JP2002522448A - ウイルス疾患の予防および治療 - Google Patents

ウイルス疾患の予防および治療

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ヌンバーグ，ジャック，エイチ．
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、１以上の移行性融合関連決定基を含む融合関連分子構造体(Fusion-Related Molecular Structure: FRMS)の生成に関する。世界中のあらゆる場所からの、または異なる系統発生的ウイルス分枝からの、広範な一次分離株を強力に中和することができる特異な抗体を生起する融合関連決定基を免疫系に提示する非常に効果的なワクチンを構築しうる。本発明は、FRMSの形成、単離および精製方法、ならびにワクチン用免疫原、診断薬、治療薬などの種々の組成物および方法におけるFRMSの使用を提供する。本発明は、ウイルス病原体およびウイルスの一次分離株に対する中和抗体を引き出すことができるFRMSに関する。FRMSに対する抗体を用いて、ウイルスと宿主細胞の融合に関する分子経路を研究し、かつ該経路を抗体によって遮断しうる位置を同定することができる。本発明はまた、抗ウイルス薬、血液製剤用添加剤、避妊薬用添加剤、暴露後治療における受動免疫感作、または胎児免疫感作のための本発明抗体の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 それぞれFRMSおよびアフィニティータグを付けたエンベロープタンパク質に対
するモノクローナル抗体で構成される本発明は、National Institutes of Healt
hから授与された付与番号 R01 AI44669-01およびR21 AI44312-02として国家の援
助を受けてなされた。これらの発明について国家は一定の権利を有する。
【０００２】 本出願は米国特許仮出願第60/095,105号（1998年8月3日出願）および米国特許
仮出願第60/141,806号（1999年6月29日出願）に対して優先権を主張する。これ
ら両者の全部を参照により本明細書に組み入れる。
【０００３】１．緒言 本発明は、世界中のあらゆる場所からの、および異なる系統発生的ウイルス分
枝からの、広範な一次分離株を強力に中和することができる特異な抗体を生起す
る一過性の融合関連決定基を免疫系に提示するのに非常に効果的なワクチンを構
築することができるという、驚くべき発見に関する。本発明は１以上の融合関連
決定基を含む融合関連分子構造体（FRMS）の作製に関する。本発明はさらに、多
様な一次分離株の広範で均一な中和が、FRMSによって提示される重要な決定基が
高度に保存されていること、そして結合および融合におけるエンベロープタンパ
ク質の基本的な機能作用に密接に結びついているらしいことを意味するという発
見に関係している。本発明はFRMSの形成、単離および精製方法、ならびに例えば
ワクチン用免疫原、診断薬および治療薬などの各種の組成物および方法における
こうしたFRMSの使用を提供する。
【０００４】 本発明はウイルス病原体およびウイルスの一次分離株に対する中和抗体を引き
出すことができるFRMSに関係する。FRMSに対する抗体を使用して、ウイルスと宿
主の融合に至る分子経路を研究し、その経路を抗体によって遮断し得る箇所を同
定することができる。本発明は、抗ウイルス薬、血液製剤用添加剤、避妊薬用添
加剤、曝露後の治療における受動免疫感作、または胎児免疫感作のための、本発
明の抗体の使用にも関する。
【０００５】２．発明の背景 本明細書の参照文献の引用はこうした参照文献が本発明の先行技術であること
の承認として解釈すべきものではない。
【０００６】 ウイルスはヒト、動物、細菌および植物の多くの疾病の原因となる感染物質で
あり、したがって医療および商業上非常に重要である。概説すると、ビリオンと
称される遊離の１ウイルス粒子はタンパク質またはポリアミドに結合した１ゲノ
ム（RNAまたはDNA）、ならびにキャプシドと称されるタンパク質外被で構成され
ている。ビリオンによっては、さらに膜状のエンベロープで取り囲まれている。
キャプシドおよびエンベロープ構造は環境中に存在するヌクレアーゼからゲノム
を保護するのに役立ち、またウイルスが感染して複製されることになる細胞への
ウイルスの付着および侵入を促進するのにも役立つ。
【０００７】２．１．ウイルスの侵入 ウイルスは複製のために宿主の生合成機構を利用しなければならない。ウイル
スは動物細胞中で利用し得る合成経路および基質を使用して、自体の遺伝情報を
維持し増殖する。細胞の生物機構への接近を確保するため、ウイルスはその細胞
に侵入または感染しなければならない。侵入は宿主細胞膜上の１以上のウイルス
レセプタータンパク質の存在によって促進される。ウイルスタンパク質がこれら
のレセプターに結合し、複雑な一連の現象を開始することによって、ウイルスの
核酸または核タンパク質が細胞内に放出される。
【０００８】 包膜ウイルスの場合、感染はウイルスエンベロープと細胞表面膜または内部膜
などの細胞性膜との融合によって促進される。多種の包膜ウイルスがヒトおよび
動物の疾患に関係する。
【０００９】２．２．HIV 臨床的に重要な包膜ウイルスの１例がHIVである。ヒト免疫不全ウイルス（HIV
）は後天性免疫不全症候群（AIDS）と命名された緩慢退行性免疫系疾患の主要な
原因に関係するものとされた（Barre-Sinoussi,F.ら、1983,Science 220:868-87
0；Gallo,R.ら、1984,Science 224:500-503）。ヒトにおいて、HIVの複製はCD4
＋Tリンパ球集団中で卓越して発生し、そしてHIV感染はこの細胞型の枯渇をもた
らし、結果的に、免疫機能不全、日和見感染、神経機能障害、新生物増殖、そし
て最終的には死に至る。HIVには以下のものを含む少なくとも２種の別個の型が
存在する：HIV-1（Barre-Sinoussi,F.ら、1983,Science 220:868-870；Gallo,R.
ら、1984,Science 224:500-503）およびHIV-2（Clavel,F.ら、1986,Science 233
:343-346；Guyader,M.ら、1987,Nature 326:662-669）。その上、各型の集団内
には有意な遺伝的異質性が存在する。
【００１０】 HIVはレトロウイルスファミリー内のレンチウイルスクラスのメンバーである
（Teich,N.ら、1984,RNA Tumor Viruses,Weiss,R.ら、eds.,CSH-Press,pp.949-9
56）。レトロウイルスは一本鎖RNAゲノムを含む小さな包膜ウイルスで、ウイル
スにコードされた逆転写酵素、RNA依存性DNAポリメラーゼによって生成するDNA
中間体を介して複製する（varmus,H.,1988,Science 240:1427-1439）。
【００１１】 HIVウイルス粒子は、ウイルスRNAゲノムおよび初期の複製事象に必要な酵素と
ともに、部分的にキャプシドタンパク質で構成されるウイルスコアを含む。ミリ
スチル化ギャグ(gag)タンパク質がウイルスコアを囲む外殻を形成し、さらにこ
れが感染した細胞膜から誘導される脂質膜エンベロープで囲まれる。HIVエンベ
ロープの表面の糖タンパク質は一本の160キロダルトン前駆体タンパク質として
合成され、これがウイルス出芽中に細胞プロテアーゼによって２つの糖タンパク
質、gp41およびgp120に切断される。gp41は膜貫通糖タンパク質であり、gp120は
細胞外糖タンパク質で、おそらく３量体または多量体形態でgp41と非共有結合し
たままになっている（Hammarskjold,M.ら、1989,Biochem.Biophys.Acta 989:269
-280）。
【００１２】 CD4細胞性膜タンパク質（CD4）がHIV-1ウイルスのための細胞レセプターとし
て作用するので、HIVはCD4＋細胞を標的とする（Dalgleish,A.ら、1984,Nature
312:763-767；Klatzmannら、1984,Nature 312:767-768；Maddonら、1986,Cell 4
7:333-348）。細胞中へのウイルスの侵入はgp120の細胞CD4レセプター分子との
結合如何によるので（McDougal,J.S.ら、1986,Science 231:382-385；Maddon,P.
J.ら、1986,Cell 47:333-348）、CD4＋細胞に対するHIVの向性(tropism)が説明
される。
【００１３】 ウイルスエンベロープタンパク質と細胞レセプターとの相互作用の際、エンベ
ロープタンパク質-CD4複合体がコンホメーションを変更し、その後の宿主細胞の
コレセプターとの相互作用を促進して３量体複合体を形成させる。３量体複合体
のさらなるコンホメーションの変化によって、隣接する細胞膜とウイルスエンベ
ロープの融合が可能になり、ウイルスの遺伝物質が細胞内に放出される。
【００１４】２．３．ウイルス治療戦略 ２．３．１．薬剤療法 有効な治療薬の設計について相当な努力を投入しているが、AIDSに対する治療
効果がある抗レトロウイルス薬剤は現在存在しない。こうした薬剤の開発の努力
はHIVのライフサイクルのいくつかの段階に焦点を当ててきた（Mitsuya,H.ら、1
991,FASEB J.5:2369-2381）。HIVのライフサイクルを妨害するための多くのウイ
ルスの標的が示唆された。なぜならば宿主細胞タンパク質の妨害は障害となる副
作用を持つというのが支配的見解だからである。例えば、ウイルスにコードされ
た逆転写酵素が薬剤開発の１つの焦点となった。AZT、ddI、ddCおよびd4Tなどの
2',3'-ジデオキシヌクレオシド類似体を含む多数の逆転写酵素を標的とする薬剤
が開発され、これらはHIVに対して活性であることが示された（Mitsuya,H.ら、1
991,Science 249:1533-1544）。
【００１５】 HIV-1のための新しい治療状況から、逆転写酵素（RT）を標的とする、アジド
チミジン（AZT）、ラミブジン(lamivudine)（3TC）、ジデオキシイノシン（ddI
）、ジデオキシシチジン（ddC）などの抗HIV化合物の組合せをHIV-1プロテアー
ゼインヒビターと組合せて使用すると、AZTのみ（約1 logの低下）に比較して、
ウイルスの負荷に対してはるかに大きな効果（2〜3 logの低下）を持つことが証
明されている。例えば、AZT、ddI、3TCおよびリトナビル(ritonavir)の組合せで
改善された結果が最近得られた（Perelson,A.S.ら、1996,Science 15:1582-1586
）。しかし、これらの化学物質の組合せの長期の使用の結果として、特に骨髄に
対して毒性をもたらすらしい。長期の細胞毒性の治療は、キラー細胞活性を介し
て（Blazevic,V.ら、1995,AIDS Res.Hum.Retroviruses 11:1335-1342）、ならび
に抑制因子、とりわけケモカインRantes、MIP-1αおよびMIP-1βの放出によって
（Cocchi,F.ら、1995,Science 270:1811-1815）、HIVをコントロールするために
必須のCD8＋T細胞の抑制をももたらすらしい。長期の化学物質による抗レトロウ
イルス療法のもう１つの主要な関心事は部分的または完全な耐性を持つHIVの突
然変異の進展である（Lange,J.M.,1995,AIDS Res.Hum.Retroviruses 10:S77-82
）。こうした突然変異は抗ウイルス療法の必然的結果であると考えられる。治療
による野生型ウイルスの消失と突然変異ウイルスの出現のパターンは、CD4＋T細
胞の数の符合する減少と併せて、少なくともいくつかの化合物については、ウ
イルス突然変異体の出現がAIDS治療法の失敗の基本的要因であることを強く示唆
している。
【００１６】 その上、従来の薬剤の失敗は、緩慢に増殖する細胞集団内のHIVの保有にも起
因するらしい。これらは潜伏性で活発にウイルスを産生せず、したがって多くの
従来の治療から逃れるからである。
【００１７】 ウイルスの細胞内への侵入を抑制することができる薬剤を開発する試みも実施
されてきた。これらの研究のため、焦点はこれまでCD4、HIVのための細胞表面レ
セプター、に向けられてきた。例えば、組換え可溶性CD4はあるHIV-1株によるCD
4＋T細胞の感染を抑制することが示された（Smith,D.H.ら、1987,Sciencs 238:1
704-1707）。しかし、ある種の一次HIV-1分離株は組換えCD4による抑制に対して
相対的に感受性が小さい（Daar,E.ら、1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6574-6
579）。その上、組換え可溶性CD4の臨床試験では、確定的でない結果が得られた
（Schooley,R.ら、1990,Ann.Int.Med.112:247-253；Kahn,J.O.ら、1990,Ann.Int
.Med.112:254-261；Yarchoan,R.ら、1989,Proc.Vth Int.Conf.on AIDS,p.564,MC
P 137）。
【００１８】 HIV複製の後期段階は、ウイルスにコードされた一定のタンパク質の重要なウ
イルス特異的プロセシングが関与するので、やはり可能な抗HIV薬剤の標的とし
て示唆された。後期段階のプロセシングはウイルスプロテアーゼの活性に依存す
るので、このプロテアーゼを阻害する薬剤が開発されてきた（Erickson,J.,1990
,Science 249:527-533）。
【００１９】 最近、CD8＋T細胞によって産生されるケモカインがHIV感染の抑制に関係する
ものとされた（Paul,W.E.,1994,Cell 82:177；Bolognesi,D.P.,1993,Semin. Imm
unol.5:203）。CD8＋T細胞によって分泌されるケモカイン RANTES、MIP-1αおよ
びMIP-1βがin vitroでHIV-1またはHIV-2分離株によって感染させた細胞中でのH
IV-1 p24抗原の産生を抑制することが示された（Cocchi,F.ら、1995,Science 27
0:1811-1815）。したがって、これらのおよびその他のケモカインがHIV感染のた
めの治療に有用であることが証明されるかもしれない。しかし、これらすべてお
よびその他の候補薬剤の臨床結果はなお疑問のままである。
【００２０】２．３．２．ワクチン 抗ウイルス治療および予防の別の重要な戦略はワクチンの開発である。HIVな
どのウイルス感染が潜在的に汎流行性であるため、効果的なワクチンに対する多
大な需要がある。
【００２１】 一般的に、ワクチンを調製するための伝統的な方法として、不活性化または弱
毒化病原体の使用が含まれる。病原微生物の好適な不活性化はこれを生物学的薬
剤として無害にするが、その免疫原性は破壊しない。したがってこれらの「死菌
」粒子の宿主中への注入は、将来の生菌微生物による感染を予防する能力がある
免疫応答を引き出す。しかし、（不活性化病原体を使用した）死菌ワクチンの使
用における重大な懸念は、微生物粒子のすべてを不活性化するのに失敗すること
である。これが達成された場合でも、死滅した病原体はその宿主中で増殖しない
こと、あるいはその他の未知の理由によって、獲得した免疫は不完全で、短命で
あることが多く、多数回の免疫感作を必要とする。最後に、不活性化過程で微生
物の抗原が変更されて、免疫原としての効果が低下することがある。
【００２２】 弱毒化とは、基本的に疾患産生能力を喪失した病原性微生物株の製造を称する
。これを達成するための１方法は、微生物を異常な増殖条件にし、かつ／または
細胞培養中に頻繁な継代培養をすることである。その後、毒性を喪失しているが
免疫応答を引き出す能力はまだある突然変異体を選択する。弱毒化病原体は現実
に宿主細胞中で複製するので、良好な免疫原を形成し、長期間続く免疫を引き出
すことが多い。しかし、生ワクチンの使用についてはいくつかの問題に遭遇する
。最も心配されるのは不十分な弱毒化と毒性の復帰のリスクである。
【００２３】 上記の方法の別法はサブユニットワクチンの使用である。これには、関係する
免疫学的物質を含有する成分のみによる免疫感作が関与する。
【００２４】 例えばHIVの場合、エンベロープタンパク質（gp160、gp120、gp41）がAIDS患
者中に存在する抗HIV抗体に対する主要な抗原であることが示された（Barinら、
1985,Science 228:1094-1096）。したがって、これまでのところでは、これらの
タンパク質が抗HIVワクチン開発のための免疫原として作用する最も一般的な候
補であった。いくつかのグループが、宿主免疫系のための免疫原標的として、gp
160、gp120および／またはgp41の各種の部分を使用することを開始した。例えば
、Ivanoff,L.ら、米国特許第5,141,867号；Saith,G.ら、WO92/22,654；Shafferm
an,A.、WO91/09,872；Formoso,C.ら、WO90/07,119を参照されたい。
【００２５】 HIVエンベロープタンパク質は感染における初期の結合および侵入段階を仲介
するので、多くのワクチン戦略はウイルスのエンベロープ糖タンパク質の機能の
遮断に焦点を当ててきた。1993年、National Institutes of Health（NIH）によ
って支援された大規模な有効性試験のための候補ワクチンとして、HIVエンベロ
ープタンパク質の表面gp120サブユニットの２つの組換え形態（rgp120）が提起
された。以前の臨床研究において、これらのrgp120ワクチンは安全で、実験用に
順応させた関連するHIV分離株を強力に中和する抗体を引き出すことが示されて
いた（Belshe,R.B.ら、1994,Journal of the American Medical Association 27
2:475；Kahn,J.O.ら、1994,Journal of Infectious Diseases 170:1288）。しか
し、rgp120ワクチン血清による中和に対して一次分離（「PI」）ウイルスが非常
に抵抗性であるという知見によって、進展しなかった（Cohen,J.,1993,Science
262:980；Cohen,J.,1994,Science 264:1839）。
【００２６】２．４．一次分離株の中和の必要性 HIV感染の拡大する流行は2000年までに世界中で4000万人以上への感染に迫っ
ている（UNAIDS Report(www.unaids.org/unaids/report)）。有効なHIVワクチン
の必要性は緊急性であるが、HIVに感染した個体からの各種の一次分離株（PI）
の感染力を中和することができる抗体を引き出すためのどのワクチン候補も無効
であるため、このゴールに向けた進展は途絶した（Wrin,T.ら、1995,Journal of
Virology 69:39；Moore,J.P.ら、1995,AIDS 9(suppl A),S117；Mascola,J.R.ら
、1996,Journal of Infectious Diseases 173:340）。
【００２７】 不幸なことに、今日まで、研究者たちはHIVの広範な一次分離株を遮断する抗
体を産生するワクチンを製造することに成功していない。一次分離株は感染者か
ら直接採取して、実験室において一次末梢血リンパ球（PB l）中でのみに限定し
て増殖させる。したがって、一次HIV分離株は実験用に順応させた株よりも臨床
上関連性がある。実験用に順応させた株は実験室で樹立T細胞系で持続して増殖
するものである（Wrinら、1995,J. of Virology 69:39参照）。従来のワクチン
候補は実験用に順応させた株を中和する抗体を引き出した。例えば、Wrinら、19
95,J. of Virology 69:39では、実験用に順応させた分離株に由来し、組換えDNA
技 術によって製造したHIVエンベロープタンパク質を試験している。これらの組
換えタンパク質での免疫感作によって産生された抗体はウイルスの実験用に順応
させた分離株のみを中和した。天然のオリゴマーエンベロープタンパク質をin s
itu製造するために使用した組換えウイルスベクターおよびDNAも一次分離株に対
する中和抗体を引き出すことができなかった。その上、組換え技術によって製造
したgp120および可溶性CD4レセプターを含む免疫原はgp120に対する抗体を引き
出した（Gershoni,1993,FASEB Journal 7:1185）が、これらの抗体は一次分離株
を中和することはできなかった。
【００２８】 中和抗体は宿主細胞に対するウイルスの結合および融合を阻止するために重要
である。実験用に順応させた分離株を中和する抗体の作用を分析した。gp120上
のCD4結合ドメインに対して特異的な中和抗体はCD4の結合を妨害する。しかし、
大部分の中和抗体はCD4の結合後の段階を妨害する。例えば、いくつかの中和抗
体はコレセプターとの相互作用を抑制する（Trkolaら、1998,Journal of Virolo
gy 72:1876；Wuら、1996,Nature 384:179-83）。
【００２９】 宿主中で中和抗体を引き出す免疫原の同定には、有効なワクチンの開発が必要
である。中和抗体は実験用に順応させた分離株のみでなく、臨床上関連がある一
次分離株に対しても同様に作用するものでなければならない。上記から理解する
ことができるように、多様な一次分離株を効果的に中和する抗体を産生する新し
い免疫原分子に対する要請が持続している。
【００３０】３．発明の概要 本発明は、世界中のあらゆる場所からの、および異なる系統発生的ウイルス分
枝からの広範な包膜ウイルスの一次分離株を強力に中和することができる特異な
抗体を生起する一過性の融合関連決定基を免疫系に提示するのに非常に効果的な
ワクチンを構築することができるという、驚くべき発見に基づいている。本発明
のワクチンは免疫原として１以上の融合関連決定基を含む融合関連分子構造体（
FRMS）を含んでいる。本発明はさらに、多様な一次分離株の広範で均一な中和が
、FRMSによって提示される重要な決定基が高度に保存されており、そして結合お
よび融合におけるエンベロープタンパク質の基本的な機能作用に密接に結びつい
ているらしいことを意味するという発見に基づいている。本発明は例えばワクチ
ン用免疫原、診断薬および治療薬を含む各種の組成物および方法におけるこうし
たFRMSの使用を提供する。
【００３１】 本発明は包膜ウイルス病原体に対する中和抗体を引き出すことができるFRMSに
関する。これらの中和抗体を引き出すエピトープはウイルスエンベロープと宿主
細胞膜の結合および融合過程中のコンホメーションの変化の結果として生成する
。
【００３２】 １実施形態において、ウイルスタンパク質と宿主細胞の少なくとも１個のレセ
プターまたはコレセプターとの相互作用の結果として複合体が生成するが、これ
はウイルスタンパク質を発現する核酸によって形質転換した細胞と宿主細胞レセ
プター（群）を発現する細胞を同時培養することによって作製される。好ましく
は、その細胞は組換えによって宿主細胞レセプター（群）を発現する。別の１実
施形態において、融合適格性免疫原を保持するため、培養を細胞-細胞相互作用
の開始時で固定する。好ましい１実施形態において、融合関連免疫原を、主要ヒ
ト免疫不全ウイルス１型（HIV-1）エンベロープタンパク質、宿主細胞レセプタ
ーCD4および宿主細胞コレセプターCCR5の相互作用の結果として形成させる。
【００３３】 免疫原として本発明の主題であるFRMSによるワクチン免疫はウイルス病原体に
対する免疫応答を生起し、ワクチン免疫した宿主中で中和抗体の産生を引き出す
。FRMSをワクチンとして使用する他に、ウイルスと宿主細胞の融合に至る分子経
路を研究し、その経路を抗体によって遮断し得る箇所を同定するために、FRMSに
対して生起した抗体を使用することができる。その上、エンベロープタンパク質
または宿主細胞レセプター（群）の一部として、特異的な高アフィニティー「タ
グ」を発現させて、本発明のFRMSの単離および精製を促進させてもよい。
【００３４】 本発明はさらに、これらのFRMS免疫原によって引き出されるモノクローナル抗
体（mAb）の開発に関する。一次分離株を中和することができるモノクローナル
抗体を提供する。機能性が保存された融合依存性エピトープに対する中和mAbも
、曝露後治療における受動免疫感作または胎児免疫感作のために有用であると考
えられる。
【００３５】 本発明は、(a) 包膜ウイルスのエンベロープタンパク質と、(b) １以上の細胞
性膜タンパク質と、の会合の結果として形成されるエピトープを含む単離された
分子構造体を提供し、該エンベロープタンパク質および該細胞性膜タンパク質は
、適当な条件下で、該ウイルスのエンベロープと該細胞性膜タンパク質を含む細
胞膜とが融合するのに必要かつ十分なものである。
【００３６】 本発明は、(a) 集合してウイルスエンベロープとなるHIVエンベロープタンパ
ク質またはその変異体と、(b) ヒトCD4およびHIV融合のためのコレセプターと、
の会合の結果として形成されるエピトープを含む単離された分子構造体を提供す
る。一実施形態において、コレセプターはケモカインレセプターCCR5またはCXCR
4である。別の実施形態において、該分子構造体は融合欠損性であるHIV gp41の
変異体の会合により形成される。別の実施形態では、該変異体がV2E、G10V、V57
0RおよびY586Eからなる群より選択される１以上の突然変異を含む。さらに別の
実施形態では、該分子構造体が野生型HIVエンベロープタンパク質の会合により
形成される。
【００３７】 本発明は、(a) 包膜ウイルスの変異型エンベロープタンパク質と、(b) 該エン
ベロープタンパク質のレセプターとして機能する１以上の宿主細胞性膜タンパク
質と、の会合の結果として形成されるエピトープを含む単離された分子構造体を
提供し、野生型の該エンベロープタンパク質はウイルスエンベロープと宿主細胞
膜との融合において機能し、該変異型エンベロープタンパク質は融合欠損性であ
る。
【００３８】 一実施形態において、該ウイルスはレトロウイルス科、ラブドウイルス科、カ
ロナウイルス科、フィロウイルス科、ポックスウイルス科、ブンヤウイルス科、
フラビウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイ
ルス科、およびヘルペスウイルス科からなる群より選択されるウイルスファミリ
ー由来のものである。別の実施形態では、エンベロープタンパク質がHCVのE1お
よびE2であり、細胞性膜タンパク質がCD81である。別の実施形態では、該分子構
造体が架橋された細胞性分子構造体である。さらに別の実施形態では、該分子構
造体が細胞溶解物から単離されたものである。一実施形態において、細胞性分子
構造体は該エンベロープタンパク質を組換え的に発現している細胞を含む。さら
に別の実施形態では、細胞溶解物が該エンベロープタンパク質を組換え的に発現
している細胞を含む複数個の細胞に由来するものである。さらに別の実施形態で
は、細胞性分子構造体が１以上の宿主細胞性膜タンパク質を組換え的に発現して
いる細胞をさらに含む。
【００３９】 本発明は、エンベロープ上に、ウイルスの天然エンベロープタンパク質の細胞
レセプターを組換え的に発現する組換え包膜ウイルスを提供する。一実施形態に
おいて、該細胞レセプターはヒトCD4またはHIVのコレセプターであるか、または
該ウイルスがヒトCD4と該コレセプターの両方を組換え的に発現する。別の実施
形態では、前記適当な条件がpHを下げることを含む。別の実施形態では、架橋さ
れた細胞性分子構造体が、該エンベロープタンパク質を含む該ウイルスの架橋さ
れたウイルス粒子をさらに含む。
【００４０】 本発明は、免疫原量の前記分子構造体および製薬上許容される担体を含有する
ワクチン製剤を提供する。
【００４１】 本発明は、前記分子構造体に対するモノクローナル抗体を提供する。一実施形
態において、該抗体は標識されている。
【００４２】 本発明は、前記分子構造体に特異的な精製されたポリクローナル抗血清を提供
する。
【００４３】 本発明は、ウイルス感染を阻止または減少するのに有効な量の前記抗体を含有
する避妊用ゼリー、フォーム、クリームまたは軟膏を提供する。
【００４４】 本発明は、HIV感染を阻止または減少するのに有効な量の前記抗体を含有する
避妊用ゼリー、フォーム、クリームまたは軟膏を提供する。
【００４５】 本発明は、HIV感染を阻止または減少するのに有効な量の前記抗血清を含有す
る避妊用ゼリー、フォーム、クリームまたは軟膏を提供する。
【００４６】 本発明は、ウイルス感染を阻止または減少するのに有効な量の抗体が添加され
ている、哺乳動物血液のサンプルを提供する。
【００４７】 本発明は、HIV感染を阻止または減少するのに有効な量の抗体が添加されてい
る、ヒト血液のサンプルを提供する。一実施形態において、前記エンベロープタ
ンパク質または宿主細胞性膜タンパク質はアフィニティータグをさらに含む。別
の実施形態では、前記エンベロープタンパク質、CD4またはコレセプターがアフ
ィニティータグをさらに含む。さらに別の実施形態では、抗体が標識されている
。
【００４８】 本発明は、１個以上の容器内に前記分子構造体に対する標識モノクローナル抗
体を含むキットを提供する。
【００４９】 本発明は、１個以上の容器内に前記分子構造体に対する標識モノクローナル抗
体を含むキットを提供する。一実施形態において、該キットは別の容器内に前記
分子構造体をさらに含む。
【００５０】 本発明は、ウイルスエンベロープと宿主細胞膜との融合において機能する包膜
ウイルスのエンベロープタンパク質、または融合欠損性である該エンベロープタ
ンパク質の変異体を組換え的に発現し、かつ該エンベロープタンパク質のレセプ
ターとして機能する１以上の細胞性膜タンパク質を発現する細胞系を提供する。
一実施形態において、レセプターとして機能する１以上の前記タンパク質は組換
え的に発現される。
【００５１】 本発明は、HIV gp160を組換え的に発現し、かつCD4およびHIVのコレセプター
を発現し、gp160を切断してgp120とgp41を生成する機能性プロテアーゼを欠いて
いる細胞系を提供する。
【００５２】 本発明は、ウイルス感染を治療または予防するのに有効な免疫原量の前記分子
構造体を被験体に投与することを含んでなる、被験体のウイルス感染の治療また
は予防方法を提供する。一実施形態において、被験体はヒトである。別の実施形
態において、被験体は家畜である。
【００５３】 本発明は、HIV感染を治療または予防するのに有効な免疫原量の前記分子構造
体をヒトに投与することを含んでなる、ヒトのHIV感染の治療または予防方法を
提供する。
【００５４】 本発明は、ウイルス感染を治療または予防するのに有効な量の前記モノクロー
ナル抗体を被験体に投与することを含んでなる、被験体のウイルス感染の治療ま
たは予防方法を提供する。
【００５５】 本発明は、HIV感染を治療または予防するのに有効な量の前記モノクローナル
抗体をヒトに投与することを含んでなる、ヒトのHIV感染の治療または予防方法
を提供する。一実施形態においては、前記ヒトがHIVに感染するリスクが高いヒ
トである。別の実施形態では、前記方法はヒトのAIDSを治療するためのものであ
る。
【００５６】 本発明は、胎児を身ごもった妊娠ヒトに、該胎児のHIV感染を治療または予防
するのに有効な量の前記モノクローナル抗体を投与することを含んでなる、ヒト
胎児のHIV感染の治療または予防方法を提供する。
【００５７】 本発明は、血液サンプルに、ウイルス感染を阻止するのに有効な量の前記モノ
クローナル抗体を接触させることを含んでなる、血液サンプル中のウイルスによ
る感染の阻止方法を提供する。
【００５８】 本発明は、ヒト血液サンプルに、HIV感染を阻止するのに有効な量の前記モノ
クローナル抗体を接触させることを含んでなる、ヒト血液サンプル中のHIVによ
る感染の阻止方法を提供する。
【００５９】 本発明は、手術用または歯科用器具に、ウイルス感染を阻止するのに有効な量
の前記モノクローナル抗体を接触させることを含んでなる、手術用または歯科用
器具の汚染除去方法を提供する。
【００６０】 本発明は、手術用または歯科用器具に、HIV感染を阻止するのに有効な量の前
記モノクローナル抗体を接触させることを含んでなる、手術用または歯科用器具
の汚染除去方法を提供する。
【００６１】 本発明は、ある量の前記分子構造体を以前に投与された被験体における該分子
構造体に対する抗体の産生をモニタリングする方法を提供し、該方法は、該被験
体より血清サンプルを分離し、該血清中の該分子構造体に対する抗体の存在を検
出することを含んでなる。一実施形態において、前記検出は、該分子構造体に対
する標識抗体を用いて競合イムノアッセイを行なうことを含む方法により実施さ
れる。
【００６２】 本発明は、ウイルス感染の治療または予防用ワクチンに使用する免疫原を製造
する方法を提供し、該方法は、記載した順に、(a) 包膜ウイルスのエンベロープ
タンパク質もしくはそのキメラ体（ただし、該エンベロープタンパク質はウイル
スエンベロープと細胞膜との融合において機能するものである）、または融合欠
損性である該エンベロープタンパク質の変異体もしくはそのキメラ体に、該エン
ベロープタンパク質のレセプターとして機能する１以上の細胞タンパク質もしく
はそのキメラ体を接触させ、(b) 該エンベロープタンパク質もしくはそのキメラ
体または該変異体もしくはそのキメラ体と、該１以上の宿主細胞タンパク質もし
くはそのキメラ体とを、架橋剤にさらし、(c) 該エンベロープタンパク質もしく
はそのキメラ体または該変異体もしくはそのキメラ体を含む架橋構造体を単離す
る、各ステップを含んでなる。
【００６３】 本発明は、HIV感染の治療または予防用ワクチンに使用する免疫原を製造する
方法を提供し、該方法は、記載した順に、(a) HIVエンベロープタンパク質もし
くはそのキメラ体、または融合欠損性である該エンベロープタンパク質の変異体
もしくはそのキメラ体を組換え的に発現している第１の細胞を、(i)ヒトCD4また
はそのキメラ体および(ii)HIVのためのコレセプターまたはそのキメラ体を発現
している第２の細胞と共に培養し、(b) 該エンベロープタンパク質もしくはその
キメラ体、または該変異体もしくはそのキメラ体と、該CD4またはそのキメラ体
および該コレセプターまたはそのキメラ体とを、架橋剤にさらし、(c) 該エンベ
ロープタンパク質もしくはそのキメラ体、または該変異体もしくはそのキメラ体
を含む架橋構造体を単離する、各ステップを含んでなる。一実施形態において、
前記ウイルスはHIVであり、前記宿主細胞タンパク質はヒトCD4およびHIVのコレ
セプターである。別の実施形態では、第２の細胞がCD4もしくは前記コレセプタ
ー、またはCD4と該コレセプターの両方、または前記のもののいずれかのキメラ
体を組換え的に発現する。
【００６４】 他の実施形態において、第１および第２の細胞が同じ細胞型である。さらに別
の実施形態において、前記エンベロープタンパク質もしくはそのキメラ体、また
は前記変異体もしくはそのキメラ体はウイルス粒子またはウイルス様粒子の上に
存在する。さらに他の実施形態では、前記架橋構造体が架橋細胞複合体である。
【００６５】 別の実施形態において、前記ウイルスはレトロウイルス科、ラブドウイルス科
、カロナウイルス科、フィロウイルス科、ポックスウイルス科、ブンヤウイルス
科、フラビウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソ
ウイルス科、およびヘルペスウイルス科からなる群より選択される。
【００６６】 別の実施形態において、前記接触ステップは、前記宿主細胞タンパク質を発現
している細胞に、前記エンベロープタンパク質もしくはそのキメラ体または前記
変異体もしくはそのキメラ体を発現している前記ウイルスを感染させることによ
り行なう。別の実施形態では、前記エンベロープタンパク質または前記宿主細胞
タンパク質のキメラ体を接触させ、該キメラ体がアフィニティータグを含む。
【００６７】 別の実施形態においては、前記エンベロープタンパク質またはCD4または前記
コレセプターのキメラ体を接触させ、該キメラ体がアフィニティータグを含む。
【００６８】 本発明は、HIV感染の治療または予防用ワクチンに使用する免疫原を製造する
方法を提供し、該方法は、記載した順に、(a) HIVエンベロープタンパク質もし
くはそのキメラ体、または融合欠損性である該エンベロープタンパク質の変異体
もしくはそのキメラ体を組換え的に発現している第１の細胞を、(i)ヒトCD4また
はそのキメラ体および(ii)HIVのためのコレセプターまたはそのキメラ体を発現
している第２の細胞と共に培養し、その際、アフィニティータグを含む該キメラ
体の少なくとも１つが発現されており、(b) 共培養した細胞を溶解して、非変性
条件下で細胞溶解物を形成し、(c) 該細胞溶解物と該アフィニティータグに対す
る結合パートナーとを接触させ、該アフィニティータグに結合した分子構造体を
回収することを含む方法により、該エンベロープタンパク質もしくはそのキメラ
体または前記変異体もしくはそのキメラ体を含む分子構造体を該細胞溶解物から
単離する、各ステップを含んでなる。
【００６９】 本発明は、前記方法の産物である架橋構造体を提供する。
【００７０】 本発明は、次のHIVの一次分離株：92US657、92US660、92RW023、93IN101、92U
G035および92TH023をin vitroで中和する、前記構造体に対するモノクローナル
抗体を提供する。
【００７１】 本発明は、HIV感染を阻止または減少する量の前記抗体を含む避妊用ゼリー、
フォーム、クリームまたは軟膏を提供する。
【００７２】 本発明は、ウイルス感染を治療または予防するのに有効な免疫原量の前記構造
体を被験体に投与することを含んでなる、被験体のウイルス感染の治療または予
防方法を提供する。
【００７３】 本発明は、HIV感染を治療または予防するのに有効な免疫原量の前記分子構造
体をヒトに投与することを含んでなる、ヒトのHIV感染の治療または予防方法を
提供する。
【００７４】 本発明は、手術用または歯科用器具に、HIV感染を阻止するのに有効な量の前
記モノクローナル抗体を接触させることを含んでなる、手術用または歯科用器具
の汚染除去方法を提供する。
【００７５】 本発明は、手術用または歯科用器具に、ウイルス感染を阻止するのに有効な量
の前記モノクローナル抗体を接触させることを含んでなる、手術用または歯科用
器具の汚染除去方法を提供する。
【００７６】 本発明は、ワクチン効力について分子構造体をスクリーニングする方法を提供
し、該方法は、前記分子構造体を用いて、１個以上の導入遺伝子からヒトCD4とH
IVのためのコレセプターの両方を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を
免疫し、該哺乳動物により産生されるHIVに対する中和抗体を検出することを含
んでなる。
【００７７】 本発明は、ワクチン効力について分子構造体をスクリーニングする方法を提供
し、該方法は、前記分子構造体を用いて、１個以上の導入遺伝子から前記１以上
の宿主細胞性膜タンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫
し、該哺乳動物により産生される前記ウイルスに対する中和抗体を検出すること
を含んでなる。一実施形態において、前記哺乳動物がマウスである。別の実施形
態において、第１の細胞はHIVエンベロープタンパク質またはそのキメラ体を組
換え的に発現する。
【００７８】４．図面の簡単な説明 （図面の説明については下記参照）５．発明の詳細な説明 本発明は包膜ウイルス病原体に対する中和抗体を引き出すことができる融合関
連分子構造体（FRMS）に関する。本発明のFRMSは１以上の細胞性分子と１以上の
ウイルスエンベロープ分子との会合の結果として形成されるエピトープを含む。
細胞膜とのウイルスエンベロープの融合の過程は宿主細胞上の特異的な細胞レセ
プターおよび／またはコレセプターとのウイルスエンベロープタンパク質の結合
後に開始され、そしてそのウイルスエンベロープと表面または内部細胞膜との融
合が関与する。融合はエンベロープ-レセプター／コレセプター複合体内で発生
するコンホメーションの変化によって推進される。特定の機構によって限定する
意図はないが、融合中に発生するコンホメーションの変化は中和抗体のための新
しい特異な免疫原エピトープを出現させるものと確信する。本発明の主題である
融合関連分子構造体は融合中に形成されるコンホメーション中間体を模倣するも
のである。本発明のFRMSを、限定するわけではないが、本明細書の第5.5および
5.7節に提示するものを含む多様な目的のために使用することができる。例えば
、本発明の好ましい１実施形態において、FRMSは、宿主動物のワクチン免疫のた
めに使用する場合に、感染するウイルスに対する中和抗体を引き出すので、した
