CN101313216A - 酵母突变体中产生的糖基化多肽及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可用于疫苗制剂的多种高甘露糖糖基化多肽。本发明还提供制备这类糖基化多肽的方法及其激发HIV中和抗体的用途。

Description

酵母突变体中产生的糖基化多肽及其使用方法
相关申请的交叉参考
本申请要求在2005年9月22日递交的美国临时申请系列号No.60/719,952的优先权利益，其公开内容在本文整体引为参考。
技术领域
本发明涉及免疫学和医学领域。更具体地，本发明涉及生产用于激发有效免疫应答的糖基化抗原的方法和使用这类抗原的疫苗接种策略。
关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
本发明在美国政府支持下进行，其国家卫生研究院(National Institutesof Health)资助号为AI51903和AI58724。美国政府对本发明可具有某些权利。
发明背景
一些病原体表达的复合糖便于病原体逃离宿主的免疫应答，并促成诸如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameingitidis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和人免疫缺陷病毒(“HIV”)等生物感染之后的破坏性后遗症。糖蛋白中的糖富含区域尤其是弱免疫原性的。导致免疫原性缺乏的因素包括由于糖的微观不均一性所致的单抗原应答的稀释，以及高免疫原性蛋白质表位的空间位阻影响。参阅例如Rudd等，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.32：1-100(1997)；Woods等，Nature Struct.Biol.1：499-501(1994)。另外，病毒常常通过使用细胞糖基化机器来表达宿主已经耐受的内源聚糖来欺骗宿主免疫系统。
糖蛋白，特别是gp120，在HIV致病性方面的作用例证了复合糖在激发保护性宿主免疫应答中的难度和重要性。像所有的病毒一样，HIV需要细胞的转录和翻译机器，以便在宿主中成功地繁殖其自身。HIV通过与特定细胞受体的相互作用进入细胞来实现此繁殖需求。具体地，HIV病毒颗粒在早期感染阶段通过其病毒包膜蛋白(“Env”)与细胞CD4受体和CCR5细胞共受体的相互作用，在感染晚期通过CD4受体-CXCR4共受体复合物的相互作用进入细胞，通常为T淋巴细胞。参阅例如
Figure A20068004332000091
等，J.Virol.75：4664-72(2001)；Teunis等，Cell 100：587-97(2000)。Env蛋白是称为gp120的糖蛋白。在HIV病毒颗粒的表面，三个gp120分子与另一细胞表面蛋白gp41非共价连接。参阅例如Zolla-Pazner，Nature Rev.Immunol.4：199-210(2004)。gp41是作为病毒包膜中同源三聚体复合物存在的跨膜糖蛋白。该gp120-gp41复合物形成HIV病毒颗粒上的异源寡聚体刺突，所述病毒颗粒首先结合CD4/共受体复合物，随后发生构象变化，导致病毒融合肽暴露，从而介导病毒进入细胞。
最近的证据提示有别于CD4/共受体相互作用的第二相互作用对于HIV传播和感染也是关键性的，特别是在最早的阶段。树突细胞(DC)，一种高度特异性的抗原呈递细胞，是在感染之际被HIV靶向的第一类细胞。参阅Geijtenbeek等，Cell 100：587-97(2000)。粘膜处的DC捕获、内在化HIV并通过gp120与DC上的细胞表面分子即DC-SIGN之间的相互作用将HIV从粘膜表面转运至远处的淋巴结。DC对完整病毒的递送随后导致CD4+T淋巴细胞的感染。参阅Bashirova等，J.Exp.Med.193：671-78(2001)。换言之，DC-SIGN反式作用以介导HIV对CD4+细胞的有效感染。参阅等，J.Virol.75：4664-72(2001)。后来的研究显示DC-SIGN也顺式作用以促进有效的病毒感染。参阅例如Lee等，J.Virol.75：12028-38(2001)。
考虑到消除受感染细胞的难度，免疫应答可能是最有效的：如果被激发的应答阻止病毒进入细胞的话。迄今为止，gp120的弱免疫原性妨碍了激发这类保护性应答的尝试。gp120含有广泛的糖基化和高度可变的环，其间分散着更加保守的、功能受限的区域，所述区域起着关键性gp120表位的物理屏蔽作用，gp120表位即与来自能够阻断病毒进入或中和病毒的抗体的受体/共受体复合物相互作用的那些表位。参阅例如Garber等，Lancet Infect.Dis.4：397-413(2004)。然而，天然激发的中和抗体已经被鉴定，证实了有效中和应答的潜在可能。参阅例如Burton等，Nature Immunol.5：233-36(2004)。
在发现AIDS 25年之后，开发HIV/AIDS疫苗以诱导抗广谱HIV-1元代分离株(primary isolate)的中和抗体仍然是一项具有高度挑战性的努力。开发有效疫苗的挑战性在于合适抗原表位的鉴定，所述表位能够被免疫原性地呈递从而激发宿主中的中和抗体。开发成功的HIV疫苗的挑战性还由于元代HIV分离株的庞杂多样性而变得复杂化。参阅例如Gaschen等，Science 296：2354-60(2002)。迄今为止，传统的疫苗设计方法在激发中和抗体应答方面尚未被证明成功。在HIV疫苗的约30例临床试验中，没有一例能够广谱诱导中和抗体。主要的挑战性之一在于缺乏适当设计的抗原，其具有暴露于抗原表面并在大部分或所有的HIV-1亚型中高度保守的中和表位。Pantophlet R等，Annu Rev Immunol.24：739-69，2006。迄今为止，仅从HIV-1感染的人类分离出四个具有广谱有效中和活性的单克隆抗体(MAb)。Douek DC等，Cell 124：677-81(2006)。其中没有任何一个能够在所有的测试动物物种中复制。在这四个MAb中，一个靶向HIV-1env gp120的构象表位，两个识别gp41，一个即2G12结合gp120上的高甘露糖型糖。
HIV感染最早的靶细胞是树突细胞(DC)，因此最有效的疫苗是破坏HIV靶向宿主DC的能力的疫苗。gp120的高甘露糖寡糖提供对于HIV-DC相互作用关键性的表位，从而提供了合适的疫苗靶标。高甘露糖寡糖介导DC-SIGN和gp120之间的相互作用。参阅Geijtenbeek等，Cell 100：587-97(2000)。然而，天然存在的gp120仅表达约20％的Man8GlcNAc2(Man8)和10％的Man9GlcNAc2(Man9)。参阅Scalan等，J.Virol.76：7306-21(2002)。一种蓝细菌蛋白质即蓝藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N，CV-N)与gp120的高甘露糖寡糖结合，特异性地识别Man9GlcNAc2(Man9)上的Manα1，2-Man结构和Man8GlcNAc2(Man8)的D1D3异构体，并通过此相互作用充当抗HIV的有效杀微生物剂。参阅Bewley等，J.Am.Chem.Soc.123：3982-902(2001)；Sandstrom等，Biochem.43：13926-31(2004)。另外，天然存在的中和抗体之一特异性地识别gp120的Manα1，2-Man高甘露糖寡糖簇。参阅Scanlan等，J.Virol.76：7306-21(2002)。称为2G12抗体的这种抗体通过抑制HIV病毒颗粒与DC和CD4+T细胞的相互作用，有效地中和广谱的HIV-1元代分离株。参阅例如Trkola等，J.Virol.70：1100-08(1996)；Sanders等，J.Virol.76：7293-305(2002)。
作为HIV-1疫苗靶标的高甘露糖型聚糖
开发基于糖的HIV疫苗据认为是预防性疫苗的新方法之一。Wang，Curr Opin Drug Discov Devel.9(2)：194-206，2006。若干迹象已经证明见于Man8NAcGlc2 D1和D3臂上的末端Manα1，2-Man结构(α1，2-连接的甘露糖)构成gp120糖蛋白上的新靶标，可能诱导有效的中和抗体，抵抗不同株系和亚型的HIV-1。
Gp120上的高甘露糖聚糖为广谱中和性单抗MAb 2G12所识别。已经在啮齿类中产生并从HIV-1感染的人类分离的抗gp120的数百个Mab中，2G12是唯一一个识别病毒糖并有效中和广谱HIV-1元代分离株的MAb。其通过抑制HIV-1与DC和CD4+T细胞的相互作用实现之。Trkola等，J Virol.70(2)：1100-8，1996；Scanlan等，J Virol.76(14)：7306-21，2002；.Sanders等，J Virol.76(14)：7293-305，2002。2G12的结合位点已经被鉴定为HIV-1env gp120糖蛋白上的高甘露糖型聚糖。更具体地，2G12MAb与来自至少三个高甘露糖聚糖的末端α1，2-连接的甘露糖残基簇结合(Scanlan等，J Virol.76(14)：7306-21，2002)；其不识别其它糖或具有不同末端链接(α1，3-链接的或α1，6-链接的甘露糖)的甘露糖残基。
高甘露糖聚糖上的Manα1，2-Man结构也是有效HIV-1抑制剂的结合位点。称作蓝藻抗病毒蛋白-N(CV-N)的蓝细菌蛋白质能够灭活多种多样的HIV-1、HIV-2和SIV实验室株系和元代分离株。Boyd等，AntimicrobAgents Chemother.41(7)：1521-30，1997。该蛋白质也能够阻断HIV-1gp120与CD4和共受体的相互作用、阻止病毒与细胞的融合并终止细胞感染。Esser等，J Virol.73(5)：4360-71，1999。Dey等，J Virol.74(10)：4562-9，2000。CV-N的这些有效特性归因于其以极高亲和力结合gp120上的高甘露糖寡糖的能力。具体地，此抑制剂识别Man9GlcNAc2(Man9)上的Manα1，2-Man结构和Man8GlcNAc2(Man8)的D1D3异构体，但是不识别其它形式的高甘露糖，包括Man7、Man6和Man5。Bewley等，J Am Chem Soc.123(17)：3892-902，2001；Sandstrom等，Biochemistry.43(44)：13926-139312004。CV-N抑制HIV感染的能力构成了能够结合这些末端聚糖结构的这类分子的效力论据。
已经显示树突细胞通过DC-SIGN与gp120上高甘露糖聚糖的相互作用促进感染。最近发现DC是体内HIV靶向的第一种细胞类型。发现粘膜处的DC捕获、内在化HIV，并将其转运至远处的淋巴结，在淋巴结中它们将完整的病毒递送给CD4+T淋巴细胞。Geijtenbeek等，Cell.100：587-97，2000。发现所有测试的HIV-1、HIV-2、SIV和SHIV株系均与DC结合，DC-SIGN在该过程中起重要作用。Pohlmann等，J Virol.75(10)：4664-72，2001。HIV和DC-SIGN之间的相互作用是由gp120上的高甘露糖聚糖介导的。Geijtenbeek等，Cell.100：587-97，2000。事实上，合成的高甘露糖寡糖能够结合DC-SIGN，并阻止随后的HIV相互作用。Feinberg等，Science.294(5549)：2163-6，2001。
HIV-1的gp120蛋白是重度糖基化的，并含有平均25个N-连接的糖基化位点。其中约半数被高甘露糖型或杂合型聚糖占据(Leonard等，J BiolChem.265(18)：10373-82，1990)，其中高甘露糖聚糖通过不同的结合位点与2G12、CV-N和DC-SIGN相互作用。MAb 2G12与来自至少三个Man9或Man8残基的D1臂簇结合，CV-N以高亲和力与来自单个Man9和Man8残基的D1和D3臂结合，而DC-SIGN通过其四聚体结合若干个甘露糖残基。
总之，这些结果意味着以高特异性的中和抗体抑制HIV感染早期阶段的强可能性，所述抗体针对见于高甘露糖聚糖的Manα1，2-Man结构。主要的挑战是开发这样的抗原，所述抗原严格地含有具有末端α1，2-连接的甘露糖结构的高甘露糖，并激发针对[能够与gp120交叉反应的]该表位的免疫原性应答。
已经采用两种方法构建同源HIV-1糖肽，以建立基于糖肽的HIV疫苗。Wang，Curr.Opin.Drug Discov.Devel.9(2)：194-206，2006。这些方法是完全化学合成带有杂合型或者高甘露糖型N-聚糖的HIV-1gp120糖肽，以及构建多种HIV-1糖肽的化学酶(chemoenzymatic)法。参阅Mandal等，Angew.Chem.Int.Ed.43：2557-2561，2004和Geng等，Angew.Chem.Int.Ed.43：2562-2565，2004；Singh等，Bioorg.Med.Chem.Lett.13：327-330，2003；Wang等，ChemBioChem.6：1068-1074(2005)；Zeng等，J.Am.Chem.Soc.127：9692-9693，2005；Li等，J Org.Chem.70：9990-9996，2005。然而，这些合成的糖肽需要在动物模型中进一步评价其免疫原性。
发明概述
能够激发针对广谱病毒分离株的中和抗体的有效HIV疫苗是控制HIV流行病的最好希望。不幸的是，主要的障碍持续妨碍这类疫苗的开发，所述障碍包括Env糖蛋白的弱免疫原性、病毒抗原的多样性和免疫逃避。响应这些挑战，本文提供的组合物提供了不同的重组抗原，所述抗原配备有对于HIV进入宿主细胞关键的多种复合糖表位。糖表位的数量增加，使得这些表位的免疫原性及其在疫苗组合物中激发中和抗体的相对效力最大化。
例如，本文提供的gp120表达基本上均一的带有末端α1-2聚糖的甘露糖寡糖，例如甘露糖-9-N-乙酰葡萄糖胺-2(“MaN9GlcNAc2”)或Man8GlcNAc。本文还说明了制备这种高甘露糖gp120组合物和使用所得的组合物激发有效的抗HIV中和抗体应答的方法。
因此，本文提供了基本上均一的糖基化重组蛋白质，其中末端聚糖是末端α1-2聚糖结构。重组蛋白质可以如下获得：用编码蛋白质的核苷酸序列转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)变体、发酵经转化的细胞，并从细胞或培养上清液中分离蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是毒力因子。蛋白质可以是病毒蛋白质。在具体的实施方案中，病毒蛋白质是表面蛋白质。在一个实施方案中，蛋白质是人免疫缺陷病毒的gp120。末端聚糖可以是甘露糖。在一些实施方案中，聚糖为寡甘露糖。在一些实施方案中，末端α1-2结构位于Man9GlcNAc2或Man8GlcNAc2上，或其组合。
本文还提供了制备均一糖基化重组蛋白质的方法，其中末端聚糖是末端α1-2聚糖结构，所述方法包括：a)提供含蛋白质编码核苷酸序列的载体；b)转化蛋白质糖基化缺陷型细胞；c)发酵经转化的细胞；和d)从细胞上清液中纯化分泌的重组蛋白质。在一些实施方案中，核苷酸序列编码以其天然状态糖基化的蛋白质。核苷酸序列可以编码为毒力因子的蛋白质。在具体的实施方案中，核苷酸序列编码gp120蛋白。在一些实施方案中，细胞表达带有大量Man9GlcNAc2或Man8GlcNAc2的gp120。本方法的细胞可以是酵母细胞，如酿酒酵母mns1Δ或酿酒酵母pmr1Δ。载体可以是YEpL，且在一些实施方案中可以含有GAL1启动子。在一些实施方案中，使用His标签纯化糖蛋白。
本文还提供了制备抗体的方法，所述抗体特异性地结合包含末端α1-2聚糖结构的蛋白质，所述方法包括用有效量的组合物免疫动物，所述组合物包含通过本文公开的方法制备的重组蛋白质或本文公开的蛋白质。组合物还可以包含佐剂、运载体或二者均有。
本文提供了通过本文公开的方法产生的分离的抗体，以及产生所述分离的抗体的杂交瘤。
本文还提供了用于激发[对包含抗体2G12识别表位的蛋白质特异的]受试者抗体的组合物，所述组合物包含分离的糖基化多肽和可药用的赋形剂，所述多肽包含至少两个被抗体2G12识别的N-连接的高甘露糖寡糖，其中糖基化多肽上大于50％的N-连接的聚糖是高甘露糖寡糖，且其中高甘露糖寡糖为Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其组合。
本文还提供了用于激发[对包含抗体2G12识别表位的蛋白质特异的]受试者抗体的组合物，所述组合物包含分离自突变真菌[所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母基因pmr1，或破坏了的酿酒酵母基因pmr1同源物基因]的糖基化多肽和可药用的赋形剂，其中糖基化多肽被抗体2G12识别。
本文还提供了用于激发[对包含抗体2G12识别表位的蛋白质特异的]受试者抗体的组合物，所述组合物包含分离自突变真菌[所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母基因pmr1和mnn1，或破坏了的酿酒酵母基因pmr1和mnn1同源物基因]的糖基化多肽和可药用的赋形剂，其中糖基化多肽被抗体2G12识别。
本文还提供了用于激发[对包含抗体2G12识别表位的蛋白质特异的]受试者抗体的组合物，所述组合物包含分离自突变真菌[所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母基因och1和mnn1或者och1、mnn1和mnn4，或破坏了的酿酒酵母基因och1和mnn1或者och1、mnn1和mnn4同源物基因]的糖基化多肽和可药用的赋形剂，其中糖基化多肽被抗体2G12识别。
本文还提供了用于制备激发[对包含抗体2G12识别表位的蛋白质特异的]受试者抗体的组合物的方法，所述方法包括：a)发酵突变真菌，其中所述突变真菌被突变以产生糖基化多肽，其中所述糖基化多肽包含至少两个被抗体2G12识别的N-连接的高甘露糖寡糖，其中糖基化多肽上大于50％的N-连接的聚糖是高甘露糖寡糖，且其中所述高甘露糖寡糖是Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其组合；和b)从突变真菌细胞裂解物或上清液中分离糖基化多肽。在一些实施方案中，所述方法还包括将糖基化多肽与可药用赋形剂配制的步骤。在一些实施方案中，突变真菌是具有破坏了的och1、mnn1和mnn4基因的酿酒酵母，具有破坏了的och1和mnn1基因的酿酒酵母，具有破坏了的pmr1和mnn1基因的酿酒酵母，或具有破坏了的och1基因的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或白色念珠菌(Candida albicans)。
本文还提供了用于制备激发[对包含抗体2G12识别表位的蛋白质特异的]受试者抗体的组合物的方法，所述方法包括：a)发酵突变真菌，其中所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母基因pmr1同源物基因；和b)从突变真菌细胞中分离被抗体2G12识别的糖基化多肽。该方法还可包括将糖基化多肽与可药用赋形剂配制的步骤。在一些实施方案中，突变真菌是其中pmr1基因破坏了的酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母。在一些实施方案中，突变真菌已经在步骤a)之前用含糖基化多肽编码核苷酸序列的载体转化。在一些实施方案中，糖基化多肽是HIV gp120或其片段。
本文还提供了用于制备激发[对包含抗体2G12识别表位的蛋白质特异的]受试者抗体的组合物的方法，所述方法包括：a)发酵突变真菌，其中所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母基因pmr1和mnn1同源物基因；和b)从突变真菌细胞中分离被抗体2G12识别的糖基化多肽。该方法还可包括将糖基化多肽与可药用赋形剂配制的步骤。在一些实施方案中，突变真菌是其中pmr1和mnn1基因破坏了的酿酒酵母。在一些实施方案中，突变真菌已经在步骤a)之前用含有糖基化多肽编码核苷酸序列的载体转化。在一些实施方案中，糖基化多肽是HIV gp120或其片段。
本文还提供了用于制备激发[对包含抗体2G12识别表位的蛋白质特异的]受试者抗体的组合物的方法，所述方法包括：a)发酵突变真菌，其中所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母基因och1和mnn1或者och1、mnn1和mnn4同源物基因；和b)从突变真菌细胞中分离被抗体2G12识别的糖基化多肽。该方法还可包括将糖基化多肽与可药用赋形剂配制的步骤。在一些实施方案中，突变真菌是och1、mnn1和mnn4基因破坏了的酿酒酵母，或och1和mnn1基因破坏了的酿酒酵母。在一些实施方案中，突变真菌已经在步骤a)之前用含有糖基化多肽编码核苷酸序列的载体转化。在一些实施方案中，糖基化多肽是HIV gp120或其片段。
本文还提供了含有多核苷酸的突变真菌细胞，所述多核苷酸包含gp120或其包含至少两个N-糖基化位点的片段的编码核苷酸序列，其中突变酵母细胞能够产生gp120或其片段，所述片段包含至少两个能被抗体2G12识别的N-连接的高甘露糖寡糖，其中所述高甘露糖寡糖为Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其组合。在一些实施方案中，突变真菌是och1、mnn1和mnn4基因破坏了的酿酒酵母，och1和mnn1基因破坏了的酿酒酵母，或och1基因破坏了的巴斯德毕赤酵母或白色念珠菌。在一些实施方案中，突变真菌是pmr1和mnn1基因破坏了的酿酒酵母。在一些实施方案中，突变真菌是pmr1基因破坏了的酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母。
本文还提供了包含突变酵母完整细胞和可药用赋形剂的组合物，其中所述突变酵母具有破坏了的酿酒酵母基因pmr1和mnn1，och1和mnn1，或och1、mnn1和mnn4；或破坏了的酿酒酵母基因pmr1和mnn1，och1和mnn1，或och1、mnn1和mnn4同源物基因。
本文还提供了用于产生[对包含抗体2G12识别表位的蛋白质特异的]受试者抗体的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的任何本文所述的组合物。
本文还提供了对受试者诱导抗病原体(如HIV)的中和抗体的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的任何本文所述的组合物。
本文还提供了对需要的受试者诱导抗病原体的中和抗体的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的药物组合物，所述组合物包含本文提供的蛋白质或通过本文提供的方法制备的蛋白质以及适宜的赋形剂。在一些实施方案中，所述方法还包括施用佐剂。在具体的实施方案中，病原体为HIV。
本文还提供了对受试者预防或治疗病原体诱导的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的任何本文所述的组合物。
本文还提供了对需要的受试者预防或治疗病原体诱导的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含本文提供的蛋白质或通过本文提供的方法制备的蛋白质，以及适宜的赋形剂。在一些实施方案中，所述方法还包括施用佐剂。在具体的实施方案中，病原体为HIV。在一个实施方案中，蛋白质为gp120。在一些实施方案中，药物组合物还包含来自不同HIV株系的多种gp120蛋白。
