WO2023167238A1 - Ｆｃ含有分子の製造方法 - Google Patents

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WO2023167238A1
WO2023167238A1 PCT/JP2023/007583 JP2023007583W WO2023167238A1 WO 2023167238 A1 WO2023167238 A1 WO 2023167238A1 JP 2023007583 W JP2023007583 W JP 2023007583W WO 2023167238 A1 WO2023167238 A1 WO 2023167238A1
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endo
sugar chain
antibody
enzyme
molecule
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PCT/JP2023/007583
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洋史 武藤
充広 岩本
史織 荒川
雄大 酒井
佳織 奈良
芳文 田中
侑紀 中谷
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第一三共株式会社
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    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Definitions

  • the present invention provides a method for producing an Fc-containing molecule having an N297-linked sugar chain containing a sugar chain derived from a sugar chain donor molecule, a novel sugar chain donor molecule preferably used in the production method, and an N297-linked sugar chain.
  • the present invention relates to methods for isolating Fc-containing molecules, and the like.
  • An antibody is a glycoprotein molecule having an N-linked sugar chain (N297-linked sugar chain) linked to the 297th Asn side chain located in the Fc region of the heavy chain molecule.
  • Antibodies are important molecules in basic research and the medical field, and research and development of antibody drugs in particular are being actively pursued, and various effects of sugar chains are being clarified (Non-Patent Document 1).
  • Medical antibodies that are mainly used at present are IgG class molecules, and such antibodies are generally produced using cultured animal cells such as CHO cells and NS0 cells.
  • Non-Patent Document 2 The N297-linked sugar chains of antibodies produced in these animal cells are biantennary complex-type sugar chains, but they are heterogeneous in core fucose, terminal sialic groups and galactosyl groups, and bisecting GlcNAc. It has been revealed that the N297-linked sugar chain of the antibody greatly affects effector activities including ADCC activity (Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity) and CDC activity (Complement-Dependent Cytotoxicity) (Non-Patent Document 3, Non- Patent Document 4), and the possibility of affecting the blood half-life has also been pointed out (Non-Patent Document 5).
  • ADCC activity Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity
  • CDC activity Complement-Dependent Cytotoxicity
  • Non-Patent Document 6 antibody-drug conjugates and peptide-Fc conjugates using chemically modified sugar chains as linkers have been developed.
  • Enzymatic transglycosylation is known as a method for homogenizing sugar chains added to glycoprotein molecules containing antibodies and antibody Fc regions for medical use (Non-Patent Documents 10-12).
  • a method of transferring a sugar chain having an oxazoline at the reducing end to a GlcNAc (N-acetylglucosamine) acceptor using a single ENGase (Patent Documents 5 and 6, Non-Patent Documents 10 and 11);
  • a one-pot method is known in which two types of ENGase are used to directly transfer a sugar chain to a GlcNAc acceptor (Non-Patent Document 12, Patent Document 1).
  • Non-Patent Documents 7 and 9 As one method for solving this problem, the one-pot method, which is a method using a sugar chain donor molecule whose reducing end is not activated, has been proposed.
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 12
  • the ENGase used in this one-pot method a combination of two enzymes, the Endo-S mutant enzyme and the Endo-M mutant enzyme or Endo-CC mutant, is known. It has also been confirmed that when the amount is reduced, the transglycosylation rate is lowered.
  • endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase has different substrate specificity depending on the species from which it is derived, and it is necessary to use it properly according to the purpose. Depending on the degree, the combination of enzymes that can be used is limited. Therefore, regardless of residual hydrolytic activity or enzyme species, endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase can be freely selected from a wide range of options, and a highly pure and uniform sugar chain structure can be obtained with a smaller amount of sugar chain donor molecules.
  • the present invention is a method for producing an Fc-containing molecule having a highly pure and uniform sugar chain structure with the least possible amount of sugar chain donor molecule used, and is used from a wide range of options regardless of residual hydrolytic activity and enzyme species. To establish a method that allows the free selection of an enzyme that performs the function, to provide a novel sugar chain donor molecule that can be suitably used in the method, and to establish a method for selectively isolating such an Fc-containing molecule etc.
  • the reaction conditions can be set to obtain Fc-containing molecules having a moderate or higher transglycosylation rate even with a small amount of sugar chain donor molecule used, and cation exchange chromatography under acidic conditions
  • the transglycosylation reaction mixture into contact with a graphic medium or a multimode chromatography medium, the Fc-containing molecule to which the target sugar chain has been added and the unreacted Fc-containing molecule (acceptor molecule) can be isolated,
  • the inventors have found that Fc-containing molecules having a highly pure and uniform sugar chain structure can be recovered at a high yield.
  • a method for producing an Fc-containing molecule having an N297-linked sugar chain containing a sugar chain derived from a sugar chain donor molecule comprising the following steps 1 and 2: [Step 1] An acceptor molecule, which is an Fc-containing molecule having a core GlcNAc to which fucose may be added as an N297-linked sugar chain, and a sugar chain donor molecule containing a sugar chain are combined with the N297-linked sugar chain of the Fc-containing molecule.
  • the reaction mixture is brought into contact with a cation exchange chromatography medium or multimode chromatography medium under acidic conditions to obtain an Fc-containing molecule having an N297-linked sugar chain containing a sugar chain derived from a sugar chain donor molecule.
  • the process of collecting [2] The method of [1], wherein the sugar chain donor molecule contains GlcNAc whose reducing end is not activated.
  • step 1 the acceptor molecule and the sugar chain donor molecule are reacted in the presence of enzyme-A and endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (enzyme-B) that uses the sugar chain of the sugar chain donor molecule as a substrate to react.
  • enzyme-A enzyme-A
  • endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase enzyme-B
  • Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase which uses the sugar chain of the sugar chain donor molecule as a substrate, acts on the sugar chain donor molecule in the presence of Enzyme-A, resulting in a sugar chain donor by Enzyme-A.
  • Enzyme-B is an enzyme having a transglycosylation activity from SGP to a GlcNAc derivative.
  • Enzyme-B is a mutant enzyme of Endo-M, Endo-Om, Endo-CC, or Endo-Rp, which has lower hydrolytic activity than its corresponding wild-type enzyme, [3]-[ 5].
  • Enzyme-B is Endo-Rp N172Q, Endo-Rp N172H, Endo-Rp N172A, Endo-Rp N172C, Endo-Rp N172D, Endo-Rp N172E, Endo-Rp N172G, Endo-Rp N172I, Endo - Rp N172L, Endo-Rp N172M, Endo-Rp N172P, Endo-Rp N172S, Endo-Rp N172T, Endo-Rp N172V, Endo-Rp W278F/S216V, Endo-Rp W278F/N246D, Endo-Rp W27 8F/D276N, Endo-Rp W278F /A310D, Endo-Rp W278F/N172D/F307Y, Endo-Rp W278F/N172D/F307H, Endo-Rp W278F/N172D/A310D, Endo-Rp W
  • the sugar chain donor molecule is SGP, AG(9)-P, AG(7)-P, SG-Asn, AG(9)-Asn, AG(7)-Asn, which may be chemically modified at the non-reducing end , SG-OR, AG(9)-OR, AG(7)-OR, (MSG1)-Asn, (MSG2)-Asn, a mixture of (MSG1)-Asn and (MSG2)-Asn, MSG1-OR, MSG2 -OR, or a mixture of MSG1-OR and MSG2-OR, wherein R is any substituent linked to the oxygen atom through at least one carbon atom.
  • R represents a C1-C6 alkyl group or an optionally substituted aryl group.
  • R consists of methyl group, ethyl group, n-propyl group, i-propyl group, n-butyl group, i-butyl group, s-butyl group, t-butyl, n-pentyl group, and n-hexyl group phenyl group, benzyl group, indenyl group, naphthyl group, fluorenyl group, anthranyl group, and The method of [13], which is selected from the group consisting of phenanthrenyl groups.
  • R is PMP, Me, A-Mor, iPr, nPr, PrOMe and A-PEG-N 3 (A is sandwiched between the acetyl group in the glycolic acid unit, that is, the anomeric hydroxyl group and the amino group in Mor or PEG.
  • the sugar chain donor molecules are ([N 3 -PEG(3)] 2 -SG)-P-PEG(3)-N 3 , ([N 3 -PEG(3)] 2 -SG)-Asn-PEG( 3) -N 3 , ([N 3 -PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N 3 , ([N 3 -PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3) -N 3 , or ([N 3 -PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N 3 and ([N 3 -PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)- The method of [11] or [12], which is a mixture of N3 .
  • the sugar chain donor molecules are ([N 3 -PEG(3)] 2 -SG)-OR, ([N 3 -PEG(3)]-MSG1)-OR, ([N 3 -PEG(3)]- MSG2)-OR, or a mixture of ([N 3 -PEG(3)]-MSG1)-OR and ([N 3 -PEG(3)]-MSG2)-OR of [12]-[15] A method according to any one of paragraphs. [18] The sugar chain donor molecule has the formula:
  • Enzyme-A is a mutant enzyme of Endo-S, Endo-S2, Endo-Si, Endo-Se, Endo-Sd, or Endo-Sz, wherein the mutant enzyme has lower hydrolytic activity than its corresponding wild-type enzyme The method according to any one of [1] to [20].
  • Enzyme-A is Endo-S D233Q, Endo-S D233Q/Q303L, Endo-S D233Q/E350A, Endo-S D233Q/E350Q, Endo-S D233Q/E350D, Endo-S D233Q/E350N, Endo-S D 233Q/ D405A, Endo-Si D241Q, Endo-Si D241Q/Q311L, Endo-Si D241Q/E360Q, Endo-Si D241M, Endo-Si D241M/Q311L, Endo-Si D241M/E360Q, Endo-Si T190Q, Endo-Si T190/ D241Q, Endo-Si T190Q/D241M, Endo-S2 D184M, Endo-S2 T138Q, Endo-S2 D184Q/Q250L, Endo-S2 D184M/Q250L, Endo-Se D
  • the sugar chain has a non-reducing end chemically modified with a substituent having an azide group (N - ), and the method further adds an alkyne structure to the azide group (N - ) of the sugar chain;
  • the method according to any one of [1] to [28], comprising the step of reacting the molecule having [30]
  • a molecule having an alkyne structure is a chemotherapeutic agent, a molecular target drug, an immunostimulant, a toxin, a photosensitizer, an antibacterial agent, an antiviral agent, a diagnostic agent, a protein, a peptide, an amino acid, a nucleic acid molecule, a nucleic acid, an antigen,
  • the method of [29] selected from vitamins and hormones.
  • chemotherapeutic agent is selected from camptothecins, pyrrolobenzodiazepines, doxorubicins, auristatins, taxanes and derivatives thereof.
  • immunostimulatory agent is selected from STING agonists, TLR agonists and A2AR antagonists.
  • a method for isolating Fc-containing molecules having N297-linked sugar chains containing sugar chains derived from a sugar chain donor molecule comprising steps 1 and 2 of the following: [Step 1] An acceptor molecule, which is an Fc-containing molecule having a core GlcNAc to which fucose may be added as an N297-linked sugar chain, and a sugar chain donor molecule containing a sugar chain are combined with the N297-linked sugar chain of the Fc-containing molecule.
  • the reaction mixture is brought into contact with a cation exchange chromatography medium or multimode chromatography medium under acidic conditions to obtain an Fc-containing molecule having an N297-linked sugar chain containing a sugar chain derived from a sugar chain donor molecule. isolating.
  • the chromatographic medium is a cation exchange chromatographic medium.
  • Fc-containing molecules having N297-linked sugar chains are anti-HER2 antibodies, anti-HER3 antibodies, anti-DLL3 antibodies, anti-FAP antibodies, anti-CDH11 antibodies, anti-CDH6 antibodies, anti-A33 antibodies, anti-CanAg antibodies, anti-CD19 antibodies, anti-CD20 antibodies , anti-CD22 antibody, anti-CD30 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD56 antibody, anti-CD70 antibody, anti-CD98 antibody, anti-TROP2 antibody, anti-CEA antibody, anti-Cripto antibody, anti-EphA2 antibody, anti-G250 antibody, anti-MUC1 antibody, anti- selected from the group consisting of GPNMB antibody, anti-Integrin antibody, anti-PSMA antibody, anti-Tenascin-C antibody, anti-SLC44A4 antibody, anti-Mesothelin antibody, anti-ENPP3 antibody, anti-CD47 antibody, anti-EGFR antibody, anti-GPR20 antibody, and anti-DR5 antibody
  • a fusion protein of Enzyme-A and Enzyme-B Enzyme-A is an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase whose substrate is the N297-linked sugar chain of an Fc-containing molecule;
  • Enzyme-B uses, as a substrate, the sugar chain of a sugar chain-containing molecule having GlcNAc in which the reducing end of the sugar chain is not activated, but does not use the N297-linked sugar chain as a substrate, or does not use the N297-linked sugar chain as a substrate.
  • the production method of the present invention by cation exchange chromatography under acidic conditions, it is possible to separate the Fc-containing molecule to which the target sugar chain is added and the unreacted Fc-containing molecule (acceptor molecule). It is possible to produce highly purified Fc-containing molecules having a uniform sugar chain structure with a minimal amount of sugar chain donor molecule.
  • the purity of the desired Fc-containing molecule can be increased in the isolation step, so that the efficiency of the transglycosylation reaction itself can be extremely improved.
  • Enzyme-A which exhibits transglycosylation activity on the N297-linked sugar chain of the Fc-containing molecule
  • Enzyme-B which exhibits the property of activating the sugar chain in the sugar chain donor molecule
  • the sugar chain donor molecule can be freely selected from N-linked sugar chains whose reducing ends are not chemically activated or O-linked sugar chains.
  • one aspect of the present invention provides a novel sugar chain donor molecule suitable for transglycosylation reaction in a one-pot method, particularly for transglycosylation reaction using a combination of specific endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase.
  • novel isolation methods are provided comprising isolating the Fc-containing molecule of interest from impurities.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a transglycosylation reaction in a one-pot reaction in which an acceptor molecule ((Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc-mAb), a sugar chain donor molecule (X-SG-Z), an enzyme-A, and an enzyme-B are mixed. It is a list of structural formulas of representative examples of sugar chain donor molecules.
  • 1 is a schematic diagram of a transglycosylation reaction when using a sugar chain donor molecule and either G-1, G-3, or G-4.
  • FIG. FIG. 2 is a schematic diagram of transglycosylation reaction when using a sugar chain donor molecule and any one of G-1 to G-17. It is a schematic diagram of a hydrolysis reaction that is a competing reaction of the one-pot reaction.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a transglycosylation reaction when using a sugar chain donor molecule and either G-1, G-3, or G-4.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of transglycosylation reaction when using
  • FIG. 3 is a schematic diagram of the hydrolytic activity reaction of mAb2 using Enzyme-A.
  • Amino acid sequence of wild-type Endo-S (SEQ ID NO: 69). Bold and underlined amino acid residues corresponding to the catalytic activity center of the enzyme, and bold and underlined amino acid residues that were substituted in the mutant enzymes used in the Examples, or that are expected to control enzyme activity by adding mutations. Indicated.
  • Amino acid sequence of wild-type Endo-S2 (SEQ ID NO: 70). Bold and underlined amino acid residues corresponding to the catalytic activity center of the enzyme, and bold and underlined amino acid residues that were substituted in the mutant enzymes used in the Examples, or that are expected to control enzyme activity by adding mutations.
  • Amino acid sequence of wild-type Endo-Si (SEQ ID NO: 71). Bold and underlined amino acid residues corresponding to the catalytic activity center of the enzyme, and bold and underlined amino acid residues that were substituted in the mutant enzymes used in the Examples, or that are expected to control enzyme activity by adding mutations.
  • Amino acid sequence of wild-type Endo-M (SEQ ID NO: 72). Bold and underlined amino acid residues corresponding to the catalytic activity center of the enzyme, and bold and underlined amino acid residues that were substituted in the mutant enzymes used in the Examples, or that are expected to control enzyme activity by adding mutations. Indicated.
  • Amino acid sequence of wild-type Endo-Rp (SEQ ID NO: 73). Bold and underlined amino acid residues corresponding to the catalytic activity center of the enzyme, and bold and underlined amino acid residues that were substituted in the mutant enzymes used in the Examples, or that are expected to control enzyme activity by adding mutations. Indicated. Amino acid sequence of wild-type Endo-CC (SEQ ID NO: 74). Amino acid residues corresponding to the catalytically active central site of the enzyme are underlined in bold, and amino acid residues that are expected to control enzyme activity by adding mutations are indicated in bold. Amino acid sequence of wild-type Endo-Om (SEQ ID NO: 75).
  • Amino acid residues corresponding to the catalytically active central site of the enzyme are underlined in bold, and amino acid residues that are expected to control enzyme activity by adding mutations are indicated in bold.
  • 1 shows the amino acid sequence of anti-CD70 antibody 1 light chain (SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence of anti-CD70 antibody 1 heavy chain (SEQ ID NO: 2).
  • the amino acid sequence of anti-CD70 antibody 2 light chain (SEQ ID NO: 3) and the amino acid sequence of anti-CD70 antibody 2 heavy chain (SEQ ID NO: 4) are shown.
  • Shown are the amino acid sequence of the anti-TROP2 antibody 1 light chain (SEQ ID NO: 5) and the amino acid sequence of the anti-TROP2 antibody 1 heavy chain (SEQ ID NO: 6).
  • FIG. 7 shows the amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 2 light chain (SEQ ID NO: 7) and the amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 2 heavy chain (SEQ ID NO: 8).
  • the amino acid sequence of anti-EGFR antibody 1 light chain (SEQ ID NO: 9) and the amino acid sequence of anti-EGFR antibody 1 heavy chain (SEQ ID NO: 10) are shown.
  • 11 shows the amino acid sequence of the light chain of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 11) and the amino acid sequence of the heavy chain of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 12).
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 1 (SEQ ID NO: 13), CDRL2 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 1 (SEQ ID NO: 14), CDRL3 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 1 (SEQ ID NO: 15), CDRH1 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 1 (SEQ ID NO: 16), the CDRH2 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 1 (SEQ ID NO: 17), and the CDRH3 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 1 (SEQ ID NO: 18).
  • CDR sequences were determined according to the Kabat definition.
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 2 (SEQ ID NO: 19), CDRL2 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 2 (SEQ ID NO: 20), CDRL3 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 2 (SEQ ID NO: 21), CDRH1 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 2 (SEQ ID NO: 22), the CDRH2 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 2 (SEQ ID NO: 23), and the CDRH3 amino acid sequence of anti-CD70 antibody 2 (SEQ ID NO: 24).
  • CDR sequences were determined according to the Kabat definition.
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 1 (SEQ ID NO: 25), CDRL2 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 1 (SEQ ID NO: 26), CDRL3 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 1 (SEQ ID NO: 27), CDRH1 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 1 (SEQ ID NO: 28), the CDRH2 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 1 (SEQ ID NO: 29), and the CDRH3 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 1 (SEQ ID NO: 30). CDR sequences were determined according to the Kabat definition.
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 2 (SEQ ID NO: 31), CDRL2 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 2 (SEQ ID NO: 32), CDRL3 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 2 (SEQ ID NO: 33), CDRH1 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 2 (SEQ ID NO: 34), the CDRH2 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 2 (SEQ ID NO: 35), and the CDRH3 amino acid sequence of anti-TROP2 antibody 2 (SEQ ID NO: 36). CDR sequences were determined according to the Kabat definition.
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 1 (SEQ ID NO: 37), CDRL2 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 1 (SEQ ID NO: 38), CDRL3 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 1 (SEQ ID NO: 39), CDRH1 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 1 (SEQ ID NO: 40), the CDRH2 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 1 (SEQ ID NO: 41), and the CDRH3 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 1 (SEQ ID NO: 42). CDR sequences were determined according to the Kabat definition.
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 43), CDRL2 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 44), CDRL3 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 45), CDRH1 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 46), the CDRH2 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 47), and the CDRH3 amino acid sequence of anti-EGFR antibody 2 (SEQ ID NO: 48). CDR sequences were determined according to the Kabat definition.
  • the amino acid sequence of the trastuzumab light chain (SEQ ID NO:49) and the amino acid sequence of the trastuzumab heavy chain (SEQ ID NO:50) are shown.
  • the amino acid sequence of the light chain of the modified HER2 antibody (SEQ ID NO: 49) and the amino acid sequence of the heavy chain of the modified HER2 antibody (SEQ ID NO: 51) are shown.
  • Figure 5 shows the amino acid sequence of pertuzumab light chain (SEQ ID NO:52) and the amino acid sequence of pertuzumab heavy chain (SEQ ID NO:53).
  • 5 shows the amino acid sequence of the light chain of modified HER2 antibody 2 (SEQ ID NO: 52) and the amino acid sequence of the heavy chain of modified HER2 antibody 2 (SEQ ID NO: 54). 5 shows the amino acid sequence of the light chain of anti-CDH6 antibody (SEQ ID NO: 55) and the amino acid sequence of the heavy chain of anti-CD33 antibody (SEQ ID NO: 56).
  • CDRL1 amino acid sequence of pertuzumab (SEQ ID NO: 57), CDRL2 amino acid sequence of pertuzumab (SEQ ID NO: 58), CDRL3 amino acid sequence of pertuzumab (SEQ ID NO: 59), CDRH1 amino acid sequence of pertuzumab (SEQ ID NO: 60), CDRH2 amino acid sequence of pertuzumab ( SEQ ID NO: 61), and the CDRH3 amino acid sequence of pertuzumab (SEQ ID NO: 62).
  • CDR sequences were determined by the IMGT definition.
  • CDRL1 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody (SEQ ID NO: 63), CDRL2 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody (SEQ ID NO: 64), CDRL3 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody (SEQ ID NO: 65), CDRH1 amino acid sequence of anti-CDH6 antibody (SEQ ID NO: 66 ), the CDRH2 amino acid sequence of the anti-CDH6 antibody (SEQ ID NO: 67), and the CDRH3 amino acid sequence of the anti-CDH6 antibody (SEQ ID NO: 68).
  • CDR sequences were determined according to the Kabat definition. Amino acid sequence of wild-type Endo-Sd (SEQ ID NO: 76).
  • FIG. 7 shows the sequence of SEQ ID NO: 79 ([Endo-Si D241Q/Q311L]-[Endo-Rp N172V] fusion protein). Amino acid residues substituted in the fusion proteins described in the Examples are shown in bold, and amino acid linker sequences are underlined.
  • FIG. 8 shows the sequence of SEQ ID NO: 80 ([Endo-Rp N172V]-[Endo-Si D241Q/Q311L] fusion protein). Amino acid residues substituted in the fusion proteins used in the examples are shown in bold, and amino acid linker sequences are underlined.
  • FIG. 8 shows the sequence of SEQ ID NO: 81 ([Endo-Rp N172H]-[Endo-Si D241M/Q311L] fusion protein). Amino acid residues substituted in the fusion proteins used in the examples are shown in bold, and amino acid linker sequences are underlined.
  • a specific mutant having a mutation is represented by a molecular name and a mutation (for example, a mutant in which the 241st Asp of Endo-Si is replaced with Gln is "Endo-Si D241Q”) and has multiple mutations.
  • the mutations are separated by "/" (for example, in Endo-Si D241Q, a mutant having an additional mutation in which Gln at position 311 is replaced by Leu is "Endo-Si D241Q/Q311L”) and represent.
  • a method for producing an Fc-containing molecule having an N297-linked sugar chain containing a sugar chain derived from a sugar chain donor molecule comprising steps 1 and 2 below.
  • An acceptor molecule which is an Fc-containing molecule having a core GlcNAc to which fucose may be added as an N297-linked sugar chain, and a sugar chain donor molecule containing a sugar chain, are combined with the N297-linked sugar chain of the Fc-containing molecule.
  • Step 2 A step of reacting in the presence of endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (enzyme-A) as a substrate to obtain a reaction mixture;
  • Enzyme-A endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase
  • Step 2 A step of contacting the reaction mixture with a cation exchange chromatography medium under acidic conditions to recover Fc-containing molecules having N297-linked sugar chains containing sugar chains derived from sugar chain donor molecules.
  • N297-linked sugar chain means an N-linked sugar chain that is linked to the side chain of Asn at position 297 of an IgG heavy chain. Even if the addition position of the N-linked sugar chain is changed, as long as the N-linked sugar chain receives the action of Enzyme-A, it is included in the N297-linked sugar chain.
  • the N297-linked sugar chain in IgG produced in animals etc. has a basic structure consisting of the structure of the following formula (I) or (II), and the non-reducing end thereof may be further chemically modified.
  • Gal or sialic acid may be added.
  • N297-linked sugar chains of IgG produced by cells have a sugar chain structure in which sugar chains are further linked at the reducing end GlcNAc (core GlcNAc), the non-reducing end, branched sugars, etc. in this basic structure. diversity.
  • the N297-linked sugar chain may have a structure ((Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc) having a core fucose in which fucose (Fuc) is ⁇ 1,6-linked at position 6 of the core GlcNAc.
  • Man which is a branched sugar, sometimes forms a triantennary type sugar chain in which a sugar chain containing GlcNAc is further bound to the 5-position.
  • GlcNAc at the non-reducing end may be further bound with a sugar chain containing galactose (Gal) or sialic acid (Sia).
  • a "sugar chain donor molecule” (also referred to as a “sugar chain donor”) means a molecule that donates a sugar chain to an acceptor molecule.
  • sugar chains are sugar chains that are known not to exhibit antigenicity in the human body.
  • high mannose type, hybrid type, and complex type sugar chains are used. etc. are known. These three have a common basic structure.
  • the high mannose type is a sugar chain with a mannose-rich structure in which multiple mannose are continuous in two branched chains (chains 1-3 and 1-6) branched from mannose ( ⁇ -mannose) located near the reducing end. is.
  • the hybrid type is a structure in which one of two branched chains (1-3 chain, 1-6 chain) branched from mannose ( ⁇ -mannose) located near the reducing end has GlcNAc.
  • the complex type is a structure having GlcNAc in two branched chains (1-3 chain, 1-6 chain) branched from mannose ( ⁇ mannose) at a position close to the reducing end, and the presence or absence of galactose , the presence or absence of sialic acid, and their bond isomerism and positional isomerism.
  • Biantennary, triantennary, and tetraantennary types are known as complex-type sugar chains.
  • the sugar chain moiety in the sugar chain donor molecule may be any of a high mannose sugar chain, a hybrid sugar chain, and a complex sugar chain, but is preferably a high mannose sugar chain or a complex sugar chain.
  • a chain particularly preferably a complex-type sugar chain.
  • the sugar chain donor molecule comprises a complex sugar chain.
  • the complex-type sugar chain may be any of biantennary, triantennary, or tetraantennary type.
  • the sugar chain donor molecule of the present invention is a biantennary complex type Contains sugar chains.
  • the sugar chain donor molecule in the present invention is a sugar chain-containing molecule having GlcNAc in which the reducing end of the sugar chain is not activated, or GlcNAc in which the reducing end of the sugar chain is activated (for example, It is a carbohydrate-containing molecule with an oxazolylated GlcNAc).
  • activation of the reducing end of a sugar chain donor molecule synthesized by a chemical method refers to a state in which the reactivity of the anomeric position of the reducing end of the sugar chain donor molecule is chemically enhanced, Typically, it refers to a state in which the anomeric position is oxazolinated or halogenated.
  • Enzyme-B acts on a sugar chain donor molecule containing a sugar chain containing GlcNAc whose reducing end is not activated
  • Enzyme-A converts the sugar chain donor molecule into the desired transglycosylation reaction.
  • activation to make a sugar chain donor molecule available refers to a state in which the reactivity of the anomeric position at the reducing end of the sugar chain donor molecule is enzymatically enhanced. That is, it means that an activated intermediate is produced, and refers to a state in which the activated sugar chain donor molecule alone cannot be isolated and purified.
  • the sugar chain donor molecule is a sugar chain-containing molecule having GlcNAc in which the reducing end of the sugar chain is not activated, preferably SGP, (SG-)Asn, (MSG1-)Asn , (MSG2-)Asn or a mixture of (MSG1-)Asn, (MSG2-)Asn.
  • These sugar chain moieties are representative of N-linked sugar chains, and include sialyl glycans (hereinafter referred to as "SG") having structures represented by the following structural formulas and sequence formulas.
  • the binding mode of the sugar chain on the reducing end side may be changed from the N-linked type to the O-linked type.
  • MSG a sugar chain structure lacking sialic acid at the non-reducing end of only one of the ⁇ -Man branched chains of SG. MSG1, and MSG2, which has sialic acid only in the branched 1-6 sugar chains.
  • AG (9) (the following structural formula and sequence formula) is obtained by treating SG with neuraminidase and deleting NeuAc at two non-reducing ends.
  • AG (9)) AG (7) obtained by treating AG (9) with galactosidase and deleting two non-reducing ends of Gal (AG (7) in the structural formula and sequence formula below), etc. be able to.
  • the sugar chain donor molecule may be chemically modified, for example, the non-reducing end may be chemically modified.
  • sugar chain moieties in sugar chain donor molecules that may be chemically modified at the non-reducing end that can be used in the present invention include derivatives in which the site on wild-type sialic acid is chemically modified with an arbitrary substituent group. (SG type).
  • X represents a substituent introduced on the non-reducing terminal sialic acid of both the 1-3 chain side and the 1-6 chain side of the ⁇ -Man branched chain, and in the field of organic synthetic chemistry Substituents that can be synthesized by applying various known methods, referring to substituents used in binding methods applied to synthesis of antibody-drug conjugates (Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2198-2215).
  • the “substituent having an azide group (N 3 —)” includes, for example, a polyethylene glycol linker having N 3 , that is, included in the linker structure
  • the upper limit of the number of ethylene glycol units ( --CH.sub.2 -- CH.sub.2 --O--) is about 20 or less, preferably about 11 or less, more preferably about 7 or less.
  • N 3 — includes, for example, a polyethylene glycol linker having N 3 (e.g., 35-azido-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33- undecaoxapentatriacontane-1-amino group, 32-azido-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30-decaoxadotriacontane-1-amino group, 29-azido -3,6,9,12,15,18,21,24,27-nonoxanonacosane-1-amino group, 26-azido-3,6,9,12,15,18,21,24-octa Oxahexacosane-1-amino group, 23-azido-3,6,9,12,15,18,21-heptaoxatricosane-1-amino group, 20-azido-3,6,9,12,15,15
  • X-MSG type 1 which is a structure lacking the chemically modified sialic acid on the 1-6 chain side of the ⁇ -Man branched chain, and the chemically modified sialic acid on the 1-3 chain side
  • An acid-deficient structure, X-MSG2 type is also an example of a sugar chain moiety in a sugar chain donor molecule in which the non-reducing end may be chemically modified.
  • sites other than sialic acid that may be chemically modified are also conceivable, including AG(9) type derivatives and AG(7) type derivatives.
  • X represents a substituent introduced on the galactose at the non-reducing ends of both the 1-3 chain side and the 1-6 chain side of the ⁇ -Man branched chain, specifically, in the above It has the same meaning as defined.
  • "-(N/O)" indicates a glycosidic bond with an N atom or an O atom.
  • X represents a substituent introduced on the GlcNAc at the non-reducing end of both the 1-3 chain side and the 1-6 chain side of the ⁇ -Man branched chain, specifically, in the above It has the same meaning as defined.
  • "-(N/O)" indicates a glycosidic bond with an N atom or an O atom.
  • the structure lacking the chemically modified galactose on the 1-6 chain side of the ⁇ -Man branched chain the structure lacking the chemically modified galactose on the 1-3 chain side
  • the structure lacking the chemically modified GlcNAc on the 1-6 chain side of the ⁇ -Man branched chain the structure lacking the chemically modified GlcNAc on the 1-3 chain side are also examples of carbohydrate moieties in the donor molecule.
  • the sugar chain donor molecule of the present invention is preferably SGP, AG(9)-P, AG(7)-P, SG-Asn, AG(9)-Asn, which may be chemically modified at the non-reducing end, AG(7)-Asn, SG-OR, AG(9)-OR, AG(7)-OR, (MSG1)-Asn, (MSG2)-Asn, mixtures of (MSG1)-Asn and (MSG2)-Asn , MSG1-OR, MSG2-OR, or a mixture of MSG1-OR and MSG2-OR, or a carbohydrate donor molecule having the structure shown in FIG.
  • "P" indicates a peptide portion derived from SGP, and "X" in FIG.
  • the sugar chain donor molecule of the present invention is ([N 3 -PEG(3)] 2 -SG)-P-PEG(3)-N 3 , ( [N 3 -PEG(3)] 2 -SG)-Asn-PEG(3)-N 3 , ([N 3 -PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N 3 , ([ N 3 -PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N 3 , or ([N 3 -PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N 3 and ([N 3 -PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N 3 mixtures, including O-linked sugar chains, ([N 3 -PEG(3)] 2 -SG)-OR, ([N -PEG (3)]-MSG1)-OR, ([N -PEG (3)]-MSG2)-OR, or (
  • the sugar chain donor molecule is preferably a novel sugar chain donor molecule specifically disclosed in the chapter ⁇ Novel sugar chain donor molecule>.
  • the sugar chain donor molecule of the present invention is preferably appropriately selected according to various conditions such as the combination of Enzyme-A and Enzyme-B to be used.
  • R represents an optional substituent linked to an oxygen atom through at least one carbon atom, preferably a C1-C6 alkyl group or an optionally substituted aryl group.
  • C1-C6 alkyl group means a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as methyl group, ethyl group, n-propyl group, i-propyl group, n-butyl group , i-butyl, s-butyl, t-butyl, n-pentyl, n-hexyl and the like, but are not limited thereto.
  • aryl group examples include, but are not limited to, phenyl group, benzyl group, indenyl group, naphthyl group, fluorenyl group, anthranyl group, phenanthrenyl group, and the like.
  • substituents of the aryl group include C1-C6 alkoxy groups (eg, methoxy group, ethoxy group, isopropoxy group, etc.), C1-C6 alkyl groups (eg, methyl group, ethyl group, etc.), and halogen groups. It can be, but is not limited to.
  • substituted aryl groups include, but are not limited to, para-methoxyphenyl groups, para-methylphenyl groups, and the like.
  • R is PMP, Me, A-Mor, iPr, nPr, PrOMe and A-PEG-N 3 (A is the acetyl group in the glycolic acid unit, i.e. the anomeric hydroxyl group; Mor or the portion sandwiched between amino groups in PEG).
  • the sugar chain donor molecule comprises a high mannose-type sugar chain.
  • Such sugar chain donor molecules include Man9-GlcNAc 2 -Asn (“M9-Asn”) having the following structure, and M9-Asn having a structure lacking one, two, or three mannose.
  • Man8-GlcNAc 2 -Asn (“M8-Asn”), Man7-GlcNAc 2 -Asn (“M7-Asn”), Man6-GlcNAc 2 -Asn (“M6-Asn”) which include is not limited.
  • the sugar chain donor molecule is a sugar chain-containing molecule having activated GlcNAc at the reducing end of the sugar chain, preferably oxazolylated GlcNAc.
  • Molecules with various sugar chain structures can be used as such sugar chain donor molecules.
  • sugar chain donor molecules include SG-Ox ("Ox" indicates oxazoline), MSG1-Ox, MSG2-Ox, or a mixture of MSG1-Ox and MSG2-Ox. is not limited to
  • a sugar chain-containing molecule having GlcNAc with an activated reducing end of the sugar chain may be chemically modified in the same manner as a sugar chain-containing molecule having GlcNAc in which the reducing end of the sugar chain is not activated.
  • the non-reducing end may be chemically modified. Examples of the chemical modification of the non-reducing end of the sugar chain include modifications similar to those mentioned for sugar chain-containing molecules having GlcNAc in which the reducing end of the sugar chain is not activated.
  • a sugar chain donor molecule can be appropriately purchased from a commercial product or prepared by using or applying a known method, for example, using the method shown in Example 7 or Reference Example 23-1. Or it can be produced by applying.
  • Fc-containing molecule refers to a molecule containing an Fc region, such as an antibody (immunoglobulin), an Fc-fusion protein, an Fc fragment, etc. (or Fc-containing fragment) can be exemplified.
  • Antibodies (immunoglobulins) in the present invention may be any of IgG, IgA, IgM, IgE and IgD, and may be either monoclonal antibodies or polyclonal antibodies, and may be of natural origin. IgG, especially IgG-type monoclonal antibodies can be mentioned preferably.
  • Fc-containing fragments other than antibodies include CLCH, for example, Fc fragment of IgG (especially IgG-type monoclonal antibody), CLCH consisting only of constant regions (Patent Document 1), bispecific antibody containing Fc fragment (Expert Opin Ther Pat.2018 28, 251-276), etc., but not limited to these.
  • acceptor molecule means a molecule that accepts a sugar chain from a sugar chain donor molecule.
  • a typical acceptor molecule is an IgG derived from a monoclonal antibody or an Fc fragment thereof having an N297-linked sugar chain consisting only of core GlcNAc optionally bound by core Fuc.
  • core Fuc (or “core fucose”) means fucose bound to the core GlnNAc. Core Fuc may or may not be bound to core GlcNAc, depending on the antibody from which it is derived or the production method thereof.
  • the acceptor molecule is an Fc-containing molecule (e.g., an antibody or an Fc-containing fragment thereof) having a core GlcNAc optionally fucose-added as N297-linked sugar chains, preferably GlcNAc
  • Fc-containing molecules e.g, antibodies or Fc-containing fragments thereof
  • N297-linked sugar chains consisting of (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc can be mentioned.
  • Acceptor molecules can be derived from various monoclonal antibodies, sugar chain-containing molecules, or Fc region-containing molecules (e.g., Fc, consisting only of a constant region obtained by deleting the variable region from the heavy chain and consisting only of the constant region of the light chain).
  • Acceptor molecules of the present invention are preferably (Fuc ⁇ 1,6)-GlcNAc-IgG (for example, (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc-mAb1 in FIG. 4), (Fuc ⁇ 1,6)-GlcNAc-Fc, (Fuc ⁇ 1,6)- GlcNAc-CLCH, GlcNAc-mAb4, etc. (Patent Document 1).
  • the Fc-containing molecule having an N297-linked sugar chain can be derived from an antibody, such as an anti-HER2 antibody, an anti-HER3 antibody, an anti-DLL3 antibody, an anti-FAP antibody, and an anti-CDH11 antibody.
  • Antibodies of the present invention are preferably anti-HER2 antibodies (e.g., trastuzumab or pertuzumab), anti-CDH6 antibodies, anti-CD33 antibodies, anti-EphA2 antibodies, anti-CD70 antibodies, anti-TROP2 antibodies, or anti-EGFR antibodies, more preferably , anti-HER2 antibody, anti-CDH6 antibody, anti-CD70 antibody, anti-TROP2 antibody, or anti-EGFR antibody.
  • anti-HER2 antibodies e.g., trastuzumab or pertuzumab
  • anti-CDH6 antibodies e.g., anti-CD33 antibodies, anti-EphA2 antibodies, anti-CD70 antibodies, anti-TROP2 antibodies, or anti-EGFR antibodies
  • anti-HER2 antibody e.g., trastuzumab or pertuzumab
  • anti-CDH6 antibodies e.g., trastuzumab or pertuzumab
  • anti-CD33 antibodies e.g
  • the above antibody can be obtained by immunizing an animal with a polypeptide that serves as an antigen, and collecting and purifying the antibody produced in vivo, using methods commonly practiced in this field.
  • the origin of the antigen is not limited to humans, and animals can also be immunized with antigens derived from non-human animals such as mice and rats.
  • antibodies applicable to human diseases can be screened by testing the cross-reactivity between the obtained antibodies that bind to heterologous antigens and human antigens.
  • a monoclonal antibody can also be obtained by fusing an antibody-producing cell that produces an antibody against an antigen with a myeloma cell to establish a hybridoma.
  • An antigen can be obtained by genetically manipulating a gene encoding an antigen protein to produce it in a host cell.
  • the "host cell” can be appropriately selected from animal cells, plant cells, Escherichia coli, yeast, and other cells commonly used for protein production.
  • the above antibody may be a humanized antibody, and a known method (for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984), Nature (1986) 321, p. 522- 525, WO 90/07861).
  • anti-HER2 antibody US5821337, WO2004/008099, WO2020/050406 etc.
  • anti-CD33 antibody WO2014/057687, WO2020/050406 etc.
  • anti-EphA2 antibody WO2009/028639, WO2020/050406 etc.
  • anti CDH6 antibody WO2018/212136, WO2020/050406, etc.
  • anti-CD70 antibody WO2004/073656, WO2007/038637, WO2021/177438, etc.
  • anti-TROP2 antibody WO2015/098099, WO2021/177438, etc.
  • anti-EGFR antibody WO1998/050433, WO2002/092771, WO2021/177438, etc.
  • Antibodies will be described in detail below, but it is known that there are multiple allotypes in the constant region of antibodies, and examples include G1m17, G1m3, G1m1, and G1m2 for IgG1 heavy chains.
  • the constant region of the antibody used in the present invention is not particularly limited, it is preferable to use G1m17 or G1m3.
  • IgG1 is used as the isotype of the antibody of the present invention, it is possible to adjust the effector function by substituting a part of the amino acid residues of the constant region. It can enhance or attenuate toxic activity, enhance or attenuate antibody-dependent cell-mediated phagocytosis, or enhance or attenuate complement-dependent cytotoxic activity.
  • Antibodies used in the invention can also have one or two amino acids deleted at the carboxyl terminus of one or both of the heavy chains.
  • the above anti-HER2 antibody is not particularly limited, but preferably has the following properties, for example.
  • an anti-HER2 antibody characterized by having the following properties; (a) specifically binds to HER2; (b) having the activity of internalizing into HER2-expressing cells by binding to HER2; (2) The antibody according to (1) above, which binds to the extracellular domain of HER2. (3) The antibody according to (1) or (2) above, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cellular cytotoxicity
  • the antibody according to any one of (1) to (4) above which is a mouse monoclonal antibody, chimeric monoclonal antibody or humanized monoclonal antibody.
  • the antibody according to (8) above which is a humanized monoclonal antibody comprising a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:54 and a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:52.
  • a light chain comprising CDRL1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 57, CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 58, and CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 59, and SEQ ID NO: 60;
  • CDRL1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 57
  • CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 58
  • CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 59, and SEQ ID NO: 60
  • (1) above which is a humanized monoclonal antibody comprising a heavy chain comprising CDRH1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 61, CDRH2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 61, and CDRH3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 62
  • the antibody according to (3), (6) or (8)
  • the antibody according to any one of (1) to (12) above which has a deletion of one or two amino acids at the carboxyl terminus of the heavy chain.
  • (14) a step of culturing a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide encoding the antibody according to any one of (1) to (13) above; antibody obtained by a method for producing the antibody, which comprises the step of collecting the antibody of
  • the anti-CD70 antibody used in the production of the antibody-immunostimulatory agent conjugate of the present invention is not particularly limited, it preferably has the following properties, for example.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cellular cytotoxicity
  • the antibody according to any one of (1) to (4) above which is a mouse monoclonal antibody, chimeric monoclonal antibody, or humanized monoclonal antibody.
  • the antibody according to (7) above which is a humanized monoclonal antibody comprising a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:2 and a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:1.
  • CDRL1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13
  • CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14
  • CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15
  • a humanized monoclonal antibody comprising a heavy chain comprising CDRH1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17, CDRH2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17, and CDRH3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18.
  • CDRL1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19
  • CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20
  • CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21
  • a humanized monoclonal antibody comprising a heavy chain comprising CDRH1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:23, CDRH2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:23, and CDRH3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:24
  • the anti-TROP2 antibody used in the production of the antibody-immunostimulatory agent conjugate of the present invention is not particularly limited, but preferably has the following properties, for example.
  • An anti-TROP2 antibody that specifically binds to TROP2. (2) The antibody according to (1) above, which binds to the extracellular domain of TROP2. (3) The antibody according to (1) or (2) above, wherein the antibody is a monoclonal antibody.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cellular cytotoxicity
  • the antibody according to any one of (1) to (4) above which is a mouse monoclonal antibody, chimeric monoclonal antibody, or humanized monoclonal antibody.
  • a light chain comprising CDRL1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25, CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26, and CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27, and SEQ ID NO: 28;
  • CDRL1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25
  • CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26
  • CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27, and SEQ ID NO: 28
  • (1) above which is a humanized monoclonal antibody comprising a heavy chain comprising CDRH1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:29, CDRH2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:29, and CDRH3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:30
  • a light chain comprising CDRL1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:31, CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:32, and CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:33;
  • CDRL1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:31
  • CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:32
  • CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:33
  • (1) above which is a humanized monoclonal antibody comprising a heavy chain comprising CDRH1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:35, CDRH2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:35, and CDRH3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:36
  • the antibody according to (3), (6) or (8).
  • the anti-EGFR antibody used in the production of the antibody-immunostimulatory agent conjugate of the present invention is not particularly limited, but preferably has the following properties, for example.
  • An anti-EGFR antibody that specifically binds to EGFR. (2) The antibody according to (1) above, which binds to the extracellular domain of EGFR. (3) The antibody according to (1) or (2) above, wherein the antibody is a monoclonal antibody. (4) The antibody according to any one of (1) to (3) above, which has antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity and/or complement-dependent cellular cytotoxicity (CDC) activity.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cellular cytotoxicity
  • the antibody according to any one of (1) to (4) above which is a mouse monoclonal antibody, chimeric monoclonal antibody, or humanized monoclonal antibody.
  • the antibody according to (7) above which is a humanized monoclonal antibody comprising a heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:10 and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:9.
  • CDRL1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:37
  • CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:38
  • CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:39
  • (1) above which is a humanized monoclonal antibody comprising a heavy chain comprising CDRH1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41, CDRH2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 41, and CDRH3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 42
  • a light chain comprising CDRL1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43, CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44, and CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 45, and SEQ ID NO: 46;
  • CDRL1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43
  • CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44
  • CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 45, and SEQ ID NO: 46
  • (1) above which is a humanized monoclonal antibody comprising a heavy chain comprising CDRH1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 47, CDRH2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 47, and CDRH3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 48
  • the antibody according to (3), (6) or (7).
  • the anti-CDH6 antibody used in the production of the antibody-immunostimulatory agent conjugate of the present invention is not particularly limited, but preferably has the following properties, for example.
  • An anti-CDH6 antibody that specifically binds to CDH6. (2) The antibody according to (1) above, which binds to the extracellular domain of CDH6. (3) The antibody according to (1) or (2) above, wherein the antibody is a monoclonal antibody. (4) The antibody according to any one of (1) to (3) above, which has antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity and/or complement-dependent cellular cytotoxicity (CDC) activity.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cellular cytotoxicity
  • the antibody according to any one of (1) to (4) above which is a mouse monoclonal antibody, chimeric monoclonal antibody, or humanized monoclonal antibody.
  • the antibody according to (7) above which is a humanized monoclonal antibody comprising a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:56 and a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:55.
  • a light chain comprising CDRL1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 63, CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 64, and CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 65;
  • CDRL1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 63
  • CDRL2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 64
  • CDRL3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 65
  • (1) above which is a humanized monoclonal antibody comprising a heavy chain comprising CDRH1 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 67, CDRH2 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 67, and CDRH3 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 68
  • the acceptor molecule can be appropriately purchased as a commercial product, or can be produced by using or applying a known method, for example, by using or applying the method mentioned in Example 1. can be done.
  • the acceptor molecule is typically an Fc-containing molecule that is subject to sugar chain modification (also called sugar chain remodeling) (typically, an IgG monoclonal antibody or an Fc fragment or constant region of the antibody).
  • sugar chain modification also called sugar chain remodeling
  • N297-linked sugar chains of Fc-containing molecules such as CLCH are treated with ENGase that retains the activity of specifically hydrolyzing the 1,4-glycosidic bond (GlcNAc ⁇ 1-4GlcNAc) between GlcNAcs in the corechitobiose structure of the N297-linked sugar chains.
  • the acceptor molecule is an enzyme that is the same as or different from the enzyme-A (enzyme having the activity of transferring the sugar chain in the sugar chain donor molecule to the acceptor molecule) used in step 1.
  • Fc-containing molecules Fc-containing molecules to be glycosylated, typically host cell-derived N297-linked sugar chains, heterogeneous N297-linked sugar chains, or host cell-derived heterogeneous N297-linked
  • the transglycosylation reaction in step 1 can be prepared in an independent step by a method such as reacting with Fc-containing molecule having a sugar chain).
  • Enzyme-A As a feature of Enzyme-A that can be used in Step 1, there is "the hydrolytic activity may remain". Therefore, instead of prior treatment with these ENGases, Enzyme-A may act on Fc-containing molecules with heterogeneous carbohydrate chains derived from host cells to prepare acceptor molecules in situ.
  • the acceptor molecule is a raw material Fc-containing molecule (Fc-containing molecule to be subjected to sugar chain modification, typically host cell-derived N297-linked sugar chain, heterogeneous Fc-containing molecules having a heterogeneous N297-linked sugar chain or host cell-derived heterogeneous N297-linked sugar chain) are prepared in situ and/or one-pot by acting Enzyme-A.
  • the IgG or Fc-containing molecule used for sugar chain modification is preferably derived from an IgG heavy chain consisting of the same amino acid sequence and produced in a form having an N297-linked sugar chain. Just do it.
  • the production method is not limited, and IgG produced by a commonly known monoclonal antibody production method, CLCH of IgG, or an Fc fragment obtained by enzymatic treatment thereof can be used. . Also, such IgG or Fc fragments may be taken from mixtures of samples obtained from different production methods and different lots.
  • Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase is a sugar hydrolase, also known as ENGase: Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase, and is responsible for cleaving the chitobiose structure in the sugar chain structure and forming bonds. . Also, it is called differently depending on its origin.
  • Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase whose substrate is the N297-linked sugar chain of an Fc-containing molecule, is referred to herein as "Enzyme-A" and does not have a sugar chain of a sugar chain donor molecule, such as fucose.
  • An endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase whose substrate is the sugar chain of a sugar chain source (for example, SGP) is called “enzyme-B”. Enzyme-A and Enzyme-B in the present invention are described below.
  • Enzyme-A means an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase with the N297-linked carbohydrate chain of an Fc-containing molecule (eg, antibody) as substrate.
  • Enzyme-A generally contains a domain with high affinity for Fc-containing molecules, a domain with high affinity for sugar chains, and a glycosylation catalytic domain, and is typically an Fc-containing molecule (eg, antibody). has both hydrolytic activity and transglycosylation activity using the N297-linked sugar chain of . The hydrolytic activity may be attenuated or eliminated, since it is the activity of transferring the activated sugar chain) to the acceptor molecule.
  • an enzyme that retains strong hydrolytic activity may hydrolyze, as a substrate, the sugar chain transferred to the core GlcNAc of the acceptor molecule by the transglycosylation activity.
  • Activity is preferably relatively reduced.
  • Enzyme-A still has hydrolytic activity, there is an advantage that it can be prepared in situ in the same reaction vessel in Step 1 without separately preparing the acceptor molecule in Step 1. can.
  • Enzyme-A has an activity capable of acting on the sugar chain of an Fc-containing molecule (particularly, a transglycosylation activity using the N297-linked sugar chain of an Fc-containing molecule as a substrate), In another aspect of the present invention, Enzyme-A has activity capable of acting on sugar chains of Fc-containing molecules and retains hydrolytic activity, or has hydrolytic activity It has disappeared.
  • the hydrolytic activity of Enzyme-A refers to the activity of specifically hydrolyzing the ⁇ 1,4 glycosidic bond contained in corechitobiose in the common basic structure of sugar chains, particularly in N297-linked sugar chains of Fc-containing molecules. It means the activity of specifically hydrolyzing the ⁇ 1,4 glycosidic bond contained in corechitobiose in the common basic structure.
  • Schematic diagrams of the hydrolysis activity of Enzyme-A are shown in FIGS. 5 and 6.
  • the glycosylation activity of Enzyme-A is such that the sugar chain donor molecule (reducing end is the activity of glycoside-bonding the reducing end of a sugar chain-containing molecule having an activated GlcNAc or a GlcNAc in which the reducing end is not activated.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the glycosylation activity of Enzyme-A when the sugar chain donor molecule contains GlcNAc whose reducing end is not activated.
  • Enzyme-A in the present invention includes, for example, Endo-S (Streptococcus pyogenes-derived enzyme) (Collin Man and Olsen A., EMBO J. 2001, 20, 3046-3055, and Goodfellow JJ, et al., J Am Chem See Soc. b).2018, 54, 6161-6164), Endo-F3 (enzyme derived from Flavobacterium meningosepticum) (Huang W, et al., Chembiochem. 2011, 12, 932-941, and Giddens JP, et al., J Biol Ch em.2016, 291 , 9356-9370), or mutant enzymes thereof.
  • Endo-S Streptococcus pyogenes-derived enzyme
  • Endo-F3 enzyme derived from Flavobacterium meningosepticum
  • Enzyme-A in the present invention endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (hereinafter referred to as "Endo -Si", whose amino acid sequence (SEQ ID NO: 71) is shown in Figure 9), or mutant enzymes thereof.
  • Enzyme-A in the present invention an enzyme whose sequence is specified from the genome information of the genus Streptococcus (see Vincent P. Richard, et al., Genome Biol. Evol. 2014, 6, 741-753), Or its mutant enzyme can be mentioned.
  • Enzyme-A of the present invention is not limited to the specific enzymes used in the examples as long as it has the above properties. It may be an enzyme artificially produced or modified based on the sequence information of. In the case of isolating from nature, the species to be used as the isolation source is not particularly limited, but preferably bacteria.
  • Endo-Si and the carbohydrate-binding module are aligned with EndoS (B. Trastoy et al., PNAS (2014) vol111, No. 18, pp6714-6719) for which crystal structure analysis has been performed.
  • Enzyme-A of the present invention includes the amino acid sequences set forth in amino acid numbers 106 to 447 and/or amino acid numbers 762 to 897 of SEQ ID NO:71, preferably those set forth in amino acid numbers 106 to 897 of SEQ ID NO:71.
  • It contains an amino acid sequence, more preferably an amino acid sequence set forth in amino acid numbers 106 to 928 of SEQ ID NO:71, more preferably an amino acid sequence set forth in amino acid numbers 34 to 928 of SEQ ID NO:71, and transglycosylation Polypeptides that exhibit activity are included.
  • endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase usually has both hydrolytic activity and transglycosylation activity.
  • Antibodies with core GlcNAc or their Fc region-containing molecules may also hydrolyze the sugar chains transferred to the core GlcNAc as substrates, and the desired transglycosylation form may not be obtained appropriately. Therefore, in synthesizing a sugar chain remodeling antibody or a sugar chain-modifying compound, mutant enzymes with relatively reduced hydrolysis activity compared to transglycosylation activity are useful.
  • Enzyme-A is a mutant enzyme of Endo-S, EndoS-2, Endo-Si, Endo-Sd, Endo-Se, or Endo-Sz and its corresponding wild-type A mutant enzyme having a hydrolytic activity lower than that of the enzyme, preferably a mutant enzyme in which the amino acid residues shown in bold in FIGS.
  • Enzyme-A may be further mutated. 1 to several amino acid residues may be substituted, deleted, inserted, and/or added to the extent that they do not occur.
  • the amino acid sequence of Enzyme-A is at least 80% or more, preferably 85% or more, with respect to amino acid residues other than specific mutated amino acid residues, referring to Patent Document (International Publication No. 2022/050300). , more preferably 90% or more, and still more preferably 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more homology or identity.
  • “several” means an integer of 30 or 20 or less, preferably an integer of 10 or less, more preferably an integer of 5 or less, most preferably means 4, 3, 2 or 1.
  • Enzyme-B is an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase that uses the sugar chain of a sugar chain donor molecule as a substrate, particularly the sugar chain of a sugar chain donor molecule as a substrate, but does not use an N297-linked sugar chain as a substrate ( In other words, it means an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase that has low reactivity (preferably extremely low reactivity) to N297-linked sugar chains.
  • the sugar chain portion on the sugar chain donor molecule that is the substrate for Enzyme-B may be any of high mannose type sugar chain, hybrid type sugar chain and complex type sugar chain, preferably high mannose type sugar chain.
  • the sugar chain moiety on the sugar chain donor molecule that is the substrate of Enzyme-B is a high-mannose sugar chain or a complex sugar chain, preferably a complex sugar chain.
  • the complex-type sugar chain may be any of a biantennary type, a triantennary type, or a tetraantennary type. The part is a biantennary complex type sugar chain.
  • Enzyme-B is an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase whose substrate is a sugar chain raw material (glycopeptide or glycoprotein such as SGP) that does not have fucose, preferably fucose. It is an endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase that uses as a substrate a sugar chain raw material containing a biantennary complex type sugar chain that does not have endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase.
  • a sugar chain raw material glycopeptide or glycoprotein such as SGP
  • Enzyme-B of the present invention in the presence of Enzyme-A, by acting on a sugar chain donor molecule containing a sugar chain containing GlcNAc whose reducing end has not been activated, the reducing end is converted to transglycosylation reaction.
  • It is an enzyme that has the property of producing an activated intermediate that is ready for use and, as a result, promoting the transglycosylation reaction of a sugar chain derived from a sugar chain donor molecule by Enzyme-A to an acceptor molecule. is preferred.
  • Enzyme-B is Among the endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidases that use the sugar chain of a sugar chain donor molecule (for example, SGP) that contains an unbound GlcNAc as a substrate, but do not use an N297-linked sugar chain as a substrate, an acceptor having a GlcNAc (for example, , 1-methylethyl-2-(acetylamino)-2-deoxy- ⁇ -D-glucopyranoside, 2-(acetylamino)-2-deoxy- ⁇ -D-glucopyranoside and other GlnNAc derivatives). can be selected as an index. Therefore, in one aspect of the present invention, Enzyme-B is an enzyme having a transglycosylation activity from SGP to GlcNAc derivatives.
