JP2000505299A - 合成ｈｉｖ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＨＩＶ遺伝子及び改変型ＨＩＶ遺伝子をコードする合成ＤＮＡ分子を提供する。該合成分子のコドンは、宿主細胞が好むコドンを使用する。該合成分子は、中和抗体及び細胞媒介性免疫を介してＨＩＶ感染に対して有効な免疫予防を提供するポリヌクレオチドワクチンとして用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称 合成ＨＩＶ遺伝子発明の分野 ＨＩＶワクチン発明の背景 １． ＨＩＶ感染 ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）は、後天性ヒト免疫不全症候群（Ａ ＩＤＳ）及び関連疾患の病因物質である。ＨＩＶ−１はレトロウイルス科のＲＮ Ａウイルスであり、全てのレトロウイルスが有する５’ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ −ｅｎｖ−ＬＴＲ３’構造を示す。さらに、ＨＩＶ−１は、ｔａｔ及びｒｅｖ遺 伝子を含めた調節機能又は未解明の機能を有する小数の遺伝子をも含んでいる。 ｅｎｖ遺伝子は１６０キロダルトン（ｋＤａ）の前駆体（ｇｐ１６０）として翻 訳され、さらに細性プロテアーゼによって切断されて、１２０ｋＤａの外層エン ベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）と４１−ｋＤａの膜貫通型エンベロープ糖 タンパク質（ｇｐ４１）を生成するウイルスエンベロープ糖タンパク質をコード する。ｇｐ１２０とｇｐ ４１は結合状態に維持され、ウイルス粒子及びＨＩＶ感染細胞表面に呈示される 。ｇｐ１２０は、ヘルパーＴリンパ球、マクロフアージ及び他の標的細胞の表面 に存在するＣＤ４受容体と結合する。ｇｐ１２０がＣＤ４と結合した後、ｇｐ４ １はウイルスの侵入に関与する融合事象を媒介する。 ウイルス粒子上のｇｐ１２０がＴ４リンパ球又は他の標的細胞の表面のＣＤ４ 受容体と結合すると感染が始まる。結合したウイルスは標的細胞と同化して、そ のＲＮＡゲノムを該細胞の二本鎖ＤＮＡ中に逆転写する。ウイルスＤＮＡは細胞 核の遺伝物質中に組み込まれ、そこで、ウイルスＤＮＡが新生ウイルスＲＮＡ、 ウイルスタンパク質及び新生ウイルス粒子の産生を誘導する。新生粒子は、標的 細胞の膜から分裂して他の細胞に感染する。 免疫防御にとって重要なＴ４リンパ球の破壊は、ＨＩＶ感染症の特徴である進 行性免疫不全の主因である。標的細胞の欠損は、殆どの侵入物に対する身体の抵 抗力を著しく弱めるが、ウイルス、菌類、寄生虫及びマイコバクテリアを含めた 特定のバクテリアに対する防御には特に危険な影響を与える。 ＨＩＶ−１は、複製し、複製体から分裂し、細胞膜に損傷を 与えることにより、感染した細胞を殺す。ＨＩＶ−１は、感染した細胞の表面に 呈示されるウイルスｇｐ１２０を介して間接的に標的細胞を殺し得る。Ｔ細胞上 のＣＤ４受容体はｇｐ１２０に対して強力な親和性を有しているために、ＣＤ４ 受容体を発現する健康な細胞はｇｐ１２０と結合し、感染細胞と融合してシンシ チウムを形成し得る。シンシチウムは生存し得ない。 ＨＩＶ−１は、感染細胞に対する正常な細胞性免疫防御をも誘発し得る。抗体 の助けを借りても借りなくても、細胞傷害性防御細胞は、その表面にウイルスタ ンパク質を呈示する感染細胞を破壊し得る。最後に、遊離ｇｐ１２０がＨＩＶ− １に感染した個体の血液中で循環し得る。該遊離タンパク質は、未感染細胞のＣ Ｄ４受容体に結合し、該細胞を感染しているように見せて、免疫応答を誘発し得 る。 ＨＩＶ−１に感染すると殆ど全ての場合死に至るが、現在のところ、ＨＩＶ− １感染症に対する治療法は存在していない。ＨＩＶ−１感染症の予防に有効なワ クチンはまだ開発されていない。弱毒生ウイルスは、復帰変異又は感染の恐れが あるために、ワクチンとして用いることは恐らく不可能であろう。殆どのサブユ ニットワクチン法はＨＩＶ感染の予防には成功を治め ていない。ＨＩＶ−１感染症の治療は、それによって生存年数が伸びる感染者が いるにしても、重度の副作用を伴う。従って、この致命的な感染症に対して有効 な治療法やワクチンが大いに必要とされている。 ２． ワクチン 予防接種は疾患予防の有効な形態であり、数種のウイルス感染症に有効であるこ とが証明されている。感染防御体液性及び細胞性免疫を誘発するためにヒト免疫 系にＨＩＶ−１抗原を呈示する方法を決定することは困難な作業である。今まで のところ、有効なＨＩＶワクチンを製造しようとする試みは成功を治めていない 。ＡＩＤＳ患者では、遊離ウイルスは低レベルでしか存在しない。ＨＩＶ−１の 伝播は融合及びシンシチウムの形成を介した細胞同士の相互作用によって促進さ れる。従って、一般に遊離ウイルス又はウイルスサブユニットに対して産生され る抗体はウイルス感染細胞の除去には有効でない。 ワクチンは身体の抗原「記憶」能を利用する。所与の抗原との最初の出会いの 後、免疫系は個体の生存期間中該抗原の免疫学的記憶を保持する細胞を生産する 。その後で、該抗原に露出されると、免疫応答が刺激され、該病原体が除去又は 不活化さ れる。 免疫系は、２つの経路、体液性応答及び細胞媒介性応答を介して病原体に対処 する。体液性応答の場合、リンパ球が、抗原に結合して病原体を不活化する特異 抗体を産生する。細胞媒介性応答には、感染細胞を特異的に攻撃して破壊する細 胞傷害性Ｔリンパ球及びヘルパーＴリンパ球が関与する。 ＨＩＶ−１ウイルスを用いたワクチンの開発には、ワクチンによって免疫系中 で活性化される必要がある細胞と同種の細胞（即ち、Ｔ４リンパ球）にＨＩＶ− １が感染するために問題がある。免疫不全が生じる前にＨＩＶを不活化するワク チンを開発すれば有利であろう。特に適当なＨＩＶワクチンのタイプは、ＨＩＶ 変異体を認識し、感染初期のＨＩＶ陽性個体において機能する抗ＨＩＶ免疫応答 を生起させるものであろう。 中和及び感染防御免疫応答の誘発が望ましいウイルス、特にヒト免疫不全ウイ ルスなどの突然変異率が高いウイルスに対するワクチンの開発にあたっての主要 な難題は、種々のウイルス分離体又はウイルス株間のウイルスエンベロープタン パク質の多様性である。マウスやヒトの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は保存 された内因性ウイルスタンパク質由来のエピトープ を認識し得、従って、ウイルスに対する免疫応答において重要であると考えられ るので、種々のウイルス株に対して異種感染防御を提供し得るＣＴＬワクチンの 開発に努力が傾けられてきた。 ＣＤ８⁺ＣＴＬは、そのＴ細胞受容体がＭＨＣクラスＩ分子に結合したウイル スペプチドを認識するとウイルスに感染した細胞を殺すことは公知である。ウイ ルスペプチドは、内在性合成ウイルスタンパク質から、該タンパク質のウイルス 内での位置や機能に関係なく誘導される。従って、ＣＴＬは、保存されたウイル スタンパク質由来のエピトープを認識することにより、交雑株を防御し得る。Ｃ ＴＬが認識するＭＨＣクラスＩに結合し得るペプチドは、細胞質又は小胞体中に 存在するか又はそこを通過するタンパク質を起源とする。一般に、（ＭＨＣクラ スII分子によって呈示される抗原の場合と同様に）エンドソームプロセシング経 路に入ってくる外因性タンパク質は、ＣＤ８⁺ＣＴＬ応答の生起には有効でない 。 ＣＴＬ応答を生起させようとする研究の殆どは、複製ベクターを用いて細胞内 でタンパク質抗原を生産する方法を用いるか、又はサイトゾル中にペプチドを導 入することに焦点を合わせた 方法を用いた。これらの方法は、ワクチンとしてのその有用性を低下させ得る限 界を有している。レトロウイルスベクターは組換えウイルスの複製能を維持しつ つ融合タンパク質として発現させ得るポリペプチドの大きさと構造に限界があり 、連続して免疫感作に用いるワクシニアなどのベタターの有効性はベクター自体 に対する免疫応答によって低下し得る。また、ウイルスベクター及び変性病原体 は、ヒトにおける使用を妨げ得る固有のリスクを有している。さらに、呈示すべ きペプチドエピトープの選択は個体のＭＨＣ抗原の構造に依存し、従って、ペプ チドワクチンは、遠縁交配集団におけるＭＨＣハプロタイプの多様性の故に有効 性が制限されてしまう可能性がある。 ３． ＤＮＡワクチン Ｎ．Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ及びＬ．Ｒｅｓｈｅｆ〔ＰＮＡＳ ８３，９５５１ −９５５５，（１９８６）〕は、マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）、静脈内（ｉ．ｖ ．）又は筋肉内（ｉ．ｍ．）導入したＣａＣｌ₂沈降ＤＮＡを発現させ得ること を示した。ＣａＣｌ₂処理せずにマウスにＤＮＡ発現ベクターをｉ．ｍ．注射す ると、筋肉細胞がＤＮＡを取り込み、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質が 発現した。該プラスミドはエピソ ームで維持され、複製しなかった。次いで、ラット、サカナ及び霊長類の骨格筋 、並びにラットの心筋にｉ．ｍ．注射すると、持続性発現が認められた。治療薬 として核酸を用いる方法がＷＯ９１／１１０９２号（１９９０年１０月４日）に 記載されており、該方法では、脊椎動物に対する子防接種に裸のポリヌクレオチ ドを用いた。 該方法を成功させるために免疫感作を筋肉内に行う必要はない。ウシ成長ホル モン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡでコートした金微小発射体（gold microproj ectile）をマウスの皮膚内に導入すると、マウスにおいて抗ＢＧＨ抗体が産生し た。生きている動物の皮膚、筋肉、脂肪及び乳房組織にトランスフェクトする場 合にはジェットインジェクターが用いられた。核酸の導入には種々の方法が検討 された。Ｚｈｕら，〔Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−２１１（１９９３年７ 月９日）〕により、クローン化トランスジーンの全身性発現を得るために、マウ スにＤＮＡ：カチオン性リポソーム複合体を静脈注射する方法が示された。Ｕｌ ｍｅｒら，〔Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９（１９９３）〕は、 インフルエンザウイルスタンパク質をコードするＤＮＡの筋肉内注射によるイン フルエンザ ウイルス感染に対する異種感染防御を発表した。 病原体及び腫瘍抗原に対して所望の免疫応答を誘発し得る特定の治療薬及び予 防薬に対する要求は本発明により満たされる。この治療法において特に重要な点 は、抗原遺伝子を得た株とは異種のウイルス株によって引き起こされる感染症や 疾患でさえ予防し得るＴ細胞免疫応答を誘発する能力である。これは、ＨＩＶウ イルスが急激に突然変異を起こすことが認識され且つ多くのビルレント分離体が 同定されているので、ＨＩＶに対処する際に特に重要である〔例えば、２４５種 の別個のＨＩＶ分離体を同定する、ＬａＲｏｓａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： ９３２−９３５（１９９０）を参照されたい〕。この認識された多様性に答えて 、研究者は、ペプチド免疫感作を基にＣＴＬを生産しようと試みた。例えば、Ｔ ａｋａｈａｓｈｉら，〔Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３３３−３３６（１９９２） 〕は、ＨＩＶエンベロープ（ｇｐ１６０）決定基を認識する広域交差反応性の細 胞傷害性Ｔ細胞の誘発について発表した。しかし、該研究者は、真に交差反応性 のＣＴＬ応答の達成が困難であることを認識し、極めて厳しいＴ細胞の初回抗原 刺激又は再刺激と、既に刺激を受けたＣＴＬからの細胞傷害性を含めたエフェク タ ー機能の誘発との間には２叉分枝が存在することを示唆している。 Ｗａｎｇらは、マウスにクローン化ゲノム（スプライシングされていない）Ｈ ＩＶ遺伝子を筋肉内接種することによる抗ＨＩＶ免疫応答の誘発について発表し た。しかし、これらの研究で達成された免疫応答のレベルは極めて低いものであ った。さらに、Ｗａｎｇらは、ＤＮＡ構築物としてＨＩＶをコードする隣接Ｔａ ｔ／ＲＥＶ−ｇｐ１６０−Ｔａｔ／ＲＥＶコード配列の実質的にゲノムからなる フラグメントを利用した。以下に詳細に述べるように、これはｇｐ１６０の高レ ベル発現を得るための次善の方法である。さらに該方法は、Ｔａｔの発現がカポ ジ肉腫進行の原因となるために潜在的に危険をはらんでいる。 ＷＯ９３／１７７０６号は、動物にウイルスに対する予防接種を施す方法を記 載しており、該方法では、担体粒子を遺伝子構築物でコートし、コートされた粒 子を動物の細胞中に加速導入（accelerate）する。ＨＩＶに関しては、長い末端 反復配列を除く実質的に全てのゲノムを用いることが提案されている。該方法は 受容者に対して重大なリスクを有している。一般に、ＨＩＶ構築物はＨＩＶゲノ ムの約５０％末満しか含まないこと でワクチンの安全性が確保されると考えられている。それによって、多くは未解 明又は解明が進んでいない機能を有する酵素部分及びウイルス調節タンパク質の 排除が確実になる。従って、遺伝子送出技術から有用なヒトＨＩＶワクチンを生 産しようとする方法には未だ多くの問題が残されている。 本発明は、生きている組織にポリヌクレオチドを導入してタンパク質の発現を 誘発する既知方法のいずれをも包含する。しかし、本発明は、ＨＩＶ及び他のタ ンパク質を抗原プロセシング経路に導入して効率的にＨＩＶ特異的ＣＴＬ及び抗 体を産生させるための新規な免疫原を提供する。医薬品は細胞性抗ＨＩＶ及び体 液性抗ＨＩＶやＨＩＶ中和免疫応答を誘発するワクチンとして有効である。本発 明では、上記問題に取り組み、動物中に導入すると、上記方法に係わるリスクを 伴わずにＨＩＶタンパク質及びエピトープの効率的な発現を誘導するポリヌクレ オチド免疫原を提供することにより該問題を解決する。このようにして生起した 免疫応答は、ＨＩＶの認識、ＨＩＶ複製の抑制、ＨＩＶ感染細胞の同定及び死滅 化に有効であり、且つ多くのＨＩＶ株に対して交差反応性である。 ４． コドン利用及びコドンのコンテックス 微生物のコドンの組み合わせは高度に規則的であり、微生物毎に異なっている 。この情報を構築に用い、所望レベルの翻訳効率を有する改変又は合成遺伝子を 発現させて、ゲノム中のどの領域がタンパタ質コード領域であるかを決定し、翻 訳終結部位を異種遺伝子中に導入して、ヌクレオチド配列の関係又は始祖を確定 する。 形質転換された微生物における外来異種遺伝子の発現は今や一般的に行われて いる。例えば、ネズミやヒトの遺伝子を含めた多数の哺乳動物の遺伝子が単細胞 微生物中に首尾良く挿入されている。これに関する標準的な技術には、発現させ るべき外来遺伝子をプラスミド又はフアージなどのベクター中に導入し、該ベク ターを用いて該遺伝子を微生物中に挿入する技術が含まれる。一般に、そのよう な遺伝子の天然プロモーターは、該遺伝子が挿入される宿主と適合し得る強力な プロモーターに置き換えられる。タンパク質配列決定装置により、微量の天然タ ンパク質でもアミノ酸配列の解明が可能である。これらのアミノ酸配列から該タ ンパク質をコードするＤＮＡ配列を推定し得る。ＤＮＡ合成法も急速に発展して いる技術であり、推定されたこれらのＤＮＡ配列に対応する合成遺伝子を容易に 構築すること ができる。 発現系及び組換えＤＮＡについての知識が急速に増大しているにも拘わらず、 微生物中で外来又は合成遺伝子を発現させようとする場合には未だに重大な障害 が残されている。例えば、多くの天然活性タンパク質は、該タンパク質が外来宿 主中で発現する場合とは違うようにグリコシル化される。そのために、多くの哺 乳動物遺伝子の発現には細菌宿主よりも酵母などの真核生物宿主が好ましい。こ のグリコシル化問題は今後とも研究課題である。 別の問題はもっと解明が進んでいない問題である。合成遺伝子の翻訳は、該遺 伝子が強力なプロモーターと結合している場合でさえ、予想をはるかに下回る効 率でしか進められないことが多い。同じことが発現微生物に対して異種である外 因性遺伝子にもしばしば当てはまる。回収可能な量の翻訳産物を生産するに十分 な程効率的な方法で該遺伝子が転写された場合でも、該タンパク質が不活性であ るか、さもなければ天然タンパク質とは特性が異なるものであることが多い。 後者の問題は、一般に種々の微生物におけるタンパク質の折りたたみ（foldin g）の違いに起因すると認識されている。こ の問題に対する解決法は確立されておらず、タンパク質の折りたたみを調節する 機構の解明も進んでいない。 翻訳効率に関する問題はコドンのコンテックス効果に関連すると考えられる。 全ての微生物における遺伝子のタンパク質コード領域は多岐にわたる機能的規制 に支配されており、該規制のうちには、正常に機能するタンパク質をコードする ための要件や、適切な翻訳開始又は終結シグナルに応じて異なるものがある。し かし、タンパク質コード領域には、これらの規制の観点からは容易に理解し得な いいくつかの特徴が認められている。そのうち２つの重要な特徴には、コドンの 利用とコドンのコンテックスが関与する。 コドンの利用には大きな偏りがあり、微生物毎に相当異なることは公知である 。コドンの利用パターンはｔＲＮＡのアイソアクセプターの相対量に関連するこ とが証明されている。高低量のタンパク質をコードする遺伝子はそれらのコドン の優先順位（preference）に差がある。コドン利用における偏りによってペプチ ドの延長速度が変わる可能性が広く検討された。コドン利用における差は翻訳速 度の差に関連するが、翻訳に及ぼすコドン選択の直接的な影響は証明が困難であ った。コドンの利 用パターンに関して提起された他の規制には、翻訳の正確さを最大にし且つタン パク質合成の動力学的効率を最適化することが含まれる。 コドンの規則的な利用とは別に、コドン／アンチコドンの認識がコドン自体以 外の配列、「コドンコンテックス」と称される現象によって影響を受けることを 証明する多くの証拠が示された。ナンセンスコドンやミスセンスコドンの抑制効 率には周囲のヌクレオチドが強力な影響を及ぼす。天然の細菌集団におけるサプ レッサー活性の量やセレノシステイン及びホスホセリンをコードするための「終 結」コドンの利用には、終結がコンテックス依存性であることが要求される。類 似のコンテックス効果が翻訳の正確さや翻訳開始効率にも影響を与えることが示 された。 Ｅ．ｃｏｌｉのタンパク質コード領域の統計的分析により、「コドンコンテッ クス」の別の徴候が証明された。ある位置に特定のコドンが存在すると、隣接す るコドンにおける特定のヌクレオチドの頻度に強力な影響を与え、且つこれらの コンテックスの規制は、高低レベルで発現した遺伝子では著しく異なる。コンテ ックス効果は認識されたものの、コドンに隣接する好ま しいヌクレオチドに関する統計的規則の子言的価値は比較的低い。そのために、 所望レベルの翻訳効率を得るべくコドンを選択する際のそのようなヌクレオチド 優先データの有用性が制限されている。 自動化ヌクレオチド配列決定装置の出現により、多岐にわたる微生物に関し大 量の配列データが利用可能になった。これらのデータを理解することは相当に困 難である。例えば、遺伝子配列データとタンパク質配列とを関連づけるためには ゲノムのコード領域の同定が重要である。さらに、特定の微生物のゲノムの祖先 は基本的に重要である。ある種の微生物のゲノムが交雑祖先由来であることは公 知である。ウイルスを起源とする配列のなかには、今や真核微生物のゲノム中に 安定に組み込まれているものもある。該ウイルス配列自体は別の実質的に無関係 の種由来であったかもしれない。遺伝子の祖先を理解することは、関連遺伝子と 他の微生物における該遺伝子の翻訳産物との正しい相似性を明確にする際に重要 であり得る。 