KR20030016374A - Ｈｉｖ 보조 단백질을 암호화하는 ｄｎａ 백신 - Google Patents
Ｈｉｖ 보조 단백질을 암호화하는 ｄｎａ 백신 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20030016374A KR20030016374A KR10-2003-7000154A KR20037000154A KR20030016374A KR 20030016374 A KR20030016374 A KR 20030016374A KR 20037000154 A KR20037000154 A KR 20037000154A KR 20030016374 A KR20030016374 A KR 20030016374A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- hiv
- vpu
- nef
- vif
- cells
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 139
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 82
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 title description 10
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 title description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 55
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 47
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 claims description 44
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 44
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 44
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 27
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 22
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 21
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 20
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 18
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 17
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 14
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 claims description 3
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 claims description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 34
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 134
- 101710201961 Virion infectivity factor Proteins 0.000 description 75
- 101000650854 Homo sapiens Small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing protein alpha Proteins 0.000 description 73
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 73
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 71
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 61
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 58
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 57
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 55
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 53
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 36
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 32
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 32
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 27
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 26
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 24
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 24
- 230000004044 response Effects 0.000 description 23
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 18
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 16
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 16
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 15
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 15
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 15
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 13
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 13
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 13
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 13
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 12
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 11
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 11
- 229960003150 bupivacaine Drugs 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- -1 nef Proteins 0.000 description 11
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 11
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 11
- LEBVLXFERQHONN-UHFFFAOYSA-N 1-butyl-N-(2,6-dimethylphenyl)piperidine-2-carboxamide Chemical compound CCCCN1CCCCC1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C LEBVLXFERQHONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 10
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 9
- 101710149136 Protein Vpr Proteins 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 9
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 9
- 108010061299 CXCR4 Receptors Proteins 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 8
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 7
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 7
- 101710192141 Protein Nef Proteins 0.000 description 7
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 7
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 7
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 229940090044 injection Drugs 0.000 description 6
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 6
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 5
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 101710149122 Protein Vpu Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 4
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- INWLQCZOYSRPNW-UHFFFAOYSA-N mepivacaine Chemical compound CN1CCCCC1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C INWLQCZOYSRPNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N monobenzene Natural products C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 150000003931 anilides Chemical class 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 229960002409 mepivacaine Drugs 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 108700004028 nef Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 108700026222 vpu Genes Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- NMPOSNRHZIWLLL-XUWVNRHRSA-N Cocaethylene Chemical group O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OCC)C(=O)C1=CC=CC=C1 NMPOSNRHZIWLLL-XUWVNRHRSA-N 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 229940033332 HIV-1 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 2
- 108700020147 Human immunodeficiency virus 1 vif Proteins 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 2
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N benzocaine Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001558 benzoic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229960002023 chloroprocaine Drugs 0.000 description 2
- VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N chloroprocaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1Cl VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001747 cinchocaine Drugs 0.000 description 2
- PUFQVTATUTYEAL-UHFFFAOYSA-N cinchocaine Chemical compound C1=CC=CC2=NC(OCCCC)=CC(C(=O)NCCN(CC)CC)=C21 PUFQVTATUTYEAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 2
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 2
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 2
- 229960005015 local anesthetics Drugs 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- LJQWYEFHNLTPBZ-UHFFFAOYSA-N metabutoxycaine Chemical compound CCCCOC1=C(N)C=CC=C1C(=O)OCCN(CC)CC LJQWYEFHNLTPBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950004316 metabutoxycaine Drugs 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 2
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 2
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 2
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 2
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 230000009447 viral pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- 125000000027 (C1-C10) alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182837 (R)-adrenaline Natural products 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- XFDUHJPVQKIXHO-UHFFFAOYSA-N 3-aminobenzoic acid Chemical class NC1=CC=CC(C(O)=O)=C1 XFDUHJPVQKIXHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical class NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HQFWVSGBVLEQGA-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid 3-(dibutylamino)propyl ester Chemical compound CCCCN(CCCC)CCCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 HQFWVSGBVLEQGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHSGDXCJYVZFTP-UHFFFAOYSA-N 4-ethoxybenzoic acid Chemical class CCOC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 SHSGDXCJYVZFTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000713826 Avian leukosis virus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101710149863 C-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100032976 CCR4-NOT transcription complex subunit 6 Human genes 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- MQIXMJWNEKUAOZ-KCFXOXMASA-N Cinnamoylcocaine Natural products O=C(O[C@H]1[C@H](C(=O)OC)[C@@H]2N(C)[C@H](C1)CC2)/C=C/c1ccccc1 MQIXMJWNEKUAOZ-KCFXOXMASA-N 0.000 description 1
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 108010031111 EBV-encoded nuclear antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 101710202081 FAD-linked sulfhydryl oxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108700010908 HIV-1 proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- YQKAVWCGQQXBGW-UHFFFAOYSA-N Piperocaine Chemical compound CC1CCCCN1CCCOC(=O)C1=CC=CC=C1 YQKAVWCGQQXBGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCLANYCVBBTKTO-UHFFFAOYSA-N Proparacaine Chemical compound CCCOC1=CC=C(C(=O)OCCN(CC)CC)C=C1N KCLANYCVBBTKTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010047139 Vasoconstriction Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108070000030 Viral receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940051881 anilide analgesics and antipyretics Drugs 0.000 description 1
- 235000020244 animal milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000001555 benzenes Chemical class 0.000 description 1
- 229960005274 benzocaine Drugs 0.000 description 1
- VXJABHHJLXLNMP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid [2-methyl-2-(propylamino)propyl] ester Chemical compound CCCNC(C)(C)COC(=O)C1=CC=CC=C1 VXJABHHJLXLNMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 229940013767 bupivacaine injection Drugs 0.000 description 1
- 229960003369 butacaine Drugs 0.000 description 1
- WDICTQVBXKADBP-UHFFFAOYSA-N butethamine Chemical compound CC(C)CNCCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 WDICTQVBXKADBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950009376 butethamine Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229940105270 carbocaine Drugs 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 229960003920 cocaine Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012059 conventional drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000011443 conventional therapy Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000007711 cytoplasmic localization Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- YGSFZBYOMFZJPV-UHFFFAOYSA-N isobucaine Chemical compound CC(C)CNC(C)(C)COC(=O)C1=CC=CC=C1 YGSFZBYOMFZJPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 230000001589 lymphoproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 229950007594 meprylcaine Drugs 0.000 description 1
- MQIXMJWNEKUAOZ-UYCDZTDFSA-N methyl (1s,3s,4r,5r)-8-methyl-3-[(e)-3-phenylprop-2-enoyl]oxy-8-azabicyclo[3.2.1]octane-4-carboxylate Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 MQIXMJWNEKUAOZ-UYCDZTDFSA-N 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004682 monohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 239000002687 nonaqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229960003502 oxybuprocaine Drugs 0.000 description 1
- CMHHMUWAYWTMGS-UHFFFAOYSA-N oxybuprocaine Chemical compound CCCCOC1=CC(C(=O)OCCN(CC)CC)=CC=C1N CMHHMUWAYWTMGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- OWWVHQUOYSPNNE-UHFFFAOYSA-N parethoxycaine Chemical compound CCOC1=CC=C(C(=O)OCCN(CC)CC)C=C1 OWWVHQUOYSPNNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003899 parethoxycaine Drugs 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- QXDAEKSDNVPFJG-UHFFFAOYSA-N phenacaine Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1N\C(C)=N\C1=CC=C(OCC)C=C1 QXDAEKSDNVPFJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950007049 phenacaine Drugs 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229940075930 picrate Drugs 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-M picrate anion Chemical compound [O-]C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XIMBESZRBTVIOD-UHFFFAOYSA-N piperidine-2-carboxamide Chemical compound NC(=O)C1CCCCN1 XIMBESZRBTVIOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001045 piperocaine Drugs 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 229960001896 pramocaine Drugs 0.000 description 1
- DQKXQSGTHWVTAD-UHFFFAOYSA-N pramocaine Chemical compound C1=CC(OCCCC)=CC=C1OCCCN1CCOCC1 DQKXQSGTHWVTAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 229960001807 prilocaine Drugs 0.000 description 1
- MVFGUOIZUNYYSO-UHFFFAOYSA-N prilocaine Chemical compound CCCNC(C)C(=O)NC1=CC=CC=C1C MVFGUOIZUNYYSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 229960003981 proparacaine Drugs 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 229950000332 pyrrocaine Drugs 0.000 description 1
- OYCGKECKIVYHTN-UHFFFAOYSA-N pyrrocaine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC(=O)CN1CCCC1 OYCGKECKIVYHTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 1
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 1
- 239000012132 radioimmunoprecipitation assay buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108700004030 rev Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- 229960002372 tetracaine Drugs 0.000 description 1
- GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N tetracaine Chemical compound CCCCNC1=CC=C(C(=O)OCCN(C)C)C=C1 GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 150000003673 urethanes Chemical class 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000025033 vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 101150059019 vif gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 108700026215 vpr Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150040614 vpx gene Proteins 0.000 description 1
- HLDCSYXMVXILQC-UHFFFAOYSA-N xenysalate Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=CC(C=2C=CC=CC=2)=C1O HLDCSYXMVXILQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003434 xenysalate Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
개선된 백신 및 이를 이용하는 방법이 개시되어 있다. 자가면역 질병 또는 이식을 가지는 개인들을 치료하기 위한 면역억제 조성물 및 이를 이용하는 방법이 개시되어 있다.
Description
발명의 분야
본 발명은 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 대하여 개체를 면역시키는 개선된 백신 및 방법에 관한 것으로 단백질 및 핵산 분자, 이들로 구성되는 제약 조성물, 및 이들을 이용한 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
효과적인 백신은 어떠한 유해한 부작용 또는 질병 상태로의 복귀를 유발하지 않고 장시간 지속되는 면역성을 제공해야 한다. 전통적인 백신은 살아있는 약독화, 모두 죽인 또는 살아있지 않은 숙주에 대한 병원체의 준비에 초점을 맞춰왔다. 상기 백신은 수많은 바이러스에 대한 방어적인 체액성 및 세포성 면역 반응 모두를 발생시키는데 효과적인 것으로 입증되어 왔다. 동일한 바이러스성 병원체에 대한 백신의 발달은 쉬운 과업이 아니다. 상기 과업은 병원체 및 숙주 면역 반응의 특이성에 대한 병리 생물학(pathobiology)을 포함하는 여러 가지 요인들로 인해 복잡하다. 최근에, 상기 상호작용에 관계되는 면역 성분을 이해하기 위한 새로운 도구가 이용가능하게 되었다. 상기 도구 즉, 유전자 면역법 또는 DNA 백신 접종은 넓은 범위의 병원체에 대항하는 안전하고 기능적인 백신을 발달시키기 위한 노력을 위한 독특한 자원이다.
인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1)은 후천성 면역 결핍증(AIDS)의 병원 인자(etiological agent)이다. HIV-1은 그 표적 세포에 메시지를 전달할 때 RNA를 사용하는 렌티바이러스(lentivirus)로 RNA는 표적 세포 내에서 cDNA로 전환되고 표적 세포의 핵으로 통합된다. RNA에서 cDNA로의 전환 과정에서 일어나는 높은 비율의 에러 때문에, HIV-1은 매우 돌연변이가 쉬운 바이러스로 어려운 과업에 반대하여 전통적인 백신의 발달을 만들어낸다. 유전자 면역법(전체 바이러스 게놈에 대립되는 짧은 DNA 단편이 환자를 면역시키는데 이용된다)은 상기 바이러스에 대항하여 백신접종을 하는 안전한 방법임을 증명하고 있다. 지금까지, DNA 백신은 HIV-1의 구조, 효소, 및 보조 유전자에 대항하여 발달되어 왔고, 쥐과 및 영장류 동물 내에서 면역 반응을 유도하는 그 능력이 테스트되었다. 상기 백신의 몇 가지 구성체는 페이즈 Ⅰ(phase Ⅰ) 임상실험에서 최근에 나타난다.
HIV-1에 대항한 방어에 관계되는 면역 메커니즘은 분명하지 않은 상태로 남아있다. 다양한 숙주 면역 반응의 스펙트럼에서, 세포 매개 면역의 유도는 효과적인 HIV-1 백신 후보에 특별히 중요한 요구 사항일 수 있다. 왜냐하면, 세포성 면역은 바이러스의 제거에 결정적인 역할을 할 수도 있기 때문이다. CTLs는 바이러스 입자 내에 존재하는 유전자 산물(gene products)뿐만 아니라 바이러스의 복제 중에 발현되는 모든 바이러스 유전자 산물을 타겟으로 할 수 있다. 초기의 연구는 HIV-1에 감염된 환자에서, 최초 바이러스 감염(viremia)의 컨트롤은 CD+8 T 림프구 세포성 반응의 존재와 연관되어 있다는 것을 보여주어 왔다. 게다가, HIV-1 양성이면서 장기간 진행되지 않는 개체 및 HIV-1 감염 모체에서 태어난 감염되지 않은 어린이들은 HIV-1 단백질에 대한 매우 높은 CTL 반응을 보이는데 이것은 CTL 반응의 획득이 안티 HIV-1 백신 발달의 중요한 초점이라는 사실을 암시한다. 특이적인 CTL 반응의 발달을 통한 바이러스 단백질에 대항하는 면역반응을 타겟으로 하는 것은 바이러스 생산소(viral factory)를 파괴시켜 바이러스 부하를 낮추는 것 및 그리하여 최초 바이러스 부하의 확립을 낮추는 것을 도울 수 있다.
영장류 렌티바이러스 게놈은 새로운 조절 및 보조 단백질을 암호화하는 유전자 외에 그 구조 및 효소 유전자를 포함한다. 조절유전자,tat 및 rev,그리고 보조 단백질,nef, vif, vpr, vpu, 및 vpx는 HIV-1, HIV-2, 및 SIV를 포함하는 영장류 렌티바이러스에 잘 보존되어 있다. 상기 유전자들의 잘 보존되는 본질은 그 단백질 산물이 생체 내에서의 바이러스 발병기전(pathogenesis)에 결정적인 역할을 한다는 것을 암시한다. 최근의 연구는 강화된 비리온 생산에서의 보조 유전자를 밝혀내고 및 그 보조 유전자가 HIV 감염의 발병기전의 원인임을 밝혀냈다. 상기 두 가지 사실 모두 보조 유전자가 HIV-1의 실제적인 생명 구성요소라는 견해를 지지한다. 상기 유전자 산물은 바이러스 해독틀(open reading frame)의 20%를 나타내고 생체 조건에서 면역원성이고 돌연변이 발생에 덜 민감할 가능성이 있으며, 또한 상기 유전자 산물은 백신의 발달에 중요한 타겟임을 나타낸다. HIV-1 보조 및 조절유전자에 대항하는 DNA 백신의 발달은 연구되고 있으나, 상기 유전자들이 잠재적으로 정상 세포 활동을 붕괴시킬 수 있다는 사실은 안티 보조 유전자 DNA 백신(anti-accessory gene DNA vaccines)의 발달을 더욱 복잡하게 한다.
HIV에 대항하는 백신에 대한 요구가 있다. 다른 클레이드들로부터 바이러스에 감염된 타겟 세포를 줄일 수 있는 면역 반응을 생산하는 조성물과 방법에 대한 필요성이 있다.
도면의 간단한 설명
도 1a 및 도 1b는 실시예에서 묘사된 실험으로부터 얻은 데이터를 보여준다. 도 1a는 기능적이고 약독화 된vif및nef발현 카세트에 의해 유도된 세포독성 T 림프구 활성을 연구하는 실험으로부터의 데이터를 보여준다. 도 1b는 T 세포 증식이vif, vpu, vpr및nef를 발현하는 플라스미드의 면역화에 의해 유도된 T 세포의 증식 실험으로부터의 데이터를 보여준다:
도 2a는 구성체를 묘사하고 도 2b는 실시예에서 묘사된 실험으로부터의 데이터를 보여준다. 도 2a는vif, vpu, 및 nef융합 단백질 및 단수 발현 카세트(single expression cassettes)로서 단백질 분해 분할 지점(proteolytic cleavage site)을 가지는 융합 단백질의 구성 및 디자인을 묘사한다. 도 2b는 T7 시스템을 이용한 시험관 내 번역에 따르는 VVN과 VVN-P의 발현으로부터의 데이터를 보여준다.
도 3a, 도 3b 및 도 3c는 실시예에서 묘사된 실험으로부터의 데이터를 보여준다. 도 3a는 면역침전에 의한 HeLa 세포에서의 VVN 및 VVN-P 융합 단백질의 발현 및 처리(processing)에 관련된 데이터를 보여준다. 도 3b는 생체 조건에서 VVN 및 VVN-P 융합 단백질의 세포 이하 국소화(subcellular localization)와 관련된 데이터를 보여준다. 도 3c는 VVN 및 VVN-P 항원 발현의 면역조직화학(immunohistochemical) 분석 결과를 보여준다.