  • SGP sugar chain donor molecule
  • the activating action of the sugar chain donor molecule by Enzyme-B acts on the sugar chain donor molecule containing GlcNAc whose reducing end is not activated, and the reducing end is used for the transglycosylation reaction. It is intended to generate an activated intermediate that is in a ready state, but if the hydrolysis activity of Enzyme-B is high, the activated intermediate may react with the acceptor molecule via Enzyme-A. However, there is a possibility that many free sugar chains may be generated by reacting with H 2 O molecules present in the reaction system. Therefore, Enzyme-B in the present invention preferably has a relatively reduced hydrolytic activity in comparison with sugar chain activating activity.
  • Enzyme-B of the present invention includes, for example, Endo-M (Mucorhiemalis-derived enzyme) (Yamamoto K, et al., Biochem Biophys Res Commun. 1994, 203, 244-252, and Umekawa M, et al., J. Biol Chem. 2021, 285, 511-521), Endo-CC (enzyme derived from Coprinopsis cinerea) (Eshima Y, et al., PLoS One. 2015, 10, see e0132859), Endo-Om (Ogataea minu ta-derived enzyme ) (Murakami S, et al., Glycobiology.
  • Endo-M Macorhiemalis-derived enzyme
  • Enzyme-B is a mutant enzyme of Endo-M, Endo-Om, Endo-CC, or Endo-Rp and has lower hydrolytic activity than its corresponding wild-type enzyme. Enzymes, preferably mutant enzymes in which the amino acid residues shown in bold in FIGS.
  • enzyme-B may be further mutated in addition to the specific mutations mentioned above. 1 to several amino acid residues may be substituted, deleted, inserted, and/or added to the extent that they do not occur.
  • the amino acid sequence of Enzyme-B is at least 80% or more, preferably 85% or more, with respect to amino acid residues other than specific mutated amino acid residues, referring to Patent Document (International Publication No. 2022/050300). , more preferably 90% or more, and still more preferably 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more homology or identity.
  • Enzyme-A and Enzyme-B are each added as separate molecules to Step 1, but Enzyme-A and Enzyme-B each play a desired role. As long as they are directly or indirectly bound, they may be added to the reaction system. Therefore, in one aspect of the present invention, Enzyme-A and Enzyme-B may be added to the reaction system as chemically bound directly or indirectly. It may be added to the reaction system in the form of an immobilized enzyme immobilized on a carrier, or a fusion protein bound with an arbitrary amino acid, a polymer such as PEG, an oligomer linker, or the like.
  • an immobilized enzyme immobilized on an arbitrary solid phase carrier, an arbitrary amino acid, a polymer such as PEG, an oligomer linker, etc., preferably as a fusion protein bound by an amino acid linker can be added to the reaction system.
  • Enzyme-A and Enzyme-B are functional fragments rather than full-length molecules without deletions, as long as the functional fragment has the desired function, the fragment can also be Enzyme-A. , as an aspect of Enzyme-B.
  • Enzyme-A and Enzyme-B in the present invention are, for example, "Enzyme-A” and “Enzyme-B,” “Enzyme fragment having the function of Enzyme-A” and “Enzyme fragment having the function of Enzyme-B.”
  • ⁇ Enzyme-A'' and ⁇ Enzyme fragment having the function of Enzyme-B'', and ⁇ Enzyme fragment having the function of Enzyme-A'' and ⁇ Enzyme-B'' are chemically bonded directly or indirectly. Also includes state.
  • enzyme fragment having the function of enzyme-A the above enzyme-A, or Endo-BI1 (GenBank Accession number: ACJ53522.1), Endo-BI2 (GenBank Accession number: BAJ71450.1), Endo-BT- 3987 (GenBank Accession number: AAO79092.1), Endo-E (GenBank Accession number: AAR20477.1), Endo-F (GenBank Accession number: AAA24922.1), Endo-F 2 (GenBank Accession number: AAA24923.1), Endo-F3 (GenBank Accession number: AAA24924.1), Endo-CoM (GenBank Accession number: XP006673222.1), Endo-SB (GenBank Accession number: BBB35949.1) An amino acid sequence fragmented into specific functional sequences and a fragment having an amino acid sequence that may have specific mutations added.
  • Enzyme fragment having the function of Enzyme-B includes the catalytic activity domain of Enzyme-B described above, Endo-A (GenBank Accession number: AAD10851.1), Endo-CE (GenBank Accession number: BAB84821.
  • Endo-Tsp1006 (GenBank Accession number: CCY37287.1), Endo-Tsp1263 (GenBank Accession number: CDD88945.1), Endo-Tsp1457 (GenBank Accession n number: CDD89351.1), Endo-BB (GenBank Accession number: AAN25135.1), Endo-BH (GenBank Accession number: BAB04504.1), Endo-BN (GenBank Accession number: WP_007484749.1), Endo-CC1 (GenBank Accession nu mber: XP_001839402.1), Endo-CC2 (GenBank Accession number: XP_002911817.1), Endo-D (GenBank Accession number: AAK74656.1), Endo-Pm (GenBank Accession number: ADK97032.1), which is an amino acid sequence fragmented into a specific functional sequence, and A fragment having an amino acid sequence optionally with specific mutations can be mentioned.
  • Enzyme-A and Enzyme-B can be used as long as Enzyme-A and Enzyme-B play their respective roles.
  • Enzyme-A and Enzyme-B listed in the table below can be used.
  • Enzyme-A and Enzyme-B are fused, any combination of Enzyme-A and Enzyme-B can be used as long as they perform their respective roles. More specifically, for example, Enzyme-A is an Endo-Si mutant and Enzyme-B is an Endo-Rp mutant, for example, Enzyme-A is Endo-Si D241M/Q311L or Endo-Si D241Q/Q311L and Enzyme-B is Endo-Rp N172H or Endo-Rp N172V.
  • the fusion enzyme is a fusion protein of Endo-Rp N172H and Endo-Si D241M/Q311L, a fusion protein of Endo-Rp N172V and Endo-Si D241Q/Q311L, or Endo-Si D241Q /Q311L and Endo-Rp N172V, for example, [Enzyme-A]-[Enzyme-B] fusion protein enzyme, [Enzyme-B]-[Enzyme-A] fusion protein enzyme described in the table below can be done.
  • a fusion protein of Enzyme-A and Enzyme-B can be produced according to a conventional method with reference to non-patent literature (Joaquim, et al., Processes. 2022, 10, 494.). It can be produced by binding A and Enzyme-B to any solid-phase carrier through physical or chemical interaction.
  • non-patent literature F Grüninger-Leitch, et al., Protein Sci. 1996, 12, 2617-22, and Emily MK, et al., Protein Eng Des Sel. 2005, 10, 497-501
  • a fusion protein can be produced in a host cell by genetic engineering with reference to patent literature (WO2017137459) and the like.
  • Enzyme-A and Enzyme-B after the genes encoding Enzyme-A and Enzyme-B are linked, a single enzyme having functions derived from Enzyme-A and Enzyme-B can be produced in host cells by genetic engineering.
  • a fusion enzyme is produced in a host cell by genetic engineering in this way, there is no need to separately prepare Enzyme-A and Enzyme-B, and the number of enzymes to be prepared can be reduced, resulting in increased production costs of the enzyme and Labor can be reduced.
  • the linker in one aspect, is composed of one or more amino acids and is described in non-patent literature (Chen, et al., Adv Drug Deliv Rev 2013 October 15; 65(10): 1357-1369.), etc., those having typical properties known in the art can be used, flexible or rigid linkers, cleavable or cleavable Impossible linkers can be used, long or short linkers can be used.
  • the linker is (SGGS)n, (GGGS)n, (GGGGS)n, (G)n, (EAAAK)n, (EF)n, or (GGS)n, or a combination thereof, as an amino acid sequence fragment (n is an integer from 1 to 30, preferably an integer from 1 to 20, more preferably an integer from 1 to 10, more preferably an integer from 1 to 6).
  • the linker can contain amino acid sequences commonly used as purification tags, such as polyhistidine tag, HA tag, FLAG tag, CBD tag, Fc tag and GST tag.
  • the purification tag is polyhistidine tag, HA tag, FLAG tag, Fc tag, GST tag, preferably polyhistidine tag, HA tag, FLAG tag, CBD tag, more preferably polyhistidine tag, FLAG tag. and more preferably a polyhistidine tag.
  • step 1 an acceptor molecule, which is an Fc-containing molecule having a core GlcNAc to which fucose may be added as an N297-linked sugar chain, and a sugar chain donor molecule containing a sugar chain, are combined with Fc
  • the N297-linked sugar chain of the contained molecule is reacted in the presence of endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (enzyme-A) as a substrate to obtain a reaction mixture.
  • an acceptor molecule and a sugar chain donor molecule are transformed into enzyme-A and endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (enzyme-B) using the sugar chain of the sugar chain donor molecule as a substrate. It is a step of reacting in the presence to obtain a reaction mixture.
  • the reaction conditions of the step 1 are according to the reaction conditions of known transglycosylation reaction using GlcNAc with activated reducing end (eg GlcNAc with oxazolination) or non-activated GlcNAc as a sugar chain donor molecule. or by utilizing or applying reaction conditions for known transglycosylation reactions (eg, Patent Document 3).
  • the reaction in step 1 is preferably carried out in a buffer and under conditions that do not promote the degradation of the sugar chain donor molecule containing GlcNAc with or without activated reducing end.
  • the pH in the reaction system of step 1 is between 5.8 and 9.5. It is preferably in the range of 6.2 to 8.5, more preferably 6.5 to 8.0, still more preferably 6.5 to 7.5.
  • the pH in the reaction system in step 1 can be appropriately selected between 5.5 and 8.0, preferably 6.0.
  • the buffer is appropriately selected from phosphate buffer (pH 6.0 to 7.5), MOPS-NaOH buffer (pH 6.5 to 8.0), Tris-HCl buffer (pH 7.0 to 9.0), and the like. preferably Tris-HCl buffer (pH 7.0 to 9.0).
  • Additives that do not inhibit the enzymatic reaction may be added to the reaction solution for the purpose of stabilizing the enzyme.
  • the reaction temperature can be appropriately selected between 4°C and 50°C, preferably 15°C to 45°C, more preferably 20°C to 40°C, and even more preferably 25°C to 40°C.
  • the reaction time can be appropriately selected from 10 minutes to 96 hours, preferably 0.5 hours to 80 hours, more preferably 2 hours to 70 hours, still more preferably 4 hours to 60 hours, and particularly preferably is 6-48 hours, most preferably 8-30 hours.
  • a small amount of the reaction solution may be sampled over time to determine the completion of the reaction while confirming the progress of the transglycosylation reaction.
  • the degree of progress of the transglycosylation reaction is measured by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), capillary electrophoresis, microchip electrophoresis, fully automated electrophoresis system, or liquid chromatography mass spectrometry (LC- MS), etc., for example, after fragmenting a sugar chain remodeling antibody into heavy and light chains, using a fully automated electrophoresis system, the heavy chain side to which the N297-linked sugar chain is added. Only by confirming that the retention time changes can be monitored.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • capillary electrophoresis capillary electrophoresis
  • microchip electrophoresis microchip electrophoresis
  • LC- MS liquid chromatography mass spectrometry
  • step 1 the sugar chain of the sugar chain donor molecule is used as the N297-linked sugar chain as the acceptor molecule, and the core may be fucose-added. It can be performed as a one-pot method for direct transfer to antibodies with GlcNAc or Fc region-containing molecules thereof.
  • Step 1 requires Enzyme-A as well as Enzyme-B as described above.
  • 1.2 mg/mL to 16 mg/mL is 1.2 mg/mL to 16 mg/mL, more preferably 3 mg/mL to 14 mg/mL, still more preferably 4.2 mg/mL to 13.2 mg/mL, particularly preferably 6 mg/mL to 12 mg/mL. can be done.
  • the upper limit of the internal final acceptor molecule concentration is 200 mg/mL, preferably 160 mg/mL, more preferably 120 mg/mL, still more preferably 100 mg/mL, and particularly preferably 80 mg/mL. is 10 mg/mL, preferably 14 mg/mL, more preferably 18 mg/mL, and even more preferably 20 mg/mL, and the concentration range includes any of the upper and lower limits mentioned above. combination or 10 mg/mL to 200 mg/mL, preferably 14 mg/mL to 160 mg/mL, more preferably 18 mg/mL to 120 mg/mL, even more preferably 20 mg/mL to 100 mg/mL, particularly preferably 20 mg/mL ⁇ 80 mg/mL can include, but are not limited to.
  • the amount of sugar chain donor molecule to be added in step 1 can be appropriately set by using or applying a known method.
  • the addition amount of the sugar chain donor molecule affects the transglycosylation rate. It was common to use large amounts of sugar chain donor molecules (100-300 equivalents, US Pat.
  • an Fc-containing molecule to which a target sugar chain has been added and an unreacted Fc-containing molecule (acceptor molecule) are separated by cation exchange chromatography under acidic conditions.
  • the lower limit of the amount of the sugar chain donor molecule added (used) in step 1 is 2 equivalents, 3 equivalents, 4 equivalents, 5 equivalents, relative to 1 equivalent of the acceptor molecule.
  • the upper limit of the amount of the sugar chain donor molecule is 300 equivalents, 200 equivalents, 150 equivalents, 100 equivalents, 90 equivalents, 80 equivalents, 75 equivalents, 70 equivalents, 65 equivalents, 60 equivalents, 55 equivalents, 45 equivalents, and 40 equivalents. , 35 equivalents, 30 equivalents, 25 equivalents or 20 equivalents.
  • the range of the amount of the sugar chain donor molecule to be added (used) in step 1 is any combination of the upper and lower limits mentioned above, or 5 to 5 to 1 equivalent of the acceptor molecule. 80 equivalents, preferably 7 to 60 equivalents, more preferably 8 to 50 equivalents, and particularly preferably 10 to 40 equivalents can be used, but are not limited thereto.
  • an Fc-containing molecule to which a target sugar chain has been added and an unreacted Fc-containing molecule (acceptor molecule) can be separated by cation exchange chromatography under acidic conditions. Therefore, it is not necessary to extremely improve the efficiency of the transglycosylation reaction itself in step 1. Therefore, any numerical value can be set as the transglycosylation rate in step 1. For example, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, % or more, 90% or more, or 95% or more can be set. % or less, 75% or less, 70% or less, 65% or less, or 60% or less.
  • the transglycosylation rate in step 1 is above 80%, preferably above 85%, and particularly preferably above 90%.
  • the above-mentioned "glycan transfer rate" can be determined according to a conventional method, for example, using the fully automated electrophoresis system disclosed in Example 8.
  • the timing for measuring the transglycosylation rate varies depending on the enzyme used, but is 1 minute to 100 hours, preferably 1 hour to 80 hours, more preferably 2 hours to 72 hours.
  • the acceptor molecule used in step 1 can be prepared in a separate preparation method independent of step 1. Therefore, in one aspect of the invention, the method of the invention further comprises, prior to step 1, the step of separately preparing the acceptor molecule.
  • the acceptor molecule is, for example, an enzyme that is the same as or different from the enzyme-A used in step 1 (an enzyme that has the activity of transferring a sugar chain in a sugar chain donor molecule to an acceptor molecule), and an Fc-containing molecule as a raw material.
  • the transglycosylation reaction in step 1 can be prepared in an independent step by a method such as reacting with the Fc-containing molecule possessed).
  • the acceptor molecule is, for example, a 1,4-glycosidic bond (GlcNAc ⁇ 1- 4GlcNAc) can be prepared by treatment with ENGase that retains the activity of specifically hydrolyzing 4GlcNAc).
  • step 1 of the present invention includes embodiments in which the acceptor molecule is prepared in situ.
  • the manufacturing process is simplified since the step of separately preparing the acceptor molecule prior to step 1 can be omitted.
  • the simplification of the production process eliminates the need for the step of removing the ENGase used in the separate step, and further eliminates the need for treatment such as separating and purifying the relatively unstable acceptor molecule generated in the separate step. Very informative.
  • step 1 the Fc-containing molecule to be subjected to sugar chain modification (typically, an IgG-type monoclonal An antibody or an Fc-containing molecule such as CLCH consisting only of an Fc fragment of the antibody or a constant region) is added to the reaction system.
  • sugar chain modification typically, an IgG-type monoclonal An antibody or an Fc-containing molecule such as CLCH consisting only of an Fc fragment of the antibody or a constant region
  • the N297-linked sugar chain of the Fc-containing molecule to be input as such a raw material is not particularly limited as long as it is different from the sugar chain derived from the target sugar chain donor molecule, but typically , a host cell-derived N297-linked sugar chain, a heterogeneous N297-linked sugar chain, or a heterogeneous N297-linked sugar chain derived from the host cell used in producing the Fc-containing molecule.
  • the acceptor molecule is generated in situ, it is not isolated or purified, so it is as if the N297-linked sugar chain of the Fc-containing molecule input as a raw material is transformed into a sugar chain derived from a sugar chain donor molecule in one step. appears to have been directly replaced by Therefore, in the present specification, such an aspect is appropriately referred to as "direct exchange reaction of N297-linked sugar chain".
  • sugar chain donor molecules in which the reducing end of the sugar chain is activated.
  • sugar chain donor molecules in which the reducing end of the sugar chain is activated.
  • a sugar chain whose reducing end is activated for example, a sugar chain whose reducing end is oxazolated
  • the sugar chain is rapidly hydrolyzed in water, resulting in decreased reactivity with antibodies. Therefore, in the direct exchange reaction of N297-linked sugar chains, it is recommended to use a sugar chain donor molecule in which the reducing end of the sugar chain is not activated. is preferred.
  • the sugar chain donor molecule used in the direct exchange reaction of the N297-linked sugar chain is a sugar chain donor molecule in which the reducing end of the sugar chain is not activated.
  • the sugar chain donor molecule used in step 1 has a sugar chain whose reducing end has not been activated. It is a sugar chain donor molecule.
  • Such a sugar chain donor molecule is not limited, and examples thereof include novel sugar chain donor molecules specifically disclosed in the chapter ⁇ Novel sugar chain donor molecule>.
  • Fc-containing molecule -[SG] 2 is obtained, and G-4, G-13, G-14, or G-16 is selected as the sugar chain donor molecule.
  • Fc-containing molecule -[X-MSG1] 2 is obtained, and further, G-3, G-6, G-7, G-8, G-9, G-10, G- If we choose 11, G-12, or G-15, we get the Fc-containing molecule -[X-SG] 2 .
  • an enzyme with stronger hydrolytic activity for N297-linked sugar chains in order to generate acceptor molecules in a short time and complete the reaction in a short time while avoiding hydrolysis of activated sugar chains (e.g., oxazoline sugar chains) -A is preferably used.
  • non-patent literature Xiao Zhang, et al., ACS Chem Biol. 2021, 11, 2502-25114
  • patent literature WO2022226420
  • reaction temperature in the direct exchange reaction of the N297-linked sugar chain is as described above. is preferably set.
  • step 2 the reaction mixture obtained in step 1 is brought into contact with a cation exchange chromatography medium or a multimode chromatography medium under acidic conditions to obtain a sugar derived from a sugar chain donor molecule.
  • a step of recovering Fc-containing molecules having N297-linked sugar chains containing chains preferably by contacting the reaction mixture obtained in step 1 with a cation exchange chromatography medium or a multimode chromatography medium under acidic conditions. to isolate and recover Fc-containing molecules having N297-linked sugar chains containing sugar chains derived from sugar chain donor molecules contained in the reaction mixture from partially or wholly unreacted Fc-containing molecules (acceptor molecules) It is a process to do.
  • step 2 the reaction mixture obtained in step 1 is used as the loading liquid as it is, or a buffer is added to the reaction mixture as appropriate to prepare a loading liquid, and the loading liquid is prepared.
  • a cation exchange chromatography medium or multimode chromatography medium under acidic conditions, the unreacted acceptor molecule is selectively adsorbed on the medium, while the sugar derived from the sugar chain donor molecule is absorbed. It is a step of selectively recovering the Fc-containing molecules by recovering the flow-through containing the Fc-containing molecules having N297-linked sugar chains containing chains.
  • step 2 the Fc-containing molecule to which the target sugar chain is added and the unreacted Fc-containing molecule (acceptor molecule) can be separated. Even when only the chain donor molecule is used, it is possible to produce Fc-containing molecules with high purity and uniform sugar chain structures.
  • step 2 in order to produce Fc-containing molecules having a sugar chain structure with a high glycosylation rate while suppressing the amount of the sugar chain donor molecule used in step 1, step 2 has high selectivity and recovery. must have a rate.
  • the target Fc-containing molecule to which the sugar chain is added cannot be isolated from the unreacted Fc-containing molecule (acceptor molecule), so that the glycosylation rate cannot be increased.
  • the recovery rate is low, it is necessary to increase the amount of the acceptor molecule charged in step 1 in order to increase the yield of the Fc-containing molecule. is not obtained.
  • the present invention is applied as a method for producing an antibody for medical use on an industrial scale, it is necessary to be able to efficiently isolate the target antibody in step 2 while maintaining the desired biological activity.
  • capillary gel electrophoresis is used as an analytical method for detecting non-glycosylated antibodies (without core GlcNAc) contained in antibodies to which N297-linked sugar chains are added.
  • -SDS capillary gel electrophoresis
  • the method can isolate fragmented antibody heavy chains according to the hydrodynamic size of the molecule under reducing conditions, while the antibody denatures and loses its biological activity during pretreatment.
  • the processing capacity is limited to about several hundred ⁇ g.
  • HILIC hydrophilic interaction chromatography
  • This method does not require antibody fragmentation and can separate antibodies with N297-linked glycans and antibodies with core GlcNAc, while the antibodies are denatured by heating and exposure to organic solvents, resulting in loss of biological activity.
  • This method can separate antibodies with N297-linked sugar chains and antibodies with core GlcNAc without denaturing the antibodies.
  • the throughput is limited to about several hundred ⁇ g, and there are drawbacks that satisfactory yields cannot be obtained. Therefore, prior to the present invention, no method for isolating antibodies with or without glycosylation that can be applied to isolation and purification purposes on an industrial scale has been reported.
  • the present inventors have found that the reaction mixture is brought into contact with a cation exchange chromatographic medium or a multimode chromatographic medium under acidic conditions in a very simple manner.
  • the present inventors have found that Fc-containing molecules to which sugar chains have been added can be selectively isolated and purified at high yields without denaturation.
  • Step 2 can be carried out according to a conventional method in cation exchange chromatography or multimode chromatography.
  • the reaction mixture obtained in step 1 is mixed with an acidic buffer solution to obtain a load solution, and the load solution is applied to a column packed with a cation exchange chromatography medium or a multimode chromatography medium.
  • the equilibration solution or washing solution
  • the elution solution or regeneration solution
  • Molecules specifically adsorbed to the column can be eluted.
  • a cleaning liquid can then optionally be run through for cleaning-in-place purposes.
  • step 2 cation exchange chromatography or multimode chromatography is performed under acidic conditions.
  • the loading solution (or loading solution and equilibration solution) in step 2 has an acidic pH.
  • any acidic pH ⁇ 7.0
  • any pH selected from 8, 3.7, 3.6 and 3.5 can be employed.
  • the pH range in the "acidic conditions" is any combination of the upper and lower limits mentioned above, or 2.5 to 5.0.
  • the acidic conditions in step 2 are pH 2.5-5.0, preferably pH 3.0-4.8, more preferably pH 3.3-4.7, particularly preferably pH 3.0-4.7. It means a range of pH 4-4.6, most preferably pH 3.5-4.5.
  • the reaction mixture obtained in step 1 can be used as the loading liquid for passing through the column as it is, or the loading liquid can be prepared by adding a buffer solution to the reaction mixture as appropriate.
  • a buffer for preparing the loading solution any buffer can be used as long as the loading solution has an acidic pH.
  • acetate buffer, citrate buffer, phosphate buffer, glycine Buffers, phthalate buffers can be mentioned.
  • the salt concentration can be adjusted to the desired level.
  • Salts for preparing the loading solution are not particularly limited as long as the desired isolation can be achieved, but examples include sodium chloride, potassium chloride, and magnesium chloride.
  • the salt concentration is, for example, 30 to 2000 mM, preferably 150 to 1000 mM, more preferably 200 to 750 mM, still more preferably 280 to 600 mM, particularly preferably 310 to 500 mM.
  • the salt concentration in the loading liquid affects the yield and purity of the final target product, and the optimum salt concentration depends on the target product and the type of cation exchange chromatography medium or multimode chromatography medium. Depending on the given chromatographic environment, it is preferred to employ the optimum salt concentration, as it will vary.
  • the concentration of the Fc-containing molecule in the loading liquid is not particularly limited as long as the desired isolation can be achieved. 5 to 30 mg/mL, more preferably 2 to 20 mg/mL, and particularly preferably 3 to 10 mg/mL. Also, the volume of the load liquid itself to be passed through the medium can be appropriately determined according to the volume of the medium, etc., according to a conventional method.
  • the pH and salt concentration in the medium are equilibrated before isolation, and the molecules adsorbed to the medium are non-specifically adsorbed to the medium without being substantially isolated. Anything that can wash away molecules can be used.
  • the flow rate of the equilibration solution can be appropriately determined according to the volume of the medium, etc., according to a conventional method. Preferably 10 to 30 CV, particularly preferably 12 to 20 CV, but not limited to these.
  • the eluent and the cleaning liquid can be appropriately determined according to known methods or by applying known methods.
  • any numerical value can be set as the sugar chain transfer rate after the end of step 2, for example, 85% or more, 90% or more, or 95% or more can be set.
  • the transglycosylation rate in step 2 is above 90%, preferably above 95%, and particularly preferably above 99%.
  • an arbitrary value can be set as the step yield of step 2, but as described above, the amount of sugar chain donor molecules used in step 1 can be reduced as the step yield of step 2 is increased, so a higher step yield is desirable.
  • the step yield is not particularly limited, for example, 1 to 99%, preferably 5 to 95%, more preferably 20 to 95%, particularly preferably 40 to 90%. can be mentioned.
  • a cation exchange chromatography medium means a medium having cation exchange groups.
  • the cation exchange chromatography medium is a medium of strong or weak acid type and/or contains sulfonic acid groups, carboxyl groups, phenolic hydroxyl groups, phosphonic acid groups as cation exchange groups. or phosphinic acid groups.
  • Specific ion-exchange chromatography media may be in the form of particles, membranes, monoliths, plates, chips, fibers, or the like. shape, membrane shape, monolith shape, and the like, but are not limited to these.
  • SP sepharose FF (Cytiva), SOURCE 15S (Cytiva), Capto S Impact (Cytiva), Eshmuno CP-FT (Merck), Exhmuno CPX (Merck), POROS HS (Thermo) , POROS XS (Thermo), Nuvia HR-S (BiO-RAD), Cellufine Max GS (JNC), etc., but are not limited to these.
  • Membrane-like cation exchange chromatography media include, but are not limited to, Sartobind S (Sartorius), Mustang S (Pall), and the like.
  • monolithic cation exchange chromatography media examples include, but are not limited to, CIM monolith SO3 (BIA Separation).
  • the cation exchange chromatography in step 2 can be performed using known equipment, such as AKTA Avant 25 (Cytiva), but not limited thereto. Also, the flow rate of the mobile phase in the cation exchange chromatography in step 2 can be appropriately determined according to a conventional method.
  • the multimode chromatography medium includes at least one functional group capable of acting differently from the cation exchange group and the cation exchange group, and in one embodiment, the functional group capable of acting differently from the cation exchange group is It is a functional group capable of hydrophobic interaction.
  • Cation exchange groups include those similar to those mentioned for cation exchange chromatography media.
  • Forms of multimode chromatographic media also include those similar to those mentioned for cation exchange chromatographic media.
  • Multimode chromatographic media include, but are not limited to, Capto(TM) MMC and TOYOPEARL(TM) MX-TRP-650M.
  • Multimode chromatography in step 2 can be performed using known equipment.
  • the flow rate of the mobile phase in multimode chromatography in step 2 can be appropriately determined according to a conventional method.
  • the Fc-containing molecules obtained via steps 1 and 2 of the present invention can be further chemically or biochemically modified.
  • a sugar chain donor molecule having a substituent having an azide group (N 3 —), for example, a polyethylene glycol linker (L(PEG)) having N 3 is used in the portion X in the structural formula of the sugar chain donor molecule described above.
  • Fc-containing molecules having an azide group at the non-reducing end of the sugar chain such as N297-(Fuc)SG-L(PEG) 2 and N297-(Fuc)MSG1-L ( PEG) or N297-(Fuc)MSG2-L(PEG).
  • L (PEG) is bound to the carbonyl group attached to the 2-position of the sialic acid at the non-reducing end of both the 1-3 chain side and the 1-6 chain side of the branched chain of ⁇ -Man.
  • L(PEG) is a linker structure that contains an ethylene glycol structure and may contain other binding structures and/or modified structures.
  • L (PEG) represents binding to the carbonyl group attached to the 2-position of the non-reducing terminal sialic acid on the 1-3 chain side of the ⁇ -Man branched chain.
  • L (PEG) is It is a linker structure that contains an ethylene glycol structure and may contain other binding structures and/or modified structures.
  • L (PEG) represents binding to the carbonyl group attached to the 2-position of the non-reducing terminal sialic acid on the 1-6 chain side of the ⁇ -Man branched chain.
  • L (PEG) is , is a linker structure that contains an ethylene glycol structure and may contain other binding structures and/or modified structures.
  • the azide group (N 3 —) forms a 1,2,3-triazole ring (SPAAC (strain-promoted alkyne azide cycloaddition: Agard NJ, et al., J Am Chem Soc. N 3 —), or the sugar chain itself derived from the sugar chain donor molecule does not have an azide group, but after step 1 or step 2,
  • SPAAC strain-promoted alkyne azide cycloaddition: Agard NJ, et al., J Am Chem Soc. N 3 —
  • the production method according to the present invention further comprises reacting the azide group ( N -) of the sugar chain with a molecule having an alkyne structure.
  • step 1 and step 2 the Fc-containing molecule bound to a molecule having an alkyne structure are sometimes referred to as a "conjugate".
  • step 1 and step 2 An Fc-containing molecule obtained via step 2, which is conjugated with another molecule by a reaction other than SPAAC, may also be referred to as a "conjugate.”
  • Molecules having an alkyne structure include, for example, molecules having a (hetero)cycloalkynyl group and having desired activity, preferably pharmaceutically active compounds (e.g., chemotherapeutic agents, Molecularly targeted drugs, immunostimulants (e.g., STING agonists (WO2020/050406, WO2014/099824, WO2014/179335, WO2014/189805, WO2014/189806, WO2015/074145, WO2015/185565, WO20 16/096714, WO2016/012305, WO2016/145102, WO2017/027646, WO2017/027645, WO2017/075477, WO2017/093933, WO2017/100305, WO2017/123669, WO2017/161349, WO2017/17 5147, WO2017/175156, WO2018/009466, WO2018/045204, WO2018/ WO2018/067423, WO2018/0
  • Chemotherapeutic agents or toxins include camptothecin (eg, WO2014/057687), pyrrolo Benzodiazepines (e.g. WO2013/173496, WO2014/130879, WO2017/004330, WO2017/004025, WO2017/020972, WO2016/036804, WO2015/095124, WO2015/052322, WO 2015/052534, WO2016/011519, WO2015/052321, WO2015/ 031693, WO2011/130613, WO2019/065964), doxorubicin, auristatins, taxanes or derivatives thereof, but are not limited thereto.
  • camptothecin eg, WO2014/057687
  • pyrrolo Benzodiazepines e.g. WO2013/173496, WO2014/130879, WO2017/004330, WO2017/004025, WO2017/020972,
  • immunostimulatory agents include, but are not limited to, STING agonists, TLR agonists, and A2AR antagonists.
  • the molecule having an alkyne structure preferably includes molecules selected from the group consisting of (A) to (E) below: (A) N-[4-(11,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6H)-yl)-4-oxobutanoyl]glycylglycyl-L-valyl-N- ⁇ 4-[( ⁇ [(11′S,11a′S)-11′-hydroxy-7′-methoxy-8′-[(5- ⁇ [(11aS)-7-methoxy-2-(4-methoxyphenyl)-5- oxo-5,10,11,11a-tetrahydro-1H-pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-yl]oxy ⁇ pentyl)oxy]-5′-oxo-11′,
  • Fc-containing molecules produced by the production methods described above are also within the scope of the present invention. Accordingly, the present invention, in one aspect thereof, encompasses Fc-containing molecules produced by the production methods described above.
  • a glycoprotein having a desired sugar chain (particularly, an Fc-containing molecule having an N297-linked sugar chain) and a glycoprotein having no sugar chain discovered by the present inventors were subjected to a positive reaction under acidic conditions.
  • the finding that separation by ion-exchange chromatography or multimode chromatography is possible can be applied to the use of simply isolating target glycoproteins independently of the production methods described above.
  • a method for isolating a glycoprotein comprising: contacting a cation exchange chromatographic medium or multimode chromatographic medium under acidic conditions to selectively trap impurities in the cation exchange chromatographic medium or multimode chromatographic medium.
  • the isolation method comprises contacting a solution comprising said glycoprotein (Fc-containing molecule) and one or more impurities with a cation exchange chromatography medium or a multimode chromatography medium under acidic conditions.
  • a glycoprotein having a desired sugar chain N297-linked sugar
  • An isolation method comprising the step of selectively recovering the glycoprotein (Fc-containing molecule) by recovering a flow-through containing the Fc-containing molecule having a chain.
  • the glycoprotein is an Fc-containing molecule, typically an Fc-containing molecule having an N297-linked sugar chain.
  • the N297-linked sugar chain may be a high-mannose sugar chain, a hybrid sugar chain, or a complex sugar chain, but is preferably a complex sugar chain. Therefore, in one aspect of the present invention, the N297-linked sugar chain is a complex-type sugar chain.
  • impurities to be separated from a glycoprotein having an intended sugar chain typically include the target glycoprotein (Fc-containing molecule) , has the same structure as a glycoprotein (Fc-containing molecule), except that the structure of the sugar chain (e.g., N297-linked sugar chain) is different or lacks the sugar chain (e.g., N297-linked sugar chain) Molecules can be mentioned.
  • the one or more impurities include molecules identical to the Fc-containing molecules except that they have a core GlcNAc optionally fucose-added as an N297-linked glycan.
  • the isolation method according to the present invention is basically the same as step 2 of the production method according to the present invention, except that it does not necessarily have to be incorporated as one step in the method for producing Fc-containing molecules. . Therefore, what has been mentioned with respect to step 2 above also applies as is when carrying out the isolation method according to the present invention.
  • the isolation method according to the present invention can be combined with the desired transglycosylation reaction. Accordingly, in one aspect of the present invention, there is provided a method for isolating Fc-containing molecules having N297-linked sugar chains containing sugar chains derived from sugar chain donor molecules, comprising steps 1 and 2 below.
  • An acceptor molecule which is an Fc-containing molecule having a core GlcNAc to which fucose may be added as an N297-linked sugar chain, and a sugar chain donor molecule containing a sugar chain are combined with the N297-linked sugar chain of the Fc-containing molecule.
  • Step 2 a step of reacting in the presence of endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (enzyme-A) as a substrate to obtain a reaction mixture;
  • the reaction mixture is brought into contact with a cation exchange chromatography medium or multimode chromatography medium under acidic conditions to obtain an Fc-containing molecule having an N297-linked sugar chain containing a sugar chain derived from a sugar chain donor molecule.
  • a step of isolating, recovering or isolating and recovering. Steps 1 and 2 in the isolation method are the same as steps 1 and 2 in the production method according to the present invention described above. Therefore, what has been mentioned with respect to steps 1 and 2 above also applies to carrying out the isolation method.
  • a novel sugar chain donor molecule represented by a formula selected from the group consisting of is provided. As will be specifically described in the examples below, it has been demonstrated that these novel sugar chain donor molecules can be suitably used in the production method according to the present invention. It can be expected that it can also be used for transfer reaction).
  • compatibility of each sugar chain donor molecule with the combination of Enzyme-A and Enzyme-B to be used is checked with reference to the test results in Examples. It is preferable to take this into account and decide as appropriate.
  • Step 1 An acceptor molecule, which is an Fc-containing molecule having a core GlcNAc to which fucose may be added as an N297-linked sugar chain, and a sugar chain donor molecule containing a sugar chain are combined with the N297-linked sugar chain of the Fc-containing molecule.
  • a method for producing an antibody-immunostimulatory agent conjugate comprising the step of combining a cyclic dinucleotide (CDN) conjugate precursor represented by a cycloaddition reaction.
  • CDN cyclic dinucleotide
  • Step 3 is shown by the following schematic diagram.
  • the antibody-immunostimulatory agent conjugate (Rp, Rp-XIII) combines the Fc-containing molecule (3) obtained in step 2 with the CDN conjugate precursor (Rp, Rp-XII) by cycloaddition reaction. , can be manufactured.
  • CDN conjugate precursors (Rp, Rp-XII) can be prepared with reference to WO2020/050406, WO2021/177438, or WO2022/163846.
  • the cycloaddition reaction includes, for example, the Diels-Alder reaction and 1,3-dipolar cycloaddition reaction, and the 1,3-dipolar cycloaddition reaction is preferably used for production.
  • step 3 comprises combining the Fc-containing molecule (3) obtained in step 2 with the CDN conjugate precursor (Rp, Rp-XII) by SPAAC reaction.
  • step 3 The SPAAC reaction in step 3 is described below.
  • a buffer solution (phosphate buffer, acetate buffer, borate buffer, etc.) of the Fc-containing molecule (3) obtained in step 2 and the CDN conjugate precursor (Rp, Rp-XII) are combined in an appropriate solvent ( dimethylsulfoxide, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, propylene glycol, or a mixed solvent thereof), the SPAAC reaction can be carried out.
  • an appropriate solvent dimethylsulfoxide, N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, propylene glycol, or a mixed solvent thereof
  • the CDN conjugate precursor (Rp, Rp-XII) is 2 mol to excess mol, preferably 4 mol to 30 mol, relative to 1 mol of the Fc-containing molecule (3), and the ratio of the organic solvent is the Fc-containing Preferred is 1% to 200% (v/v) to the buffered solution of molecule (3).
  • the reaction temperature is 0° C. to 37° C., preferably 15° C. to 25° C., and the reaction time is 1 hour to 150 hours, preferably 6 hours to 72 hours.
  • the pH of the reaction solution is preferably 5 to 9.
  • the reaction solution can be isolated according to the method described in Common Procedure D below to obtain the antibody-immunostimulatory agent conjugate (Rp, Rp-XIII).
  • the antibody-immunostimulant conjugate is subjected to buffer exchange, isolation, measurement of the antibody concentration, and measurement of the average binding number of the immunostimulator per antibody molecule by common operations D to G described below, and the antibody-immunostimulatory Identification of agent conjugates can be performed.
  • Antibody concentration can be measured using a UV measuring device (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific, Inc.) according to the method specified by the manufacturer. At that time, a different 280 nm extinction coefficient (1.3 mL mg ⁇ 1 cm ⁇ 1 to 1.8 mL mg ⁇ 1 cm ⁇ 1 ) is used for each antibody.
  • Common Procedure C Antibody Buffer Exchange A buffer solution (phosphate buffered saline (pH 6.0), phosphate buffer (pH 6.0), etc.) is added to the aqueous antibody solution, and concentrated according to the method described in Common Procedure A. . After performing this operation several times, the antibody concentration is measured according to the method described in common operation B. To this antibody buffer solution, an appropriate buffer (phosphate buffered saline (pH 6.0), phosphate buffer (pH 6.0), etc.) is added to obtain the desired concentration (e.g., about 10 mg/mL) of the antibody. A buffer solution can be prepared.
  • Common operation E measurement of antibody concentration in antibody-immunostimulant conjugate and average binding number of immunostimulant per antibody molecule (UV method)
  • the binding immunostimulant concentration in the antibody-immunostimulatory agent conjugate is measured using an absorption photometer (UV/VIS Spectrometer Lambda 25, PerkinElmer, Inc.) according to the methods described in WO2020/050406 and WO2021/177438. can be calculated by measuring the absorbance of the antibody-immunostimulatory agent conjugate aqueous solution at two wavelengths of 280 nm and 250 nm.
  • Common operation F antibody concentration in the antibody-immunostimulant conjugate and measurement of the average binding number of the immunostimulator per antibody molecule (reversed-phase high-performance liquid chromatography method: RP-HPLC)
  • the antibody concentration in the antibody-immunostimulatory agent conjugate and the average binding number of the immunostimulatory agent per antibody molecule are high-speed liquid according to the methods described in WO2020/050406 and WO2021/177438. It can be determined by chromatographic analysis.
  • Common operation G antibody concentration in the antibody-immunostimulant conjugate and measurement of the average binding number of immunostimulators per antibody molecule (hydrophobic interaction-high performance liquid chromatography method: HI-HPLC)
  • the antibody concentration in the antibody-immunostimulatory agent conjugate and the average binding number of the immunostimulatory agent per antibody molecule are, in addition to the above-described common operations E and F, according to the methods described in WO2020/050406 and WO2021/177438. It can be determined by high performance liquid chromatography analysis.
  • an antibody-immunostimulatory agent conjugate produced by the production method described above is also within the scope of the present invention. Accordingly, the present invention, in one aspect thereof, encompasses an antibody-immunostimulatory agent conjugate produced by the method of production described above.
  • Antibody-immunostimulatory agent conjugates produced by the methods of the present invention may include stereoisomers or optical isomers derived from an asymmetric carbon atom, geometric isomers, tautomers or d-, l-, atropic isomers. Although optical isomers such as isomers may exist, all of these isomers, optical isomers and mixtures thereof are included in the present invention.
  • the binding number of the immunostimulatory agent to one antibody molecule is an important factor affecting its efficacy and safety.
  • the production of antibody-immunostimulatory agent conjugates is carried out by defining the reaction conditions such as the amounts of raw materials and reagents to be reacted so that the number of bonds of the immunostimulatory agent is constant. Unlike chemical reactions of compounds, it is usually obtained as a mixture in which different numbers of immunostimulatory agents are attached.
  • steps 1 and 2 Fc-containing molecules having a uniform sugar chain structure of high purity can be produced.
  • - Immunostimulatory agent conjugates can be obtained in high purity.
  • the binding number of an immunostimulatory agent to one antibody molecule can be specified as an average value, ie, the average number of immunostimulatory agent binding (DAR: Drug to Antibody Ratio).
  • the binding number of the cyclic dinucleotide derivative to the antibody molecule can be controlled, and the average binding number of the immunostimulatory agent per antibody can range from 1 to 4 cyclic dinucleotide derivatives, but preferably It is 2 to 4, more preferably 3 to 4, still more preferably 3.2 to 4, particularly preferably 3.5 to 4.
  • immunostimulation per antibody is performed in the same manner as the above method except that G-14 is used instead of G-10 as the sugar chain donor molecule of the above [Step 1].
  • a method for producing an antibody-immunostimulatory agent conjugate having an average number of agent attachments ranging from 1 to 3 cyclic dinucleotide derivatives is provided.
  • the Fc-containing molecule obtained in step 2 has the structure shown by (3') below instead of (3).
  • the binding number of the cyclic dinucleotide derivative to the antibody molecule can be controlled, and the average binding number of the immunostimulatory agent per antibody is preferably 1.0 to 2.5, more preferably 1.2 to 2.2 range.
  • the antibody-immunostimulatory agent conjugate produced by the method of the present invention may absorb water, attach adsorbed water, or become a hydrate when left in the atmosphere or recrystallized. Yes, and such water-containing compounds and salts are also included in the present invention.
  • the antibody-immunostimulatory agent conjugate produced by the method of the present invention has a basic group such as an amino group, it can be made into a pharmaceutically acceptable salt if desired.
  • salts include hydrohalides such as hydrochloride and hydroiodide; inorganic acid salts such as nitrates, perchlorates, sulfates and phosphates; methanesulfonates and trifluoromethanesulfones; arylsulfonates such as benzenesulfonate and p-toluenesulfonate; formic acid, acetic acid, malic acid, fumarate, succinate, citric acid organic acid salts such as acid salts, tartrates, oxalates and maleates; and amino acid salts such as ornithates, glutamates and aspartates.
  • the antibody-immunostimulatory agent conjugate produced by the method of the present invention contains a phosphate group and/or a thiophosphate group in its structure, it is generally capable of forming a base addition salt.
  • Pharmaceutically acceptable salts include, for example, sodium salts, potassium salts, alkali metal salts such as lithium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts; inorganic salts such as ammonium salts; , morpholine salt, phenylglycine alkyl ester salt, ethylenediamine salt, N-methylglucamine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, tert-butylamine salt, cyclohexylamine salt, dicyclohexylamine salt, N,N'-dibenzylethylenediamine salt, diethanolamine salts, organic amine salts such as N-benzyl-N-(2-phenylethoxy)amine salts, piperazine salts,
  • the antibody-immunostimulatory agent conjugate produced by the method of the present invention may exist as a hydrate due to absorption of moisture in the air.
  • the solvate of the present invention is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable. Specifically, hydrates, ethanolates, 2-propanolates and the like are preferred.
  • a nitrogen atom is present in the antibody-immunostimulatory agent conjugate of the present invention, it may be in the form of an N-oxide, and these solvates and N-oxides are also included in the scope of the present invention.
  • the antibody-immunostimulatory agent conjugate of the present invention has a sulfur atom, it may be in a sulfoxide form, and these solvates and sulfoxide forms are also included in the scope of the present invention.
  • Antibody-immunostimulatory agent conjugates produced by the method of the present invention also include compounds labeled with various radioactive or non-radioactive isotopes.
  • One or more of the atoms comprising the antibody-immunostimulatory agent conjugates produced by the methods of the invention may also contain non-natural proportions of atomic isotopes.
  • Atomic isotopes include, for example, deuterium (2H), tritium (3H), iodine-125 (125I), carbon-14 (14C), and the like.
  • Antibody-immunostimulatory agent conjugates produced by the methods of the invention may also be radiolabeled with a radioisotope such as tritium (3H), iodine-125 (125I) or carbon-14 (14C). obtain. Radiolabeled compounds are useful as therapeutic or prophylactic agents, research reagents, eg, assay reagents, and diagnostic agents, eg, in vivo imaging agents. All isotopic variants of the antibody-immunostimulatory agent conjugates of the invention, whether radioactive or not, are included within the scope of the invention.
  • a radioisotope such as tritium (3H), iodine-125 (125I) or carbon-14 (14C).
  • Radiolabeled compounds are useful as therapeutic or prophylactic agents, research reagents, eg, assay reagents, and diagnostic agents, eg, in vivo imaging agents. All isotopic variants of the antibody-immunostimulatory agent conjugates of the invention,
  • a fusion protein of Enzyme-A and Enzyme-B is provided.
  • a fusion protein of Enzyme-A and Enzyme-B means a protein in which Enzyme-A and Enzyme-B are bound directly or indirectly.
  • the fusion protein of Enzyme-A and Enzyme-B is an immobilized enzyme in which both Enzyme-A and Enzyme-B are immobilized on any solid phase carrier
  • the fusion protein of Enzyme-A and Enzyme-B is a fusion protein in which Enzyme-A and Enzyme-B are directly linked, or any linker such as any amino acid, a polymer such as PEG, A fusion protein that is preferably linked via an amino acid linker, such as an oligomeric linker.
  • Enzyme-A and Enzyme-B used in the fusion protein of Enzyme-A and Enzyme-B any combination can be used as long as they play their respective roles.
  • [enzyme-A]-[enzyme-B] fusion protein enzymes and [enzyme-B]-[enzyme-A] fusion protein enzymes described in the table below can be mentioned.
  • the fusion protein of Enzyme-A and Enzyme-B when used in the production of Fc-containing molecules, can bring advantages such as reducing the number of enzymes to be prepared and prepared in the production process, which is the advantage of the present invention. It is an advantage obtained independently of step 2.
  • step 1' an acceptor molecule that is an Fc-containing molecule having a core GlcNAc optionally fucose-added as an N297-linked sugar chain, and a sugar chain donor molecule containing a sugar chain endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (enzyme-A) whose substrate is the N297-linked sugar chain of the Fc-containing molecule and endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (enzyme-A) whose substrate is the sugar chain of the sugar chain donor molecule
  • a method for producing an Fc-containing molecule having an N297-linked sugar chain containing a sugar chain derived from a sugar chain donor molecule comprising the step of B) reacting in the presence of the fusion protein to obtain a reaction mixture.
  • step 1' For the acceptor molecule, the sugar chain donor molecule, and the reaction conditions used in the step 1', the same as described for the step 1 above can be applied as they are. In addition, a higher transglycosylation rate can be achieved by following step 1' with step 2.
  • SGP sialylglycopeptide
  • SGP sialylglycopeptide
  • AG(9)-P in the examples can be prepared by the method described in Step 1-17A of Example 1-17 of WO2014115797.
  • AG(7)-P in the examples can be prepared by the method described in Step 1-17B of Example 1-17 of WO2014115797.
  • ([N 3 -PEG(3)] 2 -SG)-Asn-PEG(3)-N 3 in the examples can be prepared by the method described in Example 1-12, step 1-12A of WO2018003983.
  • ([N 3 -PEG(3)]-MSG1)-Asn-PEG(3)-N 3 , ([N 3 -PEG(3)]-MSG2)-Asn-PEG(3)-N in the examples 3 can be made by the method described in step 3 of Example 154 of WO2019065964.
  • mAb1 in the examples indicates Trastuzumab.
  • (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc-mAb1 represents a sugar chain hydrolyzate of Trastuzumab that can be prepared by the method described in Example 3 of WO2017010559.
  • mAb2 in the examples refers to antibodies that can be made with the methods described in Example 136 of WO2019065964 and SEQ ID NOs: 36 and 52 within WO2019065964.
  • (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc-mAb2 indicates a sugar chain hydrolyzate (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc-anti-CLDN6 antibody (H1L1) that can be prepared by the method described in Step 1 of Example 61 of WO2019065964.
  • mAb2-[MSG1-N 3 ] 2 indicates anti-CLDN6 antibody (H1L1)-[MSG1-N 3 ] 2 that can be produced by the method described in step 2 of Example 61 of WO2019065964.
  • mAb3 in the examples represents modified HER2 antibody 2 that can be produced by the method described in Reference Example 5 of WO2020050406 and SEQ ID NOs: 28 and 30 in WO2020050406.
  • (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc-mAb3 represents sugar chain hydrolyzate (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc-modified anti-HER2 antibody 2 that can be prepared by the method described in step 1 of Example 85 of WO2020050406.
  • mAb3-[SG-N 3 ] 2 indicates modified anti-HER2 antibody-[MSG1-N 3 ] 2 that can be produced by the method described in step 2 of Example 85 of WO2020050406.
  • the progress of glycan hydrolysis and transglycosylation was confirmed using protein gel electrophoresis (WO2013/120066, Huang W, et al., J Am Chem Soc. 2012, 134, 12308-12318).
  • LabChip GX II manufactured by PerkinElmer
  • Protein Express Assay LabChip and Protein Express Reagent Kit manufactured by PerkinElmer
  • Enzyme-A is an enzyme having a domain with affinity for Fc-containing molecules, a domain with affinity for sugar chains, and a glycosylation catalytic domain
  • Enzyme-B is Enzyme-A is an enzyme that activates from a fucose-free biantennary sugar chain donor molecule to a state (activated intermediate) that can be used for a sugar chain transfer reaction to an Fc-containing molecule (the following schematic diagram or See Figure 1).
  • Enzyme-A and Enzyme-B are listed in Table Y- below. Designed for 1. Enzyme species are not limited as long as Enzyme-A and Enzyme-B play their respective roles, and desired transglycosylation can be obtained by combining them arbitrarily.
  • Enzyme-A although the hydrolytic activity remains, a representative example of the Endo-S mutant that can be expected to have a suppressed hydrolytic activity compared to the corresponding wild-type enzyme, Endo-S2 mutation A representative example of the body and a representative example of Endo-Si mutants were selected.
  • Enzyme-B Since the glycosylation activity of Enzyme-B itself is considered to be correlated with its ability to activate a sugar chain donor, a representative example of Enzyme-B is SGP, a biantennary sugar chain donor molecule that does not have fucose.
  • SGP a biantennary sugar chain donor molecule that does not have fucose.
  • X on sialic acid represents an arbitrary substituent containing a hydrogen atom.
  • X is PEG-azide.
  • Z at the sugar chain reducing end is an arbitrary substituent, preferably represented by NHR or OR bonded via a nitrogen atom or an oxygen atom.
  • R can be PMP, Me, A-Mor, iPr, nPr, PrOMe and A-PEG-N 3 (A is the acetyl group in the glycolic acid unit, i.e., the anomeric hydroxyl group and the amino group in Mor or PEG. It is a substituent selected from the group consisting of the sandwiched portion).
  • Example 2 Preparation of Endo-Si Enzyme (Example 2-1) Expression of Endo-Si Enzyme
  • An Endo-Si expression plasmid encoding the gene corresponding to SEQ ID NO: 3 is introduced into the methanol-assimilating yeast Ogataea minuta.
  • an Endo-Si producing strain was obtained.
  • Methanol-induced Endo-Si protein expression was subsequently performed under shaking or aerated stirring culture conditions. In the case of shaking culture, using a 500 ml baffle flask (CORNING, 431401), methanol was induced on the first day after inoculation, the culture was terminated on the third day after inoculation, and the cells were collected by centrifugation. .
  • CORNING 500 ml baffle flask
  • Example 2-2 Purification of Endo-Si enzyme
  • the cells collected in Example 2-1 were crushed using YeastBuster Protein Extraction Reagent (Merck, 71186) or a high-pressure homogenizer, and centrifuged. The supernatant was purified with a combination of Capto Chelating, Capto DEAE and Capto Phenyl ImpRes (Cytiva). Finally, Amicon Ultra-15, 30 kDa (Merck) was used to replace the buffer with PBS( ⁇ ) (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries) to obtain an enzyme solution.
  • Example 3 Preparation of Endo-Rp enzyme (Example 3-1) Expression of Endo-Rp enzyme An Endo-Rp expression plasmid encoding the gene corresponding to SEQ ID NO: 5 is introduced into the methanol-assimilating yeast Ogataea minuta. Thus, an Endo-Rp producing strain was obtained. Subsequently, methanol-induced expression of Endo-Rp protein was performed under shaking culture conditions or under aerated agitation culture conditions.
  • Example 3-2 Purification of Endo-Rp Enzyme
  • the cells collected in Example 3-1 were crushed using YeastBuster Protein Extraction Reagent (Merck, 71186) or a high-pressure homogenizer, and the supernatant was centrifuged. was purified using any two or all of Capto Chelating, POROS 50 HQ (Thermo Fisher Scientific) and Capto MMC (Cytiva) to obtain an enzyme solution. A portion was concentrated with Amicon Ultra-15, 30 kDa (Merck) or buffer exchanged to obtain an enzyme solution.
  • Example 4 Preparation of Endo-S2 enzyme (Example 4-1) Expression of Endo-S2 enzyme An Endo-S2 expression plasmid encoding the gene corresponding to SEQ ID NO: 2 is introduced into the methanol-assimilating yeast Ogataea minuta. Thus, an Endo-S2 producing strain was obtained. Methanol-induced Endo-S2 protein expression was then performed under shaking culture conditions. A 1000 ml baffle flask (CORNING, 431403) was used for shaking culture, methanol induction was performed on day 1 after inoculation, culture was terminated on day 3 after inoculation, and the cells were collected by centrifugation.
  • CORNING CORNING
  • Example 4-2 Purification of Endo-S2 enzyme
  • the cells collected in Example 4-1 were disrupted using YeastBuster Protein Extraction Reagent (Merck, 71186) and centrifuged. Purified using Chelating. Finally, Amicon Ultra-15, 30 kDa (Merck) was used to replace the buffer with PBS( ⁇ ) (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries) to obtain an enzyme solution.
  • Example 5 Preparation of Endo-S enzyme (Example 5-1) Expression of Endo-S enzyme An Endo-S expression plasmid encoding the gene corresponding to SEQ ID NO: 1 is introduced into the methanol-assimilating yeast Ogataea minuta. Thus, an Endo-S producing strain was obtained. Subsequently, the Endo-S protein was expressed by methanol induction under aerated agitation culture conditions. Using a 42L culture tank (Infors HT), the cells were induced with methanol one day after the inoculation, culture was terminated on the fourth day after the inoculation, and the cells were collected by centrifugation.
  • Infors HT 42L culture tank
  • Example 5-2 Purification of Endo-S enzyme
  • the cells collected in Example 5-1 were crushed with a high-pressure homogenizer and centrifuged. Purification was combined with purification using 50 HQ (Thermo Fisher Scientific). Finally, Pellicon 3 cassette, 30 kDa (Merck) was used to replace the buffer with PBS( ⁇ ) (Merck) to obtain an enzyme solution.
  • Example 6 Preparation of Endo-M enzyme (Example 6-1) Expression of Endo-M enzyme An Endo-M expression plasmid encoding the gene corresponding to SEQ ID NO: 4 is introduced into the methanol-assimilating yeast Ogataea minuta. Thus, an Endo-M producing strain was obtained. Subsequently, methanol-induced expression of Endo-M protein was performed under aerated agitation culture conditions. A 3L culture tank (Able, BMS-03KP3 pressurized type) was used for the aeration stirring culture. Methanol was induced on the first day after inoculation, the culture was terminated on the second day after inoculation, and the cells were separated by centrifugation. Bacteria were collected.
