JP2010512306A

JP2010512306A - 抗炎症特性が増強され、細胞毒性特性が減少したポリペプチドおよび関連する方法

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Publication number: JP2010512306A
Application number: JP2009534723A
Authority: JP
Inventors: ニンマージャン，フォーク; 佳賢金子; ラベッチ，ジェフリー，ブイ．
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 2006-10-27
Filing date: 2007-07-03
Publication date: 2010-04-22
Also published as: CA2666308C; IL197920A0; CA2666308A1

Abstract

本発明は、少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域がα２，６結合により各末端シアル酸部分に結合する少なくとも一つのガラクトース部分でグリコシル化され、該ポリペプチドが未精製の抗体に比してより高い抗炎症活性を有する、少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を含むポリペプチドを提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００６年４月５日に出願された米国仮特許出願第６０／７８９，３８４号に対して優先権を主張する、２００７年４月３日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／０８３９６号の一部継続出願であり、これらは双方とも参考で本明細書中に引用される。本出願はまた、２００６年１０月２７日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０６／４１７９１号、及び２００５年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６０／７３４，１９６号に対して優先権を主張する、２００７年４月３日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／０８３９６号に対して優先権を主張し、これらは双方とも参考で本明細書中に引用される。

連邦政府の資金による研究に関する言及
本発明に至る研究は、一部、国立衛生研究所認可番号ＡＩ０３４６６２によって支援された。したがって、米国政府が、本発明についてある程度権利を有しうる。

技術分野
本発明は、炎症性疾患の治療を目的とした、治療用ポリペプチドを設計する新規な方法に関する。

免疫グロブリンに対する細胞受容体は、４０年近く前に最初に同定されたけれども、免疫反応におけるそれらの中心的役割は、ここ１０年ほどで見出されたに過ぎない。免疫反応の末梢から中枢に向かう時期（ａｆｆｅｒｅｎｔｐｈａｓｅ）および中枢から末梢に向かう時期（ｅｆｆｅｒｅｎｔｐｈａｓｅ）の双方においてそれらは中心的存在であり、Ｂ細胞活性化および抗体産生の閾値を設定し、樹状細胞の成熟を調節し、そして抗体反応の高い特異性を、食作用、抗体依存性細胞障害ならびに炎症性細胞の動員および活性化のようなエフェクター経路へと導く。体液性免疫システムを固有のエフェクター細胞に導く際のそれらの中心的役割により、それらは、in vivoにおける抗体活性を増強させる、または抑制するための魅力的な免疫治療用ターゲットとなる。

抗体および抗体−抗原複合体と、免疫システムの細胞との相互作用は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、食作用、炎症性メディエータの放出、抗原クリアランス、ならびに抗体半減期などの種々の反応を引き起こす（Ｄａｒｏｎ，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，１５，２０３−２３４（１９９７）；ＷａｒｄａｎｄＧｈｅｔｉｅ，ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＩｍｍｕｎｏｌ，２，７７−９４（１９９５）；ＲａｖｅｔｃｈａｎｄＫｉｎｅｔ，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，９，４５７−４９２（１９９１）中で概説され，各々は、本明細書で参照として引用される）。

抗体定常領域は、直接的には抗原への抗体の結合に関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、抗体または免疫グロブリンを、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちいくつかはさらにサブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４；ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、に分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。種々のヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３がＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりもより効果的にＡＤＣＣを媒介する。

抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合フラグメントが生成するが、このフラグメントは、各々が単一の抗原結合部位を有するＦａｂフラグメント、および、すぐに結晶化できることを示す名前である「Ｆｃ」フラグメントと呼ばれる。Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能の中心となる。ヒトＩｇＧＦｃ領域の結晶構造が決定されてきた（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，２３６１−２３７０（１９８１）、これは本明細書に参照として引用される）。ヒトＩｇＧ分子において、Ｆｃ領域は、パパインでＮ末端からＣｙｓ２２６までを切断することによって得られる。

ＩｇＧは、Ｆｃフラグメントによって媒介される相互作用を通じて、炎症性、および抗炎症性双方の活性を媒介すると長い間考えられてきた。したがって、Ｆｃ−ＦｃｙＲ相互作用は、免疫複合体および細胞障害抗体の炎症性特性に関与する一方、静脈内ガンマグロブリン（ＩＶＩＧ）およびそのＦｃフラグメントは、抗炎症性であり、炎症性疾患を抑制するために広く用いられる。そのような逆説的な特性の正確なメカニズムは不明であるが、ＩｇＧのグリコシル化がＩｇＧの細胞毒性および炎症性の制御に重要であることが提案されてきている。

ＩｇＧは、その２つの重鎖の各々のＣＨ２ドメイン中のＡｓｎ^２９７に単一の、Ｎ−結合型グリカンを含む。共有結合した複合糖質は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧＩｃＮＡｃ）およびマンノース（ｍａｎ）を含む、コアの二分岐ペンタ−ポリサッカロイドから構成される。コア糖質構造のさらなる修飾が、可変的に見出されるフコース、分岐ＧＩｃＮＡｃ、ガラクトース（ｇａｌ）および末端シアル酸（ｓａ）部分の存在によって血清抗体中に見られる。それ故、４０を超える異なる糖型が、この一つのグリコシル化部位に共有結合していることが見出されている。Ｆｕｊｉｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６５，６００９（１９９０）。ＩｇＧのグリコシル化は、２つの重鎖のオープン構造（ｏｐｅｎｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を維持することによって、全てのＦｃｙＲへの結合に不可欠であることが示されてきている。ＪｅｆｆｅｒｉｓａｎｄＬｕｎｄ，Ｉｍｍｕｎｅ．ｌＬｅｔｔ．８２，５７（２００２），Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９，７３７（２００１）。このようにＦｃｙＲ結合にＩｇＧグリコシル化が絶対不可欠であることは、脱グリコシル化ＩｇＧ抗体がＡＤＣＣ、食作用および炎症性メディエーターの放出のような、インビボで誘発される炎症反応を媒介することができないことの説明となる。ＮｉｍｍｅｒｊａｈｎａｎｄＲａｖｅｔｃｈ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２４，１９（２００６）。さらに、フコースを含むまたは欠くＩｇＧ抗体に対して報告された各々のＦｃｙＲに対して親和性が変化し、その結果として細胞毒性に影響を与えることにより、個々のＩｇＧの糖型が炎症反応の調節に寄与しうるという知見が示唆された。Ｓｈｉｅｌｄｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２６７３３（２００２），ＮｉｍｍｅｒｊａｈｎａｎｄＲａｖｅｔｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１０，１５１０（２００５）。自己免疫状態とＩｇＧ抗体の特定のグリコシル化パターンとの関連が、ＩｇＧ抗体のガラクトシル化およびシアル化の減少が報告されている関節リウマチ、および自己免疫血管炎患者において見出されている。Ｐａｒｅｋｈｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１６，４５２（１９８５），Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１，６１２３（１９９４），Ｍａｔｓｕｍｏｔｏｅｔａｌ．，１２８，６２１（２０００），Ｈｏｌｌａｎｄｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ＡｃｔａＤｅｃ２７；［印刷に先立つ電子出版］２００５。ＩｇＧ糖型の変化のインビボにおける重要性は究明されていないものの、ＩｇＧ糖型の変化もまた老化および免疫性に関連することが報告されている。Ｓｈｉｋａｔａｅｔａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１５，６８３（１９９８），Ｌａｓｔｒａ，ｅｔａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ２８，２５（１９９８）。