도 4(A), 도 4(B) 및 도 4(C)는 재조합 Vif, Vpu 및 Nef 시험관 내에서의 자극을 하고 pVVN 및 pVVN-P로 면역화된 쥐의 비장세포(spleenocyte) T 세포 증식과 관련된 실시예에서 묘사된 실험으로부터의 데이터를 보여준다.
도 5는 pVVN 및 pVVN-P 면역화에 의해 유도되는 세포독성 T 림프구 반응과 관련된 실시예에서 묘사된 실험으로부터의 데이터를 보여준다.
도 6a 및 도 6b는 HIV-1(T 트로픽 및 이중 트로픽) 감염된 타겟에 대항하는 pVVN 및 pVVN-P 면역화에 의해 유도되는 세포독성 T 림프구 반응 및 VVN 및 VVN-P 발현 구성물로 면역된 쥐로부터 분리된 비장세포에 의해 유도된 크로스 클레이드 CTL 반응과 관련된 실시예에서 묘사된 실험으로부터의 데이터를 보여준다. 도 6a는 HIV-1(T트로픽 및 이중 트로픽) 감염된 타겟에 대항하는 pVVN 및 pVVN-P 면역화법에 의해 유도된 세포독성 T 림프구 반응과 관련된 실험으로부터의 데이터를 보여준다. 도 6b는 VVN 및 VVN-P 발현 구성물로 면역된 쥐로부터 분리된 비장세포에 의해 유도된 크로스 클레이드 CTL 반응과 관련된 실험으로부터의 데이터를 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에 이용되는 바와 같이, "HIV VVN 다단백질(polyprotein)"라는 용어는 단단백질(single protein)로서 HIV Vif, HIV Vpu 및 HIV Nef의 아미노산 시퀀스를 포함하는 다단백질을 의미한다. HIV VVN 다단백질은 하나 또는 그이상의 HIV Vif, HIV Vpu 및 HIV Nef가 약독화된 다단백질을 포함한다. HIV VVN 다단백질은 HIV Vif, HIV Vpu 및 HIV Nef가 어떠한 순서로 존재하는 다단백질을 포함한다. HIV VVN 다단백질은 구성 단백질( HIV Vif, HIV Vpu 및 HIV Nef)이 단백질 분해 분열 지점을 구성하는 아미노산 시퀀스에 한정되지 않는 비구성(non component) 단백질 시퀀스에 의해 다른 구성 단백질과 인접하거나 분리되는 다단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "HIV VVN 구성체(constructs)"라는 용어는 HIV VVN 다단백질을 암호화하는 핵산 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약독화된(attenuated)"이라는 용어는 야생형(wild type)과 면역원적으로 교차반응성(cross reactive)이지만 야생형에 비해 비기능성이거나 기능적으로 손상된 HIV 보조 단백질을 의미한다. 일반적으로, 약독화된 단백질은 기능성인 야생형 단백질에 비해 변형된 시퀀스(modified sequence)를 가지고 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 야생형과 면역원적으로 교차반응성이지만 야생형에 비해 비기능성이거나 기능적으로 손상된 변형 시퀀스를 가진 단백질을 쉽게 식별할 수 있다.
HIV 단백질 Vif는 말초 혈액(peripheral blood) 림프구, 대식세포(macrophage), 및 특정 세포 라인에서 HIV의 복제에 필수적이라고 보고되어온 23-kD 폴리펩티드이다. 변형된 형태가 야생형에 비해 비기능성이거나 기능적으로 손상된 것인지 결정하기 위해 변형된 시퀀스를 가진 Vif 단백질의 테스트를 수행하는 분석을 할 수 있다. HIV Vif의 핵산 및 아미노산 시퀀스는 잘 알려져 있고, 본 명세서에서 참고문헌으로 각각 삽입된 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov) 및 HIV 시퀀스 데이터베이스(hiv-web.lanl.gov)에서 입수될 수 있다. 약독화된 HIV Vif를 암호화하는 유전자 구성체는 본 명세서에서 참고문헌으로 삽입된 Ayyavoo V, et al(1997) AIDS 11: 1433-1444,에서 설명된 바와 같이 생산될 수 있다. HIV Vif의 바람직한 약독화형을 암호화하는 핵산 시퀀스는 SEQ ID NO:1이다:
상기 vif 유전자는 증상이 없는 HIV-1 환자로부터 분리된다. 기능성의 분석은 트랜스컴플리멘테이션(transcomplementation) 연구에서 수행되었고 그 결과는 상기 변형이 시험관 내에서 무세포(cell-free) HIV-1 감염을 지지할 수 없다는 것을 나타낸다.
HIV 단백질 Vpu는 주로 세포의 막 내부에 위치하고 있는 인테그랄 막 인단백질(integral membrane phosphoprotein)인 16-kD 폴리펩티드이다.(본 명세서에서 참고문헌으로 삽입된, Sato A., et al. Virus Gene 1990;4:303-312) HIV 감염 세포에서, 복합체는 소포체 내에서 바이러스 수용체, CD4와 바이러스 외피(envelop) 단백질사이에서 상기 구획 내로 두가지 단백질을 모두 붙잡으면서 형성된다. 그리하여 세포내 Env-CD4 복합체의 형성은 비리온의 조립을 방해한다. Vpu는 Env와 합성된 CD4 분자의 분해를 유발시킴으로써 바이러스 외피를 유리시킨다.(Willey R.L., et al, J Virol 1992;66(12):7193-7200, 본 명세서에 참고문헌으로 삽입) Vpu는 또한 감염된 세포의 표면으로부터 HIV의 분리를 증가시킨다.(Klimkait T., et al. J Virol 1990;64:621-629, 본 명세서에 참고문헌으로 삽입) 변형된 형태가 야생형에 비해 비기능적이거나 기능적으로 손상된 것인지를 결정하기 위해 변형된 시퀀스를 가지는 Vpu 단백질을 테스트하는 분석을 수행할 수 있다. HIV Vpu의 핵산과 아미노산 시퀀스는 잘 알려져 있고, 본 명세서에서 참고문헌으로 각각 삽입된 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov) 및 HIV 시퀀스 데이터베이스(hiv-web.lanl.gov)에서 입수될 수 있다. HIV Vpu의 바람직한 약독화형을 암호화하는 핵산 시퀀스는 SEQ ID NO:2이다:
HIV 단백질 Nef는 CD4의 세포 표면 발현의 하위 조절(down regulation) (Garcia J.V. & Miller A.D. Res Virol 1992;143:52-55, 본 명세서에 참고문헌으로 삽입), T 세포 활성의 동요(Luria S., et al. Proc Natl Acad Sci USA 1991;88:5326-533, 본 명세서에 참고문헌으로 삽입), 및 HIV 감염력의 자극(Miller M.D., et. al., J Exp Med 1994;179:101-103, 본 명세서에 참고문헌으로 삽입)을 포함한 여러 활성을 가지는 것으로 알려져 왔다. 변형된 형태가 야생형에 비해 비기능적이거나 기능적으로 손상된 것인지를 결정하기 위해 변형된 시퀀스를 가지는 Nef 단백질을 테스트하는 분석을 수행할 수 있다. HIV Nef의 핵산과 아미노산 시퀀스는 잘 알려져 있고, 본 명세서에서 참고문헌으로 각각 삽입된 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov) 및 HIV 시퀀스 데이터베이스(hiv-web.lanl.gov)에서 입수될 수 있다. HIV Nef의 바람직한 약독화형을 암호화하는 핵산 시퀀스는 SEQ ID NO:3이다:
장기간 진행되지 않는 환자에서 분리된 상기 Nef 클론은 CD4 세포 내 발현에서 CD4 및 MHC-1 분자를 하위 조정(down modulate)하지 않는다.
본 발명은 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 보조 단백질 Vif, Vpu, 및 Nef의 단백질 성분 시퀀스를 구성하는 다단백질에 관계되어 있다. 일부 구체예에서, 다단백질의 구성 단백질은 Vif, Vpu, 및 Nef N 말단으로부터 C 말단까지의 순서로 정렬된다. 일부 구체예에서, 각 인간 면역 결핍 바이러스 보조 단백질 Vif, Vpu, 및 Nef 단백질 성분이 약독화된 형이다.
일부 구체예에서, 단백질 분해효소 분할 지점은 다단백질의 단백질 성분들 사이에 포함되어 있다. 일부 구체예에서, 단백질 분해효소 분할 지점은 HIV 보조 단백질 Vif와 Vpu사이에 포함되어 있다. 일부 구체예에서, 단백질 분해효소 분할지점은 HIV 보조 단백질 Vpu와 Nef사이에 포함되어 있다. 일부 구체예에서, 다단백질의 성분 단백질은 Vif, Vpu, 및 Nef N 말단으로부터 C 말단으로의 순서로 정렬되고, 한 단백질 분해 효소 분할 지점은 HIV 보조 단백질 Vif 및 Vpu사이에 포함되며, 한 단백질 분해 효소 분할 지점은 HIV 보조 단백질 Vpu 및 Nef 사이에 포함된다. 일부 구체예에서, 단백질 분해 효소 분할 지점은 REKRAVVG(SEQ ID NO:4)이다. 일부 바람직한 구체예에서, 구성 단백질의 약독화형은 다단백질 내에 포함되어 있고, 상기 다단백질의 구성 단백질은 Vif, Vpu, 및 Nef N 말단으로부터 C 말단으로의 순서로 정렬되고, 단백질 분해 효소 분할 지점 REKRAVVG(SEQ ID NO:4)은 Vif와 Vpu 사이 및 Vpu와 Nef 사이에 포함된다.
본 발명은 HIV 보조 단백질 Vif, Vpu, 및 Nef의 단백질 구성 시퀀스를 이루는 다단백질을 암호화하는 코딩 시퀀스를 구성하는 핵산 분자에 관련된다. 일부 구체예에서, 코딩 시퀀스는 구성 단백질이 Vif, Vpu, 및 Nef N 말단으로부터 C 말단의 순서로 정렬되어 있는 다단백질을 암호화한다. 일부 구체예에서, 코딩 시퀀스는 하나 또는 그 이상의 HIV 보조 단백질 Vif, Vpu, 및 Nef의 약독화 형을 암호화한다. 일부 구체예에서, 코딩 시퀀스는 HIV 보조 단백질 Vif, Vpu, 및 Nef 각각의 약독화형을 암호화한다. 일부 구체예에서, 단백질 분해 효소 분할 지점을 암호화하는 코딩 시퀀스는 다단백질의 단백질 성분을 암호화하는 코딩 시퀀스들 사이에 포함되어 있다. 일부 구체예에서, 단백질 분해 효소 분할 지점을 암호화하는 코딩 시퀀스는 HIV 보조 단백질 Vif 및 Vpu를 암호화하는 코딩 시퀀스 사이에 있다. 일부 구체예에서, 단백질 분해 효소 분할 지점을 암호화하는 코딩 시퀀스는 HIV 보조 단백질Vpu, 및 Nef를 암호화하는 코딩 시퀀스들 사이에 있다. 일부 구체예에서, 코딩 시퀀스는 Vif, Vpu, 및 Nef N 말단으로부터 C 말단의 순서로 정렬되어 있는 다단백질의 구성 단백질을 암호화하고, 어떤 단백질 분해 효소 분할 지점은 HIV 보조 단백질 Vif와 Vpu 사이에 포함되어 있으며, 단백질 분해 효소 분할 지점은 HIV 보조 단백질 Vpu와 Nef 사이에 포함되어 있다. 일부 구체예에서, 코딩 시퀀스는 REKRAVVG(SEQ ID NO:4)인 단백질 분해 효소 분할 지점을 암호화한다. 일부 바람직한 구체예에서, 코딩 시퀀스는 다단백질에 포함되는 구성 단백질의 약독화형을 암호화하고, 다단백질의 구성 단백질은 Vif, Vpu 및 Nef N 말단으로부터 C 말단의 순서로 정렬되며, 코딩 시퀀스는 Vif와 Vpu 사이 및 Vpu와 Nef 사이의 단백질 분해 효소 분할 지점 REKRAVVG(SEQ ID NO:4)을 암호화한다.
일부 구체예에서, 핵산 분자의 코딩 시퀀스는 실시 가능하도록 조절 인자(regulatory elements)에 연결되어 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 플라스미드이다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 플라스미드이고 핵산 분자의 코딩 시퀀스는 조절 인자에 실시 가능하도록 연결되어 있다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 재조합 백신 또는 약독화 백신의 일부로서 또는 연합되어 포함되고, 핵산 분자의 코딩 시퀀스는 조절 인자에 실시가능하도록 연결되어 있다.
본 발명은 상기 기술된 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자를 포함하는 주사 가능한 제약조성물이 포함된 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 HIV 감염에 대항하여 개인을 면역시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 앞서 기술된 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자로 구성되는 조성물을 치료 또는 예방 면역 반응을 유도하는데 효과적인 양만큼 투여하는 단계로 구성된다. 일부 구체예에서, 개인은 비감염되고, 방법은 예방적이다. 일부 구체예에서, 개인은 감염되고, 방법은 치료적이다. 일부 치료 방법은 HIV에 감염된 개인들을 식별하는 단계를 포함한다. HIV에 감염된 개인들을 식별하는 방법은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 일부 구체예에서, 개인은 다단백질이 투여된다. 일부 구체예에서 개인은 다단백질을 암호화하는 핵산 분자가 투여된다.
본 발명에 따르면, 조성물과 방법은 HIV에 대항하여 예방학적 및/또는 치료적으로 개인을 면역시킨다. 유전 물질은 개인의 세포에 의해 발현되고 면역 반응이 유도되는 것에 대항하는 면역원성 타겟이 된다. 결과 면역 반응은 폭넓게 근거를 가진다: 체액성 면역 반응에 부가하여, 세포성 면역 반응의 지류 양자 다 유도된다. 본 발명의 방법은 예방적 및 치료적 면역을 주는데 유용하다. 그리하여, 면역시키는 방법은 HIV 감염으로부터 개인을 보호하는 방법과 HIV 감염을 앓고 있는 개인을 다루는 방법을 모두 포함한다.
세포에 의해 취해졌을 때, 본 발명의 유전적 구성체는 염색체외 분자(extrachromosomal molecule)로 기능하면서 세포 내에서 존재 및/또는 세포의 염색체 DNA로 통합될 수 있다. DNA는 플라스미드 하나 또는 플라스미드들의 형태에서 별개의 유전 물질로 남아있는 세포 내로 도입될 수 있다. 양자 택일적으로, 염색체로 통합될 수 있는 선형 DNA는 세포 내로 도입될 수 있다. DNA를 세포로 도입할 때, 염색체로의 DNA 통합을 촉진하는 시약이 첨가될 수 있다. 통합을 촉진하는데 유용한 DNA 시퀀스가 DNA 분자 내에 역시 포함될 수 있다. 양자 택일적으로, RNA가 세포로 투여될 수 있다. 본 발명의 구성체를 센트로미어, 텔로미어, 및 복제 원점(origin of replication)을 포함하는 선형 미니염색체로서 제공하는 방법이 역시 고려될 수 있다.
본 발명의 유전 구성체는 핵산 분자의 유전자 발현에 필수적인 조절인자를 포함한다. 인자들은 다음을 포함한다: 프로모터, 개시 코돈, 정지 코돈, 및 폴리아데닐레이션 신호. 게다가, 인핸서가 본 발명의 단백질을 암호화하는 시퀀스의 유전자 발현에 종종 요구된다. 상기 인자들이 요구되는 단백질을 암호화하는 시퀀스에 실시 가능하게 연결되고, 조절 인자가 투여되는 개인에게 실시 가능해야 하는 것이 필수적이다.
개시 코돈 및 정지 코돈은 일반적으로 요구되는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스의 일부로 고려된다. 그러나, 상기 인자들이 유전자 구성체가 투여되는 개인에게 기능성인 것이 필수적이다. 개시와 종말 코돈은 코딩 시퀀스와 틀을 이루어야 한다.
사용된 프로모터와 폴리아데닐레이션 신호는 개인의 세포 내에서 기능성이어야 한다.
특히 인간을 위한 유전자 백신의 생산에서 본 발명을 사용하기에 유용한 프로모터의 예로 들 수 있는 것은, 시미안 바이러스(Simian virus, SV40), 마우스 매머리 종양 바이러스(Mouse Mammary Tumor Virus, MMTV) 프로모터, HIV 롱 터미널리피트(LTR) 프로모터 같은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 몰로니 바이러스(Moloney virus), ALV, CMV 즉시 초기 프로모터(CMV immediate early promoter)와 같은 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus, CMV), 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus, EBV), 라우스 사코마 바이러스(Rous Sarcoma Virus, RSV) 뿐만 아니라 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 인간 메탈로티오네인(metalothionein)과 같은 인간 유전자로부터의 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
특히 인산을 위한 유전자 백신의 생산에서, 본 발명이 실시에 유용한 폴리아데닐레이션 신호의 예로는, 인간 및 소의 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 신호, SV40 폴리아데닐레이션 신호 및 LTR 폴리아데닐레이션 신호를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 구체적으로, SV40 폴리아데닐레이션 신호라 지칭되는 pCEP4 플라스미드(Invitrogen, San Diego CA) 내의 SV40 폴리아데닐레이션 신호가 이용되었다.
