KR102493562B1 - hANP-Fc 함유 분자 콘주게이트 - Google Patents

hANP-Fc 함유 분자 콘주게이트 Download PDF

Info

Publication number
KR102493562B1
KR102493562B1 KR1020187037962A KR20187037962A KR102493562B1 KR 102493562 B1 KR102493562 B1 KR 102493562B1 KR 1020187037962 A KR1020187037962 A KR 1020187037962A KR 20187037962 A KR20187037962 A KR 20187037962A KR 102493562 B1 KR102493562 B1 KR 102493562B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
val
peg
leu
asn
Prior art date
Application number
KR1020187037962A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190025576A (ko
Inventor
미츠히로 이와모토
쇼헤이 오이시
유키코 세키구치
히로유키 자야
류키 미야우치
다케시 혼다
Original Assignee
다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 filed Critical 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Publication of KR20190025576A publication Critical patent/KR20190025576A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102493562B1 publication Critical patent/KR102493562B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/2242—Atrial natriuretic factor complex: Atriopeptins, atrial natriuretic protein [ANP]; Cardionatrin, Cardiodilatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01006—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은, hANP 펩티드가 폴리에틸렌글리콜 링커를 개재하여, Fc 함유 분자의 Asn297 에 결합하는 당사슬 (N297 당사슬) 에 결합한 콘주게이트체 또는 그 약학상 허용되는 염, 그것을 유효 성분으로 하는 의약, 그 제조 방법 등을 제공한다.

