PT1294910E - Modificação da glicosilação de proteínas em pichia pastoris - Google Patents

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Nico L M Callewaert
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Description

ΕΡ 1 294 910/PT
DESCRIÇÃO
"Modificação da glicosilação de proteínas em Pichia pastoris" CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se a métodos úteis para modificar geneticamente o processo de glicosilação em estirpes de leveduras metilotróficas com o fim de produzir glicoproteinas com reduzida glicosilação. 0 presente invento refere-se ainda a estirpes de leveduras metilotróficas geradas utilizando os presentes métodos.
ANTECEDENTES DO INVENTO
As leveduras metilotróficas incluindo Pichia pastoris têm sido amplamente utilizadas para a produção de proteínas recombinantes de importância comercial ou médica. No entanto, a produção e as aplicações médicas de algumas glicoproteinas terapêuticas podem ser impedidas pelas diferenças na biossíntese de hidratos de carbono ligados às proteínas entre estas leveduras e o organismo alvo tal como um sujeito mamífero. A N-glicosilação das proteínas tem origem no retículo endoplasmático (RE), onde um oligossacárido ligado em N (GlC3MangGlcNAc2) montado em dolicol (um transportador lipídico intermediário) é transferido para o Asn apropriado de uma proteína nascente. Isto é um acontecimento comum a todas as glicoproteinas eucarióticas ligadas em N. Os três resíduos de glicose e um resíduo específico de manose ligado em a-1,2 são removidos através de glucosidades específicas e uma a-1,2-manosidase no RE, resultando na estrutura central do oligossacárido, Man8GlcNAc2. A proteína com esta estrutura central de açúcar é transportada para o aparelho de Golgi onde a porção de açúcar sofre várias modificações. Existem diferenças significativas nas modificações da cadeia de açúcar no aparelho de Golgi entre as leveduras e os eucariotas superiores.
Em células de mamífero, a modificação da cadeia de açúcar prossegue através de 3 vias diferentes dependendo da porção 2 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ proteica à qual é adicionada. Isto é, (1) a cadeia de açúcar central não se altera; (2) a cadeia de açúcar central é alterada através da adição da porção N-acetilglucosamina-1-fosfato (GlcNAc-I-P) em UDP-N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc) na posição 6 de manose na cadeia de açúcar central, seguido da remoção da porção GlcNAc para formar uma cadeia de açúcar ácida na glicoproteína; ou (3) a cadeia de açúcar central é primeiro convertida em MansGlcNAc2 através da remoção de 3 resíduos de manose com manosidase I; Man5GlcNAc2 é ainda modificada através da adição de GlcNAc e da remoção de mais 2 resíduos de manose, seguido da adição sequencial de GlcNAc, galactose (Gal) e ácido N-acetilneuramínico (também designado ácido siálico (NeuNAc)) para formar várias cadeias híbridas ou complexas de açúcar (R. Kornfeld e S. Kornfeld, Ann. Rev. Biochem. 54: 631-664, 1985; Chiba et al., J. Biol. Chem. 273: 26298-26304, 1998) .
Em leveduras, a modificação da cadeia de açúcar no Golgi envolve uma série de adições de resíduos de manose através de diferentes manosiltransferases (glicosilação da "cadeia externa"). A estrutura da glicosilação da cadeia externa é específica dos organismos, tipicamente com mais de 50 resíduos de manose em S. cerevisiae, e mais vulgarmente com estruturas menores que Mani4GlcNAc2 em Pichia pastoris. Esta glicosilação da cadeia externa específica das leveduras do tipo rico em manose é também designada hiperglicosilação. A hiperglicosilação é frequentemente indesejada uma vez que conduz a heterogeneidade de um produto proteico recombinante tanto na composição em hidratos de carbono como no peso molecular, o que pode complicar a purificação da proteína. A actividade específica (unidades/peso) de enzimas hiperglicosiladas pode ser baixada através da porção aumentada de hidratos de carbono. Adicionalmente, a glicosilação da cadeia externa é fortemente imunogénica o que é indesejável numa aplicação terapêutica. Para além disso, o grande açúcar da cadeia externa pode mascarar os determinantes imunogénicos de uma proteína terapêutica. Por exemplo, a neuraminidase (NA) de influenza expressa em P. pastoris é glicosilada com N-glicanos contendo até 30-40 resíduos de manose. A NA hiperglicosilada tem uma imunogenicidade reduzida em ratinhos, uma vez que as voltas variáveis e imunodominantes da 3 ΕΡ 1 294 910/PT superfície no topo da molécula de NA sao mascaradas pelos N-glicanos (Martinet et al.r Eur. J. Biochem. 247: 332-338, 1997).
Por essa razão, é desejável modificar geneticamente estirpes de levedura metilotróficas nas quais a glicosilação das proteínas pode ser manipulada e a partir das quais podem ser produzidas proteínas recombinantes que não sejam comprometidas na estrutura nem na função por grandes cadeias laterais de N-glicanos.
SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento dirige-se a métodos úteis para modificar geneticamente o processo de glicosilação em estirpes de levedura metilotróficas para produzir glicoproteínas com reduzida glicosilação. São também proporcionadas estirpes de levedura metilotróficas geradas utilizando os presentes métodos. 0 presente invento é definido nas reivindicações anexas. 0 presente invento pode utilizar vectores "knock-in" que sejam capazes de expressar numa estirpe de levedura metilotrófica uma ou mais proteínas cujas actividades enzimáticas conduzam a uma redução da glicosilação em glicoproteínas produzidas pela estirpe de levedura metilotrófica.
Os vectores knock-in incluem uma sequência nucleotidica codificando para uma a-1,2-manosidase ou uma parte funcional desta e são capazes de expressar a a-1,2-manosidase ou a parte funcional numa estirpe de levedura metilotrófica. Uma sequência nucleotidica preferida é uma sequência nucleotidica codificando a a-1,2-manosidase de uma espécie de fungo e, de maior preferência, Trichoderma reesei. De preferência, o vector de expressão de a-1,2-manosidase é desenhado de modo a que a a-1,2-manosidase ou uma parte funcional desta expressa a partir do vector inclua um sinal de retenção no RE. Um sinal de retenção no RE preferido é HDEL. A sequência de codificação da a-1,2-manosidase pode estar operativamente ligada a um promotor constitutivo ou indutível e a uma sequência de terminação a 3'. Os vectores podem ser vectores integrativos 4 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ ou replicativos. Vectores de expressão de a-1,2-manosidase particularmente preferidos incluem pGAPZMFManHDEL, pGAPZMFManMycHDEL, pPICZBMFManMycHDEL, pGAPZmManHDEL, pGAPZmMycManHDEL, pPIC9mMycManHDEL e pGAPZmMycManHDEL.
Os vectores knock-in podem incluir uma sequência de codificação para uma glucosidase II ou uma parte funcional desta e são capazes de expressar a glucosidase II ou a parte funcional numa estirpe de levedura metilotrófica. Uma sequência nucleotídica preferida é uma sequência nucleotidica codificando a glucosidase II de uma espécie de fungo, e de maior preferência, Saccharomyces cerevisiae. De preferência, o vector de expressão da glucosidase II é desenhado de modo a que a glucosidase II ou uma parte funcional desta expressa a partir do vector inclua um sinal de retenção no RE. Um sinal de retenção no RE preferido é HDEL. A sequência de codificação da glucosidase II pode estar operativamente ligada a um promotor constitutivo ou indutivel e a uma sequência de terminação a 3' . Os vectores podem ser vectores integrativos ou vectores replicativos. Vectores de expressão de glucosidase II particularmente preferidos incluem pGAPZAGLSII, pPICZAGLSII, pA0X2ZAGLSII, pYPTIZAGLSII, pGAPADEglsII, pPICADEglsII, pA0X2ADEglsII, pYPTIADEglsII, pGAPZAglsIIHDEL e pGAPADEglsIIHDEL.
Podem ser utilizados vectores de expressão que incluam tanto uma unidade de expressão de a-1,2-manosidase como uma unidade de expressão de glucosidase II. 0 presente invento pode utilizar vectores "knock-out" que, quando introduzidos numa estirpe de levedura metilotrófica, inactivam ou destroem um gene facilitando deste modo a redução na glicosilação de glicoproteinas produzidas na estirpe de levedura metilotrófica. 0 presente invento pode utilizar um vector "knock-out” que, quando introduzido numa estirpe de levedura metilotrófica, inactiva ou destrói o gene Ochl. Um vector knock-out de Ochl preferido é pBLURA5'PpOCHl. 0 presente invento pode utilizar vectores que incluam tanto uma unidade knock-in como uma unidade knock-out. 5 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ
Para além disso, qualquer um dos vectores knock-in ou knock-out pode incluir também uma sequência nucleotidica capaz de expressar uma proteina heteróloga de interesse numa levedura metilotrófica.
Outra concretização do presente invento proporciona métodos de modificação da glicosilação numa levedura metilotrófica através da transformação da levedura com um ou mais vectores.
As estirpes de uma levedura metilotrófica que podem ser modificadas utilizando os presentes métodos incluem, mas não se limitam a, estirpes de levedura capazes de crescer em metanol tais como leveduras do género Candida, Hansenula, Torulopsis e Pichia. As leveduras metilotróficas preferidas são as do género Pichia. São especialmente preferidas as estirpes de Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851), GS190 (NRRL Y-18014), PPF1 (NRRL Y-18017), PPY120H, yGC4 e estirpes derivadas destas. As estirpes de levedura metilotróficas que podem ser modificadas utilizando os presentes métodos incluem também as estirpes de levedura metilotróficas que foram modificadas para expressarem uma ou mais proteinas heterólogas de interesse. A glicosilação nas proteinas heterólogas expressas a partir destas estirpes geneticamente modificadas podem ser reduzidas através da transformação de tais estirpes com um ou mais dos vectores do presente invento.
As estirpes de levedura metilotróficas que são modificadas através da prática dos presentes métodos são proporcionadas noutra concretização do presente invento.
Um outro aspecto do presente invento é dirigido a métodos de produção de glicoproteínas com uma glicosilação reduzida.
De acordo com tais métodos, uma sequência nucleotidica capaz de expressar uma glicoproteina pode ser introduzida numa estirpe de levedura metilotrófica que tenha sido previamente transformada. 6 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ
Alternativamente, pode ser transformada uma estirpe de levedura metilotrófica que tenha sido geneticamente modificada para expressar uma glicoproteína.
Para além disso, se uma estirpe de levedura metilotrófica não estiver transformada com uma sequência nucleotídica codificando uma glicoproteína de interesse nem qualquer um dos vectores, tal estirpe de levedura pode ser transformada, consecutivamente ou simultaneamente, com uma sequência nucleotídica capaz de expressar a glicoproteína e um ou mais vectores. Adicionalmente, uma estirpe de levedura metilotrófica pode ser transformada com um ou mais vectores knock-in e/ou knock-out que incluam também uma sequência nucleotídica capaz de expressar uma glicoproteína na estirpe de levedura metilotrófica. São também proporcionados estojos que incluem uma ou mais estirpes modificadas para produzirem glicoproteínas com reduzida glicosilação.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 representa vectores possuindo uma cassete de expressão de oí-1,2-manosidase de Trichoderma reesei marcada com HDEL e descreve o modo pelo qual estes vectores foram construídos de acordo com métodos conhecidos na arte. Abreviaturas utilizadas ao longo dos esquemas de construções: 5 Ά0Χ1 ou A0X1 P: sequência do promotor de A0X1 de Pichia pastoris; Amp R: gene de resistência à ampicilina; ColEl: origem de replicação ColEl; 3'AOXl: sequências 3' do gene AOXl de Pichia pastoris; HIS4: gene HIS4 de Pichia pastoris; AOX TT: sequência terminadora da transcrição do gene AOXl de
Pichia pastoris; ORF: enquadramento de leitura aberto; S: sinal de secreção; P TEF1: a sequência do promotor do gene do factor 1 de alongamento da transcrição de Saccharomyces cerevisiae; P EM7: promotor procariótico constitutivo sintético EM7; Zeocina: gene de resistência à Zeocina; CYC1 TT: extremidade 3' do gene CYC1 de S. cerevisiae; GAP: sequência do promotor do gene da gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase de Pichia pastoris; PpURA3: gene URA3 de Pichia pastoris. Tal como se pode observar nesta figura, a a-1,2-manosidase de Trichoderma reesei estava operativamente ligada 7 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ à sequência de codificação para a sequência sinal de secreção do factor de conjugação α de S. cerevisiae e ainda operativamente ligada no terminal 3' da sequência de codificação com a sequência de codificação para um péptido HDEL. A construção de fusão inteira estava operativamente ligada ao promotor A0X1 de P. pastoris (em pPIC9MFManHDEL) ou ao promotor GAP de P. pastoris (em pGAPZMFManHDEL). A Figura 2 representa vectores possuindo uma cassete de expressão de α-l,2-manosidase IB de Mus musculus marcada com HDEL e descreve o modo pelo qual estes vectores foram construídos de acordo com métodos conhecidos na arte. Tal como se pode observar nesta figura, o domínio catalítico da cx-1,2-manosidase IB de Mus musculus estava operativamente ligado à sequência de codificação para a sequência sinal de secreção do factor de conjugação α de S. cerevisiae e ainda operativamente ligado no terminal 3' da sequência de codificação com a sequência de codificação para um péptido HDEL. A construção de fusão inteira estava operativamente ligada ao promotor A0X1 de P. pastoris (em pPIC9mManHDEL) ou ao promotor GAP de P. pastoris (em pGAPZmManHDEL) . Para além disso, foram produzidas variantes da cassete de expressão nas quais a sequência de codificação para um epítopo marcador cMyc foi inserida entre a sequência de codificação para a sequência sinal de secreção do factor de conjugação α de S. cerevisiae e a sequência de codificação do domínio catalítico da cx-1,2-manosidase IB de Mus musculus. Esta cassete de expressão estava também operativamente ligada ao promotor A0X1 de P. pastoris (em pPIC9mMycManHDEL) ou ao promotor GAP de P. pastoris (em pGAPZmMycManHDEL). A Figura 3 representa vectores possuindo uma a-1,2-manosidase de Trichoderma reesei marcada com MycHDEL e o modo pelo qual estes vectores foram obtidos. A construção de fusão resultante estava novamente operativamente ligada ao promotor A0X1 de P. pastoris (em pPICZBMFManMycHDEL) ou ao promotor GAP de P. pastoris (em pGAPZMFManMycHDEL). A Figura 4 demonstra a localização intracelular da a-1,2-manosidase de Trichoderma reesei marcada com MycHDEL e indica o direccionamento para o RE através de análise de imunofluorescência. Painel A Western blotting. As estirpes de 8 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ levedura foram criadas em 10 ml de culturas de YPG até uma DC>6oo=10, diluídas cinco vezes e criadas em YPM durante 48 h. 1/50 do meio de cultura e 1/65 das células foram analisados através de SDS-PAGE e Western blotting com o anticorpo monoclonal de ratinho anti-Myc 9E10. A posição das proteínas marcadoras do peso molecular está indicada com setas. Pistas 1-5: lisados celulares. 1,2: transformantes de pGAPZMFManMycHDEL. 3: PPY120H não transformada (controlo negativo). 4,5: transformantes de pPICZBMFManMycHDEL. Pistas 6-10: meio de cultura. 6: PPY120H não transformada (controlo negativo). 7,8: transformantes de pGAPZMFManMycHDEL. 9,10: transformantes de pPICZBMFManMycHDEL. Painel B Microscopia de imunofluorescência. 1: imagem de contraste de fase de uma célula de P. pastoris (estirpe PPY120H transformada com pGAPZMFManHDEL) a uma ampliação de ΙΟΟΟχ. O núcleo é visível como uma elipse no quadrante inferior direito da célula. 2: A mesma célula que em 1, mas em modo de microscopia de fluorescência para mostrar a localização da proteína manosidase-Myc-HDEL de T. reesei. A proteína está principalmente localizada numa distribuição circular em torno do núcleo (envelope nuclear), o que é típico para uma distribuição estável no retículo endoplasmático. 3: imagem de contraste de fase de uma célula de P. pastoris (estirpe PPY120H transformada com pGAPZMFManHDEL) a uma ampliação de ΙΟΟΟχ. 4: a mesma célula em microscopia de fluorescência para mostrar a localização da proteína marcadora do Golgi OCHl-HA na estirpe PPY120H de P. pastoris. A distribuição semelhante a pontos ao longo do citoplasma, com 3-4 pontos por célula é típica da distribuição do Golgi cis em P. pastoris.
