나타내고,
    여기서, Z1 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 Z1 에 인접하는 C(=O) 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 당사슬 또는 리모델링된 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  18. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    L 이, -Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-* 로 나타내어지고,
    식 중, 아스테리스크는, D 와 결합하고 있는 것을 나타내고,
    B 는, 1,4-페닐기를 나타내고,
    Lp 는, -GGVA-, 또는, -VA 를 나타내고,
    La 는, -(CH2)n9-C(=O)-, 또는, -(CH2CH2)n10-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n11-CH2CH2-C(=O)- 를 나타내고,
    n9 는 2 ∼ 7 의 정수, n10 은 1 ∼ 3 의 정수, n11 은 6 ∼ 10 의 정수를 나타내고,
    Lb 는, -(숙신이미드-3-일-N)- 인, 항체-약물 콘쥬게이트.
  19. 제 18 항에 있어서,
    L 이, 이하의 군 :
    -(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 및,
    -(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
    에서 선택되는 어느 하나인 것을 나타내고,
    여기서, B 는 1,4-페닐기인, 항체-약물 콘쥬게이트.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, IgG 인, 항체-약물 콘쥬게이트.
  21. 제 20 항에 있어서,
    항체가, IgG1, IgG2 또는 IgG4 인, 항체-약물 콘쥬게이트.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 종양 세포에 결합하고, 종양 세포 내에 흡수되어 내재화하는 것을 특징으로 하는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  23. 제 22 항에 있어서,
    항체가, 추가로 항종양 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  24. 제 1 항 내지 제 17 항 및 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 항체의 Asn297 에 결합하는 당사슬 (N297 당사슬) 로부터 L 에 결합하고 있는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  25. 제 24 항에 있어서,
    N297 당사슬이, 리모델링된 당사슬인, 항체-약물 콘쥬게이트.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서,
    N297 당사슬이, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 인, 항체-약물 콘쥬게이트 :
    Figure pct00482

    식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
    L(PEG) 는, -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH- 를 나타내고, 여기서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
    아스테리스크는, 상기 링커 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
    n5 는 2 ∼ 10 의 정수를 나타낸다 ;
    Figure pct00483

    식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
    L(PEG) 는, -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH- 를 나타내고, 여기서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
    아스테리스크는, 상기 링커 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, 및 n5 는 2 ∼ 10 의 정수를 나타낸다 ; 그리고,
    Figure pct00484

    식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
    L(PEG) 는, -(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH- 를 나타내고, 여기서, 우단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고,
    아스테리스크는, 상기 링커 L 과 결합하고 있는 것을 나타내고, 및
    n5 는 2 ∼ 10 의 정수를 나타낸다.
  27. 제 26 항에 있어서,
    n5 가 2 ∼ 5 의 정수인, 항체-약물 콘쥬게이트.
  28. 제 24 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다음 식 :
    Figure pct00485

    (식 중, m2 는 1 또는 2 의 정수를 나타내고,
    L 은, Ab 의 N297 당사슬과 D 를 연결하는 링커이고, 이하의 군 :
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-,
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-, 및
    -Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-
    에서 선택되는 어느 하나의 링커이며,
    여기서, B 는 1,4-페닐기이며, Z1 은 이하의 구조식 :
    Figure pct00486

    을 나타내고,
    여기서, 상기에서 나타내는 Z1 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 Z1 에 인접하는 C(=O) 와 결합하고 있는 것을 나타내고, 파선은 Ab 의 N297 당사슬과 결합하고 있는 것을 나타내고,
    Ab 는, IgG 항체 또는 그 항체의 기능성 단편을 나타내고,
    Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
    Figure pct00487

    Figure pct00488

    Figure pct00489

    상기 식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
    N297 당사슬 중의 L(PEG) 는, -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)n5-* 를 나타내고,
    여기서, n5 는 2 ∼ 5 의 정수인 것을 나타내고, 좌단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, 아스테리스크는, 상기 링커 L 에 있어서의 Z1 의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내고,
    D 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나이며,
    Figure pct00490

    여기서, 식 중, 아스테리스크는 L 과 결합하고 있는 것을 나타낸다)
    으로 나타내는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  29. 다음의 군 :
    Figure pct00491