本文还提供了用于鉴定与N-连接的高甘露糖寡糖特异性结合的抗体的方法，所述方法包括检测抗体与糖基化多肽(其包含被抗体2G12识别的至少两个N-连接的高甘露糖寡糖)的结合，其中糖基化多肽上大于50％的N-连接的聚糖是高甘露糖寡糖，且其中高甘露糖寡糖是Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其组合。
本文还提供了用于鉴定与N-连接的高甘露糖寡糖特异性结合的抗体的方法，所述方法包括检测抗体与突变真菌中产生的糖蛋白的结合，所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母基因pmr1或破坏了的酿酒酵母基因pmr1同源物基因，其中糖蛋白被抗体2G12识别。
本文还提供了用于鉴定与N-连接的高甘露糖寡糖特异性结合的抗体的方法，所述方法包括检测抗体与突变真菌中产生的糖基化多肽的结合，所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母基因pmr1和mnn1或破坏了的酿酒酵母基因pmr1和mnn1同源物基因，其中糖蛋白被抗体2G12识别。
本文还提供了用于鉴定与N-连接的高甘露糖寡糖特异性结合的抗体的方法，所述方法包括检测抗体与突变真菌中产生的糖基化多肽的结合，所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母基因och1和mnn1或者och1、mnn1和mnn4，或破坏了的酿酒酵母基因och1和mnn1或者och1、mnn1和mnn4同源物基因，其中糖蛋白被抗体2G12识别。
在一些实施方案中，抗体存在于HIV感染受试者的血清中。在一些实施方案中，糖基化多肽存在于突变酵母细胞裂解物中。
本文还提供了鉴定用于HIV传染的中和性单克隆抗体的方法，所述方法包括：a)将第一细胞与第二细胞接触，其中所述第一细胞表达树突细胞特异性的C型凝集素(DC-SIGN)，所述第二细胞表达CD4+和CCR5+，b)将第一和第二细胞与传染性病毒颗粒共培养；c)将共培养物与通过权利要求20的方法制备的候选抗体接触；和d)测定相对传染性，其中中和抗体降低或消除传染性病毒颗粒对第二细胞相对传染性。
附图的简短说明
图1阐述了哺乳动物细胞中高甘露糖的结构和加工。左边的方框显示内质网ER中聚糖从前体到Man8的加工。主要带有Man8的蛋白质随之被转运至高尔基体进行进一步加工(右上方框，以哺乳动物细胞为例)。当阻断ER到高尔基体的蛋白质转运[例如通过酵母中Pmr1基因突变]时，这些聚糖不会被进一步加工，得到仅含有Man8和Man9形式聚糖的糖蛋白(右下)。
图2显示酵母中HIV gp120糖蛋白的表达。A：Δpmr1中来自3个HIV-1株系的gp120蛋白的表达被半乳糖诱导指定天数。用2G12检测培养上清液中的蛋白质。B：纯化的HIVYU2gp120。第1道显示浓缩的酵母培养基，第2道是透析和离心之后，第3道和第4道分别是GNL和凝胶过滤之后的200ng和400ng，第5道和第6道是在293T细胞中产生的200ng和400ng HIVYU2 gp120。
图3显示酵母中产生的gp120蛋白的EndoH消化测定。对用于MS/MS分析的相同批次的纯化gp120蛋白进行EndoH消化。然后通过SDS-PAGE将未消化的和消化的蛋白质分离，接着进行考马斯蓝染色。第2道是200ng未消化的，第3道是400ng消化的，第4道是来自酵母中表达的HIVSF2的非糖基化gp120。
图4显示抗甘露糖的抗体。(A)在第0周用含有CFA的200μg酵母聚糖(Zymosan)A免疫两只兔子，并在第2周、第4周和之后每4周用含有不完全弗氏佐剂(“IFA”)的100μg抗原加强。在第5周和每次加强后1周收集免疫血清。在用酵母聚糖和酵母甘露聚糖包被的微孔板中使用ELISA一式两份测试抗体。显示了来自两只兔子的平均抗体效价。(B)抗甘露糖的抗体与一些测试的gp120糖蛋白具有反应性。微孔板用5μg/ml的gp120蛋白包被。(C)该图显示来自YU2株系的gp120蛋白在哺乳动物细胞和酵母细胞中的抗原性的比较，通过抗甘露聚糖酶抗体测试。
图5显示BSA-Man9缀合物的分析。BSA-Man9缀合物用10％SDS-PAGE凝胶分析，接着进行考马斯蓝染色。第1道是未缀合的BSA，第2道是BSA-SMCC，第3道是BSA-SMCC-Man9。
图6A显示DC-SIGN ECD重组蛋白的表达和纯化。DC-SIGN ECD重组蛋白的表达和纯化。于25℃、不存在(第2道)及存在IPTG(第3道)时在大肠杆菌中表达ECD蛋白4小时。分离包涵体(第4道)，并使用Ni-NTA柱纯化来自不溶性级分的重新折叠的蛋白质(第5道)。在12％SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质，并用考马斯蓝染色。6B显示使用DC-SIGN和抗gp120多克隆抗体包被的微孔板的ELISA。使用YU2株系的HIV-1gp120结合包被蛋白。
图7显示DC-SIGN Mab的显影。使用纯化的DC-SIGN ECD蛋白免疫Balb/c小鼠。使用具有良好抗体应答的小鼠脾细胞进行细胞融合。ELISA筛选培养物上清液后，对来自阳性孔的细胞进行扩增和亚克隆。使用蛋白质印迹(Western blots)筛选来自单克隆孔的上清液。每个单独的泳道表示独立的克隆。
图8显示中和实验。使用由携带pHXB2gp160的假病毒感染的LuSIV细胞系测试两个多克隆(P)抗体的中和活性。使用三种公知的中和MAb(M)作为阳性对照。每种抗体检测四种剂量(50、25、12.5和6.25μg/ml)。
图9显示N-连接的寡糖的结构和加工。图9A显示ER中MNS1对聚糖从Man9GlcNAc2到Man8GlcNAc2的加工。主要带有Man8GlcNAc2形式高甘露糖核心的蛋白质随之被转运至高尔基体进行进一步加工。图9B下框显示超级糖基化(superglycosylation)，这是主要(粗箭头)的途径。图9B右上框显示核心上添加α1，3-Man，这是次要途径(细箭头)。当Och1、Mnn1和Mnn4基因均被缺失时，Man8GlcNAc2核心上不能添加任何糖，得到几乎均质的Man8GlcNAc2型聚糖(图9C)。
图10显示使用Western印迹在酵母突变体菌株中筛选2G12交叉反应性蛋白质。A：用HIV-1MAb 2G12筛选来自多种突变体菌株的酵母培养基(波利门科学生物免疫研究有限公司：Polymun Scientific Inc.ForschungGmbH)。用丙酮(ethetone)沉淀培养基中的分泌蛋白质，并上样至4-20％的梯度SDS-PAGE凝胶上。用2G12探测所述印迹，随后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG孵育。用ECL显影信号并将其曝光于X射线胶片。B：来自相同设置的酵母突变体株系细胞裂解物用HIV-1gp120糖蛋白的对照筛选。
图11显示在Δpmr1酵母细胞中诱导2G12交叉反应性蛋白质。A.在指定的时间点培养用gp120转化的Δpmr1酵母细胞。用丙酮(ethetone)沉淀培养基中的分泌蛋白质，并上样至4-20％的梯度SDS-PAGE凝胶上。用2G12探测所述印迹，随后与HRP-抗人IgG孵育。用ECL显影信号并将其曝光于X射线胶片。B.如A中所述，用2G12检测来自未转化的(第1-3道)和用gp120转化的(第4-6道)Δpmr1细胞的培养基中的蛋白质。
图12显示2G12反应性糖蛋白的纯化和鉴定。使用GNL凝集素亲和层析部分地纯化约100kDa的蛋白质(命名为Yp100)。培养基与结合了琼脂糖的GNL孵育16小时。将起始材料(第1道)、流出液(第2道)、洗涤液(第3-6道)和洗脱液(第7-11道)的样品上样至4-20％SDS-PAGE凝胶上。用MAb 2G12探测转移的膜上的蛋白质。
图13显示2G12反应性糖蛋白的鉴定。对100kDa条带中的蛋白质进行凝胶内消化。抽提消化的肽，并使用纳米LC-MS/MS分析。在带有纳米电喷射源的质谱公司(Micromass)Q-Tof即杂种四极/飞行时间质谱仪上进行分析。用ProteinLynx软件(沃特斯公司：Waters)加工原始文件并提交给MASCOT搜索。在酿酒酵母中具有登录号NP_010340和45,749Da质量的酵母蛋白质PST1(SEQ ID NO：1)中总计鉴定了6个肽。N端的粗体字母是鉴定的信号传导肽。C端的粗体字母是鉴定的GPI锚定信号。单下划线标出通过质谱法鉴定的肽。高亮显示字母是潜在的N-连接的糖基化位点。
图14显示2D凝胶对2G12反应性蛋白质的确认。A.部分纯化的Yp100蛋白质通过2D凝胶分离，并进行考马斯蓝染色(A)、以2G12MAb和在兔中产生的针对合成肽的抗PST1多克隆抗体进行Western印迹(B)。尽管来自酵母的部分纯化的Yp100蛋白有其它酵母糖蛋白杂质，但是它们中没有一个和PST1具有相似的PI。
图15显示2G12交叉反应性的蛋白质PST1的聚糖分析。A.用EndoH消化部分纯化的Yp100蛋白，将未消化的(第2、4和6道)和消化的(第3、5和7道)蛋白质通过SDS-PAGE凝胶分离并进行考马斯蓝染色(第1-3道)、以抗PST1多克隆抗体(第4和5道)和MAb 2G12(第6和7道)进行Western印迹。之后与HPR标记的第二抗体ECL孵育并曝光于X射线胶片。
图16显示在pmr1和mnn1双突变体中PST1与2G12的交叉反应性。制备来自5个不同双突变体菌株的细胞裂解物，并在4-20％梯度SDS-PAGE上分离。用MAb 2G12探测印迹，然后与HPR标记的第二抗体ECL孵育并曝光于X射线胶片。
图17显示双突变体中PST1的上调和移行。A.酵母细胞裂解物中的PST1。在4-20％梯度SDS-PAGE上分离来自不同菌株的细胞裂解物。使用Western印迹以抗PST1多克隆抗体分析野生型和突变体中PST1表达的水平。第1道，野生型；第2道，Δmnn1；第3道，Δoch1；第4道，Δpmr1；第5道，Δpmr1和Δmnn1双突变体。上图显示仅在pmr1和mnn1双突变体中检测到PST1。下图显示在所有5个菌株都可检测到另一糖基化蛋白质GP38。B.酵母细胞培养基中的PST1。将来自不同菌株的酵母细胞在富集培养基上培养24小时，并用丙酮沉淀培养基中的蛋白质。使用Western印迹以抗PST1抗体(上图)和抗GP38(下图)检测蛋白质分泌水平。
图18显示在双突变体中PST1上α1，3-Man和α1，2-Man的分析。通过Western印迹，使用抗α1，3连接的甘露糖的多克隆抗体和2G12，检测来自pmr1单突变体(第1道)和pmr1+mnn1双突变体(第2道)的酵母细胞培养基的末端α1，3-Man和α1，2-Man。使用och1单突变体和纯化的PST1作为对照。用丙酮沉淀培养基中的蛋白质，并上样至4-20％SDS-PAGE梯度凝胶上。印迹在硝酸纤维素上以后，膜分别用所示的2G12MAb和兔抗α1，3Man抗体或抗PST1抗体探测，接着是山羊抗人IgG-HRP和山羊抗兔IgG-HRP。
图19显示通过免疫印迹在双突变体中验证2G12交叉反应性蛋白质。离心来自双突变体的培养上清液并弃去沉淀。上清液(第1道)用琼脂糖预先清洗(第2道)。然后将样品与MAb 2G12在4℃孵育16小时。将免疫复合物与蛋白质A琼脂糖于室温孵育1小时。短暂离心样品并使用上清液作为流出液(第3道)。结合了蛋白质A-琼脂糖的免疫复合物洗涤两次(第4道和第5道)。结合的蛋白质用SDS样品缓冲液洗脱(第6道)。然后在4-20％梯度凝胶上分离样品，并用抗PCT1多克隆抗体对其进行探测。
图20显示18个物种间的PST1同源物基因。使用PST1(NP_010340)和ECM33(NP_009634)的蛋白质序列从国家生物技术信息中心(NCBI)的HomoloGene(同源基因)数据库(版本50.1)搜索同源物基因。HomoloGene是用于在若干个完整测序的真核基因组的注释基因中自动检测同源物的系统。目前，HomoloGene数据库含有来自18个物种的165,820个HomoloGene群。通过在NCBI主页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上输入蛋白质参照序列(RefSeq)号获得目的HomoloGene。通过clustalw程序进行HomoloGene的多重比对。PST1和三个同源物基因(粟酒裂殖酵母(S.pombe)和棉假囊酵母(E.gossypii)的蛋白质得自HomeloGene数据库搜索；来自光滑假丝酵母(Candida glabrata)的蛋白质使用抗NCBI nr序列数据库的blastp搜索获得)。
图21显示使用PCR分析双突变体和三突变体。三突变体单倍体基因型的筛选和验证。图A显示用PCR筛选推定的三突变体的1.5％琼脂糖凝胶，对Δmnn4基因型(上图)使用MNN4A和KanB引物(预期大小为609bp)，对Δoch1基因型(下图)使用OCH1A和KanB引物(697bp)。第1道含有单倍体克隆2-2。第2道含有单倍体克隆2-3。第3道含有单倍体克隆2-4。第4道含有单倍体克隆2-5。图B显示用PCR验证三突变体单倍体克隆2-5和2-6(分别为上图和下图)的Δmnn1、Δmnn4和Δoch1基因型的1.5％琼脂糖凝胶。每个泳道含有所示的不同PCR引物对。内部ORF特异引物(MNN1B、MNN4B、OCH1B、MNN1C、MNN4C和OCH1C)和上游或下游引物(MNN1A、MNN4A、OCH1A、MNN1D、MNN4D和OCH1D)组合，如果ORF缺失，则没有PCR产物。第1道是MNN1A+MNN1B。第2道是MNN4A+MNN4B。第3道是OCH1A+OCH1B。第4道是MNN1C+MNN1D。第5道是MNN4C+MNN4D。第6道是OCH1C+OCH1D。相反，上游或下游引物和内部KanMX特异引物(KanB和KanC)组合，存在缺失时也有PCR产物。第7道是MNN1A+KanB(预期大小是591bp)。第8道是MNN1D+KanC(944bp)。第9道是MNN4D+KanC(931bp)。第10道是OCH1D+KanC(854bp)。
图22显示全细胞ELISA。使用ELISA检测2G12和α1，3-连接的甘露糖抗体抗全细胞酵母的特异性。将INVSc1(二倍体)和Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP酵母在PBS中稀释至5.0×107细胞/ml，并用于包被ELISA平板。在50mM的碳酸盐缓冲液中将SF162gp120和野生型酵母甘露聚糖稀释至5μg/ml。使用10μg/ml的2G12和抗α1，3-甘露糖进行捕获，以封闭缓冲液进行三倍的系列稀释。图A显示抗α1，3抗体对野生型细胞和甘露聚糖具有高亲和力，三突变体显示低亲和力，而SF 162显示无结合。相反，图B显示三突变体细胞和SF162gp120对2G12抗体分别具有中度和高度的亲和力，该2G12抗体特异于末端α1，2-连接的甘露糖残基。野生型细胞和甘露聚糖均显示不与2G12结合。该实验一式两份进行，上方OD450读数表示平均值。
图23显示三突变体细胞中α1，3-Man反应性的丧失。使用抗α1，3连接的甘露糖免疫血清和抗酵母聚糖抗体进行三突变体和野生型酵母的免疫荧光。对数期的Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP细胞(图A、C)和INVScI细胞(图B、D)用4％的多聚甲醛固定，并转移至多聚赖氨酸包被的玻片上。细胞与0.5％SDS一起孵育，并用1∶500稀释的α1，3-连接的甘露糖抗血清(图A、B)和10μg/ml纯化的抗酵母聚糖(图C、D)染色，随后是Alexa Fluor568缀合的山羊抗兔IgG。
图24显示三突变体细胞中末端α1，2-Man的暴露。使用2G12和抗酵母聚糖进行三突变体和野生型酵母的免疫荧光。对数期的Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP细胞(图A、B和C)和INVScI细胞(图D、E和F)用4％的多聚甲醛固定，并转移至多聚赖氨酸包被的玻片上。细胞与0.5％SDS一起孵育，并分别用100μg/ml的2G12(图A、D)和10μg/ml兔抗酵母聚糖(图B、E)染色，随后是Alexa Fluor568缀合的山羊抗兔IgG。图C和F显示抗体的共定位。
图25显示酵母突变体的糖蛋白上α1，2-Man和α1，3-Man的分析。对所有酵母突变体的糖蛋白使用2G12和α1，3-连接的甘露糖抗血清进行Western印迹。将对数期的细胞在RIPA缓冲液中裂解，并以2.4μg/道上样至4-20％SDS-PAGE梯度凝胶上。印迹至硝酸纤维素上之后，膜分别用2G12MAb或α1，3Man抗血清探测，随后是山羊抗人IgG-HRP和山羊抗兔IgG-HRP。第1道含有INVSc1野生型裂解物。第2道含有Δmnn1裂解物。第3道是Δoch1裂解物。第4道含有Δmnn4裂解物。第5道含有Δmnn1Δmnn4裂解物。第6道含有Δmnn1Δoch1裂解物。第7道含有Δmnn1Δmnn4Δoch1裂解物。有至少四种蛋白质与见于Δmnn1Δoch1和Δmnn1Δoch1Δmnn4细胞裂解物中的2G12强结合(左道)。相反，仅WT(野生型)酵母和无Δmnn1基因型的突变体显示结合特异于α1，3-连接的甘露糖的抗血清(右道)。
图26显示所有分离的三突变体中2G12的反应性。对六个酵母三突变体克隆使用2G12进行Western印迹。将对数期的酵母三突变体克隆在SDS上样缓冲液中进行粗裂解，并上样至4-20％SDS-PAGE梯度凝胶上。印迹在硝酸纤维素上后，膜用1μg/ml的2G12探测，随后是山羊抗人IgG-HRP。第1道含有单倍体克隆1-2。第2道含有单倍体克隆1-3。第3道含有单倍体克隆2-2。第4道含有单倍体克隆2-4。第5道含有单倍体克隆2-5。第6道含有单倍体克隆2-6。有至少四种蛋白质与见于各三突变体单倍体克隆中的2G12强结合。
图27显示酵母三突变体细胞中均质的Man8形式高甘露糖。三突变酵母裂解物的MALDI-TOF质谱。将对数期的Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP细胞匀浆，进行脂质抽提，并用PNGase F消化得到的裂解物。高甲基化(permethylation)后通过Maldi-TOF质谱法构建N-聚糖谱。代表多于90％的总聚糖的主峰是Man8GlcNAc2，同时有代表Man5GlcNAc2和Man9GlcNAc2的两个次峰。
图28显示从三突变酵母的细胞裂解物中部分纯化和分离的2G12反应性蛋白质。在图A中，2G12反应性蛋白质的亚细胞定位使用差速离心评估。对数期的Δmnn1Δmnn4Δoch1细胞在蔗糖裂解液中使用玻璃珠裂解。去除未裂解的细胞和大聚集体后，蛋白质被分为两种级分：22,000g上清液(第1道)和22,000g沉淀(第2道)。将该沉淀级分重溶于1.0％TritonX-100中，并分离为两种另外的级分：Triton可溶性沉淀(第3道)和Triton不溶性沉淀(第4道)。所有的泳道表示使用1μg/ml 2G12的Western印迹。在图B中，使用ConA琼脂糖部分纯化2G12反应性蛋白质。将来自Δmnn1Δmnn4Δoch1细胞的Triton可溶性级分(第1道)与ConA琼脂糖珠孵育，并收集流出液(第2道)。用结合缓冲液进行洗涤(第3道)后，用0.5M甲基甘露型吡喃糖苷(第4、5道)或2mM EDTA+1.0％SDS(第6道)洗脱蛋白质。所有的泳道表示使用1μg/ml 2G12的Western印迹。在图C中，使用2D电泳分离2G12反应性蛋白质。来自ConA纯化的洗脱级分(图B，第4-6道)在英骏公司(Invitrogen)IPG ZOOM 4-7IPG胶条上电泳，然后使用4-12％的IPG ZOOM系统进行大小分离。使用1μg/ml的2G12通过Western印迹染色一条凝胶。从Sypro宝石红蛋白(ruby)凝胶上切下通过Western印迹显示阳性信号的两个大印斑，用胰蛋白酶消化，并在质谱公司(Micromass)Q-Tof 2上通过纳米LC/MS/MS分析进行肽鉴定。使用MS/MS在上方印斑中鉴定到三个糖蛋白(ECM33、Gasl和Gas5)，而下方印斑有单个糖蛋白(YJL171c)。
图29显示在三突变酵母培养基中表达和部分纯化2G12反应性糖蛋白。在图A中，通过将来自对数期INVSc1和Δmnn1Δmnn4Δoch1酵母的100μl培养上清液在-80℃与两倍体积冰冻的丙酮孵育30分钟，进行丙酮沉淀。将得到的沉淀物重悬于10μl的SDS样品缓冲液中，并上样至4-20％SDS-PAGE梯度凝胶上。转移至硝酸纤维素后，用2μg/ml的2G12探测蛋白质。三突变酵母有至少四个蛋白质对2G12MAb具强反应性(第2道)，而野生型酵母上清液显示无信号(第1道)。在图B中，使用ConA琼脂糖部分纯化2G12反应性蛋白质。将来自对数期Δmnn1Δmnn4Δoch1细胞的培养上清液(第1道)直接与ConA琼脂糖珠孵育。收集流出液(第2道)并用结合缓冲液洗涤珠子(第3道)。通过用SDS-PAGE上样缓冲液煮沸ConA珠来洗脱结合的2G12反应性蛋白质(第4道)。使用1μg/ml的2G12通过Western印迹检测蛋白质。使用MS/MS从第4道所示的2G12沉淀物的等分式样中鉴定了两种糖蛋白(ECM33和GP38)。
图30显示2G12反应性蛋白质的免疫沉淀。用2G12对三突变体细胞的细胞裂解物和培养基进行免疫沉淀，并用针对所鉴定的2G12反应性蛋白质的抗体进行印迹。来自Δmnn1Δmnn4Δoch1细胞(第1道)的细胞裂解物(图A)和培养基(图B)通过与蛋白质A-琼脂糖4B一起孵育来进行预清洗。向样品中添加2G12，孵育1小时，然后是蛋白质A-琼脂糖。未结合的蛋白质作为上清液去除(第2道)并用PBS洗涤(第3道)。通过用40μl1xSDS样品缓冲液煮沸来洗脱结合的蛋白质(第4道)。将所有的样品上样至4-20％梯度SDS-PAGE凝胶上，印迹，并使用抗ECM33、抗gp38、抗YJL171C、抗Gas1和抗PST1进行Western分析。
图31显示不同基因的突变体中糖蛋白的移行。将酵母细胞培养至对数期并收集细胞和培养基。细胞在RIPA缓冲液中裂解，并以2.4μg/道上样至4-20％SDS-PAGE梯度凝胶上。用丙酮沉淀培养基并将蛋白质也上样至4-20％SDS-PAGE梯度凝胶上。第1道为WT。第2道为Δmnn1。第3道为Δoch1。第4道为Δmnn4。第5道为Δmnn1mnn4。第6道为Δmnn1Δoch1。第7道为Δmnn1Δmnn4Δoch1。印迹在硝酸纤维素上以后，用抗ECM33(上图)或抗GP38(下图)探测膜，接着是山羊抗兔IgG-HRP。
图32显示在用三突变酵母细胞免疫的兔中产生的抗α1，2-连接的甘露糖的抗体分析。用来自野生型(WT)和三突变体(TM)酿酒酵母的全细胞免疫兔子。用5μg/ml的在293T细胞中产生的JRFL菌株HIV-1gp120包被微孔板。免疫血清稀释至1∶500并用2G12检测抗α1，2-Man的抗体。
图33显示PST1中潜在N-连接和O-连接糖基化位点的分析。图A显示前体的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。N末端的粗体字母是鉴定的信号肽。C末端的粗体字母是鉴定的GPI锚定信号。单下划线标出通过质谱鉴定的肽，而双下划线标出在相同或不同质谱分析中鉴定了两次的肽。高亮显示的字母是潜在的N-连接的糖基化位点。图B显示使用公开网站http://www.cbs.dtu.dk/services/netoglyc中由丹麦技术大学(TechnicalUniversity of Denmark)的生物学序列分析中心(CBS)开发的软件NetOGlyc 3.1分析O-连接的糖基化位点。Julenius K.，A.