DNA 발현에 필수적인 조절 인자에 부가하여, 다른 인자들이 DNA 분자 내에 포함될 수 있다. 상기 부가 인자들은 인핸서를 포함한다. 인핸서는 다음의 그룹으로부터 선택되지만 이에 한정되는 것은 아니다: 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 CMV, RSV 및 EBV로부터의 것과 같은 바이러스 인핸서.
본 발명의 유전자 구성체는 상기 구성체를 염색체 외로 유지하기 위해 포유류 복제 원점을 가질 수 있고, 세포 내에서 상기 구성체의 복수의 복제물을 생산한다. Invitrogen(San Diego, CA)로부터의 플라스미드 pCEP4 및 pREP4는 엡스타인 바 바이러스 복제 원점 및 통합(integration) 없이 높은 복제수의 에피솜 복제를 만들어 내는 핵 항원 EBNA-1 코딩 부위(nuclear antigen EBNA-1 coding region)를 포함한다.
면역법 적용에 관계되는 일부 바람직한 구체예에서, 핵산 분자들은 HIV VVN 다단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스 및 이에 부가하여 상기 타겟 단백질에 대항하는 면역 반응을 더욱 강화시키는 단백질에 대한 유전자를 제공한다. 그러한 유전자들의 예는 시토카인(cytokine) 및α-인터페론, 감마-인터페론, 성장 인자로부터 유도된 혈소판(platelet derived grwoth factor, PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, 표피 성장 인자(epidermal grwoth factor, EGF), IL-1, IL-2, IL-4. IL-6, IL-8, IL-10, ILK-12 및 B7.2와 같은 림포카인을 암호화하는 유전자들이다. 타겟 단백질에 대항하는 면역반응을 더욱 강화시키는 단백질에 대한 유전자의 이용은, 본 명세서에 참고문헌으로 삽입된, PCT 출원으로서 1999년 2월 26일 출원된 PCT/US99/04332 및 1999년 9월 2일에 공개된 International Publication No. WO 99/43839에 서술되어 있다.
단백질 생산을 극대화하기 위해, 상기 구성체가 투여되는 세포내에서 유전자 발현에 잘 적합시키는 것이 조절 시퀀스는 선택될 수 있다. 게다가, 코돈은 가장 효율적으로 세포에서 전사하는 것이 선택될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 세포 내에서 기능을 가지는 DNA 구성체를 생산할 수 있다.
본 발명의 방법은 개인의 조직(tissue)에 핵산 분자를 투여하는 과정으로 구성된다. 일부 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 근육 내로, 코 안으로, 복막 내로 (intraperatoneally), 피하로(subcutaneously), 피부 내로(intradermally), 정맥 내로(intravenously), 폐 조직으로 에어로졸 투여에 의해 또는 국소적으로 또는 질(vaginal), 직장(rectal), 요도(urethral), 구강(buccal) 및 혀밑(sublingual)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 점막 조직으로의 세척(lavage)에 의해 투여된다.
본 발명의 양상은 본 발명의 방법에 유용한 제약 조성물과 관계 있다. 제약 조성물은 핵산 분자로, 바람직하게는 개인의 세포 내에서의 발현에 필수적인 조절 인자에 실시 가능하게 연결된 하나 또는 이상의 단백질 뉴클레오티드 시퀀스로 구성되는 DNA 분자로 구성된다. 제약 조성물은 더 나아가 제약적으로 용인할 수 있는 매개체(carrier) 또는 희석액으로 구성된다. "제약의(pharmaceutical)"라는 용어는 잘 알려져 있고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 폭넓게 이해된다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "제약 조성물(pharmaceutical compositions)" 및 "주사 가능한 제약 조성물(injectable pharmaceutical compositions)"이라는 용어는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 인식되는 통상의 의미를 가진다. 제약 조성물은 무균(sterility), 발열원(pyrogen), 미립자 물질(particulate matter) 뿐만 아니라 등장성삼투압(isotonicity) 및 pH에 관한 특이적인 기준에 부합되는 것이 요구된다. 예를 들면, 주사 가능한 제약은 무균이고 발열원이 없다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 약1ng부터 약10,000μg의 DNA로 구성될 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 제약 조성물은 약2000μg, 3000μg, 4000 μg 또는 5000 μg의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 제약 조성물은 약1000μg의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 제약조성물은 약 10ng에서 약 800μg의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 제약 조성물은 약0.1에서 약500μg의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 제약 조성물은 약1에서 약350μg의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 제약 조성물은 약 25에서 약 250μg의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 제약 조성물은 약 100μg의 DNA를 포함한다.
본 발명의 유전자 구성체를 구성하는 본 발명에 따른 제약 조성물은 사용된 투여 양식에 따라 나타난다. 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 유전적 구성체를 구성하는 백신 또는 비면역원성 치료요법을 명확히 설명할 수 있다. 근육 내 주사가 투여 양식으로 선택되는 경우에, 등장 공식화가 바람직하게 이용된다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제는 염화 나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토오스를 포함할 수 있다. 어떤 경우에 인 완충 염수(phosphate buffered saline)와 같은 등장 용액이 선호된다. 안정제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다. 일부 구체예에서, 혈관 수축제(vasoconstriction agent)가 상기 공식에 부가된다. 본 발명에 따른 제약 조제는 무균이고 발열원이 없게 준비된다. 본 발명에 따른 제약 조성물은 더 나아가 예를 들면 염수(saline)같은 제약학적으로 수용 가능한 매개체 또는 운반체(vehicle)로 구성되는 운반 성분(delivery component)을 핵산 분자와 공동하여 포함한다. 핵산의 운반을 성공적으로 하게 하는 어떤 매질도이용될 수 있다. 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명에서 이용될 수 있는 다수의 제약학적으로 수용 가능한 매질을 손쉽게 이해할 것이다. 적당한 제약 매개체는 본 명세서에서 참고문헌으로 삽입된 본 발명의 분야에서 표준 참고문헌인레밍턴 파마수티컬 사이언스(Remington's Pharmaceutical Sciences),A. Osol에 서술되어 있다.
일부 구체예에서, 핵산 분자는 촉진제의 투여와 함께 세포에 운반된다. 촉진제는 또한 폴리뉴클레오티드 기능 강화제 또는 유전 백신 촉진제로서 표현되기도 한다. 촉진제는 본 명세서에서 참고문헌으로 삽입된 1998년 11월 3일 등록된 미국특허 제5,830,876호, 1997년 1월 14일 등록된 미국특허 제5,593,972호, 및 1994년 1월 26일에 출원된 국제 출원 출원번호 PCT/US94/00899호(1997년 11월 29일에 출원된 미국출원 제08/949,785호)에 서술되어 있다. 게다가, 촉진제는 본 명세서에 참고문헌으로 삽입된 1998년 4월 14일에 등록된 미국특허 제5,739,118호, 1998년 11월 17일에 등록된 미국특허 제5,837,533호, 1995년 9월 28일에 출원된 PCT/US95/12502호 및 1995년 3월 30일에 출원된 PCT/US95/04071호에 서술되어 있다. 핵산 분자와 함께 투여되는 촉진제는 핵산 분자의 투여 전후에 핵산 분자와의 혼합물로 투여되거나 또는 동시에 별개로 투여될 수 있다. 게다가, 다른 약제들은 핵산 전달 감염제(transfecting agents) 및/또는 복제제(replicating agents) 및/또는 염증제(inflammatory agents)로 기능할 수도 있고 성장 인자, 시토카인 및 α-인터페론, 감마-인터페론, 성장인자로부터 유도된 혈소판(PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, 표피 성장 인자(EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 및B7.2와 같은 림포카인 뿐만 아니라 피브로블라스트 성장 인자, 면역자극 복합체(Immune-stimulating complexes, ISCOMS), 프로이드 불완전 보강제(Freud's incomplete adjuvant), LPS 모노포스포릴 리피드 A(MPL)를 포함하는 아날로그, 뮤라밀 펩티드(muramyl peptides), 퀴논(quinone) 아날로그 및 스콸렌(squalene) 및 스콸렌 같은 소포(vesicles)와 같은 표면 활성제, 및 히알루론산(hyaluronic acid)을 포함하는 촉진제와 함께 또는 포함하지 않고 공동 투여될 수 있다. 면역시키는 방법과 관계된 구체예에서, 공작용제(채-agent)는 우선적으로 면역 반응을 강화시키는 것으로 선택된다. 면역억제(immunosuppressing)의 방법에 관계되는 구체예에서, 공작용제는 면역 반응을 강화시키지 않는 것으로 선택된다.
일부 바람직한 구체예에서, 본 발명의 유전자 구성체는 벤조산(benzoic acid) 에스테르, 아닐리드(anilides), 아미딘(amidines), 우레탄(urethanes) 및 국부 마취제 군(family)으로부터의 것과 같은 것으로부터의 염산염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 촉진제(facilitator)로 공식화하거나 상기 촉진제와 함께 투여된다.
일부 바람직한 구체예에서의 촉진제는 하기 구조식 중의 하나를 가지는 화합물일 것이다:
Ar-R
1
-O-R
2
-R
3
또는
Ar-N-R
1
-R
2
-R
3
또는
R
4
-N-R
5
-R
6
또는
R
4
-O-R
1
--R
7
여기서:
Ar은 벤젠,p-아미노벤젠,m-아미노벤젠,o-아미노벤젠, 치환된 벤젠, 치환된p-아미노벤젠, 치환된m-아미노벤젠, 치환된o-아미노벤젠, 상기 아미노벤젠 화합물에서의 아미노 그룹은 C1-C5알킬아민, C1-C5다이알킬아민이고 치환된 화합물에서의 치환기는 할로겐, C1-C5알킬 및C1-C5알콕시인 아미노일 수 있다;
R1은 C＝O;
R2는 가지 난(branched) 알킬을 포함하는 C1-C10알킬;
R3는 수소, 아민, C1-C5알킬아민,C1-C5,C1-C5다이알킬아민;
R2+ R3는 시클릭 알킬, C1-C10알킬 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 알리파틱 아킨, C1-C10알킬 치환된 시클릭 알리파틱 아민, 헤테로사이클, C1-C10알킬 N-치환된 헤테로사이클을 포함하는 C1-C10알킬 치환된 헤테로사이클;
R4는 Ar, R2또는 C1-C5알콕시, 시클릭 알킬, C1-C5알킬 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 알리파틱 아민, C1-C10알킬 치환된 시클릭 알리파틱 아민, 헤테로사이클, C1-C10알킬 치환된 헤테로사이클 및 C1-C10N-치환된 헤테로사이클을 포함하는 C1-C10알콕시 치환된 헤테로사이클;
R5는 C＝NH;
R6는 Ar, R2또는 C1-C5알콕시, 시클릭 알킬, C1-C10알킬 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 알리파틱 아민, C1-C10알킬 치환된 시클릭 알리파틱 아민. 헤테로 사이클,C1-C10알킬 치환된 헤테로사이클 및 C1-C10알킬 N-치환된 헤테로사이클을 포함하는C1-C10알콕시 치환된 헤테로사이클; 및.
R7은 Ar, R2또는 C1-C5알콕시, 시클릭 알킬, C1-C10알킬 치환된 시클릭 알킬, 시클릭 알리파틱 아민,C1-C10알킬 치환된 시클릭 알리파틱 아민, 헤테로 사이클,C1-C10알킬 치환된 헤테로사이클 및 C1-C10알킬 N-치환된 헤테로사이클을 포함하는 C1-C10알콕시 치환된 헤테로사이클임.
에스테르의 예는 다음을 포함한다: 피페로 케인(piperocaine),메프릭케인(meprylcaine) 및 이소부케인(isobucaine)과 같은 벤조산 에스테르; 프로케인(procaine), 테트라케인(tetracaine), 부테타민(butethamine), 프로폭시케인(proproxycaine) 및 클로로프로케인(chloroprocaine)과 같은 파라-아미노벤조산 에스테르; 메타부타민(metabuthamine) 및 프리마케인(primacaine)을 포함하는 메타-아미노벤조산 에스테르; 및 파레톡시케인(parethoxycaine)과 같은 파라-에톡시벤조산 에스테르. 아닐리드의 예는 리도케인(lidocaine), 에티도케인(etidocaine), 메피바케인(mepivacaine), 부피바케인(bupivacaine), 피로케인(pyrrocaine) 및 프릴로케인(prilocaine)을 포함한다. 상기의 화합물의 다른 예는 다이부케인(dibucaine), 벤조케인(benzocaine), 다이클로닌(dyclonine), 프라목신(pramoxine), 프로파라케인(proparacaine), 부타케인(butacaine), 베녹시네이트(benoxinate), 카르보케인(carbocaine), 메틸 부피바케인(methyl bupivacaine), 부타신 피크레이트(butasin picrate), 페나케인(phenacaine), 디오탄(diothan), 루케인(luccaine), 인트라케인(intracaine), 누퍼케인(nupercaine), 메타부톡시케인(metabutoxycaine), 피리도케인(piridocaine), 비페나민(biphenamine) 및 코케인(cocaine), 시나모일코케인(cinnamoylcocaine), 트럭실린(truxiiline) 및 코카에틸렌(cocaethylene)과 같은 식물에서 채취한 바이시클릭(bicyclics) 및 염산염(hydrochloride)과 합성된 모든 상기 화합물들을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 촉진제는 부피바케인이다. 부피바케인과 메피바케인 사이의 차이는 부피바케인이 메피바케인의 N-메틸 그룹 대신에 N-부틸 그룹을 가지고 있다는 점이다. 화합물들은 N, C1-C10을가질 수 있다. 화합물들은 프로케인 및 클로로프로케인과 같은 할로겐에 의해 치환될 수 있다. 아닐리드는 선호된다.
촉진제는 유전적 구성체에 우선, 동시에 또는 나중에 투여된다. 촉진제 및 유전적 구성체는 같은 성분으로 공식화될 수 있다.
부피바케인-HCl은 2-피페리딘마르복사미드(2-piperidinecarboxamide), 1-부틸-N-(2,6-디메틸페닐)-모노하이드로클로라이드(1-butyl-N-(2,6-dimethylphenyl)-monohydrochloride), 모노하이드레이트(monohydrate)로 화학적으로 표시되고, 아스트라 파마수티칼 프러덕츠(Astra Pharmaceutical Products Inc., Westboro, MA) 및 사노피 위느롭 파마수티칼(Sanofi Winthrop Pharmaceuticals, New York, NY), 이스트만 코닥(Eastman Kodak, Rochester, NY)를 포함하는 많은 출처로부터 제약 용도로 넓리 상업적으로 이용 가능하다. 부피바케인은 메틸파라벤(methyl paraben)과 함께 또는 이를 포함하지 않고, 에피네프린(epinephrine)과 함께 또는 이를 포함하지 않고 상업적으로 공식화된다. 어떠한 상기 공식도 이용될 수 있다. 본 발명에 이용 가능한 0.25%, 0.5% 및 0.75%의 농도로서 제약 용도로 상업적으로 이용 가능하다. 양자 택일의 농도, 특히 바람직한 효과를 이끌어내는 0.05%-1.0% 사이의 농도는 요구된다면 준비될 수 있다. 본 발명에 따르며, 약250μg 내지 약10mg의 부피바케인이 투여된다. 일부 구체예에서 약250μg 내지 약7.5mg이 투여된다. 일부 구체예에서, 약 0.05mg 내지 약 5.0mg이 투여된다. 일부 구체예에서, 약 0.5mg 내지 약3.0mg이 투여된다. 일부 구체예에서 약5내지 50μg이 투여된다. 예를 들면, 일부구체예에서 0.25-0.50% 부피바케인-HCl의 약50μl 내지 약2ml, 바람직하게 50μl 내지 약 1500μl 및 보다 바람직하게 약1ml 및 0.1% 메틸로파라벤이 등장 제약 매개체(isotonic pharmaceutical carrier) 내에서 백신과 같은 자리에서 백신이 투여되는 이전, 동시 또는 이후에 투여된다. 이와 비슷하게, 일부 구체예에서, 0.25-0.50% 부피바케인-HCl의 약 50μl 내지 약2ml, 바람직하게 50μl 내지 약1500μl 및 보다 바람직하게 약 1ml가 등장 제약 매개체 내에서 백신과 같은 자리에서 백신이 투여되는 이전, 동시 또는 이후에 투여된다. 부피바케인 및 다른 비슷한 작용을 하는 화합물, 특히 국부 마취제의 군과 관계 있는 것들이 세포에 의한 유전적 구성체의 섭취의 바람직한 촉진을 하는 농도에서 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 개인은 유전적 구성체의 투여에 앞서 촉진제의 주입이 먼저 되어야 한다. 그것은, 예를 들어, 유전적 구성체의 투여에 앞서는 약 일주일 내지 열흘까지 개인은 먼저 촉진제가 주사된다는 것이다. 개인은 일부 구체예에서는 약1 내지 5일, 일부 구체예에서는 24시간 유전적 구성체의 투여 이전 또는 이후에 촉진제가 주사된다. 양자 택일적으로, 모두 이용된다면, 촉진제는 유전적 구성체의 투여와 동시에, 몇분 이전 또는 이후에 투여된다. 그에 따라서, 촉진제 및 유전적 구성체는 단수의 제약 조성물을 형성하도록 결합될 수 있다.
