JPH06500086A - ワクチンアジュバントとしての、ノイラミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチンアジュバントとしての、ノイラミニダーゼおよびガラクトースオキシダ ーゼ本発明はワクチンアジュバントに関するものである。

予防接種は、ヒトにおける天然痘の撲滅、および動物およびヒトの両方における 、その他の多くの感染性作用体の防御に主として寄与している。古典的なワクチ ンは弱体化されているか、または殺されている、今宵種物であった。組換えＤＮ 、Ａチクノロシイの出現および免疫学の理解の増大によって、サブユニットワク チンの製造がかなり進歩した。このようなワクチンは、古典的ワクチンが付随す る問題の可能性を育していない。

しかしなから、これらの新しい世代のワクチンは、全体として、免疫学的に弱く 、したがって、アジュバント（すなわち、特異的免疫応答を強化する作用物質） の存在を必要とする。

アジュバント活性を育する物質は周知である。しかしなから、現時点で、ヒト用 に認可されているアジュバントはアルム（Ａｌｕｍ）（Ａｌ（ＯＨ）−）、およ び類似するアルミニウムゲルのみである。アルムのアジュバント活性は、１９２ ６年にＧｌｅｎｎｙによって、初めて発見された（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ 　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　、　１９２６年６月１５日；Ｊ。

を育するものとして公知のその他の物質には、次の物質が含まれる：　Ｆｒｅｕ ｎｄの完全アジュバント、これは油相中に、殺し、乾燥したミコバクテリアを含 有する鉱油中水型エマルジョンである；　Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバント、 これはミコバクテリアを含有していない弱い製剤である；サポニン、これは樹木 クイリア　サボナリア（Ｑｕｉｌｌｉａ　５ａｐｏｎａｒｉａ）から抽出した膜 活性グルコシドである：非イオン性ブロック共重合体界面活性剤、これはタンパ ク質を細胞表面に結合させる傾向を有する、未代謝合成分子である；　ＴＳＣＯ ＭＳ、これは、物理的観点で、感染性粒子を偽装する、タイル（Ｑｕｉｌ）Ａ　 （サポニン）を混入した液状ミセルである；およびムラミルジペプチド、これは 殺したミコバクテリアの活性成分の一つである白血球刺激分子である。

これらの作用物質はいずれも、毒性を有し、かつまた投与量によって、受入れら れない慢性反応を示す特徴を有することから、アルムの強力な代用物質としての 使用が、現在制限されている。他方で、アルムは細胞性免疫付与を刺激しない。

アルムはまた、広い活性スペクトルを存するか、ペプチドワクチン須では、ペプ チドの大きさが小さいことから、アルム上への吸着が貧弱であることがあり、全 部の潜在性ワクチンに有効ではない。時には、アルムは強力な効力を存するプロ テアーゼによる抗原の分解を誘発させることもある。

ノイラミニダーゼとがラクトースオキシダーゼとの組合せであるＮＡＧＯは当技 術において、細胞膜におけるアルデヒドの誘発により、Ｔリンパ球増殖を生じさ せることが知られている（Ｊ、　ＩｍｍｕｎｏＬ　１１５　（４）巻、９３２− ８頁）。

ここに、本発明によって、ノイラミニダーゼとガラクトースオキシダーゼとの組 合せ（ＮＡＧＯ）が強力なアジュバント性を有することが見い出された。ＮＡＧ Ｏは、Ｔ細胞応答の誘発に関して、先例のないほど強力な非反応原性アジュバン トであることが見出された。特に、ペプチドにより誘発され、生きているウィル スに感染した細胞を認識する、細胞毒性Ｔ細胞の誘発に関して、Ｆｒｅｕｎｄ完 全アジュバントよりも、有効もしくは良好であった。ＮＡＧＯはまた、ヒト免疫 不全ウィルスのエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０に対するＴ細胞のブライミ ングに関して、Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバントよりも、効果が大きい。強力なア ジュバント効果は、ペプチドならびにバクテリア、ウィルスおよび原生動物由来 の多糖類抗原およびタンパク質抗原により証明された。ＮＡＧＯによって生じる 局所反応は非常に温和であり、ヒト用に認可されている由−のアジュバントであ るアルヒドロゲルによって生じる反応と差違がないか、あるいはアルヒドロゲル よりも小さい。

したがって、本発明は、抗原成分およびアジュバント成分として、ノイラミニダ ーゼおよびガラクトースオキシダーゼを含有するワクチン製剤を提供する。本発 明はまた、ワクチンアジュバントとして、ノイラミニダーゼおよびガラクトース オキシダーゼを使用することを包含する。したがって、抗原成分を、アジュバン トとしての、ノイラミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼとともに製剤形 成することにより、ワクチンを製造することかできる。

ガラクトースオキシダーゼおよびノイラミニダーゼは適当な供給源のいずれから も得ることができることは勿論、明白であるが、好ましくは、ガラクトースオキ シダーゼは、ダクチリウム　プントロイデス（Ｄａｃｔｙｌｉｕｍｄｅｎｄｒｏ ｉｄｅｓ）から単離する。ダクチリウム　デンドロイーゼは、２００〜９００単 位（すなわち、ｕ）／タンパク質ｍｇの活性を有することができる。ノイラミニ ダーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）から単離される。

ビブリオ類（Ｅｃ３．２．１．１８）は好ましくは、２５ｕ／タンパク質μｇの 活性を育する（販売元のＢ　Ｄ　Ｈ、Ｐｏｏｌｅ。

５０〜４００単位／タンパク質ｍｇの活性を有するが、１単位／固体ｍｇの部分 的に精製されたものもまた、有効であることが示されている。これらの酵素は両 方ともに、たとえばＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｐｏｏ ｌｅ、　Ｄｏｒｓｅｔ、英国から、市販されている。

好適には、ノイラミニダーゼ対ガラクトースオキシダーゼの比率は、活性単位と して、１：２−１：１０、最適には約ｌ：５である。注射用製剤１００μｍ当り のＮＡの量は０．０５〜１２ｕ、好ましくは０．２〜１．２　ｕであることがで きる。注射用製剤１００μｍ当りのＧＯの量は、０．１〜２５ｕ、好ましくは２ 〜８ｕであることができる。注射用製剤１００μｍ当りの最適量はＮＡｌｕとＧ Ｏ５ｕである。

ワクチン製剤に特に有用であることができる抗原には、ペプチド、タンパク質お よび炭水化物抗原が含まれる。

抗原はバクテリア、菌類、原生動物またはウィルス抗原であることができる。抗 原はまた、インフルエンザウィルスからのサブユニット抗原（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、１４３．３００７頁、１９８９）、ヒト免疫不全ウィルスからのサブユニ ット抗原（Ｌａｎｃｅｔ　３３５．１０８１頁、１９９０）、たとえばｇｐ１２ ０．および肝炎ウィルスからのサブユニット抗原（Ｌａｎｃｅｔ　３３５．１１ ４２頁、１９９０）であることもできる。加熱により殺した、またはその他の弱 体化した、全有機物ワクチンもまた、ＮＡＧＯと一緒に使用するのに適する。そ の他の抗原の例には、ポリオウィルス、サイトメガロウィルス、ヘルペスシンプ レックスウィルス、呼吸器系シンシチウムウイルス、ライフウィルス、およびエ プスタイン−バールウィルスが含まれる。ＮＡＧＯと適合できる動物ウィルスの 例には、狂犬病、口蹄疫、エクイリン゛ｆｌｕネコ免疫不全症およびネコ白血病 のウィルスが含まれる（Ｌａｎｃｅｔ　３３５．５８７頁、１９９０）。

下記の群などからのバクテリア性抗原は、本発明に係るワクチン製剤に存利に含 有させることができる二Ｂ。

ペルタシス（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｃ，テタニ（ｔｅｔａｎｉ）　、旦工旦（ ｃｏｌｉ）　、Ｃ，ジフテリアエ（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、Ｐ。

９２　（ｍｅｎｉｎｇｊｔｉｄｉｓ）　、Ｓ、ブヌモニアエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉ ａｅ）　、Ｎ、ゴノルヘア（ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）およびその他の適当なタンパ ク質成分またはタンパク質と組合された多糖類を含有するバクテリア（Ｂａｃｔ ｅｒｉａｌ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ。

