JP7068167B2 - 糖鎖リモデリングされたFc含有分子の製造方法 - Google Patents
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Description
hANPのような内因性の生理活性ペプチドは、特異的な受容体に対する選択性が非常に高い為、高い有効性と安全性が期待できる。その反面、体循環中に、様々な代謝酵素により速やかに代謝されるか、腎において糸球体濾過により速やかに排出される為、血中半減期が極めて短いことが知られている。このことから、代謝酵素耐性を付与する、あるいは腎排泄を回避することで、ペプチドの血中半減期を延長する試みがなされている。例えば、糖鎖修飾ペプチド(特許文献1)、融合ポリペプチド(特許文献2)、アルブミン融合ペプチド(特許文献3、非特許文献1)、免疫グロブリンFc融合ペプチド(特許文献4、非特許文献2)、ポリエチレングリコール(PEG)修飾ペプチド(非特許文献3、4)など様々な方法が挙げられる。
抗体医薬品は、neonatal Fc receptor(FcRn)を介したリサイクリング機構によって、ペプチド医薬品やタンパク医薬品と比べて非常に長い血中半減期を有している(非特許文献5)。このことから、同様のリサイクリング効果が期待される融合ペプチドもhANPの半減期延長の手段として考えられてきた(特許文献3及び4、非特許文献1及び2)。しかしながら、血中で速やかに代謝されるhANPをそのままキャリアタンパクに搭載した場合、キャリア上のhANP部分が循環中に代謝を受けると示唆されており、「hANP-タンパク融合体」をキャリアタンパク部分の血中滞留性と同等レベルで血中に滞留させることが難しい(非特許文献2)。
このように、緩やかな血中移行性、十分な血中滞留時間及び薬理効果に必要な活性の保持を全て併せ持つhANP製剤の開発が望まれている。
(1) hANPペプチドがポリエチレングリコールリンカー(L(PEG))を介して、Fc含有分子のAsn297に結合する糖鎖(N297糖鎖)に結合したコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩、ここで、
hANPペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列において、N末端から連続する1~5個のアミノ酸および/またはC末端の1アミノ酸が欠失していても良く、且つ、当該ペプチドのN末端およびC末端のいずれか、または、両方が糖鎖修飾されていても良く、
L(PEG)は、10~35個のエチレングリコール構造を含み、他の結合構造および/または修飾構造を含んでいても良いリンカー構造であり、
Fc含有分子は、ヒトIgGのFc領域に相当するアミノ酸配列を有し、ヒトの生体分子に対する特異的な結合能を持たない分子であり、並びに、
N297糖鎖は、以下の式で表される構造を有する糖鎖N297-(Fuc)SG、N297-(Fuc)MSG1又はN297-(Fuc)MSG2である、
(2) hANPペプチドが、hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)又はhANP(3-27)である(1)のコンジュゲート体、または、その薬学上許容される塩。
(3) hANPペプチドが、以下式で表されるAG5、AG7、AG9またはSGのいずれかの糖鎖が側鎖にNグリコシド結合したアスパラギンまたはグルタミンが当該ペプチドのN末端またはC末端に結合した糖鎖修飾ペプチドである、(1)又は(2)のコンジュゲート体、または、その薬学上許容される塩、
(4) hANPペプチドが、SG糖鎖が側鎖にNグリコシド結合したアスパラギンがそのN末端に結合したhANP(1-28)であることを特徴とする、(3)のコンジュゲート体、または、その薬学上許容される塩。
(5) L(PEG)が、25~30個のエチレングリコール構造を含み、結合構造として、アミド結合、及び、1,2,3-トリアゾール環を含んでいるリンカー構造である(1)のコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩。
(6) L(PEG)が、以下のいずれかの式で表されるリンカー構造である(1)のコンジュゲート体またはその薬理学上許容される塩、
(7) Fc含有分子が、ヒトの生体成分以外の物質を抗原とするヒトIgGモノクローナル抗体、または、ヒトIgGのFc領域を有し可変領域部を欠損させた断片又は改変体である(1)のコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩。
(8) Fc含有分子が、ヒトIgGに由来するFcまたはヒトIgGの定常領域からなるCLCHである(7)のコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩。
(9) Fc含有分子が、配列番号3のアミノ酸番号20~474のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号5のアミノ酸番号21~234のアミノ酸配列からなる軽鎖の組み合わせからなる抗体(mAb-A)、配列番号7のアミノ酸番号20~349のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号9のアミノ酸番号21~125のアミノ酸配列からなる軽鎖の組み合わせからなるCLCH(CLCH-A)、配列番号11のアミノ酸番号20~349のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号9のアミノ酸番号21~125のアミノ酸配列からなる軽鎖の組み合わせからなるCLCH(CLCH-B)、配列番号15のアミノ酸番号21~243のアミノ酸配列からなるFc断片(Fc-B)、又は、配列番号17のアミノ酸番号21~247のアミノ酸配列からなるFc断片(Fc-A)或いはそれらの改変体である(7)のコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩。
(10) hANPペプチドが、hANP(1-28)又は(SG-)Asn-hANP(1-28)、
PEGリンカーが、L(PEG)-A、L(PEG)-B、L(PEG)-C、L(PEG)-D、L(PEG)-E、L(PEG)-F、L(PEG)-G又はL(PEG)-H、
Fc含有分子が、mAb-A、CLCH-A、CLCH-B、Fc-A又はFc-B、
N297糖鎖が、N297-(Fuc)SG、
である、(1)のコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩。
(11) hANPペプチドが(SG-)Asn-hANP(1-28)、PEGリンカーがL(PEG)-B、Fc含有分子がFc-A又はFc-B、及び、N297糖鎖がN297-(Fuc)SG、である、(1)のコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩。
(12) (1)~(11)のいずれかのコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩を有効成分として含有する医薬。
(13) GC-Aの活性化により治療可能な疾患の治療剤、又は、予防剤である(12)の医薬。
(14) 高血圧症、急性心不全、慢性心不全、急性腎不全、慢性腎不全の治療剤、又は、予防剤である(12)の医薬。
(15) 以下の工程を含む、(1)~(11)のいずれかのコンジュゲート体の製造方法:
工程A:動物細胞で産生したFc含有分子を加水分解酵素で処理し、(Fucα1,6)GlcNAc-Fc含有分子を製造する工程;
工程B1:SG(10)又はMSG(9)のシアル酸にアジド基を導入し、還元末端をオキサゾリン化した糖鎖ドナー分子と、糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc-Fc含有分子と反応させ、シアル酸にアジド基が導入されたSG型糖鎖リモデリングFc含有分子を合成する工程、あるいは、工程B2:(SG-)Asn、(MSG-)Asnのシアル酸にアジド基を導入した糖鎖ドナー分子と、2種の糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc-Fc含有分子と反応させ、シアル酸にアジド基が導入されたSG型糖鎖リモデリングFc含有分子を合成する工程;
及び、
工程C:一方にhANPペプチド、他方にDBCOを有するリンカー分子を、工程Bで作製されたシアル酸にアジド基が導入されたSG型糖鎖リモデリングFc含有分子と反応させ、(1)のコンジュゲート体を合成する工程。
(16) 工程Aの反応液を、ハイドロキシアパタイトカラムによる精製を含む工程により(Fucα1,6)GlcNAc-Fc含有分子を精製する工程を更に含む、(15)の製造方法。
(17) 投与が必要な対象に対して、(1)~(11)のいずれかのコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩を有効成分として投与することを含む、GC-Aの活性化により治療可能な疾患を治療、又は、予防する方法。
(18) GC-Aの活性化により治療可能な疾患の治療、又は、予防のために使用される、(1)~(11)のいずれかのコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩。
(19) GC-Aの活性化により治療可能な疾患の治療剤、又は、予防剤の製造のための(1)~(11)のいずれかのコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩の使用。
上記の(17)~(19)において、GC-Aの活性化により治療可能な疾患は、好ましくは、高血圧症、急性心不全、慢性心不全、急性腎不全、慢性腎不全である。
本発明において、複数の構造単位が「連結された」とは、それぞれの構造単位が直接共有結合により結合しているか、又は、リンカーを介して間接的に結合されることで、同一分子中に存在していることを意味する。構造単位間を連結する化学構造は特に限定されない。
本発明のコンジュゲート体を構成する構造単位は非常に分子量が大きく、複雑な構造を有するため、便宜上記号を利用して簡略的に記載する場合がある。このような記号表記において、hANPペプチドは「hANP」、PEGリンカーは「L(PEG)」又は「PEG(n)」(nは含まれる連続したエチレングリコール単位((-CH2-CH2-O-)の構造単位)の個数)、Fc含有分子に含まれるN297糖鎖は「N297 GLY」、Fc含有分子は「mAb」、「CLCH」、「Fc」のようにそれぞれ記載する。また、糖鎖には、後述の通り、SG等の表記を用いる。それぞれの構造単位同士の結合は、一般的な結合様式は省略される場合もあるが、特徴的な構造や官能基については有機合成化学分野で通常用いられる表現により表示することがある。
これに対して、本明細書におけて、アミノ酸又はペプチドがそのC末端のカルボキシル基において別の構造単位と連結する場合、連結される構造単位を表す記号は、当該アミノ酸又はペプチドを表す記号の右側にハイフンを付けて、括弧を付けずに記載され、この場合のハイフンはペプチド又はアミノ酸のC末端カルボキシル基とリンカー構造の有するアミノ基(又はアジド基)の間で形成されるアミド結合を表すものとする。例えば、Tyrのカルボキシル基にSGが連結した構造は、”Tyr-SG”として表記される。
糖鎖に含まれる単糖としては、糖の基本構造を有するものであれば特に限定されず、6員糖、5員糖、など様々なものを用いることができる。また、天然に存在する糖であっても、人工的に合成された糖であっても良いが、天然に存在する糖が好ましい。単糖としては、例えば、グルコース(Glu)、フルクトース(Flu)、マンノース(Man)、ガラクトース(Gal)、グルコサミン(Glc)、Nアセチルグルコサミン(GlcNAc)、グルクロン酸(GlucA)、ノイラミニン酸(Neu)、シアル酸/N-アセチルノイラミニン酸(Sia/NeuNAc/Neu5Ac)、ガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミン(GalNAc)、キシロース(Xyl)、イズロン酸(IdoA)、フコース(Fuc)、アルドトリオース、グリセルアルデヒド、アルドテトロース、エリトロース、トレオース、アルドペントース、リボース、リキソース、アラビノース、アルドヘキソース、アロース、タロース、グロース、アルドロース、イドース、ケトトリオース、ジヒドロキシアセトン、ケトテトロース、エリトルロース、ケトペントース、キシルロース、リブロース、ケトヘキソース、プシコース、ソルボース、タガトース、等を挙げることができる。
本発明において、「hANPペプチド」とは、28個のアミノ酸からなる生理活性ペプチドであるヒト型心房性ナトリウム利尿ペプチド(human Atrial Natriuretic Peptide:配列番号1、以下天然型hANP、又は、hANP(1-28))のアミノ酸配列において、少なくとも7位から27位のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチドを意味する。天然型hANPは、細胞表面に発現するGC-A受容体(Chinkers M,et al.,Nature 338;78-83,1989))に結合し、その受容体の細胞内ドメインに存在するグアニレートサイクレースを活性化させ、細胞内のcGMP濃度を上昇させることにより、その生理活性を発揮する。天然型hANPは、Biochem.Biophys.Res.Commun.,118巻,131頁,1984年に記載のα-hANPが、一般名カルペリチド(carperitide)として、日本において製造販売承認を取得し、販売(商品名:ハンプ、HANP)されている。α-hANPは、一般的にはHuman pro-ANP[99-126]としても知られている。
天然型hANPは、配列番号1の7位と23位のCys残基同士がジスルフィド結合し、分子内リング構造を形成する。hANPによるGC-A受容体の活性化には、このリング構造と、そのC末端側27位Arg残基までのアミノ酸が重要であることが知られている(Silver, MA,, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. (2006), 15, p14-21、A. Calderone, Minerva Endocrinol.(2004), 29, p.113-127)。そのため、このリング構造からなるhANP(7-27)は、GC-Aを活性化させる最小単位であると考えられる。本発明のhANPペプチドとしては、配列番号1)において、N末端側から連続する1乃至6個のアミノ酸、及び/又は28位のアミノ酸が欠失していても良いアミノ酸配列からなるペプチドであり、好ましくは、配列番号1の1位、1位及び2位、並びに、28位のアミノ酸の少なくとも一箇所が欠失していても良いペプチドであり、より好ましくは配列番号1の1位、並びに、1位及び2位のアミノ酸が欠失しても良いアミノ酸配列からなるペプチド(hANP(2-28)、hANP(3-28)等)であり、最も好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド(hANP(1-28))である。
N結合型糖鎖の多くは、この基本構造を有しており、その非還元末端や分岐糖においてさらに別の糖が結合していても良い。
N結合型複合型糖鎖の代表的なものとしては、鶏卵の卵黄に含まれるシアリルグリコペプチド(Sialyl GlycoPeptide:以下、「SGP」という)に含まれる糖鎖であり、以下の構造式及び配列式で示される構造からなるシアリルグリカン(Sialyl Glycan、以下、「SG」という)を例示することができる。
また、SGの還元末端のGlcNAcを別の糖に置き換えた還元末端改変糖鎖を、公知の糖転移反応を利用して、上記のジシアロサッカリドを用いて作製することができる。SGの還元末端のGlcNAcを、Glcに置き換えた還元末端改変糖鎖をSG(Glc)、Manに置き換えた還元末端改変糖鎖をSG(Man)、とそれぞれ表記するものとする。
本発明のコンジュゲート体において、hANPペプチドに結合する糖鎖の個数の上限はないが、例えば3個以下であり、好ましくは2個又は1個である。hANPペプチドに付加する糖鎖は、同一の構造のものであっても異なる構造の糖鎖が混在していても良いが、全て同一の糖鎖構造であることが好ましい。