일부 구체예에서, 유전적 구성체는 촉진제가 없이 투여된다. 그것은 유전적 구성체가 촉진제의 투여와 공동하여 투여되지 않는 투여 프로토콜을 이용하는 촉진제가 없는 공식인 것이다.
면역법에 관계되는 일부 구체예에서, 본 발명의 유전적 구성체는 약독화된생(live) 미생물 또는 재조합 미생물 벡터에서의 유전 물질 일부로 남을 것이다. 본 발명은 개선된 약독화 생백신(attenuated live vaccine) 및 VVN 다단백질 및/또는 다단백질을 암호화하는 핵산 분자를 전달하기 위해 재조합 벡터를 이용하는 개선된 백신에 관한 것이다. 약독화 생백신의 예 및 외부 항원을 전달하는 재조합 벡터를 이용하는 예는 다음 미국특허들에 서술되어 있다: 제4,722,848호; 제5,017,487호; 제5,077,044호; 제5,110,587호; 제5,112,749호; 제5,174,993호; 제5,223,424호; 제5,225,336호; 제5,240,703호; 제5,242,829호; 제5,294,441호; 제5,294,548호; 제5,310,668호; 제5,387,744호; 제5,389,368호; 제5,424,065호; 제5,451,499호; 제5,453,364호; 제5,462,734호; 제5,470,734호; 및 제5,482,713호이며, 이들 각각은 본 명세서에 참고문헌으로 삽입되어 있다. 유전자 구성체가 제공되는데, 백신을 맞는 환자에서의 발현에 영향을 미치도록 기능을 할 수 있는 조절 시퀀스에 실시 가능하게 연결되어 있는 HIV VVN 다단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함한다. 유전자 구성체는 본 발명에 따라 약독화된 생백신 및 개선된 백신을 생산할 수 있는 재조합 백신에 삽입된다. 유전자 구성체는 유전적 물질이 세포의 염색체로 통합되거나 염색체외에 남아있는 재조합 바이러스 백신 게놈의 일부일 수 있다.
본 발명의 일부 구체예는 단백질 및 그것을 이용하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 면역시키는 일부 방법에서, HIV VVN 다단백질이 개인에게 투여된다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "본 발명의 단백질(proteins of the invention)"라는 용어는 본 발명의 방법에서의 용도를 위한 비슷한 수단에 의해 각 생산될 수 있고, 그와 비슷한 방식으로 공식화되고 투여될 수 있는 HIV VVN 다단백질을 의미하도록 의도된 것이다.
본 발명의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스로 구성되는 재조합 발현 벡터를 포함하는 벡터는 일상적으로 생산될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "재조합 발현 벡터(recombinant expression vector)"라는 용어는 플라스미드, 파지, 바이러스 입자 또는 적당한 숙주에 도입되었을 때, 코딩 시퀀스의 발현을 지시하는 필수적인 유전적 요소를 포함하는 다른 벡터를 의미한다. 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 분리하거나 합성하고 표준의 기술 및 손쉽게 얻을 수 있는 출발물질을 사용하여 발현 벡터에 그것을 삽입할 수 있다. 코딩 시퀀스는 필수 조절 시퀀스에 실시 가능하게 연결되어 있다. 발현 벡터는 잘 알려져 있고 쉽게 이용 가능하다. 발현 벡터의 예는 플라스미드, 파지, 바이러스 벡터 및 다른 핵산 분자 또는 숙주세포를 변환하는데 유용한 전달체(vehicle)를 함유하는 핵산 분자를 포함하고 코딩 시퀀스의 발현을 촉진한다. 본 발명의 일부 구체예는 HIV VVN 다단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스를 구성하는 재조합 발현 벡터에 관계된다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주를 변환시키는 데 유용하다. 본 발명은 HIV VVN 다단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스로 구성되는 재조합 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명은 HIV VVN 다단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스를 포함하는 재조합 발현 벡터로 구성되는 숙주 세포에 관한 것이다. 단백질 생산을 위한 잘 알려진 재조합 발현 시스템에서의 이용을 위한 숙주 세포는 잘알려져있고 손쉽게 이용 가능하다. 숙주세포의 예는E.coli와 같은 박테리아,S.cerevisiae와 같은 효모 세포,S.frugiperda와 같은 곤충 세포, 비인간 포유류 조직 배양세포 차이니즈 햄스터 오버리(chinese hamster ovary, CHO) 세포 및 HeLa 세포와 같은 인간 조직 배양세포를 포함한다.
일부 구체예에서, 예를 들면, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 통상의 기술을 사용하여, 잘 알려진 발현 시스템에서의 이용을 위해 상업적으로 이용 가능한 발현 벡터로 DNA 분자를 삽입할 수 있다. 예를 들면, 상업적으로 이용 가능한 플라스미드 pSE420 (Invitrogen, San Diego, CA)E.coli에서 CD80△C 돌연변이 단백질의 생산을 위해 이용될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 플라스미드 pYES2(Invitrogen, SanDiego, CA)는 예를 들어,S.cerevisiae효모 스트레인에서의 생산을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 버큘로바이러스 발현 시스템을 완성하는 상업적으로 이용가능한 MAXBATM은 곤충세포에서의 생산을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 플라스미드 pcDNA I 또는 pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA)는 차이니즈 햄스터 오버리 세포와 같은 포유류 세포에서의 생산을 위해 이용될 수 있다. 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 통상의 기술 및 손쉽게 입수 가능한 출발물질을 사용하여 본 발명의 단백질을 생산하기 위해 상기 시판되는 발현벡터 및 시스템 또는 다른 것들을 이용할 수 있다. (Sambrook et al.,Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)를 참조할 것) 그리하여, 의도하는 단백질은 원핵및 진핵 시스템 모두에서 제조될 수 있고 결과적으로 단백질의 프로세스된 형태의 스펙트럼을 생기게 한다.
본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 다른 상업적으로 이용 가능한 발현 벡터 및 시스템을 이용하거나 통상의 방법 및 손쉽게 입수 가능한 출발 물질을 사용하여 벡터를 생산할 수 있다. 프로모터 및 폴리아데닐레이션 시그날과 같은, 바람직하게는 인핸서와 같은 필수 콘트롤 시퀀스를 함유하는 발현 시스템은 손쉽게 입수 가능하고 숙주의 다양성에 따라 본 발명의 기술 분야에서 알려져 있다. Sambrook et al.,Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)을 참고하라.
본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 발현벡터는 배양되고 외부 DNA의 발현이 일어나는 조건하에서 유지되는 호환성 있는 숙주를 변환시키기 위해 이용된다. 이렇게 생산된 본 발명의 단백질은 배양으로부터 세포를 용해하거나 적절하고 본 발명의 기술분야에 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 대로 배양 배지로부터 회수된다. 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 통상의 기술을 이용하여, 상기 발현 시스템을 이용하여 생산된 본 발명의 단백질을 회수할 수 있다. 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 천연원료로부터의 본 발명의 단백질을 정제하는 방법이 상기 항체를 만들어내는 방법과 같이 통상적이다. (본 명세서에 참고문헌으로 삽입된 Harlow, E. 및 Lane, E.,Antibodies:A Laboratory Manual,1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참고할 것) 상기 항체는 재조합 DNA 방법론 또는 천연 원료에 의해 생산되는 정제 단백질이 이용될 수 있다.
유전적 구성체의 예는 본 발명의 단백질을 암호화하고 상기 구성체가 감염되는 세포 라인에서 기능을 가지는 프로모터에 실시가능하게 연결된 코딩 시퀀스를 포함한다. 구성적인 프로모터(constitutive promoter)의 예는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 또는 SV40으로부터의 프로모터를 포함한다. 유도적인 프로모터(inducible promoter)의 예는 마우스 매머리 류케미아 바이러스(mouse mammary leukemia virus) 또는 메탈로티오네인 프로모터(metallothionein promoter)를 포함한다. 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 손쉽게 입수 가능한 출발 물질로부터 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA와 함께 세포에 감염시키는 데 유용한 쉽게 유전적 구성체를 생산할 수 있다. 상기 유전적 구성체는 본 발명의 단백질의 생산을 위해 유용하다.
재조합 기술에 의해 본 발명의 단백질을 생산함과 함께, 자동화된 펩티드 합성기가 본 발명의 단백질 생산을 위해 사용될 수 있다. 상기 기술은 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있고, DNA가 암호화된 단백질 생산에서 치환기를 가진 유도체(derivatives)가 제공되지 않는다면 유용하다.
본 발명의 단백질은 하기의 공개된 기술의 어느 것에 의해 제조될 수 있다. 편리하게는, 본 발명의 명세서에 참고문헌으로 삽입된Merrifield, in J. Am. Chem. Soc., 15:2149-2154(1963)에 최초로 서술된 고체상 합성 기술을 이용하여 본 발명의 단백질이 제조될 수 있다. 예를 들어, 다른 단백질 합성 기술은 본 발명의 명세서에 참고문헌으로 삽입된 M. Bodanszkyet al.,(1976)Peptide Synthesis,John Wiley & Sons, 2d Ed.; Kent and Clark-Lewis inSynthetic Peptide inBiology and Medicine,p. 295-358, eds, Alitalo, K.,et al.Science Publisher,(Amsterdam, 1985); 뿐만 아니라 본 발명의 분야에서 통상의 기술자에게 알려진 다른 참고 연구들에서 발견될 수 있다. 합성 기술의 요약은 본 발명의 명세서에 참고문헌으로 삽입된 J. Stuart 및 J.D. Young,Solid Phase Peptide Synthelia, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984)에서 발견될 수 있다. 분해(solution) 방법에 의한 합성은 본 발명의 명세서에 참고문헌으로 삽입된The Proteins, Vol. Ⅱ, 3d ED., p. 105-237, Neurath, H. et al., Eds., Academic Press, New York, NY(1976)에 서술된 대로 이용될 수 있다. 상기 합성에서의 이용을 위한 적당한 방어 그룹은 상기 텍스트뿐만 아니라 본 발명의 명세서에 참고문헌으로 삽입된 J.F.W. Mc Omie,Protective Groups in Organic Chemistry,Plenum Press, New York, NY(1973)에서 발견될 것이다.
일반적으로, 상기 합성 방법은 하나 또는 이상의 아미노산 잔기 또는 적당한 보호되는(protected) 아미노산 잔기를 자라는 펩티드 사슬에 순차적으로 첨가하는 것을 포함한다. 보통, 첫 아미노산 잔기의 아미노 그룹이든 카르복실 그룹이든 적당하고, 선택적으로 제거 가능한 보호 그룹에 의해 보호된다. 다른, 선택적으로 제거 가능한 보호 그룹은 라이신 같은 반응성 있는 사이드 그룹을 함유하는 아미노산에 이용된다.
한 예로, 고체상 합성을 이용하여, 비활성 고체 지지체에 보호되거나 유도되는 아미노산이 그의 비보호되는 카르복실 또는 아미노 그룹을 통해 붙여진다. 아미노 또는 카르복실 그룹의 보호 그룹은 선택적으로 제거되고, 적절히 보호되는 상보성의(아미노 또는 카르복실)그룹을 가지는 시퀀스에서 다음 아미노산이 혼합되고 고체 지지체에 이미 부착된 잔기와 반응한다. 아미노 또는 카르복실 그룹의 보호 그룹은 상기 새롭게 첨가된 아미노산 잔기로부터 제거되고, 다음 아미노산(적절히 보호된)은 그리고 나서 첨가되고 기타등등이다. 모든 의도된 아미노산이 적절한 시퀀스에서 연결이 된 후에, 어떠한 잔존 말단기 및 사이드 그룹 보호 그룹(그리고 고체 지지체)은 순차적으로 제거되거나 동시에, 최종 펩티드를 제공한다. 본 발명의 펩티드는 바람직하게 벤질화되거나 메틸벤질화된 아미노산이 없다. 상기 보호그룹 일부분은 합성 코스에서 이용될 수 있지만 상기 펩티드가 이용되기 전에 제거된다. 첨가 반응은 다른 데서 서술된 바와 같이, 배치(conformation)를 저지하도록 분자내 연결을 형성하기 위해 필수적일 수 있다.
일부 구체예에서, 단백질은 유전자 변환 동물(transgenic animal)에서 생산될 수 있다. 본 발명은 HIV VVN 다단백질을 암호화하는 핵산 분자 시퀀스로 구성되는 재조합 발현 벡터로 구성되는 유전자 변환 비인간 포유류에 관련된다. 재조합 단백질에 유용한 유전자 변환 비인간 포유류는 필수적인 발현 벡터 및 유전자 변환 동물을 만들어내는 기술과 같이 잘 알려져 있다. 일반적으로, 유전자 변환동물은 HIV VVN 다단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스가 코딩시퀀스가 단지 포유류 세포에서만 발현되고 재조합 단백질이 발현되고 동물의 젖으로부터 회수되는 포유류 세포에 특이적인 프로모터에 연결된 재조합 발현 벡터로 구성된다. 1989년 10월 10일에 Wagner에게 등록된 미국특허 제4,873,191호 및 1988년 4월 12일에 Leder에게 등록된 미국특허 제4,736,866호에서 기술되는 것과 같은 표준 기술을 사용하는본 발명의 분야의 통상의 기술자는 HIV VVN 다단백질을 생산하는 유전자 변환 동물을 생산할 수 있다. 바람직한 동물은 염소, 및 설치류, 특히 랫(rat)과 마우스이다.
본 발명의 단백질의 아미노산 시퀀스의 보존성 치환(conservative substitution)은 고려된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "보존성 치환"은 비슷한 구조 및/또는 전하의 특징을 공동으로 하는 다른 잔기(residue)와의 HIV VVN 다단백질의 아미노산 치환을 의미한다. 본 발명의 분야에서 통상의 기술자는 잘 알려진 보존성 그룹에 바탕을 둔 아미노산을 위한 보존성 치환과 함께 손쉽게 본 발명의 단백질을 디자인할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 활성제(active agent)가 포유류의 체내에서의 활성제의 작용 지점에 도달하도록 하는 어떤 수단에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 국부처리가 요구되는지 시스템적인 처리가 요구되는지에 따라 그리고 처리되는 분야에 따라 여러 가지 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여는 국부적(topical) (눈(ophthalmic), 질(vaginal), 직장(rectal), 코 안(intranasal), 피부(transdermal)를 포함하는), 구강의(oral) 또는 장관외(parenteral) 일 수 있다. 구강으로 투여되면 펩티드가 소화되기 쉬우므로, 구강의 조성(oral formulation)은 장으로 활성제를 덮거나 그렇지 않으면 위에서의 분해로부터 그것을 보호하도록 조성된다(예비중화(preneutralization). 모체 투여(parental administration)는 정맥 드립, 피하의, 복막 속의 또는 근육 속의 주사, 허파 투여, 예를 들어, 흡입(inhalation) 또는 흡입법(insufflation), 또는경막내(intrathecal) 또는 심실속 투여(intraventricular administration)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 모체 투여, 즉, 정맥의, 피하의, 피부를 통한, 근육내, 는 통상적으로 흡수를 적정화시키기 위해 이용된다. 정맥 투여는 주입 펌프의 보조와 함께 달성될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 에멀전으로서 조성될 수 있다.
본 발명의 기술자는 본 발명에서 이용될 수 있는 제약적으로 용인가능한 배지의 다수를 쉽게 이해할 수 있다. 적당한 제약 매개체(carrier)는 본 발명의 분야에서 표준 참고 텍스트이고 본 명세서에 참고문헌으로 삽입된Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol에 서술되어 있다. 국부 투여용 조성(formulation)은 피부를 통하는 패치(patches), 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌약(suppositories), 스프레이, 액체 및 파우더를 포함할 수 있다. 종래의 제약 매개체(parmacuetical carrier), 물의, 파우더 또는 오일 기초, 농축제(thickeners) 및 그러한 것은 필수적이거나 요구될 수 있다. 구강 투여용 조성물은 파우더 또는 그래뉼, 현탁 또는 물 속의 용액 또는 비수성(non-aqueous) 배지, 캡슐, 작은 봉지(sachets) 또는 정제(tablet)를 포함한다. 농축제, 향 보조제(flavoring agents), 희석제(dilulents), 유화제(emulsifiers), 분산 보조제(dispersing aids) 또는 결합제가 요구될 수 있다. 모체, 정맥, 경막 또는 심실 내 투여를 위한 조성물은 완충액을 포함할 수 있는 무균 수성 용액, 희석제 및 다른 적정한 첨가제를 포함할 수 있고 바람직하게는 무균 및 발열원이 없을 수 있다. 본 발명에 따른 정맥 투여를 위해 적정한 제약 조성물은 무균이고 발열원이없다. 모체 투여를 위해, 예를 들면, 본 발명의 펩티드는 제약적으로 수용가능한 모체 전달체와 공동으로 용액, 현탁, 에멀전 또는 동결 건조된 파우더로서 조성될 수 있다. 상기 매개체의 예는 물, 염수(saline), 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 세럼 알부민이다. 리포좀 및 고정상 오일(fixed oil)과 같은 비수성 매개체가 이용될 수 있다. 매개체 또는 동결건조된 파우더는 등장성삼투압(isotonicity)(e.g., 염화나트륨, 만니톨) 및 화학 안정성(e.g. 완충액 및 보존제)을 유지하는 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 조성물은 통상적으로 이용되는 기술에 의해 살균된다. 예를 들면, 주사에 의한 투여에 적정한 모체용 조성물은 0.9% 염화나트륨 용액에서 활성 성분의 무게비로 1.5%를 용해하여 조제된다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 일회분량 또는 다수의 분량으로서 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 개별적인 치료제로서이거나 다른 치료제와 혼합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 처리는 종래의 치료법과 연합할 수 있는데 순차적으로 또는 동시에 투여된다.
복용량은 특정 작용제의 약역학(pharmacodynamic) 특징 및 그것의 양식과 같은 알려진 요소 및 투여 루트에 따라 다양화된다; 나이, 건강, 및 피투여자의 몸무게; 천성, 증상의 범위, 동시 처리의 양식, 처리의 빈도 및 요구되는 효과. 치료 조성물의 조성 및 그 하위 투여는 본 발명의 분야 내의 기술이라고 인정된다. 통상, 펩티드의 복용량은 몸무게 50kg당 약 1 내지 3000mg일 수 있다; 바람직하게는 몸무게 50kg당 10 내지 1000 mg; 보다 바람직하게는 몸무게 50 kg 당 25 내지 800mg이다. 통상 8 내지 800mg이 개인에게 매일 하루에 1 내지 6회로 나눈 분량으로 투여되거나 유지되는 방출 형태(release form)로 투여되는 것이 의도하는 결과를 얻기 위해 효과적이다.
단백질을 위한 방법이나 투여되는 단백질에 따라, 본 발명의 제약 조성물은 조성될 수 있고 가장 효과적으로 투여된다. 투여 방식은 공지된 기술을 습득한 자에게 명백할 것이다.
본 발명의 방식은 인간 및 수의학(veterinary medicine) 양쪽의 분야에서 모두 유용하다. 따라서, 본 발명은 포유류, 새 및 물고기의 유전적 면역법에 관련된다. 본 발명의 방법은 사람, 소, 양(ovine), 돼지(porcine), 말(equine), 개(canine) 및 고양이(feline) 종을 포함하는 포유류 종에 특히 유용하다.
본 발명은 또한 약독화된 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 보조 단백질 Vif, Vpu 및 Nef, 특히 본 명세서에서 기술되고 설명된, 상기 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및 본 명세서에 넓게 기술된 단백질 또는 핵산으로 구성되는 백신 및 그것을 만들고 이용하는 방법에 관련된다. 일부 구체예에서, 본 발명은 Vif, Vpu 및 Nef로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 단수의 보조 단백질에 관련되고, 상기 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 관련되고 본 명세서에서 넓게 기술된 바와 같은 단수의 단백질 또는 핵산으로 이루어지는 백신 및 그것을 만들고 이용하는 것에 관련된다. 일부 구체예에서, 본 발명은 Vif, Vpu 및 Nef로 구성되는 그룹으로부터 선택된 두 보조 단백질로 이루어지는 다단백질에 관련되고 상기 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및 본 명세서에서 넓게 기술된 바와 같이 상기 다단백질 또는 핵산으로 이루어지는 백신, 그것을 만들고 이용하는 방법에 관련된다.
하기에 서술되어 있는 실시예는 본 발명의 양상의 대표예를 포함한다. 실시예들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니고 예를 제공하기 위함이다. 더구나, 본 발명의 다양한 모습은 하기의 서술에 의해 요약될 수 있다. 그러나 이것은 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니고 다양한 본 발명의 모습을 강조하기 위함이다. 본 발명의 분야에서 통상의 기술자는 쉽게 부가적인 모습 및 본 발명의 구체예를 평가할 수 있다.
실시예
HIV Vif, HIV Vpu 및 HIV Nef로 구성되는 복수의 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1) 보조 유전자를 발현하는 DNA 백신 카세트는 본 명세서에 참고문헌으로 삽입된 Ayyavoo V, (2000), AIDS 14:1-9 서술된 바와 같이 생산될 수 있다.
재료 및 방법
세포: 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 얻은 HeLa 및 NIH3T3 세포는 37℃, 5% CO2,둘베코스 모디파이드 이글스 미디움(Dulbecco's Modified Eagle's medium), 10% 소의 태아 세럼(fetal bovine serum), 1% 페니실린, 1% 스트렙토마이신 및 1% L-글루타민(L-glutamine)에서 단층으로 자랐다. ATCC로부터 얻은 p815 세포는 RPMI 1640, 10% 소의 태아 세럼, 1% 페니실린, 1% 스트렙토마이신, 및 1% L-글루타민, 37℃, 5% CO2에서 현탁 배양으로서 유지되었다. 파이토헤마플루티닌(phytohemagglutinin, PHA)-자극된 (5μg/ml) PBLs은 10% T세포 성장 인자를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 유지되었다.
복수의 면역원 발현 카세트의 발생:HIV-1vif, vpr, vpu및nef유전자는 PCR을 이용하여 개별적으로 클론되었다. 약독화된 HIV-1 보조 유전자vif(N17), vpu(M5256) 및nef(S313)는 다유전자 융합(multigene fusion) 카세트를 구성하기 위해 선택되었다. 융합 단백질 및 단백질 분해 분할 지점을 가지는 융합 단백질을 구성하기 위해, 본 발명자들은 오버랩 PCR 테크닉(overlap PCR technique)을 사용하였다. HIV-1vif, vpu및nef이 하기 프라이머를 이용하여 이러한 순서로 융합되었다.
동일한 프라이머가 8개 아미노산(REKRAVVG) (SEQ ID NO:4) 부가 단백질 분해분할 지점을 가지는vif(-) 프라이머 및vpu(-) 프라이머를 제외하고 융합단백질을 구성하기 위해 이용되었다. 증폭된 융합 유전자 산물(1.4kb)은 HinⅢ(인식 시퀀스가 외부 프라이머 쌍으로 삽입되는 지점)와 함께 소화되었고, pcDNA3 (Invitrogen, CA)로 클론되었으며, 돌연변이를 확인하고 융합 유전자의 통합을 확실히 하기 위해 시퀀스 되었다.
T7 시스템을 이용하는 융합 단백질의 시험관 내 번역: 시험관 내 전사 및 번역은 생산자의 사용설명에 따라(Promega, Madison, WI) T7 RNA 중합효소를 사용하여 1μg의 융합 단백질 발현 구성체 DNA에서 수행되었다. 시험관내 번역 반응 산물 5μl는 500μl의 방사선면역침전 분석 완충액(radioimmunoprecipitation assay buffer)과 결합되었고 토끼 항-Vif, 항-Vpu 및 항-Nef 항혈청으로 면역침전되었다. 면역침전된 산물은 12% SDS-PAGE에서 용해되었고 자가방사선상(autoradiograph)으로 되었다.
웨스턴 블롯(Western blot)(면역블롯 분석):HeLa 세포는 DOTAP (BMB, IN)을 사용하여 20μg의 pVVN 및 pVVN-P 발현 구성체로 세포 감염되었다. 세포 감염 이후 48시간동안 선택 배지(DMEM 함유 400 μg/ml 제네티신(Geneticin))에서 배분되었고 단세포 클론이 분리되었다. 발현, 기능성 및 세포의 단백질 분해효소에 의한 단백질의 적당한 분할을 분석하기 위해, 안정한 세포는 용해되었고 세포 용해질(cell lysate)은 면역침전에서 항-Vif, 항-Vpu, 및 항-Nef 항체를 이용하여이용되었고 이후 웨스턴 블롯팅되었다.
면역형광 분석:HeLa 세포는 DMEM 함유 10% FBS에서 유지되었고 폴리-L-라이신으로 코팅된 글래스 커버 슬립으로 디쉬(dish)(35mm)마다 1×106밀도에서 세포 접종되었다. 24시간 후에 상기 세포들은 vTF7-3으로 감염되었고 상기 서술된 바와 같이 세포 감염되었다. 세포 감염이후 16 내지 24시간에, 세포는 PBS로 세척되었고 90분동안 제1(primary) 항혈청(1:50)과 함께 인큐베이트되었다. PBS로 세척된 후, 커버슬립은 90분 동안 PBS에서 1:100으로 희석된 염소 항-토끼 IgG (ICN Biochemicals; CA)의 FITC-접합된 친화성 정제된 F(ab)'2 단편과 함께 인큐베이트 되었고, PBS에서 6회 세척되었다. 커버슬립은 5분동안 DAPI(PBS에서 0.1%; Sigma; St. Louis, MO)로 카운터 염색되었고, 페이드 방지(fade-resistant) 마운팅 배지(Citiflour; England)를 사용하여 슬라이드 글라스 위에 올려놓기에 앞서 다시 세척되었다. 모든 인큐베이션은 37℃, ??셔진 챔버(humidification chamber)에서 수행되었다.
CTL을 위한 hCD4 및 CCR5 또는 CXCR4를 발현하는 마우스 안정한 세포 라인의 발달:NHI3T3 세포는 DOTAP(BMB, IN)을 사용하여 hCD4 발현 벡터 및 pBabe-Fusin 또는 hCD4 및 pBabe-CCR5 발현 벡터로 공동 세포 감염되었다. 세포 감염이후 400μg/ml의 제네티신 및 2μg/ml의 퓨로마이신(puromycin)에서 48시간이 유지되었다. 안정한 세포 라인은 단세포 클론으로부터 확립되었고 플로우 시토메트리(flow cytometry)에 의해 hCD4 및 Fusin 또는 CCR5의 발현을 위해 분석되었다. 간단히 말해, 세포(5×105)는 FITC 또는 PE 라벨된 CD4, CCR5 및 Fusin에 대한 인간 mAb(Pharmingen, CA)로 1시간동안 염색되었고, FACS 완충액(1X PBS에서 3% BSA, 0.1 NaN3)으로 2X 세척되었으며, 2% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정되었고 형광 활성 세포 소터(Fluoresence Activated Cell Sorter)(Beckton Dickinson, CA)에 의해 분석되었다.
첫 번째 분리주(isolates)에 의한 바이러스 세포감염:hCD4/Fusin 및 hCD4/CCR5를 발현하는 NHI3T3 세포는 첫 번째 및 잘 특성화된 T-트로픽(pNL43) 및 이중 트로픽(89.6) 실험실 분리주에 상당하는 10-50ng의 HIV-1 p24로 세포감염되었다. 첫 번째 분리주는 또한 다른 클레이드 C, D ,E 및 A(NIH ARRPP를 통해 WHO로부터 얻은)로부터 유도된 바이러스를 포함한다. 세포의 세포감염성은 배지로 방출된 p24 항원의 측정에 의해 분석되었다. p24분석은 제조자의 사용설명에 따라 p24 캡쳐 ELISA 키트(p24 capture ELISA kit)(Counlter, FL)를 사용하여 수행되었다.
마우스들:Harlan Sprague Dawley, Inc., (Indianapolis, Indiana)로부터 6 내지 8 주된 Balb/c 암컷 마우스들을 구입하였다. 마우스들은 온도 조절되고, 빛 주기성을 가진 방에서 각각 National Institute of Health 및 University ofPennsylvania의 지침에 따라 길러졌다.
DNA 접종(inoculation):본 발명자들은 생체 내에서 플라스미드 운반된 유전자로부터 증가된 단백질 발현 레벨을 발생시키는 촉진된 DNA 접종 프로토콜을 사용하였다. 특히, Balb/c 마우스의 네 갈래 근육(quadricepsmuscles)이 27 게이지(gauge) 바늘을 사용하여 100μl의 0.25% 부피바케인-HCL(Sigma, MO)로 주사되었다. 48시간 후에, 포스페이트 버퍼 염수에서 관심이 있는 100μg의 DNA 구성체가 근육의 같은 지역에 부피바케인 주사와 같이 주사되었다. 마우스들은 한번의 주사를 맞았고 2주 후에 한번 부스트(boost)되었다. 두 번째 주사 2주 후에, 각 그룹 마우스들의 반이 그것들의 비장을 떼기 위해 희생되었고, 남은 마우스들은 적당한 DNA 구성체로 두 번째 부스트되었다.
T 헬퍼 세포 증식 분석:마우스 비장으로부터 채취된 림프구가 준비되었다. 분리주 세포 현탁액은 10% FBS 함유 RPMI 1640에서 5×106cells/ml의 농도로 다시 현탁되었다. 5×105세포를 함유하는 100μl 부분표본(aliquot)이 각 분석 레이아웃으로서 96 웰 마이크로티터 플랫 바텀 플레이트(96 well microtiter flat bottom plate)의 적당한 웰(well)로 첨가되었다. 100μl의 적당한 단백질은 10 또는 2μg/ml에서 최종 단백질 농도 5 및 1μg/ml를 각각 만들면서 세 배로서 웰에 첨가되었다. 세포들은 3일동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이트 되었다. 삼중티미딘(tritiated thymidine)의 하나의 μCi이 각 웰에 첨가되었고, 세포들은 37℃에서 12-18시간동안 인큐베이트되었다. 플레이트는 채취되었고 삽입된 삼중 티미딘의 양이 베타 플레이트 리더(beta plate reader)에서 측정되었다. 세포가 건강하다는 것을 확인하기 위해, 10μg/ml의 PHA가 폴리클로날 자극기(polyclonal stimulator) 양의 대조군(positive control)으로 이용되었다.
세포독성 T 림프구 분석:5 시간51Cr 방출 CTL 분석이 우두 감염된 타겟(vaccinia infected target) 또는 펩티드 처리된 타겟을 이용하여 수행되었다. 림프구는 비장으로부터 채집되었고 적혈구(erythrocyte)의 제거 및 신선한 배지와 함께 여러 번 세척을 함으로써 작동체 세포(effector cell)로 준비되었다. 분석은 작동체의 시험관 내 자극과 함께도 자극이 없이도 수행되었다. 시험관 내에서 자극된 분석의 경우, 작동체 세포는 1일 동안 2μg/ml 농도에서 ConcavalinA (sigma, St. Louis, MO)로 자극되었다. 작동체는 3일동안 적정한 우두-감염 또는 1μM 펩티드 처리된 p815 세포로 자극되었는데, 상기 세포는 0.1%의 글루타알데하이드(glutaraldehyde) 및 0.1M 글리신(Glycine)으로 고정되었다. 우두-감염 타겟은 5-12 시간동안 37℃에서3×106p815 세포를 감염시킴으로써 준비되었다. 타겟 세포는 100μCi/ml Na2 51CrO4로 60-120분 동안 라벨되었고 자극된 비장세포와 함께 4-6시간동안 37℃에서 인큐베이트되었다. CTL은 작동체로 테스트되었다.: 50:1 내지 12.5:1 범위의 타겟(E:T)비율. 부유물(supernatant )은 채취되었고 LKB 감마-카운터에서 카운팅되었다. 퍼센트 특이적 용해는 다음 식으로부터 결정된다: 100×｛(실험상 방출-자발적 방출)/ (최대 방출-자발적 방출)｝. 최대 방출은 5% 트리톤 X-100 포함 배지에서 타겟 세포의 용해에 의해 결정된다. 재조합 우두(vNef 및 vSC8)은 NIH AIDS Research 및 Reference Reagent Program으로부터 얻어진다.
