JP2017031132A - コアフコース含有抗体の調製方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】コアフコースを有する均一な糖鎖構造を持つ抗体の調製方法を提供することである。また、該抗体の調製方法を用いた、コアフコースを有する均一な糖鎖構造を持つ抗体を高純度で製造する方法を提供することである。【解決手段】コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体から、コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させる抗体の調製方法であって、少なくとも以下の工程(1)及び工程(2)を行うことを特徴とする抗体の調製方法により上記課題を解決した。(1)該抗体をエンドグリコシダーゼ(1)で処理して、「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミン」に結合している糖鎖を加水分解する工程(2)工程(1)で得られた「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」を除去する工程【選択図】図14
Description
本発明は、抗体の調製方法、該抗体の調製方法を用いた高純度抗体の製造方法、及び均一糖鎖構造を持つ糖鎖改変した抗体に関する。
抗体医薬として認可されている、エリスロポエチン、インフリキシマブ、ベバシズマブ、トラスツズマブ、アダリムバブ等は、いずれもタンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質である。特に癌治療に用いられている抗体はイムノグロブリンクラスがIgGである。癌細胞に発現している抗原に上記IgGが結合すると、抗体依存性細胞傷害(ADCC)、補体依存性細胞傷害(CDC)、シグナル伝達の変化等により抗癌活性を発揮する。
IgG抗体のFc領域のCH2ドメインに位置する297番目のアスパラギン(Asn297)には不均一なN型糖鎖が付加されている。付加される糖鎖の種類により抗体の活性が変化することが知られている。例えば、α1−6結合フコース(以下、「コアフコース」と呼ぶことがある)が欠落すると、FcγRIIIaを介するADCC活性が高まることが知られている(非特許文献1)。また、フコース欠損トラスツズマブは、フコースが付加されたトラスツズマブの少なくとも50倍のADCC活性を有することが報告されており、同様な結果が、リツキシマブや抗CCR4抗体(モガムリズマブ)等(非特許文献2)においても報告されている。
現在、抗体医薬の多くはヒト型の糖鎖を付加する哺乳動物細胞(CHO細胞、NSO細胞等)により製造されている。CHO細胞等により産生された抗体の糖鎖は、糖鎖転移酵素により生合成されるため、糖鎖構造や糖鎖付加の量が、同じ細胞株であっても継代が異なることで変化することが知られている。このように、CHO細胞等で製造された糖タンパク質は、アミノ酸配列レベルでは均一であっても、糖鎖レベルでは不均一となるとの問題があった。また、ヒト血清中IgGのFcに付加している糖鎖構造とCHOで作成したFcの糖鎖構造は種類も存在比も全く異なっていることが報告されていた(非特許文献3)。
抗体のN結合型糖鎖には、高マンノース型糖鎖(ジアセチルキトビオース(GlcNAc−GlcNAc)にマンノースのオリゴマーが結合している糖鎖);複合型糖鎖(ジアセチルキトビオースにマンノース及びGlcNAc、ガラクトース、シアル酸の少なくとも1つが結合した糖鎖);並びに混合(hybrid)型糖鎖(ジアセチルキトビオースに高マンノース型と複合型が混成している糖鎖)が存在する。さらにシアル酸(Sia)の有無、結合様式の違い、コアフコースの有無、分岐N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)の有無等の違いがあり、これらの組み合わせで様々な種類の糖鎖が存在し得る。
したがって、現在市販されている抗体医薬は何れも多数の糖鎖構造を含んでおり、その品質維持が問題となっている。また、バイオシミラーの認可においても糖鎖構造の不均一さに基づき同一成分としての認可が困難となっており、例えば、エリスロポエチンはエポエチンカッパ等の異なる成分名で認可される等の措置が取られている。
したがって、現在市販されている抗体医薬は何れも多数の糖鎖構造を含んでおり、その品質維持が問題となっている。また、バイオシミラーの認可においても糖鎖構造の不均一さに基づき同一成分としての認可が困難となっており、例えば、エリスロポエチンはエポエチンカッパ等の異なる成分名で認可される等の措置が取られている。
抗体に付加された糖鎖の長さとそれが活性や安定性に与える影響が検討されており、糖鎖を短縮化した抗体を用いて、糖鎖の長さがCH2ドメインの構造安定化と活性に影響を与えることが示されている(非特許文献4及び5)。また、医薬品として好ましい糖鎖構造の特性として、例えば、分岐GlcNAcを含むN型糖鎖や、脱コアフコースが知られているが、現在市販されている抗体医薬の多くはこれらの糖鎖を10%程度しか含んでいない。
このように、抗体における糖鎖構造の機能についての解析結果から、医薬品として好ましい特性を抗体に付与することができる均一な糖鎖構造を持つ抗体を製造することが望まれている。また、医薬品として十分な品質管理を達成するためにも、均一な糖鎖構造を持つ抗体を製造することが望まれている。
また、FcγRの遺伝子多型がADCC活性に影響を与えることが報告されている。リツキシマブを投与された患者のうち、FcγRIIIaの176番目のアミノ酸がV/Vホモ接合体である場合、F/Fホモ接合体と比較して、IgG1及びIgG3との結合力が強いことが報告されている(非特許文献6)。
また、FcγRIIIaの158V/158Vの相同染色体を持つ患者、及び、FcγRIIaの131H/131Hの相同染色体を持つ患者は、FcγRIIIaの158F遺伝子を持つ患者やFcγRIIaの131R遺伝子を持つ患者と比較して、リツキシマブへの反応性が高いことが報告されている(非特許文献7)。
また、抗イディオタイプ抗体によるワクチン療法においても、FcγRIIIaの158V/V遺伝子型は、V/F及びF/F遺伝子型と比較して無増悪生存率が高いことが報告されている(非特許文献8)。
また、FcγRIIIaの158V/158Vの相同染色体を持つ患者、及び、FcγRIIaの131H/131Hの相同染色体を持つ患者は、FcγRIIIaの158F遺伝子を持つ患者やFcγRIIaの131R遺伝子を持つ患者と比較して、リツキシマブへの反応性が高いことが報告されている(非特許文献7)。
また、抗イディオタイプ抗体によるワクチン療法においても、FcγRIIIaの158V/V遺伝子型は、V/F及びF/F遺伝子型と比較して無増悪生存率が高いことが報告されている(非特許文献8)。
このように、抗体医薬の効果は患者のFcγRの遺伝子多型に依存することが知られているが、FcγR遺伝子多型に応じて最適な効果を奏し得る糖鎖構造に関する報告はない。
したがって、好ましい糖鎖構造を解析する上でも、均一の糖鎖構造を有する抗体の製造方法の確立が望まれている。
したがって、好ましい糖鎖構造を解析する上でも、均一の糖鎖構造を有する抗体の製造方法の確立が望まれている。
これまで、抗体への糖鎖付与の制御のための検討が種々行われてきた。例えば、抗体の短縮化がAsn297への糖鎖付加や付加される糖鎖構造に与える影響が調べられている(非特許文献9)。また、抗体を産生させる細胞の種類によって付加される糖鎖が異なることが報告されている(非特許文献10)。
また、抗体を大量に生産する生産株において、GnTIIIを共発現させることで分岐GlcNAcの付加された抗体の割合を高め、共発現させない場合と比較して10〜20倍低い濃度で標的細胞を殺傷すること(非特許文献11)が報告されている。
また、抗体を大量に生産する生産株において、GnTIIIを共発現させることで分岐GlcNAcの付加された抗体の割合を高め、共発現させない場合と比較して10〜20倍低い濃度で標的細胞を殺傷すること(非特許文献11)が報告されている。
また、脱コアフコースの方法として、FUT8等のα−フコシルトランスフェラーゼをノックアウトする方法が開示されている(非特許文献3)。しかし、この方法はコアフコースのみをコントロールするものであり、糖鎖構造が均一な抗体を取得することはできなかった。
また、抗体の糖鎖を切断するエンドグリコシダーゼとして、エンドグリコシダーゼS(EndoS)及びその改変体(非特許文献12及び13)が報告されている。該エンドグリコシダーゼには糖鎖構造を認識し、特定の構造に対する特異性があることが知られている。例えば、該グリコシダーゼは、CHO細胞で産生させた抗体に付加するあらゆる糖鎖構造を持つ糖鎖を認識し切断することはできず、不純物として未切断の糖鎖が付加された抗体が残存するという問題があった。
また、抗体の糖鎖を切断するエンドグリコシダーゼとして、エンドグリコシダーゼS(EndoS)及びその改変体(非特許文献12及び13)が報告されている。該エンドグリコシダーゼには糖鎖構造を認識し、特定の構造に対する特異性があることが知られている。例えば、該グリコシダーゼは、CHO細胞で産生させた抗体に付加するあらゆる糖鎖構造を持つ糖鎖を認識し切断することはできず、不純物として未切断の糖鎖が付加された抗体が残存するという問題があった。
また、非特許文献12ではコアフコースを除去するために、CHO細胞から製造されたリツキサンをEndoSで加水分解し、さらにウシからのα−フコシダーゼを20日反応させアクセプターのGlcNAc−Asn−リツキサンを調製しているが、このような煩雑な方法は工業化には適さないという問題があった。
一方で、抗体以外のタンパク質の糖鎖エンジニアリングに関しては、種々の報告が行われている。
非特許文献3には、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼM(Endo−M)を用いてin vitroで糖鎖が付加されていないインスリンにフコースが付加されていないN−グリカンを結合させたことや、N−グリコプロテインである単球走化性タンパク質3(MCP−3)を合成したことが記載されている。また、特許文献1には糖タンパク質が有するN結合型糖鎖を加水分解により遊離させ、かつ糖鎖を転移させる活性を有するエンドグリコシダーゼCC(Endo−CC)が記載されている。
非特許文献3には、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼM(Endo−M)を用いてin vitroで糖鎖が付加されていないインスリンにフコースが付加されていないN−グリカンを結合させたことや、N−グリコプロテインである単球走化性タンパク質3(MCP−3)を合成したことが記載されている。また、特許文献1には糖タンパク質が有するN結合型糖鎖を加水分解により遊離させ、かつ糖鎖を転移させる活性を有するエンドグリコシダーゼCC(Endo−CC)が記載されている。
しかし、糖タンパク質として抗体を用いる場合には、Fcドメインの内側に糖鎖が位置することから、他の糖タンパク質とは異なりEndo−M又はEndo−CCによって完全に糖鎖を切断することは難しいと考えられていた。
また、抗体以外のタンパク質の糖鎖エンジニアリング手法としてエンドグリコシダーゼのトランスグリコシレーション反応を利用し、糖タンパク質の糖鎖を還元末端のGlcNAcを残して切断してアクセプタータンパク質を生成させた後、付加する目的糖鎖ドナーを残存GlcNAcに転移させることにより目的の糖鎖を有する糖タンパク質を製造する方法が報告されている。この方法は、糖鎖ドナーとして均一糖鎖構造を有する糖鎖を用いることにより、任意の均一糖鎖構造を持つ糖タンパク質を合成する方法が開示されている(特許文献2)。
糖鎖リモデリング法を用いて均一糖鎖構造を有する糖タンパク質を合成するために、少なくとも、転移酵素、オキサゾリン誘導体、ドナー基質の3つの技術が必要だと考えられている。
また、抗体以外のタンパク質の糖鎖エンジニアリング手法としてエンドグリコシダーゼのトランスグリコシレーション反応を利用し、糖タンパク質の糖鎖を還元末端のGlcNAcを残して切断してアクセプタータンパク質を生成させた後、付加する目的糖鎖ドナーを残存GlcNAcに転移させることにより目的の糖鎖を有する糖タンパク質を製造する方法が報告されている。この方法は、糖鎖ドナーとして均一糖鎖構造を有する糖鎖を用いることにより、任意の均一糖鎖構造を持つ糖タンパク質を合成する方法が開示されている(特許文献2)。
糖鎖リモデリング法を用いて均一糖鎖構造を有する糖タンパク質を合成するために、少なくとも、転移酵素、オキサゾリン誘導体、ドナー基質の3つの技術が必要だと考えられている。
非特許文献14では、カイコ絹糸腺から産生された抗体を出発原料として糖鎖リモデリング法を用いてコアフコースを有さない均一糖鎖を持つトラスツズマブを調製している。
一方、アクセプタータンパク質として哺乳類動物細胞から生産された抗体を用いる場合には、コアフコースが結合しているN−アセチルグルコサミンとコアフコースが結合していないN−アセチルグルコサミンが混在している。そのため、目的とする糖鎖のみが付いたコアフコースを有する均一糖鎖構造を持つ抗体の製品としての生産に利用可能な製造方法に関する報告はこれまでにない。
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本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、前記問題点を解決し、コアフコースを有する抗体の調製方法を提供することである。また、該抗体の調製方法を用いた、コアフコースを有する均一な糖鎖構造を持つ抗体を高純度で製造する方法を提供することである。
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、特定のエンドグリコシダーゼを使用することにより、「コアフコースを有する糖鎖構造を持つ抗体」の含有割合を増加させることができることを見出した。
また、特定のエンドグリコシダーゼ及び転移酵素を使用することによって、コアフコースを有し、かつ均一糖鎖構造を持つ抗体を調製できることを見出して本発明を完成するに至った。
また、特定のエンドグリコシダーゼ及び転移酵素を使用することによって、コアフコースを有し、かつ均一糖鎖構造を持つ抗体を調製できることを見出して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体から、コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させる抗体の調製方法であって、少なくとも以下の工程(1)及び工程(2)を行うことを特徴とする抗体の調製方法を提供するものである。
(1)該抗体をエンドグリコシダーゼ(1)で処理して、「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミン」に結合している糖鎖を加水分解する工程
(2)工程(1)で得られた「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」を除去する工程
(1)該抗体をエンドグリコシダーゼ(1)で処理して、「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミン」に結合している糖鎖を加水分解する工程
(2)工程(1)で得られた「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」を除去する工程
また、本発明は、コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させると共に、糖鎖部分を均一にする抗体の調製方法であって、
上記工程(1)の前に、以下の工程(A)及び工程(B)を行う上記の抗体の調製方法を提供するものである。
(A)上記抗体をエンドグリコシダーゼ(2)で処理して、N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖を加水分解する工程
(B)工程(A)で得られた「N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」に、均一な糖鎖を転移酵素で付加させる工程
上記工程(1)の前に、以下の工程(A)及び工程(B)を行う上記の抗体の調製方法を提供するものである。
(A)上記抗体をエンドグリコシダーゼ(2)で処理して、N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖を加水分解する工程
(B)工程(A)で得られた「N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」に、均一な糖鎖を転移酵素で付加させる工程
また、本発明は、上記抗体の調製方法を用いることを特徴とする高純度抗体の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、上記抗体の調製方法を用いることを特徴とする高純度な抗体のFcドメインを有する糖タンパク質の製造方法である。
また、本発明は、コアフコースを有するA2、G2、G0、G1a、G1b、及びM3から選択される1種類の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を持つ糖鎖改変した抗体である。
また、本発明は、少なくとも以下の工程(G1)を行い、下記量が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法である。
(G1)コアフコース、コアフコースを有する糖鎖、及び/又は、「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」を定量する工程
(G1)コアフコース、コアフコースを有する糖鎖、及び/又は、「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」を定量する工程
また、本発明は、少なくとも以下の工程(G2)を行い、下記含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法である。
(G2)「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」の含有割合を測定する工程
(G2)「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」の含有割合を測定する工程
また、本発明は、少なくとも以下の工程(G3)を行い、下記フコース結合抗体の含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法である。
(G3)コアフコースを有するA2、G2、G0、G1a、G1b及びM3よりなる群から選択される1種以上の糖鎖が結合したフコース結合抗体の含有割合を測定する工程
(G3)コアフコースを有するA2、G2、G0、G1a、G1b及びM3よりなる群から選択される1種以上の糖鎖が結合したフコース結合抗体の含有割合を測定する工程
また、本発明は、上記抗体の含有量を測定する工程を行い、該抗体の含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法である。
また、本発明は、上記抗体の品質評価方法を使用することを特徴とする抗体の品質管理方法である。
また、本発明は、上記抗体の品質管理方法を使用して抗体を製造することを特徴とする抗体の製造方法である。
本発明によれば、前記問題点や上記課題を解決し、目的とする糖鎖(コアフコースを有する糖鎖)が付加された抗体を調製することができる。更に、目的とする糖鎖が付加され、かつ均一な糖鎖構造を有する抗体を調製することができる。
特に、従来から抗体医薬の製造方法で用いられている、哺乳動物細胞から調製した抗体に対して、本発明の効果を発揮させることができる。
特に、従来から抗体医薬の製造方法で用いられている、哺乳動物細胞から調製した抗体に対して、本発明の効果を発揮させることができる。
また、本発明によれば、酵素処理及び目的の抗体の回収という、簡単なステップにより、効率的かつ低コストで、目的とする糖鎖が付加された抗体を高純度で調製することができる。また、目的とする糖鎖が付加され、かつ均一な糖鎖構造を有する抗体も、簡単なステップにより、効率的かつ低コストで高純度に調製することができる。