本発明のコンジュゲート体において、「Fc含有分子」は、IgG重鎖のFc領域においてよく保存されたN結合型糖鎖による修飾を受けるアスパラギン(「Asn297」という。)の側鎖に結合する糖鎖(「N297糖鎖」という)を介してhANPペプチドと連結し、血中でhANPペプチドを長期間持続させるためのキャリアタンパク質として機能するため、ヒトIgGのFc領域に相当するアミノ酸配列を有し、ヒトの生体分子に対する特異的な結合能を持たないことが必要である。IgGのFc領域に相当するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号7のアミノ酸番号128~349のアミノ酸配列、配列番号11のアミノ酸番号128~349のアミノ酸配列、配列番号15のアミノ酸番号22~243のアミノ酸配列、配列番号17のアミノ酸番号26~247のアミノ酸配列、及び、それらの配列を改変したアミノ酸配列を挙げることができる。
IgGは重鎖と軽鎖からなる。両鎖はジスルフィド結合で連結されており、さらに、重鎖同士がヒンジ領域でジスルフィド結合してホモ2量体を形成している。また、IgGはドメイン構造を有しており、可変領域を含み抗原結合能を有するFabドメインと、Fc受容体と結合するFcドメインがヒンジ領域を介して連結されている。本発明のFc含有分子は、Fc領域を含むものであれば特に限定されず、全長IgG重鎖、Fc領域を含む抗体断片、それらのアミノ酸配列を部分的に改変した改変体などを用いることができる。また、本発明のFc含有分子は、重鎖のみでも良く、重鎖の構造に対応した軽鎖を有していても良い。Fc含有分子の元となるIgGのサブクラスは特に限定されず、いずれのサブクラスを選択しても良いが、好ましくはIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4であり、より好ましくはIgG1である。IgGの定常領域におけるアミノ酸配列はよく保存されており、Edelman et al.,(Biochemistry、(1969) Vol. 63, pp. 98-85)においてそれぞれのアミノ酸がEu番号(Eu INDEX)で特定されている。例えば、Fc領域においてN結合型糖鎖が付加するAsn297は、Eu番号において297位に相当するものであり、分子の断片化や領域欠損によって実際のアミノ酸位置が変動した場合であってもEu番号で表示することによってアミノ酸が一義的に特定される。
また、目的分子の発現、精製効率の向上を目的として、シグナル配列、ペプチド分解酵素認識配列、GSTのようなTag配列を付加させても良い。
本発明のコンジュゲート体において、N297糖鎖が、N297-(Fuc)MSG1又はN297-(Fuc)MSG2である場合、Fc含有分子が二量体であり、通常両方のモノマーにN297糖鎖を有するため、コンジュゲート体は2つのPEGリンカー及びhANPペプチドが結合された分子(2価のhANPペプチド)となる(Fc含有分子が糖鎖欠損体の場合、一方のモノマーのみにN297-(Fuc)MSG1又はN297-(Fuc)MSG2が付加し、1価のhANPペプチドとなる)。一方で、N297糖鎖が、N297-(Fuc)SGである場合、Fc含有分子が二量体であるため、コンジュゲート体は4つのPEGリンカー及びhANPペプチドが結合された分子(4価のhANPペプチド)となる(Fc含有分子が糖鎖欠損体の場合、一方のモノマーのみにN297-(Fuc) SGが付加し、2価のhANPペプチドのコンジュゲートとなる)。本発明のコンジュゲート体は、これら複数種類のN297糖鎖を有する分子、又はそれらの通常体と糖鎖欠損体の混合物(本発明において、このような混合物は、便宜上、通常体のコンジュゲートとして表記される。)であっても良く、いずれか一つの構造からなるN297糖鎖を有する分子であっても良く、好ましくはいずれか一つの構造からなるSG型N297糖鎖を有する分子であり、より好ましくはN297糖鎖としてN297-(Fuc)SGを有し、コンジュゲート体が4価のhANPペプチド(糖鎖欠損体では2価)を有するものである。
上記の加水分解反応により得られた(Fucα1,6)GlcNAc-Fc含有分子を糖鎖アクセプター分子として、EndoS D233Q変異体のような糖転移酵素を用いてSG型糖鎖ドナー分子と反応させることによって、上述の構造からなるSG型N297糖鎖を有するFc含有分子(図2のB参照)を得ることができる(図3B)。
目的物が2価のhANPペプチドを有するコンジュゲート体である場合、糖鎖としてMSG1(9)又はMSG2(9)を有する糖鎖ドナー分子を採用する。このような糖鎖は、市販のmonosialo-Asn free (1S2G/1G2S-10NC-Asn、(株)糖鎖工学研究所)を原料に実施例1-11に記載の方法に準じて分離して採用することもできるし、分離せずに混合物として採用することもできる。
使用する2種類のEndo酵素は、複合型糖鎖を広く基質とする酵素A(EndoM様酵素)とFc含有分子のN297糖鎖を基質とする酵素B(EndoS様酵素)を適切に組合せることが重要である。
酵素Aとしては、EndoM、EndoOm、EndoCCとその加水分解活性を低下させたEndoM変異体、EndoOm変異体、EndoCC変異体などを例示できる。酵素Aとして好ましいものは、EndoM N175Q、EndoCC N180H、EndoOm N194Qである。
酵素Bとしては、EndoS、EndoS2(EndoS49)及びそれらの加水分解活性を低下させたEndoS変異体、 EndoS2(EndoS49)変異体などを例示できる。酵素Bとして好ましいものは、EndoS D233Q 、EndoS D233Q/Q303L、EndoS D233Q/E350A、EndoS D233Q/E350Q、EndoS D233Q/E350D、EndoS D233Q/E350N、EndoS D233Q/D405Aなどである。
糖鎖ドナーの構造は、採用される酵素Aに認識される糖鎖構造を有するものであれば、特に限定されず、天然から取得されたもの、化学反応あるいは酵素反応との組み合わせで合成可能な分子など、様々なものを用いることができる。アノマー部位の置換基Rは、R=H以外、何を使用してもよい。N結合型糖鎖構造の場合(下記式参照。アノマーの置換基Rは一番上の構造式の還元末端のR)、アミド構造やアジドを例示できる。
反応温度は、用いる酵素の至適温度に応じて適宜選択することができるが、通常15~50℃であり、好ましくは、25~40℃である。本方法では、2種類の酵素を用いるため、一方の酵素の至適温度で他方の酵素が失活してしまうと、適切に転移反応が進まない場合がある。そのため、至適反応温度等の条件が近い酵素の組み合わせを選択するのが好ましい。
本発明においてPEGリンカーとは、本発明のコンジュゲート体においてhANPペプチドとFc含有分子の連結を仲介する、ポリエチレングリコール構造を含む化学構造を意味する。PEGリンカー構造は、通常は分岐構造を含まない直鎖構造からなり、一方の末端でhANPペプチドのN末端のアミノ基又はC末端のカルボキシル基と結合し、他方の末端でFc含有分子のN297糖鎖のシアル酸2位のカルボン酸と結合している。
本発明のPEGリンカーが、一つのリンカー分子に由来する場合、Fc含有分子との結合にはSG型N297糖鎖のシアル酸の2位カルボン酸と結合させるため、コンジュゲート体の構造の均一性を確保するため、hANPペプチドとはN末端と結合するように、リンカー分子に含まれる官能基を選択することが好ましい。
用いられるリンカー分子は、コンジュゲート体製造の効率や利便性を考慮して適宜、適切な官能基や構造を有する化合物が選択される。そのため、最終的に構成されるPEGリンカー構造において、合計として所定の個数のエチレングリコール単位構造を含んでいれば良く、一種類のリンカー分子のみがPEGを含んでいても良く、2つ又はそれ以上のリンカー分子がエチレングリコール単位を含んでいても良い。
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(CuAAC)]、アジド基とジベンジルシクロオクテン(DBCO)の反応により1,2,3-トリアゾール環を形成させる付加環化反応[Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition(SPAAC)]を例示でき、ここでは、その他同様に歪んだシクロオクチン構造を有する化合物、ビシクロ[6.1.0]ノン-4-エン(BCN)(Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,9422-9425)や中員環構造上にヘテロ原子を含むシクロアルキン(Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,1190-1194)なども利用できる。別の環形成反応として、1,2,4,5-テトラジン環と歪んだアルケンとのDiels-Alder付加環化反応(Curr.Opin.Chem.Biol.,2014,21,89-95)を例示できる。また、アルデヒド基とのPictet-Spengler反応型の環化縮合として、Hydrazino-Pictet-Spengler ligation(Bioconjugate Chem. 24,846-851.)やOxyamine-based Pictet-Spengler ligation(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 46-51)が例示できる。その他、アミノ基とカルボキシル基によるアミド結合、SH基とマレイミド基のマレイミド縮合、SH基とメチルスルフォニルフェニルオキサジアゾール基との縮合(Angew. Chem., Int. Ed. 52, 12592-6.)、SH基とヨードアセチル基との結合、SH基と2-ピリジルジチオ基との縮合によるジスルフィド結合、アルデヒド基とヒドラジドのヒドラゾン縮合、アルデヒド基とアミノオキシ基のオキシム縮合等を例示することができる。本発明で採用されるリンカー分子としてはこれらの結合様式に合致した官能基を有するものを適宜選択して、リンカー構造の形成に用いることができる。
~L(PEG) H1、及びL(PEG) A2~L(PEG) H2、のような構造を挙げることができる。
本発明のコンジュゲート体は、上述したhANPペプチド、Fc含有分子、リンカー分子等の中間体を適宜、有機合成化学分野で公知の反応を利用して結合させることで製造することができる。その製造の順序は特に限定されず、中間体や目的物の構造に合わせて、常法に従って、様々な方法を採用することができる。
それぞれの中間体の有する官能基は、当該製造工程に応じて、常法に従って、適宜、活性化、不活性化、保護基の付加、脱保護等を行う。
上記に例示したPEGリンカーを有するコンジュゲート体は、例えば以下のように製造することができる。
N297糖鎖に結合するリンカー分子は、N297糖鎖の非還元末端に官能基(例えばアジド基)を有する分子であり、上述のFc含有分子の糖鎖リモデリング工程で合成する。一方にアミノ基、他方に別の官能基(例えばアジド基)を有するリンカー分子をSG(10)と反応させ、糖鎖の非還元末端のシアル酸2位のカルボン酸に当該リンカー分子を結合させる。続いて、この糖鎖分子の還元末端GlcNAcを活性化させて、糖鎖ドナー分子とし、糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc-Fc含有分子と反応させて、Fc含有分子のN297糖鎖の非還元末端に官能基を導入する。
hANPペプチドのN末端に結合するリンカー分子は、一方にカルボキシル基、他方に別の官能基(DBCO、保護基が導入されたアミノ基など)を有する分子である。hANPペプチドを当該リンカー分子と反応させることで、hANPペプチドのN末端側に所望の官能基を導入することができる。
配列番号7のアミノ酸番号20~349のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号9のアミノ酸番号21~125のアミノ酸配列からなる軽鎖の組み合わせからなるCLCH(CLCH-A)であり、SG型N297糖鎖がN297-(Fuc)SG又はN297-(Fuc)MSG1であり、より具体的には実施例3で合成された、化合物3-1~化合物3-14を挙げることができるが、好ましくは化合物3-1~化合物3-6である。
本発明のコンジュゲート体は、修飾されていないhANP(1-28)と比較して、延長された血中持続時間、及び、優れた物性を示し、且つ、皮下投与時にhANP製剤として好ましい緩やかな血中移行性能を有している。天然型hANP(1-28)は、血中から速やかに消失するため、臨床では点滴等により静脈内へ持続投与する必要があったが、本発明のコンジュゲート体は通常の皮下投与によっても長期間薬理効果を発揮できる。また、本発明のコンジュゲート体は、高濃度においても凝集性が低いという特性を有する。このような、本発明のコンジュゲート体の特性によって、従来の天然型hANPや既存のhANP製剤では達成できなかった投与方法、投与経路、製剤技術を採用することが可能となり、急性の循環器系疾患のみならず、慢性の循環器系疾患(高血圧症や慢性心疾患など)の治療に用いることも可能となる。さらに、本発明のコンジュゲート体は生物学的研究ツールとしても有用である。天然型hANPは、長期間血中に存在した場合の組織移行性などは不明であるが、本発明のコンジュゲート体を投与することで、このような局在やhANPが長期間血中に存在することによる生体への影響を調べることが可能となる。
本発明のコンジュゲート体の血中持続性は、実施例4-2の方法に準じて、動物への投与後の末梢血中のcGMP濃度、及び/又は、末梢血サンプル中に含有される当該コンジュゲート体を検出することによって試験することが出来る。本発明のコンジュゲート体は、体内に投与された後、約24時間後においても末梢血中のcGMP濃度を上昇させる効果を維持しており、より好ましくは投与約48時間後においても当該効果を維持しており、より好ましくは投与約72時間後においても当該効果を維持しており、さらにより好ましくは投与約96、120、144又は168時間後においても当該効果を維持している。更に、本発明のコンジュゲート体は、皮下投与後緩やかに活性を発現し、そのピークは24~48時間後である場合が多く、このような血中動態は低血圧発現のリスクを低減・回避できると期待される。また、コンジュゲート体の投与後の末梢血からの、当該コンジュゲート体の検出に関して、約24時間後においても検出されることが好ましく、より好ましくは約48時間後においても検出されることであり、さらに好ましくは約72時間後においても検出されることであり、さらにより好ましくは約96、120、144又は168時間後においても検出されることである。
本発明に係る医薬の有効成分として用い得る物質は、上述したコンジュゲート体の薬学的に許容される塩であってもよい。すなわち、本発明においては、上述した物質の、無機酸、例えば塩酸、硫酸、リン酸、又は有機酸、例えばギ酸、酢酸、酪酸、トリフルオロ酢酸(TFA)、コハク酸、クエン酸等の酸付加塩を、有効成分として使用することもできる。あるいは、本発明においては、上述した物質の、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム等の金属塩、有機塩基による塩の形態を有効成分として使用することもできる。このような、本発明のコンジュゲート体の塩は、hANPペプチド部分の塩であっても良く、糖鎖の構造において塩を形成していても良い。本発明のコンジュゲート体の塩として好ましくは、hANPペプチド部分で薬学上許容される塩を形成したものであり、また、本発明に係る医薬組成物は、その有効成分に係る物質の遊離形としても、又はその薬学上許容し得る塩であってもよい。
以下において、構造式中で、単に「hANP」と表記される場合、修飾ペプチド中のhANPペプチドがhANP(1-28)(配列番号1)であることを示し、当該ペプチドはN末端のSerにおいて、リンカー分子と結合、又は、糖鎖修飾されている。
Fmoc-PEG試薬であるFmoc-PEG(12)-COOH;3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ) エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ]プロパン酸(Novabiochem製、304mg,0.36mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(4.6ml)に、N,N,N',N'-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボラート(東京化成工業(株)製,109mg,0.36mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(1.0ml)とジイソプロピルエチルアミン(131μl,0.75mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。