Figure A20068004332000281
R.Gupta和S.Brunak.Prediction，conservation analysis and structuralcharacterization of mammalian mucin-type O-glycosylation sites.Glycobiology，15：153-164，2005。
图34显示ECM33的潜在的N-连接和O-连接糖基化位点分析。图A显示前体的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。N末端的粗体字母是鉴定的信号肽。C末端的粗体字是鉴定的GPI锚定信号。单下划线标出通过质谱鉴定的肽，而双下划线标出在相同或不同质谱分析中鉴定了两次的肽。高亮显示的字母是潜在的N-连接的糖基化位点。图B显示使用公开网站http://www.cbs.dtu.dk/services/netoglyc中由丹麦技术大学的生物学序列分析中心(CBS)开发的软件NetOGlyc 3.1分析O-连接的糖基化位点。
图35显示分析GP38的潜在的N-连接和O-连接糖基化位点。图A显示前体的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。N末端的粗体字母是鉴定的信号肽。C末端的粗体字是鉴定的GPI锚定信号。单下划线标出通过质谱鉴定的肽，而双下划线标出在相同或不同质谱分析中鉴定了两次的肽。高亮显示的字母是潜在的N-连接的糖基化位点。图B显示使用公开网站http://www.cbs.dtu.dk/services/netoglyc中由丹麦技术大学的生物学序列分析中心(CBS)开发的软件NetOGlyc 3.1分析O-连接的糖基化位点。
图36显示分析YJL171c的潜在的N-连接和O-连接的糖基化位点。图A显示前体的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。N末端的粗体字母是经鉴定的信号肽。C末端的粗体字是经鉴定的GPI锚定信号。单下划线标出通过质谱鉴定的肽，而双下划线标出在相同或不同质谱分析中鉴定了两次的肽。高亮显示的字母是潜在的N-连接的糖基化位点。图B显示使用公开网站http://www.cbs.dtu.dk/services/netoglyc中由丹麦技术大学的生物学序列分析中心(CBS)开发的软件NetOGlyc 3.1分析O-连接的糖基化位点。
图37显示分析Gas1的潜在的N-连接和O-连接糖基化位点。图A显示前体的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。N末端的粗体字母是鉴定的信号肽。C末端的粗体字是鉴定的GPI锚定信号。单下划线标出通过质谱鉴定的肽，而双下划线标出在相同或不同质谱分析中鉴定了两次的肽。高亮显示的字母是潜在的N-连接的糖基化位点。图B显示使用公开网站http://www.cbs.dtu.dk/services/netoglyc中由丹麦技术大学的生物学序列分析中心(CBS)开发的软件NetOGlyc 3.1分析O-连接的糖基化位点。
图38显示分析Gas5的潜在的N-连接和O-连接糖基化位点。图A显示前体的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。N末端的粗体字母是鉴定的信号肽。C末端的粗体字是鉴定的GPI锚定信号。单下划线标出通过质谱鉴定的肽，而双下划线标出在相同或不同质谱分析中鉴定了两次的肽。高亮显示的字母是潜在的N-连接的糖基化位点。图B显示使用公开网站http://www.cbs.dtu.dk/services/netoglyc中由丹麦技术大学的生物学序列分析中心(CBS)开发的软件NetOGlyc 3.1分析O-连接的糖基化位点。
图39显示在三突变酵母中克隆和表达gp120。图A显示在1.0％琼脂糖凝胶上电泳的酵母转化株上的菌落PCR结果。从-ura/葡萄糖平板上挑取以YU2-gp120或JRPL-gp120转化的四个不同的Δmnn1Δmnn4Δoch1酵母克隆，并用PCR主混合物(PCR master mix)孵育。所述PCR混合物含有用于pJRFL-gp120验证的引物MFα1-Kpn-5和JRFL-Xba-3，以及用于pYU2-gp120验证的引物MFα1-Kpn-5和YU2-Xba-3。JRFL和YU2转化株预期的PCR产物大小分别为1724kB和1697kB。图B显示使用抗gp120-IIIB(怀罗斯塔特有限公司：Virostat Inc.)检测gp120。通过在-ura/半乳糖培养基上生长诱导每种质粒(JRFL-gp120和YU2-gp120)的一个Δmnn1Δmnn4Δoch1转化株进行gp120表达。在四个不同的时间点：第0、3、6和9天收集培养基样品。用丙酮沉淀蛋白质，在4-20％SDS-PAGE凝胶上电泳，并使用抗gp120-IIIB检测。图C显示使用抗gp120-YU2检测gp120。相同的Δmnn1Δmnn4Δoch1转化株诱导所示的天数。用丙酮沉淀蛋白质，在4-20％SDS-PAGE凝胶上电泳，并使用抗gp120-YU2检测。通过两种抗gp120检测的得到的蛋白质显示在～110kDa处的清晰条带，在第6天和第9天最佳表达。
图40显示用2G12检测表达的gp120。通过在-ura/半乳糖培养基上生长来诱导每种质粒(JRFL-gp120和YU2-gp120)的一个Δmnn1Δmnn4Δoch1转化株进行gp120表达，未转化的Δmnn1Δmnn4Δoch1的一个克隆在SC/半乳糖上培养。如图所示，在第3、6和9天收集培养基样品。蛋白质用丙酮沉淀，在4-20％SDS-PAGE凝胶上电泳，并使用2G12检测。这些gp120糖蛋白对于JR-FL和YU-2gp120而言分别具有96.4和99.6kDa的预测分子量。
实施本发明的方式
CV-N和2G12抑制HIV感染的能力提示：激发应答Man9、Man8或两者的中和抗体能够提供抗HIV传染的有效免疫力。然而迄今尚无提供具有特定糖基化模式的gp120抗原的可再现手段。因此，本文提供的重组高甘露糖gp120组合物提供了抗HIV感染的保护性免疫力的有力诱导剂。
为清楚公开而非限制起见，本发明的详细说明分为以下各小节。
A.定义
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文提到的所有专利、公开的专利申请和其它出版物以及来自GenBank和其它数据库的序列作为参考以其整体并入本文。如果该小节中公开的定义与作为参考并入本文的专利、公开的专利申请和其它出版物以及来自GenBank和其它数据库的序列中公开的定义相反或以其它方式不一致，则在该小节中公开的定义优先于作为参考并入本文的定义。
本发明的其它特征和优点将会因详细说明和权利要求书而显而易见。
本文使用术语“一种”或“一个”表示“至少一种”或“一个或多个”。
本文使用术语“佐剂”是指添加到免疫原性物质中时，非特异性地促进或增强接触混合物的受体宿主对所述物质的免疫应答的物质。佐剂可包括例如水包油乳剂、油包水乳剂、明矾(例如氢氧化铝/磷酸铝)、脂质体和微粒。例示性的佐剂包括，但不限于角鲨烯混合物(SAF-I)、胞壁肽、皂苷衍生物、分枝杆菌细胞壁制品、单磷酰脂质A、分枝菌酸衍生物、非离子嵌段共聚物表面活性剂、Quil A、霍乱毒素B亚基、聚磷腈(polyphosphazene)及衍生物、免疫刺激复合物(ISCOM)和细胞因子。参阅例如Vogel等，Immunological Adjuvants，VACCINES 69-79(Plotkin等编，第4版，Saunders(2004))。对于兽医用途和在动物中生产抗体而言，也可以使用(完全和不完全的)弗氏佐剂的促有丝分裂成分。
本文使用“AIDS”是指HIV感染的症状期，并包括获得性免疫缺陷综合征(通常称为AIDS)和AIDS相关复合征(“ARC”)。参阅例如Kilby等，Natural History of HIV-1Disease，TEXTBOOK OF AIDS MEDICINE49-58(Merrigan等编，Williams&Wilkins，第2版，1999)。AIDS的免疫和临床表现为本领域公知，并包括例如机会性感染和免疫缺陷导致的癌症。
本文使用术语“抗体”是指来自一个或多个免疫球蛋白基因的、以其为模型的或基本由其编码的任何形式的肽或多肽或其片段，其能够特异性结合抗原或表位。参阅例如FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(W.E.Paul编，第5版，Lippincott，Williams&Wilkins(2003))；CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(Coligan等编，John Wiley&Sons，最新版本)；ANTIBODY ENGINEERING：A PRACTICAL APPROACH(J.McCafferty等编，Oxford University Press 1996)。抗体片段的实例是保持结合抗原的片段，并包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd和Fv片段；双体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子，例如scFv和VHH；微型抗体(minibody)；纳米抗体(nanobody)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。通常，结合片段或衍生物保持其结合活性的至少50％。优选地，结合片段或衍生物保持其生物活性的至少60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。抗体或其抗原结合片段可含有保守氨基酸取代，所述取代不显著改变其结合和/或生物活性。因此，术语“抗体”以最广泛的含义使用，并特别涵盖单克隆(包括全长单克隆抗体)、多克隆、多特异性(例如双特异性)、杂缀合物、嵌合、人源化、人、鼠及合成抗体，以及特异性结合期望抗原并显示期望结合和/或生物活性的抗体片段。
术语“抗原”是指被抗体特异识别和结合的任何分子。在生物中激发免疫应答(如生物中产生特异性抗体所证明的那样)的抗原被称作“免疫原”。抗原或免疫原中被抗体结合的特异性部分称作“结合表位”或“表位”。当抗体选择性地结合抗原从而将其与其它抗原区分开时，抗体对该特定抗原是特异性的。优选抗体缺乏对无关抗原的显著结合。
本文使用术语“表达盒”是指能够影响宿主中结构基因(即蛋白质如本文提供的抗体的编码序列)表达的核苷酸序列，所述宿主与这类序列相容。表达盒包括至少一个与多肽编码序列有效连接的启动子；和任选的其它序列，例如转录终止信号。本文使用术语“启动子”包括所有能够在细胞(例如哺乳动物或植物细胞)中驱动编码序列转录的序列。因此，本发明构建体中使用的启动子包括顺式作用转录控制元件和参与调控或调节基因转录时间和/或速率的调控序列。例如，启动子可以是参与转录调控的顺式作用转录控制元件，包括增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5’和3’非翻译区或内含子序列。启动子可以是组成型的或诱导型的。也可以使用对于影响表达是必需的或有帮助的其它因子，例如增强子。如果启动子刺激或调节编码序列在适当宿主细胞或其它表达体系中的转录，则启动子与编码序列(例如本发明的核酸)有效连接。通常，与被转录序列有效连接的启动子转录调控序列与被转录的序列在物理上是相邻的，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调控序列例如增强子不需要与编码序列(其转录被所述增强子增强)相邻或位置靠得很近。表达盒还包括质粒、表达载体、重组病毒、任何形式重组的“裸DNA”载体等等。
术语“分离的”包括从其初始环境(例如，天然存在时的天然环境)中取出的物质。例如，分离的多核苷酸或多肽是从天然体系中一些或所有共存物质中分离的多核苷酸或多肽。这类多核苷酸可以是载体的部分和/或这类多核苷酸或多肽可以是组合物的部分并且仍然是分离的，因为这类载体或组合物不是其天然环境的部分。
短语“核酸”或“核酸序列”包括寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或其中任一的片段，基因组或合成来源的DNA或RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA)，其可以是单链的或双链的，编码本发明的抗体或其生物活性片段。该术语包括含有天然核苷酸已知类似物的核酸，即寡核苷酸。该术语还包括具有合成主链的核酸样结构。参阅例如Mata，Toxicol. Appl. Pharmacol.144：189-97(1997)；Strauss-Soukup，Biochemistry 36：8692-98(1997)；和Samstag，Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6：153-56(1996)。
“重组”多肽或蛋白质是指通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白质；例如由编码期望多肽或蛋白质的外源DNA构建体转化的细胞产生。参阅例如CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausebel等编，John Wiley&Sons，最新版本)。
术语“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，表示任何长度的氨基酸多聚物。所述多聚物可以是线性的或分枝的，其可包含经修饰的氨基酸，且其可以被非氨基酸中断。该术语还包括已被天然或干预修饰的氨基酸多聚物；例如二硫键的形成、糖基化、脂质化、酰化、磷酸化，或任何其它操作或修饰，如与标记成分缀合。还包括在该定义中的是例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其它修饰的多肽。应当理解因为本发明的多肽是以抗体为基础的，所以所述多肽可以作为单链或结合的链存在。
术语“同源物”用于表示来自一个物种的基因或基因产物，其与来自另一物种的基因具有相同的共同起源和功能。例如，酿酒酵母pmr1基因的真菌同源物基因是指这样的真菌基因，所述真菌基因与酿酒酵母的pmr1基因具有相同的共同起源，并编码具有相同功能的蛋白质。
“载体”包括能够感染、转染、瞬时或永久转导细胞的核酸。应当理解载体可以是裸核酸，或与蛋白质或脂质复合的核酸。载体任选地包含病毒或细菌核酸和/或蛋白质和/或膜(例如细胞膜、病毒脂质包膜等)。
本文使用术语“协同作用”是指一种物质提高另一种物质抗病原体效应或中和效应的能力。因此，协同活性包括但不限于：一起使用两种物质时生物效应提高(例如更为有效或更为持久)，而在单独使用所述物质时未观察到所述效应；施用单一物质所不能达到的更有效的生物效应，例如消除多类毒性；或者为实现单一物质观察到的效应所需施用的物质量减少。
术语“病原体”是指诱导或激发不期望的症状或疾病状态的任何生物。病原体可以是细菌、病毒或真菌。
本文使用术语“受试者”包括人以及其它动物物种，例如犬、猫、牛、猪、啮齿动物等等。开业医师将会理解受试者具有本发明抗体靶向的病原体或疾病。
本文使用术语“改善、治疗或预防”包括与感染或其它病症相关的一种或多种症状的延缓、将要发生或预期会发生的症状严重性的降低、或这类症状的完全消除。这些术语还包括改善现存的病原体相关症状、减少疾病持续时间、预防额外的症状、改善或预防严重的后遗症、预防或逆转死亡事件，以及减少或预防病原体传播。因此，该术语表示赋予具有病原体或有可能接触这类病原体的受试者的有益结果。具体地，改善、治疗或预防包括例如预防接触HIV的个体的初始感染；减少HIV感染个体的病毒负荷；延长HIV感染的无症状期；提高患AIDS个体的整体健康或生命质量；以及延长患AIDS个体的预期寿命。临床医师能够将免疫效果与患者治疗前的状况比较，或与未治疗患者的预期状况比较，以确定治疗在抑制AIDS方面是否有效。
本文使用术语“有效量”足以部分或完全地抑制或预防病原体传播、组织损伤或受试者体内或身体上与毒力因子作用相关的其它症状，或预防或减少这类症状的进一步发展。对于有效成分单独施用的个体，有效剂量是指该成分单独所需的剂量。对于活性剂组合，有效剂量是指产生治疗效果的活性成分的组合量，无论组合施用、序惯施用或同时施用。术语“治疗有效用量”和“有效量”可互换使用。
本文使用术语“生物活性剂”是指任何合成的或天然存在的化合物，其增强或介导期望的生物效应以减少或消除特定生物的传染性或致病性。生物活性剂包括例如药剂，如化疗药物、杀微生物药物、抗病毒药物、毒素、细胞因子、配体、抗体或它们的一些组合。
本文使用“阻止有效相互作用(productive interaction)”是指与没有抗体或其生物活性片段时可能发生的量相比，相互作用的量被减少。可以通过任何手段减少或阻止相互作用，包括但不限于掩蔽或改变毒力因子上的相互作用区域，以及改变毒力因子的表达、聚集、构型或缔合状态。
本文使用术语“治疗”是指出于治愈、治疗、缓和、减轻、改变、补救、改善、改进或影响疾病或病症的目的，对受试者应用或施用治疗剂，或对来自受试者的分离的组织或细胞系应用或施用治疗剂，所述受试者患有疾病或病症、具有疾病或病症的症状或具有疾病或病症易感体质。
B.组合物
本文提供了均一糖基化的重组蛋白，其中末端糖是末端α1-2-甘露糖结构。重组蛋白可以这样获得：用编码该蛋白质的核苷酸序列转化酿酒酵母变体、发酵转化的细胞并从细胞或培养上清液中分离蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质是毒力因子。蛋白质可以是病毒蛋白质。在具体的实施方案中，病毒蛋白质是表面蛋白质。在一个实施方案中，蛋白质是人免疫缺陷病毒的gp120。在一些实施方案中，聚糖是寡甘露糖。在一个实施方案中，末端α1-2-甘露糖结构位于Man9GlcNAc2或Man8GlcNAc2上。
本文公开的组合物中可以使用任何合适的毒力因子。毒力因子是介导或参与微生物在在合适条件下在宿主生物中引起疾病的能力的任何糖蛋白。例如，毒力因子可以是粘附因子、外壳蛋白、侵入因子、荚膜、外毒素或内毒素。表达糖蛋白毒力因子的例示性生物包括但不限于：慢病毒(例如HIV)、埃博拉病毒、革兰氏阴性细菌(例如空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、大肠弯曲菌(Campylobacter coli)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacteria bovis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、披衣菌(Chlamydia spp.)和副血链球菌(Streptococcus parasanguis))。
蛋白质毒力因子的糖基化可以是N-连接的或O-连接的。聚糖是由彼此通过糖苷键连接的多于约五个单糖残基组成的多糖。代表性的聚糖包括甘露糖。蛋白质毒力因子基本均一的糖基化是指单一糖型(glycoform)的糖基化大于70％、80％、90％或100％。
一方面，本文提供的组合物是以Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其一些组合基本均一地糖基化的gp120，其具有末端α1-2-Man结构。本文使用术语“基本均一地”是指gp120上的聚糖大于70％是Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其一些组合。在具体的实施方案中，本文提供的糖基化gp120组合物具有大于90％的Man9GlcNAc2或Man8GlcNAc2，优选地具有100％的Man9GlcNAc2或Man8GlcNAc2。术语“高甘露糖”是指不含其它种类末端糖的具有5到9个甘露糖残基的聚糖。参阅例如图1。哺乳动物细胞表面和血清糖蛋白很少含有末端甘露糖残基。参阅例如Weis等，Immunol Rev.163：19-34(1998)。哺乳动物糖蛋白主要含复合型寡糖，带有很少的Man5或Man6；而HIV-1gp120蛋白含更大量的Man7-9，意味着HIV-1病毒和人糖蛋白上的高甘露糖在质和量上的显著差异。参阅例如Scanlan等，J Virol.76：7306-21(2002)；Cutalo等，JAm Soc Mass Spectrom.15：1545-55(2000)。
本文还提供了包含分离的糖基化多肽和可药用赋形剂的组合物，所述糖基化多肽含有至少两种被抗体2G12识别的N-连接的高甘露糖寡糖，其中糖基化多肽上大于50％的N-连接的聚糖是高甘露糖寡糖，且其中高甘露糖寡糖为Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其组合。
本文还提供了包含从突变真菌中分离的糖基化多肽的组合物，所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母基因pmr1或破坏了的酿酒酵母基因pmr1的同源物基因，其中糖基化多肽被抗体2G12识别。
本文还提供了包含从突变真菌中分离的糖基化多肽的组合物，所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母基因pmr1和mnn1，或破坏了的酿酒酵母基因pmr1和mnn1的同源物基因，其中糖基化多肽被抗体2G12识别。
本文还提供了包含从突变真菌中分离的糖基化多肽的组合物，所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母基因och1、mnn1和/或mnn4，或破坏了的酿酒酵母基因och1、mnn1和/或mnn4的同源物基因，其中糖基化多肽被抗体2G12识别。
糖基化多肽可包含至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个N-连接的高甘露糖寡糖。糖基化多肽可以是真菌(例如酵母)或非真菌的糖蛋白或其片段。例如，糖基化多肽是酿酒酵母的PAT1、ECM33、Gas1、Gas5、GP38或YJL171c，或任一这些蛋白质的同源物。糖基化多肽可以是毒力因子。在一些实施方案中，糖基化多肽是病毒蛋白质或其片段。在一些实施方案中，糖基化多肽是HIV gp120或其片段。
在一些实施方案中，糖肽上至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％N-连接的聚糖是Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其组合。
本发明的组合物排除Wang，Curr.Opin.Drug Discov.Devel.9(2)：194-206，2006；Mandal等，Angew.Chem.Int.Ed.43：2557-2561，2004；Geng等，Angew.Chem.Int.Ed.43：2562-2565，2004；Singh等，Bioorg.Med.Chem.Lett.13：327-330，2003；Wang等，ChemBioChem.6：1068-1074(2005)；Zeng等，J Am.Chem.Soc.127：9692-9693，2005以及Li等，J Org.Chem.70：9990-9996，2005中描述的任何糖基化多肽。
本文还提供了包含突变酵母全细胞和可药用赋形剂的组合物，其中突变酵母具有破坏了的酿酒酵母基因pmr1和mnn1，och1和mnn1，或och1、mnn1和mnn4，或者破坏了的酿酒酵母基因pmr1和mnn1，och1和mnn1，或och1、mnn1和mnn4的同源物基因。酵母全细胞可以是活细胞或死细胞。组合物可用于治疗性或预防性疫苗(例如用于HIV疫苗)。
本文所述的组合物包含可药用的赋形剂。可以使用冻干制剂或水性溶液形式的任何可药用的运载体、赋形剂或稳定剂(Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy第20版(2000)Lippincott Williams and Wilkins，编辑K.E.Hoover)。可接受的运载体、赋形剂或稳定剂在剂量和浓度上对于接收者是无毒的，并可包含缓冲液如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；氯化苯甲烃铵；氯化苄乙氧铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如Zn蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，可药用赋形剂为佐剂。包含佐剂的组合物可以用作疫苗。
本文还提供了制备均一糖基化重组蛋白质的方法，其中末端聚糖为末端α1-2-Man结构，所述方法包括：a)提供包含蛋白质编码核苷酸序列的载体；b)转化具有蛋白质糖基化缺陷的细胞；c)发酵转化的细胞；和d)从细胞上清液中纯化所分泌的重组蛋白质。在一些实施方案中，核苷酸序列编码以其天然状态被糖基化的蛋白质。核苷酸序列可以编码属于毒力因子的蛋白质。在一些实施方案中，突变的细胞表达具有大量Man9GlcNAc2或Man8GlcNAc2的糖蛋白。在具体的实施方案中，核苷酸序列编码gp120蛋白。在一些实施方案中，细胞表达具有大量Man9GlcNAc2或Man8GlcNAc2的gp120蛋白。本方法的细胞可以是酵母细胞如酿酒酵母mns1Δ或酿酒酵母pmr1Δ。载体可以是YepL，且在一些实施方案中可以包含GAL1启动子。在一些实施方案中，使用His标签纯化糖蛋白。
本文还提供了通过发酵突变真菌制备本文所述任何组合物的方法，其中所述突变真菌被突变以产生糖基化多肽；分离或纯化糖基化多肽；并将多肽与可药用赋形剂组合以形成组合物。包含全酵母细胞的组合物可以通过发酵突变酵母制备；制备全酵母细胞与可药用赋形剂以形成组合物。
可使用任何合适的细胞。优选细胞具有这样的缺陷：允许截短或以其它方式调控聚糖的典型胞内加工。在一些实施方案中，细胞是真菌细胞(例如酵母或霉菌细胞)。在具体的实施方案中，细胞是酵母细胞。参阅例如美国专利No.5,919,651；5,705,616。分泌的酵母蛋白质的外部链糖基化是高(或长)甘露糖型寡糖链。因此，酵母生产提供了异源蛋白质，其中此酵母特异性的外部链糖基化为高甘露糖型，这有时被称作“高糖基化”。简言之，酵母蛋白质的O-糖苷糖结构由1-5个甘露糖残基的未分枝的甘露糖链组成。O-糖基化始于ER(第一个甘露糖残基的转移)，并在高尔基体中完成。N-糖基化始于N-乙酰葡萄糖胺核心单位，甘露糖和葡萄糖在脂质运载体中间体上堆积，随后被转移至内质网中蛋白质的天冬酰胺(Asn)残基上。结合了蛋白质的核心单位随之在特定的葡萄糖和甘露糖残基处切割，接着是高尔基体中多糖的延长，导致“外部链”糖基化。
可使用许多酵母菌株产生本文提供的组合物。通常使用酿酒酵母细胞，但是巴斯德毕赤酵母和粟酒裂殖酵母的细胞也是可商业获得用于生产异源蛋白质的。参阅例如Tuite等，Expressing Cloned Genes in the YeastsSaccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris，PROTEIN EXPRESSION：APRACTICAL APPROACH 61-100(Higgins等编，Oxford University Press1999)；Hitzeman等，Methods Enzymol.185：421-440(1990)；Barr等，Vaccine 5：90-101(1987)；Liu等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.5：592-94(1998)。Mns1p或Pmr1p缺陷的酵母菌株是有用的。Msn1p是位于ER中的α1，2甘露糖苷酶，在ER中它通过去除α1，2连接的甘露糖中心臂将Man9切短为Man8单异构体。因此，酿酒酵母mans1p突变体菌株Mns1Δ产生仅以Man9糖基化的蛋白质。Pmr1p蛋白是对Ca++从ER到高尔基体的转运非常重要的钙依赖型ATP酶。参阅Herscovics，Biochim.Biophys.Acta1426：275-85(1999)；Camirand等，J.Biol.Chem.266：15120-27(1991)。酿酒酵母pmr1p突变菌株pmr1Δ分泌仅由Man8组成的糖蛋白，Man8在ER中由甘露糖苷酶I从Man9切短而来。参阅例如Harmsen等，Gene 125：115-23(1993)。不过，在N-糖基化方面具有合适缺陷的任何菌株都可用于生产本文提供的组合物。参阅例如美国专利No：5,705,616、5,798,226。
