SK112998A3 - Synthetic polynucleotide containing dna sequence being coding hiv env protein, a vaccine with its content and its use - Google Patents

Description

Syntetický polynukleotid, obsahujúci DNA sekvenciu, kódujúcu HIV env proteín, vakcína s jeho obsahom a jeho použitie f

Oblasť techniky

Vynález sa týka syntetického polynukleotidu, obsahujúceho DN^ sekvencie kódujúce HIV proteíny, vakcína s jeho obsahom a jeho použitie na indukciu imunitných odpovedí proti HIV epitopom u stavovcov.

Doterajší stav techniky

1. HIV infekcia

Ľudský vírus imunitnej nedostatočnosti typ-1 (HIV-1) je etiologické činidlo syndrómu získanej ľudskej imunitnej nedostatočnosti (AIDS) a súvisiacich ochorení. HIV-1 je RNA vírus zo skupiny retrovírusov a vykazuje 5'l_TR-gag-po/-env-LTR3' organizáciu všetkých retrovírusov. Naviac, HIV-1 obsahuje viaceré gény s regulačnými alebo neznámymi funkciami, vrátane ŕaŕ a rev génov. Gén env kóduje glykoproteín vírusového obalu, ktorý sa transláciou prenáša ako 160-kilodaltonový (kDa) prekurzor (gp160) a potom sa štiepi bunkovou proteázou, aby poskytol vonkajší 120-kDa obalový glykoproteín (gp120) a transmembránový 41-kDa obalový glykoproteín (gp41). Gp120 a gp41 zostanú spojené a prejavujú sa na • vírusových časticiach a povrchu HlV-infikovaných buniek. Gp120 sa viaže na CD4 receptor, prítomný na povrchu pomocných T-lymfocytov, makrofágov a iných cieľových buniek. Po naviazaní gp120 na GD4 gp41 sprostredkuje jav fúzie, zodpovedný za vstup vírusu.

Infekcia sa začína, keď sa gp120 na vírusovej častici naviaže na CD4 receptor na povrchu T4 lymfocytov alebo iných cieľových buniek. Viazaný vírus splynie s cieľovou bunkou a reverzne transkribuje jej RNA genóm do dvojvláknovej

DNA bunky. Vírusová DNA sa včlení do genetického materiálu v bunkovom jadre, kde vírusová DNA riadi tvorbu novej vírusovej RNA, vírusových proteínov a nových

-2vírusových častíc. Nové častice pučia z membrány cieľovej bunky a infikujú iné bunky.

Deštrukcia T4 lymfocytov, ktorá je kritická pre imunitnú ochranu, je hlavnou príčinou progresívnej imunitnej dysfunkcie, ktorá je charakteristickým znakom HIV infekcie. Strata cieľových buniek vážne oslabí schopnosť organizmu bojovať proti väčšine votrelcov, ale má zvlášť ťažký dopad na obranyschopnosť proti vírusom, hubám, parazitom a určitým baktériám, vrátane mykobaktérií.

HIV-1 zabíja bunky, ktoré infikuje replikáciou, uniknutím z nich a poškodením bunkovej membrány. HIV-1 môže zabíjať cieľové bunky nepriamo prostredníctvom vírusového gp120, ktorý sa prejavuje na povrchu infikovanej bunky. Pretože CD4 receptor T-buniek má silnú afinitu ku gp120, zdravé bunky, expresujúce CD4 receptor, môžu viazať gp120 a fúzovať s infikovanými bunkami do syncýcia. Syncýcium nemôže prežiť.

HIV-1 tiež môže vyvolať normálnu bunkovú imunitnú obranu proti infikovaným bunkám. S pomocou alebo bez pomoci protilátok, cytotoxické obranné bunky môžu zničiť infikovanú bunku, ktorá vykazuje na svojom povrchu vírusové proteíny. Nakoniec, voľný gp120 môže cirkulovať v krvi jednotlivcov, infikovaných HIV-1. Voľný proteín sa môže viazať na CD4 receptor neinfikovaných buniek, čím spôsobí, že sa budú javiť ako zdanlivo infikované a vyvolajú imunitnú odpoveď.

Infekcia vírusom HIV-1 je takmer vždy smrteľná a v súčasnosti neexistujú žiadne lieky na HIV-1 infekciu. Účinné vakcíny na prevenciu HIV-1 infekcie ešte nie sú k dispozícii. Kvôli nebezpečenstvu zvratu alebo infekcie živý oslabený vírus pravdepodobne nemožno použiť ako vakcínu. Väčšina prístupov s podjednotkovými vakcínami nebola v prevencii HIV infekcie úspešná. Liečenia HIV-1 infekcie, hoci predlžujú životy niektorých infikovaných osôb, majú vážne vedľajšie účinky. Existuje teda veľká potreba účinnej liečby a vakcín na boj s touto smrteľnou infekciou.

2. Vakcíny

Vakcinácia je účinná forma prevencie chorôb a ukázala sa byť úspešnou proti viacerým typom vírusových infekcií. Určenie spôsobov prezentácie HIV-1

-3antigénov ľudskému imunitnému systému tak, aby sa vyvolala obranná humorálna a bunková imunita, je ťažkou úlohou. Pokusy vytvoriť účinnú HIV vakcínu dodnes neboli úspešné. U AIDS pacientov je voľný vírus prítomný len v nízkych hladinách. Prenos HIV-1 sa zvýši interakciou bunka-s-bunkou ich fúziou a tvorbou syncýcia. Teda protilátky, vytvorené proti voľnému vírusu alebo vírusovým podjednotkám, sú vo všeobecnosti neúčinné pri eliminácii vírusom infikovaných buniek.

Vakcíny využívajú schopnosť organizmu zapamätať si antigén. Po prvom stretnutí s daným antigénom imunitný systém tvorí bunky, ktoré si udržujú * imunologickú pamäť na tento antigén počas života jednotlivca. Ďalšia expozícia antigénu stimuluje imunitnú odpoveď a má za následok elimináciu alebo inaktiváciu patogénu.

Imunitný systém reaguje na patogény dvoma spôsobmi: humorálnou a bunkami sprostredkovanou odpoveďou. Pri humorálnej odpovedi lymfocyty tvoria špecifické protilátky, ktoré sa viažu na antigén, teda inaktivujú patogén. Bunkou sprostredkovaná odpoveď zahrnuje cytotoxické a pomocné T-lymfocyty, ktoré špecificky napádajú a ničia infikované bunky.

Vývoj vakcíny s HIV-1 vírusom prináša problémy, pretože HIV-1 infikuje niektoré z tých istých buniek, ktoré vakcína potrebuje aktivovať v imunitnom systéme (t.j. T4-lymfocyty). Bolo by výhodné vyvinúť vakcínu, ktorá inaktivuje HIV skôr, než dôjde k poškodeniu imunitného systému. Zvlášť vhodný typ HIV vakcíny by vyvolal anti-HIV imunitnú odpoveď, ktorá by rozpoznávala HIV varianty a ktorá by bola účinná u HlV-pozitívnych jedincov na začiatku ich infekcie.

Najväčšou výzvou pre vývoj vakcín proti vírusom, zvlášť tým, ktoré majú vysokú rýchlosť mutácie, ako je vírus ľudskej imunitnej nedostatočnosti, proti ktorým je žiaduce vyvolať neutralizujúce a ochranné imunitné odpovede, je rozmanitosť vírusových obalových proteínov medzi rôznymi vírusovými izolátmi alebo kmeňmi. Pretože cytotoxické T-lymfocyty (CTL) tak u myší, ako aj u ľudí sú schopné rozpoznať epitopy, pochádzajúce zo zachovaných vnútorných vírusových proteínov, a považujú sa za dôležité pri imunitnej odpovedi proti vírusom, doterajšie úsilie bolo namierené na vývoj CTL vakcín, schopných poskytnúť heterológnu ochranu proti rôznym vírusovým kmeňom.

-4Je známe, že CD8⁺ CTL zabíjajú vírusmi infikované bunky, keď ich Tbunkové receptory rozoznávajú vírusové peptidy spojené s MHC molekulami triedy

I. Vírusové peptidy pochádzajú z endogénne syntetizovaných vírusových proteínov, bez ohľadu na lokalizáciu alebo funkciu proteínu vnútri vírusu. Teda rozpoznaním epitopov zo zachovaných vírusových proteínov CTL môžu poskytovať ochranu pred kríženými kmeňmi. Peptidy, schopné spájať sa s MHC molekulami triedy I na CTL rozpoznanie, vznikajú z proteínov, ktoré sú prítomné alebo prechádzajú cez cytoplazmu alebo cez endoplazmatické retikulum. Vo všeobecnosti exogénne proteíny, ktoré vstupujú do cesty endozomálneho spracovania (ako v prípade antigénov, prezentovaných MHC molekulami triedy II), sú neúčinné pri tvorbe CD8+ CTL odpovedí.

Vo väčšine pokusov vytvoriť CTL odpovede sa použili replikujúce vektory na produkciu proteínového antigénu vo vnútri bunky, alebo sa tieto sústredili zavedenie peptidov do cytosólu. Tieto prístupy majú obmedzenia, ktoré môžu znižovať ich využiteľnosť ako vakcín. Retrovírusové vektory majú obmedzenia vo veľkosti a štruktúre polypeptidov, ktoré sa môžu prejaviť ako fúzne proteíny, pričom si udržia schopnosť replikácie rekombinantného vírusu, a účinnosť vektorov, ako sú kiahne, na následné imunizácie, môže byť ohrozená imunitnými odpoveďami proti týmto vektorom samotným. Tiež vírusové vektory a modifikované patogény nesú so sebou im vlastné riziká, čo môže zabrániť ich použitiu u ľudí. Okrem toho výber peptidových epitopov, ktoré sa majú prezentovať, závisí od štruktúry MHC antigénov jednotlivca, a preto peptidové vakcíny môžu mať obmedzenú účinnosť, spôsobenú rozmanitosťou MHC haplotypov u krížených populácií.

3. DNA vakcíny

Benvenisty, N. a Reshef, L. [PNAS 83. 9551 až 9555, 1986] ukázali, že CaCI₂-precipitovaná DNA, zavedená do myší intraperitoneálne (i.p.), intravenózne (i.v.) alebo intramuskulárne (i.m.) sa nemôže expresovať. I.m. injekcia vektorov DNA expresie bez spracovania pomocou CaCI₂ u myší má za následok absorpciu DNA svalovými bunkami a expresiu proteínu, kódovaného DNA. Plazmidy boli udržiavané epizomálne a nereplikovali sa. Následne sa pretrvávajúca expresia

-5pozorovala po i.m. injekcii do kostrového svalu krýs, rýb a primátov, a do srdcového svalu krýs. Spôsob použitia nukleových kyselín ako terapeutických činidiel bol opísaný vo W090/11092 (4. október 1990), v ktorom sa obnažené polynukleotidy použili na vakcináciu stavovcov.

Pre úspech tejto metódy nie je nevyhnutné, aby sa imunizácia vykonala intramuskulárne. Zavedenie zlatých mikroprojektilov, potiahnutých DNA, kódujúcou hovädzí rastový hormón (BGH), do kože myší má za následok produkciu anti-BGH protilátok u myší. Trysková injekcia sa použila na transfekciu kože, svalov, tuku a prsníkového tkaniva živých zvierat. Preskúmali sa rôzne metódy zavádzania jadier. Intravenózna injekcia DNA: Zhu a kol. [Science 261. 209 až 211, 9. júla 1993] ukázali, že katiónový lipozómový komplex u myší vedie k systémovej expresii klonovaného transgénu. Ulmer a kol. [Science 259. 1745 až 1749, 1993] referujú o heterológnej ochrane proti infekcii vírusom chrípky intramuskulárnou injekciou DNA, kódujúcej proteíny vírusu chrípky.

Potrebe špecifických terapeutických a profylaktických činidiel, schopných vyvolať požadované imunitné odpovede proti patogénom a nádorovým antigénom, vyhovuje tento vynález. Zvlášť dôležitou v tomto terapeutickom prístupe je schopnosť indukovať T-bunkové imunitné odpovede, ktoré môžu zabrániť infekciám alebo chorobe, spôsobeným dokonca vírusovými kmeňmi, ktoré sú heterológne s kmeňom, z ktorého sa antigénový gén získal. Zvlášť sa to týka manipulovania s HIV, pretože sa rozpoznalo, že tento vírus rýchlo mutuje a identifikovalo sa mnoho virulentných izolátov [pozri napríklad LaRosa a kol., Science 249, 932 až 935,1990, identifikujúci 245 samostatných HIV izolátov]. V odpovedi na túto rozpoznanú rozmanitosť sa výskumníci pokúsili vytvoriť CTL na základe peptidovej imunizácie. Tak Takahashi a kol. [Science 255, 333 až 336, 1992] opísali indukciu široko krížovo reagujúcich cytotoxických T-buniek, rozpoznávajúcich HIV obalový (gp160) determinant. Avšak tito pracovníci zistli, aké ťažké je dosiahnuť skutočne krížovo reagujúce CTL odpovede, a navrhli, že existuje dichotómia medzi senzibilizáciou alebo restimuláciou T-buniek, ktorá je veľmi prísna, a vyvolanie efektorovej funkcie, vrátane cytotoxicity z už stimulovaných CTL.

-6Wang a kol. opísali vyvolanie imunitných odpovedí u myší proti HIV intramuskulárnym naočkovanim klonovaného genómového (nezostrihaného) HIV génu. Avšak hladina imunitných odpovedí, dosiahnutá v týchto štúdiách, bola veľmi nízka. Naviac, DNA konštrukt Wanga a kol. využíval v podstate genómovú časť HIV, kódujúcu súvislé Tat//?EV-gp160-Tat//?EV kódujúce sekvencie. Ako je podrobne opísané nižšie, toto je suboptimálny systém na dosiahnutie vysokej úrovne expresie gp160. To je tiež potenciálne nebézpečné, pretože expresia Tat prispieva k progresii Kaposiho sarkómu.

WO 93/17706 opisuje metódu vakcinácie zvieraťa proti vírusu, v ktorej častice nosiča boli obalené génovým konštruktom a obalené častice sa zrýchlene dopravovali do buniek zvieraťa. S ohľadom na HIV sa navrhlo, aby sa použil v podstate celý genóm bez dlhých koncových, opakujúcich sa sekvencií. Táto metóda predstavuje podstatné riziká pre príjemcov. Všeobecne sa verí, že konštrukty HIV by mali obsahovať menej než asi 50 % HIV genómu, aby sa zaručila bezpečnosť vakcíny; to zabezpečuje, že enzymatické časti štruktúry a vírusové regulačné protelny, z ktorých mnohé majú neznáme alebo nedostatočne pochopené funkcie, boli vylúčené. Teda mnoho problémov zostáva, keď sa má vytvoriť užitočná ľudská HIV vakcína technológiou dodania génu.

Tento vynález uvažuje o využití ktorejkoľvek zo známych metód na zavedenie polynukleotidov do živého tkaniva na indukovanie expresie proteínov. Avšak tento vynález poskytuje nový imunogén na zavedenie HIV a ďalších proteínov do dráhy spracovania antigénu, aby sa účinne tvorili HlV-špecifické CTL a protilátky. Liečivo je účinné ako vakcína na indukovanie tak bunkových, ako aj humorálnych anti-HIV a HIV neutralizujúcich imunitných odpovedí. V tomto vynáleze sa na vyššie uvedené problémy reaguje a riešia sa poskytnutím polynukleotidových imunogénov, ktoré, keď sa zavedú do zvieraťa, riadia účinnú expresiu HIV proteínov a epitopov bez sprievodných rizík, spojených s týmito metódami. Takto vytvorené imunitné odpovede sú účinné pri rozpoznávaní HIV, pri inhibícii replikácie HIV, pri identifikácii a zabíjaní buniek, infikovaných HIV, a krížovo reagujú proti mnohým HIV kmeňom.

4. Použitie kodónov a kodónový kontext

Párovanie kodónov organizmov je vysoko nenáhodné a líši sa od organizmu k organizmu. Táto informácia sa využíva na konštrukciu a expresiu zmenených alebo syntetických génov, dosahujúcich žiadané úrovne translačnej účinnosti, na určenie oblastí v genóme, ktoré kódujú proteíny, na zavedenie miest prerušenia translácie do heterológnych génov a na zistenie vzťahov alebo predchádzajúceho pôvodu nukleotidových sekvencií.

Expresia cudzích heterológnych génov v transformovaných organizmoch je teraz bežná. Veľký počet cicavčích génov, vrátane napríklad myších a ľudských génov, sa úspešne vložil do jednobunkových organizmov. Štandardné techniky v tomto prípade zahrnujú zavedenie cudzieho génu, ktorý sa má expresovať .do vektora, ako je plazmid alebo fág, a využitie tohto vektora na vloženie génu do organizmu. Natívne promótory pre takéto gény sa bežne nahradia silnými promótormi, kompatibilnými s hostiteľom, do ktorého sa gén vloží. Mechanizmus sekvenovania proteínov umožňuje objasnenie sekvencií aminokyselín dokonca i v nepatrných množstvách natívneho proteínu. Z týchto aminokyselinových sekvencií možno usúdiť, aké sú DNA sekvencie, kódujúce tieto proteíny. Syntéza DNA je tiež rýchlo sa rozvíjajúcou technikou a syntetické gény, zodpovedajúce týmto odvodeným DNA sekvenciám, sa dajú ľahko skonštruovať.

Napriek objavujúcim sa vedomostiam o systémoch expresie a rekombinantnej DNA zostávajú podstatné prekážky pri pokusoch o expresiu cudzieho alebo syntetického génu v organizme. Veľa natívnych aktívnych proteínov sa napríklad glykozyluje spôsobom, odlišným od toho, ktorý nastáva, keď sa expresujú v cudzom hostiteľovi. Z tohto dôvodu sa eukaryotickí hostitelia, ako sú kvasinky, môžu uprednostňovať pred bakteriálnymi hostiteľmi na expresiu mnohých cicavčích génov. Problém glykozylácie je predmetom pokračujúceho výskumu.

Ďalšiemu problému rozumieme ešte menej. Translácia syntetického génu, aj keď je spojený so silným promótorom, často pokračuje menej účinne, ako by sa predpokladalo. To isté často platí pre exogénne gény, ktoré sú cudzie organizmu expresie. Aj keď sa gén transkribuje dostatočne účinným spôsobom tak, že sa

-8vytvoria získateľné množstvá translačných produktov, proteín je často inaktívny, alebo sa svojimi vlastnosťami ináč líši od natívneho proteínu.

Zistilo sa, že posledne uvedený problém je všeobecne spôsobený rozdielmi v zbaľovaní proteínov v rôznych organizmoch. Riešenie tohto problému doteraz unikalo a mechanizmom, kontrolujúcim zbavovanie proteínov, málo rozumieme.

Predpokladá sa, že problémy, týkajúce sa translačnej účinnosti, súvisia s účinkami kodónového kontextu. Proteíny kódujúce oblasti génov vo všetkých organizmoch sú vystavené širokej rozmanitosti funkčných obmedzení, z ktorých niektoré závisia od požiadaviek na kódovanie správne fungujúceho proteínu, ako aj od príslušného translačného štart a stop signálu. Avšak rozpoznali sa viaceré znaky oblastí, kódujúcich proteín, ktoré z hľadiska týchto obmedzení nevieme ľahko pochopiť. Dve dôležité skupiny týchto vlastností sú tie, ktoré zahrnujú použitie kodónu a kodónový kontext.

Je známe, že využitie kodónu je vysoko neurčité a značne sa mení medzi rôznymi organizmami. Ukázalo sa, že schémy použitia kodónu súvisia s relatívnym výskytom tRNA izoakceptorov. Gény, kódujúce proteíny s veľkým verzus malým výskytom, vykazujú rozdiely v preferencii ich kodónov. O možnosti, že neurčitosť vo využití kodónu mení rýchlosti predlžovania peptidu, sa široko diskutovalo. Hoci rozdiely v použití kodónu sú spojené s rozdielmi v rýchlosti translácie, priame účinky výberu kodónu na transláciu bolo ťažké demonštrovať. Iné navrhnuté obmedzenia v schémach použitia kodónu zahrnujú maximalizáciu presnosti translácie a optimalizáciu kinetickej účinnosti proteínovej syntézy.