翻訳に対するコドンコンテックス効果をより良く理解すること、及び所望の翻 訳作用を得るために適切なコドンを決定する方法が必要である。ヌクレオチド配 列データからゲノムのコー ド領域を同定する方法も必要である。さらに、タンパク質の折りたたみを調節す る方法や外来遺伝子が宿主中で発現したときに適切に折りたたまれることを確実 にする方法も必要である。所望の翻訳効率に従って改変又は構築された遺伝子は 有意な両値を有するであろう。 工業的に且つ医薬品として重要なタンパク質を微生物により発現させる組換え ＤＮＡ技術の別の実施態様は「コドン優先順位」現象である。現行の遺伝子発現 法は、所与の所望産物を構築するべく「働く」（operate）ように宿主細胞を遺 伝子的に形質転換するものであることは先に記載したが、微生物中で達成される 発現レベルは、部分的には挿入される外因性遺伝子中に存在するアミノ酸指定遺 伝子コードの特定の代替え形態に応じて大きく変動し得る。４種の可能なヌクレ オチド塩基のうちの「トリプレット」コドンは６４通りの変異形態で存在し得る 。これらの形態がたった２０種の異なるアミノ酸（並びに転写開始及び終結）に 対応するメッセージを提供するということは、アミノ酸のなかには１種以上のコ ドンによってコードされ得るものもあることを意味する。実際、６種もの「過剰 な」（redundant）代替えコドンを有するアミノ酸もあれば、必要 なたった１種のコドンしか有していないアミノ酸もある。完全には解明されてい ない理由から、代替えコドンは必ずしも全てが均一に種々のタイプの細胞の内因 性ＤＮＡ中に存在するわけではなく、特定のタイプの細胞には特定のコドンに対 して不変の天然の階層関係、即ち「優先順位」が存在するようである。 １つの例として、アミノ酸ロイシンは、（それそれ、ｍＲＮＡコドン、ＣＵＡ 、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、ＵＵＡ及びＵＵＧに対応する）ＣＴＡ、ＣＴＣ、Ｃ ＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡ及びＴＴＧを含めた６通りのＤＮＡコドンのいずれかによ って表される。微生物のゲノムコドンの頻度についての徹底的な分析により、Ｅ ．ｃｏｌｉ の内因性ＤＮＡは最も一般的にはＣＴＧロイシン指定コドンを含んで おり、酵母及び変形菌類のＤＮＡは最も一般的にはＴＴＡロイシン指定コドンを 含んでいることが判明した。この階層関係から見ると、一般に、Ｅ．ｃｏｌｉ宿 主によるロイシンに富むポリペプチドの高レベル発現を得る可能性は、ある程度 コドンの利用頻度に依存すると考えられる。例えば、ＴＴＡコドンに富む遺伝子 は、恐らくＥ．ｃｏｌｉでは発現レベルが低いが、ＣＴＧに富む遺伝子は恐らく ポリペプチドを高レベルで発現するであろう。同様に、酵母細胞がロイ シンに富むポリペプチドを発現させるように計画された形質転換宿主細胞である 場合、挿入されるＤＮＡに使用するのに好ましいコドンはＴＴＡであろう。 組換えＤＮＡ技術にコドンの優先順位現象が影響を与えることは明らかであり 、該現象は、首尾良く形質転換された宿主微生物中で外因性遺伝子の高発現レベ ルを達成し得なかったり、「好ましい」ものではないコドンが挿入遺伝子中に繰 り返し存在したり、また宿主細胞の発現機構が効率的に働かないといったこれま での数々の失敗の説明に役立つであろう。この現象は、計画された宿主細胞の好 ましいコドンを含むように設計された合成遺伝子が、組換えＤＮＡ技術の実施に 好ましい形態の外来遺伝子物質を提供することを示唆している。 ５． タンパク質の交通 真核生物細胞の特徴を表す機能の多様性は、該細胞の膜境界の構造の差異によ る。これらの構造を形成・維持するためには、タンパク質は、小胞体中のタンパ ク質の合成部位から細胞中の所与の目的地に輸送されなければならない。そのた めには、交通（traficking）タンパク質が主要交通経路に至るアクセスポイント に位置する経路選択に関与する分子機構によって認識さ れる選別シグナル（sorting signal）を示すことが必要である。殆どのタンパク 質では、選別決定は、タンパク質がその生合成経路を通るときに１度だけ行えば よい。というのは、タンパク質の最終目的地、即ち、タンパク質がその機能を果 たす細胞位置がタンパク質の永久の住処となるからである。 細胞内結合性の維持は、部分的にはタンパク質の正しい目的地への選択的選別 と正確な輸送とに依存する。数年前から、タンパク質の標的化及び局在化分子機 構についての詳細な分析が活発に行われている。「アドレスラベル」として機能 し得るタンパク質に関する確定配列モチーフが同定された。膜タンパク質の細胞 質ドメインに関連する多くの選別シグナルが見出された。発明の要旨 ＨＩＶｅｎｖ及び改変型ＨＩＶｅｎｖをコードする合成ＤＮＡ分子を提供する 。該合成分子のコドンには、計画された宿主細胞の好ましいコドンが含まれる。 該合成分子は好ましい形態の外来遺伝物質を提供する。該合成分子は、中和抗体 及び細胞媒介性免疫を介してＨＩＶ感染に対する効果的な免疫予防を提供するポ リヌクレオチドワクチンとして用い得る。本発明は、 霊長類やヒトなどの哺乳動物を含めた脊椎動物中にｉｎ ｖｉｖｏで直接導入す ると、動物内でコードされたタンパク質の発現を誘導するポリヌクレオチドを提 供する。図面の簡単な説明 図１は、ＨＩＶｅｎｖカセットをベースとする発現法を示す。 図２は、ＤＮＡワクチン媒介性抗ｇｐ１２０応答を示す。 図３は、ネズミＤＮＡワクチンの接種血清の抗ｇｐ１２０ＥＬＩＳＡタイター を示す。 図４は、ＨＩＶｅｎｖＰＮＶ細胞培養株のトランスフェクション後のｇｐ１２ ０の相対発現を示す。 図５は、ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＡ対ｏｐｔＢ ＤＮＡ予防接種後の平均 抗ｇｐ１２０ ＥＬＩＳＡ応答を示す。 図６は、ネズミＤＮＡワクチンの接種血清によるＨＩＶの中和を示す。 図７は、ネズミＨＩＶｅｎｖＤＮＡワクチンの接種血清によるＨＩＶの中和を 示す。 図８は、最適化ＨＩＶｅｎｖＤＮＡ構築物のイムノブロット分析である。発明の詳細な説明 ＨＩＶｅｎｖをコードする合成ＤＮＡ分子及び改変型ＨＩＶｅｎｖをコードす る合成ＤＮＡ分子を提供する。該合成分子のコドンは、計画された宿主細胞が好 むコドンを利用するように設計されている。該合成分子は、中和抗体及び細胞媒 介性免疫を介してＨＩＶ感染に対して有効な免疫予防を提供するポリヌクレオチ ドワクチンとして使用し得る。該合成分子は免疫原性組成物として使用し得る。 本発明は、霊長類やヒトなどの哺乳動物を含めた脊椎動物中にｉｎ ｖｉｖｏで 直接導入すると、該動物内でコードされたタンパク質の発現を誘発する。 本明細書に用いられているポリヌクレオチドは、生きている脊椎動物細胞中に 導入すると、該ポリヌクレオチドが細胞機構に該ポリヌクレオチドを含む核酸に よってコードされる翻訳産物を産生するように誘導し得るような調節成分を含む 核酸の組み合わせである。本発明の１つの実施態様において、該ポリヌクレオチ ドは、転写プロモーターに作動可能に結合した少なくとも１種のＨＩＶ遺伝子を 含むポリデオキシリボ核酸である。本発明の別の実施態様において、ポリヌクレ オチドワクチン（ＰＮＶ）は、真核細胞機構（リボソーム、ｔＲＮＡ及び他の翻 訳因子）による翻訳が可能な少なくとも１種のＨＩＶ遺伝子 をコードするポリリボ核酸を含む。ポリヌクレオチドによりコードされるタンパ ク質が、通常、病的状態にある動物でしか産生されないタンパク質（即ち、外因 性タンパク質）、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病因物質である ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関連するタンパク質である場合、該動物の免 疫系は感染防御免疫応答を生起するように活性化される。これらの異種タンパク 質は動物の組織により産生されるために、発現した産物は主要組織適合抗原系（ ＭＨＣ）により、関連微生物（ＨＩＶ）に実際に感染したときと同じようにプロ セシングされる。その結果、同種病原体に対する免疫応答が誘発される。 本発明のポリヌクレオチドは、生物系中に導入されると、ＨＩＶタンパク質及 びエピトープの発現並びに特異的免疫応答の生起を誘発する。誘発された抗体応 答は、発現したＨＩＶタンパク質に特異的であり、ＨＩＶを中和する。さらに、 ＨＩＶ感染細胞を特異的に認識して破壊する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が 誘発される。 本発明は、哺乳動物組織中に導入されると、ｉｎ ｖｉｖｏで単一細胞におけ る離散遺伝子産物の発現を誘発するポリヌク レオチドの使用法を提供する。本発明は、ＲＥＶ非依存性遺伝子を得るためにＲ ＥＶ依存性ＨＩＶ遺伝子の多重操作を必要としない解決法を提供する。本明細書 に記載のＲＥＶ非依存性発現系は、それ自体有用であり、ｉｎ ｖｉｖｏで単一 細胞における単一の所望遺伝子産物の発現を示す系である。 本発明の用途の多くは抗ウイルス予防接種用であるので、該ポリヌクレオチド はしばしばポリヌクレオチドワクチン又はＰＮＶと称される。これは、免疫刺激 や抗腫瘍治療薬におけるこれらのポリヌクレオチドの別の有用性が本発明の範囲 外であると考えられるということではない。 １つの実施態様においては、ＨＩＶ遺伝子産物をコードする遺伝子を発現ベク ターに組み込む。該ベクターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼによって認識され る転写プロモーターとＨＩＶ遺伝子コード配列の末端の転写ターミネーターとを 含む。好ましい実施態様において、該プロモーターは、イントロンＡ配列（ＣＭ Ｖ−ｉｎｔＡ）を含むサイトメガロウイルスプロモーターであるが、当業者には 、強力な免疫グロブリンなどの他の多くの公知プロモーター又は他の真核生物遺 伝子ブロモーターのいずれをも使用し得ることが認識されよう。好ましい転写タ ーミネーターは、ウシ成長ホルモンターミネーターである。ＣＭＶｉｎｔＡ−Ｂ ＧＨターミネーターの組み合わせが特に好ましい。 原核細胞におけるポリヌクレオチドの生産を支援するために、発現ベクター中 に抗生物質耐性マーカーを含めてもよく、該マーカーは、その発現が真核細胞中 では起こらないように原核生物プロモーターの転写調節下に置くことができる。 アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子及び他の医薬上許容し得る抗 生物質耐性マーカーを用い得る。原核微生物中での発酵による高レベルのポリヌ クレオチドの生産を支援するためには、ベクターが原核生物複製源を含み且つ高 コピー数のものであることが有利であり得る。多くの市販の原核生物クローニン グベクターがこれらの利点を提供する。必須ではないＤＮＡ配列を除去して、該 ベクターが真核細胞中では複製し得ないことを確実にするのが望ましい。そうす ることにより、ポリヌクレオチドワクチン配列が受容者のゲノム中に組み込まれ るというリスクが最小限になる。ポリヌクレオチドの発現を特定の組織タイプに 限定することが望ましい場合には組織特異プロモーター又はエンハンサーを用い 得る。 １つの実施態様においては、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復配 列（ＬＴＲ）がプロモーターとして用いられる発現ベクターｐｎＲＳＶを用いる 。別の実施態様では、ＣＭＶプロモーターとＢＧＨ転写ターミネーターがクロー ン化された突然変異型ｐＢＲ３２２ベクター、Ｖ１を用いる。別の実施態様にお いては、Ｖ１及びｐＵＣ１９成分を組み合わせてＶ１Ｊと称される発現ベクター を作製した。Ｖ１Ｊ又は別の望ましい発現ベクター中には、ｇｐ１２０、ｇｐ４ １、ｇｐ１６０、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなどのＨＩＶ遺伝子、又は抗ＨＩＶ免 疫応答を誘発し得る任意の他のＨＩＶ遺伝子をクローン化した。別の実施態様で は、Ｖ１Ｊからアンピシリン耐性遺伝子を除去して、ネオマイシン耐性遺伝子と 置き換え、本発明に従って用いるためにクローン化された異なるＨＩＶ遺伝子中 にＶ１Ｊ−ｎｅｏを生成させる。別の実施態様では、ベクターはＶ１Ｊｎｓであ り、該ベクターは、独特なＳｆｉ１制限部位がＶ１Ｊｎｅｏの２１１４位の単一 のＫｐｎ１部位に組み込まれていること以外はＶ１Ｊｎｅｏと同じである。ヒト ゲノムＤＮＡ中のＳｆｉｌ部位の数は極めて少ない（１００，０００塩基当たり 約１部位）。従って、このベクターは、抽出されたゲノムＤＮＡ をＳｆｉ１部位消化するだけで、宿主ＤＮＡ中への発現ベクターの組み込みを慎 重にモニターする手間が省ける。さらに改良された態様では、ベクターはＶ１Ｒ である。該ベクターにおいて、出来る限り多くの非必須ＤＮＡをベクターから「 取り除いて」、高度にコンパクトなベクターを作製した。このベクターはＶ１Ｊ ｎｓの誘導体である。該ベクターにより、大きな挿入物の使用が可能となり、望 ましくない配列がコードされる心配が少なく、且つ細胞による取り込みが最適化 される。 本発明の１つの実施態様は、ＨＩＶ ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇａｇ及びＳ Ｆ２、IIIＢ又はＭＮなどの実験室適合ＨＩＶ株由来の他の遺伝子産物をコード する遺伝子を含む。当業者には、ＨＩＶ−１由来の遺伝子に対して類似の機能を 有するＨＩＶ−２株由来の遺伝子を用いると、ＨＩＶ−１構築物に関して本明細 書に記載のものと類似の免疫応答の生起が期待されることが認識されよう。これ らの遺伝子を得るためのクローン化及び操作法は当業者には公知である。 実験室適応ＨＩＶ株に対する免疫応答の誘発はＨＩＶの初代圃場分離体の中和 には不適であり得ると認識される。従って、本発明の別の実施態様では、ＨＩＶ のビルレント、初代圃場分 離体由来の遺伝子をポリヌクレオチド免疫原に組み込む。これは、ウイルス遺伝 子のｃＤＮＡコピーを作製し、次いで、個々の遺伝子をポリヌクレオチド免疫原 中にサブクローン化することにより達成される。今や、多くのＨＩＶ株の多くの 遺伝子の配列がＧＥＮＢＡＮＫ上で公に入手し得、そのようなＨＩＶの初代圃場 分離体は、Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，〔７５８１ Ｌ ｉｎｄｂｅｒｇｈ Ｄｒｉｖｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙ１ａｎｄ ２０８７９〕と契約したＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌ ｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｅｓｅａｓｅｓ（ＮＩＡＩＤ ）から入手し得る。そのような株は、世界保健機構（ＷＨＯ）〔Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ ＨＩＶ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔ ｉｏｎ，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｕｎｉｔ，Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｇｌｏｂａｌ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ ｏｎ ＡＩＤＳ ，ＣＨ−１２１１ Ｇｅｎｅｖａ ２７，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ〕からも入手 し得る。本研究から、当業者には、本発明の有効性の１つは、ＨＩＶ配列の多様 性とＨＩＶ中和の血清学との相互作用並びに他のパラメーターを得ることが できる、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでのテスト及び分析法を提供するこ とであることが認識されよう。ＨＩＶ株の初代分離体由来の遺伝子を組み込むこ とにより、該ウイルスの臨床分離体に対する免疫応答が誘発され、それによって 当該分野において未だに満たされていない要求を満たす免疫原が提供される。さ らに、ビルレント分離体は変異するので、必要に応じてその免疫原を新規な配列 を反映するように改変し得る。 本明細書では、用語の統一をはかるために、ポリヌクレオチド免疫原構築物の 記載は以下の取り決めに従う：「ベクター名−ＨＩＶ株−遺伝子−追加成分」。 従って、ＭＮ株のｇｐ１６０遺伝子を発現ベクターＶ１Ｊｎｅｏ中にクローン化 した構築物は、本明細書では、「Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＭＮ−ｇｐｌ６０」と称される 。構築物に添加される追加成分については以下にさらに詳細に記載する。ウイル スの病因株は変異するので、医薬品に組み込むのに最適な厳密な遺伝子も変化し 得る。しかし、以下に示すように、異種株に対して感染防御し得るＣＴＬ応答が 誘発されるために、本発明の免疫原及びワクチンにおける株の変異性は、全ウイ ルス又はサブユニットポリペプチドをベースとするワクチンに比べてあまり重要 ではない。さらに、医薬品 は新たな遺伝子を挿入するように容易に操作し得るので、これは、分子生物学の 標準的な技術によって容易に行われる調整である。 本明細書に用いられている用語「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが 結合するＤＮＡ鎖上の認識部位を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと 共に開始複合体を形成して、転写活性を開始・推進する。該複合体は、「エンハ ンサー」と称される活性化配列又は「サイレンサー」と称される抑制配列を用い て改変し得る。 本明細書に用いられている用語「リーダー」とは、構造遺伝子と共に転写され る構造遺伝子の５’末端のＤＮＡ配列を指す。通常、リーダーにより、プロ配列 （pro-sequence）と称されることもあるＮ末端ペプチド延長配列を有するタンパ ク質が得られる。細胞外媒体又は膜に分泌されるタンパク質の場合、一般に疎水 性であるこのシグナル配列は、タンパク質を小胞体中に誘導し、タンパク質はそ こから適切な目的地に向けて放出される。 本明細書に用いられている用語「イントロン」とは、遺伝子産物中でアミノ酸 をコードしない遺伝子の中央に生ずるＤＮＡ セクションを指す。イントロンの前駆体ＲＮＡは切り取られるので、ｍＲＮＡ中 に転写されることも、タンパク質に翻訳されることもない。 用語「カセット」とは、発現されるべき核酸配列を含む本発明の配列を指す。 カセットは、概念的にはカセットテープと類似である。各カセットはそれ自身の 配列を有する。従って、カセットを交換すると、ベクターは異なる配列を発現す る。５’及び３’末端の制限部位のために、カセットは容易に挿入、除去又は別 のカセットと交換し得る。 用語「３’非翻訳領域」又は「３’ＵＴＲ」とは、通常、構造遺伝子と共に転 写される構造遺伝子の３’末端側の配列を指す。この３’ＵＴＲ領域は、通常、 ポリＡ配列を含んでいる。３’ＵＴＲはＤＮＡから転写されるが、タンパク質に 翻訳される前に切り取られる。 用語「非コード領域」又は「ＮＣＲ」とは、構造遺伝子の３’ＵＴＲ領域に隣 接する領域を指す。ＮＣＲ領域は転写終結シグナルを含んでいる。 用語「制限部位」とは、制限エンドヌクレアーゼの配列特異的切断部位を指す 。 用語「ベクター」とは、ＤＮＡ断片を宿主微生物又は宿主組織中に導入し得る ある種の手段を指す。プラスミド、バクテリオファージ及びコスミドを含めた種 々のタイプのベクターがある。 