また、本発明の抗体の調製方法を用いることにより、目的とする糖鎖のみが付加された抗体を高純度に製造することができる、また、目的とする糖鎖のみが付加され、かつ均一な糖鎖構造を有する抗体も高純度に製造することができる。
また、本発明の抗体は、均一の糖鎖構造を有することにより、医薬品として使用することができる。また、「コアフコースの存在/不存在が糖タンパク質に及ぼす影響」等の検討に、本発明の抗体を利用することができる。
本発明の抗体の品質評価方法や抗体の品質管理方法等を用いることにより、「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」の含有割合が多いほど、抗体の品質が低いと評価することができる。また、該方法を用いて、「コアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を製造することができる。
以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的形態に限定されるものでなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
<抗体の調製方法>
本発明の抗体の調製方法は、コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体から、コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させる抗体の調製方法であって、少なくとも以下の工程(1)及び工程(2)を行うことを特徴とする抗体の調製方法である。
(1)該抗体をエンドグリコシダーゼ(1)で処理して、「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミン」に結合している糖鎖を加水分解する工程
(2)工程(1)で得られた「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」を除去する工程
本発明の抗体の調製方法は、コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体から、コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させる抗体の調製方法であって、少なくとも以下の工程(1)及び工程(2)を行うことを特徴とする抗体の調製方法である。
(1)該抗体をエンドグリコシダーゼ(1)で処理して、「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミン」に結合している糖鎖を加水分解する工程
(2)工程(1)で得られた「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」を除去する工程
本明細書中において、「コアフコース」とは、「糖鎖の還元末端に存在するα1−6結合フコース」を指す。
「コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体」とは、以下の抗体を指す。
(i)「コアフコースを有する糖鎖及びコアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を含有する抗体
(ii)「コアフコースを有する糖鎖のみが結合している抗体」及び「コアフコースを有さない糖鎖のみが結合している抗体」を含有する抗体
(iii)「コアフコースを有する糖鎖のみが結合している抗体」及び「コアフコースを有する糖鎖及びコアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を含有する抗体
(iv)「コアフコースを有さない糖鎖のみが結合している抗体」及び「コアフコースを有する糖鎖及びコアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を含有する抗体
(v)「コアフコースを有する糖鎖のみが結合している抗体」、「コアフコースを有さない糖鎖のみが結合している抗体」及び「コアフコースを有する糖鎖及びコアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を含有する抗体
(i)「コアフコースを有する糖鎖及びコアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を含有する抗体
(ii)「コアフコースを有する糖鎖のみが結合している抗体」及び「コアフコースを有さない糖鎖のみが結合している抗体」を含有する抗体
(iii)「コアフコースを有する糖鎖のみが結合している抗体」及び「コアフコースを有する糖鎖及びコアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を含有する抗体
(iv)「コアフコースを有さない糖鎖のみが結合している抗体」及び「コアフコースを有する糖鎖及びコアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を含有する抗体
(v)「コアフコースを有する糖鎖のみが結合している抗体」、「コアフコースを有さない糖鎖のみが結合している抗体」及び「コアフコースを有する糖鎖及びコアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を含有する抗体
出発物質である「コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体」は、特に限定されないが、例えば、哺乳動物細胞により産生された抗体等が挙げられる。限定はされないが、原料抗体の調製しやすさ等の観点から、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞を用いることが好ましい。
抗体は、定常領域の構造の違いにより、IgG、IgA、IgM、IgD、IgEの5種類に分類されるが、上記抗体は何れの種類の抗体であってもよい。本発明で使用する抗体はIgG抗体であることが好ましい。
上記抗体の例として、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等が、好ましいものとして挙げられる。
「非ヒト抗体」とは、ヒト以外の哺乳動物に免疫して作製された抗体のことである。
「キメラ抗体」とは、異なる動物種由来の可変領域と定常領域を連結した抗体のことである。
「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体の相補性決定領域(CDR;complementarity determining region)をヒト由来の抗体のCDRへ移植したものである。
「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。
これらの抗体は公知の方法により作製することができる。
また、上記抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。また、抗体は、抗体の定常領域の一部又は全部を構成するFc断片であってもよい。
「非ヒト抗体」とは、ヒト以外の哺乳動物に免疫して作製された抗体のことである。
「キメラ抗体」とは、異なる動物種由来の可変領域と定常領域を連結した抗体のことである。
「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体の相補性決定領域(CDR;complementarity determining region)をヒト由来の抗体のCDRへ移植したものである。
「ヒト抗体」とは、すべての領域がヒト由来の抗体である。
これらの抗体は公知の方法により作製することができる。
また、上記抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。また、抗体は、抗体の定常領域の一部又は全部を構成するFc断片であってもよい。
上記抗体は抗体医薬であることが好ましく、特に、トラスツズマブ、インフリキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、トシリズマブ、又はセツキシマブであることが好ましい。
<<工程(1)>>
工程(1)は、コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体をエンドグリコシダーゼ(1)で処理して、「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミン」に結合している糖鎖を加水分解する工程である。
工程(1)は、コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体をエンドグリコシダーゼ(1)で処理して、「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミン」に結合している糖鎖を加水分解する工程である。
ここで、「エンドグリコシダーゼ(1)」とは、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼであって、「『フコースが結合していないN−アセチルグルコサミン』に結合している糖鎖」を加水分解する酵素である。すなわち、「エンドグリコシダーゼ(1)」とは、特定の糖鎖の構造を認識して、該糖鎖ごと切断することができる酵素である。
エンドグリコシダーゼ(1)としては、例えば、エンドグリコシダーゼM(Endo−M)、エンドグリコシダーゼCC(Endo−CC)等が挙げられる。
エンドグリコシダーゼ(1)としては、例えば、エンドグリコシダーゼM(Endo−M)、エンドグリコシダーゼCC(Endo−CC)等が挙げられる。
エンドグリコシダーゼMについては、例えば、Kadowaki,S.,et al.,Agric Biol Chem,54:97-106(1990)に開示されている。エンドグリコシダーゼCCについては、例えば、特許文献1に開示されている。
エンドグリコシダーゼ(1)は、1種を単独で又は2種以上を組み合わせて使用することができる。
エンドグリコシダーゼ(1)は、1種を単独で又は2種以上を組み合わせて使用することができる。
<<工程(2)>>
工程(2)は、上記工程(1)で得られた、「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」を除去する工程である。工程(2)により上記抗体を除去することによって、コアフコースを有する糖鎖の含有割合が増加した抗体を得ることができる。
工程(2)は、上記工程(1)で得られた、「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」を除去する工程である。工程(2)により上記抗体を除去することによって、コアフコースを有する糖鎖の含有割合が増加した抗体を得ることができる。
工程(2)では、上記工程(1)で得られた加水分解処理物をクロマトグラフィーに供することにより、「『フコースが結合していないN−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖』が加水分解された抗体」を除去することが好ましい。
上記クロマトグラフィーの例として、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等が挙げられる。効率よく目的の抗体を除去することができる点で、イオン交換クロマトグラフィーを用いることが好ましい。
<糖鎖部分を均一にする抗体の調製方法>
また、本発明の抗体の調製方法は、コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させると共に、糖鎖部分を均一にする抗体の調製方法であって、上記工程(1)の前に、以下の工程(A)及び工程(B)を行う抗体の調製方法であることが好ましい。
(A)上記抗体をエンドグリコシダーゼ(2)で処理して、N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖を加水分解する工程
(B)工程(A)で得られた「N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」に、均一な糖鎖を転移酵素で付加させる工程
すなわち、工程(A)、工程(B)、工程(1)、工程(2)の順で行うことが好ましい。
また、本発明の抗体の調製方法は、コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させると共に、糖鎖部分を均一にする抗体の調製方法であって、上記工程(1)の前に、以下の工程(A)及び工程(B)を行う抗体の調製方法であることが好ましい。
(A)上記抗体をエンドグリコシダーゼ(2)で処理して、N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖を加水分解する工程
(B)工程(A)で得られた「N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」に、均一な糖鎖を転移酵素で付加させる工程
すなわち、工程(A)、工程(B)、工程(1)、工程(2)の順で行うことが好ましい。
本明細書において、「糖鎖部分を均一にする」とは、「抗体に結合している糖鎖構造を同一にする」ことを言う。
均一の糖鎖構造を持つ抗体には糖鎖結合部位が2箇所あり、(1)両方に糖鎖が結合したfully glycosylated型、(2)片方に糖鎖が結合したhemi−glycosylated型、及び(3)糖鎖が結合していないaglycosylated型が存在する(Wang,S,et al.,J Crom A,1217:6496-6502(2010))が、本発明では(1)の抗体の調製方法を示す。
均一の糖鎖構造を持つ抗体には糖鎖結合部位が2箇所あり、(1)両方に糖鎖が結合したfully glycosylated型、(2)片方に糖鎖が結合したhemi−glycosylated型、及び(3)糖鎖が結合していないaglycosylated型が存在する(Wang,S,et al.,J Crom A,1217:6496-6502(2010))が、本発明では(1)の抗体の調製方法を示す。
<<工程(A)>>
工程(A)は、コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体をエンドグリコシダーゼ(2)で処理して、N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖を加水分解する工程である。
工程(A)は、コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体をエンドグリコシダーゼ(2)で処理して、N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖を加水分解する工程である。
ここで、「エンドグリコシダーゼ(2)」とは、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼであって、N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖を加水分解し、該糖鎖ごと切断することができる酵素である。
エンドグリコシダーゼ(2)としては、例えば、エンドグリコシダーゼS(Endo−S)、エンドグリコシダーゼD(Endo−D)等が挙げられる。
エンドグリコシダーゼ(2)としては、例えば、エンドグリコシダーゼS(Endo−S)、エンドグリコシダーゼD(Endo−D)等が挙げられる。
エンドグリコシダーゼSについては、例えば、非特許文献12や、W.Huang,et al.,J Am Chem Soc,134:12308-12318(2012)に開示されている。
エンドグリコシダーゼDについては、例えば、Muramatsu,T.,J Biol Chem,246: 5535-5537(1971)に開示されている。
エンドグリコシダーゼDについては、例えば、Muramatsu,T.,J Biol Chem,246: 5535-5537(1971)に開示されている。
エンドグリコシダーゼ(2)は1種を単独で又は2種以上を組み合わせて使用することができる。エンドグリコシダーゼ(2)は、効率よくN−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖を加水分解する点等で、Endo−S及びEndo−Dを組み合わせて使用することが好ましい。
エンドグリコシダーゼ(2)は、後述する工程(B)(均一な糖鎖を付加させる工程)において付加させた糖鎖が、残存するエンドグリコシダーゼ(2)によって加水分解を受けることを防止するために、工程(A)の後に除去することが好ましい。
エンドグリコシダーゼ(2)の除去方法は、特に限定されないが、例えば、実施例のように、エンドグリコシダーゼ(2)を固定化することが好ましい。工程(A)の後に濾過フィルターを用いて固定化酵素を分離することにより、固定化したエンドグリコシダーゼ(2)を除去することができる。
エンドグリコシダーゼ(2)の除去方法は、特に限定されないが、例えば、実施例のように、エンドグリコシダーゼ(2)を固定化することが好ましい。工程(A)の後に濾過フィルターを用いて固定化酵素を分離することにより、固定化したエンドグリコシダーゼ(2)を除去することができる。
<<工程(B)>>
工程(B)は、工程(A)で得られた、上記「N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」に、均一な糖鎖を転移酵素で付加させる工程である。
工程(B)は、工程(A)で得られた、上記「N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」に、均一な糖鎖を転移酵素で付加させる工程である。
工程(B)では、工程(A)で得られた、上記「N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」に均一な糖鎖を付加させることができる。
例えば、上記「N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」をアクセプターとして、均一な糖鎖をドナーとして、両者を、転移酵素を用いて反応させることにより、均一な(同一の)糖鎖を付加させることができる。
例えば、均一な糖鎖に対してオキサゾリンを結合させて得られた誘導体(糖鎖−オキサゾリン)等を糖鎖ドナーとして用いることができる。
例えば、均一な糖鎖に対してオキサゾリンを結合させて得られた誘導体(糖鎖−オキサゾリン)等を糖鎖ドナーとして用いることができる。
工程(B)で、抗体に付加される均一な糖鎖の構造は、目的に応じて適宜選択すればよい。例えば、均一な糖鎖の構造の例として、M2型糖鎖(ジアセチルキトビオース(GlcNAc−GlcNAc)に、2個のマンノースが結合している糖鎖)、高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖等が挙げられる。
「高マンノース型糖鎖」とは、GlcNAc−GlcNAcに、マンノースのオリゴマーが結合している糖鎖のことである。高マンノース型糖鎖の例として、3個、4個、5個、6個、7個、8個又は9個のマンノースよりなるマンノースオリゴマーが、GlcNAc−GlcNAcに結合している、M3型、M4型、M5型、M6型、M7型、M8型、M9型等が挙げられる。
「複合型糖鎖」とは、ジアセチルキトビオース(GlcNAc−GlcNAc)に、マンノース、及びGlcNAc、ガラクトース、シアル酸の少なくとも1つが結合した糖鎖のことである。
複合型糖鎖の例として、A2型、G2型、G0型、G1a型、G1b型等が挙げられる。複合型糖鎖の具体的な構造を図2729に示す。
「複合型糖鎖」とは、ジアセチルキトビオース(GlcNAc−GlcNAc)に、マンノース、及びGlcNAc、ガラクトース、シアル酸の少なくとも1つが結合した糖鎖のことである。
複合型糖鎖の例として、A2型、G2型、G0型、G1a型、G1b型等が挙げられる。複合型糖鎖の具体的な構造を図2729に示す。
工程(B)で用いる転移酵素は、上記「N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」に、上記均一な糖鎖を付加する作用を有する酵素であればよい。
