WO2001030814A1 - Complexe deglycosyle env/cd4 et son utilisation pour la vaccination contre le vih - Google Patents

Complexe deglycosyle env/cd4 et son utilisation pour la vaccination contre le vih Download PDF

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WO2001030814A1
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deglycosylated
envelope glycoprotein
hiv
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PCT/FR2000/002940
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Florence Boudet
Michel Chevalier
Jean Dubayle
Raphaëlle EL HABIB
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Aventis Pasteur
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    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to a new antigen and its use in an HIV vaccine and relates more particularly to a deglycosylated protein complex capable of inducing antibodies neutralizing primary isolates of HIV.
  • the HIV envelope glycoprotein which is required to make the virus infectious is the target of neutralizing antibodies. These characteristics have made the latter a subject of intense investigation.
  • the HIV envelope glycoprotein has been shown to be an oligomer composed of an extracellular domain, gp 120, and a transmembrane domain, gp 41, (Gallaher et al AIDS Research & Human Retroviruses. 11 (2 ): 191-202, 1995).
  • the gp120 subunit responsible for binding the virion to CD4 receptors and co-receptors present on the host cell, is a highly glycosylated protein. The first structural studies of gp120 showed that half of its molecular weight corresponded to the glycan residues attached to the molecule.
  • gp120 has approximately 24 potential N-glycosylation sites distributed between the variable and constant domains.
  • the gp41 subunit which induces fusion of cell and viral membranes is a less protein highly glycosylated. It is estimated that it has between 4 and 7 potential N-glycosylation sites.
  • the antibodies induced by these different forms of deglycosylated gp160 were tested to determine their reactivity against a panel of synthetic peptides.
  • the results described show that, compared to the native anti-gp160 serum, the reactivity towards the majority of the peptides remains unchanged, or can in certain cases decrease or increase. According to this work, only the antibodies derived from antisera produced against native gp160 or desialylated gp160 neutralize the infectious power of HIV-1 (TCLA) and inhibit the formation of syncytium between cells infected with HIV-1 and cells CD4 + non-infected.
  • TCLA infectious power of HIV-1
  • WO93 / 17705 The obtaining of partially deglycosylated mutant gp160 or gp120 glycoproteins in their C-terminal part and their use for inducing a protective immune response are described in WO93 / 17705.
  • WO98 / 41536 referring to W O93 / 17705, describes for its part that the selective elimination of N-glycan residues located in the N-terminal part of the gp120 protein of HIV-1 or VIS leads to a mutant glycoprotein capable of '' induce an improved protective humoral response.
  • Neutralizing antibody responses as described in the prior art mentioned above, have the disadvantage of either being specific for a given serotype, or of being incapable of leading to the neutralization of primary HIV isolates. Due to the very large genetic variability of the AIDS virus, such immune responses are therefore of little or no interest from a vaccine point of view.
  • the present invention aims to overcome this need and therefore relates to a new deglycosylated antigen capable of inducing antibodies neutralizing the primary HIV isolates and its use in an HIV vaccine.
  • the present invention therefore relates to a deglycosylated protein complex composed of the envelope glycoprotein of HIV -1 and of CD4 capable of being obtained by a process comprising the steps of:
  • the envelope glycoprotein is a gp160MN / LAI.
  • the gp160MN / LAI is in dimeric form.
  • CD4 is a soluble CD4.
  • the molar ratio (mole of envelope glycoprotein monomer / mole of soluble CD4) is 1/1.
  • the degree of deglycosylation expressed in terms of reduction in the molecular mass (MM) of the glycoprotein of step (a) represents 1 to 50% (a) and more advantageously 20% (a) such as determined by SDS PAGE gel electrophoresis.
  • the deglycosylation step is carried out by using an enzyme, or a mixture of enzymes, selected from the group consisting of: peptide N-glycosidase F, endoglycosidase F, and sialidase .
  • the deglycosylation step is carried out by using peptide N-glycosidase (PNGase F) or sialidase.
  • the present invention relates to a composition comprising a mixture of deglycosylated complexes.
  • the present invention relates to an antibody directed against the deglycosylated complex, this antibody preferably being monoclonal.
  • the subject of the present invention is an HIV vaccine comprising:
  • the vaccine according to the invention is used to induce antibodies neutralizing HIV in a human subject for therapeutic or prophylactic purposes.
  • the vaccine according to the present invention is used to induce a protective cellular response (CTL) in a human subject for therapeutic or prophylactic purposes.
  • CTL protective cellular response
  • envelope glycoprotein is meant in the context of the present invention a glycosylated protein gp160, gp 120 or gp 140.
  • the envelope protein can be in monomeric, dimeric or multimeric form, it will preferably be in dimeric form.
  • This envelope protein may or may not be a recombinant protein and may also consist of a hybrid protein; the hybrid term being used here in its classic acceptance, namely a protein comprising sequences originating from envelope proteins of different strains of virus adapted in the laboratory or from primary isolates of HIV.
  • Envelope proteins whose amino acid sequence differs from that of the native protein by mutation (s), deletion (s), insertion (s), or substitution (s) of amino acid (s) are also included in the above definition provided that (1) these modifications do not substantially abolish the binding of the coat protein to CD4, ie at least 75% by mass, preferably at least 80% by mass of the CD4 present is associated with the envelope glycoprotein, determined by measurement using a Biacore TM (see the following article for the technical aspect of the measurements: VanCott et al. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 7 (11): 1103-15, 1994 Nov), and (2) that the envelope protein / CD4 complex thus formed leads to the formation of antibodies capable of neutralizing primary isolates of HIV.
  • glycoprotein in the context of the present invention is used in a substantially purified isolated form.
  • isolated and substantially purified protein is meant a protein having a purity level of at least 75%, preferably at least 80%, as determined by the electrophoresis method on acrylamide gel (SDS PAGE) (LAEMMLI UK 1970. Nature 27: 680-685.) and analysis by densitometry.
  • CD4 is meant in the context of the present invention, a CD4 protein comprising all or only part of the CD4 receptor sequence, anchored or not anchored in a lipid membrane or a membrane fragment. This CD4 protein can also correspond to a recombinant protein.
  • CD4 proteins whose amino acid sequence differs from that of the native protein by mutation (s), deletion (s), insertion (s), or substitution (s) of amino acid (s) are also included in the above definition provided (1) that these modifications do not substantially abolish the binding of CD4 to the envelope protein as defined above, ie at least 75% by mass, preferably at least 80% by mass of the CD4 present is associated with the envelope glycoprotein, and (2) that the envelope protein / CD4 complex thus formed leads to the formation of antibodies capable of neutralizing primary isolates of HIV. These two characteristics can easily be determined using the tests provided in the present application.
  • CD4 proteins which can be used in the context of the present invention, the CD4 protein anchored in a lipid membrane, or the soluble CD4 sold by Intracel under the reference 13101. It is preferably used in the context of the present invention a soluble CD4.
  • the CD4 protein in the context of the present invention is used in a substantially purified isolated form.
  • the expression isolated and substantially purified protein is understood to mean a protein having a purity level of at least 75%, preferably 80%, as determined by SDS PAGE and densitometry.
  • envelope glycoprotein / CD4 complex means a complex formed by the non-covalent association between an envelope glycoprotein of HIV as defined above and of CD4 as defined above.
  • the envelope glycoprotein and CD4 are present in the protein complex as defined above according to a molar ratio (mole of envelope glycoprotein monomer / mole of CD4) ranging from 1 / 0.2 to 1/2 and preferably in a molar ratio of 1/1.
