JP2004525604A - Hivアクセサリータンパク質をコードするdnaワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
発明の分野
本発明は、個人をヒト免疫不全ウイルス(HIV)に対して免疫化するための、改良されたワクチン及び方法、タンパク質及び核酸分子、それを含む医薬組成物並びにその利用方法に関係する。
【0002】
発明の背景
有効なワクチンは、長期間持続する免疫を、如何なる有害な副作用も病状の復帰も引き起こすことなく与えるべきである。伝統的なワクチンは、生弱毒化ワクチン、宿主に対する全殺菌製剤即ち生きてない製剤に集中してきた。これらのワクチンは、多くのウイルスに対する防護のための液性及び細胞性免疫応答の両方の成立において立証された効果を有する。幾つかのウイルス性病原体に対するワクチンの開発は、簡単な仕事ではない。この仕事は、病原体の病理生物学と宿主の免疫応答の特異性を含む幾つかの因子によって、面倒なものとなる。最近、これらの相互作用に関係する免疫成分の理解のための新しいツールが利用可能になった。このツール即ち遺伝子免疫又はDNAワクチン接種は、広範囲の病原体に対する安全で機能的なワクチンを開発する努力に対するユニークな源である。
【0003】
1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1)は、後天性免疫不全症候群(AIDS)病因子である。HIV−1は、RNAを利用してそのメッセージを標的細胞に伝え、その後、それが、該標的細胞内でcDNAに変換されてその核に組み込まれるレンチウイルスである。RNAのcDNAへの変換における高率のエラーのために、HIV−1は、高度に変異しやすいウイルスであり、これは、それに対する伝統的なワクチンの開発を困難な仕事にしている。全ウイルスゲノムではなくて短いDNAセグメントを用いて患者を免疫化する遺伝子免疫は、このウイルスに対してワクチン接種する安全な方法であることが判明しつつある。現在まで、DNAワクチンは、HIV−1の構造遺伝子、酵素遺伝子及びアクセサリー遺伝子に対して開発されて、マウス及び霊長類において免疫応答を誘導する能力について試験されてきた。これらのワクチン構築物の幾つかは、現在、フェーズIの臨床試験にある。
【0004】
HIV−1に対する防護に関係する免疫機構は、不明のままである。様々な宿主免疫応答のスペクトルの内で、細胞媒介の免疫の誘導は、該免疫がウイルス除去において決定的な役割を演じうるので、有効なHIV−1ワクチン候補の特に重要な必要条件でありえよう。CTLは、ウイルス粒子中に存在する遺伝子産物を標的とすることができるだけでなく、ウイルスの複製中に発現されたすべてのウイルス遺伝子産物をも標的とすることができる。初期の研究は、HIV−1感染した患者において、初期ウイルス血症の制御は、CD8+Tリンパ球の細胞性応答の存在と関係するということを示した。加えて、HIV陽性の長期間進行しないもの及びHIV感染した母親に生まれた未感染の子供は、HIV−1タンパク質に対する非常に高いCTL応答を示し、これは、CTL応答を得ることが抗HIVワクチンの開発の重要な焦点であろうということを示唆している。特異的CTL応答の発生によりウイルスタンパク質に狙いを定めた免疫応答は、ウイルス充填を、ウイルスファクトリーを破壊し、それ故に初期ウイルス充填の確立を低下させることによって低下させるのを助けることができるであろう。
【0005】
霊長類レンチウイルスゲノムは、新規な調節及びアクセサリータンパク質をコードする遺伝子を、それらの構造遺伝子及び酵素遺伝子に加えて含む。これらの調節遺伝子tat及びrev、並びにアクセサリー遺伝子nef、vif、vpr、vpu及びvpxは、HIV−1、HIV−2及びSIVを含む霊長類レンチウイルスにおいてよく保存されている。これらの遺伝子のよく保存された性質は、それらのタンパク質産物がイン・ビボでのウイルスの病因論において決定的に重要な役割を演じていることを意味する。最近の研究は、これらのアクセサリー遺伝子を増大されたビリオン生成に関連付け、それらをHIV感染の病因論に帰しており、これらは共に、アクセサリー遺伝子がHIV−1の実際的な活発な成分であるという考えに支持を与えるものである。これらの遺伝子産物は、このウイルスのオープンリーディングフレームの20%に相当し、イン・ビボで免疫原性であり、おそらくは一層突然変異生成しやすくなく、従って、それらは、ワクチン開発のための重要な標的に相当する。HIV−1アクセサリー遺伝子及び調節遺伝子に対するDNAワクチンの開発は研究されてはいるが、これらの遺伝子は潜在的に正常な細胞活性を破壊しうるという事実が、抗アクセサリー遺伝子DNAワクチンの開発に更なるレベルの複雑さを加えている。
【0006】
HIVに対するワクチンに対する要求がある。ウイルスに感染した標的細胞を種々の分岐群から排除することのできる免疫応答を生成する組成物及び方法に対する要求がある。
【0007】
図面の簡単な説明
図1A及び1Bは、実施例に記載の実験からのデータを示している。図1Aは、機能的及び弱毒化vif及びnefカセットにより誘導された細胞傷害性Tリンパ球活性を研究する実験からのデータを示している。図1Bは、T細胞増殖実験からのデータを示しており、該実験においては、T細胞増殖を、vif、vpu、vpr及びnefを発現するプラスミドでの免疫化により誘導した。
【0008】
図2Aは、構築物を描いており、図2Bは、実施例に記載の実験からのデータを示している。図2Aは、単一発現カセットとしての、vif、vpu及びnefの融合タンパク質及びタンパク質分解性開裂部位を有する融合タンパク質の構築及びデザインを描いている。図2Bは、T7系を利用したイン・ビトロ翻訳後のVVN及びVVN−Pの発現からのデータを示している。
【0009】
図3A、3B及び3Cは、実施例に記載の実験からのデータを示している。図3Aは、免疫沈降によるHeLa細胞中でのVVN及びVVN−P融合タンパク質の発現及びプロセッシングに関するデータを示している。図3Bは、イン・ビボでのVVN及びVVN−P融合タンパク質の細胞内局在性に関するデータを示している。図3Cは、VVN及びVVN−P抗原発現の免疫組織化学的分析の結果を示している。
【0010】
図4A、4B及び4Cは、組換えVif、Vpu及びNefでのイン・ビトロ刺激後にpVVN及びpVVN−Pで免疫化したマウス由来の脾臓細胞のT細胞増殖に関する実施例に記載の実験からのデータを示している。
【0011】
図5は、pVVN及びpVVN−P免疫化により誘導された細胞傷害性Tリンパ球応答に関する実施例に記載の実験からのデータを示している。
【0012】
図6A及び6Bは、HIV−1(T向性及び二向性)感染した標的に対するpVVN及びpVVN−P免疫化により誘導された細胞傷害性Tリンパ球応答並びにVVN及びVVN−P発現構築物により免疫化されたマウスから単離した脾臓細胞により誘導されたクロスクレードCTL応答に関する実施例に記載の実験からのデータを示している。図6Aは、HIV−1(T向性及び二向性)感染した標的に対するpVVN及びpVVN−P免疫化により誘導された細胞傷害性Tリンパ球応答に関する実験からのデータを示している。図6Bは、VVN及びVVN−P発現構築物で免疫化されたマウスから単離した脾臓細胞により誘導されたクロスクレードCTL応答に関する実験からのデータを示している。
【0013】
発明の説明
ここで用いる場合、用語「HIV VVNポリタンパク質」は、HIV Vif、HIV Vpu及びHIV Nefのアミノ酸配列を単一タンパク質として含むポリタンパク質を指すことを意味する。HIV VVNポリタンパク質は、HIV Vif、HIV Vpu及びHIV Nefの少なくとも1つが弱毒化されたポリタンパク質を含む。HIV VVNポリタンパク質は、HIV Vif、HIV Vpu及びHIV Nefが任意の順序で存在するポリタンパク質を含む。HIV VVNポリタンパク質は、コンポーネントタンパク質(HIV Vif、HIV Vpu及びHIV Nef)が他のコンポーネントタンパク質と隣接し又は非コンポーネントタンパク質配列例えばタンパク質分解による開裂部位を作るアミノ酸配列(これらに限らない)によって分離されているポリタンパク質を含む。
【0014】
ここで用いる場合、用語「HIV VVN構築物」は、HIV VVNポリタンパク質をコードする核酸分子を指すことを意味する。
【0015】
ここで用いる場合、用語「弱毒化」は、野生型と免疫学的に交差反応性であるが、機能性でないか又は野生型と比較して機能的に欠陥を有するHIVアクセサリータンパク質を指すことを意味する。一般に、弱毒化タンパク質は、機能的な野生型タンパク質と比較して改変された配列を有する。当業者は、容易に、野生型と免疫学的に交差反応性であるが機能性ではないか又は野生型と比較して機能的に欠陥を有する改変された配列を有するタンパク質を同定することができる。
【0016】
HIVタンパク質Vifは、末梢血液リンパ球、マクロファージ及びある種の細胞株においてHIVの複製に必須であると報告された23kDのポリペプチドである。アッセイを行って、改変配列を有するVifタンパク質を試験して、その改変型が機能性でないか又は機能的に野生型と比較して血管を有するかどうかを測定することができる。HIV Vifのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、周知であり、Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov) 及びHIV配列データベース(hiv−web.lanl.gov)でアクセスすることができる(これらを、各々、参考として本明細書中に援用する)。弱毒化HIV Vifをコードする遺伝子構築物を、Ayyavoo V、等(1997)AIDS 11:1433−1444(参考として本明細書中に援用する)に記載のようにして製造することができる。好適な弱毒化形態のHIV Vifをコードするヌクレオチド配列は、下記のSEQ ID NO:1である:
【化1】
【0017】
このvif遺伝子は、無症候性のHIV−1患者から単離される。機能アッセイ例えばトランス相補性研究を行ったところ、それらの結果は、この変異体がイン・ビトロでの無細胞HIV−1感染を支持できないことを示している。
【0018】
HIVタンパク質Vpuは、主として細胞の内膜に局在している一体式の膜リンタンパク質である16kDのポリペプチドである(Sato A.等、Virus Genes 1990;4:303−312、参考として本明細書中に援用する)。HIV感染細胞において、ウイルスレセプターCD4とウイルスエンベロープタンパク質との間で複合体が小胞体中で形成され、この区画内への両タンパク質の捕獲が引き起こされる。従って、細胞内Env−CD4複合体の形成は、ビリオンのアセンブリを邪魔する。Vpuは、Envと複合体化したCD4分子の分解の引き金を引くことによって、ウイルスエンベロープを遊離させる。(Willey R.L.等、J Virol 1992;66(12):7193−7200、参考として本明細書中に援用する。)Vpuも又、HIVの感染細胞表面からの放出を増大させる。(Klimkait T.等、J Virol 1990;64:621−629、参考として本明細書中に援用する。)アッセイを行って、改変された配列を有するVpuタンパク質を試験して、その改変型が非機能性であるか又は野生型と比較して機能的に欠陥を有するかを測定することができる。HIV Vpuのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、周知であり、Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov) 及びHIV配列データベース(hiv−web.lanl.gov)でアクセスすることができる(これらを、各々、参考として本明細書中に援用する)。好適な弱毒化形態のHIV Vpuをコードするヌクレオチド配列は、下記のSEQ ID NO:2である:
【化2】
【0019】
HIVタンパク質Nefは、CD4の細胞表面での発現のダウンレギュレーション、(Garcia J.V.及びMiller A.D. Res Virol 1992;143:52−55, 参考として本明細書中に援用する)T細胞活性化の動揺、(Luria S.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1991;88:5326−533、参考として本明細書中に援用する)及びHIV感染性の刺激を含む複数の活性を有することが示されている。(Miller M.D.等、J Exp Med 1994;179:101−113、参考として本明細書中に援用する。)アッセイを行って、改変された配列を有するNefを試験して、その改変型が非機能性であるか又は野生型と比較して機能的に欠陥を有するかを測定することができる。HIV Nefのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、周知であり、Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov) 及びHIV配列データベース(hiv−web.lanl.gov)でアクセスすることができる(これらを、各々、参考として本明細書中に援用する)。好適な弱毒化形態のHIV Nefをコードするヌクレオチド配列は、下記のSEQ ID NO:3である:
