JP2013529908A - 改善された特性を有する抗体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本発明は、Fc領域のアミノ酸位置243位および264位に突然変異を含むFc含有ポリペプチドに関するものであり、ここで、243位の突然変異は、F243A、F243G、F243S、F243T、F243V、F243L、F243I、F243D、F243Y、F243E、F243R、F243WおよびF243Kからなる群から選択され、264位の突然変異は、V264A、V264G、V264S、V264T、V264D、V264E、V264K、V264W、V264H、V264P、V264N、V264QおよびV264Lからなる群から選択され、ここで、番号付けはKabatにおけるものと同様のEUインデックスに準拠している。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243AおよびV264Aを含む。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243YおよびV264Gを含む。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243TおよびV264Gを含む。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243LおよびV264Aを含む。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243LおよびV264Nを含む。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243VおよびV264Gを含む。もう1つの実施形態においては、本発明のFc含有ポリペプチドは抗体または抗体フラグメントである。1つの実施形態においては、本発明のFc含有ポリペプチドは、配列番号18を含む抗体フラグメントである。もう1つの実施形態においては、本発明のFc含有ポリペプチドは、配列番号19を含む抗体フラグメントである。もう1つの実施形態においては、本発明のFc含有ポリペプチドは、配列番号18または配列番号19からなる(または実質的になる)抗体フラグメントである。
定義
本明細書中で用いる「G0」なる語は、ガラクトースもフコースも含有しない複合二分岐オリゴ糖GlcNAc2Man3GlcNAc2を意味する。
本発明のFc含有ポリペプチドはいずれかの宿主生物または細胞系において製造されうる。1つの実施形態においては、本発明のFc含有ポリペプチドは、シアル酸化N−グリカンを産生しうる宿主細胞において製造される。
多数のFc含有ポリペプチドに関しては、FcγRおよびC1q結合の低下により示される、エフェクター機能の欠如またはその有意な低下(Idusogieら,J.Immunology,164(8):4178−84(2000)およびShieldsら,J.Biol.Chem.,276:6591−6604(2001))、ならびに抗炎症特性の増強は、望ましい特性であろう。本出願人は、IgGのFc領域内のアミノ酸243位および264位における特定の修飾が、末端グリカン位置におけるシアル酸化の存在には無関係に、エフェクター機能の欠如またはその有意な低下をもたらしうることを、本発明において見出した。特に、本出願人は、Fc領域内の残基F243およびV264に対するアラニンへの修飾が、Fcγ受容体およびC1qへの結合の低下を伴う抗体を与えることを見出した。これらのFc領域修飾を伴って産生された抗体は、それらが末端グリカンとしてα2,6結合シアル酸形態を有することが判明しているかどうかにかかわらず、Fcγ受容体への結合の低下を示したことに注目すべきである。
本発明のFc含有ポリペプチドは、Fc領域を含むポリペプチドの製造に適した当技術分野で公知のいずれかの方法に従い製造されうる。1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは、抗体または抗体フラグメント(限定的なものではないが、抗体のFc領域からなる又は実質的になるポリペプチドを含む)である。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドはイムノアドヘシンである。抗体および抗体フラグメントの製造方法は当技術分野でよく知られている。ポリペプチド内への点突然変異の導入方法、例えば部位特異的突然変異誘発も当技術分野でよく知られている。
ある抗体を含む多数の糖タンパク質に関しては、IgG Fc領域の末端N結合グリカンのシアル酸化は、治療活性をもたらす適正なコンホメーションを有する糖タンパク質および抗体の産生に必須である。例えば、末端シアル酸化がIVIG調製物の抗炎症活性と相関されている、Anthonyら,Science,320:373−376(2008)を参照されたい。シアル酸化は最後から2番目のガラクトースの存在を要し、それに対してシアリルトランスフェラーゼが作用してシアル酸化グリカンを形成する。したがって、1以上の末端ガラクトースグリコフォームを欠く糖タンパク質は、抗炎症活性を伴うα2,6結合シアル酸組成を有する抗体を産生し得ない。
ELISAに基づくアッセイを用いて、本出願人は、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)Her抗体、単一および二重Fc突然変異タンパク質抗体ならびにHer2抗体へのFcガンマ受容体(FcγR)結合を比較した。実施例11および15に記載されている実験において示されているとおり、Fc二重突然変異タンパク質はFcγRIに対するアフィニティの低下を示した。FcγRIは、抗体結合に際して免疫応答を刺激することが示されている受容体であるため、これらのデータは、二重突然変異タンパク質抗体がより低い免疫応答促進能を有することを示唆しているであろう。
抗体−C1q結合は補体依存性細胞傷害に関する重要なパラメーターである。C1qへの免疫グロブリン(IgG)分子の結合活性(アフィニティ)は、細胞に基づくアッセイ、例えば、本明細書中の実施例13に記載されているアッセイにより測定されうる。開示されているアッセイは任意のIgG分子での使用に容易に適合化されうる、と当業者は認識し理解するであろう。
FcγRIIIa(CD16)受容体は抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)をもたらすことが十分に確認されている(Daeronら,Annu.Rev.Immunol.15:203−234,1997)。本出願人は、本明細書に記載されている二重Fc突然変異タンパク質から産生された抗体がFcγRIIIa結合の低下を伴い(図9CおよびD;表4および5)、したがって、FcγRIIIa媒介性ADCCを引き起こす能力の低下を伴う可能性があることを見出した。
バイオアベイラビリティは、活性部分が、それが薬物であるか代謝産物であるかには無関係に、ヒトの循環内に進入して作用部位に接近する度合および速度を意味する。薬物のバイオアベイラビリティは、薬物の物理化学的特性よりも剤形の特性に主に影響され、今度はこれがその吸収能を決定しうる。化学的同等性は、薬品が同一活性成分を同量で含有するが、他の不活性物は異なりうることを示唆する。同様に、生物学同等性は、2つの薬品が、同一患者に同一投与計画で投与された場合、循環および組織内で同等の薬物濃度を与えることを示唆する。逆に、同一でない2つの薬品は、同一患者に投与された場合、同一の治療効果(および副作用)を与えうるかもしれない。したがって、薬物のバイオアベイラビリティは、バイオアベイラビリティがたとえ異なる場合であっても、治療的同等性を達成する可能性がありうる点でのいずれかの同等性の決定に関連している。狭い治療係数(すなわち、50%有効濃度に対する最小毒性濃度の比)を有する薬物の場合、バイオアベイラビリティの相違は治療的非同等性をもたらしうる。