  • a 3L culture tank Able, BMS-03KP3 pressurized type
  • Example 6-2 Purification of Endo-M enzyme
  • the cells collected in Example 6-1 were disrupted using YeastBuster Protein Extraction Reagent (Merck, 71186), centrifuged, and the supernatant was subjected to Capto Chelating. and purified with Capto DEAE (Cytiva). Finally, the buffer composition was changed to 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 30% Glycerol, pH 8.0 to obtain an enzyme solution.
  • the sugar chain donor of the present invention can be produced according to the method described later (enzymatic conversion and chemical conversion of sugar chain starting material or sugar chain intermediate).
  • the target compound of each reaction is collected from the reaction mixture according to a conventional method. For example, it can be obtained by appropriately neutralizing the reaction mixture, removing any insoluble matter by filtration, and distilling off the solvent.
  • the obtained compound can be separated and purified by a conventional method such as silica gel column chromatography or ion exchange chromatography, if necessary. Alternatively, it can be purified by reprecipitation, recrystallization, and ultrafiltration.
  • the masses of the sugar chain derivatives described herein were confirmed by the following method.
  • the device uses Xevo G2-XS Family mass spectrometer (manufactured by Waters), ACQUITY BEH C18 (manufactured by Waters) (1.7 ⁇ m, 2.1 x 50 mm), mobile phase A is acetonitrile, mobile phase B is A 10 mM aqueous solution of ammonium acetate was used, mobile phase A was used with a gradient of 1% to 30% in 5 minutes, and the analysis was performed at a flow rate of 0.8 mL/min and 40°C.
  • step (7-1b) [condensation reaction]
  • the solid (11.0 g) obtained in step (7-1a) was dissolved in DMF (121.0 mL) and DMSO (33.0 mL) and treated with N,N-diisopropylethylamine (3.16 g, 24.4 mmol).
  • N,N-diisopropylethylamine (3.16 g, 24.4 mmol)
  • 11-azido-3,6,9-trioxaundecane-1-amine (5.33 g, 24.4 mmol) were added sequentially and cooled to -7°C.
  • This aqueous solution was added dropwise to ethanol (550 mL), and the aqueous solution was washed with purified water (22 mL). The resulting slurry was collected by filtration, and the cake was washed with a mixture of ethanol (275 mL) and purified water (55 mL) to obtain a wet solid (162.0 g). After dissolving this in purified water (220 mL), it was concentrated to half by vacuum concentration to remove ethanol. By freeze-drying this, a crude product (8.81 g), which is a mixture of the sugar chain raw material 3, the sugar chain raw material 3-1, the sugar chain raw material 3-2, and the sugar chain raw material 2-3, was obtained.
  • step (7-1c) [Preparation of Sugar Chain Raw Material 3 and Sugar Chain Raw Material 3-1 Using Triart C18]
  • a crude product (10.05 g in total), which is a mixture of 3 is used as an eluent with acetonitrile and purified water, using K-Prep Lab 100G (manufactured by YMC) as an apparatus and Triart C18 (manufactured by YMC) as a column. and separated and purified.
  • the main peak detected by UV detection (210 nm) was collected and concentrated under reduced pressure. This concentrate was freeze-dried to obtain target compound sugar chain raw material 3 (2.09 g) and target compound sugar chain raw material 3-1 (2.02 g) as white powders.
  • step (7-5-2b) [condensation reaction] After dissolving the solid 4 (3.0 g) obtained in step (7-5-2a) with DMF (59.1 mL) and purified water (0.9 mL), N,N-diisopropylethylamine (1 .03 g, 7.94 mmol), 11-azido-3,6,9-trioxaundecane-1-amine (867 mg, 3.97 mmol) were added. To this solution, 1H-benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (6.20 g, 11.9 mmol) was added in three portions at 20° C., and the mixture was stirred at that temperature for 23 hours. .
  • step (7-9-2b) [condensation reaction] To the solid matter (0.8 g) that is a mixture of sugar chain raw material 5-1, sugar chain raw material 5-2, sugar chain raw material 5-3, and sugar chain raw material 5-4 obtained in step (7-9-2a), DMF (8.0 mL), N,N-diisopropylethylamine (0.13 g, 1.0 mmol) were added and cooled to 0°C.
  • N,N-dimethylformamide (5.0 ml) and piperidine (0.35 ml) were added to the above solid and stirred at 37° C. for 4 hours. After that, N,N-dimethylformamide (3.3 ml) was added and stirred at room temperature for 16 hours.
  • tert-butyl dicarbonate (359 mg) was added, aqueous sodium hydroxide solution (1N, 2.3 mL) was added, and the mixture was stirred for 3 hours.
  • Hydrochloric acid (1N) was added to adjust the pH to 8 to obtain a solution containing sugar chain starting material 7-1, sugar chain starting material 7-2, sugar chain starting material 7-3, and sugar chain starting material 7-4.
  • step (7-11b) [condensation] DMF is added to half the solution containing sugar chain starting material 7-1, sugar chain starting material 7-2, sugar chain starting material 7-3, and sugar chain starting material 7-4 obtained in step (7-11a). (10 mL) was added, acetonitrile (10 mL) was added, and acetonitrile was distilled off under reduced pressure four times to perform dehydration. 11-azido-3,6,9-trioxaundecane-1-amine (0.46 g) was added to the resulting DMF solution and cooled to 0°C.
  • step (7-12b) [Purification] One-third of the reaction solution obtained in step (7-12a) was separated and purified using X-Bridge C18 (manufactured by Waters) as a column with acetonitrile and water as eluents. The target peak detected by UV detection (210 nm) was collected and concentrated under reduced pressure. This concentrate was freeze-dried to obtain the target compound G-16 (16.3 mg) as a white powder.
  • ESI-MS Calcd for C88H143N9O57: [M+2H] 2+ 1119.94 (most abundant mass), Found 1119.93
  • the direct glycosylation reaction proceeds in the form conceived this time as shown in Fig. 1, if the biantennary sugar chain structure is recognized by Enzyme-B, it is not necessary to limit the structure on the non-reducing end side to the N-linked type. It is thought that the target reaction proceeds in any structure without For example, the structure shown below or in FIG. 2 can be used as a sugar chain donor.
  • step 1 antibody concentration
  • Lys in the antibody It has been reported that saccharification (Glycation), which is a chemical reaction not mediated by Endo enzyme, progresses easily. Furthermore, in order to suppress this side reaction, it was recommended that the reaction be carried out at a weak acidity (pH 6.50) and the oxazoline derivative solution be repeatedly added to react, that is, to dilute the reaction solution (Ref. Bioconjugate Chemistry 2019 30(5), 1343-1355). In this report, the antibody concentration in the reaction solution was set at 40 ⁇ M or less.
  • the acceptor molecule (for example, antibody) concentration in the reaction system applicable to the production method of the present invention is not limited, in Example 8, regardless of the acceptor molecule (antibody) concentration in the reaction system, In order to confirm that an antibody with a moderate (>80%) or higher glycosylation rate can be obtained, the antibody concentration in the system was set at 20 mg/mL to 80 mg/mL.
  • Example 8-1 When antibody concentration in reaction system is 20 mg/mL [Glycosylation reaction standard protocol 1] (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc-mAb1 (6 mg), sugar chain donor (20 equivalents), Enzyme-A (1.6-1.7% w/w), Enzyme-B (0.2% w/w) and an appropriate amount of 50 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.25) was added to make a total volume of 300 ⁇ L, and reacted at 30° C. for 28 hours. Samples were taken at 2 hours, 4 hours, 6 hours, 8 hours, 24 hours and 28 hours after initiation of the reaction. After completion of the reaction, the pH of the reaction solution was measured.
  • a transglycosylation reaction was carried out and a sampling solution was prepared.
  • the acceptor molecule solution 1-1 prepared in Reference Example 1 was used.
  • Either the Enzyme-A solution (Si-001-2) prepared in Example 2 or the Enzyme-A solution (S-001) prepared in Example 5 was used.
  • Enzyme-B solution (Rp-001-2) prepared in Example 3 was used.
  • Either sugar chain donor G-1, G-3, or G-4 prepared according to Table Z6 was used. Depending on the structure of the sugar chain donor used in each experiment, the transglycosylation reaction shown in the schematic diagram below or FIG. 3 proceeds.
  • Example 8-1-7 Example 8-1-8, and Example 8-1-9, respectively, Example 8-1-4, Example 8-1-5, and Example 8-1-6
  • [Glycosylation standard protocol 1] used in the sugar chain donor was changed from 20 equivalents to 40 equivalents. As expected, the glycosylation rate was improved.
  • the amount of sugar chain donor should be doubled.
  • Example 8-2 When antibody concentration in reaction system is 40 mg/mL Instead of standard protocol 1 for transglycosylation, standard protocol 2 for transglycosylation is performed in the same manner as in Example 8-1 for transglycosylation. The reaction was performed and the transglycosylation rate was measured using LabChip analysis.
  • Example 8-3 When antibody concentration in reaction system is 60 mg/mL Instead of standard protocol 1 for transglycosylation, standard protocol 3 for transglycosylation is performed in the same manner as in Example 8-1 for transglycosylation. The reaction was performed and the transglycosylation rate was measured using LabChip analysis.
  • Example 8-4 When antibody concentration in reaction system is 80 mg/mL Instead of standard protocol 1 for transglycosylation, standard protocol 4 for transglycosylation is performed in the same manner as in Example 8-1 for transglycosylation. The reaction was performed and the transglycosylation rate was measured using LabChip analysis.
  • Example 8 a combination of a representative enzyme and a representative sugar chain donor was used, and the sugar chain donor amount was mainly fixed at 20 equivalents, and the sugar chain transfer rate was confirmed for up to 28 hours. It can be seen that in any enzyme combination, the higher the final antibody concentration in the reaction system, the higher the glycosylation rate. Moreover, it can be confirmed that an antibody with a moderate (>80%) or higher transglycosylation rate can be obtained in the transglycosylation reaction regardless of the antibody concentration in the reaction system.
  • Example 9 Reaction conditions for “Step 1”: sugar chain equivalents
  • the antibody concentration in the reaction system applicable to the production method of the present invention is not limited, in Example 9, a sugar chain donor molecule added to the reaction system In order to confirm that an antibody with a moderate (>80%) or higher transglycosylation rate can be obtained in the transglycosylation reaction regardless of the amount of did.
  • Example 9-1 When using 10 equivalents of sugar chain for antibody Instead of standard protocol 1 for transglycosylation, follow standard protocol 5 for transglycosylation in the same manner as in Example 8-1. , transglycosylation reaction was performed, and the transglycosylation rate was measured using LabChip analysis.
  • the acceptor molecule solution 1-1 prepared in Reference Example 1 was used.
  • Either the Enzyme-A solution (Si-001-2) prepared in Example 2 or the Enzyme-A solution (S-001) prepared in Example 5 was used.
  • Enzyme-B solution (Rp-001-2) prepared in Example 3 was used.
  • Either sugar chain donor G-1, G-3, or G-4 prepared according to Table Z6 was used.
  • the transglycosylation reaction shown in FIG. 3 proceeds according to the structure of the sugar chain donor used in each experiment.
  • Example 9-1-7 the sugar chain donor (20 equivalents) was changed to the sugar chain donor (10 equivalents) in [Transglycosylation Reaction Standard Protocol 4] used in Example 8-4. reacted under the conditions As expected, the glycosylation rate was improved.
  • Example 9-2 When 30 Equivalents of Sugar Chain are Used for Antibody Instead of standard protocol 1 for transglycosylation, standard protocol 6 for transglycosylation is performed in the same manner as in Example 8-1. , transglycosylation reaction was performed, and the transglycosylation rate was measured using LabChip analysis.
  • Example 9-3 When 40 Equivalents of Sugar Chain are Used for Antibody Instead of standard protocol 1 for transglycosylation, standard protocol 7 for transglycosylation is performed in the same manner as in Example 8-1. , transglycosylation reaction was performed, and the transglycosylation rate was measured using LabChip analysis.
  • Example 9 with a combination of a representative enzyme and a representative sugar chain donor, 28 The glycosylation rate up to time was confirmed. It was confirmed that in any combination of enzymes, the higher the amount of sugar chain donor used, the higher the transglycosylation rate. In addition, it can be confirmed that an antibody with a moderate (>80%) or higher transglycosylation rate can be obtained in the transglycosylation reaction regardless of the sugar chain equivalent added to the reaction system. From Experimental Examples 8 and 9, in "step 1", a high glycosylation rate can be achieved by appropriately adjusting the amount of sugar chain donor used and the final antibody concentration in the reaction system.
  • Example 10 mainly the amount of sugar chain donor used (20 equivalents) and the final concentration of antibody in the reaction system (60 mg/mL) were fixed, and the structures of available sugar chain donors and enzymes were determined. Confirmed the combination.
  • the transglycosylation rate was measured using LabChip analysis in the same manner as in 8-1).
  • the acceptor molecule solution, the enzyme-A solution, the enzyme-B solution, and the sugar chain donor were properly used according to the combinations described in Table Z14.
  • any one of the acceptor molecule solutions 1-1, 2-1, 2-2, and 3-1 prepared in Reference Examples 1 to 3 was used.
  • Either one of the Enzyme-A solutions prepared in Example 2 or Example 5 was used.
  • Either one of the Enzyme-B solutions prepared in Example 3 or Example 6 was used.
  • Any one of sugar chain donors G-1 to G-17 prepared according to Table Z6 was used.
  • the transglycosylation reaction shown in the schematic diagram below or FIG. 4 proceeds.
  • Example 10 combinations of the structures of available sugar chain donors and enzymes were compared, and antibodies with moderate (>80%) or higher glycosylation rates were obtained in any of the combinations. can be confirmed.
  • Endo-S mutants, Endo-S2 mutants, and Endo-Si mutants can be arbitrarily selected as enzymes that can be used in "Step 1".
  • the experiment of Example 11 was performed.
  • the enzyme used in “Step 1" has "a hydrolysis rate of less than 90% at 4 hours from the start of the reaction” and "at 24 hours from the start of the reaction It can be seen that the hydrolysis rate of less than 99.9%” can be used as an index and can be arbitrarily selected.
  • Example 12 Confirmation of effect of combination of "Step 1" and “Step 2" In Example 12, it was verified whether or not the glycosylation rate could be improved in “Step 2" regardless of the conditions of "Step 1".
  • the acceptor molecular species (antibody species), sugar chain donor species, and enzyme species to which the production method of the present invention can be applied are not limited, but the effects of the combination of "step 1" and “step 2" are confirmed in several patterns.
  • the combinations described in Table Z16 that is, 5 types of sugar chain donors, 3 types of antibodies, 3 types of enzyme-A, and 2 types of enzyme-B were selected as representative examples.
  • the sugar chain donor used was 10 equivalents or 20 equivalents.
  • Step 1 Acceptor molecule (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-mAb, 10, 20, or 60 equivalents of sugar chain donor molecule, 1.6% (w/w) Enzyme-A, 0.2% (w/ An appropriate amount of 50 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.25) was added to the mixed solution with enzyme-B in w), and the volume of the reaction solution was adjusted so that the final antibody concentration was 20 mg/mL or 60 mg/mL. It was adjusted. Subsequently, the reaction solution was incubated at 30° C., and the reaction was terminated 28 hours after initiation of the reaction.
  • ⁇ Sampling> After completion of the reaction, a minute amount of the reaction solution was sampled for the purpose of measuring the glycosylation rate, diluted with purified water so that the antibody concentration was 1 mg/mL, and then stored frozen until the start of LabChip analysis.
  • ⁇ Adjustment of pH and salt concentration of load liquid> 100 mM acetate buffer (pH 3.9), 1 M aqueous sodium chloride solution, 1 M hydrochloric acid, and purified water were added to the reaction solution to prepare a column load solution.
  • the loading solution was prepared to have an antibody concentration of 5 mg/mL and to have the same pH and sodium chloride final concentration as the column-equilibrated solution for each experiment. After preparation of the loading liquid, 0.5 mL was sampled for the purpose of confirming the transglycosylation rate of the loading liquid.
  • acceptor molecule solution the enzyme-A solution, and the sugar chain donor were properly used according to the combinations described in Table Z16.
  • any one of acceptor molecule solution 4-1 prepared in Reference Example 4, acceptor molecule solution 5-1 prepared in Reference Example 5, or acceptor molecule solution 6-1 prepared in Reference Example 6 was used. used.
  • Either the Enzyme-A solution (Si-001-2) prepared in Example 2 or the Enzyme-A solution (S-001) prepared in Example 5 was used.
  • Enzyme-B solution Rp-001-3) prepared in Example 3 or the Enzyme-B solution (M-002) prepared in Example 6 was used.
  • Either one of sugar chain donors G-1, G-3, G-4, G-10, or G-16 prepared according to Table Z6 was used.
  • the antibody concentration was confirmed with a UV-visible spectrophotometer system SoloVPE (manufactured by C Technologies), and the sugar chain transfer rate was confirmed using a microchip type capillary fully automated electrophoresis system LabChip GX (manufactured by Perkin Elmer).
  • the antibody, enzyme, and sugar chain used in "step 1" Regardless of the type, antibodies with improved glycosylation rates could be recovered in the flow-through solution in "step 2" compared to the load solution.
  • the combination of "Step 1" and “Step 2” can produce a highly pure, uniform sugar chain structure with the smallest possible amount of sugar chain donor molecules (40 equivalents or less, preferably 10 to 20 equivalents).
  • sugar chain remodeling antibody molecules contained in the recovered liquid obtained in Example 12, representative compounds and acceptor molecules used in the preparation of each compound were confirmed by the following method.
  • the sugar chain remodeling antibody molecules were separated in an analysis column in the form of complexes of heavy and light chains, or fragmented into heavy and light chains, and introduced into a mass spectrometer.
  • the equipment includes Orbitrap Exploris 240 (Thermo Fisher Scientific Inc), Vanquish Flex UHPLC system (Thermo Fisher Scientific Inc) and MAbPac RP (Thermo Fisher Scientific Inc) (5 ⁇ m, 2.1 x 50 mm), mobile phase A
  • mobile phase B acetonitrile/0.1% formic acid/0.02% trifluoroacetic acid was used, and mobile phase A was 10%.
  • Analysis was performed at a flow rate of 0.4 mL/min and 80° C. using a gradient varying from 20% to 50% in minutes.
  • Example 13 Examination of the type of cation exchange chromatography medium In Example 13, it was confirmed that the effect of improving the sugar chain transfer rate shown in Example 12 does not depend on a specific chromatography medium.
  • the loading fluid prepared according to the standard protocol 1 for loading fluid preparation used in Example 12, was loaded onto a cation exchange chromatography medium commonly used in antibody production.
  • cation exchange chromatography media such as particulate, membrane, and monolithic media
  • representative products of various media were used for experiments.
  • Cation exchange chromatography media are not limited to these.
  • each experiment shown in Table Z17 was performed under operating conditions suitable for the aforementioned media. That is, the buffer or loading solution was applied to the CEX particles at a contact time of 3 minutes (0.3 mL/min or 0.55 mL/min) and to the CEX membrane at a membrane volume (MV)/min of 5 (5 mL/min). Or 4.3 mL/min), and the CEX monolith was passed at a flow rate of 1 minute contact time (1 mL/min). After the equilibration solution was equilibrated by feeding 5 CV or 5 to 15 MV, the CEX medium was loaded with the aforementioned loading solution.
  • the target substance was detected by absorbance at 280 nm, and the flow-through liquid was collected in 5 mL increments when 50 mAU/2 mm UV cell or more, and each fraction was mixed together. It was adjusted to 0-5.4 and used as the pass-through fraction.
  • the washing liquid passed through 5 CV or 5 MV was collected in one container and used as a washing fraction.
  • the pH of the loading solution and the equilibration solution affects the effect of improving the transglycosylation rate and the yield when using any CEX medium.
  • the pH range of pH 4.5 to 6.0 is selected for the loading solution and equilibration solution (Groenberg A, Optimizing Cation-Exchange Chromatography with High- Throughput Process Development for mAb Purification.Biopharm Int.2015;28:44-47, and Thermo Fisher Scientific.POROS XS and HS 50 chromatography resin.
  • Example 15 Application example related to "step 1" (enzyme, sugar chain donor molecule, sugar chain acceptor molecule) (Example 15a) Preparation of Enzyme-A used in Example 15 From Example 11 and Reference Example 8, it is suggested that an enzyme having an appropriate residual hydrolysis activity can be adopted as Enzyme-A used in "Step 1". was done. Therefore, it was verified whether Endo-Se, Endo-Sd, and Endo-Sz, which are known to exhibit properties similar to those of Endo-S and Endo-S2, can be used in step 1. Enzymes were prepared in the same manner as in Examples 2, 4 and 5 by introducing plasmids encoding genes corresponding to SEQ ID NOS: 76-78 into the methanol-assimilating yeast Ogataea minuta (Table Z20).
  • Example 15b Hydrolysis of mAb2-[MSG1-N 3 ] 2
  • Table Z21 The experiments shown in Table Z21 were performed. Using Enzyme-A prepared in Example 15a, the hydrolysis rate at each reaction time was calculated in the same manner as in Example 11 (Table Z21). However, antibody solution 7-2 was used instead of antibody solution 7-1.
  • Example 15c Reaction conditions for “Step 1”: Combination of Enzyme-A and Enzyme-B
  • the transglycosylation reaction was carried out according to [Standard protocol for transglycosylation reaction 2] described in (Example 8-2). , prepared the sampling solution. Thereafter, the transglycosylation rate at each reaction time was calculated in the same manner as in (Example 8-1) (Table Z22). However, the sugar chain donor, sugar chain equivalent, and enzyme used in each experiment were appropriately changed to those shown in Table Z22.
  • GlcNAc-mAb4 (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc-Fc-A, and (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc-CLCH-A prepared in Reference Example 22 were used as acceptor molecules. It was used.
  • Enzyme-A in the present invention is not limited to these, and can be arbitrarily selected depending on the purpose using the residual hydrolytic activity as an index.
  • the fucoseless antibody, the Fc fragment, and the "CH consisting only of the constant region with the variable region deleted and CL consisting only of the constant region of the light chain A moderate (>80%) or higher glycosylation rate was also obtained when using CLCH combined with. From this, it was demonstrated that the type of Fc-containing molecule is not limited to antibodies, and that "step 1" of the present invention can be applied to a wide range of Fc-containing molecules.
  • an enzyme such as a fusion protein of Endo-S and Endo-H, or Endo-F3 and Endo-H in which endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidases with different substrate selectivity are fused together is described.
  • a method has been reported in which a deglycosylated antibody is obtained in a single step from an antibody to which a sugar chain having a different basic structure, such as a high-mannose-type sugar chain or a complex-type sugar chain, is added.
  • fusion proteins for the purpose of improving the efficiency of the reaction of transferring sugar chains from a sugar chain donor molecule to an acceptor molecule.
  • Enzyme-A and Enzyme-B may be added to the reaction system in a directly or indirectly bound state as long as they perform their desired roles.
  • a fusion protein was prepared in which Enzyme-B and Enzyme-A were linked by a linker containing consecutive amino acid residues, and the reactivity was confirmed.
  • a production strain of the fusion protein was obtained by introducing an expression plasmid encoding genes corresponding to SEQ ID NOS: 80 to 81 into the methanol-assimilating yeast Ogataea minuta.
  • Example 15e Hydrolysis of mAb2-[MSG1-N 3 ] 2
  • Table Z24 The experiments shown in Table Z24 were performed. Using the enzyme prepared in Example 15d, the hydrolysis rate at each reaction time was calculated in the same manner as in Example 11 (Table Z24).
  • Enzyme-B/Enzyme-A fusion protein Enzyme reaction example (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-mAb1 (1 mg), sugar chain donor (20 equivalents), Enzyme-B/Enzyme-A fusion protein (3 .2% w/w) and an appropriate amount of 50 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.25) were added to make a total volume of 16.7 ⁇ L, and reacted at 30° C. for 24 hours. Samples were taken at 16 hours, 18 hours, 20 hours, 22 hours and 24 hours after initiation of the reaction. After completion of the reaction, the pH of the reaction solution was measured.
  • a fusion protein of SEQ ID NO: 79 can also be prepared in the same manner as the fusion proteins of SEQ ID NOS: 80 and 81 according to the procedure described above.
  • a fusion protein in which the full length of each enzyme is directly linked via amino acids was used as a representative fusion protein, but the fusion protein in the present invention is not limited to this.
  • Example 16 Application example of “Step 2” (Example 16-1) Purification using cation-hydrophobic multimode resin It was confirmed that it can be obtained even when a mode resin is used.
  • a loading solution prepared according to Standard Protocol 2 for Loading Solution Preparation below was loaded onto a cationic-hydrophobic multimode resin commonly used for antibody production.
  • representative commercial products were used in the experiment, the cationic-hydrophobic multimode resin in the present invention is not limited to these.
  • the loading solution was prepared to have an antibody concentration of 5 mg/mL and to have the same pH and sodium chloride final concentration as the column-equilibrated solution for each experiment. After preparation of the loading liquid, 0.5 mL was sampled for the purpose of confirming the transglycosylation rate of the loading liquid. After passing about 30 mL of the prepared loading solution through the column (sample passing), 5 CV of equilibration solution (50 mM acetate buffer, 490 mM sodium chloride aqueous solution, pH 3.8) was passed through (column washing). Thereafter, 5 CV of an eluate (50 mM acetate buffer, 1 M sodium chloride aqueous solution, pH 4.0)) was run for the purpose of column regeneration.
  • equilibration solution 50 mM acetate buffer, 490 mM sodium chloride aqueous solution, pH 3.8
  • cleaning liquid 0.5 M sodium hydroxide aqueous solution
  • the target substance in the column flow-through is detected by absorbance at 280 nm when the sample is passed through the column, and is recovered when it is 50 mAU/2 mm UV cell or more, adjusted to pH 5.0-5.4 by adding 1 M Tris solution, and recovered. liquid.
  • the antibody concentration was confirmed with an ultraviolet-visible spectrophotometer system SoloVPE (manufactured by C Technologies), and the sugar chain transfer rate was confirmed using a microchip-type capillary fully automated electrophoresis system LabChip GX (manufactured by Perkin Elmer) (Table Z26).
  • Example 16-2 Comparison with Purification Method in Binding/Elution Mode Even when the target substance was adsorbed on a cation exchange column and then passed through the eluate to collect in the elution fraction, sugar chain transfer It was confirmed that the rate improvement effect was obtained.
  • a reaction solution prepared by the same method (standard protocol 2 for preparation of loading solution (step 1)) was used. , standard protocol 4 for cation exchange chromatography, or standard protocol 5 for cation exchange chromatography.
  • an eluent 50 mM acetate buffer, 1 M sodium chloride aqueous solution, pH adjusted to the equilibration solution
  • a linear concentration gradient of sodium chloride (0 to 100 at 20 CV).
  • the target substance in the eluate was detected by the absorbance at 280 nm, and fractionated by 0.5 ml at 20 mAU/2 mm UV cell or more.
  • the antibody concentration was confirmed using a UV-visible spectrophotometer system SoloVPE (manufactured by C Technologies), and the sugar chain transfer rate was confirmed using a fully automated microchip capillary electrophoresis system LabChip GX (manufactured by Perkin Elmer). Only the fractions with improved transglycosylation rate compared to the loading liquid were mixed to obtain a recovery liquid (Table Z27).
  • Example liquid After about 30 mL of the loading liquid was passed through the column (sample liquid), 5 CV of an equilibration liquid (50 mM acetate buffer, 490 mM sodium chloride aqueous solution, pH 3.8) was passed through (column washing). Thereafter, 5 CV of an eluate (50 mM acetate buffer, 1 M sodium chloride aqueous solution, pH 4.0)) was run for the purpose of column regeneration. Finally, for cleaning-in-place (CIP) purposes, 3 CV of cleaning liquid (0.5 M sodium hydroxide aqueous solution) was run.
  • an equilibration liquid 50 mM acetate buffer, 490 mM sodium chloride aqueous solution, pH 3.8
  • eluate 50 mM acetate buffer, 1 M sodium chloride aqueous solution, pH 4.0
  • the target substance in the column flow-through is detected by absorbance at 280 nm when the sample is passed through the column, and is recovered when it is 50 mAU/2 mm UV cell or more, adjusted to pH 5.0-5.4 by adding 1 M Tris solution, and recovered. liquid.
  • the antibody concentration was confirmed with an ultraviolet-visible spectrophotometer system SoloVPE (manufactured by C Technologies), and the sugar chain transfer rate was confirmed using a microchip-type capillary fully automated electrophoresis system LabChip GX (manufactured by Perkin Elmer) (Table Z27).
  • Example 16-3 When a reaction mixture was prepared using the oxazoline method I made sure I got it. First, an appropriate amount of sugar chain donor to be used in step 1 was confirmed.
  • step 1 when 4 equivalents or more of the sugar chain donor N 3 -MSG1-Ox was used in step 1, the sugar chain transfer rate was extremely high. It was considered unsuitable for evaluating the improvement effect. Therefore, in step 1, 2 equivalents of sugar chain donor N 3 -MSG1-Ox were used to prepare the loading solution in step 2.
  • step 2 As shown here, it was confirmed that even when an oxazoline compound was used as the sugar chain donor in step 1, the effect of improving the sugar chain transfer rate was obtained in step 2.
  • Enzyme A that can be used in the present invention is not limited to known enzymes and variants thereof. Any enzyme can be selected as long as it meets the requirements described in Example 1. New mutants may be searched based on known enzyme sequence information. Therefore, in Examples 17 to 19, a method for confirming amino acid mutation of enzyme A (hereinafter referred to as "method for confirming amino acid mutation") that can be used in "Step 1" is shown.
  • Example 17 Preparation of Endo-Si Single Mutants
  • D241X, T190X, Q311X, E360X were prepared in order to analyze the activity of a single mutation of the amino acid at the mutation position.
  • Single mutants of T190 and single mutants of D241, Q311, and E360 other than the mutants designed in Example 1 were prepared according to the method described in Example 2 (Table Z31).
  • Example 18 Hydrolysis of mAb2-[MSG1-N 3 ] 2
  • a method for narrowing down enzymes having a residual hydrolytic activity equal to or lower than that of Endo-Si WT will be described. Any antibody may be used as the antibody used here as long as it is an antibody to which a sugar chain is added.
  • a total of 23.2 ⁇ L reaction solution containing mAb2-[MSG1-N 3 ] 2 (50 ⁇ g), Endo-Si single mutant (1 ⁇ g) prepared in Example 17 and 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.25) was prepared. and reacted at 30°C. Samples of the reaction solution were taken 1 hour, 4 hours and 24 hours after the start of the reaction.
  • any amino acid mutation may be included in the catalytically active domain of enzyme A that can be used in "Step 1".
  • this method is not limited to Endo-Si, Endo-S, and Endo-S2, and can be used for all endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidases whose substrates are N297-linked sugar chains of Fc-containing molecules. . Therefore, the enzyme A available for step 1 is the specific Endo-Si mutant, Endo-S mutant, Endo-S2 mutant, Endo-Se mutant, Endo-Sd mutant described in the Examples of the present invention.
  • Example 20 Direct exchange reaction of host cell-derived N297 sugar chain
  • an enzyme that retains hydrolytic activity can be selected as Enzyme-A.
  • acceptor molecules can be prepared in situ by the action of Enzyme-A on Fc-containing molecules with heterogeneous carbohydrate chains derived from host cells. Further, by transferring sugar chains from a sugar chain donor molecule to an acceptor molecule prepared in situ, as shown in Example 10, etc., an antibody to which desired sugar chains are uniformly added can be obtained.
  • Enzyme-A By adding Enzyme-A, Enzyme-B, and a sugar chain donor molecule to an antibody having N297-linked sugar chains derived from host cells, the desired sugar chains derived from the sugar chain donor molecules are uniformly distributed. It is possible to obtain an antibody attached to In this conception, Enzyme-A exhibits both the hydrolysis reaction on host cell-derived N297-linked sugar chains and the transglycosylation reaction on sugar chain donor molecules in the same reaction vessel. That is, first, enzyme-A acts on an antibody having a host cell-derived N297-linked sugar chain and hydrolyzes the host cell-derived N297-linked sugar chain to generate an acceptor molecule in situ.
  • Enzyme-A also acts on the sugar chain donor molecule activated by the action of Enzyme-B in the same reaction vessel, and the sugar chain can be transferred to the acceptor molecule.
  • the series of reactions described in this section is hereinafter referred to as "direct exchange reaction of host cell-derived N297 sugar chain”.
  • the host cell-derived N297-linked sugar chain can be replaced with the desired sugar chain structure, as shown in Fig. xx2.
  • G-1 is chosen as the sugar chain donor molecule
  • mAb-[SG] 2 will be obtained.
  • G-4, G-13, G-14, or G-16 is selected as the sugar chain donor molecule
  • mAb-[X-MSG1] 2 can be obtained.
  • G-3, G-6, G-7, G-8, G-9, G-10, G-11, G-12, or G-15 is selected, mAb-[X-SG] 2 It is considered to be obtained.
  • the sugar chain remodeling antibody molecule was fragmented into heavy and light chains, separated by an analytical column, and introduced into a mass spectrometer.
  • TCEP tris(2-carboxyethyl)phosphine
  • Staudinger reaction also proceeded on the sugar chain site N3 group derived from the sugar chain donor introduced into the antibody by the transglycosylation reaction, and the mass reduced to the NH2 group was observed as the main peak.
  • X represents N 3 -PEG(3).
  • the numerical value (about 26 Da) considering the change of two nitrogen atoms and two hydrogen atoms per N3 group is Observed as a difference from the theoretical value.
  • Naked mAb1 is an antibody to which host cell-derived N297-linked sugar chains are heterogeneously added, so in MS analysis, the structure in which host cell-derived N297 sugar chains are added to the H chain was confirmed as multiple MS peaks. (Table Z36). Focusing on Example 20-1, the host cell-derived N297-linked sugar chain was almost hydrolyzed and replaced with the G-1-derived sugar chain structure at 24 hours after the start of the reaction. This indicates that the main structure of the antibody in the reaction is mAb1-[SG] 2 .
  • Example 20-2 On the other hand, focusing on Example 20-2, at 24 hours after the start of the reaction, the host cell-derived N297-linked sugar chain was almost hydrolyzed and replaced with the G-1-derived sugar chain structure and its hydrolyzate structure. was This indicates that the main structures of the antibodies in the reaction are mAb1-[SG] 2 and (Fuc ⁇ 1,6)GlcNAc-mAb1. Subsequently, Examples 20-3 and 20-4 using G-16 as a sugar chain donor, or Examples 20-5 and 20-6 using G-10 as a sugar chain donor , MS peaks were detected as the sugar chain structure derived from G-16 and the sugar chain structure derived from G-10, respectively.
  • the pH of the reaction solution was measured.
  • a portion of the reaction solution was withdrawn, diluted with purified water so that the concentration of the contained antibody was 1 mg/mL, and stored frozen until the start of LabChip analysis.
  • the transglycosylation rate was measured in the same manner as in Examples.
  • Anti-CD70 antibody 1 was produced with reference to WO2004/073656.
  • the anti-CD70 antibody 1 has an isotype of IgG1 and LALA mutations (IgG1-L234A, L235A).
  • the light chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the anti-CD70 antibody 1 are shown in FIG.
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 112 is the light chain variable region
  • the heavy chain sequence shown in SEQ ID NO: 2 Fig. 14
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 118 is the heavy chain variable region.
  • CDRL1 amino acid sequence SEQ ID NO: 13
  • CDRL2 amino acid sequence SEQ ID NO: 14
  • CDRL3 amino acid sequence SEQ ID NO: 15
  • CDRH1 amino acid sequence SEQ ID NO: 16
  • CDRH2 amino acid sequence SEQ ID NO: 16
  • the amino acid sequence of CDRH3 SEQ ID NO: 18
  • the anti-CD70 antibody 2 was produced with reference to WO2007/038637.
  • the anti-CD70 antibody 2 is isotype IgG1 and has the LALA mutation.
  • the light chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) and heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of the anti-CD70 antibody 2 are shown in FIG.
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 108 is the light chain variable region
  • the heavy chain sequence shown in SEQ ID NO: 4 Fig. 15
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 118 is the heavy chain variable region.
  • CDRL1 amino acid sequence SEQ ID NO: 19
  • CDRL2 amino acid sequence SEQ ID NO: 20
  • CDRL3 amino acid sequence SEQ ID NO: 21
  • CDRH1 amino acid sequence SEQ ID NO: 22
  • CDRH2 amino acid sequence SEQ ID NO: 22
  • the amino acid sequence of CDRH3 SEQ ID NO: 24
  • Anti-TROP2 antibody 1 was prepared with reference to WO2015/098099.
  • the anti-TROP2 antibody 1 has an isotype of IgG1.
  • the light chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) and heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of the anti-TROP2 antibody 1 are shown in FIG.
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 108 is the light chain variable region
  • the heavy chain sequence shown in SEQ ID NO: 6 Figure 16
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 121 is the heavy chain variable region.
  • CDRL1 amino acid sequence SEQ ID NO: 25
  • CDRL2 amino acid sequence SEQ ID NO: 26
  • CDRL3 amino acid sequence SEQ ID NO: 27
  • CDRH1 amino acid sequence SEQ ID NO: 28
  • CDRH2 amino acid sequence SEQ ID NO: 28
  • amino acid sequence of CDRH3 SEQ ID NO: 30
  • Anti-TROP2 antibody 1 was produced with reference to WO2015/098099.
  • the anti-TROP2 antibody 1 has an isotype of IgG1.
  • Anti-TROP2 antibody 2 introduced the LALA mutation into anti-TROP2 antibody 1.
  • the light chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) and heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) of the anti-TROP2 antibody 2 are shown in FIG. In the light chain sequence shown in SEQ ID NO: 7 (Fig. 17), the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 108 is the light chain variable region, and in the heavy chain sequence shown in SEQ ID NO: 8 (Fig.
  • CDRL1 amino acid sequence SEQ ID NO: 31
  • CDRL2 amino acid sequence SEQ ID NO: 32
  • CDRL3 amino acid sequence SEQ ID NO: 33
  • CDRH1 amino acid sequence SEQ ID NO: 34
  • CDRH2 amino acid sequence SEQ ID NO: 34
  • Anti-EGFR antibody 1 was produced with reference to the Vectibix Intravenous Infusion 100 mg Examination Result Report (March 5, 2010, Pharmaceutical and Food Safety Bureau, Evaluation Division).
  • the anti-EGFR antibody 1 is isotype IgG1 and has the LALA mutation.
  • the light chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) and heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) of the anti-EGFR antibody 1 are shown in FIG.
  • Anti-EGFR antibody 2 was prepared with reference to WO2002/092771.
  • the anti-EGFR antibody 2 is isotype IgG1 and has the LALA mutation.
  • the light chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) and heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 12) of the anti-EGFR antibody 2 are shown in FIG.
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 108 is the light chain variable region
  • the heavy chain sequence shown in SEQ ID NO: 12 Fig. 19
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 116 is the heavy chain variable region.
  • CDRL1 amino acid sequence (SEQ ID NO: 43), CDRL2 amino acid sequence (SEQ ID NO: 44), CDRL3 amino acid sequence (SEQ ID NO: 45), CDRH1 amino acid sequence (SEQ ID NO: 46), CDRH2 amino acid sequence (SEQ ID NO: 46) of the antibody 47), and the amino acid sequence of CDRH3 (SEQ ID NO: 48) is shown in FIG.
  • trastuzumab is also referred to as HERCEPTIN (registered trademark), huMAb4D5-8, rhuMAb4D5-8, and a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 49 and A humanized IgG1 antibody having a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:50.
  • the amino acid sequence was referenced from US5821337.
  • the light chain amino acid sequence (SEQ ID NO:49) and heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO:50) of trastuzumab are shown in FIG.
  • the anti-HER2 antibody is a modified trastuzumab constant region in which the leucines (L) at positions 234 and 235 of the EU index of the heavy chain amino acid sequence of trastuzumab are mutated to alanine (A) (also referred to herein as LALA mutation).
  • IgG1 antibodies also referred to herein as modified anti-HER2 antibodies
  • the light chain amino acid sequence (SEQ ID NO:49) and heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO:51) of the modified anti-HER2 antibody are shown in FIG.
  • Reference Example 16 Production of anti-HER2 antibody 2
  • Pertuzumab is sometimes called PERJETA (registered trademark), and has a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 52 and a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 53. is a humanized IgG1 antibody with See WO2004/008099 for the amino acid sequence. Also referred to herein as anti-HER2 antibody 2.
  • the light chain amino acid sequence (SEQ ID NO:52) and heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO:53) of pertuzumab are shown in FIG.
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 108 is the light chain variable region
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 119 is the heavy chain variable region, and the position of the variable region was determined according to the IMGT definition.
  • Anti-HER2 antibody 2 in addition to the LALA mutation, designed and produced anti-HER2 antibody 2 having a G1m3 allotype constant region in which lysine (K) at EU index 214 in the heavy chain amino acid sequence was mutated to arginine (R) (also referred to herein as modified anti-HER2 antibody 2).
  • FIG. 29 shows the light chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 52) and heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 54) of the modified anti-HER2 antibody 2.
  • CDRL1 amino acid sequence (SEQ ID NO: 57), CDRL2 amino acid sequence (SEQ ID NO: 58), CDRL3 amino acid sequence (SEQ ID NO: 59), CDRH1 amino acid sequence (SEQ ID NO: 60), CDRH2 amino acid sequence (SEQ ID NO: 60) of the antibody 61), and the amino acid sequence of CDRH3 (SEQ ID NO: 62) are shown in FIG.
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 108 is the light chain variable region
  • the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 119 is the heavy chain variable region, and the position of the variable region was determined according to the IMGT definition.
  • FIG. 30 shows the light chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 55) and heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 56) of the anti-CDH6 antibody.
  • CDRL1 amino acid sequence SEQ ID NO: 63
  • CDRL2 amino acid sequence SEQ ID NO: 64
  • CDRL3 amino acid sequence SEQ ID NO: 65
  • CDRH1 amino acid sequence SEQ ID NO: 66
  • CDRH2 amino acid sequence SEQ ID NO: 66
  • amino acid sequence of CDRH3 SEQ ID NO: 68
  • a non-oxazolinated O-linked sugar chain donor molecule or N-linked sugar chain donor molecule with one GlcNAc extended on the reducing end side may be used.
  • a wild-type enzyme- By allowing A to act, it is possible to obtain a reaction solution containing the desired product. Therefore, such applications are included in "step 1" of the present invention.
  • those skilled in the art can refer to this specification to identify the structures of enzyme-A and enzyme-B that work in concert, which are not exemplified in this example and specification.
  • Endo-S, Endo-Si, etc., and Endo-M Endo-Rp, Endo-CC (SEQ ID NO: 6), Endo-Om (SEQ ID NO: 7), Endo-A (GenBank Accession number: AAD10851), Endo-CE (GenBank Accession number: BAB84821), Endo-Tsp1006 (GenBank Accession number: CCY37287), En do-Tsp1263 (GenBank Accession number: CDD88945), Endo-Tsp1457 (GenBank Accession number: CDD89351), Endo-BB (GenBank Accession number: AAN25135), Endo-BH (GenBank Accession number: BAB04504.1), Endo-BN (GenBank Accession number er: WP_007484749.1), Endo-CC1 (GenBank Accession number: XP_001839402.1), Endo-CC2 (GenBank Accession number: XP_0029)
  • Enzyme-A of the present invention is an enzyme that can act on sugar chains of Fc-containing molecules.
  • Endo-BI1 GenBank Accession number: ACJ53522.1
  • Endo-BI2 GeneBank Accession number: BAJ71450.1
  • Endo-BT-3987 GeneBank Accession number: AAO 79092.1
  • Endo-E GeneBank Accession number : AAR20477.1
  • Endo-F GeneBank Accession number: AAA24922.1
  • Endo-F2 GenBank Accession number: AAA24923.1
  • Endo-F3 GenBank Accession number : AAA24924.1
  • Endo-CoM GeneBank Accession number: XP006673222
  • Endo-SB GeneBank Accession number: BBB35949
  • Endo-F3-Fc-binding peptide complex acts similarly to Endo-S, that is, by combining the enzyme-A fragment and the Fc-binding structure, artificially It was shown that it is possible to create enzymes that can act on the strand. Even when using an artificially produced enzyme-A, a person skilled in the art can refer to this specification to find out the structure of enzyme-A and concertedly It is possible to identify the structures of enzyme-A and enzyme-B that work, and obtain a reaction mixture containing the desired product. Therefore, such applications are included in "step 1" of the present invention. (However, an Fc binding structure is any peptide, nucleic acid, small molecule, etc. that shows affinity for an Fc fragment.)
  • the sugar chain donor molecule of the present invention is an N-linked sugar chain or an O-linked sugar chain that contains non-activated GlcNAc at the reducing end and may be chemically modified at the non-reducing end.
  • Sugar chain donor molecules are not limited to the sugar chains used in the examples of the present specification, and sugar chain donors having a triantennary type sugar chain structure, a tetraantennary type sugar chain structure, a sugar chain structure with a payload, etc. It is reasonably expected that it can also be applied to molecules. That is, by appropriately selecting Enzyme-B and Enzyme-A that can act on the above-described sugar chain donor molecule, the desired transglycosylation reaction proceeds.
  • Endo-S2 acts on Fc-containing molecules including GlcNAc, triantennary-type sugar chains, tetraantennary-type sugar chains, or payloads can be expected to work as Enzyme-A for introducing sugar chains loaded with . That is, even when a sugar chain donor molecule having a triantennary-type sugar chain structure, a tetraantennary-type sugar chain structure, a sugar chain structure with a payload, or the like is used, a person skilled in the art can refer to the present specification.
  • Step 1 Identify the structure of Enzyme-A and the structures of Enzyme-A and Enzyme-B that work in concert, which are not exemplified in this example and the specification, and obtain a reaction solution containing the desired product. is possible. Therefore, such applications are included in "Step 1".
  • Mogamulizumab (Poteligeo 20 mg, Kyowa Kirin Co., Ltd.) was used as the antibody, the sugar chain was cleaved with wild-type Endo-S, and after purification, ultrafiltration.
  • a membrane, Amicon Ultra-15, 30 kDa (Merck) was buffer-exchanged by concentration dialysis (UFDF) using 50 mM Tris-HCl (pH 7.25) to prepare acceptor molecule solution 9-1.
  • Soybean powder is known to contain the [M9-Asn] structure (non-patent literature: Chem. Biol. 2004, 127-134).
  • M8-Asn, M7-Asn, or M6-Asn has a structure lacking one, two, or three mannose from M9-Asn, respectively.
  • soybean powder Soybean Flour Type I, 1 kg, manufactured by Sigma-Aldrich
  • 0.15N sodium hydroxide aqueous solution 5 L
  • 0.15N sodium hydroxide aqueous solution 5 L
  • centrifuged 8000 rpm, 30 minutes
  • Supernatant 1 3.8 L
  • the equipment includes Agilent 1200 (made by Agilent Technologies), ORBITRAP ELITE (STRMO FISHER SCIENTICIC INC) and Hypercarb (THERMO FISHER SCIE).
  • NTIFIC Inc 5 ⁇ m, 4.6x150 mm
  • the mobile phase A is water and a moving phase.
  • Analysis was performed at a flow rate of 1.0 mL/min and 40° C. using a gradient in which acetonitrile was used for B and the mobile phase B changed from 5% to 15% in 15 minutes. Mainly, 4 peaks were confirmed.
  • Man8GlcNAc2-Asn is a structure in which one mannose on the non-reducing end side of M9-Asn is deleted.
  • ESI-MS Calcd for M8-Asn C68H112N4O53: [M-2H] 2- 916.31 (most abundant mass), Found 916.31.
  • Man7GlcNAc2-Asn is a structure of M9-Asn lacking two mannose on the non-reducing terminal side.
  • ESI-MS Calcd for M7-Asn C62H102N4O48: [M-2H] 2- 835.28 (most abundant mass), Found 835.28.
  • Man6GlcNAc2-Asn is a structure of M9-Asn lacking three mannose on the non-reducing terminal side.
  • ESI-MS Calcd for M6-Asn C62H102N4O48: [M-2H] 2- 754.26 (most abundant mass), Found 754.26.
  • Enzyme-B The essence of Enzyme-B that can be used in "Step 1" is a state in which Enzyme-A can be used for the transglycosylation reaction from a sugar chain donor molecule that does not have fucose to an Fc-containing molecule (activated intermediate). is the ability to activate
  • the transglycosylation reaction by Enzyme-A always competes with the hydrolysis reaction of the transglycosylation product. Under such circumstances, if the rate of activation of the sugar chain donor molecule by Enzyme-B is insufficient, the expected glycosylation rate is expected to be low. In order to solve this problem, it is necessary to properly use Enzyme-B according to the sugar chain structure of the sugar chain donor molecule.