    Figure pct00492

    Figure pct00493

    Figure pct00494

    에서 선택되고,
    상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 의 정수인 것을 나타내고,
    Ab 는 IgG 항체 또는 그 기능성 단편인 것을 나타내고,
    Ab 의 N297 당사슬은 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
    Figure pct00495

    Figure pct00496

    Figure pct00497

    식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
    N297 당사슬 중의 L(PEG) 는, -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-* 인 것을 나타내고,
    여기서, 좌단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, 아스테리스크는, 각각의 구조식에 있어서의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  30. CLDN6 및/또는 CLDN9 에 결합하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
  31. 제 30 항에 있어서,
    CLDN6 이 서열 번호 1 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 분자이며, CLDN9 가 서열 번호 3 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 분자인, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
  32. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서,
    이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는 중사슬, 그리고 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
    (a) 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 그리고, 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3,
    (b) 서열 번호 15 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 그리고, 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3.
  33. 제 32 항에 있어서,
    이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는 중사슬, 그리고 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
    (a) 서열 번호 9 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 10 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 11 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및 서열 번호 5 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 6 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 7 에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호 8 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3,
    (b) 서열 번호 15 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 16 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 서열 번호 17 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및 서열 번호 12 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 13 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 서열 번호 14 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3.
  34. 제 30 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
    (a) 서열 번호 21 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 19 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (b) 서열 번호 25 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 23 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역.
  35. 제 30 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및 (f) ∼ (k) 로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
    (a) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열,
    (b) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열,
    (c) 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열,
    (d) (a) ∼ (c) 의 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열,
    (e) (a) ∼ (c) 의 서열에 있어서의 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열,
    (f) 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열,
    (g) 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열,
    (h) 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열,
    (i) 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열,
    (j) (f) ∼ (i) 의 서열에 있어서 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및
    (k) (f) ∼ (i) 의 서열에 있어서의 각 CDR 서열 이외의 프레임 워크 영역의 서열에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열.
  36. 제 35 항에 있어서,
    이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
    (a) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (b) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (c) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
    (d) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역으로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및,
    (e) 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역.
  37. 제 30 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 키메라 항체인, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
  38. 제 30 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 인간화 항체인, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
  39. 제 30 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체가, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 의 중사슬 정상 영역을 포함하는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
  40. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서,
    이하의 (a) ∼ (e) 로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 및 경사슬을 포함하는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 :
    (a) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 36 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 (H1L1),
    (b) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는, 중사슬 및 서열 번호 40 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 (H2L2),
    (c) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 (H1L3),
    (d) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 48 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 (H2L4), 및,
    (e) 서열 번호 60 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 (H3L3).
  41. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서,
    제 32 항 내지 제 36 항 및 제 40 항 중 어느 한 항에 기재된 항체가 인식하는 항원 상의 부위에 결합하는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
  42. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서,
    제 32 항 내지 제 36 항 및 제 40 항 중 어느 한 항에 기재된 항체와, CLDN6 및/또는 CLDN9 에의 결합에 있어서 경합하는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
  43. 제 30 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  44. 제 43 항에 있어서,
    이하의 (a) ∼ (j) 로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 :
    (a) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 38 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
    (b) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 42 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
    (c) 서열 번호 54 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
    (d) 서열 번호 58 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 50 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
    (e) 서열 번호 62 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 46 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
    (f) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 36 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
    (g) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 40 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
    (h) 서열 번호 52 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드,
    (i) 서열 번호 56 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 48 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및,
    (j) 서열 번호 60 의 아미노산 번호 20 ∼ 471 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 44 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  45. 제 43 항 또는 제 44 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터.
  46. 제 45 항에 기재된 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
  47. 제 46 항에 있어서,
    숙주 세포가 진핵 세포인, 숙주 세포.
  48. 제 47 항에 있어서,
    숙주 세포가 동물 세포인, 숙주 세포.
  49. 제 46 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적의 항체를 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제 30 항 내지 제 42 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편의 제조 방법.
  50. 제 49 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
  51. 제 30 항 내지 제 42 항 및 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서,
    N-결합형 당사슬 부가, O-결합형 당사슬 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 있어서의 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화, 및 중사슬의 카르복실 말단에 있어서의 1 개 또는 2 개의 아미노산 잔기의 결실로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 포함하는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
  52. 제 51 항에 있어서,
    중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 수개의 아미노산 잔기가 결실하고 있는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
  53. 제 52 항에 있어서,
    2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산 잔기가 결실하고 있는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
  54. 제 50 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서,
    중사슬의 카르복실 말단의 프롤린 잔기가 추가로 아미드화되어 있는, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
  55. 이하의 공정 :
    i) 제 46 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 기재된 숙주 세포를 배양하고, 얻어진 배양물로부터 목적의 항체를 채취하는 공정,
    ii) 공정 i) 에서 얻어진 항체를 가수분해 효소로 처리하고, (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 제조하는 공정, 및,
    iii)-1 MSG(9) 또는 SG(10) 의 시알산의 2 위치의 카르복실산의 카르보닐기에 아지드기를 갖는 PEG 링커를 도입하고, 환원 말단을 옥사졸린화하여 얻은 당사슬 도너 분자와, 당전이 효소 존재하에서 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 반응시키는 공정, 또는,
    iii)-2 α-아미노기가 보호되어 있어도 되는 (MSG-)Asn 또는 (SG-)Asn 에 있어서의 시알산의 2 위치의 카르복실산의 카르보닐기 및 상기 Asn 의 카르복실산의 카르보닐기에 아지드기를 갖는 PEG 링커를 도입하고, 가수분해 효소를 작용시킨 후, 환원 말단을 옥사졸린화하여 얻은 당사슬 도너 분자와, 당전이 효소 존재하에서 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 반응시키는 공정을 포함하는 당사슬 리모델링 항체의 제조 방법.
  56. 제 55 항에 있어서,
    추가로, 공정 ii) 의 반응액을, 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제에 의해 (Fucα1,6)GlcNAc-항체를 정제하는 공정을 포함하는, 당사슬 리모델링 항체의 제조 방법.
  57. 이하의 공정 :
    i) 제 55 항 또는 제 56 항에 기재된 방법에 의해, 당사슬 리모델링 항체를 제조하는 공정, 및
    ii) DBCO 를 갖는 드러그 링커를 공정 i) 에서 제조된 당사슬 리모델링 항체의 당사슬에 있어서의 아지드기와 반응시키는 공정을 포함하는, 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트체의 제조 방법.
  58. 제 55 항 또는 제 56 항에 기재된 제조 방법으로 얻어지는 것을 특징으로 하는, 당사슬 리모델링 항체.
  59. 제 57 항에 기재된 제조 방법으로 얻어지는 것을 특징으로 하는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  60. 다음의 군 :
    Figure pct00498


    Figure pct00499

    Figure pct00500

    , 또는,
    Figure pct00501

    에서 선택되고,
    상기에서 나타내는 각각의 구조식에 있어서, m2 는 1 또는 2 의 정수인 것을 나타내고,
    Ab 는, 제 30 항 내지 제 42 항, 제 50 항 내지 제 54 항 및 제 58 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 혹은 그 항체의 기능성 단편 또는 항 HER2 항체인 것을 나타내고,
    Ab 의 N297 당사슬은, 다음 식으로 나타내는 구조를 갖는 N297-(Fuc)MSG1, N297-(Fuc)MSG2 혹은 그들의 혼합물, 또는 N297-(Fuc)SG 중 어느 하나인 것을 나타내고,
    Figure pct00502

    Figure pct00503

    Figure pct00504

    식 중, 파선은 항체의 Asn297 에 결합하고 있는 것을 나타내고,
    L(PEG) 는, -NH-CH2CH2-(O-CH2CH2)3-* 인 것을 나타내고, 여기서, 좌단의 아미노기가 N297 당사슬의 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 또는/및 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치의 카르복실산과 아미드 결합하고 있는 것을 나타내고, 아스테리스크는, 각각의 구조식에 있어서의 트리아졸 고리 상의 1 위치 또는 3 위치의 질소 원자와 결합하고 있는 것을 나타내는, 항체-약물 콘쥬게이트.
  61. 제 1 항 내지 제 29 항, 제 59 항 또는 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체-약물 콘쥬게이트에 있어서의 항체 1 분자당의 평균 약물 결합수가, 1 ∼ 3 또는 3 ∼ 5 인, 항체-약물 콘쥬게이트.
  62. 다음 식
    Figure pct00505

    (식 중, l 은, 2 내지 8 의 정수를 나타내고,
    E 는, 1 ∼ 4 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리, 또는 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리를 나타내고,
    R9 및 R10 은, 각각 독립적으로, C1 ∼ C6 알콕시기, C1 ∼ C6 알킬기, 수소 원자, 수산기, 티올기, C1 ∼ C6 알킬티오기, 할로겐 원자 또는 -NR'R'' 를 나타내고,
    여기서, R' 및 R'' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C6 알킬기를 나타내고,
    R11, R12 및 R13 은, 하기 (i) ∼ (iii) 에서 선택되고,
    (i) R11 및 R12 가 하나로 합쳐져, 각각의 기가 결합하는 탄소 원자와 함께, 이중 결합을 형성하고,
    R13 은, 군 7 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기 혹은 헤테로아릴기, 또는 군 8 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기를 나타낸다,
    (ii) R11 은, 수소 원자를 나타내고,
    R12 및 R13 이, R12 및 R13 이 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 혹은 3 ∼ 5 원의 포화 복소 고리 또는 CH2= 를 형성한다, 또는,
    (iii) R11, R12 및 R13 이, R11 이 결합하고 있는 탄소 원자 그리고 R12 및 R13 이 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 군 9 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 벤젠 고리 또는 6 원의 복소 고리를 형성한다,
    R13 은, 단결합을 나타낸다,
    R14 및 R15 는, 함께 수소 원자를 나타내거나, R14 및 R15 가 하나로 합쳐져, 이민 결합 (C=N) 인 것을 나타내고,
    R16 및 R17 은, 하기 (a) 또는 (b) 를 나타내고,
    (a) R16 및 R17 이 하나로 합쳐져, 이민 결합 (N=C) 을 형성한다,
    (b) R16 은, J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-*
    식 중, 아스테리스크는, R16 에 인접하는 질소 원자에 결합하고 있는 것을 나타내고,
    B' 는 페닐기 또는 헤테로아릴기를 나타내고,
    Lp' 는, 표적 세포에 있어서 절단 가능한 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 나타내고,
    La' 는, 이하의 군 :
    -C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-NH-(CH2CH2)n7-C(=O)-,
    -C(=O)-(CH2CH2)n6-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n7-CH2-C(=O)-,
    -C(=O)-(CH2CH2)n6-NH-C(=O)-(CH2CH2O)n7-CH2CH2-C(=O)-, -(CH2)n8-O-C(=O)-,
    -(CH2)n12-C(=O)-, 및, -(CH2CH2)n13-C(=O)-NH-(CH2CH2O)n14-CH2CH2-C(=O)-
    에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
    여기서, 식 중, n6 은 1 ∼ 3 의 정수, n7 은 1 ∼ 5 의 정수, n8 은 0 ∼ 2 의 정수, n12 는 2 ∼ 7 의 정수, n13 은 1 ∼ 3 의 정수, n14 는 6 ∼ 10 의 정수를 나타내고,
    J 는, 이하에서 나타내는 어느 하나를 나타내고,
    Figure pct00506

    여기서, 상기에서 나타내는 J 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La' 와 결합하고 있는 것을 나타내고,
    R17 은, 수산기 또는 C1 ∼ C3 알콕시기인 것을 나타내고,
    V 및 W 는, 각각 독립적으로, 산소 원자, 질소 원자, 또는 황 원자이며,
    군 7 은, a) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알콕시기,
    b) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자, 수산기, -OCOR', -NR'R'', -C(=NR')-NR''R''' 및 -NHC(=NR')-NR''R''' 에서 선택되는 어느 하나로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기,
    c) 할로겐 원자,
    d) C3 ∼ C5 시클로알콕시기,
    e) C1 ∼ C6 알킬티오기,
    f) -NR'R'',
    g) -C(=NR')-NR''R''',
    h) -NHC(=NR')-NR''R''',
    i) -NHCOR', 또는
    j) 수산기를 나타내고,
    여기서, R' 및 R'' 는, 전술에서 정의한 바와 같고, R''' 는 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C6 알킬기를 나타내고,
    군 8 은, 할로겐 원자, 수산기, 또는 C1 ∼ C6 알콕시기를 나타내고, 그리고,
    군 9 는, 할로겐 원자, 또는 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C6 알킬기 혹은 C1 ∼ C6 알콕시기를 나타낸다)
    으로 나타내는 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
  63. 제 62 항에 있어서,
    E 가, 1 ∼ 2 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리를 나타내고,
    R9 및 R10 이, 각각 독립적으로, C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내고,
    R11 및 R12 가 하나로 합쳐져, 각각의 기가 결합하는 탄소 원자와 함께 이중 결합을 형성하고,
    R13 이, 군 10 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 아릴기 혹은 헤테로아릴기, 또는 군 11 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기인 것을 나타내고,
    V 및 W 가, 산소 원자이며,
    군 10 은, a) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알콕시기,
    b) 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자, 수산기, -OCOR'', -C(=NR')-NR''R''', 및 -NHC(=NR')-NR''R''' 에서 선택되는 어느 하나로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기,
    c) C3 ∼ C5 시클로알콕시기,
    d) -C(=NR')-NR''R''',
    e) -NHC(=NR')-NR''R''', 또는
    f) 수산기를 나타내고,
    여기서, R', R'', 및 R''' 는, 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 C1 ∼ C3 알킬기를 나타내고, 그리고,
    군 11 은, 할로겐 원자, 수산기, 또는 C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내는, 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
  64. 제 62 항에 있어서,
    E 가, 1 ∼ 2 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리를 나타내고,
    R9 및 R10 이, 각각 독립적으로, C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내고,
    R11 이, 수소 원자를 나타내고,
    R12 및 R13 이, R12 및 R13 이 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리 또는 CH2= 를 형성하고, 그리고,
    V 및 W 가, 산소 원자인, 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
  65. 제 62 항에 있어서,
    E 가, 1 ∼ 2 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 스피로 결합의 3 ∼ 5 원의 포화 탄화수소 고리를 나타내고,
    R9 및 R10 이, 각각 독립적으로, C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내고,
    R11, R12 및 R13 이, R11 이 결합하고 있는 탄소 원자 그리고 R12 및 R13 이 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 합쳐져, 군 12 에서 선택되는 1 혹은 복수개의 치환기를 가지고 있어도 되는 벤젠 고리를 형성하고,
    V 및 W 가, 산소 원자이며, 그리고,
    군 12 는, 할로겐 원자, 또는 1 ∼ 3 개의 할로겐 원자로 치환되어 있어도 되는 C1 ∼ C3 알킬기 혹은 C1 ∼ C3 알콕시기를 나타내는, 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
  66. 제 62 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항에 있어서,
    B' 가, 1,4-페닐기, 2,5-피리딜기, 3,6-피리딜기, 2,5-피리미딜기, 2,5-티에닐기에서 선택되는 어느 하나인, 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
  67. 제 66 항에 있어서,
    B' 가, 1,4-페닐기인, 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
  68. 제 62 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서,
    Lp' 가, 이하의 군 :
    -GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, -GG(D-)P-I-, 및
    -GGPL- 에서 선택되는 아미노산 잔기인, 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
  69. 제 62 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서,
    La' 가, 이하의 군 :
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -CH2-OC(=O)-, -OC(=O)-, -(CH2)5-C(=O)-, 및, -CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-
    에서 선택되는, 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
  70. 제 62 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R16 이, J-La'-Lp'-NH-B'-CH2-O(C=O)-* 로 나타내어지고,
    식 중, B' 는, 1,4-페닐기이며,
    Lp' 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
    -GGVA-, -GG-(D-)VA-, -VA-, -GGFG-, -GGPI-, -GGVCit-, -GGVK-, 및, -GGPL-,
    La' 는, 이하의 군에서 선택되는 어느 하나를 나타내고,
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-,
    -C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-, -CH2-OC(=O)-, -OC(=O)-,
    -(CH2)5-C(=O)-, 및, -CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-, 그리고,
    J 는, 이하에서 나타내는 어느 하나를 나타내고,
    Figure pct00507