Okrem nenáhodného použitia kodónov sa nazhromaždilo značné množstvo dôkazov, že rozpoznanie kodónu/antikodónu je ovplyvnené sekvenciami mimo samotného kodónu, jav, ktorý sa nazýva kodónový kontext. Existuje silný vplyv priľahlých nukloeotidov na účinnosť potlačenia nesmerových kodónov, ako aj kodónov s nesprávnym smerom. Samozrejme, dostatočná supresorová aktivita v prírodných populáciách baktérií, ako aj použitie terminačných kodónov na kódovanie selenocysteínu a fosfoserínu vyžaduje, aby zakončenie bolo závislé od kontextu. Ukázalo sa, že podobné kontextové účinky ovplyvňujú presnosť translácie, ako aj účinnosť iniciácie translácie.

-9Štatistické analýzy oblastí E. coli, kódujúcich proteín, demonštrovali ďalší prejav kodónového kontextu. Prítomnosť konkrétneho kodónu v jednej polohe silne ovplyvňuje frekvenciu výskytu určitých nukleotidov v susediacich kodónoch a tieto kontextové obmedzenia sa výrazne líšia pre gény, ktoré sa expresovali pri vysokých a pri nízkych hladinách. Hoci sa kontextový účinok rozpoznal, predpovedná hodnota štatistických pravidiel, týkajúcich sa výhodných nukleotidov, susediacich s kodónmi, je relatívne nízka. To obmedzilo užitočnosť takýchto údajov o výhodnosti nukleotidov na výber kodónov na dosiahnutie požadovaných úrovní translačnej účinnosti.

Zariadenie na automatizované sekvenovanie nukleotidov umožnilo sprístupnenie veľkého množstvá údajov o sekvenciách pre širokú škálu organizmov. Pochopenie týchto údajov predstavuje značné problémy. Napríklad je dôležité identifikovať kódujúce oblasti genómu, aby sa korelovali genetické údaje o sekvenciách so sekvenciami proteínov. Okrem toho pôvod genómu určitých organizmov je mimoriadne zaujímavý. Je známe, že genómy niektorých organizmov majú zmiešaný pôvod. Niektoré sekvencie, ktoré sú vírusového pôvodu, sú teraz stabilne včlenené do genómu eukaryotických organizmov. Vírusové sekvencie samotné môžu pochádzať z iných, v podstate nepríbuzných druhov. Pochopenie pôvodu génu môže byť dôležité pri odvodzovaní správnych analógií medzi príbuznými génmi a ich translačnými produktami v iných organizmoch.

Existuje potreba lepšieho pochopenia účinkov kodónového kontextu na transláciu a metódy stanovenia príslušných kodónov pre akýkoľvek požadovaný translačný účinok. Tiež existuje potreba metódy identifikácie kódujúcich oblastí genómu z údajov o nukleotidovej sekvencii. Tiež existuje potreba metódy ovládania zbaľovania proteínu a zabezpečenia, že cudzí gén sa bude príslušne zbaľovať, keď bude dochádzať k jeho expresii v hostiteľovi. Gény, zmenené alebo konštruované s požadovanými translačnými účinnosťami, by mali veľký význam.

Iným aspektom praxe technológií rekombinantnej DNA pre expresiu proteínov, ktoré sú priemyselne a farmaceutický dôležité, mikroorganizmami, je jav kodónovej preferencie. Zatiaľ čo sa už predtým ukázalo, že existujúcim mechanizmom pre génovú expresiu je to, že geneticky transformované hostiteľské

-10bunky budú pôsobiť tak, aby skonštruovali daný požadovaný produkt, dosiahnuté úrovne expresie v mikroorganizme môžu podliehať širokej variabilite, čiastočne v závislosti od špecifických alternatívnych foriem aminokyselinu špecifikujúceho genetického kódu, prítomného vo vloženom vonkajšom géne. Tripletový kodón zo štyroch možných nukleotidových báz môže existovať v 64 variantných formách. To, že tieto formy poskytujú správu len pre 20 rôznych aminokyselín (ako aj iniciáciu a skončenie transkripcie), znamená, že niektoré aminokyseliny sa môžu kódovať viac než jedným kodónom. Skutočne, niektoré aminokyseliny majú až šesť nadbytočných, alternatívnych kodónov, zatiaľ čo niektoré iné majú jediný, požadovaný kodón. Z dôvodov, ktoré nie sú doteraz úplne jasné, alternatívne kodóny vôbec nie sú rovnomerne prítomné v endogénnej DNA rôznych typov buniek a zdá sa, že existuje meniaca sa prirodzená hierarchia alebo preferencia pre určité kodóny v určitých typoch buniek.

Ako jeden príklad, aminokyselina leucín je špecifikovaná ktorýmkoľvek zo šiestich DNA kodónov, vrátane CTA, CTC, CTG, CTT, TTA a TTG (ktoré zodpovedajú mRNA kodónom, CUA, CUC, CUG, CUU, UUA a UUG). Vyčerpávajúca analýza frekvencií genómových kodónov pre mikroorganizmy ukázala, že endogénna DNA z E. coli najčastejšie obsahuje CTG-leucín špecifikujúci kodón, zatiaľ čo DNA z kvasiniek a hlienových plesní najčastejšie zahrnuje TTA-leucín špecifikujúci kodón. Z hľadiska tejto hierarchie vo všeobecnosti platí, že pravdepodobnosť dosiahnutia vysokých úrovní expresie na leucín bohatého polypeptidu E. coli ako hostiteľom bude do istej miery závisieť od frekvencie použitia kodónu. Napríklad gén, ktorý je bohatý na TTA kodóny, bude so všetkou pravdepodobnosťou slabo expresovaný v E. coli, zatiaľ čo na CTG bohatý gén bude pravdepodobne silne expresovať tento polypeptid. Podobne, keď sú kvasinkové bunky projektovanými transformovanými hostiteľskými bunkami na expresiu na leucín bohatého polypeptidu, výhodným kodónom na použitie vo vloženej DNA by bol TTA.

Dôsledky javu kodónovej preferencie na technológie rekombinantnej DNA sú zrejmé a tento jav môže slúžiť na vysvetlenie mnohých predchádzajúcich zlyhaní pri snahe dosiahnuť vysoké úrovne expresie exogénnych génov v úspešne

-11 transformovaných hostiteľských organizmoch - menej preferovaný kodón môže byť opakovane prítomný vo vloženom géne a mechanizmus hostiteľskej bunky na expresiu nemôže pôsobiť tak účinne. Tento jav napovedá, že syntetické gény, ktoré sa skonštruovali tak, aby zahrnovali gény, preferované projektovanou hostiteľskou bunkou, poskytujú preferovanú formu cudzieho genetického materiálu pre prax metód rekombinantnej DNA.

5. Transport proteinov

Rôznorodosť funkcií, ktorá typizuje eukaryotické bunky, závisí od štruktúrnej diferenciácie ich membránových hraníc. Na vytvorenie a udržanie týchto štruktúr sa proteíny musia transportovať z miesta ich syntézy v endoplazmatickom retikule do vopred určených cieľových miest po celej bunke. To vyžaduje, aby transportujúce sa proteíny vykazovali triediace signály, ktoré rozozná molekulový mechanizmus, zodpovedný za výber cesty, umiestnený v prístupových bodoch k hlavným dráham transportu. Triediace rozhodnutia pre väčšinu proteinov sa musia urobiť len raz, keď prechádzajú svojimi biosyntetickými cestami, pretože ich konečné miesto určenia, bunkové miesto, v ktorom vykonávajú svoju funkciu, sa stáva ich stálym sídlom.

Udržanie vnútrobunkovej integrity závisí čiastočne od selektívneho triedenia a presného transportu proteinov na ich správne miesta určenia. V posledných niekoľkých rokoch sa rozčlenenie molekulových mechanizmov na smerovanie a lokalizovanie proteinov intenzívne študovalo. Na proteínoch sa identifikovali motívy s definovanými sekvenciami, ktoré môžu pôsobiť ako adresové štítky. Zistili sa viaceré triediace signály, spojené s cytoplazmatickými doménami membránových proteinov.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu sú syntetické molekuly DNA, kódujúce gén env HIV a jeho modifikácie. Kodóny syntetických molekúl zahrnujú kodóny, uprednostňované projektovanou hostiteľskou bunkou. Tieto syntetické molekuly poskytujú výhodné formy cudzieho genetického materiálu. Tieto syntetické molekuly možno použiť ako

-12polynukleotidovú vakcínu, ktorá poskytuje účinnú imunoprofýlaxiu proti HIV infekcii neutralizujúcimi protilátkami a bunkami sprostredkovanou imunitou. Tento vynález poskytuje polynukleotidy, ktoré, keď sa priamo zavedú do stavovcov in vivo, vrátane cicavcov, ako sú primáty a ľudia, indukujú expresiu kódovaných proteínov vo zvierati.

Poskytujú sa syntetické DNA molekuly, kódujúce HIV env a syntetické DNA molekuly, kódujúce modifikované formy HIV env. Kodóny týchto syntetických molekúl sú navrhnuté tak, aby sa použili kodóny, preferované projektovanou hostiteľskou bunkou. Tieto syntetické molekuly sa môžu použiť ako polynukleotidová vakcína, ktorá poskytuje účinnú imunoprofýlaxiu proti HIV infekcii neutralizujúcimi protilátkami a bunkami sprostredkovanou imunitou. Tieto syntetické molekuly sa môžu použiť ako imunogénna kompozícia. Tento vynález poskytuje polynukleotidy, ktoré, keď sa priamo zavedú do stavovca in vivo, vrátane cicavcov, ako sú primáty a ľudia, indukujú expresiu kódovaných proteínov vo zvierati.

Ako sa tu používa, polynukleotid je kombinácia nukleových kyselín, ktoré obsahujú regulačné prvky také, že pri zavedení do živej bunky stavovca je polynukleotid schopný riadiť bunkový mechanizmus tvorby translačných produktov, kódovaných nukleovými kyselinami, zahrnujúcimi tento polynukleotid. V jednom uskutočnení tohto vynálezu je týmto polynukleotidom kyselina polydeoxyribonukleová, obsahujúca najmenej jeden HIV gén, funkčne spojený s transkripčným promótorom. V inom uskutočnení tohto vynálezu polynukleotidová vakcína (PNV) obsahuje kyselinu polyribonukleovú, kódujúcu najmenej jeden HIV gén, ktorý je prístupný translácii eukaryotickým bunkovým mechanizmom (ribozómy, tRNA a iné translačné faktory). Tam, kde proteínom, kódovaným týmto polynukleotidom, je taký proteín, ktorý sa normálne nevyskytuje vo zvierati, s výnimkou patologických podmienok (t. j. heterológny proteín), ako sú proteíny, spojené s vírusom ľudskej imunitnej nedostatočnosti (HIV), etiologickým činidlom syndrómu získanej imunitnej nedostatočnosti (AIDS), imunitný systém zvieraťa sa aktivuje na vyslanie ochrannej imunitnej odpovede. Pretože tieto exogénne proteíny sú produkované tkanivami zvieraťa, expresované proteíny spracúva hlavný histokompatibilný systém, MHC, spôsobom, ktorý je analogický tomu, keď nastane

-13skutočná infekcia príbuzným organizmom (HIV). Výsledkom je indukcia imunitných odpovedí proti príbuznému patogénu.

Keď sa polynukleotidy podľa tohto opisu zavedú do biologického systému, indukujú expresiu HIV proteínov a epitopov a vyvolanie špecifickej imunitnej odpovede. Indukovaná protilátková odpoveď je špecifická pre expresovaný HIV protein a neutralizuje HIV. Okrem toho sa indukujú cytotoxické T-lymfocyty (CTL), ktoré špecificky rozpoznávajú a ničia HIV infikované bunky.

Tento opis poskytuje spôsoby použitia polynukleotidu, ktorý pri zavedení do tkaniva cicavca indukuje expresiu v jedinej bunke, in vivo, diskrétnych génových produktov. Opis poskytuje riešenie, ktoré nevyžaduje viacnásobné manipulácie s od REV závislými HIV génmi, aby sa získali od REV nezávislé gény. Tu opísaný systém od REV nezávislej expresie je užitočný ako taký a je to systém na demonštrovanie expresie. v jedinej bunke in vivo jediného požadovaného génového produktu.

Pretože mnohé z aplikácií tohto vynálezu sa týkajú protivírusovej vakcinácie, tieto polynukleotidy sa často označujú ako polynukleotidová(é) vakcína(y) alebo PNV. To neznamená, že ďalšie užitočné vlastnosti týchto polynukleotidov pri imunitnej stimulácii a protinádorovej liečbe by nemali patriť do rámca tohto vynálezu.

V jednom uskutočnení je gén, kódujúci HIV génový produkt, včlenený do vektora expresie. Tento vektor obsahuje transkripčný promótor, rozoznávaný eukaryotickou RNA polymerázou, a transkripčný terminátor na konci kódujúcej sekvencie HIV génu. Vo výhodnom uskutočnení je promótorom cytomegalovírusový promótor s intrón A sekvenciou (CMV-intA), hoci odborníci v tejto oblasti budú vedieť, že sa môže použiť ľubovoľný z mnohých ďalších známych promótorov, ako je silný imunoglobulín alebo iné eukaryotické génové promótory. Výhodným transkripčným terminátorom je terminátor hovädzieho rastového hormónu (BGH). Kombinácia CMVintA-BGH terminátora je zvlášť výhodná.

Aby sa napomohla príprava týchto polynukleotidov v prokaryotických bunkách, marker odolnosti voči antibiotikám môže byť zahrnutý do vektora expresie; tento marker môže byť pod transkripčnou kontrolou prokaryotického

-14promótora, takže k expresii markera nedôjde v eukaryotických bunkách. Môžu sa použiť gény odolnosti voči ampicilínu, gény odolnosti voči neomycínu a ďalšie farmaceutický prijateľné markery odolnosti voči antibiotikám. Na podporenie produkcie vysokých hladín polynukleotidu fermentáciou v prokaryotických organizmoch môže byť výhodné, aby vektor obsahoval prokaryotický začiatok replikácie a aby dával vysoký počet kópií. Viaceré komerčne dostupné prokaryotické klonovacie vektory poskytujú tieto výhody. Je žiaduce odstrániť nepodstatné DNA sekvencie a zabezpečiť, aby vektory neboli schopné replikovať sa v eukaryotických bunkách. To minimalizuje riziko integrácie sekvencií polynukleotidovej vakcíny do genómu príjemcu. Tkanivovo špecifické promótory alebo zosilňovače sa môžu použiť, kedykoľvek je potrebné obmedziť expresiu polynukleotidu v konkrétnom type tkaniva.

V jednom uskutočnení sa použije vektor expresie pnRSV, pričom Rous Sarcoma Virus (RSV) dlhá terminálna opakovacia sekvencia (LTR) sa použije ako promótor. V inom uskutočnení sa použije V1, mutovaný pBR322 vektor, do ktorého boli klonované CMV promótor a BGH transkripčný terminátor. V inom uskutočnení sa prvky V1 a pUC19 skombinovali na vytvorenie vektora expresie, ktorý sa nazýva V1J. Do V1J alebo iného žiaduceho vektora expresie sa klonuje HIV gén, ako je gp120, gp41, gp160, gag, pol, env alebo akýkoľvek iný HIV gén, ktorý môže indukovať anti-HIV imunitné odpovede. V inom uskutočnení sa gén odolnosti voči ampicilínu odstráni z V1J a nahradí sa génom odolnosti voči neomycínu, aby vznikol V1J-neo, do ktorého sa klonovali rôzne gény HIV na použitie podľa tohto vynálezu. V inom uskutočnení je vektorom V1Jns, ktorý je rovnaký ako VUneo s výnimkou toho, že jedinečné Sfi1 reštrikčné miesto sa vytvorilo v jedinom mieste Kpn1 v polohe 2114 vo VUneo. Výskyt Sfi1 miest v ľudskej genómovej DNA je veľmi malý (približne 1 miesto na 100 000 báz). Teda tento vektor umožňuje opatrné monitorovanie integrácie vektora expresie do DNA hostiteľa, jednoducho Sfi1 štiepením extrahovanej genómovej DNA. V ďalšom variante je vektorom V1R. V tomto vektore sa toľko nepodstatnej DNA, koľko len bolo možné, odstrihlo z vektora, aby vznikol vysoko kompaktný vektor. Tento vektor je derivátom V1Jns.

-15Tento vektor umožňuje použiť väčšie inzerty s menšou obavou, že sa budú kódovať nežiaduce sekvencie, a optimalizuje absorpciu bunkami.

Jedno uskutočnenie tohto vynálezu zahrnuje gény, kódujúce HIV gp160, gp120, gag a iné génové produkty z laboratórne prispôsobených kmeňov HIV, ako sú SF2, IIIB alebo MN. Odborníci v tejto oblasti budú vedieť, že pri použití génov z HIV-2 kmeňov, ktoré majú analogickú funkciu ako gény z HIV-1, by sa očakávalo vyvolanie imunitných odpovedí, analogických odpovediam, tu opísaným pre HIV-1 konštrukty. Metódy klonovania a manipulácie na získanie týchto génov sú odborníkom v tejto oblasti známe.

Zistilo sa, že vyvolanie imunitných odpovedí proti laboratórne prispôsobeným kmeňom HIV nemusí byť primerané na dosiahnutie neutralizácie izolátov HIV z primárneho poľa. Teda v inom uskutočnení tohto vynálezu sú gény z virulentných izolátov HIV z primárneho poľa včlenené do polynukleotidového imunogénu. To sa uskutoční prípravou cDNA kópií vírusových génov a subklonovaním individuálnych génov do polynukleotidového imunogénu. Sekvencie mnohých génov mnohých HIV kmeňov sú dnes verejne prístupné v GENBANK a takéto izoláty HIV z primárneho poľa sú dostupné z National Inštitúte of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), ktorý sa dohodol s Quality Biological, Inc. [7581 Lindbergh Drive, Gaithersburg, Maryland 20879], že tieto kmene budú dostupné. Takéto kmene sú tiež dostupné z World Health Organization (WHO) [Network for HIV Isolation and Characterization, Vaccine Development Unit, Office of Research, Global Programme on AIDS, CH1211 Geneva 27, Švajčiarsko]. Z tejto práce bude odborníkom v tejto oblasti zrejmé, že jedným z užitočných prínosov tohto vynálezu je poskytnutie systému na in vivo, ako aj in vitro testovanie a analýzu, takže možno korelovať rôznorodosť HIV sekvencií so serológiou HIV neutralizácie, ako aj s inými parametrami. Včlenenie génov z primárnych izolátov HIV kmeňov poskytuje imunogén, ktorý indukuje imunitné odpovede proti klinickým izolátom vírusu a teda vyhovuje potrebe spôsobom, s akým sme sa ešte v tejto oblasti nestretli. Naviac, ako sa virulentné izoláty menia, imunogén sa môže modifikovať, aby odrážal nové sekvencie podľa potreby.

-16Aby sme dodržali konzistentnú terminológiu, pri opise konštruktov polynukleotidového imunogénu sa dodržiava nasledujúca konvencia: Názov vektora HIV kmeň - gén - ďalšie prvky. Teda konštrukt, v ktorom je gp160 gén MN kmeňa klonovaný do vektora expresie VIJneo, tu bude mať meno: V1Jneo-MN-gp160. Ďalšie prvky, ktoré sa pridajú ku konštruktu, sú podrobnejšie opísané ďalej. Keďže etiologický kmeň vírusu sa mení, presný gén, ktorý je optimálny na včlenenie do liečiva, sa môže zmeniť. Avšak, ako demonštrujeme ďalej, v dôsledku toho, že sa indukujú CTL odpovede, ktoré sú schopné chrániť proti heterológnym kmeňom, premenlivosť kmeňa je menej kritická v imunogéne a vakcínach podľa tohto vynálezu v porovnaní s vakcínami na základe celého vírusu alebo podjednotkových polypeptidov. Okrem toho, keďže s liečivom sa ľahko manipuluje na vloženie nového génu, toto je úprava, ktorá sa ľahko uskutoční štandardnými metódami molekulovej biológie.

Výraz promótor, ako sa tu používa, sa týka rozpoznávacieho miesta na DNA vlákne, ku ktorému sa viaže RNA polymeráza. Promótor vytvorí iniciačný komplex s RNA polymerázou, aby inicioval a vybudzoval transkripčnú aktivitu. Tento komplex sa môže modifikovať aktivačnými sekvenciami, ktoré sa nazývajú zosilňovače, alebo inhibičnými sekvenciami, ktoré sa nazývajú tlmiče.

