CN1216064A

CN1216064A - 合成的hiv基因

Info

Publication number: CN1216064A
Application number: CN97193817A
Authority: CN
Inventors: J·W·施维尔; M·E·达维斯; D·C·弗雷德; M·A·刘; H·C·佩尔赖
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1996-02-22
Filing date: 1997-02-18
Publication date: 1999-05-05
Also published as: AU729231B2; WO1997031115A2; NO983876L; HRP970092A2; AR005930A1; NO983876D0; DE69734585D1; AU2124697A; HUP9901112A2; DE69734585T2; NZ331161A; JP2000505299A; YU35498A; EE9800257A; ATE309366T1; IS4814A; EP0904380A2; PL328730A1; HUP9901112A3; EP0904380B1

Abstract

提供编码HIV基因的合成DNA分子和HIV基因的修饰。所述合成分子的密码子用预定宿主细胞优选的密码子。所述合成分子可作为多核苷酸疫苗使用,这种疫苗通过中和抗体和细胞介导的免疫,来提供针对HIV感染的有效免疫预防。

Description

合成的HIV基因

相关申请的相互参照

这是于1996年2月22日申请的美国序号60/012,082相关的非临时申请。关于联邦资助的R&D的声明

不适用微缩胶片附录的参照

不适用发明领域HIV疫苗发明背景1．HIV感染：

人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)是获得性人类免疫缺陷综合症(AIDS)和相关失调的致病剂。HIV是逆转录病毒家族的一种RNA病毒，并表现出所有逆转录病毒的5’LTR-gag-pol-env-LTR3’结构。另外，HIV-1包含少数具有调节或未知功能的基因，包括tat和REV基因。env基因编码病毒被膜糖蛋白，这种糖蛋白作为160千道尔顿(kDa)的前体(gp160)翻译，然后被细胞蛋白酶酶切，产生外部120-kDa被膜糖蛋白(gp120)和跨膜41-kDa被膜糖蛋白(gp41)。gp120和gp41保持相连并且呈现在病毒颗粒和HIV感染的细胞表面上。gp120与存在于辅助T-淋巴细胞、巨噬细胞和其它靶细胞表面上的CD4受体结合。gp120与CD4结合后，gp41介导负责病毒侵入的融合事件。

当病毒粒子上的gp120与T4淋巴细胞或其它靶细胞表面上的CD4受体结合时，感染开始。结合的病毒与靶细胞融合，并逆转录它的RNA基因组到细胞的的双链DNA中。病毒DNA被整合到细胞核的遗传物质中，在那里病毒DNA指导新病毒RNA、病毒蛋白质和新病毒粒子的产生。新粒子从靶细胞膜上芽生，并感染其它细胞。

对免疫防御很关键的T淋巴细胞的破坏是作为HIV感染标志的进行性免疫机能障碍的主要原因。靶细胞的丧失严重地损坏了机体对大部分侵入者的抵抗能力，但它对于针对病毒、真菌、寄生虫和包括分枝杆菌的某些细菌的防御有特别严重的影响。

HIV-1通过复制、从细胞中芽生和损坏细胞膜杀伤它感染的细胞。HIV可能间接地利用呈现在被感染细胞表面上的病毒gp120来杀伤靶细胞。因为T细胞上的CD4受体对gp120有强的亲合力，表达CD4受体的健康细胞可以结合gp120，并与被感染细胞融合形成合胞体。合胞体不能存活。

HIV还能引起针对被感染细胞的正常细胞免疫防御。有或没有抗体的协助，细胞毒性的防御细胞都能够破坏在其表面呈现病毒蛋白质的被感染细胞。最后，游离的gp120能在感染有HIV的个体的血液中循环。游离的蛋白质能结合到未感染细胞的CD4受体上，使它们看来似乎被感染，因此引起免疫应答。

HIV-1感染几乎都是致命的，目前还没有HIV-1感染的治疗方法。也没有得到预防HIV-1感染的有效疫苗。活的减毒病毒因为有回复或感染的危险，不能作为疫苗使用。大多数亚单位疫苗方法尚未成功地预防HIV感染。对于HIV感染的治疗，尽管延长一些被感染的人的生命，但有严重的副作用。因此很需要有效的治疗和疫苗，来与这种致命的感染作斗争。2．疫苗

接种疫苗是疾病预防的一种有效形式，并已证明能成功地抵抗几种类型的病毒感染。决定把HIV-1抗原提呈给人免疫系统以便引起保护性体液免疫和细胞免疫的方法是一项困难的工作。到目前为止，试图生产有效的HIV疫苗还未成功。在AIDS病人中，游离的病毒仅以低水平出现。HIV-1的传染被通过融合和合胞体形成的细胞与细胞的相互作用所加强。因此，针对游离病毒或病毒亚基所产生的抗体一般对消除病毒感染的细胞无效。

疫苗利用机体的“记忆”抗原的能力。第一次与给定的抗原相遇后，免疫系统就产生在个体的一生中保持该抗原免疫学记忆的细胞。以后接触该抗原就刺激免疫应答，并导致消除或灭活该病原体。

免疫系统以两种方式对付病原体：通过体液应答和通过细胞-介导的应答。在体液应答中，淋巴细胞产生与该抗原结合的专一性抗体，由此使病原体失活。细胞介导的应答涉及细胞毒性和专一性攻击和消灭被感染细胞的协助T淋巴细胞。

用HIV-1病毒研制的疫苗存在一些问题，因为HIV-1感染一些在免疫系统中疫苗需要激活的相同的细胞(如T4淋巴细胞)。研制在免疫系统损害发生之前使HIV失活的疫苗是有益的。特别合适的一类型的HIV疫苗能产生识别HIV变异体的抗-HIV免疫应答，该免疫应答在处于感染开始时的HIV-阳性个体中起作用。

研制针对病毒的疫苗的主要挑战是在不同的病毒分离物或毒株中的病毒被膜蛋白的多样性；特别是那些具有高突变率的病毒，例如人类免疫缺陷病毒，针对这种病毒诱出中和性和保护性免疫应答是合乎需要的。因为在小鼠和人类中的细胞毒性的T-淋巴细胞(CTL)能够识别得自保守的内部病毒蛋白质的抗原决定基，被认为在针对病毒的免疫应答中是重要的，因此已做了研制能够提供针对不同病毒株的异源性保护的CTL疫苗的努力。

已经知道CD8+CTL当其T细胞受体识别与MHCⅠ型分子相结合的病毒肽时，杀伤病毒感染的细胞。这些病毒肽得自内源性合成的病毒蛋白质，与该蛋白质在病毒中的定位或功能无关。这样，CTL通过识别来自保守的病毒蛋白的抗原决定基，可提供交叉毒株保护。能够与用于CTL识别的MHCⅠ型结合的肽来源于存在于或穿过细胞质或内质网的蛋白质，一般来说，进入核内体加工途径的外源性蛋白质(如在由MHCⅡ型分子呈递的抗原的情况下)在产生CD8+CTL应答中无效。

产生CTL应答的大多数尝试已用复制型载体在细胞内产生蛋白质抗原，或这些尝试集中于将肽导入细胞胞质中。这些方法有一些限制，可减低它们作为疫苗的实用性。逆转录病毒载体在可以作为融合蛋白表达而同时保持重组体病毒复制能力的多肽的大小和结构上有限制，用于后续免疫接种的载体(例如牛痘)效力可被针对所述载体本身的免疫应答所损害。另外，病毒载体和修饰的病原体有在人类中阻碍其用途的固有的风险。此外，呈现出来的抗原决定基的选择依赖于个体的MHC抗原的结构，因此，由于在远系繁殖的群体中MHC单倍型的多样性，肽疫苗可能具有有限的功效。3．DNA疫苗

Benvenisty,N.和Reshf.L(PNAS 83,9551-9555,(1986))显示：腹膜内(i.p.)、静脉内(i.v)或肌内(i.m.)导入小鼠中的CaCl₂-沉淀的DNA能够被表达。在鼠中i.m.注射不用CaCl₂处理的DNA表达载体导致肌肉细胞摄取DNA，并表达该DNA所编码的蛋白质。该质粒以附加体形式保持并且不复制。随后，在大鼠、鱼和灵长类骨骼肌和大鼠的心肌内i.m.注射后，已经观察到持续的表达。用核酸作为治疗剂的技术已在WO90/11092(1990年10月4日)中报道，其中裸露的多核苷酸用来接种脊椎动物。

肌内免疫方法的成功不是必须的。将覆盖有编码牛生长激素(BGH)的DNA的金微弹导入小鼠皮肤中，导致鼠中抗-BGH抗体的产生。喷射注射器已用来转染活动物的皮肤、肌肉、脂肪和乳房组织。导入核的不同方法已有综述。Zhu显示了：在小鼠中静脉内注射DNA：阳离子脂质体复合物(Science 261:209-211(1993年7月9日)产生克隆的转移基因的系统表达。Ulmer等(Science 259:1745-1749,(1993))报道了：通过肌肉内注射编码病毒蛋白的DNA异源性保护抵抗流感病毒感染。

本发明满足对能够引起对病原体和肿瘤抗原所需免疫应答的专一性治疗剂和预防剂的需要。在这种治疗方法中特别重要的是诱导T细胞免疫应答的能力，这种免疫应答可以预防感染或甚至由与获取该抗原基因的毒株异源的病毒毒株引起的疾病。当处理HIV时，这是特别需考虑的，因为这种病毒已被认为能快速突变，并已鉴定了许多毒性分离物(见例如LaRosa等Science 249:932-935(1990)，鉴定245个独立的HIV分离物)。为了响应这种识别的多样性，研究者们已试图产生基于肽免疫的CTL。因此，Takahashi等(Science 255:333-336(1992))报道了：诱导识别HIV被膜(gp160)决定簇的广谱交叉反应细胞毒性的T细胞。然而，那些工作者认识到在达到真正的交叉反应性CTL反应的困难，并提示：在非常严格的引发或重刺激T细胞和引起包括来自已刺激的CTL的细胞毒性在内的效应物功能之间有二叉分枝。

Wang等报道了：通过肌肉内接种克隆的基因组(未剪接型)HIV基因，引起小鼠中针对HIV的免疫应答。然而，在这些研究中得到的免疫应答水平是很低的。另外，Wang等的DNA构成物利用编码邻接Ta+/REV-gp/160-Tat/REV编码序列的HIV必需基因组片段。如在下面详细描述的，有一获取高水平表达gp160的次优系统。这也是一潜在的危险，因为Tat的表达有助于Kaposis氏肉瘤的发展。

WO93/17706描述用于针对病毒给动物接种疫苗的方法，其中载体粒子包有基因构成物，并且将包被粒子加速到动物的细胞中。对于HIV，建议使用失去长末端重复片段的基本上整个基因。这个方法指出了接受者的实质风险。一般认为HIV构成物应包含少于大约50％的HIV基因，以保证疫苗的安全；这保证已消除酶部分和病毒调节蛋白质，它们中的许多其功能是未知或了解很少。这样，如果由该基因传递技术生产出有用的人类HIV疫苗，尚存在许多问题。

本发明设想将多核苷酸导入活体组织中来诱导蛋白质表达的任何已知的方法。然而，本发明提供了一新型免疫原，用于将HIV和其它蛋白质导入抗原加工途径中，以有效地产生HIV-专一性CTL和抗体。作为诱导细胞和体液抗-HIV和HIV中和免疫应答的疫苗，在药物学上是有效的。在本发明中，谈到前面所提到的问题，并通过提供多核苷酸免疫原来解决，这种免疫原当被导入动物体时，指导HIV蛋白和抗原决定基的有效表达，而没有与那些方法有关的相伴的风险。这样产生的免疫应答对识别HIV、抑制HIV的复制、鉴别和杀伤被HIV感染的细胞是有效的，并对许多HIV毒株为交叉反应性的。4．密码子用法和密码子上下文

有机体的密码子配对是高度非随机的，并从有机体到有机体不同，这一信息已用来构建和表达具有所需水平翻译效率的改变的和合成的基因、决定基因组的哪一区域是蛋白编码区、将翻译中止位点导入异源性基因上和确定核苷酸序列的关系或祖先起源。

在转化的有机体中外来的异源基因的表达现在已是常事。大量的哺乳动物基因包括例如鼠和人类的基因已被成功地插入到单细胞有机体中。这方面的标准技术包括待表达的外来基因导入例如质粒或噬菌体的载体中，并利用这种载体将该基因插入到有机体中。这类基因的天然启动子通常用与该基因所插入到的宿主相容的强启动子所取代。蛋白质测序仪能够阐明甚至是极小量的天然蛋白质的氨基酸序列。从这些氨基酸序列可推断编码这些蛋白质的DNA序列。DNA合成也是一快速发展的技术。能容易地构建对应于这些推断的DNA序列的合成基因。

尽管有高速增长的表达系统和重组DNA的知识，但当人们试图在有机体中表达异种或合成基因时，仍存在很大的阻碍，许多天然的活性蛋白质例如以不同于它们在异种宿主中表达时出现的形式糖基化。因为这一原因，对于表达许多哺乳动物基因，例如酵母的真核生物宿主可能优于细菌宿主。糖基化的问题是继续研究的课题。

另一个问题了解的更少。通常合成基因甚至当与一强启动子偶联时，其翻译进行的效率比所期望的低得多。非表达有机体原有的外源基因通常也是如此。甚至当该基因以生产可回收量翻译产物的充分有效的方式转录时，该蛋白质通常为无活性的或在性质上不同于天然蛋白质。

已经认识到后一个问题通常是由于不同有机体中蛋白质折叠的差异。这一问题的解释是难以理解的，而且对控制蛋白质折叠的机制知之甚少。

与翻译效率相关的问题被认为是与密码字上下文作用有关联的。在所有有机体中基因的蛋白编码区受到很多种功能上的限制，其中的一些限制取决于编码合适功能的蛋白质的需求和适宜的翻译起始和终止信号。然而，已分辨出蛋白编码区的几个特征，按照这些限制因素不容易理解这些特征。这些特征的两个重要类型是涉及密码子用法和密码子上下文的那些特征。

已经知道在不同有机体之间密码子利用是有高度倾向性的，并且变异相当大。已经显示密码子用法的类型是与tRNA同工受体的相对丰度相关连的。高与低丰度的编码蛋白质的基因在它们的密码子倾向性上显示了差异。已广泛讨论了密码子用法的倾向性改变肽延伸速率的可能性。尽管密码子用法的差异是与翻译速率上的差异相关联的，但要证实密码子选择对翻译的直接作用是困难的。其它已提出的密码子用法类型上的限制包括：把翻译的可靠性增加到最大程度和使蛋白质合成的动力学效率最佳化。

除密码子的非随机用法外，已积累了相当多的证据证明密码子/反密码子识别是受该密码子本身之外的序列影响的，即称为“密码子上下文”的现象。邻近的核苷酸对无义密码子和错义密码子的抑制效率存在强烈的影响。显然，天然细菌群体中抑制基因活性的丰度和编码硒代胱氨酸和磷酸丝氨酸“终止”密码子的使用需要终止为上下文依赖性的。已经显示了类似的上下文效应影响翻译的可靠性和翻译起始的效率。

大肠杆菌蛋白编码区的统计分析表明了另一种“密码子上下文”形式。在一位置的特定密码子的存在强烈地影响邻近密码子的某些核苷酸同时出现的频率，这些上下文的限制在高水平和低水平表达的基因中差异很大。尽管已认识到上下文效应，但与邻近密码子的优选核苷酸相联系的统计规律的预计值是相对低的。这就限制了选择密码子以达到所需水平翻译效率的这些核苷酸选择数据的实用性。

自动化核苷酸序列仪的出现已使得得到许多种有机体的大量序列数据。弄懂这些数据存在实际的困难。例如，为了将该遗传序列数据与蛋白序列联系起来而鉴定该基因组的编码区是很重要的。另外，某些有机体基因组的祖先是有实质价值。已知一些有机体的基因组是来自混合祖先的。在起源上是病毒的一些序列现在已稳定地整合到真核有机体的基因组中。这些病毒序列本身可能起源于另外实质不相关连的物种。了解基因的祖先对获取相关基因和它们在其它有机体中的翻译产物之间的合适相似性可能是重要的。

需要更好地了解密码子上下文对翻译的作用和确定任何所需的翻译作用合适的密码子的方法。也需要用于鉴定来自核苷酸序列数据的该基因组编码区的方法。还需要用于控制蛋白质折叠和保证当异种基因在宿主中表达时异种基因合适地折叠的方法。按照所需的翻译效率来改变或构建的基因将是非常有价值的。

用于微生物表达工业上和药物学上有价值的蛋白质的另一方面的重组DNA技术的实践是“密码子优先权”现象。尽管已较早注意到用于基因表达的现存机构是遗传转化的宿主细胞，它将“工作”来构建给定的所需产物，但在微生物中达到的表达水平能够受到很大的变异，这部分依赖存在于插入的外源基因中氨基酸专一化的遗传密码的特定选择形式。四个可能的核苷酸碱基的“三联体”密码子能够以64个变异体形式存在。这些形式为仅仅20个不同的氨基酸(还有转录起始和终止)提供信息，这就意味着：一些氨基酸能被不止一个密码子所编码。的确，一些氨基酸具有多达6个“丰余的”可供选择的密码子，同时一些氨基酸只有单个所需的密码子。因为不完全了解的原因，可供选择的密码子不都是均匀地存在于不同类型细胞的内源性DNA中，并且在某些类型的细胞中对某些密码子似乎存在可用的天然等级制度或“优先权”。

作为一个例子，氨基酸亮氨酸被6个DNA密码子的任何一个所指定，包括CTA、CTC、CTG、CTT、TTA和TTG(它们分别对应于mRNA密码子CUA、CUC、CUG、CUU、UUA和UUG)。微生物的基因组密码子频率的完全分析揭示：大肠杆菌的内源性DNA最常包含CTG亮氨酸特定性密码子，而酵母和粘菌的DNA最常包含TTA亮氨酸特定性密码子。考虑到这种等级制度，通常认为：获得大肠杆菌宿主高水平表达富含亮氨酸多肽的可能性将在某种程序上依赖于密码子使用频率。例如，富含TTA密码子的基因很可能在大肠杆菌中表达差，而富含CTG的基因将可能高水平表达该多肽。同样，当酵母细胞为用于表达富含亮氨酸的多肽的预定转化宿主细胞，在插入DNA中使用的优选密码子将是TTA。

密码子优先权现象在重组DNA技术上的意义是显而易见的，这种现象可用来解释为在成功转化的宿主有机体中获取外源性基因的高水平表达的许多以前的失败即较少“优选的”密码子在插入的基因中可重复出现，用于表达的宿主细胞机构可能不能有效地运作。这个现象提示：已设计成包含预定宿主细胞的优选密码子的合成基因为重组DNA技术的实践提供异种遗传物质的一种优选形式。5．蛋白质运送

象征真核细胞的功能多样性依赖于它们的膜边界结构上的差异。为了产生和保持这些结构，蛋白质必须贯穿细胞，从它们在内质网的合成部位运送到预定的目的地。这需要运送的蛋白质显示位于主要运送通道入口点的负责通道选择的分子机构所识别的分类信号。大部分蛋白质横穿其生物合成途径时，其分类决定仅需进行一次，因为它们的最终目的地，即行使其功能的细胞位置成为它们的永久居住点。

胞间完整性的维持部分依赖于蛋白质的选择性分类和将其精确转运到它们的正确目的地。过去的几年，很活跃地研究了用于蛋白质导向和定位的分子机构的分析。在可以作为“地址标记”的蛋白质上已鉴定了定义的序列的基序。已发现许多分类标记是与膜蛋白的胞质结构域相联系的。发明概述

提供编码HIV env的合成DNA分子和HIV env的修饰。该合成分子的密码子包括预定宿主细胞的优选密码子。该合成分子提供异种遗传物质的优选形式。该合成分子可作为多核苷酸疫苗使用，这种疫苗通过中和抗体和细胞介导的免疫作用来提供针对HIV感染的有效的免疫预防。本发明提供多核苷酸，当这种多核苷酸直接导入包括哺乳动物(例如灵长类和人类)的脊椎动物体内时，诱导该动物中编码蛋白质的表达。附图简述

图1显示基于HIV env盒的表达策略。

图2表示DNA疫苗介导的抗gp120反应。

图3表示鼠的DNA疫苗血清的抗gp120 ELISA效价。

图4表示HIV env PNV细胞培养物转染后，gp120的相对表达。

图5表示tPA-gp143/optA对optB DNA接种后的普通抗gp120 ELISA反应。

图6表示鼠的DNA疫苗血清对HIV的中和作用。

图7显示来自鼠HIV env DNA疫苗的血清对HIV的中和作用。

图8是最佳化HIV env DNA构成物的免疫印迹分析。本发明的详细描述

提供编码HIV env的合成DNA分子和编码修饰形式的HIV env的合成DNA分子。设计所述合成分子的密码子以便使用预定宿主细胞优选的密码子。所述合成分子能作为多核苷酸疫苗使用，这种疫苗通过中和抗体和细胞介导的免疫作用来提供针对HIV有效的免疫预防。所述合成分子能作为免疫原组合物使用。本发明提供多核苷酸，当这种多核苷酸直接导入包括哺乳动物(如灵长类和人类)的脊椎动物体内时，诱导该动物中编码的蛋白质的表达。

如本文中所用的，多核苷酸是一种含有调节元件的核酸组合物，使得导入活的脊椎动物细胞中时，该多核苷酸能够指导细胞机构产生包含该多核苷酸的核酸所编码的翻译产物。在本发明的一实施方案中，该多核苷酸是包含至少一个在操作上与转录启动子相连的HIV基因的多聚脱氧核糖核酸。在本发明的另一实施方案中，该多核苷酸疫苗(PNV)包含编码至少一个经得起真核细胞机构(核糖体、tRNA和其它翻译因子)翻译检验的HIV基因的多聚核糖核酸。该多核苷酸编码的蛋白质是那些在动物中除非在病理条件下出现而通常不出现的蛋白质(如异源性蛋白质)时，例如为与获得性免疫缺陷综合症(AIDS)致病剂人类免疫缺陷病毒(HIV)相关的蛋白质时，则该动物的免疫系统被激活，引起保护性免疫应答。因为这些外源性蛋白质是由该动物组织产生的，表达的蛋白质由主要组织相容性系统MHC以类似于相关生物(HIV)真正感染时的形式加工。结果就是诱导针对同种病原体的免疫应答。

本说明书的多核苷酸当导入生物系统中时，诱导HIV蛋白质与抗原决定基的表达和专一性免疫应答的产生。诱导的抗体反应是专一性针对表达的HIV蛋白质，并中和HIV。另外，诱导专一性识别和破坏HIV感染的细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。

本说明书提供导入哺乳动物组织时在体内在单个细胞中诱导不连续基因产物表达的多核苷酸的使用方法。本说明书提供不需要多次操纵REV赖性HIV基因来获得不依赖REV的基因的方法。这里描述的不依赖REV的表达系统对于它自身的机制是有用的，并且是用于证明在体内单个细胞中表达所需单个基因产物的系统。

因为本发明的许多应用运用于抗病毒接种疫苗，所述多核苷酸通常称为核苷酸疫苗或PNV。这不是说在免疫刺激中和抗肿瘤治疗中，这些多核苷酸另外的应用被认为在本发明发范围之外。

在一实施方案中，将编码HIV基因产物的基因加入表达载体中。该载体含有真核细胞RNA聚合酶识别的转录启动子和一个位于HIV基因编码序列末端的转录终止子。在一优选实施方案中，该启动子是带有内含子A序列的巨细胞病毒启动子(CMV-intA)，尽管那些熟知这一技术的人将认识到：可以使用许多其它已知启动子的任何一种，例如强免疫球蛋白或其它真核基因启动子。一个优选的转录终止子是牛生长激素终止子。特别推荐CMVint A-BGH终止子组合物。

为了帮助制备原核细胞中的多核苷酸，抗生素抗性标记可包含到该表达载体中；该标记可在原核细胞启动子的转录控制之下，以至该标记的表达不发生在真核细胞中。可以利用氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因和其它药学上可接受的抗生素抗性标记。为了帮助通过原核生物的发酵高水平地生产多核苷酸，该载体可能最好含有原核生物的复制起点并且是高拷贝数目。许多市售的原核生物克隆载体提供这些益处。最好是去掉非必需的DNA序列并保证该载体在真核细胞中不能够复制。这就将多核苷酸疫苗序列整合到受体的基因组的风险降低到最低程度。只要当需要将该多核苷酸表达限于特定的组织类型时，可使用组织专一性的启动子或增强子。

在一实施方案中，使用了表达载体pnRSV，其中劳氏肉瘤病毒(RSV)长末端重复(LTR)是作为该启动子使用的。在另一实施方案中，使用了突变的pBR322载体V1，这个载体中克隆有CMV启动子和BGH转录终止子。在另一实施方案中，已将元件V1和pUC19结合，用来生产命名为V1J的表达载体。在V1J或另一个希望的表达载体中克隆了一个HIV基因，例如gp120、gp41、gp160、gag、pol、env或能够诱导抗HIV免疫应答的任何其它的HIV基因。在另一实施方案中，从VIJ中去掉氨苄青霉素抗性基因，并用新霉素抗性基因代替，以在按本发明使用的已克隆出的不同HIV基因中产生V1J-neo。在另一实施方案中，该载体是V1Jns，它和V1Jneo一样，区别是唯一的SfiⅠ限制性位点已加工到V1J-neo位置2114的单个KnpⅠ位点中。在人类基因组DNA中SfiⅠ位点的发生率是非常低的(大约每100,000个碱基一个位点)。因此，这个载体允许简单地通过SfiⅠ消化提取的基因组DNA，小心地监测表达载体整合到宿主DNA中。在进一步的精制中，该载体是V1R。在这个载体中，尽可能多的非必需DNA从载体中“修剪”掉，产生一高度紧密的载体。这个载体是V1Jns的衍生物。该载体允许利用大的插入，较少考虑不适宜的序列被编码和使细胞的摄取最佳化。

本发明的一个实施方案加入来自实验室采用的HIV毒株(例如SF2、ⅢB或MN)的编码HIV的gp160、gp120、gag和其它基因产物的基因。熟知这一技术的人将认识到：利用具有与HIV-1的基因类似功能的HIV-2毒株的基因，期望产生类似于在这里对HIV-1构成物所描述的免疫应答。熟知这项技术的人员已知道获得这些基因的克隆和操作方法。

已经认识到：引起针对实验室采用的HIV毒株的免疫应答可能不足以提供HIV原始现场分离物的中和作用。这样，在本发明的另一实施方案中，将来自毒性HIV原始现场分离物的基因加入该多核苷酸免疫原中。这是通过制备该病毒基因的cDNA拷贝，然后将各个基因亚克隆到该多核苷酸免疫原中来完成的。许多HIV毒株的很多基因的序列现在能在GENEBANK公开获得，并且这些HIV的原始现场分离物能从国立变态反应和感染病研究所(NIAID)获取，这个研究所已与QualityBiological,Inc.[7581 Lindbergh Drive,Gaithersburg，马里兰20879]订有合约使得可得到这些毒株。这些毒株也能从世界卫生组织(WHO)获取[HIV分离和特征记述网络，疫苗研制单位，研究所，世界AIDS方案，CH-1211 Geneva 27，瑞士)。从这一工作中那些熟知这项技术的人将认识到：本发明的一个应用是提供用于体内和体外检验和分析的系统，使得能够作出HIV序列多样性与HIV中和作用的血清学和其它参数的相互关系。加入来自HIV毒株原始分离物的基因提供诱导针对该病毒临床分离物的免疫应答的免疫原，这样，就满足了此领域尚未遇到的需求。此外，由于所述毒性分离物改变，可修饰该免疫原来反映所需要的新序列。

为了保持术语上的一致，遵照下面的本文为描述多核苷酸免疫原构成物的惯例：“载体名称-HIV毒株-基因-附加元件”。这样，其中MN毒株的gp160基因克隆到表达载体V1Jneo上的构成物，这里它给出的名称是“V1Jneo-MN-gp160”。加入到该构成物的另外的元件在下面进一步详细描述。因为该病毒的病原毒株改变，可改变在药物学上最适宜加入的精确基因。然而，如下面所表明的，因为诱导能够保护抵抗异源性毒株的CTL应答，与完整病毒或基于亚单位多核苷酸的疫苗相比，该毒株的变异性在本发明的免疫原和疫苗中是较不关键的。另外，因为该药物容易操作插入新基因，这是容易用分子生物学的标准技术进行的调整。

这里所使用的术语“启动子”是指DNA链上的识别位点，在这一点上RNA聚合酶与之结合。该启动子与RNA聚合酶形成起始复合物，来起始和驱动转录活性，该复合物能够被命名为“增强子”的激活序列或命名为“沉默子”的抑制序列所修饰。

这里所使用的术语“前导序列”是指位于结构基因5’末端与该基因一起被转录的DNA序列。前导序列通常产生具有N末端肽延伸的有时称为原序列的蛋白质。对于注定或分泌到胞外介质或膜上的蛋白质，这种信号序列一般为疏水性序列，指导蛋白质到内质网中，蛋白质从内质网被运输到合适的目的地。

这里所使用的术语“内含子”是指出现于基因中间的DNA区域，这一区域不编码该基因产物中的氨基酸。该内含子的前体RNA被切断，因此既不被转录mRNA，也不被翻译成蛋白质。

术语“盒”是指含有待表达核酸序列的本发明的序列。该盒在概念上类似于盒式磁带。每个盒将有它自身的序列。这样通过交换该盒，该载体将表达不同的序列。因为限制性位点位于5’和3’末端，因此该盒能够容易地被插入、去除或用另一个盒代替。