したがって、インビボにおけるＩＶＩＧ特性の種々の知見を説明しうるポリペプチドの作製方法の開発が必要とされている。

発明の要約
本発明は、そのような方法および分子を提供することによって前述の要求を満たすものである。一態様において、本発明は、少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を含み、未精製の抗体調製物とは性質の異なる単離ポリペプチドであって、該単離ポリペプチドのシアル化能(sialylation)が未精製の抗体調製物より高い、単離ポリペプチドを提供する。一実施形態では、該少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を有する単離ポリペプチドは、α２，６結合により各末端シアル酸部分に結合する少なくとも一つのガラクトース部分でグリコシル化され、該ポリペプチドが未精製抗体に比してより高い抗炎症活性を有する。一実施形態では、該少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を有する単離ポリペプチドは、α２，６結合により各末端シアル酸部分に結合する少なくとも一つのガラクトース部分でグリコシル化され、該ポリペプチドが未精製の抗体調製物に比してＦｃ活性化レセプターに対する結合能が低い。さらなる実施形態では、Ｆｃ活性化レセプターがＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣおよびＦｃγＲＩＩＩＡからなる群より選択される。

他の態様において、本発明は、抗炎症活性のより高い少なくとも一のＦｃ領域を有するポリペプチドおよび適当な担体または希釈剤を含む薬剤を提供する。

Ｆｃ領域の多糖鎖のシアル化能(sialylation)を変更することを有する、ポリペプチドの性質の調節方法。

一実施形態では、本方法は、末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖を有する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチド、および末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖が欠損する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドを含む、少なくとも一のＦｃ領域を含むポリペプチドの未精製源を用意し；さらに末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖が欠損する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドに対する末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖を有する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドの割合を増加させる、ことを有する。

図面の簡単な説明
図１Ａは、ＳＮＡ^＋ＦＣ結合のＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ分析結果を示すものである。図１Ｂは、ＳＮＡ^＋ＦＣ結合のＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ分析結果を示すものである。図１Ｃは、ＳＮＡ^＋ＦＣ結合のＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ分析結果を示すものである。図２は、シアル酸とがガラクトースとのα２，６結合を増加させることにより、ＩＶＩＧＦｃフラグメントの抗炎症性が向上することを示す実験を要約したものである。図３は、シアル酸とがガラクトースとのα２，６結合の除去により、ＩＶＩＧＦｃフラグメントの抗炎症性が低減することを示す実験を要約したものである。

発明の詳細な説明
本発明者らは、驚くべきことに、ＩｇＧＦｃドメインの細胞毒性および抗炎症反応が、Ｆｃに結合したコア多糖のシアル化が異なることに起因することを見出した。ＩｇＧ抗体の細胞毒性は、シアル化時に低減する；逆に、ＩＶＩＧの抗炎症活性は増強される。ＩｇＧシアル化は、抗原特異的免疫反応の誘導によって制御されることが示され、したがって、抗原投与によって、定常状態の固有の抗炎症分子から、適応的、炎症性種にＩｇＧを転換する新規な方法を提供する。Ｆｃ−シアル化ＩｇＧはマクロファージ上の固有のレセプターに結合し、次に阻害性Ｆｃγレセプター（ＦｃγＲ）をアップレギュレートし、これにより自己抗体が仲介する病変に対する保護が生じる。概して、ＲａｖｅｔｃｈａｎｄＮｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２４（１）：１１−１５（２００７）を参照。

したがって、本明細書では、所望の細胞毒性および抗炎症性ポテンシャルを有するＩｇＧの製造および選択の有利な戦略を提供する。

定義
本明細書および請求項を通じて、免疫グロブリン重鎖における残基のナンバリングは、本明細書に参照として明示的に引用される、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に記載されるようなＥＵｉｎｄｅｘのものである。「Ｋａｂａｔに記載されるようなＥＵｉｎｄｅｘ」とは、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。

「ネイティブ」または「親（ｐａｒｅｎｔ）」という用語は、Ｆｃアミノ酸配列を含む改変されていないポリペプチドを指す。親ポリペプチドは、ネイティブ配列Ｆｃ領域または（付加、欠失および／または置換のような）予め存在するアミノ酸配列の改変を持つＦｃ領域を含みうる。

「ポリペプチド」という用語は、少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を含むタンパク質のいずれかの断片を指し、以下に限定されるものではないが、例えば、抗体、例えばＩｇＧ抗体のような、十分に機能するタンパク質が挙げられる。

「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ−末端領域を規定するために用いられる。「Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域であっても、または変異Ｆｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、変化しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常Ｃｙｓ２２６位、またはＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで伸びると規定される。

ヒトＩｇＧＦｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃγ２」ドメインとしても言及される）は、通常、約２３１番目のアミノ酸から約３４０番目のアミノ酸まで拡がる。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接に対をなさない点で特有である。正確には、２つのＮ−結合分岐糖質鎖が、正常ネイティブＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に入っている。糖質は、ドメイン−ドメイン対の代わりとなり、ＣＨ２ドメインの安定化を助けると考えられている（Ｂｕｒｔｏｎ，ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，２２，１６１−２０６（１９８５）、これは参考で本明細書中に引用される）。

「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣ−末端からＣＨ２ドメインまでの残基の拡がりを含む（すなわち、ＩｇＧの約３４１番目のアミノ酸残基から約４４７番目のアミノ酸残基まで）。

「ヒンジ領域」という用語は、一般的には、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までの拡がりとして定義される（Ｂｕｒｔｏｎ（１９８５））。他のＩｇＧイソタイプのヒンジ領域を、最初および最後にシステイン残基を配置して、同じ位置に重鎖Ｓ−Ｓ結合間（ｉｎｔｅｒ−ｈｅａｖｙｃｈａｉｎＳ−−Ｓｂｏｎｄ）を形成することによって、ＩｇＧ１配列と並べてもよい。

「結合ドメイン」は、他の分子に結合するポリペプチドの領域を指す。ＦｃＲの場合、結合ドメインは、Ｆｃ領域との結合に関与するポリペプチド鎖（例えば、そのα鎖）の一部を含みうる。結合ドメインの一例としては、ＦｃＲ鎖の細胞外ドメインがある。

「機能的Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域の部分的「エファクター機能」を少なくとも有する。「エフェクター機能」の例としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター（Ｂｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ）；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが挙げられる。かようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変領域）に結合することを必要とし、例えば本明細書で開示されているような種々のアッセイを用いて分析することができる。

「ネイティブ配列Ｆｃ領域」は、天然で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列に一致したアミノ酸配列を含む。当業者によって認識されているように、「変異Ｆｃ領域」は、少なくとも一つの「アミノ酸修飾」によりネイティブ配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異Ｆｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比べて少なくとも一つのアミノ酸置換、例えば、ネイティブ配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域において約１から約１０アミノ酸置換、好ましくは約１から約５アミノ酸置換を有する。本明細書における変異Ｆｃ領域は、好ましくは、ネイティブ配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、より好ましくはこれらと少なくとも約９０％の相同性、より好ましくはこれらと少なくとも約９５％の相同性、より好ましくは少なくとも約９９％の相同性を有するであろう。

「変化した（ａｌｔｅｒｅｄ）グリコシル化」という用語は、上記で定義したような、特定の糖成分を増加させるか、減少させるために、重鎖定常領域への糖質付加が操作された、ネイティブでのあるいは修飾されたポリペプチドを指す。例えば、Ｌｅｃ２またはＬｅｃ３のような特定の細胞系中で準備された抗体のような、ポリペプチドは、フコースやシアル酸のような糖部分の付着ができない可能性がある。