用語「有効量」とは、適切なレベルのポリペプチドの産生に十分なＰＮＶの注 入量を指す。当業者は、このレベルが変動し得ることを認識している。 本発明を説明するために、ＨＩＶに関する情報を以下に記載する。ヒト免疫不 全ウイルスは、その構造が図１に示されているリボ核酸（ＲＮＡ）ゲノムを有し ている。このＲＮＡゲノムは、本明細書に教示されている方法に従ってクローン 化及び操作するためのｃＤＮＡコピーを作製するためには、当業界で公知の方法 に従って逆転写されなければならない。該ゲノムの各末端には、プロモーターと しての働きをする長い末端反復配列がある。これらの末端の間で、該ゲノムは、 種々の読み取りフレームで、主要遺伝子産物としてｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖをコ ードする。ｇａｇはグループ特異抗原であり、ｐｏｌは逆転写酵素又はポリメラ ーゼである。代替え読み取りフレームでこの領域によりコードされるものには、 さらに、例えば、ｇｐｌ ６０からｇｐ１２０及びｇｐ４１への翻訳後プロセシングに関与するウイルスプ ロテアーゼがある。ｅｎｖはエンベロープタンパク質である。ｖｉｆはビリオン 感染性因子である。ＲＥＶはビリオンタンパク質発現の調節物質である。ｎｅｇ は負の調節因子である。ｖｐｕはビリオン産生因子「ｕ」である。ｔａｔは転写 のトランスアクチベーターである。ｖｐｒはウイルスタンパク質ｒである。これ らの成分のそれぞれの機能は既に記載されている。 本発明の１つの実施態様においては、ＨＩＶ又はＳＩＶタンパク質をコードす る遺伝子を直接転写プロモーターに結合する。ｅｎｖ遺伝子は大きな膜結合タン パク質、ｇｐ１６０をコードする。該タンパク質は、翻訳後修飾を受けてｇｐ４ １及びｇｐ１２０を生成する。ｇｐ１２０遺伝子は発現のためにサイトメガロウ イルスプロモーターターの調節下に置かれ得る。しかし、ｇｐ１２０は膜結合タ ンパク質ではなく、従って、発現すると、細胞から分泌され得る。ＨＩＶは感染 細胞中で休眠状態に保たれる傾向があるので、細胞結合ＨＩＶエピトープで誘導 される免疫応答も生起させるのが望ましい。さらに、ウイルスの中和に最も効力 のある抗体応答を生起させるためには、ワクチンが、 ウイルス感染により生成されるものと構造が類似した膜結合オリゴマーＥＮＶ抗 原を生成することが望ましい。この目的は、本発明において、細胞膜結合エピト ープ、ｇｐ１６０をｉｎ ｖｉｖｏで発現させて免疫系を始動させることにより 達成される。しかし、ｇｐ１６０の発現は、スプライスされていない遺伝子が核 からは輸送されないためにＲＥＶの不在下には抑制される。このシステムを理解 するためには、ＨＩＶの生活環をさらに詳細に説明する必要がある。 ＨＩＶの生活環において、ＨＩＶのＲＮＡゲノムは、宿主細胞に感染すると、 プロウイルスＤＮＡ中に逆転写され、単一の転写単位として宿主のゲノムＤＮＡ に組み込まれる。ＬＴＲは５’→３’方向にＨＩＶ遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅ ｎｖ）を転写して、全ゲノムのスプライスされていない転写産物を形成するプロ モーターを提供する。スプライスされていない転写産物は、ｇａｇ及びｐｏｌに 翻訳されるｍＲＮＡとして機能するが、ｅｎｖをコードする遺伝子の翻訳には限 定されたスプライシングが生起しなければならない。調節遺伝子産物ＲＥＶを発 現させるためには、１回以上のスプライシング事象が生起しなければならない。 というのは、図１に示されているように、 ゲノム設定において、ＲＥＶとｅｎｖはオーバーラップするからである。ｅｎｖ が転写されるためには、ＲＥＶの転写を中断しなければならず、またＲＥＶが転 写されるためにはｅｎｖの転写を中断しなければならない。さらに、スプライス されていないＲＮＡを核から輸送するには、ＲＥＶの存在を必要とする。しかし 、このようにＲＥＶを機能させるには、ＲＥＶの応答成分（ＲＲＥ）が転写産物 上に存在していなければならない〔Ｍａｌｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２５ ４−２５７（１９８９）〕。 本発明のポリヌクレオチドワクチンの場合、完全にスプライスされた遺伝子を 提供すること（即ち、読み取りフレームにおけるスイッチ又は非コード領域の除 去を必要とせずに所望の遺伝子産物の完全な読み取りフレームが得られること； 当業者は、特定の遺伝子をスプライスする際に、得られる厳密な配列中に幾分か のゆとりが存在することを認識するであろう；しかし、機能的コード配列が得ら れる限り、これは許容し得る）により、特定のＨＩＶ遺伝子の義務的スプライシ ングが排除される。従って、１つの実施態様において、ｇｐ１６０の全コード配 列は、各遺伝子産物の間欠的な発現が不要となるようにスプライ スされる。 本発明によって生起される体液性及び細胞性の二重免疫応答は、感染集団内や 感染個体においてＨＩＶが突然変異を起こす傾向があることを考えれば、ＨＩＶ 感染の抑制に特に重要である。ＨＩＶに対する有効な感染防御ワクチンを配合す るためには、例えば、ＨＩＶに関する主要な中和標的であるｇｐ１６０（ｅｎｖ は、米国のヒト集団における主要株である種々のＨＩＶ−１、グレードＢ株全体 に約８０％保存されている）並びにｇｐ１６０の保存部分及びｇａｇによってコ ードされる内因性ウイルスタンパク質に対して反応性の細胞傷害性Ｔ細胞に対す る多価抗体応答を生起させることが望ましい。本発明者は、共通実験室株から； 感染集団内に認められる優勢な初代ウイルス分離体から；交雑株の中和抗体エピ トープを露出するように設計された突然変異型ｇｐ１６０から；及び（ＨＩＶ分 離体間に〜９５％保存されている）ｇａｇやｐｏｌ遺伝子などの他の代表的なＨ ＩＶ遺伝子から選択されたｇｐ１６０遺伝子を含むＨＩＶワクチンを製造した。 未だ免疫不全状態には進行していない実質的に全てのＨＩＶ血清反応陽性患者 は抗ｇａｇＣＴＬを有しているが、これらの 患者のうち約６０％は、交雑株、ｇｐ１６０特異的ＣＴＬを示す。しかし、ＡＩ ＤＳとして知られる疾患状態まで進行した感染個体に認められるＨＩＶ特異的Ｃ ＴＬの量ははるかに低く、これは、本発明者が交雑株ＣＴＬ応答を誘発し得ると いう本発明者の知見の重要性を証明している。 本発明のｅｎｖ及びｇａｇポリヌクレオチドワクチン構築物によって誘発され る免疫応答はマウス及び霊長類で示される。マウスにおける抗ｅｎｖ抗体の産生 をモニターすることにより、所与の構築物が適切に免疫原性であること、即ち、 予防接種した動物の大部分が抗体応答を示すことを確認し得る。マウスはさらに 、本発明の構築物によるＣＴＬ誘発のテストに適切な最も手軽な動物モデルを提 供し、従って、特定の構築物がそのような活性を生成し得るかどうかの評価に用 いられる。サル（サバンナモンキー、アカゲザル、チンパンジー）は、大型の非 げっ歯動物における抗体評価において霊長類を含めた別の種を提供する。該種は 、抗血清中和アッセイの場合にも、マウスの血清中に認められるレトロウイルス に対する高レベルの内因性中和活性の故にマウスより好まれる。これらのデータ は、本発明のワクチンにより、該系に対する既知感染防御レベルの中和 抗体に基づくチンパンジー／ＨＩＶ/_IIIBチャレンジモデルでの実験において、 感染防御の達成に十分な免疫原性が生じることを証明している。しかし、科学コ ミュニティーにおいて感染防御について最近明らかになり且つますます適切であ ると見なされている定義は、ＨＩＶ感染からの完全な感染防御を示す、疾患の予 防に対するいわゆる「殺ウイルス性免疫」からは遠ざかろうとしている。この目 的に相関するものとしては、ＨＩＶ逆転写酵素活性、血清試料の感染性、血中の ｐ２４又は他のＨＩＶ抗原濃度に関するＥＬＩＳＡアッセイ、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の 増大濃度、及び生存率の上昇により測定される血中ウイルス価の低下が含まれる 〔例えば、抗ＨＩＶワクチンの効力について進展している定義に関する、Ｊ．Ｃ ｏｈｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１８２０−１８２１．１９９３を参照され たい〕。本発明の免疫原は、ＨＩＶの感染性（臨床、初代圃場）分離体に対する 中和免疫応答をも生起する。免疫学 Ａ． ｅｎｖに対する抗体応答 １． ｇｐ１６０及びｇｐ１２０． ＥＬＩＳＡアッセイを用い、分泌型 ｇｐ１２０又は膜結合型ｇｐ１６０のいずれ かを発現するワクチンベクターがｅｎｖ特異抗体の産生に有効かどうかを決定す る。本発明の予防接種ベクターによるｅｎｖ発現の初期ｉｎ ｖｉｔｒｏ特性決 定は、ｇｐ１６０トランスフェクト細胞溶解物のイムノブロット分析により行わ れる。これらのデータにより、トランスフェクトされた細胞ｇｐ１６０の発現を 視覚化するために抗ｇｐ４１及び抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体を用いたｇｐ １６０の発現を確認・評価する。本発明の１つの実施態様においては、以下の理 由からｇｐ１６０の方がｇｐ１２０より好ましい：（１）一次ｇｐ１２０ベクタ ーは、マウスでは一貫性でない免疫原性を生起し、サバンナモンキーにおいては 極めて低応答又は無応答であった；（２）ｇｐ１６０はｇｐ４１を含んでいるた めに約１９０個のアミノ酸残基が加わることにより追加の中和抗体及びＣＴＬエ ピトープを産生する；（３）ｇｐ１６０の発現はテトラマーアセンブリー及び全 体構造に関してウイルスｅｎｖにより類似しているので、オリゴマー依存性中和 エピトープを提供し得る；且つ（４）本発明者は、マウスやフェレット及び非ヒ ト霊長類における中和抗体応答の生起に膜結合インフルエンザＨＡ構築物が成功 を治めた場合のように、抗ｇｐ１６０抗体の産生の方が抗 ｇｐ１２０抗体の産生より多いことを知見している。いずれかのタイプのｅｎｖ を選択するのが好ましいか、又はｅｎｖサブフラグメントのカクテルが好ましい かどうかは、以下に略記する実験によって決定される。 ２． 中和抗体の存在及び大きさ． サル由来のＥＬＩＳＡ陽性抗血清を テストし、該血清が同種及び異種ＨＩＶ株のいずれをも中和することを証明する 。 ３． Ｖ３対非Ｖ３中和抗体． ｅｎｖＰＮＶの主要目的は、広域中和抗 体を産生させることである。Ｖ３ループに対して誘導される抗体は極めて株特異 的であることが示され、この応答の血清学を株の定義に用いた。 ａ． 非Ｖ３中和抗体は、最初にＣＤ４の結合に関与するｇｐ１ ２０内の不連続構造エピトープを認識するようである。このドメインに対する抗 体は、恐らく、ウイルスがその細胞リガンドに結合する必要性により課される突 然変異に対する制約のためにポリクローナルであり且つより広義には交差中和性 である。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用い、免疫感作した動物由来の血清を用い て９６ウエルプレートに固定されたＣＤ４に対するｇｐ１２０の結合阻止テスト を行う。第２のｉｎ ｖｉｔｒｏ アッセイで、プラスチック上に固定した選択されたＶ３ドメインを表 す合成ペプチドに直接結合した抗体を検出する。これらのアッセイは、本発明の 研究に用いたいずれの動物タイプ由来の血清にも適合し得、且つ本発明のワクチ ンが生成した中和抗体のタイプを明確にすると共に、ウイルス中和に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ相関物を提供する。 ｂ． ｇｐ４１は、広域中和性２Ｆ５モノクローナル抗体〔Ｖｉｒ ａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐ．，Ｔｅｘａｓ Ｃｏｍｍｅ ｒｃｅ Ｔｏｗｅｒ，６００ Ｔｒａｖｉｓ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｓｕｉｔｅ ４７ ５０，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ７７００２−３００５（ＵＳＡ）又はＷａｌｄｈｅ ｉｍ Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｋａ ＧｍｂＨ，Ｂｏｌｔｚｍａｎｇａｓｓｅ １１，Ａ−１０９１ Ｗｉｅｎ，Ａ-ｕｓｔｒｉａから市販されている〕により 認識される高度に保存された直鎖状エピトープに対応する少なくとも１個の主要 中和決定基、及びｇｐ４１のＮ末端に位置する十分に保存された「融合ペプチド 」ドメインを含めた他の潜在部位を有している。上記イムノブロットによる、ｇ ｐ４１に対して誘導された抗体の検出の他に、プラスチック上に固定された上述 のドメインを表 す合成ペプチドに結合する抗体に対してもｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイテストを用 いる。 ４． 抗体応答の成熟． ＨＩＶ血清反応陽性患者においては、中和抗体 応答は、主として抗Ｖ３から進行して、ｇｐ４１エピトープを含めた上記の構造 ｇｐ１２０ドメインエピトープ（＃３）を含むより広域の中和抗体を含むものと なる。これらのタイプの抗体応答を、時間経過とその後の予防接種にわたってモ ニターする。 Ｂ． ｅｎｖ及びｇａｇに対するＴ細胞の反応性 １． ＣＴＬ応答の生起． 細胞内で合成されるウイルスタンパク質はＭ ＨＣ Ｉ拘束型ＣＴＬ応答を生起する。これらのタンパク質はぞれそれ血清反応 陽性患者にＣＴＬを誘発する。本発明のワクチンもマウスにＣＴＬを誘発し得る 。インフルエンザＮＰの場合に証明されたように、そのような研究に対してマウ ス株の免疫遺伝学が役に立つ。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいては、ＨＩＶタンパク 質、ｅｎｖ、ＲＥＶ、ｎｅｆ及びｇａｇについて数種のエピトープが明確にされ ており、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＴＬ培養アッセイ及び細胞傷害性 アッセイが容易になる。これらの遺伝子でトランスフェクト されたネズミ肥満細胞腫Ｐ８１５などの同系腫瘍株をＣＴＬ及びｉｎ ｖｉｔｒ ｏ 抗原特異的再刺激の標的とするのが有利である。ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞傷 害性Ｔリンパ球を誘発し得る免疫原を確定する方法は公知である。１５２〜１７ ５アミノ酸にわたるペプチドもＨＩＶ中和抗体を誘発させることが知見されてお り、これらの方法は、本発明のＰＮＶに包含される免疫原性エピトープの同定に も用い得る。あるいは、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０プロテアーゼ又はｇａｇをコー ドする全遺伝子を用いてもよい。本明細書においては、Ｔ細胞エフェクター機能 は、成熟Ｔ細胞表現型、例えば、細胞傷害性、Ｂ細胞を活性化するためのサイト カインの分泌及び／又はマクロファージや好中球の補充若しくは刺激に関与する 。 ２． Ｔ_H活性の測定． 組換えタンパク質又はペプチドエピトープを加 えて、予防接種した動物由来の脾臓細胞培養を特異抗原に対する記憶についてテ ストする。随伴する脾臓抗原提示細胞、ＡＰＣによって提示されるそのような抗 原によるＴ細胞の活性化を、上記培養細胞の増殖又はサイトカインの産生により モニターする。サイトカインの産生パターンによっても、Ｔ_H応答がタイプ１で あるかタイプ２であるかの分類が可 能である。免疫減弱血清反応陽性患者においては優位なＴ_H２応答が細胞性免疫 の排除と相関するようなので、患者の所与のＰＮＶによって生ずる応答のタイプ を明確にすることが可能であり、それによって、得られる免疫応答を操作し得る 。 ３． 遅延型過敏症（ＤＴＨ）． ｉ．ｄ．注射後のウイルス抗原に対 するＤＴＨは、細胞性の、主としてＭＨＣクラスII拘束性免疫を示すものである 。既知エピトープに対する組換えＨＩＶタンパク質及び合成ペプチドは市販され ているので、ＤＴＨ応答は、これらの試薬を用いて予防接種した脊椎動物中で容 易に定量し得、それによって細胞性免疫を誘発させるためのさらなるｉｎ ｖｉ ｖｏ 相関物が得られる。感染防御 上述の免疫学的研究に基づき、本発明のワクチンは、脊椎動物においてビルレ ントＨＩＶによるチャレンジに対して有効であると予測し得る。これらの研究は 、ＨＩＶ_IIIB／チンパンジーチャレンジモデルに、ＰＮＶ構築物、又はｇｐ１６ ０_IIIB、ｇａｇ_IIIB、ｎｅｆ_IIIB及びＲＥＶ_IIIBからなるＰＮＶ構築物カクテル を用いて十分な予防接種を行うことにより達成される。これに関し、IIIＢ株は 、致死量の該株のチンパンジー価が確立さ れているので有用である。しかし、同じ研究をＨＩＶの任意の株及び所与の株に 対して特異的であるか又は異種のエピトープを用いて行うことも考えられる。チ ンパンジー以外の第２の予防接種／チャレンジモデルはｓｃｉｄ−ｈｕＰＢＬマ ウスである。このモデルにより、マウス宿主におけるその後のＨＩＶチャレンジ に対するヒトリンパ球免疫系及び本発明のワクチンのテストが可能になる。該系 は、ＨＩＶ株と共に用いるように容易に適合し得、且つＨＩＶの初代圃場分離体 の多くの株に対する感染防御の証拠を提供するのが有利である。第３のチャレン ジモデルはハイブリッドＨＩＶ／ＳＩＶウイルス（ＳＨＩＶ）を利用する。該Ｓ ＨＩＶのなかには、アカゲザルに感染し、免疫不全疾患に至らせて死を招くこと が証明されたものもある〔Ｊ．Ｌｉら，Ｊ．ＡＩＤＳ ５：６３９−６４６，１ ９９２〕。本発明のポリヌクレオチドワクチン構築物を用いてアカゲザルに予防 接種すると、致死量のＳＨＩＶを用いたその後のチャレンジに対しても防御し得 る。ＰＮＶ構築物の概要 ＨＩＶ及び他の遺伝子をポリヌクレオチド予防接種用に最適化した発現ベクタ ー中に連結する。転写プロモーター、免疫原 性エピトープ、転写ターミネーター、複製細菌源及び抗生物質耐性遺伝子からな る必須成分を残し、実質的に全ての異種遺伝子を除去する。 ｅｎｖ及びｇａｇなどのＨＩＶ後期遺伝子の発現はＲＥＶ依存性であり、且つ ＲＥＶ応答成分（ＲＲＥ）がウイルス遺伝子転写産物上に存在することを必要と する。分泌型ｇｐ１２０は、ｇｐ１２０リーダーペプチドを、ｔｐＡ（組織型プ ラスミノーゲンアクチベーター）などの異種リーダー、好ましくは免疫グロブリ ンリーダーペプチドなどの高度に発現した哺乳動物タンパク質中に見出されるよ うなリーダーペプチドに置き換えることによりＲＥＶの不在下に産生させ得る。 本発明では、ｔＰＡ−ｇｐ１２０キメラ遺伝子を、トランスフェクトされた細胞 （ＲＤ、ヒト横紋筋肉腫株）で効率的に分泌型ｇｐ１２０を発現するＶ１Ｊｎｓ 中に挿入した。モノシストロニックｇｐ１６０は、ＲＥＶ発現ベクターを加えず にトランスフェクトしてもタンパク質を産生しない。代表的な構築物構成成分には以下が含まれる（但し、それらに は限定されない）： １． ｔＰＡ−ｇｐ１２０_MN； ３． ｇＰ１６０_IIIB； １０．ｇａｇ_IIIB：抗ｇａｇＣＴＬの場合； １１．ｔＰＡ−ｇｐ１２０_IIIB； １２．構造的突然変異：Ｖ１、Ｖ２及び／又はＶ３ ループ欠失又は置換を有するｇｐ１６０； ２０．ＨＩＶ以外の病原体により発現した抗原、 例えば、インフルエンザウイルス抗タンパク質 赤血球凝集素、マトリックス、ノイラミニダー ゼや他の抗原タンパク質（但し、それらには限 定されない）をコードする遺伝子；単純ヘルペ スウイルス遺伝子；ヒトパピローマウイルス遺 伝子；結核症抗原；Ａ型、Ｂ型又はＣ型肝炎ウ イルス抗原。 本発明の非複製型プラスミドＤＮＡを用いて免疫感作して、その後のウイルス チャレンジに対するポリヌクレオチドＨＩＶ免疫原の感染防御力を証明する。こ れは、感染性物質が関与せず、ウイルス粒子アセンブリーの必要がなく、且つ決 定基の選択が可能である故に有利である。