A Figura 5 representa a co-sedimentação de manosidase-MycHDEL com Dissulfureto-Isomerase de Proteínas (PDI) em centrifugação de gradiente de densidade de sacarose. O painel superior mostra a distribuição pelas diferentes fracções do gradiente de sacarose da proteína marcadora do Golgi OCHl-HA. 0 painel do meio mostra esta distribuição para a proteína marcadora do retículo endoplasmático Dissulfureto-Isomerase de Proteínas. Finalmente, o painel inferior mostra a distribuição da oí-1,2-manosidase de Trichoderma reesei marcada com MycHDEL pelas mesmas fracções. Concluiu-se que a manosidase-MycHDEL corresponde quase exactamente à distribuição do marcador do RE 9
ΕΡ 1 294 910/PT PDI e reside assim principalmente no RE das células de levedura de Pichia pastoris. A Figura 6 representa a análise de N-glicanos da trans-sialidase de Trypanosoma cruzi co-expressa com manosidase-HDEL de Trichoderma reesei. Painel A: escala de referência do tamanho de malto-oligossacáridos. Os tamanhos dos glicanos são expressos em Unidades de Glicose (UG) por comparação da sua mobilidade electroforética com a mobilidade destes malto-oligossacáridos. Painel B: N-glicanos derivados da trans- sialidase recombinante de Trypanosoma cruzi expressa em Pichia pastoris. 0 pico a UG=9,2 corresponde a MansGlcNAc2. Painel C: os mesmos objectos de análise que no Painel 2, mas após tratamento de um dia para o outro com 3 U/ml de a-1,2- manosidase recombinante purificada de T. reesei. Painel D: N-glicanos derivados da trans-sialidase recombinante co-expressa em Pichia pastoris com manosidase-HDEL de T. reesei (sob controlo do promotor GAP). 0 pico a UG=7,6 corresponde ao pico de Man5GlcNAc2 no perfil da ARNase B (Painel F) . Painel E: os mesmos objectos de análise que no Painel D, mas após tratamento de um dia para o outro com 3 mU/ml de a-1,2- manosidase recombinante purificada de T. reesei. Painel F: N-glicanos derivados da ARNase B bovina. Estes glicanos consistem em Man5GlcNAc2 a Man8GlcNAc2. São resolvidos diferentes isómeros, responsáveis pelo número de picos para Man7GlcNAc2. A Figura 7 representa o processamento de N-glicanos da hemaglutinina de influenza através de a-1,2-manosidase de
Trichoderma reesei marcada com HDEL e do domínio catalítico marcado com HDEL da a-1,2-manosidase IB de murídeo. 0 oligossacárido de referência Man5GlcNAc2 corre no varrimento 1850 nesta análise (não mostrado). Painel 1: escala de referência do tamanho de malto-oligossacáridos. Painel 2: N-glicanos derivados da hemaglutinina de influenza recombinante expressa em Pichia pastoris. O pico no varrimento 2250 corresponde a Man9GlcNAc2. Painel 3: N-glicanos derivados da hemaglutinina recombinante co-expressa em Pichia pastoris com manosidase-HDEL de T. reesei (sob controlo do promotor GAP) . O pico no varrimento 1950 corresponde a MangGlcNAC2. Painel 4: os mesmos objectos de análise que no Painel 3, mas após tratamento de um dia para o outro com 30 mU de a-1,2- 10
ΕΡ 1 294 910/PT manosidase recombinante purificada de T. reesei. Painel 5: N-glicanos derivados da hemaglutinina recombinante co-expressa em Pichia pastoris com manosidase IB-HDEL de ratinho (sob controlo do promotor GAP). Painel 6: os mesmos objectos de análise que no Painel 5, mas após tratamento de um dia para o outro com 30 mU de a-1,2-manosidase recombinante purificada de T. reesei. A Figura 8 representa graficamente o vector pBLURA5'PpOCHl e o modo pelo qual foi construído. A Figura 9 representa o esquema de destruição do gene OCHl de Pichia pastoris através de recombinação homóloga simples utilizando pBLURA5'PpOCHl. A Figura 10 representa a análise de N-glicanos das glicoproteínas da parede celular do clone com Ochl inactivado e de três clones derivados deste clone com Ochl inactivado através de transformação com PGAPZMFMANHDEL. O Painel 1 mostra a análise de uma mistura de malto-oligossacáridos, o grau de polimerização dos quais é dado através dos números no topo da figura. Esta análise serve como uma referência do tamanho para os outros painéis. No eixo vertical de todos os painéis, é dada a intensidade dos picos em unidades de fluorescência relativa. Painel 2-6: análise de N-glicanos das glicoproteínas da parede celular das seguintes estirpes: Painel 2, P. pastoris não modificada estirpe yGC4; Painel 3, yGC4 transformada com pBLURA5'PpOchl; 4-6, três clones da estirpe do Painel 3, suplementarmente transformada com pGAPZMFManHDEL. Painel 7: os N-glicanos derivados da ARNaseB bovina, consistindo numa mistura de Man5_9GlcNAc2. Tal como se pode observar da comparação entre o Painel 2 e o 3 e com referência ao Painel 7, a transformação com pBLURAS'PpOchl conduz a uma abundância fortemente aumentada do N-glicano substrato Man8GlcNAc2 (designado pico 1 no Painel 2) de OCHlp. O Pico 2 representa o produto Man9GlcNAc2 de OCHlp. Para além disso, após transformação suplementar de pGAPZMFManHDEL, o principal glicano nas glicoproteínas da parede celular de três clones independentes é o produto final Man5GlcNAc2 (pico 3 do Painel 4) da digestão com a-1,2-manosidase de T. reesei do substrato Man8GlcNAc2. 11
ΕΡ 1 294 910/PT A Figura 11 representa a análise de exactamente as mesmas misturas de glicanos que na Figura 10, mas após digestão in vitro com 3 mU/ml de a-1,2-manosidase purificada de Trichoderma reesei, de um dia para o outro em acetato de sódio 20 mM pH=5,0. A definição do eixo é a mesma que na Figura 10. Forma-se mais Man5GlcNAc2 na estirpe transformada com pBLURA5'PpOchl (Painel 3) que na estirpe parental (Painel 2). Os picos em todos painéis antes do varrimento 3900 devem-se a contaminantes e devem ser ignorados na análise. A Figura 12 representa o vector de expressão pGAPZAGLSII (SEQ ID NO:18). P TEF1: promotor do gene do factor de alongamento da transcrição de S. cerevisiae. P Em7: promotor procariótico sintético. Zeocina: gene marcador de resistência à zeocina. CYC1 TT: terminador da transcrição do gene Cl do citocromo de S. cerevisiae. Col El: origem de replicação bacteriana. GAP: promotor do gene GAP de P. pastoris. GLS2: gene da glucosidase II de S. cerevisiae. AOX1 TT: terminador da transcrição do gene AOXl de P. pastoris. A Figura 13 representa o vector de expressão pAOX2ZAGLSII (SEQ ID NO:16) . P TEF1: promotor do gene do factor de alongamento da transcrição de S. cerevisiae. P Em7: promotor procariótico sintético. Zeocina: gene marcador de resistência à zeocina. CYC1 TT: terminador da transcrição do gene Cl do citocromo de S. cerevisiae. Col El: origem de replicação bacteriana. AOX2 P: promotor do gene A0X2 de P. pastoris. GLS2: gene da glucosidase II de S. cerevisiae. AOXl TT: terminador da transcrição do gene AOXl de P. pastoris. A Figura 14 representa o vector de expressão pPICZAGLSII (SEQ ID NO:20) . P TEF 1: promotor do gene do factor de alongamento da transcrição de S. cerevisiae. P Em7: promotor procariótico sintético. Zeocina: gene marcador de resistência à zeocina. CYC1 TT: terminador da transcrição do gene Cl do citocromo de S. cerevisiae. Col El: origem de replicação. AOXl P: promotor do gene AOXl de P. pastoris. GLS2: gene da glucosidase II de S. cerevisiae. AOXl TT: terminador da transcrição do gene AOXl de P. pastoris. A Figura 15 representa o vector de expressão pYPTIZAGLSII (SEQ ID NO:22) . P TEF 1: promotor do gene do factor de 12 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ alongamento da transcrição de S. cerevisiae. P Em7: promotor procariótico sintético. Zeocina: gene marcador de resistência à zeocina. CYC1 TT: terminador da transcrição do gene Cl do citocromo de S. cerevisiae. Col Ei: origem de replicação. PYPT1: promotor do gene YPT1 de P. pastoris. GLS2: gene da glucosidase II de S. cerevisiae. A0X1 TT: terminador da transcrição do gene AOXl de P. pastoris. A Figura 16 representa o vector de expressão pGAPADElglsII (SEQ ID N0:19). Amp R: gene marcador de resistência à ampicilina. ADE1: gene marcador de selecção ADE1 de P. pastoris. GAP: promotor do gene GAP de P. pastoris. GLS2: gene da glucosidase II de S. cerevisiae. AOXl TT: terminador da transcrição do gene AOXl de P. pastoris. A Figura 17 representa o vector de expressão pA0X2ADElglsII (SEQ ID NO:17). Amp R: gene marcador de resistência à ampicilina. ADE1: gene marcador de selecção ADEl de P. pastoris. A0X2 P: promotor do gene A0X2 de P. pastoris. GLS2: gene da glucosidase II de S. cerevisiae. AOXl TT: terminador da transcrição do gene AOXl de P. pastoris. A Figura 18 representa o vector de expressão pPICADElglsII (SEQ ID N0:21). Amp R: gene marcador de resistência à ampicilina. ADEl: gene marcador de selecção ADEl de P. pastoris. AOXl P: promotor do gene AOXl de P. pastoris. GLS2: gene da glucosidase II de S. cerevisiae. AOXl TT: terminador da transcrição do gene AOXl de P. pastoris. A Figura 19 representa o vector de expressão pYPTIADElglsII (SEQ ID NO:23). Amp R: gene marcador de resistência à ampicilina. ADEl: gene marcador de selecção ADEl de P. pastoris. P YPT1: promotor do gene YPTl de P. pastoris. GLS2: gene da glucosidase II de S. cerevisiae. AOXl TT: terminador da transcrição do gene AOXl de P. pastoris. A Figura 20 representa o vector de expressão pGAPZAglsIIHDEL (SEQ ID NO:24). Amp R: gene marcador de resistência à ampicilina. ADEl: gene marcador de selecção ADEl de P. pastoris. GAP: promotor do gene GAP de P. pastoris. GLS2: gene da glucosidase II de S. cerevisiae. AOXl TT: terminador da transcrição do gene AOXl de P. pastoris. 13
ΕΡ 1 294 910/PT A Figura 21 representa o vector de expressão pGAPADElglsIIHDEL (SEQ ID NO:25). P TEF1: promotor do gene do factor de alongamento da transcrição de S. cerevisiae. P Em7: promotor procariótico sintético. Zeocina: gene marcador de resistência à zeocina. CYC1 TT: terminador da transcrição do gene Cl do citocromo de S. cerevisiae. Col El: origem de replicação bacteriana. GAP: promotor do gene GAP de P. pastoris. GLS2: gene da glucosidase II de S. cerevisiae. A0X1 TT: terminador da transcrição do gene AOXl de P. pastoris. A Figura 22 representa o teste do ensaio de actividade de GLSII utilizando uma alfa-glucosidase de levedura comercialmente disponível (Sigma: N.° de Cat. G-5003). A mistura do ensaio contém tampão fosfato-citrato pH 6,8, manose, 2-desoxi-D-glicose, o substrato 4-metilumbeliferil-alfa-D-glucopiranósido e alfa-glucosidase de Sigma. 1: mistura de ensaio iluminada com luz UV após incubação de um dia para o outro a 37°C; 2: o mesmo que 1, mas desta vez a mistura de ensaio não tem a alfa-glucosidase; 3: o mesmo que 1, mas desta vez a mistura de ensaio não tem o substrato. A Figura 23 representa os resultados da actividade da GLSII expressa de forma recombinante a partir de Pichia pastoris. Todas as misturas de ensaio foram incubadas de um dia para o outro a 37°C e posteriormente iluminadas com luz UV. 1: ensaio com alfa-glucosidase de levedura (Sigma: N.° de Cat. G-5003); 2: ensaio com o meio purificado da estirpe 18 (PPY12-0H transformada com pGAPZAGLSII); 3: ensaio com meio purificado da estirpe WT PPY12-0H; 4: ensaio com o meio purificado da estirpe H3 (PPY12-0H transformada com pGAPZAglsIIHDEL).
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO
Foi estabelecido que a maioria dos N-glicanos nas glicoproteínas que deixam o retículo endoplasmático (RE) de Pichia tem uma estrutura central de oligossacárido Man8GlcNAc2. Após as proteínas serem transportadas do RE para o aparelho de Golgi, são adicionados resíduos adicionais de manose a esta porção central de açúcar através de diferentes manosiltransferases, resultando em glicoproteínas com grandes 14 ΕΡ 1 294 910/PT cadeias laterais de manose. Tal hiperglicosilação de glicoproteinas recombinantes é indesejável em muitos casos. Assim, o presente invento proporciona métodos para modificar geneticamente estirpes de levedura metilotróficas para produzir glicoproteinas com glicosilação reduzida. São também proporcionadas estirpes de levedura metilotróficas geradas utilizando os presentes métodos. 0 presente invento utiliza uma sequência codificando para uma a-1,2-manosidase ou uma parte funcional desta, capaz de expressar a a-1,2-manosidase ou a parte funcional numa estirpe de levedura metilotrófica.
Uma a-1,2-manosidase cliva os resíduos de manose ligados em a-1,2 nas extremidades não redutoras de Man8GlcNAC2 e converte este oligossacárido central das glicoproteinas em Man5GlcNAc2· In vitro, MansGlcNAc2 é um substrato muito pobre de qualquer manosiltransferase do Golgi de Pichia, i.e., não podem ser adicionados resíduos de manose a esta estrutura de açúcar. Por outro lado, Man5GlcNAc2 é o substrato aceitador para a N-acetilglucosaminil-transferase I de mamífero e é um intermediário para as cadeias de açúcar de tipo híbrido e complexo características das glicoproteinas de mamífero. Assim, por meio da introdução de uma a-1,2-manosidase em leveduras metilotróficas tais como Pichia, podem ser produzidas glicoproteinas com reduzido teor de manose. A sequência nucleotídica codificando uma a-1,2-manosidase para utilizar no presente invento pode derivar de qualquer espécie. Vários genes de a-1,2-manosidase foram clonados e estão disponíveis para os peritos na arte, incluindo genes de mamífero codificando, p. ex., uma a-1,2-manosidase de murídeo (Herscovics et ai., J. Biol. Chem. 269: 9864-9871, 1994), uma a-1,2-manosidase de coelho (Lai et al., J. Biol. Chem. 269: 9872-9881, 1994) ou uma a-1,2-manosidase humana (Tremblay et al., Glycobiology 8: 585-595, 1998), bem como genes fúngicos codificando, p. ex., uma a-1,2-manosidase de Aspergillus (gene msdS), uma a-1,2-manosidase de Trichoderma reesei (Maras et al., J. Biotechnol. 11: 255-263, 2000), ou uma a-1,2-manosidase de Saccharomyces cerevisiae. A análise da sequência proteica revelou um elevado grau de conservação entre as a-1,2-manosidases eucarióticas identificadas até agora. 15
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De preferência, a sequência nucleotidica codifica uma a-1,2-manosidase fúngica, de preferência, uma a-1,2-manosidase de Trichoderma reesei e mais particularmente a a-1,2-manosidase de Trichoderma reesei descrita por Maras et ai., J. Biotechnol. 77: 255-63, 2000. A sequência nucleotidica pode também codificar para apenas uma parte funcional de uma a-1,2-manosidase.