임상 HIV-1 분리주를 사용하는 CTL은 타켓을 감염시켰음: hCD4/Fusin 또는 hCD4/CCR5를 발현하는 NIH3T3 세포가 HIV-1 실험실 및 T-트로픽 및 MΦ-트로픽 바이러스 모두를 나타내는 임상 분리주로 감염되었다. HIV-1 감염된 NIH3T3 클론은 크롬으로 라벨되었고, CTL 분석에서 타겟으로 이용되었다.
교차 클레이드 CTL 사멸:다른 클레이드로부터 분리된 HIV-1 바이러스는 hCD4/Fusin 또는 hCD4/CCR5를 발현하는 NIH3T3 세포를 감염시키기 위해 이용되었다. 감염성은 p14 항원의 측정에 의해 분석되었고 감염 세포는 CTL 분석에서 타겟으로 이용되었다.
결과
DNA 면역화를 위한 약독화된 vif, vpu, 및 nef 유전자의 구성 및 특징화:HIV-1 보조 유전자vif, vpu, 및 nef는HIV-1 양성(positive) 환자로부터 클론되었고, 그들의 기능 및 약독화를 위해 분석되었다. 상기 유전자들의 생물학적 특징화는 표 1에서 보는 바와 같이 표준 기능 분석에 뒤이어 수행되었다. 약독화된vif, vpr, vpu, 및 nef클론은 마우스에서 좀 더 면역학적 분석을하기 위해 선택되었다. 기능성 있고(야생형) 많은 비기능성(약독화된)vif, vpr, vpu 및 nef클론이 마우스를 면역화하기 위해 이용되었고 발생된 면역 반응은 측정되었다. 마우스의 그룹은 백신 구성체의 하나로 면역화되었고 추가 부스트가 15일 후에 주어졌다. 동물들은 두 번째 주사 후 두 주 후에 뒤이어 희생되었고 그것들의 비장이 세포독성 T 세포(CTL) 및 림프세포증식(lymphoproliferative) 분석에서의 이용을 위해 얻어졌다. CTL을 위한 시약(reagent)의 이용가능성 때문에, Vif를 발현하는 P815 세포 또는 우두를 발현하는 Nef로 감염된 P815가 타겟 세포로 이용되었다. 기능성이고 약독화된vif 및 nef구성체는 마우스를 면역시키는 벡터 구성체와 비교해서 항원 특이적인 CTL을 유도할 수 있다.
도 1A는 기능성 있기도 하고 약독화 되기도 한vif 및 nef구성체에의해 유도된 특이적인 CTL 활성의 퍼센트를 보여준다. 100μg의 야생형 및 약독화된vif 또는 nef발현 플라스미드가 마우스의 근육내로 투여되었다. 첫 번째 주사 2주 후, 마우스들은 각 플라스미드와 같은 양만큼 한 번 부스트되었다. 추가의 2주후에, CTL 분석은 본 발명의 방법에서 기술된 대로 면역된 마우스로부터 채취된 비장세포에서 수행되었다. 분석은 비장의 채취를 하는 날 특이적이고 무관계한 우두 감염된 타겟으로부터 크롬 방출을 측정하며 수행되었다. 단지 벡터 백본(backbone)으로 면역된 대조 그룹은 상기 배경 레벨에서 타겟 세포의 비특이적 용해를 일으킨다. 우두 발현 β-gal(vSC8)은 무관계한 타겟을 준비하기 위한 p815를 감염시키기 위해 이용되었다. 비슷한 결과는 다수의 실험에서 얻어졌다. 50:1 작동체(effector)에서: 타겟 비율,vif클론 T-37(기능성인) 및 N-17(약독화된)은 19.9 및 25%의 각 특이적인 용해를 보여준다. 상기 결과는 다른vif구성체에 의한 DNA 면역법이 항원 특이적인 CTL 반응을 유도한다는 것을 설명한다. 비슷하게, 기능성인nef클론(Nef-Mn) 및 약독화된nef클론(Nef-Hxb2)는 Nef 우두 감염된 타겟에 대항하는 특이적인 세포독성 T 세포 용해를 유도할 수 있다.
본 발명자들은 그 각각의 항원 자극과 함께 약독화된vif, vpr, vpu 및 nef클론에 의해 유도된 T 세포 증식 반응을 측정하였다. 도 1B는 T 세포 증식이vif, vpu, vpr, 및 nef를 발현하는 플라스미드의 면역화에 의해 유도된 T 세포 증식 실험으로부터의 데이터를 보여준다: 100μg의 각 cDNA 발현 카세트는 마우스에서 근육 내로 주사되었고 마우스는 2주 후에 한번 부스트되었다. 부스트 후 1주 후에, 비장세포는 2 마우스들로부터 분리되었고 보아졌고 T 세포 증식을 위해 이용되었다. 비장세포는 3일동안 5 및 1 μg/ml 재조합 단백질로 자극되었다. 하나의 μCi3H는 첨가되었고 삽입된 cpm은 카운트되었다. PHA는 양성 대조로 첨가되었다. 항원 특이적인 자극(SI)는 계산되었고 Vif, Vpu 및 Nef를 위해 제공되었다. 비슷한 결과가 적어도 세 개별 실험에서 얻어졌다. 결과는vif, vpu, 및 nef가 눈에 띄는 림프증식 반응을 유도한다는 것을 보여주고 반면 Vpr 항원에 의한 자극이 상기 분석에서 이득이 없다는 것을 보여준다. 상기 결과들 및 초기 연구로부터 입수가능한정보에 바탕을 두고, 보조 유전자 vpr은 본 연구에 다유전자(multigene) 백신 구성체의 일부로서 포함되지 않는다.
본 발명자들의 결과는 병원성 유전자는 기능성 도메인을 밝히고 그 도메인을 항원 발현의 방해 없이 약독화시킨 후에 면역원으로서 이용될 수 있다는 것을 보여준다. 다유전자 카세트의 그 이상의 구성을 위해, 본 발명자들은 약독화된vif, vpu, 및 nef클론을 사용하였다.
vif/vpu/nef 융합 단백질 카세트(pVVN) 및 vif/vpu/nef 융합 단백질의 구성 및 발현은 단백질 분해 분할 지점 (pVVN-P)을 구성한다:융합 단백질로서 보조 유전자를 함유하는 다유전자 DNA 발현 카세트를 구성하기 위해, 본 발명자들은 기초로서 약독화되었지만 아직 면역학적으로 활성이 있는vif(N17)vpu(M5256) 및nef(S313)클론을 선택하였다.vif 및 vpu의 정지 코돈은 제거되었고 틀 내에서 융합되어서 융합 단백질이 개별 유전자로서 같은 에피토프(epitope)를 가질 수 있게 하였다. 상기vif/vpu/nef융합 유전자 구성체는 pVVN으로서 알려져있다. 본 발명자들은 또한 단백질 분해 분할 지점을 가지는 pVVN-P로 지칭된vif/vpu/nef융합 단백질 발현에 의해 자연의 아미노산 카르복실 말단을 보존하기 원하였다. 도 2A는vif, vpu 및 nef융합 단백질 및 단수의 발현 카세트로서 단백질 분해 분할 지점을 가지는 융합 단백질의 구성 및 디자인을 묘사한다.vif 및 vpu의 정지 코돈은 삭제되었고 다음의 시퀀스는 틀에서 융합되었다. pVVN은 단수의 유전자로서vif, vpu 및 nef의 발현을 나타낸다; pVVN-P는vif 및 vpu와 vpu 및 nef의 사이에서 단백질분해 분할 지점을 가지는 단수의 유전자로서vif, vpu 및 nef의 발현을 나타낸다. pVVN-P 융합 단백질에서,vif 및 vpu의 정지 코돈은 제거되었고 다음의 단백질 시퀀스로부터 분할을 허용하도록 8 아미노산 세포성 단백질 분해 분할 지점(REKRAVVG)이 틀 내에서 배치되었다.
새로운 융합 구성체가 융합유전자 단백질을 생산하는 데에서 기능성인지 테스트를 하기 위해, 시험관 내 번역이 pVVN과 pVVN-p 양쪽에서 수행되었고, 뒤이어 Vif, Vpu, 및 Vef에 특이적인 항체와의 면역침전이 행해졌다. 그것들만으로, Vif, Vpu 및 Vef는 각각 24, 10 및 27 kDa 단백질로서 발현된다. pVVN과 pVVN-P 벡터의 시험관 내 번역은 세 가지 단백질에 특이적인 항체로 발견될 수 있도록 기대되는 대로 61 kDa 융합 단백질의 발현을 발생시켰다. 도 2B는 T7 시스템을 사용하는 시험관 내 번역에 뒤따르는 VVN과 VVN-P의 발현으로부터의 데이터를 보여준다. pVVN(클론#14) 및 pVVN-P(클론#2) DNA의 1μg이 시험관 내 번역 시스템에서 사용되었다. 시험관 내에서 번역된 산물은 항-Vif(aVif), 항-Vpu(aVpu) 및 항-Nef(aNef) 항체로 면역침전되었다.
HeLa 세포에서 VVN과 VVN-P 융합 단백질의 발현 및 세포 하위 국지화(localization):포유류 세포에서 VVN과 VVN-P 융합 단백질의 발현은 pVVN 및 pVVN 구성체를 발현하는 HeLa-VVN 및 HeLa-VVN-P 안정한 세포 라인을 사용하여 각각 평가되었다. DNA 벡터로 세포 감염이 된 후에, 세포들은 선택배지에서 이틀동안 성장하였고, PBS로 두 번 세척되었으며, 용해되었다. 세포 용해질(cell lysate)은 항-Vif, 항-Vpu 및 항-Nef 항체로 인큐베이트되었고, 면역침전되었으며, SDS-PAGE 겔에서 용해되었고, 면역블롯 분석을 하기 쉽게 되었다. HeLa 세포에서 pVVN의 감염은 61 kDa 융합 단백질의 발현을 야기시켰는데, 상기 발현은 모든 세 항체에 의해 탐지되었다.(데이터는 제공되지 않음.) 이와 대조적으로, pVVN-P 감염은 높은 분자량의 종뿐만 아니라 각각 항-Vif, 항-Vpu 및 항-Nef 항체에 의해 인식되는 24, 10 및 27 kDa 단백질 모두를 야기시켰다. 도 3A는 면역침전에 의한 HeLa 세포에서의 VVN 및 VVN-P 융합 단백질의 발현 및 프로세싱에 관련된 데이터를 보여준다. HeLa 세포는 하루밤 동안 pVVN-P 플라스미드로 감염되었다. 세포는 G418 셀렉션에 그것들을 배치하기 전에 정상상태에서 48시간 동안 유지되었다. G418 셀렉션은 2 주동안 수행되었고 세포는 용해되었으며, 본 발명의 재료 및 방법에서 기술된 바와 같이 항-Vif, 항-Vpu 및 항-Nef 항체로 면역침전 되었다. 면역침전은 SDS-PAGE(12%)에 의해 분석되었다. 항혈청의 자리는 맨 위에 표시되었고, 분할된 산물은 화살표로 표시되었다. 상기 결과는 기대되는 대로 pVVN의 생체 내 발현이 융합 단백질을 발생시키고 pVVN-P의 생체 내 발현이 세포 단백질 분해효소에 의해 적어도 부분적으로 분할되는 융합 단백질을 발생시키는 것을 나타낸다.
HIV-1 감염된 세포에서, Vif, Vpu 및 Nef는 세포질 막에서 정상적으로 존재한다. 상기 단백질들의 융합이 단수의 단백질로의 융합인지 그것들의 세포성 국지화를 바꾸는 단백질 분해 분할 지점을 가지는 융합 단백질로의 융합인지 확인하기 위해, 본 발명자들은 면역형광 및 면역조직화학 연구를 시험관 내 및 생체 내에서 수행하였다. HeLa 세포는 pVVN 및 pVVN-P로 세포감염되었고,vif/vpu/nef융합 단백질의 국지화 및 단백질 분해 지점을 가지는 융합단백질이 항-Vif, 항-Vpu 및 항-Nef 항체를 사용하는 간접적인 면역형광에 의해 연구되었다. 도 3B는VVN 및 VVN-P 융합 단백질의 생체 내에서의 세포하위 국지화와 관련되는 데이터를 보여준다. HeLa 세포는 재조합 우두 바이러스 v-TF7-3에 의해 감염되었고, VVN 및 VVN-P 발현 플라스미드에 의해 감염되었다. 밤새도록 감염을 시킨 후에, 세포들은 고정되고 항-Vif, 항-Vpu 및 항-Nef 혈청 및 그에 뛰따라 친화-정제 형광 이소티아시네이트-접합(isothiocynate-conjugated) 염소 항-토끼 면역글로불린 G로 염색되었다. 모든 항혈청이 토끼에게서 자라났기 때문에 단수의 면역형광에서 결합될 수 없다. DAPI, 핵 염색; FITC,는 특이적인 항혈청 염색된 세포를 나타낸다. 도 3B에서의 데이터는 Vif, Vpu 및 Vef가 융합 단백질이거나 단백질 분해지점을 가지는 융합 단백질이거나 그 야생형 세포질 국지화 패턴을 유지하는 것을 보여준다. 상기 결과는 상기 유전자들을 유합하는 것이 그 세포하위 분배 패턴을 변경하지 않는다는 것을 보여주고, 양 유전자 산물 모두가 야생형 유전자의 그것과 같이 같은 프로세스 경로에 노출되기 쉽고 그리하여 야생형과 유사한 MHC 분자를 제공할 수 있다는 사실을 암시한다. 이에 부가하여, 본 발명자들은 항-Nef 항체를 사용하여, pVVN 및 pVVN-P로 면역된 마우스의 근육 절단에서 면역조직화학 분석을 수행함으로써 생체 내 VVN 및 VVN-P의 발현을 또한 분석하였다. 근육 절단의 면역조직화학은 VVN 및 VVN-P 융합단백질 양자 모두 유전자 전달을 통해 생체 내에서 높은 레벨로 발현될 수 있는 것을 나타낸다. 도 3C는 VVN 및 VVN-P 항원 발현의 면역조직화학 분석의 결과를 보여준다. 실험처리 되지 않은(naive), pVVN 및 pVVN-P 면역된 마우스로부터의 얼린 근육 절단이 면역 후 5일에 준비되었고, 항-Nef 항체로 염색되었다. 파넬(Panel)(DAPI)은 핵 염색을 나타내고 파넬(panel)(FITC) 항-Nef 항체로의 특이적인 염색을 나타낸다. 양성의 세포는 FITC로 염색되었다. 다섯 가지 파넬(panel)이 각 실험에서의 각 염색을 위해 검사되었다.
T 헬퍼 세포 증식 분석:T 헬퍼 림프구의 활성화 및 증식은 항원-활성화 B세포의 확장을 위한 신호에 의한 체액성 면역 반응과 CD8+세포독성 T 림프구의 확장을 위한 세포성 신호를 발생시키는 세포성 면역 반응 모두를 유도하는 데 중요한 역할을 담당한다. 마우스의 그룹은(그룹마다 4) 두 구성체의 하나 또는 벡터 단독으로 주사되었다. 첫 번째 DNA 면역화 이후 2주에, 마우스는 같은 양으로 부스트되었다. 부가적인 2주 후에, 비장은 면역된 쥐로부터 수집되었고 그것들의 림프구가 분리되었다. 상기 세포들은 그리고나서 T 세포 증식을 위해 방법에 기술된 바와 같이 테스트되었다. 도 4는 pVVN 및 pVVN-P 그에 뒤이어 시험관 내 자극에서의 재조합 Vif, Vpu 및 Nef로 면역된 마우스로부터 얻은 비장세포의 T 세포 증식과 관련되는 것으로 기술된 실험으로부터의 데이터를 보여준다. 100μg의 각각 cDNA 발현 카세트가 마우스에서 근육내로 주사되었고 마우스는 2 주후에 한번 부스트되었다. 부스트 후 일주일 이후, 비장세포는 2 마우스로부터 분리되었고 모아졌으며 T 세포 증식을 위해 이용되었다. 비장세포는 3일 동안 5 및 1μg/ml 재조합 단백질로 자극되었다. 하나의 μCi3H가 삼입된 cpm에 첨가된 것이 카운트되었다. PHA는 양성 대조로서 첨가되었다. 이용된 DNA 구성체는 바닥에 위치되었다. 항원 특이적인 자극(SI)는 계산되었고 Vif, Vpu 및 Nef를 위해 제공되었다. 비슷한 결과는 여러 실험에서 얻어졌다. 도 4A, 도 4B 및 도 4C는 Vif, Vpu 및 Nef 단백질을 항원으로 이용하여 DNA 백신 카세트 pVVN 및 pVVN-P로 면역된 마우스를 위한 증식 분석 결과를 보여준다. 재조합 단백질(10μg/ml)은 T 세포의 증식을 자극하기 위해 각 웰에서 배치되었다. 10μg/ml의 렉틴(lectin)(PHA)이 폴리클로날 자극기 양성 대조로서 이용되었다. 보여진 대로, 증식의 낮은 배경 레벨(자극 지수(stimulation index)0.2에서 1)이 실험 처리되지 않은 마우스 비장의 대조 그룹에서 관찰되었다. 모든 세 단백질에 대한 증식의 적당한 레벨이 pVVN 및 pVVN-P로 면역된 그룹으로부터의 비장세포에서 관찰되었다(도 4A, 도 4B 및 도 4C). VVN 및 VVN-P가 비교되는 T 세포 증식을 유도하는 것을 확인하기 위해, 본 발명자들은 또한 병행하여 단수의 유전자 구성체로 면역된 마우스로 T 세포 증식을 수행하였다. Vif 단독으로, 또는 VVN 및 VVN-P 융합 단백질에서 각각 6, 5 및 5.4의 SI를 보였다(도 4A). 비슷한 결과가 항원으로서 Vpu 단백질(도 4B) 및 재조합 Nef 단백질(도 4C)을 사용하여 얻어졌다.