  • Endo-A (GenBank Accession number: AAD10851), Endo-CE (GenBank Accession number: BAB84821), Endo-Tsp1006 (GenBank Accession number: BAB84821) session number: CCY37287), Endo-Tsp1263 (GenBank Accession number: CDD88945), Endo-Tsp1457 (GenBank Accession number: CDD89351), Endo-BB (GenBank Accession number: AAN2513 5), Endo-BH (GenBank Accession number: BAB04504.1), Endo-BN ( GenBank Accession number: WP_007484749.1), Endo-CC1 (GenBank Accession number: XP_001839402.1), Endo-CC2 (GenBank Accession number: XP_0029118 17.1), Endo-D (GenBank Accession number: AAK74656.1), or Endo-D -Pm (GenBank Accession number: AAD10851), Endo-CE (GenBank Accession number: BAB

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Abstract

【課題】可能な限り少ない糖鎖ドナー分子使用量で高純度の均一な糖鎖構造を有するＦｃ含有分子を製造する方法であって、残存加水分解活性や酵素種に関わらず幅広い選択肢から使用する酵素を自由に選択できる方法を確立すること等。 【解決手段】本明細書で詳述した工程１及び２を組み合わせることを特徴とする、所期のＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子の新規製造方法を提供すること等。

Description

Ｆｃ含有分子の製造方法
　本発明は、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子の製造方法、当該製造方法において好適に使用される新規糖鎖ドナー分子、及びＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子の単離方法等に関する。
　抗体は、重鎖分子中のＦｃ領域に位置する２９７番目のＡｓｎ側鎖に結合したＮ結合型糖鎖（Ｎ２９７結合糖鎖）を有する糖タンパク分子である。抗体は、基礎研究や医療分野において重要な分子であり、特に抗体医薬としての研究開発が盛んに進められており、糖鎖の様々な影響が明らかにされつつある（非特許文献１）。現在、主に使われている医療用抗体は、ＩｇＧクラスの分子であり、このような抗体は、一般的にＣＨＯ細胞やＮＳ０細胞に代表される培養動物細胞を用いて産生される。これら動物細胞で産生される抗体のＮ２９７結合糖鎖はｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ複合型糖鎖であるが、コアフコースや末端のシアル基やガラクトシル基、そしてｂｉｓｅｃｔｉｎｇ　ＧｌｃＮＡｃにおいて不均一である（非特許文献２）。抗体のＮ２９７結合糖鎖が、ＡＤＣＣ活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）やＣＤＣ活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を含むエフェクター活性に大きく影響することが明らかになっており（非特許文献３、非特許文献４）、血中半減期にも影響を及ぼす可能性が指摘されている（非特許文献５）。また、Ｎ２９７結合糖鎖の非還元末端が２，６－ｓｉａｌｙｌ化された抗体がＩＶＩＧ（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）における主要薬効成分であることが明らかになっている（非特許文献６）。更に、近年、化学修飾した糖鎖をリンカーとした抗体薬物複合体やペプチド－Ｆｃ複合体が開発されている（特許文献１～４、非特許文献７～９）。
　医療用の抗体や抗体Ｆｃ領域を含む糖タンパク分子に付加する糖鎖を均一にする方法としては、酵素を使った糖鎖転移反応が知られている（非特許文献１０～１２）。糖鎖転移反応には、単独のＥＮＧａｓｅを用いて還元末端をオキサゾリン化した糖鎖をＧｌｃＮＡｃ（Ｎ－アセチルグルコサミン）アクセプターに転移する方法（特許文献５～６、非特許文献１０～１１）と、２種類のＥＮＧａｓｅを使用して糖鎖をＧｌｃＮＡｃアクセプターに直接転移するワンポット法が知られている（非特許文献１２、特許文献１）。
　これまで、前者のオキサゾリン体（還元末端が活性化されている糖鎖ドナー分子）を利用する糖鎖転移反応が広く用いられてきた。しかしながら、水溶液中で不安定なオキサゾリン体を糖鎖ドナー分子に使用する場合、その不安定性から酵素非介在型の化学反応である抗体Ｌｙｓへの糖化反応（Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）が進行することが知られている（非特許文献７、９）。これを解決する一つの方法として、還元末端が活性化されていない糖鎖ドナー分子を利用する方法であるワンポット法が提案された。しかしながら、高純度の均一な糖鎖構造を有するＦｃ含有分子を取得するためには、大量の糖鎖ドナー分子使用量、１００当量から３００当量が必要とされた（特許文献１、非特許文献１２）。また、このワンポット法で使用されるＥＮＧａｓｅとしては、Ｅｎｄｏ－Ｓ変異酵素と、Ｅｎｄｏ－Ｍ変異酵素若しくはＥｎｄｏ－ＣＣ変異株の２種類の酵素の組合せが知られているが、糖鎖ドナー分子使用量を削減すると、糖鎖転移率が低くなることも確認されている。
　均一な糖鎖構造を有するＦｃ含有分子を医療用途にて用いる場合は、その製造コストを抑えるために高額な原料である糖鎖ドナー分子の使用量が低減されていることが望ましい。エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼを用いてＦｃ含有分子の糖鎖を均一にする方法において、糖鎖転移反応の効率を改善し、より少ない糖鎖ドナー分子使用量で高純度の均一な糖鎖構造を有するＦｃ含有分子を得るには、加水分解活性の抑えられた糖鎖転移酵素を探索するアプローチが考えられる。一方で、ワンポット法において、既に加水分解活性が抑制された変異酵素が選択されていた場合、同様のアプローチにて糖鎖ドナー分子の使用量を低減することは非常にハードルが高い。また、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは、由来となった生物種ごとに異なる基質特異性を有しており、目的に応じて使い分ける必要があるため、同アプローチの場合、加水分解活性の抑制度合いに応じて使用できる酵素の組み合わせが限定されてしまう。このため、残存加水分解活性や酵素種に関わらず、幅広い選択肢からエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼを自由に選択しつつ、より少ない糖鎖ドナー分子使用量で高純度の均一な糖鎖構造を有するＦｃ含有分子を得る方法が望まれていた。
国際公開２０１８／００３９８３号 国際公開２０１８／０９００４５号 国際公開２０１９／０６５９６４号 国際公開２０２０／０５０４０６号 国際公開２０１７／１２４０８４号 国際公開２０１８／０３９３７３号
Ａｒｎｏｌｄ　ＪＮ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２００７，　２５，　２１－５０ Ｊｅｆｆｅｒｉｓ　Ｒ，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｐｒｏｇ．　２００５，　２１，　１１－１６ Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ　Ｆ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２００８，　８，　３４－４７ Ｊｅｆｆｅｒｉｓ　Ｒ，　Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖ．　２００９，　８，　２２６－２３４ Ｂｕｍｂａｃａ　Ｄ，　ｅｔ　ａｌ．，　ＡＡＰＳ　Ｊ．　２０１２，　１４，　５５４－５５８ Ａｎｔｈｏｎｙ　ＲＭ，　　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２００８，　３２０，　３７３－３７６ Ｐａｒｓｏｎｓ　ＴＢ，　，　　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｇｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　Ｉｎｔ．　Ｅｄ．　Ｅｎｇｌ．　２０１６，５５，　２３６１－２３６７ Ｉｗａｍｏｔｏ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．　２０１８，　２９，　２８２９－２８３７ Ｍａｎａｂｅ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．　２０１９，　３０，１３４３－１３５５ Ｗａｎｇ　ＬＸ，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｌｙｃｏｓｃｉ　Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２０１１，　２３，　３３－５２ Ｈｕａｎｇ　Ｗ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ．　２０１２，　１３４，　１２３０８－１２３１８ Ｉｗａｍｏｔｏ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，　ＰＬｏＳ　ＯＮＥ　２０１８，　１３，　ｅ０１９３５３４
　本発明は、可能な限り少ない糖鎖ドナー分子使用量で高純度の均一な糖鎖構造を有するＦｃ含有分子を製造する方法であって、残存加水分解活性や酵素種に関わらず幅広い選択肢から使用する酵素を自由に選択できる方法を確立することや、当該方法において好適に使用できる新規糖鎖ドナー分子を提供すること、及びこのようなＦｃ含有分子を選択的に単離する方法を確立すること等を目的とする。
　発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、糖鎖転移反応で使用するエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ワンポット法においては、２つ以上のエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの組み合わせ）に関わらず、少ない糖鎖ドナー分子使用量であっても中程度以上の糖鎖転移率を有するＦｃ含有分子が得られる反応条件を設定できること、及び酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体に糖鎖転移反応混合液を接触させることで、目的物である糖鎖が付加されたＦｃ含有分子と未反応のＦｃ含有分子（アクセプター分子）を単離でき、結果的に、高純度の均一な糖鎖構造を有するＦｃ含有分子を収率よく回収できることを見出した。この知見を活かして、可能な限り少ない糖鎖ドナー分子使用量で、高純度の均一な糖鎖構造を有するＦｃ含有分子を取得する製造法を見出し、また、この製造法であれば、ワンポット法において、幅広い選択肢からエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの組み合わせを選択できること、また、それらのうちの特定の組み合わせの酵素を用いた糖鎖転移反応に適した新規な糖鎖ドナー分子を見出し、さらに、上述の酸性条件下での陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体を用いた単離工程が、Ｆｃ含有分子の製造法のみならず、単に、所期のＦｃ含有分子の単離にも適用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の発明を提供する。
［１］
　以下の工程１及び２を含む、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子の製造方法：
　［工程１］　Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有するＦｃ含有分子であるアクセプター分子と、糖鎖を含む糖鎖ドナー分子とを、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ａ）の存在下で反応させ、反応混合液を得る工程、
　［工程２］　前記反応混合液を、酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体に接触させ、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子を回収する工程。
［２］
　糖鎖ドナー分子が、還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを含む、［１］に記載の方法。
［３］
　工程１が、アクセプター分子と糖鎖ドナー分子とを、酵素－Ａ及び糖鎖ドナー分子の糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ｂ）の存在下で反応させ、反応混合液を得る工程である、［２］に記載の方法。
［４］
　糖鎖ドナー分子の糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ｂ）が、酵素－Ａの存在下、糖鎖ドナー分子に作用することで、酵素－Ａによる糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖のアクセプター分子への糖鎖転移反応を促進する性質を持つ酵素である、［３］に記載の方法。
［５］
　酵素－Ｂが、ＳＧＰからＧｌｃＮＡｃ誘導体への糖鎖転移活性を有する酵素である、［３］又は［４］に記載の方法。
［６］
　酵素－Ｂが、Ｅｎｄｏ－Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｏｍ、Ｅｎｄｏ－ＣＣ、又はＥｎｄｏ－Ｒｐの変異酵素であり、当該変異酵素はその対応する野生型酵素より低い加水分解活性を有する、［３］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］
　酵素－Ｂが、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｃ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｅ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｇ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｉ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｐ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｔ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｖ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｓ２１６Ｖ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ２４６Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｄ２７６Ｎ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ａ３１０Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ｆ３０７Ｙ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ｆ３０７Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ａ３１０Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２１４Ｆ／Ｆ３０７Ｙ／Ｌ３０６Ｉ、Ｅｎｄｏ－Ｍ　Ｎ１７５Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｍ　Ｎ１７５Ｑ／Ｙ２１７Ｆ、Ｅｎｄｏ－ＣＣ　Ｎ１８０Ｈ及びＥｎｄｏ－Ｏｍ　Ｎ１９４Ｑからなる群から選択される、［３］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］
　酵素－Ａと酵素－Ｂとが、融合されている、［３］～［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］
　工程１において、アクセプター分子１当量に対して２当量から４０当量の糖鎖ドナー分子が使用される、［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
　工程１において、糖鎖転移率が８０％を超える、［１］～［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］
　糖鎖ドナー分子が有する糖鎖が、非還元末端が化学修飾されていても良いＮ－結合型糖鎖又はＯ－結合型糖鎖である、［１］～［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］
　糖鎖ドナー分子が、非還元末端が化学修飾されていても良いＳＧＰ、ＡＧ（９）－Ｐ、ＡＧ（７）－Ｐ、ＳＧ-Ａｓｎ、ＡＧ(９)－Ａｓｎ、ＡＧ(７)－Ａｓｎ、ＳＧ－ＯＲ、ＡＧ（９）－ＯＲ、ＡＧ（７）－ＯＲ、（ＭＳＧ１）－Ａｓｎ、（ＭＳＧ２）－Ａｓｎ、（ＭＳＧ１）－Ａｓｎと（ＭＳＧ２）－Ａｓｎの混合物、ＭＳＧ１－ＯＲ、ＭＳＧ２－ＯＲ、又はＭＳＧ１－ＯＲとＭＳＧ２－ＯＲの混合物であり、式中、Ｒは、少なくとも一つの炭素原子を介して酸素原子に連結する任意の置換基である、［１１］に記載の方法。
［１３］
　Ｒが、Ｃ１～Ｃ６アルキル基又は置換されていても良いアリール基を示す、［１２］に記載の方法。
［１４］
　Ｒが、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｉ－ブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル基、及びｎ－ヘキシル基からなる群より選択されるか、又は、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、又はハロゲン基で置換されていてもよいフェニル基、ベンジル基、インデニル基、ナフチル基、フルオレニル基、アントラニル基、及びフェナンスレニル基からなる群より選択される、［１３］に記載の方法。
［１５］
　Ｒが、ＰＭＰ、Ｍｅ、Ａ－Ｍｏｒ、ｉＰｒ、ｎＰｒ、ＰｒＯＭｅ及びＡ－ＰＥＧ－Ｎ３（Ａはグリコール酸ユニット中のアセチル基、すなわち、アノマー水酸基と、ＭｏｒまたはＰＥＧ中のアミノ基に挟まれた部分を表す）からなる群より選択される、［１２］～［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］
　糖鎖ドナー分子が、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ）－Ｐ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、又は（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３と（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３の混合物である［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１７］
　糖鎖ドナー分子が、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ）－ＯＲ、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１）－ＯＲ、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２）－ＯＲ、又は（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１）－ＯＲと（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２）－ＯＲの混合物である、［１２］～［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］
　糖鎖ドナー分子が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
からなる群より選択される式によって表される化合物である、［１１］～［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］
　Ｆｃ含有分子が、免疫グロブリン、ＣＬＣＨ又はＦｃ含有断片である、［１］～［１８］のいずれか一項に記載の方法。
［２０］
　Ｎ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎアセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ａ）が、Ｆｃ含有分子の糖鎖に作用できる、加水分解活性が残留していてもよい酵素である、［１］～［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］
　酵素－Ａが、Ｅｎｄｏ－Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ、Ｅｎｄｏ－Ｓｅ、Ｅｎｄｏ－Ｓｄ、又はＥｎｄｏ－Ｓｚの変異酵素であり、当該変異酵素はその対応する野生型酵素より低い加水分解活性を有する、［１］～［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］
　酵素－Ａが、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｎ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｄ４０５Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ／Ｑ３１１Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ／Ｅ３６０Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ／Ｑ３１１Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ／Ｅ３６０Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｔ１９０Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｔ１９０／Ｄ２４１Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｔ１９０Ｑ／Ｄ２４１Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８４Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｔ１３８Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８４Ｑ／Ｑ２５０Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８４Ｍ／Ｑ２５０Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓｅ　Ｄ２３３Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓｚ　Ｄ２３４Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓｚ　Ｄ２３４Ｍ／Ｑ３０４Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１X１（X１は、Ｋ、Ｒ及びＤ以外のいずれかのアミノ酸残基を示す）、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｔ１９０X２（X２は、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｗ又はＹのアミノ酸残基を示す）、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｑ３１１X３（X３は、Ｆ、Ｎ、又はＹのアミノ酸残基を示す）、又はＥｎｄｏ－Ｓｉ　Ｅ３６０Ｋである、［２１］に記載の方法。　　
［２３］
　工程１の反応系内ｐＨが、６．５から８．０の範囲である、［１］～［２２］のいずれか一項に記載の方法。
［２４］
　工程１の反応系内最終アクセプター分子濃度が、２０ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下である、［１］～［２３］のいずれか一項に記載の方法。
［２５］
　陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体の素通り画分に、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子を回収する、［１］～［２４］のいずれか一項に記載の方法。
［２６］
　工程２における酸性条件がｐＨ３．５から４．５の範囲を意味する、［１］～［２５］のいずれか一項に記載の方法。
［２７］
　クロマトグラフィー媒体が粒子状、メンブレン状、又はモノリス状である、［１］～［２６］のいずれか一項に記載の方法。
［２８］
　クロマトグラフィー媒体が陽イオン交換クロマトグラフィー媒体である、［１］～［２７］のいずれか一項に記載の方法。
［２９］
　糖鎖が、アジド基（Ｎ３－）を有する置換基で化学修飾されている非還元末端を有し、当該方法が、更に、当該糖鎖のアジド基（Ｎ３－）に、アルキン構造を有する分子を反応させる工程を含む、［１］～［２８］のいずれか一項に記載の方法。
［３０］
　アルキン構造を有する分子が、化学療法剤、分子標的薬、免疫賦活化剤、毒素、光感受性物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、診断用薬剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸分子、核酸、抗原、ビタミン、及びホルモンから選択される、［２９］に記載の方法。
［３１］
　化学療法剤が、カンプトテシン、ピロロベンゾジアゼピン、ドキソルビシン、オーリスタチン、タキサン及びこれらの誘導体から選択される、［３０］に記載の方法。
［３２］
　免疫賦活化剤が、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＴＬＲアゴニスト、及びＡ２ＡＲアンタゴニストから選択される、［３０］に記載の方法。
［３３］
　アルキン構造を有する分子が、（Ａ）～（Ｅ）からなる群から選択される、［２９］～［３２］のいずれか一項に記載の方法；
（Ａ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、
（Ｂ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－［４－（｛［（１１’Ｓ，１１’ａＳ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－（３－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝プロポキシ）－５’－オキソ－１１’，１１’ａ－ジヒドロ－１’Ｈ，３’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］－Ｌ－アラニンアミド、
（Ｃ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、
（Ｄ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１０’，１１’，１１ａ’－テトラヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、並びに、
（Ｅ）（ビス（Ｎ，Ｎ－ジエチルエタンアミニウム）　Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛９－［（５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－２，１０－ジオキソ－２，１０－ジスルフィド－１４－（６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］グリシンアミド。
［３４］
　［１］～［３３］のいずれか一項に記載の方法によって製造された、Ｆｃ含有分子。
［３５］
　Ｎ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子の単離方法であって、前記Ｆｃ含有分子と１つ以上の不純物を含む溶液を、酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体に接触させ、不純物を選択的に陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体にトラップさせる工程、又は前記Ｆｃ含有分子を選択的に陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体にトラップさせる工程を含む、前記方法。
［３６］
　Ｎ２９７結合糖鎖が、複合型糖鎖を含む、［３５］に記載の方法。
［３７］
　Ｎ２９７結合糖鎖が、フコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃではなく、及び、前記１つ以上の不純物が、Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有する以外は前記Ｆｃ含有分子と同一である分子を含む、［３５］又は［３６］に記載の方法。
［３８］
　クロマトグラフィー媒体が陽イオン交換クロマトグラフィー媒体である、［３５］～［３７］のいずれか一項に記載の方法。
［３９］
　以下の工程１及び２を含む、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子の単離方法：
　［工程１］　Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有するＦｃ含有分子であるアクセプター分子と、糖鎖を含む糖鎖ドナー分子とを、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ａ）の存在下で反応させ、反応混合液を得る工程、
　［工程２］　前記反応混合液を、酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体に接触させ、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子を単離する工程。
［４０］
　クロマトグラフィー媒体が陽イオン交換クロマトグラフィー媒体である、［３９］に記載の方法。
［４１］
　Ｎ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子が、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＤＬＬ３抗体、抗ＦＡＰ抗体、抗ＣＤＨ１１抗体、抗ＣＤＨ６抗体、抗Ａ３３抗体、抗ＣａｎＡｇ抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ９８抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体、抗ＥＮＰＰ３抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＧＰＲ２０抗体、及び抗ＤＲ５抗体からなる群から選択される抗体に由来する、［１］～［４０］のいずれか一項に記載の方法またはＦｃ含有分子。
［４２］
　以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
からなる群より選択される式によって表される化合物。
［４３］
　酵素－Ａと酵素－Ｂとの融合タンパクであって、
　酵素－Ａは、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼであり、
　酵素－Ｂは、糖鎖の還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖含有分子の糖鎖を基質とするが、前記Ｎ２９７結合糖鎖を基質としない、又は、前記Ｎ２９７結合糖鎖への反応性が低いエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼである、融合タンパク。
　本発明における製造方法では、酸性条件下での陽イオン交換クロマトグラフィーにより、目的物である糖鎖が付加されたＦｃ含有分子と未反応のＦｃ含有分子（アクセプター分子）を分離できるため、可能な限り少ない糖鎖ドナー分子使用量で高純度の均一な糖鎖構造を有するＦｃ含有分子を製造することが可能となる。また、特に、本発明における製造方法をワンポット法に適用する場合、上記の単離工程にて、所期のＦｃ含有分子の純度を高めることができるため、糖鎖転移反応そのものの効率を極度に高める必要がなくなり、結果的に、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖に対して糖鎖転移活性を示す酵素－Ａと、糖鎖ドナー分子における糖鎖を活性化する性質を示す酵素－Ｂを、幅広い選択肢から自由に選択することが可能となる。つまり、酵素の生産性、及び物性という視点から、大量製造プロセスに適した酵素を自由に設定することが可能となる。
　また、本発明の製造方法をワンポット法に適用する場合、糖鎖ドナー分子として、化学的に還元末端が活性化されていないＮ－結合型糖鎖、あるいはＯ－結合型糖鎖の中から自由に選択することが可能となる。つまり、化学的に還元末端が活性化されているオキサゾリン体を糖鎖ドナー分子として設定する場合と異なり、中性付近の水溶液中で自然分解せず、Ｆｃ含有分子中のＬｙｓと直接化学結合を形成しない、化学的に安定な構造を有する糖鎖ドナー分子を設定することが可能となる。
　以上のことから、均一な糖鎖構造を有するＦｃ含有分子を、効率よく取得するための糖鎖ドナー分子必要量の削減が可能となり、糖鎖リモデリングされたＦｃ含有分子の製造コストの低減につながる。
　また、本発明の一態様では、ワンポット法における糖鎖転移反応、特に、特定のエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの組み合わせを用いた糖鎖転移反応に適した新規な糖鎖ドナー分子が提供され、さらに、本発明の別の一態様では、所期のＦｃ含有分子を不純物から単離することを含む、新規単離方法が提供される。
アクセプター分子（（Ｆｕｃα１，　６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ）、糖鎖ドナー分子（Ｘ－ＳＧ－Ｚ）、酵素－Ａ、及び酵素－Ｂを混合したワンポット反応における、糖鎖転移反応の模式図である。 糖鎖ドナー分子代表例の構造式一覧である 糖鎖ドナー分子、及びＧ－１、Ｇ－３、あるいは、Ｇ－４のいずれかを使用した場合の糖鎖転移反応の模式図である。 糖鎖ドナー分子、及びＧ－１からＧ－１７のいずれかを使用した場合の糖鎖転移反応の模式図である。 ワンポット反応の競合反応となる加水分解反応の模式図である。 酵素－Ａを用いたｍＡｂ２の加水分解活性反応の模式図である。 野生型Ｅｎｄｏ－Ｓのアミノ酸配列（配列番号６９）である。酵素の触媒活性中心部位に相当するアミノ酸残基を太字下線、実施例で使用した変異酵素において置換したアミノ酸残基、又は変異を加えることで酵素活性を制御できることが期待できるアミノ酸残基を太字で示した。 野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２のアミノ酸配列（配列番号７０）である。酵素の触媒活性中心部位に相当するアミノ酸残基を太字下線、実施例で使用した変異酵素において置換したアミノ酸残基、又は変異を加えることで酵素活性を制御できることが期待できるアミノ酸残基を太字で示した。 野生型Ｅｎｄｏ－Ｓｉのアミノ酸配列（配列番号７１）である。酵素の触媒活性中心部位に相当するアミノ酸残基を太字下線、実施例で使用した変異酵素において置換したアミノ酸残基、又は変異を加えることで酵素活性を制御できることが期待できるアミノ酸残基を太字で示した。 野生型Ｅｎｄｏ－Ｍのアミノ酸配列（配列番号７２）である。酵素の触媒活性中心部位に相当するアミノ酸残基を太字下線、実施例で使用した変異酵素において置換したアミノ酸残基、又は変異を加えることで酵素活性を制御できることが期待できるアミノ酸残基を太字で示した。 野生型Ｅｎｄｏ－Ｒｐのアミノ酸配列（配列番号７３）である。酵素の触媒活性中心部位に相当するアミノ酸残基を太字下線、実施例で使用した変異酵素において置換したアミノ酸残基、又は変異を加えることで酵素活性を制御できることが期待できるアミノ酸残基を太字で示した。 野生型Ｅｎｄｏ－ＣＣのアミノ酸配列（配列番号７４）である。酵素の触媒活性中心部位に相当するアミノ酸残基を太字下線、変異を加えることで酵素活性を制御できることが期待できるアミノ酸残基を太字で示した。 野生型Ｅｎｄｏ－Ｏｍのアミノ酸配列（配列番号７５）である。酵素の触媒活性中心部位に相当するアミノ酸残基を太字下線、変異を加えることで酵素活性を制御できることが期待できるアミノ酸残基を太字で示した。 抗ＣＤ７０抗体１軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１）及び抗ＣＤ７０抗体１重鎖のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。 抗ＣＤ７０抗体２軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３）及び抗ＣＤ７０抗体２重鎖のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。 抗ＴＲＯＰ２抗体１軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５）及び抗ＴＲＯＰ２抗体１重鎖のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。 抗ＴＲＯＰ２抗体２軽鎖のアミノ酸配列（配列番号７）及び抗ＴＲＯＰ２抗体２重鎖のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。 抗ＥＧＦＲ抗体１軽鎖のアミノ酸配列（配列番号９）及び抗ＥＧＦＲ抗体１重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。 抗ＥＧＦＲ抗体２の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１１）及び抗ＥＧＦＲ抗体２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。 抗ＣＤ７０抗体１のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号１３）、抗ＣＤ７０抗体１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号１４）、抗ＣＤ７０抗体１のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号１５）、抗ＣＤ７０抗体１のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号１６）、抗ＣＤ７０抗体１のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号１７）、及び抗ＣＤ７０抗体１のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号１８）を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義により決定した。 抗ＣＤ７０抗体２のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号１９）、抗ＣＤ７０抗体２のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号２０）、抗ＣＤ７０抗体２のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号２１）、抗ＣＤ７０抗体２のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号２２）、抗ＣＤ７０抗体２のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号２３）、及び抗ＣＤ７０抗体２のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号２４）を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義により決定した。 抗ＴＲＯＰ２抗体１のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号２５）、抗ＴＲＯＰ２抗体１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号２６）、抗ＴＲＯＰ２抗体１のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号２７）、抗ＴＲＯＰ２抗体１のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号２８）、抗ＴＲＯＰ２抗体１のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号２９）、及び抗ＴＲＯＰ２抗体１のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号３０）を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義により決定した。 抗ＴＲＯＰ２抗体２のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号３１）、抗ＴＲＯＰ２抗体２のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号３２）、抗ＴＲＯＰ２抗体２のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号３３）、抗ＴＲＯＰ２抗体２のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号３４）、抗ＴＲＯＰ２抗体２のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号３５）、及び抗ＴＲＯＰ２抗体２のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号３６）を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義により決定した。 抗ＥＧＦＲ抗体１のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号３７）、抗ＥＧＦＲ抗体１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号３８）、抗ＥＧＦＲ抗体１のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号３９）、抗ＥＧＦＲ抗体１のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号４０）、抗ＥＧＦＲ抗体１のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号４１）、及び抗ＥＧＦＲ抗体１のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号４２）を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義により決定した。 抗ＥＧＦＲ抗体２のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号４３）、抗ＥＧＦＲ抗体２のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号４４）、抗ＥＧＦＲ抗体２のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号４５）、抗ＥＧＦＲ抗体２のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号４６）、抗ＥＧＦＲ抗体２のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号４７）、及び抗ＥＧＦＲ抗体２のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号４８）を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義により決定した。 トラスツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４９）及びトラスツズマブ重鎖のアミノ酸配列（配列番号５０）を示す。 改変ＨＥＲ２抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号４９）及び改変ＨＥＲ２抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号５１）を示す。 ペルツズマブ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５２）及びペルツズマブ重鎖のアミノ酸配列（配列番号５３）を示す。 改変ＨＥＲ２抗体２の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５２）及び改変ＨＥＲ２抗体２の重鎖のアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。 抗ＣＤＨ６抗体の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号５５）及び抗ＣＤ３３抗体の重鎖のアミノ酸配列（配列番号５６）を示す。 ペルツズマブのＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号５７）、ペルツズマブのＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号５８）、ペルツズマブのＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号５９）、ペルツズマブのＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号６０）、ペルツズマブのＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号６１）、及びペルツズマブのＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号６２）を示す。ＣＤＲ配列はＩＭＧＴの定義により決定した。 抗ＣＤＨ６抗体のＣＤＲＬ１アミノ酸配列（配列番号６３）、抗ＣＤＨ６抗体のＣＤＲＬ２アミノ酸配列（配列番号６４）、抗ＣＤＨ６抗体のＣＤＲＬ３アミノ酸配列（配列番号６５）、抗ＣＤＨ６抗体のＣＤＲＨ１アミノ酸配列（配列番号６６）、抗ＣＤＨ６抗体のＣＤＲＨ２アミノ酸配列（配列番号６７）、及び抗ＣＤＨ６抗体のＣＤＲＨ３アミノ酸配列（配列番号６８）を示す。ＣＤＲ配列はＫａｂａｔの定義により決定した。 野生型Ｅｎｄｏ－Ｓｄのアミノ酸配列（配列番号７６）である。酵素の触媒活性中心部位に相当するアミノ酸残基を太字下線、実施例で使用した変異酵素において置換したアミノ酸残基、又は変異を加えることで酵素活性を制御できることが期待できるアミノ酸残基を太字で示した。 野生型Ｅｎｄｏ－Ｓｚのアミノ酸配列（配列番号７７）である。酵素の触媒活性中心部位に相当するアミノ酸残基を太字下線、実施例で使用した変異酵素において置換したアミノ酸残基、又は変異を加えることで酵素活性を制御できることが期待できるアミノ酸残基を太字で示した。 野生型Ｅｎｄｏ－Ｓｅのアミノ酸配列（配列番号７８）である。酵素の触媒活性中心部位に相当するアミノ酸残基を太字下線、実施例で使用した変異酵素において置換したアミノ酸残基、又は変異を加えることで酵素活性を制御できることが期待できるアミノ酸残基を太字で示した。 配列番号７９の配列（［Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ／Ｑ３１１Ｌ］－［Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｖ］の融合タンパク質）を示す図である。実施例で記載した融合タンパク質において置換したアミノ酸残基を太字で示し、アミノ酸リンカー配列を下線で示した。 配列番号８０の配列（［Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｖ］－［Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ／Ｑ３１１Ｌ］の融合タンパク質）を示す図である。実施例で使用した融合タンパク質において置換したアミノ酸残基を太字で示し、アミノ酸リンカー配列を下線で示した。 配列番号８１の配列（［Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｈ］－［Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ／Ｑ３１１Ｌ］の融合タンパク質）を示す図である。実施例で使用した融合タンパク質において置換したアミノ酸残基を太字で示し、アミノ酸リンカー配列を下線で示した。
　以下に、本発明を詳細に説明する。
　本明細書において、分子中に含まれるアミノ酸の表記法は、本分野の慣例に従い、変異箇所を示す場合は野生型のアミノ酸の一文字表記とその番号（例えば、２４１番目のＡｓｐであれば「Ｄ２４１」）により表す。また、変異については、野生型のアミノ酸の一文字表記、その番号及び変異後のアミノ酸の一文字表記（例えば、２４１番目のＡｓｐがＧｌｎに置換された変異は「Ｄ２４１Ｑ」）により表す。また、変異を有する特定の変異体は、分子名と変異（例えば、Ｅｎｄｏ－Ｓｉの２４１番目ＡｓｐがＧｌｎに置換された変異体は、「Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ」）により表し、複数の変異を有する場合は、変異の間を「／」で区切る形（例えば、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑにおいて、３１１番目のＧｌｎがＬｅｕに置換された追加変異を有する変異体は、「Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ／Ｑ３１１Ｌ」）と表す。
　本発明の一態様において、以下の工程１及び２を含む、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子の製造方法が提供される。
　［工程１］Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有するＦｃ含有分子であるアクセプター分子と、糖鎖を含む糖鎖ドナー分子とを、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ａ）の存在下で反応させ、反応混合液を得る工程、
　［工程２］前記反応混合液を、酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体に接触させ、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子を回収する工程。
＜Ｎ２９７結合糖鎖＞
　本発明において、「Ｎ２９７結合糖鎖」とは、ＩｇＧ重鎖の２９７番目のＡｓｎの側鎖に結合している状態のＮ結合型糖鎖を意味し、また、任意の手法でＩｇＧ重鎖のＮ結合型糖鎖の付加位置を変更した場合であっても、Ｎ結合型糖鎖が酵素－Ａの作用を受ける限りＮ２９７結合糖鎖に含まれるものとする。例えば、本発明の一態様において、ＩｇＧ重鎖を断片化した場合、当該Ａｓｎを含むペプチド断片において、対応するＡｓｎに結合している状態の糖鎖であっても、Ｎ２９７結合糖鎖に含まれる。通常、動物等で産生されたＩｇＧにおけるＮ２９７結合糖鎖は、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）の構造からなる基本構造を有しており、その非還元末端は、さらに化学修飾されていてもよく、例えばＧａｌやシアル酸が付加していてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　細胞が産生するＩｇＧのＮ２９７結合糖鎖の多くは、この基本構造において、その還元末端のＧｌｃＮＡｃ（コアＧｌｃＮＡｃ）、非還元末端、分岐糖などにおいてさらに糖鎖が結合したものを含む、糖鎖構造の多様性を有している。Ｎ２９７結合糖鎖は、コアＧｌｃＮＡｃの６位にフコース（Ｆｕｃ）がα１，６結合したコアフコースを有する構造（（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ）を有していてもよい。分岐糖であるＭａｎにおいては、その５位にさらにＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖が結合した３分岐型の糖鎖を形成している場合もある。非還元末端のＧｌｃＮＡｃにおいては、ガラクトース（Ｇａｌ）やシアル酸（Ｓｉａ）を含む糖鎖がさらに結合している場合もある。
＜糖鎖ドナー分子＞
　本発明において、「糖鎖ドナー分子」（「糖鎖供与体」ともいう）とは、アクセプター分子に糖鎖を供与する分子を意味する。
　創薬を目的とした糖鎖リモデリングに用いる場合、ヒトへ適用した際に問題の少ないヒト型糖鎖、又は、ヒト適合型糖鎖を有する糖鎖ドナー分子を採用することが好ましい。このような糖鎖は、ヒトの体内で抗原性を示さないことが知られている糖鎖であり、Ｎ－結合型糖鎖では、ハイマンノース型、混成（ハイブリッド）型、複合（コンプレックス）型などが知られている。これら３つには共通の基本構造がある。ハイマンノース型は、還元末端に近い位置にあるマンノース（βマンノース）から枝分かれした２つの分岐鎖（１－３鎖、１－６鎖）に、複数のマンノースが連続したマンノースリッチ構造を有する糖鎖である。混成型とは、還元末端に近い位置にあるマンノース（βマンノース）から枝分かれした２つの分岐鎖（１－３鎖、１－６鎖）のうち、一方がＧｌｃＮＡｃを有する構造となったものである。複合型とは、還元末端に近い位置にあるマンノース（βマンノース）から枝分かれした２つの分岐鎖（１－３鎖、１－６鎖）にＧｌｃＮＡｃを有する構造となったものであり、ガラクトースの有無、シアル酸の有無、さらにこれらの結合異性や位置異性を含む多彩な構造を有するものである。複合型糖鎖としては２分岐型、３分岐型又は４分岐型のものが知られている。
　以下に、ハイマンノース型、混成型及び複合型の構造の例を示す。なお、これらの共通の基本構造を、点線四角で示す（点線四角内には、βマンノースの４位に導入されたＧｌｃＮＡｃ（バイセクティングＧｌｃＮＡｃ）を含む構造と、含まない構造が混在するが、本明細書においては、いずれも共通の基本構造を指すものとする）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　本発明において、糖鎖ドナー分子における糖鎖部分は、ハイマンノース型糖鎖、混成型糖鎖及び複合型糖鎖のいずれであってもよいが、好ましくは、ハイマンノース型糖鎖又は複合型糖鎖であり、特に好ましくは、複合型糖鎖である。したがって、本発明の一態様において、糖鎖ドナー分子は、複合型糖鎖を含む。また、本発明において、複合型糖鎖は、２分岐型、３分岐型又は４分岐型のいずれであってもよいが、好ましくは、本発明の糖鎖ドナー分子は、２分岐型の複合型糖鎖を含む。
　本発明の一態様において、本発明における糖鎖ドナー分子は、糖鎖の還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖含有分子、又は糖鎖の還元末端が活性化されたＧｌｃＮＡｃ（例えば、オキサゾリン化されたＧｌｃＮＡｃ）を有する糖鎖含有分子である。本明細書において、化学的な手法で合成された糖鎖ドナー分子の還元末端の活性化とは、糖鎖ドナー分子の還元末端のアノマー位の反応性が化学的に高められた状態を指し、典型的には、当該アノマー位がオキサゾリン化又はハロゲン化されている状態を指す。すなわち、活性化された糖鎖ドナー分子単独で単離精製が可能な状態を指す。
　一方、酵素－Ｂが、還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖を含む糖鎖ドナー分子に作用することで、酵素－Ａが、当該糖鎖ドナー分子を所期の糖鎖転移反応に利用可能な状態とする活性化とは、糖鎖ドナー分子の還元末端のアノマー位の反応性が酵素学的に高められた状態を指す。すなわち、活性化中間体が生成することを意味し、活性化された糖鎖ドナー分子単独では単離精製が不可能な状態を指す。
　本発明の一態様において、糖鎖ドナー分子は、糖鎖の還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖含有分子であり、好ましくは、ＳＧＰ、（ＳＧ－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ１－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ２－）Ａｓｎ若しくは（ＭＳＧ１－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ２－）Ａｓｎの混合物を挙げることができる。これらの糖鎖部分は、Ｎ－結合型糖鎖の代表であり、以下の構造式及び配列式で示される構造からなるシアリルグリカン（Ｓｉａｌｙｌ　Ｇｌｙｃａｎ、以下、「ＳＧ」という）を含む。還元末端側糖鎖の結合様式をＮ－結合型からＯ－結合型へと変更しても良い。なお、本明細書において、特別な記載がない限り、アミノ酸の側鎖において糖鎖と連結した場合の部分構造は、側鎖部分を括弧で表示し、上記のように、例えば、「（ＳＧ－）Ａｓｎ」のように表記するものとする。また本明細書において、ＳＧのβ－Ｍａｎの分岐鎖のいずれか一方のみで非還元末端のシアル酸が欠失した糖鎖構造をＭＳＧといい、分岐鎖の１－３糖鎖のみにシアル酸を有するものをＭＳＧ１、分岐鎖の１－６糖鎖のみにシアル酸を有するものをＭＳＧ２、とそれぞれ表記するものとする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 （式中、「－（Ｎ／Ｏ）」は、Ｎ原子又はＯ原子とグリコシド結合することを示す。）
　本発明で用いることができる糖鎖ドナー分子における糖鎖部分の具体例として、ＳＧをノイラミニダーゼ処理し、２つの非還元末端のＮｅｕＡｃを欠失させたＡＧ(９)（以下の構造式及び配列式のＡＧ(９)）、ＡＧ（９）をガラクトシダーゼ処理し、２つの非還元末端のＧａｌを欠失させたＡＧ(７）（以下構造式及び配列式のＡＧ(７)）、などを例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 （式中、「－（Ｎ／Ｏ）」は、Ｎ原子又はＯ原子とグリコシド結合することを示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 （式中、「－（Ｎ／Ｏ）」は、Ｎ原子又はＯ原子とグリコシド結合することを示す。）
　本発明において、糖鎖ドナー分子は、化学修飾されていてもよく、例えば、非還元末端が化学修飾されていてもよい。
　本発明で用いることができる非還元末端が化学修飾されていてもよい糖鎖ドナー分子における糖鎖部分の例として、野生型のシアル酸上の部位が任意の置換基により化学修飾されている誘導体（ＳＧ型）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 （式中、Ｘは、β－Ｍａｎの分岐鎖の１－３鎖側及び１－６鎖側の両方の非還元末端のシアル酸上に導入された置換基を表し、有機合成化学の分野で公知の様々な方法を適用して合成できる置換基であり、抗体－薬物コンジュゲート合成に応用されている結合法に使用される置換基を参考に（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，２１９８－２２１５）して、例えば、アセチレン基、アジド基（Ｎ３－）、ジベンジルシクロオクテン（ＤＢＣＯ）基、ビシクロ［６．１．０］ノン－４－エン（ＢＣＮ）基、１，２，４，５－テトラジン環を含む構造、アルデヒド基、ＳＨ基、メチルスルフォニルトリアゾール基など、を挙げることができ、好ましくは、アセチレン基、アジド基（Ｎ３－）、さらに好ましくは、アジド基（Ｎ３－）を有する置換基を挙げることができるが、これらに限定されない。また、「アジド基（Ｎ３－）を有する置換基」としては、例えば、Ｎ３を有するポリエチレングリコールリンカー、すなわち、リンカー構造に含まれるエチレングリコール単位（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）の個数の上限は約２０個以下であり、好ましくは約１１個以下であり、より好ましくは約７個以下であり、「アジド基（Ｎ３－）を有する置換基」としては、例えば、Ｎ３を有するポリエチレングリコールリンカー（例えば、３５－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３－ウンデカオキサペンタトリアコンタン－１－アミノ基、３２－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０－デカオキサドトリアコンタン－１－アミノ基、２９－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサノナコサン－１－アミノ基、２６－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘキサコサン－１－アミノ基、２３－アジド－３，６，９，１２，１５，１８，２１－ヘプタオキサトリコサン－１－アミノ基、２０－アジド－３，６，９，１２，１５，１８－ヘキサオキサエイコサン－１－アミノ基、１７－アジド－３，６，９，１２，１５－ペンタオキサヘプタデカン－１－アミノ基、１４－アジド－３，６，９，１２－テトラオキサテトラデカン－１－アミノ基、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミノ基、２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エチルアミノ基、２－（アジドエトキシ）エチルアミノ基、２－アジドエチルアミノ基、２－［２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］－Ｎ－［２－［２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エトキシ］エチル］エタンアミン基など、直鎖状の置換基、あるいは、１，３－ビス［２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エトキシ］プロパン－２－アミノ基、３－［２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エトキシ］－２－［２－［２－（２－アジドエトキシ）エトキシ］エトキシメチル］プロパン－１－アミノ基など分岐している置換基等）を挙げることができるが、これらに限定されない。式中、「－（Ｎ／Ｏ）」は、Ｎ原子又はＯ原子とグリコシド結合することを示す。）
　ここに示したＸ－ＳＧ型の構造のうち、β－Ｍａｎの分岐鎖の１－６鎖側の化学修飾シアル酸が欠損した構造であるＸ－ＭＳＧ１型、１－３鎖側の化学修飾シアル酸が欠損した構造であるＸ－ＭＳＧ２型も、非還元末端が化学修飾されていてもよい糖鎖ドナー分子における糖鎖部分の例として挙げられる。
　さらに、化学修飾されてもよい部位は、シアル酸以外でも考えられ、以下、ＡＧ(９)型の誘導体、ＡＧ(７)型の誘導体が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 （式中、Ｘは、β－Ｍａｎの分岐鎖の１－３鎖側及び１－６鎖側の両方の非還元末端のガラクトース上に導入された置換基を表し、具体的には、上記において規定したものと同じ意味を表す。式中、「－（Ｎ／Ｏ）」は、Ｎ原子又はＯ原子とグリコシド結合することを示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 （式中、Ｘは、β－Ｍａｎの分岐鎖の１－３鎖側及び１－６鎖側の両方の非還元末端のＧｌｃＮＡｃ上に導入された置換基を表し、具体的には、上記において規定したものと同じ意味を表す。式中、「－（Ｎ／Ｏ）」は、Ｎ原子又はＯ原子とグリコシド結合することを示す。）
　ここに示したＸ－ＡＧ(９)型の構造のうち、β－Ｍａｎの分岐鎖の１－６鎖側の化学修飾ガラクトースが欠損した構造、１－３鎖側の化学修飾ガラクトースが欠損した構造、あるいは、Ｘ－ＡＧ(７)型の構造のうち、β－Ｍａｎの分岐鎖の１－６鎖側の化学修飾ＧｌｃＮＡｃが欠損した構造、１－３鎖側の化学修飾ＧｌｃＮＡｃが欠損した構造についても、ドナー分子における糖鎖部分の例として挙げられる。
　本発明の糖鎖ドナー分子は、好ましくは、非還元末端が化学修飾されていても良いＳＧＰ、ＡＧ（９）－Ｐ、ＡＧ（７）－Ｐ、ＳＧ-Ａｓｎ、ＡＧ(９)-Ａｓｎ、ＡＧ(７)-Ａｓｎ、ＳＧ－ＯＲ、ＡＧ（９）－ＯＲ、ＡＧ（７）－ＯＲ、（ＭＳＧ１）－Ａｓｎ、（ＭＳＧ２）－Ａｓｎ、（ＭＳＧ１）－Ａｓｎと（ＭＳＧ２）－Ａｓｎの混合物、ＭＳＧ１－ＯＲ、ＭＳＧ２－ＯＲ、又はＭＳＧ１－ＯＲとＭＳＧ２－ＯＲの混合物を挙げることができ、又は、図２に示した構造を有する糖鎖ドナー分子を挙げることができる。なお、以上の構造式中、「Ｐ」はＳＧＰに由来するペプチド部分を示し、図２における「Ｘ」は、上記において規定したものと同じ意味を表す。本発明の糖鎖ドナー分子として、さらに好ましくは、Ｎ－結合型糖鎖を含むものとして、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ）－Ｐ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、又は（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３と（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３の混合物を挙げることができ、Ｏ－結合型糖鎖を含むものとして、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ）－ＯＲ、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１）－ＯＲ、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２）－ＯＲ、又は（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１）－ＯＲと（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２）－ＯＲの混合物を挙げることができる。さらに、本発明の一態様において、糖鎖ドナー分子として、好ましくは、＜新規糖鎖ドナー分子＞の章において具体的に開示する新規糖鎖ドナー分子を挙げることができる。本発明の糖鎖ドナー分子は、使用する酵素－Ａと酵素－Ｂの組み合わせ等の諸条件に応じて、適宜、選択することが好ましい。
　上記の化学式において、「Ｒ」は、少なくとも一つの炭素原子を介して酸素原子に連結する任意の置換基を示し、好ましくは、Ｃ１～Ｃ６アルキル基又は置換されていても良いアリール基を示す。「Ｃ１～Ｃ６アルキル基」とは、炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｉ－ブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、「アリール基」としては、例えば、フェニル基、ベンジル基、インデニル基、ナフチル基、フルオレニル基、アントラニル基、フェナンスレニル基等を挙げることができるが、これらに限定されない。アリール基の置換基としては、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基等）、Ｃ１～Ｃ６アルキル基（例えば、メチル基、エチル基等）、ハロゲン基を挙げることができるが、これらに限定されない。置換されているアリール基としては、パラメトキシフェニル基、パラメチルフェニル基等を挙げることができるが、これらに限定されない。本発明の一態様において、「Ｒ」は、ＰＭＰ、Ｍｅ、Ａ－Ｍｏｒ、ｉＰｒ、ｎＰｒ、ＰｒＯＭｅ及びＡ－ＰＥＧ－Ｎ３（Ａは、グリコール酸ユニット中のアセチル基、すなわち、アノマー水酸基と、ＭｏｒまたはＰＥＧ中のアミノ基に挟まれた部分を表す）からなる群より選択される。
　本発明の一態様において、糖鎖ドナー分子は、ハイマンノース型糖鎖を含む。このような糖鎖ドナー分子としては、以下の構造を有するＭａｎ９－ＧｌｃＮＡｃ２－Ａｓｎ（「Ｍ９－Ａｓｎ」）や、Ｍ９－Ａｓｎからマンノースが１つ、２つ、あるいは３つ欠損した構造を有するＭａｎ８－ＧｌｃＮＡｃ２－Ａｓｎ（「Ｍ８－Ａｓｎ」）、Ｍａｎ７－ＧｌｃＮＡｃ２－Ａｓｎ（「Ｍ７－Ａｓｎ」）、Ｍａｎ６－ＧｌｃＮＡｃ２－Ａｓｎ（「Ｍ６－Ａｓｎ」）を挙げることができるが、これらには限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　本発明の一態様において、糖鎖ドナー分子は、糖鎖の還元末端が活性化されたＧｌｃＮＡｃ、好ましくは、オキサゾリン化されたＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖含有分子である。このような糖鎖ドナー分子としては、多様な糖鎖構造の分子を用いることができる。このような糖鎖ドナー分子の例としては、ＳＧ－Ｏｘ（「Ｏｘ」はオキサゾリンを示す）、ＭＳＧ１－Ｏｘ、ＭＳＧ２－Ｏｘ若しくはＭＳＧ１－ＯｘとＭＳＧ２－Ｏｘの混合物を挙げることができるが、これらに限定されない。
　糖鎖の還元末端が活性化されたＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖含有分子も、糖鎖の還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖含有分子と同様、化学修飾されていてもよく、例えば、非還元末端が化学修飾されていてもよい。非還元末端の化学修飾としては、糖鎖の還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖含有分子について言及したものと同様の修飾を挙げることができ、例えば、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ）－Ｏｘ、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－Ｏｘ、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２－Ｏｘ、又は［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－Ｏｘと［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２－Ｏｘの混合物を挙げることができるが、これらに限定されない。
　糖鎖ドナー分子は、適宜、市販品を購入するか、あるいは、既知の方法を利用又は応用することにより作製することができ、例えば、実施例７又は参考例２３－１に示した方法を利用又は応用することにより作製することができる。
＜Ｆｃ含有分子＞
　本発明において、「Ｆｃ含有分子」（「Ｆｃ領域含有分子」と称することもある）とは、Ｆｃ領域を含有する分子を示し、例えば、抗体（免疫グロブリン）、Ｆｃ－融合タンパク質、Ｆｃ断片等（又はＦｃ含有断片）を例示することができる。本発明における抗体（免疫グロブリン）としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＤのいずれであってもよく、また、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよく、さらに、天然由来のものであっても、合成したものであってもよいが、好ましくはＩｇＧ、特にＩｇＧ型のモノクローナル抗体を挙げることができる。抗体以外のＦｃ含有断片としては、ＣＬＣＨ、例えば、ＩｇＧ（特に、ＩｇＧ型のモノクローナル抗体）のＦｃ断片や定常領域のみからなるＣＬＣＨ（特許文献１）、Ｆｃ断片を含むバイスペシフィック抗体（Ｅｘｐｅｒｔ　Ｏｐｉｎ　Ｔｈｅｒ　Ｐａｔ．２０１８　２８，２５１－２７６）、等を挙げることができるが、これらに限定されない。
＜アクセプター分子とは＞
　本発明において、「アクセプター分子」とは、糖鎖ドナー分子から糖鎖を受領する分子を意味する。アクセプター分子として典型的なものは、モノクローナル抗体に由来する、コアＦｕｃが結合していてもよいコアＧｌｃＮＡｃのみからなるＮ２９７結合糖鎖を有するＩｇＧ又はそのＦｃ断片である。なお、本明細書において、「コアＦｕｃ」（又は、「コアフコース」）とは、上記コアＧｌｎＮＡｃに結合しているフコースを意味するものとする。コアＧｌｃＮＡｃには、その由来となる抗体又はその産生方法に応じて、コアＦｕｃが結合していても良く、結合していなくても良い。したがって、本発明の一態様において、アクセプター分子は、Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有するＦｃ含有分子（例えば、抗体又はそのＦｃ含有断片）であり、好ましくは、ＧｌｃＮＡｃ若しくは（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃからなるＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子（例えば、抗体又はそのＦｃ含有断片）を挙げることができる。アクセプター分子の由来としては様々なモノクローナル抗体又は糖鎖含有分子若しくはＦｃ領域含有分子（例えば、Ｆｃ、重鎖から可変領域を欠失させた定常領域のみからなるＣＨと軽鎖の定常領域のみからなるＣＬと組み合わせたＣＬＣＨなど）を利用することができる。本発明のアクセプター分子は、好ましくは（Ｆｕｃα１，６）－ＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧ（例えば、図４の（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１）、（Ｆｕｃα１，６）－ＧｌｃＮＡｃ－Ｆｃ、（Ｆｕｃα１，６）－ＧｌｃＮＡｃ－ＣＬＣＨ、ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ４などが挙げられる（特許文献１）。
　発明の一態様において、Ｎ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子は、抗体由来とすることができ、抗体としては、例えば、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＤＬＬ３抗体、抗ＦＡＰ抗体、抗ＣＤＨ１１抗体、抗ＣＤＨ６抗体、抗Ａ３３抗体、抗ＣａｎＡｇ抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ９８抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体、抗ＥＮＰＰ３抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＧＰＲ２０抗体又は抗ＤＲ５抗体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体として、好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ又はペルツズマブ）、抗ＣＤＨ６抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、又は抗ＥＧＦＲ抗体であり、より好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤＨ６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、又は抗ＥＧＦＲ抗体である。
　上記抗体は、この分野で通常実施される方法を用いて、抗原となるポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原の由来はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来する抗原を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種抗原に結合する抗体とヒト抗原との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
　また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５－４９７、Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５－３６７，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、抗原に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによってハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
　なお、抗原は抗原蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子操作によって宿主細胞に産生させることによって得ることができる。本発明において、「宿主細胞」は、動物細胞、植物細胞、大腸菌、酵母など、タンパク質産生に通常用いられる細胞等を適宜選択できる。
　上記抗体はヒト化抗体でもよく、公知の方法（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１－６８５５，（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２－５２５、ＷＯ９０／０７８６１）に従って取得することができる。
　例えば、抗ＨＥＲ２抗体（ＵＳ５８２１３３７、ＷＯ２００４／００８０９９、ＷＯ２０２０／０５０４０６等）、抗ＣＤ３３抗体（ＷＯ２０１４／０５７６８７、ＷＯ２０２０／０５０４０６等）、抗ＥｐｈＡ２抗体（ＷＯ２００９／０２８６３９、ＷＯ２０２０／０５０４０６等）、抗ＣＤＨ６抗体（ＷＯ２０１８／２１２１３６、ＷＯ２０２０／０５０４０６等）、抗ＣＤ７０抗体（ＷＯ２００４／０７３６５６、ＷＯ２００７／０３８６３７、ＷＯ２０２１／１７７４３８等）、抗ＴＲＯＰ２抗体（ＷＯ２０１５／０９８０９９、ＷＯ２０２１／１７７４３８等）、抗ＥＧＦＲ抗体（ＷＯ１９９８／０５０４３３、ＷＯ２００２／０９２７７１、ＷＯ２０２１／１７７４３８等）は、公知の手段によって取得することができる。
　以下、抗体の詳細を説明するが、抗体の定常領域には複数のアロタイプがあることが知られており、例えばＩｇＧ１重鎖についてはＧ１ｍ１７、Ｇ１ｍ３、Ｇ１ｍ１、Ｇ１ｍ２が挙げられる。本発明で使用される抗体の定常領域としては、特に限定されないが、Ｇ１ｍ１７又はＧ１ｍ３を用いることが好ましい。また、本発明の抗体のアイソタイプとしてＩｇＧ１を用いる場合は、定常領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、エフェクター機能を調整することが可能であり、一態様としては、抗体依存性細胞傷害活性を増強若しくは減弱、抗体依存性細胞媒介食作用を増強若しくは減弱、又は、補体依存性細胞傷害活性を増強若しくは減弱することができ、変異体の一態様としては、野生型ヒトＩｇＧ１の定常領域のアミノ酸配列のうちＥＵ　ｉｎｄｅｘ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．１（Ｍａｙ　１５，１９６９），ｐｐ．７８－８５）により特定される２３４位のロイシン及び２３５位のロイシンがそれぞれアラニン及びアラニンに置換されたもの、又は、ＥＵ　ｉｎｄｅｘにより特定される２３４位のロイシン、２３５位のロイシン及び３２９位のプロリンがそれぞれアラニン、アラニン、及びアラニンに置換されたものを挙げることができる。また、本発明で使用される抗体について重鎖の一方又は両方のカルボキシル末端において１つ又は２つのアミノ酸が欠失しているものとすることができる。
　上記抗ＨＥＲ２抗体は、特に制限はないが、例えば、以下の特性を有するものが望ましい。
（１）以下の特性を有することを特徴とする抗ＨＥＲ２抗体；
　（ａ）ＨＥＲ２に特異的に結合する。
　（ｂ）ＨＥＲ２と結合することによってＨＥＲ２発現細胞に内在化する活性を有する。
（２）ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合する上記（１）に記載の抗体。
（３）前記抗体がモノクローナル抗体である上記（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する上記（１）～（３）のいずれかに記載の抗体。
（５）マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体である、上記（１）～（４）のいずれかに記載の抗体。
（６）重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、上記（１）～（３）に記載の抗体。
（７）配列番号５０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（１）～（４）のいずれかに記載の抗体。