Ｒ，Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ纒、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、　Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋ、１バントとして使用した場合に、下記の成分が単独で、または組合 せて使用できる抗原要素として認められており、Ｂ、ペルツシスに対する効果的 な非細胞性ワクチンを提供するものと認識されている：糸状赤血球凝集素（ＦＨ Ａ）、Ｐ、６９（ペルタフチン）およびペルタシス毒素３３５．１２６３頁、１ ９９０）にもまた、アジュバントとしてＮＡＧＯを使用することができる。この ような抗原は原則的に、部分接合体表面抗原物質である。

アルムはアジュバント効果を発揮するが、我々の実験では、ＮＡＧＯはｉｎ　ｖ ｉｖｏ抗体応答の発現に関して、実質的に効果か大きいことが証明された。アジ ュバントとしてのＮＡＧＯの効力は自己抗原に対する、望ましくない、許容され ない自己免疫応答を惹起する可能性を呼び起す。しかしながら、我々の実験はこ の予想が全く違うことを示した。すなわち、ＮＡＧＯは、遺伝子的に決定される 無応答性の規則に違反しない。したがって、マウスにおける既知のＭＨＣ制限性 のインフルエンザペプチドの場合に、アジュバントとしてのＮＡＧＯによる応答 は、ＭＨＣハブロタイブが許容される場合には生じるが、限局性リンパ結節リン パ球数が、非許容の場合にＮＡＧＯに対する応答を増加させても、指定ペプチド に関して非許容である場合には生じない。

本発明のワクチン製剤はまた、適当な担体、代表的には注射用ワクチンに慣用の 担体を含有することができる。

ＮＡＧＯは原則的に、単独または脂質担体と組合せた、可溶性もしくは粒状抗原 を含有する水性稀釈液中で使用される。ＮＡＧＯはまた、追加の免疫刺激要素、 たとえばムラミルジペプチドを含有する油中水型エマルジョンおよび（または） ベヒクル中に混合することもできる。

注射用ワクチン製剤の患者に対する適量は２００μｌ〜２ｍｌ、代表的には、５ ００μｍである（皮下または皮肉注射では少ない方の量で、筋肉内注射では多い 方の量で使用する）。

以下の例は本発明を説明するためのものであって、本発明を制限しようとするも のではない。添付図面において： ＦｉｇｌＡは、キイホール　リンベット　ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉ ｍｐｅｔ　ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）　（Ｋ　Ｌ　Ｈ）に対する応答に係るＮＡ ＧＯの効果を示しており、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｋ　Ｌ　Ｈの濃度（μｇ／ｍｌ； ｘ軸）がリンパ球ＤＮＡ合成（５Ｈ−ＴｄＲ配合、ｃｐｍＸ　１０−’ｓｅ　； ｘ軸）に対してグラフに描かれている：このグラフにおいて、・は５００μｇＫ ＬＨ＋ＮＡＧＯを表わし、ムは５００μｇＫＬＥ（を表わし、そして口はＮＡＧ Ｏのみの場合を表わす。

ＦｉｇｌＢはインフルエンザＡの核タンパク質からのペプチド（１６７）に対す る応答に係るＮＡＧＯの効果を示しており、抗原の濃度（μｇ／ｍｌ；ｘ軸）が リンパ球ＤＮＡ合成（”Ｈ−ＴｄＲ配合、ｃｐｍＸ　１０−”ｓｅ　；ｘ軸）に 対してグラフに描かれている；このグラフにおいて、閣はペプチド１６７＋ＮＡ ＧＯを表わし、ムはペプチド１６７のみの場合を表わし、口はＮＡＧＯのみの場 合を表わし、そしてＯは抗原が存在しない場合を表わす。

ＦｉｇｌＣはペプチド１６７に対する応答に係るＧＯおよびアフイニテイ精製し たＮＡの効果を示しており、抗原の濃度（μｇ／ｍｌ、　ｘ軸）が、リンパ球Ｄ ＮＡ合成（’Ｈ−ＴｄＲ配合、ｃｐｍＸ　１０−”ｓｅ　Ｈｙ軸）に対してグラ フに描かれている；このグラフにおいて、■は粗製ＮＡ＋ＧＯ＋ペプチド１６７ を表わし、ムはアフイニテイ精製したＮＡｆＧＯ＋ペプチド１６７を表わし、・ はペプチド１６７のみの場合を表わし、モしてＯは抗原が存在しない場合を表わ す。

ＦｉｇｌＤはＮＡＧＯの加熱不活性化による効果を示しており、抗原の濃度（μ ｇ／ｍＬ　ｘ軸）がリンパ球ＤＮＡ合成（”Ｈ−ＴｄＲ配合、ｃｐｍＸ　１０− ’ｓｅ　Ｈｙ軸）に対してグラフに描かれている；このグラフにおいて、■はＮ ＡＧＯ＋ペプチド１６７を表わし、ムは加熱不活性化したＮＡＧＯ＋ペプチド１ ６７を表わし、○はペプチド１６７のみの場合を表わし、モしてＯは抗原が存在 しない場合を表わす。

Ｆｉｇ２はペプチド１６７に、ＮＡＧＯ（■）、水酸化アルミニウム（◆）およ びＦｒｅｕｎｄｓ完全アジュバント（ＦＣＡ、ム）を加えた場合の比較を示して おり、抗原の濃度（μｇ／ｍｉｘ軸）がリンパ球ＤＮＡ合成（２Ｈ−ＴｄＲ配合 、ｃｐｍＸ　１０−”ｓｅ、　ｘ軸）に対してグラフに描かれている：このグラ フにおいて、・はペプチド１６７のみの場合を表わし、そしてＯは抗原が存在し ない場合を表わす。

Ｆｉｇ３Ａは、Ｂａ１ｂ／ｃマウスにおいて、ＮＡＧＯがＢＩＯＳエピトープペ プチド１６７に対する応答を破壊しないことを示している。Ｆｉｇ３Ａでは、抗 原濃度（μｇ／ｍｌ、ｘ軸）がリンパ球ＤＮＡ合成（”Ｈ−ＴｄＲ配合、ｃｐｍ Ｘ　１０−”ｓｅ、　ｘ軸）に対してグラフに描かれており、・はペプチド１６ ７（１０μｇ）を表わし、厘はＮＡＧＯ＋Ｂａ１ｂ／ｃ　Ｔ−細胞エピトープイ ンフルエンザＡＭタンパク質ペプチド（１７１）（１０μｇ）を表わし、口はペ プチド１７１（１０μｇ）を表わし、モして○は抗原が存在しない場合を表わす 。

Ｆｉｇ３Ｂは、ＮＡＧＯがＢａ１ｂ／ｃｖウスにおけるペプチド１７１のアジュ バントとして作用することを示している。Ｆｉｇ３Ｂにおいて、抗原濃度（μｇ ／ｍＬｘ軸）がリンパ球ＤＮＡ合成（２Ｈ−ＴｄＲ配合、ｃｐｍｘｌｏ−”ｓｅ ；ｘ軸）に対してグラフに描かれており、閣はペプチド１７１　＋ＮＡＧＯを表 わし、Ｏはペプチド１７１を表わし、そして△は抗原か存在しない場合を表わす 。

Ｆｉｇ４はＢＩＯＳマウスにおけるオボアルブミンに対する一次抗体応答を示し ており、血清稀釈度（ｘ軸）が４５０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ４５０ｎｍ、 　ｘ軸）に対してグラフに描かれており、このグラフにおいて、腸はオボアルブ ミン十ＮＡＧＯを表わし、◆はオボアルブミン＋アルムを表わし、・はオボアル ブミンのみの場合を表わし、モしてＯは抗原が存在していない場合を表わす。