Por "parte funcional" entenda-se um fragmento polipeptidico de uma a-1,2-manosidase que mantém substancialmente a actividade enzimática da proteína inteira. Por "substancialmente" entenda-se que é mantida pelo menos cerca de 40% ou de preferência pelo menos 50% ou mais da actividade enzimática da a-1,2-manosidase inteira. Por exemplo, tal como ilustrado pelo presente invento, o domínio catalítico da a-1,2-manosidase IB de murídeo constitui uma "parte funcional" da a-1,2-manosidase IB de murídeo. Os peritos na arte podem facilmente identificar e fazer partes funcionais de uma a-1,2-manosidase utilizando uma combinação de técnicas conhecidas na arte. As previsões das porções de uma a-1,2-manosidase essencial ou suficiente para conferir a actividade enzimática podem ser feitas com base na análise da sequência proteica. A actividade de uma porção de uma a-1,2-manosidase de interesse, expressa e purificada a partir de um sistema de expressão apropriado, pode ser verificada utilizando ensaios in vitro ou in vivo aqui descritos abaixo.
No presente invento, uma a-1,2-manosidase ou uma parte funcional desta expressa numa estirpe de levedura metilotrófica é de preferência direccionada a um local na via de secreção onde Man8GlcNAc2 (o substrato de a-1,2-manosidase) está já formado numa glicoproteína, mas não alcançou uma gl icosiltransferase do Golgi que alonga a cadeia de açúcar com resíduos adicionais de manose.
Assim, numa concretização preferida do presente invento, o vector de expressão de a-1,2-manosidase é desenhado de modo a que a a-1,2-manosidase ou uma parte funcional desta expressa a partir do vector inclua um sinal de retenção no RE. 16 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ "Um sinal de retenção no RE" refere-se a uma sequência peptídica que dirige uma proteína possuindo uma tal sequência peptídica para ser transportada para o RE e aí retida. Tais sequências de retenção no RE são frequentemente encontradas em proteínas que residem e funcionam no RE.
Estão disponíveis aos peritos na arte múltiplas escolhas de sinais de retenção no RE, p. ex., os primeiros 21 resíduos de aminoácidos da proteína do RE MNS1 de S. cerevisiae (Martinet et ai., Biotechnology Letters 20: 1171-1177, 1998).
Um sinal de retenção no RE preferido é o péptido HDEL (SEQ ID NO:l). A sequência do péptido HDEL, verificada no terminal C de várias proteínas de levedura, actua como um sinal de retenção/recuperação para o RE (Pelham, EMBO J. 7: 913-918, 1988) . As proteínas com uma sequência HDEL ligam-se a um receptor ligado à membrana (Erd2p) e depois entram numa via de transporte retrógrado para regresso ao RE a partir do aparelho de Golgi.
De acordo com o presente invento, um sinal de retenção no RE pode ser colocado em qualquer local na sequência proteica de uma a-1,2-manosidase, mas de preferência no terminal C da a-1,2-manosidase. A a-1,2-manosidase pode ainda ser modificada, p. ex., através da inserção de um marcador epitópico para o qual estão disponíveis anticorpos, tais como os marcadores Myc, HA, FLAG e His6 bem conhecidos na arte. Uma a-1,2-manosidase marcada com um epítopo pode ser convenientemente purificada ou monitorizada tanto quanto à expressão como à localização intracelular.
Um sinal de retenção no RE e um marcador epitópico podem ser facilmente introduzidos numa proteína de interesse através da inserção de sequências nucleotídicas codificando para tal sinal ou marcador na sequência nucleotídica codificando a proteína de interesse, utilizando qualquer uma das técnicas de biologia molecular conhecidas na arte.
Noutra concretização preferida, o vector inclui uma sequência de codificação para uma glucosidase II ou uma parte 17 ΕΡ 1 294 910/PT funcional desta que é capaz de expressar a glucosidase II ou a parte funcional desta na estirpe de levedura metilotrófica.
Foi estabelecido que o oligossacárido inicial ligado em N (GlC3Man9GlcNAc2) , transferido no RE para uma proteína, é clivado no RE através de glucosidases específicas para remover os resíduos de glicose e através de uma manosidase para remover uma manose específica ligada em a-1,2. Foi observado pelos presentes inventores que algumas proteínas recombinantes expressas em Pichia têm resíduos de glicose residuais na porção açúcar quando tais proteínas deixam o RE para o aparelho de Golgi. As moléculas residuais de glicose presentes na estrutura de açúcar impedem a completa digestão da porção açúcar através de uma cx-1,2-manosidase, e a introdução de uma glucosidase exógena pode facilitar a remoção destes resíduos de glicose. A sequência nucleotídica codificando uma glucosidase II pode derivar de qualquer espécie. Genes de glucosidase II foram clonados a partir de várias espécies de mamífero incluindo de rato, ratinho, porco e humano. A proteína glucosidase II destas espécies de mamífero consiste numa subunidades alfa e uma beta. A subunidade alfa tem cerca de 110 kDa e contém a actividade catalítica da enzima, enquanto a subunidade beta possui uma sequência de retenção no RE HDEL C-terminal e crê-se que seja importante para a localização no RE da enzima. O gene da glucosidase II de S. cerevisiae também foi clonado (ORF YBR229c, localizado no cromossoma II). Este gene codifica uma proteína de cerca de 110 kDa, que mostra um elevado grau de homologia com a subunidade alfa de mamífero.
Um gene de glucosidase II preferido para utilizar nos vectores é de uma espécie fúngica tal como Pichia pastoris e S. cerevisiae. Um exemplo de um gene de glucosidase II fúngica é o gene da subunidade alfa da glucosidase II de S. cerevisiae. A sequência nucleotídica pode também codificar apenas uma parte funcional de uma glucosidase II. Por "parte funcional" entenda-se um fragmento polipeptídico de uma glucosidase II que mantém substancialmente a actividade enzimática da proteína inteira. Por "substancialmente" entenda-se que é 18 ΕΡ 1 294 910/PT mantida pelo menos cerca de 40%, ou de preferência pelo menos 50% ou mais da actividade enzimática da glucosidase II inteira. As partes funcionais de uma glucosidase II podem ser identificadas e produzidas pelos peritos na arte utilizando uma variedade de técnicas conhecidas na arte.
Numa concretização preferida do presente invento, a proteína glucosidase II é modificada para incluir um sinal de retenção no RE de modo a que a proteína expressa numa estirpe de levedura metilotrófica seja direccionada ao RE e se mantenha aí para funcionar. Os sinais de retenção no RE são tal como aqui descrito acima, p. ex., a sequência peptídica HDEL . A glucosidase II pode ainda ser modificada, p. ex., através da inserção de um marcador epitópico para a qual estão disponíveis anticorpos, tal como o marcador Myc, HA, FLAG e His6, que são bem conhecidos na arte.
Ainda de acordo com o presente invento, a sequência nucleotídica codificando para a enzima a expressar (p. ex., uma a-1,2-manosidase ou uma parte funcional desta; uma glucosidase II ou uma parte funcional desta) pode ser colocada numa ligação operativa a um promotor e a uma sequência terminadora a 3'.
Promotores apropriados para expressão de uma proteína numa levedura metilotrófica podem incluir tanto promotores constitutivos como promotores indutíveis. Os promotores constitutivos incluem, p. ex., o promotor da gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase de Pichia pastoris ("o promotor GAP"). Exemplos de promotores indutíveis incluem, p. ex., o promotor da álcool-oxidase I de Pichia pastoris ("o promotor AOXI") (Patente U.S. N.° 4855231), ou o promotor da formaldeído-desidrogenase de Pichia pastoris ("o promotor FLD") (Shen et ai., Gene 216: 93-102, 1998).
Sequências de terminação a 3' são sequências a 3' do codão de terminação de um gene estrutural que funcionam estabilizando o produto da transcrição de ARNm do gene a cuja sequência estão operativamente ligadas, tais como sequências que provocam poliadenilação. As sequências de terminação a 3' 19 ΕΡ 1 294 910/PT podem ser obtidas de Pichia ou de outra levedura metilotrófica. Exemplos de sequências de terminação a 3' de Pichia pastoris úteis para a prática do presente invento incluem sequências de terminação do gene AOXl, do gene p40, do gene HIS4 e do gene FLDl.
Os vectores contêm de preferência um gene marcador seleccionável. 0 marcador seleccionável pode ser qualquer gene que confira um fenótipo seleccionável a uma estirpe de levedura metilotrófica e permita que as células transformadas sejam identificadas e seleccionadas das células não transformadas. 0 sistema marcador seleccionável pode incluir uma estirpe de levedura metilotrófica mutante auxotrófica e um gene de tipo selvagem que complementa o defeito do hospedeiro. Exemplos de tais sistemas incluem o gene HIS4 de Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris que pode ser utilizado para complementar estirpes de Pichia his4r ou o gene ARG4 de S. cerevisiae ou Pichia pastoris que pode ser utilizado para complementar mutantes arg de Pichia pastoris. Outros genes marcadores seleccionáveis que funcionam em Pichia pastoris incluem o gene ZeoR, o gene G418R e semelhantes.
Os vectores podem também incluir uma sequência de replicação autónoma (ARS). Por exemplo, a Patente U.S. N.° 4837148 descreve sequências de replicação autónoma que proporcionam um meio adequado para manter plasmídeos em Pichia pastoris.
Os vectores podem também conter genes marcadores seleccionáveis que funcionam em bactérias, bem como sequências responsáveis pela replicação e manutenção extracromossómica em bactérias. Exemplos de genes marcadores seleccionáveis bacterianos incluem genes de resistência à ampicilina (Amp1) , de resistência à tetraciclina (Tet), de resistência à neomicina, de resistência à higromicina e de resistência à zeocina (ZeoR) . A sequência nucleotídica codificando a proteína a expressar numa levedura metilotrófica pode ser colocada num vector integrativo ou num vector replicativo (tal como um plasmídeo circular replicativo). 20 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ
Vectores integrativos são divulgados, p. ex., na Patente U.S. N.° 4882279.
Os vectores integrativos incluem geralmente uma seguência disposta em série de pelo menos um primeiro fragmento de ADN inserivel, um gene marcador seleccionável e um segundo fragmento de ADN inserivel. O primeiro e o segundo fragmentos de ADN inseriveis têm cada um cerca de 200 nucleótidos de comprimento e possuem sequências nucleotidicas que são homólogas a porções do ADN genómico das espécies a transformar. Uma sequência nucleotidica contendo um gene estrutural de interesse para expressão é inserida neste vector entre o primeiro e o segundo fragmentos de ADN inseriveis antes ou após o gene marcador. Os vectores integrativos podem ser linearizados antes da transformação de leveduras para facilitar a integração da sequência nucleotidica de interesse no genoma da célula hospedeira.
Vectores replicativos e integrativos possuindo uma ou ambas as sequências de codificação de cx-1,2-manosidase e glucosidase II podem ser construídos através de técnicas
padrão, conhecidas dos peritos na arte e verificadas, por exemplo, em Sambrook et al., em "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual", 1989 ou qualquer um de uma miríade de manuais de laboratório sobre tecnologia de ADN recombinante que está amplamente disponível.
Vectores preferidos possuindo uma sequência de expressão de a-1,2-manosidase incluem pGAPZMFManHDEL, pGAPZMFManMycHDEL, pPICZBMFManMycHDEL, pGAPZmManHDEL, pGAPZmMycManHDEL, pPIC9mMycManHDEL e pGAPZmMycManHDEL, que são melhor descritos nos Exemplos aqui abaixo. 0 vector preferido possuindo uma sequência de expressão de glucosidase II inclui pGAPZAGLSII, pPICZAGLSII, PAOX2ZAGLSII, pYPTIZAGLSII, pGAPADElglsII, pPICADElglsII, pAOX2ADElgls11, pYPTIADElDElgls11, pGAPZAglsIIHDEL e pGAPADElglsIIHDEL, que são melhor descritos nos Exemplos aqui abaixo. 21
ΕΡ 1 294 910/PT Ο presente invento utiliza um vector "knock-out" que, quando introduzido numa estirpe de levedura metilotrófica, inactiva ou destrói o gene Ochl. O gene OCH1 de S. cerevisiae foi clonado (Nakayama et al. , EMBO J. 11: 2511-2519, 1992). Codifica uma oí-1,6-manosiltransferase ligada à membrana, localizada no complexo de Golgi inicial, que é funcional na iniciação da adição da cadeia externa da a-1,6-polimanose ao oligossacárido central ligado em N (Man5GlcNAc2 e MansGlcNAc2) (Nakanishi-Shindo et al., J. Biol. Chem. 268: 26338-26345, 1993).
Foi descrita uma sequência de Pichia no Pedido de Patente Japonesa N.° 07145005 que codifica uma proteína altamente homóloga a 0CH1 de S. cerevisiae. Para os fins do presente invento, esta sequência é aqui designada como "o gene OCHl de Pichia". Os peritos na arte podem isolar os genes OCHl de outras leveduras metilotróficas utilizando técnicas bem conhecidas na arte.
De acordo com o presente invento, uma destruição do gene OCHl de uma levedura metilotrófica pode resultar na produção de um produto proteico inactivo ou na ausência de produto. A destruição pode ter a forma de uma inserção de uma sequência de ADN heteróloga na sequência de codificação e/ou da deleção de parte ou de toda a sequência de codificação. As destruições de genes podem ser geradas através de recombinação homóloga essencialmente como descrito por Rothstein (em Methods in Enzymology, Wu et al., eds., vol 101: 202-211, 1983).
Para destruir o gene Ochl através de recombinação homóloga, pode ser construído um vector knock-out de Ochl de modo a incluir um gene marcador seleccionável. O gene marcador seleccionável é operativamente ligado, tanto na extremidade 5' como na 3', a porções do gene Ochl de comprimento suficiente para mediar a recombinação homóloga. O marcador seleccionável pode ser um de vários genes que complementem a auxotrofia da célula hospedeira ou proporcionem resistência a um antibiótico, incluindo os genes URA3, LEU2 e HIS3. Outros marcadores seleccionáveis adequados incluem o gene CAT, que confere resistência a cloranfenicol em células de levedura, ou o gene lacZ, que resulta em colónias azuis devido à expressão 22 ΕΡ 1 294 910/PT de β-galactosidase activa. Fragmentos de ADN linearizados de um vector knock-out de Ochl são então introduzidos em células de levedura metilotrófica hospedeiras utilizando métodos bem conhecidos na arte. A integração dos fragmentos lineares no genoma e a destruição do gene Ochl podem ser determinadas com base no marcador seleccionável e podem ser verificadas através, por exemplo, de análise Southern blot.
Alternativamente, pode ser construído um vector knock-out de Ochl de modo a incluir uma porção do gene Ochl a destruir, cuja porção é desprovida de qualquer sequência promotora de Ochl e não codifica nenhum fragmento ou codifica um fragmento inactivo da proteína Ochl. Por “fragmento inactivo", entenda-se um fragmento da proteína Ochl que tenha, de preferência, menos de cerca de 10% e de maior preferência, cerca de 0% da actividade da proteína OCH1 inteira. Tal porção do gene OCHl é inserida num vector de modo a que nenhuma sequência de promotor conhecida fique operativamente ligada à sequência de OCHl, mas que um codão de terminação e uma sequência de terminação da transcrição fiquem operativamente ligadas à porção do gene Ochl. Este vector pode ser subsequentemente linearizado na porção da sequência OCHl e transformado numa estirpe de levedura metilotrófica utilizando qualquer um dos métodos conhecidos na arte. Por meio de recombinação homóloga simples, este vector linearizado é então integrado no gene OCHl. São produzidas duas sequências de Ochl no cromossoma em resultado da recombinação homóloga simples. A primeira sequência de Ochl é a porção do gene Ochl do vector, que fica agora sob o controlo do promotor OCH1 da levedura metilotrófica hospedeira, contudo não pode produzir uma proteína OCH1 activa uma vez que tal sequência de Ochl não codifica para nenhum fragmento ou codifica para um fragmento inactivo da proteína OCH1, tal como aqui descrito acima. A segunda sequência de Ochl é uma sequência de codificação de OCH1 inteira, mas que não está operativamente ligada a qualquer sequência promotora conhecida e, assim, não se espera que se forme qualquer mensageiro activo para síntese de uma proteína OCH1 activa. De preferência, é introduzida uma mutação inactivadora na sequência de OCH1, na extremidade 5' do local de linearização do vector e na extremidade 3' do codão de iniciação da tradução de OCHl. Por “mutação inactivadora" entenda-se uma mutação que introduz um codão de 23 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ terminação, uma mutação de mudança de enquadramento ou qualquer outra mutação causando uma destruição do enquadramento de leitura. Tal mutação pode ser introduzida numa sequência de Ochl utilizando qualquer um dos métodos de mutagénese dirigida ao local conhecidos na arte. Tal mutação inactivadora assegura que não pode ser formada nenhuma proteína 0CH1 funcional mesmo que existam algumas sequências promotoras a 5' da sequência de Ochl no vector knock-out.