さらに、ｇａｇやプロテアーゼ及び他 の数種のウイルス遺伝子産物の配列がＨＩＶの種々の 株間に保存されているために、クローン化遺伝子を得る株と同種及び異種のＨＩ Ｖビルレント株によるその後のチャレンジに対する防御が可能である。 ｇｐ１６０をコードするＤＮＡ発現ベクターのｉ．ｍ．注射により、その後の ウイルスチャレンジに対する有意な感染防御免疫が生ずる。特に、ｇｐ１６０特 異抗体及び一次ＣＴＬが産生する。保存されたタンパク質に対して誘導される免 疫応答は、変異性エンベロープタンパク質の抗原不連続変異や連続変異にも拘わ らず有効であり得る。ＨＩＶ遺伝子産物はそれぞれある程度保存され、且つＣＴ Ｌは細胞内発現及びＭＨＣプロセシングに応答して生成するので、多くのウイル ス遺伝子はｇｐ１６０の場合に生ずるものと類似の応答を生起すると予言し得る 。従って、これらの遺伝子の多くは、発現ベクター中でクローン化且つ配列決定 された接合部（以下参照）によって示されるように、これらの構築物が利用可能 な形態の免疫原性物質となるようにクローン化されている。 本発明は、自己複製物質又はアジュバントを必要とせずに交雑株の感染防御免 疫を誘導する手段を提供する。さらに、本発明のポリヌクレオチドを用いた免疫 感作は他にも多くの利点を 提供する。この予防接種法は腫瘍にも伝染性物質にも適用可能な筈である。とい うのは、ＣＤ８⁺ＣＴＬ応答はどちらの病態生理学的プロセスにも重要であるか らである〔Ｋ．Ｔａｎａｋａら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，３５ ９（１９８８）〕。従って、形質転換プロセスに極めて重要なタンパク質に対す る免疫応答を誘発させることは、ガンの防御や免疫療法の有効な手段となり得る 。ウイルスタンパク質やヒト成長ホルモンＤＮＡの注射後に発現したタンパク質 に対する高タイターの抗体が産生するということは、これが、抗体ベースのワク チンを、保存された抗原を標的とする細胞傷害性Ｔリンパ球ワクチンとは別個に 又は該ワクチンと組み合わせて製造する容易且つ極めて有効な手段であることを 示唆している。 ＤＮＡ構築物の作製及び精製法は、従来のタンパク質精製法に比べて容易であ り、故に、組み合わせワクチンの製造も容易になる。従って、例えば、ｇｐ１６ ０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１又は任意の他のＨＩＶ遺伝子をコードする多重構築物 を、作製、混合、同時投与し得る。タンパク質の発現はＤＮＡの注射後も維持さ れるので、Ｂ細胞やＴ細胞の記憶の持続性が促進され得、それによって長期的な 体液性及び細胞媒介性免疫が生じる。 ＤＮＡ構築物を作製及び精製するための標準的な分子生物学技術により、本発 明のＤＮＡ免疫原を製造し得る。従って、標準的な分子生物学技術は本発明の産 物の生産には十分であるが、本明細書に開示されている特定の構築物は、驚くべ きことに、交雑株及び初代ＨＩＶ分離体を中和し、これまで標準的な不活化全ウ イルス又はサブユニットタンパク質ワクチンでは達成し得なかった結果を生み出 す新規なポリヌクレオチド免疫原を提供する。 発現し得るＤＮＡ又は転写ＲＮＡのワクチン受容者への導入量は、用いられる 転写及び翻訳プロモーターの強さと、発現する遺伝子産物の免疫原性とに応じて 異なる。一般に、免疫又は予防に有効な用量約１ｎｇ〜１００ｍｇ、好ましくは 約１０〜３００μｇを直接筋肉組織中に投与する。皮下注射、皮内導入、経皮圧 入や、腹腔内、静脈内、又は吸入投与などの他の投与形態も考えられる。また、 追加免疫接種を行うことも企図される。ＨＩＶポリヌクレオチド免疫原を用いて 予防接種した後、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０及びｇａｇ遺伝子産物などのＨＩＶタ ンパク質免疫原を用いた追加免疫を行うことも企図される。本発明のＰＮＶの非 経口導入と同時に又はその後で、静脈内、筋肉内、 皮下又は他の投与手段などによるインターロイキン−１２タンパク質の非経口投 与を行うことも有利である。 本発明のポリヌクレオチドは、裸、即ち、タンパク質、アジュバント又は受容 者の免疫系に強い影響を与える他の物質と結合していないものであってよい。こ の場合、該ポリヌクレオチドは、滅菌生理食塩液又は滅菌緩衝生理食塩液など（ 但し、それらには限定されない）の生理的に許容し得る溶液であることが望まし い。あるいは、該ＤＮＡは、レシチンリポソームや、ＤＮＡ−リポソーム混合物 のような当業界で公知の他のリポソームなどと結合していてもよいし、免疫応答 をさらに刺激する当業界で公知のタンパク質や他の担体などのアジュバントと結 合していてもよい。ＤＮＡの細胞取り込みを支援するカルシウムイオン（但し、 それには限定されない）などの物質を用いるのも有利である。これらの物質は、 本明細書では概して、トランスフェクション促進試薬及び医薬上許容し得る担体 と称されている。ポリヌクレオチドでコートした微小発射体のコーティング法は 当業界では公知であり、本発明に関しても有用である。 以下の実施例は、本発明を例示するために提供されており、本発明の範囲を限 定するものではない。実施例１ 材料の説明 ベクターｐＦ４１１及びｐＦ４１２：これらのベクターを、Ｒ．Ｇａｌｌｏの 実験室で構築したベクターｐＳＰ６２からサブクローン化した。ｐＳＰ６２はＢ ｉｏｔｅｃｈ Ｒｅｓｅｒａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入 手し得る試薬である。ｐＳＰ６２は、ラムダＨＸＢ２からサブクローン化された ＨＸＢ２ゲノムの１２．５ｋｇのＫｂａＩフラグメントを有する。ｐＳＰ６２を ＳａｌＩ及びＸｂａＩで消化して、ＨＸＢ２フラクメント：５’−ＸｂａＩ／Ｓ ａｌＩ（６．５ｋｂ）及び３’−Ｓａ１Ｉ／ＸｂａＩ（６ｋｂ）を得る。これら の挿入体をＳｍａＩ及びＳａｌＩ部位でｐＵＣ１８にサブクローン化して、ｐＦ ４１１（５’−ＸｂａＩ／ＳａｌＩ）及びｐＦ４１２（３’−ＸｂａＩ／Ｓａｌ Ｉ）を得る。ｐＦ４１１はｇａｇ／ｐｏｌを含んでおり、ｐＦ４１２はｔａｔ／ ｒｅｖ／ｅｎｖ／ｎｅｆを含んでいる。レプリゲン試薬： 組換えｒｅｖ（IIIＢ）、＃ＲＰ１０２４−１０ 組換えｇｐ１２０（IIIＢ）、＃ＲＰ１００１−１０ 抗ｒｅｖモノクローナル抗体、＃ＲＰ１０２９−１０ 抗ｇｐ１２０ｍＡＢ、＃１Ｃ１、＃ＲＰ１０１０−１０ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａ ｅｎｔ Ｐｒｏ ｒａｍ： 抗ｇｐ４１ｍＡＢハイブリドーマ、Ｃｈｅｓｓｉｅ ８、＃５２６ 該方法は、主としてＨＩＶｇａｇ（〜９５％保存）及びｅｎｖ（ｇｐ１６０又 はｇｐ１２０；７０〜８０％保存）遺伝子産物で誘導される、ＨＩＶに対する細 胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答と中和抗体応答とを誘発させるように設計さ れている。ｇｐ１６０は、ＨＩＶ粒子上に既知中和抗体エピトープのみを含んで いるが、抗ｅｎｖ及び抗ｇａｇＣＴＬ応答の重要性は、これらの細胞性免疫の開 始と中和抗体の出現に先だって生じる感染後の初期ウイルス血症のクリアランス との既知関連、並びに無病状態の維持におけるＣＴＬの役割によって強調される 。ＨＩＶはその遺伝子多様性で悪名高いので、本発明者は、臨床分離体及びｇｐ ４１（〜９０％保存）由来の数種の代表的なｅｎｖ遺伝子を含めることによりさ らに広範囲の中和抗体を得ることを希望しているが、高度に保存されたｇａｇ遺 伝子は広域 の交雑株ＣＴＬ応答を生起するであろう。 実施例２ ＨＩＶ後期遺伝子産物の外因性発現 ｅｎｖ及びｇａｇなどのＨＩＶ構造遺伝子は、全長のタンパク質を効率的に産 生させるためには、ＨＩＶ調節遺伝子、ｒｅｖの発現を必要とする。本発明者は 、ｇａｇのｒｅｖ依存性発現からは低レベルのタンパク質しか産生されず、且つ ｒｅｖ自体が細胞に対して毒性であり得ることを知見した。本発明者はｉｎ ｖ ｉｔｒｏ でｇｐ１６０の比較的高レベルのｒｅｖ依存性発現を達成したが、この ワクチンは、ｒｅｖ／ｇｐ１６０ＤＮＡを用いたｉｎ ｖｉｖｏ免疫感作後には 低レベルの抗ｇｐ１６０抗体しか誘発しなかった。これは、ｒｅｖの既知細胞障 害作用や、数百個の核を含む筋細管においてｒｅｖ機能を得ることが極めて困難 であること（ｒｅｖタンパク質は、ｇａｇ又はｅｎｖタンパク質を発現させるた めにはｒｅｖ依存性転写産物と同じ核内に存在する必要があること）に起因し得 る。しかし、ｅｎｖ及びｇａｇ遺伝子の選択的改変を用いてｒｅｖ非依存性発現 を得ることは可能であった。ワクチンに用いることを目的とするこれらのプラス ミドの評価は進行中である。 一般に、本発明のワクチンは、発現を最適化するために、主としてＣＭＶタン パク質合成前〔ＩＥ（immediate−early）〕プロモーター、ＢＧＨポリアデニル 化部位及びｐＵＣバックボーンからなる本発明の全身性（generalized）予防接 種ベクター、Ｖ１Ｊｎｓ内にＨＩＶ（IIIＢ）ｅｎｖ及びｇａｇ遺伝子を用いた 。用いる遺伝子セグメントの大きさ（例えば、ｇｐ１２０対ｇｐ１６０）に応じ て変わるｒｅｖ非依存性発現の効率は、ｅｎｖに関しては、その天然の分泌型リ ーダーペプチドを組織特異プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）遺伝子由 来のものに置き換え、得られたキメラ遺伝子をＣＭＶイントロンＡを含むＣＭＶ ＩＥプロモーターの後で発現させることにより達成し得る。ｔＰＡ−ｇｐ１２０ は、予防接種したマウス及びサルに抗ｇｐ１２０免疫応答を誘発させるのに十分 な程度機能するように構築された分泌型ｇｐ１２０ベクターの例である。 膜結合タンパク質が分泌型タンパク質よりはるかにより実質的な（且つ恐らく ＨＩＶ中和に対してより特異的な）抗体応答を誘発し得るとの報告があったこと 、及び追加の免疫エピトープを得るために、本発明者は、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ− ｇＰ１６０及びＶ１Ｊｎｓ−ｒｅｖ／ｇｐ１６０を作製した。トランス フェクトされた細胞のイムノブロット分析により示されるように、ｔＰＡ−ｇｐ １６０ベクターはｒｅｖを加えなくとも検出可能な量のｇｐ１６０及びｇｐ１２ ０を産生したが、その発現レベルは、ｒｅｖ依存性ｇｐ１６０発現プラスミドで あるｒｅｖ／ｇｐ１６０を用いて得られた発現レベルよりはるかに低かった。こ れは、恐らくｇｐ１６０転写産物にｒｅｖ依存性を付与する抑制領域（ＩＮＳと 称される）がｇｐ４１のＣＯＯＨ末端におけるものを含めたｇｐ１６０内の多重 部位で生ずるためと考えられる（以下の概要参照）。ｔＰＡ−ｇｐ１６０、ｔＰ Ａ−ｇｐ１４３を得るための、ＣＯＯＨ末端がトランケイトされた形態のベクタ ーを作製した。該ベクターは上記抑制配列を排除することによりｅｎｖの全発現 レベルを増大させるように設計された。ｇｐ１４３ベクターは、細胞表面よりむ しろリソソームに向かって膜タンパク質の分岐を引き起こすことが知られている ペプチドモチーフ（例えばｌｅｕ−ｌｅｕ）を含む細胞内ｇｐ４１領域も排除さ れている。従って、ｇｐ１４３は、（ｒｅｖ依存性を低下させることによる）ｅ ｎｖタンパク質の発現も、全長のｇｐ１６０に比べ、ＤＮＡ予防接種後にこれら のタンパク質が抗ｇｐ１６０抗体をより良く誘発し得る細胞表 面へのタンパク質の輸送効率をも増大させることが期待される。ｒｅｖ応答成分 （ＲＲＥ）配列（３５０ｂｐ）の広域サイレント突然変異によりｔＰＡ−ｇｐ１ ４３をさらに改変してさらなる抑制配列の発現を排除した。この構築物、ｇｐ１ ４３／ｍｕｔＲＲＥは、２つの形態：ｇｐ１２０／４１のタンパク質分解性切断 部位を排除したもの（Ａ形態）又は保持したもの（Ｂ形態）で作製した。２つの 形態を作製した理由は、ワクシニア中で発現させた非切断型ｇｐ１６０を用いて マウスに予防接種すると、切断型を用いた場合よりはるかに高レベルの抗ｇｐ１ ６０抗体が誘発されたとの文献記載があったためである。 トランスフェクトされた細胞におけるｇｐ１６０／ｇｐ１２０の発現に関する 定量ＥＬＩＳＡを展開して、これらのベクターの相対発現能力を定量した。２９ ３個の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクトし、次いで細胞結合型対分泌 ／放出型ｇｐ１２０の定量を行って、以下の結果を得た：（１）ｔＰＡーｇｐ１ ６０はｒｅｖ／ｇｐ１６０の５〜１０倍少ないｇｐ１２０しか発現しなかったが 、細胞内に保持されたものと細胞表面に向かったものの比率は類似であった；（ ２）ｔＰＡ−ｇＰ１４３はｒｅｖ／ｇｐ１６０より３〜６倍多いｇｐ１２０を分 泌したが、細胞結合型ｇｐ１４３は極く低レベルであり、これは、ｇｐ１６０の 細胞質テールがこの配列の部分的な欠失により克服され得るｇｐ１６０の細胞内 保持を引き起こすことを確認するものである；及び（３）ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ ｍｕｔＲＲＥ Ａ及びＢは、親のｔＰＡ−ｇｐ１４３の１０倍以上の高い発現レ ベルでタンパク質を産生し、Ａ形態では、タンパク質分解プロセシングが排除さ れているのが確認された。 このように、ｒｅｖ非依存性発現を増大させる本発明の方法により、発現全体 における段階的増大及びリソソームではなく細胞表面への膜結合ｇｐ１４３の再 誘導が生じた。種々のウイルス分離体由来のｇｐ１２０配列を、種々のウイルス 株間に抗原性の違いが少ないＮＨ₂末端（ｔＰＡリーダー）又はＣＯＯＨ末端（ ｇｐ４１）に所在する上記改変を含むベクターカセット内に挿入するのは可能な 筈であることに留意することが重要である。言い換えれば、これは、種々の初代 ウイルス分離体由来のｇｐ１２０を挿入して臨床的に関連するワクチンを得るこ とにより、容易に改変し得る遺伝子構築物である。 これらの発現法をワクチンの製造に関連するウイルスに適用し且つ本発明の方 法の普遍性を確認するために、本発明者はさ らに、（Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ共通Ｖ３ペプチドループ；マクロファー ジ向性、非シンシチウム誘発性表現型を含む）初代ＨＩＶ分離体由来のｔＰＡ− ｇｐ１２０ベクターを作製した。このベクターにより、トランスフェクトされた ２９３個の細胞から高発現／分泌率でｇｐ１２０を得、且つマウスにおいては抗 ｇｐ１２０抗体が誘発されたが、これは、該ベクターが機能性形態でクローン化 されたことを証明している。初代分離体ｇｐ１６０遺伝子も、実験室株由来のｇ ｐ１６０の場合と同じ方法で発現に用い得る。 実施例３ ＨＩＶ−１ｅｎｖポリヌクレオチドワクチンに対する免疫応答 ： ｇｐ１２０ＤＮＡワクチンの投与を受けたサバンナモンキー（ＡＧＭ）及びア カゲザル（ＲＨＭ）は、２〜３回の予防接種後に低レベルの中和抗体を示したが 、追加の予防接種をしても抗体のレベルを増大させることができなかった。これ らの結果や、ＨＩＶワクチン分野においてオリゴマーｇｐ１６０がｇｐ１２０モ ノマーより中和抗体の誘発により関連のある標的抗原であろうという見解〔Ｍｏ ｏｒｅ及びＨｏ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６７：８６３（１９９５）〕が広まりつつあることから、本発明者は、ｇｐ１６ ０ベースのベクター（上記参照）の効率的な発現を得ることに集中した。マウス とＡＧＭには、初代分離体由来のｔＰＡ−ｇｐ１２０ワクチンを用いた予防接種 も行った。これらの動物は、５００〜５，０００の範囲の（同種配列を用いた） 抗Ｖ３ペプチドの逆数終末点抗体価を示したが、これは、該ワクチンの設計が臨 床的に関連するウイルス分離体に対して機能性であることを示している。 ｇｐ１６０ベースのワクチン、ｒｅｖ−ｇｐ１６０及びｔＰＡ−ｇｐ１６０は 、マウス及び非ヒト霊長類において持続的な抗体応答を誘発し得なかったか又は 低抗体価しか生成しなかった。ｔＰＡ−ｇｐ１４３プラスミドを用いた本発明の 初期の結果から、２回の予防接種後のマウス及びＡＧＭにおいて＞１０³の幾何 学的平均タイターを得た。これらのデータは、本発明者が、発現レベルを増大さ せることによりｇｐ１６０様ワクチンの免疫原性を有意に向上させたことを示し ている。この構築物並びにｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥ Ａ及びＢベクタ ーにより、抗体応答、特にウイルスの中和が特徴づけられ続けることであろう。 ｇｐ１２０ＤＮＡの予防接種により、テストした全てのリンパ球区分（脾臓、血 液、鼡径部、腸間膜及び腸骨節）において、Ｔ_H１様サイトカイン分泌プロフィ ール（即ち、ｇ−インターフェロン及びＩＬ−２が産生したが、ＩＬ−４は殆ど 又は全く産生しない）を有する有効なヘルパーＴ細胞応答が生起したことは重要 である。これらのサイトカインは、一般に強力な細胞性免疫を促進し、ＨＩＶ血 清反応陽性患者の無病状態の維持に関与している。リンパ節は、ウイルスが血液 中では容易に検出し得ないときでさえ大量のウイルスを保有している初期ＨＩＶ 複製部位であることが証明されている。本発明のＤＮＡワクチンで示されたよう な、種々のリンパ部位で抗ＨＩＶ免疫応答を誘発し得るワクチンは、初感染後の リンパ系のコロニー形成の阻止を支援し得る。 先に述べたように、本発明者は、以下の目標を達成することがこのプログラム の成功のチャンスを最大限にするために必須であると考える：（１）霊長類にお ける強力な中和抗体応答を生起させ得るｅｎｖベースベクター；（２）霊長類に おけるＣＴＬ及びヘルパーエフェクター機能を特徴とする強力なＴリンパ球応答 を誘発するｇａｇ及びｅｎｖベクター；（３）本発明 のワクチンにおける臨床的に関連するＨＩＶ−１株由来のｅｎｖ及びｇａｇ遺伝 子の使用、及び該遺伝子が誘発する免疫応答、特に初代分離体の中和の特性決定 ；（４）適切な最適化ワクチンを用いたチンパンジー／ＨＩＶ（IIIＢ）又はア カゲザル／ＳＨＩＶなどの動物チャレンジモデルにおける感染防御の証明；及び （５）臨床使用に適切な免疫応答の持続期間の測定。上記目標の最初の３項目に 関しては有意な進展が見られ、本発明の最近のｇｐ１６０及びｇａｇに対する予 防接種構築物がこれらの初期の結果を改善するかどうかを決定する実験が進行中 である。 実施例４ ワクチン製造用ベクター Ａ． Ｖ１Ｊｎｅｏ発現ベクター： アンピシリンは大規模発酵槽では使用し得ないのでＶ１Ｊを保有する細菌の抗 生物質の選択にあたってはａｍｐ^r遺伝子を除去することが必要であった。Ｖ１ ＪのｐＵＣバックボーン由来のａｍｐ^r遺伝子を、ＳｓｐＩ及びＥａｍＩ １０ ５１制限酵素で消化して除去した。残留プラスミドをアガロースゲル電気泳動に かけて精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端と し、次いでウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。トランスポゾン９０３か ら誘導され、ｐＵＣ４Ｋプラスミド内に含まれる市販のｋａｎ^r遺伝子をＰｓｔ Ｉ制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動にかけて精製、Ｔ４ＤＮＡポリメ ラーゼで平滑末端とした。このフラグメントをＶ１Ｊバックボーンと連結し、い ずれかの配向でｋａｎ^r遺伝子を含むプラスミドを誘導し、これをＶ１Ｊｎｅｏ ＃１及び３と称した。これらのプラスミドのそれぞれを、制限酵素消化分析、結 合領域のＤＮＡ配列決定により確認すると、Ｖ１Ｊと類似の量のプラスミドが生 成することが示された。異種遺伝子産物の発現もこれらのＶ１Ｊｎｅｏベクター と同等であった。本発明者は、発現構築物としてＶ１Ｊのａｍｐ^r遺伝子と同じ 配向でｋａｎ^r遺伝子を含む、以後Ｖ１Ｊｎｅｏと称されるＶ１Ｊｎｅｏ＃３を 任意に選択した。 Ｂ． Ｖ１Ｊｎｓ発現ベクター： 統合研究を容易にするために、Ｖ１ＪｎｅｏにＳｆｉＩ部位を加えた。