CN1216640C - 人免疫缺陷病毒的活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HIV活疫苗模型的开发，使用了经基因工程改造而表面表达特定HIV蛋白的减毒沙门氏菌，并在小鼠中测试了该疫苗。本发明提供了两种重组质粒，其中包含暴露于表面所需的Lpp-OmpA基因，其后是HIV-1蛋白基因、逆转录酶基因或反式激活蛋白(Tat)基因。这些质粒经电穿孔进入减毒沙门氏菌，还验证了抗原的表达。然后，用这些活疫苗给小鼠口服接种，并测定了接种小鼠的HIV抗原特异性排泄物IgA应答和辅助性T细胞应答。

Description

人免疫缺陷病毒的活疫苗

                         发明背景

联邦资助申明

NIH生物技术培训基金给予本发明部分资助。所以，美国政府对本发明享有当然的权利。

发明领域

本发明主要涉及分子生物学和生物化学领域。具体地说，本发明涉及人免疫缺陷病毒(HIV)活疫苗的开发。

现有技术

疫苗是传染病最经济有效的治疗方法。成功的疫苗极大地降低了麻疹、腮腺炎、百日咳、风疹、脊髓灰质炎、破伤风和天花的发病率。然而，目前迫切需要开发HIV的有效疫苗。世界卫生组织估计，至2000年，全世界有40,000,000人感染HIV。

最近，Schultz在“改进HIV疫苗的范例”(1996)中评价了HIV疫苗的开发方法。该论文中，Schultz讨论了几种范例，第一种称为“灭菌免疫力”。原先认为，要防止AIDS必须绝对避免HIV感染。达到上述目的的合乎逻辑的方法是诱导高效价的中和抗体。允许用于此类疫苗的抗原只有gp120和gp41，它们是HIV的包膜蛋白，含有中和表位。开发此类疫苗有数种通用方法。第一种，用基因工程改造的表达系统产生包膜亚基蛋白，gp120或gp160。然后将重组蛋白配制在明矾或新型佐剂中。第二种方法，将HIV env基因插入牛痘和金丝雀痘等活载体。第三种方法使用肽表位，为的是去除无关表位而迫使免疫系统聚焦于相关的中和表位。

属于“灭菌免疫力”范例的另两个实验系列在非人灵长类动物中进行了研究。全灭活疫苗很普通，一直很有效。然而，从未就HIV对人进行过类似研究，这主要是因为病毒颗粒如果没有完全灭活将导致严重后果。

HIV疫苗开发的第二种范例所涉及的概念对疫苗研究来说并不是新的，但代表着对付HIV方法上的一种改进。它不是在最初时避免感染，而是感染虽已经开始，但受到限制并最终被清除。如果病毒被迅速清除，或减少至不再产生症状或传递，则认为该疫苗有效(Johnston，1997)。导致这一改进的一个主要进展是发现血液AIDS病毒水平显示每日产生和清除大量HIV之间的稳态平衡(Wei，1995，Ho，1995)。这些发现表明，免疫系统几乎将成功战胜HIV，但最终却落败。

最近对HIV病毒的研究包括使用gag基因、蛋白酶基因、和部分pol基因。其他则集中于使用假病毒颗粒，即全灭活病毒的非感染性安全形式。此类疫苗之一目前正在小灵长类动物中进行试验。已经开发出了合成肽疫苗，并发现它们与某些脂质偶联能在小鼠中诱导细胞毒T淋巴细胞应答。目前正在进行某些此类肽产品的人体试验。基于DNA的疫苗也正在研究中，因为它们比较便宜，而且易于生产。早期结果显示出良好的细胞应答和强体液免疫(Glaser，1997)。

大多数HIV感染是通过黏膜表面传递的。该传入途径明确指示需要强烈的黏膜免疫应答。过去一直难以在黏膜表面激发此类应答。最近在第9届AIDS国家合作疫苗开发年会上(1997年5月)，Musey最近的工作描述了在被感染的男性和女性的生殖道黏膜内存在有HIV特异性的细胞毒T淋巴细胞。从男性精子样品和女性子宫洗出物中分离出黏膜T细胞，用不同特异性的HIV抗原进行刺激。发现了对HIV Env、Gag和Pol蛋白的应答。该年会上(1997年5月)Clerici的研究指出未感染的伴侣可能受到IgA的保护。

开发活疫苗比之开发死疫苗(亚单位疫苗)有许多优点。已经对减毒菌株进行了基因工程改造，使之表达不同病原的毒性抗原。已经发现，这些细菌中有些能够激发不仅针对同种野生型，而且针对提供抗原遗传材料的病原的体液和细胞免疫应答(1989，Curtiss)。

沙门氏菌能够优先结合肠道内的M细胞。虽然该方法一般能够使免疫系统做出应答和清除感染，但沙门氏菌已形成了一种独特的躲避检测的方法。沙门氏菌一旦入侵黏膜即被细胞摄入而成为内涵体，它们可以滞留在那里不被测知。已经在人细胞系中，在内部划分的这类内涵体的膜上捕获了所述细菌(Sztein，1995)。

沙门氏菌的这一适应性改变可能在疫苗的开发中很有帮助。如果能有足量的减毒沙门氏菌在细胞内存活，这可能有助于确立长期感染，由此形成对外来抗原的持久免疫。

使用沙门氏菌的另一重要优点是，该细菌似乎具有佐剂的作用，产生比单用抗原更强的免疫应答。亚单位疫苗单独使用，一激发的应答般较弱，而目前可用于人体的佐剂很少。即使借助于佐剂，大多数亚单位疫苗的肠胃外传递也不能在黏膜表面诱导分泌性应答或激发强烈的T细胞应答。如前所述，对能够清除HIV感染来说，强烈的细胞应答和黏膜应答都是很重要的。

现有技术缺乏廉价的人免疫缺陷病毒活疫苗。本发明满足了本领域长期以来的这一需要。

                         发明概述

本发明公开了一例HIV活疫苗的开发，使用了经基因工程改造而在表面表达特异性HIV蛋白的减毒沙门氏菌。实施例之一中，提供了一种人免疫缺陷病毒的活疫苗，它包含有暴露于表面所需的基因和人免疫缺陷病毒蛋白编码基因的重组质粒。

本发明实施例之一提供重组质粒，它们含有暴露于表面所需的Lpp-OmpA基因，后接HIV-1蛋白、逆转录酶或反式激活蛋白(Tat)的基因。优选实施例中，质粒通过电穿孔进入减毒沙门氏菌SL3261。

本发明另一实施例中，活疫苗被用于给小鼠口服接种，然后测定该动物的排泄物IgA应答和HIV抗原特异性T细胞应答。

以下对本发明优选实施方式的描述将进一步阐明本发明的其他内容、特征和优点。提供以下实施例的目的是公开本发明。

                         附图简述

为了阐明和详细说明本发明的上述特征、优点、目的及其他，以下将结合附图所展示的具体实施例对以上概述的本发明进行更具体的说明。这些附图是说明书的一部分。然而，需要指出的是，附图所展示的是本发明的优选实施方式，因此不能认为是对其范围的限定。

图1显示对重组质粒pHART的菌落筛选。泳道1和12所含是分子量标准物。泳道2-11含HindIII消化的质粒。

图2显示对质粒pHAT的菌落筛选。泳道1含分子量标准物。其余泳道含HindIII消化的质粒。

图3显示大肠杆菌DH5α-pHART的Western印迹。泳道2、3和4分别含被诱导大肠杆菌DH5α-pHART、非诱导大肠杆菌DH5α-pHART和对照大肠杆菌DH5α的全细胞裂解物。箭头指示泳道2和3内的独特条带。