Um vector knock-out de Ochl preferido é pBLURA5'PpOCHl.
Se desejado, a sequência de expressão de uma manosidase ou a sequência de expressão de uma glucosidase ou ambas podem estar contidas no mesmo plasmídeo utilizado para destruir o gene 0CH1 para criar um vector "knock-in-e-knock-out".
Adicionalmente, qualquer um dos vectores acima descritos pode ainda incluir uma sequência nucleotídica capaz de expressar uma glicoproteína de interesse numa estirpe de levedura metilotrófica.
Outro aspecto do presente invento é dirigido a métodos de modificação de estirpes de levedura metilotróficas para reduzir a glicosilação em proteínas produzidas pelas estirpes de levedura metilotróficas. De acordo com os presentes métodos, estirpes de levedura metilotróficas são modificadas através da transformação nestas estirpes de levedura de vectores tal como aqui descritos acima, e tal como definido nas reivindicações.
Estirpes de levedura metilotróficas que podem ser modificadas utilizando os presentes métodos incluem mas não se limitam a leveduras capazes de crescer em metanol tais como leveduras dos géneros Candida, Hansenula, Torulopsis e Pichia. Uma lista de espécies que são exemplares desta classe de leveduras pode ser verificada em C. Anthony (1982) "The Biochemistry of Methylotrophs", 269. Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia anomola, Hansenula polymorpha e Candida boidinii são exemplos de leveduras metilotróficas úteis na prática do presente invento. As leveduras metilotróficas preferidas são do género Pichia. Especialmente preferidas são as estirpes de Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851); GS190 24 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ (NRRL Υ-18014) divulgadas na Patente U.S. N.° 4818700; PPF1 (NRRL Y-18017) divulgada na Patente U.S. N.° 4812405; PPY120H e yGC4; bem como estirpes derivadas destas.
Estirpes de levedura metilotróficas que podem ser modificadas utilizando os presentes métodos incluem também as estirpes de levedura metilotróficas que foram geneticamente modificadas para expressarem uma ou mais glicoproteinas heterólogas de interesse. A glicosilação das glicoproteinas heterólogas expressas a partir destas estirpes previamente modificadas pode ser reduzida através da transformação de tais estirpes.
Os vectores podem ser introduzidos nas células de uma estirpe de levedura metilotrófica utilizando métodos conhecidos tais como a técnica de esferoplastos, descrita por Cregg et al., 1985, ou o sistema de transformação de levedura de células inteiras com cloreto de litio, Ito et al., Agric. Biol. Chem. 48: 341, modificado para utilização em Pichia tal como descrito em EP 312934. Outros métodos publicados úteis para transformação dos plasmídeos ou vectores lineares incluem Patente U.S. N.° 4929555; Hinnen et al., Proc. Nat. Acad Sei. USA 75: 1929, 1978; Ito et al. , J. Bacteriol. 153: 163, 1983; Patente U.S. N.° 4879231; Sreekrishna et al., Gene 59: 115, 1987. Podem também ser utilizados procedimentos de electroporação e transformação de células inteiras com PEG1000. Cregg e Russel "Methods in Molecular Biology: Pichia Protocols", Capítulo 3, Humana Press, Totowa, N.J., págs. 27-39, 1998.
As células de levedura transformadas podem ser seleccionadas através da utilização de técnicas apropriadas incluindo mas não se limitando à cultura de células auxotróficas após transformação na ausência do produto bioquímico requerido (devido à auxotrofia das células), selecção e detecção de um novo fenótipo, ou cultura na presença de um antibiótico que seja tóxico para a levedura na ausência de um gene de resistência contido nos transformantes. Os transformantes podem também ser seleccionados e/ou verificados através da integração da cassete de expressão no genoma, o que pode ser avaliado p. ex., através de Southern blot ou análise de PCR. 25
ΕΡ 1 294 910/PT A expressão de uma a-1,2-manosidase introduzida numa estirpe de levedura metilotrófica pode ser verificada tanto ao nivel do ARNm, p. ex., através de análise Northern Blot, como ao nivel proteico, p. ex., através de análise Western Blot. A localização intracelular da proteína pode ser analisada através da utilização de uma variedade de técnicas, incluindo fraccionamento subcelular e experiências de imunof luorescência. Uma localização no RE de uma a-1,2-manosidase pode ser determinada através de co-sedimentação desta enzima com uma proteína residente no RE conhecida (p. ex., a Dissulfureto-Isomerase de Proteínas) numa experiência de fraccionamento subcelular. Uma localização no RE pode também ser determinada através de um padrão de coloração de imunofluorescência característico de proteínas residentes no RE, tipicamente um padrão de coloração perinuclear.
Para confirmar que uma a-1,2-manosidase ou uma parte funcional desta expressa numa estirpe de levedura metilotrófica tem a actividade de corte da manose esperada, podem ser utilizados ensaios tanto in vitro como in vivo. Tipicamente, um ensaio in vitro envolve a digestão de um substrato sintetizado in vitro, p. ex., MansGlcNAc2, com a enzima expressa e purificada a partir uma estirpe de levedura metilotrófica, e a avaliação da capacidade de tal enzima para cortar Man8GlcNAc2, p. ex., em Man5GlcNAc2. Em ensaios in vivo, a a-1,2-manosidase ou uma parte desta é co-expressa numa levedura metilotrófica com uma glicoproteína que se sabe estar glicosilada com N-glicanos possuindo resíduos de manose terminais ligados em a-1,2 em tal levedura. A actividade enzimática de tal a-1,2-manosidase, ou uma parte desta, pode ser medida com base na redução do número de resíduos de manose ligados em a-1,2 nas estruturas dos N-glicanos da glicoproteína. Tanto nos ensaios in vitro como in vivo, a composição de um grupo hidrato de carbono pode ser determinada utilizando técnicas que são bem conhecidas na arte e estão aqui ilustradas nos Exemplos abaixo. A actividade enzimática de uma glucosidase II ou de uma parte funcional desta expressa numa estirpe de levedura metilotrófica transformada pode ser avaliada utilizando uma variedade de ensaios. Por exemplo, as células de levedura 26
ΕΡ 1 294 910/PT metilotrófica transformadas com uma sequência codificando uma glucosidase II ou uma parte desta podem ser postas a crescer em meio sólido contendo um substrato da glucosidase, p. ex., 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-glucopiranósido ou 4-MU-a-D-Glc. Quando a enzima é expressa por Pichia e segregada
extracelularmente, a enzima actua sobre o substrato, dando origem a sinais detectáveis em torno das colónias tais como cor azul ou brilho fluorescente. Alternativamente, o meio de cultura liquido contendo as moléculas da proteína expressa pode ser colhido e incubado em tubos de ensaio com um substrato, p. ex., p-nitrofenil-a-D-glucopiranósido. A actividade enzimática pode ser determinada através da medição do produto específico libertado. Para além disso, podem ser empregues ensaios in vivo, em que uma glucosidase II é co-expressa em levedura com uma glicoproteína que se saiba ser N-glicosilada com resíduos de glicose, p. ex., neuraminidase de influenza. A actividade enzimática da glucosidase II pode ser medida com base na redução do teor de glicose na cadeia ou cadeias de açúcar da glicoproteína.
No presente invento, uma estirpe de levedura metilotrófica pode ser transformada com um vector knock-out de Ochl. Como resultado da transformação e da integração do vector, o gene Ochl genómico nas estirpes de levedura é destruído.
No presente invento, uma estirpe de levedura metilotrófica é transformada através de transformações consecutivas em série, i.e., introduzindo um vector de cada vez, ou alternativamente através de co-transformação, i.e., introduzindo os vectores simultaneamente.
As estirpes de levedura metilotróficas modificadas aqui descritas acima podem ainda ser modificadas se desejado. Por exemplo, pode ser feita a destruição adicional de genes codificando quaisquer outras manosiltransferases de Pichia. Podem também ser introduzidos genes codificando enzimas de mamífero para produzir glicoproteínas possuindo N-glicanos de tipo híbrido ou complexo, se desejado.
Deve entender-se que certos aspectos do presente invento, especif icamente a introdução de uma actividade de oí-1,2- 27 ΕΡ 1 294 910/PT manosidase expressa intracelularmente, são também úteis para obter uma reduzida glicosilação dos glicanos ligados em 0 em glicoproteinas produzidas numa levedura metilotrófica, uma vez que é conhecido na arte que estes glicanos ligado em 0 consistem principalmente em resíduos de manose ligados em oí-1,2. Os glicanos ligados em 0, tal como aqui utilizados, referem-se a estruturas de hidratos de carbono ligadas a resíduos de serina ou treonina das glicoproteinas.
Um outro aspecto do presente invento é dirigido a métodos de produção de uma glicoproteína com reduzida glicosilação numa levedura metilotrófica, especificamente uma glicoproteína heteróloga à levedura metilotrófica. "Uma glicoproteína" tal como aqui se utiliza refere-se a uma proteína que, em leveduras metilotróficas, é glicosilada num ou mais resíduos de asparagina ou num ou mais resíduos de serina ou treonina ou em ambos resíduos de asparagina e de serina ou treonina. 0 termo "glicosilação reduzida" refere-se a um tamanho reduzido da porção hidrato de carbono na glicoproteína, particularmente com menos resíduos de manose, quando a glicoproteína é expressa numa estirpe de levedura metilotrófica que foi modificada de acordo com o presente invento, em comparação com uma estirpe de tipo selvagem não modificada da levedura metilotrófica.
De acordo com o presente invento, a produção de uma glicoproteína de interesse com reduzida glicosilação pode ser alcançada de vários modos. Uma sequência nucleotídica capaz de expressar uma glicoproteína pode ser introduzida numa estirpe de levedura metilotrófica que tenha sido previamente modificada de acordo com o presente invento, i.e., uma estirpe transformada com um ou mais vectores e capaz de produzir glicoproteinas com reduzida glicosilação. Alternativamente, uma estirpe de levedura metilotrófica que tenha sido já geneticamente modificada para expressar uma glicoproteína pode ser transformada com um ou mais dos vectores. De outro modo, se uma estirpe de levedura metilotrófica não expressar uma glicoproteína de interesse, nem estiver a estirpe transformada com qualquer um dos vectores, tal estirpe de levedura pode ser 28 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ transformada, consecutiva ou simultaneamente, com uma sequência nucleotidica capaz de expressar então a glicoproteina e um ou mais vectores. Adicionalmente, uma estirpe de levedura metilotrófica pode ser transformada com um ou mais vectores knock-in e/ou knock-out que incluem também uma sequência nucleotidica capaz de expressar uma glicoproteina na estirpe de levedura metilotrófica. A sequência nucleotidica capaz de expressar uma glicoproteina numa levedura metilotrófica pode ser produzida de modo a incluir de 5' para 3', um promotor, uma sequência codificando a glicoproteina e uma sequência de terminação a 3' . Os promotores e as sequências de terminação a 3' que são adequados para expressão de uma glicoproteina podem incluir qualquer um dos promotores e sequências de terminação a 3' aqui descritos acima. A sequência nucleotidica para expressão de uma glicoproteina pode incluir sequências adicionais, p. ex., sequências sinal codificando para péptidos de trânsito quando é desejada a secreção de um produto proteico. Tais sequências são amplamente conhecidas, estão facilmente disponíveis e incluem prepro do factor de conjugação alfa de Saccharomyces cerevisiae (amf), a sequência sinal da fosfatase ácida (PH01) de Pichia pastoris e semelhantes. A sequência nucleotidica para expressão de uma glicoproteina pode ser colocada num vector replicativo ou num vector integrativo. A escolha e a construção de tais vectores são tal como aqui descrito acima. A sequência nucleotidica capaz de expressar uma glicoproteina pode ser transportada no mesmo plasmideo replicativo que uma unidade de expressão de a-1,2-manosidase ou glucosidase II do plasmideo. Alternativamente, a sequência nucleotidica contendo a sequência de codificação da glicoproteina é transportada num plasmideo separado ou integrada no genoma do hospedeiro.
As glicoproteínas podem ser purificadas através de métodos convencionais. Os protocolos de purificação podem ser determinados através da natureza da proteína específica a 29
ΕΡ 1 294 910/PT purificar. Tal determinação está dentro do nivel vulgar de perícia na arte. Por exemplo, o meio de cultura de células é separado das células e a proteína segregada pelas células pode ser isolada do meio através de técnicas de isolamento de rotina tais como precipitação, imunoadsorção, fraccionamento ou uma variedade de métodos cromatográficos.
As glicoproteínas que podem ser produzidas através dos métodos do presente invento incluem, p. ex., α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens, invertase de S. cerevisiae, trans-sialidase de Trypanosoma cruzi, proteína do envelope de VIH, hemaglutinina do vírus influenza A, neuraminidase de influenza, glicoproteína D do vírus de herpes bovino de tipo 1, angiostatina humana, receptor CTLA-4 de B7-1, B7-2 e B-7 humano, factor tecidual humano, factores de crescimento (p. ex., factor de crescimento derivado de plaquetas), activador do plasminogénio tecidual, inibidor I do activador do plasminogénio, uroquinase, proteínas lisossómicas humanas tais como α-galactosidase, plasminogénio, trombina, factor XIII e imunoglobulinas. Para glicoproteínas úteis adicionais que podem ser expressas nas estirpes de Pichia geneticamente modificadas do presente invento, ver Bretthauer e Castellino, Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 193-200, 1999, e
Kukuruzinska et ai., Ann. Rev. Biochem. 56: 915-44, 1984.
Ainda outro aspecto do presente invento proporciona estojos que contêm uma estirpe de levedura metilotrófica que foi transformada de acordo com o presente invento. EXEMPLO 1
Introdução de a-1,2-Manosidase na Fronteira RE-Golgi 1.1 Plasmídeos
Plasmídeo Promotor Enzima Marcador pGAPZMFManHDEL GAP a-1,2-manosidase de T. reesei — pGAPZMFManMycHDEL GAP a-1,2-manosidase de T. reesei Myc pPICZBMFManMycHDEL AOX1 a-1,2-manosidase de Γ. reesei Myc pGAPZMFmManHDEL GAP domínio catalítico da manosidase IB de ratinho — pGAPZMFmMycManHDEL GAP domínio catalítico da manosidase IB de ratinho Myc 30 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ Ο gene da α-1,2-manosidase de Trichoderma reesei foi isolado e descrito por Maras et al. (J. Biotechnol. 77: 255-263, 2000). A sequência deste gene está disponível em NCBI Genbank sob o N.° de Entrada AF212153. Foi gerado um fragmento de construção através de PCR utilizando o plasmídeo pPIC9MFmanase (o mesmo que pPPIMFmdsl descrito por Maras et al., 2000) como molde e utilizando os seguintes iniciadores oligonucleotídicos: 5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3' (SEQ ID NO: 2) e 5'-AGTCTAGATTACAACTCGTCGTGAGCAAGGTGGCCGCCCCGTCG-3' (SEQ ID NO:3). O produto resultante continha a extremidade 3' do promotor AOXI de Pichia pastoris, a sequência sinal prepro do factor de conjugação α S. cerevisiae, o enquadramento de leitura aberto da α-l,2-manosidase de Trichoderma reesei clonado enquadrado com a sequência sinal, a sequência de codificação para HDEL, um codão de terminação e um local de restrição XhaI. Este fragmento foi digerido com EcoRI e Xbal, removendo as sequências 5' até ao ORF da manosidase e depois clonado no vector pGAPZaA (Invitrogen, Baarn, Holanda) que tinha sido digerido com EcoRI e Xbal, restaurando assim a fusão com a sequência sinal do factor de conjugação α de S. cerevisiae. 0 plasmídeo resultante foi designado pGAPZMFManHDEL e está graficamente representado na Figura 1. A sequência do ORF da fusão MFManHDEL em pGAPZMFManHDEL está exposta em SEQ ID NO:14.