具有酿酒酵母、白色念珠菌和巴斯德毕赤酵母的破坏了的pmr1基因，破坏了的pmr1和mnn1基因，破坏了的och1基因，与mnn1、mns1和mnn4基因中一种或多种组合的破坏了的och1基因，破坏了的och1和mnn1基因，或破坏了的och1、mnn1和mnn4基因的酵母菌株，或具有破坏了的同源物基因的其它酵母菌株，也可用于生产糖基化多肽或全酵母细胞组合物。
产生突变真菌细胞的方法是本领域已知的。本发明的实施例提供了产生多种突变酵母细胞的细节。参阅例如Chiba等，J.Biol.Chem.273：26298-26304，1998；Rudolph等，Cell 58：133-145，1989；Nakanishi-Shindo等，J.Biol.Chem.268：26338-26345，1993。
可使用任何合适的载体转染突变体细胞产生重组糖基化多肽。酵母细胞通常使用基于质粒的载体。载体可以是自主复制的多拷贝质粒(例如Yep或YRp)，自主复制的单拷贝质粒(例如YCp)，或整合型(通常是单拷贝的)质粒(例如YIp)。参阅例如Yeast Vectors(第13.4单元)，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausebel等编，John Wiley&Sons，最新版本)。在一个实施方案中，载体是YEpL或pYES2-CT。可使用本领域公知的导致转化细胞中产生异源蛋白质的任何启动子。对于酵母细胞而言，可获得天然的和经改造的启动子。这类启动子包括但不限于：PGK、GAP、TEF1、GAL1、ADH2、PHO5、CUP1、MFα1、TRP1、PAL、GAP/GAL、GAP/ADH2、CYC1/GRE和PGK/ARE。在一个实施方案中，启动子为GAL1。参阅例如美国专利No.5,139,936。载体也可以包括其它序列，例如复制起点和用于纯化异源毒力因子如gp120的多种标签序列。
用毒力因子编码载体转化细胞，并使用本领域公知的技术发酵。对酵母而言，细胞可以使用醋酸锂、原生质球转化或电穿孔来转化，接着是标准发酵。参阅例如Yeast(第13单元)，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(Ausebel等编，John Wiley&Sons，最新版本)。
例示性的毒力因子包括但不限于gp120、埃博拉病毒包膜蛋白、或其它糖基化的病毒包膜蛋白或病毒蛋白质。参阅例如美国专利No.6,630,144；6,713,069。
一方面，任何合适的gp120核苷酸序列都可以用于本文提供的组合物中。gp120分子由60kD的多肽核心组成，被N-连接的糖基化广泛修饰从而其表观分子量升至120kD。参阅例如Zolla-Pazner等，Nature Rev.Immunol.4：199-209(2004)。Gp120的氨基酸序列含有被五个高变结构域隔开的五个相对保守的结构域。gp120一级序列中18个半胱氨酸残基的位置，和gp120序列中约24个N-连接的糖基化位点中13个的位置普遍见于所有的gp120。参阅Modrow等，J.Virol.61：570-78(1987)。高变的结构域含有广泛的氨基酸取代、插入和缺失。这些结构域中的序列变异导致来自多种病毒分离株的gp120分子之间高达30％的总体序列变异性。参阅例如Gaschen等，Science 296：2354-60(2002)。尽管如此，gp120序列维持病毒与病毒受体CD4和DC-SIGN结合的能力。例示性的序列包括但不限于这些文献中公开的序列：Ratner等，Nature 313：227(1985)；Muesing等，Nature 313：450-58(1985)；McCutchan等，AIDS Res.Human Retroviruses8：1887-95(1992)；Gurgo等，Virol.164：531-36(1988)；和HIV SEQUENCECOMPENDIUM 1987-PRESENT(Myers等编，Theoretical Biology andBiophysics Group，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，NM)。也可使用来自新分离菌株的序列。参阅例如Ou等，Science 256：1165-71(1992)；Zhang等，AIDS 5：675-81(1991)；和Wolinsky，Science 255：1134-37(1992)。
可以使用任何合适的纯化和糖基化分析方法用于本文提供的糖基化多肽(例如均一糖基化的)。例如，来自重组gp120的荧光标记的N-聚糖的NP-HPLC使用外葡糖苷酶消化与HPLC用于鉴定多种形式的聚糖。参阅例如Scalan等，J.Virol 76：7306-21(2002)。或者，可以通过流式细胞计数分析、ELISA或Western印迹使用聚糖特异性抗体如2G12抗体来确定表达水平。其它例示性的方法包括基于凝集素的实验、火箭亲合电脉(rocketaffinoelectropheresis)、双向电泳、荧光辅助糖电泳(FACE)、毛细管电泳、核磁共振、质谱法、气液色谱-质谱(GLC/MS)、快原子轰击(FAB)和电喷射离子化(ESI)。参阅例如Brooks等，FUNCTIONAL&MOLECULARGLYCOBIOLOGY(BIOS Scientific Publishers Ltd 2002)。
本文提供的糖基化多肽(例如均一糖基化的蛋白质)也可以用于检测针对病原体(例如HIV)的中和抗体存在的测定中。在这类测定中，蛋白质通常用适用于测定的多种标记之一标记。这些标记已在专利和技术文献中广泛报导，并包括放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、颗粒、小分子等等。
无需使用毒力因子的野生型蛋白质血清型，因为可添加、缺失或取代一个或多个氨基酸，只要保留有关的结合特性、糖基化位点和其它有关的免疫学特性即可。因此，至少90％的，通常至少95％的，更通常至少99％的氨基酸将是正确的氨基酸并在正确的序列中。通常，任何改变将会位于N端，此处可有0到5个氨基酸差异。
在一个实施方案中，本文提供的均一糖基化的gp120显示这样的构象表位，所述构象表位激发能够中和HIV-1元代分离株的高度中和性抗体。在一些实施方案中，优选的蛋白质能够激发这样的抗体，所述抗体中和两个或多个不同进化枝的元代分离株(例如进化枝A、B、C、D和E中的两个或多个)。中和作用如本文所公开的那样测定。
本发明提供包含本文所述任何组合物(例如均一糖基化的蛋白质)的试剂盒。试剂盒也可以含有教导本文所述的本发明方法和工业用途的说明材料。
本文特特别提供了包含一个或多个容器的区室试剂盒，其中第一个容器含有通过本发明方法改造的一种或多种抗体，且一个或多个其它容器含有以下的一种或多种：洗涤剂、施用组合物所必需的或能够检测特异于组合物的抗体存在的试剂。容器可以是玻璃、塑料或塑性条带或纸制条带。检测剂的种类包括标记的第二抗体、其它标记的第二结合剂，或者在第一抗体被标记的情况下，包括能够与所述标记抗体反应的酶试剂或抗体结合试剂。有助于或使我们能够实施这类方法的辅助材料可包括在本文提供的试剂盒内。
C.使用糖基化多肽或全突变酵母细胞的疫苗
本文提供了对受试者诱导抗病原体(例如HIV)的中和抗体的方法，包括给受试者施用有效量的任何本文所述的组合物。
本文提供了对需要的受试者诱导抗病原体的中和抗体的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含均一糖基化的重组蛋白质[其中末端聚糖为末端α1-2聚糖结构]、或通过制备均一糖基化的重组蛋白质的方法制备的蛋白质[其中聚糖为具有末端α1-2聚糖结构的寡甘露糖]和合适的赋形剂，所述方法包括a)提供包含蛋白质编码核苷酸序列的载体；b)转化蛋白质糖基化有缺陷的细胞；c)发酵转化的细胞；和d)如本文所公开的那样从细胞清液中纯化被分泌的重组蛋白质。所述方法还可包括施用佐剂。在一个实施方案中，病原体为HIV。在具体的实施方案中，均一糖基化的重组蛋白质为Man9GlcNAc2 gp120或Man8GlcNAc2gp120。
本文还提供了对受试者预防或治疗病原体诱导的(例如HIV-1诱导的)疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的任何本文所述组合物。
本文还提供了对需要的受试者预防或治疗病原体诱导的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含均一糖基化的重组蛋白质[其中末端聚糖为末端α1-2聚糖结构]或通过制备均一糖基化的重组蛋白质的方法制备的蛋白质[其中聚糖为具有α1-2聚糖结构的寡甘露糖]和合适的赋形剂，所述方法包括：a)提供包含蛋白质编码核苷酸序列的载体；b)转化蛋白质糖基化有缺陷的细胞；c)发酵转化的细胞；和d)如本文所公开的那样从细胞上清液中纯化被分泌的重组蛋白质。本发明还包括施用佐剂。在一个实施方案中，病原体为HIV。在具体的实施方案中，均一糖基化的重组蛋白质是Man9GlcNAc2gp120或Man8GlcNAc2gp120。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物还包含来自不同HIV菌株的多种gp120蛋白。
本发明的疫苗组合物可以通过临床指定的任何途径被施用，例如通过应用于粘膜表面，包括但不限于鼻内、口服、眼内、经肠胃、直肠、阴道、或泌尿生殖途径。或者也可以使用肠胃外施用模式，例如静脉内、皮下、腹膜内或肌内施用。在一些实施方案中，蛋白质经皮或经粘膜施用。
典型地，抗HIV感染的疫苗保护诱导粘膜免疫应答、系统性免疫应答，或二者均有。适用于施用的途径可包括肠胃外或非肠胃外途径，包括但不限于皮下、皮内、静脉内、肌内、经口、粘膜或鼻内施用。
根据本发明的疫苗可以根据本领域已知的任何合适方法配制，并可含有任何合适并兼容的稀释剂、运载体、防腐剂、药物赋形剂或其它成分。参阅例如REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OFPHARMACY，第20版(Gennaro等编，University of Sciences 2000)。用于静脉内、腹膜内、肌内、经粘膜(例如鼻内、直肠、阴道、口腔)、经皮、皮下施用或任何其它施用途径的合适的药物运载体是本领域公知的，并考虑用于本发明。参阅例如Robinson等编，VACCINE PROTOCOLS，第2版(Humana Press 2003)；Powell等编，VACCINE DESIGN：THESUBUNIT AND ADJUVANT APPROACH(Plenum Press 1995)；Plotkin等编，VACCINES，第4版(Saunders 2004)；美国专利No.4,235,877；4,372,945和4,474,757。合适的配方(其可包含佐剂)可根据经验确定。
所施用的疫苗量取决于本领域技术人员所确定的具体的疫苗抗原和使用的任何佐剂、施用的方式和频率、受体的年龄和体重，以及所期望的效果(例如预防和/或治疗)。疫苗剂量中蛋白质的量选择为这样的用量：其诱导免疫保护应答而无一般疫苗显著有害的副作用。这样的用量会根据采用的特定免疫原而变化。通常期望每份剂量包含1μg至100mg的蛋白质，有时在2-200μg，其它情况下为4-40μg。特定疫苗的最佳量可以通过标准研究确定，这包括观察受试者的抗体效价和其它应答。
当本领域技术人员确定需要时，可重复施用。在许多情况下，会期望多次施用疫苗，通常不超过六次疫苗接种，更通常不超过四次疫苗接种，优选一次或多次，通常为约三次疫苗接种。疫苗接种通常会以从2周到12周的间隔，更通常从3周到5周的间隔，在1到5年的间隔进行任选的周期性免疫加强。免疫接种的过程可以用病原体的抗体(例如HIV gp120抗体)测试跟踪。
本发明的活性疫苗可以单独使用或与生物活性剂组合使用，所述生物活性剂包括但不限于其它毒力因子、减毒或失效形式的病毒或佐剂。这样的其它制剂可以经由相同或直接的施用途径同时施用或序惯施用。在一些实施方案中，被施用的蛋白质来自相同或相关病原体的不同血清型。在一个实施方案中，生物活性剂与本文提供的糖基化的蛋白质协同作用，以刺激抗病原体的有效免疫应答。
在一些实施方案中，本文提供的糖基化蛋白质(例如均一糖基化的重组蛋白质)与佐剂一起施用。在用于本发明的疫苗配制方面，优选佐剂组合物诱导体液应答或Th2应答。这类佐剂可包括诱导IL-4、L-6和/或IL-10生产的佐剂以及增强T细胞非依赖性抗原的免疫原性的其它手段。参阅例如Mond等，Annual Reviews 13：655-92(1995)；Lesinski等，J.Microbiolog.Methods 47：135-49(2001)。然而应当理解不排除其它应答，包括细胞应答，特别是在疫苗策略中共同施用其它毒力因子的情况下。因此，也考虑公知的佐剂如CpG寡脱氧核苷酸、破伤风类毒素、皂苷、脂肽和IL-12。在具体的实施方案中，本文提供的糖基化蛋白质与破伤风毒素的刺激性表位缀合。参阅例如Kumat等，J.Immunol.148：1499-505(1992)。
本文提供的蛋白质可以以制剂的形式与佐剂一起同时或序惯递送或单独递送。合适的佐剂包括铝盐，如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝，但是也可以是钙、铁或锌盐，或可以是酰化酪氨酸、或酰化糖[阳离子或阴离子衍生多糖或聚磷腈]的不溶性混悬液。参阅例如Robinson等编，VACCINEPROTOCOLS第2版(Humana Press 2003)；Powell等编，VACCINEDESIGN：THE SUBUNIT AND ADJUVANT APPROACH(Plenum Press1995)；Plotkin等编，VACCINES第4版(Saunders 2004)；美国专利No：6,797,276；6,596,278；6,491,919；4,894,229；5,814,321；5,679,355和4,803,070。在一些实施方案中，佐剂是不完全弗氏佐剂(IFA)或明矾。使用的佐剂量可根据佐剂的性质广泛变化，通常范围在免疫原重量的0.1倍到100倍，更通常从约1倍到约10倍。
在一些实施方案中，本文描述的全突变酵母细胞(例如活或死细胞)可用于预防性或治疗性的疫苗中。例如，全突变酵母细胞被配制为胶囊、丸剂、凝胶剂或霜剂用于口服、阴道或直肠施用。
所诱导的抗体的中和能力可以使用常规方法评估。因此，认为中和HIV的抗体可抑制以下一种或多种：病毒附着、共受体接合、膜融合或某些有效相互作用。参阅例如美国专利No.6,391,567；Lin等，Virology77：1337(2003)；Lee等，J.Virol.75：12028(2001)；Geijtenbeek等，Cell100：587(2000)；Brewley等，J.Am.Chem.Soc.123：3892-3902(2001)；美国专利申请No.20030096221；20050064390；20040259785；20040228869和20040096823。细胞融合包括见于哺乳动物细胞或病毒如HIV-1的脂质双分子层膜的连接或联合。该过程有别于HIV-1对靶细胞的附着。在一个实施方案中，附着通过HIV-1外部糖蛋白与人CD4受体的结合介导。所述相互作用也可包括共受体，其包括但不限于CCR5、CXCR4、CCR2、CCR3、CCR8、STRL33、GPR-15、CX3CR1和APJ。参阅例如Opperman等，CellSignal.16：1201-10(2004)；Philpott等，Curr.HIV Res.1：217-27(2003)。在具体的实施方案中，中和抗体是阻止或抑制糖基化gp120与DC-SIGN结合的抗体。参阅例如美国专利No.6,391,567；Lin等，J.Virol.77：1337-46(2003)；Mitchell等，J.Biol.Chem.276：31：28939-45(2001)。
中和抗体可以是任何同种型。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。更特别地，抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
D.制备和鉴定特异于基本上均一糖基化组合物的抗体的方法
本文还提供了制备与含末端α1-2聚糖结构的蛋白质特异性结合的抗体的方法，所述方法包括用有效量的本文所述组合物(例如包含通过本文公开的方法制备的重组蛋白质或本文公开的蛋白质的组合物)免疫动物。所述组合物可还包含佐剂、运载体或二者均有。本文提供了通过本文公开的方法产生的分离的抗体，以及生产所述分离抗体的杂交瘤。在一个实施方案中，抗体特异于Man9GlcNAc2gp120或Man8GlcNAc2gp120，并优选与人糖蛋白不具有显著的交叉反应性。
可以使用特异于本文提供的糖基化蛋白质的抗体的任何合适的生产方法。免疫、生产和分离抗体(多克隆和单克隆)的方法是本领域技术人员已知的，并描述于科学文献和专利文献中。参阅例如Coligan，CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley 2005)；Stites编，BASICAND CLINICAL IMMUNOLOGY第9版(Lange Medical Publications1998)；Goding，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLE ANDPRACTICE第3版(Academic Press 1996)；Harlow，ANTIBODIES：ALABORATORY MANUAL，(Cold Spring Harbor 1998)。
本文提供的抗体可以分离自天然来源、合成、或是使用本领域已知的方法重组产生的多肽。抗体可以体外或体内重组表达。参阅例如Caruthers(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)Nucleic AcidsRes.Symp.Ser.225-232；Banga，A.K.，THERAPEUTIC PEPTIDES ANDPROTEINS，FORMULATION，PROCESSING AND DELIVERYSYSTEMS(1995)Technomic Publishing Co.，Lancaster，Pa.。例如，抗体合成可以使用多种固相技术(参阅例如Roberge(1995)Science 269：202；Merrifield(1997)Methods Enzymol.289：3-13)进行，并可以例如使用ABI431A肽合成仪(珀金埃尔默公司：Perkin Elmer)根据制备商提供的说明书实现自动化合成。抗体产生和生产的重组手段的例示性说明包括Delves，ANTIBODY PRODUCTION：ESSENTIAL TECHNIQUES(Wiley，1997)；Shephard等，MONOCLONAL ANTIBODIES(Oxford University Press，2000)；Goding，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES ANDPRACTICE(Academic Press，1993)；CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY(John Wiley&Sons，最新版本)。除了使用动物(包括但不限于经遗传工程改造的动物)的传统体内方法外，也可以体外(例如使用重组抗体结合位点表达噬菌体展示文库)产生抗体。参阅例如HoogenboomTrends Biotechnol.15：62-70(1997)；Katz(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26：27-45(1997)；Fishwild等，Nat.Biotech.14：845(1996)；Mendez等，Nat.Genet.15：146(1997)；美国专利No：6,632,976。
多克隆和单克隆抗体一经生产，就通过Western印迹或免疫沉淀分析通过例如前文Ausubel等中所述的标准方法测试它们对糖基化蛋白质的特异性识别。在一些实施方案中，抗体可以被人源化。美国专利No.5,585,089；美国专利No.5,693,761和WO 90/07861。
基本上均一糖基化的抗原使用本文提供的方法生产。激发抗原可以是单个表位、多个表位、或整个蛋白质单独的或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合。激发抗原可以是分离的全长蛋白质、细胞表面蛋白质(例如用抗原的少一部分转染的细胞免疫)或可溶性蛋白质(例如仅用蛋白质的胞外结构域部分免疫)。
本发明的抗体可以是IgG、IgM、IgD、IgE或IgA抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。更特别地，抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。抗体可使用任何合适的来源。例如，抗体可以是人、鼠、大鼠、兔、牛、骆驼、美洲驼、单峰骆驼或猿猴的抗体。一旦鉴定了合适的抗原结合区域(例如在体外、体内或者体外和体内中和的抗体的CDR)，则可以用任何合适的手段修饰抗体以增强其治疗效力。本发明抗体的修饰包括抗体氨基酸序列中的至少一个突变。例如，可以通过修饰、添加或缺失向编码抗体的核酸中引入一个或多个突变，以改变抗体的一种或多种特性。本发明的抗体可以以任何合适的手段修饰以赋予或增强期望的效应功能或物理特征。参阅例如美国专利No.6,737,056和US 2004/0132101。因此，通过本发明方法修饰的抗体的编码核酸可以通过任何合适的手段予以改变。
因此，抗体可以是人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、融合蛋白，或它们的生物活性片段。在一些实施方案中，抗体(或其生物活性片段)为融合蛋白。融合蛋白可以包括简化纯化或生产的额外的肽序列。融合蛋白也可以包括具有生物活性的结构域和/或整个多肽，以补充抗体的活性。例如，抗体可以与细胞因子、配体、粘附分子、肽、受体、酶、治疗蛋白质、染料、有机小分子或它们的任何生物活性部分融合。
可使用任何合适途径测定本发明抗体的亲合力。在一个实例中，通过表面等离振子共振(百艾括尔公司：Biacore)测定亲和力。本发明的抗体也可以通过本领域已知的方法进一步修饰以提高结合亲合力。参阅例如美国专利No.6,350,861。
本文提供的抗体可以是适用于免疫测定的抗体。特别的测定包括ELISA测定、三明治测定、放射免疫测定和Western印迹。参阅例如ANTIBODY ENGINEERING：A PRACTICAL APPROACH(OxfordUniversity Press，1996)。这些单克隆抗体通常会与至少约1μM、更通常与至少约300nM、一般至少约30nM、优选至少约10nM、更优选至少约3nM或更佳的Kd结合，通常通过ELISA测定。
可以使用任何合适的方法测定存在毒力因子时抗体的生物活性。在一个实施方案中，如果抗体将生物的致病性和/或毒力因子的毒性降低至少20％、至少50％、60％、70％、80％、90％或100％，则抗体具有抗毒力因子的活性。在另一实施方案中，如果存在一种或多种其它抗毒力因子时，本发明的抗体将生物的致病性和/或毒力因子的毒性降低至少20％、至少50％、60％、70％、80％、90％或100％，则该抗体具有抗毒力活性。
本发明的抗体可特异性地结合任何合适的糖基化毒力因子。毒力因子可以是粘附因子、外壳蛋白、侵入因子、荚膜、外毒素或内毒素。抗体的抗病原体效应可得自抗体与毒力因子的结合、因子的清除、因子的灭活等等。
另一方面，本发明提供了分离的或重组的核酸(其含有编码本文公开的抗体的序列)、包含编码核酸的载体和包含编码核酸或载体(其包含编码核酸)的细胞。通常，载体包含与启动子有效连接的抗体编码核酸，所述启动子适用于在指定的宿主细胞中表达。用于表达本发明的核酸、表达盒和载体的宿主细胞包括细菌、酵母、真菌、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。因此，本发明提供了用于在所有这些细胞中优化密码子使用的方法、密码子改变的核酸和由密码子改变的核酸制备的多肽。例示性的宿主细胞包括革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌和荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)；革兰氏阳性细菌，例如Streptomyces diversa、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。例示性的宿主细胞也包括真核生物，例如多种酵母，如酵母属物种(Saccharomyces spp.)，包括酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、黑曲霉(Aspergillus niger)和哺乳动物细胞及细胞系，以及昆虫细胞及细胞系。因此，本发明还包括抗体及其编码核酸，它们在这些生物和物种中的表达已经被优化。参阅例如美国专利No.5,795,737；Baca(2000)Int.J.Parasitol.30：113-118；Hale(1998)Protein Expr.Purif.12：185-188；Narum(2001)Infect.Immun.69：7250-7253；Outchkourov(2002)Protein Expr.Purif.24：18-24；Feng(2000)Biochemistry 39：15399-15409；和Humphreys(2000)Protein Expr.Purif.20：252-264。
一方面，本发明提供了包含本发明抗体和合适赋形剂的药物组合物，作为治疗剂被施用。一方面，本发明提供了包含经改造的本发明抗体和合适赋形剂的药物组合物。本发明提供了包含上文公开的至少一种单克隆抗体和合适赋形剂的药物组合物。适用于药物组合物的配方和赋形剂是本领域公知的。适用于本发明的抗体(来自任何来源，包括但不限于重组来源)本身可向需要的受试者施用，或以治疗或改善多种病症的剂量与合适的运载体或赋形剂混合以药物组合物的形式施用。参阅例如REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(最新版本)。这样的组合物也可含有(除了蛋白质和运载体外)稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域公知的其它物质。术语“可药用的”是指不干扰活性成分的生物活性效果的无毒物质。运载体的特征取决于施用的途径。本发明的药物组合物也可含有期望的其它抗病原体物质，如细胞因子或抗微生物剂。
当本发明的抗体与一种或多种生物活性剂共同施用时，本文提供的抗体可以与生物活性剂同时施用或序惯施用。如果序惯施用，则主治医师将会决定与生物活性剂组合施用本发明蛋白质的适当顺序。