图4显示大肠杆菌DH5α-pHART粗细胞膜制剂的Western印迹。泳道1和2分别是大肠杆菌DH5α-pHART和对照大肠杆菌DH5α的外膜组分。泳道3和4分别是大肠杆菌DH5α-pHART和对照大肠杆菌DH5α的全细胞膜组分。箭头指示泳道1和3内的独特条带。

图5显示大肠杆菌DH5α-pHAT的Western印迹。泳道1、2和3分别含被诱导大肠杆菌DH5α-pHAT、非诱导大肠杆菌DH5α-pHAT和对照大肠杆菌DH5α的全细胞裂解物。箭头指示泳道1和2内的独特条带。

图6显示SL3261-pHART的Western印迹。泳道1含分子量标准物。泳道2和4含SL3261-pHART的全细胞裂解物。泳道3和5含对照SL3261的全细胞裂解物。箭头指示泳道2和4内的独特条带。

图7显示SL3261-pHART内膜和外膜的Western印迹。泳道1和2分别含SL3261-pHART和对照SL3261的外膜组分。泳道3和4分别含SL3261-pHART和对照SL3261的内膜组分。

图8显示SL3261-pHAT的Western印迹。泳道1和2分别含对照SL3261和SL3261-pHAT的全细胞裂解液。泳道3含分子量标准物。箭头指示泳道2内的独特条带。

图9显示SL3261-pHAT和SL3261的内膜和外膜的Western印迹。泳道1含分子量标准物。泳道2和3分别含SL3261-pHAT和对照SL3261的外膜组分。泳道4和5分别含SL3261-pHAT和对照SL3261的内膜组分。

图10显示第9周测得的接种SL3261-pHART小鼠内的逆转录酶特异性IgA图。柱R-2、T-2、S-2、C-1和C-2分别代表取自接种SL3261-pHART的小鼠、接种SL3261-pHAT的小鼠、接种SL3261的小鼠、接种PBS的对照小鼠和接种PBS并一直使用氨苄青霉素小鼠的样品。

图11显示第9周测得的接种SL3261-pHAT小鼠内的Tat特异性IgA图。柱R-2、T-2、S-2、C-1和C-2分别代表取自接种SL3261-pHART的小鼠、接种SL3261-pHAT的小鼠、接种SL3261的小鼠、接种PBS的对照小鼠和接种PBS并持续使用氨苄青霉素小鼠的样品。

图12显示10周内接种SL3261-pHART的小鼠内测得的逆转录酶特异性IgA图。柱R-2代表取自接种SL3261-pHART并一直使用氨苄青霉素小鼠的样品。C-2柱代表取自喂以PBS并一直使用氨苄青霉素小鼠的样品。

图13显示小鼠接种SL3261-pHART后第3周看到的增殖应答。所有小鼠都接种了SL3261-pHART。分离的脾细胞与RPMI-1640(对照介质)(柱1即RT-RPMI柱)、热灭活SL3261(RT-SL柱)、2μg逆转录酶(RT-RT 2μg柱)或10μg逆转录酶(RT-RT 10μg柱)一起培养。

图14显示小鼠接种SL3261-pHART后第12周看到的增殖应答。所有小鼠都接种了SL3261-pHART。分离的脾细胞与RPMI-1640(对照介质)(柱1即RT-RPMI柱)、热灭活SL3261(SL柱)、2μg逆转录酶(RT 2μg柱)或10μg逆转录酶(RT 10μg柱)一起培养。

                      本发明的详细描述

本发明中，用减毒沙门氏菌SL3261作为载体用表面表达法向免疫系统传递HIV抗原；用该活疫苗给小鼠口服接种，然后测定小鼠对HIV的特异性免疫应答。

本发明实施例之一中，提供了一种由大肠杆菌脂蛋白(lpp)信号序列与大肠杆菌外膜蛋白ompA的一部分连接而成的融合构建物。脂蛋白信号序列是将蛋白质构建物导向革兰氏阴性菌外膜所必需的，它是N末端的前9个氨基酸。虽然该信号为导向表面所必需，但它本身并不暴露于表面。因此，给该结构内加上ompA的氨基酸46-159，因为这些残基编码天然ompA蛋白内8个跨膜区中的5个。这5个环具有一个暴露于表面的C末端，该末端在此与异源蛋白相融合。在早期实验中，选择暴露于表面的周质蛋白是β-内酰胺酶。通过免疫荧光、细胞分离或酶活性试验等方法，结果显示，实际上，β-内酰胺酶暴露于大肠杆菌的外膜表面(Francisco，Earhat，Georgiou，1992)。

本发明另一实施例中，提供HIV-1逆转录酶蛋白作为HIV抗原。该蛋白被证明是被感染的人体内细胞毒T淋巴细胞的靶蛋白(Walker，1998，Lieberman，1992，Rowland-Jones，1995)。因为需要强烈的细胞介导免疫应答，这使得逆转录酶成为很好的选择。此外还发现，编码逆转录酶蛋白的HIV-1 pol基因比其他HIV-1基因在不同灵长类动物分离物之间具有更高的保守性(Hahn等，1985)。其他研究确定，HIV-1和HIV-2之间存在着pol特异性的体液交叉反应性，以及相当程度的序列同源性(Clavel，1986)(Guyader，1987)。此外，最近的研究着重于使用蛋白内部病毒而不是包膜蛋白作为抗原，希望诱导细胞介导的应答。

在本发明另一实施例中，提供HIV反式激活蛋白(Tat)作为表面表达的第二种HIV抗原。Li等(1995)发现，感染细胞分泌的HIV-1 Tat能在T细胞内诱导细胞的程序性死亡。原先认为只有被HIV病毒感染的细胞才被破坏，但此后Li(1995)获得的结果出人意料地发现：实际丧失的被感染细胞远远少于T细胞。是直接感染之外的某种因素导致了主导性的T细胞死亡，较大可能性之一是分泌的HIV Tat蛋白。选择Tat蛋白的另一个希望是由此类疫苗激发产生的抗体也许能够通过中和分泌Tat蛋白而保护未感染的T细胞。促使选择Tat作为抗原的另一个因素是辅助性T细胞表位的鉴定(Blazevic，1993)。

本发明另一实施例中，提供了一种构建HIV疫苗的模型系统。用脂蛋白-OmpA融合的基因序列，插入HIV-1逆转录酶和HIV-1 tat的基因，使之在表面表达。这些构建物受脂蛋白启动子系统的调控，这是一种不需要诱导的渗漏型启动子。这一点很重要，因为细菌载体是给予哺乳动物的，蛋白质表达的诱导是必需的。

本发明另一实施例中，提供了减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261，其中有电穿孔进入的重组质粒。重复表达实验，进一步研究测定所表达HIV蛋白所在位置。具体地说，用蔗糖梯度法分离细菌的内膜和外膜，并对分离成分进行Western印迹。

本发明另一实施例中，提供了BALB/c小鼠，它们口服接种了含所述重组质粒的SL3261构成的活疫苗。小鼠被喂以逆转录酶或tat活疫苗，无重组质粒的SL3261，或PBS。接种在第0、14和28日进行。

本发明另一实施例中，在BALB/c小鼠中进行了一系列接种试验，在整个研究过程中，每周采集排泄物样品，检测对逆转录酶或tat特异性的IgA。在第21天和第85天，杀死动物，分离出脾细胞。通过测定增殖应答或细胞因子水平，分析脾细胞的辅助性T细胞活性。