Para introduzir a sequência de codificação para um marcador c-Myc entre o domínio catalítico e o sinal HDEL, a extremidade 3' do ORF da α-l, 2-manosidase de T. reesei foi amplificada por PCR utilizando um iniciador de sentido directo 5'-CCATTGAGGACGCATGCCGCGCC-3' (SEQ ID NO:4) (contendo um local de restrição SphI) e um iniciador anti-sentido GTATCTAGATTACAACTCGTCGTGCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCAGCAAGGT GGCCGCCCCGTCGTGATGATGAA (SEQ ID NO:5) (contendo as sequências de codificação do marcador c-Myc e o sinal HDEL, seguido de um codão de terminação e de um local de restrição Xbal) . O produto de PCR resultante foi digerido com Sphl e Xbal, purificado através de electroforese em gel de agarose e inserido em pGAPZMFManHDEL que tinha sido cortado com as mesmas enzimas de restrição, resultando no plasmídeo pGAPZMFManMycHDEL. Para colocar o ORF de pGAPZMFManMycHDEL sob o controlo do promotor indutível AOXI, o ORF inteiro foi libertado de pGAPZMFManMycHDEL com BstBI e Xbal e clonado em 31 ΕΡ 1 294 910/PT pPICZB (Invitrogen, Baarn, Holanda), resultando em pPICZBMFManMycHDEL. A clonagem do domínio catalítico da manosidase IB de ratinho com concomitante adição da seguência de codificação para um marcador HDEL C-terminal foi feita através de PCR numa biblioteca de ADNc de ratinho (ARNm isolado da linha celular L929 induzida com ciclo-heximida e Factor de Necrose Tumoral de ratinho. 0 comprimento médio da inserção da biblioteca de ADNc foi de 2000 pb). Os iniciadores oligonucleotidicos de PCR utilizados foram: 5'AACTCGAGATGGACTCTTCAAAACACAAACGC3' (SEQ ID NO: 6) e 5'TTGCGGCCGCTTACAACTCGTCGTGTCGGACAGCAGGATTACCTGA3' (SEQ ID NO: 7) . O produto continha um local Xhol a 5' e a seguência de codificação para o local HDEL C-terminal, seguido por um codão de terminação e um local NotI na extremidade 3'. O produto foi clonado em pGAPZaA através dos locais Xhol/Notl no produto de PCR e no vector, resultando numa fusão enguadrada do domínio catalítico da manosidase de ratinho com a seguência sinal do factor de conjugação α de S. cerevisiae. A seguência do enquadramento de leitura aberto inteiro gerado é exposta em SEQ ID NO:15. 1.2 Transformação de Levedura e Integração Genómica
Tabela 2 Estirpe parental ADN transformado GS115 (his4) pGAPZMFManHDEL pPIC9MFManHDEL pPIC9mManHDEL pPIC9mMycManHDEL pGAPZmManHDEL pGAPZmMycManHDEL GS115 (his4 complementado por pPIC9lnfluenzaHA) pGAPZMFManHDEL pGAPZmManHDEL pGAPZmMycManHDEL PPY120H (his4 complementado por pPIC9sOCHl) pGAPZMFManMycHDEL pPICZBMFManMycHDEL yGC4 (his4arglade2ura3 complementado por pBLURA5'PpOCHl) pPIC9lnfluenzaNeuraminidase pGAPZMFManHDEL pPIC9Glucoseoxidase 32 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ
Todas as transformações em Pichia pastoris foram efectuadas com electroporação de acordo com as orientações de Invitrogen. Os transformantes de vectores possuindo o gene de resistência à Zeocina foram seleccionados em YPD contendo 100 pg/ml de Zeocina (Invitrogen, Baarn, Holanda) e sorbitol 1 Μ. A selecção de transformantes de derivados de pPIC9 foi feita em meio mínimo sem histidina e contendo sorbitol 1 Μ. A integração genómica das cassetes de expressão foi verificada utilizando PCR em ADN genómico purificado das estirpes de Pichia utilizando o método Yeast Miniprep (Nucleon). Em todos os casos referentes às fusões de genes de Trichoderma reesei, os iniciadores utilizados foram o iniciador de sentido directo 5'-CCATTGAGGACGCATGCCGCGCC-3' (SEQ ID NO:8), que se ligou à metade 3' do ORF da manosidase, e o iniciador anti-sentido 3ΆΟΧΙ 5' -GCAAATGGCATTCTGACATCCT-3' (SEQ ID NO: 9) , que se ligou ao terminador da transcrição AOXI que estava presente em todas as nossas construções de expressão. Para o controlo da integração genómica dos transgenes de manosidase de ratinho, foi realizada PCR utilizando o iniciador de sentido directo 5'GAP 5'GTCCCTATTTCAATCAATTGAA3' (SEQ ID NO:10, que se liga ao promotor GAP) ou 5'AOXI 5'GACTGGTTCCAATTGACAAGC3' (SEQ ID NO: 11, que se liga ao promotor AOXI), e o iniciador anti-sentido 3ΆΟΧΙ (acima). Para as construções de expressão contendo uma unidade de expressão da a-1,2-manosidase de Trichoderma reesei marcada com Myc, obtiveram-se mais evidências da integração genómica utilizando Southern blotting com o ORF de MFManMycHDEL inteiro (marcado com 32P utilizando HighPrime, Boehringer Mannheim) como sonda. 1.3. Expressão da g-1,2-Manosidase A expressão de uma a-1,2-manosidase em estirpes GS115 expressando hemaglutinina do vírus influenza foi verificada através de Northern blot qualitativo. A expressão de uma a-1,2-manosidase em estirpes PPY120H foi verificada através de Western blot anti-Myc.
Northern Blot Qualitativo - ARN total foi purificado de estirpes de Pichia e o rendimento foi determinado espectrofotometricamente. Foi efectuado Northern blotting de acordo com procedimentos padrão e foi feita uma estimativa da quantidade de ARN carregada utilizando coloração com azul-de- 33 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ metileno da membrana, visualizando as bandas de ARNr. A membrana foi sondada com um fragmento Ciai/NarI da manosidase, marcado com 32P utilizando HighPrime (Boehringer Mannheim). SDS-PAGE e Western Blotting - Foram preparados lisados totais de células de levedura através da lavagem das células duas vezes com PBS, seguido de fervura num volume de tampão de carga de Laemmli concentrado 2x durante 5 min. 0 lisado foi centrifugado rapidamente numa microcentrífuga antes do carregamento no gel e foi carregado apenas o sobrenadante. Para a análise das proteínas segregadas para o meio de cultura, foram precipitadas as proteínas de 200 μΐ destes meios utilizando desoxicolato/ácido tricloroacético de acordo com procedimentos padrão. O sedimento foi novamente dissolvido em tampão de carga de Laemmli concentrado 2x e foi corrigido o pH das soluções utilizando Tris. Foi efectuada SDS-PAGE seguida de electrotransferência semi-seca para membranas de nitrocelulose. Para Western Blotting, foram utilizados os anticorpos monoclonais de ratinho 9E10 anti-Myc e anti-HA (Boehringer Mannheim) a uma concentração de 1 pg/ml, e o anti-soro de coelho anti-PDI (Stressgen) foi utilizado a uma diluição 1/500. Os anticorpos secundários foram IgG de cabra anti-ratinho conjugado com fosfatase alcalina para os monoclonais e IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase para o policlonal (anticorpos secundários de
Sigma). A detecção foi efectuada utilizando o sistema NBT/BCIP para fosfatase alcalina e o substrato Renaissance (NENBiosciences) para peroxidase. A imagiologia do último resultado de blot foi feita num dispositivo de imagiologia Lumilager (Boehringer Mannheim).
Os resultados mostrados na Figura 4 indicaram que a grande maioria da proteína marcada com HDEL foi mantida intracelularmente, tanto quando expressa a partir do forte promotor constitutivo GAP como quando expressa a partir do forte promotor indutivel AOXI. 1.4 Localização da g-1,2-Manosidase
Centrifugação isopicnica em gradiente de densidade de sacarose - Para determinar a localização da manosidase marcada com HDEL, foi realizado fraccionamento subcelular utilizando 34 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ células expressando a manosidase-Myc-HDEL a partir do forte promotor constitutivo GAP.
Resumidamente, 0,5 g de peso líquido de células de levedura foram Usados utilizando vórtice 4x1 min com 4,5 g de contas de vidro em 1 ml de tampão de lise (Tris-HCl 50 mM pH 7,5 contendo sorbitol 0,6 M, β-mercaptoetanol 10 mM e MgCl2 5 mM) . Entre os períodos de vórtice, a mistura foi colocada em gelo durante 5 min. O sobrenadante foi colhido e as contas de vidro foram lavadas uma vez com tampão de lise e o sobrenadante deste passo de lavagem foi adicionado ao primeiro sobrenadante. Este lisado foi sujeito a um procedimento de centrifugação diferencial. O sedimento P10000 foi solubilizado em 0,5 ml de uma solução de sacarose a 60% em tampão de lise. Esta solução foi colocada no fundo de um tubo de ultracentrífuga Ultraclear (Beckman) de 14 χ 89 mm. Subsequentemente, 1,5 ml de cada solução de sacarose a 55, 50, 45, 42,5, 40 e 37,5% foram cuidadosamente vertidos uns sobre os outros. O tubo foi enchido até ao bordo com sacarose a 35%. A centrifugação isopícnica em gradiente de sacarose foi efectuada durante 14 h a 180000 g num rotor Beckman SW 41 numa ultracentrífuga preparativa Beckman Modelo L8-70. Após o termo, fracções de 1 ml foram colhidas do topo e parcialmente dialisadas do excesso de sacarose, evaporadas até à secura numa centrífuga de vácuo. Após nova dissolução do sedimento em tampão de Laemmli, as amostras foram sujeitas a SDS-PAGE em triplicado e os Western blots foram tratados com anti-HA, anti-Myc ou anti-PDI ("PDI" para Dissulfureto-Isomerase de Proteínas), respectivamente.
Os resultados ilustraram uma co-sedimentação quase exacta da proteína MFManMycHDEL com a proteína marcadora Dissulfureto-Isomerase de Proteínas (que também é direccionada com a sequência sinal HDEL) (Figura 5) . No mesmo ensaio, a OCH1 marcada com HA estava distribuída por todo o gradiente, com a mais elevada abundância em fracções possuindo uma densidade inferior à das fracções contendo a manosidase e a PDI. Este resultado indicou que a manosidase foi direccionada para a localização esperada (a fronteira RE-Golgi) através da adição de um sinal HDEL. Em contraste, a manosidase sem HDEL, expressa a partir do promotor indutível da álcool-oxidase I 35 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ (que era de força comparável à do promotor GAP), foi segregada a um elevado nível de cerca de 20 mg/1.
Microscopia de imunofluorescência - Para confirmar o correcto direccionamento da manosidase-Myc-HDEL, foi efectuada uma experiência de microscopia de imunofluorescência.
Resumidamente, foram criadas culturas de levedura até uma ΌΟεοο em YPD (para pGAPZMFManMycHDEL) ou em YMP após uma fase de crescimento em YPGlicerol para pPICZBMFManMycHDEL. Foi adicionado formaldeído às culturas de levedura até uma concentração final de 4% e incubou-se durante 10 min à temperatura ambiente. As células foram sedimentadas e ressuspensas em tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 6,5 contendo MgCl2 1 mM e formaldeído a 4% e incubou-se durante 2 h à temperatura ambiente. Após sedimentação, as células foram ressuspensas até uma D06oo=10 em tampão fosfato de potássio 100 mM pH 7,5 contendo MgCl2 1 mM e uma mistura de inibidores de proteases livre de EDTA Complete™ (Boehringer Mannheim). A 100 μΐ de suspensão celular foram adicionados 0,6 μΐ de β-mercaptoetanol e 20 μΐ de 20000 U/ml de Zymolyase 100T (ICN), seguido de uma incubação de 25 minutos com agitação suave. As células foram lavadas duas vezes no tampão de incubação e adicionadas a lamelas revestidas com polilisina (estas são preparadas utilizando anéis adesivos normalmente utilizados para reforçar furos em papel). O excesso de líquido foi absorvido com uma mecha de algodão e as células foram deixadas secar a 20°C. Todos os passos de bloqueio, incubação de anticorpos e lavagem são efectuados em PBS contendo albumina de soro bovino a 0,05%. Os anticorpos primários são utilizados a 2 pg/μΐ e os anticorpos secundários conjugados com fluoróforos (Molecular Probes) foram utilizados a 5 pg/μΐ. O núcleo foi corado com o corante de ácido nucleico HOECHST 33258. Após fixação e permeabilização da parede celular, a integridade da morfologia das células de levedura foi verificada em microscopia de contraste de fase e após imunocoloração, as lâminas foram examinadas num microscópio de fluorescência Zeiss Axiophot equipado com uma câmara digital Kodak. As imagens foram processadas utilizando o suporte lógico Macprobe 4.0 e preparadas com Corel Photopaint 9.0. 36 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ A proteína marcadora do Golgi 0CH1-HA deu o padrão de coloração típico do Golgi descrito na literatura (coloração semelhante a grânulos). A coloração com o anticorpo monoclonal 9E10 anti-Myc, gue reconhece manosidase-Myc-HDEL, deu um padrão de coloração perinuclear com alguma coloração indistinta no citoplasma, altamente indicadora de um direccionamento para o RE (Figura 4).
Com base nas experiências antecedentes, concluiu-se gue a manosidase-Myc-HDEL de Trichoderma reesei se direccionava para a fronteira RE-Golgi. EXEMPLO 2
Co-expressão de Manosidase-HDEL com Glicoproteínas Recombinantes
Co-expressão de Manosidase-HDEL com a trans-Sialidase de Trichoderma cruzi A clonagem de um gene de trans-sialidase de Trypanosoma cruzi codificando para um membro activo das trans-sialidases sem o domínio de repetição C-terminal foi descrita por Laroy et al. (Protein Expression and Purification 20: 389, 2000) gue é agui incorporado por referência. A seguência deste gene de trans-sialidase de Trypanosoma cruzi está disponível através de NCBI Genbank sob o N.° de Entrada AJ276679. Para expressão em P. pastoris, o gene inteiro foi clonado em pHILD2 (Invitrogen, San Diego, CA), criando pHILD2-TS. Para permitir uma melhor secreção, foi criado pPIC9-TS no gual a trans-sialidase foi ligada ao sinal de secreção prepro do factor de conjugação α de levedura. Foram criados os plasmídeos pPIC9-TSE e pCAGGS-prepro-TSE onde o marcador epitópico E foi adicionado ao terminal C da trans-sialidase para permitir fácil detecção e purificação. A construção de pHILD2-TS, pPIC9-TSE e pCAGGS-prepro-TSE foi descrita por Laroy et al., 2000, agui incorporado por referência. Os vectores utilizados na construção foram tornados disponíveis através de http://www.belspo.be/bccm/lmbp.htm#main para pCAGGS (N.° LMBP 2453), Invitrogen, San Diego, CA para pHILD2 e pPIC9, e Pharmacia Biotech para pCANTAB-5E. 37 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ Ο plasmídeo pPIC9-TSE foi linearizado com SstI e foi transformado na estirpe GS115 (his4) de P. pastoris através de electroporação de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Um dos transformantes foi ainda transformado com o plasmídeo pGAPZMFManHDEL, estabelecendo uma estirpe que co-expressa a Manosidase-HDEL e a trans-sialidase de Trypanosoma cruzi. A fermentação e a purificação proteica foram de acordo com os procedimentos descritos por Laroy et al., 2000. A trans-sialidase purificada foi sujeita a análise de hidratos de carbono de acordo com Callewaert et al., Glycobiology 11: 4, 275-281, 2001. Resumidamente, as glicoproteínas eram ligadas à membrana de PVDF nos poços de uma placa de 96 poços, reduzidas, alquiladas e submetidas a desglicosilação da péptido-N-glicosidase F. Os glicanos foram derivados com ácido 8-amino-l,3,6-pirenotrisulfónico através de aminação redutora. Subsequentemente, o excesso de marcador livre foi removido utilizando colunas de centrifugação empacotadas de Sephadex G10 e os glicanos foram analisados através de electroforese num gel de sequenciação de 36 cm num sequenciador de ADN ABI 377A e detectados utilizando o laser de árgon incorporado. Digestões com 3 mU/ml da a-1,2-manosidase de Γ. reesel purificada (descrita por Maras et al., J. Biotechnol. 77: 255-63, 2000) foram também efectuadas em acetato de sódio 20 mM pH=5,0. Os glicanos derivados de 1 pg das glicoproteínas recombinantes purificadas foram utilizados como substrato. 1 U da a-1,2-manosidase é definida como a quantidade de enzima que liberta 1 pmol de manose de manano da levedura de padeiro por minuto a 37°C e pH=5,0.