【化3】
【0020】
このNefクローンは、やはり長期間進行しない患者から単離されるが、CD4細胞での発現に際してCD4及びMHC−1分子を下方調節しない。
【0021】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)アクセサリータンパク質のVif、Vpu及びNefのタンパク質コンポーネントの配列を含むポリタンパク質に関係する。幾つかの具体例において、このポリタンパク質のコンポーネントタンパク質は、N末端からC末端へ、Vif、Vpu及びNefの順序で配置される。幾つかの具体例においては、少なくとも1つのタンパク質コンポーネントは、弱毒化形態のアクセサリータンパク質である。幾つかの具体例においては、ヒト免疫不全ウイルスのアクセサリータンパク質のVif、Vpu及びNefタンパク質コンポーネントの各々は、弱毒化形態である。
【0022】
幾つかの具体例においては、プロテアーゼ開裂部位を、ポリタンパク質のタンパク質コンポーネントの間に導入する。幾つかの具体例においては、プロテアーゼ開裂部位を、HIVアクセサリータンパク質VifとVpuの間に含ませる。幾つかの具体例においては、プロテアーゼ開裂部位を、HIVアクセサリータンパク質VpuとNefの間に含ませる。幾つかの具体例においては、ポリタンパク質のコンポーネントタンパク質を、N末端からC末端へ、Vif、Vpu及びNefの順序で配置し且つプロテアーゼ開裂部位をHIVアクセサリータンパク質VifとVpuの間に含ませ且つプロテアーゼ開裂部位をHIVアクセサリータンパク質VpuとNefの間に含ませる。幾つかの具体例においては、プロテアーゼ開裂部位は、REKRAVVG(SEQ ID NO:4)である。幾つかの好適具体例においては、弱毒化形態のコンポーネントタンパク質をポリタンパク質に含ませ、ポリタンパク質のコンポーネントタンパク質を、N末端からC末端へ、Vif、Vpu及びNefの順序で配置し、プロテアーゼ開裂部位REKRAVVG(SEQ ID NO:4)をVifとVpuの間及びVpuとNefの間に含ませる。
【0023】
本発明は、HIVアクセサリータンパク質Vif、Vpu及びNefのタンパク質コンポーネント配列を含むポリタンパク質をコード配列を含む核酸分子と関係している。幾つかの具体例において、コード配列は、コンポーネントタンパク質がN末端からC末端へVif、Vpu及びNefの順序で配置されたポリタンパク質をコードする。幾つかの具体例において、コード配列は、HIVアクセサリータンパク質Vif、Vpu及びNefの少なくとも1つの弱毒化形態をコードしている。幾つかの具体例において、コード配列は、HIVタンパク質Vif、Vpu及びNefの各々の弱毒化形態をコードする。幾つかの具体例において、プロテアーゼ開裂部位をコードするコード配列は、ポリタンパク質のタンパク質コンポーネントをコードするコード配列の間に含まれる。幾つかの具体例において、プロテアーゼ開裂部位をコードするコード配列は、HIVアクセサリータンパク質Vif及びVpuをコードするコード配列の間に含まれる。幾つかの具体例において、プロテアーゼ開裂部位をコードするコード配列は、HIVアクセサリータンパク質Vpu及びNefをコードするコード配列の間に含まれる。幾つかの具体例において、コード配列は、ポリタンパク質のコンポーネントタンパク質をコードし、該コンポーネントタンパク質は、N末端からC末端へ、Vif、Vpu及びNefの順序で配置され、1つのプロテアーゼ開裂部位は、HIVアクセサリータンパク質VifとVpuの間に含まれ、1つのプロテアーゼ開裂部位は、HIVアクセサリータンパク質VpuとNefの間に含まれる。幾つかの具体例において、コード配列は、REKRAVVG(SEQ ID NO:4)であるプロテアーゼ開裂部位をコードする。幾つかの好適具体例において、コード配列は、ポリタンパク質に含まれるコンポーネントタンパク質の弱毒化形態をコードし、ポリタンパク質のコンポーネントタンパク質は、N末端からC末端へ、Vif、Vpu及びNefの順序で配置され、そしてコード配列は、プロテアーゼ開裂部位REKRAVVG(SEQ ID NO:4)をVifとVpuの間及びVpuとNefの間にコードする。
【0024】
幾つかの具体例において、核酸分子のコード配列は、調節エレメントに操作可能に結合される。幾つかの具体例において、核酸分子は、プラスミドである。幾つかの具体例において、核酸分子はプラスミドであり且つ核酸分子のコード配列は、調節配列に操作可能に結合される。
【0025】
幾つかの具体例において、核酸分子は、組換えワクチン又は弱毒化ワクチンの部分として又は該ワクチンと結合して含まれ、核酸分子のコード配列は、調節エレメントに操作可能に結合される。
【0026】
本発明は、上記のようなこの発明のポリタンパク質及び/又は核酸分子を含む注射用医薬組成物を含む医薬組成物と関係する。
【0027】
本発明は、HIV感染に対して個人を免疫化する方法に関係する。これらの方法は、上記のようなこの発明のポリタンパク質及び/又は核酸分子を含む組成物を治療又は予防のための免疫応答を誘導するのに有効な量で投与するステップを含む。幾つかの具体例において、個人は、未感染であり、方法は、予防用である。幾つかの具体例において、個人は、感染しており、方法は、治療用である。幾つかの治療方法は、HIVに感染した個人を同定するステップを含む。HIVに感染した個人を同定する方法は、当業者には周知である。幾つかの具体例においては、個人に、ポリタンパク質を投与する。幾つかの具体例においては、個人に、ポリタンパク質をコードする核酸分子を投与する。
【0028】
本発明により、予防及び/又は治療のために個人をHIVに対して免疫化する組成物及び方法を提供する。遺伝物質は、個人の細胞により発現され、免疫原性の標的として働いて、それに対する免疫応答が誘出される。その結果生じる免疫応答は、広域的であり:液性免疫応答に加えて、細胞性免疫応答の両アームが誘出される。本発明の方法は、予防及び治療用の免疫を与えるのに有用である。従って、免疫化方法は、HIV感染から個人を防護する方法並びにHIV感染を患った個人を治療する方法の両方を含む。
【0029】
細胞により取り込まれると、この発明の遺伝子構築物は、その細胞内に、機能的な染色体外分子として存在し続けることができ及び/又はその細胞の染色体DNA中に組み込まれる。DNAは、細胞に導入することができ、該細胞においてそれは別個の遺伝物質としてプラスミド形態で存続する。或は、染色体に組み込まれうる直線状DNAを細胞に導入することができる。DNAを細胞に導入する場合には、DNAの染色体への組込みを促進する試薬を加えることができる。組込みを促進するのに有用なDNA配列も又、DNA分子に含ませることができる。或は、RNAを細胞に投与することができる。この発明の遺伝子構築物を、セントロメア、テロメア及び複製起点を含む直線状ミニクロモソームとして与えることも又、企図される。
【0030】
この発明の遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節エレメントを含む。これらのエレメントには:プロモーター、開始コドン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、エンハンサーが、この発明のタンパク質をコードする配列の遺伝子発現のためにしばしば必要とされる。これらのエレメントは、所望のタンパク質をコードする配列と操作可能に結合されること及びこれらの調節エレメントは、それらが投与される個人において操作可能であることが必要とされる。
【0031】
開始コドン及び終止コドンは、一般に、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の部分と考えられる。しかしながら、これらのエレメントは、遺伝子構築物が投与される個人において機能的であることが必要である。開始コドン及び終止コドンは、コード配列とイン・フレームでなければならない。
【0032】
使用するプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、個人の細胞内で機能的でなければならない。
【0033】
本発明を実施するのに(特に、ヒトのための遺伝子ワクチンの製造において)有用なプロモーターの例には、シミアンウイルス40(SV40)由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)由来のプロモーター例えばHIVロングターミナルリピート(LTR)プロモーター、モロニーウイルス、ALV、サイトメガロウイルス(CMV)由来のプロモーター例えばCMV最初期プロモーター、エプスタインバールウイルス(EBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)由来のプロモーター並びにヒトの遺伝子例えばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びヒトメタロチオネインに由来するプロモーターが含まれるが、これらに限らない。
【0034】
本発明の実施(特に、ヒト用の遺伝子ワクチンの製造)に有用なポリアデニル化シグナルの例には、ヒト及びウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル、SV40ポリアデニル化シグナル及びLTRポリアデニル化シグナルが含まれるが、これらに限らない。特に、pCEP4プラスミド(Invitrogen、カリフォルニア、San Diego在)中にあるSV40のポリアデニル化シグナル(SV40ポリアデニル化シグナルとして言及される)が用いられる。
【0035】
DNA発現に必要とされる調節エレメントに加えて、他のエレメントも、このDNA分子に含ませることができる。かかる追加的エレメントには、エンハンサーが含まれる。エンハンサーは、次のものを含む群から選択することができる(但し、これらに限らない):ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン及びウイルス性エンハンサー例えばCMV、RSV及びEBV由来のもの。
【0036】
この発明の遺伝子構築物は、それを染色体外に維持して細胞内に複数コピーを生成するために哺乳動物の複製起点を用いて提供することができる。Invitrogen(カリフォルニア、San Diego在)製のプラスミドpCEP4及びpREP4は、エプスタインバールウイルスの複製起点及び核抗原EBNA−1コード領域を含み、組込みを起こすことなく高コピー性のエピソーム的複製を生じる。
【0037】
免疫化適用に関する幾つかの好適具体例においては、HIV VVNポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、更に、かかる標的タンパク質に対する免疫応答を増強するタンパク質の遺伝子を含む核酸分子を送達する。かかる遺伝子の例は、サイトカイン及びリンホカイン例えばα−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子(PDGF)、GC−SF、GM−CSF、TNF、上皮成長因子(EGF)、IL−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−8、IL−10、IL−12及びB7.2をコードするものである。標的タンパク質に対する免疫応答を更に増強するタンパク質の遺伝子の利用は、PCT出願PCT/US99/04332(1999年2月26日出願)にも記載されており、国際公開No.WO99/43839として1999年9月2日に公開されている。
【0038】
タンパク質生成を最大にするために、構築物を投与する細胞内での遺伝子発現によく適合した調節配列を選択することができる。その上、細胞内で最も効率的に転写されるコドンを選択することができる。当業者は、細胞内で機能的であるDNA構築物を生成することができる。
【0039】
本発明の方法は、核酸分子を個人の組織に投与するステップを含む。幾つかの好適具体例において、これらの核酸分子は、筋肉内投与され、鼻内投与され、腹腔内投与され、皮下投与され、皮内投与され、静脈投与され、エアゾル投与により肺組織に若しくは局所投与され、又は洗浄により粘膜組織(膣、直腸、尿道、頬及び舌下よりなる群から選択)に投与される。