Ｆ　ｉｇ５はＮ　Ａ　Ｇ　ＯニよるＨＩＶ　ｇｐ１２０４：対するＴ−細胞のブ ライミングを示しており、ｇｐ１２０／ｍｌの濃度（ｘ軸）がリンパ球ＤＮＡ合 成（’Ｈ−ＴｄＲ配合、ｃｐｍ　ｘ　Ｉ　Ｏ−２ｓｅ、　ｘ軸）に対してグラフ に描かれてぃる；このグラフにおいて、・はｇｐｌ　２０＋ＮＡＧＯを表わし、 口はｇ１１１２０のみの場合を表わし、そしてＯは抗原が存在しない場合を表わ す。

Ｆｉｇ６Ａは、ＮＡＧＯによるベルタシスのｐ６９サブユニットに対するＴ−細 胞ブライミングを示しており、Ｐ６９の濃度（μｇ／ｍｌ　ｘ軸）がリンパ球Ｄ ＮＡ合成（３Ｈ−Ｔｄｋ配合、ｃｐｍＸ　１０−”ｓｅ、　ｘ軸）に対してグラ フに描かれている：このグラフにおいて、ムはｐ６９＋ＮＡＧＯを表わし、・は ｐ６のみの場合を表わし、そしてＯは抗原が存在しない場合を表わす。

Ｆｉｇ６Ｂは、ｐ６９に対する抗体応答を示しており、血清稀釈度（ｘ軸）がＯ Ｄ４５０ｎｍ（ｘ軸）に対してグラフに描かれている；このグラフにおいて、ム はｐ６９＋ＮＡＧ○を表わし、・はｐ６９のみの場合を表わし、そしてＯは対照 を表わす。

Ｆｉｇ７は、ＮＡＧＯによる細胞毒性Ｔ細胞の誘発を示しており、エフェクタ一 対ターゲット比率（ｘ軸）がインフルエンザペプチドｐ１１０により（・）、ま たはインフルエンザウィルスＰＲ８により（−）パルスされている、あるいは抗 原によってパルスされていない、洗剤溶解した細胞から放出された総５ＩＣｒの パーセンテージに対してグラフに描かれている。

Ｆｉｇ８Ａはバクロウィルス系（ｇｐ　Ｉ　２０　ｂａｃ）において、ＮＡＧＯ またはＦＣＡにより発現された、Ｈｒｖｇｐｔ２０により免疫付与したマウスか らのＴ細胞の応答を示している。ｇｐ１２０の濃度（μｇ／ｆｆ１１、ｘ軸）が 、リンパ球ＤＮＡ合成（”Ｈ−ＴｄＲ配合、ｃｐｍＸ　Ｉ　Ｏ−’ｓｅ　；ｘ軸 ）に対してグラフに描かれており、・はｇｐ１２０−ｂａｃにより再刺激された ｇｐｌ　２０　ｂａｃ＋ＮＡＧｏを表わし、ムはチャイニーズハムスター卵巣細 胞で発現したｇｐｌ　２０　（ａｐｌ　２０　ＣＨＯ）により再刺激されたｇｐ １２０ｂａｃ＋ＮＡＧ○を表わし、閣はｇｐｌ　２０　ｂａｃにより再刺激され たｇｐｌ　２０ｂａｃ　＋ＦＣＡを表わし、ムはｇｐ１２０ＣＨＯにより再刺激 されたｇｐｌ　２０　ｂａｃ十ＦＣＡを表わし、△はｇｐｌ　２０　ｂａｃによ り再刺激されたｇｐｘ　２０　ｂａｃを表わし、そしてＯはｇｌ）１２０ｃＨｏ により再刺激されたｇｐｌ　２０　ｂａｃを表わす。

Ｆｉｇ８Ｂはｇｐ１２０ｃＨｏで免疫付与されたマウスからのＴ細胞のＮＡＧＯ またはＦＣＡによる応答を示している。ｇｐ１２０の濃度（μｇ／ｍ１１ｘ軸） がリンパ球ＤＮＡ合成（’Ｈ−ＴｄＲ配合、ｃｐｍＸ　１０−”ｓｅ、　ｘ軸） に対してグラフに描かれており、・はｇｐ１２０ｃＨｏにより再刺激されたｇｐ ｌ　２０ＣＨＯ＋ＮＡＧＯを表わし、マ＋ｔｇｐｔ　２０　ＣＨＯＧ：より再刺 激されたｇｐ１２０ｃＨ０十ＮＡＧＯを表わし、■はｇｐ１２０ｃＨｏにより再 刺激されたｇｌ）１２０ＣＨＯ＋ＦＣＡを表わし、ムはｇｐ１２０ｂａｃにより 再刺激されたｇｐｌ　２０ＣＨＯ＋ＦＣＡを表わし、△＋ｔｇｐｔ　２０　ＣＨ ＣＮ：：より再刺激されたｇｐ１２０ｃＨＯを表わし、そしてＯはｇｐｌ　２０ 　ｂａｃにより再刺激されたｇｐ１２０ｃＨ○を表わす。

Ｆｉｇ９Ａは、ｇｐ１２０ｃＨｏに対する抗体応答を示しており、血清稀釈度（ ｘ軸）が０Ｄ４５０（ｘ軸）に対してグラフに描かれている。このグラフにおい て、■はＮＡＧＯ＋ｇｐｌ　２０ＣＨＯを表わし、口はＦＣＡ＋ｇｐ１２０ＣＨ Ｏを表わし、ムはＮＡＧＯ＋ｇｐ１２０ＣＨＯを表わし、△はアルム＋ｇｐ１２ ０ｃＨｏを表わし、Ｏはｇｐ１２０ＣＨＯのみの場合を表わし、そして・は抗原 が存在しない場合を表わす。

Ｆｉｇ９Ｂは、ＦＣＡ　（１）　、サポニン（ＩＩ）　、ＮＡＧＯ（ＩＩＩ）、 アルム（ｍおよびアジュバントなしくＶ）に係るＩｇＧ抗体力価を比較するもの である。

ＦｉｇｌＯは、主要マラリア部分接合体表面抗原（γＰＭＭＳＡ）に対する、Ｎ ＡＧＯｌＦＣＡ、サポニンまたはアルムによるＴ細胞ブライミングを示している 。γＰＭＭＳＡの濃度（μｇ／ｍＬ　ｘ軸）がリンパ球ＤＮＡ合成（”Ｈ−Ｔｄ Ｒ配合、ｃｐｍＸ　１０−”ｓｅ、　ｘ軸）に対してグラフに描かれており、ム はＮＡＧＯ＋γＰＭＭＳＡを表わし、■はＦＣＡ十γＰＭＭＳＡを表わし、・は サポニン＋γＰＭＭＳＡを表わし、口はアルム＋γＰＭＭＳＡを表わし、△はγ ＰＭＭＳＡのみの場合を表わし、そしてＯは抗原が存在しない場合を表わす。

Ｆｉｇｌｌは、γＰＭＭＳＡに対する抗体応答を示しており、血清稀釈度（ｘ軸 ）が０Ｄ４５０（３’軸）に対してグラフに描かれている；このグラフにおいて 、△はＮＡＧＯ＋γＰＭＭＳＡを表わし、ムはＦＣＡ＋γＰＭＭＳＡを表わし、 マはサポニン＋γＰＭＭＳＡを表わし、■はアルム＋γＰＭＭＳＡを表わし、Ｏ はγＰＭＭＳＡのみの場合を表わし、そしてＯは抗原が存在しない場合を表わす 。

Ｆｉｇ１２は、メニンゴコッカル（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）ワクチンＭＢ ６４００に対する抗体応答を示している。メニンゴコッカル多糖類に対する特異 抗体（μｇ／血清ｍｌ）が、（１）’７クチ：ｚ＋ＮＡＧｏ、（ＩＩ）’７クチ ン＋アルヒドロゲル、（ＩＩＩ）’７クチンノみ、（ＩＶ）Ｎ　Ａ　Ｇ　Ｏ（７ ）み、（ｖ）ワクチン＋ＧＯ１（Ｖ［）ワクチン＋１時間先に与えたＮＡＧＯお よび（ｖｔｒ＞免疫付与しない場合に関して記録されている。