术语“3’非翻译区域”或“3’UTR”是指通常与该基因一起转录的位于结构基因3’末端的序列。这个3’UTR区通常含有poly A序列。尽管3’UTR从该DNA转录，但在翻译成蛋白质之前它从DNA上被切下。

术语“非编码区”或“NCR”是指与该结构基因的3’UTR区邻近的区域。NCR区含有转录终止信号。

术语“限制性位点”是指限制性内切酶的序列专一性切割位点。

术语“载体”是指一些工具，通过这些工具可以将DNA片段导入宿主有机体或宿主组织中。有各种类型的载体，包括质粒、噬菌体和粘粒。

术语“有效量”表示注射足够的PNA以产生足够水平的多肽。熟知这一技术的人认识到：这一水平可以变化。

为了提供本发明的说明，现提供下面的HIV背景资料。人类免疫缺陷病毒有一核糖核酸(RNA)基因组，其结构描述在图1中。这个RNA基因按照本领域已知的方法必须反转录，以便产生用于克隆和按照这里所指出方法的操纵的cDNA拷贝。在该基因组的每个末端是一用作启动子的长末端重复。在这些末端中间，该基因组在不同的阅读框架中编码作为主要基因产物的gag-pol-env:gag是基团专一性抗原；pol是逆转录酶或聚合酶；也由这一区域编码、在另一的阅读框架中的是负责将例如gp160翻译后加工为gp120和gp41的病毒蛋白酶；env是被膜蛋白；vif是病毒粒子感染性因子；REV是病毒粒子蛋白质表达调节因子；neg是负调节因子；vpu是病毒粒子产率因子“u”；tat是转录的凡是激活因子；vpr是病毒蛋白r。已描述了这些成分的每一种的功能。

在本发明的一个实施方案中，将编码HIV或SIV蛋白质的基因直接连接到转录启动子上。env基因编码大的膜结合蛋白质gp160，它翻译后修饰为gp41和gp120。gp120基因可放在用于表达的巨细胞病毒启动子的控制之下。然而，gp120不是膜结合的，因此，表达时，它可从细胞中分泌出来。因为HIV趋向在被感染细胞中保持休眠状态，最好是也产生针对细胞结合的HIV抗原决定基的免疫应答。另外，最好是疫苗产生在结构上类似于病毒感染产生的膜结合的寡聚ENV抗原，以产生用于中和病毒的最有效的抗体反应。在这里这一目标通过在体内表达细胞膜结合的抗原决定基gp160，以引发免疫系统来完成。但是，由于从未剪接的基因的核中没有输出，因此在缺少REV的情况下，gp160的表达被抑制。为了了解该系统，必须进一步详细描述HIV的生活周期。

在HIV的生活周期中，感染宿主细胞时，HIV RNA基因被反转录成前病毒DNA，这一DNA整合到宿主基因组的DNA中，作为单个转录单位。LTR提供从5’到3’的方向转录HIV基因(gag、pol、env)的启动子，形成整个基因组未剪接的转录物。未剪接转录物作为翻译gag和pol的mRNA；而为了翻译env编码基因，必须发生有限的剪接。关于该表达的调节基因产物REV，必须发生不止一个剪接事件，因为如在图1所示的基因组的装置中REV和env重叠。为了转录env,REV转录必须停止，反之也一样。另外，从细胞核输出未剪接的RNA，需要REV的存在。但是，为了REV以这种方式起作用，REV反应性元件(RRE)必须存在于转录物上(Malim等，Nature 338:254-259(1989))。

在本发明的多核苷酸疫苗中，通过提供完整的剪接基因来消除某些HIV基因必须的剪接(即：提供所需基因产物的完全的开放阅读框架，在该阅读框架中不需要开关或消除非编码区；熟知这项技术的那些人将认识到：当剪接一特定的基因时，在产生的准确的序列中有一些变化幅度；但是只要能得到功能性编码序列，这是可接受的)。因此，在一实施方案中，剪接gp160的整个编码序列，以至于不需要每个基因产物间断的表达。

已知HIV在群体和被感染个体中突变的倾向，按照本发明产生的二元体液免疫应答和细胞免疫应答特别明显地抑制HIV感染。为了配制对HIV的有效保护性疫苗，最好既产生例如对gp160的多价抗体反应(在各种美国人群体中的流行毒株HIV、分化体(clade)B毒株中env的保守性大约为80％)、以HIV为靶子的主要中和作用，也产生对gp160的保守部分和gag编码的病毒内部蛋白有反应性的细胞毒性T细胞。我们已经制备了一包含gp160基因的HIV疫苗，这些gp160基因选自普通实验室毒株、被感染的人群中发现的主要原始病毒分离物、设计成来暴露交叉毒株中和抗体抗原决定基的突变gp160和其它代表性HIV基因，例如gag和pol基因(在HIV分离物中-95％保守)。

实际上，还没有朝免疫缺陷状态发展的所有HIV血清阳性的病人都含有抗gag CTL，同时这些病人中的大约60％显示交叉毒株gp160专一性的CTL。然而，在已经发展成已知为AIDS疾病状态的被感染个体中发现的HIV专一性CTL的量非常低，这证明了我们下述发现的重要性：我们能够诱导交叉毒株CTL反应。

在小鼠和灵长类动物中证实了我们的env和gag多核苷酸疫苗构成物诱导的免疫应答。监视小鼠中监测针对env的抗体产生允许证实：给予的构成物是合适的免疫原，即高比率的接种疫苗的动物显示抗体反应。小鼠还提供适合于检验我们的构成物对CTL诱导的最易得到的动物模型，并因此用来评价特定的构成物是否能够产生这种活性。猴(非洲绿猴、恒河猴、黑猩猩)提供用于在大的非啮齿类动物中抗体评价的另外的物种，包括灵长类。由于在小鼠血清中观察到针对逆转录病毒的高水平的内源性中和作用活性，对于抗血清中和作用检验这些物种也优于小鼠。这些数据表明：我们的疫苗产生足够的免疫原性，以在这一系统已知保护水平中和性抗体的基础上在实验中获得黑猩猩/HIVⅢB攻击免疫模型的保护。然而，现在在科学界出现的和日益接受的保护的定义是远离所谓的“消毒性免疫”，这表示免于HIV感染的完全保护，来预防疾病。这一目标的许多相关物包括通过或者HIV逆转录酶活性、血清样品的传染性、p24 ELISA检验或者血液中其它的HIV抗原浓度、增加的CD4+T细胞浓度和增加的存活率来测定的降低的血液病毒效价。(参见例如Cohen,J.,Science 262:1820-1821,1993，关于抗HIV疫苗效力的发展的定义的讨论)。本发明的免疫原还产生针对传染性(临床，基础领域)的HIV分离物的中和性免疫应答。免疫学A．对env的抗体反应

1．gp160和gp120.用ELISA分析来确定表达或是分泌型gp120、或是膜结合型gp160的疫苗载体对env专一性抗体的生产是否是有效的。通过gp160转染细胞的溶胞产物的免疫印迹分析，提供我们疫苗接种载体的env表达的最初体外特征记述。这些数据证实并定量分析gp160的表达，用抗gp41和抗gp120单克隆抗体使转染子细胞gp160的表达可见。在本发明的一实施方案中，因为下列原因gp160较gp120优选：(1)原始的gp120载体在鼠中产生不一致的免疫原性，并且在非洲绿猴中反应性非常差或无反应性；(2)gp160通过由于包含gp41而提供增加的大约190个氨基酸残基，来贡献出额外的中和抗体和CTL抗原决定基。(3)就四聚体装配和总体构象而论，gp160的表达更类似于病毒的env，这可提供寡聚物依赖性中和作用抗原决定基；并且(4)我们发现，象在小鼠、白鼬和非人类的灵长类中产生中和抗体反应的膜结合流感HA构成物的成功一样，抗gp160抗体的产生胜过抗gp120抗体产生。选择哪种类型的env或是否优选env亚片段的混合物是由下面略述的实验决定的。

2．中和活性的存在和广度

检测来自猴的ELISA阳性抗血清，显示它既中和同源性HIV毒株，也中和异源性HIV毒株。

3．V3对非V3中和抗体

对于env PNV的主要目标是产生广谱中和抗体。现在已经表明：针对V3环的抗体是非常毒株专一性的，这一反应的血清学已用来定义毒株。

a．非V3中和抗体似乎主要识别gp120之中负责与CD4结合的不连续的结构抗原决定基。可能由于病毒与其细胞配体结合的需要所施加的突变上的限制，对这一结构域的抗体是多克隆的并具有更宽范围交叉中和性。体外分析用来检验免疫动物的血清阻止gp120与固定在96孔板的CD4的结合。第二个体外分析检测与代表固定在塑料上的选定V3域的合成多肽的直接抗体结合。这些分析适用于来源于我们研究中所用的任何动物类型的抗血清，并定义我们的疫苗已产生中和抗体的类型，以及提供在体外与病毒中和作用的关联。

b．gp41含有至少一个主要中和决定簇，对应于广谱中和2F5单克隆抗体(可由Viral Testing Systems Corp.,Texas Commerce Tower,600Travis street,Suite 4750,Houston,TX 77002-3005(美国)得到，或由Waldheim Pharmazeutika GmbH,Boltzmangasse 11,A-1091 Wien,Austria得到)识别的高度保守的线状抗原决定基和其它潜在的位点，包括位于gp41 N末端保守性好的“融合肽”域。除了上面描述的通过免疫印迹来检测针对gp41的抗体外，用一用于抗体的体外分析检验，所述抗体与代表固定在塑料上的这些域的合成肽结合。

4．抗体反应的成熟。在HIV血清阳性病人中，中和抗体反应从主要的抗V3发展到包括更广谱的中和抗体，这些抗体包含上面描述的(#3)结构gp120域抗原决定基，包括gp41抗原决定基。在当时和随后的疫苗接种的过程中监测这些类型的抗体反应。B．针对env和gag的T细胞反应性。

1．CTL反应的产生。在细胞内合成的病毒蛋白质引起MHCI限制的CTL反应。这些蛋白质中的每一种在血清阳性病人中都诱出CTL。我们的疫苗还能够在小鼠中诱出CTL。这些小鼠毒株的免疫遗传学有助于这些研究，如用流感NP所证明的。已在Balb/C的鼠中定义了HIV蛋白质env、REV、nef和gag的几个抗原决定基，这样有利于体外的CTL培养和细胞毒性分析。最好使用同源肿瘤品系，例如用这些基因转染的鼠肥大细胞瘤P815，以提供CTL和体外抗原专一性再刺激的靶子。已经知道定义能够诱出MHCI型限制性细胞毒性T淋巴细胞的方法。还发现包含氨基酸152-176的肽诱导HIV中和抗体，这些方法可用来鉴定包含在本发明的PNV中的致免疫性的抗原决定基。另一方面，可以使用编码gp160、gp120、蛋白酶或gag的整个基因。如这里所使用，T细胞效应物功能是与成熟T细胞表型相联系的，例如细胞毒性、用于B细胞激活的细胞因子的分泌和/或巨噬细胞和嗜中性白细胞的补充或刺激。

2．T_H活性的测定。通过加入或重组蛋白质或肽抗原决定基，检验得自免疫动物的回忆专一性抗体的脾脏细胞培养物。通过这些培养物的增殖或细胞因子的产生来监测T细胞被伴随性脾脏抗原提呈细胞APC提呈的这些抗原的激活作用。细胞因子产生的类型还允许将T_H反应分类为1型和2型。因为占优势的T_H2反应似乎与免疫平衡的血清阳性病人中的细胞免疫排斥相关联，定义在病人中给定的PNV所引起的反应类型是可能的，允许操纵产生的免疫应答。

3．延迟型超敏感性(DTH)。i.d.注射后，DTH对病毒抗原表示细胞的主要MHCⅡ限制的免疫作用。因为可得到商品形式的重组体HIV蛋白质和已知抗原决定基的合成肽，用这些试剂容易在接种疫苗的脊椎动物中测定DTH反应，这样就提供诱导细胞免疫的另一体内关联。保护

基于上面的免疫学研究，可预言我们的疫苗在脊椎动物中对毒性HIV的攻击是有效的。在用PNV构成物或包含gp160ⅢB、gagⅢB、nefⅢB和REVⅢB的PNV构成物混合物充分地疫苗接种黑猩猩后的HIVⅢB/黑猩猩攻击模型中完成这些研究。ⅢB毒株在这方面是有用的，因为已经建立了这种毒株的致死剂量的黑猩猩效价。然而，用HIV的任何毒株和对于给定毒株专一性或异源性的抗原决定基来设想同样的研究。除了黑猩猩外，第二个疫苗接种/攻击模型是Scid-hu PBL小鼠。在这个模型允许用随后的HIV攻击小鼠宿主检验人类淋巴系统免疫系统和我们的疫苗。这个系统是有益的，因为它容易适合于与任何HIV毒株一起使用，并且它提供针对HIV原始现场分离物的多种毒株的保护证据。第三种攻击模型利用杂种HIV/SIV病毒(SHIV)，它们中一些已显示感染恒河猴并引起导致死亡的免疫缺陷(参见Li,J.等J.AIDS 5:639-646,1992)。用我们的多核苷酸疫苗构成物接种恒河猴，对用致死剂量的SHIV的后续攻击是有保护性的。PNV构成物概述

将HIV和其它基因连接到最适于多核苷酸疫苗接种的表达载体中。基本上去掉所有的外来DNA，留下转录启动子、免疫原性的抗原决定基、转录终止子、细菌的复制起点和抗生素抗性基因这些必须元件。

HIV晚期基因如env和gag的表达是REV依赖性的，并需要REV反应元件(RRE)存在于病毒基因转录物上。在没有REV的情况下，通过用例如来自tPA(组织型血纤维蛋白溶酶激活物)的异源前导序列，更优选是用例如在高度表达的哺乳动物蛋白质(如免疫球蛋白)前导肽中发现的前导肽来取代gp120前导肽，可以产生一分泌形式的gp120。我们已将tPA-gp120嵌合基因插入到在被转染细胞中(RD，人横纹肌肉瘤系)有效表达分泌gp120的V1Jns中。不加入REV表达载体，单顺反子gp160转染时不产生任何蛋白质。典型的构成物组分包括(但不局限于)：

1．TPA-gp120MN；

3．gp160ⅢB；

10．gagⅢB：对于抗gag CTL；

11．tPA-gp120ⅢB；

12．具有结构突变的gp160:V1、V2、和/或V3环缺失或取代

20．编码抗原的基因，这些抗原由非HIV病原体表达，例如(但不局限于)流感病毒核蛋白质、血细胞凝集素、基质、神经氨酸苷酶和其它抗原性蛋白质；单纯疱疹病毒基因；人乳头瘤病毒基因；肺结核抗原；甲、乙或丙性肝炎病毒抗原。