（８）重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、ＥＵインデックスにより示される２３４位及び２３５位のロイシンがアラニンに置換されている、上記（６）に記載の抗体。
（９）配列番号５１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（８）に記載の抗体。
（１０）配列番号５３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（１）～（４）に記載の抗体。
（１１）配列番号５４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（８）に記載の抗体。
（１２）配列番号５７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号５９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、並びに、配列番号６０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号６２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（１）～（３）、（６）又は（８）に記載の抗体。
（１３）重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失している上記（１）～（１２）のいずれかに記載の抗体。
（１４）上記（１）～（１３）のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する工程及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体を採取する工程を含む当該抗体の製造方法によって得られる抗体。
　本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの製造に使用される抗ＣＤ７０抗体は、特に制限はないが、例えば、以下の特性を有す
るものが望ましい。
（１）ＣＤ７０に特異的に結合する抗ＣＤ７０抗体。
（２）ＣＤ７０の細胞外ドメインに結合する上記（１）に記載の抗体。
（３）前記抗体がモノクローナル抗体である上記（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する上記（１）～（３）のいずれかに記載の抗体。
（５）マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、又はヒト化モノクローナル抗体である、上記（１）～（４）のいずれかに記載の抗体。
（６）重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、上記（１）～（３）に記載の抗体。
（７）重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、ＥＵインデックスにより示される２３４位及び２３５位のロイシンがアラニンに置換されている、上記（６）に記載の抗体。
（８）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（７）に記載の抗体。
（９）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（７）に記載の抗体。
（１０）配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、並びに、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（１）～（３）、（６）又は（７）に記載の抗体。
（１１）配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、並びに、配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（１）～（３）、（６）又は（７）に記載の抗体。
（１２）重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失している上記（１）～（１１）のいずれかに記載の抗体。
（１３）上記（１）～（１２）のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する工程及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体を採取する工程を含む当該抗体の製造方法によって得られる抗体。
　本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの製造に使用される抗ＴＲＯＰ２抗体は、特に制限はないが、例えば、以下の特性を有するものが望ましい。
（１）ＴＲＯＰ２に特異的に結合する抗ＴＲＯＰ２抗体。
（２）ＴＲＯＰ２の細胞外ドメインに結合する上記（１）に記載の抗体。
（３）前記抗体がモノクローナル抗体である上記（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する、上記（１）～（３）のいずれかに記載の抗体。
（５）マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、又はヒト化モノクローナル抗体である、上記（１）～（４）のいずれかに記載の抗体。
（６）重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、上記（１）～（３）に記載の抗体。
（７）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（１）～（４）のいずれかに記載の抗体。
（８）重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、ＥＵインデックスにより示される２３４位及び２３５位のロイシンがアラニンに置換されている、上記（６）に記載の抗体。
（９）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（８）に記載の抗体。
（１０）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、並びに、配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（１）～（３）、（６）又は（８）に記載の抗体。
（１１）配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、並びに、配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（１）～（３）、（６）又は（８）に記載の抗体。
（１２）重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失している上記（１）～（１１）のいずれかに記載の抗体。
（１３）上記（１）～（１２）のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する工程及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体を採取する工程を含む当該抗体の製造方法によって得られる抗体。
　本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの製造に使用される抗ＥＧＦＲ抗体は、特に制限はないが、例えば、以下の特性を有するものが望ましい。
（１）ＥＧＦＲに特異的に結合する抗ＥＧＦＲ抗体。
（２）ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する上記（１）に記載の抗体。
（３）前記抗体がモノクローナル抗体である上記（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する上記（１）～（３）のいずれかに記載の抗体。
（５）マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、又はヒト化モノクローナル抗体である、上記（１）～（４）のいずれかに記載の抗体。
（６）重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、上記（１）～（３）に記載の抗体。
（７）重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、ＥＵインデックスにより示される２３４位及び２３５位のロイシンがアラニンに置換されている、上記（６）に記載の抗体。
（８）配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（７）に記載の抗体。
（９）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（７）に記載の抗体。
（１０）配列番号３７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号３９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、並びに、配列番号４０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号４１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（１）～（３）、（６）又は（７）に記載の抗体。
（１１）配列番号４３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号４４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号４５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、並びに、配列番号４６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号４７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号４８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（１）～（３）、（６）又は（７）に記載の抗体。
（１２）重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失している上記（１）～（１１）のいずれかに記載の抗体。
（１３）上記（１）～（１２）のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する工程及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体を採取する工程を含む当該抗体の製造方法によって得られる抗体。
本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの製造に使用される抗ＣＤＨ６抗体は、特に制限はないが、例えば、以下の特性を有するものが望ましい。
（１）ＣＤＨ６に特異的に結合する抗ＣＤＨ６抗体。
（２）ＣＤＨ６の細胞外ドメインに結合する上記（１）に記載の抗体。
（３）前記抗体がモノクローナル抗体である上記（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する上記（１）～（３）のいずれかに記載の抗体。
（５）マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、又はヒト化モノクローナル抗体である、上記（１）～（４）のいずれかに記載の抗体。
（６）重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、上記（１）～（３）に記載の抗体。
（７）重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、ＥＵインデックスにより示される２３４位及び２３５位のロイシンがアラニンに置換されている、上記（６）に記載の抗体。
（８）配列番号５６に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５５に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（７）に記載の抗体。
（９）配列番号６３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号６４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、並びに、配列番号６６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号６８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖を含んでなるヒト化モノクローナル抗体である上記（１）～（３）、（６）又は（７）に記載の抗体。
（１０）重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失している上記（１）～（９）のいずれかに記載の抗体。
（１１）上記（１）～（１０）のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する工程及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体を採取する工程を含む当該抗体の製造方法によって得られる抗体。
　アクセプター分子は、適宜、市販品として購入するか、あるいは、既知の方法を利用又は応用することにより作製することができ、例えば、実施例１において言及する方法を利用又は応用することにより作製することができる。アクセプター分子は、典型的には、糖鎖改変（糖鎖リモデリングともいう）の対象となるＦｃ含有分子（典型的には、ＩｇＧ型のモノクローナル抗体又は当該抗体のＦｃ断片や定常領域のみからなるＣＬＣＨ等のＦｃ含有分子）のＮ２９７結合糖鎖を、Ｎ２９７結合糖鎖のコアキトビオース構造におけるＧｌｃＮＡｃ間の１，４－グリコシド結合（ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃ）を特異的に加水分解する活性を保持したＥＮＧａｓｅで処理することにより調製することができる。この場合、ＥＮＧａｓｅとしては、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴ、Ｅｎｄｏ－Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｅ、Ｅｎｄｏ－Ｆ３、Ｅｎｄｏ－Ｈ、Ｅｎｄｏ-Ｓ、Ｅｎｄｏ-Ｓ２、Ｅｎｄｏ-Ｓｉをはじめ様々なものを利用することができる。したがって、本発明の一態様において、アクセプター分子は、工程１において使用する酵素－Ａ（糖鎖ドナー分子における糖鎖をアクセプター分子に転移する活性を有する酵素）と同一又は異なる酵素を、原料となるＦｃ含有分子（糖鎖改変の対象となるＦｃ含有分子であって、典型的には、宿主細胞由来のＮ２９７結合糖鎖、不均一なＮ２９７結合糖鎖、又は宿主細胞由来の不均一なＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子）と反応させる等といった手法により、工程１における糖鎖転移反応とは、独立した工程において準備することでできる。また、工程１で利用できる酵素－Ａの特徴として、「加水分解活性が残存していてもよい」がある。このため、これらのＥＮＧａｓｅで事前に処理する代わりに、酵素－Ａが宿主細胞由来の不均一な糖鎖を有するＦｃ含有分子に作用することで、ｉｎ　ｓｉｔｕでアクセプター分子を調製してもよい。したがって、本発明の一態様において、アクセプター分子は、原料となるＦｃ含有分子（糖鎖改変の対象となるＦｃ含有分子であって、典型的には、宿主細胞由来のＮ２９７結合糖鎖、不均一なＮ２９７結合糖鎖、又は宿主細胞由来の不均一なＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子）に、酵素－Ａを作用させることで、ｉｎ　ｓｉｔｕ及び／又はワンポットで調製される。また、糖鎖改変（糖鎖リモデリング）に用いられるＩｇＧ又はＦｃ含有分子は、好ましくは同一のアミノ酸配列からなるＩｇＧ重鎖に由来し、Ｎ２９７結合糖鎖を有する形で産生されたものであればよい。その産生方法は限定されるものではなく、通常知られたモノクローナル抗体の生産方法により産生されたＩｇＧ、ＩｇＧのＣＬＣＨ、又は、それを酵素処理して得られたＦｃ断片などを利用することができる。また、このようなＩｇＧ又はＦｃ断片は、異なる生産方法や異なるロットで得られたサンプルの混合物を採用してもよい。
＜エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ＞
　「エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ」とは、ＥＮＧａｓｅ：Ｅｎｄｏ－β－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅとしても知られている糖加水分解酵素であり、糖鎖構造中のキトビオース構造の切断、及び結合生成を担う。また、その由来により、呼び方が異なる。本明細書においては、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼを「酵素－Ａ」と呼び、糖鎖ドナー分子の糖鎖、例えば、フコースを有さない糖鎖原料（例えば、ＳＧＰ）の糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼを「酵素－Ｂ」と呼ぶ。以下、本発明における酵素－Ａ及び酵素－Ｂについて説明する。
＜酵素－Ａ＞
　「酵素－Ａ」は、Ｆｃ含有分子（例えば、抗体）のＮ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼを意味する。酵素－Ａは、一般に、Ｆｃ含有分子と親和性の高いドメインと、糖鎖と親和性の高いドメインと、糖鎖転移反応触媒ドメインを含み、典型的には、Ｆｃ含有分子（例えば、抗体）のＮ２９７結合糖鎖を基質として、加水分解活性と糖鎖転移活性を併せ持つものであるが、本発明において重要なのは、糖鎖ドナー分子における糖鎖（特に、化学的手法、あるいは酵素学的手法で活性化された糖鎖）を、アクセプター分子に転移する活性であるから、加水分解活性については、減弱又は消失していてもよい。むしろ、強い加水分解活性を保持する酵素は、糖鎖転移活性によりアクセプター分子のコアＧｌｃＮＡｃに転移させた糖鎖をも基質として加水分解する可能性があるため、本発明における酵素－Ａの加水分解活性は、相対的に低減されていることが好ましい。なお、上記のとおり、酵素－Ａに加水分解活性が残存している場合、工程１におけるアクセプター分子を別途調製することなく、工程１における同一反応槽内でｉｎ　ｓｉｔｕで調製し得るという利点を享受し得る。したがって、本発明の一態様において、酵素－Ａは、Ｆｃ含有分子の糖鎖に作用できる活性（特に、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を基質とする糖鎖転移活性）を有するものであり、また、本発明の別の一態様においては、酵素－Ａは、Ｆｃ含有分子の糖鎖に作用できる活性を有しており、かつ、加水分解活性を残留しているか、又は、加水分解活性を消失しているものである。
　酵素－Ａの加水分解活性は、糖鎖における共通の基本構造中のコアキトビオースに含まれるβ１，４グリコシド結合を特異的に加水分解する活性を意味し、特に、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖における共通の基本構造中のコアキトビオースに含まれるβ１，４グリコシド結合を特異的に加水分解する活性を意味する。酵素－Ａの加水分解活性の反応模式図を図５、図６に示す。
　酵素－Ａの糖鎖転移活性は、Ｎ２９７にコアＧｌｃＮＡｃ（コアフコースが付加していても、付加していなくても良い）のみを有するＦｃ部位を含むアクセプター分子に、上記糖鎖ドナー分子（還元末端が活性化されたＧｌｃＮＡｃ、若しくは還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖含有分子）の還元末端をグリコシド結合させる活性を意味する。糖鎖ドナー分子が、還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを含む場合における、酵素－Ａの糖鎖転移活性の反応模式図を図１に示す。
　本発明における酵素－Ａとしては、例えば、Ｅｎｄｏ－Ｓ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来酵素）（Ｃｏｌｌｉｎ　Ｍ　ａｎｄ　Ｏｌｓｅｎ　Ａ．，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　２００１，　２０，　３０４６－３０５５、及びＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ　ＪＪ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ．　２０１２，　１３４，　８０３０－８０３３参照）、ＥｎｄｏＳ２若しくはＥｎｄｏＳ４９（Ｓｊｏｇｒｅｎ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．　２０１３，　４５５，　１０７－１１８、及びＳｈｉｖａｔａｒｅ　ＳＳ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｈｅｍ　Ｃｏｍｍｕｎ　（Ｃａｍｂ）．　２０１８，　５４，　６１６１－６１６４参照）、Ｅｎｄｏ－Ｆ３（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由来酵素）（Ｈｕａｎｇ　Ｗ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．　２０１１，　１２，　９３２－９４１、及びＧｉｄｄｅｎｓ　ＪＰ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２０１６，　２９１，　９３５６－９３７０参照）、又はこれらの変異酵素を挙げることができる。また、本発明における酵素－Ａとしては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｉａｅ（Ｐｉｅｒ　ＧＢ　ａｎｄ　Ｍａｄｉｎ　ＳＨ．，　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｓｙｓｔ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１９７６　２６，　５４５－５５３参照）に由来するエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（以下、「Ｅｎｄｏ－Ｓｉ」と呼び、そのアミノ酸配列（配列番号７１）を図９に示す）、又はその変異酵素を挙げることができる。さらに、本発明における酵素－Ａとしては、Ｓｔｏｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属のゲノム情報から、その配列が特定される酵素（Ｖｉｎｃｅｎｔ　Ｐ．　Ｒｉｃｈａｒｄ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｉｏｌ．　Ｅｖｏｌ．　２０１４，　６，　７４１－７５３参照）、又はその変異酵素を挙げることができる。
　本発明の酵素－Ａは、上記の特性を有するものであれば、実施例で使用した具体的な酵素に限定されるものではなく、天然から分離された酵素であっても、本発明の酵素の配列情報に基づき人為的に作製又は改変された酵素であっても良い。天然から分離する場合、その分離源とする生物種は特に限定されないが、好ましくは細菌である。
　Ｅｎｄｏ－Ｓｉの活性ドメイン及びＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｄｕｌｅ（ＣＢＭ）は、結晶構造解析が行われているＥｎｄｏＳ（Ｂ．　Ｔｒａｓｔｏｙ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＮＡＳ（２０１４）ｖｏｌ１１１，Ｎｏ．１８，　ｐｐ６７１４－６７１９）との配列比較から、それぞれ、配列番号７１のアミノ酸番号１０６～４４７及びアミノ酸番号７６２～８９７の領域であると推察され、この２つが加水分解活性及び／又は転移活性と、抗体との相互作用に重要な部位であると考えられる。したがって、本発明の酵素－Ａとして、配列番号７１のアミノ酸番号１０６～４４７及び／又はアミノ酸番号７６２～８９７に記載のアミノ酸配列を含み、好ましくは、配列番号７１のアミノ酸番号１０６～８９７に記載のアミノ酸配列を含み、より好ましくは配列番号７１のアミノ酸番号１０６～９２８に記載のアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは配列番号７１のアミノ酸番号３４～９２８に記載のアミノ酸配列を含み、かつ、糖鎖転移活性を示すポリペプチドが挙げられる。
　上記のとおり、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは、通常、加水分解活性と糖鎖転移活性を併せ持つところ、強い加水分解活性を保持する酵素は、糖鎖転移活性によりアクセプター分子（Ｎ２９７結合糖鎖としてコアＧｌｃＮＡｃを有する抗体若しくはそのＦｃ領域含有分子）のコアＧｌｃＮＡｃに転移させた糖鎖をも基質として加水分解し、所望の糖鎖転移体を適切に取得できない場合がある。そのため、糖鎖リモデリング抗体若しくは糖鎖修飾化合物の合成においては、糖鎖転移活性との比較において加水分解活性を相対的に低下させた変異酵素が有用である。したがって、本発明の一態様において、酵素－Ａは、Ｅｎｄｏ－Ｓ、ＥｎｄｏＳ－２、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ、Ｅｎｄｏ－Ｓｄ、Ｅｎｄｏ－Ｓｅ、又はＥｎｄｏ－Ｓｚの変異酵素であり、かつその対応する野生型酵素より低い加水分解活性を有する変異酵素であり、好ましくは、図７～図９において太字で示したアミノ酸残基を適宜置換した変異酵素であり、特に好ましくは、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｎ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｄ４０５Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ／Ｑ３１１Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ／Ｅ３６０Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ／Ｑ３１１Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ／Ｅ３６０Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｔ１９０Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｔ１９０／Ｄ２４１Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｔ１９０Ｑ／Ｄ２４１Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１X１（X１は、Ｋ、Ｒ及びＤ以外のいずれかのアミノ酸残基を示し、具体的には、Ａ、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、又はＶ、好ましくは、Ａ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、又はＶを示す）、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｔ１９０X２（X２は、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｗ又はＹのアミノ酸残基を示す）、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｑ３１１X３（X３は、Ｆ、Ｎ、又はＹのアミノ酸残基を示す）、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｅ３６０Ｋ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８４Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｔ１３８Ｑ、　Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８４Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８４Ｑ／Ｑ２５０Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８４Ｑ／Ｅ２８９Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８４Ｍ／Ｑ２５０Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８４Ｍ／Ｅ２８９Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８２Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ２２６Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｔ２２７Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｔ２２８Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｄ　Ｄ２３２Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｄ　Ｄ２３２Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓｄ　Ｄ２３２Ｑ／Ｑ３０２Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓｄ　Ｄ２３２Ｍ／Ｑ３０２Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓｅ　Ｄ２３３Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｅ　Ｄ２３３Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓｅ　Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓｅ　Ｄ２３３Ｍ／Ｑ３０３Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓｚ　Ｄ２３４Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｚ　Ｄ２３４Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓｚ　Ｄ２３４Ｑ／Ｑ３０４Ｌ、又はＥｎｄｏ－Ｓｚ　Ｄ２３４Ｍ／Ｑ３０４Ｌを挙げることができるが、これらに限定されない。また、酵素－Ａは、上記において言及した特定の変異に加えて、さらなる変異が加えられていてもよく、例えば、特許文献（国際公開２０２２／０５０３００号）などを参考に、本酵素活性に影響しない範囲で、１～数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は、付加していてもよい。また、酵素－Ａのアミノ酸配列としては、特許文献（国際公開２０２２／０５０３００号）などを参考に、特定の変異アミノ酸残基以外のアミノ酸残基に対して少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　なお、本発明において、「数個」とは、３０個もしくは２０個以下の整数を意味し、好ましくは１０個以下の整数を意味し、さらに好ましくは５個以下の整数を意味し、最も好ましくは４個、３個、２個又は１個を意味する。
＜酵素－Ｂ＞
　「酵素－Ｂ」は、糖鎖ドナー分子の糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、特に、糖鎖ドナー分子の糖鎖を基質とするがＮ２９７結合糖鎖を基質としない（言い換えれば、Ｎ２９７結合糖鎖への反応性が低い、好ましくは反応性が極めて低い）エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼを意味するものである。酵素－Ｂが基質とする糖鎖ドナー分子上の糖鎖部分は、ハイマンノース型糖鎖、混成型糖鎖及び複合型糖鎖のいずれであってもよいが、好ましくは、ハイマンノース型糖鎖又は複合型糖鎖であり、特に好ましくは、複合型糖鎖である。したがって、本発明の一態様において、酵素－Ｂが基質とする糖鎖ドナー分子上の糖鎖部分は、ハイマンノース型糖鎖又は複合型糖鎖であり、好ましくは、複合型糖鎖である。また、本発明において、複合型糖鎖は、２分岐型、３分岐型又は４分岐型のいずれであってもよいが、好ましくは、酵素－Ｂが基質とする糖鎖ドナー分子上の糖鎖部分は、２分岐型の複合型糖鎖である。本発明の一態様において、酵素－Ｂは、フコースを有さない糖鎖原料（ＳＧＰ等の糖ペプチドや糖タンパク質）を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼであり、好ましくは、フコースを有さない２分岐型の複合型糖鎖を含む糖鎖原料を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼである。
　本発明の酵素－Ｂとしては、酵素－Ａの存在下、還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖を含む糖鎖ドナー分子に作用することで、当該還元末端が糖鎖転移反応に利用可能な状態となった活性化中間体を生成し、結果的に、酵素－Ａによる糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖のアクセプター分子への糖鎖転移反応を促進する性質を持つ酵素であることが好ましい。ここで、酵素－Ｂ自身の糖鎖転移活性が、糖鎖ドナー分子を活性化する能力と相関があると考えられることから、本発明の一態様において、酵素－Ｂは、還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖ドナー分子（例えば、ＳＧＰ）の糖鎖を基質とするが、Ｎ２９７結合糖鎖を基質としないエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの中から、ＧｌｃＮＡｃを有するアクセプター（例えば、１－メチルエチル－２－（アセチルアミノ）－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド、２－（アセチルアミノ）－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシド等のＧｌｎＮＡｃ誘導体）への糖鎖転移活性を指標として、選択することができる。したがって、本発明の一態様において、酵素－Ｂは、ＳＧＰからＧｌｃＮＡｃ誘導体への糖鎖転移活性を有する酵素である。
　酵素－Ｂによる、糖鎖ドナー分子の活性化作用は、図１に示すとおり、還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖ドナー分子に作用し、当該還元末端が糖鎖転移反応に利用可能な状態となった活性化中間体を生成するというものであるところ、酵素－Ｂによる加水分解活性が高い場合、活性化中間体は、酵素－Ａを介して、アクセプター分子と反応するのではなく、反応系に存在するＨ２Ｏ分子と反応し、多数の遊離糖鎖が生成されるおそれがある。したがって、本発明における酵素－Ｂは、糖鎖活性化作用との比較において、相対的に低減された加水分解活性を有するものが好ましい。
　本発明の酵素－Ｂとしては、例えば、Ｅｎｄｏ－Ｍ（Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ由来酵素）（Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．　１９９４，　２０３，　２４４－２５２、及びＵｍｅｋａｗａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２０２１，　２８５，　５１１－５２１参照）、Ｅｎｄｏ－ＣＣ（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ由来酵素）（Ｅｓｈｉｍａ　Ｙ，　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　２０１５，　１０，　ｅ０１３２８５９参照）、Ｅｎｄｏ－Ｏｍ（Ｏｇａｔａｅａ　ｍｉｎｕｔａ由来酵素）（Ｍｕｒａｋａｍｉ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．　２０１３，　２３，　７３６－７４４参照）、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｐｕｓｉｌｌｕｓ由来酵素）（ＷＯ２０１８１０１４５４）、又はそれらの変異酵素（好ましくは、野生型と比較して加水分解活性を低下させた変異酵素）が挙げられる。本発明の一態様において、酵素－Ｂは、Ｅｎｄｏ－Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｏｍ、Ｅｎｄｏ－ＣＣ、又はＥｎｄｏ－Ｒｐの変異酵素であって、かつその対応する野生型酵素より低い加水分解活性を有する変異酵素であり、好ましくは、図１０～図１３において太字で示したアミノ酸残基を適宜置換した変異酵素であり、特に好ましくは、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｃ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｅ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｇ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｉ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｐ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｔ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｖ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｓ２１６Ｖ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ２４６Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｄ２７６Ｎ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ａ３１０Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ｆ３０７Ｙ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ｆ３０７Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ａ３１０Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２１４Ｆ／Ｆ３０７Ｙ／Ｌ３０６Ｉ、Ｅｎｄｏ－Ｍ　Ｎ１７５Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｍ　Ｎ１７５Ｑ／Ｙ２１７Ｆ、Ｅｎｄｏ－ＣＣ　Ｎ１８０Ｈ及びＥｎｄｏ－Ｏｍ　Ｎ１９４Ｑからなる群から選択される酵素を挙げることができるが、これらに限定されない。また、酵素－Ｂは、上記において言及した特定の変異に加えて、さらなる変異が加えられていてもよく、例えば、特許文献（国際公開２０２２／０５０３００号）などを参考に、本酵素活性に影響しない範囲で、１～数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は、付加していてもよい。また、酵素－Ｂのアミノ酸配列としては、特許文献（国際公開２０２２／０５０３００号）などを参考に、特定の変異アミノ酸残基以外のアミノ酸残基に対して少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明に係る製造方法の典型的な実施態様において、酵素－Ａと酵素－Ｂは、それぞれ別分子として工程１に添加されるが、酵素－Ａと酵素－Ｂは、それぞれ所望の役割を果たす限り、直接的又は間接的に結合した状態において反応系に添加されてもよい。したがって、本発明の一態様において、酵素－Ａと酵素－Ｂは、直接的又は間接的に化学的に結合した状態として反応系に添加されてもよく、例えば、両分子は、任意の固相担体に固定化された固定化酵素や、任意のアミノ酸、ＰＥＧなどのポリマー、オリゴマーリンカーなどで結合された融合タンパク質の状態で反応系に添加されてもよい。言い換えれば、本発明の一態様において、酵素－Ａと酵素－Ｂとは、直接的又は間接的に化学的に結合されており（＝酵素－Ａと酵素－Ｂとは、融合されており）、例えば、任意の固相担体に固定化された固定化酵素や、任意のアミノ酸、ＰＥＧなどのポリマー、オリゴマーリンカーなど、好ましくは、アミノ酸リンカーで結合された融合タンパク質として反応系に添加され得る。なお、本発明においては、酵素－Ａ、酵素－Ｂが、欠失のない全長分子ではなく、機能断片であったとしても、当該機能断片が所望の機能を有する限り、当該断片も酵素－Ａ、酵素－Ｂの一態様としてみなす。よって、本発明における酵素－Ａと酵素－Ｂは、例えば、「酵素－Ａ」と「酵素－Ｂ」、「酵素－Ａの機能を有する酵素断片」と「酵素－Ｂの機能を有する酵素断片」、「酵素－Ａ」と「酵素－Ｂの機能を有する酵素断片」、及び、「酵素－Ａの機能を有する酵素断片」と「酵素－Ｂ」が、直接的又は間接的に化学結合した状態も含む。「酵素－Ａの機能を有する酵素断片」としては、上記した酵素－Ａ、あるいは、Ｅｎｄｏ－ＢＩ１(ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＡＣＪ５３５２２．１)、Ｅｎｄｏ－ＢＩ２(ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＢＡＪ７１４５０．１)、Ｅｎｄｏ－ＢＴ－３９８７（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＡＡＯ７９０９２．1）、Ｅｎｄｏ－Ｅ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＡＡＲ２０４７７．１）、Ｅｎｄｏ－Ｆ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＡＡＡ２４９２２．１）、Ｅｎｄｏ－Ｆ２（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＡＡＡ２４９２３．１）、Ｅｎｄｏ－Ｆ３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＡＡＡ２４９２４．１）、Ｅｎｄｏ－ＣｏＭ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＸＰ００６６７３２２２．１）、Ｅｎｄｏ－ＳＢ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＢＢＢ３５９４９．１）の全長配列から特定の機能配列に断片化したアミノ酸配列であり、かつ特定の変異が加えられていてもよいアミノ酸配列を有する断片を挙げることができる。また、「酵素－Ｂの機能を有する酵素断片」としては、上記した酵素－Ｂの触媒活性ドメインあるいは、Ｅｎｄｏ－Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＡＡＤ１０８５１．１）、Ｅｎｄｏ－ＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＢＡＢ８４８２１．１）、Ｅｎｄｏ－Ｔｓｐ１００６（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＣＣＹ３７２８７．１）、Ｅｎｄｏ－Ｔｓｐ１２６３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＣＤＤ８８９４５．１）、Ｅｎｄｏ－Ｔｓｐ１４５７（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＣＤＤ８９３５１．１）、Ｅｎｄｏ－ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＡＡＮ２５１３５．１）、Ｅｎｄｏ－ＢＨ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＢＡＢ０４５０４．１）、Ｅｎｄｏ－ＢＮ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＷＰ_００７４８４７４９．１）、Ｅｎｄｏ－ＣＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＸＰ_００１８３９４０２．１）、Ｅｎｄｏ－ＣＣ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＸＰ_００２９１１８１７．１）、Ｅｎｄｏ－Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＡＡＫ７４６５６．１）、Ｅｎｄｏ－Ｐｍ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ: ＡＤＫ９７０３２．１）の全長配列から特定の機能配列に断片化したアミノ酸配列であり、かつ特定の変異が加えられていてもよいアミノ酸配列を有する断片を挙げることができる。例えば、酵素－Ａ、酵素－Ｂ、各々の機能配列に関して、特許文献（国際公開２０２２／０５０３００号）などを参考に、上記機能に影響しない範囲で、１～数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は、付加していてもよく、また、各々のアミノ酸配列としては、特許文献（国際公開２０２２／０５０３００号）などを参考に、活性に影響する特定のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基に対して少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　酵素－Ａと酵素－Ｂの組み合わせとしては、それぞれの役割を果たす酵素－Ａと酵素－Ｂであれば、任意の組み合わせを使用することができる。例えば、以下の表に記載した酵素－Ａと酵素－Ｂの任意の組み合わせを使用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
　また、上記のとおり、酵素－Ａと酵素－Ｂとが融合されている場合、当該酵素－Ａと酵素－Ｂとしては、それぞれの役割を果たす限り、任意の組み合わせを使用することができる。より具体的には、例えば、酵素－ＡはＥｎｄｏ－Ｓｉ変異体であり酵素－ＢはＥｎｄｏ－Ｒｐ変異体であり、例えば、酵素－ＡはＥｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ／Ｑ３１１ＬあるいはＥｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ／Ｑ３１１Ｌであり、酵素－ＢはＥｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２ＨあるいはＥｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｖである。さらに別の具体的態様としては、融合酵素はＥｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２ＨとＥｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ／Ｑ３１１Ｌとの融合タンパク質、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２ＶとＥｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ／Ｑ３１１Ｌとの融合タンパク質、又は、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ／Ｑ３１１ＬとＥｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｖであり、例えば、以下の表に記載した［酵素－Ａ］－［酵素－Ｂ］融合タンパク酵素、［酵素－Ｂ］－［酵素－Ａ］融合タンパク酵素を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
　酵素－Ａと酵素－Ｂとの融合タンパク質は、非特許文献（Ｊｏａｑｕｉｍ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．　２０２２，　１０，　４９４．）などを参考に、常法に従って製造することができ、例えば、酵素－Ａと酵素－Ｂを任意の固相担体に物理的、または化学的相互作用を介して結合させることで製造できる。あるいは、非特許文献（Ｆ　Ｇｒｕｅｎｉｎｇｅｒ－Ｌｅｉｔｃｈ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ．　１９９６，１２，　２６１７－２２、および、Ｅｍｉｌｙ　ＭＫ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ　Ｄｅｓ　Ｓｅｌ．　２００５，１０，４９７－５０１）、および特許文献（ＷＯ２０１７１３７４５９）などを参考に、融合タンパク質を遺伝子操作によって宿主細胞に産生させることができる。すなわち、酵素－Ａと酵素－Ｂをコードする遺伝子を結合させた後、遺伝子操作によって酵素－Ａと酵素－Ｂに由来する機能を持つ単一の酵素を宿主細胞に産生させることができる。このように遺伝子操作によって融合酵素を宿主細胞に生産させる場合、酵素－Ａと酵素－Ｂを別々に準備する必要がなく、準備すべき酵素の数を減らすことができるため、酵素の製造コストならびに労力を削減でき得る。酵素－Ａと酵素－Ｂとをアミノ酸からなるリンカーを介して結合させる場合、リンカーは、一態様において、一または複数のアミノ酸から構成され、非特許文献（Ｃｈｅｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ａｄｖ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖ　Ｒｅｖ．　２０１３　Ｏｃｔ　１５；　６５（１０）：　１３５７－１３６９.）などを参考に、当該技術分野で知られる典型的な性質を有しているものが使用でき、柔軟あるいはリジッドなリンカー、切断可能または切断不可能な性質なリンカーでもよく、長いあるいは短いリンカーを使用可能である。一態様においてリンカーは、アミノ酸配列断片として、（ＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、（ＥＦ）ｎ、又は（ＧＧＳ）ｎ或いはこれらの組合せを含むことができる（ｎは１～３０の整数であり、好ましくは１～２０の整数であり、さらに好ましくは１～１０の整数であり、より好ましくは１～６の整数である）。また、リンカーには、ポリヒスチジンタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、ＣＢＤタグ、Ｆｃタグ、ＧＳＴタグなど、精製タグとして常用されるアミノ酸配列を含めることができる。一態様において精製タグはポリヒスチジンタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｆｃタグ、ＧＳＴタグであり、好ましくはポリヒスチジンタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、ＣＢＤタグであり、さらに好ましくはポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグであり、より好ましくはポリヒスチジンタグである。
＜工程１＞
　本発明に係る製造方法において、工程１は、Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有するＦｃ含有分子であるアクセプター分子と、糖鎖を含む糖鎖ドナー分子とを、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ａ）の存在下で反応させ、反応混合液を得る工程である。本発明の一態様において、工程１は、アクセプター分子と糖鎖ドナー分子とを、酵素－Ａ及び糖鎖ドナー分子の糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ｂ）の存在下で反応させ、反応混合液を得る工程である。当該工程１の反応条件としては、還元末端が活性化されたＧｌｃＮＡｃ（オキサゾリン化されたＧｌｃＮＡｃ等）若しくは活性化されていないＧｌｃＮＡｃを糖鎖ドナー分子として用いる既知の糖鎖転移反応の反応条件に準じて、又は、既知の糖鎖転移反応の反応条件を利用又は応用することによって、適宜選択することができる（例えば、特許文献３）。
　工程１の反応は、緩衝液中で行うことが好ましく、還元末端が活性化された、若しくは活性化されていないＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖ドナー分子の分解を促進しない条件下で行うことが望ましい。この観点から、本発明の一態様において、糖鎖ドナー分子が、還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを含む場合、工程の１の反応系内のｐＨは、５．８～９．５の間で適宜選択でき、好ましくは６．２～８．５、より好ましくは６．５～８．０、さらに好ましくは６．５～７．５の範囲である。また、糖鎖ドナー分子が、還元末端が活性化されたＧｌｃＮＡｃを含む場合、工程の１の反応系内のｐＨは、５．５～８．０の間で適宜選択でき、好ましくは６．０～７．５、より好ましくは６．２～７．５、さらに好ましくは６．５～７．５の範囲である。緩衝液は、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０～７．５）、ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５～８．０）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０～９．０）などから適宜選ぶことが可能であり、好ましくは、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０～９．０）である。酵素を安定化させる目的で、反応液中に酵素反応を阻害しない添加剤を加えてもよい。
　反応温度は、４℃から５０℃の間で適宜選択できるが、好ましくは１５℃～４５℃であり、より好ましくは２０℃～４０℃であり、さらに好ましくは２５℃～４０℃である。
　反応時間は、１０分から９６時間の間で適宜選択できるが、好ましくは、０．５時間～８０時間であり、より好ましくは、２時間～７０時間、さらに好ましくは４時間～６０時間、特に好ましくは６～４８時間であり、最も好ましくは８～３０時間である。反応液の少量を経時的に採取し、糖鎖転移反応の進行度を確認しながら反応の終了を判断してもよい。一般に、糖鎖転移反応の進行度は、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、マイクロチップ電気泳動、全自動電気泳動システム、あるいは液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）などによりモニタリングすることができ、例えば、糖鎖リモデリング抗体を重鎖と軽鎖にフラグメント化した後、全自動電気泳動システムを用いて、Ｎ２９７結合糖鎖が付加している重鎖側のみ保持時間が変化することを確認することで、モニタリングすることができる。
　糖鎖ドナー分子が、還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを含む場合、工程１は、糖鎖ドナー分子の糖鎖を、アクセプター分子であるＮ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有する抗体若しくはそのＦｃ領域含有分子に直接転移するワンポット法として行うことができる。この態様においては、工程１は、酵素－Ａに加え、上述した酵素－Ｂも必要とする。
　実施例８において詳述するとおり、還元末端がオキサゾリン化された糖鎖を含む糖鎖ドナー分子を用いる糖鎖リモデリングにおいては、アクセプター分子中のＬｙｓに対してＥｎｄｏ酵素非介在型の化学反応である糖化（Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）が進行しやすくなることから、反応液中の抗体濃度を低く設定することが常用されている。したがって、本発明に係る製造方法において、糖鎖ドナー分子が、還元末端が活性化されたＧｌｃＮＡｃを含む場合、工程１では、比較的低いアクセプター分子濃度を採用することが好ましい。このような実施態様におけるアクセプター分子濃度は、既知の方法に準じて適宜設定することができるが、例えば、工程１の反応系内最終アクセプター分子濃度として、０．６ｍｇ／ｍＬ～１８ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１．２ｍｇ／ｍＬ～１６ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは３ｍｇ／ｍＬ～１４ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは４．２ｍｇ／ｍＬ～１３．２ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは６ｍｇ／ｍＬ～１２ｍｇ／ｍＬを挙げることができる。
　他方、還元末端が活性化されていないＧｌｎＮＡｃを含む糖鎖ドナー分子を用いる場合、糖化の原因である、化学的に合成されたオキサゾリン体溶液を添加しないため、糖化を懸念する必要がなく、よって、比較的高濃度のアクセプター分子濃度を採用することができる。むしろ、分子間の接触頻度が高まるという観点から、高濃度のアクセプター分子を添加することが効果的である。したがって、糖鎖ドナー分子が、還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを含む場合、工程１におけるアクセプター分子濃度は、既知の方法に準じて適宜設定することができるが、例えば、工程１の反応系内最終アクセプター分子濃度の上限値としては、２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１６０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１２０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１００ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは８０ｍｇ／ｍＬを挙げることができ、下限値としては、１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１４ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１８ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２０ｍｇ／ｍＬを挙げることができ、濃度範囲としては、上記において言及した上限値及び下限値のそれぞれの任意の組み合わせ、又は、１０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１４ｍｇ／ｍＬ～１６０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１８ｍｇ／ｍＬ～１２０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍＬを挙げることができるが、これらに限定されない。
　工程１における、糖鎖ドナー分子の添加量としては、既知の方法を利用又は応用することにより適宜設定することができる。特に、還元末端が活性化されていないＧｌｎＮＡｃを含む糖鎖ドナー分子を用いる糖鎖リモデリング反応では、糖鎖ドナー分子の添加量は、糖鎖転移率に影響を及ぼすことから、従来、比較的多量の糖鎖ドナー分子（１００～３００当量、特許文献１、非特許文献１２）を使用することが通常であった。他方、上述のとおり、本発明における製造方法では、酸性条件下での陽イオン交換クロマトグラフィーにより、目的物である糖鎖が付加されたＦｃ含有分子と未反応のＦｃ含有分子（アクセプター分子）を分離できるため、工程１の糖鎖転移反応そのものの効率を極度に高める必要はなく、よって、糖鎖ドナー分子の添加量を、比較的少量とすることができる。糖鎖ドナー分子は高価であることが多いため、この利点は、高純度の均一な糖鎖構造を有するＦｃ含有分子を取得するために、大量の糖鎖ドナー分子使用量を必要とする、ワンポット法において特に有用である。したがって、本発明の一態様において、工程１において添加（使用）される糖鎖ドナー分子の量の下限値としては、アクセプター分子１当量に対して、２当量、３当量、４当量、５当量、６当量、７当量、８当量、９当量、１０当量、１１当量、１２当量、１３当量、１４当量、１５当量、１６当量、１７当量、１８当量、１９当量又は２０当量を挙げることができ、糖鎖ドナー分子の量の上限値としては、３００当量、２００当量、１５０当量、１００当量、９０当量、８０当量、７５当量、７０当量、６５当量、６０当量、５５当量、４５当量、４０当量、３５当量、３０当量、２５当量又は２０当量を挙げることができるが、これらに限定されない。また、工程１において添加（使用）される糖鎖ドナー分子の量の範囲としては、上記において言及した上限値及び下限値のそれぞれの任意の組み合わせ、又は、アクセプター分子１当量に対して、５～８０当量、好ましくは７～６０当量、より好ましくは８～５０当量、特に好ましくは１０～４０当量を挙げることができるが、これらに限定されない。
　上述のとおり、本発明における製造方法では、酸性条件下での陽イオン交換クロマトグラフィーにより、目的物である糖鎖が付加されたＦｃ含有分子と未反応のＦｃ含有分子（アクセプター分子）を分離できるため、工程１の糖鎖転移反応そのものの効率を極度に高める必要はない。したがって、工程１の糖鎖転移率としては、任意の数値を設定でき、例えば、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上を設定することができ、他方、糖鎖転移反応そのものの効率を極度に高める必要はないという観点から、９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下又は６０％以下に設定することもできる。本発明の一態様において、工程１の糖鎖転移率は、８０％を超えるものであり、好ましくは、８５％を超えるものであり、特に好ましくは９０％を超えるものである。なお、上記「糖鎖転移率」は、常法に従って決定することができ、例えば、実施例８において開示した全自動電気泳動システムを用いて決定することができる。なお、糖鎖転移率の測定のタイミングは使用する酵素によって異なるが、１分以上１００時間以内、好ましくは１時間以上８０時間以内、より好ましくは２時間以上７２時間以内である。
　なお、工程１において使用するアクセプター分子は、工程１とは独立した別個の調製方法において調製することができる。したがって、本発明の一態様において、本発明の方法は、工程１に先立ち、アクセプター分子を別個に調製する工程をさらに含む。この態様において、アクセプター分子は、たとえば、工程１において使用する酵素－Ａ（糖鎖ドナー分子における糖鎖をアクセプター分子に転移する活性を有する酵素）と同一又は異なる酵素を、原料となるＦｃ含有分子（糖鎖改変の対象となるＦｃ含有分子であって、典型的には、宿主細胞由来のＮ２９７結合糖鎖、不均一なＮ２９７結合糖鎖、又は宿主細胞由来の不均一なＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子）と反応させる等といった手法により、工程１における糖鎖転移反応とは、独立した工程において準備することができる。本発明の一態様において、アクセプター分子は、たとえば、糖鎖改変の対象となるＦｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を、Ｎ２９７結合糖鎖のコアキトビオース構造におけるＧｌｃＮＡｃ間の１，４－グリコシド結合（ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃ）を特異的に加水分解する活性を保持したＥＮＧａｓｅで処理すること等により調製することができる。
　あるいは、工程１で使用する酵素－Ａに加水分解活性が残存している場合、工程１におけるアクセプター分子は、工程１と同一槽内においてｉｎ　ｓｉｔｕで調製することができる。したがって、本発明の工程１は、アクセプター分子がｉｎ　ｓｉｔｕで調製される態様を含む。この態様では、工程１に先立って、アクセプター分子を別個に調製する工程を省略できることから、製造工程が簡略化される。当該製造工程の簡略化は、当該別工程において使用したＥＮＧａｓｅを除去する工程も不要となり、さらに、当該別工程において生じた比較的不安定なアクセプター分子を分離・精製するといった処置も必要なくなるため、非常に有益である。また、原料となるＦｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を加水分解する酵素と、糖鎖ドナー分子における糖鎖を転移するための酵素として、同一の酵素－Ａを使用するため、使用される酵素の数・種類を低減できるという製造工程上の利点も享受し得る（この点は、酵素－Ａと酵素－Ｂの融合タンパク質を用いた場合、さらに顕著となる）。この態様では、工程１において、糖鎖ドナー分子から糖鎖を直接的に受領する分子であるアクセプター分子そのものではなく、糖鎖改変の対象となるＦｃ含有分子（典型的には、ＩｇＧ型のモノクローナル抗体又は当該抗体のＦｃ断片や定常領域のみからなるＣＬＣＨ等のＦｃ含有分子）を反応系に投入する。このような原料として投入するためのＦｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖としては、目的物である糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖とは異なるものであれば、特に制限ないが、典型的には、当該Ｆｃ含有分子を製造する際に使用した宿主細胞由来のＮ２９７結合糖鎖、不均一なＮ２９７結合糖鎖、又は当該宿主細胞由来の不均一なＮ２９７結合糖鎖を挙げることができる。このようなＦｃ含有分子を工程１の反応系に投入すると、酵素－Ａの加水分解活性により、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖のコアキトビオース構造におけるＧｌｃＮＡｃ間の１，４－グリコシド結合（ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃ）が特異的に加水分解され、アクセプター分子がｉｎ　ｓｉｔｕで生成する。続いて、酵素－Ａの糖鎖転移活性により、当該ｉｎ　ｓｉｔｕで生成したアクセプター分子に、糖鎖ドナー分子の糖鎖が転移することにより、目的物である糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子がワンポットで製造される。この態様では、アクセプター分子はｉｎ　ｓｉｔｕで生成されるものの、単離・精製はされないため、あたかも、原料として投入したＦｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖が、ワンステップで糖鎖ドナー分子由来の糖鎖に直接交換されたように見える。そのため、本明細書では、このような態様を、適宜、「Ｎ２９７結合糖鎖の直接交換反応」と呼ぶ。
　Ｎ２９７結合糖鎖の直接交換反応においては、特段制限なく、上述したようなあらゆる種類の糖鎖ドナー分子を使用することができ、たとえば、糖鎖の還元末端が活性化されていない糖鎖ドナー分子と、糖鎖の還元末端が活性化されている糖鎖ドナー分子のいずれも使用することができる。しかしながら、還元末端が活性化されている糖鎖（例えば、還元末端がオキサゾリン化された糖鎖）を糖鎖ドナー分子として用いる場合、糖鎖が水中で速やかに加水分解され、抗体への反応性を失うため、短時間で反応を完結させる必要があるという制約があるため、Ｎ２９７結合糖鎖の直接交換反応においては、糖鎖の還元末端が活性化されていない糖鎖ドナー分子を使用することが好ましい。したがって、本発明の一態様において、Ｎ２９７結合糖鎖の直接交換反応において使用される糖鎖ドナー分子は、糖鎖の還元末端が活性化されていない糖鎖ドナー分子である。言い換えれば、本発明の一態様において、工程１が、アクセプター分子がｉｎ　ｓｉｔｕで調製される態様を含む場合、工程１で使用する糖鎖ドナー分子は、糖鎖の還元末端が活性化されていない糖鎖ドナー分子である。このような糖鎖ドナー分子としては、制限はなく、例えば、＜新規糖鎖ドナー分子＞の章において具体的に開示する新規糖鎖ドナー分子を挙げることができる。例えば、糖鎖ドナー分子にＧ－１を選んだ場合、Ｆｃ含有分子－［ＳＧ］２が得られ、糖鎖ドナー分子にＧ－４、Ｇ－１３、Ｇ－１４、あるいはＧ－１６を選んだ場合、Ｆｃ含有分子－［X－ＭＳＧ１］２が得られ、さらに、糖鎖ドナー分子にＧ－３、Ｇ－６、Ｇ－７、Ｇ－８、Ｇ－９、Ｇ－１０、Ｇ－１１、Ｇ－１２、あるいはＧ－１５を選んだ場合、Ｆｃ含有分子－［X－ＳＧ］２が得られる。
　他方、Ｎ２９７結合糖鎖の直接交換反応において、還元末端が活性化されている糖鎖（例えば、還元末端がオキサゾリン化されている糖鎖）を糖鎖ドナー分子として用いる場合、上記のとおり、糖鎖が水中で速やかに加水分解され、抗体への反応性を失うため、短時間で反応を完結させる必要があるという制約がある。ｉｎ　ｓｉｔｕでアクセプター分子を調製する場合、短時間でアクセプター分子を生成させるには原料として投入するＦｃ含有分子の濃度を高めることが想起されるが、この濃度が高すぎると、還元末端が活性化されている糖鎖と原料として投入したＦｃ含有分子の接触頻度が高まり、酵素非介在型の糖化（Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）が優位に進行する可能性がある。よって、還元末端が活性化されている糖鎖を用いてＮ２９７結合糖鎖の直接交換反応を行うには、糖化反応を抑制するため、原料として投入するＦｃ含有分子濃度を低く設定することが好ましい。あるいは、短時間でアクセプター分子を生成させ、活性化糖鎖（例えば、オキサゾリン化糖鎖）の加水分解を避けて短時間に反応を完結させるため、Ｎ２９７結合糖鎖の加水分解活性がより強い酵素－Ａを用いることが好ましい。なお、非特許文献（Ｘｉａｏ　Ｚｈａｎｇ，ｅｔ　ａｌ．，ＡＣＳ　Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ．　２０２１，１１，２５０２－２５１４）、および特許文献（ＷＯ２０２２２２６４２０）においては、宿主細胞由来の不均一な糖鎖を有する抗体に対してオキサゾリン化した２糖と野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２を加え、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を高い糖鎖転移率で抗体に付加できることが報告されている。当該報告においては、抗体に転移された２糖オキサゾリン由来の糖鎖がＥｎｄｏ－Ｓ２の加水分解活性に耐性をもつため、加水分解活性の高い野生型Ｅｎｄｏ－Ｓ２を用いて短時間で反応を完結させることが可能とされている。したがって、本発明におけるＮ２９７結合糖鎖の直接交換反応においても、このような既知の方法を利用して、反応に使用する糖鎖ドナー分子や酵素－Ａを適宜選択することができる。
　なお、Ｎ２９７結合糖鎖の直接交換反応における反応温度等の諸条件については、上記のとおりであるが、反応時間については、アクセプター分子を別個に調製する工程を含む態様と比較して、長い時間を設定することが好ましい。
＜工程２＞
　本発明に係る製造方法において、工程２は、工程１で得た反応混合液を、酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体に接触させ、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子を回収する工程であり、好ましくは、工程１で得た反応混合液を、酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体に接触させ、反応混合液に含まれる糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子を、一部又は全部が未反応のＦｃ含有分子（アクセプター分子）から単離し、回収する工程である。本発明の一態様において、工程２は、工程１で得た反応混合液をそのまま負荷液とするか、又は反応混合液に適宜、緩衝液を追加することにより、負荷液を調製し、当該負荷液を、酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体に接触させることで、未反応のアクセプター分子を当該媒体に選択的に吸着させ、他方、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子を含む素通り液を回収することで、当該Ｆｃ含有分子を選択的に回収する工程である。
　上述のとおり、本発明における製造方法では、工程２において目的物である糖鎖が付加されたＦｃ含有分子と未反応のＦｃ含有分子（アクセプター分子）を分離できるため、工程１にて少量の糖鎖ドナー分子のみを使用した場合であっても高純度の均一な糖鎖構造を有するＦｃ含有分子を製造することができる。本着想においては、工程１にて用いる糖鎖ドナー分子の使用量を抑制しつつ、高い糖鎖転移率の糖鎖構造を有するＦｃ含有分子を製造するには、工程２が高い選択性と回収率を有している必要がある。選択性が低い場合は、目的物である糖鎖が付加されたＦｃ含有分子を未反応のＦｃ含有分子（アクセプター分子）から単離できないため、糖鎖転移率を高めることができず、また、回収率が低い場合は、Ｆｃ含有分子の収量を増やすためには工程１にてアクセプター分子の仕込み量を増やす必要があるため、結果として糖鎖ドナー分子の使用量が増大し、目的とする効果が得られない。また、本発明を工業スケールでの医療用の抗体の製造方法として応用する場合は、工程２にて目的物である抗体を所望の生物学的な活性を保ったまま効率的に単離できる必要がある。
　従来の単離技術としては、Ｎ２９７結合糖鎖が付加された抗体中に含まれる糖鎖が付加されていない（コアＧｌｃＮＡｃを有さない）抗体を検出する分析手法としてキャピラリーゲル電気泳動法（ＣＥ－ＳＤＳ）が知られている（Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｒ．　Ｒｕｓｔａｎｄｉら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２００８　Ｓｅｐ；２９（１７）：３６１２－２０）。本手法は、還元条件下でフラグメント化した抗体の重鎖を分子の流体力学的サイズに応じて単離することができる一方で、前処理の過程で抗体が変性し生物学的な活性を失うほか、微細なキャピラリーに充填した媒体により抗体を単離するため、処理能が数百μｇ程度に限られている。また、ＥＮＧａｓｅを用いて調製したコアＧｌｃＮＡｃを有する抗体を、ＥＮＧａｓｅを作用させる前のＮ２９７結合糖鎖を有する抗体から単離する分析手法として、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を用いた方法が知られている（Ｍａｔｔｈｅｗ　Ａら、Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｇｌｙｃａｎ　Ｏｃｃｕｐａｎｃｙ　ｏｆ　Ｉｎｔａｃｔ　ｍＡｂｓ　ｕｓｉｎｇ　ＨＩＬＩＣ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）。本手法は、抗体のフラグメント化を必要とせず、Ｎ２９７結合糖鎖を有する抗体とコアＧｌｃＮＡｃを有する抗体を分離できる一方で、加熱と有機溶媒への暴露により抗体が変性し生物学的な活性を失うほか、単離には高理論段数の分析用カラムや超高速液体クロマトグラフィー装置（ＵＨＰＬＣ）を必要とするため、処理能が数μｇ程度に限られている。また、ＥＮＧａｓｅを用いて調製したコアＧｌｃＮＡｃを有する抗体を、ＥＮＧａｓｅを作用させる前のＮ２９７結合糖鎖を有する抗体から単離する分析手法として、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いた方法が知られている（Ｍａｓａｋｉ　Ｋｕｒｏｇｏｃｈｉら、ＰＬＯＳ　ＯＮＥ｜ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１３２８４８　Ｊｕｌｙ　２２，　２０１５、及びＳｈｉｙｉ　Ｗａｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ，　１２１７　（２０１０）　６４９６－６５０２）。本手法は、抗体を変性させずにＮ２９７結合糖鎖を有する抗体とコアＧｌｃＮＡｃを有する抗体を分離できる一方で、高分解能の分離を達成するには高理論段数の分析用カラムを用い、２液を複雑なプログラムで混合するグラジエント溶出方式を必要とし、処理能が数百μｇ程度に限られているほか、満足のいく収率が得られない欠点があった。したがって、本発明以前においては、工業スケールでの単離・精製目的に適用できる、糖鎖付加の有無に応じて抗体を単離する方法は、一切報告されていなかった。
　このような状況下にあって、本発明者らは、反応混合液を、酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体に接触させるという極めてシンプルな方法で、目的物である糖鎖が付加されたＦｃ含有分子を変性させることなく選択的に高収率で単離・精製できることを見出したものである。
　工程２は、陽イオン交換クラマトグラフィー又はマルチモードクロマトグラフィーにおける常法に従い、実施することができる。例えば、工程１で得た反応混合液を、酸性を示す緩衝液と混合することで負荷液を得て、当該負荷液を、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体を充填したカラムに通液することで、カラムに吸着した分子と、素通りした分子を分離することできる。工程２では、続けて、平衡化液（又は洗浄液）を通液することで、カラムに非特異的に吸着した分子を洗い流した上で、溶出液（又は再生液）を通液することで、カラムに特異的に吸着した分子を溶離させることができる。工程２では、その後、適宜、定置洗浄目的で、クリーニング液を通液することができる。
　工程２において、陽イオン交換クロマトグラフィー又はマルチモードクロマトグラフィーは酸性条件下で実行される。本発明の一態様において、工程２における負荷液（又は負荷液及び平衡化液）は酸性のｐＨを有する。工程２においては、負荷液（又は負荷液及び平衡化液）のｐＨが低いほど糖鎖転移率の向上効果が高く、ｐＨの増加に伴って糖鎖転移率の向上効果が低下する傾向が見られる。本発明における「酸性条件」としては、所期の単離を達成できる限り、任意の酸性ｐＨ（＜７．０）を使用することができ、例えば、下限値（負荷液及び平衡化液のｐＨの下限値）としては、２．５，２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９及び４．０から選択される任意のｐＨを採用することでき、上限値（負荷液及び平衡化液のｐＨの上限値）としては５．０、４．９、４．８、４．７、４．６、４．５、４．４、４．３、４．２、４．１、４．０、３．９、３．８、３．７、３．６及び３．５から選択される任意のｐＨを採用することできる。また、「酸性条件」におけるｐＨの範囲（負荷液及び平衡化液のｐＨの範囲）としては、上記において言及した上限値及び下限値のそれぞれの任意の組み合わせ、又は、２．５～５．０、好ましくは３．０～４．８、さらに好ましくは３．３～４．７、特に好ましくは３．４～４．６、最も好ましくは３．５～４．５を挙げることができるが、これらに限定されない。したがって、本発明の一態様において、工程２における酸性条件は、ｐＨ２．５～５．０、好ましくはｐＨ３．０～４．８、さらに好ましくはｐＨ３．３～４．７、特に好ましくはｐＨ３．４～４．６、最も好ましくはｐＨ３．５～４．５の範囲を意味する。
　工程２では、工程１で得た反応混合液をそのままカラムに通液するための負荷液とするか、反応混合液に適宜、緩衝液を追加することにより、負荷液を調製することができる。負荷液を調製するための緩衝液としては、負荷液が酸性のｐＨを有する限り、あらゆる緩衝液を使用することができるが、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、フタル酸緩衝液を挙げることができる。
　また、負荷液に、適宜、塩を加えることにより、所期の塩濃度を有するように調整することもできる。負荷液を調製するための塩としては、所期の単離を達成できる限り、特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムを挙げることができる。また、塩濃度としては、例えば、３０～２０００ｍＭ、好ましくは１５０～１０００ｍＭ、より好ましくは２００～７５０ｍＭ、さらに好ましくは２８０～６００ｍＭ、特に好ましくは３１０～５００ｍＭを挙げることができる。なお、負荷液における塩濃度は、最終的な目的物の収率や純度に影響を及ぼし、また、その最適塩濃度は、目的物や陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体の種類に応じて変化することから、所与のクロマトグラフィー環境に応じて、最適な塩濃度を採用することが好ましい。
　負荷液におけるＦｃ含有分子の濃度は、所期の単離を達成できる限り、特に限定されないが、例えば、０．１～１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５～５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１．５～３０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは２～２０ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは３～１０ｍｇ／ｍＬを挙げることができる。また、媒体に通液する負荷液自体の体積としては、常法に従って、媒体の体積等に応じて適宜決定することができる。