本明細書における知見の結果として、本出願人は、Asn297位のシアル酸化およびガラクトシル化の増加を伴う抗体をインビボで産生しうる株が作製されるように、抗体のFc領域の修飾により、α2,6結合シアル酸の増加を伴う抗体の製造方法を開発した。いずれの理論にも束縛されるものではないが、抗体のAsn297位にN−グリカン上に存在する低レベルのガラクトースおよびシアル酸の欠如は、それぞれのグリコシルトランスフェラーゼの低い効率によるものではなく、むしろ、Fc領域の構造に固有の立体障害によるものである、と本出願人は提示している。Fc領域の構造は、抗体が分泌経路を通過する短時間の間にガラクトースおよびシアル酸の付加を妨げる、と本出願人は考えている。これまでの報告は、インビボで典型的に用いられるものより長いインキュベーション時間がガラクトシルトランスフェラーゼと共に用いられた場合、CD20 mAbの高レベルのガラクトシル化がインビトロで可能であったことを示唆している(Liら,Nat.Biotechnol.24(2):210−215(2006))。より少ない立体障害を伴って抗体が開いた立体配置で存在する場合、ガラクトース転移が生じると考えられた。二重突然変異(すなわち、二重Fc突然変異タンパク質)から生じる構造変化またはコンホメーション変化は永久的な開いたコンホメーションをもたらして、ガラクトースおよびシアル酸転移の著しい増強を可能にする。
後記実施例においては、商業的に入手可能な抗Her2および抗TNF抗体の配列に類似した配列を有するIgG1抗体を使用する本発明の材料および方法を本出願人は例示しているが、本発明は、開示されている抗体に限定されないことに注目すべきである。本明細書における材料および方法は、抗炎症活性の増強またはエフェクター機能の低下の特性が望ましい任意のFc含有ポリペプチドを製造するために使用されうる、と当業者は認識し理解するであろう。更に、本発明によりこのようにして製造されるFc含有ポリペプチドまたは抗体のタイプ(型)には何ら制限がないことに注目すべきである。該Fc含有ポリペプチドのFc領域はIgA、IgD、IgE、IgGまたはIgMからのものでありうる。1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドのFc領域は、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4を含むIgGからのものである。1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドのFc領域はIgG1からのものである。特定の実施形態においては、本明細書における材料および方法により製造される抗体または抗体フラグメントはヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体でありうる。
本発明はまた、炎症の治療に有用な親Fc含有ポリペプチド(例えば、炎症に関与する抗原に結合する抗体またはイムノアドヘシン)を選択し、該Fc含有ポリペプチドの243位および264位(該番号付けはKabatにおけるものと同様のEUインデックスに準拠している)に突然変異を導入することを含む、Fc含有ポリペプチドの抗炎症特性を増強する方法を含み、ここで、該Fc含有ポリペプチドは、該親Fc含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症活性を有する。1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243AおよびV264Aを含む。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243YおよびV264Gを含む。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異243TおよびV264Gを含む。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243LおよびV264Aを含む。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243LおよびV264Nを含む。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243VおよびV264Gを含む。1つの実施形態においては、該親Fc含有ポリペプチドは、炎症に関与する抗原に結合する抗体、抗体フラグメントまたはイムノアドヘシンである。1つの実施形態においては、該親Fc含有ポリペプチドは、炎症状態の治療のために既に市販されている又は開発中である抗体、抗体フラグメントまたはイムノアドヘシンである。もう1つの実施形態においては、該親Fc含有ポリペプチドは、以下のものからなる群から選択される抗体である:ムロモナブ(Muromonab)−CD3(抗CD3受容体抗体)、アブシキシマブ(Abciximab)(抗CD41 7E3抗体)、リツキシマブ(Rituximab)(抗CD20抗体)、ダクリズマブ(Daclizumab)(抗CD25抗体)、バシリキシマブ(Basiliximab)(抗CD25抗体)、パリビズマブ(Palivizumab)(抗RSV(呼吸器性シンシチウムウイルス)抗体)、インフリキシマブ(Infliximab)(抗TNFα抗体)、トラスツズマブ(Trastuzumab)(抗Her2抗体)、ゲムツズマブ オゾガマイシン(Gemtuzumab ozogamicin)(抗CD33抗体)、アレムツズマブ(Alemtuzumab)(抗CD52抗体)、イブリツモマブチウキセテン(Ibritumomab tiuxeten)(抗CD20抗体)、アダリムマブ(Adalimumab)(抗TNFα抗体)、オマリズマブ(Omalizumab)(抗IgE抗体)、トシツモマブ(Tositumomab)−131I(抗CD20抗体のヨウ素化誘導体)、エファリズマブ(Efalizumab)(抗CD11a抗体)、セツキシマブ(Cetuximab)(抗EGF受容体抗体)、ゴリムマブ(Golimumab)(抗TNFα抗体)、ベバシズマブ(Bevacizumab)(抗VEGF−A抗体)、ナタリズマブ(Natalizumab)(抗α4インテグリン)、エファリズマブ(Efalizumab)(抗CD11a)、セトリズマブ(Cetolizumab)(抗TNFα抗体)、トシリズマブ(Tocilizumab)(抗IL−6R)、ウステンキヌマブ(Ustenkinumab)(抗IL−12/23)、アレムツズマブ(alemtuzumab)(抗CD52)およびナタリズマブ(natalizumab)(抗α4インテグリン)ならびにそれらの変異体。もう1つの実施形態においては、該親Fc含有ポリペプチドは、以下のものからなる群から選択されるFc融合タンパク質である:アルカリスト/リロナセプト(Arcalyst/rilonacept)(IL1R−Fc融合体)、オレニシア/アバタセプト(Orencia/abatacept)(CTLA−4−Fc融合体)、アメビベ/アレファセプト(Amevive/alefacept)(LFA−3−Fc融合体)、アナキンラ(Anakinra)−Fc融合体(IL−1Ra−Fc融合タンパク質)、エタネルセプト(etanercept)(TNFR−Fc融合タンパク質)、FGF−21−Fc融合タンパク質、GLP−1−Fc融合タンパク質、RAGE−Fc融合タンパク質、ActRIIA−Fc融合タンパク質、ActRIIB−Fc融合タンパク質、グルカゴン−Fc融合タンパク質、オキシントモジュリン(oxyntomodulin)−Fc−融合タンパク質、GM−CSF−Fc融合タンパク質、EPO−Fc融合タンパク質、インスリン−Fc融合タンパク質、プロインスリン−Fc融合タンパク質およびインスリン前駆体−Fc融合タンパク質ならびにそれらの類似体および変異体。