がって、ウイルス感染およびそれによる望ましくない結果の治療または予防のた
めの、本発明のワクチン製剤の新規で効果的な成分を提供する。
【００７９】 したがって、本発明は、(a)包膜ウイルスのエンベロープタンパク質と、(b)１
以上の細胞性膜タンパク質と、の会合の結果として形成されるエピトープを含む
単離された分子構造体であって、該エンベロープタンパク質および該細胞性膜タ
ンパク質が、適当な条件下で、該ウイルスのエンベロープと該細胞性膜タンパク
質を含む細胞膜とが融合するのに必要かつ十分なものである、分子構造体を提供
する。本明細書で使用する細胞性膜タンパク質として、細胞表面膜および（限定
するわけではないが、小胞体膜を含む）内部膜のタンパク質が含まれる。こうし
た細胞性膜タンパク質は内在性膜タンパク質（例えば膜貫通タンパク質）でもよ
く、あるいは付着した脂質（例えば脂肪酸鎖若しくはフェニル基）またはオリゴ
糖によって膜（例えばリン脂質、ホスファチジルイノシトール）に付着していて
もよく、あるいは細胞性膜タンパク質もまた非共有結合性相互作用によって（例
えば内在性膜タンパク質との会合によって）膜と会合していてもよい。
【００８０】 本発明はまた、(a)包膜ウイルスの変異型エンベロープタンパク質と、(b)該エ
ンベロープタンパク質のレセプターとして機能する１以上の宿主細胞性膜タンパ
ク質と、の会合の結果として形成されるエピトープを含む単離された分子構造体
であって、野生型の該エンベロープタンパク質はウイルスエンベロープと宿主細
胞膜との融合において機能し、該変異型エンベロープタンパク質は融合欠損性で
ある、分子構造体をも提供する。
【００８１】 特定の１実施形態において、本発明は、(a)集合してウイルスエンベロープと
なるHIVエンベロープタンパク質またはその変異体と、(b)ヒトCD4およびHIV融合
のためのコレセプターと、の会合の結果として形成されるエピトープを含む単離
された分子構造体を提供する。１実施形態において、コレセプターはケモカイン
レセプター CCR5またはCXCR4である。別の特定の１実施形態において、分子構造
体は融合欠損性であるHIV gp41の変異体の会合によって形成される。さらに別の
１実施形態において、変異体はV2E、G10V、V570RおよびY586Eからなる群より選
択される１以上の突然変異を含む。別の実施形態において、分子構造体は野生型
HIVエンベロープタンパク質の会合により形成される。別の特定の１実施形態に
おいて、エンベロープタンパク質はフラビウイルスHCVのE1およびE2であり、細
胞性膜タンパク質はCD81である。
【００８２】 本発明はまた、以下のステップを記載する順番で含む、ウイルスによる感染を
治療または予防するためのワクチンにおいて使用する免疫原を製造するための方
法をも提供する；(a)包膜ウイルスのエンベロープタンパク質またはそのキメラ
体であって、該エンベロープタンパク質が該ウイルスエンベロープと細胞膜との
融合において機能するものであるか、または融合欠損性である該エンベロープタ
ンパク質の変異体もしくはそのキメラ体と、該エンベロープタンパク質のための
レセプターとして機能する１以上の細胞タンパク質またはそのキメラ体とを接触
させ；(b)該エンベロープタンパク質若しくはそのキメラ体または変異体若しく
はそのキメラ体、および該１以上の宿主細胞タンパク質若しくはそのキメラ体を
架橋剤に曝露し；そして(c)該エンベロープタンパク質若しくはそのキメラ体ま
たは変異体若しくはそのキメラ体を含む架橋された構造体を単離する。１実施形
態において、ウイルスはHIVで、宿主細胞タンパク質はヒトCD4およびHIVのコレ
セプターである。
【００８３】 特定の１実施形態において、本発明はまた、以下のステップを記載する順番で
含む、HIVによる感染を治療または予防するためのワクチンにおいて使用する免
疫原を製造するための方法をも提供する；(a)HIVエンベロープタンパク質（群）
若しくはそのキメラ体、または融合欠損性である該エンベロープタンパク質の変
異体もしくはそのキメラ体を組換え的に発現する第１細胞と、(i)ヒトCD4若しく
はそのキメラ体、および(ii)HIVのコレセプター若しくはそのキメラ体を発現す
る第２細胞を共培養し；(b)該エンベロープタンパク質若しくはそのキメラ体ま
たは変異体若しくはそのキメラ体、ならびにヒトCD4若しくはそのキメラ体およ
びコレセプター若しくはそのキメラ体を架橋剤に曝露し；そして(c)該エンベロ
ープタンパク質若しくはそのキメラ体または変異体若しくはそのキメラ体を含む
架橋された構造体を単離する。
【００８４】 特定の１実施形態において、第２細胞はCD4または前記コレセプターまたはCD4
と該コレセプターの両方、あるいは前記のいずれかのキメラ体を組換え的に発現
する。別の特定の１実施形態において、本発明はまた、以下のステップを記載す
る順番で含む、HIVによる感染を治療または予防するためのワクチンにおいて使
用する免疫原を製造するための方法をも提供する；(a)HIVエンベロープタンパク
質（群）若しくはそのキメラ体、または融合欠損性である該エンベロープタンパ
ク質の変異体もしくはそのキメラ体を組換え的に発現する第１細胞と、(i)ヒトC
D4若しくはそのキメラ体、および(ii)HIVのコレセプター若しくはそのキメラ体
を発現する第２細胞を共培養するが、その際アフィニティータグを含む該キメラ
体の少なくとも１つが発現されており；(b)非変性条件下で共培養した細胞を溶
解して細胞溶解物を形成させ；そして(c)該細胞溶解物を該アフィニテイータグ
に対する結合パートナーと接触させて、該アフィニティータグに結合した分子構
造体を回収することを含む方法によって、該細胞溶解物から該エンベロープタン
パク質若しくはそのキメラ体または変異体若しくはそのキメラ体を含む細胞構造
体を単離する。
【００８５】５．１．FRMSの形成 本発明は、１以上のウイルスエンベロープ分子（群）と１以上の宿主細胞分子
（群）の会合の結果として形成されるエピトープを含むFRMSに関する。本発明の
FRMSは少なくとも１個のウイルスエンベロープタンパク質と少なくとも１個の宿
主細胞タンパク質の会合の結果として形成される構造体を包含する。例えば、本
発明のFRMSは、融合適格性複合体（ウイルスエンベロープと細胞性膜との融合現
象中に形成される複合体など）、融合欠損性複合体（融合欠損性ウイルスエンベ
ロープと細胞性膜との間の融合前現象中に形成されるものなど）ならびに１以上
のウイルスエンベロープ分子とウイルスのための１以上の細胞レセプターおよび
／またはコレセプターとの会合によって形成される複合体を包含する。HIVの場
合、HIVエンベロープタンパク質とCD4およびケモカインレセプターとの会合の結
果としてFRMSが生成する。
【００８６】 本発明のFRMSはこのようにウイルスに対する中和抗体を引き出すことができる
エピトープを含む。
【００８７】 本発明のFRMSは本明細書に記載するような各種の方法によって形成される。好
ましい１実施形態において、会合の結果FRMSを生成する１以上の成分を発現する
細胞を培養して、FRMSを形成させる。すべての成分を１細胞上で発現させてもよ
く、または第１成分を１細胞上で発現させ、第２成分を別の細胞上で発現させ、
そして（もしあれば）第３成分を前記の細胞の１つ若しくは別の細胞上で発現さ
せてもよい。あるいは、表面に成分（群）を含有するウイルス粒子または偽ウイ
ルスまたは組換えウイルスまたはウイルス様粒子で細胞の１つを置換してもよい
。成分（ウイルスエンベロープタンパク質、宿主細胞レセプター、および／また
は任意の必要な宿主細胞コレセプター）をそれぞれ細胞によって内在的にまたは
組換え的に発現させることができる。こうして、FRMSは内在性分子、外来性分子
（例えば組換え的に発現されたもの）またはこれらの任意の組合せの相互作用に
よって形成される。
【００８８】 本発明のさらに別の実施形態において、本発明のFRMSの形成に際し、包膜ウイ
ルスの可溶性形態のウイルスエンベロープタンパク質を使用する。例えば、１実
施形態において、可溶性エンベロープタンパク質をそのウイルスのためのレセプ
ター（群）を発現する宿主細胞にin vitroで添加することができる。こうして、
可溶性ウイルスエンベロープタンパク質と宿主細胞レセプター（群）の会合の結
果としてFRMSが形成される。
【００８９】 本発明の別の実施形態において、FRMSの形成に際し、１以上の可溶性細胞レセ
プター（群）を使用する。例えば１実施形態において、FRMSの形成に際して、ウ
イルスエンベロープタンパク質（群）との会合の結果としてFRMSが形成されるよ
うな可溶性細胞レセプター（群）を、ウイルスエンベロープタンパク質（群）と
該可溶性細胞レセプター（群）とを接触させることによって、使用することがで
きる。別の特定の実施形態において、会合の結果としてFRMSが形成される成分の
すべてが可溶性形態で、FRMSはin vitroで再構成可能である。この実施形態にお
いて、FRMSの再構成は任意手段としてFRMSへのmAbの添加によって促進してもよ
い。
【００９０】 本発明のさらに別の実施形態において、FRMSを強制的にpH低下させる。例えば
、実施形態によっては、このようにpH調整した細胞融合体で、細胞性膜タンパク
質が内部細胞性膜に所在している包膜ウイルスのためのFRMSの形成が可能になる
。
【００９１】５．１．１．複合体の成分の内在性発現 特定のウイルスのためのFRMSの形成に関与する細胞成分として、その特定のウ
イルスのための細胞レセプターおよび／またはコレセプターが含まれる。特定の
実施形態において、これらの成分の少なくともいくつかが細胞によって内在的に
発現される。したがって、FRMSの細胞性成分を発現する当分野で知られている任
意の細胞をFRMSの形成において使用することができる。
【００９２】 ウイルスタンパク質の天然の細胞レセプターおよび／またはコレセプターを発
現する細胞を使用することができる。例えば、本明細書に記載したように、HIV
の細胞レセプターとして、当分野でヒトCD4が知られている。本発明の１実施形
態において、CD4を内在性発現する細胞をFRMSの形成において使用する。
【００９３】 本発明の複合体の１成分を内在性発現する細胞はFRMSを形成するために使用す
る１以上の細胞成分を含んでいてもよい。例えば、FRMSの必要な細胞成分のすべ
てを発現する細胞を使用してもよく、または必要な細胞成分の全部は発現しない
細胞を使用してもよい。例えば、HIV FRMSの場合、CD4およびHIVコレセプターの
１種、CCR5など、の両方を発現する任意の細胞をHIV FRMSの形成において使用す
ることができる。あるいは、CD4は内在性発現するが、この実施形態のHIVコレセ
プターの１種は内在性発現しない任意の細胞を使用し、そして以下に記載するよ
うに内在性発現されない複合体の成分をこの細胞中に導入し、また組換え的に発
現させることができる。この実施形態の場合、細胞が内在性および外来性細胞成
分の両方を発現するように、複合体の追加の細胞成分を細胞に導入する。本発明
の特定の１実施形態において、コレセプター CXCR4は主としてT細胞系上に所在
する。本発明の別の特定の実施形態において、コレセプターCCR5は主としてマク
ロファージ細胞上に所在する。本発明の特定の１実施形態において、コレセプタ
ー CXCR4は主としてT細胞系上に所在する。本発明の別の特定の実施形態におい
て、コレセプターCCR5は主としてマクロファージ細胞上に所在する。以下の第5.
1.2.節に記載するものを含む当分野で既知の任意の方法によって、外来性成分を
細胞中に導入することができる。
【００９４】 本発明のさらに別の実施形態において、融合関連複合体の形成に際し、ウイル
ス遺伝子またはゲノムの組み込みによって形質転換してFRMSのウイルス成分を発
現するようにした細胞を使用することができる。この手法において、この細胞は
、FRMSの構築において重要なウイルス成分を内在性発現すると言うことができる
。こうしたウイルスによって形質転換した細胞もまたFRMSの１以上の細胞成分を
内在性発現することができる。あるいは、FRMSのウイルス成分の内在性発現の源
としてウイルス粒子を使用してもよい。
【００９５】5.1.2. FRMSの形成において重要な構成成分の組換えによる発現 FRMSまたはその断片、類似体、もしくは誘導体の構築に重要ないかなる構成成
分もその外因性構成成分が細胞中で発現されるように細胞中に導入することがで
きる。
【００９６】 本発明は、真核細胞および原核細胞の発現ベクターの双方の発現系を包含して
おり、それらの発現系を本発明のFRMSまたはその断片、類似体、もしくは誘導体
の構築に重要な構成成分の発現のために用いることができる。
【００９７】 本発明の別の実施形態においては、ウイルスエンベロープタンパク質は宿主細
胞中で発現される。この実施形態においては、外因性ウイルスエンベロープタン
パク質は、本明細書に記載のトランスフェクションもしくはウイルスベクターに
よって、またはそのウイルスエンベロープタンパク質を含んでいる生きたウイル
スもしくは弱毒化ウイルスで感染させることによって、細胞内に導入することが
できる。好ましい実施形態においては、ウイルス感染によってウイルスエンベロ
ープタンパク質を産生させることができるようになり、細胞膜上でのウイルスエ
ンベロープタンパク質の発現は、ウイルスエンベロープタンパク質をその細胞表
面、またはその他の細胞膜上での発現を増大させるように改変(例えば、組換え
法によって)することによって増強される。例えば、ターゲティングシグナルは
細胞性タンパク質の特定の細胞下コンパートメントもしくは場所への送達を増強
することが当業界では知られている。例えば、小胞体シグナルであるKDEL(1文字
アミノ酸コード)をウイルスエンベロープタンパク質中に操作して含ませて、そ
のウイルスに細胞が感染する際に、そのタンパク質が小胞体を標的とすることを
促進させうる。
【００９８】 本発明はまた、FRMSの形成に重要なウイルス性および細胞性の構成成分を発現
する細胞を提供する。1実施形態においては、細胞は、ウイルスのための細胞性
レセプターおよび/またはコレセプターを発現し、組換え的にウイルスエンベロ
ープタンパク質を発現するように構築される。そのような細胞は、ウイルスのた
めの宿主細胞レセプターおよび/もしくはコレセプターを内因性に発現させるか
、またはそれらのタンパク質の一方もしくは双方を組換え的に発現させることが
できる。ウイルス性および細胞性タンパク質が組換え的に発現される実施形態に
おいては、そのようなタンパク質をコードする核酸は、異なるベクターから、も
しくは単一のベクター(例えば1つのベクターが機能を有する形で単一のプロモー
ターと連結された複数の遺伝子を含むもの)から発現させることができる。この
実施形態では、FRMSの形成に必要な構成成分の全てが個々の細胞上で発現される
。特別な1実施形態においては、1つの細胞がCD4、コレセプターCCR5もしくはCXC
R4、およびHIV gp160を発現するように組換え的に構築される。あるいはまた、g
p160の代わりにgp120およびgp41を用いることができる。好ましい1実施形態にお
いては、個々の細胞がgp160、CD4、およびHIV-1のコレセプターを発現するよう
に構築された場合には、ウイルスエンベロープタンパク質もまた、gp160のgp120
とgp41への開裂に関与する、天然のプロテアーゼ部位を欠いて構築される。この
実施形態においては、ウイルスエンベロープタンパク質中へ別のプロテアーゼ部
位、そのプロテアーゼはその宿主細胞に天然に存在するものではないが(細菌性
プロテアーゼなど)、その部位がウイルスエンベロープタンパク質中に構築され
る。FRMSの形成はこれら3種のタンパク質を発現している細胞上で非天然のプロ
テアーゼとその細胞を接触させること(開裂を誘導するために有効な量を細胞の
培地に添加することなど)によって引き金が引かれる。種々のプロテアーゼおよ
びプロテアーゼ部位が当業界で知られており、本発明で用いることができる。
【００９９】 本発明のウイルスエンベロープタンパク質もしくは細胞性レセプタータンパク
質またはそれらの機能的に活性な類似体もしくは断片もしくはその他の誘導体を
コードする核酸配列は、適切な発現ベクター、例えば、挿入されたタンパク質を
コードする配列の転写及び翻訳、および/または本発明の方法の実行のために必
要なエレメントを含んでいるベクター中に挿入することができる。
【０１００】 本発明は、FRMSまたはその類似体、誘導体、もしくはその断片の構成成分のコ
ード配列、それは機能を有する形でそれらのコード配列の発現を指令する調節エ
レメントを伴っているが、それらを含んでいるDNA発現ベクターおよび/もしくは
ウイルスベクター、ならびに宿主細胞中でのコード配列の発現を指令する調節エ
レメントを機能を有する形で伴う前述のコード配列のいずれかを含んでいる、遺
伝子操作された宿主細胞の使用を包含する。
【０１０１】 本発明のFRMSの形成に重要な構成成分をコードする核酸を含んでいるDNA発現
ベクターおよびウイルスベクターは当業界ではよく知られた技術を用いて組換え
DNA技法で作製することができる。FRMSまたはその類似体、誘導体、もしくは断
片の形成に重要な構成成分をコードする配列を含んでいる核酸を発現させること
による本発明の発現ベクターおよびウイルスベクターの調製方法は、本明細書に
述べられている。遺伝子産物をコードする配列および適切な転写及び翻訳制御シ
グナルを含んでいる発現ベクターの構築には、当業者にはよく知られた方法を用
いることができる。そのような方法としては、例えば、in vitro組換えDNA技法
、合成法、および遺伝的組換えが挙げられる。例えば、Sambrookら, 1989, Mole
cular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, N.Y
. およびAusubelら, 1989-1999, Current Protocols in Molecular Biology, Gr
een Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., に述べられている
技法を参照すればよいが、これらの文献の双方の全体を本明細書中に参照により
組み入れることとする。あるいはまた、遺伝子産物は例えばオリゴヌクレオチド
シンセサイザーを用いて化学的に合成することができる。例えば、"Oligonucleo
tide Synthesis", 1984, Gait, M. J.編, IRL Press, Oxfordに述べられている
技法を参照すればよいが、これはその全体を本明細書中に参照により組み入れる
こととする。遺伝子の発現は当業界では既知の種々の方法によって調節すること
ができるが、そのような方法としては、限定はされないが、Mizuno, T.ら, 1984
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(7):1966-70に示されているものを挙げること
ができる。
【０１０２】 FRMSの形成をもたらす1つ以上の構成成分をコードする核酸またはDNAは細胞中
に導入されるが、その導入はリポゾーム、電気穿孔法、トランスフェクション、
ウイルスベクター、バクテリオファージ、その他などの種々の方法で行うことが
できる。
【０１０３】 1実施形態においては、FRMSの形成に重要な1つ以上の構成成分をコードする核
酸は、その構成成分をコードする核酸を含んでいるプラスミドDNAをリポゾーム
中にパッケージングするか、またはその構成成分をコードする核酸を含んでいる
プラスミドDNAを脂質もしくはリポゾームと複合体化してDNA-脂質もしくはDNA-
リポゾーム複合体を形成させることによって作られる。リポゾームはin vitroで
の細胞のトランスフェクションに一般的に用いられる陽イオン性および中性脂質
から作られる。陽イオン性脂質はプラスミドDNAと複合体を作りリポゾームを形
成する。
【０１０４】 陽イオン性および中性リポゾームは本発明に包含されている。陽イオン性リポ
ゾームは負に荷電した生物活性分子(例えばDNA)とこれらの構成成分を混合しそ
れらの電荷を会合させることによって複合体化することができる。陽イオン性リ
ポゾームは核酸と共に用いると核酸が負の荷電を有するので特に有用である。陽
イオン性リポゾームの例としてはリポフェクチン、リポフェクタミン、リポフェ
クタス、およびDOTAPが挙げられる(Hawley-Nelsonら, 1992, Focus 15(3):73-83
; Felgnerら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84;7413; Stewartら, 1992,
Human Gene Therapy 3;267-275)。市販の陽イオン性脂質も用いることができ、
例えばジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド(DDAB); 生物崩壊性脂質
1,2-ビス(オレオイロキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP); これら
のリポゾームは中性脂質、例えばL-α-ジオレオイルホスファチジルエタノール
アミン(DOPE)またはコレステロール(Chol)、これら2種は全身への送達に一般的
に用いられている中性脂質であるが、これらの中性脂質と混合することができる
。DNA:リポゾームの比率は当業者に用いられている方法を用いて最適化すること
ができ(例えば、Nicolauら, 1987, Methods Enzymol. 149;157を参照せよ）、当
業者であれば本発明の複合体を作成するために容易に用いることができる。
【０１０５】 別の1実施形態においては、本発明のFRMS形成をもたらす1種以上の構成成分を
コードする遺伝子または核酸をコードしているプラスミドDNAはポリカチオン、
それは複数の正の電荷を持ちin vitro、in vivo、およびex vivoでの遺伝子移送
を行うために用いられるものであるが、それを介して送達することができる。ポ
リエチレンイミンなどのポリカチオンは遺伝子移送をうまく行うために用いるこ
とができる(例えば、Bolettaら, 1996, J. Am. Soc. Nephrol. 7:1728を参照せ
よ)。
【０１０６】 組換えウイルスは会合してFRMSを作る構成成分を送達するために用いることが
できる。これらのウイルスに感染した細胞またはウイルスゲノムによって形質転
換された細胞は、所望の構成成分を発現する。本発明の別の1実施形態において
は、本明細書に述べられている1つ以上の構成成分を発現する生きている組換え
ベクターまたは不活化組換えウイルスベクターのどちらかを操作することができ
る。この点に関しては、種々のウイルスをFRMSの形成に重要な構成成分を発現す
るように遺伝子操作することができる。ある場合には、組換えウイルスは低温適
応性、温度感受性、または弱毒なもののいずれかであることが望ましいであろう
。
【０１０７】 本発明では、広範囲のウイルスおよびウイルスベクターを、本発明のFRMSの形
成に重要な1つ以上の構成成分をコードするヌクレオチド配列を送達するために
用いることができるが、その2、3の例について下記に述べる。
【０１０８】 レトロウイルスベクターは宿主細胞に遺伝子を送達するために一般的に用いら
れている。レトロウイルスベクターは細胞中に入り込んだ際に検出可能な害作用
を起こさない、非常に効率的な遺伝子送達ヴィークルである。レトロウイルスの
核酸は宿主の染色体のDNAに組み込まれて長期に持続し後代へ安定に伝播される
が、このようなベクターはFRMSの形成をもたらす1つ以上の構成成分の送達に有
用である。適切なレトロウイルスベクターの例としては、非分裂性細胞に感染し
て形質導入することができるという利点のあるレンチウイルスがある。そのよう
な実施形態においては、パッケージ可能なRNAベクターゲノムをコードし機能を
有する形でプロモーターに連結されその他の機能的なレトロウイルス遺伝子は欠
失しているレンチウイルスベクターが、本発明のFRMSの形成に重要な構成成分を
コードするDNAの移送に用いられる。そのようなベクターの例はWO98/17815、WO9
8/17816およびWO98/17817に記載されており、これらの各々を本明細書中に参照
により組み込むこととする。
【０１０９】 また別の1実施形態においては、非分裂細胞に感染して形質導入する非組み込
みウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターをFRMS形成に重要な構成成
分を送達するために用いることができる。アデノウイルスベクターは、宿主細胞
のゲノムを恒久的に変えてしまうことまたは挿入によって突然変異誘発を促進す
ることに伴う危険性を避けることができるので、いくつかの利点がある。アデノ
ウイルスは非組み込みウイルスベクターとして開発されたものの最上のものの1
つで、75kbまでの発現カセットを移送するために用いることができる。組換えア
デノウイルスは非常に高タイターで産生させることができ、高度に感染性で、遺
伝子を広範囲の非複製および複製細胞へ効率的に移送することができ、さらにin
vivoの哺乳動物遺伝子の移送には理想的である。
【０１１０】 アデノウイルスをベースとしたベクターは比較的安全で、所望の構成成分をコ
ードするように操作すると同時に正常な溶解性ウイルスライフサイクルにおいて
複製能が不活化されるように操作することができる。アデノウイルスは天然の状
態では気道上皮に臓器向性を持っている。従って、アデノウイルスをベースとし
たベクターは上皮に送達させるような適用には特に好ましい。特定の1実施形態
においては、アデノウイルスをベースとした遺伝子治療用ベクターはアデノウイ
ルス2型の血清型ゲノムを含み、そのゲノム中ではElaおよびElb領域、それらは
ウイルス複製の初期のステージに関与しているが、それらの領域が削除され対象
の配列と置換されている。さらなる1実施形態においては、アデノウイルスをベ
ースとした遺伝子治療用ベクターは、必須のオープンリーディングフレーム(ア
デノウイルス初期領域4(E4)のORF3もしくはORF6)のみを含みその他のE4オープン
リーディングフレームの全てを削除されているか、またはさらにE3領域に削除部
分がある(例えば米国特許第5,670,488号、その全体を本明細書中に参照により組
み込むこととする)。また別の1実施形態においては、用いられるアデノウイルス
をベースとした遺伝子治療用ベクターは偽アデノウイルス(PAV)であってもよく
、これは無害なウイルス遺伝子を含み、理論的にはほぼ36kbの外来性のものの容
量がある。
【０１１１】 また別の1実施形態においては、アデノ関連ウイルス(AAV)系を本発明のFRMS形
成に重要な構成成分の送達に用いることができる。AAVは広範囲な宿主を持ち、A
AVベクターは現在はヘルパーウイルスを必要としないようにデザインされている
。そのようなAAVベクターの例はWO97/17458に述べられている。
【０１１２】 ワクシニアウイルスベクターはそのゲノム中にDNAの大きな断片を容易にクロ
ーン化することができるので本発明で用いることができ、組換え弱毒化ワクシニ
ア変異体については報告されている(Meyerら, 1991, J. Gen. Virol. 72:1031-1
038)。本発明の1実施形態においては、FRMS形成に重要な構成成分を、その構成
成分が組換えワクシニア感染細胞中で発現されるように送達させるために用いら
れる。特別な1実施形態においては、該構成成分はヒトCD4、コレセプター(例え
ばCCR5またはCXCR4)、およびHIVエンベロープタンパク質である。この特別な実
施形態においては、細胞への組換えワクシニアの感染によって該構成成分の発現
およびHIV FRMSの形成がもたらされる。
【０１１３】 別の特別な1実施形態においては、2種類の異なる組換えワクシニアウイルスが
、その第1のウイルスがHIV envタンパク質をコードし、第2のウイルスがヒトCD4
およびケモカインレセプターをコードするように構築される。この実施形態にお
いては、第1のウイルスは第1の細胞集団に感染させ、その感染によってHIV env
タンパク質の発現がもたらされるようにするために用いられる。第2のウイルス
は第2の細胞集団に感染させ、その感染によってCD4およびケモカインレセプター
の発現がもたらされるようにするために用いられる。第1感染細胞集団を第2感染
細胞集団と同時培養することによってHIV FRMSの形成がもたらされる。さらなる
1実施形態においては、同時培養させた細胞を架橋させることができる。
【０１１４】 インフルエンザウイルスを含むオルトミクソウイルス；RSウイルスおよびセン
ダイウイルスを含むパラミクソウイルス；およびラブドウイルスを操作して変異
を発現させ弱毒化表現型をもたらすようにすることができる(米国特許第5,578,4
73号、1996年11月26日公布を参照せよ。これは本明細書中にその全体を参照によ
り組み込むこととしている)。これらのウイルスゲノムはまた、本発明のFRMS形
成に重要な構成成分などの外来性核酸配列を発現させるために操作することもで
きる(米国特許第5,166,057号、1992年11月24日公布を参照せよ。これは本明細書
中にその全体を参照により組み込むこととしている)。
【０１１５】 逆方向の遺伝学的技法を、ネガティブおよびポジティブRNA鎖ウイルスゲノム
を操作して変異を導入しその結果弱毒化表現型をもたらすために適用することが
でき、それはインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルスおよ
びポリオウイルスで行われている(Paleseら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 93:11354-11358)。これらの技法は、外来性DNA、すなわちFRMSの形成に重要な
構成成分またはタンパク質をコードするものを導入して、本発明で用いられる組
換えウイルスベクターを創出するためにも用いることができる。さらに、弱毒化
されたアデノウイルスおよびレトロウイルスはFRMS形成に重要な構成成分を発現
するように操作することができる。従って、本発明のFRMS形成に重要な構成成分
の送達のために広範囲のウイルスを操作することができる。
【０１１６】 細菌に特異的に感染させるためにバクテリオファージを用いることができる(S
oothill, J.S., 1992, J. Med. Microbiol. 37:358-261)。
【０１１７】 本発明のウイルスベクター中では非ウイルス性DNA(例えば細胞性レセプターを
コードするもの)または非天然ウイルス性DNA(例えばウイルスエンベロープタン
パク質をコードするもの)を、FRMS形成に重要な構成成分のいかなるものでもコ
ードするものとすることができる。
【０１１８】 当業者であれば、本発明のFRMSを構築するために用いられるウイルスエンベロ
ープタンパク質、細胞性レセプター、および/またはコレセプターを、組換えDNA
法によってもしくは裸のDNAとして産生された、ウイルス粒子、ウイルスに感染
した細胞、または化学的/遺伝子的に不活化されたウイルス粒子、ウイルスベク
ター、ウイルスレプリコン(すなわち、非複製性ウイルス構築物、例えばVEEレプ
リコン)、ウイルス様粒子によって細胞に提供することができることは理解でき
るであろう。
【０１１９】 上述のとおり、組換え発現系は調節エレメントを用いることができ、そのよう
なエレメントとしては、限定はされないが、誘導可能なおよび誘導可能でないプ
ロモーター、エンハンサー、オペレーターが挙げられる。これまでに報告されて
いるDNAもしくは核酸断片をベクター中に挿入するいかなる方法でも、適切な転
写/翻訳調節シグナルおよびタンパク質コード配列からなる遺伝子もしくはキメ
ラ遺伝子を含有する発現ベクターの構築のために用いることができる。これらの
方法としては、in vitro組換えDNA法および合成技法がある。一般的には、タン
パク質もしくはペプチド断片をコードする核酸配列の発現は、組換えDNA分子で
形質転換された宿主細胞中でそのタンパク質もしくはペプチドが発現されるよう
に、第2の核酸配列によって調節されるようにすることができる。例えば、ウイ
ルスエンベロープタンパク質の発現は、当業界で既知のいかなるプロモーター/
エンハンサーでも制御することができる。プロモーター/エンハンサーは同種の
もの(すなわち天然の状態)または異種のもの(すなわち非天然の状態)のいずれと
することもできる。タンパク質の発現を制御するために用いられるプロモーター
としては、限定はされないが、SV40初期プロモーター領域(Benoistら, 1981, Na
ture 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'LTR中に含まれるプロモーター(Yam
amotoら, 1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wa
gnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネ
イン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982, Nature 296:39-42)、ノパリン合成酵
素プロモーター領域を含む植物発現ベクター(Herrera-Estrellaら, Nature 303:
209-213)、カリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Gardnerら, 198
1, Nucl. Acids Res. 9:2871)、および光合成酵素リブロースビホスフェートカ
ルボキシラーゼ(Herrera-Estrellaら, 1984, Nature 310:115-120)、Gal4応答性
プロモーターなどの酵母もしくはその他の真菌由来のプロモーターエレメント、
ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナ
ーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに下記の動
物転写調節領域、それらは組織特異性を示しトランスジェニック動物中で用いら
れてきたものであるが：膵臓の腺房細胞中で活性であるエラスターゼI遺伝子調
節領域(Swiftら, 1984, Cell, 38:639-646; Ornitzら, 1986, Cold Spring Harb
or Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515)
、膵臓のβ細胞内で活性であるインシュリン遺伝子の調節領域(Hanahan, 1985,
Nature 315:115-122)、リンパ系細胞中で活性の免疫グロブリン遺伝子の調節領
域(Grosschedlら, 1984, Cell 38:647-658; Adamesら, 1985, Nature 318:533-5
38; Alexanderら, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)、精巣、乳房、リンパ
系細胞および肥満細胞中で活性のあるマウス乳癌ウイルス調節領域(Lederら, 19
86, Cell 45:485-495)、肝臓内で活性であるアルブミン遺伝子調節領域(Pinkert
ら, 1987, Genes and Devel. 1:268-276)、肝臓内で活性であるアルファフェト
プロテイン遺伝子調節領域(Krumlaufら, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648;
Hammerら, 1987, Science 235:53-58)、肝臓内で活性であるα-1-アンチトリプ
シン遺伝子調節領域(Kelseyら, 1987, Genes and Devel. 1:161-171)、赤芽球細
胞内で活性であるβ-グロビン遺伝子調節領域(Mogramら, 1985, Nature 315:338
-340; Kolliasら, 1986, Cell 46:89-94)、脳のオリゴデンドロサイト中で活性
であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域(Readheadら, 1987, Cell 48:7
03-712)、骨格筋中で活性であるミオシン軽鎖-2遺伝子調節領域(Sani, 1985, Na
ture 314:283-286)、および視床下部で活性であるゴナドトロピン放出ホルモン
遺伝子調節領域(Masonら, 1986, Science 234:1372-1378)が挙げられる。
【０１２０】 特別な1実施形態においては、ウイルス性もしくは細胞性タンパク質またはキ
メラタンパク質をコードする核酸に機能を有する形で連結されたプロモーター、
および1つ以上の複製起点、ならびに、任意で1つ以上の選択可能なマーカー(例
えば、抗生物質耐性遺伝子)を含むベクターを用いることができる。別の1実施形
態においては、単一のプラスミド内の2つ以上の遺伝子の発現を指令するために2
つ以上のプロモーターを用いることができる。
【０１２１】 特別な1実施形態においては、CMV即時型(IE)プロモーターをウイルス性もしく
は細胞性タンパク質またはキメラタンパク質をコードする核酸の発現を指令する
ために用いることができる。
【０１２２】 プロモーターは誘導可能なもの、または構成的なものとすることができる。特
定のプロモーターからの発現は特定のインデューサーの存在によって増大させる
ことができる；例えば、遺伝子操作されたタンパク質キメラの発現を制御するこ
とができる。誘導可能なプロモーターを、本発明のタンパク質がインデューサー
の存在下でのみ産生されるように、そのタンパク質の発現の制御のために用いる
ことができる。
【０１２３】 本発明はまた、本発明のFRMS形成をもたらす構成成分を安定的に発現させる方
法をも提供する。組換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生のための安定な
発現が可能である。例えば、ウイルスの細胞性レセプターおよびコレセプターを
1つ以上安定に発現する細胞系を作ることができる。ウイルス性の複製起点を含
んでいる発現ベクターを用いるよりはむしろ、宿主細胞を適切な発現制御エレメ
ント(例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポ
リアデニル酸部位、その他)、および選択可能なマーカーで制御されるDNAで形質
転換することができる。例えば、外来性DNAを導入した後、操作された細胞を集
積培地中で1から2日間増殖させ、次いで選択培地に転換する。組換えプラスミド
中の選択可能なマーカーは選択巣（selection foci）に抵抗性を与え(例えば、
プラスミドを染色体中に安定に組み込むことにより)、細胞が増殖できるように
し、それがまたクローン化されて細胞系へと拡張することができる。この方法は
細胞系を操作するために都合よく用いることができる。この方法は選択された遺
伝子産物を発現する細胞系を操作するために都合よく用いることができる。その
ような細胞系は選択された遺伝子産物の内在性の活性に影響を及ぼす化合物のス
クリーニングおよび評価には特に有用であろう。
【０１２４】 安定な発現を行う細胞系において多数の選択システムを用いることができ、そ
のようなものとしては、限定はされないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナ
ーゼ(Wiglerら, 1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ(Szybalskaら, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026
)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら, 1980, Cell 22:
817)遺伝子を,それぞれtk−、hgpt−、またはaprt−の細胞中で用いることがで
きる。また、代謝拮抗物質耐性も下記の遺伝子の選択の基礎として用いることが
できる：DHFR、これはメトトレキセートに対する耐性を付与する(Wiglerら, 198
0, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 78:1527); gpt、これはミコフェノール酸への耐性を付与する(Mullig
anら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo、これはアミノグリコ
シドG-418に対する耐性を付与する(Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol.