  • a molar ratio mole of envelope glycoprotein monomer / mole of CD4
  • the above ratio should be understood as the mole ratio of monomers of gp120 / moles of CD4.
  • deglycosylation is understood to mean, within the framework of the present invention, the partial or total elimination, by enzymatic route, of the glycans present on the glycosylated protein, preferably the deglycosylation is an N-deglycosylation.
  • Deglycosylation can for example be carried out by the action of one or more of the following enzymes: sialidases, peptide N-glycosidase F, mannosidases, O-glycosidases, endoglycosidases F, H or D, N-glycosidase A (PNGase A), fucosidases , galactosidases, N-acetyl-beta-D-glucosaminidase.
  • the deglycosylation of the complex is carried out by using an enzyme or a mixture of enzymes selected from the group consisting of: N-glycosidase F peptide, endoglycosydase F and sialidase, preferably by using PNGase F or sialidase.
  • the parameters of the glycosylation step, the enzyme / substrate ratio, the temperature and the incubation time of the substrate with the enzyme are selected so that deglycosylation leads to a decrease in the molecular mass (MM) of the glycoprotein.
  • step (a) represents 1 to 50% and more advantageously 20% as determined by SDS PAGE. More advantageously, the parameters which cause the maximum decrease in the molecular weight of the glycoprotein / CD4 complex are selected, as determined by electrophoresis on acrylamide gel.
  • the enzyme / substrate ratio varies depending on the specific activity of the enzyme.
  • the appropriate parameters for the deglycosylation of a gp160MN / LAI / CD4 complex soluble in sialidase having an activity of 30 units are 1/116 (weight / weight) with incubation of the complex for 3 hours at 37 ° C.
  • the appropriate operating conditions for the different enzymes are easily deducible by those skilled in the art from the teaching provided here and from the information contained in the technical sheets accompanying the enzymes.
  • Deglycosylation is carried out by addition to the preparation containing the envelope glycoprotein of the enzyme in solution in a buffer suitable for its enzymatic activity. The choice of tampon is within the skill of the art and is generally indicated by the supplier.
  • the reaction is carried out by mixing the two proteins, ie CD4 and envelope glycoprotein at room temperature and with stirring.
  • the nature of the buffer and the parameters of the deglycosylation reaction can be readily determined by those skilled in the art from the teaching provided herein. This deglycosylation step is described in more detail in the examples which follow.
  • the term “deglycosylated complex” therefore means a glycosyl complex as defined above which, after its formation (ie after the non-covalent association of the envelope glycoprotein and CD4 subunits ) is subjected to enzymatic deglycosylation as defined above. Once deglycosylated, the envelope glycoprotein / CD4 complexes in solution tend to aggregate, thus forming multimeric structures.
  • the present invention also relates to a composition comprising a mixture of at least two deglycosylated complexes as defined above.
  • these complexes can be differentiated for example by the nature of the constitutive envelope glycoprotein (for example the glycoproteins originating from different primary strains or isolates, some of which may also correspond to hybrid proteins) or by the degree or nature of deglycosylation or by the nature of CD4. Any conceivable mixture comprising one or more complexes is included within the scope of the present invention.
  • the present invention also relates to the antibodies directed against the deglycosylated complexes as described above. The preparation of such antibodies is carried out by conventional techniques for obtaining antibodies. polyclonal and monoclonal (Kohler G et al European Journal of Immunology. 6 (7): 511-9, 1976 Jul).
  • the present invention also relates to vaccines useful for therapeutic and prophylactic purposes.
  • the vaccines according to the present invention comprise a deglycosylated protein complex as defined above or a mixture of deglycosylated complexes, a pharmaceutically acceptable carrier or diluent and optionally an adjuvant.
  • the vaccine according to the present invention can therefore contain a single type of deglycosylated protein complex or a mixture of various types of deglycosylated complexes.
  • these complexes can be differentiated for example by the nature of the constitutive envelope glycoprotein (for example the glycoproteins originating from different primary strains or isolates, some of which may also correspond to hybrid proteins) or by the degree or nature of deglycosylation or by the nature of CD4. Any conceivable mixture comprising one or more complexes is included within the scope of the present invention.
  • the present invention includes anti-deglycosylated protein complex antibodies.
  • any mixture of antibodies, monoclonal or polyclonal, directed against different parts of the same deglycosylated complex or against different deglycosylated complexes is part of the present invention.
  • the amount of deglycosylated protein complex in the vaccine according to the present invention depends on many parameters as will be understood by those skilled in the art, such as the nature of the complex, the route of administration and the condition of the person to be treated ( weight, age, clinical condition, etc.).
  • An appropriate amount is an amount such that a humoral or cellular immune response capable of neutralizing primary HIV isolates is induced after administration of the latter.
  • the vaccines according to the present invention may also contain an adjuvant. Any pharmaceutically acceptable adjuvant or mixture of adjuvants may be used for this purpose. Mention may be made, by way of example, of the salts aluminum such as aluminum hydroxide or aluminum phosphate. Conventional auxiliary agents such as wetting agents, fillers, emulsifiers, buffers etc. can also be added to the vaccine according to the invention.
  • the vaccines according to the present invention can be prepared by any conventional method known to those skilled in the art.
  • the antigens are mixed with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent, such as water or phosphate-buffered saline.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or diluent such as water or phosphate-buffered saline.
  • the carrier or diluent will be selected according to the dosage form chosen, the mode and the route of administration as well as pharmaceutical practice.
  • the appropriate carriers or diluents as well as the pharmaceutical formulation requirements are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, which represents a reference work in this field.
  • the vaccines mentioned above can be administered by any conventional route, usually used in the field of vaccines, such as the parenteral route (intravenous, intramuscular, subcutaneous, etc.).
  • the administration can be carried out by injection. a single dose or repeated doses, for example OJ, 1 month, 3 months, 6 months and 12 months.
  • OJ injections, 1 month and 3 months, should preferably be used.
  • the present invention also intends to cover the deglycosylated complex as defined above and the vaccine containing such a complex or mixture of deglycosylated complexes for their use for inducing antibodies neutralizing primary isolates of HIV as well as for their use for inducing a CTL response. against HIV.
  • FIG. 1 represents the average values of the assay of the specific immunoglobulins of gp160 MN / LAI-2 induced in the guinea pig by the deglycosylated complexes according to the invention.
  • Example 1 Preparation of the gp160MN / LAI glycoprotein
  • the gp160MN / LAI glycoprotein is a soluble hybrid glycoprotein in which the gp120 subunit derives from HIV-1 MN and the gp41 subunit derives from the LAI isolate.
  • the DNA sequences corresponding to these two components are fused using a SmaI restriction site which does not modify the amino acid sequence of gp120 or that of gp41. The preparation of this protein is described below.
  • the sequence coding for gp120MN is amplified by PCR from SupT1 cells infected with HIV-MN, using oligonucleotides introducing the restriction sites Sphl and Smal respectively immediately downstream of the sequence coding for the leader peptide and upstream of the cleavage sites located between the gp120 and the gp41.
  • the sequence coding for the gp41 subunit is produced as follows: the complete sequence coding for the env protein of HIV1-LAI is placed under the control of the promoter pH5R of the vaccinia virus. Several modifications are introduced in this coding region. A Sphl restriction site is created immediately downstream of the sequence coding for the leader peptide, without alteration of the amino acid sequence.
  • a Smal restriction site is created immediately upstream of the sequence coding for the cleavage sites located between gp120 and gp41, without alteration of the amino acid sequence.
  • the two cleavage sites in position 507-516 (amino acids numbered according to the method of Myers et al, described in Human retroviruses and AIDS (1994) Los Alamos National Lab. (USA)) were mutated (ie the original sequence KRR ... REKR has been transferred to QNH ... QEHN).