転移酵素の例として、実施例で用いられたEndo−Sの変異型酵素(Endo−S D233Q)等の糖転移酵素(グライコシンターゼ)等が挙げられる。
転移酵素の例として、実施例で用いられたEndo−Sの変異型酵素(Endo−S D233Q)等の糖転移酵素(グライコシンターゼ)等が挙げられる。
本発明の抗体の調製方法によって得られる抗体は、コアフコースを有するA2、G2、G0、G1a、G1b、及びM3から選択される1種類の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を持つ抗体であることが好ましい。
<高純度抗体の製造方法>
本発明の高純度抗体の製造方法は、上記抗体の調製方法を用いることを特徴とする。
本発明の高純度抗体の製造方法は、上記抗体の調製方法を用いることを特徴とする。
本発明において「高純度抗体」とは、抗体全体を100%としたときに、2箇所の糖鎖結合部位に同一の糖鎖構造を有する抗体の割合が90%以上の抗体を指す。該同一の糖鎖構造を有する抗体の割合が、92%以上が好ましく、94%以上がより好ましく、96%以上が特に好ましく、99%以上が最も好ましい。
本発明によって得られた高純度抗体は、製薬学的に許容し得る担体と共に、公知の方法で製剤化することが可能である。製剤化された抗体の剤形は、投与の目的や方法に応じて適宜選択すればよく、例えば、粉末、顆粒、カプセル、錠剤、液剤等の経口投与用;注射剤、経静脈剤、坐剤、経皮、経鼻、経腸、吸入剤等の非経口投与用等の何れでもよい。
経口投与のための賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、デンプン、ポリビニルピロリドン等、公知の賦形剤を用いることができ、液剤とする場合は、本発明の化合物に、不活性な溶媒、例えば、精製水、エタノール等と共に、薬学的に許容される乳剤、懸濁剤、可溶化剤、甘味剤、pH調整剤、芳香剤、防腐剤等を含有させて用いることができる。
注射剤として用いる場合は、注射用の蒸留水や生理食塩水のような無菌の水性液剤を用いることができ、非水性の液剤としては、オリーブ油等の植物油;エタノール、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール等のアルコール類等を用いることができる。更に、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、シクロデキストリン等の溶解補助剤を含んでいてもよい。
経口投与のための賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、デンプン、ポリビニルピロリドン等、公知の賦形剤を用いることができ、液剤とする場合は、本発明の化合物に、不活性な溶媒、例えば、精製水、エタノール等と共に、薬学的に許容される乳剤、懸濁剤、可溶化剤、甘味剤、pH調整剤、芳香剤、防腐剤等を含有させて用いることができる。
注射剤として用いる場合は、注射用の蒸留水や生理食塩水のような無菌の水性液剤を用いることができ、非水性の液剤としては、オリーブ油等の植物油;エタノール、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール等のアルコール類等を用いることができる。更に、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、シクロデキストリン等の溶解補助剤を含んでいてもよい。
<高純度な抗体のFcドメインを有する糖タンパク質の製造方法>
本発明の高純度な抗体のFcドメインを有する糖タンパク質の製造方法は、上記抗体の調製方法を用いることを特徴とする。
本発明の高純度な抗体のFcドメインを有する糖タンパク質の製造方法は、上記抗体の調製方法を用いることを特徴とする。
本発明において「高純度な抗体のFcドメインを有する糖タンパク質」とは、高純度な「『抗体のFcドメイン』を有する糖タンパク質」の意味であり、「抗体のFcドメインを有する糖タンパク質」全体を100%としたときに、抗体のFcドメイン中の2箇所の糖鎖結合部位に同一の糖鎖構造を有する糖タンパク質の割合が90%以上の糖タンパク質を指す。
該「同一の糖鎖構造を有する抗体のFcドメインを有する糖タンパク質」の割合が、92%以上が好ましく、94%以上がより好ましく、96%以上が特に好ましく、99%以上が最も好ましい。
<抗体>
本発明の別の形態は、コアフコースを有するA2、G2、G0、G1a、G1b、及びM3から選択される1種類の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を持つ糖鎖改変した抗体である。
本発明の別の形態は、コアフコースを有するA2、G2、G0、G1a、G1b、及びM3から選択される1種類の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を持つ糖鎖改変した抗体である。
上記本発明における上記抗体は、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体であることが好ましい。
また、本発明の抗体は抗体医薬であることが好ましく、特に、トラスツズマブ、インフリキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、トシリズマブ、又はセツキシマブであることが好ましい。
また、本発明の抗体は、高純度の抗体である。「高純度の抗体」とは、抗体全体を100%としたときに、2箇所の糖鎖結合部位に同一の糖鎖構造を有する抗体の割合が90%以上の抗体を指す。該同一の糖鎖構造を有する抗体の割合が、92%以上が好ましく、94%以上がより好ましく、96%以上が特に好ましく、99%以上が最も好ましい。
また、本発明の抗体は抗体医薬であることが好ましく、特に、トラスツズマブ、インフリキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、トシリズマブ、又はセツキシマブであることが好ましい。
また、本発明の抗体は、高純度の抗体である。「高純度の抗体」とは、抗体全体を100%としたときに、2箇所の糖鎖結合部位に同一の糖鎖構造を有する抗体の割合が90%以上の抗体を指す。該同一の糖鎖構造を有する抗体の割合が、92%以上が好ましく、94%以上がより好ましく、96%以上が特に好ましく、99%以上が最も好ましい。
<抗体の品質評価方法>
本発明の抗体の品質評価方法は、少なくとも以下の工程(G1)を行い、下記量が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする。
(G1)コアフコース、コアフコースを有する糖鎖、及び/又は、「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」を定量する工程
本発明の抗体の品質評価方法は、少なくとも以下の工程(G1)を行い、下記量が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする。
(G1)コアフコース、コアフコースを有する糖鎖、及び/又は、「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」を定量する工程
また、本発明の抗体の品質評価方法は、少なくとも以下の工程(G2)を行い、下記含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする。
(G2)「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」の含有割合を測定する工程
(G2)「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」の含有割合を測定する工程
また、本発明の抗体の品質評価方法は、少なくとも以下の工程(G3)を行い、下記フコース結合抗体の含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする。
(G3)コアフコースを有するA2、G2、G0、G1a、G1b及びM3よりなる群から選択される1種以上の糖鎖が結合したフコース結合抗体の含有割合を測定する工程
(G3)コアフコースを有するA2、G2、G0、G1a、G1b及びM3よりなる群から選択される1種以上の糖鎖が結合したフコース結合抗体の含有割合を測定する工程
また、本発明の抗体の品質評価方法は、本発明の抗体の含有量を測定する工程を行い、該抗体の含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする。
上記抗体の品質評価方法は、必要に応じて、その他の工程を含んでいてもよい。
<抗体の品質管理方法>
本発明の抗体の品質管理方法は、上記抗体の品質評価方法を使用することを特徴とする。
本発明の抗体の品質管理方法は、上記抗体の品質評価方法を使用することを特徴とする。
本発明の品質管理方法は、必要に応じて上記抗体の品質評価方法に加えて、別の方法を用いる、及び/又は他の工程を含んでいてもよい。
<抗体の製造方法>
本発明の抗体の製造方法は、上記抗体の品質管理方法を使用して抗体を製造することを特徴とする。
本発明の抗体の製造方法は、上記抗体の品質管理方法を使用して抗体を製造することを特徴とする。
本発明の抗体の製造方法により、「コアフコースを有さない糖鎖が結合している抗体」を製造することができる。
本発明によって得られた抗体は、製薬学的に許容し得る担体と共に、公知の方法で製剤化することが可能である。製剤化された抗体の剤形は、投与の目的や方法に応じて適宜選択すればよく、例えば、粉末、顆粒、カプセル、錠剤、液剤等の経口投与用;注射剤、経静脈剤、坐剤、経皮、経鼻、経腸、吸入剤等の非経口投与用等の何れでもよい。
経口投与のための賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、デンプン、ポリビニルピロリドン等、公知の賦形剤を用いることができ、液剤とする場合は、本発明の化合物に、不活性な溶媒、例えば、精製水、エタノール等と共に、薬学的に許容される乳剤、懸濁剤、可溶化剤、甘味剤、pH調整剤、芳香剤、防腐剤等を含有させて用いることができる。
注射剤として用いる場合は、注射用の蒸留水や生理食塩水のような無菌の水性液剤を用いることができ、非水性の液剤としては、オリーブ油等の植物油;エタノール、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール等のアルコール類等を用いることができる。更に、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、シクロデキストリン等の溶解補助剤を含んでいてもよい。
経口投与のための賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、デンプン、ポリビニルピロリドン等、公知の賦形剤を用いることができ、液剤とする場合は、本発明の化合物に、不活性な溶媒、例えば、精製水、エタノール等と共に、薬学的に許容される乳剤、懸濁剤、可溶化剤、甘味剤、pH調整剤、芳香剤、防腐剤等を含有させて用いることができる。
注射剤として用いる場合は、注射用の蒸留水や生理食塩水のような無菌の水性液剤を用いることができ、非水性の液剤としては、オリーブ油等の植物油;エタノール、ポリエチレングリコール、ブチレングリコール等のアルコール類等を用いることができる。更に、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、シクロデキストリン等の溶解補助剤を含んでいてもよい。
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。
<実施例1>トラスツズマブのEndo−M又はEndo−CCによる糖鎖加水分解
チャイニーズハムスター卵巣細胞から産生された抗HER2ヒト化モノクローナル抗体、トラスツズマブ(中外製薬社、製品名ハーセプチン)150mgを滅菌水15mLに溶解した。アミコンウルトラ−15(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながら50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に置換し、トラスツズマブを調製した。
上述のトラスツズマブ(50μg)とEndo−M(東京化成工業社、1.5μg)、又はEndo−CC(1.5μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量50μLとして37℃で60時間静置した。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに反応後の抗体0.5μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが増加したことが確認された(図1)。
チャイニーズハムスター卵巣細胞から産生された抗HER2ヒト化モノクローナル抗体、トラスツズマブ(中外製薬社、製品名ハーセプチン)150mgを滅菌水15mLに溶解した。アミコンウルトラ−15(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながら50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に置換し、トラスツズマブを調製した。
上述のトラスツズマブ(50μg)とEndo−M(東京化成工業社、1.5μg)、又はEndo−CC(1.5μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量50μLとして37℃で60時間静置した。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに反応後の抗体0.5μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが増加したことが確認された(図1)。
<実施例2>エンド酵素(Endo−M、Endo−CC)によって糖鎖切断されたトラスツズマブの糖ペプチドGlu−Glu−Gln−Tyr−Asn(Glycan)−Ser−Thr−Tyr−Arg解析
トラスツズマブ(10μg)及びエンド酵素(Endo−M、Endo−CC)によって糖鎖加水分解が施されたトラスツズマブ(10μg)をそれぞれ100mM炭酸水素アンモニウム水溶液(30μL)に溶かし、80℃で15分間加熱し、室温で30分間静置する。この溶液にシークエンスグレードのトリプシン(0.25mg/mL、3μL)を加え、37℃で30時間反応させた。反応溶液を90℃で30分間加熱することにより酵素を失活させ、G−25カラム(0.8×6cm、3mL)で脱塩し、濃縮した。これらに、それぞれ水(10μL)とピリジン(5μL)を加え、エンド酵素によって処理が施されたトラスツズマブの方には200mM軽水素標識の安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、酵素処理していないトラスツズマブの方には200mM重水素標識の安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルホルムアミド溶液(10μL)を加え、57℃で12時間反応を行い、0.5M水酸化ナトリウム水溶液(60μL)を加え、室温にて30分間撹拌した。
トラスツズマブ(10μg)及びエンド酵素(Endo−M、Endo−CC)によって糖鎖加水分解が施されたトラスツズマブ(10μg)をそれぞれ100mM炭酸水素アンモニウム水溶液(30μL)に溶かし、80℃で15分間加熱し、室温で30分間静置する。この溶液にシークエンスグレードのトリプシン(0.25mg/mL、3μL)を加え、37℃で30時間反応させた。反応溶液を90℃で30分間加熱することにより酵素を失活させ、G−25カラム(0.8×6cm、3mL)で脱塩し、濃縮した。これらに、それぞれ水(10μL)とピリジン(5μL)を加え、エンド酵素によって処理が施されたトラスツズマブの方には200mM軽水素標識の安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、酵素処理していないトラスツズマブの方には200mM重水素標識の安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルホルムアミド溶液(10μL)を加え、57℃で12時間反応を行い、0.5M水酸化ナトリウム水溶液(60μL)を加え、室温にて30分間撹拌した。
その後、水(200μL)を加え、エタノール(400μL)にて3回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物をC18 Spinカラム(10mg)にロードし、水(2mL)で十分洗浄した後に、25%アセトニトリル水溶液(650μL)、50%アセトニトリル水溶液(650μL)で回収し、減圧濃縮を行った。この試料を水に溶かし、トラスツズマブ由来の重水素標識された糖ペプチドとエンド酵素処理を行ったトラスツズマブ由来の軽水素標識された糖ペプチドを濃度比で1:1に混ぜ合わせ、200ng分をZorbax Extend−C18 1.0×150mm カラムを繋げたThermoScientific製LC−ESI MS装置(Ultimate3000+VelosPro)を用いてMS測定を行った。
標識されたペプチド鎖(Bz−Glu−Glu−Gln−Tyr−Asn−Ser−Thr−Tyr−Arg)に糖鎖が結合した糖ペプチドの[m−2H]2−イオンを検出して、酵素処理していない重水素標識された糖ペプチドとエンド酵素処理を行った軽水素標識された糖ペプチドを比較した(図2A及び図2B)。複合型GN1、GN1F、GN2、G1GN1F、GN2F、G1GN2、G1GN2F、G2GN2、G2GN2Fの糖鎖が結合したm/z=1193.3(H)/1195.8(D)、1266.3(H)/1268.8(D)、1294.8(H)/1297.3(D)、1347.3(H)/1349.8(D)、1347.3(H)/1349.8(D)、1367.8(H)/1370.3(D)、1375.8(H)/1378.3(D)、1448.8(H)/1451.3(D)、1456.8(H)/1459.3(D)、1529.8(H)/1532.8(D)とハイマンノ−ス型M5の糖鎖が結合したm/z=1253.2(H)/1255.7(D)及びエンド酵素によって糖鎖が切断されたGlcNAcが1個付いたペプチド(pep+Gn)m/z=746.7(H)/749.2(D)とGlcNAcFucが1個付いたペプチド(pep+GnF)m/z=819.8(H)/822.3(D)をモニタリングした。これらのイオン量を比較して棒グラフを作成することにより、糖鎖切断の割合とフコース含有糖鎖割合を算出した(図3A及び図3B)。
その結果、トラスツズマブは糖鎖が99%以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は84.2%であった。Endo−M処理後のトラスツズマブは糖鎖(pep+Gn、pep+GnF以外)が86.7%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は98.6%であった。Endo−CC処理後のトラスツズマブは糖鎖(pep+Gn、pep+GnF以外)が72.3%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は98.9%であった。このことから、Endo−Mが抗体のコアフコースなしの糖鎖を選択的に、Endo−CCが抗体のコアフコースなしの糖鎖を優先的に切断できることがわかった。
その結果、トラスツズマブは糖鎖が99%以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は84.2%であった。Endo−M処理後のトラスツズマブは糖鎖(pep+Gn、pep+GnF以外)が86.7%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は98.6%であった。Endo−CC処理後のトラスツズマブは糖鎖(pep+Gn、pep+GnF以外)が72.3%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は98.9%であった。このことから、Endo−Mが抗体のコアフコースなしの糖鎖を選択的に、Endo−CCが抗体のコアフコースなしの糖鎖を優先的に切断できることがわかった。
<実施例3>トラスツズマブのEndo−CCによる糖鎖加水分解
トラスツズマブ(1.2mg)とEndo−CC(12μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量1.2mLとして37℃で60時間静置した。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに反応後の抗体1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが増加したことが確認された(図4)。
トラスツズマブ(1.2mg)とEndo−CC(12μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量1.2mLとして37℃で60時間静置した。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに反応後の抗体1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが増加したことが確認された(図4)。
<実施例4>トラスツズマブEndo−CC糖鎖加水分解体の分離精製とHPLC分析
実施例3で調製したEndo−CC加水分解後のトラスツズマブ(500μg)を4℃条件下で設置したAKTA−FPLCシステムを用いて、MonoSカラム(GE healthcare社、4.6×100mm)を使用して、流速1.35mL/分で20mM酢酸ナトリウム水溶液(pH4.3)と20mM酢酸ナトリウム+500mM塩化ナトリウム水溶液の2液によるステップワイズのグラジェント溶出により分離した(図5)。図5の両矢印で示した画分を回収し、Amicon Ultra−15(分画分子量10kDa、メルクミリポア社)の限外濾過フィルターを用いて濃縮した。
実施例3で調製したEndo−CC加水分解後のトラスツズマブ(500μg)を4℃条件下で設置したAKTA−FPLCシステムを用いて、MonoSカラム(GE healthcare社、4.6×100mm)を使用して、流速1.35mL/分で20mM酢酸ナトリウム水溶液(pH4.3)と20mM酢酸ナトリウム+500mM塩化ナトリウム水溶液の2液によるステップワイズのグラジェント溶出により分離した(図5)。図5の両矢印で示した画分を回収し、Amicon Ultra−15(分画分子量10kDa、メルクミリポア社)の限外濾過フィルターを用いて濃縮した。
分離精製の確認は、HPLCシステム(島津製作所社)を用いたPropac WCX−10(Thermo Fisher Scientific社、4.0×250mm)と280nmのUV検出を使用して、流速1.0mL/分で10mM酢酸ナトリウム水溶液(pH4.3)と10mM酢酸ナトリウム+1000mM塩化ナトリウム水溶液の2液によるグラジェント溶出により行った。その結果、fully glycosylated型のトラスツズマブが分離精製できていることを確認した(図6)。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに分離精製後の抗体1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが消失したことからも、fully glycosylated型のトラスツズマブを分離精製できたことが認められた(図4)。
<実施例5>Endo−CC処理後の精製したトラスツズマブの糖ペプチドGlu−Glu−Gln−Tyr−Asn(Glycan)−Ser−Thr−Tyr−Arg解析
トラスツズマブ(10μg)及びEndo−CC処理後の精製トラスツズマブ(10μg)をそれぞれ100mM炭酸水素アンモニウム水溶液(30μL)に溶かし、80℃で15分間加熱し、室温で30分間静置した。
この溶液にシークエンスグレードのトリプシン(0.25mg/mL、3μL)を加え、37℃で30時間反応させた。反応溶液を90℃30分間、加熱することにより酵素を失活させ、G−25カラム(0.8×6cm、3mL)で脱塩し、濃縮した。
トラスツズマブ(10μg)及びEndo−CC処理後の精製トラスツズマブ(10μg)をそれぞれ100mM炭酸水素アンモニウム水溶液(30μL)に溶かし、80℃で15分間加熱し、室温で30分間静置した。
この溶液にシークエンスグレードのトリプシン(0.25mg/mL、3μL)を加え、37℃で30時間反応させた。反応溶液を90℃30分間、加熱することにより酵素を失活させ、G−25カラム(0.8×6cm、3mL)で脱塩し、濃縮した。
これらに、それぞれ水(10μL)とピリジン(5μL)を加え、Endo−CC処理後の精製トラスツズマブの方には200mM軽水素標識の安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、酵素処理していないトラスツズマブの方には200mM重水素標識の安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルホルムアミド溶液(10μL)を加え、57℃で12時間反応を行い、0.5M水酸化ナトリウム水溶液(60μL)を加え、室温にて30分間撹拌した。
その後、水(200μL)を加え、エタノール(400μL)にて3回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物を、C18 Spinカラム(10mg)にロードし、水(2mL)で十分洗浄した後に、25%アセトニトリル水溶液(650μL)、50%アセトニトリル水溶液(650μL)で回収し、減圧濃縮を行った。
この試料を水に溶かし、トラスツズマブ由来の重水素標識された糖ペプチドとEndo−CC処理後の精製したトラスツズマブ由来の軽水素標識された糖ペプチドを濃度比で1:1に混ぜ合わせ、200ng分をZorbax Extend−C18 1.0×150mm カラムを繋げたThermoScientific製LC−ESI MS装置(Ultimate3000+VelosPro)を用いてMS測定を行った。
この試料を水に溶かし、トラスツズマブ由来の重水素標識された糖ペプチドとEndo−CC処理後の精製したトラスツズマブ由来の軽水素標識された糖ペプチドを濃度比で1:1に混ぜ合わせ、200ng分をZorbax Extend−C18 1.0×150mm カラムを繋げたThermoScientific製LC−ESI MS装置(Ultimate3000+VelosPro)を用いてMS測定を行った。
標識されたペプチド鎖(Bz−Glu−Glu−Gln−Tyr−Asn−Ser−Thr−Tyr−Arg)に糖鎖が結合した糖ペプチドの[m−2H]2−イオンを検出して、酵素処理していない重水素標識された糖ペプチドとエンド酵素処理を行った軽水素標識された糖ペプチドを比較した(図7)。複合型GN1、GN1F、GN2、G1GN1F、GN2F、G1GN2、G1GN2F、G2GN2、G2GN2Fの糖鎖が結合したm/z=1193.3(H)/1195.8(D)、1266.3(H)/1268.8(D)、1294.8(H)/1297.3(D)、1347.3(H)/1349.8(D)、1347.3(H)/1349.8(D)、1367.8(H)/1370.3(D)、1375.8(H)/1378.3(D)、1448.8(H)/1451.3(D)、1456.8(H)/1459.3(D)、1529.8(H)/1532.8(D)とハイマンノース型M5の糖鎖が結合したm/z=1253.2(H)/1255.7(D)及びエンド酵素によって糖鎖が切断されたGlcNAcが1個付いたペプチド(pep+Gn)m/z=746.7(H)/749.2(D)とGlcNAcFucが1個付いたペプチド(pep+GnF)m/z=819.8(H)/822.3(D)をモニタリングした。これらの強度比を比較して棒グラフを作成することにより、糖鎖切断の割合とコアフコース含有糖鎖割合を算出した(図8)。
その結果、Endo−CC処理後の精製トラスツズマブは糖鎖が99%以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は97.1%であった。このことにより、精製過程で2つの重鎖の両方に糖鎖が付いているfully glycosylated型の抗体が分離できていることも示された。また、コアフコースを高純度(97%以上)で含むトラスツズマブを調製できた。
その結果、Endo−CC処理後の精製トラスツズマブは糖鎖が99%以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は97.1%であった。このことにより、精製過程で2つの重鎖の両方に糖鎖が付いているfully glycosylated型の抗体が分離できていることも示された。また、コアフコースを高純度(97%以上)で含むトラスツズマブを調製できた。
<実施例6>固定化GST−Endo−Sの調製
GST融合Endo−S(GST−Endo−S)は、W.Huang,et al.,J Am Chem Soc,134:12308-12318(2012)を参考に大腸菌で発現及び精製した。固定化GST−Endo−Sは、100μLのNHS−activated Sepharose 4 FAST FLOW(GE healthcare社)及び上述の100μgの精製したGST−Endo−Sを0.15M炭酸水素ナトリウム水溶液及び0.5M塩化ナトリウム水溶液存在化で混合し、50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)及び1M塩化ナトリウム水溶液の混合液で洗浄し、最後にPBSに懸濁して調製した。
GST融合Endo−S(GST−Endo−S)は、W.Huang,et al.,J Am Chem Soc,134:12308-12318(2012)を参考に大腸菌で発現及び精製した。固定化GST−Endo−Sは、100μLのNHS−activated Sepharose 4 FAST FLOW(GE healthcare社)及び上述の100μgの精製したGST−Endo−Sを0.15M炭酸水素ナトリウム水溶液及び0.5M塩化ナトリウム水溶液存在化で混合し、50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)及び1M塩化ナトリウム水溶液の混合液で洗浄し、最後にPBSに懸濁して調製した。
<実施例7>トラスツズマブのアクセプターの調製
調製したトラスツズマブ(10mg)と実施例6で調製した固定化GST−Endo−Sをウェットボリュームで24μL及びRemove−iT Endo−D(NEB社、25ユニット)を20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)中に加え、総量1250μLとして37℃で20時間回転振盪した。反応後、固定化GST−Endo−Sを含んだ反応液をMicro Bio−Spin Empty Column(Bio−Rad社)に通し、固定化酵素を除去した。得られた濾液に20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したCOSMOGEL GST−Accept(ナカライテスク社)をウェットボリュームで40μL及びChitin Resin(NEB社)をウェットボリュームで100μL加え、室温で1時間回転振盪した。このゲル担体を除いた液にPBSで平衡化したAb−Capcher ExTra(プロテノバ社)をウェットボリュームで280μL加え、4℃で14時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。
調製したトラスツズマブ(10mg)と実施例6で調製した固定化GST−Endo−Sをウェットボリュームで24μL及びRemove−iT Endo−D(NEB社、25ユニット)を20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)中に加え、総量1250μLとして37℃で20時間回転振盪した。反応後、固定化GST−Endo−Sを含んだ反応液をMicro Bio−Spin Empty Column(Bio−Rad社)に通し、固定化酵素を除去した。得られた濾液に20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したCOSMOGEL GST−Accept(ナカライテスク社)をウェットボリュームで40μL及びChitin Resin(NEB社)をウェットボリュームで100μL加え、室温で1時間回転振盪した。このゲル担体を除いた液にPBSで平衡化したAb−Capcher ExTra(プロテノバ社)をウェットボリュームで280μL加え、4℃で14時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。
ゲル担体は4mLのNETN緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム、1mMEDTA及び1%(w/v)NP−40)で室温、5分間の洗浄作業を計3回、4mLのNET緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム及び1mMEDTA)でのリンスを計2回、4mLのPBSでのリンスを1回行った。洗浄した担体に700μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を23.3μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながらPBSに緩衝液置換した。
その結果、8.3mgのトラスツズマブのアクセプターが得られた。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに精製後の抗体1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしているトラスツズマブが確認された(図9)。
<実施例8>糖鎖改変A2トラスツズマブの調製
実施例7で調製したトラスツズマブのアクセプター(5mg)、糖供与体としてA2オキサゾリン(4.6875μmol)、並びに、大腸菌で発現及び精製した変異型酵素GST−Endo−S D233Q(500μg)を糖転移酵素として、50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)中に加え、総量1.25mLとして37℃で1時間静置した。
この反応液に同緩衝液で平衡化したCOSMOGEL GST−Accept(ナカライテスク社)をウェットボリュームで400μL加えて室温で30分回転振盪を行いGST−EndoS D233Qを吸着させた。
実施例7で調製したトラスツズマブのアクセプター(5mg)、糖供与体としてA2オキサゾリン(4.6875μmol)、並びに、大腸菌で発現及び精製した変異型酵素GST−Endo−S D233Q(500μg)を糖転移酵素として、50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)中に加え、総量1.25mLとして37℃で1時間静置した。
この反応液に同緩衝液で平衡化したCOSMOGEL GST−Accept(ナカライテスク社)をウェットボリュームで400μL加えて室温で30分回転振盪を行いGST−EndoS D233Qを吸着させた。
このゲル担体を除いた液に同じく50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したAb−Capcher ExTra(プロテノバ社)をウェットボリュームで200μL加えて室温で1時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は4mLのNETN緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム、1mMEDTA及び1%(w/v)NP−40)で室温、10分間の洗浄作業を計3回、1mLのPBSでのリンスを4回行った。
洗浄した担体に500μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を16.7μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながらPBSに緩衝液置換した。
洗浄した担体に500μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を16.7μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながらPBSに緩衝液置換した。
その結果、4.1mgの糖鎖改変抗体が得られた。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに精製後の抗体1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖受容体の転移により重鎖が高分子側にシフトしたことが確認された(図10)。
<実施例9>糖鎖改変A2トラスツズマブ中のコアフコースの付いていない糖鎖のEndo−Mによる加水分解
実施例8で調製した糖鎖改変A2トラスツズマブをトラスツズマブ濃度1μg/μL又は5μg/μLにしてEndo−Mによる糖鎖加水分解を行った。トラスツズマブ濃度1μg/μLでは、糖鎖改変A2トラスツズマブ(50μg)、Endo−M(東京化成工業社、1.5μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量50μLとして37℃で48時間静置した。トラスツズマブ濃度5μg/μLでは、糖鎖改変A2トラスツズマブ(50μg)、Endo−M(東京化成工業社、1.5μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量10μLとして37℃で48時間静置した。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEにEndo−M加水分解後糖鎖改変A2トラスツズマブ1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された(図11)。
実施例8で調製した糖鎖改変A2トラスツズマブをトラスツズマブ濃度1μg/μL又は5μg/μLにしてEndo−Mによる糖鎖加水分解を行った。トラスツズマブ濃度1μg/μLでは、糖鎖改変A2トラスツズマブ(50μg)、Endo−M(東京化成工業社、1.5μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量50μLとして37℃で48時間静置した。トラスツズマブ濃度5μg/μLでは、糖鎖改変A2トラスツズマブ(50μg)、Endo−M(東京化成工業社、1.5μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量10μLとして37℃で48時間静置した。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEにEndo−M加水分解後糖鎖改変A2トラスツズマブ1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された(図11)。
<実施例10>糖鎖改変A2トラスツズマブ中のコアフコースの付いていない糖鎖のEndo−CCによる加水分解
実施例8で調製した糖鎖改変A2トラスツズマブをトラスツズマブ濃度1μg/μL又は5μg/μLにしてEndo−CCによる糖鎖加水分解を行った。トラスツズマブ濃度1μg/μLでは、糖鎖改変A2トラスツズマブ(50μg)、Endo−CC(1.5μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量50μLとして37℃で48時間静置した。トラスツズマブ濃度5μg/μLでは、糖鎖改変A2トラスツズマブ(50μg)、Endo−CC(1.5μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量10μLとして37℃で48時間静置した。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEにEndo−CC加水分解後糖鎖改変A2トラスツズマブ1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された(図11)。
実施例8で調製した糖鎖改変A2トラスツズマブをトラスツズマブ濃度1μg/μL又は5μg/μLにしてEndo−CCによる糖鎖加水分解を行った。トラスツズマブ濃度1μg/μLでは、糖鎖改変A2トラスツズマブ(50μg)、Endo−CC(1.5μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量50μLとして37℃で48時間静置した。トラスツズマブ濃度5μg/μLでは、糖鎖改変A2トラスツズマブ(50μg)、Endo−CC(1.5μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量10μLとして37℃で48時間静置した。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEにEndo−CC加水分解後糖鎖改変A2トラスツズマブ1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された(図11)。
<実施例11>エンド酵素(Endo−M 1μg/μL、5μg/μL、Endo−CC 1μg/μL、5μg/μL)によって糖鎖切断された糖鎖改変A2トラスツズマブの糖ペプチドGlu−Glu−Gln−Tyr−Asn(Glycan)−Ser−Thr−Tyr−Arg解析
糖鎖改変A2トラスツズマブ(10μg)及びエンド酵素(Endo−M 1μg/μL、5μg/μL、Endo−CC 1μg/mL、5μg/mL)によって糖鎖切断処理が施されたトラスツズマブ(10μg)をそれぞれ100mM炭酸水素アンモニウム水溶液(30μL)に溶かし、80℃で15分間加熱し、室温で30分間静置する。この溶液にシークエンスグレードのトリプシン(0.25mg/mL、3μL)を加え、37℃で30時間反応させた。反応溶液を90℃で30分間加熱することにより酵素を失活させ、G−25カラム(0.8×6cm、3mL)で脱塩し、濃縮した。
糖鎖改変A2トラスツズマブ(10μg)及びエンド酵素(Endo−M 1μg/μL、5μg/μL、Endo−CC 1μg/mL、5μg/mL)によって糖鎖切断処理が施されたトラスツズマブ(10μg)をそれぞれ100mM炭酸水素アンモニウム水溶液(30μL)に溶かし、80℃で15分間加熱し、室温で30分間静置する。この溶液にシークエンスグレードのトリプシン(0.25mg/mL、3μL)を加え、37℃で30時間反応させた。反応溶液を90℃で30分間加熱することにより酵素を失活させ、G−25カラム(0.8×6cm、3mL)で脱塩し、濃縮した。
これらに、それぞれ水(10μL)とピリジン(5μL)を加え、エンド酵素によって処理が施されたトラスツズマブの方には200mM軽水素標識の安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、酵素処理していないトラスツズマブの方には200mM重水素標識の安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルホルムアミド溶液(10μL)を加え、57℃で12時間反応を行い、0.5M水酸化ナトリウム水溶液(60μL)を加え、室温にて30分間撹拌した。
その後、水(200μL)を加え、エタノール(400μL)にて3回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物を、C18 Spinカラム(10mg)にロードし、水(2mL)で十分洗浄した後に、25%アセトニトリル水溶液(650μL)、50%アセトニトリル水溶液(650μL)で回収し、減圧濃縮を行った。
この試料を水に溶かし、酵素処理していない重水素標識された糖ペプチドとエンド酵素処理を行った軽水素標識された糖ペプチドを濃度比で1:1に混ぜ合わせ、200ng分をZorbax Extend−C18 1.0×150mm カラムを繋げたThermoScientific製LC−ESI MS装置(Ultimate3000+VelosPro)を用いてMS測定を行った。
この試料を水に溶かし、酵素処理していない重水素標識された糖ペプチドとエンド酵素処理を行った軽水素標識された糖ペプチドを濃度比で1:1に混ぜ合わせ、200ng分をZorbax Extend−C18 1.0×150mm カラムを繋げたThermoScientific製LC−ESI MS装置(Ultimate3000+VelosPro)を用いてMS測定を行った。
標識されたペプチド鎖(Bz−Glu−Glu−Gln−Tyr−Asn−Ser−Thr−Tyr−Arg)に糖鎖が結合した糖ペプチドの[m−2H]2−イオンを検出して、糖鎖改変A2トラスツズマブの重水素標識された糖ペプチドとエンド酵素処理を行った糖鎖改変A2トラスツズマブの軽水素標識された糖ペプチドを比較した(図12)。
糖鎖改変されたA2F、A2の糖鎖が結合した糖ペプチドm/z=1821.1(H)/1823.6(D)、1747.8(H)/1750.3(D)及びエンド酵素によって糖鎖が切断されたGlcNAcが1個付いたペプチド(pep+Gn)m/z=746.7(H)/749.2(D)とGlcNAcFucが1個付いたペプチド(pep+GnF)m/z=819.8(H)/822.3(D)をモニタリングした。
シアル酸を含むA2、A2F糖鎖が結合している酸性糖ペプチドと糖鎖が切断された中性ペプチド(pep+Gn、pep+GnF)のイオン化効率が大幅に違っているため、検量線を用いてモル比にして棒グラフを作成することによって、糖鎖切断の割合とコアフコース含有糖鎖割合を算出した(図13)。
糖鎖改変されたA2F、A2の糖鎖が結合した糖ペプチドm/z=1821.1(H)/1823.6(D)、1747.8(H)/1750.3(D)及びエンド酵素によって糖鎖が切断されたGlcNAcが1個付いたペプチド(pep+Gn)m/z=746.7(H)/749.2(D)とGlcNAcFucが1個付いたペプチド(pep+GnF)m/z=819.8(H)/822.3(D)をモニタリングした。
シアル酸を含むA2、A2F糖鎖が結合している酸性糖ペプチドと糖鎖が切断された中性ペプチド(pep+Gn、pep+GnF)のイオン化効率が大幅に違っているため、検量線を用いてモル比にして棒グラフを作成することによって、糖鎖切断の割合とコアフコース含有糖鎖割合を算出した(図13)。
その結果、糖鎖改変A2トラスツズマブは糖鎖が97.7%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は82.3%であった。抗体濃度が1μg/μLでEndo−Mで処理した糖鎖改変A2トラスツズマブは糖鎖(pep+Gn、pep+GnF以外)が96.6%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は85.3%であった。抗体濃度が5μg/μLでEndo−Mで処理した糖鎖改変A2トラスツズマブは糖鎖(pep+Gn、pep+GnF以外)が93.5%付加しており、そのうちコアフコ−スが結合している糖鎖は87.8%であった。
抗体濃度が1μg/μLでEndo−CCで処理した糖鎖改変A2トラスツズマブは糖鎖(pep+Gn、pep+GnF以外)が86.0%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は96.6%であった。抗体濃度が5μg/μLでEndo−CCで処理した糖鎖改変A2トラスツズマブは糖鎖(pep+Gn、pep+GnF以外)が38.6%付加しており、そのうちコアフコ−スが結合している糖鎖は84.3%であった。
このことから、Endo−Mは、抗体の糖鎖の還元末端側のコアフコースの有無を見分けて、コアフコースのない糖鎖だけを切断できる。一方、Endo−CCは、糖鎖の還元末端側のコアフコースの有無に関わらず、糖鎖を切断出来るが、基質濃度を変えることによって、コアフコースなしの糖鎖の切断を優位にする制御ができることがわかった。
このことから、Endo−Mは、抗体の糖鎖の還元末端側のコアフコースの有無を見分けて、コアフコースのない糖鎖だけを切断できる。一方、Endo−CCは、糖鎖の還元末端側のコアフコースの有無に関わらず、糖鎖を切断出来るが、基質濃度を変えることによって、コアフコースなしの糖鎖の切断を優位にする制御ができることがわかった。
<実施例12>糖鎖改変A2トラスツズマブ中のコアフコースの付いていない糖鎖のEndo−Mによる加水分解
実施例8で調製した糖鎖改変トラスツズマブ(2mg)、Endo−M(東京化成工業社、20μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量133.3μLとして37℃で72時間静置した。反応途中12時間おきに20μgのEndo−Mを5回添加した。72時間後この反応液にPBSを1.2mL加え、同じくPBSで平衡化したAb−Capcher ExTra(プロテノバ社)をウェットボリュームで80μL加えて4℃で14時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は1.8mLのNETN緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム、1mMEDTA及び1%(w/v)NP−40)で室温、10分間の洗浄作業を計3回、1mLのPBSでのリンスを4回行った。洗浄した担体に200μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を6.67μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながらPBSに緩衝液置換した。
その結果、1.8mgのEndo−M加水分解後糖鎖改変トラスツズマブが得られた。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに精製後の抗体1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された(図14)。
実施例8で調製した糖鎖改変トラスツズマブ(2mg)、Endo−M(東京化成工業社、20μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量133.3μLとして37℃で72時間静置した。反応途中12時間おきに20μgのEndo−Mを5回添加した。72時間後この反応液にPBSを1.2mL加え、同じくPBSで平衡化したAb−Capcher ExTra(プロテノバ社)をウェットボリュームで80μL加えて4℃で14時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は1.8mLのNETN緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム、1mMEDTA及び1%(w/v)NP−40)で室温、10分間の洗浄作業を計3回、1mLのPBSでのリンスを4回行った。洗浄した担体に200μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を6.67μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながらPBSに緩衝液置換した。
その結果、1.8mgのEndo−M加水分解後糖鎖改変トラスツズマブが得られた。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに精製後の抗体1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された(図14)。
<実施例13>糖鎖改変A2トラスツズマブEndo−M糖鎖加水分解体の分離精製とHPLC分析
実施例12で調製した糖鎖改変A2トラスツズマブのEndo−M糖鎖加水分解体(500μg)を4℃条件下で設置したAKTA−FPLCシステムを用いて、MonoSカラム(GE healthcare社、4.6×100mm)を使用して、流速1.35mL/分で20mM酢酸ナトリウム水溶液(pH4.3)と20mM酢酸ナトリウム+500mM塩化ナトリウム水溶液の2液によるステップワイズのグラジェント溶出により分離した(図15)。図15の両矢印で示した画分を回収し、Amicon Ultra−15(分画分子量10kDa、メルクミリポア社)の限外濾過フィルターを用いて濃縮した。分離精製の確認は、HPLCシステム(島津製作所社)を用いたPropac WCX−10(Thermo Fisher Scientific社、4.0×250mm)と280nmのUV検出を使用して、流速1.0mL/分で10mM酢酸ナトリウム水溶液(pH4.3)と10mM酢酸ナトリウム+1000mM塩化ナトリウム水溶液の2液によるグラジェント溶出により行った。
その結果、fully glycosylated型の糖鎖改変A2トラスツズマブが分離精製できていることを確認した(図16)。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに分離精製後の抗体1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが消失したことからも、fully glycosylated型の糖鎖改変A2トラスツズマブを分離精製できたことが認められた(図14)。
実施例12で調製した糖鎖改変A2トラスツズマブのEndo−M糖鎖加水分解体(500μg)を4℃条件下で設置したAKTA−FPLCシステムを用いて、MonoSカラム(GE healthcare社、4.6×100mm)を使用して、流速1.35mL/分で20mM酢酸ナトリウム水溶液(pH4.3)と20mM酢酸ナトリウム+500mM塩化ナトリウム水溶液の2液によるステップワイズのグラジェント溶出により分離した(図15)。図15の両矢印で示した画分を回収し、Amicon Ultra−15(分画分子量10kDa、メルクミリポア社)の限外濾過フィルターを用いて濃縮した。分離精製の確認は、HPLCシステム(島津製作所社)を用いたPropac WCX−10(Thermo Fisher Scientific社、4.0×250mm)と280nmのUV検出を使用して、流速1.0mL/分で10mM酢酸ナトリウム水溶液(pH4.3)と10mM酢酸ナトリウム+1000mM塩化ナトリウム水溶液の2液によるグラジェント溶出により行った。
その結果、fully glycosylated型の糖鎖改変A2トラスツズマブが分離精製できていることを確認した(図16)。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに分離精製後の抗体1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが消失したことからも、fully glycosylated型の糖鎖改変A2トラスツズマブを分離精製できたことが認められた(図14)。
<実施例14>糖鎖改変A2トラスツズマブ中のコアフコースの付いていない糖鎖のEndo−CCによる加水分解
実施例8で調製した糖鎖改変トラスツズマブ(1mg)、Endo−CC(30μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量1mLとして37℃で48時間静置した。48時間後この反応液にPBSを400μL加え、同じくPBSで平衡化したAb−Capcher ExTra(プロテノバ社)をウェットボリュームで40μL加えて4℃で14時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は1mLのNETN緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム、1mMEDTA及び1%(w/v)NP−40)で室温、10分間の洗浄作業を計3回、1mLのPBSでのリンスを4回行った。洗浄した担体に100μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を3.33μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながらPBSに緩衝液置換した。
その結果、900μgのEndo−CC加水分解後糖鎖改変トラスツズマブが得られた。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに精製後の抗体1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された(図17)。
実施例8で調製した糖鎖改変トラスツズマブ(1mg)、Endo−CC(30μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量1mLとして37℃で48時間静置した。48時間後この反応液にPBSを400μL加え、同じくPBSで平衡化したAb−Capcher ExTra(プロテノバ社)をウェットボリュームで40μL加えて4℃で14時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は1mLのNETN緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム、1mMEDTA及び1%(w/v)NP−40)で室温、10分間の洗浄作業を計3回、1mLのPBSでのリンスを4回行った。洗浄した担体に100μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を3.33μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながらPBSに緩衝液置換した。
その結果、900μgのEndo−CC加水分解後糖鎖改変トラスツズマブが得られた。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに精製後の抗体1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された(図17)。
<実施例15>糖鎖改変A2トラスツズマブEndo−CC糖鎖加水分解体の分離精製とHPLC分析
実施例14で調製した糖鎖改変A2トラスツズマブのEndo−CC糖鎖加水分解体(500μg)を4℃条件下で設置したAKTA−FPLCシステムを用いて、MonoSカラム(GE healthcare社、4.6×100mm)を使用して、流速1.35mL/分で20mM酢酸ナトリウム水溶液(pH4.3)と20mM酢酸ナトリウム+500mM塩化ナトリウム水溶液の2液によるステップワイズのグラジェント溶出により分離した(図18)。図18の両矢印で示した画分を回収し、Amicon Ultra−15(分画分子量10kDa、メルクミリポア社)の限外濾過フィルターを用いて濃縮した。分離精製の確認は、HPLCシステム(島津製作所社)を用いたPropac WCX−10(Thermo Fisher Scientific社、4.0×250mm)と280nmのUV検出を使用して、流速1.0mL/分で10mM酢酸ナトリウム水溶液(pH4.3)と10mM酢酸ナトリウム+1000mM塩化ナトリウム水溶液の2液によるグラジェント溶出により行った。
その結果、fully glycosylated型の糖鎖改変A2トラスツズマブが分離精製できていることを確認した(図19)。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに分離精製後の抗体1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが消失したことからも、fully glycosylated型の糖鎖改変A2トラスツズマブを分離精製できたことが認められた(図17)。
実施例14で調製した糖鎖改変A2トラスツズマブのEndo−CC糖鎖加水分解体(500μg)を4℃条件下で設置したAKTA−FPLCシステムを用いて、MonoSカラム(GE healthcare社、4.6×100mm)を使用して、流速1.35mL/分で20mM酢酸ナトリウム水溶液(pH4.3)と20mM酢酸ナトリウム+500mM塩化ナトリウム水溶液の2液によるステップワイズのグラジェント溶出により分離した(図18)。図18の両矢印で示した画分を回収し、Amicon Ultra−15(分画分子量10kDa、メルクミリポア社)の限外濾過フィルターを用いて濃縮した。分離精製の確認は、HPLCシステム(島津製作所社)を用いたPropac WCX−10(Thermo Fisher Scientific社、4.0×250mm)と280nmのUV検出を使用して、流速1.0mL/分で10mM酢酸ナトリウム水溶液(pH4.3)と10mM酢酸ナトリウム+1000mM塩化ナトリウム水溶液の2液によるグラジェント溶出により行った。
その結果、fully glycosylated型の糖鎖改変A2トラスツズマブが分離精製できていることを確認した(図19)。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに分離精製後の抗体1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが消失したことからも、fully glycosylated型の糖鎖改変A2トラスツズマブを分離精製できたことが認められた(図17)。
<実施例16>Endo−M処理後の精製した糖鎖改変A2トラスツズマブ及びEndo−CC処理後の精製した糖鎖改変A2トラスツズマブの糖ペプチドGlu−Glu−Gln−Tyr−Asn(Glycan)−Ser−Thr−Tyr−Arg解析
糖鎖改変A2トラスツズマブ(10μg)、Endo−M処理後の精製した糖鎖改変A2トラスツズマブ(10μg)及びEndo−CC処理後の精製した糖鎖改変A2トラスツズマブ(10μg)をそれぞれ100mM炭酸水素アンモニウム水溶液(30μL)に溶かし、80℃で15分間加熱し、室温で30分間静置した。
この溶液にシークエンスグレードのトリプシン(0.25mg/mL、3μL)を加え、37℃で30時間反応させた。反応溶液を90℃で30分間加熱することにより酵素を失活させ、G−25カラム(0.8×6cm、3mL)で脱塩し、濃縮した。
糖鎖改変A2トラスツズマブ(10μg)、Endo−M処理後の精製した糖鎖改変A2トラスツズマブ(10μg)及びEndo−CC処理後の精製した糖鎖改変A2トラスツズマブ(10μg)をそれぞれ100mM炭酸水素アンモニウム水溶液(30μL)に溶かし、80℃で15分間加熱し、室温で30分間静置した。
この溶液にシークエンスグレードのトリプシン(0.25mg/mL、3μL)を加え、37℃で30時間反応させた。反応溶液を90℃で30分間加熱することにより酵素を失活させ、G−25カラム(0.8×6cm、3mL)で脱塩し、濃縮した。
これらに、それぞれ水(10μL)とピリジン(5μL)を加え、エンド酵素によって処理が施された糖鎖改変A2トラスツズマブ由来糖ペプチドには200mM軽水素標識の安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、糖鎖改変A2トラスツズマブの糖ペプチドには200mM重水素標識の安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルホルムアミド溶液(10μL)を加え、57℃で12時間反応を行い、0.5M水酸化ナトリウム水溶液(60μL)を加え、室温にて30分間撹拌した。
その後、水(200μL)を加え、エタノール(400μL)にて3回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物を、C18 Spinカラム(10mg)にロードし、水(2mL)で十分洗浄した後に、25%アセトニトリル水溶液(650μL)、50%アセトニトリル水溶液(650μL)で回収し、減圧濃縮を行った。
その後、水(200μL)を加え、エタノール(400μL)にて3回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物を、C18 Spinカラム(10mg)にロードし、水(2mL)で十分洗浄した後に、25%アセトニトリル水溶液(650μL)、50%アセトニトリル水溶液(650μL)で回収し、減圧濃縮を行った。
この試料を水に溶かし、酵素処理していない重水素標識された糖ペプチドとエンド酵素処理を行った軽水素標識された糖ペプチドを濃度比で1:1に混ぜ合わせ、200ng分をZorbax Extend−C18 1.0×150mm カラムを繋げたThermoScientific製LC−ESI MS装置(Ultimate3000+VelosPro)を用いてMS測定を行った。
標識されたペプチド鎖(Bz−Glu−Glu−Gln−Tyr−Asn−Ser−Thr−Tyr−Arg)に糖鎖が結合した糖ペプチドの[m−2H]2−イオンを検出して、糖鎖改変A2トラスツズマブの重水素標識された糖ペプチドとエンド酵素処理を行った糖鎖改変A2トラスツズマブの軽水素標識された糖ペプチドを比較した(Endo−M処理:図20A、Endo−CC処理:図20B)。
糖鎖改変されたA2F、A2の糖鎖が結合した糖ペプチドm/z=1821.1(H)/1823.6(D)、1747.8(H)/1750.3(D)及びエンド酵素によって糖鎖が切断されたGlcNAcが1個付いたペプチド(pep+Gn)m/z=746.7(H)/749.2(D)とGlcNAcFucが1個付いたペプチド(pep+GnF)m/z=819.8(H)/822.3(D)をモニタリングした。
シアル酸を含むA2、A2F糖鎖が結合している酸性糖ペプチドと、糖鎖が切断された中性ペプチド(pep+Gn、pep+GnF)のイオン化効率が大幅に違っているため、検量線を用いてモル比にして棒グラフを作成することにより、糖鎖切断の割合とフコース含有糖鎖割合を算出した(Endo−M処理:図21A、Endo−CC処理:図21B)。
シアル酸を含むA2、A2F糖鎖が結合している酸性糖ペプチドと、糖鎖が切断された中性ペプチド(pep+Gn、pep+GnF)のイオン化効率が大幅に違っているため、検量線を用いてモル比にして棒グラフを作成することにより、糖鎖切断の割合とフコース含有糖鎖割合を算出した(Endo−M処理:図21A、Endo−CC処理:図21B)。
その結果、糖鎖改変A2トラスツズマブは糖鎖が98.9%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は85.6%であった。一方、精製したEndo−M処理後の糖鎖改変A2トラスツズマブは糖鎖が99%以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は97.6%であった。また、精製したEndo−CC処理後の糖鎖改変A2トラスツズマブは糖鎖が99%以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は94.7%であった。このことにより、精製過程で重鎖の両方に糖鎖が付いているfully glycosylated型の抗体が分離できていることも示せた。また、コアフコースを高純度(94%以上)で含む糖鎖改変A2Fトラスツズマブを調製できた。
<実施例17>各種トラスツズマブのマイクロプレートアッセイ法によるFcγRIIIa−V158との結合試験
LG.Prestaらの報告(J.Biol.Chem.(2001)276, 6591−6604)を参考にして、各種トラスツズマブのFcγRIIIa−V158に対する結合試験を行った。
ヒト型FcγRIIIa−V158溶液(novoprotein社、10μg/mL、100μL)をELISA用マイクロプレート(Thermoscienfitic社)に加えて4℃で一晩固定化した後に、140mM塩化ナトリウム、1%BSA及び0.05%Tween20含有50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)でブロッキングを行った。各ステップ間に140mM塩化ナトリウム及び0.05%Tween20含有50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)で5回洗浄を行った。
LG.Prestaらの報告(J.Biol.Chem.(2001)276, 6591−6604)を参考にして、各種トラスツズマブのFcγRIIIa−V158に対する結合試験を行った。
ヒト型FcγRIIIa−V158溶液(novoprotein社、10μg/mL、100μL)をELISA用マイクロプレート(Thermoscienfitic社)に加えて4℃で一晩固定化した後に、140mM塩化ナトリウム、1%BSA及び0.05%Tween20含有50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)でブロッキングを行った。各ステップ間に140mM塩化ナトリウム及び0.05%Tween20含有50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)で5回洗浄を行った。
次にチャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ(トラスツズマブ−F84.2%)、実施例3及び4で調製したコアフコース含有率を97.1%に向上させたトラスツズマブ(トラスツズマブ−F97.1%)、実施例8で調製したコアフコース含有率が85.6%である糖鎖改変A2トラスツズマブ(トラスツズマブ−A2−F85.6%)、実施例8、12及び13で調製したコアフコース含有率を97.6%に向上させた糖鎖改変A2トラスツズマブ(トラスツズマブ−A2−F97.6%)及び非特許文献14で調製した糖鎖改変A2トラスツズマブ(トラスツズマブ−A2−F0%)をそれぞれ140mM塩化ナトリウム、1%BSA及び0.05%Tween20含有50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)で希釈した。
各希釈溶液(100μL)は、ヒト型FcγRIIIa−V158を固定化したプレートウェルに加えて、室温で2時間結合させた。プレ−トから抗体溶液を取り除き、十分に洗浄した後、HRPコンジュゲートproteinG(Bio−rad社)を加え室温で1時間結合させた。発色試薬としてTMB溶液(eBioscience社)を加え、室温で15分間反応させ、0.18M硫酸水溶液でクエンチした後にプレートリーダーで450nmの波長を検出した。
結果を図22に示す。この結果より、抗体の糖鎖の種類がFcγRIIIa−V158に対する結合に大きく関与していることがわかった。チャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブはコアフコースが付いているが、糖鎖改変の有無に関わらずいずれのトラスツズマブも、コアフコースが付いていないカイコ絹糸腺産生の糖鎖改変A2トラスツズマブに比して低い結合能を示した。このことより、コアフコースの有無がFcγRIIIa−V158に対する結合活性に対し影響が大きいことがわかった。また、コアフコース含有率を高めたトラスツズマブ−F97.1%は、トラスツズマブ−F84.2%に比してFcγRIIIa−V158に対する結合活性が大きく低下した。一方、糖鎖改変したトラスツズマブ−A2−F85.6%とコアフコース含有率を高めたトラスツズマブ−A2−F97.6%では結合活性に差は見られなかった。
<実施例18>各種トラスツズマブの表面プラズモン共鳴法によるFcγRIIIa−V158との結合活性解析
BIACORE−X100Plus(GE healthcare社)を用いて、各種トラスツズマブのFcγRIIIa−V158に対する結合活性を調べた。センサーチップCM5にProteinAを3861RUになるまで固定化したものに対し、それぞれ約250RUとなるまでチャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ(トラスツズマブ−F84.2%)、実施例3及び4で調製したコアフコース含有率を97.1%に向上させたトラスツズマブ(トラスツズマブ−F97.1%)、実施例8で調製したコアフコ−ス含有率が85.6%である糖鎖改変A2トラスツズマブ(トラスツズマブ−A2−F85.6%)、実施例8、12及び13で調製したコアフコ−ス含有率を97.6%に向上させた糖鎖改変A2トラスツズマブ(トラスツズマブ−A2−F97.6%)及び非特許文献14で調製した糖鎖改変A2トラスツズマブ(トラスツズマブ−A2−F0%)を吸着させた。その後、ヒト型FcγRIIIa−V158溶液を0.0016μM、0.008μM、0.04μM、0.2μM及び1μMの濃度で添加するシングルサイクル法という手法で各種トラスツズマブとFcγRIIIa−V158の結合活性を調べた。
BIACORE−X100Plus(GE healthcare社)を用いて、各種トラスツズマブのFcγRIIIa−V158に対する結合活性を調べた。センサーチップCM5にProteinAを3861RUになるまで固定化したものに対し、それぞれ約250RUとなるまでチャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ(トラスツズマブ−F84.2%)、実施例3及び4で調製したコアフコース含有率を97.1%に向上させたトラスツズマブ(トラスツズマブ−F97.1%)、実施例8で調製したコアフコ−ス含有率が85.6%である糖鎖改変A2トラスツズマブ(トラスツズマブ−A2−F85.6%)、実施例8、12及び13で調製したコアフコ−ス含有率を97.6%に向上させた糖鎖改変A2トラスツズマブ(トラスツズマブ−A2−F97.6%)及び非特許文献14で調製した糖鎖改変A2トラスツズマブ(トラスツズマブ−A2−F0%)を吸着させた。その後、ヒト型FcγRIIIa−V158溶液を0.0016μM、0.008μM、0.04μM、0.2μM及び1μMの濃度で添加するシングルサイクル法という手法で各種トラスツズマブとFcγRIIIa−V158の結合活性を調べた。
結果を図23及び表1に示す。その結果、コアフコース含有量が増えるにつれて結合速度並びに解離速度が変化し解離定数が大きくなっていることがわかった。また、コアフコース含有量が多い(97%以上)トラスツズマブは解離速度が非常に速いことがわかった。
表1は各種トラスツズマブ(トラスツズマブ−F84.2%、トラスツズマブ−F97.1%、トラスツズマブ−A2−F0%、トラスツズマブ−A2−F85.6%及びトラスツズマブ−A2−F97.6%)のFcγRIIIa−V158結合活性を示す。表1より糖鎖改変していないトラスツズマブについても同様の結果が得られた。
表1は各種トラスツズマブ(トラスツズマブ−F84.2%、トラスツズマブ−F97.1%、トラスツズマブ−A2−F0%、トラスツズマブ−A2−F85.6%及びトラスツズマブ−A2−F97.6%)のFcγRIIIa−V158結合活性を示す。表1より糖鎖改変していないトラスツズマブについても同様の結果が得られた。
<実施例19>糖鎖改変G2、G1a、G1b、G0及びM3トラスツズマブの調製
実施例7で調製したトラスツズマブのアクセプター(3.5mg)、糖供与体としてG2、G1a、G1b、G0またはM3オキサゾリン(2.1875μmol)(G1a及びG1bは特願2015−234188に記載の方法により調製した)、並びに、大腸菌で発現及び精製した変異型酵素GST−Endo−S D233Q(350μg)を糖転移酵素として、50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.0)中に加え、総量875μLとして37℃で1時間静置した。
この反応液に同緩衝液で平衡化したCOSMOGEL GST−Accept(ナカライテスク社)をウェットボリュームで280μL加えて室温で30分回転振盪を行い、GST−EndoS D233Qを吸着させた。
実施例7で調製したトラスツズマブのアクセプター(3.5mg)、糖供与体としてG2、G1a、G1b、G0またはM3オキサゾリン(2.1875μmol)(G1a及びG1bは特願2015−234188に記載の方法により調製した)、並びに、大腸菌で発現及び精製した変異型酵素GST−Endo−S D233Q(350μg)を糖転移酵素として、50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.0)中に加え、総量875μLとして37℃で1時間静置した。
この反応液に同緩衝液で平衡化したCOSMOGEL GST−Accept(ナカライテスク社)をウェットボリュームで280μL加えて室温で30分回転振盪を行い、GST−EndoS D233Qを吸着させた。
このゲル担体を除いた液に同じく50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したAb−Capcher ExTra(プロテノバ社)をウェットボリュームで140μL加えて室温で1時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は3.5mLのNETN緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム、1mMEDTA及び1%(w/v)NP−40)で室温、10分間の洗浄作業を計3回、1mlのPBSでのリンスを3回行った。
洗浄した担体に350μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を11.67μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながらPBSに緩衝液置換した。
洗浄した担体に350μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を11.67μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながらPBSに緩衝液置換した。
その結果、G2体2.5mg、G1a体2.7mg、G1b体2.8mg、G0体2.5mg及びM3体2.6mgの糖鎖改変抗体が得られた。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに得られた糖鎖改変抗体をG2体は1μg、G1a体、G1b体、G0体及びM3体は0.5μg供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖受容体の転移により重鎖が高分子側にシフトしたことが確認された。代表例としてG2体の電気泳動写真を図24に示す。
<実施例20>糖鎖改変G2、G1a、G1b及びG0トラスツズマブ中のコアフコースの付いていない糖鎖のEndo−CCによる加水分解
糖鎖改変G2体は、実施例19で調製した糖鎖改変トラスツズマブ(800μg)、Endo−CC(24μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量800μLとして37℃で24時間静置した。24時間後この反応液にPBSを600μL加え、同じくPBSで平衡化したAb−Capcher ExTra(プロテノバ社)をウェットボリュームで32μL加えて4℃で15時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は800μLのNETN緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム、1mMEDTA及び1%(w/v)NP−40)で室温、10分間の洗浄作業を計3回、1mLのPBSでのリンスを4回行った。洗浄した担体に80μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を2.67μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながらPBSに緩衝液置換した。
その結果、680μgのEndo−CC加水分解後糖鎖改変G2トラスツズマブが得られた。
糖鎖改変G2体は、実施例19で調製した糖鎖改変トラスツズマブ(800μg)、Endo−CC(24μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量800μLとして37℃で24時間静置した。24時間後この反応液にPBSを600μL加え、同じくPBSで平衡化したAb−Capcher ExTra(プロテノバ社)をウェットボリュームで32μL加えて4℃で15時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は800μLのNETN緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム、1mMEDTA及び1%(w/v)NP−40)で室温、10分間の洗浄作業を計3回、1mLのPBSでのリンスを4回行った。洗浄した担体に80μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を2.67μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながらPBSに緩衝液置換した。
その結果、680μgのEndo−CC加水分解後糖鎖改変G2トラスツズマブが得られた。
糖鎖改変G1a体、G1b体及びG0体は、それぞれ実施例19で調製した糖鎖改変トラスツズマブ(750μg)、Endo−CC(22.5μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量750μLとして37℃で24時間静置した。24時間後この反応液にPBSを600μL加え、同じくPBSで平衡化したAb−Capcher ExTra(プロテノバ社)をウェットボリュームで32μL加えて4℃で15時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は750μLのNETN緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム、1mMEDTA及び1%(w/v)NP−40)で室温、10分間の洗浄作業を計3回、1mLのPBSでのリンスを4回行った。洗浄した担体に80μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を2.67μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながらPBSに緩衝液置換した。
その結果、G1a体580μg、G1b体630μg及びG0体590μgのEndo−CC加水分解後糖鎖改変トラスツズマブが得られた。
8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに得られたEndo−CC加水分解後糖鎖改変トラスツズマブをG2体は1μg、G1a体、G1b体及びG0体は0.5μg供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された。代表例としてG2体の電気泳動写真を図24に示す。
8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに得られたEndo−CC加水分解後糖鎖改変トラスツズマブをG2体は1μg、G1a体、G1b体及びG0体は0.5μg供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された。代表例としてG2体の電気泳動写真を図24に示す。
<実施例21>糖鎖改変M3トラスツズマブ中のコアフコースの付いていない糖鎖のEndo−Mによる加水分解
実施例19で調製した糖鎖改変M3トラスツズマブ(1.9mg)、Endo−M(57μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量380μLとして37℃で48時間静置した。48時間後この反応液にPBSを1mL加え、同じくPBSで平衡化したAb−Capcher ExTra(プロテノバ社)をウェットボリュームで80μL加えて4℃で15時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は1.8mLのNETN緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム、1mMEDTA及び1%(w/v)NP−40)で室温、10分間の洗浄作業を計3回、1mLのPBSでのリンスを4回行った。洗浄した担体に200μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を6.67μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながらPBSに緩衝液置換した。
その結果、1.65mgのEndo−M加水分解後糖鎖改変M3トラスツズマブが得られた。
8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに精製後の抗体0.5μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された。
実施例19で調製した糖鎖改変M3トラスツズマブ(1.9mg)、Endo−M(57μg)を50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中に加え、総量380μLとして37℃で48時間静置した。48時間後この反応液にPBSを1mL加え、同じくPBSで平衡化したAb−Capcher ExTra(プロテノバ社)をウェットボリュームで80μL加えて4℃で15時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は1.8mLのNETN緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム、1mMEDTA及び1%(w/v)NP−40)で室温、10分間の洗浄作業を計3回、1mLのPBSでのリンスを4回行った。洗浄した担体に200μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を6.67μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながらPBSに緩衝液置換した。
その結果、1.65mgのEndo−M加水分解後糖鎖改変M3トラスツズマブが得られた。
8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに精製後の抗体0.5μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の加水分解により重鎖が低分子側にシフトした糖鎖改変トラスツズマブが増加したことが確認された。
<実施例22>糖鎖改変G2、G1a、G1b及びG0トラスツズマブEndo−CC糖鎖加水分解体並びに糖鎖改変M3トラスツズマブEndo−M糖鎖加水分解体の分離精製とHPLC分析
実施例20で調製した糖鎖改変G2、G1a、G1b及びG0トラスツズマブのEndo−CC糖鎖加水分解体並びに実施例21で調製した糖鎖改変M3トラスツズマブのEndo−M糖鎖加水分解体は、実施例13と同様の手順で分離精製し、分離精製物の確認を実施した。AKTA−FPLCシステムを用いた分離精製では、糖鎖改変G2、G1a、G1b及びG0トラスツズマブのEndo−CC糖鎖加水分解体をそれぞれ500μg使用した。また、糖鎖改変M3トラスツズマブEndo−M糖鎖加水分解体は1回当たり500μgを使用し、計3回(計1500μg)の操作を行い3回分の分離精製物を混合した。HPLCシステムを用いた分離精製物の確認の結果、fully glycosylated型の糖鎖改変トラスツズマブがそれぞれ分離精製できていることを確認した。また、8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEによる確認により、重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが消失したことからも、fully glycosylated型の糖鎖改変G2、G1a、G1b、G0及びM3トラスツズマブを分離精製できたことが認められた(図25)。
実施例20で調製した糖鎖改変G2、G1a、G1b及びG0トラスツズマブのEndo−CC糖鎖加水分解体並びに実施例21で調製した糖鎖改変M3トラスツズマブのEndo−M糖鎖加水分解体は、実施例13と同様の手順で分離精製し、分離精製物の確認を実施した。AKTA−FPLCシステムを用いた分離精製では、糖鎖改変G2、G1a、G1b及びG0トラスツズマブのEndo−CC糖鎖加水分解体をそれぞれ500μg使用した。また、糖鎖改変M3トラスツズマブEndo−M糖鎖加水分解体は1回当たり500μgを使用し、計3回(計1500μg)の操作を行い3回分の分離精製物を混合した。HPLCシステムを用いた分離精製物の確認の結果、fully glycosylated型の糖鎖改変トラスツズマブがそれぞれ分離精製できていることを確認した。また、8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEによる確認により、重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブが消失したことからも、fully glycosylated型の糖鎖改変G2、G1a、G1b、G0及びM3トラスツズマブを分離精製できたことが認められた(図25)。
<実施例23>Endo−CC処理後の精製した糖鎖改変G2、G1a、G1b及びG0トラスツズマブ並びにEndo−M処理後の精製した糖鎖改変M3トラスツズマブの糖ペプチドGlu−Glu−Gln−Tyr−Asn(Glycan)−Ser−Thr−Tyr−Arg解析
実施例19で調製した糖鎖改変G2、G1a、G1b、G0及びM3トラスツズマブ、実施例20及び実施例22で調製したEndo−CC処理後の精製した糖鎖改変G2、G1a、G1b及びG0トラスツズマブ並びに実施例21及び実施例22で調製したEndo−M処理後の精製した糖鎖改変M3トラスツズマブを使用し、実施例16と同様の手順でMS測定を行い、糖鎖切断の割合とコアフコース含有糖鎖割合を算出した。
実施例19で調製した糖鎖改変G2、G1a、G1b、G0及びM3トラスツズマブ、実施例20及び実施例22で調製したEndo−CC処理後の精製した糖鎖改変G2、G1a、G1b及びG0トラスツズマブ並びに実施例21及び実施例22で調製したEndo−M処理後の精製した糖鎖改変M3トラスツズマブを使用し、実施例16と同様の手順でMS測定を行い、糖鎖切断の割合とコアフコース含有糖鎖割合を算出した。
その結果、糖鎖改変G2トラスツズマブは糖鎖が97.3%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は95.6%であった。一方、精製したEndo−CC処理後の糖鎖改変G2トラスツズマブは糖鎖が99%以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は99%以上であった。
糖鎖改変G1aトラスツズマブは糖鎖が98.4%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は93.0%であった。一方、精製したEndo−CC処理後の糖鎖改変G1aトラスツズマブは糖鎖が99%以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は99%以上であった。
糖鎖改変G1bトラスツズマブは糖鎖が98.3%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は94.3%であった。一方、精製したEndo−CC処理後の糖鎖改変G1bトラスツズマブは糖鎖が99%以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は99%以上であった。
糖鎖改変G0トラスツズマブは糖鎖が98.5%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は91.6%であった。一方、精製したEndo−CC処理後の糖鎖改変G0トラスツズマブは糖鎖が99%以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は99%以上であった。
糖鎖改変M3トラスツズマブは糖鎖が97.1%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は91.9%であった。一方、精製したEndo−M処理後の糖鎖改変M3トラスツズマブは糖鎖が99%以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は99%以上であった。
このことにより、精製過程で重鎖の両方に糖鎖が付いているfully glycosylated型の抗体が99%以上分離できていることも示せた。また、コアフコースを高純度(99%以上)で含む糖鎖改変G2、G1a、G1b、G0及びM3トラスツズマブを調製できた。
糖鎖改変G1aトラスツズマブは糖鎖が98.4%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は93.0%であった。一方、精製したEndo−CC処理後の糖鎖改変G1aトラスツズマブは糖鎖が99%以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は99%以上であった。
糖鎖改変G1bトラスツズマブは糖鎖が98.3%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は94.3%であった。一方、精製したEndo−CC処理後の糖鎖改変G1bトラスツズマブは糖鎖が99%以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は99%以上であった。
糖鎖改変G0トラスツズマブは糖鎖が98.5%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は91.6%であった。一方、精製したEndo−CC処理後の糖鎖改変G0トラスツズマブは糖鎖が99%以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は99%以上であった。
糖鎖改変M3トラスツズマブは糖鎖が97.1%付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は91.9%であった。一方、精製したEndo−M処理後の糖鎖改変M3トラスツズマブは糖鎖が99%以上付加しており、そのうちコアフコースが結合している糖鎖は99%以上であった。
このことにより、精製過程で重鎖の両方に糖鎖が付いているfully glycosylated型の抗体が99%以上分離できていることも示せた。また、コアフコースを高純度(99%以上)で含む糖鎖改変G2、G1a、G1b、G0及びM3トラスツズマブを調製できた。
<実施例24>PNGase処理によるトラスツズマブ−aglyconの調製
調製したトラスツズマブ(800μg)とPNGase F(NEB社、1500ユニット)を10XG7 Reaction Buffer(NEB社)中に加え、総量160μLとして37℃で17時間静置した。17時間後この反応液にPBSを500μL加え、同じくPBSで平衡化したAb−Capcher ExTra(プロテノバ社)をウェットボリュームで32μL加えて4℃で15時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は800μLのNETN緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム、1mMEDTA及び1%(w/v)NP−40)で室温、10分間の洗浄作業を計3回、1mLのPBSでのリンスを4回行った。洗浄した担体に80μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を2.67μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながら20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に緩衝液置換した。
その結果、660μgのトラスツズマブ−aglyconが得られた。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに精製後の抗体1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブ−aglyconが確認された(図26)。
調製したトラスツズマブ(800μg)とPNGase F(NEB社、1500ユニット)を10XG7 Reaction Buffer(NEB社)中に加え、総量160μLとして37℃で17時間静置した。17時間後この反応液にPBSを500μL加え、同じくPBSで平衡化したAb−Capcher ExTra(プロテノバ社)をウェットボリュームで32μL加えて4℃で15時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は800μLのNETN緩衝液(50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)、150mM塩化ナトリウム、1mMEDTA及び1%(w/v)NP−40)で室温、10分間の洗浄作業を計3回、1mLのPBSでのリンスを4回行った。洗浄した担体に80μLの0.1Mグリシン塩酸緩衝液(pH2.7)を加え溶出させ、溶出液に1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を2.67μL加えて中和した。この溶出作業を計3回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−0.5(分画分子量30kDa、メルクミリポア社)で濃縮しながら20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に緩衝液置換した。
その結果、660μgのトラスツズマブ−aglyconが得られた。8.5%ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS−PAGEに精製後の抗体1μgを供し、クーマシーブリリアントブルー染色で確認したところ、糖鎖の分解により重鎖が低分子側にシフトしたトラスツズマブ−aglyconが確認された(図26)。
<実施例25>各種トラスツズマブのマイクロプレートアッセイ法によるFcγRIIIa−V158との結合試験
実施例17と同様の手順で各種トラスツズマブのFcγRIIIa−V158に対する結合試験をマイクロプレートアッセイ法により行った。結合試験に使用したトラスツズマブは、カイコ絹糸腺産生トラスツズマブ(トラスツズマブ−F0%)、チャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ(トラスツズマブ−F84.2%)、実施例19、20及び22で調製したコアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G2トラスツズマブ(トラスツズマブ−G2−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G1aトラスツズマブ(トラスツズマブ−G1a−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G1bトラスツズマブ(トラスツズマブ−G1b−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G0トラスツズマブ(トラスツズマブ−G0−F99%)、実施例19、21及び22で調製したコアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変M3トラスツズマブ(トラスツズマブ−M3−F99%)並びに実施例24で調製した糖鎖を取り除いたトラスツズマブ(トラスツズマブ−aglycon)である。
実施例17と同様の手順で各種トラスツズマブのFcγRIIIa−V158に対する結合試験をマイクロプレートアッセイ法により行った。結合試験に使用したトラスツズマブは、カイコ絹糸腺産生トラスツズマブ(トラスツズマブ−F0%)、チャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ(トラスツズマブ−F84.2%)、実施例19、20及び22で調製したコアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G2トラスツズマブ(トラスツズマブ−G2−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G1aトラスツズマブ(トラスツズマブ−G1a−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G1bトラスツズマブ(トラスツズマブ−G1b−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G0トラスツズマブ(トラスツズマブ−G0−F99%)、実施例19、21及び22で調製したコアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変M3トラスツズマブ(トラスツズマブ−M3−F99%)並びに実施例24で調製した糖鎖を取り除いたトラスツズマブ(トラスツズマブ−aglycon)である。
結果を図27に示す。チャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ及びコアフコース含有率を向上させた糖鎖改変トラスツズマブは、いずれもコアフコースが結合していないカイコ絹糸腺産生トラスツズマブに比して低い結合活性を示した。また、トラスツズマブ−G2−F99%、トラスツズマブ−G1a−F99%、トラスツズマブ−G1b−F99%、トラスツズマブ−G0−F99%及びトラスツズマブ−M3−F99%は、糖鎖を除去したトラスツズマブ−aglyconに近い結合活性を示し、FcγRIIIa−V158との相互作用が極めて弱いことがわかった。
<実施例26>各種トラスツズマブの表面プラズモン共鳴法によるFcγRIIIa−V158との結合活性解析
実施例18と同様の手順でBIACORE−X100Plus(GE healthcare社)を用いて、各種トラスツズマブのFcγRIIIa−V158に対する結合活性を調べた。結合試験に使用したトラスツズマブは、チャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ(トラスツズマブ−F84.2%)、実施例19、20及び22で調製したコアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G2トラスツズマブ(トラスツズマブ−G2−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G1aトラスツズマブ(トラスツズマブ−G1a−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G1bトラスツズマブ(トラスツズマブ−G1b−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G0トラスツズマブ(トラスツズマブ−G0−F99%)、実施例19、21及び22で調製したコアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変M3トラスツズマブ(トラスツズマブ−M3−F99%)である。
実施例18と同様の手順でBIACORE−X100Plus(GE healthcare社)を用いて、各種トラスツズマブのFcγRIIIa−V158に対する結合活性を調べた。結合試験に使用したトラスツズマブは、チャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ(トラスツズマブ−F84.2%)、実施例19、20及び22で調製したコアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G2トラスツズマブ(トラスツズマブ−G2−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G1aトラスツズマブ(トラスツズマブ−G1a−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G1bトラスツズマブ(トラスツズマブ−G1b−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G0トラスツズマブ(トラスツズマブ−G0−F99%)、実施例19、21及び22で調製したコアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変M3トラスツズマブ(トラスツズマブ−M3−F99%)である。
結果を表2に示す。その結果、コアフコース含有率を向上させた糖鎖改変トラスツズマブは、コアフコース含有率が低いトラスツズマブ−F84.2%に比していずれも解離定数KDが大きくなり、FcγRIIIa−V158との相互作用が弱まっていることがわかった。
表2は各種トラスツズマブ(トラスツズマブ−F84.2%、トラスツズマブ−G2−F99%、トラスツズマブ−G1a−F99%、トラスツズマブ−G1b−F99%、トラスツズマブ−G0−F99%及びトラスツズマブ−M3−F99%)の平衡時の解離定数KDを示す。
表2は各種トラスツズマブ(トラスツズマブ−F84.2%、トラスツズマブ−G2−F99%、トラスツズマブ−G1a−F99%、トラスツズマブ−G1b−F99%、トラスツズマブ−G0−F99%及びトラスツズマブ−M3−F99%)の平衡時の解離定数KDを示す。
<実施例27>各種トラスツズマブのADCC活性測定
トラスツズマブに対する抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性をADCC reporter Bioassayキット(Promega社)を用いて測定した。ADCC活性測定に使用したトラスツズマブはチャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ(トラスツズマブ−F84.2%)、実施例19、20及び22で調製したコアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G2トラスツズマブ(トラスツズマブ−G2−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G1aトラスツズマブ(トラスツズマブ−G1a−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G1bトラスツズマブ(トラスツズマブ−G1b−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G0トラスツズマブ(トラスツズマブ−G0−F99%)、実施例19、21及び22で調製したコアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変M3トラスツズマブ(トラスツズマブ−M3−F99%)並びに実施例7で調製したトラスツズマブのアクセプター(トラスツズマブ アクセプター)である。
エフェクター細胞はキット付属であり、FcγRIIIaのV158バリアントを安定に発現し、ホタルルシフェラーゼの発現を駆動するNFAT応答配列を安定に保持する遺伝子組換えJurkat細胞である。ターゲット細胞はHER2の高発現株であるSK−BR−3細胞を用いた。
SK−BR−3細胞は、10%FBS、NEAA及びピルビン酸を添加したRPMI−1640培地で培養し、測定前々日に96ウェル白色ソリッドプレート(Corning社)に1ウェル当たり5000個を播種した。37℃、5%CO2のインキュベーター内で一晩培養し、翌日ウェルより培地を入念に除き、各種トラスツズマブの段階希釈液50μLを加えた。段階希釈にはADCCアッセイ培地(10%Super Low IgG FBS(HyClone社)含有RPMI−1640培地)を用いた。段階希釈のスタートの抗体濃度は0.33μg/mLとし、以降1/3希釈を8回繰り返して計9段階の希釈液を調製した。これに抗体を含まないADCCアッセイ培地を加えた計10種の濃度の抗体希釈液を測定に用いた。
ターゲット細胞に抗体を加えた後はプレインキュベーション時間を設けず、直ちにエフェクター細胞を加えた。エフェクター細胞は、ADCCアッセイ培地に懸濁し、エフェクター細胞:ターゲット細胞の比が15:1となるよう、1ウェル当たり75000個を加えた。この際、加える細胞懸濁液は25μLとなるよう調製した。エフェクター細胞を加えた後はプレートを37℃、5%CO2のインキュベーター内で24時間静置した。
測定当日、プレートはインキュベーターから取り出して室温で15分以上静置し温度を下げ、ウェル内のADCCアッセイ培地と等量のBio−Gloルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega社)をウェルに加えた。5分経過したところでルシフェラーゼの化学発光強度を発光マイクロプレートリーダーTriStar2 LB−942(Berthold社)で測定した。
トラスツズマブに対する抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性をADCC reporter Bioassayキット(Promega社)を用いて測定した。ADCC活性測定に使用したトラスツズマブはチャイニーズハムスター卵巣細胞産生トラスツズマブ(トラスツズマブ−F84.2%)、実施例19、20及び22で調製したコアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G2トラスツズマブ(トラスツズマブ−G2−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G1aトラスツズマブ(トラスツズマブ−G1a−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G1bトラスツズマブ(トラスツズマブ−G1b−F99%)、コアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変G0トラスツズマブ(トラスツズマブ−G0−F99%)、実施例19、21及び22で調製したコアフコース含有率を99%以上に向上させた糖鎖改変M3トラスツズマブ(トラスツズマブ−M3−F99%)並びに実施例7で調製したトラスツズマブのアクセプター(トラスツズマブ アクセプター)である。
エフェクター細胞はキット付属であり、FcγRIIIaのV158バリアントを安定に発現し、ホタルルシフェラーゼの発現を駆動するNFAT応答配列を安定に保持する遺伝子組換えJurkat細胞である。ターゲット細胞はHER2の高発現株であるSK−BR−3細胞を用いた。
SK−BR−3細胞は、10%FBS、NEAA及びピルビン酸を添加したRPMI−1640培地で培養し、測定前々日に96ウェル白色ソリッドプレート(Corning社)に1ウェル当たり5000個を播種した。37℃、5%CO2のインキュベーター内で一晩培養し、翌日ウェルより培地を入念に除き、各種トラスツズマブの段階希釈液50μLを加えた。段階希釈にはADCCアッセイ培地(10%Super Low IgG FBS(HyClone社)含有RPMI−1640培地)を用いた。段階希釈のスタートの抗体濃度は0.33μg/mLとし、以降1/3希釈を8回繰り返して計9段階の希釈液を調製した。これに抗体を含まないADCCアッセイ培地を加えた計10種の濃度の抗体希釈液を測定に用いた。
ターゲット細胞に抗体を加えた後はプレインキュベーション時間を設けず、直ちにエフェクター細胞を加えた。エフェクター細胞は、ADCCアッセイ培地に懸濁し、エフェクター細胞:ターゲット細胞の比が15:1となるよう、1ウェル当たり75000個を加えた。この際、加える細胞懸濁液は25μLとなるよう調製した。エフェクター細胞を加えた後はプレートを37℃、5%CO2のインキュベーター内で24時間静置した。
測定当日、プレートはインキュベーターから取り出して室温で15分以上静置し温度を下げ、ウェル内のADCCアッセイ培地と等量のBio−Gloルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega社)をウェルに加えた。5分経過したところでルシフェラーゼの化学発光強度を発光マイクロプレートリーダーTriStar2 LB−942(Berthold社)で測定した。
結果を図28に示す。コアフコース含有率が低いトラスツズマブ−F84.2%がこの中では最も高い活性を示した。そして、トラスツズマブ−G2−F99%、トラスツズマブ−G1a−F99%、トラスツズマブ−G1b−F99%、トラスツズマブ−G0−F99%及びトラスツズマブ−M3−F99%は、トラスツズマブ濃度が0.33μg/mLのときいずれも発光量が7000RLU以下となり、ADCC活性が大きく低下した。このことから、コアフコースの含有率がADCC活性と大きく関与していることが示唆された。
本発明は、コアフコースを有しかつ均一な糖鎖構造を有する抗体を高純度に製造することができるので、均一な糖鎖構造を有する抗体(医薬品)を製造することが望まれている医薬品業界等において利用可能である。
Claims (24)
- コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体から、コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させる抗体の調製方法であって、
少なくとも以下の工程(1)及び工程(2)を行うことを特徴とする抗体の調製方法。
(1)該抗体をエンドグリコシダーゼ(1)で処理して、「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミン」に結合している糖鎖を加水分解する工程
(2)工程(1)で得られた「フコースが結合していないN−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」を除去する工程 - コアフコースを有する糖鎖の含有割合を増加させると共に、糖鎖部分を均一にする抗体の調製方法であって、
上記工程(1)の前に、以下の工程(A)及び工程(B)を行う請求項1に記載の抗体の調製方法。
(A)上記抗体をエンドグリコシダーゼ(2)で処理して、N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖を加水分解する工程
(B)工程(A)で得られた「N−アセチルグルコサミンに結合している糖鎖が加水分解された抗体」に、均一な糖鎖を転移酵素で付加させる工程 - 上記エンドグリコシダーゼ(1)がエンドグリコシダーゼM及びエンドグリコシダーゼCCからなる群から選択される少なくとも1種である請求項1又は請求項2に記載の抗体の調製方法。
- 上記工程(2)において、クロマトグラフィーを用いる請求項1ないし請求項3の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
- 更に、上記エンドグリコシダーゼ(2)を工程(A)の後に除去する工程を含む請求項2ないし請求項4の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
- 上記エンドグリコシダーゼ(2)が固定化したエンドグリコシダーゼである請求項2ないし請求項5の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
- 上記エンドグリコシダーゼ(2)がエンドグリコシダーゼS及びエンドグリコシダーゼDからなる群から選択される少なくとも1種である請求項2ないし請求項6の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
- 上記「コアフコースを有する糖鎖とコアフコースを有さない糖鎖とが混合している抗体」が哺乳動物細胞により産生された抗体である請求項1ないし請求項7の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
- 上記抗体がIgG抗体である請求項1ないし請求項8の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
- 上記抗体が非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である請求項1ないし請求項9の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
- 上記抗体がトラスツズマブ、インフリキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、トシリズマブ、又はセツキシマブである請求項1ないし請求項10の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法。
- 請求項1ないし請求項11の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法を用いることを特徴とする高純度抗体の製造方法。
- 請求項1ないし請求項11の何れかの請求項に記載の抗体の調製方法を用いることを特徴とする高純度な抗体のFcドメインを有する糖タンパク質の製造方法。
- 高純度が99%以上の高純度である請求項12又は請求項13に記載の製造方法。
- コアフコースを有するA2、G2、G0、G1a、G1b、及びM3から選択される1種類の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を持つ糖鎖改変した抗体。
- 上記抗体が非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である請求項15に記載の抗体。
- 上記抗体がトラスツズマブ、インフリキシマブ、ベバシズマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、トシリズマブ、又はセツキシマブである請求項15又は請求項16に記載の抗体。
- 抗体が99%以上の高純度の抗体である請求項15ないし請求項17の何れかの請求項に記載の抗体。
- 少なくとも以下の工程(G1)を行い、下記量が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法。
(G1)コアフコース、コアフコースを有する糖鎖、及び/又は、「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」を定量する工程 - 少なくとも以下の工程(G2)を行い、下記含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法。
(G2)「コアフコースを有する糖鎖が結合している抗体」の含有割合を測定する工程 - 少なくとも以下の工程(G3)を行い、下記フコース結合抗体の含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法。
(G3)コアフコースを有するA2、G2、G0、G1a、G1b及びM3よりなる群から選択される1種以上の糖鎖が結合したフコース結合抗体の含有割合を測定する工程 - 請求項15ないし請求項18の何れかの請求項に記載の抗体の含有量を測定する工程を行い、該抗体の含有割合が多い程、品質が低いと評価することを特徴とする抗体の品質評価方法。
- 請求項19ないし請求項22の何れかの請求項に記載の抗体の品質評価方法を使用することを特徴とする抗体の品質管理方法。
- 請求項23に記載の抗体の品質管理方法を使用して抗体を製造することを特徴とする抗体の製造方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2023167238A1 (ja) * | 2022-03-02 | 2023-09-07 | 第一三共株式会社 | Fc含有分子の製造方法 |
-
2016
- 2016-03-22 JP JP2016056741A patent/JP2017031132A/ja active Pending
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2023167238A1 (ja) * | 2022-03-02 | 2023-09-07 | 第一三共株式会社 | Fc含有分子の製造方法 |
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