Ｆｉｇ１３Ａは、ＮＡＧＯｌＦＣＡ、サニポンまたはアルムによる、細胞毒性Ｔ ＩＢ胞の誘発を比較するものであり、エフェクタ一対ターゲット細胞比（ｘ軸） が、（ａ）インフルエンザウィルスＰＲ８または（ｂ）インフルエンザＡの核タ ンパク質の残基２１６−２２９に結合したインフルエンザＡの核タンパク質のア ミノ酸残基１４７−１６９からなるハイブリドペプチド、によりパルスされてい るか、あるいは未処理の（Ｃ）細胞の特異的溶解（ｓＩＣｒ放出、ｙｏ；ｘ軸） に対してグラフに描かれている。この図において、ムは生きているウィルスの感 染を表わし、・はＮＡＧＯ＋バイブリドペプチドを表わし、ＯはＦＣＡ＋ハイブ リドペプチドを表わし、口はサポニン＋ハイブリドベブチドを表わし、■はアル ム＋ハイブリドペプチドを表わし、モして△はアジュバントのみの場合を表わす 。

Ｆｉｇ１３Ｂは免疫付与したマウスにおける、細胞毒性Ｔ細胞発現に係る増殖応 答を示すものである。Ｆｉｇ１３Ｂにおいては、ペプチド濃度（μｇ／ｍｌ、Ｘ 軸）がリンパ球ＤＮＡ合成（”Ｈ−ＴｄＲ配合、ＣｐＯＩＸ　１０−’ｓｅ、ｙ 軸）に対してグラフに描かれており、Ａはハイブリドペプチドに対する応答を表 わし、ＢはインフルエンザＡ核タンパク質アミノ酸残基２１６−２２９からなる ヘルパーＴ細胞ペプチドに対する応答を表わし、ＣはインフルエンザＡ核タンパ ク質アミノ酸残基１４７−１６９からなる細胞毒性Ｔ細胞エビトープペプチドに 対する応答を表わし、・はＮＡＧＯ＋ハイブリドペプチドを表わし、口はサポニ ン＋ハイブリドペプチドを表わし、ＯはＦＣＡ＋ハイブリドベブチドを表わし、 園はアルム＋ハイブリドベブチドを表わし、モして△はアジュバント単独を表わ す。

Ｆｉｇ１４Ａは、インフルエンザＡ核タンパク質の免疫優性アミノ酸残基２６０ −２８３からなるペプチドにより免疫付与されたマウスからのＴ細胞応答を示す ものである。ペプチドの濃度（μｇ／ｍｌ、　ｘ軸）がリンパ球ＤＮＡ合成（’ Ｈ−ＴｄＲ配合、ｃｐ［ＩＩＸ　Ｉ　Ｏ−’ｓｅ　；　ｙ軸）に対してグラフに 描かれており、■はペプチド十ＮＡＧＯ（ただし、このＮＡはクロストリジウム ペルフリンゲ（ただし、このＮＡはビブリオコレラエに由来する）を表わし、・ はペプチド＋Ｇｏを表わし、口はペプチドのみの場合を表わし、そしてＯは抗原 が存在しない場合を表わす。

Ｆｉｇ１４Ｂは、ＮＡ：ＧＯの濃度を単位／ｍｌで比較するものであり、単位／ ｍ１（ｘ軸）がリンパ球ＤＮＡ合成（’Ｈ−ＴｄＲ配合、ｃｐｍＸ　１０−’ｓ ｅ　；　ｙ軸）に対してグラフに描かれている。このグラフにおいて、ムは抗原 ０、１　ｔ、ｔ　ｇ／ｍｌを表わし、△は抗原０．４μｇ／ｍｌを表わし、■は 抗原１．６μｇ／ｍｌを表わし、口は抗原６μｇ／ｍｌを表わし、・は抗原２５ μｇ／ａ＋１を表わし、モしてＯは抗原１００μｇ／ｍｌを表わす。

Ｆｉｇｌ　４　Ｃｉ；！　１　：　３（７）ＮＡ　：　Ｇｏ（７）固定比率にお いて、リンパ球ＤＮＡ合成（、’Ｈ−ＴｄＲ配合、ｃｐｍＸ　１０−’５ｅｒｙ 軸）がＮＡ　二Ｇｏの濃度（単位／ｍｌ；ｘ軸）により如何に変化するかを示し ている。

Ｆｉｇ１４Ｄおよび１４Ｅはそれぞれ、ＮＡ濃度および００１１度（単位／ｍｌ 、ｘ軸）によって、リンパ球ＤＮＡ合成（”Ｈ−ＴｄＲ配合、ｃｐｍＸ　１０− ’ｓｅ　；　ｙ軸）が如何に変わるかを示している。

例　ｌ ノイラミニダーゼ／ガラクトースオキシダーゼ物質のアジュバント効果および方 法 限局性リンパ結節におけるＴ細胞ブライミング。マウスを、その尾基底部の背側 に、抗原を皮下注射することによって免疫付与した。７日後に、限局性遠位（ソ ケイ部）リンパ結節を無菌下に、取り出した。組織をおだやかにホモジネートし 、細胞を４Ｘ１０’細胞／ｍｌの濃度で、０，５％正常マウス血清含有クリック （Ｃ１ｉｃｋ）の培地に再懸濁することによって、リンパ結節細胞の中の１個の 細胞の懸濁液を調製した。この懸濁液の一定量ｌＯＯμｍを９６のくぼみを有す る微量滴定プレートの各くぼみに入れ、抗原含有培養液１００μｍを次いで加え た。

３日後に、培養物を３Ｈ−チミジン（Ｉ１１ｃｉ／＜ぼみ）によりパルス処理し た。さらに１８時間後に、細胞をガラスマイクロファイバーフィルターに採取し 、ＤＮＡ中へのチミジン取り込みの程度を液体シンチレーションスベクトロスコ ーピイによって測定した。

抗体応答。尾の基底部の背側に、抗原を皮下注射することによって、マウスに免 疫付与した。２１日後に、動物から採血し、血清をＥＬＩＳＡにより抗体に関し て検査した。９６個のくぼみを存する平底のプレートを１００μｍ量の炭酸塩緩 衝液（ｐＨ９，６）中の抗体で、２４時間、４°Ｃにおいて被覆し、その後で、 このプレートを３回洗浄した。プレートを、リン酸塩緩衝した塩類溶液中の０． ２％カゼインにより遮へいした（２００μＩ／くぼみ、３７°で２時間、引続い て２回洗浄）。０．０５％ｔｗｅｅｎ　８０および１０％ＦＣＳを含有するＰＢ Ｓ中に稀釈した血清試料を加え（１００μＩ／＜ぼみ）、次いで３７°で２時間 、インキュベートした。これらのプレートを次いで、３回洗浄した。抗マウス免 疫グロブリン抗体に、同一稀釈緩衝液中の種々の濃度（市販品の１／１００−１ ／３ｏｏ）で、結合させた西洋ワサビパーオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏ、　Ｐｏｏｌｅ　Ｄｏｒｓｅｔ、英国）を次いで加え（１００μ Ｉ／＜ぼみ）、これらのプレートを次いで、３７°で１−２時間インキュベート した。プレートを次いで、３回洗浄した。同一稀釈緩衝液中の種種の濃度（市販 品の１／１００〜１／３００）で、抗マウス免疫グロブリン抗体に結合させた西 洋ワサビパーオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　Ｐｏｏｌ ｅ　Ｄｏｒｓｅｔ、英国）を次いで加え（１００μＩ／＜ぼみ）、プレートを次 いで３７°で１−２時間インキュベートした。プレートは次いで３回洗浄した。

酢酸塩緩衝溶液中にテトラメチルベンジジンおよび過酸化水素を含有する基質溶 液を次いで、加え（１００μＩ／くぼみ）、プレートを２０°Ｃで１０−３０分 間、インキュベートした。反応は１Ｍ硫酸の添加によって止めた。次いで、４５ ０ｎｍにおけるＯＤを、自動式プレートリーダーによって測定した。プライムさ れたマウスの追加免疫を静脈投与によって行ない、７〜１２日後に血液試料を採 取した。