Výraz vedúca sekvencia (reťazec), ako sa tu používa, sa týka DNA sekvencie na 5' konci štruktúrneho génu, ktorá sa transkribuje spolu s génom. Vedúca sekvencia obyčajne vedie k proteínu, ktorý má N-terminálne peptidové rozšírenie, ktoré sa niekedy nazýva pro-sekvencia. Pre proteíny, určené buď na sekréciu do mimobunkového média alebo na membránu, táto signálna sekvencia, ktorá je vo všeobecnosti hydrofóbna, smeruje protein do endoplazmatického retikula, z ktorého sa vypustí do príslušného miesta určenia.

Výraz intrón, ako sa tu používa, sa týka úseku DNA, nachádzajúceho sa v strede génu, ktorý nekóduje aminokyselinu v génovom produkte. Prekurzor RNA intrónu sa vysekne, a preto sa netranskribuje do mRNA, ani sa neprenáša transláciou do proteínu.

Výraz kazeta sa týka sekvencie podľa tohto vynálezu, ktorá obsahuje sekvenciu nukleových kyselín, ktorá sa má expresovať. Kazeta sa obsahom pojmu

- 17podobá kazetovej páske. Každá kazeta bude mať svoju vlastnú sekvenciu. Teda pri výmene kazety vektor bude expresovať inú sekvenciu. V dôsledku obmedzujúcich miest na 5' a 3' koncoch sa kazeta dá ľahko vložiť, odstrániť alebo nahradiť inou kazetou.

Výraz 3' transláciou neprenesená oblasť alebo 3' UTR sa týka sekvencie na 3' konci štruktúrneho génu, ktorá sa obyčajne transkribuje s génom. Táto 3' UTR oblasť obyčajne obsahuje poly A sekvenciu. Hoci 3' UTR sa transkribuje z DNA, vysekne sa pred transláciou do proteínu.

Výraz nekódujúca oblasť alebo NCR sa týka oblasti, ktorá prilieha k 3' UTR oblasti štruktúrneho génu. NCR oblasť obsahuje signál skončenia transkripcie.

Výraz reštrikčné miesto sa týka pre sekvenciu špecifického miesta štiepenia reštrikčných endonukleáz.

Výraz vektor sa týka niektorých prostriedkov, pomocou ktorých sa DNA fragmenty môžu zaviesť do hostiteľského organizmu alebo hostiteľského tkaniva. Existujú rozličné typy vektorov, vrátane plazmidov, bakteriofágov a kozmidov.

Výraz účinné množstvo znamená, že sa vstrekne množstvo PNV, dostatočné na to, aby sa vytvorili príslušné hladiny polypeptidu. Odborník v tejto oblasti bude vedieť, že táto hladina sa môže meniť.

Aby sme opísali tento vynález, podávame nasledujúce doterajšie znalosti o HIV. Vírus ľudskej imunitnej nedostatočnosti má genóm ribonukleovej kyseliny (RNA), ktorého štruktúra je reprezentovaná na obr. 1. Tento RNA genóm sa musí reverzne transkribovať podľa metód, známych v doterajšom stave techniky, aby sa vytvorila cDNA kópia na klonovanie a manipuláciu podľa tu uvedených metód. Na každom konci tohto genómu je dlhá terminálna sekvencia opakovania, ktorá pôsobí ako promótor. Medzi týmito koncami genóm kóduje v rôznych čítacích rámcoch gag-pol-env ako hlavné génové produkty; gag je skupinovo špecifický antigén; pol je reverzná transkriptáza alebo polymeráza; tiež kódovaná touto oblasťou, v striedavom čítacom rámci, je vírusová proteáza, ktorá je zodpovedná za posttranslačné spracovanie, napríklad gp160 do gp120 a gp41; env je obalový proteín; vif je faktor viriónovej neúčinnosti; REV je regulátor expresie viriónového proteínu; neg je negatívny regulačný faktor; vpu je faktor u viriónovej produktivity;

-18tat je transaktivátor transkripcie; vpr je vírusový proteín r. Funkcia každého z týchto prvkov bola opísaná.

V jednom uskutočnení tohto vynálezu gén, kódujúci HIV alebo SIV proteín, je priamo viazaný na transkripčný promótor. Gén env kóduje veľký, na membránu viazaný proteín gp160, ktorý sa posttranslačne modifikuje na gp41 a gp120. gp120 gén sa môže umiestniť pod kontrolu cytomegalovirusového promótora pre expresiu. Avšak gp120 nie je viazaný na membránu, a preto pri expresii sa môže sekretovať z bunky. Keďže HIV má tendenciu zostať v infikovaných bunkách ako latentný, je žiaduce, aby sa tiež vytvorili imunitné odpovede, smerujúce na bunkovo viazané HIV epitopy. Naviac je žiaduce, aby vakcína produkovala membránou viazaný, oligomérny ENV antigén, štruktúrou podobný antigénu, produkovanému vírusovou infekciou, aby vznikli najúčinnejšie protilátkové odpovede na neutralizáciu vírusu. Tento cieľ sa tu dosiahne expresiou in vivo epitopu, spojeného s bunkovou membránou, gp160, na aktiváciu imunitného systému. Avšak expresia gp160 je potlačená v neprítomnosti REV v dôsledku toho, že z jadra sa neexportujú nezostrihané gény. Na pochopenie tohto systému musíme ešte podrobnejšie opísať životný cyklus HIV.

V životnom cykle HIV sa pri infekcii hostiteľskej bunky HIV RNA genóm reverzne transkribuje do provírusovej DNA, ktorá sa integruje do hostiteľskej genómovej DNA ako jediná transkripčná jednotka. LTR poskytne promótor, ktorý transkribuje HIV gény v smere od 5' k 3' (gag, pol, env), aby sa vytvoril nezostrihaný transkript celého genómu. Nezostrihaný transkript pôsobí ako mRNA, z ktorej sa transláciou prenášajú gag a pol, zatiaľ čo na transláciu env kódovaných génov musí dôjsť k obmedzenému zostrihaniu. Na to, aby došlo k expresii regulačného génového produktu REV, musí dôjsť k viac než jednému prípadu zostrihania, pretože v genómovom nastavení sa REV a env, ako je znázornené na obr. 1, prekrývajú. Aby došlo k transkripcii env, REV transkripcia sa musí zastaviť a naopak. Okrem toho sa prítomnosť REV vyžaduje na exportovanie nezostrihanej RNA z jadra. Avšak, aby REV fungoval týmto spôsobom, na transkripte musí byť prítomný REV responzívny prvok (RRE) [Málim a kol., Náture 338. 254 až 257, 1989].

V polynukleotidovej vakcíne podľa tohto vynálezu je povinné zostrihávanie určitých HIV génov eliminované tým, že sa poskytnú úplne zostrihané gény (t.j. poskytnutie úplne otvoreného čítacieho rámca pre požadovaný génový produkt bez potreby prepínačov v čítacom rámci alebo eliminácie nekódujúcich oblastí; odborníci v tejto oblasti budú vedieť, že keď sa zostriháva konkrétny gén, existuje určitá voľnosť v presnej sekvencií, ktorá vznikne; pokiaľ sa však získa funkčná, kódujúca sekvencia, toto je prijateľné). Teda v jednom uskutočnení sa celá kódujúca sekvencia pre gp160 zostrihá tak, že nie je potrebná žiadna nespojitá expresia každého génového produktu.

Duálne humorálne a bunkové odpovede, vyvolané podľa tohto vynálezu, sú zvlášť významné pre inhibíciu HIV infekcie, ak existuje náchylnosť HIV mutovať vnútri populácie, ako aj v infikovaných jedincoch. Aby sa formulovala účinná ochranná vakcína proti HIV, je žiaduce vytvoriť tak multivalentnú protilátkovú odpoveď, napríklad proti gp160 (env je asi na 80 % zachovaný v rôznych HIV-1, clade B kmeňoch, ktoré sú prevládajúcimi kmeňmi v US ľudskej populácii), hlavnému neutralizačnému cieľu v HIV, ako aj cytotoxické T-bunky, ktoré reagujú na zachované časti gp160, a vnútorné vírusové proteíny, kódované pomocou gag. Vyrobili sme HIV vakcínu, obsahujúcu gp160 gény, vybrané z bežných laboratórnych kmeňov; z prevládajúcich primárnych vírusových izolátov, nájdených v infikovanej populácii; z mutovaného gp160, skonštruovaného na odmaskovanie skríženého kmeňa, neutralizujúceho epitopy protilátok; a z iných reprezentatívnych HIV génov, ako sú gag a pol gény (zachované asi na 95 % vo všetkých HIV izolátoch).

Prakticky všetci HIV séropozitívni pacienti, ktorí nepokročili k stavu imunitnej nedostatočnosti, prechovávajú anti-gag CTL, zatiaľ čo asi 60 % týchto pacientov vykazuje skrížený kmeň, gp160 špecifické CTL. Množstvo HIV špecifických CTL, zistené u infikovaných jedincov, ktorí pokročili do chorobného stavu, známeho ako AIDS, je však oveľa menšie, čo demonštruje význam našich zistení, že môžeme indukovať CTL odpovede skrížených kmeňov.

Imunitné odpovede, indukované našimi env a gag polynukleotidovými vakcínovými konštruktami, sú demonštrované u myší a primátov. Monitorovanie

-20tvorby protilátok k env u myší umožňuje potvrdiť, že daný konštrukt je vhodne imunogénny, t.j. vysoký podiel vakcinovaných zvierat vykazuje protilátkovú odpoveď. Myši tiež predstavujú najdostupnejší zvierací model, vhodný na testovanie CTL indukcie našimi konštruktami, a preto sa použili na vyhodnotenie, či je konkrétny konštrukt schopný vyvolať takúto aktivitu. Opice (africké zelené, rézusy, šimpanzy) predstavujú ďalšie druhy, zahrnujúce primáty, na vyhodnotenie protilátok u väčších zvierat, nie hlodavcov. Tieto druhy sú tiež výhodnejšie než myši pre antisérové neutralizačné testy v dôsledku vysokých hladín endogénnych neutralizačných aktivít proti retrovirusom, pozorovaných v myšom sére. Tieto údaje demonštrujú, že našimi vakcínami sa vyvolá dostatočná imunogenicita, aby sa dosiahla ochrana pri pokusoch s modelom vyvolania odozvy širnpanz/HIV_mB na základe známych ochranných hladín neutralizujúcich protilátok pre tento systém. Avšak v súčasnosti sa objavujúca a vo zvyšujúcej sa miere akceptovaná definícia ochrany sa presúva od takzvanej sterilizujúcej imunity, ktorá znamená úplnú ochranu pred HIV infekciou, k prevencii choroby. Viaceré koreláty tohto cieľa zahrnujú znížený krvný vírusový titer, ako sa nameria buď aktivitou HIV reverznej transkriptázy, infekčnosťou vzoriek séra, ELISA testom p24 alebo inej HIV antigénovej koncentrácie v krvi, zvýšenou CD4⁺ T-bunkovou koncentráciou a zvýšeným prežívaním [pozri napríklad Cohen J., Science 262. 1820 až 1821, 1993, na diskusiu o vyvíjajúcej sa definícii účinnosti anti-HIV vakcíny]. Imunogény podľa tohto vynálezu tiež vyvolávajú neutralizačné imunitné odpovede proti infekčným (klinickým, z primárneho poľa) izolátom HIV.

Imunológia

A. Protilátkové odpovede na env

1. gp160 a gp120. ELISA test sa použije na určenie, či vektory vakcíny, expresujúce buď sekretovaný gp120 alebo na membránu viazaný gp160, sú účinné pri produkcii env-špecifických protilátok. Začiatočná in vitro charakterizácia env expresie našimi vakcinačnými vektormi sa dosiahne imunoblotovou analýzou gp160 lyzátov transfektovaných buniek. Tieto údaje potvrdzujú a kvantifikujú gp160 expresiu s použitím anti-gp41 a anti-gp120 monoklonálnych protilátok, aby sa vizualizovala gp160 expresia transfektujúcich buniek. V jednom uskutočnení tohto vynálezu je gp160 výhodnejší než gp120 z nasledujúcich dôvodov: (1) pôvodný gp120 vektor dával nekonzistentnú imunogenicitu u myší a vykazoval veľmi slabú alebo žiadnu odpoveď u afrických zelených opíc; (2) gp160 prispieva ďalšími neutralizujúcimi protilátkami, ako aj CTL epitopmi tým, že pridá približne 190 aminokyselinových zvyškov v dôsledku zahrnutia gp41; (3) gp160 expresia sa viac podobá vírusovému env vzhľadom na tetramérnu zostavu a celkovú konformáciu, ktorá môže poskytnúť od oligomérov závislé neutralizačné epitopy; a (4) zistili sme, že tak ako pre úspešné, na membránu viazané chrípkové HA konštrukty na vyvolanie neutralizujúcich protilátkových odpovedí u myší, fretiek a nie ľudských primátov, tvorba gp160 protilátok prevláda nad tvorbou gp120 protilátok. Výber, ktorý typ env alebo či zmes env fragmentov je výhodná, sa určí pokusmi, opísanými ďalej.

2. Prítomnosť a šírka neutralizačnej aktivity. ELISA pozitívne antiséra z opíc sa testovali a ukázalo sa, že neutralizujú tak homológne, ako aj heterológne HIV kmene.

3. V3 verzus non-V3 neutralizujúce protilátky. Hlavným cieľom env PNV je vytvoriť široko neutralizujúce protilátky. Teraz sa ukázalo, že protilátky, smerované proti V3 slučkám, sú veľmi špecifické pre daný kmeň, a sérológia tejto odpovede sa použila na určenie kmeňov.

a. Ukazuje sa, že non-V3 neutralizujúce protilátky primárne rozoznávajú nespojité, štruktúrne epitopy v gp120, ktoré sú zodpovedné za viazanie CD4. Protilátky tejto domény sú polyklonálne a širšie krížovo neutralizujúce, pravdepodobne v dôsledku obmedzení pri mutáciách, spôsobených potrebou vírusu viazať svoj bunkový ligand. Jeden test in vitro sa používa na testovanie blokovania gp120 viazania k CD4, imobilizovanému na 96-miskových platniach sérom z imunizovaných zvierat. Druhý in vitro test deteguje priamu väzbu protilátky k syntetickým peptidom, reprezentujúcim zvolené V3 domény, imobilizované na plaste. Tieto testy sú kompatibilné pre antiséra z ľubovoľného typu zvierat, ktoré sa

-22použili v našich štúdiách, a definujú typy neutralizujúcich protilátok, ktoré naše vakcíny vytvorili, ako aj poskytujú in vitro korelát k neutralizácii vírusu.

b. gp41 prechováva najmenej jeden hlavný neutralizačný determinant, zodpovedajúci vysoko zachovanému lineárnemu epitopu, rozpoznanému široko neutralizujúcou 2F5 monoklonálnou protilátkou (komerčne dostupnou od Viral Testing Systems Corp., Texas Commerce Tower, 600 Tráviš Street, Suite 4750, Houston, TX 77002-3005 (USA), alebo od Waldheim Pharmazeutika GmbH, Boltzmangasse 11, A-1091 Wien, Rakúsko), ako aj ďalšie potenciálne miesta, vrátane dobre zachovanej domény fúzneho peptidu, umiestnenej na N-konci gp41. Popri detekcii protilátok, smerovaných proti gp41, imunoblotom, ako sme opísali vyššie, sa jeden in vitro. test použije pre protilátky, ktoré sa viažu k syntetickým peptidom, reprezentujúcim tieto domény, imobilizované na plaste.

4. Maturácia protilátkovej odpovede. U HIV séropozitívnych pacientov sa neutralizujúce protilátkové Odpovede vyvíjajú od najmä anti-V3 tak, aby zahrnovali širšie neutralizujúce protilátky,, obsahujúce štruktúrne gp120 doménové epitopy, opísané vyššie (# 3), vrátane gp41 epitopov. Tieto typy protilátkových odpovedí sa monitorujú tak v priebehu času, ako aj pri následných vakcináciách.

B. T-bunkové reaktivity proti env a gag

1. Tvorba CTL odpovedí. Vírusové proteíny, ktoré sa syntetizujú vnútri buniek, spôsobujú vznik MHC l-obmedzených CTL odpovedí. Každý z týchto proteínov vyvoláva CTL u séropozitívnych pacientov. Naše vakcíny sú tiež schopné vyvolať CTL u myší. Imunogenetika myších kmeňov napomáha takéto štúdie, ako sa demonštrovalo chrípkovým NP. Niekoľko epitopov bolo definovaných pre HIV proteíny env, REV, nef a gag u Balb/c myší, čím sa uľahčujú in vitro štúdie CTL kultivácie a cytotoxicity. Je výhodné použiť geneticky identické nádorové línie, ako je myší mastocytóm P815, transfektovaný s týmito génmi, aby poskytol ciele pre CTL, ako aj pre in vitro antigén-špecifickú restimuláciu. Metódy definovania imunogénov, schopných vyvolať MFC triedy I obmedzené cytotoxické T-lymfocyty, sú známe. Zistilo sa, že aj peptid, obsahujúci aminokyseliny 152 až 176, indukuje HIV neutralizujúce protilátky, a tieto metódy sa dajú použiť na identifikáciu imunogénnych epitopov na zahrnutie do PNV podľa tohto vynálezu. Alternatívne by sa mohol použiť celý gén, kódujúci gp160, gp120, proteázu alebo gag. Ako sa tu používa, funkcia T-bunkového efektora je spojená so zrelým T-bunkovým fenotypom, napríklad cytotoxicitou, vylučovaním cytokínov na aktiváciu B-buniek a/alebo posilnením alebo stimuláciou makrofágov a neutrofilov.

2. Meranie T_H aktivít. Slezinové bunkové kultúry, získané z vakcinovaných zvierat, sa testujú na vyvolanie špecifických antigénov pridaním buď rekombinantného proteinu alebo peptidových epitopov. Aktivácia T-buniek takýmito antigénmi, prezentovaná bunkami APO, prezentujúcimi sprievodné slezinové antigény, sa monitoruje proliferáciou týchto kultúr alebo produkciou cytokínov. Obrazec produkcie cytokínov tiež umožňuje klasifikáciu T_H odpovedí na typ 1 alebo typ 2. Pretože sa ukazuje, že dominantné T_H2 odpovede korelujú s vylúčením bunkovej imunity u imunokompromizovaných séropozitívnych pacientov, je možné definovať typ odpovede, vyvolaný daným PNV u pacientov, umožňujúc manipuláciu výsledných imunitných odpovedí.

3. Hypersenzitivita oneskoreného typu (DTH). DTH na vírusový antigén po

i.d. injekcii indikuje bunkovú, primárne MHC ll-obmedzenú imunitu. V dôsledku komerčnej dostupnosti rekombinantných HIV proteinov a syntetických peptidov pre známe epitopy, DTH odpovede sa ľahko určujú u vakcinovaných stavovcov s použitím týchto reagentov, čím sa poskytuje dodatočný in vivo korelát na indukovanie bunkovej imunity.

Ochrana

Na základe vyššie uvedených imunologických štúdií sa dá predpovedať, že naše vakcíny sú účinné u stavovcov proti expozícii virulentnému HIV. Tieto štúdie sa uskutočňujú s modelom HIV_ll)B/šimpanz na expozíciu po dostatočnej vakcinácii týchto zvierat PNV konštruktom alebo zmesou PNV konštruktov, ktoré sa skladajú z gp160|n_B, gag_WB, nef_MB a R£Vm_B. IIIB kmeň je z tohto hľadiska užitočný, pretože bol stanovený titer šimpanzov pre smrteľné dávky tohto kmeňa. Avšak tie isté štúdie sú možné s použitím ľubovoľného kmeňa HIV a epitopov, špecifických pre alebo heterológnych s daným kmeňom. Druhým modelom vakcinácie/expozície je okrem

-24šimpanzov sc/d-hu PBL myš. Tento model umožňuje testovanie ľudského lymfocytového imunitného systému a našej vakcíny s následnou expozíciou HIV u myšieho hostiteľa. Tento systém je výhodný, pretože sa ľahko prispôsobí použitiu s ľubovoľným HIV kmeňom a poskytuje dôkaz ochrany proti viacnásobným kmeňom izolátov HIV z primárneho poľa. Tretí model vyvolania odozvy využíva hybridné HIV/SIV vírusy (SHIV). O niektorých z nich sa ukázalo, že infikujú makaky rézus a vedú k chorobe imunitnej nedostatočnosti, ktorá vyústi do smrti [pozri Li J. a kol., J. AIDS 5, 639 až 646, 1992]. Vakcinácia rézusov našimi polynukleotidovými vakcínovými konštruktami chráni proti následnej expozícii smrteľným dávkam SHIV.