　工程２における、平衡化液としては、単離前に媒体内のｐＨ及び塩濃度を平衡化し、また、媒体に吸着した分子を実質的に単離することなく、媒体に非特異的に吸着した分子を洗い流すことができるものであれば、あらゆる物を使用することができる。平衡化液として使用できる緩衝液や、平衡化液中の塩濃度については、負荷液についての言及を参照されたい。平衡化液の通液量については、常法に従って、媒体の体積等に応じて適宜決定でき、例えば、１～１００カラム容量（ＣＶ）、好ましくは５～５０ＣＶ、より好ましくは８～４０ＣＶ、さらに好ましくは１０～３０ＣＶ、特に好ましくは１２～２０ＣＶを挙げることができるが、これらには限定されない。
　工程２における、溶出液は、媒体に吸着した分子を溶離できるものであるが、あらゆる物を使用でき、クリーニング液は、媒体を定置洗浄（ＣＩＰ）できるものであれば、あらゆる物を使用できる。したがって、溶出液やクリーニング液については、既知の方法に準じて、又は、既知の方法を応用することで、適宜決定することできる。
　本発明における製造方法では、工程２の終了後の糖鎖転移率としては、任意の数値を設定でき、例えば、８５％以上、９０％以上又は９５％以上を設定することができる。本発明の一態様において、工程２の糖鎖転移率は、９０％を超えるものであり、好ましくは、９５％を超えるものであり、特に好ましくは９９％を超えるものである。また、工程２の工程収率としても任意の数値を設定できるが、上述のとおり工程２の工程収率を高めるほど工程１の糖鎖ドナー分子使用量を削減できることからより高い工程収率が望ましい。ただし、所期の単離を達成できる限り、工程収率は特に限定されず、例えば、１～９９％、好ましくは５～９５％、より好ましくは２０～９５％、特に好ましくは４０～９０％を挙げることができる。
　本発明において、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体とは、陽イオン交換基を有する媒体を意味する。陽イオン交換クロマトグラフィー媒体は、その表面にスルホン酸基（Ｒ－ＳＯ３Ｈ）が結合した強酸型と、カルボキシル基（Ｒ－ＣＯＯＨ）、フェノール性ヒドロキシル基（Ｒ－ＯＨ）、ホスホン酸基［Ｒ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２］、あるいは、ホスフィン酸基［Ｒ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）－Ｒ］が結合した弱酸型に分類される。したがって、本発明の一態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体は、強酸型若しくは弱酸型の媒体であり、及び／又は陽イオン交換基として、スルホン酸基、カルボキシル基、フェノール性ヒドロキシル基、ホスホン酸基、又はホスフィン酸基を有する媒体である。具体的なイオン交換クロマトグラフィー媒体の形態としては、粒子状、メンブレン状、モノリス状、板状、チップ状、繊維状、等のいずれでもよいが、媒体に吸着させる分子の特性の観点から、粒子状、メンブレン状、モノリス状などが挙げられるが、これらに限定されない。
　粒子状の陽イオン交換クロマトグラフィー媒体として、ＳＰ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（Ｃｙｔｉｖａ）、ＳＯＵＲＣＥ　１５Ｓ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｃａｐｔｏ　Ｓ　Ｉｍｐａｃｔ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｅｓｈｍｕｎｏ　ＣＰ－ＦＴ（Ｍｅｒｃｋ）、Ｅｘｈｍｕｎｏ　ＣＰＸ（Ｍｅｒｃｋ）、ＰＯＲＯＳ　ＨＳ（Ｔｈｅｒｍｏ）、ＰＯＲＯＳ　ＸＳ（Ｔｈｅｒｍｏ）、Ｎｕｖｉａ　ＨＲ－Ｓ　（ＢｉＯ－ＲＡＤ）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　Ｍａｘ　ＧＳ（ＪＮＣ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　メンブレン状の陽イオン交換クロマトグラフィー媒体として、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ　Ｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｍｕｓｔａｎｇ　Ｓ（Ｐａｌｌ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　モノリス状の陽イオン交換クロマトグラフィー媒体として、ＣＩＭ　ｍｏｎｏｌｉｔｈ　ＳＯ３（ＢＩＡ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　工程２の陽イオン交換クロマトグラフィーは、既知の装置を使用して実行することができ、このような装置としては、ＡＫＴＡ ａｖａｎｔ ２５(Ｃyｔiｖａ)を挙げることができるが、これに限定されない。また、工程２の陽イオン交換クロマトグラフィーにおける、移動相の流速は、常法に従って適宜決定できる。
　本発明において、マルチモードクロマトグラフィー媒体とは、陽イオン交換基及び陽イオン交換基とは相違する作用が可能な官能基を少なくとも１種含み、一実施態様では相違する作用が可能な官能基は疎水性相互作用が可能な官能基である。陽イオン交換基としては、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体で言及のものと同様のものが挙げられる。また、マルチモードクロマトグラフィー媒体の形態としては、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体で言及のものと同様のものが挙げられる。マルチモードクロマトグラフィー媒体として、Ｃａｐｔｏ（ＴＭ）ＭＭＣやＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（ＴＭ）ＭＸ－ＴＲＰ－６５０Ｍなどが挙げられるが、これらに限定されない。工程２のマルチモードクロマトグラフィーは、既知の装置を使用して実行することができる。また、工程２のマルチモードクロマトグラフィーにおける、移動相の流速は、常法に従って適宜決定できる。
＜コンジュゲート＞
　本発明の工程１及び工程２を介して得られたＦｃ含有分子は、更に化学的に若しくは生化学的に修飾することができる。前述した糖鎖ドナー分子の構造式中Xの部分に、アジド基（Ｎ３－）を有する置換基、例えば、Ｎ３を有するポリエチレングリコールリンカー（Ｌ（ＰＥＧ））を有する糖鎖ドナー分子を用いることで、糖鎖の非還元末端にアジド基を有するＦｃ含有分子、例えば、以下の式で表される、Ｎ２９７－（Ｆｕｃ）ＳＧ－Ｌ（ＰＥＧ）２、Ｎ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ１－Ｌ（ＰＥＧ）又はＮ２９７－（Ｆｕｃ）ＭＳＧ２－Ｌ（ＰＥＧ）の構造を有するＦｃ含有分子を作製できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 （式中、Ｌ（ＰＥＧ）は、β－Ｍａｎの分岐鎖の１－３鎖側及び１－６鎖側の両方の非還元末端のシアル酸の２位に結合したカルボニル基と結合することを表す。Ｌ（ＰＥＧ）は、エチレングリコール構造を含み、他の結合構造及び／又は修飾構造を含んでいても良いリンカー構造である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 （式中、Ｌ（ＰＥＧ）は、β－Ｍａｎの分岐鎖の１－３鎖側の非還元末端のシアル酸の２位に結合したカルボニル基と結合することを表す。Ｌ（ＰＥＧ）は、エチレングリコール構造を含み、他の結合構造及び／又は修飾構造を含んでいても良いリンカー構造である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 （式中、Ｌ（ＰＥＧ）は、β－Ｍａｎの分岐鎖のうち１－６鎖側の非還元末端のシアル酸の２位に結合したカルボニル基と結合することを表す。Ｌ（ＰＥＧ）は、エチレングリコール構造を含み、他の結合構造及び／又は修飾構造を含んでいても良いリンカー構造である。）
　アジド基（Ｎ３－）は、（ヘテロ）シクロアルキニル基（例えば、ＤＢＣＯ（Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ））等のアルキン構造と反応させることにより、１，２，３－トリアゾール環を形成する（ＳＰＡＡＣ（ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ　ａｌｋｙｎｅ　ａｚｉｄｅ　ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ：Ａｇａｒｄ　ＮＪ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ．　２００４，　１２６，　４６，　１５０４６-１５０４７）。したがって、本発明の一態様において、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖が、アジド基（Ｎ３－）を有する置換基で化学修飾されている非還元末端を有するか、あるいは、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖自体はアジド基を有さないが、工程１又は工程２の後に、当該糖鎖の非還元末端にアジド基を有する置換基を導入した場合、本発明に係る製造方法は、更に、当該糖鎖のアジド基（Ｎ３－）に、アルキン構造を有する分子を反応させる工程を含むことができる。本明細書では、このようにして、アルキン構造を有する分子と結合した状態のＦｃ含有分子を、「コンジュゲート」とよぶことがある。なお、本発明の工程１及び工程２を介して得られたＦｃ含有分子を、ＳＰＡＡＣ以外の反応により、他分子と複合体化したものも、「コンジュゲート」とよぶことがある。
　アルキン構造を有する分子としては、例えば、（ヘテロ）シクロアルキニル基を有し、かつ、所望の活性を有する分子を挙げることができ、好ましくは、薬学的に活性な化合物（例えば、化学療法剤、分子標的薬、免疫賦活化剤（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト（ＷＯ２０２０／０５０４０６、ＷＯ２０１４／０９９８２４、ＷＯ２０１４／１７９３３５、ＷＯ２０１４／１８９８０５、ＷＯ２０１４／１８９８０６、ＷＯ２０１５／０７４１４５、ＷＯ２０１５／１８５５６５、ＷＯ２０１６／０９６７１４、ＷＯ２０１６／０１２３０５、ＷＯ２０１６／１４５１０２、ＷＯ２０１７／０２７６４６、ＷＯ２０１７／０２７６４５、ＷＯ２０１７／０７５４７７、ＷＯ２０１７／０９３９３３、ＷＯ２０１７／１００３０５、ＷＯ２０１７／１２３６６９、ＷＯ２０１７／１６１３４９、ＷＯ２０１７／１７５１４７、ＷＯ２０１７／１７５１５６、ＷＯ２０１８／００９４６６、ＷＯ２０１８／０４５２０４、ＷＯ２０１８／０６０３２３、ＷＯ２０１８／０６７４２３、ＷＯ２０１８／０６５３６０、ＷＯ２０１４／０９３９３６、ＷＯ２０１８／００９６４８、ＷＯ２０１８／１００５５８）、ＴＬＲアゴニスト、Ａ２ＡＲアンタゴニスト、ＩＤＯ阻害剤、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３及びＰＤ－１経路のアンタゴニスト、チェックポイント阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体阻害剤、スムーズン（ｓｍｏｏｔｈｅｎ）阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、レチノイド及び抗がんワクチン、アジュバント、脂質、リポソーム、毒素、抗菌剤、抗ウイルス剤、診断用薬剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、抗原、ビタミン、ホルモン等）を例示できるが、これらに限定されない。化学療法剤若しくは毒素としては、カンプトテシン（例えば、ＷＯ２０１４／０５７６８７）、ピロロベンゾジアゼピン（例えば、ＷＯ２０１３／１７３４９６、ＷＯ２０１４／１３０８７９、ＷＯ２０１７／００４３３０、ＷＯ２０１７／００４０２５、ＷＯ２０１７／０２０９７２、ＷＯ２０１６／０３６８０４、ＷＯ２０１５／０９５１２４、ＷＯ２０１５／０５２３２２、ＷＯ２０１５／０５２５３４、ＷＯ２０１６／０１１５１９、ＷＯ２０１５／０５２３２１、ＷＯ２０１５／０３１６９３、ＷＯ２０１１／１３０６１３、ＷＯ２０１９／０６５９６４）、ドキソルビシン、オーリスタチン、タキサンもしくはその誘導体を挙げることができるが、これらに限定されない。また、免疫賦活化剤としては、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＴＬＲアゴニスト、及びＡ２ＡＲアンタゴニストを例示できるが、これらに限定されない。アルキン構造を有する分子としては、好ましくは、以下の（Ａ）～（Ｅ）からなる群から選択される分子を挙げることができる：
（Ａ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、
（Ｂ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－［４－（｛［（１１’Ｓ，１１’ａＳ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－（３－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝プロポキシ）－５’－オキソ－１１’，１１’ａ－ジヒドロ－１’Ｈ，３’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］－Ｌ－アラニンアミド、
（Ｃ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、
（Ｄ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１０’，１１’，１１ａ’－テトラヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、並びに、
（Ｅ）（ビス（Ｎ，Ｎ－ジエチルエタンアミニウム）　Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛９－［（５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－２，１０－ジオキソ－２，１０－ジスルフィド－１４－（６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］グリシンアミド。
　上記において記述してきた製造方法により製造されるＦｃ含有分子もまた、本発明の範囲内である。したがって、本発明は、その一態様において、上記において記述してきた製造方法により製造されるＦｃ含有分子を包含する。
＜単離方法＞
　本発明者らにおいて発見した、所期の糖鎖を有する糖タンパク質（特に、Ｎ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子）と、当該糖鎖を有さない糖タンパク質とを、酸性条件下での陽イオン交換クロマトグラフィー又はマルチモードクロマトグラフィーにより分離できるという知見は、上記において述べてきたような製造方法とは独立して、単に、目的糖タンパク質を単離する用途にも適用できる。したがって、本発明の一態様において、糖タンパク質（特に、Ｎ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子）の単離方法であって、前記糖タンパク質（Ｆｃ含有分子）と１つ以上の不純物を含む溶液を、酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体に接触させ、不純物を選択的に陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体にトラップさせる工程を含む、単離方法が提供される。本発明の一態様において、当該単離方法は、前記糖タンパク質（Ｆｃ含有分子）と１つ以上の不純物を含む溶液を、酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体に接触させることで、不純物を選択的に陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体にトラップさせ、他方、当該媒体に選択的にはトラップされない、所期の糖鎖を有する糖タンパク質（Ｎ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子）を含む素通り液を回収することで、当該糖タンパク質（Ｆｃ含有分子）を選択的に回収する工程を含む、単離方法である。
　本発明における単離方法の一態様において、糖タンパク質は、Ｆｃ含有分子であり、典型的には、Ｎ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子である。Ｎ２９７結合糖鎖は、ハイマンノース型糖鎖、混成型糖鎖及び複合型糖鎖のいずれであってもよいが、好ましくは、複合型糖鎖である。したがって、本発明の一態様において、Ｎ２９７結合糖鎖は、複合型糖鎖である。また、所期の糖鎖を有する糖タンパク質（例えば、Ｎ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子）から分離すべき不純物としては、典型的には、目的物である糖タンパク質（Ｆｃ含有分子）とは、糖鎖（例えば、Ｎ２９７結合糖鎖）の構造が異なるか、あるいは、糖鎖（例えば、Ｎ２９７結合糖鎖）を欠失している以外は、糖タンパク質（Ｆｃ含有分子）と同一構造を有する分子を挙げることができる。例えば、目的物であるＦｃ含有分子におけるＮ２９７結合糖鎖が、フコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃではない場合（例えば、Ｎ２９７結合糖鎖が、ハイマンノース型糖鎖、混成型糖鎖及び複合型糖鎖のいずれかである場合）、前記１つ以上の不純物は、Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有する以外は前記Ｆｃ含有分子と同一である分子を含む。
　本発明に係る単離方法は、必ずしも、Ｆｃ含有分子の製造方法の一工程として組み込まれる必要はないという点を除いては、基本的に、本発明に係る製造方法の工程２と同一である。したがって、上記工程２に関して言及してきたことは、本発明に係る単離方法を実施する際にもそのまま適用される。
　また、本発明に係る単離方法は、所期の糖鎖転移反応と組み合わせることもできる。したがって、本発明の一態様において、以下の工程１及び２を含む、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子の単離方法が提供される。
［工程１］　Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有するＦｃ含有分子であるアクセプター分子と、糖鎖を含む糖鎖ドナー分子とを、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ａ）の存在下で反応させ、反応混合液を得る工程、
［工程２］　前記反応混合液を、酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体に接触させ、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子を単離、回収又は単離回収する工程。
　当該単離方法における工程１及び２は、上記において記述してきた本発明に係る製造方法の工程１及び工程２と同一である。したがって、上記工程１及び工程２に関して言及してきたことは、当該単離方法を実施する際にもそのまま適用される。
＜新規糖鎖ドナー分子＞
　本発明のさらなる別の一態様において、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000047
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000048
からなる群より選択される式によって表される新規糖鎖ドナー分子が提供される。以下の実施例において具体的に記載するとおり、これらの新規糖鎖ドナー分子は、本発明に係る製造方法において好適に使用できることが実証されているが、それ以外の糖鎖リモデリング反応（糖鎖転移反応）にも使用できることが期待できる。本発明に係る製造方法において上記新規糖鎖ドナー分子を使用する場合、各糖鎖ドナー分子は、実施例における試験結果を参照しながら、使用する酵素－Ａと酵素－Ｂの組み合わせに対する相性等を勘案し、適宜決定することが好ましい。
＜抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート（Ｒｐ，Ｒｐ－ＸＩＩＩ）の製造方法＞
　本発明の一態様において、
　［工程１］　Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有するＦｃ含有分子であるアクセプター分子と、糖鎖を含む糖鎖ドナー分子とを、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ａ）及び糖鎖ドナー分子の糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ｂ）の存在下で反応させ、反応混合液を得る工程であって、前記Ｆｃ含有分子が抗体であり、前記糖鎖ドナー分子が式Ｇ－１０によって表される化合物である工程、
　［工程２］　前記反応混合液を、酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体に接触させ、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子を回収する工程、並びに
　［工程３］　当該糖鎖のアジド基（Ｎ３－）に、以下の式（Ｒｐ，Ｒｐ－ＸＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 で表されるＣｙｃｌｉｃ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＣＤＮ）コンジュゲート前駆体を環化付加反応により結合させる工程を含む、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート（Ｒｐ，Ｒｐ－ＸＩＩＩ）の製造方法が提供される。当該製造方法において、工程１及び工程２は、上記＜工程１＞及び＜工程２＞の章において言及してきたことが、そのまま適用される。したがって、以下において工程３及び本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートについて詳述する。
　工程３は、以下の模式図により示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 （式中、
　（３）は、工程２において得られた、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子を模式的に示したものであり、
　抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート（Ｒｐ，Ｒｐ－ＸＩＩＩ）の左側の２つのアステリスク（＊）は右側のアステリスクで示されるＣＤＮ－リンカー部分を示し、及び
　Ａ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 のいずれかを示す）。
　抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート（Ｒｐ，Ｒｐ－ＸＩＩＩ）は、工程２において得られたＦｃ含有分子（３）とＣＤＮコンジュゲート前駆体（Ｒｐ，Ｒｐ－ＸＩＩ）を環化付加反応により結合させ、製造することができる。ＣＤＮコンジュゲート前駆体（Ｒｐ，Ｒｐ－ＸＩＩ）は、ＷＯ２０２０／０５０４０６、ＷＯ２０２１／１７７４３８、又はＷＯ２０２２／１６３８４６を参照して製造することができる。環化付加反応としては、例えばＤｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ反応、及び１，３－双極子環化付加反応が挙げられ、好ましくは１，３－双極子環化付加反応を用いて製造する。１，３－双極子環化付加反応としては、例えば、アジドと末端アルキンとの環化付加反応、及びＳＰＡＡＣ（歪み促進型アジド－アルキン付加環化反応　ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ　ａｚｉｄｅ－ａｌｋｙｎｅ　ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ：Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６，１５０４６－１５０４７）反応が挙げられ、好ましくはＳＰＡＡＣ反応を用いて製造する。したがって、本発明の一態様において、工程３は、工程２において得られたＦｃ含有分子（３）とＣＤＮコンジュゲート前駆体（Ｒｐ，Ｒｐ－ＸＩＩ）を、ＳＰＡＡＣ反応により結合させる工程を含む。
　（Ｅ－１工程）
　以下において、工程３におけるＳＰＡＡＣ反応について記述する。工程２において得られたＦｃ含有分子（３）の緩衝溶液（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等）と、ＣＤＮコンジュゲート前駆体（Ｒｐ，Ｒｐ－ＸＩＩ）を適当な溶媒（ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、プロピレングリコール又はそれらの混合溶媒）に溶解させた溶液を混合することで、ＳＰＡＡＣ反応を実施できる。ＣＤＮコンジュゲート前駆体（Ｒｐ，Ｒｐ－ＸＩＩ）は、Ｆｃ含有分子（３）１モルに対して、２モルから過剰モル、好ましくは４モルから３０モルであり、有機溶媒の比率は、Ｆｃ含有分子（３）の緩衝溶液に対し１％から２００％（ｖ／ｖ）が好ましい。反応温度は０℃から３７℃、好ましくは１５℃から２５℃であり、反応時間は１時間から１５０時間、好ましくは６時間から７２時間である。反応溶液のｐＨは５から９が好ましい。適宜、反応溶液を後述の共通操作Ｄに記載の方法に従って単離し、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート（Ｒｐ，Ｒｐ－ＸＩＩＩ）を得ることができる。
　抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、後述の共通操作ＤからＧによってバッファー交換、単離、抗体濃度の測定及び抗体一分子あたりの免疫賦活化剤平均結合数の測定を行い、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの同定を行うことができる。
　共通操作Ａ：抗体水溶液の濃縮
　Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）　Ｕｌｔｒａ遠心式フィルターデバイス（５０，０００　ＮＭＷＬ，Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｌｔｄ．）に抗体又は抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート溶液を入れ、遠心機（Ａｌｌｅｇｒａ　Ｘ－１５Ｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いた遠心操作（２０００Ｇから４０００Ｇで５分間から２０分間遠心）により、抗体及び抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート溶液を濃縮できる。
　共通操作Ｂ：抗体の濃度測定
　ＵＶ測定器（Ｎａｎｏｄｒｏｐ　１０００，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を用いて、メーカー規定の方法に従い、抗体濃度の測定を行うことができる。その際に、抗体ごとに異なる２８０ｎｍ吸光係数（１．３ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１から１．８ｍＬｍｇ－１ｃｍ－１）を用いる。
　共通操作Ｃ：抗体のバッファー交換
　抗体水溶液に緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）等）を加え、共通操作Ａに記載の方法に従って濃縮する。この操作を数回行った後、共通操作Ｂに記載の方法に従って抗体濃度を測定する。この抗体緩衝溶液に、適宜緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）等）を加えて、目的の濃度（例えば、約１０ｍｇ／ｍＬ）の抗体緩衝溶液を調製できる。
　共通操作Ｄ：抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの単離（ゲル濾過クロマトグラフィー）
　酢酸緩衝液（１０ｍＭ　Ａｃｅｔａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ，５％　Ｓｏｒｂｉｔｏｌ，ｐＨ５．５；本明細書ではＡＢＳと称する）又はそれ以外の適当な緩衝液でＮＡＰカラム（ＮＡＰ－５，ＮＡＰ－１０，ＮＡＰ－２５（ＧＥヘルスケア製））を平衡化させる。このＮＡＰカラムに、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート反応溶液をチャージし、メーカー規定量の緩衝液を自然流下させ、抗体画分を分取する。この画分を再度ＮＡＰカラムにチャージし、メーカー規定量の緩衝液を自然流下させ、抗体画分を分取する。この操作を合計２回から３回繰り返すことで、未結合の免疫賦活化剤リンカーやジメチルスルホキシド、プロピレングリコールを除いた抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートを得ることができる。必要に応じて、共通操作Ａ及びＣにより抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート溶液の濃度を調節できる。
　共通操作Ｅ：抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける抗体濃度及び抗体一分子あたりの免疫賦活化剤平均結合数の測定（ＵＶ法）
　抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける結合免疫賦活化剤濃度は、ＷＯ２０２０／０５０４０６、ＷＯ２０２１／１７７４３８に記載の方法に準じて、吸光光度計（ＵＶ／ＶＩＳ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ　Ｌａｍｂｄａ　２５，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）を用いて、抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート水溶液の２８０ｎｍ及び２５０ｎｍの二波長における吸光度を測定することにより算出することができる。
　共通操作Ｆ：抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける抗体濃度及び抗体一分子あたりの免疫賦活化剤平均結合数の測定（逆相高速液体クロマトグラフィー法：ＲＰ－ＨＰＬＣ）
　抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける抗体濃度及び抗体一分子あたりの免疫賦活化剤平均結合数は、前述の共通操作Ｅに加え、ＷＯ２０２０／０５０４０６、ＷＯ２０２１／１７７４３８に記載の方法に準じて高速液体クロマトグラフィー分析によって求めることができる。
　共通操作Ｇ：抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける抗体濃度及び抗体一分子あたりの免疫賦活化剤平均結合数の測定（疎水性相互作用－高速液体クロマトグラフィー法：ＨＩ－ＨＰＬＣ）
　抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおける抗体濃度及び抗体一分子あたりの免疫賦活化剤平均結合数は、前述の共通操作Ｅ及びＦに加え、ＷＯ２０２０／０５０４０６、ＷＯ２０２１／１７７４３８に記載の方法に準じて高速液体クロマトグラフィー分析によって求めることができる。
　上記において記述してきた製造方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートもまた、本発明の範囲内である。したがって、本発明は、その一態様において、上記において記述してきた製造方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートを包含する。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートには、立体異性体あるいは不斉炭素原子に由来する光学異性体、幾何異性体、互変異性体又はｄ体、ｌ体、アトロプ異性体等の光学異性体が存在することもあるが、これらの異性体、光学異性体及びこれらの混合物のいずれも本発明に含まれる。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートにおいて、抗体１分子への免疫賦活化剤の結合数は、その有効性、安全性に影響する重要因子である。抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの製造は、免疫賦活化剤の結合数が一定の数となるよう、反応させる原料・試薬の使用量等の反応条件を規定して実施されるが、低分子化合物の化学反応とは異なり、異なる数の免疫賦活化剤が結合した混合物として得られるのが通常である。しかしながら、本発明の方法では、工程１及び２において、高純度の均一な糖鎖構造を有するＦｃ含有分子を製造することができるため、結果的に、免疫賦活化剤の結合数が均一な抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートを高純度で得ることができる。抗体１分子への免疫賦活化剤の結合数は平均値、すなわち、平均免疫賦活化剤結合数（ＤＡＲ：Ｄｒｕｇ　ｔｏ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｒａｔｉｏ）として特定することができる。抗体分子への環状ジヌクレオチド誘導体の結合数はコントロール可能であり、１抗体あたりの免疫賦活化剤平均結合数として、１から４の範囲の環状ジヌクレオチド誘導体を結合させることができるが、好ましくは２から４個であり、より好ましくは３から４個、さらに好ましくは３．２から４個、特に好ましくは３．５から４個である。
　本発明のさらなる別の一態様において、上記［工程１］の糖鎖ドナー分子を式Ｇ－１０の代わりにＧ－１４を使用すること以外は上記方法と同様にして、１抗体あたりの免疫賦活化剤平均結合数として、１から３の範囲の環状ジヌクレオチド誘導体を結合させた抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの製造方法が提供される。この場合、工程２において得られるＦｃ含有分子は、（３）ではなく、以下の（３’）により示される構造を有する。抗体分子への環状ジヌクレオチド誘導体の結合数はコントロール可能であり、１抗体あたりの免疫賦活化剤平均結合数は、好ましくは１．０から２．５個であり、より好ましくは１．２～２．２の範囲である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、大気中に放置したり、又は再結晶することにより、水分を吸収し、吸着水がついたり、水和物になる場合が有り、そのような水を含む化合物及び塩も本発明に包含される。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、アミノ基等の塩基性基を有しているため、所望により医薬的に許容される塩とすることができる。そのような塩としては、例えば塩酸塩、ヨウ化水素酸塩等のハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩等の低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩等のアリ－ルスルホン酸塩；ギ酸、酢酸、りんご酸、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及びオルニチン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等のアミノ酸塩を挙げることができる。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、リン酸基及び／又はチオリン酸基をその構造に含むため、一般的に塩基付加塩を形成することが可能である。医薬的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩等の無機塩；ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ｔｅｒｔ－ブチルアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジル－Ｎ－（２－フェニルエトキシ）アミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩等の有機アミン塩、等を挙げることができる。
　本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、空気中の水分を吸収すること等により水和物として存在することもある。本発明の溶媒和物としては、医薬的に許容し得るものであれば特に限定されないが、具体的には、水和物、エタノール和物、２－プロパノール和物等が好ましい。また、本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲート中には窒素原子が存在するため、Ｎ－オキシド体となっていてもよく、これら溶媒和物及びＮ－オキシド体も本発明の範囲に含まれる。また、本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートには硫黄原子が存在するため、スルホキシド体となっていてもよく、これら溶媒和物及びスルホキシド体も本発明の範囲に含まれる。
　また、本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートには、種々の放射性又は非放射性同位体でラベルされた化合物も包含される。本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートを構成する原子の１以上に、原子同位体の非天然割合も含有し得る。原子同位体としては、例えば、重水素（２Ｈ）、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素－１２５（１２５Ｉ）又は炭素－１４（１４Ｃ）等を挙げることができる。また、本発明の方法により製造される抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートは、例えば、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素－１２５（１２５Ｉ）又は炭素－１４（１４Ｃ）のような放射性同位体で放射性標識され得る。放射性標識された化合物は、治療又は予防剤、研究試薬、例えば、アッセイ試薬、及び診断剤、例えば、インビボ画像診断剤として有用である。本発明の抗体－免疫賦活化剤コンジュゲートの全ての同位体変異種は、放射性であると否とを問わず、本発明の範囲に包含される。
＜酵素－Ａと酵素－Ｂの融合タンパク質及び当該融合タンパク質を用いたＦｃ含有分子の製造方法＞
　本発明のさらなる一態様において、酵素－Ａと酵素－Ｂの融合タンパク質が提供される。本明細書において、酵素－Ａと酵素－Ｂの融合タンパク質とは、酵素－Ａと酵素－Ｂが直接的又は間接的に結合している状態のタンパク質を意味する。本発明の一態様において、酵素－Ａと酵素－Ｂの融合タンパク質は、酵素－Ａと酵素－Ｂの両方が任意の固相担体に固定化された固定化酵素であり、また、本発明の別の一態様において、酵素－Ａと酵素－Ｂの融合タンパク質は、酵素－Ａと酵素－Ｂとが直接結合されているか、あるいは、任意のリンカー、例えば、任意のアミノ酸、ＰＥＧなどのポリマー、オリゴマーリンカーなど、好ましくはアミノ酸リンカーを介して結合されている融合タンパク質である。酵素－Ａと酵素－Ｂの融合タンパク質において使用される酵素－Ａと酵素－Ｂとしては、それぞれの役割を果たす限り、任意の組み合わせを使用することができる。例えば、以下の表に記載した［酵素－Ａ］－［酵素－Ｂ］融合タンパク酵素、［酵素－Ｂ］－［酵素－Ａ］融合タンパク酵素を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
　酵素－Ａと酵素－Ｂの融合タンパク質は、Ｆｃ含有分子の製造において使用される場合、製造工程において調製・準備すべき酵素の数を減らせる等といった利点をもたらし得、これは、本発明の工程２とは独立して得られる利点である。よって、本発明の一態様において、以下の工程１’：Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有するＦｃ含有分子であるアクセプター分子と、糖鎖を含む糖鎖ドナー分子とを、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ａ）と糖鎖ドナー分子の糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ｂ）の融合タンパク質の存在下で反応させ、反応混合液を得る工程、を含む、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子の製造方法が提供される。当該工程１’において使用されるアクセプター分子や糖鎖ドナー分子や、反応条件等は、いずれも上記において工程１について説明してきたものをそのまま適用できる。また、工程１’に工程２を後続させることで、より高い糖鎖転移率を達成することもできる。
　以下、実施例を用いて、本発明を具体的に説明する。実施例に示されたものは、本発明の実施形態の一例であり、本発明はこれに限定されるものではない。
　本明細書に記載されているタンパク質濃度は、超微量分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ８０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）、あるいは紫外可視分光光度計システムＳｏｌｏＶＰＥ（Ｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いて定量した。
　実施例中のＳＧＰ（シアリルグリコペプチド）は、ＷＯ２０１７１１０９８４の実施例１に記載された方法、あるいは、ＷＯ２０１４２０８７４２の実施例１に記載された方法で作製できる。実施例中のＡＧ（９）－Ｐは、ＷＯ２０１４１１５７９７の実施例１－１７の工程１－１７Ａに記載された方法で作製できる。実施例中のＡＧ（７）－Ｐは、ＷＯ２０１４１１５７９７の実施例１－１７の工程１－１７Ｂに記載された方法で作製できる。
　実施例中の（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３は、ＷＯ２０１８００３９８３の実施例１－１２、工程１－１２Ａに記載された方法で作製できる。実施例中の（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３は、ＷＯ２０１９０６５９６４の実施例１５４の工程３に記載された方法で作製できる。
　実施例中のｍＡｂ１は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを示す。（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１は、ＷＯ２０１７０１０５５９の実施例３に記載された方法で作製できるＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂの糖鎖加水分解体を示す。実施例中のｍＡｂ２は、ＷＯ２０１９０６５９６４の実施例１３６に記載された方法及びＷＯ２０１９０６５９６４内の配列番号３６及び５２で作製できる抗体を示す。（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ２は、ＷＯ２０１９０６５９６４の実施例６１の工程１に記載された方法で作製できる糖鎖加水分解体（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－抗ＣＬＤＮ６抗体（Ｈ１Ｌ１）を示す。実施例中ｍＡｂ２－［ＭＳＧ１－Ｎ３］２は、ＷＯ２０１９０６５９６４の実施例６１の工程２に記載された方法で作製できる抗ＣＬＤＮ６抗体（Ｈ１Ｌ１）－［ＭＳＧ１－Ｎ３］２を示す。実施例中のｍＡｂ３は、ＷＯ２０２００５０４０６の参考例５に記載された方法及びＷＯ２０２００５０４０６内の配列番号２８及び３０で作製できる改変ＨＥＲ２抗体２を示す。（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ３は、ＷＯ２０２００５０４０６の実施例８５の工程１に記載された方法で作製できる糖鎖加水分解体（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－改変抗ＨＥＲ２抗体２を示す。実施例中ｍＡｂ３－［ＳＧ－Ｎ３］２は、ＷＯ２０２００５０４０６の実施例８５の工程２に記載された方法で作製できる改変抗ＨＥＲ２抗体－［ＭＳＧ１－Ｎ３］２を示す。
　糖鎖加水分解、及び糖鎖転移反応の進行具合をタンパク質のゲル電気泳動法を用いて確認した(ＷＯ２０１３／１２００６６、Ｈｕａｎｇ　Ｗ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ．　２０１２，　１３４，　１２３０８－１２３１８)。タンパク質の全自動電気泳動システムとして、装置にはＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ　II（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）、試薬はＰｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ａｓｓａｙ　ＬａｂＣｈｉｐ及びＰｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を用いた。
＜実施例１＞酵素－Ａと酵素－Ｂの選択方法
　酵素－Ａと酵素－Ｂが協奏的に働くと、化学的に活性化されていない糖鎖ドナー分子から、その糖鎖ユニットの、Ｆｃ含有分子のＧｌｃＮＡｃ（アクセプター分子）への直接転移が可能となる。本実施例では、酵素－Ａは、Ｆｃ含有分子と親和性のあるドメインと、糖鎖と親和性のあるドメインと、糖鎖転移反応触媒領域を有する酵素であり、また、酵素－Ｂは、フコースを有さない２分岐糖鎖ドナー分子から、酵素－ＡがＦｃ含有分子への糖鎖転移反応に利用可能な状態（活性化中間体）に活性化する酵素である（以下の模式図又は図１参照）。実施例８以降で組み合わせることができる酵素－Ａと酵素－Ｂの一般的な性質、効果的な反応条件を確認するため、実施例２から実施例６で調製する酵素を、以下の表Ｙ－１にデザインした。
　それぞれの役割を果たす酵素－Ａと酵素－Ｂであれば、酵素種は限定されず、それらを任意に組み合わせることで、所望の糖鎖転移体を得ることができる。
　酵素－Ａの代表例として、加水分解活性は残存するものの、対応するそれぞれの野生型酵素よりも加水分解活性が抑えられていることが期待できるＥｎｄｏ-Ｓ変異体の代表例、Ｅｎｄｏ-Ｓ２変異体の代表例、及びＥｎｄｏ-Ｓｉ変異体の代表例を選択した。酵素－Ｂ自身の糖鎖転移活性は、糖鎖ドナー活性化能力と相関があると考えられることから、酵素－Ｂの代表例として、フコースを有さない２分岐糖鎖ドナー分子であるＳＧＰからＧｌｃＮＡｃ誘導体への糖鎖転移活性が知られているＥｎｄｏ-Ｍ変異体の代表例、及びＥｎｄｏ-Ｒｐ変異体の代表例を選択した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　上記模式図及び図１中、シアル酸上のXは、水素原子を含む任意の置換基を示す。例えば、Xは、ＰＥＧ－ａｚｉｄｅである。図中、糖鎖還元末端のＺは、任意の置換基であり、好ましくは、窒素原子あるいは酸素原子を介して結合されるＮＨＲ、ＯＲで示される。例えば、Ｒは、ＰＭＰ、Ｍｅ、Ａ－Ｍｏｒ、ｉＰｒ、ｎＰｒ、ＰｒＯＭｅ及びＡ－ＰＥＧ－Ｎ３（Ａはグリコール酸ユニット中のアセチル基、すなわち、アノマー水酸基と、ＭｏｒまたはＰＥＧ中のアミノ基に挟まれた部分を表す）からなる群より選択される置換基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
＜実施例２＞Ｅｎｄｏ－Ｓｉ酵素の調製
（実施例２－１）Ｅｎｄｏ－Ｓｉ酵素の発現
　配列番号３に対応する遺伝子をコードしたＥｎｄｏ－Ｓｉ発現プラスミドをメタノール資化性酵母Ｏｇａｔａｅａ　ｍｉｎｕｔａに導入することで、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ産生株を得た。続いて、振盪培養条件下又は通気攪拌培養条件下でのメタノール誘導によるＥｎｄｏ－Ｓｉタンパク質の発現を行った。振盪培養の場合、５００ｍｌ容バッフルフラスコ（ＣＯＲＮＩＮＧ，４３１４０１）を用いて、植菌後１日目にメタノール誘導、植菌後３日目に培養を終了し、遠心分離にて菌体を集菌した。通気攪拌培養の場合、３Ｌ培養槽（エイブル，ＢＭＳ－０３ＫＰ３加圧型）を用いて、植菌後一日目にメタノール誘導、植菌後２日目に培養を終了し、遠心分離にて菌体を集菌した。
（実施例２－２）Ｅｎｄｏ－Ｓｉ酵素の精製
　実施例２－１で集菌した菌体を、ＹｅａｓｔＢｕｓｔｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ，７１１８６）又は高圧ホモジナイザーを用いて破砕し、遠心分離を行った上清をＣａｐｔｏ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ、Ｃａｐｔｏ　ＤＥＡＥ及びＣａｐｔｏ　Ｐｈｅｎｙｌ　ＩｍｐＲｅｓ（Ｃｙｔｉｖａ）を組み合わせて精製した。最後にＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５，３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）でＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬）にバッファーを置換して酵素液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
＜実施例３＞Ｅｎｄｏ－Ｒｐ酵素の調製
（実施例３－１）Ｅｎｄｏ－Ｒｐ酵素の発現
　配列番号５に対応する遺伝子をコードしたＥｎｄｏ－Ｒｐ発現プラスミドをメタノール資化性酵母Ｏｇａｔａｅａ　ｍｉｎｕｔａに導入することで、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ産生株を得た。続いて、振盪培養条件下又は通気攪拌培養条件下でのメタノール誘導によるＥｎｄｏ－Ｒｐタンパク質の発現を行った。振盪培養の場合、１０００ｍｌ容バッフルフラスコ（ＣＯＲＮＩＮＧ，４３１４０３）を用いて、植菌後１日目にメタノール誘導、植菌後２日目か３日目に培養を終了し、遠心分離にて菌体を集菌した。通気攪拌培養の場合、３Ｌ培養槽（エイブル，ＢＭＳ－０３ＫＰ３加圧型）を用いて、植菌後一日目にメタノール誘導、植菌後４日目に培養を終了し、遠心分離にて菌体を集菌した。
（実施例３－２）Ｅｎｄｏ－Ｒｐ酵素の精製
　実施例３－１で集菌した菌体をＹｅａｓｔＢｕｓｔｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ，７１１８６）又は高圧ホモジナイザーを用いて破砕し、遠心分離を行った上清をＣａｐｔｏ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ、ＰＯＲＯＳ　５０　ＨＱ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＣａｐｔｏ　ＭＭＣ（Ｃｙｔｉｖａ）のいずれか二つ、あるいは全てを使用して精製し、酵素液を得た。一部については、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５，３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）での濃縮あるいはバッファー交換を行い、酵素液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
＜実施例４＞Ｅｎｄｏ－Ｓ２酵素の調製
（実施例４－１）Ｅｎｄｏ－Ｓ２酵素の発現
　配列番号２に対応する遺伝子をコードしたＥｎｄｏ－Ｓ２発現プラスミドをメタノール資化性酵母Ｏｇａｔａｅａ　ｍｉｎｕｔａに導入することで、Ｅｎｄｏ－Ｓ２産生株を得た。続いて、振盪培養条件下でのメタノール誘導によるＥｎｄｏ－Ｓ２タンパク質の発現を行った。振盪培養には１０００ｍｌ容バッフルフラスコ（ＣＯＲＮＩＮＧ，４３１４０３）を用いて、植菌後１日目にメタノール誘導、植菌後３日目に培養を終了し、遠心分離にて菌体を集菌した。
（実施例４－２）Ｅｎｄｏ－Ｓ２酵素の精製
　実施例４－１で集菌した菌体を、ＹｅａｓｔＢｕｓｔｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ，７１１８６）を用いて破砕し、遠心分離を行った上清をＣａｐｔｏ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇを用いて精製した。最後にＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５，３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）でＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬）にバッファーを置換して酵素液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
＜実施例５＞Ｅｎｄｏ－Ｓ酵素の調製
（実施例５－１）Ｅｎｄｏ－Ｓ酵素の発現
　配列番号１に対応する遺伝子をコードしたＥｎｄｏ－Ｓ発現プラスミドをメタノール資化性酵母Ｏｇａｔａｅａ　ｍｉｎｕｔａに導入することで、Ｅｎｄｏ－Ｓ産生株を得た。続いて、通気攪拌培養条件下でのメタノール誘導によるＥｎｄｏ－Ｓ蛋白質の発現を行った。４２Ｌ培養槽（Ｉｎｆｏｒｓ　ＨＴ）を用いて、植菌後一日目にメタノール誘導、植菌後４日目に培養を終了し、遠心分離にて菌体を集菌した。
（実施例５－２）Ｅｎｄｏ－Ｓ酵素の精製
　実施例５－１で集菌した菌体を高圧ホモジナイザーにより破砕し、遠心分離を行った上清をＣａｐｔｏ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ、Ｃａｐｔｏ　ＭＭＣ（Ｃｙｔｉｖａ）、及びＰＯＲＯＳ　５０　ＨＱ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた精製を組み合わせて精製した。最後にＰｅｌｌｉｃｏｎ　３　ｃａｓｓｅｔｔｅ，３０ｋＤａ　（Ｍｅｒｃｋ）でＰＢＳ（－）（Ｍｅｒｃｋ）にバッファーを置換して酵素液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059
＜実施例６＞Ｅｎｄｏ－Ｍ酵素の調製
（実施例６－１）Ｅｎｄｏ－Ｍ酵素の発現
　配列番号４に対応する遺伝子をコードしたＥｎｄｏ－Ｍ発現プラスミドをメタノール資化性酵母Ｏｇａｔａｅａ　ｍｉｎｕｔａに導入することで、Ｅｎｄｏ－Ｍ産生株を得た。続いて、通気攪拌培養条件下でのメタノール誘導によるＥｎｄｏ－Ｍタンパク質の発現を行った。通気攪拌培養には３Ｌ培養槽（エイブル，ＢＭＳ－０３ＫＰ３加圧型）を用いて、植菌後１日目にメタノール誘導、植菌後２日目に培養を終了し、遠心分離にて菌体を集菌した。
（実施例６－２）Ｅｎｄｏ－Ｍ酵素の精製
　実施例６－１で集菌した菌体をＹｅａｓｔＢｕｓｔｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ，７１１８６）を用いて破砕し、遠心分離を行った上清をＣａｐｔｏ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ及びＣａｐｔｏ　ＤＥＡＥ（Ｃｙｔｉｖａ）で精製した。最後にバッファー組成を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，３０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，ｐＨ８．０とし、酵素液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000060
＜実施例７＞糖鎖供与体の合成
　本発明の糖鎖供与体は、後述する方法（糖鎖原料、あるいは糖鎖中間体の酵素変換、及び化学変換）に従って製造することができる。各反応終了後、各反応の目的化合物は常法に従って、反応混合物から採取される。例えば、反応混合物を適宜中和し、また、不溶物が存在する場合にはろ過により除去し、溶剤を留去することによって得られる。得られた化合物は、必要ならば、常法、例えばシリカゲルカラムクロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーで分離・精製することができる。あるいは、再沈殿、再結晶、限外ろ過により精製することができる。
　本明細書に記載されている糖鎖誘導体の質量は、次の方法で確認した。装置には、Ｑ　Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ製）、Ｕｌｔｉｍａｔｅ　３０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ製）及びＣＯＲＥＴＥＣＳ　ＵＰＬＣ　Ｃ１８（ＷａｔｅｒｓＩｎｃ製）（１．６μｍ、２．１ｘ５０ｍｍ）を使用し、移動相Ａにはアセトニトリル、移動相Ｂには０．１％ギ酸添加水溶液を利用し、移動相Ａが４分間で２％から９５％に変化するグラジェントにて使用し、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ、４０℃にて分析した。
　又は、装置には、Ｘｅｖｏ　Ｇ２－ＸＳ　Ｆａｍｉｌｙ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ　（Ｗａｔｅｒｓ製）、ＡＣＱＵＩＴＹ　ＢＥＨ　Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ製）（１．７μｍ、２．１ｘ５０ｍｍ）を使用し、移動相Ａにはアセトニトリル、移動相Ｂには１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液を利用し、移動相Ａが５分間で１％から３０％に変化するグラジェントにて使用し、流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ、４０℃にて分析した。
（実施例７－１）糖鎖供与体原料（糖鎖原料３，糖鎖原料３－１）の合成
（合成スキーム）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
（７－１ａ）［Ｎ－アセチル化及び加水分解反応］
　ＳＧＰ（Ｇ－１）（２５．０ｇ）を精製水（１００ｍＬ）に溶解し、アセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解したＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（６．７７ｇ）、アセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解したＮ－（アセトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（８．２２ｇ）を順次加えて、室温で２時間攪拌した。反応終了を確認した後、水酸化ナトリウム水溶液（５Ｎ、２５ｍＬ）を加え、１時間攪拌した。
　この液を冷却後、ｐＨメーターで確認しながら、塩酸（５Ｎ、３６．６ｇ）を加え、ｐＨ２．２０に調整した後、温度を５７－５９℃に保ち、３時間半攪拌した。室温に冷却した後、ｐＨメーターで確認しながら水酸化ナトリウム水溶液（５Ｎ、２５ｍＬ）を加え、ｐＨ５．９８に調整した。
［精製］
　ｐＨ５．９８に調整した液のうちＳＧＰ１４ｇ分に相当する分を、ＳＥＰＨＡＤＥＸ　Ｇ－２５　Ｆｉｎｅ（ＧＥヘルスケアジャパン）を用いて精製した（溶出液には精製水を用いた）。目的物を含むフラクションを回収し、減圧濃縮及び凍結乾燥により、糖鎖原料１、糖鎖原料２－１、糖鎖原料２－２、糖鎖原料２－３の混合物である固形物（１３．５ｇ）を得た。
（７－１ｂ）［縮合反応］　　
　工程（７－１ａ）で得られた固形物（１１．０ｇ）をＤＭＦ（１２１．０ｍＬ）、ＤＭＳＯ（３３．０ｍＬ）に溶解し、Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３．１６ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン（５．３３ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）を順次加え、－７℃に冷却した。この混合液に１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（１２．７２ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２２．０ｍＬ）溶液を１５分かけて加えた後、－５℃付近で１時間攪拌した
［粗精製］
　反応終了後、反応液を室温に上げ、エタノール（５５０ｍＬ）に滴下した。さらに反応容器をエタノール（１１０ｍＬ）で洗浄し、洗いこんだ。生じたスラリーをろ取し、ケーキをエタノール（１１０ｍＬ）で洗浄した後、室温で減圧乾燥を行い、反応粗体１５．７ｇを得た。
　この反応粗体に精製水（１９８ｇ）を加え溶解した。わずかに残った残渣をろ過して除き、得られたろ液を減圧濃縮した後、精製水で８８ｇに調整した。この水溶液をエタノール（５５０ｍＬ）に滴下し、さらに水溶液を精製水（２２ｍＬ）で洗いこんだ。生じたスラリーをろ取し、ケーキをエタノール（２７５ｍＬ）と精製水（５５ｍＬ）の混合液で洗浄することで湿固体（１６２．０ｇ）を得た。これを精製水（２２０ｍＬ）に溶解した後、減圧濃縮により半分量に濃縮し、エタノールを除去した。これを凍結乾燥することにより、糖鎖原料３、糖鎖原料３－１、糖鎖原料３－２、糖鎖原料２－３の混合物である粗体（８．８１ｇ）を得た。
（７－１ｃ）［Ｔｒｉａｒｔ　Ｃ１８を用いた、糖鎖原料３と糖鎖原料３－１の分取］
　工程（７－１ｂ）に記載された方法で得たスケールが異なる２つのロットの混合品、すなわち、糖鎖原料３、糖鎖原料３－１、糖鎖原料３－２、糖鎖原料２－３の混合物である粗体（計１０．０５ｇ）を、アセトニトリルと精製水を溶離液とし、装置にはＫ－Ｐｒｅｐ　Ｌａｂ　１００Ｇ（ワイエムシィ社製）、カラムにはＴｒｉａｒｔ　Ｃ１８（ワイエムシィ社製）を使用し、分離精製を行った。ＵＶ検出（２１０ｎｍ）によって検出されたメインピークを回収し、減圧濃縮した。この濃縮液を凍結乾燥し、目的化合物　糖鎖原料３（２．０９ｇ）、目的化合物　糖鎖原料３－１（２．０２ｇ）を白色粉末として得た。
（実施例７－５）糖鎖供与体の合成（Ｇ－１０）
　Ｇ－１０の合成方法１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
（７－５－１）［糖鎖交換反応］
　工程（７－１ｃ）で得た糖鎖原料３（２００ｍｇ）及び１－Ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ　２－（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（７３３ｍｇ、　５０ｅｑｕｉｖ）をリン酸緩衝液（０．５ｍＬ、ｐＨ６．７、０．２ｍｏｌ／Ｌ）に溶解した後、５０℃に加温した。この混合溶液にＥｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑ（１．３ｍｇ）を加え、そのままの温度で９０時間振とうした。
［精製］
　反応終了後、室温にて反応液に精製水８ｍＬを加えたのち、不溶物をろ過して除いた。このろ液を、アセトニトリルと水を溶離液として、カラムにＹＭＣ－Ａｃｔｕｓ　Ｔｒｉａｒｔ　Ｃ１８（ワイエムシィ社製）を用いて分離精製を行った。ＵＶ検出（２１０ｎｍ）によって検出されたメインピークを回収し、減圧濃縮、凍結乾燥により目的物Ｇ－１０（８２ｍｇ）を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１０３Ｈ１７６Ｎ１４Ｏ６６：　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１３３３．５４９６　（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　１３３３．５４５０
　Ｇ－１０の合成方法２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
（７－５－２ａ）［糖鎖交換反応］
　ＳＧＰ（Ｇ－１）（２０．０ｇ）及び１－Ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ　２－（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（３６．８ｇ、２０ｅｑｕｉｖ）をリン酸緩衝液（２８０ｍＬ、ｐＨ５．５、０．２ｍｏｌ／Ｌ）に溶解した後、５０℃に加温した。この混合溶液にＥｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｈ（９．１ｍｇ）を加え、そのままの温度で７２時間攪拌した。
［精製］
　反応終了後、室温にて反応液をろ過した。このろ液の一部についてＳａｒｔｏｃｏｎ　Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ－２ｋＤａ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、次いでＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲ１２０　Ｈ　ｆｏｒｍ（Ｍｅｒｃｋ）で精製した後、凍結乾燥により固形物４（３．７２ｇ　ｆｒｏｍ　ＳＧＰ　５．６ｇ）を得た。
（７－５－２ｂ）［縮合反応］
　工程（７－５－２ａ）で得た固形物４（３．０ｇ）をＤＭＦ（５９．１ｍＬ）と精製水（０．９ｍＬ）を用いて、溶解したのち、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．０３ｇ、７．９４ｍｍｏｌ）、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン（８６７ｍｇ、３．９７ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液に１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（６．２０ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）を２０℃にて３回に分けて添加後、そのままの温度で２３時間攪拌した。
［精製］
　反応後、反応液を精製水で希釈した後、Ｓａｒｔｏｃｏｎ　Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ－２ｋＤａ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で精製し濃縮した。この濃縮液を、アセトニトリルと水を溶離液とし、カラムにはＹＭＣ－Ａｃｔｕｓ　Ｔｒｉａｒｔ　Ｐｒｅｐ　Ｃ１８－Ｓ（ワイエムシィ社製）を用いて分離精製を行った。ＵＶ検出（２１０ｎｍ）によって検出されたメインピークを回収し、減圧濃縮し、目的化合物Ｇ－１０（２．７７ｇ）を得た。
（実施例７－９）糖鎖供与体の合成（Ｇ－１４）
　Ｇ－１４の合成方法１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
（７－９－１）［糖鎖交換反応］
　工程（７－１ｃ）で合成した糖鎖原料３－１（４００ｍｇ）、１－Ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ　２－（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（６７９ｍｇ、２０ｅｑｕｉｖ）及びＥｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑ（４．２ｍｇ）をリン酸緩衝液（１３．０ｍＬ、ｐＨ６．８、０．２ｍｏｌ／Ｌ）中で５０℃に加温した。そのままの温度で６日間振とうした。
［精製］
　反応終了後、室温にて反応液を精製水で希釈し、不溶物をろ過して除いた。Ｖｉｖａｓｐｉｎ　１５Ｒ，　２，０００　ＭＷＣＯ　Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で精製し濃縮した。この濃縮液を、アセトニトリルと水を溶離液とし、カラムにはＳｆａｅｒ　Ｃ１８（バイオタージ社製）を用いて分離精製を行った。ＵＶ検出（２１０ｎｍ）によって検出されたメインピークを回収し、減圧濃縮し、目的化合物Ｇ－１４（１７４ｍｇ）を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ８４Ｈ１４３Ｎ９Ｏ５６：　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１０８７．９３８２　（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　１０８７．９３５７
　Ｇ－１４の合成方法２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
（７－９－２ａ）［加水分解反応］　
　工程（７－５－２ａ）で得た固形物４（１．０ｇ）に水（２０ｍＬ）を加えて溶解した後、希塩酸（１．０ｍｏｌ／Ｌ）を用いてｐＨを２．５に調整した。この水溶液を６０℃に加温し、そのままの温度で９０分攪拌した。
［精製］
　反応終了後、室温に冷却した後、ＮａＯＨ水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）を用いてｐＨ７．０に調整した。Ｓａｒｔｏｃｏｎ　Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ－２ｋＤａ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて精製した後、凍結乾燥により糖鎖原料５－１、糖鎖原料５－２、糖鎖原料５－３、糖鎖原料５－４の混合物である固形物（１．０６ｇ）を得た。
（７－９－２ｂ）［縮合反応］
　工程（７－９－２ａ）で得た糖鎖原料５－１、糖鎖原料５－２、糖鎖原料５－３、糖鎖原料５－４の混合物である固形物（０．８ｇ）にＤＭＦ（８．０ｍＬ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を加え、０℃に冷却した。このスラリー溶液に、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン（０．２３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）と１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を順次加えた。０℃で３０分攪拌した後、室温にて１．５時間攪拌した。スラリーが溶解しないため、再度、０℃に冷却しＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン（０．２３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（０．５５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を順次加えた。室温にて１３．５時間攪拌した後、０℃に冷却し、さらに１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（０．４１ｇ、０．７８ｍｍｏｌ）、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン（５７ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３３ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を順次加えた。室温で１時間攪拌し、水（６８ｍＬ）を加え反応を停止し、Ｇ－１４、Ｇ－１０、糖鎖原料６、糖鎖原料５－４を含む反応液を得た。
［精製］
　この反応液を精製水でさらに希釈した後、Ｓａｒｔｏｃｏｎ　Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ－２ｋＤａ　（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で精製し濃縮した。この濃縮液を、アセトニトリルと水を溶離液とし、カラムにＴｒｉａｒｔ　Ｃ１８（ワイエムシィ社製）を用いて、分離精製を行った。ＵＶ検出（２１０　ｎｍ）によって検出されたメインピークを回収し、減圧濃縮した。この濃縮液を凍結乾燥し、目的化合物Ｇ－１４（９８ｍｇ）を白色粉末として得た。
（実施例７－２）糖鎖供与体の合成（Ｇ－７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
　工程（７－１ｃ）で合成した糖鎖３（２００ｍｇ）及びＭｅｔｈｙｌ　２－（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（６５５ｍｇ、５０ｅｑｕｉｖ）を用いて、「Ｇ－１０の合成方法１」に記載した工程（７－５－１）と同様の方法で、Ｇ－７（６４．９ｍｇ）を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１０１Ｈ１７２Ｎ１４Ｏ６６：　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１３１９．５３４０　（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　１３１９．５２９２
（実施例７－３）糖鎖供与体の合成（Ｇ－８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
　工程（７－１ｃ）で合成した糖鎖３（１００ｍｇ）及び２－（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ－４－ｙｌ）－２－ｏｘｏｅｔｈｙｌ　２－（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１９４ｍｇ、２０ｅｑｕｉｖ）を用いて、「Ｇ－１０の合成方法１」に記載した工程（７－５－１）と同様の方法で、Ｇ－７（３２．０ｍｇ）を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１０６Ｈ１７９Ｎ１５Ｏ６８：　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１３７６．０５７８　（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　１３７６．０５２５
（実施例７－４）糖鎖供与体の合成（Ｇ－９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
　原料としてＳＧ－Ａ（３０ｍｇ）を使用すること以外は、「Ｇ－１０の合成方法２」に記載した工程（７－５－２ｂ）と同様の方法で、Ｇ－９（２３．８　ｍｇ）を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１１０Ｈ１８８Ｎ１８Ｏ７０：　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１４４１．５９２５　（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　１７３３．７８．
（実施例７－６）糖鎖供与体の合成（Ｇ－１１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
　工程（７－１ｃ）で合成した糖鎖３（２００ｍｇ）及びＰｒｏｐｙｌ　２－（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（７３３ｍｇ、５０ｅｑｕｉｖ）を用いて、「Ｇ－１０の合成方法１」に記載した工程（７－５－１）と同様の方法で、Ｇ－１１（８０．９ｍｇ）を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１０３Ｈ１７６Ｎ１４Ｏ６６：　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１３３３．５４９６　（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　１３３３．５４７１
（実施例７－７）糖鎖供与体の合成（Ｇ－１２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
　工程（７－１ｃ）で合成した糖鎖３（２００ｍｇ）及び３－Ｍｅｔｈｏｘｙｐｒｏｐｙｌ　２－（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（８１６ｍｇ、５０ｅｑｕｉｖ）を用いて、「Ｇ－１０の合成方法１」に記載した工程（７－５－１）と同様の方法で、Ｇ－１２（７０．０ｍｇ）を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　　Ｃ１０４Ｈ１７８Ｎ１４Ｏ６７：　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１３４８．５５４９　（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　１３４８．５４９１
（実施例７－８）糖鎖供与体の合成（Ｇ－１３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
　工程（７－１ｃ）で合成した糖鎖３－１（１５０ｍｇ）及びＭｅｔｈｙｌ　２－（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（５６９ｍｇ、５０ｅｑｕｉｖ）を用いて、「Ｇ－１４の合成方法１」に記載した工程（７－９－１）と同様の方法で、Ｇ－１３（５０．０ｍｇ）を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ８２Ｈ１３９Ｎ９Ｏ５６：　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１０７３．９２２６　（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　１０７３．９１９８
（実施例７－１０）［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧＰ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３（糖鎖供与体Ｇ－１５）の合成
（７－１０ａ）ＳＧＰ－ｔｒｉ－Ｆｍｏｃ体の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
［アミノ基のＦｍｏｃ保護］
　ＳＧＰ（２００ｍｇ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（２．１ｍｌ）／蒸留水（０．７ｍｌ）混合溶液に、Ｎ－［（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニルオキシ］スクシンイミド（１８８ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１２ｍｌ、０．７０ｍｍｏｌ）を加えて、室温で３０分攪拌した。
［粗精製］
　反応終了後、反応液をあらかじめジエチルエーテル（３０ｍｌ）を加えた遠沈管（５０ｍｌ）に移した。小型遠心機（日立工機、ＣＦ１６ＲＸ　ＩＩ）を利用して、２層に分離し、上澄みを取り除いた。この操作を２回繰り返した。続いて、メチルアルコール（２ｍｌ）を加え、酢酸エチル（２０　ｍｌ）を加え、小型遠心機（日立工機、ＣＦ１６ＲＸ　ＩＩ）を用いて、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。この操作を２回繰り返した。続いて、適量のジエチルエーテルで固形物を洗浄した後に、減圧下乾燥し、目的化合物を含む固形物（４１２ｍｇ）を得た。これ以上精製せずに次の反応に用いた。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１５７Ｈ２１９Ｎ１５Ｏ７６：　［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１１７８．１３　（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　１１７８．１３．
（７－１０ｂ）［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧＰ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３（糖鎖供与体Ｇ－１５）の合成　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
［縮合反応］
　工程（７－１０ａ）で得られた固形物（４１２ｍｇ）と、１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（２４３ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）　のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（６．７ｍｌ）混合液に、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン（１２７ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）　Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．６ｍｌ）溶液と、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１８ｍｌ、１．４０ｍｍｏｌ）を加えて、３７℃で１．５時間攪拌後、室温で１９時間攪拌した。