Description

hANP-Fc 함유 분자 콘주게이트
본 발명은, hANP 펩티드를 캐리어가 되는 Fc 함유 분자에 탑재함으로써, 피하 투여 후에 완만하게 혈중으로 이행하며, 또한 hANP 의 약리 작용 지속 시간을 대폭 연장시킨 콘주게이트체, 그것을 유효 성분으로서 함유하는 의약, 당해 콘주게이트의 제조 방법 등에 관한 것이다.
인간 심방성 나트륨이뇨 펩티드 (hANP) 는, 혈관 확장 작용, 이뇨 작용, 세포 증식 억제 작용, 정맥 관류량의 저하 작용, 교감 신경 활성 억제 작용을 갖는 생리 활성 펩티드이다. 천연형의 hANP 는, 혈중의 중성 엔도펩티다아제 (NEP) 에 의해 절단되는 등에 의해, 혈중에서는 신속하게 활성이 소실된다. 일본에 있어서, hANP 는 급성 심부전 치료약으로서 임상 응용되고 있지만, 투여 후의 급격한 혈압 저하를 피할 목적으로, 혈압 모니터링하면서의 점적 (点滴) 등에 의한 정맥 내 지속 투여가 필요하다.
hANP 와 같은 내인성의 생리 활성 펩티드는, 특이적인 수용체에 대한 선택성이 매우 높기 때문에, 높은 유효성과 안전성을 기대할 수 있다. 그 반면, 체순환 중에, 여러 가지 대사 효소에 의해 신속하게 대사되거나, 신장에 있어서 사구체 여과에 의해 신속하게 배출되기 때문에, 혈중 반감기가 매우 짧은 것이 알려져 있다. 이러한 점에서, 대사 효소 내성을 부여하거나, 혹은 신장 배설을 회피함으로써, 펩티드의 혈중 반감기를 연장하는 시도가 이루어지고 있다. 예를 들어, 당사슬 수식 펩티드 (특허문헌 1), 융합 폴리펩티드 (특허문헌 2), 알부민 융합 펩티드 (특허문헌 3, 비특허문헌 1), 면역 글로불린 Fc 융합 펩티드 (특허문헌 4, 비특허문헌 2), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 수식 펩티드 (비특허문헌 3, 4) 등 여러 가지 방법을 들 수 있다.
항체 의약품은, neonatal Fc receptor (FcRn) 를 개재한 리사이클링 기구에 의해, 펩티드 의약품이나 단백 의약품과 비교하여 매우 긴 혈중 반감기를 갖고 있다 (비특허문헌 5). 이러한 점에서, 동일한 리사이클링 효과가 기대되는 융합 펩티드도 hANP 의 반감기 연장의 수단으로서 고려되어 왔다 (특허문헌 3 및 4, 비특허문헌 1 및 2). 그러나, 혈중에서 신속하게 대사되는 hANP 를 그대로 캐리어 단백에 탑재한 경우, 캐리어 상의 hANP 부분이 순환 중에 대사를 받는 것으로 시사되고 있어, 「hANP-단백 융합체」를 캐리어 단백 부분의 혈중 체류성과 동등 레벨로 혈중에 체류시키는 것이 어렵다 (비특허문헌 2).
최근, 항체-약물 결합체의 기술 개발이 활발히 이루어지고 있고, 여러 가지 합성법이 보고되어 있다 (비특허문헌 6, 비특허문헌 7, 8). 그러나, 캐리어 단백과 탑재하는 약물 부분의 상성 (相性) 이 나빠지는 결합법을 채용하면, 캐리어 부분 혹은 약물 부분이 불안정화되어, 혈중 반감기가 연장되지 않거나, 응집성이 증가하거나 할 우려가 있다. 그 때문에, 최적인 결합 방법이나 링커를 선택하는 것은 매우 중요해진다. 또, 일반적으로 바이오 의약품에 있어서는, 정맥 내 투여보다 피하 투여에 있어서, 완만하게 혈중으로 이행하는 것이 알려져 있지만 (비특허문헌 9), 화학 수식을 받은 항체의 체내 동태를 예측하는 것이 곤란하다.
이와 같이, 완만한 혈중 이행성, 충분한 혈중 체류 시간 및 약리 효과에 필요한 활성의 유지를 모두 겸비하는 hANP 제제의 개발이 요망되고 있다.
PCT 국제 특허출원공개 WO2014/115797 A1 미국 특허출원공개 US2006-036227 미국 특허출원공개 US2007-0162986 A1 PCT 국제 특허출원공개 WO2008/154226 A1
Regulatory Peptides, 2012, 175, 7-10 Bioconjugate Chem., 2012, 23, 518-526 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 12544-12548 Bioconjugate Chem., 2008, 19, 342-348 Chem. Soc. Rev., 2012, 41, 2686-2695 Bioconjugate Chem., 2015, 26, 176-192 J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 12308-12318 Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 2361-2367 Drug Metab. Dispos., 2014, 42, 1881-1889
본 발명은, 피하 투여에 있어서 약효와 안전성을 겸비하는 hANP 의 개량체를 알아내는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 피하 투여에 있어서 약효와 안전성을 겸비하는 hANP 의 개량체에 대하여 예의 검토한 결과, hANP 펩티드를 IgG 중사슬의 297 번째에 상당하는 Asn 에 결합하는 당사슬과 특정의 PEG 링커를 개재하여 연결시킨 콘주게이트체가, GC-A 수용체 발현 세포에 대하여 세포 내 cGMP 농도를 상승시킨 것, 래트에 투여했을 때의 혈중 지속 시간이 연장된 것, 이 때, 콘주게이트체의 투여 후 168 시간 이후에 있어서도 지속적으로 혈중의 cGMP 농도가 상승되어 있었던 것, hANP 펩티드로서 당사슬 수식된 hANP 를 채용한 콘주게이트체가 특히 양호한 물성을 갖는 것 등을 알아내고, 더욱 연구를 거듭하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은, 이하를 제공하는 것이다.
(1) hANP 펩티드가 폴리에틸렌글리콜 링커 (L(PEG)) 를 개재하여, Fc 함유 분자의 Asn297 에 결합하는 당사슬 (N297 당사슬) 에 결합한 콘주게이트체 또는 그 약학상 허용되는 염, 여기서,
hANP 펩티드가, 서열 번호 1 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, N 말단으로부터 연속하는 1 ∼ 5 개의 아미노산 및/또는 C 말단의 1 아미노산이 결실되어 있어도 되며, 또한, 당해 펩티드의 N 말단 및 C 말단 중 어느 일방, 또는, 양방이 당사슬 수식되어 있어도 되고,
L(PEG) 는, 10 ∼ 35 개의 에틸렌글리콜 구조를 포함하고, 다른 결합 구조 및/또는 수식 구조를 포함하고 있어도 되는 링커 구조이고,
Fc 함유 분자는, 인간 IgG 의 Fc 영역에 상당하는 아미노산 서열을 갖고, 인간의 생체 분자에 대한 특이적인 결합능을 갖지 않는 분자이고, 그리고,
N297 당사슬은, 이하의 식으로 나타내는 구조를 갖는 당사슬 N297-(Fuc)SG, N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)MSG2 이다,
[화학식 1]
Figure 112018131250960-pct00001
(식 중, [L(PEG)] 는, L(PEG) 가 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치에 결합한 카르보닐기와 결합하는 것을 나타낸다.)
[화학식 2]
Figure 112018131250960-pct00002
(식 중, [L(PEG)] 는, L(PEG) 가 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치에 결합한 카르보닐기와 결합하는 것을 나타낸다.)
[화학식 3]
Figure 112018131250960-pct00003
(식 중, [L(PEG)] 는, L(PEG) 가 β-Man 의 분기 사슬 중 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치에 결합한 카르보닐기와 결합하는 것을 나타낸다.)
(2) hANP 펩티드가, hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(1-27), hANP(2-27) 또는 hANP(3-27) 인 (1) 의 콘주게이트체, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(3) hANP 펩티드가, 이하 식으로 나타내는 AG5, AG7, AG9 또는 SG 중 어느 당사슬이 측사슬에 N 글리코시드 결합한 아스파라긴 또는 글루타민이 당해 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 결합한 당사슬 수식 펩티드인, (1) 또는 (2) 의 콘주게이트체, 또는, 그 약학상 허용되는 염,
[화학식 4]
Figure 112018131250960-pct00004
[화학식 5]
Figure 112018131250960-pct00005
[화학식 6]
Figure 112018131250960-pct00006
[화학식 7]
Figure 112018131250960-pct00007
(상기 식 중, “-(N/Q)” 는, N 글리코시드 결합에 의해 아스파라긴 또는 글루타민의 측사슬에 결합하는 것을 나타낸다.).
(4) hANP 펩티드가, SG 당사슬이 측사슬에 N 글리코시드 결합한 아스파라긴이 그 N 말단에 결합한 hANP(1-28) 인 것을 특징으로 하는, (3) 의 콘주게이트체, 또는, 그 약학상 허용되는 염.
(5) L(PEG) 가, 25 ∼ 30 개의 에틸렌글리콜 구조를 포함하고, 결합 구조로서, 아미드 결합, 및 1,2,3-트리아졸 고리를 포함하고 있는 링커 구조인 (1) 의 콘주게이트체 또는 그 약학상 허용되는 염.
(6) L(PEG) 가, 이하 중 어느 식으로 나타내는 링커 구조인 (1) 의 콘주게이트체 또는 그 약학상 허용되는 염,
[화학식 8]
Figure 112018131250960-pct00008
[화학식 9]
Figure 112018131250960-pct00009
[화학식 10]
Figure 112018131250960-pct00010
[화학식 11]
Figure 112018131250960-pct00011
[화학식 12]
Figure 112018131250960-pct00012
[화학식 13]
Figure 112018131250960-pct00013
[화학식 14]
Figure 112018131250960-pct00014
[화학식 15]
Figure 112018131250960-pct00015
(상기 식에 있어서, 「hANP」는 hANP 펩티드의 N 말단과 결합하는 것을 나타내고, 「N297 GLY」는 N297 결합 당사슬의 비환원 말단과 결합하고 있는 것을 나타낸다. 또, 각 링커 구조는 식 중 L(PEG)-X1 및 L(PEG)-X2 (이들을 통합하여, L(PEG)-X (X 는 A, B, C, D, E, F, G 또는 H 이다) 라고 표기한다.) 의 구조로 나타내도록, 1,2,3-트리아졸 고리 부위에, 결합 형성시에 생성되는 기하 이성 구조를 갖고, 콘주게이트체 1 분자 중에, 이들 구조로 이루어지는 링커 중 어느 일방만이 존재하거나, 또는, 그 양방이 혼재하고 있다.).
(7) Fc 함유 분자가, 인간의 생체 성분 이외의 물질을 항원으로 하는 인간 IgG 모노클로날 항체, 또는, 인간 IgG 의 Fc 영역을 갖고 가변 영역부를 결손시킨 단편 또는 개변체인 (1) 의 콘주게이트체 또는 그 약학상 허용되는 염.
(8) Fc 함유 분자가, 인간 IgG 에서 유래하는 Fc 또는 인간 IgG 의 정상 영역으로 이루어지는 CLCH 인 (7) 의 콘주게이트체 또는 그 약학상 허용되는 염.
(9) Fc 함유 분자가, 서열 번호 3 의 아미노산 번호 20 ∼ 474 의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 5 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬의 조합으로 이루어지는 항체 (mAb-A), 서열 번호 7 의 아미노산 번호 20 ∼ 349 의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 9 의 아미노산 번호 21 ∼ 125 의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬의 조합으로 이루어지는 CLCH (CLCH-A), 서열 번호 11 의 아미노산 번호 20 ∼ 349 의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 9 의 아미노산 번호 21 ∼ 125 의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬의 조합으로 이루어지는 CLCH (CLCH-B), 서열 번호 15 의 아미노산 번호 21 ∼ 243 의 아미노산 서열로 이루어지는 Fc 단편 (Fc-B), 또는, 서열 번호 17 의 아미노산 번호 21 ∼ 247 의 아미노산 서열로 이루어지는 Fc 단편 (Fc-A) 혹은 그들의 개변체인 (7) 의 콘주게이트체 또는 그 약학상 허용되는 염.
(10) hANP 펩티드가, hANP(1-28) 또는 (SG-)Asn-hANP(1-28),
PEG 링커가, L(PEG)-A, L(PEG)-B, L(PEG)-C, L(PEG)-D, L(PEG)-E, L(PEG)-F, L(PEG)-G 또는 L(PEG)-H,
Fc 함유 분자가, mAb-A, CLCH-A, CLCH-B, Fc-A 또는 Fc-B,
N297 당사슬이, N297-(Fuc)SG 인, (1) 의 콘주게이트체 또는 그 약학상 허용되는 염.
(11) hANP 펩티드가 (SG-)Asn-hANP(1-28), PEG 링커가 L(PEG)-B, Fc 함유 분자가 Fc-A 또는 Fc-B, 및 N297 당사슬이 N297-(Fuc)SG 인, (1) 의 콘주게이트체 또는 그 약학상 허용되는 염.
(12) (1) ∼ (11) 중 어느 하나의 콘주게이트체 또는 그 약학상 허용되는 염을 유효 성분으로서 함유하는 의약.
(13) GC-A 의 활성화에 의해 치료 가능한 질환의 치료제, 또는, 예방제인 (12) 의 의약.
(14) 고혈압증, 급성 심부전, 만성 심부전, 급성 신부전, 만성 신부전의 치료제, 또는, 예방제인 (12) 의 의약.
(15) 이하의 공정을 포함하는, (1) ∼ (11) 중 어느 하나의 콘주게이트체의 제조 방법 :
공정 A : 동물 세포에서 산생한 Fc 함유 분자를 가수 분해 효소로 처리하여, (Fucα1,6)GlcNAc-Fc 함유 분자를 제조하는 공정 ;
공정 B1 : SG(10) 또는 MSG(9) 의 시알산에 아지드기를 도입하고, 환원 말단을 옥사졸린화한 당사슬 도너 분자와, 당 전이 효소 존재하에서 (Fucα1,6)GlcNAc-Fc 함유 분자와 반응시켜, 시알산에 아지드기가 도입된 SG 형 당사슬 리모데링 Fc 함유 분자를 합성하는 공정, 혹은, 공정 B2 : (SG-)Asn, (MSG-)Asn 의 시알산에 아지드기를 도입한 당사슬 도너 분자와, 2 종의 당 전이 효소 존재하에서 (Fucα1,6)GlcNAc-Fc 함유 분자와 반응시켜, 시알산에 아지드기가 도입된 SG 형 당사슬 리모데링 Fc 함유 분자를 합성하는 공정 ;
및,
공정 C : 일방에 hANP 펩티드, 타방에 DBCO 를 갖는 링커 분자를, 공정 B 에서 제작된 시알산에 아지드기가 도입된 SG 형 당사슬 리모데링 Fc 함유 분자와 반응시켜, (1) ∼ (11) 중 어느 하나의 콘주게이트체를 합성하는 공정.
(16) 공정 A 의 반응액을, 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제를 포함하는 공정에 의해 (Fucα1,6)GlcNAc-Fc 함유 분자를 정제하는 공정을 추가로 포함하는, (15) 의 제조 방법.
(17) 투여가 필요한 대상에 대하여, (1) ∼ (11) 중 어느 하나의 콘주게이트체 또는 그 약학상 허용되는 염을 유효 성분으로서 투여하는 것을 포함하는, GC-A 의 활성화에 의해 치료 가능한 질환을 치료, 또는, 예방하는 방법.
(18) GC-A 의 활성화에 의해 치료 가능한 질환의 치료, 또는, 예방을 위해 사용되는, (1) ∼ (11) 중 어느 하나의 콘주게이트체 또는 그 약학상 허용되는 염.
(19) GC-A 의 활성화에 의해 치료 가능한 질환의 치료제, 또는, 예방제의 제조를 위한 (1) ∼ (11) 중 어느 하나의 콘주게이트체 또는 그 약학상 허용되는 염의 사용.
상기 (17) ∼ (19) 에 있어서, GC-A 의 활성화에 의해 치료 가능한 질환은, 바람직하게는, 고혈압증, 급성 심부전, 만성 심부전, 급성 신부전, 만성 신부전이다.
본 발명의 콘주게이트체는, 피하 투여시의 완만한 혈중 이행성, 장기간의 혈중 반감기 및 장기간의 약리 효과 발현을 겸비하기 때문에, 임상에 있어서, 종래 알려져 있는 hANP 제제에서는 치료 효과가 얻어지지 않았던 질환에 대한 적용이나 환자의 편리성이 향상된 약제의 개발이 가능해진다. 또, 본 콘주게이트체에 있어서, hANP 펩티드로서 당사슬 수식된 hANP 펩티드를 채용함으로써, 콘주게이트체의 응집성이 대폭 억제되고, 양호한 물성을 나타냈기 때문에, 다양한 제제 형태로의 적용이 기대된다.
도 1 은, 본 발명의 콘주게이트체 ((Ⅰ) 의 분자) 를 모식적으로 나타낸 것이다. (a) 는, hANP 펩티드, (b) 는 PEG 링커, (c) 는 N297 당사슬 (여기서, 흰색의 타원은 NeuAc(Sia), 흰색의 육각형은 Man, 색칠된 육각형은 GlcNAc, 흰색의 마름모는 Gal, 및 흰색의 역삼각형은 Fuc) 을 각각 나타낸다. Y 자형은, Fc 함유 분자를 나타내고, 편의상 Fab 를 포함하는 전장 IgG 로서 도시하였지만, 본 발명의 콘주게이트체의 Fc 함유 분자는, N297 당사슬이 결합하는 Fc 영역을 갖는 것이면 된다. 또, 본 모식도에서는, N297 당사슬을 편의상 N297-(Fuc)SG 로서 표시하고, 모든 분기 사슬의 비환원 말단의 시알산에 PEG 링커가 결합한 양태가 도시되어 있지만, N297-(Fuc)MSG 를 채용함으로써, 어느 일방만의 분기 사슬에 있어서만 PEG 링커가 결합한 시알산을 갖고, 타방의 분기 사슬의 비환원 말단에는 시알산을 갖지 않아도 된다. 이와 같은 표시 방법은, 특별히 언급이 없는 한, 본 명세서의 전체를 통해서 적용된다.
도 2 는, 본 발명의 콘주게이트체의 제조 중간체인, (Fucα1,6)GlcNAc-Fc 함유 분자 (도 2 의 A 의 (Ⅱ) 의 분자), 및 SG 형 당사슬 리모데링 Fc 함유 분자 (도 2 의 B 의 (Ⅲ) 의 분자) 의 구조를 나타내는 모식도이다. 양방의 도면에 있어서, Y 자형은 도 1 과 동일한 Fc 함유 분자를 나타낸다. 도 2 의 A 에 있어서, (d) 는 Fuc 의 1 위치와, 6 위치에 있어서 α 글리코시드 결합한 GlcNAc 만으로 이루어지는 N297 당사슬을 나타낸다. 도 2 의 B 에 있어서, (c) 는 도 1 과 동일한 N297 당사슬을 나타내고, (e) 는, PEG 링커의 부분 구조이고, 말단에 다른 링커 분자와의 결합에 제공되는 관능기 (여기서는 아지드기가 예시되지만, 이것에 한정되지 않는다) 를 나타낸다. PEG 링커의 결합 양식은, 도 1 의 설명과 동일하다.
도 3A 및 도 3B 는, 동물 세포에서 산생된 Fc 함유 분자로부터 SG 형 당사슬 리모데링 Fc 함유 분자를 제조하는 공정의 모식도이다. 도면 중의 분자 (Ⅱ), (Ⅲ) 은, 도 2 와 동일하게, (Fucα1,6)GlcNAc-Fc 함유 분자 및 SG 형 당사슬 리모데링 Fc 함유 분자를 각각 나타낸다. (Ⅳ) 의 분자는 동물 세포에서 산생된 Fc 함유 분자이고, N297 당사슬이 불균일한 분자의 혼합물이다. 도 3A 는, (Ⅳ) 의 불균일한 N297 당사슬을, EndoS 와 같은 가수 분해 효소로 처리함으로써, 균일한 (Fucα1,6)GlcNAc-Fc 함유 분자 (Ⅱ) 가 제작되는 공정을 나타낸다. 여기서 사용되는 SG 형 당사슬 도너 분자는, SG(10), MSG1(9) 또는 MSG2(9) 의 비환원 말단의 시알산이 PEG 링커로 수식된 것이고, 제작되는 SG 형 N297 당사슬 리모데링 Fc 함유 분자에 있어서도, 도 2 의 B 에서 설명한 바와 같이, 비환원 말단의 시알산이 동일한 수식을 받은 것이 된다. 도면에 있어서는, 편의상 도너 분자로서 SG(10) 을 사용한 형태로 나타내지만, MSG1(9) 또는 MSG2(9) 를 당사슬 도너로 함으로써, (Ⅲ) 의 리모데링 항체는 N297 당사슬 중 어느 일방만의 비환원 말단에 관능기를 갖는 링커 분자가 결합한 리모데링 Fc 함유 분자가 합성된다.
도 3A 및 도 3B 는, 동물 세포에서 산생된 Fc 함유 분자로부터 SG 형 당사슬 리모데링 Fc 함유 분자를 제조하는 공정의 모식도이다. 도면 중의 분자 (Ⅱ), (Ⅲ) 은, 도 2 와 동일하게, (Fucα1,6)GlcNAc-Fc 함유 분자 및 SG 형 당사슬 리모데링 Fc 함유 분자를 각각 나타낸다. (Ⅳ) 의 분자는 동물 세포에서 산생된 Fc 함유 분자이고, N297 당사슬이 불균일한 분자의 혼합물이다. 도 3B 는, Fc 함유 분자 (Ⅱ) 의 N297 당사슬의 GlcNAc 에 대하여, EndoS D233Q 변이체와 같은 당 전이 효소를 사용하여, SG 형 당사슬 도너 분자의 당사슬을 당사슬 전이시킴으로써, (Ⅲ) 의 SG 형 당사슬 리모데링 Fc 함유 분자가 제작되는 공정을 나타낸다. 여기서 사용되는 SG 형 당사슬 도너 분자는, SG(10), MSG1(9) 또는 MSG2(9) 의 비환원 말단의 시알산이 PEG 링커로 수식된 것이고, 제작되는 SG 형 N297 당사슬 리모데링 Fc 함유 분자에 있어서도, 도 2 의 B 에서 설명한 바와 같이, 비환원 말단의 시알산이 동일한 수식을 받은 것이 된다. 도면에 있어서는, 편의상 도너 분자로서 SG(10) 을 사용한 형태로 나타내지만, MSG1(9) 또는 MSG2(9) 를 당사슬 도너로 함으로써, (Ⅲ) 의 리모데링 항체는 N297 당사슬 중 어느 일방만의 비환원 말단에 관능기를 갖는 링커 분자가 결합한 리모데링 Fc 함유 분자가 합성된다.
도 4 는, 화합물 1-10 ([N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox) 의 NMR 차트이다.
도 5 는, 화합물 1-11 ([N3-PEG(3)]-MSG1(9)-Ox) 의 NMR 차트이다.
도 6 은, 본 발명의 콘주게이트체를 피하 투여한 래트의 혈장 중 cGMP 농도의 시간 경과적 변화를 나타내는 그래프이다. 가로축이 투여 후의 경과 시간 (h), 세로축은 cGMP 농도 (pmol/㎖) 를 나타내고, 각 데이터는 평균치 ± 표준 오차로 나타냈다 (n ＝ 2 - 4). 실선의 ● 가 화합물 3-1, 실선의 ○ 가 화합물 3-2, 실선의 ■ 가 화합물 3-3, 실선의 □ 가 화합물 3-4, 파선의 ○ 가 화합물 3-5, 파선의 □ 가 화합물 3-6 을 각각 나타낸다.
도 7 은, 본 발명의 콘주게이트체를 피하 투여한 래트의 혈장 중의 전체 인간 Fc 함유 분자 및 콘주게이트체의 검출량의 시간 경과적 변화를 나타내는 그래프이다. 가로축이 투여 후의 경과 시간 (h), 세로축은 검출물 농도 (㎍/㎖) 를 나타내고, 각 데이터는 평균치 ± 표준 편차로 나타냈다 (n ＝ 3 - 4). ● 는 화합물 3-1, ○ 는 화합물 3-2, ■ 는 화합물 3-3 이고, □ 는 화합물 3-4 이다. 각각의 화합물에 있어서, 실선은 콘주게이트로서의 검출량, 파선은 인간 Fc 함유 분자의 검출량을 나타낸다. 각각의 화합물에서, 실선과 파선이 겹쳐져 있는 것은, hANP(1-28) 부분만이 Fc 함유 분자보다 신속하게 분해되지 않거나, 혹은 hANP(1-28) 이 Fc 함유 분자로부터 괴리되지 않고, 콘주게이트로서 혈중에 지속되어 있는 것을 나타낸다.
도 8 은, 본 발명의 콘주게이트체를 피하 투여한 래트의 혈장 중 cGMP 농도의 시간 경과적 변화를 나타내는 그래프이다. 가로축이 투여 후의 경과 시간 (h), 세로축은 cGMP 농도 (pmol/㎖) 를 나타내고, 각 데이터는 평균치 ± 표준 오차로 나타냈다 (n ＝ 2 - 4). 실선의 ◆ 가 화합물 3-7, 실선의 ◇ 가 화합물 3-8, 실선의 × 가 화합물 3-9, 실선의 △ 가 화합물 3-10, 실선의 ▲ 가 화합물 3-11, 파선의 ◆ 가 화합물 3-12, 파선의 × 가 화합물 3-13, 파선의 ▲ 가 화합물 3-14 를 각각 나타낸다.
도 9 는, 본 발명의 콘주게이트체를 피하 투여한 원숭이의 혈장 중의 전체 인간 Fc 함유 분자 및 콘주게이트체의 검출량의 시간 경과적 변화를 나타내는 그래프이다. 가로축이 투여 후의 경과 시간 (h), 세로축은 검출물 농도 (㎍/㎖) 를 나타내고, 각 데이터는 평균치 ± 표준 편차로 나타냈다 (n ＝ 3 - 4). ● 는 화합물 3-2, ○ 는 화합물 3-4, ■ 는 화합물 3-15 이고, □ 는 화합물 3-16, ◆ 는 화합물 3-17 이다. 각각의 화합물에 있어서, 도 7 과 동일하게, 실선은 콘주게이트로서의 검출량, 파선은 인간 Fc 함유 분자의 검출량을 나타낸다.
본 발명에 대하여, 이하에 상세하게 설명한다.
본 발명은, hANP 펩티드가 PEG 링커를 개재하여, Fc 함유 분자의 보존된 아스파라긴 (Asn297) 에 결합하는 N 결합형 당사슬 (N297 당사슬) 에 연결된 콘주게이트체 또는 그 약학상 허용되는 염을 제공한다. 본 발명의 콘주게이트체는 hANP 펩티드, PEG 링커, Fc 함유 분자, 그것들을 구성하는 부분 구조 등, 복수의 구조 단위가 연결된 대형의 분자이고, 이 구조의 모식도를 도 1 에 나타낸다.
본 발명에 있어서, 복수의 구조 단위가 「연결된」이란, 각각의 구조 단위가 직접 공유 결합에 의해 결합되어 있거나, 또는, 링커를 개재하여 간접적으로 결합됨으로써, 동일 분자 중에 존재하고 있는 것을 의미한다. 구조 단위 사이를 연결하는 화학 구조는 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 콘주게이트체를 구성하는 구조 단위는 매우 분자량이 크고, 복잡한 구조를 갖기 때문에, 편의상 기호를 이용하여 간략적으로 기재하는 경우가 있다. 이와 같은 기호 표기에 있어서, hANP 펩티드는 「hANP」, PEG 링커는 「L(PEG)」 또는 「PEG(n)」(n 은 포함되는 연속한 에틸렌글리콜 단위 ((-CH2-CH2-O-) 의 구조 단위) 의 개수), Fc 함유 분자에 포함되는 N297 당사슬은 「N297 GLY」, Fc 함유 분자는 「mAb」, 「CLCH」, 「Fc」와 같이 각각 기재한다. 또, 당사슬에는, 후술하는 바와 같이, SG 등의 표기를 사용한다. 각각의 구조 단위끼리의 결합은, 일반적인 결합 양식은 생략되는 경우도 있지만, 특징적인 구조나 관능기에 대해서는 유기 합성 화학 분야에서 통상 사용되는 표현에 의해 표시하는 경우가 있다.
본 발명의 콘주게이트체 또는 그 부분 구조의 표기에 있어서, 아미노산 또는 펩티드는, 특별한 기재가 없는 한, 좌측에 N 말단 (아미노기), 우측에 C 말단 (카르복실기) 이 되도록 표기한다. 아미노산 또는 펩티드의 우측에 “*”를 붙여 기재하는 경우 (예를 들어, Gln*), 상기의 룰을 역전시켜, 좌측에 C 말단, 우측에 N 말단이 되는 것을 나타내는 것으로 한다.
또, 아미노산에 대하여 표기하는 경우, 중심이 되는 탄소 원자 (α 탄소) 에 직접 결합한, 아미노산으로서 필수의 구조인, 아미노기 및 카르복실기를, 각각 「α 아미노기」 및 「α 카르복실기」라고 표기하는 것으로 한다.
본 명세서에 있어서, 콘주게이트체 또는 그 부분 구조의 표기에 있어서, 아미노산 또는 펩티드가 그 N 말단의 아미노기에 있어서 다른 링커와 연결되는 경우, 연결되는 구조 단위를 나타내는 기호는 당해 펩티드 또는 아미노산을 나타내는 기호의 좌측에, 하이픈을 넣고, 괄호를 치지 않고 기재되고, 이 경우의 하이픈은 펩티드 또는 아미노산의 아미노기와 링커 구조가 갖는 카르복실기 사이에서 형성되는 아미드 결합을 나타내는 것으로 한다. 예를 들어, Asn 의 아미노기에 SG 가 연결된 구조는, “SG-Asn”으로서 표기된다.
이에 대하여, 본 명세서에 있어서, 아미노산 또는 펩티드가 그 C 말단의 카르복실기에 있어서 다른 구조 단위와 연결되는 경우, 연결되는 구조 단위를 나타내는 기호는, 당해 아미노산 또는 펩티드를 나타내는 기호의 우측에 하이픈을 넣고, 괄호를 치지 않고 기재되고, 이 경우의 하이픈은 펩티드 또는 아미노산의 C 말단 카르복실기와 링커 구조가 갖는 아미노기 (또는 아지드기) 사이에서 형성되는 아미드 결합을 나타내는 것으로 한다. 예를 들어, Tyr 의 카르복실기에 SG 가 연결된 구조는, “Tyr-SG”로서 표기된다.
또한, 본 명세서에 있어서, 아미노산의 측사슬에 있어서 당사슬과 연결한 경우의 부분 구조는, 측사슬 부분을 괄호로 표시하고, 예를 들어, 「(SG-)Asn」과 같이 표기하는 것으로 한다.
본 발명에 있어서, 「당사슬」이란, 2 개 이상의 단당이 글리코시드 결합에 의해 결합된 구조 단위를 의미한다. 구체적인 단당이나 당사슬을, 예를 들어 “GlcNAc-”, “SG-”와 같이, 약호로서 표기하는 경우가 있다. 구조식 중에서 이들의 약호로 기재한 경우, 환원 말단에서 다른 구조 단위와의 글리코시드 결합에 귀속하는 산소 원자 또는 질소 원자는, 특별한 정의가 있는 경우를 제외하고, 당해 당사슬을 나타내는 약호에는 포함되지 않는 것으로서 표시된다.
본 명세서에 있어서, 당사슬의 기본 단위가 되는 단당의 기재는, 별도로 정하는 경우를 제외하고, 편의상, 그 고리 구조에 있어서, 고리를 구성하는 산소 원자에 결합하며, 또한, 수산기 (또는 글리코시드 결합에 귀속하는 산소 원자) 와 직접 결합한 탄소 원자를 1 위치 (시알산에 있어서만 2 위치) 로서 표기한다. 실시예 화합물의 명칭은, 화학 구조 전체로서 부여된 것이고, 이 룰은 반드시 적용되는 것은 아니다.
당사슬에 포함되는 단당으로는, 당의 기본 구조를 갖는 것이면 특별히 한정되지 않고, 6 원자 당, 5 원자 당 등 여러 가지의 것을 사용할 수 있다. 또, 천연에 존재하는 당이어도 되고, 인공적으로 합성된 당이어도 되지만, 천연에 존재하는 당이 바람직하다. 단당으로는, 예를 들어, 글루코오스 (Glu), 프룩토오스 (Fru), 만노오스 (Man), 갈락토오스 (Gal), 글루코사민 (Glc), N 아세틸글루코사민 (GlcNAc), 글루크론산 (GlucA), 뉴라미닌산 (Neu), 시알산/N-아세틸뉴라미닌산 (Sia/NeuNAc/Neu5Ac), 갈락토사민, N 아세틸갈락토사민 (GalNAc), 크실로오스 (Xyl), 이두론산 (IdoA), 푸코오스 (Fuc), 알도트리오스, 글리세르알데히드, 알도테트로오스, 에리트로오스, 트레오스, 알도펜토오스, 리보오스, 릭소오스, 아라비노오스, 알도헥소오스, 알로오스, 탈로오스, 굴로오스, 알도오스, 이도오스, 케토트리오스, 디하이드록시아세톤, 케토테트로오스, 에리트룰로오스, 케토펜토오스, 크실룰로오스, 리불로오스, 케토헥소오스, 프시코오스, 소르보오스, 타가토오스 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 당사슬을 기호 (예를 들어, GLY, SG, GlcNAc 등) 로서 기재하는 경우, 별도로 정의되는 경우를 제외하고, 환원 말단의 탄소까지를, 당해 기호에 포함시키는 것으로 하고, N- 또는 O-글리코시드 결합에 귀속하는 N 또는 O 는, 당해 기호에는 포함되지 않는 것으로 한다. 또, 동일하게, hANP 펩티드를 기호 (예를 들어, hANP, hANP(1-28) 등) 로서 표기하는 경우에는, 원칙적으로 N 말단의 -NH, 및 C 말단의 C=O 는, 당해 기호에 포함되는 것으로서 표기된다. 또, 특별히 언급이 없는 한 좌측이 N 말단, 우측이 C 말단으로서 표기된다. 즉, 수식을 받지 않는 hANP 펩티드는, H-hANP-OH 로서 표기된다.
<hANP 펩티드>
본 발명에 있어서, 「hANP 펩티드」란, 28 개의 아미노산으로 이루어지는 생리 활성 펩티드인 인간형 심방성 나트륨이뇨 펩티드 (human Atrial Natriuretic Peptide : 서열 번호 1, 이하 천연형 hANP, 또는, hANP(1-28)) 의 아미노산 서열에 있어서, 적어도 7 위치로부터 27 위치의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 의미한다. 천연형 hANP 는, 세포 표면에 발현하는 GC-A 수용체 (Chinkers M, et al., Nature 338 ; 78-83, 1989)) 에 결합하고, 그 수용체의 세포 내 도메인에 존재하는 구아닐레이트 사이클레이스를 활성화시키고, 세포 내의 cGMP 농도를 상승시킴으로써, 그 생리 활성을 발휘한다. 천연형 hANP 는, Biochem. Biophys. Res. Commun., 118 권, 131 페이지, 1984년에 기재된 α-hANP 가, 일반명 카르페리티드 (carperitide) 로서, 일본에 있어서 제조 판매 승인을 취득하고, 판매 (상품명 : 한프, HANP) 되고 있다. α-hANP 는, 일반적으로는 Human pro-ANP[99-126] 으로서도 알려져 있다.
천연형 hANP 는, 서열 번호 1 의 7 위치와 23 위치의 Cys 잔기끼리가 디술파이드 결합하여, 분자 내 링 구조를 형성한다. hANP 에 의한 GC-A 수용체의 활성화에는, 이 링 구조와, 그 C 말단측 27 위치 Arg 잔기까지의 아미노산이 중요하다는 것이 알려져 있다 (Silver, MA,, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. (2006), 15, p14-21, A. Calderone, Minerva Endocrinol. (2004), 29, p.113-127). 그 때문에, 이 링 구조로 이루어지는 hANP(7-27) 은, GC-A 를 활성화시키는 최소 단위라고 생각된다. 본 발명의 hANP 펩티드로는, 서열 번호 1 에 있어서, N 말단측으로부터 연속하는 1 내지 6 개의 아미노산, 및/또는 28 위치의 아미노산이 결실되어 있어도 되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드이고, 바람직하게는, 서열 번호 1 의 1 위치, 1 위치 및 2 위치, 그리고, 28 위치의 아미노산의 적어도 1 개 지점이 결실되어 있어도 되는 펩티드이고, 보다 바람직하게는 서열 번호 1 의 1 위치, 그리고, 1 위치 및 2 위치의 아미노산이 결실되어도 되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (hANP(2-28), hANP(3-28) 등) 이고, 가장 바람직하게는, 서열 번호 1 의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 (hANP(1-28)) 이다.
본 발명에 있어서, 서열 번호 1 의 펩티드는 「hANP(1-28)」, 서열 번호 1 의 1 위치의 아미노산이 결실된 펩티드는 「hANP(2-28)」, 서열 번호 1 의 1 위치 및 2 위치의 아미노산이 결실된 펩티드는 「hANP(3-28)」 등으로 각각 표기되고, 다른 일부의 아미노산이 결실된 펩티드도 동일하게 표기된다.
본 발명의 콘주게이트체 1 분자 중의 hANP 분자의 개수는, Fc 함유 분자에 결합되는 N297 당사슬이나 PEG 링커의 구조에 의존하여 변동되지만, 통상은, 2 또는 4 개이다.
본 발명의 콘주게이트체에 있어서, hANP 펩티드와 PEG 링커의 결합은, 예를 들어, N 말단의 α 아미노기, 또는, C 말단의 α 카르복실기와 아미드 결합에 의해 결합할 수 있고, hANP 펩티드의 N 말단에 PEG 링커가 결합하는 것이 바람직하다.
본 발명의 콘주게이트체에 있어서, hANP 펩티드는 당사슬 수식되어 있어도 된다. hANP 펩티드의 당사슬 수식에 대해서는, 특허문헌 1 에 여러 가지 양태가 기재되어 있고, 이들을 이용하여 다양한 당사슬 수식 펩티드를 적용할 수 있다. hANP 펩티드의 수식에 사용하는 당사슬로는, 인간의 체내에 존재하는 당사슬과 유사한 구조를 갖는 당사슬을 채용하는 것이 적절하다.
천연의 당단백질에 포함되는 당사슬에는, 당단백질의 아스파라긴에 결합하고 있는 N 결합형 당사슬과, 세린 또는 트레오닌에 결합하고 있는 O 결합형 당사슬로 대별되고, 각각에 특징적인 기본 구조를 갖는다. 천연에 있어서는, N 결합형 당사슬은 N 글리코시드 결합, O 결합형 당사슬은 O 글리코시드 결합에 의해, 단백질의 아미노산 측사슬과 결합하고 있지만, 인공적으로는, 어느 글리코시드 결합에 의해서도 다른 화합물과 결합시킬 수 있다. 그 때문에, 글리코시드 결합의 양식을 한정하는 것은 아니다. 예를 들어, 당사슬의 환원 말단을 아지드화하고, 당해 아지드화된 당사슬과 카르복실기를 갖는 화합물을 트리페닐포스핀 존재하에 반응시킴으로써, 당사슬에 원하는 구조를 갖는 화합물을 N-글리코시드 결합에 의해 결합시킬 수 있다. 또, 당사슬을 알코올과 같은 수산기를 갖는 화합물과 반응시킴으로써, 원하는 화합물과 당사슬을 O-글리코시드 결합으로 결합시킬 수 있다.
N 결합형 당사슬의 기본 구조는, 이하의 구조식 및 서열식으로 나타내고, 이 당사슬 구조로 이루어지는 당사슬을 AG5 라고 부르는 것으로 한다.
[화학식 16]
Figure 112018131250960-pct00016
[화학식 17]
Figure 112018131250960-pct00017
(식 중, 「-(N/Q)」는, Asn 또는 Gln 의 측사슬과 N 글리코시드 결합하는 것을 나타낸다.)
N 결합형 당사슬의 대부분은, 이 기본 구조를 갖고 있고, 그 비환원 말단이나 분기 당에 있어서 추가로 다른 당이 결합하고 있어도 된다.
인간형 당사슬, 또는, 인간 적합형 당사슬이란, 인간의 체내에서 항원성을 나타내지 않는 것이 알려져 있는 당사슬이고, N 결합형 당사슬에서는, 고 (高) 만노오스형, 복합 (컴플렉스) 형, 혼성형 등이 알려져 있다. 고만노오스형은, N 형 기본 구조의 비환원 말단에, 복수의 만노오스가 연속한 만노오스 리치 구조를 갖는 당사슬이다. 복합형이란, N 결합형 기본 구조의 비환원 말단에, Galβ1-4GlcNAc 의 모티프 구조를 갖는 당사슬이다. 혼성형 당사슬이란, N 결합형 기본 구조의 비환원 말단에, Galβ1-4GlcNAc 모티프 구조를 가지며, 또한, 복수의 만노오스로 이루어지는 만노오스 리치인 구조를 갖는 당사슬이다.
N 결합형 복합형 당사슬의 대표적인 것으로는, 계란의 노른자에 포함되는 시알릴 글리코펩티드 (Sialyl GlycoPeptide : 이하, 「SGP」라고 한다) 에 포함되는 당사슬이고, 이하의 구조식 및 서열식으로 나타내는 구조로 이루어지는 시알릴 글리칸 (Sialyl Glycan, 이하, 「SG」라고 한다) 을 예시할 수 있다.
[화학식 18]
Figure 112018131250960-pct00018
[화학식 19]
Figure 112018131250960-pct00019
(식 중, 「-(N/Q)」는, Asn 또는 Gln 의 측사슬과 N 글리코시드 결합하는 것을 나타낸다.
SGP 는, 계란의 노른자로부터, 통상적인 방법 예를 들어, WO2011/0278681 에 기재된 방법에 따라 단리, 정제할 수 있다. 또, SGP 의 정제품이 시판 (토쿄 화성 (주), (주) 후시미 제약소) 되고 있어, 구입할 수 있다. 또, SG 의 당사슬 부분에 있어서 환원 말단의 GlcNAc 가 1 개 결손된 당사슬 (이하, 「SG(10)」) 만으로 이루어지는 디시알로옥타사카라이드 (토쿄 화성 (주) 제조) 등이 시판되고 있다. 또한 본 명세서에 있어서, SG(10) 의 β-Man 의 분기 사슬 중 어느 일방에서만 비환원 말단의 시알산이 결실된 당사슬 구조를 MSG(9) 라고 하고, 분기 사슬의 1-3 당사슬에만 시알산을 갖는 것을 MSG1(9), 분기 사슬의 1-6 당사슬에만 시알산을 갖는 것을 MSG2(9) 라고 각각 표기하는 것으로 한다.
또, SG 의 환원 말단의 GlcNAc 를 다른 당으로 치환한 환원 말단 개변 당사슬을, 공지된 당 전이 반응을 이용하여, 상기의 디시알로사카라이드를 사용하여 제작할 수 있다. SG 의 환원 말단의 GlcNAc 를, Glc 로 치환한 환원 말단 개변 당사슬을 SG(Glc), Man 으로 치환한 환원 말단 개변 당사슬을 SG(Man) 이라고 각각 표기하는 것으로 한다.
본 발명의 당사슬로서 사용할 수 있는 개변 당사슬의 구체예로서, SG 를 뉴라미니다아제 처리하여, 2 개의 비환원 말단의 NeuAc 를 결실시킨 AG9 (이하의 구조식 및 서열식의 AG9), AG9 를 갈락토시다아제 처리하여, 2 개의 비환원 말단의 Gal 을 결실시킨 AG(7) (이하 구조식 및 서열식의 AG7), AG7 을 추가로 N-아세틸글루코사미니다아제로 처리하여, 2 개의 비환원 말단의 GlcNAc 를 결실시킨 AG5 (상기, N 결합형 기본 구조로 이루어지는 당사슬) 등을 예시할 수 있다. 또, 상기에 있어서, SG 대신에 SG 의 환원 말단 개변 당사슬 (예를 들어 SG(Glc), SG(Man) 등) 을 채용하여 동일하게 처리함으로써, AG(9), AG(7) 및 AG(5) 의 환원 말단 개변 당사슬 (예를 들어 AG(9) 의 환원 말단의 GlcNAc 가 Glc 로 치환된 AG(9-Glc), AG(9) 의 환원 말단의 GlcNAc 가 Man 으로 치환된 AG(9-Man) 등) 도, 본 발명의 당사슬 수식에 채용할 수 있다.
[화학식 20]
Figure 112018131250960-pct00020
[화학식 21]
Figure 112018131250960-pct00021
(식 중, 「-(N/Q)」는, Asn 또는 Gln 의 측사슬과 N 글리코시드 결합하는 것을 나타낸다.)
[화학식 22]
Figure 112018131250960-pct00022
[화학식 23]
Figure 112018131250960-pct00023
(식 중, 「-(N/Q)」는, Asn 또는 Gln 의 측사슬과 N 글리코시드 결합하는 것을 나타낸다.)
본 발명의 콘주게이트체에 있어서, hANP 펩티드에 결합하는 당사슬의 개수의 상한은 없지만, 예를 들어 3 개 이하이고, 바람직하게는 2 개 또는 1 개이다. hANP 펩티드에 부가하는 당사슬은, 동일한 구조의 것이어도 되고 상이한 구조의 당사슬이 혼재하고 있어도 되지만, 모두 동일한 당사슬 구조인 것이 바람직하다.
본 발명의 당사슬 수식된 hANP 펩티드의 일 양태로서, 상기 서술한 바와 같은 N 결합형 당사슬이 측사슬에 N 글리코시드 결합한 Asn 또는 Gln (「(GLY-)Asn」 또는 「(GLY-)Gln」을 포함하는 hANP 펩티드를 들 수 있다. 이와 같은 펩티드에 있어서, 서열 번호 1 의 아미노산 서열의 1 위치 ∼ 5 위치, 및 28 위치 중 어느 하나 또는 복수의 아미노산이 (GLY-)Asn 또는 (GLY-)Gln 으로 치환되어 있어도 된다. 또, 서열 번호 1 의 6 위치 ∼ 27 위치를 포함하는 연속한 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드의 N 말단 및 C 말단 중 어느 일방 또는 양방에 (GLY-)Asn 또는 (GLY-)Gln 이 펩티드 결합한 것이어도 된다. 이와 같은 펩티드로서 바람직한 것은, hANP(1-28), hANP(2-28), hANP(3-28), hANP(4-28), hANP(5-28), 또는, hANP(6-28) 의 N 말단 및/또는 C 말단에 (GLY-)Asn 혹은 (GLY-)Gln 이 펩티드 결합한 펩티드이고, 보다 바람직하게는, hANP(1-28), hANP(2-28) 또는 hANP(3-28) 의 N 말단에 (SG-)Asn 혹은 (SG-)Gln 이 펩티드 결합한 펩티드이고, 더욱 바람직하게는, (SG-)Asn-hANP(1-28) 이다.
본 발명에 있어서, hANP 펩티드의 수식에 사용되는 당사슬로서, 천연에 존재하는 당단백질 또는 당지질에서 유래하는 당사슬을 사용하는 경우, 예를 들어 특허문헌 1 등에 기재된 방법에 준하여, 당해 당사슬은, 가수 분해 효소를 사용하여, 절단·단리되고, 또는, 당 전이 효소를 사용한 전이 반응에 의해 원하는 화합물 (피전이 화합물) 로 전이시켜, 사용할 수 있다. 예를 들어 SG 는, SGP 를 공지된 방법으로 가수 분해 효소 (Endo M 등) 와 반응시켜 가수 분해에 의해 잘라내거나, 또는, 당 전이 효소 (Endo-M N175Q 변이체 등) 를 사용하여 원하는 화합물로 전이시켜 추출할 수 있다. 또, SGP 를 악티나아제 등의 펩티드 분해 효소로 처리함으로써, (SG-)Asn, 또는, (SG-)Asn 을 포함하는 펩티드 단편으로 분해되고, 당사슬 결합 획분을 공지된 분리 방법에 의해 정제함으로써, 당사슬 결합 아미노산으로서 취득할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진, (SG-)Asn, (SG-)Gln 또는 그들을 포함하는 펩티드 단편을, 통상적인 보호기를 사용한 반응에 의해 hANP 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단에 펩티드 결합시킴으로써, 당사슬 수식을 포함하는 hANP 펩티드를 제조할 수 있다.
<Fc 함유 분자>
본 발명의 콘주게이트체에 있어서, 「Fc 함유 분자」는, IgG 중사슬의 Fc 영역에 있어서 잘 보존된 N 결합형 당사슬에 의한 수식을 받는 아스파라긴 (「Asn297」이라고 한다.) 의 측사슬에 결합하는 당사슬 (「N297 당사슬」이라고 한다) 을 개재하여 hANP 펩티드와 연결하고, 혈중에서 hANP 펩티드를 장기간 지속시키기 위한 캐리어 단백질로서 기능하기 때문에, 인간 IgG 의 Fc 영역에 상당하는 아미노산 서열을 갖고, 인간의 생체 분자에 대한 특이적인 결합능을 갖지 않는 것이 필요하다. IgG 의 Fc 영역에 상당하는 아미노산 서열로는, 예를 들어, 서열 번호 7 의 아미노산 번호 128 ∼ 349 의 아미노산 서열, 서열 번호 11 의 아미노산 번호 128 ∼ 349 의 아미노산 서열, 서열 번호 15 의 아미노산 번호 22 ∼ 243 의 아미노산 서열, 서열 번호 17 의 아미노산 번호 26 ∼ 247 의 아미노산 서열, 및 그들 서열을 개변한 아미노산 서열을 들 수 있다.
IgG 는 중사슬과 경사슬로 이루어진다. 양 사슬은 디술파이드 결합으로 연결되어 있고, 또한, 중사슬끼리가 힌지 영역에서 디술파이드 결합하여 호모 2 량체를 형성하고 있다. 또, IgG 는 도메인 구조를 갖고 있고, 가변 영역을 포함하고 항원 결합능을 갖는 Fab 도메인과, Fc 수용체와 결합하는 Fc 도메인이 힌지 영역을 개재하여 연결되어 있다. 본 발명의 Fc 함유 분자는, Fc 영역을 포함하는 것이면 특별히 한정되지 않고, 전장 IgG 중사슬, Fc 영역을 포함하는 항체 단편, 그들의 아미노산 서열을 부분적으로 개변한 개변체 등을 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 Fc 함유 분자는, 중사슬만이어도 되고, 중사슬의 구조에 대응한 경사슬을 갖고 있어도 된다. Fc 함유 분자의 유래가 되는 IgG 의 서브클래스는 특별히 한정되지 않고, 어느 서브클래스를 선택해도 되지만, 바람직하게는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이고, 보다 바람직하게는 IgG1 이다. IgG 의 정상 영역에 있어서의 아미노산 서열은 잘 보존되어 있고, Edelman et al., (Biochemistry, (1969) Vol.63, pp.98-85) 에 있어서 각각의 아미노산이 Eu 번호 (Eu INDEX) 로 특정되어 있다. 예를 들어, Fc 영역에 있어서 N 결합형 당사슬이 부가하는 Asn297 은, Eu 번호에 있어서 297 위치에 상당하는 것이고, 분자의 단편화나 영역 결손에 의해 실제의 아미노산 위치가 변동된 경우에도 Eu 번호로 표시함으로써 아미노산이 일의적으로 특정된다.
Fc 함유 분자로서, 완전장 IgG 를 채용하는 경우, 인간 체내에 통상 존재하는 물질에 특이적인 결합능을 갖지 않는 IgG 이면 특별히 한정은 없지만, 비인간 동물의 단백질을 항원으로 한 IgG 는 인간의 대응 분자·관련 분자가 존재하는 경우에는 인간의 분자에 교차 반응성을 나타낼 가능성이 있기 때문에, 인간이 대응 분자·관련 분자를 갖지 않는 항원에 대한 모노클로날 항체를 선택하는 것이 바람직하다. 또, 인간 체내의 성분에 결합할 우려가 있는 항체이더라도, 유전자 공학적 수법에 의해, 그 가변 영역에 변이를 도입하고, 인간 성분과의 결합 활성을 결실시킨 분자이면, 본 발명의 Fc 함유 분자로서 채용할 수 있다. 본 발명의 Fc 함유 분자에 사용되는 완전장 IgG 로서, 보다 바람직하게는 포유 동물 이외의 생물에서 유래하는 분자를 항원으로 하는 IgG 이고, 보다 바람직하게는 미생물 유래의 분자를 항원으로 한 IgG 이고, 더욱 바람직하게는 리포폴리사카라이드 (LPS) 를 항원으로 한 IgG 이다. 이와 같은 모노클로날 항체는, 예를 들어, WO2015/046505 등에 기재되어 있고, 구체적으로는 서열 번호 3 의 아미노산 번호 20 ∼ 474 의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 (아미노산 번호 1 ∼ 19 는 시그널 펩티드, 당해 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2), 및 서열 번호 5 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 (아미노산 번호 1 ∼ 20 은 시그널 펩티드, 그 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 4) 의 조합으로 이루어지는 mAb-A 등을 들 수 있다.
본 발명의 Fc 함유 분자로서, 항체 단편 또는 개변체를 채용하는 경우, 2 량체를 형성할 수 있는 형태로 Fc 영역을 포함하는 것이면 특별히 한정되지 않고, 다양한 서열의 것을 채용할 수 있다. 유래가 되는 항체가, 상기 서술한 바와 같은 인간 성분과 특이적인 결합능을 갖지 않는 것이면, 가변 영역의 일부 또는 전부를 유지한 개변체를 채용해도 되지만, 바람직하게는 가변 영역을 결손시킨 단편 또는 개변체이다.
이와 같은 개변체의 예로는, 예를 들어, 인간 IgG 중사슬로부터 가변 영역을 결실시킨 정상 영역만으로 이루어지는 CH 를 들 수 있다. 본 발명의 Fc 함유 분자로서 CH 를 채용하는 경우, 그 유래가 되는 IgG 서브클래스는 특별히 한정되지 않는다. 인간 IgG1 에서 유래하는 CH (「CH-A」라고 한다) 의 아미노산 서열을 서열 번호 7 의 아미노산 번호 20 ∼ 349 (N 말단측 1 위치 ∼ 19 위치는 시그널 펩티드, CH-A 를 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 6) 로 나타낸다. 이 서열에 있어서, 힌지 영역은 118 위치 Glu ∼ 132 위치 Pro 의 EPKSCDKTHTCPPCP 이고, Fc 영역은 133 위치 Ala ∼ 349 위치 Lys 이고, 199 위치 Asn 이 Asn297 에 상당한다 (서열 번호 11 에서도 동일). Fc 함유 분자로서 CH 를 선택하는 경우, CH 만을 채용해도 되고, 경사슬의 정상 영역만으로 이루어지는 CL 과 조합한 CLCH 로서 채용할 수도 있다. IgG1 경사슬의 CL (「CL-A」라고 한다) 의 아미노산 서열을 서열 번호 9 의 아미노산 번호 21 ∼ 125 (N 말단측의 1 위치 ∼ 20 위치의 아미노산은 시그널 펩티드, CL-A 를 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 8) 로 나타낸다. 본 발명의 Fc 함유 분자의 바람직한 양태로서 CLCH 를 들 수 있고, 보다 바람직하게는, CH-A 와 CL-A 를 조합한 CLCH-A 이다.
본 발명의 Fc 함유 분자로서, Fc 영역을 주체로 하는 단편 또는 개변체를 채용하는 경우, 예를 들어, IgG 의 Fc 영역의 N 말단에 힌지 영역의 일부인 CPPC 가 부가된 아미노산 서열 (IgG1 의 서열의 예로는, 서열 번호 7 의 128 위치 ∼ 349 위치의 서열) 로 이루어지는 항체 단편을 채용할 수 있다. 힌지 영역은 Fc 함유 분자의 구조적 자유도를 높이는 영역이고, 본 발명의 목적인 캐리어 단백질로서의 기능에 영향을 주는 것이 아니기 때문에, CPPC 를 포함하는 한, 적절히 길이를 조정하여 채용할 수 있다. 이와 같은 Fc 를 주체로 하는 항체 단편의 예로는, IgG1 에서 유래하는 것으로는, 서열 번호 7 또는 서열 번호 11 의 118 위치 Glu ∼ 349 위치 Lys 의 아미노산 서열에 있어서, N 말단으로부터 연속하는 1 ∼ 10 개의 아미노산이 결실되어도 되는 아미노산 서열로 이루어지는 Fc 함유 분자 또는 그 아미노산 서열이 개편된 개변체이고, 바람직하게는, 서열 번호 7 의 123 위치 Asp ∼ 349 위치 Lys, 127 위치 Thr ∼ 349 위치 Lys, 또는, 126 위치 His ∼ 349 위치 Lys 로 이루어지는 Fc 함유 분자이다. 또, Fc-A 및 Fc-B 에 관련하는 분자로는, 서열 번호 15 의 아미노산 번호 22 ∼ 243 의 아미노산 서열, 혹은, 서열 번호 17 의 아미노산 번호 26 ∼ 247 의 아미노산 서열, 또는, 그들의 N 말단에, T, HT, THT, KTHT 혹은 DKTHT 가 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 Fc 함유 분자 혹은 그들 아미노산 서열이 개편된 개변체를 예시할 수 있다. 바람직하게는, 서열 번호 15 의 아미노산 번호 21 ∼ 243 의 아미노산 서열, 또는, 서열 번호 17 의 아미노산 번호 25 ∼ 247 의 아미노산 서열, 또는, 서열 번호 17 의 아미노산 번호 21 ∼ 247 의 아미노산 서열로 이루어지는 Fc 함유 분자이다. 이들의 Fc 단편에 있어서의 Asn297 은, 서열 번호 15 에서는 93 위치의 Asn 이고, 서열 번호 17 에서는 97 위치 Asn 이다.
또, 본 발명의 Fc 함유 분자로서 항체 단편 또는 개변체를 설계하는 경우, 힌지 영역에 있어서 2 량체를 구성하기 위한 Cys, Fc 영역에 있어서 분자 내 디술파이드 결합에 기여하는 Cys, N297 당사슬이 결합하는 Asn297 및 그 주변의 아미노산을 유지하면서, 캐리어 단백으로서의 기능을 저해하지 않는 범위에서, 1 ∼ 수 지점 (바람직하게는 5 개 지점 이하, 보다 바람직하게는 3, 2 또는 1 개 지점) 에 있어서, 1 ∼ 수 개 (개변 지점당, 바람직하게는 20 개 이하, 보다 바람직하게는 15 개 이하, 더욱 바람직하게는 10 개 이하, 더욱더 바람직하게는 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개) 의 아미노산을, 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가시킨 개변체를 채용해도 된다. 아미노산 서열의 개변의 지점으로는, N 말단, 및 C 말단에 있어서의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 부가 등이 실시된다. 특히 N 말단의 아미노산은 생물 공학적 수법으로 Fc 함유 분자를 산생시킬 때에 영향을 주는 경우가 있고, 원하는 생산계에 적절한 아미노산 서열로 개변시킬 수 있다. 또, Eu 번호로, Leu234 - Lue235 의 아미노산은, 항체와 Fc 수용체의 결합에 의한 T 세포 활성화에 의한 이펙터 활성 발현에 영향을 미치는 부위인 것이 알려져 있다. 이 영역에 포함되는 Leu 를 Ala 로 치환함 (얻어지는 변이체를 「LALA 체」라고 한다) 으로써 이 이펙터 활성을 소실시키고, 부작용 리스크를 저감시킬 수 있는 경우가 있어 (미국 특허 공보 US5885573), 필요에 따라 이와 같은 개변을 실시해도 된다. 본 발명의 실시예에 있어서, CLCH-A 의 LALA 체로서 CLCH-B 가, Fc-B 의 LALA 체로서 Fc-A 가, 각각 제작되고, 본 발명의 콘주게이트에 있어서의 캐리어 분자로서 적절히 기능하는 것이 확인되어 있다.
또, 목적 분자의 발현, 정제 효율의 향상을 목적으로 하여, 시그널 서열, 펩티드 분해 효소 인식 서열, GST 와 같은 Tag 서열을 부가시켜도 된다.
본 발명에 사용되는 Fc 함유 분자는, 동물 세포를 사용한 산생 과정에서 번역 후 수식을 받고 Asn297 에 불균일한 당사슬이 부가되는데, 그 N297 당사슬이 이하 중 어느 구조로 이루어지는 SG 형 당사슬로 리모데링된 것 (SG 형 N297 당사슬) 이다. 통상은 동물 세포로부터의 산생시에, 2 량체의 양방의 모노머의 Asn297 에 당사슬이 부가되고, 2 량체의 Fc 함유 분자당 2 개의 N297 당사슬을 갖는 통상체 (通常體) 로서 산생된다. 그러나, 산생 조건이나 Fc 함유 분자의 구조에 따라서는, 일방의 모노머에만 N297 당사슬이 부가된 당사슬 결손체 (2 량체의 Fc 함유 분자당 1 개의 N297 당사슬을 갖는 분자) 가, 일정한 비율로 산생되는 경우가 있다. 이와 같은, 당사슬 결손체를 포함하는 Fc 함유 분자이더라도, 본 발명에 사용할 수 있다.
[화학식 24]
Figure 112018131250960-pct00024
(식 중, [L(PEG)] 는, L(PEG) 가 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측 및 1-6 사슬측의 양방의 비환원 말단의 시알산의 2 위치에 결합한 카르보닐기와 결합하는 것을 나타낸다.
[화학식 25]
Figure 112018131250960-pct00025
(식 중, [L(PEG)] 는, L(PEG) 가 β-Man 의 분기 사슬의 1-3 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치에 결합한 카르보닐기와 결합하는 것을 나타낸다.
[화학식 26]
Figure 112018131250960-pct00026
(식 중, [L(PEG)] 는, L(PEG) 가 β-Man 의 분기 사슬 중 1-6 사슬측의 비환원 말단의 시알산의 2 위치에 결합한 카르보닐기와 결합하는 것을 나타낸다.).