Súhrn PNV konštruktov

HIV a iné gény sa spoja do vektora expresie, ktorý bol optimalizovaný na polynukleotidové vakcinácie. V podstate celá nepotrebná DNA sa odstráni, ponechajúc podstatné prvky transkripčného promótora, imunogénnych epitopov, transkripčného terminátora, bakteriálneho začiatku replikácie a génu rezistencie voči antibiotiku.

Expresia HIV oneskorených génov, ako sú env a gag, závisí od REV a vyžaduje, aby REV responzívny prvok (RRE) bol prítomný na vírusovom génovom transkripte. Sekretovaná forma gp120 sa dá vytvoriť v neprítomnosti REV substitúciou gp120 vedúceho peptidu s heterológnym vedúcim reťazcom, ako z tPA (plazminogénový aktivátor tkanivového typu), a s výhodou vedúcim peptidom, aký sa nachádza vo vysoko expresovaných proteínoch cicavcov, ako sú imunoglobulínové vedúce peptidy. Vložili sme tPA-gp120 chimérický gén do V1Jns, ktorý účinne expresuje sekretovaný gp120 v transfektovaných bunkách (RD, ľudská rabdomyosarkómová línia). Monocistrónový gp160 neprodukuje žiadny proteín pri transfekcii bez pridania vektora REV expresie.

Zložky reprezentatívneho konštruktu zahrnujú (ale neobmedzujú sa na):

1. tPA-gp120_MN;

3. gp160||_)B;

10· gafiľ/HB: Pre anti-gag CTL;

11. tPA-gp120_lllB;

12. gp160 so štruktúrnymi mutáciami: V1, V2, a/alebo V3 slučkové odstránenia alebo substitúcie

20. gény, kódujúce antigény, expresované patogénmi inými než HIV, ako sú, ale neobmedzujúc sa na ne, nukleoproteín vírusu chrípky, hemaglutinín, matrix, neuraminidáza a iné antigénové proteíny; vírusové gény herpes simplex; gény ľudského papilomavírusu; antigény tubrkulózy; vírusové antigény hepatitídy A, B alebo C.

Ochranná účinnosť polynukleotidových HIV imunogénov proti následnej expozícii vírusom je demonštrovaná imunizáciou nereplikujúcim sa plazmidom DNA podľa tohto vynálezu. To je výhodné, pretože sa tu nezúčastňuje žiadne infekčné činidlo, nevyžaduje sa súbor vírusových častíc a je povolený výber determinantu. Naviac, pretože sekvencia gag a proteázy a niekoľkých ďalších vírusových génových produktov je medzi rôznymi kmeňmi HIV zachovaná, umožni sa ochrana proti následnej expozícii virulentnému kmeňu HIV, ktorý je homológny s, ako aj kmeňu, heterológnemu s kmeňom, z ktorého sa klonovaný gén získal.

Vnútrosvalová injekcia vektora DNA expresie, kódujúceho gp160, vedie k vytvoreniu významnej ochrannej imunity proti následnej expozícii vírusu. Konkrétne sa tvoria gp160-špecifické protilátky a primárne CTL. Imunitné odpovede, smerované proti zachovaným proteínom, môžu byť účinné napriek antigénovému odklonu a posunu rôznych obalových proteínov. Pretože každý z HIV génových produktov vykazuje istý stupeň zachovania, a pretože CTL sa tvoria v odpovedi na vnútrobunkovú expresiu a MHC spracovanie, dá sa predpovedať, že mnohé vírusové gény spôsobujú odpovede, ktoré sú analogické odpovediam, ktoré sa dosiahli pre gp160. Teda, mnohé z týchto génov boli klonované, ako sa ukázalo klonovanými a sekvenovanými spojmi vo vektore expresie (pozri ďalej) takými, že tieto konštrukty sú imunogénnymi činidlami v dostupnej forme.

Vynález ponúka prostriedky na indukovanie ochrannej imunity proti skríženým kmeňom bez potreby autoreprodukčných činidiel alebo adjuvans. Naviac, imunizácia polynukleotid mi podľa tohto vynálezu ponúka viaceré ďalšie výhody.

-26Tento prístup k vakcinácii by sa mal dať aplikovať pri nádoroch, ako aj pri infekčných činidlách, pretože CD8* CTL odpoveď je dôležitá pre oba patofýziologické procesy [K. Tanaka a kol., Annu. Rev. Immunol. 6, 359, 1988], Preto vyvolanie imunitnej odpovede proti proteínu, ktorý je rozhodujúci pre transformačný proces, môže byť účinným prostriedkom na ochranu proti rakovine alebo imunoterapiu. Tvorba vysokého titra protilátok proti expresovaným proteínom po injekcii vírusového proteínu a ľudského rastového hormónu DNA naznačuje, že toto je jednoduchý a vysoko účinný prostriedok na výrobu vakcín na báze protilátok, buď samostatne alebo v kombinácii s cytotoxickými T-lymfocytovými vakcínami, smerovanými k zachovaným antigénom.

Jednoduchosť výroby a čistenia DNA konštruktov je výhodná v porovnaní s tradičnými metódami čistenia proteínov, čím sa uľahčuje tvorba kombinovaných vakcín. Podľa toho sa dajú pripraviť, namiešať a súčasne podávať viacnásobné konštrukty, napríklad kódujúce gp160, gp120, gp41 alebo akýkoľvek iný HIV gén. Pretože expresia proteínu .sa zachováva po injekcii DNA, pretrvávanie B- a Tbunkovej pamäte sa môže zlepšiť, čím sa vyvolá dlhotrvajúca humorálna a bunkami sprostredkovaná imunita.

Štandardné metódy molekulovej biológie na prípravu a čistenie DNA konštruktov umožňujú prípravu DNA imunogénov podľa tohto vynálezu. Zatiaľ čo štandardné metódy molekulovej biológie preto postačujú na výrobu produktov podľa tohto vynálezu, špecifické konštrukty, ktoré sú tu opísané, poskytujú nové polynukleotidové imunogény, ktoré prekvapujúco vyvolávajú neutralizáciu skrížených kmeňov a primárneho HIV izolátu, čo je výsledok, ktorý sa doteraz nedal dosiahnuť štandardnými vakcínami s inaktivovaným celým vírusom alebo podjednotkovým proteínom.

Množstvo expresovateľnej DNA alebo transkribovanej RNA, ktoré sa má zaviesť do príjemcu vakcíny, bude závisieť od sily použitého transkripčného a translačného promótora a od imunogenicity expresovaného génového produktu. Vo všeobecnosti sa imunologický alebo profylaktický účinná dávka od asi 1 ng do 100 mg, s výhodou od asi 10 pg do 300 pg, podá priamo do svalového tkaniva. Podkožná injekcia, vnútrokožné zavedenie, vtlačenie cez kožu a iné spôsoby

-27podania, ako je intraperitoneálne, vnútrožilové alebo inhalačné podanie, sa taktiež predpokladajú. Tiež sa predpokladá, že sa budú uskutočňovať posilňovacie vakcinácie. Následná vakcinácia HIV polynukleotidovým imunogénom, posilnenie HIV proteínovými imunogénmi, ako sú gp160, gp120 a gag génové produkty, sa predpokladá taktiež. Parenterálne podanie, ako je vnútrožilové, vnútrosvalové, podkožné, alebo iné prostriedky podania interleukín-12-proteínu, súčasne alebo následne po parenterálnom zavedení PNV podľa tohto vynálezu, sú tiež výhodné.

Polynukleotid môže byť obnažený, to jest nespojený s akýmikoľvek proteínmi, adjuvans alebo inými činidlami, ktoré majú účinok na imunitný systém príjemcu. V tomto prípade je žiaduce, aby sa polynukleotid nachádzal vo fýziologicky prijateľnom roztoku, ako je, ale neobmedzujúc sa naň, sterilný fýziologický roztok alebo sterilný pufrovaný fyziologický roztok. Alternatívne môže byť DNA spojená s lipozómami, ako sú lecitínové lipozómy alebo iné lipozómy, známe v doterajšom stave techniky, ako je DNA-lipozómová zmes, alebo DNA môže byť spojená s adjuvans, známym v doterajšom stave techniky, na posilnenie imunitných odpovedí, ako je proteín alebo iný nosič. Činidlá, ktoré napomáhajú bunkovú absorpciu DNA, ako sú, ale neobmedzujúc sa na ne, kalciové ióny, sa tiež môžu použiť s výhodou. Na tieto činidlá sa tu vo všeobecnosti odvolávame ako na transfekciu uľahčujúce reagenty a farmaceutický prijateľné nosiče. Metódy obaľovania mikroprojektilov, obalených polynukleotidom, sú v doterajšom stave techniky známe a tiež sú užitočné v spojitosti s týmto vynálezom.

Nasledujúce príklady uvádzame na ilustráciu a nemajú nijakým spôsobom obmedziť tento vynález.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje stratégie expresie na báze HIV env kazety.

Obr. 2 znázorňuje DNA vakcínou sprostredkované anti-gp120 odpovede. Obr. 3 znázorňuje anti-gp120 ELISA titre séra DNA vakcinovaných myší.

Obr. 4 znázorňuje relatívnu expresiu gp120 po transfekcii HIV env PNV bunkovej kultúry.

-28Obr. 5 znázorňuje stredné anti-gp120 ELISA odpovede po tPA-gp143/optA verzus optB DNA vakcinácii.

Obr. 6 znázorňuje neutralizáciu HIV sérom z DNA vakcinovaných myší.

Obr. 7 znázorňuje HIV neutralizáciu sérom z HIV env DNA vakcinovaných myší.

Obr. 8 je imunoblotová analýza optimalizovaných HIV env DNA konštruktov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Opis materiálov

Vektory pF411 a pF412: Tieto vektory sa subklonovali z vektora pSP62, ktorý sa skonštruoval v R. Gallovom laboratóriu. pSP62 je činidlo, dostupné od Biotech Research Laboratories, Inc.. pSP62 má 12,5 kb Xbal fragment HXB2 genómu, subklonovaného z lambda HXB2. Sali a Xbal štiepenie pSP62 poskytuje HXB2 fragmenty: 5-Xbal/Sall, 6,5 kb, a 3-Sall/Xbal, 6 kb. Tieto inzerty sa subklonovali do pUC18 v Smal a Sali miestach, poskytujúc pF411 (5'-Xbal/Sa11) a pF412 (3‘Xbal/Sa1l). pF411 obsahuje gaglpola pF412 obsahuje tat/rev/env/nef.

Repligénové činidlá: rekombinantný rev (IIIB), #RP1024-10 rekombinantný gp120 (IIIB), #RP1001-10 anti-nev monoklonálna protilátka, #RP1029-10 anti-gp120 mAB, #1C1, #RP1010-10

Program AIDS výskumu a referenčných reagentov: anti-gp41 mAB hybridom, Chessie 8, #526

Stratégie sú navrhnuté tak, aby indukovali tak cytotoxický T-lymfocyt (CTL), ako aj neutralizujúce protilátkové odpovede na HIV, principiálne smerované na HIV gag (~ 95 % zachovaných) a env (gp160 alebo gp120; 70 až 80 % zachovaných)

-29génové produkty. gp160 obsahuje jediné známe neutralizujúce protilátkové epitopy na HIV častici, zatiaľ čo dôležitosť anti-env a anti-gag CTL odpovedí je zdôraznená známym spojením začiatku týchto bunkových imunít s odstránením primárnej virémie po infekcii, ktorá vzniká pred objavením sa neutralizujúcich protilátok, ako aj úlohou CTL pri udržiavaní nechorobného .stavu. Pretože HIV je notoricky známy svojou genetickou rôznorodosťou, dúfame, že dosiahneme väčšiu šírku neutralizujúcich protilátok včlenením niekoľkých reprezentatívnych env génov, získaných z klinických izolátov a gp41 (~ 90 % zachovaných), zatiaľ čo vysoko zachovaný gag gén by mal vyvolať široké CTL odpovede na skrížené kmene.

Príklad 2

Heterológna expresia HIV oneskorených génových produktov

HIV štruktúrne gény, ako env a gag, vyžadujú expresiu HIV regulačného génu, rev, aby účinne produkovali proteíny s plnou dĺžkou. Zistili sme, že od rev závislá expresia gag poskytovala nízke hladiny proteínu a že rev samotný môže byť pre bunky toxický. Hoci sme dosiahli pomerne vysoké hladiny od rev závislej expresie gp160 in vitro, táto vakcína vyvolala nízke hladiny protilátok voči gp160 po in vivo imunizácii pomocou rev/gp160 DNA. To môže vyplývať zo známych cytotoxických účinkov rev, ako aj zo zvýšenej obťažnosti pri dosahovaní rev funkcie v myotubuloch, obsahujúcich stovky jadier {rev protein musí byť v tom istom jadre ako od rev závislý transkript, aby došlo ku gag alebo env proteínovej expresii). Bolo však možné dosiahnuť od rev nezávislú expresiu, keď sa použili vybrané modifikácie env gén.gag. Vyhodnotenie týchto plazmidov na účely vakcín sa teraz vykonáva.

Vo všeobecnosti naše vakcíny využili najmä HIV (IIIB) env a gag gény na optimalizáciu expresie v našom zovšeobecnenom vakcinačnom vektore V1Jns, ktorý sa skladá z CMV okamžitého-skorého (IE) promótora, BGH polyadenylačného miesta a pUC chrbtice. V závislosti od toho, aký veľký génový segment sa použije (napríklad gp120 verzus gp160), pre env sa dajú dosiahnuť premenlivé účinnosti od rev nezávislej expresie nahradením jeho natívneho sekrečného vedúceho peptidu

-30peptidom z tkanivovo špecifického plazminogénového aktivátorového (tPA) génu a expresiou výsledného chimérického génu za CMVIE promótorom s CMV intrónom

A. tPA-gp120 je príkladom sekretovaného gp120 vektora, konštruovaného týmto spôsobom, ktorý funguje dostatočne dobre na to, aby vyvolal anti-gp120 imunitné odpovede u vakcinovaných myší a opíc.

V dôsledku správ o tom, že na membráne zakotvené proteíny môžu indukovať oveľa väčšie (a snáď pre HIV neutralizáciu Špecifickejšie) protilátkové odpovede v porovnaní so sekretovanými proteínmi, ako aj získať dodatočné imunitné epitopy, pripravili sme V1Jns-tPA-gp160 a V1Jns-rev/gp160. tPA-gp160 vektor vytvoril zistiteľné množstvá gp160 a gp120 bez pridania rev, ako ukázala imunoblotová analýza transfektovaných buniek, hoci hladiny expresie boli oveľa nižšie než hladiny, ktoré sa dosiahli pre rev/gp160, od rev závislý, gp160 expresujúci plazmid. To je pravdepodobne dôsledkom toho, že inhibičné oblasti (označené ako INS), ktoré udeľujú závislosť od rev gp160 transkriptu, sa vyskytujú v mnohopočetných miestach v gp160, vrátane COOH-konca GP41 (pozri ďalej schematicky). Pripravil sa vektor pre formu tPA-gp160, tPA-gp143, odseknutú na COOH-konci, ktorá sa navrhla na zvýšenie celkových hladín expresie env elimináciou týchto inhibičných sekvencií. gp143 vektor tiež eliminuje vnútrobunkové gp41 oblasti, obsahujúce peptidové motívy (ako je leu-leu), o ktorých je známe, že spôsobujú odvedenie membránových proteínov k lyzozýmom, a nie k povrchu bunky. Teda možno očakávať, že gp143 zvyšuje tak expresiu env proteínu (znížením závislosti od rev), ako aj účinnosť transportu proteínu k bunkovému povrchu v porovnaní s gp160 plnej dĺžky, kde tieto proteíny môžu byť lepšie schopné vyvolať anti-gp160 protilátky po DNA vakcinácii. tPA-gp143 sa ďalej modifikoval rozsiahlou latentnou mutagenézou sekvencie (350 bp) rev responzívneho prvku (RRE), aby sa eliminovali prídavné inhibičné sekvencie pre expresiu. Tento konštrukt, gp143/mutRRE, sa pripravil vo dvoch formách: buď eliminujúci (forma A) alebo zachovávajúci (forma B) miesta proteolytického štiepenia pre gp120/41. Obe formy sa pripravili kvôli správam z literatúry, že vakcinácia myší s použitím neštiepiteľného gp160, expresovaného pri kiahňach, vyvolala oveľa vyššie hladiny protilátok voči gp160 než štiepiteľné formy.

-31 Kvantitatívny ELISA test na gp160/gp120 expresiu v bunkových transfektantoch sa vyvinul na stanovenie relatívnych schopností expresie pre tieto vektory. In vitro transfekcia 293 buniek, po ktorej nasledovala kvantifikácia s bunkami spojeného verzus sekretovaného/uvoľneného gp120, poskytla nasledujúce výsledky: (1) tPA-gp160 expresoval 5 až 10 x menej gp120 než rev/gp160 s podobnými podielmi, zachovanými vnútrobunkovo verzus prenesenými na povrch bunky; (2) tPA-gp143 dal 3 až 6 x väčšiu sekréciu gp120 než rev/gp160 s len nízkymi hladinami s bunkami spojeného gp143, čo potvrdzuje, že cytoplazmatický chvost gp160 spôsobuje vnútrobunkové zadržanie gp160, ktorému sa dá vyhnúť čiastočným odstránením tejto sekvencie; a (3) tPA-gp143/mutRRE A a B dali ~10 x vyššie hladiny expresie proteínu než parenterálny tPA-gp143, zatiaľ čo eliminácia proteolytického spracovania sa potvrdila pre formu A.

Teda naša stratégia zvýšiť od rev nezávislú expresiu poskytla postupné zvýšenia celkovej expresie, ako aj presmerovanie na membránu zakotveného gp143 k bunkovému povrchu, preč od lyzozýmov. Je dôležité poznamenať, že by malo byť možné vložiť gp120 sekvencie, získané z rôznych vírusových izolátov vo vektorovej kazete, obsahujúcej tieto modifikácie, ktoré sa nachádzajú buď na NH₂konci (tPA vedúci reťazec) alebo COOH-konci (gp41), kde existuje málo antigénových rozdielov medzi rôznymi vírusovými kmeňmi. Inými slovami, toto je generický konštrukt, ktorý sa dá ľahko modifikovať vložením gp120, získaného z rôznych primárnych vírusových izolátov, aby sa získali klinicky významné vakcíny.

Aby sme aplikovali tieto stratégie expresie na vírusy, ktoré sú významné na účely vakcín, a na potvrdenie všeobecnosti našich prístupov sme tiež pripravili tPAgp120 vektor, získaný z primárneho HIV izolátu (obsahujúci severoamerickú concensus V3 peptidovú slučku; makrofágové-tropné a nonsyncýcium indukujúce fenotypy). Tento vektor poskytol vysokú expresiu/sekréciu gp120 s 293 transfektovanými bunkami a vyvolal anti-gp120 protilátky u myší, čo demonštruje, že bol klonovaný vo funkčnej forme. Gény primárneho izolátu gp160 sa tiež použijú na expresiu tým istým spôsobom ako pre gp160, získaný z laboratórnych kmeňov.

-32Príklad 3

Imunitné odpovede na HIV-1 env polynukleotidové vakcíny

Africké zelené opice (AGM) a makaky rézus (RHM), ktoré dostali gp120 DNA vakcíny, vykázali nízke hladiny neutralizujúcich protilátok po 2 až 3 vakcináciách, ktoré sa nedali zvýšiť ďalšou vakcináciou. Tieto výsledky, ako aj rastúce uvedomovanie si v oblasti HIV vakcín, že oligomérny gp160 je pravdepodobne významnejším cieľovým antigénom na vyvolanie neutralizujúcich protilátok než gp120 monoméry (Moore a Ho, J. Virol. 67, 863, 1993), nás viedli k tomu, aby sme sa sústredili na dosiahnutie účinnej expresie vektorov na báze gp160 (pozri vyššie). Myši a AGM sa tiež vakcinovali tPA-gp120 vakcínou, získanou z primárneho izolátu. Tieto zvieratá vykazovali anti-V3 peptidové (s použitím homológnej sekvencie) protilátkové titre v recipročnom koncovom bode v rozsahu 500 až 5000, demonštrujúc, že tento návrh vakcíny je funkčný pre klinicky významné vírusové izoláty.

Vakcíny na báze gp160, rev-gp160 a tPA-gp160 zlyhali z hľadiska konzistentného vyvolávania protilátkových odpovedí u myší a nie ľudských primátov, alebo poskytovali nízke protilátkové titre. Naše začiatočné výsledky s tPAgp143 plazmidom poskytli geometrické stredné titre > 10³ u myší a AGM po dvoch vakcináciách. Tieto údaje indikujú, že sme významne zlepšili imunogenicitu vakcín typu gp160 zvýšením hladín expresie. Tento konštrukt, ako aj tPA-gp143/mutRRE A a B vektory budeme charakterizovať ďalej na protilátkové odpovede, najmä na neutralizáciu vírusov.