150:1); およびhygro、これはハイグロマイシンに対する耐性を付与する(Santer
reら, 1984, Gene 30:147)。
【０１２５】 5.1.3. 会合してFRMSをもたらす構成成分を発現する細胞 本発明は、その会合によってFRMSの形成をもたらすような構成成分の発現を包
含する。本発明のいくつかの実施形態においては、発現は1次細胞、動物細胞、
および昆虫細胞系で行うことができる。本発明では、種々の1次もしくは2次細胞
、または細胞株を用いることができ、それらとしては、限定はされないが、皮膚
、骨髄、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、副腎、および神経組織から単離されたものを
、その他にもあるが挙げることができる。本発明で用いることができるその他の
細胞型としては免疫細胞(T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、その他など)、
マクロファージ/単球、脂肪細胞、周皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、網状細胞
、その他がある。さらなる1実施形態においては、2次細胞系を用いることができ
、そのようなものとしては、限定はされないが、CWSV、NR、Chang肝細胞などの
肝細胞系、またはCHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、293、373、CaSkiおよびW1
38細胞系などのその他の細胞系が挙げられる。好ましい1実施形態においては、
宿主細胞は結合またはウイルス感染を容易にする1つ以上の細胞性レセプターを
含んでいる。
【０１２６】 本発明の好ましい1実施形態においては、細胞は真核細胞で、好ましくは細胞
系であり、好ましくは哺乳動物のもので、最も好ましくはヒトの細胞系を本発明
の方法に用いることができる。細胞はヒト(例えばHeLa細胞)、霊長類、マウス、
ウサギ、ニワトリ、その他から由来したものとすることができ、トランスジェニ
ックのヒト以外の動物からのものであってもよい。多数の真核細胞をATCC(Ameri
can Type Culture Collection, Rockville, 米国メリーランド州)から購入する
ことができる。最も好ましい1実施形態においては、真核細胞系はヒトから由来
するものである。他の実施形態においては、細胞はマウス、サル、またはラット
由来のものとすることができる。好ましくは、非腫瘍細胞系および自己許容細胞
が本発明のFRMSの調製に用いられる。
【０１２７】 本発明では、本発明のFRMS形成をもたらす1つ以上の構成成分を含む細胞を提
供する。本発明はまた、本発明のFRMS形成のために必要な全ての構成成分を含む
細胞をも提供する。1実施形態においては、本発明は、宿主細胞膜とウイルスエ
ンベロープとの融合の際に機能するエンベロープを有するウイルスのエンベロー
プタンパク質、または融合を行えない該エンベロープタンパク質の変異型を組換
え的に発現する細胞を提供する。さらなる1実施形態においては、該細胞は該エ
ンベロープタンパク質のためのレセプターとして機能する1つ以上の細胞膜タン
パク質を発現する。特別な1実施形態においては、本発明は、組換え的にHIV gp1
60、ヒトCD4、およびHIVに対するコレセプターを発現する。
【０１２８】 本発明はまた、宿主細胞膜とウイルスエンベロープとの融合の際に機能するエ
ンベロープを有するウイルスのエンベロープタンパク質、または融合を行えない
該エンベロープタンパク質の変異型を組換え的に発現する細胞系を提供する。さ
らなる1実施形態においては、該細胞系は該エンベロープタンパク質のためのレ
セプターとして機能する1つ以上の細胞膜タンパク質を発現する。特別な1実施形
態においては、本発明は、HIV gp160を組換え的に発現する細胞系を提供し、そ
の細胞系はCD4、およびHIVに対するコレセプターを発現する；該細胞系はgp160
を開裂させてgp120とgp41を産生させる機能を有するプロテアーゼを欠いている
。
【０１２９】 本発明の他の実施形態においては、本発明のFRMSを含んでいる細胞は、免疫原
として被験者に投与される(本明細書の第5.5節を参照せよ)。好ましい実施形態
においては、被験者がヒトである場合には、細胞はヒト1次細胞である。さらな
る好ましい実施形態においては、細胞は自己由来のものである。
【０１３０】 5.1.4. 複合体形成における融合欠損性変異体の使用 1実施形態においては、野生型の融合活性を有しているいかなるウイルスエン
ベロープタンパク質でもFRMSを作成するために用いることができる。あるいはま
た別の1実施形態においては、本節で述べているように、融合欠損性のエンベロ
ープタンパク質が用いられる。
【０１３１】 本発明はウイルスエンベロープタンパク質または宿主細胞性レセプターまたは
コレセプタータンパク質に対する変異の使用を提供するが、その変異はウイルス
エンベロープと細胞膜との融合過程の完了を阻害するような変異である。本発明
はウイルスエンベロープと細胞膜との融合過程の完了ができないような融合欠損
性変異を提供するが、その変異は本発明の融合関連分子構造体の形成はもたらす
ものである。融合欠損性の変異はFRMSを含むエピトープを構築するために用いら
れる。本発明の1実施形態においては、融合欠損性エンベロープタンパク質と細
胞性レセプターとの会合はFRMSの蓄積をもたらす。本発明の融合欠損性変異はFR
MS形成に用いることができる。
【０１３２】 当業界で既知の突然変異誘発のいかなる技法も、制限酵素切断部位の創出/削
除のため、またはアフィニティータグの付加のための、発現されたペプチド配列
中におけるアミノ酸置換を行う目的で、DNA配列中の個々のヌクレオチドの改変
に用いることができる。そのような技法としては、限定はされないが、化学的突
然変異誘発、in vitro部位指向性突然変異誘発(Hutchinson, C.ら, 1978, J. Bi
ol. Chem. 253:6551)、オリゴヌクレオチドが指令する突然変異誘発(Smith, 198
5, Ann. Rev. Genet. 19:423-463; Hillら, 1987, Methods Enzymol. 155:558-5
68)、PCRをベースとするオーバーラップ伸長(Hoら, 1989, Gene, 77:51-59)、PC
Rをベースとするメガプライマー突然変異誘発(Sarkarら, 1990, Biotechniques
8:404-407)、その他を挙げることができる。改変はDNA配列を調べることによっ
て確認することができる。
【０１３３】 融合欠損性変異はいかなる包膜ウイルスについても構築することができる。特
別な1実施形態においては、変異は融合を完了させる能力に影響を及ぼすように
構築される。変異の選択は、公表されている研究に基づいて行うか、または既知
のもしくは仮説的構造予測から組み立てた分子モデルに基づいて行う。エンベロ
ープタンパク質の発現および細胞表面への移動に悪影響を及ぼさないことが知ら
れている変異が好ましい。
【０１３４】 さらなる1実施形態においては、融合欠損性変異体は変異した遺伝子を細胞、
例えばCOS、293Tなどの細胞中で発現させる(例えば本発明の方法)ことによって
確認され、融合能についてアッセイされる。次いで、変異構成成分の細胞表面で
の発現について細胞をアッセイすることができる(例えば、フローサイトメトリ
ーまたは生細胞間接免疫蛍光法などの当業界で既知の方法によって)。さらに、H
IV gp160の変異体などの変異体タンパク質のタンパク質分解性プロセシングにつ
いてはウエスタンブロット分析または当業界で既知のその他の方法によってアッ
セイすることができる。変異体構成成分の融合能は本明細書の第5.7節に記載の
とおりアッセイすることができる(例えば、例としてHIVの場合にはシンシチウム
形成アッセイによって、U87-CD4コレセプターでは細胞融合アッセイによって)。
【０１３５】 本発明のさらなる1実施形態においては、結合欠損性、融合欠損性もしくは融
合阻止性変異体エンベロープタンパク質について、トランスジェニックマウスワ
クチン接種アッセイで、1次単離体のウイルス中和抗体を引き出す能力を試験す
る。この実施形態においては、免疫原は、例えばU87-CD4-CCR5細胞(HIV関連変異
体を試験する際には)とともに同時培養された供試変異体エンベロープタンパク
質を発現している細胞を含み得る。
【０１３６】 本発明の好ましい1実施形態においては、広範なPIウイルス中和を引き出す変
異は、サブユニットおよび組換えウイルスベースの免疫原として開発される。表
IはHIV用に作られた変異の例を示したものである。当業者には明らかなことであ
ろうが、同様な変異を他の包膜ウイルスについても構築することができる。
【０１３７】
【表１】（原文第３１ページ） 例えばgp120のコア構造の架橋シート(bridging sheet)などの内部に作る別の変
異としてはKwongらが報告しているもの(Kwong PDら, 1998, Nature 393:648-59;
Kwong PDら, 1999, J. Biol. Chem. 274:4115-23)および推定上のgp41/120相互
作用領域へのものがある。
【０１３８】 別の1実施形態においては、本発明のFRMSは、結合および融合関連変異を有す
るウイルスエンベロープタンパク質を用いて調製される。1実施形態においては
、ウイルスタンパク質は宿主細胞のレセプターと結合するが、変異があるとウイ
ルスエンベロープと宿主細胞膜との融合の前または途中で融合プロセスが阻止さ
れてしまうことが起こる。従って、本発明のFRMSは1つ以上のウイルスエンベロ
ープタンパク質と1つ以上の細胞膜タンパク質の会合の結果もたらされたエピト
ープを含んでおり、その細胞膜タンパク質には融合欠損性、融合阻止性、または
結合欠損性のタンパク質が、それらの変異型タンパク質が本発明の方法で用いら
れたときにPI中和抗体を引き出すエピトープをもたらすようなものである限りは
、含まれる。融合のプロセスの途中で阻止されたタンパク質複合体は単離して本
発明の方法および組成物として用いることができるが、そのようなものとしては
、限定はされないが、免疫原、診断薬、キット、ワクチンおよび組成物が挙げら
れる。
【０１３９】 例えば、特別な1実施形態においては、FRMSはHIV-1の主要ウイルスエンベロー
プタンパク質を含んでいる。本発明の複合体の構築に用いることのできる種々の
クラスの融合関連変異がある。機作に関する限定はしないが、HIV-1と宿主細胞
の融合の際は、オリゴマー性のエンベロープタンパク質複合体であるgp160、こ
れはgp120表面とgp41膜貫通部分からなるが、このgp160はまず宿主細胞上のCD4
レセプターと結合する。エンベロープタンパク質およびCD4レセプター双方のコ
ンホメーションの変化によって宿主細胞表面上のコレセプター分子との相互作用
が容易となる。さらにウイルスタンパク質-CD4-コレセプター3分子複合体のコン
ホメーションの変化が起こることによってウイルスgp41プレヘアピン中間体の露
出およびN末端gp41疎水性融合ドメインの宿主細胞膜中への挿入が可能となる。
次いで、プレヘアピン中間体内のらせん状の7回繰り返し領域は陥没して融合に
活性なgp41の3量体性のコイルドコイルコアを形成する。コイルドコイルコアは
並置された細胞とウイルス膜の最終的な融合を推進する。
【０１４０】 gp160前駆体タンパク質の開裂によってgp41の疎水性融合ドメインが解放され
ることを阻害する変異を有するウイルスエンベロープタンパク質は、対象とする
複合体の構築に用いることができる。とりわけ、gp120のC末端の高度に保存され
ているlys/arg-X-lys/arg-arg部位を変える特定の変異によって融合原性が阻害
されることが示されている(例えば、Lee CNら, 1994, AIDS Res. Hum. Retrovir
uses 10:1065-9を参照せよ)。
【０１４１】 さらに、N末端gp41融合ペプチドに影響を及ぼす変異を、本発明の複合体の創
出に用いることができる。gp41の疎水性N末端領域は細胞膜中に挿入されておそ
らくはらせん構造ををとることで脂質２重層を不安定化し、それによって融合を
メディエートする。この領域での特定のアミノ酸の変更によってエンベロープタ
ンパク質が非融合性となる。このような変更を有する合成ペプチドは脂質2重層
に結合しえないか融合を引き起こしえないかのいずれかである。gp41の融合欠損
性変異体の2種類については特徴がよく調べられている：V2EおよびG10V(Kliger
Yら, 1997, J. Biol. Chem. 272:13496-505)。前者には疎水性ペプチド中の極性
の置換が含まれており、それに対して後者はおそらく脂質2重層中にあると考え
られるらせん状構造に影響を及ぼし得る。これらの変異は168P エンベロープ遺
伝子(gp41:ala-val-gly-ile-gly-val-leu-phe-leu-gly-phe-leu-gly…)中に部位
指向性突然変異誘発または当業界で既知のいかなる方法によっても導入すること
ができ、そのエンベロープタンパク質は発現および融合原性について試験される
。
【０１４２】 さらに、gp41のコイルドコイルコア領域を変える変異を有するエンベロープタ
ンパク質は、本発明の構造物の構築に用いられ得る。高度に保存されたコイルド
コイルモチーフは多数のウイルスファミリーの融合に関与するタンパク質中に認
められ、同様な構造は小胞の融合をメディエートする細胞性タンパク質中にも同
定されている。N-またはC-らせん状領域のどちらかを模倣した合成ペプチド(例
えばDP107およびDP178)(Furutaら, 1998, Nature Structural Biology 5:276-27
9)はウイルスの感染性を強力に中和し、これはおそらく同類のらせん状領域に結
合しプレヘアピン中間体の崩壊を妨害することによるものと考えられる。結晶解
析から得られた構造の詳細な情報に加えて、gp41のN-およびC-らせん状領域は突
然変異誘発によって飽和されてもいる。正常なエンベロープタンパク質の発現と
アセンブルを保持しながら非融合原性であるようないくつかの変異が同定されて
おり、それはおそらくN-およびC-らせん状コイル間(例えばV570RおよびY586E)の
相互作用の崩壊によるものであろう(Wengら, 1998, Journal of Virology 72:96
76-9682)。
【０１４３】 コンピテントなまたは変異型ウイルスエンベロープタンパク質ならびに細胞性
レセプターおよび/またはコレセプターは、本明細書に記載したものを含む当業
界で既知の方法によってウイルスベクターまたは2倍体細胞中に取り込むことが
できる。ウイルスタンパク質をコードするウイルス遺伝子は、通常どおり細菌細
胞、真核細胞もしくは原核細胞、またはウイルスベクターもしくはDNAベクター
内での発現のためにクローン化される。同様に、ヒト細胞性レセプターをクロー
ン化し発現させて、危険な病原体による疾患の研究のためのモデルを産生させる
ことができる。ウイルス遺伝子または宿主レセプターは外来性DNA中にトランス
フェクションまたはウイルスベクターの使用によって取り込むことができる。
【０１４４】 5.1.5. FRMS形成のためのその他の方法 さらに、本発明の構造物の形成に引き金を引くため、pH条件、温度、および塩
濃度の操作を含む他の方法も意図されている。さらにまた、エンベロープタンパ
ク質と十分強力に結合するモノクローナル抗体は、本発明の構造物を形成するた
めに必要なコンホメーションの変化の引き金を引くことができる。このように、
本発明のFRMSはウイルスタンパク質と上述の種々の動物性細胞構成成分、それら
に限定はされないが、との間の相互作用の結果として形成することができる。
【０１４５】 5.2. FRMSの捕捉 ひとたびFRMSが形成されれば、1次ウイルス単離体にたいして有効なワクチン
を提供する免疫原性の形態中へFRMSを保存または「捕捉」するために種々の方法
を用いることができる。
【０１４６】 1実施形態においては、本発明のFRMSは1つ以上のエンベロープタンパク質と1
つ以上の宿主細胞性レセプターおよび/またはコレセプターとの相互作用の結果
得られるものである。1実施形態においては、複合体はFRMSの固定または架橋に
よって「捕捉される」。例えば、ウイルス性と細胞性の構成成分をそれぞれ発現
している細胞の同時培養中で形成されるFRMSでは、FRMSは細胞を架橋剤で固定す
ることによって捕捉することができるようになる。
【０１４７】 特別な1実施形態においては、ウイルスエンベロープタンパク質を発現する核
酸で形質転換された細胞、および宿主細胞性レセプターおよびコレセプターを発
現する核酸で形質転換された細胞は一緒に培養される。第1の細胞の表面上で発
現されたウイルスタンパク質は第2の細胞の表面上で発現されたレセプターと結
合する。それらの細胞をこの細胞-細胞相互作用の開始時に固定する。機作に関
して限定はしないが、架橋によって融合複合体の中間体が「捕捉され」、単離さ
れて例えばワクチンの成分として用いうる融合関連決定基が提供される。細胞内
で融合複合体のウイルス性または細胞性の構成成分を発現させるために、当業界
で既知のいかなる方法も用いることができる(例えば、本明細書の第5.1.1節を参
照せよ)。
【０１４８】 FRMSの捕捉においては、融合細胞もしくは融合欠損変異細胞は当業界で既知の
いかなる方法を用いても固定もしくは架橋することができる。架橋剤として用い
ることのできるものは、限定はされないが、ホルムアルデヒド、グルタールアル
デヒド、ホルマリン、p-アジドベンゾイルヒドラジド、N-(4-[p-アジドサリシク
ラミド]-ブチル)-3'(2'-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド、ビス[β-[4-アジ
ドサリチルアミノ]-エチル]ジスルフィド、1,4-ビスマレイミジル-2,3-ジヒドロ
キシブタン、1,6-ビスマレイミドヘキサン、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベン
ゼン、ジメチルアジピミデート-2HCl、ジメチルスベリミデート-2HCl、ジメチル
アジポジミデート-2HCl、ジメチルピメリミデート-2HCl、ジスクシニミジルグル
タレート、ジスクシニミジルタートレート、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロ
ピル（Dimethylanonopropyl）]カーボジイミド塩酸塩、(N-ヒドロキシスクシニ
ミジル)-4-アジドサリチル酸、スルホスクシニミジル 2-[7-アジド-4-メチル-ク
マリン-3-アセトアミドメチル-1,3-アミノプロピオン酸、N-スクシニミジル-4-
アイオドアセチルアミノ安息香酸、N-スクシニミジル-3-[2-ピリジルチオ]プロ
ピオン酸、およびスクシニミジル6-[3-(2-ピリジルチオ)-プロピオンアミド]ヘ
キサノエート(Pierce Chemical Co., Rockford, 米国イリノイ州)がある。
【０１４９】 本発明の好ましい実施形態においては、架橋剤はホルムアルデヒドである。特
別な1実施形態においては、抗原性を保持するために低レベル(0.2%)のホルムア
ルデヒドが用いられる。しかし他の実施形態においては、安定性を最適化するた
めにより高い濃度を用いることができる。本発明の複合体の調製には約0.01%か
ら約8%の濃度のホルムアルデヒドを用いることができる。融合細胞を架橋するた
めに用いることのできるその他の架橋剤としては、限定はされないが、グルタル
アルデヒド(0.05-0.5%)が挙げられる。本明細書に述べられている開示事項から
の利益を得られる当業者であれば、FRMSの免疫原性のための最適な条件を決定す
るために、固定または架橋条件(すなわち、用いる試薬、試薬濃度、反応時間と
温度)を変えうることが理解されるであろう。
【０１５０】 さらなる1実施形態においては、本発明の複合体は、細胞培養中のヒト2倍体細
胞に、例えば、ウイルスエンベロープタンパク質およびCD4/コレセプター(もし
これらが内在性に存在していない場合には)を発現している組換えワクシニアウ
イルスを感染させることによって調製することができる。融合の途中で細胞は架
橋して融合関連構造体および決定基を捕捉する。
【０１５１】 本発明のまた別の1実施形態においては、ウイルスに対する細胞性レセプター
および/またはコレセプターを発現している細胞に生きたまたは弱毒ウイルスを
感染させると、感染を受けつつある細胞はFRMSを捕捉するために架橋することが
できる。
【０１５２】 本発明の他の実施形態においては、単一の細胞を操作してFRMS形成に重要な構
成成分の全てを発現するようにすることができる。この実施形態においては、そ
のような1個のまたは複数の細胞はFRMSを捕捉するために架橋または固定するこ
とができる。この実施形態においては、全ての構成成分が個々の細胞上で発現さ
れるので、細胞-細胞の相互作用が固定時に起こる必要はない。
【０１５３】 本発明は、ウイルスエンベロープ中にFRMS形成に重要な細胞性構成成分または
タンパク質を発現するように操作されたウイルス粒子を提供する。この実施形態
においては、組換えウイルス粒子は、ウイルス粒子エンベロープ内に形成された
FRMSを捕捉するために架橋することができる。
【０１５４】 本発明の別の1実施形態においては、複合体は固定または架橋される必要はな
い。本発明の複合体が溶液中で細胞溶解物中に形成されることが見出された。従
って、本発明の複合体の、例えば、FRMSが溶液中で形成されているHIV-1エンベ
ロープタンパク質ならびにCD4/コレセプターをトランスフェクトさせたまたは感
染させた細胞を単に溶解させることによって、作製することができる。細胞溶解
プロトコールは当業界ではよく知られている(例えば、Sambrookら, 上述、を参
照せよ)。細胞溶解プロトコールとしては、界面活性剤による溶解(例えば1%NP40
)、凍結融解による溶解、超音波処理による溶解、または当業界で既知のいかな
る方法も含むことができる。特別な1実施形態においては、細胞培養物は細胞-細
胞相互作用の開始時点で食塩加リン酸緩衝液中の氷冷0.2%ホルムアルデヒド固定
によって固定される。本発明の別の1実施形態においては、界面活性剤による細
胞の溶解は界面活性剤Brij97の使用を含むものである。
【０１５５】 このようにして、本発明は架橋された細胞性分子構造体または細胞溶解物から
単離された分子構造体を提供する。本発明の別の実施形態においては、FRMSの蓄
積が可能となりFRMSの捕捉ができる融合欠損性変異体を提供する。
【０１５６】5.3. FRMSの単離 １つの実施形態においては、その会合がFRMSを生ずる成分を発現する細胞（例
えば架橋細胞）は本発明のワクチンにおける免疫原として使用できる。あるいは
また、FRMSを包含する分子構造体は免疫原として使用するために単離されうる。
【０１５７】 ひとたびFRMSが形成されると、該FRMSはクロマトグラフィー（例えばイオン交
換、アフィニティ、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、
示差溶解度を含む標準的方法によるか、またはタンパク質精製のための任意の他
の標準的技術により単離および精製されうる。加えて、FRMSの生成に重要な、回
収および精製を容易にするアフィニティタグを包含する成分が合成されうる。ペ
プチドタグは、修飾された成分と複合体の他の構成員との会合により生成された
エピトープ形成をそのような会合が変化させない限り、タンパク質の任意の部分
と会合されうる。種々の実施形態において、アフィニティタグを包含するかかる
キメラタンパク質は、その成分をコードする遺伝子配列を適正な読み取り枠内で
ペプチドタグをコードする配列と連結させ、そしてそのタンパク質を組換え的に
発現させることにより作ることができる。修飾された遺伝子が翻訳停止シグナル
によって中断されることなく同じ翻訳読みとり枠内に存在することを確保するよ
うに注意が払われねばならない。
【０１５８】 当分野で公知の種々のペプチドタグがタンパク質の修飾に使用でき、例えば、
それらに限定されるわけではないが、ポリヒスチジン配列（Petty, 1996, Metal
-chelate affinity chromatography, in Current Protocols in Molecular Biol
ogy, Vol.2, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscie
nce）、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST; Smith, 1993, Methods Mol.
Cell Bio. 4:220-229)、大腸菌(E.coli) マルトース結合性タンパク質(Guan et
al., 1987, Gene 67:21-30)、および種々のセルロース結合性ドメイン(米国特許
第5,496,934号、第5,202,247号、第5,137,819号; Tomme et al., 1994, Protein
Eng. 7:117-123)、S TAG（商標）System(Novagen, Inc.)など。他のありうるペ
プチドタグは、モノクローナル抗体が利用できる短いアミノ酸配列で、例えば下
記の周知の例があげられるがそれらに限定されるわけではない：FLAGエピトープ
、アミノ酸408-439 でのmyc エピトープ、インフルエンザウイルス血球凝集素(H
A)エピトープ。他のペプチドタグは特異的な結合パートナーにより認識され、こ
のため、好ましくは固定化されるかおよび／または固相表面上にある結合パート
ナーへの親和性結合による単離を容易にする。当業者により認識されようように
、ＤＮＡクローニング、ＤＮＡ増幅、および合成的方法を含むがそれらに限定さ
れない多くの方法が前記ペプチドタグのコード領域を得るのに使用できる。幾つ
かのペプチドタグおよびそれらの検出用および単離用の試薬は商業的に入手でき
る。
【０１５９】 公知であるかまたはライブラリーからもしくは商業的供給者から容易に入手で
きる所望のペプチドタグをコードするＤＮＡ配列は本発明の実施に好適である。
これらおよび他のペプチドタグは特異的な結合パートナーにより認識され、この
ため、固相表面上に固定化されうる結合パートナーへの親和性結合による単離を
容易にする。キメラタンパク質遺伝子産物は組換えＤＮＡ技術を用いて製造でき
る。例えば、FRMSの形成に重要な成分をコードする遺伝子配列を、その成分遺伝
子がペプチドタグ付きキメラタンパク質として発現されるようにペプチドタグの
配列を含有するベクター中に導入できる。特異的な結合パートナーによって認識
されうるペプチドタグは固相表面上に固定化された結合パートナーへの親和性結
合に利用されうる。
【０１６０】 １つの好ましい実施形態においては、ポリヒスチジンタグ付き融合関連タンパ
ク質は、融合関連タンパク質遺伝子または遺伝子断片を、挿入された配列をN-末
端ポリヒスチジンタグを有するキメラタンパク質として発現する発現ベクター、
例えばpET15 系列のベクター(Novagen) の一つのような発現ベクター中に挿入す
ることにより構築される。連続した６個またはそれ以上のヒスチジン残基をアミ
ノ末端またはカルボキシル末端に有するタンパク質はニッケルへの強力な結合親
和性を有する。ポリヒスチジンタグ付きキメラタンパク質はキレート化ニッケル
で被覆された固相の表面に特異的に結合するだろう。特定の好ましい実施形態に
おいては、金属キレートで被覆されたマイクロタイタープレートがポリヒスチジ
ンタグ付きキメラタンパク質(Pierce)の単離に使用される。
【０１６１】 あるいはまた、例えば、Janknecht らにより記載された系により、ヒト細胞系
で発現された非変性キメラタンパク質の容易な精製が可能となる(Janknechtら、
1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8972-8976) 。この系においては、問題
の遺伝子が、その遺伝子の読み取り枠が６ヒスチジン残基からなるアミノ末端タ
グに翻訳可能に融合されるようにワクシニア組換えプラスミド中にサブクローン
化される。組換えワクシニアウイルスに感染した細胞からの抽出物をNi２+ニト
リロ酢酸−アガロースカラムに充填し、そしてヒスチジンタグ付きタンパク質を
イミダゾール含有緩衝液を用いて選択的に溶離する。
【０１６２】 もう１つの特定の実施形態においては、発現構築物は融合関連タンパク質を３
個のpGEXベクター（グルタチオンS-トランスフェラーゼ発現ベクター；Smith et
al., 1988, Gene 7:31-40）のそれぞれのEcoRI 制限部位中にサブクローン化す
ることにより作られる。これにより、生成するキメラタンパク質内にGST 結合活
性が１つの枠内で保持されるように、すべての３個の読み取り枠内でGST 結合ド
メインに連結した融合関連タンパク質を包含するキメラタンパク質の発現が可能
となる。GST キメラペプチドはその基質グルタチオンに対して強い結合親和性を
有する。特定の実施形態においては、GST タグを包含するFRMSは細胞溶解物また
は固定された細胞を包含する結合混合物から、かかる混合物をグルタチオン連結
固相表面、例えばグルタチオンセファロースビーズと接触させることにより分離
される。例えば、GST キメラタンパク質はグルタチオンアガロースビーズまたは
グルタチオンセファロースカラムに固定されうる。この混合物は次に相互作用お
よび結合が起こるのを可能にする様式でカラムまたはビーズに添加される。反応
期間の終わりに、未結合の物質を洗い去ることができる。キメラタンパク質とグ
ルタチオンアガロースビーズとの間の相互作用により、複合体を単離できる。
【０１６３】 もう１つの実施形態では、キメラタンパク質はその発現されたキメラタンパク
質に対して特異的な抗体を利用することにより容易に精製できる。
【０１６４】 さらにもう１つの実施形態では、アフィニティタグ付きFRMSはアフィニティ化
合物を融合関連タンパク質にコンジュゲートさせることにより構築できる。それ
らに限定されるわけではないが、例えばビオチン、フォトビオチン、または当分
野で公知の他の化合物のような親和性化合物を使用できる。１つの実施形態では
、親和性化合物またはアフィニティタグは多官能性架橋剤、好ましくは２官能性
分子、によって融合関連タンパク質にコンジュゲートさせることができる。本明
細書中で使用される多官能性架橋剤なる用語は、融合関連タンパク質上の官能基
と反応する官能基を１つより多く有する分子を包含する。典型的には、かかる架
橋剤はポリペプチド上のアミノまたはスルフヒドリル基と共有結合を形成する。
例えば、ビオチンN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用できる。
【０１６５】 本発明の好ましい実施形態においては、ケモク(chemok)コレセプター(co-rece
ptor)のCD4 との会合またはエンベロープタンパク質との会合を介してFRMSを単
離する高度に特異的な方法は、RNアーゼA の15アミノ酸S-ペプチドおよびRNアー
ゼS (S- タンパク質; RNアーゼA のアミノ酸21-124) （Potts et al., 1963; Do
rai et al., 1994） で示されるより大きいサブチリシン消化断片の特異的かつ
高度のアフィニティ相互作用(Kd =10-9 M)を利用するS-ペプチドアフィニティタ
グ付き分子の使用である。このS-TAG(商標)系は細菌系およびバキュロウイルス
系で発現された組換えキメラタンパク質の検出および単離に使用するためNovage
n, Inc. により商業的に開発され、そして最近哺乳動物性キメラタンパク質にも
拡大されてきている。FRMSの融合関連タンパク質はS-ペプチドでタグ付けされる
。本発明はCD4, CCR5 またはエンベロープタンパク質分子のＣ末端でS-ペプチド
でタグ付けされた複合体の成分の例を提供する。タグ付けされた複合体は容易に
単離されそしてS-タンパク質アガロースアフィニティクロマトグラフィーにより
精製された。
【０１６６】 １つの実施形態では、タグ付けされた複合体を含有する細胞を固定するのに膜
非透過性架橋剤を使用できる。１つの特定の実施形態においては、タグ付けされ
た複合体を含有する細胞を膜非透過性架橋剤で固定することは細胞質S-ペプチド
タグの不活性化の回避を容易にする。あるいはまた、S-ペプチド配列を、それが
もはや傷つきやすいリジン残基を含有せず従って細胞質タグの不活性化を生ずる
ことなくホルムアルデヒドで固定されうるよう変化させることができる（ala-gl
u-thr-ala-ala-ala-ala-phe-glu-arg-gln-his-met-asp-ser）。融合細胞はBS３
およびDTSSP （アミンを介して反応してそれぞれ非開裂性のまたは可逆性の連結
を形成するホモ２官能性N-ヒドロキシスクシンイミジル（NHS)エステル）；スル
ホ-SMPB （アミンおよびスルフヒドリル基と不可逆的に架橋するためのヘテロ２
官能性NHSエステルおよびマレイミド）；スルホ-SANPAH およびSASD (それぞれ
非開裂性のまたは可逆性の連結を形成するヘテロ２官能性NHS エステルおよび光
反応性フェニルアジド架橋剤）(Pierce Chemical Company) を含むがそれらに限
定されない広範囲の膜非透過性架橋剤を用いて固定できる。
【０１６７】 タグ付き複合体は容易に精製されて融合関連成分の単離された調製物を生じ、
該調製物を例えばワクチン製剤への封入に使用できる。精製されたかまたは単離
されたタグ付き複合体はまた、in vitroアッセイのための診断標準物としても使
用できる。さらに、タグ付き複合体はエンベロープにより仲介された融合を機能
的に分析するのを可能にする。
【０１６８】 従って、本発明は、ヒトCD4 およびヒトCCR5と機能的に相互作用するヒト免疫
不全ウイルス１型のエンベロープタンパク質を包含するタンパク質複合体を精製
するに当たり、a)後続の精製を容易にするために前記複合体にペプチド配列をタ
グ付けし；そしてb)タグ付けされた複合体を単離する、ステップを含むことから
なる方法を提供する。
【０１６９】 他の特定の実施形態においては、本発明はヒトCD4 およびヒトCCR5と機能的に
相互作用するヒト免疫不全ウイルス１型のエンベロープタンパク質を包含する単
離されたタンパク質複合体を提供する。
【０１７０】 5.4. FRMSの種類 当業者に明白なように、任意の包膜ウイルスがFRMSを構築するかまたは使用す
るために本発明の方法に使用されうる。例えば、本発明のFRMSの重要な用途はワ
クチン免疫原としてである。FRMSを含有するワクチンの利点の１つは、これらの
免疫原が一次分離株に相当に高い中和率を提供することである。使用できる包膜
ウイルスには、それらに限定されるわけではないが、レトロウイルス科（Retrov
iridae） 、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、コロナウイルス科（Coronavi
ridae）、フィロウイルス科（Filoviridae）、アレナウイルス科（Arenaviridae
） 、ポックスウイルス科（Poxviridae） 、ブンヤウイルス科（Bunyaviridae)
、フラビウイルス科（Flaviviridae) 、トガウイルス科（Togaviridae)、オルト
ミクソウイルス科（Orthomyxoviridae) 、パラミクソウイルス科（Paramyxoviri
dae)、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae)、およびイリドウイルス科（Iridov
iridae) のファミリーが包含される。
【０１７１】 本発明の１つの実施形態においては、本発明の方法によりレトロウイルスFRMS
が形成される。例えば、好ましい形態においては、本発明のFRMSはヒト免疫不全
ウイルス１型(HIV-1) の主要ウイルス性エンベロープ免疫原を包含し、そしてHI
V-1 の宿主細胞性レセプターおよび宿主細胞性コレセプターとの相互作用から生
ずる。宿主細胞性コレセプターはCCR5, CXCR4, CCR3, CCR2bまたは当技術分野で
知られた任意の他のものであることができる。本発明の例示されたFRMSは、宿主
細胞性レセプターCD4 および宿主細胞性コレセプターCCR5との相互作用から生ず
るHIV-1 分離株168Pウイルス性エンベロープタンパク質の相互作用から生成する
。独立して作用するCD4 の組換えHIV エンベロープタンパク質を含む他の組換え
HIV エンベロープタンパク質が本発明の範囲内でFRMSの製造に使用できようこと
は当業者には明白な筈である。
【０１７２】 例をあげるがそれらに限定されないHIV ワクチンの詳細な実施形態においては
、本発明の免疫原はエンベロープタンパク質発現性COS-7 細胞(LaCasseら, 1998
, Science, 283:357-360)およびヒトCD4 レセプターおよびCCR5コレセプターを
発現する細胞（U87-CD4-CCR5) の共培養により調製される。この形態においては
、エンベロープ発現性細胞はトランスフェクション（トランスフェクション効率
30-60%）24時間後に0.5 mM EDTA を用いて回収し、同数のU87-CD4-CCR5標的細胞
と共培養する。融合への進行はエンベロープ発現性細胞を染色しそして多核シン
シチアへのそれらの取り込みを顕微鏡的に監視することにより評価される。融合
は12-24 時間内に完結する。複合体は直ちに形成される。共培養1-5時間後に固
定された細胞は最大シンシチウム形成の10-30%と推定される。融合のこの早期時
点は当初融合に至る一時的中間体を捕捉するために選択された。他の時点（例え
ば10時間、24時間またはそれ以上）もまた本発明の融合関連複合体を得るのに使
用されうる。融合過程における後期時点からの複合体によりなおさらに中和性エ
ピトープが示され、そして決定的に重要な免疫原の出現および時間的経過のマッ
プをつくるのに使用できる。
【０１７３】 他の実施形態においては、フラビウイルスFRMSが本発明の方法により生成され
る。フラビウイルスファミリー内のウイルスには、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス(H
CV) 、デングウイルス、黄熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、およびウシウイ
ルス性下痢ウイルスが包含される。ファミリーとしては、フラビウイルスはトガ
ウイルス科と同様であり、これにはアルファウイルス（例えば、ベネズエラウマ
脳炎ウイルス、シンドビス(Sindbis) ウイルス、セムリキ森林ウイルス）および
麻疹ウイルスが包含される。HIV と対照的に、フラビウイルスはレセプター媒介
エンドサイトーシスに続くエンドソーム内のpH誘導融合により標的細胞内に入る
。
【０１７４】 フラビウイルスファミリー内のウイルスはエンベロープ（E)タンパク質をコー
ドし、該タンパク質は多くのファミリー構成員においてタンパク質分解的に開裂
されて成熟E1およびE2タンパク質となる。HCV (C型肝炎ウイルス）の特定の場合
、E2タンパク質はレセプター結合性部分（細胞性膜タンパク質CD81を結合する）
であり、E1は推定のウイルス性融合タンパク質である。
【０１７５】 本発明のもうひとつの実施形態においては、フラビウイルスまたはトガウイル
スFRMSが本発明の方法により形成される。例えば、本発明のHCV FRMSがE1、E2お
よびCD81の会合から生ずる。詳細な実施形態においては、HCV E1およびE2タンパ
ク質は許容できる細胞基質中に同時発現でき、そして細胞内質細網(ER)に局在す
るが細胞表面上にはあまり存在しないであろう。ひとつの形態においては、細胞
内膜のE1E2融合を誘発するためにこれら細胞培養物をpH5-6.8 に緩衝された媒体
中でインキュベートする。培養物を架橋剤で処理して中間体融合能のある構造物