本发明可能用到本领域技术人员所掌握的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。文献中对此类技术有详细的论述。参见，例如，Maniatis，Fritsch &Sambrook，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)；“DNA Cloning：APractical Approach”，第I和II卷(D.N.Glover编，1985)；“OligonucleotideSynthesis”(M.J.Gait编，1984)；“Nucleic Acid Hybridization”[B.D.Hames &S.J.Higgins编(1985)]；“动物细胞培养”[R.I.Freshney编(1986)]；“Immobilized Cellsand Enzymes”[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，“A Practical Guide To MolecularCloning”(1984)。

所以，本文出现的以下用语其定义如下。

“载体”是一个复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，可将其他DNA节段与之结合从而引起所结合节段的复制。

“DNA分子”指脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的单链或双螺旋链形式的聚合物。它只涉及所述分子的一级和二级结构，不限于任何特定的三级结构。因此，该用语包括线性DNA分子(例如限制性片段)、病毒、质粒和染色体内的双链DNA。在此讨论结构时，按照常规，只按从5’末端至3’末端的方向给出DNA非转录链的序列(即，序列与mRNA相同的链)。

“复制起点”指参与DNA合成的那些DNA序列。

DNA“编码序列”指在合适的调控序列调控下，在体内被转录并翻译成多肽的双链DNA序列。编码序列的边界由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子确定。编码序列包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、真核动物(例如哺乳动物)的基因组DNA序列，甚至包括合成DNA序列。编码序列的3’末端通常有聚腺苷酸化信号和转录终止序列。

转录和翻译调控序列是DNA调节序列，例如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子等，它们参与编码序列在宿主细胞内的表达。

“启动子序列”是能够在细胞内结合RNA聚合酶并引发下游(3’方向)编码序列转录的DNA调节区。为了定义本发明，启动子序列的3’末端结合有转录起始位点，向上游(5’方向)延伸而包括引发高于背景的可测水平转录所必需的最少碱基。启动子序列内有转录起始位点(一般通过以S1核酸酶作图来确定)和负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合域(共有序列)。真核启动子一般，但不一定，含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核启动子除-10和-35共有序列之外还含Shine-Dalgarno序列。

“表达调控序列”是控制和调节另一DNA序列转录和翻译的DNA序列。当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，然后翻译成编码序列所编码的蛋白质时，编码序列在细胞内“受到转录翻译调控序列的调控”。

可在编码序列前包含“信号序列”。该序列编码一段信号肽，位于多肽的N末端，与宿主细胞沟通，从而将多肽导向细胞表面或将多肽分泌到介质中。如果是分泌蛋白，该信号序列在蛋白质离开细胞之前被宿主细胞切除。许多原核和真核生物的天然蛋白质都结合有信号序列。

“寡核苷酸”在此指本发明的探针，定义为包含2个或2个以上，最好8个以上核糖核苷酸的分子。其确切大小取决于许多因素，这些因素又取决于该核苷酸的最终功能和用途。

“引物”在此指纯化限制性消化产物中天然存在或合成的一段寡核苷酸，当所处条件诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物时，即存在核苷酸和DNA聚合酶等诱导剂以及适宜的温度和pH，它可作为合成的起点。引物可以是单链或双链，其长度必需足以在诱导剂存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用方法。例如，对诊断应用来说，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物一般含15-25或更多个核苷酸，虽然也可能含比这少的核苷酸。

在此选择与特定靶DNA序列不同链“基本”互补的引物。即引物与对应链的互补性必需足以与之杂交。所以，引物序列不一定完全反映模板的序列。例如，可在引物的5’端连接一段非互补核苷酸片段，引物序列的其余部分则与该链互补。或者，可将非互补的碱基或更长的序列插入引物中，条件是引物序列与该序列具有足够的互补性或与之杂交，从而形成合成延伸产物的模板。

“限制性核酸内切酶”和“限制性酶”指能在或靠近特定核苷酸序列处剪切双链DNA的各种细菌酶。

当将DNA引入细胞后，称该细胞被外源或异源DNA“转化”。转化DNA可能整合(共价连接)也可能不整合到细胞的基因组中。在原核生物中，例如酵母、哺乳动物细胞中，转化DNA可保留在诸如质粒的附加元件上。对真核生物来说，稳定转化的细胞中，转化DNA整合到染色体中，从而通过染色体复制被其子代细胞继承。这一稳定性表现为真核细胞能够建立由含转化DNA的子细胞群构成的细胞系或菌落。“克隆”是单个细胞或同一祖先通过有丝分裂形成的细胞群。“细胞系”是能够在体外稳定生长许多代的一个原代细胞的菌落。

当两DNA序列确定长度的序列中至少75％(至少80％更好，至少90％或95％最好)的核苷酸匹配时，则称这两DNA序列“基本同源”。可用序列数据库的标准软件进行比较，或进行系统特定严谨条件下的Southern杂交实验，来鉴定基本同源的序列。确定合适的杂交条件是本领域熟练技术人员所熟悉的。参见，例如，Maniatis等，同上；DNA克隆，第I和II卷，同上；核酸杂交，同上。

DNA构建物的“异源”区是较大DNA分子内一段可鉴别节段，它并不天然地与该较大DNA分子相联。因此，当异源节段编码一哺乳动物基因时，该基因两侧的DNA一般不是源生物该哺乳动物基因组DNA两侧的DNA。另一实施例中，编码序列是一构建物，其中的编码序列本身不是天然所有(例如，含有内含子的基因组编码序列的cDNA，或密码子不同于天然基因的合成序列)。等位变异或天然突变不会产生上述DNA的异源区。

此类研究最常用的标记是放射性元素、酶、接受紫外光后发荧光的化合物等。许多荧光物质是已知的，可用作标记。这包括，例如，荧光素、罗丹明、金胺、Texas红，AMCA蓝和荧光黄。一种特殊的检测物质是在山羊中制备的通过异硫氰酸酯与荧光素偶联的抗兔抗体。

酶标记可能有用，并可用各种目前所用比色法、分光光度法、荧光分光光度法、电流测定法或气体定量技术测定。所述酶通过与碳化二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等桥连分子反应与选定颗粒相连。上述过程中可用的许多酶是已知的，可以使用。优选的是过氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。美国专利3,654,090，3,850,752和4,016,043等公开了其他的标记材料和方法。

本发明是一种关于人免疫缺陷病毒(HIV)的活疫苗，它含有一个暴露于表面所需的基因和一个编码人免疫缺陷病毒蛋白的基因。暴露于表面所需基因的代表性例子是编码与大肠杆菌外膜蛋白ompA一部分相连的大肠杆菌脂蛋白信号序列的基因。编码人免疫缺陷病毒蛋白的基因的代表性例子选自逆转录酶和反式激活蛋白的编码基因。

较好的是，重组质粒通过电穿孔进入减毒细菌宿主。减毒细菌宿主的代表性例子是鼠伤寒沙门氏菌SL3261。

本发明涉及在需要治疗的个体内产生对人免疫缺陷病毒抗原特异性免疫应答的方法，它包括将所述疫苗给予所述个体。通常，所需的免疫应答包括黏膜IgA应答，辅助性T细胞应答和细胞毒T淋巴细胞应答。