【0040】
本発明の一つの面は、本発明の方法において有用な医薬組成物に関係する。これらの医薬組成物は、少なくとも一種のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、個人の細胞における発現に必要な調節エレメントに操作可能に結合して含む核酸分子好ましくはDNA分子を含む。これらの医薬組成物は、製薬上許容しうるキャリアー又は希釈剤を更に含む。用語「医薬」は、当業者に周知で、広く理解されている。ここで用いる場合、用語「医薬組成物」及び「注射用医薬組成物」は、当業者に理解されている普通の意味を有することを意味する。医薬組成物は、無菌性、発熱物質、粒子物質並びに等張性及びpHに関する特定の標準に合致することを要する。例えば、注射用医薬品は、無菌であり且つ発熱物質を含まない。
【0041】
本発明による医薬組成物は、約1ng〜10,000μgのDNAを含むことができる。幾つかの好適具体例において、これらの医薬品は、約2000μg、3000μg、4000μg又は5000μgのDNAを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約1000μgのDNAを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約10ng〜800μgのDNAを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約0.1〜500μgのDNAを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約1〜350μgのDNAを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約25〜250μgのDNAを含む。幾つかの好適具体例において、これらの医薬組成物は、約100μgのDNAを含む。
【0042】
この発明の遺伝子構築物を含む本発明による医薬組成物を、利用すべき投与方法に応じて配合する。当業者は、遺伝子構築物を含むワクチン又は非免疫原性治療剤を容易に配合することができる。筋肉内注射が選択した投与方法である場合には、好ましくは、等張性配合物を用いる。一般に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースを含むことができる。幾つかの場合には、等張溶液例えばリン酸緩衝塩溶液が好適である。安定剤には、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。幾つかの具体例においては、血管収縮剤をこの配合物に加える。本発明のこれらの医薬製剤は、無菌で且つ発熱物質を含まないで提供される。この発明による医薬組成物は、核酸分子と共に送達用成分を含み、更に、製薬上許容しうるキャリアー又はビヒクル例えば塩溶液を含む。任意の媒質を、核酸の上首尾の送達のために利用することができる。当業者は、本発明で利用することのできる多数の製薬上許容しうる媒質を容易に理解することができる。適当な製薬用キャリアーは、Remington’s Pharmaceutical Sciences、A.Osol(この分野の標準的参考書)(参考として本明細書中に援用する)に記載されている。
【0043】
幾つかの具体例においては、核酸分子を、促進剤と共に細胞に送達する。促進剤は又、ポリヌクレオチド機能増強剤又は遺伝子ワクチン進行剤とも呼ばれる。促進剤は、米国特許第5,830,876号(1998年11月3日発行)、米国特許第5,593,972号(1997年1月14日発行)及び国際特許出願PCT/US94/00899号(1994年1月26日出願)(米国特許出願第08/979,385号、1997年11月29日出願)に記載されている(これらの各々を参考として本明細書中に援用する)。加えて、促進剤は、米国特許第5,739,118号(1998年4月14日発行)、米国特許第5,837,533号(1998年11月17日発行)、PCT/US95/12502(1995年9月28日出願)及びPCT/US95/04071(1995年3月30日出願)に記載されている(これらの各々を参考として本明細書中に援用する)。核酸分子と共に投与される促進剤は、核酸分子との混合物として投与することができ、又は核酸分子の投与と同時に若しくは前後して別々に投与することができる。加えて、トランスフェクティング剤及び/又は複製剤及び/又は炎症剤として機能しうる他の薬剤並びに促進剤を伴って又は伴わずに同時投与されうる他の薬剤には、サイトカイン及びリンホカイン例えばα−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子(PDGF)、GC−SF、GM−CSF、TNF、上皮成長因子(EGF)、IL−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−8、IL−10、IL−12及びB7.2並びに繊維芽細胞成長因子、表面活性剤例えば免疫刺激性複合体(ISCOMS)、不完全フロイントアジュバント、モノホスホリルリピドA(MPL)を含むLPS類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体及び小胞例えばスクアレン及びスクアレン、及びヒアルロン酸が含まれる。免疫化の方法に関係する具体例においては、好適に免疫応答を増強する協力剤を選択する。免疫抑制方法に関係する具体例においては、免疫応答を増強しない協力剤を選択する。
【0044】
幾つかの好適具体例において、この発明の遺伝子構築物は、安息香酸エステル、アニリド、アミジン、ウレタン及びこれらの塩酸塩例えば局所麻酔剤の系統のものよりなる群から選択する進行剤と配合され又は該剤と共に投与される。
【0045】
幾つかの好適具体例における進行剤は、下記式の1つを有する化合物であってよい:
【化4】
Ar−R1−O−R2−R3
又は
【化5】
Ar−N−R1−R2−R3
又は
【化6】
R4−N−R5−R6
又は
【化7】
R4−O−R1−R7
{式中、
Arは、ベンゼン、p−アミノベンゼン、m−アミノベンゼン、o−アミノベンゼン、置換されたベンゼン、置換されたp−アミノベンゼン、置換されたm−アミノベンゼン、置換されたo−アミノベンゼンであり、ここに、これらのアミノベンゼン化合物中のアミノ基は、アミノ、C1〜C5アルキルアミン、C1〜C5、C1〜C5ジアルキルアミンであってよく、置換された化合物中の置換基は、ハロゲン、C1〜C5アルキル及びC1〜C5アルコキシであり;
R1は、C=O;
R2は、C1〜C10アルキル(分枝アルキルを含む);
R3は、水素、アミン、C1〜C5アルキルアミン、C1〜C5、C1〜C5ジアルキルアミン;
R2+R3は、環状アルキル、C1〜C10アルキル置換された環状アルキル、環状脂肪族アミン、C1〜C10アルキル置換された環状脂肪族アミン、ヘテロ環、C1〜C10アルキル置換されたヘテロ環(C1〜C10アルキルN置換されたヘテロ環を含む)を形成することができ;
R4は、Ar、R2若しくはC1〜C5アルコキシ、環状アルキル、C1〜C10アルキル置換された環状アルキル、環状脂肪族アミン、C1〜C10アルキル置換された環状脂肪族アミン、ヘテロ環、C1〜C10アルキル置換されたヘテロ環及びC1〜C10アルコキシ置換されたヘテロ環(C1〜C10アルキルN置換されたヘテロ環を含む)であり;
R5は、C=NH;
R6は、Ar、R2若しくはC1〜C5アルコキシ、環状アルキル、C1〜C10アルキル置換された環状アルキル、環状脂肪族アミン、C1〜C10アルキル置換された環状脂肪族アミン、ヘテロ環、C1〜C10アルキル置換されたヘテロ環及びC1〜C10アルコキシ置換されたヘテロ環(C1〜C10アルキルN置換されたヘテロ環を含む)であり;そして
R7は、Ar、R2若しくはC1〜C5アルコキシ、環状アルキル、C1〜C10アルキル置換された環状アルキル、環状脂肪族アミン、C1〜C10アルキル置換された環状脂肪族アミン、ヘテロ環、C1〜C10アルキル置換されたヘテロ環及びC1〜C10アルコキシ置換されたヘテロ環(C1〜C10アルキルN置換されたヘテロ環を含む)である}。
【0046】
エステルの例には、安息香酸エステル例えばピペロカイン、メプリルカイン及びイソブカイン;パラ−アミノ安息香酸エステル例えばプロカイン、テトラカイン、ブテタミン、プロポキシカイン及びクロロプロカイン;メタブタミン及びプリマカインを含むパラ−アミノ安息香酸エステル;並びにパラ−エトキシ安息香酸エステル例えばパラエトキシカインが含まれる。アニリドの例には、リドカイン、エチドカイン、メピバカイン、ブピバカイン、ピロカイン及びプリロカインが含まれる。かかる化合物の他の例には、ジブカイン、ベンゾカイン、ジクロニン、プラモキシン、プロパラカイン、ブタカイン、ベノキシネート、カルボカイン、メチルブピバカイン、ピクリン酸ブタシン、フェナカイン、ジオタン、ルカイン、イントラカイン、ヌパカイン、メタブトキシカイン、ピリドカイン、ビフェナミン及び植物由来の二環式化合物例えばコカイン、シンナモイルコカイン、トラキシリン及びコカエチレン並びにすべてのかかる化合物の塩酸塩との複合体が含まれる。
【0047】
好適具体例において、進行剤は、ブピバカインである。ブピバカインとメピバカインの間の違いは、ブピバカインが、メピバカインのN−メチル基の代わりにN−ブチル基を有していることである。化合物は、そのNにC1〜C10を有しうる。化合物は、プロカイン及びクロロプロカインのようにハロゲンによって置換されうる。これらのアニリドは好適である。
【0048】
促進剤は、遺伝子構築物と同時に又はそれと前後して投与される。促進剤と遺伝子構築物は、同じ組成物において配合することができる。
【0049】
ブピバカイン−HClは、2−ピペリジンカルボキサミド、1−ブチル−N−(2,6−ジメチルフェニル)−一塩酸塩、一水化物として化学的にデザインされて、医薬用途のために、Astra Pharmaceutical Products Inc.(マサチューセッツ、Westboro在)及びSanofi Winthrop Pharmaceuticals(ニューヨーク、New York在)、Eastman Kodak(ニューヨーク、Rochester在)を含む多くの供給源から広く商業的に入手可能である。ブピバカインは、メチルパラベンを伴って及び伴わないでそしてエピネフリンを伴って又は伴わないで商業的に配合される。任意のかかる配合を用いることができる。それは、医薬用途のために濃度0.25%、0.5%及び0.75%で市販されており、この発明において用いることができる。或は、特に、所望の効果を誘出する0.05〜1.0%の濃度を適宜調製することができる。本発明により、約250μg〜10mgのブピバカインを投与する。幾つかの具体例においては、約250μg〜7.5mgを投与する。幾つかの具体例においては、約0.05〜5.0mgを投与する。幾つかの具体例においては、約0.5〜3.0mgを投与する。幾つかの具体例においては、約5〜50μgを投与する。例えば、幾つかの具体例においては、約50μl〜約2mlの、好ましくは50〜1500μlの及び一層好ましくは約1mlの0.25〜0.50% ブピバカイン−HCl及び0.1% メチルパラベン(等張医薬用キャリアー中)をワクチンと同じ部位に、ワクチンの投与と同時又は前後して投与する。同様に、幾つかの具体例においては、約50μl〜2mlの、好ましくは50〜約1500μlの及び一層好ましくは約1mlの0.25〜0.50% ブピバカイン−HCl(等張医薬用キャリアー中)をワクチンと同じ部位に、ワクチンの投与と同時に又は前後して投与する。ブピバカインと他の任意の類似の作用をする化合物(特に、局所麻酔剤の関連系統のもの)を、所望の遺伝子構築物の細胞による取り込みの促進を与える濃度で投与することができる。
【0050】
この発明の幾つかの具体例においては、個人に、先ず、進行剤の注射をしてから、遺伝子構築物を投与する。即ち、遺伝子構築物の投与の例えば約1週間から10日前までに、個人に、先ず、進行剤を注射する。幾つかの具体例においては、この個人に、進行剤を、遺伝子構築物の投与の約1〜5日前又は後(幾つかの具体例においては、24時間前又は後)に注射する。或は、用いたとしても、進行剤を、遺伝子構築物の投与と同時か又は数分前後して投与する。従って、進行剤と遺伝子構築物を合わせて、単一の医薬組成物を形成することができる。
【0051】
幾つかの具体例においては、遺伝子構築物を、促進剤なしで、即ち促進剤を含まない配合物にて、遺伝子構築物を促進剤の投与と共には投与しない投与プロトコールを利用して投与する。
【0052】