这类抗体的毒性和治疗效果可以使用常规方法测定。可由个人医师根据患者的状况选择精确的配方、施用途径和剂量。参阅例如Fingl.等，THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS1(最新版本)。
本文还提供了对需要的受试者诱导抗病原体的中和抗体的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述组合物包含本文提供的蛋白质或由本文提供的方法制备的蛋白质和合适的赋形剂。在一些实施方案中，该方法还包括施用佐剂。在具体的实施方案中，病原体为HIV。
本文还提供了对需要的受试者预防或治疗病原体诱导的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述组合物包含本文提供的蛋白质或由本文提供的方法制备的蛋白质和合适的赋形剂。在一些实施方案中，该方法还包括施用佐剂。在具体的实施方案中，病原体为HIV。在一个实施方案中，蛋白质为gp120。在一些实施方案中，药物组合物还包含来自不同HIV菌株的多种gp120蛋白。
本文还提供了鉴定抗HIV传播的中和性单克隆抗体的方法，包括：a)将第一细胞与第二细胞接触，其中所述第一细胞表达树突细胞特异性的C型凝集素(DC-SIGN)，所述第二细胞表达CD4+和CCR5+，b)将第一和第二细胞与传染性病毒颗粒共培养；c)将共培养物与通过权利要求20的方法制备的候选抗体接触；和d)测定相对传染性，其中中和抗体减少或消除传染性病毒颗粒对第二细胞的相对传染性。参阅例如US 6,391,567；Bashirova等，J.Exp.Med.193：671(2001)；Lee等，J.Virol.75：12028(2001)。
本发明经此一般性的说明后，通过参照以下的实施例将会更容易理解，除非另有说明，提供所述实施例仅用于举例说明，而不旨在限制本发明。
实施例
实施例1
表达系统的选择。选择Pmr1蛋白质缺陷型酿酒酵母菌株，其中pmr1为对于Ca++从ER到高尔基体的转运非常重要的钙依赖性ATP酶(55，56)。Pmr1Δ菌株是所谓的异源蛋白质的超级分泌菌，其分泌接近100％的异源蛋白质(57-58)。该菌株分泌仅带有Man8GlcNAc2的糖蛋白，所述Man8GlcNAc2通过甘露糖苷酶在ER中从Man9GlcNAc2切短而来，这在数种蛋白质中已有报导(58-60)。
克隆HIV-1gp120以表达分泌的糖蛋白。将酿酒酵母α交配因子(MFα)的信号序列克隆进表达载体pYES2/CT(英骏公司：Invitrogen)中。通过PCR从酵母总DNA中扩增MFα的编码序列。PCR引物含有KpnI和BamHI位点。扩增了250bp的片段，将其纯化并连接进pGEM-T(普洛麦格Promega)中。转化和小量制备鉴定后，鉴定了阳性克隆。然后用BamHI和KpnI同时消化pGEM-T-MFα和pYES2/CT质粒。纯化MFα条带和pYES2条带后，连接质粒，转化进NovaBlue感受态细胞中并涂布在LB-氨苄青霉素平板上。鉴定含MFα的阳性克隆并用于克隆gp120。
使用相应的质粒(艾滋病研究和参照试剂项目，ARRRP)作为模板，通过PCR扩增来自菌株JR-FL、JR-CSF和YU2的HIV-1gp120蛋白的编码序列。将经PCR扩增的pg120DNA片段克隆进含有EcoRI和XbaI位点的pYES2/CT-MFα质粒中。然后将三种pYES2/CT-MFα-gp120质粒转化进NovaBlue感受态细胞中，并通过小量制备进行消化分析来鉴定阳性克隆。使用快速醋酸锂转化方案将这些质粒转化进二倍体酵母菌株pmr1Δ(英骏公司：Invitrogen)中。pYES2/CT载体含有诱导型的GAL1启动子，能够在半乳糖诱导后高水平表达重组蛋白质。为了生产gp120并将其分泌到培养基中，将转化的酵母细胞在-Ura/棉子糖培养基上于30℃培养过夜。离心后，用-Ura/半乳糖培养基重悬细胞用于诱导gp120表达。
均一糖基化HIV-1Env蛋白的表达、纯化和分析。pmr1Δ菌株是温度敏感的，在许可温度下生长缓慢。因此，在不同的温度和时间点检查gp120表达，从而测定这些酵母细胞能够表达最高水平蛋白质并将其最为有效地分泌到培养基中的条件。pmr1Δ酵母细胞在25℃分泌最大量的gp120蛋白7到14天(图2A)。在培养1天后检测到gp120蛋白，并在培养基中持续积累至少14天，表明酵母细胞持续生产和分泌异源蛋白质。还表明糖基化gp120蛋白在室温是稳定的。如果pmr1Δ菌株中生产的gp120糖蛋白仅含有Man8GlcNAc2寡糖，则对于JR-CSF、JR-FL和YU2而言，蛋白质应当分别具有99603Da、96385Da和99621Da的预测分子量。Western印迹显示在SDS-PAGE中这些预测大小的蛋白质移行。印迹用MAb 2G12探测，其可容易地检测pmr1Δ菌株中生产的gp120蛋白(图2A)。
纯化步骤很简单，因为酵母培养基蛋白质含量少。甘露糖结合凝集素亲和层析和凝胶过滤的组合足够获得高于95％的纯度。简言之，浓缩第14天的培养上清液，并在4℃在透析缓冲液(1mM CaCl2和1mM MnCl2)中透析16小时。在40,000g于4℃离心30分钟后，去除含有非目的蛋白质的沉淀。然后使用琼脂糖-Con-A柱(Vector实验室，CA)纯化这些gp120蛋白。将含有gp120蛋白的上清液上样至预平衡的Con-A-琼脂糖柱上，并在4℃孵育16小时。然后用透析缓冲液洗涤柱，并用洗脱缓冲液(500mM α-甲基甘露糖苷、250mM NaCl、20mM TrisCl、1mM CaCl2和1mM MnCl2，pH6)洗脱结合的蛋白质。纯化的物质主要含有100kDa和160kDa的蛋白质。然后使用凝胶过滤去除160kDa的蛋白质。用洗涤缓冲液(50mM咪唑、100mM NaCl、10mM磷酸钠，pH 8.0)洗涤预先装填的Sephacryl S-100HR(安发玛西亚生物技术公司：Amersham Pharmacia Biotech)柱。用洗脱缓冲液(50mM咪唑、100mM NaCl、10mM磷酸钠，pH 8.0)洗脱结合的蛋白质并收集1ml级分。通过SDS-PAGE和随后的考马斯蓝染色分析级分(图2B)。
纯化后，使用PGNase F消化和质谱法分析糖型。通常大于90％的Man会是Man8或Man9。
为了评估gp120和污染物的量，用内切糖苷酶H(Endo H)消化纯化的蛋白质，所述酶已知切割高甘露糖和杂合型的糖。来自图3的结果显示主要的条带为55-60kDa的蛋白质，对应于gp120多肽的大小。基于图3数据所评估的gp120纯度大于90％。在后来的实验中，该条带被进一步鉴定为主要是PST1，一种酵母蛋白质。参阅图15。
特异于糖基化gp120蛋白的抗体。为了测试甘露糖特异性抗体是否能够被HIV-1Env蛋白质诱导并与之反应，用酵母细胞壁提取物酵母聚糖A免疫兔子，所述酵母聚糖A含有β-葡聚糖和α-甘露聚糖。这些富含甘露糖的结构主要含有末端α1，3和α1，6键，极少有α1，2结构，例如通常见于gp120中的那些。在第0周用含酵母聚糖A的200μg CFA免疫两只兔子，并在第2周和第4周和之后每四周用100μg含抗原的IFA加强。在第5周和每次加强后1周收集免疫血清。如通过ELISA分析(其使用被平板捕获的酵母聚糖A或甘露糖)所确定的那样，抗原激发了良好的抗体应答(图4A)。值得注意的是，免疫血清也识别一些测试的gp120糖蛋白(图4B)。抗甘露聚糖血清对进化枝E(ChenMai和93TH975)、C(CN54和96ZM651)和进化枝B之一(LAV)显示广谱的、但是相对低水平的反应性。相反，2G12MAb主要与进化枝B(ADA，JR-FL，BAL，LAV)菌株反应，但是对进化枝C(CN54和96ZM651)没有应答，或对测试的进化枝E菌株(93TH975和ChenMai)很少应答。通过Western印迹和重复的ELISA进一步证实了抗体对进化枝E Chen菌株的高效价。这些结果提示可以在动物中诱导抗甘露糖的抗体，并且能够获得对HIV gp120的反应性。这些发现为我们新颖的、富含甘露糖的gp120免疫原的发展提供了有力的理论基础。
在pmr1Δ酵母细胞中表达的来自菌株YU2、JR-FL和JR-CSF的gp120蛋白含有22-24个Man8结构，而在哺乳动物细胞中表达的来自相同HIV菌株的gp120蛋白含有约一半的Man5-9和一半的复合糖结构。为了确定在酵母中表达的gp120蛋白是否被抗甘露聚糖抗体以及2G12更有效地识别，我们使用在酵母中表达的来自YU2菌株的纯化的gp120蛋白与在哺乳动物细胞中表达的YU2进行比较。来自该ELISA分析(图4C)的结果显示来自酵母的gp120蛋白与来自哺乳动物细胞的相比对抗甘露聚糖抗体具有高得多的抗原性。该图也显示抗甘露聚糖抗体识别Man9-BSA缀合物但不识别单独的BSA。
Man9的分离以及Man9与BSA的缀合。为了使用Man9GlcNAc2作为筛选抗α1，2-Man结构抗体的工具，从植物蛋白质分离Man9并与BSA缀合。具体地，通过加利福尼亚大学圣地亚哥分校(University of CaliforniaSan Diego，UCSD)的糖生物学核心设备(Glycobiology Core Facility)从大豆凝集素(SBA，EY labs)中分离Man9聚糖。简言之，使用PNGase F释放纯化的SBA上的N-聚糖并使用TCA沉淀纯化，以去除蛋白质。将上清液通过Sep-Pak C18管以去除残余的洗涤剂，并在多孔的石墨化碳管(graphitized carbon cartridge)上纯化聚糖。单糖分析表明产率为每25mg蛋白质0.2mg。通过HPAEC-PAD分析聚糖，并与还原的Man9GlcNAc2标准和还原的RNAse B聚糖比较。经评估，90％的聚糖事实上是Man9GlcNAc2，并且Man9GlcNAc2与Man8GlcNAc2的比例为9∶1。对等分式样进行MALDI-TOF质谱分析。主要的种类是Hex9HexNAc2，尽管也观察到更少量的更小的聚糖。
然后使用sulfo-SMCC(Pierce生化药剂公司)方法将Man9GlcNAc2与BSA缀合。简言之，使Man9GlcNAc2与2-氨基乙硫醇盐酸盐于85℃反应30分钟。将反应混合物在水中进行透析以去除反应试剂和盐，然后真空干燥。然后将Man9衍生物溶解在100μl SMCC反应缓冲液(0.1M磷酸钠，50mM EDTA，pH 7.4)中。将BSA在反应缓冲液中用sulfo-SMCC活化2小时。通过将反应混合物经过交联葡聚糖凝胶G25柱，去除过量的SMCC。合并并浓缩含有BSA-SMCC的级分。将100μg BSA-SMCC与50μg衍生的Man9反应30分钟。通过添加0.5M半胱氨酸终止反应，并在磷酸盐缓冲液中进行透析。将溶液真空干燥并将BSA-Man9缀合物溶解在0.1ml水中，得到BSA为1mg/ml的浓度。图5显示与BSA-SMCC和未缀合的BSA相比，BSA-Man9缀合物的移行。
DC-SIGN抗体和重组蛋白质的制备。使用抗DC-SIGN抗体监测重组DC-SIGN蛋白质的表达。使用合成肽在兔子中生产两种抗体。通过免疫亲和层析纯化免疫血清。两种肽抗体均识别来自人粘膜组织裂解物中的44kDa条带。该条带被抗原肽封闭，指示这两种抗体是特异性的。
DC-SIGN的克隆和表达。为了进行gp120-DC-SIGN结合测定并测试激发的抗体的中和活性，克隆和表达DC-SIGN的胞外结构域。通过PCR扩增制备DC-SIGN的cDNA片段，并连接进pET100载体(英骏公司：Invitrogen)。使用BL21(DE3)细菌在存在0.5M IPTG时表达重组蛋白质。IPTG诱导4小时后收获细菌细胞。将细菌裂解物分离为可溶和不溶的级分，并通过SDS-PAGE分析。在不溶级分中发现重组的ECD蛋白质，并使用Ni-NTA柱纯化(图6A)。
从细菌包涵体中重新折叠并纯化DC-SIGN。因为包涵体中的不溶蛋白质被不正确地折叠。重新折叠变性的蛋白质以获得具有生物学功能的蛋白质，并用Ni-NTA和D-甘露糖亲和层析纯化重新折叠的蛋白质。简言之，用含有1mg/ml溶菌酶和5μg/ml DNAse I的裂解缓冲液(50mMTris-Cl、150mM NaCl、5mM 2ME，pH 7.45)裂解细菌细胞，以释放包涵体和可溶性蛋白质。通过离心沉淀包涵体并充分洗涤以去除可溶性蛋白质。将包涵体在含有8M尿素的重新折叠缓冲液(20mM Tris、10mM 2ME、10mM DTT、1mM甘氨酸、1mM GSH、0.1mM GSSG、1mM EDTA，pH 10.5)中裂解。用重新折叠缓冲液稀释尿素浓度，并用1N HCl将溶液顺次调节为pH 9.0、8.8、8.5和8.0。将重新折叠溶液在40,000g离心30分钟以去除不溶物质。然后用Ni-NTA琼脂糖柱纯化重新折叠的蛋白质，并用含有500mM咪唑的裂解缓冲液洗脱。用SDS-PAGE和随后的考马斯蓝染色分析纯化的ECD蛋白质的量和纯度。图6A显示Ni-NTA纯化后，重新折叠的蛋白质具有高于90％的纯度。使用用上样缓冲液预平衡的D-甘露糖-琼脂糖柱进一步纯化来自Ni-NTA柱的、含有ECD蛋白质的洗脱液，从而选择能够结合配体的蛋白质。用上样缓冲液洗涤柱，并用50mMα-D-甘露糖洗脱结合的蛋白质。通过SDS-PAGE和随后的考马斯蓝染色分析级分。图6B中的结合测定显示重组蛋白质是功能性的，因为它以对多克隆抗体相似的亲和力与gp120结合。
DC-SIGN-gp120相互作用的结合测定。为了测试DC-SIGN活性，进行DC-SIGN-gp120结合测定。将不同的免疫血清稀释液(使用不同浓度的2G12MAb作为对照)与200ng gp120蛋白孵育以测定IC50值。平行使用在哺乳动物细胞和酵母细胞中产生的来自YU2和JR-FL菌株的gp120蛋白用于比较。然后将孔与抗gp120多克隆抗体(美国生物公司：USBiological)、随后与山羊抗兔IgG-HRP缀合物孵育。每个条件一式两份进行。使用根据gp120浓度和OD值创建的标准曲线测定与DC-SIGN结合的gp120的量。在给定的抗体浓度下的百分比抑制表达为[(无抗体时的gp120量-存在给定浓度抗体时的gp120量)/无抗体时的gp120量]×100。测定了抑制能力，即50％(IC50)和90％(IC90)抑制剂量。为了测试每种抗体的广谱中和反应性，使用来自进化枝A、B和C的重组gp120糖蛋白。
使用500ng/孔的纯化的ECD蛋白质将微孔板包被16小时。用含有0.1％BSA的TBS-Tween封闭孔。使用在哺乳动物细胞中生产的来自YU2菌株的gp120蛋白与固定的蛋白质结合。然后与抗gp120-MN多克隆抗体、随后与山羊抗兔IgG-HRP缀合物孵育孔。底物显色后，用微孔读数器读出光密度(OD450)。每个条件一式两份设置。
除了两种多克隆抗体外，还开发了抗纯化ECD蛋白质的MAb。使用ELISA对培养上清液进行第一次筛选并扩增阳性克隆后，使用Western印迹进一步筛选杂交瘤(图7)。这些MAb显示高特异性，因为更长的胶片曝光(30分钟)不显示其它可检测的条带。
重组的gp120蛋白和中和实验。使用来自不同进化枝的gp120蛋白进行免疫血清和杂交瘤上清液的初级筛选。这些蛋白质理想地在哺乳动物细胞中表达以被完全糖基化。这些蛋白质中的许多可得自商业来源。筛选需要少于1mg的每种蛋白质。HIV中和实验一般如Binley等，J.Virol.78：13232-52(2004)，Li等，J Virol.79：10108-25(2005)；Mascola等，J.Virol.79：10103-7(2005)中所述进行。简言之，逆转录病毒质粒pHIV-gpt和gp160env pHXB2在共转染Cos-7细胞后生产高滴度的假病毒。如使用Bright-Glo荧光素酶测定试剂盒(普洛麦格Promega)和最近购买的Veritas化学发光检测仪(特纳生物系统公司：Tuner Biosystems)通过荧光素酶活性所测量的那样，该假病毒非常好地感染荧光素酶指示细胞系LuSIV。使用该系统测试我们实验室最近生产的抗HIV-1多克隆抗体(图8)。两种多克隆抗体显示剂量依赖性的中和活性。使用Trim5α多克隆抗体作为阴性对照，而人MAb(2F5、4E10和2G12)作为阳性对照。
制备与免疫刺激剂缀合的gp120。为了增强均一糖基化gp120的免疫原性，合成来自破伤风毒素的含有通用T细胞表位的多抗原肽(MAP)，使用不同的偶联步骤制备gp120-破伤风类毒素和gp120-MAP的缀合物，并分析其偶联效力和抗原性。简言之，通过发展成熟的肽公司(AnaSpec有限公司)合成带有四个p2序列分枝(p24)的多抗原肽(MAP)。MAP肽通过HPLC纯化为高于90％的纯度，并通过质谱法分析。通过使用已被添加进磁心矩阵(core matrix)的半胱氨酸残基将MAP肽与gp120共价偶联。使用SMCC方法将半胱氨酸巯基基团与gp120蛋白上游离的氨基基团交联，因此不会修饰我们希望开发抗它的抗体的糖结构。简言之，10mg/ml的gp120蛋白与10mg/ml Sulfo-SMCC(Pierce公司)溶液在偶联缓冲液(1×PBS，0.1M EDTA，pH 7.2)中反应2小时。反应溶液应经过交联葡聚糖凝胶G-25柱以去除过量的SMCC。收集含有蛋白质的级分。合成的MAP肽以10mg/ml溶解在偶联缓冲液中，并与活化的抗原以30∶1的摩尔比混合，这使得gp120蛋白上大部分游离的氨基基团被偶联。交联反应进行2小时。所有的反应应在室温进行。
应使用类似途径制备gp120-破伤风类毒素缀合物。借助于它们的游离氨基通过交联将破伤风类毒素蛋白质(TT，丹麦国家血清研究所：StatensSerum Institute)与gp120偶联。简言之，将100倍摩尔过量的新鲜戊二醛(防止自身缀合物)与TT在50mM硼酸盐缓冲液，pH 8.0中反应。通过交联葡聚糖凝胶G-25柱去除游离的戊二醛。然后将TT-戊二醛与gp120偶联。通过添加1M甘氨酸封闭游离的醛基。反应混合物再次经过交联葡聚糖凝胶G-25柱。收集含有TT-gp120的级分并以PBS透析。
使用凝胶移动测定分析偶联效率。简言之，用4-20％梯度SDS-PAGE和随后的考马斯蓝染色以及使用抗gp120的抗体通过Western印迹分析缀合物。缀合物比未缀合的蛋白质移动得更慢。缀合物的大小改变取决于已经与gp120蛋白偶联的MAP肽和蛋白质分子的数目。使用ELISA通过将未缀合的gp120与抗甘露聚糖的多克隆抗体和2G12MAb比较来测试缀合物的抗原性。
体内筛选gp120蛋白及其缀合物的免疫原性。免疫5到6周龄的六组BALB/c小鼠(表1)。以所示的剂量皮下注射抗原。在初次免疫后14天和之后每三周用相同剂量的抗原对小鼠加强免疫。每次加强注射后1周对它们放血。因此，在第0、2、5、8和11周免疫小鼠，并在第0、3、6、9和12周收集免疫血清。可以使用YU2和JR-FL二者，从而具有更多的Manα1，2-Man表位，并开发更多的广谱中和性MAb。
表1
免疫组别
  组   gp120/缀合物   佐剂   意义
  1.   10μg   无   无佐剂对照
  2.   10μg   CFA/IFA   Gp120与CFA/IFA佐剂共同施用作为对照
  3.   20μg   gp120-TT   比较TT与CFA/IFA的效应
  4.   50μg   gp120-TT   比较缀合物的剂量效应
  5.   20μg   gp120-MAP   比较TT-MAP与CFA/IFA的效应
  6.   50μg   gp120-MAP   比较缀合物的剂量效应
应使用ELISA用gp120抗原包被的微孔板测试抗体效价。简要说明ELISA步骤。Costar微孔板用300ng抗原/孔在100μl的50mM碳酸盐(pH9.5)中包被24小时。用200μl封闭缓冲液(溶于PBS的1％BSA，0.02％硫柳汞)将孔封闭2小时。洗涤后，将100μl系列稀释的免疫血清与抗原包被的孔孵育2小时。用PBS-Tween洗涤5次后，将孔与100μl山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物(西格玛公司：Sigma)在1∶5000的封闭缓冲液中孵育2小时。洗涤后，将孔与100μl HRP底物TMB溶液(碧迪生物科学：BDBioscience)孵育10分钟，并通过添加100μl的1N HCl终止反应。通过微孔读数器读出A450的光密度。所有的反应在室温进行。
筛选免疫血清中来自不同进化枝的gp120蛋白的交叉反应抗体。全球已经报导了多达12个进化枝的HIV-1分离株，进化枝A(27％)、B(12％)和C(42％)构成所有HIV-1感染的80％以上。Man9和Man8形式的高甘露糖寡糖在所有的HIV-1菌株和分离株中是高度保守的。因此，抗Manα1，2-Man结构的抗体应当识别来自单个Man8或Man9的表位，或由2种或3种这些聚糖形成的构象表位。因此，抗Manα1，2-Man表位的抗体应当识别大部分HIV-1菌株和分离株。
为了开发具有广谱中和活性的MAb，我们用gp120糖蛋白筛选经免疫的小鼠和杂交瘤上清液，所述gp120糖蛋白来自进化枝A(例如Q2317、B2539和Q1769)、B(ADA、YU2、JR-FL、89.6、BaL、SF162)和C(例如DU123、DU422、DU179和98IN012)的菌株。另外，可以测试抗高甘露糖Man8结构的抗体。Man8应从酵母中生产的gp120蛋白分离，并使用本文公开的sulfo-SMCC方法与BSA缀合。BSA-Man8将用于包被微孔板并筛选免疫血清中抗Manα1，2-Man表位的抗体。
选择对免疫原的血清效价≥1∶10,000、对来自不同进化枝的gp120蛋白和BSA-Man8的血清效价≥1∶1,000的小鼠用于创建杂交瘤。简言之，融合前三天用相同剂量的抗原对小鼠进行加强，之后将小鼠处死并无菌收集脾。通过向脾中注射20ml无菌的完全无血清DMEM(CSFD)制备细胞悬浮液。同时，收集骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14(ATCC)的培养物。用DMEM将脾细胞和骨髓瘤细胞洗涤三次，并独立地重悬于10ml CSFD中。评估细胞生存力后，将它们以1∶1的比例混合，补充30ml DMEM并通过离心沉淀。通过缓慢地添加1ml 50％聚乙二醇(PEG 400，罗氏：Roche)并在每滴后搅拌来重悬细胞沉淀物。向混合物中逐滴地添加无菌的CSFD并搅拌，使得终体积为10ml。将融合的细胞离心并用完全的DMEM-20/HEPES/丙酮酸盐/HAT重悬。将细胞悬浮液调节至2.5×106个总细胞/ml。将融合的细胞接种于96孔板中并在潮湿的37℃、5％CO2温箱中孵育7天。然后用完全的DMEM-20/HEPES/丙酮酸盐/HT替换培养基。在第12到15天，根据可见的杂交瘤菌落证实，杂交瘤已可用于筛选。一般将每个脾的约1×108个细胞接种在十个96孔板中，并获得≥80％的融合效率。
使用ELISA用免疫原筛选有可见菌落的孔中的上清液。除了被抗原包被的孔用100μl未稀释的杂交瘤上清液探测以外，步骤与筛选免疫血清的相同。将阳性孔中的候选杂交瘤细胞转移至含有DMEM-20/HEPES/丙酮酸盐和克隆/增殖培养基的24孔中，并增殖3到5天。用来自不同进化枝的gp120和BSA-Man8如上所述再次筛选上清液。对所有或大部分测试的gp120蛋白和BSA-Man8显示阳性的孔进行克隆，每孔涂板1到3个细胞。将细胞培养7到10天，并如上所述使用相同的抗原组再次筛选候选克隆。重复亚克隆和筛选，直到建立的稳定的目的杂交瘤细胞系。
为了测试这些MAb抗大量HIV-1菌株和元代分离株的中和活性，在小鼠中生产MAb并用蛋白质A亲和层析纯化。
鉴定能够有效地中和广谱HIV-1菌株和元代分离株的MAb。对培养物上清液和MAb进行HIV中和测试以测试中和同源HIV菌株的能力。因此，对来自用酵母中生产的YU2或JR-FL gp120免疫的动物的杂交瘤培养物上清液测试中和HIV假型的能力，所述HIV假型带有YU2或JR-FL Env蛋白质以及荧光素酶报告基因。测试上清液和MAb中和储存于U87细胞中的p24-标准化的病毒感染的能力，所述病毒带有CD4和CCR5(或当使用X4病毒株系时为CXCR4)。感染之前，病毒假型首先与未经稀释的上清液或系列稀释的MAb孵育一个小时。在48到72小时后测量被感染细胞中产生的荧光素酶的量。中和活性表示为与抗体阴性对照相比，每种抗体稀释度下病毒复制(荧光素酶活性)的抑制百分比：％抑制{1[荧光素酶Ab荧光素酶Ab]}100。效价计算为带来50％抑制的MAb稀释度的倒数(IC50)。然后测试中和同源病毒的上清液和MAb中和多种元代HIV-1菌株的能力。
实施例2-4中所使用的材料和方法
酵母双突变体和三突变体的产生：
酵母菌株和培养基。该研究中使用的四种酵母缺陷菌株得自OpenBioSystems公司：MATα、his3Δ1、leu2Δ0、lys2Δ0、ura3Δ0、mnn1：kanMX4(10322)；MATa、his3Δ1、leu2Δ0、met15Δ0、ura3Δ0、mnn4：kanMX4(7034)；MATa、his3Δ1、leu2Δ0、met15Δ0、ura3Δ0、och1：kanMX4(4406)；和MATahis3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0pmr1：kanMX4(14534)。两种亲本酵母菌株得自ATCC用于证实和筛选交配型：MATa、trp1Δ63(命名：BY4710)和MATα、trp1Δ63(命名：BY4711)。野生型二倍体酵母菌株INVSc1得自英骏公司(Invitrogen)。所示基因的敲除通过PCR证实，使用特异于MNN1、OCH1、MNN4和PMR1基因(参阅http://www.sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project主页上酵母缺失工程(Yeast Deletion Project)中的序列)的合成引物和特异于KanMX4盒的合成引物(KanB，5’-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3’(SEQ ID NO：8)和KanC，5’-TGATTTTGATGACGAGCGTAAT-3’(SEQ ID NO：9))。如(Giaever，2002)所述使用JumpStart Taq DNA聚合酶(西格玛：Sigma)进行菌落PCR。所有的酵母培养物在所示的补充了200μg/ml G418(英骏公司：Invitrogen)的YPD(1％Bacto-酵母膏、2％Bacto-蛋白胨、2％葡萄糖)或YPD+0.3MKCl中生长。二倍体和单倍体的选择使用补充了20μg/ml L-甲硫氨酸(CSM-lys)或50μg/ml L-赖氨酸盐酸盐(CSM-met)的CSM-met-lys平板(0.67％不含氨基酸的酵母氮基、0.07％CSM-met-lys省却混合物(dropoutmix)、2％葡萄糖、2％Bacto-琼脂)进行。CSM-met-lys省却混合物得自QbioGene公司。对于酵母交配型测试而言，菌株在SD平板(0.67％不含氨基酸的酵母氮基、2％葡萄糖、2％Bacto-琼脂)上选择。