［粗精製］
　反応終了後、反応液（２．５ｍＬ）をあらかじめジエチルエーテル（３５ｍｌ）を加えた遠沈管（５０ｍｌ）に移した。小型遠心機（日立工機、ＣＦ１６ＲＸ　ＩＩ）を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。この操作を反応液がなくなるまで繰り返した。続いて、メチルアルコール（３ｍｌ）を加え、沈殿物をスパーテルで砕いた。その後、酢酸エチル（３０ｍｌ）を加え、固形物を析出させた後に、小型遠心機（日立工機、ＣＦ１６ＲＸ　ＩＩ）を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。この操作を３回繰り返した。続いて、適量のジエチルエーテルで固形物を洗浄した後に、減圧下乾燥し、固形物を得た。
［Ｆｍｏｃ基の脱保護］
　上記固形物に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５．０ｍｌ）とピペリジン（０．３５ｍｌ）を加え、３７℃で４時間攪拌した。その後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３．３ｍｌ）を加え、室温で１６時間攪拌した。
［粗精製］
　反応終了後、反応液（２．５ｍＬ）をあらかじめジエチルエーテル（３５ｍｌ）を加えた遠沈管（５０ｍｌ）に移した。小型遠心機（日立工機、ＣＦ１６ＲＸ　ＩＩ）を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。この操作を反応液がなくなるまで繰り返した。続いて、メチルアルコール（８ｍｌ）を加え、沈殿物をスパーテルで砕いた。その後、酢酸エチル（１６ｍｌ）を加え、固形物を析出させた後に、小型遠心機（日立工機、ＣＦ１６ＲＸ　ＩＩ）を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。この操作を２回繰り返した。続いて、適量のジエチルエーテルで固形物を洗浄した後に、減圧下乾燥し、固形物を得た。
［精製］
　得られた固形物を０．１％トリフルオロ酢酸水溶液に溶解させた。０．１％トリフルオロ酢酸水溶液と０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはＰｕｒｉｆ－Ｒｐ２（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはＩｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－３（ＧＬサイエンス製）を使用した。溶出中にＵＶ検出（２２０ｎｍ）された目的物を含むフラクションを凍結乾燥した。もう一度蒸留水に溶解し、凍結乾燥前に、適量のアンモニア水を加えて、酸性でないことを確認して再凍結乾燥し、目的化合物Ｇ－１５（９０ｍｇ）を凍結乾燥粉末として得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１３６Ｈ２３７Ｎ２７Ｏ７６：　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１７３３．７８　（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　１７３３．７８．
（実施例７－１１）糖鎖供与体原料（糖鎖原料８－１，糖鎖原料８－２,糖鎖原料８－３）の混合液の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
（７－１１ａ）［加水分解反応及びＮ－Ｂｏｃ化］
　ＳＧＰ（Ｇ－１）（１０．０ｇ）を精製水（１００ｍＬ）に溶解し、ｐＨメーターで確認しながら塩酸（１Ｎ）を加え、ｐＨ２．４に調整した後、温度を６０℃に保ち、３時間攪拌した。室温に冷却した後、ｐＨメーターで確認しながら水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ）を加え、ｐＨ７．５に調整した。　この溶液の５分の１量に対し、二炭酸－ｔｅｒｔ－ブチル（７０８ｍｇ）をテトラヒドロフラン（６ｍＬ）に溶解して加えた後、水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ）を加え、ｐＨ１２に調整し２時間攪拌した。さらに、二炭酸－ｔｅｒｔ－ブチル（３５９ｍｇ）を加え、水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ、２．３ｍＬ）を加え、さらに３時間攪拌した。塩酸（１Ｎ）を加え、ｐＨ８に調整し、糖鎖原料７－１、糖鎖原料７－２、糖鎖原料７－３、糖鎖原料７－４を含む溶液を得た。
（７－１１ｂ）［縮合］
　工程（７－１１ａ）で得られた糖鎖原料７－１、糖鎖原料７－２、糖鎖原料７－３、糖鎖原料７－４を含む溶液の２分の１量に対し、ＤＭＦ（１０ｍＬ）を加えた後、アセトニトリル（１０ｍＬ）を加え、アセトニトリルを減圧留去する操作を４回繰り返し、脱水操作を行った。得られたＤＭＦ溶液に、１１－アジド－３，６，９－トリオキサウンデカン－１－アミン（０．４６ｇ）を加え、０℃に冷却した。続いて、１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（１．０９ｇ）を加えた後、室温で１時間攪拌し、糖鎖原料８－１、糖鎖原料８－２、糖鎖原料８－３、糖鎖原料７－４を含む溶液を得た。
（実施例７－１２）糖鎖供与体の合成（Ｇ－１６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
（７－１２ａ）［糖鎖変換反応］
　工程（７－１１ｂ）で得られた糖鎖原料８－２を含む混合物の溶液をＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５，３ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）を用いてリン酸緩衝液（９．２ｍＬ、ｐＨ６．７、０．２ｍｏｌ／Ｌ）に置換した。この溶液に４－Ｍｅｔｈｏｘｙｌｐｈｅｎｙｌ　２－（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（２８０ｍｇ、７ｅｑｕｉｖ）、トルエン（１．２ｍＬ）、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑ（２．６ｍｇ）を加え、温度を５０℃に保ち、１５０時間攪拌した。
（７－１２ｂ）［精製］
　工程（７－１２ａ）で得られたこの反応液の３分の１について、アセトニトリルと水を溶離液とし、カラムにＸ－Ｂｒｉｄｇｅ　Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて、分離精製を行った。ＵＶ検出（２１０ｎｍ）によって検出された目的物のピークを回収し、減圧濃縮した。この濃縮液を凍結乾燥し、目的化合物Ｇ－１６（１６．３ｍｇ）を白色粉末として得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ８８Ｈ１４３Ｎ９Ｏ５７：　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１１１９．９４（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　１１１９．９３
（実施例７－１３）糖鎖供与体の合成（Ｇ－６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
（７－１３）［糖鎖交換反応］
　工程（７－１ｃ）で得た糖鎖原料３（１００ｍｇ）及び４－Ｍｅｔｈｏｘｙｌｐｈｅｎｙｌ　２－（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｄｅｏｘｙ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（１８２ｍｇ、　２０ｅｑｕｉｖ）を用いて「Ｇ－１０の合成方法１」に記載した工程（７－５－１）と同様の方法で、Ｇ－６（３５ｍｇ）を得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ１０７Ｈ１７６Ｎ１４Ｏ６７：　［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１３６５．５５（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　１３６５．５４
　今回着想した図１に示した形で直接糖鎖転移反応が進行する場合、酵素－Ｂが認識する２分岐糖鎖構造であれば、非還元末端側の構造をＮ結合型に限定する必要はなく、任意の構造で目的の反応が進行すると考えられる。例えば、以下又は図２に示した構造を糖鎖供与体として利用できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
　そこで、以下の実施例では、下記糖鎖誘導体を適宜使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000078
＜実施例８＞「工程１」の反応条件：抗体濃度
　一般的に広く使用されている糖鎖供与体、化学的に合成されたオキサゾリン体を用いた場合には、抗体中のＬｙｓに対してＥｎｄｏ酵素非介在型の化学反応である糖化（Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）が進行しやすくなることが報告されている。更に、この副反応を抑えるためには、弱酸性（ｐＨ６．５０）で反応させ、オキサゾリン体溶液を繰り返し添加して反応させる、つまり反応液を希釈する、ことが推奨された（Ｒｅｆ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０１９　３０（５），１３４３－１３５５）。この報告では、反応液中の抗体濃度は４０μＭ以下に設定されていた。また、化学的に合成されたオキサゾリン体を用いた糖鎖転移反応の詳細プロトコルに関する報告においても、濃度に関して「ｆｉｎａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：　Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ＝１０ｍｇ／ｍｌ」と記載されている（Ｒｅｆ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｖｏｌｕｍｅ　１２，　ｐａｇｅｓ１７０２－１７２１（２０１７））。このように、反応総液量を減らすこと、つまり高濃度抗体溶液で糖鎖転移反応を実施するという発想は、抗体への糖鎖転移反応において、一般的ではない。
　一方、今回着想した図１に示した形で直接糖鎖転移反応が進行する場合、反応溶液の総量を減らすこと、すなわち、分子間の接触頻度が高まる条件、高濃度で反応させることは非常に効果的である。表Ｚ６に代表される安定な糖鎖供与体と抗体を高濃度で混合しても、化学反応の一種である糖化（Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）は起こらない。図１における「工程１」の反応条件では、上記副反応の原因となっている化学的に合成されたオキサゾリン体溶液を添加しないからである。
　本発明における製造方法で適応可能な反応系中のアクセプター分子（例えば、抗体）濃度は限定されないが、実施例８では、反応系中のアクセプター分子（抗体）濃度に関わらず糖鎖転移反応にて中程度（＞８０％）以上の糖鎖転移率の抗体が得られることを確認するため、系内の抗体濃度を２０ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍＬに設定した。
（実施例８－１）反応系中抗体濃度２０ｍｇ／ｍＬの場合
［糖鎖転移反応標準プロトコル１］
　（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１（６ｍｇ）、糖鎖供与体（２０当量）、酵素－Ａ（１．６～１．７％ｗ／ｗ）、酵素－Ｂ（０．２％ｗ／ｗ）と、適量の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ　７．２５）を加え、総量液量３００μＬとし、３０℃で２８時間反応させた。反応開始後、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間、２８時間にサンプリングした。反応終了後、反応液のｐＨを測定した。サンプリング時には反応液を一部抜き取り、含有抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈し、ＬａｂＣｈｉｐ分析開始時まで凍結保管した。
　糖鎖転移反応標準プロトコル１に従って、糖鎖転移反応させ、サンプリング液を準備した。ここでは、参考例１で準備したアクセプター分子溶液１－１を使用した。実施例２で準備した酵素－Ａ溶液（Ｓｉ－００１－２）、あるいは実施例５で準備した酵素－Ａ溶液（Ｓ－００１）のいずれかを使用した。実施例３で準備した酵素－Ｂ溶液（Ｒｐ－００１－２）を使用した。表Ｚ６に従い準備した糖鎖供与体Ｇ－１、Ｇ－３、あるいは、Ｇ－４のいずれかを使用した。各実験に使用した糖鎖供与体の構造に応じて、以下の模式図又は図３に示した糖鎖転移反応が進行する。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
［ＬａｂＣｈｉｐ分析を用いた糖鎖転移率測定］
　前述した方法に従い、サンプリング液をＬａｂＣｈｉｐ分析すると、そのエレクトロフェログラムから、未反応物と糖鎖転移体が分離したピークとして確認される。未反応物と糖鎖転移体のピーク面積比から糖鎖転移率を下記算出式により算出した。
　糖鎖転移率（％）　＝　〔［糖鎖転移抗体由来のＨ鎖のピーク面積］　／｛［未反応物由来のＨ鎖ピーク面積］　＋　［糖鎖転移抗体由来のＨ鎖のピーク面積］｝〕×１００
　（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１に用いた各反応条件に対して、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表Ｚ７．）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000080
　使用する酵素－Ａのポテンシャルに応じて、実施例８－１－４、実施例８－１－５、実施例８－１－６のように糖鎖転移率が２８時間までに８０％を超えない場合がある。このような場合、使用する糖鎖供与体量を増やすと、転移効率が改善することが予想される。実施例８－１－７、実施例８－１－８、実施例８－１－９では、それぞれ、実施例８－１－４、実施例８－１－５、実施例８－１－６で使用した［糖鎖転移反応標準プロトコル１］において、糖鎖供与体を２０当量から４０当量に変更した。予想通りに、糖鎖転移率が改善した。このように、酵素の組み合わせを変えず、かつ最終抗体濃度を変えずに糖鎖転移率を改善したい場合、糖鎖供与体量を倍にするだけよいことがわかる。
（実施例８－２）反応系中抗体濃度４０ｍｇ／ｍＬの場合
　糖鎖転移反応標準プロトコル１の代わりに、糖鎖転移反応標準プロトコル２に従って、実施例８－１と同様にして、糖鎖転移反応させ、ＬａｂＣｈｉｐ分析を用いた糖鎖転移率を測定した。
［糖鎖転移反応標準プロトコル２］
　（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１（６ｍｇ）、糖鎖供与体（２０当量）、酵素－Ａ（１．６～１．７％ｗ／ｗ）、酵素－Ｂ（０．２％ｗ／ｗ）と、適量の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ　７．２５）を加え、総量液量１５０μＬとし、３０℃で２８時間反応させた。反応開始後、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間、２８時間にサンプリングした。反応終了後、反応液のｐＨを測定した。サンプリング時には反応液を一部抜き取り、含有抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈し、ＬａｂＣｈｉｐ分析開始時まで凍結保管した。
　（実施例８－１）と同様にして、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１に用いた各反応条件に対して、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表Ｚ８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000081
（実施例８－３）反応系中抗体濃度６０ｍｇ／ｍＬの場合
　糖鎖転移反応標準プロトコル１の代わりに、糖鎖転移反応標準プロトコル３に従って、実施例８－１と同様にして、糖鎖転移反応させ、ＬａｂＣｈｉｐ分析を用いた糖鎖転移率を測定した。
［糖鎖転移反応標準プロトコル３］
　（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１（６ｍｇ）、糖鎖供与体（２０当量）、酵素－Ａ（１．６～１．７％ｗ／ｗ）、酵素－Ｂ（０．２％ｗ／ｗ）と、適量の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ　７．２５）を加え、総量液量１００μＬとし、３０℃で２８時間反応させた。反応開始後、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間、２８時間にサンプリングした。反応終了後、反応液のｐＨを測定した。サンプリング時には反応液を一部抜き取り、含有抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈し、ＬａｂＣｈｉｐ分析開始時まで凍結保管した。
　実施例８－１と同様にして、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１に用いた各反応条件に対して、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表Ｚ９）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000082
（実施例８－４）反応系中抗体濃度８０ｍｇ／ｍＬの場合
　糖鎖転移反応標準プロトコル１の代わりに、糖鎖転移反応標準プロトコル４に従って、実施例８－１と同様にして、糖鎖転移反応させ、ＬａｂＣｈｉｐ分析を用いた糖鎖転移率を測定した。
［糖鎖転移反応標準プロトコル４］
　（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１（６ｍｇ）、糖鎖供与体（２０当量）、酵素－Ａ（１．６～１．７％ｗ／ｗ）、酵素－Ｂ（０．２　％ｗ／ｗ）と、適量の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ　７．２５）を加え、総量液量７５μＬとし、３０℃で２８時間反応させた。反応開始後、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間、２８時間にサンプリングした。反応終了後、反応液のｐＨを測定した。サンプリング時には反応液を一部抜き取り、含有抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈し、ＬａｂＣｈｉｐ分析開始時まで凍結保管した。ただし、ここでは、参考例１で準備したアクセプター分子溶液１－２を使用した。
　（実施例８－１）と同様にして、Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１に用いた各反応条件に対して、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表Ｚ１０）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000083
　実施例８では、代表的な酵素と代表的な糖鎖供与体の組み合わせで、主に糖鎖供与体量を２０当量に固定して、２８時間までの糖鎖転移率を確認した。どの酵素の組み合わせの場合でも、反応系内の最終抗体濃度が高いほど、糖鎖転移率が高くなることがわかる。また、反応系中の抗体濃度に関わらず糖鎖転移反応にて中程度（＞８０％）以上の糖鎖転移率の抗体が得られることが確認できる。
＜実施例９＞「工程１」の反応条件：糖鎖当量
　本発明における製造方法に適応可能な反応系中の抗体濃度は限定されないが、実施例９では、反応系中に加える糖鎖ドナー分子の量に関わらず糖鎖転移反応にて中程度（＞８０％）以上の糖鎖転移率の抗体が得られることを確認するため、系内に加える糖鎖当量を１０当量～４０当量に設定した。
（実施例９－１）抗体に対して、１０当量の糖鎖を使用する場合
　糖鎖転移反応標準プロトコル１の代わりに、糖鎖転移反応標準プロトコル５に従って、実施例８－１と同様にして、糖鎖転移反応させ、ＬａｂＣｈｉｐ分析を用いた糖鎖転移率を測定した。
［糖鎖転移反応標準プロトコル５］
　（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１（６ｍｇ）、糖鎖供与体（１０当量）、酵素－Ａ（１．６～１．７％ｗ／ｗ）、酵素－Ｂ（０．２％ｗ／ｗ）と、適量の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ　７．２５）を加え、総量液量１００μＬとし、３０℃で２８時間反応させた。反応開始後、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間、２８時間にサンプリングした。反応終了後、反応液のｐＨを測定した。サンプリング時には反応液を一部抜き取り、含有抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈し、ＬａｂＣｈｉｐ分析開始時まで凍結保管した。
　ここでは、参考例１で準備したアクセプター分子溶液１－１を使用した。実施例２で準備した酵素－Ａ溶液（Ｓｉ－００１－２）、あるいは実施例５で準備した酵素－Ａ溶液（Ｓ－００１）のいずれかを使用した。実施例３で準備した酵素－Ｂ溶液（Ｒｐ－００１－２）を使用した。表Ｚ６に従い準備した糖鎖供与体Ｇ－１、Ｇ－３、あるいは、Ｇ－４のいずれかを使用した。各実験に使用した糖鎖供与体の構造に応じて、前述した図３の糖鎖転移反応が進行する。
　実施例８－１と同様にして、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１に用いた各反応条件に対して、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表Ｚ１１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000084
　実施例９－１－４のように糖鎖転移率が２８時間までに８０％を超えない場合、最終抗体濃度を高くすると、転移率が改善すると予想される。そこで、実施例９－１－７では、実施例８－４で使用した［糖鎖転移反応標準プロトコル４］で、糖鎖供与体（２０当量）から糖鎖供与体（１０当量）に変更した条件で反応させた。予想通りに、糖鎖転移率が改善した。このように、糖鎖当量数を変えずに糖鎖転移率を改善したい場合、反応系内の最終抗体濃度を高くするとよい。
（実施例９－２）抗体に対して、３０当量の糖鎖を使用する場合
　糖鎖転移反応標準プロトコル１の代わりに、糖鎖転移反応標準プロトコル６に従って、実施例８－１と同様にして、糖鎖転移反応させ、ＬａｂＣｈｉｐ分析を用いた糖鎖転移率を測定した。
［糖鎖転移反応標準プロトコル６］
　（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１（６ｍｇ）、糖鎖供与体（３０当量）、酵素－Ａ（１．６～１．７％ｗ／ｗ）、酵素－Ｂ（０．２％ｗ／ｗ）と、適量の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ　７．２５）を加え、総量液量１００μＬとし、３０℃で２８時間反応させた。反応開始後、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間、２８時間にサンプリングした。反応終了後、反応液のｐＨを測定した。サンプリング時には反応液を一部抜き取り、含有抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈し、ＬａｂＣｈｉｐ分析開始時まで凍結保管した。
　実施例８－１と同様にして、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１に用いた各反応条件に対して、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表Ｚ１２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000085
（実施例９－３）抗体に対して、４０当量の糖鎖を使用する場合
　糖鎖転移反応標準プロトコル１の代わりに、糖鎖転移反応標準プロトコル７に従って、実施例８－１と同様にして、糖鎖転移反応させ、ＬａｂＣｈｉｐ分析を用いた糖鎖転移率を測定した。
［糖鎖転移反応標準プロトコル７］
　（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１（６ｍｇ）、糖鎖供与体（４０当量）、酵素－Ａ（１．６～１．７％ｗ／ｗ）、酵素－Ｂ（０．２％ｗ／ｗ）と、適量の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ　７．２５）を加え、総量液量１００μＬとし、３０℃で２８時間反応させた。反応開始後、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間、２８時間にサンプリングした。反応終了後、反応液のｐＨを測定した。サンプリング時には反応液を一部抜き取り、含有抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈し、ＬａｂＣｈｉｐ分析開始時まで凍結保管した。
　実施例８－１と同様にして、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１に用いた各反応条件に対して、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表Ｚ１３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000086
　実施例９では、代表的な酵素と代表的な糖鎖供与体の組み合わせで、主に反応系内の最終抗体濃度を６０ｍｇ／ｍＬに固定し、糖鎖供与体量を変更することで、２８時間までの糖鎖転移率を確認した。どの酵素の組み合わせの場合でも、糖鎖供与体使用量が高いほど、糖鎖転移率が高くなることを確認した。また、反応系中に加えた糖鎖当量に関わらず糖鎖転移反応にて中程度（＞８０％）以上の糖鎖転移率の抗体が得られることが確認できる。
　実験例８と実験例９より、「工程１」では、糖鎖供与体使用量と反応系内最終抗体濃度を適宜調節することで、高い糖鎖転移率を達成できる。
　続いて、以下、実施例１０では、主に糖鎖供与体使用量（２０当量）と反応系内最終抗体濃度（６０ｍｇ／ｍＬ）を固定し、利用可能な糖鎖供与体の構造と酵素の組み合わせを確認した。
＜実施例１０＞「工程１」の反応条件：酵素－Ａと酵素－Ｂの組み合わせ
　（実施例８－３）で使用した糖鎖転移反応標準プロトコル３に従って、糖鎖転移反応させ、（実施例８－１）と同様にして、ＬａｂＣｈｉｐ分析を用いて糖鎖転移率を測定した。
　ここでは、表Ｚ１４に記載した組み合わせで、適宜、アクセプター分子溶液、酵素－Ａ溶液、酵素－Ｂ溶液、及び、糖鎖供与体を使い分けた。具体的には、参考例１から参考例３で準備したアクセプター分子溶液１－１、２－１、２－２、あるいは３－１のいずれか一つを使用した。実施例２、あるいは実施例５で準備した酵素－Ａ溶液のいずれか一つを使用した。実施例３、あるいは実施例６で準備した酵素－Ｂ溶液のいずれか一つを使用した。表Ｚ６に従い準備した糖鎖供与体Ｇ－１からＧ－１７のいずれか一つを使用した。各実験に使用した糖鎖供与体の構造に応じて、以下の模式図又は図４の糖鎖転移反応が進行する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
　（実施例８－１）と同様にして、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１、あるいは（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ２、あるいは（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ３に用いた各反応条件に対して、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表Ｚ１４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000088
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000089
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000090
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000091
　実施例１０では、利用可能な糖鎖供与体の構造と酵素の組み合わせを比較し、いずれの組み合わせにおいても糖鎖転移反応にて中程度（＞８０％）以上の糖鎖転移率の抗体が得られることが確認できる。
（酵素－Ａの残留加水分解活性）
　今回着想した図１に示した形で直接糖鎖転移反応が進行する場合、「工程１」で使用する酵素－Ａに加水分解活性が残存していると、例えば、ｍＡｂ－［X－ＭＳＧ１］２が目的物となる場合には、以下の模式図又は図５の加水分解反応が競合すると考えられる。つまり、使用する酵素－Ａの残存加水分解活性が野生型酵素と同等かそれ以上の場合、見かけ上の糖鎖転移率は低くなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
　「工程１」で使用可能な酵素として、Ｅｎｄｏ－Ｓ変異体、Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体、及びＥｎｄｏ－Ｓｉ変異体を任意に選択することができる。任意の変異体として好ましい残存加水分解活性の程度の指標を明確にするため、実施例１１の実験を実施した。
（実施例１１）ｍＡｂ２－［ＭＳＧ１－Ｎ３］２の加水分解
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
［加水分解反応標準プロトコル１］
　ｍＡｂ２－［ＭＳＧ１－Ｎ３］２（０．２ｍｇ）、と酵素－Ａ（２．０％ｗ／ｗ）、適量の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ　７．２５）を加え、総量液量２１μＬとし、３０℃で２４時間反応させた。反応開始後、４時間と２４時間にサンプリングした。サンプリング時には反応液を一部抜き取り、含有抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈し、ＬａｂＣｈｉｐ分析開始時まで凍結保管した。
　ここでは、加水分解反応標準プロトコル１に従って、加水分解し、サンプリング液を準備した。ここでは、参考例７で準備した抗体溶液７－１を使用した。実施例２、実施例４、あるいは実施例５で準備した酵素－Ａ溶液のいずれか一つを使用した。
［ＬａｂＣｈｉｐ分析を用いた糖鎖転移率測定］
　前述した方法に従い、サンプリング液をＬａｂＣｈｉｐ分析すると、そのエレクトロフェログラムから、未反応物と加水分解体が分離したピークとして確認される。未反応物と加水分解体のピーク面積比から加水分解率を、下記算出式により算出した。
　加水分解率（％）＝〔［加水分解体由来のＨ鎖のピーク面積］／｛［未反応物由来のＨ鎖ピーク面積］＋［加水分解体由来のＨ鎖のピーク面積］｝〕×１００
　ｍＡｂ２－［ＭＳＧ１－Ｎ３］２に用いた各反応条件に対して、各反応時間における加水分解率を算出した（表Ｚ１５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000094
　「工程１」で高い糖鎖転移率が期待できる酵素は、反応開始４時間時点において、その野生型酵素と比べて、加水分解率が低いことが確認された。また、反応開始２４時間時点において、その野生型酵素と比べて、おおむね加水分解率が低いものが多いが、中には同等の加水分解率を示す変異体も含まれていた。
　一方で、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８４ＭやＥｎｄｏ－Ｓ２　Ｔ１３８Ｑは、オキサゾリン体を糖鎖供与体にした場合、糖鎖転移率が高くなることが報告されている。しかしながら、オキサゾリン体非存在下で、糖鎖転移抗体と反応させた場合、反応開始４時間時点、及び反応開始２４時間時点において、それらの野生型酵素とほぼ同じ加水分解活性を示した。
　実施例１０、実施例１１、及び参考例８の結果から、「工程１」で使用する酵素は、「反応開始４時間時点の加水分解率が９０％未満」であり、「反応開始２４時間時点の加水分解率が９９．９％未満」を指標にして、任意に選択してよいことがわかる。
＜実施例１２＞「工程１」と「工程２」の組み合わせの効果確認
　実施例１２では、「工程１」の条件に関わらず「工程２」で糖鎖転移率を向上できるか検証した。
　本発明における製造方法が適応可能なアクセプター分子種（抗体種）、糖鎖供与体種、酵素種は限定されないが、いくつかのパターンで「工程１」と「工程２」の組み合わせの効果を確認する目的で、表Ｚ１６に記載した組み合わせ、すなわち、糖鎖供与体５種類、抗体３種類、酵素－Ａ３種類、酵素－Ｂ２種を代表例に選んだ。また、使用する糖鎖供与体量を１０当量、あるいは２０当量とした。
［負荷液調製の標準プロトコル１（工程１）］
　＜工程１＞
　アクセプター分子（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂと、１０当量、２０当量、あるいは６０当量の糖鎖ドナー分子と、１．６％（ｗ／ｗ）の酵素－Ａと、０．２％（ｗ／ｗ）の酵素－Ｂとの混合液に、適量の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ　７．２５）を加え、抗体の終濃度が２０ｍｇ／ｍＬあるいは６０ｍｇ／ｍＬになるように、反応液量を調整した。続いて、その反応液を３０℃でインキュベートし、反応開始２８時間後に反応を終了した。
　＜サンプリング＞
　反応終了後、糖鎖転移率を測定する目的で、極微量の反応液をサンプリングし、抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈した後、ＬａｂＣｈｉｐ分析開始まで凍結保管した。
　＜負荷液のｐＨ、塩濃度調整＞
　続いて、反応液に１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ　３．９）、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、１Ｍ塩酸、精製水を加えてカラム負荷液を調製した。負荷液は抗体濃度が５ｍｇ／ｍＬとなり、かつ、各実験のカラム平衡化液と同じｐＨ及び塩化ナトリウムの終濃度となるように調製した。負荷液の調製後、負荷液の糖鎖転移率を確認することを目的として、０．５ｍＬをサンプリングした。
　ここでは、表Ｚ１６に記載した組み合わせで、適宜、アクセプター分子溶液、酵素－Ａ溶液、及び、糖鎖供与体を使い分けた。具体的には、参考例４で準備したアクセプター分子溶液４－１、参考例５で準備したアクセプター分子溶液５－１、あるいは参考例６で準備したアクセプター分子溶液６－１のいずれか一つを使用した。実施例２で準備した酵素－Ａ溶液（Ｓｉ－００１－２）、あるいは、実施例５で準備した酵素－Ａ溶液（Ｓ－００１）のいずれか一つを使用した。実施例３で準備した酵素－Ｂ溶液（Ｒｐ－００１－３）、あるいは、実施例６で準備した酵素－Ｂ溶液（Ｍ－００２）のいずれか一つを使用した。表Ｚ６に従い準備した糖鎖供与体Ｇ－１、Ｇ－３、Ｇ－４、Ｇ－１０、あるいはＧ－１６のいずれか一つを使用した。
　［陽イオン交換クロマトグラフィーの標準プロトコル１（工程２）］
装置：ＡＫＴＡ　ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ製）
カラム：ＰＯＲＯＳ　ＸＳ（１ｍｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
　負荷液調製の標準プロトコル１に従って準備した負荷液約７０ｍＬをカラムに通液（サンプル通液）した後に、平衡化液（５０ｍＭ　酢酸バッファー、４４５ｍＭ　塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ３．８）を１５ＣＶ（カラム洗浄）流した。その後、カラム再生目的で、溶出液（５０ｍＭ　酢酸バッファー、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ４．０））を８ＣＶ流した。最後に、定置洗浄（ＣＩＰ）目的で、クリーニング液（５０ｍＭ　酢酸バッファー、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）を３ＣＶ流した。
　目的物は２８０ｎｍにおける吸光度により検出し、素通り液は５０ｍＡＵ／２ｍｍ　ＵＶセル以上の場合に回収し、１Ｍトリス溶液を加えてｐＨ５．０－５．４に調整し、素通り画分とした。また、平衡化液によるカラム洗浄工程においては５ＣＶ通液した洗浄液を１つの容器に回収し、洗浄画分とした。この回収液に関して、紫外可視分光光度計システムＳｏｌｏＶＰＥ（Ｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）で抗体濃度、及びマイクロチップ型キャピラリー全自動電気泳動システムＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ製）を用いて糖鎖転移率を確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000095
　ここで示したように、１０当量あるいは２０当量の糖鎖ドナー分子を用いて「工程１」を実施した後に「工程２」を実施した結果、「工程１」で用いる抗体、酵素、糖鎖の種類に関わらず、「工程２」の素通り液中に負荷液よりも糖鎖転移率の向上した抗体を回収することができた。これにより、「工程１」と「工程２」の組み合わせで、可能な限り少ない糖鎖ドナー分子使用量（４０当量以下、好ましくは、１０当量から２０当量）で、高純度の均一な糖鎖構造を有するＦｃ含有分子を取得することが可能であることが示された。また、実施例１２－２、実施例１２－８のように条件によっては洗浄液中にも負荷液よりも糖鎖転移率の向上した抗体が回収されることを確認した。このため、回収率を高めることを目的に必要に応じて回収液と洗浄液を混合できると考えられる。
［糖鎖リモデリング抗体、及びアクセプター分子の質量分析］
　実施例１２で得られた回収液に含まれる糖鎖リモデリング抗体分子のうち、代表的な化合物、及び各化合物調製に使用したアクセプター分子を次の方法で確認した。糖鎖リモデリング抗体分子を重鎖と軽鎖の複合体の状態、あるいは重鎖と軽鎖にフラグメント化した状態で分析カラムで分離し、質量分析計に導入した。装置には、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｘｐｌｏｒｉｓ ２４０（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ製）、Ｖａｎｑｕｉｓｈ Ｆｌｅｘ ＵＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ製）及びＭＡｂＰａｃ　ＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ製）（５μｍ、２．１ｘ５０ｍｍ）を使用し、移動相Ａには水／０．１％ギ酸／０．０２％トリフルオロ酢酸溶液、移動相Ｂにはアセトニトリル／０．１％ギ酸／０．０２％トリフルオロ酢酸添溶液を利用し、移動相Ａが１０分間で２０％から５０％に変化するグラジェントを使用し、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ、８０℃にて分析した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000096
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000097
＜実施例１３＞陽イオン交換クロマトグラフィー媒体の種類の検討
　実施例１３では、実施例１２で示した糖鎖転移率の向上効果が特定のクロマトグラフィー媒体に依存しないことを確認した。ここでは、実施例１２で使用した負荷液調製の標準プロトコル１に従って準備した負荷液を、抗体製造に一般的に用いられる陽イオン交換クロマトグラフィー媒体に負荷した。本発明における方法が粒子状、メンブレン状、モノリス状など幅広い陽イオン交換クロマトグラフィー媒体に適用可能であることを示すため、各種の媒体のうち代表的な製品を実験に用いたが、本発明における陽イオン交換クロマトグラフィー媒体はこれらに限定されるものではない。
［陽イオン交換クロマトグラフィーの標準プロトコル２（工程２）］
　実施例１２で示した［陽イオン交換クロマトグラフィーの標準プロトコル１（工程２）］　のうち、「陽イオン交換クロマトグラフィー媒体」の種類を、ＰＯＲＯＳ　ＸＳ（１ｍｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製）から、ＣＥＸ粒子（ＰＯＲＯＳ　ＨＳ（１ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製）、ＳＯＵＲＣＥ　１５Ｓ（１．６６ｍＬ、Ｃｙｔｉｖａ製）、Ｅｓｈｍｕｎｏ　ＣＰ－ＦＴ（１ｍＬ、Ｍｅｒｃｋ製））、ＣＥＸメンブレン（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ　Ｓ（１ｍＬ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製）、Ｍｕｓｔａｎｇ　Ｓ（０．８６ｍＬ、Ｐａｌｌ製））、あるいはＣＥＸモノリス（ＣＩＭ　ｍｏｎｏｌｉｔｈ　ＳＯ３（１ｍＬ、ＢＩＡ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ製））に変更した。更に、前述の媒体に適した操作条件で、表Ｚ１７に示す各実験を実施した。すなわち、バッファーあるいは負荷液は、ＣＥＸ粒子に対しては接触時間３分（０．３ｍＬ／ｍｉｎあるいは０．５５ｍＬ／ｍｉｎ）、ＣＥＸメンブレンに対しては５メンブレン体積（ＭＶ）／ｍｉｎ（５ｍＬ／ｍｉｎあるいは４．３ｍＬ／ｍｉｎ）、ＣＥＸモノリスに対しては接触時間１分（１ｍＬ／ｍｉｎ）の流速で通液した。平衡化液を５ＣＶあるいは５～１５ＭＶ送液して平衡化した後、ＣＥＸ媒体に対して前述の負荷液を負荷した。負荷液は、ＰＯＲＯＳ　ＨＳ、Ｅｓｈｍｕｎｏ　ＣＰ－ＦＴ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ　Ｓ、ＣＩＭ　ｍｏｎｏｌｉｓｈ　ＳＯ３に対しては約２９ｍＬ、ＳＯＵＲＣＥ　１５Ｓに対しては４９ｍＬ、Ｍｕｓｔａｎｇ　Ｓに対しては２５ｍＬを負荷した。カラム負荷液及び平衡化液のｐＨは用いる担体に応じてｐＨ３．７あるいはｐＨ３．８とし、塩濃度は２８０～４４５ｍＭの範囲で設定した。５～１５ＣＶあるいは１５ＭＶの平衡化液でカラムを洗浄した後、５～８ＣＶあるいは８～５０ＭＶの溶出液（５０ｍＭ酢酸バッファー、１Ｍ塩化ナトリウム溶液、ｐＨ４．０）でＣＥＸ媒体を再生した。目的物は２８０ｎｍにおける吸光度により検出し、素通り液は５０ｍＡＵ／２ｍｍ　ＵＶセル以上の場合に５ｍＬずつ分画して回収し、各画分を１つに混合した後、１Ｍトリス溶液を加えてｐＨ５．０－５．４に調整し、素通り画分とした。また、平衡化液によるカラム洗浄工程においては５ＣＶあるいは５ＭＶ通液した洗浄液を１つの容器に回収し、洗浄画分とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000098
　ここで示したように、実施例１２で使用したクロマトグラフィー媒体以外の媒体を使用した場合であっても糖鎖転移率を向上できることが確認された。
＜実施例１４＞クロマトグラフィー操作条件の検討
　「工程２」の糖鎖転移率向上効果が期待できる単離条件を明確にするため、２種類のＣＥＸ媒体を用いて各種の単離条件で反応液を処理した。
［陽イオン交換クロマトグラフィーの標準プロトコル３（工程２）］
装置：ＡＫＴＡ　ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ製）
カラム：ＰＯＲＯＳ　ＨＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製）、ＳＯＵＲＣＥ　１５Ｓ（Ｃｙｔｉｖａ製）
　単離条件は、実施例１３で使用した［陽イオン交換クロマトグラフィーの標準プロトコル２（工程２）］に従った。ただし、ｐＨ、及び塩濃度は、表Ｚ１９に設定した条件で、各実験を実施した。すなわち、カラム負荷液及び平衡化液のｐＨをｐＨ３．５～５．０、塩濃度を３１０～５００ｍＭの範囲とした。また、平衡化液によるカラム洗浄工程においては５ＣＶ通液したうちの最初の１ＣＶ分を容器に回収し、洗浄画分とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000099
　ここで示したように、いずれのＣＥＸ媒体を用いた場合も、負荷液及び平衡化液のｐＨが糖鎖転移率の向上効果と収率に影響を与えることを確認した。負荷液及び平衡化液のｐＨが低いほど糖鎖転移率の向上効果が高く、ｐＨの増加に伴って糖鎖転移率の向上効果が低下した。一般的には、抗体の陽イオン交換クロマトグラフィー精製では負荷液及び平衡化液のｐＨにはｐＨ４．５～６．０の範囲が選択されるが（Ｇｒｏｅｎｂｅｒｇ　Ａ，　Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　Ｃａｔｉｏｎ－Ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｗｉｔｈ　Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｆｏｒ　ｍＡｂ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．　Ｂｉｏｐｈａｒｍ　Ｉｎｔ．　２０１５；　２８：　４４－４７、及びＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．　ＰＯＲＯＳ　ＸＳ　ａｎｄ　ＨＳ　５０　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｒｅｓｉｎｓ．　［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ；　ｃ２０１６　［ｃｉｔｅｄ　２０２２　Ｊａｎ　１３］．　３　ｐ．　Ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｆｒｏｍ：　ｈｔｔｐｓ：／／ａｓｓｅｔｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ＴＦＳ－Ａｓｓｅｔｓ／ＬＳＧ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ－Ｎｏｔｅｓ／ＰＯＲＯＳ－ｖｉｒａｌ－ｃｌｅａｒａｎｃｅ－ＣＥＸ－ａｐｐ－ｎｏｔｅ．ｐｄｆＰＯＲＯＳ　ＸＳ　ａｎｄ　ＨＳ　５０　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｒｅｓｉｎｓ．　Ｖｉｒａｌ　ｃｌｅａｒａｎｃｅ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｃａｔｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）、本実験では、ｐＨ５．０では糖鎖転移率の向上効果が全く見られず、糖鎖転移率を向上させるにはｐＨ５．０より低いｐＨ（例えば、ｐＨ３．５～４．５）の範囲で単離を行うことが重要であった。
　また、ｐＨと同様に塩濃度が糖鎖転移率の向上効果と収率に影響を与えることを確認した。
＜実施例１５＞「工程１」に関する応用例（酵素、糖鎖ドナー分子、糖鎖アクセプター分子）
（実施例１５ａ）実施例１５で使用する酵素－Ａの調製
　実施例１１と参考例８から、適切な加水分解残存活性を有する酵素を「工程１」に使用する酵素－Ａとして採用できることが示唆された。そこで、Ｅｎｄｏ－ＳやＥｎｄｏ－Ｓ２と同様の性質を示すことが知られているＥｎｄｏ－Ｓｅ、Ｅｎｄｏ－Ｓｄ、Ｅｎｄｏ－Ｓｚを工程１に使用できるか検証した。酵素は、配列番号７６～７８に対応する遺伝子をコードしたプラスミドをメタノール資化性酵母Ｏｇａｔａｅａ　ｍｉｎｕｔａに導入し、実施例２、実施例４、実施例５と同様に調製した（表Ｚ２０）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000100
（実施例１５ｂ）ｍＡｂ２－［ＭＳＧ１－Ｎ３］２の加水分解
　「工程１」で使用可能な酵素として好ましい残存加水分解活性の程度の指標を明確にするため、
表Ｚ２１に示す実験を実施した。
　実施例１５ａで調製した酵素－Ａを用い、実施例１１と同様にして、各反応時間における加水分解率を算出した（表Ｚ２１）。ただし、抗体溶液７－１の代わりに、７－２を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000101
（実施例１５ｃ）「工程１」の反応条件：酵素－Ａと酵素－Ｂの組み合わせ
　（実施例８－２）に記載した［糖鎖転移反応標準プロトコル２］に従って、糖鎖転移反応を実行し、サンプリング液を準備した。その後、（実施例８－１）と同様にして、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表Ｚ２２）。ただし、各実験に使用した糖鎖供与体や糖鎖当量、酵素は、適宜、表Ｚ２２に表記したものに変更した。また、実施例１５－１９から実施例１５－２１では、アクセプター分子として、参考例２２で調製したＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ４、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－Ｆｃ－Ａ、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ＣＬＣＨ－Ａを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000102
　ここで示したように、酵素－ＡにＥｎｄｏ－Ｓ２　Ｔ１３８Ｑを用いた場合（実施例１５－１０）を除き、いずれの酵素の組み合わせにおいても糖鎖転移反応にて中程度（＞８０％）以上の糖鎖転移率の抗体が得られることを確認した。参考例８で示すとおり、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｔ１３８Ｑを用いる場合も、糖鎖供与体の使用量を増やす、残存加水分解活性を低減する変異を導入することで中程度以上の糖鎖転移率の抗体を得ることが可能と推察される。本実施例においては、代表的な酵素の組み合わせを評価することを目的として酵素－ＡとしてＥｎｄｏ－Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２、Ｅｎｄｏ－Ｓｅ、Ｅｎｄｏ－Ｓｚを用いたが、実施例１１に記載のとおり、本発明における酵素－Ａはこれらに限定されず、残存加水分解活性を指標に目的に応じて任意に選択できる。また、実施例１５－１９から実施例１５－２１に示したとおり、フコースレス抗体、Ｆｃ断片、及び「可変領域を欠失させた定常領域のみからなるＣＨと軽鎖の定常領域のみからなるＣＬとを組み合わせたＣＬＣＨ」を用いた場合も、中程度（＞８０％）以上の糖鎖転移率が得られた。このことから、本発明の「工程１」は、Ｆｃ含有分子の種類は抗体に限定されず、幅広いＦｃ含有分子に応用可能であることが実証された。
（実施例１５ｄ）酵素－Ａ／酵素－Ｂ融合タンパク酵素の調製
　化学的、あるいは遺伝子工学的な手法により２つ以上のタンパク質またはタンパク質断片を結合させ、１つの融合タンパク質として機能させる方法が知られている。例えば、非特許文献（Ｆ　Ｇｒｕｅｎｉｎｇｅｒ－Ｌｅｉｔｃｈ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ．　１９９６，１２，　２６１７－２２、および、Ｅｍｉｌｙ　ＭＫ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ　Ｄｅｓ　Ｓｅｌ．　２００５，１０，４９７－５０１）において、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼに精製タグとして炭水化物結合モジュールあるいはグルタチオン　Ｓ－トランスフェラーゼを融合させた例が報告されている。また、特許文献（ＷＯ２０１７１３７４５９）において、基質選択性の異なるエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ同士を融合した酵素（Ｅｎｄｏ－ＳとＥｎｄｏ－Ｈ、あるいはＥｎｄｏ－Ｆ３とＥｎｄｏ－Ｈの融合タンパク質など）を用い、ハイマンノース型糖鎖および複合型糖鎖など、基本構造の異なる糖鎖が付加された抗体から単一のステップで糖鎖が切断された抗体を得る方法が報告されている。一方で、糖鎖ドナー分子からアクセプター分子に糖鎖を転移させる反応を効率化することを目的に融合タンパク質を用いた例はこれまで報告されていない。本明細書に記載のとおり、本発明において、酵素－Ａと酵素－Ｂは、それぞれ所望の役割を果たす限り、直接的又は間接的に結合した状態において反応系に添加されてもよい。ここでは、代表として、酵素－Ｂと酵素－Ａを連続したアミノ酸残基を含むリンカーにより結合した融合タンパク質を調製し、反応性を確認した。融合タンパク質は、配列番号８０～８１に対応する遺伝子をコードした発現プラスミドをメタノール資化性酵母Ｏｇａｔａｅａ　ｍｉｎｕｔａに導入することで産生株を得た。メタノール誘導によるタンパク質の発現では、振盪培養の場合、バッフルフラスコを用いて植菌後１日目にメタノール誘導、植菌後３日目に培養を終了し、遠心分離にて菌体を集菌した。集菌した菌体を、ＹｅａｓｔＢｕｓｔｅｒ（登録商標）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｅｒｃｋ，７１１８６）を用いて破砕し、遠心分離を行った上清をＣａｐｔｏ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇを用いて精製した。最後にＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５，３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）でＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬）にバッファーを置換して酵素液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000103
（実施例１５ｅ）ｍＡｂ２－［ＭＳＧ１－Ｎ３］２の加水分解
　「工程１」で使用可能な酵素として好ましい残存加水分解活性の程度の指標を明確にするため、
表Ｚ２４に示す実験を実施した。
　実施例１５ｄで調製した酵素を用い、実施例１１と同様にして、各反応時間における加水分解率を算出した（表Ｚ２４）。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000104
（実施例１５ｆ）酵素－Ｂ／酵素－Ａ融合タンパク酵素の反応例
　（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１（１ｍｇ）、糖鎖供与体（２０当量）、酵素－Ｂ／酵素－Ａ融合タンパク（３．２％ｗ／ｗ）と、適量の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ　７．２５）を加え、総量液量１６．７μＬとし、３０℃で２４時間反応させた。反応開始後、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間にサンプリングした。反応終了後、反応液のｐＨを測定した。サンプリング時には反応液を一部抜き取り、含有抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈し、ＬａｂＣｈｉｐ分析開始時まで凍結保管した。
　その後、（実施例８－１）と同様にして、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表Ｚ２５）。ただし、各実験に使用した糖鎖供与体や糖鎖当量、酵素は、適宜、表Ｚ２５に表記したものに変更した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000105
　ここで示したように、酵素－Ｂと酵素－Ａをアミノ酸で結合した融合タンパク質を用いた場合も、２種類の酵素を別分子として工程１に添加した場合（実施例１０）と同様に、所望の糖鎖が付加された抗体を得ることができた。また、配列番号７９についても、上記手順に従い配列番号８０及び８１の融合タンパク質と同様に融合タンパク質を調製することができる。本実施例においては、代表的な融合タンパク質の例として、それぞれの酵素の全長をアミノ酸により直接結合した融合タンパク質を用いたが、本発明における融合タンパク質はこれに限定されない。
＜実施例１６＞「工程２」の応用例
（実施例１６－１）陽イオン－疎水マルチモード樹脂を用いた精製
　実施例１２で示した糖鎖転移率の向上効果が、陽イオン－疎水マルチモード樹脂を用いた場合にも得られることを確認した。
　ここでは、下記の負荷液調製の標準プロトコル２に従って準備した負荷液を、抗体製造に一般的に用いられる陽イオン－疎水マルチモード樹脂に負荷した。市販の代表的な製品を実験に用いたが、本発明における陽イオン－疎水マルチモード樹脂はこれらに限定されるものではない。
［負荷液調製の標準プロトコル２（工程１）］
　＜工程１＞
　（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１（アクセプター分子溶液、２０００ｍｇ）と、２０当量の糖鎖ドナー分子（Ｇ－１）と、１．６％（ｗ／ｗ）の酵素－Ａ（Ｓ－００１）と、０．２％（ｗ／ｗ）の酵素－Ｂ（Ｍ－００１）との混合液に、適量の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ　７．２５）を加え、抗体の終濃度が６０ｍｇ／ｍＬになるように、反応液量を調整した。続いて、その反応液を３０℃でインキュベートし、反応開始２４時間後に反応を終了し、精製実験を開始するまで凍結保管した。
　＜サンプリング＞
　反応終了後、糖鎖転移率を測定する目的で、極微量の反応液をサンプリングし、抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈した後、ＬａｂＣｈｉｐ分析開始まで凍結保管した。
［陽イオン－疎水マルチモードクロマトグラフィーの標準プロトコル１（工程２）］
装置：ＡＫＴＡ　ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ製）
カラム（いずれも容量１ｍｌ）：Ｃａｐｔｏ　ＭＭＣ　Ｉｍｐｒｅｓｓ（Ｃｙｔｉｖａ製）、Ｅｓｈｍｕｎｏ　ＣＭＸ（Ｍｅｒｃｋ製）、Ｎｕｖｉａ　ｃＰｒｉｍｅ（ＢＩＯ－ＲＡＤ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
　負荷液調製の標準プロトコル２に従って準備した反応液に１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ　３．９）、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、１Ｍ塩酸、精製水を加えてカラム負荷液を調製した。負荷液は抗体濃度が５ｍｇ／ｍＬとなり、かつ、各実験のカラム平衡化液と同じｐＨ及び塩化ナトリウムの終濃度となるように調製した。負荷液の調製後、負荷液の糖鎖転移率を確認することを目的として、０．５ｍＬをサンプリングした。調製した負荷液約３０ｍＬをカラムに通液（サンプル通液）した後に、平衡化液（５０ｍＭ　酢酸バッファー、４９０ｍＭ　塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ３．８）を５ＣＶ流した（カラム洗浄）。その後、カラム再生目的で、溶出液（５０ｍＭ　酢酸バッファー、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ４．０））を５ＣＶ流した。最後に、定置洗浄（ＣＩＰ）目的で、クリーニング液（０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）を３ＣＶ流した。サンプル通液時のカラム素通り液中の目的物は２８０ｎｍにおける吸光度により検出し、５０ｍＡＵ／２ｍｍ　ＵＶセル以上の場合に回収し、１Ｍトリス溶液を加えてｐＨ５．０－５．４に調整し、回収液とした。この回収液に関して、紫外可視分光光度計システムＳｏｌｏＶＰＥ（Ｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）で抗体濃度、及びマイクロチップ型キャピラリー全自動電気泳動システムＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ製）を用いて糖鎖転移率を確認した（表Ｚ２６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000106
　ここで示したように、陽イオン－疎水マルチモード樹脂を用いた場合にも糖鎖転移率の向上効果が得られることが確認された。
（実施例１６－２）結合／溶出モードで精製した方法との比較
　目的物を陽イオン交換カラムに吸着させた後、溶出液を通液して溶出画分に回収した場合も、糖鎖転移率の向上効果が得られることを確認した。実施例１２に記載したように目的物を陽イオン交換カラム素通り画分に回収する方法と直接比較するため、同じ方法（負荷液調製の標準プロトコル２（工程１））で調製した反応液を用い、陽イオン交換クロマトグラフィーの標準プロトコル４、あるいは陽イオン交換クロマトグラフィーの標準プロトコル５にて精製を行った。
［陽イオン交換クロマトグラフィーの標準プロトコル４（工程２）］
装置：ＡＫＴＡ　ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ製）
カラム：ＭｏｎｏＳ（１ｍｌ）（Ｃｙｔｉｖａ製）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
　負荷液調製の標準プロトコル２に従って準備した反応液に対し、１１倍量の平衡化液（５０ｍＭ　酢酸バッファー、ｐＨ３．８、ｐＨ４．０、あるいはｐＨ４．２）を加えてカラム負荷液を調製した。負荷液を表Ｚ２７に従った負荷量となるようにカラムに通液し、目的物をカラムに吸着させた。平衡化液を５ＣＶ流してカラムを洗浄した後、溶出液（５０ｍＭ　酢酸バッファー、１Ｍ　塩化ナトリウム水溶液、ｐＨは平衡化液に合わせた）を用いて塩化ナトリウムの直線的濃度勾配（２０ＣＶで０～１００％）により目的物をカラムから溶出させた。溶出液中の目的物は２８０ｎｍにおける吸光度により検出し、２０ｍＡＵ／２ｍｍ　ＵＶセル以上の場合に０．５ｍｌずつ分画した。この分画液に関して、紫外可視分光光度計システムＳｏｌｏＶＰＥ（Ｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）で抗体濃度、及びマイクロチップ型キャピラリー全自動電気泳動システムＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ製）を用いて糖鎖転移率を確認し、負荷液と比較して糖鎖転移率が向上している画分のみを混合し、回収液とした（表Ｚ２７）。
［陽イオン交換クロマトグラフィーの標準プロトコル５（工程２）］
装置：ＡＫＴＡ　ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ製）
カラム：ＭｏｎｏＳ（１ｍｌ）（Ｃｙｔｉｖａ製）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
　負荷液調製の標準プロトコル２に従って準備した反応液に対し、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ　３．９）、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、１Ｍ塩酸、精製水を加えてカラム負荷液を調製した。負荷液は抗体濃度が５ｍｇ／ｍＬとなり、かつ、各実験のカラム平衡化液と同じｐＨ及び塩化ナトリウムの終濃度となるように調製した。負荷液約３０ｍＬをカラムに通液（サンプル通液）した後に、平衡化液（５０ｍＭ　酢酸バッファー、４９０ｍＭ　塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ３．８）を５ＣＶ流した（カラム洗浄）。その後、カラム再生目的で、溶出液（５０ｍＭ　酢酸バッファー、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ４．０））を５ＣＶ流した。最後に、定置洗浄（ＣＩＰ）目的で、クリーニング液（０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）を３ＣＶ流した。サンプル通液時のカラム素通り液中の目的物は２８０ｎｍにおける吸光度により検出し、５０ｍＡＵ／２ｍｍ　ＵＶセル以上の場合に回収し、１Ｍトリス溶液を加えてｐＨ５．０－５．４に調整し、回収液とした。この回収液に関して、紫外可視分光光度計システムＳｏｌｏＶＰＥ（Ｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）で抗体濃度、及びマイクロチップ型キャピラリー全自動電気泳動システムＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ製）を用いて糖鎖転移率を確認した（表Ｚ２７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000107
　ここで示したように、目的物を陽イオン交換カラムに吸着させた後、溶出液を通液して溶出画分に回収した場合も、糖鎖転移率の向上効果が得られることを確認した。また、目的物を素通り画分に回収する場合（実施例１４）と同様に、ｐＨが低いほど糖鎖転移率の向上効果が高く、ｐＨの増加に伴って糖鎖転移率の向上効果が低下することを確認した。
（実施例１６－３）オキサゾリン法を用いて、反応液を準備した場合
　実施例１２で示した糖鎖転移率の向上効果が、工程１の糖鎖供与体にオキサゾリン体を用いた場合にも得られることを確認した。まず、工程１における糖鎖供与体の適切な使用量を確認した。
［負荷液調製の標準プロトコル３（工程１）］
　＜工程１＞
　（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１（アクセプター分子溶液、６ｍｇ）と、糖鎖供与体Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘ（以下、適宜「Ｎ３－ＭＳＧ１－Ｏｘ」と表記する、特許文献：ＷＯ２０１９０６５９６４）（２当量、４当量、６当量、８当量、あるいは１０当量）、酵素－Ａ（０．５％ｗ／ｗ）と、適量の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ　７．２５）を加え、総液量３００μＬとし、３０℃で２時間反応させた。
　＜サンプリング＞
　反応終了後、糖鎖転移率を測定する目的で、極微量の反応液をサンプリングし、抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈した後、マイクロチップ型キャピラリー全自動電気泳動システムＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ製）を用いて糖鎖転移率を確認した（表Ｚ２８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000108
　表Ｚ２８で示した結果から、工程１にて４当量以上の糖鎖供与体Ｎ３－ＭＳＧ１－Ｏｘを用いた場合は糖鎖転移率が非常に高くなるため、工程２で糖鎖転移率の向上効果を評価するのに適さないと考えられた。このため、工程１にて２当量の糖鎖供与体Ｎ３－ＭＳＧ１－Ｏｘを用いて工程２の負荷液を調製した。
［負荷液調製の標準プロトコル４（工程１）］
　［負荷液調製の標準プロトコル３（工程１）］のうち、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１（アクセプター分子溶液）の添加量を１５０ｍｇに、糖鎖供与体Ｎ３－ＭＳＧ１－Ｏｘの添加量を２当量に変更した。更に、反応総液量を７．５ｍｌとした。
＜負荷液のｐＨ、塩濃度調整＞
　続いて、反応液に１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ　３．９）、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、１Ｍ塩酸、精製水を加えてカラム負荷液を調製した。負荷液は抗体濃度が５ｍｇ／ｍＬとなり、かつ、各実験のカラム平衡化液と同じｐＨ及び塩化ナトリウムの終濃度となるように調製した。負荷液の調製後、負荷液の糖鎖転移率を確認することを目的として、０．５ｍＬをサンプリングした。
［陽イオン交換クロマトグラフィーの標準プロトコル５（工程２）］
装置：ＡＫＴＡ　ａｖａｎｔ　２５（Ｃｙｔｉｖａ製）
カラム：ＰＯＲＯＳ　ＨＳ（１ｍｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製）
流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ
　負荷液調製の標準プロトコル４に従って準備した負荷液約２０ｍＬをカラムに通液（サンプル通液）した後に、平衡化液（５０ｍＭ　酢酸バッファー、４９０ｍＭ　塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ３．８）を５ＣＶ流した（カラム洗浄）。その後、カラム再生目的で、溶出液（５０ｍＭ　酢酸バッファー、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ４．０）を５ＣＶ流した。最後に、定置洗浄（ＣＩＰ）目的で、クリーニング液（０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）を３ＣＶ流した。サンプル通液時のカラム素通り液、およびカラム洗浄時の洗浄液に含まれる目的物は、２８０ｎｍにおける吸光度により検出し、５０ｍＡＵ／２ｍｍＵＶセル以上の場合に回収し、１Ｍトリス溶液を加えてｐＨ５．０－５．４に調整し、それぞれ素通り液および洗浄液とした。これらの回収液に関して、紫外可視分光光度計システムＳｏｌｏＶＰＥ（Ｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）で抗体濃度、及びマイクロチップ型キャピラリー全自動電気泳動システムＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ製）を用いて糖鎖転移率を確認した。（表Ｚ２９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000109
　ここで示したように、工程１の糖鎖供与体にオキサゾリン体を用いた場合でも工程２にて糖鎖転移率の向上効果が得られることが確認された。
　本発明に利用可能な酵素Ａは、既知の酵素、及びその変異体に限定されない。実施例１に記載した要件を満たせば、任意の酵素が選択できる。既知の酵素配列情報をもとにして、新たに変異体を探索しても良い。そこで、実施例１７から実施例１９に、「工程１」に利用可能な酵素Ａのアミノ酸変異確認方法（以下、「アミノ酸変異確認法」と呼ぶ）を示す。
＜実施例１７＞Ｅｎｄｏ－Ｓｉ単変異体の調製
　ここでは網羅的探索法を示すため、Ｅｎｄｏ－Ｓｉの触媒活性ドメインに着目した。変異位置アミノ酸の単独変異での活性を解析するため、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ単変異体（Ｄ２４１Ｘ、Ｔ１９０X、Ｑ３１１X、Ｅ３６０X）を調製した。
　Ｔ１９０の単変異体、及び実施例１でデザインした変異体以外のＤ２４１、Ｑ３１１、Ｅ３６０各単変異体について、実施例２に記載の方法に準じて調製した（表Ｚ３１）。ただし、反応スケールが異なるため、培養時には５００ｍＬあるいは１０００ｍＬ容バッフルフラスコの代わりに、９６穴ディープウェルプレートを使用し、精製時には、Ｃａｐｔｏ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇの代わりに、Ｈｉｓタグ精製キットＣａｐｔｕｒｅｍ　Ｈｉｓ－Ｔａｇｇｅｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用し、簡易精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000110
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000111
＜実施例１８＞ｍＡｂ２－［ＭＳＧ１－Ｎ３］２の加水分解
　次にＥｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴと比べて同等以下の残存加水分解活性を有する酵素を絞り込む方法を示す。ここで用いる抗体には、糖鎖が付加されている抗体であれば、任意の抗体を用いて良い。
　ｍＡｂ２－［ＭＳＧ１－Ｎ３］２（５０μｇ）、実施例１７で準備したＥｎｄｏ－Ｓｉ単変異体（１μｇ）及び５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．２５）を含む計２３．２μＬの反応液を調製し、３０℃で反応させた。反応開始後、１時間、４時間及び２４時間の反応液をサンプリングした。サンプリング時には反応液を一部抜き取り、含有抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈し、ＬａｂＣｈｉｐ分析開始時まで凍結保管した。実施例１１と同様にして、各反応時間における加水分解率を算出した。この試験を計２回実施した（表Ｚ３２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000112
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000113
　この評価では、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴと比べて同等以下の残存加水分解活性を有する酵素に絞り込むことが可能である。「１時間時点で加水分解率が＞９９．９％を示した酵素」は、実施例１１で測定したＥｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴの加水分解活性と比較して、同等以上の残存加水分解活性を示すと判定できる。そこで、「１時間時点で加水分解率が＞９９．９％を示さなかった酵素」について、実施例１９の評価を実施した。
＜実施例１９＞糖鎖供与体Ｇ－１（ＳＧＰ）を用いた糖転移反応確認
　次に、「工程１」に採用可能な酵素のアミノ酸変異を特定する方法を示す。
　（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ２（５０μｇ）、糖鎖供与体Ｇ－１（１２２．７２μｇ、５０当量）、実施例１７で準備したＥｎｄｏ－Ｓｉ単変異体（２μｇ）、実施例３－２で調製したＥｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｈ（５．７μｇ）、及び５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．２５）を含む計２８μＬの反応液を調製し、３０℃で反応させた。
　反応開始後、４時間、８時間及び２４時間の反応液をサンプリングした。サンプリング時には反応液を一部抜き取り、含有抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈し、ＬａｂＣｈｉｐ分析開始時まで凍結保管した。実施例８－１と同様にして、各反応時間における糖鎖転移率を算出した。（表Ｚ３３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000114
　表Ｚ３３の結果より、次のことが確認された。
「Ｄ２４１に単変異を入れる場合」
　酵素Ａとして利用可能なＥｎｄｏ－Ｓｉ単変異体は、必ずしもＤ２４１X１が、X１＝ＱあるいはX１＝Ｍに限定されず、一態様としては、X１＝ＫとX１＝Ｒを除く、任意のアミノ酸が考えられる。
「Ｄ２４１に単変異を入れない場合」
　ここでは、代表例として、Ｔ１９０X２、Ｑ３１１X３、Ｅ３６０X４の３カ所について、網羅的な解析を実施した。一態様としては、Ｔ１９０X２は、X２＝Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｗ、Ｙが考えられ、Ｑ３１１X３は、X３＝Ｆ、Ｎ、Ｙが考えられ、Ｅ３６０X４は、X４＝Ｋが考えられる。
　実施例１９の実験は、極小スケールで実施するため、反応中抗体濃度は、実施例８から実施例１０で実施した反応中抗体濃度と比べて、著しく低く、４．４６ｍｇ／ｍＬであった。実施例８で示したように反応中抗体濃度を高くすると、糖鎖転移率が向上することを考慮すると、各酵素に最適な条件を用いれば、一態様としては、２４時間時点で糖鎖転移率が＜０．１％の酵素を除く大部分の酵素は、「工程１」に採用可能と考えられる（表Ｚ３４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000115
　同様にして、Ｅｎｄｏ－Ｓｉの触媒活性中心付近の全てのアミノ酸の単変異網羅的解析は可能である。従って、「工程１」に利用可能な酵素Ａの触媒活性ドメインに、任意のアミノ酸変異が含まれてよい。
　さらに、この方法は、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ、Ｅｎｄｏ－Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２に限定されず、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ全てに対して利用可能である。従って、工程１に利用可能な酵素Ａは、本発明の実施例に記載された特定のＥｎｄｏ－Ｓｉ変異体、Ｅｎｄｏ－Ｓ変異体、Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体、Ｅｎｄｏ－Ｓｅ変異体、Ｅｎｄｏ－Ｓｄ変異体、Ｅｎｄｏ－Ｓｚ変異体に限定されない。当業者であれば、本明細書を参考にして、本実施例、及び明細書中に例示記載のない、実施例１に記載した要件を満す酵素－Ａの構造を特定できる。従って、実施例１に記載した要件を満たせば、「工程１」には任意の酵素が選択できる。
＜実施例２０＞宿主細胞由来Ｎ２９７糖鎖の直接交換反応
　前述の実施例で示したように、本発明では、加水分解活性が残存している酵素を酵素－Ａとして選択できる。したがって、本発明の一態様において、アクセプター分子は、酵素－Ａが宿主細胞由来の不均一な糖鎖を有するＦｃ含有分子に作用することによりｉｎ　ｓｉｔｕで調製することができる。また、ｉｎ　ｓｉｔｕで調製されたアクセプター分子に対し、実施例１０などで示したように糖鎖ドナー分子から糖鎖を転移させ、所望の糖鎖が均一に付加した抗体を得ることができる。
　具体的には、宿主細胞由来のＮ２９７結合糖鎖を有する抗体に対し、酵素－Ａ、酵素－Ｂ、および糖鎖ドナー分子を加えることで、糖鎖ドナー分子に由来する所望の糖鎖が均一に付加された抗体を得ることができる。本着想においては、酵素－Ａは宿主細胞由来のＮ２９７結合糖鎖に対する加水分解反応と、糖鎖ドナー分子の糖転移反応の両方の作用を同一反応槽内で示す。つまり、まず、酵素－Ａが宿主細胞由来のＮ２９７結合糖鎖を有する抗体に作用し、宿主細胞由来のＮ２９７結合糖鎖を加水分解することでアクセプター分子がｉｎ　ｓｉｔｕで発生する。続いて、同一の反応槽内で酵素－Ｂの作用により活性化された糖鎖ドナー分子に対しても酵素－Ａが作用し、アクセプター分子に糖鎖を転移することができる。本項で記述した一連の反応を以後、「宿主細胞由来Ｎ２９７糖鎖の直接交換反応」と表記する。
　宿主細胞由来Ｎ２９７糖鎖の直接交換反応では、図ｘｘ２に示すとおり、宿主細胞由来のＮ２９７結合糖鎖を所望の糖鎖構造に置換できると考えられる。例えば、糖鎖ドナー分子にＧ－１を選んだ場合、ｍＡｂ－［ＳＧ］２が得られると考えられる。また、糖鎖ドナー分子にＧ－４、Ｇ－１３、Ｇ－１４、あるいはＧ－１６を選んだ場合はｍＡｂ－［X－ＭＳＧ１］２が得られると考えられ、さらに、糖鎖ドナー分子にＧ－３、Ｇ－６、Ｇ－７、Ｇ－８、Ｇ－９、Ｇ－１０、Ｇ－１１、Ｇ－１２、あるいはＧ－１５を選んだ場合、ｍＡｂ－［X－ＳＧ］２が得られると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000116
［Ｎ２９７糖鎖の直接交換反応標準プロトコル１］
　宿主細胞由来のＮ２９７結合糖鎖が不均一に付加された抗体（ｎａｋｅｄ　ｍＡｂ１、１２ｍｇ）、糖鎖供与体Ｇ－１、Ｇ－１０あるいはＧ－１６（４０当量）、酵素－Ａ（１．６％ｗ／ｗ）、酵素－Ｂ（０．２％ｗ／ｗ）と、適量の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ　７．２５）を加え、総量液量２００μＬとし、３０℃で７２時間反応させた。反応開始後、２４時間、４８時間、７２時間にサンプリングした。サンプリング時には反応液を一部抜き取り、含有抗体濃度が１．５ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ　７．２５）で希釈し、分析開始時まで凍結保管した。質量分析、及び／あるいは、ＬａｂＣｈｉｐ分析を用いて、宿主細胞由来のＮ２９７結合糖鎖が所望の糖鎖に交換されていることを確認した。
［質量分析］
　糖鎖リモデリング抗体分子を重鎖と軽鎖にフラグメント化した状態で分析カラムで分離し、質量分析計に導入した。フラグメント化のための還元剤として、ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）を使用した。これにより、糖鎖転移反応で抗体に導入された糖鎖ドナー由来の糖鎖部位Ｎ３基に対してＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応も進行し、ＮＨ２基まで還元された質量がメインのピークとして観測された。