hANP(1-28)酢酸塩(1000mg)をN,N-ジメチルホルムアミド(11ml)、蒸留水(3ml)に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(315μl,1.81mmol)を加えた。この溶液に対して、事前に調製した活性エステルを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液(5.6m)を加え、室温で1時間攪拌した。
反応終了後、反応液にトリフルオロ酢酸(186μl,2.41mmol)を加え、20mL-scintillation vial(Biotage製)に移し、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去した。適量のアセトニトリルを前記バイアルに加え、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去し、固形物を得た。この固形物に適量のジエチルエーテルを加えてデカンテーションした後に、適量のアセトニトリル/ジエチルエーテル(1/2)を加え再びデカンテーションした。得られた固形物を減圧下乾燥し、表記目的化合物を含む粗生成物を得た。これ以上精製せず、そのまま次の反応に用いた。
工程(1-1A)で合成した粗生成物(全量)をN,N-ジメチルホルムアミド(16ml)と蒸留水(3.2ml)の混合溶液に溶解させ、ピペリジン(518μl,5.23mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。反応終了後、反応液に酢酸(451μl,7.88mmol)加え、20mL-scintillation vial(Biotage)に移し、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去した。適量のアセトニトリルを前記バイアルに加え、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去し、固形物を得た。この固形物に適量のジエチルエーテルを加えてデカンテーションした後に、適量のアセトニトリル/ジエチルエーテル(1/2)を加え、再びデカンテーションした。得られた固形物を適量の0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と酢酸を加えて溶解させ、数回に分けて、逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2(昭光サイエンティフィック製)を使用し、カラムにはInertsil ODS-3(GLサイエンス製)を使用した。溶出中にUV検出(220nm)された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。表記目的化合物(826mg)を無色固体として得た。
Fmoc-PEG試薬であるFmoc-PEG(12)-COOH;3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ) エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ]プロパン酸(Novabiochem製,251mg,0.30mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(3.8ml)に、N,N,N',N'-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボラート(東京化成工業(株)製、90mg,0.30mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(0.8ml)とジイソプロピルエチルアミン(87μl,0.50mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。
工程(1-1B)で合成した化合物(826mg)をN,N-ジメチルホルムアミド(10ml)と蒸留水(3.5ml)を加えて溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(160μl,0.92mmol)を加えた。この溶液に対して、事前に調製した活性エステルを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液(4.6m)を加え、室温で1時間攪拌した。反応終了後、反応液にトリフルオロ酢酸(77μl,1.00mmol)を加え、20mL-scintillation vial(Biotage製)に移し、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去した。適量のアセトニトリルを前記バイアルに加え、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去し、固形物を得た。この固形物にジエチルエーテルを加えてデカンテーションした後に、適量のアセトニトリル/ジエチルエーテル(1/2)を加え、再びデカンテーションした。得られた固形物を減圧下乾燥し、表記目的化合物を含む粗生成物を得た。これ以上精製せず、そのまま次の反応に用いた。
工程(1-1C)で合成した粗生成物(全量)をN,N-ジメチルホルムアミド(14ml)と蒸留水(1.4ml)を加えて溶解させ、ピペリジン(395μl,3.99mmol)を加え、室温で30分攪拌した。反応液に蒸留水(1.0ml)を加え、更に30分攪拌した。反応終了後、反応液に酢酸(343μl,5.99mmol)を加え、20mL-scintillation vial(Biotage製)に移し、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去した。アセトニトリルを前記バイアルに加え、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去し、固形物を得た。この固形物に適量のジエチルエーテルを加えてデカンテーションした後に、適量のアセトニトリル/ジエチルエーテル(1/2)を加え再びデカンテーションした。得られた固形物を適量の0.2%トリフルオロ酢酸水溶液と酢酸を加えて溶解させ、数回に分けて、逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2(昭光サイエンティフィック製)を使用し、カラムにはInertsil ODS-3(GLサイエンス製)を使用した。溶出中にUV検出(220nm)された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。表記目的化合物(694mg)を無色固体として得た。
工程(1-1D)で合成した化合物(520mg)をN,N-ジメチルホルムアミド(5.5ml)と蒸留水(1.5ml)を加えて溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(77μl,0.44mmol)を加えた。この溶液に対して、DBCO-NHS ester(Click Chemistry Tools製, 53mg, 132mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(0.2m)を加え、室温で1時間攪拌した。反応終了後、20mL-scintillation vial(Biotage製)に移し、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去した。この固形物にジエチルエーテルを加えてデカンテーションした後に、アセトニトリル/ジエチルエーテル(1/2)を加え再びデカンテーションした。得られた固形物を適量の0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と酢酸を加えて溶解させ、数回に分けて、逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2(昭光サイエンティフィック製)を使用し、カラムにはInertsil ODS-3(GLサイエンス製)を使用した。溶出中にUV検出(220nm)された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥し、表記目的化合物(化合物1-1)(283mg)を無色固体として得た。
ESI-MS: Calcd for C200H322N48O67S3: [M+4H]4+ 1142.8(ave.), Found 1142.6 ; [M+5H]5+914.4(ave.), Found 914.3; [M+6H]6+ 762.2(ave.), Found 762.0
Fmoc-(SG-)Asn (1S2S-11NC-Asn-Fmoc、糖鎖工学研究所製,2g)を適量の0.1%トリフルオロ酢酸水溶液に溶解させ、複数回に分けて逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2(昭光サイエンティフィック製)を使用し、カラムにはInertsil ODS-3(GLサイエンス製)を使用した。溶出中にUV検出(220nm)された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。無色固体(1.8g)を得た。
カルペリチド酢酸塩(hANP(1-28)酢酸塩)(2.7g)を蒸留水(200 ml)に溶解させ、トリフルオロ酢酸(4ml,52.3mmol)加え、10分間放置した後に、凍結乾燥した。凍結乾燥終了後、蒸留水(200 ml)に溶解させ、再び凍結乾燥した。無色固体(2.7g)を得た。
工程(1-2A)で調製したFmoc-(SG-)Asnフリー体(436mg)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(7.2ml)に対して、氷冷下HATU(65mg,0.17mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(0.8ml)とジイソプロピルエチルアミン(118μl,0.68mmol)を加え、2.5分攪拌し、速やかに次の反応に用いた(溶液1-2C)。
工程(1-2B)で調製したhANP(1-28)TFA塩(400mg)をN,N-ジメチルホルムアミド溶液(4.8ml)と蒸留水(1.2ml)を加えて溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(118μl,0.68mmol)を加えた。この溶液に対して、事前に調製した活性エステルを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液1-2C(8.0m)を加え、室温で30分攪拌した。反応終了後、酢酸(82μl,1.36mmol)を加えた。約5mlずつの反応液をあらかじめアセトニトリル(35ml)を加えた遠沈管(50ml)3本に移した。小型遠心機(日立工機、CF16RX)を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。3本の遠沈管に分かれた固形物を1つの遠沈管にまとめ、アセトニトリル(30mL)で洗浄した後、ジエチルエーテル(30mL)で2回洗浄した後に、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。
得られた粗生成物(全量)をN,N-ジメチルホルムアミド溶液(8.4ml)、蒸留水(1.4ml)に溶解させ、ピペリジン(224μl,2.26mmol)を加え、室温で30分攪拌した。反応終了後、酢酸(194μl,3.39mmol)を加えた。約5mlずつの反応液をあらかじめアセトニトリル(35ml)を加えた遠沈管(50ml)2本に移した。小型遠心機(日立工機、CF16RX)を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。2本の遠沈管に分かれた固形物を1つの遠沈管にまとめ、アセトニトリル(30mL)で洗浄、ジエチルエーテル(30mL)x2で洗浄した後に、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。
以上の操作を3ロット分行い、各粗生成物(3ロット分)を1つにまとめた。得られた固形物を適量の0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と酢酸を加えて溶解させ、数回に分けて、逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2(昭光サイエンティフィック製)を使用し、カラムにはInertsil ODS-3(GLサイエンス製)を使用した。溶出中にUV検出(220nm)された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。表記目的化合物(SG-)Asn-hANP(1-28) (1.49g)を無色固体として得た。
ESI-MS: Calcd for C215H345N53O102S3: [M+4H]4+ 1351.1(ave.), Found 1351.1; [M+5H]5+1081.1(ave.), Found 1080.9
WO2014115797A1 (実施例2-28A)に記載された方法に従って合成したFmoc-NH-PEG(12)2-COOH(122mg,0.085mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(1.0ml)に、N,N,N',N'-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボラート(東京化成工業(株),23mg,0.077mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(1.0ml)とジイソプロピルエチルアミン(54μl,0.31mmol)を加え、室温で1時間攪拌した(溶液1-2D)。
工程(1-2C)で合成した化合物(300mg)をN,N-ジメチルホルムアミド(3ml)、蒸留水(1.4ml)に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(54μl,0.31mmol)を加えた。この溶液に対して、事前に調製した活性エステルを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液1-2D(2.0m)を加え、室温で22時間攪拌した。
反応終了後、反応液にトリフルオロ酢酸(47μl,0.61mmol)を加え、約3.2mlずつの反応液をあらかじめジエチルエーテル/アセトニトリル(30ml/10ml)を加えた遠沈管(50ml)2本に移した。小型遠心機(日立工機、CF16RX)を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。2本の遠沈管に分かれた固形物を1つの遠沈管にまとめ、適量のジエチルエーテル/アセトニトリル(1/1)で洗浄した後に、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。これ以上精製せずにそのまま用いた。上記操作を4ロット分行い、表記目的化合物を含む粗生成物を計1.47g得た。
工程(1-2D)で合成した粗生成物(0.734g)をN,N-ジメチルホルムアミド(7.2ml)、蒸留水(1.2ml)に溶解させ、ピペリジン(200μl,2.05mmol)を加え、室温で45分攪拌した。反応終了後、反応液に酢酸(176μl,3.07mmol)加え、約2.1mlずつの反応液をあらかじめジエチルエーテル/アセトニトリル(30ml/10ml)を加えた遠沈管(50ml)4本に移した。小型遠心機(日立工機、CF16RX)を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。4本の遠沈管に分かれた固形物を1つの遠沈管にまとめ、適量のジエチルエーテル/アセトニトリル(1/1)及び適量のジエチルエーテルで洗浄した後に、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。得られた固形物を適量の0.2%トリフルオロ酢酸水溶液と酢酸を加えて溶解させ、数回に分けて、逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2(昭光サイエンティフィック製)を使用し、カラムにはInertsil ODS-3(GLサイエンス製)を使用した。溶出中にUV検出(220nm)された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。表記目的化合物(416mg)を無色固体として得た。
工程(1-2E)で合成した化合物(832mg)をN,N-ジメチルホルムアミド(12ml)、蒸留水(2.4ml)に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(123μl,0.71mmol)を加えた。この溶液に対して、DBCO-NHS ester(Click Chemistry Tools製, 57mg, 142mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(0.4m)を加え、室温で1時間攪拌した。反応終了後、反応液にトリフルオロ酢酸(109μl,1.42mmol)を加え、約2.5mlずつの反応液をあらかじめジエチルエーテル/アセトニトリル(30ml/5ml)を加えた遠沈管(50ml)6本に移した。小型遠心機(日立工機、CF16RX)を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。6本の遠沈管に分かれた固形物を1つの遠沈管にまとめ、適量のジエチルエーテル/アセトニトリル(1/1)で洗浄した後に、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。得られた固形物を適量の0.2%トリフルオロ酢酸水溶液と酢酸を加えて溶解させ、逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2(昭光サイエンティフィック製)を使用し、カラムにはInertsil ODS-3(GLサイエンス製)を使用した。溶出中にUV検出(220nm)された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。表記目的化合物(620mg)を無色固体として得た。
ESI-MS: Calcd for C288H464N56O130S3: [M+5H]5+ 1378.4(ave.), Found 1378.2; [M+6H]6+1148.9(ave.), Found 1148.7; [M+7H]7+ 984.9(ave.), Found 984.9
PEGリンカーが有するPEG長やPEG縮合数は、使用するFmoc-PEG試薬、縮合・Fmoc脱保護の順番、及び繰り返し回数の選択により制御可能である。従って、実施例1-1あるいは実施例1-2の方法にこれらの要素の選択を組み入れることで、DBCO-L(PEG) -hANPを自在に合成することが可能である。以下に、実施例1-1に記載した方法と同様の方法に従って、Fmoc-PEG試薬、縮合・Fmoc脱保護の順番、及び繰り返し回数を変えて合成した化合物を示す。
実施例1-1の工程(1-1E)において、出発物質を工程(1-1B)で合成したH2N-PEG(12)-hANP(1-28)に置き換えて合成することで、標題の目的化合物1-3を得た。
ESI-MS: Calcd for C173H269N47O54S3: [M+3H]3+ 1323.5(ave.), Found 1323.2; [M+5H]5+794.5(ave.), Found 794.4
実施例1-1の工程(1-1A)においてFmoc-PEG試薬としてFmoc-PEG(24)-COOHを用い、工程(1-1E)の出発物を当該方法において工程(1-1B)で得られたH2N-PEG(24)-hANP(1-28)に置き換えて合成することで、標題の目的化合物1-4を得た。
ESI-MS: Calcd for C197H317N47O66S3: [M+4H]4+ 1125.0(ave.), Found 1124.8,[M+5H]5+ 900.2(ave.), Found 900.0; [M+6H]6+ 750.4(ave.), Found 750.2
実施例1-1の工程(1-1A)においてFmoc-PEG試薬としてFmoc-PEG(6)-COOHに置き換えて合成することで、標題の目的化合物1-5を得た。
ESI-MS: Calcd for C288H464N56O130S3: [M+5H]5+ 1378.4(ave.), Found 1378.2; [M+6H]6+1148.9(ave.), Found 1148.7; [M+7H]7+ 984.9(ave.), Found 984.9
実施例1-1の工程(1-1C)においてFmoc-PEG試薬としてFmoc-PEG(6)-COOHに置き換えて合成することで、標題の目的化合物1-6を得た。
ESI-MS: Calcd for C188H298N48O61S3: [M+3H]3+ 1435.3(ave.), Found 1435.0; [M+4H]4+1076.7(ave.), Found 1076.5; [M+5H]5+ 861.6(ave.), Found 861.4
実施例1-1の工程(1-1A)及び工程(1-1C)においてFmoc-PEG試薬としてFmoc-PEG(6)-COOHに置き換えて合成することで、標題の目的化合物1-7を得た。
ESI-MS: Calcd for C176H274N48O55S3: [M+3H]3+ 1347.2(ave.), Found 1347.0; [M+4H]4+1010.6(ave.), Found 1010.5; [M+5H]5+ 808.7(ave.), Found 808.6
実施例1-1の工程(1-1A)及び工程(1-1C)においてFmoc-PEG試薬としてFmoc-PEG(6)-COOHに置き換え、工程(1-1D)と(1-1E)の間で更に工程(1-1C)~(1-1D)を繰り返すことによって合成することで、標題の目的化合物1-8を得た。
ESI-MS: Calcd for C191H303N49O62S3: [M+3H]3+ 1459.0(ave.), Found 1458.7; [M+4H]4+1094.5(ave.), Found 1094.3; [M+5H]5+ 875.8(ave.), Found 875.6
実施例1-1の工程(1-1A)及び工程(1-1C)においてFmoc-PEG試薬としてFmoc-PEG(6)-COOHに置き換え、工程(1-1D)と(1-1E)の間で更に工程(1-1C)~(1-1D)を2回繰り返すことによって合成することで、標題の目的化合物1-9を得た。
ESI-MS: Calcd for C206H332N50O69S3: [M+4H]4+ 1178.3(ave.), Found 1178.3; [M+5H]5+942.9(ave.), Found 942.7; [M+6H]6+ 785.9(ave.), Found 785.7
5mlサンプリングチューブ((株)イナ・オプティカ)に、11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミン(Aldrich,96μl,0.485mmol)、ジシアロオクタサッカリド(東京化成工業(株), 50 mg, 0.24mmol)の水溶液(0.5ml)を加え、1時間攪拌した後に、凍結乾燥した。凍結乾燥後の5mlサンプリングチューブに、HATU(92mg,0.24mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(0.6ml)とジイソプロピルエチルアミン(42μl,0.24mmol)を加え、37℃で4時間攪拌した。
ESI-MS: Calcd for C92H157N13O61 : [M+2H]2+1211.7(ave.), Found 1211.5; [M-2H]2- 1209.6(ave.), Found 1209.5
5mlサンプリングチューブ((株)イナ・オプティカ製)に、工程(1-10A)で合成した化合物(40mg)、2-クロロ-1,3-ジメチル-1H-ベンズイミダゾール-3-イウム-クロライド(CDMBI)(伏見製薬所製、17.9mg,0.083mmol)の水溶液(200μl)を加えた。氷冷後の反応液にりん酸三カリウム(52.6 mg, 0.25mmol)の水溶液(200μl)を加え、氷冷下で2時間攪拌した。得られた反応液を、アミコンウルトラ(ウルトラセル30K、 Merck Millipore製)を用いて限外ろ過し、固形物を除去した。その通過液を、ゲルろ過クロマトグラフィーにて精製した。装置にはPurif-Rp2(昭光サイエンティフィック製)を使用し、カラムにはHiPrep 26/10 Desalting(GEヘルスケア製)を使用し、移動相に0.03%- NH3水溶液を使用し、流速を10ml/min、分画容量を10mlとした。溶出中にUV検出(220nm)された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、1N水酸化ナトリウム水溶液(33μl,0.033mmol)を加えて凍結乾燥した。表記目的化合物(34 mg)を無色固体として得た。
NMR(in D2O)(図4のチャート)。
市販品であるmonosialo-Asn free (1S2G/1G2S-10NC-Asn 、(株)糖鎖工学研究所製)(「(MSG-)Asn」と呼ぶ)(500mg)を以下の条件で逆相HPLC分離精製し、1st main peakとして溶出される(MSG1-)Asn(保持時間 15~19 min 付近)と2nd main peakとして溶出される(MSG2-)Asn(保持時間 21~26 min 付近)に分離した。0.1%ぎ酸水溶液を溶離液として使用し、装置にはELS-PDAトリガー分取システム(日本分光株式会社製)を使用し、カラムにはInertsil ODS-3(10um、30Φx250mm、GLサイエンス社製)を使用し、流速を30ml/minとした。溶出中にUV検出(210nm)された最初のピークに帰属するフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥して、表記目的化合物(238mg)を無色固体として得た。上記の溶出操作でUV検出される2つ目のピークに帰属するフラクションを集めることで、(MSG2-)Asnを取得することができる。
工程(1-11A)で得られた化合物(229mg)を200mMりん酸緩衝溶液(pH6.25)(1145μL)に溶解させ、EndoM(東京化成工業(株)製、1U/mL))水溶液(100μL)を加え、35℃で6日間インキュベートした。反応終了後、反応液をVIVASPIN 15R (Hydrosart膜、30K,6,000 g)を用いて限外ろ過し、得られた通過液を逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液を溶離液として使用し、装置にはELS-PDA トリガー分取システム(日本分光株式会社製)、カラムにはInertsil ODS-3(GLサイエンス社製)を使用した。溶出中にUV検出(210nm)された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥して、表記目的化合物(117mg)を無色固体として得た。
工程(1-11B)で合成した化合物(169mg)を使い、工程(1-10A)と同様の手法に従って、表記目的物 (94.2mg)を得た。
ESI-MS: Calcd for C73H124N8O51: [M+H]+ 1929.9(ave.), Found 1929.7
(1-11D)[N3-PEG(3)]-MSG1(9)-Oxの合成
工程(1-11C)で合成した化合物(100mg)を使い、工程(1-10B)と同様の手法に従って、表記目的物(89mg)を得た。NMR(in D2O)(図5のチャート)。
また、工程(1-11B)の出発物質として、工程(1-11A)の2つ目のピークとして得られる(MSG2-)Asnを用いて、以降同様の操作を行うことによって、[N3-PEG(3)]-MSG2(9)-Ox(化合物1-11において、β-Manの分岐鎖のうち1-6鎖側のシアル酸にリンカーが結合した化合物1-12)を合成することができる。実施例3-5、3-6において化合物1-11を化合物1-12に置換することで、2つのhANPペプチドが異なる分岐鎖に連結したコンジュゲートを合成することができる。
上記(1-10A)で合成した[N3-PEG(3)]2-SG(10)は、以下の方法によっても合成された。この方法で得られた化合物を用いて、工程(1-10B)を行うことで、化合物1-10を合成することができる。
ESI-MS: Calcd for C112H192N20O70: [M+3H]3+ 980.6(ave.), Found 980.4。
ESI-MS: Calcd for C92H157N13O61: [M+2H]2+ 1211.7(ave.), Found 1211.5
キャリア用全長抗体として、ヒト体内に存在しない抗原を認識する抗LPS抗体A(以降、「mAb-A」と呼ぶ)(WO2015/046505におけるh#1G5-H1/L1)を選択し、当該抗体をWO2015/046505の実施例2、5及び7等に記載された方法と同様の方法で調製した。最終保存サンプルは、19.4mg/mlのmAb-A溶液 (HBSor(25mM ヒスチジン/5% ソルビトール、pH6.0))とした。
キャリア用分子として、IgG1の可変領域を欠損させた部分抗体分子であるCLCH-Aを以下のように作製した。
ヒト重鎖分泌シグナルとヒトIgG1定常領域を結合したCHタイプ重鎖(CH―A)のアミノ酸をコードするDNA配列を含むDNA断片(配列番号6)を合成した。合成したDNA断片をPCRにより増幅し、WO2015/046505に記載されたpCMA-LKをXbaI及びPmeIで消化してκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたDNA断片とIn-Fusion HD PCRクローニングキット(Clontech社)を用いて結合して、CH―A発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA/CH」と命名した。CH―Aのアミノ酸配列を配列番号7のアミノ酸番号20~349(アミノ酸番号1~19はシグナル配列)に示した。
ヒト軽鎖分泌シグナルとヒトκ鎖定常領域を結合したCLタイプ軽鎖(CL―A)のアミノ酸をコードするDNA配列を含むDNA断片(配列番号8)を合成した。工程(2-2A)と同様の方法で、CL発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA/CL」と命名した。CL―Aのアミノ酸配列を配列番号9のアミノ酸番号21~125(アミノ酸番号1~20はシグナル配列)に示した。
WO2015/046505の実施例2に記載された方法と同様の方法で、上記で構築したpCMA/CHとpCMA/CLの組み合わせてFreeStyle 293F細胞(INVITROGEN社製)を用いて、CH―AとCL―Aを組み合わせた部分抗体分子を含む培養上清を得た。得られた部分抗体分子を「CLCH-A」と命名した。
工程(2-2C)で得られた培養上清からCLCH-Aを、組み換えProteinAアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーの2段階工程で精製した。精製工程と精製後のバッファー置換、濃縮工程は4-6℃下で実施した。最初に、培養上清を、PBSで平衡化したMabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience社製)が充填されたカラムにアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、カラム容量2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液(pH4.0)で溶出し、溶出液を分画し、吸光度に基づきCLCH-Aの含まれる画分を集めた。回収液を透析(Thermo Scientific社、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)により50mM MES/20mM NaCl、pH6.0への液置換を行った。回収した溶液を50mM MES/20mM NaCl、pH6.0で平衡化したHiTrap SP HP(GE Healthcare Bioscience社製)にアプライした。50mM MES/20mM NaCl、pH6.0でカラムを洗浄したのち、0から200 mM塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出(10カラム容量)を実施し、上記と同様の方法で溶出液からCLCH-Aの含まれる画分を集めた。回収液を透析(Thermo Scientific社、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)によりHBSor(25mM ヒスチジン/5% ソルビトール、pH6.0)への液置換を行った。最後にCentrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分画分子量UF10K,Sartorius社,4℃下)にて濃縮し、濃度を20mg/ml以上に調製し、CLCH-A精製サンプルとした。
キャリア用分子として、CLCH-Aの重鎖にLALA変異を導入させた部分抗体分子であるCLCH-Bを以下のように作製した。
pCMA/CHをテンプレートとし、下記プライマーセット(CHLALA-F及びCHLALA-R)とKOD -Plus- Mutagenesis Kit(TOYOBO社)を用いて、配列番号9のアミノ酸番号136-137のLeu-Leu(Eu番号でLeu234 - Lue235に相当)をAla-Alaに置換する変異を導入することによりCH-B発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「pCMA/CH-B」と命名した。CH―BをコードするDNAのヌクレオチド配列を配列番号10のヌクレオチド番号58~1047(ヌクレオチド番号1~57はシグナル配列)に示し、アミノ酸配列を配列番号11のアミノ酸番号20~349(アミノ酸番号1~19はシグナル配列)に示した。
プライマーセット
CHLALA-F;5’-GCGGGAGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCC-3’(配列番号12)
CHLALA-R;5’-GGCTTCGGGGGCAGGACAAGGGGGACAGGTG-3’(配列番号13)。
(2-3B)CLCH-Bの生産及び精製
pCMA/CH―Bと工程(2-2B)で作製したpCMA/CLを組み合わせて工程(2-2C)と同様の方法で、CH-BとCL-Aを組み合わせた部分抗体分子(得られる部分抗体分子を「CLCH-B」と命名した。)を含む培養上清を得た。得られた培養上清から工程2-2Dと同様の方法で部分抗体分子を精製し、CLCH-B精製サンプルとした。
キャリア用分子として、IgG1のFc断片からなる部分抗体分子であるFc-Bを以下のように作製した。
ヒト軽鎖分泌シグナルとヒトFc領域を結合したFc-Bのアミノ酸配列をコードするDNA配列を含むDNA断片(配列番号14)を合成した。工程(2-2A)と同様の方法で、Fc-B発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA/Fc-B」と命名した。Fc-Bのアミノ酸配列を配列番号15のアミノ酸番号21~243(アミノ酸番号1~20はシグナル配列)に示した。
pCMA/Fc-Bを用いて、実施例(2-2C)と同様の方法でFc-Bを部分抗体分子として含む培養上清を得た。
工程(2-4B)で得られた培養上清からFc断片を、組み換えProteinAアフィニティークロマトグラフィー(4-6℃下)とセラミックハイドロキシアパタイト(室温下)の2段階工程で精製した。組み換えProteinAアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックハイドロキシアパタイト精製後のバッファー置換工程は4-6℃下で実施した。最初に、培養上清を、PBSで平衡化したMabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience社製、HiTrapカラム)にアプライした。培養上清がカラムに全て入ったのち、カラム容量2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液(pH4.0)で溶出し、Fc断片の含まれる画分を集めた。その画分を透析(Thermo Scientific社、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)によりPBSに置換した後、5mM りん酸ナトリウム/50mM MES/pH7.0のバッファーで5倍希釈したFC断片溶液を、5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシアパタイトカラム(日本バイオラッド、Bio-Scale CHT Type-l Hydroxyapatite Column)にアプライした。0から2M塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、Fc-Bの含まれる画分を集めた。その画分を透析(Thermo Scientific社、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)によりHBSor(25mM ヒスチジン/5% ソルビトール、pH6.0)への液置換を行った。最後にCentrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分画分子量UF10K,Sartorius社,4℃下)にて濃縮し、濃度を10mg/mlに調製し、精製Fc-Bサンプルとした。
キャリア用分子として、Fc-BのLALA体であり、N末端が延長された、Fc-Aを以下のように作製した。
pCMA/Fc-Bをテンプレートとし、下記プライマーセット(FcLALA-F及びFc05-R)とKOD -Plus- Mutagenesis Kit(TOYOBO社)を用いて、配列番号15のアミノ酸番号30-31のLeu-Leu(Eu番号でLeu234 - Lue235に相当)をAla-Alaに置換させ、且つ、N末端に4アミノ酸(DKTH)を付加する変異を導入することによりFc-A発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「pCMA/Fc-A」と命名した。Fc-AをコードするDNAのヌクレオチド配列を配列番号16のヌクレオチド番号61~741(ヌクレオチド番号1~60はシグナル配列)に示し、アミノ酸配列を配列番号17のアミノ酸番号21~247(アミノ酸番号1~20はシグナル配列)に示した。
プライマーセット
FcLALA-F;5’-TGTCCTGCTCCAGAGGCCGCGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCC-3’(配列番号18)
Fc05-R;5’-TGGAGGACAGGTGTGAGTTTTGTCGCCGTAGGCGCCGCTGATCCACAGCAG-3’(配列番号19)
pCMA/Fc-Aを用いて、工程(2-2C)と同様の方法でFc-Aを部分抗体分子として含む培養上清を得た。得られた培養上清から実施例2-4Cと同様の方法で精製し、Fc-A精製サンプルとした。
本実施例で製造された各コンジュゲート体には、その構造的特徴を表示する名称を付した。当該名称は、原則として上記の明細書に定義した命名法を採用するが、完全な構造は図や構造式を参照して特定される。PEGリンカーにおいて、「//」はアジド基とDBCOの反応により形成される1,2,3-トリアゾール環を表し、「-」はアミド結合を表す。
精製装置:AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム:HiTrap rProtein A FF (5ml)(GE ヘルスケア製)
流速:5ml/min(チャージ時は1.25ml/min)
上記で得た反応液を5回に分けて精製した。カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー(20mMりん酸緩衝液(pH7.0))を1.25ml/minで2CV流し、更に5ml/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液(20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 塩化ナトリウム溶液)を15CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Eution buffer、PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。溶出中にUV検出(280nm)されたフラクションについて、微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及びExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。
目的物を含むフラクションをアミコンウルトラ(ウルトラセル30K、 Merck Millipore製)を用いて濃縮し、緩衝液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH6.8))交換を行った。
精製装置:AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム:Bio-Scale Mini CHT Type Iカートリッジ(5ml)(BIO-RAD製)
流速:5ml/min(チャージ時は1.25ml/min)
カラムを2連結し、上記(1)で得られた溶液を2回に分けて精製した。溶液をカラムの上部へ添加し、A液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH6.8))を1.25ml/minで2CV流し、更に5ml/minで3CV流した。その後、A液とB液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH6.8)、2M塩化ナトリウム溶液)を用いて、溶出した。溶出条件は、A液:B液 = 100:0 ~ 0:100 (15CV)である。さらに、洗浄溶液(500mMりん酸緩衝液(pH6.5))を5CV流した。
溶出中にUV検出(280nm)されたフラクションについて、微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及びExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。
目的物を含むフラクションをアミコンウルトラ(ウルトラセル30K、 Merck Millipore製)を用いて濃縮し、50mM りん酸緩衝液(pH6.0)へ緩衝液交換を行い、23.7mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-mAb-A溶液(50 mMりん酸緩衝液(pH6.0))(19.9ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of (Fucα1, 6)GlcNAc-mAb-A (-Lys, pyrGlu), M = 50166.6 found(m/z), 50165.3 (deconvolution data).
calculated for the light chain of (Fucα1, 6)GlcNAc-mAb-A, M = 23292.9 found(m/z), 23292.0 (deconvolution data).
工程(3-1A)で得られた23.7mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-mAb-A溶液 (50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(8.90ml)に50mMりん酸緩衝液(pH6.0)(1.65ml)、実施例1-10で合成した[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (33.8mg) 50mMりん酸緩衝液(pH6.0)溶液(0.676ml)、2.10mg/ml EndoS D233Q/Q303L溶液(PBS)(1.98ml)を加えて、30℃で3.5時間インキュベートした。以上の操作を2ロット分行った。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。反応終了後、アフィニティークロマトグラフィーによる精製時の結合バッファーを20mMりん酸緩衝液(pH7.0)から20mMりん酸緩衝液(pH6.0)に変えて、工程(3-1A)と同様の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製を行った後、目的物を含むフラクションをアミコンウルトラ(ウルトラセル30K、 Merck Millipore製)を用いて濃縮、続いて20mM りん酸緩衝液(pH6.0)へ緩衝液交換を行い、20.5mg/ml mAb-A-[PEG(3)-N3]4溶液(20mMりん酸緩衝液(pH6.0))(19.0ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of mAb-A-[PEG(3)-N3]4(-Lys, pyrGlu), M = 52569.9 found(m/z), 52569.4 (deconvolution data).
calculated for the light chain of mAb-A-[PEG(3)-N3]4, M = 23292.9 found(m/z), 23292.1 (deconvolution data).
工程(3-1B)で得られた20.5mg/ml mAb-A-[PEG(3)-N3]4溶液 (20mMりん酸緩衝液(pH6.0))(2.44ml)に20mMりん酸緩衝液(pH6.0)(1.56ml)、ジメチルスルホキシド(0.736ml)、実施例1-1で合成したDBCO-PEG(12)2-hANP(1-28) (12.9mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.264ml)をDBCO化合物として加えて、30℃で16時間インキュベートした(Click反応)。反応液をNAP25(GE ヘルスケア製)、20mMりん酸緩衝液(pH6.0)で粗精製した。反応の進行具合を、下記の条件による疎水性相互作用クロマトグラフィーで確認後、下記のアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行った。
分析装置:日立D-7000 (日立製)
カラム:TSKgel Butyl-NPR (4.6x100mm)(東ソー製)
移動層:A液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、2M 硫酸アンモニウム溶液
B液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)
グラジェント:A:B=75:25~0:100(0~25分)-0:100(25~30分)
温度:25℃
波長:214nm
流速:1ml/min
精製装置:AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム:HiTrap rProtein A FF (5ml)(GE ヘルスケア製)
流速:5ml/min(チャージ時は1.25ml/min)
カラムへの結合時は、上記で得た反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー(20mMりん酸緩衝液(pH6.0))を1.25ml/minで2CV流し、更に5ml/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液(20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 塩化ナトリウム溶液)を10CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Elution buffer、PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。溶出中にUV検出(280nm)されたフラクションについて、微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて確認した。
目的物を含むフラクションをアミコンウルトラ(ウルトラセル30K、 Merck Millipore製)を用いて濃縮し、5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)へ緩衝液交換を行い、フィルター(Millex-GV、0.22μm、PVDF、滅菌済、Merck Millipore製)でろ過し、19.4mg/ml mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(2.14ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP]4 (-Lys, pyr-Glu), M = 61708.2 found(m/z), 61706.4 (deconvolution data).
calculated for the light chain of mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP]4, M = 23292.9 found(m/z), 23291.7 (deconvolution data).
工程(3-1B)で得られた20.5mg/ml mAb-A-[PEG(3)-N3]4溶液 (20mMりん酸緩衝液(pH6.0))(5.51ml)、20mMりん酸緩衝液(pH6.0)(2.49ml)、ジメチルスルホキシド(1.40ml)、工程(1-2F)で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) (43.1mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.596ml)を用いて、30℃で16時間インキュベートした。以上の操作を2ロット分行った。以下工程(3-1C)と同様の方法で21.6mg/ml mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4溶液(5%ソルビトール/10 mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(10.2ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP]4(-Lys, pyrGlu), M = 66348.4 found(m/z), 66347.5 (deconvolution data).
calculated for the light chain of mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP]4, M =23292.9 found(m/z), 23291.9 (deconvolution data).
(3-3A)(Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-Aの調製
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A (-Lys), M = 36386.4 found(m/z), 36386.1 (deconvolution data).
calculated for the light chain of (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A, M =11507.6 found(m/z), 11506.8 (deconvolution data).
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of CLCH-A-[PEG(3)-N3]4 (-Lys), M = 38789.6 found(m/z), 38789.4(deconvolution data).
calculated for the light chain of CLCH-A-[PEG(3)-N3]4, M = 11507.6 found(m/z), 11506.7 (deconvolution data).
工程(3-3B)で得られた19.3mg/ml CLCH-A-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(5.18ml)に5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5) (2.82ml)、ジメチルスルホキシド(1.18ml)、実施例1-1で合成したDBCO-PEG(12)2-hANP(1-28)(40.1mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.816ml)を加えて、30℃で16時間インキュベートした。以上の操作を2ロット分行った。反応液をNAP25(GE ヘルスケア製)、20mMりん酸緩衝液(pH6.0)で粗精製した。反応の進行具合を下記の条件の疎水性相互作用クロマトグラフィーで確認後、下記のアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行った。
分析装置:日立D-7000 (日立製)
カラム:TSKgel Butyl-NPR (4.6x100mm)(東ソー製)
移動層:A液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、2M 硫酸アンモニウム溶液
B液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)
グラジェント:A:B=75:25~0:100(0~25分)-0:100(25~30分)
温度:25℃
波長:214nm
流速:1ml/min
精製装置:AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム:HiTrap rProtein A FF (5ml)(GE ヘルスケア製)
流速:5ml/min(チャージ時は1.25ml/min)
上記で得た2ロット分の反応液を3回に分けて精製した。カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー(20mMりん酸緩衝液(pH6.0))を1.25ml/minで4CV流し、更に5ml/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液(20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 塩化ナトリウム溶液)を10CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Eution buffer、PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。溶出中にUV検出(280nm)されたフラクションについて、微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて確認した。
目的物を含むフラクションをアミコンウルトラ(ウルトラセル10K、 Merck Millipore製)を用いて濃縮し、5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)へ緩衝液交換を行い、フィルター(Millex-GV、0.22μm、PVDF、滅菌済、Merck Millipore製)でろ過し、21.3mg/ml CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(9.60ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP]4 (-Lys), M = 47928.0 found(m/z), 47928.4 (deconvolution data).
calculated for the light chain of CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP]4, M = 11507.6 found(m/z), 11506.7 (deconvolution data).
工程(3-3B)で得られた19.3mg/ml CLCH-A-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)) (2.59ml)、5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5) (1.41ml)、ジメチルスルホキシド(0.602ml)、実施例1-2で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)(28.7mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.398ml)を用いて、30℃で16時間インキュベートした。以下工程(3-3C)と同様の方法で、20.0mg/ml CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(2.46ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP]4 (-Lys), M = 52568.2 found(m/z), 52568.4(deconvolution data).
calculated for the light chain of CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP]4, M = 11507.6 found(m/z), 11506.7(deconvolution data).
(3-5A)mAb-A-[PEG(3)-N3]2の調製
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of mAb-A-[PEG(3)-N3]2 (-Lys, pyrGlu), M = 52078.4 found(m/z), 52077.0(deconvolution data).
calculated for the light chain of mAb-A-[PEG(3)-N3]2, M = 23292.9 found(m/z), 23291.7 (deconvolution data).
。)
工程(3-5A)で合成した化合物に対して、実施例1-2で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) 4当量を用いて、実施例3-2と同様の操作を行うことで、17.9mg/ml mAb-A-[PEG(3)//PEG(12) 2-hANP(1-28)]2溶液(5%ソルビトール/10 mM 酢酸緩衝液(pH5.5)) (2.55ml)を得た。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of mAb-A-[PEG(3)//PEG(12) 2-hANP]2(-Lys, pyrGlu), M = 58967.7 found(m/z), 58968.1 (deconvolution data).
calculated for the light chain of mAb-A-[PEG(3)//PEG(12) 2-hANP]2, M = 23292.9 found(m/z), 23291.8 (deconvolution data).
(3-6A)CLCH-A-[PEG(3)-N3]2の調製
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of N3-MSG-CLCH-A(-Lys), M = 38298.1 found(m/z), 38297.7 (deconvolution data).
calculated for the light chain of N3-MSG-CLCH-A, M =11507.6 found(m/z), 11506.8 (deconvolution data).
工程(3-6A)で合成した化合物に対して、実施例1-2で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) 4当量を用いて、実施例3-4と同様の操作を行うことで、19.2mg/ml CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12) 2-(SG-)Asn-ANP(1-28)]2溶液(5%ソルビトール/10 mM 酢酸緩衝液(pH5.5)) (2.62ml)を得た。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of CLCH-A- [PEG(3)//PEG(12) 2-(SG-)Asn-ANP]2 (-Lys), M = 45187.4 found(m/z), 45188.0 (deconvolution data).
calculated for the light chain of CLCH-A- [PEG(3)//PEG(12) 2-(SG-)Asn-ANP]2, M =11507.6 found(m/z), 11506.8 (deconvolution data).
本実施例の各工程の反応スキーム及び物質の構造は、実施例3-2の対応するスキームにおいてCLCH-AをCLCH-Bに置き換えたものである。
(3-8A)(Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-Bの調製
工程(3-3A)に記載したCLCH-A溶液の部分を、実施例2-3で調整した20.6mg/mLのCLCH-B溶液(5%ソルビトール/25 mMヒスチジン溶液(pH6.0))に置き換え、工程(3-3A)に記載された方法に準じて、19.8mg/ml(Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-B溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(16ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-B(-Lys), M = 36303.1; found 36302.6(deconvolution data).
calculated for the light chain of (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-B, M = 11507.8; found 11506.7(deconvolution data).
工程(3-3B)に記載した(Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A溶液の部分を、工程(3-8A)で得られた19.8mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-B溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0)) に置き換え、工程(3-3B)に記載された方法に準じて、19.3mg/ml CLCH-B-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(15.7ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of CLCH-B-[PEG(3)-N3]4 (-Lys), M = 38706.3; found 38704.7(deconvolution data).
calculated for the light chain of CLCH-B-[PEG(3)-N3]4, M = 11507.8; found 11506.8(deconvolution data).
工程(3-8B)で得られた19.3mg/ml CLCH-B-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5) ) (3.90ml)、5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5) (4.1ml)、ジメチルスルホキシド(1.4ml)及び実施例1-2で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)(43.4mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.6ml)を混合して、30℃で16時間インキュベートした。上記操作を4ロット実施した。以下工程(3-3C)と同様の方法で、27.1mg/ml CLCH-B-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(11.5ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of CLCH-B-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP]4(-Lys), M = 52484.9; found 52484.4(deconvolution data).
calculated for the light chain of CLCH-B-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP]4, M = 11507.8; found 11506.7(deconvolution data).
実施例2-5で調製したFc-A溶液10.4mg/ml (5%ソルビトール/25mMヒスチジン溶液(pH6.0) )(80.0ml)をVIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて50mM りん酸緩衝液(pH6.0)へ緩衝液交換を行い、約50mLとした。得られたFc-A溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0))を2本のビオラモ遠沈管(VIO-50B)にわけ、7.70mg/ml 野生型EndoS溶液(PBS)(0.8ml)を加えて、37℃で2時間インキュベートした。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。反応終了後、以下の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトカラムによる精製を行った。
精製装置:AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム:MediaScout ValiChrom 25mm ID x 100mm H; V=50.0mL
担体:KANEKA KanCapA
流速:40mL/min (サンプル添加時は10mL/min)
上記で得た反応液(x2本)を0.45um PVDFフィルターでろ過し、約40mL(x2)とし、2回に分けて精製した。カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー(20mMりん酸緩衝液(pH7.0))を10ml/minで4.4CV流し、更に40ml/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液(20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 塩化ナトリウム溶液)を10CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Elution buffer、PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。溶出中にUV検出(280nm)されたフラクションについて、必要に応じて、微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及びExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。目的物を含むフラクションをVIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて濃縮し、緩衝液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH7.0))交換した。
精製装置:AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム:MediaScout ValiChrom 25mm ID x 100mm H; V=50.0mL
担体:BIO-RAD CHT Type I 40um
流速:20mL/min (サンプル添加時は10mL/min)
上記(1)で得られた溶液を0.45um PVDFフィルターでろ過し、約40mLずつ2つに分けた。これらを以下の工程により、2回に分けて精製した。溶液をカラムの上部へ添加し、A液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH7.0))を10ml/minで4.2CV流し、更に20ml/minで2CV流した。その後、A液とB液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH7.0)、2M塩化ナトリウム溶液)を用いて、溶出した。溶出条件は、A液:B液 = 100:0 ~ 0:100 (15CV)である。さらに、洗浄溶液(500mMりん酸緩衝液(pH6.5))を5CV流した。
溶出中にUV検出(280nm)されたフラクションについて、必要に応じて微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及びExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。
目的物を含むフラクションをVIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて濃縮し、50mM りん酸緩衝液(pH6.0)へ緩衝液交換を行い、得られた溶液を24mL ずつ4つの容器に分け、、以下の溶液a~dとした。
溶液a:7.24mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A溶液(50 mMりん酸緩衝液(pH6.0))(24ml)(173.8mg)
溶液b:7.42mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A溶液(50 mMりん酸緩衝液(pH6.0))(24ml) (178.1mg)
溶液c:7.18mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A溶液(50 mMりん酸緩衝液(pH6.0))(24ml) (172.3mg)
溶液d:7.19mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A溶液(50 mMりん酸緩衝液(pH6.0))(24ml) (172.6mg)
ESI-MS:
calculated for the chain of (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A(-Lys), M = 25685.0, found 25681.9 (deconvolution data).
工程(3-8A)で得られた4つの(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A溶液 (50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(24ml)をそれぞれ2つにわけ、計8本の50mL 遠沈管に分けた。
1本の(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(12ml)に、50mMりん酸緩衝液(pH6.0)(1.65ml)、実施例1-10で合成した[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (56.0mg) 50mMりん酸緩衝液(pH6.0)溶液(1.0ml)及び4.3mg/ml EndoS D233Q/Q303L溶液(PBS)(1.16ml)を加えて、30℃で4時間インキュベートした。以上の操作を8ロット分行った。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。反応終了後、アフィニティークロマトグラフィーによる精製時の結合バッファーを20mMりん酸緩衝液(pH7.0)から20mMりん酸緩衝液(pH6.0)に変えて、工程(3-9A)と同様の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製を行った。目的物を含むフラクションを全てまとめた後、限外ろ過膜(Pellicon XL50 Cassette Ultracel 10kDa (2個使用))を装着した限外ろ過装置(CogentμScale TFF System)を使用して、約100mLに濃縮した。VIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)へ緩衝液交換を行い、得られた溶液を2つの容器に分け、以下の溶液a及び溶液bを得た。
溶液a:12.45mg/mL Fc-A-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(19.7ml)(245.3mg)
溶液b:14.95mg/mL Fc-A-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)) (19.5ml) (291.5mg)
ESI-MS:
calculated for the chain of Fc-A-[PEG(3)-N3]4 (-Lys), M = 28088.3; found 28086.4(deconvolution data).
工程(3-9B)で調製した溶液aである12.45mg/mL Fc-A-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(4.0ml)、5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5) (6.0ml)、ジメチルスルホキシド(1.9ml)、及び、実施例1-2で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)(45.1mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.62ml)を混合して、30℃で16時間インキュベートした。上記操作を溶液aについて4ロット実施した。また、工程(3-9B)で調製した溶液bである14.95mg/mL Fc-A-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(3.3ml)、5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5) (6.7ml)、ジメチルスルホキシド(1.9ml)、及び、実施例1-2で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)(45.1mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.62ml)を混合して、30℃で16時間インキュベートした。上記操作を溶液bについて4ロット実施した。このようにして得られた計8ロット分の反応液をNAP25(GE ヘルスケア製)、20mMりん酸緩衝液(pH6.0)で粗精製した。反応の進行具合を下記の条件の疎水性相互作用クロマトグラフィーで確認後、下記のアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行った。
分析装置:日立D-7000 (日立製)
カラム:TSKgel Butyl-NPR (4.6x100mm)(東ソー製)
移動層:A液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、2M 硫酸アンモニウム溶液
B液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)
グラジェント:A:B=75:25~0:100(0~25分)-0:100(25~30分)
温度:25℃
波長:214nm
流速:1ml/min
精製装置:AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム:MediaScout ValiChrom 25mm ID x 100mm H; V=50.0mL
担体:KANEKA KanCapA
流速:40mL/min (サンプル添加時は10mL/min)
上記で得られた溶液を0.45um PVDFフィルターでろ過し、約80mLずつ2つに分け、以下の操作により、2回に分けて精製した。カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー(20mMりん酸緩衝液(pH6.0))を10ml/minで5CV流し、更に40ml/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液(20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 塩化ナトリウム溶液)を10CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Elution buffer、PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。溶出中にUV検出(280nm)されたフラクションについて、必要に応じて微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて確認した。
目的物を含むフラクションを2回分全てまとめた後、限外ろ過膜(Pellicon XL50 Cassette Ultracel 10kDa (2個使用))を装着した限外ろ過装置(CogentμScale TFF System)を使用して、約40mLに濃縮した後に、5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)へ緩衝液交換した。最後に、フィルター(Millex-GV、0.22μm、PVDF、滅菌済、Merck Millipore製)でろ過し、7.81mg/ml Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(56ml)が得られた。
calculated for the chain of Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4 (-Lys), M = 41866.8; found 41863.8 (deconvolution data).
以下に、コンジュゲート体をフラグメント化せずに質量分析した結果を示す。
calculated for Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4 (-Lys), M = 83713.5; found 83712.6 (deconvolution data).
calculated for Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]2 (-Lys), M = 67186.4; found 67184.8(deconvolution data).
本実施例の各工程の反応スキーム及び物質の構造は、実施例3-9の対応するスキームにおいてFc-AをFc-Bに置き換えたものである。
実施例2-4で調整したFc-B溶液13.0mg/ml (5%ソルビトール/25mMヒスチジン溶液(pH6.0))(20.0ml)をVIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて50mM りん酸緩衝液(pH6.0)へ緩衝液交換した。得られた20.0mg/ml Fc-B溶液 (50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(13.0ml)に、50mM りん酸緩衝液(pH6.0)(7.0ml)加え、2.00mg/ml 野生型EndoS溶液(PBS)(1.92ml)を加えて、37℃で2時間インキュベートした。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。反応終了後、以下の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトカラムによる精製を行った。
精製装置:AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム:HiTrap rProtein A FF (5ml)(GE ヘルスケア製)
流速:5ml/min(チャージ時は1.25ml/min)
上記で得た反応液を5つにわけ、以下の方法により5回に分けて精製した。カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー(20mMりん酸緩衝液(pH7.0))を1.25ml/minで2CV流し、更に5ml/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液(20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 塩化ナトリウム溶液)を10CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Elution buffer、PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。溶出中にUV検出(280nm)されたフラクションについて、必要に応じて、微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及びExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。
目的物を含むフラクションを5回分全てまとめた後、VIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて濃縮し、緩衝液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH6.5))交換を行い、12mLとした。
精製装置:AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム:Bio-Scale Mini CHT Type Iカートリッジ(5ml)(BIO-RAD製)
流速:5ml/min(チャージ時は1.25ml/min)
カラムを2連結し、上記(1)で得られた溶液を3つに分け、以下の方法により3回に分けて精製した。溶液をカラムの上部へ添加し、A液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH6.5))を1.25ml/minで2CV流し、更に5ml/minで3CV流した。その後、A液とB液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH6.5)、2M塩化ナトリウム溶液)を用いて、溶出した。溶出条件は、A液:B液 = 100:0 ~ 0:100 (15CV)である。さらに、洗浄溶液(500mMりん酸緩衝液(pH6.5))を5CV流した。
溶出中にUV検出(280nm)されたフラクションについて、必要に応じて微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及びExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。
目的物を含むフラクションを3回分全てまとめた後、VIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて濃縮し、50mM りん酸緩衝液(pH6.0)へ緩衝液交換を行い、7.17mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-B溶液(50 mMりん酸緩衝液(pH6.0))(35.4ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the chain of (Fucα1, 6)GlcNAc-Fc-B(-Lys), M = 25287.7; found 25286.8 (deconvolution data).
工程(3-10A)で得られた7.17mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-B溶液 (50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(6.0ml)に実施例1-10で合成した[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (28.6mg)溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(0.50ml)及び2.10mg/ml EndoS D233Q/Q303L溶液(PBS)(1.2ml)を加えて、30℃で3.5時間インキュベートした。この反応液に更に、実施例1-10で合成した[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (6.1mg)溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(0.10ml)を加え、30℃で0.5時間インキュベートした。以上の操作を5ロット分行った。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。反応終了後、アフィニティークロマトグラフィーによる精製時の結合バッファーを20mMりん酸緩衝液(pH7.0)から20mMりん酸緩衝液(pH6.0)に変えて、工程(3-10A)と同様の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製を行った。分割操作で得られた分を併せて、目的物を含むフラクションの全てをVIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて濃縮後、NAP25(GE ヘルスケア製)を用いて、5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)へ緩衝液交換し、13.06mg/mL Fc-B-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(13.7ml)を得た。
ESI-MS:
calculated for the chain of Fc-B-[PEG(3)-N3]4 (-Lys), M = 27691.0; found 27690.4(deconvolution data).
工程(3-10B)で調製した13.06mg/mL Fc-B-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(3.1ml)、5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5) (4.9ml)、ジメチルスルホキシド(1.5ml)、及び、実施例1-2で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)(36.6mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.51ml)を混合して、30℃で16時間インキュベートした。上記操作を4ロット実施した。反応液をNAP25(GE ヘルスケア製)、20mMりん酸緩衝液(pH6.0)で粗精製した。反応の進行具合を下記の条件の疎水性相互作用クロマトグラフィーで確認後、下記のアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行った。
分析装置:日立D-7000 (日立製)
カラム:TSKgel Butyl-NPR (4.6x100mm)(東ソー製)
移動層:A液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、2M 硫酸アンモニウム溶液
B液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)
グラジェント:A:B=75:25~0:100(0~25分)-0:100(25~30分)
温度:25℃
波長:214nm
流速:1ml/min
精製装置:AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム HiTrap rProtein A FF, 5mL
流速:5mL/min (サンプル添加時は1.25mL/min)
上記で得られた溶液を6つにわけ、以下の方法により6回に分けて精製した。カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー(20mMりん酸緩衝液(pH6.0))を1.25ml/minで4CV流し、更に5ml/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液(20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 塩化ナトリウム溶液)を10CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Elution buffer、PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。溶出中にUV検出(280nm)されたフラクションについて、必要に応じて微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて確認した。
目的物を含むフラクションを6回分全てあわせたものをVIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて濃縮後、5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)へ緩衝液交換した。最後に、フィルター(Millex-GV、0.22μm、PVDF、滅菌済、Merck Millipore製)でろ過し、13.03mg/ml Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4溶液(5%ソルビトール/10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(13.6ml)が得られた。
calculated for the chain of Fc-B-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4 (-Lys), M = 41469.4; found 41467.9 (deconvolution data).
以下に、コンジュゲート体をフラグメント化せずに質量分析した結果を示す。
calculated for Fc-B-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4(-Lys), M = 82918.8; found 82917.0 (deconvolution data).
calculated for Fc-B-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]2 (-Lys), M = 66391.7; found 66390.8 (deconvolution data).
以下の方法により、実施例3で作製した化合物3-1~化合物3-6のcGMP上昇活性を測定した。
CHO細胞にhuman GC-Aを恒常的に発現させたCHO/human GC-A細胞をα-MEM, 10%FBS, 1%Penicillin-streptomycinで2×105cells/mlに懸濁し、384 well plate (Corning製, 3826)に20 μl/wellで播種し(4×103 cells/well)、CO2インキュベーター内で一晩培養した。翌日、このプレートから培地を除去した後、1.6 mM IBMX/KRB bufferを10-15 μl/well添加し、プレートシェイカーで攪拌後、室温で10分間インキュベーションをした。次に、0.1%BSA/PBSに溶解した被験物質(各コンジュゲート及び天然型hANP(1-28)を最終濃度が0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10及び100 nMとなるように希釈系列を調製)を5 μl/wellずつ添加し、プレートシェイカーで攪拌後、CO2インキュベーター内で15分間インキュベーションをした。その後、各well中のcGMP量をcGMP kit(CISBIO製)を用いて添付のプロトコールに従って測定した。各濃度における被験物質の活性値(T/C)は溶媒のみを添加したウェルの測定値を0とし、1 nM天然型hANPを添加したウェルの測定値を1として補正し、これに基づき、各被験物質の比活性(被験物質のEC50値/天然型hANPのEC50値)及びEmax(濃度範囲における被験物質の最大活性値)を算出した(表2)。
以下の方法により、実施例3で作製した各コンジュゲートのラットの血中における持続性(血中cGMPの持続的上昇作用及び被験物質の血中からの検出時間)を調べた。
イソフルラン:日本薬局方イソフルラン
採血用針およびシリンジ:テルモシリンジ 25G x 1 SR ツベルクリン用
採血用チューブ:キャピジェクト微量採血管 EDTA-2Na 500 μL
サンプル保管用チューブ:MTARIX4170 サンプルトラックチューブ 0.75 mL
8-9週齢の雄性Slc:SDラットに対しイソフルラン吸入麻酔((エスカイン吸入麻酔液を1-2%の濃度で維持して吸入)を行った。必要に応じてPBSで希釈した被験物質(各コンジュゲート、化合物3-1~3-6)の溶液を、皮下より、100 nmol/kgの用量(1 mL/kg)で急速投与した。投与前並びに投与後0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、72、96、120及び168時間のうち化合物毎に選抜した時点で、頸静脈から経時的採血(200μL/回)を行い、血液サンプルは速やかに氷上に置いた。
採取した血液サンプルは遠心機(Sigma 4K15、ローター:Nr12130-H)を用いて5000 rpm,5 min,4℃で遠心分離し、分離した血漿サンプルをPK測定用とcGMP測定用の2本に分け測定まで-80℃に保存した。
血漿中のcGMP濃度は、100倍に希釈した血漿サンプルについて、Amersham cGMP Enzymeimmunoassay BiotrakTM (EIA) System (dual range)を用いて、キットに添付のプロトコールに従って測定した。得られた血漿中cGMP濃度推移を図6に示す。
(1)で調整したラット血漿サンプル10 μLをRexxip HN Buffer (Gyros AB.製)で10倍希釈し、必要に応じて適宜、更に同バッファーで10倍希釈(最終:100倍希釈)し、あるいは、これを更に1%血漿/ Rexxip HN Bufferで10倍希釈(最終:1000倍希釈)し、測定用血漿サンプルとした。1次抗体としてはサンプル中の全てのヒトFc含有分子(Fc/Fc) 測定用にGoat Anti-Human IgG Biotin conjugate (SouthernBiotec) を、サンプル中のhANP(1-28)が結合したコンジュゲート(ANP/Fc)測定用にはMouse Anti-ANP IgG (GeneTex) を用いた。1次抗体をそれぞれ700 nMになるよう0.1%PBS-Tにて調製した。検出用の2次抗体として両者ともに、DyLight標識したGoat Anti-Human IgG (SouthernBiotec) を10 nMになるようRexxip F Buffer (Gyros AB.) にて調製した。各溶液を自動ELISA装置Gyrolab xP workstation にセットし、Bioaffy 200 CD (Gyros AB.) にインジェクションして被験物質(Fc/Fc、ANP/Fc)の含有量をサンドウィッチELISA法により測定し、血漿中の濃度を算出した。
得られた血漿中濃度推移を図7に示す。
図6、及び図7より、天然型hANPに比べて各種コンジュゲートは、緩やかな血中移行性、長い血中滞留性、及び薬理作用持続性を併せ持つGC-A活性化薬であることが確認された。
図6より、以下のことが確認された。
hANP-mAb-Aコンジュゲートである化合物3-1は、最も高いEmaxを示した。また、化合物3-1は、hANP-CLCH-Aコンジュゲートである化合物3-3と比べて、より長い薬理活性持続を示した。
糖鎖修飾hANP-mAb-Aコンジュゲートである化合物3-2、及び糖鎖修飾hANP-CLCH-Aコンジュゲートである化合物3-4は、化合物3-1と比べてEmaxに到達するまでの時間と減衰速度も遅延した。すなわち、糖鎖修飾hANP-mAb-Aコンジュゲートの方がより長い薬理活性持続を示すと考えられる。
本実験は、実施例3-7で合成したコンジュゲートを用いて、cGMP上昇活性に対するPEGリンカー部分の影響を検討することを目的に実施した。実施例4-1に記載した方法と同様にして、天然型hANPと被験物質の比活性及びEmaxを算出した。結果を表3に示す。
本実験は、実施例3-7で合成したコンジュゲートを用いて、動物血中での持続性に対するPEGリンカー部分の影響を検討することを目的に実施した。実施例4-2に記載した方法と同様に、被験物質をラットに皮下投与した後の血漿中cGMP濃度の経過時変化を調べた。結果を図8に示す。
天然型hANP(1-28)については、凝集性が高いことが分かっている。例えば、7mg/mL PBS溶液中、30℃でインキュベートした場合、24時間以内に、ゲル状析出物が確認され、48時間以内に溶液全体がゲル状となることが確認される。
(1)加速劣化試験
各サンプルをVivapore 5(Vivascience製)で濃縮し、25 mM AcONa 5% sorbitol pH5.5(ABSor液)またはPBSへ透析後、70 mg/mLに調製した。Spin-X 0.22 μm遠心式フィルター(Costar製)でろ過し、0.5 mL滅菌スリムチューブ(住友ベークライト製)に80 μLずつ分注して密封後 40℃で2週間静置した。劣化前後のサンプルをAgilent 1260 LC、DAWN HELEOS 8、Eclipse3+で構成されたSEC-MALSシステム(Wyatt Technology製)で測定し、ASTRAソフトウェア(Wyatt Technology製)で解析した。測定は、カラム: Nanofilm SEC-250 7.8´300 mm(Sepax製)、バッファー: 0.2 M KPi 0.2 M KCl pH 7.0、流速: 0.5 mL/min、カラム温度: 30°C、検出波長: 280 nmの条件で実施した。結果を表4に示す。
以下の方法により、実施例3で作製したキャリア分子が異なる各コンジュゲートのサルの血中における被験物質の血中からの検出時間を調べることで、コンジュゲートの血中持続性に対するキャリア分子の影響を検討した。
採血用針およびシリンジ:テルモシリンジ 25G x 1 SR ツベルクリン用
採血用チューブ:キャピジェクト微量採血管 EDTA-2Na、 もしくはベノジェクと真空採血管EDTA-2Na
サンプル保管用チューブ:MTARIX4170 サンプルトラックチューブ 0.75 mL
3-7年齢の雄性カニクイザルに対し無麻酔下において披験物質の投与および採血を実施した。必要に応じてPBSで希釈した被験物質(各コンジュゲート、化合物3-2、3-4、3-15、3-16、及び3-17)の溶液を、皮下より、10 nmol/kgの用量(1 mL/kg)で急速投与した。投与前並びに投与後0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、96、168、336、528(あるいは504)、及び696(あるいは672)時間の時点で、静脈から経時的採血(約500μL/回)を行い、血液サンプルは速やかに氷上に置いた。
採取した血液サンプルを遠心分離することで得られた血漿サンプルを測定まで-80℃に保存した。
(1)で調整したサル血漿サンプル10 μLにRexxip HN Buffer (Gyros AB.) を90 μL添加後混合(10倍希釈サンプル、MRD 10)、もしくはさらにRexxip HN Bufferで10倍希釈(100倍希釈サンプル、MRD 100)、さらに1%血漿/ Rexxip HN Bufferで10倍希釈(1000倍希釈サンプル、MRD 100)して測定用血漿サンプルを調製した。1次抗体としてはサンプル中の全てのヒトFc含有分子(Fc/Fc) 測定用にGoat Anti-Human IgG Biotin conjugate (SouthernBiotec)を、サンプル中のhANP(1-28)が結合したコンジュゲート(ANP/Fc)測定用にはMouse Anti-ANP IgG (GeneTex) を用いた。1次抗体をそれぞれ700 nMになるよう0.1%PBS-Tにて調製した。検出用の2次抗体として両者ともに、DyLight標識したGoat Anti-Human IgG (SouthernBiotec)を10 nMになるようRexxip F Buffer (Gyros AB.) にて調製した。こ各溶液を自動ELISA装置Gyrolab xP workstation にセットし、Bioaffy 200 CD (Gyros AB.) にインジェクションして被験物質(Fc/Fc、ANP/Fc)の含有量をサンドウィッチELISA法により測定し、血漿中の濃度を算出した。
得られた血漿中濃度推移を図9に示す。
図9より、この試験で用いたhANPコンジュゲートは、投与後672時間(28日)後においても、分解されずにコンジュゲート体として血中濃度が確認された。キャリア分子がそれぞれCLCH-A、CLCH-Bである化合物3-4および化合物3-15は、キャリア分子がmAb-Aである化合物3-2と比べて速やかに血中から減衰した。一方、キャリア分子がそれぞれFc-A、Fc-Bである化合物3-16及び化合物3-17は、化合物3-2より緩やかに血中から減衰した。すなわち、サルにおいて糖鎖修飾hANP-Fcコンジュゲートの血中持続性が最も長いことが示された。
使用する2種類のEndo酵素に関して、酵素A(EndoM様酵素)及び酵素B(EndoS様酵素)は適切に組合せることができる。酵素Aには、EndoM,EndoOm,EndoCCとその加水分解活性を低下させたEndoM変異体,EndoOm変異体,EndoCC変異体などを例示できる。また、酵素Bには、EndoS,EndoS2(EndoS49)とその加水分解活性を低下させたEndoS変異体, EndoS2(EndoS49)変異体などを例示できる。糖鎖供与体部分の構造は、化学反応あるいは酵素反応との組み合わせで合成可能な分子であれば、アノマー部位の置換基Rは、R=H以外、何を使用してもよい。
mAb-Cとして、市販のTrastuzumabを使用した。Trastuzumab(440mg/vial、Genentech製)に対して、実施例3-1に記載された方法を用い、51.3mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液(50 mMトリス緩衝液(pH7.4))(1.65ml)とした。51.3mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液 (50 mMトリス緩衝液(pH7.4))(19.5μl)に対して、50 mMトリス緩衝液(pH7.4)(0.5μl)、SGP(東京化成製)(5.82mg)溶液(50mMトリス緩衝液(pH7.4))(29.1μl)、1U/ml EndoM N175Q溶液(東京化成製) (5.0μl)及び2.00mg/ml EndoS D233Q溶液(PBS)(10.0μl) を加えて、28℃で48時間インキュベーションした。
反応開始から、2時間後、4時間後、8時間後、24時間後及び48時間後の各時点で、この反応液の一部を採取し、反応の進行度をExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)で測定した。測定に当っては、機器に付随している手順書に従って、測定サンプルを調製した。この過程で、採取した反応液をジチオトレイトールを含む溶液にさらして、95℃で5分間加熱する操作がある為、糖鎖転移反応は即座に停止される。
糖鎖転移率(%) = [SG-Trastuzumab由来のH鎖のピーク面積] /{[(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab由来のH鎖ピーク面積 + [SG-Trastuzumab由来のH鎖のピーク面積]}×100
同様にして各種Endo酵素の組み合わせを変えて反応を行い、各反応時間における糖鎖転移率を算出した(表5)。
51.3mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液 (50 mMトリス緩衝液(pH7.4))(19.5μl)に対して、50 mMトリス緩衝液(pH7.4)(0.5μl)、SG-Asn アンモニウム塩 (4.74mg)溶液(50mMトリス緩衝液(pH7.4))(23.7μl)、1U/ml EndoM N175Q溶液 (5.0μl)及び、2.00mg/ml EndoS D233Q溶液(PBS)(10.0μl) を加えて、28℃で48時間インキュベーションした。以下実施例5-1と同様の方法で、各反応時間における糖鎖転移率を算出した(表5)。
51.3mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液 (50 mMトリス緩衝液(pH7.4))(19.5μl)に対して、50 mMトリス緩衝液(pH7.4)(0.5μl)、SGP(東京化成製)(5.82mg)溶液(50mMトリス緩衝液(pH7.4))(29.1μl)、1.16U/ml EndoCCあるいは2.21U/ml EndoCC N180H溶液(伏見製薬所) (15.0μl)及び2.00mg/ml EndoS D233Q溶液(PBS)(10.0μl) を加えて、28℃あるいは37℃で48時間インキュベーションした。以下実施例5-1と同様の方法で、各反応時間における糖鎖転移率を算出した(表5)。
糖鎖ドナーとして([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3を用い、mAb-A-[PEG(3)-N3]4を以下の方法で作製した。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of mAb-A-[PEG(3)-N3]4(-Lys, pyrGlu), M = 52569.9; found 52570.0(deconvolution data).
calculated for the light chain of mAb-A-[PEG(3)-N3]4, M = 23292.9; found 23292.0 (deconvolution data).
糖鎖ドナーとして([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3を用い、CLCH-B-[PEG(3)-N3]4を以下の方法で作製した。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of CLCH-B-[PEG(3)-N3]4 (-Lys), M = 38706.3; found 38706.1(deconvolution data).
calculated for the light chain of CLCH-B-[PEG(3)-N3]4, M = 11507.8; found 11506.7(deconvolution data).
糖鎖ドナーとして([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3を用い、Fc-A-[PEG(3)-N3]4を以下の方法で作製した。
calculated for the chain of Fc-B-[PEG(3)-N3]4 (-Lys), M = 28088.3; found 28085.6(deconvolution data).
Claims (8)
- 還元末端が活性化されていない複合型糖鎖を含む糖鎖ドナー分子、N297 糖鎖の非還元末端にGlcNAcを有するFc含有分子であるアクセプター分子、当該糖鎖ドナー分子の複合型糖鎖を基質とするがFc含有分子のN297糖鎖を基質としないエンドーβ-Nアセチルグルコサミニダーゼ(酵素A)、及び、Fc含有分子のN297糖鎖を基質とするエンドーβ-Nアセチルグルコサミニダーゼ(酵素B)を同一の反応液中で反応させる工程、を含む、糖鎖ドナー分子に由来する複合型糖鎖を含むN297糖鎖を有するFc含有分子の製造方法:
ここで、酵素Aは、EndoM N175Q、またはEndoCC N180Hであり、
酵素Bは、EndoS D233Q、EndoS D233Q/Q303L、またはEndoS D233Q/E350Qである。 - 反応液から糖鎖ドナー分子に由来する複合型糖鎖を含むN297糖鎖を有するFc含有分子を精製する工程をさらに含む、請求項1の製造方法。
- 糖鎖ドナー分子が有する複合型糖鎖が、非還元末端が化学修飾されていても良いN結合型糖鎖又はO結合型糖鎖である請求項1または2の製造方法。
- 糖鎖ドナー分子が、含まれる複合型糖鎖の非還元末端が化学修飾されていても良い(MSG1-)Asn、(MSG2-)Asn、SGPまたは(SG-)Asnである請求項3の製造方法。
- アクセプター分子が、GlcNAc又は(Fucα1,6)GlcNAcからなるN297糖鎖を有するFc含有分子である請求項1~4のいずれかの製造方法。
- Fc含有分子が、IgG、CLCHまたはFc断片である請求項1~5のいずれかの製造方法。
- 糖鎖ドナー分子に含まれる複合型糖鎖の非還元末端にアジド基が導入されていることを特徴とする、請求項1~6のいずれかの製造方法。
- 複合型糖鎖の非還元末端に導入されたアジド基にDBCOを含む化合物を結合させる工程をさらに含む、請求項7の製造方法。
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