本発明はまた、炎症状態の治療を要する対象における炎症状態の治療方法を含み、該方法は、243位および264位(該番号付けはKabatにおけるものと同様のEUインデックスに準拠している)に突然変異を含むFc含有ポリペプチドの治療的有効量を該対象に投与することを含む。1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243AおよびV264Aを含む。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243YおよびV264Gを含む。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243TおよびV264Gを含む。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243LおよびV264Aを含む。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243LおよびV264Nを含む。もう1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは突然変異F243VおよびV264Gを含む。本発明のFc含有ポリペプチドは任意の経路により投与されうる。1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは非経口投与される。1つの実施形態においては、該Fc含有ポリペプチドは皮下投与される。
本発明はまた、本発明のFc含有ポリペプチドと医薬上許容される担体とを含む医薬製剤を含む。
抗Her2 IgG1 Fc突然変異タンパク質およびピチア・パストリス(Pichia pastoris)組換え発現ベクターの構築
ピチア・パストリス(Pichia pastoris)におけるHer2 IgG1モノクローナル抗体の単一および二重Fc突然変異タンパク質の製造を、後記に挙げる配列およびプロトコールを用いて行った。
Her2モノクローナルIgG1抗体の製造に使用した重鎖および軽鎖配列(それぞれ、配列番号1および2)は後記に記載されている。重鎖抗Her2二重突然変異タンパク質抗体のアミノ酸配列は配列番号9に示されている。該重鎖および軽鎖はピチア・パストリス(Pichia pastoris)コドン使用頻度に従い最適化され、GeneArt AG(Josef−Engert−Str.11,D−93053 Regensburg,Germany)により合成され、pUC19内にクローニングされた。
α−接合因子プレドメインのシグナル配列を、PCR融合により、軽鎖または重鎖の5’末端にインフレームで融合させた。該配列を前記のとおりにコドン最適化した。コザック配列AAACGをメチオニンの5’末端に付加し、クローニング目的のためにEcoRI部位を該コザック配列の前に付加した。DNA配列(配列番号7)およびアミノ酸(配列番号8)の翻訳は後記に示されているとおりである。
IgG1およびその突然変異タンパク質の融合シグナル配列を有する重鎖および軽鎖を、それぞれ、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)AOX1プロモーター下およびサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)Cycターミネーターの前にクローニングした。その完成した重鎖および軽鎖の発現カセットを最終的な発現ベクターへと合体させた。ピチア・パストリス(Pichia pastoris)内へのゲノム挿入を、Spe1での該ベクターの線状化およびTrp2部位内への標的化組込みにより行った。
抗Her2およびそのFc突然変異タンパク質を製造するための糖操作ピチア(Pichia)GFI5.0およびGFI6.0宿主
2つの異なる糖操作ピチア(Pichia)宿主、すなわち、GFI5.0およびGFI6.0を、本発明において適用した。Gerngross,US 7,029,872およびGerngross,US 7,449,308に開示されている方法に従い、所望のN−グリコフォームを主要種として有する所望のポリペプチドを発現しうるように下等真核宿主細胞を遺伝的に操作するのに有用であるベクターを構築することが可能である。Hamiltonら,Science,313:1441−1443(2006)およびHamilton US 2006/0286637に記載されている方法に従い、NRRL11430(American Type Culture Collection(ATCC)P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,USA)からGFI5.0およびGFI6.0株を操作した。操作されたピチア・パストリス(Pichia pastoris)株GFI5.0は、末端ガラクトースを伴う二分岐N−グリカン構造を有するタンパク質を産生しうる。本明細書において使用されているGFI5.0株RDP697の遺伝子型は以下のとおりである:ura5Δ::ScSUC2 och1Δ::lacZ bmt2Δ::lacZ/KlMNN2−2 mnn4L1Δ::lacZ/MmSLC35A3 pno1Δ::lacZ ADE1::lacZ/FB8/NA10/MmSLC35A3 his1::lacZ−URA5−lacZ/XB33/SpGALE/DmUGT arg1::HIS1/KD53/TC54。操作されたピチア・パストリス(Pichia pastoris)株GFI6.0であるYGLY3582の遺伝子型は以下のとおりである:ura5Δ::ScSUC2 och1Δ::lacZ,bmt2Δ::lacZ/KlMNN2−2 mnn4L1Δ::lacZ/MmSLC35A3,pno1Δmnn4Δ::lacZ met16Δ::lacZ,his1Δ::lacZ/ScGAL10/XB33/DmUGT,arg1Δ::HIS1/KD53/TC54,ADE1::lacZ/NA10/MmSLC35A3/FB8,PRO1::lacZ−URA5−lacZ/TrMDS1,TRP2:ARG1/MmCST/HsGNE/HsCSS/HsSPS/MmST6−33Y。GFI6.0株は、末端α2,6結合シアル酸がガラクトースに結合した二分岐N−グリカン構造を有するタンパク質を産生しうる。
ScSUC2:サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)インベルターゼ;
OCH1:アルファ−1,6−マンノシルトランスフェラーゼ;
KlMNN2−2:クライベロミセス・ラクチス(K.lactis)UDP−GlcNAc輸送体;
BMT1:ベータ−マンノース−転移(ベータ−マンノース除去);
BMT2:ベータ−マンノース−転移(ベータ−マンノース除去);
BMT3:ベータ−マンノース−転移(ベータ−マンノース除去);
BMT4:ベータ−マンノース−転移(ベータ−マンノース除去);