본 발명의 콘주게이트체에 있어서, N297 당사슬이, N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)MSG2 인 경우, Fc 함유 분자가 2 량체이고, 통상 양방의 모노머에 N297 당사슬을 갖기 때문에, 콘주게이트체는 2 개의 PEG 링커 및 hANP 펩티드가 결합된 분자 (2 가의 hANP 펩티드) 가 된다 (Fc 함유 분자가 당사슬 결손체인 경우, 일방의 모노머에만 N297-(Fuc)MSG1 또는 N297-(Fuc)MSG2 가 부가되고, 1 가의 hANP 펩티드가 된다). 한편으로, N297 당사슬이, N297-(Fuc)SG 인 경우, Fc 함유 분자가 2 량체이기 때문에, 콘주게이트체는 4 개의 PEG 링커 및 hANP 펩티드가 결합된 분자 (4 가의 hANP 펩티드) 가 된다 (Fc 함유 분자가 당사슬 결손체인 경우, 일방의 모노머에만 N297-(Fuc)SG 가 부가되고, 2 가의 hANP 펩티드의 콘주게이트가 된다). 본 발명의 콘주게이트체는, 이들 복수 종류의 N297 당사슬을 갖는 분자, 또는 그들의 통상체와 당사슬 결손체의 혼합물 (본 발명에 있어서, 이와 같은 혼합물은, 편의상, 통상체의 콘주게이트로서 표기된다.) 이어도 되고, 어느 하나의 구조로 이루어지는 N297 당사슬을 갖는 분자여도 되고, 바람직하게는 어느 하나의 구조로 이루어지는 SG 형 N297 당사슬을 갖는 분자이고, 보다 바람직하게는 N297 당사슬로서 N297-(Fuc)SG 를 갖고, 콘주게이트체가 4 가의 hANP 펩티드 (당사슬 결손체에서는 2 가) 를 갖는 것이다.
이들 당사슬 구조 중, 환원 말단의 푸코오스 부가한 GlcNAc(Fucα1,6)GlcNAc) 는, 동물 세포에서 산생된 Fc 함유 분자에서 유래하고, 그것으로부터 비환원 말단측의 당사슬은, 상기 서술한 SG 와 동일한 당사슬 구조로 리모데링된 것이다. 모두 그 비환원 말단의 시알산 2 위치에 결합한 카르복실산을 이용하여, PEG 링커와 결합하고 있다.
이와 같은 SG 형 N297 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자는, 예를 들어 WO2013/120066 등에 기재된 방법에 준하여, 도 3 에 나타내는 바와 같은 방법으로 제조할 수 있다. 공지된 방법에 준하여, 동물 세포를 사용하여, 유전자 재조합 단백질로서 Fc 함유 분자를 산생시킨 경우, N297 당사슬은, 기본 구조로서 푸코오스 부가한 N 결합형 당사슬 구조를 갖지만, 비환원 말단의 구조나 구성 당에 다양한 수식이 된 여러 가지 구조로 이루어지는 당사슬을 갖는 항체 또 단편의 혼합물로서 얻어진다 (도 3A 의 (Ⅳ)). 이와 같이 동물 세포에서 산생된 Fc 함유 분자는, EndoS 등의 가수 분해 효소로 처리함으로써, 환원 말단의 키토비오스 구조의 GlcNAcβ1-4GlcNAc 사이의 글리코시드 결합이 가수 분해되고, N297 당사슬로서 (Fucα1,6)GlcNAc 만을 갖는 단일의 당사슬 구조를 갖는 Fc 함유 분자 (「(Fucα1,6)GlcNAc-Fc 함유 분자」라고 한다, 도 2 의 A 참조) 가 얻어진다 (도 3A).
이와 같은 N297 당사슬의 가수 분해 반응에 사용하는 효소로는, EndoS 또는 그 가수 분해 활성을 유지한 변이 효소 등을 사용할 수 있다.
상기 가수 분해 반응에 의해 얻어진 (Fucα1,6)GlcNAc-Fc 함유 분자를 당사슬 억셉터 분자로 하여, EndoS D233Q 변이체와 같은 당 전이 효소를 사용하여 SG 형 당사슬 도너 분자와 반응시킴으로써, 상기 서술한 구조로 이루어지는 SG 형 N297 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자 (도 2 의 B 참조) 를 얻을 수 있다 (도 3B).
목적물이 4 가의 hANP 펩티드를 갖는 콘주게이트체인 경우, 이 당 전이 반응에는 당사슬로서 SG(10) 을 갖는 당사슬 도너 분자를 사용한다. 이와 같은 SG(10) 당사슬은, 예를 들어 SGP 로부터 가수 분해 등에 의해 취득된 것을 사용해도 되고, 시판되는 디시알로옥타사카라이드 (토쿄 화성 공업 (주)) 와 같은 SG(10) 당사슬만을 사용해도 된다.
목적물이 2 가의 hANP 펩티드를 갖는 콘주게이트체인 경우, 당사슬로서 MSG1(9) 또는 MSG2(9) 를 갖는 당사슬 도너 분자를 채용한다. 이와 같은 당사슬은, 시판되는 monosialo-Asn free (1S2G/1G2S-10NC-Asn, (주) 당사슬 공학 연구소) 를 원료로 실시예 1-11 에 기재된 방법에 준하여 분리하여 채용할 수도 있고, 분리하지 않고 혼합물로서 채용할 수도 있다.
도너 분자에 포함되는 SG 형 당사슬의 환원 말단의 GlcNAc 는, 예를 들어 2-클로로-1,3-디메틸-1H-벤즈이미다졸-3-이움-클로라이드 처리에 의한 옥사졸린화와 같은 형태로 활성화된 것을 사용하는 것이 바람직하지만, 후술하는 2 종류의 효소를 동시에 사용하는 경우에는 활성화의 필요는 없다.
도너 분자에 포함되는 SG 형 당사슬은, 그 비환원 말단의 시알산에 포함되는 카르복실산에, PEG 링커, 또는, 그 부분 구조를 갖는 링커 분자를 결합시킨 당사슬을 갖는다.
이와 같은 당 전이 반응에 사용하는 효소로는, N297 당사슬에 복합형 당사슬을 전이시키는 활성을 갖는 것이면 여러 가지의 것을 채용할 수 있지만, 바람직한 것은 EndoS 의 233 번째의 Asp 를 Gln 으로 치환함으로써 가수 분해 반응을 억제한 개변체인 EndoS D233Q 이다. EndoS D233Q 를 사용한 당 전이 반응에 대해서는, WO2013/120066 등에 기재되어 있다. 또, EndoS D233Q 에 대하여, 추가로 변이를 가한 EndoS D233Q/Q303L, EndoS D233Q/E350A, EndoS D233Q/E350Q, EndoS D233Q/E350D, EndoS D233Q/E350N, EndoS D233Q/D405A 등과 같은 개변체 효소를 이용해도 된다. 이와 같은 EndoS D233Q 의 개변체를 사용한 당 전이 반응은, WO2017/010559 에 기재되어 있다.
Fc 함유 분자의 당사슬 리모데링 (당 가수 분해, 및 당사슬 전이 반응) 후의 Fc 함유 분자의 정제 조작은, 반응에 사용한 저분자 화합물 및 효소와의 분리를 목적으로 하고, 이와 같은 정제에는, 통상, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등이 사용되지만, 추가로 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 추가 정제를 실시함으로써, 당사슬 전이 반응 효율의 향상이 확인되었다. 즉, 본 발명은, Fc 함유 분자의 당 가수 분해 후의 반응액으로부터의 중간체의 정제 공정에 있어서, 추가로 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제 공정을 포함하는, 콘주게이트체의 제조 방법을 제공한다.
당사슬 리모데링 보고예 (J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308-12318., Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367) 에 따르면, Fc 함유 분자를 가수 분해 효소로 처리한 반응액을 프로테인 A 칼럼 (어피니티 크로마토그래피 칼럼) 으로 정제하는 것뿐이지만, 이 정제 방법으로는, 가수 분해 효소 (EndoS) 를 완전하게는 제거할 수 없고, 잔류 효소가 영향을 주어, 다음의 당 전이 반응에 영향을 미치는 것이 판명되었다. 여기서, 정제법을 검토한 결과, Fc 함유 분자를 가수 분해 효소로 처리한 반응액을 프로테인 A 칼럼, 하이드록시 아파타이트 칼럼 (CHT 칼럼, Bio-Rad Laboratories, Inc.) 의 순으로 정제함으로써, 잔류 효소의 영향 없이, 다음의 당사슬 전이 반응의 반응 효율이 향상되었다.
또, 본 발명은, 2 종류의 효소를 동시에 사용함으로써, 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 SGP 나 (SG-)Asn 등을 직접 당사슬 도너로 하여, Fc 함유 분자의 N297 당사슬에 당 전이시키는 방법을 제공한다. 통상적인 당 전이 반응은, 당사슬 도너의 환원 말단이 활성화되어 있을 필요가 있고, 이와 같은 활성형 도너의 조제에 시간과 비용을 필요로 하고 있었다. 본 방법은, 천연으로부터 취득되거나, 또는, 시판되고 있는 당 펩티드 등을 직접 당 전이 반응에 사용할 수 있기 때문에, 효율적인 당사슬 리모데링이 가능해진다.
사용하는 2 종류의 Endo 효소는, 복합형 당사슬을 넓게 기질로 하는 효소 A (EndoM 형 효소) 와 Fc 함유 분자의 N297 당사슬을 기질로 하는 효소 B (EndoS 형 효소) 를 적절히 조합하는 것이 중요하다.
효소 A 로는, EndoM, EndoOm, EndoCC 와 그 가수 분해 활성을 저하시킨 EndoM 변이체, EndoOm 변이체, EndoCC 변이체 등을 예시할 수 있다. 효소 A 로서 바람직한 것은, EndoM N175Q, EndoCC N180H, EndoOm N194Q 이다.
효소 B 로는, EndoS, EndoS2(EndoS49) 및 그들의 가수 분해 활성을 저하시킨 EndoS 변이체, EndoS2(EndoS49) 변이체 등을 예시할 수 있다. 효소 B 로서 바람직한 것은, EndoS D233Q, EndoS D233Q/Q303L, EndoS D233Q/E350A, EndoS D233Q/E350Q, EndoS D233Q/E350D, EndoS D233Q/E350N, EndoS D233Q/D405A 등이다.
당사슬 도너의 구조는, 채용되는 효소 A 로 인식되는 당사슬 구조를 갖는 것이면, 특별히 한정되지 않고, 천연으로부터 취득된 것, 화학 반응 혹은 효소 반응과의 조합으로 합성 가능한 분자 등, 여러 가지의 것을 사용할 수 있다. 아노머 부위의 치환기 R 은, R=H 이외에, 무엇을 사용해도 된다. N 결합형 당사슬 구조의 경우 (하기 식 참조. 아노머의 치환기 R 은 가장 위의 구조식의 환원 말단의 R), 아미드 구조나 아지드를 예시할 수 있다.
[화학식 27]
Figure 112018131250960-pct00027
O 결합형 당사슬 구조의 경우 (하기 식 참조. 아노머의 치환기 R 은 가장 위의 구조식의 환원 말단의 R), 에틸렌글리콜 구조나 글리콜산 구조, 혹은 아노머 수산기의 보호기로서 사용되는 벤질기, 알릴기, 파라니트로페닐기 등을 예시할 수 있다. 또, 당사슬 도너의 비환원 말단의 구조에 대해서도, 효소 A 로 인식되는 것이면 특별히 한정되지 않고, 천연의 당사슬 구조, 천연의 당사슬 구조로부터 비환원 말단 당사슬을 결실시킨 것, 임의의 수산기를 인산 수식한 것, 화학적으로 링커 구조가 결합한 것 등, 여러 가지의 것을 사용할 수 있다. 바람직한 당사슬 도너로는, SGP, (SG-)Asn, ([N3-PEG(3)]2-SG)-Asn-PEG(3)-N3 등이다.
[화학식 28]
Figure 112018131250960-pct00028
본 방법에 사용하는 억셉터 분자로는, N297 당사슬을 갖는 Fc 함유 분자이면 특별히 제한 없이, mAb, CLCH, Fc 단편 등 여러 가지 타입의 것을 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
반응 온도는, 사용하는 효소의 지적 (至適) 온도에 따라 적절히 선택할 수 있지만, 통상 15 ∼ 50 ℃ 이고, 바람직하게는 25 ∼ 40 ℃ 이다. 본 방법에서는, 2 종류의 효소를 사용하기 때문에, 일방의 효소의 지적 온도에서 타방의 효소가 실활하여 버리면, 적절히 전이 반응이 진행되지 않는 경우가 있다. 그 때문에, 지적 반응 온도 등의 조건이 가까운 효소의 조합을 선택하는 것이 바람직하다.
<PEG 링커>
본 발명에 있어서 PEG 링커란, 본 발명의 콘주게이트체에 있어서 hANP 펩티드와 Fc 함유 분자의 연결을 중개하는, 폴리에틸렌글리콜 구조를 포함하는 화학 구조를 의미한다. PEG 링커 구조는, 통상은 분기 구조를 포함하지 않는 직사슬 구조로 이루어지고, 일방의 말단에서 hANP 펩티드의 N 말단의 아미노기 또는 C 말단의 카르복실기와 결합하고, 타방의 말단에서 Fc 함유 분자의 N297 당사슬의 시알산 2 위치의 카르복실산과 결합하고 있다.
본 발명의 콘주게이트체에 포함되는 PEG 링커는, 약 10 개 이상의 에틸렌글리콜 단위를 직사슬형으로 포함하고 있고, 이 길이는, 콘주게이트체가 유지하는 hANP 의 활성 발현에 중요하다. 링커 구조에 포함되는 에틸렌글리콜 단위 (-CH2-CH2-O-) 의 개수의 상한은 약 50 개 이하이고, 바람직하게는 약 40 개 이하이고, 보다 바람직하게는 약 35 개 이하이고, 더욱 바람직하게는 약 30 개 이하이다. 링커 구조에 포함되는 에틸렌글리콜 단위의 하한으로는, 바람직하게는 약 15 개 이상이고, 보다 바람직하게는 약 20 개 이상이고, 더욱 바람직하게는 약 25 개 이상이다.
이와 같은 PEG 링커는, 단일의 분자에서 유래하는 것이어도 되고, 복수의 분자를 결합시킨, 복수의 부분 구조로 이루어지는 것이어도 된다. 이와 같은, 링커 구조의 유래가 되는 분자를 「링커 분자」라고 한다.
본 발명의 PEG 링커가, 하나의 링커 분자에서 유래하는 경우, Fc 함유 분자와의 결합에는 SG 형 N297 당사슬의 시알산의 2 위치 카르복실산과 결합시키기 위해, 콘주게이트체의 구조의 균일성을 확보하기 위해, hANP 펩티드와는 N 말단과 결합하도록, 링커 분자에 포함되는 관능기를 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 PEG 링커가, 복수의 링커 분자에서 유래하는 경우, 당해 링커 분자로는, 적어도, N297 당사슬의 시알산 2 위치의 카르복실산에 결합하는 관능기를 포함하는 화합물, 및 hANP 펩티드의 N 말단 또는 C 말단과 결합할 수 있는 관능기를 갖는 화합물이 사용된다. 이 2 종류의 링커 분자가 직접 결합할 수 있는 관능기를 추가로 갖고 있으면, 직접 결합할 수도 있고, 추가로 다른 화합물을 중개하여 연결되어 있어도 된다.
사용되는 링커 분자는, 콘주게이트체 제조의 효율이나 편리성을 고려하여 적절히, 적절한 관능기나 구조를 갖는 화합물이 선택된다. 그 때문에, 최종적으로 구성되는 PEG 링커 구조에 있어서, 합계로서 소정 개수의 에틸렌글리콜 단위 구조를 포함하고 있으면 되고, 1 종류의 링커 분자만이 PEG 를 포함하고 있어도 되고, 2 개 또는 그 이상의 링커 분자가 에틸렌글리콜 단위를 포함하고 있어도 된다.
링커 구조에 있어서, 「PEG(n)」이라고 표시하는 경우, n 은 포함되는 연속한 에틸렌글리콜 단위의 개수를 나타내고, 다른 화학 구조가 삽입된 경우, PEG(n)-PEG(m) 과 같이 표시한다. 예를 들어, 24 단위의 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 링커 구조는 PEG(24) 로 나타내고, 12 단위의 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 링커 분자와 6 단위의 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 링커 분자가 결합하여 형성된 링커 구조는, PEG(12)-PEG(6) 과 같이 표시한다. 예를 들어, 동일한 링커 분자가 결합하여 형성되는 PEG(12)-PEG(12) 부분은, PEG(12)2 로 간이 표기를 사용하여 표시하는 경우도 있다. 이와 같은 원하는 길이의 PEG 링커는, 예를 들어, 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (Fmoc-PEG(12)-COOH) 와 같이, 일방에 Fmoc 보호된 아미노기, 타방에 카르복실산을 갖는 Fmoc-PEG 시약을 사용하여, 탈보호 및 카르복실산의 활성화를 반복함으로써, 원하는 PEG 길이를 갖는 링커를 형성할 수 있다. 이와 같은 Fmoc-PEG 시약은, Novabiochem 으로부터, Fmoc-PEG(3)-COOH, Fmoc-PEG(6)-COOH, Fmoc-PEG(12)-COOH, Fmoc-PEG(24)-COOH 등이 시판되고 있다.
이와 같은 링커 분자끼리의 결합에는, 유기 합성 화학의 분야에서 공지된 여러 가지 방법을 적용할 수 있고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 항체-약물 콘주게이트 합성에 응용되고 있는 결합법을 참고로 할 수 있다 (Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2198-2215). 예를 들어, 아지드기와 아세틸렌기의 Husgen 반응에 의한 고리 형성법으로서, 1,2,3-트리아졸 고리를 형성시키는 부가 고리화 반응 [Cu(Ⅰ)-Catalyzed Azide-Alkyne 1498711133922_0 (CuAAC)], 아지드기와 디벤질시클로옥텐 (DBCO) 의 반응에 의해 1,2,3-트리아졸 고리를 형성시키는 부가 고리화 반응 [Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC)] 을 예시할 수 있고, 여기서는, 그 밖에 동일하게 변형된 시클로옥틴 구조를 갖는 화합물, 비시클로[6.1.0]논-4-엔 (BCN) (Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9422-9425) 이나 중 (中) 원자 고리 구조 상에 헤테로 원자를 포함하는 시클로알킨 (Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 1190-1194) 등도 이용할 수 있다. 다른 고리 형성 반응으로서, 1,2,4,5-테트라진 고리와 변형된 알켄과의 Diels-Alder 부가 고리화 반응 (Curr. Opin. Chem. Biol., 2014, 21, 89-95) 을 예시할 수 있다. 또, 알데히드기와의 Pictet-Spengler 반응형의 고리화 축합으로서 Hydrazino-Pictet-Spengler ligation (Bioconjugate Chem. 24, 846-851.) 이나 Oxyamine-based Pictet-Spengler ligation (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 46-51) 을 예시할 수 있다. 그 밖에, 아미노기와 카르복실기에 의한 아미드 결합, SH 기와 말레이미드기의 말레이미드 축합, SH 기와 메틸술포닐페닐옥사디아졸기의 축합 (Angew. Chem., Int. Ed. 52, 12592-6.), SH 기와 요오드아세틸기의 결합, SH 기와 2-피리딜디티오기의 축합에 의한 디술파이드 결합, 알데히드기와 히드라지드의 히드라존 축합, 알데히드기와 아미노옥시기의 옥심 축합 등을 예시할 수 있다. 본 발명에서 채용되는 링커 분자로는 이들 결합 양식에 합치된 관능기를 갖는 것을 적절히 선택하여, 링커 구조의 형성에 사용할 수 있다.
이와 같은 결합 반응에 있어서, 결합 양식에 따라서는 입체 이성체, 광학 이성체, 기하 이성체 등이 형성되는 경우가 있다. 이들 이성체는 공지된 방법으로 분리하여 사용해도 되고, 혼합물로서 사용해도 된다. 최종적인 콘주게이트가 거대 분자이기 때문에 이들 부분 구조의 이성체의 구조적 상위는 거의, 콘주게이트체에는 영향을 주지 않는 것으로 생각된다.
이와 같은 PEG 링커의 구체예로는, 예를 들어, 이하의 L(PEG)A1 ∼ L(PEG)H1, 및 L(PEG)A2 ∼ L(PEG)H2 와 같은 구조를 들 수 있다.
[화학식 29]
Figure 112018131250960-pct00029
[화학식 30]
Figure 112018131250960-pct00030
[화학식 31]
Figure 112018131250960-pct00031
[화학식 32]
Figure 112018131250960-pct00032
[화학식 33]
Figure 112018131250960-pct00033
[화학식 34]
Figure 112018131250960-pct00034
[화학식 35]
Figure 112018131250960-pct00035
[화학식 36]
Figure 112018131250960-pct00036
(상기 식에 있어서, 「hANP」는 hANP 펩티드의 N 말단과 결합하는 것을 나타내고, 「N297 GLY」는 N297 당사슬의 비환원 말단의 시알산 2 위치의 카르보닐기와 결합하고 있는 것을 나타낸다.).
이들 링커 구조는, Fc 함유 분자에 결합하는 N297 당사슬에 도입된 아지드기와 hANP 펩티드를 포함하는 링커 분자에 결합한 DBCO 기의 클릭 (Click) 반응으로 형성되는 1,2,3-트리아졸 고리를 갖는다. 이 구조에서는, 아지드기에 결합하는 링커 구조가, 트리아졸 고리의 1 위치 또는 3 위치에 결합한 기하 이성체가 형성되지만, Fc 함유 분자 1 분자당 2 또는 4 개의 아지드기로 반응하기 때문에, 콘주게이트 1 분자 중에 기하 이성 구조가 혼재하고 있다.
<콘주게이트체 및 그 제조 방법>
본 발명의 콘주게이트체는, 상기 서술한 hANP 펩티드, Fc 함유 분자, 링커 분자 등의 중간체를 적절히, 유기 합성 화학 분야에서 공지된 반응을 이용하여 결합시킴으로써 제조할 수 있다. 그 제조의 순서는 특별히 한정되지 않고, 중간체나 목적물의 구조에 맞추어, 통상적인 방법에 따라, 여러 가지 방법을 채용할 수 있다.
각각의 중간체가 갖는 관능기는, 당해 제조 공정에 따라, 통상적인 방법에 따라, 적절히, 활성화, 불활성화, 보호기의 부가, 탈보호 등을 실시한다.
각 반응 공정에 있어서, 중간체 및 최종물은, 적절히 분리·정제되어 다음의 반응에 제공되거나, 또는 의약품 원체 혹은 시약으로서 이용된다.
상기에 예시한 PEG 링커를 갖는 콘주게이트체는, 예를 들어 이하와 같이 제조할 수 있다.
N297 당사슬에 결합하는 링커 분자는, N297 당사슬의 비환원 말단에 관능기 (예를 들어 아지드기) 를 갖는 분자이고, 상기 서술한 Fc 함유 분자의 당사슬 리모데링 공정으로 합성한다. 일방에 아미노기, 타방에 다른 관능기 (예를 들어 아지드기) 를 갖는 링커 분자를 SG(10) 과 반응시키고, 당사슬의 비환원 말단의 시알산 2 위치의 카르복실산에 당해 링커 분자를 결합시킨다. 계속해서, 이 당사슬 분자의 환원 말단 GlcNAc 를 활성화시켜, 당사슬 도너 분자로 하고, 당 전이 효소 존재하에서 (Fucα1,6)GlcNAc-Fc 함유 분자와 반응시켜, Fc 함유 분자의 N297 당사슬의 비환원 말단에 관능기를 도입한다.
hANP 펩티드의 N 말단에 결합하는 링커 분자는, 일방에 카르복실기, 타방에 다른 관능기 (DBCO, 보호기가 도입된 아미노기 등) 를 갖는 분자이다. hANP 펩티드를 당해 링커 분자와 반응시킴으로써, hANP 펩티드의 N 말단측에 원하는 관능기를 도입할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진, 관능기가 도입된 Fc 함유 분자와 hANP 펩티드를 직접, 또는 다른 링커 분자를 개재하여 연결시킴으로써, 본 발명의 콘주게이트체를 얻을 수 있다.
본 발명의 콘주게이트체의 구체예로는, 상기의 L(PEG)A ∼ L(PEG)H 에 있어서, hANP 펩티드가 hANP(1-28) 또는 (SG-)Asn-hANP(1-28) 이고, Fc 함유 분자가 서열 번호 3 의 아미노산 번호 20 ∼ 474 의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 5 의 아미노산 번호 21 ∼ 234 의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬의 조합 (mAb-A) 으로 이루어지는 항체, 또는, 서열 번호 7 의 아미노산 번호 20 ∼ 349 의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 9 의 아미노산 번호 21 ∼ 125 의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬의 조합으로 이루어지는 CLCH (CLCH-A) 이고, SG 형 N297 당사슬이 N297-(Fuc)SG 또는 N297-(Fuc)MSG1 이고, 보다 구체적으로는 실시예 3 에서 합성된, 화합물 3-1 ∼ 화합물 3-14 를 들 수 있지만, 바람직하게는 화합물 3-1 ∼ 화합물 3-6 이다.
<기능, 활성>
본 발명의 콘주게이트체는, 수식되어 있지 않은 hANP(1-28) 과 비교하여, 연장된 혈중 지속 시간, 및 우수한 물성을 나타내며, 또한, 피하 투여시에 hANP 제제로서 바람직한 완만한 혈중 이행 성능을 갖고 있다. 천연형 hANP(1-28) 은, 혈중으로부터 신속하게 소실되기 때문에, 임상에서는 점적 등에 의해 정맥 내에 지속 투여할 필요가 있었지만, 본 발명의 콘주게이트체는 통상적인 피하 투여에 의해서도 장기간 약리 효과를 발휘할 수 있다. 또, 본 발명의 콘주게이트체는, 고농도에 있어서도 응집성이 낮다는 특성을 갖는다. 이와 같은, 본 발명의 콘주게이트체의 특성에 의해, 종래의 천연형 hANP 나 기존의 hANP 제제에서는 달성할 수 없었던 투여 방법, 투여 경로, 제제 기술을 채용하는 것이 가능해져, 급성의 순환기계 질환뿐만 아니라, 만성의 순환기계 질환 (고혈압증이나 만성 심질환 등) 의 치료에 사용하는 것도 가능해진다. 또한, 본 발명의 콘주게이트체는 생물학적 연구 툴로서도 유용하다. 천연형 hANP 는, 장기간 혈중에 존재한 경우의 조직 이행성 등은 불명확하지만, 본 발명의 콘주게이트체를 투여함으로써, 이와 같은 국재 (局在) 나 hANP 가 장기간 혈중에 존재하는 것에 의한 생체에 대한 영향을 조사하는 것이 가능해진다.
본 발명의 콘주게이트체의 혈중 지속성은, 실시예 4-2 의 방법에 준하여, 동물에 대한 투여 후의 말초혈 중의 cGMP 농도, 및/또는, 말초혈 샘플 중에 함유되는 당해 콘주게이트체를 검출함으로써 시험할 수 있다. 본 발명의 콘주게이트체는, 체내에 투여된 후, 약 24 시간 후에 있어서도 말초혈 중의 cGMP 농도를 상승시키는 효과를 유지하고 있고, 보다 바람직하게는 투여 약 48 시간 후에 있어서도 당해 효과를 유지하고 있고, 보다 바람직하게는 투여 약 72 시간 후에 있어서도 당해 효과를 유지하고 있고, 더욱더 바람직하게는 투여 약 96, 120, 144 또는 168 시간 후에 있어서도 당해 효과를 유지하고 있다. 또한, 본 발명의 콘주게이트체는, 피하 투여 후 완만하게 활성을 발현하여, 그 피크는 24 ∼ 48 시간 후인 경우가 많고, 이와 같은 혈중 동태는 저혈압 발현의 리스크를 저감·회피할 수 있을 것으로 기대된다. 또, 콘주게이트체의 투여 후의 말초혈로부터의, 당해 콘주게이트체의 검출에 관하여, 약 24 시간 후에 있어서도 검출되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 약 48 시간 후에 있어서도 검출되는 것이고, 더욱 바람직하게는 약 72 시간 후에 있어서도 검출되는 것이고, 더욱더 바람직하게는 약 96, 120, 144 또는 168 시간 후에 있어서도 검출되는 것이다.
본 발명의 콘주게이트체는, 높은 농도의 수용액에 있어서도 응집하기 어렵다는 우수한 물성을 나타낸다. hANP 펩티드는 용액 중의 염의 영향 등에 의해 겔화하기 쉬운 성질을 갖고 있어, 제제 취급에 주의가 필요하였다. 본 발명의 콘주게이트체는 응집성의 문제가 저감되어, 유효 성분을 고농도로 하거나, 여러 가지 첨가물을 채용할 수 있는 등, 다양한 형태의 제제에 적용할 수 있다. 특히, 당사슬 수식된 hANP 펩티드를 포함하는 콘주게이트체는, 매우 양호한 비응집성을 나타내는 것이 확인되어 있다.
본 발명의 콘주게이트체의 혈중 지속 시간은, 콘주게이트체를 생체에 투여하고, 일정 시간 간격으로 혈액을 채취하여, 당해 혈액 샘플 중에 포함되는 콘주게이트체를 검출함으로써 측정할 수 있다. 콘주게이트체의 검출 방법으로는, 예를 들어, LC-MS 에 의한 검출, hANP 의 링 구조를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 ELISA 법 등, 여러 가지 방법을 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 콘주게이트체를 cGMP 상승 활성을 발현하는 용량으로 투여한 경우, 당해 혈액 샘플의 cGMP 레벨을 시판되는 측정 키트를 사용하여 측정하고, 투여 개시 전의 혈중의 cGMP 레벨과 비교함으로써, 혈중의 콘주게이트체의 생물 활성으로서의 지속 시간을 측정할 수 있다. 또, 콘주게이트체를 방사성 동위체로 표지하고, 혈액 샘플을 SDS-PAGE 등으로 분리하고, 방사성 시그널을 검출함으로써, 검출할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 「혈중 지속 시간이 연장된」이란, 천연형 hANP 와 비교하여 피험 물질의 투여 후에 혈중으로부터 검출 가능한 시간이 연장되는 것을 의미한다. 원숭이에 대한 피하 투여에 있어서, 천연형 hANP 는 200 nmol/㎏ 의 투여 후 30 분의 시점에서 혈중 농도가 측정 한계 이하가 되지만 (data not shown), 콘주게이트체는 100 nmol/㎏ 의 투여 7 일 후에도 혈중으로부터 검출되었다.
또, 본 발명의 콘주게이트체는, NEP 에 의한 hANP 펩티드의 분해에 대하여 내성을 갖는 것이, 지속 시간이 연장되는 요인의 하나로 생각된다. 이와 같은 NEP 분해 내성은, 공지된 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 콘주게이트체의 cGMP 상승 활성은, GC-A 수용체를 발현하는 세포를 충분량까지의 농도 구배로 조정한 피험 물질로 자극한 후, 세포를 용해하여 그 세포 용해액 중의 cGMP 농도를 측정하고, 최대의 cGMP 농도 (Emax) 를 동정함으로써 측정한다. 본 발명의 콘주게이트체가 「cGMP 상승 활성을 유지한다」란, 콘주게이트체가 나타내는 최대 cGMP 농도가, 천연형 hANP 의 최대 cGMP 농도와 비교하여, 약 30 ％ 이상인 것을 의미하고, 바람직하게는 약 50 ％ 이상이고, 보다 바람직하게는 약 70 ％ 이상이다. 본 발명의 콘주게이트체는, 천연형 hANP 와 비교하여, 고농도로 제제화할 수 있으며, 또한, 연장된 혈중 지속 시간을 나타내기 때문에, 이른바 EC50 값과 같은 지표로 활성을 정의하는 것은 적절하지 않고, 농도를 상승시킨 경우의 최대의 활성이, 천연형의 일정 이상의 활성을 나타낼 수 있으면, 임상에 있어서, 지속적, 및/또는, 고농도로 투여된 경우에 충분한 약효를 얻을 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 콘주게이트체를 유효 성분으로서 함유하는 의약을 제공한다.
<의약>
본 발명에 관련된 의약의 유효 성분으로서 사용할 수 있는 물질은, 상기 서술한 콘주게이트체의 약학적으로 허용되는 염이어도 된다. 즉, 본 발명에 있어서는, 상기 서술한 물질의, 무기산, 예를 들어 염산, 황산, 인산, 또는 유기산, 예를 들어 포름산, 아세트산, 부티르산, 트리플루오로아세트산 (TFA), 숙신산, 시트르산 등의 산 부가 염을, 유효 성분으로서 사용할 수도 있다. 혹은, 본 발명에 있어서는, 상기 서술한 물질의, 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘 등의 금속염, 유기 염기에 의한 염의 형태를 유효 성분으로서 사용할 수도 있다. 이와 같은, 본 발명의 콘주게이트체의 염은, hANP 펩티드 부분의 염이어도 되고, 당사슬의 구조에 있어서 염을 형성하고 있어도 된다. 본 발명의 콘주게이트체의 염으로서 바람직하게는, hANP 펩티드 부분에서 약학상 허용되는 염을 형성한 것이고, 또, 본 발명에 관련된 의약 조성물은, 그 유효 성분에 관련된 물질의 유리형으로 해도 되고, 또는 그 약학상 허용할 수 있는 염이어도 된다.
본 발명에 관련된 의약의 유효 성분으로서 사용할 수 있는 물질 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염은, 공지된 약학적으로 허용할 수 있는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 의약에 일반적으로 사용되고 있는 투여 방법, 즉 경구 투여 방법, 또는, 경점막 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여 혹은 피하 투여 등의 비경구 투여 방법에 의해 개체에 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명에 관련된 의약의 유효 성분으로서 사용할 수 있는 물질의 투여량은, 질환의 종류, 개체 (환자) 의 연령, 체중, 증상의 정도 및 투여 경로 등에 따라서도 상이하지만, 일반적으로 1 일당 투여량의 상한으로는, 예를 들어 약 100 ㎎/㎏ 이하이고, 바람직하게는 약 50 ㎎/㎏ 이하이고, 더욱 바람직하게는 1 ㎎/㎏ 이하이다. 또, 1 일당 투여량의 하한으로는, 예를 들어 약 0.1 ㎍/㎏ 이상이고, 바람직하게는 0.5 ㎍/㎏ 이상이고, 보다 바람직하게는 1 ㎍/㎏ 이상이다.
본 발명에 관련된 의약의 투여 빈도는, 사용하는 유효 성분, 투여 경로, 및 처치하는 특정의 질환에 의존해서도 변동된다. 예를 들어 펩티드성의 물질을 경구 투여하는 경우, 1 일당 4 회 이하의 투여 횟수로 처방하는 것이 바람직하고, 또 비경구 투여, 예를 들어 정맥 내 투여하는 경우에는, 통상적인 시린지를 사용하여 주사할 수도 있고, 인퓨전 펌프, 카테터 등을 이용하여 지속적으로 투여할 수도 있다. 또, 피하 주사, 근육 내 주사 등의 경로로 투여하는 것도 바람직하고, 그 경우, 통상 사용되는 여러 가지 투여 디바이스를 이용할 수 있다.
본 발명의 의약의 유효 성분을 액제로서 조정하는 경우, 본 발명의 콘주게이트체 또는 그 약학적으로 허용할 수 있는 염을, 수성 용매에 용해하고, 필요에 따라, 안정화제, pH 조정제, 계면 활성제 등을 첨가하여 조정할 수 있다. 또, 동결 건조 제제로 하는 경우, 상기와 같이 조제한 액제를 동결 건조시키고, 사용시에 생리 식염수, 주사 용수, 포도당액 등으로 용해하여 사용할 수 있다.
본 발명의 의약은, GC-A 에 작용하여 cGMP 레벨을 상승시킴으로써, 치료할 수 있는 질환의 환자에 투여함으로써, 당해 질환을 치료하는 효과를 갖는다. 여기서, 질환 또는 증상의 「치료」란 GC-A 의 활성화에 의해 정상화가 기대되는 병적 증상의 진행을 지연, 경감, 완화 및/또는 억제함으로써, 증상을 정상화에 가깝게 하는 것을 의미한다. 질환의 조기 또는 질환 리스크가 높은 상태에서 투여를 개시함으로써, 질환의 중증화 또는 발증을 억제하는 효과가 기대된다. 또, 과거에 당해 질환을 이환한 것은, 재발, 또는, 만성화에 빠질 위험성이 있는데, 이와 같은 환자에 대하여, 본 발명의 의약을 계속적으로 투여함으로써, 재발이나 만성화의 리스크를 저감시키는 것을 기대할 수 있다. 이와 같은 효과도, 치료에 포함되는 것으로 한다.
이와 같은 질환으로는, 예를 들어, 고혈압, 급성 심부전 (급성 심부전 발증 후에 있어서의 병상 관리를 포함한다), 만성 심부전, 허혈성 심질환, 급성 신염 (급성 신염 발증 후에 있어서의 병상 관리를 포함한다), 만성 신염, 급성 신부전 (급성 신부전 발증 후에 있어서의 병상 관리를 포함한다), 만성 신부전, 허혈성 심질환 (심근경색 등), 악성 종양의 전이, 간섬유화, 간경변, 투석에 있어서의 조직의 유착, 섬유화 등이다.
실시예
이하, 실시예를 사용하여, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 실시예에 나타낸 것은, 본 발명의 실시형태의 일례이고, 본 발명은 이것에 한정되지 않는다.
실시예 1 은, 본 발명의 콘주게이트의 제조 중간체인, hANP 펩티드, 링커 분자 또는 그 유도체의 제조예이고, 실시예 2 는 항체 분자의 제작예이고, 실시예 3 은, 콘주게이트체의 합성예이고, 실시예 4 는, 본 발명의 콘주게이트체의 특성이나 효과를 확인한 시험예이다.
본 명세서에 기재되어 있는 각 중간체의 질량은, 다음의 방법으로 확인하였다. 장치에는, Q Exactive (Thermo Fisher Scientific Inc 제조), Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific Inc 제조) 및 CORETECS UPLC C18 (Waters Inc 제조) (1.6 ㎛, 2.1 x 50 ㎜) 을 사용하고, 이동상 A 에는 아세토니트릴, 이동상 B 에는 0.1 ％ 포름산 첨가 수용액을 이용하고, 이동상 A 가 4 분 동안에 2 ％ 로부터 95 ％ 로 변화하는 그레이디언트로 사용하고, 유속 0.4 ㎖/분, 40 ℃ 에서 분석하였다.
본 특허에 기재되어 있는 단백 농도는, 미량 분광 광도계 Xpose (Trinean 제조) 를 사용하여 정량하였다. 당사슬 리모데링 항체 분자, 콘주게이트체의 질량은, 다음의 방법으로 확인하였다. 당사슬 리모데링 항체 분자, 콘주게이트체를 중사슬과 경사슬로 프래그먼트화한 후에, 각각의 피크를 분석 칼럼으로 분리하고, 질량 분석하였다. 장치에는, Q Exactive (Thermo Fisher Scientific Inc 제조), Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific Inc 제조) 및 MAbPac RP (Thermo Fisher Scientific Inc 제조) (4.0 ㎛, 2.1 x 50 ㎜) 를 사용하고, 이동상 A 에는 아세토니트릴, 이동상 B 에는 0.1 ％ 포름산/0.02 ％ 트리플루오로아세트산 첨가 수용액을 이용하고, 이동상 A 가 4 분 동안에 20 ％ 로부터 50 ％ 로 변화하는 그레이디언트로 사용하고, 유속 0.6 ㎖/분, 80 ℃ 에서 분석하였다.
[실시예 1] 각종 중간체의 합성
이하에 있어서, 구조식 중에서, 간단히 「hANP」라고 표기되는 경우, 수식 펩티드 중의 hANP 펩티드가 hANP(1-28) (서열 번호 1) 인 것을 나타내고, 당해 펩티드는 N 말단의 Ser 에 있어서, 링커 분자와 결합, 또는, 당사슬 수식되어 있다.
<실시예 1-1> DBCO-PEG(12)2-hANP(1-28) (하기 식의 화합물 1-1) 의 합성
[화학식 37]
Figure 112018131250960-pct00037
(상기 도면에 있어서, 구조식의 우측의 모식도는, 도 1 ∼ 3 및 실시예 3 의 반응식에 표시되는 콘주게이트체 또는 중간체의 모식도 중의 대응 구조를 나타낸다.)
(1-1A) Fmoc-PEG(12)-hANP(1-28) 의 합성
Fmoc-PEG 시약인 Fmoc-PEG(12)-COOH ; 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (Novabiochem 제조, 304 ㎎, 0.36 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (4.6 ㎖) 에, N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)우로늄테트라플루오로보레이트 (토쿄 화성 공업 (주) 제조, 109 ㎎, 0.36 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (1.0 ㎖) 과 디이소프로필에틸아민 (131 ㎕, 0.75 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다.
hANP(1-28) 아세트산염 (1000 ㎎) 을 N,N-디메틸포름아미드 (11 ㎖), 증류수 (3 ㎖) 에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (315 ㎕, 1.81 mmol) 을 첨가하였다. 이 용액에 대하여, 사전에 조제한 활성 에스테르를 포함하는 N,N-디메틸포름아미드 용액 (5.6 m) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다.
반응 종료 후, 반응액에 트리플루오로아세트산 (186 ㎕, 2.41 mmol) 을 첨가하고, 20 ㎖ - 신틸레이션 바이알 (scintillation vial (Biotage 제조)) 에 옮기고, 고속 농축 장치 V-10 (Biotage) 을 사용하여 용매를 제거하였다. 적량의 아세토니트릴을 상기 바이알에 첨가하고, 고속 농축 장치 V-10 (Biotage) 을 사용하여 용매를 제거하고, 고형물을 얻었다. 이 고형물에 적량의 디에틸에테르를 첨가하고 데칸테이션한 후에, 적량의 아세토니트릴/디에틸에테르 (1/2) 를 첨가하고 다시 데칸테이션하였다. 얻어진 고형물을 감압하 건조시켜, 표기 목적 화합물을 포함하는 미정제 생성물을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고, 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(1-1B) H2N-PEG(12)-hANP(1-28) 의 합성
공정 (1-1A) 에서 합성한 미정제 생성물 (전체량) 을 N,N-디메틸포름아미드 (16 ㎖) 와 증류수 (3.2 ㎖) 의 혼합 용액에 용해시키고, 피페리딘 (518 ㎕, 5.23 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액에 아세트산 (451 ㎕, 7.88 mmol) 을 첨가하고, 20 ㎖ - scintillation vial (Biotage) 에 옮기고, 고속 농축 장치 V-10 (Biotage) 을 사용하여 용매를 제거하였다. 적량의 아세토니트릴을 상기 바이알에 첨가하고, 고속 농축 장치 V-10 (Biotage) 을 사용하여 용매를 제거하고, 고형물을 얻었다. 이 고형물에 적량의 디에틸에테르를 첨가하고 데칸테이션한 후에, 적량의 아세토니트릴/디에틸에테르 (1/2) 를 첨가하고 다시 데칸테이션하였다. 얻어진 고형물을 적량의 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 아세트산을 첨가하여 용해시키고, 수 회로 나누어, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용사고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모아, 동결 건조시켰다. 표기 목적 화합물 (826 ㎎) 을 무색 고체로서 얻었다.
(1-1C) Fmoc-PEG(12)2-hANP 의 합성
Fmoc-PEG 시약인 Fmoc-PEG(12)-COOH ; 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐아미노)에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]에톡시]프로판산 (Novabiochem 제조, 251 ㎎, 0.30 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3.8 ㎖) 에, N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)우로늄테트라플루오로보레이트 (토쿄 화성 공업 (주) 제조, 90 ㎎, 0.30 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (0.8 ㎖) 과 디이소프로필에틸아민 (87 ㎕, 0.50 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다.
공정 (1-1B) 에서 합성한 화합물 (826 ㎎) 을 N,N-디메틸포름아미드 (10 ㎖) 와 증류수 (3.5 ㎖) 를 첨가하여 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (160 ㎕, 0.92 mmol) 을 첨가하였다. 이 용액에 대하여, 사전에 조제한 활성 에스테르를 포함하는 N,N-디메틸포름아미드 용액 (4.6 m) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액에 트리플루오로아세트산 (77 ㎕, 1.00 mmol) 을 첨가하고, 20 ㎖ - scintillation vial (Biotage 제조) 에 옮기고, 고속 농축 장치 V-10 (Biotage) 을 사용하여 용매를 제거하였다. 적량의 아세토니트릴을 상기 바이알에 첨가하고, 고속 농축 장치 V-10 (Biotage) 을 사용하여 용매를 제거하고, 고형물을 얻었다. 이 고형물에 디에틸에테르를 첨가하고 데칸테이션한 후에, 적량의 아세토니트릴/디에틸에테르 (1/2) 를 첨가하고 다시 데칸테이션하였다. 얻어진 고형물을 감압하 건조시켜, 표기 목적 화합물을 포함하는 미정제 생성물을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고, 그대로 다음의 반응에 사용하였다.
(1-1D) H2N-PEG(12)2-hANP(1-28) 의 합성
공정 (1-1C) 에서 합성한 미정제 생성물 (전체량) 을 N,N-디메틸포름아미드 (14 ㎖) 와 증류수 (1.4 ㎖) 를 첨가하여 용해시키고, 피페리딘 (395 ㎕, 3.99 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 30 분 교반하였다. 반응액에 증류수 (1.0 ㎖) 를 첨가하고, 추가로 30 분 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액에 아세트산 (343 ㎕, 5.99 mmol) 을 첨가하고, 20 ㎖ - scintillation vial (Biotage 제조) 에 옮기고, 고속 농축 장치 V-10 (Biotage) 을 사용하여 용매를 제거하였다. 아세토니트릴을 상기 바이알에 첨가하고, 고속 농축 장치 V-10 (Biotage) 을 사용하여 용매를 제거하고, 고형물을 얻었다. 이 고형물에 적량의 디에틸에테르를 첨가하고 데칸테이션한 후에, 적량의 아세토니트릴/디에틸에테르 (1/2) 를 첨가하고 다시 데칸테이션하였다. 얻어진 고형물을 적량의 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 아세트산을 첨가하여 용해시키고, 수 회로 나누어, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모아, 동결 건조시켰다. 표기 목적 화합물 (694 ㎎) 을 무색 고체로서 얻었다.
(1-1E) DBCO-PEG(12)2-hANP(1-28) 의 합성
공정 (1-1D) 에서 합성한 화합물 (520 ㎎) 을 N,N-디메틸포름아미드 (5.5 ㎖) 와 증류수 (1.5 ㎖) 를 첨가하여 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (77 ㎕, 0.44 mmol) 을 첨가하였다. 이 용액에 대하여, DBCO-NHS ester (Click Chemistry Tools 제조, 53 ㎎, 132 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (0.2 m) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 20 ㎖ - scintillation vial (Biotage 제조) 에 옮기고, 고속 농축 장치 V-10 (Biotage) 을 사용하여 용매를 제거하였다. 이 고형물에 디에틸에테르를 첨가하고 데칸테이션한 후에, 아세토니트릴/디에틸에테르 (1/2) 를 첨가하고 다시 데칸테이션하였다. 얻어진 고형물을 적량의 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 아세트산을 첨가하여 용해시키고, 수 회로 나누어, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모아, 동결 건조시켜, 표기 목적 화합물 (화합물 1-1) (283 ㎎) 을 무색 고체로서 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00038
<실시예 1-2> DBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) (하기 식의 화합물 1-2) 의 합성
[화학식 38]
Figure 112018131250960-pct00039
(상기 도면에 있어서, 구조식의 우측의 모식도는, 도 1 ∼ 3 및 실시예 3 의 반응식에 표시되는 콘주게이트체 또는 중간체의 모식도 중의 대응 구조를 나타낸다.)
(1-2A) Fmoc-(SG-)Asn 프리체의 조제
Fmoc-(SG-)Asn (1S2S-11NC-Asn-Fmoc, 당사슬 공학 연구소 제조, 2 g) 을 적량의 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액에 용해시키고, 복수 회로 나누어 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모아, 동결 건조시켰다. 무색 고체 (1.8 g) 를 얻었다.
(1-2B) hANP(1-28) TFA 염 (트리플루오로아세트산염) 의 조제
카르페리티드아세트산염 (hANP(1-28) 아세트산염) (2.7 g) 을 증류수 (200 ㎖) 에 용해시키고, 트리플루오로아세트산 (4 ㎖, 52.3 mmol) 을 첨가하고, 10 분간 방치한 후에, 동결 건조시켰다. 동결 건조 종료 후, 증류수 (200 ㎖) 에 용해시키고, 다시 동결 건조시켰다. 무색 고체 (2.7 g) 를 얻었다.
(1-2C) (SG-)Asn-hANP(1-28) 의 합성
공정 (1-2A) 에서 조제한 Fmoc-(SG-)Asn 프리체 (436 ㎎) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (7.2 ㎖) 에 대하여, 빙랭하 HATU (65 ㎎, 0.17 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (0.8 ㎖) 과 디이소프로필에틸아민 (118 ㎕, 0.68 mmol) 을 첨가하고, 2.5 분 교반하고, 신속하게 다음의 반응에 사용하였다 (용액 1-2C).
공정 (1-2B) 에서 조제한 hANP(1-28) TFA 염 (400 ㎎) 을 N,N-디메틸포름아미드 용액 (4.8 ㎖) 과 증류수 (1.2 ㎖) 를 첨가하여 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (118 ㎕, 0.68 mmol) 을 첨가하였다. 이 용액에 대하여, 사전에 조제한 활성 에스테르를 포함하는 N,N-디메틸포름아미드 용액 1-2C (8.0 m) 를 첨가하고, 실온에서 30 분 교반하였다. 반응 종료 후, 아세트산 (82 ㎕, 1.36 mmol) 을 첨가하였다. 약 5 ㎖ 씩의 반응액을 미리 아세토니트릴 (35 ㎖) 을 첨가한 원침관 (遠沈管) (50 ㎖) 3 개에 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 공기, CF16RX) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 3 개의 원침관에 나누어진 고형물을 1 개의 원침관에 모아, 아세토니트릴 (30 ㎖) 로 세정한 후, 디에틸에테르 (30 ㎖) 로 2 회 세정한 후에, 감압하 건조시켜, 미정제 생성물을 얻었다.
얻어진 미정제 생성물 (전체량) 을 N,N-디메틸포름아미드 용액 (8.4 ㎖), 증류수 (1.4 ㎖) 에 용해시키고, 피페리딘 (224 ㎕, 2.26 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 30 분 교반하였다. 반응 종료 후, 아세트산 (194 ㎕, 3.39 mmol) 을 첨가하였다. 약 5 ㎖ 씩의 반응액을 미리 아세토니트릴 (35 ㎖) 을 첨가한 원침관 (50 ㎖) 2 개에 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 공기, CF16RX) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 2 개의 원침관에 나누어진 고형물을 1 개의 원침관에 모아, 아세토니트릴 (30 ㎖) 로 세정, 디에틸에테르 (30 ㎖) x 2 로 세정한 후에, 감압하 건조시켜, 미정제 생성물을 얻었다.
이상의 조작을 3 로트분 실시하고, 각 미정제 생성물 (3 로트분) 을 하나로 모았다. 얻어진 고형물을 적량의 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 아세트산을 첨가하여 용해시키고, 수 회로 나누어, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모아, 동결 건조시켰다. 표기 목적 화합물 (SG-)Asn-hANP(1-28) (1.49 g) 을 무색 고체로서 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00040
(1-2D) Fmoc-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP 의 합성
WO2014115797A1 (실시예 2-28A) 에 기재된 방법에 따라 합성한 Fmoc-NH-PEG(12)2-COOH (122 ㎎, 0.085 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (1.0 ㎖) 에, N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-숙신이미딜)우로늄테트라플루오로보레이트 (토쿄 화성 공업 (주), 23 ㎎, 0.077 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (1.0 ㎖) 과 디이소프로필에틸아민 (54 ㎕, 0.31 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다 (용액 1-2D).
공정 (1-2C) 에서 합성한 화합물 (300 ㎎) 을 N,N-디메틸포름아미드 (3 ㎖), 증류수 (1.4 ㎖) 에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (54 ㎕, 0.31 mmol) 을 첨가하였다. 이 용액에 대하여, 사전에 조제한 활성 에스테르를 포함하는 N,N-디메틸포름아미드 용액 1-2D (2.0 m) 를 첨가하고, 실온에서 22 시간 교반하였다.
반응 종료 후, 반응액에 트리플루오로아세트산 (47 ㎕, 0.61 mmol) 을 첨가하고, 약 3.2 ㎖ 씩의 반응액을 미리 디에틸에테르/아세토니트릴 (30 ㎖/10 ㎖) 을 첨가한 원침관 (50 ㎖) 2 개에 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 공기, CF16RX) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 2 개의 원침관에 나누어진 고형물을 1 개의 원침관에 모아, 적량의 디에틸에테르/아세토니트릴 (1/1) 로 세정한 후에, 감압하 건조시켜, 미정제 생성물을 얻었다. 더 이상 정제하지 않고 그대로 사용하였다. 상기 조작을 4 로트분 실시하여, 표기 목적 화합물을 포함하는 미정제 생성물을 합계 1.47 g 얻었다.
(1-2E) H2N-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) 의 합성
공정 (1-2D) 에서 합성한 미정제 생성물 (0.734 g) 을 N,N-디메틸포름아미드 (7.2 ㎖), 증류수 (1.2 ㎖) 에 용해시키고, 피페리딘 (200 ㎕, 2.05 mmol) 을 첨가하고, 실온에서 45 분 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액에 아세트산 (176 ㎕, 3.07 mmol) 을 첨가하고, 약 2.1 ㎖ 씩의 반응액을 미리 디에틸에테르/아세토니트릴 (30 ㎖/10 ㎖) 을 첨가한 원침관 (50 ㎖) 4 개에 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 공기, CF16RX) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 4 개의 원침관에 나누어진 고형물을 1 개의 원침관에 모아, 적량의 디에틸에테르/아세토니트릴 (1/1) 및 적량의 디에틸에테르로 세정한 후에, 감압하 건조시켜, 미정제 생성물을 얻었다. 얻어진 고형물을 적량의 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 아세트산을 첨가하여 용해시키고, 수 회로 나누어, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모아, 동결 건조시켰다. 표기 목적 화합물 (416 ㎎) 을 무색 고체로서 얻었다.
(1-2F) DBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP 의 합성
공정 (1-2E) 에서 합성한 화합물 (832 ㎎) 을 N,N-디메틸포름아미드 (12 ㎖), 증류수 (2.4 ㎖) 에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민 (123 ㎕, 0.71 mmol) 을 첨가하였다. 이 용액에 대하여, DBCO-NHS ester (Click Chemistry Tools 제조, 57 ㎎, 142 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (0.4 m) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액에 트리플루오로아세트산 (109 ㎕, 1.42 mmol) 을 첨가하고, 약 2.5 ㎖ 씩의 반응액을 미리 디에틸에테르/아세토니트릴 (30 ㎖/5 ㎖) 을 첨가한 원침관 (50 ㎖) 6 개에 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 공기, CF16RX) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 6 개의 원침관에 나누어진 고형물을 1 개의 원침관에 모아, 적량의 디에틸에테르/아세토니트릴 (1/1) 로 세정한 후에, 감압하 건조시켜, 미정제 생성물을 얻었다. 얻어진 고형물을 적량의 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 아세트산을 첨가하여 용해시키고, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모아, 동결 건조시켰다. 표기 목적 화합물 (620 ㎎) 을 무색 고체로서 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00041