結果 ｌａ　Ｔ細胞ブライミング：ＮＡＧＯキーホールリンペットヘモシアニン Ｆ’１ｇ１Ａノデータハ、ＮＡＧＯをＡｇと混合し、単衣皮下投与した場合の、 ５００μｇキーホールリンペットヘモシアニン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏ、　Ｐｏｏｌｅ　Ｄｏｒｓｅｔ）に対する応答に係るＮＡＧＯ（２，５ｕ ＮＡ＋５　ｕＧｏ）の効果を示している。

１ｂおよびｃＴ細胞ブライミング：ＮＡＧＯおよびインフルエンザペプチド１６ ７ ＦｉｇｌＢのデータは、インフルエンザＡの核タンパク質からのペプチド（１６ ７）（これはＢＩＯＳマウスにおけるＮＰに対する主要Ｔ細胞認識抗原であると 定義される）に対する応答に係るＴ細胞ブライミングの、同一の衝撃的増強を示 している。同一程度の増強が、２００倍高い純度を有するアフイニテイ精製ＮＡ を使用して見い出された（ＦｉｇｌＣ）。粗製品質のＮＡから調製したＮＡＴＯ の加熱不活性化は、ＦｉｇｌＤに示されているように、アジュバント効果を完全 に阻害した。これらのデータは、市販品質の酵素製品中に存在する熱安定性また は熱不安定性のバクテリア夾雑物による、アジュバント効果に対する関与をいず れも、排除する。

例　２ ＮＡＧＯ１Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバントおよび水酸化アルミニウムの比較 Ｆｉｇ２のデータは、ＢＩＯＳマウスにおけるＮＰペプチド１６７に対する応答 に係るＮＡＧＯのアジュバント効果を、水酸化アルミニウムおよびＦｒｅｕｎｄ 完全アジュバント（ＦＣＡ）の場合と比較するものである。ＮＡＧＯは、アルム に対して劇的に優れており、またｉｎ　ｖｉｔｒ。

二次チャレンジに使用された高濃度の抗原の下でも、ＦＣＡよりも格別に優れて いる。

例　３ ＮＡＧＯか遺伝子的に決定される非応答性の規則を破るものではないことの証明 アジュバントとしてのＮＡＧＯの効力によって、自己抗原（すなわち、補助細胞 上のＭＨＣクラスＩＩ分子のグローブを占拠する自己ペプチド）に対する許容さ れない自己免疫応答も誘導するＮＡＧＯの可能性をもたらす。

この可能性はＦｉｇ３Ａのデータによって、はとんど否定された。すなわち、Ｆ ｉｇ３Ａのデータは、ＮＡＧＯがＢａ１ｂ／ｃマウスにおいて遺伝的に決定され る非応答性の規則を破らないことを示している。ＮＡＧＯはＢａ１ｂ／Ｃマウス におけるＢＩＯＳエピトープＮＰ　１６７に対する応答を扇動しない。これに反 して、ＮＡＧＯはこれらのマウスにおける、Ｂａ１ｂ／ｃ　Ｔ細胞エピトープＮ ＰＩ７１に対して、アジュバント効果を発揮する。

例　４ 抗体応答 Ｆｉｇ４のデータは、ＢＩＯＳマウスにおけるタンパク質オボアルブミンに対す る一次抗体応答を示している。

ＮＡＧＯは、等量の抗体を含有する抗血清の稀釈に関して、アルムに比較して１ ５〜２０倍の利益を提供する。

ペプチドに対する抗体応答もまた、ＮＡＧＯによってアジュバント作用を受ける 。

例　５ ＮＡＧＯによるＨＩＶ抗原に対するＴ細胞ブライミング Ｆｉｇ５のデータは、ＨＩＶエンベロープ抗原（Ａｇ）ｇｐ１２０に対するＴ細 胞ブライミングを示している。

Ａｇのみではプライミングは生じないが、強力なアジュバント効果がＮＡＧＯに よって達成されている。ＢＩＯＳマウスに、その尾の基底部に、ｇｐ１２０（バ クロウィルスから）１μｇを、標準用量のＮＡＧＯとともに、またはＮＡＧＯを 投与することなく、皮下に投与した。７日後に、限局性（ソケイ部）リンパ結節 を取り出し、このリンパ結節細胞を、指示濃度のｇｐ１２０により　堕ｖｉｔｒ ｏ再刺激した。リンパ球ＤＮＡ合成はさらに４日後に測定した。

例　６ ペルタシスのｐ６９（ベルタフチン）サブユニットに対する、ＮＡＧＯによるＴ 細胞プライミングおよび抗体応答 Ｆｉｇ６Ａのデータは、ベルタシスの９６９に対するＴ細胞ブライミングを示し ている。Ａｇのみではブライミングは生じないが、ＮＡＧＯにより強力なアジュ バント効果が得られた。ＢＩＯＳマウスには、その尾基底部からｐ６９（ビチア パストラリス＝　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒａｌｉｓから）１μｇを、標準用 量のＮＡＧＯとともに、またはＮＡＧＯを使用することなく、皮下投与した。７ 日後に、限局性（ソケイ部）リンパ結節を取り出し、このリンパ結節を特定濃度 のｐ６９によりｉｎ　ｖｉｔｒｏ再刺激した。さらに４日後に、リンパ球ＤＮＡ 合成を測定した。Ｆｉｇ６ｂのデータは、ｐ６９により免疫付与されたＢＩＯＳ マウスの血清ＩｇＧ抗体応答が、まさに同一の様相であることを示している。ｐ ６９１μｇの単衣皮下注射の後の１４日後に、血清試料を採取した。ＮＡＧＯに よって、実質的量の抗体が発現されたのに対し、Ａｇのみによっては抗体発現は 生じなかった。

例　７ 細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のＮＡＧＯによる誘発体液性免疫に加えて、細胞性エ フェクターメカニズムは、特にウィルス感染に関して、重要な防御機構である。

アルムなどの慣用のアジュバントは細胞毒性Ｔ細胞を誘発しない。これに対して 、ＮＡＧＯはこのようなＣＴＬを誘発することが見い出された。Ｆｉｇ７のデー タは、アジュバントとしてＮＡＧＯを使用して、インフルエンザペプチドにより 免疫付与されたマウスからの細胞毒性Ｔ細胞によって、ウィルス抗原を発現する ターゲット細胞が殺されることを示している。マウスには、標準用量のＮＡＧＯ とともに、ペプチドｐ１１０を皮下投与し、５週間後に、同一材料により追加免 疫付与した。さらに７週間後に、膵臓を採取し、この膵臓細胞をペプチドにより 、５日間、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ再刺激した。６時間のインキュベーション中に、タ ーゲット細胞の殺滅か測定された。この測定は、”Ｃｒの放出によって行なわれ 、洗剤溶解した細胞からの総放出パーセンテージとして表わされる。

この殺滅はエフェクタ一対ターゲット細胞比の函数として測定される。

例　８ ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）のｇｐ１２０サブユニットに対するＴｍ胞応答 におけるＮＡＧＯとＦｒｅｕｎｄ完全アジュバントとの比較 ＮＡＧＯがＨＩＶのｇｌ）１２０エンベロープ糖タンパク質サブユニツトに対す るＴ細胞ブライミングにおいて前動であることは確立されており、この観点で、 ＮＡＧＯを強力な慣用のアジュバントであるＦｒｅｕｎｄ完全アジュバント（Ｆ ＣＡ）と直接に比較した、殺したミコバクテリアを含有する非代謝性油性アジュ バントであるＦＣＡは、ヒトに使用するには過激すぎ、かつまた解消できない慢 性肉芽腫を発症させる傾向を有する。比較に際しては、バクロウィルス系（Ａｍ ｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、からのｇｐｌ　２０ 　ｂａａ）またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ　Ｌｔｄ 、からのｇｅｔ　２０　ＣＨＯ）で発現したｇｐ１２０を抗原として使用した（ 前者のｇｌ）１２０　ｂａｃはグリコジル化度が小さい）。Ｆｉｇ８Ａのデータ は、ＮＡＧＯ（１ｕＮＡ＋５ｕＧｏ）を用いて、または標準用量のＦＣＡを用い て、ｇｐｌ　２０　ｂａｃによって免疫付与された動物からのＴ細胞の応答を示 している。