Významné je, že gp120 DNA vakcinácia vyvolávala silné odpovede pomocných T-buniek vo všetkých lymfatických oddeleniach, ktoré sa testovali (slezinové, krvné, slabinové, mezenterické a iliacké uzliny) s T_H1-podobnými cytokínovými sekrečnými profilmi (t.j. produkcia g-interferónu a IL-2 s malým alebo žiadnym množstvom IL-4). Tieto cytokíny vo všeobecnosti podporujú silnú bunkovú imunitu a prisudzuje sa im udržiavanie nechorobného stavu u HlV-séropozitívnych pacientov. Ukázalo sa, že lymfatické uzliny sú primárnymi miestami pre HIV replikáciu, prechovávajúc veľké rezervoáre vírusu, dokonca aj keď sa vírus nedá

-33ľahko zistiť v krvi. Vakcína, ktorá môže vyvolať anti-HIV imunitnú odpoveď v rôznych lymfatických uzlinách, ako sme ukázali s našou DNA vakcínou, môže pomôcť zabrániť úspešnej kolonizácii lymfatických uzlín po začiatočnej infekcii.

Ako sme uviedli predtým, uvažujeme o uskutočnení nasledujúcich cieľov, ktoré sú podstatné pre maximalizáciu našich šancí na úspech s týmto programom:

(1) vektory na báze env, schopné vyvolávať silnejšie neutralizujúce protilátkové odpovede u primátov; (2) gag a env vektory, ktoré vyvolávajú silné T-lymfocytové odpovede, ako sú charakterizované funkciami CTL a pomocných efektorov u primátov; (3) použitie env a gag génov z klinicky významných HIV-1 kmeňov v našich vakcínach a charakterizácia imunologických odpovedí, najmä neutralizácie primárnych izolátov, ktoré vyvolávajú; (4) demonštrácia ochrany vo zvieracom modeli na vyvolanie odozvy, ako je šimpanz/HIV (IIIB) alebo rézus/SHIV, s použitím príslušných optimalizovaných vakcín; a (5) stanovenie trvania imunitných odpovedí, vhodných na klinické použitie. Významný pokrok sa urobil v prvých troch z týchto cieľov a uskutočňujú sa.experimenty na stanovenie, či sa naše súčasné vakcínové konštrukty pre gp160 a gag zlepšia po týchto začiatočných výsledkoch.

Príklad 4

Vektory na produkciu vakcíny

A. Vektor VUneo expresie

Bolo nevyhnutné odstrániť amp^r gén, používaný na výber antibiotika pre baktérie, prechovávajúce V1J, pretože ampicilín sa nemôže používať vo veľkokapacitných fermentoroch. Tento amp^r gén sa odstránil z pUC chrbtice V1J štiepením s Sspl a Eam1 1051 reštrikčnými enzýmami. Zvyšný plazmid sa čistil elektroforézou na agarózovom géli, zarovnali sa jeho konce T4 DNA polymerázou a potom sa naň pôsobilo teľacou črevnou alkalickou fosfatázou. Komerčne dostupný karí gén, získaný z transpozónu 903 a nachádzajúci sa v pUC4K plazmide, sa vysekol s použitím Pstl reštrikčného enzýmu, vyčistil elektroforézou na agarózovom géli a zarovnali sa jeho konce T4 DNA polymerázou. Tento fragment sa naviazal na

-34V1J chrbticu a získali sa plazmidy s karí génom v oboch orientáciách, ktoré sa označili ako VIJneo #1 a #3. Každý z týchto plazmidov sa potvrdil analýzou štiepením reštrikčnými enzýmami, DNA sekvenovaním spojovacích oblastí a ukázalo sa, že produkuje podobné množstvá plazmidu ako V1J. Expresia heterológnych génových produktov pre tieto VIJneo vektory bola tiež porovnateľná s V1J. Náhodne sme vybrali VUneo #3, ktorý budeme ďalej označovať ako VUneo, ktorý obsahuje karí gén v tej istej orientácii ako amp^r gén vo V1J, ako konštrukt expresie.

B. Vektory expresie V1 Jns

Sfi I miesto sa pridalo k VUneo na uľahčenie štúdií integrácie. Komerčne dostupná Sfi I spojka s 13 pármi báz (New England BioLabs) sa pridala v mieste Κρη I v BGH sekvencií vektora. VUneo sa linearizoval pomocou Κρη I, vyčistil sa na géli, zarovnal T4 DNA polymerázou a naviazal sa k zarovnanej Sfi I spojke. Klonálne izoláty sa vybrali reštrikčným mapovaním a verifikovali sa sekvenovaním cez spojku. Nový vektor sa označil ako VUns. Expresia heterológnych génov vo VUns (s Sfi I) bola porovnateľná s expresiou tých istých génov vo VUneo (s Kpn I).

C. VUns-tPA

Aby sa vytvorila heterológna vedúca peptidová sekvencia k sekretovaným a/alebo membránovým proteínom, VUn sa modifikoval, aby zahrnoval ľudský tkanivovo špecifický vedúci reťazec plazminogénového aktivátora (tPA). Dva syntetické komplementárne oligoméry sa spevnili a potom naviazali do VUn, ktorý sa natrávil Bg1ll. Súhlasne smerovými a protismerovými oligomérmi boli 5-GATC ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA-3', sekv. id.: 18:, a 5-GAT CTC GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GGT-3'. Kozákova sekvencia je podčiarknutá v súhlasne smerovom oligoméri. Tieto oligoméry majú prečnievajúce bázy, vhodné na naviazanie na Bg1 II štiepené sekvencie. Po naviazaní sa miesto

-35Bg1 II proti smeru transkripcie zničí, zatiaľ čo Bg1 II v smere transkripcie sa zachová pre nasledujúce naviazania. Tak spojovacie miesta, ako aj celá tPA vedúca sekvencia sa verifikovali DNA sekvenovaním. Naviac, aby sa prispôsobil nášmu, zhodne optimalizovanému vektoru V1Jns (=V1Jneo s Sfil miestom), reštrikčné miesto Sfil sa umiestnilo na KpnI miesto v BGH terminátorovej oblasti V1Jn-tPA zarovnaním KpnI miesta T4 DNA polymerázou s následným naviazaním s Sfil spojkou (katalóg #1138,. New England Biolabs). Táto modifikácia sa verifikovala reštrikčným štiepením a elektroforézou na agarózovom géli.

Príklad 5

HIV env vakcínové konštrukty

Vakcíny, produkujúce sekretovaný, od env odvodený antigén (gp120 a gp140)

Expresia od REV závislého env génu, ako gp120, sa viedla nasledujúcim spôsobom: gp120 sa PCR-klonoval z MN kmeňa HIV buď so sekvenciou natívneho vedúceho peptidu (V1Jns-gp120) alebo ako fúzia s vedúcim peptidom tkanivového plazminogénového aktivátora (tPA), nahradzujúca natívny vedúci peptid (V1JnstPA-gp120). Ukázalo sa, že tPA-gp120 expresia je od REV nezávislá [B. S. Chapman a kol., Nuc. Acids Res. 19, 3979, 1991; poznamenajme, že iné vedúce sekvencie by poskytli podobnú funkciu pri zachovaní gp120 génu nezávislým od REV]. Toto sa uskutočnilo prípravou nasledujúcich gp120 konštruktov, využívajúcich vyššie opísané vektory:

Príklad 6 gp120 vakcínové konštrukty

A. V1Jns-tPA-HIV_MNgp120

HIV_MNgp120 gén (Medimmune) sa PCR-amplifikoval s použitím oligomérov, navrhnutých na odstránenie prvých 30 aminokyselín peptidovej vedúcej sekvencie a na uľahčenie klonovania do V1Jns-tPA, vytvoriac chimérický proteín,

-36pozostávajúci z tPA vedúceho peptidu, nasledovaného zostávajúcou gp120 sekvenciou po aminokyselinovom zvyšku 30. Tento návrh umožňuje pre od REV nezávislý gp120 expresiu a sekréciu rozpustného gp120 z buniek, prechovávajúcich tento plazmid. Použitými súhlasne smerovými a protismerovými PCR oligomérmi boli 5'-CCC CGG ATC CTG ATC ACA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3' a 5'-C CCC AGG AATC CAC CTG TTA GCG CTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TCT C-3'. Translačný stop kodón je podčiarknutý. Tieto oligoméry obsahujú BamHI reštrikčné enzýmové miesta na každom konci translačného otvoreného čítacieho rámca s Bc11 miestom, umiestneným v 3' k BamHI súhlasne smerového oligoméru. PCR produkt sa sekvenčne štiepil s Bc1l, po ktorom nasledoval BamHI a naviazal sa do V1Jns-tPA, ktorý bol štiepený Bglll s následným pôsobením teľacou črevnou alkalickou fosfatázou. Výsledný vektor sa sekvenoval, aby sa potvrdila fúzia vnútri rámca medzi tPA vedúcou sekvenciou a gp120 kódujúcou sekvenciou, a gp120 expresia a sekrécia sa verifikovali imunoblotovou analýzou transfektovaných RB buniek.

B. V1Jns-tPA-HIV_lllBgp120

Tento vektor je analogický k I.A s výnimkou toho, že sa pre gp120 sekvenciu použil HIV IIIB kmeň. Použitými súhlasne smerovými a protismerovými PCR oligomérmi boli: 5'-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3', a 5-CCA CAT TGA TCA GAT ATC TTA TCT TTT TTC TCT CTG GAC CAC TCT TC-3’. Tieto oligoméry vytvárajú Bc1l miesta na každom konci inzertu, ako aj EcoRV hneď proti smeru transkripcie od Bc11 miesta na 3'-konci. 5-koncové Bc11 miesto umožňuje naviazanie k Bglll miestu V1Jns-tPA, aby sa vytvoril chimérický tPA-gp120 gén, kódujúci tPA vedúcu sekvenciu a gp120 bez jeho natívnej vedúcej sekvencie. Spojené produkty sa verifikovali reštrikčným štiepením a DNA sekvenovanim.

Príklad 7

Vakcínové konštrukty gp140

-37Tieto konštrukty sa pripravili pomocou PCR podobne ako tPA-gp120 s tPA vedúcim reťazcom namiesto natívneho vedúceho reťazca, ale navrhnutým tak, aby produkoval sekretovaný antigén okamžitým zakončením génu NH₂-koncom transmembránového peptidu (projektovaná karboxyterminálna aminokyselinová sekvencia = NH₂- ...... TNWLWYIK-COOH). Na rozdiel od gp120 produkujúcich konštruktov by gp140 konštrukty mali produkovať oligomérny antigén a zachovať známe, v gp41 obsiahnuté protilátkové neutralizačné epitopy, ako je ELDKWA, definované 2F5 monoklonálnou protilátkou.

Konštrukty sa pripravili vo dvoch formách (A alebo B) v závislosti od toho, či sa gp160 miesta proteolytického štiepenia na spoji gp120 a gp41 zachovali (B) alebo eliminovali (A) príslušnými aminokyselinovými substitúciami, ako opísali Kieny a kol. (Prot. Eng. 2, 219 až 255, 1998) (sekvencia prirodzeného typu = NH₂...KAKRRWQREKR...COOH a mutovaná sekvencia = NH₂-... KAQNHWQNEHQ ...COOH s mutovanými aminokyselinami podčiarknutými).

A. V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-A/SRV-1 3'-UTR (na báze HIV-1_IIIB)

Tento konštrukt sa získal pomocou PCR s použitím nasledujúcich súhlasne smerových a protismerových PCR oligomérov: 5'-CT GAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAAT TTG GGG TTG CTC TGG-3', sekv. id.: :, a 5'-CGC AGG GGA GGT GGT CTA GAT ATC TTA TTA TTT TAT ATA CCA CAG CCA ATT TGT TAT G-3¹, aby sa získal AvrlI/EcoRV segment z vektora IVB (obsahujúceho optimalizovaný RRE-A segment). 3-UTR, pripravený ako syntetický génový segment, ktorý sa získava zo Simianovho retrovírusu 1 (SRV-1, pozri ďalej), sa vložil do Srfl miesta reštrikčného enzýmu, zavedeného bezprostredne do 3'- gp140 otvoreného čítacieho rámca. Táto UTR sekvencia bola predtým opísaná ako uľahčujúca od rev nezávislú expresiu HIV env a gag.

B. V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-B/SRV-1 3'-UTR (na báze HIV-1 _IIIB)

Tento konštruk je podobný IIA s výnimkou toho, že env miesta proteolytického štiepenia sa zachovali s použitím konštruktu IVC ako východiskového materiálu.

C. V1Jns-tPA-gp140/opt30-A (na báze HIV-1m_B)

Tento konštrukt sa získal zo IVB pomocou štiepenia Avrll a Srfl reštrikčnými enzýmani s následným naviazaním syntetického DNA segmentu, zodpovedajúceho gp30, ale skladajúceho sa z optimálnych kodónov pre transláciu (pozri gp32-opt ďalej). gp30-opt DNA sa získal z gp32-opt PCR amplifikáciou s použitím nasledujúcich súhlasne smerových a protismerových oligomérov: 5-GGT ACA CCT AGG CAT CTG GGG CTG CTC TGG-3¹; a 5'-CCA CAT GAT ATC G CCC GGG C TTA TTA TTT GAT GTA CCA CAG CCA GTT GGT GAT G-3'. Tento DNA segment sa štiepil Avrll a EcoRV reštrikčnými enzýmami a naviazal sa do V1Jns-tPAgp143/opt32-A (IVD), ktorý bol štiepený pomocou Avrll a Srfl, aby sa odstránil zodpovedajúci DNA segment. Výsledné produkty sa verifikovali DNS sekvenovaním spojov naviazania a imunoblotovou analýzou.

D. V1Jns-tPA-gp140/opt30-B (na báze HIV-1,h_B)

Tento konštrukt je podobný IIC s výnimkou toho, že env miesta proteolytického štiepenia sa zachovali.

E. V1 Jns-tPA-gp140/opt all-A

Gén env tohto konštruktu sa skladá kompletne z optimálnych kodónov. Konštatné oblasti (C1, C5, gp32) sú tie, ktoré sú opísané v IVB, D, H s prídavným syntetickým DNA segmentom, zodpovedajúcim premenným oblastiam 1 až 5, ktorý sa vloží s použitím syntetického DNA segmentu, skladajúceho sa z optimálnych kodónov pre transláciu (pozri príklad ďalej na báze HIV-1 MN V1-V5).

F. V1 Jns-tPA-gp140/opt all-B

Tento konštrukt je podobný IIE s výnimkou toho, že env miesta proteolytického štiepenia sa zachovali.

G. V1 Jns-tPA-gp140/opt all-A (non-IIIB kmene)

-39Tento konštrukt je podobný IIE s výnimkou toho, že env aminokyselinové sekvencie z kmeňov iných než IIIB sa použijú na stanovanie použitia optimálnych kodónov v premenných (V1 až V5) oblastiach.

H. V1 Jns-tPA-gp140/opt all-B (non-IIIB kmene)

Tento konštrukt je podobný IIG s výnimkou toho, že env miesta proteolytického štiepenia sa zachovali.

Príklad 8

Vakcínové konštrukty gp160

Konštrukty sa pripravili vo dvoch formách (A alebo B) v závislosti od toho, či gp160 miesta proteolytického štiepenia sú, ako je opísané vyššie.

A. V1Jns-rev/env

Tento vektor je obmenou vektora, opísaného vyššie v odseku D, s výnimkou toho, že celá tat kódujúca oblasť v exóne 1 je odstránená až po začiatok REV otvoreného čítacieho rámca. V1Jns-gp160m_B (pozri odsek A vyššie) sa štiepil pomocou Pstl a Kpnl reštrikčnými enzýmami, aby sa odstránila 5-oblasť gp160 génu. PCR amplifikácia sa použila na získanie DNA segmentu, kódujúceho prvý REV exón až po Kpnl miesto v gp160 z HXB2 genómového klonu. Súhlasne smerovými a protismerovými PCR oligomérmi boli 5-GGT ACA CTG CAG TCA CCG TCC T ATG GCA GGA AGA AGC GGA GAC-3’ a 5-CCA TAT CA GGT ACC CCA TAA TAG ACT GTG ACC-3'. Tieto oligoméry poskytujú miesta Pstl a Kpnl reštrikčných enzýmov v 5’- a 3'- koncoch DNA fragmentu. Výsledná DNA sa štiepila pomocou Pstl a Kpnl, čistila z agarózového elektroforetického gélu a naviazala na V1Jns-gp160(Pstl/Kpnl). Výsledný plazmid sa verifikoval štiepením reštrikčnými enzýmami.

B. V1Jns-gp160

HIVm_bgp160 sa klonoval PCR amplifikáciou z plazmidu pF412, ktorý obsahuje 3'-koncovú polovicu HIV_ll)b genómu, získaného z HIV_mb klonu HXB2. PCR súhlasne

-40smerovými a protismerovými oligomérmi boli 5-GGT ACA TGA TCA ACC ATG AGA GTG AAG GAG AAA TAT CAG C-3' a 5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3'. Kozákova sekvencia a translačný stop kodón sú podčiarknuté. Tieto oligoméry poskytujú miesta Bc11 reštrikčného enzýmu mimo translačného otvoreného čítacieho rámca na oboch koncoch env génu. (Bc1l štiepené miesta sú kompatibilné pre naviazanie na Bglll štiepené miesta s následnou stratou citlivosti k obom reštrikčným enzýmom. Bc1l sa vybral na PCR klonovanie gp160, pretože tento gén obsahuje vnútorné Bglll, ako aj BamHI miesta.) Protismerový oligomér tiež vloží EcoRV miesto tesne pred Bc1l miesto, ako sme opísali vyššie pre iné pomocou PCR získané gény. Amplifikovaný gp160 gén sa čistil agarózovým gélom, štiepil Bc1l a naviazal na V1Jns, ktorý bol štiepený Bglll a pôsobilo sa naň teľacou črevnou alkalickou fosfatázou. Klonovaný gén mal veľkosť asi 2,6 kb a každý spoj gp160 s V1 Jns sa potvrdil DNA sekvenovaním.

C. V1Jns-tPA-gp160 (na báze HIV-1m_B)

Tento vektor je podobný vyššie uvedenému príkladu 1 (C) s výnimkou toho, že plná dĺžka gp160 bez natívnej vedúcej sekvencie sa získala pomocou PCR. Súhlasne smerový oligomér bol ten istý, ako sa použil v I.C, a protismerovým oligomérom bol 5-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3*. Tieto oligoméry poskytujú Bc11 miesta na každom konci inzertu, ako aj EcoRV hneď za Bc1l miestom proti smeru translácie na 3-konci. 5'-koncové Bc1l miesto umožňuje naviazanie na Bglll miesto V1Jns-tPA, aby sa vytvoril chimérický tPA-gp160 gén, kódujúci tPA vedúcu sekvenciu a gp160 bez jeho natívnej vedúcej sekvencie. Produkty naviazania sa verifikovali reštrikčným štiepením a DNA sekvenovaním.

D. V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-A (na báze HIV-1_IIIB)

Tento konštrukt bol založený na IVH, ktorý mal kompletný optimalizovaný kodónový segment pre C5 a gp41, nie pre gp32, s prídavným optimalizovaným kodónovým segmentom (pozri ďalej), nahradzujúcim C1 na amino-konci gp120 za tPA vedúcou sekvenciou. Nový C1 segment sa spojil so zvyšným gp143

-41 segmentom cez SOE PCR, použijúc nasledujúce oligoméry pre PCR na syntetizovanie spojeného C1/143 segmentu: 5-CCT GTG TGT GAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3'. Výsledný gp143 gén obsahuje optimálne kodónové využitie s výnimkou V1 až V5 oblastí a má jedinečné Pmel miesto reštrikčného enzýmu umiestnené v spoji C1 a V1 na vloženie premenných oblastí z iných HIV génov.

E. V1 Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-B (na báze HIV-1 m_B)

Tento konštrukt je podobný IIID s výnimkou toho, že env miesta proteolytického štiepenia sa zachovali.