MNN4L1:MNN4様1(電荷除去);
MmSLC35A3:UDP−GlcNAc輸送体のマウスホモログ;
PNO1:N−グリカンのホスホマンノシル化(電荷除去);
MNN4:マンノシルトランスフェラーゼ(電荷除去);
ScGAL10:UDP−グルコース4−エピメラーゼ;
XB33:ScKRE2リーダーに融合したトランケート化HsGalT1;
DmUGT:UDP−ガラクトース輸送体;
KD53:ScMNN2リーダーに融合したトランケート化DmMNSII;
TC54:ScMNN2リーダーに融合したトランケート化RnGNTII;
NA10:PpSEC12リーダーに融合したトランケート化HsGNTI;
FB8:ScSEC12リーダーに融合したトランケート化MmMNS1A;
TrMDS1:分泌トリコデルマ・レーゼイ(T.reesei)MNS1;
ADE1:N−スクシニル−5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミドリボチド(SAICAR)シンテターゼ;
MmCST:マウスCMP−シアル酸輸送体;
HsGNE:ヒトUDP−GlcNAc 2−エピメラーゼ/N−アセチルマンノサミンキナーゼ;
HsCSS:ヒトCMP−シアル酸シンターゼ;
HsSPS:ヒトN−アセチルノイラミナート−9−ホスファートシンターゼ;
MmST6−33:ScKRE2リーダーに融合したトランケート化マウスアルファ−2,6−シアリルトランスフェラーゼ;
LmSTT3d:リーシュマニア・メジャー(Leishmania major)からのオリゴサッカリルトランスフェラーゼ触媒サブユニット。
酵母の形質転換およびスクリーニング
糖操作GFI5.0およびGS6.0株を、YPDに富む培地(酵母エキス1%、ペプトン2%および2%デキストロース)内で増殖させ、対数増殖期に遠心分離により集め、氷冷1Mソルビトールで3回洗浄した。1〜5μgのSpe1消化プラスミドをコンピテント酵母細胞と混合し、Bio−Rad Gene Pulser Xcell(商標)(Bio−Rad,2000 Alfred Nobel Drive,Hercules,CA 94547)プリセット ピチア・パストリス(Pichia pastoris)エレクトロポレーションプログラムを使用してエレクトロポレーションした。24℃の回収用豊富(rich)培地内で1時間の後、該細胞を、300μg/ml ゼオシンを含有する最少デキストロース培地(1.34% YNB、0.0004% ビオチン、2% デキストロース、1.5% 寒天)上でプレーティングし、該形質転換体が出現するまで24℃でインキュベートした。
バイオリアクター(Sixfors)スクリーニング
バイオリアクター発酵スクリーニングを、以下のとおりに記載されているとおりに行った。糖操作ピチア・パストリス(Pichia pastoris)のフェッドバッチ発酵を0.5リットルのバイオリアクター(Sixforsマルチ・ファーメンテーション・システム(multi−fermentation system),ATR Biotech,Laurel,MD)内で以下の条件下で行った:pH 6.5、24℃、300ml 気流/分、および350mL(330mLのBMGY培地[100mM リン酸カリウム、10g/l 酵母エキス、20g/l ペプトン(BD,Franklin Lakes,NJ)、40g/l グリセロール、18.2g/l ソルビトール、13.4g/l YNB(BD,Franklin Lakes,NJ)、4mg/l ビオチン]および20mLの接種物)の初期実施体積での550rpmの初期攪拌速度。該発酵の1時間から10時間までの間に攪拌速度を550rpmから1200rpmへ直線的に増加させるために、IRISマルチ・ファーメンター(multi−fermentor)ソフトウェア(ATR Biotech,Laurel.MD)を使用した。それにより、溶存酸素濃度が該発酵中に変動することを可能にした。初期グリセロール仕込み(40g/l)が消費されるまで(典型的には18〜24時間)、該発酵をバッチ形態で行った。17mlのグリセロール供給溶液(50%[w/w]グリセロール,5mg/l ビオチン,12.5mL/l PMT1塩(65g/l FeSO4・7H2O,20g/l ZnCl2,9gl H2SO4,6g/l CuSO4・5H2O,5g/l H2SO4,3g/l MnSO4・7H2O,500mg/l CoCl2 6H2O,200mg/l NaMoO4・2H2O,200mg/l ビオチン,80mg/l NaI,20mg/l H3BO4)を該バイオリアクターに加えることにより、第2バッチ段階を開始した。加えたグリセロールが消費されるまで(典型的には6〜8時間)、該発酵を再びバッチ形態で行った。溶存酸素の急上昇により示される、第2バッチ段階の完了の後、メタノール溶液(100%[w/w]メタノール,5mg/l ビオチンおよび12.5mL/l PMT1塩)を、0.6g/時間で、典型的には回収前に36時間にわたって供給することにより、誘導段階を開始した。全容量を該リアクターから取り出し、SLC−6000ローターを備えたSorvall Evolution RC遠心機(Thermo Scientific,Milford,MA)で8,500rpmで30分間遠心分離した。細胞塊を廃棄し、上清を精製および分析のために保持した。グリカンの質をMALDI飛行時間型(TOF)質量分析および2−アミノベンジジン(2−AB)標識(Liら,Nat.Biotech.24(2):210−215(2006)に従って行う)により評価する。グリカンをPNGアーゼ−Fでの処理により該抗体から遊離させ、MALDI−TOFにより分析してグリカンの構造を確認した。存在する中性および荷電グリカンの相対量を定量するために、N−グリコシダーゼFにより遊離したグリカンを2−ABで標識し、HPLCにより分析した。
バイオリアクター培養
3L(Applikon,Foster City,CA)および15L(Applikon,Foster City,CA)ガラスバイオリアクターならびに40L(Applikon,Foster City,CA)ステンレス鋼スチーム・イン・プレイス(steam in place)バイオリアクターにおいて発酵を行った。凍結ストックバイアルを1%の体積比で直接的にBMGY培地に接種することにより、シード培養を調製した。移した直後に細胞が指数関数的に増殖することが保証されるように、20±5の光学密度(OD600)を得るためにシードフラスコを24℃で48時間インキュベートする。該培地は、1リットル当たり、40g グリセロール、18.2g ソルビトール、2.3g K2HPO4,11.9g KH2PO4,10g 酵母エキス(BD,Franklin Lakes,NJ),20g ペプトン(BD,Franklin Lakes,NJ),4×10−3g ビオチンおよび13.4g 酵母窒素ベース(BD,Franklin Lakes,NJ)を含有していた。該バイオリアクターに初期培地に対して10%の体積比のシードを接種する。以下の条件下、フェッドバッチ形態で培養を行った:24±0.5℃に設定された温度、NH4OHで6.5±0.1に制御されたpH、O2の添加の際の段階的(cascading)攪拌速度による1.7±0.1mg/Lに維持された溶存酸素。気流速度は0.7vvmに維持した。初期仕込みグリセロール(40g/L)が消失した後、250g/Lの湿潤細胞重量に達するまで、12.5mL/LのPTM1塩を含有する50% グリセロール溶液を、最大増殖速度の50%で、8時間にわたって指数関数的に供給した。0.01時間−1の比増殖速度を維持するためにメタノールを指数関数的に供給して、30分間の飢餓段階を行った後、誘導を開始した。150mM/L/時間の酸素取り込み速度に達したら、酸素限界を避けるために、該メタノール供給速度を一定に維持した。