「Ｆｃレセプター」または「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを表すために用いられる。本発明の一実施形態において、ＦｃＲはネイティブ配列ヒトＦｃＲである。他の実施形態において、ヒトＦｃＲを含むＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合し（γレセプター）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これにはこれらのレセプターの対立遺伝子多型および選択的スプライス型を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性レセプター」）を含むが、これらのレセプターは主としてこれらの細胞質ドメインにおいて異なる、同様のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターであるＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにおいて、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｍｏｔｉｆ（ＩＴＡＭ））を含む。阻害性レセプターであるＦｃγＲＩｌＢは、細胞質ドメインにおいて、免疫受容体チロシン系阻害性モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｍｏｔｉｆ（ＩＴＩＭ））を含む（Ｄａｒｏｎ，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，１５，２０３−２３４（１９９７）；ＦｃＲｓａｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄｉｎＲａｖｅｔｃｈａｎｄＫｉｎｅｔ，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，９，４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４，２５−３４（１９９４）；ａｎｄｄｅＨａａｓｅｔａｌ．，ＪＬａｂＣｌｉｎＭｅｄ，１２６，３３０−４１（１９９５），ＮｉｍｍｅｒｊａｈｎａｎｄＲａｖｅｔｃｈ２００６，ＲａｖｅｔｃｈＦｃＲｅｃｅｐｔｏｒｓｉｎＦｕｎｄｅｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄＷｉｌｌｉａｍＰａｕｌ５^ｔｈＥｄ．のレビューを参照、各々は本明細書に参照として引用される）。

「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」および「ＡＤＣＣ」は、ＦｃＲを発現する細胞障害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞やマクロファージのような単球細胞）が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、インビトロまたはインビボ細胞媒介反応を指す。原則として、活性化ＦｃγＲを有するいかなるエフェクター細胞もＡＤＣＣを媒介する誘因となりうる。そのような細胞の一つである、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球は活性化、局在化、または分化によって、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現することができる。造血細胞上のＦｃＲ発現は、本明細書に参照として引用される、ＲａｖｅｔｃｈａｎｄＢｏｌｌａｎｄ，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，（２００１）に要約される。

「ヒトエフェクター細胞」は、一以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を行う白血球である。好ましくは、細胞は、例えばＦｃγＲｌＩＩのような活性化Ｆｃレセプターの少なくとも一つの型を発現し、ＡＤＣＣエファクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣ））、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、および好中球が挙げられ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、本明細書で開示されているように、例えば血液またはＰＢＭＣなどのこれらの天然源から単離されうる。

「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、特にモノクローナル抗体（完全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクロール抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、および所望の生物学的活性を示す限り抗体断片にまでわたる。

抗体の「シアル酸含有量」という語は、この語が文脈上他の意味を意図していることを明確に示唆していない場合には、抗体の重鎖のＦｃ領域上のシアル酸残基の総数および未精製抗体調製物中の非シアル化（ａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）抗体に対するシアル化抗体の比率の双方を指す。

本発明の目的のために定義される際、「抗体断片」は、通常、完全な（ｉｎｔａｃｔ）抗体の抗原結合または可変領域あるいはＦｃＲ結合能力を保持している抗体のＦｃ領域を含む、完全な抗体の部分を含む。抗体断片の例としては、線状（ｌｉｎｅａｒ）抗体；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多特異的抗体が挙げられる。抗体断片は、好ましくはＩｇＧ重鎖のヒンジの少なくとも一部および必要であればＣＨｌ領域を保持する。より好ましくは、抗体断片は、ＩｇＧ重鎖の全定常領域を保持し、ＩｇＧ軽鎖を含む。

本明細書で用いられる場合、「モノクローナル抗体」とは、実質的に同質の抗体集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）から得られる抗体を意味し、すなわち、当該集団を含む個々の抗体が、少量で存在しうる、自然に起こりうる変異を除いて一致している。モノクローナル抗体は、非常に特異的で、単一の抗原部位に対して指向している。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して指向している異なる抗体を通常含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物に対して、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向している。修飾語の「モノクローナル」は、抗体の実質的に同質な集団から得られるような抗体の特徴を示し、特定の方法によって抗体を製造する必要があると解されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、本明細書に参照として引用される、ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）によって最初に開示されたハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４、８１６、５６７号参照、これは、本明細書に参照として引用される）によって作製されてもよい。モノクローナル抗体は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓｅｔａｌ．，ＪＭｏＩＢｉｏｌ，２２２，５８１−５９７（１９９１）に開示されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい、なお、上記は本明細書に参照として引用される。

本発明の他の実施形態において、少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を含むポリペプチドは、以下に限定されるものではないが、全タンパク質などの、他のタンパク質断片に融合されてもよい。当業者は、多くのタンパク質が、以下に限定されるものではないが、他の免疫グロブリン、特に、それぞれのＦｃ領域を欠く免疫グロブリンなどの、本発明のポリペプチドに融合されうることを、確かに理解するであろう。あるいは、例えば、本明細書に参照として引用される、米国特許第６、６６０、８４３号に記載されているように、他の生物学的に活性なタンパク質またはその断片を、本発明のポリペプチドに融合してもよい。この実施形態は、そのような生物学的に活性なタンパク質またはその断片をＦｃレセプターを発現する細胞へデリバリーするのにとりわけ有利である。さらに、例えば、ＧＳＴタグもしくは緑色蛍光タンパク質、またはＧＦＰなどの異なるマーカーを用いてもよい。

本明細書中に詳細に記載されるモノクローナル抗体は、所望の生物学的活性を発揮する限り、抗体断片のみならず、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種由来のまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属している抗体中の対応する配列には一致するまたは相同するが、鎖の残りの部分は他の種由来のまたは他の抗体クラスもしくはサブクラスに属している抗体中の対応する配列に一致するまたは相同する「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を包含する（米国特許第４、８１６、５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，８１，６８５１−６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１２，６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４，４５２−４５４（１９８５）;；国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２を参照、各々が本明細書に参照として引用される）。

非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。大部分では、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたはヒト以外の霊長類等の非ヒト種の超可変領域（ドナー抗体）由来の残基で置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にまたはドナー抗体には存在しない残基を含んでいてもよい。これらの改変は、抗体性能をさらに向上させるためになされる。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも一つの、通常は２つの可変ドメインを実質的に全てを含むが、可変ドメイン中、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲ残基の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ残基である。ヒト化抗体はまた、必要であれば、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常はヒト免疫グロブリンの一部を含むであろう。さらに詳細には、Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，ＣｕｒｒＯｐＳｔｒｕｃｔＢｉｏｌ，２，５９３−５９６（１９９２）；米国特許第５，２２５，５３９号を参照、各々が本明細書に参照として引用される。

少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を含むポリペプチドとしては、特定のアミノ酸置換、付加または欠失が、重鎖定常領域をコードする遺伝子を改変するために組み換えＤＮＡ技術を用いることによって親の配列に導入されるポリペプチドがある。これらの改変の導入は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌ，（２００１））などのマニュアルに記載されてのと同様にして、分子生物学のよく確立された技術に従う。加えて、少なくとも一つのＦｃ領域を有するポリペプチドは、自身のグリコシル化特異性で分かる細胞系での発現（ＳｔａｎｌｅｙＰ．，ｅｔａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，６，６９５−９（１９９６）；ＷｅｉｋｅｒｔＳ．，ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，１１１６−１１２１（１９９９）；ＡｎｄｒｅｓｅｎＤＣａｎｄＫｒｕｍｍｅｎＬ．，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３，１１７−１２３（２００２））によってまたは特異的なレクチンの増加（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）または枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）によってまたは酵素処理（Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉｅｔａｌ．，ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＢＡｎａｌｙｔＴｅｃｈｎｏｌＢｉｏｍｅｄＬｉｆｅＳｃｉ，７７１，６７−８７（２００２）；ＲｏｂｅｒｔｓｏｎａｎｄＫｅｎｎｅｄｙ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，６，１−１５（１９９６））によってのいずれかによって得られる、特定の糖質改変を含むよう選択された上記ポリペプチドを含むであろう。抗体グリコシル化の質および程度は、用いられる細胞のタイプや培養条件によって異なることが本分野において知られている。（例えば、Ｐａｔｅｌｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＪ，２８５，８３９−８４５（１９９２））は、抗体が結合した糖側鎖中のシアル酸含有量が、抗体が腹水としてまたは血清を含まないもしくは血清を含む培地中で生産される際には、有意に異なることを報告している。さらに、Ｋｕｎｋｅｌｅｔａｌ．，ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＰｒｏｇ，１６，４６２−４７０（２０００）は、細胞成長に異なるバイオリアクターを使用することおよび培地中の溶存酸素の量が抗体が結合した糖部分中のガラクトースおよびシアル酸の量に影響を与えることを示した。しかしながら、これらの研究は、様々なシアル酸残基の量がどのようにインビボで抗体活性に影響を与えるかについては取り上げていなかった。

ホスト発現系
本発明のポリペプチドは、Ｎ−結合型グリコシル化が可能なホスト発現系、すなわち、ホスト細胞中で発現させることができる。通常、このようなホスト発現系としては、細菌の、真菌の、植物の、脊椎動物または無脊椎動物の発現系が挙げられる。一実施形態において、ホスト細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣＣＣＬ−６１）、ＧｒｅｅｎＭｏｎｋｅｙ細胞系（ＣＯＳ）（例えばＣＯＳ１（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ７（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５１））等の哺乳類細胞；マウス細胞（例えばＮＳ／０）、ＢａｂｙＨａｍｓｔｅｒＫｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）細胞系（例えば、ＡＴＣＣＣＲＬ−１６３２またはＡＴＣＣＣＣＬ−１０）、またはヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５７３））、または例えば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．等の公的な寄託機関から入手可能な他の適当な細胞系である。さらに、鱗翅目細胞系（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｏｒａｃｅｌｌｌｉｎｅ）、例えばＳｆ９、等の昆虫細胞系、植物細胞系、真菌細胞系、例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｓｐｐ等の酵母、またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ等のＢａｃｉｌｌｕｓ、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｉａｅｃｏｌｉを用いた細菌の発現系が使用できる。場合によっては、ヒトＩｇＧのＦｃ領域上で通常見られるように複雑な、二分岐の糖となるためには、ホスト細胞への修飾がＮ−結合型グリコシル化およびグリカン成熟が確実に起こるために必要とされる場合もあることが理解されるであろう。

治療製剤
少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を有するポリペプチドを含む治療製剤は、所望の精製度を有する本発明のポリペプチドを、必要であれば生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、保管用に製造されうる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）参照）。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、用いられる投与量および濃度で患者に無毒であり、これらとしては、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸およびメチオニン等の抗酸化剤；（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェニル、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール等の）防腐剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリン等の単糖、二糖、および他の糖質；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等の糖；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のノニオン界面活性剤が挙げられる。

本明細書における製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な一以上の活性化合物、好適には互いに悪影響を与えない相補的活性を有する化合物を含んでいてもよい。このような分子は、所望の目的に効果的な量で、適切に組み合わせて存在する。

活性成分はまた、それぞれ、コロイドドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）中にまたはマクロエマルション中に、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、取り込まれていてもよい。かような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

好ましい実施形態において、インビボ投与用に用いられる製剤は滅菌されている。本発明の製剤は、例えば、殺菌した濾過膜を通した濾過によって、容易に滅菌することができる。

徐放性製剤もまた準備されうる。徐放性製剤の適切な例としては、修飾抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、該マトリクスは、例えばフィルム、またはマイクロカプセルなどの、成形物の形態である。徐放性マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号参照）、Ｌ−グルタミン酸およびｙエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）等の分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸等のポリマーは、１００日以上分子の放出が可能であるが、ヒドロゲルの中にはより短い期間タンパク質を放出するものもある。カプセル化された抗体は長時間体内に残存すると、３７℃で湿度に晒される結果、変性するまたは凝集し、その結果、生物学的活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。安定化に対する合理的戦略が、関連するメカニズムによって考え出されうる。例えば、凝集メカニズムがチオール−ジスルフィド交換により分子間でＳ−Ｓ結合が形成されることが見出される際には、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、湿度量を制御し、添加剤を用い、そして特定のポリマーマトリクスを開発することによって達成されうる。

少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を含むシアル化されたポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、未修飾および／または未精製の抗体と比較してシアル酸の量が増加するように、さらに精製または修飾してもよい。この目的に到達するために多数の方法が存在する。一つの方法では、例えば、ＩＶＩＧ等の、未精製のポリペプチド源を、シアル酸に結合することが知られているレクチンを有するカラムに通過させる。当業者は、レクチンが異なれば、ガラクトースとシアル酸との間でのα２，６結合およびα２，３結合に対する親和性が異なることを理解するであろう。ゆえに、特定のレクチンを選択することによりシアル酸とガラクトースとの間の所望の結合型を有する抗体を増加することができるであろう。一実施形態においては、レクチンをセウヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｃｕｓｎｉｇｒａ）から分離する。当業者であれば、セウヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｃｕｓｎｉｇｒａ）のアグルチニン（ＳＮＡ）が（２−６）結合によりガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンに結合するシアル酸に特異的であることを理解するであろう。Ｓｈｉｂｕｙａｅｔａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１５９６−１６０１（１９８７）。これに対して、イヌエンジュ（Ｍａａｋｉａａｍｕｒｅｎｓｉｓ）（「ＭＡＡ」）レクチンは、（２−３）結合によりガラクトースに結合するシアル酸に結合する。Ｗａｎｇｅｔａｌ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．，２６３：４５７６−４５８５（１９８８）。

したがって、ガラクトースとシアル酸との間の所望の結合を有する少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を含むポリペプチドのシアル化フラクションはカラム中に保持されるが、一方、このような結合をもたないフラクションは通過するであろう。少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を含むポリペプチドのシアル化フラクションは、異なるストリンジェンシーな条件で別の洗浄液によって溶出されうる。このようにして、シアル酸含有量が通常の含有量と比較して増加する本発明のポリペプチドの調製物を得ることができる。さらに、シアリルトランスフェラーゼおよび、例えば、米国特許出願公開第２００６／００３０５２１号に記載されるようなシアル酸の供与体を用いた酵素反応を使用してもよい。

限定されるものではないが、請求の範囲に記載される方法に使用できるシアリルトランスフェラーゼの適切な例としては、α−（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＥＣ２．４．９９．６）、およびα−（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．１）とも称される、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩがある。

α−（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、Ｇａｌ−β−１，３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌ−β−１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアル酸の転移を触媒し（例えば、Ｗｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１（１９９２）；ＶａｎｄｅｎＥｉｊｎｄｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９（１９９１）を参照）、糖ペプチド中のアスパラギン結合オリゴ糖のシアル化に応答する。シアル酸は、２つの単糖間のα−連結（α−ｌｉｎｋａｇｅ）を形成してＧａｌに連結する。単糖間の結合（連結）は、ＮｅｕＡｃの２位およびＧａｌの３位間でおこる。この特有の酵素は、ラットの肝臓から単離することができ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５（１９８２））；ヒトのｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉｅｔａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２−２２７８７；Ｋｉｔａｇａｗａ＆Ｐａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４−１４０１）およびゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａｅｔａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１−９３８）ＤＮＡ配列が知られており、これにより組み換え発現によってこの酵素を容易に製造できる。

α−（２，６）シアリルトランスフェラーゼの活性は、６−シアル化ガラクトースなどの、６−シアル化オリゴ糖でみられる。「α−（２、６）シアリルトランスフェラーゼ」の名は、アクセプター多糖の６番目の原子にシアル酸を結合するシアリルトランスフェラーゼのファミリーを指す。ａ−（２、６）シアリルトランスフェラーゼの異なる型は、異なる組織から単離されうる。例えば、この酵素の一つの特定の型である、ＳＴ６ＧａｌＩＩは、脳および胎生組織から単離することができる。Ｋｒｚｅｗｉｎｓｋｉ−Ｒｅｃｃｈｉｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，９５０（２００３）。

さらに、平均的な当業者であれば、シアル化率を変化させるために細胞培養条件を操作することができることを理解するであろう。例えば、シアル酸含有量を増加させるためには、生成率を減少させ、培養される特定のホスト細胞に適切なより低い範囲内で浸透圧を通常維持する。シアル酸含有量を増加させるためには、約２５０ｍＯｓｍから約４５０ｍＯｓｍの範囲内の浸透圧が適切である。このおよび他の適切な細胞培養条件は、例えば、米国特許第６，６５６，４６６号に開示されている。Ｐａｔｅｌｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＪ，２８５，８３９−８４５（１９９２）では、抗体を腹水からまたは血清を含まない若しくは血清含有培養培地中で生産する場合では、抗体が結合した糖側鎖中のシアル酸の含有量は顕著に異なることが報告されている。さらに、Ｋｕｎｋｅｌｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１６，４６２−４７０（２０００）では、細胞成長を目的とした異なるバイオリアクターの使用および培地中の溶解酸素量が抗体が結合した糖部分中のガラクトースおよびシアル酸の量に影響を与えることが示されている。

別の実施形態において、例えば、不死化ヒト胎生期網膜細胞等の、ホスト細胞を、例えば、ＣＭＶプロモーター等の、プロモーターに操作して結合される、例えば、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼまたはα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ等の、シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸を導入することによって改変してもよい。このα−２，３−シアリルトランスフェラーゼは、ＳＩＡＴ４ＣまたはＳＴＺ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｌ２３７６７）として知られ、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１８１３５９号に開示される、ヒトのα−２，３−シアリルトランスフェラーゼであってもよい。

シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸は、当業者に公知の方法によってホスト細胞中に導入されうる。外来の核酸配列を導入する適切な方法は、ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（３^ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＮＹ，２０００中にも開示されている。これらの方法としては、以下に限定されるものではないが、例えば、マイクロインジェクションまたはエレクトロポーション等の物理的導入技術；例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション等のトランスフェクション；例えば、リポソームを用いた膜融合転写（ｍｅｍｂｒａｎｅｆｕｓｉｏｎｔｒａｎｓｆｅｒ）；および例えば、ＤＮＡまたはレトロウィルスベクターを用いた導入等のウィルス導入が挙げられる。

少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を含むポリペプチドは、細胞上清から回収してもよく、また、このポリペプチドに、所望であれば、例えば、イオン交換またはアフィニティークロマトグラフィー等の一以上の精製段階を行なってもよい。適切な精製方法は、当業者にとって明白であろう。

当業者であれば、上述したシアル化方法の様々な組合わせによって、非常に高いシアル化レベルで少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を含むポリペプチドを製造することができることを理解するであろう。例えば、上述したように、シアリルトランスフェラーゼを過剰発現したホスト細胞中で、少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を含むポリペプチドを発現させた後、例えば、酵素反応中でこれらのポリペプチドをシアル化し、続いてレクチンを含むカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことによって、これらのポリペプチドのシアル化フラクションをさらに濃縮してもよい。同様にして、酵素反応およびその後のアフィニティークロマトグラフィーを、少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を含むＩＶＩＧ源に用いてもよい。

少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を含むポリペプチドのグリコシル化の程度を調べるために、これらのポリペプチドを精製し、還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分析することができる。グリコシル化は、特定のレクチンを用いて単離されたポリペプチドを反応させることによって決定することができる、または、当業者によって認識されているように、糖型を同定するためにＨＰＬＣ次いで質量分析を用いることができるＷｏｒｍａｌｄ，ＭＲｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ３６：１３７０（１９９７）。

本発明をより詳細に説明するために、非制限的な幾つかの実施例を下記に記載する。

実施例１．シアル酸含有量が増加したＩＶＩＧは、細胞毒性の減少を示す
ＩｇＧの特定の糖型が抗体のエフェクター機能を調節することに関与するかどうかを究明するために、特定のＩｇＧモノクローナル抗体の細胞毒性ｗｐ仲介する際の特定のＡｓｎ^２９７に結合した炭水化物の役割を調べた。前記（６）で記載されるのと同様にして２９３個の細胞中でＩｇＧ１、２ａまたは２ｂスイッチ変異体のいずれかとして発現している、６Ａ６ハイブリドーマ由来の、抗血小板抗体を、これらの具体的な炭水化物組成および構造を決定するために質量分析によって分析した。これらの抗体は、最小限のシアル酸残基を含む。セイヨウニワトコ（Ｓａｍｂｕｃｕｓｎｉｇｒａ）レクチンアフィニティークロマトグラフィーによるシアル酸含有種の濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）によって、シアル酸含有量が６０〜８０倍高い抗体を産生した。シアル化および非シアル化６Ａ６−ＩｇＧ１および２ｂ抗体の血小板クリアランスを媒介する能力を比較すると、シアル化とインビボ活性との間で逆相関を示した。６Ａ６ＩｇＧ抗体のシアル化により、生物学的活性が４０〜８０％低下した。

このような活性の減少のメカニズムを究明するため、マウスＦｃＹＲの各々に対するおよび同種の抗原に対するこれらの抗体について、表面プラズモン共鳴結合を行った。

表面プラズモン共鳴分析は、ＮｉｍｍｅｒｊａｈｎａｎｄＲａｖｅｔｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１０，１５１０（２００５）に記載されているのと同様にして行なった。簡潔に述べると、糖側鎖中のシアル酸残基レベルが高いまたは低い６Ａ６抗体変異体を、ＣＭ５センサーチップの表面上に固定化した。可溶性Ｆｃｙ−レセプターを、３０μＩ／分の流量でＨＢＳ−ＥＰランニングバッファー（１０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭＮａＣｌ、３．４ｍＭＥＤＴＡ、および０．００５％界面活性剤Ｐ２０）中で室温にてフローセルを通じて異なる濃度で注入した。可溶性Ｆｃ−レセプターを３分間注入し、７分間結合分子の解離を観察した。コントロールフローセルに対するバックグラウンド結合を自動的に引いた。物質移動の制限を排除するためにコントロール実験を行なった。結合および解離相に対する同時フィッティングならびに一連の全てのカーブに対するグローバルフィッティングを用いて、親和定数をセンサーグラムデータから誘導した。１：１ラングミュア結合モデルが観察されたセンサーグラムデータに緊密に適合したため、全ての実験においてこれを用いた。

各々の活性化ＦｃｙＲに対するこれらの抗体のシアル化型で、非シアル化のカウンターパートと比較して、結合親和性が５〜１０倍減少することが観察された一方で、抗原に対する結合親和性においては何ら相違が観察されなかった。ＩｇＧ２ｂは、活性化レセプターであるＦｃｙＲＩＩＩに対するＩｇＧ１の結性に比べて、活性化レセプターであるＦｃｙＲＩＶに対してより高い親和性で結合するため、シアル化の効果として、活性化レセプターであるＦｃｙＲＩＩＩに対する非シアル化ＩｇＧ１結合親和性に匹敵する活性化レセプターであるＦｃｙＲＩＶに対するＩｇＧ２ｂの結合親和性を生じることがある。活性化レセプター結合性のこのような定量的な相違のこの効果は、非シアル化ＩｇＧ１の活性に匹敵するｉｎｖｉｖｏ活性を示すシアル化ＩｇＧ２ｂで認められる。同様にして、ＩｇＧ１のシアル化により、７の係数（ｆａｃｔｏｒ）ほど、活性化レセプターであるＦｃｙＲＩＩＩに対するすでに低い結合親和性を低減し、これにより生理学的に不活性な抗体を生産する。ゆえに、ＩｇＧのＡｓｎ^２９７結合グリカン構造のシアル化は、サブクラス−限定的活性ＦｃｙＲに対する結合親和性の減少をもたらし、したがってインビボ細胞毒性の減少をもたらした。