を捕捉し、そしてワクチン免疫原として直接（または細胞内ER膜を単離し）使用
する。
【０１７６】 別の詳細な実施形態においては、E1E2タンパク質を含有する破壊した細胞内ER
膜を外転したミセルとして単離し、次にE2レセプターCD81を発現する適切な許容
される細胞とインキュベートする。E1E2含有ミセルが内面化され、E1媒介融合が
エンドソームで起こる。次に細胞を架橋させ、そして例えばワクチン免疫原とし
て使用する。あるいはまた、E1E2タンパク質を操作してER保持シグナルを変化さ
せ、それによって細胞表面上へのE1E2タンパク質の発現が可能となり、かくして
ER膜を単離する必要がなくなる。
【０１７７】 別の詳細な実施形態においては、組換えＤＮＡ由来HCV ウイルス様粒子または
偽型ビリオン（例えばアルファウイルスまたはVSV)を含有するHCV E1E2を生成し
、pH5-6.8 に調整した培地中でレセプター発現性細胞とインキュベートすること
により融合を誘発することができる。培養物をホルムアルデヒドのような架橋剤
で処理しそしてFRMSをワクチン免疫原として使用する。あるいはまた、ビリオン
をCD81発現性細胞とインキュベートすることもできる。内面化されたビリオンは
エンドソーム内で融合するよう誘導され、本発明のワクチン免疫原として使用す
るために架橋処理することにより捕捉できる。
【０１７８】 本発明のさらに別の実施形態においては、オルトミクソウイルスFRMSが本発明
の方法により生成される。オルトミクソウイルス科ファミリーにはインフルエン
ザＡ、インフルエンザＢおよびインフルエンザＣが含まれるがそれらに限定され
ないすべてのインフルエンザウイルスが包含される。従って、好ましい実施形態
においては、インフルエンザFRMSは広範囲のインフルエンザ株に対する中和抗体
を誘発し、変動から無関係のインフルエンザワクチンを与える。
【０１７９】 フラビウイルスおよびトガウイルスと同様に、オルトミクソウイルスはレセプ
ター媒介エンドサイトーシスおよびエンドーム内の融合によって標的細胞に入る
。この場合、ウイルスノイラミニダーゼ(NA)タンパク質がシアル酸レセプター結
合性タンパク質として機能し（遍在的に細胞表面炭水化物が発現される）、血球
凝集素(HA)タンパク質がpH誘導融合において機能する。フラビウイルスと対照的
に、インフルエンザウイルスは細胞表面から発芽し、それゆえ組換えNAおよびHA
タンパク質発現は細胞表面上で起こる。
【０１８０】 他の実施形態においては、インフルエンザFRMSが本発明の方法により生成され
る。インフルエンザFRMSはフラビウイルスに関して上述した方法と同様の方法に
より生成され、適切な細胞間または細胞と単離された細胞膜もしくはビリオン粒
子との間のpH惹起HA媒介融合が包含され、複合体の捕捉は、例えば、架橋剤を用
いて実施され、NA媒介エンドサイトーシスおよび続くエンドソーム性融合が捕捉
されるのを可能にする。
【０１８１】 本発明のもうひとつの実施形態においては、パラミクソウイルスFRMSが本発明
の方法により生成される。パラミクソウイルスファミリーには、麻疹ウイルス（
麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルス) 、ルブラウイルス(R
ubulavirus) ( オタフクカゼウイルス、ニューカッスル病) 、パラミクソウイル
ス（ヒトおよびウシパラインフルエンザ）、および肺ウイルス（呼吸シンシチウ
ムウイルス）を含むがそれらに限定されない、かなりの医学的および獣医学的重
要性を有する幾つかのサブグループが包含される。これらのウイルスは、パラミ
クソウイルス融合がエンドソームよりむしろ細胞表面で起こり、そしてpHと無関
係である点を除けば、オルトミクソウイルスと同様である。パラミクソウイルス
に関しては、ノイラミニダーゼ−血球凝集素(HN)（または単に血球凝集素(H))タ
ンパク質は細胞付着を媒介するが、一方融合(F) タンパク質はウイルス−細胞ま
たは細胞−細胞融合を媒介する。例えば、麻疹ウイルスの場合、H タンパク質は
細胞性CD46レセプターに結合し、そしてF タンパク質は膜融合を媒介する。詳細
な実施形態においては、MVからのH およびF タンパク質を発現する細胞がCD46（
および現在未確認のコレセプター）を発現する細胞と共培養し、そして架橋によ
るかまたは本明細書に記載した他の方法により捕捉されうる細胞−細胞融合が得
られる。あるいは、他の実施形態においては、コレセプターは外因性CD46を発現
する融合許容性細胞上に発現され得る。また、（HIV および他の前記ウイルスに
関して記載したような）詳細な実施形態も使用できる。
【０１８２】 本発明の１つの実施形態においては、ヘルペスウイルスFRMSが本発明の方法に
より生成される。ヘルペスウイルスにはかなりの医学的および獣医的重要性を有
する構成員を含有する大きいファミリーより構成されている。ヒトヘルペスウイ
ルスは、HSV1およびHSV2、水痘−帯状胞疹ウイルス、エプスタイン−バールウイ
ルス、サイトメガロウイルス、およびカポジヘルペスウイルスHHV8を含むがそれ
らに限定されない。
【０１８３】 例えば、HSV1の場合、結合および侵入は、幾種類かのウイルス性糖タンパク質
（gD, gCおよびgH/gL)および幾種類かの細胞レセプターおよび付着分子（グリコ
サミノグリカンおよびヘルペスウイルス侵入メジエーター（Hve)タンパク質A-C)
が関与する複雑な過程である。結合および融合は細胞表面上でpHに無関係な方法
で起こる。
【０１８４】 詳細な実施形態においては、HSV FRMSは細胞性レセプターおよび付着分子( 例
えばヒトMRC5細胞）を発現する細胞を用い、かかる細胞をHSV 糖タンパク質gD,
gC, gHおよびgLを発現する細胞と共培養することにより構築される。細胞−細胞
融合は好ましくはFRMSの捕獲ができるように架橋剤で固定することにより停止す
る。
【０１８５】 本明細書に記載したように、ウイルス性タンパク質および宿主細胞性レセプタ
ーを組み合わせ、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パラミクソウイルス、
麻疹、オタフクカゼ、麻疹、呼吸シンシチアルウイルス、インフルエンザ、Ｃ型
肝炎、エボラおよびフラビウイルス例えばデングおよび黄熱を含むウイルスのた
めの本発明のFRMSを形成できる。加えて、本発明のFRMSは、狂犬病、ネコ白血病
、ネコ免疫不全ウイルスおよび牛疫を含む獣医学的に重要なウイルスからのウイ
ルス性タンパク質を包含しうる。
【０１８６】 表２は個々の包膜ウイルスに関する細胞性レセプターの一覧を例示する。これ
らはウイルスエンベロープタンパク質と一緒に発現され、エンベロープタンパク
質と会合せしめられるとFRMSの形成を来す。
【０１８７】
【表２】 本発明の方法により治療または予防されうる他のウイルス性疾病には、C 型肝
炎、インフルエンザ、水痘、単純ヘルペスＩ型(HSV-1）、単純ヘルペスＩＩ型（
HSV-2)、牛疫、呼吸シンシチアルウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイ
ルス(echinovirus) 、アルボウイルス(arbovirus) 、ハンタウイルス(hantaviru
s)、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、麻疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイル
スＩ型(HIV-1) 、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型(HIV-2) 、すべてのトガウイルス
（例えばデングウイルス）、アルファウイルス、フラビウイルス、コロナウイル
ス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、パラインフルエ
ンザウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルス、アレナウイルス、ヒト
Ｔ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型、シミアン免疫不
全ウイルス、レンチウイルス、エプスタイン−バールウイルス、ヒトヘルペスウ
イルス、オナガザルヘルペスウイルスＩ型（Ｂウイルス）、およびポックスウイ
ルスにより惹起されるｍのが包含されるが、それらに限定されるわけではない。
【０１８８】 表３は個々の包膜ウイルスのファミリーに関するエンベロープタンパク質の一
覧を例示する。これらは細胞性レセプタータンパク質と一緒に発現され、細胞性
レセプタータンパク質と会合せしめられるとFRMSの形成を来す。
【０１８９】
【表３】 本発明の他の実施形態においては、オルトミクソウイルス科（例えばインフル
エンザ）、フィロウイルス科(Filoviridae）（例えばエボラ）、またはレトロウ
イルス科（例えばHIV)の３本鎖コイル化コイル構造はFRMSの形成を促進する。
【０１９０】 他の実施形態においては、合成ペプチドがウイルス感染を阻止するのに使用さ
れうる。例えば、実例としては、gp41らせんコイルのどれかを包含する合成ペプ
チドは同起源のらせん領域に結合でき、ウイルス性感染を幅広く阻止する（例え
ば、Wild, C.ら, 1992, Proceedings of the National Academy of Sciences US
A 89:10537; Furuta, R. A.ら, 1998, Nature Structural Biology 5:276を参照
されたい）。
【０１９１】 他の実施形態においては、FRMS免疫原に対する中和抗体も同様に融合の活性化
に関与する構造を標的化しうる。
【０１９２】 本発明の他の実施形態においては、宿主細胞レセプターを必要としないが、し
かしウイルスとの会合に宿主細胞コレセプターのみを必要とするウイルス株を使
用することができる。例えば、HIV の場合、ウイルス結合にCD4 を必要としない
HIV株が本発明方法に使用されうる（例えば、Hoxieら, 1998, J. Reprod. Immun
ol. 41:197-211 を参照されたい）。それゆえ、かかる株を使用する場合は、CD4
の発現は必要でない。
【０１９３】 5.5 ワクチン製剤および投与 本発明はまた、ウイルスに対する免疫応答を惹起させ、かつウイルスによる感
染を予防するために個体または動物に予防接種する方法にも関する。本発明のFR
MSは幾種かの手段でワクチン被接種体に提供されうる。前記FRMSはアジュバント
と組み合わせた固定化細胞としてワクチン被接種体に投与されうる。さらに、単
離および精製されたFRMSがワクチン被接種体に投与されうる。
【０１９４】 FRMSは、ウイルスタンパク質を発現するトランスフェクトされた細胞および宿
主細胞性レセプターおよび／またはコレセプターを発現するトランスフェクトさ
れた細胞を用いてワクチン被接種体に同時免疫付与することにより in situで調
製されうる。同様に、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクタ
ーおよびレセプタータンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターがこの免
疫付与方法で使用されうる。ベクターはワクシニアのようなウイルスベクターお
よびＤＮＡ免疫付与に使用されるベクターを包含しうる。同時免疫付与後、ウイ
ルスタンパク質と宿主細胞性レセプタータンパク質との間の相互作用が in vivo
で生じて本発明のFRMSが形成され、それにより、中和抗体を惹起しうる特有のエ
ピトープに対してワクチン被接種体が作用を受ける。
【０１９５】 FRMSを in situで形成しうる他の方法には宿主細胞上のレセプターおよびコレ
セプターの利用が包含される。例えば、CD4 およびCCR5との相互作用により生ず
る例示されたHIV エンベロープFRMSの調製においては、HIV 糖タンパク質を発現
するトランスフェクトされた細胞またはそのタンパク質をコードするＤＮＡを含
有するベクターを宿主のリンパ節に注射するかまたはそこに標的化する（例えば
VEE または他のベクターによる）。ウイルスタンパク質はウイルスレセプターお
よびコレセプターを有する宿主細胞に結合し、そして in vivoで融合を開始して
FRMSを形成し、それにより、ワクチン被接種体が新たに形成された中和性エピト
ープの作用をうける。
【０１９６】 詳細な実施形態においては、ワクチン製剤はヒトCD4 およびヒトCCR5と機能的
に相互作用するヒト免疫不全ウイルス１型のエンベロープタンパク質を包含する
単離されたタンパク質複合体、および製剤上許容されうる担体を包含する。他の
実施形態において、本発明は、１種またはそれ以上の宿主細胞性レセプターまた
はコレセプターと機能的に相互作用してウイルス結合、侵入および／または感染
を媒介する１種またはそれ以上のウイルス性タンパク質を含有するタンパク質複
合体を包含するワクチン製剤を動物に投与する工程を包含し、それによりウイル
スに対する中和抗体が生成されるものである、ウイルスに対して動物を免疫する
方法を提供する。
【０１９７】 １つの実施形態においては、本発明は、(a) 包膜ウイルスのエンベロープタン
パク質をコードする第１の核酸；および(b) １種またはそれ以上の細胞性膜タン
パク質をコードする第２の核酸（ただし、該エンベロープタンパク質および細胞
性膜タンパク質は適当な条件下で前記ウイルスのエンベロープと前記細胞性膜タ
ンパク質含有細胞膜とが融合するのに必要かつ十分なものであり、その結果、エ
ンベロープタンパク質と細胞性膜タンパク質とが被験者において発現され、ウイ
ルスに対する中和抗体が産生される）；および(c) 製剤上許容される担体、を包
含するワクチン製剤を提供する。
【０１９８】 １つの実施形態においては、本発明はウイルスにさらされた宿主を治療するか
または該ウイルスによる宿主の感染を予防する方法を提供するものであって、か
かる方法は、前記宿主にヒトCD4 およびヒトCCR5と機能的に相互作用するヒト免
疫不全ウイルス１型のエンベロープタンパク質を包含する単離されたタンパク質
複合体を前記宿主の感染を治療または予防するのに有効な量で用いて動物を免疫
することにより生成された宿主抗体を投与する工程を包含する。
【０１９９】 別の実施形態においては、本発明は、(a) １種またはそれ以上のウイルスタン
パク質を発現する第１の細胞を培養し；(b) 前記１種またはそれ以上のウイルス
タンパク質にとっての１種またはそれ以上の宿主細胞性レセプターまたはコレセ
プターを発現する第２の細胞を培養し；(c) 第１および第２の細胞を共培養し；
(d)細胞−細胞融合期間中に前記共培養物を固定し；(e) 固定した細胞を単離す
る、各ステップを含んでなる、１種またはそれ以上の宿主細胞性レセプターまた
はコレセプターと機能的に相互作用してウイルスの結合、侵入および／または感
染を媒介する１種またはそれ以上のウイルスタンパク質を含むタンパク質複合体
を調製する方法を提供する。
【０２００】 本発明のワクチン製剤を導入するのに多くの方法を使用できる。それらには、
経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内経路、および乱切法（例えば
、２股針を使用して皮膚の上層を通して引っかく）が包含されるがそれらに限定
されない。
【０２０１】 ワクチンが投与される患者または被験体は好ましくは哺乳動物、最も好ましく
はヒトであるが、牛、馬、羊、豚、家禽（例えばニワトリ）、山羊、猫、犬、ハ
ムスター、マウスおよびラットが包含されるがそれらに限定されないヒト以外の
動物であることもできる。
【０２０２】 ワクチンが投与される患者または被験体は、ライオン、チータ、象、キリン、
ウイルドビースト、豹、パンサーなどを包含するがそれらに限定されないヒト以
外の野性動物であることもできる。従って、この実施形態においては、本発明は
野性生活の管理手段を提供し、高度の近親交配があってウイルス性疾患に高度に
罹りやすい野性動物または動物集団の予防および治療方法を提供する。
【０２０３】 本明細書記載の方法の幾つかの実施形態においては、被験者はヒトである。別
の実施形態においては前記ヒトは高いHIV 感染リスクを有する。他の実施形態に
おいては被験者は家庭内動物である。
【０２０４】 このように本発明は動物に本発明のワクチンの有効な免疫付与量を投与するこ
とを包んでなる、動物の免疫付与方法、または動物のウイルス性疾患または障害
の治療または予防方法を提供する。
【０２０５】 本発明のワクチン製剤はまた、異種有機体に対する予備形成抗体の投与により
宿主の短期間防御が得られる受動免疫療法に使用するための抗体を産生するのに
も使用できる。
【０２０６】 本発明のFRMSを含有する免疫原をマウスに接種すると、免疫された動物による
中和抗体の産生が引き起こされる。例示の実施形態においては、複合体はアジュ
バントを用いて製剤化された固定化全細胞を含有するワクチンとして投与される
。しかしながら、本発明を実施するのに他のワクチン方法も用いうることは当業
者には明白であろう。例えば、単離および精製されたFRMSおよび／またはそのエ
ピトープがサブユニットワクチンとして投与されうる。さらに、先に記載したよ
うに、機能的複合体をコードする遺伝子を構築し、そしてベクターまたはプラス
ミド中に入れて生ベクターまたはＤＮＡプラスミドワクチンとして使用すること
ができる。
【０２０７】 本発明のウイルスワクチン製剤は本発明のワクチン免疫原として１種またはそ
れ以上のFRMSの有効な免疫付与量および製剤上許容できる担体または賦形剤を含
有する。ブースター投与も意図される。１つの実施形態においては、本発明のワ
クチン組成物は「製剤上許容できる担体」を含有できる。本明細書において使用
される製剤上許容できる担体は、免疫原の作用を妨害せず、その動物に対して無
毒である物質である。製剤上許容できる担体は当技術分野で良く知られており、
食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、滅菌等張水性緩衝液
、水中油型または油中水型乳濁液、水性組成物、リポソーム、マイクロビーズ、
ミクロソームまたはアジュバント化合物およびそれらの組み合わせを含むがそれ
らに限定されない。かかる許容できる担体の１例は、１種またはそれ以上の安定
剤、例えば安定化され、加水分解されたタンパク質、ラクトース、等を含有する
生理学的に平衡化された培養基である。担体は好ましくは無菌である。製剤は投
与様式に適合すべきである。
【０２０８】 組成物は、所望の場合は、また少量の湿潤剤または乳化剤、またはpH緩衝剤を
も含有できる。組成物は液体溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐
放性製剤、または粉剤であることができる。経口製剤は医薬等級のマンニトール
、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セル
ロース、炭酸マグネシウム、等のような標準的な担体を含有できる。
【０２０９】 一般的には、成分は別々に、または混合して単位投薬形態、例えば活性成分の
量を指示するアンプルまたは小袋のような密封容器中の乾いた凍結乾燥粉末また
は水不含濃縮物として供給される。組成物を注射により投与する場合は、投与に
先立ち成分を混合できるように滅菌希釈剤のアンプルを提供できる。
【０２１０】 詳細な実施形態においては、本発明の凍結乾燥された融合能のある複合体が第
１の容器にて提供され、第２の容器はグリセリン50％、フェノール0.25％、およ
び防腐剤（例えば、0.005%ブリリアントグリーン）の水溶液からなる希釈剤を含
有する。
【０２１１】 製剤中で用いられるべき免疫原またはFRMSの正確な量はまた、投与経路、およ
び患者の性質の如何にもよろうし、そして標準的な臨床技術に従い医療従事者の
判断および各患者の状態に従って決定されるべきである。有効な免疫付与量は融
合依存性複合体またはワクチン免疫原が投与された宿主における複合体に対する
免疫応答を生ずるに充分な量である。
【０２１２】 詳細な実施形態においては、本発明のヒト被験者にとってのワクチン免疫原の
有効な免疫付与量は、体重Kg当たり10〜100 mg、より好ましくは体重Kg当たり0.
1 〜10mgの範囲内である。ブースター投与は可能であるが好ましくない。
【０２１３】 所定の製剤において使用されたワクチン免疫原の正確な量は、免疫応答を誘発
するに必要な最小限量が投与されている限り限定的でない。約10μｇの少量から
ミリグラムまたはそれ以上の量までの用量範囲が意図される。１つの例として、
詳細な実施形態においては、個々の量は１免疫化当たり約50-650μｇの間で変動
できよう。他の形態においては、用量決定はワクチン免疫原の製剤の如何による
（例えば、精製ミミトープ、対精製FRMS、対全細胞調製物）。
【０２１４】 好ましい実施形態においては、ワクチン製剤は好ましくは免疫刺激剤と組み合
わせた有効な免疫化量のFRMS免疫原、および製剤上許容できる担体を包含する。
この文脈で使用される「免疫刺激剤」とは、特異的な免疫原と組み合わせた特異
的な強化効果であろうと、または免疫応答の１種またはそれ以上のエレメントの
活性に及ぼす単なる独立した効果であろうと、免疫系の活性を増強する能力を有
する任意の化合物または組成物を包含することを意味する。ワクチン組成物にお
いてより普通に利用される免疫刺激剤化合物の幾つかは、アジュバントみょうば
ん(alum)またはムラミルジペプチド(MDP) およびその類似体である。これら物質
の使用方法は当技術分野で知られており、そして所定のウイルスワクチンにとっ
て最適の刺激剤量の決定は充分に当業者の能力の範囲内である。所定の製剤中に
１種より多い免疫刺激剤を使用することも所望されうる。
【０２１５】 精製された免疫原または複合体ワクチンの使用は標準的方法で実施できる。例
えば、精製タンパク質（類）は適切な濃度に調整され、任意の好適なワクチンア
ジュバントを用いて製剤化され、使用用に包装されるべきである。好適なアジュ
バントには、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム；表面活性物質、例えば
リゾレシチン、プルロニック(pluronic)ポリオール；ポリアニオン；ペプチド；
オイル乳濁液、みょうばん、およびMDP が包含されうるがそれらに限定されない
。また、免疫原はリポソーム中に取り込むこともできるし、またはワクチン製剤
に使用するために多糖類および／または他のポリマーと複合させることもできる
。複合体がハプテンである場合、すなわちそれが同族の抗体と選択的に反応しう
るという点で抗原的である分子であるがしかし免疫応答を惹起しえないという点
で、免疫原性でない場合、ハプテンを担体または免疫原性分子に共有結合させる
ことができる。例えば、血清アルブミンのような大きいタンパク質はそれに結合
したハプテンに免疫原性を付与する。ハプテン−担体はワクチンとして使用する
ために製剤化されうる。
【０２１６】 また、本発明のワクチン有効量（免疫付与量）は、動物モデル試験系から導か
れた用量−応答曲線からも推定されうる。
【０２１７】 従って、本発明は被験者にウイルスによる感染の治療または予防に有効な免疫
原量のFRMSを投与することを含んでなる、被験者におけるウイルス感染の治療ま
たは予防方法を提供する。詳細な実施形態においては、本発明はヒトにHIV によ
る感染の治療または予防に有効な免疫原量のFRMSを投与することを含んでなる、
ヒトにおけるHIV 感染の治療または予防方法を提供する。
【０２１８】 本発明はまた、被験者にウイルスによる感染の治療または予防に有効な量のFR
MSを投与することを含んでなる、被験者におけるウイルス感染の治療または予防
方法を提供する。詳細な実施形態においては、本発明はヒトにHIV による感染の
治療または予防に有効な量のモノクローナル抗体を投与することを含んでなる、
ヒトにおけるHIV 感染の治療または予防方法を提供する。
【０２１９】 5.6. 産生された抗体 本発明は、本発明のFRMSと反応性であるポリクローナル抗体およびモノクロー
ナル抗体の形成に関する。本発明によれば、FRMS、その抗体の断片または他の誘
導体、またはその類似体は、かかる免疫原を免疫特異的に結合する抗体を産生さ
せるための免疫原として使用されうる。かかる抗体にはポリクローナル、モノク
ローナル、キメラ、１本鎖、Fab フラグメント、およびFab 発現ライブラリーが
包含されるがそれらに限定されない。
【０２２０】 本発明はまた、免疫応答を生じさせるための方法、例えば動物における抗体産
生にも関する。１つの実施形態においては、動物に本発明のFRMSが投与される。
好ましくは、FRMSはHIV エンベロープタンパク質を包含し、CD4 およびCCR5との
相互作用から生ずる。FRMSは免疫原に対する免疫応答が動物中で生じるような様
式で投与される。好ましくは、FRMS上のエピトープに対する抗体が産生される。
より好ましくは、産生された抗体には中和抗体が包含される。高度に好ましい実
施形態においては、産生された抗体はウイルスの多種多様な一次分離株を中和す
ることができる。
【０２２１】 FRMSまたはその誘導体または類似体に対するポリクローナル抗体を産生させる
ために当技術分野知られた種々の操作を使用できる。個々の実施形態においては
、FRMSのエピトープに対するウサギポリクローナル抗体またはそのサブ配列が得
られうる。抗体の産生には、ウサギ、マウス、ラット等を含むがそれらに限定さ
れない種々の宿主動物を、天然FRMS、または合成物、またはそれらの誘導体（例
えばフラグメントまたはキメラ）の注射により免疫化することができる。種々の
アジュバントが宿主種に応じて免疫学的応答を増大させるのに使用でき、それら
にはフロイント（完全および不完全）、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウ
ム、表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオ
ン、ペプチド、オイル乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフ
ェノール、および有用な可能性のあるヒトアジュバント、例えばBCG(bacille Ca
lmette-Guerin)およびコリネバクテリウム・パルブム(Corynebacterium parvum)
が包含されるがそれらに限定されない。
【０２２２】 FRMS、その誘導体または類似体に対するモノクローナル抗体を調製するには、
培養中の連続的な細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技術が使用でき
る。例えば、初めKohlerおよびMilstein (Kohlerら, 1975, Nature 256:495-497
)により開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ技術、ヒトB-細胞
ハイブリドーマ技術(Kozborら, 1983, Immunology Today 4:72)、およびヒトモ
ノクローナル抗体を生産するためのEBV ハイブリドーマ技術(Coleら, 1985, in
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp77-96)
。本発明のさらなる実施形態においては、モノクローナル抗体は無胚動物（例え
ばPCT/US90/022548 を参照されたい）中で産生されうる。本発明によれば、ヒト
抗体を使用でき、それはヒトハイブリドーマの使用によるか(Coleら, 1983, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030)、またはヒトB 細胞をin vitroでEBV
を用いて形質転換することにより得られうる(Coleら, 1985, in Monoclonal Ant
ibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp77-96)。
【０２２３】 詳細な実施形態においては、FRMSで免疫化したマウスから脾臓を取り出し、そ
して脾臓を培養基中ばらばらに細断することにより脾細胞を単離する。ポリエチ
レングリコール(PEG) を用いて脾細胞をHPRT陰性マウスミエローマ細胞と融合さ
せる。4:1 比の脾細胞対ミエローマ細胞を含有する細胞ペレットを再懸濁し、50
% 予備テストずみPEG-4000を含有する無血清培地中で処理する（接触2.5 分）。
次にこの細胞懸濁液を無血清培地中にゆっくりと希釈し、細胞を96ウエル培養皿
中HAT 選択培地に入れる。DMEM培養基は20% 予備テストずみウシ胎児血清、10%
NCTC-109(Gibco) 、1%非必須アミノ酸、1Xグルタミンおよび1X Pen-Strep, 1X O
PI(15mg/mlオキサロアセテート、5mg/mlナトリウムピルベート、および20単位/m
l のインスリン）、100 μM ヒポキサンチン、0.4 μM アミノプテリンおよび16
μM チミジンを含有する。ハイブリドーマを含有するウエルを顕微鏡により監視
し、上清を適切／必要な場合に回収して抗体産生に関してアッセイする。
【０２２４】 事実、本発明によれば、FRMS特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を適切な生
物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と共に接着させることにより「キ
メラ抗体」の産生に関して開発された技術(Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A. 81:6851-6855; Neubergerら, 1984, Nature 312:604-608; Take
daら, 1985, Nature 314:452-454)を使用できる。かかる抗体は本発明の範囲内
である。他の実施形態においては、「ヒト化」された抗体も本発明により提供さ
れる(米国特許第5,225,539号) 。
【０２２５】 本発明によれば、１本鎖抗体の生産について記載された技術（米国特許第4,94
6,778号)をFRMS特異的な１本鎖抗体の産生に適合させることができる。本発明の
さらなる実施形態では、腫瘍サプレッサータンパク質、誘導体または類似体に関
する所望の特異性を有するモノクローナルFab フラグメントの迅速で容易な同定
ができるように、Fab'発現ライブラリーの構築について記載された技術（Huseら
, 1989, Science 246:1275-1281) を用いる。
【０２２６】 分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは既知技術により生成され
うる。例えば、かかるフラグメントには抗体分子のペプシン消化により生成され
うるF(ab')２ フラグメント、F(ab')２ フラグメントのジスルフィッド橋を還元
することにより生成されうるFab'フラグメント、抗体分子をパパインおよび還元
剤で処理することにより生成されうるFab フラグメント、およびFvフラグメント
が包含されるがそれらに限定されない。
【０２２７】 組み合わせライブラリーからのFab フラグメントも本発明に意図される（例え
ば、Chanockら, 1993, Infect Agents Dis. 2:118-31 を参照されたい）。
【０２２８】 抗体の産生においては、所望される抗体のスクリーニングは当技術分野で知ら
れた技術により達成されうる（例えば、酵素結合免疫吸着定量法、すなわちELIS
A)。例えば、FRMSを特異的に認識する抗体を選択するには、生成したハイブリド
ーマを、FRMSエピトープに結合し他のタンパク質により生成されたエピトープに
は結合しない産物についてアッセイできよう。第１のFRMS相同物に特異的に結合
するが異なるFRMS相同物には特異的に結合しない抗体を選択するには、第１のFR
MS相同物への結合陽性および第２のFRMS相同物への結合欠如に基づき選択しうる
。また、抗体のスクリーニングは機能的アッセイ、例えば当技術分野で知られて
いるかまたは本明細書に記載されたようなウイルス中和アッセイによっても実施
できる。
【０２２９】 FRMSのドメインに対する特異的な抗体も提供される。FRMSタンパク質のエピト
ープに対する特異的な抗体も提供される。
【０２３０】 産生された抗体は当技術分野で知られた標準的技術（例えば、イムノアフィニ
ティクロマトグラフィー、遠心分離、沈降、等）により単離され、診断イムノア
ッセイに使用されうる。また、抗体は治療および／または疾病の進行を監視する
のにも使用できる。上に列記したような当技術分野で知られた任意のイムノアッ
セイ系がこの目的に使用でき、それらには少数をあげれば、ラジオイムノアッセ
イ、ELISA （酵素結合免疫吸着定量法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、沈
降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセ
イ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインA イム
ノアッセイおよびイムノ電気泳動アッセイ、のような技術を用いる競合的および
非競合的アッセイ系が包含されるがそれらに限定されない。
【０２３１】 本発明のFRMSは、免疫原として使用された場合、ウイルス性病原体に対する中
和抗体を惹起しうる。好ましい実施形態においては、FRMSはウイルスの多種多様
な一次分離株に対する中和抗体を惹起する。詳細な実施形態においては、FRMSは
HIV-1 の一次分離株に対する中和抗体を惹起する。中和抗体は、静止HIV エンベ
ロープタンパク質によっては惹起されないが、少なくとも弱くは静止エンベロー
プに結合でき、そして結合および融合過程を通してエンベロープタンパク質とと
もに担持され、その間に抗体が決定的に重要な中間体構造への高アフィニティ結
合を完結させる。かかる中和抗体は、事実、細胞性作用部位、特に膜融合の細胞
性部位に係わりなく（細胞表面上または内膜例えばエンドソーム膜）臨界的瞬間
に利用可能な臨界的部位に輸送されうる。従って、ウイルスエンベロープタンパ
ク質は抗体（例えばトキシン、他のタンパク質、ワクチン免疫原に例えば連結）
を細胞中へ、細胞質中へまたは組織適合性複合体提示経路へと運ぶためのベクタ
ーとして役立ちうる。
【０２３２】 本発明のハイブリドーマ細胞上清は相同ウイルスの中和能に関して、ならびに
一連の遺伝子的に多様なウイルスの中和能に関してアッセイされうる。遺伝子的
に多様なウイルスの中和能は保存された決定基のmAb による認識を示唆している
。さらに、mAb はエンベロープ媒介細胞−細胞融合の阻止について試験されうる
。MAb はまたエンベロープタンパク質およびエンベロープタンパク質含有レセプ
ター会合複合体を結合および／または免疫沈降させる能力に関してもアッセイさ
れうる。融合依存性エピトープに対して特異的であり静止的エンベロープタンパ
ク質にはもしあったとしても弱くしか結合しないmAb が特に重要である。
【０２３３】 １つの実施形態においては、ハイブリドーマはPIウイルス中和を検出するため
の高スループットスクリーニングアッセイを用いて同定され、mAb 類が特性決定
されてPIウイルス中和の幅および分子標的が決定される。
【０２３４】 本発明の種々の実施形態においては、本発明方法により産生された抗体が個々
に（例えば単一の mAb）または組み合わせて（例えば同じかまたは異なるエピト
ープに対する１種またはそれ以上の mAb）使用される。抗体の組み合わせ使用に
は、同じウイルスまたは異なるウイルスに対する複数のmAbが包含されうる。本
発明の幾つかの実施形態においては、同じウイルスに対する複数のmAbまたはウ
イルスの同じFRMSに対する複数のmAbを使用することが好都合でありうる。
【０２３５】 5.7. 抗体結合およびウイルス感染の阻止に関するアッセイ 本発明の抗体またはその誘導体または類似体の、本発明のFRMSを結合する能力
およびそれによるウイルス感染妨害能は種々の方法によりアッセイされうる。
【０２３６】 結合は当技術分野で良く知られた手段によりアッセイされうる。例えば、ケモ
カインレセプターを発現することが知られた細胞が、試験すべき mAb誘導体また
は類似体にさらされ、知られた効果（例えばシグナルトランスダクション）につ
いてアッセイされるものであるバイオアッセイを行うことができる。あるいはま
た、mAb、誘導体または類似体は、タンパク質アフィニティクロマトグラフィー
、アフィニティブロッティング、免疫沈降、架橋、およびライブラリーに基づく
方法例えばタンパク質プロービング、ファージ提示、および２ハイブリッド系を
含むがそれらに限定されない操作により、ケモカインレセプター、宿主細胞レセ
プターまたはウイルスエンベロープタンパク質への結合能について試験されうる
（一般的には、Phizickyら, 1995, Microbiol. Rev. 59:94-123を参照されたい
）。
【０２３７】 mAb、誘導体または類似体結合についての高スループットスクリーニングはフ
ローサイトメトリーを含むがそれに限定されない当技術分野で知られた方法によ
り行うことができる。詳細な形態においては、ヒトCD4 およびHIV コレセプター
の１つ（例えば、CC CKR5, CxC CKR4, CCR5, CXCR4等）を発現する細胞をビオチ
ニル化 mAb、誘導体または類似体で処理しそしてFRMSへの細胞表面の結合をアビ
ジンFITCコンジュゲートを用いて検出する。あるいはまた、フローサイトメトリ
ー系が本発明のモノクローナル抗体を下記様式でまたは当技術分野で知られた任
意の方法により使用する競合的結合アッセイで使用されうる。詳細な実施形態に
おいては、本発明のmAbを標識しそして本発明のFRMSを結合する能力を、試験抗
体が同じFRMSを結合する能力と比較して試験する。本発明の試験抗体は被験者か
らの血清のようなサンプルに由来するか、またはハイブリドーマ上清のような製
造サンプルに由来しうる。
【０２３８】 別の実施形態においては、本発明の mAb、 mAb誘導体および／または類似体に
より示される抗ウイルス活性は、例えば、容易に実施されるin vitroアッセイに
より測定されうる。これはその化合物のシンシチア形成阻止能または細胞不含ウ
イルスによる感染の阻止能を試験でき、そして細胞増殖および生存能力に及ぼす
その化合物の作用を評価する能力を試験しうる。これらアッセイを適用すること
により、 mAb、誘導体および／または類似体が、ウイルス特異的および株特異的
な阻止活性に最も適合する免疫不全ウイルス製剤の所定のウイルスまたは株に対
して示す相対的な抗ウイルス活性が判定されうる。
【０２３９】 １つの実施形態においては、 mAb、誘導体または類似体がin vitroでウイルス
誘導シンシチア形成を阻止する能力を試験するのに細胞融合アッセイが用いられ
る。詳細な形態においては、本発明の mAb、誘導体または類似体がin vitroでHI
V 誘導シンシチア形成を阻止する能力を試験するのに細胞融合アッセイが用いら
れる。この実施形態においては、かかるアッセイは慢性的HIV 感染細胞の存在下
に未感染CD4＋細胞およびアッセイ予定の mAb、誘導体または類似体を含有する
組成物を培養することを包含する。それぞれに関して、ある範囲の濃度が試験さ
れよう。この範囲には何ら mAb、誘導体および／または類似体が添加されていな
い対照培養物が包含されねばならない。当業者に良く知られた標準的培養条件が
用いられる。例えば、37℃で24時間のような適切な期間培養後、その培養物を多
核巨細胞の存在に関して顕微鏡で検査し、それが細胞融合およびシンシチア形成
の指標である。
【０２４０】 別の実施形態においては、in vitro感染力アッセイが一次マクロファージおよ
び向マクロファージ性HIV-1 ＢａＬ 分離株（第一番目に記載された向マクロフ
ァージ性HIV-1 分離株）を用いて実施される（Gartnerら, 1986, Science 233:2
15を参照されたい）。このアッセイによれば、当技術分野で知られた方法により