市販の １３塩基対ＳｆｉＩリンカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をベ クターのＢＧＨ配列内のＫｐｎＩ部位に加えた。Ｖ１ＪｎｅｏでＫｐｎＩと線状 にし、ゲ ル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、平滑ＳｆｉＩリンカーに連 結した。クローナル分離体を制限マッピングにより選択し、リンカーを介した配 列決定により確認した。新規ベクターをＶ１Ｊｎｓと称した。（ＳｆｉＩを含む ）Ｖ１Ｊｎｓにおける異種遺伝子の発現は（ＫｐｎＩを含む）Ｖ１Ｊｎｅｏにお ける同一遺伝子の発現と比較し得るものであった。 Ｃ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ： 分泌型タンパク質及び／又は膜タンパク質に対して異種のリーダーペプチド配 列を得るために、Ｖ１Ｊｎをヒト組織特異プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ ＰＡ）リーダーを含めるように改変した。２つの合成相補オリゴマーをアニーリ ングし、次いで、ＢｇｌII消化したＶ１Ｊｎに連結した。センス及びアンチセン スオリゴマーは、５’−ＧＡＴＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＣＡ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＧＡ ＧＧＧ ＣＴＣ ＴＧＣＴＧＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ Ｃ ＴＧ ＴＧＴ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＴＣ ＧＴＴ ＴＣＧ ＣＣＣ Ａ ＧＣ ＧＡ−３’、配列番号１８；及び５’−ＧＡＴ ＣＴＣ ＧＣＴ ＧＧＧ ＣＧＡ ＡＡＣ ＧＡＡ ＧＡＣ ＴＧＣ ＴＣＣ ＡＣＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＣＡ ＧＡＧ ＣＣ Ｃ ＴＣＴ ＣＴＴ ＣＡＴ ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＧＴ−３’であった 。センスオリゴマー中Ｋｏｚａｋ配列には下線を付してある。これらのオリゴマ ーはＢｇｌII切断配列への連結に適合したオーバーハング塩基を有している。連 結後、上流のＢｇｌII部位を破壊し、下流のＢｇｌIIをその後の連結用に保持す る。両接合部位及び全ｔＰＡリーダー配列をＤＮＡ配列決定して確認した。さら に、本発明の共通最適化ベクターＶ１Ｊｎｓ（＝ＳｆｉＩ部位を含むＶ１Ｊｎｅ ｏ）と一致させるために、ＫｐｎＩ部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑とし、 次いでＳｆｉＩリンカー（カタログ＃１１３８、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ ｏｌａｂｓ）と連結して、Ｖ１Ｊｎ−ｔＰＡのＢＧＨターミネーター領域内のＫ ｐｎＩ部位にＳｆｉＩ制限部位を配置した。この改変を制限消化及びアガロース ゲル電気泳動により確認した。 実施例５ Ｉ． ＨＩＶｅｎｖワクチン構築物：分泌型ｅｎｖ由来抗原（ｇｐ１２０及びｇｐ１４０）を生成するワクチン ： ＲＥＶ依存性ｅｎｖ遺伝子をｇｐ１２０として以下の方法で 発現させた：天然リーダーペプチド配列（Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１２０）を用いるか 又は天然リーダーペプチドを置き換える組織−プラスミノーゲンアクチベーター （ｔＰＡ）リーダーペプチドとの融合体（Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０）と してＨＩＶのＭＮ株からｇｐ１２０をＰＣＲクローン化した。ｔＰＡ−ｇｐ１２ ０ｎの発現はＲＥＶ依存性であることが示された〔Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎら， Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，３９７９（１９９１）；他のリーダー配列 はｇｐ１２０遺伝子のＲＥＶ依存性の付与において類似の機能を果たすであろう ことに留意されたい〕。これは、上記ベクターを用いて以下のｇｐ１２０構築物 を形成することにより達成された： 実施例６ ｇｐ１２０ワクチン構築物 ： Ａ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ＨＩＶ_MNｇｐ１２０： ペプチドリーダー配列の最初の３０個のアミノ酸を除去し、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰ Ａへのクローン化を容易にして、ｔＰＡリーダーペプチド、アミノ酸残基３０の 後の残留ｇｐ１２０配列からなるキメラタンパク質を形成するするように設計し たオリゴマーを用いてＨＩＶＭＮｇｐ１２０遺伝子（Ｍｅｄｉｍｍｕｎ ｅ）をＰＣＲ増幅した。このように設計することにより、このプラスミドを保有 する細胞からのＲＥＶ依存性ｇｐ１２０の発現及び可溶性ｇｐ１２０の分泌が可 能になる。用いたセンス及びアンチセンスオリゴマーは、５’−ＣＣＣ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＴＧ ＡＴＣ ＡＣＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＴＴＧ ＴＧＧ ＧＴＣ ＡＣＡ ＧＴＣ−３’、及び５’−Ｃ ＣＣＣ ＡＧＧ ＡＡＴＣ ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＴＡ ＧＣＧ ＣＴＴ ＴＴＣ ＴＣＴＣＴＧ ＣＡＣ ＣＡＣ Ｔ ＣＴ ＴＣＴ Ｃ−３’であった。翻訳終結コドンには下線が付されている。こ れらのオリゴマーは、翻訳読み取りフレームのいずれかの末端にＢａｍＨＩ制限 酵素部位を含み、ＢｃｌＩ部位はセンスオリゴマーのＢａｍＨＩに対して３’に 位置している。ＰＣＲ産物を逐次Ｂｃ１Ｉ、ＢａｍＨＩで消化し、ＢｇｌII消化 し、次いでウシ腸アルカリホスファターゼ処理しておいたＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡに 連結した。得られたベクターを配列決定して、ｔＰＡリーダーとｇｐ１２０コー ド配列の間のフレーム内融合を確認し、ｇｐ１２０の発現及び分泌をトランスフ ェクトされたＲＢ細胞のイムノブロット分析により確認した。 Ｂ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ＨＩＶ_IIIBｇｐ１２０： このベクターは、ｇｐ１２０配列にＨＩＶIIIＢ株を用いたこと以外はＩ．Ａ ．に類似である。用いたセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーはそれぞれ： ５’−ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＣＡ ＣＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＴＴＧ ＴＧ Ｇ ＧＴＣ ＡＣＡ ＧＴＣ−３’、及び５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＧＡ ＴＣ Ａ ＧＡＴ ＡＴＣ ＴＴＡ ＴＣＴ ＴＴＴ ＴＴＣ ＴＣＴＣＴＧ ＣＡＣ ＣＡＣ ＴＣＴ ＴＣ−３’であった。これらのオリゴマーは、挿入体のいず れかの末端にＢｃｌＩ部位を、また３’末端のＢｃｌＩ部位のすぐ上流にＥｃｏ ＲＶを提供する。５’末端のＢｃｌＩ部位により、ｔｐＡリーダー配列及びその 天然リーダー配列を含まないｇｐ１２０をコードするキメラｔｐＡ−ｇｐ１２０ 遺伝子を形成するためのＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡのＢｇｌII部位への連結が可能にな る。連結産物を制限消化及びＤＮＡ配列決定により確認した。 実施例７ ｇｐ１４０ワクチン構築物 ： これらの構築物は、天然リーダーの代わりにｔＰＡリーダーを用いてｔＰＡ− ｇｐ１２０と同じようにＰＣＲにより作製したが、該遺伝子を膜貫通型ペプチド のＮＨ₂末端の後で終結さ せて分泌型抗原を産生するように設計した（計画されたカルボキシ末端アミノ酸 配列＝ＮＨ₂...−ＴＮＷＬＷＹＩＫ−ＣＯＯＨ）。ｇｐ１２０産生構築物とは異 なり、ｇｐ１４０構築物はオリゴマー抗原を産生し、２Ｆ５モノクローナル抗体 によって範囲が定められるＥＬＤＫＷＡなどの既知ｇｐ１４０含有抗体中和エピ トープを保持するであろう。 構築物は、ｇｐ１２０とｇｐ４１の接合部のｇｐ１６０タンパク質分解性切断 部位を保持する（Ｂ）か、又はＫｉｅｎｙら，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．２：２１９− ２５５（１９８８）により記載されたような適切なアミノ酸置換により排除する （Ａ）かによって２つの形態（Ａ又はＢ）で作製した。（野生型配列＝ＮＨ₂−. ..ＫＡＫＲＲＶＶＱＲＥＫＲ...ＣＯＯＨ、及び変異配列＝ＮＨ₂−...ＫＡＱＮ Ｈ ＶＶＱＮＥＨＱ...ＣＯＯＨ（変異アミノ酸には下線が付されている）。 Ａ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｍｕｔＲＲＥ−Ａ／ＳＲＶ−１ ３’ −ＵＴＲ（ＨＩＶ−１_IIIBをベースとする この構築物は、以下のセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマー：５’−ＣＴ ＧＡＡ ＡＧＡ ＣＣＡ ＧＣＡ ＡＣＴ ＣＣＴ ＡＧＧ ＧＡＡＴ ＴＴ Ｇ ＧＧＧ ＴＴＧ ＣＴＣ ＴＧ Ｇ−３’、及び５’−ＣＧＣ ＡＧＧ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＧＴ ＣＴＡ ＧＡ Ｔ ＡＴＣ ＴＴＡ ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＡＴ ＡＴＡ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＣ Ａ ＡＴＴ ＴＧＴ ＴＡＴ Ｇ−３’を用いて（最適化ＲＲＥ−Ａセグメント を含む）ベクターＩＶＢからＰＣＲによりＡｖｒII／ＥｃｏＲＶセグメントを得 た。合成遺伝子セグメントとして作製した、Ｓｉｍｉａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕ ｓ−１（ＳＲＶ−１、以下参照）由来の３’−ＵＴＲを、ｇｐ１４０読み取りフ レームの３’末端のすぐ後に導入したＳｒｆＩ制限酵素部位に挿入した。このＵ ＴＲ配列は先にＨＩＶｅｎｖ及びｇａｇのｒｅｖ依存性発現を容易にするものと して記載した。 Ｂ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｍｕｔＲＲＥ−Ｂ／ＳＲＶ−１ ３’ −ＵＴＲ（ＨＩＶ−１_IIIBをベースとする） ： この構築物は、出発物質として構築物ＩＶＣを用いることによりｅｎｖタンパ ク質分解性切断部位が保持されていること以外はIIＡと類似である。 Ｃ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ３０−Ａ（ＨＩＶ−１_IIIBをベ ースとする） ： この構築物は、ＡｖｒII及びＳｒｆＩ制限酵素消化、次いで ｇｐ３０に対応するが翻訳に最適なコドン（以下のｇｐ３２−ｏｐｔ参照）から なる合成ＤＮＡと連結したＩＶＢから誘導された。ｇｐ３０−ｏｐｔＤＮＡは、 ｇｐ３２−ｏｐｔから、それぞれ以下のセンス及びアンチセンスオリゴマー：５ ’−ＧＧＴ ＡＣＡ ＣＣＴ ＡＧＧ ＣＡＴ ＣＴＧ ＧＧＧ ＣＴＧ ＣＴ Ｃ ＴＧＧ−３’、及び５（−ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＡＴ ＡＴＣ Ｇ ＣＣＣ ＧＧＧ Ｃ ＴＴＡ ＴＴＡ ＴＴＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＣ Ａ ＧＴＴ ＧＧＴ ＧＡＴ Ｇ−３’を用いてＰＣＲ増幅した。このＤＮＡセ グメントをＡｖｒII及びＥｃｏＲＶ制限酵素で消化し、ＡｖｒII及びＳｒｆＩで 消化して対応ＤＮＡセグメントを除去しておいたＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４ ３／ｏｐｔ３２−Ａ（ＩＶＤ）に連結した。得られた生成物を連結接合部のＤＮ Ａ配列決定及びイムノブロット分析により確認した。 Ｄ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ３０−Ｂ（ＨＩＶ−１_IIIBをベ ースとする） ： この構築物は、ｅｎｖタンパク質分解性節電部位を保持したこと以外はIIＣと 類似である。 Ｅ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／oｐt ａｌｌ− Ａ ： この構築物のｅｎｖ遺伝子は、完全に最適コドンからなる。不変領域（Ｃ１、 Ｃ５、ｇｐ３２）は、ＩＶＢ、Ｄ、Ｈに記載されているものであり、可変領域１ 〜５に対応する追加の合成ＤＮＡセグメントは、翻訳に最適なコドン（ＨＩＶ− １ ＭＮＶ１−Ｖ５ベースの以下の例を参照）からなる合成ＤＮＡセグメントを 用いて挿入する。 Ｆ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ ａｌｌ− Ｂ ： この構築物は、ｅｎｖタンパク質分解性切断部位を保持したこと以外はIIＥと 類似である。 Ｇ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐt ａｌｌ−Ａ （非IIIＢ株） ： この構築物は、IIIＢ以外のカブ由来のｅｎｖアミノ酸配列を用いて可変（Ｖ １−Ｖ５）領域全体の最適コドン利用を決定したこと以外は上記IIＥと類似であ る。 Ｈ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／oｐｔ ａｌｌ−Ｂ （非IIIＢ株）： この構築物は、ｅｎｖタンパク質分解性切断部位を保持した こと以外はIIＧと類似である。 実施例８ ｇｐ１６０ワクチン構築物 ： 構築物は、ｇｐ１６０タンパク質分解性切断部位が上述の通りであるかどうか により２つの形態（Ａ又はＢ）で作製した。 Ａ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｒｅｖ／ｅｎｖ： このベクターは上記セクションＤに記載のものの変異形である。但し、エキソ ン１の全ｔａｔコード領域はＲＥＶ読み取りフレームの開始部までが欠失してい る。Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０_IIIB（上記セクションＡ参照）をＰｓｔＩ及びＫｐ ｎＩ制限酵素で消化してｇｐ１６０遺伝子の５’領域を除去した。ＰＣＲ増幅に より、ＨＸＢ２ゲノムクローン由来のｇｐ１６０のＫｐｎＩ部位までの最初のＲ ＥＶエキソンをコードするＤＮＡセグメントを得た。センス及びアンチセンスＰ ＣＲオリゴマーは、それぞれ：５’−ＧＧＴ ＡＣＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＣＡ ＣＣＧ ＴＣＣ Ｔ ＡＴＧ ＧＣＡ ＧＧＡ ＡＧＡ ＡＧＣ ＧＧＡ Ｇ ＡＣ−３’、及び５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＣＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＣＣＡ ＴＡ Ａ ＴＡＧ ＡＣＴ ＧＴＧ ＡＣＣ−３’であった。これらのオリゴマーは、 それぞれＤＮＡフラグメン トの５’末端及び３’末端のＰｓｔＩ及びＫｐｎＩ制限酵素部位を提供する。得 られたＤＮＡをＰｓｔＩ及びＫｐｎＩで消化し、アガロース電気泳動ゲルから精 製し、Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０（ＰｓｔＩ／ＫｐｎＩ）と連結した。得られたプ ラスミドを制限酵素消化により確認した。 Ｂ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０： ＨＩＶ_IIIbクローンＨＸＢ２由来のＨＩＶ_IIIbゲノムの半分の３’末端を含む プラスミドｐＦ４１２からＰＣＲ増幅によりＨＩＶ_IIIbｇＰ１６０をクローン化 した。ＰＣＲセンス及びアンチセンスオリゴマーはそれぞれ、５’−ＧＧＴ Ａ ＣＡ ＴＧＡ ＴＣＡ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＧＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＡＧ Ａ ＡＡ ＴＡＴ ＣＡＧ Ｃ−３’、及び５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＧＡ ＴＣＡ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＣＣ ＡＴＣ ＴＴＡ ＴＡＧ ＣＡＡ ＡＡＴ ＣＣＴ ＴＴＣ Ｃ−３’であった。Ｋｏｚａｋ配列及び翻訳終結コドンには下線を付 してある。これらのオリゴマーは、ｅｎｖ遺伝子の両末端の翻訳読み取りフレー ムの外側のＢｃ１Ｉ制限酵素部位を提供する。（ＢｃｌＩ消化部位は、ＢｇｌII 消化部位との連結に適合しており、それによって両制限酵素に対する感受性が失 われる。ｇｐ１６０のＰ ＣＲクローン化にＢｃｌＩを選んだ理由は、該遺伝子が内部ＢｇｌII部位とＢａ ｍＨＩ部位とを含んでいるからである）。アンチセンスオリゴマーにはさらに、 他のＰＣＲ由来の遺伝子について上述したＢｃｌＩ部位の直前にＥｃｏＲＶ部位 を挿入する。増幅されたｇｐ１６０遺伝子をアガロースゲル精製し、ＢｃｌＩで 消化し、Ｖ１Ｊｎｓに連結した。該Ｖ１Ｊｎｓは、ＢｇｌIIで消化し、ウシ腸ア ルカリホスファターゼで処理しておいた。クローン化遺伝子は約２．６ｋｂの大 きさであり、ｇｐ１６０のＶ１Ｊｎｓとの各接合部をＤＮＡ配列決定により確認 した。 Ｃ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０（ＨＩＶ−１_IIIBをベースとする）： このべクターは上記実施例１（Ｃ）に類似である。但し、全長のｇｐ１６０を 天然リーダー配列を用いずにＰＣＲにより得た。センスオリゴマーはＩ．Ｃに用 いたものと同じであり、アンチセンスオリゴマーは、５’−ＣＣＡ ＣＡＴ Ｔ ＧＡ ＴＣＡ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＣＣ ＡＴＣ ＴＴＡ ＴＡＧ ＣＡＡ Ａ ＡＴ ＣＣＴ ＴＴＣ Ｃ−３’であった。これらのオリゴマーは、挿入体のど ちらかの末端にＢｃｌIIを、また３’末端の ＢｃｌＩ部位のすぐ上流にＥｃｏＲＶを提供する。５’末端のＢｃｌＩ部位は、 ｔＰＡリーダー配列及び天然リーダー配列を含まないｇｐ１６０をコードするキ メラｔＰＡ−ｇｐ１６０遺伝子を形成するためのＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡのＢｇｌII 部位への連結を可能にする。連結生成物を制限消化及びＤＮＡ配列決定により確 認した。 Ｄ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ４１−Ａ（ＨＩＶ −１_IIIBをベースとする） ： この構築物は、ｇｐ２２よりむしろＣ５及びｇｐ４１の完全な最適化コドンセ グメントを有するＩＶＨをベースとし、追加の最適化コドンセグメント（以下参 照）がｔＰＡリーダーの後のｇｐ１２０のアミノ末端でＣ１に置き換わる。