Tal como se pode observar na Figura 6, Painel B, o principal N-glicano na trans-sialidase foi Man8GlcNAc2 (Comparar com o Painel F, representando uma análise dos N-glicanos da ARNase B bovina. O penúltimo pico neste perfil é Man8GlcNAc2, o primeiro pico é Man5GlcNAC2) . In vitro, este glicano era digerível em Man5GlcNAc2 com a-1,2-manosidase (Figura 6, Painel C). No perfil de N-glicanos da trans-sialidase co-expressa com manosidase-HDEL, o pico principal correspondeu a Man5GlcNAc2 (Figura 6, Painel D) . 38
ΕΡ 1 294 910/PT
Co-expressão de Manosidase-HDEL com a Hemaglutinina do Vírus Influenza A
Sabia-se que a hemaglutinina do vírus influenza A era glicosilada em Pichia pastoris com N-glicanos ricos em manose contendo 9-12 resíduos de manose (Saelens et al., Eur. J. Biochem. 260: 166-175, 1999). O efeito de uma manosidase co-expressa nos N-glicanos da hemaglutinina foi avaliado num método de obtenção do perfil dos N-glicanos descritos abaixo. Adicionalmente, para comparar a eficiência da enzima de Trichoderma (possuindo uma temperatura óptima de 60°C) com uma manosidase de mamífero possuindo uma temperatura óptima de 37°C, o domínio catalítico da manosidase IB de ratinho de uma biblioteca de ADNc de ratinho foi clonado e marcado com um sinal HDEL através de amplificação por PCR. Este ORF foi clonado a seguir à sequência sinal prepro do factor de conjugação α de S. cerevisiae sob o controlo do promotor GAP. A expressão dos transgenes manosidase-HDEL ao nível do ARNm foi confirmada através de Northern blotting qualitativo. A hemaglutinina foi expressa e purificada a partir de uma estirpe de controlo que não expressa manosidase e de estirpes que co-expressam a manosidase-HDEL de Trichoderma reesei ou a manosidase IB-HDEL de ratinho de acordo com o procedimento descrito por Kulakosky et al., Glycobiology 8: 741-745, 1998. A hemaglutinina purificada foi sujeita a digestão com PNGase F tal como descrito por Saelens et al., Eur. J. Biochem. 260: 166-175, 1999. As proteínas e os glicanos foram precipitados com 3 volumes de acetona gelada e os glicanos foram extraídos do sedimento com metanol a 60%. Após evaporação em vácuo, os glicanos foram marcados com ácido 8-amino-l,3,6-pirenotrissulfónico através da adição de 1 μΐ de uma mistura 1:1 de APTS 20 mM em ácido cítrico 1,2 M e NaCNBH3 1 M em DMSO e incubação durante 16h a 3 7°C no fundo de um tubo de PCR de 250 μΐ. A reacção foi parada através da adição de 10 μΐ de água desionizada e a mistura foi carregada num leito de Sephadex G10 de 1,2 cm empacotado até à secura numa coluna de microcentrifugação através de centrifugação num rotor basculante, que proporcionou uma superfície de resina lisa. Após carregamento, 50 μΐ de água desionizada foram cuidadosamente adicionados ao leito de resina e a coluna de centrifugação foi rapidamente centrifugada durante 5 segundos 39 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ a 750 g numa centrífuga de bancada. Este processo de eluição foi repetido duas vezes e todos os eluatos foram reunidos e evaporados até à secura numa centrífuga de vácuo Speedvac (Savant). Os glicanos marcados foram reconstituídos em 1,5 μΐ de tampão de carregamento em gel contendo formamida a 50% e 0,5 μΐ de Genescan 500™, marcado com rodamina (Perkin Elmer Bioscience), servindo como padrão de referência interno. Esta mistura foi carregada num gel de sequenciação de ADN contendo 10% de uma mistura 19:1 de acrilamida:bis-acrilamida (Biorad, Hercules, CA, USA) e perfeita no tampão de sequenciação de ADN padrão (Tris 89 mM, borato 89 mM, EDTA 2,2 mM) . A polimerização do gel foi catalisada através da adição de 200 μΐ de solução de persulfato de amónio a 10% em água e 20 μΐ de TEMED. O gel foi o de comprimento padrão de 36 cm well-to-read e foi corrido num aparelho de sequenciação de ADN Applied Biosystems Modelo 373A. O gel foi previamente corrido a 1000 V durante 15 min. e após o carregamento, o gel foi sujeito a electroforese durante 8h a 1250 V sem aquecimento. Esta metodologia dá um limite de detecção de 10 fmol por pico. Os dados foram analisados com o suporte lógico Genescan 3.0.
Tal como mostrado na Figura 7, a a-1,2-manosidase de Trichoderma reesei proporcionou a redução mais completa no número de a-1,2-manoses presentes nos N-glicanos. O processamento dos N-glicanos através da manosidase IB-HDEL de ratinho foi menos eficiente que através da a-1,2-manosidase de Trichoderma reesei.
Apesar da eficiente remoção de a-1,2-manoses dos N-glicanos da hemaglutinina, não se obteve Man5GlcNAc2. Mesmo após a digestão dos N-glicanos com 3 mU de a-1,2-manosidase de Trichoderma reesei purificada, apenas se obteve Man6GlcNAc2 como menor cadeia de açúcar. Estes resultados indicaram que os restantes resíduos eram possivelmente manoses ligadas em a-1,6, originárias das actividades enzimáticas das a-1,6-manosiltransferases iniciadoras 0CH1. Observou-se que a OCH1 se localizava na parte mais inicial do aparelho de Golgi e podia actuar sobre os N-glicanos da hemaglutinina antes da digestão completa do MansGlcNAC2 precursor de Man5GlcNAc2 através das manosidases-HDEL. Assim, para proteínas cujos glicanos são eficientemente modificados através da a-1,6-manosiltransferase, seria desejável uma inactivação do gene 40 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ OCH1 codificando para a transferase para obter proteínas com Man5GlcNAc2. EXEMPLO 3
Inactivação do Gene Ochl de Pichia
Verificou-se uma sequência de Pichia pastoris no GenBank sob o N.° de entrada E12456 e foi descrita no Pedido de Patente Japonesa N.° 07145005, aqui incorporado por referência. Esta sequência mostra todas as características típicas de uma a-1,β-manosiltransferase e é muito homóloga à OCH1 de S. cerevisiae, por isso referida aqui como o gene Ochl de Pichia pastoris.
Primeiro, o ORF inteiro do gene Ochl de Pichia pastoris foi clonado por PCR em pUC18 para obter o plasmídeo pUC18pOchl. O pUC18pOchl foi cortado com HindIII, tornado de extremidades cegas com polimerase de T4, depois cortado com Xbal, libertando um fragmento contendo a parte 5' do gene Ochl de Pichia pastoris. Este fragmento foi ligado no vector pBLURA IX (disponível em Keck Graduate Institute, Dr. James Cregg, http://www.kgi.edu/html/noncore/faculty/cregg/cregg.htm) que tinha sido cortado com EcoRl, tornado de extremidades cegas com polimerase T4 e depois cortado com NheI. Esta ligação gerou pBLURA5'PpPCHl, tal como mostrado na Figura 8. A destruição deste gene OCHl de Pichia no genoma de Pichia foi alcançada através de recombinação homóloga simples utilizando pBLURA5'PpOCHl, tal como ilustrado na Figura 9. Como resultado da recombinação homóloga simples, o gene Ochl no cromossoma de Pichia foi substituído por duas sequências de Ochl: uma consistiu apenas cerca do primeiro terço do ORF inteiro de Ochl, a outra tinha um ORF inteiro de Ochl sem um promotor Ochl. A recombinação homóloga simples foi alcançada como se segue. Células da estirpe yGC4 de Pichia foram transformadas através de electroporação com pBLURA5'PpOCHl que tinha sido linearizado com um corte único por BstBI. Foram obtidos cerca de 500 transformantes em meio mínimo contendo sorbitol 1 M, biotina, arginina, adenina e histidina e incubação a 27°C. Trinta e dois destes transformantes foram apanhados e novamente seleccionados sob as mesmas condições. 41 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ
Doze clones foram ainda analisados quanto à correcta integração genómica da cassete através de PCR. Sete dos doze clones prototróficos para URA continham a cassete no locus correcto.
Um dos clones inactivados em Ochl foi também ainda transformado com pGAPZMFManHDEL para produzir "super-transformantes". Tanto o clone com Ochl inactivado como os três super-transformantes que também expressam a ManHDEL foram avaliados na análise de glicanos da parede celular como se segue. Células de levedura foram criadas em 10 ml de YPD até uma DC>6oo=2 e as manoproteínas foram preparadas através de autoclavagem das células de levedura em tampão citrato de sódio 20 mM, pH 7 durante 90 min. a 120°C e recuperação do sobrenadante após centrifugação. As proteínas foram precipitadas a partir deste sobrenadante com 3 volumes de metanol frio. A preparação proteica obtida deste modo foi utilizada para análise dos N-glicanos utilizando DSA-FACE tal como descrito por Callewaert et al., Glycobiology 11: 275-281, 2001. Tal como mostrado na Figura 10, havia uma maior quantidade do glicano MansGlcNAc2 no clone com Ochl inactivado em comparação com a estirpe parental yGC4, indicador de uma reduzida actividade da enzima Ochl. Em todos os três super-transf ormantes que também expressavam a a-1,2-manosidase marcada com HDEL, foi observada a produção de Man5GlcNAc2. Para além disso, após digestão das mesmas misturas de glicanos com 3 mU/ml de oí-1,2-manosidase de Trichoderma reesei recombinante purificada, formou-se mais Man5GlcNAc2 na estirpe transformada com pBLURA5'PpOCHl que na estirpe parental (Figura 11, comparar Painel 2 e 3).
Estes resultados confirmaram que a falta de uma produção de glicanos Man5 nas proteínas produzidas de modo recombinante tal como hemaglutinina de células expressando a-1,2-manosidase foi devida à actividade da proteína Ochl. Estes resultados indicam ainda que a produção de glicoproteínas com glicanos Man5 podia ser facilitada pela inactivação do gene Ochl. 42 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ EXEMPLO 4
Expressão de Glucosidase II em Pichia pastoris 4.1 Amplificação do ORF da Subunidade Alfa de GLSII de S. cerevisiae ADN genómico foi preparado a partir da estirpe INVS de S. cerevisiae (a, leu2-3, 112 his3Al, trpl-289, ura3-52), utilizando o estojo Nucleon (Amersham). Foi efectuada uma reacção de PCR de contacto utilizando este ADN genómico como molde e a polimerase LA TaKaRa (ImTec Diagnostics). A sequência dos iniciadores de PCR foi baseada na sequência conhecida do ORF de GLSII de S. cerevisiae: iniciador de sentido directo; 5' CCG CTC GAG ATG GTC CTT TTG AAA TGG CTC 3'
Xhol (SEQ IDN0:12)
iniciador anti-sentido; 5- CCGGGÇÇÇA AAA ATA ACT TCC CAA TCT TCA
Apal G 3' (SEQ ID NO: 13) 4.2. Clonagem do ORF da Glucosidase II de S. cerevisiae em Vectores de Expressão de Pichia pastoris
Construção dos vectores de expressão de glucosidase II -0 fragmento de PCR foi digerido com Xhol/Apal e ligado no vector pGAPZA (Invitrogen), colocando deste modo o ORF sob o controlo de transcrição do promotor GAP. Utilizando esta estratégia, os marcadores myc e His6 foram colocados enquadrados com o terminal C da Glucosidase II, criando pGAPZAGLSII. 0 ORF completo de pGAPZAGLSII foi então sequenciado para assegurar que não eram geradas mutações na reacção de PCR. A sequência do vector pGAPZAGLSII foi exposta em SEQ ID NO: 18. 0 ORF de GLSII do vector pGAPZAGLSII foi clonado no vector pPICZA (Invitrogen) para criar pPICZAGLSII, colocando deste modo o ORF sob o controlo de transcrição do promotor AOXI. 0 ORF de GLSII do vector pGAPZAGLSII foi clonado no vector pA0X2ZA, colocando deste modo o ORF sob o controlo de transcrição do promotor A0X2. Este vector foi criado através da substituição do local de múltipla clonagem do vector pA0X2ZB pelo local de múltipla clonagem de pPICZA. 0 43
ΕΡ 1 294 910/PT
vector ρΑΟΧ2ΖΒ foi gerado através da substituição do promotor AOX1 de pPICZB pela região promotora AOX2 do gene AOX2 (Martinet et al., Biotechnology Letters 21). A região promotora A0X2 foi gerada através de PCR em ADN genómico de Pichia com o iniciador de sentido directo 5'GACGAGATCTTTTTTTCAGACCATATGACCGG3' (SEQ ID NO:26) e O iniciador anti-sentido 5'GCGGAATTCTTTTCTCAGTTGATTTGTTTGT3' (SEQ ID NO: 2 7) . 0 ORF de GLSII do vector pGAPZGLSII foi clonado no vector pYPTIZA para criar pYPTIZAGLSII, colocando deste modo o ORF sob o controlo de transcrição do promotor YPT1. 0 vector pYPTZA foi criado através da substituição do promotor A0X1 de pPICZA pelo promotor YPT1 presente no plasmideo pIB3 (número de entrada GenBank AF027960) (Sears et al., Yeast 14: 783-790, 1998). Todas as construções contêm o gene de resistência à fleomicina. Os vectores de expressão finais resultantes (pGAPZAGLSII, pAOX2ZAGLSII, pPICZAGLSII e pYPTIZAGLSII) estão representados nas Figuras 12-15.
Foram construídos vectores de expressão semelhantes, possuindo o marcador de resistência à Ampicilina e o marcador de selecção ADEl de Pichia. Em princípio, a cassete de expressão de resistência à Zeocina dos plasmídeos pAOX2ZAGLS11, pGAPZAGLSII e pYPTIZAGLSII foi substituída pela cassete de Ampicilina e ADEl de Pichia do vector pBLADE IX (Cregg, J.M.) para resultar nos vectores pAOX2ADElglsII, pGAPADElglsII e pYPTlADElglsII. O vector pPICADElglsII foi obtido através da inserção do enquadramento de leitura aberto da glucosidase II no local de clonagem múltipla do vector pBLADE IX (Cregg, J.M.). Os vectores de expressão finais resultantes (pGAPADElglsII, pAOX2ADElglsII, pPICADElglsII e pYPTlADElglsII) estão representados nas Figuras 16-20.
Adição do marcador de retenção no RE HDEL aos vectores de expressão da glucosidase II - Os seguintes iniciadores foram utilizados para gerar um fragmento de PCR contendo HDEL:
Iniciador 1 : 5'OCG GGT CGA C/CA C/GA C/GA A/CTG/TGAJGT TTT AGC CTT
Sal I HDEL stop AGA CAT GAC 3' (SEQ ID NO:28)
Iniciador 2 ; 5'CAG GAG CAAA GCT CGT ACG AG 31 (SEQIDNO:29)
Spll 44 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ
Foi efectuada PCR em pGAPZAGLSII com pol. Taq., a 60°C. O fragmento de PCR de 225 pb foi cortado com Sall/Spll e ligado no vector pGAPZAGLSII aberto com Sall/Spll, criando o plasmideo pGAPZAglsIIHDEL. A sequência do plasmideo pGAPZAglsIIHDEL é exposta em SEQ ID NO:24. A estratégia de construção e os vectores de expressão finais resultantes (pGAPZAglsIIHDEL e pGAPADElglsIIHDEL) estão representados nas Figuras 20-21. 4.3 Transformação de uma Estirpe de Pichia pastoris A transformação foi efectuada utilizando as técnicas de electroporação convencionais, tal como descrito por Invitrogen. Células da estirpe PPY12-OH de Pichia pastoris foram transformadas com pGAPZGLSII que tinha sido cortado com um corte único por Avrll. Os transformantes foram seleccionados com base na sua resistência a zeocina.
Análise genómica dos transformantes - ADN genómico foi preparado a partir de alguns transformantes de Pichia resistentes a zeocina. Foi efectuada uma reacção de PCR no ADN genómico para determinar se o gene da glucosidase II estava ou não integrado no genoma da levedura. A PCR foi efectuada utilizando ADN-polimerase Taq (Boehinger) (MgCl2 2,5 mM, 55°C para ligação). Os iniciadores foram os mesmos que utilizámos para a amplificação do ORF no ADN genómico de S. cerevisiae. Os transformantes de pGAPZAGLSII foram confirmados através da presença de um produto de PCR específico indicador do ORF da glucosidase II. 4.4 Expressão e Secreção da Subunidade Alfa da Glucosidase II de S. cerevisiae em Pichia pastoris
Análise ao nível da transcrição - ARN foi preparado a partir dos transformantes que deram positivo após a análise genómica. 0 ARN foi preparado utilizando fenol ácido. De cada amostra, foram isolados 15 pg de ARN num gel de agarose de formaldeído. Após electroforese o ARN foi transferido para uma membrana Hybond N. A membrana foi hibridada utilizando uma sonda radioactiva, que consiste num fragmento específico da glucosidase II de 344 pb, correspondendo à região 3' do ORF da glucosidase II. Não foram detectados sinais com as estirpes de 45 ΕΡ 1 294 910/PT controlo não transformadas, enquanto foram observados sinais claros com os transformantes.
Análise ao nível proteico utilizando um ensaio de membrana dupla - Uma membrana de nitrocelulose foi colocada num meio de dextrose tamponado (BMDY). No topo dessa membrana de nitrocelulose foi colocada uma membrana de acetato de celulose. Transformantes de Pichia de pGAPZAGLSII foram riscados no acetato de celulose e criados durante alguns dias. As células de levedura permaneceram no acetato de celulose, enquanto as proteínas segregadas atravessaram esta membrana. Como tal a proteína segregada foi capturada sobre a membrana de nitrocelulose. Após alguns dias foi removido o acetato de celulose, contendo as colónias de levedura. A membrana de nitrocelulose foi analisada quanto à presença de glucosidase II utilizando anticorpo anti-myc. A maioria dos transformantes deu um sinal claro em comparação com um sinal desvanecido, dificilmente visível com a estirpe WT não transformada.
Expressão extracelular - Os transformantes de PPY12-0H da construção pGAPZAGLSII(mychisô) (estirpes 12, 14 e 18) e os transformantes da construção pGAPZAGLSII(myc)HDEL (estirpes Hl, H2 e H3) foram criados durante 2 dias em 2x10 ml de meio BMDY. Estes 6 transformantes deram inicialmente positivo tanto ao nível genómico (PCR de ADNg) como ao nível de ARN (Northern blot) . 0 meio de cultura foi colhido através de centrifugação e concentrado com colunas Vivaspin até cerca de 1 ml. As proteínas deste concentrado foram precipitadas com TCA, ressuspensas em tampão de Laemmli e carregadas para análise SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose. A membrana foi incubada de um dia para o outro com Ac anti-myc. O Ac secundário foi ligado a peroxidase. Utilizando o estojo de detecção de luminescência Renaissance (NEN) e uma película sensível à luz (Kodak), foi observada uma forte banda de cerca de 110 kDa para os transformantes 12, 14 e 18, indicando que GLSII era expressa e segregada a partir destes transformantes. Não se obteve sinal para os transformantes Hl-3, o que indica que o marcador HDEL, que foi adicionado de modo C-terminal ao ORF de GLSII, resultou numa localização da proteína no RE, prevenindo que GLSII fosse segregada para o meio de cultura. ΕΡ 1 294 910/ΡΤ 4 β
Expressão intracelular - Os 6 transformantes e a estirpe WT foram criados durante 2 dias em 500 ml de BMDY. As células foram colhidas através de centrifugação, lavadas e ressuspensas num volume mínimo (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, glicerol a 5%) e rompidas utilizando contas de vidro. Os restos celulares foram removidos através de vários passos de centrifugação (centrifugação a baixa velocidade (2000-3000g)). As membranas foram obtidas do sobrenadante através de ultracentrifugação. Os sedimentos foram ressuspensos em tampão de Laemmli e carregados para análise SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A expressão intracelular de GLSII foi verificada utilizando Ac anti-myc e Ac secundário conjugado com peroxidase. Após a detecção de luminescência, foi observada uma banda de cerca de 110 kDa com os transf ormantes GLSIIHDEL (Hl e H3, sinal desvanecido para H2), mas não com as estirpes WT e de expressão de GLSII. Estes resultados indicam claramente a presença intracelular da GLSII recombinante quando expressa com um marcador HDEL C-terminal. Não foi detectada GLSII intracelularmente quando este marcador não estava presente. 4.5 Purificação e Ensaios de Actividade da Subunidade Alfa da Glucosidase II Recombinante
Um ensaio de GLSII foi montado como se segue e foi testado utilizando uma alfa-glucosidase de levedura comercialmente disponível (Sigma) como controlo positivo.
Composição: 70 μΐ de tampão fosfato-citrato 80 mM, pH 6,8, 7 μΐ de manose 250 mM, 3,5 μΐ de 2-desoxi-D-glucose 250 mM, 0,8 μΐ de 4-MeUmbeliferil-alfa-D-glucopiranósido (1 μΜ) . Foram realizados três ensaios: um com 1 unidade de enzima comercial, um sem a enzima e um com a enzima mas sem o substrato. A mistura de ensaio foi incubada de um dia para o outro a 30°C. Quando iluminada com UV, apenas a mistura reaccional com a enzima e o substrato apresentava fluorescência (Figura 22). Isto indica que o ensaio era muito específico na detecção da actividade da alfa-glucosidase. A estirpe WT PPY12-OH, a estirpe 18 e a estirpe H3 foram criadas durante 2 dias em 2x10 ml de meio de crescimento. As 47 ΕΡ 1 294 910/ΡΤ células foram centrifugadas e o meio foi ajustado a NaCl 300 mM e imidazole 10 mM e concentrado com colunas Vivaspin até 0,5-1 ml. O meio foi carregado numa coluna de centrifugação Ni-NTA (Qiagen) e a purificação foi efectuada de acordo com as recomendações do fabricante. A proteína foi eluída da coluna em 2x100 μΐ de tampão de eluição (NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, imidazole 250 mM pH 8,0) . De cada eluato, foram ensaiados 20 μΐ quanto à sua actividade de glucosidase II. Foram utilizadas 0,33 unidades da enzima comercial diluídas em 20 μΐ do tampão de eluição como controlo positivo. Foi observada fluorescência com o controlo positivo e o eluato da estirpe 18, a estirpe que segregou a enzima para o meio de crescimento. Estes resultados indicam que a subunidade alfa da GLSII recombinante de S. cerevisiae, segregada por Pichia pastoris, era uma enzima funcionalmente activa. A actividade não foi observada na estirpe WT (não transformada) , nem na estirpe H3 uma vez que a GLSII era expressa intracelularmente (Figura 23). Estes resultados indicam também que a subunidade beta não é necessária para a funcionalidade da parte alfa da proteína. EXEMPLO 5
Criação de Estirpes de Pichia Expressando tanto Glucosidase II como Manosidase A estirpe GS115 foi transformada com pGAPZGLSII e pGAPZglsIIHDEL. Os transformantes foram seleccionados em YPDSzeo. A estirpe yGC4 foi transformada com as seguintes construções, respectivamente: 1) pGAPADEglsII e pGAPADEglsIIHDEL: selecção em meio de sorbitol sintético sem adenina; 2) pGAPZMFManHDEL: selecção em YPDSzeo; e 3) pGAPZMFManHDEL/pGAPADEglsIIHDEL: selecção em meio de sorbitol sintético sem adenina e com zeocina. A estirpe yGC4 com knock-in de OCHl e expressando MFmanosidaseHDEL foi transformada com pGAPADEglsII e 48 ΕΡ 1 294 910/PT pGAPADEglsIIHDEL. A selecçao de transformantes foi feita em meio de sorbitol sintético sem adenina nem uracilo. transformações. ou vectores de através de PCR. alguns destes
Obtiveram-se colónias para todas as Obtiveram-se transformantes com o vector expressão integrados no genoma, determinados Observou-se a expressão de GLSII de transformantes.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 HDEL (péptido) SEQ ID NO: 2 5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3' SEQ ID NO: 3 5'-AGTCTAGATTACAACTCGTCGTGAGCAAGGTGGCCGCCCCG TCG-3' SEQ ID NO: 4
CCATTGAGGACGCATGCCGCGCC SEQ ID NO: 5
GTATCTAGATTACAACTCGTCGTGCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGT
TCAGCAAGGTGGCCGCCCCGTCGTGATGATGAA SEQ ID NO: 6 AACTCGAGAT GGAC T C T T CAAAACACAAACGC SEQ ID NO: 7
TTGCGGCCGCTTACAACTCGTCGTGTCGGACAGCAGGATTACCTGA SEQ ID NO: 8
CCATTGAGGACGCATGCCGCGCC SEQ ID NO: 9
GCAAATGGCATTCTGACATCCT SEQ ID NO: 10
GTCCCTATTTCAATCAATTGAA SEQ ID NO:11
GACTGGTTCCAATTGACAAGC SEQ ID NO:12 CCG CTC GAG ATG GTC CTT TTG AAA TGG CTC SEQ ID NO: 13
CCG GGC CCA AAA ATA ACT TCC CAA TCT TCAG 49
ΕΡ 1 294 910/PT SEQ ID NO: 14 A sequência de ORF da fusão MFManHDEL em pGAPZMFManHDEL: a/gagatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaa acggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaaca gcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgagaaaagag aggctgaagctgaattcgccacaaaacgtggatctcccaaccctacgagggcggcagcagtcaaggccgcattccagac gtcgtggaacgcttaccaccattttgcctttccccatgacgacctccacccggtcagcaacagctttgatgatgagagaaacg gctggggctcgtcggcaatcgatggcttggacacggctatcctcatgggggatgccgacattgtgaacacgatccttcagta tgtaccgcagatcaacttcaccacgactgcggttgccaaccaaggatcctccgtgttcgagaccaacattcggtacctcggt ggcctgctttctgcctatgacctgttgcgaggtcctttcagctccttggcgacaaaccagaccctggtaaacagccttctgag gcaggctcaaacactggccaacggcctcaaggttgcgttcaccactcccagcggtgtcccggaccctaccgtcttcttcaac cctactgtccggagaagtggtgcatctagcaacaacgtcgctgaaattggaagcctggtgctcgagtggacacggttgagc gacctgacgggaaacccgcagtatgcccagcttgcgcagaagggcgagtcgtatctcctgaatccaaagggaagcccgg aggcatggcctggcctgattggaacgtttgtcagcacgagcaacggtacctttcaggatagcagcggcagctggtccggc ctcatggacagcttctacgagtacctgatcaagatgtacctgtacgacccggttgcgtttgcacactacaaggatcgctgggt ccttggtgccgactcgaccattgggcatctcggctctcacccgtcgacgcgcaaggacttgacctttttgtcttcgtacaacg gacagtctacgtcgccaaactcaggacatttggccagttttggcggtggcaacttcatcttgggaggcattctcctgaacgag caaaagtacattgactttggaatcaagcttgccagctcgtactttggcacgtacacccagacggcttctggaatcggccccga aggcttcgcgtgggtggacagcgtgacgggcgocggcggctcgccgccctcgtcccagtccgggttctactcgtcggca ggattctgggtgacggcaccgtattacatcctgcggccggagacgctggagagcttgtactacgcataccgcgtcacggg cgactccaagtggcaggacctggcgtgggaagcgttgagtgccattgaggacgcatgccgcgccggcagcgcgtactcg tccatcaacgacgtgacgcaggccaacggcgggggtgcctctgacgatatggagagcttctggtttgccgaggcgctcaa gtatgcgtacctgatctttgcggaggagtcggatgtgcaggtgcaggccaccggcgggaacaaatttgtctttaacacgga ggcgcacccctttagcatccgttcatcatcacgacggggcggccaccttgctcacgacgagttgtófl SEQ ID NO: 15 A sequência de ORF da fusão MFmManHDEL em pGAPZMFmManHDEL a/gagatttccttcaatttttactgctgttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaa acggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaaca 50
ΕΡ 1 294 910/PT gcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgagatggact cttcaaaacacaaacgctttgatctgggcttagaagãtgtgttaattcctcacgtagatgccggcaaaggagctaaaaacccc ggcgtcttcctgatccatggacccgacgaacacagacacagggaagaagaagagcgtctgagaaataagattagagctg accatgagaaagccctggaagaagcaaaagaaaaattaagaaagtcaagagaggaaatccgtgcagaaattcagacaga gaaaaacaaagtagcccaagcaatgaagacaaaagagaccagggtactgccgcctgtccctgtcccacaacgtgtaggg gtcagtggtggggatccagaagacatggagatcaagaagaaaagagacaaaattaaagagatgatgaaacatgcctggg ataattacagaacatacggatggggacataatgaactaaggcctattgcaaggaaaggccattccactaacatattcggaag ctcacagatgggtgccaccatagtggatgctttggataccctttatatcatggggcttcatgatgaattcatggatgggcaaag atggattgaagaaaaccttgatttcagtgtgaattcagaagtgtctgtctttgaagttaacattcgctttattggagggctcctcg ctgcatattacctgtcaggagaggaaatattcaagactaaagcagtgcagttggctgagaaactccttcctgcctttaacacac ctactgggattccctgggcaatggtgaacctgaaaagtggagtaggtcgaaactggggctgggcgtctgcaggcagcagc atcctggctgagttcggcaccctgcacatggagtttgtgcacctcagctacttgaccggtgacttgacttactataataaggtc atgcacattcggaaactactgcagaaaatggaacgcccaaatggtctttatccaaattatttaaacccaagaacagggcgctg gggtcagtatcacacatcagttggtggtctgggagatagtttttatgaatacttactgaaagcatggctgacgtcagataaaac agaccacgaggcaagaaggatgtatgacgatgctgttgaggctatagaaaaacatcttattaagaagtcccgaggaggtct ggtttttattggagaatggaagaatggacacttggaaaggaagatggggcacttggcctgctttgctgggggaatgcttgcc cttggagcagatggttccagaaaggataaagctggccactacttagaactaggggcagaaattgcacgaacatgtcatgag tcatatgacagaactgcattgaaactaggtccggagtcattcaagtttgatggtgcagtggaagccgtggctgtgcggcagg ctgaaaagtattacatccttcgtccagaagtaattgaaacctattggtatctatggcgatttacccacgacccaagatacaggc agtggggctgggaagcagcactggctattgagaagtcgtgccgggtcagcggtgggttttctggtgtcaaggatgtatacg ccccgacccctgtgcatgacgacgtgcagcagagcttttctcttgctgaaacattaaaatacttgtacctgctgttctctggcga tgaccttctacctttagaccactgggtgtttaacacagaggcgcaccctctgccggtgttgcgcttagccaacagcactctttc aggtaatcctgctgtccgacacgacgagttgtaa
