CN1217954C - 兔出血病病毒重组衣壳和蛋白质及含有它们的诊断药盒和疫苗 - Google Patents
兔出血病病毒重组衣壳和蛋白质及含有它们的诊断药盒和疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1217954C CN1217954C CN951150588A CN95115058A CN1217954C CN 1217954 C CN1217954 C CN 1217954C CN 951150588 A CN951150588 A CN 951150588A CN 95115058 A CN95115058 A CN 95115058A CN 1217954 C CN1217954 C CN 1217954C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rhdv
- vaccine
- rabbit
- protein
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 93
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 title claims description 72
- 241000714203 Rabbit hemorrhagic disease virus Species 0.000 title claims description 21
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 title claims 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 95
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 77
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 86
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 55
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 31
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 31
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 31
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 20
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 16
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 16
- 108010045075 rabbit hemorrhagic disease virus viral protein 60 Proteins 0.000 claims description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 9
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 claims description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 6
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical group [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 241001644525 Nastus productus Species 0.000 claims description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 claims description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 claims 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 abstract description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 abstract description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 abstract 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 abstract 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 abstract 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 abstract 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 abstract 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 abstract 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 abstract 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 abstract 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 abstract 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 abstract 1
- 210000002105 tongue Anatomy 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 75
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 52
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 35
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 32
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 24
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 22
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 21
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 20
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 20
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 15
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000034994 death Effects 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 10
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 6
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 5
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 4
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 3
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000008676 import Effects 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 3
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 3
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 3
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710153593 Albumin A Proteins 0.000 description 2
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N Cyanamide Chemical compound NC#N XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 2
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 2
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- XXPDBLUZJRXNNZ-UHFFFAOYSA-N promethazine hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 XXPDBLUZJRXNNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 2
- 238000009781 safety test method Methods 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical class C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101000653197 Beet necrotic yellow vein virus (isolate Japan/S) Movement protein TGB3 Proteins 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000224483 Coccidia Species 0.000 description 1
- 208000003495 Coccidiosis Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 206010014080 Ecchymosis Diseases 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 206010023076 Isosporiasis Diseases 0.000 description 1
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 1
- 241001481504 Radi vesiculovirus Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 206010042434 Sudden death Diseases 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 241000710914 Totivirus Species 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- BIGPRXCJEDHCLP-UHFFFAOYSA-N ammonium bisulfate Chemical compound [NH4+].OS([O-])(=O)=O BIGPRXCJEDHCLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000077 angora Anatomy 0.000 description 1