F. V1 Jns-tPA-gp160/opt all-A (na báze HIV-1_IIIB) env gén tohto konštruktu sa skladá kompletne z optimálnych kodónov, ako je opísané vyššie. Konštantné oblasti (C1, C5, gp32) sú tie, opísané v IIID, E, ktoré sú použité ako kazeta (použité pre všetky kompletne optimalizované gp160), zatiaľ čo premenné oblasti V1 až V5 sú získané zo syntetického DNA segmentu, skladajúceho sa z optimálnych kodónov.

G. V1Jns-tPA-gp160/opt all-B

Tento konštrukt je podobný IIIF s výnimkou toho, že env miesta proteolytického štiepenia sa zachovali.

H. V1Jns-tPA-gp160/opt all-A (non-IIIB kmene)

Tento konštrukt je podobný IIIF s výnimkou toho, že env aminokyselinové sekvencie z kmeňov iných než IIIB sa použili na stanovenie optimálneho využitia kodónov v celých premenných (V1 až V5) oblastiach.

I. V1Jns-tPA-gp160/opt all-B (non-IIIB kmene)

Tento konštrukt je podobný IIIH s výnimkou toho, že env miesta proteolytického štiepenia sa zachovali.

-42Príklad 9

Vakcínové konštruky gp143

Tieto konštrukty sa pripravili pomocou PCR podobne ako iné tPA obsahujúce konštrukty, opísané vyššie (tPA-gp120, tPA-gp140 a tPA-gp160), s tPA vedúcim reťazcom namiesto natívneho reťazca, ale navrhnuté tak, aby produkovali COOH zakončený, na membránu viazaný env (projektovaná vnútrobunková aminokyselinová sekvencia = NH₂-NRVRQGYSP-COOH). Tento konštrukt sa navrhol za účelom skombinovania zvýšenej expresie env, sprevádzajúcej zavedenie tPA, a minimalizácie možnosti, že transkripčná alebo peptidová oblasť, zodpovedajúca vnútrobunkovej časti env, by mohla negatívne ovplyvniť expresiu alebo stabilitu/transport proteínu k povrchu bunky. Konštrukty sa pripravili vo dvoch formách (A alebo B) v závislosti od toho, či sa gp160 miesta proteolytického štiepenia odstránili alebo zachovali, ako sme opísali vyššie. Zvyškový gp41 fragment, ktorý je výsledkom odseknutia z gp143, sa označuje ako gp32.

A. V1Jns-tPA-gp143

Tento konštrukt sa pripravil pomocou PCR s použitím plazmidu pF412 s nasledujúcimi súhlasne smerovými a protismerovými PCR oligomérmi: 5-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3', sekv. id.::, a 5-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3'. Výsledný DNA segment obsahuje Bc11 reštrikčné miesta na každom konci na klonovanie do V1Jns-tPA/Bg1ll, štiepeného s Srfl miestom, umiestneným bezprostredne za 3'- k env otvorenému čítaciemu rámcu. Konštrukty sa verifikovali DNA sekvenovaním spojov naviazania a imunoblotovou analýzou transfektovaných buniek.

B. V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-A

Tento konštrukt bol na báze IVA odseknutím DNA segmentu, použijúc jedinečné Munl miesto reštrikčného enzýmu a Srfl miesto v smere transkripcie, opísané vyššie. Tento segment zodpovedá časti gp120 C5 domény a celému gp32.

-43Syntetický DNA segment, zodpovedajúci ~ 350 bp z rev responzívneho prvku (RRE A) gp160, skladajúceho sa z optimálnych kodónov pre transláciu, sa spojil so zvyšným gp32 segmentom zostrihovým prekryvovým rozširovacím (SOE) PCR, vytvárajúcim Avrll miesto reštrikčného enzýmu na spoji oboch segmentov (ale so žiadnymi zmenami v aminokyselinovej sekvencii). Tieto PCR reakcie sa uskutočnili s použitím nasledujúcich súhlasne smerových a protismerových PCR oligomérov na vytvorenie gp32 obsahujúcej domény: 5'-CT GAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAT TTG GGG TTG CTG TGG-3' a 5'-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3' (ktorý sa použil ako protismerový oligomér pre IVA). Mutovaný RRE (mutRRE-A) segment sa spojil so sekvenciou prirodzeného typu gp32 pomocou SOE PCR s použitím nasledujúceho súhlasne smerového oligoméru, 5-GGT ACA CAA TTG GAG GAG CGA GTT ATA TAA ΑΤΑ TAA G-3', a protismerového oligoméru, použitého na vytvorenie gp32 segmentu. Výsledný spojený DNA segment sa štiepil Munl a Srfl reštrikčnými enzýmami a naviazal sa do materského gp143/Munl/Srfl štiepeného plazmidu. Výsledný konštrukt sa verifikoval DNA sekvenovaním naviazania a SOE PCR spojov a imunoblotovou analýzou transfektovaných buniek.

C. V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-B

Tento konštrukt je podobný IVB s výnimkou toho, že env miesta proteolytického štiepenia sa zachovali s použitím mutRRE-B syntetického génového segmentu namiesto mutRRE-A.

D. V1Jns-tPA-gp143/opt32-A

Tento konštrukt sa získal zo IVB štiepením Avrll a Srfl reštrikčnými enzýmami s následným naviazaním syntetického DNA segmentu, zodpovedajúceho gp32, ale skladajúceho sa z optimálnych kodónov pre transláciu (pozri gp32 opt ďalej). Výsledné produkty sa verifikovali DNA sekvenovaním spojov naviazania a imunoblotovou analýzou.

E. V1Jns-tPA-gp143/opt32-B

Tento konštrukt je podobný IVD s výnimkou toho, že env miesta proteolytického štiepenia sa zachovali s použitím IVC ako začiatočného plazmidu.

G. V1Jns-tPA-gp143/SRV-1 3'-UTR

Tento konštrukt je podobný IVA s výnimkou toho, že 3'-UTR, získaný zo Simianovho retrovírusu 1 (SRV-1, pozri ďalej), sa vložil do Srfl miesta reštrikčného enzýmu, zavedeného bezprostredne za 3'- gp143 otvoreného čítacieho rámca. Táto UTR sekvencia bola opísaná už predtým ako uľahčujúca od rev nezávislú expresiu HIV env a gag.

H. V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32A

Tento konštrukt sa zakladal na IVD, majúc kompletný optimalizovaný kodónový segment pre C5 a gp32 s ďalším optimalizovaným kodónovým segmentom (pozri ďalej), nahradzujúcim C1 na amino konci gp120 za tPA vedúcim reťazcom. Nový C1 segment sa spojil so zvyšným gp143 segmentom cez SOE PCR, použijúc nasledujúce oligoméry pre PCR na syntetizovanie spojeného C1/143 segmentu: 5-CCT GTG TGT GAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3'. Výsledný gp143 gén obsahuje optimálne kodónové využitie s výnimkou V1 až V5 oblastí a má jedinečné Pmel miesto reštrikčného enzýmu, umiestnené na spoji C1 a V1 na vloženie premenných oblastí z iných HIV génov.

I. V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32B

Tento konštrukt je podobný IVH s výnimkou toho, že env miesta proteolytického štiepenia sa zachovali.

J. V1Jns-tPA-gp143/opt all-A env gén tohto konštruktu sa skladá kompletne z optimálnych kodónov. Konštantné oblasti (C1, C5, gp32) sú tie, ktoré boli opísané v 4B, D, H, s ďalším syntetickým DNA segmentom, zodpovedajúcim premenným oblastiam V1 až V5,

-45vloženým s použitím syntetického DNA segmentu, skladajúceho sa z optimálnych kodónov pre transláciu.

K. V1 Jns-tPA-gp143/opt all-B

Tento konštrukt je podobný IVJ s výnimkou toho, že env miesta proteolytického štiepenia sa zachovali.

L. V1 Jns-tPA-gp143/opt all-A (non-IIIB kmene)

Tento konštrukt je podobný IIIG s výnimkou toho, že env aminokyselinové sekvencie z kmeňov iných než IIIB sa použili na stanovenie optimálneho využitia kodónov v celých premenných (V1 až V5) oblastiach.

M. V1Jns-tPA-gp143/opt all-B (non-IIIB kmene)

Tento konštrukt je podobný IIIG··s výnimkou toho, že env aminokyselinové sekvencie z kmeňov iných, než IIIB sa použili na stanovenie optimálneho využitia kodónov v celých premenných (V1 až V5) oblastiach.

Príklad 10 gp143/glyB vakcínové konštrukty

Tieto konštrukty sa pripravili pomocou PCR podobne ako iné, tPA obsahujúce konštrukty, opísané vyššie (tPA-gp120, tPA-gp140, tPA-gp143 a tPAgp160), s tPA vedúcim reťazcom namiesto natívneho reťazca, ale navrhnuté tak, aby produkovali COOH zakončený, na membránu viazaný env, ako s gp143. Avšak gp143/glyB konštrukty sa líšia od gp143 tým, že zo šiestich aminokyselín, projektovaných, aby tvorili vnútrobunkovú peptidovú doménu, posledné štyri sú tie isté, ako sú na karboxylovom konci ľudského glykoforín B (glyB) proteinu (projektovaná vnútrobunková aminokyselinové sekvencia = ΝΗ-,-NRLIKA-COOH s podčiarknutými zvyškami, zodpovedajúcimi glyB a R, spoločným pre env a glyB). Tento konštrukt sa navrhol za účelom získania ďalšej env expresie a cieleného smerovania na povrch bunky úplnou elimináciou akejkoľvek transkripčnej alebo

-46peptidovej oblasti, zodpovedajúcej vnútrobunkovej časti env, ktorá by mohla negatívne ovplyvniť expresiu alebo stabilitu/transport proteínu k povrchu bunky nahradením tejto oblasti peptidovou sekvenciou z hojne expresovaného proteínu (glyB), ktorý má krátku cytoplazmatickú doménu (vnútrobunková aminokyselinová sekvencia = NH₂-RRLIKA-COOH). Konštrukty sa pripravili vo dvoch formách (A alebo B) v závislosti od toho, či sa gp160 miesta proteolytického štiepenia odstránili alebo zachovali, ako sme opísali vyššie.

A. V1Jns-tPA-gp143/opt32-A/glyB

Tento konštrukt je ten istý ako IVD s výnimkou toho, že na nahradenie vnútrobunkovej peptidovej domény gp143 doménou z glykoforínu B, ako sme opísali vyššie, sa použil nasledujúci protismerový PCR oligomér: 5'-CCA CAT GAT ATC G CCC GGG C TTA TTA GGC CTT GAT CAG CCG GTT CAC AAT GGA CAG CAC AGC-3'.

B. V1Jns-tPA-gp143/opt32-B/glyB

Tento konštrukt je podobný VA s výnimkou toho, že env miesta proteolytického štiepenia sa zachovali.

C. V1 Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-A/glyB

Tento konštrukt je ten istý ako VA s výnimkou toho, že prvá konštantná oblasť (C1) gp120 sa nahradí optimálnymi kodónmi pre transláciu ako pri IVH.

D. V1 Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-B/glyB

Tento konštrukt je podobný VC s výnimkou toho, že env miesta proteolytického štiepenia sa zachovali.

E. V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB env gén tohto konštruktu sa skladá kompletne z optimálnych kodónov, ako sme opísali vyššie.

F. V1 Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB

Tento konštrukt je podobný VE s výnimkou toho, že env miesta proteolytického štiepenia sa zachovali.

G. V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB (non-IIIB kmene)

Tento konštrukt .je podobný IIIG s výnimkou toho, že env aminokyselinové sekvencie z kmeňov iných než IIIB sa použili na stanovenie optimálneho využitia kodónov v premenných (V1 až V5) oblastiach.

H. V1 Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB (non-IIIB kmene)

Tento konštrukt je podobný VG s výnimkou toho, že env miesta proteolytického štiepenia sa zachovali.

HIV em/vakcinové konštrukty s odstráneniami premenných slučiek

Tieto konštrukty môžu zahrnovať všetky env formy, uvedené vyššie (gp120, gp140, gp143, gp160, gp143/glyB), ktoré ale mali premenné slučky v gp120 oblasti, odstránenej počas prípravy (napríklad V1, V2 a/alebo V3). Cieľom týchto modifikácií je eliminovať peptidové segmenty, ktoré môžu blokovať expozíciu zachovaných neutralizačných epitopov, ako je CD4 viažuce miesto. Napríklad, nasledujúci oligomér sa použil v PCR reakcii na vytvorenie V1/V2 odstránenia, ktoré vedie k spojeniu THE C1 a C2 segmentov: 5-CTG ACC CCC CTG TGT GTG GGG GCT GGC AGT TGT AAC ACC TCA GTC ATT ACA CAG-3'.

Príklad 11

Návrh syntetických génových segmentov na zvýšenú expresiu env génu

Génové segmenty sa konvertovali na sekvencie, ktoré majú identické sekvencie, prenesené transláciou (okrem prípadov, kde je uvedené ináč), ale s alternatívnym využitím kodónov, ako definoval R. Lathe vo výskumnom článku v J. Molec. Biol. 183. 1-12, 1985 s nadpisom Syntetické oligonukleotidové vzorky, odvodené z údajov o aminokyselinovej sekvencii: Teoretické a praktické úvahy.

-48Metodika, opísaná ďalej, na zvýšenie od rev nezávislej expresie HIV env génových segmentov sa zakladala na našej hypotéze, že známa neschopnosť účinne expresovať tento gén v bunkách cicavcov je dôsledkom celkového zloženia transkriptov. Teda použitie alternatívnych kodónov, kódujúcich tú istú proteínovú sekvenciu, môže odstrániť obmedzenia env expresie v neprítomnosti rev. Kontrola využitia kodónov v env odhalila, že vysoké percento kodónov bolo medzi tými, ktoré sa zriedka využívajú vysoko expresovanými ľudskými génmi. Použitú metódu špecifickej náhrady kodónov môžeme opísať nasledovne s použitím údajov z práce Latheakol.:

1. Identifikácia umiestnenia kodónov pre príslušný otvorený čítací rámec.

2. Porovnanie kodónu prirodzeného typu s pozorovanou frekvenciou použitia ľudskými génmi (pozri tabuľku 3 v Lathe a kol.).

3. Ak kodón nie je najčastejšie používaný, nahradí sa optimálnym kodónom na vysokú expresiu na základe údajov z tabuľky 5.

4. Skontrolovanie tretieho nukleotidu nového kodónu a prvého nukleotidu susediaceho kodónu bezprostredne za 3'- prvého. Ak sa výberom nového kodónu vytvorilo párovanie 5'-CG-3', nahradí sa výberom, naznačeným v tabuľke 5.

5. Opakovanie tohto postupu, kým sa nenahradil celý génový segment.

6. Skontrolovanie novej génovej sekvencie na prítomnosť nežiaducich sekvencií, vytvorených týmito náhradami kodónov (napríklad ATTTA sekvencie, neúmyselné vytvorenie miest rozpoznávania intrónového zostrihávania, nechcené miesta reštrikčných enzýmov, atď.), nahradenie kodónmi, ktoré eliminujú tieto sekvencie.

7. Zostavenie syntetických génových segmentov a ich testovanie na zlepšenú expresiu.

Tieto metódy sa použili na vytvorenie nasledujúcich syntetických génových segmentov pre HIV env, vytvoriac gén, ktorý sa celý skladá z optimálne využitých kodónov na expresiu: (i) gp120-C1 (opt); (ii) V1-V5 (opt); (iii) RRE-A/B (mut alebo opt); a (iv) gp30 (opt) s percentami náhrad kodónov/substitúciami nukleotidov 56/19, 73/26, 78/28 a 61/25, získanými pre každý segment. Každý z týchto segmentov bol podrobne opísaný vyššie a aktuálne sekvencie sú uvedené ďalej.

-49gp120-C1 (opt)

Toto je génový segment gp120 s konštantnou oblasťou 1 (C1), ktorý bol navrhnutý tak, že má od zrelého N-konca po začiatok V1 optimálne využitie kodónov na expresiu.

TGATCACAGA GAAGCTGTGG GTGACAGTGT ATTATGGCGT GCCAGTCTGG

AAGGAGGCCA CCACCACCCT GTTCTGTGCC TCTGATGCCA AGGCCTATGA

101 CACAGAGGTG CACAATGTGT GGGCCACCCA TGCCTGTGTG CCCACAGACC

151 CCAACCCCCA GGAGGTGGTG CTGGTGAATG TGACTGAGAA CTTCAACATG

201 TGGAAGAACA ACATGGTGGA GCAGATGCAT GAGGACATCA TCAGCCTGTG

251 GGACCAGAGC CTGAAGCCCT GTGTGAAGCT GACCCCCCTG TGTGTGAGTT

301 TAAAC

MN V1-V5 (opt)

Toto je génový segment, zodpovedajúci získanej proteínovej sekvencii pre HIV MN V1-V5 (1066BP), ktorý má optimálne využitie kodónov na expresiu.

1	AGTTTAAACT GCACAGACCT GAGGAACACC ACCAACACCA ACAACTCCAC
51	AGCCAACAAC AACTCCAACT CCGAGGGCAC CATCAAGGGG GGGGAGATGA
101	AGAACTGCTC CTTCAACATC ACCACCTCCA TCAGGGACAA GATGCAGAAG
151	GAGTATGCCC TGCTGTACAA GCTGGACATT GTGTCCATTG ACAATGACTC
201	CACCTCCTAC AGGCTGATCT CCTGCAACAC CTCTGTCATC ACCCAGGCCT
251	GCCCCAAAAT CTCCTTTGAG CCCATCCCCA TCCACTACTG TGCCCCTGCT
301	GGCTTTGCCA TCCTGAAGTG CAATGACAAG AAGTTCTCTG GCAAGGGCTC

CTGCAAGAAT	GTGTCCACAG	TGCAGTGCAC	ACATGGCATC	AGGCCTGTGG
TGTCCACCCA	GCTGCTGCTG	AATGGCTCCC	TGGCTGAGGA	GGAGGTGGTC
ATCAGGTCTG	AGAACTTCAC	AGACAATGCC	AAGACCATCA	TCGTGCACCT
GAATGAGTCT	GTGCAGATCA	ACTGCACCAG	GCCCAACTAC	AACAAGAGGA
AGAGGATCCA	CATTGGCCCT	GGCAGGGCCT	TCTACACCAC	CAAGAACATC
ATTGGCACCA	TCAGGCAGGC	CCACTGCAAC	ATCTCCAGGG	CCAAGTGGAA
TGACACCCTG	AGGCAGATTG	TGTCCAAGCT	GAAGGAGCAG	TTCAAGAACA
AGACCATTGT	GTTCAÄCCAG	TCCTCTGGGG	GGGACCCTGA	GATTGTGATG
CACTCCTTCA	ACTGTGGGGG	GGAGTTCTTC	TACTGCAACA	PCTCCCCCCT
GTTCAACTCC	ACCTGGAATG	GCAACAACAC	CTGGAACAAC	ACCACAGGCT
CCAACAACAA	CATCACCCTC	CAGTGCAAGA	TCAAGCAGAT	CATCAACATG
TGGCAGGAGG	TGGGCAAGGC	CATGTATGCC	CCCCCCATTG	AGGGCCAGAT
CAGGTGCTCC	TCCAACATCA	CAGGCCTGCT	GCTGACCAGG	GATGGGGGGA
AGGACACAGA	CACCAACGAC	ACCGAAATCT	TCAGGCCTGG	GGGGGGGGAC

ATGAGGGACA ATTGG

-51 RRE.Mut (A)

Toto je DNA segment, zodpovedajúci rev responzívnemu prvku (RRE) HIV-1, skladajúci sa z optimálneho využitia kodónov na expresiu. A forma tiež odstránila známe miesta proteolytického štiepenia na gp120/gp41 spoji s použitím nukleotidov, označných tučným písmom.

GACAATTGGA GGAGCGAGTT ATATAAATAT AAGGTGGTGA AGATTGAGCC

CCTGGGGGTG GCCCCAACAA AAGCTCAGAACCACGTGGTG CAGAACGAGC

101	ACCAGGCCGT GGGCATTGGG GCCCTGTTTC TGGGCTTTCT GGGGGCTGCT
151	GGCTCCACAA TGGGCGCCGC TAGCATGACC CTCACCGTGC AAGCTCGCCA
201	GCTGCTGAGT GGCATCGTCC AGCAGCAGAA CAACCTGCTC CGCGCCATCG
251	AAGCCCAGCA GCACCTCCTC CAGCTGACTG TGTGGGGGAT CAAACAGCTT
301	CAGGCCCGGG TGCTGGCCGT CGAGCGCTAT CTGAAAGACC AGCAACTCCT
351	AGGC

RRE.Mut (B)

Toto je DNA segment, zodpovedajúci rev responzívnemu prvku (RRE) HIV-1, skladajúci sa z optimálneho využitia kodónov na expresiu. B forma zachováva známe miesta proteolytického štiepenia na gp120/gp41 spoji.