PEG 링커가 갖는 PEG 길이나 PEG 축합수는, 사용하는 Fmoc-PEG 시약, 축합·Fmoc 탈보호의 순서, 및 반복 횟수의 선택에 의해 제어 가능하다. 따라서, 실시예 1-1 혹은 실시예 1-2 의 방법에 이들 요소의 선택을 도입함으로써, DBCO-L(PEG)-hANP 를 자유롭게 합성하는 것이 가능하다. 이하에, 실시예 1-1 에 기재한 방법과 동일한 방법에 따라, Fmoc-PEG 시약, 축합·Fmoc 탈보호의 순서, 및 반복 횟수를 변경하여 합성한 화합물을 나타낸다.
<실시예 1-3> DBCO-PEG(12)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물 1-3) 의 합성
[화학식 39]
Figure 112018131250960-pct00042
(상기 도면에 있어서, 구조식의 우측의 모식도는, 도 1 ∼ 3 및 실시예 3 의 반응식에 표시되는 콘주게이트체 또는 중간체의 모식도 중의 대응 구조를 나타낸다.)
실시예 1-1 의 공정 (1-1E) 에 있어서, 출발 물질을 공정 (1-1B) 에서 합성한 H2N-PEG(12)-hANP(1-28) 로 치환하여 합성함으로써, 표제의 목적 화합물 1-3 을 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00043
<실시예 1-4> DBCO-PEG(24)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물 1-4) 의 합성
[화학식 40]
Figure 112018131250960-pct00044
(상기 도면에 있어서, 구조식의 우측의 모식도는, 도 1 ∼ 3 및 실시예 3 의 반응식에 표시되는 콘주게이트체 또는 중간체의 모식도 중의 대응 구조를 나타낸다.)
실시예 1-1 의 공정 (1-1A) 에 있어서 Fmoc-PEG 시약으로서 Fmoc-PEG(24)-COOH 를 사용하고, 공정 (1-1E) 의 출발물을 당해 방법에 있어서 공정 (1-1B) 에서 얻어진 H2N-PEG(24)-hANP(1-28) 로 치환하여 합성함으로써, 표제의 목적 화합물 1-4 를 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00045
<실시예 1-5> DBCO-PEG(12)-PEG(6)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물 1-5) 의 합성
[화학식 41]
Figure 112018131250960-pct00046
(상기 도면에 있어서, 구조식의 우측의 모식도는, 도 1 ∼ 3 및 실시예 3 의 반응식에 표시되는 콘주게이트체 또는 중간체의 모식도 중의 대응 구조를 나타낸다.)
실시예 1-1 의 공정 (1-1A) 에 있어서 Fmoc-PEG 시약으로서 Fmoc-PEG(6)-COOH 로 치환하여 합성함으로써, 표제의 목적 화합물 1-5 를 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00047
<실시예 1-6> DBCO-PEG(6)-PEG(12)-hANP(1-28) (하기 식의 화합물 1-6) 의 합성
[화학식 42]
Figure 112018131250960-pct00048
(상기 도면에 있어서, 구조식의 우측의 모식도는, 도 1 ∼ 3 및 실시예 3 의 반응식에 표시되는 콘주게이트체 또는 중간체의 모식도 중의 대응 구조를 나타낸다.)
실시예 1-1 의 공정 (1-1C) 에 있어서 Fmoc-PEG 시약으로서 Fmoc-PEG(6)-COOH 로 치환하여 합성함으로써, 표제의 목적 화합물 1-6 을 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00049
<실시예 1-7> DBCO-PEG(6)2-hANP(1-28) (하기 식의 화합물 1-7) 의 합성
[화학식 43]
Figure 112018131250960-pct00050
(상기 도면에 있어서, 구조식의 우측의 모식도는, 도 1 ∼ 3 및 실시예 3 의 반응식에 표시되는 콘주게이트체 또는 중간체의 모식도 중의 대응 구조를 나타낸다.)
실시예 1-1 의 공정 (1-1A) 및 공정 (1-1C) 에 있어서 Fmoc-PEG 시약으로서 Fmoc-PEG(6)-COOH 로 치환하여 합성함으로써, 표제의 목적 화합물 1-7 을 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00051
<실시예 1-8> DBCO-PEG(6)3-hANP(1-28) (하기 식의 화합물 1-8) 의 합성
[화학식 44]
Figure 112018131250960-pct00052
(상기 도면에 있어서, 구조식의 우측의 모식도는, 도 1 ∼ 3 및 실시예 3 의 반응식에 표시되는 콘주게이트체 또는 중간체의 모식도 중의 대응 구조를 나타낸다.)
실시예 1-1 의 공정 (1-1A) 및 공정 (1-1C) 에 있어서 Fmoc-PEG 시약으로서 Fmoc-PEG(6)-COOH 로 치환하고, 공정 (1-1D) 와 (1-1E) 사이에서 추가로 공정 (1-1C) ∼ (1-1D) 를 반복하는 것에 의해 합성함으로써, 표제의 목적 화합물 1-8 을 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00053
<실시예 1-9> DBCO-PEG(6)4-hANP(1-28) (하기 식의 화합물 1-9) 의 합성
[화학식 45]
Figure 112018131250960-pct00054
(상기 도면에 있어서, 구조식의 우측의 모식도는, 도 1 ∼ 3 및 실시예 3 의 반응식에 표시되는 콘주게이트체 또는 중간체의 모식도 중의 대응 구조를 나타낸다.)
실시예 1-1 의 공정 (1-1A) 및 공정 (1-1C) 에 있어서 Fmoc-PEG 시약으로서 Fmoc-PEG(6)-COOH 로 치환하고, 공정 (1-1D) 와 (1-1E) 사이에서 추가로 공정 (1-1C) ∼ (1-1D) 를 2 회 반복하는 것에 의해 합성함으로써, 표제의 목적 화합물 1-9 를 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00055
<실시예 1-10> [N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (하기 식으로 이루어지는 화합물) 의 합성
[화학식 46]
Figure 112018131250960-pct00056
(상기 도면에 있어서, 구조식의 우측의 모식도는, 도 1 ∼ 3 및 실시예 3 의 반응식에 표시되는 콘주게이트체 또는 중간체의 모식도 중의 대응 구조를 나타낸다.)
(1-10A) [N3-PEG(3)]2-SG(10) 의 합성
5 ㎖ 샘플링 튜브 ((주) 이나·옵티카) 에, 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 (Aldrich, 96 ㎕, 0.485 mmol), 디시알로옥타사카라이드 (토쿄 화성 공업 (주), 50 ㎎, 0.24 mmol) 의 수용액 (0.5 ㎖) 을 첨가하고, 1 시간 교반한 후에, 동결 건조시켰다. 동결 건조 후의 5 ㎖ 샘플링 튜브에, HATU (92 ㎎, 0.24 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (0.6 ㎖) 과 디이소프로필에틸아민 (42 ㎕, 0.24 mmol) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 4 시간 교반하였다.
반응 종료 후, 미리 디에틸에테르 (20 ㎖) 를 첨가한 원침관 (50 ㎖) 에 반응액을 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 공기, CF16RX) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 디에틸에테르 (20 ㎖) 를 첨가하고, 데칸테이션하였다. 계속해서, 아세토니트릴 (20 ㎖) 을 첨가하고, 데칸테이션한 후에, 감압하 건조시켜, 미정제 생성물을 얻었다. 얻어진 고형물을 적량의 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액에 용해시키고, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모아, 동결 건조시켜, 표기 목적 화합물 (42 ㎎) 을 무색 고체로서 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00057
(1-10B) [N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox 의 합성
5 ㎖ 샘플링 튜브 ((주) 이나·옵티카 제조) 에, 공정 (1-10A) 에서 합성한 화합물 (40 ㎎), 2-클로로-1,3-디메틸-1H-벤즈이미다졸-3-이움-클로라이드 (CDMBI) (후시미 제약소 제조, 17.9 ㎎, 0.083 mmol) 의 수용액 (200 ㎕) 을 첨가하였다. 빙랭 후의 반응액에 인산삼칼륨 (52.6 ㎎, 0.25 mmol) 의 수용액 (200 ㎕) 을 첨가하고, 빙랭하에서 2 시간 교반하였다. 얻어진 반응액을, 아미콘울트라 (울트라셀 30K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 한외 여과하고, 고형물을 제거하였다. 그 통과액을, 겔 여과 크로마토그래피로 정제하였다. 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 HiPrep 26/10 Desalting (GE 헬스케어 제조) 을 사용하고, 이동상에 0.03 ％ - NH3 수용액을 사용하고, 유속을 10 ㎖/분, 분획 용량을 10 ㎖ 로 하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모아, 1 N 수산화나트륨 수용액 (33 ㎕, 0.033 mmol) 을 첨가하고 동결 건조시켰다. 표기 목적 화합물 (34 ㎎) 을 무색 고체로서 얻었다.
NMR(in D2O) (도 4 의 차트).
<실시예 1-11> [N3-PEG(3)]-MSG1(9)-Ox (하기 식으로 이루어지는 화합물) 의 합성
[화학식 47]
Figure 112018131250960-pct00058
(상기 도면에 있어서, 구조식의 우측의 모식도는, 도 1 ∼ 3 및 실시예 3 의 반응식에 표시되는 콘주게이트체, 중간체 또는 반응식의 모식도 중의 대응 구조를 나타낸다.)
(1-11A) (MSG1-)Asn 의 조제
시판품인 monosialo-Asn free (1S2G/1G2S-10NC-Asn, (주) 당사슬 공학 연구소 제조) (「(MSG-)Asn」이라고 한다) (500 ㎎) 를 이하의 조건에서 역상 HPLC 분리 정제하고, 1st main peak 로서 용출되는 (MSG1-)Asn (유지 시간 15 ∼ 19 분 부근) 과 2nd main peak 로서 용출되는 (MSG2-)Asn (유지 시간 21 ∼ 26 분 부근) 으로 분리하였다. 0.1 ％ 포름산 수용액을 용리액으로서 사용하고, 장치에는 ELS-PDA 트리거 분취 시스템 (니혼 분광 주식회사 제조) 을 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (10 um, 30 Φ x 250 ㎜, GL 사이언스사 제조) 을 사용하고, 유속을 30 ㎖/분 으로 하였다. 용출 중에 UV 검출 (210 ㎚) 된 최초의 피크에 귀속하는 프랙션을 하나로 모아, 동결 건조시켜, 표기 목적 화합물 (238 ㎎) 을 무색 고체로서 얻었다. 상기의 용출 조작으로 UV 검출되는 2 번째의 피크에 귀속하는 프랙션을 모음으로써, (MSG2-)Asn 을 취득할 수 있다.
(1-11B) MSG1(9) 의 합성
공정 (1-11A) 에서 얻어진 화합물 (229 ㎎) 을 200 mM 인산 완충 용액 (pH 6.25) (1145 μL) 에 용해시키고, EndoM (토쿄 화성 공업 (주) 제조, 1 U/㎖)) 수용액 (100 μL) 을 첨가하고, 35 ℃ 에서 6 일간 인큐베이트하였다. 반응 종료 후, 반응액을 VIVASPIN 15R (Hydrosart 막, 30K, 6,000 g) 을 사용하여 한외 여과하고, 얻어진 통과액을 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액을 용리액으로서 사용하고, 장치에는 ELS-PDA 트리거 분취 시스템 (니혼 분광 주식회사 제조), 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스사 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (210 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모아, 동결 건조시켜, 표기 목적 화합물 (117 ㎎) 을 무색 고체로서 얻었다.
(1-11C) [N3-PEG(3)]-MSG1(9) 의 합성
공정 (1-11B) 에서 합성한 화합물 (169 ㎎) 을 사용하고, 공정 (1-10A) 와 동일한 수법에 따라, 표기 목적물 (94.2 ㎎) 을 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00059
(1-11D) [N3-PEG(3)]-MSG1(9)-Ox 의 합성
공정 (1-11C) 에서 합성한 화합물 (100 ㎎) 을 사용하고, 공정 (1-10B) 와 동일한 수법에 따라, 표기 목적물 (89 ㎎) 을 얻었다. NMR(in D2O) (도 5 의 차트).
또, 공정 (1-11B) 의 출발 물질로서, 공정 (1-11A) 의 2 번째의 피크로서 얻어지는 (MSG2-)Asn 을 사용하여, 이후 동일한 조작을 실시함으로써, [N3-PEG(3)]-MSG2(9)-Ox (화합물 1-11 에 있어서, β-Man 의 분기 사슬 중 1-6 사슬측의 시알산에 링커가 결합한 화합물 1-12) 를 합성할 수 있다. 실시예 3-5, 3-6 에 있어서 화합물 1-11 을 화합물 1-12 로 치환함으로써, 2 개의 hANP 펩티드가 상이한 분기 사슬에 연결된 콘주게이트를 합성할 수 있다.
[화학식 48]
Figure 112018131250960-pct00060
<실시예 1-12> [N3-PEG(3)]2-SG(10) 의 합성 - 2
상기 (1-10A) 에서 합성한 [N3-PEG(3)]2-SG(10) 은, 이하의 방법에 의해서도 합성되었다. 이 방법으로 얻어진 화합물을 사용하여, 공정 (1-10B) 를 실시함으로써, 화합물 1-10 을 합성할 수 있다.
(1-12A) ([N3-PEG(3)]2-SG)-Asn-PEG(3)-N3 (하기 식의 화합물) 의 합성
[화학식 49]
Figure 112018131250960-pct00061
공정 (1-2A) 에서 조제한 Fmoc-(SG-)Asn 프리체 (1000 ㎎) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (10 ㎖) 에 대하여, HATU (891 ㎎, 2.34 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 ㎖), 11-아지드-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민 (토쿄 화성 공업 (주), 511 ㎎, 2.34 mmol) 과 디이소프로필에틸아민 (816 ㎕, 4.69 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (3 ㎖) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 3 시간 교반하였다. 추가로, HATU (148 ㎎, 0.39 mmol) 의 N,N-디메틸포름아미드 용액 (500 ㎕) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 1 시간 교반하였다. 그 후에, 피페리딘 (386 ㎕, 3.91 mmol) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 1 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 아세트산 (469 ㎕) 을 첨가하였다.
미리 디에틸에테르 (100 ㎖) 를 첨가한 점보 코니칼 튜브 (175 ㎖) 2 개에 반응액을 절반씩 옮겼다. 소형 원심기 (히타치 공기, CF16RX) 를 이용하여, 고형물을 침전시키고, 상청을 제거하였다. 검 상태의 고형물을 원침관 (50 ㎖) 에 옮기고, 디에틸에테르 (30 ㎖), 아세토니트릴 (10 ㎖) 을 첨가하고, 데칸테이션하였다. 이 조작을 2 회 반복하였다. 동일하게 하여, 적량의 아세토니트릴, 혹은 적량의 디에틸에테르를 첨가하고, 데칸테이션한 후에, 감압하 건조시켜, 미정제 생성물을 얻었다. 얻어진 고형물을 적량의 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액에 용해시키고, 역상 HPLC 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모아, 동결 건조시켜, 표기 목적 화합물 (637 ㎎) 을 무색 고체로서 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00062
(1-12B) [N3-PEG(3)]2-SG(10) (공정 (1-10A) 의 화합물) 의 합성
[화학식 50]
Figure 112018131250960-pct00063
2 ㎖ 의 튜브에, 공정 (1-12A) 에서 합성한 ([N3-PEG(3)]2-SG)-Asn-PEG(3)-N3 (78.6 ㎎) 을 100 mM 인산 버퍼, pH 6.0 (나카라이테스크 (주), 465 ㎕) 에 용해시켰다. 이 용액에 1 U/㎖ EndoM (토쿄 화성 공업 (주), 70 ㎕) 을 첨가하고, 28 ℃ 에서 5 시간 진탕한 후에, 실온에서 4 일간 정치 (靜置) 하였다. 반응 종료 후, 적량의 0.2 ％ 트리플루오로아세트산 수용액을 첨가하고, 역상 HPLC 에 의해 분리 정제하였다. 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 수용액과 0.1 ％ 트리플루오로아세트산아세토니트릴 용액을 용리액으로 하고, 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 Inertsil ODS-3 (GL 사이언스 제조) 을 사용하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 하나로 모아, 동결 건조시켜, 표기 목적 화합물 (40 ㎎) 을 무색 고체로서 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00064
[실시예 2] 캐리어 단백의 조제
<실시예 2-1> 캐리어용 전장 항체 (mAb-A) 의 조제
캐리어용 전장 항체로서, 인간 체내에 존재하지 않는 항원을 인식하는 항 LPS 항체 A (이후, 「mAb-A」라고 한다) (WO2015/046505 에 있어서의 h＃1G5-H1/L1) 를 선택하고, 당해 항체를 WO2015/046505 의 실시예 2, 5 및 7 등에 기재된 방법과 동일한 방법으로 조제하였다. 최종 보존 샘플은, 19.4 ㎎/㎖ 의 mAb-A 용액 (HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH 6.0)) 으로 하였다.
<실시예 2-2> CLCH-A 의 조제
캐리어용 분자로서, IgG1 의 가변 영역을 결손시킨 부분 항체 분자인 CLCH-A 를 이하와 같이 제작하였다.
(2-2A) CH-A 발현 벡터의 구축
인간 중사슬 분비 시그널과 인간 IgG1 정상 영역을 결합한 CH 타입 중사슬 (CH-A) 의 아미노산을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 6) 을 합성하였다. 합성한 DNA 단편을 PCR 에 의해 증폭하고, WO2015/046505 에 기재된 pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 κ 사슬 분비 시그널 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편과 In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여 결합하고, CH-A 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/CH」라고 명명하였다. CH-A 의 아미노산 서열을 서열 번호 7 의 아미노산 번호 20 ∼ 349 (아미노산 번호 1 ∼ 19 는 시그널 서열) 로 나타냈다.
(2-2B) CL-A 발현 벡터의 구축
인간 경사슬 분비 시그널과 인간 κ 사슬 정상 영역을 결합한 CL 타입 경사슬 (CL-A) 의 아미노산을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 8) 을 합성하였다. 공정 (2-2A) 와 동일한 방법으로, CL 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/CL」이라고 명명하였다. CL-A 의 아미노산 서열을 서열 번호 9 의 아미노산 번호 21 ∼ 125 (아미노산 번호 1 ∼ 20 은 시그널 서열) 로 나타냈다.
(2-2C) CLCH-A 의 생산
WO2015/046505 의 실시예 2 에 기재된 방법과 동일한 방법으로, 상기에서 구축한 pCMA/CH 와 pCMA/CL 를 조합하고 FreeStyle 293F 세포 (INVITROGEN 사 제조) 를 사용하여, CH-A 와 CL-A 를 조합한 부분 항체 분자를 포함하는 배양 상청을 얻었다. 얻어진 부분 항체 분자를 「CLCH-A」라고 명명하였다.
(2-2D) CLCH-A 의 정제
공정 (2-2C) 에서 얻어진 배양 상청으로부터 CLCH-A 를, 재조합 Protein A 어피니티 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피의 2 단계 공정으로 정제하였다. 정제 공정과 정제 후의 버퍼 치환, 농축 공정은 4 - 6 ℃ 하에서 실시하였다. 맨 처음에, 배양 상청을, PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 가 충전된 칼럼에 어플라이하였다. 배양액이 칼럼에 전부 들어간 후, 칼럼 용량 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하고, 용출액을 분획하고, 흡광도에 기초하여 CLCH-A 가 포함되는 획분을 모았다. 회수액을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 50 mM MES/20 mM NaCl, pH 6.0 으로의 액 치환을 실시하였다. 회수한 용액을 50 mM MES/20 mM NaCl, pH 6.0 으로 평형화한 HiTrap SP HP (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 에 어플라이하였다. 50 mM MES/20 mM NaCl, pH 6.0 으로 칼럼을 세정한 후, 0 으로부터 200 mM 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출 (10 칼럼 용량) 을 실시하고, 상기와 동일한 방법으로 용출액으로부터 CLCH-A 가 포함되는 획분을 모았다. 회수액을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH 6.0) 로의 액 치환을 실시하였다. 마지막으로 Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사, 4 ℃ 하) 으로 농축하여, 농도를 20 ㎎/㎖ 이상으로 조제하고, CLCH-A 정제 샘플로 하였다.
<실시예 2-3> CLCH-B 의 조제
캐리어용 분자로서, CLCH-A 의 중사슬에 LALA 변이를 도입시킨 부분 항체 분자인 CLCH-B 를 이하와 같이 제작하였다.
(2-3A) CH-B 발현 벡터의 구축
pCMA/CH 를 템플릿으로 하고, 하기 프라이머 세트 (CHLALA-F 및 CHLALA-R) 와 KOD -Plus- Mutagenesis Kit (TOYOBO 사) 를 사용하여, 서열 번호 9 의 아미노산 번호 136-137 의 Leu-Leu (Eu 번호로 Leu234 - Lue235 에 상당) 를 Ala-Ala 로 치환하는 변이를 도입함으로써 CH-B 발현 벡터를 구축하였다. 구축한 발현 벡터를 「pCMA/CH-B」라고 명명하였다. CH-B 를 코드하는 DNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 10 의 뉴클레오티드 번호 58 ∼ 1047 (뉴클레오티드 번호 1 ∼ 57 은 시그널 서열) 로나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 11 의 아미노산 번호 20 ∼ 349 (아미노산 번호 1 ∼ 19 는 시그널 서열) 로 나타냈다.
프라이머 세트
CHLALA-F ; 5'-GCGGGAGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCC-3' (서열 번호 12)
CHLALA-R ; 5'-GGCTTCGGGGGCAGGACAAGGGGGACAGGTG-3' (서열 번호 13).
(2-3B) CLCH-B 의 생산 및 정제
pCMA/CH-B 와 공정 (2-2B) 에서 제작한 pCMA/CL 을 조합하여 공정 (2-2C) 와 동일한 방법으로, CH-B 와 CL-A 를 조합한 부분 항체 분자 (얻어지는 부분 항체 분자를 「CLCH-B」라고 명명하였다.) 를 포함하는 배양 상청을 얻었다. 얻어진 배양 상청으로부터 공정 2-2D 와 동일한 방법으로 부분 항체 분자를 정제하고, CLCH-B 정제 샘플로 하였다.
<실시예 2-4> Fc-B (야생형 Fc) 의 조제
캐리어용 분자로서, IgG1 의 Fc 단편으로 이루어지는 부분 항체 분자인 Fc-B 를 이하와 같이 제작하였다.
(2-4A) Fc-B 발현 벡터의 구축
인간 경사슬 분비 시그널과 인간 Fc 영역을 결합한 Fc-B 의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편 (서열 번호 14) 을 합성하였다. 공정 (2-2A) 와 동일한 방법으로, Fc-B 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pCMA/Fc-B」라고 명명하였다. Fc-B 의 아미노산 서열을 서열 번호 15 의 아미노산 번호 21 ∼ 243 (아미노산 번호 1 ∼ 20 은 시그널 서열) 로 나타냈다.
(2-4B) Fc-B 의 생산
pCMA/Fc-B 를 사용하여, 실시예 (2-2C) 와 동일한 방법으로 Fc-B 를 부분 항체 분자로서 포함하는 배양 상청을 얻었다.
(2-4C) Fc-B 의 정제
공정 (2-4B) 에서 얻어진 배양 상청으로부터 Fc 단편을, 재조합 Protein A 어피니티 크로마토그래피 (4 - 6 ℃ 하) 와 세라믹 하이드록시 아파타이트 (실온하) 의 2 단계 공정으로 정제하였다. 재조합 Protein A 어피니티 크로마토그래피 정제 후와 세라믹 하이드록시 아파타이트 정제 후의 버퍼 치환 공정은 4 - 6 ℃ 하에서 실시하였다. 맨 처음에, 배양 상청을, PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap 칼럼) 에 어플라이하였다. 배양 상청이 칼럼에 전부 들어간 후, 칼럼 용량 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출하고, Fc 단편이 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 PBS 로 치환한 후, 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/pH 7.0 의 버퍼로 5 배 희석한 FC 단편 용액을, 5 mM NaPi/50 mM MES/30 mM NaCl/pH 7.0 의 버퍼로 평형화된 세라믹 하이드록시 아파타이트 칼럼 (니혼 바이오 라드, Bio-Scale CHT Type-l Hydroxyapatite Column) 에 어플라이하였다. 0 으로부터 2 M 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하고, Fc-B 가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH 6.0) 로의 액 치환을 실시하였다. 마지막으로 Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사, 4 ℃ 하) 으로 농축하여, 농도를 10 ㎎/㎖ 로 조제하고, 정제 Fc-B 샘플로 하였다.
<실시예 2-5> Fc-A (LALA 체) 의 조제
캐리어용 분자로서, Fc-B 의 LALA 체이고, N 말단이 연장된, Fc-A 를 이하와 같이 제작하였다.
(2-5A) Fc-A 발현 벡터의 구축
pCMA/Fc-B 를 템플릿으로 하고, 하기 프라이머 세트 (FcLALA-F 및 Fc05-R) 와 KOD -Plus- Mutagenesis Kit (TOYOBO 사) 를 사용하여, 서열 번호 15 의 아미노산 번호 30 - 31 의 Leu-Leu (Eu 번호로 Leu234 - Lue235 에 상당) 를 Ala-Ala 로 치환시키며, 또한, N 말단에 4 아미노산 (DKTH) 을 부가하는 변이를 도입함으로써 Fc-A 발현 벡터를 구축하였다. 구축한 발현 벡터를 「pCMA/Fc-A」라고 명명하였다. Fc-A 를 코드하는 DNA 의 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 16 의 뉴클레오티드 번호 61 ∼ 741 (뉴클레오티드 번호 1 ∼ 60 은 시그널 서열) 로 나타내고, 아미노산 서열을 서열 번호 17 의 아미노산 번호 21 ∼ 247 (아미노산 번호 1 ∼ 20 은 시그널 서열) 로 나타냈다.
프라이머 세트
FcLALA-F ; 5'-TGTCCTGCTCCAGAGGCCGCGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCC-3' (서열 번호 18)
Fc05-R ; 5'-TGGAGGACAGGTGTGAGTTTTGTCGCCGTAGGCGCCGCTGATCCACAGCAG-3' (서열 번호 19)
(2-5B) Fc-A 의 생산 및 정제
pCMA/Fc-A 를 사용하여, 공정 (2-2C) 와 동일한 방법으로 Fc-A 를 부분 항체 분자로서 포함하는 배양 상청을 얻었다. 얻어진 배양 상청으로부터 실시예 2-4C 와 동일한 방법으로 정제하고, Fc-A 정제 샘플로 하였다.
[실시예 3] 콘주게이트의 제작
본 실시예에서 제조된 각 콘주게이트체에는, 그 구조적 특징을 표시하는 명칭을 부여하였다. 당해 명칭은, 원칙적으로 상기의 명세서에 정의한 명명법을 채용하지만, 완전한 구조는 도면이나 구조식을 참조하여 특정된다. PEG 링커에 있어서, 「//」는 아지드기와 DBCO 의 반응에 의해 형성되는 1,2,3-트리아졸 고리를 나타내고, 「-」는 아미드 결합을 나타낸다.
<실시예 3-1> mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4 (화합물 3-1) 의 합성
(3-1A) (Fucα1,6)GlcNAc-mAb-A 의 조제
[화학식 51]
Figure 112018131250960-pct00065
실시예 2-1 에서 조정한 mAb-A 용액 19.4 ㎎/㎖ (5 ％ 소르비톨/25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0)) (26.0 ㎖) 를 아미콘울트라 (울트라셀 30K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 완충액 교환을 실시하였다. 얻어진 24.5 ㎎/㎖ mAb1 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (20.0 ㎖) 에 2.00 ㎎/㎖ 야생형 EndoS 용액 (PBS) (1.26 ㎖) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 3 시간 인큐베이트하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 이하의 방법에 따라, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제를 실시하였다.
(1) 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA pure150 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : HiTrap rProtein A FF (5 ㎖) (GE 헬스케어 제조)
유속 : 5 ㎖/분 (차지시에는 1.25 ㎖/분)
상기에서 얻은 반응액을 5 회로 나누어 정제하였다. 칼럼에 대한 결합시에는, 반응액을 칼럼 상부에 첨가하고, 결합 버퍼 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)) 를 1.25 ㎖/분으로 2 CV 흘리고, 추가로 5 ㎖/분으로 5 CV 흘렸다. 중간 세정시에는, 세정 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 염화나트륨 용액) 을 15 CV 흘렸다. 용출시에는, 용출 버퍼 (ImmunoPure IgG Eution buffer, PIERCE 제조) 를 6 CV 흘렸다. 용출액을 1 M 트리스 완충액 (pH 9.0) 으로 즉시 중화하였다. 용출 중에 UV 검출 (280 ㎚) 된 프랙션에 대하여, 미량 분광 광도계 Xpose (Trinean 제조), 및 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다.
목적물을 포함하는 프랙션을 아미콘울트라 (울트라셀 30K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 농축하고, 완충액 (5 mM 인산 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8)) 교환을 실시하였다.
(2) 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA pure150 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : Bio-Scale Mini CHT Type I 카트리지 (5 ㎖) (BIO-RAD 제조)
유속 : 5 ㎖/분 (차지시에는 1.25 ㎖/분)
칼럼을 2 연결하고, 상기 (1) 에서 얻어진 용액을 2 회로 나누어 정제하였다. 용액을 칼럼의 상부에 첨가하고, A 액 (5 mM 인산 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8)) 을 1.25 ㎖/분으로 2 CV 흘리고, 추가로 5 ㎖/분으로 3 CV 흘렸다. 그 후, A 액과 B 액 (5 mM 인산 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.8), 2 M 염화나트륨 용액) 을 사용하여, 용출하였다. 용출 조건은, A 액 : B 액 ＝ 100 : 0 ∼ 0 : 100 (15 CV) 이다. 추가로, 세정 용액 (500 mM 인산 완충액 (pH 6.5)) 을 5 CV 흘렸다.
용출 중에 UV 검출 (280 ㎚) 된 프랙션에 대하여, 미량 분광 광도계 Xpose (Trinean 제조), 및 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다.
목적물을 포함하는 프랙션을 아미콘울트라 (울트라셀 30K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 농축하고, 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 완충액 교환을 실시하여, 23.7 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-mAb-A 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (19.9 ㎖) 이 얻어졌다.
Figure 112018131250960-pct00066
(3-1B) mAb-A-[PEG(3)-N3]4 의 조제
[화학식 52]
Figure 112018131250960-pct00067
[화학식 53]
Figure 112018131250960-pct00068
(상기 식은, SG 형 N297 당사슬의 비환원 말단 시알산에 아지드기가 도입된 링커 구조를 나타낸다. 실시예 3 에 있어서, N297 당사슬에 아지드기를 도입한 중간체의 링커 구조는 모두 상기 식과 동일한 구조이다.)
공정 (3-1A) 에서 얻어진 23.7 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-mAb-A 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (8.90 ㎖) 에 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) (1.65 ㎖), 실시예 1-10 에서 합성한 [N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (33.8 ㎎) 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 용액 (0.676 ㎖), 2.10 ㎎/㎖ EndoS D233Q/Q303L 용액 (PBS) (1.98 ㎖) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 3.5 시간 인큐베이트하였다. 이상의 조작을 2 로트분 실시하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제시의 결합 버퍼를 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 으로부터 20 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 변경하고, 공정 (3-1A) 과 동일한 방법에 따라, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제를 실시한 후, 목적물을 포함하는 프랙션을 아미콘울트라 (울트라셀 30K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 농축, 계속해서 20 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 완충액 교환을 실시하여, 20.5 ㎎/㎖ mAb-A-[PEG(3)-N3]4 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (19.0 ㎖) 이 얻어졌다.
Figure 112018131250960-pct00069
(3-1C) mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4 (하기 식의 목적 화합물, 화합물 3-1) 의 조제
[화학식 54]
Figure 112018131250960-pct00070
[화학식 55]
Figure 112018131250960-pct00071
(상기 식은, 화합물 3-1 에 있어서의, N297 당사슬의 시알산, PEG 링커 및 hANP 펩티드의 구조를 나타낸다. 식 중, 클릭 (Click) 반응으로 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 화합물 3-1 은 상기 식의 좌우의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다. 화합물 3-1 에는, 모든 N297 당사슬의 비환원 말단 시알산이 상기 식의 링커에 의해 수식되어 있기 때문에, 콘주게이트 1 분자당 4 개의 hANP(1-28) 이 연결되어 있다.)
공정 (3-1B) 에서 얻어진 20.5 ㎎/㎖ mAb-A-[PEG(3)-N3]4 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (2.44 ㎖) 에 20 mM 인산 완충액 (pH 6.0) (1.56 ㎖), 디메틸술폭시드 (0.736 ㎖), 실시예 1-1 에서 합성한 DBCO-PEG(12)2-hANP(1-28) (12.9 ㎎) 디메틸술폭시드 용액 (0.264 ㎖) 을 DBCO 화합물로서 첨가하고, 30 ℃ 에서 16 시간 인큐베이트하였다 (Click 반응). 반응액을 NAP25 (GE 헬스케어 제조), 20 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 조 (粗) 정제하였다. 반응의 진행 정도를, 하기의 조건에 의한 소수성 상호 작용 크로마토그래피로 확인 후, 하기의 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하였다.
(1) 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의한 분석 조건
분석 장치 : 히타치 D-7000 (히타치 제조)
칼럼 : TSKgel Butyl-NPR (4.6 x 100 ㎜) (토소 제조)
이동층 : A 액 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 2 M 황산암모늄 용액
B 액 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)
그레이디언트 : A : B ＝ 75 : 25 ∼ 0 : 100 (0 ∼ 25 분) - 0 : 100 (25 ∼ 30 분)
온도 : 25 ℃
파장 : 214 ㎚
유속 : 1 ㎖/분
(2) 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA pure150 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : HiTrap rProtein A FF (5 ㎖) (GE 헬스케어 제조)
유속 : 5 ㎖/분 (차지시에는 1.25 ㎖/분)
칼럼에 대한 결합시에는, 상기에서 얻은 반응액을 칼럼 상부에 첨가하고, 결합 버퍼 (20 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) 를 1.25 ㎖/분으로 2 CV 흘리고, 추가로 5 ㎖/분으로 5 CV 흘렸다. 중간 세정시에는, 세정 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 염화나트륨 용액) 을 10 CV 흘렸다. 용출시에는, 용출 버퍼 (ImmunoPure IgG Elution buffer, PIERCE 제조) 를 6 CV 흘렸다. 용출액을 1 M 트리스 완충액 (pH 9.0) 으로 즉시 중화하였다. 용출 중에 UV 검출 (280 ㎚) 된 프랙션에 대하여, 미량 분광 광도계 Xpose (Trinean 제조), 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 사용하여 확인하였다.
목적물을 포함하는 프랙션을 아미콘울트라 (울트라셀 30K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 농축하고, 5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) 으로 완충액 교환을 실시하고, 필터 (Millex-GV, 0.22 ㎛, PVDF, 멸균 완료, Merck Millipore 제조) 로 여과하여, 19.4 ㎎/㎖ mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (2.14 ㎖) 이 얻어졌다.
Figure 112018131250960-pct00072
<실시예 3-2> mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4 (하기 식의 목적 화합물, 화합물 3-2) 의 합성
[화학식 56]
Figure 112018131250960-pct00073
[화학식 57]
Figure 112018131250960-pct00074
(상기 식은, 화합물 3-2 에 있어서의, N297 당사슬의 시알산, PEG 링커 및 hANP 펩티드의 구조를 나타낸다. 식 중, Click 반응으로 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 화합물 3-2 는 상기 식의 좌우의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다. 화합물 3-2 에는, 모든 N297 당사슬의 비환원 말단 시알산이 상기 식의 링커에 의해 수식되어 있기 때문에, 콘주게이트 1 분자당 4 개의 hANP(1-28) 이 연결되어 있다.)
공정 (3-1B) 에서 얻어진 20.5 ㎎/㎖ mAb-A-[PEG(3)-N3]4 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (5.51 ㎖), 20 mM 인산 완충액 (pH 6.0) (2.49 ㎖), 디메틸술폭시드 (1.40 ㎖), 공정 (1-2F) 에서 합성한 DBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) (43.1 ㎎) 디메틸술폭시드 용액 (0.596 ㎖) 을 사용하여, 30 ℃ 에서 16 시간 인큐베이트하였다. 이상의 조작을 2 로트분 실시하였다. 이하 공정 (3-1C) 와 동일한 방법으로 21.6 ㎎/㎖ mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (10.2 ㎖) 이 얻어졌다.
Figure 112018131250960-pct00075
<실시예 3-3> CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4 (화합물 3-3) 의 합성
(3-3A) (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A 의 조제
[화학식 58]
Figure 112018131250960-pct00076
실시예 2-2 에서 조정한 21.6 ㎎/㎖ CLCH-A 용액 (5 ％ 소르비톨/25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0)) (21.0 ㎖) 을 아미콘울트라 (울트라셀 10K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 완충액 교환을 실시하였다. 얻어진 22.0 ㎎/㎖ CLCH-A 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (20.0 ㎖) 에 2.00 ㎎/㎖ 야생형 EndoS 용액 (PBS) (2.27 ㎖) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 6 시간 인큐베이트하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 공정 (3-1A) 와 동일한 방법에 따라, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제를 실시한 후, 목적물을 포함하는 프랙션을 아미콘울트라 (울트라셀 10K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 농축, 계속해서, 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 완충액 교환을 실시하여, 21.1 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (20.4 ㎖) 이 얻어졌다.
Figure 112018131250960-pct00077
(3-3B) CLCH-A-[PEG(3)-N3]4 의 조제
[화학식 59]
Figure 112018131250960-pct00078
공정 (3-3A) 에서 얻어진 21.1 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (4.65 ㎖) 에 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) (2.66 ㎖), 실시예 1-10 에서 합성한 [N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (23.5 ㎎) 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 용액 (0.470 ㎖), 2.10 ㎎/㎖ EndoS D233Q/Q303L 용액 (PBS) (1.40 ㎖) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 3 시간 인큐베이트하였다. 추가로, (1-10B) 에서 합성한 [N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (11.8 ㎎) 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 용액 (0.236 ㎖) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 1 시간 인큐베이트하였다. 이상의 조작을 3 로트분 실시하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 어피니티 칼럼에 의한 정제시의 결합 버퍼를 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 으로부터 20 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 변경하고, 공정 (3-1A) 와 동일한 방법에 따라, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제를 실시한 후, 목적물을 포함하는 프랙션을 아미콘울트라 (울트라셀 10K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 농축, 계속해서, 5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) 으로 완충액 교환을 실시하여, 19.3 ㎎/㎖ CLCH-A-[PEG(3)-N3]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (13.8 ㎖) 이 얻어졌다.
Figure 112018131250960-pct00079
(3-3C) CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4 (화합물 3-3) 의 조제
[화학식 60]
Figure 112018131250960-pct00080
[화학식 61]
Figure 112018131250960-pct00081
(상기 식은, 화합물 3-3 에 있어서의, N297 당사슬의 시알산, PEG 링커 및 hANP 펩티드의 구조를 나타낸다. 식 중, Click 반응으로 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 화합물 3-3 은 상기 식의 좌우의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다. 화합물 3-3 에는, 모든 N297 당사슬의 비환원 말단 시알산이 상기 식의 링커에 의해 수식되어 있기 때문에, 콘주게이트 1 분자당 4 개의 hANP(1-28) 이 연결되어 있다.)
공정 (3-3B) 에서 얻어진 19.3 ㎎/㎖ CLCH-A-[PEG(3)-N3]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (5.18 ㎖) 에 5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) (2.82 ㎖), 디메틸술폭시드 (1.18 ㎖), 실시예 1-1 에서 합성한 DBCO-PEG(12)2-hANP(1-28) (40.1 ㎎) 디메틸술폭시드 용액 (0.816 ㎖) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 16 시간 인큐베이트하였다. 이상의 조작을 2 로트분 실시하였다. 반응액을 NAP25 (GE 헬스케어 제조), 20 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 조정제하였다. 반응의 진행 정도를 하기 조건의 소수성 상호 작용 크로마토그래피로 확인 후, 하기의 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하였다.
(1) 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의한 분석 조건
분석 장치 : 히타치 D-7000 (히타치 제조)
칼럼 : TSKgel Butyl-NPR (4.6 x 100 ㎜) (토소 제조)
이동층 : A 액 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 2 M 황산암모늄 용액
B 액 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)
그레이디언트 : A : B ＝ 75 : 25 ∼ 0 : 100 (0 ∼ 25 분) - 0 : 100 (25 ∼ 30 분)
온도 : 25 ℃
파장 : 214 ㎚
유속 : 1 ㎖/분
(2) 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA pure150 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : HiTrap rProtein A FF (5 ㎖) (GE 헬스케어 제조)
유속 : 5 ㎖/분 (차지시에는 1.25 ㎖/분)
상기에서 얻은 2 로트분의 반응액을 3 회로 나누어 정제하였다. 칼럼에 대한 결합시에는, 반응액을 칼럼 상부에 첨가하고, 결합 버퍼 (20 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) 를 1.25 ㎖/분으로 4 CV 흘리고, 추가로 5 ㎖/분으로 5 CV 흘렸다. 중간 세정시에는, 세정 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 염화나트륨 용액) 을 10 CV 흘렸다. 용출시에는, 용출 버퍼 (ImmunoPure IgG Eution buffer, PIERCE 제조) 를 6 CV 흘렸다. 용출액을 1 M 트리스 완충액 (pH 9.0) 으로 즉시 중화하였다. 용출 중에 UV 검출 (280 ㎚) 된 프랙션에 대하여, 미량 분광 광도계 Xpose (Trinean 제조), 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 사용하여 확인하였다.
목적물을 포함하는 프랙션을 아미콘울트라 (울트라셀 10K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 농축하고, 5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) 으로 완충액 교환을 실시하고, 필터 (Millex-GV, 0.22 ㎛, PVDF, 멸균 완료, Merck Millipore 제조) 로 여과하여, 21.3 ㎎/㎖ CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (9.60 ㎖) 이 얻어졌다.
Figure 112018131250960-pct00082
<실시예 3-4> CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4 (하기 식의 목적 화합물, 화합물 3-4) 의 합성
[화학식 62]
Figure 112018131250960-pct00083
[화학식 63]
Figure 112018131250960-pct00084
(상기 식은, 화합물 3-4 에 있어서의, N297 당사슬의 시알산, PEG 링커 및 hANP 펩티드의 구조를 나타낸다. 식 중, Click 반응으로 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 화합물 3-4 는 상기 식의 좌우의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다. 화합물 3-4 에는, 모든 N297 당사슬의 비환원 말단 시알산이 상기 식의 링커에 의해 수식되어 있기 때문에, 콘주게이트 1 분자당 4 개의 hANP(1-28) 이 연결되어 있다.)
공정 (3-3B) 에서 얻어진 19.3 ㎎/㎖ CLCH-A-[PEG(3)-N3]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (2.59 ㎖), 5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) (1.41 ㎖), 디메틸술폭시드 (0.602 ㎖), 실시예 1-2 에서 합성한 DBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) (28.7 ㎎) 디메틸술폭시드 용액 (0.398 ㎖) 을 사용하여, 30 ℃ 에서 16 시간 인큐베이트하였다. 이하 공정 (3-3C) 와 동일한 방법으로, 20.0 ㎎/㎖ CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (2.46 ㎖) 이 얻어졌다.
Figure 112018131250960-pct00085
<실시예 3-5> mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP]2 의 합성 (화합물 3-5)
(3-5A) mAb-A-[PEG(3)-N3]2 의 조제
[화학식 64]
Figure 112018131250960-pct00086
공정 (3-1A) 에서 합성한 화합물에 대하여, 실시예 1-11 에서 합성한 [N3-PEG(3)]-MSG1(9)-Ox 를 당사슬 공여체로서 사용하고, 30 ℃ 에서 3 시간 인큐베이트하고, 공정 (3-1B) 와 동일한 조작을 실시함으로써, 14.1 ㎎/㎖ mAb-A-[PEG(3)-N3]2 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (5.90 ㎖) 을 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00087
(3-5B) mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]2 (하기 식의 목적 화합물, 화합물 3-5) 의 조제
[화학식 65]
Figure 112018131250960-pct00088
[화학식 66]
Figure 112018131250960-pct00089