該新 規Ｃ１セグメントを、以下のＰＣＲオリゴマー：５’−ＣＣＴ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＡＧ ＴＴＴ ＡＡＡ Ｃ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＴＧ ＡＡＧ Ａ ＡＴ ＧＡＴ ＡＣＴ ＡＡＴ ＡＣ−３’を用いてＳＯＥ ＰＣＲにより残留 ｇｐ１４３セグメントに結合し、結合したＣ１／１４３セグメントを合成した。 得られたｇｐ１４３遺伝子は、Ｖ１−Ｖ５領域を除いて最適コドン利用を含み、 他のＨＩＶ遺伝子由来の可変領域を挿入するためのＣ１ とＶ１の接合部に位置する非反復ＰｍｅＩ制限酵素部位を有する。 Ｅ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ４１−Ｂ（ＨＩ Ｖ−１_IIIBをベースとする） ： この構築物はｅｎｖタンパク質分解性切断部位を保持したこと以外はIIIＤと 類似である。 Ｆ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐt ａｌｌ−Ａ（ＨＩＶ−１_IIIB をベースとする） ： この構築物のｅｎｖ遺伝子は、上述のように完全に最適コドンからなる。不変 領域（Ｃ１、Ｃ５、ｇｐ３２）は、（全ての完全に最適化されたｇｐ１６０に用 いられる）カセットとして用いられる、IIIＤ、Ｅに記載のものであるが、可変 領域（Ｖ１−Ｖ５）は最適コドンからなる合成ＤＮＡセグメント由来である。 Ｇ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ： この構築物はｅｎｖタンパク質分解性切断部位を保持したこと以外はIIIＦと 類似である。 Ｈ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ （非IIIＢ株） ： この構築物は、IIIＢ以外の株由来のｅｎｖアミノ酸配列を用いて可変（Ｖ１ −Ｖ５）領域全体の最適コドン利用を決定したこと以外は上記IIIＦと類似であ る。 Ｉ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐt ａｌｌ−Ｂ（非IIIＢ株）： この構築物はｅｎｖタンパク質分解性切断部位を保持したこと以外はIIIＨと 類似である。 実施例９ ｇｐ１４３ワクチン構築物 ： これらの構築物は上記の他のｔＰＡ含有構築物（ｔＰＡ−ｇｐ１２０、ｔＰＡ −ｇｐ１４０及びｔＰＡ−ｇｐ１６０）と同じようにＰＣＲにより作製した。但 し、天然のリーダーの代わりにｔＰＡリーダーを用い、末端にＣＯＯＨを有する 膜結合ｅｎｖを生成するように設計した（計画された細胞内アミノ酸配列＝ＮＨ₂ −ＮＲＶＲＱＧＹＳＰ−ＣＯＯＨ）。この構築物は、ｔＰＡの導入を伴うｅｎ ｖの発現を増大させることと、ｅｎｖの細胞内部分に対応する転写産物又はペプ チド領域が発現又はタンパク質の安定性／細胞表面に対する輸送に悪影響を与え る 可能性を最小限にすることとの両立を目的として設計した。構築物は、上記のよ うにｇｐ１６０タンパク質分解性切断部位を除去したか、又は保有したかに応じ て２つの形態（Ａ又はＢ）で作製した。ｇｐ１４３が切り取られた後に残留する ｇｐ４１フラグメントはｇｐ３２と称される。 Ａ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３： この構築物は、以下のセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマー：５’−ＧＧ Ｔ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＣＡ ＣＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＴＴＧ ＴＧＧ ＧＴＣ ＡＣＡ ＧＴＣ−３’、及び５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＧＡ ＴＣＡ Ｇ Ｃ ＣＣ ＧＧＧ Ｃ ＴＴＡ ＧＧＧ ＴＧＡ ＡＴＡ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＣＴ ＣＡＣ ＴＣＴ ＧＴＴ ＣＡＣ−３’を用い、プラスミドｐＦ４１２を用い てＰＣＲにより作製した。得られたＤＮＡセグメントは、どちらかの末端に、ｅ ｎｖ読み取りフレームに対して３’末端のすぐ後に位置する、ＳｒｆＩ部位で消 化したＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ／ＢｇｌIIにクローン化するためのＢｃｌＩ制限部位 を含む。構築物を連結接合部のＤＮＡ配列決定及びトランスフェクトされた細胞 のイムノブロット分析により確認した。 Ｂ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥ−Ａ： この構築物は、非反復ＭｕｎＩ制限酵素部位及びその下流の上記ＳｒｆＩ部位 を用いてＤＮＡセグメントを切断したＩＶＡをベースとする。このセグメントは 、ｇｐ１２０のＣ５ドメインの一部及びｇｐ３２全体に対応する。翻訳最適コド ンからなるｇｐ１６０の〜３５０ｂｐのｒｅｖ応答成分（ＲＲＥ Ａ）に対応す る合成ＤＮＡセグメントを、２つのセグメントの接合部にＡｖｒII制限酵素部位 を形成する（但しアミノ酸配列には変化がない）スプライスオーバーラップ延長 （ＳＯＥ）ＰＣＲにより残留ｇｐ３２セグメントに結合した。これらのＰＣＲ反 応は、ｇｐ３２含有ドメインを生成させるために、それぞれ以下のセンス及びア ンチセンスＰＣＲオリゴマー：５’−ＣＴＧＡＡ ＡＧＡ ＣＣＡ ＧＣＡ Ａ ＣＴ ＣＣＴ ＡＧＧ ＧＡＴ ＴＴＧ ＧＧＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＧＧ − ３’、及び５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＧＡ ＴＣＡ Ｇ ＣＣＣ ＧＧＧ Ｃ ＴＴＡ ＧＧＧ ＴＧＡ ＡＴＡ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＣＴ ＣＡＣ ＴＣＴ ＧＴＴ ＣＡＣ−３’（ＩＶＡを得るためのアンチセンスオリゴマーとして用い た）を用いて行った。変異型ＲＲＥ（ｍｕｔＲＲＥ−Ａ）セグメントを、以下の センスオリゴマー、５’−ＧＧＴ ＡＣＡ ＣＡＡ ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＧＡ ＧＴＴ ＡＴＡ ＴＡＡ ＡＴＡ ＴＡＡ Ｇ−３’と、ｇｐ３２セグメントの 作製に用いたアンチセンスオリゴマーとを用いてＳＯＥ ＰＣＲによりｇｐ３２ の野生型配列に結合した。得られた結合ＤＮＡセグメントをＭｕｎＩ及びＳｒｆ Ｉ制限酵素で消化し、親のｇｐ１４３／ＭｕｎＩ／ＳｒｆＩ消化プラスミドに連 結した。得られた構築物を連結体及びＳＯＥ ＰＣＲ接合部のＤＮＡ配列決定及 びトランスフェクトされた細胞のイムノブロット分析により確認した。 Ｃ． ＶＩＪｎｓ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥ−Ｂ： この構築物は、ｍｕｔＲＲＥ−Ａの代わりにｍｕｔＲＲＥ−Ｂ合成遺伝子セグ メントを用いてｅｎｖタンパク質分解性切断部位を保持したこと以外はＩＶＢと 類似である。 Ｄ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ａ： この構築物は、ＡｖｒII及びＳｒｆＩ制限酵素による消化、その後のｇｐ３２ に対応するが翻訳最適コドン（以下のｇｐ３２ｏｐｔ参照）からなる合成ＤＮＡ セグメントの連結によりＩＶＢから誘導した。得られた生成物を連結接合部のＤ ＮＡ配列決定及びイムノブロット分析により確認した。 Ｅ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ｂ： この構築物は、初期プラスミドとしてＩＶＣを用いることによりｅｎｖタンパ ク質分解性切断部位を保持したこと以外は、ＩＶＤと類似である。 Ｇ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ＳＲＶ−１ ３’ＵＴＲ： この構築物は、Ｓｉｍｉａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−１（ＳＲＶ−１，以下 参照）由来の３’−ＵＴＲを、ｇｐ１４３読み取りフレームの３’末端のすぐ後 に導入したＳｒｆＩ制限酵素部位に挿入したこと以外はＩＶＡと類似である。こ のＵＴＲ配列はＨＩＶｅｎｖ及びｇａｇのｒｅｖ依存性発現を容易にするものと して先に記載されている。 Ｈ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２Ａ： この構築物は、Ｃ５及びｇｐ３２の完全な最適化コドンセグメントを有するＩ ＶＤをベースとし、追加の最適化コドンセグメント（以下参照）はｔＰＡリーダ ーの後のｇｐ１２０のアミノ末端でＣ１を置き換える。新規なＣ１セグメントを 、以下のＰＣＲ用オリゴマー：５’−ＣＣＴ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＡＧ ＴＴＴ ＡＡＡ Ｃ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＴＧ ＡＡＧ ＡＡＴ ＧＡＴ ＡＣＴ ＡＡＴ ＡＣ−３’を用い、ＳＯＥ ＰＣＲにより残 留ｇｐ１４３セグメントに結合して、結合Ｃ１／１４３セグメントを合成した。 得られたｇｐ１４３遺伝子は、Ｖ１−Ｖ５領域を除き最適コドン利用を含み、他 のＨＩＶ遺伝子由来の可変領域を挿入するための、Ｃ１とＶ１の接合部に配置さ れた非反復ＰｍｅＩ制限酵素部位を有する。 Ｉ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２Ｂ： この構築物は、ｅｎｖタンパク質分解性切断部位を保持したこと以外はＴＶＨ と類似である。 Ｊ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ： この構築物のｅｎｖ遺伝子は、完全に最適コドンからなる。 不変領域（Ｃ１、Ｃ５、ｇｐ３２）は４Ｂ、Ｄ、Ｈに記載のものであり、可変領 域Ｖ１−Ｖ５に対応する追加の合成ＤＮＡセグメントは、翻訳用最適コドンから なる合成ＤＮＡセグメントを用いて挿入する。 Ｋ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ： この構築物は、ｅｎｖタンパク質分解性切断部位を保持したこと以外はＩＶＪ と類似である。 Ｌ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ（非IIIＢ株）： この構築物は、IIIＢ以外の株由来のｅｎｖアミノ酸配列を用いて可変（Ｖ１ −Ｖ５）領域全体の最適コドン利用を決定したこと以外は上記IIIＧと類似であ る。 Ｍ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ（非IIIＢ株）： この構築物は、IIIＢ以外の株由来のｅｎｖアミノ酸配列を用いて可変（Ｖ１ −Ｖ５）領域全体の最適コドン利用を決定したこと以外は上記IIIＧと類似であ る。 実施例１０ ｇｐ１４３／ｇlｙＢワクチン構築物 これらの構築物は、天然リーダーの代わりにｔＰＡリーダーを用い、上記の他 のｔＰＡ含有構築物（ｔＰＡ−ｇｐ１２０、ｔＰＡ−ｇｐ１４０、ｔＰＡ−ｇｐ １４３及びｔＰＡ−ｇｐ１６０）と同じようにＰＣＲにより作製した。ｇｐ１４ ３の場合と同様にＣＯＯＨ末端を有する膜結合ｅｎｖを生成するように 設計した、しかし、ｇｐ１４３／ｇｌｙＢ構築物は、細胞内ペプチドドメインを 含むように計画された６個のアミノ酸のうち最後の４個がヒトグリコホリンＢ（ ｇｌｙＢ）タンパク質のカルボキシル末端におけるものと同じであるという点で ｇｐ１４３と異なる〔計画された細胞内アミノ酸配列＝ＮＨ₂−ＮＲＬＩＫＡ− ＣＯＯＨ（下線を付した残基はｇ１ｙＢに対応し、「Ｒ」はｅｎｖとｇｌｙＢに 共通である）〕。この構築物は、さらなるｅｎｖ発現を得る目的で設計され、発 現又はタンパク質安定性／細胞表面に対する輸送に悪影響を与えかねないｅｎｖ の細胞内部分に対応する転写産物又はペプチド領域を、短い細胞質ドメインを有 する豊富に発現したタンパク質（ｇｌｙＢ）由来のペプチド配列で置き換えて、 前記転写産物又はペプチド領域を完全に排除することにより細胞表面に対する標 的化を誘導した（細胞内アミノ酸配列＝ＮＨ₂−ＲＲＬＩＫＡ−ＣＯＨ）。構築 物は、上記のようにｇｐ１６０タンパク質分解性切断部位を除去するか、又は保 持するかにより２つの形態（Ａ又はＢ）で作製した。 Ａ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−ＡｌｙＢ： この構築物は、以下のアンチセンスＰＣＲオリゴマー：５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＡＴ ＡＴＣ Ｇ ＣＣＣ ＧＧＧ Ｃ ＴＴＡ ＴＴＡ ＧＧＣ ＣＴＴ ＧＡＴ ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＴＴ ＣＡＣ ＡＡＴ ＧＧＡ ＣＡＧ ＣＡＣ ＡＧＣ−３’を用いて、ｇｐ１４３の細胞内ペプチドドメインを上記のグリコ ホリンＢのものと置き換えたこと以外はＩＶＤと同じである。 Ｂ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ｂ／ｌｙＢ： この構築物は、ｅｎｖタンパタ質分解性切断部位を保持したこと以外はＶＡと 類似である。 Ｃ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２−Ａ／ｇｌｙ Ｂ ： この構築物は、ｇｐ１２０の最初の不変領域（Ｃ１）をＩＶＨの場合のように 翻訳最適コドンで置き換えること以外はＶＡと同じである。 Ｄ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２−Ｂ／ｇｌｙ Ｂ ： この構築物は、ｅｎｖタンパク質分解性切断部位が保持されていること以外は ＶＣと類似である。 Ｅ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ／ｇｌｙＢ： この構築物のｅｎｖ遺伝子は完全に上記最適コドンからなる。 Ｆ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ／ｇｌｙＢ： この構築物は、ｅｎｖタンパク質分解性切断部位が保持されていること以外は ＶＥと類似である。 Ｇ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ／ｇｌｙＢ（非II IＢ株） ： この構築物は、IIIＢ以外の株由来のｅｎｖアミノ酸配列を用いて可変（Ｖ１ −Ｖ５）領域全体の最適コドン利用を決定したこと以外はIIIＢと類似である。 Ｈ． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ／ｇｌｙＢ（非II IＢ株） ： この構築物は、ｅｎｖタンパク質分解性切断部位が保持されえいること以外は ＶＧと類似である。可変ループを欠失するＨＩＶｅｎｖワクチン構築物 ： これらの構築物には、上記にリストした全てのｅｎｖ形態（ｇｐ１２０、ｇｐ １４０、ｇｐ１４３、ｇｐ１６０、ｇｐｌ ４３／ｇｌｙＢ）が含まれ得るが、該構築物は、製造中にｇｐ１２０領域内の可 変ループ（例えば、Ｖ１、Ｖ２及び／又はＶ３）を欠失させた。これらの改変の 目的は、ＣＤ４接合部位などの保存された中和エピトープの露出を妨げ得るペプ チドセグメントを排除することにある。例えば、ＰＣＲ反応において以下のオリ ゴマー：５’−ＣＴＧ ＡＣＣ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ ＧＧＧ Ｇ ＣＴ ＧＧＣ ＡＧＴ ＴＧＴ ＡＡＣ ＡＣＣ ＴＣＡ ＧＴＣ ＡＴＴ Ａ ＣＡ ＣＡＧ−３’を用いてＶ１／Ｖ２欠失部をつくり、隣接するＴＨＥ Ｃ１ 及びＣ２セグメントを得た。 実施例１１ ｅｎｖ遺伝子の発現を増大させるための合成遺伝子セグメントの設計 ： 遺伝子セグメントを、同一翻訳配列（注記した箇所を除く）を有するがＪ．Ｍ ｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．第１８３巻，１〜１２ページ（１９８５）の“Ｓｙｎｔｈ ｅｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ Ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ：Ｔｈｅｏｒｅ ｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅ ｒａｔｉｏｎｓ”と題する研究論文でＲ．Ｌａｔｈｅが定義した代替えコドン利 用を含む配列に変換した。ＨＩＶｅｎｖ遺伝子セグメントのｒｅｖ依存性発現を 増大させるための以下に記載の方法は、哺乳動物細胞中で該遺伝子を効率的に発 現させることが不可能であることが公知であるが、それは全転写産物組成物を用 いることによるとの本発明者の仮説に基づくものであった。例えば、同じタンパ ク質配列をコードする代替えコドンを用いてｒｅｖ不在下のｅｎｖ発現の制約を 除去し得る。ｅｎｖ内のコドン利用を調べると、コドンの大部分が高度に発現さ れたヒト遺伝子では滅多に利用されていないコドンであることが判明した。利用 した特異的コドン置換法は、Ｌａｔｈｅらのデータを用いて以下のように説明し 得る： １． 正しい読み取りフレームに対するコドンの配置を同定する； ２． 観察されたヒト遺伝子による利用頻度に関して野生型コドンを比較する （Ｌａｔｈｅらの表３を参照）。 ３． コドンが最も一般的に用いられているものでない場合、該コドンを表５ のデータに基づいて高発現に最適なコドンと置き換える。 ４． 新規なコドンの第３ヌクレオチドと、第１のヌクレオチドの３’末端の すぐ後の隣接コドンの第１ヌクレオチドを調べる。５’−ＣＧ−３’のペア形成 が、該新規なコドンの選択により形成された場合には、該コドンを表５に示され ている選択されたものと置き換える。 ５． 全遺伝子セグメントが置き換えられるまで上記手順を繰り返す。 ６． 新規な遺伝子配列を、これらのコドン置換により生成した望ましくない 配列（例えば、「ＡＴＴＴＡ」配列、不注意によるイントロンスプライス認識部 位の形成、不要な制限酵素部位など）について調べ、これらの配列を排除するコ ドンと置き換える。 ７． 合成遺伝子セグメントを集め、発現の改良についてテストする。 これらの方法を用い、ＨＩＶｅｎｖを得るための、全体が発現に最適なコドン 利用からなる遺伝子を形成する以下の合成遺伝子セグメントを形成した：（ｉ） ｇｐ１２０−Ｃ１（ｏｐｔ）；（ii）Ｖ１−Ｖ５（ｏｐｔ）；（iii）ＲＲＥ− Ａ／Ｂ（ｍｕｔ又はｏｐｔ）；及び（iv）ｇｐ３０（ｏｐｔ）。各セ グメントに関し、それぞれ５６／１９、７３／２６、７８／２８及び６１／２５ のコドン置換／ヌクレオチド置換率を得た。これらのセグメントはそれぞれ、以 下にリストした実際の配列と共に上記に詳細に記載されている。 ｇｐ１２０−Ｃ１（ｏｐｔ） これは、発現に最適なコドン利用を有するように設計された、成熟Ｎ末端から Ｖ１の始めまでのｇｐ１２０不変領域１（Ｃ１）遺伝子セグメントである。 ＭＮ ｖ１−Ｖ５（ｏｐｔ） これは、発現に最適なコドン利用を有するＨＩＶ ＭＮ Ｖ１−Ｖ５誘導タン パク質配列（１０６６ｂｐ）に対応する遺伝子セグメントである。 ＲＲＥ.