抗体の精製
分泌抗体の精製は、利用可能な公開されている方法、例えば、Liら,Nat.Biotech.24(2):210−215(2006))の方法を用いて当業者により行われることが可能であり、この場合、抗体が発酵上清からプロテインAアフィニティクロマトグラフィーにより捕捉され、フェニルセファロース高速流動樹脂を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィーにより更に精製される。
グリカンのMALDI−TOF分析
Choiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:5022−5027(2003)およびHamiltonら,Science 301:1244−1246(2003)に記載されているとおりにN−グリカンを分析した。糖タンパク質を還元し、カルボキシメチル化した後、ペプチド−N−グリコシダーゼFでの処理によりN−グリカンを遊離させた。該タンパク質をエタノールで沈殿させた後、該遊離オリゴ糖を回収した。Voyager PROリニアMALDI−TOF(Applied Biosystems)質量分析計を遅延抽出と共に該製造業者の説明に従い用いることにより、分子量を決定した。前記実施例に従い製造された抗Her2抗体のN−グリカン分析の結果を図4〜8に示す。
HPLCによるN結合グリカン分析
各グリコフォームの相対量を定量するために、N−グリコシダーゼF遊離グリカンを2−アミノベンジジン(2−AB)で標識し、HPLCにより分析した(Choiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:5022−5027(2003)およびHamiltonら,Science 313:1441−1443(2006)に記載されているとおりに行った)。3Lバイオリアクターにおいて産生された単一および二重突然変異タンパク質に関する並びに小規模0.5Lバイオリアクターにおいて産生された野生型および二重突然変異タンパク質に関するGFI6.0株において産生されたシアル酸化抗Her2抗体の量を表3に示す。
抗原アフィニティアッセイ
抗原を発現する哺乳類細胞をトリプシン処理により集め、40μm細胞濾過器で濾過し、96深ウェルプレート内のリン酸緩衝食塩水(PBS)中の1% ウシ胎児血清(FBS)に懸濁させた。該精製抗体の系列希釈物を10から0.01μgml−1までの範囲の最終濃度で該細胞に加えた。該抗体細胞混合物を氷上で45分間インキュベートした。該細胞を冷PBS中で洗浄し、PBS中の1% FBS中の2μgml−1の抗ヒトIgG−AlexaFluor488(Invitrogen,Carlsbad,CA)で、暗室内で氷上で45分間染色した。該細胞を冷PBS中で再び洗浄し、PBS中の1% FBSに懸濁させ、U底96ウェルプレート(USA Scientific,Ocala,FL)に移した。488nmの励起波長および525nmの発光波長を用いて、Guava ExpressPlus(Millipore,Billerica,MA)上で平均蛍光強度(MFI)を検出した。結果を図3に示す。
FcγR結合アッセイ
Shieldsら,J.Biol.Chem.276:6591−6604(2001)に記載されている方法を若干変更した方法により、Fcγ受容体結合アッセイを行った。高タンパク質結合96ウェルプレート(Corning Costar,Lowell,MA)をPBS中の以下の濃度の100μl/ウェルのFcγ受容体溶液でコートした:FcγRI(R&D Systems)およびFcγRIIa(Pichia pastoris産生体)は1μg/mL、FcγRIIb/c(P.pastoris産生体)は2μg/mL、FcγRIIIa−V158は0.4μg/mLならびにFcγRIIIa−F158(共にP.pastoris産生体)は0.8μg/mL。FcγRIIIa−V158およびFcγRIIIa−F158受容体を、Liら,Nat.Biotech.24:210−215(2006)に記載されているとおりにピチア・パストリス(P.pastoris)を使用して発現させた。
抗Her2抗体およびそのFc突然変異タンパク質に関するC1q結合アッセイ
Idusogieら,J.Immunology,164:4178−4184(2000)の方法を記載どおりに用いて、C1q結合アッセイを行った。高結合性プレートを無効(clear)にするために、系列希釈抗体を50mM Na2HCO3(pH9.0)中の100μl/ウェルでコートした。ヒトC1q補体(US Biological,Swampscott,MA)をアッセイ希釈剤(0.1% Bovine Gelatin,PBS,0.05% Tween20)中の2μg/mLで2時間コートした。C1qをHRP結合ヒツジポリクローナル抗ヒトC1q抗体(AbDSerotec)で検出し、OD450を測定することにより定量した。
抗Her2およびそのFc突然変異タンパク質に関する抗体依存性細胞傷害
ユウロピウム取り込みアッセイを用いて抗体依存性細胞傷害(ADCC)を測定した。ヒト卵巣腺癌系SKOV3を、10%ウシ胎児血清(FBS)で補足されたMcCoyの5A培地内で培養した。末梢血単核細胞(PBMC)をロイコパック(leucopak)から得た。PBMCをフィコール・パック密度遠心分離に付し、2% FBSで補足されたPBS中で洗浄し、10% FBSを含有するMcCoyの5A培地に再懸濁させた。FcγRIIIA F158V遺伝子型を各ドナーに関して決定した。SKOV3細胞をEuDTPAで標識した。該細胞を5000/ウェルで96ウェル組織培養プレートに加え、エフェクター細胞(PBMC)を300,000/ウェル(E:T 60:1)で加えた。抗体を種々の濃度で加え、該プレートにわたって希釈した。対照には、バックグラウンド、標的およびエフェクターベースライン計数、ならびに100% 細胞溶解ウェルが含まれた。抗体を含有する又は含有しない該PBMC混合物を37℃で4時間インキュベートした。20μlの該上清をDELPHIA増強溶液(Perkin Elmer,cat#1244−105)と混合して高蛍光キレートを形成させ、それを時間分解蛍光光度分析を用いて測定することにより、細胞溶解PBMCからのEuDTPAの遊離を決定した。各抗体希釈物に関して三重ウェルを準備し、式:((実験的遊離−バックグラウンド)/(最大遊離−バックグラウンド))−((自然細胞傷害−バックグラウンド)/(最大遊離−バックグラウンド))に従い、細胞溶解の割合を計算した。これらの用語は以下のとおりに定義される。実験的遊離は、エフェクター細胞および抗体の存在下の標的細胞に関する平均計数を表し、バックグラウンドは、標的細胞を標識した後の最終洗浄からの上清に関する平均を表し、最大遊離は、DELPHIA細胞溶解バッファー(Perkin Elmer,cat#4005−0010)と共にインキュベートされた標的細胞に関する平均を表し、自然細胞毒性はエフェクター細胞の存在下の標的細胞に関する平均計数を表す。Prism 5.0ソフトウェアを使用して、データ点を4パラメータ・ロジスティック回帰モデルに当てはめた。全ての曲線は、同じ最大値、最小値および勾配を共有するように拘束された。
抗Her2およびそのFc突然変異タンパク質に関する皮下PK研究