(상기 구조식은, 화합물 3-5 에 있어서의, N297 당사슬의 시알산, PEG 링커 및 hANP 펩티드의 구조를 나타내는 식 중, Click 반응으로 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 화합물 3-5 는 상기 식의 좌우의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다. 화합물 3-5 에는, 모든 N297 당사슬의 비환원 말단 시알산이 상기 식의 링커에 의해 수식되어 있기 때문에, 콘주게이트 1 분자당 2 개의 hANP(1-28) 이 연결되어 있다.)
공정 (3-5A) 에서 합성한 화합물에 대하여, 실시예 1-2 에서 합성한 DBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) 4 당량을 사용하여, 실시예 3-2 와 동일한 조작을 실시함으로써, 17.9 ㎎/㎖ mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]2 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (2.55 ㎖) 을 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00090
<실시예 3-6> CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]2 (화합물 3-6) 의 합성
(3-6A) CLCH-A-[PEG(3)-N3]2 의 조제
[화학식 67]
Figure 112018131250960-pct00091
공정 (3-3A) 에서 합성한 화합물에 대하여, 실시예 1-11 에서 합성한 [N3-PEG(3)]-MSG1(9)-Ox 를 당사슬 공여체로서 사용하고, 30 ℃ 에서 3 시간 인큐베이트하고, (3-3B) 와 동일한 조작을 실시함으로써, 14.6 ㎎/㎖ CLCH-A-[PEG(3)-N3]2 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (3.98 ㎖) 을 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00092
(3-6B) CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-ANP(1-28)]2 의 조제
[화학식 68]
Figure 112018131250960-pct00093
[화학식 69]
Figure 112018131250960-pct00094
(상기 식은, 화합물 3-6 에 있어서의, N297 당사슬의 시알산, PEG 링커 및 hANP 펩티드의 구조를 나타낸다. 식 중, Click 반응으로 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 화합물 3-6 은 상기 식의 좌우의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다. 화합물 3-6 에는, 모든 N297 당사슬의 비환원 말단 시알산이 상기 식의 링커에 의해 수식되어 있기 때문에, 콘주게이트 1 분자당 2 개의 hANP(1-28) 이 연결되어 있다.)
공정 (3-6A) 에서 합성한 화합물에 대하여, 실시예 1-2 에서 합성한 DBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) 4 당량을 사용하여, 실시예 3-4 와 동일한 조작을 실시함으로써, 19.2 ㎎/㎖ CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-ANP(1-28)]2 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (2.62 ㎖) 을 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00095
<실시예 3-7> 다양한 링커 구조를 갖는 콘주게이트 (화합물 3-7 ∼ 화합물 3-14) 의 합성
[화학식 70]
Figure 112018131250960-pct00096
어느 모노클로날 항체 (mAb-B) 에 대하여, 실시예 3-1 에 기재된 방법을 사용함으로써, mAb-B-[PEG(3)-N3]4 를 합성하였다. 계속해서, Click 반응에 사용하는 DBCO 화합물로서, 실시예 1 에서 합성한 화합물 1-1, 화합물 1-3, 화합물 1-4, 화합물 1-5, 화합물 1-6, 화합물 1-7, 화합물 1-8 및 화합물 1-9 를 구분하여 사용함으로써, PEG 링커 부분의 구조가 상이한 mAb-B-[L(PEG)-hANP(1-28)]4 를 합성하였다. 사용한 DBCO 화합물과 목적으로 하는 콘주게이트의 구조의 대응을 표 1 에 나타낸다 (각 화합물에 대응하는 L(PEG) 는, 화합물 3-7 : L(PEG)B, 화합물 3-8 : L(PEG)E, 화합물 3-9 : L(PEG)A, 화합물 3-10 : L(PEG)D, 화합물 3-11 : L(PEG)C, 화합물 3-12 : L(PEG)F, 화합물 3-13 : L(PEG)G, 화합물 3-14 : L(PEG)H). 화합물 3-1 ∼ 3-6 과 동일하게, 어느 화합물에 있어서도, Click 반응으로 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 기하 이성 구조를 갖는 링커를 혼합하여 유지한다. 또, 콘주게이트 1 분자당 4 개의 hANP(1-28) 이 연결되어 있다.
Figure 112018131250960-pct00097
<실시예 3-8> CLCH-B-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4 (상기 화합물 3-2 의 구조에 있어서, CLCH-A 가 CLCH-B 로 치환된 목적 화합물, 화합물 3-15) 의 합성
본 실시예의 각 공정의 반응 스킴 및 물질의 구조는, 실시예 3-2 의 대응하는 스킴에 있어서 CLCH-A 를 CLCH-B 로 치환한 것이다.
(3-8A) (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-B 의 조제
공정 (3-3A) 에 기재한 CLCH-A 용액의 부분을, 실시예 2-3 에서 조정한 20.6 ㎎/㎖ 의 CLCH-B 용액 (5 ％ 소르비톨/25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0)) 으로 치환하고, 공정 (3-3A) 에 기재된 방법에 준하여, 19.8 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-B 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (16 ㎖) 이 얻어졌다.
Figure 112018131250960-pct00098
(3-8B) CLCH-B-[PEG(3)-N3]4 의 조제
공정 (3-3B) 에 기재한 (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A 용액의 부분을, 공정 (3-8A) 에서 얻어진 19.8 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-B 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) 으로 치환하고, 공정 (3-3B) 에 기재된 방법에 준하여, 19.3 ㎎/㎖ CLCH-B-[PEG(3)-N3]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (15.7 ㎖) 이 얻어졌다.
Figure 112018131250960-pct00099
(3-8C) CLCH-B-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4 (화합물 3-15) 의 조제
공정 (3-8B) 에서 얻어진 19.3 ㎎/㎖ CLCH-B-[PEG(3)-N3]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (3.90 ㎖), 5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) (4.1 ㎖), 디메틸술폭시드 (1.4 ㎖) 및 실시예 1-2 에서 합성한 DBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) (43.4 ㎎) 디메틸술폭시드 용액 (0.6 ㎖) 을 혼합하고, 30 ℃ 에서 16 시간 인큐베이트하였다. 상기 조작을 4 로트 실시하였다. 이하 공정 (3-3C) 와 동일한 방법으로, 27.1 ㎎/㎖ CLCH-B-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (11.5 ㎖) 이 얻어졌다.
Figure 112018131250960-pct00100
<실시예 3-9> Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4 (하기 식의 목적 화합물, 화합물 3-16) 의 합성
(3-9A) (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A 의 조제
[화학식 71]
Figure 112018131250960-pct00101
(상기 식은, 조제된 캐리어 단백에 당사슬 구조 결손체가 포함되는 것에서 유래하는 혼합물을 나타내고 있다. n ＝ 1 외에, n ＝ 0 이 포함되어 있어도 된다.)
실시예 2-5 에서 조제한 Fc-A 용액 10.4 ㎎/㎖ (5 ％ 소르비톨/25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0)) (80.0 ㎖) 를 VIVASPIN 20 (10,000MWCO, Sartorius 제조) 을 사용하여 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 완충액 교환을 실시하고, 약 50 ㎖ 로 하였다. 얻어진 Fc-A 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) 을 2 개의 비오라모 원침관 (VIO-50B) 에 나누어 7.70 ㎎/㎖ 야생형 EndoS 용액 (PBS) (0.8 ㎖) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 이하의 방법에 따라, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제를 실시하였다.
(1) 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA pure150 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : MediaScout ValiChrom 25 ㎜ ID x 100 ㎜ H ; V ＝ 50.0 ㎖
담체 : KANEKA KanCapA
유속 : 40 ㎖/분 (샘플 첨가시에는 10 ㎖/분)
상기에서 얻은 반응액 (x2 개) 을 0.45 um PVDF 필터로 여과하고, 약 40 ㎖ (x2) 로 하고, 2 회로 나누어 정제하였다. 칼럼에 대한 결합시에는, 반응액을 칼럼 상부에 첨가하고, 결합 버퍼 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)) 를 10 ㎖/분으로 4.4 CV 흘리고, 추가로 40 ㎖/분으로 5 CV 흘렸다. 중간 세정시에는, 세정 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 염화나트륨 용액) 을 10 CV 흘렸다. 용출시에는, 용출 버퍼 (ImmunoPure IgG Elution buffer, PIERCE 제조) 를 6 CV 흘렸다. 용출액을 1 M 트리스 완충액 (pH 9.0) 으로 즉시 중화하였다. 용출 중에 UV 검출 (280 ㎚) 된 프랙션에 대하여, 필요에 따라, 미량 분광 광도계 Xpose (Trinean 제조), 및 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 VIVASPIN 20 (10,000MWCO, Sartorius 제조) 을 사용하여 농축하고, 완충액 (5 mM 인산 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 7.0)) 교환하였다.
(2) 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA pure150 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : MediaScout ValiChrom 25 ㎜ ID x 100 ㎜ H ; V ＝ 50.0 ㎖
담체 : BIO-RAD CHT Type I 40 um
유속 : 20 ㎖/분 (샘플 첨가시에는 10 ㎖/분)
상기 (1) 에서 얻어진 용액을 0.45 um PVDF 필터로 여과하고, 약 40 ㎖ 씩 2 개로 나누었다. 이들을 이하의 공정에 의해, 2 회로 나누어 정제하였다. 용액을 칼럼의 상부에 첨가하고, A 액 (5 mM 인산 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 7.0)) 을 10 ㎖/분으로 4.2 CV 흘리고, 추가로 20 ㎖/분으로 2 CV 흘렸다. 그 후, A 액과 B 액 (5 mM 인산 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 7.0), 2 M 염화나트륨 용액) 을 사용하여, 용출하였다. 용출 조건은, A 액 : B 액 ＝ 100 : 0 ∼ 0 : 100 (15 CV) 이다. 추가로, 세정 용액 (500 mM 인산 완충액 (pH 6.5)) 을 5 CV 흘렸다.
용출 중에 UV 검출 (280 ㎚) 된 프랙션에 대하여, 필요에 따라 미량 분광 광도계 Xpose (Trinean 제조), 및 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다.
목적물을 포함하는 프랙션을 VIVASPIN 20 (10,000MWCO, Sartorius 제조) 을 사용하여 농축하고, 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 완충액 교환을 실시하고, 얻어진 용액을 24 ㎖ 씩 4 개의 용기에 나누어, 이하의 용액 a ∼ d 로 하였다.
용액 a : 7.24 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (24 ㎖) (173.8 ㎎)
용액 b : 7.42 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (24 ㎖) (178.1 ㎎)
용액 c : 7.18 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (24 ㎖) (172.3 ㎎)
용액 d : 7.19 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (24 ㎖) (
Figure 112018131250960-pct00102
(3-9B) Fc-A-[PEG(3)-N3]4 의 조제
[화학식 72]
Figure 112018131250960-pct00103
(상기 식은, 조제된 캐리어 단백에 당사슬 구조 결손체가 포함되는 것에서 유래하는 혼합물을 나타내고 있다. n ＝ 1 외에, n ＝ 0 이 포함되어 있어도 된다.)
공정 (3-8A) 에서 얻어진 4 개의 (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (24 ㎖) 을 각각 2 개로 나누고, 합계 8 개의 50 ㎖ 원침관에 나누었다.
1 개의 (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (12 ㎖) 에, 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) (1.65 ㎖), 실시예 1-10 에서 합성한 [N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (56.0 ㎎) 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 용액 (1.0 ㎖) 및 4.3 ㎎/㎖ EndoS D233Q/Q303L 용액 (PBS) (1.16 ㎖) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 4 시간 인큐베이트하였다. 이상의 조작을 8 로트분 실시하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제시의 결합 버퍼를 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 으로부터 20 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 변경하고, 공정 (3-9A) 와 동일한 방법에 따라, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하였다. 목적물을 포함하는 프랙션을 모두 모은 후, 한외 여과막 (Pellicon XL50 Cassette Ultracel 10kDa (2 개 사용)) 을 장착한 한외 여과 장치 (CogentμScale TFF System) 를 사용하여, 약 100 ㎖ 로 농축하였다. VIVASPIN 20 (10,000MWCO, Sartorius 제조) 을 사용하여 5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) 으로 완충액 교환을 실시하고, 얻어진 용액을 2 개의 용기에 나누어, 이하의 용액 a 및 용액 b 를 얻었다.
용액 a : 12.45 ㎎/㎖ Fc-A-[PEG(3)-N3]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (19.7 ㎖) (245.3 ㎎)
용액 b : 14.95 ㎎/㎖ Fc-A-[PEG(3)-N3]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (19.5 ㎖) (291.5 ㎎)
Figure 112018131250960-pct00104
(3-9C) Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4 (화합물 3-16) 의 조제
[화학식 73]
Figure 112018131250960-pct00105
(상기 식은, 조제된 캐리어 단백에 당사슬 구조 결손체가 포함되는 것에서 유래하는 혼합물을 나타내고 있다. n ＝ 1 외에, n ＝ 0 이 포함되어 있어도 된다.)
[화학식 74]
Figure 112018131250960-pct00106
(상기 식은, 화합물 3-16 에 있어서의, N297 당사슬의 시알산, PEG 링커 및 hANP 펩티드의 구조를 나타낸다. 식 중, Click 반응으로 형성되는 트리아졸 고리는 기하 이성을 갖고, 화합물 3-16 은 상기 식의 좌우의 구조로 이루어지는 링커를 혼합하여 유지한다. 화합물 3-16 에는, 모든 N297 당사슬의 비환원 말단 시알산이 상기 식의 링커에 의해 수식되어 있기 때문에, 콘주게이트 1 분자당, 통상체 Fc-A 에서는 4 개의 hANP(1-28), 당사슬 결손체 Fc-A 에서는 2 개의 hANP(1-28) 이 연결되어 있다.)
공정 (3-9B) 에서 조제한 용액 a 인 12.45 ㎎/㎖ Fc-A-[PEG(3)-N3]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (4.0 ㎖), 5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) (6.0 ㎖), 디메틸술폭시드 (1.9 ㎖), 및 실시예 1-2 에서 합성한 DBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) (45.1 ㎎) 디메틸술폭시드 용액 (0.62 ㎖) 을 혼합하고, 30 ℃ 에서 16 시간 인큐베이트하였다. 상기 조작을 용액 a 에 대하여 4 로트 실시하였다. 또, 공정 (3-9B) 에서 조제한 용액 b 인 14.95 ㎎/㎖ Fc-A-[PEG(3)-N3]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (3.3 ㎖), 5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) (6.7 ㎖), 디메틸술폭시드 (1.9 ㎖), 및 실시예 1-2 에서 합성한 DBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) (45.1 ㎎) 디메틸술폭시드 용액 (0.62 ㎖) 을 혼합하고, 30 ℃ 에서 16 시간 인큐베이트하였다. 상기 조작을 용액 b 에 대하여 4 로트 실시하였다. 이와 같이 하여 얻어진 합계 8 로트분의 반응액을 NAP25 (GE 헬스케어 제조), 20 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 조정제하였다. 반응의 진행 정도를 하기 조건의 소수성 상호 작용 크로마토그래피로 확인 후, 하기의 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하였다.
(1) 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의한 분석 조건
분석 장치 : 히타치 D-7000 (히타치 제조)
칼럼 : TSKgel Butyl-NPR (4.6 x 100 ㎜) (토소 제조)
이동층 : A 액 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 2 M 황산암모늄 용액
B 액 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)
그레이디언트 : A : B ＝ 75 : 25 ∼ 0 : 100 (0 ∼ 25 분) - 0 : 100 (25 ∼ 30 분)
온도 : 25 ℃
파장 : 214 ㎚
유속 : 1 ㎖/분
(2) 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA pure150 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : MediaScout ValiChrom 25 ㎜ ID x 100 ㎜ H ; V ＝ 50.0 ㎖
담체 : KANEKA KanCapA
유속 : 40 ㎖/분 (샘플 첨가시에는 10 ㎖/분)
상기에서 얻어진 용액을 0.45 um PVDF 필터로 여과하고, 약 80 ㎖ 씩 2 개로 나누고, 이하의 조작에 의해, 2 회로 나누어 정제하였다. 칼럼에 대한 결합시에는, 반응액을 칼럼 상부에 첨가하고, 결합 버퍼 (20 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) 를 10 ㎖/분으로 5 CV 흘리고, 추가로 40 ㎖/분으로 5 CV 흘렸다. 중간 세정시에는, 세정 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 염화나트륨 용액) 을 10 CV 흘렸다. 용출시에는, 용출 버퍼 (ImmunoPure IgG Elution buffer, PIERCE 제조) 를 6 CV 흘렸다. 용출액을 1 M 트리스 완충액 (pH 9.0) 으로 즉시 중화하였다. 용출 중에 UV 검출 (280 ㎚) 된 프랙션에 대하여, 필요에 따라 미량 분광 광도계 Xpose (Trinean 제조), 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 사용하여 확인하였다.
목적물을 포함하는 프랙션을 2 회분 모두 모은 후, 한외 여과막 (Pellicon XL50 Cassette Ultracel 10kDa (2 개 사용)) 을 장착한 한외 여과 장치 (Cogent μScale TFF System) 를 사용하여, 약 40 ㎖ 로 농축한 후에, 5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) 으로 완충액 교환하였다. 마지막으로, 필터 (Millex-GV, 0.22 ㎛, PVDF, 멸균 완료, Merck Millipore 제조) 로 여과하여, 7.81 ㎎/㎖ Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (56 ㎖) 이 얻어졌다.
Figure 112018131250960-pct00107
이하에, 콘주게이트체를 프래그먼트화하지 않고 질량 분석한 결과를 나타낸다.
Figure 112018131250960-pct00108
<실시예 3-10> Fc-B-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4 (화합물 3-16 의 구조에 있어서, Fc-A 를 Fc-B 로 치환한 구조를 갖는 화합물, 화합물 3-17) 의 합성
본 실시예의 각 공정의 반응 스킴 및 물질의 구조는, 실시예 3-9 의 대응하는 스킴에 있어서 Fc-A 를 Fc-B 로 치환한 것이다.
(3-10A) (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-B 의 조제
실시예 2-4 에서 조정한 Fc-B 용액 13.0 ㎎/㎖ (5 ％ 소르비톨/25 mM 히스티딘 용액 (pH 6.0)) (20.0 ㎖) 를 VIVASPIN 20 (10,000MWCO, Sartorius 제조) 을 사용하여 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 완충액 교환하였다. 얻어진 20.0 ㎎/㎖ Fc-B 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (13.0 ㎖) 에, 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) (7.0 ㎖) 을 첨가하고, 2.00 ㎎/㎖ 야생형 EndoS 용액 (PBS) (1.92 ㎖) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 2 시간 인큐베이트하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 이하의 방법에 따라, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 칼럼에 의한 정제를 실시하였다.
(1) 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA pure150 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : HiTrap rProtein A FF (5 ㎖) (GE 헬스케어 제조)
유속 : 5 ㎖/분 (차지시에는 1.25 ㎖/분)
상기에서 얻은 반응액을 5 개로 나누고, 이하의 방법에 의해 5 회로 나누어 정제하였다. 칼럼에 대한 결합시에는, 반응액을 칼럼 상부에 첨가하고, 결합 버퍼 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)) 를 1.25 ㎖/분으로 2 CV 흘리고, 추가로 5 ㎖/분으로 5 CV 흘렸다. 중간 세정시에는, 세정 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 염화나트륨 용액) 을 10 CV 흘렸다. 용출시에는, 용출 버퍼 (ImmunoPure IgG Elution buffer, PIERCE 제조) 를 6 CV 흘렸다. 용출액을 1 M 트리스 완충액 (pH 9.0) 으로 즉시 중화하였다. 용출 중에 UV 검출 (280 ㎚) 된 프랙션에 대하여, 필요에 따라, 미량 분광 광도계 Xpose (Trinean 제조), 및 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다.
목적물을 포함하는 프랙션을 5 회분 모두 모은 후, VIVASPIN 20 (10,000MWCO, Sartorius 제조) 을 사용하여 농축하고, 완충액 (5 mM 인산 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.5)) 교환을 실시하고, 12 ㎖ 로 하였다.
(2) 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA pure150 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : Bio-Scale Mini CHT Type I 카트리지 (5 ㎖) (BIO-RAD 제조)
유속 : 5 ㎖/분 (차지시에는 1.25 ㎖/분)
칼럼을 2 연결하고, 상기 (1) 에서 얻어진 용액을 3 개로 나누고, 이하의 방법에 의해 3 회로 나누어 정제하였다. 용액을 칼럼의 상부에 첨가하고, A 액 (5 mM 인산 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.5)) 을 1.25 ㎖/분으로 2 CV 흘리고, 추가로 5 ㎖/분으로 3 CV 흘렸다. 그 후, A 액과 B 액 (5 mM 인산 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액 (pH 6.5), 2 M 염화나트륨 용액) 을 사용하여, 용출하였다. 용출 조건은, A 액 : B 액 ＝ 100 : 0 ∼ 0 : 100 (15 CV) 이다. 추가로, 세정 용액 (500 mM 인산 완충액 (pH 6.5)) 을 5 CV 흘렸다.
용출 중에 UV 검출 (280 ㎚) 된 프랙션에 대하여, 필요에 따라 미량 분광 광도계 Xpose (Trinean 제조), 및 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다.
목적물을 포함하는 프랙션을 3 회분 모두 모은 후, VIVASPIN 20 (10,000MWCO, Sartorius 제조) 을 사용하여 농축하고, 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 완충액 교환을 실시하여, 7.17 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-B 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (35.4 ㎖) 이 얻어졌다.
Figure 112018131250960-pct00109
(3-10B) Fc-B-[PEG(3)-N3]4 의 조제
공정 (3-10A) 에서 얻어진 7.17 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-B 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (6.0 ㎖) 에 실시예 1-10 에서 합성한 [N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (28.6 ㎎) 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (0.50 ㎖) 및 2.10 ㎎/㎖ EndoS D233Q/Q303L 용액 (PBS) (1.2 ㎖) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 3.5 시간 인큐베이트하였다. 이 반응액에 추가로, 실시예 1-10 에서 합성한 [N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (6.1 ㎎) 용액 (50 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) (0.10 ㎖) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 0.5 시간 인큐베이트하였다. 이상의 조작을 5 로트분 실시하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제시의 결합 버퍼를 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 으로부터 20 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 변경하고, 공정 (3-10A) 와 동일한 방법에 따라, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 아파타이트 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하였다. 분할 조작으로 얻어진 분을 합쳐, 목적물을 포함하는 프랙션의 모두를 VIVASPIN 20 (10,000MWCO, Sartorius 제조) 을 사용하여 농축 후, NAP25 (GE 헬스케어 제조) 를 사용하여, 5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) 으로 완충액 교환하여, 13.06 ㎎/㎖ Fc-B-[PEG(3)-N3]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (13.7 ㎖) 을 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00110
(3-10C) Fc-B-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4 (화합물 3-17) 의 조제
공정 (3-10B) 에서 조제한 13.06 ㎎/㎖ Fc-B-[PEG(3)-N3]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (3.1 ㎖), 5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) (4.9 ㎖), 디메틸술폭시드 (1.5 ㎖), 및 실시예 1-2 에서 합성한 DBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) (36.6 ㎎) 디메틸술폭시드 용액 (0.51 ㎖) 을 혼합하고, 30 ℃ 에서 16 시간 인큐베이트하였다. 상기 조작을 4 로트 실시하였다. 반응액을 NAP25 (GE 헬스케어 제조), 20 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 조정제하였다. 반응의 진행 정도를 하기 조건의 소수성 상호 작용 크로마토그래피로 확인 후, 하기의 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하였다.
(1) 소수성 상호 작용 크로마토그래피에 의한 분석 조건
분석 장치 : 히타치 D-7000 (히타치 제조)
칼럼 : TSKgel Butyl-NPR (4.6 x 100 ㎜) (토소 제조)
이동층 : A 액 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 2 M 황산암모늄 용액
B 액 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)
그레이디언트 : A : B ＝ 75 : 25 ∼ 0 : 100 (0 ∼ 25 분) - 0 : 100 (25 ∼ 30 분)
온도 : 25 ℃
파장 : 214 ㎚
유속 : 1 ㎖/분
(2) 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제
정제 장치 : AKTA pure150 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 HiTrap rProtein A FF, 5 ㎖
유속 : 5 ㎖/분 (샘플 첨가시에는 1.25 ㎖/분)
상기에서 얻어진 용액을 6 개로 나누고, 이하의 방법에 의해 6 회로 나누어 정제하였다. 칼럼에 대한 결합시에는, 반응액을 칼럼 상부에 첨가하고, 결합 버퍼 (20 mM 인산 완충액 (pH 6.0)) 를 1.25 ㎖/분으로 4 CV 흘리고, 추가로 5 ㎖/분으로 5 CV 흘렸다. 중간 세정시에는, 세정 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 염화나트륨 용액) 을 10 CV 흘렸다. 용출시에는, 용출 버퍼 (ImmunoPure IgG Elution buffer, PIERCE 제조) 를 6 CV 흘렸다. 용출액을 1 M 트리스 완충액 (pH 9.0) 으로 즉시 중화하였다. 용출 중에 UV 검출 (280 ㎚) 된 프랙션에 대하여, 필요에 따라 미량 분광 광도계 Xpose (Trinean 제조), 및 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 사용하여 확인하였다.
목적물을 포함하는 프랙션을 6 회분 모두 합친 것을 VIVASPIN 20 (10,000MWCO, Sartorius 제조) 을 사용하여 농축 후, 5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5) 으로 완충액 교환하였다. 마지막으로, 필터 (Millex-GV, 0.22 ㎛, PVDF, 멸균 완료, Merck Millipore 제조) 로 여과하여, 13.03 ㎎/㎖ Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (13.6 ㎖) 이 얻어졌다.
Figure 112018131250960-pct00111
이하에, 콘주게이트체를 프래그먼트화하지 않고 질량 분석한 결과를 나타낸다.
Figure 112018131250960-pct00112
[실시예 4] 각종 콘주게이트의 평가
<실시예 4-1> 콘주게이트의 cGMP 상승 활성 시험
이하의 방법에 의해, 실시예 3 에서 제작한 화합물 3-1 ∼ 화합물 3-6 의 cGMP 상승 활성을 측정하였다.
CHO 세포에 human GC-A 를 항상적으로 발현시킨 CHO/human GC-A 세포를 α-MEM, 10 ％ FBS, 1 ％ Penicillin-streptomycin 으로 2 x 105 cells/㎖ 에 현탁하고, 384 well plate (Corning 제조, 3826) 에 20 ㎕/well 로 파종하고 (4 x 103 cells/well), CO2 인큐베이터 내에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 이 플레이트로부터 배지를 제거한 후, 1.6 mM IBMX/KRB buffer 를 10 - 15 ㎕/well 첨가하고, 플레이트 셰이커로 교반 후, 실온에서 10 분간 인큐베이션을 하였다. 다음으로, 0.1 ％ BSA/PBS 에 용해한 피험 물질 (각 콘주게이트 및 천연형 hANP(1-28) 을 최종 농도가 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 및 100 nM 이 되도록 희석 계열을 조제) 을 5 ㎕/well 씩 첨가하고, 플레이트 셰이커로 교반 후, CO2 인큐베이터 내에서 15 분간 인큐베이션을 하였다. 그 후, 각 well 중의 cGMP 량을 cGMP kit (CISBIO 제조) 를 사용하여 첨부의 프로토콜에 따라 측정하였다. 각 농도에 있어서의 피험 물질의 활성값 (T/C) 은 용매만을 첨가한 웰의 측정값을 0 으로 하고, 1 nM 천연형 hANP 를 첨가한 웰의 측정값을 1 로서 보정하고, 이것에 기초하여, 각 피험 물질의 비활성 (比活性) (피험 물질의 EC50 값/천연형 hANP 의 EC50 값) 및 Emax (농도 범위에 있어서의 피험 물질의 최대 활성값) 를 산출하였다 (표 2).
표 2 의 결과로부터, 모든 콘주게이트가 cGMP 상승 활성을 나타냈다. 또, 콘주게이트의 Emax 는 천연형 hANP 와 거의 등가였다. 당사슬 수식 hANP-mAb-A 콘주게이트 (화합물 3-2) 는, hANP-mAb-A 콘주게이트 (화합물 3-1) 보다 비 활성은 약한 것이 확인되었다. 또, 당사슬 수식 hANP-CLCH-A 콘주게이트 (화합물 3-4) 는, hANP-CLCH-A 콘주게이트 (화합물 3-3) 보다 비활성은 약한 것이 확인되었다. 이러한 점에서, hANP 펩티드에 당사슬을 도입하면 in vitro 활성은 저하되는 경향이 있다고 시사되었다. 또, hANP 펩티드수가 2 개인 당사슬 수식 hANP-mAb-A 콘주게이트 (화합물 3-5) 는, hANP 펩티드의 수가 4 개인 당사슬 수식 hANP-mAb-A 콘주게이트 (화합물 3-2) 보다 비활성이 4.5 배 감약 (減弱) 하였다. 또, hANP 펩티드수가 2 개인 당사슬 수식 hANP-CLCH-A 콘주게이트 (화합물 3-6) 는, hANP 펩티드의 수가 4 개인 당사슬 수식 hANP-CLCH-A 콘주게이트 (화합물 3-4) 보다 비활성이 3.2 배 감약하였다. 이러한 점에서, hANP 펩티드수가 많은 쪽이, 양호한 활성을 나타내는 경향이 시사되었다.
또, 캐리어 분자로서, CLCH 의 LALA 체인 CLCH-B 를 채용한 화합물 3-15, Fc 단편의 LALA 체인 Fc-A 를 채용한 화합물 3-16, 및 야생형 Fc 단편인 Fc-B 를 채용한 화합물 3-17 은, 모두 천연형 hANP 와 동 레벨의 in vitro 활성을 나타냈다.
Figure 112018131250960-pct00113
<시험예 4-2> 콘주게이트의 래트의 혈중 지속성 시험
이하의 방법에 의해, 실시예 3 에서 제작한 각 콘주게이트의 래트의 혈중에 있어서의 지속성 (혈중 cGMP 의 지속적 상승 작용 및 피험 물질의 혈중으로부터의 검출 시간) 을 조사하였다.
(1) 혈장 샘플의 조제
이소플루란 : 일본 약국방 이소플루란
채혈용 바늘 및 시린지 : 테루모 시린지 25 G x 1 SR 투베르쿨린용
채혈용 튜브 : 캐피젝트 미량 채혈관 EDTA-2Na 500 μL
샘플 보관용 튜브 : MTARIX4170 샘플 트랙 튜브 0.75 ㎖
8-9 주령의 웅성 Slc : SD 래트에 대하여 이소플루란 흡입 마취 ((에스카인 흡입 마취액을 1 - 2 ％ 의 농도로 유지하여 흡입) 를 실시하였다. 필요에 따라 PBS 로 희석한 피험 물질 (각 콘주게이트, 화합물 3-1 ∼ 3-6) 의 용액을, 피하로부터, 100 nmol/㎏ 의 용량 (1 ㎖/㎏) 으로 급속 투여하였다. 투여 전 및 투여 후 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120 및 168 시간 중 화합물마다 선발한 시점에서, 경정맥으로부터 시간 경과적 채혈 (200 μL/회) 을 실시하고, 혈액 샘플은 신속하게 빙상에 두었다.
채취한 혈액 샘플은 원심기 (Sigma 4K15, 로터 : Nr12130-H) 를 사용하여 5000 rpm, 5 분, 4 ℃ 에서 원심 분리하고, 분리한 혈장 샘플을 PK 측정용과 cGMP 측정용의 2 개로 나누고 측정까지 -80 ℃ 로 보존하였다.
(2) 혈장 중 cGMP 농도의 측정
혈장 중의 cGMP 농도는, 100 배로 희석한 혈장 샘플에 대하여, Amersham cGMP Enzymeimmunoassay BiotrakTM (EIA) System (dual range) 을 사용하여, 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 측정하였다. 얻어진 혈장 중 cGMP 농도 추이를 도 6 에 나타낸다.
(3) 혈장 샘플 중의 피험 물질의 검출
(1) 에서 조정한 래트 혈장 샘플 10 μL 를 Rexxip HN Buffer (Gyros AB. 제조) 로 10 배 희석하고, 필요에 따라 적절히, 추가로 동 버퍼로 10 배 희석 (최종 : 100 배 희석) 하거나, 혹은, 이것을 추가로 1 ％ 혈장/Rexxip HN Buffer 로 10 배 희석 (최종 : 1000 배 희석) 하여, 측정용 혈장 샘플로 하였다. 1 차 항체로는 샘플 중의 모든 인간 Fc 함유 분자 (Fc/Fc) 측정용에 Goat Anti-Human IgG Biotin conjugate (SouthernBiotec) 를, 샘플 중의 hANP(1-28) 이 결합한 콘주게이트 (ANP/Fc) 측정용에는 Mouse Anti-ANP IgG (GeneTex) 를 사용하였다. 1 차 항체를 각각 700 nM 이 되도록 0.1 ％ PBS-T 로 조제하였다. 검출용의 2 차 항체로서 양자 모두, DyLight 표지한 Goat Anti-Human IgG (SouthernBiotec) 를 10 nM 이 되도록 Rexxip F Buffer (Gyros AB.) 로 조제하였다. 각 용액을 자동 ELISA 장치 Gyrolab xP workstation 에 세트하고, Bioaffy 200 CD (Gyros AB.) 에 인젝션하여 피험 물질 (Fc/Fc, ANP/Fc) 의 함유량을 샌드위치 ELISA 법에 의해 측정하고, 혈장 중의 농도를 산출하였다.
얻어진 혈장 중 농도 추이를 도 7 에 나타낸다.
도 6, 및 도 7 로부터, 천연형 hANP 에 비해 각종 콘주게이트는, 완만한 혈중 이행성, 긴 혈중 체류성, 및 약리 작용 지속성을 겸비하는 GC-A 활성화 약인 것이 확인되었다.
도 6 으로부터, 이하의 것이 확인되었다.
hANP-mAb-A 콘주게이트인 화합물 3-1 은, 가장 높은 Emax 를 나타냈다. 또, 화합물 3-1 은, hANP-CLCH-A 콘주게이트인 화합물 3-3 과 비교하여, 보다 긴 약리 활성 지속을 나타냈다.
당사슬 수식 hANP-mAb-A 콘주게이트인 화합물 3-2, 및 당사슬 수식 hANP-CLCH-A 콘주게이트인 화합물 3-4 는, 화합물 3-1 과 비교하여 Emax 에 도달할 때까지의 시간과 감쇠 속도도 지연되었다. 즉, 당사슬 수식 hANP-mAb-A 콘주게이트 쪽이 보다 긴 약리 활성 지속을 나타낸다고 생각된다.
hANP 펩티드의 수가 2 개인 콘주게이트체인 화합물 3-5, 및 화합물 3-6 은, hANP 펩티드의 수가 4 개인 콘주게이트체인 화합물 3-2 및 화합물 3-4 와 비교하면, Emax 가 감약하였다. 즉, hANP 펩티드의 수가 많은 당사슬 수식 hANP-mAb-A 콘주게이트 쪽이 보다 강한 약리 활성을 나타낸다고 생각된다.
도 7 로부터, 이하의 것이 확인되었다.
hANP 콘주게이트는, 투여 후 168 시간 후에 있어서도, 혈중 농도가 확인되었다.
hANP-mAb-A 콘주게이트인 화합물 3-1 은, hANP-CLCH-A 콘주게이트인 화합물 3-3 과 비교하면, Fc/Fc 와 ANP/Fc 의 괴리폭이 작고, 투여 후 168 시간의 혈장 중 농도가 높고, 감쇠 속도가 느리다. 이것은, 화합물 3-1 은, 화합물 3-3 보다 긴 혈중 체류성을 갖고 있는 것을 나타내고 있다.
당사슬 수식 hANP-mAb-A 콘주게이트인 화합물 3-2 는, hANP-mAb-A 콘주게이트인 화합물 3-1 과 비교하면, Fc/Fc 와 ANP/Fc 의 괴리폭이 작고, 투여 후 168 시간의 혈장 중 농도가 높고, 감쇠 속도가 느리다. 이것은, 화합물 3-2 는, 화합물 3-1 보다 긴 혈중 체류성을 갖고 있는 것을 나타내고 있다. 또, 당사슬 수식 hANP-CLCH-A 콘주게이트인 화합물 3-4 는, hANP-CLCH-A 콘주게이트인 화합물 3-3 과 비교하면, Fc/Fc 와 ANP/Fc 의 괴리폭이 작고, 투여 후 168 시간의 혈장 중 농도가 높고, 감쇠 속도가 느리다. 이것은, 화합물 3-4 는, 화합물 3-3 보다 긴 혈중 체류성을 갖고 있는 것을 나타내고 있다.
<실시예 4-3> 콘주게이트의 cGMP 상승 활성에 대한 PEG 링커의 영향
본 실험은, 실시예 3-7 에서 합성한 콘주게이트를 사용하여, cGMP 상승 활성에 대한 PEG 링커 부분의 영향을 검토하는 것을 목적으로 실시하였다. 실시예 4-1 에 기재한 방법과 동일하게 하여, 천연형 hANP 와 피험 물질의 비활성 및 Emax 를 산출하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.
PEG 링커의 길이·종류의 in vitro 활성에 미치는 영향에 대하여, 이하의 것이 확인되었다. Emax 에 대해서는 모든 화합물에서 hANP 와 동일한 정도까지 유지되어 있었다. 또, hANP 에 대한 비활성은 0.41 - 2.84 배의 폭에 있고, 어느 화합물도 일정 이상의 cGMP 상승 활성을 갖고 있었다. PEG 링커에 포함되는 에틸렌글리콜 단위가 많은 화합물일수록 양호한 활성을 나타내는 경향이 보였다. 한편으로, 전체로서 동일한 정도의 길이의 링커 구조의 경우, 짧은 PEG (예를 들어 PEG(6)) 를 포함하는 링커 분자를 다수 결합시킨 링커 구조의 화합물보다, 긴 PEG 를 소수 결합시킨 링커 구조의 화합물 쪽이 양호한 활성을 나타내는 경향이 시사되었다.
Figure 112018131250960-pct00114
<시험예 4-4> 콘주게이트의 래트의 혈중 지속성에 대한 PEG 링커의 영향
본 실험은, 실시예 3-7 에서 합성한 콘주게이트를 사용하여, 동물 혈중에서의 지속성에 대한 PEG 링커 부분의 영향을 검토하는 것을 목적으로 실시하였다. 실시예 4-2 에 기재한 방법과 동일하게, 피험 물질을 래트에 피하 투여한 후의 혈장 중 cGMP 농도의 경과시 변화를 조사하였다. 결과를 도 8 에 나타낸다.
PEG 링커의 길이·종류의 in vitro 활성에 미치는 영향에 대하여, 이하의 것이 확인되었다. PEG(12)-PEG(12) 를 갖는 화합물 3-7 의 Emax 가 가장 높았지만, in vitro 의 결과와 상반되게, PEG(24) 를 갖는 화합물 3-9 는 가장 활성이 약하고 지속도 짧았다.
<시험예 4-5> 콘주게이트의 물성 평가
천연형 hANP(1-28) 에 대해서는, 응집성이 높은 것을 알 수 있었다. 예를 들어, 7 ㎎/㎖ PBS 용액 중, 30 ℃ 에서 인큐베이트한 경우, 24 시간 이내에, 겔상 석출물이 확인되고, 48 시간 이내에 용액 전체가 겔상으로 되는 것이 확인된다.
함유되는 hANP 의 몰수 환산으로 거의 동량이 되는 농도로 시험을 실시하면, hANP 콘주게이트의 응집성을 간접적으로 비교할 수 있다. 본 발명의 콘주게이트체의 응집성을 확인할 목적으로, 이하의 시험을 실시하였다.
(1) 가속 열화 시험
각 샘플을 Vivapore 5 (Vivascience 제조) 로 농축하고, 25 mM AcONa 5 ％ sorbitol pH 5.5 (ABSor 액) 또는 PBS 에 투석 후, 70 ㎎/㎖ 로 조제하였다. Spin-X 0.22 ㎛ 원심식 필터 (Costar 제조) 로 여과하고, 0.5 ㎖ 멸균 슬림 튜브 (스미토모 베이크라이트 제조) 에 80 μL 씩 나누어 붓고 밀봉 후 40 ℃ 에서 2 주간 정치하였다. 열화 전후의 샘플을 Agilent 1260 LC, DAWN HELEOS 8, Eclipse3+ 로 구성된 SEC-MALS 시스템 (Wyatt Technology 제조) 으로 측정하고, ASTRA 소프트웨어 (Wyatt Technology 제조) 로 해석하였다. 측정은, 칼럼 : Nanofilm SEC-250 7.8′300 ㎜ (Sepax 제조), 버퍼 : 0.2 M KPi 0.2 M KCl pH 7.0, 유속 : 0.5 ㎖/분, 칼럼 온도 : 30 ℃, 검출 파장 : 280 ㎚ 의 조건에서 실시하였다. 결과를 표 4 에 나타낸다.
천연형 hANP 의 PBS 용액이 48 시간 이내에 용액 전체가 겔상으로 되는 데 대하여, 콘주게이트에서는 2 주간 후에도 용액의 유동성이 확인되고, 용액 안정성이 개선되었다. 가속 열화 처리에 의해 화합물 3-3 의 고분자량체는 ABSor 액의 경우에서 8.2 ％ 로부터 14.2 ％ 로, PBS 액의 경우에서 9.2 ％ 로부터 45.7 ％ 로 증가하였다. 화합물 3-3 의 hANP 부 근방에 당사슬을 도입한 화합물 3-4 의 경우, 가속 열화 처리에 의해 고분자량체는 ABSor 액의 경우에서 1.8 ％ 로부터 4.5 ％ 로, PBS 액의 경우에서 2.8 ％ 로부터 12.8 ％ 로 증가하였다. 따라서, hANP 부 근방에 대한 당사슬 도입에 의해, 응집성이 현저하게 저감되는 것이 밝혀졌다.
Figure 112018131250960-pct00115
<시험예 4-6> 콘주게이트의 원숭이의 혈중 지속성 시험
이하의 방법에 의해, 실시예 3 에서 제작한 캐리어 분자가 상이한 각 콘주게이트의 원숭이의 혈중에 있어서의 피험 물질의 혈중으로부터의 검출 시간을 조사함으로써, 콘주게이트의 혈중 지속성에 대한 캐리어 분자의 영향을 검토하였다.
(1) 혈장 샘플의 조제
채혈용 바늘 및 시린지 : 테루모 시린지 25 G x 1 SR 투베르쿨린용
채혈용 튜브 : 캐피젝트 미량 채혈관 EDTA-2Na, 혹은 베노젝과 진공 채혈관 EDTA-2Na
샘플 보관용 튜브 : MTARIX4170 샘플 트랙 튜브 0.75 ㎖
3 - 7 연령의 웅성 게잡이 원숭이에 대하여 무마취 하에서 피험 물질의 투여 및 채혈을 실시하였다. 필요에 따라 PBS 로 희석한 피험 물질 (각 콘주게이트, 화합물 3-2, 3-4, 3-15, 3-16, 및 3-17) 의 용액을, 피하로부터, 10 nmol/㎏ 의 용량 (1 ㎖/㎏) 으로 급속 투여하였다. 투여 전 및 투여 후 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96, 168, 336, 528 (혹은 504), 및 696 (혹은 672) 시간의 시점에서, 정맥으로부터 시간 경과적 채혈 (약 500 μL/회) 을 실시하고, 혈액 샘플은 신속하게 빙상에 두었다.
채취한 혈액 샘플을 원심 분리함으로써 얻어진 혈장 샘플을 측정까지 -80 ℃ 로 보존하였다.
(2) 혈장 샘플 중의 피험 물질의 검출
(1) 에서 조정한 원숭이 혈장 샘플 10 μL 에 Rexxip HN Buffer (Gyros AB.) 를 90 μL 첨가 후 혼합 (10 배 희석 샘플, MRD 10), 혹은 추가로 Rexxip HN Buffer 로 10 배 희석 (100 배 희석 샘플, MRD 100), 추가로 1 ％ 혈장/ Rexxip HN Buffer 로 10 배 희석 (1000 배 희석 샘플, MRD 100) 하여 측정용 혈장 샘플을 조제하였다. 1 차 항체로는 샘플 중의 모든 인간 Fc 함유 분자 (Fc/Fc) 측정용에 Goat Anti-Human IgG Biotin conjugate (SouthernBiotec) 를, 샘플 중의 hANP(1-28) 이 결합한 콘주게이트 (ANP/Fc) 측정용에는 Mouse Anti-ANP IgG (GeneTex) 를 사용하였다. 1 차 항체를 각각 700 nM 이 되도록 0.1 ％ PBS-T 로 조제하였다. 검출용의 2 차 항체로서 양자 모두, DyLight 표지한 Goat Anti-Human IgG (SouthernBiotec) 를 10 nM 이 되도록 Rexxip F Buffer (Gyros AB.) 로 조제하였다. 각 용액을 자동 ELISA 장치 Gyrolab xP workstation 에 세트하고, Bioaffy 200 CD (Gyros AB.) 에 인젝션하여 피험 물질 (Fc/Fc, ANP/Fc) 의 함유량을 샌드위치 ELISA 법에 의해 측정하고, 혈장 중의 농도를 산출하였다.
얻어진 혈장 중 농도 추이를 도 9 에 나타낸다.
도 9 로부터, 이 시험에서 사용한 hANP 콘주게이트는, 투여 후 672 시간 (28 일) 후에 있어서도, 분해되지 않고 콘주게이트체로서 혈중 농도가 확인되었다. 캐리어 분자가 각각 CLCH-A, CLCH-B 인 화합물 3-4 및 화합물 3-15 는, 캐리어 분자가 mAb-A 인 화합물 3-2 와 비교하여 신속하게 혈중으로부터 감쇠하였다. 한편, 캐리어 분자가 각각 Fc-A, Fc-B 인 화합물 3-16 및 화합물 3-17 은, 화합물 3-2 보다 완만하게 혈중으로부터 감쇠하였다. 즉, 원숭이에 있어서 당사슬 수식 hANP-Fc 콘주게이트의 혈중 지속성이 가장 긴 것이 밝혀졌다.
[실시예 5] 2 종류의 Endo 효소를 사용한 당사슬 전이 반응
사용하는 2 종류의 Endo 효소에 관하여, 효소 A (EndoM 형 효소) 및 효소 B (EndoS 형 효소) 는 적절히 조합할 수 있다. 효소 A 에는, EndoM, EndoOm, EndoCC 와 그 가수 분해 활성을 저하시킨 EndoM 변이체, EndoOm 변이체, EndoCC 변이체 등을 예시할 수 있다. 또, 효소 B 에는, EndoS, EndoS2(EndoS49) 와 그 가수 분해 활성을 저하시킨 EndoS 변이체, EndoS2(EndoS49) 변이체 등을 예시할 수 있다. 당사슬 공여체 부분의 구조는, 화학 반응 혹은 효소 반응과의 조합으로 합성 가능한 분자이면, 아노머 부위의 치환기 R 은, R ＝ H 이외에, 무엇을 사용해도 된다.
[화학식 75]
Figure 112018131250960-pct00116
[화학식 76]
Figure 112018131250960-pct00117
<실시예 5-1> 당사슬 공여체에 SGP 를 사용한 당사슬 전이율의 측정
mAb-C 로서, 시판되는 Trastuzumab 를 사용하였다. Trastuzumab (440 ㎎/vial, Genentech 제조) 에 대하여, 실시예 3-1 에 기재된 방법을 사용하여, 51.3 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab 용액 (50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)) (1.65 ㎖) 으로 하였다. 51.3 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab 용액 (50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)) (19.5 ㎕) 에 대하여, 50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4) (0.5 ㎕), SGP (토쿄 화성 제조) (5.82 ㎎) 용액 (50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)) (29.1 ㎕), 1 U/㎖ EndoM N175Q 용액 (토쿄 화성 제조) (5.0 ㎕) 및 2.00 ㎎/㎖ EndoS D233Q 용액 (PBS) (10.0 ㎕) 을 첨가하고, 28 ℃ 에서 48 시간 인큐베이션하였다.
반응 개시로부터, 2 시간 후, 4 시간 후, 8 시간 후, 24 시간 후 및 48 시간 후의 각 시점에서, 이 반응액의 일부를 채취하고, 반응의 진행도를 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 으로 측정하였다. 측정에 있어서는, 기기에 부수되어 있는 순서서에 따라, 측정 샘플을 조제하였다. 이 과정에서, 채취한 반응액을 디티오트레이톨을 포함하는 용액에 노출시키고, 95 ℃ 에서 5 분간 가열하는 조작이 있기 때문에, 당사슬 전이 반응은 즉석에서 정지된다.
얻어진 측정 샘플을 Experion Pro260 Chips 에 옮겨, Experion 전기 영동 스테이션에 부수되어 있는 순서서에 따라 측정하였다. 얻어진 크로마토그램으로부터, 미반응물과 당사슬 전이체가 분리된 피크로서 확인된다. 미반응물과 당사슬 전이체의 피크 면적비로부터 당사슬 전이율을 하기 산출식에 의해 산출하였다.
당사슬 전이율 (％) ＝ [SG-Trastuzumab 유래의 H 사슬의 피크 면적]/{[(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab 유래의 H 사슬 피크 면적 ＋ [SG-Trastuzumab 유래의 H 사슬의 피크 면적]｝× 100