酵母交配。酵母菌株10322(Δmnn1)与菌株7034(Δmnn4)、4406(Δoch1)和14534(Δpmr1)交配形成二倍体菌株DIP-mnn1mnn4(MATa/α；his3Δ1/his3Δ1；leu2Δ0/leu2Δ0；LYS2/lys2Δ0；met15Δ0/MET15；ura3Δ0/ura3Δ0；mnn4：kanMX4/MNN4；MNN1/mnn1：kanMX4)、DIP-mnn1och1(MATa/α；his3Δ1/his3Δ1；leu2Δ0/leu2Δ0；met15Δ0/MET15；LYS2/lys2Δ0；ura3Δ0/ura3Δ0；och1：kanMX4/OCH1；MNN1/mnn1：kanMX4)和DIP-mnn1pmr1(MATa/α；his3Δ1/his3Δ1；leu2Δ0/leu2Δ0；LYS2/lys2Δ0；met15Δ0/MET15；ura3Δ0/ura3Δ0；pmr1：kanMX4/PMR1；MNN1/mnn1：kanMX4)。如(Giaever，2002)所述，在CSM-met-lys上选择二倍体并形成孢子。用裂解酶(Zymolyase)100T(美国生物公司：US Biological)消化形成孢子的二倍体的子囊，并如CurrentProtocols in Molecular Biology中所述进行随机孢子分析。将来自DIP-mnn1mnn4和DIP-mnn1pmr1的孢子涂布在YPD上，而将来自DIP-mnn1och1的孢子涂布在YPD+0.3M KCl上。通过将得到的单倍体孢子与亲本菌株(BY4710和BY4711)在SD上杂交选择交配型，并通过影印培养在CSM-met和CSM-lys上选择营养缺陷型需要。通过在YPD上37℃的缓慢生长筛选Δoch1突变，而所有的ORF敲除使用菌落PCR筛选和证实。最终的双突变体为Δmnn1Δmnn4-9(MATa、his3Δ1、leu2Δ0、met15Δ0、ura3Δ0、mnn1：kanMX4、mnn4：kanMX4)、Δmnn1Δoch1-3(MATα、his3Δ1、leu2Δ0、lys2Δ0、ura3Δ0、mnn1：kanMX4、och1：kanMX4)和Δmnn1Δpmr1-5(MATα、his3Δ1、leu2Δ0、lys2Δ0、ura3Δ0、mnn1：kanMX4、pmr1：kanMX4)。
将单倍体双突变体Δmnn1Δmnn4-9和Δmnn1Δoch1-3交配，形成二倍体菌株DIP-mnn1mnn4och1(MATa/α；his3Δ1/his3Δ1；leu2Δ0/leu2Δ0；met15Δ0/MET15；LYS2/lys2Δ0；ura3Δ0/ura3Δ0；mnn1：kanMX4/mnn1：kanMX4；mm4：kanMX4/MNN4；OCH1/och1：kanMX4)，然后如上文进行孢子形成、消化、随机孢子分析和选择。最后的三突变体单倍体为：Δmnn1Δmnn4Δoch1-1-2、Δmnn1Δmnn4Δoch1-1-3和Δmnn1Δmnn4Δoch1-2-5(MATa、his3Δ1、leu2Δ0、met15Δ0、ura3Δ0、mnn1：kanMX4、mnn4：kanMX4、och1：kanMX4)；Δmnn1Δmnn4Δoch1-2-4和Δmnn1Δmnn4Δoch1-2-6(MATα、his3Δ1、leu2Δ0、lys2Δ0、ura3Δ0、mnn1：kanMX4、mnn4：kanMX4、och1：kanMX4)；和Δmnn1Δmnn4Δoch1-2-2(MATa、Ms3Δ1、leu2Δ0、lys2Δ0、ura3Δ0、mnn1：kanMX4、mnn4：kanMX4、och1：kanMX4)。通过在3’和5’端PCR对所有克隆证实每个ORF的KanMX敲除。
将两个单倍体三突变体Δmnn1Δmnn4Δoch1-2-4和Δmnn1Δmnn4Δoch1-2-5交配，形成二倍体三突变体Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP(MATa/α；his3Δ1/his3Δ1；leu2Δ0/leu2Δ0；met15Δ0/MET15；LYS2/lys2Δ0；ura3Δ0/ura3Δ0；mnn1：kanMX4/mnn1：kanMX4；mnn4：kanMX4/mnn4：kanMX4；och1：kanMX4/och1：kanMX4)。
制备免疫血清：
抗酵母酵母聚糖的抗体。使用酵母细胞壁提取物酵母聚糖A免疫兔子，所述酵母聚糖A由野生型酵母的β-葡聚糖和α-甘露聚糖组成。在第0周用200μg含酵母聚糖A的CFA免疫两只兔子，并在第2周和第4周和之后每四周用100μg含抗原的IFA加强。在第5周和每次加强后1周收集免疫血清。合并得到的血清并用蛋白质A-琼脂糖纯化。
抗酵母糖蛋白的抗体。使用合成肽在兔子中产生抗目的酵母蛋白质的免疫血清。使用加速的免疫接种时间表，开始使用200μg的初次免疫接种，在第2、4、6和10周使用100μg的免疫接种，并在第5、7、8和11周采集测试血样。使用的肽的序列如下：PST1为CDSLESITDSLNLQSLT(SEQID NO：10)，ECM33为CDSIKKITGDLNMQE(SEQ ID NO：11)，Gp38为CAVNGVTSKSALESIFP(SEQ ID NO：12)，Gas1为CTPKEQLSFVMNLYYEKSGGSKSD(SEQ ID NO：13)和CPATGKYWSAATELPPTPNG(SEQ ID NO：14)，Gas5为CPAMPSAASAYFTSGAGSPMGTGIATQQS(SEQ ID NO：15)和CEIKGNAFFNSESGERFYIRGVDYQPGGS(SEQ ID NO：16)，而YJL171c为CSGPQSYQKLDFTNVGFTGS(SEQ ID NO：17)和CEVGDRVWFSGKNAPLADY(SEQ ID NO：18)。抗原特异性抗体通过免疫亲和层析纯化，使用与SulfoLink凝胶(Pierce公司)偶联的抗原肽。
对α1，3-连接的甘露糖特异的抗体。如以前所述(Raschke等，J.Biol.Chem.248(13)：4660-6，1973和Ballon，J Biol Chem.245：1197-1203，1970)制备对α1，3-连接的甘露糖残基特异的抗体，稍加变动。简言之，将以3.0×107细胞/ml悬浮于0.9％NaCl中的对数期INVScI细胞在70℃加热杀死90分钟。在第1周、第2周、第3周和第4周分别用0.25ml、0.5ml、0.75ml和1.0ml该悬浮液在兔的耳缘静脉注射三次。末次注射后三天对兔放血。然后将得到的血清吸附至Δmnn1酵母细胞。每5ml血清与5g(湿重)热杀死的Δmnn1酵母在50ml 0.9％NaCl中孵育。添加叠氮化钠至0.2％，并将悬浮液在室温颠倒混合孵育过夜。通过在6,000g离心20分钟去除细胞并重复吸附。最终的血清以0.9％NaCl透析，并用0.2微米滤纸灭菌。
确定酵母全细胞上的糖型。
材料。2G12单克隆抗体购自波利门科学生物免疫研究有限公司(Polymum Scientific Inc.(Forschung GmbH))。蛋白质A-琼脂糖4B缀合物购自英骏公司(Invitrogen，Carlsbad，CA)。山羊抗兔IgG HRP购自杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)。
免疫荧光。用1ml新鲜的4％多聚甲醛将30℃于YPD+0.3M KCl中生长至对数期的Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP和INVScI细胞固定1小时，并通过离心沉淀。用PBS将细胞洗涤一次，并转移至多聚赖氨酸包被的玻片上。风干后将细胞与0.5％SDS在室温(RT)孵育15分钟。对于单个染色，将兔抗酵母聚糖抗体稀释至10μg/ml，并使用1∶500稀释度的α1，3-连接的甘露糖抗血清。将这些抗体与细胞在RT孵育1小时。洗涤玻片，并在RT用第二抗体Alexa Fluor 568缀合的山羊抗兔IgG(美国分子探针公司：Molecular Probe，USA)孵育1小时。用PBS洗涤细胞，并封固在玻片上。对于共定位染色，将抗酵母聚糖和2G12抗体分别稀释至10μg/ml和20μg/ml，并与细胞孵育1小时。将玻片洗涤、探测并如上文所述使用AlexaFluor 568缀合的山羊抗人IgG和Alexa Fluor 488缀合的山羊抗兔IgG作为第二抗体封固在玻片上。使用Zeiss Axioskope荧光显微镜(美国麦可班恩公司：McBain，USA)获得图像。
全细胞ELISA。在热杀死的全酵母细胞上进行酶联免疫吸附试验(ELISA)。在0.9％NaCl中于70℃将对数期的Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP和INVScI细胞热杀死1小时，并在PBS中稀释为5.0×107细胞/ml用于包被ELISA板。在50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.5中将来自SF162菌株(ARRRP)和野生型酵母甘露聚糖(西格玛：Sigma)的HIV-1gp120稀释至5μg/ml。各孔中一百微升的抗原在室温孵育过夜。用ELISA封闭缓冲液(PBS，0.1％BSA，0.02％硫柳汞)封闭各孔，并在室温潮湿的温箱中孵育2小时。两次dH2O冲洗后，添加10μg/ml的2G12和抗α1，3-甘露糖抗体，在封闭缓冲液中进行三倍的系列稀释，并在室温孵育过夜。用ELISA洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween 20，0.02％硫柳汞)洗涤各孔，并分别用1∶10,000稀释度的山羊抗人IgG-HRP或山羊抗兔IgG-HRP(杰克逊免疫研究公司：JacksonImmunoResearch)在37℃对2G12或α1，3-甘露糖孵育1小时。如前所述洗涤孔，与YMB孵育进行显色，并用HCl终止。使用EMax微板读数器(分子装置公司：Molecular Devices)通过450nm处的吸光值读出HRP活性。
聚糖谱型。将在30℃生长的对数期Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP细胞在0.9％NaCl中稀释至～3.0×107细胞/ml。在70℃将细胞热杀死1小时。通过PNGase F消化从细胞释放N-连接的聚糖。释放的N-连接的聚糖被高甲基化，并通过Maldi-TOF质谱法(MS)通过UCSD的糖技术核心资源设备(Glycotechnology Core Resource)分析。
鉴定和证实2G12交叉反应性糖蛋白
Western印迹。来自INVSc1、Δmnn1、Δmnn4、Δoch1、Δmnn1Δmnn4、Δmnn1Δoch1和Δmnn1Δmnn4Δoch1菌株的酵母细胞于30℃在YPD+0.3M KCl中生长至3.0的OD600。将酵母细胞在14,000g离心2分钟。通过与两倍体积冰冷的丙酮在-80℃孵育30分钟，对培养上清液进行丙酮沉淀。将样品以14,000g离心15分钟并去除上清液。风干15分钟后，将沉淀物用初始样品体积1/10的2x Laemmli SDS样品缓冲液煮沸5分钟。
通过在RIPA缓冲液中裂解制备酵母细胞裂解物。简言之，将每1ml细胞沉淀物重悬于100μl冰冷的RIPA缓冲液(150mM NaCl、10mM TrispH 7.4、1mM EDTA pH 8.0、1％Triton X-100、1％DOC、0.1％SDS、1mM PMSF、1μg/ml抑肽酶和1μg/ml亮肽酶素)中，并通过与酸洗玻璃珠(西格玛Sigma)一起振荡10分钟破坏细胞壁。将得到的裂解物在13,000g离心30分钟以去除任何碎片，将各蛋白质浓度在稀释缓冲液(50mM TrispH 7.4、1mM EDTA pH8.0、1μg/ml抑肽酶、1μg/ml亮肽酶素和0.1％SDS)中稀释至0.3mg/ml。添加Laemmli SDS缓冲液至1x并将含有0.24mg/ml蛋白质的样品煮沸5分钟。
对上清液和细胞裂解物级分在4-20％梯度凝胶上进行SDS-PAGE分离，并以250mA向硝酸纤维素膜转移2小时。使用第一抗体和随后用第二抗体在所示的稀释度下进行Western印迹，所述第一抗体包括MAb2G12和如上所述在兔中产生的多克隆抗体，所述第二抗体为山羊抗人IgG-HRP和山羊抗兔IgG-HRP(杰克逊免疫研究：JacksonImmunoResearch)。使用ECL(通用电气生物科学：GE Biosciences)进行化学发光检测。
2G12交叉反应性蛋白质的部分纯化。内源酵母蛋白质的亚细胞定位使用Current Protocols in Cell Biology中所述的差速离心评价。如上所述将来自INVSc1和Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP菌株的对数期细胞培养至3.0的OD600。将每1ml细胞沉淀物重悬于100μl蔗糖裂解缓冲液(0.4M蔗糖、2mM EDTA、25mM咪唑，pH7.0、1mM PMSF、1μg/ml抑肽酶和1μg/ml亮肽酶素)中。添加等体积的酸玻璃珠(西格玛Sigma)，并通过高速振荡与冰浴孵育交替进行15分钟破坏细胞壁。将裂解物在500g离心5分钟，以沉淀未裂解的细胞和大的聚集体，并将上清液在22,000g离心30分钟。保留得到的含有细胞质、高尔基复合体和核内体蛋白质的上清液用于分析。将主要含有液泡、核、ER和质膜蛋白质的沉淀物重悬于相似体积的PBS+1.0％Triton中以溶解膜蛋白。如上所述离心级分，以分离可溶和不溶的膜级分。
凝集素亲和层析。对刀豆球蛋白A(ConA)凝集素亲和层析而言，将9.5ml Triton可溶膜级分在4℃与1ml ConA-琼脂糖(Vector实验室)在5ml Triton洗涤缓冲液(20mM Tris，pH7.0、50mM NaCl、10mM CaCl2和1％Triton X-100)中孵育过夜。用Triton洗涤缓冲液将柱彻底洗涤。为了洗脱与ConA结合的蛋白质，向柱中添加5ml含有0.5M甲基吡喃型甘露糖苷的Triton洗涤缓冲液，然后添加5ml含有0.2mM EDTA和1.0％SDS的Triton洗涤缓冲液。
为了从培养上清液中纯化，将300ml Δmnn1Δmnn4Δoch1-2-5酵母上清液与10mM CaCl2上样至5ml ConA琼脂糖柱(Vector实验室)上，并用ConA洗涤缓冲液(20mM Tris，pH 7.0、50mM NaCl、10mM CaCl2)、随后是含有0.5M甲基吡喃型甘露糖苷的ConA洗涤缓冲液彻底洗涤。为了洗脱ConA结合的蛋白质，向柱中添加5ml 2×SDS上样缓冲液，并煮沸5分钟。
双向凝胶电泳和质谱。用TCA沉淀经ConA-琼脂糖纯化的蛋白质级分，并重溶于200μl尿素/硫脲再水合溶液(7M尿素、2M硫脲、2％CHAPS、60mM DTT；1％两性电解质pH 3-10；0.01％溴酚蓝)中。将IPGZOOM 4-7IPG胶条(英骏Invitrogen)用120μl样品和20μl再水合缓冲液(7M尿素、2M硫脲、2％CHAPS、60mM DTT、1％两性电解质pH 3-10、0.01％溴酚蓝)再水合过夜，用于sypro宝石红蛋白凝胶，用80μl样品和60μl再水合缓冲液再水合过夜用于Western印迹。将胶条上样至ZOOMIPG电泳仪(英骏Invitrogen)上并调节如下：200V 30分钟，450V 25分钟，750V 25分钟和2000V 60分钟。
对于第二向而言，将IPG胶条在含有DTT的LDS平衡缓冲液中在定轨摇床上还原15分钟两次。然后在含有碘乙酰胺的LDS平衡缓冲液中将胶条烷基化15分钟，并使用4-12％梯度丙烯酰胺凝胶用MES跑胶缓冲液在IPG ZOOM系统上电泳。凝胶电泳直到染料前沿迁移至凝胶底部约0.3cm。
对于sypro宝石红蛋白染色而言，将凝胶在40％甲醇、10％乙酸中固定一小时并用SYPRO宝石红蛋白荧光染料染色过夜。将凝胶在10％甲醇、6％乙酸中脱色120分钟(换一次脱色溶液)，并在Molecular ImagerPharoxFX激光成像仪上用以下参数成像：532nm的激发波长、605nm的发射波长和100μm的分辨率。
对于Western印迹而言，在第二向电泳后立刻将凝胶浸泡在转移缓冲液(荧骏Invitrogen)中。将蛋白质转移至硝酸纤维素上并用1μg/ml的2G12探测。
通过2G12在2D印迹上检测的蛋白质与用sypro宝石红蛋白染色的斑点匹配。将匹配的斑点剪下并用胰蛋白酶(trypson)进行凝胶内消化。通过纳米LC MS/MS分析消化的肽。上述实验由蛋白质组研究服务公司(Proteomic Research Services Incorporated)进行。
免疫沉淀。如上所述从对数期的Δmnn1Δmnn4Δoch1-2-5制备培养物上清液和细胞裂解物。通过在室温与蛋白质A-琼脂糖4B缀合物孵育2小时预清洗这些样品。对于抗原-抗体复合物形成而言，向细胞裂解物或培养基样品中添加10μg的2G12，并在摇床上室温孵育1小时。孵育后，向抗原-抗体复合物中添加20μl蛋白质A-琼脂糖4B缀合物，并在摇床上室温再孵育1小时。将样品在10,000g离心5分钟并吸出上清液。用800μl PBS将珠子洗涤两次，并通过用40μl1x SDS样品缓冲液煮沸来洗脱结合的蛋白质。将所有的样品上样至4-20％梯度SDS-PAGE凝胶上，印迹，并使用抗鉴定的酵母糖蛋白的抗体进行Western分析，所述酵母糖蛋白包括ECM33、PST1、GP38、YJL171C、Gas1和Gas5。
N-连接的和O-连接的糖基化位点的生物信息学分析
N-连接的糖基化位点的分析。使用我们最近开发的软件分析酿酒酵母基因组和本研究中鉴定的糖蛋白上的N-连接的糖基化位点。
O-连接的糖基化位点的分析。使用软件NetOGlyc 3.1分析酿酒酵母基因组中一些蛋白质和本研究中鉴定的糖蛋白上的O-连接的糖基化位点，所述软件由丹麦技术大学的生物学序列分析中心(CBS)开发，该软件可得自http://www.cbs.dtu.dk/services/netoglyc。
酵母三突变体中生产的gp120的克隆、表达和表征
试剂。pYES2/CT载体得自荧骏(Invitrogen)，pJR-FLsyngp120和pYU-2质粒得自艾滋病研究和参照项目(AIDS Research and ReferenceProgram，ARRRP)。不含氨基酸的酵母氮基和-Ura省却混合物得自美国生物公司(U.S.Biological.)。抗来自HIV-1IIIB的gp120的兔多克隆抗体(抗gp120-IIIB)得自怀罗斯塔特有限公司(Virostat Inc.)。抗HIV-1YU-2的另一兔多克隆抗体(抗gp120-YU2)使用合成的肽CEQMHEDIISLWDQSLK(SEQID NO：19)内部合成，并使用与Sulfolink凝胶(Pierce公司)偶联的肽亲和纯化。
α-交配因子和gp120的PCR克隆。将酿酒酵母α-交配因子(MFα)的信号序列添加到pYES2/CT载体的多克隆位点(MCS)上游。通过PCR从总酵母DNA(提取自INVSc1)克隆MFα，使用引物MFα1-Kpn-5(5’-ATGGTACCAAAGAATGAGATTTCCTTCAATT-3’(SEQ ID NO：20))和MFα1-Bam-3(5’-ATGGATCCAGCTTCAGCCTCTCTTTTATC-3’(SEQ ID NO：21))，分别添加KpnI和BamHI位点。该片段含有将信号序列从gp120上去除的Kex2位点。使用T4DNA聚合酶(西格玛Sigma)根据制备商的方案进行PCR。将PCR产物纯化、用BamHI和KpnI消化，并使用标准分子生物学技术连接进类似消化的pYES2/CT质粒中。得到的质粒为pYES2/CT-α。
JR-FL的编码序列通过PCR从pJR-FLsyngp120扩增，使用引物JRFL-Eco-5(5’-TGGAATTCTGTGGGTGACTGTATACTAT(SEQ IDNO：22))和JRFL-Xba-3(5’-TATCTAGACCCCACAGCGCGCTTCTCCCT-3’(SEQ ID NO：23))，分别添加EcoRI和XbaI位点。从pYU-2扩增YU-2的编码序列，使用引物YU2-Eco-5(5’-TGGAATTCTGTTGTGGGTCACAGTCTATTAT-3’(SEQ ID NO：24))和YU2-Xba-3(5’-ATTCTAGATTCTCTTTGCACCACTCTTCT-3’(SEQ ID NO：25))，分别添加EcoRI和XbaI位点。如上所述使用EcoRI和XbaI消化，将gp120产物克隆进pYES2/CT-α。最终的质粒为pYES2/CT-α-JRFL(pJRFL-gp120)和pYES2/CT-α-YU2(pYU2-gp120)。
醋酸锂转化Δmnn1Δmnn4Δoch1-2-5酵母。使用质粒pJRFL-gp120和pYU2-gp120转化Δmnn1Δmnn4Δoch1-2-5酵母细胞。简言之，沉淀1.5ml在YPD+0.3M KCl中生长的酵母过夜培养物。去除所有但是余下～50μl的上清液，并重悬细胞。然后加入2μl10mg/ml单链的鲑精DNA(西格玛Sigma)，然后加入1μg pJRFL-gp120或pYU2-gp120。振荡后加入500μlPLATE混合物(40％PEG 4000、100mM LiAc、10mM Tris，pH 7.5、1mMEDTA)和20μl 1M DTT，并将混合物在室温孵育4小时。将细胞在42℃热激10分钟，沉淀，并重悬于100μl的无菌dH2O中。将细胞涂布在-ura/葡萄糖(2％葡萄糖、0.67％不含氨基酸的酵母氮基、0.2％-Ura省却混合物、2％Bacto-琼脂)上。将平板在30℃孵育直至菌落出现。直接对菌落进行PCR，以证实每种质粒的存在，对pJRFL-gp120转化株使用引物MFα1-Kpn-5和JRPL-Xba-3，对于pYU2-gp120使用引物MFα1-Kpn-5和YU2-Xba-3。
在Δmnn1Δmnn4Δoch1酵母中表达gp120。用pJRFL-gp120和pYU2-gp120转化的三突变酵母细胞在-ura/葡萄糖培养基(2％葡萄糖、0.67％不含氨基酸的酵母氮基、0.2％-Ura省却混合物)上培养至对数期。将细胞离心并用-ura/半乳糖培养基(2％半乳糖、0.67％不含氨基酸的酵母氮基、0.2％-Ura省却混合物)洗涤两次，并以OD600＝0.4重悬于-ura/半乳糖中。细胞在30℃培养，并在不同的时间点取样培养基以测试蛋白质诱导。
纯化酵母表达的糖蛋白
硫酸铵沉淀。收集来自Δmnn1Δpmr1的酵母培养物上清液中的PST1蛋白质以及经转化的Δmnn1Δmnn4Δoch1中表达的gp120，并在3000g于40℃离心(贝克曼库尔特：Beckman Coulter，AllegraTM 64R，转子F0650)10分钟以去除任何不溶颗粒。将上清液转移至清洁的烧杯中，加入10mMEDTA，并使用1M Tris碱将pH调节至pH 7.4。缓慢加入硫酸铵同时搅拌，直至达到4℃55％饱和的终浓度。将溶液再搅拌30分钟并在4℃以15,000×g离心30分钟。将沉淀重悬于2ml PBS中，并通过在4℃以15,000×g离心1小时回收不溶物质。该物质被称作AS55沉淀物。向55％AS上清液中缓慢加入硫酸铵同时搅拌，直到达到4℃90％饱和的终浓度。将沉淀重悬于2ml PBS中，并通过在4℃以15,000×g离心1小时回收不溶物质。该物质被称作AS90沉淀物。使用5ml HiTrap脱盐柱(通用电气生命科学：GE Life Sciences)将AS55和AS90沉淀物脱盐至5mM pH 7.5的磷酸钠中，并将蛋白质浓度调节为1mg/ml。
免疫亲和纯化酵母表达的gp120。根据制备商的方案，以每1ml凝胶5mg抗体将抗gp120-IIIB与溴化氰活化的琼脂糖4B(西格玛Sigma)缀合。用PBS彻底洗涤柱后，将来自Δmnn1Δmnn4Δoch1细胞的AS55样品与免疫亲和柱在室温孵育2小时。收集流出液，并用PBS再次洗涤柱。用100mM甘氨酸，pH 2.5将结合的蛋白质洗脱在1ml含有50μl 1M Tris，pH 9.5的级分中。通过Western印迹使用2G12和抗gp120-YU2对这些级分进行gp120测试。合并含有gp120的级分并称作AS55-AP。
阳离子交换层析。对不同的样品进行独立的层析，AS55-AP用于gp120纯化，AS90用于PST1纯化。用5mM磷酸钠，pH 7.5平衡5ml HiTrap SPFF柱(通用电气生命科学：GE Life Sciences)。将样品以1ml/分钟上样至柱上，并用15ml 5mM磷酸钠，pH 7.5洗涤。用80ml 5mM磷酸钠，pH 7.5中0-500mM梯度的NaCl以1ml/分钟的流速洗脱蛋白质。总共收集2ml的级分，并使用斑点印迹试验测试3μl样品中预期的糖蛋白的存在。合并显示显著量蛋白质的级分，并称作GP-IEC-55和GP-IEC-90。使用如前所述的糖蛋白的ConA纯化法进一步纯化这些级分。将蛋白质洗脱进1M甲基吡喃型甘露糖苷中，伴有60分钟的孵育。
糖蛋白的凝胶过滤层析。最后一步，将两种GP-IEC-55和GP-IEC-90级分脱盐进上样缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，5mM 2-bME，pH 7.5)中并通过
Figure A20068004332000721
30(密理博：Millipore)浓缩至～1mg/ml的终浓度。用相同的缓冲液平衡150ml丙烯葡聚糖凝胶S-HR-200(通用电气生命科学：GE Life Sciences)，并将GP-IEC库上样至柱上。用上样缓冲液以0.3ml/分钟的流速洗脱蛋白质，收集2ml级分，并使用斑点印迹试验测试每种级分的3μl样品中糖蛋白的存在。合并显示显著量糖蛋白的级分，并总称为GP-SHR200-55和GP-SHR200-90。使用以下的标准并从过滤柱中共同洗脱：IgG(MW150kD)、AP(MW 140kD)、卵清亲合素(MW68)和链霉亲和素(MW 53)。
聚糖谱型。用PNGase F分别消化含有纯化gp120PST1的GP-SHR200-55和GP-SHR200-90，以释放所有N-连接的聚糖。将这些聚糖高甲基化，并用UCSD的糖技术核心研究设备通过Maldi-TOF质谱法(MS)分析。
对α1，2-连接的末端甘露糖特异的抗体的免疫和制备
使用酵母全细胞产生抗α1，2连接的甘露糖的抗体。使用三突变体制备对α1，2连接的甘露糖残基特异的免疫血清(Raschke等，J Biol Chem.248(13)：4660-6，1973和Ballon，J Biol Chem.245：1197-1203，1970)。简言之，在70℃将以3.0×107细胞/ml悬浮于0.9％NaCl中的对数期Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP热杀死90分钟。在第1周、第2周、第3周和第4周分别用0.25ml、0.5ml、0.75ml和1.0ml该悬浮液在兔的耳缘静脉注射三次。从第2、3和4周的最后一次注射后三天对兔放血。休息四周后，在第9周、第10周和第11周用相同的悬浮液以0.5ml、0.75ml和1.0ml在兔耳缘静脉对兔注射三次。末次注射后3天收集第四次的最终放血。通过ELISA和Western印迹测试得到的血清的gp120结合。
使用酵母细胞提取物产生抗α1，2连接的甘露糖的抗体。使用三突变体的膜级分制备对α1，2连接的甘露糖残基特异的免疫血清。使用酸洗玻璃珠(西格玛Sigma)在蔗糖裂解缓冲液(0.4M蔗糖、2mM EDTA、25mM咪唑，pH7.0、1mM PMSF、1μg/ml抑肽酶和1μg/ml亮肽酶素)中裂解来自Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP菌株的对数期细胞。将裂解物在500g离心5分钟沉淀未裂解的细胞和大的聚集体，并将上清液在22,000g离心30分钟。将得到的主要含有液泡、核、ER和质膜蛋白质的沉淀物重悬于相似体积的PBS+1.0％Triton中以溶解膜蛋白。如上所述离心级分，以分离可溶和不溶的膜级分。用这些级分免疫四组(每组两只)兔子，一组用野生型(INVSc1)的Triton可溶的级分，两组用三突变体的Triton可溶级分，一组用三突变体的Triton不溶级分。使用加速的免疫接种时间表，开始使用200μg的初次免疫接种，在第2、4、6和10周使用100μg的免疫接种，并在第5、7、8和11周采取测试血样。通过ELISA和Western印迹测试得到的血清的gp120结合。
抗血清对热杀死的全细胞酵母的吸附。为了富集对α1，2连接的甘露糖残基特异的抗体，接着对任一显示gp120结合的血清进行Δoch1和INVSc1(WT)酵母细胞吸附。将每1ml血清与1.0-2.0g(湿重)热杀死的Δoch1和/或WT酵母在5ml 0.9％NaCl中孵育。添加叠氮化钠至0.2％，并将悬浮液在室温颠倒混合孵育过夜。通过在6,000g离心20分钟去除细胞，并重复吸附。最终的血清以0.9％NaCl透析，并用0.2微米滤器灭菌。然后，在蛋白质A-琼脂糖(英骏：Invitrogen)上纯化抗体，并再次通过ELISA和Western印迹测试gp120结合。
亲和纯化抗α1，2连接的甘露糖残基特异的抗体。为了进一步纯化对α1，2连接的甘露糖残基特异的抗体，使用来自三突变体的ConA洗脱的糖蛋白通过ELISA纯化血清，所述血清来自显示gp120结合的任一被吸附的抗体。简言之，如前所述使用ConA凝集素亲和层析纯化来自Δmnn1Δmnn4Δoch1-2-5细胞的培养物上清液和细胞裂解物。根据制备商的方案，按照每1ml凝胶10mg总蛋白质，将来自每种级分(上清液和裂解物)的蛋白质独立地与溴化氰活化的琼脂糖4B(西格玛Sigma)缀合。用PBS彻底洗涤柱后，将10-20ml选择的血清过滤灭菌，并与5ml培养基在室温孵育2小时。收集流出液，并用PBS再次洗涤柱。用100mM甘氨酸，pH 2.5将结合的蛋白质洗脱在1ml含有50μl 1M Tris，pH 9.5的级分中。以PBS透析后，通过ELISA和Western印迹对这些抗体进行gp120结合测试。
对免疫血清进行抗gp120反应性和假病毒中和分析
针对gp120的ELISA。进行酶联免疫吸附试验(ELISA)以测试抗α1，2连接的甘露糖血清对gp120的特异性。将不同的HIV-1gp120蛋白(来自多种来源，包括Doms博士的实验室、ARRRP和商业公司)在50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.5中稀释至3-5μg/ml。将一百微升抗原于每孔中室温孵育过夜。用ELISA封闭缓冲液(PBS，1％BSA，0.02％硫柳汞)封闭孔，并在室温潮湿的温箱中孵育2小时。两次dH2O冲洗后，以封闭缓冲液中不同的稀释度添加2G12和抗Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP的抗血清，并在室温孵育过夜。用ELISA洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween 20，0.02％硫柳汞)洗涤孔，并在37℃与1∶10,000稀释度的山羊抗人IgG-HRP或山羊抗兔IgG-HRP(杰克逊免疫研究公司：Jackson ImmunoResearch)孵育1小时。如前所述洗涤孔，与TMB孵育进行显色，并用HCl终止。使用EMax微板读数器(分子装置公司：Molecular Devices)通过450nm处的吸光值读出HRP活性。通过国家卫生研究所艾滋病研究和参照试剂项目(NIH AIDS Researchand Reference Reagent Program)(ARRRP)获得在CHO细胞中表达的SF162gp120。在293T细胞中表达的ADA、JR-FL和YU2gp120得自费城大学(University of Philadelphia)的Doms博士。
在上文使用的类似方法中，通过定量ELISA将哺乳动物细胞中表达的gp120蛋白的结合亲合力与三突变酵母表达的进行比较。使用来自不同菌株的等量的gp120酵母(在Δmnn1Δmnn4Δoch1中表达)和gp120-293(在293T细胞中表达)包被微孔板。然后使用2G12、抗gp120-IIIB和抗gp120-YU2探测。通过捕获等量的蛋白质和系列稀释结合抗体，来计算和比较2G12对各gp120的结合亲合力。
中和测定。293T/17细胞购自美国典型培养物保藏中心(马纳萨斯，吉尼亚洲：Manassas，VA)并在含有10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中维持。质粒pNL4-3.luc.R-E-购自朗道(Landau)博士实验室。用于生产假病毒的多种HIV-1 env gp160质粒得自国家卫生研究所艾滋病研究和参照试剂项目(NIH AIDS Research Reference ReagentProgram)(NIH，ARRRP)。表达用于假病毒传染性的CCR5和CD4的U87.CD4.CCR5和U87.CD4.CXCR4细胞系由费城大学(University ofPhiladelphia)的Doms博士赠送。
对于假病毒而言，使用磷酸钙方法根据制备商的说明(英骏：Invitrogen)用gp160 env表达质粒和补偿性病毒基因组报告基因载体pNL4-3.Luc.E-R-共转染10cm皿的70-80％融合的293T/17细胞。转染后48小时，收集含有Env蛋白质假型重组病毒的培养物上清液，离心，通过0.45μm的滤器过滤，并冷冻在-80℃。为了测量假病毒传染性，使用收集的上清液的等分式样感染每个表达CCR5(U87.CD4.CCR5)或CXCR4(U87.CD4.CXCR4)的细胞系的96孔板中的10,000个细胞。在72小时的细胞培养后，使用Bright-Glo荧光素酶测定系统试剂(普洛麦格Promega，Madison，WI)和Veritas微孔板化学发光检测仪(特纳生物系统公司：TurnerBiosystems)设备根据制备商的说明，测量来自单轮感染细胞的荧光素酶活性。测定一式三份的孔的平均相对光单位(RLU)，并使用≥2×105rlu/ml的假病毒储液用于随后的中和测定。
对中和测定而言，使用单轮假型报告基因测定来测定动物血清或纯化抗体抗HIV-1病毒的中合抗体(NAb)活性。简言之，将表达CCR5(U87.CD4.CCR5)或CXCR4(U87.CD4.CXCR4)的细胞系以10,000细胞/孔涂布在96孔平底板上，并过夜培养。为了用血清测试，使用前将样品于56℃热灭活45分钟。第二天在独立的96孔平底板上，将25μl适当稀释的假病毒悬浮液一式三份与25μl系列稀释的抗体样品混合(这使得抗体终浓度为200ug/ml，或对于纯化的抗体为50ug/ml或对于血浆样品为1∶5的稀释度)，并在37℃孵育1小时。孵育抗体/病毒混合物后，将培养基从预孵育的平板细胞中去除；向细胞中添加抗体混合物并于37℃在CO2温箱中孵育四小时。孵育后将混合物从细胞中去除并用新鲜培养基替代。根据制备商指示，感染后72小时通过向培养细胞中添加等体积(通常为50-100ul)的Bright-Glo荧光素酶测定系统试剂(普洛麦格Promega，Madison，WI)收集细胞，并通过使用Veritas微孔板化学发光检测仪(特纳生物系统公司：Turner Biosystems)测量荧光素酶活性(以RLU计)。使用下式将测试样品孔(细胞/抗体/病毒)、病毒对照(细胞/病毒)和细胞对照(仅细胞)孔的荧光素酶活性测量值平均来测定每个样品的抑制百分比：[(病毒对照孔-测试样品孔)/(病毒对照孔-细胞对照)×100]。
实施例2.酵母糖蛋白PST1与酿酒酵母突变体菌株中的2G12交叉反应， 所述突变体的pmr1基因破坏或者pmr1和mnn1基因均破坏
在酵母突变体菌株中筛选2G12交叉反应性蛋白质。酿酒酵母的糖基化途径已经被深入研究。酿酒酵母基因组中几乎所有ORF的缺失(Winzeler等，Science 285：901-906，1999和Giaever等，Nature，418：387-391，2002)以及各种突变体菌株的可获得性，已经提供了研究酵母中聚糖谱型改变的极好机会。首先使用2G12对不同的突变体筛选任一突变体中可能的交叉反应性糖蛋白。如图10所示，测试了来自五种单突变体的细胞裂解物和培养基，所述突变体中缺失了参与ER和高尔基体中糖加工的酶，包括Mns1、Och1、Mnn9、Mnn1和Pmr1。结果显示在Δpmr1突变体的细胞裂解物中，在约100和120kDa处检测到两个模糊条带，尽管信号比用作阳性对照的来自HIV-1gp120糖蛋白(298T表达的)的信号弱。
PMR1基因编码高亲和力的Ca2+/Mn2+P型ATPase，其对于Ca2+和Mn2+转运进入高尔基体是必需的，并参与Ca2+依赖型蛋白质分选和加工(Rudolph等，Cell.58：133-145，1989)。PMR1基因的缺失被认为引起一些糖蛋白直接从ER分泌，从而绕过高尔基体和其中所有的聚糖加工(Rudolph等，Cell.58：133-145，1989)。这会导致聚甘露糖外部链和N-连接的聚糖上末端α-1，3-连接的帽缺乏(Verostek等，Glycobiology 5(7)：671-81，1995)。来自YU-2菌株的含有酿酒酵母α交配因子信号序列的HIV-1gp120基因被用于转化Δpmr1酵母。如图11A所示，培养24小时后培养基中约100kDa的蛋白质在Western印迹中被2G12识别(本文称作YP100)。在平行的生长条件下培养3到9天后，在来自转化细胞的培养基中显示有2G12反应性的YP100，但是在来自未转化的pmr1突变细胞的培养基中不可检测(图11B)。在该实验中，未转化的和转化的细胞中显示有范围90到160kDa的若干条带，但是其它实验中未显示。这些结果提示gp120质粒转化引起该蛋白质表达或分泌的提高。
起初认为gp120转化的pmr1突变体中2G12反应性蛋白质(YP100)是gp120糖蛋白，归因于以下证据：2G12可检测的条带被gp120质粒的转化诱导(图2A、11A)、在gp120转化的酵母细胞中检测到该条带但在未转化的细胞中未检测到(图11B)、其显示96到100kDa糖蛋白的预期大小(图2A和11)、其显示～60kDa(与未糖基化的gp120相似的分子量)的预期的Endo H消化的蛋白质大小(图3)。其它研究对被诱导的YP100蛋白质确实是gp120提出了怀疑，因为使用抗gp120的抗体观察到了不一致的结果(数据未显示)。如图10所示，Δpmr1酵母细胞裂解物中～100kDa和120kDa处的两个模糊条带被2G12识别。这些结果表明2G12反应性的100kDa条带可能是表达的外源HIV-1gp120或者是未知的内源酵母蛋白质。
在Pmr1突变体中鉴定2G12交叉反应性蛋白质。为了确定被2G12识别的蛋白质是gp120或酵母糖蛋白，使用凝集素亲和层析(图2B和12)和凝胶过滤部分纯化YP100。使用纳米LC-MS/MS鉴定纯化物质中的蛋白质。六种肽被鉴定为属于未知的酵母蛋白质PST1(图13)，尽管一些其它肽与gp120和酵母蛋白质匹配。PST1蛋白质在其羧基端含有信号肽和GPI锚定点，表明其为细胞壁或膜蛋白质并能够被分泌。成熟蛋白质的400个氨基酸中存在15个潜在的N-连接的糖基化位点，占3.8％的密度，表明PST1被重度糖基化。
为了证实YP100事实上是PST1，在兔中产生抗合成肽的多克隆抗体，并使用抗原免疫亲和层析纯化。通过2D分离部分纯化的Yp100蛋白质，随后考马斯蓝染色并进行Western印迹分析。图14A显示分子量100kDa和等电点(PI)9-10的主要斑点。相同的斑点同样被2G12(图14B)和抗PST1多克隆抗体(图14C)识别。PST1具有计算为9.25的PI。所有这些结果吻合并提示：与2G12交叉反应性糖蛋白很可能是酵母糖蛋白PST1。这些结果构成了内源酵母蛋白质显示出对HIV特异性中和抗体2G12结合亲合力的首个证据。
为了进一步证实PST1的2G12特异性，用内切-L-N-乙酰葡糖胺糖苷酶H(Endo H)消化YP100，该酶特异性地切割高甘露糖型的聚糖。如图15通过考马斯蓝和抗PST1抗体染色所示，消化后PST1蛋白质的迁移从～100kDa变化为～60kDa(将第2和4道与第3和5道比较)。尽管Endo H消化后PST1蛋白质仍可被抗PST1识别，但是其不再被2G12识别(第7道)，这提示了PST1蛋白上的N聚糖是被HIV-1中和性MAb 2G12识别的表位。SDS-PAGE中Endo H消化后PST1的分子量(～60kDa)高于来自成熟蛋白质的氨基酸的计算的分子量(41kDa)。这可归因于O-连接的糖基化，因为PST含有潜在的O-连接的糖基化位点(图33)。这些结果进一步证实了图2和11中所示的2G12反应性蛋白质事实上是具有未知功能的酵母糖蛋白PST1。该蛋白质至少被外源基因HIV-1gp120Env的转化诱导。
双突变体的产生以及双突变体中PST1的表征。gp120上2G12的结合位点被鉴定为在至少三个N-连接的聚糖簇上发现的末端α1，2连接的甘露糖残基。酵母中的Δpmr1突变被认为绕过高尔基体，从而仅在酵母蛋白质上留下Man8聚糖。然而，其它证据提示该突变可能仅绕过早期高尔基区室，或引起的Ca++变化影响见于高尔基体的酶的效力。考虑到这个，用于高尔基体中2G12结合的最弱的糖基化酶之一将是Mnn1p，该酶负责为所有α1，2残基加上末端α1，3连接的甘露糖帽(Nakajima等，Proc NatAcad Sci USA 72：3912-3916，1975)。为了阻止PST1的这类加帽，创建了酵母双突变体菌株Δmnn1Δpmr1。将MNN1和PMR1基因中ORF敲除的酵母缺失菌株交配并形成孢子，以生产Δmnn1Δpmr1单倍体。进行菌落PCR，选择和证实Δmnn1和Δpmr1表型(数据未显示)。验证每个基因缺失的四个独特引物证实每种ORF完全缺失并被替换为KanMX4模块。
使用Western印迹用2G12筛选五个双突变体菌株(Δmnn1Δpmr1)。如所预期的，在所有五个突变体菌株(图16)中均检测到先前实验(见图10)中看到的～100kDa条带。事实上似乎存在信号的增强，这很可能归因于末端α1，3-Man帽的丢失和蛋白质上更多α1，2-Man的暴露。该假说被图17和18中所示的以下实验研究证实。
为了分析参与糖基化途径的基因缺失的作用，研究了该双突变体与其它酵母单突变体中PST1蛋白质大小的变化。使用Western印迹以抗PST1多克隆抗体分析来自不同菌株的细胞裂解物(图17A，上图)和培养基(图17B，下图)。仅在Δmnn1Δpmr1双突变体的细胞裂解物中检测到PST1。培养基显示野生型菌株中在＞200kDa处存在超糖基化的PST1。Och1突变体中PST1显示到约105kDa处的显著移行，其与pmr1单突变体在类似大小处移行。这些结果提示像och1突变体一样，pmr1突变体中PST1上的高甘露糖外部链没有添加。双突变体中的PST1比其在pmr1或och1中移行得更快，表明双突变体中Man8GlcNAc2核心上的末端α1，3-Man缺失。
与PST1相反，另一糖蛋白GP38存在于来自所有测试菌株的细胞裂解物中(图17A，下图)。该蛋白质的大小随着菌株突变而大幅地变化。野生型和Δmnn1显示大于200kDa的大型超糖基化的大小。Δoch1中显示～90kDa的条带，而Δpmr1中显示～110kDa的条带，提示这两个突变体中超糖基化分别完全丧失和截短。pmr1mnn1双突变体中GP38显示比pmr1单突变体中略微更小的大小，表明α1，3连接的甘露糖帽的丧失，这与这两种突变体中用PST1观察到的一致。另外，在来自野生型或来自mnn1突变体的培养基中均不能检测到GP38(图17B，下图)。令人感兴趣的是，其被pmr1或och1突变强烈诱导。这进一步指出Pmr1p与Och1p相似，在至少一些蛋白质的糖基化中起关键作用。然而，尽管因为缺失负责外部链起始的基因，Δoch1突变几乎确保超糖基化的丧失，但是Δpmr1似乎影响这类链延长的效率。这导致一些蛋白质如PST1完全丧失超糖基化，而其它蛋白质如Gp38超糖基化降低。Pmr1单突变体和pmr1mnn1双突变体中GP38的大小改变显示与这两种突变体中PST1相似的模式，表明在高尔基体中被添加的α1，3-Man的缺失。
为了证实mnn1p功能的丧失，通过Western印迹用各结构特异的抗体分析末端α1，3-Man和α1，2-Man的存在。图18下图显示pmr1单突变体和pmr1mnn1双突变体中的PST1表达水平是相似的。然而，抗α1，3-Man特异性多克隆抗体在pmr1单突变体中检测到一个条带，而该活性在双突变体中完全丧失(图18，上图)。相反，抗α1，2-Man MAb 2G12显示相反的结果。双突变体中2G12信号比单突变体中强得多(图18，中图)。在och1突变体中，抗α1，3-Man抗体检测到范围从70kDa到超过150kDa的强弥散条带(smear)，而抗α1，2-Man(2G12)检测不到，这表明具有α1，3-Man结构的多种糖蛋白被抗α1，3-Man抗体检测。部分纯化的Yp100显示对PST1抗体和2G12的反应性，但对抗α1，3-Man抗体无反应性。
2G12MAb与天然和变性的PST1糖蛋白均交叉反应。为了测试2G12是否识别天然形式PST1上的聚糖，进行免疫印迹。用2G12沉淀来自双突变体培养基中的蛋白质，随后与抗人IgG琼脂糖孵育。使用SDS样品缓冲液洗脱免疫复合物，并在4-20％SDS-PAGE上分离。然后用抗PST1多克隆抗体探测印迹。如图19所示，抗PST1在起始材料(第1道)、预清洗搅拌(beat)的流出液(第2道)和洗脱液(第6道)中检测到强信号，但是在上清液和洗涤液(第3-5道)中未检测到或检测到弱信号。这些结果表明2G12识别天然的PST1蛋白质，并与糖表位具有高亲和力，因为大部分MAb不沉淀蛋白质。
PST1基因和蛋白质的背景信息：
PST1p(原生质体分泌的蛋白质1)属于SPS2家族。该蛋白质通过糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚点附着在膜上，并通过再生原生质体分泌。PST1p据认为对细胞壁完整性非常重要，这是因为其经Rlm1p介导的细胞完整性途径激活而上调，并且经Fks1p介导的细胞壁损伤而上调。
基因和家族：其前体具有444个氨基酸，带有推定的19个氨基酸的信号肽，以及用于GPI锚点附着的25个氨基酸的C末端结构域。前体的分子量和等电点分别为45,776Da和9.91。其具有大量N-连接的糖基化位点，并富含丝氨酸和苏氨酸，它们很可能被重度O-糖基化。其成熟蛋白质具有400个氨基酸，预测的分子量为41,260Da，等电点为9.25。PST1含有15个潜在的N-连接的糖基化位点，占据400个氨基酸中的3.8％。总共有118个丝氨酸和苏氨酸，占据400个残基中的29.5％。这些丝氨酸和苏氨酸中一些是O-连接的糖基化位点(图33)。
PST1与Ecm33最为相似，在整个蛋白质水平上显示58％的同一性和79％的相似性。在酵母和真菌的不同物种中发现PST1和Ecm33的同源物，但是在任何其它物种(包括哺乳动物、植物、昆虫、蠕虫和鸟)中没有发现(图20)。它们具有类似或重叠到活性，但是它们功能上不是冗余的(Pardo M，Microbiology，150：4157-4170，2004)。
功能：PST1的分子功能是未知的。其参与细胞壁组建和生物发生。PST1和Ecm33均为GPI锚定的细胞壁蛋白质，并定位于细胞表面。
表达、诱导和分泌：PST1(YDR055W)最初发现于酿酒酵母的培养基中，所述酿酒酵母在再生条件下用蜗牛酶处理孵育以获得原生质体(Padro等，Yeast，15：459-472，1999)。葡聚糖合酶的一个亚基FKS1的破坏上调YDR055W RNA和蛋白质的表达水平(Terashima等，Mol Gen Genet，264：64-74，2000)。发现MAP激酶Mpk1/Slt2的活化或升高的温度导致环境胁迫，对酵母细胞壁的完整性构成危险，从而激活其miRNA的表达水平(Jung等，Mol.Microbiol.34(5)：1049-57，1999)。
总而言之，我们发现酵母糖蛋白与HIV-1广谱中和性MAb 2G12交叉反应，所述MAb 2G12结合由高甘露糖型聚糖上Manα1，2-Man组成的表位。该重度糖基化的蛋白质被鉴定为PST1，通过GPI锚点附着的细胞壁或膜蛋白。其为分泌的蛋白质，并在转化或缺失参与糖基化途径的基因后被上调。
实施例3.构建三突变体并鉴定Och1/Mnn1/Mnn4突变体中的2G12交叉 反应性糖蛋白
I.构建和表征酵母三突变体：
酵母交配和Δmnn1Δmnn4Δoch1三突变体的验证
为了探索使用酵母生产类似于见于gp120上的糖蛋白的可能性，必须突变糖基化途径。酿酒酵母特异的三种蛋白质对于创建N-连接的聚糖是至关重要的：OCH1p起始超甘露糖基化必需的第一个α1，6甘露糖残基(Lehle等，FEBS Lett.，370(1-2)：41-5，1995)，MNN1p负责α1，2残基的所有末端α1，3连接的甘露糖加帽(Nakajima等，Proc Nat Acad Sci USA，72：3912-3916，1975)，MNN4p是甘露糖基磷酸化的正调节物(Jigami等，Biochim BiophysActa，1426(2)：335-45，1999)。将这些基因ORF敲除的酵母缺失菌株交配并形成孢子，以生产Δmnn1Δmnn4和Δmnn1Δoch1单倍体。由于Δoch1表型所显示的温度敏感性(Lee等，Proc Natl Acad Sci，97(22)：12679-84，1999)，这些克隆的选择通过在YPD上于37℃的缓慢生长确定。进行菌落PCR用于Δmnn1和Δmnn4表型的选择和验证(数据未显示)。
将得到的双突变体单倍体交配并形成孢子，以产生单倍体三突变体Δmnn1Δmnn4Δoch1。Δmnn4和Δoch1表型的筛选如前进行，对Δoch1使用在YPD上37℃的缓慢生长，对Δmnn4和Δoch1使用PCR。图23A显示筛选四种克隆的菌落PCR样品，其中三个克隆显示既存在Δmnn4又存在Δoch1表型。
通过PCR测试六个推定的三突变体以证实Δmnn1Δmnn4Δoch1基因型。图21B显示这些克隆中两个克隆的结果：Δmnn1Δmnn4Δoch1-2-5和Δmnn1Δmnn4Δoch1-2-6。每个基因缺失的四种独特ORF特异性引物证实了每个基因被完全缺失。如果存在ORF，则内部ORF特异性引物(MNN1B、MNN4B、OCH1B、MNN1C、MNN4C和OCH1C)以及上游或下游引物(MNN1A、MNN4A、OCH1A、MNNlD、MNN4D和OCH1D)的组合得到PCR产物(即MNN1A+MNN1B、MNN1C+MNN1D等)。如图所示，两个克隆对于MNN1、MNN4和Och1的引物对均显示无PCR产物，证实了缺失的基因型。还以WT作为阳性对照测试了每种ORF特异性引物对(结果未显示)。
相反，如果ORF被替换为KanMX模块，则上游或下游引物与内部KanMX特异性引物(KanB和KanC)的组合得到PCR产物。如图23B所示，对每个基因缺失用两种引物对测试时，这些克隆均显示预期大小的PCR产物。
将单倍体三突变体中的两个：Δmnn1Δmnn4Δoch1-2-6和Δmnn1Δrnnn4Δoch1-2-5交配以形成二倍体三突变体Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP。该菌株可用于与野生型二倍体菌株INVSc1的进行任何进一步的比较研究，包括ELISA、免疫荧光和免疫接种。
通过ELISA测定三突变体α1，3-甘露糖的缺失和2G12交叉反应性的提高
Δmnn1Δmnn4Δoch1突变酵母菌株预期生产具有占多数的Man8GlcNAc2聚糖的糖蛋白。为了直接验证这些寡糖的存在，测试三突变体与两种甘露糖特异性抗体2G12和抗α1，3连接的甘露糖(抗α1，3)抗体的交叉反应性。通过用INVSc1全细胞免疫兔子制备对α1，3连接的甘露糖特异的免疫血清，并将血清吸附至Δmnn1细胞(Raschke等，J Biol Chem.248(13)：4660-6，1973和Ballon，J Biol Chem，245：1197-1203，1970)。得到的血清预期富含对末端α1，3连接的甘露糖残基特异的抗体，Mnn1p利用所述α1，3连接的甘露糖残基对α1，2连接的残基进行加帽。相反，已知2G12对见于核心N-连接的聚糖上的末端α1，2连接的甘露糖残基特异，虽说是这样的残基簇(Scanlan等，J Virol，76：7306-21，2002)。
使用WT(INVSc1)和Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP细胞的完整全酵母细胞包被ELISA平板，并使用2G12和α1，3特异性Ab进行探测。如图22A所示，抗α1，3抗体显示对野生型细胞的高亲和力，而三突变体显示低亲和力。纳入SF 162和野生型酵母甘露聚糖分别作为阴性和阳性对照。这些结果显示三突变体中缺失末端α1，3连接的甘露糖残基。抗α1，3对三突变体的任何残余的亲和力可归因于吸收过程不完全有效的事实；仍然存在的其它酵母特异性抗体能够与三突变体上暴露的表位(即细胞壁蛋白质和β-聚糖)结合。
图22B显示2G12能够与三突变体全细胞结合，而在与野生型的结合中没有交叉反应。观察到亲和力为10μg/ml到～1μg/ml。SF162和野生型酵母甘露聚糖也分别作为阳性和阴性对照而纳入。这些结果不仅证实三突变体中末端α1，3连接的甘露糖残基的缺失，而且表明了见于核心Man8聚糖上的α1，2连接的甘露糖的暴露。更重要的是，Δmnn1Δmnn4Δoch1酵母结合2G12的亲和力暗示了见于酵母细胞壁上的一种或多种蛋白质上2G12样表位的存在。
通过免疫荧光测定三突变体α1，3-甘露糖的缺失和2G12交叉反应性的提高
酵母中的末端α1，3甘露糖残基不仅加帽α1，2连接的甘露糖残基，而且是高度免疫原性的，使得它们区别于HIV gp120上发现的聚糖。为了进一步证实Δmnn1Δmnn4Δoch1菌株中α1，3连接的甘露糖残基的缺失，我们用抗α1，3-Man对完整的全细胞进行了免疫荧光。如图23(图A和C)所示，野生型细胞壁显示出对抗血清(其对α1，3连接的甘露糖残基特异)的强反应，而二倍体三突变体在相同的稀释度上显示无信号。作为对照，通过免疫荧光发现对酵母酵母聚糖(其含有常见于酵母细胞壁的成分即α-甘露聚糖和β-葡聚糖)特异的抗体对INVSc1和Δmnn1Δmnn4Δoch1全细胞给出相似的信号(图23，图B和图D)。这些结果表明对MNN1蛋白质特异的α1，3甘露糖基转移酶活性的丧失。这样的活性缺失几乎严格地在三突变体细胞壁中发现的所有糖蛋白上留下α1，2-连接的末端甘露糖残基。
为了证实三突变体上将α1，2-连接的末端甘露糖残基的暴露，随后用抗酵母聚糖通过免疫荧光来测试2G12的共定位。图24(图A、B、C)显示2G12与Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP细胞强烈结合，并与抗酵母聚糖共定位于细胞壁上。野生型酵母仅显示与抗酵母聚糖结合，未看到2G12信号(图D、E、F)。这些数据与全细胞ELISA的结果相似，说明三突变体中发现的糖蛋白含有暴露的α1，2-连接的甘露糖结构，所述结构具有在天然条件下与2G12结合的能力。值得一提的是三突变酵母细胞的大小显著大于野生型细胞的大小。
通过Western印迹测定三突变体糖蛋白上α1，3甘露糖的缺失和α1，2甘露糖的暴露
这些2G12反应性蛋白质在Δmnn1Δmnn4Δoch1酵母的细胞壁中出现，但是在野生型中缺失。然而，这并不直接意味着暴露的α1，2-连接的甘露糖残基是对2G12具有亲和力的主要原因。使用Western印迹对一组酵母糖基化突变体测试了2G12反应性蛋白质的存在。如图25左图所示，仅来自双突变体Δmnn1Δoch1和三突变体Δmnn1Δmnn4Δoch1的裂解物显示被2G12检测的特异性蛋白质条带。事实上，这些糖基化突变体均显示具有相同数量(～4-5)的2G12反应性蛋白质。这连同其它酵母突变体中信号的缺乏一起提示了Δmnn1Δmnn4Δoch1和Δmnn1Δoch1突变体中核心Man8的存在对于2G12对这些蛋白质的特异性起重要作用。另外，Δmnn1和Δmnn1Δmnn4突变体(其具有超糖基化的N-连接的聚糖，所述聚糖带有大量暴露的α1，2连接的甘露糖残基)中看到的信号的缺失进一步提示了Man8聚糖在2G12结合中的独特作用。
该组酵母糖基化突变体也用抗α1，3探测以验证α1，3连接的甘露糖帽的存在或缺失。图25右图显示抗α1，3-Man血清不能检测任何Δmnn1表型突变体(包括Δmnn1Δoch1和三突变体)上的蛋白质。这进一步表明了三突变体和Δmnn1Δoch1菌株以及Δmnn1和Δmnn1Δmnn4菌株上α1，2表位的暴露不被2G12识别。另一相同的Western印迹进行假孵育(不含第一抗体)并显示在任何菌株内无显著信号，从而排除了与山羊抗人第二抗体的相互作用(结果未显示)。
为了证实三突变体蛋白质对2G12的反应性归因于酵母菌株的基因型以及具有补偿功能的其它蛋白质不表达，分析了不同的三突变体克隆。从Δmnn1Δmnn4×Δmnn1Δoch1杂交获得了总计六个Δmnn1Δmnn4Δoch1酵母菌株。各菌株从在YPD+KCl平板上生长的独立单倍体菌落中挑取，并被证实含有三个突变(见图21的克隆2-5和2-6)。在图26中通过Western印迹，所有六个克隆显示2G12对相同蛋白质的反应性。这表明这些蛋白质对2G12的反应性很可能归因于三突变体的基因型，所述基因型导致突变的聚糖。
验证三突变体上的聚糖
作为对Δmnn1Δmnn4Δoch1糖蛋白上存在的寡糖的最终确认，对从全酵母细胞提取物中提取的N-连接的聚糖进行MALDI-TOF和NP-HPLC分型。在图26中，MALDI-TOF结果显示Man8GlcNAc2是三突变体提取物中的主要聚糖，具有极其少量的Man9GlcNAc2和Man5GlcNAc2。Man8聚糖的水平比Man9或Man5多20倍，从而Man8GlcNAc2代表了三突变体中多于90％的总聚糖。NP-HPLC结果显示与MALDI-TOF一致，从而Man8是存在于Δmnn1Δmnn4Δoch1细胞提取物中的主要N-连接的聚糖。
总而言之，这些结果证明了存在于Δmnn1Δmnn4Δoch1细胞中的聚糖类型主要是Man8GlcNAc2，与核心N-连接的聚糖中发现的类似。这不仅表明了高度免疫原性的末端α1，3连接的甘露糖残基的缺失，还表明了高甘露糖基化的外部链的缺失。所致的末端α1，2连接的甘露糖残基暴露很可能是2G12对该突变体中发现的特异性细胞壁蛋白质的亲和力的原因。
II.在酵母三突变体中鉴定和验证2G12交叉反应性糖蛋白
从酵母细胞中2D分离2G12反应性蛋白质。
Δmnn1Δmnn2Δoch1酵母中通过ELISA、免疫荧光和Western印迹显示对2G12结合的这些蛋白质是用于生产2G12样抗体的有希望的抗原。它们将代表在酵母中生产的具有模拟2G12表位能力的第一种这类抗原，其由见于N-连接的聚糖簇上的α1，2连接的甘露糖残基构象组成。因此，以这些蛋白质的部分纯化和鉴定继续该研究。由于细胞壁和质膜中糖蛋白的优势，使用差速离心从胞质蛋白质中大量分离膜结合的蛋白质。将对数期的Δmnn1Δmnn4Δoch1-DIP细胞裂解，并进行离心，以去除胞质、高尔基复合体和核内体蛋白质。将主要含液泡、核、ER和质膜蛋白质的沉淀物溶于1％Triton X-100中，以分离高度可溶的蛋白质。如图28A中观察到的，2G12结合蛋白质主要存在于膜级分中，小部分这些蛋白质被发现溶于Triton中。这些结果与全细胞ELISA和免疫荧光一致，因为这些蛋白质似乎主要是与细胞壁或质膜结合的。
除了与膜结合外，先前的结果还表明了这些2G12反应性蛋白质被高度糖基化。因此，使用刀豆球蛋白A(ConA)凝集素亲和层析纯化存在于Triton可溶性级分中的2G12反应性蛋白质。图28B显示这些蛋白质对ConA具有高亲和力，从而大部分蛋白质不能通过竞争性结合(使用0.5M甲基吡喃型甘露糖苷)被完全洗脱，而需要更苛刻的条件洗脱(1％SDS)。
从ConA洗脱物得到的蛋白质代表了存在于Δmnn1Δmnn4Δoch1细胞中的高度糖基化的膜蛋白质，包括与2G12结合的蛋白质。为了有效地分离这些蛋白质用于鉴定，对该级分使用2-D凝胶电泳。将两个独立的等分式样在pH4.0-7.0IPG胶条上跑胶，随后在4-12％梯度凝胶上进行SDS-PAGE分离。用Sypro宝石红蛋白对一块凝胶染色，将另块一凝胶转移至硝酸纤维素上使用2G12进行Western印迹。图28C显示通过Western印迹鉴定了两个大斑点，其对应于在Sypro宝石红蛋白染色的凝胶上显影的两个斑点(未显示)。将这些斑点切下进行胰蛋白酶消化和纳米LC/MS/MS鉴定。较高的2D斑点(～110kDa处)鉴定了来自三种酵母糖蛋白的肽：Gas5(5种肽)、ECM33(4种肽)和Gas1(2种肽)。较低的2D点(～95kDa处)鉴定了来自单个酵母糖蛋白YJL171c的7种肽。这些蛋白质代表了具有2G12反应性的所有或大部分的更高分子量的蛋白质。可能在该大小范围内存在更多未被鉴定的这类蛋白质，但是在该筛选中确定地存在未被鉴定的～35kDa的蛋白质(见图25和28)。该蛋白质的身份未知，但是目前正在研究中。
从培养物上清液中1-D分离2G12反应性蛋白质。
除了细胞裂解物外，发现酵母三突变体的培养上清液含有具2G12反应性的糖蛋白。通过Western印迹测试来自INVSc1和Δmnn1Δmnn4Δoch1细胞的培养基的2G12反应性。图29A显示三突变体中对2G12MAb具有强反应性的至少四个条带的表达，而野生型酵母上清液显示无信号。
培养基中这些2G12反应性蛋白质可能代表分泌的糖蛋白，或者代表天然或由于三突变体细胞壁结构变化而被释放进培养基中的细胞壁蛋白质。事实上，这四种蛋白质的大小似乎与细胞裂解物中存在的2G12反应性蛋白质类似(见图25A和28A)，主要信号见于90到115kDa以及～37kDa处的一个条带。这提示它们可能是存在于细胞裂解物中的相同蛋白质。无论如何，这些蛋白质可能代表模拟2G12表位的其它抗原的事实保证了它们的鉴定。来自Δmnn1Δmnn4Δoch1酵母的上清液被直接用在ConA柱上用于部分纯化糖蛋白。培养上清液中的蛋白质显示对ConA柱非常高的亲和力，且不能通过使用甲基吡喃型甘露糖苷的竞争性结合洗脱。因此，通过用SDS-PAGE上样缓冲液将ConA珠子煮沸来洗脱2G12反应性蛋白质(图29B)。使用大型(10cm×16cm)SDS-PAGE凝胶来分离SDS洗脱物。凝胶的考马斯蓝染色显示五个独立的蛋白质条带，将每个条带从凝胶上切下(数据未显示)。通过再上样至SDS-PAGE微型胶上并通过Western印迹以2G12探测来检测这些条带的2G12反应性。发现两个蛋白质条带(在110kDa处和95kDa处)与2G12结合(结果未显示)，并将其切下。用胰蛋白酶消化这些蛋白质，并通过纳米LC/MS/MS在质谱公司(Micromass)Q-Tof 2上分析，进行肽鉴定。110kDa条带仅在凝胶切片上鉴定了一个蛋白质[其中4个肽与ECM33匹配]，为通过2D在膜级分中110kDa处鉴定的相同蛋白质。95kDa条带仅在凝胶切片上鉴定了一个蛋白质，其中4个肽与酵母糖蛋白Gp38匹配。
这两种蛋白质可能仅代表了培养基中一半的2G12反应性蛋白质(见图29A)；事实上培养上清液中存在似乎是2G12反应性的四个条带。这两种未鉴定的蛋白质可以与细胞裂解物中存在的相同，或像GP38一样，可能代表具2G12结合能力的未知蛋白质。这些未鉴定的蛋白质仍然在研究中。
通过免疫沉淀验证2G12反应性蛋白质。
ECM33、Gas1、Gas5、GP38和YJL171c作为2G12反应性酵母糖蛋白的鉴定间接进行；使用LC/MS/MS鉴定凝胶电泳中通过Western印迹与2G12结合的条带。为了证实这些蛋白质对2G12的亲和力，用2G12免疫沉淀Δmnn1Δmnn4Δoch1细胞的细胞裂解物和培养基，并用抗这些蛋白质的抗体探测得到的Western印迹。图30A显示4种蛋白质Gas1、ECM33、YJL171c和GP38的鉴定，所述蛋白质通过2G12从培养上清液中沉淀。Gas1、ECM33和YJL171c通过2D分离在三突变体的细胞裂解物中鉴定，并在两种实验中均显示分别为～115kDa、～110kDa和～95kDa的相似大小。GP38最初在三突变体的培养上清液中鉴定，但是此处显示其也能够被2G12从细胞裂解物中沉淀。Gas5也用2G12以相对低的亲和力(数据未显示)被沉淀，这可能归因于与来自其它鉴定的蛋白质相比更少量和更低密度的N-连接的聚糖(图38)。
图30B显示用免疫印迹鉴定3种蛋白质PST1、ECM33和GP38。通过2G12将这些蛋白质从培养上清液中沉淀。也通过1D分离在三突变体的培养基中鉴定了ECM33和GP38，并且它们在两个实验中分别显示～110kDa和～95kDa的类似大小。令人感兴趣的是，PST1最初被鉴定为Δpmr1酵母培养上清液中的2G12结合蛋白质(实施例2)。与ECM33和GP38相比，能够观察到三突变体的上清液中PST1表达水平非常低(图30B，第1道)，这可以解释该蛋白质最初未在该突变体中鉴定到的原因。
这些结果证实了ECM33、Gas1、Gas5、GP38、PST1和YJL171c在该免疫沉淀实验的天然条件下结合2G12的能力。当用我们先前的实验分析时，显示这些酵母糖蛋白具有模拟HIV-1gp120糖蛋白上存在的2G12表位的能力，从而引起通过Western印迹、免疫沉淀、免疫荧光和ELISA检测时对该抗体的结合。
两种2G12反应性酵母蛋白质的糖蛋白大小移行
潜在模拟2G12表位的六种酵母糖蛋白的发现和鉴定保证了进一步研究这些蛋白质上的聚糖结构。就一组酵母糖基化突变体通过Western印迹对这些蛋白质中的两种即ECM33和GP38进行分析。ECM33是对细胞壁稳定性重要的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定的蛋白质(Pardo，Microbiology150：4157-70，2004)，而gp38是细胞壁相关的分泌性蛋白质(Destruelle，Mol.Cell.Biol. 14(4)：2740-54，1994)。图31(左图)显示结果。在细胞裂解物中，这些蛋白质均存在于所有的菌株中，虽然水平不同。另外，这些蛋白质在不含Δoch1基因型的任何菌株中被超甘露糖基化。事实上，Δoch1基因型对两种蛋白质均导致大于80kDa的急剧大小移行，GP38显示更显著的改变。这些菌株的更精密的分析显示Δoch1和Δoch1Δmnn1菌株中两种蛋白质均存在可察觉的大小移行，表明末端α1，3连接的甘露糖残基的缺失。Δmnn1Δmnn4Δoch1突变体中最终的蛋白质大小显示与2G12沉淀的蛋白质是相同的大小；对ECM33为～110kDa，对GP38为～95kDa(见图31)。在SDS-PAGE凝胶上未观察到Δmnn4突变体中磷酸甘露糖缺失引起的任何大小移行，提示改变过于轻微。
在培养上清液(图31，右图)中，带有OCH1基因的任何菌株中存在很少甚至无GP38或ECM33。似乎含Δoch1酵母突变体的脆弱细胞壁导致这些蛋白质释放进培养基中。然而，通过将存在于Δmnn1Δmnn4突变体中的～200kDa条带与存在于含Δoch1突变体中的110-115kDa条带比较，能够在ECM33中看到类似的大小移行。这再次显示了外部链超甘露糖基化的缺乏。同样在Δoch1和Δoch1Δmnn1突变体或三突变体之间也看到来自Δmnn1突变的类似大小移行。
总而言之，这些结果帮助我们观察到酵母菌株被突变时超甘露糖基化和α1，3连接的甘露糖帽的缺失。通过将这些结果与图25比较，除非聚糖结构中的这些改变均存在，否则不存在2G12反应性。因此，ECM33和GP38以及Gas1、Gas5、YJL171c和PST1结合2G12的能力取决于酵母三突变体和Δoch1Δmnn1双突变体中保留的核心Man8寡糖的存在。
在兔中生产α1，2甘露糖特异性抗血清，ELISA检测其与gp120交叉反应
我们从Δmnn1Δmnn4Δoch1细胞中鉴定了至少六种对HIV MAb 2G12显示交叉反应性的酵母糖蛋白PST1、ECM33、Gas1、Gas5、GP38和YJL171c。另外，通过全细胞ELISA和免疫荧光测定酵母三突变体的细胞壁能够与2G12交叉反应。因此，为了尝试诱导与2G12类似的抗体(从而它们对α1，2连接的末端甘露糖特异)，使用全细胞、热杀死的三突变体细胞免疫兔子。对来自第0、4、5和12周的血清样品测试HIV Env特异性总IgG抗体。如图32所示，对gp120特异的抗体水平显示从第0周到第5周显著提高，并随后在第12周降低。与第0周相比，来自第5周的血清中存在显著提高的gp120结合(P＜0.001)，而第12周的结合也显示显著的提高(P＜0.05)，尽管效价较低。
为进行比较，用全细胞、热杀死的WT细胞平行免疫兔子。得到的血清显示从第0周到第12周不存在gp120特异性抗体水平的显著提高(见图32)。通过比较来自WT和三突变体免疫的兔子的平行血样，我们再次看到与WT相比，三突变体中gp120特异性IgG显著提高，特别是在第5周(P＜0.001)。所有这些p值通过Student双尾t检验计算。总之，这些结果可以代表在动物体内生产抗体的第一个实例，所述抗体能够与gp120上α1，2连接的末端甘露糖残基交叉反应。
III.酵母三突变体中被2G12识别的糖蛋白中N-连接和O-连接的糖基化位点的生物信息学分析
图33-38显示PST1、ECM33、GP38、YJL171c、Gas1和Gas5中潜在N-连接和O-连接的糖基化位点的分析。下表2显示在酵母突变体中鉴定的2G12反应性糖蛋白的概述。鉴定的2G12交叉反应性糖蛋白存在若干值得注意的特征。它们均具有大量和高密度的N-连接的和/或O-连接的糖基化位点。其中PST1和ECM33是同一家族的成员，并具有大量和高密度的N-连接和O-连接的两种糖基化位点。GP38和YJL171c仅具有大量和高密度的N-连接的糖基化位点，而同一家族中的Gas1和Gas5具有大量和高密度的O-连接的糖基化位点和较低百分比的聚糖分子质量(约50％，与其它四种的60％相对)。
表2.酵母突变体中鉴定的2G12反应性糖蛋白概述
Figure A20068004332000921
下表3显示18个基因组中2G12交叉反应性糖蛋白的同源物。使用六种2G12反应性糖蛋白的蛋白质序列从国家生物技术信息中心(NCBI)的HomoloGene(同源基因)数据库(版本50.1)中搜索同源基因。HomoloGene是用于在若干个完整测序的真核基因组的注释基因中自动检测同源物的系统。目前，HomoloGene数据库含有来自18个物种的165,820个HomoloGene群。通过在NCBI主页上输入蛋白质参照序列(RefSeq)号获得目的HomoloGene。通过clustalw程序进行HomoloGene的多重比对。各基因的同源物得自HomoloGene数据库搜索并列于表中。在NCBI数据库中发现六个基因的光滑假丝酵母同源物，但是光滑假丝酵母的基因组未包括在HomoloGene数据库中。
表3.18个基因组中2G12反应性糖蛋白的同源物
Figure A20068004332000931
Figure A20068004332000941
实施例4.在Och1/Mnn1/Mnn4三突变体中生产和表征带有均质Man8型 聚糖的HIV-1gp120糖蛋白。
与哺乳动物表达体系不同，酿酒酵母中生产的糖蛋白上的糖仅含有构建于核心GlcNAc2糖上的甘露糖残基。全长gp120蛋白已经在酿酒酵母中成功表达，尽管它们显示被超糖基化。为了在酵母中产生严格带有Man8GlcNAc2的gp120蛋白，必须突变糖基化途径。三种蛋白质负责产生对酿酒酵母特异的N-连接的聚糖：OCH1p起始超甘露糖基化必须的第一个α1，6甘露糖残基(Lehle等，FEBS Lett.，370(l-2)：41-5，1995)，MNN1p负责为所有α1，2残基加上末端α1，3连接的甘露糖帽(Nakajima等，Proc NatAcad Sci USA，3912-3916，1975)，而MNN4p是甘露糖基磷酸化的正调节物(Jigami等，Biochim Biophys Acta，1426(2)：335-45，1999)。通过缺失酿酒酵母中的这三个基因，产生了用于生产严格带有Man8寡糖的gp120的菌株。
为了让gp120在ER中有效地糖基化并分泌到培养基中，我们首先将酿酒酵母α交配因子(MFα)的信号序列克隆进pYES2/CT载体(英骏：Invitrogen)中，所述载体含有用于在甘露糖诱导后高水平表达重组蛋白质的GAL1启动子。然后将来自JR-FL和YU2菌株的HIV-1gp120基因(ARRRP)PCR克隆进pYES2/CT-α质粒。使用快速醋酸锂转化方案将得到的gp120表达质粒转化进单倍体酵母菌株Δmnn1Δmnn4Δoch1中。如图40的图A中所看到的，通过菌落PCR验证用pYU2-gp120或pJRFL-gp120转化的四个独立的Δmnn1Δmnn4Δoch1-2-5克隆含有相应的质粒。JRFL-gp120转化株显示预期的724kB的PCR产物大小，而YU2-gp120转化株显示1697kB处的产物。
通过将细胞转移至含有半乳糖的培养基上诱导含pYU2-gp120和pJRFL-gp120的这些酵母转化株表达蛋白质。通过Western印迹用抗gp120-IIIB(怀罗斯塔特有限公司：Virostat Inc.)和抗gp120-YU2检测培养基中gp120糖蛋白的诱导和分泌。发现Δmnn1Δmnn4Δoch1酵母转化株通过在30℃生长6到9天分泌最大量的gp120(图39，图B和C)。如Western印迹所示，这些gp120蛋白移动至假设其主要含有Man8寡糖而推定的分子量处(对JR-FL和YU-2gp120分别为96.4kDa和99.6kDa)。
除了对抗gp120抗体具有反应性以外，这些表达的gp120蛋白也显示对2G12的反应性(图40)。两种Δmnn1Δmnn4Δoch1转化株(带有pYU2-gp120和pJR-FL-gp120)与未转化的菌株平行生长，向未转化株的培养基中添加尿嘧啶。由于Δmnn1Δmnn4Δoch1细胞培养上清液中其它2G12反应性蛋白质(其中一种具有～110kDa的分子量)的存在，gp120的诱导在用2G12检测时只能间接看到。未转化的酵母显示从3-9天起稳定的基底表达水平，强烈提示～110kDa处的基底水平蛋白质(ECM33)在该时间段中不增加。相反，两种gp120转化的酵母从3-9天起均显示110kDa蛋白质表达显著提高，提示2G12抗体所识别的gp120糖蛋白的诱导。
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Claims (65)

1.组合物，用于对受试者激发对包含抗体2G12识别表位的蛋白质特异的抗体，所述组合物包含分离的糖基化多肽和可药用的赋形剂，所述多肽含有至少两个抗体2G12所识别的N-连接的高甘露糖寡糖，其中糖基化多肽上大于50％的N-连接的聚糖是高甘露糖寡糖，且其中高甘露糖寡糖为Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其组合。
2.权利要求1的组合物，其中多肽含有至少三个N-连接的高甘露糖寡糖。
3.权利要求1的组合物，其中多肽含有gp120或其片段的氨基酸序列。
4.权利要求1的组合物，其中多肽含有真菌糖蛋白或其片段的氨基酸序列。
5.权利要求1的组合物，其中多肽含有酵母糖蛋白或其片段的氨基酸序列。
6.权利要求5的组合物，其中酵母为酿酒酵母。
7.权利要求6的组合物，其中酵母糖蛋白选自PST1、ECM33、Gas1、Gas5、GP38和YJL171c。
8.权利要求5的组合物，其中酵母为巴斯德毕赤酵母。
9.权利要求5的组合物，其中酵母为白色念珠菌。
10.权利要求4的组合物，其中多肽含有真菌糖蛋白的氨基酸序列，所述真菌糖蛋白为酿酒酵母PST1、ECM33、Gas1、Gas5、GP38或YJL171c的同源物。
11.权利要求1的组合物，其中多肽上至少90％的N-连接的聚糖为Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其组合。
12.权利要求1的组合物，其中多肽上至少90％的N-连接的聚糖为Man8GlcNAc2。
13.权利要求1的组合物，其中可药用的赋形剂为佐剂。
14.用于对受试者激发对具抗体2G12识别表位的蛋白质特异的抗体的组合物，所述组合物包含分离自突变真菌的糖基化多肽和可药用的赋形剂，所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母pmr1基因或者破坏了的酿酒酵母pmr1基因同源物基因，其中所述糖基化多肽被抗体2G12识别。
15.权利要求14的组合物，其中突变真菌为突变酵母。
16.权利要求15的组合物，其中突变酵母为具有破坏了的pmr1基因的酿酒酵母。
17.权利要求16的组合物，其中糖基化多肽含有PST1或其片段的氨基酸序列。
18.用于对受试者激发对具抗体2G12识别表位的蛋白质特异的抗体的组合物，所述组合物包含分离自突变真菌的糖基化多肽和可药用的赋形剂，所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母pmr1和mnn1基因或者破坏了的酿酒酵母pmr1和mnn1基因同源物基因，其中糖基化多肽被抗体2G12识别。
19.权利要求18的组合物，其中突变真菌为突变酵母。
20.权利要求19的组合物，其中突变酵母为具有破坏了的pmr1和mnn1基因的酿酒酵母。
21.权利要求20的组合物，其中糖基化多肽含有PST1或其片段的氨基酸序列。
22.用于对受试者激发对具抗体2G12识别表位的蛋白质特异的抗体的组合物，所述组合物包含分离自突变真菌的糖基化多肽和可药用的赋形剂，所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母och1和mnn1基因，或och1、mnn1和mnn4基因或者破坏了的酿酒酵母och1和mnn1基因，或och1、mnn1和mnn4基因的同源物基因，其中糖基化多肽被抗体2G12识别。
23.用于制备组合物的方法，所述组合物用于对受试者激发对包含抗体2G12识别表位的蛋白质特异的抗体，所述方法包括：
a)发酵突变真菌，其中所述突变真菌被突变以产生糖基化多肽，其中所述糖基化多肽含有至少两个抗体2G12识别的N-连接的高甘露糖寡糖和可药用的赋形剂，其中糖基化多肽上大于50％的N-连接的聚糖是高甘露糖寡糖，且其中所述高甘露糖寡糖是Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其组合；
b)从突变真菌细胞裂解物或上清液中纯化糖基化多肽；和
c)将糖基化多肽与可药用赋形剂配制。
24.权利要求23的方法，其中突变真菌为突变酵母。
25.权利要求24的方法，其中突变酵母为具有破坏了的och1、mnn1和mnn4基因的酿酒酵母。
26.权利要求24的方法，其中突变酵母为具有破坏了的pmr1和mnn1基因的酿酒酵母。
27.权利要求24的方法，其中突变酵母为具有破坏了的och1和mnn1基因的酿酒酵母。
28.权利要求24的方法，其中突变酵母为具有破坏了的och1基因的巴斯德毕赤酵母。
29.权利要求24的方法，其中突变酵母为具有破坏了的och1基因的白色念珠菌。
30.权利要求23的方法，其中糖基化多肽为酵母糖蛋白或其片段。
31.权利要求30的方法，其中酵母糖蛋白选自酿酒酵母的PST1、ECM33、Gas1、Gas5、GP38和YJL171c。
32.权利要求30的方法，其中酵母糖蛋白是酿酒酵母PST1、ECM33、Gas1、Gas5、GP38或YJL171c的同源物。
33.权利要求23的方法，其中突变真菌在步骤a)之前已经被载体转化，所述载体含有编码糖基化多肽的核苷酸序列。
34.权利要求33的方法，其中核苷酸序列编码gp120或其片段。
35.包含多核苷酸的突变真菌细胞，所述多核苷酸含有编码含至少两个N-糖基化位点的gp120或其片段的核苷酸序列，其中突变酵母细胞能够生产gp120或其片段，所述gp120或其片段包含至少两个能被抗体2G12识别的N-连接的高甘露糖寡糖，其中所述高甘露糖寡糖为Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其组合。
36.权利要求35的突变真菌细胞，其中突变真菌为具有破坏了的och1、mnn1和mnn4基因的酿酒酵母。
37.权利要求35的突变真菌细胞，其中突变真菌为具有破坏了的pmr1和mnn1基因的酿酒酵母。
38.权利要求35的突变真菌细胞，其中突变真菌为具有破坏了的och1和mnn1基因的酿酒酵母。
39.权利要求35的突变真菌细胞，其中突变真菌为具有破坏了的och1的巴斯德毕赤酵母。
40.生产受试者对包含抗体2G12识别表位的蛋白质特异的抗体的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的权利要求1的组合物。
41.生产受试者对包含抗体2G12识别表位的蛋白质特异的抗体的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的权利要求14的组合物。
42.生产受试者对包含抗体2G12识别表位的蛋白质特异的抗体的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的权利要求18的组合物。
43.生产受试者对包含抗体2G12识别表位的蛋白质特异的抗体的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的权利要求22的组合物。
44.对受试者诱导抗病原体的中和抗体的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的权利要求1的组合物。
45.权利要求44的方法，其中病原体为HIV。
46.对受试者诱导抗病原体的中和抗体的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的权利要求14的组合物。
47.权利要求46的方法，其中病原体为HIV。
48.对受试者诱导抗病原体的中和抗体的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的权利要求18的组合物。
49.权利要求48的方法，其中病原体为HIV。
50.对受试者诱导抗病原体的中和抗体的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的权利要求22的组合物。
51.权利要求50的方法，其中病原体为HIV。
52.对受试者预防或治疗病原体诱导的疾病的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的权利要求1的组合物。
53.权利要求52的方法，其中病原体为HIV。
54.对受试者预防或治疗病原体诱导的疾病的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的权利要求14的组合物。
55.权利要求54的方法，其中病原体为HIV。
56.对受试者预防或治疗病原体诱导的疾病的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的权利要求18的组合物。
57.权利要求56的方法，其中病原体为HIV。
58.对受试者预防或治疗病原体诱导的疾病的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的权利要求22的组合物。
59.权利要求58的方法，其中病原体为HIV。
60.用于鉴定与N-连接的高甘露糖寡糖特异性结合的抗体的方法，所述方法包括检测抗体与糖基化多肽和可药用赋形剂的结合，所述糖基化多肽含有被抗体2G12识别的至少两个N-连接的高甘露糖寡糖，其中糖基化多肽上大于50％的N-连接的聚糖是高甘露糖寡糖，且其中高甘露糖寡糖是Man9GlcNAc2、Man8GlcNAc2或其组合。
61.权利要求60的方法，其中抗体存在于HIV感染受试者的血清中。
62.权利要求60的方法，其中糖基化多肽存在于突变酵母细胞裂解物中。
63.用于鉴定与N-连接的高甘露糖寡糖特异性结合的抗体的方法，所述方法包括检测抗体与突变真菌中产生的糖蛋白的结合，所述突变真菌具有破坏了的酿酒酵母och1和mnn1，或och1、mnn1和mnn4基因或者破坏了的酿酒酵母och1和mnn1，或och1、mnn1和mnn4基因的同源物基因，其中糖基化多肽被抗体2G12识别。
64.权利要求63的方法，其中抗体存在于HIV感染受试者的血清中。
65.组合物，包含突变酵母全细胞和可药用的赋形剂，其中突变酵母具有破坏了的酿酒酵母pmr1和mnn1基因，och1和mnn1基因，或och1、mnn1和mnn4基因，或者破坏了的酿酒酵母pmr1和mnn1基因，och1和mnn1基因，或och1、mnn1和mnn4基因的同源物基因。
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