免疫化と関連する幾つかの具体例において、この発明の遺伝子構築物は、弱毒化生微生物の遺伝物質又は組換え微生物ベクターの部分のままであってよい。本発明は、改良された弱毒化生ワクチン及びVVNポリタンパク質及び/又は該ポリタンパク質をコードする核酸分子を送達するために組換えベクターを利用する改良されたワクチンに関係する。弱毒化生ワクチン及び外来抗原を送達するために組換えベクターを利用するものの例は、米国特許第4,722,848号;5,017,487号;5,077,044号;5,110,587号;5,112,749号;5,174,993号;5,223,424号;5,225,336号;5,240,703号;5,242,829号;5,294,441号;5,294,548号;5,310,668号;5,387,744号;5,389,368号;5,424,065号;5,451,499号;5,453,364号;5,462,734号;5,470,734号;及び5,482,713号に記載されている(これらの各々を参考として本明細書中に援用する)。
HIV VVNポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物は供給され、ワクチン被接種者において機能して発現を達成することのできる調節配列に操作可能に結合されている。これらの遺伝子構築物は、弱毒化生ワクチン及び組換えワクチンに取り込まれて、この発明の改良されたワクチンを生成する。遺伝子構築物は、組換えウイルスワクチンのゲノムの部分であってよく、遺伝物質は、細胞の染色体に組み込まれてもよいし染色体外に維持されてもよい。
【0053】
この発明の幾つかの具体例は、タンパク質及びその利用方法に関係する。例えば、幾つかの免疫化方法においては、HIV VVNポリタンパク質を個人に投与する。ここで用いる場合、用語「この発明のタンパク質」は、この発明の同様の手段により生成することができて、この発明の方法における利用のための同様の仕方で配合して投与することのできるHIV VVNポリタンパク質を意味することを意図している。
【0054】
この発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター(組換え発現ベクターを含む)は、日常的に生成することができる。ここで用いる場合、用語「組換え発現ベクター」は、適当な宿主に導入された場合にコード配列の発現を指示するのに必要な遺伝子エレメントを含むプラスミド、ファージ、ウイルス粒子又は他のベクターを指すことを意味する。当業者は、標準的技術及び用意に入手できる出発材料を用いて、この発明のタンパク質をコードする核酸分子を単離し又は合成して、発現ベクターに挿入することができる。このコード配列は、必要な調節配列に操作可能に結合される。発現ベクターは、周知であって、容易に入手できる。発現ベクターの例には、宿主細胞をトランスフォームしてコード配列の発現を即死するのに有用なプラスミド、ファージ、ウイルスベクター及び他の核酸分子含有ビヒクルが含まれる。この発明の幾つかの具体例は、HIV VVNポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターに関係する。この発明の組換え発現ベクターは、宿主をトランスフォームするのに有用である。本発明は、HIV VVNポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターに関係する。
【0055】
本発明は、HIV VVNポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関係する。タンパク質生成のための周知の組換え発現系において利用するための宿主細胞は、周知であり、容易に入手できる。宿主細胞の例には、細菌細胞例えば大腸菌、酵母細胞例えばS.cerevisiae、昆虫細胞例えばS.frugiperda、非ヒト哺乳動物組織培養細胞チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞及びヒト組織培養細胞例えばHeLa細胞が含まれる。
【0056】
幾つかの具体例において、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、DNA分子を市販の発現ベクターに、周知の発現系で用いるために、挿入することができる。例えば、市販のプラスミドプラスミドpSE420(Invitrogen, カリフォルニア、San Diego在)を、大腸菌において、CD80ΔC変異型タンパク質の生成のために利用することができる。市販のプラスミドpYES2(Invitrogen, カリフォルニア、San Diego在)を、例えば、酵母のS.cerevisiae株中での生成のために利用することができる。市販のMAXBAC(商標)完全バキュロウイルス発現系(Invitrogen, カリフォルニア、San Diego在)を、例えば、昆虫細胞における生成のために利用することができる。市販のプラスミドpcDNAI又はpcDNA3(Invitrogen, カリフォルニア、San Diego在)を、例えば、哺乳動物細胞例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞において、生成のために利用することができる。当業者は、日常的技術及び容易に入手できる出発材料を利用して、この発明のタンパク質を生成するために、市販のベクター及び系又は他のものを利用することができる。(例えば、Sambrook等、Molecular Cloning a Laboratory Manual, 第二版、Cold Spring Harbor Press (1989)(参考として、本明細書中に援用する)を参照されたい。)従って、所望のタンパク質を、原核生物の系及び真核生物の系(該タンパク質のプロセッシングを受けた形態のスペクトルを生じる)の両方で生成することができる。
【0057】
当業者は、他の市販の発現ベクター及び系を利用し、又は周知の技術と容易に入手できる材料を用いてベクターを生成することができる。必要な制御配列例えばプロモーター及びポリアデニル化シグナル及び好ましくはエンハンサーを含む発現系は、容易に入手でき、様々な宿主について公知である。例えば、Sambrook等、Molecular Cloning a Laboratory Manual, 第二版、Cold Spring Harbor Press(1989)を参照されたい。
【0058】
この発明のタンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターを利用して、適合性の宿主をトランスフォームし、次いで、それを、外来DNAの発現が起きる条件下で培養して維持する。こうして生成したこの発明のタンパク質を、適宜、細胞を溶解させることにより又は当分野で公知の培養培地から回収する。当業者は、周知の技術を利用して、かかる発現系を用いて生成されたこの発明のタンパク質を単離することができる。この発明のタンパク質を天然起源から、かかるタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて精製する方法は、かかる抗体を生成する方法が日常的であるように日常的なものである(Harlow, E. 及びLane, E., Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press(参考として、本明細書中に援用する)を参照されたい)。かかる抗体を利用して、組換えDNA技術により生成した又は天然起源のタンパク質を精製することができる。
【0059】
遺伝子構築物の例には、この発明のタンパク質をコードし且つ当該構築物をトランスフェクトされた細胞株において機能的なプロモーターに操作可能に結合されたコード配列 が含まれる。構成的プロモーターの例には、サイトメガロウイルス又はSV40由来のプロモーターが含まれる。誘導性プロモーターの例には、マウス乳腺白血病ウイルス又はメタロチオネインプロモーターが含まれる。当業者は、この発明のタンパク質をコードするDNAで細胞をトランスフェクトするのに有用な遺伝子構築物を、容易に入手できる出発材料から容易に生成することができる。かかる遺伝子構築物は、この発明のタンパク質の生成に有用である。
【0060】
この発明のタンパク質の組換え技術による生成に加えて、自動化ペプチド合成を用いて、この発明のタンパク質を生成することもできる。かかる技術は、当業者に周知であり、もしも置換を有する誘導体がDNAにコードされたタンパク質の生成において与えられないならば、有用である。
【0061】
この発明のタンパク質は、以下の公知の技術の何れかにより調製することができる。都合よく、この発明のタンパク質は、初期にMerrifield, J.Am.Chem.Soc.,15:2149−2154(1963)(参考として、本明細書中に援用する)により記載された固相合成技術を利用して調製することができる。他のタンパク質合成技術は、例えば、M.Bodanszky等(1976) Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 第二版(参考として、本明細書中に援用する);Kent及びClark−Lewis, Synthetic Peptides in Biology and Medicine, p295−358, Alitalo等編、Science Publishers, (Amsterdam, 1985)(参考として、本明細書中に援用する);並びに他の当業者に公知の参考文献記載の仕事の中に見出すことができる。合成技術の概略は、J.Stuart及びJ.D.Young, Solid Phase Peptide Synthelia, Pierce Chemical Company(イリノイ、Rockford在)(1984)(参考として、本明細書中に援用する)中に見出されうる。溶液法による合成も又、The Proteins, Vol.II, 第三版、p.105−237, Neurath,H.等編、Academic Press, ニューヨーク、New York在(1976)(参考として、本明細書中に援用する)に記載されているように利用することができる。かかる合成において用いるのに適当な保護基は、上記のテキスト並びにJ.F.W.McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, ニューヨーク、New York在(参考として、本明細書中に援用する)中に見出されよう。
【0062】
一般に、これらの合成方法は、少なくとも1つのアミノ酸残基又は適当な保護されたアミノ酸残基の成長中のペプチド鎖への順次的追加を含む。通常、第一のアミノ酸残基のアミノ基又はカルボキシル基を適当な選択的に除去できる保護基で保護する。反応性側鎖を含むアミノ酸例えばリジンについては、異なる選択的に除去できる保護基を利用する。
【0063】
固相合成を例として用いて、保護された又は誘導体化されたアミノ酸を、不活性固体支持体に、その保護してないカルボキシル基又はアミノ基を介して結合させる。次いで、アミノ基又はカルボキシル基の保護基を選択的に除去して、適当に保護された相補的な(アミノ又はカルボキシル)基を有する次の順番のアミノ酸を混合し、既に固体支持体に結合してある残基と反応させる。次いで、アミノ又はカルボキシル基の保護基をこの新たに加えられたアミノ酸残基から除去して、次のアミノ酸(適当に保護されたもの)を加え、以下これを繰り返す。すべての所望のアミノ酸を適当な順序で結合した後で、任意の残りの末端及び側鎖基の保護基(及び固体支持体)を順次的に又は同時に除去して、最終的なペプチドを与える。この発明のペプチドには、好ましくは、ベンジル化又はメチルベンジル化アミノ酸がない。かかる保護基部分は、合成過程中は利用することができるが、ペプチドを用いる前にそれらは除去される。他所で記載したように、コンホメーションを制限する分子内結合を形成するためには、更なる反応が必要でありうる。
【0064】
幾つかの具体例において、タンパク質は、トランスジェニック動物中で生成することができる。本発明は、HIV VVNポリタンパク質をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関係する。組換えタンパク質の生成に有用な非ヒトトランスジェニック動物は、必要な発現ベクター及びトランスジェニック動物の生成のための技術が周知であるように周知である。一般に、このトランスジェニック動物は、HIV VVNポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列が乳腺細胞特異的プロモーターに操作可能に結合された組換え発現ベクターを含み、それにより、そのコード配列は、乳腺細胞でのみ発現されて、そのように発現された組換えタンパク質は、その動物の乳汁から回収される。当業者は、標準的技術例えばWagnerの米国特許第4,873,191号(1989年10月10日発行)及びLederの米国特許第4,736,866号(1988年4月12日発行)(これらの両者を参考として、本明細書中に援用する)に教示されたものを利用して、HIV VVNポリタンパク質を生成するトランスジェニック動物を生成することができる。好適な動物は、ヤギ及びゲッ歯動物特にラット及びマウスである。