동일하게 하여 각종 Endo 효소의 조합을 변경하여 반응을 실시하고, 각 반응 시간에 있어서의 당사슬 전이율을 산출하였다 (표 5).
<실시예 5-2> 당사슬 공여체에 SG-Asn 을 사용한 당사슬 전이율의 측정
51.3 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab 용액 (50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)) (19.5 ㎕) 에 대하여, 50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4) (0.5 ㎕), SG-Asn 암모늄염 (4.74 ㎎) 용액 (50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)) (23.7 ㎕), 1 U/㎖ EndoM N175Q 용액 (5.0 ㎕) 및, 2.00 ㎎/㎖ EndoS D233Q 용액 (PBS) (10.0 ㎕) 을 첨가하고, 28 ℃ 에서 48 시간 인큐베이션하였다. 이하 실시예 5-1 과 동일한 방법으로, 각 반응 시간에 있어서의 당사슬 전이율을 산출하였다 (표 5).
<실시예 5-3> 효소 A 에 EndoCC 를 사용한 당사슬 전이율의 측정
51.3 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab 용액 (50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)) (19.5 ㎕) 에 대하여, 50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4) (0.5 ㎕), SGP (토쿄 화성 제조) (5.82 ㎎) 용액 (50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)) (29.1 ㎕), 1.16 U/㎖ EndoCC 혹은 2.21 U/㎖ EndoCC N180H 용액 (후시미 제약소) (15.0 ㎕) 및 2.00 ㎎/㎖ EndoS D233Q 용액 (PBS) (10.0 ㎕) 을 첨가하고, 28 ℃ 혹은 37 ℃ 에서 48 시간 인큐베이션하였다. 이하 실시예 5-1 과 동일한 방법으로, 각 반응 시간에 있어서의 당사슬 전이율을 산출하였다 (표 5).
표 5. 반응 조건과 당사슬 전이율의 시간 경과적 변화
Figure 112018131250960-pct00118
당사슬 공여체에 옥사졸린체를 사용하지 않는 경우, 2 종류의 Endo 효소 변이체를 적당한 비율로 혼합시킴으로써 당사슬 전이 반응이 효율적으로 진행되는 것을 확인하였다. 효소 A 의 가수 분해 활성이 높은 경우, 효소 B 에 가수 분해 활성을 억제한 변이체를 사용해도, 당사슬 전이율은 낮다. 가수 분해 활성을 억제한 효소 B 는, 그 정도에 따라, 당사슬 전이율 90 ％ 를 넘을 때까지의 반응 시간에 차이가 있다. 반응의 지적 온도가 50 ℃ 가 되는 EndoCC 는, 반응 온도가 높은 쪽이 전이율이 높아지는 경향이 있다.
적절히 화학 수식된 당사슬 공여체를 선택함으로써, Fc 함유 분자에 화학 수식된 당사슬 구조를 도입할 수 있다. 예를 들어, 당사슬 공여체 SGP 나 (SG-)Asn 대신에, (N3-PEG(3)-SG-)Asn-PEG(3)-N3 을 사용하면 대응하는 당사슬을 Fc 함유 분자에 전이시킬 수 있다. 또, Fc 함유 분자는 mAb, CLCH, Fc 를 적절히 사용할 수 있다.
<실시예 5-4> ([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3 을 사용한 mAb-A-[PEG(3)-N3]4 의 조제
당사슬 도너로서 ([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3 을 사용하고, mAb-A-[PEG(3)-N3]4 를 이하의 방법으로 제작하였다.
51.27 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-mAb-A 용액 (50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)) (200 ㎕) 에, 공정 (1-12A) 에서 작성한 ([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3 (50.0 ㎎) 용액 (50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)) (240 ㎕), 1 U/㎖ EndoM N175Q 용액 (토쿄 화성 제조) (50 ㎕) 및 2.10 ㎎/㎖ EndoS D233Q Q303L 용액 (PBS) (100 ㎕) 을 첨가하고, 28 ℃ 에서 20 시간 인큐베이트한 후에, 실시예 3-1 에 기재된 방법에 준하여, 반응 스케일에 적절한 정제 방법 (정제 장치, 칼럼) 이나 한외 여과 방법 (한외 여과막) 을 선택하여, 14.78 ㎎/㎖ mAb-A-[PEG(3)-N3]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (500 ㎕) 을 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00119
<실시예 5-5> ([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3 을 사용한 CLCH-B-[PEG(3)-N3]4 의 조제
당사슬 도너로서 ([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3 을 사용하고, CLCH-B-[PEG(3)-N3]4 를 이하의 방법으로 제작하였다.
39.2 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-B 용액 (50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)) (150 ㎕) 에 50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4) (50 ㎕), 공정 (1-12A) 에서 작성한 ([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3 (53.0 ㎎) 용액 (50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)) (240 ㎕), 1 U/㎖ EndoM N175Q 용액 (토쿄 화성 제조) (50 ㎕) 및 2.10 ㎎/㎖ EndoS D233Q Q303L 용액 (PBS) (100 ㎕) 을 첨가하고, 28 ℃ 에서 20 시간 인큐베이트한 후에, 실시예 3-8 에 기재된 방법에 준하여, 반응 스케일에 적절한 정제 방법 (정제 장치, 칼럼) 이나 한외 여과 방법 (한외 여과막) 을 선택하여, 8.92 ㎎/㎖ CLCH-B-[PEG(3)-N3]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (500 ul) 을 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00120
<실시예 5-6> ([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3 을 사용한 Fc-A-[PEG(3)-N3]4 의 조제
당사슬 도너로서 ([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3 을 사용하고, Fc-A-[PEG(3)-N3]4 를 이하의 방법으로 제작하였다.
24.8 ㎎/㎖ (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A 용액 (50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)) (140 ㎕) 에 50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4) (60 ㎕), 공정 (1-12A) 에서 작성한 ([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3 (60.0 ㎎) 50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4) 용액 (240 ㎕), 1 U/㎖ EndoM N175Q 용액 (토쿄 화성 제조) (50 ㎕) 및 2.10 ㎎/㎖ EndoS D233Q Q303L 용액 (PBS) (100 ㎕) 을 첨가하고, 28 ℃ 에서 20 시간 인큐베이트한 후에, 실시예 3-9 에 기재된 방법에 준하여, 반응 스케일에 적절한 정제 방법 (정제 장치, 칼럼) 이나 한외 여과 방법 (한외 여과막) 을 선택하여, 4.06 ㎎/㎖ Fc-A-[PEG(3)-N3]4 용액 (5 ％ 소르비톨/10 mM 아세트산 완충액 (pH 5.5)) (500 ul) 을 얻었다.
Figure 112018131250960-pct00121
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Conjugate of Atrial Natriuretic Peptide and Fc-containing Molecule <130> FP1711 <150> JP2016-131450 <151> 2016-07-01 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 <210> 2 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide encoding the heavy chain of anti-LPS mAb-A <220> <221> CDS <222> (1)..(1422) <223> Encoding polypeptides including a signal sequence (19 aa) followed by Heavy chain of mAb-A (20-474: 455 aa) <400> 2 atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggc gcc gaa gtg aag aaa 96 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cca ggc gcc agc gtg aag gtg tcc tgc aag gcc agc ggc tac acc ttt 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 acc agc tac tgg atc aac tgg gtg cgc cag gcc cct gga cag ggc ctg 192 Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 gaa tgg atg ggc aac atc tac ccc ggc agc agc agc atc aac tac aac 240 Glu Trp Met Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Asn 65 70 75 80 gag aag ttc aag agc cgc gtg acc atc acc gcc gac acc agc aca agc 288 Glu Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 acc gcc tac atg gaa ctg agc agc ctg cgg agc gag gac acc gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tac tac tgc gcc cgg acc atc tac aac tac ggc agc tcc ggc tac aat 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ile Tyr Asn Tyr Gly Ser Ser Gly Tyr Asn 115 120 125 tac gcc atg gac tac tgg ggc cag ggc acc ctc gtg acc gtg agc tca 432 Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 gcc tcc acc aag ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 480 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 145 150 155 160 agc acc tct ggc ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 528 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 ttc ccc gaa ccc gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 576 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 ggc gtg cac acc ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc 624 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 672 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 210 215 220 tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 720 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 aga gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc 768 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 245 250 255 cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 816 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 864 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 912 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 290 295 300 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag 960 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 1008 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 1056 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc 1104 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 cag ccc cgg gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag 1152 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 370 375 380 atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 1200 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac 1248 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 405 410 415 aac tac aag acc acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 1296 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac 1344 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 435 440 445 gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc 1392 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 cag aag agc ctc tcc ctg tct ccc ggc aaa 1422 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 3 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ile Tyr Asn Tyr Gly Ser Ser Gly Tyr Asn 115 120 125 Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 145 150 155 160 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 210 215 220 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 370 375 380 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 435 440 445 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 4 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotides encoding the light chain of anti-LPS mAb-A <220> <221> CDS <222> (1)..(702) <223> Encoding polypeptides including a signal sequence (20 aa) followed by light chain of mAb-A (21-234: 214 aa) <400> 4 atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggc gcg tac ggc gac atc gtg atg acc cag agc cct gac agc ctg gcc 96 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 gtg tct ctg gga gag aga gcc acc atc aac tgc aag gcc agc gag aac 144 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn 35 40 45 gtg ggc aac agc gtg tcc tgg tat cag cag aag ccc ggc cag ccc ccc 192 Val Gly Asn Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 50 55 60 aag ctg ctg atc tac ggc gcc agc aac aga tac acc ggc gtg ccc gat 240 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 aga ttc agc ggc agc ggc tct ggc acc gac ttc acc ctg aca atc agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 tcc ctg cag gcc gag gac gtg gcc gtg tac tac tgt ggc cag agc tac 336 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr 100 105 110 agc tac ccc tac acc ttc ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag cgt 384 Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc ccc tcc gac gag cag 432 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tac 480 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac aac gcc ctg cag tcc 528 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac agc aag gac agc acc 576 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa gcc gac tac gag aag 624 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag ggc ctg agc tcc ccc 672 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 702 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 5 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Val Gly Asn Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr 100 105 110 Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 6 <211> 1097 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the heavy chain of CLCH-1 <220> <221> CDS <222> (26)..(1072) <223> Encoding polypeptides including a signal sequence (19 aa) followed by CH-A (20-349: 330 aa) <400> 6 ccagcctccg gactctagag ccacc atg aag cac ctg tgg ttc ttt ctg ctg 52 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 1 5 ctg gtg gcc gct ccc aga tgg gtg ctg agc gcc tct aca aag ggc ccc 100 Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 10 15 20 25 agc gtg ttc cct ctg gcc cct agc agc aag agc aca tct ggc gga aca 148 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 30 35 40 gcc gcc ctg ggc tgc ctc gtg aag gac tac ttt ccc gag ccc gtg acc 196 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 45 50 55 gtg tcc tgg aac tct ggc gct ctg aca agc ggc gtg cac acc ttt cca 244 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 60 65 70 gcc gtg ctg cag agc agc ggc ctg tac tct ctg agc agc gtc gtg aca 292 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 75 80 85 gtg ccc agc agc tct ctg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aac 340 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 90 95 100 105 cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag cgg gtg gaa ccc aag agc 388 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 110 115 120 tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt cct gcc ccc gaa ctg ctg 436 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 125 130 135 gga ggc cct tcc gtg ttc ctg ttc ccc cca aag ccc aag gac acc ctg 484 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 140 145 150 atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc gtg gtg gtg gat gtg tcc 532 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 155 160 165 cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg tac gtg gac ggc gtg gaa 580 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 170 175 180 185 gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag gaa cag tac aac agc acc 628 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 190 195 200 tac cgg gtg gtg tcc gtg ctg aca gtg ctg cac cag gac tgg ctg aac 676 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 205 210 215 ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac aag gcc ctg cct gcc ccc 724 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 220 225 230 atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc cag ccc cgc gaa ccc cag 772 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 235 240 245 gtg tac aca ctg ccc cca agc cgg gaa gag atg acc aag aac cag gtg 820 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 250 255 260 265 tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac ccc tcc gat atc gcc gtg 868 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 270 275 280 gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc acc ccc 916 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 285 290 295 cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc ctg tac agc aag ctg acc 964 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 300 305 310 gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac gtg ttc agc tgc agc gtg 1012 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 315 320 325 atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc cag aag tcc ctg agc ctg 1060 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 330 335 340 345 agc ccc ggc aaa tgagtttaaa cgggggaggc taact 1097 Ser Pro Gly Lys <210> 7 <211> 349 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 20 25 30 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 35 40 45 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 50 55 60 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 65 70 75 80 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 85 90 95 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 100 105 110 Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 115 120 125 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 130 135 140 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 165 170 175 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 180 185 190 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 195 200 205 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 210 215 220 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 225 230 235 240 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 245 250 255 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 260 265 270 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 275 280 285 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 290 295 300 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 305 310 315 320 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 325 330 335 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345 <210> 8 <211> 425 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the light chain of CLCH-A <220> <221> CDS <222> (26)..(400) <223> Encoding polypeptides including a signal sequence (20 aa) followed by CL-A (21-125: 105 aa) <400> 8 ccagcctccg gactctagag ccacc atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc 52 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile 1 5 agc ctg ctg ctg tgg atc agc ggc gcc tat ggc gtg gca gcc cct agc 100 Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Val Ala Ala Pro Ser 10 15 20 25 gtg ttc atc ttc cca ccc agc gac gag cag ctg aag tct ggc aca gcc 148 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 30 35 40 agc gtc gtg tgc ctg ctg aac aac ttc tac ccc cgc gag gcc aag gtg 196 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 45 50 55 cag tgg aag gtg gac aat gcc ctg cag agc ggc aac agc cag gaa agc 244 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 60 65 70 gtg acc gag cag gac agc aag gac tcc acc tac agc ctg agc agc acc 292 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 75 80 85 ctg acc ctg agc aag gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc 340 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 90 95 100 105 gaa gtg acc cac cag ggc ctg tct agc ccc gtg acc aag agc ttc aac 388 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 110 115 120 cgg ggc gag tgt tgagtttaaa cgggggaggc taact 425 Arg Gly Glu Cys 125 <210> 9 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 20 25 30 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 35 40 45 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 50 55 60 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 65 70 75 80 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 85 90 95 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 100 105 110 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 115 120 125 <210> 10 <211> 1047 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the heavy chain of CLCH-B (LALA form) <220> <221> CDS <222> (1)..(1047) <223> Encoding polypeptides including a signal sequence (19 aa) followed by CH-B (20-349: 330 aa) <400> 10 atg aag cac ctg tgg ttc ttt ctg ctg ctg gtg gcc gct ccc aga tgg 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 gtg ctg agc gcc tct aca aag ggc ccc agc gtg ttc cct ctg gcc cct 96 Val Leu Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 20 25 30 agc agc aag agc aca tct ggc gga aca gcc gcc ctg ggc tgc ctc gtg 144 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 35 40 45 aag gac tac ttt ccc gag ccc gtg acc gtg tcc tgg aac tct ggc gct 192 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 50 55 60 ctg aca agc ggc gtg cac acc ttt cca gcc gtg ctg cag agc agc ggc 240 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 65 70 75 80 ctg tac tct ctg agc agc gtc gtg aca gtg ccc agc agc tct ctg ggc 288 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 85 90 95 acc cag acc tac atc tgc aac gtg aac cac aag ccc agc aac acc aag 336 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 100 105 110 gtg gac aag cgg gtg gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt 384 Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 115 120 125 ccc cct tgt cct gcc ccc gaa gcc gcg gga ggc cct tcc gtg ttc ctg 432 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 130 135 140 ttc ccc cca aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa 480 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 145 150 155 160 gtg acc tgc gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag 528 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 165 170 175 ttc aat tgg tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag 576 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 180 185 190 cct aga gag gaa cag tac aac agc acc tac cgg gtg gtg tcc gtg ctg 624 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 195 200 205 aca gtg ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag 672 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 210 215 220 gtg tcc aac aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag 720 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 225 230 235 240 gcc aag ggc cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cca agc 768 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 245 250 255 cgg gaa gag atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa 816 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 260 265 270 ggc ttc tac ccc tcc gat atc gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag 864 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 275 280 285 ccc gag aac aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc 912 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 290 295 300 tca ttc ttc ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag 960 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 305 310 315 320 cag ggc aac gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac 1008 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 325 330 335 cac tac acc cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa 1047 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345 <210> 11 <211> 349 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 20 25 30 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 35 40 45 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 50 55 60 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 65 70 75 80 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 85 90 95 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 100 105 110 Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 115 120 125 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 130 135 140 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 165 170 175 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 180 185 190 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 195 200 205 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 210 215 220 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 225 230 235 240 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 245 250 255 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 260 265 270 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 275 280 285 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 290 295 300 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 305 310 315 320 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 325 330 335 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of CHLALA-F <400> 12 gcgggaggcc cttccgtgtt cctgttcccc 30 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of CHLALA-R <400> 13 ggcttcgggg gcaggacaag ggggacaggt g 31 <210> 14 <211> 779 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding Fc fragment (wild type) <220> <221> CDS <222> (26)..(754) <223> Encoding polypeptide containing a signal sequence (20 aa) followed by Fc-B (223 aa) <400> 14 ccagcctccg gactctagag ccacc atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc 52 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile 1 5 agc ctg ctg ctg tgg atc agc ggc gcc tac ggc acc tgt cct cca tgt 100 Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Thr Cys Pro Pro Cys 10 15 20 25 cct gct cca gag ctg ctg ggc gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca 148 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 30 35 40 aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 196 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 45 50 55 gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg 244 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 60 65 70 tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag ccc aga gag 292 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 75 80 85 gaa cag tac aac agc acc tac cgg gtg gtg tcc gtg ctg acc gtg ctg 340 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 90 95 100 105 cac cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 388 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 110 115 120 aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc 436 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 125 130 135 cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc agg gac gag 484 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 140 145 150 ctg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aag ggc ttc tac 532 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 155 160 165 ccc tcc gat atc gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 580 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 170 175 180 185 aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 628 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 190 195 200 ctg tac agc aag ctg aca gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 676 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 205 210 215 gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 724 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 220 225 230 cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tgagtttaaa cgggggaggc 774 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 235 240 taact 779 <210> 15 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 20 25 30 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 35 40 45 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 50 55 60 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 65 70 75 80 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 85 90 95 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 100 105 110 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 115 120 125 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 130 135 140 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 145 150 155 160 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 165 170 175 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 180 185 190 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 195 200 205 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 210 215 220 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 225 230 235 240 Pro Gly Lys <210> 16 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding Fc-A (LALA form) <220> <221> CDS <222> (1)..(741) <223> Encoding a signal peptide (20 aa) and Fc-A (227 aa) <400> 16 atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc agc ctg ctg ctg tgg atc agc 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggc gcc tac ggc gac aaa act cac acc tgt cct cca tgt cct gct cca 96 Gly Ala Tyr Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 20 25 30 gag gcc gcg ggc gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca aag ccc aag 144 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 35 40 45 gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc gtg gtg gtg 192 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 50 55 60 gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg tac gtg gac 240 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 65 70 75 80 ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag ccc aga gag gaa cag tac 288 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 85 90 95 aac agc acc tac cgg gtg gtg tcc gtg ctg acc gtg ctg cac cag gac 336 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 100 105 110 tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac aag gcc ctg 384 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 115 120 125 cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc cag ccc cgc 432 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 130 135 140 gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc agg gac gag ctg acc aag 480 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 145 150 155 160 aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aag ggc ttc tac ccc tcc gat 528 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 165 170 175 atc gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac aac tac aag 576 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 180 185 190 acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc ctg tac agc 624 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 195 200 205 aag ctg aca gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac gtg ttc agc 672 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 210 215 220 tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc cag aag tcc 720 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 225 230 235 240 ctg agc ctg agc ccc ggc aaa 741 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 <210> 17 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 20 25 30 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 35 40 45 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 50 55 60 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 65 70 75 80 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 85 90 95 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 100 105 110 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 115 120 125 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 130 135 140 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 145 150 155 160 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 165 170 175 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 180 185 190 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 195 200 205 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 210 215 220 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 225 230 235 240 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 <210> 18 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of FcLALA-F <400> 18 tgtcctgctc cagaggccgc gggcggacct agcgtgttcc tgttcccc 48 <210> 19 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Fc05-R <400> 19 tggaggacag gtgtgagttt tgtcgccgta ggcgccgctg atccacagca g 51