Nef 우두를 사용한 세포독성 T 림프구 활성:상기 구성체에 의한 결과적인 세포성 면역 반응의 유도를 좀 더 조사하기 위해, 본 발명자들은 세포독성 T 림프구(CTL) 분석을 Nef 우두 감염된 또는 Nef 펩티드 펄스된 p815 타겟에 대항하는 pVVN 및 pVVN-P로 면역된 마우스의 비장 세포에서 수행하였다. CTL 분석은 면역된마우스로부터 채취된 비장세포를 사용하여 수행되었고 그리고나서 특이적이고 비특이적인 우두 감염되었거나 펩티드 처리된 타겟으로부터 크롬 방출에 대한 분석에 앞서 시험관 내에서 자극되었다. Balb/C 마우스는 100μg의 pVVN, pVVN-P 및 대조 벡터로 면역되었다. 비장세포는 첫 번째 및 두 번째 부스트 2주 후에 마우스로부터 얻어졌고 항원 특이적인 CTL 분석은 6시간51Cr 방출 방법으로 수행되었다. pVVN 및 pVVN-P로 면역된 마우스로부터의 비장세포에 의해 유도된 특이적인 용해는 계산되었고 도 5에서 보여졌다. 그래프들은 대조 재조합 우두에 의해 감염된 타겟 세포를 사용한 분석에 의해 측정된 비특이적인 용해를 빼는 것에 의해 유도된 특이적인 용해의 퍼센트를 나타낸다. CTL 분석은 기술된 바와 같이 면역된 마우스로부터 채취된 비장 세포에서 수행되었다. 비슷한 결과는 다수의 실험에서 얻어졌다. 작동체에서: Nef 우두 감염된 타겟과 50:1의 타겟 비율, 특이적인 용해의 퍼센트는 각각 pVVN-P 및 pVVN 면역된 마우스로부터의 비장세포에 의해 38 및 31%이다. 특이적인 용해의 퍼센트는 적정할 수 있다(titratable). 비슷한 결과는 Vif를 발현하는 P815 타겟에서 관찰되었다. 반복된 분석에서 pVVN-P로 면역된 마우스에서 관찰되는 특이적인 용해의 퍼센트는 pVVN 면역된 마우스보다 더 높은 복제가능성을 보였다.
HIV-1 감염된 타겟을 사용한 세포독성 T 세포 용해:일반적으로 HIV-1이 자연적으로 쥐의 세포를 감염하지 않으므로 마우스 시스템에서 HIV-1 바이러스에 대항하는 CTL 분석을 수행하는 것이 어려웠었다. VVN 및 VVN-P의 HIV-1 감염된 타겟을 용해하는 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 hCD4 및 CCR5 또는 Fusin 공수용체(co-receptor)를 발현하는 NIH3T3 세포 라인을 구성하였다. NIH3T3 세포 라인은 본 발명에서 이용된 Balb/C 마우스에 대한 MHC-적합성(compatibility)때문에 선택되었다. 쥐의 세포가 HIV-1 감염을 지지하지 않지만, 상기 안정한 세포 라인은 HIV-1의 다른 스트레인에 의해 복제의 한 라운드동안 감염될 수 있다. 본 발명자들은 상기 한 라운드의 감염이 CTL 분석에 이용될 수 있다는 가설을 세웠다. NIH3T3/hCD4/Fusin 및 NIH3T3/hCD4/CCR5 안정한 세포 라인은 첫째의 그리고 잘 특성화된 실험실 바이러스로 감염되었고 감염성은배지로 방출되는 p24 항원에 의해 측정되었다(표 2). HIV-1 분리주의 주요(primary) 및 분자 클론은 탐지가능하고 재생산이 가능한 방식으로 상기 세포라인을 감염시킬 수 있었다. 일부 주요 분리주(92RW009&BJ)는 세포가 없는 방식으로 상기 세포들을 감염시키지 않았다. pVVN 및 pVVN-P 구성체의 면역화가 HIV-1 감염된 타겟 세포를 죽일 수 있는지 분석하기 위해, 본 발명자들은 NIH3T3/CD4/CXCR4 및 NIH3T3/CD4/CCCR4 세포를 감염시키기 위해 클레이드 B T-트로픽(HIV-1 NL43) 및 이중-트로픽(HIV-1 89.6) 바이러스를 각각 이용하였다. 상기 감염된 세포들이 상기 CTL 분석에서 타겟 세포로서 이용되었다. pVVN 및 pVVN-P 면역된 마우스들 양쪽으로부터의 비장세포는 실험 처리되지 않은 병원체 감염 세포의 용해를 유도하였다. 도 6A는 HIV-1(T-트로픽 및 이중-트로픽) 감염된 타겟에 대항하는 pVVN 및 pVVN-P 면역법에 의해 유도된 세포독성 T 림프구 반응에 관련되는 실험으로부터의 데이터를 보여준다. CD4/CCCR4 또는 CD4/CXCR4를 발현하는 NIH3T3 세포들은 이중-트로픽(89.6) 및 T-트로픽(pNL43) 바이러스로 감염되었고 CTL 분석에서 타겟 세포로 이용되었다. Balb/C 마우스는 100μg의 pVVN, pVVN-P 및 대조 벡터로 감염되었다. 비장세포는 첫 번째 두 번째 부스트 후 2 주의 마우스로부터 얻어졌고, 항원 특이적인 CTL 분석은 6시간51Cr 방출 방법으로 수행되었다. HIV-1 감염된 타겟 세포의 자연(비특이적인) 용해는 계산되었고 상기 분석에서 면역화된 마우스로부터의 비장세포에 의해 유도된 특이적인 용해를 설명하는 실험상 샘플로부터 제외되었다. 유사한 결과는 복수의 독립 실험에서 관찰되었다. 데이터는 HIV-1으로 감염된 NIH3T3/CD4/CCCR4 세포를 사용하여 pVVN 및 pVVN-P에 의한 특이적인 용해의 퍼센트를 보여준다. 50:1 작동체에서: 타겟 비율, VVN 및 VVN-P에 의한 용해의 퍼센트는 이중-트로픽 바이러스 감염된 타겟에서 각각 29 및 42이고, 반면에 특이적인 용해는 T-트로픽 감염된 타겟에서 16 및 21%이다. 흥미롭게도, pVVN-P 구성체에 의해 유도된 특이적인 CTL의 퍼센트는 항상 pVVN 구성체 면역법보다 높다.
pVVN 및 pVVN-P 구성체에 의해 유도된 교차 클레이드 CTL:상기 구성체(B 클레이드 바이러스로부터의 유전자)에 의한 크로스 클레이드 CTL 인식을 평가하기 위해, 본 발명자들은 NIH3T3/hCD4/CCR4 또는 NIH3T3/hCD4/Fusin 세포 라인을 클레이드 D, E, C 및 A(표 2)로부터의 HIV-1 분리주로 감염시켰다. 일단 세포들이 적당한 감염 레벨에 도달하면, 세포들은51Cr로 라벨되었고 CTL 분석을 위한 타겟으로 이용되었다. 도 6B는 VVN 및 VVN-P 발현 구성체로 면역된 마우스로부터 분리된 비장세포에 의해 유도된 교차 클레이드 CTL 반응과 관련된 실험으로부터의 데이터를 보여준다. VVN 및 VVN-P 발현 구성체로 면역된 마우스로부터 분리된 비장세포에 의해 유도된 교차 클레이드 CTL 반응: CD4/CCR5 또는 CD4/CXCR4를 발현하는 NIH3T3 세포가 클레이드 B, C/A, C 및 E로부터 유도된 HIV-1 바이러스로 감염되었고, CTL 분석에서 타겟 세포로 이용되었다. Balb/C 마우스는 100μg의 pVVN, pVVN-P 및 대조 벡터로 면역되었다. 비장세포는 첫 번째 및 두 번째 부스트 후 2주의 마우스로부터 얻어졌고 항원 특이적인 CTL 분석이 6시간51Cr 방출 방법으로 수행되었다. HIV-1 감염된 타겟 세포의 자연(비특이적인) 용해는 계산되었고 분석에서 면역화된 마우스로부터의 비장세포에 의해 유도된 특이적인 용해를 설명하는 실험 샘플로부터 제외되었다. 유사한 결과는 다수의 독립적인 실험에서 얻어졌다. 도 6B에 보이는 결과는 pVVN 및 pVVN-P 모두 클레이드 B(임상 분리주), D(HIV-1Zr6) 및 E(92THA022) 감염된 타겟에 대항하는 CTL 활성을 유도하였다는 것을 보여준다. 감소하는 작동체와의 활성 타이터(titer): 타겟 비율. 게다가, 본 발명자들은 또한 pVVN-P 면역된 마우스로부터의 비장세포가 높은 클레이드 E 및 D 감염 타겟에 대한 CTL 반응을 유도하고 그리고 나서 pVVN 면역된 마우스로부터의 비장세포가 유도한다는 사실에 주목하였다. 그러나 본 발명자들은 pVVN 또는 pVVN-P 면역법 모두에 의한 어떤 클레이드 C/A(92RW009) 감염된 타겟에 대한 CTL 활성도 관찰하지 않았다. 상기 결과가 상기 마우스 세포 라인에서 (표 2)상기 분리주의 낮은 감염율을 반영한다는 것이 있을 수 없는 것은 아니다.
토의
UNAIDS에 의한 최근의 보고는 세계적으로 3천 6백만이 HIV-1에 감염되었고 상기 숫자는 특히 개발도상국에서 급속히 커지고 있음을 보여준다. 항-바이러스 치료법이 생체 내 HIV-1 복제를 콘트롤하는 것으로 나타나지만, 그 과도한 비용 및 통제된 투여 프로토콜은 세계적인 HIV 문제에 이상적인 해결책에 미치지 못하게 하였다. 백신은 세계에 걸친 HIV-1 감염을 통제하기에 가장 비용 효율적인 수단으로 보여진다. DNA 백신 기술은 항-바이러스 백신 발달에서 중요한 도구로 보여진다. 전체 게놈에 대해 HIV-1 게놈의 일부를 함유하는 DNA 구성체의 주사는 감염의 염려없이 면역을 유도할 수 있다. DNA 접종을 사용하는 생체내 면역 반응의 발생은 본 발명자들의 실험실을 포함하여 다른 실험실들에서 다른 치료 타겟 및 전달 기술을 사용하여 보고되어 왔다. 일찍이 본 발명자들 및 다른 연구자들은 핵산 전달 접근(nucleic acid delivery approach)이 마우스에서뿐만 아니라 비인간 영장류 및 이제는 인간에서도 항-HIV-1 세포성 및 체액성 면역 반응을 만들어냄을 보여왔다.
발생하는 데이터는 세포-매개 면역성의 유도가 HIV-1용 백신 후보를 위한 중요한 특징일 수 있다는 것을 지지한다. 자연 감염을 하는 동안, 항-HIV-1 CTL 반응은 매우 일찍 나타나고 일시적으로 바이러스 셋 포인트(set point)의 확립과 상호관계를 나타낸다. CTLs는 바이러스 감염된 세포의 타겟팅 및 파괴에 의한 바이러스의 제거에서 중요한 역할을 한다. 특이적인 CTL 반응의 발달을 통해 바이러스 단백질에 대항하는 면역반응을 지시하는 것은 바이러스 내에서 다수의 항원 타겟에 대항하는 보다 넓은 면역반응의 유도를 허용할 것이다. 바이러스에 대한 CTL 활성은 AIDS 가 진행된 환자에 비해 건강한 감염된 환자에서 보다 통상적으로 측정된다. 특이적인 CTLs는 질병 발명기전(disease pathogenesis)이 CTL 반응과 바람직한 임상 상태 사이의 링크를 확립하는 것이 증가함에 따라 감소하는 것으로 보고되어왔다. 특이적인 CTL 반응은 HIV-1 감염의 무증상의 상태(asymptomatic phase)를 유지하는데 기여하는 것으로 나타난다. 그리하여, 생체 내에서 강한 HIV-1 특이적인 CTLs의 유도는 감염 및 최종적으로 HIV 감염의 진행의 확립으로부터 숙주의 최후 방어에서 중요한 역할을 할 수 있다.
상기 보고에서 본 발명자들은 면역원으로서 HIV-1 보조 유전자vif, vpr, vpu 및 nef의 이용을 평가하였다. 한때 소모적인 것으로 믿어졌던, 최근의 연구는 HIV-1 보조 유전자가 정상적인 세포 활성을 조정함에 의해 AIDS 발명기전에서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 증명한다. 예를 들어, 주요 세포에서 세포가 없는 감염이 기능성 있는vif유전자로 교차-보완(trans-complementing)에 의해 강화될 수 있고 이는 Vif가 특정 세포 타입(47)에서 바이러스 복제를 보완하는 것을 암시한다. Vpu와 Nef 양자 모두 내부에서 발현될 때, CD4 및 MHC-클래스 Ⅰ 분자의 하위 조절에 포함됨을 보여왔다. Nef는 감염된 세포의 표면에서의 MHC-클래스 Ⅰ의 발현을 방해하여 CTL 매개 파괴로부터 바이러스에 감염된 세포를 보호해준다. 상기 유전자들의 생물학적인 기능성의 적당한 약독화는 그들의 중요한 면역학적 에피토프를 유지하는 동안 어떤 개념적인 음성 숙주 세포적인 효과를 감소시켜야 한다.
본 발명자들의 연구에서,vif, vpu, 및 nef유전자들은다양한 임상 상태의환자로부터 분리된 바이러스로부터 클론되었다. 기능성 있고 약독화된 형태의 상기 유전자들을 발현하는 DNA 구성체는 면역반응 능력이 있는(immunocompetent) 마우스에서 그 세포성 및 체액성 반응을 유도하는 능력을 알기 위해 분석되었다. 면역원으로서 기능성 있고 약독화된 유전자의 이용에서 면역학 데이터는 매우 유사하다. 약독화된 클론뿐만아니라 기능성있는 클론이 마우스에서 강하지만 다양한 CTL 및 T 세포 증식반응을 유도할 수 있었다. 일반적으로 상기 보조 유전자들이 세포 내에서 발현되었고 그리하여 B 세포 면역글로불린 인식을 위해 쉽게 제공되지 않기 때문에 세포 내로 상기 유전자에 의한 체액성 반응은 주로 낮은 레벨에 있다. vpu가 면역원으로서 이용되고 상기 모델에서 항원 특이적인 면역 반응을 발생시키는 것이 중요한 관찰이었다.
HIV-1 보조 유전자는 그것이 전체적으로 면역 공격 하에서 감염된 타겟의 수를 늘려 바이러스의 탈출을 제한하는 것을 돕기 때문에 항 HIV DNA 백신에서의 이용을 위한 중요한 면역원일 수 있다. 게다가, 상기 보조 유전자는 HIV-1 표면 및 핵심 단백질보다 선택압 하에서 있을 수 있다. 이것을 평가하기 위해 본 발명자들은 마우스 모델에서의 HIV-1 임상 및 실험실 분리주에 대항하는 세포성 면역 반응을 테스트하기 위한 새로운 시스템을 채택하였다. 상기 단일 라운드 감염 시스템은 개별 바이러스 항원의 재조합 벡터의 발생의 필요 없이 항원의 HIV-1 완성 바이러스 타겟에 대항하는 작동체 반응을 발생시키는 능력을 테스트하는 것을 촉진한다. 이러한 사실은 pVVN 및 pVVN-P 구성체로 면역된 마우스들이 HIV-1의 클레이드 B, E 및 D로부터 유도된 타겟을 용해시킬 수 있는 것을 보여주는 본 명세서의 증명에 의해 지지된다. 이 사실은 상기 보조유전자들의 보존적인 자연특성(conservative nature) 때문에 보조유전자들이 백신 발달에서 유용한 추가 도구를 될 수 있는 교차 클레이드 CTL 반응을 유도할 수 있다는 사실을 지지한다. 게다가, 본 연구에서 본 발명자들은 약독화된 형태의 병원체 유전자의 이용의 실행가능성을 보여왔다. 백신 타겟으로서 보조 유전자들을 사용하는 본 발명자들의 초기 분석은 상기 구성체들이 마우스에서 잘 허용된다는 것을 보여주고 어떤 역 효과도 보여주지 않는다. 본 명세서에서 증명된 명료한 이익은 보조 유전자의 교차 클레이드 인식 및 CTL 반응에서 참여하는 능력이다. 단백질 분해 분할 지점의 삽입은 상기 융합된 백신 항원의 보다 자연적인 프로세스를 발생시키고, 이것은 본 연구의 추가 가치를 추가할 수 있음을 보여준다. 이것은 본 명세서에서 상기 카세트에 의해 유도되는 세포성 면역 반응에 대한 경향의 관찰에 의해 증명된다. 상기 반응은 백신 고려를 위해 중요할 것이다.
구조적인 및 효소적인 유전자들을 포함하는 다구성요소(multicomponent) 백신 칵테일의 일부로서 보조 유전자들의 결합은 치료 백신으로서 감염된 개인에서 보다 격렬한 면역 반응을 유도할 수 있다. 상기의 접근은 새로운 표준 항 레트로바이러스 치료 방식에 대한 흥미로운 부록이 될 수 있고 그리하여 치료적인 공격 하에서 유전자 타겟의 수를 증가시킬 수 있다. 생약독화 SIV 백신의 발달에서 정액의 연구는 바이러스 발병기전에 대한 생체내 공헌자로서 HIV-1 보조 유전자의 중요성을 증명해왔다. 이론상 보조 유전자 기능이 결여된 바이러스 탈출 돌연변이(viral escape mutant)를 선택하는 CTL 반응은 약독화된 생체 내 바이러스 표현형을 발생시키는 것으로 기대된다. 그리하여 비 멸균 예방 백신이라도 또는 면역 치료로서 치료 세팅에서 결과는 특이적인 이익을 가지는 것으로 여전히 기대될 것이다. 하나의 이익은 결과적인 바이러스가 발병기전의 양상을 느슨하게 할 수 있다는 것이고 두 번째는 남은 바이러스가 실제로 생약독화 백신 방어의 일면을 모방할 수 있다는 것이다. 본 발명자들이 만들었다시피, 많은 유전자들에 면역성을 유도할 수 있는 하나의 DNA 백신 구성체는 발달하고 투여하는 단수의 유전자 DNA 백신 카세트보다 투여하기 쉬울 것이고 보다 비용 효율적일 것이다.
HIV-1 보조 유전자 vif 및 Nef는 임상의 분리 및 그것들의 기능 분석에 바탕을 둔 특징으로부터 클론된다. 돌연변이들은 Npr 및 Vpu에서 초기 연구(41. 58). 에 바탕을 두고 소개되었다. NA는 적용할 수 없는(not applicable)임.
HIV-1 초기 분리물은 NIH AIDS RRRP를 통해 UNAIDS로부터 얻어지고 보통 PBMC에서 전파되었다. hCD4/CCR5 및 hCD4/CXCR4를 발현하는 NIH 3T3 세포가 12시간동안의 p24 항원 해당량 10-50ng으로 감염되었다. 세포는 PBS로 세척되었고 보통의 배양 배지에서 유지되었다. 세포는 감염을 위해 모니터되었고 세포 및 배지는 수집되고 p24 생산을 위해 분석되었다. ND.는 결정되지 않음(Not determined)을 의미한다.
Claims (20)
- HIV Vif, HIV Vpu 및 HIV Nef로 구성되는 다단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 HIV Vif가 SEQ ID NO:1인 것을 특징으로 하는 다단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 HIV Vpu가 SEQ ID NO:2인 것을 특징으로 하는 다단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 HIV Nef가 SEQ ID NO:3인 것을 특징으로 하는 다단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 HIV Vif, HIV Vpu 및 HIV Nef가 N 말단으로부터 C 말단까지 서로 관계있는 HIV Vif, HIV Vpu 및 HIV Nef의 순서로 존재하는 것을 특징으로 하는 다단백질.
- 제5항에 있어서, 단백질 분해 효소 분할 지점이 HIV Vif와 HIV Vpu의 사이에 위치하고, 단백질 분해효소 분할 지점이 HIV Vpu와 HIV Nef사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 다단백질.
- 제6항에 있어서, 상기 HIV Vif가 SEQ ID NO:1인 것을 특징으로 하는 다단백질.
- 제6항에 있어서, 상기 HIV Vpu가 SEQ ID NO:2인 것을 특징으로 하는 다단백질.
- 제6항에 있어서, 상기 HIV Nef가 SEQ ID NO:3인 것을 특징으로 하는 다단백질.
- 제6항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소 분할 지점이 REKRAVVG인 것을 특징으로 하는 다단백질.
- 제11항에 있어서, 상기 HIV Vif가 SEQ ID NO:1; HIV Vpu가 SEQ ID NO:2 및 HIV Nef가 SEQ ID NO:3인 것을 특징으로 하는 다단백질.
- 제1항 내지 제11항의 다단백질을 암호화하는 코딩시퀀스로 구성되는 핵산 분자.
- 제12항에 있어서, 상기 코딩시퀀스가 실시가능하게 조절 인자에 연결된 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제12항에 있어서, 상기 핵산 분자가 플라스미드인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
- 제14항의 플라스미드는 상기 코딩 시퀀스가 조절인자에 실시 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 플라스미드.
- 제12항의 핵산 분자로 구성되는 재조합 백신 또는 약독화 백신.
- 제1항 내지 제16항의 주제 물질로 구성되는 제약 조성물.
- 제17항에 의한 조성물로 구성되는 조성물을 투여하는 것으로 이루어지는 HIV에 대하여 개인을 면역시키는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 면역법이 예방적인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 면역법이 치료적인 것을 특징으로 하는 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US21819200P | 2000-07-14 | 2000-07-14 | |
| US60/218,192 | 2000-07-14 | ||
| PCT/US2001/041357 WO2002006303A2 (en) | 2000-07-14 | 2001-07-12 | Dna vaccines encoding hiv accessory proteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20030016374A true KR20030016374A (ko) | 2003-02-26 |
| KR100815888B1 KR100815888B1 (ko) | 2008-03-21 |
Family
ID=22814104
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020037000154A KR100815888B1 (ko) | 2000-07-14 | 2001-07-12 | Ｈｉｖ 보조 단백질을 암호화하는 ｄｎａ 백신 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7488484B2 (ko) |
| EP (1) | EP1301637B1 (ko) |
| JP (1) | JP2004525604A (ko) |
| KR (1) | KR100815888B1 (ko) |
| CN (1) | CN1312171C (ko) |
| AT (1) | ATE398188T1 (ko) |
| AU (2) | AU2001283493B2 (ko) |
| BR (1) | BR0112486A (ko) |
| CA (1) | CA2415187C (ko) |
| DE (1) | DE60134408D1 (ko) |
| DK (1) | DK1301637T3 (ko) |
| ES (1) | ES2307640T3 (ko) |
| IL (2) | IL153576A0 (ko) |
| PT (1) | PT1301637E (ko) |
| WO (1) | WO2002006303A2 (ko) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK1506223T3 (da) | 2002-05-16 | 2006-04-10 | Bavarian Nordic As | Fusionsprotein af regulatoriske/accessoriske HIV-proteiner |
| TW200613554A (en) * | 2004-06-17 | 2006-05-01 | Wyeth Corp | Plasmid having three complete transcriptional units and immunogenic compositions for inducing an immune response to HIV |
| DK3037429T3 (en) | 2006-07-28 | 2019-01-21 | Univ Pennsylvania | IMPROVED HIV VACCINES |
| CN101897964B (zh) * | 2009-04-27 | 2013-04-10 | 中国农业大学 | 一种预防自身免疫疾病的药物 |
| KR20120093941A (ko) * | 2009-10-08 | 2012-08-23 | 버베리안 노딕 에이/에스 | 인간에서 ｈｉｖ에 대한 광범위한 ｔ-세포 반응의 생성 |
| US10398772B2 (en) | 2014-01-08 | 2019-09-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Ras pathways as markers of protection against HIV and methods to improve vaccine efficacy |
| WO2024144267A1 (ko) * | 2022-12-27 | 2024-07-04 | (주)한국바이오셀프 | Hiv-1 mrna를 포함하는 백신 조성물 |
Family Cites Families (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5077044A (en) * | 1980-05-19 | 1991-12-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Novel non-reverting shigella live vaccines |
| US4873191A (en) * | 1981-06-12 | 1989-10-10 | Ohio University | Genetic transformation of zygotes |
| US5174993A (en) * | 1981-12-24 | 1992-12-29 | Health Research Inc. | Recombinant avipox virus and immunological use thereof |
| US5338683A (en) * | 1981-12-24 | 1994-08-16 | Health Research Incorporated | Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins |
| US4722848A (en) * | 1982-12-08 | 1988-02-02 | Health Research, Incorporated | Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus |
| US5110587A (en) * | 1981-12-24 | 1992-05-05 | Health Research, Incorporated | Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus |
| US4736866A (en) * | 1984-06-22 | 1988-04-12 | President And Fellows Of Harvard College | Transgenic non-human mammals |
| JPS61170732A (ja) * | 1985-01-25 | 1986-08-01 | Fuji Photo Film Co Ltd | ハロゲン化銀写真感光材料 |
| GB8508845D0 (en) * | 1985-04-04 | 1985-05-09 | Hoffmann La Roche | Vaccinia dna |
| US5223424A (en) * | 1985-09-06 | 1993-06-29 | Prutech Research And Development | Attenuated herpesviruses and herpesviruses which include foreign DNA encoding an amino acid sequence |
| US5310668A (en) * | 1986-06-20 | 1994-05-10 | Merck & Co., Inc. | Varicella-zoster virus as a live recombinant vaccine |
| US5242829A (en) * | 1986-09-23 | 1993-09-07 | Therion Biologics Corporation | Recombinant pseudorabies virus |
| US5387744A (en) * | 1987-06-04 | 1995-02-07 | Washington University | Avirulent microbes and uses therefor: Salmonella typhi |
| IL86583A0 (en) * | 1987-06-04 | 1988-11-15 | Molecular Eng Ass | Vaccine containing a derivative of a microbe and method for the production thereof |
| US5294441A (en) * | 1987-06-04 | 1994-03-15 | Washington University | Avirulent microbes and uses therefor: salmonella typhi |
| US5112749A (en) * | 1987-10-02 | 1992-05-12 | Praxis Biologics, Inc. | Vaccines for the malaria circumsporozoite protein |
| JP3044062B2 (ja) * | 1989-03-08 | 2000-05-22 | ヘルス・リサーチ・インク | 組換えポックスウイルス宿主選択系 |
| US5225336A (en) * | 1989-03-08 | 1993-07-06 | Health Research Incorporated | Recombinant poxvirus host range selection system |
| ES2090129T3 (es) * | 1989-03-31 | 1996-10-16 | Univ Washington | Vacunas que contienen microorganismos tipo phop avirulentos. |
| EP0431668B1 (en) * | 1989-12-04 | 1995-02-15 | Akzo Nobel N.V. | Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof |
| US5294548A (en) * | 1990-04-02 | 1994-03-15 | American Biogenetic Sciences, Inc | Recombianant Hepatitis a virus |
| US5462734A (en) * | 1990-11-02 | 1995-10-31 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Bovine herpesvirus vaccine and method of using same |
| US5240703A (en) * | 1991-03-01 | 1993-08-31 | Syntro Corporation | Attenuated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof |
| US5593972A (en) * | 1993-01-26 | 1997-01-14 | The Wistar Institute | Genetic immunization |
| US5482701A (en) * | 1993-05-03 | 1996-01-09 | Church & Dwight Co., Inc. | Microporous alkali metal bicarbonate |
| US5739118A (en) * | 1994-04-01 | 1998-04-14 | Apollon, Inc. | Compositions and methods for delivery of genetic material |
| US5861161A (en) * | 1994-09-07 | 1999-01-19 | Universite De Montreal | Chimeric proteins comprising a Vpr/Vpx virion incorporation domain for targeting into HIV-1 or HIV-2 virions |
| US5837533A (en) * | 1994-09-28 | 1998-11-17 | American Home Products Corporation | Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent |
| JP2967094B2 (ja) * | 1995-11-02 | 1999-10-25 | 工業技術院長 | 窒化アルミニウム焼結体、及び窒化アルミニウム粉末の製造方法 |
| MXPA00008352A (es) | 1998-02-27 | 2002-10-17 | Univ Pennsylvania | Vacunas, composiciones inmunoterapeuticas y metodos para usar las mismas. |
| US7935805B1 (en) | 1998-12-31 | 2011-05-03 | Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc | Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof |
-
2001
- 2001-07-12 EP EP01962300A patent/EP1301637B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-12 DE DE60134408T patent/DE60134408D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-12 KR KR1020037000154A patent/KR100815888B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2001-07-12 BR BR0112486-2A patent/BR0112486A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-07-12 DK DK01962300T patent/DK1301637T3/da active
- 2001-07-12 US US10/312,197 patent/US7488484B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-12 AT AT01962300T patent/ATE398188T1/de active
- 2001-07-12 PT PT01962300T patent/PT1301637E/pt unknown
- 2001-07-12 CN CNB018127762A patent/CN1312171C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-12 ES ES01962300T patent/ES2307640T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-12 CA CA2415187A patent/CA2415187C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-12 WO PCT/US2001/041357 patent/WO2002006303A2/en active Application Filing
- 2001-07-12 AU AU2001283493A patent/AU2001283493B2/en not_active Ceased
- 2001-07-12 AU AU8349301A patent/AU8349301A/xx active Pending
- 2001-07-12 IL IL15357601A patent/IL153576A0/xx unknown
- 2001-07-12 JP JP2002512204A patent/JP2004525604A/ja active Pending
-
2002
- 2002-12-22 IL IL153576A patent/IL153576A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL153576A0 (en) | 2003-07-06 |
| EP1301637B1 (en) | 2008-06-11 |
| CA2415187A1 (en) | 2002-01-24 |
| WO2002006303A2 (en) | 2002-01-24 |
| DE60134408D1 (de) | 2008-07-24 |
| EP1301637A4 (en) | 2005-06-01 |
| JP2004525604A (ja) | 2004-08-26 |
| WO2002006303A3 (en) | 2002-08-15 |
| DK1301637T3 (da) | 2008-09-29 |
| US20040106100A1 (en) | 2004-06-03 |
| IL153576A (en) | 2010-11-30 |
| PT1301637E (pt) | 2008-09-18 |
| AU8349301A (en) | 2002-01-30 |
| ATE398188T1 (de) | 2008-07-15 |
| KR100815888B1 (ko) | 2008-03-21 |
| CA2415187C (en) | 2013-06-18 |
| ES2307640T3 (es) | 2008-12-01 |
| BR0112486A (pt) | 2004-12-07 |
| CN1312171C (zh) | 2007-04-25 |
| EP1301637A2 (en) | 2003-04-16 |
| AU2001283493B2 (en) | 2006-11-30 |
| CN1636013A (zh) | 2005-07-06 |
| US7488484B2 (en) | 2009-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6265539B1 (en) | Prophylaxis and therapy of acquired immunodeficiency syndrome | |
| US8183352B2 (en) | Attenuated vif DNA immunization cassettes for genetic vaccines | |
| JP2002529112A (ja) | Ｈｉｖ特異的ｔ細胞誘導 | |
| ES2262250T3 (es) | Expresion constitutiva de particulas no infecciosas del tipo del vih. | |
| JP2000506727A (ja) | 組換え生ネコ免疫不全ウイルスおよびプロウイルスｄｎａワクチン | |
| US5336758A (en) | Peptides stimulating cytotoxic T cells immune to HIV RT | |
| KR100815888B1 (ko) | Ｈｉｖ 보조 단백질을 암호화하는 ｄｎａ 백신 | |
| WO1998041536A1 (en) | Glycosylation deficient siv and hiv envelope glycoproteins | |
| WO1998041536A9 (en) | Glycosylation deficient siv and hiv envelope glycoproteins | |
| AU2001283493A1 (en) | DNA vaccines encoding HIV accessory proteins | |
| EP0328390B1 (en) | Peptide treatment of refractory infectious diseases | |
| WO1998059074A1 (en) | Human immunodeficiency viruses causing aids in a nonhuman primate | |
| Vogt et al. | Heterologous HIV-2 challenge of rhesus monkeys immunized with recombinant vaccinia viruses and purified recombinant HIV-2 proteins | |
| CA2283490A1 (en) | Fiv vaccine | |
| Geretti | Role of cytotoxic T lymphocyte responses in the control of primate immunodeficiency viruses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130308 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140319 Year of fee payment: 7 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |