KR102549282B1 - 시알산화된 면역글로불린을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시알산화된 면역글로불린을 유효성분으로 포함하는 자가면역 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 DC-SIGN 매개 면역관용을 유도하고, 특히 출산 시 DC-SIGN 발현 호프바우어 세포 수와 IL-10의 발현이 현저하게 감소되는 임신중독증(preeclampsia) 산모에서의 면역 불균형을 크기 개선시켜, 임신중독증 산모에 투여 시 오히려 염증반응의 증가를 일으키던 종래 IVIG의 부작용을 완전히 극복할 수 있다.

Description

시알산화된 면역글로불린을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료용 조성물{A Composition for Treating Inflammatory Diseases Comprising Sialylated Immunoglobulins}

본 발명은 시알산화된 면역글로불린, 보다 구체적으로는 α-2,6-시알산화된 정맥주사 면역글로불린을 유효성분으로 포함하는 자가면역 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

면역글로불린(Ig) Fc 영역의 CH2 도메인의 297번째 아스파라진 잔기는 30가지 이상의 다양한 형태로 글리코실화되어 있으며, 이 중 α-2,6-SA-IVIG는 2,6 위치에 시알산이 결합되어 있는 Ig이다. Ig의 글리코실화 형태는 그 기능에 있어 매우 중요한데, 완전한 형태의 α-2,6-SA-IVIG는 전체 Ig 중 5% 미만으로 존재할 뿐 아니라, 현재까지 30종이 넘는 공유결합 글리칸이 면역글로불린 CH2 부위에서 발견되고 있기 때문에 α-2,6-SA-IVIG 함량은 더욱 적을 수 있다.

당사슬의 말단에 부가되는 시알산 캡핑(capping)은 당단백질의 체내 수명을 결정하는 주요 인자로서, 말단에 시알산을 가지지 않는 당단백질들은 체내에서 빠르게 제거된다. 면역글로불린의 경우 Asn297에 부착되는 당 사슬이 두 개의 중쇄가 이량체(dimer)를 이루는 안쪽에 위치하고 Fc에 부착된 당 사슬의 종류와 구조에 따라서 Fc의 3차구조가 변하게 되며, 이는 결과적으로 항체의 Fc부위와 Fc수용체들(FcγI, FcγⅡ, FcγⅢ, C1q 등) 간의 상호작용에 영향을 미친다.

Fc에 의해서 유도되는 ADCC(antibody dependent cell cytotoxicity)와 CDC(complement dependent cytotoxicity) 등이 항체의 치료 효능을 결정하므로, 부착된 당 사슬 형태가 항체의 성능을 결정하게 된다. Fc에 당 사슬이 부가되지 않은 항체는 이러한 기능이 심각하게 저해된다(Nature Rev Immunol 8: 34-47).

한편, SIGN-R1/human DC-SIGN은 IVIG의 항염증 작용에 필수적인 α-2,6-시알산화된 IgG Fc를 인식하는 수용체이다(Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Dec 16; 105 (50):19571-8). 아울러, IVIG가 주입되면 IVIG의 시알산화된 Fc가 human DC-SIGN을 발현하는 단핵세포에 결합하여 IL-33를 생성하고, IL-33은 FcεRI+ 내인성 백혈구를 활성화시켜 IL-4를 생성시킨 후, 대식세포의 FcRIIb를 증가시킴으로써 염증반응 유발을 위해 요구되는 역치값을 증가시켜 염증반응이 쉽게 일어나지 못하도록 함이 보고되었다(Nature. 2011 Jun 19; 475(7354):110-3).

IVIG는 인체에서 분리된 혈액에서 Ig 성분만을 추출하여 제작하므로, 건강한 혈액의 확보와 안정적인 보관이 필수적이며, 현재 1회 주사를 위한 비용이 매우 고가이다. 아울러, 각종 면역계 질환을 치료하는데 다양하게 적용되며 정맥주사로 투여할 경우 강력한 항염증효과를 유발하여 그 수요는 계속 높아지고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

비특허문헌 1. David R. Martinez et al., PLoS Pathog. 2018 Aug; 14(8): e1007161.

본 발명자들은 과도한 면역반응을 효율적으로 억제함으로써 다양한 자가면역 질환과 염증성 질환을 효과적으로 제어하는 우수한 치료 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 α-2,6-시알산화된 정맥주사 면역글로불린(α-2,6-SA-IVIG)을 투여할 경우 DC-SIGN 매개 면역관용을 유도하고, 특히 출산 시 DC-SIGN 발현 호프바우어 세포 수와 IL-10 발현이 현저하게 감소되는 임신중독증(preeclampsia) 산모에서의 면역 불균형이 현저히 개선됨을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 자가면역 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 시알산화된 면역글로불린을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 과도한 면역반응을 효율적으로 억제함으로써 다양한 자가면역 질환과 염증성 질환을 효과적으로 제어하는 우수한 치료 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 α-2,6-시알산화된 정맥주사 면역글로불린(α-2,6-SA-IVIG)을 투여할 경우 DC-SIGN 매개 면역관용을 유도하고, 특히 출산 시 DC-SIGN 발현 호프바우어 세포 수와 IL-10 발현이 현저하게 감소되는 임신중독증(preeclampsia) 산모에서의 면역 불균형이 현저히 개선될 수 있음을 발견하였다.

본 명세서에서 용어“자가면역질환(autoimmune disease)”은 정상적인 신체 기관에 대한 비정상적인 면역 반응을 원인으로 하는 병적 상태를 망라하는 의미이며 용어“염증성 질환(inflammatory disease)은 림프구, 형질 세포(plasma cell), 호산구 및 호중구를 포함하는 염증 세포가 병변 부위에 확산되면서 만성 염증 반응을 야기하는 질환을 의미한다. 자가면역 또는 과도한 면역 반응의 결과 염증성 손상이 발생하므로, 자가면역 질환과 염증성 질환은 서로 밀접하게 연관되어 있다.

본 발명의 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 자가면역질환 또는 염증성 질환은 예를 들어 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 전신성 홍반성 낭창, 다발성경화증, 특발성섬유성폐포염, 다발성근염, 피부근염, 국한피부경화증, 전신피부경화증, 대장염, 염증성 장질환, 조르젠신드롬(Sjorgen's syndrome), 레이노현상(Raynaud's phenomenon), 베쳇병(Bechet's disease), 가와사키병(Kawasaki's disease), 원발성담즙성경화증(primary biliary sclerosis), 원발성경화성담관염(primary sclerosing cholangitis), 궤양성대장염(ulcerative olitis), 크론병(Crohn's disease) 및 임신중독증(preeclampsia)을 포함하나, 이에 제한되지 않고 과도한 면역반응 및 염증을 원인으로 하는 모든 질환이 포함될 수 있다.

본 명세서에서 용어어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면 DC-SIGN 매개 면역관용을 유도하고 항염증성 사이토카인의 분비를 촉진하면서 면역 불균형을 크기 개선함으로써, 과도하거나 원치 않는 면역반응으로 인한 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 이들 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.

명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.

본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.

본 명세서에서 용어“대상체”는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 시알산화된 면역글로불린은 α-2,6-시알산화된 면역글로불린(α-2,6-sialylated Immunoglobulin)이다.

보다 구체적으로는, 상기 면역글로불린은 정맥주사용 면역글로불린(Intravenous Immunoglobulin; IVIG)이다.

본 명세서에서 용어“정맥주사용 면역글로불린”은 다양한 병원균에 대한 항체를 함유하는 혈장 단백인 면역글로불린을 정맥을 통한 전신 주사에 적합한 물성을 가지도록 제형화한 주사제를 의미한다.