本发明疫苗以口服给予为佳。较好的是，疫苗的口服给予剂量约为10¹²至10¹⁴CFU(菌落形成单位)。

以下实施例是为了说明本发明的各种实施方式，而绝不是对本发明的限定。

                            实施例1

逆转录酶-Lpp-OmpA构建物的克隆

由NIH AIDS试剂库获得含逆转录酶基因的pKRT2质粒。从Austin的University of Texas的Dr.C.Earhart处获得含lpp-ompA融合蛋白结构基因的第二质粒pTX101。由Promega获得第三质粒pSP72。首先，构建中间质粒pSP72-RT，其中，将pKRT2中的逆转录酶基因转移到质粒pSP72中。以聚合酶链反应(PCR)修饰pKRT2所含逆转录酶基因，使其包含将逆转录酶基因插入质粒pSP72所需的新限制性位点。质粒用BamHI和HindIII消化，在1％琼脂凝胶上电泳，筛选正确的克隆。

克隆的第二步是将脂蛋白启动子和脂蛋白-ompA序列插在逆转录酶基因之前。脂蛋白启动子和脂蛋白-ompA融合序列原先在pTX101质粒中。要将脂蛋白-ompA序列插入pSP72-RT质粒需要互补限制性位点。pSP72-RT质粒上的HindIII限制性位点被选作脂蛋白-ompA序列的插入位点。向GIBCO Life Technologies定制PCR引物，用于以pCRII-脂蛋白-ompA质粒为模板扩增两端含HindIII位点的的脂蛋白-ompA序列。该反应含1μl稀释度1∶10的模板DNA，引物各1μl，和45μl PCR Supermix(GIBCO Life Technologies)。

以HindIII消化PCR产物和纯化质粒pSP72-RT：20μl反应体积中含2μlHindIII和2μl REact2缓冲液(LifeTechnologies)，37℃过夜。PCR产物在消化后，凝胶纯化，乙醇沉淀，然后重悬于5μl水中。

载体先消化，然后去磷酸，以保证载体只与插入片段连接而不自身连接。为此，乙醇沉淀载体，重悬于17μl水、2μl 10X缓冲液、1μl龙虾碱性磷酸酶(UnitedStates Biochemical)。反应在37℃进行1小时。然后升温至65℃15分钟以灭活磷酸酶。然后以苯酚/氯仿抽提载体，乙醇沉淀，取一份走凝胶测定浓度。

用0.1pmol载体和0.5pmol插入片段进行连接反应。反应体积为10μl，其中含2μl T4连接酶缓冲液(33μl 1M Tris-Cl，pH8，5μl 1M MgCl₂，5μl 1M DTT，5μl0.1M ATP，1.25μl 20mg/ml BSA(牛血清白蛋白)，加水至100μl)，1ml T4连接酶，载体和插入片段。反应在16℃进行过夜。次日，1∶5稀释连接反应混合物，用于电穿孔DH5α细胞。电穿孔后，将细胞接种在LB amp板上，培养过夜。裂解筛选菌落，挑选在1％琼脂凝胶上走在对照之前的质粒接受进一步筛检。将培养物培养过夜，用QIAgen prep试剂盒纯化质粒。用HindIII消化纯化质粒以确定是否插入有脂蛋白-ompA。因为只用一种限制性位点，所以基因可双向插入。为了确定哪些质粒含正确正向插入的基因，再用XbaI和XhoI进行消化。如果脂蛋白-ompA片段插入正确，将得到一种300bp的片段。如果片段插反了，所得片段将是450bp。鉴定了插入方向正确的质粒后，培养培养物，并在-80℃与甘油一起冷冻。所得质粒称为pHART。

将纯化后的质粒送至Austin的University of Texas的测序机构进行验证。要进行测序反应，在1.5ml试管内混合2μl引物、1μl DNA和9μl水。所用引物为T7和SP6(Promega)，因为质粒pSP72上有这些序列。

                           实施例2

反式激活(tat)蛋白-Lpp-OmpA构建物的克隆

为了构建含有产生lpp-ompA-HIV-1 Tat融合蛋白的基因序列的载体，从NIHAIDS试剂库获取Tat蛋白的基因，得到的是含质粒pTAT的DH5α的甘油储备液。质粒pTAT含288bp的tat序列，经基因工程改造而含有大肠杆菌所偏好的密码子。tat基因的5’侧是一个HindIII位点，接着是一个EcoRI位点。选作骨架的质粒pSP72在一多克隆区含有以上两种限制性位点，所以不需要以PCR进行改变。第一步是将tat基因插入载体构成中间质粒pSP72-Tat。

将含pTAT质粒的大肠杆菌培养物和第二种培养物即含质粒pSP72的大肠杆菌都在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。用Promega Wizard Prep试剂盒从培养物中纯化出所需质粒。然后在以下反应中用HindIII和EcoRI限制性核酸内切酶(Promega)消化质粒DNA：20μl DNA，20μl水，5μl 10X Multi-core缓冲液(Promega)和2.5μl各种酶。该反应在37℃进行2小时。消化物然后在1％琼脂糖凝胶上电泳。用剃须刀片切取pTAT消化物中300bp的tat条带，2.4Kb条带则对应于消化的pSP72载体。用BioRad的Prep-A-Gene试剂盒从琼脂糖中纯化出以上两片段。然后以乙醇沉淀凝胶纯化的DNA，去除其余盐，重悬于10μl水中，用于连接反应。如下进行连接反应：3μl消化后的pSP72，4μl消化后的pTAT基因，1μl 0.1M ATP，4μl 5X连接缓冲液(LifeTechnologies)，1μl T4 DNA连接酶((LifeTechnologies)和7μl水。连接反应室温(25℃)进行过夜。然后乙醇沉淀连接反应，重悬于10μl水中。用该浓缩DNA电穿孔大肠杆菌DH5α细胞。将电穿孔后的细胞接种在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上。筛检板上5个菌落是否含正确的插入片段。将这些菌落在5ml培养物中培养过夜，用Wizard Prep试剂盒分离质粒DNA。然后以HindIII和EcoRI消化这些DNA。以消化物进行1％琼脂糖凝胶电泳时，有几个菌落显示具有300bp的插入片段。该新的重组质粒称为pSP72-Tat。取这些含正确插入片段的培养物之一制成甘油储备液，于-80℃保存。

为了在构建中完成第二步并将脂蛋白启动子和脂蛋白-ompA序列插在反式激活蛋白(tat)基因之前，使用与逆转录酶构建物所用相同的方法。然后将纯化质粒pHAT送至Austin的University of Texas的测序机构进行验证。

                            实施例3

逆转录酶构建物在大肠杆菌内的表达

3ml对照DH5α和DH5α-pHART培养物在LB培养基中37℃振荡培养过夜。对照细胞培养在纯LB培养基中，含逆转录酶的细胞培养在含500mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。次日，将200ml以上过夜培养物接种在10ml LB amp或LB中，培养4小时。此时，取5ml DH5α-pHART培养物，转移到含50ml 0.1M IPTG(异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷)的新试管中。该细胞继续培养2.5小时。取一份1ml对照、DH5α-pHART诱导和DH5α-pHART未诱导培养物，在40ml完全蛋白酶抑制剂(Boehringer Mannheim)中沉淀。将细胞沉淀重悬在60ml水、40ml蛋白酶抑制剂和10ml含DTT的2X SDS Tris-甘氨酸样品缓冲液(Novex)中。

将样品煮沸5分钟，然后在-80℃冷冻。将样品融化，再次煮沸5分钟，然后加到Novex 10％ Tris-甘氨酸SDS凝胶上。电压为120伏，电泳2小时。将样品对称地加到两半凝胶上。凝胶电泳结束后，将凝胶对半切开，将两半都转移到PVDF膜上，以56毫安电流转移1小时。转移后，将膜干燥，放置过夜。