【0065】
この発明のタンパク質のアミノ酸配列の保存的置換を企図する。ここで用いる場合、用語「保存的置換」は、HIV VVNポリタンパク質のアミノ酸の、他の類似の構造的及び/又は電荷的特徴を共有する残基での置換を指すことを意味する。当業者は、アミノ酸の保存的置換を有するこの発明のタンパク質を周知の保存的基に基づいて、容易にデザインすることができる。
【0066】
本発明の医薬組成物は、活性剤を哺乳動物の身体内の該剤の作用部位に到達させることのできる任意の手段によって投与することができる。本発明の医薬組成物は、局所的治療を希望するか全身的治療を希望するかにより及び処理すべき領域に応じて、多くの方法で投与することができる。投与は、局所投与(眼、膣、直腸、鼻内、経皮投与を含む)、経口投与又は非経口投与であってよい。ペプチドは、経口投与された場合には消化対象であるので、経口用配合物は、活性剤を腸溶性被覆するように、或は、それを胃における分解から保護するように配合される(例えば、予備中和)。非経口投与には、静脈内点滴、皮下投与、腹腔内投与又は筋肉注射、肺投与(例えば、吸入による)、又は髄膜下投与又は脳室内投与が含まれる。好適具体例において、非経口投与即ち静脈、皮下、経皮、筋肉内投与は、通常、吸収を最適にするように用いられる。静脈内投与は、注入ポンプの助成を受けて達成することができる。本発明の医薬組成物は、エマルジョンとして配合することができる。
【0067】
当業者は、本発明で利用することのできる多くの製薬上許容しうる媒質を容易に理解するであろう。適当な製薬用キャリアーは、Remington’s Pharmaceutical Sciences, (A.Osolのこの分野における標準的参考書であり、本明細書中に参考として援用する)に記載されている。局所投与用の配合物には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、リキッド及び粉末が含まれうる。慣用の製薬用キャリアー(水性、粉末又は油ベース)、増粘剤などが、必要又は望ましいことがありうる。経口投与用の組成物には、粉末若しくは顆粒、懸濁液若しくは溶液(水中又は非水性媒質中)、カプセル、サッシェ又は錠剤が含まれる。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましいことがありうる。非経口投与、静脈投与、髄膜内投与又は脳室内投与用組成物は、無菌の水溶液を含むことができ、これは又、緩衝剤、希釈剤及び他の適当な添加剤をも含むことができ、好ましくは、無菌であって発熱物質を含まない。本発明による静脈投与に適した医薬組成物は、無菌であって発熱物質を含まない。非経口投与のためには、この発明のペプチドは、例えば、溶液、懸濁液、乳液又は凍結乾燥粉末として、製薬上許容しうる非経口用ビヒクルと共に配合することができる。かかるビヒクルの例は、水、塩溶液、リンゲル溶液、デキストロース溶液及び5% ヒト血清アルブミンである。リポソーム及び非水性ビヒクル例えば固定油も又、用いることができる。このビヒクル又は凍結乾燥粉末は、等張性を維持する添加剤(例えば、塩化ナトリウム、マンニトール)及び化学的安定性を維持する添加剤(例えば、緩衝剤及び防腐剤)を含むことができる。この配合物を、通常用いられる技術によって滅菌する。例えば、注射による投与に適した非経口用組成物を、1.5重量%の活性成分を0.9%塩化ナトリウム溶液に溶解させることにより調製する。
【0068】
本発明による医薬組成物は、単一投与量として又は多数回の投与量として投与することができる。本発明の医薬組成物は、個々の治療剤として又は他の治療剤と組合せて投与することができる。本発明の治療剤は、慣用の治療と合せることができ、該治療は、順次に施してもよく、又は同時であってもよい。
【0069】
投薬量は、公知の因子例えば特定の薬剤の薬力学的特性、並びにその投与様式及び経路;レシピエントの年齢、健康状態及び体重;徴候の性質及び程度、同時の治療の種類、治療の頻度、及び所望の効果に依って変化する。治療用組成物の配合及びそれらのその後の投与は、当業者の技量の内にあると考えられる。通常、ペプチドの投薬量は、体重50キログラム当たり約1〜3000ミリグラム;好ましくは、10〜1000ミリグラム;一層好ましくは、25〜800ミリグラムであってよい。通常、所望の結果を得るために、1日当たり800ミリグラムを一日に1〜6回の分割投与量にて投与し、又は持続的放出形態で投与する。
【0070】
こ(れら)のタンパク質を投与する方法に依って、本発明の医薬組成物を、最も効果的に配合して投与することができる。投与方法は、当業者には、本願の開示に照らして明らかとなろう。
【0071】
本発明の方法は、ヒトの医学及び獣医学の両分野で有用である。従って、本発明は、哺乳類、鳥類及び魚類の遺伝学的免疫に関係する。本発明の方法は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ及びネコ種を含む哺乳動物種に特に有用である。
【0072】
本発明は、加えて、弱毒化ヒト免疫不全ウイルス(HIV)アクセサリータンパク質Vif、Vpu及びNef(特に、ここに記載して示したもの)、それらをコードする核酸分子並びにそれらのタンパク質又は核酸を含むここに一般的に開示したワクチン並びにそれらの製造及び利用方法にも関係する。幾つかの具体例において、この発明は、Vif、Vpu及びNefよりなる群から選択する単一のアクセサリータンパク質、それらをコードする核酸分子並びにここに一般的に記載したそれらの単一タンパク質又は核酸を含むワクチン並びにそれらの製造及び利用方法に関係する。幾つかの具体例において、この発明は、Vif、Vpu及びNefよりなる群から選択する2つのアクセサリータンパク質を含むポリタンパク質、それをコードする核酸分子並びにかかるポリタンパク質又は核酸を含むここに一般的に記載したワクチン並びにその製造及び利用方法に関係する。
【0073】
下記の実施例は、本発明の代表的な面の例を含んでいる。これらの実施例は、この発明の範囲を制限することを意味せず、むしろ、具体例として役立つものである。加えて、この発明の様々な面を以下の記載によって要約することができる。しかしながら、この記載は、この発明の範囲を制限することは意味せず、むしろ、この発明の様々な面を強調するものである。当業者は、容易に、この発明の更なる面及び具体例を認めることができよう。
【0074】
(実施例)
HIV Vif、HIV Vpu及びHIV Nefを含む複数のヒト免疫不全ウイルス(HIV−1)アクセサリー遺伝子を発現するDNAワクチンカセットはAyyavoo V,(2000), AIDS 14:1−9(参考として、本明細書中に援用する)に記載されたように生成することができる。
【0075】
材料と方法
細胞:HeLa及びNIH3T3細胞(American Type Culture Collection(ATCC)から得られる)を、ダルベッコ改変イーグル培地、10% ウシ胎児血清、1% ペニシリン、1% ストレプトマイシン及び1% L−グルタミン中で、5% CO2中で、37℃で、単層で生育させた。ATCCから得たP815細胞を、RPMI 1640、10% ウシ胎児血清、1% ペニシリン、1% ストレプトマイシン及び1% L−グルタミン中で懸濁培養として、37℃で、CO2中で維持した。フィトヘマグルチニン(PHA)刺激した(5μg/ml)PBLを、10%T細胞成長因子を含むRPMI 1640培地中に維持した。
【0076】
複数の免疫原発現カセットの生成:HIV−1 vif、vpr、vpu及びnef遺伝子を、PCRを用いて、個々にクローン化した。弱毒化HIV−1アクセサリー遺伝子vif(N17)、vpu(M5256)及びnef(S313)を、複数遺伝子融合カセットを構築するために選択した。融合タンパク質及びタンパク質分解性開裂部位を有する融合タンパク質を構築するために、我々は、オーバーラップPCR技術を利用した。HIV−1 vif、vpu及びnefを、この順序で、下記のプライマーを用いて融合させた:
【化8】
vif(+) 5’ATTGAAAGCTTATGGAAAACAGATGGCAGG 3’(SEQ ID NO:5);
【化9】
vif(−) 5’TACTATTATAGGTTGCATCTCGTGTCCATTCATTGT 3’(SEQ ID NO:6);
【化10】
vpu(+) 5’GGACACGAGATGCAACCTATAATAGTAGCA 3’(SEQ ID NO:7);
【化11】
vpu(−) 5’TGACCACTTGCCACCCATCTCGAGATCATCAATATCCCAAGG 3’(SEQ ID NO:8);
【化12】
nef(+) 5’GGAGATGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAGT 3’(SEQ ID NO:9);及び
【化13】
nef(−) 5’CGCAAGCTTCGATGTCAGCAGTCTTTGTAG 3’(SEQ ID NO:10)。
【0077】
同じプライマーを用いて、融合タンパク質を構築したが、vif(−)プライマー及びvpu(−)プライマーは、8アミノ酸(REKRAVVG)(SEQ ID NO:4)の付加的なタンパク質分解性開裂部位を有した。増幅融合遺伝子産物(1.4kb)をHindIIIで消化し(認識配列のための部位を外側プライマー対に組み込んだ)、pcDNA3(Invitrogen, カリフォルニア)中にクローン化して配列決定して突然変異を確認し且つ融合遺伝子の完全性を確実にした。
【0078】
T7系を利用する融合タンパク質のイン・ビトロ翻訳:イン・ビトロ転写及び翻訳を、1μgの融合タンパク質発現用構築物DNAにて、T7RNAポリメラーゼを利用して、製造業者(Promega, ウィスコンシン、Madison在)の指示に従って行った。5μlのイン・ビトロ翻訳反応生成物を500μlの放射免疫沈降アッセイ緩衝液と合せて、ウサギ抗Vif、抗Vpu及び抗Nef抗血清を用いて免疫沈降させた。免疫沈降生成物を12%SDS−PAGE上で分離してオートラジオグラフィーにかけた。
【0079】
ウエスタンブロット(イムノブロット分析):HeLa細胞を、20μgのpVVN及びpVVN−P発現構築物で、DOTAP(BMB, インディアナ)を利用してトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、細胞を、選択培地(400μg/mlのゲネチシンを含むDMEM)中に置き、単一細胞クローンを単離した。その発現、機能性及び細胞性プロテアーゼによるタンパク質の適当な開裂を分析するために、安定な細胞を溶解させて、細胞溶解物を抗Vif、抗Vpu及び抗Nef抗体を用いる免疫沈降で利用してからウエスタンブロッティングにかけた。
【0080】
免疫蛍光アッセイ:HeLa細胞を、10% FBSを含むDMEM中に維持して、ポリ−L−リジンコートしたカバーガラス上に1×106細胞/ディッシュ(35mm)の密度で播種した。24時間後に、それらに、vTF7−3を感染させて上記のようにトランスフェクトした。トランスフェクションの16〜24時間後に、それらの細胞をPBSで洗い、メタノールで、室温で30分間固定した。次いで、これらの細胞をPBSで洗い、一次抗血清(1:50)と共に90分間インキュベートした。PBSでの洗浄後に、これらのカバーガラスをPBSで1:100に希釈したFITC結合体化したヤギの抗ウサギIgGアフィニティー精製F(ab)’2断片(ICN Biochemicals;カリフォルニア在)と共に90分間インキュベートし、PBSで6回洗った。次いで、カバーガラスを、5分間、DAPI(PBS中の0.1%、Sigma;ミズーリ、St.Louis在)を用いて対比染色し、再度洗ってから、退色抵抗性マウンティング媒質(Citiflour;英国)を用いてスライドガラスに載せた。すべてのインキュベーションは、保湿チャンバー内で37℃で行った。
【0081】
CTLのためのhCD4及びCCR5又はCXCR4を発現するマウス安定細胞株の開発:NIH3T3細胞をhCD4発現ベクターとpBabe−Fusin又はhCD4及びpBabe−CCR5発現ベクターでDOTAP(BMB, インディアナ)を用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、細胞を400μg/mlのゲネチシン及び2μg/mlのピュロマイシン中に維持した。安定な細胞株を単一細胞クローンから樹立して、hCD4及びFusin又はCCR5の発現についてフローサイトメトリーにより分析した。簡単には、細胞(5×105)をFITC又はPE標識したCD4、CCR5及びFusinに対するヒトmAb(Pharmingen, カリフォルニア)で1時間染色し、FACS緩衝液(3% BSA、0.1% NaN3、1×PBS中)で洗い(2×)、2% パラホルムアルデヒドで固定して、蛍光活性化セルソーター(Becton Dickinson, カリフォルニア)で分析した。