ＩｇＧのＮ−結合型グリカンのシアル化がインビボでの免疫活性を調節することに関与しているという考察の一般性を明らかにするために、我々は、次に、ＩＶＩＧの抗炎症活性におけるＮ−結合型グリカンの役割を調べた。５〜１０、０００ドナーのプールされた血清から得られるこの精製ＩｇＧフラクションは、高投与量（１〜２ｇ／ｋｇ）で静脈内投与されると、広く炎症性疾患の処置を目的とした治療に用いられる。Ｄｗｙｅｒ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６，１０７（１９９２）。この抗炎症活性は、Ｆｃフラグメントの特性であり、ＩＴＰ、ＲＡおよび腎毒性腎炎のネズミモデルで保護特性を示す。Ｉｍｂａｃｈｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ１，１２２８（１９８１），Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９１，４８４（２００１），Ｂｒｕｈｎｓｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１８，５７３（２００３），Ｋａｎｅｋｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．ｉｎｐｒｅｓｓ（２００６）。

この抗炎症活性の共通のメカニズムは、エフェクターマクロファージ上の阻害性ＦｃｙＲＩＩＢ分子の表面発現を誘導し、それによる細胞毒性ＩｇＧ抗体または免疫複合体に必要とされる閾値を高めて、活性化ＦｃｙＲトリガーによるエフェクター細胞反応を誘導することに係わりがあると、報告された。ＮｉｍｍｅｒｊａｈｎａｎｄＲａｖｅｔｃｈ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２４，１９（２００６）。

実施例２．ＩＶＩＧの脱シアル化がマウス関節炎モデルでＩＶＩＧの抗炎症効果を減少させる
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６およびＮＯＤマウスは、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、メイン州）から購入した。ＦｃｙＲＩＩＢ^−／−マウスは、発明者の研究室で作製され、Ｃ５７ＢＬ／バックグラウンドに対して１２世代戻し交配された。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド（Ｋ／Ｂ）のＫＲＮＴＣＲトランスジェニックマウスは、Ｄ．ＭａｔｈｉｓおよびＣ．Ｂｅｎｏｉｓｔ（ハーバードメディカルスクール、ボストン、マサチューセッツ州）から贈与され、ＮＯＤマウスと交配させて、Ｋ／ＢｘＮマウスを作製した。８〜１０週齢のメスマウスを全ての実験に用い、ロックフェラーユニバーシティ動物施設で飼育した。全ての実験は連邦法および機関ガイドラインにしたがって行われ、ロックフェラーユニバーシティ（ニューヨーク、ニューヨーク州）によって認証された。

抗体および可溶性Ｆｃレセプター
６Ａ６抗体スイッチ変異体を、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションを行ない、次いでＮｉｍｍｅｒｊａｈｎａｎｄＲａｖｅｔｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１０，１５１０（２００５）に記載されるのと同様にしてプロテインＧにより精製することによって作製した。シアル酸リッチな抗体変異体を、Ｓａｍｂｕｃｕｓｎｉｇｒａａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＳＮＡ）アガロース（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）を用いたレクチンアフィニティークロマトグラフィーによってこれらの抗体調製物から分離した。シアル酸含有量が高いことは、レクチンブロットによって確認した（下記参照）。静脈注射用ヒト免疫グロブリン（ＩＶＩＧ、１０％マルトース中５％、クロマトグラフィー精製）は、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ（Ｈｅｍｄｏｎ、バージニア州）から購入した。ＫａｎｅｋｏＹ．ｅｔａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．ｉｎｐｒｅｓｓ（２００６）に記載されるのと同様にして、ヒトＩＶＩＧの消化を行なった。簡単に述べると、ＩＶＩＧを３７℃で１時間０．５ｍｇ／ｍｌパパインによって消化し、２．５ｍｇ／ｍｌヨードアセトアミドを添加することによって止めた。得られたＦａｂおよびＦｃフラグメントを、ＨｉＰｒｅｐ２６／６０Ｓ−２００ＨＲカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）で、未消化ＩＶＩＧから分離した後、プロテインＧカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびプロテインＬカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）を用いてＦｃおよびＦａｂフラグメントを精製した。フラグメントの純度は、抗−ヒトＩｇＧＦａｂまたはＦｃに特異的な抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ、ペンシルバニア州）を用いて免疫ブロット法によって確認した。純度は、９９％より高いと判断された。Ｆ４／８０抗体はＳｅｒｏｔｅｃ（オックスフォード、イギリス）社製である。Ｌｙ１７．２抗体は、Ｃａｌｔａｇ（バーリンゲーム、カリフォルニア州）社製である。ヒツジ抗糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗血清（腎毒性血清（ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｓｅｒｕｍ）、ＮＴＳ）は、Ｍ．Ｐ．Ｍａｄａｉｏ（ペンシルバニア大学、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）から贈与された。Ｃ−末端のヘキサ−ヒスチジンタグを含む可溶性Ｆｃレセプターを、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって作製し、製造元（Ｑｉａｇｅｎ社）によって示されるのと同様にして、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを用いて細胞培養上清から精製した。

ＩＶＩＧをノイラミニダーゼで処理し、得られた調製物の組成および構造を質量分析によって分析した。ノイラミニダーゼ処理後には、グリカンを含むシアル酸は何ら検出されなかった。次いで、これらのＩｇＧ調製物について、ＩｇＧ１免疫複合体が仲介する炎症性疾患モデルである、ＫｘＮ血清の受動伝達によって誘発される関節炎からマウスを保護する能力を試験した。ノイラミニダーゼによる脱シアル化は、ＫｘＮ血清誘発性関節炎モデルにおいてＩＶＩＧ調製物の保護効果を消滅させた。この活性の消失は、非シアル化ＩｇＧ調製物の血清半減期の減少の結果またはＩｇＧの単量体組成もしくは構造的完全性への変化の結果ではなかった。ＰＮＧａｓｅを用いた全てのグリカンの除去は同様の効果を有し、インビボでのＩＶＩＧの保護効果を消滅させた。

実施例３．シアル酸含有量が高いＩＶＩＧフラクションはマウス関節炎モデルにおいて炎症を抑制する
シアル酸含有量が増加したＩＶＩＧの調製
シアル酸はＩＶＩＧの抗炎症活性に必要であると思われるので、この抗炎症活性には高投与量（１ｇ／ｋｇ）が必要であるという根拠は、全ＩｇＧ調製物中のシアル化ＩｇＧの限定濃度でありうる。ＩＶＩＧをＳＮＡ−レクチンアフィニティカラムで分画して、シアル酸修飾グリカン構造が濃縮されたＩｇＧ分子を得た。

これらのシアル酸濃縮フラクションについて、未分画のＩＶＩＧと比較した、ＫｘＮ血清転移関節炎モデルにおける保護的効果を試験した。未分画のＩＶＩＧが１ｇ／ｋｇであったのに対して、ＳＮＡ濃縮ＩＶＩＧでは０．１ｇ／ｋｇで同等の保護が得られ、１０倍の保護増強がＳＮＡ−結合フラクションで観察された。ＳＮＡ濃縮フラクションの血清半減期およびＩｇＧサブクラス分布は、未分画のＩＶＩＧのものと同等であった。シアル化の効果は、ＩｇＧに特異的であった；同じような２つのアンテナ（ｂｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ）、複合炭水化物構造を有するフェチュインまたはトランスフェリン等のシアル化Ｎ−結合型グリコプロテインは、等モル濃度のＩｇＧで統計学的に有意な抗炎症活性を示さなかった。最後に、シアル化ＩＶＩＧ調製物の保護機構は、ＦｃｙＲＩＩＢ発現に依存し、エフェクターマクロファージでのこの阻害性レセプターの発現の増大をもたらすという点で、未分画のＩＶＩＧと同様である。

実施例４．シアル酸含有量が増加したＩＶＩＧの抗炎症反応の向上はＦＣドメインのＮ−結合型グリカンのシアル化によって仲介される
ポリクローナルＩｇＧもまたシアル化されうる軽鎖または重鎖可変領域のＯおよびＮ結合型グリカンをＩＶＩＧ中の含むので、我々は、ＳＮＡ−リッチなＩｇＧ調製物の抗炎症活性の増加がＦｃ上のＮ−結合型グリコシル化部位のシアル化が増加した結果であることを、確認した。Ｆｃ−フラグメントは、未分画化のおよびＳＮＡ分画されたＩＶＩＧから作製し、それらのインビボ活性を試験した。インタクトＩｇＧで観察されたように、未分画化のＩＶＩＧから作製したＦｃ−フラグメントと比較した場合に、ＳＮＡ−精製Ｆｃフラグメントはインビボにおける保護効果を向上した。これに対して、Ｆａｂフラグメントはこのインビボアッセイにおいて何ら抗炎症活性を示さなかった。したがって、ＩＶＩＧの抗炎症活性には高投与量が必要であることは、全調製物中に存在するシアル化ＩｇＧの寄与がより小さいことに起因している可能性がある。シアル酸結合レクチンクロマトグラフによってこれらのフラクションを濃縮することは、その結果として抗炎症活性を増加した。

ＩｇＧ抗体の受動免疫法を用いたこれらの結果から、炎症性種から抗炎症種へと切り替えるＩｇＧの能力がＦｃドメインのＮ−結合型グリカンのシアル化の程度の影響を受けることが示された。

実施例５．ＩｇＧのシアル化によって媒介される、抗炎症活性の増加は、活性免疫反応中に起こる
グッドパスチャー症候群のマウスモデル
このモデルでは、マウスを最初にアジュバントを併用したヒツジＩｇＧで感作し、４日後にヒツジ抗マウス糸球体基底膜調製物を注射した（腎毒性血清、ＮＴＳ）。簡単に述べると、ＣＦＡ中ヒツジＩｇＧ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）２００μｇをマウスに腹腔内に予め免疫した後、４日後に体重グラムあたりＮＴＳ血清２．５μｌを静脈注射した。血液を、抗ＧＢＭ抗血清を注射してから４日後に未処理コントロールマウスから集め、血清ＩｇＧをプロテインＧ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、プリンストン、ニュージャージー州）およびＮＨＳ−活性化セファロースカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、プリンストン、ニュージャージー州）にヒツジＩｇＧを共有結合することによって作製される、セファロース結合ヒツジＩｇＧカラム、アフィニティークロマトグラフィーで精製した。

予備感作、続いてのＮＴＳ処理により、マウスＩｇＧ２ｂ抗−ヒツジＩｇＧ抗体を誘発する（ＮＴＮ免疫付与）。ＫａｎｅｋｏＹ．ｅｔａｌ．，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０３：７８９（２００６）。マウスＩｇＧ２ｂ抗体は、ＮＴＳ抗体とともに糸球体中に蓄積され、浸潤性マクロファージのＦｃｙＲＩＶのＩｇＧ２ｂ媒介活性化による急性劇症炎症反応をもたらす。予備感作がない場合、炎症は観察されないことから、マウスＩｇＧ２ｂ抗−ヒツジＩｇＧ抗体は炎症性反応のメディエーターであることが示される。

炎症促進性ＩｇＧ（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＩｇＧ）をもたらす能動的な免疫処置（ａｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）がシアル化の変化と関連するかどうかを明らかにするために、免疫処置前のおよびＮＴＳで免疫処置されたマウスの血清ＩｇＧおよびＩｇＭについて、ＳＮＡレクチン結合によってシアル酸含有量を特性化した。全ＩｇＧシアル化は、免疫処置されていないコントロールと比較して、免疫処置されたマウスで平均で４０％減少した。この効果はＩｇＧに特異的であった；ＩｇＭのシアル化は免疫処置前および免疫処置後で同等であった。マウス血清のヒツジ特異的ＩｇＧフラクションを分析すると、このシアル化の相違はより顕著であり、免疫処置前のＩｇＧと比較してシアル化が５０〜６０％減少したことが示された。

これらの結果は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析によって確認された。単糖組成分析は、ＵＣＳＤＧｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏｒｅＲｅｓｏｕｒｃｅ（サンディエゴ、カリフォルニア州）によって行なった。糖タンパク質サンプルを、ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールで変性し、ＰＮＧａｓｅＦで消化した。放出された混合Ｎ−グリカンは逆相ＨＰＬＣおよび固相抽出によって精製した後、Ｎ−グリカンの露出した水酸基をメチル化した。得られた誘導体化単糖類を逆相ＨＰＬＣで再度精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにかけた。

免疫処置前および免疫処置後のＩｇＧの分析によって、Ｎ−グリカン構造の変化が末端シアル酸部分に特異的であることが確認された。ＦｃｙＲＩＶ産生のエンゲージメント（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）に応答することを前記で示した、糸球体、浸潤性マクロファージ中に蓄積されるマウスＩｇＧ２ｂ抗−ヒツジ抗体は、免疫処置前のコントロールと比較してシアル酸含有量が減少した。

実施例６．ＩＶＩＧにおけるシアル酸とガラクトースとの結合の分析
ＳＮＡ^＋（ＳａｍｂｕｃｃｕｓＮｉｇｒａＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）ＩＶＩＧＦｃのＳｅｑｕｅｎｔｉａｌＭａｌｄｉ−Ｔｏｆ分析を行ない、上記したＩＴＰ、ＲＡおよび腎毒性腎炎モデルで保護特性を示したシアル化ＩｇＧＦｃフラクションの構造を決定した。Ｍａｌｄｉ−Ｔｏｆで生じたグリカンピークを単離し、さらに分画して、ガラクトース−シアル酸構造が得られるまで再分析した。インビボで抗炎症活性を有する高濃度のガラクトース−シアル酸構造物のフットプリントヒストグラム（図１Ａ）を、シアル酸結合の標準物である、ａ２−３シアリルラクトース（図１Ｂ）およびａ２−６シアリルラクトース（図１Ｃ）のヒストグラムと比較した。標準物質の付号のついたピーク（ｓｉｇｎａｔｕｒｅｐｅａｋ）は矢印で識別され、それぞれ、ａ２−３（図１Ｂ）またはａ２−６（図１Ｃ）では矢印で示され、サンプルから得られたピークと比較する。

実施例７．ＩＶＩＧＦｃフラグメントのインビトロでのグリコシル化によるα２，６結合の濃縮により、ＩＶＩＧの抗炎症特性が向上する
図２Ａで示されるように、ＩＶＩＧＦｃフラグメントのグリカンＭａｌｄｉ−ＴｏｆＭＳ分析から、末端にガラクトースが存在しない（ピークＧ０）、１個のガラクトースが存在する（ピークＧ１）、２個のガラクトースが存在する（ピークＧ２）、またはシアル酸が存在する（「末端シアル酸」と記載される括弧で示される）構造物が示される。２，３または２，６シアル化ＩｇＧＦｃのインビボ活性を測定するために、サンプルをシアリダーゼで処理した後、ガラクトーストランスフェラーゼで処理して、Ｇ０（ガラクトースなし）およびＧ１（１個のガラクトース）をＧ２（完全にガラクトシル化）に変換して、シアル化の可能性のある部位を増やした。図２Ｂに示されるように、ＥＣＬによって測定される末端ガラクトースの相対的なバンド強度比をクマシーをのせたコントロールと比較することによって、過剰ガラクトシル化（ｈｙｐｅｒｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ）が確認された。インビトロのシアル化を、２−６シアリルトランスフェラーゼ（「ＳＴ６Ｇａｌ」）または２−３シアリルトランスフェラーゼ（「ＳＴ３Ｇａｌ」）のいずれかを用いて行ない、ＳＮＡでは２−６結合（上段）またはＥＣＬ（中段）およびクマシー（下段）では２−３結合をレクチンブロットによって確認した。インビトロでのシアル化Ｆｃが炎症を阻害する能力を評価する（図２Ｄ）ために、マウスに、０．６６ｍｇの２−６シアル化Ｆｃ（黒三角）または０．６６ｍｇの２−３シアル化Ｆｃ（赤三角）のいずれかを投与した。１時間後、０．２ｍｌのＫ／ＢｘＮ血清を投与し、足底の腫れ（臨床スコア）を次の７日間モニターした。抗炎症活性は、２，６シアル化ＩｇＧＦｃフラグメントでは観察されたが、２，３シアル化分子では観察されなかった。これらの結果は上記データと一致し、これから２，６シアル酸−ガラクトースの優先的結合がシアル化ＩｇＧの抗炎症活性に関与していることが示される。

実施例８．２，３シアル酸結合ではなく２−６シアル酸結合を除去すると、ＩＶＩＧの免疫抑制特性が無効にされる
ＩＶＩＧを結合に特異的なシアリダーゼ（ＳＡ）で処理し、消化物をレクチンブロットで確認した（図３Ａ）。上段は、ＩＶＩＧの２−６結合（左レーン）、および２−３ＳＡｔｘＩＶＩＧ（中央レーン）では染色が確認され、陽性Ｓａｍｂｕｃｕｓｎｉｇｒａレクチン（ＳＮＡ）を示すが、２−３，６ＳＡｔｘＩＶＩＧ（右レーン）では染色が確認されなかった。中段は、ａ２−３シアル酸結合に関するドットブロットであり（ＭＡＬＩ）、フェチュイン陽性コントロールでのみ陽性の染色が示される；１００μｇのタンパク質を１ドット当たりのせる。下段は、クマシーをのせたコントロールを示す。１０μｇ／レーンがブロットおよびゲルで示される。シアル酸部分の特異的な除去効果を調べるために、マウスに、１ｇ／ｋｇのＩＶＩＧ調製物を投与した後、２００μｌのＫ／ＢｘＮ血清を投与した。図３Ｂに示されるように、Ｋ／ＢｘＮ血清が投与されたマウス（白丸）では、１週間の間中、臨床スコアによって測定される際の、足底の腫れが観察された。ＩＶＩＧで処置されたマウスでは、ａ２−３ＳＡｔｘＩＶＩＧで処置されたマウス（白三角）と同様、わずかなむくみが観察された（黒三角）が、２−３，６ＳＡｔｘＩＶＩＧが投与されたマウス（赤四角）は足底の腫れが保護されなかった。

本明細書で引用される全ての特許および非特許文献は、これらの特許および非特許文献の各々が全体で参照によって本明細書に組み込まれる範囲で本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書の発明が例え特定の例や実施形態を参照して説明されているとしても、これらの実施例や実施形態は、本発明の原理および用途を単に詳細に説明するにすぎないと理解されるべきである。したがって、詳細な実施形態には多数の修飾が可能であり、下記特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から外れない限り、他の改変が考え出されうることが理解されるべきである。

Claims

少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域を含み、未精製の抗体調製物とは性質の異なる単離ポリペプチドであって、該単離ポリペプチドのシアル化能が該未精製の抗体調製物より高い、単離ポリペプチド。
該少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域がα２，６結合により各末端シアル酸部分に結合する少なくとも一つのガラクトース部分でグリコシル化され、該ポリペプチドが未精製の抗体調製物に比してより高い抗炎症活性を有する、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
該少なくとも一つのＩｇＧＦｃ領域がα２，６結合により各末端シアル酸部分に結合する少なくとも一つのガラクトース部分でグリコシル化され、該ポリペプチドが未精製の抗体調製物に比してＦｃ活性化レセプターに対する結合能が低い、請求項１または２に記載の単離ポリペプチド。
該Ｆｃ活性化レセプターがＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣおよびＦｃγＲＩＩＩＡからなる群より選択される、請求項３に記載の単離ポリペプチド。
ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４Ｆｃ領域を有し、未精製抗体に比してα２，６結合により各シアル酸末端部分に結合する少なくとも一つのガラクトース部分の含量が高い、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
ｉｎｖｉｔｒｏでの抗炎症性が向上した、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
ｉｎｖｉｖｏでの抗炎症性が向上した、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
天然に存在する抗体源由来である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
組換え抗体源由来である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
該未修飾抗体がＩＶＩＧを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
少なくとも一つのガラクトース部分とタンパク質の多糖鎖中の各末端シアル酸との間のα２，６結合を生じる活性が向上した細胞系由来である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
α−（２，６）シアリルトランスフェラーゼによる処理で修飾される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
精製される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド。
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドおよび適当な担体または希釈剤を含む薬剤。
Ｆｃ領域の多糖鎖のシアル化能（ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）を変更することを有する、Ｆｃ領域を含むポリペプチドの性質の調節方法。
該性質は、未精製の抗体調製物より抗炎症活性が高い、請求項１５に記載の方法。
シアル化を変更する段階が、
末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖を有する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチド、および末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖が欠損する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドを含む、少なくとも一のＦｃ領域を含むポリペプチドの未精製源を用意し；さらに
末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖が欠損する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドに対する末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖を有する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドの割合を増加させる、
ことを有する、請求項１５または１６に記載の方法。
該少なくとも一のＦｃ領域を含むポリペプチドの未精製源は、ヒトの未精製ＩｇＧ抗体を含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
該少なくとも一のＦｃ領域を含むポリペプチドの未精製源は、発現系に核酸配列を含むベクターを発現させることから提供され、ここで、該核酸配列はＩｇＧ抗体に翻訳される、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
該発現システムは、細菌、真菌、植物、脊椎動物及び無脊椎動物の発現系、ならびにこれらの組合せからなる群より選択されるＮ−結合グリコシル化（Ｎ−ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）が可能である修飾宿主発現系を有する、請求項１９に記載の方法。
末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖が欠損する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドに対する末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖を有する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドの割合を増加させる段階が、末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖が欠損する少なくとも一のＦｃ領域を含むポリペプチドを除去することによって達成される、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
該除去は、物理的または化学的方法によって達成される、請求項２１に記載の方法。
該除去は、ＨＰＬＣ、レクチンアフィニティクロマトグラフィー、高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー、及びこれらの組合せからなる群より選択される方法によって達成される、請求項２１に記載の方法。
該レクチンアフィニティクロマトグラフィーは、ガラクトース部分と末端シアル酸との間のα２，３結合に対するよりα２，６結合に対する方が親和性の低いレクチンを用いて実施される、請求項２３に記載の方法。
末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖が欠損する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドに対する末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖を有する少なくとも一のＦｃ領域を含む複数のポリペプチドの割合を増加させる段階が、末端シアル酸がα２，６結合を介してガラクトース部分に連結してなる多糖鎖を有する少なくとも一のＦｃ領域を含むポリペプチドの未精製源を増やすこと（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）によって達成される、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の方法。
該増やすこと（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）は、ＨＰＬＣ、レクチンアフィニティクロマトグラフィー、高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィー、及びこれらの組合せからなる群より選択される方法によって達成される、請求項２５に記載の方法。
該レクチンアフィニティクロマトグラフィーは、ガラクトース部分と末端シアル酸との間のα２，３結合に対するよりα２，６結合に対する方が親和性の高いレクチンを用いて実施される、請求項２６に記載の方法。
該増やすことは、少なくとも一のＦｃ領域を含むポリペプチドに結合する糖質と末端シアル酸との間のα２，６結合を作製する酵素との化学反応によって実施される、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
該酵素は、α−（２，６）シアリルトランスフェラーゼである、請求項２８に記載の方法。
治療上有効な量の、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチドを、患者に投与することを有する、炎症性疾患の治療方法。
該炎症性疾患は、関節炎、血小板減少症、および腎炎からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。