Ｍｕｔ（Ａ） これは、発現に最適なコドン利用からなるＨＩＶ−１のｒｅｖ応答成分（ＲＲ Ｅ）に対応するＤＮＡセグメントである。「Ａ」形態も、太字で示されているヌ クレオチドを用いてｇｐ１２０／ｇｐ４１接合部の既知タンパク質分解性切断部 位を除去してある。 ＲＲＥ.Ｍｕｔ（Ｂ） これは、発現に最適なコドン利用からなるＨＩＶ−１のｒｅｖ応答成分（ＲＲ Ｅ）に対応するＤＮＡセグメントである。「Ｂ」形態はｇｐ１２０／ｇｐ４１接 合部に既知タンパク質分解性切断部位を保持している。 ｇｐ３２（ｏｐｔ） これは、（ＲＲＥの末端のすぐ後で始まる）ＡｖｒII部位から発現に最適なコ ドンからなるｇｐ１４３の末端までのｇｐ３２遺伝子セグメントである。 ＳＲＶ−１ ＣＴＥ（Ａ） これは、Ｓｉｍｉａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−１ゲノム由来の３’−ＵＴＲ に対応する合成遺伝子セグメントである。このＤＮＡを以下の配向でＨＩＶ遺伝 子の３’末端に挿入して、ｒｅｖ依存性発現を増大させる。 ＳＲＶ−１ ＣＴＥ（Ｂ） この合成遺伝子セグメントは、単一のヌクレオチド変異（太字で示されている ）を用いてＡＴＴＴＡ配列を除去したこと以外は、上記に示されているＳＲＶ− １ ＣＴＥ（Ａ）と同一である。この配列はｍＲＮＡの回転の増大に関与してい る。 実施例１１ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｐ１２０ワクチンの発現 ： これらの構築物に関し、トランスフェクトされたヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞 でｉｎ ｖｉｔｒｏ発現をテストした。トランスフェクトされたＲＤ細胞由来の 分泌型ｔＰＡ−ｇｐ１２０の定量により、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０ベク ターが分 泌型ｇｐ１２０を産生することが示された。ｉｎ ｖｉｖｏｇｐ１２０予防接種 図１２（マウスデータ）参照： Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０_MNＰＮＶ誘発クラスIIＭＨＣ拘束Ｔ リンパ球ｇｐ１２０特異抗原の反応性 ２００μｇのＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０_MNを用いて２回予防接種してお いたＢａｌｂ／ｃマウスを殺し、組換えｇｐ１２０に対するヘルパーＴリンパ球 の反応性をｉｎ ｖｉｔｒｏ定量するために該マウスの脾臓を抽出した。ＰＢＭ Ｃ（末梢血単核細胞）に関し、４×１０⁵細胞／ｍｌに対して組換えｇｐ１２０_{I IIB} （Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，カタログ＃ＲＰ１０１６−２０）を５μｇ／ｍｌで用 いてＴ細胞増殖アッセイを行った。これらの細胞を培地のみで培養して、該細胞 による³Ｈ−チミジン取り込みの基準レベルを得、２μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ刺激 を用いて最大増殖を誘発した。ＣｏｎＡ誘発反応性は〜３日目にピークに達し、 その時点で培地対照試料と共に収穫し、抗原処理試料は５日目に追加の培地対照 と共に収穫した。予防接種を受けたマウスの応答を予防接種を受けていない同年 令の同系マウスと比較した。ＣｏｎＡ陽性対照は予想通り予防接種を受 けていないマウスにも免疫感作したマウスにも極めて高い増殖を与えた。予防接 種したマウスをｇｐ１２０処理して極めて強力なヘルパーＴ細胞記憶応答を得た が、子防接種をしなかったマウスは応答しなかった〔比反応性のしきい値は＞３ 〜４の刺激指数（ＳＩ）である；ＳＩは試料ｃｐｍ／培地ｃｐｍ比として計算す る〕。予防接種したマウスでは、該マウスのそれぞれ５，６４３及び１１，９０ ０の抗ｇｐ１２０ＥＬＩＳＡタイターに対応する６５及び１４のＳＩを得た。興 味深いことには、これら２匹のマウスの場合、抗体に対する応答が高いマウスの 方が、抗体価が低いマウスより著しく低いＴ細胞反応性を示した。この実験は、 分泌型ｇｐ１２０ベクターがｉｎ ｖｉｖｏで効率的にヘルパーＴ細胞を活性化 すると同時に強力な抗体応答を生起することを証明している。さらに、これらの 免疫応答はいずれも、ＰＮＶの接種によりコードされるものに対して異種である 抗原（IIIＢ対ＭＮ）を用いて定量した。 実施例１２ ｇｐ１６０ワクチン ： 本発明者は、分泌型ｇｐ１２０構築物の他に、全長の膜結合ｇｐ１６０を発現 させる構築物を作製した。ｇｐ１２０に加え てｇｐ１６０構築物を作製した理論的根拠は、（１）より多くのエピトープが、 ＣＴＬ刺激にも、強力なＨＩＶ中和モノクローナル抗体（２Ｆ５、上記参照）を 誘導する、ｇｐ４１を含めた中和抗体の産生にも利用し得ること；（２）ウイル ス産生ｇｐ１６０に関してより天然に近いタンパク質構造が得られること；及び （３）免疫原性を得るための膜結合インフルエンザＨＡ構築物が成功したこと〔 Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９，１９９３；Ｄ． Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２：７７ ７−７８３，１９９３〕である。ｇｐ１６０は、異種リーダーペプチド配列を用 いた場合でも、実質的なＲＥＶ依存性を保持するので、ＲＥＶ不在下に発現を増 大させるべく他の構築物を作製した。 実施例１３ ＨＩＶ細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ ： この項に記載の方法は、予防接種したマウスに用いたアッセイを示している。 実質的に類似のアッセイを霊長類にも用い得るが、但し、各動物に対する標的細 胞として用いるには自己由来のＢ細胞系を確立しなければならない。これは、ヒ トの場合 にはＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスを用い、アカゲザルの場合にはＢ型ヘル ペスウイルスを用いて達成し得る。 新たに抽出した血液又は脾臓から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取し、Ｆｉ ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離を用いて赤血球と白血球を分離した。マウス の場合には、リンパ節を用いてもよい。エフェクターＣＴＬは、ＰＢＭＣからＩ Ｌ−２（２０Ｕ／ｍ）及びコンカナバリンＡ（２μｇ／ｍｌ）中で６〜１２０日 間ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養するか、又は同数の放射線照射抗原提示細胞を用いた特 異抗原を用いることにより作製し得る。特異抗原は、用いられる動物のＭＨＣハ プロタイプに対する既知ＣＴＬ認識エピトープである合成ペプチド（通常９〜１ ５アミノ酸）か、又は適切な抗原を発現するように工学的に合成されたワクシニ アウイルス構築物から構成し得る。標的細胞は、ＣＴＬのｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激 について記載したような適切な抗原を提示するように処理された同系又はＭＨＣ ハプロタイプ適合細胞系であってよい。Ｂａｌｂ／ｃマウスの場合、Ｐ１８ペプ チド（ＡｒｇＩｌｅＨｉｓＩｌｅＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒｇＡｌａＰｈｅＴｙｒ ＴｈｒＴｈｒＬｙｓＡｓｎ（配列番号５１：ＨＩＶ ＭＮ株用）を１０μＭの濃 度で用い、放射 線照射同系脾細胞を用いて、ＣＴＬをｉｎ ｖｉｔｒｏで再刺激し得る。該ペプ チドは、細胞傷害性アッセイにおいては、１〜１０μＭの濃度で、アッセイの約 ２時間前に３７℃でインキュベーションすることにより標的細胞の感作に用いる ことができる。これらのＨ−２^dＭＨＣハプロタイプマウスの場合、ネズミの肥 満細胞腫細胞系（Ｐ８１５）は良好な標的細胞を提供する。抗原感作標的細胞は 、ＣＴＬで殺し、標的を３７℃で１〜２時間インキュベート（〜５×１０⁶細胞 に対し０．２ｍＣｉ）し、その後で標的細胞を数回洗浄すると標的細胞の内部か ら放出されるＮａ⁵¹ＣｒＯ₄を積み込んでいる。ＣＴＬ集団を、１００：１、５ ０：１、２５：１などの変動エフェクター：標的比で標的細胞と混合し、一緒に ペレット化し、３７℃で４〜６時間インキュベートしてから、上清を収穫し、次 いで、ガンマ計数管を用い、上清を放射能の放出についてアッセイする。細胞傷 害性は、標的細胞からの自発性放出を差し引いた（０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１ ００処理を用いて得た）標的細胞からの総放出可能カウントの百分率として計算 する。実施例１４ ＨＩＶ特異抗体アッセイ ： 基質抗原として特異的組換えタンパク質又は合成ペプチドを用い、ＨＩＶに対 して産生される抗体を検出するようにＥＬＩＳＡを設計した。９６ウエルマイク ロタイタープレートを、４℃で一晩、揺動プラットフォーム上５０μ／ウエルで 用いるＰＢＳ（リン酸緩衝生理的食塩水）溶液中２μｇの組換え抗原でコートし た。抗原は、組換えタンパク質（ｇｐ１２０、ｒｅｖ：Ｒｅｐｌｉｇｅｎ Ｃｏ ｒｐ．；ｇｐ１６０、ｇｐ４１：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）又は合成ペプチド（IIIＢなど由来のウイルス分離体配列 に対応するＶ３ペプチド：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ， Ｉｎｃ．；モノクローナル抗体２Ｆ５のｇｐ４１エピトープ）から構成し た。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回、次い で２００μｌ／ウエルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ− ２０中１％Ｃａｒｎａｔｉｏｎ無糖練乳液）を加えて１時間室温で揺動下にリン スした。免疫前血清及び免疫血清をブロッキング緩衝液に所望の稀釈度範囲で稀 釈し、１ウエルに付き１００μｌを加えた。プレートを室温で１時間揺動下にイ ンキュベートし、次いで、洗浄緩衝液で４回洗浄した。次いで、 各試料に、ブロッキング緩衝液に１：２，０００稀釈した西洋ワサビペルオキシ ダーゼと結合した二次抗体（抗アカゲザルＩｇ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ；抗マウス及び抗ウサギＩｇ、Ｊａｃｋ ｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅｒａｃｈ）を１００μｌ／ウエルで加え、室温 で１時間揺動下にインキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、次 いで、ｐＨ４．５の１００ｍＭクエン酸緩衝液中１ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレン ジアミン（ｏ−ＰＤ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）溶液１００μｌ／ウエルを加えて 展開させた。動力学的に（反応の最初の１０分問）及び１０分及び３０分の終末 点で４５０ｎｍでの吸光度についてプレートの読み取り（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘマ イクロプレート読み取り機、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖiｃｅｓ）を行った。実施例１５ ＨＩＶ中和抗体アッセイ ： 予防接種した動物由来の血清を用い、以下のように、ＨＩＶ分離体のｉｎ ｖ ｉｔｒｏ 中和アッセイを行った。テスト血清と免疫前血清を５６℃で６０分間熱 失活させてから用いた。滴定量のＨＩＶ−１を１：２系列稀釈のテスト血清に加 え、室温 で６０分間インキュベートしてから、９６ウエルマイクロタイタープレート中の １０⁵ＭＴ−４ヒトリンパ球に加えた。ウイルス／細胞混合物を３７℃で７日間 インキュベートし、テトラゾリウム染料で培養株を染色して細胞のウイルス媒介 性死滅化についてアッセイした。ウイルスの中和はウイルス媒介性細胞死の阻止 により認められる。 実施例１６ 臨床ＨＩＶ分離体由来の遺伝子の分離 ： ＣｏｎＡ処理により活性化された感染ＰＢＭＣからＨＩＶウイルス遺伝子をク ローン化した。該ウイルス遺伝子を得るための好ましい方法は、所望の遺伝子を フランキングする特異的オリゴマーを用いて感染細胞のゲノムからＰＣＲ増幅す る方法であった。ウイルス遺伝子を得るための第２の方法は、感染細胞の上清か らウイルスＲＮＡを精製し、該物質からｃＤＮＡを作製し、次いでＰＣＲを行う 方法であった。この方法は、ネズミＢ７遺伝子のクローン化について上述した方 法に極めて類似した方法であるが、但し、ＰＣＲオリゴマーを用い、ｃＤＮＡの 作製には特異的プライミングオリゴマーよりむしろランダムヘキサマーを用いた 。 感染細胞のペレットをＳＴＥ溶液（１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ 、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解してケノムＤＮＡを精製し 、これに、タンパク質分解酵素Ｋ及びＳＤＳをそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌ及び０ ．５％の最終濃度まで加えた。この混合物を５６℃で一晩インキュベートし、０ ．５容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１ ）で抽出した。次いで、０．３Ｍの最終濃度までの酢酸ナトリウム及び２容量の 冷エタノールを加えて水性相を沈降させた。溶液からＤＮＡをペレット化した後 、該ＤＮＡを０．１×ＴＥ溶液（１×ＴＥ＝１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。次いで、０．１％までのＳＤＳと、 ２ＵのリボヌクレアーゼＡを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。この 溶液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、次いで、上 記のようにエタノールで沈降させた。ＤＮＡを０．１×ＴＥに懸濁し、その２６ ０ｎｍでの紫外線吸光度を測定して定量した。試料をＰＣＲに使用するまで−２ ０℃で貯蔵した。 Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓキットを用い、以下のセンス及びアン チセンスオリゴマー：５’−ＧＡ ＡＡＧ ＡＧＣ ＡＧＡ ＡＧＡ ＣＡＧ ＴＧＧ ＣＡＡ ＴＧＡ−３’及び５’−Ｇ ＧＧ ＣＴＴ ＴＧＣ ＴＡＡ ＡＴＧ ＧＧＴ ＧＧＣ ＡＡＧ ＴＧＧ Ｃ ＣＣ ＧＧＧ Ｃ ＡＴＧ ＴＧＧ−３’を用いてｇｐ１６０を得るためのＰＣ Ｒを実施した。これらのオリゴマーにより得られたＤＮＡフラグメントの３’末 端にＳｒｆＩ部位が加えられる。ＰＣＲ誘導セグメントをＶ１Ｊｎｓ又はＶ１Ｒ 予防接種ベクター中にクローン化し、Ｖ３領域及び連結接合部位をＤＮＡ配列決 定により確認する。 実施例１７ Ｔ細胞増殖アッセイ ： ＰＢＭＣを得、ＰＢＭＣ集団内での増殖により定量される特異抗原に対する記 憶応答についてテストする。収穫前の最後の１８〜２４時間のインキュベーシヨ ンの間に細胞培養株に³Ｈ−チミジンを加えて増殖をモニターする。細胞収穫装 置は、増殖が起こった場合にはフィルター上に同位元素含有ＤＮＡを保持するが 、静止細胞は遊離形態でフィルター上に保持されない同位元素を取り込まない。 げっ歯類又は霊長類の場合、合計２００μｌの完全培地（ＲＰＭＩ／１０％ウシ 胎児血清）中の９６ウエルマイクロタイタープレートに４×１０⁵個の細胞を平 板培養する。ＰＢＭＣ及び培地のみを用いてバックグラウンド増殖応答を定量し 、非特異的応答は、陽性対照として働く植物性血球凝集素又はコンカナバリンＡ （ＣｏｎＡ）などのレクチンを１〜５μｇ／ｍｌの濃度で用いて生起させる。特 異抗原は既知ペプチドエピトープ、精製タンパク質又は不活化ウイルスから構成 する。抗原濃度は、ペプチドの場合は１〜１０μＭ、タンパク質の場合は１〜１ ０μｇ／ｍｌである。レクチン誘発性増殖は細胞培養株のインキュベーション３ 〜５日目にピークに達するが、抗原特異応答は５〜７日目にピークに達する。特 異的増殖は、培地バックグラウンドの少なくとも３倍である放射線カウントが得 られたときに起こり、しばしばバックグラウンドに対する比又は刺激指数（ＳＩ ）として示される。ＨＩＶｇｐ１６０が、ｇｐ１６０／ｇｐ１２０免疫感作又は ＨＩＶ感染個体にＴ細胞増殖を起こさせることが知られている数種のペプチドを 含むことは公知である。これらのうち最も一般的に用いられているのは：Ｔ１（ ＬｙｓＧｌｎＩｌｅＩ１ｅＡｓｎＭｅｔＴｒｐＧｌｎＧｌｕＶａｌＧｌｙＬｙｓ ＡｌａＭｅｔＴｙｒＡｌａ；Ｔ２（ＨｉｓＧｌｕＡｓｐＩｌｅＩｌｅＳｅｒＬｅ ｕＴｒｐＡｓｐＧｌｎＳｅｒＬｅｕＬｙｓ）；及びＴＨ４（Ａ ｓｐＡｒｇＶａｌＩｌｅＧｌｕＶａｌＶａｌＧｌｎＧｌｙＡａｌＴｙｒＡｒｇＡ ｌａＩｌｅＡｒｇ）である。これらのペプチドは、抗原感作マウス、非ヒト霊長 類及びヒト由来のＰＢＭＣの増殖を刺激することが証明されている。 実施例１８ ベクターＶ１Ｒの作製 ： 本発明の基本的な予防接種ベクターを最適化しようとの継続的な試みにおいて 、本発明者はＶＩＲと称されるＶ１Ｊｎｓの誘導体を作製した。このベクター構 築の目的は、最小サイズのワクチンベクター、即ち、全最適化異種遺伝子発現特 性及びＶ１ｊ及びＶ１Ｊｎｓを生成する高プラスミド収率は保持するが、不必要 なＤＮＡを含まないワクチンベクターを得ることであった。本発明者は、文献か ら又は実験により、（１）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起源を含むｐＵＣバックボーン内の 領域を細菌からプラスミド収率に影響を与えずに除去し得ること；（２）カナマ イシン読み取りフレーム後のｋａｎ^r遺伝子の３’末端領域は、その代わりに細 菌ターミネーターを挿入すれば除去し得ること；及び（３）３’末端側からＢＧ Ｈターミネーターの半分の（ＢＧＨ成分内の初期ＫｐｎＩ制限酵素部位の後の） 〜３００ ｂｐをその調節機能に影響を与えずに除去し得ることを決定した。 ＰＣＲを用い、それぞれ、ＣＭＶｉｎｔＡプロモーター／ＢＧＨターミネータ ー、複製起源及びカナマイシン耐性成分を構成するＶ１Ｊｎｓ由来のＤＮＡの３ つのセグメントを合成してＶ１Ｒを構築した。ＰＣＲオリゴマー：ＣＭＶｉｎｔ Ａ／ＢＧＨの場合にはＳｓｐＩ及びＸｈｏＩ；ｋａｎ^r遺伝子の場合にはＥｃｏ ＲＶ及びＢａｍＨＩ；及びｏｒｉ^rの場合にはＢｃｌＩ及びＳａｌＩを用いて、 各セグメントに特異的な制限酵素を各セグメントの末端に加えた。これらの酵素 部位を選択した理由は、該酵素が各ＰＣＲ誘導ＤＮＡセグメントの誘導性連結反 応とその後の各部位の欠損を可能にするからである。ＥｃｏＲＶとＳｓｐＩは連 結に適合する平滑末端ＤＮＡを生成し、ＢａｍＨＩとＢｃｌＩはＳａｌＩやＸｈ ｏＩのように相補的オーバーハングを生成する。ＰＣＲによりこれらのセグメン トを得た後、各セグメントを上述のような適切な制限酵素で消化し、次いで３つ のＤＮＡセグメント全てを含む単一の反応混合物として連結した。ｏｒｉ^rの５ ’末端は、カナマイシン耐性遺伝子に関する終結情報を提供し得るように、該領 域に通常認められ るＴ２ ｒｈｏ依存性ターミネーター配列を含むように設計した。