Claims (18)

  1. 복합형 N297 당사슬을 포함하는 원하는 Fc 함유 분자의 제조 방법으로서, 환원 말단이 활성화되어 있지 않은 복합형 당사슬을 포함하는 당사슬 도너, 억셉터 N297 당사슬을 포함하는 초기 Fc 함유 분자, 그 기질로서 당사슬 도너의 복합형 당사슬을 인지하나 억셉터 N297 당사슬은 인지하지 않는 Endo 효소 A, 및 그 기질로서 억셉터 N297 당사슬을 인지하는 Endo 효소 B 를, 반응액에서 반응시키는 것을 포함하며,
    여기서, 당사슬 도너가 (MSG1-) Asn, (MSG2-) Asn, SGP 또는 (SG-) Asn 이고,
    억셉터 N297 당사슬이 GlcNAc 또는 (Fuca1,6)GlcNAc 이며,
    Endo 효소 A 가 EndoM N175Q 또는 EndoCC N180H 이고,
    Endo 효소 B 가 EndoS D233Q, EndoS D233Q/Q303L 또는 EndoS D233Q/E350Q 인, 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 반응액으로부터 원하는 Fc 함유 분자를 정제하는 것을 추가로 포함하는, 제조 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 당사슬 도너가 SGP 또는 (SG-) Asn 인, 제조 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 당사슬 도너 중의 복합형 당사슬이 화학적으로 수식된 비환원 말단을 포함하는, 제조 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 원하는 Fc 함유 분자가 IgG, CLCH 또는 Fc 단편인, 제조 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 비환원 말단의 화학적 수식이 비환원 말단의 시알산에 아지드기를 도입하는 것인, 제조 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 디벤질시클로옥텐을 포함하는 분자를 상기 아지드기와 반응시키는 단계를 추가로 포함하는, 제조 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
KR1020187037962A 2016-07-01 2017-06-30 hANP-Fc 함유 분자 콘주게이트 KR102493562B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2016-131450 2016-07-01
JP2016131450 2016-07-01
PCT/JP2017/024206 WO2018003983A1 (ja) 2016-07-01 2017-06-30 ｈＡＮＰ－Ｆｃ含有分子コンジュゲート