皮下PK研究をC57B6マウスにおいて行った。抗体サンプルを1mg/kgの用量で皮下投与した(n=3)。10μlの血液を1、6、24、53、77、120、192、240、288および360時間の採集時点において毛管で集め、90μlのカルシウムおよびマグネシウム非含有PBSならびに1.8mg/ml K2EDTAを含有するミクロフュージ(microfuge)チューブに移した。サンドイッチイムノアッセイを用いて、Gyros(登録商標)Bioaffy(Uppsala,Sweden)ワークステーションでヒトIgGレベルを決定した。100μg/ml ビオチン化マウスモノクローナル抗ヒトカッパ鎖(BD Pharmingen,San Diego,CA)を捕捉抗体として使用し、12.5nM ALEXA−64標識マウスモノクローナル抗ヒトFc Pan IgG(Southern Biotech,Birmingham,AL)を検出抗体として使用した。捕捉抗体の固定化およびアナライトの添加から、検出抗体の添加および洗浄工程まで、全イムノアッセイを自動化した。標準物およびQCを5% マウス対照血漿(EDTA)中で20×ストックとして調製し、分析前にアッセイバッファー(PBS、0.01% Tween)中の5% マウス血漿中に1:20希釈した。正確なIgG濃度の決定のための直線範囲を添加QCで確定し、それが5〜5000ng/mlであることが判明した。正確さ及び精度の許容性限界は、+/−25%の定量下限(LLOQ)を伴う+/−20%であった。標準物およびQCは、シグナルの有意な喪失を伴うことなく、3回、凍結および解凍することが可能であった。標準物、QCおよび研究サンプルは−70℃で貯蔵した。研究サンプルを解凍し、アッセイバッファー中の5% マウス血漿中に1:20希釈し、レベルが直線アッセイ範囲外である場合には更に1:10希釈した。全ての標準物、QCおよび研究サンプルを二重にアッセイし、平均結果を示した。第5パラメータ・ロジスティック曲線フィットを用いて、濃度を決定した。血清mAb濃度−時間データ(WinNonlin Enterprise Version 5.01,Pharsight Corp,Mountain View,CA)の非コンパートメント分析を用いて、WinNonlinで、薬物動態学的パラメータを各動物に関して計算した。
本発明の抗Her2抗体およびそのFc突然変異タンパク質に関するもう1つの一連のFcγ受容体結合アッセイを、実施例11に記載されているとおりに行い、結果を図13ならびに表4および5に示す。
抗HER2抗体およびFc突然変異タンパク質のADCCの評価
SKOV3標的細胞(ATCC,Cat#HTB−77)を使用してADCC分析を行った。該アッセイの前日に、初代NKエフェクター細胞(Biological Specialty,Cat#215−11−10)を1000rpmで15分間にわたりペレット化し、10% FBS(Ceilgro,Cat#35−016−CV)で補足されたRPMIマイナス フェノールレッド培地(Invitrogen,カタログ#11835−030)に1×106細胞/mlまで再懸濁させた。該再懸濁NK細胞を5% CO2下、37℃で一晩インキュベートした。
抗HER2抗体およびその突然変異タンパク質のADCCデータの統計分析
本研究の目的は、該二重突然変異体の細胞溶解率が、それらの2つの単一突然変異体と比較して相乗的であるかどうかを判定することであった。該決定は、該二重突然変異体(群4)と推定相加的参照曲線(図15および表6に示されている)との間でED50(50%細胞溶解に対応する抗体レベル)を比較することによりなされる。該二重突然変異体曲線のED50の下限は、アッセイされた最高抗体レベルより高く、相加的参照曲線のED50の上限よりも十分に高いため、本発明者らは、該二重突然変異の効果は相加的効果より遥かに大きいと結論づけている。
該目的は、ヘルセプチン(Herceptin)抗体の二重突然変異体(GS6.0/F243A/V264A)が、2つの単一突然変異変異体(GS6.0/F243AおよびGS6.0/V264A)と比較して相乗効果を示すかどうかを判定することであった。以下の4つの抗体群を用いた:群1(GS5.0)、群2(GS6.0/F243A)、群3(GS6.0/V264A)および群4(GS6.0/F243A/V264A)。
ここで、
Yijは第jの処理に関する第iの応答(100−%細胞溶解)である。
Xijは、Yijに対応する抗体レベル(対数表示)である。
j=GS5.0に関しては1、j=GS6.0/F243Aに関しては2、j=GS6.0/V264Aに関しては3、j=GS6.0/F243A/V264Aに関しては4。
Ho:γ4=(γ2+γ3) 対 Ha:γ4>(γ2+γ3)
検定統計量:
[1]SAS(r)Proprietary Software 9.2(TS2M2),SAS Institute Inc.,Cary,NC,USA。
[2]‘Application of the Four−Parameter Logistic Model to Bioassay:Comparison with Slope Ratio and Parallel Line Models’;Aage Volund,Biometrics,Vol.34,No.3(Sep.1978),pp.357−365。
抗TNFα Fc突然変異タンパク質の構築およびADCC評価
ピチア・パストリス(Pichia pastoris)における抗TNFモノクローナル抗体の二重Fc突然変異タンパク質(F243A/V264A)の製造を、後記に挙げる配列およびプロトコールを用いて行った。親(野生型)抗TNFα抗体の重鎖および軽鎖配列は配列番号10および11に記載されている。該二重突然変異タンパク質抗TNFα抗体の重鎖の配列は配列番号12に記載されている。wtおよび二重突然変異タンパク質抗TNFα抗体の軽鎖配列は同一である。
抗TNFα抗体およびそのFc突然変異タンパク質の発現のために使用されるGFI5.0株YGLY16786の遺伝子型は以下のとおりである:ura5Δ::ScSUC2 och1Δ::lacZ bmt1Δ::lacZ bmt2Δ::lacZbmt3Δ::lacZbmt4Δ::lacZ/KlMNN2−2 mnn4L1Δ::lacZ/MmSLC35A3pno1Δ::lacZ ADE1::lacZ/FB8/NA10/MmSLC35A3 his1::lacZ−URA5−lacZ/XB33/SpGALE/DmUGT arg1::HIS1/KD53/TC54 PRO1::ARG1/AOX1−ScMFpreTrMNS1PRO1::ARG1/AOX1−ScMFpreTrMNS1。
最初の12アミノ酸が除去されたTNFαの非切断可能変異体を安定に発現するJurkat FlpIn標的細胞、すなわち、Jurkat FlpIn TNFα(Δ1−12)標的細胞を使用して、ADCC分析を行った。Jurkat FlpInヒトT細胞白血病細胞(Invitrogen)をTNFαの非分泌性細胞表面突然変異体(Δ1−12 TNFα)(Perezら,Cell 63;251−258(1990))でトランスフェクトすることにより、これらの細胞を調製した。Δ1−12 TNFα DNAを、トランスフェクションに使用するためにpcDNA5ベクター(Invitrogen)内にクローニングした。細胞表面TNFαの発現をフローサイトメトリーにより確認した。
1)バックグラウンド対照の平均を全ての生(raw)の値から差し引いた。
2)ADCC活性の割合(%)を、((ADCC実験値−自然遊離)/(最大細胞溶解−自然遊離))*100として計算した。そして、
3)最終細胞溶解率(%)を、工程2からの%ADCC活性から「無抗体」対照を差し引いたものとして示した。
抗TNFα二重Fc突然変異タンパク質の補体依存性細胞傷害(CDC)の評価
最初の12アミノ酸が除去されたTNFαの非切断可能変異体を安定に発現するHEK293 FlpIn細胞を使用して、CDC分析を行った。10% 熱不活性化FBS(Sigma,Cat#F4135)、100μg/ml ヒグロマイシンB(Cellgro,Cat#30−240−CR)およびL−グルタミン(Cellgro,Cat#25−005−CI)で補足されたダルベッコ最少必須培地(DMEM)マイナス フェノールレッド(Gibco,Cat#21063)内で組織培養フラスコにおいて70%コンフルエンスまでHEK293 FlpIn TNFα(Δ1−12)を増殖させた。細胞を2mlのトリプシン(Cellgro,Cat#MT25−053−CI)で処理し、8mlの DMEMマイナス フェノールレッド培地、10% 熱不活性化FBSを使用して集め、1200rpmで10分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットをDMEMマイナス フェノールレッド培地、熱不活性化10% FBSに4×105細胞/mlの濃度まで再懸濁させた。該細胞を96ウェル黒色透明底プレート(Costar,Cat#3603)内で100μl(40,000細胞)/ウェルでプレーティングし、5% CO2下、37℃で一晩インキュベートした。
コラーゲン−抗体誘発性関節炎(AIA)モデルにおける抗TNFα抗体およびそのFc突然変異タンパク質の効果
モデル誘発:II型コラーゲンの種々の種における保存されたエピトープを認識する5つのモノクローナル抗体、すなわち、クローンA2−10(IgG2a)、F10−21(IgG2a)、D8−6(IgG2a)、D1−2G(IgG2b)およびD2−112(IgG2b)の混合物からなる市販のArthrogen−CIA(登録商標)関節炎生成性モノクローナル抗体(Chondrexから購入)で、AIA(抗体誘発性関節炎)を誘発させる。
コラーゲン−抗体誘発性関節炎(AIA)モデルにおける抗TNFα抗体またはその突然変異タンパク質の効果
実施例20に記載されている実験を、GAMMAGARDを静脈内投与した(一方、全ての他の試薬は皮下投与した)こと以外は、それにおいて記載されているとおりに反復した。
抗TNF抗体および突然変異タンパク質のFcγR結合アッセイ
Fcγ受容体結合アッセイを、実施例18に記載されている抗TNF抗体を使用して、実施例1に記載されているとおりに行った。結果を図20および表9〜10に示す。
追加的な抗Her2 Fc二重突然変異タンパク質(243/264位におけるもの)およびそれらのN−グリカン組成物の構築
縮重プライマーを使用して飽和突然変異誘発を行うために、Stratagene QuikChange(登録商標)Site−Directed Mutagenesis Kit Catalog #200518(30反応)を、それが提供しているプロトコールに従い使用して、実施例2に記載されているHer2 IgG1抗体の追加的なFc二重突然変異タンパク質を構築した。アルファ−接合因子プレドメインのシグナル配列を軽鎖および重鎖の5’末端にインフレームで融合した。IgG1およびその突然変異タンパク質の融合シグナル配列を有する得られた重鎖および軽鎖をそれぞれピチア・パストリス(Pichia pastoris)AOX1プロモーター下およびサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)Cycターミネーターの前にクローニングした。完成した重鎖および軽鎖の発現カセットを最終的な発現ベクターへと合体させた。
・洗浄バッファー#1:20mM Tris pH7.0,1M NaCl
・洗浄バッファー#2:20mM tりs pH7.0
・中和バッファー:1M Tris pH8.0〜pH9.0
・溶出バッファー:100mMまたは50mM クエン酸ナトリウム pH3.0
・クリーニング溶液:水中の6M 尿素
精製プロトコールは以下のとおりである。
・500μlのSTREAMLINE rProtein Aビーズを各BioRaカラムに加える。該ビーズは20%エタノール中に存在するべきである。該ビーズスラリーの組成は50% ビーズ、50% 液体であるべきである。
・該プロテインAビーズが該カラム内に入ったら、それらを5mlの洗浄バッファー#2で洗浄すべきである(フロースルーは廃棄する)。
・10mlの上清をBioRadカラムに加える。この工程中に、該抗体はプロテインAビーズに結合するであろう(フロースルーは廃棄する)。
・5mlの洗浄バッファー#1を該カラムに加えることにより、望ましくない過剰のタンパク質を洗い落とす(フロースルーは廃棄する)。
・5mlの洗浄バッファー#2を加えることにより、該カラムを再び洗浄する(フロースルーは廃棄する)。
・1mlの中和バッファーを15mlタンパク質収集チューブに加える。
・BioRadカラムを該15ml収集チューブ内に配置する。
・3mlの溶出バッファーをBioRadカラムに加える。これは所望の抗体をプロテインAビーズから除去するであろう。
・溶出タンパク質を該15mlタンパク質収集チューブ内に集める。
・ブラッドフォードアッセイ(10μlのタンパク質をブラッドフォードアッセイに使用する)により該溶出タンパク質の濃度を決定する。
抗PCKS9親抗体およびFc突然変異タンパク質
配列番号13の重鎖アミノ酸配列と配列番号14の軽鎖アミノ酸配列とを有する抗PCSK9抗体も構築し、重鎖の突然変異F243AおよびV264Aを導入した(実施例2に記載されているとおりに行った)。該抗PCSK9二重突然変異タンパク質の重鎖アミノ酸配列を配列番号15に示す。該抗体の野生型および二重突然変異形態を糖操作ピチア(Pichia)GFI5.0およびGFI6.0において発現させ、精製し(実施例3〜7に記載されている方法に従い行った)、種々のFcγ受容体へのそれらの結合能を、実施例11に記載されている方法を用いて測定した。該抗PCSK9二重突然変異タンパク質抗体(配列番号15の重鎖アミノ酸配列と配列番号14の軽鎖アミノ酸配列とを含む、GFI6.0において産生されたもの)は、親抗体(GFI5.0において産生されたもの)と比較された場合、FcγRIへの結合における約4倍の低下、FcγRIIIa LFへの結合における8〜60倍の低下、FcγRIIIa LVへの結合における2〜6倍の低下を示し、また、FcγRIIaまたはFcγRIIb/cへの検出可能な結合を示さなかった。
コラーゲン−抗体誘発性関節炎(AIA)モデルにおける抗Her2抗体およびそのFc突然変異タンパク質の効果
モデル誘発:II型コラーゲンの種々の種における保存されたエピトープを認識する5つのモノクローナル抗体、すなわち、クローンA2−10(IgG2a)、F10−21(IgG2a)、D8−6(IgG2a)、D1−2G(IgG2b)およびD2−112(IgG2b)の混合物からなる市販のArthrogen−CIA(登録商標)関節炎生成性モノクローナル抗体(Chondrexから購入)で、AIA(抗体誘発性関節炎)を誘発させる。
Claims (20)
- Fc領域のアミノ酸位置243位および264位に突然変異を含むFc含有ポリペプチドであって、243位の突然変異が、F243A、F243G、F243S、F243T、F243V、F243L、F243I、F243D、F243Y、F243E、F243R、F243WおよびF243Kからなる群から選択され、264位の突然変異が、V264A、V264G、V264S、V264T、V264D、V264E、V264K、V264W、V264H、V264P、V264N、V264QおよびV264Lからなる群から選択され、ここで、該番号付けがKabatにおけるものと同様のEUインデックスに準拠している、Fc含有ポリペプチド。