  • the sequence coding for the hydrophobic transmembrane peptide IFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIV ie amino acids 689-710 according to Myers et al supra) has been deleted.
  • the second codon E of the sequence coding for PEGIEE has been replaced by a stop codon (ie amino acids 735-740 according to Myers et al (supra)), corresponding to the 29 th amino acid of the intracytoplasmic domain.
  • the plasmid in which the LAI sequence is inserted between the homologous regions of the TK gene of the vaccinia virus is cut with Sphl and SmaI then ligated with the sequence of gp120MN.
  • the WTG9150 virus is then constructed by conventional homologous recombination.
  • the recombinant vaccinia virus vector WTG9150 thus produced is used for the production of gp160MN / LAI.
  • the vector is propagated on BHK21 cells.
  • Gp160 MN / LAI-2 is produced on BHK21 cells infected for 72 hours with the recombinant vaccinia virus WTG9150. After culturing in a biogenerator, the supernatant is collected, filtered and ultrafiltered to give the concentrated harvest. The purification takes place in three stages. Certain contaminants of gp160 MN / LAI-2 are fixed on an anion exchange column. The unbound fraction is chromatographed on an immunoaffinity column using a 5F3 monoclonal antibody.
  • the gp160 MN / LAI-2 is desalted by gel filtration chromatography in PBS buffer. To inactivate the residual vaccinia, the glycoprotein is heated at 60 ° C for 1 hour before being filtered to give the purified antigen.
  • concentration of gp160 MN / LAI-2 used for the production of deglycosylated complexes is 0.87 mg / ml of proteins (determined by colorimetric assay kit BCA, Pierce) and its purity of 77% (determined by SDS PAGE electrophoresis and optical densitometry analysis using the Biorad TM ScannerGS700).
  • the glycoprotein is in a phosphate buffer of the following composition: 137 mM NaCl; 2.7 mM KCI
  • Each complex is made from 150 ⁇ g of gp160MN / LAI.
  • the glycoprotein is stored at -20 ° C.
  • Example 2 Preparation of the deglycosylated complexes
  • Preparation of the qp160MN / LAI / CD4 complexes Recombinant soluble CD4 consisting of amino acids 1-307 of the extracellular domain of human CD4 (Intracell TM, reference no. 13101) at 1 mg / ml in MES buffer ( 50 mM MES, 350 mM NaCl, pH 6.0) is added to the gp160 prepared in Example 1 according to a molar ratio (mole of gp160 monomer / mole of CD4) of 1/1.
  • the operating conditions leading to the deglycosylated complexes according to the invention (called BA34, BA35 and BA 36 respectively) and to the control preparations (called BA1, BA2, BA3, BA4 and BA33) are summarized in Table 1 below.
  • CD4s soluble CD4
  • HIV envelope glycoprotein induces a significant conformational change (Furuta et al., 1998). It seems that the association of CD4 with the preparation of gp160 MN / LAI-2 exposes previously hidden epitopes.
  • Electrophoretic analysis on acrylamide gel shows that the soluble CD4 added to the preparation is formed by a single band at 42 kDa.
  • the monomer of gp160 MN / LAI-2 is located at 129 kDa.
  • EGS ethylene glycol bis succinimidyl succinate
  • the band corresponding to CD4s disappears indicating that this molecule is indeed associated with gp160 MN / LAI -2 in solution (band at 243 kDa).
  • the oligomeric state of gp160 MN / LAI is not modified by the addition of CD4s.
  • the gp160 / CD4 complexes thus formed are then deglycosylated.
  • the deglycosylation step is carried out using the following enzymes or enzyme mixtures; N-glycosidase F peptide (PNGase F), endoglycosidase F / N-glycosidase F peptide mixture (endo F / PNGase F), and sialidase from Oxford Glycosciences, Abingdon UK.
  • the activity of these enzymes expressed in activity units per mg of enzyme, is for PNGase F 20 units for the endo F / PNGase F mixture 42 and
  • glycosidases act at pH 7.4 in the PBS buffer of gp160 MN / LAI-2 and are added directly.
  • Sialidase acts at pH 5, necessitating lowering the pH of the preparation of gp160 MN / LAI-2 with 0.5 M sodium acetate at pH 5.
  • the sialidase is dissolved in sodium acetate buffer 0, 1 M pH 5, then added to the gp160 MN / LAI-2.
  • the deglycosylations are carried out in a thermostatically controlled bath at 37 ° C. with gentle stirring. The deglycosylation reaction is stopped by freezing at -20 ° C.
  • the pH is increased to approximately 7.4 by adding PBS 10 times concentrated.
  • the operating parameters and conditions used to carry out the deglycosylation reaction are given in Table 1 below in which the enzyme / gp160 ratio is expressed in weight / weight (w / w).
  • the complexes are numbered BA1, BA2, BA3, BA4 and BA33 for the control preparations and BA 34, BA35 and BA36 for the complexes according to the invention.
  • the deglycosylated complexes are sterile diluted in a stabilizing medium and then adsorbed on aluminum phosphate.
  • the stabilizing mixture is composed of a mixture of amino acids and "Dulbecco's Modified Eagle Medium” medium DMEM-F12 (Gibco, France).
  • the deglycosylated complexes prepared in Example 2 (BA1, BA2, BA3, BA4 and BA33 and BA34, BA35 and BA36) are diluted in the stabilizing mixture before an equal volume of aluminum phosphate at 6.3 mg / ml in PBS is added to this mixture.
  • the guinea pig sera thus obtained were analyzed by ELISA assay against the native gp160 MN / LAI.
  • the gp160 MN / LAI is immobilized on the solid phase at a rate of 130 ng per well for 1 hour at 37 ° C.
  • the plate is emptied then saturated with a PBS buffer, 0.1% Tween 20 containing 5% of skimmed milk powder.
  • Each serum is diluted on the plate according to serial dilutions of reason 3, between 1/100 e and 1/10000 e depending on the case, in saturation buffer and incubated for 1 hour 30 minutes at 37 ° C.
  • a rabbit anti-guinea pig antibody (Sigma, St Louis) coupled with peroxidase, diluted to 1/3000 e , makes it possible to reveal the presence of antibodies specific for gp160MN / LAI.
  • the titles are calculated automatically by the reader from the optical density read and from the straight line obtained with a standard serum.
  • the mean values of the specific immunoglobulin assay for gp160 MN / LAI-2 for each group of guinea pigs are shown in FIG. 1.
  • the control groups injected with untreated gp160 MN / LAI are denoted BA1, BA2, BA3, BA4 and BA33. Overall, the various preparations injected induce specific antibodies at fairly comparable levels. No antibody specific for gp160 MN / LAI-2 was detected in the pre-immune sera.
  • the antigens according to the present invention are produced from a gp160MN / LAI, from an HIV-1 virus adapted in the laboratory.
  • these antigens make it possible to induce in the immunized animal a humoral response capable of neutralizing primary isolates of the HIV-1 virus, which constitutes an improvement over current knowledge on this subject.

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Abstract

La présente invention concerne un complexe protéique constitué d'une glycoprotéine d'enveloppe du VIH et de CD4 susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes de : (a) mélange de la glycoprotéine d'enveloppe et du CD4 selon un rapport molaire (mole de monomère de glycoprotéine d'enveloppe/mole de CD4 soluble) de 1/0,2 à 1/2 pour former un complexe glycoprotéine d'enveloppe/CD4 et (b) déglycosylation par voie enzymatique du complexe formé dans l'étape (a) et son utilisation dans un vaccin contre le VIH.