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190025576A KR20190025576A (ko) 2019-03-11
KR102493562B1 true KR102493562B1 (ko) 2023-01-30

Family

ID=60787355

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187037962A KR102493562B1 (ko) 2016-07-01 2017-06-30 hANP-Fc 함유 분자 콘주게이트

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11008392B2 (ko)
EP (2) EP4159749A3 (ko)
JP (1) JP7068167B2 (ko)
KR (1) KR102493562B1 (ko)
CN (2) CN109462989A (ko)
CA (1) CA3029605C (ko)
WO (1) WO2018003983A1 (ko)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6731381B2 (ja) * 2016-08-10 2020-07-29 公益財団法人野口研究所 ポリエチレングリコール鎖が導入された化合物の製造方法
CN117003875A (zh) 2017-09-29 2023-11-07 第一三共株式会社 抗体或其功能性片段、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、糖链重构抗体、药物组合物、应用
US11802146B2 (en) 2018-01-05 2023-10-31 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding anti-chikungunya virus antibodies
KR20230122685A (ko) 2018-09-06 2023-08-22 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 신규 고리형 디뉴클레오티드 유도체 및 그 항체 약물콘쥬게이트
AU2019379418A1 (en) * 2018-11-14 2021-06-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-CDH6 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
CA3191804A1 (en) * 2019-03-25 2020-10-01 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
WO2020196474A1 (ja) * 2019-03-25 2020-10-01 第一三共株式会社 抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
WO2020196712A1 (ja) * 2019-03-27 2020-10-01 第一三共株式会社 抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲートとｐａｒｐ阻害剤の組み合わせ
WO2021177438A1 (ja) 2020-03-06 2021-09-10 第一三共株式会社 新規環状ジヌクレオチド誘導体を含む抗体薬物コンジュゲート
US20230128032A1 (en) 2020-03-31 2023-04-27 Curtails Llc Early Drug Interventions to Reduce COVID-19 Related Respiratory Distress, Need for Respirator Assist and Death
TW202227479A (zh) 2020-09-02 2022-07-16 日商第一三共股份有限公司 新穎內－β－Ｎ－乙醯葡萄糖胺苷酶
AU2022207708A1 (en) 2021-01-13 2023-07-27 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
TW202241454A (zh) 2021-02-01 2022-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－免疫賦活化劑共軛物之新穎製造方法
KR20230157983A (ko) 2021-03-12 2023-11-17 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 당사슬 및 당사슬을 포함하는 의약품의 제조 방법
CN115671308A (zh) * 2021-07-30 2023-02-03 北京键凯科技股份有限公司 一种靶向性的抗体-聚乙二醇-siRNA药物偶联物
CN115703845A (zh) * 2021-08-05 2023-02-17 中国科学院上海药物研究所 寡糖连接子与侧链亲水性片段组合的糖链定点抗体-药物偶联物，其制法及用途
TW202334238A (zh) 2021-11-30 2023-09-01 日商第一三共股份有限公司 蛋白酶分解性遮蔽抗體
TW202344264A (zh) * 2022-01-17 2023-11-16 日商第一三共股份有限公司 Tsp1抑制劑
WO2023141855A1 (en) * 2022-01-27 2023-08-03 Glyco-Therapy Biotechnology Co., Ltd. Protein conjugates with multiple payloads and methods for making the same
WO2023167238A1 (ja) * 2022-03-02 2023-09-07 第一三共株式会社 Ｆｃ含有分子の製造方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008079995A2 (en) 2006-12-21 2008-07-03 Pdl Biopharma, Inc. Conjugate of natriuretic peptide and antibody constant region
WO2008154226A1 (en) 2007-06-06 2008-12-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh Natriuretic fusion proteins
JP2015507925A (ja) 2012-02-10 2015-03-16 ユニバーシティー オブ メリーランド，ボルティモア 抗体及びそのＦｃフラグメントの酵素化学的糖鎖改変
WO2017010559A1 (ja) 2015-07-16 2017-01-19 第一三共株式会社 新規ＥｎｄｏＳ変異酵素

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US7291138B2 (en) 2002-12-13 2007-11-06 Hakujuji Kabushiki Kaisha Disposable absorbent article
US8008257B2 (en) 2005-10-20 2011-08-30 University Of Ottawa Heart Institute ANF fusion proteins
US7763534B2 (en) 2007-10-26 2010-07-27 Tela Innovations, Inc. Methods, structures and designs for self-aligning local interconnects used in integrated circuits
HUE038285T2 (hu) * 2012-10-23 2018-10-29 Synaffix Bv Módosított antitest, antitest-konjugátum és eljárás ezek elõállítására
TW201442721A (zh) * 2013-01-23 2014-11-16 Daiichi Sankyo Co Ltd 糖鏈修飾心房利尿鈉肽
AU2014245917B2 (en) * 2013-03-29 2017-09-28 Glytech, Inc. Polypeptide having sialylated sugar chains attached thereto
US9951123B2 (en) 2013-09-30 2018-04-24 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-LPS O11 antibody
AU2015243512B2 (en) 2014-04-08 2020-06-04 University Of Georgia Research Foundation Inc. Site-specific antibody-drug glycoconjugates and methods
JP6750148B2 (ja) * 2014-04-25 2020-09-02 公益財団法人野口研究所 糖鎖切断抗体の製造方法及び均一糖鎖抗体

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008079995A2 (en) 2006-12-21 2008-07-03 Pdl Biopharma, Inc. Conjugate of natriuretic peptide and antibody constant region
WO2008154226A1 (en) 2007-06-06 2008-12-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh Natriuretic fusion proteins
JP2010530222A (ja) 2007-06-06 2010-09-09 べーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲーエムベーハー ナトリウム利尿融合タンパク質
JP2015507925A (ja) 2012-02-10 2015-03-16 ユニバーシティー オブ メリーランド，ボルティモア 抗体及びそのＦｃフラグメントの酵素化学的糖鎖改変
WO2017010559A1 (ja) 2015-07-16 2017-01-19 第一三共株式会社 新規ＥｎｄｏＳ変異酵素
US20180208915A1 (en) 2015-07-16 2018-07-26 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel endos mutant enzyme

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190025576A (ko) 2019-03-11
EP4159749A2 (en) 2023-04-05
JP7068167B2 (ja) 2022-05-16
WO2018003983A1 (ja) 2018-01-04
EP4159749A3 (en) 2023-06-14
EP3480211A1 (en) 2019-05-08
EP3480211A4 (en) 2019-12-25
JPWO2018003983A1 (ja) 2019-05-23
CA3029605C (en) 2024-01-16
US20190169293A1 (en) 2019-06-06
US11008392B2 (en) 2021-05-18
CN116064705A (zh) 2023-05-05
CA3029605A1 (en) 2018-01-04
CN109462989A (zh) 2019-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102493562B1 (ko) hANP-Fc 함유 분자 콘주게이트
EP3107563B1 (en) Glycotargeting therapeutics
US20210040170A1 (en) Glyco-modified atrial natriuretic peptide
US20240116995A1 (en) Mutant fgf-21 peptide pegylated conjugates and uses thereof
US20230338471A1 (en) Liquid formulations comprising mutant fgf-21 peptide pegylated conjugates
US20230417762A1 (en) Sialylated glycoproteins
EA044172B1 (ru) Терапевтические средства с углевод-опосредованной адресной доставкой

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant