ES2307640T3

ES2307640T3 - Vacunad de adn codificantes de proteinas accesorias del vih.

Info

Publication number: ES2307640T3
Application number: ES01962300T
Authority: ES
Inventors: David B. Weiner; Velpandi Ayyavoo
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2000-07-14
Filing date: 2001-07-12
Publication date: 2008-12-01
Anticipated expiration: 2021-07-12
Also published as: AU2001283493B2; CA2415187A1; BR0112486A; PT1301637E; US20040106100A1; EP1301637B1; CA2415187C; JP2004525604A; EP1301637A2; IL153576A0; US7488484B2; AU8349301A; DE60134408D1; EP1301637A4; DK1301637T3; WO2002006303A3; WO2002006303A2; KR100815888B1; CN1636013A; CN1312171C

Abstract

Poliproteína que comprende Vif de VIH atenuado, Vpu de VIH atenuado y Nef de VIH atenuado, en la que Vif de VIH atenuado carece de la transcomplementación de provirus VIH-1 vif- en la infección libre de células, el Vpu de VIH atenuado muestra una pérdida de CD4 y una degradación de MHC-1 y el Nef de VIH atenuado muestra una pérdida de regulación negativa de CD4 y de expresión de MHC-1.

Description

Vacunas de ADN codificantes de proteínas accesorias del VIH.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a vacunas mejoradas y procedimientos de inmunización de individuos frente al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), a proteínas y a moléculas de ácidos nucleicos, a composiciones farmacéuticas que comprenden las mismas y a procedimientos que utilizan las mismas.

Antecedentes de la invención

Una vacuna efectiva debe proporcionar inmunidad de larga duración sin causar ningún efecto secundario negativo o la reversión al estado de enfermedad. Las vacunas tradicionales se han centrado en la administración en el huésped de preparaciones vivas atenuadas, muertas completas o no vivas de patógeno. Estas vacunas han demostrado resultar efectivas en la generación de respuestas inmunológicas protectoras tanto humorales como celulares frente a varios virus. El desarrollo de vacunas contra algunos patógenos víricos no resulta una tarea fácil. Esta tarea resulta complicada por varios factores, incluyendo la patobiología del patógeno y la especificidad de la respuesta inmunológica del huésped. Recientemente, se ha puesto a disposición del público una nueva herramienta para comprender el componente inmunológico implicado en dichas interacciones. Esta herramienta, es decir, la inmunización genética o la vacunación con ADN, resulta un recurso único en el esfuerzo para desarrollar vacunas seguras y funcionales contra un amplio abanico de patógenos.

El virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) es el agente etiológico del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA). El VIH-1 es un lentivirus que utiliza ARN para transmitir su mensaje a la célula diana del mismo, en la que se convierte a continuación en ADNc y se integra en el núcleo de la célula diana. Debido a la elevada tasa de errores en la conversión de ARN a ADNc, VIH-1 es un virus altamente mutable, convirtiendo el desarrollo de una vacuna tradicional contra el mismo en una tarea difícil. La inmunización genética, en la que se utilizan segmentos cortos de ADN y no el genoma vírico completo para inmunizar pacientes, está demostrando ser una manera segura para vacunar contra este virus. Hasta el momento, se han desarrollado vacunas de ADN contra genes estructurales, enzimáticos y accesorios del VIH-1 y se han sometido a ensayo para su capacidad de inducir respuestas inmunológicas en muri-
nos y en primates. En la actualidad, algunos de estos constructos de vacuna se encuentran en ensayos clínicos de

\hbox{fase I.}

Sigue desconociéndose el mecanismo o mecanismos inmunológicos implicados en la protección frente al VIH-1. De entre el espectro de diversas respuestas inmunológicas del huésped, la inducción de inmunidad mediada por células podrían resultar un requisito especialmente importante de un candidato de vacuna efectiva contra VIH-1, debido a que la inmunidad celular podría desempeñar un papel crítico en la eliminación de los virus. Las CTL pueden presentar como diana no sólo los productos génicos presentes en la partícula vírica, sino también todos los productos génicos víricos que se expresan durante la replicación vírica. Algunos estudios anteriores han demostrado que en los pacientes infectados por VIH-1, el control de la viremia inicial se asocia con la presencia de respuestas celulares de linfocitos T CD8^{+}. Además, los pacientes VIH-1-positivos que no han progresado a la enfermedad a largo plazo y los niños no infectados que han nacido de madres infectadas por VIH-1 muestran respuestas de CTL muy elevadas contra proteínas de VIH-1, sugiriendo que la obtención de respuestas de CTL debería ser un tema importante en el desarrollo de una vacuna anti-VIH. La dirección de las respuestas inmunológicas contra proteínas víricas mediante el desarrollo de respuestas específicas de CTL podría ayudar a reducir la carga vírica mediante la destrucción de fábricas víricas y de esta manera reducir el establecimiento de la carga vírica inicial.

Los genomas lentivíricos de primates contienen genes codificantes de nuevas proteínas reguladoras y accesorias además de los genes estructurales y enzimáticos de los mismos. Los genes reguladores, tat y rev, y los genes accesorios, nef, vif, vpr, vpu y vpx, se encuentran bien conservados en los lentivirus de primates, incluyendo VIH-1, VIH-2 y VIS. La bien conservada naturaleza de estos genes implica que los productos proteicos de los mismos desempeñan un papel crítico en la patogénesis vírica in vivo. Estudios recientes implican los genes accesorios en la producción incrementada de viriones y los atribuyen a la patogénesis de la infección por VIH, apoyando la idea de que los genes accesorios con componentes vitales del VIH-1. Estos productos génicos representan 20% del marco de lectura abierto vírico y son inmunogénicos in vivo y posiblemente resultan menos susceptibles a la mutagénesis y de esta manera representan una diana importante para el desarrollo de vacunas. Se está investigando el desarrollo de vacunas de ADN contra genes accesorios y reguladores de VIH-1, aunque el hecho de que estos genes pueden potencialmente alterar las actividades normales celulares añade un nivel adicional de complejidad al desarrollo de vacunas de ADN anti-gen accesorio.

La inducción de la inmunidad mediada por células puede ser una característica importante de cualquier candidato de vacuna para el VIH-1. Durante la infección natural, las respuestas de CTL anti-VIH-1 aparecen muy pronto y temporalmente se correlacionan aparentemente con el establecimiento del punto de estabilización vírica. Las CTL desempeñan un papel crítico en la eliminación vírica, dirigiéndose y destruyendo las células infectadas por virus. La dirección de las respuestas inmunológicas contra las proteínas víricas mediante el desarrollo de respuestas específicas de CTL permitiría inducir una respuestas inmunológica más amplia contra múltiples dianas antigénicas dentro del virus. La actividad de CTL contra el virus se mide más comúnmente en pacientes infectados sanos en comparación con pacientes que han progresado hasta el SIDA. Se ha informado de la reducción de CTL específicas a medida que se incrementaba la patogénesis de la enfermedad, estableciendo una conexión entre las respuestas de CTL y el estado clínico preferido. Las respuestas de CTL específicas aparentemente contribuyen al mantenimiento de la etapa asintomática de la infección por VIH-1. De esta manera, la inducción de CTL VIH-1-específicas fuertes in vivo podría desempeñar un papel crucial en la protección final del huésped frente al establecimiento de la infección y finalmente hasta la progresión de la infección por VIH.

Aunque anteriormente se creía que los genes accesorios de VIH-1 no eran imprescindibles, estudios recientes demuestran que podrían desempeñar un papel importante en la patogénesis del SIDA mediante la modulación de la actividad celular normal. Por ejemplo, la infección libre de células en células primarias puede intensificarse mediante transcomplementación con un gen vif funcional, sugiriendo que Vif complementa la replicación vírica en determinados tipos celulares. Tanto Vpu como Nef se ha demostrado que se encuentran implicados en la regulación negativa de moléculas de CD4 y de MHC clase I cuando se expresan internamente. Nef bloquea la expresión de MHC clase I sobre la superficie de las células infectadas, protegiendo de esta manera a las células infectadas por virus frente a la destrucción mediada por CTL.

Aygavoo et al., AIDS vol. 14, nº 1 (7 de enero de 2000), páginas 1 a 9, da a conocer una poliproteína que comprende Vif de VIH, Vpu de VIH y Nef de VIH.

Sumario de la invención

Según un primer aspecto de la presente invención, una poliproteína comprende vif de VIH atenuada, Vpu de VIH atenuado y Nef de VIH atenuado, en la que Vif de VIH atenuado carece de la transcomplementación del provirus VIH-1 vif- en la infección libre de células, la Vpu de VIH atenuado muestra pérdida de CD4 y degradación del MHC-1 y el Nef de VIH atenuado muestra la pérdida de la regulación negativa de CD4 y la expresión de MHC-1. Son aspectos adicionales de la invención una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de la poliproteína, una vacuna que comprende dicha molécula, una composición que comprende la poliproteína o molécula de ácido nucleico, y la utilización de la molécula de ácido nucleico, para la preparación de una composición farmacéutica para la inmunización de un individuo frente al VIH.

La invención se basa en un estudio en el que los genes vif, vpu y nef se clonaron a partir de virus aislados de pacientes de diversos estudios clínicos. Se analizaron constructos de ADN que expresaban las formas tanto funcionales como atenuadas de estos genes, para la capacidad de los mismos de inducir respuestas celulares y humorales en ratones inmunocompetentes. Los datos inmunológicos sobre la utilización de los genes funcionales y atenuados como inmunógenos son bastante comparables. Los clones tanto atenuados como funcionales fueron capaces de inducir respuestas fuertes pero viables de CTL y células T en ratones. En general, la respuesta humoral inducida por estos genes se encontraba a niveles reducidos, muy probablemente debido a que estos genes accesorios se expresan intracelularmente y por lo tanto no se presentan fácilmente para ser reconocidas por inmunoglobulinas de células B. Una observación importante es que vpu puede utilizarse como inmunógeno, resultando en respuestas inmunológicas específicas de antígeno en estos modelos.

Los genes accesorios de VIH-1 podrían ser inmunógenos importantes para la utilización en una vacuna de ADN anti-VIH debido a que globalmente amplían el número de dianas infectadas bajo ataque inmunológico, ayudando de esta manera a limitar el escape vírico. Además, pueden encontrarse bajo más presión selectiva que las proteínas superficiales y nucleares de VIH-1. Con el fin de evaluar lo expuesto anteriormente, los presentes inventores adaptaron un nuevo sistema para someter a ensayo respuestas inmunológicas celulares contra aislados clínicos y de laboratorio de VIH-1 en un modelo de ratón. Este sistema de infección de una sola ronda facilita el ensayo de las capacidades de los antígenos de generar respuestas efectoras contra dianas víricas VIH-1 completas sin la necesidad de generar un vector recombinante de antígenos víricos individuales. Lo expuesto anteriormente se ve soportado por la demostración en la presente invención que muestra que los ratones inmunizados con constructos de pVVN y pVVN-P podían lisar dianas derivadas de los clados B, E y D de VIH-1. Lo expuesto anteriormente sugiere que, debido a la naturaleza conservadora de dichos genes accesorios, pueden inducir una respuesta de CTL cruzada de clados, que puede resultar una herramienta adicional útil en el desarrollo de vacunas. Además, en el presente estudio se ha demostrado la viabilidad de utilizar genes patogénicos en formas atenuadas. El análisis inicial de lo expuesto en la presente memoria con los genes accesorios como dianas de vacuna demuestra que estos constructos resultan bien tolerados en ratones y que no muestran ningún efecto adverso. Un beneficio claro demostrado en la presente invención es la capacidad de los genes accesorios de participar en el reconocimiento cruzado de clados y en respuestas de CTL. Aparentemente la inserción de sitios de corte proteolítico resulta en el procesamiento más natural de dichos antígenos de vacuna fusionados, y ello podría añadir valor adicional a dichos enfoques, tal como se pone de manifiesto en la presente invención mediante la observación de la tendencia de estos casetes de inducir respuestas inmunológicas celulares más elevadas. Estas respuestas probablemente resultarán importantes durante la consideración de una vacuna.

La combinación de los genes accesorios como parte de una vacuna cóctel multicomponente que incluye los genes estructurales y enzimáticos podría inducir una respuesta inmunológica más vigorosa en los individuos infectados como vacuna terapéutica. Este enfoque podría ser un suplemento interesante de nuevos regímenes terapéuticos antiretrovíricos estándares, incrementando de esta manera el número de dianas génicas bajo ataque terapéutico. Los estudios seminales sobre el desarrollo de vacunas de VIS vivas atenuadas han demostrado la importancia de los genes accesorios de VIH-1 como contribuyentes in vivo a la patogénesis vírica. En teoría, las respuestas de CTL que seleccionan los mutantes de escape vírico que carecen de funciones de gen accesorio se esperaría que resultarían en fenotipos víricos in vivo que en la actualidad se encuentran atenuados. De esta manera, incluso una vacuna profiláctica no esterilizadora o, en un contexto terapéutico, la terapia inmunológica, todavía se esperaría que el resultado presentase dos beneficios específicos. Un beneficio es que los virus resultantes podrían perder aspectos de patogénesis y el otro aspecto es que el virus remanente podría incluso imitar aspectos de protección por vacuna viva atenuada. Un solo constructo de vacuna de ADN, tal como han preparado los presentes inventores, que puede inducir inmunidad frente a numerosos genes, podría resultar más fácil de administrar y resultar más económico que el desarrollo y administración de casetes de vacuna de ADN de un solo gen.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A y 1B muestran datos procedentes de experimentos descritos en el Ejemplo. La figura 1A muestra datos de experimentos que estudian la actividad de linfocitos T citotóxicos inducidos por casetes de expresión vif y nef funcionales y atenuados. La figura 1B muestra datos de experimentos de proliferación de células T en los que la proliferación de células T resultó inducida por la inmunización de plásmidos que expresaban vif, vpu, vpr y nef.

La figura 2A ilustra constructos y la figura 2B muestra datos de experimentos descritos en el Ejemplo. La figura 2A ilustra la construcción y diseño de proteínas de fusión vif, vpu y nef, y proteínas de fusión con sitios de corte proteolítico en forma de casetes de expresión únicos. La figura 2B muestra datos de la expresión de VVN y de VVN-P tras la traducción in vitro utilizando el sistema T7.

Las figuras 3A, 3B y 3C muestran datos de experimentos descritos en el Ejemplo. La figura 3A muestra datos que hacen referencia a la expresión y al procesamiento de proteínas de fusión VVN y VVN-P en células HeLa mediante inmunoprecipitación. La figura 3B muestra datos que hacen referencia a la localización subcelular de proteínas de fusión VVN y VVN-P in vivo. La figura 3C muestra los resultados del análisis inmunohistoquímico de la expresión de antígenos VVN y VVN-P.

Las figuras 4A, 4B y 4C muestran datos de experimentos descritos en el Ejemplo que hace referencia a la proliferación de células T de esplenocitos de ratones inmunizados con pVVN y pVVN-P tras la estimulación in vitro recombinante de Vif, Vpu y Nef.

La figura 5 muestra datos de experimentos descritos en el Ejemplo que hace referencia a la respuesta de linfocitos T citotóxicos inducidos por la inmunización con pVVN y con pVVN-P.

Las figuras 6A y 6B muestran datos de experimentos descritos en el Ejemplo que hace referencia a la respuesta de linfocitos T citotóxicos inducidos por la inmunización con pVVN y con pVVN-P frente a dianas infectadas por VIH-1 (T-trópicas y dual-trópicas) y respuestas de CTL cruzadas de clados inducidas por esplenocitos aislados de ratones inmunizados con constructos de expresión VVN y VVN-P. La figura 6A muestra datos de experimentos que hacen referencia a la respuesta de linfocitos T citotóxicos inducidos por la inmunización con pVVN y con pVVN-P frente a dianas infectadas por VIH-1 (T-trópicos y dual-trópicos). La figura 6B muestra datos de experimentos que hacen referencia a respuestas de CTL cruzadas de clados inducidos por esplenocitos aislados de ratones inmunizados con los constructos de expresión VVN y VVN-P.

Descripción de la invención

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "poliproteína VVN de VIH" pretende hacer referencia a una poliproteína que incluye las secuencias de aminoácidos de Vif de VIH, Vpu de VIH y Nef de VIH en forma de proteína única. Entre las poliproteínas VVN de VIH se incluyen las poliproteínas en las que uno o más de entre Vif de VIH, Vpu de VIH y Nef de VIH se encuentran atenuadas. Entre las poliproteínas VVN de VIH se incluyen las poliproteínas en las que Vif de VIH, Vpu de VIH y Nef de VIH se encuentran presentes en cualquier orden. Entre las poliproteínas VVN de VIH se incluyen las poliproteínas en las que las proteínas componentes (Vif de VIH, Vpu de VIH y Nef de VIH) son contiguas a otra proteína componente o se encuentran separadas por secuencias de proteína no componente, tales como, aunque sin limitación, las secuencias de aminoácidos que forman los sitios de corte proteolítico.

Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión "constructos de VVN de VIH" pretende hacer referencia a moléculas de ácidos nucleicos que codifican poliproteínas de VVN de VIH.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "atenuado" pretende hacer referencia a proteínas accesorias del VIH que presentan reactividad inmunológica cruzada con formas de tipo salvaje pero que son no funcionales o se encuentran funcionalmente alteradas respecto a las formas de tipo salvaje. Generalmente, las proteínas atenuadas presentan secuencias modificadas respecto a las proteínas de tipo salvaje funcionales. Los expertos ordinarios en la materia podrán identificar fácilmente las proteínas con secuencias modificadas que presentan reactividad inmunológica cruzada con las formas de tipo salvaje pero que son no funcionales o que presentan funcionalidad alterada respecto a las formas de tipo salvaje.

La proteína Vif de VIH es un polipéptido de 23 kD del que se ha informado que resulta esencial para la replicación del VIH en linfocitos sanguíneos periféricos, macrófagos y determinadas líneas celulares. Puede llevarse a cabo un ensayo con proteínas Vif que presentan secuencias modificadas con el fin de determinar si la forma modificada es no funcional o se encuentra funcionalmente alterada respecto a formas de tipo salvaje. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de Vif de VIH son bien conocidas y puede accederse a las mismas en Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov) y en la base de datos de secuencias del VIH (hiv-web.lan1.gov), cada una de las cuales se incorpora como referencia a la presente memoria. Pueden producirse constructos génicos que codifican un Vif de VIH atenuado tal como se describe en Ayyavoo V. et al., AIDS 11:1433-1444, 1997, que se incorpora a la presente memoria como referencia. La secuencia de nucleótidos que codifica una forma atenuada preferida de VIF de VIH es la SEC ID nº 1:

1

Dicho gen vif se aísla a partir de un paciente de VIH-1 que es asintomático. Se llevaron a cabo ensayos funcionales, tales como estudios de transcomplementación, y los resultados indican que esta variante no puede dar soporte a una infección por VIH-1 libre de células in vitro.

La proteína Vpu de VIH es un polipéptido de 16 kD que es una fosfoproteína membranal integral que se localiza principalmente en las membranas internas de la célula (Sato A. et al., Virus Genes 4:303-312, 1990, que se incorpora a la presente memoria como referencia). En las células infectadas por VIH, se forman complejos entre el receptor vírico, CD4, y la proteína de cubierta vírica en el retículo endoplásmico, causando el atrapado de ambas proteínas dentro de este compartimiento. La formación de complejos Env-CD4 intracelulares interfiere de esta manera con el ensamblaje de viriones. Vpu libera la cubierta vírica mediante el desencadenamiento de la degradación de moléculas CD4 acomplejadas con Env. (Willey R.L. et al., J. Virol. 66(12):7193-7200, 1992, que se incorpora a la presente memoria como referencia). Vpu también incrementa la liberación de VIH de la superficie de una célula infectada (Klimkait T. et al., J. Virol. 64:621-629, 1990, que se incorpora como referencia a la presente memoria). Pueden llevarse a cabo ensayos para someter a ensayo las proteínas Vpu con secuencias modificadas para determinar si la forma modificada es no funcional o se encuentra funcionalmente alterada respecto a las formas de tipo salvaje. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de Vpu de VIH son bien conocidas y puede accederse a las mismas en Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov) y en la base de datos de secuencias de VIH (hiv-web-lan1.gov), cada una de las cuales se incorpora como referencia a la presente memoria. La secuencia de nucleótidos que codifica una forma atenuada preferida de Vpu de VIH es la SEC ID nº 2:

2

Se ha demostrado que la proteína Nef de VIH presenta múltiples actividades, incluyendo la regulación negativa de la expresión en superficie celular de CD4 (Garcia J.V. y Miller, A.D., Res. Virol. 143:52-55, 1992, que se incorporan en la presente memoria como referencia), la perturbación de la activación de las células T (Luria S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5326-533, 1991, que se incorpora a la presente memoria como referencia) y la estimulación de la infectividad del VIH (Miller M.D. et al., J. Exp. Med. 179:101-113, 1994, que se incorpora a la presente memoria como referencia). Pueden llevarse a cabo ensayos con proteínas Nef que presentan secuencias modificadas con el fin de determinar si la forma modificada es no funcional o se encuentra funcionalmente alterada respecto a las formas de tipo salvaje. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de Nef de VIH son bien conocidas y puede accederse a las mismas en Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov) y la base de datos de secuencias de VIH (hiv-web.lan1.gov), cada una de las cuales se incorpora a la presente memoria como referencia. La secuencia de nucleótidos que codifica una forma atenuada preferida de Nef de VIH es la SEC ID nº 3:

3

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Este clon de Nef, que también se aisló a partir de un paciente que no progresó hasta la enfermedad a largo plazo, no modula negativamente las moléculas CD4 y MHC-1 tras la expresión en células CD4.

La presente invención se refiere a poliproteínas que comprenden secuencias proteicas componente de las proteínas accesorias Vif, Vpu y Nef del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En algunas formas de realización, las proteínas componente de la poliproteína se encuentran organizadas en el siguiente orden, de extremo N-terminal a extremo C-terminal: Vif, Vpu y Nef. En algunas formas de realización, una o más de las proteínas componente es una forma atenuada de la proteína accesoria. En algunas formas de realización, cada una de las proteínas componente accesorias Vif, Vpu y Nef de virus de la inmunodeficiencia humana es una forma atenuada.

En algunas formas de realización, se incluye un sitio de corte de proteasa entre los componentes proteicos de la poliproteína. En algunas formas de realización, se incluye un sitio de corte de proteasa entre las proteínas accesorias de VIH Vif y Vpu. En algunas formas de realización, se incluye un sitio de corte de proteasa entre las proteínas accesorias de VIH Vpu y Nef. En algunas formas de realización, las proteínas componente de la poliproteína se encuentran organizadas en el orden siguiente, de extremo N-terminal a extremo C-terminal: Vif, Vpu y Nef, y se incluye un sitio de corte de proteasa entre las proteínas accesorias del VIH Vif y Vpu, y se incluye un sitio de corte de proteasa entre las proteínas accesorias del VIH Vpu y Nef. En algunas formas de realización, el sitio de corte de proteasa es REKRAVVG (SEC ID nº 4). En algunas formas de realización preferidas, se encuentran incluidas formas atenuadas de las proteínas componente en la poliproteína, las proteínas componente de la poliproteína se encuentran organizadas en el orden siguiente, de extremo N-terminal a extremo C-terminal: Vif, Vpu y Nef, el sitio de corte de proteasa REKRAVVG (SEC ID nº 4) se encuentra incluido entre Vif y Vpu, y entre Vpu y Nef.

La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que comprende secuencias codificantes que codifican poliproteínas que comprenden secuencias proteicas componentes de las proteínas accesorias de VIH Vif, Vpu y Nef. En algunas formas de realización, las secuencias codificantes codifican una poliproteína, las proteínas componente de la cual se encuentran dispuestas en el orden siguiente, de extremo N-terminal a extremo C-terminal: Vif, Vpu y Nef. En algunas formas de realización, las secuencias codificantes codifican formas atenuadas de una o más de las proteínas accesorias de VIH Vif, Vpu y Nef. En algunas formas de realización, la secuencia codificante codifica formas atenuadas de cada una de las proteínas de VIH Vif, Vpu y Nef. En algunas formas de realización, las secuencias codificantes que codifican un sitio de corte de proteasa se encuentran incluidas entre las secuencias codificantes que codifican componentes proteicos de la poliproteína. En algunas formas de realización, las secuencias codificantes que codifican un sitio de corte de proteasa se encuentran incluidas entre las secuencias codificantes que codifican proteínas accesorias de VIH Vif y Vpu. En algunas formas de realización, las secuencias codificantes que codifican un sitio de corte de proteasa se encuentran incluidas entre las secuencias codificantes que codifican proteínas accesorias de VIH Vpu y Nef. En algunas formas de realización, las secuencias codificantes codifican componentes proteicos de la poliproteína que se encuentran dispuestas en el orden siguiente, de extremo N-terminal a extremo C-terminal: Vif, Vpu y Nef, y un sitio de corte de proteasa se encuentra incluido entre las proteínas accesorias de VIH Vif y Vpu, y un sitio de corte de proteasa se encuentra incluido entre proteínas accesorias de VIH Vpu y Nef. En algunas formas de realización, las secuencias codificantes codifican el sitio de corte de proteasa REKRAVVG (SEC ID nº 4). En algunas formas de realización, las secuencias codificantes codifican formas atenuadas de las proteínas componente que se encuentran incluidas en la poliproteína, las proteínas componente de la poliproteína se encuentran dispuestas en el orden siguiente, de extremo N-terminal a extremo C-terminal: Vif, Vpu y Nef, y las secuencias codificantes codifican el sitio de corte de proteasa REKRAVVG (SEC ID nº 4) entre Vif y Vpu y entre Vpu y Nef.

En algunas formas de realización, las secuencias codificantes de la molécula de ácido nucleico se encuentran de manera operable ligadas a elementos reguladores. En algunas formas de realización, la molécula de ácido nucleico es un plásmido. En algunas formas de realización, la molécula de ácido nucleico es un plásmido y las secuencias codificantes de la molécula de ácido nucleico se encuentran operablemente ligadas a elementos reguladores.

En algunas formas de realización, la molécula de ácido nucleico se encuentra incluida como parte o en asociación con una vacuna recombinante o vacuna atenuada y las secuencias codificantes de la molécula de ácido nucleico se encuentran operablemente ligadas a elementos reguladores.

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas, incluyendo composiciones farmacéuticas inyectables que incluyen las moléculas de poliproteína y/o de ácido nucleico de la invención tal como se ha indicado anteriormente.

Durante la utilización de la presente invención, pueden inmunizarse individuos contra la infección por VIH. La utilización comprende la etapa de administrar una composición que comprende las moléculas de poliproteína y/o de ácido nucleico de la invención tal como se ha indicado anteriormente en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmunológica terapéutica o profiláctica. En algunas formas de realización, el individuo no se encuentra infectado y el procedimiento es profiláctico. En algunas formas de realización, el individuo se encuentra infectado y el procedimiento es terapéutico. Entre algunos procedimientos terapéuticos se incluyen la etapa de identificar individuos que se encuentran infectados por VIH. Los procedimientos para identificar individuos que se encuentran infectados por VIH son bien conocidos por los expertos ordinarios en la materia. En algunas formas de realización, se administra una poliproteína en el individuo. En algunas formas de realización, se administra una molécula de ácido nucleico que codifica la poliproteína en el individuo.

Según la presente invención, se proporcionan composiciones y procedimientos que inmunizan profiláctica y/o terapéuticamente a un individuo frente al VIH. Las células del individuo expresan el material genético y sirven como diana inmunogénica frente a la que se induce una respuesta inmunológica. La respuesta inmunológica resultante presenta una base amplia: además de una respuesta inmunológica humoral, se inducen ambos brazos de la respuesta inmunológica celular. Los procedimientos de la presente invención resultan útiles para proporcionar inmunidad profiláctica y terapéutica. De esta manera, un procedimiento de inmunización incluye ambos procedimientos de protección de un individuo frente a la infección por VIH, así como procedimientos de tratamiento de un individuo infectado por
VIH.

Tras introducirse en una célula, los constructos genéticos de la invención pueden permanecer en la célula como molécula extracromosómica funcional y/o integrarse en el ADN cromosómico de la célula. Puede introducirse ADN en las células, en las que permanece como material genético separado en la forma de un plásmido o plásmidos. Alternativamente, puede introducirse en la célula ADN lineal que puede integrarse en el cromosoma. Al introducir ADN en la célula, pueden añadirse reactivos que estimulan la integración del ADN en cromosomas. También pueden incluirse en la molécula de ADN secuencias de ADN que resulten útiles para estimular la integración. Alternativamente, puede administrarse ARN en la célula. También se contempla proporcionar los constructos genéticos de la invención en forma de un minicromosoma lineal, que incluye un centrómero, telómeros y un origen de replicación.

Los constructos genéticos de la invención incluyen elementos reguladores necesarios para la expresión génica de una molécula de ácido nucleico. Entre los elementos se incluyen: un promotor, un codón de iniciación, un codón de para y una señal de poliadenilación. Además, con frecuencia se requieren intensificadores para la expresión génica de la secuencia que codifica la proteína de la invención. Resulta necesario que estos elementos se encuentren ligados de manera operable a la secuencia que codifica las proteínas deseadas y que los elementos reguladores se encuentren operables en el individuo en el que se administran.

Los codones de inicio y el codón de parada se consideran generalmente parte de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína deseada. Sin embargo, resulta necesario que estos elementos sean funcionales en el individuo en el que se administra el constructo génico. Los codones de inicio y de terminación deben encontrarse en el mismo marco de lectura que la secuencia codificante.

Los promotores y señales de poliadenilación utilizados deben ser funcionales dentro de las células del individuo.

Entre los ejemplos de promotores que resultan útiles en la práctica de la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para seres humanos, se incluyen, aunque sin limitación, promotores procedentes del virus 40 del simio (SV40), promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV), del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), tal como el promotor de la repetición terminal larga (LTR) del VIH, de virus de Moloney, de ALV, de citomegalovirus (CMV), tal como el promotor temprano inmediato del CMV, de virus de Epstein Barr (EBV), de virus de sarcoma de Rous (RSV), así como promotores de genes humanos, tales como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana y metalotioneína humana.

Entre los ejemplos de señales de poliadenilación útiles para la práctica de la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para seres humanos, se incluyen, aunque sin limitación, señales de poliadenilación de hormona de crecimiento humana y bovina, señales de poliadenilación de SV40 y señales de poliadenilación de LTR. En particular, se utiliza la señal de poliadenilación de SV40 que se encuentra en plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA), denominada señal de poliadenilación de SV40.

Además de los elementos reguladores requeridos para la expresión del ADN, también pueden incluirse otros elementos en la molécula de ADN. Entre dichos elementos adicionales se incluyen intensificadores. El intensificador puede seleccionarse de entre el grupo que incluye, aunque sin limitación, Actina humana, Miosina humana, Hemoglobina humana, creatina muscular humana e intensificadores víricos, tales como aquellos de CMV, RSV y EBV.

Pueden proporcionarse constructos genéticos de la invención con origen de replicación de mamífero, con el fin de mantener el constructo fuera del cromosoma y producir múltiples copias del constructo en la célula. Los plásmidos pCEP4 y pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA) contienen el origen de replicación del virus de Epstein Barr y la región codificante del antígeno nuclear EBNA-1 que produce la replicación episómica de elevado número de copia sin integrarse.

En algunas formas de realización preferidas relacionadas con aplicaciones de inmunización, se administra una o más moléculas de ácido nucleico que incluyen secuencias de nucleótidos que codifican poliproteínas VVN de VIH y, además, genes de proteínas que intensifican adicionalmente la respuesta inmunológica frente a dichas proteínas diana. Son ejemplos de dichos genes aquellos que codifican citoquinas y linfoquinas, tales como \alpha-interferón, gamma-interferón, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 y B7.2. La utilización de genes de proteínas que intensifican adicionalmente la respuesta inmunológica frente a proteínas diana también se describe en la patente WO nº 99/43839.

Con el fin de maximizar la producción de proteínas, pueden seleccionarse secuencias reguladoras que resultan muy adecuadas para la expresión génica en las células en las que se administra el constructo. Además, pueden seleccionarse codones que se transcriben eficientemente en la célula. Un experto ordinario en la materia puede producir constructos de ADN que resultan funcionales en las células.

Los procedimientos de la invención comprenden la etapa que consiste en administrar moléculas de ácido nucleico en tejido del individuo. En algunas formas de realización preferidas, las moléculas de ácido nucleico se administran intramuscularmente, intranasalmente, intraperitonealmente, subcutáneamente, intradérmicamente, intravenosamente, mediante administración con aerosol en tejido pulmonar, o tópicamente o mediante lavado de tejido mucosal seleccionado de entre el grupo que consiste de mucosa vaginal, rectal, uretral, bucal y sublingual.

Un aspecto de la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas útiles en los procedimientos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas comprenden una molécula de ácido nucleico, preferentemente una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas ligadas de manera operable a elementos reguladores necesarios para la expresión en las células del individuo. Las composiciones farmacéuticas además comprenden un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. El término "farmacéutico" es bien conocido y ampliamente entendido por los expertos en la materia. Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "composiciones farmacéuticas" y "composiciones farmacéuticas inyectables" pretenden poseer su significado ordinario tal como es entendido por los expertos en la materia. Se requieren composiciones farmacéuticas para alcanzar los estándares específicos respecto a esterilidad, pirógenos, materia particulada, así como isotonicidad y pH. Por ejemplo, los fármacos inyectables son estériles y libres de pirógenos.

Las composiciones farmacéuticas según la presente invención pueden comprender entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 10.000 \mug de ADN. En algunas formas de realización preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 2.000 \mug, 3.000 \mug, 4.000 \mug o 5.000 \mug de ADN. En algunas formas de realización preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 1.000 \mug de ADN. En algunas formas de realización preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 10 ng y aproximadamente 800 \mug de ADN. En algunas formas de realización preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 500 \mug de ADN. En algunas formas de realización preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 1 y aproximadamente 350 \mug de ADN. En algunas formas de realización preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen entre aproximadamente 25 y aproximadamente 250 \mug de ADN. En algunas formas de realización preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 100 \mug de ADN.

Las composiciones farmacéuticas según la presente invención que comprenden constructos genéticos de la invención se formulan según el modo de administración que debe utilizarse. El experto ordinario en la materia puede formular fácilmente una vacuna o terapéutico no inmunogénico que comprende un constructo genético. En los casos en los que la inyección intramuscular sea el modo de administración seleccionado, preferentemente se utiliza una formulación isotónica. Generalmente, entre los aditivos para la isotonicidad se incluyen cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, resultan preferidas las soluciones isotónicas, tales como la solución salina tamponada con fosfato. Entre los estabilizadores se incluyen gelatina y albúmina. En algunas formas de realización, se añade a la formulación un agente vasoconstrictor. Las preparaciones farmacéuticas según la presente invención se proporcionan estériles y libre de pirógenos. Entre las composiciones farmacéuticas según la invención se incluyen componentes de administración en combinación con moléculas de ácido nucleico que además comprenden portadores o vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como, por ejemplo, solución salina. Puede utilizarse cualquier medio que permita la administración con éxito del ácido nucleico. El experto en la materia apreciará con facilidad la multitud de medios farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse en la presente invención. Se describen portadores farmacéuticos adecuados en Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia estándar en este campo.

En algunas formas de realización, la molécula de ácido nucleico se administra en las células conjuntamente con la administración de un agente facilitador. Los agentes facilitadores también se denominan intensificadores de función de polinucleótido o agentes facilitadores de vacuna genética. Se describen agentes facilitadores en las patentes US nº 5.593972, nº 5.739.118, nº 5.830.876 y nº 5.837.533. Pueden administrarse agentes facilitadores que se administran conjuntamente con moléculas de ácido nucleico en forma de mezcla con la molécula de ácido nucleico o administrarse separadamente de manera simultánea, antes o después de la administración de las moléculas de ácido nucleico. Además, entre otros agentes que pueden funcionar como agentes de transfección y/o agentes de replicación y/o agentes inflamatorios y que pueden coadministrarse con o sin un agente facilitador se incluyen factores de crecimiento, citoquinas y linfoquinas, tales como \alpha-interferón, gamma-interferón, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), GC-SF, GM-CSF, TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 y B7.2, así como factor de crecimiento fibroblástico, agentes activos en superficie, tales como complejos inmunoestimuladores (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freund, análogo de LPS, incluyendo monofosforil lípido A (MPL), péptidos muramilo, análogos de quinona y vesículas, tales como escualeno y ácido hialurónico. En las formas de realización que se refieren a procedimientos de inmunización, se seleccionan coagentes que preferentemente incrementan las respuestas inmunológicas. En las formas de realización que se refieren a procedimientos de inmunosupresión, se seleccionan coagentes que no incrementan las respuestas inmunológicas.

En algunas formas de realización preferidas, los constructos genéticos de la invención se formulan o se administran conjuntamente con un facilitador seleccionado de entre el grupo que consiste de ésteres de ácido benzoico, anilidas, amidinas, uretanos y las sales hidrocloruro de los mismos, tales como aquellos de la familia de los anestésicos
locales.

Los facilitadores en algunas formas de realización preferidas pueden ser un compuesto que presente una de entre las fórmulas siguientes:

Ar-R^{1}-O-R^{2}-R^{3}

o

Ar-N-R^{1}-R^{2}-R^{3}

o

R^{4}-N-R^{5}-R^{6}

o

R^{4}-O-R^{1}-R^{7}

\newpage

en las que:

\quad: Ar es benceno, p-aminobenceno, m-aminobenceno, o-aminobenceno, benceno sustituido, p-aminobenceno sustituido, m-aminobenceno sustituido, o-aminobenceno sustituido, en los que el grupo amino en los compuestos aminobenceno puede ser amino, alquilamina C_{1}-C_{5}, C_{1}-C_{5}, dialquilamina C_{1}-C_{5} y las sustituciones en los compuestos sustituidos son halógeno, alquilo C_{1}-C_{5} y alcoxi C_{1}-C_{5},

\quad: R^{1} es C=O,

\quad: R^{2} es alquilo C_{1}-C_{10}, incluyendo alquilos ramificados,

\quad: R^{3} es hidrógeno, amina, alquilamina C_{1}-C_{5}, C_{1}-C_{5}, dialquilamina C_{1}-C_{5},

\quad: R^{2}+R^{3} pueden formar un alquilo cíclico, un alquilo cíclico sustituido con alquilo C_{1}-C_{10}, una amina alifática cíclica, una amina alifática cíclica sustituida con alquilo C_{1}-C_{10}, un heterociclo, un heterociclo sustituido con alquilo C_{1}-C_{10}, incluyendo un heterociclo N-sustituido con alquilo C_{1}-C_{10},

\quad: R^{4} es Ar, R^{2} o alcoxi C_{1}-C_{5}, alquilo cíclico, alquilo cíclico sustituido con alquilo C_{1}-C_{10}, amina alifática cíclica, amina alifática sustituida con alquilo C_{1}-C_{10}, heterociclo, heterociclo sustituido con alquilo C_{1}-C_{10} y un heterociclo sustituido con alcoxi C_{1}-C_{10}, incluyendo un heterociclo N-sustituido con alquilo C_{1}-C_{10},

\quad: R^{5} es CH=NH,

\quad: R^{6} es Ar, R^{2} o alcoxi C_{1}-C_{5}, alquilo cíclico, alquilo cíclico sustituido con alquilo C_{1}-C_{10}, amina alifática cíclica, amina alifática cíclica sustituida con alquilo C_{1}-C_{10}, heterociclo, heterociclo sustituido con alquilo C_{1}-C_{10} y heterociclo sustituido con alcoxi C_{1}-C_{10}, incluyendo un heterociclo N-sustituido con alquilo C_{1}-C_{10}, y

\quad: R^{7} es Ar, R^{2} o alcoxi C_{1}-C_{5}, alquilo cíclico, alquilo cíclico sustituido con alquilo C_{1}-C_{10}, amina alifática cíclica, amina alifática cíclica sustituida con alquilo C_{1}-C_{10}, heterociclo, heterociclo sustituido con alquilo C_{1}-C_{10} y heterociclo sustituido con alcoxi C_{1}-C_{10}, incluyendo heterociclo N-sustituido con alquilo C_{1}-C_{10}.

Entre los ejemplos de ésteres se incluyen: ésteres de ácido benzoico, tales como piperocaína, meprilcaína e isobucaína; ésteres de ácido para-aminobenzoico, tales como procaína, tetracaína, butetamina, propoxicaína y cloroprocaína, ésteres de ácido meta-aminobenzoico, incluyendo metabutamina y primacaína, y ésteres de ácido para-etoxibenzoico, tales como paretoxicaína. Entre los ejemplos de anilidas se incluyen lidocaína, etidocaína, mepivacaína, bupivacaína, pirrocaína y prilocaína. Entre otros ejemplos de dichos compuestos se incluyen dibucaína, benzocaína, ciclonina, pramoxina, proparacaína, butacaína, benoxinato, carbocaína, metilbupivacaína, picrato de butasin, fenacaína, diotano, lucaína, intracaína, nupercaína, metabutoxicaína, piridocaína, bifenamina y los bicíclicos derivados botánicamente, tales como cocaína, cinamoilcocaína, truxilina y cocaetileno y todos dichos compuestos acomplejados con hidrocloruro.

En las formas de realización preferidas, el facilitador es la bupivacaína. La diferencia entre bupivacaína y mepivacaína es que la bupivacaína presenta un grupo N-butilo en lugar de un grupo N-metilo de la mepivacaína. Los compuestos pueden presentar en dicho N, C_{1}-C_{10}. Los compuestos pueden sustituirse con halógeno, tales como procaína y cloroprocaína. Las anilidas resultan preferidas.

Se administra el agente facilitador antes, simultáneamente o después que el constructo genético. El agente facilitador y el constructo genético pueden formularse en la misma composición.

La bupivacaína-HCl químicamente se denomina 2-piperidinocarboxamida, 1-butil-N-(2,6-dimetilfenil)-monohidrocloruro, monohidrato, y se encuentra ampliamente disponible comercialmente para usos farmacéuticos de muchas fuentes, incluyendo de Astra Pharmaceutical Products Inc. (Westboro, MA) y de Sanofi Winthrop Pharmaceuticals (New York, NY), Eastman Kodak (Rochester, NY). La bupivacaína se formula comercialmente con y sin metilparabén y con o sin epinefrina. Puede utilizarse cualquiera de dichas formulaciones. Se encuentra disponible comercialmente para la utilización farmacéutica a una concentración de 0,25%, 0,5% y 0,75%, que pueden utilizarse en la invención. Si se desea pueden prepararse concentraciones alternativas, particularmente aquéllas comprendidas entre 0,05% y 1,0%, que inducen efectos deseables. Según la presente invención, se administran entre aproximadamente 250 \mug y aproximadamente 10 mg de bupivacaína. En algunas formas de realización se administran entre aproximadamente 250 \mug y aproximadamente 7,5 mg. En algunas formas de realización se administran entre aproximadamente 0,05 mg y aproximadamente 5,0 mg. En algunas formas de realización se administran entre aproximadamente 0,5 mg y aproximadamente 3,0 mg. En algunas formas de realización se administran entre aproximadamente 5 y 50 \mug. Por ejemplo, en algunas formas de realización se administran entre aproximadamente 50 \mul y aproximadamente 2 ml, preferentemente entre 50 \mul y aproximadamente 1.500 \mul y más preferentemente aproximadamente 1 ml de bupivacaína-HCl a una concentración de entre 0,25% y 0,50% y metilparabén al 0,1% en un portador farmacéutico isotónico, en el mismo sitio que la vacuna anteriormente, simultáneamente con la administración de la vacuna o después de la misma. De manera similar, en algunas formas de realización, se administran entre aproximadamente 50 \mul y aproximadamente 2 ml, preferentemente entre 50 \mul y aproximadamente 1.500 \mul y más preferentemente aproximadamente 1 ml de bupivacaína-HCl a una concentración de entre 0,25% y 0,50% en un portador farmacéutico isotónico, en el mismo sitio que la vacuna anteriormente, simultáneamente con la administración de la vacuna o después de la misma. Pueden administrarse bupivacína y cualquier otro compuesto de acción similar, particularmente los de la familia relacionada de anestésicos locales a concentraciones que proporcionan la facilitación deseada de asimilación de los constructos genéticos por las células.

En algunas formas de realización de la invención, en primer lugar el facilitador se inyecta en el individuo antes de la administración del constructo genético. Es decir, por ejemplo aproximadamente una semana a diez días como máximo antes de la administración del constructo genético, en primer lugar se inyecta el facilitador en el individuo. En algunas formas de realización, se inyecta facilitador en el individuo 1 a 5 días, en algunas formas de realización 24 horas, antes o después de la administración del constructo genético. Alternativamente, en caso de utilizarse, el facilitador se administra simultáneamente, minutos antes o después de la administración del constructo genético. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, el facilitador y el constructo genético pueden combinarse para formar una sola composición farmacéutica.

En algunas formas de realización, los constructos genéticos se administran libres de agentes facilitadores, es decir en formulaciones libres de agentes facilitadores utilizando protocolos de administración en los que las construcciones genéticas no se administran conjuntamente con la administración de agentes facilitadores.

En algunas formas de realización que hacen referencia a la inmunización, los constructos génicos de la invención pueden seguir formando parte del material genético en microorganismos vivos atenuados o en vectores microbianos recombinantes. La presente invención se refiere a vacunas vivas atenuadas mejoradas y a vacunas mejoradas que utilizan vectores recombinantes para administrar las poliproteínas VVN y/o las moléculas de ácido nucleico que codifican las poliproteínas. Se describen ejemplos de vacunas vivas atenuadas y de las que utilizan vectores recombinantes para administrar antígenos foráneos, en las patentes US nº 4.722.848, nº 5.017.487, nº 5.077.044, nº 5.110.587, nº 5.112.749, nº 5.174.993, nº 5.223.424, nº 5.225.336, nº 5.240.703, nº 5.242.829, nº 5.294.441, nº 5.294.548, nº 5.310.668, nº 5.387.744, nº 5.389.368, nº 5.424.065, nº 5.451.499, nº 5.453.364, nº 5.462.734, nº 5.470.734 y nº 5.482.713. Se proporcionan constructos génicos que incluyen la secuencia de nucleótidos que codifican una poliproteína VVN de VIH se encuentra operablemente ligada a secuencias reguladoras que pueden funcionar en la vacuna para llevar a cabo la expresión. Se incorporan los constructos génicos en las vacunas vivas atenuadas y en vacunas recombinantes con el fin de producir vacunas mejoradas según la invención. Los constructos génicos pueden formar parte de genomas de vacunas víricas recombinantes en las que el material genético se integra en el cromosoma de la célula o permanece en estado extracromosómico.

Algunas formas de realización de la invención se refieren a proteínas y procedimientos de utilización de las mismas. Por ejemplo, en algunos procedimientos de inmunización, la poliproteína VVN de VIH se administra en individuos. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "proteínas de la invención" pretende hacer referencia a la poliproteína VVN de VIH, cada una de las cuales puede producirse mediante medios similares y que pueden formularse y administrarse de manera similar para la utilización en procedimientos de la invención.

Pueden producirse rutinariamente vectores, incluyendo vectores de expresión recombinante, que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican proteínas de la invención. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "vector de expresión recombinante" pretende hacer referencia a un plásmido, fago, partícula vírica u otro vector que, al introducirse en un huésped apropiado, contiene los elementos genéticos necesarios para dirigir la expresión de una secuencia codificante. Un experto ordinario en la materia podrá aislar o sintetizar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de la invención e insertar la misma en un vector de expresión utilizando técnicas estándares y materiales de partida disponibles con facilidad. La secuencia codificante se encuentra operablemente ligada a las secuencias reguladoras necesarias. Los vectores de expresión son bien conocidos y resultan fácilmente disponibles. Entre los ejemplos de vectores de expresión se incluyen plásmidos, fagos, vectores víricos y otra molécula o moléculas de ácido nucleico que contienen vehículos útiles para transformar células huésped y para facilitar la expresión de las secuencias codificantes. Algunas formas de realización de la invención se refieren a vectores de expresión recombinante que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una poliproteína VVN de VIH. Los vectores de expresión recombinante de la invención resultan útiles para transformar huéspedes. La presente invención se refiere a vectores de expresión recombinante que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una poliproteína VVN de VIH.

La presente invención se refiere a una célula huésped que comprende el vector de expresión recombinante que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una poliproteína VVN de VIH. Las células huésped para la utilización en sistemas de expresión recombinante bien conocidos para la producción de proteínas son bien conocidos y se encuentran disponibles fácilmente. Entre los ejemplos de células huésped se incluyen células bacterianas, tales como E. coli, células de levadura, tales como S. cerevisiae, células de insecto, tales como S. frugiperda, células de cultivo de tejido de mamífero no humano, células de ovario de hámster chino (CHO) y células de cultivo de tejido humano, tales como células HeLa.

En algunas formas de realización, por ejemplo, el experto ordinario en la materia puede, utilizando técnicas bien conocidas, insertar moléculas de ADN en un vector de expresión disponible comercialmente para la utilización en sistemas de expresión bien conocidos. Por ejemplo, el plásmido pSE420 disponible comercialmente (Invitrogen, San Diego, CA) puede utilizarse para la producción de una proteína mutante CD80\DeltaC en E. coli. El plásmido pYES2 disponible comercialmente (Invitrogen, San Diego, CA) puede utilizarse, por ejemplo, para la producción de cepas de S. cerevisiae de levadura. El sistema de expresión baculovirus completo MAXBAC^{TM} disponible comercialmente (Invitrogen, San Diego, CA) puede utilizarse, por ejemplo, para la producción en células de insecto. El plásmido pcDNA I o pcDNA3 disponible comercialmente (Invitrogen, San Diego, CA) puede utilizarse, por ejemplo, para la producción en células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino. El experto ordinario en la materia podrá utilizar estos vectores y sistemas comerciales de expresión u otros para la producción en células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino. El experto ordinario en la materia puede utilizar estos vectores y sistemas comerciales de expresión u otros para producir proteínas de la invención utilizando técnicas rutinarias y materiales de partida disponibles fácilmente (ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Press, 1989, que se incorpora a la presente memoria como referencia). De esta manera, las proteínas deseadas pueden prepararse en sistemas tanto procarióticos como eucarióticos, resultando en un espectro de formas procesadas de la proteína.

El experto ordinario en la materia podrá utilizar otros vectores y sistemas de expresión disponibles comercialmente o producir vectores utilizando procedimientos bien conocidos y materiales de partida fácilmente disponibles. Los sistemas de expresión que contienen las secuencias de control necesarias, tales como los promotores y señales de poliadenilación, y preferentemente los intensificadores, se encuentran fácilmente disponibles y son conocidos de la técnica para una diversidad de huéspedes. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Press, 1989.

El vector de expresión que incluye el ADN que codifica una proteína de la invención se utiliza para transformar el huésped compatible, que después se cultiva y se mantiene bajo condiciones en las que tiene lugar la expresión del ADN foráneo. La proteína de la invención producida de esta manera se recupera a partir del cultivo, lisando las células o a partir del medio de cultivo según resulte apropiado y conocido por los expertos en la materia. El experto ordinario en la materia podrá, utilizando técnicas bien conocidas, aislar la proteína de la invención que se produce utilizando dichos sistemas de expresión. Los procedimientos para purificar proteínas de la invención a partir de fuentes naturales utilizando anticuerpos que se unen específicamente a dichas proteínas son rutinarios, al igual que el procedimiento para producir dichos anticuerpos (ver Harlow, E. y Lane, E., Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, que se incorpora a la presente memoria como referencia). Dichos anticuerpos pueden utilizarse para purificar proteínas producidas mediante metodología de ADN recombinante o a partir de fuentes naturales.

Entre los ejemplos de constructos genéticos se incluyen secuencias codificantes que codifican una proteína de la invención y que se encuentran ligadas operablemente a un promotor que es funcional en la línea celular en la que se transfectan los constructos. Entre los ejemplos de promotores constitutivos se incluyen promotores procedentes de citomegalovirus o de SV40. Entre los ejemplos de promotores inducibles se incluyen virus de la leucemia mamaria de ratón o promotores metalotioneína. Los expertos ordinarios en la materia pueden producir fácilmente constructos genéticos útiles para transfectar células con ADN que codifican proteínas de la invención a partir de materiales de partida disponibles fácilmente. Dichos constructos génicos resultan útiles para la producción de proteínas de la invención.

Además de producir proteínas de la invención mediante técnicas recombinantes, también pueden utilizarse sintetizadores automáticos de péptidos para producir proteínas de la invención. Dichas técnicas son bien conocidas para los expertos ordinarios en la materia y resultan útiles con derivados que presentan sustituciones no proporcionadas en la producción de proteínas codificadas en ADN.

Las proteínas de la invención pueden prepararse mediante cualquiera de las técnicas conocidas siguientes. Convenientemente, las proteínas de la invención pueden prepararse utilizando la técnica sintética de fase sólida inicialmente descrita por Merrifield, en J. Am. Chem. Soc. 15:2149-2154, 1963. Pueden encontrarse otras técnicas de síntesis de proteínas, por ejemplo, en M. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2a edición, 1976, Kent y Clark-Lewis, en: Synthetic Peptides in Biology and Medicine, páginas 295 a 358, editores Alitalo, K. et al., Science Publishers (Amsterdam, 1985), así como otras referencias conocidas por los expertos en la materia. Puede encontrarse un resumen de las técnicas de síntesis en J. Stuart y J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthelia, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 1984. También puede utilizarse la síntesis mediante procedimientos en solución, tal como se describe en The Proteins, vol. II., 3a edición, páginas 105-237, Neurath, H. et al., editores, Academic Press, New York, NY, 1976. Pueden encontrarse en los textos anteriormente indicados grupos protectores apropiados para la utilización en dichas síntesis, así como en J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY, 1973.

En general, dichos procedimientos sintéticos implican la adición secuencial de uno o más residuos aminoácidos o residuos aminoácidos protegidos adecuados a una cadena de péptidos en crecimiento. Normalmente se protege el grupo amino o carboxilo del primer residuo aminoácido con un grupo protector selectivamente eliminable adecuado. Se utiliza un grupo protector selectivamente eliminable diferente para los aminoácidos que contienen un grupo lateral reactivo, tal como la lisina.

Utilizando una síntesis en fase sólida como ejemplo, se une el aminoácido protegido o derivatizado a un soporte sólido inerte con el grupo carboxilo o amino no protegido de dicho aminoácido. A continuación el grupo protector del grupo amino o carboxilo se elimina selectivamente y el siguiente aminoácido en la secuencia que presente el grupo (amino o carboxilo) complementario convenientemente protegido se mezcla y se hace reaccionar con el residuo ya unido al soporte sólido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo se separa a continuación de dicho residuo aminoácido nuevamente añadido y después se añade el siguiente aminoácido (convenientemente protegido), y de esta manera sucesivamente. Tras unirse todos los aminoácidos deseados en la secuencia correcta, se elimina cualquier grupo protector (y soporte sólido) de grupo lateral y terminal restante de manera secuencial o concurrente, para proporcionar el péptido final. El péptido de la invención preferentemente carece de aminoácidos bencilados o metilbencilados. Dichas partes de grupo protector pueden unirse durante el curso de la síntesis, aunque se separan antes de utilizar los péptidos. Pueden resultar necesarias reacciones adicionales, tal como se describe en otras fuentes, para formar enlaces intramoleculares con el fin de restringir la conformación.

En algunas formas de realización, pueden producirse proteínas en animales transgénicos. La presente invención se refiere a un mamífero no humano transgénico que comprende el vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una poliproteína VVN de VIH. Son bien conocidos mamíferos no humanos transgénicos útiles para producir proteínas recombinantes, de la misma manera que los vectores de expresión necesarios y las técnicas para generar animales transgénicos. Generalmente, el animal transgénico comprende un vector de expresión recombinante en el que la secuencia de nucleótidos que codifica una poliproteína VVN de VIH se encuentra operablemente ligada a un promotor específico de célula mamaria, en el que la secuencia codificante únicamente se expresa en células mamarias y la proteína recombinante expresada de esta manera se recupera de la leche del animal. El experto ordinario en la materia utilizando técnicas estándares, tales como aquéllas que se enseñan en las patentes US nº 4.736.866 y nº 4.873.191, puede producir animales transgénicos que producen una poliproteína VVN de VIH. Son animales preferidos las cabras y los roedores, particularmente las ratas y los ratones.

Se contemplan sustituciones conservativas de secuencias de aminoácidos de proteínas de la invención. Tal como utiliza en la presente memoria, la expresión "sustituciones conservativas" pretende hacer referencia a sustituciones de aminoácidos de una poliproteína VVN de VIH por otros residuos que comparten características estructurales y/o de carga similares. Los expertos ordinarios en la materia pueden diseñar con facilidad proteínas de la invención con sustituciones conservativas de aminoácidos basadas en grupos conservativos bien conocidos.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse mediante cualquier medio que permita que el agente activo alcance el sitio de acción del agente en el cuerpo de un mamífero. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de varias maneras, dependiendo de si se desea el tratamiento local o sistémico y del área que debe tratarse. La administración puede ser tópica (incluyendo oftálmica, vaginal, rectal, intranasal, transdérmica), oral o parenteral. Debido a que los péptidos se someten a la digestión al administrarse oralmente, se preparan formulaciones orales para recubrir entéricamente el agente activo o para proteger de otra manera al mismo frente a la degradación en el estómago (tal como la preneutralización). La administración parenteral incluye el goteo intravenoso, la inyección subcutánea, intraperitoneal o intramuscular, la administración pulmonar, por ejemplo mediante inhalación o insuflado, o la administración intratecal o intraventricular. En las formas de realización preferidas, ordinariamente se utiliza la administración parenteral, es decir intravenosa, subcutánea, transdérmica, intramuscular, con el fin de optimizar la absorción. La administración intravenosa puede conseguirse con la ayuda de una bomba de infusión. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse en forma de emulsión.

El experto en la materia entenderá fácilmente la multitud de medios farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse en la presente invención. Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia estándar en este campo, que se incorpora a la presente memoria como referencia. Las formulaciones para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizaciones, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, de polvos o aceitosas, espesantes y similares. Entre las composiciones para la administración oral se incluyen polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, sobres o tabletas. Pueden resultar deseables espesantes, agentes saborizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersión o ligantes. Entre las composiciones para la administración parenteral, administración intravenosa, intratecal o intraventricular pueden incluirse soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados y que preferentemente son estériles y que se encuentran libres de pirógenos. Las composiciones farmacéuticas que resultan adecuadas para la administración intravenosa según la invención son estériles y se encuentran libres de pirógenos. Para la administración parenteral, los péptidos de la invención pueden formularse, por ejemplo, en forma de solución, suspensión, emulsión o polvos liofilizados en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Son ejemplos de dichos vehículos, agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina de suero humano al 5%. También pueden utilizarse liposomas y vehículos no acuosos, tales como aceites fijados. El vehículo o polvos liofilizados pueden contener aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo cloruro sódico, manitol) y la estabilidad química (por ejemplo tampones y conservantes). La formulación se esteriliza mediante técnicas utilizadas comúnmente. Por ejemplo, se prepara una composición parenteral adecuada para la administración mediante inyección mediante la disolución de 1,5% en peso de ingrediente activo en solución de cloruro sódico al 0,9%.

Las composiciones farmacéutica según la presente invención pueden administrarse en forma de dosis única o en dosis múltiples. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse en forma de agentes terapéuticos individuales o en combinación con otros agentes terapéuticos. Los tratamientos de la presente invención pueden combinarse con terapias convencionales, que pueden administrarse secuencialmente o simultáneamente.

La dosificación varía dependiendo de factores conocidos, tales como características farmacodinámicas del agente particular y el modo y vía de administración del mismo; edad, salud y peso del receptor; naturaleza y grado de los síntomas, tipo de tratamiento concurrente, frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. La formulación de las composiciones terapéuticas y la administración posterior de las mismas se cree que se encuentran comprendidos dentro de los conocimientos de la técnica. Habitualmente, la dosificación de péptido puede encontrarse entre aproximadamente 1 y 3.000 miligramos por cada 50 kilogramos de peso corporal, preferentemente entre 10 y 1.000 miligramos por cada 50 kilogramos de peso corporal; más preferentemente entre 25 y 800 miligramos por cada 50 kilogramos de peso corporal. Habitualmente entre 8 y 800 miligramos administrados en un individuo por día en dosis divididas 1 a 6 veces al día o en forma de liberación sostenida resultan efectivos para obtener los resultados deseados.

Dependiendo del procedimiento con el que se administran la proteína o proteínas, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse y administrarse para la máxima efectividad. Los modos de administración resultarán evidentes para el experto en la materia en vista de la presente exposición.

Los procedimientos de la presente invención resultan útiles en los campos de la medicina tanto humana como veterinaria. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, la presente invención se refiere a la inmunización genética de mamíferos, aves y peces. Los procedimientos de la invención pueden resultar particularmente útiles para las especies de mamífero, incluyendo las especies humana, bovina, ovina, porcina, equina, canina y felina.

Entre los Ejemplos proporcionados posteriormente se incluyen ejemplos representativos de los aspectos de la presente invención. Los ejemplos no pretenden limitar el alcance de la invención sino que se proporcionan a título de ejemplo. Además, pueden resumirse diversos aspectos de la invención mediante la descripción siguiente. Sin embargo, la presente descripción no pretende limitar el alcance de la invención sino señalar diversos aspectos de la invención. El experto ordinario en la materia apreciará fácilmente otros aspectos y formas de realización de la invención.

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Ejemplo

Puede producirse un casete de vacuna de ADN que expresa genes accesorios de virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1), que comprende Vif de VIH, Vpu de VIH y Nef de VIH, tal como se describe en Ayyavoo V., AIDS 14:1-9, 2000.

Materiales y métodos

Células: se cultivaron células HeLa y NIH3T3, obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC), en una monocapa a 37ºC en 5% de CO_{2} en medio de Eagle modificado por Dulbecco, suero de feto bovino al 10%, penicilina al 1%, estreptomicina al 1% y L-glutamina al 1%. Se mantuvieron células P815 obtenidas de ATCC en forma de cultivos en suspensión en RPMI 1640, suero de feto bovino al 10%, penicilina al 1%, estreptomicina al 1% y L-glutamina al 1% a 37ºC con 5% de CO_{2}. Se mantuvieron PBLs estimuladas con fitohemaglutinina (PHA) (5 \mug/ml), en medio RPMI 1640 que contenía factor de crecimiento de células T al 10%.

Generación de múltiples casetes de expresión de inmunógeno: se clonaron individualmente por PCR los genes vif, vpr, vpu y nef de VIH-1. Se seleccionaron los genes accesorios de VIH-1 atenuado vif (N17), vpu (M5256) y nef (S313) para construir los casetes multigénicos de fusión. Con el fin de construir la proteína de fusión y la proteína de fusión con sitios de corte proteolítico, los presentes inventores utilizaron la técnica de PCR de solapamiento. Se fusionaron vif, vpu y nef de VIH-1 en este orden utilizando los cebadores siguientes:

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Se utilizaron los mismos cebadores para construir la proteína de fusión, excepto el cebador vif(-) y el cebador vpu(-), que presentan un sitio de corte proteolítico adicional de ocho aminoácidos (REKRAVVG) (SEC ID nº 4). Los productos de gen de fusión amplificados (1,4 kb) se digirieron con HindIII (sitios para los que se introdujeron secuencias de reconocimiento en las parejas de cebadores externas), se clonaron en pcDNA3 (Invitrogen, CA), y se secuenciaron para verificar las mutaciones y garantizar la integridad de los genes de fusión.

Traducción in vitro de proteínas de fusión utilizando el sistema T7: se llevó a cabo la transcripción y traducción in vitro en 1 \mug de constructo de ADN de expresión de proteína de fusión utilizando ARN polimerasa de T7 siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI). Se combinaron cinco (5) \mul de productos de reacción de traducción in vitro con 500 \mul de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación y se inmunoprecipitaron con antisueros anti-Vif, anti-Vpu y anti-Nef de conejo. Los productos de inmunoprecipitados se resolvieron en SDS-PAGE al 12% y se autorradiografiaron.

Transferencia western (análisis de inmunotransferencia): se transfectaron células HeLa con 20 \mug de constructos de expresión pVVN y pVVN-p utilizando DOTAP (BMB, IN). Cuarenta y ocho horas después de la transfección se introdujeron células en medio de selección (DMEM que contenía 400 \mug/ml de geneticina) y se aislaron clones de células individuales. Con el fin de analizar la expresión, funcionalidad y corte correcto de las proteínas por parte de las proteasas celulares, las células estables se lisaron y los lisados celulares se utilizaron en la inmunoprecipitación utilizando anticuerpos anti-Vif, anti-Vpu y anti-Nef seguido de transferencia western.

Ensayo de inmunofluorescencia: se mantuvieron células HeLa en DMEM que contenía FBS al 10% y se sembraron en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina a una densidad de 1 x 10^{6} células por placa (35 mm). Veinticuatro horas después se infectaron con vTF7-3 y se transfectaron tal como se ha descrito anteriormente. Dieciséis a 24 horas después de la transfección, las células se lavaron con PBS y se fijaron con metanol a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron con PBS y se incubaron durante 90 minutos con antisuero primario (1:50). Tras lavar con PBS, los cubreobjetos se incubaron durante 90 minutos con fragmento F(ab)'_{2} purificado por afinidad conjugado con FITC de IgG anticonejo de cabra (ICN Biochemicals, CA) diluido 1:100 en PBS, y se lavaron seis veces con PBS. A continuación, los cubreobjetos se contratiñeron durante 5 minutos con DAPI (al 0,1% en PBS; Sigma, St. Louis, MO) y nuevamente se lavaron previamente al montaje sobre portaobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje resistente al palidecimiento (Citiflour, Inglaterra). Todas las incubaciones se llevaron a cabo a 37ºC en una cámara de humidificación.

Desarrollo de líneas celulares estables de ratón que expresan hCD4 y CCR5 o CXCR4 para CTL: se cotransfectaron células NIH3T3 con vector de expresión hCD4 y pBabe-fusina o con vectores de expresión hCD4 y pBabe-CCR5 utilizando DOTAP (BMB, IN). Cuarenta y ocho horas después de la transfección se mantuvieron células en 400 \mug/ml de geneticina y 2 \mug/ml de puromicina. Se establecieron líneas celulares estables a partir de clones celulares individuales y se analizaron para la expresión de hCD4 y fusina o CCR5 mediante citometría de flujo. Brevemente, se tiñeron células (5 x 10^{5}) con mAbs humanos marcados con FITC o PE contra CD4, CCR5 y fusina (Pharmingen, CA) durante 1 hora, se lavaron 2X con tampón FACS (BSA al 3%, NaN_{3} al 0,1% en 1X PBS) y se fijaron con paraformaldehído al 2% y se analizaron con un separador celular activado por fluorescencia (Beckton Dickinson, CA).

Infección vírica por aislados primarios: se infectaron células NIH3T3 que expresaban hCD4/fusina y hCD4/CCR5 con 10 a 50 ng de equivalente de p24 de VIH-1 de aislados de laboratorio T-trópicos (pNL43) y dual-trópicos (89.6) bien caracterizados. Los aislados primarios también incluyen virus derivados de los diferentes clados C, D, E y A (obtenidos de WHO mediante NIH ARRPP). Se sometió a ensayo la infectividad de las células mediante la medición del antígeno p24 liberado al medio. El ensayo de p24 se llevó a cabo utilizando el kit ELISA de captura de p24 (Coulter, FL) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ratones: los ratones Balb/c hembra de 6 a 8 semanas de edad se adquirieron de Harlan Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis, Indiana). Los ratones se alojaron en un una sala de temperatura controlada y fotoperiodo controlado siguiendo las directrices del National Institute of Health y de la University of Pennsylvania.

Inoculación de ADN: los presentes inventores utilizaron un protocolo facilitado de inoculación de ADN que resulta en niveles incrementados de expresión de proteínas a partir de genes administrados por plásmido in vivo. Específicamente, se inyectaron 100 \mul de bupivacaína-HCL al 0,25% (Sigma, MO) utilizando una aguja de calibre 27 en los músculos cuádriceps de ratones BALB/c. Cuarenta y ocho horas después, se inyectaron 100 \mug del constructo de ADN de interés en solución salina con tampón fosfato en la misma región del músculo que la inyección de bupivacaína. Los ratones recibieron una inyección seguido de un refuerzo dos semanas después. Dos semanas después de la segunda inyección, se sacrificó la mitad de los ratones en cada grupo para obtener sus bazos, y los ratones restantes recibieron un segundo refuerzo con el constructo de ADN apropiado.

Ensayo de proliferación de células T ayudantes: se prepararon linfocitos procedentes de bazos recolectados de ratones. Las suspensiones de células aisladas se resuspendieron a una concentración de 5 x 10^{6} células/ml en RPMI 1640 que contenía FBS al 10%. Se añadió una alícuota de 100 \mul que contenía 5 x 10^{5} células al pocillo apropiado de una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano según la distribución del ensayo. Se añadieron 100 \mul de la proteína apropiada a pocillos por triplicado a una concentración de 10 ó 2 \mug/ml, proporcionando las concentraciones finales de proteínas de 5 y 1 \mug/ml, respectivamente. Las células se incubaron a 37ºC en 5% de CO_{2} durante tres días. Se añadió un \muCi de timidina tritiada a cada pocillo y las células se incubaron durante 12 a 18 horas a 37ºC. Se recogieron las placas y se midió la cantidad de timidina tritiada incorporada en un lector de placas beta. Con el fin de garantizar que las células eran sanas, se utilizaron 10 \mug/ml de PHA como control positivo de estimulador policlonal.

Se determinó el índice de estimulación a partir de la fórmula:

índice de estimulación = (recuento experimental-recuento espontáneo)/recuento espontáneo.

Ensayo de linfocitos T citotóxicos: se llevó a cabo un ensayo de CTL de liberación de ^{51}Cr de 5 horas utilizando dianas infectadas por Vaccinia o dianas tratadas con péptido. Se recolectaron linfocitos de los bazos y se prepararon como células efectoras mediante separación de los eritrocitos y lavando varias veces con medio fresco. El ensayo se llevó a cabo con estimulación in vitro de los efectores o sin ella. En el caso del ensayo con estimulación in vitro, las células efectoras se estimularon durante 1 día con concavalina A (Sigma, St. Louis, MO) a una concentración de 2 \mug/ml. A continuación, los efectores se estimularon durante 3 días con células P815 relevantes infectadas por Vaccinia o tratadas con 1 \muM de péptido, que se fijaron con glutaraldehído al 0,1% y glicina 0,1 M. Se prepararon dianas infectadas por Vaccinia mediante infección de 3 x 10^{6} células P815 durante 5 a 12 horas a 37ºC. Se prepararon dianas pulsadas con péptido mediante incubación de células P815 durante 5 a 12 horas con péptidos. Las células diana se marcaron con 100 \muCi/ml de Na_{2}^{51}CrO_{4} durante 60 a 120 minutos y después se incubaron con los esplenocitos estimulados durante 4 a 6 horas a 37ºC. Se sometieron a ensayo las CTL a proporciones efector:diana (E:T) comprendidas entre 50:1 y 12,5:1. Se recolectaron los sobrenadantes y se realizaron recuentos en un contador Gamma de LKB. Se determinó el porcentaje de lisis específica con la fórmula: 100 x {(liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea)}. Se determinó la liberación máxima mediante lisis de las células diana en medio Tritón X-100 al 5%. Se obtuvieron Vaccinia recombinante (vNef y vSC8) del AIDS Research and Reference Reagent Program del NIH.

Ensayo CTL utilizando dianas infectadas por aislados clínicos de VIH-1: se infectaron células NIH3T3 que expresaban hCD4/CCR5 con aislados clínicos y de laboratorio de VIH-1 que representaban virus tanto T-trópicos como M\diameter-trópicos. Se marcaron clones NIH3T3 infectados por VIH-1 con cromo y se utilizaron como dianas en el ensayo de CTL.

Eliminación de CTL de clados cruzados: se utilizaron virus VIH-1 aislados de diferentes clados para infectar células NIH3T3 que expresaban hCD4/fusina y hCD4/CCR5. Se sometió a ensayo la infectividad midiendo el antígeno p24 y se utilizaron células infectadas como dianas en el ensayo de CTL.

Resultados

Construcción y caracterización de genes vif, vpu y nef atenuados para la inmunización con ADN: se clonaron los genes accesorios vif, vpu y nef de VIH-1 a partir de pacientes VIH-1-positivos y se analizaron para su función y se atenuaron. Se llevó a cabo la caracterización biológica de dichos genes siguiendo los ensayos funcionales estándares, tal como se indica en la Tabla 1. Se seleccionaron clones atenuados vif, vpr, vpu y nef para los análisis inmunológicos adicionales en ratones. Se utilizaron clones de vif, vpr, vpu y nef funcionales (de tipo salvaje) y no funcionales (atenuados) para inmunizar ratones y se midieron las respuestas inmunológicas generadas. Se inmunizaron grupos de ratones con uno de los constructos de vacuna, recibiendo un refuerzo adicional 15 días después. Posteriormente se sacrificaron los animales, dos semanas después de la segunda inyección y se obtuvieron los bazos de los mismos para la utilización en ensayos de células T citotóxicas (CTL) y linfoproliferativos. Debido a la disponibilidad de reactivos para el ensayo CTL, se utilizaron como células diana, células P815 que expresaban Vif o células P815 infectadas por Vaccinia que expresa Nef.

Los constructos de vif y de nef tanto funcionales como atenuados pueden inducir CTL antígeno-específicas, comparado con ratones inmunizados con constructo de vector.

La figura 1A muestra el porcentaje de actividad de CTL específicas inducidas por constructos de vif y de nef tanto funcionales como atenuados. Se administraron intramuscularmente en ratones 100 \mug de plásmido de expresión de nef o de vif tanto de tipo salvaje como atenuado. Dos semanas tras la primera inyección, los ratones recibieron un refuerzo una vez con la misma dosis del plásmido respectivo. Tras 2 semanas adicionales, se llevó a cabo el ensayo de CTL en células de bazo recolectadas de ratones inmunizados tal como se describe en la sección de métodos. El ensayo se llevó a cabo el día de recolección de los bazos midiendo la liberación de cromo a partir de dianas infectadas por Vaccinia específica e irrelevante. El grupo de control inmunizado con únicamente esqueleto de vector resultó en la falta de lisis específica de células diana por encima del nivel de fondo. Se utilizaron Vaccinia que expresaban \beta-gal (vSC8) para infectar p815 para preparar dianas irrelevantes. Se obtuvieron resultados similares en múltiples experimentos. A una proporción de efector:diana de 50:1, los clones de vif T-37 (funcional) y N-17 (atenuado) mostró 19,9% y 25% de lisis específica, respectivamente. Estos resultados demuestran que la inmunización con ADN con diferentes constructos de vif indujo respuestas de CTL antígeno-específicas. De manera similar, el clon de nef funcional (Nef-Mn) y un clon de nef atenuado (Nef-Hxb2) pueden inducir la lisis específica de células T citotóxicas contra dianas infectadas por Vaccinia Nef.

Los presentes inventores también midieron las respuestas proliferativas de células T inducidas por clones atenuados de vif, vpr, vpu y nef con la estimulación de antígeno respectiva. La figura 1B muestra datos de experimentos de proliferación de células T en los que se indujo la proliferación de células T mediante inmunización de plásmidos que expresaban vif, vpu, vpr y nef: se inyectaron intramuscularmente 100 \mug de casetes de expresión del ADNc respectivo en ratones y los ratones recibieron un refuerzo una vez tras 2 semanas. Una semana después del refuerzo, se aislaron esplenocitos de 2 ratones y se agruparon y utilizaron para la proliferación de células T. Se estimularon esplenocitos con 5 y 1 \mug/ml de proteína recombinante durante 3 días. Se añadió un \muCi de ^{3}H y se realizó un recuento de la incorporación de cpm. Se añadió PHA como control positivo. Se calculó la estimulación específica de antígeno (SI) y se presentó para Vif, Vpu y Nef. Se obtuvieron resultados similares por lo menos en tres experimentos separados. Los resultados indican que vif, vpu y nef pueden inducir una respuesta linfoproliferativa significativa, mientras que la estimulación con antígeno Vpr no proporcionó ningún beneficio en este ensayo. Basándose en estos resultados y en la información disponible de estudios anteriores, no se incluye el gen accesorio vpr en el presente estudio como parte del constructo multigénico de vacuna.

Los resultados de los presentes inventores indican que pueden utilizarse genes patogénicos como inmunógenos tras identificar los dominios funcionales y atenuar los dominios sin interferir con la expresión del antígeno. Para la construcción adicional de un casete multigénico, los presentes inventores utilizaron los clones atenuados de vif, vpu y nef.

Construcción y expresión de casete de proteína de fusión vif/vpu/nef (pVVN) y constructo de proteína de fusión vif/vpu/nef con sitios de corte proteolítico (pVVN-P): con el fin de construir un casete de expresión multigénico de ADN que contuviese los genes accesorios como proteína de fusión, los presentes inventores seleccionaron los clones atenuados aunque inmunológicamente activos vif (N17), vpu (M5256) y nef (S313) como base. Se eliminó el codón de parada de vif y de vpu, y se fusionó en el mismo marco de lectura, de manera que la proteína de fusión presentase los mismos epítopos que los genes individuales. Este constructo génico de fusión vif/vpu/nef se denominó pVVN. Los presentes inventores también deseaban conservar los extremos amino y carboxi naturales mediante la expresión de la proteína de fusión vif/vpu/nef con sitios de corte proteolítico, que se denomina en la presente memoria pVVN-P. La figura 2A ilustra la construcción y el diseño de proteína de fusión vif, vpu y nef y de proteína de fusión con sitios de corte proteolítico en forma de casetes de expresión individuales. Se delecionó el codón de parada de vif y de vpu y se fusionaron en el mismo marco de lectura las secuencias situadas a continuación. pVVN representa la expresión de vif, vpu y nef como gen individual, pVVN-P representa la expresión de vif, vpu y nef como gen individual con sitio de corte proteolítico entre vif y vpu y entre vpu y nef. En la proteína de fusión pVVN-P, se eliminó el codón de parada de vif y de vpu y se introdujo un sitio de corte proteolítico celular de ocho aminoácidos (REKRAVVG) en el mismo marco de lectura para permitir el corte respecto a la secuencia proteica siguiente.

Con el fin de someter a ensayo si los nuevos constructos de fusión eran funcionales en la producción de proteína o proteínas de fusión génica, se llevó a cabo una traducción in vitro tanto con pVVN como con pVVN-p, seguido de la inmunoprecipitación con anticuerpos específicos contra Vif, Vpu y Nef. Por sí mismas, Vif, Vpu y Nef expresan proteínas de 24 kDa, 10 kDa y 27 kDa, respectivamente. La traducción in vitro de los vectores pVVN y pVVN-P resultó en la expresión de una proteína de fusión de 61 kDa según lo esperado, que era detectable con anticuerpos específicos para las tres proteínas. La figura 2B muestra datos de la expresión de VVN y de VVN-P tras la traducción in vitro utilizando el sistema T7. Se utilizó 1 \mug de ADN de pVVN (clon nº 14) y pVVN-P (clon nº 2) en el sistema de traducción in vitro. Los productos traducidos in vitro se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-Vif (aVif), anti-Vpu (aVpu) y anti-Nef (aNef).

Expresión y localización subcelular de proteínas de fusión VVN y VVN-P en células HeLa: se evaluó la expresión de las proteínas de fusión VVN y VVN-P en células de mamífero utilizando las líneas celulares estables HeLa-VVN y HeLa-VVN-P que expresan los constructos pVVN y pVVN-P, respectivamente. Tras la transfección con los vectores de ADN, las células se cultivaron en medio de selección durante dos días, se lavaron dos veces con PBS y se lisaron. El lisado celular se incubó con anticuerpos anti-vif, anti-vpu y anti-nef, se inmunoprecipitó y se resolvió en un gel de SDS-PAGE y se sometió a análisis de inmunotransferencia. La transfección de pVVN en células HeLa resultó en la expresión de una proteína de fusión de 61 kDa, que se detectó con los tres anticuerpos (datos no mostrados). Por el contrario, la transfección con pVVN-P resultó tanto en especies de peso molecular más elevado como en proteínas de 24, 10 y 27 kDa reconocidas por los anticuerpos anti-Vif, anti-Vpu y anti-Nef, respectivamente. La figura 3A muestra datos referidos a la expresión y procesamiento de proteína de fusión VVN y VVN-P en células HeLa mediante inmunoprecipitación. Se transfectaron células HeLa con plásmidos pVVN-P y se dejaron durante la noche. Las células se mantuvieron durante 48 horas en medio normal, antes de introducirlas en un medio de selección G418. Se llevó a cabo la selección con G418 durante 2 semanas y las células se lisaron y se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-Vif, anti-Vpu y anti-Nef tal como se describe en los materiales y métodos. Los inmunoprecipitados se analizaron mediante SDS-PAGE (al 12%). Se indican las denominaciones de los antisueros en la parte superior y los productos cortados se encuentran señalados con una flecha. Los resultados indican que la expresión in vivo de pVVN resulta en una proteína de fusión y la expresión in vivo de pVVN-P resulta en que las proteasas celulares cortan la proteína de fusión por lo menos parcialmente, según lo esperado.

En células infectadas por VIH-1, Vif, Vpu y Nef se encuentran normalmente presentes en las membranas citoplasmáticas. Con el fin de verificar si la fusión de estas proteínas para formar una sola proteína o una proteína de fusión con sitios de corte proteolítico modifica la localización celular de las mismas, los presentes inventores llevaron a cabo estudios de inmunofluorescencia e inmunohistoquímicos in vitro e in vivo. Las células HeLa se transfectaron con pVVN y con pVVN-P y se estudió la localización de la proteína de fusión vif/vpu/nef y de la proteína de fusión con sitios proteolíticos mediante inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos anti-Vif, anti-Vpu y anti-Nef. La figura 3B muestra datos que hacen referencia a la localización subcelular de las proteínas de fusión VVN y VVN-P in vivo. Las células HeLa se infectaron con virus Vaccinia recombinante vTF7-3 y se transfectaron con los plásmidos de expresión VVN y VVN-P. Tras la transfección durante la noche, las células se fijaron y se tiñeron con sueros anti-Vif, anti-Vpu y anti-Nef seguido de inmunoglobulina G anticonejo de cabra purificada por afinidad conjugada con isotiocianato de fluoresceína. Debido a que todos los antisueros se cultivaron en conejos, no pudieron combinarse en una sola inmunofluorescencia. DAPI, tinción nuclear, FITC representan células teñidas antisuero específicas. Los datos en la figura 3B muestran que Vif, Vpu y Nef mantienen su patrón de tipo salvaje de localización citoplasmática en forma de proteína de fusión o de proteína de fusión con sitios proteolíticos. Los resultados indican que la fusión de estos genes no alteró el patrón de distribución subcelular de los mismos, y sugiere que ambos productos génicos se someten a la misma ruta de procesamiento que los genes de tipo salvaje y por lo tanto podrían presentarse a las moléculas de MHC similares al tipo salvaje. Además, los presentes inventores también analizaron la expresión de VVN y de VVN-P in vivo llevando a cabo análisis inmunohistoquímicos en secciones de músculo de ratones inmunizados con pVVN y con pVVN-P utilizando anticuerpos anti-Nef. La inmunohistoquímica de secciones de músculo indicó que las proteínas de fusión tanto VVN como VVN-P podrían expresar a niveles elevados in vivo mediante administración génica. La figura 3C representa los resultados del análisis inmunohistoquímico de la expresión de antígenos VVN y VVN-P. Se prepararon secciones de músculo congelado a partir de ratones no inmunizados e inmunizados con pVVN y pVVN-P cinco días después de la inmunización y se tiñeron con anticuerpos anti-Nef. El panel (DAPI) representa la tinción nuclear y el panel (FITC) representa la tinción específica con anticuerpos anti-Nef. Las células positivas se tiñeron con FITC. Se examinaron cinco paneles para cada tinción para cada experimento.

Ensayo de proliferación de células T ayudantes: la activación y proliferación de los linfocitos T ayudantes desempeña un papel crucial en la inducción de la respuesta inmunológica tanto humoral mediante la señalización para la expansión de las células B activadas por antígeno, como la respuesta inmunológica celular, produciendo señales celulares para la expansión de los linfocitos T citotóxicos CD8+. Se inyectó uno de los dos constructos o vector solo en grupos de ratones (cuatro en cada grupo). Dos semanas después de la primera inmunización con ADN, los ratones recibieron un refuerzo con la misma dosis. Tras 2 semanas más, se recolectaron los bazos de los ratones inmunizados y se aislaron los linfocitos de los mismos. A continuación, se sometieron a ensayo estas células para la proliferación de células T tal como se ha descrito en los métodos. La figura 4 muestra datos de experimentos descritos que hacen referencia a la proliferación de células T de esplenocitos de ratones inmunizados con pVVN y pVVN-P tras la estimulación de Vif, Vpu y Nef recombinantes in vitro. Se inyectaron 100 \mug de los casetes de expresión de ADNc respectivos intramuscularmente en ratones y los ratones recibieron un refuerzo tras 2 semanas. Una semana después del refuerzo, se aislaron esplenocitos de los 2 ratones y se agruparon y se utilizaron para la proliferación de las células T. Se estimularon esplenocitos con 5 y 1 \mug/ml de proteína recombinante durante 3 días. Se añadió 1 \muCi de ^{3}H y se realizó un recuento de los cpm incorporados. Se añadió PHA como control positivo. Se denominan los constructos de ADN utilizados en la parte inferior. Se calculó la estimulación específica de antígeno (SI) y se presentó para Vif, Vpu y Nef. Se obtuvieron resultados similares en múltiples experimentos. Las figuras 4A, 4B y 4C muestran los resultados del ensayo de proliferación para los ratones inmunizados con los casetes de vacuna de ADN pVVN y pVVN-P utilizando las proteínas Vif, Vpu y Nef como antígenos. Se sembraron en placa las proteínas recombinantes (10 \mug/ml) en cada pocillo para estimular la proliferación de las células T. Se utilizaron 10 \mug/ml de la lectina (PHA) como control positivo de estimulador policlonal. Tal como se muestra, se observó un nivel de fondo reducido de proliferación (índice de estimulación de entre 0,2 y 1) en el grupo de control de bazos de ratones no inmunizados. Se observó un nivel moderado de proliferación contra las tres proteínas en esplenocitos de los grupos inmunizados con pVVN y con pVVN-P (figuras 4A, 4B y 4C). Con el fin de confirmar que VVN y VVN-P inducen una proliferación comparable de células T, los presentes inventores también llevaron a cabo en paralelo proliferación de células T con ratones inmunizados con constructos de gen individual. Vib por sí mismo, o en proteínas de fusión de VVN y VVN-P, resultó en SI de 6, 5 y 5,4, respectivamente (figura 4A). Se obtuvieron resultados similares utilizando proteína Vpu (figura 4B) y proteína Nef recombinante (figura 4C) como antígenos.

Actividad de linfocitos T citotóxicos utilizando Nef de Vaccinia: con el fin de investigar adicionalmente la inducción de la respuesta inmunológica célula resultante por parte de dichos constructos, los presentes inventores llevaron a cabo ensayos de linfocitos T citotóxicos (CTL) en esplenocitos de ratones inmunizados con pVVN y pVVN-P contra dianas P815 infectadas con Nef de Vaccinia o pulsadas con péptido Nef. Se llevó a cabo el ensayo de CTL utilizando células de bazo recolectadas de ratones inmunizados y después estimulados in vitro previamente al ensayo de la liberación de cromo a partir de dianas específicas y no específicas infectadas por Vaccinia o tratadas con péptido. Se inmunizaron ratones Balb/c con 100 \mug de pVVN, pVVN-P y vector de control. Se obtuvieron esplenocitos de los ratones 2 semanas después de los primer y segundo refuerzos y se llevó a cabo un ensayo de CTL antígeno-específicos en un procedimiento de liberación de 51Cr de 6 horas. Se calculó la lisis específica inducida por esplenocitos de ratones inmunizados con pVVN y pVVN-P, y se presenta en la figura 5. Los gráficos representan el porcentaje de lisis específica inducida restando la lisis no específica medida por el ensayo utilizando las células diana infectadas con Vaccinia recombinante de control. Se llevó a cabo el ensayo de CTL en células de bazo recolectadas de ratones inmunizados tal como se ha descrito. Se obtuvieron resultados similares en múltiples experimentos. A una proporción de efector:diana de 50:1 con dianas infectadas por Vaccinia con Nef, el porcentaje de lisis específica fue de 38% y 31% por esplenocitos de ratones inmunizados por pVVN-P y pVVN, respectivamente. El porcentaje de lisis específica era titulable. Se observaron resultados similares con dianas P815 que expresaban Vif. En ensayos repetidos, el porcentaje de lisis específica observado en ratones inmunizados con pVVN-P aparentemente era reproduciblemente superior que el de ratones inmunizados con pVVN.

Lisis de células T citotóxicas utilizando dianas infectadas por VIH-1: en general ha resultado difícil llevar a cabo ensayos de CTL contra virus VIH-1 en el sistema de ratón debido a que VIH-1 no infecta naturalmente las células murinas. Con el fin de evaluar la capacidad de VVN y de VVN-P de lisar dianas infectadas por VIH-1, los presentes inventores construyeron líneas celulares NIH3T3 que expresaban hCD4 y coreceptores CCR5 o fusina. Se seleccionó la línea celular NIH3T3 debido a la compatibilidad de MHC con ratones Balb/c utilizados en el estudio de los presentes inventores. Aunque las células murinas no dan soporte a la infección por VIH-1, estas líneas celulares estables pueden infectarse con diferentes cepas de VIH-1 durante una sola ronda de replicación. Los presentes inventores plantearon la hipótesis de que esta única ronda de infección podía utilizarse para los ensayos de CTL. Se infectaron las líneas celulares estables NIH3T3/hCD4/fusina y NIH3T3/hCD4/CCR5 con virus primarios y de laboratorio bien caracterizados y se midió la infectividad a partir del antígeno p24 liberado al medio (Tabla 2). Los aislados primarios y moleculares de aislados de VIH-1 pudieron infectar estas líneas celulares de manera detectable y reproducible. Algunos aislados primarios (92RW009&BJ) no infectaron estas células de una manera libre de células. Con el fin de analizar si la inmunización con constructos de pVVN y pVVN-P pudo eliminar las células diana infectadas por VIH-1, los presentes inventores utilizaron virus T-trópicos (VIH-1 NL43) y dual-trópicos (VIH-1 89.6) de clado B para infectar células NIH3T3/CD4/CXCR4 y NIH3T3/CD4/CCR5. Se utilizaron estas células infectadas como células diana en dicho ensayo de CTL. Los esplenocitos de ratones inmunizados tanto con pVVN y con pVVN-P indujeron la lisis de las células infectadas por patógeno nativo. La figura 6A muestra datos de experimentos que hacen referencia a la respuesta de linfocitos T citotóxicos inducidos por la inmunización con pVVN y pVVN-P contra dianas infectadas por VIH-1 (T-trópicos y dual-trópicos). Se infectaron células NIH3T3 que expresaban CD4/CCR5 o CD4/CXCR4 con virus dual-trópicos (89.6) y T-trópicos (pNL43) y se utilizaron como células diana en el ensayo de CTL. Se inmunizaron ratones Balb/c con 100 \mug de pVVN, pVVN-P y vector de control. Se obtuvieron esplenocitos de los ratones 2 semanas después del primer y segundo refuerzos y se llevó a cabo un ensayo de CTL antígeno-específicas en un procedimiento de liberación de ^{51}Cr de 6 horas. Se calculó la lisis natural (no específica) de células diana infectadas por VIH-1 y se restó de las muestras experimentales para incluir la lisis específica inducida por esplenocitos procedentes de ratones inmunizados en este ensayo. Se observaron resultados similares en experimentos independientes múltiples. Los datos muestran el porcentaje de lisis específica por pVVN y por pVVN-P utilizando células NIH3T3/CD4/CCR5 infectadas por VIH-1. A una proporción de efector:diana de 50:1, el porcentaje de lisis por VVN y VVN-P fue de 29 y 42, respectivamente, en dianas infectadas por virus dual-trópico, mientras que la lisis específica fue de 16% y 21% en dianas infectadas por virus T-trópico. Resulta interesante que el porcentaje de CTL específicas inducidas por el constructo pVVN-P siempre fue superior que con la inmunización con constructo pVVN.

CTL de clados cruzados inducidas por constructos pVVN y pVVN-P: con el fin de evaluar el reconocimiento de CTL de clados cruzados por parte de estos constructos (genes del virus de clado B), los presentes inventores infectaron líneas celulares NIH3T3/CD4/CCR5 o NIH3T3/hCD4/fusina con aislados de VIH-1 de clados D, E, C y A (Tabla 2). Tras alcanzar las células niveles moderados de infección, las células se marcaron con ^{51}Cr y se utilizaron como dianas para el ensayo de CTL. La figura 6B muestra datos experimentales que hacen referencia a las respuestas de CTL de clados cruzados inducidas por esplenocitos aislados de ratones inmunizados con constructos de expresión VVN y VVN-P. Respuestas de CTL de clados cruzados inducidas por esplenocitos aislados de ratones inmunizados con constructos de expresión VVN y VVN-P: se utilizaron como células diana en el ensayo de CTL, células NIH3T3 que expresan CD4/CCR5 o CD4/CXCR4 infectadas por virus VIH-1 derivados de los clados B, C/A, D y E. Se inmunizaron ratones Balb/c con 100 \mug de pVVN, pVVN-P y vector de control. Se obtuvieron esplenocitos de los ratones 2 semanas tras los primer y segundo refuerzos y se llevó a cabo el ensayo de CTL antígeno-específicos en un procedimiento de liberación de ^{51}Cr de 6 horas. Se calculó la lisis natural (no específica) de células diana infectadas por VIH-1 y se restó de las muestras experimentales para incluir la lisis específica inducida por esplenocitos procedentes de ratones inmunizados en este ensayo. Se observaron resultados similares en experimentos independientes múltiples. Los resultados presentados en la figura 6B muestran que tanto pVVN como pVVN-P indujeron actividad de CTL contra dianas infectadas por clado B (aislado clínico), D (VIH-1_{Zr6}) y E (92THA022). Títulos de actividad a menores proporciones de efector:diana. Además, los presentes inventores también han advertido que los esplenocitos procedentes de ratones inmunizados con pVVN-P indujeron una respuesta de CTL más elevada contra dianas infectadas por clado B y D que los esplenocitos procedentes de ratones inmunizados con pVVN. Sin embargo, los presentes inventores no observaron ninguna actividad de CTL contra dianas infectadas por clado C/A (92RW009) tanto con inmunización con pVVN como con pVVN-P. No resulta improbable que este resultado refleje la menor tasa de infección de dicho aislado en dichas líneas celulares de ratón (Tabla 2).

TABLA 1 Ensayos biológicos utilizados en el estudio para identificar los genes accesorios de VIH atenuado vif, vpu, vpr y nef

5

Se clonaron los genes accesorios de VIH-1 vif y nef a partir de aislados clínicos y se caracterizaron basándose en el ensayo funcional de los mismos. Se introdujeron mutaciones en Vpr y Vpu basándose en estudios anteriores (41, 58). NA: no aplicable.

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TABLA 2 Infectividad en células NIH3T3 que expresan CD4 y CCR5 humanas o CD4 y CXCR4 de aislados víricos VIH-1 de diversos clados con diferente tropismo celular

6

Se obtuvieron aislados primarios de VIH-1 de UNAIDS mediante NIH AIDS RRRP y se propagaron en PBMCs normales. Se infectaron células NIH3T3 que expresan hCD4/CCR5 y hCD4/CXCR4 con 10 a 50 ng de equivalente vírico antígeno p24 durante 12 horas. Las células se lavaron dos veces con PBS y se mantuvieron en un medio de cultivo normal. Se realizó un seguimiento de las células para infección y se recolectaron las células y el medio y se sometieron a ensayo para la producción de p24. ND: no determinado.

<110> The Trustees Of The University of Pennsylvania

\hskip1cm Weiner, David B.

\hskip1cm Velpandi, Ayyavoo

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<120> Vacunas de ADN codificantes de proteínas accesorias del VIH

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<130> UPAP0444

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<150> 60/218.192

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<151> 2000-07-14

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<160> 10

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<212> ADN

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> The Trustees Of The University of Pennsylvania

\hskip1cm Weiner, David B.

\hskip1cm Velpandi, Ayyavoo

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<120> Vacunas de ADN codificantes de proteínas accesorias del VIH

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<130> REP07396EP

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<140> 01962300.8

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<141> 2001-07-12

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<150> 60/218.192

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<160> 10

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 579

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Secuencia nueva

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<223> Secuencia nueva

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<212> ADN

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<223> Secuencia nueva

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<212> PRT

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<223> Secuencia nueva

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<223> Secuencia nueva

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<223> Secuencia nueva

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<223> Secuencia nueva

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm24

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<210> 9

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<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia nueva

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia nueva

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm26

Claims

1. Poliproteína que comprende Vif de VIH atenuado, Vpu de VIH atenuado y Nef de VIH atenuado, en la que Vif de VIH atenuado carece de la transcomplementación de provirus VIH-1 vif^{-} en la infección libre de células, el Vpu de VIH atenuado muestra una pérdida de CD4 y una degradación de MHC-1 y el Nef de VIH atenuado muestra una pérdida de regulación negativa de CD4 y de expresión de MHC-1.

2. Poliproteína según la reivindicación 1, en la que el Vif de VIH atenuado se encuentra codificado por la SEC ID nº 1.

3. Poliproteína según la reivindicación 1 ó 2, en la que el Vpu de VIH atenuado se encuentra codificado por la SEC ID nº 2.

4. Poliproteína según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el Nef de VIH atenuado se encuentra codificado por la SEC ID nº 3.

5. Poliproteína según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, en orden de extremo N-terminal a extremo C-terminal, el Vif de VIH atenuado, el Vpu de VIH atenuado y el Nef de VIH atenuado.

6. Poliproteína según la reivindicación 5, en la que un sitio de corte de proteasa se encuentra situado entre el Vif de VIH atenuado y el Vpu de VIH atenuado, y un sitio de corte de proteasa se encuentra situado entre el Vpu de VIH atenuado y el Nef de VIH atenuado.

7. Poliproteína según la reivindicación 6, en la que el sitio de corte de proteasa es REKRAVVG.

8. Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante que codifica la poliproteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8, en la que la secuencia codificante se encuentra de manera operable ligada a los elementos reguladores.

10. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8 ó 9, que es un plásmido.

11. Vacuna recombinante o vacuna atenuada que comprende la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

12. Composición farmacéutica que comprende la poliproteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

13. Utilización de la poliproteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o la molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para la preparación de una composición farmacéutica para la inmunización de un individuo frente al VIH.

14. Utilización según la reivindicación 13, en la que la inmunización es profiláctica.

15. Utilización según la reivindicación 13, en la que la inmunización es terapéutica.