Description

Complexe déglycosylé protéine env/CD4 et son utilisation pour la vaccination contre le VIH
La présente invention a pour objet un nouvel antigène et son utilisation dans un vaccin contre le VIH et concerne plus particulièrement un complexe protéique déglycosylé capable d'induire des anticorps neutralisant les isolats primaires du VIH.
Les travaux issus de cette demande ont été co-financés par l'ANRS.
Au cours des dix dernières années plusieurs vaccins contre le VIH ont été proposés et testés chez le singe ou chez l'homme. Aucun des vaccins proposés à ce jour n'a apporté de solution totalement satisfaisante. Les obstacles majeurs que sont la grande variabilité génétique du virus (SARAGOSTI S. 1997. Virologie 1 : 313-320) et la faible exposition au système immunitaire d'épitopes viraux neutralisant freinent considérablement l'élaboration d'un vaccin permettant l'induction d'une immunité neutralisante.
La glycoprotéine d'enveloppe du VIH qui est requise pour conférer au virus son caractère infectieux représente la cible des anticorps neutralisants. Ces caractéristiques ont fait de cette dernière un sujet d'investigations intenses. Il a été montré que la glycoprotéine d'enveloppe du VIH est un oligomère composé d'un domaine extracellulaire, la gp 120, et d'un domaine transmembranaire, la gp 41 , (Gallaher et al AIDS Research & Human Retroviruses. 11(2):191-202, 1995). La sous-unité gp120, responsable de la liaison du virion sur les récepteurs CD4 et co-récepteurs présents sur la cellule hôte, est une protéine fortement glycosylée. Les premières études structurales de la gp120 ont montré que la moitié du poids moléculaire de cette dernière correspondait aux résidus glycannes fixés sur la molécule. On estime que la gp120 comporte environ 24 sites potentiels de N- glycosylation répartis entre les domaines variables et constants La sous-unité gp41 qui induit la fusion des membranes cellulaire et virale est une protéine moins fortement glycosylée. On estime qu'elle comporte entre 4 et 7 sites potentiels de N-glycosylation.
A la vue de cette glycosylation importante, l'hypothèse a très tôt été émise que ces résidus N-glycannes pouvaient constituer une barrière protégeant le virus d'une reconnaissance par le système immunitaire limitant notamment l'induction d'une réponse humorale efficace. Diverses expériences de déglysosylation ont donc été mises en œuvre pour tester le bien fondé de cette hypothèse. A ce jour peu de preuves ont été apportées pour conforter cette hypothèse et les résultats obtenus sont souvent contradictoires. A. Benjouad et al dans Journal of Virology 1992, p.2473-2483 ont comparé l'immunogénicité de la gp160 native à celle d'une gp160 déglycosylée par voie enzymatique par utilisation d'endo F-N glycannase, de neuraminidase ou d'α- mannosidase. Les anticorps induits par ces différentes formes de gp160 déglycosylées ont été testés pour déterminer leur réactivité contre un panel de peptides synthétiques. Les résultats décrits montrent que, par rapport au sérum anti-gp160 native, la réactivité à l'égard de la majorité des peptides reste inchangée, ou peut dans certains cas diminuer ou augmenter. D'après ces travaux seuls les anticorps issus d'antisérums produits contre la gp160 native ou la gp160 désialylée neutralisent le pouvoir infectieux du VIH-1 (TCLA) et inhibent la formation de syncytium entre les cellules infectées par le VIH-1 et les cellules CD4+ non-infectées.
Bolmsted et al dans J. Acquired Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 12, 213-220 (1996), ainsi que Benjouad et al dans FEBS letters 341 , 244-250 (1994), pour n'en citer que quelques-uns, on conclut qu'une immunisation à l'aide de composants comprenant, ou exprimant, la protéine d'enveloppe partiellement déglycosylée n'améliorait pas les réponses en anticorps neutralisants des isolats primaires du virus .
J.N.Reitter et al dans Nature Médecine, Vol. 4 (6), 679-684, 06/98, ont montré quant à eux que des gp160 mutantes du virus de l'immunodéficience simienne (VIS) dans lesquelles 2 sites de N-glycosylation ont été abolis au niveau et dans la partie V1 conduisent à une augmentation de la réponse immunitaire contre des déterminants structuraux de cette région et à une augmentation en anticorps neutralisants.
L'obtention de glycoprotéines gp160 ou gp120 mutantes partiellement déglycosylées dans leur partie C-terminale et leur utilisation pour induire une réponse immunitaire protectrice sont décrites dans WO93/17705. WO98/41536 faisant référence à W O93/17705, décrit quant à lui que l'élimination sélective de résidus N-glycannes situés dans la partie N-terminale de la protéine gp120 du VIH-1 ou du VIS conduit à une glycoprotéine mutante capable d'induire une réponse humorale protectrice améliorée. Les réponses en anticorps neutralisants, telles que décrites dans l'art antérieur mentionné ci-dessus, ont pour inconvénient d'être soit spécifiques d'un sérotype donné, soit d'être incapables de conduire à la neutralisation des isolats primaires du VIH. Du fait de la très grande variabilité génétique du virus du SIDA, de telles réponses immunitaires présentent donc peu, voire pas d'intérêt d'un point de vue vaccinal.
Il existe donc un besoin pour un vaccin capable d'induire une immunité neutralisante contre les isolats primaires du VIH.
La présente invention a pour objet de pallier ce besoin et concerne donc un nouvel antigène déglycosylé capable d'induire des anticorps neutralisant les isolats primaires du VIH et son utilisation dans un vaccin contre le VIH.
La demanderesse a mis en évidence de façon surprenante qu'un complexe glycoprotéine env/CD4 déglycosylé permettait d'atteindre cet objectif.
La présente invention concerne donc un complexe protéique déglycosylé composé de la glycoprotéine d'enveloppe du VIH -1et du CD4 susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes de :
(a) mélange de la glycoprotéine d'enveloppe et du CD4 selon un rapport molaire (mole de monomère de glycoprotéine d'enveloppe/mole de CD4 soluble) de 1/0,2 à 1/2 pour former un complexe glycoprotéine d'enveloppe/CD4 et
(b) déglycosylation par voie enzymatique du complexe formé dans l'étape (a). Selon un mode de réalisation particulier, la glycoprotéine d'enveloppe est une gp160MN/LAI. Selon un autre mode de réalisation spécifique, la gp160MN/LAI est sous forme dimérique.
Selon un mode de réalisation différent le CD4 est un CD4 soluble.
Selon un autre mode de réalisation, le rapport molaire (mole de monomère de glycoprotéine d'enveloppe/mole de CD4 soluble) est de 1/1.
Selon un autre mode de réalisation, le degré de déglycosylation exprimé en terme de diminution de la masse moléculaire (MM) de la glycoprotéine de l'étape (a) représente 1 à 50% (a) et plus avantageusement 20% (a) telle que déterminée par électrophorèse sur gel SDS PAGE.
Selon un autre mode de réalisation l'étape de déglycosylation est réalisée par utilisation d'une enzyme, ou d'un mélange d'enzymes, sélectionné(e) dans le groupe consistant en : peptide N-glycosidase F, endoglycosidase F, et sialidase. Selon un mode spécifique de réalisation, l'étape de déglycosylation est réalisée par utilisation de peptide N-glycosidase (PNGase F) ou de sialidase.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne une composition comprenant un mélange de complexes déglycosylés.
Selon un autre aspect, la présente invention est relative à un anticorps dirigé contre le complexe déglycosylé, cet anticorps étant de préférence monoclonal.
Selon un quatrième aspect, la présente invention a pour objet un vaccin contre le VIH comprenant :
(a) un complexe déglycosylé tel que défini ci-dessus ou une composition telle que définie ci-dessus, ou un anticorps tel que défini ci-dessus ou un mélange de ces anticorps,
(b) un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable et
(c) éventuellement un adjuvant ou mélange d'adjuvants.
Selon un mode de réalisation particulier, le vaccin selon l'invention est utilisé pour induire des anticorps neutralisant le VIH chez un sujet humain à titre thérapeutique ou prophylactique. Selon un autre mode de réalisation, le vaccin selon la présente invention est utilisé pour induire une réponse cellulaire (CTL) protectrice chez un sujet humain à titre thérapeutique ou prophylactique.
Les autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront dans la description détaillée qui suit.
Par « glycoprotéine d'enveloppe » on entend dans le cadre de la présente invention une protéine glycosylée gp160, gp 120 ou gp 140. La protéine d'enveloppe peut être sous forme monomérique, dimerique ou multimérique, elle sera de préférence sous forme dimerique. Cette protéine d'enveloppe pouvant être une protéine recombinante ou non et peut également être constituée d'une protéine hybride ; le terme hybride étant utilisé ici dans son acceptation classique à savoir une protéine comprenant des séquences provenant de protéines d'enveloppe de différentes souches de virus adaptées en laboratoire ou d' isolats primaires du VIH. Les protéines d'enveloppe dont la séquence en acides aminés diffère de celle de la protéine native par des mutation(s), délétion(s), insertion(s), ou substitution(s) d'acide(s) aminé(s) sont également inclues dans la définition ci- dessus pour autant que (1 ) ces modifications n'abolissent pas substantiellement la liaison de la protéine d'enveloppe au CD4, i.e. au moins 75% en masse, de préférence au moins 80% en masse du CD4 présent est associé à la glycoprotéine d'enveloppe, déterminé par mesure à l'aide d'un Biacore™ (voir l'article suivant pour l'aspect technique des mesures : VanCott et al.. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 7(11): 1103-15, 1994 Nov), et (2) que le complexe protéine d'enveloppe/CD4 ainsi formé conduise à la formation d'anticorps susceptibles de neutraliser des isolats primaires du VIH. Ces deux caractéristiques sont aisément déterminables à l'aide des tests fournis dans la présente demande. On utilise de préférence la gp160MN/LAI. La glycoprotéine dans le cadre de la présente invention est utilisée sous une forme isolée substantiellement purifiée. On entend par protéine isolée et substantiellement purifiée, une protéine présentant un taux de pureté d'au moins 75% , de préférence d'au moins 80% , tel que déterminé par la méthode d'électrophorèse sur gel d'acrylamide (SDS PAGE) (LAEMMLI U.K. 1970. Nature 27 : 680-685.) et analyse par densitométrie.
Par « CD4 » on entend dans le cadre de la présente invention, une protéine CD4 comprenant l'intégralité ou une partie seulement de la séquence du récepteur CD4, ancrée ou non dans une membrane lipidique ou un fragment membranaire. Cette protéine CD4 peut également correspondre à une protéine recombinante. Les protéines CD4 dont la séquence en acides aminés diffère de celle de la protéine native par mutation(s), délétion(s), insertion(s), ou substitution(s) d'acide(s) aminé(s) sont également inclues dans la définition ci- dessus pour autant (1 ) que ces modifications n'abolissent pas substantiellement la liaison du CD4 à la protéine d'enveloppe telle que définie ci-dessus, i.e. au moins 75% en masse, de préférence au moins 80% en masse du CD4 présent est associé à la glycoprotéine d'enveloppe, et (2) que le complexe protéine d'enveloppe/CD4 ainsi formé conduise à la formation d'anticorps susceptibles de neutraliser des isolats primaires du VIH. Ces deux caractéristiques sont aisément déterminables à l'aide des tests fournis dans la présente demande.
On peut citer à titre d'exemple non limitatifs de protéines CD4 utilisables dans le cadre de la présente invention, la protéine CD4 ancrée dans une membrane lipidique, ou le CD4 soluble vendu par Intracel sous la référence 13101. On utilise de préférence dans le cadre de la présente invention un CD4 soluble.
La protéine CD4 dans le cadre de la présente invention est utilisée sous une forme isolée substantiellement purifiée. On entend par protéine isolée et substantiellement purifiée, une protéine présentant un taux de pureté d'au moins 75%, de préférence 80% , tel que déterminé par SDS PAGE et densitométrie.
Dans le cadre de la présente invention on entend par « complexe glycoprotéine d'enveloppe/CD4», un complexe formé par l'association non- covalente entre une glycoprotéine d'enveloppe du VIH telle que définie ci-dessus et du CD4 tel que défini ci-dessus. La glycoprotéine d'enveloppe et le CD4 sont présents dans le complexe protéique tel que défini ci-dessus selon un rapport molaire (mole de monomère de glycoprotéine d'enveloppe/ mole de CD4) allant de 1/0,2 à 1/2 et de préférence dans un rapport molaire de 1/1. Dans le cas de figure où la glycoprotéine d'enveloppe comprend les deux types de sous-unités i.e. gp120 et gp41 , le rapport ci-dessus doit être compris comme le rapport moles de monomères de gp120/moles de CD4.
On entend par « déglycosylation » dans le cadre de la présente invention l'élimination, partielle ou totale, par voie enzymatique des glycannes présents sur la protéine glycosylée, de préférence la déglycosylation est une N- déglycosylation. La déglycosylation peut par exemple être réalisée par action d'une ou de plusieurs des enzymes suivantes : sialidases, peptide N-glycosidase F, mannosidases, O-glycosidases, endoglycosidases F, H ou D, N-glycosidase A (PNGase A), fucosidases, galactosidases, N-acétyl-beta-D-glucosaminidase. Cette liste n'est pas limitative, toute enzyme susceptible de déglycosyler le complexe selon l'invention peut être utilisée sous réserve que l'enzyme ou le mélange enzymatique sélectionné(e) conduise à un complexe déglycosylé susceptible d'induire des anticorps neutralisant les isolats primaires. Cette caractéristique peut être aisément vérifiée à l'aide du test de neutralisation auquel il est fait référence dans l'exemple 4 ci-dessous. De préférence la déglycosylation du complexe est réalisée par utilisation d'une enzyme ou d'un mélange d'enzymes sélectionnés dans le groupe consistant en : peptide N-glycosidase F, endoglycosydase F et sialidase de préférence par utilisation de PNGase F ou de sialidase.
Les paramètres de l'étape de glycosylation que sont le rapport enzyme/substrat, la température et le temps d'incubation du substrat avec l'enzyme sont sélectionnés de sorte que la déglycosylation entraîne une diminution de la masse moléculaire (MM) de la glycoprotéine de l'étape (a) représente 1 à 50% et plus avantageusement 20% tel que déterminé par SDS PAGE. Plus avantageusement on sélectionne les paramètres qui provoquent la diminution maximum du poids moléculaire du complexe glycoprotéine/CD4, tel que déterminé par électrophorèse sur gel d'acryiamide. Le rapport enzyme/substrat varie en fonction de l'activité spécifique de l'enzyme. A titre illustratif, les paramètres appropriés pour la déglycosylation d'un complexe gp160MN/LAI/ CD4 soluble par la sialidase présentant une activité de 30 unités sont de 1/116 (poids/poids) avec incubation du complexe pendant 3 heures à 37°C. Les conditions opératoires appropriées pour les différentes enzymes sont facilement déductibles par l'homme de l'art à partir de l'enseignement fourni ici et des renseignements contenus dans les fiches techniques accompagnant les enzymes. La déglycosylation est mise en œuvre par addition à la préparation contenant la glycoprotéine d'enveloppe de l'enzyme en solution dans un tampon approprié pour son activité enzymatique. Le choix du tampon est à la portée de l'homme de l'art et il est généralement indiqué par le fournisseur. La réaction est mise en œuvre par mélange des deux protéines i.e. CD4 et glycoprotéine d'enveloppe à la température ambiante et sous agitation. La nature du tampon et les paramètres de la réaction de déglycosylation peuvent être facilement déterminés par l'homme de l'art à partir de l'enseignement fourni ici. Cette étape de déglycosylation est décrite plus en détails dans les exemples qui suivent.