マウスには、その尾基底部の背側中央に、ｇｐ１２０１μｇを皮下投与した。７ 日後に、限局性（ソケイ部）リンパ結節を標準方法により採取し、この細胞をｇ ｐ１２０ｂａＣまたはｇｐ１２０ｃＨｏによって、ｉｎ　ＶｉｔｒＯ再刺激した 。この系で、ＮＡＧＯは、ＦＣＡと比較してＴ細胞応答を明確に５〜１０倍増加 させた。同様にして、アジュバントとしてＮＡＧＯまたはＦＣＡを用いて、ｇｐ １２０ＣＨＯ１μｇにより免疫付与されたマウスのＴ細胞応答をＦｉｇ８Ｂで比 較した。Ｔ細胞はｇｐ１２０ｃＨｏまたはｇｐｌ　２０　ｂａｃのどちらかで再 刺激した。この場合にも、ＮＡＧＯはＦＣＡに比較して、２倍有利であった。

例　９ ＨＩＶのｇｐ１２０サブユニットに対する一次および二次抗体応答の誘発におけ る、ＮＡＧＯとＦｒｅｕｎｄ完全アジュバント。アルヒドロゲル（アルム）およ びサポニンとの比較 ＣＢＡマウスに、次のアジュバントの中の１種とともにｇｐｌ　２０　ＣＨＯ１ μｇを使用して、免疫付与した：アルヒドロゲル（１００μｇ）、サポニン（５ ０μｇ）またはＦＣＡ（等量のＦＣＡとともに、乳化させた５０μＩＡｇ溶液の 標準用量）。２週間後に、血清試料を採取し、グループ毎に集めた。ｇｐ１２０ に対する抗体を次いで、ＥＬＩＳＡにより測定した。Ｆｉｇ９Ａのデータは、Ｎ ＡＧＯがアルヒドロゲル（ヒト用の標準的アジュバント）に比較して格別に優れ ており、サポニンの効果に匹敵する効果を存することを示している。ＦＣＡは、 この−次応答においては、僅かに効果が高い。最初の免疫付与から１２週間後に 、ブライミングとして同一の方法（１μｇ　ｇｐ１２０ｃＨｏ＋アジュバント） を用いて、マウスを追加免疫付与した。１週間後に、血清を採取し、抗体レベル をＥＬＩＳＡによって測定した。滴定最終点がＦｉｇ９Ｂに示されている。アル ム（標準的ヒト用アジュバント）は無視できる量の抗−ｇｐ１２０抗体を生じさ せた。これに対して、ＮＡＧＯは４匹のうち２匹で、サポニンおよびＦＣＡによ ってもたらされる結果に匹敵する、高力価をもたらした。

例１Ｏ バクロウィルス由来の主要マラリア部分接合体表面抗原（γＰＭＭＳＡ）に対す るＴ細胞ブライミングにおける、ＮＡＧＯとＦｒｅｕｎｄ完全アジュバント、サ ポニンおよびアルムとの比較 Ｂ２Ｏ５マウスを、次のアジュバントとともに、マラリアワクチン候補抗原γＰ ＭＭＳＡ２μｇにより免疫付与した：アルム（１００μｇ）、サポニン（５０μ ｇ）、ＦＣＡ　（標準用量）、また１ｔＮＡＧｏ（１単位ＮＡ＋５単位Ｇｏ）。

７日後に、標準的方法によりリンパ結ｔｍ細胞を採取し、γＰＭＭＳＡにより再 刺激した。ＦｉｇｌＯのデータは、ＮＡＧＯにより、およびまたＦＣＡにより、 強力なＴ細胞ブライミングか生じたこと、およびまたこれら２種のアジュバント が広く匹敵しうるものであるのに対し、サポニンでは、弱いブライミングが生じ たのみであり、またアルムでは前章のブライミングが生じなかったことを示して いる。

例１１ γＰＭＭＳＡに対する一次抗体応答における、ＮＡＧＯとＦｒｅｕｎｄ完全アジ ュバント、サポニンおよびアルムとの比較 ＢＩＯＳマウスに、例１０に記載のとおりの４種のアジュバントの標準用量とと もに、γＰＭＭＳＡ２μｇを投与した。２週間後に、血清試料を採取した。この 場合に、ＮＡＧＯはアルムに匹敵する実質的なアジュバント効果を生じた。サポ ニンおよびＦＣＡはこの抗原に対して、さらに強い応答を示した。このデータは Ｆｉｇｌｌに示されている。

例１２ グループＢメニンゴコッカルワクチン（ＭＢ　６４００）に対する抗体応答に係 るブライミングにおける、ＮＡＧＯとアルヒドロゲルとの比較 マウスに、リン酸塩緩衝した塩類溶液中のグループＢメニンゴコッカルワクチン ＭＢ　６４．００　０．１ｍｌをアジュバントとともに、またはアジュバントを 使用することなく、−次皮下免疫付与投与した。標準用量（１００μｇ）のアル ヒドロゲルを、標準用量（ＮＡＩ単位十Ｇ。

５単位）のＮＡＧＯと比較した。一群には、このワクチンとともにＧｏ　（５単 位）を投与した。対照群には、ワクチンのみ、またはアジュバントのみを投与し た。ワクチンの投与量はそれぞれ、多糖類に共有結合したタンノくり質１０μｇ からなる。２８日後に、全部のマウスに、ワクチンをアルヒドロゲル１００μｇ とともに、二次皮下免疫付与投与した。７日後に、血清試料を採取し、酵素結合 免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって、特異抗−多糖類抗体に関して評価した 。これらの結果は、特異抗体の重量／血清の単位容積で表わされ、Ｆｉｇ１２に 示されている。ＮＡＧＯはアルヒドロゲルに比較して５倍有利な結果をもたらし た。

例１３ インフルエンザ抗原を認識する細胞毒性Ｔ細胞の誘発に係る、ＮＡＧＯとサポニ ン、アルムおよびＦｒｅｕｎｄ完全アジュバントとの比較 ＮＡＧＯはＴ細胞増殖応答の誘発に非常に強力であるが（ＦＣＡに匹敵するか、 またはＦＣＡよりも良好である）、この効力は抗体誘発に係るその効力（この効 力はＦＣＡまたはサポニンに比較して幾分劣る）に反映しない。Ｔ細胞の機能は 抗体産生を助け、ウィルス感染細胞に対する細胞毒性応答を作り出すことにある 。したがって、ＮＡＧＯによって誘発されるＴ細胞応答は細胞毒性Ｔ細胞誘発傾 向をもたらす。この点を、インフルエンザＡの核タンパク質からのペプチドを使 用して試験した。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを、この種のマウスに係る主要Ｔ−ヘルパー細胞 エピトープ（２１６−２２９）に結合したドミナント細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ） エピトープ（ａａ１４７−１６９）を含有するハイブリドペプチド１００μｇの 皮下投与により、初回抗原刺激した。各場合に、標準用量のアジュバントを使用 した（ＦＣＡＩ　：　１容積／容積、サポニン５０μｇ、アルム１００μｇまた はＮＡＧ○１単位ＮＡ＋５単位Ｇｏ）。３週間後に、同一アジュバント中の同一 用量のペプチドの皮下投与により、マウスを追加免疫付与した（ただし、ＦＣＡ 群では、肉芽腫形成応答を最低にするために、ミコバクテリアを含有していない Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュバントを投与した）。

対照マウスには、ペプチドのみ、またはアジュバントのみを投与した。全群の応 答を、生きているＡ／ＰＲ８ウィルスを鼻内感染させたマウスで比較した。

この方法は以下のとおりである二重次免疫後の少なくとも３週間の時点で、膵臓 を取り出し、この膵臓細胞を、ＰＲ８感染牌臓細胞、または同種免疫付与性ペプ チドでパルスした膵臓細胞あるいは未処置膵臓細胞により、すｖｉｔｒｏ刺激し た。５日後に、ＰＲ８ウィルスに感染しているか、またはペプチドａａ１４７− １６０　（ＣＴＬにより認識されるペプチド）によりパルスされているか、また は対照として未処置の、ラベルしたＰ８１５腫瘍細胞から放出される５１Ｃｒを 使用して、ＣＴＬ発現を測定した。９組のデータが得られる。すなわち、細胞が ３種の方法（ウィルス感染した、ペプチドパルスした、または未処置の膵臓細胞 ）でｉｎ　ＶｉｔｒＯ再刺激されており、これらの３種の方法のそれぞれについ て、ウィルス感染した。ペプチドパルスした、または未処置のＰ８１５−５細胞 からなる３種のターゲットが存在していた。

このデータはＦｉｇ１３Ａに示されている。Ａ欄は、上記３種のターゲット、す なわちウィルス感染したターゲット（ａ）、ペプチドパルスしたターゲット（ｂ ）、または未処置のターゲット（Ｃ）に対するウィルス感染した膵臓細胞による ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ刺激後の応答を示している。

Ｂ欄は、同一の３種のターゲットに対するペプチドパルスした膵臓細胞によるｉ ｎ　ＶｉｔｒＯ刺激後の刺激音示している。Ｃ欄は、同一の３種のターゲットに 対する正常膵臓細胞によるｉｎ　ＶｉｔｒＯ刺激後の刺激音示されている。

Ａｌｌのデータは、生きているウィルスによる鼻内感染が、ウィルス感染細胞に よるｉｎ　ｖｉｔｒｏ再刺激に係るＣＴＬの初回抗原刺激に関し、最も強力な方 法であることを示しており、これは予想外のことではない。しかしながら、ペプ チドによる非常に良好なブライミングがまた、ＦＣＡおよびＮＡＧＯを用いて得 られ、この２種の効果は匹敵するものである。サポニンはまた、ペプチドによる 良好な初回抗原刺激をもたらすが、効果は僅かに劣る。

ペプチドによる有意のブライミングはまた、アルムの場合にも見出されたが、こ の効果は他の３種のアジュバントよりも小さかった。同様の様相がペプチド−パ ルスしたターゲットにおいても得られた。一番下の図はＡｇ−陰性ターゲット細 胞からのＳ′クロムの非特異的放出を示している。

Ｂ欄のデータは、ペプチド−パルスした膵臓細胞によるｉｎ　ｖｉｔｒｏ再刺激 に係るＴ細胞ブライミングにおいて、ＮＡＧＯがＦＣＡ、サポニンまたはアルム よりも強力であることを示している。これは、ウィルス−パルスしたターゲット およびペプチド−パルスしたターゲットの両方による場合であった。ウィルス感 染ターゲットの場合には、ＮＡＧＯ＋ペプチドは、ペプチド−パルスした膵臓細 胞による再刺激のための最も強力なプライマーとして、生きているウィルス感染 と同等であった。Ｃ欄のデータは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ二次刺激が存在しない場合 には、存意の細胞毒性が検出されなかったことを示している。

この例で証明された細胞毒性Ｔ−リンパ球は抗−ＣＤ８抗体によって阻害される が、抗−ＣＤ４抗体によっては阻害されなかった。これらの細胞はＭＨＣクラス Ｉ陽性ターゲット細胞を溶解するが、クラスＩＩ陽性ターゲット細胞は溶解しな かった。このことは、これらが通常のクラスニー制限ＣＤ８”　ＣＴＬであるこ とを示している。

このような細胞はウィルス感染に対する防御の主要メディエータ−であるように 見える。ＮＡＧＯが生きているウィルスに感染した細胞を認識するペプチド特異 性ＣＴＬの誘発に有効なアジュバントであることに留意することも重要である。

この性質がペプチド基材ワクチンのいずれにとっても、必要であることは勿論の ことである。

免疫付与したマウスにおいて、ＣＴＬ発現に関する増殖応答をまた、追跡試験し た。この方法は上記の方法にしたがった。二次免疫付与後の３週間目に、細繊細 胞を採取した。増殖応答に係るブライミング能力はＣＴＬ応答の誘発能力と充分 に相関関係を育していた。アルヒドロゲルは、ＮＡＧＯｌＦＣＡまたはサポニン に比較して、その効果は実質的に小さかった。このデータはＦｉｇ１３Ｂに示さ れている。バイブリド（ＣＴＬ＋ヘルパー）ペプチドに対する応答はＡに示され ている。ヘルパーデターミナントのみに対する応答はＢに示されており、ＣＴＬ デターミナントのみに対する応答はＣに示されている。

明白なように、大部分の増殖応答はヘルパーデターミナントに向けられている。

例１４ 新規アジュバントＮＡＧＯの最適用量 Ｇｏ単独（５単位）のアジュバント効果を、同一用量のＧＯを下記２種の微生物 源からのノイラミニダーゼ２゜５単位と組合せた場合と比較した：クロストリジ ウムＩＯＳマウスの’ｆｌｕＮＰからの免疫優性（ｉｍｍｕｎａｄｏｍｉｎａｎ ｔ）ペプチドａａ２６０−２８３　Ｃ１１１ｇ／マウス）であった。Ｔ細胞ブラ イミングは標準法により測定した。この結果はＦｉｇ１４Ａに示されている。Ｇ Ｏ単独でも良好なアジュバント効果が生じるが、ＮＡ＋ＧＯ組合せは実質的に優 れていた。２種の異なる微生物源からのノイラミニダーゼは均等に有効であった 。

ｌ：２のノイラミニダーゼ：ガラクトースオキシダーゼの固定比率におけるＮＡ ＧＯ（ビブリオ　コレラエからのＮＡを使用）の最適用量の測定をＦｉｇ１４Ｂ に示す。

Ａｏ、７５単位＋ＧＯ１，５単位に、明白な最適値が見い出された。用量を多く した場合にアジュバント効果の減少か生じる可能性が、ｉｎ　ｖｉｔｒＯで検出 され、このデータはＦｉｇ１４Ｃ−Ｅに示されている。ＮＡＣＯの直接（Ａｇ− 独立性）分裂誘発効果（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ）を、末梢血液単核 細胞（ＰＢＭＣ）培養物にＮＡＧＯを加えることによって評価した。上記で見出 された最適値以上の１＝３ＮＡ　：　Ｇｏの固定比率で、非常に顕著な抑制が見 出された（Ｆｉｇ１４Ｃ）。ノイラミニダーゼとガラクトースオキシダーゼとを 次いで、ＰＢＭＣ増殖に対するそれらの効果に関して、別々に試験した。ＮＡの みによっては、若干の増殖が生じたが、これは用量を増加することによって、急 激に制限された（Ｆｉｇ１４Ｄ）。これに対して、ＧＯの分裂誘発効果は用量を １０単位／ｍｌまで増加しても制限されなかった（Ｆｉｇ１４Ｅ）。ノイラミニ ダーゼは用量を増加することによってその応答が制限され、ガラクトースオキシ ダーゼは制限されないことから、１００μｍ当りで、ＮＡＩ単位で＋ＧＯ５単位 の標準用量がｉｎ　ｖｉｖｏ用途に適していた。

例１５ ＮＡＧＯの非反応原性 マウスに皮下投与したＮＡＧＯは顕微鏡レンズでも見ることはできなかった。Ｎ ＡＧＯ皮下投与の顕微鏡的作用を検査するために、ＮＡＧＯとアルヒドロゲルと の比較組織学的試験を行なった。８週令の雌のマウスを使用した。第一群（６匹 のマウス）には、標準用Ｊｉ（１００μｇ）のアルヒドロゲルを皮下投与し、第 二群には標準用量（ノイラミニダーゼ１単位十ガラクトースオキシダーゼ５Ｒ位 ）のＮＡＧＯを皮下投与した。試験は２種のマウス：ＢＡＬＢ／ＣおよびＢＩＯ ３で重複して行なった。注入後の１週間目、３週間目および６週間目に、各群か ら２匹のマウスを犠牲にし、注入部位付近の組織を採取し、組織学検査用に固定 した。初めに、皮膚試料を顕微鏡検査し、存在する病巣を同定し、次いで重篤度 を尺度評価した。この後で、試料のさらに詳細な評価を行なった。この評価には 、各皮膚試料の皮下組織に存在する細胞タイプの定量およびそれらの分布パーセ ンテージが含まれる。ＮＡＧＯを与えた２匹のマウスに反応が全く示されなかっ た場合を除いて、全ての処置マウスが皮下注射部位に、極少から僅かなまでの重 篤度で、低度の反応が見られた。どちらのアジュバントを皮下注射しても生じた 、皮下組織の低度の炎症応答は、若干の線維芽細胞とともに、かつまたコラーゲ ン沈着をともなう、マクロファージ、単球、好酸球および好中球による細胞浸潤 を特徴としていた。２種の動物間の差違は明白でなく、また時間の経過にともな う病因の差異に係る明白なパターンも見られなかった。炎症応答はいずれも、非 常におだやかてあったが、ＮＡＧＯはアルヒドロゲルに比較して僅かに弱い炎症 を生じさせた。