종래에는 면역글로불린을 치료제로 사용하기 위해 냉에탄올 분획법 등을 통해 피하 및 근육 주사용으로 제조되었으나, 이러한 투여 루트는 투여량이 제한될 뿐 아니라 항체기능의 핵심인 면역글로불린 G(IgG) 함량이 적고, 주사 부위의 단백질 분해효소(protease)에 의한 면역글로불린의 항체가 분해되는 등의 여러 가지 난점을 가지고 있었다. 이러한 근육 주사의 문제점을 해결하기 위해 제조 및 보관 기간에 발생하는 응집체(Aggregate)를 제거하고, 혈액응고 인자(피브리노겐, 알부민, PKA 및 트랜스페린 등) 또는 IgA 및 IgE 등의 불순물을 제거하여 순도와 안정성을 높임으로써 정맥 주사에 적합한 IVIGrk 개발되기에 이르렀다. 이에, 본 발명의 정맥주사용 면역글로불린은 당업계에서 상용화된 IVIG는 물론 현재 개발이 진행 중이거나 또는 향후 개발될 새로운 제형의 IVIG가 모두 제한없이 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 자가면역질환 또는 염증성 질환은 DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) 양성 세포를 가지는 조직에서의 자가면역질환 또는 염증성 질환이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 자가면역질환 또는 염증성 질환은 저산소성 허혈 상태를 수반한다.

본 명세서에서 용어“저산소성 허혈(Hypoxic ischemia) 상태”는 조직으로의 혈액 공급이 제한되면서 물질대사에 필요한 산소와 글루코스가 부족해진 상태를 말한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 DC-SIGN 양성 세포는 DC-SIGN 발현 호프바우어 세포(DC-SIGN⁺ HBC)이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 자가면역질환 또는 염증성 질환은 임신중독증(preeclampsia)이다.

본 명세서에서 용어“임신중독증”은 임신과 합병된 고혈압성 질환을 포괄하는 의미로서 자간전증이라고도 불린다. 임신중독증은 인간에게만 발생하며 매우 다양한 원인이 관여하는 난치성 질환에 해당한다. 자궁에 수정란이 착상한 이후 태반 형성과정에서 정상적으로 발생하는 영양막 세포가 모체 내로 잘 침투되지 않아 태반으로의 혈류공급에 장애가 생기고, 이에 따라 태아의 혈관에 손상을 입혀 과도한 염증 반응, 혈관 수축, 내피 손상, 모세관 누출, 응고 항진, 혈소판 기능부전 등 다양한 증상들이 발생한다. 즉, 임신중독증은 염증에 의한 혈관내피세포의 기능 장애를 원인으로 하는 염증성 질환의 하나로 분류된다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 DC-SIGN 매개 면역관용을 유도하고, DC-SIGN 발현 호프바우어 세포 수와 IL-10의 발현이 현저하게 감소되는 산모의 저산소성 허혈 상태 및 염증성 손상을 크기 개선시킴으로써, 임신중독증에 대한 효율적인 치료 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i)α-2,6-시알산화된 정맥주사용 면역글로불린(α-2,6-sialylated Intravenous Immunoglobulin); 및 (ⅱ) IL-10 단백질 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 임신중독증(preeclampsia)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 "단백질"은 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 IL-10 단백질은 IL-10 단백질을 구성하는 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열로 구성된 단백질도 포함한다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 70%의 상동성, 구체적으로는 최소 80%의 상동성, 보다 구체적으로는 최소 90%의 상동성, 가장 구체적으로는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

본 명세서에서 용어“핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다. 본 발명으 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 genbank와 같은 공중의 데이터베이스에 등재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다. 뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있는데, 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈, 코돈의 축퇴성에 의해 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 가지는 핵산분자를 모두 포괄한다.

본 발명의 유효성분인 IL-10은 단백질 형태로 제공될 수도 있고, 이를 인코딩하는 유전자를 적절한 유전자 전달시스템에 탑재하여 환자 세포에서 발현시키기 위한 유전자 치료제 형태로 제공될 수도 있다.

본 명세서에서 용어“발현시키다”는 대상체가 외래(exogenous) 유전자를 발현하게 하거나 또는 내인성(endogenous) 유전자의 자연적 발현량을 증가시키기 위해 유전자 전달체를 이용하여 인위적으로 이를 도입함으로써 유전자가 대상체 세포 내에서 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 따라서, 용어“발현”은“형질전환(transformation)”, "형질감염(transfection)" 또는 "형질도입(transduction)"과 동일한 의미이다.

본 명세서에서, 용어“유전자 전달 시스템(gene delivery system)”는 유전자를 세포 내로 운반하는 모든 수단을 의미하며, 유전자 전달은 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달 시스템은 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여되며, 구체적으로는 정맥 투여된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 또는 유화액 형태를 비롯하여 주사제에 적합한 액상의 물성을 가질 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) DC-SIGN(Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) 양성 세포를 포함하는 생물학적 시료에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 시료 내 DC-SIGN 발현량, IL-10 수준, 인산화된 카베올린-1의 수준 또는 이들의 조합을 측정하는 단계,

상기 DC-SIGN 발현량, IL-10 수준 및 인산화된 카베올린-1의 수준 중 어느 하나 이상이 증가한 경우, 상기 시험물질은 자가면역질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 판정한다.

본 발명에서 이용되는 DC-SIGN 양성 세포와 자가면역질환 및 염증성 질환에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, DC-SIGN 양성 세포를 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로는, 상기 생물학적 시료는 태반 조직, 태반 세포 또는 이의 배양액을 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어“시험물질”은 DC-SIGN 양성 세포를 포함하는 시료에 첨가되어 DC-SIGN 발현량, IL-10 수준 및/또는 인산화된 카베올린-1의 수준에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시험물질을 처리한 생물학적 시료에서 상기 단백질의 발현량 또는 분비량을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 명세서에서 용어“발현량 또는 수준의 증가”는 저산소 분압 자극에 의해서 감소된 DC-SIGN 발현량, IL-10 수준 및 인산화된 카베올린-1 수준이 측정 가능한 수준으로 개선되는 것을 의미한다. 구체적으로는 대조군에 발현량 또는 수준(농도)이 20% 이상 증가한 상태, 보다 구체적으로는 40% 이상 증가한 상태, 더욱 구체적으로는 60% 이상 증가한 상태를 의미할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 저산소 상태에서 수행된다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 시알산화된 면역글로불린을 유효성분으로 포함하는 자가면역 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명은 DC-SIGN 매개 면역관용을 유도하고, 특히 출산 시 DC-SIGN 발현 호프바우어 세포 수와 IL-10의 발현이 현저하게 감소되는 임신중독증(preeclampsia) 산모에서의 면역 불균형을 크기 개선시켜, 임신중독증 산모에 투여 시 오히려 염증반응의 증가를 일으키던 종래 IVIG의 부작용을 완전히 극복할 수 있다.