【0082】
一次分離株によるウイルス感染:hCD4/Fusin及びhCD4/CCR5を発現するNIH3T3細胞に、10〜50ngのHIV−1 p24等量の一次のよく特性決定されたT向性(pNL43)及び二向性(89.6)実験室分離株を感染させた。一次分離株は又、種々のクレードC、D、E及びA(WHOからNIH ARRPPを介して入手)に由来するウイルスをも含んでいる。これらの細胞の感染性を、培地に放出されたp24抗原を測定することによりアッセイした。このp24アッセイを、p24キャプチャELISAキット(Coulter, フロリダ)を製造業者の指示に従って用いて行った。
【0083】
マウス:Balb/c雌マウス(6〜8週齢)を、Harlan Sprague Dawley,Inc.(インディアナ、Indianapolis在)から購入した。これらのマウスを、National Institute of Health及びペンシルベニア大学のガイドラインにより、温度制御して光サイクルにした部屋に入れた。
【0084】
DNA接種:我々は、プラスミドで送達された遺伝子からの、イン・ビボでの増大された発現レベルを生じる促進されたDNA接種プロトコールを利用してきた。特に、BALB/cマウスの大腿四頭筋に、100μlの0.25% ブピバカイン−HCl(Sigma, ミズーリ)を27ゲージ針を用いて注射した。48時間後に、100μgの関心あるDNA構築物(リン酸緩衝液中)を、その筋肉のブピバカイン注射と同じ領域に注射した。マウスに注射をしてから2週間後に追加の注射をした。第二回目の注射の2週間後に、各グループのマウスの半分を犠牲にして脾臓を取り、残りのマウスには適当なDNA構築物の第二回目の追加注射をした。
【0085】
ヘルパーT細胞増殖アッセイ:採収したマウス脾臓からリンパ球を調製した。単離した細胞懸濁液を、10% FBSを含むRPMI1640中に5×106の濃度で再懸濁した。5×105細胞を含む100μlのアリコートを、アッセイレイアウトにより、96ウェルの平底ミクロ滴定プレートの適当なウェルに加えた。100μlの適当なタンパク質を、10又は2μg/mlで、ウェルに、二連で加えて、それぞれ、タンパク質終濃度を5及び1μg/mlとした。これらの細胞を、37℃で、5% CO2中で、3日間インキュベートした。トリチウム化チミジン1μCiを各ウェルに加えて、これらの細胞を12〜18時間、37℃でインキュベートした。これらのプレートを採収し、取り込まれたトリチウム化チミジンの量をベータプレートリーダーにて測定した。細胞が健康であることを確認するために、10μg/mlのPHAをポリクローナル刺激剤陽性対照として利用した。刺激インデックスを次式により測定した:刺激インデックス=(実験での計数値−自然の計数値)/自然の計数値。
【0086】
細胞傷害性Tリンパ球アッセイ:5時間の51Cr放出CTLアッセイを、ワクシニア感染標的又はペプチド処理した標的を用いて行った。リンパ球を脾臓から採収し、赤血球を除去して新鮮な培地で数回洗浄することによりエフェクター細胞として調製した。このアッセイを、エフェクターのイン・ビトロ刺激あり又はなしの両方を用いて行った。イン・ビトロ刺激したアッセイの場合には、これらのエフェクター細胞を、1日間、2μg/mlの濃度のコンカナバリンA(Sigma, ミズーリ、St.Louis在)で刺激した。次いで、エフェクターを、3日間、関連ワクシニア感染又は1μM ペプチド処理したP815細胞で刺激し、これらを0.1% グルタルアルデヒド及び0.1M グリシンで固定した。ワクシニア感染した標的を、3×106のP815細胞を5〜12時間37℃で感染させることにより調製した。ペプチドパルスト標的を、P815細胞を5〜12時間、ペプチドとインキュベートすることにより調製した。これらの標的細胞を、100μCi/mlのNa2 51CrO4で60〜120分間標識し、次いで、刺激した脾臓細胞と共に4〜6時間37℃でインキュベートした。CTLを、50:1〜12.5:1の範囲のエフェクター:標的(E:T)比で試験した。上清を採収してLKBガンマカウンターにて計数した。特異的溶解パーセントを、次式により測定した:100×{(実験での放出−自然の放出)/(最大放出−自然の放出)}。最大放出は、5% トリトンX−100含有培地中での標的細胞の溶解により測定した。組換えワクシニア(vNef及びvSC8)を、NIH AIDS Research and Reference Reagent Programから得た。
【0087】
臨床的HIV−1分離株に感染した標的を利用するCTL:hCD4/Fusin又はhCD4/CCR5を発現するNIH3T3細胞に、T向性及びMφ向性ウイルスの両方を代表するHIV−1実験室分離株及び臨床的分離株を感染させた。HIV−1感染したNIH3T3クローンを、クロムで標識し、CTLアッセイにおいて標的として利用した。
【0088】
クロスクレードCTLキリング:種々のクレードから分離されたHIV−1ウイルスを、hCD4/Fusin及びhCD4/CCR5を発現するNIH3T3細胞への感染に用いた。感染性を、p24抗原を測定することによってアッセイし、感染細胞をCTLアッセイにおける標的として用いた。
【0089】
結果
DNA免疫化のための弱毒化vif,vpu及びnef遺伝子の構築及び特性決定:HIV−1アクセサリー遺伝子vif、vpu及びnefを、HIV−1陽性患者からクローン化して、それらの機能及び弱毒化について分析した。これらの遺伝子の生物学的特性決定を、表1に示した標準的機能アッセイの後に行なった。弱毒化vif,vpr、vpu及びnefクローンを、マウスにおける更なる免疫学的分析のために選択した。機能的(野生型)及び幾つかの非機能的(弱毒化)vif、vpr、vpu及びnefクローンを用いてマウスを免疫化し、生成された免疫応答を測定した。マウスのグループをワクチン構築物の一つを用いて免疫化し、15日後に追加免疫化を行った。第二回目の注射の2週間後に動物を犠牲にして、細胞傷害性T細胞(CTL)及びリンパ球増殖アッセイで用いるために脾臓を得た。CTL用の試薬の利用可能性のために、Vifを発現するP815細胞又はNefを発現するワクシニアに感染したP815を標的細胞として用いた。機能的及び弱毒化vif及びnef構築物は、両方共、ベクター構築物免疫化マウスと比較して抗原特異的CTLを誘導することができる。
【0090】
図1Aは、機能的及び弱毒化vif及びnef構築物の両方により誘導された特異的CTL活性のパーセンテージを示している。100μgの野生型及び弱毒化nef又はvif発現プラスミドをマウスの筋肉内に投与した。最初の注射の2週間後に、それらのマウスに、同じ投薬量の各プラスミドを一回追加投与した。更に2週間後に、CTLアッセイを、方法に記載したように免疫化マウスから採収した脾臓細胞について行なった。このアッセイを、脾臓採収の日に行ない、特異的及び無関係のワクシニア感染標的からのクロム放出を測定した。ベクター主鎖だけで免疫化した対象用グループは、バックグラウンドレベルを超える標的細胞の特異的溶解を生じなかった。β−galを発現するワクシニア(vSC8)をp815に感染させて無関係の標的を調製した。複数の実験において、同様の結果が得られた。50:1のエフェクター:標的比で、vifクローンT−37(機能的)及びN−17(弱毒化)は、それぞれ、19.9及び25%の特異的溶解を示した。これらの結果は、異なるvif構築物によるDNA免疫化が抗原特異的なCTL応答を誘導することを示している。同様に、機能的nefクローン(Nef−Mn)及び弱毒化nefクローン(Nef−Hxb2)は、Nefワクシニア感染標的に対して特異的な細胞傷害性T細胞溶解を誘導することができる。
【0091】
我々は、弱毒化vif、vpr、vpu及びnefクローンによりそれぞれの抗原刺激により誘導されるT細胞増殖応答をも測定した。図1Bは、T細胞増殖実験からのデータを示しており、該実験においては、T細胞の増殖が、vif、vpu、vpr及びnefを発現するプラスミドでの免疫化により誘導された。100μgの各cDNA発現カセットをマウスに筋肉注射し、2週間後に一回、それらのマウスに追加の注射をした。追加の注射の1週間後に、2匹のマウスから脾臓を分離して。T細胞増殖用に用いた。脾臓細胞を、5及び1μg/mlの組換えタンパク質で3日間刺激した。1μCi3Hを加えて、取り込まれたcpmを計数した。抗原特異的な刺激(SI)を計算し、Vif、Vpu及びNefにつき提示した。少なくとも3つの別々の実験において、同様の結果が得られた。結果は、vif、vpu及びnefが有意のリンパ球増殖応答誘導することができるが、Vpr抗原による刺激はこのアッセイにおいて利益がなかったことを示している。これらの結果及び以前の研究から得られた情報に基づいて、アクセサリー遺伝子vprは、本研究にマルチ遺伝子ワクチン構築物の部分として含めない。
【0092】
我々の結果は、病原性遺伝子を、機能的ドメインを同定して、それらのドメインを抗原の発現を邪魔することなく弱毒化した後で、免疫原として利用することができることを示している。マルチ遺伝子カセットの更なる構築のために、我々は、弱毒化vif、vpu及びnefクローンを利用した。
【0093】
vif/vpu/nef融合タンパク質カセット(pVVN)及びタンパク質分解性開裂部位を有するvif/vpu/nef融合タンパク質構築物(pVVN−P)の構築及び発現:融合タンパク質としてアクセサリー遺伝子を含むマルチ遺伝子DNA発現カセットを構築するために、我々は、弱毒化して尚免疫学的に活性なvif(N17)vpu(M5256)及びnef(S313)クローンを出発点として選択した。vif及びvpuの停止コドンを除去して、融合タンパク質が個々の遺伝子と同じエピトープを有するようにイン・フレームで融合した。このvif/vpu/nef融合遺伝子構築物を、pVVNと呼ぶ。我々は、タンパク質分解による開裂部位を有するvif/vpu/nef融合タンパク質を発現させることによって、天然のアミノ及びカルボキシ末端を保存することをも希望した(該融合タンパク質を、ここでは、pVVN−Pと呼ぶ)。図2Aは、vif/vpu/nef融合タンパク質及びタンパク質分解性開裂部位を有する融合タンパク質の単一発現カセットとしての構築及びデザインを描いている。vif及びvpuの停止コドンを削除し、後続の配列をイン・フレームで融合させた。pVVNは、vif、vpu及びnefの単一遺伝子としての発現を表し;pVVN−Pは、vifとvpu及びvpuとnefの間にタンパク質分解性開裂部位を有するvif、vpu及びnefの単独遺伝子としての発現を表す。pVVN−P融合タンパク質においては、vif及びvpuの停止コドンを除去して、8つのアミノ酸の細胞性タンパク質分解性開裂部位(REKRAVVG)を、それ以降のタンパク質配列からの開裂を可能にするようにイン・フレームで配置した。
【0094】
新規な融合構築物が融合遺伝子産物の生成において機能的であるかどうかを試験するために、pVVN及びpVVN−pの両方についてイン・ビトロ翻訳を行ってから、Vif,Vpu及びNefに特異的な抗体を用いる免疫沈降を行った。それらだけによって、Vif,Vpu及びNefは、それぞれ、24、10及び27kDaのタンパク質を発現する。pVVN及びpVVN−Pベクターのイン・ビトロ翻訳は、これらの3つのタンパク質に特異的な抗体を用いて検出可能であると予想される61kDaの融合タンパク質の発現を生じた。図2Bは、T7系を利用したイン・ビトロ翻訳後のVVN及びVVN−Pの発現からのデータを示している。1μgのpVVN(クローン#14)及びpVVN−P(クローン#2)DNAを、このイン・ビトロ翻訳系において用いた。イン・ビトロ翻訳産物を、抗Vif(aVif)、抗Vpu(aVpu)及び抗Nef(aNef)抗体を用いて免疫沈降させた。
【0095】
VVN及びVVN−P融合タンパク質のHeLa細胞における発現及び細胞内局在性:VVN及びVVN−P融合タンパク質の哺乳動物細胞における発現を、pVVN及びpVVN−P構築物をそれぞれ発現するHeLa−VVN及びHeLa−VVN−P安定細胞株を用いて評価した。これらのDNAベクターを用いたトランスフェクション後に、細胞を選択培地中で2日間成長させ、PBSで2回洗って、溶解させた。細胞溶解物を、抗vif、抗vpu及び抗nef抗体とインキュベートし、免疫沈降させ、SDS−PAGEゲル上で分離して、イムノブロット分析にかけた。HeLa細胞におけるpVVNのトランスフェクションは、61kDaの融合タンパク質の発現を生じ、これは、3つのすべての抗体によって検出された(データは、示さない)。対照的に、pVVN−Pトランスフェクションは、一層高分子量の種と、抗Vif、抗Vpu及び抗Nef抗体によりそれぞれ認識される24、10及び27kDaのタンパク質の両方を生じた。図3Aは、HeLa細胞におけるVVN及びVVN−P融合タンパク質の発現及びプロセッシングに関する免疫沈降によるデータを示している。HeLa細胞に、pVVN−Pプラスミドを一晩トランスフェクトした。細胞を48時間正常に維持してから、G418選択にかけた。G418選択を2週間行ない、それらの細胞を溶解させて、抗Vif、抗Vpu及び抗Nef抗体を用いて免疫沈降させた。免疫沈降物を、SDS−PAGE(12%)によって分析した。抗血清の指示は上部に示してあり、開裂産物は、矢印で記してある。これらの結果は、pVVNのイン・ビボ発現が融合タンパク質を生じ、pVVN−Pのイン・ビボ発現が少なくとも部分的に予想通りに細胞性プロテアーゼによって開裂された融合タンパク質を生じるということを示している。