Dans le cadre de la présente invention, on entend donc par « complexe déglycosylé », un complexe glycosyle tel que défini ci-dessus qui, après sa formation (ie après l'association non-covalente des sous-unités glycoprotéine d'enveloppe et CD4) est soumis à une déglycosylation par voie enzymatique telle que définie ci-dessus. Une fois déglycosylés les complexes glycoprotéine d'enveloppe/CD4 en solution ont tendance à s'agréger formant ainsi des structures multimériques.
La présente invention a également pour objet une composition comprenant un mélange d'au moins deux complexes déglycosylés tels que définis ci-dessus. Dans un tel cas de figure, ces complexes peuvent se différentier par exemple par la nature de la glycoprotéine d'enveloppe constitutive (par ex. les glycoproteines provenant de différentes souches ou isolats primaires, certaines pouvant correspondre également à des protéines hybrides) ou par le degré ou la nature de la déglycosylation ou par la nature du CD4. Tout mélange envisageable comprenant un ou plusieurs complexe est inclus dans la portée de la présente invention. La présente invention a également pour objet les anticorps dirigés contre les complexes déglycosylés tels que décrits ci-dessus. La préparation de tels anticorps est mise en œuvre par les techniques classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et monoclonaux (Kohler G et al European Journal of Immunology. 6(7):511-9, 1976 Jul).
Ces anticorps sont particulièrement appropriés pour être utilisés dans un schéma d'immunisation passive. La présente invention a également pour objet des vaccins utiles à des fins thérapeutiques et prophylactiques. Les vaccins selon la présente invention comprennent un complexe proteique déglycosylé tel que défini ci-dessus ou un mélange de complexes déglycosylés, un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un adjuvant. Le vaccin selon la présente invention peut donc contenir un seul type de complexe proteique déglycosylé ou un mélange de divers types de complexes déglycosylés. Dans un tel cas de figure, ces complexes peuvent se différentier par exemple par la nature de la glycoprotéine d'enveloppe constitutive (par ex. les glycoprotéines provenant de différentes souches ou isolats primaires, certaines pouvant correspondre également à des protéines hybrides) ou par le degré ou la nature de la déglycosylation ou par la nature du CD4. Tout mélange envisageable comprenant un ou plusieurs complexe est inclus dans la portée de la présente invention.
Selon un autre aspect, la présente invention comprend des anticorps anti- complexe proteique déglycosylé. Dans ce cas de figure également tout mélange d'anticorps, monoclonaux ou polyclonaux, dirigés contre différentes parties d'un même complexe déglycosylé ou contre différents complexes déglycosylés fait partie de la présente invention.
La quantité de complexe proteique déglycosylé dans le vaccin selon la présente invention dépend de nombreux paramètres comme le comprendra l'homme de l'art, tels que la nature du complexe, la voie d'administration et l'état de la personne à traiter (poids, âge, état clinique, etc. ). Une quantité appropriée est une quantité telle qu'une réponse immunitaire humorale ou cellulaire capable de neutraliser des isolats primaires du VIH est induite après administration de cette dernière. Les vaccins selon la présente invention peuvent également contenir un adjuvant. Tout adjuvant ou mélange d'adjuvants pharmaceutiquement acceptable peut être utilisé à cette fin. On peut citer à titre d'exemple les sels d'aluminium tels que l'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium. Des agents auxiliaires classiques tels que agents mouillants, charges, émulsifiants, tampons etc. peuvent également être additionnés au vaccin selon l'invention.
Les vaccins selon la présente invention peuvent être préparés par tout procédé classique connu de l'homme de d'art. Classiquement les antigènes sont mélangés avec un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable, tel que eau ou solution saline tamponnée au phosphate. Le support ou diluant va être sélectionné en fonction de la forme galénique choisie, du mode et de la voie d'administration ainsi que de la pratique pharmaceutique. Les supports ou diluants appropriés ainsi que les exigences en matière de formulation pharmaceutique sont décrits en détails dans Remington's Pharmaceutical Sciences, représentant un ouvrage de référence dans ce domaine.
Les vaccins mentionnés ci-dessus peuvent être administrés par toute voie classique, habituellement utilisée dans le domaine des vaccins, telle que la voie parenterale (intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, etc..) L'administration peut être réalisée par l'injection d'une dose unique ou de doses répétées, par exemple à JO, à 1 mois, à 3 mois, à 6mois et à 12 mois. On utilisera de préférence les injections à JO , à 1 mois et à 3 mois.
La présente invention entend également couvrir le complexe déglycosylé tel que défini ci-dessus et le vaccin contenant un tel complexe ou mélange de complexes déglycosylés pour leur utilisation pour induire des anticorps neutralisant des isolats primaires du VIH ainsi que pour leur utilisation pour induire une réponse CTL contre le VIH.
La demanderesse a mis en évidence de façon surprenante que les complexes déglycosylés selon l'invention étaient capables après administration d'induire des anticorps susceptibles de neutraliser des isolats primaires du VIH. Ces antigènes représentent donc des candidats de valeur pour l'élaboration d'un vaccin utilisable pour la protection et/ou le traitement d'un grand nombre, voire la totalité des sujets à risques ou infectés par le VIH. La présente invention va être décrite de façon plus détaillée dans les exemples qui suivent par référence à la figure suivante dans laquelle : La figure 1 représente les valeurs moyennes du dosage des immunoglobulines spécifiques de la gp160 MN/LAI-2 induites chez le cobaye par les complexes déglycosylés selon l'invention.
Les exemples décrits ci-dessous sont donnés à titre purement illustratif de l'invention et ne peuvent en aucun cas être considérés comme limitant la portée de cette dernière. A des fins de clarté, les exemples sont limités à des complexes déglycosylés constitués de gp160MN/LAI/CD4.
Exemple 1 : Préparation de la glycoprotéine gp160MN/LAI La glycoprotéine gp160MN/LAI est une glycoprotéine soluble hybride dans laquelle la sous-unité gp120 dérive du VIH-1 MN et la sous- unité gp41 dérive de l'isolât LAI. Les séquences d'ADN correspondant à ces deux composants sont fusionnées à l'aide d'un site de restriction Smal qui ne modifie ni la séquence en acides aminés de la gp120 ni celle de la gp41. La préparation de cette protéine est décrite ci-dessous.
La séquence codant pour la gp120MN est amplifiée par PCR à partir des cellules SupT1 infectées par le VIH-MN, à l'aide d'oligonucléotides introduisant les sites de restrictions Sphl et Smal respectivement immédiatement en aval de la séquence codant pour le peptide leader et en amont des sites de clivage localisés entre la gp120 et la gp41. La séquence codant pour la sous-unité gp41 est produite de la façon suivante : la séquence complète codant pour la protéine env du VIH1-LAI est placée sous le contrôle du promoteur pH5R du virus de la vaccine. Plusieurs modifications sont introduites dans cette région codante. Un site de restriction Sphl est créé immédiatement en aval de la séquence codant pour le peptide leader, sans altération de la séquence des acides aminés. Un site de restriction Smal est créé immédiatement en amont de la séquence codant pour les sites de clivage situées entre gp120 et gp41 , sans altération de la séquence en acides aminés. Les deux sites de clivage en position 507-516 (acides aminés numérotés selon la méthode de Myers et al, décrite dans Human retroviruses and AIDS (1994) Los Alamos National Lab. (USA)) ont été mutés (i.e. la séquence d'origine KRR ... REKR a été mutée en QNH ... QEHN). La séquence codant pour le peptide hydrophobe transmembranaire IFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIV (i.e. acides aminés 689-710 selon Myers et al supra) a été délétée. Enfin, le second codon E de la séquence codant pour PEGIEE a été remplacé par un codon stop (i.e. acides aminés 735-740 selon Myers et al (supra)), correspondant au 29eme acide aminé du domaine intracytoplasmique.
Le plasmide dans lequel la séquence LAI est insérée entre les régions homologues du gène TK du virus de la vaccine est coupé par Sphl et Smal puis ligaturé avec la séquence de la gp120MN. Le virus WTG9150 est ensuite construit par une recombinaison homologue classique.
Le vecteur recombinant du virus de la vaccine, WTG9150, ainsi produit est utilisé pour la production de la gp160MN/LAI. Pour ce faire, le vecteur est propagé sur des cellules BHK21. La gp160 MN/LAI-2 est produite sur cellules BHK21 infectées pendant 72 heures par le virus de la vaccine recombinante WTG9150. Après culture en biogénérateur, le surnageant est récolté, filtré et ultrafiltré pour donner la récolte concentrée. La purification se déroule en trois étapes. Certains contaminants de la gp160 MN/LAI-2 sont fixés sur une colonne échangeuse d'anions. La fraction non fixée est chromatographiée sur colonne d'immunoaffinité à l'aide d'un anticorps monoclonal 5F3. Après élution, la gp160 MN/LAI-2 est dessalée par chromatographie de filtration sur gel en tampon PBS. Pour inactiver la vaccine résiduelle, la glycoprotéine est chauffée à 60°C pendant 1 heure avant d'être filtrée pour donner l'antigène purifié. La concentration de la gp160 MN/LAI-2 utilisée pour la réalisation des complexes déglycosylés est de 0,87 mg/ml de protéines (déterminée par dosage colorimétrique kit BCA, Pierce) et sa pureté de 77% (déterminée par électrophorèse SDS PAGE et analyse par densitométrie optique à l'aide du ScannerGS700 de Biorad™). La glycoprotéine est dans un tampon phosphate de composition suivante : NaCI 137 mM; KCI 2,7 mM
; Na2HPθ4 6,5 mM ; KH2PO4 1 ,5 mM ; pH 7,4 (PBS). Chaque complexe est réalisé à partir de 150 μg de gp160MN/LAI. La glycoprotéine est conservée à -20°C.
Exemple 2 : préparation des complexes déglycosylés Préparation des complexes qp160MN/LAI/CD4 Du CD4 soluble recombinant constitué des acides aminés 1-307 du domaine extracellulaire du CD4 humain (Intracell™, No référence 13101 ) à 1 mg/ml dans un tampon MES (50mM MES, 350 mM NaCI, pH6,0) est ajouté à la gp160 préparée dans l'exemple 1 selon un rapport molaire (mole de monomère de gp160/mole de CD4) de 1/1. Les conditions opératoires conduisant aux complexes déglycosylés selon l'invention (nommés respectivement BA34, BA35 et BA 36) et aux préparations témoins (nommées BA1 , BA2, BA3, BA4 et BA33) sont résumées dans le tableau 1 ci-dessous.
L'association du CD4 soluble (CD4s) à la glycoprotéine d'enveloppe du VIH induit un changement conformationnel important (Furuta et al., 1998). Il semble que l'association du CD4 à la préparation de gp160 MN/LAI-2 expose des épitopes auparavant cachés.
L'analyse électrophorétique sur gel d'acrylamide, montre que le CD4 soluble ajouté à la préparation est formé d'une bande unique à 42 kDa. Le monomère de gp160 MN/LAI-2 se situe à 129 kDa. Après traitement par l'éthylene glycol bis succinimidyl succinate (EGS) (GETHING et al 1989. Methods in cell biology 32 : 185-206.), la bande correspondant au CD4s disparaît indiquant que cette molécule est bien associée à la gp160 MN/LAI-2 en solution (bande à 243 kDa). L'état oligomérique de la gp160 MN/LAI n'est pas modifié par l'ajout du CD4s.
Déglycosylation des complexes gp160MN/LAI/CD4
Les complexes gp160/CD4 ainsi formés sont ensuite déglycosylés. L'étape de déglycosylation est réalisée à l'aide des enzymes ou mélanges enzymatiques suivants ; peptide N-glycosidase F (PNGase F), mélange endoglycosidase F/peptide N-glycosidase F (endo F/PNGase F), et sialidase provenant de chez Oxford Glycosciences, Abingdon UK. L'activité de ces enzymes, exprimée en unités d'activité par mg d'enzyme, est pour la PNGase F de 20 unités pour le mélange endo F/PNGase F de 42 et
57 unités respectivement et pour la sialidase de 30 unités. (Rappel : 1 unité représente la quantité d'enzyme capable d'hydrolyser 1 micromole de substrat par minute dans les conditions de pH de température etc.. définies).
Ces glycosidases, à l'exception de la sialidase, agissent à pH 7,4 dans le tampon PBS de la gp160 MN/LAI-2 et sont ajoutées directement. La sialidase agit à pH 5, nécessitant d'abaisser le pH de la préparation de la gp160 MN/LAI-2 par de l'acétate de sodium 0,5 M à pH 5. La sialidase est solubilisée en tampon acétate de sodium 0,1 M pH 5, puis ajoutée à la gp160 MN/LAI-2. Les déglycosylations sont réalisées en bain thermostaté à 37°C sous agitation douce. La réaction de déglycosylation est arrêtée par congélation à -20°C. Pour les antigènes traités par la sialidase le pH est augmenté à environ 7,4 par ajout de PBS 10 fois concentré. Les paramètres et les conditions opératoires utilisés pour mettre en œuvre la réaction de déglycosylation sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous dans lequel le rapport enzyme/gp160 est exprimé en poids/poids (p/p).
Les complexes sont numérotés BA1 , BA2, BA3, BA4 et BA33 pour les préparations témoins et BA 34, BA35 et BA36 pour les complexes selon l'invention.
Tableau 1 Conditions opératoires de déglycosylation des préparations gp160MN/LAI préparées dans l'Exemple 1
Figure imgf000016_0001
Les complexes ainsi formés ont été analysés par SDS PAGE. Les résultats sont résumés dans le tableau 2 ci-dessous.
Après action de la PNGase F (BA35), l'analyse électrophorétique montre que la masse moléculaire du monomère de gp160 MN/LAI est réduite de 31 kDa semblablement à celle de BA2 (traitée PNGase F sans CD4s). La masse moléculaire du CD4s est légèrement réduite au cours de l'opération. Lorsque la préparation est traitée par de l'EGS, la bande correspondant au CD4s n'est plus visible montrant qu'il est associé avec la gp160 MN/LAI.
L'analyse SDS-PAGE de la préparation BA36 traitée par l'endo F/PNGase F montre une diminution de la masse moléculaire de 40 kDa. Ces résultats suggèrent que l'ajout du CD4s réduit le clivage des N-glycannes en gênant l'accessibilité des enzymes. Le CD4s est déglycosylé par ces enzymes. Le traitement à l'EGS montre également que le CD4s reste fixé à la gp160MN/LAI.
Le traitement de la gp160 par la sialidase en présence de CD4s provoque une très légère diminution de la masse moléculaire du complexe d'environ 3kDa, visible enSDS-PAGE.
Tableau 2 : Masses moléculaires des complexes gp160MN/LAI/CD4s
Figure imgf000017_0001
Exemple 3 : Analyse de l'immunogénicité chez le cobaye des complexes selon l'invention Formulation des complexes déglycosylés
Les complexes déglycosylés sont dilués stérilement en milieu stabilisateur puis adsorbés sur du phosphate d'aluminium. Le mélange stabilisant est composé d'un mélange d'acides aminés et de milieu "Dulbecco's Modified Eagle Médium" DMEM-F12 (Gibco, France). Les complexes déglycosylés préparés dans l'exemple 2 (BA1 , BA2, BA3, BA4 et BA33 et BA34, BA35 et BA36) sont dilués dans le mélange stabilisateur avant qu'un volume égal de phosphate d'aluminium à 6,3 mg/ml en PBS soit ajouté à ce mélange. Immunisations Pour chaque complexe, un groupe de 5 cobayes femelles albinos Dunkin-Hartiey (Charles River) de 400 g, reçoivent 5μg d'antigène par voie intramusculaire, dans les cuisses droite et gauche (0,5 ml dans chaque cuisse) à J1 et à J29. Un volume de 3 ml de sang est prélevé par ponction cardiaque sous anesthésie aux jours -1 , 28 et 56 (saignée finale environ 30 ml). Titrages des sérums par ELISA contre la gp160 MN/LAI-2
Les sérums des cobayes ainsi obtenus ont été analysés par dosage ELISA contre la gp160 MN/LAI native. La gp160 MN/LAI est immobilisée sur la phase solide à raison de 130 ng par cupule pendant 1 heure à 37°C. La plaque est vidée puis saturée par un tampon PBS, Tween 20 0,1 % contenant 5% de lait écrémé en poudre. Chaque sérum est dilué sur la plaque selon des dilutions sériées de raison 3, entre 1/100e et 1/10000e selon les cas, en tampon de saturation et incubé pendant 1 heure 30 à 37°C.
Un anticorps de lapin anti cobaye (Sigma, St Louis) couplé à la peroxydase, dilué au 1 /3000e, permet de révéler la présence d'anticorps spécifiques de la gp160MN/LAI. Les titres sont calculés automatiquement par le lecteur à partir de la densité optique lue et de la droite obtenue avec un sérum étalon. Les valeurs moyennes du dosage des immunoglobulines spécifiques de la gp160 MN/LAI-2 pour chaque groupe de cobayes sont représentées sur la figure 1. Les groupes témoins injectés avec de la gp160 MN/LAI non traitée sont notés BA1 , BA2, BA3, BA4 et BA33. Globalement les différentes préparations injectées induisent des anticorps spécifiques à des niveaux assez comparables. Aucun anticorps spécifique de la gp160 MN/LAI-2 n'a été détecté dans les sérums pré immuns.
Ces résultats montrent clairement que les complexes déglycosylés selon la présente invention sont capables d'induire des anticorps reconnaissant spécifiquement la glycoprotéine d'enveloppe du VIH.
Exemple 4 : Test de neutralisation des isolats primaires de VIH
Les tests de neutralisation des isolats primaires de VIH ont été mis en œuvre sur les isolats Bx17 et T051 par utilisation de la méthode de C. Moog et al, telle que décrite dans AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1997, 13, 19-27 dont l'intégralité est incorporée ici à titre de référence.
Ce test a été mis en œuvre contre plusieurs isolats primaires de VIH-1 ; seuls les résultats obtenus avec l' isolats Bx17 et T051 sont détaillés ici.
Les résultats obtenus montrent clairement que les complexes selon la présente invention sont supérieurs aux glycoprotéines déglycosylées selon l'art antérieur et permettent la neutralisation d'isolats primaires du virus à partir d'antigènes fabriqués à l'aide d' une gp160 isolée à partir d'une souche adaptée en laboratoire
(TCLA). On peut dans ces conditions raisonnablement penser que les mélanges de complexes selon l'invention puissent conduirent à la neutralisation de nombreux isolats primaires du VIH.
Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 3 ci-dessous :
Tableau 3 : titre de neutralisation des isolats primaires des virus HIV1 , exprimés en inverse de la dilution
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
<5/ : pas d'activité neutra isante à la dilution de sérum au 1/5
(IX) diminution du titre du virus d'un facteur X
Conlusions
Les antigènes selon la présente invention sont fabriqués à partir d'une gp160MN/LAI , d'un virus VIH-1 adapté en laboratoire. Cependant ces antigènes permettent d'induire chez l'animal immunisé une réponse humorale capable de neutraliser des isolats primaires du virus VIH-1 , ce qui constitue un progrès par rapport aux connaissances actuelles sur ce sujet.

Claims

Revendications :
1.- un complexe proteique constitué d'une glycoprotéine d'enveloppe du VIH et de CD4 susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes de : (a) mélange de la glycoprotéine d'enveloppe et du CD4 selon un rapport molaire (mole de monomère de glycoprotéine d'enveloppe/mole de CD4 soluble) de 1/0,2 à 1/2 pour former un complexe glycoprotéine d'enveloppe. CD4 et (b) déglycosylation par voie enzymatique du complexe formé dans l'étape (a).
2.- Le complexe selon la revendication 1 dans lequel la glycoprotéine d'enveloppe est une gp160MN/LAI.
3.- Le complexe selon la revendication 2 dans lequel la gp160MN/LAI est sous forme dimerique.
4.- Le complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans lequel le CD4 est un CD4 soluble.
5.- Le complexe selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel le rapport molaire (mole de monomère de glycoprotéine d'enveloppe/mole de
CD4 soluble) est de 1/1.
6.- Le complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le degré de déglycosylation exprimé en terme de diminution de la masse moléculaire de la glycoprotéine de l'étape (a) représente de 1 à 50% et de préférence 20% (a) telle que déterminée par électrophorèse SDS PAGE.
7.- Le complexe selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'étape de déglycosylation est réalisée par utilisation d'une enzyme, ou d'un mélange d'enzymes, sélectionnée(s) dans le groupe consistant en : peptide N-glycosidase F, endoglycosidase F, et sialidase.
8.- Le complexe selon la revendication 6 dans lequel l'étape de déglycosylation est réalisée par utilisation de PNGase F.
9.- Une composition comprenant un mélange de complexes déglycosylés selon l'une quelconque des revendications précédentes.
10.- Un anticorps dirigé contre le complexe déglycosylé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
11.- Un vaccin contre le VIH comprenant :
(d) un complexe déglycosylé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou une composition selon la revendication 9,
(e) un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable et
(f) éventuellement un adjuvant ou mélange d'adjuvant.
12.- Le vaccin selon la revendication 11 comprenant un complexe déglycosylé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou une composition selon la revendication 9 pour son utilisation pour induire des anticorps neutralisants le VIH chez un sujet humain à titre thérapeutique ou prophylactique.
13.- Le vaccin selon la revendication 11 comprenant un complexe déglycosylé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, ou une composition selon la revendication 9 pour son utilisation pour induire une réponse CTL protectrice chez un sujet humain à titre thérapeutique ou prophylactique
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