単離された一次マクロファージ細胞を、一次マクロファージ中でのみ増殖および
保持されたHIV-1 ＢａＬ に感染させる。供給免疫不全ウイルスは試験予定の mA
b、誘導体または類似体のある濃度の存在下に一次マクロファージとインキュベ
ートする。所定の感染期間後、未結合ウイルスを洗い去り、そして細胞を培養す
る。このアッセイにおけるウイルス複製レベルは、逆転写酵素(RT)レベルの測定
、または感染後の異なる日における細胞外p24 コア抗原の放出の測定を含むがそ
れらに限定されない当技術分野で知られた技術により評価できる。 mAb、誘導体
または類似体の非存在下に実施された対照アッセイに比較して、一定したレベル
のウイルス感染または複製の阻止が産出HIVp24レベル（または例えばRTのような
ウイルス感染または複製の他の指標）の測定により決定される。 mAb、誘導体ま
たは類似体は試験化合物の非存在下に実施された対照アッセイに比較して、例え
ばp24 により測定して50％またはそれ以上ウイルスレベルを減少させるのが好ま
しい。p24 の存在は商業的に入手できるエンザイムリンクトイムノソルベントア
ッセイ（Coulter, Hialeah, Florida; Abbott Laboratories, Hvalstad, Norway
）のような当業上知られた方法を用いて判定できる。あるいはまた、RT活性は例
えば、Goffら、 (Goffら, 1981, J. Virol. 38:239-248)およびWilleyら、 (Wil
ley et al., 1988, J. Virol. 62:139-147)に記載されるそれのような標準的技
術を用いて、無細胞上清を監視することにより試験されうる。
【０２４１】 本発明の別の実施形態においては、本発明の mAbが一次分離株中和アッセイで
アッセイされる。種々の中和アッセイが当技術分野で知られており、そして本発
明の範囲内にある。１つの実施形態においては、本発明の mAbはフォーカスアッ
セイでアッセイされる。フォーカスアッセイの１つの実施形態においては、宿主
細胞にウイルスを添加するに先立ち、試験抗体を測定量のウイルスとインキュベ
ートする。宿主細胞の感染はこの細胞を、ウイルスタンパク質に特異的な抗体を
用いて当技術分野で知られた免疫組織化学的方法により染色することにより測定
される。一般的に、試験抗体を用いない対照アッセイを並行して実施する。対照
感染と比較して感染を阻止（例えば予防または減少）する試験抗体が中和抗体の
指標である。本発明の別の実施形態においては、試験抗体による中和のアッセイ
にPBL アッセイを使用できる。PBL アッセイの１つの形態においては、宿主細胞
にウイルスを添加するに先立ち、試験抗体を測定量のウイルスとインキュベート
する。宿主細胞培養物を数日間インキュベートせしめ、そして宿主細胞上清サン
プル中に存在するビリオンを測定することにより感染をアッセイする。一般的に
、試験抗体を用いない対照アッセイを並行して実施する。対照感染と比較して感
染を阻止（例えば予防または減少）する試験抗体が中和抗体の指標である。
【０２４２】 5.7.1. トランスジェニックマウスモデル 本発明は、その会合の結果として本発明のFRMSが形成される1以上の構成要素
を発現する非ヒトトランスジェニック動物の使用を包含する。特定の実施形態に
おいて、その会合の結果として本発明のFRMSが形成される構成要素は、本明細書
中の表IIおよび表IIIに挙げたものを含み得る。本発明のトランスジェニック動
物モデルは、耐性モデルおよび／または感染モデルとして用いてもよい。耐性モ
デルの場合には、FRMSの形成に重要な全細胞構成要素をトランスジェニック動物
中で発現させることが好ましい。感染モデルの場合には、トランスジェニック動
物がウイルス感染に対してFRMSを誘導できるようにして、FRMSの形成に重要な1
以上の構成要素を発現させればよい。
【０２４３】 限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミ
ニブタ、ヤギ、ヒツジ、ならびに非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、サル、およびチ
ンパンジーを含む任意の種の動物を用いて、その結果としてFRMSが形成される構
成要素を発現するトランスジェニック動物を作製してもよい。本明細書において
用語「トランスジェニック」とは、その会合の結果として異種由来のFRMS遺伝子
配列が形成される1以上の構成要素を発現する動物(例えば、その会合の結果とし
てFRMSが形成される1以上の構成要素をコードするヒト配列を発現するマウス)、
ならびにその会合の結果としてFRMSが形成される1以上の構成要素をコードする
内因性（すなわち、同種）配列を過剰発現するように遺伝子操作された動物、ま
たはその会合の結果としてFRMSが形成される1以上の構成要素をコードする内因
性遺伝子配列をもはや発現しないように遺伝子操作された動物（すなわち、「ノ
ックアウト」動物）、およびそれらの後代をいう。
【０２４４】 当技術分野で公知のいずれかの技術を用い、その会合の結果としてFRMS導入遺
伝子が形成される1以上の構成要素をコードする遺伝子を動物に導入してトラン
スジェニック動物の創始ラインを作製してもよい。かかる技術としては、限定さ
れるものではないが、前核マイクロインジェクション(HoppeおよびWagner, 1989
, 米国特許第4,873,191号)、レトロウイルス媒介による生殖細胞系列への遺伝子
導入(Van der Puttenら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82, 6148-6152)
、胚性幹細胞における遺伝子ターゲッティング(Thompsonら, 1989, Cell 56, 31
3-321)、胚のエレクトロポレーション(Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3, 1803-18
14)、ならびに精液媒介型遺伝子導入(Lavitranoら, 1989, Cell 57, 717-723)が
挙げられる。(かかる技術の総説については、Gordon, 1989, トランスジェニッ
ク動物, Intl. Rev. Cytol. 115, 171-229を参照) 当技術分野で公知のいずれかの技術を用い、その会合の結果としてFRMS導入遺
伝子が形成される1以上の構成要素を含有するトランスジェニック動物クローン
を作製してもよく、例えば、静止期へ誘導された培養胚、胎児または成人細胞由
来の核を除核した卵母細胞に核移植してもよい(Campbellら, 1996, Nature 380,
64-66; Wilmutら, Nature 385, 810-813)。
【０２４５】 本発明は、その会合の結果としてFRMSが形成される1以上の構成要素の導入遺
伝子を担持するトランスジェニック動物、ならびにそれらの全細胞ではなく、一
部の細胞において導入遺伝子をその全細胞において担持する動物、すなわちモザ
イク動物を提供する。導入遺伝子は単体導入遺伝子として、またはコンカテマー
、例えば、ヘッド−ヘッド連結型またはヘッド−テール連結型中へ組み込んでも
よい。導入遺伝子はまた、例えばLaskoらの教示(Laskoら, 1992, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 89, 6232-6236)に従って、特定の細胞型に選択的に導入して活性
化させてもよい。かかる細胞型特異的な活性化に必要な調節配列は目的とする特
定の細胞型によって異なり、当業者には明らかである。導入遺伝子が内因性遺伝
子の染色体部位に組み込まれることを望むときは、遺伝子ターゲッティングが好
ましい。簡単に説明すると、かかる技術を用いるときは、染色体配列との相同組
換えによって組み込み、内因性遺伝子のヌクレオチド配列の機能を破壊するため
に、内因性遺伝子に相同ないくつかのヌクレオチド配列を含有するベクターとし
て設計する。また導入遺伝子を特定の細胞型に選択的に導入し、それにより、例
えばGuらの教示(Guら, 1994, Science 265, 103-106)に従い、その細胞型だけに
おいて、その会合の結果としてFRMSが形成される1以上の構成要素をコードする
内因性遺伝子を不活性化させる。かかる細胞型特異的な不活性化に必要な調節配
列は目的とする特定の細胞型によって異なり、当業者には明らかである。
【０２４６】 ひとたびトランスジェニック動物を作製すれば、その会合の結果としてFRMS遺
伝子が形成される組換え構成要素の発現を標準技術を用いてアッセイすることが
できる。導入遺伝子の組み込みが起こったかどうかをアッセイするには、動物組
織を分析するためのサザンブロット解析またはPCR技術によって一次スクリーニ
ングを行ってもよい。トランスジェニック動物の組織中の導入遺伝子のmRNA発現
のレベルもまた、限定されるものではないが、動物から入手した組織サンプルの
ノーザンブロット解析、in situハイブリダイゼーション解析、およびRT-PCR(逆
転写酵素PCR)をはじめとする技術を用いて評価すればよい。構成要素遺伝子発現
組織のサンプルはまた、構成要素導入遺伝子産物に特異的な抗体を用いて免疫細
胞化学的に評価してもよい。
【０２４７】 特定の実施形態において、本発明は、マウス以外の種に対するワクチンとして
意図された試験ワクチンのスクリーニングを行うことができるモデルシステムの
開発にトランスジェニックマウスを使用することを包含する。好ましい実施形態
において、その試験ワクチンはヒトを意図したワクチンである。
【０２４８】 本発明のトランスジェニックマウスモデルは、宿主細胞レセプターおよび／ま
たはマウスが本来持っていないウイルスに対する別の種のコレセプターを発現す
べく構築されているマウスを包含する。宿主細胞に向けられた抗体を中和する効
果が排除されるので、かかるマウスはウイルス中和の分析にとって有利である。
これらのマウスはウイルス耐性のモデル系を提供する。例えば、(HIVのような)
ヒトに感染することができるウイルスに対するヒト宿主細胞受容体を発現するト
ランスジェニックマウスを構築、または使用することができる。
【０２４９】 本発明のある実施形態において、ワクチン研究に、胸腺細胞およびTヘルパー
リンパ球に対して同時発現を制限するCD4調節エレメントの制御下で、ヒトCD4お
よびCCR5コレセプターを発現するトランスジェニックマウスを利用する(Killeen
ら, 1993, EMBO J., 12:1547-53)。CD4またはCCR5に向けられた抗体を中和する
効果を乱すことなくウイルス中和を分析可能にするために、これらのマウスを用
いる。この点で、その免疫応答は、ヒトにおいて免疫原性エピトープがCD4およ
びコレセプターのHIV依存性コンホメーションならびにエンベロープに限定され
ることを模している。侵入後のHIVの複製の抑制のため、感染性の研究における
これらのマウスの使用はこれまで限られていたが、本発明はHIVワクチンの分析
のための系としての新規な利用を提供する。このモデルにおいて、導入遺伝子は
ワクチンのヒトCD4およびCCR5構成要素に対する耐性を与えることだけに機能す
る。
【０２５０】 アッセイを行うために、トランスジェニックマウスを本発明のFRMSで1回以上
免疫する。所望により、対照免疫原を用いて他のマウスにワクチン接種し対照と
してもよい。FRMS免疫原は、細胞溶解物、溶液、架橋構造体、分離株、精製株な
どを含む、本明細書に記載されたいずれの形態であってもよい。FRMS免疫原をま
た、ワクチン製剤としてマウスに導入してもよい。
【０２５１】 次に、FRMSまたは対照免疫原で免疫したマウスから産生された血清または抗体
を採取し、PIウイルスを中和する能力についてアッセイした。マウスにおいて免
疫応答を引き起こすことができるように免疫し、その後適切な時点に血清を採取
する。かかる時点は当業者には十分公知である。ある実施形態においては、血清
はそれぞれ免疫した後、2週間で得た。
【０２５２】 好ましくは、血清または抗体についてウイルスの2、3または4の一次分離株を
中和する能力を試験する。さらに好ましくは、血清または抗体についてウイルス
の4、6または8の一次分離株を中和する能力を試験する。最も好ましくは、血清
または抗体についてウイルスの10-15、15-25、またはそれより多い一次分離株を
中和する能力を試験する。
【０２５３】 一次分離株の中和を、本明細書に示したものを含む当技術分野で公知の方法に
よってアッセイしてもよい。ある実施形態において、感染に使用すべきウイルス
のサンプルとともに試験抗体をインキュベートすることに伴う感染性を抑制する
ことによって中和を決定する。ウイルス感染を阻止する（例えば、減少させるま
たは防ぐ）抗体は、中和抗体であることを示す。他の実施形態において、血清ま
たは抗体について、シンシチウムの形成を阻止する能力または無細胞ウイルスに
よる感染を阻止する能力を試験し、化合物が細胞の増殖および生存率に及ぼす効
果を評価する。本発明の好ましい実施形態において、試験抗体はモノクローナル
抗体である。本発明のさらに好ましい実施形態において、試験抗体はFRMS免疫原
に応答して産生されたヒトモノクローナル抗体である。当業者には明白なことで
あるが、対照免疫原で免疫したマウスから得た血清または抗体は感染性または中
和活性をほとんどまたは全く抑制しないことが観察されると予想される。
【０２５４】 本発明の他の実施形態においては、ウイルス中和アッセイを２以上の一次分離
株で行う。好ましい実施形態において、ウイルス中和アッセイを、2-5、5-10、1
0-15の一次分離株で行う。さらに好ましい実施形態において、中和アッセイを、
15-20、20-30、または30以上の一次分離株で行う。別の好ましい実施形態におい
て、アッセイした一次分離株は以上のウイルスクレード由来のものである。
【０２５５】 中和は一次分離株の数の内で中和したパーセンテージによって特徴付けられる
。一般に、この実施形態において、1つのアッセイだけを用いて抗体の中和を評
価する。ある実施形態においては、本発明の抗体は、ウイルスの一次分離株の30
-40%、40-50%、または50-60%を中和する。好ましい実施形態においては、本発明
の抗体は、ウイルスの一次分離株の60-75%、70-85%、または80-90%を中和する。
最も好ましい実施形態においては、本発明の抗体は、ウイルスの一次分離株の90
-95%、95-98%、または99-100%を中和する。好ましい実施形態においては、mAbに
ついて一次分離株の中和を試験するときは、培地のみの存在下での数と比較した
、mAb（またはハイブリドーマの上清）の存在下でのフォーカスの数として中和
を表す。
【０２５６】 特定の実施形態においては、トランスジェニックマウス(hu CD4+, hu CCR5+,
マウスCD4+)をHIV FRMS免疫原(U87-CD4-CCR5細胞で同時培養した架橋COS-env)で
、または細胞対照(U87-CD4-CCR5細胞単独または擬似トランスフェクトCOS細胞で
同時培養したもの)で免疫する。相同168Pウイルスのワクチン血清による中和に
対する感受性は、CCR5またはCXCR4コレセプターのいずれかを発現するU87-CD4細
胞で決定する(LaCasseら, 1998, Science 72:2491; Follis, K.E.ら, 1998, Jou
rnal of Virology 72:7603を参照のこと)。
【０２５７】 本発明のもう１つの特定の実施形態において、中和アッセイにHIVの一次分離
株を用いる場合、この一次分離株としては、限定されるものではないが、92US65
7、92US660、92TH014、89.6、320NSI、320SI、SHIV89.6P、168P、92RW023、92UG
031、92UG037、92RW008、93IN101、93IN999、93IN905、93IN904、92UG035、92UG
021、92UG024、92UG046、92TH023、92TH024、93TH051、および93TH053が含まれ
る。
【０２５８】 発明のある実施形態においては、本発明の方法（第5.6節を参照のこと）によ
りHIV FRMSに対して産生された抗体は、HIVのかかる一次分離株の60-70%、70-80
%、80-85%を中和することができる。好ましい実施形態においては、HIV FRMSに
対して産生された抗体は、HIVのかかる一次分離株の80-90%、90-95%、または95-
99%を中和することができる。最も好ましい実施形態においては、HIV FRMSに対
して産生された抗体は、HIVのかかる一次分離株の100%を中和することができる
。
【０２５９】 もう１つの特定の実施形態においては、HIVの一次分離株は、クレードA、B、C
、D、E、F、G、H、またはIの1以上の分離株を含んでもよい。他の実施形態にお
いて、HIVの一次分離株は、Mグループ、Oグループ、またはNグループの1以上の
分離株を含んでもよい。
【０２６０】 もう１つの実施形態においては、中和活性を当技術分野で公知の方法によって
抗体により媒介された形で示すことができる。例えば、血清をプロテインAおよ
びプロテインGを含有する固相支持体に吸着させることができる。抗体が血清の
ウイルス中和活性の原因である場合、プロテインAおよびプロテインGが結合性の
タンパク質を使いはたした血清はウイルス中和活性をほとんどまたは全く含まな
いことが予想される一方で、プロテインAおよびプロテインG固相支持体の溶出液
はウイルス中和活性を含むと予想される。
【０２６１】 従って、本発明はワクチンの有効性に対して分子構造体をスクリーニングする
方法を提供し、該方法は非ヒトトランスジェニック哺乳動物を分子構造体で免疫
し、その際該非ヒトトランスジェニック哺乳動物は1以上の導入遺伝子からヒトC
D4およびHIVに対するコレセプターの両方を発現し、さらに該哺乳動物によって
産生されたHIVに対する任意の中和抗体を検出することを含んでなる。
【０２６２】 本発明はまた、ワクチンの有効性に対して分子構造体をスクリーニングする方
法を提供し、該方法は非ヒトトランスジェニック哺乳動物を分子構造体で免疫し
、その際該非ヒトトランスジェニック哺乳動物は1以上の導入遺伝子から該1以上
の宿主細胞性膜タンパク質を発現し、さらに該哺乳動物によって産生された該ウ
イルスに対する任意の中和抗体を検出することを含んでなる。
【０２６３】 5.7.2. ワクチンの有効性の決定 本発明の1以上の免疫原の免疫力は、FRMSで免疫した後に、当技術分野で公知
のいずれかのイムノアッセイを用いて試験動物の免疫応答をモニターすることに
より決定できる。体液性（抗体）応答および／または細胞性免疫の生起を、免疫
応答の指標として利用してもよい。試験動物には、マウス、ハムスター、イヌ、
ネコ、サル、ウサギ、チンパンジー等、および事実上ヒトの被験者が含まれる。
【０２６４】 本明細書の第5.10節に記載したように、ワクチンの導入方法には、経口、脳内
、皮膚内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、鼻腔内またはその他のいずれかの標
準免疫経路が含まれる。試験被験体の免疫応答を種々のアプローチによって分析
することができる。例えば結果として生じた免疫血清の本発明の免疫原に対する
反応性は、公知の技術、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)、イムノ
ブロット、放射線免疫検定法(RIA)、放射線免疫沈降等によってアッセイする。
別法として、免疫した宿主を病原体による感染から防御すること、および／また
は免疫した宿主において病原体による感染に基づく症状を軽くすることをワクチ
ンの有効性の証拠として役立てることができる。
【０２６５】 ウイルスワクチンの好適な動物試験の1つの例として、ウサギにおいて本発明
のワクチンがFRMS免疫原に対して抗体応答を誘発する能力を試験してもよい。特
定の病原体を含まない(SPF)オスの若い成体のニュージーランド白ウサギを用い
てもよい。それぞれの試験群は所定濃度のワクチンを投与される。対照群はFRMS
免疫原の入っていない1mM Tris-HCl pH 9.0の注射を受けた。血液サンプルを1ま
たは2週間ごとにウサギから抜き取って、FRMSに対する抗体について血清を分析
すればよい。免疫原に特異的な抗体が存在することを、例えばELISAを用いてア
ッセイしてもよい。
【０２６６】 本発明の好ましい実施形態においては、ウイルスワクチン有効性の動物試験は
本明細書の第5.7.1節に記載したトランスジェニックマウスモデルを使用して行
う。
【０２６７】 本発明はまた、被験体のFRMSを含んでなるワクチンを最適化および定量化する
方法を提供する。好ましくは、被験体の複合体を宿主細胞性構成要素に対する反
応性を打ち消す自己由来細胞を用いて製造する。しかしながら、非自己由来細胞
を用いて製造した複合体を含んでなるワクチン組成物を、複合体の宿主細胞性構
成要素に対して耐性をもつように遺伝的に設計されたトランスジェニック動物を
用いて評価することができる。これらのトランスジェニック動物を用い、本発明
の融合複合体をワクチン接種することによって達成された成果が複合体によって
提示された新規の融合コンピテントエピトープによるものかどうかを決定するこ
とができる。例えば、ある好ましい実施形態においては、FRMSはHIV(168P)ウイ
ルスのエンベロープタンパク質とヒトタンパク質CD4およびCCR5との相互作用か
ら生じる。第6節に記載するように、ワクチンのヒト構成要素に対して耐性をも
つように遺伝子操作されたトランスジェニックマウスにおいてワクチン組成物を
試験した。ヒトCD4レセプターおよびヒトCCR5コレセプターの両方を発現するマ
ウスを用いて複合体を調べ、生じた中和抗体がエンベロープタンパク質またはCD
4およびコレセプターのHIV依存性コンホメーションに限定される免疫学的エピト
ープであることを実証した。これらのトランスジェニックマウスを独自にHIV感
染用マウスモデルとして用いたことが注目される。トランスジェニック動物をワ
クチン免疫原のスクリーニングに利用することは、これらのマウスの新しい用途
である。ワクチンの宿主部分に対して耐性を示すトランスジェニックマウスを用
いてワクチン構成要素を最適化し、変異体を試験し、およびアジュバントを評価
することができる。
【０２６８】 さらに、この原則をウイルスワクチンをスクリーニングするための迅速で安全
な方法を提供する任意のウイルスモデルにも当てはめることができるということ
は、当業者には明らかはずである。さらに、トランスジェニックマウス以外のト
ランスジェニック動物を用いても候補ワクチンをスクリーニングすることができ
ることは、当業者には明らかなはずである。
【０２６９】 ある実施形態において、本発明はワクチンの有効性に対して分子構造体をスク
リーニングする方法を提供し、該方法は非ヒトトランスジェニック哺乳動物を(a
)包膜ウイルスのエンベロープタンパク質と、(b)1以上の細胞膜性タンパク質と
、の会合の結果として形成されるエピトープを含む分子構造体で免疫し（このエ
ンベロープタンパク質および細胞膜性タンパク質は、適当な条件下で、該ウイル
スのエンベロープと該細胞膜性タンパク質を含む細胞膜とが融合するのに必要か
つ十分なものである）、ここで該非ヒトトランスジェニック哺乳動物は1以上の
導入遺伝子から該1以上の宿主細胞性膜タンパク質を発現し、さらに該哺乳動物
によって産生された該ウイルスに対する任意の中和抗体を検出することを含んで
なる。好ましい実施形態において、分子構造体は単離されたものである。
【０２７０】 特定の実施形態において、本発明はワクチンの有効性に対して分子構造体をス
クリーニングする方法を提供し、該方法は非ヒトトランスジェニック哺乳動物を
(a)HIVのエンベロープタンパク質、またはウイルスのエンベロープ中に構築され
るその変異体と、(b)ヒトCD4およびHIV融合体に対するコレセプターと、の会合
の結果として形成されるエピトープを含む分子構造体で免疫し、ここで該非ヒト
トランスジェニック哺乳動物は1以上の導入遺伝子からヒトCD4およびHIVに対す
るコレセプターの両方を発現し、さらに該哺乳動物によって産生されたHIVに対
する任意の中和抗体を検出することを含んでなる。好ましい実施形態において、
哺乳動物はマウスである。別の好ましい実施形態において、分子構造体は単離さ
れたものである。
【０２７１】 5.8. 抗体の用途 本発明の抗体のワクチン形成によって産生された抗体を、当技術分野で公知の
方法に用いることができる。例えば、本発明のFRMSを用いた免疫によりFRMSまた
はワクチン免疫原に対して産生された抗体もまた、診断用イムノアッセイ、受動
的免疫治療、ウイルス汚染除去、抗ウイルス治療および予防ならびに抗イディオ
タイプ抗体の産生等の可能性のある用途を有する。
【０２７２】 本発明はまた、診断アッセイおよびキットにおいて比較標準として有用な抗体
および構成要素を含む本発明のFRMSの新規エピトープによってもたらされる抗体
を包含する。さらに、本発明のFRMSに対するmAbをin vitroおよびin vivoバイオ
アッセイ用の比較標準、診断薬として、ならびに結合および融合における重大な
決定基用のマーカーとして用いることができる。例えば、本発明のFRMSを大スケ
ールで産生する際に、本発明のmAbはそれぞれのバッチまたはロットにおいて産
生したFRMSの量を測定するのに有用である。この実施形態においては、mAbを用
いてロット間の量の変動を（例えば、ELISA、またはmAbを用いるRIAによって）
測定してもよい。別法として、標識したFRMSを、FRMSに特異的なmAbとの結合に
対する試験FRMSを用いた拮抗アッセイによって使用してもよい。
【０２７３】 同様のアッセイを用いて被験体由来の血清サンプルの抗体力価を決定してもよ
い。かかるアッセイにおいて、被験体由来の血清サンプルを本発明のワクチン投
与伍のある時点で採取する。次いで血清サンプルのウイルスを中和する能力を試
験する。血清についてはまた、免疫原FRMSに結合する能力、または免疫原FRMSへ
の結合に対して中和mAbと拮抗する能力を試験してもよい。ウイルスを中和する
かまたはFRMSと結合する血清サンプルの能力がないかまたはその能力が弱いこと
は、FRMS免疫原による追加のワクチン接種を被験体に行うことが望ましいことを
示している。従って、本発明は、ある量の分子構造体を先に投与した被験体にお
いて分子構造体に対する抗体の産生をモニターする方法を提供し、該方法は該被
験体から血清を含むサンプルを単離し、さらに該血清において分子構造体に対す
るいずれかの抗体の存在を検出することを含んでなる。ある実施形態において、
分子構造体に対して標識した抗体で拮抗イムノアッセイを行うことを含んでなる
方法によって検出を行う。
【０２７４】 さらに、ウイルス感染およびその結果の治療または予防のために、ポリクロー
ナル血清またはモノクローナル抗体を個体に投与することができる。特定の実施
形態において、暴露後の予防のため、または受動免疫によって母親のウイルスが
新生児に移行するのを防ぐために、かかる抗体を投与することができる。本発明
のヒト化mAbを母親から幼児へのウイルス感染の防御に、または暴露後の予防も
しくは治療に用いることができる。本発明のmAbはまた、HIV感染のhu-PBL-scid
マウスモデルでの受動免疫の研究において、およびアカゲザル(rhesus macaques
)でのSHIV研究において有用である。従って、本発明はヒト胎児においてHIVによ
る感染を治療または予防する方法を提供し、該方法は該胎児においてHIVによる
感染を治療または予防するために有効な量のモノクローナル抗体を該胎児を身ご
もった妊娠ヒトに投与することを含んでなる。
【０２７５】 本発明のFRMSに対するmAbの産生を利用して、さらに生化学的および免疫化学
的な感染経路を描写し、そしてPIウイルス中和にとって重大なエピトープを定義
することができる。本発明のFRMSに対して産生されたモノクローナル抗体（mAb
）を用いて結合および侵入に関する生化学的根拠、ならびに一次分離株のウイル
ス中和に関する免疫化学的根拠を詳細に吟味することができる。この実施形態に
おいて、免疫原はワクチン接種モデルでの免疫原性研究において優れたmAb開発
品を選ぶべきであり、それらは有効性があって広範囲の一次分離株のウイルス中
和抗体をもたらす。
【０２７６】 本発明の抗体は抗イディオタイプ抗体の産生に使用することもできる。次いで
病原性微生物の一次抗原と結合する抗体の小集団を作るために、抗イディオタイ
プ抗体を順次免疫に使用することができる(Jerne, 1974, Ann. Immunol. (Paris
) 125e:373; Jerneら, 1982, EMBO J. 1:234)。
【０２７７】 さらに、mAbを血液および血液製剤中の抗ウイルス剤として使用することもで
きる。本発明は、ウイルスで汚染されているかまたは汚染されていると疑われて
いる血液または血液製剤の汚染除去用添加剤として有効である中和抗体を提供す
る。例えば、本発明のmAbは、患者の治療に使用すべきドナー血液（例えば、血
液バンク内の血液）への添加剤として有効である。本発明のmAbは、血液を採集
する袋、手袋、血液サンプル採集容器等への添加剤として有効である。本発明の
特定の実施形態において、本発明の1以上のmAbを用い、周産期感染を防ぐために
、子どもを出産する前に産道を浄化する。血液および血液製剤用添加剤としての
本発明のmAbの有効量は、1μg/ml〜10mg/mlを含む。当業者には明らかなことで
あるが、有効量は、抗体の親和性、添加剤、および製剤に影響される。有効量が
ウイルス感染を阻止する（例えば、減少させるまたは防ぐ）ことができるような
任意の量を使用してもよい。好ましい実施形態において、種々のウイルスに対す
る中和mAbの混合物を汚染除去に使用する。特定の実施形態において、かかる血
液を受容者に輸血する前に、HIVに対して免疫特異的である本発明の中和mAbの有
効量をヒト血液のサンプルに添加する。この実施形態においては、HIVをmAbによ
って中和する。従って、本発明は、ウイルスによる感染を阻止または減少させる
ために有効な量の抗体を添加した哺乳動物血液のサンプルを提供する。特定の実
施形態においては、本発明は、HIVによる感染を阻止または減少させるために有
効な量の抗体を添加したヒト血液のサンプルを提供する。本発明はまた血液のサ
ンプルにおいてウイルスによる感染を阻止する方法を提供し、該方法は該血液の
サンプルを該ウイルスによる感染を阻止するために有効な量のモノクローナル抗
体と接触させることを含んでなる。特定の実施形態においては、本発明はヒト血
液のサンプルにおいてHIVによる感染を阻止する方法を提供し、該方法は該ヒト
血液のサンプルをHIVによる感染を阻止するために有効な量のモノクローナル抗
体と接触させることを含んでなる。
【０２７８】 本発明の中和抗体はまた、抗体が向けられているウイルスに暴露されたいかな
る物体の汚染除去にも有効である。本発明のmAbで汚染除去され得る物体には、
限定されないが、（ドリル、ピック、外科用メス等の）手術のおよび歯科の道具
が含まれる。好ましい実施形態において、種々のウイルスに対する中和mAbの混
合物を汚染除去に使用する。好ましい実施形態において、容易に処分できない物
体（例えば、コンピュータ補助器具、ロボット補助器具、特殊化した道具等）を
、本発明の1種以上のmAbで汚染除去する。汚染除去のための本発明のmAbの有効
量は、1μg/ml〜10mg/mlを含む。当業者には明らかなことであるが、有効量は、
抗体の親和性、添加剤、および製剤に影響される。有効量が汚染除去後のウイル
ス感染を阻止できるような任意の量を使用してもよい。特定の実施形態において
は、汚染除去でHIVが中和される。従って、本発明は手術のおよび歯科の道具を
汚染除去する方法を提供し、該方法は該道具を該ウイルスによる感染を阻止する
ために有効な量のモノクローナル抗体と接触させることを含んでなる。特定の実
施形態においては、本発明は手術のおよび歯科の道具を汚染除去する方法を提供
し、該方法は該道具をHIVによる感染を阻止するために有効な量のモノクローナ
ル抗体と接触させることを含んでなる。
【０２７９】 本発明の別の実施形態においては、FRMSに向けられた抗体を用いて抗体によっ
て認識されるエピトープを含む分子をスクリーニングしてもよい。例えば、本発
明のmAbを用い、抗体に認識されるエピトープの存在下で小分子をスクリーニン
グすることができる。mAbと小分子との1つの結合が、小分子上にかかるエピトー
プが存在することを示す。かかる小分子を順次免疫原または治療薬として可能性
があるものとして試験してもよい。もう１つの実施形態においては、本発明のmA
bを用いて（例えば、ファージ提示ライブラリーから）抗体に結合するペプチド
を同定してもよい。かかるペプチドを、例えば免疫原性について（すなわち、ミ
メトープ(mimetopes)として）試験してもよい。
【０２８０】 本発明のmAbはまた、避妊薬または殺菌製剤中の抗ウイルス薬としても有効で
ある。避妊薬または殺菌製剤に本発明の1以上のmAbを添加することは、性感染す
ることが知られているウイルスに特に好ましい。従って、本発明は、本発明の1
以上の中和mAbを有効量含む避妊薬を提供する。本発明のmAbを添加してもよい避
妊薬または殺菌製剤には、限定されないが、クリーム、フォーム、ゼリー、軟膏
、コンドーム、隔膜等が含まれる。避妊薬はさらに殺精子剤を含んでもよい。好
ましい実施形態において、種々のウイルスに対する中和mAbの混合物を避妊薬に
用いる。避妊薬または殺菌製剤としての本発明のmAbの有効量は、1μg/ml〜10mg
/mlを含む。当業者には明らかなことであるが、有効量は、抗体の親和性、添加
剤、および製剤に影響される。有効量がウイルス感染を阻止する（例えば、減少
させるまたは防ぐ）ことができるような任意の量を使用してもよい。例えば、抗
ウイルス性避妊薬に使用するためには、有効量はウイルスの性的伝播による暴露
の際の感染を阻止することができる量である。特定の実施形態においては、避妊
薬または殺菌製剤は、HIVまたはその他の性感染するウイルスに対して免疫特異
的な本発明のmAbを含む。従って、本発明は、ウイルスによる感染を阻止または
減少ために有効な量の本発明の抗体を含んでなる、ゼリー、フォーム、クリーム
、または軟膏の剤形の避妊薬または殺菌製剤を提供する。特定の実施形態におい
て、本発明は、HIVによる感染を阻止または減少させるには効力の無い量の抗体
を含んでなる、ゼリー、フォーム、クリーム、または軟膏の剤形の避妊薬または
抗菌製剤を提供する。
【０２８１】 5.9. 治療用組成物 本発明は、FRMSの投与によって被験体中に抗FRMS抗体の産生を誘導する方法を
提供する。本発明のFRMS、並びにこれらの機能上活性な断片、類似体および誘導
体；本発明のFRMSをコードする核酸、並びにこれらの機能上活性な断片および誘
導体；並びにFRMSへ免疫特異的に結合する抗体は、いずれも「治療薬」として使
用することができる。
【０２８２】 本発明はまた、医薬組成物を提供する。このような組成物は、治療上有効な量
の治療薬および製薬上許容し得る担体を含んでなるものである。特定の実施形態
では、用語「製薬上許容し得る」とは、動物(特に、ヒト)における使用について
、連邦政府もしくは州政府の規制局によって認可されているか、または米国薬局
方もしくは他の一般に認められている薬局方に記載されていることを意味する。
用語「担体」とは、治療薬とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤ま
たは媒介物(vehicle)をいう。このような医薬用担体は、水および、石油、動物
油、植物油または合成油等の油といった滅菌液体であってよく、例えば、ラッカ
セイ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等が挙げられる。医薬組成物を静脈内投与する場
合には、水が好適な担体である。特に注射用溶液に対しては、食塩水、デキスト
ロース水溶液およびグリセロース水溶液を液体担体として使用することもできる
。適切な医薬用賦形剤としては、デンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチ
ン、麦芽、コメ、穀粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノ
ステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール
、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。必要であれば、該組
成物は、少量の湿潤剤、乳化剤またはpH調整剤を含んでいてもよい。このような
組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、徐放性製剤等
の剤形をとることができる。組成物は、慣用の結合剤およびトリグリセリド等の
担体と共に坐剤として製剤化することも可能である。経口製剤には、医薬品等級
のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナト
リウム、セルロース、炭酸マグネシウムといった標準的な担体が含まれる。適切
な医薬用担体の例は、E.W.Martin著「Remington’s Pharmaceutical Sciences」
に記載されている。このような組成物には、治療上有効な量の治療薬が、好まし
くは精製された状態で、適切な量の担体と共に含有され、患者への投与に適した
剤形とされる。製剤は、投与方法に適したものでなければならない。
【０２８３】 好適な実施形態では、該組成物を、慣用の手順にて、ヒトへの静脈内投与に適
した医薬組成物として製剤化する。典型的には、静脈内投与用組成物は、水性の
滅菌等張緩衝液に溶解した溶液である。必要であれば、組成物に可溶化剤とリド
カイン等の局所麻酔剤とを含有させて注射部位の痛みを和らげることも可能であ
る。一般に、各成分は別々に供給されるか、または、ともに混合して単位剤形と
して供給され、例えば、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として、活性薬剤の量
を表示したアンプルまたはサッシェ等の容器内に密閉した状態で供給される。組
成物を点滴によって投与する場合には、医薬品等級の滅菌水または滅菌食塩水を
含む点滴用ボトルを用いて投薬することが可能である。組成物を注射によって投
与する場合には、注射用滅菌水または滅菌食塩水のアンプルを用意して、投与前
に成分どうしを混合すればよい。
【０２８４】 本発明の治療薬は、中性または塩の状態で製剤化することができる。製薬上許
容し得る塩としては、遊離のアミノ基を利用して形成したもの(例えば、塩酸、
リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等から誘導した塩)および遊離のカルボキシル
基を利用して形成したもの(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸
化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリ
エチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導
した塩)が挙げられる。
【０２８５】 5.10. 遺伝子治療 遺伝子治療とは、核酸分子を被験体へ投与することによって行なわれる治療法
をいう。本発明のこの実施形態では、核酸分子は、該核酸分子にコードされたタ
ンパク質を産生し、in vivoにおけるFRMSの形成を介して治療効果を発揮する。
【０２８６】 特定の実施形態では、会合によって本発明のFRMSまたはその機能的誘導体をも
たらす１つ以上の成分をコードする配列を含んでなる核酸分子を、遺伝子治療を
利用して投与し、FRMSに対する免疫学的応答を惹起する。さらに特定の実施形態
では、包膜ウイルスのウイルスエンベロープタンパク質、宿主細胞レセプターお
よび宿主細胞コレセプターもしくはその機能的誘導体をコードする１つ以上の核