【0096】
HIV−1に感染した細胞において、Vif、Vpu及びNefは、細胞膜中に普通に存在している。これらのタンパク質を単一のタンパク質又はタンパク質分解性開裂部位を有する融合タンパク質に融合することがそれらの細胞内局在性を変化させるかどうかを確認するために、我々は、イン・ビトロ及びイン・ビボでの免疫蛍光及び免疫組織化学的研究を行った。HeLa細胞を、pVVN及びpVVN−Pでトランスフェクトし、vif/vpu/nef融合タンパク質及びタンパク質分解部位を有する融合タンパク質の局在性を、抗Vif、抗Vpu及び抗Nef抗体を用いる免疫蛍光法により研究した。図3Bは、イン・ビボでの、VVN及びVVN−P融合タンパク質の細胞内局在性に関するデータを示している。HeLa細胞に、組換えワクシニアウイルスvTF7−3を感染させ、VVN及びVVN−P発現プラスミドをトランスフェクトした。一晩のトランスフェクション後に、これらの細胞を固定し、抗Vif、抗Vpu及び抗Nef抗血清を用い、その後、アフィニティー精製したフルオレセインイソチオシアネート結合体化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンGを用いて染色した。すべての抗血清はウサギにおいて高めたものなので、それらは、単一免疫蛍光において結合されえなかった。DAPI、核染色;FITCは、特異的抗血清染色された細胞を表す。図3Bのデータは、Vif、Vpu及びNefが、融合タンパク質であっても、タンパク質分解部位を有する融合タンパク質であっても、それらの野生型の細胞質内局在性パターンを維持していることを示している。これらの結果は、これらの遺伝子の融合が、それらの細胞内分布パターンを変化させなかったことを示しており、両遺伝子産物が野生型遺伝子と同じプロセッシング経路にかけられること従って野生型と同様のMHC分子に提示されうることを示唆している。加えて、我々は又、VVN及びVVN−Pのイン・ビボでの発現をも、pVVN及びpVVN−Pで免疫化したマウスの筋切片について抗Nef抗体を用いる免疫組織化学的分析を行うことによって分析した。筋切片の免疫組織化学は、VVN及びVVN−P融合タンパク質の両者が、遺伝子送達により、イン・ビボで高レベルに発現されうることを示した。図3Cは、VVN及びVVN−P抗原の発現の免疫組織化学的分析の結果を示している。ネイティブ、pVVN及びpVVN−P免疫化マウスからの凍結筋切片を、免疫化の5日後に調製して、抗Nef抗体で染色した。パネル(DAPI)は、核染色を表し、パネル(FITC)は、抗Nef抗体を用いた特異的染色を表している。陽性細胞は、FITCで染色される。5つのパネルを、各実験について各染色につき試験した。
【0097】
ヘルパーT細胞増殖アッセイ:ヘルパーTリンパ球の活性化及び増殖は、抗原活性化B細胞の拡張のシグナルを送ることによる液性免疫応答及びCD8+細胞傷害性Tリンパ球の拡張の細胞性シグナルを生じる細胞性免疫応答の両方の誘導において重要な役割を演じる。マウスのグループ(各グループ当たり4匹)に、これら2種の構築物又はベクターのみを注射した。第一のDNA免疫化の2週間後に、これらのマウスに同量の追加の注射をした。更に2週間後に、脾臓を、免疫化マウスから集めて、それらのリンパ球を分離した。次いで、これらの細胞を、方法に記載したように、T細胞増殖について試験した。図4は、pVVN及びpVVN−Pで免疫化したマウス由来の脾臓細胞の、イン・ビトロでの組換えVif、Vpu及びNef刺激後の、T細胞増殖に関して記載した実験からのデータを示している。100μgの各cDNA発現カセットをマウスに筋肉注射し、それらのマウスに2週間後に追加の注射を一回行なった。追加の注射の1週間後に、脾臓細胞を2匹のマウスから分離して、プールし、T細胞増殖用に用いた。脾臓細胞を、5及び1μg/mlの組換えタンパク質で3日間刺激した。1μCiの3Hを加えて、取り込まれたcpmを計数した。PHAを陽性対照として加えた。用いたDNA構築物は、下部に示してある。抗原特異的な刺激(SI)を計算して、Vif、Vpu及びNefについて提示した。同様の結果が、複数の実験において得られた。図4A、4B及び4Cは、Vif、Vpu及びNefタンパク質を抗原として用いて、DNAワクチンカセットpVVN及びpVVN−Pで免疫化したマウスについての増殖アッセイ結果を示している。組換えタンパク質(10μg/ml)を各ウェルに入れて、T細胞の増殖を刺激した。10μg/mlのレクチン(PHA)をポリクローナル刺激剤陽性対照として用いた。示したように、低いバックグラウンドレベルの増殖(刺激インデックス0.2〜1)が、ネイティブマウス脾臓の対照グループにおいて認められた。これら3種のタンパク質に対する中位のレベルの増殖が、pVVN及びpVVN−Pで免疫化したグループからの脾臓細胞において認められた(図4A、4B及び4C)。VVN及びVVN−Pが適合性のT細胞増殖を誘導するということを確認するために、我々は、単一遺伝子構築物で免疫化したマウスを用いるT細胞増殖も並行して行なった。Vifは、それだけで、又はVVN及びVVN−P融合タンパク質中で、それぞれ、6.5及び5.4のSIを生じた(図4A)。同様の結果が、Vpuタンパク質(図4B)及び組換えNefタンパク質(図4C)を抗原として用いて、得られた。
【0098】
Nefワクシニアを用いる細胞傷害性Tリンパ球活性:これらの構築物により生じた細胞性免疫応答の誘導を更に研究するために、我々は、pVVN及びpVVN−Pで免疫化したマウスの脾臓細胞について、Nefワクシニア感染した又はNefペプチドパルスしたP815標的に対して、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)アッセイを行なった。このCTLアッセイを、免疫化したマウスから採収してイン・ビトロで刺激した脾臓細胞を用いて行ない、特異的及び非特異的ワクシニア感染し又はペプチド処理した標的からのクロム放出につきアッセイした。Balb/Cマウスを、100μgのpVVN、pVVN−P及び対照用ベクターで免疫化した。脾臓細胞を、これらのマウスから、第一及び第二回目の注射の2週間後に得て、抗原特異的CTLアッセイを、6時間51Cr放出法にて行なった。pVVN及びpVVN−Pで免疫化したマウスからの脾臓細胞により誘導された特異的溶解は、計算して図5に与えた。これらのグラフは、対照用ワクシニアに感染した標的細胞を用いるアッセイにより測定した非特異的溶解を差し引くことにより導かれた特異的溶解のパーセンテージを表している。このCTLアッセイを、上記のように免疫化したマウスから採収した脾臓細胞について行なった。同様の結果が、複数の実験において得られた。50:1のエフェクター:標的比において、Nefワクシニア感染標的を用いて、特異的溶解のパーセンテージは、pVVN−P及びpVVN免疫化マウス由来の脾臓細胞によって、それぞれ、38及び31%である。特異的溶解のパーセンテージは、滴定可能であった。同様の結果が、Vifを発現するP815標的を用いて認められた。反復するアッセイにおいて、pVVN−Pで免疫化したマウスにおいて認められた特異的溶解のパーセンテージは、再現可能に、pVVN免疫化マウスより一層高いようである。
【0099】
HIV−1感染した標的を用いる細胞傷害性T細胞溶解:一般に、マウスの系においてHIV−1ウイルスに対するCTLアッセイを行なうことは、HIV−1が自然にはマウス細胞に感染しないので困難であった。VVN及びVVN−PのHIV−1感染した標的を溶解させる能力を評価するために、我々は、hCD4及びCCR5又はFusin共通レセプターを発現するNIH3T3細胞株を構築した。我々の研究において用いるBalb/Cマウスに対するMHC適合性の故に、NIH3T3細胞株を選択した。マウス細胞はHIV−1感染を支持しないが、これらの安定な細胞株は、1ラウンドの複製につき、種々のHIV−1株によって感染されうる。我々は、この単一ラウンドの感染は、CTLアッセイに利用することができるという仮説を設ける。NIH3T3/hCD4/Fusin及びNIH3T3/hCD4/CCR5安定な細胞株に、第一の十分に特性決定されている実験室ウイルスを感染させ、その感染性を、培地に放出されたp24抗原により測定した(表2)。HIV−1分離株の第一の及び分子クローンは、これらの細胞株に、検出可能で再現可能な様式で感染することができた。幾つかの主要な分離株(92RW009及びBJ)は、これらの細胞に無細胞様式で感染しなかった。pVVN及びpVVN−P構築物での免疫化がHIV−1感染した標的細胞を殺すことができるかどうかを分析するために、我々は、NIH3T3/CD4/CXCR4及びNIH3T3/CD4/CCR5細胞への感染のために、それぞれ、クレードBのT向性(HIV−1 NL43)及び二向性(HIV−1 89.6)ウイルスを用いた。これらの感染細胞を、このCTLアッセイにおいて、標的細胞として用いた。pVVN及びpVVN−P免疫化マウスの両方に由来する脾臓細胞は、ネイティブな病原体感染細胞の溶解を誘導した。図6Aは、HIV−1(T向性及び二向性)感染した標的に対するpVVN及びpVVN−P免疫化により誘導される細胞傷害性Tリンパ球応答に関係する実験からのデータを示している。CD4/CCR5又はCD4/CXCR4を発現するNIH3T3細胞に、二向性(89.6)及びT向性(pNL43)ウイルスを感染させて、CTLアッセイにおいて標的細胞として用いた。Balb/Cマウスを、100μgのpVVN、pVVN−P及び対照用ベクターを用いて免疫化した。脾臓細胞を、これらのマウスから、第一及び第二の注射の2週間後に得て、抗原特異的CTLアッセイを、6時間51Cr放出法にて行なった。HIV−1感染標的細胞の自然の(非特異的)溶解を計算して、実験試料から差し引いて、このアッセイにおける免疫化マウス由来の脾臓細胞により誘導された特異的溶解を説明した。同様の結果が、複数の独立した実験において認められた。それらのデータは、HIV−1に感染したNIH3T3/CD4/CCR5細胞を用いるpVVN及びpVVN−Pによる特異的溶解のパーセンテージを示している。50:1のエフェクター:標的比において、VVN及びVVN−Pによる溶解パーセンテージは、二向性イルスに感染した標的では、それぞれ、29及び42であり、特異的溶解は、T向性感染標的において、16及び21%である。興味深いことに、pVVN−P構築物により誘導された特異的CTLのパーセンテージは、常に、pVVN構築物による免疫化よりも高い。
【0100】
pVVN及びpVVN−P構築物により誘導されるクロスクレードCTL:これらの構築物(Bクレードウイルス由来の遺伝子)によるクロスクレードCTL認識を評価するために、我々は、NIH3T3/hCD4/CCR5又はNIH3T3/hCD4/Fusin細胞株に、クレードD、E、C及びAからのHIV−1分離株を感染させた(表2)。一度それらの細胞が中レベルの感染に達したならば、それらの細胞を51Crで標識して、CTLアッセイのための標的として用いた。図6Bは、VVN及びVVN−P発現構築物で免疫化したマウスから分離した脾臓細胞により誘導されたクロスクレードCTL応答に関する実験からのデータを示している。VVN及びVVN−P発現構築物で免疫化されたマウスから分離された脾臓細胞により誘導されるクロスクレードCTL応答:CD4/CCR5又はCD4/CXCR4を発現するNIH3T3細胞にクレードB、C/Aから導かれたHIV−1ウイルスを感染させ、D及びEをCTLアッセイにおける標的として用いた。Balb/Cマウスを100μgのpVVN、pVVN−P及び対照用ベクターで免疫化した。脾臓細胞をこれらのマウスから、第一及び第二の注射の2週間後に得て、抗原特異的CTLアッセイを6時間51Cr放出法にて行なった。HIV−1感染標的細胞の自然の(非特異的)溶解を計算して実験試料から差し引いて、このアッセイにおける免疫化マウス由来の脾臓細胞により誘導された特異的溶解を説明した。同様の結果が、複数の独立した実験において認められた。図6Bに与えた結果は、pVVNとpVVN−Pの両方が、クレードB(臨床的分離株)、D(HIV−1Zr6)及びE(92THA022)感染した標的に対するCTL活性を誘導したことを示している。減少するエフェクター:標的比を有する活性力価。加えて、我々は又、pVVN−Pで免疫化されたマウスに由来する脾臓細胞が、クレードE及びD感染標的に対して、pVVNで免疫化されたマウスに由来する脾臓細胞よりも一層高いCTL応答を誘導することにも気付いた。しかしながら、我々は、pVVN又はpVVN−P免疫化の両方によるクレードC/A(92RW009)感染標的に対しては如何なるCTL活性も認めなかった。この結果が、これらのマウス細胞株におけるこの単離株の一層低い感染率を反映しているということはありそうもないことではない(表2)。