次日，将膜在甲醇中浸湿，然后以酰胺黑染色来验证蛋白质转移。拍摄染色后PVDF薄膜的照片。然后将薄膜脱色，在振荡仪上用3％BSA(牛血清白蛋白)在PBS中封闭1小时。封闭后，膜即可用第一抗体进行印迹了。膜1与1∶2000稀释的4种单克隆抗逆转录酶抗体的混合物一起培养。膜2与1∶5000稀释的亲和纯化的多克隆抗逆转录酶抗体一起培养。单克隆抗体和多克隆抗体都以10ml洗涤缓冲液(3％BSA(牛血清白蛋白)的PBS溶液，其中含0.05％Tween-20)稀释。与第一抗体培养1小时后，用洗涤缓冲液洗膜6次，每次5分钟。将第二抗体1∶20,000稀释在10ml洗涤缓冲液中。以HRP标记的山羊抗小鼠抗体与单克隆第一抗体一起用于膜1，HRP标记的山羊抗兔抗体与多克隆抗体一起用于膜2，各膜与第二抗体一起培养12小时。培养后，用十二烷基肌氨酸钠缓冲液(50mM Tris-Cl，pH7.5，1M NaCl，5mM EDTA，0.4％十二烷基肌氨酸钠)洗涤5次，每次10分钟。然后用水彻底洗膜，在暗室中静置于约10ml水中。保持膜的湿润十分重要。将5ml鲁米诺/增强剂溶液与5ml稳定的过氧化物溶液混合，制备成SuperSignal(Pierce)。在暗室中，去除膜中的水，加入SuperSignal混合物，培养3-5分钟。然后，从溶液中取出膜，放在塑料薄膜上，将塑料膜折起盖住薄膜。切割适当大小的一片Hyperfilm-MP(Amersham)，薄膜与胶片接触15-30分钟。然后，立即显影。

发现逆转录酶蛋白在大肠杆菌内表达后，实验测定该融合构建物是否位于外膜内。进行膜的粗制备，从总膜组分中分离出外膜。然后以Western印迹法分析各不同组分，确定逆转录酶融合构建物位于何处。Western印迹的进行如前所述。

                           实施例4

反式激活蛋白(Tat)构建物在大肠杆菌中的表达

Tat构建物的表达实验和Western印迹与逆转录酶细胞所用的十分相似。区别之一在于，将b-巯基乙醇加入2X Novex Tricine样品缓冲液，而不是以DTT作为还原剂。样品也在10-20％ Tricine凝胶上电泳。所用第一抗体是多克隆抗tat抗体，是从NIH AIDS试剂库获得的，使用的是1∶1000稀释液。

                           实施例5

逆转录酶构建物在沙门氏菌SL3261中的表达

纯化的pHART质粒通过电穿孔进入电感受态的沙门氏菌SL3261。用限制性消化验证质粒的吸收。所有SL3261内的实验都用非诱导细胞进行。

为了在凝胶上加更多的粘稠的沙门氏菌样品，首先必需先后用20号针头和26号针头上下吸吹以剪切DNA。样品然后在微型离心机中以10,000rpm离心10分钟。将逆转录酶样品加到Novex 10％ Tris-甘氨酸凝胶上，分离蛋白质条带。上样到凝胶上之前未加还原剂时，所得逆转录酶的Western印迹最好。

用于进一步特征描述SL3261样品的一个附加步骤是用蔗糖梯度分离内膜和外膜。这一分离膜组分的方法比用于大肠杆菌样品的膜粗制备方法更清晰。获得对照SL3261和含质粒pHART的SL3261的内膜和外膜组分后，样品在SDS凝胶上电泳，并如前所述，用抗逆转录酶抗体进行Western印迹分析。

                           实施例6

反式激活蛋白(tat)构建物在沙门氏菌SL3261中的表达

纯化pHAT通过电穿孔进入沙门氏菌SL3261，通过适当的限制性消化验证质粒吸收。和逆转录酶构建物样品一样，不进行诱导实验。

如前所述制备上样到凝胶上的样品，然后加到Novex 10-20％ Tricine凝胶上。当加入β-巯基乙醇作为还原剂时，可在含Tat样品泳道的Western印迹上看到单一条带。如果在上样到凝胶之前不还原，该条带将在Tat的Western印迹中消失。

和逆转录酶样品一样，用蔗糖梯度分离内膜和外膜。用抗Tat抗体和抗ompA抗体以类似方式对样品进行Western印迹分析。因为用抗Tat抗体看到的非特异性结合水平很高，该Western印迹很不明确。当Western印迹使用抗ompA抗体时，获得了更明确的结果。

                           实施例7

为IgA和增殖试验进行的接种

为了测定疫苗的效力，给小鼠喂以含HIV融合构建物的减毒沙门氏菌SL3261。监测黏膜和辅助性T细胞应答。黏膜应答的监测是通过采集排泄物样品分析抗逆转录酶的IgA，辅助性T细胞应答的测定是通过增殖试验和细胞因子试验。增殖试验包括脾细胞与抗原一起培养，然后掺加³H-胸腺嘧啶。发生增殖因而对抗原有应答的细胞将比无应答细胞摄取更多的放射性胸腺嘧啶。收获并计数细胞后，计数越高，表示增殖越多，抗原识别越强。细胞因子试验包括分离出与抗原一起培养的细胞的上清液。受抗原刺激的细胞将向上清液分泌不同的细胞因子。可用夹心ELISA测定IL-2和IL-10的水平。IL-2水平高表示辅助性T细胞应答(T_H2应答)，IL-10水平高则表示细胞毒T细胞应答(TH1应答)。

视需要将细菌培养物培养在不含或含500μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。培养物在37℃振荡培养22小时。以5,000rpm离心10分钟沉淀细胞，然后重悬于500μl PBS。取每份30μl加至有标签的0.5ml试管，冰上保存直至接种。

从Jackson试验室获得5周龄BALB/c小鼠。将小鼠分成4组，每组10只，5只一笼。实验开始前，小鼠为2周龄。如下给小鼠接种：接种前禁食禁水4小时。给予细菌前，先用滴管给予小鼠10μl 6％碳酸氢钠。等候10分钟后，给小鼠喂以相应的细菌。一组小鼠标记为R，喂以20μl SL3261-pHART。第二组标记为T，喂以20μl SL3261-pHAT。第三组标记为S，喂以20μl对照SL3261。第4组标记为C，喂以20μl PBS(表1)。笼养于笼R-1和R-2的R组小鼠在研究全过程中都接受氨苄青霉素。这样做是因为质粒稳定性问题。每日供给含1g/L氨苄青霉素的新鲜水。笼C-2内的小鼠也给予同剂量的氨苄青霉素，以排除抗菌素对免疫应答的任何影响。

在第0和14天对全体小鼠给予疫苗。第21天，R、T、S组各取1笼，笼C、C-1和C-2中各取2只小鼠，将其杀死以进行3周的研究。其余小鼠在第28天再次给予疫苗，并在第85天杀死，进行12周的研究。