SEQ ID NO: 16 pA0X2ZAGLSII catggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccgg ctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtc caggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcg gaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcggga 51 ΕΡ 1 294 910/PT gttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtccgacggcggcc cacgggtcccaggcctcggagatccgtcccccttttcctttgtcgatatcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccct ccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagt attaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttga gaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctggagaccaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccagga accgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtca gaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgttlccxcctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgac cctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagt tcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaact atcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggt atgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctg ctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacãaaccaccgctggtãgcggtggtttttttgtt tgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtgga acgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatcagatctttttttcagaccatatgaccggtccatcttctacggggggat tatctatgctttgacctctatcttgattcttttatgattcaaatcacttttacgttatttattacttactggttatttacttagcgccttttctg aaaaacatttactaaaaatcatacatcggcactctcaaacacgacagattgtgatcaagaagcagagacaatcaccactaag gttgcãcatttgagccagtãggctcctaatagãggttcgatacttattttgatããtacgâcãtattgtcttacctctgaatgtgtcã atactctctcgttcttcgtctcgtcagctaaaaatataacacttcgagtaagatacgcccaattgaaggctacgagataccaga 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aaaagaagcaaccaaaatcccttattgtccttttctgatcagcatcaaagaatattgtcttaaaacgggcttttaactacattgttc ttacacattgcaaacctcttccttctatttcggatcaactgtattgactacattgatcttttttaacgaagtttacgacttactaaatcc ccacaaacaaatcaactgagaaaagaattcacgtggcccagccggccgtctcggatcggtacctcgagatggtccttttga aatggctcgtatgccaattggtcttctttaccgctttttcgcatgcgtttaccgactatctattaaagaagtgtgcgcaatctgggt tttgccatagaaacagggtttatgcagaaaatattgccaaatctcatcactgctattacaaagtggacgccgagtctattgcac acgatcctttagagaatgtgcttcatgctaccataattaaaactataccaagattggagggcgatgatatagccgttcagttccc attctctctctcttttttacaggatcactcagtaaggttcactataaatgagaaagagagaatgccaaccaacagcagcggtttg ttgatctcttcacaacggttcaatgagacctggaagtacgcattcgacaagaaatttcaagaggaggcgaacaggaccagta ttccacaattccacttccttaagcaaaaacaaactgtgaactcãttctggtcgaaaatatcttcatttttgtcactttcaaactccac tgcagacacatttcatcttcgaaacggtgatgtatccgtagaaatctttgctgaaccttttcaattgaaagtttactggcaaaatg cgctgaaacttattgtaaacgagcaaaatttcctgaacattgaacatcatagaactaagcaggaaaacttcgcacacgtgctg 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tgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttctt gaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaa gagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcaga aaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttg gtcatgcatgagatcagatcttttttgtagaaatgtcttggtgtcctcgtccaatcaggtagccatctctgaaatatctggctccgt tgcaactccgaacgacctgctggcaacgtaaaattctccggggtaaaacttaaatgtggagtaatggaaccagaaacgtctc ttcccttctctctccttccaccgcccgttaccgtccctaggaaattttactctgctggagagcttcttctacggcccccttgcagc aatgctcttcccagcattacgttgcgggtaaaacggaggtcgtgtacccgacctagcagcccagggatggaaaagtcccg gccgtcgctggcaataatagcgggcggacgcatgtcatgagattattggaaaccaccagaatcgaatataaaaggcgaac acctttcccaattttggtttctcctgacccaaagactttaaatttaatttatttgtccctatttcaatcaattgaacaactatttcgaaa cgaggaattcacgtggcccagccggccgtctcggatcggtacc 76
ΕΡ 1 294 910/PT SEQ ID NO: 25 pGAPADElglsIIHDEL cgtactcacctctttggtagccaaaagtttctccatcatcaacataaagatctccaacggctcgtccctcggtatcaggggctat aactattacatatggatcgtttttcattaacattgaagatcttctatacttatctttcatagtgataatgtgaccgccttcaataaataa tggaattttatccaatggtgcagaaatattcttttctatcaaatcagtaccattgtttataaaagagtgtaaagatgcgaattcatag aatataccgggtgggaaaaccatttccgtttctgattgaccaggctccgtgacaggtttgactaatagacctgaattactccag taaaattggttatcgatatgatacaattcagcaaattcagggtgttcaataaacattggattcattatcggaaatccagtgacact tgatttatgaaacatggtgtataaggtaggtagcaggaaatatctcaattggataatatcacgtactatcgacttcaaaggttcat tgaataagtatggttctcttctcttggtgtctatatgggcgtgtgctctaaaaaatgggtaccataagcccgcttggtaccaacgt gcaatcaattcaggtgtaggatcctcagcaaagccagctatgtcggctcctataaatggcataccagcaatgttgtttgacag aaccataggaatggaaatctttaagtaatcccaattggccacattgtcaccagtccatgtggcagcagtacgttgagagccg gcaaaaaaagcccttgttagaaggaaaggacgcttatcggatggtgaataaatcgattttattgcgtcgtaagtagcttcatgc actgatagaccatatatgttatggacggatctttcctcaatgtaattgtcgtgaatcaaatcttttggagctgtggtctctgggcca tcgaaaatcgaaggctcgttcatatcattccaaatgaataaattagttaaatcagccggcagatccataaaccgttcgaaaaag gacttccaaatcttttggccatatttgcttatggtatcaatccatatagaattacctggccagcaatgacctacatagtcatttccat tgtgatccttgactgctacattttcattaattaccctgtcactgatttcataatctttctttaaatgaggatcgattagtacgacaaga tttctacccaacttttttaatttggataacagcctttttggattgggaaaggagtgctgcttccaagtaaaatattttttgtcgttcgta tactccaagtccaaccaaataaaatcgtaaggaatcatatgagcatccatctgagagtccactgtgagaacgtccatctcatc attataattccatctacattgatggtaccctatagaggaaatgggcggtaaaaagggtctaccagtcaaatcggtaaatttgtca atgatagttggaatatctggccccagggacatgactacatctatgacaccattttcggagatccaatgagtcatcgttttattttta ctggtgtcatactttatgtctacccaagtgtcagctgcattgacccaaaagatagatgtggacgaagatgaaaacatgaatgg gatcgaaccgtacattggttggctggtaccgatgttgtactcaaagacatcaacgttgaaaagcctgtagggttcctttccacc tgaagtgtccatcagccttagcgacgtcgcatgttccggtataccgtagacattagtagaacccatgaaagagaaatctagc gcaaccgattcaggccccaaaggcatagagtcatgctttgaatacaagaaattgtccttaaacatgttgaaagttgtttcttctg 77 ΕΡ 1 294 910/PT gcagcacgtgtgcgaagttttcctgcttagttctatgatgttcaatgttcaggaaattttgctcgtttacaataagtttcagcgcatt ttgccagtaaactttcaattgaaaaggttcagcãaagatttctacggatacatcãccgtttcgaagãtgaaatgtgtctgcâgtg gagtttgaaagtgãcaaaaatgaagatattttcgaccãgaatgagttcacagtttgtttttgcttaaggaagtggaattgtggaat actggtcctgttcgcctcctcttgaaatttcttgtcgaatgcgtacttccaggtctcattgaaccgttgtgaagagatcaacaaac cgctgctgttggttggcattctctctttctcatttatagtgaaccttactgagtgatcctgtaaaaaagagagagagaatgggaa ctgaacggctatatcatcgccctccaatcttggtatagttttaattatggtagcatgaagcacattctr.taaflggfltr,gtgtgcaa tagactcggcgtccactttgtaatagcagtgatgagatttggcaatattttctgcataaaccctgtttctatggcaaaacccagat tgcgcacacttctttaatagatagtcggtaaacgcatgcgaaaaagcggtaaagaagaccaattggcatacgagccatttca aaaggaccatctcgaggtaccgatccgagacggccggctgggccacgtgaattcctcgtttcgaaatagttgttcaattgatt gaaatagggacaaataaattaaatttaaagtctttgggtcaggagaaaccaaaattgggaaaggtgttcgccttttatattcgat tctggtggtttccaataatctcatgacatgcgtccgcccgctattattgccagcgacggccgggacttttccatccctgggctg ctaggtcgggtacacgacctccgttttacccgcaacgtaatgctgggaagagcattgctgcaagggggccgtagaagaag ctctccagcagagtaaaatttcctagggacggtaacgggcggtggaaggagagagaagggaagagacgtttctggttcca ttactccacatttaagttttaccccggagaattttacgttgccagcaggtcgttcggagttgcaacggagccagatatttcagag atggctacctgattggacgaggacaccaagacatttctacaaaaaagatctgatctcatcgaccggctgcattaatgaatcgg ccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcgg ctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacat gtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctg acgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccct ggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggc gctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgt tcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagca gccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctac actagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaa acaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctt tgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatctt cacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgctta atcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatac gggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataa 78 ΕΡ 1 294 910/PT accagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtoctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccggg aagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtt tggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagcto cttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactg tcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagtt gctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcg gggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatct tttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaa atgttgaatactcatactcttcctttttcaatagctccaaggcaacaaattgactactcagaccgacattcattcgttattgattttaa atcaacgataaacggaaíggttacttgaatgatttcactttatgatcattgtttactaattacctaaataggattttaíatggaattgg aagaataagggaaatttcagatgtctgaaaaaggcgaggagggtactaatcattcaagcccatttcttgccagtaattgcttca ccãatctctgagaaactgcttatcgtaactctcttgcgatttacccãcttggtaagtcttttgattccaaaatctagaagaatctgg agttaaaacttcatctactagtaccaattcattgttttcgtccagtccaaattcgaatttcgtatcagcaataatgatccccttcaaa agggcgaagttttttgcagcagaatacaactcgaccgccttgacagcgaccttctcacaaatgtctttacctacaatctcagca gcttgttcaatagagatgttttcatcgtgttcaccctgttcagctttcgttgaaggtgtgaaaatcggagttggaaaggcgtcgct ctcttgaaggttctcgttttcaaccttgactccatggacagtttttgagttcttgtactctttccatgcacttccagtgatgtaacctc tgacaatggcttccaaaggtatcagtctgtgctuutactatcaaggatcgtccctctaattgagatttgtatttttcttcagacagt tttgatggtagtaaagcaaagacttccttgtcattagaagcaaccaaatgattctttatgtagggtgccaaaaaatcaaaccag aaaactgagagctgagtcaaaatctttcccttatcaggaataccgtttgtcataatcacatcgtaagcggagatacggtcagtt gcgacgaacagcaagttgttctcatcgactgcataaatgtctctaacctttcctttggcgattaaaggtaggattccgtccagat cagtgttcacaatggacatacttggaaggatacagcaaagtgtgttggaagcgatgacacatggaaaggaatttttcgagttt cctagagtagtatattggggcggtgaaagttcagatgtttaatgcttaatactcttatactcttcaaagcgcccaagtgtttctgc caacctgacttttttctgaataatgaatcgttcaagtggagtatttaaaccatgattaagttacgtgatttggcactggataaggtc gaaaaatatccgtattcataaacgattattggtaaaagttacaaaataccactaattacggagaagcttagtaacagttatcatct cttggtcgattaacgcttacaatttccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcg ctãttacgccagggcctcgaggcacaaacgaacgtctcacttaatcttctgtactctgaagaggagtgggaaataccaagaa aaacatcaaactcgaatgattttcccaaacccctaccacaagatattcatcagctgcgagataggctgatcaggagcaagct tctctcaggcaaatggcattctgacatcctcttgattagaatctagcaagaccggtcttctcgtaagtgcccaacttgaactgag gaacagtcaígtctaaggctaaaactcacagttcgtcgtggtcgacggcgctattcagatcctcttctgagatgagtttttgttc gggcccaaaaataacttcccaatcttcagttatgtcaagcgataggttaagaatggtgatcttattatcattctcatatgacgatc tagtcggcaatgaactttcttcgccattttttttgactttaatactgtctttcaacgttatgttgtgttgtaaattattctttgcgataatg attttttcaatattggtattcctcaaagtattgtggtgaatgcctgtcaaattctcgggaatatgacttcgaacattttttaaggtattg ttttcgaaaatgaactgagtttcta SEQ ID NO: 26 GACGAGATCTTTTTTTCAGACCATATGACCGG SEQ ID NO: 27
GCGGAATTCTTTTCTCAGTTGATTTGTTTGT 79
ΕΡ 1 294 910/PT SEQ ID NO: 28 GCG GGT CGA CCA CGA CGA ACT GTG AGT TTT AGC CTT AGA CAT GAC SEQ ID NO: 29
CAG GAG CAAA GCT CGT ACG AG
Lisboa, 2009-02-06

Claims (13)

  1. ΕΡ 1 294 910/PT 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Estirpe geneticamente modificada de uma levedura metilotrófica, em que a referida estirpe é transformada com um vector capaz de expressar na referida estirpe uma a-1,2-manosidase ou uma parte funcional desta, em que o referido vector compreende uma sequência nucleotidica codificando para a referida a-1,2-manosidase ou a referida parte funcional, e em que o gene Ochl genómico na referida estirpe é destruído de modo a que a referida estirpe não consiga produzir uma proteína Ochl funcional. 2 . referida Estirpe de acordo com a reivindicação 1, a-1,2-manosidase é de uma espécie fúngica. em que a 3 . referida Estirpe de acordo com a reivindicação espécie fúngica é Trichoderma reesei. 2, em que a 4. referida Estirpe de acordo com a reivindicação 1, em que a-1,2-manosidase é de uma espécie de mamífero. a
  2. 5. Estirpe de acordo com a reivindicação 4, em que a referida a-1,2-manosidase é a-1,2-manosidase IA ou IB de murídeo.
  3. 6. Estirpe de acordo com a reivindicação 1, em que a referida a-1,2-manosidase ou a referida parte funcional é marcada com um sinal de retenção no RE.
  4. 7. Estirpe de acordo com a reivindicação 6, em que o referido sinal de retenção no RE compreende o péptido HDEL.
  5. 8. Estirpe de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência nucleotidica codificando para a referida a-1,2-manosidase ou a referida parte funcional está operativamente ligada a um promotor e a uma sequência de terminação a 3'.
  6. 9. Estirpe de acordo com a reivindicação 8, em que o referido promotor é o promotor de um gene seleccionado de entre o grupo que consiste em AOXI, AOXII, GAP e FLD. ΕΡ 1 294 910/PT 2/3
  7. 10. Estirpe de acordo com a reivindicação 1, transformada ainda com um vector que compreende uma sequência nucleotidica codificando para uma glucosidase II ou uma parte funcional desta.
  8. 11 . Estirpe de acordo com a reivindicação 10, em que a referida glucosidase II é de uma espécie fúngica. 12 . Estirpe de acordo com a reivindicação 11, em que a referida espécie fúngica é Saccharomyces cerevisiae. 13 . Estirpe de acordo com a reivindicação 10, em que a referida glucosidase II é de uma espécie de mamífero. 14. Estirpe de acordo com a reivindicação 10, em que a referida glucosidase II ou a referida parte funcional é marcada < com um sinal de retenção no RE. 15 . Estirpe de acordo com a reivindicação 14, em que o referido sinal de retenção no RE compreende o péptido HDEL. 16 . Estirpe de acordo com a reivindicação 10, em que a sequência nucleotidica codificando para a referida glucosidase II ou a referida parte funcional está operativamente ligada a um promotor e a uma sequência de terminação a 3'.
  9. 17. Estirpe de acordo com a reivindicação 16, em que o referido promotor é o promotor de um gene seleccionado de entre o grupo que consiste em AOXI, AOXII, GAP e FLD.
  10. 18. Estirpe de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, transformada ainda com uma sequência de ácido nucleico codificando para, e capaz de expressar, uma glicoproteína heteróloga.
  11. 19. Utilização de uma estirpe de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18 para reduzir a glicosilação em proteína produzidas a partir de leveduras metilotróficas. numa
  12. 20. Método de produção gl icosilaçao reduzida de uma glicoproteína com levedura metilotrófica, ΕΡ 1 294 910/PT 3/3 compreendendo a transformação de células de uma estirpe de levedura metilotrófica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, e com uma sequência nucleotídica capaz de expressar a referida glicoproteína na referida levedura, e a produção da referida glicoproteína a partir das células transformadas.
  13. 21. Estojo compreendendo uma estirpe de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18. Lisboa, 2009-02-06
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