　装置には、Ｑ　Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ製）、Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００　ＵＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ製）及びＰＬＲＰ－Ｓ　１０００Ａ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）（８μｍ、２．１ｘ５０ｍｍ）を使用し、移動相Ａには水／０．１％ギ酸／０．０２％トリフルオロ酢酸溶液、移動相Ｂにはアセトニトリルを利用し、移動相Ａが４分間で２０％から５０％に変化するグラジェントを使用し、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、６０℃にて分析し、デコンボリューションされたスペクトルを得た（表Ｚ３６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000117
　上記において「Ｘ」は、Ｎ３－ＰＥＧ（３）を表す。ただし、Ｎ３基がＮＨ２基まで還元されたピークとして検出される場合は、Ｎ３基１つあたり、窒素原子２個分と水素原子２個分の変化を加味した数値（２６Ｄａ程度）が理論値との差として観測される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000118
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000119
　ｎａｋｅｄ　ｍＡｂ１は、宿主細胞由来のＮ２９７結合糖鎖が不均一に付加された抗体であるため、ＭＳ分析においてＨ鎖に宿主細胞由来Ｎ２９７糖鎖が付加した構造が、複数のＭＳピークとして確認された（表Ｚ３６）。実施例２０－１に着目すると、反応開始２４時間時点で、宿主細胞由来のＮ２９７結合糖鎖はほぼ加水分解され、Ｇ－１由来の糖鎖構造に置き換わっていた。これは、反応液中の抗体の主な構造がｍＡｂ１－［ＳＧ］２であることを示す。一方、実施例２０－２に着目すると、反応開始２４時間時点で、宿主細胞由来のＮ２９７結合糖鎖はほぼ加水分解され、Ｇ－１由来の糖鎖構造、及びその加水分解体の構造に置き換わっていた。これは、反応液中の抗体の主な構造がｍＡｂ１－［ＳＧ］２、及び（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１であることを示す。
　続いて、糖鎖供与体としてＧ－１６を用いた実施例２０－３と実施例２０－４、あるいは、糖鎖供与体としてＧ－１０を用いた実施例２０－５と実施例２０－６に着目すると、それぞれ、Ｇ－１６由来の糖鎖構造、及び、Ｇ－１０由来の糖鎖構造としてのＭＳピークが検出された。また、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑよりも更に残存加水分解活性が弱いＥｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ／Ｑ３０３Ｌを用いた場合においても、直接交換反応開始４８時間時点で、既に宿主細胞由来Ｎ２９７糖鎖はほぼ加水分解された。これは、反応液中の抗体の主な構造がｍＡｂ１－［X－ＳＧ］２、及び（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１、あるいは、ｍＡｂ１－［X－ＭＳＧ１］２、及び（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１であることを示す。ここで示したように、宿主細胞由来の不均一な糖鎖を有する抗体に酵素－Ａを作用させた場合にも、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖が均一に付加された抗体を得ることができた。また、異なる酵素や糖鎖ドナー分子の組み合わせを用いた場合にも同様の結果が得られることを確認した。実施例１９までに得られた結果を考慮すると、本実施例に記載されている組合せの酵素や糖鎖ドナー分子を用いる場合、宿主細胞由来Ｎ２９７糖鎖の直接交換反応も「工程１」に含まれることが実証された。
　さらに、当業者であれば、本明細書を参考して、本実施例、及び明細書中に例示記載のない、実施例２０に記載した要件を満す酵素－Ａ、酵素－Ｂや糖鎖ドナー分子の構造を特定できる。従って、宿主細胞由来Ｎ２９７糖鎖の直接交換反応を「工程１」に採用する場合には、任意の酵素、糖鎖ドナー分子が選択できる。
＜参考例＞
　以下において、参考例を提示する。本明細書において、参考例は、本発明の範囲外の態様を開示するものではなく、あくまで、参考として、各種アクセプター分子、抗体、糖鎖ドナー分子等の製造例や、それらを用いた試験例、本発明の応用的な実施態様等を開示するものである。
　直接糖鎖転移反応にアクセプター分子として使用する（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－Ｆｃ含有分子溶液（アクセプター分子溶液）、加水分解反応に使用する抗体－［ＭＳＧ１－Ｎ３］２溶液（抗体溶液）、及び抗体－［ＳＧ－Ｎ３］２溶液（抗体溶液）を、以下の方法で調製した。
（参考例１）（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１溶液の調製（１）
　ＷＯ２０１７０１０５５９の実施例３に記載された方法で作製できる（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１を含有する溶液を、限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５，３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）と、５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．５）を用いた濃縮透析（ＵＦＤＦ）で緩衝液交換し、表Ｙ－２に示す（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ溶液（アクセプター分子溶液１－１、アクセプター分子溶液１－２）を準備した。
（参考例２）（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ２溶液の調製（１）
　ＷＯ２０１９０６５９６４の実施例６１の工程１に記載された方法で作製できる（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ２を含有する溶液を、限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５，３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）と、５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．５）を用いた濃縮透析（ＵＦＤＦ）で緩衝液交換し、表Ｙ－２に示す（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ溶液（アクセプター分子溶液２－１、アクセプター分子溶液２－２）を準備した。
（参考例３）（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ３溶液の調製（１）
　ＷＯ２０２００５０４０６の実施例８５の工程１に記載された方法で作製できる（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ３を含有する溶液を、限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５，３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）と、５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．５）を用いた濃縮透析（ＵＦＤＦ）で緩衝液交換し、表Ｙ－２に示す（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ溶液（アクセプター分子溶液３－１）を準備した。
（参考例４）（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１溶液の調製（２）
　（参考例１）で使用した５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．５）の代わりに、５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．２５）を用い、（参考例１）と同様にして、表Ｙ－２に示す（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ溶液（アクセプター分子溶液４－１）を準備した。
（参考例５）（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ２溶液の調製（２）
　（参考例２）で使用した５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．５）の代わりに、５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．２５）を用い、（参考例２）と同様にして、表Ｙ－２に示す（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ溶液（アクセプター分子溶液５－１）を準備した。
（参考例６）（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ３溶液の調製（２）
　（参考例３）で使用した５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．５）の代わりに、５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．２５）を用い、（参考例３）と同様にして、表Ｙ－２に示す（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ溶液（アクセプター分子溶液６－１）を準備した。
（参考例７）ｍＡｂ２－［ＭＳＧ１－Ｎ３］２溶液の調製　
　ＷＯ２０１９０６５９６４の実施例６１の工程２に記載された方法で作製できるｍＡｂ２－［ＭＳＧ１－Ｎ３］２を含有する溶液を、限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５，３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）と、５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．２５）を用いた濃縮透析（ＵＦＤＦ）で緩衝液交換し、表Ｙ－２に示すｍＡｂ２－［ＭＳＧ１－Ｎ３］２溶液（抗体溶液７－１及び抗体溶液７－２）を準備した。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000120
（参考例８）Ｅｎｄｏ－Ｓ２変異体の反応性確認
　実施例で使用した標準プロトコルのいずれかに従い、下記表Ｚ３８に示したとおり、適宜条件を設定した。（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１（６ｍｇ）に対して、各種糖鎖供与体（１０当量～４０当量、あるいは１００当量）、酵素－Ａ（０．８％ｗ／ｗ）、酵素－Ｂ（０．２％ｗ／ｗ）、適量の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．２５）を加えて、総量液量１００～３００μＬとし、３０℃で２８時間反応させた。反応開始後、２時間、４時間、６時間、８時間、２４時間、２８時間にサンプリングした。反応終了後、反応液のｐＨを測定した。サンプリング時には反応液を一部抜き取り、含有抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈し、ＬａｂＣｈｉｐ分析開始時まで凍結保管した。実施例と同様にして、糖鎖転移率を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000121
　実施例１１で示したように、残存加水分解活性が野生型とほぼ同等のＥｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８４Ｍに、糖鎖未修飾のＧ－１を糖鎖供与体とした場合は、［工程１］において適切な条件を設定すれば、８０％を超える糖鎖転移率を達成できる。
　一方、化学修飾された糖鎖供与体を使用した場合は、一旦糖鎖が転移した抗体が、残存加水分解活性が野生型とほぼ同等のＥｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８４Ｍで容易に加水分解をうけるため、４０当量以下の糖鎖供与体使用量で糖鎖転移率が８０％を超えなかった。しかしながら、参考例８－１６や参考例８－１７の結果より、糖鎖供与体の使用量を増やせば、糖鎖転移率が改善する傾向が確認された。このような場合、残存加水分解活性を低減する変異を導入することで、「工程１」に採用することが可能であると期待できる。
参考例９：抗ＣＤ７０抗体１の作製
　抗ＣＤ７０抗体１はＷＯ２００４／０７３６５６を参照して作製した。当該抗ＣＤ７０抗体１は、アイソタイプがＩｇＧ１であり、ＬＡＬＡ変異（ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を有する。当該抗ＣＤ７０抗体１の軽鎖アミノ酸配列（配列番号１）及び重鎖アミノ酸配列（配列番号２）を図１４に示す。配列番号１（図１４）に示される軽鎖配列中で、１～１１２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号２（図１４）に示される重鎖配列中で、１～１１８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号１３）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号１４）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号１５）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号１６）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号１７）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号１８）を図２０に示す。
参考例１０：抗ＣＤ７０抗体２の作製
　抗ＣＤ７０抗体２はＷＯ２００７／０３８６３７を参照して作製した。当該抗ＣＤ７０抗体２は、アイソタイプがＩｇＧ１であり、ＬＡＬＡ変異を有する。当該抗ＣＤ７０抗体２の軽鎖アミノ酸配列（配列番号３）及び重鎖アミノ酸配列（配列番号４）を図１５に示す。配列番号３（図１５）に示される軽鎖配列中で、１～１０８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号４（図１５）に示される重鎖配列中で、１～１１８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号１９）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号２０）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号２１）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号２２）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号２３）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号２４）を図２１に示す。
参考例１１：抗ＴＲＯＰ２抗体１の作製
　抗ＴＲＯＰ２抗体１はＷＯ２０１５／０９８０９９を参照して作製した。当該抗ＴＲＯＰ２抗体１は、アイソタイプがＩｇＧ１である。当該抗ＴＲＯＰ２抗体１の軽鎖アミノ酸配列（配列番号５）及び重鎖アミノ酸配列（配列番号６）を図１６に示す。配列番号５（図１６）に示される軽鎖配列中で、１～１０８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号６（図１６）に示される重鎖配列中で、１～１２１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号２５）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号２６）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号２７）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号２８）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号２９）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号３０）を図２２に示す。
参考例１２：抗ＴＲＯＰ２抗体２の作製
　抗ＴＲＯＰ２抗体１はＷＯ２０１５／０９８０９９を参照して作製した。当該抗ＴＲＯＰ２抗体１は、アイソタイプがＩｇＧ１である。抗ＴＲＯＰ２抗体２は、抗ＴＲＯＰ２抗体１にＬＡＬＡ変異を導入した。当該抗ＴＲＯＰ２抗体２の軽鎖アミノ酸配列（配列番号７）及び重鎖アミノ酸配列（配列番号８）を図１７に示す。配列番号７（図１７）に示される軽鎖配列中で、１～１０８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号８（図１７）に示される重鎖配列中で、１～１２１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号３１）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号３２）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号３３）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号３４）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号３５）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号３６）を図２３に示す。
参考例１３：抗ＥＧＦＲ抗体１の作製
　抗ＥＧＦＲ抗体１は、ベクティビックス点滴静注１００ｍｇ審査結果報告書（平成２２年３月５日　医薬食品局審査管理課）を参照して作製した。当該抗ＥＧＦＲ抗体１は、アイソタイプがＩｇＧ１であり、ＬＡＬＡ変異を有する。当該抗ＥＧＦＲ抗体１の軽鎖アミノ酸配列（配列番号９）及び重鎖アミノ酸配列を（配列番号１０）を図１８に示す。配列番号９（図１８）に示される軽鎖配列中で、１～１０８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号１０（図１８）に示される重鎖配列中で、１～１１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号３７）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号３８）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号３９）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号４０）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号４１）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号４２）を図２４に示す。ＣＤＲ配列はＷＯ１９９８／０５０４３３を参照した。
参考例１４：抗ＥＧＦＲ抗体２の作製
　抗ＥＧＦＲ抗体２はＷＯ２００２／０９２７７１を参照して作製した。当該抗ＥＧＦＲ抗体２は、アイソタイプがＩｇＧ１であり、ＬＡＬＡ変異を有する。当該抗ＥＧＦＲ抗体２の軽鎖アミノ酸配列（配列番号１１）及び重鎖アミノ酸配列を（配列番号１２）を図１９に示す。配列番号１１（図１９）に示される軽鎖配列中で、１～１０８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号１２（図１９）に示される重鎖配列中で、１～１１６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号４３）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号４４）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号４５）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号４６）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号４７）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号４８）を図２５に示す。
参考例１５：抗ＨＥＲ２抗体の作製
　本明細書において、「トラスツズマブ」はＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５－８、ｒｈｕＭＡｂ４Ｄ５－８と呼ばれることもあり、配列番号４９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号５０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖を有するヒト化ＩｇＧ１抗体である。アミノ酸配列はＵＳ５８２１３３７を参照した。トラスツズマブの軽鎖アミノ酸配列（配列番号４９）及び重鎖アミノ酸配列（配列番号５０）を図２６に示す。
　抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブの重鎖アミノ酸配列のＥＵインデックス２３４番目及び２３５番目のロイシン（Ｌ）をアラニン（Ａ）に変異（本明細書中、ＬＡＬＡ変異ともいう）させた、トラスツズマブの定常領域改変ＩｇＧ１抗体（本明細書中、改変抗ＨＥＲ２抗体ともいう）を設計し、作製することができる。改変抗ＨＥＲ２抗体の軽鎖アミノ酸配列（配列番号４９）及び重鎖アミノ酸配列（配列番号５１）を図２７に示す。
参考例１６：抗ＨＥＲ２抗体２の作製
　「ペルツズマブ」はＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標）と呼ばれることもあり、配列番号５２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号５３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖を有するヒト化ＩｇＧ１抗体である。アミノ酸配列はＷＯ２００４／００８０９９を参照した。本明細書では抗ＨＥＲ２抗体２ともいう。ペルツズマブの軽鎖アミノ酸配列（配列番号５２）及び重鎖アミノ酸配列（配列番号５３）を図２８に示す。配列番号５２（図２８）に示される軽鎖配列中で、１～１０８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号５３（図２８）に示される重鎖配列中で、１～１１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は重鎖可変領域であり、当該可変領域の位置はＩＭＧＴの定義により決定した。
　抗ＨＥＲ２抗体２は、ＬＡＬＡ変異に加え、重鎖アミノ酸配列のＥＵインデックス２１４番目のリシン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）に変異させたＧ１ｍ３アロタイプの定常領域を有する抗ＨＥＲ２抗体２を設計し、作製することができる（本明細書中、改変抗ＨＥＲ２抗体２ともいう）。当該改変抗ＨＥＲ２抗体２の軽鎖アミノ酸配列（配列番号５２）及び重鎖アミノ酸配列（配列番号５４）を図２９に示す。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号５７）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号５８）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号５９）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号６０）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号６１）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号６２）を図３１に示す。配列番号５２（図２９）に示される軽鎖配列中で、１～１０８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号５４（図２９）に示される重鎖配列中で、１～１１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は重鎖可変領域であり、当該可変領域の位置はＩＭＧＴの定義により決定した。
参考例１７：抗ＣＤＨ６抗体の作製
　抗ＣＤＨ６抗体はＷＯ２０１８／２１２１３６を参照して作製することができる。当該抗ＣＤＨ６抗体は、アイソタイプがＩｇＧ１であり、ＬＡＬＡ変異に加え、重鎖アミノ酸配列のＥＵインデックス３２９番目のプロリン（Ｐ）をグリシン（Ｇ）にした変異を有する。当該抗ＣＤＨ６抗体の軽鎖アミノ酸配列（配列番号５５）及び重鎖アミノ酸配列を（配列番号５６）を図３０に示す。配列番号５５（図３０）に示される軽鎖配列中で、１～１０７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は軽鎖可変領域であり、配列番号５６（図３０）に示される重鎖配列中で、１～１２２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は重鎖可変領域である。当該抗体のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号６３）、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列（配列番号６４）、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号６５）、ＣＤＲＨ１のアミノ酸配列（配列番号６６）、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列（配列番号６７）、及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（配列番号６８）を図３２に示す。
参考例１８：「工程１」の応用法例示１
　近年、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　ＷＴで分解され難い糖鎖構造を、Ｆｃ含有分子である抗体に転移させる例が報告された［非特許文献：ＡＣＳ　Ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｌ．　２０２１，　２５０２－２５１４．、非特許文献：Ａｃｔａ　Ｐｈａｒｍ．　Ｓｉｎ．　Ｂ　２０２２，　２４１７－２４２８］。このことから、糖鎖ドナー分子の構造を適宜選ぶことで、野生型酵素を用いた場合でも、アクセプター分子に糖鎖ドナー分子由来の糖鎖が転移した所望の生成物を得ることができる。例えば、これらの報告に記載されている糖鎖オキサゾリン体の構造を参考にして、還元末端側にＧｌｃＮＡｃを一つ伸張したオキサゾリン化されていないＯ結合型糖鎖ドナー分子あるいはＮ結合型糖鎖ドナー分子を準備し、さらに本明細書の条件を参考にして、これら糖鎖供与体のＯ結合型糖鎖あるいはＮ結合型糖鎖に作用できる適切な酵素－Ｂの存在下、野生型の酵素－Ａを作用させることで所期の生成物を含む反応液を得ることが可能である。したがって、このような応用例は、本発明の「工程１」に含まれる。また、当業者であれば、本明細書を参考して、本実施例、及び明細書中に例示記載のない、協奏的に働く酵素－Ａと酵素－Ｂの構造を特定でき、例えば、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　、Ｅｎｄｏ－Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉなどから選ばれた野生型の酵素－Ａ、および、Ｅｎｄｏ－Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ、Ｅｎｄｏ－ＣＣ（配列番号６）、Ｅｎｄｏ－Ｏｍ（配列番号７）、Ｅｎｄｏ－Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＡＡＤ１０８５１）、Ｅｎｄｏ－ＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＢＡＢ８４８２１）、Ｅｎｄｏ－Ｔｓｐ１００６（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＣＣＹ３７２８７）、Ｅｎｄｏ－Ｔｓｐ１２６３（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＣＤＤ８８９４５）、Ｅｎｄｏ－Ｔｓｐ１４５７（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＣＤＤ８９３５１）、Ｅｎｄｏ－ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＡＡＮ２５１３５）、Ｅｎｄｏ－ＢＨ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＢＡＢ０４５０４．１）、Ｅｎｄｏ－ＢＮ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＷＰ＿００７４８４７４９．１）、Ｅｎｄｏ－ＣＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＸＰ＿００１８３９４０２．１）、Ｅｎｄｏ－ＣＣ２（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＸＰ＿００２９１１８１７．１）、Ｅｎｄｏ－Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＡＡＫ７４６５６．１）、あるいはＥｎｄｏ－Ｐｍ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＡＤＫ９７０３２．１）などから選ばれた酵素－Ｂが挙げられる。
参考例１９：「工程１」の応用法例示２
　本明細書の実験例では、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ反応での例のみを示したが、抗体の生産細胞に酵素－Ａと酵素－Ｂを共発現させた場合も、生産細胞内で図１あるいは図ＸＸ２と同様の状況が再現されることが期待される。当業者であれば、本明細書を参考して共発現の条件を適宜設定することで、所期の生成物を含む反応液（培養液中でも目的の反応が進行する場合、反応液に該当する）を得ることが可能である。したがって、このような応用例は本発明の「工程１」に含まれる。
参考例２０：「工程１」の応用法例示３
　本発明の酵素－Ａは、Ｆｃ含有分子の糖鎖に作用できる酵素である。例えば、Ｅｎｄｏ－ＢＩ１（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＡＣＪ５３５２２．１）、Ｅｎｄｏ－ＢＩ２（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＢＡＪ７１４５０．１）、Ｅｎｄｏ－ＢＴ－３９８７（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＡＡＯ７９０９２．１）、Ｅｎｄｏ－Ｅ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＡＡＲ２０４７７．１）、Ｅｎｄｏ－Ｆ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＡＡＡ２４９２２．１）、Ｅｎｄｏ－Ｆ２（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＡＡＡ２４９２３．１）、Ｅｎｄｏ－Ｆ３（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＡＡＡ２４９２４．１）、Ｅｎｄｏ－ＣｏＭ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＸＰ００６６７３２２２）、あるいはＥｎｄｏ－ＳＢ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＢＢＢ３５９４９）などのアミノ酸配列を部分的に含む酵素（以下、酵素－Ａ断片）に対して、抗体のＦｃ断片に親和性のある構造を導入した場合、本発明の酵素－Ａとして働くことが期待される。
　オキサゾリン体を糖鎖供与体とし、Ｅｎｄｏ－Ｆ３変異体を用いる場合、Ｅｎｄｏ－Ｓなどと比べ、より多い糖鎖量や酵素量が必要であるという点、すなわち大量製造の観点から効率が良くないことが知られていた（非特許文献：Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２０１６，　９３５６－９３７０）。一方、Ｅｎｄｏ－Ｆ３変異体にＦｃ結合性ペプチドを付与することにより、抗体Ｆｃ部分に効率的に糖鎖を転移させることが可能になることが報告されている（非特許文献：Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２０２２，　３０８６－３０９５）。このことから、Ｅｎｄｏ－Ｆ３－Ｆｃ結合性ペプチド複合体は、Ｅｎｄｏ－Ｓと同様の働きをする、すなわち、酵素－Ａ断片とＦｃ結合性構造を組み合わせることで、人工的にＦｃ含有分子の糖鎖に作用できる酵素を作製できることが示された。人工的に作製した酵素－Ａを用いる場合でも、当業者であれば、本明細書を参考して、本実施例、及び明細書中に例示記載のない、酵素－Ａの構造並びに協奏的に働く酵素－Ａと酵素－Ｂの構造を特定し、所期の生成物を含む反応液を得ることが可能である。したがって、このような応用例は、本発明の「工程１」に含まれる。（ただし、Ｆｃ結合性構造とは、Ｆｃ断片に親和性を示す任意のペプチド、核酸、低分子などである。）
参考例２１：「工程１」の応用法例示４
　本発明の糖鎖ドナー分子は、還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを含み、非還元末端が化学修飾されていても良いＮ－結合型糖鎖又はＯ－結合型糖鎖である。糖鎖ドナー分子は本明細書の実施例で使用された糖鎖に限定されず、３分岐型糖鎖構造、４分岐型糖鎖構造、ペイロードが搭載された糖鎖構造などを有する糖鎖ドナー分子にも応用できることが合理的に期待される。すなわち、前述の糖鎖ドナー分子に対して作用できる酵素－Ｂと、酵素－Ａを適宜選択することで、目的の糖鎖転移反応が進行する。
　例えば、Ｅｎｄｏ－Ｓまたはその変異体、Ｅｎｄｏ－Ｓ２またはその変異体、あるいはＥｎｄｏ－Ｆ３またはその変異体を、目的に応じて適宜用いると、３分岐型糖鎖オキサゾリン、あるいは４分岐型糖鎖オキサゾリンあるいは、ペイロードが搭載された糖鎖オキサゾリン体を糖鎖ドナーに用いた場合、所期の化合物を取得できることが報告された（非特許文献：Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ，　２０１８，　１３４７－１３５５．、　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２０１６，　１６５０８－１６５１８、Ａｃｔａ　Ｐｈａｒｍ．　Ｓｉｎ．　Ｂ　２０２２，　２４１７－２４２８、特許文献：ＷＯ２０１７１２４０８４、ＵＳ２０１９００２５４２、ＪＰ２０２１－１４５５４８）。このことから、本明細書を参考して条件を適宜利用することで、Ｅｎｄｏ－Ｓ２は、ＧｌｃＮＡｃを含むＦｃ含有分子に対して作用し、３分岐型糖鎖、４分岐型糖鎖、あるいはペイロードが搭載された糖鎖を導入するための酵素－Ａとして働くことが期待できる。すなわち、３分岐型糖鎖構造、４分岐型糖鎖構造、ペイロードが搭載された糖鎖構造などを有する糖鎖ドナー分子を用いた場合でも、当業者であれば、本明細書を参考して、本実施例、及び明細書中に例示記載のない、酵素－Ａの構造並びに協奏的に働く酵素－Ａと酵素－Ｂの構造を特定し、所期の生成物を含む反応液を得ることが可能である。したがって、このような応用例は「工程１」に含まれる。
参考例２２　実施例１５、および実施例２０に使用する抗体溶液の調製
　抗体には入手可能なＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、あるいはＭｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ（ポテリジオ２０ｍｇ、協和キリン株式会社）を用い、限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５，３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）と、５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．２５）を用いた濃縮透析（ＵＦＤＦ）で緩衝液交換し、表Ｙ－３に示す抗体溶液を準備した。
　また、ＷＯ２０１７０１０５５９の実施例３に記載された方法に準じて、抗体にはＭｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ（ポテリジオ２０ｍｇ、協和キリン株式会社）を用い、野生型Ｅｎｄｏ－Ｓで糖鎖を切断し、精製後、限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５，３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）と、５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．２５）を用いた濃縮透析（ＵＦＤＦ）で緩衝液交換し、アクセプター分子溶液９－１を準備した。
　さらに、ＷＯ２０１８００３９８３の実施例３－９Ａに記載された方法で調製した（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－Ｆｃ－Ａ溶液を用い、限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－５００，１０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）と、５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．２５）を用いた濃縮透析（ＵＦＤＦ）で緩衝液交換し、表Ｙ－３に示すアクセプター分子溶液１０－１を準備した。
　ＷＯ２０１８００３９８３の実施例３－３Ａに記載された方法で調製した（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ＣＬＣＨ－Ａ溶液を用い、限外ろ過膜であるＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－５００，１０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）と、５０ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ７．２５）を用いた濃縮透析（ＵＦＤＦ）で緩衝液交換し、表Ｙ－３に示すアクセプター分子溶液１１－１を準備した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000122
参考例２３　糖鎖供与体Ｇ－１８（Ｍ９－Ａｓｎ、Ｍ８－Ａｓｎ、Ｍ７－Ａｓｎ、Ｍ６－Ａｓｎの混合物）の調製と［工程１］の確認
参考例２３－１　糖鎖供与体Ｇ－１８の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000123
　大豆粉末には、［Ｍ９－Ａｓｎ］の構造が含まれることが知られている（非特許文献：Ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｌ．２００４，　１２７－１３４）。Ｍ８－Ａｓｎ、Ｍ７－Ａｓｎ、あるいはＭ６－Ａｓｎは、それぞれＭ９－Ａｓｎからマンノースが１つ、２つ、あるいは３つ欠損した構造を有する。
［不溶性成分の除去（１）］
　市販品である大豆粉末（Ｓｏｙｂｅａｎ　Ｆｌｏｕｒ　ＴｙｐｅＩ，１Ｋｇ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を０．１５Ｎ　水酸化ナトリウム水溶液（５Ｌ）に懸濁させ、１２０分間攪拌した後に、遠心分離（８０００ｒｐｍ、３０分）し、上清１（３．８Ｌ）を回収した。
［水溶性成分の除去］
　続いて、上清１に硫酸アンモニウム（１．１４Ｋｇ）を加えた。その後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、３０分）し、上清２を取り除き沈殿物１を得た。
［不溶性成分の除去（２）］
　沈殿物１を０．１５Ｎ　水酸化ナトリウム水溶液（４Ｌ）に溶解させた後に、適量の５Ｎ塩酸を加えてｐＨ５．０に調整した。その後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、３０分）し、上清３を取り除き沈殿物２を得た。
［酵素反応］
　沈殿物２を０．１５Ｎ　水酸化ナトリウム水溶液（３Ｌ）に溶解させた後に、適量の５Ｎ塩酸を加えてｐＨ５．０に調整した。その後、Ａｃｔｉｎａｓｅ　ＡＳ（３００ｇ、科研製薬製）を加えた後に、３７℃で４８時間攪拌した。反応終了後、適量の５Ｎ塩酸を加えてｐＨ５．０に調整し、混合液を減圧下セライトろ過（プリコート：セライト５０５，　ボディフィード：セライト５４５）し、ろ液Ａ（２．７Ｌ）を得た。
［不溶性成分の除去（３）］
　ろ液Ａ（２．７Ｌ）に対して、３倍量のアセトンを添加し、生じた沈殿物３を回収する目的で、遠心分離（８０００ｒｐｍ、３０分）し、上清４と分離した。続いて、分離した上清４に対して、１回目と同量のアセトンを添加し、生じた沈殿物４を回収する目的で、遠心分離（８０００ｒｐｍ、３０分）し、上清５と分離した。１回目の操作、及び２回目の操作で得られた沈殿物３と沈殿物４を一つにまとめ、蒸留水（２Ｌ）に溶解した。続いて、減圧下ろ過（ろ紙：ＡＤＶＡＮＴＥＣ　Ｎｏ．２）し、ろ液Ｂを得た。
［不溶性成分の除去（４）］
　ろ液Ｂから減圧下アセトンを除去した後に、適量の５Ｎ塩酸を加えてｐＨ３．０に調整した後に、減圧下セライトろ過（プリコート：セライト５０５，　ボディフィード：セライト５４５）し、ろ液Ｃ（１．５Ｌ）を得た。
［粗精製（１）：カラム精製］
　ろ液Ｃ（１．５Ｌ）をＳＥＰＡＢＥＡＤＳ　ＳＰ２０７（２００ｍＬ、三菱ケミカル製）を充填したカラムに通液し、通過液を回収した。その後、蒸留水を加え、５．０Ｌにメスアップし、カラム処理液（５．０Ｌ）を得た
［粗精製（２）：膜精製］
　カラム処理液（５．０Ｌ）を限外ろ過膜（Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ　２　ｋＤａ，　０．１　ｍ２、ザルトリウス製）を用いて、蒸留水１０Ｌを加水しながら限外ろ過し、限外ろ過処理液（３Ｌ）を得た。
［抽出物の取得］
　限外ろ過処理液（３Ｌ）に対して、２倍量のアセトンを添加し、生じた沈殿物５を回収する目的で、遠心分離（８０００ｒｐｍ、３０分）し、上清６と分離した。続いて、分離した上清６に対して、１回目と同量のアセトンを添加し、生じた沈殿物６を回収する目的で、遠心分離（８０００ｒｐｍ、３０分）し、上清７と分離した。１回目の操作、及び２回目の操作で得られた沈殿物５と沈殿物６を一つにまとめ、凍結乾燥し、抽出物（７８．６ｇ）を得た。
［カラム精製］
　０．１％のギ酸を含む蒸留水とアセトニトリルを溶離液とし、装置にはＡｇｉｌｅｎｔ　１１００シリーズＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、カラムにはＨｙｐｅｒｃａｒｂ（２０Φ　ｘ　１５０　ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ製）を使用し、上記で得られた抽出物の一部（約２０ｇ）の分離精製を行った。ＭＳ検出によって検出されたメインピークを回収し、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥粉末を蒸留水に溶解させ、適量のアンモニア水を加えて、ｐＨ７．０に調整した。その後、再び凍結乾燥し、糖鎖原料Ｇ－１８（４６．７ｍｇ）を凍結乾燥粉末として得た。
［質量分析］
　装置には、Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００（Ａｇｉｌｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、Ｏｒｂｉｔｒａｐ　Ｅｌｉｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ製）及びＨｙｐｅｒｃａｒｂ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ製）（５μｍ、４．６ｘ１５０ｍｍ）を使用し、移動相Ａには水、移動相Ｂにはアセトニトリルを利用し、移動相Ｂが１５分間で５％から１５％に変化するグラジェントを使用し、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、４０℃にて分析した。主に、４つのピークが確認された。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｍ９－Ａｓｎ　Ｃ７４Ｈ１２２Ｎ４Ｏ５８：　［Ｍ－２Ｈ］２－　９９７．３４　（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　９９７．３４．
　Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２－Ａｓｎ　［Ｍ８－Ａｓｎ］は、Ｍ９－Ａｓｎの非還元末端側マンノースが１つ欠損した構造である。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｍ８－Ａｓｎ　Ｃ６８Ｈ１１２Ｎ４Ｏ５３：　［Ｍ－２Ｈ］２－　９１６．３１　（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　９１６．３１．
　Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２－Ａｓｎ　［Ｍ７－Ａｓｎ］は、Ｍ９－Ａｓｎの非還元末端側マンノースが２つ欠損した構造である。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｍ７－Ａｓｎ　Ｃ６２Ｈ１０２Ｎ４Ｏ４８：　［Ｍ－２Ｈ］２－　８３５．２８　（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　８３５．２８．
　Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２－Ａｓｎ　［Ｍ６－Ａｓｎ］は、Ｍ９－Ａｓｎの非還元末端側マンノースが３つ欠損した構造である。
ＥＳＩ－ＭＳ：　Ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｍ６－Ａｓｎ　Ｃ６２Ｈ１０２Ｎ４Ｏ４８：　［Ｍ－２Ｈ］２－　７５４．２６　（ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｍａｓｓ），　Ｆｏｕｎｄ　７５４．２６．
［ＨＰＬＣ分析］
　装置には、Ａｇｉｌｅｎｔ　１２６０（Ａｇｉｌｅｎｔ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、及びＨｙｐｅｒｃａｒｂ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ製）（５μｍ、４．６ｘ１５０ｍｍ）を使用し、移動相Ａには水、移動相Ｂにはアセトニトリルを利用し、移動相Ｂが２０分間で５％から１５％に変化するグラジェントを使用し、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、４０℃にて分析した。主に、４つのピークが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000124
参考例２３－２　糖鎖供与体Ｇ－１８を用いた糖鎖転移反応
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000125
　（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１（０．６ｍｇ）、糖鎖供与体（４０当量）、酵素－Ａ（０．８～１．６％ｗ／ｗ）、酵素－Ｂ（０．０２％～０．２％ｗ／ｗ）と、適量の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ　７．２５）を加え、総量液量１５μＬとし、３０℃で２４時間反応させた。反応開始後、２時間、４時間、６時間、８時間、２２時間、２４時間にサンプリングした。反応終了後、反応液のｐＨを測定した。サンプリング時には反応液を一部抜き取り、含有抗体濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように精製水で希釈し、ＬａｂＣｈｉｐ分析開始時まで凍結保管した。
　（実施例８－１）と同様にして、（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１に用いた各反応条件に対して、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表ＺＺ１７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000126
　実施例２３－１から実施例２３－６の結果より、「酵素－Ｂの添加比率を変えること」、すなわち、「酵素－Ｂによる糖鎖ドナー分子の活性化の速度を変えること」で、最大転移率に影響がでることを確認した。
　「工程１」に利用可能な酵素－Ｂの本質は、フコースを有さない糖鎖ドナー分子から、酵素－ＡがＦｃ含有分子への糖鎖転移反応に利用可能な状態（活性化中間体）に活性化する能力である。一方、酵素－Ａによる糖鎖転移反応は、実施例１１で示したように、その生成物である糖鎖転移体の加水分解反応と必ず競合する。このような環境下、もし、酵素－Ｂによる糖鎖ドナー分子の活性化の速度が十分でない場合、期待される糖鎖転移率は低くなることが予想される。
　これを解決するには、糖鎖ドナー分子の糖鎖構造に応じて、酵素－Ｂを適宜使い分ける必要がある。Ｅｎｄｏ－ＭやＥｎｄｏ－Ｒｐの変異体を変更する他、例えば、Ｅｎｄｏ－Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＡＡＤ１０８５１）、Ｅｎｄｏ－ＣＥ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＢＡＢ８４８２１）、Ｅｎｄｏ－Ｔｓｐ１００６（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＣＣＹ３７２８７）、Ｅｎｄｏ－Ｔｓｐ１２６３（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＣＤＤ８８９４５）、Ｅｎｄｏ－Ｔｓｐ１４５７（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＣＤＤ８９３５１）、Ｅｎｄｏ－ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＡＡＮ２５１３５）、Ｅｎｄｏ－ＢＨ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＢＡＢ０４５０４．１）、Ｅｎｄｏ－ＢＮ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＷＰ＿００７４８４７４９．１）、Ｅｎｄｏ－ＣＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＸＰ＿００１８３９４０２．１）、Ｅｎｄｏ－ＣＣ２（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＸＰ＿００２９１１８１７．１）、Ｅｎｄｏ－Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＡＡＫ７４６５６．１）、あるいはＥｎｄｏ－Ｐｍ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ：　ＡＤＫ９７０３２．１）をスクリーニングし、Ｇ－１８に適した酵素－Ｂの構造を特定することにより、より高い糖鎖転移率が得られることが合理的に予想される。

Claims (43)

  1. 　以下の工程１及び２を含む、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子の製造方法：
    　［工程１］　Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有するＦｃ含有分子であるアクセプター分子と、糖鎖を含む糖鎖ドナー分子とを、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ａ）の存在下で反応させ、反応混合液を得る工程、
    　［工程２］　前記反応混合液を、酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体に接触させ、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子を回収する工程。
  2. 　糖鎖ドナー分子が、還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　工程１が、アクセプター分子と糖鎖ドナー分子とを、酵素－Ａ及び糖鎖ドナー分子の糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ｂ）の存在下で反応させ、反応混合液を得る工程である、請求項２に記載の方法。
  4. 　糖鎖ドナー分子の糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ｂ）が、酵素－Ａの存在下、糖鎖ドナー分子に作用することで、酵素－Ａによる糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖のアクセプター分子への糖鎖転移反応を促進する性質を持つ酵素である、請求項３に記載の方法。
  5. 　酵素－Ｂが、ＳＧＰからＧｌｃＮＡｃ誘導体への糖鎖転移活性を有する酵素である、請求項３又は４に記載の方法。
  6. 　酵素－Ｂが、Ｅｎｄｏ－Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｏｍ、Ｅｎｄｏ－ＣＣ、又はＥｎｄｏ－Ｒｐの変異酵素であり、当該変異酵素はその対応する野生型酵素より低い加水分解活性を有する、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　酵素－Ｂが、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｃ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｅ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｇ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｉ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｐ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｔ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｖ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｓ２１６Ｖ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ２４６Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｄ２７６Ｎ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ａ３１０Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ｆ３０７Ｙ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ｆ３０７Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ａ３１０Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２１４Ｆ／Ｆ３０７Ｙ／Ｌ３０６Ｉ、Ｅｎｄｏ－Ｍ　Ｎ１７５Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｍ　Ｎ１７５Ｑ／Ｙ２１７Ｆ、Ｅｎｄｏ－ＣＣ　Ｎ１８０Ｈ及びＥｎｄｏ－Ｏｍ　Ｎ１９４Ｑからなる群から選択される、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　酵素－Ａと酵素－Ｂとが、融合されている、請求項３～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　工程１において、アクセプター分子１当量に対して２当量から４０当量の糖鎖ドナー分子が使用される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　工程１において、糖鎖転移率が８０％を超える、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　糖鎖ドナー分子が有する糖鎖が、非還元末端が化学修飾されていても良いＮ－結合型糖鎖又はＯ－結合型糖鎖である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　糖鎖ドナー分子が、非還元末端が化学修飾されていても良いＳＧＰ、ＡＧ（９）－Ｐ、ＡＧ（７）－Ｐ、ＳＧ-Ａｓｎ、ＡＧ(９)－Ａｓｎ、ＡＧ(７)－Ａｓｎ、ＳＧ－ＯＲ、ＡＧ（９）－ＯＲ、ＡＧ（７）－ＯＲ、（ＭＳＧ１）－Ａｓｎ、（ＭＳＧ２）－Ａｓｎ、（ＭＳＧ１）－Ａｓｎと（ＭＳＧ２）－Ａｓｎの混合物、ＭＳＧ１－ＯＲ、ＭＳＧ２－ＯＲ、又はＭＳＧ１－ＯＲとＭＳＧ２－ＯＲの混合物であり、式中、Ｒは、少なくとも一つの炭素原子を介して酸素原子に連結する任意の置換基である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　Ｒが、Ｃ１～Ｃ６アルキル基又は置換されていても良いアリール基を示す、請求項１２に記載の方法。
  14. 　Ｒが、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｉ－ブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル基、及びｎ－ヘキシル基からなる群より選択されるか、又は、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ基、Ｃ１～Ｃ６アルキル基、又はハロゲン基で置換されていてもよいフェニル基、ベンジル基、インデニル基、ナフチル基、フルオレニル基、アントラニル基、及びフェナンスレニル基からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 　Ｒが、ＰＭＰ、Ｍｅ、Ａ－Ｍｏｒ、ｉＰｒ、ｎＰｒ、ＰｒＯＭｅ及びＡ－ＰＥＧ－Ｎ３（Ａはグリコール酸ユニット中のアセチル基、すなわち、アノマー水酸基と、ＭｏｒまたはＰＥＧ中のアミノ基に挟まれた部分を表す）からなる群より選択される、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　糖鎖ドナー分子が、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ）－Ｐ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、又は（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３と（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２）－Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３の混合物である請求項１１又は１２に記載の方法。
  17. 　糖鎖ドナー分子が、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ）－ＯＲ、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１）－ＯＲ、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２）－ＯＲ、又は（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１）－ＯＲと（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２）－ＯＲの混合物である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  18. 　糖鎖ドナー分子が、以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
    からなる群より選択される式によって表される化合物である、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　Ｆｃ含有分子が、免疫グロブリン、ＣＬＣＨ又はＦｃ含有断片である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 　Ｎ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎアセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ａ）が、Ｆｃ含有分子の糖鎖に作用できる、加水分解活性が残留していてもよい酵素である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 　酵素－Ａが、Ｅｎｄｏ－Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ、Ｅｎｄｏ－Ｓｅ、Ｅｎｄｏ－Ｓｄ、又はＥｎｄｏ－Ｓｚの変異酵素であり、当該変異酵素はその対応する野生型酵素より低い加水分解活性を有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 　酵素－Ａが、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｑ３０３Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｅ３５０Ｎ、Ｅｎｄｏ－Ｓ　Ｄ２３３Ｑ／Ｄ４０５Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ／Ｑ３１１Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ／Ｅ３６０Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ／Ｑ３１１Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ／Ｅ３６０Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｔ１９０Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｔ１９０／Ｄ２４１Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｔ１９０Ｑ／Ｄ２４１Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８４Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｔ１３８Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８４Ｑ／Ｑ２５０Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２　Ｄ１８４Ｍ／Ｑ２５０Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓｅ　Ｄ２３３Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓｚ　Ｄ２３４Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｓｚ　Ｄ２３４Ｍ／Ｑ３０４Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１X１（X１は、Ｋ、Ｒ及びＤ以外のいずれかのアミノ酸残基を示す）、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｔ１９０X２（X２は、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｗ又はＹのアミノ酸残基を示す）、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｑ３１１X３（X３は、Ｆ、Ｎ、又はＹのアミノ酸残基を示す）、又はＥｎｄｏ－Ｓｉ　Ｅ３６０Ｋである、請求項２１に記載の方法。　　
  23. 　工程１の反応系内ｐＨが、６．５から８．０の範囲である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 　工程１の反応系内最終アクセプター分子濃度が、２０ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 　陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体の素通り画分に、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子を回収する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 　工程２における酸性条件がｐＨ３．５から４．５の範囲を意味する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 　クロマトグラフィー媒体が粒子状、メンブレン状、又はモノリス状である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 　クロマトグラフィー媒体が陽イオン交換クロマトグラフィー媒体である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 　糖鎖が、アジド基（Ｎ３－）を有する置換基で化学修飾されている非還元末端を有し、当該方法が、更に、当該糖鎖のアジド基（Ｎ３－）に、アルキン構造を有する分子を反応させる工程を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 　アルキン構造を有する分子が、化学療法剤、分子標的薬、免疫賦活化剤、毒素、光感受性物質、抗菌剤、抗ウイルス剤、診断用薬剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸分子、核酸、抗原、ビタミン、及びホルモンから選択される、請求項２９に記載の方法。
  31. 　化学療法剤が、カンプトテシン、ピロロベンゾジアゼピン、ドキソルビシン、オーリスタチン、タキサン及びこれらの誘導体から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 　免疫賦活化剤が、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＴＬＲアゴニスト、及びＡ２ＡＲアンタゴニストから選択される、請求項３０に記載の方法。
  33. 　アルキン構造を有する分子が、（Ａ）～（Ｅ）からなる群から選択される、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法；
    （Ａ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、
    （Ｂ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－［４－（｛［（１１’Ｓ，１１’ａＳ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－（３－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝プロポキシ）－５’－オキソ－１１’，１１’ａ－ジヒドロ－１’Ｈ，３’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］－Ｌ－アラニンアミド、
    （Ｃ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、
    （Ｄ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１０’，１１’，１１ａ’－テトラヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、並びに、
    （Ｅ）（ビス（Ｎ，Ｎ－ジエチルエタンアミニウム）　Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛９－［（５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－２，１０－ジオキソ－２，１０－ジスルフィド－１４－（６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］グリシンアミド。
  34. 　請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法によって製造された、Ｆｃ含有分子。
  35. 　Ｎ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子の単離方法であって、前記Ｆｃ含有分子と１つ以上の不純物を含む溶液を、酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体に接触させ、不純物を選択的に陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体にトラップさせる工程、又は前記Ｆｃ含有分子を選択的に陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体にトラップさせる工程を含む、前記方法。
  36. 　Ｎ２９７結合糖鎖が、複合型糖鎖を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 　Ｎ２９７結合糖鎖が、フコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃではなく、及び、前記１つ以上の不純物が、Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有する以外は前記Ｆｃ含有分子と同一である分子を含む、請求項３５又は３６に記載の方法。
  38. 　クロマトグラフィー媒体が陽イオン交換クロマトグラフィー媒体である、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 　以下の工程１及び２を含む、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子の単離方法：
    　［工程１］　Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有するＦｃ含有分子であるアクセプター分子と、糖鎖を含む糖鎖ドナー分子とを、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素－Ａ）の存在下で反応させ、反応混合液を得る工程、
    　［工程２］　前記反応混合液を、酸性条件下で陽イオン交換クロマトグラフィー媒体又はマルチモードクロマトグラフィー媒体に接触させ、糖鎖ドナー分子に由来する糖鎖を含むＮ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子を単離する工程。
  40. 　クロマトグラフィー媒体が陽イオン交換クロマトグラフィー媒体である、請求項３９に記載の方法。
  41. 　Ｎ２９７結合糖鎖を有するＦｃ含有分子が、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＤＬＬ３抗体、抗ＦＡＰ抗体、抗ＣＤＨ１１抗体、抗ＣＤＨ６抗体、抗Ａ３３抗体、抗ＣａｎＡｇ抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ９８抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃｉｎ－Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体、抗ＥＮＰＰ３抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＧＰＲ２０抗体、及び抗ＤＲ５抗体からなる群から選択される抗体に由来する、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法またはＦｃ含有分子。
  42. 　以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
    からなる群より選択される式によって表される化合物。
  43. 　酵素－Ａと酵素－Ｂとの融合タンパクであって、
    　酵素－Ａは、Ｆｃ含有分子のＮ２９７結合糖鎖を基質とするエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼであり、
    　酵素－Ｂは、糖鎖の還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖含有分子の糖鎖を基質とするが、前記Ｎ２９７結合糖鎖を基質としない、又は、前記Ｎ２９７結合糖鎖への反応性が低いエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼである、融合タンパク。
     
PCT/JP2023/007583 2022-03-02 2023-03-01 Ｆｃ含有分子の製造方法 WO2023167238A1 (ja)

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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016082962A (ja) * 2014-04-25 2016-05-19 公益財団法人野口研究所 糖鎖切断抗体の製造方法及び均一糖鎖抗体
JP2017031132A (ja) * 2015-07-29 2017-02-09 公益財団法人野口研究所 コアフコース含有抗体の調製方法
WO2018003983A1 (ja) * 2016-07-01 2018-01-04 第一三共株式会社 ｈＡＮＰ－Ｆｃ含有分子コンジュゲート
US20190040374A1 (en) * 2016-02-08 2019-02-07 Synaffix B.V. Enzymes for trimming of glycoproteins

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016082962A (ja) * 2014-04-25 2016-05-19 公益財団法人野口研究所 糖鎖切断抗体の製造方法及び均一糖鎖抗体
JP2017031132A (ja) * 2015-07-29 2017-02-09 公益財団法人野口研究所 コアフコース含有抗体の調製方法
US20190040374A1 (en) * 2016-02-08 2019-02-07 Synaffix B.V. Enzymes for trimming of glycoproteins
WO2018003983A1 (ja) * 2016-07-01 2018-01-04 第一三共株式会社 ｈＡＮＰ－Ｆｃ含有分子コンジュゲート

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIN-WEI LIN, MING-HUNG TSAI, SHIOU-TING LI, TSUNG-I TSAI, KUO-CHING CHU, YING-CHIH LIU, MENG-YU LAI, CHIA-YU WU, YUNG-CHIEH TSENG: "A common glycan structure on immunoglobulin G for enhancement of effector functions", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 112, no. 34, 25 August 2015 (2015-08-25), pages 10611 - 10616, XP055425565, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.1513456112 *
IWAMOTO MITSUHIRO, SEKIGUCHI YUKIKO, NAKAMURA KENSUKE, KAWAGUCHI YOSHIROU, HONDA TAKESHI, HASEGAWA JUN: "Generation of efficient mutants of endoglycosidase from Streptococcus pyogenes and their application in a novel one-pot transglycosylation reaction for antibody modification", PLOS ONE, vol. 13, no. 2, 23 February 2018 (2018-02-23), pages e0193534, XP055907059, DOI: 10.1371/journal.pone.0193534 *
MASAKI KUROGOCHI, MORI MASAKO, OSUMI KENJI, TOJINO MAMI, SUGAWARA SHU-ICHI, TAKASHIMA SHOU, HIROSE YURIKO, TSUKIMURA WATARU, MIZUN: "Glycoengineered Monoclonal Antibodies with Homogeneous Glycan (M3, G0, G2, and A2) Using a Chemoenzymatic Approach Have Different Affinities for FcγRIIIa and Variable Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Activities", PLOS ONE, PUBLIC LIBRARY OF SCIENCE, vol. 10, no. 7, 22 July 2015 (2015-07-22), pages e0132848, XP055239650, DOI: 10.1371/journal.pone.0132848 *
OU CHONG, LI CHAO, ZHANG ROUSHU, YANG QIANG, ZONG GUANGHUI, DAI YUANWEI, FRANCIS REBECCA L., BOURNAZOS STYLIANOS, RAVETCH JEFFREY : "One-Pot Conversion of Free Sialoglycans to Functionalized Glycan Oxazolines and Efficient Synthesis of Homogeneous Antibody–Drug Conjugates through Site-Specific Chemoenzymatic Glycan Remodeling", BIOCONJUGATE CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 32, no. 8, 18 August 2021 (2021-08-18), US , pages 1888 - 1897, XP093088241, ISSN: 1043-1802, DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.1c00314 *
WANG SHIYI, IONESCU ROXANA, PEEKHAUS NORBERT, LEUNG JIN-YU, HA SHA, VLASAK JOSEF: "Separation of post-translational modifications in monoclonal antibodies by exploiting subtle conformational changes under mildly acidic conditions", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 1217, no. 42, 1 October 2010 (2010-10-01), AMSTERDAM, NL, pages 6496 - 6502, XP093088239, ISSN: 0021-9673, DOI: 10.1016/j.chroma.2010.08.044 *

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