                                          表1

                              IgA和增殖研究的小鼠接种计划

	10只R小鼠	10只T小鼠	10只S小鼠	10只C小鼠
					第0天	20μl SL3261-逆转录酶	20μl SL3261-Tat	20μl SL3261	20μl PBS
第14天	20μl SL3261-逆转录酶	20μl SL3261-Tat	20μl SL3261	20μl PBS
					第21天	杀死5只小鼠	杀死5只小鼠	杀死5只小鼠	杀死4只小鼠
第28天	20μl SL3261-逆转录酶	20μl SL3261-Tat	20μl SL3261	20μl PBS
					第85天	杀死5只小鼠		杀死5只小鼠	杀死4只小鼠

                           实施例8

采集排泄进行IgA试验

为了监测黏膜IgA应答，每周将每笼小鼠的新鲜粪便采集到2ml的微离心试管中。向各试管加入1ml PBS，样品静置1-2小时，偶尔加以涡流搅拌。样品以14,000rpm离心15分钟。取上清液加到干净的试管中，保存于-80℃。

如下进行IgA ELISA：事先将200ng逆转录酶或Tat在50μl PBS中所成溶液涂在96孔聚苯乙烯板上，放置过夜。测试板保温于4℃，包在塑料膜内，密封在塑料容器内，盖以湿的纸巾。次日，倒掉抗原，测试板用洗涤缓冲液(0.05％Tween-20的PBS溶液)洗涤3次。然后室温下用200μl 3％牛血清白蛋白的PBS溶液封闭2小时。封闭后，测试板用洗涤缓冲液洗3次。每孔加100μl新鲜稀释、再度离心的样品。样品以3％牛血清白蛋白的PBS溶液按1∶10和1∶50稀释。测试板室温培养2.5小时。样品结合后，测试板用洗涤缓冲液洗4次。每孔加100μl以3％牛血清白蛋白的PBS溶液按1∶500稀释的山羊抗小鼠IgA(Sigma，标记有辣根过氧化物酶)。测试板室温培养1小时。然后用洗涤缓冲液洗板4次，每孔加100μl ABTS(2，2’-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉磺酸))。充分显色后，加100μl草酸终止反应。然后在BioRad板读数仪上在414nm处读数。

                           实施例9

增殖试验和细胞因子试验

在无菌条件下以颈脱臼杀死小鼠。取出脾脏放在含3ml RPMI1640(含2mML-谷胺酰胺、50μg/ml庆大霉素、50μM β-巯基乙醇和10％胎牛血清(LifeTechnologies))(LifeTechnologies)中。取出小肠放在含5ml 50mM EDTA和2mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma)的无菌15ml试管中。取出肝脏放在含PBS的无菌15ml试管中。将肝脏和小肠保持在冰上，直至于-80℃冷冻。

用剪刀和镊子将脾脏剪碎。用5ml针筒活塞的平端向盘底挤压组织。重复挤压，直至只留下纤维状的组织。然后用19号针头反复上下吸吹该悬浮液，然后以尼龙筛网过筛，加至无菌15ml试管中，放在冰上。另用4ml RPMI-1640洗涤培养皿，将洗液加入15ml试管。此后，所有脾细胞样品都保持在冰上。

脾细胞然后以1250rpm离心10分钟，然后取出上清液。留下的红色沉淀重悬于5ml无菌裂解缓冲液(0.15M NH₄Cl，1.0mM KHCO₃，0.1mM EDTA，pH7.4)以裂解红细胞。脾细胞室温培养5分钟，偶尔振荡。培养后，试管内加RPMI培养基至13ml，样品以1250rpm离心10分钟。弃去上清液，再次用培养基洗涤细胞。第二次洗涤后，将白色沉淀重悬于5ml含10％胎牛血清的RPMI中。

所有样品都用血细胞计数仪计数。充分悬浮的样品各取50μl加入450μl台盼蓝中。取一滴该溶液加到血细胞计数仪上，计数不吸收台盼蓝的活细胞。

需要对照小鼠的细胞作为抗原呈递细胞，所以必须用丝裂霉素C(Sigma)处理以抑制增殖。该过程前，对照细胞样品各取一份留作对照应答细胞。其余对照细胞1250rpm离心10分钟。去除上清液，将细胞重悬于2ml的无菌/PBS试管内。将2mg丝裂霉素C溶于4ml PBS，过滤除菌。将此含丝裂霉素的试管包在铝铂内以全天避免光照。每毫升细胞内加100μl丝裂霉素溶液，或每支试管加200μl。将试管包在铝铂内，37℃培养20分钟。在样品中加含10％胎牛血清的RPMI，将试管充满至13ml。细胞以1250rpm离心10分钟，去除上清液。再重复洗涤2次。将这些被灭活的效应细胞重悬于5ml含10％胎牛血清的RPMI，再次如前所述用血细胞计数仪计数。通过以培养基适当稀释调整所有样品的浓度至1×10⁶细胞/ml，留在冰上等待接种。

以相同方式制备用于增殖试验和细胞因子试验的测试板。被测抗原是浓度为10μg/ml或50μg/ml的重组逆转录酶或Tat，热灭活的SL3261或RPMI。为了制备热灭活的SL3261，培养物在LB培养基中培养过夜。取2ml细胞在2ml微离心试管内65℃加热2小时。然后离心沉淀细胞，重悬于2ml无菌PBS中。将细胞制成1∶10稀释液，即1ml SL3261溶于9ml RPMI，用于试验。

取50ml适当稀释的抗原加入各孔。然后，向各孔加入100μl 1×10⁵效应细胞(经丝裂霉素C处理的对照细胞)。然后加入待测应答细胞，每孔100μl 1×10⁵个细胞。所有样品一式三份。给板加盖，37℃，5％CO₂培养。

进行细胞因子试验的板培养48小时。此时，从各孔取出150μl上清液。将一式三份的各150μl合并在一支含10μl Complete^TM蛋白酶抑制剂(BoehringerMannheim，1片/1ml水)的0.5ml试管中。样品于-80℃保存，直至用于ELISA。

进行增殖实验的测试板培养3天或5天。收获细胞前18小时，各孔内掺入1mCi ³H-胸腺嘧啶。如下稀释放射性胸腺嘧啶(1μCi/μl)：将200μl ³H-胸腺嘧啶加入3800μl RPMI培养基，形成50μCi/ml的浓度。将20μl该稀释液加至各孔，使最终浓度为1μCi/ml。然后将测试板放回培养箱在37℃，5％CO₂培养18小时。

用Brandel M-24细胞收获仪将细胞收集在Whatman玻璃滤膜上。然后将滤膜放到含5ml Econofluor液体闪烁混合物的液体闪烁瓶中，样品在BeckmanLS6000SC上计数。如文献所述进行白细胞介素ELISA，测定IL-2和IL-10的浓度。

                           实施例10

本发明公开了HIV模型活疫苗的开发，是通过在减毒沙门氏菌中表面表达HIV抗原，以产生细胞和黏膜免疫应答以及体液应答。如前所述，首先构建中间质粒pSP72-RT或pSP72-Tat，然后以其为骨架插入Lpp-OmpA序列，最后得到所需重组质粒pHART(图1)或pHAT(图2)。

两种质粒构建完成并测序后，先在大肠杆菌DH5α中分析融合蛋白的表达。图3是大肠杆菌DH5α-pHART的Western印迹照片。在所含样品来自含pHART细菌的泳道内可看到独特的条带。没有重组质粒的对照大肠杆菌DH5α所在泳道内没有上述Western印迹条带。这些独特条带的存在说明HIV逆转录酶蛋白的确被表达。

当用抗Tat抗体染色的Western印迹分析大肠杆菌DH5α-pHAT时，所得结果相似(图5)。该印迹中，可看到含pHAT大肠杆菌特有的条带，对照大肠杆菌泳道中则没有。对照大肠杆菌不含带有tat基因的重组pHAT质粒。