GACAATTGGA GGAGCGAGTT ATATAAATAT AAGGTGGTGA AGATTGAGCC

CCTGGGGGTG GCCCCAACAA AAGCTAAGAGAAGAGTGGTG CAGAGAGAGA

101 AGAGAGCCGT GGGCATTGGG GCCCTGTTTC TGGGCTTTCT GGGGGCTGCT

151 GGCTCCACAA TGGGCGCCGC TAGCATGACC CTCACCGTGC AAGCTCGCCA

201 GCTGCTGAGT GGCATCGTCC AGCAGCAGAA CAACCTGCTC CGCGCCATCG

-52251 AAGCCCAGCA GCACCTCCTC CAGCTGACTG TGTGGGGGAT CAAACAGCTT

301 CAGGCCCGGG TGCTGGCCGT CGAGCGCTAT CTGAAAGACC AGCAACTCCT

351 AGGC gp32 (opt)

Toto je gp32 génový segment od Avrll miesta (začínajúc bezprostredne na konci RRE) po koniec gp143, skladajúci sa z optimálnych kodónov na expresiu.

CCTAGGCA TCTGGGGCTG CTCTGGCAAG CTGATCTGCA CCACAGCTGT

51	GCCCTGGAAT	GCCTCCTGGT	CCAACAAGAG	CCTGGAGCAA	ATCTGGAACA
101	ACATGACCTG	GATGGAGTGG	GACAGAGAGA	TCAACAACTA	CACCTCCCTG
151	ATCCACTCCC	TGATTGAGGA	GTCCCAGAAC	CAGCAGGAGA	AGAATGAGCA
201	GGAGCTGCTG	GAGCTGGACA	AGTGGGCCTC	CCTGTGGAAC	TGGTTCAACA
251	TCACCAACTG	GCTGTGGTAC	ATCAAAATCT	TCATCATGAT	TGTGGGGGGC
301	CTGGTGGGGC	TGCGGATTGT	CTTTGCTGTG	CTGTCCATTG	TGAACCGGGT
351	GAGACAGGGC	TACTCCCCCT	AATAAGCCCG	GGCGATATC

SRV-1 CTE (A)

Toto je syntetický génový segment, zodpovedajúci 3-UTR z genómu Simianovho retrovírusu 1. Táto DNA je umiestnená v nasledujúcej orientácii na 3'konci HIV génov na zvýšenie od rev nezávislej expresie.

Srfl EooRV

5'-GCCC GGGC GATATC TA GACCACCTCC CCTGCGAGCT AAGCTGGACA

GCCAATGACG GGTAAGAGAG TGACATTTTT CACTAACCTA AGACAGGAGG

GCCGTCAGAG CTACTGCCTA ATCCAAAGAC GGGTAAAAGT GATAAAAATG

-53TATCACTCCA ACCTAAGACA GGCGCAGCTT CCGAGGGATT TGTCGTCTGT

TTTATATATA TTjCAAAAGGG TGACCTGTCC GGAGCCGTGC TGCCCGGATG

ATGTCTTGG GATATC GCCC GGGC -3 '

EcoRV Srfl

SRV-1 CTE (B)

Tento syntetický génový segment je identický s SRV-1 CTE (A), uvedeným vyššie, s výnimkou toho, že sa použila jediná nukleotidová mutácia (označená tučným písmom) na eliminovanie ATTTA sekvencie. Táto sekvencia sa spájala so zvýšeným mRNA zvratom.

Srfl EcoRV

5'-GCCC GGGC GATATC TA GACCACCTCC CCTGCGAGCT AAGCTGGACA

GCCAATGACG GGTAAGAGAG TGACATTTTT CACTAACCTA AGACAGGAGG

GCCGTCAGAG CTACTGCCTA ATCCAAAGAC GGGTAAAAGT GATAAAAATG

TATCACTCCA ACCTAAGACA GGCGCAGCTT CCGAGGGATT TGTCGTCTGT

TTTATATATA TT&AAAAGGG TGACCTGTCC GGAGCCGTGC TGCCCGGATG

ATGTCTTGG GATATC GCCC GGGC -3 ¹

EcoRV Srfl

Príklad 11

Expresia gp120 vakcíny in vitro

In vitro expresia sa testovala v transfektovaných bunkách ľudského rabdomyosarkómu (RD) pre tieto konštrukty. Kvantifikácia sekretovaného tPAgp120 z transfektovaných RD buniek ukázala, že V1Jns-tPA-gp120 vektor produkoval sekretovaný gp120.

-54ln vivo gp120 vakcinácia

Údaje pre myši (Obr. 12):

V1Jns-tPA-gp120_MNPNV-indukované MHC triedy II obmedzené Tlymfocytové gp120 špecifické antigénové reaktivity.

Balb/c myši, ktoré sa vakcinovali dvakrát 200 pg V1Jns-tPA-gp120_MN, sa utratili a ich sleziny sa extrahoval i na in vitro stanovenie reaktivity pomocných T-lymfocytov na rekombinantný gp120. Štúdie T-bunkovej proliferácie sa uskutočnili s PBMC (periférnymi krvnými jednojadrovými bunkami), použijúc rekombinantný gp120_mB (Repligen, katalóg #RP1016-20) pri 5 gg/ml so 4 x 10⁵ bunkami/ml. Bazálne hladiny absorpcie ³H-tymidínu týmito bunkami sa získali kultiváciou buniek v samotnom médiu, zatiaľ čo maximálna proliferácia sa indukovala použitím ConA stimulácie pri 2 pg/ml. ConA-indukované reaktivity vrcholia pri ~ 3 dňoch a odobrali sa v tomto okamihu so vzorkami kontroly s médiom, zatiaľ čo vzorky, na ktoré sa pôsobilo antigénom, sa odobrali po 5 dňoch s ďalšou kontrolou s médiom. Odpovede vakcinovaných myší sa porovnali s geneticky totožnými myšami rovnakého veku, s ktorými sa ešte neuskutočnil žiadny pokus. Ako sa očakávalo, ConA pozitívne kontroly poskytli veľmi vysokú proliferáciu tak pre myši, s ktorými sa ešte neuskutočnil žiadny pokus, ako aj pre imunizované myši. Veľmi silné pamäťové odpovede pomocných T-buniek sa dosiahli pôsobením gp120 u vakcinovaných myši, zatiaľ čo myši, s ktorými sa ešte neuskutočnil žiadny pokus, neodpovedali (prahom pre špecifickú reaktivitu je stimulačný index (SI) > 3 až 4; SI sa počíta ako pomer vzorka počet impulzov za minútu/médium počet impulzov za minútu). SI 65 a 14 sa získali pre vakcinované myši, čo je porovnateľné s antigp120 ELISA titrami 5643 a 11 900 pre tieto myši. Je zaujímavé, že pre tieto dve skupiny myší skupina s vyššou odpoveďou pre protilátky vykázala významne nižšiu T-bunkovú reaktivitu než skupina, ktorá mala nižší protilátkový titer. Tento pokus demonštruje, že sekretovaný gp120 vektor účinne aktivuje pomocné T-bunky in vivo, ako aj vyvoláva silné protilátkové odpovede. Naviac, každá z týchto imunitných

-55odpovedí sa určila s použitím antigénu, ktorý bol heterológny v porovnaní s tým, ktorý bol kódovaný očkovaním PNV (IIIB verzus MN).

Príklad 12 gp160 vakcíny

Okrem sekretovaných gp120 konštruktov sme pripravili konštrukty expresie pre gp160 s plnou dĺžkou, viazaný na membránu. Logickými dôvodmi pre gp160 konštrukt popri gp120 sú, že (1) viac epitopov je k dispozícii tak pre CTL stimuláciu, ako aj pre produkciu neutralizujúcich protilátok, vrátane gp41, proti ktorému je smerovaná silná, HIV neutralizujúca monoklonálna protilátka (2F5, pozri vyššie); (2) dá sa získať natívnejšia proteínová štruktúra vzhľadom na vírusom produkovaný gp160; a (3) úspech na membránu viazaných chrípkových HA konštruktov pre imunogenicitu [Ulmer a koľ, Science 259, 1745 až 1749, 1993; Montgomery D. a kol., DNA and Celí Biol. 12, 777 až 783, 1993]. gp160 si zachováva podstatnú závislosť od REV dokonca i s heterológnou vedúcou peptidovou sekvenciou, takže sa urobili ďalšie konštruktyna zvýšenie expresie v neprítomnosti REV.

Príklad 13

Test na Hiv cytotoxické T-lymfocyty

Metódy, opísané v tomto odseku, ilustrujú test, ako sa použil pre vakcinované myši. V podstate podobný test sa môže použiť u primátov, s výnimkou toho, že sa musia zaistiť autológne B bunkové línie na použitie ako cieľové bunky pre každé zviera. To sa dá pre ľudí uskutočniť s použitím Epstein-Barrovho vírusu a pre makaky rézus s použitím herpes B vírusu.

Periférne krvné jednojadrové bunky (PBMC) sa získajú buď z čerstvo odobratej krvi alebo sleziny s použitím Ficoll-Hypaque centrifugácie, aby sa oddelili erytrocyty od bielych krviniek. Pre myši sa rovnako môžu použiť lymfatické uzliny. Efektorové CTL sa môžu pripraviť z PBMC buď in vitro kultiváciou v IL-2 (20 U/ml) a konkanavalíne A (2 pg/ml) po dobu 6 až 12 dní, alebo použitím špecifického

-56antigénu, pričom sa použije rovnaký počet ožiarených, antigén prezentujúcich buniek. Špecifický antigén môže pozostávať buď zo syntetických peptidov (obyčajne 9 až 15 aminokyselín), ktoré sú známymi epitopmi na CTL rozpoznanie pre MHC haplotyp použitých zvierat, alebo konštrukty z vírusu kiahní, zostrojené na expresiu príslušného antigénu. Cieľovými bunkami môžu byť buď geneticky identické alebo MHC haplotypu zodpovedajúce bunkové línie, na ktoré sa pôsobilo, aby prezentovali príslušný antigén, ako je opísané pre in vitro stimuláciu CTL. Pre Balb/c myši sa môže použiť P18 peptid (ArgileHislleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsn, sekv. id.: 51, pre HIV MN kmeň) s koncentráciou 10 μΜ na restimuláciu CTL in vitro, s použitím ožiarených, geneticky identických splenocytov, a môže sa použiť na senzibilizáciu cieľových buniek počas testu cytotoxicity pri 1 až 10 μΜ inkubáciou pri 37 °C po dobu asi dvoch hodín pred testom. Pre tieto myši H-2^d MHC haplotypu poskytuje dobré cieľové bunky myšia mastocytómová bunková línia, P815. Na antigén senzibilizované cieľové bunky sa zavedú s Na⁵¹CrO₄, ktorý sa uvoľňuje z vnútra cieľových buniek pri zabití pomocou CTL, inkubáciou cieľov po dobu 1 až 2 hodín pri 37 °C (0,2 mCi pre ~ 5 x 10^B buniek), po ktorej nasleduje niekoľko premytí cieľových buniek. CTL populácie sa zmiešajú s cieľovými bunkami pri rôznych pomeroch efektorov k cieľom, ako sú 100:1, 50:1, 25:1, atď., speletujú sa a inkubujú 4 až 6 hodín pri 37 °C predtým, než sa odoberú supernatanty, ktoré sa potom testujú na uvoľňovanie rádioaktivity s použitím počítača pre gama žiarenie. Cytotoxicita sa počíta ako percento celkového počtu impulzov, uvoľniteľného z cieľových buniek (získaného pôsobením na ne 0,2 % Triton X-100), od ktorého sa odpočítalo spontánne uvoľnenie z cieľových buniek.

Príklad 14

Test na Hiv špecifické protilátky

ELISA test sa navrhol na detegovanie protilátok, vytvorených proti HIV, s použitím buď špecifického rekombinantného proteínu alebo syntetických peptidov ako substrátových antigénov. 96-miskové mikrotitračné platne sa pokryli pri 4 °C

-57cez noc rekombinantným antigénom pri 2 gg/ml v PBS (fosfátom pufrovaný fýziologický-roztok) roztoku s použitím 50 μΙ/misku na kolísajúcej sa základni. Antigény pozostávali buď z rekombinantného proteinu (gp120, rev. Repligen Corp.; gp160, gp41: Američan Bio-Technologies, Inc.) alebo syntetického peptidu (V3 peptid, zodpovedajúci sekvenciám z vírusového izolátu z IIIB, atď.: Američan BioTechnologies, Inc.; gp41 epitop pre monoklonálnu protilátku 2F5). Platne sa opláchli štyrikrát s použitím premývacieho pufra (PBS/0,05 % Tween 20) s následným pridávaním 200 μΙ/misku blokujúceho pufra (1 % roztok pleťového mlieka v PBS/0,05 % Tween 20) po dobu 1 hodiny pri teplote mietnosti s kolísaním. Pre-séra a imunizačné séra sa zriedili v blokujúcom pufri v požadovanom rozsahu zriedení a pridalo sa 100 μΙ na misku. Platne sa inkubovali 1 hodinu pri teplote miestnosti s kolísaním a potom sa premyli štyrikrát premývacím pufrom. Sekundárne protilátky, konjugované chrenovou peroxidázou (anti-rézus Ig, Southern Biotechnology Associates; anti-myší a anti-králičí Ig, Jackson Immuno Research), zriedené 1:2000 v blokujúcom pufri, sa potom pridali ku každej vzorke v množstve 100 μΙ/misku a inkubovali 1 h pri teplote miestnosti s kolísaním. Platne sa premyli 4.razy premývacím pufrom a potom sa vyvolali pridaním 100 μΙ/misku ofenyléndiamínového (o-PD, Calbiochem) roztoku s 1 mg/ml v 100 n M citrátového pufra s pH 4,5. Platne sa snímali na absorbanciu pri 450 nm tak kinetický (prvých desať minút reakcie), ako aj pri 10 minútovom a 30 minútovom konečnom bode (Thermomax microplate reader, Molecular Devices).

Príklad 15

Test na Hiv neutralizujúce protilátky

Testy in vitro neutralizácie HIV izolátov s použitím sér, získaných z vakcinovaných zvierat, sa uskutočnili nasledovne. Testované séra a pre-imunizačné séra sa teplom inaktivovali pri 56 °C 60 minút pred použitím. Titrované množstvo HIV-1 sa pridalo v 1:2 postupných zriedeniach testovaného séra a inkubovalo sa 60 minút pri teplote miestnosti pred pridaním k 10⁵ MT-4 ľudských lymfoidných buniek

-58v 96-miskových mikrotitračných platniach. Vírusové/bunkové zmesi sa inkubovali 7 dní pri 37 ’C a testovali na vírusom sprostredkované zabíjanie buniek farbením kultúr tetrazóliovým farbivom. Neutralizácia vírusu sa pozoruje, keď sa zabráni vírusom sprostredkovanej smrti buniek.

Príklad 16

Izolácia génov z klinických Hiv izolátov:

HIV vírusové gény sa klonovali z infikovaných PBMC, ktoré sa aktivovali pôsobením ConA. Výhodnou metódou na získanie vírusových génov bola PCR amplifikácia z infikovaného bunkového genómu s použitím špecifických oligomérov, lemujúcich požadované gény. Druhou metódou získania vírusových génov bolo čistenie vírusovej RNA zo supernatantov infikovaných buniek a príprava cDNA z tohto materiálu s následným PCR. Táto metóda bola veľmi analogická vyššie opísanej metóde klonovania myšieho B7 génu, s výnimkou použitých PCR oligomérov a náhodných hexamérov, použitých na tvorbu cDNA, skôr než špecifických senzibilizujúcich oligomérov.

Genómová DNA sa čistila z peliet infikovaných buniek lýzou v STE roztoku (10 mM NaCI, 10 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI, pH 8,0), ku ktorému sa pridala Proteináza K a SDS na konečné koncentrácie 0,1 mg/ml a 0,5 %. Táto zmes sa inkubovala cez noc pri 56 °C a extrahovala 0,5 objemom fenol:chloroform:izoamylalkoholu (25:24:1). Vodná fáza sa potom precipitovala pridaním acetátu sodného na 0,3 M konečnú koncentráciu a dvoch objemov studeného etanolu. Po peletovaní DNA z roztoku sa DNA resuspendovala v 0,1 X TE roztoku (1 X TE = 10 mM TRis-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA). V tomto bode sa pridal SDS do 0,1 % s 2 U RNAzy A s inkubáciou 30 minút pri 37 °C. Tento roztok sa extrahoval fenolom/ chloroformom/izoamylalkoholom a potom sa precipitoval etanolom ako predtým. DNA sa suspendovala v 0,1 X TE a kvantifikovala meraním jej ultrafialovej absorbancie pri 260 nm. Vzorky sa skladovali pri -20 °C, kým sa nepoužili pre PCR.

-59PCR sa uskutočnil s použitím súpravy Perkin-Elmer Cetus a postupu, používajúceho nasledujúce súhlasne smerové a protismerové oligoméry pre gp160: 5'-GA AAG AGC AGA AGA CAG TGG CAA TGA-3' a 5'-GGG CTT TGC TAA ATG GGT GGC AAG TGG CCC GGG C ATG TGG-3'. Tieto oligoméry pridávajú Srfl miesto na 3’-konci výsledného DNA fragmentu. PCR získané segmenty sa klonujú do buď V1Jns alebo V1R vakcinačného vektora a V3 oblastí, ako aj miest spojov naviazania, potvrdených DNA sekvenovaním.

Príklad 17

Testy T-bunkovej proliferácie

PBMC sa získajú a testujú na vyvolanie odpovedí na špecifický antigén, ako sa určia proliferáciou v PBMC populácii. Proliferácia sa monitoruje s použitím ³Htymidínu, ktorý sa pridá k bunkovým kultúram v posledných 18 až 24 hodinách inkubácie pred odberom. Zberače buniek zachovajú izotop obsahujúcu DNA na filtroch, ak došlo k proliferácii, zatiaľ čo pokojové bunky neobsahujú izotop, ktorý sa nezachytí na filtri vo voľnej forme. Pre druh hlodavcov alebo primátov sa 4 x 10⁵ buniek umiestni na 96-miskové mikrotítračné platne v celkovom množstve 200 μί kompletného média (RPMI/10 % plodového teľacieho séra). Proliferačné odpovede z pozadia sa určia s použitím PBMC a média samotného, zatiaľ čo nešpecifické odpovede sa vytvoria použitím lektínov, ako je fytohemaglutín (PHA) alebo konkanavalín A (ConA) v koncentráciách 1 až 5 pg/ml, aby slúžili ako pozitívna kontrola. Špecifický antigén pozostáva buď zo známych peptidových epitopov, čisteného proteínu alebo inaktivovaného vírusu. Koncentrácie antigénu sa pohybujú v rozsahu 1 až 10 μΜ pre peptidy a 1 až 10 μg/ml pre proteín. Lektínom indukovaná proliferácia vrcholí po 3 až 5 dňoch inkubácie bunkovej kultúry, zatiaľ čo antigénšpecifické odpovede vrcholia po 5 až 7 dňoch. K špecifickej proliferácii dôjde, keď sa dosiahne počet impulzov žiarenia, ktorý je najmenej trojnásobkom nad pozadím média a často sa udáva ako pomer k pozadiu alebo stimulačný index (SI). Je známe, že HIV gp160 obsahuje niekoľko peptidov, o ktorých sa vie, že spôsobujú

-60T-bunkovú proliferáciu gp160/gp120 imunizovaných alebo HIV infikovaných jednotlivcov; Z nich najčastejšie používanými sú: T1 (LysGInlIelleAsnMetTrpGInGluValGIyLysAlaMetTyrAla); T2 (HisGluAspllelleSerLeu TrpAspGInSerLeuLys) a TH4 (AspArgVallleGluValValGInGlyAalTyrArgAlalleArg). Demonštrovalo sa, že tieto peptidy stimulujú proliferáciu PBMC z na antigén senzibilizovaných myši, nie ľudských primátov a ľudí.