- 230000002303 anti-venom Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 229960004217 benzyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 230000003778 catagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 230000008473 connective tissue growth Effects 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- GDPJWJXLKPPEKK-SJAYXVESSA-N dT4 Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)CO)[C@@H](O)C1 GDPJWJXLKPPEKK-SJAYXVESSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000010218 electron microscopic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 208000001780 epistaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 206010016629 fibroma Diseases 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 208000011309 nasal bleeding Diseases 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 231100000628 reference dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000017610 release of virus from host Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCS([O-])(=O)=O DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 229960004418 trolamine Drugs 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/16011—Caliciviridae
- C12N2770/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
已用在昆虫细胞培养物上复制的重组杆状病毒表达系统生产了兔出血病病毒(RHDV)的重组衣壳和重组蛋白质。这些重组衣壳和蛋白质与RHDV天然VP60蛋白质有类似的免疫原性和抗原性,并适用于配制能有效保护兔抵御RHDV感染的疫苗,以及用于制备诊断药盒,所述诊断药盒适用于检测识别RHDV的抗体的存在和来自兔的生物学样品中之RHDV的存在。本发明对于生产兽医药物是有价值的。
Description
本发明涉及用重组杆状病毒系统,经在昆虫细胞中表达而生产的为兔出血病病因的病毒(RHDV)的重组衣壳和蛋白质。本发明还涉及含所述重组衣壳和蛋白质的诊断药盒和疫苗。
早在1988年夏,在西班牙Asturias和Almeria-Murcia区的农村兔养殖场,出现了一种奇怪的疾病,其中种畜, 有时是成年兔在没有任何明显的临床症状的情况下就死掉了。开始,由于它是急性的而将其归因于毒性型疾病,或者因在病畜中检测到抗粘液瘤病病毒抗体而归因于粘液瘤病病毒。这两种假设均被放弃了,结论是临床症状与1984年首次在中国(江苏省)报道并称为“出血性兔疾病”或“感染性病毒肺炎”(Liu.S.J,等人,1984,An.Hus.Vet.Med.16(6):253-255)的传染性疾病非常相近。
根据Xu等人在1988年于匈牙利举行的世界兔会议(4thWorldRabbit Congress W.R.S.A.,1988,3:456-462)上展示的资料,这种疾病是由联邦德国进口的一批Angora兔传入中国的。这个事实得出的结论是,这种病毒可能已在欧洲潜伏了很长时间了。欧洲第一例病毒性出血病病例是1986年在意大利检查出来的,开始称为“X疾病”(Cancelloti,F.M.等人,1988,Coniglicoltura,25,9:41-46)。在1988到1989年之间,在法国、德国、和西班牙也报道了这种疾病(Villares,A,等人,1988,Med.Vet.,5:645-650;Plana,J.等人,1989,Med.Vet.6:87-88)。
这种病主要影响成年兔。年幼的未成熟兔和肥胖兔似乎自然受到保护。来自工业化农场的动物似乎比在小型农场中饲养的那些动物不易受这种病毒的影响。
潜伏期为2-3天;死亡率在90%以上。临床症状是抽搐、共济失调,呼吸困难和随着鼻出血而突然死亡。损伤的特征在于在不同器官—主要在肺中产生充血和瘀斑或出血区。在肝中检测到不同的退化期,因为这里是病毒复制的靶器官。
这种病的致病因子是被称为兔出血病病毒的病毒。这种病毒首次同时在西班牙(Plana,J.等人,见上文;Parra,F.andPrieto,M.,1990,J.Virology,64:4013-4015)和德国(ohlinger,V.F.,等人,1990,J.Virology,64:3331-3336)分离出。RHDV的大小为40nm,未包被的,以单股RNA链为基因组材料。以形态学资料为基础,开始将其分为微小RNA病毒(Pu,B.等人,1985,Chi.J.Vet.Med.11:16-17)和细小病毒(Xu等人,4th World Rabbit Congress,上文)。但根据相应的病毒粒子大小、密度、形态学和分子结构,已将其确定地分为萼状病毒(calicivirus)。
已在两篇文献中描述了德国RHDV分离物的分子特征和核苷酸序列:
a)Meyers,G,Wirblich,C,和THiel,H-J,1991,“Rabbit Hemorrhagic disease virus.MoleCular cloningand nucleotide sequencing of a calicivirus genome”,Virology,184:664-676。
b)Meyers,G,Wirblich,C.,and Thiel,H-J.,1991,“Genomic and subgenomic RNAs of rabbithemorrhagic disease virus are both protein-linkedand packaged into particles”,Virology,184:677-686。
最近,克隆并定序了完整的RHDV基团组(Meyers,G.等人,见上文)。RHDV基团组由在3′末端含腺嘌呤残基尾部(poly-A)的单链RNA分子组成。基团组的长度约800个核苷酸或碱基对(bp);在其结构中,它含有占病毒基因组89%的单一开放阅读框架(ORF)。5′区编码非结构病毒蛋白,与由猫萼状病毒(FCV)编码的蛋白质相比呈现出高度同源性。在此,已经描述了与参予RNA合成之微小RNA病毒基因2C所述者相似的序列,与在含Cys残基之蛋白酶中所呈现者相似的结构,以及RNA依赖性RNA聚合酶。相反,该单一RHDVORF的3′区则编码构成病毒衣壳的结构蛋白质。由于其大小约60KDa,所以称该区为VP60,并且从来自基因组RNA的长转录本和后加工,以及从2200pb亚基因组RNA的转译完成其合成。对RHDV,已描述了这两种病毒RNA形式—其它RNA病毒的特征(Meyers,G.等人,见上文),并认为它们均存在于与15KDa蛋白质相联系并被包裹的病毒粒子中。
对于制备抗RHDV引起之疾病的疫苗来说,一个主要的困难是只可能在体内复制这种病毒。已描述了一些容许的细胞系统。具体地说,在我们的实验室,我们已在兔肾RH-13细胞中增殖了病毒,不过病毒产率很低。这意味着,为了得到疾苗抗原,必需感染并杀死兔。
本发明提供一种可替代的途径以解决与传统疫苗有关的不利方面。这种可供选择的方法包括制备并使用能有效对抗RHDV感染的重组疫苗。新的重组疫苗可以含有由本发明提供的重组衣壳和/或蛋白质。这些重组疫苗不需使用全病毒,而只需要其部分,从而排除病毒释放事故造成的危险,得到一种明显优于传统第一代疫苗的新疫苗。另一方面,用本发明的重组衣壳和/或蛋白质已研制出一种用酶免疫检测技术(ELISA)诊断RHDV的新方法。
许多表达和生产重组蛋白质的系统是已知的。大规模生产重组蛋白质的一种最有效的系统是以在培养的昆虫细胞中,复制衍生于Autographa californica核多角体病病毒(AcNPV)的重组杆状病毒为基础的。在杆状病毒中表达技术的描述可参见下列文章和文献:
a)Luckow.V.A.和Summer,M.D.,“Trends in thedevelopment of baculovirus expression vectors”Bio/Technology,6:47-55(1988)。
b)Bishop,D.H,L.,“Baculovirus expressionvectors”,Seminars in VIROLOGY,3:253-264(1992)。
本发明提供用在许可的宿主细胞上复制的适宜表达系统产生的RHDV重组衣壳和蛋白质。在一个具体的例子中,本发明提供的重组衣壳和蛋白质是通过用重组杆状病毒系统在昆虫细胞中表达而产生的。能产生所述重组衣壳和蛋白质的重组杆状病毒,以及所用的转移载体构成本发明的另外两个目的。获得所述重组杆状病毒和产物(衣壳和蛋白质)的方法也构成本发明的一个目的。
本发明还提供一种能保护兔免于RHDV感染的新疫苗,包含由本发明提供的重组衣壳和/或蛋白质,以及适宜的载体或佐剂。
另外,本发明提供能预防兔出血病和其他兔感染的二或多价疫苗,其含有由本发明提供的RHDV重组衣壳和/或蛋白质,以及一种或多种兔病原体和适宜的载体或佐剂。
本发明还提供检测生物学样品,如来自可疑被感染之兔血清中特异性识别RHDV之抗体存在的方法和诊断药盒,其包括使用本发明提供的重组衣壳和/或蛋白质,和适宜的检测方法。
本发明还提供一种检测可疑被感染原兔生物学样品,如血液、血清、肺、脾或肝中抗原(RHDV)存在的方法和诊断药盒,其包括已借助本发明提供的重组衣壳和/或重组蛋白质免疫动物而得到的、特异地识别RHDV的抗体和充分的检测方法。
图1说明转移载体pAcRHDV-710的构建,指明将编码RHDVVP60的基因插入质粒pAcYM1中所进行的操作。
图2列出了天然VP60基因[RHDV(VP60)]和经修饰的基因[pRHD-7]结构,显示了两者间存在的不同。可以观察到,在这种特定情况下,经修饰的基因含有一序列编码:(i)两个氨基酸,不同于在天然VP60序列(位点+2和+3氨基酸)中存在者,其在重组蛋白质中已被两种其他氨基酸取代,和(ii)在天然VP60序列中没有的,并源于编码pMTL22质粒多聚接头之序列的5个附加氨基酸。该图还显示了与重组pAcRHDV-710克隆中的多角体蛋白启动子有关的,借助限制性核酸内切酶酶切图谱分析得知的经修饰之基因的正确方向,其中可观察到在位点BamHI和转录起始点之间的距离仅2个碱基。
图3显示通过集聚本发明提供的一种RHDV重组蛋白质而形成的病毒衣壳的制备(图3a)以及纯化之病毒颗粒的制备(图3b)
历经多年,我们实验室完成了鉴定兔出血病病原因子(RHDV)的研究工作。这项研究的结果是,分离并描述了RHDV的特征(Plana等人,见上文),开发并以商标名“CYLAP HVD”上市了一种抗所述感染性疾病的常规疫苗。
最近,已发表了我们的研究成果,分离并克隆了所述RHDV分离物的基因组,并研制出有效对抗RHDV感染的新重组疫苗。到此为止,已克隆了其基因组的一个片段—相当于病毒基因组的3′末端,编码称为VP60的结构病毒蛋白质,该蛋白质可能与病毒的抗原性和免疫原性有关。
本发明提供了在免疫原性和抗原性方面类似于天然RHDV和该病毒之天然VP60蛋白质的RHDV重组衣壳和蛋白质。为此,可以使用这些产物—重组衣壳和/或重组蛋白质—制造能够预防RHDV感染的疫苗,和适用于该病毒的诊断药盒。可通过本发明提供的RHDV重组蛋白质的聚集作用得到所述的重组衣壳。
短语“抗原性类似于天然RADV和该病毒的天然VP60蛋白质”或相似的表述在本发明的意义上应是可以理解的,即是指重组衣壳和/或重组蛋白质能够以与天然RHDV和该病毒之天然VP60蛋白质相同的诱导方式诱导产生抗体。
短语“免疫原性上类似于天然RHDV和该病毒的天然VP60蛋白质”或相似的表述在本发明描述所用的意义上应是可以理解的,即是指重组衣壳和/或重组蛋白能诱导动物的免疫反应以足以保护它抵御RHDV感染,由于该原因,前述的重组衣壳和/或重组蛋白质适用于配制RHDV疫苗。
使用常规的遗传工程技术,可在适当细胞上复制的适宜表达系统中,生产本发明提供的重组衣壳和蛋白质。