为了进一步确定HIV逆转录酶抗原的位置，进行了膜的粗制备。用抗逆转录酶抗体染色的Western印迹分析了对照大肠杆菌和含pHART大肠杆菌的全膜和外膜。该Western印迹的结果显示在图4中。全膜和外膜组分中都有与大肠杆菌DH5α全细胞裂解物特有条带相同的条带。该结果说明，HIV逆转录酶位于这些细菌细胞的外膜。

确认逆转录酶和tat都存在于大肠杆菌DH5α后，将重组质粒pHART和pHAT转化到减毒沙门氏菌SL3261中，并验证融合蛋白的表达。用多克隆抗逆转录酶抗体染色SL3261-pHART的Western印迹，见图6。和大肠杆菌一样，沙门氏菌样品中有2条独特条带。这些正确分子量独特条带的存在说明逆转录酶蛋白的确被表达。用多克隆抗Tat抗体染色SL3261-pHAT的Western印迹，见图8。只在含pHAT质粒的泳道内看到一条独特条带，对照SL3261中则没有。该条带跑在预计分子量之上，这可能是因为ompA蛋白在SDS中的增溶。为了在沙门氏菌系统中更好的确定HIV逆转录酶的位置，分离内膜和外膜，并进行Western印迹分析，见图7。只在含pHART细胞的外膜组分中看到一条条带，这说明逆转录酶蛋白位于减毒沙门氏菌的外膜。也分离了含pHAT细胞的内膜和外膜。其Western印迹的结果见图9。含pHAT的SL3261的外膜组分中的独特条带与SL3261-pHAT全细胞裂解液Western印迹中所见独特条带具有相同的分子量，这说明HIV Tat蛋白位于这些细胞的外膜。

                           实施例12

所构建的、含质粒pHART或pHAT的减毒沙门氏菌SL3261所构成的活疫苗被确定表达相应的HIV蛋白后，用这些细菌来接种小鼠。2至3次口服接种后，分析小鼠对相应HIV抗原的免疫应答。

在第一组实验中，分析小鼠对HIV逆转录酶(图10)和HIV tat(图11)的分泌性IgA应答。只在接种SL3261-pHART或SL3261-pHAT的小鼠中看到特异性IgA应答，这说明：两种疫苗实际上都诱导一定程度的特异性IgA应答，但接种逆转录酶疫苗的小鼠对逆转录酶抗原的应答比接种Tat疫苗的小鼠对Tat抗原的好2倍以上。

图12显示接种SL3261-pHART小鼠内获得的逆转录酶特异性IgA应答与时间的图表。应答似乎在第一次接种后第三周达到峰值后随时间衰减。逆转录酶特异性抗体的这一减少可用使用活疫苗构建物常见的现象来解释。当小鼠第一次接种活疫苗时，它们产生不仅针对抗原(在此是逆转录酶)的抗体，而且产生针对沙门氏菌的抗体。旨在增强特异性应答的后续接种效果可能较差，因为黏膜中较多的抗沙门氏菌抗体减少了能够成功感染小鼠的沙门氏菌数量(Kraehenbuhl，1992)。这较高的抗沙门氏菌抗体水平实际上降低了接种的有效剂量。

进行增殖试验测定HIV抗原特异性辅助性T细胞应答。3周的短期研究显示：尽管背景水平很高，第一次接种后3周，SL3261-pHART接种小鼠内仍似乎产生了逆转录酶特异性应答(图13)。对Tat抗原进行的试验结果不太好(数据未显示)。

图14显示3周试验所进行的首次接种逆转录酶疫苗后的12周研究。在此，由不同小鼠分离的脾细胞内的应答更显著。5个接种含逆转录酶构建物SL3261的小鼠中有4个对用于刺激脾细胞的两种浓度逆转录酶抗原表现出阳性应答。5只小鼠对用来刺激脾细胞的热灭活沙门氏菌都表现出阳性应答。这一对沙门氏菌的阳性应答是预料中的，因为小鼠不仅接触逆转录酶抗原，还接触沙门氏菌载体。当脾细胞仅与RPMI-1640培养基一起培养时，5只小鼠都表现出背景水平增殖。该结果非常明确地表明，在用表达HIV逆转录酶抗原的活疫苗接种时，这些小鼠将产生对逆转录酶特异性的辅助性T细胞应答。

本发明说明了一种HIV活疫苗的开发，即通过在减毒沙门氏菌表面表达HIV抗原，从而产生细胞和黏膜以及体液应答。通过使用减毒沙门氏菌作为活疫苗的载体，可以既激发细胞应答又激发黏膜应答。

开发本发明疫苗的第一步涉及构建两个用于向减毒沙门氏菌内转化的质粒。这两质粒都含lpp启动子调控下的lpp-ompA融合结构，从而允许蛋白构建物的恒定表达。lpp-ompA基因后面是HIV逆转录酶蛋白或HIV Tat蛋白的基因。该三元融合结构能在细菌外膜上表达HIV蛋白。

构建上述质粒后，确定HIV蛋白是否在细菌内表达。设计检测大肠杆菌内表达的方法，并将质粒转化到减毒沙门氏菌内。评价蛋白质的表达，并确定该蛋白质的位置。进一步特征描述活疫苗后，给小鼠喂以重组减毒沙门氏菌，监测它们的免疫应答。通过测定排泄物中的IgA水平来评价黏膜免疫应答的产生，通过增殖试验并测定细胞因子水平来检测辅助性T细胞应答。

在构建重组质粒时，第一步是构建两种质粒，一种含有lpp-ompA融合序列，后面是HIV逆转录酶基因，都在lpp启动子调控之下。另一个含同样的lpp-ompA融合序列，但后面是HIV tat蛋白。两种质粒都以质粒pSP72为骨架。复限制性消化产物的琼脂凝胶显示预计大小的所需片段。这些重组质粒含有所需的lpp-ompA基因片段和相应的HIV基因序列。

质粒构成后，需确认HIV蛋白是否在细菌系统中表达。用含重组质粒、以IPTG诱导和不诱导的大肠杆菌，以及无质粒的对照大肠杆菌的全细胞裂解液在SDS凝胶上电泳，然后转移到PVDF膜上进行Western印迹。在Western印迹上可检测到HIV逆转录酶蛋白。该膜以多克隆抗逆转录酶抗体染色。在所需分子量位置有2条含重组质粒pHART独有的独特条带。从大肠杆菌中纯化出抗原。

含诱导细菌细胞的样品与含非诱导细菌细胞的样品未表现出任何区别。含用于表面表达的重组质粒的细菌不如对照细菌健康，而且质粒不稳定。重组SL3261的生长速度比对照SL3261慢。无抗菌素存在下生长的SL3261内的pHART质粒稳定性是12％。SL3261内pHAT质粒的稳定性是90％。生长速度慢和质粒并不稳定这些因素可能减少诱导后所见的蛋白质表达量。

为了进一步确定HIV逆转录酶抗原的位置，用膜的粗制备来从全膜组分中分离出外膜。用抗逆转录酶抗体染色的Western印迹分析这些膜样品。在Western印迹中，全膜和外膜组分中都有与DH5α大肠杆菌全细胞裂解液中相同的独特条带。这一结果说明，HIV逆转录酶位于细菌细胞的外膜内。