【0101】
検討
UNAIDSによる最近の報告は、世界的に3600万人より多くがHIV−1に感染しており、この数は、特に開発途上国において急速に増大しているということを示している。抗ウイルス療法は、イン・ビボでHIV−1の複製を制御するようであるが、それらの高価なコスト及び統制的な投与プロトコールが、世界的なHIV問題に対する理想的な解決に及ばないものとしている。ワクチンは、HIV−1の世界的感染を制御する費用に対し最も効率のよい手段であるようである。DNAワクチン技術は、抗ウイルスワクチン開発における重要なツールの代表である。HIV−1ゲノムの全ゲノムではなくて部分を含むDNA構築物の注射は、感染の懸念を伴わずに免疫化を誘導することができる。DNA接種を利用するイン・ビボでの免疫応答の生成が、種々の研究室によって報告されてきた(我々の他の治療標的及び他の送達技術を用いるものを含む)。以前に我々及び他の研究者は、核酸送達アプローチが、マウスにおいて並びに非ヒト霊長類においてそして現在はヒトにおいて抗HIV−1細胞性及び液性免疫応答を生じることを示してきた。
【0102】
発生するデータは、細胞媒介の免疫の誘導が、HIV−1に対する如何なる候補のワクチンについても重要な特徴でありうることを支持している。自然の感染において、抗HIV−1 CTL応答は、非常に初期に現われ、一時的に、ウイルスのセットポイントの確立に相関するようである。CTLは、ウイルス感染細胞をターゲットとして破壊することによるウイルスクリアランスにおいて決定的な役割を演じる。特異的CTL応答の生成によって免疫応答をウイルスタンパク質に向けることは、ウイルス内の複数の抗原性標的に対する広範な免疫応答の誘導を可能にするであろう。このウイルスに対するCTL活性は、健康な感染した患者において、AIDSに進行した患者と比べて一層普通に測定される。特異的CTLは、病気の病因が、CTL応答と好適な臨床状態との間のリンクの確立を増すにつれて減少すると報告されている。特異的なCTL応答は、無症候段階のHIV−1感染の維持に寄与するようである。従って、強いHIV−1特異的CTLのイン・ビボでの誘導は、感染の確立及び最終的なHIV感染の進行からの宿主の最終的防護において決定的役割を演じうる。
【0103】
この報告において、我々は、HIV−1アクセサリー遺伝子vif、vpr及びnefの免疫原としての利用を評価した。一度消耗性であると考えられると、最近の研究は、HIV−1アクセサリー遺伝子がAIDS病因論において、正常な細胞活性を調節することによって重要な役割を演じうることを示している。例えば、主要細胞における無細胞感染は、機能的vif遺伝子によるトランス相補によって増強されうるが、これは、Vifがある種の細胞型においてウイルス複製を相補することを示唆している(47)。Vpu及びNefの両方とも、内部で発現された場合にCD4及びMHCクラスI分子のダウンレギュレーションに関与することが示されている。Nefは、感染細胞表面のMHCクラスIの発現をブロックし、それにより、ウイルス感染細胞をCTL媒介の破壊から保護する。これらの遺伝子の生物学的機能の適当な弱毒化は、宿主細胞の仮説的な負の効果を、それらの重要な免疫学的エピトープを保持したままで排除するであろう。
【0104】
我々の研究において、これらのvif、vpu及びnef遺伝子を、様々な臨床状態の患者から分離したウイルスからクローン化した。これらの遺伝子の機能的及び弱毒化形態の両方を発現するDNA構築物を、免疫適格マウスにおいて細胞性及び液性応答を誘導する能力について分析した。機能的及び弱毒化遺伝子の免疫原としての利用についての免疫学的データは、全く比較できる。弱毒化並びに機能的クローンの両方が、強いが変化しやすいCTL及びT細胞増殖応答をマウスにおいて誘導することができた。一般に、これらの遺伝子により誘導された液性応答は低レベルであり、その最もありそうな理由は、これらのアクセサリー遺伝子が細胞内で発現され、それ故に、容易にB細胞免疫グロブリン認識のために提示されないからである。一つの重要な観察は、vpuを免疫原として利用することができるということであった(抗原特異的な免疫応答をこれらのモデルにおいて生じる)。
【0105】
HIV−1アクセサリー遺伝子は、抗HIV DNAワクチンにおける利用のために重要な免疫原でありえよう(何故なら、それらは、全体的に、免疫攻撃下で、感染標的の数を拡大し、そうして、ウイルスが逃れるのを制限するからである)。加えて、それらは、HIV−1の表面及びコアタンパク質よりも一層強い選択圧下にありうる。これを評価するために、我々は、マウスモデルにおいて、HIV−1の臨床分離株及び実験室分離株に対する細胞性免疫応答を試験するための新しい系を改作した。この単一ラウンド感染の系は、HIV−1完全ウイルス標的に対するエフェクター応答を生成する抗原の能力の試験を容易にする(個々のウイルス抗原の組換えベクターの生成を必要としない)。これは、pVVN及びpVVN−P構築物で免疫化されたマウスがクレードB、E及びDのHIV−1から導かれた標的を溶解させることができるということをここに示すことによって支持される。これは、これらのアクセサリー遺伝子の保存的性質の故に、それらがクロスクレードCTL応答を誘導することができることを示唆しているが、これは、ワクチン開発における有用な追加的ツールでありうる。加えて、この研究において、我々は、弱毒化形態での病原性遺伝子の利用の実行可能性をも示した。アクセサリー遺伝子をワクチン標的として利用する我々の初期の分析は、これらの構築物が、マウスにおいて十分に許容されて、何らの悪影響も示さなかったことを示している。ここに示された明らかな利益は、アクセサリー遺伝子の、クロスクレード認識及びCTL応答に参加する能力である。タンパク質分解性開裂部位の挿入は、かかる融合ワクチン抗原の一層自然なプロセッシングを生じるようであり、これは、これらのカセットにより誘導される一層高度な細胞性免疫応答に向かう流れの観察によって、ここに証明されるように、更なる価値をこれらのアプローチに加えることができる。かかる応答が、ワクチンの考察に関して重要であることはありそうなことである。
【0106】
構造遺伝子及び酵素遺伝子を含むマルチコンポーネントワクチンカクテルの部分としてアクセサリー遺伝子を結合させることは、感染した個体における治療用ワクチンとして一層活発な免疫応答を誘導することができるであろう。かかるアプローチは、新たな標準的抗レトロウイルス治療養生法に対する興味深い補足たりうるものであり、そうして、治療攻撃下の遺伝子標的の数を増大させる。生弱毒化SIVワクチンの開発における独創的研究は、HIV−1アクセサリー遺伝子のイン・ビボでのウイルス病因の誘因としての重要性を示してきた。理論においては、アクセサリー遺伝子機能を欠くウイルス逸脱変異体を選択するCTL応答は、イン・ビボで今や弱毒化されているウイルス性表現型を生じることが予想される。そうして、滅菌してない予防用ワクチンでさえも(又は、免疫療法としての治療環境において)、結果は、やはり、2つの特異的な利益を有することが期待されよう。一つの利益は、生成したウイルスが病因の面をゆるめることができるであろうことであり第二の利益は、残りのウイルスが事実上生弱毒化ワクチン防護の面を模倣することができるであろうことである。我々が作成したような多くの遺伝子に対する免疫を誘導することのできる単一DNAワクチン構築物は、単一遺伝子DNAワクチンカセットを開発して投与するよりも投与しやすくて一層費用有効性が高い。
【0107】
【表1】
HIV−1アクセサリー遺伝子vif及びNefを、臨床分離株からクローン化して、それらの機能的アッセイに基づいて特性決定した。突然変異を、Vpr及びVpuに、初期の研究に基づいて導入した(41、58)。NA、利用不能。
【0108】
【表2】
HIV−1主要分離株を、UNAIDSから、NIH AIDS RRRPを介して得て、正常なPBMC中で繁殖させた。hCD4/CCR5を及びhCD4/CXCR4を発現するNIH 3T3細胞に、10〜50ngのp24抗原当量のウイルスを、12時間感染させた。細胞を、PBSで2回洗って、正常な細胞培地中に維持した。細胞を感染につきモニターして、それらの細胞及び培地を集めてp24産生につきアッセイした。ND、未測定。
【図面の簡単な説明】
【図1A】
図1Aは、実施例に記載の実験からのデータを示す図である。
【図1B】
図1Bは、実施例に記載の実験からのデータを示す図である。
【図2】
図2は、実施例に記載の実験からのデータ及びT7系を利用したイン・ビトロ翻訳後のVVN及びVVN−Pの発現からのデータを示す図である。
【図3A】
図3Aは、免疫沈降によるHeLa細胞中でのVVN及びVVN−P融合タンパク質の発現及びプロセッシングに関するデータを示している図である。
【図3B】
図3Bは、イン・ビボでのVVN及びVVN−P融合タンパク質の細胞内局在性に関するデータを示している図である。
【図3C】
図3Cは、VVN及びVVN−P抗原発現の免疫組織化学的分析の結果を示している図である。
【図4】
図4は、組換えVif、Vpu及びNefでのイン・ビトロ刺激後にpVVN及びpVVN−Pで免疫化したマウス由来の脾臓細胞のT細胞増殖に関する実施例に記載の実験からのデータを示している図である。
【図5】
図5は、pVVN及びpVVN−P免疫化により誘導された細胞傷害性Tリンパ球応答に関する実施例に記載の実験からのデータを示している図である。
【図6A】
図6Aは、HIV−1(T向性及び二向性)感染した標的に対するpVVN及びpVVN−P免疫化により誘導された細胞傷害性Tリンパ球応答に関する実験からのデータを示している図である。
【図6B】
図6Bは、VVN及びVVN−P発現構築物で免疫化されたマウスから単離した脾臓細胞により誘導されたクロスクレードCTL応答に関する実験からのデータを示している図である。
Claims (20)
- HIV Vif、HIV Vpu及びHIV Nefを含むポリタンパク質。
- HIV Vifが、SEQ ID NO:1である、請求項1に記載のポリタンパク質。
- HIV Vpuが、SEQ ID NO:2である、請求項1に記載のポリタンパク質。
- HIV Nefが、SEQ ID NO:3である、請求項1に記載のポリタンパク質。
- HIV Vif、HIV Vpu及びHIV Nefが、互いに、N末端からC末端に向けて、HIV Vif、HIV Vpu及びHIV Nefの順序で存在する、請求項1に記載のポリタンパク質。
- プロテアーゼ開裂部位が、HIV VifとHIV Vpuの間に位置され、プロテアーゼ開裂部位が、HIV VpuとHIV Nefの間に配置された、請求項5に記載のポリタンパク質。
- HIV Vifが、SEQ ID NO:1である、請求項6に記載のポリタンパク質。
- HIV Vpuが、SEQ ID NO:2である、請求項6に記載のポリタンパク質。
- HIV Nefが、SEQ ID NO:3である、請求項6に記載のポリタンパク質。
- プロテアーゼ開裂部位が、REKRAVVG、請求項6に記載のポリタンパク質。
- HIV Vifが、SEQ ID NO:1であり;HIV Vpuが、SEQ ID NO:2であり且つHIV Nefが、SEQ ID NO:3である、請求項11に記載のポリタンパク質。
- 請求項1〜11に記載のポリタンパク質をコードするコード配列を含む核酸分子。
- 前記のコード配列が、調節エレメントに操作可能に結合されている、請求項12に記載の核酸分子。
- 前記の核酸分子が、プラスミドである、請求項12に記載の核酸分子。
- 前記のコード配列が、調節エレメントに操作可能に結合されている、請求項14に記載のプラスミド。
- 請求項12に記載の核酸分子を含む組換えワクチン又は弱毒化ワクチン。
- 請求項1〜16に記載の主題の物質を含む医薬組成物。
- 請求項17に記載の組成物を含む組成物を投与することを含む、HIVに対して個人を免疫化する方法。
- 前記の免疫化が、予防のためである、請求項18に記載の方法。
- 前記の免疫化が、治療のためである、請求項18に記載の方法。
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