도 1은 총 IVIG로부터 α-2,6-SA-IVIG를 분리하는 과정에 대한 모식도(도 1a)와 이를 이용한 면역블롯팅 결과(도 1b)를 보여주는 그림이다.
도 2는 태반 세포 중 DC-SIGN를 발현하는 HBC에서 CD14 및 CD163가 공동발현함을 확인한 결과를 보여주는 그림이다.
도 3은 태반 HBC의 세포 내 IL-10가 과발현됨을 확인한 면역형광염색 결과를 보여주는 그림이다.
도 4는 태반 HBC에서 특이적으로 고발현되는 사이토카인의 발현 양상을 보여주는 그림이다.
도 5는 DCEK-DC-SIGN 세포와 2,6-SA-IVIG 결합을 FACS, 형광현미경, ELISA 방법으로 재확인한 결과를 보여주는 그림이다.
도 6은 태반세포들 중 HBC 만이 유일하게 2,6-SA-IVIG와 결합함을 보여주는 그림이다.
도 7은 HBC와 2,6-SA-IVIG의 결합을 형광현미경으로 확인한 결과를 보여주는 그림이다.
도 8은 태반조직 상태에서도 HBC가 주요하게 2,6-SA-IVIG와 결합함을 확인한 결과를 보여주는 그림이다.
도 9는 α-2,6-SA-IVIG과는 반대로 IVIG에 의한 태반 HBC DC-SIGN가 감소함을 보여주는 웨스턴 블롯 분석결과를 나타낸다.
도 10은 α-2,6-SA-IVIG과는 반대로 IVIG에 의해 태반 HBC에서의 IL-10 분비가 감소함을 보여주는 그림이다.
도 11은 α-2,6-SA-IVIG는 DCEK_DC-SIGN 마우스 세포주에서 IL-10의 분비를 특이적으로 자극함을 보여주는 그림이다.
도 12는 α-2,6-SA-IVIG는 SIGN-R1 TKO DC-SIGN 발현 마우스에서 IL-10과 IL-6 분비를 촉진하고 염증성 사이토카인 IL-1β분비는 억제함을 보여주는 그림이다.
도 13은 HBC에 α-2,6-SA-IVIG를 처리할 경우 DC-SIGN의 세포표면으로 이동함을 보여주면서(도 13a), 세포 표면의 지질 뗏목(lipid raft) 구조단백질 중 하나인 카베올린(Caveolin)과 결합함을 확인(도 13b)하는 그림이다.
도 14는 HBC에 α-2,6-SA-IVIG를 처리할 경우 30분 경과 후부터 DC-SIGN 결합 단백질인 카베올린이 인산화됨을 보여주는 그림이다.
도 15는 HBC에 α-2,6-SA-IVIG를 처리할 경우 24시간 또는 48시간 경과 후에 DC-SIGN과 인산화된 카베올린의 동일한 위치에서 확인됨을 보여주는 그림이다.
도 16은 HBC 전체 세포 용해물에 대한 웨스턴블롯 분석 결과를 보여주는 그림이다.
도 17은 저산소 분압 환경에서 HBC의 IL-10 및 TNFα 생성능력이 감소됨을 보여주는 그림이다.
도 18은 정상 뿐만 아니라 저산소 분압 환경에서 자란 HBC에 α-2,6-SA-IVIG를 처리할 경우 DC-SIGN가 증가됨을 면역형광염색을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 19는 저산소 분압 환경에서 자란 HBC에 α-2,6-SA-IVIG를 처리할 경우 IL-10 분비가 증가함을 보여주는 그림이다.
도 20은 α-2,6-SA-IVIG는 DC-SIGN 유사 수용체 SIGN-R1 발현 마우스에서 IVIG 보다 25배 낮은 용량에서 동일한 CIA치료 효과를 보이나 SIGN-R1 결핍 생주에서는 효과가 없음(도 20a 및 20b)을, IL-10 결핍 마우스에서는 α-2,6-SA-IVIG의 CIA치료 효과가 사라짐(도 20c)을 각각 보여주는 그림이다.
도 21은 임신 마우스에서 2,6-SA-IVIG의 태반전달을 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 도 21a는 임신 마우스에 2,6-SA-IVIG를 1일 5μg씩 3일 동안 정맥주사하고 임신 17일째 태반을 분리하여 태반조직에 2,6-SA-IVIG가 전달되었는지를 확인한 웨스턴 블롯 분석 결과이다. 도 21b는 동일한 조건으로 실험을 수행하여 임신 마우스의 비장, 간, 태반의 조직별 2,6-SA-IVIG 전달 효율을 비교한 결과를 보여준다.
도 22는 임신 마우스에서 2,6-SA-IVIG에 의해 모체 혈청 중 항염증사이토카인인 IL-10가 활성화됨을 확인한 웨스턴 분석 결과이다.
도 23은 임신 마우스에서 2,6-SA-IVIG에 의한 모체에서의 태아 발달 촉진 효과를 규명한 결과이다. non-2,6-SA-IVIG와 2,6-SA-IVIG를 정맥주사한 결과, 2,6-SA-IVIG에 의해 태아 체중이 유의하게 증가하였음을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: IVIG로부터 α-2,6-SA-IVIG의 분리

임상에 사용되고 있는 상품화된 IVIG 제제는 다양한 형태의 면역글로불린들(IgG1, IgG2, IgG3 등)이 혼합되어 있으며 300가지가 넘게 다양한 당쇄화 형태를 가지고 있다. DC-SIGN과 결합하는 α-2,6-SA-IVIG가 IVIG의 항염증 효과를 유발하는 유효 물질임이 입증되었기 때문에, 본 발명자들은 혼합형 IVIG로부터 유효성분인 α-2,6-SA-IVIG만을 분리하는 방법을 확립하였고(도 1), 이를 통해 얻어진 정제된 α-2,6-SA-IVIG를 태반면역세포에 처리한 뒤 특이적 면역억제효과를 분석하였다.

실험재료의 각 구입처는 다음과 같다: 아가로스 결합 딱총나무(sambucus nigra) 렉틴(Vector, Cat.# :AL-1303), Econo-컬럼(Bio Rad, Cat.#: 7371007). 세척 완충액은 1X TBS 및 0.1mM CaCl₂를 포함하며, 여과 후 4 ℃에 보관하였다. 용출 완충액 ①(TBS에 용해된 0.5M 락토오스) 및 용출 완충액 ②(0.2M 아세트산에 용해된 0.5M 락토오스)는 56℃에서 녹인 후 -20℃ 또는 -80℃에서 냉각시켰다. 아가로스 결합 SNA 렉틴은 사용 전 TBS로 세척하고, 세척된 아가로스 결합 SNA 렉틴 2ml를 컬럼에 첨가하였다. IVIG는 TBS 및 0.1mM CaCl₂를 이용하여 20mg/2ml로 희석하였다. 이후 희석된 IVIG(20mg/2ml)를 아가로스 결합 SNA 렉틴에 적용하여 비드(bead)가 부유하도록 넣었다. 이후 상온에서 10분간 배양하고 통과한 물질(2ml, 2,6 SA(-)-IVIG)을 수집하였다. 수집된 물질을 4ml TBS와 0.1mM CaCl₂로 세척하여 비드가 부유하지 않도록 살살 넣은 다음 통과한 물질을 수집하여 4ml TBS와 0.1mM CaCl₂로 세척하여 비드가 부유하지 않도록 살살 넣었다. 이후 다시 통과한 물질을 수집하여 2차 세척을 하고 TBS에 용해된 0.5M 락토오스(용출 완충액 ①) 2ml를 첨가하고 상온에서 10분간 배양하였다. 이를 비드가 부유하도록 넣은 다음 통과한 물질을 수집하여 용출시켰다. 0.2M 아세트산에 용해된 0.5M 락토오스(용출 완충액 ②) 2ml를 첨가하고 상온에서 10분간 배양하였다. 다시 bead가 부유하도록 넣은 다음 통과한 물질을 수집하여 용출시켰다. 이후 4ml TBS 및 0.1mM CaCl₂로 수차례 반복적으로 세척하였다.

분획은 PBS에 대해 투석하여 원심분리 여과 장비(10kDa, amicon, Millipore)를 통해 농축하되, 분획 부피의 3배의 PBS를 넣고 1ml이 될 때까지 농축하였다((2000rcf, 4℃). 이후 약 1ml로 농축이 되면 PBS 10ml을 더 넣고 최종 볼륨 0.5ml이 될 때까지 농축하였다((2000rcf, 4℃)

실시예 2: 태반 내 DC-SIGN를 발현하는 면역세포인 호프바우어 세포의 동정

1) 태아 태반면역세포 분리

건국대학교 병원으로부터 산모 유래 태반면역 관련 연구와 태반이용에 관한 IRB를 획득하고(KUH 1040054), 건국대학교 병원 산부인과 분만실에서 산모들로부터 2-3개 코틸레돈(약 50g)의 태반조직을 채취하여 4℃ PBS 통에 담궈 실험실로 이동하였다. 실험실에서 태반조직의 모체탈락막과 섬유성 조직 등을 제거하는 전처리 과정을 거치고 작은 조직들로 절개하여 냉장상태로 흔들어 주면서 12시간 이상 보관하여 과량의 혈액을 제거하였다. 이 후 여러 단계에 걸쳐 다양한 조직 분해 효소들로 배양해 주고 각 단계별로 얻어지는 태반세포들[(중간엽줄기세포(MSC), 세포영양막세포(CT), 호프바우어 세포(HBC), 림프구(Lymphos)]을 FBS 10%와 1% 앰피실린/스트렙토마이신 항생제가 포함된 RPMI 또는 DMEM 배지에서 1일 배양해 준 후 24시간 후 새로운 배지로 갈아주었다.

2) DC-SIGN 발현 호프바우어 세포(DC-SIGN ⁺ HBC)의 확인

본 발명자들은 태반 면역세포들 중 DC-SIGN를 발현하는 면역세포의 존재 및 그 성격에 대한 조사를 수행하였다. 우선 CD14 발현 탐식세포가 있는지를 FACS 분석을 통해 확인하고, CD14 발현 탐식세포 중 염증억제에 중요한 역할을 하는 CD163 발현 세포가 있는지를 확인하였다. 그 결과, CD14 발현 HBC 중 60% 이상의 세포들이 CD163 양성임을 확인하였다. 이후 DC-SIGN 항체를 이용하여 CD163 양성세포들에서의 DC-SIGN 발현 정도를 확인한 결과 대부분의 CD163 발현세포들에서 DC-SIGN이 발현되고 있음을 확인하였다. 이를 통해 태반의 DC-SIGN⁺ HBC들이 면역억제 기능을 수행할 것으로 예측되었다.

3) DC-SIGN ⁺ HBC에서의 IL-10 발현 측정

태반의 DC-SIGN⁺ HBC들이 면역억제 기능을 수행하는지 여부를 조사하고자 대표적인 면역억제성 사이토카인인 IL-10의 발현 여부를 면역형광염색법으로 확인한 결과, DC-SIGN⁺ HBC에서 IL-10을 특이적으로 높게 발현되고 있음을 확인되었다(도 3).

DC-SIGN⁺ HBC 내 높은 IL-10의 발현이 세포 밖의 분비로까지 이어지는지 여부 및 다른 태반 면역세포들(CT와 MSC)과는 어떤 차이가 있는지를 확인하기 위해 위의 세가지 유형의 태반 면역세포들을 태반조직으로부터 분리한 후 세포배양 배지에서 3일 동안 배양하고 배양액 내 다양한 사이토카인들에 대한 ELISA 분석을 수행하였다. 그 결과 DC-SIGN⁺ HBC는 CT 및 MSC와는 달리 IL-10을 특이적으로 높게 분비하고 있었으며, 항염증성 사이토카인인 TGFβ의 경우는 모든 태반면역세포들에서 분비되지 않았다(도 4). DC-SIGN⁺ HBC는 IL-10 이외에도 염증성 사이토카인인 IL-1β 또한 특이적으로 높게 분비함이 확인되었는데(도 4) 이를 통해 DC-SIGN⁺ HBC가 태아 태반 내에서 중요한 면역조절 기능을 수행할 수 있음이 확인되었다.

실시예 3: DC-SIGN ⁺ HBC에서 DC-SIGN과 α-2,6-SA-IVIG의 결합의 확인

DC-SIGN⁺ HBC에 정제된 α-2,6-SA-IVIG가 DC-SIGN와 특이적으로 결합하는지를 확인하였다. 마우스 DCEK 섬유아세포 세포주의 야생형과 마우스 DC-SIGN, DC-SIGN 마우스 유사수용체 SIGN-R1, DC-SIGN이 과발현된 세포주(DCEK_WT,_mDC-SIGN, _SIGN-R1, _DC-SIGN)에 IVIG 10mg, α-2,6-SA-IVIG 10μg을 처리하고 37℃에서 10분간 배양 후 항-인간 IgG-Alexa488 항체를 이용하여 α-2,6-SA-IVIG를 면역형광염색을 하고 FACS 및 형광현미경으로 분석하였다. 그 결과, DCEK_SIGN-R1과 _DC-SIGN 세포들만이 IVIG 및 α-2,6-SA-IVIG와 결합함이 확인되었고 또한 1/100 희석된 농도의 α-2,6-SA-IVIG가 처리되었음에도 IVIG와 동일한 양의 형광신호가 관찰되어 α-2,6-SA-IVIG가 IVIG 보다 매우 높은 특이성으로 SIGN-R1과 DC-SIGN에 결합함이 FACS분석을 통해 재확인되었다. α-2,6-SA-IVIG의 결합 결과는 면역형광현미경 분석을 통해서도 동일하게 관찰되었다(도 5a). 이들 결과를 재확인하기 위해 DCEK_WT, _SIGN-R1, _DC-SIGN에 정제된 α-2,6-SA-IVIG를 0.1과 0.5μg을 처리하고 10분 후 각각의 세포에 결합한 α-2,6-SA-IVIG를 ELISA분석을 통하여 재확인하였다. 그 결과 DCEK_SIGN-R1과 _DC-SIGN 세포들만이 α-2,6-SA-IVIG에 농도 의존적으로 특이적 결합을 함이 확인되었고, 특히 DCEK_DC-SIGN 세포에서 DCEK_SIGN-R1 세포에서보다 더 높은 친화력이 있음을 확인하였다(도 5b).

α-2,6-SA-IVIG가 DC-SIGN⁺ HBC에 특이적으로 결합하는지 확인하고자, 분리된 태반 면역세포들에 α-2,6-SA-IVIG를 도 5a에서와 같이 동일하게 처리하고 α-2,6-SA-IVIG의 결합여부를 FACS로 분석하였다. 그 결과, CT와 MSC(도 6의 섬유아세포)에서는 α-2,6-SA-IVIG의 결합이 관찰되지 않았고, DC-SIGN⁺ HBC 만이 유일하게 α-2,6-SA-IVIG와 결합함을 확인하였다(도 6). 이를 재확인하기 위해 도 6에서 분석된 DC-SIGN+ HBC를 형광현미경으로 재분석한 결과, DC-SIGN⁺ HBC에 α-2,6-SA-IVIG가 명확하게 결합하고 있음이 확인되었고, 특히 α-2,6-SA-IVIG가 결합한 부위에 DC-SIGN이 특이적으로 밀집되어 있고, DC-SIGN 발현이 증가됨을 재확인하였다(도 7).

태반 조직에서 분리된 DC-SIGN⁺ HBC를 배양하면서 배양액 내에서 α-2,6-SA-IVIG와 결합하는지를 분석하는 것은 인공적 환경에서의 분석결과이므로 이를 보정하기 위해 태반 조직에서도 DC-SIGN⁺ HBC이 α-2,6-SA-IVIG과 결합하는지 분석하였다. 정상 산모로부터 수득한 신선한 태반 조직을 신속하게 작은 조각으로 절단하여 4℃로 미리 냉각된 OCT 컴파운드에 담가주고 24시간 동안 -80℃ 초저온 냉동고에서 동결시켰다. 냉동된 OCT 컴파운드 블록을 -20℃로 미리 냉동된 마이크로챔버 내로 신속하게 이동시킨 후 마이크로톰을 이용하여 10μm 두께로 절편화한 귀 후 깨끗한 슬라이드 글라스 위에 부착시킨 다음 30분 동안 진공상태에서 건조시켰다. 건조된 냉동 절편 조직을 상온의 100% 아세톤 용액에 10분 동안 담가 조직을 고정시키고 조직으로 발생되는 자가 형광을 최소화시켰다. 고정된 냉동절편 조직으로부터 OCT 컴파운드를 제거하기 위해 슬라이드를 상온에서 10분간 3회씩 PBS로 세척한 후 α-2,6-SA-IVIG 10μg을 조직에 도포해 준 뒤 항-인간 IgG-Alexa488 항체를 이용해 녹색으로 면역형광염색을 수행하고 이어서 DC-SIGN 항체를 이용하여 붉은색으로 면역형광염색을 수행한 후 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과, DC-SIGN⁺ HBC에 매우 특이적으로 α-2,6-SA-IVIG가 결합함이 확인되었다(도 8).

실시예 4: IVIG 및 α-2,6-SA-IVIG 처리가 각각 DC-SIGN ⁺ HBC에 미치는 효과

DC-SIGN⁺ HBC은 IVIG와도 결합하고 α-2,6-SA-IVIG와도 결합하기 때문에 이들과의 결합에 의한 DC-SIGN의 발현량 변화 및 IL-10의 생성능력 변화를 조사하였다. DC-SIGN⁺ HBC에 IVIG와 α-2,6-SA-IVIG 10μg을 처리 후 48시간 뒤 세포들을 수거하여 최우선적으로 DC-SIGN과 IL-10에 대한 웨스턴 블롯 분석 수행하였다. 놀랍게도 IVIG를 처리한 경우 예상과는 다르게 DC-SIGN⁺ HBC에서 DC-SIGN의 발현이 반대로 감소됨이 확인되었고 α-2,6-SA-IVIG의 경우 기존의 결과와 마찬가지로 DC-SIGN의 발현이 매우 명확하게 증가하였다(도 9). 이 결과는 현재 다양한 자가면역질환 치료에 사용되는 상용화된 IVIG가 산과질환에서 바로 이용될 경우 면역관용을 유도하는 DC-SIGN 및 유사 수용체들에 대한 반대 작용을 초래하여 오히려 염증반응의 증가를 일으킬 수도 있음을 제시하여 주는 매우 중요한 결과이다. 또한 상용화된 IVIG가 임신중독증과 같은 산과질환에서 현재에도 사용되지 못하고 있는 이유를 설명해 주는 중요한 결과라고 할 수 있다. 따라서 산과질환에서 이러한 기존의 상품화된 IVIG의 단점을 극복하기 위해서는 반드시 정제된 α-2,6-SA-IVIG가 사용되어야 함이 본 실험을 통해 확인되었다. DC-SIGN⁺ HBC에 IVIG를 처리할 경우 DC-SIGN이 오히려 줄어드는 이유는 HBC가 다른 면역세포들과는 차별적으로 4가지의 Fc수용체들 (FcRn, FcRⅡb, FrgRⅢa 및 FcgR1)을 모두 가지고 있기 때문인 것으로 예상된다(참고문헌.: PLoS Pathog. 2018 Aug 30;14(8):e1007161). 따라서 이 수용체들이 모두 IVIG에 모두 결합하여 HBC에 과도한 불특정 다수의 신호를 전달함으로써 HBC의 과잉 활성화가 초래될 수 있다.

더불어 DC-SIGN⁺ HBC은 IVIG와도 결합하고 α-2,6-SA-IVIG와도 결합하기 때문에 IL-10 생성을 증가시킬 수 있을 것으로 예상되었다. 도 9 첫째줄에서 분석한 동일한 시료들을 이용하여 IL-10에 대한 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과, IVIG에 의해서는 IL-10의 세포 내 증가가 관찰되지 않은 반면 α-2,6-SA-IVIG를 처리한 시료의 경우에서는 IL-10의 증가가 뚜렷하게 관찰되었다(도 9 왼쪽 둘째줄). 이러한 결과는 DC-SIGN⁺ HBC에 IVIG를 처리할 경우 DC-SIGN의 발현이 예상과는 반대로 감소하였기 때문에 DC-SIGN 매개 IL-10 신호전달경로가 자극받지 못하기 때문인 것으로 예측된다.

DC-SIGN⁺ HBC에 α-2,6-SA-IVIG가 결합될 경우 DC-SIGN 뿐만 아니라 IL-10도 증가하였기 때문에, DC-SIGN 매개 신호전달에 필요한 카베올린-1의 증감도 조사하고자 하였다. 내부 대조군으로 액틴과 GAPDH에 대한 웨스턴 블롯팅을 동시에 진행하였으며, 세포의 증식 정도를 추가적으로 확인하기 위해 증식세포 표지자인 PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen) 단백질에 대한 웨스턴 블롯팅도 수행하였다. 그 결과, 흥미롭게도 α-2,6-SA-IVIG를 처리한 DC-SIGN⁺ HBC에서 PCNA, 액틴과 카베올린-1의 양적증가가 관찰되었다(도 9 왼쪽, 셋째줄-6째줄).

상기 확인된 결과들이 DC-SIGN⁺ HBC에 대한 α-2,6-SA-IVIG의 특이적인 효과인지를 확인하기 위해 동일한 실험을 CT에 대하여 수행하였으나, CT의 경우 IVIG 또는 α-2,6-SA-IVIG를 처리한 모든 군에서 어떠한 단백질의 발현 증가도 관찰되지 않았다(도 9 오른쪽).

HBC에 α-2,6-SA-IVIG를 처리하였을 경우 IVIG를 처리하였을 때와는 달리 HBC 내 DC-SIGN의 발현 및 IL-10의 생성이 매우 명확하게 증가하였기 때문에 이러한 결과가 IL-10의 분비증가로 이어지는지를 관찰하였다. 예상대로 HBC에 IVIG를 처리하자 IL-10의 분비가 오히려 감소되었고 α-2,6-SA-IVIG를 처리하였을 경우 IL-10의 분비가 증가됨을 확인하였다(도 10). 이러한 결과는 산과질환에서 상품화된 IVIG가 사용될 경우 IL-10의 감소로 이어져 오히려 면역관용을 저해하는 부작용을 초래함을 재확인해주는 결과로서, 이러한 IVIG의 단점 극복을 위해 반드시 정제된 α-2,6-SA-IVIG가 사용되어야 함을 시사한다.

실시예 5: DC-SIGN ⁺ HBC에서 DC-SIGN과 2,6-SA-IVIG의 결합에 의한 IL-10 생성

α-2,6-SA-IVIG가 DC-SIGN⁺ HBC에서 IL-10의 생성 및 분비를 유도하는 기작을 확인하기 위해 우선 마우스 DCEK 세포주에서 α-2,6-SA-IVIG에 의해 IL-10의 분비 증가 여부를 재확인하였다. DCEK_WT, -mDC-SIGN, -48(SIGN-R1의 세포 내 영역이 결핍된 돌연변이 SIGN-R1 과발현 세포주) 및 _DC-SIGN에 α-2,6-SA- IVIG를 처리할 경우, DCEK_SIGN-R1과 _DC-SIGN 세포주에서만 IL-10의 분비가 명확하게 관찰되었다(도 11a). 특히, DCEK_48에서 α-2,6-SA-IVIG에 의해 IL-10의 분비가 전혀 관찰되지 않았기 때문에 α-2,6-SA-IVIG에 의한 IL-10의 생성을 위해서는 SIGN-R1 또는 DC-SIGN의 세포 내 영역부위가 정상적으로 발현되어야함을 직접적으로 증명하였다(도 11a 세번째 그래프).

DCEK_WT, _SIGN-R1과 _DC-SIGN 세포주에서 α-2,6-SA-IVIG 결합에 의해 발현량이 변화하는 IL-10 이외의 사이토카인이 있는지 확인하기 위해 IL-4, IL-1β, TNF-α 및 IL-6에 대한 ELISA 분석을 수행하였다. 도 11a에서와 동일하게 DCEK_SIGN-R1과 _DC-SIGN 세포주들에서 α-2,6-SA-IVIG 결합에 의해서만 IL-10이 증가함을 관찰하였다(도 11b).

도 11a 및 11b의 경우 마우스 섬유아세포 세포주인 DCEK 세포주를 이용한 실험이기 때문에 α-2,6-SA-IVIG에 의해 생체 내에서도 DC-SIGN 의존적인 IL-10의 분비가 이루어지는지 확인하였다. 마우스에는 DC-SIGN이 발현되지 않기 때문에 DC-SIGN 유전자 도입(DC-SIGN TG) 마우스를 제작하고 이 마우스의 숫자를 늘리기 위해 정상 마우스의 골수를 방사선 조사로 제거한 뒤 DC-SIGN TG 마우스의 골수세포를 이식하였다. 그 후 이식된 마우스의 혈중 단핵세포를 분리하여 DC-SIGN 발현 여부를 FACS를 통해 확인하고 DC-SIGN 발현 마우스 단핵세포가 혈액에서 관찰된 마우스(DC-SIGN TG/SIGN-R1 WT 마우스)를 확보하였다. DC-SIGN TG/SIGN-R1 WT 마우스에는 DC-SIGN 유사 수용체인 SIGN-R1이 있고 SIGN-R1 또한 α-2,6-SA-IVIG와 결합하기 때문에 SIGN-R1에 의해 유발될 수 있는 IL-10 생성에 대한 간접효과를 제거하기 위해 22D1 SIGN-R1 단클론 항체를 100μg 정맥주사하여 7일간 SIGN-R1이 결핍된 마우스를 최종적으로 제작하였다(DC-SIGN TG/SIGN-R1 TKO 마우스). 우선 어떠한 물질도 처리되지 않은 상태의 DC-SIGN TG/SIGN-R1 TKO 마우스의 혈액으로부터 혈청을 분리하여 확보해 놓은 후 α-2,6-SA-IVIG 10 μg을 정맥 내 주사하고 48 시간 후 다시 혈액을 채취하고 혈청을 분리하였다. 이후 도 11b와 동일한 사이토카인들에 대한 ELISA 분석을 수행하였다. 그 결과 DC-SIGN TG/SIGN-R1 TKO 마우스 마우스에서도 IL-10의 분비가 매우 뚜렷하게 관찰되었다(도 12 가장 왼쪽 그래프). 그러나 인 비트로 세포주의 결과에서와는 다르게 α-2,6-SA-IVIG의 자극에 의해 생체 내에서는 IL-1β의 뚜렷한 감소와 IL-6의 증가가 명확하게 관찰되었다(도 12의 3번째 및 5번째 그래프).

실시예 6: DC-SIGN ⁺ HBC에서 DC-SIGN과 2,6-SA-IVIG의 결합에 의한 IL-10 생성 기작의 조사

1) DC-SIGN ⁺ HBC 지질 뗏목에서 카베올린-1과 결합 가능성 규명

DC-SIGN은 수지상세포 표면의 지질 뗏목에 대표적으로 분포하며 항원의 인식, ICAM-3와의 결합을 통한 수지상세포의 이동 및 T세포에 대한 항원제시 등의 주요한 기능을 수행함으로써 지질 뗏목 내의 분포가 매우 중요함이 알려졌다. 따라서 DC-SIGN⁺ HBC가 α-2,6-SA-IVIG와 결합을 할 경우에도 DC-SIGN의 지질 뗏목 내 위치가 중요한 역할을 할 수 있다. 이를 증명하기 위해 DC-SIGN⁺ HBC에 α-2,6-SA-IVIG 10μg을 30분, 24시간 및 48시간 처리한 후 DC-SIGN⁺ HBC을 아세톤 고정시키고 DC-SIGN에 대한 면역형광염색을 수행하였다. 그 결과 30분에서부터 DC-SIGN이 DC-SIGN⁺ HBC의 세포 표면에 높게 염색되며 24시간과 48시간에서는 세포의 가장자리 부위에 더욱 특이적으로 밀집되어 있음이 확인되었다(도 13a). 마우스 세포주 실험에서 SIGN-R1과 DC-SIGN은 지질 뗏목에 존재하며 각각의 수용체의 역할을 증폭시키기 위해 지질 뗏목의 구조단백질 중 하나인 카베올린-1과 결합하고 카베올린-1 인산화를 통해 NFkB 신호전달경로를 활성화시켜 IL-10을 생성 및 분비시킴이 본 실험실을 통해 규명되었다(결과 미기재). 따라서 DC-SIGN⁺ HBC 지질 뗏목에서 DC-SIG이 카베올린-1과 결합할 가능성이 있기 때문에 DC-SIGN⁺ HBC 전체 세포 용해물을 제작하고 DC-SIGN 항체를 이용하여 면역침강법을 수행한 결과 HBC에서도 DC-SIGN이 카베올린-1과 결합하고 있음이 확인되었다(도 13b).

2) DC-SIGN ⁺ HBC에서 2,6-SA-IVIG의 처리에 의한 카베올린-1 매개 신호전달

DC-SIGN⁺ HBC 표면에서 DC-SIGN과 카베올린-1의 결합은 DC-SIGN이 α-2,6-SA-IVIG와 결합을 할 경우 카베올린-1의 인산화를 유도할 수 있다. 이를 입증하기 위해 HBC에 α-2,6-SA-IVIG 10μg을 30분, 24시간 및 48시간 처리한 후 DC-SIGN을 붉은색, 인산화 카베올린-1을 녹색으로 면역형광염색하였다. 그 결과 30분 째부터 카베올린-1의 인산화가 증가하기 시작하였으며 24시간과 48시간 째에 보다 강력한 카베올린-1 인산화 염색신호를 관찰할 수 있었다. 예비실험결과로부터 SIGN-R1 또는 DC-SIGN 자극에 의한 카베올린-1 인산화가 유도될 경우 두 수용체와 인산화된 카베올린-1이 동일한 위치에서 관찰됨이 확인되었다. 따라서 DC-SIGN⁺ HBC에서도 2,6-SA-IVIG 자극에 의해 DC-SIGN이 자극되면 DC-SIGN이 인산화된 카베올린-1과 동일한 위치에서 관찰될 것으로 예상되었다. 이를 확인하기 위해 도 14에서 준비된 세포에 대한 확대된 면역형광현미경 관찰을 수행하였고 그 결과 24시간과 48시간에서 DC-SIGN과 인산화 카베올린-1이 동일한 곳에 정확하게 위치하고 있음이 확인되었다(도 15). 특히, HBCs의 형태가 α-2,6-SA- IVIG를 처리하지 않은 경우에는 길쭉한 모양을 유지하고 있으나 α-2,6-SA-IVIG 처리 후 48시간째에는 동그랗고 별 모양으로 형태가 변화됨이 반복적으로 확인되었다(도 14 및 도 15). 이를 통해 α-2,6-SA-IVIG에 의해 DC-SIGN⁺ HBC가 48시간 이상 자극을 받을 경우 그 세포의 특성이 변화될 수 있을 것으로 예상된다. 도 14와 도 15의 웨스턴 블롯 분석결과에 대한 정량적인 분석을 수행하기 위해 동일하게 실험된 HBC에 대한 전체 세포 용해물을 제작하고 이들 시료들을 이용해 인산화 카베올린-1 항체를 이용하여 웨스턴블롯 분석을 수행하였다. 그 결과 α-2,6-SA-IVIG 10μg으로 48시간을 자극을 준 경우 DC-SIGN의 명확한 증가와 더불어 인산화 카베올린-1의 증가도 뚜렷하게 관찰되었다(도 16 첫째줄과 둘째줄).

마우스 세포주 실험에서 SIGN-R1과 DC-SIGN은 카베올린-1과 결합하고 카베올린-1 인산화를 통해 NFkB 신호전달경로를 활성화시켜 IL-10을 생성 및 분비시킴이 확인되었다(결과 미기재). 따라서 DC-SIGN⁺ HBC에서도 이와 동일한 신호전달경로가 활성화될 수 있을 것이다. 이를 확인하기 위해 도 16 첫째줄과 둘째줄에서 사용된 동일한 시료들을 이용해 NFkB의 인산화 정도를 측정한 결과, α-2,6-SA-IVIG 10μg으로 48시간을 자극한 경우 NFkB의 인산화가 뚜렷하게 증가하여 있음이 확인되었다(도 16 네 번째 줄).

실시예 7: 저산소 분압에서 2,6-SA-IVIG 처리가 HBC의 DC-SIGN 및 IL-10 생성에 미치는 영향

1) 저산소 환경에서 HBC의 IL-10 및 TNFα 생성능력

임신중독증은 태반 형성과정에서 모체의 혈액공급이 원활하지 못해 발생하는 저산소성 허혈 상태가 주요한 원인으로 여겨진다. 따라서 저산소 환경에서 HBC의 반응 및 동일 환경에서 HBC의 DC-SIGN은 면역관용유지의 측면에서 어떤 역할을 수행하는지 확인하고자 HBC를 2%의 산소 분압 환경에 노출시킨 후 3일 후 그 배양액에 대한 사이토카인 ELISA 분석을 수행하였다. 그 결과 HBC에서 대표적인 면역억제 사이토카인인 IL-10 분비 능력이 현저하게 감소됨을 확인하였다 (도 17 첫번째 그래프). 그 밖에 대표적인 염증성 사이토카인인 TNFα도 그 분비가 현저하게 감소함을 확인하였고(도 17 4번째 그래프), 조사된 TGFβ, IL-6 및 IL-1β의 경우 큰 차이가 없음이 확인되었다. 따라서 도 12에서도 설명한 바와 같이 DC-SIGN⁺ HBC의 경우 항염증성 사이토카인과 염증성 사이토카인의 상황에 따른 생성 및 분비능력을 바탕으로 태반 내 면역 항상성 유지에 매우 중요한 역할을 수행하는 것으로 예측된다.

2) 저산소 환경에서 배양한 DC-SIGN ⁺ HBC에 α-2,6-SA-IVIG를 처리할 경우의 DC-SIGN의 증가 여부

정상 산소분압 환경에서 배양시킨 DC-SIGN⁺ HBC에 α-2,6-SA-IVIG를 처리할 경우 DC-SIGN 발현이 증가함이 다각적인 실험을 통해 반복적으로 확인되었으므로(도 18 윗줄), 저산소 분압환경에 노출된 DC-SIGN⁺ HBC를 α-2,6-SA-IVIG로 자극할 경우 DC-SIGN의 발현에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하고자 하였다. 그결과, DC-SIGN이 현저히 증가됨을 면역형광염색 분석법을 통해 확인하였다(도 18 아랫줄). 이 결과는 저산소 분압 환경에 노출된 HBC가 정상적인 면역조절기능을 회복하는 데에 있어서 α-2,6-SA-IVIG에 의한 DC-SIGN의 자극이 핵심적인 역할을 함을 보여준다.

3) 저산소 환경에서 배양한 DC-SIGN ⁺ HBC에 α-2,6-SA-IVIG를 처리할 경우의 IL-10의 증가 여부

정상 산소분압 환경에서 배양한 DC-SIGN⁺ HBC에 α-2,6-SA-IVIG를 처리할 경우 DC-SIGN 발현이 증가할 뿐 아니라 DC-SIGN 매개에 의한 IL-10의 생성 및 분비 또한 증가되는지를 확인하기 위해 HBC을 정상 산소 및 저산소 분압 환경에서 노출시키면서 각각의 군에서 α-2,6-SA-IVIG 처리하지 않거나 또는 처리하여 각각의 HBC에 대한 전체 세포 용해물을 제작하고 이에 대한 액틴, GAPDH, DC-SIGN, 카베올린-1, IL-10에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 이전 결과와 동일하게 정상산소 분압에서 α-2,6-SA-IVIG를 처리하여 줄 경우 DC-SIGN의 발현이 증가하였으나, 저산소 분압 환경에서는 α-2,6-SA-IVIG의 자극에 의해 가장 크게 DC-SIGN의 발현이 증가하였다(도 19 셋째줄). 이러한 결과는 도 18의 현미경 분석결과와도 일치하는 중요한 결과이다. 또한 동일한 조건의 시료들에 대한 IL-10의 세포 내 발현정도를 분석한 결과 정상 산소분압에서 α-2,6-SA-IVIG를 처리할 경우에 HBC 내에 IL-10의 생성이 증가하였다(도 19의 5째줄 왼쪽 두 개의 밴드). 그러나 저산소 분압에 HBC를 노출할 경우 HBC가 세포 내에서는 가장 크게 IL-10 양이 증가하였다(도 19 5째줄 왼쪽 3번째 밴드). 이 결과는 저산소 분압 자체적으로 HBC를 자극하여 HBC가 IL-10을 생성하도록 유도할 수 있음을 보여주는 결과이다. 그러나 흥미롭게도 이러한 저산소 분압의 자극에 의해 HBC 내에 높게 발현되어 있던 IL-10이 α-2,6-SA-IVIG를 처리해줄 경우 큰 폭으로 감소됨이 확인되었다(도 19 5째줄 맨 오른쪽). 이는 저산소 분압 자극에 의해서 HBC는 세포내에 IL-10을 증가시키지만 분비되지는 못하고 있다가 α-2,6-SA-IVIG가 DC-SIGN을 자극할 경우 세포 밖으로 비로소 분비됨을 보여주는 결과로 추정된다. 이외에도 분석된 액틴, GAPDH, 카베올린-1에 대한 결과를 통해서 정상 산소분압 및 저산소 분압 모두에서 α-2,6-SA-IVIG 자극에 의해 그 양이 증가됨이 관찰되었다(도 19). 이 결과는 DC-SIGN+ HBC가 α-2,6-SA-IVIG의 자극을 받아 세포 증식이 유도되었음을 추정케한다.

실시예 8: 마우스에서 DC-SIGN 유사수용체인 SIGN-R1 발현 탐식세포와 2,6-SA-IVIG의 결합에 의한 자가면역 질환의 치료 효과

DC-SIGN⁺ HBC에서 α-2,6-SA-IVIG와 DC-SIGN의 결합에 의해 생성되는 IL-10이 생체 내에서 항염증조절능력이 있는지를 확인하기 위해 DC-SIGN과 동일한 작용기작을 나타내는 마우스 SIGN-R1을 이용하였다. 그리고 산모에서의 자가면역성 임신중독증 모델과 가장 유사한 콜라겐 유도 자가면역성 관절염 마우스 모델(Collagen Induced Arthritis mouse model, CIA model)을 이용하였다. 우선 정상 마우스와 CIA 유도 마우스에 IVIG 25 mg과 α-2,6-SA-IVIG 1 mg을 정맥주사한 후 1주일 간격으로 관절염 진행정도를 확인하기 위해 규정에 따라 관절염 점수를 계산하여 그래프를 그렸다. 그 결과, 두 물질 모두에서 CIA 치료효과가 관찰되었으며 더욱이, 1mg의 α-2,6-SA-IVIG가 25 mg IVIG와 동일한 치료 효과를 보여줌으로써 CIA 마우스 모델에서 낮은 농도의 α-2,6-SA-IVIG가 관절염 치료효과가 명확함을 규명하였다(도 20a). α-2,6-SA-IVIG에 의한 마우스 CIA 치료효과가 SIGN-R1 의존적인지를 확인하기 위해 정상 마우스와 SIGN-R1 결핍 마우스에 CIA를 유도하고 10 mg의 α-2,6-SA-IVIG 정맥주사한 후 일주일 간격으로 관절염 점수를 측정하였다. 그 결과 정상 마우스에서와는 달리 SIGN-R1 결핍 마우스에서는 전혀 CIA 치료효과가 관찰되지 않았다(도 20b). 이를 통해 2,6-SA-IVIG의 치료에 SIGN-R1이 필수적임을 재확인하였다.

CIA 마우스에서 α-2,6-SA-IVIG의 SIGN-R1 매개 치료효과에서 IL-10이 중요한지를 확인하기 위해 정상 마우스와 IL-10 결핍 마우스에 CIA를 우선 유도한 후 3 mg의 α-2,6-SA-IVIG 정맥주사한 후 일주일 간격으로 관절염 점수를 측정하였다. 놀랍게도 IL-10 결핍 마우스에서는 α-2,6-SA-IVIG를 처리하고 SIGN-R1도 정상적으로 발현되어 있음에도 불구하고 전혀 CIA 치료효과가 관찰되지 않았다(도 20c). 이를 통해 IVIG 또는 α-2,6-SA-IVIG에 의한 항염증효과를 유발하기 위한 가장 중요한 사이토카인은 IL-10임을 재확인하였다.

실시예 9: 임신 마우스에서 α-2,6-SA-IVIG의 태반 전달, IL-10의 활성화 및 태아 발달 촉진 효과의 확인

DC-SIGN⁺ 2,6-SA-IVIG가 태반의 DC-SIGN⁺ HBC에 도달하여 DC-SIGN에 결합하고, DC-SIGN을 자극하여 항염증성 사이토카인인 IL-10이 분비되도록 자극하기 위해는 2,6-SA-IVIG가 태반조직으로 우선적으로 전달되어야 한다. 따라서, 본 발명자들은 이를 확인하기 위해 12일령 임신 마우스를 2일 동안 의생명과학연구원 생쥐 실험동물실에 순화시킨 후 1일 당 5μg의 2,6-SA-IVIG를 3일 동안 정맥주사하고 임신 17일 째 태반, 비장, 간 및 혈청 시료들을 준비하였다. 우선 임신 마우스의 모든 태반으로 2,6-SA-IVIG가 전달되는지를 확인하기 위해 PBS를 정맥주사한 임신 마우스의 태아와 2,6-SA-IVIG를 정맥주사한 임신 마우스의 태아 8-10개 중 무작위적으로 태반 4개를 선별하고 인간 IgG 항체를 이용하여 2,6-SA-IVIG의 존재여부를 확인하였다. 예상한 바와 같이, 4개의 태반 모두에서 2,6-SA-IVIG가 존재함을 확인하였고 이를 통해 2,6-SA-IVIG가 임신 마우스의 태반으로 문제없이 잘 전달됨을 확인하였다(도 21a 상단). 인간 IgG 항체에 의한 2,6-SA-IVIG 신호가 정상적인지를 확인하기 위해 같은 시료들에 대하여 래빗 IgG 항체를 이용하여 웨스턴 분석을 수행한 결과 래빗 IgG항체에 의해서는 어떠한 신호도 감지되지 않았다(도 21a 중간). 각각의 태반 조직을 동일한 양으로 탑재하였는지를 확인하기 위해 GAPDH 항체로 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과, 모두 같은량의 단백질이 탑재되었음을 확인하였다(도 21a 하단). 2,6-SA-IVIG가 임신 마우스의 태반으로 전달되는지를 추가적으로 확인하기 위해 도 21a와 동일한 실험을 5번 반복한 결과, 모두 동일한 결과를 얻었다.

마우스에서는 비장의 백색 속질 조직 주변부에 존재하는 탐식세포들 중 SIGN-R1 발현세포가 SIGN-R1을 이용하여 2,6-SA-IVIG를 인식하고 항염증성 사이토카인 IL-10의 분비를 자극한다. 따라서 태반으로의 2,6-SA-IVIG의 전달효율이 어느 정도인지를 추가적으로 확인하기 위해 도 21a와 동일한 실험을 수행한 후 우선 채혈을 진행하고 이후 비장, 간 그리고 태반을 준비하고 각 조직에 대하여 인간 IgG 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 예상한 바와 같이 비장에서 뚜렷하게 2,6-SA-IVIG 신호가 확인되었고 유사한 정도의 2,6-SA-IVIG가 태반에서도 확인되었다(도 21b 상단). 이 결과를 통해 2,6-SA-IVIG가 임신 마우스의 태반으로 전달되는 효율이 비장과 유사함을 확인하였다. 또한, 임신 마우스에는 2,6-SA-IVIG 수용체 중 하나인 SIGN-R1이 발현되지 않기 때문에 2,6-SA-IVIG를 인식하는 다른 수용체의 존재가 예상되었다.

임신 마우스에 정맥주사한 태반으로 전달된 2,6-SA-IVIG는 비장 주변부의 SIGN-R1 발현 탐식세포를 자극하기도 하지만 도 21에서 확인된 바와 같이 태반에도 매우 높은 효율로 전달되기 때문에 항염증성 사이토카인 IL-10의 분비 또는 활성화가 증가할 것으로 예상되었다. 이를 규명하기 위해 그림 21과 동일한 실험을 수행하고 태반, 비장, 간 그리고 혈청 시료들을 준비한 후 항-IL-10 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 2,6-SA-IVIG에 대한 대조군으로서 2,6 시알산이 제거된 non-2,6-IVIG를 이용하여 IL-10에 대한 효과가 2,6-시알산화에 의한 것인지를 규명하고자 하였다. 각 시료들을 동일량으로 탑재하여 분석에 사용되었는지를 확인하기 위해 태반, 비장 그리고 간에 대해서는 항-액틴, 항-GAPDA 항체들로 웨스턴 블롯 분석을 수행하였고, 혈청 시료에 대해서는 매우 풍부한 혈청단백질 중 하나인 면역보체 C3에 대하여 해당 항-C3 항체를 이용해 웨스턴 분석을 수행하였다. 우선적으로 non 2,6-SA-IVIG와 2,6-SA-IVIG가 각각의 조직 및 혈청으로 어느 정도 전달되는지를 확인하기 위해 인간 IgG 항체로 웨스턴 분석을 수행하였다. 놀랍게도, non 2,6-SA-IVIG가 혈청에도 매우 높은 농도로 존재하고 있지만 태반에도 매우 높게 전달됨이 확인되었다(도 22, 2번째 칸). 임신 마우스 태반에서의 이와 같은 결과는, 인간 태반에 네가지 유형의 면역글로불린 수용체(FcRn, FcgRⅡb, FcgRⅢa, FcgRI)가 존재하고 있기 때문에 마우스 태반에서도 이와 유사한 다양한 종류의 면역글로불린 수용체가 존재하여 non 2,6-SA-IVIG를 비특이적으로 인식할 수 있을 것이라 예측되었다. 그러나 상대적으로 2,6-SA-IVIG의 경우 태반과 혈청에 뚜렷하게 존재하고는 있지만 non 2,6-SA-IVIG에 비해서는 낮은 농도로 전달되고 또한 분포하고 있음이 확인되었다(도 22, 2번째 칸). 이와 같은 결과는 2,6-SA-IVIG의 경우 마우스에서 SIGN-R1 및 태반의 특정 수용체에 의해 인식되기 때문으로 예측된다. 다음으로 각각의 시료에 대한 IL-10 웨스턴 블롯 분석을 통하여 non 2,6-SA-IVIG와 2,6-SA-IVIG가 어떠한 효과를 유발하는지를 확인하였다. 매우 놀랍게도, 2,6-SA-IVIG 만이 IL-10을 활성화시켜 IL-10의 활성화 형태인 IL-10 이량체가 혈청 내에서 뚜렷하게 증가됨을 확인하였고, non 2,6-SA-IVIG에 의해서는 어떤 시료에서도 IL-10의 활성화가 관찰되지 않았다(도 22, 3번째 칸). 이러한 결과는 임신 마우스 생체 내에서 2,6-SA-IVIG가 정매 내로 투여될 경우 비장 및 태반 등의 SIGN-R1을 포함하여 아직 규명되지 않은 다양한 2,6-SA-IVIG의 수용체를 자극하고 IL-10의 생성을 자극시켜 그 활성화 형태가 증가될 수 있음을 직접적으로 규명하는 중요한 결과이며, 이를 통해 인간의 임신중독증을 비롯한 다양한 염증성 질환에서도 이와 유사한 항염증 효과를 발휘하여 이들 질병들의 병증을 개선시킬 수 있음을뒷받침해주는 실험적 근거가 될 수 있다.

임신 마우스에 2,6-SA-IVIG를 정맥주사함으로써 나타나는 IL-10 활성화 형태의 증가 및 면역관용 환경의 조성이 태아의 발달에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하고자 하였다. 이를 위해 도 22와 동일한 실험을 수행한 후 각 군으로부터 태아를 수확하여 각 군의 7개 태아 체중에 대한 평균치를 구하였다. 매우 흥미롭게도 PBS군과 non 2,6-SA-IVIG 군 간에는 평균 태아 체중 간 차이가 없이 비슷하였으나, 2,6-SA-IVIG 군에서는 태아의 체중이 유의하게 증가하였다(도 23). 이 결과는 임신 마우스에 2,6-SA-IVIG를 정맥주사함으로써 나타나는 활성화된 IL-10의 증가 및 면역관용 환경의 조성이 태아의 성장, 발달에 있어서 긍정적으로 작용할 수 있음을 나타내는 결과이다. 따라서 2,6-SA-IVIG가 산모의 임신중독증과 같은 염증성 질환에 대해서도 IL-10 활성화 증가를 통해 태반과 산모의 생체 면역관용 조건를 개선시킴으로써 최종적으로 과도한 염증성 환경으로부터 태아를 보호하고 임신 기간을 지속시킬 수 있을 가능성을 제시해 준다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

1. α-2,6-시알산화된 면역글로불린(α-2,6-sialylated Immunoglobulin)을 유효성분으로 포함하되,
   상기 면역글로불린은 정맥주사용 면역글로불린(Intravenous Immunoglobulin; IVIG)인, 임신중독증(preeclampsia)의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 면역글로불린은 모체 내 태아의 발달을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
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4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서, 상기 임신중독증은 저산소성 허혈 상태를 수반하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
   
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