诱导、不诱导的、含HIV tat基因重组质粒pHAT大肠杆菌和对照大肠杆菌的全细胞裂解物的以多克隆抗tat抗体染色的Western印迹显示含重组质粒细菌所特有的独特条带。抗tat Western印迹中还有一些非特异性的抗体结合。同样，诱导和非诱导细菌内的蛋白质表达水平似乎也没有区别。

因为在DH5α大肠杆菌细胞内既测到了逆转录酶又测到了tat，故将重组质粒pHART和pHAT转化到减毒沙门氏菌SL3261中。用含逆转录酶的pHART质粒的SL3261进行全细胞裂解液的Western印迹。检测表达所用抗体为亲和纯化的多克隆抗逆转录酶抗体。和大肠杆菌一样，沙门氏菌样品中有2条独特条带。这些正确分子量的独特条带的存在说明逆转录酶蛋白被表达。

为了更好地确定HIV逆转录酶在沙门氏菌系统内的位置，用蔗糖梯度分离内膜和外膜，并对样品进行Western印迹分析。在Western印迹中，含重组pHART质粒的细胞的外膜组分中有1条条带。因此，逆转录酶蛋白位于减毒沙门氏菌的外膜。

和重组逆转录酶质粒一样，对含HIV tat基因所在pHAT质粒的SL3261的全细胞裂解液进行Western印迹。用多克隆抗tat抗体染色Western印迹。在含pHAT质粒的泳道内看到了一条独特条带，对照SL3261则没有。该条带位于50kDa附近，高于预计分子量。

分离含质粒pHAT的SL3261的内膜和外膜，以进一步确定重组tat的位置。用抗ompA抗体染色Western印迹，含重组质粒pHAT的SL3261的外膜组分中有独特条带。这些条带比对该融合构建物所预计的高，分子量约为50kDa。含pHAT的SL3261和对照SL3261之间存在明确差异。这些独特条带的分子量与SL3261-pHAT全细胞裂解液的抗tat抗体染色Western印迹中所见独特条带相同，这说明HIV tat蛋白位于细胞的外膜。HIV抗原即逆转录酶和tat蛋白在大肠杆菌和减毒沙门氏菌中以三元融合结构的形式得以表达。逆转录酶和tat蛋白都位于细菌的外膜。

活疫苗由包含表达相应HIV蛋白的质粒pHART或pHAT的减毒沙门氏菌SL3261构成，该活疫苗构成后用于给小鼠接种。口服2至3剂后，分析小鼠对相应HIV抗原的免疫应答。本研究选用口服接种。分析12周内小鼠对HIV逆转录酶和HIV tat的分泌性IgA应答。仍用这些小鼠，通过对分离脾细胞的增殖试验分析辅助性T细胞应答。

接种小鼠中测得的逆转录酶特异性IgA水平存在差异。只有接种SL3261-pHART的小鼠才有如此之高的逆转录酶特异性IgA。在接种SL3261-pHAT活疫苗的小鼠中可看到作为特异性反应的tat特异性IgA水平。以上结果表明，疫苗诱导HIV tat特异性IgA。

接种SL3261-pHART小鼠中的逆转录酶特异性IgA应答随时间衰减。每次接种使用不同减毒菌株向黏膜传递抗原可消除或减缓抗体应答的这种衰减。有许多减毒沙门氏菌菌株可以使用。总的说来，逆转录酶和tat疫苗所得结果都是明确的，表明在接种小鼠内产生了可测水平的抗原特异性IgA。逆转录酶疫苗在诱导更高水平的分泌IgA抗体方面更有效。

用两种不同试验测定了HIV抗原特异性辅助性T细胞应答。接种SL3261-pHART的小鼠，在第一次接种后3周产生逆转录酶特异性应答。

逆转录酶疫苗首次接种后12周进行的增殖试验中，不同小鼠的分离脾细胞内所见的应答更显著。以含逆转录酶构建物的SL3261接种的5只小鼠中有4只表现出对刺激脾细胞所用两种浓度逆转录酶抗原的阳性应答。5只小鼠都表现出对刺激脾细胞所用热灭活沙门氏菌的阳性应答。以上结果表明：当用表达HIV逆转录酶抗原的活疫苗接种时，小鼠产生逆转录酶特异性的辅助性T细胞应答。以SL3261-pHART活疫苗接种的小鼠内的阳性辅助性T细胞应答和逆转录酶特异性IgA应答阳性结果表明该接种方法是有效的。

本发明涉及HIV活疫苗的模型，是通过在减毒沙门氏菌上表面表达特定的HIV抗原。该疫苗激发HIV逆转录酶抗原特异性的黏膜IgA应答和辅助性T细胞应答。活疫苗载体，例如减毒沙门氏菌，易于使用，不需要特殊处理或注射。可以给患者口服疫苗。而且，该疫苗成本低廉。

在用上述表面表达法展示诸如HIV逆转录酶和tat等蛋白外，还可用表位或肽来刺激免疫。在此类构建物中，可在lpp-ompA序列后跟一段免疫原性肽的碱基对序列，从而在表面展示该肽。已知激发免疫应答的这一特定表位将因为沙门氏菌的佐剂特性而诱导更强的免疫力。只用一种肽而不是完整蛋白的该方法可提高细菌存活率和质粒稳定性，因为表面表达中较少膜受到破坏。此类肽的实例之一是一种抗原性逆转录酶肽，已知它在人和C3H/HeJ小鼠内是一T细胞表位(Hosmalin，1990)。

用lpp-ompA融合构建物在减毒沙门氏菌SL3261中表面表达HIV蛋白，构建得到抗HIV活疫苗，该技术也可用于其他病毒性和细菌性病原。可开发出此类疫苗的另一例病毒是呼吸合胞病毒(RSV)，该病毒是西方国家内导致1岁以下婴儿住院的主要病因之一。RSV的一有用抗原是F蛋白，它可用上述lpp-ompA系统在SL3261内表面表达。该重组细菌可用作RSV的活疫苗。用上述lpp-ompA融合构建物在SL3261内表面表达病原特异性抗原，可开发出其他病毒性和细菌性疫苗。

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本说明书中的任何专利和出版物都体现了本发明所述技术领域熟练技术人员的水平。而且，本发明对这些专利和出版物进行了同等的引用，如同分别具体指明各自为本发明所引用那样。

本领域熟练技术人员将很容易理解：本发明很适合实现本文所提及的目的，获得所提及的结果和优点，以及本发明本身所蕴涵的目的和优点。以上实施例，及其中的方法、过程、处理方法、分子和具体化合物都代表了优选的实施方式，是范例性的，并不是为了限定本发明的范围。本领域熟练技术人员可以看出，权利要求范围所界定的本发明要旨还包涵了许多改变和其他用途。

Claims (6)

1.一种减毒细菌宿主，包含一种重组质粒，该重组质粒带有融合蛋白构建物，该构建物包含暴露于表面所需的基因和编码1型人免疫缺陷病毒之逆转录酶或反式激活蛋白的基因，所述暴露于表面所需的基因编码与大肠杆菌外膜蛋白ompA的一部分相连的大肠杆菌脂蛋白信号序列。

2.根据权利要求1所述减毒细菌宿主，它是鼠伤寒沙门氏菌SL3261。

3.根据权利要求1所述减毒细菌宿主用于制造针对人免疫缺陷病毒的药物的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述细菌宿主诱导黏膜IgA应答或辅助性T细胞应答。

5.根据权利要求3所述的用途，其中所述细菌宿主呈适合口服给予的形式。

6.根据权利要求3所述的用途，其中所述口服给予的形式含10¹²至10¹⁴菌落形成单位。

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