Príklad 18

Príprava vektora V1R

V úsilí pokračovať v optimalizácii nášho základného vakcinačného vektora pripravili sme derivát V1Jns, ktorý sme označili ako V1R. Účelom konštrukcie tohto vektora bolo získať vakcinačný vektor minimálnej veľkosti, t.j. bez nepotrebných DNA sekvencií, ktorý by si pritom zachoval celkovú optimalizovanú charakteristiku expresie heterológneho génu a vysoké plazmidové výťažky, ktoré poskytujú V1J a V1Jns. Z literatúry, ako aj experimentálne sme zistili, že (1) oblasti v pUC chrbtici, obsahujúce E. coli začiatok replikácie, sa dajú odstrániť bez ovplyvnenia plazmidového výťažku z baktérie; (2) 3'-oblasť karí génu za otvoreným čítacím rámcom kanamycínu sa dá odstrániť, ak sa bakteriálny terminátor vloží namiesto nej; a (3) ~ 300 bp z 3'- polovice BGH terminátora sa dá odstrániť bez ovplyvnenia jeho regulačnej funkcie (za pôvodným miestom Kpnl reštrikčného enzýmu v BGH prvku).

V1R sa skonštruoval s použitím PCR na syntetizovanie troch segmentov DNA z V1Jns, reprezentujúcich CMVintA promótor/BGH terminátor, začiatok replikácie a prvky odolnosti voči kanamycínu. Reštrikčné enzýmy, jedinečné pre každý segment, sa pridali ku každému koncu segmentu s použitím PCR oligomérov: Sspl a Xhol pre CMVintA/BGH; EcoRV a BamHI pre kaď gén a Bc1l a Sali pre orí. Tieto enzýmové miesta sa vybrali, pretože umožňujú smerové naviazanie každého z DNA segmentov, získaných PCR, s následnou stratou každého miesta: EcoRV a Sspl opustia zarovnané DNA, ktoré sú vhodné na naviazanie, zatiaľ čo BamHI a Bc1l opustia komplementárne prečnievajúce časti, tak ako Sa11 a Xhol. Po získaní

-61 týchto segmentov pomocou PCR sa každý segment štiepil príslušnými reštrikčnými enzýmami, uvedenými vyššie, a potom sa naviazali spolu do jedinej reakčnej zmesi, obsahujúcej všetky tri DNA segmenty. 5'-koniec orf sa navrhol tak, aby zahrnoval od T2 rho nezávislú terminátorovú sekvenciu, ktorá sa normálne nachádza v tejto oblasti, aby mohla poskytnúť informáciu zakončenia pre gén odolnosti voči kanamycínu. Naviazaný produkt bol potvrdený štiepením reštrikčným enzýmom (> 8 enzýmov), ako aj DNA sekvenovaním spojov naviazania. DNA plazmidové výťažky a heterológna expresia s použitím vírusových génov vo V1R sú podobné ako pre V1Jns. Dosiahnutá čistá redukcia vo veľkosti vektora bola 1346 bp (V1Jns = 4,86 kb; V1R = 3,52 kb), pozri obr. 11, sekv. id.: 45:.

Sekvencie PCR oligomérov, použitých na syntetizovanie V1R (miesta reštrikčných enzýmov sú podčiarknuté a identifikované v hranatých zátvorkách za sekvenciou):

(1) 5'-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3’ [Sspl], sekv. id.:

(2) 5'-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC-3' [Xhol], sekv. id.:

(pre CMVintA/BGH segment) (3) 5-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGTTGT GTC TCA AAATC-3' [EcoRV], sekv. id.:

(4) 5-CCA CAT GGATCC G TAATGC TCT GCC AGT GTT ACA ACC-3' [BamHI], sekv. id.:

(pre segment génu odolnosti voči kanamycínu) (5) 5-GGT ACA TGATCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TCC TTG-3' [Bc11], sekv. id.:

(6) 5'-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3' [Sa11], sekv. id.:

(pre E. coli začiatok replikácie)

Spoje naviazania sa sekvenovali pre V1R s použitím nasledujúcich oligomérov:

5-GAG CCA ATATAA ATG TAC-3', sekv. id.::

-62[CMVintA/kaď spoj] δ'-CAA TAG CAG GCA TGC-3', sekv. id.::

[BGH/o/7 spoj]

5'-G CAA GCA GCA GAT TAC-3', sekv. id.::

[orí/karí spoj]

Príklad 19

Heterológna expresia produktov HIV oneskorených génov

HIV štruktúrne gény, ako sú env a gag, vyžadujú expresiu HIV regulačného génu rev, aby účinne produkovali proteíny plnej dĺžky. Zistili sme, že od rev závislá expresia gag poskytovala nízke hladiny proteínu a že rev samotný môže byť toxický pre bunky. Hoci sme dosiahli pomerne vysoké hladiny od rev závislej expresie gp160 in vitro, táto vakcína vyvolávala nízke hladiny protilátok voči gp160 po in vivo imunizácii s rev/gp160 DNA. To môže byť dôsledkom známych cytotoxických účinkov rev, ako aj zvýšenej obťažnosti pri dosahovaní rev funkcie v myotubuloch, obsahujúcich stovky jadier (rev proteín musí byť v tom istom jadre ako od rev závislý transkript, aby došlo k expresii gag alebo env proteínu). Bolo však možné dosiahnuť od rev nezávislú expresiu s použitím vybraných modifikácií env génu.

1. Od rev nezávislá expresia env

Vo všeobecnosti naše vakcíny využívali primárne HIV (IIIB) env a gag gény na optimalizáciu expresie v našom zovšeobecnenom vakcinačnom vektore V1Jns, ktorý sa skladá z CMV okamžitého-skorého (IE) promótora, od BGH odvodenej polyadenylačnej a transkripčnej terminačnej sekvencie a pUC chrbtice. Premenlivé účinnosti od rev nezávislej expresie sa v závislosti od toho, aký veľký je použitý génový segment (napríklad gp120 verzus gp160), dajú pre env dosiahnuť nahradením jeho natívneho sekrečného vedúceho peptidu peptidom z tkanivovo špecifického génu plazminogénového aktivátora (tPA) a expresiou výsledného chimérického génu za CMVIE promótorom s CMV intrónom A. tPA-gp120 je príkladom sekretovaného gp120 vektora, konštruovaného týmto spôsobom, ktorý

-63funguje dostatočne dobre na vyvolanie anti-gp120 imunitných odpovedí u vakcinovaných myší a opíc.

V dôsledku správ, že na membránu zakotvené proteíny môžu indukovať oveľa väčšie (a snáď špecifickejšie pre HIV neutralizáciu) protilátkové odpovede v porovnaní so sekretovanými proteínmi, ako aj získať prídavné epitopy, pripravili sme V1Jns-tPA-gp160 a V1Jns-rev/gp160. tPA-gp160 vektor produkoval zistiteľné množstvá gp160 a gp120 bez pridania rev, ako ukázala imunoblotová analýza transfektovaných buniek, hoci hladiny expresie boli oveľa nižšie než hladiny, ktoré sa dosiahli pre rev/gp160, od rev závislý, gp160 expresujúci plazmid. To je pravdepodobne dôsledkom toho, že inhibičné oblasti, ktoré udeľujú rev závislosť gp160 transkriptu, sa nachádzajú vo viacpočetných miestach v gp160, vrátane COOH-konca gp41. Jeden vektor sa pripravil pre COOH-koncovo skrátenú formu tPA-gp160 (tPA-gp143), ktorá sa navrhla na zvýšenie celkových hladín expresie env elimináciou týchto inhibičných sekvencii. Vektor gp143 tiež eliminuje vnútrobunkové gp41 oblasti, obsahujúce peptidové motívy (ako Leu-Leu), o ktorých je známe, že spôsobujú odvedenie membránových proteínov k lyzozómom a nie k povrchu bunky. Teda možno očakávať, že gp143 bude mať zvýšené hladiny expresie env proteínu (znížením závislosti od rev) a vyššiu účinnosť transportu proteínu k povrchu bunky v porovnaní s gp160 s plnou dĺžkou, kde tieto proteíny môžu byť lepšie schopné vyvolať anti-gp160 protilátky po DNA vakcinácii. tPAgp143 sa ďalej modifikoval rozsiahlou latentnou mutagenézou sekvencie rev responzívneho prvku (RRE) (350 bp) na elimináciu ďalších inhibičných sekvencii pre expresiu. Tento konštrukt, gp143/mutRRE, sa pripravil vo dvoch formách : buď eliminujúci (forma A) alebo zachovávajúci (forma B) miesta proteolytického štiepenia pre gp120/41. Obidve formy sa pripravili v dôsledku správ v literatúre, že vakcinácia myší s použitím neštiepiteľného gp160, expresovaného pri kiahňach, vyvolala oveľa vyššie hladiny protilátok voči gp160, než vyvolali štiepiteľné formy.

Kvantitatívny ELISA test pre gp160/gp120 expresiu v bunkových transfektantoch sa vyvinul na stanovenie relatívnej schopnosti expresie pre tieto vektory. In vitro transfekcia 293 buniek s následnou kvantifikáciou s bunkami spojeného vs. sekretovaného/uvoľneného gp120 poskytla nasledujúce výsledky: (1)

-64tPA-gp160 expresoval 5 až 10 x menej gp120 než rev/gp160 s podobnými podielmi, zachovanými vnútri bunky vs. uvoľnenými z bunkového povrchu; (2) tPA-gp143 poskytol 3 až 6 x väčšiu sekréciu gp120 než rev/gp160 s len nízkymi hladinami s bunkami spojeného gp143, potvrdzujúc, že cytoplazmatický chvost gp160 spôsobuje zachovanie gp160 vnútri bunky, čomu sa dá vyhnúť čiastočným odstránením tejto sekvencie; a (3) tPA-gp143/mutRRE A a B poskytli ~ 10 x väčšie hladiny expresie proteínu než parenterálny tPA-gp143, zatiaľ čo eliminácia proteolytického spracovania sa potvrdila pre formu A.

Teda naša stratégia zvýšiť od rev nezávislú expresiu poskytla postupné zvýšenia celkových hladín expresie, ako aj presmerovanie na membránu zakotveného gp143 k bunkovému povrchu, preč od lyzozómov. Je dôležité poznamenať, že toto je generický konštrukt, do ktorého by malo byť možné vložiť gp120 sekvencie, získané z rôznych primárnych vírusových izolátov vo vektorovej kazete, obsahujúcej tieto modifikácie, ktoré sa nachádzajú buď na NH₂-konci (tPA vedúci reťazec) alebo COOH-konci (gp41), kde existuje menej antigénových rozdielov medzi rôznymi vírusovými kmeňmi.

2. Expresia gp120, získaného z klinického izolátu

Aby sme aplikovali tieto stratégie expresie na vírusy, ktoré sú významné na účely vakcín a potvrdzujú všeobecnosť našich prístupov, pripravili sme tiež tPAgp120 vektor, získaný z primárneho HIV izolátu (obsahujúceho severoamerickú concensus V3 peptidovú slučku; makrofágové-tropné a nonsyncícium indukujúce fenotypy). Tento vektor poskytol vysokú expresiu/sekréciu gp120 s transfektovanými 293 bunkami a vyvolal anti-gp120 u myší, čím demonštroval, že bol klonovaný vo funkčnej forme. Gény primárneho izolátu gp160 sa tiež použijú na expresiu tým istým spôsobom ako pre gp160, získaný z laboratórnych kmeňov.

B. Imunitné odpovede na HIV-1 env polynukleotidové vakcíny

Účinok vakcinačnej cesty na imunitné odpovede u myší: zatiaľ čo úsilie zlepšiť expresiu gp160 pokračuje, využili sme tPA-gp120 DNA konštrukt na odhadnutie imunitných odpovedí a spôsobov ich zvýšenia. Vnútrosvalové (i.m.) a

-65vnútrokožné (i.d.) vakcinačné cesty sa porovnali pre tento vektor pri dávkach 100, 10 a 1 pg u myší. Vakcinácia ktoroukoľvek z týchto ciest vyvolala protilátkové odpovede (GMT = 10³ až 10⁴) u všetkých príjemcov po 2 až 3 vakcináciách na všetkých troch dávkových úrovniach. Každá cesta vyvolala podobné anti-gp120 protilátkové titre s jasnými, od dávky závislými odpoveďami. Pozorovali sme však väčšiu premenlivosť odpovedí na i.d. vakcináciu, najmä pri nižších dávkach po začiatočnom očkovaní. Naviac, odpovede pomocných T-buniek, ako sa stanovili antigén-špecifickou in vitro proliferáciou a sekréciou cytokínov, boli vyššie po i.m. vakcinácii než po i.d. vakcinácii. Usúdili sme, že i.d. vakcinácia neposkytla žiadne výhody v porovnaní s i.m. vakcináciou pre túto vakcínu.

2. gp120 DNA vakcínou sprostredkovaná pomocná T-bunková imunita u myší gp120 DNA vakcinácia vyvolala silné odpovede pomocných T-buniek vo všetkých testovaných lymfatických oddeleniach (slezinové, krvné, slabinové, mezenterické a iliacké uzliny) s T_H1 -podobnými cytokínovými sekrečnými profilmi (t. j. produkcia g-interferónu a IL-2 s malým množstvom alebo žiadnym IL-4). Tieto cytokíny vo všeobecnosti :.podporujú silnú bunkovú imunitu a spájajú sa s udržiavaním nechorobného stavu u HlV-séropozitívnych pacientov. Ukázalo sa, že lymfatické uzliny sú primárnymi miestami pre HIV replikáciu, prechovávajúc veľké rezervoáre vírusu dokonca i vtedy, keď sa vírus nedá ľahko detegovať v krvi. Vakcína, ktorá môže vyvolať anti-HIV imunitné odpovede na rôznych lymfatických miestach, ako sme ukázali s našou DNA vakcínou, môže pomôcť zabrániť úspešnej kolonizácii lymfu po začiatočnej infekcii.

3. env DNA vakcínou sprostredkované protilátkové odpovede

Africká zelená opica (AGM) a makak rézus (RHM), ktoré dostali gp120 DNA vakcíny, vykázali nízke hladiny neutralizujúcich protilátok po 2 až 3 vakcináciách, ktoré sa nedali zvýšiť ďalšou vakcináciou. Tieto výsledky, ako aj zvyšujúce sa uvedomovanie si v oblasti HIV vakcín, že oligomérny gp160 je pravdepodobne významnejším cieľovým antigénom na vyvolanie nautralizujúcich protilátok než gp120 monoméry, nás viedli k tomu, aby sme sa sústredili na dosiahnutie účinnej

-66expresie vektorov na báze gp160 (pozri vyššie). Myši a AGM sa tiež vakcinovali tPA-gp120 vakcínou, získanou z primárneho izolátu. Tieto zvieratá vykazovali antiV3 peptidové (použijúc homológnu sekvenciu) protilátkové titre v recipročnom koncovom bode v rozsahu 500 až 5000, demonštrujúc, že tento návrh vakcíny je funkčný pre klinicky významné vírusové izoláty.

Vakcíny na báze gp160, rev-gp160 a tPA-gp160 zlyhali pri konzistentnom vyvolávaní protilátkových odpovedí u myši a nie ľudských primátov, alebo poskytovali nízke protilátkové titre. Naše začiatočné výsledky s tPA-gp143 plazmidom poskytli geometrické stredné titre (GMT) > 10³ u myší a AGM po dvoch vakcináciách. Tieto údaje naznačujú, že sme významne zlepšili imunogenicitu gp160-podobných vakcín zvýšením hladín expresie a účinnejším vnútrobunkovým transportom env k bunkovému povrchu. Tento konštrukt, ako aj tPA-gp143/mutRRE A a B vektory, sa budú ďalej charakterizovať z hľadiska protilátkových odpovedí, najmä vírusovej neutralizácie.

4. env DNA vakcínou sprostredkované CTL odpovede u opíc

Pokračovali sme v charakterizácii CTL odpovedí u RHM, ktoré boli vakcinované gp120 a gp160/IRES/rev DNA. Všetky štyri opice, ktoré dostali túto vakcínu, vykázali významné MHC triedy 1-obmedzené CTL aktivity (20 až 35 % špecifického zabíjania pri pomere efektor/cieľ = 20) po dvoch vakcináciách. Po štvrtej vakcinácii sa tieto aktivity zvýšili na 50 až 60 % zabíjania pri podobných podmienkach testu, čo naznačuje, že ďalšia vakcinácia významne posilnila odpovede. CTL aktivity vydržali najmenej sedem mesiacov po konečnej vakcinácii pri asi 50 % ich vrcholových hladín, čo naznačuje, že sa ustanovila dlhotrvajúca pamäť.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   7*// //Z 4 - ty?

   1. Syntetický polynukleotid, obsahujúci DNA sekvenciu, kódujúcu HIV env proteín, pričom DNA sekvencia obsahuje kodóny, optimalizované na expresiu v cicavcovi ako hostiteľovi.
2. 2. Polynukleotid podľa nároku 1, ktorý je vybraný zo skupiny: V1Jns-tPA-HIV_MNgp120;

   V1Jns-tPA-HIV_IIIBgp120;

   V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-A/SRV-1 3'-UTR;

   V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-B/SRV-1 3'-UTR;

   V1Jns-tPA-gp140/opt30-A;

   V1Jns-tPA-gp140/opt30-B;

   V1 Jns-tPA-gp140/opt all-A;

   V1 Jns-tPA-gp140/opt all-B;

   V1 Jns-tPA-gp140/opt all-A;

   V1 Jns-tPA-gp140/opt all-B;

   V1Jns-rev/env;

   V1Jns-gp160;

   V1Jns-tPA-gp160;

   V1 Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-A;

   V1 Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-B;

   V1 Jns-tPA-gp160/opt all-A;

   V1 Jns-tPA-gp160/opt all-B;

   V1 Jns-tPA-gp160/opt all-A;

   V1 Jns-tPA-gp160/opt all-B;

   V1Jns-tPA-gp143;

   V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-A;

   V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-B;

   V1Jns-tPA-gp143/opt32-A;

   V1Jns-tPA-gp143/opt32-B;

   -68V1Jns-tPA-gp143/SRV-1 3'-UTR;

   V1 Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32A;

   V1 Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32B;

   V1Jns-tPA-gp143/opt all-A;

   V1 Jns-tPA-gp143/opt all-B;

   V1 Jns-tPA-gp143/opt all-A;

   V1 Jns-tPA-gp143/opt all-B;

   V1 Jns-tPA-gp143/opt32-A/glyB;

   V1Jns-tPA-gp143/opt32-B/glyB;

   V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-A/glyB;

   V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-B/glyB;

   V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB;

   V1 Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB; a ich kombinácie.
3. 3. Polynukleotid podľa nároku 1, ktorý indukuje anti-HIV neutralizujúce protilátky, HIV špecifické T-bunkové imunitné odpovede alebo ochranné imunitné odpovede po zavedení do tkaniva stavovcov, vrátane ľudského tkaniva, in vivo, pričom tento polynukleotid obsahuje gén, kódujúci HIV gag, gag-proteázu alebo env génový produkt.
4. 4. Spôsob indukcie imunitných odpovedí proti HIV epitopom u stavovcov, v yznačujúci sa tým, že zahrnuje zavedenie polynukleotidu podľa nároku 1 v množstve medzi 1 ng a 100 mg do tkaniva stavovca.
5. 5. Spôsob indukcie imunitných odpovedí proti infekcii alebo ochoreniu, spôsobenému virulentnými kmeňmi HIV, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje zavedenie polynukleotidu podľa nároku 1 do tkaniva stavovca.
6. 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje podanie zoslabeného HIV, mrtvého HIV, HIV env proteínu, HIV gag proteínu, HIV pol proteínu a ich kombinácií.
7. 7. Vakcína proti HIV infekcii, vyznačujúca sa tým, že zahrnuje polynukleotid podľa nároku 1 a farmaceutický prijateľný nosič.
8. 8. Spôsob indukcie anti-HIV imunitných odpovedí u primáta, vyznačujúci sa t ý m, že zahrnuje zavedenie polynukleotidu podľa nároku 1 do tkaniva primáta a súčasne podanie interleukínu 12 parenterálne.
9. 9. Spôsob indukcie bunky prezentujúcej antigén na stimulovanie cytotoxickej proliferácie a proliferácie pomocných T-buniek a efektorových funkcií, vrátane lymfokínovej sekrécie, špecifickej pre HIV antigény, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje expozíciu buniek stavovca in vivo polynukleotidu podľa nároku 1.
10. 10. Spôsob zvýšenia expresie DNA, kódujúcej HIV protein alebo jeho fragment, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje (a) identifikáciu umiestnenia kodónov pre príslušný otvorený čítací rámec;

    (b) porovnanie kodónov prirodzeného typu s pozorovanou frekvenciou použitia ľudskými génmi;

    (c) nahradenie kodónov prirodzeného typu kodónmi, optimalizovanými na vysokú expresiu ľudských génov; a (d) testovanie na zlepšenú expresiu.