ＮＡＧＯの反応原性に係る問題は、これらの酵素それら自体の免疫原性の程度で ある。

バクテリア由来酵素は最も普遍的な群の抗原の一つであり、初めには、正常環境 に存在する。正常なマウスの血清か、ガラクトースオキシダーゼと反応する抗体 を、そしてまたノイラミニダーゼと僅かに少ない程度で反応する抗体を検出でき るレベルで含有することが見出されたことは驚くようなことではない。標準用量 のＮＡＧＯ（マラリアＡｇ　ｒＰ　ＭＭ　Ｓ　Ａと一緒に投与した場合）は、ガ ラクトースオキシダーゼに対する抗体レベルの若干の増大のみをもたらし、かつ またノイラミニダーゼに対する抗体に関しては、はとんど検出できない増大をも たらした。最適アジュバント効果に必要な酵素量は、細胞に対する局所的作用の 可能性があるのみであるほど非常に少なく、このことは組織病理学的試験で見ら れる皮下組繊細胞浸潤で、前章の変化が存在しないことによって確認される。成 る種のバクテリア感染の期間中に、ヒトにおいて非常に高い全身レベルの微生物 由来ノイラミニダーゼが生じる。それらの病態生理学的作用は不明のままである 。

参考例１ ガラクトースオキシダーゼの活性検定 ルイジン系中において、ｐＨ６，０，２５℃で、１分間あたり１．０のΔＡ４ｚ ｇｌＩＩ＋を生じさせる。反応量＝３．４ｍｌ、１ｃｍ光路。

Ａ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、２５℃でｐＨ６，０゜（これは、０．１Ｍ 　ＫＨｚＰＯ＜溶液と０．１　ＭＫＪＰＯｎ溶液とを混合して、６．０の最終ｐ Ｈを得ることによって調製される）。

Ｂ、　０．５　（ｗ／ｖ）ｏ　−）ルイジン溶液（これは試薬品質のメタノール ｆＯｍｌ中に０−トルイジン、Ｐｒｏｄ、　Ｎｏ、　Ｔ　−３５０１、５０ｍｇ を溶解して得られる。０〜５℃で保存）。

Ｃ６染料−緩衝剤溶液 （これは、試薬Ａリン酸カリウム緩衝液１２ＱＩｌ中に試薬Ｂ、ｏ−トルイジン 、０．１　ｍｌを添加し、充分に混合することによって得られる）。

Ｄ、１０％（ｗ／ｖ）ガラクトース基質溶液（これは、脱イオン化ＨｔＯ約５． 　Ｏｍｌ中に、Ｄ（＋）ガラクトース、Ｐｒｏｄ、　Ｎｏ、　Ｇ　−０７５０， １，０ｇを溶解し、脱イオンＨｘＯにより、１０ｍ１の最終容積まで稀釈するこ とによって得られる）。

室温で２時間放置し、受腕光させる。

Ｅ、パーオキシダーゼ酵素溶液 （使用の直前に、約５プルブロガリン単位／ｍｌを含有する脱イオン化Ｈ２０中 の溶液として調製する）。

Ｆ、ガラクトース　オキシダーゼ酵素溶液（使用の直前に、約０．５単位／ｍｌ 含有冷試薬Ａ中で溶液として調製する）。

該当する場合に、上記試薬濃度はいづれも、無水分子量にもとづいている。

■夏、方法 石英またはシリカ製のキュベツト（ｌ　０ｍ光路）中に、下記のとおりにピペッ トで装入する； 試薬　Ｃ（染料−緩衝液）　１．７０ｍ１試薬　Ｄ　（ガラクトース）　１．５ ００１１試薬　Ｅ　（パーオキシダーゼ）　１．１０ｍ１反転により混合し、次 いで２５℃で平衡化する。空気を用いる適当な温度制御スペクトロホトメーター または対照として脱イオン化Ｈ３０を含有するキュベツトを使用して、一定にな るまで、Ａ４ｔ＊ｎｍを追跡検査する。下記試薬を加える： 試薬　Ｆ　（ガラクトース　オキシダーゼ）直ちに、反転により混合し、次いで Ａ４□ｎｏｔの増加を記録する。最高線状比率を使用して、Ａａｚ＊　ｎｍ／ｍ ｌを得る。

参考例２ ノイラミニダーゼ活性の単位 ノイラミニダーゼ活性の１単位は、３７°Ｃで１５分の間に、ヒト血清（フラク ション１　、　Ｄｉｓｃｈｅ）から得た糖タンパク質からのＮ−アセチルノイラ ミン酸１μｍを遊離する酵素の量に等しい（Ｎ−アセチルノイラミン酸は、５ｃ ｈｕｉｔｚｅ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９５８．　２３９．　４９０の方法によっ て測定される）。

１：３２００　１：８００　１：２００　１：５０１、事件の表示 ザ　ウェルカム　ファウンテ゛−ジョン　リミテッド４、代理人 ６−補正により増加する請求項の数 ７、補正の対象 明細書、請求の範囲及び要約書翻訳文 国際調査報告 １，１１．ｌｌｅ＋ｗｌＡ−１ｃｍ１．ｌｌ＆ＰＣＴ／ＧＯ９１１０１３９４“ ′”°”°゛′°“°”′”＠　ｏ＋＋ｅ”′“°″“°“−”″パ９°６１ｈ ＠　＠”°”°”°°゛°゛″１“゛°″″″ＩＭＵ°〃b２“るＴ”′°−” °°““− ＴＮＩＩｔｌＩｎｍ＋ｎＰａ１−電ａｎ−ζａＩｆｌ＋＋＊＊Ｑｌｌｄ−１６１ ｔｈｅ＋ｅｐａｎ＋ｅｕ＋ｓｒ＋１−噌１ｉｅｈａｒｅ＋＋翌秩磨{ｙ＠ｔｗ＊ σｗ＋ｍｎヂｍｅｅｌ１ｍａｒママ＋５ｌｉｏ＋ｗ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．抗原成分およびアジュバント成分として、ノイラミニダーゼおよびガラクト ースオキシダーゼを含有するワクチン製剤。
2. ２．ノイラミニダーゼが、ビブリオコレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ ）またはクロストリジュウムペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅ ｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）に由来するものである、請求項１に記載の製剤。
3. ３．ガラクトースオキシダーゼが、ダクチリウムデンドロイデス（Ｄａｃｔｙｌ ｉｕｍ　ｄｅｎｄｒｏｉｄｅｓ）に由来するものである、請求項１または２に記 載の製剤。
4. ４．ノイラミニダーゼ対ガラクトースオキシダーゼの比率が活性単位で、１：２ −１：１０である、前記請求項のいづれか一項に記載の製剤。
5. ５．ノイラミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼを、当該笈剤１００μｌ あたりで、それぞれ０．２−１．２活性単位および２−８活性単位の量で含有す る、前記請求項のいづれか一項に記載の製剤。
6. ６．ペプチド、タンパク質または炭水化物の抗原を含有する、前記請求項のいづ れか一項に記載の製剤。
7. ７．抗原成分が、バクテリア、菌類、原生動物、またはウイルス抗原である、前 記請求項のいづれか一項に記載の製剤。
8. ８．加熱殺滅したまたは弱体化した、全有機物ワクチンである、前記請求項のい づれか一項に記載の製剤。
9. ９．ノイラミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼを、ワクチンアジュバン トとして使用すること。
10. １０．ノイラミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼからなるワクチンアジ ュバント。