連結生成物を 、制限酵素消化（＞８酵素）及び連結接合部のＤＮＡ配列決定により確認した。 Ｖ１Ｒ内のウイルス遺伝子を用いたＤＮＡプラスミド収率及び異種発現は、Ｖ１ Ｊｎｓと類似のようである。達成されたベクターサイズの正味の減少は１，３４ ６ｂｐ（Ｖ１Ｊｎｓ＝４．８６ｋｂ；Ｖ１Ｒ＝３．５２ｋｂ）であった。図１１ の配列番号４５を参照されたい。 Ｖ１Ｒの合成に用いたＰＣＲオリゴマー配列（制限酵素部位には下線が付され ており、配列の後の括弧内で確認される）： 以下のオリゴマーを用いてＶ１Ｒの連結接合部の配列決定を行った： ５’−ＧＡＧ ＣＣＡ ＡＴＡ ＴＡＡ ＡＴＧ ＴＡＣ−３’ ［ＣＭＶｉｎｔＡ／ｋａｎ^r接合部］ ５’−ＣＡＡ ＴＡＧ ＣＡＧ ＧＣＡ ＴＧＣ−３’ ［ＢＧＨ／ｏｒｉ接合部］ ５’−Ｇ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＣＡ ＧＡＴ ＴＡＣ−３’ ［ｏｒｉ／ｋａｎ^r接合部］。 実施例１９ ＨＩＶ後期遺伝子産物の異種発現 ： ｅｎｖやｇａｇなどのＨＩＶ構造遺伝子は、効率的に全長タンパク質を発現さ せるためには、ＨＩＶ調節遺伝子、ｒｅｖの発現を必要とする。本発明者は、ｇ ａｇのｒｅｖ依存性発現により、低レベルのタンパク質が生成し、且つｒｅｖ自 体が細胞に対して毒性であり得ることを知見した。本発明者はｇｐ１６０の比較 的高レベルのｒｅｖ依存性発現をｉｎ ｖｉｔｒｏで達成したが、このワクチン は、ｉｎ ｖｉｖｏでｒｅｖ／ｇｐ１６０ＤＮＡで感作した後ではｇｐ１６０に 対し低レベルの抗体しか誘発しなかった。これは、ｒｅｖの既知細胞障害作用や 、 数百の核を含む筋細管においてｒｅｖ機能を得ることが極めて困難である（ｒｅ ｖタンパク質はｇａｇ又はｅｎｖタンパク質発現を生起させるためにはｒｅｖ依 Yj性転写産物と同じ核内に存在しなければならない）ことに起因し得る。しかし 、ｅｎｖ遺伝子を選択的に改変することによりｒｅｖ（衣存性発現を得ることは 可能であった。 １． ｅｎｖのｒｅｖ依存性発現： 一般に、本発明のワクチンは、発現を最適化するために本発明の全身性予防接 種ベクター、Ｖ１Ｊｎｓ内に一次ＨＩＶ（IIIＢ）ｅｎｖ及びｇａｇ遺伝子を用 いた。Ｖ１Ｊｎｓは、ＣＭＶタンパク質合成前（ＩＥ）プロモーター、ＢＧＨ誘 導ポリアデニル化及び転写終結配列及びｐＵＣバックボーンからなる。用いられ る遺伝子セグメントの大きさ（例えば、ｇｐ１２０対ｇｐ１６０）に応じて異な るｒｅｖ依存性発現の効率は、ｅｎｖの場合、その天然の分泌型リーダーペプチ ドを組織特異プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）遺伝子由来のものと置 き換え、得られたキメラ遺伝子を、ＣＭＶイントロンＡを含むＣＭＶＩＥプロモ ーターの後で発現させることにより達成し得る。ｔＰＡ−ｇｐ１２０はこの方法 で構築された分泌型ｇｐ１２０ ベクターの例であり、該ベクターは、予防接種したマウスやサルで抗ｇｐ１２０ 免疫応答を誘発させるに十分な機能を果たす。 膜結合タンパク質が分泌型タンパク質よりもはるかに実質的な（且つ恐らくＨ ＩＶ中和に対してより特異的な）抗体応答を誘発し得るとの論文の存在や、追加 のエピトープを得るために、本発明者はＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０及びＶ １Ｊｎｓ−ｒｅｖ／ｇｐ１６０を作製した。ｔＰＡ−ｇｐ１６０ベクターは、ト ランスフェクトされた細胞のイムノブロット分析により示されるように、ｒｅｖ を加えなくても検出可能な量のｇｐ１６０及びｇｐ１２０を産生したが、その発 現レベルは、ｒｅｖ依存性ｇｐ１６０発現プラスミドであるｒｅｖ／ｇｐ１６０ を用いて得られたレベルよりはるかに低かった。これは、恐らく、ｇｐ１６０転 写産物にｒｅｖ依存性を付与する阻害性領域がｇｐ４１のＣＯＯＨ末端における ものを含むｇｐ１６０内の多重部位で生じるためである。ＣＯＯＨ末端がトラン ケイト形態のｔＰＡ−ｇｐ１６０（ｔＰＡ−ｇｐ１４３）を得るためのベクター を作製した。該ベクターは、これらの阻害性領域を排除することによりｅｎｖの 全発現レベルを増大させるように設計した。ｇｐ１４３ベクターも、膜タンパク 質の転換を細胞表面よ りもリソソームに対して起こすことが知られているペプチドモチーフ（例えばＬ ｅｕ−Ｌｅｕ）を含む細胞内ｇｐ４１領域が排除されている。例えば、ｇｐ１４ ３は、（ｒｅｖ依存性を低減させることによる）ｅｎｖタンパク質の発現レベル を増大させること、及び全長のｇｐ１６０に比べて、ＤＮＡ子防接種後にこれら のタンパク質が抗ｇｐ１６０抗体をより良好に誘発し得る細胞表面へのタンパク 質の輸送効率をより高めることが期待され得る。広域サイレント突然変異により 、ｔＰＡ−ｇｐｌ４３をさらに改変して、ｒｅｖ応答成分（ＲＲＥ）配列（３５ ０ｂｐ）のさらなる阻害性配列の発現を排除した。この構築物、ｇｐ１４３／ｍ ｕｔＲＲＥは、２つの形態：ｇｐ１２０／４１のタンパク質分解性切断部位を排 除した形態（Ａ形態）と該部位を保持した形態（Ｂ形態）で作製した。２つの形 態を作製した理由は、ワクシニアで発現させた切断不能なｇｐ１６０を用いてマ ウスに予防接種すると、切断可能な形態を用いた場合よりｇｐ１６０に対しては るかに高レベルの抗体が誘発されたという文献論文があったからである。 トランスフェクトされた細胞におけるｇｐ１６０／ｇｐ１２０発現に関する定 量的ＥＬＩＳＡを展開して、これらのベクタ ーの相対発現能力を定量した。２９３個の細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフ エクトし、次いで細胞結合型ｇｐ１２０と分泌／放出型ｇｐ１２０の定量を行っ て以下の結果を得た： （１）ｔＰＡ−ｇｐ１６０はｒｅｖ／ｇｐ１６０より５〜１０倍少ないｇｐ１２ ０を発現し、細胞内に保持されたものと細胞表面から放出されたものは同じ割合 であった；（２）ｔｐＡ−ｇｐ１４３はｒｅｖ／ｇｐ１６０より３〜６倍多いｇ ｐ１２０を分泌し、細胞結合型ｇｐ１４３は極く低レベルでしかなかった。これ は、ｇｐ１６０の細胞質テールが該配列を部分的に欠失させることにより克服し 得るｇｐ１６０の細胞内保持を生起させたことを証明するものである；さらに（ ３）ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥ Ａ及びＢは親ｔＰＡ−ｇｐ１４３より も１０倍以上高い発現レベルでタンパク質を産生したが、Ａ形態では、タンパク 質分解プロセシングが排除されていることが確認された。 このように、ｒｅｖ依存性発現を増大させる本発明の方法により、全発現レベ ルの段階的増大及び膜結合ｇｐ１４３のリソソームではなく細胞表面への再誘導 が生じた。これは、種々の初代ウイルス分離体由来のｇｐ１２０配列を、種々の ウイルス 株間で抗原性の違いが少ないＮＨ₂末端（ｔｐＡリーダー）又はＣＯＯＨ末端（ ｇｐ４１）に所在するこれらの改変を含むベクターカセット内に挿入し得ると考 えられる遺伝子構築物であることに留意することが重要である。 ２． 臨床分離体由来のｇｐ１２０の発現： これらの発現法を、ワクチン用として関連するウイルスに適用し、本発明の方 法の一般性を確認するために、本発明者はさらに、（北アメリカ共通Ｖ３ペプチ ドループ；マクロファージ性及び非シンシチア誘発性表現型を含む）初代ＨＩＶ 分離体由来のｔＰＡ−ｇｐ１２０ベクターを作製した。このベクターは、トラン スフェクトされた２９３個の細胞から高発現／分泌率でｇｐ１２０を得、且つマ ウスでは抗ｇｐ１２０抗体が誘発されたが、これは、該ベクターが機能性形態で クローン化されたことを証明している。初代分離体ｇｐ１６０遺伝子も、実験室 株由来のｇｐ１６０の場合と同じ方法で発現に用い得る。 Ｂ． ＨＩＶ−１ｅｎｖポリヌクレオチドワクチンに対する免疫応答 マウスにおける免疫応答に及ぼす予防接種経路の作用：ｇｐ１６０の発現を改 良する努力を続けている際に、本発明者は、 免疫応答及び免疫応答を高める方法の評価にｔＰＡ−ｇｐ１２０ ＤＮＡ構築物 を用いた。このベクターに関し、マウスにおける１００，１０及び１μｇ用量の 筋肉内（ｉ．ｍ．）及び皮内（ｉ．ｄ．）予防接種経路を比較した。どちらの経 路を介した予防接種も、全３種の用量レベルで２〜３回予防接種した後で、全て のマウスに抗体応答を誘発した。各経路は、明瞭な用量依存性応答を伴う類似の 抗ｇｐ１２０抗体価を誘発した。しかし、ｉ．ｄ．予防接種、特に最初の接種後 の低用量でのｉ．ｄ．接種に対して極めて変異性の応答が認められた。さらに、 抗原特異的ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖及びサイトカイン分泌により測定される、ヘル パーＴ細胞応答は、ｉ．ｄ．予防接種後よりもｉ．ｍ．予防接種後に高かった。 本発明者は、このワクチンの場合、ｉ．ｄ．予防接種はｉ．ｍ．に比べて利点が ないとの結論に達した。 ２． マウスにおけるｇｐ１２０ＤＮＡワクチン媒介性ヘルパーＴ細胞免疫： ｇｐ１２０ＤＮＡ予防接種は、テストした全てのリンパ系コンパートメント（ 脾臓、血液、鼡径部、腸間膜及び腸骨節）において、ＴH１様サイトカイン分泌 プロフィール（即ち、ｇ− インターフェロン及びＩＬ−２は産生するが、ＩＬ−４は殆ど又は全く産生しな い）を伴う強力なヘルパーＴ細胞応答を生起した。一般にこれらのサイトカイン は強力な細胞性免疫を促進し、且つＨＩＶ血清反応陽性患者の無病状態の維持に 関与している。リンパ節は、ウイルスが血液中に容易に検出し得ないときでさえ 大量のウイルスを保有している一次ＨＩＶ複製部位であることが示された。本発 明のＤＮＡワクチンを用いて示したように、種々のリンパ部位で抗ＨＩＶ免疫応 答を誘発し得るワクチンは初感染後のリンパ系のコロニー化を阻止する助けとな り得る。 ３． ｅｎｖＤＮＡワクチン媒介性抗体応答： ｇｐ１２０ＤＮＡワクチンの接種を受けたサバンナモンキー（ＡＧＭ）及びア カゲザル（ＲＨＭ）は、２〜３回の予防接種後に低レベルの中和抗体を示したが 、該抗体レベルは追加の予防接種を行っても増大させることができなかった。こ れらの結果や、ＨＩＶワクチン分野において、中和抗体の誘発には恐らくオリゴ マーｇｐ１６０がｇｐ１２０モノマーより関連性の高い標的抗原であろうという 見解がますます広まっていることから、本発明者は、ｇｐ１６０ベースのベクタ ー（上記参照）の 効率的な発現を得ることに集中した。マウス及びＡＧＭには、初代分離体由来の ｔＰＡ−ｇｐ１２０ワクチンを用いた予防接種も行った。これらの動物は、５０ ０〜５，０００の範囲の（同種配列を用いた）抗Ｖ３ペプチド逆数終末点抗体価 を示したが、これは、このワクチンの設計が臨床的に関連したウイルス分離体に 対して機能性であることを示している。 ｇｐ１６０ベースのワクチン、ｒｅｖ−ｇｐ１６０及びｔＰＡ−ｇｐ１６０は 、マウスや非ヒト霊長類では持続的に抗体応答を誘発し得ないか、又は低抗体価 しか生成しなかった。ｔＰＡ−ｇｐ１４３プラスミドを用いた本発明者の初期の 結果は、マウス及びＡＧＭでは２回の予防接種後に＞１０³の相乗平均力価（Ｇ ＭＴ）を生成した。これらのデータは、本発明者が発現レベルの増大及びｅｎｖ の細胞表面へのより効率的な細胞内交通により、ｇｐ１６０様ワクチンの免疫原 性を著しく高めたことを示している。この構築物並びにｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍ ｕｔＲＲＥ Ａ及びＢの抗体応答、特にウイルス中和に関して特性決定を続ける 。 ４． サルにおけるｅｎｖＤＮＡ媒介性ＣＴＬ応答： 本発明者は、ｇｐ１２０及びｇｐ１６０／ＩＲＥＳ／ｒｅｖ ＤＮＡを用いて予防接種したＲＨＭのＣＴＬ応答の特性決定を続けた。このワク チンを受容した４匹のサルは全て、２回の予防接種後に優位なＭＨＣクラスＩ拘 束性ＣＴＬ活性（エフェクター／標的における２０〜３５％の特異的死滅率＝２ ０）を示した。４回予防接種を行った後では、これらの活性は、類似のテスト条 件下に５０〜６０％の死滅率に増大したが、これは、追加の予防接種が応答を優 位に刺激したことを示している。該ＣＴＬ活性は、最終予防接種後の少なくとも ７ヵ月間にそのピークレベルの約５０％のＣＴＬ活性を持続したが、これは、長 期記憶が確立されたことを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 デイビス，マリー―エレン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 フリード，ダニエル・シイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 リウ，マーガレツト・エイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ペリイ，ヘレン・シイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＨＩＶｅｎｖタンパク質又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を 含む合成ポリヌクレオチドであって、該ＤＮＡ配列が哺乳動物宿主における発現 に対して最適化されたコドンを含むことを特徴とするポリヌクレオチド。 ２． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ＨＩＶ_MNｇｐ１２０； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ＨＩＶ_IIIBｇｐ１２０； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｍｕｔＲＲＥ−Ａ／ ＳＲＶ−１ ３’−ＵＴＲ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｍｕｔＲＲＥ−Ｂ／ ＳＲＶ−１ ３′−ＵＴＲ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ３０−Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ３０−Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ ａｌｌ− Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ ａｌｌ− Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ ａｌｌ− Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ ａｌｌ− Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｒｅｖ／ｅｎｖ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔ Ｃ１／ｏｐ ｔ４１−Ａ； Ｖ１ＪｎＳ−ｔＰＡ−ｇＰ１６０／ｏｐｔ Ｃ１／ｏｐ ｔ４１−Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔ ａｌｌ− Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔ ａｌｌ− Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔ ａｌｌ− Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔ ａｌｌ− Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥ−Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥ−Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ＳＲＶ−１ ３’− ＵＴＲ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ Ｃ１／ｏｐ ｔ３２−Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ Ｃ１／ｏｐ ｔ３２−Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ− Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ− Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ− Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ− Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ａ／ｇ ｌｙＢ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ｂ／ｇ ｌｙＢ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ ３２−Ａ／ｇｌｙＢ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ ３２−Ｂ／ｇ１ｙＢ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ ／ｇｌｙＢ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ ／ｇｌｙＢ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ ／ｇｌｙＢ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ ／ｇ１ｙＢ； 及びその組み合わせ から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３． ヒト組織を含めた脊椎動物の組織中にｉｎ ｖｉｖｏ導 入すると、抗ＨＩＶ中和抗体、ＨＩＶ特異Ｔ細胞免疫応答又は感染防御免疫応答 を誘発し、ＨＩＶｇａｇ、ｇａｇプロテアーゼ又はｅｎｖ遺伝子産物をコードす る遺伝子を含むことを特徴とする、詰求項１に記載のポリヌクレオチド。 ４． 詰求項１に記載のポリヌクレオチド１ｎｇ〜１００ｍｇを脊椎動物の組織 中に導入することを含む、脊椎動物においてＨＩＶエピトープに対する免疫応答 を誘発する方法。 ５． 脊椎動物の組織中に請求項１に記載のポリヌクレオチドを導入することを 含む、ＨＩＶのビルレント株により引き起こされる感染又は疾患に対する免疫応 答を誘発させる方法。 ６． 弱毒ＨＩＶ、死滅化ＨＩＶ、ＨＩＶｅｎｖタンパク質、ＨＩＶｇａｇタン パク質、ＨＩＶｐｏｌタンパク質及びその組み合わせの投与をさらに含むことを 特徴とする、請求項５に記載の方法。 ７． 請求項１に記載のポリヌクレオチド及び医薬上許容し得る担体を含む、Ｈ ＩＶ感染に対するワクチン。 ８． 霊長類の組織中に請求項１に記載のポリヌクレオチドを導入し、同時にイ ンターロイキン−１２を非経口投与することを含む、霊長類において抗ＨＩＶ免 疫応答を誘発させる方法。 ９． 脊椎動物の細胞をｉｎ ｖｉｖｏで請求項１に記載のポリヌクレオチドに 露出することを含む、抗原提示細胞に細胞傷害性及びヘルパーＴ細胞の増殖を刺 激して、ＨＩＶ抗原に特異的なリンホカインの分泌を含めたエフェクター機能を 誘発させる方法。 １０． ＨＩＶタンパク質又はそのフラグメントをコードするＤＮＡの発現を増 大させる方法であって、 （ａ） 正しい読み取りフレームに対するコドンの配置を確認するステップ； （ｂ） 観察されたヒト遺伝子による利用頻度に関して野生型コドンを比較す るステップ； （ｃ） 野生型コドンを、ヒト遺伝子を高度に発現するように最適化されたコ ドンで置き換えるステップ；及び （ｄ） 発現の増大についてテストするステップ を含むことを特徴とする前記方法。