酸を、遺伝治療を利用して投与する。別の実施形態では、包膜ウイルスのウイル
スエンベロープタンパク質を、遺伝子治療を利用して投与する。
【０２８７】 当該技術分野で利用可能な遺伝子治療の方法は、いずれも本発明に従って利用
できる。代表的な方法を以下に記載する。
【０２８８】 遺伝子治療の方法に関する総説としては、Goldspielら, 1993, Clinical Phar
macy 12:488-505；WuおよびWu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993,
Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:9
26-932；MorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；並び
にMay, 1993, TIBTECH 11:155-215を参照されたい。組換えDNA技術に関する当該
技術分野で一般に知られている利用可能な方法は、Ausubelら(編), 1993, Curre
nt Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY)およびKriegler,
1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press
, NYに記載されている。
【０２８９】 好適な特定の実施形態では、治療薬は、HIVエンベロープタンパク質、ヒトCD4
レセプター、および適切な宿主のコレセプター(ケモカインレセプターCCR5また
はCXCR4等)を含んでなるものである。別の特定の実施形態では、天然のCD4と天
然のコレセプターを発現する被験体へHIVエンベロープタンパク質のコード配列
を送達する核酸分子を使用する。
【０２９０】 核酸の患者への送達は、患者を核酸または核酸保有ベクターへ直接接触させる
直接的なものであってもよく、また、最初にin vitroにて細胞を核酸で形質転換
し、次いで患者へ移植する間接的なものであってもよい。これらの２つのアプロ
ーチはそれぞれ、in vivo遺伝子治療およびex vivo遺伝子治療として知られてい
る。
【０２９１】 特定の実施形態では、核酸をin vivoにて直接投与して発現させ、コード産物
を産生させる。このことは、当該技術分野で公知の数多くの方法のいずれによっ
ても達成可能であり、例えば、該核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構
築し、欠損もしくは弱毒化レトロウイルスベクターまたは他のウイルスベクター
を用いて感染させるか(米国特許第4,980,286号参照)、裸のDNAを直接注入するか
、微小粒子照射(例えば、遺伝子銃；Biolistic；Dupont)を利用するか、脂質も
しくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤で被覆するか、リポソー
ム、微粒子もしくはマイクロカプセルへカプセル化するか、核へ侵入することが
知られているペプチドへ結合させて投与するか、あるいはレセプター介在型エン
ドサイトーシスを受けるリガンドへ結合させて投与する(例えば、WuおよびWu, 1
987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照；該レセプターを特異的に発現する
細胞型へのターゲティングに利用可能)ことによって投与し、該核酸を細胞内在
性とすることで達成し得る。別の実施形態では、核酸-リガンド複合体を形成し
てもよく、この場合、該リガンドはエンドソームを破壊する融合誘導ウイルスペ
プチドを含むものであり、核酸のリソソーム分解が回避される。さらに別の実施
形態では、特定のレセプターを標的とすることで、核酸をin vivoにて細胞に特
異的に取込ませて発現させることができる(例えば、国際特許公報WO92/06180(Wu
ら)、WO92/22635(Wilsonら)、WO92/20316(Findeisら)、WO93/14188(Clarkeら)お
よびWO93/20221(Young)を参照)。あるいは、核酸を細胞内へ導入し、相同組換え
によって宿主細胞DNAへ組込んで発現させることもできる(KollerおよびSmithies
, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935, Zijlstraら, 1989, Natur
e 342:435-438)。
【０２９２】 特定の実施形態では、ウイルスのエンベロープタンパク質をコードする核酸を
含有するウイルスベクターと、宿主の細胞性膜タンパク質(例えば、宿主細胞レ
セプター)を利用する。第5.1.2節に記載したウイルスベクターは、いずれも遺伝
子治療目的に使用することができる。例えば、レトロウイルスベクターが使用で
きる(Millerら, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599を参照)。これらのレトロウ
イルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングと宿主細胞DNAへの組込み
には必要のないレトロウイルス由来の配列を欠失するように改変されている。遺
伝子治療におけるレトロウイルスベクターの利用を例示する他の文献としては、
Clowesら, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651, Kiemら, 1994, Blood 83:1467
-1473, SalmonsおよびGunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141,並びにG
rossmanおよびWilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114
が挙げられる。
【０２９３】 第5.1.2節に記載したように、アデノウイルスは、遺伝子治療に使用し得るそ
の他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、気道上皮への遺伝子送達用
媒介物として特に注目されている。アデノウイルスは、通常気道上皮へ感染して
軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスを利用した送達系のその他の標的は、
肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスには、非分裂
細胞へ感染し得るという利点がある。KozarskyおよびWilson, 1993, Current Op
inion in Genetics and Development 3:499-503には、アデノウイルスを利用し
た遺伝子治療についての総説が掲載されている。Boutら, 1994, Human Gene The
rapy 5:3-10には、アデノウイルスベクターを利用して遺伝子をアカゲザルの気
道上皮へ導入したことが示されている。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使
用に関する他の例は、Rosenfeldら, 1991, Science 252:431-434, Rosenfeldら,
1992, Cell 68:143-155およびMastrangeliら, 1993, J. Clin. Invest. 91:225
-234に見られる。
【０２９４】 アデノ関連ウイルス(AAV)も、遺伝子治療における利用が提案されている(Wals
hら, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300)。
【０２９５】 遺伝子治療に対する別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェク
ション、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、またはウイルス感染等
の方法によって遺伝子を組織培養細胞へ導入するものである。遺伝子を細胞へ導
入するための当該技術分野で公知の方法は、いずれも本発明の遺伝子治療態様と
併用可能であり、例えば、第5.1.2節に記載した方法が挙げられるが、これに限
定されない。一般に、導入方法には選択マーカーの細胞への導入が含まれる。次
いで細胞を選択条件下におき、導入された遺伝子を取込んで発現している細胞を
単離する。次いでこのような細胞を患者へ送達する。
【０２９６】 この実施形態では、核酸を細胞へ導入した後、得られた組換え細胞をin vivo
にて投与する。このような導入は、当該技術分野で公知のいずれの方法によって
も実施可能であり、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、
マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオ
ファージベクターによる感染、細胞融合、染色体を介した遺伝子導入、微小核細
胞を介した遺伝子導入、スフェロプラスト融合等が挙げられるが、これらに限定
されない。外来遺伝子を細胞へ導入するための数多くの技術が当該技術分野で公
知であり(例えば、LoefflerおよびBehr, 1993, Meth. Enzymol.217:599-618, Co
henら, 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644, Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29:
69-92を参照)、レシピエント細胞に必要な発生および生理学的機能を破壊しない
ものであれば本発明に従って使用できる。このような技術は、核酸を細胞へ安定
して導入するものでなければならず、その結果、核酸は細胞中で発現可能となり
、細胞の子孫でも遺伝かつ発現可能となる。
【０２９７】 得られた組換え細胞は、当該技術分野で公知の様々な方法によって患者へ送達
することができる。好適な実施形態では、上皮細胞を例えば皮下注射する。別の
実施形態では、組換え皮膚細胞を皮膚移植片として患者へアプライしてもよい。
組換え血液細胞(例えば、造血幹細胞または造血始原細胞)は、好ましくは静脈内
へ投与する。使用が見込まれる細胞の量は、所望の効果、患者の状態等に依存し
、当業者であれば決定できる。
【０２９８】 遺伝子治療の目的で核酸を導入し得る細胞には、入手可能な任意の所望の細胞
型が含まれ、例えば、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、繊維芽細胞、筋肉細胞、
肝細胞、およびＴリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸
球、巨核球、顆粒球等の血液細胞；各種幹細胞または始原細胞、特に造血幹細胞
または造血始原細胞、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓等から得られ
る細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９９】 好適な実施形態では、遺伝子治療に使用される細胞は、患者の自己由来の細胞
である。
【０３００】 組換え細胞を遺伝子治療に使用する実施形態では、会合によってFRMSの形成を
もたらす成分をコードする核酸分子を使用する。特定の実施形態では、例えば核
酸は、HIVウイルスのエンベロープタンパク質、ヒトCD4およびコレセプター(ケ
モカインレセプターCCR5またはCXCR4等)をコードするものである。該コード核酸
分子を、遺伝子が細胞またはその子孫において発現可能となるように細胞へ導入
し、次いで組換え細胞をin vivoにて投与することで治療効果を発揮させる。特
定の実施形態では、幹細胞または始原細胞を使用する。場合によっては、in vit
roにて単離かつ維持可能な任意の幹細胞および／または始原細胞も、本発明のこ
の実施形態に従って使用できる。このような幹細胞としては、造血幹細胞(HSC)
、皮膚や消化管の内層等の上皮組織の幹細胞、胎児の心筋細胞、肝臓幹細胞(国
際特許公報WO94/08598)および神経幹細胞(StempleおよびAnderson, 1992, Cell
71:973-985)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０１】 特定の実施形態では、遺伝子治療の目的で導入すべき核酸は、コード領域に機
能し得る形で連結された誘導プロモーター(第5.1.2節参照)を含んでなるもので
あり、これにより、適切な転写インデューサーの有無を制御することによって該
核酸の発現が制御可能となる。
【０３０２】 別の方法を改変して、本発明のFRMSの形成をもたらす成分をコードする核酸分
子の送達に利用できるようにすることは、当業者には明らかであり、本発明の範
囲内である。
【０３０３】 従って、本発明は、被験体におけるウイルス感染の治療または予防方法を提供
する。この方法は、(a)包膜ウイルスのエンベロープタンパク質をコードする第
１の核酸と、(b)１以上の細胞性膜タンパク質をコードする第２の核酸を被験体
へ投与することを含み、該エンベロープタンパク質と細胞性膜タンパク質は、適
当な条件下で、前記ウイルスのエンベロープと前記細胞性膜タンパク質を含む細
胞膜とが融合するのに必要かつ十分なものであって、これにより、エンベロープ
タンパク質と細胞性膜タンパク質が被験体中で発現し、ウイルスに対する中和抗
体が産生される。実施形態の１つとしては、第１および第２の核酸は同一のもの
である。別の実施形態としては、第１および第２の核酸は異なる核酸ベクターで
ある。特定の実施形態としては、エンベロープタンパク質がHIVのエンベロープ
タンパク質であり、細胞性膜タンパク質がCD4およびHIVのコレセプターである。
【０３０４】 5.11. 投与方法 本発明は、治療を必要とする被験体へ治療上または予防上有効な量の本発明の
治療薬を投与することによって、ウイルス感染とウイルス疾患とを治療および予
防する方法を提供する。被験体は好ましくは動物であり、例えば、サル、ウシ、
ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等の動物が挙げられるが、これらに限定され
ない。被験体は好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。特定の
実施形態では、被験体はHIV感染に罹患していないヒトである。
【０３０５】 様々な送達系が知られており、本発明の治療薬の投与に使用できる(例えば、
リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、治療薬を発現し得る組
換え細胞、レセプター介在型エンドサイトーシス(例えば、Wuら, 1987, J. Biol
. Chem. 262:4429-4432を参照)、レトロウイルスベクターもしくは他のベクター
の一部としての治療薬核酸の構築等)。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔
内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口といった経路が挙げられるが、
これらに限定されない。化合物は、点滴またはボーラス注射、上皮内層または粘
膜皮膚内層からの吸収(例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜等)といった都
合のよい任意の経路によって投与することが可能であり、他の生物学的に活性な
薬剤と一緒に投与してもよい。投与は全身または局所のいずれであってもよい。
さらに、抗体を含む本発明の医薬組成物を、脳室内およびクモ膜下注射といった
任意の適切な経路によって中枢神経系へ導入するのが望ましく、脳室内注射は、
例えばレザバー(オマヤレザバー等)に連結させた脳室内カテーテルを用いれば容
易である。経肺投与を利用してもよく、例えば、吸入器やネブライザーを使用し
たり、エアロゾル化剤と配合すればよい。
【０３０６】 特定の実施形態では、抗体を含んでなる本発明の医薬組成物を治療の必要な個
所へ局所的に投与するのが望ましく、例えば、局所適用、注射、カテーテル、坐
剤、またはインプラント等によって実施することが可能であるが、これらに限定
されない。前記インプラントは、多孔質、非多孔質もしくはゼラチン状の材料(
例えば、サイラスティック(sialastic)膜)または繊維である。極めて特定の実施
形態では、本発明の医薬組成物を、HIVへの接触が疑われるヒトの開放創へ投与
する。
【０３０７】 別の実施形態では、治療薬を小胞(特に、リポソーム)へ封入して送達してもよ
い(Langer, 1990, Science 249:1527-1533；Treatら, 1989, Liposomes in the
Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-BeresteinおよびFidler(編
), Liss, New York, pp.353-365；Lopez-Berestein, Science, pp.317-327を参
照；一般にはScienceを参照)。
【０３０８】 さらに別の実施形態では、治療薬を制御放出系にて送達することが可能である
。実施形態の1つとしては、ポンプを利用してもよい(Langer,前出；Sefton, 198
7, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201；Buchwaldら, 1980, Surgery 88:507
；Saudekら, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照)。別の実施形態では、ポ
リマー材料を利用してもよい(Medical Applications of Controlled Release, L
angerおよびWise(編), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；Controlled D
rug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, SmolenおよびBa
ll(編), Wiley, New York (1984)；Rangerら, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. M
acromol. Chem. 23:61を参照、Levyら, 1985, Science 228:190；Duringら, 198
9, Ann. Neurol. 25:351；Howardら, 1989, J. Neurosurg. 71:105も参照のこと
)。さらに別の実施形態では、制御放出系を治療対象の近傍へ配置することが可
能であり、これにより、全身用量のごく一部で済ますことができる(例えば、Goo
dson, Medical Applications of Controlled Release, 1984,前出,vol.2, pp.11
5-138を参照)。
【０３０９】 その他の制御放出系は、Langerによる総説に記載されている((Langer, 1990,
Science 249:1527-1533)。
【０３１０】 組成物は、必要であれば、有効成分を含有する１以上の単位剤形を含むパック
または投薬用具の形態をとってもよい。パックは、例えば、ブリスターパックの
ような金属またはプラスチックのホイルを含んでいてもよい。パックまたは投薬
用具には、投与に関する指示を添付することができる。本発明の化合物を適切な
医薬用担体へ配合した組成物も、調製後に適当な容器へ封入し、症状の治療につ
いて表示することができる。
【０３１１】 5.12. HIVに対する有用性の証明 本発明は、HIV-FRMSに対する抗体の抗HIV効力を試験するアッセイを提供する
。本発明はさらに、ワクチン接種後の患者または被験体に由来する血清サンプル
中の抗体をアッセイすることによって、患者または被験体におけるFRMSのワクチ
ンとしての効力をモニターする方法を提供する。本発明の治療薬は、好ましくは
、in vitro次いでin vivoにて所望の治療活性または予防活性について試験を行
ってからヒトへ使用する。ウイルス感染またはウイルス産生を測定する当該技術
分野で公知のin vitroまたはin vivoアッセイは、いずれも本発明の治療薬の効
力を試験するのに使用できる。
【０３１２】 本発明の実施形態では、mAbを含んでなる調製物を抗HIV活性についてスクリー
ニングする方法を提供する。該アッセイは、前記調製物またはその一部をHIV感
染を抑制する能力についてアッセイすることを含んでなる。
【０３１３】 例えば、治療薬をin vitroでアッセイするには、培養細胞においてHIV感染に
対する治療薬の効果を検査すればよい。簡単に言うと、培養造血細胞(例えば、
初代PBMC、単離マクロファージ、単離CD4+Ｔ細胞または培養H9ヒトＴ細胞)へ、i
n vitroで細胞に急性感染を起こすことが当該技術分野で分かっている力価(例え
ば、105 TCID50/ml)にてHIV-1を急性感染させる。次いで、適量の治療薬を細胞
培養培地へ添加する。感染の３日および10日後に、HIV抗原のレベルをELISAアッ
セイを用いて測定することにより、培養物をHIV-1産生についてアッセイする。H
IV抗原のレベルが未処理対照で観察されるレベルよりも低下していれば、治療薬
がHIV感染の治療に有効であることが分かる。あるいは、市販の任意のHIV ELISA
を利用して、治療薬による処理の前後で比較アッセイを行ってもよい。
【０３１４】 さらに、HIV-1 LTRによって引き起こされる転写についてのアッセイも、本発
明の治療薬の効力を試験するのに有用である。具体的には、リポーター遺伝子(
即ち、産物であるタンパク質またはRNAの検出が容易な遺伝子)を、リポーター遺
伝子の転写がHIV-1 LTRプロモーターによって誘導されるようにDNAプラスミド構
築物へクローニングする。該リポーター遺伝子としては、例えばクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)の遺伝子が挙げられるが、これに限定
されない。次いで得られた構築物を、トランスフェクションまたは当該技術分野
で公知の他の任意の方法によって、ヒトCD4+Ｔ細胞系HUT78といった培養細胞系
へ導入する。形質転換細胞を治療薬へ接触させた後、当該技術分野で通常行なわ
れる技術を利用したCAT活性の測定によってHIV-1 LTRからの転写を判定する。HI
V-1 LTRによって引き起こされる転写が低下していれば、治療薬がHIV感染の治療
および／または予防に有用であることが分かる。
【０３１５】 モデル動物における代表的な試験は、本明細書中、第5.7.1節に記載されてい
る。
【０３１６】 本発明の治療薬の効力は、SIVに感染したアカゲザル(Letrin, N.L.ら, 1990,J
.AIDS 3:1023-1040を参照)、特に、実験的に感染を起こさせたサルにヒトAIDSに
よく似た症候群を引き起こすSIVmac251に感染したアカゲザル(Kestler, Hら, 19
90, Science 248:1109-1112)でも判定できる。具体的には、細胞不含SIVmac251
を、例えば104.5 TCID50/mlのウイルス力価でサルへ感染させる。PBMCにおけるS
IV p27抗原の出現によって感染をモニターする。治療薬の有用性は、正常な体重
増加、PBMC中のSIV力価の低下およびCD4+Ｔ細胞の増加によって判定する。ある
いは、HIVのenvタンパク質をSIVの骨格へ組込んだSHIVモデルを使用する。実施
形態の1つでは、HIV envを発現する細胞とアカゲザルのCD4およびCCR5コレセプ
ターを発現する細胞とを含んでなるFRMSワクチンを用いてサルを免疫する。in v
itroで適切な中和が得られたら、次いで、中和感受性HIV envを保有する感染性S
HIVウイルスによって動物をチャレンジする。具体的には、１以上のFRMSを含ん
でなる免疫原でサルをワクチン接種し、SHIV 89.6P一次分離株で免疫性のテスト
をする(例えば、Montefioriら, 1998, J Virol. 72:3427-31を参照)。
【０３１７】 治療薬をin vitroおよび好ましくは非ヒトモデル動物で試験した後、ヒト被験
者において治療薬の有用性を判定することができる。治療薬による治療の効力は
、HIV感染およびHIV関連疾患の各種パラメータを測定することで評価できる。具
体的には、定量的RT-PCRを用いて血漿HIV-1 RNAを定量的にアッセイするか(Van
Gemen, B.ら, 1994, J. Virol. Methods 49:157-168；Chen, Y.H.ら, 1992, AID
S 6:533-539)、または、単離PBMCからのウイルス産生をアッセイすることによっ
て、ウイルス負荷(viral load)の変化を判定すればよい。PBMCからのウイルス産
生は、被験体由来のPBMCを非感染PBL細胞と共培養し、次いでp24抗原レベルに対
するELISAアッセイを利用してHIV-1力価を測定することで判定する(例えば、Wri
n, Tら, 1995, Science 69:39；Popovic, Mら, 1984, Science 204:497-500を参
照)。治療薬の投与も、CD4+Ｔ細胞レベルの変化、体重変化、またはHIV感染もし
くはAIDSもしくはAIDS関連合併症(ARC)に関連する他の任意の身体的状態の変化
を評価することで判定できる。HIVウイルス負荷もしくはHIVウイルス産生の低下
、CD4+Ｔ細胞の増加またはHIV関連症状の改善が認められれば、治療薬の投与がH
IV感染の治療／予防に有用であることが分かる。
【０３１８】 5.13. キット 本発明はまた、融合許容タンパク質複合体またはこのような複合体によって生
起される抗体を含んでなるキットに関する。目的の複合体または抗体を含むキッ
トを使用して、ワクチンのロットを分析したり、安定性の研究を行なったり、ワ
クチンの販売条件を開発したりすることが可能である。抗体および複合体を診断
キットに使用して、宿主系における抗体またはウイルスの有無を検出することも
できる。例えば、標準的な診断酵素免疫測定法(ELISA)または競合ELISAを行うキ
ットにおいて、抗体または目的の複合体を基質または試薬として使用することが
可能である。
【０３１９】 本発明はまた、本発明のワクチン製剤の１以上の成分を含む１つ以上の容器を
含んでなる医薬品パックまたはキットを提供する。このような容器には、医薬品
または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府の規制局によって規
定されている形式で注意書きを添付することができる。該注意書きは、ヒトへの
投与に対する製造、使用または販売に関する規制局の認可を反映したものである
。
【０３２０】 実施形態の1つでは、本発明は、１つ以上の容器に、(a)包膜ウイルスのエンベ
ロープタンパク質と、(b)１以上の細胞性膜タンパク質と、の会合の結果として
形成されるエピトープを含む分子構造体に対する標識モノクローナル抗体を含ん
でなるキットを提供する。該エンベロープタンパク質と細胞性膜タンパク質は、
適当な条件下で、前記ウイルスのエンベロープと前記細胞性膜タンパク質を含む
細胞膜とが融合するのに必要かつ十分なものである。さらなる実施形態では、本
発明は、別の容器に、(a)包膜ウイルスのエンベロープタンパク質と、(b)１以上
の細胞性膜タンパク質と、の会合の結果として形成されるエピトープを含む分子
構造体をさらに含んでなるキットを提供する。該エンベロープタンパク質と細胞
性膜タンパク質は、適当な条件下で、前記ウイルスのエンベロープと前記細胞性
膜タンパク質を含む細胞膜とが融合するのに必要かつ十分なものである。
【０３２１】 特定の実施形態では、本発明は、１つ以上の容器に、(a)集合してウイルスエ
ンベロープとなるHIVエンベロープタンパク質またはその変異体と、(b)ヒトCD4
およびHIV融合のためのコレセプターと、の会合の結果として形成されるエピト
ープを含む分子構造体に対する標識モノクローナル抗体を含んでなるキットを提
供する。さらなる実施態様では、本発明は、別の容器に、(a)集合してウイルス
エンベロープとなるHIVエンベロープタンパク質またはその変異体と、(b)ヒトCD
4およびHIV融合のためのコレセプターと、の会合の結果として形成されるエピト
ープをさらに含んでなるキットを提供する。
【０３２２】 実施形態の1つでは、本発明は、１つ以上の容器に、(a)包膜ウイルスのエンベ
ロープタンパク質と、(b)１以上の細胞性膜タンパク質と、の会合の結果として
形成されるエピトープを含む分子構造体を含んでなるキットを提供する。該エン
ベロープタンパク質と細胞性膜タンパク質は、適当な条件下で、前記ウイルスの
エンベロープと前記細胞性膜タンパク質を含む細胞膜とが融合するのに必要かつ
十分なものである。好適な実施形態では、前記分子構造体は単離されたものであ
る。さらなる実施形態では、本発明は、製薬上許容し得る担体をさらに含んでな
り、かつ前記分子構造体が免疫学的な量で含まれるキットを提供する。
【０３２３】 別の実施形態では、本発明は、１つ以上の容器に、(a)包膜ウイルスのエンベ
ロープタンパク質をコードする第１の核酸と、(b)１以上の細胞性膜タンパク質
をコードする第２の核酸とを含んでなるキットを提供する。該エンベロープタン
パク質と細胞性膜タンパク質は、適当な条件下で、前記ウイルスのエンベロープ
と前記細胞性膜タンパク質を含む細胞膜とが融合するのに必要かつ十分なもので
あって、これにより、エンベロープタンパク質と細胞性膜タンパク質が被験体中
で発現されて、ウイルスに対する中和抗体が産生される。
【０３２４】 ６． 実施例 本発明の発明者らは、rgp120ワクチンにおけるエンベロープタンパク質の提示
が静的であって、かつ機能的ではないのに比較して、能動感染におけるPIウイル
スを中和する能力が、機能的なエンベロープタンパク質の提示と関連していると
いう驚くべき発見をした。
【０３２５】 本明細書に記載したように、HIVエンベロープタンパク質は、一連の複雑なタ
ンパク質間相互作用と構造変化とを組織し、最終的にはウイルスと細胞膜とを融
合させて細胞に感染を引き起こすものである。エンベロープタンパク質はCD4へ
結合すると、複数のコレセプター分子のうちの１つ、主にCCケモカインレセプタ
ー５(CCR5)またはCXCケモカインレセプター４(CXCR4)との後続の相互作用が容易
になるようなコンフォメーション変化を受ける(Berger E.A., 1997, AIDS 11(別
冊A), S3；Moore, J.P.ら, 1997, Current Opinions in Immunology 9:551；Dor
anz, B.J.ら, 1997, Immunology Research 16:15)。メカニズムについては限定
しないが、いずれのコレセプターとの相互作用によっても、エンベロープタンパ
ク質のさらなるコンフォメーション変化と、膜貫通gp41サブユニットの疎水性融
合ドメインの露出が引き起こされ、その結果、近傍の細胞膜とウイルス膜とが融
合するようになる。このようなHIVの結合と侵入に関する動的なモデルに基づい
て、これらの機能的な中間構造体を明らかに包含するHIVワクチン用免疫原を本
発明の方法によって開発した。
【０３２６】 本明細書中に記載する実施例は、本発明の方法および組成物を例示するための
ものである。
【０３２７】実施例１ HIV-FRMS免疫原から単離した広範な１次単離体の中和反応 本発明の一例として、HIV結合および融合の際に発生する一過的な構造を捕捉
するHIVワクチン免疫原を生成した。トランスジェニックマウス免疫モデル内で
、ホルムアルデヒド固定全細胞ワクチンによって、異なる地理的場所および遺伝
的分類群Ａ〜Ｅから単離した24の１次HIV単離体のうちの23の感染力を中和する
ことが可能な抗体を惹起した。これらの融合依存性免疫原の開発により、臨床上
重要で、かつ広範な効果を有するHIVワクチンが提供される。
【０３２８】 本明細書中に記載したとおり、HIVエンベロープタンパク質は、一連の複雑な
タンパク質−タンパク質間の相互作用および構造的変化を調整し、最終的にはウ
イルスと細胞膜を融合させ、細胞を感染させる。こうしたメカニズムには限定し
ないが、エンベロープタンパク質は、CD4に結合すると構造変化を引き起こし、
次にいくつかのコレセプターのうちの１つ、すなわち主としてCCケモカイン受容
体5(CCR5)またはCXCケモカイン受容体4(CXCR4)との相互作用を促進する（Berger
, E.A., 1997, AIDS 11 (別冊 A), S3、Moore, J.P.ら, 1997, Current Opinion
s in Immunology 9:551、Doranz, B.J.ら, 1997, Immunology Research 16:15を
参照）。これらのうちいずれかのコレセプターとの相互作用によって、エンベロ
ープタンパク質におけるさらなる構造変化、および膜貫通gp41サブユニットの疎
水融合ドメインの露出が誘発され、次に並接する細胞とウイルス膜との融合が媒
介される。本実施例は、これらの機能性中間構造体を明確に組み込んだHIVワク
チン免疫原を開発する方法を具体的に説明するものである。
【０３２９】 エンベロープタンパク質の機能の１つの基準は、細胞−細胞間融合を媒介する
能力である。エンベロープタンパク質を発現する細胞を、CD4およびコレセプタ
ーを発現する細胞と共培養すると、6〜24時間後に多核融合細胞が形成される。
一例としては、広範なシンシチウム形成前にホルムアルデヒド架橋が起こること
により、結合および融合過程を捕捉できた。
【０３３０】FRMSの調製 こうした研究において、機能性エンベロープタンパク質は、Amsterdam コーホ
ート(ACH168.10; 168P)から得られたＴリンパ球PIウイルスから誘導された。ACH
168.10の分子性クローン化エンベロープ遺伝子を、pCR3.1-Uniプラスミド（Invi
trogen）を使ったPCRを利用して単離した（Tersmette, M.ら, 1989, Journal of
Virology 63:2118、Wrin, T.ら, 1995, Science 69:39、LaCasse, R.A.ら, 199
8, Journal of Virology 72:2491）。分子性クローン化エンベロープタンパク質
は、親シンシチウム誘導(SI)ウイルスと同様に、CCR5コレセプターおよびCXCR4
コレセプターの両方を利用する。
【０３３１】 Cos-7細胞をトランスフェクトさせてエンベロープタンパク質(COS-env)を発現
し、次にCD4およびCCR5コレセプター(U87-CD4-CCR5)を発現するヒトU87神経膠腫
細胞と共培養した。機能性168P(168P23)エンベロープ遺伝子を、当業界で公知の
方法により(例えばJordan, M.ら, 1996, Nucleic Acids Research 24:596参照)
、リン酸カルシウム沈殿(20μg DNA/106 細胞/10cm培養皿)によってCOS-7細胞(A
merican Type Culture Collection, Manassus, VA)にトランスフェクトした。２
日後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中0.5mM EDTAを使って一過的発現しているCOS
-7細胞を回収し、PBS中0.1mM EDTAを使用してU87-CD4-CCR5融合パートナーを調
製した(Hill, C.M.ら, 1997, Journal of Virology 71:6296)。10cmの培養皿中
の２種類の細胞（各細胞数1.5×106）を混合し、共培養を開始した。細胞−細胞
間融合に要した時間を微視的にモニタリングし、並行共培養においては免疫化学
染色（HIVIG）による観察を行なった(LaCasse, R.A.ら, 1998, Science 72:2491
)。シンシチウムがほとんどまたは全く形成されないことが明らかになってから
、共培養による培養物を、通常どおり4〜5時間ホルムアルデヒドで固定すること
によって回収した。
【０３３２】FRMSの捕捉 結合および融合過程における移行性中間物を捕捉するために、ごく少量の多核
細胞しか存在しないことが明らかになってから５時間後に、0.2％ホルムアルデ
ヒド中で、共培養物を固定した。具体的には、当業界に公知の方法 (Yamamoto,
J.K.ら, 1991, AIDS Research and Human Retroviruses 7:911、Verschoor, E.J
.ら, 1995, Veterinary Immunology and Immunopathology 46:139等参照)に従っ
て、PBS中0.2％ホルムアルデヒドを使用し、４℃で一晩、in situ固定した。次
に細胞を掻き取り、PBSで２度洗浄し、10％DMSOを含むPBS中で3×106細胞/0.1ml
の通常密度で再懸濁し、-80℃で冷凍保存するか、あるいは以下に記載するとお
りただちに免疫原として使用した。
【０３３３】FRMS免疫原を使用した免疫化 全細胞の調製に使用したホルムアルデヒドを、融合コンピテント(FC)またはFR
MS免疫原として使用した。これら免疫原の抗体を中和する能力を調べるためには
、ウイルスエピトープまたはウイルス誘導エピトープに対する免疫応答を制限す
ることが必要であった。あるいは、それ自体の感染力を停止させたCD4およびCCR
5に対する抗体を生成する必要があった。このため、ワクチンのヒト(hu)CD4およ
びCCR5コンピテントに対し免疫的に耐性のあるモデル動物を使用した。こうして
、huCD4およびhuCCR5コレセプターを発現するトランスジェニックマウスを使用
して免疫原性研究を行なった。
【０３３４】 CD4標的欠失およびhuCD4トランスジェニックマウスの構築については記載があ
る(Killeen, N.ら, 1993, EMBO Journal 12:1547)。huCCR5トランスジェニック
マウスの設計については以下のように要約される。1.15kb huCCR5 cDNAを、マウ
スCD4発現カセットのエキソン２に組み込まれた SaII部位に分子的にクローニン
グした(Sawadaら, 1994, Cell 77:917における構築物ｃ)。このミニジーンは、
マウスCD4エンハンサー、CD4プロモーター、第１（非コード）エキソンおよびイ
ントロン１を含んでおり、CD4サイレンサーの排除という１つの内部欠失を伴っ
ていた。形質転換した最初のマウスを、当業界で公知の方法に従ってmAbを用い
たフローサイトメトリーによって同定した。これらのマウスをhuCD4発現トラン
スジェニックマウスに交配させ、huCD4、huCD5およびマウスCD4を発現する子マ
ウスを得た。Coulter EPICS ELITE flow cytometerを用いるフローサイトメトリ
ーによって、子マウスのhuCD4、huCD5およびマウスCD4発現をスクリーニングし
た。以下の抗体試薬を使用した。マウスα-ヒトCD4/CyChrome(Pharmingen)、ヤ
ギα-マウスIg/FITC (Caltag)を含むマウスα-ヒトCCR5 MAB180(R&D Systems)、
およびラットα-マウス CD4 L3T4/PE。
【０３３５】 huCD4、huCCR5およびマウスCD4を発現するトランスジェニックマウスを、FRMS
免疫原または対照細胞 (単独の、または擬似トランスフェクトしたCOS細胞で共
培養したU87-CD4-CCR5細胞)のいずれかで免疫した。ワクチンは、同量のRibiア
ジュバンド(推奨される量の半分のPBSに再溶解したR-700）で調製したホルムア
ルデヒド固定全細胞(3×106細胞/0.1ml)を含んでおり、いくつかの実験では、細
胞壁物質を含有するアジュバンド(R-730)を使用して最初の免疫を行なった。マ
ウスの４つの皮下部位に0.05mlのワクチンを注射した。３週間毎に追加免疫を行
ない、免疫化から10〜28日後にマウスの尾から採血した。gp120に関連する血清
抗体を、当業界で公知の方法に従ってgp120 ELISAで定量化した(Moore, L.ら, 1
989, AIDS 3:155参照)。
【０３３６】ウイルス中和 同種の168Pウイルスの血清ワクチンによる中和への感受性を、CCR5またはCXCR
4コレセプターのいずれかを発現するU87-CD4細胞を使用して判定した。このPIウ
イルス中和アッセイは、PBL培養における標準中和アッセイを基準として有効性
が証明されており(LaCasse,R.A.ら, 1998, Science 72：2491、Follis, K.E.ら,
1998, Journal of Virology 72:7603)マウス血清の存在下でより機能すること
が確認された。中和アッセイに使用するに先だって、全血清を加熱によって不活
性化した。
【０３３７】 融合コンピテント（FC）および融合非コンピテント（FI）の血清ワクチンによ
る同種の168P PIウイルスの中和アッセイを以下のとおりに実施した。トランス
ジェニックマウス(huCD4+、huCCR5+、マウスCD4+)をFC免疫原（U87-CD4-CCR5を
含むCOS-env、四角、n=３マウス）または対照細胞（単独の、または擬似トラン
スフェクトしたCOS細胞で共培養したU87-CD4-CCR5細胞、円、n=３マウス）で免
疫した。さらに非免疫化マウスも同様に使用した（三角、n=２マウス）。CXCR4
（黒く塗りつぶした記号）またはCCR5（白抜きの記号）のいずれかを発現するU8
7-CD4細胞を使用し、168Pの中和について血清を検査した。データは、２度目、
３度目の免疫から２週間後に得た血清を使用した６回の中和アッセイのうち３回
の平均を示す。
【０３３８】 図１に示すように、ウイルス中和アッセイの結果からは、対照細胞で免疫した
マウスから得た血清ではいかなる感染阻害も認められず、またトランスジェニッ
クマウスは実際にhuCD4およびCCR5に対し耐性であり、その他の偶発的な細胞性
反応がウイルス感染アッセイを阻害することもなかったことが明らかである(図
１)。FRMS免疫原で免疫したマウス由来の血清は、同種の168P PIウイルスを中和
した。さらに中和活性が抗体介在型であることが判明し、こうした活性はプロテ
インＡおよびプロテインＧを含有する固体支持体に吸着したり、溶出することも
可能であった。具体的には、血清はプロテインＡセファロース(Sigma)およびプ
ロテインＧアガロース(Sigma)に４℃で逐次吸着した。抗体の吸着をgp120 ELISA
を使用して確認した。固体支持体を結合し、100mMグリシン(pH2.5)を使用して抗
体を溶出した。溶出物を中和し、超遠心濾過（Microcon-100、Amicon）で透析し
た。PBLアッセイにおけるFC血清による中和は99％を超えたが、U87-CD4-coR細胞
アッセイにおけるFC血清による中和は80〜90％であった。
【０３３９】 感受性PBL中和アッセイにおいて、「融合非コンピテント」血清ワクチンが、
「融合コンピテント」血清ワクチンには遠く及ばない値であったにせよ、一定の
PIウイルス複製阻害を示したことは興味深い(LaCasse, RAら, 1999, Science 28
3:357-62参照)。この最小効果は、rgp120血清ワクチンによるPIウイルス中和に
関する文献中に断続的に現れる主張を説明するものでもある(Devico, A, A Silv
erら, 1996, Virology 218:258-63、Berman, PWら, 1998, AIDS Res & Hum Retr
ovirus 14 (別冊 3) S277-S89)。現在のところ、PIウイルス間の中和感受性の相
違に関する分子的根拠は不明であり、系統発生分類群(phylogenetic clade grou
pings)自体と関係している可能性も考えられるが定かではない。血清型別の決定
基が、複数の分類群内に独立して発生することもある。こうしたことから、Ｂ以
外の分類群由来の「融合コンピテント」エンベロープタンパク質を、「融合コン
ピテント」中和血清型を定義する原型エンベロープタンパク質の数を経験的に決
定するのに使用してもよい。HIV血清型の総数に関係なく、単一代表的ではある
が適切に現れる分類群Ｂエンベロープタンパク質を使用することにより、被験PI
ウイルスの80％が強力に中和された（70％以上）ことは有意である。
【０３４０】CXCR４コレセプターのCCR5代用の可能性 U87-CD4細胞感染アッセイで使用されたコレセプターには関係なく、FC血清に
より168Pウイルスの中和が観察された（図１）。一般的に中和感受性と特定のコ
レセプターの使用とは無関係であるとの報告もなされている(LaCasse, R.A.ら,
1998, Science 72:2491、Trkola, A.ら, 1998, Journal of Virology 72:1876、
Montefiori, D.C.ら, 1998, Journal of Virology 72:3427、Follis, K.E.ら, 1
998, Science 72:7603)。
【０３４１】 動物を接触させていないコレセプターCXCR4を使用して、本実施例中で中和が観
察されたという事実から、中和はワクチンのCCR5成分を直接標的していないので
はないかという可能性が考えられる。さらに、CCR5の代わりにCXCR4コレセプタ
ーを使用できる可能性がある。
【０３４２】融合非コンピテント免疫原 PIウイルス中和の誘導における融合依存型決定基の役割を検証した。融合非コ
ンピテント(FI)免疫原とは、エンベロープタンパク質を発現するが細胞−細胞間
融合は行なわない共培養物のことである。こうしたFI免疫原としては、（CD4ま
たはCCR5コレセプター以外の）U87細胞と共培養したCOS-env、U87-CD4細胞と共
培養したCOS-env、および可溶性CD4 (sCD4)と複合したCOS-env細胞が挙げられる
。具体的には、エンベロープ発現培養物をsCD4(5μg/ml)と１時間37℃でインキ
ュベートし(Berger, E.A.ら, 1988, Proceedings of the National Academy of
Sciences USA 85:2357)、次に洗浄し未結合sCD4を除去した。全FI免疫原を前記
のとおりホルムアルデヒドで固定した。追加FI免疫原は、ワクチン調製時の混合
に先だってホルムアルデヒドでそれぞれ別々に固定した、COS-envおよびU87-CD4
-CCR5細胞を含んでいた。
【０３４３】 FRまたはFRMS免疫原とは顕著に異なり、すべてのFI免疫原は同種PIウイルスを
有意に中和することが出来なかった（図2A）。具体的には、P168はFC免疫原によ
っては中和されたが、FI免疫原によっては中和されなかった。図2Aが示すように
、トランスジェニックマウスを、FC免疫原（黒塗り四角、n=4）、FI免疫原（COS
‐env＋U87細胞、灰色円、n=4；COS-env＋U87-CD4細胞、灰色菱形、n=3；COS-en
v＋sCD4、白抜き菱形、n=2；COS-env＋U87-CD4-CCR5細胞、免疫化混合前にそれ
ぞれ個別に固定、灰色四角、n=2）、または擬似トランスフェクトCOS細胞免疫原
（U87-CD4-CCR5細胞共培養したもの、白抜き円、n=2）で免疫した。非免疫マウ
ス（白抜き三角、n=2）も同様に使用した。中和は特定のコレセプターの使用と
は無関係であり、本データはU87-CD4-CXCR4またはU87-CD4-CCR5細胞中での６回
の中和アッセイのうち３回の平均を示すものである。いくつかのケースでは、全
動物から得られた血清を各実験グループごとにプールした。こうした結果は、文
献により十分裏付けられているrgp120ワクチンのPIウイルス中和に関する欠陥と
一致するものである。また、ヒト１次血液リンパ球(PBL)を使用したアッセイに
おいては、FCおよびFI血清ワクチンによる中和の相違も観察された（図2B）。
【０３４４】 ヒトPBL培養物中で同種168P PIウイルスはFC免疫原によって中和されるが、FI
免疫原によっては中和されないことも実証された。図2Bに示すように、リンパ球
を単離し、フィトヘムアグルチニンで誘導し、インターロイキン-2の存在下で増
幅し、本明細書中に記載したとおりに中和を判定した。ELISA(Coulter Corporat
ion)を使用して、HIVp24抗原を培養から５日後に測定し、得られた測定値を対照
ウイルス(36ng/ml)に対して標準化した。*印は、p24抗原のレベルがELISAで使用
した希釈度で検出できる程度以下であることを示す。ワクチン群は図2Aで定義し
たとおりであり、このアッセイのために血清をプールした。
【０３４５】FRMS免疫原の特異性 FCワクチン血清が非特異的な方法でウイルス感染を阻止する可能性を排除する
ために、FCワクチン血清が両種向性ネズミ白血病ウイルス(MLV)のエンベロープ
タンパク質を担持する偽型HIVビリオンの感染を阻止しないことを示した(両種向
性MLVエンベロープタンパク質を用いてエンベロープ欠損HIV NL4-3-Luc-R-E-プ
ロウイルスを偽型した(Deng, H.ら, 1996, Nature 381:661))。さらに、FCワク
チン血清が類人猿の免疫欠損ウイルスSIVmac251の一次分離株を中和しないこと
を示した。アカゲザルPBL中で産生させたSIVmac251の一次分離株(Langlois, A.L
.ら, 1998, Journal of Virology 72:6950)を用いた(図3)。
【０３４６】 図3に示すように、FCワクチン血清は両種向性MLVエンベロープタンパク質また
は最初のSIVmac251を担持する偽型HIVビリオンを中和しなかった。両種向性MLV
エンベロープタンパク質を担持するHIV(ampho MLV偽型)を、U87-CD4-CXCR4細胞
中で決定したプールしておいたFCおよびFI抗血清を用いる感受性の中和に使用し
た。最初に単離したSIVmac251の中和をU87-CD4-CCR5細胞中で決定した。記号は
、図2においてFC免疫原（黒塗り四角）およびFI免疫原(Cos-env+U87細胞、黒塗
り円)と定義した通りである。
【０３４７】研究室に適応させた分離株の中和 従来のrgp120ワクチンを用いると、FCワクチンはHIVの関連研究室に適応させ
た分離株、(Wrin, T.ら, 1995, Science 69:39; LaCasse, R.A.ら, 1998, Scien
ce 72:2491に記載された)168P、168CのT細胞系に適応させた誘導体の中和を誘起
することができた。168P PIウイルスおよびそのTCLA誘導体168Cの中和感受性を
、U87-CD4-CXCR4細胞において試験した。ウイルス群および記号は図2において定
義した通りであり、血清をこのアッセイのためにプールした。図4に示した結果
は、FCワクチン血清によるTCLA 168Cウイルスの中和を表している。TCLA 168Cウ
イルスの中和力価が抗gp120抗体の力価であるFCまたはFIワクチン血清の間では
同等であったということは、ワクチンの間では固有の免疫原性の程度が類似する
ことを示唆するものである。
【０３４８】 FIワクチンがトランスジェニックマウスモデルにおいてPIウイルス中和の誘起
に失敗したことは、FCワクチンによって誘起された中和の特異性を強調する。全
実験動物および全ウイルス中和アッセイを含むデータセットで統計的な比較を行
った。ウイルスと抗体との結合に関する簡単なモデルを用いて各アッセイについ
て「結合定数」Kを計算し、Kの平均値を各マウスについて決定した。追跡試験を
用いた分散の分析によって、FC免疫原とFI免疫原との平均中和の間に有意差があ
ることが実証された(p<0.01)。全実験において、実験群内の応答は一致しており
均一であった。
【０３４９】 さらに、FIワクチン血清がPIウイルス感染を阻止することに同じく失敗したこ
とは、免疫応答は偶発的なヒト細胞性標的に向けられていないことを強く証明す
るものであるが、これは不活性化SIVワクチンの初期の研究を混乱させる(Cranag
e, M.P.ら, 1993, AIDS Research and Human Retrovituses 9:13; Putkonen, P.
ら, 1993, Journal of Medical Primatology 22:100; Arthur, L.O.ら, 1992, S
cience 258:1935を参照のこと)。むしろ、本発明では、FCまたはFRMS免疫原がPI
ウイルスの中和を媒介する特異な決定基を表していると認識する。
【０３５０】FRMSワクチン注射血清による一次分離株の中和 HIVワクチン開発における重大な問題は、広範囲の多様なPIウイルスを中和す
るワクチン抗血清の能力に集中する。FC免疫原のようなFRMS免疫原によって誘起
されたPIウイルスの中和の幅を実証するために、発明者らは5つの一般的で地理
的に多様な系統発生的分類群由来の代表的なPIウイルスのパネルの感受性を調べ
た。感染性プロウイルスACH320.2A.1.2(320SI)およびACH320.2A.2.1(320NSI))(G
roenink, M.ら, 1991, Journal of Virology 65:1968; Guillon, C.ら, 1995, A
IDS Research and Human Retrovituses 11:1537)をNIBSC(UK) AIDS Reagent Pro
gramから入手した。HIV89.6(Collman, R.ら, 1992, Journal of Virology 66:75
17)、SHIV89.6、およびSHIV89.6P(Reimann, K.A.ら, 1996, Journal of Virolog
y 70:3198)も使用した。他のすべての一次分離株をNIH AIDS Research and Refe
rence Reagent ProgramおよびUNAIDS Network for HIV-1 Isolation and Charac
terizationから入手した。PIウイルスをPHAで活性化したPBL中で限定的に増殖し
た(Wrin, T.ら, 1995, Science 69:39)。
【０３５１】 図5に表したように、機能性分類群Bのエンベロープタンパク質によって引き出
されたFC血清は、試験した24のPIウイルスの23−北アメリカ／ヨーロッパ（分類
群B）、アフリカ（分類群AおよびD）、タイ（分類群BおよびE）、およびインド
（分類群C）由来の単球／NSIおよびTリンパ球／SIウイルスを中和することがで
きた。ワクチン群および記号は図2において定義した通りであり、血清をこのア
ッセイのためにプールした。
【０３５２】 これらの分離株の間の配列の多様性にもかかわらず、ほとんどがFCワクチン血
清による中和に対して似たような感受性を示した。1つの分離株(92RW008)が>50%
の中和を達成することができず、別の2つ(93IN904および92UG024)が50%を超える
限られた中和を示した。これらの例外を除けば、広いパターンの中和が、本発明
のFC免疫原が主としてウイルス性決定基を標的とすることをさらに立証する。
【０３５３】 FI血清は一様にこれらの異種PIウイルスを中和することができなかった。FRMS
免疫原による多様なPIウイルスの広くて均一な中和は、（FC 免疫原のような）F
RMS免疫原によって表された重大な決定基が高度に保存されており、結合体およ
び融合体におけるエンベロープタンパク質の根本的な機能と密接に結び付いてい
ることを示唆するものである。
【０３５４】中和抗体 FCワクチンによるPIウイルスの中和に対する分子標的をさらに厳密に定義する
ために、トランスフェクトしたCOS細胞の表面に発現したエンベロープタンパク
質とのインキュベーションにおいて、中和抗体をFCワクチン血清から除くことを
試みた。
【０３５５】 従って、168Pエンベロープタンパク質を発現するホルムアルデヒドで固定した
COS細胞をFC血清とインキュベートし、次いで回収した血清についてPIウイルス
の中和を試験した。FCワクチン血清を168Pエンベロープタンパク質を発現する約
106のホルムアルデヒドで固定したCOS細胞で連続的に4回吸着した。インキュベ
ーションを4°で1時間、振動させながら行った。対照としては、予め採血した血
清およびホルムアルデヒドで固定した偽トランスフェクトCOS細胞を含むものと
した。バルク抗gp120抗体の吸着をgp120 ELISAで観察した。最終血清について、
U87-CD4-CXCR4細胞を用いてHIV 168Pの中和を試験した。FCワクチン血清におけ
る中和活性をエンベロープ発現細胞とのインキュベーションによって除去したが
、対照COS細胞のインキュベーションによっては最少限度しか減少しなかった（
図6および図7）。具体的には、FCワクチン血清をホルムアルデヒドで固定したCO
S-envまたは対照COS細胞と繰り返してインキュベートし、U87-CD4-CXCR4細胞を
用いて168Pの残存中和を試験した。FC免疫の前に入手した血清は、同じように吸
着した。
【０３５６】中和抗体の産生 本発明の方法が中和抗体の生成に有用であることを実証するために、ハイブリ
ドーマの上澄みを一次分離株を中和することができる（免疫原として架橋COS-en
v+U87-CD4-CCR5を用いる）本発明の方法によって製造した。要するに、前述のU8
7-CD4-CXCR4細胞アッセイにおけるウイルス中和をハイブリドーマについてアッ
セイした。ハイブリドーマの上清について2つの代表的なHIV分類群Bの分離株(AC
H168.10(168P)および92US657)を中和する能力を試験した。培地単独の存在下に
おけるフォーカス数と比較したハイブリドーマの上清の存在下におけるフォーカ
ス数として中和を表す。それぞれの点は選ばれたハイブリドーマを表す。図8に
示すように、大部分のハイブリドーマは両方のPIウイルスを60-80%中和すること
がわかった(それぞれ0.4-0.2画分の感染性が残っている)。
【０３５７】 従って、本発明のFRMS免疫原は、一次分離株のウイルスに対する中和モノクロ
ーナル抗体を引き出すことができる。ひとまとめにして考えれば、この例は適当
に表された分類群Bのエンベロープタンパク質が複数のHIV分類群由来のほとんど
のPIウイルスに対する強力な中和を引き出すことができることを説明し、広いワ
クチンタンパク質は無限のHIV血清型を必要としないことを示唆する。
【０３５８】 さらに、エンベロープタンパク質の安定形態は有効な免疫原として機能しない
が、重大な融合関連エピトープが安定したタンパク質上に十分に表れて結合を許
容すると本発明は認識する。ワクチン製剤を用いるときには、本発明のFRMS免疫
原は種々のウイルスの血清型および分類群に対する広い保護を提供する。
【０３５９】実施例2：融合欠損性突然変異 種々の突然変異について、本発明の方法への使用を検証した。
【０３６０】 HIVの場合には、限定されないが、エンベロープタンパク質の3種類の突然変異
が含まれる。すなわち、(1)gp160前駆体タンパク質のタンパク質分解的開裂を妨
げる突然変異、(2)gp41のN末端融合ペプチドドメインに作用する突然変異、およ
び(3)超らせんドメインを変化させる突然変異である。
【０３６１】 gp160前駆体タンパク質のタンパク質分解的開裂を妨げる突然変異には、gp120
のC末端で変化した高度に保存されたK/R-X-K/R-R部位がgp160ポリタンパク質の
タンパク質分解切断を防ぎ、また融合誘導性も妨げる特定の突然変異を含む(Fre
ed, B.O.ら, 1989, J. Virol. 63:4670-5; Guo H.G.ら, 1990, Virology, 174:2
17-24; Bosch, V.ら, 1990, J. Virol. 1990:2337-44; Dubay, J.W.ら, 1995, J
. Virol. 69:4675-82)。
【０３６２】 部位特異的突然変異誘発(QuikCharge, Stratagene)を用いて、証明されている
開裂部位突然変異を168Pエンベロープタンパク質(REKRからREKT)に導入した。切
断欠損性168Pエンベロープタンパク質gp160を細胞表面上に発現させたが、それ
は細胞−細胞融合または偽型HIVウイルスによる感染を媒介することができなか
った。
【０３６３】 gp41のN末端融合ペプチドドメインに作用する突然変異には、gp41の疎水性N末
端領域の突然変異を含み、該領域は細胞膜に挿入して脂質二重層を不安定化させ
ることによって融合を媒介すると考えられている。この領域内の所定のアミノ酸
の変化がエンベロープタンパク質を非融合誘導性合成ペプチドにする。
【０３６４】 gp41のN末端融合ペプチドにおける突然変異は十分に同定されており、V2E(Fre
ed, E.O.ら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992:70-4; Pereira, F.B.ら,
1997, AIDS Res. & Hum Retrovirus 13:1203-11)およびG10V(Delahunty, M.D.
ら, 1996, Virology 218-94-102)。前者は疎水性ペプチド中に極性置換基を含む
一方で、後者は脂質二重層において仮定されているらせん状構造に作用する。こ
れらの突然変異を部位特異的突然変異誘発によって168Pエンベロープ遺伝子（gp
41:AVGIGVLFLGFLG..）に導入し、エンベロープタンパク質について発現および融
合誘導性を試験した。これらの突然変異のpAbT4587-168Penvへの取り込みによっ
て、本発明の同種組換えワクシニアウイルスの容易な発生を可能にする。
【０３６５】 超らせん領域を変化させる突然変異には、数多くのウイルスファミリー(Weiss
enhorn, W.ら, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6032-6)、例えば、HIVの
V570RおよびY586Eの融合タンパク質で見出されている高度に保存された超らせん
モチーフ内に所定の突然変異を含む。一つの実施形態においては、変化を168Pエ
ンベロープ遺伝子に導入し、同種組換えワクシニアウイルスを生成するためにpA
bT4587-168Penvへ移す前に細胞アッセイにおいて発現および融合誘導性を試験し
た。
【０３６６】実施例３ FRMSの調製 分子的にクローン化されたHIV 168Pエンベロープタンパク質(CCR5およびCXCR4
の両方を利用したACH168.10シンシチウム誘導性一次分離株より得た）(LaCasse,
R. A.ら、1998, Science 72:2491)を発現するリン酸カルシウムトランスフェク
トされたCOS-7(American Type Culture Collection, Rockville, MD)細胞を、同
数の細胞融合パートナーと共培養することによって融合受容能のある免疫原を調
製した。細胞融合パートナーは、CCR5を発現するU87-CD4細胞(U87-CD4-CCR5)で
あった(Dan Littman, Skirball Institute of Biomolecular Medicine, NYU Med
ical Center)。細胞-細胞相互作用（3-5時間）の開始の時点で、氷冷したリン酸
緩衝生理食塩水中0.2%ホルムアルデヒドによる固定により培養を終結させた。回
収は、細胞-細胞融合に至る移行中間体を捕捉するよう時間を調節した。同時に
おこなった予備的な免疫学的染色により、回収の時点で、10-30%の最大シンシチ
ウム形成が示された。一晩固定した後、切り抜いて細胞を回収した。
【０３６７】実施例４ FRMSによるマウスの免疫化 ヒトCD4およびCCR5コレセプターの両方を発現するトランスジェニックマウス(
Dan Littman, Skirball Institute of Biomolecular Medicine, NYU Medical Ce
nter)を、実施例１で調製および回収された細胞によって21日の間隔をあけて３
回免疫化した。Ribiアジュバント(Ribi ImmunoChem Research, Inc)(2×106細胞
/0.2ml/マウス）を用いてワクチンに製剤した。血液を尾静脈から採取した。得
られた血清をCCR5またはCXCR4のいずれかを発現するU87-CD4細胞系の中和アッセ
イに用いた。この迅速なPIウイルス中和アッセイは、末梢血液リンパ球(PBL)培
養における標準的な中和アッセイと比較して確認され(LaCasse, R. A.ら、1998,
Science 72:2491)、マウス血清の存在下で良く機能する。３回の別々の実験で
、融合受容能のあるワクチンを３匹のマウスに投与した。相同PIウイルス168Pを
用いたウイルス中和アッセイをU87-CD4-CCR5および-CXCR4細胞の両方を用いてお
こない、いくつかの場合に第２および第３の免疫化の後に血清を分析した。すべ
ての場合に結果は一致しており、平均して出したデータを図９に示した。相同16
8P PIウイルスの中和の可能性のあるものが一貫して観察され、典型的にはマウ
ス血清の1:100希釈で80%以上の中和レベルが得られた。その動物が曝されていな
いコレセプターであるCXCR4を用いて中和が観察された。
【０３６８】 いくつかの臨界対照免疫化をおこなった。１つの基本的な対照は、非機能的エ
ンベロープタンパク質免疫原がトランスジェニックマウス予防接種モデルにおい
てPIウイルス中和抗体を誘導しないことを確認するためのものであった。１つの
研究において、１匹のマウスに、CD4またはコレセプターのいずれも発現しないU
87細胞と共培養された168Pエンベロープ/COS細胞を含むワクチンを投与した。２
つの血液からの合計３つのアッセイで168P PIウイルスのある程度の中和が観察
されたが、力価および程度は融合受容能のあるワクチンを用いて観察されたもの
と大きく異なっていた。
【０３６９】 CD4結合の際に誘導されるコンホーメーションの変化が、それに続くコレセプ
ターとの相互作用に重要であると考えられている。したがって、これらの新規の
エンベロープタンパク質に対する抗体はPIウイルスの中和に有利である。エンベ
ロープタンパク質対照ワクチンと平行して、別のマウスにU87-CD4細胞と共培養
された168Pエンベロープを発現するCOS細胞を含む対照ワクチンを投与した。こ
の融合欠損性である系を用いると、シンシチウムの形成は観察されなかった。CD
4の添加は、エンベロープタンパク質を単独で用いたときに得られる非常にわず
かな中和にはほとんど寄与していないと思われる。
【０３７０】 残りの中和は、不完全である導入遺伝子に対して耐性があるCD4およびCCR5に
対する抗体から生じ得る。そこで、U87-CD4-CCR5細胞を含む対照ワクチンを、単
独でまたは擬似トランスフェクトされたCOS細胞と共培養して試験した。３つの
研究でウイルスの感染力の阻害は観察されなかった。これらのデータによりこれ
らのトランスジェニックマウスにおける耐性が確認され、予防接種モデルの有効
性が証明された。特異的免疫応答はウイルスおよびおそらくウイルス誘導性エピ
トープに限定されて生じる。これらのマウスはヒトワクチンのようにヒトCD4お
よびCCR5に対して耐性であるように見えるのみでなく、このアッセイにおいて、
他の細胞性タンパク質に対する抗体はウイルスの感染性を妨げないように見える
。
【０３７１】 抗体応答がDNA免疫化によって部分的に媒介されているかもしれないという可
能性について調べた。トランスフェクションの間に、エンベロープ発現細胞をマ
イクログラム量のプラスミドDNAに曝した。動物がDNA免疫化に応答するかどうか
を試験するために、２匹のマウスに20μgの168P23プラスミド（pCR3.1-Uni発現
ベクター中）を皮下注射した。この投与経路はDNA免疫化には好ましくないにも
関わらず、トランスフェクトされた細胞ワクチンと共に用いられることを反映し
ていた。この実験において、DNAはホルマリンによって不活性化されなかった。
全部で8つのウイルス中和アッセイにおいて、PIウイルスの中和はDNA免疫化では
観察されなかった。
【０３７２】実施例５ FRMSに対する付加的なPI使用抗体の中和 ACH320.2A.1.2(320SI)(Amsterdam Cohort)は、HIV-IG、CD4-Ig、およびIgG1-b
12による中和に特に不応性である分子的にクローン化T-リンパ球親和性PIウイル
スである。実施例３で残った血清を、このPIウイルスの融合受容能のあるおよび
融合欠損性である免疫原としての感受性を試験するために用いた。融合受容能の
ある血清の開始時の1:100希釈に限定したにも関わらず、この非相同クレードB分
離株は明らかに中和に対して感受性があった。融合欠損性である血清(envおよび
env+CD4)が、相同168Pウイルスに対して見られた部分的な中和とは対照的に、非
相同320SIウイルスを中和できなかった点も興味深い（図10）。
【０３７３】 HIVワクチンの開発の可否を決定するものは、主に広い範囲の多様なPIウイル
スを中和する抗血清ワクチンの能力である。融合受容能のある免疫原によって誘
導されるPIウイルスの中和の幅を決定するために、５つの広く行き渡り、また地
理的に分岐した系統クレードから、代表的なPIウイルス区分の感受性を試験した
。U87-CD4-コレセプター細胞の中和アッセイは上の実施例１に記載したとおりで
ある。機能的クレードBエンベロープタンパク質によって誘導された融合受容能
のある血清は試験した24のPIウイルス、すなわち、北アメリカ/ヨーロッパ（ク
レードB）、アフリカ（クレードAおよびD)、タイ（クレードBおよびE）、および
インド（クレードC）からの単球親和性/NSIおよびT-リンパ球親和性/SIウイルス
のうち23を中和することができた。これらの分離株の間の配列の多様性にも関わ
らず、ほとんどが同様に融合受容能のあるワクチン血清による中和に対して感受
性があった。１つの分離株(92RW008)は50%を上回る中和を達成することができず
、別の２つ(931N904および92UG024)は50%を上回る限定された中和を示した。対
照の血清は、歴史的に有名なrgp120免疫原と同様に、一致してこれらの相同PIウ
イルスを中和することができなかった。１つの典型的であるが適切に提供された
クレードBエンベロープタンパク質によって引き出された多様なPIウイルスの広
範かつ一様な中和は、融合受容能のある免疫原によって提示される重要な決定基
が高度に保存され、それがエンベロープタンパク質の結合および融合に関する基
本的な機能に緊密に結びついているであろうことを示唆している。これらの知見
は、HIV感染に対する世界的な防御に必要な異なるHIV中和血清型の数は限定され
ていることを示唆している。
【０３７４】実施例６ タグ付加FRMSの調製と単離 本発明のFRMSに、その単離および精製を容易にするために商業的に入手可能な
システムを用いてタグをつけた。S-ペプチドタグをつけたCD4、CCR5、CXCR4およ
びHIVエンベロープを構築するために用いる分子遺伝子工学的方法は同様なので
、CD4-Spepについてのみ詳細に記載する。分子に、CD4分子のC-末端にS-ペプチ
ドによってタグをつける。S-ペプチドをコードした配列(lys-glu-thr-ala-ala-a
la-lys-phe-glu-arg-gln-his-met-asp-ser)を、合成オリゴヌクレオチドおよび
高フェディリティーXL PCR(PE Applied Biosystems)を用いて、CD4 cDNA発現プ
ラスミド(CD4-Spep)の細胞質性C-末端イソロイシンと終止コドン(TGA)の間にイ
ンサートした。修飾されたCD4の機能的発現は、CD4-SpepおよびCXCR4コレセプタ
ーを発現するCOS-7細胞の感染によって確かめられた。C-末端にタグをつけたCD4
は、天然のCD4に匹敵する程168Pウイルスによる感染を支持することができる。S
-ペプチドタグをつけたCD4はまたS-タンパク質アフィニティークロマトグラフィ
ー(Novagen, Inc.)を用いて容易に単離できる。同様の方法を用いて、我々は相
同のS-ペプチドタグをつけたCCR5およびCXCR4コレセプターおよびHIVエンベロー
プ分子を構築した。すべての構築物は結合および融合に関して機能を有すること
が示された。COS-7細胞に、CXCR4およびCD4-Spepまたは天然のCD4のいずれか（p
cDNA3.1発現ベクター中）をトランスフェクトし、２日後に細胞表面をビオチン
（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-ビオチン、Pierce Chemical Co.)で標識した。0.5% Tr
iton X-100にプロテアーゼ阻害剤を加えて溶解物を調製した。CD4分子を、1) MA
b T4(Coulter Corp., Hialeah, FL)およびウサギ-α-マウスIg抗体をロードした
プロテインAアガロースを用いた免疫沈降、または2) S-タンパク質アガロースを
用いたアフィニティー精製のいずれかによって精製した。タンパク質を、ドデシ
ル硫酸ナトリウム(SDS)サンプル緩衝液中で沸騰させて放出させ、10%ポリアクリ
ルアミド-SDSゲル電気泳動によって分解し、ニトロセルロースに移した。ビオチ
ニル化したタンパク質をアビジン-セイヨウワサビペルオキシダーゼ(Pierce)お
よびニッケル増強DAB基質によって検出した。S-タンパク質アガロースによって
、α-CD4-抗体媒介免疫沈降より優れた収率および純度で、62kD CD4-Spepが特異
的に精製された。
【０３７５】 ホルマリン架橋に続くS-ペプチドの単離の時間経過を試験した。COS-7細胞にC
D4-Spep(±CXCR4)をトランスフェクトした後、0.5% Triton X-100溶解緩衝液中
（対照）に回収するか、または溶解の前に氷冷ホルムアルデヒド固定をおこなっ
た。CD4-Spepタンパク質をS-タンパク質アガロースにより精製し、S-タンパク質
HRP(Novagen, Inc)を用いたウエスタンブロットにより分析した。1時間の0.2%ホ
ルムアルデヒド固定をおこなうとS-ペプチド結合（および/または回収）の損失
が最小となり、2%ホルムアルデヒドを用いると１時間でいくらかの回収の損失が
あり、３時間ではより多くなる。中間反応条件（たとえば、0.2%ホルムアルデヒ
ドで1-2時間）によって効果的に架橋された複合体の効率的な単離が可能になる
。
【０３７６】 特定のCD4-Spep複合体を同定するために、ホルムアルデヒド固定および特異的
架橋剤DTSSP(Pierce Chemical Company)を用いて実験をおこなった。DTSSPは、
ホルムアルデヒドと同様に第１アミンと反応する同族二官能性N-ヒドロキシスク
シンイミジルエステルである。そのマイナスの荷電のために、DTSSPは細胞膜を
貫通または横断することができないので、ホルムアルデヒドとは対照的に、細胞
質S-ペプチドタグを消費しない。またホルムアルデヒドと異なり、DTSSPによる
架橋は可逆的であって、内部ジスルフィド結合を切断して架橋された成分を放出
することができる。
【０３７７】 COS-7細胞に168PエンベロープまたはCD4-Spepプラスミドをトランスフェクト
し、エンベロープ発現細胞および擬似トランスフェクトされた細胞を、全体で1m
Ciの35S-メチオニンおよびシステインを用いて10cmの皿の中で８時間代謝的に標
識した。次いでエンベロープ（または擬似）およびCD4-Spep発現細胞を４時間共
培養して細胞-細胞相互作用をおこなわせた後、ホルムアルデヒド(0.2%、氷上１
時間）またはDTSSP(2mM、氷上 2×10分）で架橋をおこなった。溶解物を調製し
てS-ペプチドを含む複合体をS-タンパク質アガロースアフィニティークロマトグ
ラフィーによって単離した。
【０３７８】 ホルムアルデヒドにより架橋された複合体を6%ポリアクリルアミドSDSゲル電
気泳動によって分析した。擬似＋CD4-Spep対照では見られない高分子量の複合体
が同定された。ウイルスタンパク質gp120およびgp160もまた見られ、おそらく、
CD4-Spepとの非共有結合による会合によって単離されたものと思われる。S-タン
パク質アフィニティーにより精製された（すなわち、CD4-Spep）および代謝的に
標識された（すなわち、エンベロープ）高分子量の複合体の検出は、さらなる研
究のために架橋された複合体が単離され得ることを示唆している。
【０３７９】 これらの高分子量の複合体の分析を続けるために、DTSSPにより架橋された複
合体を試験した。 S-タンパク質アフィニティーにより精製された複合体を、50m
MのDTTによる前処理をおこなって、またはおこなわずに、6%ポリアクリルアミド
/SDSゲル電気泳動により分離し、分析した。エンベロープ特異的複合体は、DTSS
Pにより架橋された完全体と、擬似＋CD4-Spep対照から単離された上記のものと
を明瞭に分離することは不可能である。小さいgp120/gp160が検出された。けれ
ども、DTSSPによる架橋の解消はgp120およびgp160タンパク質の特異的放出をも
たらす。これらのデータは、ホルムアルデヒド固定を用いて観察されるエンベロ
ープ-CD4複合体の形成を立証し、可逆的な架橋剤の使用における能力を強調する
ものである。
【０３８０】 これらのデータは、融合活性CD4会合複合体の単離におけるCD4-Spepアフィニ
ティータグおよび化学的架橋による方法論の有用性を支持している。S-ペプチド
タグをつけたコレセプターCCR5(CCR5-Spep)、CXCR4(CXCR4-Spep)、ウイルスエン
ベロープ(Env-Spep)が製造され、これらもまた、融合活性複合体を単離するため
に用いることができる。単離された複合体は、エンベロープに媒介される膜融合
の進行に関係する分子構造を明らかにするために用いることができる。
【０３８１】 エンベロープタンパク質をCD4-SpepまたはCCR5-Spepのいずれかと共精製する
ことができるかどうかを判定するために研究をおこなった。ヒト293T細胞に別々
に168Pエンベロープタンパク質およびa) CD4-Spep、またはb) CCR5-SpepおよびC
D4、またはc) 擬似物をトランスフェクトした。エンベロープ発現細胞を融合パ
ートナー(a-c)と共に5時間共培養し、複合体を1% Brij-97界面活性剤を用いて可
溶化し(Laphamら、1996)、S-タンパク質アフィニティークロマトグラフィーを用
いて単離した。Brij-97を用いて単離された共精製されたエンベロープタンパク
質を、HIV V3-指向mAb 50.1を用いたウエスタンブロット分析によって検出した
（図11）。予想されたように、CD4-Spepを発現する細胞と共培養した後に、大量
の168Pエンベロープタンパク質が単離可能であった。より少ないがかなりの量の
エンベロープタンパク質もまた、CD4およびCCR5-Spepを発現する細胞と共培養し
た後に単離可能であった。擬似トランスフェクトされた細胞との共培養物からは
、混入したエンベロープタンパク質は検出できなかった。同様の実験においてホ
ルムアルデヒドにより架橋された融合受容能のある共培養物から複合体が単離さ
れた。
【０３８２】 これらの結果は、エンベロープタンパク質、CD4、およびCCR5の複合体は融合
の早い時期に生成し、S-タンパク質アフィニティークロマトグラフィーによって
単離できることを強く示唆している。これらのS-タンパク質により精製された分
子および複合体は「分裂ウイルス(split virus) 」またはサブユニットワクチン
免疫原として用いることができる。
【０３８３】実施例７ 細胞培養中または予防接種の部位で融合受容能のあるFRMSを生成する
組換えワクシニアウイルス 我々の発明を実用的な製剤に適用するための他の許容されるワクチン法には、
ウイルスベクターの使用が含まれる。たとえば、それぞれenvおよびCD4/CCR5を
発現する組換えワクシニアウイルスの共投与は、in situでの細胞-細胞融合を生
じさせる可能性がある。１つの実施形態において、２つの組換えワクシニアウイ
ルスで、１つはHIV 168Pエンベロープタンパク質(rV-168Penv)を発現し、第２の
ものはCD4およびCCR5コレセプター(rV-CD4/CCR5)を発現するものを構築した。rV
-168Penvを感染させた細胞およびrV-CD4/CCR5を感染させた細胞の共培養物は融
合受容能があり、多核シンシチウムを与える（図12）。rV-168Penv細胞、rV-CD4
/CCR5細胞、または架橋された共培養されたrV-168PenvおよびrV-CD4/CCR5細胞を
、上記のようにトランスジェニックマウスを予防接種するためのFRMSとして用い
た。
【０３８４】 マウスから得た血清を、架橋され共培養されたrV-168PenvおよびrV-CD4/CCR5
細胞によって予防接種した。それらの細胞はさまざまなHIVのクレードにわたっ
てウイルスの中和が可能で、これはウイルスベクターを本発明の方法におけるFR
MSの形成に首尾よく用いることができることを示している。
【０３８５】 本明細書に記載された実施例および実施形態は、説明のみを目的とするもので
あること、およびその開示の中でのさまざまな修正または変更は当業者に示唆さ
れているもので、本出願の精神および範囲および特許請求の範囲の中に含まれる
ものであることが理解されるべきである。
【０３８６】 本発明は明細書中に記載された特定の実施形態によって範囲を限定されるべき
ではない。実際、本明細書に記載したものに加えて本発明のさまざまな修正が、
以上の記載および添付した図面より当業者には明らかとなろう。このような修正
は添付した特許請求の範囲の中に含まれるものと意図されている。
【０３８７】 本明細書中に、特許出願、特許、および刊行物を含むさまざまな文献を引用し
たが、これらの開示を全体として参照により本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 FCおよびFIワクチン血清による同種(homologous) 168P PIウイルスの中和。ト
ランスジェニックマウス（hu CD4+、hu CCR5+、マウス CD4+）をFC免疫原（COS-
env＋U87-CD4-CCR5；四角；n＝3マウス）または対照細胞（U87-CD4-CCR5細胞の
み、若しくは擬似トランスフェクトCOS細胞と共培養したもの；円；n＝3マウス
）によって免疫感作した。免疫しないマウスも使用した（三角；n＝2マウス）。
CXCR4（黒く塗りつぶした記号）またはCCR5（白抜きの記号）のいずれかを発現
するU87-CD4細胞を使用して、168Pの中和について、血清を試験した。データは
二次および三次免疫感作後２週間目に取得した血清を使用する３〜６回の中和ア
ッセイの平均を表示する。
【図２】 ＡおよびＢ：FIではなくFCワクチン血清による P168の中和。（Ａ）トランス
ジェニックマウスをFC免疫原（黒色四角；n＝4）、FI免疫原（COS-env＋U87細胞
；灰色円；n＝4；COS-env＋U87-CD4細胞；灰色菱形；n＝3；COS-env＋sCD4細胞
；白色菱形；n＝2；COS-env＋U87-CD4-CCR5細胞、免疫感作のための混合前にそ
れぞれを固定；灰色四角；n＝2）または擬似トランスフェクトCOS細胞免疫原（U
87-CD4-CCR5細胞 との共培養；白色円；n＝2）によって免疫感作した。免疫しな
いマウス（白色三角；n＝2）も使用した。中和は特異的コレセプターの使用には
無関係であり、ここに示すデータはU87-CD4-CXCR4または-CCR5細胞中の３〜６回
の中和アッセイの平均を示す。場合によって、各実験グループ内の全動物からの
血清をプールした。（Ｂ）FIではなくFCワクチン血清による P168の中和。ヒトP
BL（リンパ球）培養物中の同種168P PIウイルスの中和。PBLを単離し、フィトヘ
マグルチニンで刺激し、インターロイキン-2の存在下で増殖させて、中和を判定
した。培養５日後にELISA（Coulter Corporation）によってHIV p24抗原を判定
し、数値をウイルス対照（36 ng/ml）に対して正規化した。アステリスクはELIS
Aで使用した希釈における検出限界以下のp24抗原レベルを意味している。
【図３】 FCワクチン血清は両種向性MLVエンベロープタンパク質を担持する偽型HIVビリ
オン(Ａ)または一次SIVmac251(Ｂ)を中和しない。両種向性MLVエンベロープタン
パク質を担持するHIV（両種向性MLV偽型）について、プールしたFCおよびFI抗血
清による中和感受性をU87-CD4-CXCR4細胞中で判定した。一次分離SIVmac251につ
いて、中和をU87-CD4-CCR5細胞中で判定した。記号：FC免疫原（黒色四角）およ
びFI免疫原（Cos-env＋U87細胞、灰色円）。
【図４】 ＡおよびＢ：FIワクチン血清によるTCLA 168Cウイルスの中和。168P PIウイル
ス(Ａ)およびそのTCLA誘導体168C(Ｂ)の中和感受性を、プールした血清を使用し
てU87-CD4-CXCR4細胞中で試験した；FC免疫原（黒色四角）、FI免疫原（COS-env
＋U87細胞、 灰色円；COS-env＋U87-CD4細胞、灰色菱形；COS-env＋sCD4、白色
菱形）および 擬似トランスフェクト細胞対照（白色円）。
【図５】 クレードＡ−Ｅからの多様なPIウイルスの中和。一次分離株をヒトPBL中で拡
張し、プールした血清を使用して、許容されるU87-CD4-CCR5（または-CXCR4）細
胞中で中和を判定した；FC免疫原（黒色四角）、FI免疫原（COS-env＋U87細胞、
灰色円；COS-env＋U87-CD4、灰色菱形；COS-env＋sCD4、白色菱形）および擬似
トラ ンスフェクト細胞対照（白色円）。可能な場合、ウイルスのバイオタイプ
を右下隅にSIまたはNSIとして示す。ウイルスのアイソタイプを各グラフの下隅
に示す。
【図６】 ホルムアルデヒド固定COS-env細胞によるPIウイルス中和活性の吸着。FCワク
チン血清をホルムアルデヒド固定COS-env細胞（灰色四角）または対照COS細胞（
白色四角）とともに反復してインキュベートした。FC免疫感作前に取得した血清
を同様に吸着させた（それぞれ灰色および白色円）。出発FCおよび免疫前血清を
それぞれ黒色四角または黒色円で示す。U87-CD4-CXCR4細胞を使用する168Pの中
和について、血清を試験した。
【図７】 PIウイルス中和活性は無傷のU87-CD4-CCR5細胞によって吸着されない。プール
したFCワクチン血清をU87-CD4-CCR5細胞とともに（白色四角）、または空のマイ
クロ培養ウェル中で（擬似、黒色四角）インキュベートした。プールしたFI血清
（COS-env＋U98-CD4）を同様に処理した（それぞれ白色および黒色円）。U87-CD
4-CCR5細胞を使用して残存する168Pの中和について、血清を試験した。
【図８】 ハイブリドーマ上清による２種のHIVクレードB一次分離株の中和活性。
【図９】 融合適格性（fusion-competemt）ワクチン免疫原によって免疫したマウスの血
清力価。白色四角は融合適格性（FRMS）免疫原（env＋CD4/CCR5）を示す；黒色
円はエンベロープタン パク質免疫原を発現する細胞ならびにCD4およびCCR5のい
ずれも発現しない細胞からの免疫原（env）を示す；白色円はエンベロープタン
パク質を発現する細胞およびCD4免疫原を発現する細胞からの免疫原（env＋CD4
）を示す；白色三角はCD4およびCCR5免疫原を発現する細胞対照（CD4/CCR5）を
示す。
【図１０】 本発明の主題の融合適格性免疫原複合体で免疫したマウスから取得した抗体に
よる320SI一次ウイルス分離株の交差中和。黒色円は融合適格性（FRMS）免疫原
（env＋CD4/CCR5）を示す；白色四角はエンベロープタンパク質を発現する細胞
からの免疫原（env）を示す；白色円はエンベロープタンパク質およびCD4を発現
する細胞からの免疫原（env＋CD4）を示す。
【図１１】 ウエスタンブロット分析によって検出した、CD4-SpepおよびCCR5-Spepととも
に同時精製したエンベロープタンパク質。ａ）CD4-Spepを発現する細胞とともに
共培養した後に単離した168Pエンベロープタンパク質、ｂ）CD4およびCCR5-Spep
を発現する細胞とともに共培養した後に単離した168Pエンベロープタンパク質、
ｃ）擬似トランスフェクト細胞とともに共培養した後は168Pエンベロープタンパ
ク質は検出されなかった。
【図１２】 rV-168P envおよびrV-CD4/CCR5で感染させたBSC40細胞の感染24時間後の共培
養。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/205 Ａ６１Ｋ 39/205 ４Ｈ０４５ 39/21 39/21 39/23 39/23 39/275 39/275 39/395 39/395 Ｄ Ｓ Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12 31/14 31/14 31/16 31/16 31/18 31/18 31/20 31/20 31/22 31/22 Ｃ０７Ｋ 14/005 Ｃ０７Ｋ 14/005 14/705 14/705 16/08 16/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 7/00 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA14 BA35 BA53 BA63 CA02 DA02 EA02 GA11 HA15 HA17 4B064 AG01 AG20 AG27 AG32 CA10 CA19 CA20 CC01 CC24 DA01 DA15 4B065 AA90X AA93Y AA97Y AB01 AB05 AC14 BA02 BA08 BC01 CA24 CA25 CA45 CA46 4C076 AA16 BB01 BB11 CC06 CC35 FF68 4C085 AA03 AA12 AA14 BA55 BA57 BA61 BA64 BA65 BA69 BA78 BA85 4H045 AA10 AA11 AA30 BA41 CA01 CA03 CA05 CA40 DA50 DA75 DA76 DA86 EA29 EA31 FA72 FA73 FA74

Claims (106)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (a) 包膜ウイルスのエンベロープタンパク質と、(b) １以上
    の細胞性膜タンパク質と、の会合の結果として形成されるエピトープを含む単離
    された分子構造体であって、該エンベロープタンパク質および該細胞性膜タンパ
    ク質は、適当な条件下で、該ウイルスのエンベロープと該細胞性膜タンパク質を
    含む細胞膜とが融合するのに必要かつ十分なものである、上記分子構造体。
  2. 【請求項２】 (a) 集合してウイルスエンベロープとなるHIVエンベロープ
    タンパク質またはその変異体と、(b) ヒトCD4およびHIV融合のためのコレセプタ
    ーと、の会合の結果として形成されるエピトープを含む単離された分子構造体。
  3. 【請求項３】 コレセプターがCCR5またはCXCR4である、請求項２記載の分
    子構造体。
  4. 【請求項４】 融合欠損性であるHIV gp41の変異体の会合により形成される
    、請求項２記載の分子構造体。
  5. 【請求項５】 前記変異体がV2E、G10V、V570RおよびY586Eからなる群より
    選択される１以上の突然変異を含む、請求項４記載の分子構造体。
  6. 【請求項６】 野生型HIVエンベロープタンパク質の会合により形成される
    、請求項２記載の分子構造体。
  7. 【請求項７】 (a) 包膜ウイルスの変異型エンベロープタンパク質と、(b)
    該エンベロープタンパク質のレセプターとして機能する１以上の宿主細胞性膜タ
    ンパク質と、の会合の結果として形成されるエピトープを含む単離された分子構
    造体であって、野生型の該エンベロープタンパク質はウイルスエンベロープと宿
    主細胞膜との融合において機能し、該変異型エンベロープタンパク質は融合欠損
    性である、上記分子構造体。
  8. 【請求項８】 前記ウイルスがレトロウイルス科、ラブドウイルス科、カロ
    ナウイルス科、フィロウイルス科、ポックスウイルス科、ブンヤウイルス科、フ
    ラビウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイル
    ス科、およびヘルペスウイルス科からなる群より選択される、請求項１または７
    記載の分子構造体。
  9. 【請求項９】 エンベロープタンパク質がHCVのE1およびE2であり、細胞性
    膜タンパク質がCD81である、請求項１または７記載の分子構造体。
  10. 【請求項１０】 架橋された細胞性分子構造体である、請求項１または７記
    載の分子構造体。
  11. 【請求項１１】 架橋された細胞性分子構造体である、請求項２記載の分子
    構造体。
  12. 【請求項１２】 細胞溶解物から単離されたものである、請求項１または７
    記載の分子構造体。
  13. 【請求項１３】 細胞溶解物から単離されたものである、請求項２記載の分
    子構造体。
  14. 【請求項１４】 細胞性分子構造体が該エンベロープタンパク質を組換え的
    に発現している細胞を含む、請求項１０記載の分子構造体。
  15. 【請求項１５】 細胞性分子構造体が該エンベロープタンパク質を組換え的
    に発現している細胞を含む、請求項１１記載の分子構造体。
  16. 【請求項１６】 細胞溶解物が該エンベロープタンパク質を組換え的に発現
    している細胞を含む複数個の細胞に由来するものである、請求項１２記載の分子
    構造体。
  17. 【請求項１７】 細胞性分子構造体が１以上の宿主細胞性膜タンパク質を組
    換え的に発現している細胞をさらに含む、請求項１４記載の分子構造体。
  18. 【請求項１８】 組換え包膜ウイルスであって、そのエンベロープ上に、該
    ウイルスの天然のエンベロープタンパク質の細胞レセプターを組換え的に発現す
    る、上記ウイルス。
  19. 【請求項１９】 前記ウイルスがHIVであって、前記細胞レセプターがヒトC
    D4またはHIVのコレセプターであるか、または該ウイルスがヒトCD4と該コレセプ
    ターの両方を組換え的に発現する、請求項１８記載のウイルス。
  20. 【請求項２０】 前記適当な条件がpHを下げることを含む、請求項１記載の
    分子構造体。
  21. 【請求項２１】 架橋された細胞性分子構造体が、該エンベロープタンパク
    質を含む該ウイルスの架橋されたウイルス粒子をさらに含む、請求項１１記載の
    分子構造体。
  22. 【請求項２２】 免疫原量の請求項１〜４、６および８のいずれか１項記載
    の分子構造体、および製薬上許容される担体を含有するワクチン製剤。
  23. 【請求項２３】 請求項１または７記載の分子構造体に対するモノクローナ
    ル抗体。
  24. 【請求項２４】 請求項２記載の分子構造体に対するモノクローナル抗体。
  25. 【請求項２５】 請求項２記載の分子構造体に特異的な、精製されたポリク
    ローナル抗血清。
  26. 【請求項２６】 ウイルス感染を阻止または減少するのに有効な量の請求項
    ２３記載の抗体を含有する避妊用ゼリー、フォーム、クリームまたは軟膏。
  27. 【請求項２７】 HIV感染を阻止または減少するのに有効な量の請求項２４
    記載の抗体を含有する避妊用ゼリー、フォーム、クリームまたは軟膏。
  28. 【請求項２８】 HIV感染を阻止または減少するのに有効な量の請求項２５
    記載の抗血清を含有する避妊用ゼリー、フォーム、クリームまたは軟膏。
  29. 【請求項２９】 ウイルス感染を阻止または減少するのに有効な量の請求項
    ２３記載の抗体が添加されている、哺乳動物血液のサンプル。
  30. 【請求項３０】 HIV感染を阻止または減少するのに有効な量の請求項２４
    記載の抗体が添加されている、ヒト血液のサンプル。
  31. 【請求項３１】 前記エンベロープタンパク質または宿主細胞性膜タンパク
    質がアフィニティータグをさらに含む、請求項１または７記載の分子構造体。
  32. 【請求項３２】 前記エンベロープタンパク質、CD4またはコレセプターが
    アフィニティータグをさらに含む、請求項２記載の分子構造体。
  33. 【請求項３３】 標識されている、請求項２３記載の抗体。
  34. 【請求項３４】 １個以上の容器内に請求項１記載の分子構造体に対する標
    識モノクローナル抗体を含んでなるキット。
  35. 【請求項３５】 １個以上の容器内に請求項２記載の分子構造体に対する標
    識モノクローナル抗体を含んでなるキット。
  36. 【請求項３６】 別の容器内に請求項１記載の分子構造体をさらに含む、請
    求項３４記載のキット。
  37. 【請求項３７】 別の容器内に請求項２記載の分子構造体をさらに含む、請
    求項３５記載のキット。
  38. 【請求項３８】 ウイルスエンベロープと宿主細胞膜との融合において機能
    する包膜ウイルスのエンベロープタンパク質、または融合欠損性である該エンベ
    ロープタンパク質の変異体を組換え的に発現し、かつ該エンベロープタンパク質
    のレセプターとして機能する１以上の細胞性膜タンパク質を発現する細胞系。
  39. 【請求項３９】 レセプターとして機能する１以上の前記タンパク質が組換
    え的に発現される、請求項３８記載の細胞系。
  40. 【請求項４０】 HIV gp160を組換え的に発現し、かつCD4およびHIVのコレ
    セプターを発現し、gp160を切断してgp120とgp41を生成する機能性プロテアーゼ
    を欠いている細胞系。
  41. 【請求項４１】 ウイルス感染を治療または予防するのに有効な免疫原量の
    請求項１または７記載の分子構造体を被験体に投与することを含んでなる、被験
    体におけるウイルス感染の治療または予防方法。
  42. 【請求項４２】 ウイルス感染を治療または予防するのに有効な免疫原量の
    請求項１０記載の分子構造体を被験体に投与することを含んでなる、被験体にお
    けるウイルス感染の治療または予防方法。
  43. 【請求項４３】 ウイルス感染を治療または予防するのに有効な免疫原量の
    請求項１２記載の分子構造体を被験体に投与することを含んでなる、被験体にお
    けるウイルス感染の治療または予防方法。
  44. 【請求項４４】 HIV感染を治療または予防するのに有効な免疫原量の請求
    項２記載の分子構造体をヒトに投与することを含んでなる、ヒトのHIV感染の治
    療または予防方法。
  45. 【請求項４５】 HIV感染を治療または予防するのに有効な免疫原量の請求
    項３〜６のいずれか１項記載の分子構造体をヒトに投与することを含んでなる、
    ヒトのHIV感染の治療または予防方法。
  46. 【請求項４６】 被験体がヒトである、請求項４１記載の方法。
  47. 【請求項４７】 被験体が家畜である、請求項４１記載の方法。
  48. 【請求項４８】 ウイルス感染を治療または予防するのに有効な量の請求項
    ２３記載のモノクローナル抗体を被験体に投与することを含んでなる、被験体に
    おけるウイルス感染の治療または予防方法。
  49. 【請求項４９】 HIV感染を治療または予防するのに有効な量の請求項２４
    記載のモノクローナル抗体をヒトに投与することを含んでなる、ヒトのHIV感染
    の治療または予防方法。
  50. 【請求項５０】 前記ヒトがHIVに感染するリスクが高い、請求項４９記載
    の方法。
  51. 【請求項５１】 胎児を身ごもった妊娠ヒトに、該胎児のHIV感染を治療ま
    たは予防するのに有効な量の請求項２４記載のモノクローナル抗体を投与するこ
    とを含んでなる、ヒト胎児のHIV感染の治療または予防方法。
  52. 【請求項５２】 前記ヒトのAIDSを治療するためである、請求項４９記載の
    方法。
  53. 【請求項５３】 血液サンプルに、ウイルス感染を阻止するのに有効な量の
    請求項２３記載のモノクローナル抗体を接触させることを含んでなる、血液サン
    プル中のウイルスによる感染の阻止方法。
  54. 【請求項５４】 ヒト血液サンプルに、HIV感染を阻止するのに有効な量の
    請求項２４記載のモノクローナル抗体を接触させることを含んでなる、ヒト血液
    サンプル中のHIVによる感染の阻止方法。
  55. 【請求項５５】 手術用または歯科用器具に、ウイルス感染を阻止するのに
    有効な量の請求項２３記載のモノクローナル抗体を接触させることを含んでなる
    、手術用または歯科用器具の汚染除去方法。
  56. 【請求項５６】 手術用または歯科用器具に、HIV感染を阻止するのに有効
    な量の請求項２４記載のモノクローナル抗体を接触させることを含んでなる、手
    術用または歯科用器具の汚染除去方法。
  57. 【請求項５７】 ある量の請求項１または７記載の分子構造体を以前に投与
    された被験体における請求項１または７記載の分子構造体に対する抗体の産生を
    モニタリングする方法であって、該被験体より血清サンプルを分離し、該血清中
    の請求項１または７記載の分子構造体に対する抗体の存在を検出することを含ん
    でなる、上記方法。
  58. 【請求項５８】 前記検出が、請求項１または７記載の分子構造体に対する
    標識抗体を用いて競合イムノアッセイを行なうことを含む方法により実施される
    、請求項５７記載の方法。
  59. 【請求項５９】 ウイルス感染の治療または予防用ワクチンに使用する免疫
    原を製造する方法であって、記載した順に、 (a) 包膜ウイルスのエンベロープタンパク質もしくはそのキメラ体（該エンベ
    ロープタンパク質はウイルスエンベロープと細胞膜との融合において機能する）
    、または融合欠損性である該エンベロープタンパク質の変異体もしくはそのキメ
    ラ体に、該エンベロープタンパク質のレセプターとして機能する１以上の細胞タ
    ンパク質もしくはそのキメラ体を接触させ、 (b) 該エンベロープタンパク質もしくはそのキメラ体、または該変異体もしく
    はそのキメラ体と、該１以上の宿主細胞タンパク質もしくはそのキメラ体とを、
    架橋剤にさらし、 (c) 該エンベロープタンパク質もしくはそのキメラ体、または該変異体もしく
    はそのキメラ体を含む架橋構造体を単離する、 各ステップを含んでなる上記方法。
  60. 【請求項６０】 前記ウイルスがHIVであり、前記宿主細胞タンパク質がヒ
    トCD4およびHIVのためのコレセプターである、請求項５９記載の方法。
  61. 【請求項６１】 HIV感染の治療または予防用ワクチンに使用する免疫原を
    製造する方法であって、記載した順に、 (a) HIVエンベロープタンパク質もしくはそのキメラ体、または融合欠損性で
    ある該エンベロープタンパク質の変異体もしくはそのキメラ体を組換え的に発現
    している第１の細胞を、(i)ヒトCD4またはそのキメラ体および(ii)HIVのための
    コレセプターまたはそのキメラ体を発現している第２の細胞と共に培養し、 (b) 該エンベロープタンパク質もしくはそのキメラ体、または該変異体もしく
    はそのキメラ体と、該CD4またはそのキメラ体および該コレセプターまたはその
    キメラ体とを、架橋剤にさらし、 (c) 該エンベロープタンパク質もしくはそのキメラ体、または該変異体もしく
    はそのキメラ体を含む架橋構造体を単離する、 各ステップを含んでなる上記方法。
  62. 【請求項６２】 第２の細胞がCD4もしくは前記コレセプター、またはCD4と
    該コレセプターの両方、または前記のもののいずれかのキメラ体を組換え的に発
    現する、請求項６１記載の方法。
  63. 【請求項６３】 第１および第２の細胞が同じ細胞型である、請求項６１記
    載の方法。
  64. 【請求項６４】 第１および第２の細胞が異なる細胞型である、請求項６１
    記載の方法。
  65. 【請求項６５】 ステップ(a)において、前記エンベロープタンパク質もし
    くはそのキメラ体、または前記変異体もしくはそのキメラ体がウイルス粒子また
    はウイルス様粒子の上に存在する、請求項５９記載の方法。
  66. 【請求項６６】 前記架橋構造体が架橋細胞複合体である、請求項６１記載
    の方法。
  67. 【請求項６７】 前記ウイルスがレトロウイルス科、ラブドウイルス科、カ
    ロナウイルス科、フィロウイルス科、ポックスウイルス科、ブンヤウイルス科、
    フラビウイルス科、トガウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイ
    ルス科、およびヘルペスウイルス科からなる群より選択される、請求項５９記載
    の方法。
  68. 【請求項６８】 前記接触ステップが、前記宿主細胞タンパク質を発現して
    いる細胞に、前記エンベロープタンパク質もしくはそのキメラ体または前記変異
    体もしくはそのキメラ体を発現している前記ウイルスを感染させることにより行
    なう、請求項６５記載の方法。
  69. 【請求項６９】 前記エンベロープタンパク質または前記宿主細胞タンパク
    質の１つのキメラ体を接触させ、該キメラ体がアフィニティータグを含む、請求
    項５９記載の方法。
  70. 【請求項７０】 前記エンベロープタンパク質またはCD4または前記コレセ
    プターのキメラ体を接触させ、該キメラ体がアフィニティータグを含む、請求項
    ６１記載の方法。
  71. 【請求項７１】 HIV感染の治療または予防用ワクチンに使用する免疫原を
    製造する方法であって、記載した順に、 (a) HIVエンベロープタンパク質もしくはそのキメラ体、または融合欠損性で
    ある該エンベロープタンパク質の変異体もしくはそのキメラ体を組換え的に発現
    している第１の細胞を、(i)ヒトCD4またはそのキメラ体および(ii)HIVのための
    コレセプターまたはそのキメラ体を発現している第２の細胞と共に培養し、その
    際、アフィニティータグを含む該キメラ体の少なくとも１つが発現されており、 (b) 共培養した細胞を溶解して、非変性条件下で細胞溶解物を形成し、 (c) 該細胞溶解物と該アフィニティータグに対する結合パートナーとを接触さ
    せ、該アフィニティータグに結合した分子構造体を回収することを含む方法によ
    り、該エンベロープタンパク質もしくはそのキメラ体または前記変異体もしくは
    そのキメラ体を含む分子構造体を該細胞溶解物から単離する、 各ステップを含んでなる上記方法。
  72. 【請求項７２】 請求項５９記載の方法の産物である架橋構造体。
  73. 【請求項７３】 請求項６０記載の方法の産物である架橋構造体。
  74. 【請求項７４】 請求項６１記載の方法の産物である架橋構造体。
  75. 【請求項７５】 請求項６２記載の方法の産物である架橋構造体。
  76. 【請求項７６】 HIVの次の一次分離株：92US657、92US660、92RW023、93IN
    101、92UG035および92TH023をin vitroで中和する、請求項６０記載の構造体に
    対するモノクローナル抗体。
  77. 【請求項７７】 HIV感染を阻止または低下させる量の請求項７６記載の抗
    体を含む避妊用ゼリー、フォーム、クリームまたは軟膏。
  78. 【請求項７８】 ウイルス感染を治療または予防するのに有効な免疫原量の
    請求項７２記載の構造体を被験体に投与することを含んでなる、被験体のウイル
    ス感染の治療または予防方法。
  79. 【請求項７９】 HIV感染を治療または予防するのに有効な免疫原量の請求
    項７３記載の分子構造体をヒトに投与することを含んでなる、ヒトのHIV感染の
    治療または予防方法。
  80. 【請求項８０】 HIV感染を治療または予防するのに有効な免疫原量の請求
    項７４記載の分子構造体をヒトに投与することを含んでなる、ヒトのHIV感染の
    治療または予防方法。
  81. 【請求項８１】 手術用または歯科用器具に、HIV感染を阻止するのに有効
    な量の請求項７６記載のモノクローナル抗体を接触させることを含んでなる、手
    術用または歯科用器具の汚染除去方法。
  82. 【請求項８２】 手術用または歯科用器具に、ウイルス感染を阻止するのに
    有効な量の請求項２３記載のモノクローナル抗体を接触させることを含んでなる
    、手術用または歯科用器具の汚染除去方法。
  83. 【請求項８３】 ワクチン効力について分子構造体をスクリーニングする方
    法であって、請求項２記載の分子構造体を用いて、１個以上の導入遺伝子からヒ
    トCD4とHIVのためのコレセプターの両方を発現するトランスジェニック非ヒト哺
    乳動物を免疫し、該哺乳動物により産生されるHIVに対する中和抗体を検出する
    ことを含んでなる、上記方法。
  84. 【請求項８４】 ワクチン効力について分子構造体をスクリーニングする方
    法であって、請求項１記載の分子構造体を用いて、１個以上の導入遺伝子から前
    記１以上の宿主細胞性膜タンパク質を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動
    物を免疫し、該哺乳動物により産生される前記ウイルスに対する中和抗体を検出
    することを含んでなる、上記方法。
  85. 【請求項８５】 前記哺乳動物がマウスである、請求項８３記載の方法。
  86. 【請求項８６】 第１の細胞がHIVエンベロープタンパク質またはそのキメ
    ラ体を組換え的に発現する、請求項６１記載の方法。
  87. 【請求項８７】 １個以上の容器内に請求項１記載の分子構造体を含有する
    キット。
  88. 【請求項８８】 製薬上許容される担体をさらに含み、前記分子構造体が免
    疫学的量で存在する、請求項８７記載のキット。
  89. 【請求項８９】 ヒトCD4およびヒトCCR5と機能的に相互作用しているヒト
    免疫不全ウイルス１型のエンベロープタンパク質を含む、単離されたタンパク質
    複合体。
  90. 【請求項９０】 請求項８９記載のタンパク質複合体および製薬上許容され
    る担体を含むワクチン製剤。
  91. 【請求項９１】 ウイルスに対して動物を免疫する方法であって、動物に、
    ウイルスの結合、侵入および／または感染を媒介する１以上の宿主細胞レセプタ
    ーまたはコレセプターと機能的に相互作用している１以上のウイルスタンパク質
    を含むタンパク質複合体を含有する請求項９０記載のワクチン製剤を投与し、そ
    れによりウイルスに対する中和抗体を生成させることを含んでなる上記方法。
  92. 【請求項９２】 ウイルスの結合、侵入および／または感染を媒介する１以
    上の宿主細胞レセプターまたはコレセプターと機能的に相互作用している１以上
    のウイルスタンパク質を含むタンパク質複合体を調製する方法であって、 (a) １以上のウイルスタンパク質を発現する第１の細胞を培養し、 (b) 該１以上のウイルスタンパク質の１以上の宿主細胞レセプターまたはコレ
    セプターを発現する第２の細胞を培養し、 (c) 第１および第２の細胞を共培養し、 (d) 細胞−細胞融合において該共培養物を固定させ、 (e) 固定した細胞を単離する、 各ステップを含んでなる上記方法。
  93. 【請求項９３】 請求項９２記載の方法により調製された固定細胞。
  94. 【請求項９４】 ヒトCD4およびヒトCCR5と機能的に相互作用しているヒト
    免疫不全ウイルス１型のエンベロープタンパク質を含むタンパク質複合体を精製
    する方法であって、 (a) その後の精製を容易にするペプチド配列により該複合体をタグ付けし、 (b) タグ付けされた複合体を単離する、 各ステップを含んでなる上記方法。
  95. 【請求項９５】 被験体のウイルス感染を治療または予防する方法であって
    、被験体に、(a) 包膜ウイルスのエンベロープタンパク質をコードする第１の核
    酸、および(b)１以上の細胞性膜タンパク質をコードする第２の核酸を投与する
    ことを含んでなり、ここで、該エンベロープタンパク質と該細胞性膜タンパク質
    は、適当な条件下で、該ウイルスのエンベロープと該細胞性膜タンパク質を含む
    細胞膜とが融合するのに必要かつ十分なものであり、その結果、被験体において
    該エンベロープタンパク質と該細胞性膜タンパク質とが発現されて、該ウイルス
    に対する中和抗体が産生される、上記方法。
  96. 【請求項９６】 第１および第２の核酸が同じものである、請求項９５記載
    の方法。
  97. 【請求項９７】 第１および第２の核酸が異なる核酸ベクターである、請求
    項９５記載の方法。
  98. 【請求項９８】 前記エンベロープタンパク質がHIVのエンベロープタンパ
    ク質であり、細胞性膜タンパク質がCD4およびHIVコレセプターである、請求項９
    ５記載の方法。
  99. 【請求項９９】 (a) 包膜ウイルスのエンベロープタンパク質をコードする
    第１の核酸、および(b)１以上の細胞性膜タンパク質をコードする第２の核酸（
    ただし、該エンベロープタンパク質と該細胞性膜タンパク質は、適当な条件下で
    、該ウイルスのエンベロープと該細胞性膜タンパク質を含む細胞膜とが融合する
    のに必要かつ十分なものであり、その結果、被験体において該エンベロープタン
    パク質と該細胞性膜タンパク質とが発現されて、該ウイルスに対する中和抗体が
    産生される）、および(c) 製薬上許容される担体、を含有するワクチン製剤。
  100. 【請求項１００】 ウイルスに感染した宿主を治療する、またはウイルスに
    よる宿主の感染を予防する方法であって、請求項８９記載のタンパク質複合体に
    より動物を免疫することにより生成された抗体を、該宿主の感染を治療または予
    防するのに有効な量で該宿主に投与することを含んでなる上記方法。
  101. 【請求項１０１】 ヒトCD4およびヒトCCR5と機能的に相互作用しているヒ
    ト免疫不全ウイルス１型のエンベロープタンパク質を含む単離されたタンパク質
    複合体であって、該エンベロープタンパク質、CD4またはCCR5の１以上がペプチ
    ドでタグ付けされている、上記タンパク質複合体。
  102. 【請求項１０２】 １個以上の容器内に、(a) 包膜ウイルスのエンベロープ
    タンパク質をコードする第１の核酸、および(b)１以上の細胞性膜タンパク質を
    コードする第２の核酸（ただし、該エンベロープタンパク質と該細胞性膜タンパ
    ク質は、適当な条件下で、該ウイルスのエンベロープと該細胞性膜タンパク質を
    含む細胞膜とが融合するのに必要かつ十分なものであり、その結果、被験体にお
    いて該エンベロープタンパク質と該細胞性膜タンパク質とが発現されて、該ウイ
    ルスに対する中和抗体が産生される）を含有するキット。
  103. 【請求項１０３】 (a) 請求項２３記載のモノクローナル抗体、(b) 包膜ウ
    イルスの前記エンベロープタンパク質、および(c) 製薬上許容される担体を含有
    する組成物。
  104. 【請求項１０４】 被験体のウイルス感染を治療または予防する方法であっ
    て、被験体に、ウイルス感染を治療または予防するのに有効な量の請求項１０３
    記載の組成物を投与することを含んでなる上記方法。
  105. 【請求項１０５】 ワクシニアウイルスベクターを用いて、第２の細胞にお
    いて前記１以上の宿主細胞レセプターまたはコレセプターを発現させる、請求項
    ９２記載の方法。
  106. 【請求項１０６】 ワクシニアウイルスベクターを用いて、第１の細胞にお
    いて前記１以上のウイルスタンパク質を発現させる、請求項９２記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002536416A (ja) * 1999-02-15 2002-10-29 アンスティテュ ドゥ ルシェルシュ プール ル デヴロップマーン （イ エール デ） ワクチンとして使用できる免疫性組成物

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000039304A2 (en) 1998-12-31 2000-07-06 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP1130089A1 (en) * 2000-02-17 2001-09-05 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Composition comprising membrane virus subviral target and fusion particles and vaccine comprising said composition
AU2001294667B2 (en) * 2000-09-22 2006-08-17 Duke University Immunogen comprising ligand bound HIV envelope protein
US7033593B2 (en) 2000-09-22 2006-04-25 Duke University Immunogen comprising an HIV envelope protein, a ligand and H2 peptide
FR2819256B1 (fr) * 2001-01-05 2004-04-30 Aventis Pasteur Polypeptide induisant des anticorps neutralisant le vih
CA2431881C (en) * 2001-01-05 2011-02-22 Aventis Pasteur Polypeptide inducing hiv-neutralising antibodies
AU2002320314A1 (en) 2001-07-05 2003-01-21 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
GB201412494D0 (en) 2014-07-14 2014-08-27 Ospedale San Raffaele And Fond Telethon Vector production

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993000103A1 (en) * 1991-06-21 1993-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Chimeric envelope proteins for viral targeting
WO1993005147A1 (en) * 1991-08-30 1993-03-18 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Defective interfering hiv particles with chimeric cd4-env

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002536416A (ja) * 1999-02-15 2002-10-29 アンスティテュ ドゥ ルシェルシュ プール ル デヴロップマーン （イ エール デ） ワクチンとして使用できる免疫性組成物

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