- 243位および264位の突然変異が、
a)F243AおよびV264A、
b)F243YおよびV264G、
c)F243TおよびV264G、
d)F243LおよびV264A、
e)F243LおよびV264N、ならびに
f)F243VおよびV264G
からなる群から選択される、請求項1記載のFc含有ポリペプチド。 - 該Fc含有ポリペプチドが抗体または抗体フラグメントである、請求項1記載のFc含有ポリペプチド。
- 該Fc含有ポリぺプチドがシアル酸化N−グリカンを含む、請求項1記載のFc含有ポリペプチド。
- 該シアル酸化N−グリカンのシアル酸残基がα−2,6結合により結合している、請求項4記載のFc含有ポリペプチド。
- 該Fc含有ポリペプチドが、親Fc含有ポリペプチドと比較した場合に、以下の特性、すなわち、
a)低下したエフェクター機能、
b)増強した抗炎症特性、
c)増加したシアル酸化、
d)非経口投与された場合の、増強したバイオアベイラビリティ、ならびに
e)FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIbおよびFcγRIIIaへの結合の低下
の1以上を有する、請求項1記載のFc含有ポリペプチド。 - 宿主細胞におけるFc含有ポリペプチドの製造方法であって、
a)Fc含有ポリペプチドを産生するように遺伝的に操作された細胞を準備し(ここで、該宿主細胞は、アミノ酸位置243位および264位に突然変異をコードする核酸を含み、243位の突然変異は、F243A、F243G、F243S、F243T、F243V、F243L、F243I、F243D、F243Y、F243E、F243R、F243WおよびF243Kからなる群から選択され、264位の突然変異は、V264A、V264G、V264S、V264T、V264D、V264E、V264K、V264W、V264H、V264P、V264N、V264QおよびV264Lからなる群から選択され、ここで、該番号付けはKabatにおけるものと同様のEUインデックスに準拠している)、
b)該Fc含有ポリペプチドの発現を引き起こす条件下で該宿主細胞を培養し、
c)該宿主細胞から該Fc含有ポリペプチドを単離することを含む、製造方法。 - 該核酸が、
a)F243AおよびV264A、
b)F243YおよびV264G、
c)F243TおよびV264G、
d)F243LおよびV264A、
e)F243LおよびV264N、ならびに
f)F243VおよびV264G
からなる群から選択される突然変異をコードしている、請求項7記載の製造方法。 - 該Fc含有ポリペプチドが抗体または抗体フラグメントである、請求項7記載の製造方法。
- 該Fc含有ポリぺプチドがシアル酸化N−グリカンを含む、請求項7記載の製造方法。
- 該シアル酸化N−グリカンのシアル酸残基がα−2,6結合により結合している、請求項10記載の製造方法。
- 全シアル酸化N−グリカンの量および比率が親Fc含有ポリペプチドと比較して増加しているN−グリカン組成を該Fc含有ポリペプチドが有する。請求項10記載の製造方法。
- 該Fc含有ポリペプチドが、親Fc含有ポリペプチドと比較した場合に、以下の特性、すなわち、
a)低下したエフェクター機能、
b)増強した抗炎症特性、
c)増加したシアル酸化、
d)非経口投与された場合の、増強したバイオアベイラビリティ、ならびに
e)FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIbおよびFcγRIIIaへの結合の低下
の1以上を有する、請求項7記載の製造方法。 - Fc領域のの243位および264位(該番号付けはKabatにおけるものと同様のEUインデックスに準拠している)に突然変異を導入することを含む、Fc含有ポリペプチドの抗炎症特性を増強する又は細胞傷害性を低下させる方法であって、該Fc含有ポリペプチドが、親Fc含有ポリペプチドと比較して増強した抗炎症特性または低下した細胞傷害性を有する、方法。
- 243位および264位における突然変異が、
a)F243AおよびV264A、
b)F243YおよびV264G、
c)F243TおよびV264G、
d)F243LおよびV264A、
e)F243LおよびV264N、ならびに
f)F243VおよびV264G
からなる群から選択される、請求項14記載の方法。 - 炎症状態の治療を要する対象における炎症状態の治療方法であって、Fc領域の243位および264位(該番号付けはKabatにおけるものと同様のEUインデックスに準拠している)に突然変異を含むFc含有ポリペプチドの治療的有効量を該対象に投与することを含む方法。
- 243位および264位における突然変異が、
a)F243AおよびV264A、
b)F243YおよびV264G、
c)F243TおよびV264G、
d)F243LおよびV264A、
e)F243LおよびV264N、ならびに
f)F243VおよびV264G
からなる群から選択される、請求項16記載の方法。 - 重鎖と軽鎖とを含むFc含有ポリペプチドであって、該重鎖が配列番号9のアミノ酸配列またはその変異体を含み、該軽鎖が配列番号2のアミノ酸配列またはその変異体を含み、該変異体が、配列番号1の重鎖アミノ酸配列と配列番号2の軽鎖アミノ酸配列とを含む抗体と比較した場合に、以下の特性、すなわち、
a)低下したエフェクター機能、
b)増強した抗炎症特性、
c)増加したシアル酸化、
d)非経口投与された場合の、増強したバイオアベイラビリティ、ならびに
e)FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIbおよびFcγRIIIaへの結合の低下
の1以上を有する、Fc含有ポリペプチド。 - 重鎖と軽鎖とを含むFc含有ポリペプチドであって、該重鎖が配列番号12のアミノ酸配列またはその変異体を含み、該軽鎖が配列番号11のアミノ酸配列またはその変異体を含み、該変異体が、配列番号10の重鎖アミノ酸配列と配列番号11の軽鎖アミノ酸配列とを含む抗体と比較した場合に、以下の特性、すなわち、
a)低下したエフェクター機能、
b)増強した抗炎症特性、
c)増加したシアル酸化、
d)非経口投与された場合の、増強したバイオアベイラビリティ、ならびに
e)FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIbおよびFcγRIIIaへの結合の低下
の1以上を有する、Fc含有ポリペプチド。 - 重鎖と軽鎖とを含むFc含有ポリペプチドであって、該重鎖が配列番号15のアミノ酸配列またはその変異体を含み、該軽鎖が配列番号14のアミノ酸配列またはその変異体を含み、該変異体が、配列番号13の重鎖アミノ酸配列と配列番号14の軽鎖アミノ酸配列とを含む抗体と比較した場合に、以下の特性、すなわち、
a)低下したエフェクター機能、
b)増強した抗炎症特性、
c)増加したシアル酸化、
d)非経口投与された場合の、増強したバイオアベイラビリティ、ならびに
e)FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIbおよびFcγRIIIaへの結合の低下
の1以上を有する、Fc含有ポリペプチド。
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