用本发明的非复制型质粒DNA进行免疫，证明多核苷酸HIV免疫原针对后续病毒攻击的保护性效力。这是有益的，因为没有牵涉感染性因子，不需要病毒粒子的装配，并允许选择决定簇。此外，因为gag序列和蛋白酶和几个其它病毒基因产物在HIV的不同的毒株中是保守的，因此使得能够保护抵抗与与获得克隆基因的毒株同源的和异源的毒性HIV毒株的后续攻击。

i.m.注射编码gp160的DNA表达载体，导致产生针对后续病毒攻击的显著保护性免疫。特别是，产生gp160专一性抗体和原始的CTL。尽管可变的被膜蛋白的抗原性变化和漂变，但针对保守的蛋白质的免疫应答可以是有效的。因为每个HIV基因产物显示某种程度的保守性，并因为响应胞内表达和MHC加工而产生CTL，因此可予测：许多病毒基因引起类似于gp160所取得的反应。这样，如在表达载体中克隆的和测序的接点所显示的(见下面)，已克隆出许多这些基因，使得这些构成物为可利用形式的免疫原剂。

本发明提供一种手段，不需要自主复制型因子或佐剂，来诱导交叉毒株保护性免疫。另外，用本发明的多核苷酸进行免疫提供许多其它的益处。该疫苗接种方法应适用于肿瘤和感染性因子，因为CD8+CTL反应对病理生理过程都是重要的[K.Tanaka等，Annu.Rev.Immunol.6,359(1988)]。因此，引起针对对于转化过程为决定性的蛋白质的免疫应答，可能是一种有效的肿瘤预防或免疫治疗手段。注射病毒蛋白质和人生长激素DNA后，产生针对表达的蛋白质的高效价抗体提示：这是制备或单独的、或与导向保守抗原的细胞毒性T淋巴细胞疫苗联合的、基于抗体的疫苗的一种易做到的和高效的手段。

生产和纯化DNA构成物的容易性可有利地与传统纯化蛋白质的方法相比较，这样有利于产生联合疫苗。因此，可以制备、混合和共给与例如编码gp160、gp120、gp41或任何其它HIV基因的多种构成物。因为DNA注射后保持蛋白质的表达，因此可提高B-和T-细胞记忆的持久性，借此引起长效的体液免疫和细胞介导的免疫。

用于制备和纯化DNA构成物的分子生物学的标准技术，使制备本发明的DNA免疫原成为可能。尽管标准的分子生物学技术因此足以用来生产本发明的产物，但这里公开的专一性构成物提供惊人地产生交叉毒株和原始HIV分离物中和作用的新型多核苷酸免疫原，这是用标准失活的全病毒或亚基蛋白质疫苗到目前为止未得到的结果。

待导入疫苗受体中可表达的DNA或转录的RNA的量将取决于所使用的转录和翻译启动子的强度和表达的基因产物的免疫原性。一般来说，将大约1ng-100mg，最好为10μg-300μg的免疫学或预防有效剂量直接给予到肌肉组织中。也设想皮下注射、皮内导入、通过皮肤压印、和其它的给药模式，例如腹膜内、静脉内、或吸入传送。还设想了提供加强免疫接种。还设想了在用HIV多核苷酸免疫原疫苗接种后，用HIV蛋白质免疫原(例如gp160、gp120和gag基因产物)加强免疫。例如静脉内、肌内、皮下或其它给药方式的肠胃外给与白细胞介素-12蛋白质，同时或随后肠胃外导入本发明的PNV也是有益的。

该多核苷酸可以是裸露的，就是说，不与对接受者免疫系统有影响的任何蛋白质、佐剂或其它试剂结合。在这种情况下，最好该多核苷酸是存在于生理上可接受的溶液中，例如但不局限于无菌盐水或无菌缓冲盐水。另一方面，该DNA可与脂质体、例如卵磷脂脂质体或其它本领域已知的脂质体结合，作为DNA-脂质体混合物，或该DNA可与本领域已知的佐剂(例如蛋白质或其它载体)结合，来加强免疫应答。例如但不局限于钙离子的帮助细胞摄入DNA的试剂，也能有益地应用。这些试剂在这里通常被称为转染促进剂和药学上可接受的载体。用于包被包被有多核苷酸的微弹的技术是本领域已知的，而且也可用来与本发明相结合。

下面的实施例是以说明的方式提供，并且不希望以任何方式限制本发明。

实施例1材料说明

载体pF411和pF412：这些载体是从R.Gallo实验室构建的载体pSP62亚克隆来的。pSP62是从Biotech Research Laboratories,Inc.得到的试剂。pSP62有一从λHXB2亚克隆得到的HXB2基因组的12.5kb XbaⅠ片段。pSP62的SalⅠ和XbaⅠ消化产生HXB2片段：5’-XbaⅠ/SalⅠ,6.5kb和3’-SalⅠ/XbaⅠ,6kb。将这些插入物亚克隆到pUC 18的SmaⅠ和SalⅠ位点上，产生pF411(5’-XbaⅠ/SalⅠ)和pF412(3’-XbaⅠ/SalⅠ)。pF411含有gag/pol，而pF412含有tat/env/nef。Repligen试剂：重组rev(ⅢB),#RP1024-10rec.gp120(ⅢB),#RP1001-10抗rev单克隆抗体，#RP1029-10抗gp120 mAB,#1C1,#RP1010-10AIDS研究和参考试剂方案：

抗gp41 mAB杂交瘤，Chessie8,#526

设计了方案来诱导对HIV、主要是针对HIV gag(～95％保守)和env(gp160或gp120；70-80％保守)基因产物的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和中和抗体反应。gp160含有仅已知的HIV粒子上的中和抗体抗原决定基，而抗env和抗gag CTL反应的重要性被已知的这些细胞免疫的触发与感染后原发性病毒血症的清除的关系所突出，这一反应发生在中和抗体出现之前，以及CTL在维持无病状况方面起作用。因为HIV的遗传多样性是众所周知的，我们希望通过包括得自临床分离物和gp41(～90％保守)的几个代表性env基因，来获得更宽范围的中和抗体，同时高度保守的gag基因应产生广谱的交叉毒株CTL反应。

实施例2HIV晚期基因产物的异源性表达

例如env和gag的HIV结构基因需要HIV调节基因rev的表达，以有效地产生全长蛋白质。我们已发现rev依赖性的gag表达产生低水平的蛋白质，并且rev自身对细胞可能是毒性的。尽管在体外我们获得了相对高水平的rev依赖性的gp160表达，但在体内用rev/gp160 DNA免疫后，这一疫苗引出低水平的针对gp160的抗体。这可能产生于rev已知的细胞毒性和在含有数以百计核的肌小管中获得rev功能的日益增加的困难(rev蛋白需要在和发生gag或env蛋白表达的rev依赖性转录物相同的核中)。然而，用env基因、gag的选定修饰来获得不依赖rev的表达已是可能的。这些用于疫苗目的质粒的评价正在进行之中。

一般来说，我们的疫苗已利用原始的HIV(ⅢB)env和gag基因，来使在我们的泛化疫苗接种载体V1Jns中的表达最佳化，V1Jns由CMV立即早期(IE)启动子、BGH多腺苷酸化位点和pUC骨架组成。不依赖rev的env表达的不同效率取决于使用多大的基因片段(例如gp120对gp160)，可以通过用来自组织专一性血纤维蛋白质溶酶激活子(tPA)基因的前导肽取代其天然分泌性前导肽，并且表达CMVIE启动子后面的产生的具有CMV内含子A的嵌合基因来得到。tPA-gp120是一分泌的gp120载体的例子，以这种形式构成的载体行使的作用足以在疫苗接种的小鼠和猴中引起抗gp120免疫应答。

因为据报道膜锚着蛋白与分泌的蛋白质相比，可以诱导实质得多的(并可能对HIV中和更专一性)的抗体反应和得到另外的免疫抗原决定基，我们制备了V1Jns-tPA-gp160和V1Jns-rev/gp160。如转染细胞的免疫印迹分析所显示的，不加入rev，该tPA-gp160载体产生可检测量的gp160和gp120，尽管表达水平比rev依赖型gp160表达质粒rev/gp160得到的低得多。这可能是因为赋予rev依赖于gp160转录物的抑制区域(命名为INS)出现在gp160之中包括在gp41的COOH末端的多个位点上(参见下面图示)。制备了tPA-gp160的COOH末端截短形式的载体tPA-gp143，设计这种载体，以通过消除这些抑制序列来提供env的总体表达水平。该gp143载体还消除了包含已知引起膜蛋白质转移到溶酶体上而不是细胞表面的肽基序(例如Leu-Leu)的胞内gp41区域。这样，与全长gp160相比，可能期望gp143既提高env蛋白的表达水平(通过降低rev依赖性)，也提高蛋白质运送到细胞表面的效率，在那里这些蛋白质更能够在DNA疫苗接种后诱出抗gp60抗体。通过rev反应元件(RRE)序列(350bp)广泛的沉默诱变来进一步修饰tPA-gp143，以消除另外的表达抑制序列。这个构成物gp143/mutRRE以两种形式制备：或消除(形式A)、或保留(形式B)gp120/41的蛋白酶解位点。制备了两种形式，因为文献报道：用在牛痘中表达的不可酶切的gp160疫苗接种小鼠，诱出的抗体比可酶切形式的gp160接种小鼠的水平高得多。

开发了在细胞转染子中gp160/gp120表达的定量ELISA，来测定这些载体的相对表达能力。在体外转染293细胞后，定量测定细胞结合的对分泌的/释放的gp120产生下列结果：(1)tPA-gp160表达的gp120比rev/gp160低5-10倍，胞内gp120与运送到细胞表面的gp120保持相似的比率。(2)tPA-gp143产生的gp120的分泌比rev/gp160大3-6倍，仅具有低水平的细胞结合gp143，这证明：gp160的胞质尾引起gp160胞内滞留，这一现象能通过部分缺失该序列来克服；并且，(3)tPA-gp143/mutRREA和B产生的蛋白表达水平比亲代tPA-gp143大～10倍，同时证明形式A消除了蛋白酶解加工。

因此，我们为增加不依赖rev的表达的策略，已导致逐渐增加总体表达水平以及使膜锚着gp143远离溶酶体、重导向细胞表面。重要的是注意到：将得自不同的原始病毒分离物的gp120序列插入含有或位于NH₂末端(tPA引物)或位于COOH末端(gp41)的这些修饰的载体盒之中应该是可能的，这两个末端在不同的病毒毒株间几乎没有抗原差异。换句话说，这是可以容易地通过插入得自不同原始病毒分离物的gp120来修饰的种属构成物，以获得临床相关的疫苗。

将这些表达策略应用到与疫苗目的有关的病毒上，并确定我们方法的通用性，我们还制备了得自原始HIV分离物(含有北美人共有V3肽环；巨噬细胞向性和非合胞体诱导表型)的tPA-gp120载体。这个载体在转化的293细胞中产生gp120的高度表达/分泌，并在小鼠中诱出抗gp120抗体，表明它以功能形式克隆。原始分离物gp160基因也可以用于与得自实验室毒株的gp160同样的方式表达。

实施例3对HIV-1 env多核苷酸疫苗的免疫应答：

接受gp120 DNA疫苗的非洲绿猴(AGM)和恒河猴(RHM)在疫苗接种2-3次后，显示低水平的中和抗体，这不能通过额外的疫苗接种来增加。在HIV疫苗领域日益认识到对于诱出中和性抗体，寡聚gp160可能是比gp120单体更妥当的靶抗原(Moore和Ho,J.Virol.67:863(1993))，这些结果和这种认识引导我们致力于得到基于gp160载体的有效表达(见上文)。小鼠和AGM也用原始分离物来源的tPA-gp120疫苗来接种。这些动物显示抗V3肽(用同源性序列)交互的终点抗体效价，范围为500～5000，这证实：该疫苗设计对于临床相关的病毒分离物是有作用的。

基于gp160的疫苗rev-gp160和tPA-gp160在小鼠和非人类灵长类动物中不能持续地诱出抗体反应，或产生低的抗体效价。我们用tPA-gp143质粒的在鼠中和AGM中两次疫苗接种后，产生的几何平均效价＞103。这些数据表明，我们通过提高表达水平，已显著改进了gp160样疫苗的免疫原性。将继续记述该构成物以及tPA-gp143/mutRRE A和B载体的抗体反应的特征，特别是病毒中和的特征。

显然，gp120 DNA疫苗接种在所有受试的淋巴区(脾脏、血液、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结和髂骨淋巴结)都产生有效的辅助T细胞反应，具有T_H1样细胞因子分泌轮廓(即g-干扰素和IL-2的产生，几乎没有或没有IL-4)。这些细胞因子一般启动强细胞免疫，并已经与HIV血清阳性病人无病状态的维持有关联。已经表明淋巴结是HIV复制的主要部位，当病毒不易在血液中检测到时，淋巴结含有大储藏量的病毒。能够在各种各样的淋巴部位中引起抗HIV免疫应答的疫苗，例如用我们的DNA疫苗已经显示的，可以协助阻止最初感染后淋巴管的成功移生。

如前面所述的，我们认为实现下面的目标，对于把我们这一项目成功的机会增加到最大程度是最重要的：(1)能够在灵长类中产生较强中和抗体反应的基于env的载体；(2)在灵长类动物中引起以CTL和辅助效应物功能为特征的强T淋巴细胞反应的gag和env载体；(3)在我们的疫苗中利用来自临床上相关HIV-1毒株的env和gag基因并记述它们引起的免疫学反应特征，特别是对原始分离物的中和作用；(4)用合适的最优化疫苗证明在例如黑猩猩/HIV(ⅢB)或恒河猴/SHIV的动物攻击模型中的保护作用；以及，(5)确定适于临床应用的免疫应答的持续时间。这些目标的前三个已取得了显著的进展，确定我们最近的gp160和gag疫苗接种构成物是否改善这些最初结果的实验正在进行之中。

实施例4用于疫苗生产的载体A．V1Jneo表达载体：

去除用于含有V1J的细菌的抗生素选择的amp^r基因是必要的，因为氨苄青霉素不能用在大规模的发酵罐中。通过用SspⅠ和Eam1105I限制性内切酶消化，从V1J的pUC骨架中去除amp^r基因。用琼脂糖凝胶电泳纯化剩下的质粒，用T4 DNA聚合酶钝化末端，然后用小牛肠的碱性磷酸酶处理。用PstⅠ限制性内切酶切除包含在pUC4K质粒内的得自转座子903的市售kan^r基因，用琼脂糖凝胶电泳纯化，用T4 DNA聚合酶钝化末端。将这一片段与V1J骨架相连接，并衍生出具有任意方向kan^r基因的质粒，这些质粒被命名为V1Jneo#’s 1和3。用限制性酶消化分析、接合点区域的DNA测序证实这些质粒的每一种，表明产生和V1J类似量的质粒。异源性基因产物的表达也可与V1J的这些V1Jneo载体相比拟。我们任意选择其中包含的kan^r基因的方向与V1J中的ampr基因相同的V1Jneo#3(下文称为V1Jneo)作为该表达构成物。B．V1Jns表达载体：

将一SfiⅠ位点加入V1Jneo中以有利于整合作用研究。将一市售的13个碱基对的SfiⅠ接头(New England Biolabs)加入该载体BGH序列中的KpnⅠ位点上。V1Jneo用KpnⅠ线状化、用凝胶纯化、用T4 DNA聚合酶钝化并连接到钝化的SfiⅠ接头上。通过限制性图谱分析来选择克隆的分离物，并通过该接头的测序来确认克隆分离物。这个新的载体命名为V1Jns。V1Jns中(有SfiⅠ)异源基因的表达可与V1Jneo中(有KpnⅠ)的相同基因的表达相比拟。C．V1Jns-tPA：

为了将异源前导肽序列提供给分泌蛋白和/或膜蛋上，将V1Jn修饰，以包含人组织专一性血纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)前导序列。将两个合成的互补寡聚物退火，然后连接到已被BgⅢ消化的V1Jn上。有义寡聚物和反义寡聚物是5’-GATC ACC ATG GAT GCA ATG AAGAGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTCTTC GTT TCG CCC AGC GA-3’,SEQ.ID:18：和5’-GAT CTC GCT GGGCGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG CAG CAG CAC ACA GCAGAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GGT-3’。Kozak序列是有义寡聚物的下划线部分。这些寡聚物有突出的碱基，适合于连接到BgⅢ切割的序列上。连接后破坏上游BgⅢ位点，而保留下游BgⅢ用于后续的连接。通过DNA测序证实连接点以及整个tPA前导序列。另外，为了与我们的一致最佳化载体V1Jns(=具有SfiⅠ位点的V1Jneo)一致，通过用T4 DNA聚合酶钝化KpnⅠ位点，接着与SfiⅠ接头(分类号#1138,NewEngland Biolabs)连接，将SfiⅠ限制位点置于V1Jn-tPA的BGH终止子区域中的KpnⅠ位点上。用限制消化和琼脂糖凝胶电泳确认这种修饰。

实施例5Ⅰ．HIV env疫苗构成物：产生分泌型env来源抗原(gp120和gp140)的疫苗：

如gp120的rev依赖型env基因的表达是如下进行的：将gp120从HIV的MN毒株用PCR克隆出来，该毒株或带有天然前导肽序列(V1Jns-gp120)，或是作为于组织特异性纤维蛋白的溶酶原激活剂(tPA)前导肽的融合物而取代天然前导肽(V1Jns-tPA-gp120)。已显示tPA-gp120的表达不依赖rev[B.S Chapman等，Nuc.Acids Res.19,3979(1991)；应注意的是：其它前导序列可能提供类似的功能，使gp120基因不依赖rev]。这可以通过用上面描述过的载体制备下列gp120构成物来完成：

实施例6gp120疫苗构成物：A．V1Jns-tPA-HIV_MNgp120：

用设计以除去该肽前导序列前30个氨基酸并且促进克隆于V1Jns-tPA中的寡聚物，PCR扩增HIV_MN gp120基因(Medimmune)，以产生含有tPA前导肽、在氨基酸残基30后接剩余的gp120序列的嵌合蛋白。这种设计允许不依赖rev的gp120表达，以及从包含有这种质粒的细胞中分泌可溶性gp120。所用有义和反义PCR寡聚物是5’-CCC CGG ATCCTG ATC ACA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3’和5’-C CCCAGG AATC CAC CTG TTA GCG CTT TTC TCT CTG CAC CAC TCTTCT C-3’。翻译终止密码已划下划线标出。这些寡聚物在该翻译开放阅读框架的任一末端含有BamHI限制性酶切位点，而在有义寡聚物的3’端有一BClⅠ位点。该PCR产物相继用内切酶BClⅠ和BamHI消化，再连接到已被BglⅡ消化随后用小牛肠碱性磷酸酶处理过的V1Jns-tPA中。产生的载体经序列分析证实，在tPA前导序列和pg120编码序列之间有框内融合；并且通过转染的RB细胞免疫印迹法分析证实gp120的表达和分泌。B．V1Jns-tPA-HIV_ⅢB gp120：

此载体与I.A.类似，其差别是HIVⅢB毒株用于gp120序列。有义和反义PCR寡聚物分别是：5’-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTGTGG GTC ACA GTC-3’和5’-CCA CAT TGA TCA GAT ATC TTA TCTTTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TC-3’。这些寡聚物提供位于该插入物任一末端的BclⅠ位点和恰好位于3’末端的BclⅠ位点上游的EcoRV。5’末端的BclⅠ位点充许连接到V1Jns-tPA的BglⅡ位点，以形成一个嵌合tPA-gp120基因，它编码tPA前导序列和gp120，而没有其天然前导序列。连接产物通过限制性消化和DNA序列分析而证实。

实施例7gp140疫苗构成物：

类似于tPA-gp120，用tPA前导序列取代该天然前导序列通过PCR制备这些构成物，但是通过紧接该跨膜蛋白的NH₂末端终止基因，设计生产分泌型抗原(预定的羧基末端氨基酸序列=NH₂-……TNWLWYIK-COOH)。不象产生gp120的构成物，gp140构成物应该产生低聚体的抗原，且保留有已知的含有gp41的抗体中和抗原决定基，如2F5单克隆抗体限定的ELDKWA。

根据gp160蛋白酶解切割位点在gp120和gp41的连接处是保留(B)还是通过Kieny等(Prot.Eng.2:219-255(1988))描述的用合适的氨基酸置换删除(A)，以2种形式(A或B)制备构成物(野生型序列=NH₂-…KAKRRV VQRERR…COOH；突变型序列=NH₂-…KAQNHVVQNEHQ…COOH，划线处示突变的氨基酸)。A．V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-A/SRV-13’-UTR(基于HIV-1_ⅢB)：

此构成物用以下有义和反义PCR寡聚物通过PCR方法获得：5’-CTGAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAAT TTG GGG TTG CTCTGG-3’,SEG.ID：：和5’-CGC AGG GGA GGT GGT CTA GAT ATCTTA TTA TTT TAT ATA CCA CAG CCA ATT TGT TAT G-3’，以从载体ⅣB(含有最佳化的RRE-A区段)中得到一个AvrⅡ/EcoRⅤ区段。该3’-UTR为制备的合成基因片段，它来源于猿猴逆转录病毒1(SRV-1，参见下文)，已将其插入紧接gp140开放阅读框架的3’端导入的SrfⅠ限制性酶切位点中。该UTR列先前已描述为促进HIV env和gag的不依赖rev的表达。B． V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-B/SRV-13’-UTR(基于HIV-1_ⅢB)：

此构成物与ⅡA类似，区别在于env蛋白酶解切割位点已通过用构成物ⅣC作为起始材料而被保留。C．V1Jns-tPA-gp140/opt30-A(基于HIV-1_ⅢB)：

此构成物来源于ⅣB，通过AvrⅡ和SrfⅠ限制性内切酶消化后，接着通过对应于gp30、但包含最适于翻译的密码子(参见以下gp32-opt)的合成DNA区段的连接而成。该gp30-opt DNA通过PCR从gp32-opt扩增而获得，使用的有义和反义寡聚物分别是：5’-GGT ACA CCT AGG CATCTG GGG CTG CTC TGG-3’和5’-CCA CAT GAT ATC G CCC GGG CTTA TTA TTT GAT GTA CCA CAG CCA GTT GGT GAT G-3’。此DNA区段用限制性内切酶AvrⅡ和SrfⅠ消化，并连接到已用AvrⅡ和SrfⅠ消化的V1Jns-tPA-gp143/opt32-A(ⅣD)上，以除去相应的DNA区段。所形成的产物通过连接接点的DNA序列分析和免疫印迹法分析而证实。D．V1Jns-tPA-gp140/opt30-B(基于HIV-1ⅢB)：

此构成物与ⅡC类似，区别是已保留env蛋白酶解切割位点。E．V1Jns-tPA-gp140/opt全部为A：

这种构成物的env基因含有完整的最适密码子。恒定区(C1、C5、gp32)是在ⅣB、D、H中描述的那些区域，用由最适于翻译的密码子构成的区段(见下列基于HIV-1 MN V1-V5的实施例)加入一条对应于可变区1-5的额外合成的DNA区段。F．V1Jns-tPA-gp140/opt全部为B：

此构成物与ⅡE相似，区别在于保留有env蛋白酶解切割位点。G．V1Jns-tPA-gp140/opt全部为A(非ⅢB毒株)：

此构成物与上面的ⅡE相似，区别是用来自于非ⅢB毒株的env氨基酸序列来确定整个可变区(V1-V5)的最适密码子用法。H．V1Jns-tPA-gp140/opt全部为B(非ⅢB毒株)：

此构成物与ⅡG相似，区别是保留有env蛋白酶解切割位点。

实施例8gp160疫苗构成物：

按照上文描述的，依据哪一种gp160蛋白酶解切割位点，以2种形式(A或B)制备构成物。A．V1Jns-rev/env：

此载体是上述D节中描述载体的变异型，其区别是缺失外显子1中完整的tat编码区直至REV开放阅读框架的开头部分。V1Jns-gp160ⅢB(见上文A节)用限制性内切酶PstⅠ和KpnⅠ消化以切除gp160基因的5’区。用PCR扩增得到一个编码第一个REV外显子直至来源于HXB2基因组克隆的gp160中KpnⅠ位点的DNA区段。所述有义和反义PCR寡聚物分别是：5’-GGT ACA CTG CAG TCA CCG TCC T ATG GCA GGA AGAAGC GGA GAC-3’和5’-CCA CAT CA GGT ACC CCA TAA TAG ACTGTG ACC-3’。这些寡聚物分别在该DNA片段的5’和3’末端提供PstⅠ和KpnⅠ限制性酶切位点。产生的DNA用PstⅠ和KpnⅠ消化，用琼脂糖凝胶电泳纯化，并与V1Jns-gp160(PstⅠ/KpnⅠ)连接。产生的质粒可通过限制性内切酶消化而证实。B．V1Jns-gp160：

通过从包含来源于HIV_Ⅲb克隆HXB2的HIV_Ⅲb基因组的3’末端一半的质粒pF412中PCR扩增而克隆HIV_Ⅲb gp160。此PCR有义和反义寡聚物分别为：5’-GGT ACA TGA TCA ACC ATG AGA GTG AAG GAGAAA TAT CAG C-3’和5’-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATCTTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3’。划线部分为Kozak序列和翻译终止密码子。这些寡聚物在env基因两端的翻译开放阅读框架外提供BclⅠ限制性酶切位点。(BclⅠ消化酶切位点适合于与BglⅡ消化酶切位点连接，随后丧失了对两种限制性酶的敏感性。选择BclⅠ用于PCR克隆的gp160，因为该基因带有内部BglⅠ位点和BamHI位点)。正象上文为其它PCR得到的基因描述的那样，反义寡聚物也加入一个正好在BclⅠ位点之前的EcoRV位点。扩增的gp160基因用琼脂糖凝胶电泳纯化，用BclⅠ消化，连接到已用BglⅡ消化并用小牛肠碱性磷酸酶处理过的V1Jns上。此克隆基因的大小约为2.6kb，用DNA序列分析来证实V1Jns与gp160的每个连接点。C．V1Jns-tPA-gp160(基于HIV-1_ⅢB)：

此载体与上面实施例1(C)类似，区别是用PCR法获得不带有天然前导序列的全长gp160。有义寡聚物与使用于I.C.中的相同，反义寡聚物为5’-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AATCCT TTC C-3’。这些寡聚物在该插入物一个末端提供BclⅠ位点，恰好在3’末端BclⅠ位点的上游提供一个EcoRV位点。5’末端BclⅠ位点允许连接到V1Jns-tPA的BglⅡ位点中，产生编码tPA前导序列和不含有其天然前导序列的gp160的一个嵌合tPA-gp160基因。连接产物通过限制性消化和DNA序列分析而证实。D．V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-A(基于HIV-1_ⅢB)：

此构成物基于ⅣH，带有对于C5和gp41而非gp32完整的最适宜密码子区段，带有一个额外最适宜密码子区段(见下文)来取代位于接着tPA前导序列后的gp120氨基末端的C1。通过SOE PCR法用合成连接的C1/143片段的下列PCR寡聚物，将该新C1区段连接到剩余的gp143的片段上：5’-CCT GTG TGT GAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAGAAT GAT ACT AAT AC-3’。产生的gp143基因除了V1-V5区域以外含有合适的密码子用法，且有一个独特的PmeⅠ限制性酶切位点，它位于C1和V1的连接区域以利于加入其它HIV基因的可变区。E． V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-B(基于HIV-1_ⅢB)：

此构成物与ⅢD相似，区别是保留有env蛋白酶解切割位点。F．V1Jns-tPA-gp160/opt全部为A(基于HIV-1_ⅢB)：

此构成物的env基因由上述完整的最适宜密码子组成。其恒定区(C1、C5、gp32)是那些已在ⅢD、作为盒子使用(用于所有完整的最适宜的gp160)的ⅢE中描述过的，而可变区V1-V5得自一个由最适宜密码子组成的合成DNA区段。G．V1Jns-tPA-gp160/opt全部为B：

此构成物与ⅢF相似，区别是保留了env蛋白酶解切割位点。H．V1Jns-tPA-gp160/opt全部为A：

此构成物与上面的ⅢF相似，区别是来源于非ⅢB毒株的env氨基酸序列用于确定整个可变区(V1-V5)的最适密码子用法。Ⅰ．V1Jns-tPA-gp160/opt全部为B：(非ⅢB毒株)：

此构成物与ⅢH相似，区别是保留了env蛋白酶解切割位点。

实施例9gp143疫苗构成物：

类似于上述其它含有tPA的构成物(tPA-gp120、tPA-gp140和tPA-gp160)，通过PCR制备这些构成物，tPA前导序列取代其天然前导序列，但是设计产生COOH封端的膜结合env(预定的胞内氨基酸序列=NH₂-NRVRQGYSP-COOH)。此构成物的设计目的是结合伴随tPA导入的env较高的表达，并将对应于env胞内部分的转录物或肽区域可能对表达或蛋白质稳定性/转移到细胞表面有负影响的可能性降低到最小程度。如上所述，根据gp160蛋白酶解切割位点是切除还是保留，以2种形式(A或B)制备构成物。产生于截短至gp143的残余gp41片段称为gp32。A．V1Jns-tPA-gp143：

用质粒pF412，用以下有义和反义寡聚物通过PCR制备此构成物：5’-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3’,SEQ.ID：：和5’-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGAATA GCC CTG CCT CAC TCT GTT CAC-3’。产生的DNA区段在任一末端含有BclⅠ限制性位点，以克隆入位于BglⅡ消化过的V1-Jns-tPA的紧接3’-到env开放阅读框架的SrfⅠ位点上。所述构成物用连接接点的DNA序列分析以及转染细胞的免疫印迹法分析来证实。B．V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-A：

此构成物基于ⅣA，用上述独特的MunⅠ限制性酶位点和下游的SrfⅠ位点切除该DNA区段。该区段与gp120 C5域的一部分和整个gp32相对应。合成的DNA区段对应于约350bp的gp160的rev反应元件(RRE A)，由对翻译最适宜的密码子组成，将其通过剪接重叠延伸(SOE)PCR方法在两个区段的接点产生一个AvrⅡ限制性酶切位点(但在氨基酸序列上无改变)，连接到剩余的gp32片段上。为产生含有gp32的区域，用下列有义和反义PCR寡聚物来进行PCR反应，所述寡聚物分别为：5’-CTGAA AGA CCA GCA ACT CCT AGG GAT TTG GGG TTG CTG TGG-3’和5’-CCA CAT TGA TCA G CCC GGG C TTA GGG TGA ATA GCCCTG CCT CAC TCT GTT CAC-3’(该寡聚物用作ⅣA的反义寡聚物)。通过SOE PCR方法，用以下寡聚物将突变型RRE(mutRRE-A)区段与gP32的野生型序列连接：由于寡聚物为5’-GGT ACA CAA TTG GAGGAG CGA GTT ATA TAA ATA TAA G-3’，反义寡聚物用于产生gp32区段。产生的连接DNA区段用MunⅠ和SrfⅠ限制酶消化，并连接到母本gp143/MunⅠ/SrfⅠ消化的质粒中。产生的构成物通过连接和SOE PCR接点的DNA序列分析和转染细胞的免疫印迹证实。C．V1Jns-tPA-gp143/murRRE2-B：

此构成物与ⅣB相似，区别是利用mutRRE-B合成基因区段取代mutRRE-A而保留有env蛋白酶解切割位点。D．V1Jns-tPA-gp143/opt32-A：

此构成物来源于ⅣB，通过AvrⅡ和SrfⅠ消化后连接与gp32相对应但由对翻译最适宜密码子(见下文gp32opt)组成的合成DNA区段而构建。产生构成物用连接接点的DNA序列分析和免疫印迹法证实。E．V1Jns-tPA-gp143/opt32-B：

此构成物与ⅣD相似，区别是通过用ⅣC作为最初的质粒而保留有env蛋白酶解切割位点。G．V1Jns-tPA-gp143/SRV-13’-UTR：

此构成物与ⅣA相似，区别是将来源于猿猴逆转录病毒-1(SRV-1，见下文)的3’-UTR加入紧接gp143开放阅读框架3’端导入的SrfⅠ限制性酶切位点。此UTR序列前面已描述为促进HIV env和gag的rev非依赖型表达。H．V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32A：

此构成物基于ⅣD，它有C5和gp32的完整的最适宜密码子区段段，带有在tPA前导序列后的gp120的氨基末端取代C1的另一最适密码子区段(见下文)。通过SOE PCR，用下列合成连接的C1/143区段的PCR寡聚物将这条新C1区段与剩余的gp143片段连接：5’-CCT GTG TGTGAG TTT AAA C TGC ACT GAT TTG AAG AAT GAT ACT AAT AC-3’。产生的gp143基因除去V1-V5区外含有最适密码子用法，且有一独特的PmeⅠ限制酶切位点，该位点位于C1和V1的接合处，用于插入其它HIV基因的可变区。I．V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt 32 B：

此构成物与ⅣH相似，区别是仍保留有env蛋白酶解切割位点。J．V1Jns-tPA-gp143/opt全部为A：

此构成物的env基因全部由最适密码子组成。其恒定区(C1、C5、gp32)是在4B、D、H中描述过的那些区域，用由对翻译最适密码子组成的合成DNA区段插入另一对应于可变区V1-V5的合成DNA片区段。K．V1Jns-tPA-gp143/opt全部为B：

此构成物与ⅣJ相似，区别是保留有env蛋白酶解切割位点。L．V1Jns-tPA-gp143/opt全部为A(非ⅢB毒株)：

此构成物与上面的ⅢG相似，区别是来源于非ⅢB毒株的env氨基酸序列用于确定整个可变区(V1-V5)的最适密码子。M．V1Jns-tPA-gp143/opt全部为B(非ⅢB毒株)：

此构成物与ⅢG相似，区别是来源于非ⅢB毒株的env氨基酸序列用于确定整个可变区(V1-V5)最适密码子。

实施例10gp143/glyB疫苗构成物：

与上面的其它含tPA构成物(tPA-gp120、tPA-gp140、tPA-gp143和tPA-gp160)类似，通过PCR方法制备这些构成物，它们带有取代其天然前导序列的tPA前导序列，但是设计用于产生COOH封端的膜结合env，正如gp143的情况一样。然而，gp143/glyB构成物与gp143的区别在于，在设计以包含胞内肽域的6个氨基酸中，最后4个与人类血型糖蛋白B(glyB)蛋白质的C末端哪些氨基酸相同(预定的胞内氨基酸序列=NH₂-NRLIKA-COOH，划线的残基与glyB对应，而“R”在env和glyB中都存在)。此构成物的设计目的是，通过用来源于含有一小段胞质区域(胞内氨基酸序列=NH₂-RRLIKA-COOH)的丰度表达的蛋白质(glyB)肽序列取代可能对表达或蛋白质稳定性/转移到细胞表面产生负影响的区域，完全消除对应于该env胞内部分的任何转录物或肽区域而获得额外的env表达和导向细胞表面的寻靶。以2种形式(A或B)制备构成物，这取决于如上描述的gp160蛋白酶解切割位点是切除还是保留。A．V1Jns-tPA-gp143/opt32-A/glyB：

此构成物与ⅣD相似，区别是使用下列反义PCR寡聚物，用上述血型糖蛋白B取代gp143的胞内肽域，所述寡聚物为：5’-CCA CAT GATATC G CCC GGG C TTA TTA GGC CTT GAT CAG CCG GTT CACAAT GGA CAG CAC AGG-3’。B．V1Jns-tPA-gp143/opt32-B/glyB：

此构成物与ⅤA相似，区别是保留有env蛋白酶解切割位点。C．V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-A/glyB：

此构成物与ⅤA相似，区别是与ⅣH的情况一样，gp120的第一个恒定区(C1)被最适于翻译的密码子取代。D．V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-B/glyB：

此构成物与ⅤC相似，区别是保留有env蛋白酶解切割位点。E．V1Jns-tPA-gp143/opt全A/glyB：

此构成物的env基因完全由上述最适密码子组成。F．V1Jns-tPA-gp143/opt全B/glyB：

此构成物与ⅤE相似，区别是保留有env蛋白酶解切割位点。G．V1Jns-tPA-gp143/opt全A/gly B(非ⅢB毒株)：

此构成物与上文介绍的ⅢG相似，区别是来自非ⅢB毒株的env氨基酸序列用于确定整个可变区(V1-V5)最适密码子使用。H．V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/gly B(非ⅢB毒株)：

此构成物与ⅤG相似，区别是保留有env蛋白酶解切割位点。具有可变环缺失的HIV env疫苗构成物：

这些构成物可以包含有上面列举的所有env形式(gp120、gp140、gp143、gp160、gp143/glyB)，但是具有在制备过程中缺失的gp120区内的可变环(如V1、V2和/或V3)。这些修饰的目的是为了消除那些可能封闭保守的中和抗原决定基(如CD4结合位点)暴露的肽区段。例如，下面的寡聚物可用于PCR反应，以产生导致THE C1和C2片段连接的V1/V2缺失：5’-CTG ACC CCC CTG TGT GTG GGG GCT GGC AGT TGTAAC ACC TCA GTC ATT ACA CAG-3’。

实施例11用于提高env基因表达的合成基因区段的设计：

将基因区段转化为具有相同的翻译序列(除去已注明的部位)的序列，但是具有R.Lathe在研究论文中定义的可选择密码子用法，该论文参见J.Molec.Biol.第183卷，第1-12页(1985)，标题是“从氨基酸序列数据推断的合成寡核苷酸探针：理论上与实践上考虑”。下述增加HIVenv基因区段的rev非依赖型表达的方法学基于我们的假说，即已知在哺乳动物细胞中该基因不能有效地表达是整个转录子组成的结果。因此，利用编码同一蛋白序列的可选择密码子可能在缺少rev时解除rev表达的限制。env中密码子用法的检查显示：高百分比的密码子出现在那些高表达的人类基因很少的密码子中。如下用来自Lathe等的数据描述采用的特定密码子置换方法：

1．鉴定用于适合的开放阅读框架的密码子的定位。

2．比较野生型密码子以观察人类基因使用的频率(参见Lathe等论文中表3)。

3．如果密码子不是最常用的，则用一个基于表5中数据的最适于高表达的密码子替换它。

4．检查新密码子的第三个核苷酸和紧接该第一个密码子3’端的相邻密码子的第一个核苷酸。如果配对已通过此新密码子选择而产生5’-CG-3’，则用表达5中指示的选择替换它。

5．重复此步骤直至已替换完整基因区段。

6．检查新基因序列中由这些密码子替换产生不需要序列(如“ATTTA”序列、不慎产生的内含子剪接识别位点、不需要的限制性酶切位点等)和消除这些序列的替换密码子。

7．装配合成基因区段并测试其改善的表达。

这些方法用于产生下列HIV env合成基因区段，以产生一个完全由最适于表达的密码子用法组成的基因：(ⅰ)gp120-C1(opt)；(ⅱ)V1-V5(opt)；(ⅲ)RRE-A/B(mut或opt)；以及(ⅳ)gp30(opt)；每个区段获得的密码子替代/核苷酸取代的百分率分别为56/19、73/26、78/28和61/25。这些区段的每一个都已在上文中详细描述过，其实际序列见下文。

gp120-C1(opt)

这是一个从成熟N末端到V1起始点的gp120恒定区1(C1)的基因片段，设计具有最适于表达的密码子用法。1 TGATCACAGA GAAGCTGTGG GTGACAGTGT ATTATGGCGT GCCAGTCTGG51 AAGGAGGCCA CCACCACCCT GTTCTGTGCC TCTGATGCCA AGGCCTATGA101 CACAGAGGTG CACAATGTGT GGGCCACCCA TGCCTGTGTG CCCACAGACC151 CCAACCCCCA GGAGGTGGTG CTGGTGAATG TGACTGAGAA CTTCAACATG201 TGGAAGAACA ACATGGTGGA GCAGATGCAT GAGGACATCA TCAGCCTGTG251 GGACCAGAGC CTGAAGCCCT GTGTGAAGCT GACCCCCCTG TGTGTGAGTT301 TAAAC

MN V1-V5 (opt)

这是一对应于具有最适于表达的密码子用法的HIV MN V1-V5(1066BP)的衍生蛋白序列的基因区段。1 AGTTTAAACT GCACAGACCT GAGGAACACC ACCAACACCA ACAACTCCAC51 AGCCAACAAC AACTCCAACT CCGAGGGCAC CATCAAGGGG GGGGAGATGA101 AGAACTGCTC CTTCAACATC ACCACCTCCA TCAGGGACAA GATGCAGAAG151 GAGTATGCCC TGCTGTACAA GCTGGACATT GTGTCCATTG ACAATGACTC201 CACCTCCTAC AGGCTGATCT CCTGCAACAC CTCTGTCATC ACCCAGGCCT251 GCCCCAAAAT CTCCTTTGAG CCCATCCCCA TCCACTACTG TGCCCCTGCT301 GGCTTTGCCA TCCTGAAGTG CAATGACAAG AAGTTCTCTG GCAAGGGCTC351 CTGCAAGAAT GTGTCCACAG TGCAGTGCAC ACATGGCATC AGGCCTGTGG401 TGTCCACCCA GCTGCTGCTG AATGGCTCCC TGGCTGAGGA GGAGGTGGTC451 ATCAGGTCTG AGAACTTCAC AGACAATGCC AAGACCATCA TCGTGCACCT501 GAATGAGTCT GTGCAGATCA ACTGCACCAG GCCCAACTAC AACAAGAGGA551 AGAGGATCCA CATTGGCCCT GGCAGGGCCT TCTACACCAC CAAGAACATC601 ATTGGCACCA TCAGGCAGGC CCACTGCAAC ATCTCCAGGG CCAAGTGGAA651 TGACACCCTG AGGCAGATTG TGTCCAAGCT GAAGGAGCAG TTCAAGAACA701 AGACCATTGT GTTCAACCAG TCCTCTGGGG GGGACCCTGA GATTGTGATG751 CACTCCTTCA ACTGTGGGGG GGAGTTCTTC TACTGCAACA CCTCCCCCCT801 GTTCAACTCC ACCTGGAATG GCAACAACAC CTGGAACAAC ACCACAGGCT851 CCAACAACAA CATCACCCTC CAGTGCAAGA TCAAGCAGAT CATCAACATG901 TGGCAGGAGG TGGGCAAGGC CATGTATGCC CCCCCCATTG AGGGCCAGAT951 CAGGTGCTCC TCCAACATCA CAGGCCTGCT GCTGACCAGG GATGGGGGGA1001 AGGACACAGA CACCAACGAC ACCGAAATCT TCAGGCCTGG GGGGGGGGAC1051 ATGAGGGACA ATTGG

RRE.Mut(A)

这是对应于HIV-1的rev反应元件(RRE)的由最适于表达的密码子用法组成的DNA区段。“A”形式也已在gp120/gp41接点处用粗体所示的核苷酸去掉了已知的蛋白质水解切割位点。1 GACAATTGGA GGAGCGAGTT ATATAAATAT AAGGTGGTGA AGATTGAGCC51 CCTGGGGGTG GCCCCAACAA AAGCTCAGAA CCACGTGGTG CAGAACGAGC101 ACCAGGCCGT GGGCATTGGG GCCCTGTTTC TGGGCTTTCT GGGGGCTGCT151 GGCTCCACAA TGGGCGCCGC TAGCATGACC CTCACCGTGC AAGCTCGCCA201 GCTGCTGAGT GGCATCGTCC AGCAGCAGAA CAACCTGCTC CGCGCCATCG251 AAGCCCAGCA GCACCTCCTC CAGCTGACTG TGTGGGGGAT CAAACAGCTT301 CAGGCCCGGG TGCTGGCCGT CGAGCGCTAT CTGAAAGACC AGCAACTCCT351 AGGC

RRE.Mut(B)

这是对应于HIV-1的rev反应元件(RRE)的由最适于表达的密码子用法组成的DNA区段。“B”形式在gp120/gp41接点处保留已知的蛋白质水解切割位点。1 GACAATTGGA GGAGCGAGTT ATATAAATAT AAGGTGGTGA AGATTGAGCC51 CCTGGGGGTG GCCCCAACAA AAGCTAAGAG AAGAGTGGTG CAGAGAGAGA101 AGAGAGCCGT GGGCATTGGG GCCCTGTTTC TGGGCTTTCT GGGGGCTGCT151 GGCTCCACAA TGGGCGCCGC TAGCATGACC CTCACCGTGC AAGCTCGCCA201 GCTGCTGAGT GGCATCGTCC AGCAGCAGAA CAACCTGCTC CGCGCCATCG251 AAGCCCAGCA GCACCTCCTC CAGCTGACTG TGTGGGGGAT CAAACAGCTT301 CAGGCCCGGG TGCTGGCCGT CGAGCGCTAT CTGAAAGACC AGCAACTCCT351 AGGC

gp32(opt)

这是从AvrⅡ位点(紧接RRE末端开始)到gp143末端的由最适于表达的密码子用法构成的gp32基因区段。1 CCTAGGCA TCTGGGGCTG CTCTGGCAAG CTGATCTGCA CCACAGCTGT51 GCCCTGGAAT GCCTCCTGGT CCAACAAGAG CCTGGAGCAA ATCTGGAACA101 ACATGACCTG GATGGAGTGG GACAGAGAGA TCAACAACTA CACCTCCCTG151 ATCCACTCCC TGATTGAGGA GTCCCAGAAC CAGCAGGAGA AGAATGAGCA201 GGAGCTGCTG GAGCTGGACA AGTGGGCCTC CCTGTGGAAC TGGTTCAACA251 TCACCAACTG GCTGTGGTAC ATCAAAATCT TCATCATGAT TGTGGGGGGC301 CTGGTGGGGC TGCGGATTGT CTTTGCTGTG CTGTCCATTG TGAACCGGGT351 GAGACAGGGC TACTCCCCCT AATAAGCCCG GGCGATATC

SRV-1 CTE(A)

这是对应于来自猿猴逆转录病毒-1基因组的3’-UTP的合成基因区段。该DNA按下面的方向置于HIV基因的3’末端，以增加不依赖rev的表达。

SrfⅠ EcoRV5′ -GCCC GGGC GATATC TA GACCACCTCC CCTGCGAGCT AAGCTGGACA

GCCAATGACG GGTAAGAGAG TGACATTTTT CACTAACCTA AGACAGGAGG

GCCGTCAGAG CTACTGCCTA ATCCAAAGAC GGGTAAAAGT GATAAAAATG

TATCACTCCA ACCTAAGACA GGCGCAGCTT CCGAGGGATT TGTCGTCTGT

TTTATATATA TTTAAAAGGG TGACCTGTCC GGAGCCGTGC TGCCCGGATG

ATGTCTTGG GATATC GCCC GGGC -3′

EcoRV SrfⅠ

SRV-1 CTE(B)

此合成基因区段与上文所示SRV-1 CET(A)相同，区别是使用一个单核苷酸突变(用粗体表示)以消除一段ATTTA序列。此序列与较高的mRNA更新有关。

SrfⅠ EcoRV5′-GCCC GGGC GATATC TA GACCACCTCC CCTGCGAGCT AAGCTGGACAGCCAATGACG GGTAAGAGAG TGACATTTTT CACTAACCTA AGACAGGAGGGCCGTCAGAG CTACTGCCTA ATCCAAAGAC GGGTAAAAGT GATAAAAATGTATCACTCCA ACCTAAGACA GGCGCAGCTT CCGAGGGATT TGTCGTCTGTTTTATATATA TTAAAAAGGG TGACCTGTCC GGAGCCGTGC TGCCCGGATGATGTCTTGG GATATC GCCC GGGC -3′

EcoRV SrfⅠ

实施例11体外gp120疫苗的表达：

在转染的人类横纹肌肉瘤(RD)细胞中测试这些构成物的体外表达。从转染的RD细胞分泌的tPA-gp120定量研究表明：V1Jns-tPA-gp120载体产生分泌型gp120。体内gp120疫苗：参见图12(小鼠数据)：

V1Jns-tPA-gp120_MN PNV诱导型Ⅱ类MHC限制性T淋巴细胞的gp120特异性抗原反应性。处死已用200μg V1Jns-tPA-gp120_MN疫苗接种两次的Balb/c小鼠，取其脾脏以在体外测定辅助T淋巴细胞对重组gp120的反应性。用PBMC(外周血单核细胞)用5μg/ml重组gp120ⅢB(Repligen，目录号#RP1016-20)与4×10⁵个细胞/ml进行T细胞增殖检验。通过在单独培养基中培养这些细胞来获得这些细胞摄入³H-胸苷的基础水平，同时用2μg/ml的ConA刺激诱导最大增殖。ConA诱导的反应峰出现于大约第3天(at～3days)，并在此时刻与培养基对照样本一起收获，而用抗原处理的样本与另一种培养基对照在第5天收获。接种疫苗的小鼠的反应与天然的、年龄相匹配的同种系小鼠相比较。正如所期望的那样，天然和免疫小鼠中的ConA阳性对照都产生很高的增殖。在接种疫苗的小鼠中用gp120处理得到非常强的辅助T细胞记忆反应，而天然小鼠中却没有反应(特异性反应性的阈值是＞3-4的刺激指数(SI)；SI值通按样本cpm/培养基cpm的比值计算)。分别与抗gp120ELISA效价5643和11,900比较，接种疫苗的小鼠得到的SI分别是65和14。令人感兴趣的是，对这两种小鼠而言，对抗体较高的应答者比抗体效价较低的那些小鼠给出显著低的T细胞反应性。此实验表明：分泌型gp120载体在体内有效地激活辅助T细胞和产生强抗体反应。此外，这些免疫应答的每一个均可用抗原测定，该抗原与那些由接种PNV(ⅢB对MN)编码抗原相比是异源性的。

实施例12gp160疫苗：

除了分泌型gp120构成物以外，我们已制备了用于全长的膜结合gp160的表达构成物。除了gp120以外，gp160构成物的基本原理是：(1)可利用更多的抗原决定基用于CTL刺激和包括gp41在内的中和抗体的产生，将有效的HIV中和单克隆抗体(2F5，见上文)导向所述抗原决定基；(2)可以得到与病毒产生的gp160相关的更天然的蛋白质结构；(3)膜结合的流感HA构成物免疫原性的成功[Ulmer等，Science 259:1745-1749,1993；Montgomery,D.等，DNA and Cell Biol.,12:777-783,1993]。gp160即使具有异源性前导肽序列，仍保留了实质的rev依赖性，因此制备进一步的构成物以在缺乏rev时增加表达。

实施例13Hiv细胞毒性T淋巴细胞的测定：

本节描述的方法阐明用于接种疫苗小鼠的测定。基本类似的分析可以用于灵长类，除了必须建立同源B细胞系以用作每种动物的靶细胞。这在人类可通过用EB病毒，而在恒河猴可用乙型疱疹病毒而完成。

外周血单核细胞(PBMNC)或来源于新鲜抽取的血液或来源脾脏，用Ficoll-Hypaque离心从白细胞中分离红细胞；而对小鼠也可取用淋巴结。或通过体外在IL-2(20U/ml)和伴刀豆球蛋白A(2μg/ml)中培养6-12天或者使用特异性抗原，用等量的辐射抗原提呈细胞由PBMC中制备效应CTL。特异性抗原可以或者由合成肽(通常为9-15个氨基酸)组成，所述肽是CTL识别所用动物的MXC单倍型的已知抗原决定基；或者由设计表达合适抗原的痘苗病毒构成物组成。靶细胞不是同源细胞系，就是单倍型匹配的细胞系，所述细胞系已经过处理而呈现所述的合适抗原，用于体外刺激CTL。对Balb/c小鼠，P18肽(ArgIleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsn,SEQ.ID:51:，用于HIV MN毒株)可以以10μM的浓度使用，以在体外用放射性同源脾细胞来再刺激CTL，并可以在细胞毒性分析中，在分析前通过在37℃培养约2小时而用于以1-10μM致敏靶细胞。对这些H-2^dMHC单倍型小鼠而言，鼠肥大细胞系P815提供良好的靶细胞。通过在37℃下培养靶细胞1-2小时(～5×10⁶细胞0.2mCi)，随后清洗几次靶细胞，抗原致敏的靶细胞中负载有在CTL杀伤时从靶细胞内部释放的Na⁵¹CrO₄。CTL群体与靶细胞按效应物与靶细胞的不同比例比例(例如100∶1、50∶1、25∶1等等)混合，一起沉淀，在收获上清液前于37℃培养4-6小时，然后用r计数器检验上清液中放射性释放量。细胞毒性以靶细胞(用0.2％TritonX-100处理得到)的总释放量的百分率计算，这些靶细胞的自发释放量已被扣除。

实施例14HIV专一性抗体的检验：

设计ELISA法，不是用特定的重组蛋白就是用合成肽作为底物抗原，来检测针对HIV产生的抗体。用PBS(磷酸缓冲盐水)溶液中的2μg/ml重组抗原，按每孔50μl于40℃在摇床上过夜包被96孔微量孔板。或者由抗原中重组蛋白(gp120,rev:Replign Corp；gp180,gp41:AmericanBio-technologies,Inc.)或者由合成肽(来源于ⅢB等的与病毒分离物序列相应的V3肽：American Bio-technologies,Inc.；对于单克隆抗体2F5的gp41抗原决定基)。孔板用清洗缓中液(PBS/0.05％吐温20)冲洗4次，随后加入200μl/孔封闭缓冲液(PBS/0.05％吐温20中的1％石竹乳(Camation milk)溶液)于室温下摇动约1小时。免疫前血清和免疫血清在封闭缓冲液中按所需要的稀释范围进行稀释并在每孔加入100μl。孔板在室温下摇动保温1小时，再用洗涤缓冲液洗4次。第二抗体与用封闭缓冲液按1∶2000稀释的辣根过氧化物酶(抗恒河猴Ig,SouththernBiotechnology Associates；抗鼠Ig和抗免Ig,Jackson Immuno Research)结合，再以100μl/孔加入每个样本中，于室温下摇动保温1小时。孔板用洗涤缓冲液洗4次，再按100μl/孔加入在100mM pH4.5的柠檬酸盐缓冲液中1mg/ml的邻苯二胺(o-PD,Calbiochem)溶液继续反应。孔板在450nm处在动力学上(反应的最初10分钟)和10与30分钟的终点时读出吸光度(Thermomax微孔板读板仪，Molecular Devices)。

实施例15HIV中和抗体的检验：

使用来源于接种疫苗的动物血清如下在体外进行HIV分离物中和作用测定：待测血清和免疫前血清在使用前在56℃加热60分钟灭活。将已知效价量的HIV-1在向96孔微量孔板中的10⁵MT-4人类淋巴细胞加入之前，加到待测血清的1∶2系列稀释液中，然后于室温下孵育60分钟。病毒/细胞混合物在37℃时孵育7天，再用四唑鎓染料对培养物染色以检定病毒介导的细胞杀伤。病毒的中和可通过防止病毒介导的细胞死亡观测到。

实施例16临床Hiv分离物基因的分离：

从用ConA处理而激活的受感染PBMC中克隆HIV病毒基因。获得所属病毒基因的优选方法是使用所需基因侧翼的特定寡聚物，从感染的细胞基因组中用PCR方法进行扩增。第二种获得病毒基因的方法是从感染细胞的上清液中纯化病毒RNA，并从这些材料中制备cDNA再进行PCR。此方法与上述克隆鼠B7基因的方法极相似，区别是使用的PCR寡聚物，使用随机的六聚体而非特殊的引物寡聚物以制备cDNA。

从感染细胞沉淀通过将其在STE溶液(10mM NaCl,10mMEDTA,10mM Tris-HCl,pH8.0)中裂解纯化基因组DNA,STE溶液中加入的蛋白酶K和SDS的终浓度分别为0.1mg/ml和0.5％。此混合物于56℃过夜孵育，再用0.5体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提。通过加入终浓度为0.3M的醋酸钠和2倍体积冷乙醇来沉淀水相。从溶液中沉淀DNA后，将该DNA再悬浮于0.1X TE溶液中(1X TE=10mMTris-HCl,pH8.0,1mM EDTA)。此刻加入终浓度为0.1％的SDS和2U RNA酶A，于37℃孵育30分钟。此溶液依上法用苯酚/氯仿/异戊醇抽提，然后用乙醇沉淀。将DNA悬浮于0.1X TE中并在260nm处通过测量其紫外吸收而定量。样本贮存于-20℃贮存直至用于PCR。

用Perkin-Elmer Cetus试剂盒和方法进行PCR，所用的gp160有义和反义寡聚物分别是：5’-GA AAG AGC AGA AGA CAG TGG CAATGA-3’和5’-GGG CTT TGC TAA ATG GGT GGC AAG TGG CCCGGG C ATG TGG-3’，这些寡聚物在所形成的DNA片段3’末端加入一个SrfⅠ位点。产生于PCR的区段克隆入或是V1Jns或是V1R疫苗接种载体中，通过DNA序列分析证实V3区域以及连接接点。

实施例17T细胞增殖检验：

得到PBMCs并检验通过PBMC群落中的增殖测定而测试对特定抗原的回忆反应。用在收获前加入到细胞培养物中保温最后18-24小时的³H-胸苷来监测增殖。如果增殖已发生，细胞收获物在滤膜上保留含同位素的DNA，而休眠的细胞没有加入同位素，同位素以游离形式不保留在滤膜上。将啮齿类或灵长类物种的4×10⁵细胞铺在96孔微量滴定板上中总共200μl的完全培养基(RPMI/10％胎牛血清)中。用PBMC和单独的培养基确定背景增殖反应，同时利用1-5μl/ml浓度的凝集素(例如植物凝集素(PHA)或伴刀豆球蛋白(ConA))以作为阳性对照，来产生非专一性反应。专一性抗原由或已知肽抗原决定基、纯化的蛋白质，或灭活病毒组成。抗原浓度范围对肽为1-10μM，对蛋白质为1-10μg/ml。凝集素诱导的增殖在细胞培养保温的第3-5天到达最高点，而抗原专一性反应在第5-7天到达最高点。当得到至少高于培养基背景三倍的辐射计数时，发生特异性增殖，辐射计数常给出与背景之比值，或刺激指数(SI)。已知HIV gp160包含几个已知引起gp160/gp120免疫的或HIV感染的个体的T细胞增殖的几种肽。这些肽中最常用的是：T1(LysGlnIleIleAsnMetTrpGlnGluValGlyLysAlaMetTyrAla)；T2(HisGluAspIleIleSerLeuTrpAspGlnSerLeuLys)；和TH4(AspArgValIleGluValValGlnGlyAalTyrArgAlaIleArg)。已证实这些肽刺激来自于抗原致敏的小鼠、非人类灵长类动物和人类的PBMC增殖。

实施例18载体V1R的制备：

在继续优化我们的基础接种疫苗载体的努力中，我们制备了一个命名为V1R的V1Jns衍生物。构建这一载体的目的是为了获得最小尺寸的疫苗载体，即没有不必要的DAN序列，这个载体仍保留V1J和V1Jns提供的总体最佳化的异源基因表达特征和高的质粒产量。我们从文献和通过实验确定(1)可以除掉该pUC骨架之中的包含大肠杆菌复制起点的区域，而不影响来自细菌的质粒产量；(2)如果插入一细菌终止子替代卡那霉素开放阅读框架后的Kanr基因的3’区域，该区域可以去除掉，并且(3)来自BGH终止子的3’一半的大约300bp可以去除，而不影响它的调节功能(在BGH元件之中的原始KpnⅠ限制性酶切位点后面)。

通过利用PCR来分别合成源于V1Jns代表CMVintA启动子/BGH终止子、复制起点和卡那霉素抗性元件的三个DNA区段，来构建V1R。用所述PCR寡聚物将用于每一区段的独特限制性酶切位点加入每一片段末端：SspⅠ和XholⅠ用于CMVintA/BGH；EcoRV和BamHI用于Kan^r基因；和BclⅠ和SalⅠ用于Ori^r。选择这些酶切位点，因为它们允许定向连接PCR衍生的每个DNA区段，随后丧失每一位点：EcoRV和SspⅠ留下适宜连接的平端DNA，而BamHI和BclⅠ留下互补的突出，SalⅠ和Xhol也一样。通过PCR获得这些区段后，用上面所提到的合适的限制性内切酶消化每一区段，然后在含有全部三种DNA区段的单一反应混合物中将每一区段连接起来。将Ori^r的5’末端设计成包括通常在这一区域内发现的不依赖T2 rho的终止子序列，以至于它能够提供卡那酶素抗性基因的终止信息。用限制性酶消化(＞8种酶)和通过连接位点的DNA测序来确认该连接产物。产生DNA质粒，用V1R之中的病毒基因的异源性表达似乎类似于V1Jns。获得的载体大小上的净降低值是1346bp(V1Jns=4.86kb；V1R=3.52kb)，见图11,SEQ.ID:45:。

用来合成V1R的PCR寡聚物序列(下划线的是选择性酶切位点，并序列后的括号中鉴定)：

(1)5′-GGT ACA AAT ATT GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC

G-3′

[SspⅠ],SEQ.ID:,

(2)5′-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC

ACC-3′

[XhoⅠ],SEQ.ID::

(用于CMVintA/BGH区段)

(3)5′-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA

AAA TC-3′[EcoRV],SEQ.ID::

(4)5′-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTT

ACA ACC-3′[BamHI],SEQ.ID::

(用于卡那霉素抗性基因区段)(5)5′-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATCTTC TTG-3′[BclⅠ],SEQ.ID::,(6)5′-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGCTGG-3′[SalⅠ],SEQ.ID::

(用于大肠杆菌的复制起点)

用下面的寡聚物对V1R的连接接点进行测序：

5’-GAG CCA ATA TAA ATG TAC-3’,SEQ.ID::[CMVintA/kan^r接点]

5’-CAA TAG CAG GCA TGC-3’,SEQ.ID::[BGM/ori接点]

5’-G CAA GCA GCA GAT TAC-3’,SEQ.ID::[ori/kan^r接点]

实施例19HIV晚期基因产物的异源性表达

例如env和gag的HIV结构基因需要HIV调节基因rev的表达，以有效地生产全长的蛋白质。我们已发现rev依赖性的gag表达产生低水平的蛋白质，且rev自身对细胞是有毒性的。尽管我们得到了体外相对高水平的rev依赖性的gp160表达，但在体内用rev/gp160 DNA免疫后，这个疫苗诱出低水平的针对gp160的抗体。这可能是因为已知的rev细胞毒性和在含有数以百计的核的肌小管中获得rev功能的日益增加的困难(rev蛋白需要与rev依赖性转录物在同一核中，以便表达gag或env蛋白)。然而，用选择性修饰的env基因来获得不依赖rev的表达已是可能的。1．不依赖rev的env表达：

一般来说，我们的疫苗已利用了原始HIV(ⅢB)的env和gag基因，来使我们泛化的疫苗接种载体V1Jns的表达最佳化，V1Jns是由一CMV立即早期(IE)启动子、一BGH来源的多腺苷酸化和翻译终止序列以及pUC骨架组成。根据所用的是多大的基因区段(例如gp120对gp160)，通过用从组织专一性血纤维蛋白质溶酶激活子(tPA)基因的前导肽取代它的天然分泌性前导肽，并在具有CMV内含子A的CMVIE启动子后面表达产生的嵌合基因，可以得到不依赖rev的env表达的不同效率。tPA-gp120是以该方式构建的分泌型gp120载体的一个实例，它所起的作用足以在接种疫苗的小鼠和猴中引起抗gp120的免疫应答。

因为据报道：膜固定的蛋白质可以诱导与分泌型蛋白质相比，实质得多的(并可能对HIV中和更专一性)的抗体反应和得到额外的抗原决定基，我们制备了V1Jns-tPA-gp160和V1Jns-rev/gp160。如转染细胞的免疫印迹分析所显示的，不加入rev，该tPA-gp160载体产生可检测量的gp160和gp120，尽管表达水平比从rev依赖型gp160-表达质粒rev/gp160得到的低得多。这可能是因为赋予rev对gp160转录物依赖性的抑制区域出现在包括在gp41的COOH末端的gp160之中的多位点上。制备一COOH末端截短形式的tPA-gp160(tPA-gp143)载体，设计该载体以通过消除这些抑制序列来提高env的总体表达水平。该gp143载体还消除包含已知引起膜蛋白转移到溶酶体上而不是细胞表面的肽基序(例如Leu-Leu)的胞内gp41区域。这样，与全长gp160相比，可期望gp143表达env蛋白质的水平提高(通过降低rev依赖性)和蛋白质转移到细胞表面的效率更大，在那里在DNA疫苗接种后，这些蛋白质可能更能够诱出抗gp160抗体。通过广泛地沉默诱变rev反应元件(RRE)序列(350bp)来消除另外的表达抑制序列，以进一步修饰tPA-gp143。构成物gp143/mutRRE以两种形式制备：或消除(形式A)或保留(形式B)gp120/41的蛋白水解切割位点。制备了两种形式，因为文献报道：用在牛痘中表达的不可切割的gp160疫苗接种小鼠诱出的抗体水平比可切割形式高得多。

开发了用于细胞转染物中gp160/gp120表达的定量ELISA，来确定这些载体的相对表达能力。在体外转染293细胞后定量测定细胞结合型对分泌/释放型gp120产生下列结果：(1)tPA-gp160表达的gp120比rev/gp160少5-10倍，胞内对从细胞表面释放的比例与此相似。(2)tPA-gp143产生的gp120分泌比rev/gp160大3-6倍，仅具有低水平的细胞结合gp143，这证明：gp160的胞质尾部引起gp160的胞内滞留，这一现象能通过部分缺失这一序列来克服；并且(3)tPA-gp143/mutRRE A和B产生的蛋白表达水平比亲本tPA-gp143大～10倍，同时证明消除形式A的蛋白酶解加工。

因此，我们增加不依赖rev的表达的策略已导致了在总体表达水平上的逐渐增加，并使膜固定的gp143远离溶酶体、重导向细胞表面上。重要的是注意到这是一种种属构成物，在该构成物的载体盒中应该可能插入得自不同原始病毒分离物的gp120序列，所述载体盒含有或在NH₂末端(tPA前导序列)或在COOH末端(gp41)存在的这些修饰，在NH₂末端和COOH末端不同的病毒毒株间几乎没有抗原差异。2．得自临床分离物的gp120的表达：

为将这些表达策略应用到与疫苗目的有关的病毒上，并证明我们方法的通用性，我们还制备了得自原始HIV分离物(含有北美人的共有V3肽环；巨噬细胞向性的和非合胞体诱导表型)的一tPAgp120载体。这个载体在被转染的293细胞中给出gp120的高度表达/分泌，并在鼠中诱出抗gp120抗体，因此表明它是以功能形式克隆的。也将原始分离物gp160基因以与得自实验室毒株的gp160的同样方式用于表达。B．对HIV1 env多核苷酸疫苗的免疫应答

小鼠中疫苗接种途径对免疫应答的作用：在努力提高gp160表达的同时，我们利用了tPAgp120 DNA构成物来评价免疫应答和扩大它们的方式。在小鼠中以100、10、和1μg的剂量比较了该载体肌内(i.m.)和皮内(i.d.)接种疫苗的途径。在所有三种剂量水平接种2-3次后的所有接受者中，两种途径的疫苗接种都诱出抗体反应(GMT=10³-10⁴)。每条途径诱出具有清楚的剂量依赖型反应的相似的抗gp120抗体效价。然而，我们观察到i.d.疫苗接种的反应变异性较大，特别是在初次接种后的低剂量时。而且，正如用在体外抗原专一性增殖和细胞因子分泌测定的，辅助T细胞反应在i.m.接种疫苗后比i.d.接种疫苗的反应高。我们的结论是：与i.m.接种相比，该疫苗的i.d.接种不提供任何益处。2．在小鼠中gp120 DNA疫苗介导的辅助T细胞免疫：

gp120 DNA疫苗接种在所有被检验的淋巴区(脾脏、血液、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结和髂骨淋巴结)产生强有力的辅助T细胞反应，并具有T_H1样的细胞因子分泌特征(即产生g-干扰素和IL-2，几乎没有或没有IL-4)。这些细胞因子一般促进强细胞免疫，并与维持HIV阳性血清病人的无病状态有关联。已经表明淋巴结是HIV复制的主要部位，即使当在血液中不容易检测到病毒时，淋巴结仍含有大储藏量的病毒。一个能够在许多淋巴部位诱出抗HIV免疫应答的疫苗，例如我们用我们的DNA疫苗显示的，可以有助于阻止初次感染后淋巴管的成功移生。3．env DNA疫苗介导的抗体反应：

接受gp120 DNA疫苗的非洲绿猴(ACGM)和恒河猴(RHM)在接种疫苗2-3次后，显示低水平的中和抗体，这不能通过另外的疫苗接种来增加。这些结果和在HIV疫苗领域日益增加的认识引导我们致力于得到基于gp160的载体(见上面)的有效表达，所述认识是对于诱出中和抗体，寡聚gp160可能是一比gp120单体更合适的靶抗原。小鼠和AGM也用原始分离物来源的tPA-gp120疫苗来接种。这些动物显示出的抗V3肽(用同源性序列)交互终点抗体效价的范围为500～5000，这证实：这个疫苗设计对于临床有关的病毒分离物是有作用的。

基于gp160的疫苗rev-gp160和tPA-gp160在小鼠和非人类灵长类动物中不能持续地诱出抗体反应，或产生低的抗体效价。我们用tPA-gp143质粒的最初结果在鼠中和AGM中两次接种后，产生的几何平均效价(GMT)＞10³。这些数据提示：我们通过提高表达水平和更有效地将env胞内转移到细胞表面上，已显著改善了gp160样疫苗的免疫原性。这个构成物和tPA-gp143/mutRRE A和B载体，将继续记述其抗体反应特征，特别是病毒中和特征。4．在猴中env DNA疫苗介导的CTL反应：

我们继续阐明已用gp120和gp160/IRES/rev DNA疫苗免疫的RHM的CTL反应特征。接受这一疫苗的所有的四只猴子在两次接种后显示显著的Ⅰ类MHC限制的CTL活性(在效应物/靶=20下20％-35％的专一性杀伤)。在第四次接种疫苗后，在类似的试验条件下，这些活性增加到50-60％杀伤力，这表明：额外的疫苗接种明显地加强反应。CTL活性在最后一次接种后，在它们的峰值水平的约50％处保持至少7个月，这表明：已建立了长期记忆。

Claims

1．合成的多核苷酸，包含编码HIV env蛋白或其片段的DNA序列，该DNA序列包含最适宜在哺乳动物宿主中表达的密码子。

2．权利要求1的多核苷酸，它选自：

V1Jns-tPA-HIV_MN gp120；

V1Jns-tPA-HIV_ⅢB gp120；

V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-A/SRV-13′-UTR；

V1Jns-tPA-gp140/mutRRE-B/SRV-13′-UTR；

V1Jns-tPA-gp140/opt30-A；

V1Jns-tPA-gp140/opt30-B；

V1Jns-tPA-gp140/opt all-A；

V1Jns-tPA-gp140/opt all-B；

V1Jns-tPA-gp140/opt all-A；

V1Jns-tPA-gp140/opt all-B；

V1Jns-rev/env:；

V1Jns-gp160；

V1Jns-tPA-gp160；

V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-A；

V1Jns-tPA-gp160/opt C1/opt41-B；

V1Jns-tPA-gp160/opt all-A；

V1Jns-tPA-gp160/opt all-B；

V1Jns-tPA-gp160/opt all-A；

V1Jns-tPA-gp160/opt all-B；

V1Jns-tPA-gp143；

V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-A；

V1Jns-tPA-gp143/mutRRE-B；

V1Jns-tPA-gp143/opt32-A；

V1Jns-tPA-gp143/opt32-B；

V1Jns-tPA-gp143/SRV-13′-UTR；

V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32A；

V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32B；

V1Jns-tPA-gp143/opt all-A；

V1Jns-tPA-gp143/opt all-B；

V1Jns-tPA-gp143/opt all-A；

V1Jns-tPA-gp143/opt all-B；

V1Jns-tPA-gp143/opt32-A/glyB；

V1Jns-tPA-gp143/opt32-B/glyB；

V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-A/glyB；

V1Jns-tPA-gp143/opt C1/opt32-B/glyB；

V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB；

V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB:

V1Jns-tPA-gp143/opt all-A/glyB；

V1Jns-tPA-gp143/opt all-B/glyB；和它们的组合物。

3．权利要求1的多核苷酸，它导入包括人组织的脊椎动物组织时，诱导抗-HIV中和抗体、HIV特异性T细胞免疫应答或体内保护性免疫应答，其中该多核苷酸包含编码HIV gag、gag-蛋白酶或env基因产物的基因。

4．在脊椎动物中诱导针对HIV抗原决定基的免疫应答的方法，它包括将1ng-100mg的权利要求1的多核苷酸导入该脊椎动物的组织中。

5．在脊椎动物中诱导针对HIV毒性毒株引起的感染或疾病的免疫应答的方法，它包括将权利要求1的多核苷酸导入脊椎动物的组织中。

6．权利要求5的方法，它还包括给予减毒的HIV、杀死的HIV、HIV env蛋白、HIV gag蛋白、HIV pol蛋白和它们的组合物。

7．针对HIV感染的疫苗，它包含权利要求1的多核苷酸和药学上可接受的载体。

8．在灵长类动物中诱导抗-HIV免疫应答的方法，它包括将权利要求1的多核苷酸导入该灵长类动物的组织中，并同时胃肠外给予白细胞介素12。

9．诱导刺激细胞毒性的辅助T-细胞增殖的抗原提呈细胞的效应物功能(包括对HIV抗原专一性的淋巴因子分泌)的方法，它包括将脊椎动物的细胞在体内显露于权利要求1的多核苷酸。

10．增加编码HIV蛋白或其片段的DNA表达的方法，包括：

(a)鉴定适宜的开放阅读框架的密码子的位置；

(b)比较野生型密码子观察到的人类基因所使用的频率；

(c)用最适于人类基因高表达的密码子取代野生型的密码子；并

(d)检测提高的表达。