在本发明的一个具体实施方案中—作为可以完成的一种方式的详细说明—克隆并表达重组蛋白质,该蛋白质含有RHDV天然VP60蛋白质的全部氨基酸序列,但不包括两个位点+2和+3的氨基酸。在本说明书中,将该重组蛋白质称为“重组VP60”,“rVP60”或“修饰的VP60”。
重组VP60蛋白质含有带下列修饰的RHDV天然VP60氨基酸序列:
(i)在重组VP60蛋白质中,原天然VP60蛋白质序列位点+2和+3氨基酸已被两种其他氨基酸取代,和
(ii)重组VP60蛋白质包括在天然VP60蛋白质序列中没有的、位于氨基末端的5个附加氨基酸。所述5个附加氨基酸序列来源于编码pMTL22质粒多聚接头的序列。这5个氨基酸是非功能性的,而且可替换地,可用另外相同或不同数目的类似序列取代所述的附加序列而不改变最终的结果。
将在下文进一步详细描述的所述重组VP60蛋白质的其他特征是:
a)已在于昆虫细胞培养物上复制的重组杆状病毒表达系统中生产出来;
b)令人惊异地是,它能形成与RHDV病毒衣壳类似的衣壳或多聚体结构或蛋白质聚集体;和
c)重组VP60蛋白质以及衣壳或它们可形成的蛋白质聚集体与RHDV天然VP60蛋白质及天然病毒有类似的免疫原性和抗原性,为此它们适于免疫兔使之对抗RHDV引起的感染,并可用以:
-配制有活性的,主动的、单、二或多价疫苗,所述疫苗能使兔抵御RHDV及其他兔病原体引起的感染;和
-制备进行下列检测的诊断药盒:(i)特异性识别RHDV之抗体的存在,或(ii)借助特异性识别RHDV的抗体(所述抗体是经用本发明提供的重组衣壳和蛋白质免疫动物而得到的)检测RHDV的存在。
如下文的详述的,在本发明的一个具体实施方案中,用在容许的宿主细胞培养物中增殖的重组杆状病毒表达系统生产RHDV重组衣壳和蛋白质,特别是称为重组VP60的蛋白质。得到上述重组VP60蛋白质的完整方法包括下列几大步骤:
I.制备将插入杆状病毒中的cDNA序列;和
II.得到表达重组蛋白质的重组杆状病毒。
将这些总步骤分成其他一些分步骤。因此,制备将被插入之cDNA序列,包括以下分步骤:
I.a.分离并纯化RHDV;
I.b.分离其总病毒RNA;和
I.c.从基因组RNA合成cDNA。
得到表达RHDV重组VP60的重组杆状病毒包括下列步骤:
II.a.制备编码RHDV VP60的基因;
II.b.将所述基因插入杆状病毒转移载体中;
II.c.用所述的转移载体转染允许的宿主细胞,所述载体含有编
码被插入之RHDV VP60的基因;和
II.d.选择表达所述重组VP60的重组杆状病毒。
然后完成重组杆状病毒的特征鉴定以及所得重组蛋白质的特征鉴定和纯化。所有这些步骤将在下面进一步详细描述。
按照实施例1中描述的方法,获得RHDV重组衣壳和蛋白质的步骤是从分离和纯化RHDV开始的,即此情况下利用了我们实验室得到的分离物。一旦分离并纯化了病毒,就用SDS(十二烷基磺酸钠),链霉蛋白酶和蛋白酶K处理样品并用苯酚:氯仿提取(实施例2)以分离总病毒RNA。在0.7%的中性琼脂糖凝胶上,经用溴化乙锭染色分析得到的RNA,观察到两条主带,其可能相当于病毒的基因组和亚基因组RNA。将这些带与已知大小的标准RNA进行比较,推测一带的大小为8kb。
然后,利用存在poly(A)所带来的优点,建立用oligod(T)作为能被反转录酶延伸并合成cDNA分子之引物的战略,使用商品试剂盒(BOEHRINGER)合成相当于病毒RNA之3′末端的CDNA(实施例3)。计数合成的物质中掺入的放射活性,并在碱性和中性琼脂糖凝胶上电泳,以证实并定量确定cDNA合成。
为了克隆cDNA,首先完成对合成之cDNA的大小选择。选择了三种大小的cDNA片段,即:1,000到2,000bp间,2,000和5,000bp间,5,000bp以上。以平头将纯化的cDNA克隆到载体PMTL25中,用SmaI切成线性,并用碱性磷酸酶去磷酸化。用DNA连接酶连接插入片段和载体,并用其转化E.coli XL-1Blue细胞,以完成以颜色为基础的对重组菌落的初步筛选。
以德国RHDV分离物的序列(Meyer等人,见上文)为基础, 经质粒DNA制备和用BamHI及EcoRI进行限制性位点图谱分析来分析阳性克隆。分析的38个质粒中,只有10个是阳性的,相当于RHDV的3′区,带有在800到2000dp间的插入片段。其中,命名为pRHD-24,pRHD-25和pRHD-45的3个大小约2,000bp,因此更可能含有VP60结构蛋白质基因。由于这一原因,借助用于双链质粒的双脱氧技术,测定它们的序列以确证真实性并确定插入区、方向和精确大小。使用通用寡核苷酸(5′GTAAAACGACGGCCAGT3′)和反向寡核苷酸(5′AACAGCTATGACCATG3′)。观察到克隆pRHD-24和pRHD-25开始于核苷酸5313处(依照Meyers等人的序列,见上文),而克隆pRHD-45开始于核苷酸5193处。前2个克隆终止在位于3′端的poly(A)尾部。
按下列两个战略来鉴别VP60蛋白质的起始密码子:
(a)一种实验性近似法,有意用自动蛋白质测序仪直接测定N末端序列,和
(b)用Microgenie计算机程序(BECKMANN)经序列分析从理论上预测。
从蛋白质的直接定序,没有得到实际结果,而通过模拟可能的转录本区域的大小,计算出VP60编码序列开始于RHDV基因组的核苷酸5305处(作为以后的VP60表达实验的参考)。
为了得到表达RHDV VP60的重组杆状病毒,采用下列步骤:首先制备待插入的VP60基因。为此,选择命名为pRHD-24的质粒,该质粒中CDNA插入片段开始于理论上的ATG起始密码子的5bp以下,所以需加入一个能使表达开始的ATG。用BamHI部分消化,并再克隆于pMTL22载体的Bg1 II位点,得到完整的pRHD-24插入片段,以致使插入片段的开放阅读框架与属于pMTL22靶NCOI序列的ATG一起保留在框架中。用NcoI和ECoRI消化所得到的构建体以除去cDNA克隆的3′非克隆区,用E.coli DNA聚合酶I的klenow片段补平,并再克隆到用SmaI消化的PMTL25中,得到称为pRHD-7的质粒(图1)。借助该构建体,位于天然VP60之理论位点+2和+3位的原氨基酸丢失,天然VP60序列中的这两个氨基酸(Glu和Ala)被重组VP60中的两个其他氨基酸(Ser和Pro)取代。还产生了编码5个氨基酸(Ala-Cys-Ile-Asp-Arg)的插入序列,该序列不存在于天然VP60蛋白质序列中并且来源于质粒pMTL22多接头编码序列。这5个氨基酸是非功能性的, 并且可以用另一个有相同或不同数目的类似序列取代所述的附加序列而不改变最终结果。经碱溶解纯化所得的质粒(pRHD-7)并用限制性内切酶酶切图谱法和测定插入区的序列来确定其特征。该质粒被用于提取经修饰的VP60。
以后,将编码修饰的VP60的基因插入适宜的转移载体中—如pACYM1载体,其具有一个与多角体蛋白启动子并列的BamHI位点。经修饰的VP60基因在其序列中有一个BamHI限制性位点,因此,很难克隆所述的pAcYM1载体,因为必需进行能提取完整插入片段的新的部分消化。
为了从pRHD-7质粒中分离VP60基因,试验用BamHI进行部分消化的时间。观察到最适合的时间在15和30分钟之间。通过在琼脂糖凝胶中连续电泳(实施例5),收集1.7kb带并与已用BamHI消化和用碱性磷酸酶去磷酸化的质粒pAcYM1相连接。用该连接混合物转化E.coli DH5α细胞。用限制性内切酶图谱法选择重组pAcRHDV-710和pAc RHDV-709质粒(转移载体)。测定两质粒的序列以确定与多角体蛋白启动子有关的适宜插入方向。观察到,在BamHI位点和转录起始位点之间仅有2个碱基的距离。
然后,用亲本AcRP23-lacZ病毒纯化的感染性DNA和相应转移载体的混合物转染Spodoptera frugiperda细胞,sf9克隆。一旦完成共转染,即可在用X-gal着染病毒子代后,用噬菌斑颜色表型检测法鉴定重组杆状病毒,并纯化之。该重组杆状病毒,称为AcNPV RHDV-710,已寄存了欧洲动物细胞培养物收集中心(ECACC)。
实施例4到6详细描述了表达RHDV修饰的VP60之重组杆状病毒的获得。
已评价了重组杆状病毒AcNPV RHDV-710和AcNPV RHDV-709在sf9细胞中的表达产物,并用SDS-PAGE凝胶电泳法和免疫印迹法充分鉴定了重组VP60的特征。
用SDS-PAGE凝胶电泳,主要得到与纯化的RHDV迁移位置相同的60KDa蛋白质。还注意到重组蛋白质主要保留在细胞溶解上清液中,这说明该蛋白质是非常易溶的。如果凝胶电泳进行一段足够的时间,就可能观察到,重组蛋白质的游动性比病毒的游动性稍微低一些。这是由于5个附加氨基酸的码内融合而引起的。
用免疫印迹法证明在凝胶中观察到的蛋白质相当于RHDV天然VP60。为此,将凝胶转移到硝酸纤维素膜上,用脱脂奶粉封闭该带,并使之面对多克隆抗RHDV兔血清(Laboratories Sobrino)。结果是结论性的,却因为多克隆抗RHDV兔血清识别由重组AcNPVRHDV-710杆状病毒感染的细胞中和阳性对照细胞中的相同60KDa蛋白质。但是,它不识别在未被感染的sf9提取物中的任何蛋白质(实施例7.2)。
以后对由AcNPV RHDV-710重组杆状病毒表达的VP60蛋白质的研究使问题更清楚,且令人惊异的是,该蛋白质能形成与病毒衣壳相似的衣壳或多聚结构或蛋白质聚集体。为此,用电子显微镜检查重组VP60制品并研究其血细胞凝集活性。按着实施例8中描述的方法,用低浓度硫酸铵沉淀得到重组衣壳,纯度水平高达80%以上。
重组VP60样品的电子显微镜分析令人吃惊地显示,存在结构和形态上与病毒衣壳相似的蛋白聚集体(衣壳)。这些重组衣壳的大小与原病毒粒子(35-40nm)相似。同样,可以观察到在重组衣壳制品中,所有颗粒都是空的,即不含有基因组材料(图3)。
另一方面,用加在PBS中的1%人O型红血细胞对重组衣壳进行血细胞凝集试验,结果呈现阳性。
用ELISA技术,比较重组衣壳抗纯化的RHDV的行为。按照实施例8.3描述的方法,观察到抗RHDV血清同样地识别重组表达产物(VP60或VP60衣壳)及纯化的病毒。在未感染的sf9细胞提取物前没有显示出反应性。
基于所有这些结果,可以得出肯定的结论:表达产物(衣壳和重组VP60蛋白质)在抗原性上类似于天然RHDV和RHDV天然VP60蛋白质。并且导入的序列并不改变蛋白质形成多聚衣壳型结构的固有能力。
可将本发明的重组衣壳和/或蛋白质用于诊断目的,用于检测特异性RHDV抗体的存在(实施例11),并可使用以本发明重组衣壳和/或蛋白免疫动物而得到的特异性识别RHDV的抗体,来检测是否存在抗原(RHDV)。
另外,可使用上述重组衣壳和/或蛋白质免疫兔以对抗RHDV。这样可使之用于配制重组疫苗,以有效地保护兔免于遭受RHDV感染。这些疫苗可以是主动的或被动的。可将所述的重组衣壳和/或蛋白质悬浮在适当的佐剂中,以制备主动免疫疫苗。如果这些重组衣壳和/或蛋白是以冻干形式存在的,则可将其重新悬浮在免疫学上可接受的稀释剂或佐剂中。被动疫苗—或更准确地说,被动疫苗—可通过用所述重组衣壳和蛋白质主性免疫动物,然后分离多克隆抗体而得到,后者一旦被分离和纯化即可用作疫苗进行接种治疗。
磷酸盐缓冲盐(PBS)溶液或其它相似的溶液是免疫学上可接受的稀释剂。
在配制疫苗中常用的任何佐剂均可用作重组衣壳和蛋白质的佐剂,或稀释剂。因此,这些佐剂可以是油状的、以矿物油为基础的、甘油和脂肪族醚—酸衍生物、合成的和含水佐剂,如氢氧化铝、氧化铝凝胶悬浮液,QuilA,MDP(胞壁酰二肽),ISCOM(Immuno Stimulant Complex)或脂质体。
另外,本发明提供能预防兔病毒出血病及另一种感染或其他感染的二价或多价疫苗。这些疫苗含有本发明提供的重组衣壳和/或蛋白质,并结合或联合有一种或多种兔病原体和适宜的载体或佐剂。这些病原体是:粘液瘤病病毒、Shope氏纤维瘤病毒,支气管败血性杆菌,以及巴斯德菌属、梭状芽孢杆菌属、沙门菌属、葡萄球菌属、嗜血杆菌属等的微生物种。
本发明提供的疫菌可经肌肉内(IM)、皮下(SC)、皮内(ID)和口服途径用于动物。对于IM或SC给药,疫苗可以是油型[简单的(W/O)和(O/W)型或双乳化(W/O/W)型],水溶液或其他剂型,例如使用MDP,脂质体或ISCOM的制剂。对于ID给药,可以用任何常规给药系统,较好用商标为DERMOJET R的系统。对于口服给药疫苗,可以含有或不含与抗原一起的含水佐剂。
疫苗抗原(重组产物)的存在形式可以是含上述抗原之一的溶液或悬浮液形式。在这种存在形式中,可以使用稀释剂或其他兔疫苗。也可以是冻干形式的,其中可将终产物与稀释剂、佐剂或任何其他类型的含水或油状疫苗重新配在一起应用于兔。
本发明提供的疫苗适用于保护野生的、农场的和宠物兔抵御RHDV感染。
下面将借助实施例进一步详细描述本发明。这些实施例涉及获得上述重组VP60蛋白质和其可形成的衣壳的方法,并涉及这两种重组产物的疫苗和诊断应用。
本发明有的范围不只限于本说明书中提到的重组衣壳和蛋白质,或重组杆状病毒,因为下文描述的实现仅仅是作为具体方式的举例的说明性实施例,其中依据下列条件可以获得本发明的以及任何其他的RHDV重组蛋白或衣壳:
a)功能等同于上述的那那些重组蛋白质,即:提供与天然蛋白质或衣壳相同或相似的抗原和免疫反应,而不必考虑它是否具有与天然VP60或其片段,或所述天然VP60的修饰序列相同的氨基酸序列,所述修饰序列包括几个氨基酸的修饰及用其他一些氨基酸的取代,或者抗原性和免疫原性上等同的氨基酸序列,和
b)借助遗传工程技术在可以用的等同于昆虫细胞中重组杆状病毒表达系统的任何其他表达系统中得到的,并落在本发明范围内。
实施例1.RHDV的获得和纯化
1.1用RHDV感染兔
1.1.1.动物
使用的杂种兔由我们自己的饲养场饲养,年龄大约3个月,体重超过2千克。感染前,动物经心脏穿刺法抽血,并使用血细胞凝集抑制(HAI)试验分析血清,证实其不含抗RHDV抗体。
简单地说,HAI技术包括先处理血清以除去抑制血细胞凝集的成份。然后,将血清在56℃温育30分钟。每0.1ml血清中,加入0.4ml磷酸缓冲盐水溶液(PBS)和0.5ml以25%悬浮于PBS中的高岭土(SIGMA公司)悬浊液,室温放置1小时,并不断搅拌。一旦吸附完成,将样品以200g离心10分钟。向上清液中加入50μl人O型红血细胞,悬液再按上述方法搅拌和离心。余下试验在无菌的带96个U形孔的微量试验板中进行。在50μl不同稀释度的已处理血清中加入4HAu(血细胞凝集单位)的RHDV。平板在室温下温育30分钟,随后,加入50μl以1%悬浮于PBS中的人O型红血细胞。反应混合物在4℃下保温,随后在2至24小时间进行监测。
1.1.2.感染
使用的病原性RHDV分离物得自我们自己的实验室(Plana,J.,et al.,1988,Med.Vet.,6,87-88)。从该分离物(PV1-MSV1)开始,在兔体内进行三次传代,在感染中以P3作为接种物。用0.5mlRHDV在盐溶液中的悬液经鼻内感染兔(20,400 HAu/动物)用对人O型红血细胞进行的血凝试验法来滴定病毒。然后,将50μl以1%的浓度悬浮于PBS中的人O型红血细胞悬液与50μl不同稀释度的病毒PBS中的悬液混合。4℃保温2至24小时,评价红血细胞中是否存在凝集现象。
1.1.3.肝脏的摘取
感染的结果是,兔在感染后3到5天内死亡(感染后的天数简称d.p.i.)。从死亡的动物体内摘取肝脏和脾。将残留的组织(脂肪,结缔组织)和胆囊从肝脏上分离掉。最后,用盐溶液(PBS)将它们冲洗并保存于4℃备用。
1.2 RHDV的纯化
从感染了RHDV之兔的肝脏中纯化病毒。将肝脏切碎,加入大约等体积的PBS。用超速匀浆的方法(2分钟,10次循环,间隔期进行冰浴)制备肝组织匀浆。然后将所得悬液在4℃以20,000g离心35分钟以澄清之。所得的上清液在17%蔗糖的PBS溶液缓冲层上以113,000g 4℃离心2小时,以纯化和沉淀病毒。一旦去掉上清液,即将沉淀重悬于PBS中。然后,用1.1.2-三氯三氟乙醇(MERCK公司)提取病毒悬液(1∶1)。第二次用溶剂抽提含有病毒的水相,并在连续的蔗糖梯度溶液(15-30%w/v,溶于PBS)中以113,000g离心4小时以纯化病毒。离心完成后,梯度自动被分离为几个部分(大约1ml/部分),用血凝试验检测病毒在不同部分中的存在(见实施例1.1.2)。相应于两个最大血球凝集峰的部分命名为峰-I和峰II,将它们混合,用TE缓冲液(Tris-HCl 10mM,PH=8.0和EDTA 1mM)稀释,最后以113,000g离心7小时得到病毒沉淀。
在9%聚丙烯酰胺-SDS(十二烷基硫酸钠)凝胶中电泳来分析纯化的病毒(Laemmli,U.K.,Nature,227:680,1970)。全部蛋白的检测通过考马斯蓝染色和免疫印迹方法来完成(Towbin,H.,et al.,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.76:4350-4354)。使用特异性抗RHDV血清和过氧化物酶—蛋白A结合物(SIGMA公司)显现印迹。在经过考马斯蓝染色的凝胶上,峰I和峰II样品中一条大约为60KD的主带被鉴定出来。随后,证实它们与已描述过的RHDV结构VP60蛋白质的大小相符。除了这种蛋白外。经考马斯兰染色观察到一条大约40KDa的带,在峰II处比峰I处更富集,这种蛋白也能与抗-RHDV血清发生反应,这一事实表明它是60KDa蛋白质的部分降解产物。
实施例2病毒RNA的分离
对病毒样品的总RNA进行纯化,纯化方法如实施例1.2所述。简单地说,200μl峰-I样品用1%SDS,0.5mg/ml蛋白酶K(SIGMA公司)和2mg/ml链霉蛋白酶(SIGMA公司)37℃处理30分钟,使蛋白质和RNase失活。然后,样品用酚连续处理两次,再用酚∶氯仿∶异戊醇抽提RNA,最后用加入1/10体积3M乙酸钠、0.25mg/ml糖原和2.5体积乙醇沉淀之(-2 0℃,1小时)。这一段时间过后,4℃下以16,000g离心30分钟得到RNA。弃去上清液,将NRA沉淀重新悬浮于40μl TE中。
所得的RNA在0.7%中性琼脂糖凝胶中电泳,溴化乙锭染色进行分析。观察到两条主带可能与病毒的基因组和亚基因组RNA相对应。将这些带与已知大小的RNA标准品进行比较可推导出其中一条带大小为8kb。必须指出在这些凝胶中存在的低分子量物质可能相当于细胞DNA或RNA。
实施例3.从RHDV总RNA合成cDNA
3.1.cDNA的制备
合成相应于病毒RHDV RNA之3′端的cDNA。利用3′末端存在多聚A尾部的优点,使用寡聚d(T)作为延展引物,使之在逆转录酶作用下延伸以合成DNA分子拷贝(cDNA)。
cDNA的合成以一套商品试剂盒(BOEHRINGER公司)进行并完成,所用方法简述如下:
1μg按实施例2所述方法制得的RHDV RNA-poly A,在各1mMdATP、dCTP(5-10μci 32p-α-dCTP)、dGTP、和dTTP,25RNA酶抑制单位、0.8μg 5′端磷酸化的Oligo dCT)12以及40单位逆转录酶存在下,以最终体积20μl进行保温。反应混合物在42℃保温1小时,然后在同一试管中开始合成第二条链。随后,加入缓冲液,RNA酶和25单位E.coli DNA多聚酶,22℃保温1小时,再于65℃保温10分钟。最后,产生平头末端,加入4单位DNA T4多聚酶,37℃保温10分钟后,加入EDTA(乙二胺四乙酸)和肌氨酸终止反应。然后,按实施例2所述用酚∶氯仿∶异戊醇提取混合物,并用乙醇沉淀合成的材料。
通过计数掺入所合成材料中的放射活性,并在碱性及中性琼脂糖凝胶中电泳来证实和定量cDNA的合成。
3.2 cDNA的克隆
首先,对合成的cDNA的大小进行挑选以避免克隆过短的片段。为此经以16,000g离心30分钟,回收cDNA合成得到的材料。沉淀物经真空干燥,溶解于TE缓冲液中,点样于1%琼脂糖凝胶中。分别挑选出三种大小的cDNA片段:1,000至2,000bp;2,000至5,000bp;大于5,000bp。在所有情况下,均用DEAE纤维素滤纸从凝胶中回收用NaCl洗脱、然后沉淀所需材料。将纯化的cDNA克隆到载体pMTL25(一种从PUC18中衍生的载体)的平端上。随后,用SmaI将载体切成线性并用碱性磷酸酶处理以降低再连接的可能性。用DNA T4连接酶连接后,14℃过夜,转化大肠杆菌XL-1 Blue感受态细胞,其在X-gal(5-溴-4-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷)(BOEHRINGER)和IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)(GOLD BIOCH)存在条件下,允许根据颜色来初步挑选重组菌落(兰色菌落没有插入片段而白色菌落有插入片段)。
根据德国RHDV分离物的序列(Meyers et al.,文献同上)经质粒DNA制备(Birnboim和Doly,1979,Nucleic Acids Res.,7:1513-1523)和用Bam HIY EcoRI酶进行限制性酶切图谱分析来鉴定阳性克隆。对38个质粒样品进行分析(从三个相应大小选择cDNA及其克隆),只有10个是阳性的,它们相当于RHDV 3′端,并在800至2,000bp间有插入序列。其中3个命名为pRHD-24,pRHD-25和pRHD45者大小约为2,000bp,因此很可能是含有VP60结构蛋白质基因,为证实其可靠性,确定插入区,其方向及精确大小,而对它们进行了测序。为了达到测序目的,使用了应用于双链质粒的双脱氧链终止法(Sanger,F.,et al,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463-5467),和通用(5′GTAAAACGACGGCCAGT3′)及反向(5′AACAGCTATGACCATG3′)寡聚核苷酸。测定经分析之RHDV克隆的序列,证实克隆pRHD-24和pRHD-25始于5313位核苷酸(与Meyers等人的序列相对应,文献出处同上),克隆pRHD-45则始于5193位核苷酸。这三个克隆都在位于3′端的poly(A)尾部终止。
3.3.VP60蛋白质起始密码子的鉴定
因为VP60蛋白包含于含有大部分病毒基因组的单个开放阅读框架内,故为了定位相应于VP60基因的起始ATG而采取了两种战略。一种是通过实验研究在自动蛋白序列仪上直接试测N-端序列;另一种办法是借助计算机程序MICROGENIC(BECKMANN)经序列分析进行理论推测。
因为不能获得一个清楚的序列,所以蛋白质的直接测序不能给出实际的结果。其原因可能是存在封闭蛋白质氨基末端的结构末端。
另一方面,经模拟可能的转录本区大小计算出VP60蛋白质编码序列起始在RHDV基因组核苷酸5305处(Meyer et.al.,文献同上)。在继后的rVP60表达实验中,这一核苷酸用作参考。
实施例4制备插入到转移载体中的基因
根据实施例3.3中确立的假设,选出起始点接近所述的ATG的cDNA克隆。没有一个克隆刚好在ATG之前起始,因此,选出克隆pRHD-24。在这一克隆中,CDNA插入段开始可在理论起始密码子ATG下游5bp处,因此需要加入一个ATG以使表达得以启动。随后的方法如下所述。
质粒p RHD-24的完整插入序列通过用BamHI部分消化而得到,鉴于存在另一个内部BamHI位点,故再克隆于PMTL22载体的Bg 1 II位点,这样,插入序列的开放阅读框架即定位于带有属于pMTL22靶NcoI序列之ATG的码内。然后,这一结构体经用NcoI和EcoRI消化(除去cDNA克隆内的非克隆3′区),用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段处理(室温处理15分钟),以转化成平头,最后,再克隆到用SmaI消化过的PMTL25中。所得到的质粒定名为克隆pRHD-7(图1)。
总地说来,具有这种结构的质粒,位于天然VP60理论上+2和+3位点的原始氨基酸丢失,导致这两个氨基酸(Glu和Ala)被另外两个氨基酸(Ser和Pro)取代而产生被修饰的VP60蛋白质,并且插入了5个在天然VP60序列中不存在的、起源于pMTL22序列的氨基酸(Ala-Cys-Ile-Asp-Arg)所形成的质粒被命名为pRHD-7,并用于提取修饰的VP60基因。
实施例5在pAcYM1杆状病毒转移载体中克隆
载体pAcYM1(Matsuura等人,1987,J.Gen.Vir0l.,68,1233-1250)具有一与多角体启动子相符的单个克隆位点,BamHI。由于修饰后的VP60基因在其序列中有一个BamHI限制性酶切位点,在所述的载体上进行克隆较困难,因为需要进行新的部分消化才能得以完整地提取插入段。
pAcYM1与其他杆状病毒转移载体相比具有一个优点:它不要求使用β-半乳糖苷酶作为标记,因此所得到的表达产物只能由在多角体启动子控制下的导入基因产生的—在此特定情况下,是重组VP60。
为从pRHD-7克隆中分离VP60基因,试用Bam HI部分消化不同的时间。在最初的研究中,试验了0,1,2,5和10分钟。由于没有足够的插入序列释放出来,进而试验了更长时间:1,2,5,10,15,20,25和30分钟,每次消化产物取10%加在琼脂糖凝胶上,以便观察到最合适的消化时间。得出最合适的时间为15,20,25和30分钟。将消化的余留部分加在1%的琼脂糖凝胶上,一侧为消化15和20分钟,另一侧为25和30分钟,以便挑选出1.7kb的带。用PIB-纤维素膜(SCHLEICHER和SCHUELL筛选出最高的带(HB)和紧接着它下面的带(LB)。按厂家说明书将DNA样品从膜上洗脱下来。洗脱物用乙醇沉淀并重悬于30μl体积的TE溶液中。为了避免肠胃外的pMTL 25载体底端可能的再连接,预先用ScaI总体消化。
将这样制备的材料加于1%琼脂糖凝胶上。在洗脱的HB中再出现二条带,相当于HB和LB污染。再次提取较高的带,并与经BamHI消化的pAcYM1连接,并用碱性磷酸酶脱磷酸化。用该连接混合物转化大肠杆菌DH5α,通过限制性核酸内切酶图谱分析筛选出来重组的pAcRHDV-710和pAcRHDV-709克隆。使用双脱氧链终止法(Sanger,1977,文献同上)测两者的序列(图2)。以进一步证实相应于多角体启动子来说插入片段的正确方向。BamHI位点与转录起始点间的距离仅2个碱基。