    여기서, J 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 La' 와 결합하고 있는 것을 나타내는, 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
  71. 제 62 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R16 이, 이하의 군 :
    J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J2-OC(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J4-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J4-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-, 및
    J4-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)8-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)- 에서 선택되고,
    여기서, J1, J2, J3, J4 는, 이하의 구조식 :
    Figure pct00508

    을 나타내고,
    여기서, J1, J2, J3 및 J4 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 인접하는 기와 결합하고 있는 것을 나타내고, 그리고,
    B' 는, 1,4-페닐기인, 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
  72. 제 62 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R16 이, 이하의 군 :
    J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B'-CH2-OC(=O)-, J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-,
    J4-(CH2)5-C(=O)-GGVA-NH-B'-CH2-OC(=O)-, 및
    J4-(CH2)5-C(=O)-VA-NH-B'-CH2-OC(=O)-
    에서 선택되고,
    여기서, B' 는 1,4-페닐기이며,
    J1, J4 는 이하의 구조식을 나타내고,
    Figure pct00509

    여기서, J1 및 J4 의 구조식에 있어서, 아스테리스크는 인접하는 기와 결합하고 있는 것을 나타내는, 화합물, 그 염, 또는, 그들의 수화물.
  73. 다음 식 :
    Figure pct00510

    으로 나타내는 어느 하나의 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물.
  74. 다음 식 :
    Figure pct00511

    으로 나타내는 어느 하나의 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물.
  75. 제 1 항 내지 제 29 항 및 제 59 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물, 제 30 항 내지 제 42 항, 제 50 항 내지 제 54 항 및 제 58 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 및, 제 62 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물에서 선택되는 어느 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  76. 제 75 항에 있어서,
    항종양약인 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  77. 제 76 항에 있어서,
    종양이 CLDN6 및/또는 CLDN9 가 발현하고 있는 종양인 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  78. 제 76 항 또는 제 77 항에 있어서,
    종양이 난소암 (표층 상피성 종양, 사이질성 종양, 배세포 종양), 폐암 (비소세포폐암, 소세포폐암), 위암, 자궁체암, 정소암 (세미노마, 비세미노마), 자궁경암, 태반융모암, 신암, 요로상피암, 대장암, 전립선암, 다형신경교아종, 뇌종양, 췌암, 유암, 멜라노마, 간암, 방광암 또는 식도암인 것을 특징으로 하는, 의약 조성물.
  79. 제 1 항 내지 제 29 항 및 제 59 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물, 제 30 항 내지 제 42 항, 제 50 항 내지 제 54 항 및 제 58 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 및, 제 62 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물에서 선택되는 어느 것을 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 종양의 치료 방법.
  80. 제 79 항에 있어서,
    종양이 CLDN6 및/또는 CLDN9 가 발현하고 있는 종양인 것을 특징으로 하는, 종양의 치료 방법.
  81. 제 79 항 또는 제 80 항에 있어서,
    종양이, 난소암 (표층 상피성 종양, 사이질성 종양, 배세포 종양), 폐암 (비소세포폐암, 소세포폐암), 위암, 자궁체암, 정소암 (세미노마, 비세미노마), 자궁경암, 정소암, 태반융모암, 신암, 요로상피암, 대장암, 전립선암, 다형신경교아종, 뇌종양, 췌암, 유암, 멜라노마, 간암, 방광암 또는 식도암인 것을 특징으로 하는, 종양의 치료 방법.
  82. 제 1 항 내지 제 29 항 및 제 59 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 기재된 항체-약물 콘쥬게이트, 그 염, 또는 그들의 수화물, 제 30 항 내지 제 42 항, 제 50 항 내지 제 54 항 및 제 58 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 및, 제 62 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항에 기재된 화합물, 그 염, 또는 그들의 수화물에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 의약 조성물, 및 적어도 하나의 항종양약을, 동시에, 따로따로 또는 연속하여 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 종양의 치료 방법.
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