实施例6.重组杆状病毒的转染和获得
按照Felgner的技术(Felgner等人,1987,Proc.Natl.Acad.Sci,USA,84,7413-7417),用命名为pAcRHDV-710和pAcRHDV-709的转移载体,分别与AcRP23-LacZ肠胃外杆状病毒的DNA(由Posee博士I、V、E、M.,Oxford,UK提供)一起共转染Spodoptera frugiperda昆虫细胞Sf9。为了共转染,使用2μg相应于pAcRHDV-709或pAcRDHV-710的转移载体加上500ng肠胃外病毒的混合物,并有lipofectin(GIBCO-BRL)的存在。将混合物加到培养有2.5×106个sf单层细胞的T25培养瓶(COSTAR)中。24小时后弃去转染混合物,加入含有5%小牛血清的TNMFH培养基。细胞在27℃培养,7天后收集细胞培养物上清液和细胞余留物。使用感染的细胞培养上清液筛选表达重组VP60的重组杆状病毒,在存在X-gal和中性红存在下,通过连续地铺板来进行这一筛选。重组杆状病毒产生白色的噬斑,野生型病毒则产生兰色噬斑。
将所得的重组杆状病毒命名为AcNPV RHDV-710和AcNPVRHDV-709。重组杆状病毒AcNPV RHDV-710于1994年5月18日保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC),保藏登记号为V94051819。实施例7对AcNPV RHDV-710和AcNPV RHDV-709在Sf9细胞中表达产量的评价,重组VP60的特征鉴定。
7.1 SDS-PAGE凝胶电泳
Sf9细胞经每种重组杆状病毒感染,并在感染后的72小时收集。500g离心5分钟收集细胞,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7.4冲洗并以10×106个细胞/ml重悬于溶胞液(含5%SDS,1%β-疏基乙醇和17.4%甘油)中。在9%SDS-PAGE凝胶中分析前,提取物经超声处理而分成可溶部分和不溶部分。有峰-I纯化的病毒和未感染的Sf9抽提取物的样品同时上柱。凝胶用考马斯蓝染色。相应于重组杆状病毒的样品,一种大约为60 KDa的迁移位置与纯化的病毒蛋白质相似的蛋白质,显示是主要的蛋白质。另外还观察到,大多数重组蛋白质保留在细胞溶解上清液中,这表明这种蛋白质是很易溶的。
如果凝胶电泳的时间足够,可观察到重组蛋白的游动性略低于病毒蛋白质—这是因为它在阅读框内融合有5个额外的氨基酸。
7.2免疫印迹分析
进行免疫印迹试验以证实在凝胶中观察到的蛋白质是目的产物(RHDV rVP60)。按照以前建立的方案(Burnette等人,和Towbin等人,文献同上),凝胶在半干燥装置(BIORAD)中转移到硝酸纤维素膜上。硝化纤维素带用以3%溶于缓冲液(Tris-HCl 20mM pH7.5,NaCl 500mM[TBS])中的粉末脱脂乳(MOLICOR,Nestle),室温下封闭1小时。然后使之与按1∶100 TBS-0.05%Tween-20中稀释的多克隆抗RHDV兔血清,在室温下混合2小时,然后,用含有0.05%Tween-20的TBS洗涤液洗30分钟。与标记有过氧化物酶的蛋白A(按1∶1,000在TBS-Tween-20中稀释)一起保温1小时,然后漂洗,并用4-氯-1-萘酚(SIGMA)、17%(V/V)甲醇和在TBS中的0.015%充氧水处理直到出现可见的带。用蒸馏水终止反应。
试验的结果是,多克隆抗-RHDV兔血清识别存在于感染了重组杆状病毒AcNPV RHDV-710的细胞及阳性对照(峰I)中的同种60KDa蛋白质。但不识别未感染的Sf9细胞提取物中的任何蛋白质。
出现在峰I和AcNPV RHDV-710提取物中的带低于被血清识别的60KDa带。对这条额外带的存在可给出几种解释,但决不会影响终产物的质量,例如已证明它们也出现在细小病毒中。
考虑到在得到的两种重组杆状病毒中AcNPV RHDV-710的产量校高这一事实,在随后的所有实验中,包括制备保藏于ECACC的最终接种物(实施例6)的实验均选用这一克隆。
实施例8分析基于RHDV重组VP60之空衣壳的形成
为了分析重组AcNPV RHDV-710杆状病毒表达的重组VP60蛋白质是否能形成与病毒衣壳相似的多聚结构,用电镜检查重组VP60制品并研究其血凝活性。
用AcNPV RHDV-710以每细胞感染复数为1pfu(噬斑形成单位)感染Sf9细胞,然后在27℃培养72小时。按上所述离心收集细胞并用PBS洗涤,以2×107细胞/ml重悬于25mM碳酸氢盐溶液(PH9.5)中以裂解细胞。裂解的细胞提取物以9,000g离心15分钟,弃去细胞残留物,并在标准条件下用30%酸铵沉淀上清液。由于硫酸铵百分浓度小,故可望多聚结构发生沉淀。经9%SDS-PAGE凝胶电泳分析估测样品的纯度。证实经过一次简单沉淀步骤后可得到的重组衣壳前体纯度水平超过80%。
8.
1电镜分析
用电镜分析半纯化的重组VP60样品,可见蛋白聚集体,其结构和形态与病毒衣壳相似。图3a显示纯化的衣壳制剂(增大64k倍),图3b显示峰II纯化的病毒粒子(增大79k倍)。重组衣壳前体的大小与原始的病毒粒子大小相似,估计约为35-40nm。在衣壳前体制剂中,观察到所有的颗粒都是空的,而在病毒粒子制剂中则存在有两种类型。
8.2
血凝试验
用1%人O型红血细胞PBS悬液做血凝试验,以检测与实施例8.1中所用者相同的重组VP60样品。得到的效价是:
VP60: 15,000 HAu/50μl
RHDV(峰I):390,750 HAu/50μl
然而,必须考虑到在VP60中的蛋白质量比峰I中少5倍。
8.3
ELISA
运用ELISA技术,对照分析RHDV纯化峰I前面之重组衣壳前体的行为。4℃条件下,以有不同抗原浓度的碳酸盐缓冲液(pH9.6)做噬斑试验(每孔500,100,20和4ng)。洗涤三次后,与稀释度在1/100至1/12,500之间的三份兔血清混合,其中使用在1%PBS-MolicoR的稀释因数5的稀释液。37℃保温2小时,洗涤3次,加入按1∶1,000以1%PBS-MolicoR稀释的标记有过氧化物酶的蛋白A,室温保温1小时。洗涤5次,使用ABTS[2,2′-连氮基-双(3-乙基-苯并噻唑-6磺酸)]作底物显色20分钟。用1%SDS终止反应。并监测405nm处吸光率。
估计ELISA试验的最适抗原浓度范围为每孔500和100ng。
随后,使用以2倍系列稀释的0.35kg抗原/孔。测定血清的滴度,比较峰I和重组VP60。试验条件与上面描述者相同。最好地区别阳性和阴性的血清稀释度为1/200和1/400。
抗-RHDV血清等同地识别表达产物rVP60和纯化的病毒,对未感染的Sf9细胞提取物未呈现反应性。
基于这些结果,进一步证实了表达产物(rVP60)在抗原性上是与RHDV天然VP60蛋白质相似的,并且证实所导入的序列没有改变重组蛋白形成多聚衣壳型结构的固有能力。
实施例9疫苗配制
按下述程序将疫苗(能保护兔抵抗RHDV攻击)制成油状或氢氧化铝/Quil-A乳胶的形式。
用重组杆状病毒AcNPV-RHD710以1pfu/细胞的感染复数(m.o.i)感染300ml Sf9细胞悬浮培养物。感染后72小时收集细胞,然后按实施例7所述的方法进行操作,直到最后一步,即用30%硫酸铵纯化重组VP60蛋白质。样品用9%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,并用抗-RHDV血清做免疫印迹。观察到一条分子量约为60KDa的主带(>80%),以及与VP60一起纯化的两条较小的带(43-60KDa),但它们不是病毒特异性的(未被抗-RHDV血清检测到)。
用Lowry法和考马斯兰染色的SDS-凝胶电泳法测得制剂中重组VP60蛋白质浓度为2mg/ml。
A油状疫苗按如下方法制备:
a)50%抗原相,由纯化的重组VP60蛋白质(rVP60)在PBS缓冲液中构成;以及
b)50%油相,由82.3% Marcol-82(ESSO ESPANOLA S.A.),6.5%Eumulgin-48(HENKEL),10%Montanide-80(SEPIC),1.2%苯甲醇(ELF ATO CHEM/ATO)和0.1ml三乙醇胺(MERCK)组成。
将抗原相缓慢加入油相中并持续搅拌,一旦抗原相完全加入后,再继续搅拌10分钟,并将疫苗贮存于4℃备用。
分别制备了五种不同的疫苗,其中各具有不同的重组抗原(rVP60)浓度并加有油状抗原:
疫苗参考剂型
rPV60蛋白浓度(μg/1-ml剂量)
0.5 W/O/W 0.5
3 W/O/W 3
10 W/O/W 10
25 W/O/W 25
50 W/O/W 50
B.另外,使用Munokynin R系统作佐剂(氢氧化铝和Quil-A,AMERICAN CYANAMID)制备其它疫苗。疫苗分别由两个不同浓度的重组抗原rVP60)和Munokynin R佐剂制备而成。
疫苗参考剂型
rVP60蛋白浓度(μg/1-ml剂量)
0.5 W/W 0.5
25 W/W 25
实施例10.用疫苗对兔作实验室水平的效力和安全性试验。
10.1动物
使用新西兰兔,年龄为45天,用HAI技术检查无抗RHDV抗体(实施例1)。动物按两只一组分配于笼中,以便每笼有两只兔以相同疫苗抗原浓度接种疫苗。
10.2接种和再接种
试验共使用39只兔,其中:
a)26只兔接种一剂1ml实施例9所述疫苗。接种后21天,再使用同样的疫苗对它们进行第二剂量的再接种,除了按疫苗指标为3W/O/W外,用该疫苗进行最初接种的4只兔中只有1只再次接种。
b).作为阳性对照,用一剂Laboratorios Sobrino/Cyanamid商品疫苗″CYLAP HVDR″接种和再接种4只兔。
c).剩下的9只兔作为″岗哨″或阴性对照,其中4只接种仅含油性佐剂(参考剂量W/O/W)的乳液,另外4只用仅含MunokyninR佐剂(参考剂型(W/W))的悬液接种,1只未接种。
除了仅有2只兔接种的疫苗参考剂型0.5 W/O/W外,每个剂量和每种疫苗按4只一组分配动物。每组2只动物经肌肉内(IM)途径接种,另外2只经皮下(SC)途径接种,用疫苗0.5W/O/W的2只动物经IM途径接种。
从接种开始到接种后35天期间,估测下列的参数:
A.用HAI技术检查血清学反应,动物在T0,T14,T21和T35时间时抽血。
T0:接种前抽血
T14:接种后第14天抽血
T21:接种后第21天抽血,与再接种的时间一致。
T35:接种后第35天,即再接种后第14天抽血。
表1显示在不同时间所作血凝抑制滴定的结果。
表1:与抵抗RHDV引起之疾病的重组疫苗的效力相对应的兔血清HAI滴定试验
兔号 | 疫苗参考剂型 | T0 | T14 | T21 | T35/C0 | C6 | C14 |
4552(1) | 0.5W/O/W | <1/20 | <1/20 | 1/20 | 1/5120 | 1/5120 | 1/40960 |
4553(1) | <1/20 | <1/20 | <1/20 | 1/40 | 1/1260 | * | |
4557(1) | 3W/O/W | <1/20 | <1/20 | 1/40 | 1/160 | 1/160 | 1/81920 |
4558(1) | <1/20 | <1/20 | 1/20 | 1/40 | 1/640 | 1/2560 | |
4559(2) | <1/20 | 1/320 | 1/640 | 1/2560 | 1/10240 | 1/81920 | |
4560(2) | <1/20 | <1/20 | 1/160 | 1/640 | 1/640 | 1/40960 | |
4561(1) | 10W/O/W | <1/20 | 1/320 | 1/640 | 1/2560 | 1/2560 | 1/40960 |
4562(1) | <1/20 | 1/320 | 1/1280 | 1/5120 | 1/5120 | 1/40960 | |
4563(2) | <1/20 | 1/1280 | 1/5120 | 1/10240 | 1/10240 | 1/40960 | |
4567(2) | <1/20 | 1/1280 | ND | 1/1280 | 1/1280 | 1/40960 | |
4594(1) | 25W/O/W | <1/20 | 1/640 | 1/1280 | 1/640 | 1/1280 | 1/40960 |
4595(1) | <1/20 | 1/640 | 1/1280 | 1/2560 | 1/2560 | 1/10290 | |
4596(2) | <1/20 | 1/40 | 1/640 | 1/1280 | 1/1280 | 1/40960 | |
4597(2) | <1/20 | 1/160 | 1/1280 | 1/1280 | 1/1280 | 1/40960 | |
4598(1) | 50W/O/W | <1/20 | 1/2560 | 1/10240 | 1/10240 | 1/20480 | 1/81920 |
4599(1) | <1/20 | 1/5120 | 1/10240 | 1/20480 | 1/20480 | 1/81920 | |
4591(2) | <1/20 | 1/160 | 1/1280 | 1/10240 | 1/5120 | 1/81920 | |
4592(2) | <1/20 | 1/1280 | 1/1280 | 1/10240 | 1/5120 | 1/40960 | |
4001(1) | 0.5W/W | <1/20 | <1/20 | 1/640 | 1/320 | 1/320 | 1/40960 |
4569(1) | <1/20 | <1/20 | 1/320 | 1/320 | 1/1280 | 1/40960 | |
4002(2) | <1/20 | 1/640 | 1/1280 | 1/5120 | 1/5120 | 1/81920 | |
4570(2) | <1/20 | <1/20 | <1/20 | 1/640 | 1/640 | 1/10240 | |
4003(1) | 25W/W | <1/20 | 1/320 | 1/1280 | * | * | * |
4572(1) | <1/20 | 1/640 | 1/320 | 1/1280 | * | * | |
4004(2) | <1/20 | 1/160 | 1/60 | 1/1280 | 1/640 | 1/5120 | |
4576(2) | <1/20 | 1/160 | 1/40 | 1/640 | * | * | |
4593(1) | CYLAPHVDR | <1/20 | 1/640 | 1/1280 | 1/10240 | 1/2560 | 1/40960 |
4006(1) | <1/20 | 1/160 | 1/320 | 1/1280 | 1/1280 | 1/40960 | |
4590(2) | <1/20 | 1/320 | 1/1280 | 1/10240 | * | * | |
4005(2) | <1/20 | 1/320 | 1/320 | 1/10240 | 1/10240 | 1/81920 | |
4600(1) | W/O/W | <1/20 | <1/20 | <1/20 | * | * | * |
4577(1) | <1/20 | <1/20 | <1/20 | <1/20 | | | |
4008(2) | <1/20 | <1/20 | <1/20 | <1/20 | | | |
4580(2) | <1/20 | <1/20 | <1/20 | <1/20 | | | |
4014(1) | W/W | <1/20 | <1/20 | <1/20 | * | * | * |
4579(1) | <1/20 | <1/20 | <1/20 | <1/20 | | | |
4007(2) | <1/20 | <1/20 | <1/20 | * | * | * | |
4583(2) | <1/20 | <1/20 | <1/20 | 1/640 | | | |
4013 | --- | <1/20 | <1/20 | <1/20 | <1/20 | | |
(1):肌肉内途径 :因感染死亡
(2):皮下途径 *:因抽血死亡
ND:未做
除接种较低浓度重组抗原(如0.5μg)者外,不管是否使用佐剂,接种后14天的动物均可观察到阳性血清学反应。接种安慰剂的动物没有出现可用HAI法检测到的血清学反应。相应于在接种后第21天抽取的血清可见抗体滴度升高,即使那些接种较低浓度重组抗原的动物血清也开始检测到抗体。
再接种后至感染前,即使在以较低的重组抗原浓度接种的动物中也观察到较高水平的抗体。从10μg的剂量开始,剂量的增加在血清学反应方面观察不到重大区别。
B.注射位点的局部反应
在接种过程中,没有观察到动物有明显的局部或全身型反应。
从上文A部分和B部分得到的结果证实,含有RHDV重组VP60蛋白质的疫苗(除了作为一种安全疫苗外)所引起的兔血清转化与天然病毒(CYLAR HVDR)引起的血清转化相似。
10.3
疫苗的效力
接种36天后,所有兔用剂量为3.6×104LD50(致死量的50%)的RHDV进行鼻腔内感染,感染在安全的饲养室进行。
从感染时到感染后第14天(14d.p.i),估测下面参数:
A.是否存在该疾病的特征性临床症状,以及由该疫苗所提供的保护水平。
在总共32只被感染的兔中—23只先前接种了重组抗原(rVP60),3只接种了商品天然疫苗,剩下的6只接种了安慰剂(见表1)—仅有6只岗哨动物在感染后的第5天前死亡并表现出典型的兔出血疾病症状,而经过疫苗接种的动物则能抵抗感染并在感染14天后仍存活,没有出现这一疾病的明显临床症状(见表1)。这些动物在显微镜下观察不到明显的肺和肝脏损伤,在其肝脏里也检测不到RHDV。必须指出的是,接种了3μg单一剂量重组抗原(rVP60)的兔(参考号4558,4559和4560)也能抵抗感染,这表明低剂量的重组抗原足以赋予抵抗疾病的保护作用。
B.血清学反应(HAI)
动物在C0,C6,和C14时抽血:
C0:攻击前抽血
C6:攻击后第6天抽血
C14:攻击后第14天抽血
接种疫苗动物的感染后的血清经HAI滴定所得到的结果示于表1中。感染后第6天,抗RHDV抗体滴度与攻击前滴度(T35/C0)非常相似,而在感染后第14天,滴度普遍较高而且更均匀。这种抗体滴度的增加是由于攻击中所用病毒的强化效应。
C.攻击后动物体内是否存在病毒
检查攻击中死亡之动物和感染后第14天处死之动物肝脏样品中是否有RHDV存在。从每个疫苗组挑选2只观察可能有肝脏损伤的动物(其中一只动物经IM途径接种,另一只经SC途径接种),并收集肝脏样品。两种情况下均从这些样品中分离到RHDV。为此,用超速匀浆器制备肝脏匀浆的PBS悬液(实施例1)。形成的悬液以1,600g离心30分钟澄清之。用所得的上清液以血凝试验检测是否存在RHDV(实施例1)。如表2所示,在攻击期间死亡的兔肝脏中检测到RHDV(对照组或″岗哨″兔),这一事实证实了引起死亡的原因。
表2
攻击后,兔肝中RHDV的分离和滴定
表2
兔编号 | 疫苗参考剂型 | 存活期限(d.p.i) | HA* |
4552 | 0.5W/O/W | ---- | 负 |
4553 | 7 | 负 | |
4557 | 3W/O/W | ---- | 负 |
4559 | ---- | 负 | |
4561 | 10W/O/W | ---- | 负 |
4563 | ---- | 负 | |
4594 | 25W/O/W | ---- | 负 |
4596 | ---- | 负 | |
4598 | 50W/O/W | ---- | 负 |
4591 | ---- | 负 | |
4001 | 0.5W/W | ---- | 负 |
4002 | ---- | 负 | |
4004 | 25W/W | ---- | 负 |
4593 | CYLAP HVDR | ---- | 负 |
4005 | ---- | 负 | |
4577 | W/O/W | 4 | 65,536 |
4008 | 4 | 32,768 | |
4580 | 3 | 32,768 | |
4579 | W/W | 5 | 4** |
4583 | 3 | 4,096 | |
4013 | --- | 3 | 16,384 |
*血凝(HAU/50μl)
**肝脏中存在球虫
表2显示,只在一只对照动物(参考号,4579)中检测到极低水平的病毒,这是因为在该动物的显微观察中发现有肝球虫病。这可能由于部分肝实质已被破坏,而导致RHDV的低复制率。对于接种过疫苗的动物,在感染后第14天被处死,其肝脏中检测不到病毒。一只以最低浓度重组抗原接种过的兔(参考号4553),由于感染后第6天抽血导致死亡,这正如在肝脏中未分离出RHDV这一事实所证明的(表2)。
所得的结果证实含重组VP60蛋白质的重组疫苗对兔出血病具有高免疫原性并且即使在较低剂量的情况下也能提供完全保护。疫苗经肌肉或皮下途径给药没有发现有明显的区别。
另外,重组疫苗能阻止的病毒扩散,因有可能证实用病毒攻击接种过疫苗之动物的靶器官(肝脏)中不再有RHDV复制。实施例11重组VP60蛋白在诊断方法和技术中的应用
如在实施例7.3中所提到的,重组VP60蛋白质可用于检测特异性的抗RHDV抗体。这一发现对于证实动物的感染和决定是否需要接种是有用的。所用的方法是在96圆底孔微量滴定板中做间接ELISA试验。程序简述如下:各孔内加入0.25μg重组抗原(rVP60)在碳酸盐缓冲液(pH9.6)中的溶液做噬斑试验,平板4℃下过夜。加入按合适的稀释度以0.1%PBS-MoliCoR稀释的试验血清,并于室温保温1小时。洗噬斑并使用ABTS作底物进行显色(实施例8.3)。
在用重组疫苗测定兔血清的ELISA滴度及相应的效力试验中,可用抗RHDV抗体的检测和定量程序作为例子。抗RHDV抗体的ELISA滴定结果如表3中所示。
表3 用ELISA检测抗RHDV抗体
兔编号 | 疫苗参考数据 | T0 | T14 | T21 | T35/C0 | C6 | C14 |
4552(1) | 0.5W/O/W | <1/20 | <1/100 | 1/200 | 1/12800 | 1/80000 | 1/160000 |
4553(1) | <1/20 | <1/100 | <1/100 | 1/400 | 1/10000 | * | |
4557(1) | 3W/O/W | <1/20 | <1/100 | 1/100 | 1/6400 | 1/20000 | 1/80000 |
4558(1) | <1/20 | <1/100 | <1/100 | 1/1600 | 1/5000 | 1/40000 | |
4559(2) | <1/20 | 1/100 | 1/3200 | 1/3200 | 1/40000 | 1/320000 | |
4560(2) | <1/20 | <1/100 | 1/600 | 1/1600 | 1/10000 | 1/320000 | |
4561(1) | 10W/O/W | <1/20 | 1/200 | 1/3200 | 1/40000 | 1/80000 | 1/320000 |
4562(1) | <1/20 | 1/400 | 1/3200 | 1/20000 | 1/80000 | 1/640000 | |
4563(2) | <1/20 | 1/1600 | 1/12800 | 1/320000 | 1/160000 | 1/320000 | |
4567(2) | <1/20 | 1/3200 | 1/12800 | 1/320000 | 1/80000 | 1/160000 | |
4594(1) | 25W/O/W | <1/20 | 1/3200 | 1/6400 | 1/40000 | 1/40000 | 1/160000 |
4595 (1) | <1/20 | 1/1600 | 1/12800 | 1/80000 | 1/40000 | 1/160000 | |
4596(2) | <1/20 | 1/1600 | 1/3200 | 1/40000 | 1/40000 | 1/160000 | |
4597(2) | 1/160 | 1/6400 | 1/12600 | 1/40000 | 1/40000 | >1/106 | |
4598(1) | 50W/O/W | <1/20 | 1/6400 | 1/12800 | 1/80000 | 1/320000 | 1/320000 |
4599(1) | <1/20 | 1/6400 | 1/12800 | 1/80000 | 1/160000 | 1/160000 | |
4591(2) | <1/20 | 1/3200 | 1/12800 | 1/80000 | 1/80000 | 1/80000 | |
4592(2) | <1/20 | 1/6400 | 1/12800 | 1/40000 | 1/40000 | 1/160000 | |
4001(1) | 0.5W/W | <1/20 | 1/800 | 1/1600 | 1/6400 | 1/10000 | 1/160000 |
4569(1) | 1/320 | 1/400 | 1/800 | 1/6400 | 1/20000 | 1/320000 | |
4002(2) | <1/20 | 1/1600 | 1/1600 | 1/20000 | 1/80000 | 1/160000 | |
4570(2) | <1/20 | <1/100 | <1/100 | 1/200 | 1/10000 | 1/40000 | |
4003(1) | 25W/W | <1/20 | 1/6400 | 1/6400 | * | * | * |
4572(1) | 1/160 | 1/400 | 1/800 | 1/12800 | * | * | |
4004(2) | <1/20 | 1/800 | 1/1600 | 1/6400 | 1/10000 | 1/80000 | |
4576(2) | <1/20 | 1/100 | 1/200 | 1/6400 | * | * | |
4593(1) | CYLAPHVDR | <1/20 | 1/1600 | 1/12800 | 1/40000 | 1/40000 | 1/160000 |
4006(1) | <1/20 | 1/800 | 1/3200 | 1/40000 | 1/80000 | 1/160000 | |
4590(2) | <1/20 | 1/200 | 1/1600 | 1/80000 | * | * | |
4005(1) | <1/20 | 1/1600 | 1/6400 | 1/80000 | 1/160000 | 1/320000 | |
4600(1) | W/O/W | 1/160 | 1/200 | 1/200 | * | * | * |
4577(2) | <1/20 | <1/100 | 1/100 | 1/400 | | | |
4008(2) | <1/20 | 1/200 | 1/400 | 1/100 | | | |
4580(1) | <1/20 | <1/100 | 1/200 | 1/400 | | | |
4014(1) | W/W | 1/80 | 1/400 | 1/800 | * | * | * |
4579(2) | <1/20 | <1/100 | <1/100 | <1/100 | | | |
4007(1) | <1/20 | 1/100 | <1/100 | * | * | * | |
4563(2) | <1/20 | <1/100 | <1/100 | <1/100 | | | |
4013(-) | --- | <1/20 | <1/100 | <1/100 | <1/100 | | |
(1):肌肉内途径 :死于感染
(2):皮下途径 *:死于放血
一般说来,用HAI和ELISA测得的滴度之间相关性是很好的,尽管ELISA方法的灵敏度高10倍,其所得的滴度值高5-20倍。
在4只兔(参考号.4597,4569,4572和4600)中用ELISA检测到少许的抗体滴度,但用HAI则检测不到,这一事实可能表明残留有母体免疫,但其好象并不影响诱导抗体。这一结果提示即使存在母体抗体时,疫苗可能仍是有效的。
实施例12.经口服途径接种疫苗—疫苗的效力和安全性试验
将疫苗(能保护兔不受RHDV的感染)按下述程序制备成水悬液的形式:
用重组杆状病毒AcNPV-RHDV 710以感染复数(m.o.i)为1 pfu/细胞的剂量感染300ml Sf9细胞悬浮培养物。感染后72小时收集细胞,按上面实施例7所述方法处理,直到最后一步以30%硫酸铵纯化重组VP60蛋白质。用9% SDS-聚丙烯酰胺凝胶对样品作电泳分析并用抗RHDV血清做免疫印迹分析。观察到一条分子量大约为60KDa的主带(>80%)以及两条与Vp60一起纯化的小带(43-60KDa),但后者并不是病毒特异性的(用抗RHDV血清未检测到)。
用lowry法和SDS-凝胶分析及考马斯蓝染色测知制剂中重组VP60蛋白质浓度为2mg/ml。
A.疫苗按下面方法配制:重组VP60蛋白质用PBS(pH7.2)稀释成1ml稀释液(1剂量)含3μg重组VP60蛋白质。该溶液用二等份的乙烯亚胺以终浓度5mM于37℃灭活72小时。
B.另外,使用浓度为1ml剂量含3μg重组VP60,但未灭活的同一抗原溶液配制另一疫苗。
—被试疫苗:灭活的疫苗
未灭活的疫苗
—动物
使用新西兰兔,年龄为60天,以HAI技术估测其无抗RHDV抗体(实施例1)。将动物分配于笼中。
—接种和再接种
试验共用15只兔进行,其中:
a),5只兔接种每份1ml剂量的灭活疫苗。从开始接种后的第21天,用第二份剂量的同种疫苗进行再接种[第15组,表4]。
b),5只兔用1剂量未灭活疫苗进行接种和再接种[第16组,表4]。
c),5只兔留作″岗哨″或阴性对照,用PBS接种[第17组,表4]。
疫苗经过口服途径给药,以1ml的水相放入口内。
从开始接种到接种后35天间,估测下列参数:
A.用HAI技术测血清学反应
动物在T-4,T21和T35,T43天抽血。
T-4:接种前4天抽血,
T21:接种后21天抽血,与再接种时间一致,
T35:接种后35天即再接种后第14天抽血,
T43:接种后43天即再接种后第22天抽血。
表4列出了在不同时间血凝抑制滴度的结果。
表4
与重组疫苗对抗RHDV引起之疾病的效力试验(口服接种)相对应的兔血清的HAI滴度
组别 | 动物编号 | T-4 | T21 | T35 | T43 | 肝中病毒HAI滴度 | |
攻击后8天存活 | |||||||
15 | 407 | <1/20 | <1/20 | <1/20 | 1/320 | Yes | No,neg |
401 | <1/20 | 1/160 | 1/640 | 1/2560 | Yes | No,neg. | |
413 | <1/20 | 1/20-1/40 | ≤1/20 | 1/1280 | Yes | No,neg. | |
411 | <1/20 | 1/80-1/160 | 1/40 | 1/640 | Yes | Y1/B | |
405 | <1/20 | <1/20 | <1/20 | - | | Y1/8192 | |
16 | 402 | <1/20 | <1/20 | <1/20 | - | | Y1/8192 |
415 | <1/20 | 1/80-1/160 | 1/160 | 1/1280 | Yes | Y1/4 | |
409 | <1/20 | <1/20 | ≤1/20 | - | | Y1/4096 | |
408 | <1/20 | <1/20 | * | - | * | * | |
410 | <1/20 | <1/20 | <1/20 | - | | Y1/64 | |
17 | 414 | <1/20 | <1/20 | * | - | * | * |
403 | <1/20 | <1/20 | <1/20 | - | | Y1/8192 | |
404 | <1/20 | <1/20 | <1/20 | - | | Y1/16384 | |
412 | <1/20 | <1/20 | <1/20 | - | | Y1/4096 | |
406 | <1/20 | <1/20 | <1/20 | - | | Y1/8192 |
*:死于放血
:死于感染
Y:是
Neg:阴性
接种后第21天,观察到用灭活疫苗接种的5只动物中有3只(参考号401,413和411)血清学反应呈阳性。用未灭活疫苗接种的动物中,只有一只(第415号)发生血清转化。
B.全身反应
接种期间,在兔子中观察不到明显的局部或全身反应。
表4所得的结果证实含有RHDV重组VP60蛋白质的疫苗可导致兔的血清转化,但其效力比经皮下途径给药的效力低。
—疫苗的效力
接种后35天,所有兔均以3.6×104LD50(致死剂量的50%)的RHDV进行鼻腔内感染。攻击在安全保障条件下。
从感染时到感染后第8天,测定下面参数:
A:是否存在该疾病特征性的临床症状,以及该疾苗所提供的保护水平
在15只感染的兔中,5只接种过灭活的重组抗原(rVP60),5只接种未灭活的重组抗原,剩下的5只接种的安慰剂(表4)。对于岗哨动物,100%在感染后第8天前死亡,表现出兔出血病的典型症状。用未灭活抗原接种的动物,4只中有3只死亡,在5只用灭活疫苗接种的动物中,有1只死亡。
B.攻击后在动物体内是否存在病毒
从在感染后8天前死亡以及感染后第8天处死的动物中获得肝脏样品,按照实施例1所提到的方法,检测和定量RHDV的存在。由表4中可以看出,处死动物的肝脏中RHDV的浓度实际上为0(相应于接种过疫苗的动物),而感染后8天前死亡的动物肝脏中,则检测到高浓度的RHDV。因此,这些疫苗与IM及SC疫苗(实施例9和10)一样,不仅阻止临床症状的发生,而且能避免RHDV在所分析器官(肝脏)中复制。
所得结果证实含有灭活重组VP60蛋白质的重组疫苗具有免疫原性并且经口服途径接种后能对兔出血病提供保护。微生物的保藏
命名为ACNPV RHDV-710的重组杆状病毒于1994年5月18日保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection ofAnimal Cell Culture,ECACC),Porton Down,Salisbury,Whiltshire SP4 OJG,United Kingdom′,保藏号为V94051819。
保藏的目的并不是使本发明的范围受到已保藏的重组杆状病毒的限制,因为有效的保藏物只是便于作为一种重组杆状病毒的解释例,适用于理解本发明,而且任何其他在功能上可能等同于已保藏之杆状病毒的重组体(微生物,细胞系)也应在本发明的范围之内。
Claims (18)
1.一种由修饰的兔出血病病毒RHDV VP60蛋白的聚集物组成的衣壳,所述修饰的RHDV VP60蛋白由RHDV天然VP60蛋白组成,其中:
(i)RHDV天然VP60蛋白的氨基酸序列的+2和+3位点的氨基酸残基被2个其它的氨基酸残基取代;和
(ii)在修饰的VP60蛋白的氨基末端有一个附加的氨基酸序列Ala-Cys-Ile-Asp-Arg。
2.权利要求1的衣壳,它是通过修饰的RHDV蛋白的聚集而获得的,方法是用低浓度的硫酸铵沉淀重组杆状病毒的表达产物,所述重组杆状病毒表达修饰的RHDV,在昆虫细胞培养物中复制。
3.修饰的RHDV VP60蛋白,所述修饰的RHDV VP60蛋白由RHDV天然VP60蛋白组成,其中:
(i)RHDV天然VP60蛋白的氨基酸序列的+2和+3位点的氨基酸残基被2个其它的氨基酸残基取代;和
(ii)在修饰的VP60蛋白的氨基末端有一个附加的氨基酸序列Ala-Cys-Ile-Asp-Arg。
4.一种适于免疫接种和保护兔子抵抗兔出血病的疫苗,包括:
(i)免疫学合适量的抗原,所述抗原包括:
i.a)权利要求1或2的衣壳;或
i.b)权利要求3的修饰的RHDV VP60蛋白;和
(ii)合适的载体或佐剂。
5.权利要求4的疫苗,其中所述的佐剂是基于矿物油、甘油和脂肪醚-酸衍生物的油佐剂。
6.权利要求5的疫苗,它是W/O或O/W乳剂形式,或W/O/W双重乳剂形式。
7.权利要求5的疫苗,其中所述的佐剂是合成佐剂。
8.权利要求5的疫苗,其中所述佐剂是选自氢氧化铝、氧化铝凝胶悬浮液、QuilA及其混合物的含水佐剂。
9.权利要求5的疫苗,其中所述的佐剂选自MDP、ISCOM或脂质体。
10.权利要求5的疫苗,其中所述抗原和佐剂或稀释剂一起以溶液或悬浮液的形式存在。
11.权利要求5的疫苗,所述疫苗以可用稀释剂、佐剂重新配制的冻干形式或其它含水或油状兔疫苗形式存在。
12.一种适于免疫兔使其抵抗兔出血病的被动疫苗,包括从用权利要求1或2的衣壳或权利要求3的修饰的RHDV VP60蛋白免疫的动物中得到的抗体,和合适的载体或佐剂。
13.权利要求1或2的衣壳或权利要求3的修饰的RHDV VP60蛋白在制备用于保护兔使其不受RHDV感染的疫苗中的应用。
14.一种检测来自兔的生物样品中是否存在特异性识别兔出血病病毒的抗体的方法,该方法包括将所述生物样品与权利要求1或2的衣壳或者权利要求3的修饰的RHDV VP60蛋白接触,并检测形成的抗原-抗体复合物。
15.一种检测来自兔的生物样品中的兔出血病病毒是否存在的方法,所述方法包括将样品和特异性识别RHDV的抗体接触并检测形成的抗原-抗体复合物,其中所述的抗体来自用权利要求1或2的衣壳或权利要求3的修饰的RHDV VP60蛋白免疫的动物。
16.一种用于检测来自兔的生物学样品中是否存在特异性识别兔出血病病毒的抗体的诊断试剂盒,该试剂盒包括权利要求1或2的衣壳或者权利要求3的修饰的RHDV VP60蛋白,和合适的检测工具。
17.一种用于检测来自兔的生物学样品中是否存在兔出血病病毒的诊断试剂盒,所述试剂盒包括特异性识别RHDV的抗体和合适的检测工具,其中所述的抗体是从用权利要求1或2的衣壳或权利要求3的修饰的RHDV VP60蛋白免疫的动物中获得的。
18.一种重组杆状病毒,其被命名为AcNPV RHDV-710,保藏号为ECACC V94051819。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES9401493 | 1994-07-08 | ||
ES09401493A ES2080023B1 (es) | 1994-07-08 | 1994-07-08 | Capsidas y proteinas recombinantes del virus de la enfermedad hemorragica del conejo (rhdv), kits de diagnostico y vacunas que contienen dichos productos recombinantes. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1134461A CN1134461A (zh) | 1996-10-30 |
CN1217954C true CN1217954C (zh) | 2005-09-07 |
Family
ID=8286840
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN951150588A Expired - Fee Related CN1217954C (zh) | 1994-07-08 | 1995-07-07 | 兔出血病病毒重组衣壳和蛋白质及含有它们的诊断药盒和疫苗 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0704528B1 (zh) |
CN (1) | CN1217954C (zh) |
AT (1) | ATE296887T1 (zh) |
DE (1) | DE69534242T2 (zh) |
DK (1) | DK0704528T3 (zh) |
ES (2) | ES2080023B1 (zh) |
HK (1) | HK1014547A1 (zh) |
PT (1) | PT704528E (zh) |
SI (1) | SI0704528T1 (zh) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2080024B1 (es) * | 1994-07-06 | 1996-08-16 | Univ Oviedo | Vacuna subunitaria recombinante contra la enfermedad hemorragica virica de los conejos. |
EP2272530A3 (en) * | 2001-07-26 | 2013-05-22 | Otago Innovation Limited | Antigenic Compositions |
PL205228B1 (pl) * | 2005-07-08 | 2010-03-31 | Panstwowy Inst Weterynaryjny P | Zestaw diagnostyczny do badania surowic zwierząt na obecność przeciwciał RHD oraz zestaw diagnostyczny do wykrywania wirusa RHD |
PL205229B1 (pl) * | 2005-07-08 | 2010-03-31 | Panstwowy Inst Weterynaryjny P | Sposób wytwarzania rekombinowanej szczepionki przeciwko krwotocznej chorobie królików, szczepionka oraz zastosowanie antygenu rekombinowanego białka do wytwarzania szczepionki |
CN103033622B (zh) * | 2011-12-26 | 2015-03-25 | 武汉中博生物股份有限公司 | 猪圆环病毒2型elisa抗原检测试剂盒及其制备方法和其应用 |
CN104694481B (zh) * | 2015-04-01 | 2017-07-07 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 杂交瘤细胞株McAb 1H2及兔出血症RHDVa型病毒单克隆抗体 |
CN105486861B (zh) * | 2015-07-02 | 2017-07-11 | 山东省滨州畜牧兽医研究院 | 一种兔瘟病毒抗体快速检测卡及其制备方法 |
CN107164252B (zh) * | 2016-03-08 | 2020-10-20 | 上海海利生物技术股份有限公司 | 一种rhdv的亚单位疫苗 |
CN113907046A (zh) * | 2021-11-09 | 2022-01-11 | 福建省连江县刘氏兔业养殖场 | 一种含特异性转移因子的ty26种兔群的选育方法和相应兔品系的培育方法 |
CN115725511B (zh) * | 2022-08-29 | 2024-02-09 | 四川农业大学 | 一种杂交瘤细胞株R2McAb2A1及其分泌的单克隆抗体和应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2055598C (en) * | 1989-07-21 | 1998-12-08 | Richard C. Wardley | Feline calicivirus gene |
ES2026827A6 (es) * | 1991-03-26 | 1992-05-01 | Ercros Sa | Procedimiento para la produccion de una vacuna subunidad contra el parvovirus porcino. |
FR2690838B1 (fr) * | 1992-05-06 | 1996-07-12 | Rhone Merieux | Ensemble de vaccination contre la maladie hemorragique virale du lapin et vaccins conditionnes pour etre utilises dans cet ensemble. |
ES2080024B1 (es) * | 1994-07-06 | 1996-08-16 | Univ Oviedo | Vacuna subunitaria recombinante contra la enfermedad hemorragica virica de los conejos. |
-
1994
- 1994-07-08 ES ES09401493A patent/ES2080023B1/es not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-07-05 PT PT95304719T patent/PT704528E/pt unknown
- 1995-07-05 DE DE69534242T patent/DE69534242T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-05 SI SI9530719T patent/SI0704528T1/xx unknown
- 1995-07-05 AT AT95304719T patent/ATE296887T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-07-05 DK DK95304719T patent/DK0704528T3/da active
- 1995-07-05 EP EP95304719A patent/EP0704528B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-05 ES ES95304719T patent/ES2240968T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-07 CN CN951150588A patent/CN1217954C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-12-28 HK HK98115794A patent/HK1014547A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0704528A2 (en) | 1996-04-03 |
DK0704528T3 (da) | 2005-07-04 |
ES2080023A1 (es) | 1996-01-16 |
PT704528E (pt) | 2005-09-30 |
EP0704528B1 (en) | 2005-06-01 |
EP0704528A3 (en) | 1998-03-04 |
DE69534242D1 (de) | 2005-07-07 |
HK1014547A1 (en) | 1999-09-30 |
ES2240968T3 (es) | 2005-10-16 |
CN1134461A (zh) | 1996-10-30 |
ES2080023B1 (es) | 1996-08-16 |
SI0704528T1 (en) | 2005-10-31 |
DE69534242T2 (de) | 2006-05-11 |
ATE296887T1 (de) | 2005-06-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1056878C (zh) | 重组火鸡疱疹病毒及其衍生的活载体疫苗 | |
CN1020752C (zh) | 后天性免疫缺乏综合征(爱滋病)疫苗 | |
CN1087175C (zh) | 能够产生抗猪呼吸和生殖系统疾病致病性病毒的免疫应答的疫苗 | |
US20220031831A1 (en) | Immunogenic compositions for african swine fever virus | |
CA2198461C (en) | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv), proteins encoded by the polynucleic acids, vaccines based on the proteins and/or polynucleic acids, a method of protecting a pig from a prrsv and a method of detecting a prrsv | |
CN1041326C (zh) | 制备cav核酸序列或氨基酸序列的方法 | |
JP7422795B2 (ja) | 昆虫細胞でのPCV2b ORF2タンパク質の組換え発現 | |
CA2837125A1 (en) | Combined vaccines for prevention of porcine virus infections | |
CN1267553C (zh) | 嗜血杆菌属转铁蛋白受体基因 | |
CN1217954C (zh) | 兔出血病病毒重组衣壳和蛋白质及含有它们的诊断药盒和疫苗 | |
CN1068266A (zh) | 人免疫缺陷病毒的疫苗及其治疗方法 | |
Casal | Use of parvovirus‐like particles for vaccination and induction of multiple immune responses | |
US20230302113A1 (en) | Porcine Circovirus Type 3 (PCV3) Vaccines, and Production and Uses Thereof | |
CN102221618B (zh) | 猪瘟兔化弱毒标记疫苗毒株的构建及疫苗的制备方法 | |
CN1259522A (zh) | 新颖的来自大叶性肺炎放线杆菌的蛋白质 | |
CN1295339C (zh) | 减毒痘苗病毒天坛株载体及制备方法和应用 | |
EP1000168B1 (en) | A swine hepatitis e virus and uses thereof | |
CN1556216A (zh) | 蓝舌病毒的检测方法及试剂盒 | |
CN1290175A (zh) | 人免疫缺陷病毒的活疫苗 | |
CN1125826C (zh) | 新型戊型肝炎病毒基因序列及其应用 | |
CN102604898A (zh) | 携带o型口蹄疫病毒b细胞表位的vp60蛋白重组杆状病毒 | |
CN1918288A (zh) | 表达sars免疫原的载体、含所述载体或其表达产物的组合物、制备和使用方法和实验 | |
Koo et al. | Characterization and expression of the pseudorabies virus (NYJ strain) glycoproteins in Bombyx mori cells and larvae | |
TWI361695B (en) | Pcv-2 vaccine | |
CN118531017A (zh) | 牛冠状病毒病毒样颗粒、制备方法及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20050907 Termination date: 20090807 |